(57)【要約】【課題】  ビリルビンオキシダーゼを用いて生体試料中のビリルビンδ画分を正確に測定する選択的方法およびそのための試薬を提供すること、並びに、δビリルビン値および抱合ビリルビン値の和と、総ビリルビン値の差により、精度良く非抱合ビリルビン値を算出できる方法を提供することを目的とする。【解決手段】  生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させるビリルビンの測定において、芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも１種を共存させて、さらに好ましくはアニオン型界面活性剤を共存させてビリルビン非δ画分の消去し、次いでフェノール類、アニリン類、炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択される少なくとも１種を共存させてビリルビンδ画分を選択的に測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させるビリルビンの測定において、試料に芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも１種を共存させてビリルビン非δ画分を消去することを特徴とするビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項２】
さらに、アニオン型界面活性剤を共存させることを特徴とする請求項１記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項３】
生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させるビリルビンの測定において、ビリルビン非δ画分を消去し、次いでフェノール類、アニリン類、炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択される少なくとも１種を共存させてビリルビンδ画分を測定することを特徴とするビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項４】
生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させるビリルビンの測定において、ビリルビン非δ画分を消去し、次いでビリルビンδ画分を測定することを特徴とする請求項１〜３記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項５】
芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類もしくはフェニルリン酸類、又はそれらの塩が、一般式[I]で表される請求項１記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【化１】
2005058031.tif 000008
[式中、Ｒ１〜Ｒ５はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシル基、水酸基又はカルボキシル基を示す（但し、Ｒ３が水酸基又はカルボキシル基であるものは除く）。Ｘは、芳香族スルホン酸類の場合はスルホン基又はそのアルカリ金属塩を示し、芳香族カルボン酸の場合はカルボキシル基又はそのアルカリ金属塩を示し、フェニルリン酸類の場合はリン酸基又はそのアルカリ金属塩を示す。]
【請求項６】
胆汁酸類が、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩である請求項１記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項７】
アニオン型界面活性剤が、炭素鎖５〜１６のアルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸塩及びカルボン酸塩からなる群より選択される少なくとも１種である請求項２記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項８】
炭素鎖５〜１６のアルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸塩又はカルボン酸塩が、1-ペンタンスルホン酸、1-へキサンスルホン酸、1-ヘプタンスルホン酸、1-オクタンスルホン酸、1-ノナンスルホン酸、n-ヘキサン酸、n-ヘプタン酸、n-オクタン酸、２-オクテン酸、n-ノナン酸、２-ノネン酸、n-デカン酸、n-ウンデカン酸、n-ドデカン酸、パルミチン酸及びオレイン酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩である請求項７記載のビリルビンδ画分の選択的測定。
【請求項９】
フェノール類が、一般式[II]で表される請求項３記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【化２】
2005058031.tif 000009
[式中、Ｒ６〜Ｒ１０はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシル基、水酸基又はカルボキシル基を示す（ただし、Ｒ８が水酸基又はカルボキシル基であるものは除く)。]
【請求項１０】
アニリン類が、一般式[III]で表される請求項３記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【化３】
2005058031.tif 000010
(式中、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に、水素原子もしくは炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシアルキル基、スルホアルキル基、ヒドロキシスルホアルキル基又はスルホンアミドアルキル基を示す。Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシル基を示す。)
【請求項１１】
炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類が、4-n-ヘプチルベンゼンスルホン酸、4-n-オクチルベンゼンスルホン酸、4-n-ノニルベンゼンスルホン酸、4-n-デシルベンゼンスルホン酸、4-n-ウンデシルベンゼンスルホン酸、4-n-ドデシルベンゼンスルホン酸及びセチルベンゼンスルホン酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩である請求項３記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項１２】
