(57)【要約】【課題】  新規なホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を提供すること。【解決手段】  本発明は、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３２）由来の、新規ホスホリパーゼＣを提供する。このホスホリパーゼＣは、ホスファチジルコリンに対して高い特異性を有し、他のリン脂質に対する活性は低く、約１７ｋＤａ〜１９ｋＤａの分子量のサブユニットからなる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（８）の特性を有する新規ホスホリパーゼＣ：
（１）作用：リン脂質に作用し、そのリン酸エステル結合を加水分解して、１，２−ジアシルグリセリドおよびホスホリル塩基を遊離する；
（２）基質特異性：ホスファチジルコリンに対して特異的に作用するが、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンにはほとんど作用せず、そしてｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンに対しては実質的に作用しない；
（３）最適ｐＨ：７．２；
（４）安定ｐＨ：８．２〜８．８；
（５）最適温度：約５０℃；
（６）安定温度：２０℃以下；
（７）阻害：カルシウムを除く金属イオン、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、ＳＤＳ、およびＥＤＴＡにより阻害されるが、ヨードアセトアミドによって阻害されない；および
（８）分子量：約１７ｋＤａ〜１９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【請求項２】
シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３２）由来である、請求項１に記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項３】
ホスホリパーゼＣ生産能を有する、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３２）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なホスホリパーゼＣに関する。より詳細には、新規な微生物に由来する新規なホスホリパーゼＣに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＣ［EC 3.1.4.3］（以下、ＰＬＣという）は、リン脂質に作用し、そのリン酸エステル結合を加水分解し、１，２−ジアシルグリセリド（以下、１，２−ＤＧという）とホスホリル塩基とを遊離する加水分解酵素である。ＰＬＣは、パン製造などの食品工業やセラミド製造などの油脂工業における有用性が報告されている（特許文献１および２）。また、近年では、細胞生物学の分野において、シグナル伝達系の研究が広く行われ、研究用試薬としてのＰＬＣの需要も高まっている。このように、ＰＬＣは工業用酵素および研究用試薬としての開発が強く望まれている。
【０００３】
これまでに、動物の肝臓や脾臓由来のＰＬＣ、クロストリジウム・ペルフリオンゲンス（Clostridium perfriongens）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・シュイルキリエンシス（Pseudomonas schuylkilliensis）などの微生物由来のＰＬＣなどが知られている（非特許文献１〜５）。しかし、動物内臓由来のＰＬＣは、原料となる臓器の供給や酵素精製の煩雑さ、宗教上の理由などのため、工業化に至っていない。微生物由来ＰＬＣについては、病原性に関連する研究は行われているが、工業利用を目的とする研究はほとんど行われていない（非特許文献１）。工業利用については、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のＰＬＣが報告されているが（特許文献３）、その至適ｐＨが２〜５と低いため、実際には利用しにくい。
【特許文献１】特開平８−２６６２１３号公報
【特許文献２】特開平６−６１２４７号公報
【特許文献３】特開２０００−１６６５４３号公報
【非特許文献１】Titball R.W.、「Microbiol. Rev.」，1993年，57巻，pp.347-366
【非特許文献２】Crevel I.U.S.ら、「Eur. J. Biochem.」，1994年，224巻，pp.845-852
【非特許文献３】Ivanov A.ら、「Microbiologica」，1996年，19巻，pp.113-121
【非特許文献４】Osamu Doiら、「Biochim. Biophys. Acta」，1971年，248巻，pp.234-244
【非特許文献５】荒井基夫ら、「日本農芸化学会誌」，1974年，48巻，pp.409-415
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規なホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、種々の油脂分解菌についてＰＬＣ活性を有するかどうかを検討した結果、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株がホスファチジルコリンに対して特異的に加水分解活性を有するＰＬＣを産生し得ることを発見した。本菌は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３２として寄託されている。
【０００６】
本発明は、以下の（１）〜（８）の特性を有する新規ホスホリパーゼＣを提供する：
（１）作用：リン脂質に作用し、そのリン酸エステル結合を加水分解して、１，２−ジアシルグリセリドおよびホスホリル塩基を遊離する；
（２）基質特異性：ホスファチジルコリンに対して特異的に作用するが、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンにはほとんど作用せず、そしてｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンに対しては実質的に作用しない；
（３）最適ｐＨ：７．２；
（４）安定ｐＨ：８．２〜８．８；
（５）最適温度：約５０℃；
（６）安定温度：２０℃以下；
（７）阻害：カルシウムを除く金属イオン、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、ＳＤＳ、およびＥＤＴＡにより阻害されるが、ヨードアセトアミドによって阻害されない；および
（８）分子量：約１７ｋＤａ〜１９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【０００７】
好適な実施態様では、上記ホスホリパーゼＣは、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３２）由来である。
【０００８】
本発明はまた、ホスホリパーゼＣ生産能を有する、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３２）を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、リン脂質として最も多く存在するホスファチジルコリン（レシチン）に対して特異的に作用するＰＬＣ、ならびに該ＰＬＣを産生し得るシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（ホスホリパーゼＣを産生する菌株）
本発明のシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株は、本発明者らによって土壌より得た２５６菌株の油脂分解菌を、ＰＬＣ活性についてスクリーニングすることにより得られた菌種であり、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、平成１６年３月１１日にＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３２として寄託されている。
【００１１】
上記シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株は、以下の菌学的諸性質を有する：
細胞の形および大きさ：桿菌、０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ
グラム染色性：−
胞子形成：−
運動性：＋
コロニー形態：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、黄色（培地：Nutrient Agar；２４時間培養）
培養温度：２８℃：＋、３７℃：−、４２℃：−、４５℃：−
カタラーゼ：＋
オキシダーゼ：−
ウレアーゼ：−
酸／ガス産生（グルコース）：−／−
Ｏ／Ｆテスト：−／−
嫌気条件下での生育性：−
MacConkey寒天培地での生育性：＋
King's B寒天培地上での蛍光色素産生：＋
その他の生理学的性質：以下の表１に示す。
【００１２】
【表１】
2005328781.tif 000002
【００１３】
化学分類学的性質：１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長塩基配列（１５２８ｂｐ：配列番号１）の相同性検索では、シュードモナス・モンテイリ（Pseudomonas monteilii）に対して９９．３％、およびシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０に対して９９．２％の相同性を有する。
【００１４】
（本発明のホスホリパーゼＣ）
本発明のホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）に属する微生物から産生されるものであり、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株から産生されるものが好ましい。また、後述のように、これらの組換え酵素も利用できる。この場合、産生されたＰＬＣは、菌体内に蓄積されてもよいが、好ましくは菌体外に分泌される。
【００１５】
（シュードモナス・エスピー由来のＰＬＣの製造）
本発明のＰＬＣは、以下のような、通常用いられる培養手段により製造され得る。
【００１６】
上記のシュードモナス・エスピーに属する微生物を、レシチンを含有する適切な培地中で、２０〜３５℃、好ましくは２８℃前後で好気条件下において、１〜５日、好ましくは１〜３日培養する。レシチンを含有する適切な培地としては、例えば、レシチン含有ブイヨン培地が挙げられる。