金属イオン酸化剤が、バナジン酸イオン、三価のマンガン酸イオン、フェロシアン化イオン及びフェリシアン化イオンから選択される少なくとも１種の金属塩である請求項３記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項１３】
ｐＨ６〜１１の範囲でビリルビンオキシダーゼを作用させる請求項１〜１２記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項１４】
芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類又はそれらの塩の濃度が０.1ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である請求項１記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項１５】
胆汁酸類又はそれらの塩類の濃度が、０．０１〜０．８％の範囲である請求項１記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項１６】
アニオン型界面活性剤の濃度が、０．０１〜０．２％の範囲である請求項２記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項１７】
フェノール類又はアニリン類の濃度が、０．１〜５０ｍＭの範囲である請求項３記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項１８】
炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類又はそれらの塩類の濃度が、０．０５〜１．８％の範囲である請求項３記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項１９】
金属イオン酸化剤の濃度が、０．０２〜１０ｍｇイオン／Ｌの範囲である請求項３記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【請求項２０】
生体試料の総ビリルビン測定値から、該生体試料と同一検体の請求項１〜４記載の方法により測定されたビリルビンδ画分値と、抱合ビリルビン値との和を減じて求める、非抱合ビリルビン値の算出方法。
【請求項２１】
生体試料にビリルビンオキシダーゼを使用するビリルビン測定用試薬において、芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも１種のビリルビン非δ画分消去剤と、フェノール類、アニリン類、ベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択される少なくとも１種のビリルビンδ画分消去剤を含むビリルビンδ画分測定用試薬。
【請求項２２】
さらに、アニオン型界面活性剤を含む請求項２１記載のビリルビンδ画分測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼを用いたビリルビンδ画分の選択的測定法及びそれに用いる試薬に関するものである。なお、本明細書において、δビリルビンとビリルビンδ画分、そして非δビリルビンとビリルビン非δ画分はそれぞれ同義語で使用される。
【背景技術】
【０００２】
ビリルビンは、老廃赤血球由来のヘモグロビンの代謝物で、生体中において胆汁中に最も多く存在する色素成分である。そして、その化学構造にピロール骨格を持つことから、診断分野においては含窒素成分の項目として捉えられている。老廃赤血球は、骨髄、胸腺、肝臓などで分解、代謝されるが、この時に主要構成成分であるヘモグロビンからビリルビンが生成される。このビリルビンは非抱合ビリルビンと呼ばれ、最も多く代謝される胸腺から、血中ではアルブミンと結合して肝臓に輸送される。肝臓では、非抱合ビリルビンの２つのカルボキシル基が、１つまたは２つのグルクロン酸と結合（以下各々モノグルクロナイド体、ジグルクロナイド体）し、抱合ビリルビンへと変化して胆道へ排泄される。
【０００３】
溶血性黄疸では、非抱合ビリルビンの上昇が著しく、特に、肝臓の未発達な新生児黄疸では、アルブミンから遊離した非抱合ビリルビン（遊離ビリルビン）がビリルビン脳症の成立と密接な関係があると考えられている。また、肝臓において生成された抱合ビリルビンが胆道閉塞などで正常に排泄されない場合、血流中へと逆流し、胆道閉塞性黄疸となる。そして、増加した抱合ビリルビンの一部が非酵素的にアルブミンと共有結合しδビリルビンへと変化することが１９８０年代の研究により明らかにされた。δビリルビンの寿命は、アルブミン代謝速度とほぼ同じ２週間程度で、他の抱合ビリルビンよりも非常に長いという特徴がある。
【０００４】
このような種々のビリルビンの体内動態をもとに、新生児ではビリルビン脳症の予防、成人においては、肝・胆道系疾患の鑑別や病態の把握、先天性ビリルビン代謝異常症の診断や溶血性疾患の発見、更には近年肝移植後の状態把握等にビリルビンの測定が利用されている。特に、胆道系疾患の病態把握や肝移植後の状態把握には、抱合ビリルビン／δビリルビン比や抱合ビリルビン濃度が鋭敏な指標となり得ることが明らかにされた(例えば、非特許文献１参照 。)。
【０００５】
ビリルビンの測定法には、１９１６年、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ等によって開発されたジアゾ法が広く普及し、血清中のビリルビンはジアゾ試薬に対する反応性の相違から２種類に分類されている。すなわち、ジアゾ試薬単独で発色するビリルビン（直接型ビリルビン）と、ある種の有機溶媒、界面活性剤又はカフェイン等の促進試薬を加えることによって発色するビリルビン（間接型ビリルビン）であり、そして、直接型と間接型の両方を合わせたビリルビンを総ビリルビンと称している。
【０００６】
ここで、ジアゾ法(例えば、非特許文献２参照。)等の化学的測定法における問題点としては、１）ジアゾ試薬が不安定である、２）直接型ビリルビンのうちジグルクロナイド体は速やかに反応するが、モノグルクロナイド体は反応が遅いため、反応時間を正確に規定しないと直接型ビリルビンの正確な測定ができないこと等が挙げられる。また、直接型はこれら２種類の抱合ビリルビンとδビリルビン（アルブミン抱合ビリルビン）からなり、間接型は非抱合ビリルビンからなることが解明されているが、胆道系疾患の病態把握の指標として直接型ビリルビンの有用性に疑問が生じている。すなわち、δビリルビンは、抱合ビリルビンが血液中で増加し高濃度に滞留した結果、アルブミンと結合したものであり、肝臓の実質障害や閉塞が改善されたとき抱合ビリルビンが低下していくのに対し、δビリルビンはその遅い代謝性故に、従来のジアゾ法では、いつまでも直接ビリルビンが高値を示し、正確に病態を反映しないことが明らかとなっているからである。