【００１７】
得られた培養液から濾過または遠心分離により菌体を除去し、濾液または上清を得る。こうして得られた濾液または上清を、例えば、硫安による塩析、エタノール、アセトンなどによる溶媒沈澱法、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの当業者が通常用いる酵素精製方法に供することよって、ＰＬＣが精製され得る。
【００１８】
例えば、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株を、レシチン含有ブイヨン培地中、好気的な条件下で培養し、得られた培養液から菌体を分離除去し、培養上清を得る。次いで、この培養上清を硫安分画し、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE-Sepharose Fast Flowカラム（Amersham Biosciences Corp.製））、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、Phenyl-Sepharose High performanceカラム（Amersham Biosciences Corp.製））によって精製することにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）にて分子量約１７〜１９ｋＤａの精製酵素を得ることができる。
【００１９】
（ＰＬＣの活性測定法）
リン脂質（代表的には、ホスファチジルコリン）を基質として、酵素反応により遊離するリン酸を定量することによって測定する。具体的には、酵素液10μL、0.2％(w/v)Ｌ−α−ホスファチジルコリン（以下、ＰＣという）、0.285％(v/v)Triton X-100、および46mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）を含む酵素反応液300μLを、37℃にて10分間インキュベートし、反応液を100℃で10分間加熱し、反応を停止させる。煮沸した酵素を用いて、同様に基質と緩衝液とをインキュベートし、加熱して反応を停止させたものを、ブランクとする。反応終了後、この反応液10μLをアルカリホスファターゼ溶液（0.2units アルカリホスファターゼ、１mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、50mM グリシン-NaOH緩衝液（pH9.6））190μLに添加し、37℃にて20分間脱リン酸化反応を行う。遊離したリン酸を定量することにより、ＰＬＣ活性を求める。ＰＬＣの１Ｕは、１分間に１μmolのホスホリル塩基を遊離する酵素量である。
【００２０】
なお、ホスファチジン酸を基質とする場合は、上記のように酵素反応した後、アルカリホスファターゼ処理せずに、直ちに遊離したリン酸を定量する。また、人工リン脂質であるｐ−ニトロフェニルホスホリルコリン（以下、ｐＮＰＰＣ）を基質とする場合は、酵素液50μLを酵素反応液1.45mL（3.6mM ｐＮＰＰＣ、50mM Tris-HCl緩衝液（pH7.2））に添加し、50℃にて10分間インキュベートした後、遊離のｐ−ニトロフェノールを定量する。この場合も、ＰＬＣの１Ｕは、１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量である。
【００２１】
（シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株由来のＰＬＣの理化学的性質）
本発明のシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株由来のＰＬＣの理化学的性質は、以下の（１）〜（８）のとおりである。
【００２２】
（１）作用
リン脂質に作用し、そのリン酸エステル結合を加水分解して、１，２−ジアシルグリセリドおよびホスホリル塩基を遊離する。
【００２３】
（２）基質特異性
ホスファチジルコリンに対して特異的に作用するが、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンにはほとんど作用せず、そしてｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンに対しては実質的に作用しない（実施例６参照）。
【００２４】
（３）最適ｐＨ：７．２
本酵素について、ｐＨ４〜１１の終濃度46mMの種々の緩衝液中で37℃にて10分間反応させて相対活性を測定すると、図１に示すように最適ｐＨは７．２である。
【００２５】
（４）安定ｐＨ：８．２〜８．８
本酵素について、ｐＨ４〜１２の終濃度45mMの種々の緩衝液中、５℃にて３時間インキュベートした後、ｐＨ７．２、５０℃での残存活性を測定すると、図２に示すように安定ｐＨは８．２〜８．８である。
【００２６】
（５）最適温度：約５０℃
本酵素について、２０〜７０℃の温度で、0.01％(v/v)Triton X-100および0.2mM 硫酸アンモニウムを含む終濃度46mMのTris-HCl緩衝液（pH7.2）中、10分間反応させて相対活性を測定すると、最適温度は、図３に示すように約５０℃である。
【００２７】
（６）安定温度：２０℃以下