【０００７】
一方、上記化学的分析手段とは別に、Ｌａｕｆｆ等(例えば、非特許文献３参照。)により、血清中のビリルビンが高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ法)で分析され、主にα：非抱合ビリルビン、β: モノグルクロナイドビリルビン、γ：ジグルクロナイドビリルビン、δ:δビリルビンの４画分に分けられることが報告された。各画分比および含量と疾患の関係 (例えば、非特許文献、１、４参照。)や分析法に関して多数のグループにより報告されている(例えば、非特許文献４、５、６参照 。)。しかしながら、ＨＰＬＣ法は一度に大量の検体を測定できないこと、処理速度を向上させるために血清を直接カラムに供するとカラム劣化が早まりランニングコストが高くなること等の問題があった。
【０００８】
さらに、酵素を用いたビリルビンの定量法としては、ミロセシウム属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）由来のビリルビンオキシダーゼを用いる総ビリルビンの測定法(例えば、特許文献１、２参照。)や直接ビリルビンの測定法(例えば、特許文献３参照。)が報告されており、従来のジアゾ法に比べて、いずれも簡便性に優れたものであった。
【０００９】
また、ビリルビン画分の測定に関しては、陰イオン型界面活性剤を共存させ特定ｐＨ領域で抱合ビリルビンを選択的に測定する方法(例えば、特許文献４、５参照。)、特定の菌株から得られたビリルビンオキシダーゼを用いてｐＨ４．５〜６で抱合型ビリルビンを測定する方法(例えば、特許文献６参照。)、非抱合型ビリルビンとアルブミンと共有結合したビリルビンの反応阻害剤としてキレート剤を共存させてｐＨ４．４〜６で抱合型ビリルビンを測定する方法(例えば、特許文献７参照。)、ビリルビンと錯体を形成する金属イオンと界面活性剤とを共存させてｐＨ６．５以下で抱合ビリルビンを消去し、非抱合ビリルビンを測定する方法（例えば、特許文献８参照。）、陽イオンや陰イオン型界面活性剤の共存下でも阻害を受けないビリルビンオキシダーゼを使用してビリルビン非δ画分を測定し、総ビリルビンから差し引くことで間接的にビリルビンδ画分を求める方法(例えば、特許文献９参照。)、ｐＨ９〜１１の範囲でビリルビンオキシダーゼを反応後にジアゾニウム塩を共存させるδビリルビンの測定法(例えば、特許文献１０参照。)が報告されている。
【００１０】
【特許文献１】特公昭６０−１２０３１号公報（第１−３頁）
【特許文献２】第２８８０２０９号公報（第２−３頁）
【特許文献３】特公昭６２−３３８８０号公報（第１−２頁）
【特許文献４】特公平５−９０６６号公報（第２頁）
【特許文献５】特公平５−６８２４０号公報（第２頁）
【特許文献６】特開平９−１４９７９４号公報（第２頁）
【特許文献７】特開２０００−１６６５９５号公報（第２−３頁）
【特許文献８】特開平１１−１２３０９９公報（第２−３頁）
【特許文献９】特開平１０−２３４３９７号公報（第２頁）
【特許文献１０】特開昭６２−１０５０４７号公報（第２頁）
【００１１】
【非特許文献１】中井昌弘．「肝臓」（１９９１年）、３２巻、ｐ５１〜６２
【非特許文献２】金井泉．「臨床検査法提要」（昭和５３年）、金原出版、ｐXII−２４
【非特許文献３】Ｊｏｈｎ  Ｊ．Ｌａｕｆｆ、ｅｔ．ａｌ．「Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ」(１９８１年)、２２６号、ｐ．３９１〜４０２
【非特許文献４】Ａｄａｃｈｉ  Ｙ、ｅｔ．ａｌ．「Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ」（１９８８年）、３４巻、ｐ．３８５〜３８８
【非特許文献５】Ｏｎｉｓｈｉ  Ｓ、ｅｔ．ａｌ．「Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ」（１９８０年）、１９０巻、ｐ．５２７〜５３２
【非特許文献６】Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ、ｅｔ．ａｌ．「分析化学」（１９８７年）、３６巻、ｐ．３５２〜３５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記酵素法を利用した測定法では、安価で且つ迅速にビリルビンの主要画分α、β、γおよびδを分別測定する方法は存在しない。
【００１３】
本発明はこのような従来の課題に着目してなされたものであって、検体中のビリルビンδ画分を直接的にかつ正確に測定する選択的方法および試薬を提供することを目的とする。さらに、本法の測定値（δ）および抱合ビリルビン値（β＋γ）の和を、総ビリルビン測定値の差により、精度よく非抱合ビリルビン値（α）を算出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも１種を共存させて、さらに好ましくはアニオン型界面活性剤を共存させて、ｐＨ６〜１１でビリルビンオキシダーゼを反応させることによりビリルビン非δ画分を消去し、次いでフェノール類、アニリン類、炭素数７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択される少なくとも１種を共存させることによりδ画分を精度良く測定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させるビリルビンの測定において、試料に芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも１種を共存させてビリルビン非δ画分を消去することを特徴とするビリルビンδ画分の選択的測定法。
（２）さらに、アニオン型界面活性剤を共存させることを特徴とする請求項１記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（３）生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させるビリルビンの測定において、ビリルビン非δ画分を消去し、次いでフェノール類、アニリン類、炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択される少なくとも１種を共存させてビリルビンδ画分を測定することを特徴とするビリルビンδ画分の選択的測定法。