本酵素について、４〜７０℃の温度で、終濃度46mMのTris-HCl緩衝液（pH7.2）中30分間インキュベートした後、ｐＨ７．２、５０℃での残存活性を測定すると、図４に示すように安定温度は２０℃以下である。
【００２８】
（７）阻害
本酵素は、カルシウムを除く金属イオン、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、ＳＤＳ、およびＥＤＴＡにより阻害されるが、ヨードアセトアミドによって阻害されない（実施例７参照）。
【００２９】
（８）分子量：約１７ｋＤａ〜１９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（実施例３参照）。
【００３０】
（ＰＬＣの使用形態）
本発明のＰＬＣは、ホスファチジルコリン（レシチン）に対して高い基質特異性を有する。したがって、リン脂質の除去などに利用され得る。
【００３１】
本発明のＰＬＣの使用形態としては、(i)ＰＬＣ産生菌体を通常の方法で固定化したもの、(ii) ＰＬＣ産生菌体を機械的、酵素的、もしくは界面活性剤や有機溶剤などで処理したもの、またはそれらを固定化したもの、(iii) ＰＬＣ産生菌体を破砕して破砕残渣を除去したもの、またはそれを固定化したもの、(iv)酵素精製物、またはそれを固定化したもの、(v) ＰＬＣ産生菌培養液またはＰＬＣ産生菌体を除去した培養上清、またはそれを濃縮、乾燥、および／あるいは固定化したものなどが挙げられる。固定化は、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、イオン交換担体、キトサンビーズなど、当業者が一般に用いる通常の固定化方法で行われる。
【実施例】
【００３２】
（実施例１：ＰＬＣ産生微生物のスクリーニング）
ＰＬＣ産生菌は、１％レシチン乳化普通ブイヨン寒天培地［１％(w/v)大豆レシチン、0.5％(w/v)胆汁末、１％(w/v)extract beef、１％(w/v)バクトペプトン、0.5％(w/v)NaCl、1.5％(w/v)寒天、pH7.2］中で生育する際に、菌体外に放出されるＰＬＣによってコロニー周囲に光沢のない白濁ハローを形成する。これを利用して、土壌より得た２５６菌株の油脂分解菌について、一次スクリーニングを行った。各菌株を、上記１％レシチン乳化普通ブイヨン寒天培地を用いて28℃にて培養し、白濁状ハローを形成した２９菌株を選抜した。
【００３３】
次いで、二次スクリーニングを行った。選抜された２９菌株を、１％レシチン含有普通ブイヨン培地［１％(w/v)extract beef、１％(w/v)バクトペプトン、１％(w/v)大豆レシチン、0.5％(w/v)NaCl、0.025％(w/v)antifoam SI、pH7.2］100mL中で、166rpmで振盪しながら28℃にて24時間培養した。遠心分離（18760×ｇ、５分間）により得られた培養上清20μLを、レシチン乳化寒天プレート［0.3％(w/v)大豆レシチン、９mM CaCl2・2H2O、2.73mM タウロコール酸ナトリウム、47mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)、1.5％(w/v)寒天］に設けたウェルに入れ、37℃にて24時間インキュベートし、ウェル周囲に白濁ハローを形成した１９菌株を選抜した。
【００３４】
さらに、１９菌株について三次スクリーニングを次のように行った。選抜された１９菌株を、１％レシチン含有普通ブイヨン培地100mL中で、166rpmで振盪しながら28℃にて24時間培養した後、遠心分離（18760×ｇ、５分間）により培養上清を得た。各菌株の培養上清30μL、0.2％(w/v)ＰＣ、９mM CaCl2・2H2O、2.34mM デオキシコール酸ナトリウム、41mM Tris-HCl緩衝液 (pH8.0)を含む酵素反応液300μLを、37℃にて30分間インキュベートした。反応液を、100℃で５分間加熱し、反応を停止させた後、等容量のクロロホルム／メタノール（2:1、v/v）を添加して１分間激しく振盪した。17860×ｇで４℃にて５分間の遠心分離後、クロロホルム層について、石油エーテル／ジエチルエーテル／酢酸（7:3:0.025、v/v）を展開溶媒とする薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行った。ヨウ素蒸気により、生成物である１，２−ジアシルグリセリド（以下、１，２−ＤＧという）を検出した。一方、反応液の乾燥濃縮物について、n-ブタノール／エタノール／酢酸／水（8:2:1:3、v/v）を展開溶媒とするＴＬＣを行い、もう１つの生成物であるホスホリルコリンの検出を行った。このようにして、１，２−ＤＧおよびホスホリルコリンの生成の有無を検討した結果、ＫＳ３．２という１菌株が、ＰＬＣを菌体外に産生していることがわかった。
【００３５】
（実施例２：シュードモナス・エスピーＫＳ３．２株の性状）