（４）生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させるビリルビンの測定において、ビリルビン非δ画分を消去し、次いでビリルビンδ画分を測定することを特徴とする（１）〜（３）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（５）芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類もしくはフェニルリン酸類、又はそれらの塩が、一般式[I]で表される（１）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【化４】
2005058031.tif 000002
[式中、Ｒ１〜Ｒ５はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシル基、水酸基又はカルボキシル基を示す（但し、Ｒ３が水酸基又はカルボキシル基であるものは除く）。Ｘは、芳香族スルホン酸類の場合はスルホン基又はそのアルカリ金属塩を示し、芳香族カルボン酸の場合はカルボキシル基又はそのアルカリ金属塩を示し、フェニルリン酸類の場合はリン酸基又はそのアルカリ金属塩を示す。]
（６）胆汁酸類が、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩である（１）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（７）アニオン型界面活性剤が、炭素鎖５〜１６のアルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸塩及びカルボン酸塩からなる群より選択される少なくとも１種である（２）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（８）炭素鎖５〜１６のアルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸塩又はカルボン酸塩が、1-ペンタンスルホン酸、1-へキサンスルホン酸、1-ヘプタンスルホン酸、1-オクタンスルホン酸、1-ノナンスルホン酸、n-ヘキサン酸、n-ヘプタン酸、n-オクタン酸、２-オクテン酸、n-ノナン酸、２-ノネン酸、n-デカン酸、n-ウンデカン酸、n-ドデカン酸、パルミチン酸及びオレイン酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩である（７）記載のビリルビンδ画分の選択的測定。
（９）フェノール類が、一般式[II]で表される（３）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【化５】
2005058031.tif 000003
[式中、Ｒ６〜Ｒ１０はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシル基、水酸基又はカルボキシル基を示す（ただし、Ｒ８が水酸基又はカルボキシル基であるものは除く)。]
（１０）アニリン類が、一般式[III]で表される（３）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
【化６】
2005058031.tif 000004
(式中、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に、水素原子もしくは炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシアルキル基、スルホアルキル基、ヒドロキシスルホアルキル基又はスルホンアミドアルキル基を示す。Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシル基を示す。)
（１１）炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類が、4-n-ヘプチルベンゼンスルホン酸、4-n-オクチルベンゼンスルホン酸、4-n-ノニルベンゼンスルホン酸、4-n-デシルベンゼンスルホン酸、4-n-ウンデシルベンゼンスルホン酸、4-n-ドデシルベンゼンスルホン酸及びセチルベンゼンスルホン酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩である（３）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（１２）金属イオン酸化剤が、バナジン酸イオン、三価のマンガン酸イオン、フェロシアン化イオン及びフェリシアン化イオンから選択される少なくとも１種の金属塩である（３）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（１３）ｐＨ６〜１１の範囲でビリルビンオキシダーゼを作用させる（１）〜（１２）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（１４）芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類又はそれらの塩の濃度が０.1ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である（１）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（１５）胆汁酸類又はそれらの塩類の濃度が、０．０１〜０．８％の範囲である（１）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（１６）アニオン型界面活性剤の濃度が、０．０１〜０．２％の範囲である（２）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（１７）フェノール類又はアニリン類の濃度が、０．１〜５０ｍＭの範囲である（３）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（１８）炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類又はそれらの塩類の濃度が、０．０５〜１．８％の範囲である（３）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（１９）金属イオン酸化剤の濃度が、０．０２〜１０ｍｇイオン／Ｌの範囲である（３）記載のビリルビンδ画分の選択的測定法。
（２０）生体試料の総ビリルビン測定値から、該生体試料と同一検体の（１）〜（４）記載の方法により測定されたビリルビンδ画分値と、抱合ビリルビン値との和を減じて求める、非抱合ビリルビン値の算出方法。
（２１）生体試料にビリルビンオキシダーゼを使用するビリルビン測定用試薬において、芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも１種のビリルビン非δ画分消去剤と、フェノール類、アニリン類、ベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択される少なくとも１種のビリルビンδ画分消去剤を含むビリルビンδ画分測定用試薬。
（２２）さらに、アニオン型界面活性剤を含む（２１）記載のビリルビンδ画分測定用試薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法により、特に分離手段を要せずに直接検体中のビリルビンδ画分を正確に測定することができる。同時に公知の方法を用いて、総ビリルビンと抱合ビリルビンも測定すれば、非抱合ビリルビンも容易に得ることができる。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
酵素法におけるビリルビンの測定法では、使用する酵素の由来による各種ビリルビンに対する反応性は、ｐＨや使用する緩衝液等で異なることが知られている。現在容易に入手できるミロセシウム属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｕｉｍ）由来のビリルビンオキシダーゼは、δビリルビンに対して、ｐＨ４．８付近において最も反応性が高いが、ｐＨ６．０以上では反応性が低くなる。一方、抱合ビリルビンに対しては、ｐＨ６．０〜６．５付近において最大の反応性を有するが、ｐＨ５〜１１ではほぼ一定の反応性がある。非抱合ビリルビンに対しては、ｐＨ６．５付近で最も反応性が高い。また、緩衝液の種類においては、クエン酸緩衝液や２−[４−（２-ヒドロキシエチル)−１−ピペラジル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液よりも２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液の方が高い反応性を有する性質がある。
【００１８】
また、エビタケ属（Ｔｒａｃｈｙｄｅｒｍａ  ｔｓｕｎｏｄａｅ）由来のビリルビンオキシダーゼは、δビリルビンに対して、ｐＨ４．８付近において最も反応性が高いが、６．０以上では反応性が非常に低くなる。一方、抱合ビリルビンに対しては、６．０〜６．５付近において最大の反応性を有し、９．２以上では反応性がほとんどない。非抱合ビリルビンに対しては、ｐＨ５．５〜６．０で最も反応するが、ｐＨ９以上ではほとんど反応性がない。また、ＨＥＰＥＳ緩衝液とＭＥＳ緩衝液における反応性にほとんど差はない。
【００１９】
このように、上記酵素を用いた測定法では、ｐＨや緩衝液を選択しても、δビリルビンに対する反応性を抑えた状態で、抱合ビリルビンおよび非抱合ビリルビンを充分に反応させて消去した後、ビリルビンδ画分を反応させることは不可能である。
【００２０】
本発明は、生体試料にビリルビンδ画分を選択的に測定するための分別剤として、芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも１種を共存させて、さらに好ましくはアニオン型界面活性剤を共存させてビリルビン非δ画分を消去し、次いで、残存するビリルビンδ画分にフェノール類、アニリン類、炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択される少なくとも１種の反応促進剤を共存させて、ビリルビンδ画分を消去して測定することで、上記問題点を解決したものである。即ち、本発明に使用される前記分別剤は、ビリルビンオキシダーゼのδビリルビンに対する反応性が低いｐＨ領域で、抱合ビリルビンおよび非抱合ビリルビンの反応性を上げる効果を有し、ビリルビンδ画分の反応促進剤は、δ画分の酸化促進効果を有している。
【００２１】
本発明で、ビリルビン非δ画分の選択的な消去剤に使用する芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類又はフェニルリン酸類としては、ベンゼンスルホン酸、ベンゼン硫酸、フェニルリン酸、安息香酸の骨格を有する化合物である限り、公知の中から適宜選択することができる。その具体例としては、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、p-エチルベンゼンスルホン酸、p-nプロピルベンゼンスルホン酸、p-イソプロピルベンゼンスルホン酸、2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸、2,5-ジメチルベンゼンスルホン酸、ベンゼン硫酸、p-トルエン硫酸、フェニルリン酸、p-メチルフェニルリン酸、安息香酸、サリチル酸、4-メチルサリチル酸、スルホサリチル酸、p-トルイル酸、p-エチル安息香酸、4-プロピル安息香酸、4-プロポキシ安息香酸、クミニン酸、4-イソプロポキシ安息香酸、4-n-ブチル安息香酸、4-n-ブトキシ安息香酸、4-イソブチル安息香酸、4-tert-ブチル安息香酸、4-n-アミル安息香酸、4-n-ヘキシル安息香酸、4-n-ヘプチル安息香酸及び4-n-オクチル安息香酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００２２】
これら消去剤の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは、１０〜５０ｍＭの範囲である。濃度が０．１ｍＭより低いときは、非抱合ビリルビンが充分反応しない。また、２００ｍＭより高い濃度では、δビリルビンの反応性が増強される。
【００２３】
また、胆汁酸類も公知のものの中から適宜選択することができる。その具体例としては、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００２４】
これら胆汁酸類の濃度は、０．０１〜０．８％の範囲であることが好ましく、より好ましくは、０．０２〜０．４％の範囲である。濃度が０．０１％より低いときは、非抱合ビリルビンが充分反応せず、一方、０．８％より高い濃度では、δビリルビンの反応性が増強される。
【００２５】
さらに、アニオン型界面活性剤も、アルキルスルホン酸、アルキル硫酸、アルキルカルボン酸である限り公知のものの中から適宜選択できる。その具体例としては、1-ペンタンスルホン酸、1-へキサンスルホン酸、1-ヘプタンスルホン酸、1-オクタンスルホン酸、1-ノナンスルホン酸、1-デカンスルホン酸、1-ウンデカンスルホン酸、1-ドデカンスルホン酸、ドデシル硫酸、1-トリデカンスルホン酸、トリデシル硫酸、1-テトラデカンスルホン酸、1-ペンタデカンスルホン酸、セチルスルホン酸、セチル硫酸、n-ヘキサン酸、n-ヘプタン酸、n-オクタン酸、２-オクテン酸、n-ノナン酸、２-ノネン酸、n-デカン酸、n-ウンデカン酸、n-ドデカン酸、パルミチン酸及びオレイン酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００２６】