ＫＳ３．２株の生理性状試験を、株式会社エムシーアイエムビー・ジャパンに委託して行った。その結果、ＫＳ３．２株は、上記のような生理性状を有していた。さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長塩基配列（１５２８ｂｐ：配列番号１）を、株式会社エムシーアイエムビー・ジャパンに委託して解析した。検索アルゴリズムとしてＢＬＡＳＴを用いて日本ＤＮＡデータバンクの全ＤＮＡデータベースに対する相同性検索を行った結果、シュードモナス・モンテイリ（Pseudomonas monteilii）に対して９９．３％、およびシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０に対して９９．２％の相同性が認められた。以上より、ＫＳ３．２株は、シュードモナスに属する新規な菌株であることが明らかになった。そこで、本発明のＰＬＣ産生菌を、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）ＫＳ３．２株と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、平成１６年３月１１日にＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３２として寄託した。
【００３６】
（実施例３：ＰＬＣの精製）
（ａ）培養
シュードモナス・エスピーＫＳ３．２株を、500mLバッフルフラスコ中の１％レシチン含有普通ブイヨン培地（100mL×５）に１白金耳植菌し、166rpmで振盪しながら28℃にて48時間培養した。培養液を遠心分離（15200×ｇ、15分間）して、培養上清440mLを得た。
【００３７】
（ｂ）硫安分画
培養上清に、終濃度10mMとなるように0.5M Tris-HCl緩衝液（pH8.0）を添加した後、氷冷下で硫酸アンモニウムを35％飽和量に達するまで添加し、溶解させた。４℃にて３時間攪拌した後、遠心分離（18780×ｇ、20分間）により上清を回収した。得られた上清に対して、80％飽和量に達するまで硫酸アンモニウムを添加し、４℃にて一晩攪拌した。遠心分離（18780×ｇ、20分間）により沈殿物を得、10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）を加えて懸濁した後、同緩衝液を用いて４℃にて16時間透析した。
【００３８】
（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー
透析後、終濃度0.1％(w/v)Triton X-100を加えて凝集物を可溶化した。次いで、遠心分離（20000×ｇ、15分間）後、0.45μmフィルターで濾過して不溶物を除去した。濾液を、10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）で平衡化したDEAE-Sepharose Fast Flowカラム（25×80mm、Amersham Biosciences Corp.）に供し、同緩衝液で洗浄後（流速3.0mL/分、カラムベッド体積の３倍量）、０〜１ＭのNaClの直線グラジエント（流速3.0mL/分、カラムベッド体積の１０倍量）により溶出した。
【００３９】
溶出画分については、タンパク質濃度およびＰＬＣ活性を、以下のようにして測定した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として用い、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce Biotechnology）を用いて測定した。ＰＬＣ活性は、まず、溶出液１０μL、0.2％(w/v)ＰＣ、0.285％(v/v)Triton X-100、および46mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）を含む酵素反応液300μLを、37℃にて10分間インキュベートし、反応液を100℃で10分間加熱し、反応を停止させた。次いで、この反応液10μLをアルカリホスファターゼ溶液［0.2units アルカリホスファターゼ、１mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、50mM グリシン-NaOH緩衝液（pH9.6）］190μLに添加し、37℃にて20分間脱リン酸化反応を行い、遊離したリン酸を、Biomol Green試薬（BIOMOL Research Laboratories）を用いて定量することにより、ＰＬＣ活性を求めた。ブランクは、煮沸した溶出液を用いて、同様に処理した。ＰＬＣの１Ｕは、１分間に１μmolのホスホリル塩基を遊離する酵素量である。ＰＬＣの溶出プロファイルを図５に示す。
【００４０】
（ｄ）疎水性相互作用クロマトグラフィー
上記陰イオン交換クロマトグラフィーによるＰＬＣ活性画分を集め、終濃度が0.5M 硫酸アンモニウムおよび0.1％(w/v)Triton X-100となるようにそれぞれを添加した後、0.5M 硫酸アンモニウムおよび0.1％(w/v)Triton X-100を含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）で平衡化したPhenyl-Sepharose High performanceカラム（15×120mm、Amersham Biosciences Corp.）に供した。同緩衝液で洗浄した後（流速3.0mL/分、カラムベッド体積の３倍量）、0.5〜０Ｍ硫酸アンモニウムの直線グラジエントにより（流速2.2mL/分、カラムベッド体積の１０倍量）溶出した。溶出画分について、タンパク質濃度およびＰＬＣ活性を上記と同様に測定した。ＰＬＣ活性画分は、疎水性の強いタンパク質が溶出する画分であった。ＰＬＣの溶出プロファイルを図６に示す。
【００４１】