これらアニオン型界面活性剤の濃度は、０．０１〜０．２％の範囲であることが好ましく、より好ましくは、０．０２〜０．１％の範囲である。濃度が、０．０１ ％より低いときは、非抱合ビリルビンが充分反応せず、０．２％より高い濃度では、δビリルビンの反応性が増強され、そして、非抱合ビリルビンの反応性は低下する。
【００２７】
本発明において、ビリルビン非δ画分の消去後に、ビリルビンδ画分と反応させるフェノール類、アニリン類は、各々フェノール、アニリンの構造骨格を有するものであれば特に限定されるものではなく、公知の中から適宜選択することができる。その具体例としては、フェノール、o−クレゾール、m−クレゾール、p−クレゾール,  2−エチルフェノール、3−エチルフェノール、4−エチルフェノール、2,3−ジメチルフェノール、2,4−ジメチルフェノール、2,5−ジメチルフェノール、2,6−ジメチルフェノール、3,4−ジメチルフェノール、3,5−ジメチルフェノール、2−メトキシフェノール、3−メトキシフェノール、4−メトキシフェノール、2,6−ジメトキシフェノール、3,5−ジメトキシフェノール、2−n−プロピルフェノール、4−n−プロピルフェノール、2−tert−ブチルフェノール、3−tert−ブチルフェノール、4−n−ブチルフェノール、4−tert−ブチルフェノール、2−クロルフェノール、3−クロルフェノール、4−クロルフェノール、2,3−ジクロルフェノール、2,4−ジクロルフェノール、2,5−ジクロルフェノール、2,6−ジクロルフェノール、3,4−ジクロルフェノール、3,5−ジクロルフェノール、2−ブロムフェノール、3−ブロムフェノール、4−ブロムフェノール、5−ブロムフェノール、2,4−ジブロムフェノール、2,6−ジブロムフェノール、4−クロル−2−メチルフェノール、4−クロル−3−メチルフェノール、6−クロル−2−メチルフェノール、6−クロル−3−メチルフェノール、2−ブロム−4−メチルフェノール、2−フェニルフェノール、3−フェニルフェノール、4−フェニルフェノール、3−メチルアニリン、3,5−ジメチルアニリン、3−メトキシアニリン、3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−3−メチルアニリン、N−エチル−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−3−メトキシアニリン、N−エチル−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン、N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン、N−スルホプロピルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3−クロルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−5−クロル−3−メチルアニリン及びN−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジブロムアニリンから選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２８】
これらフェノール類の濃度は０．１〜５０ｍＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは、１〜１５ｍＭの範囲である。一方、アニリン類の濃度は０．００１〜５０ｍＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは、０．０５〜１０ｍＭの範囲である。両者は、それらの濃度が、最低濃度より低いときは、δビリルビンが充分反応せず、最高濃度より高いときは溶解性に乏しく、また、試薬ブランクも大きくなる。
【００２９】
また、炭素鎖７以上のベンゼンスルホン酸類も公知のものの中から適宜選択すればよい。その具体例としては、4-n-ヘプチルベンゼンスルホン酸、4-n-オクチルベンゼンスルホン酸、4-n-ノニルベンゼンスルホン酸、4-n-デシルベンゼンスルホン酸、4-n-ウンデシルベンゼンスルホン酸、4-n-ドデシルベンゼンスルホン酸及びセチルベンゼンスルホン酸から選択される少なくとも１種、又はそれらのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００３０】
これらベンゼンスルホン酸類の濃度は、０．０５〜１．８％の範囲であることが好ましく、より好ましくは０．２〜０．７％の範囲である。濃度が、０．０５％より低いときは、δビリルビンが充分反応せず、１．８％より高い濃度では、溶解性に乏しい。
【００３１】
さらに、金属イオン酸化剤は公知の中から適宜選択すればよい。その具体例としては、バナジン酸イオン、三価のマンガン酸イオン、フェロシアン化イオン及びフェリシアン化イオンの金属塩から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３２】
これら金属イオン酸化剤の濃度は、０．０２〜１０ｍｇイオン／Ｌの範囲であることが好ましく、より好ましくは、０．１〜２ｍｇイオン／Ｌの範囲である。濃度が、０．０２ｍｇイオン／Ｌより低いときは、δビリルビンが反応せず、１０ｍｇイオン／Ｌより高い濃度では、試薬ブランクが大きくなる。
【００３３】
本発明における最終反応のｐＨは、３〜１１の範囲であることが好ましく、より好ましくはｐＨ４〜９の範囲である。ビリルビン非δ画分の消去反応時のｐＨが６よりも低いと、δビリルビンも反応してしまう。また、ｐＨが１１よりも高いと、ビリルビン非δ画分の消去反応が十分ではなく、正確な測定ができない。
【００３４】
本発明で用いることのできる緩衝液としては、ｐＨを上記範囲内に維持できるものであれば、特に制限されず、公知の緩衝液の中から適宜選択することができるが、特にグッド緩衝液やリン酸緩衝液が好ましい。
【００３５】
本発明において、ビリルビンδ画分の測定を行う検体としては、生体試料であれば特に限定されないが、一般的にはビリルビンを含有する水性検体であり、例えば、血清、血漿、胆汁等が挙げられる。これら検体は、必要に応じて希釈されたり、前処理されていてもよい。
【００３６】
また、本発明で用いられるビリルビンオキシダーゼとしては、一般に、ビリルビンオキシダーゼとして用いられている酵素であればいずれも良いが、入手し易さを考慮すると、ミロセシウム属 (Ｍｙｒｏｔｈｅｃｕｉｍ)由来またはエビタケ属 (Ｔｒａｃｈｙｄｅｒｍａ  ｔｓｕｎｏｄａｅ)由来の酵素が好ましい。これらのビリルビンオキシダーゼの濃度は、０．０２〜１０単位／ｍＬ、好ましくは、０．１〜１．０単位／ｍＬである。
【００３７】
本発明を実施できる最も一般的な試薬形態としては、芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択された少なくとも１種、好ましくはさらにアニオン型界面活性剤、及びビリルビンオキシダーゼを含む緩衝液 (試薬−１)と、 フェノール類、アニリン類、炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択された少なくとも１種を含む水溶液又は緩衝液(試薬−２)から構成される、２試薬系のビリルビンδ画分測定用試薬を提供することができる。そして、試薬−１及び試薬−２を構成する各化合物は、上述したものの中から適宜選択すれば良い。
【００３８】
本発明によるビリルビンδ画分の最も一般的な測定法は、芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類及び胆汁酸類、並びにそれらの塩類からなる群より選択された少なくとも１種、好ましくはさらにアニオン型界面活性剤、及びビリルビンオキシダーゼを含む緩衝液 (試薬−１)を検体に加え、一定時間のインキュベーション後の第１吸光度を測定し、次いでフェノール類、アニリン類、炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類及び金属イオン酸化剤からなる群より選択された少なくとも１種を含む水溶液又は緩衝液(試薬−２)を加えた結果生ずる第１吸光度からの減少値、すなわちビリルビンδ画分の消失による吸光度の減少を測定することにより行われる。
【００３９】
本発明においては、特に必要とされないが、試薬−１におけるビリルビンδ画分のさらなる安定化や自動分析機の反応セルの汚れを回避する等公知の目的で、非イオン型界面活性剤、アルブミン等の蛋白質などを適宜添加することができる。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：  各種ビリルビンに対する試薬−１の反応性
表１に示す２０ｍＭ各種芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類、フェニルリン酸類又は０．１％胆汁酸類に、０．０５％アニオン型界面活性剤、ミロセシウム属由来ビリルビンオキシダーゼ１単位／ｍＬ及び０．１％ トリトンＸ-３０５を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液(試薬−１ : ｐＨ７．２)０．２４ｍＬに、 合成δビリルビン(５ｍｇ／ｄＬ、渭原博  医学検査  １９９４年、４３巻、ｐ１２５３〜１２５５)、ジタウロビリルビン(５ｍｇ／ｄＬ、抱合ビリルビンの一種)、又は非抱合ビリルビン(５ｍｇ／ｄＬ)の各種ビリルビンを０．００８ｍＬ添加し、３７℃にて５分間加温後、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。一連の操作は日立７１７０形自動分析装置を用い、各種ビリルビンにビリルビンオキシダーゼ無添加の試薬−１を添加したときの波長４５０ｎｍでの吸光度を１００とし、各化合物の各種ビリルビンに対する試薬−１の反応性を、吸光度の減少率(％)から比較した。
【００４２】
その結果を表１に示す。芳香族スルホン酸類、芳香族カルボン酸類又はフェニルリン酸類を添加した試薬は、δビリルビンに対して３〜６％、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては９５〜１００％の反応性を示し、また、胆汁酸類又は炭素鎖５以上のアニオン型界面活性剤を添加した試薬では、δビリルビンに対して３〜８％、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては８８〜１００％の反応性を示した。これらのことから、以上の化合物により、人工的に調製した試料においては、ジタウロビリルビンと非抱合ビリルビン、すなわちビリルビン非δ画分が特異的に消去されることが確認された。
【００４３】
【表１】
2005058031.tif 000005
【００４４】
実施例２：  反応ｐＨと各種ビリルビンに対する試薬−１の反応性
実施例１の第１試薬における芳香族スルホン酸類としてp-トルエンスルホン酸を用い、ミロセシウム属由来ビリルビンオキシダーゼ１単位／ｍＬ又はエビタケ属由来ビリルビンオキシダーゼ1単位／ｍＬを含有するリン酸緩衝液又はホウ酸緩衝液１００ｍＭにてｐＨを５〜１１に調製した試薬−１の０．２４ｍＬと、実施例１と同様の試料０．００８ｍＬを３７℃で５分間予備加温後、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。一連の操作は日立７１７０形自動分析装置を用い、各種ビリルビンにビリルビンオキシダーゼ無添加の試薬−１を添加したときの波長４５０nmでの吸光度を１００とし、各化合物の各種ビリルビンに対する試薬−１の反応性を、吸光度の減少率(％)から比較した。
【００４５】
その結果を表２に示す。ミロセシウム属ビリルビンオキシダーゼを用いたときは、ｐＨ６〜９では、δビリルビンに対して２〜１２％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては９７〜１００％の反応性を示した。また、ｐＨ６未満では、δビリルビンに対して１５〜２０％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては７０〜９８％、そして、ｐＨ９より高いとδビリルビンに対して１％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては９０〜９６％の反応性を示した。一方、エビタケ属ビリルビンオキシダーゼを用いた時は、ｐＨ６〜９でδビリルビンに対して１〜１５％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては９０〜１００％の反応性を示した。また、ｐＨ６未満では、δビリルビンに対して２０〜２５％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては９５〜１００％、そして、ｐＨ９より高いとδビリルビンに対して１％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては４〜３５％の反応性を示した。これらのことから、人工的に調整した試料においては、ビリルビンオキシダーゼの菌株の由来にかかわらず、特にｐＨ６〜９の範囲で、芳香族スルホン酸により、ビリルビン非δ画分が特異的に消去されることが確認された。