（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上記疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＰＬＣ活性画分について、15％(w/v)ポリアクリルアミドを用いて、Laemmliの方法（Nature，1970年，227巻，pp.680-685）に準じてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。分子量マーカーとして、SDS-PAGE Molecular Weight Standard, Broad Range（BIO-RAD）を用い、ゲルは、銀染色キット（BIO-RAD）を用いて染色した。なお、ＰＬＣ活性は、基質としてＰＣを用い、pH8.0および３７℃にて測定した。ＰＬＣの精製の結果を表２に示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を図７に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は精製ＰＬＣ（50ngのタンパク質）である。
【００４２】
【表２】
2005328781.tif 000003
【００４３】
48時間培養上清を出発材料として、比活性は１０７倍まで精製することができ、回収率は３６％であった。精製試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果、図７に示すように、約１８．６ｋＤａおよび約１７．５ｋＤａの位置にバンドが検出された。２本のバンドのうち、約１８．６ｋＤａがメジャーバンドであった。しかし、これらのバンドはゲル濾過クロマトグラフィーを用いても全く分離されなかった。すなわち、これらの分子量の画分には溶出されず、非常に大きな分子量の位置（ほぼ素通り画分の付近）で溶出し、凝集していると考えられた。このことから、本発明のＰＬＣは、少なくとも約１８．６ｋＤａまたは約１７．５ｋＤａのサブユニットからなると推定される。この分子量は、既知のＰＬＣの分子量（約２８．５〜７８ｋＤａ）とは全く異なっている。なお、本発明のＰＬＣは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのタンパク質染色に一般的に使用されるクーマシーブリリアントブルーでは、染色されなかった。
【００４４】
次いで、活性画分を集めて、−20℃で保存して、以下の実施例に用いた。
【００４５】
（実施例４：ＰＬＣ活性に対するｐＨの影響）
上記実施例３で得た精製酵素について、ＰＣを基質としてｐＨ４〜１１の終濃度46mMの種々の緩衝液中で37℃にて10分間反応させて相対活性を測定した。図１に示すように最適ｐＨは７．２であった。また、ｐＨ４〜１２の終濃度45mMの種々の緩衝液中、５℃にて３時間インキュベートした後、終濃度46mMのTris-HCl緩衝液（pH7.2）中で50℃にて10分間反応させ、残存活性を測定して、ｐＨ安定性を検討した。図２に示すように、ｐＨ８．２〜８．８では安定であったが、他のｐＨ領域では失活することがわかった。非特許文献５によれば、シュードモナス・シュイルキリエンシス由来のＰＬＣは、ｐＨ７〜１０では全く失活しないと報告されている。したがって、本発明のＰＬＣは、ｐＨ安定性が低いと思われる。
【００４６】
（実施例５：ＰＬＣ活性に対する温度の影響）
上記実施例３で得た精製酵素について、ＰＣを基質として、２０〜７０℃の温度で、終濃度46mMのTris-HCl緩衝液（pH7.2）中、10分間反応させて相対活性を測定した。最適温度は、図３に示すように約５０℃であった。次いで、４〜７０℃の温度で、0.01％(v/v)Triton X-100および0.2mM 硫酸アンモニウムを含む終濃度46mMのTris-HCl緩衝液（pH7.2）中30分間インキュベートした後、終濃度46mMのTris-HCl緩衝液（pH7.2）中で50℃にて10分間反応させ、残存活性を測定して温度安定性を検討した。図４に示すように、２０℃以上では失活することがわかった。シュードモナス・シュイルキリエンシス由来のＰＬＣは、６０℃にて30分間の処理では全く失活しないと報告されており、一方、非特許文献４では、シュードモナス・フルオレセンスＡ−３−１由来のＰＬＣは、pH6.8での５分間の処理では３０℃において相対活性で約７０％まで失活することが報告されている。このことから、本発明のＰＬＣは、比較的温度安定性が低いと思われる。
【００４７】
（実施例６：ＰＬＣの基質特異性）
本発明のＰＬＣの基質特異性について検討した。酵素液10μL、0.2％(w/v)基質、0.285％(v/v)Triton X-100、および46mM Tris-HCl緩衝液（pH7.2）を含む酵素反応液300μLを、50℃にて10分間インキュベートし、反応液を100℃で10分間加熱し、反応を停止させた。反応終了後、この反応液10μLをアルカリホスファターゼ溶液［0.2units アルカリホスファターゼ、１mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、50mM グリシン-NaOH緩衝液（pH9.6）］190μLに添加し、37℃にて20分間脱リン酸化反応を行い、Biomol Green試薬（BIOMOL Research Laboratories）を用いて定量することにより、ＰＬＣ活性を求めた。ＰＬＣの活性は、１分間に１μmolのホスホリル塩基を遊離する酵素量を１Ｕとした。なお、ホスファチジン酸を基質とする場合は、上記と同様に酵素反応した後、アルカリホスファターゼ処理せずに、直ちに遊離したリン酸を定量した。また、ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリン（ｐＮＰＰＣ）を基質とする場合は、酵素液50μLを酵素反応液1.45mL［3.6mM ｐＮＰＰＣ、50mM Tris-HCl緩衝液（pH7.2）］に添加し、50℃にて10分間インキュベートした後、遊離ｐ−ニトロフェノールの400nmにおける吸光度を測定し、モル吸光係数（14700M-1cm-1）を用いて遊離ｐ−ニトロフェノール量を求めた。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2005328781.tif 000004
【００４９】
本発明のＰＬＣは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して最も高い活性を示した。他のリン脂質に対する活性は低く、そして人工基質ｐＮＰＰＣに対してはほとんど活性を示さなかった。既知のＰＬＣは、ＰＣおよびホスファチジルエタノールアミンの両方ともに対して活性を示すことが知られている。したがって、本発明のＰＬＣは、既知のＰＬＣに比べてＰＣに対して高い特異性を有する、新規なＰＬＣであることが、さらに明確になった。
【００５０】
（実施例７：ＰＬＣに対する各種化合物の影響）
ＰＣを基質とし、以下の表４に記載の種々の化合物を添加して、pH7.2および50℃にて、上記実施例６と同様の手順でＰＬＣの活性を測定した。添加物を加えない場合の活性を100％として、相対活性を求めた。結果を表４に示す。
【００５１】
【表４】
2005328781.tif 000005
【００５２】
本発明のＰＬＣは、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｈｇ２＋により強い阻害を受けたため、ＳＨ基を有すると考えられる。さらに、タンパク質のジスルフィド結合の還元切断剤であるジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタノールによって阻害を受けるが、ＳＨ基の修飾保護剤であるヨードアセタミドでは阻害されなかった。したがって、本発明のＰＬＣは、活性中心にＳＨ基を有するチオール酵素ではなく、立体構造および活性の保持に、ジスルフィド基が関与していると考えられる。また、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋では活性化されず、既知のＰＬＣとは異なっていた。フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）により強く阻害されるため、酵素活性には活性セリンが関与すると考えられる。また、本発明のＰＬＣは、ＳＤＳによって強く阻害され、これはシュードモナス・シュイルキリエンシス由来のＰＬＣと同様である。さらに、ＥＤＴＡによっても強い阻害を受けているので、酵素活性に金属イオンが必要である可能性がある。このように、本発明のＰＬＣは、各種化合物の影響についても、既知のＰＬＣとは異なる特徴を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のＰＬＣは、リン脂質の中で最も存在比率が高いホスファチジルコリン（レシチン）に対する基質特異性が高いので、食品工業、油脂工業などに有用である。具体的には、例えば、食品工業においては、パンの製造過程でＰＬＣを加えるとふっくらとしたパンを製造でき、ならびに、食用油やセラミドの製造においては、品質低下防止のためのリン脂質の除去に有用である。また、ホスファチジルコリンなどのリン脂質を基質とする種々のリン酸エステルの合成にも利用できる。あるいは、レシチンを豊富に含む鶏卵およびリン脂質を含む皮脂の付着による汚れを除去するための洗剤としての利用や、パルプ製造時の木材ピッチの除去も可能である。さらに、シグナル伝達系の研究などの研究用試薬としても利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】種々のｐＨにおける本発明のＰＬＣの相対活性を示すグラフである。
【図２】種々のｐＨにおいて５℃にて３時間インキュベートした場合の、本発明のＰＬＣの残存活性を示すグラフである。
【図３】pH7.2での種々の温度における本発明のＰＬＣの相対活性を示すグラフである。
【図４】pH7.2での種々の温度において３０分間インキュベートした場合の、本発明のＰＬＣの残存活性を示すグラフである。
【図５】本発明のシュードモナス・エスピーＫＳ３．２株由来のＰＬＣの精製過程における、DEAE-Sepharose Fast Flowカラムクロマトグラフィーの溶出プロファイルを示すグラフである。
【図６】本発明のシュードモナス・エスピーＫＳ３．２株由来のＰＬＣの精製過程における、Phenyl Sepharoseカラムクロマトグラフィーの溶出プロファイルを示すグラフである。
【図７】本発明の精製ＰＬＣのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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