【００４６】
【表２】
2005058031.tif 000006
【００４７】
実施例３：  各種ビリルビンに対する試薬−２の反応性
実施例１の第１試薬における芳香族スルホン酸類としてp-トルエンスルホン酸を用いて、５０ｍＭのリン酸緩衝液(ｐＨ７．２)を調製した試薬−１の０．２４ｍＬと、実施例１の試料０．００８ｍＬを３７℃で５分間予備加温後、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、表３に示す３０ｍＭのフェノール類、３０ｍＭのアニリン類又は０．２%の炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類を含有する水溶液（試薬−２）、又は表３に示す５ｍＭの金属イオン酸化剤類を含有する３００ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ３．５)（試薬−２）を０．０６ｍＬ添加後、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。一連の操作は日立７１７０形自動分析装置を用いた。各種ビリルビンに対してビリルビンオキシダーゼ無添加系での試薬−２添加時の波長４５０ｎｍの吸光度と、ビリルビンオキシダーゼ無添加と添加の試薬−1における波長４５０ｎｍでの吸光度の差より求めた値を１００とし、各化合物の各種ビリルビンに対する試薬−２の反応性を、吸光度の減少率(％)から比較した。
【００４８】
その結果を表３に示す。フェノール類又はアニリン類を含む試薬−２は、δビリルビンに対して９５〜９７％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては１〜２％とほとんど反応を示さず、また、炭素鎖７以上のアルキルベンゼンスルホン酸類を含む試薬−２も、δビリルビンに対しては９０〜９３％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては１〜２％とほとんど反応を示さず、さらに、金属イオン酸化剤を含む試薬−２に関しても、δビリルビンに対しては７５〜８０％、ジタウロビリルビン及び非抱合ビリルビンに対しては１〜２％とほとんど反応を示さなかった。これらのことから、人工的に調製した試料においては、前記化合物がδビリルビンに反応していることが確認された。
【００４９】
【表３】
2005058031.tif 000007
【００５０】
実施例１〜３の結果より、ビリルビンを含む試料において、芳香族スルホン酸類等の消去剤を含む試薬−１で非δビリルビン画分を選択的に消去し、次に、フェノール類等を含む試薬−２でビリルビンδ画分に反応させることで、δビリルビンを測定できるということが示唆される。
【００５１】
実施例４：  各種ビリルビンに対する試薬−１の反応性のＨＰＬＣによる分析
実施例１の第１試薬における芳香族スルホン酸類としてp-トルエンスルホン酸を用いた試薬−１の０．４５ｍＬと血清検体０．０１５ｍＬを３７℃で５分間予備加温後、３ｇ／ｄＬ のフッ化ナトリウム水溶液０．０３ｍＬ及び１０ｇ／ｄＬのアスコルビン酸水溶液０．０１ｍＬを加えて、その反応液０．１ｍＬをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件は、溶離液−１に０．０５ｇ／ｄＬのフッ化ナトリウムおよび０．２ｇ／ｄＬのアスコルビン酸を添加したこと、ＨＰＬＣ装置に東ソー ８０２０分析装置を用いたこと以外、Ｌａｕｆｆ等の方法(Ｊｏｈｎ  Ｊ．Ｌａｕｆｆ、ｅｔ．ａｌ．「Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ」(１９８１年)、２２６号、ｐ．３９１〜４０２ )に準じて行った。なお、試薬−１の他に、フッ化ナトリウム水溶液およびアスコルビン酸水溶液を添加し、ビリルビンオキシダーゼ反応を抑制した反応液中の各種ビリルビンを対照とした。
【００５２】
その結果を図１に示す。本試薬におけるビリルビンオキシダーゼ反応により、ジグルクロナイドビリルビン（γ）、モノグルクロナイドビリルビン（β）及び非抱合ビリルビン（α）のビリルビン非δ画分に相当するピークが消失し、δビリルビンに相当するピークは、ほとんど変化なしに残存していることがわかった。このことから、本発明による試薬−１は、血清検体中のビリルビン非δ画分を特異的に消去していることが確認された。
【００５３】
実施例５：  各種ビリルビンに対する試薬−１および試薬−２の反応性のＨＰＬＣによる分析
実施例１の第１試薬における芳香族スルホン酸類としてp-トルエンスルホン酸を用いた試薬-１の０．４５ｍＬと血清検体０．０１５ｍＬを３７℃で５分間予備加温後、実施例３のフェノール類を用いた試薬−２の０．１１２ｍＬを加えて、更に３７℃で５分間予備加温し、３ｇ／ｄＬ のフッ化ナトリウム水溶液０．０３ｍＬおよび１０ｇ／ｄＬのアスコルビン酸水溶液０．０１ｍＬを加えて、その反応液０．１ｍＬをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件は、実施例４と同様である。
【００５４】
その結果を図２に示す。本試薬−２におけるビリルビンオキシダーゼ反応により、ジグルクロナイドビリルビン（γ）、モノグルクロナイドビリルビン（β）、非抱合ビリビン（α）及びδビリルビンに相当するピークがほぼ消失していることがわかった。このことから、本発明による試薬−２は、血清検体中のビリルビンδ画分を特異的に消去していることが確認された。
実施例４の結果と併せ総合的に判断すると、本発明を実施できる試薬は、血清検体中のビリルビンδ画分を特異的に測定することができると示唆される。
【００５５】
実施例６：  本発明法による測定値とＨＰＬＣ法測定値の相関
実施例５で用いた試薬−１の０．２４ｍＬと１２例の血清検体０．００８ｍＬ を混合して、３７℃にて５分間予備加温し、次いで試薬−２の０．０６ｍＬを加えて３７℃５分加温した。３７℃で日立７１７０形自動分析装置を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、標準品の吸光度を対照にδビリルビン値を算出した。ＨＰＬＣは、日本臨床衛生検査技師会の ビリルビン測定法の標準化ワーキンググループ報告(１９９９年)の方法に準じて行った。カラムにバイオプティックＡＶ２、 溶離液に５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ６．５とアセトニトリルの１０対３混合液を、ＨＰＬＣ装置に東ソー８０２０分析装置を使用した。各検体の４５０ｎｍにおけるクロマトグラムから、ジグルクロナイドビリルビン、モノグルクロナイドビリルビン及び非抱合ビリビンに相当するピーク面積を算出し、米国標準技術協会（ＮＩＳＴ）標準品ＳＲＭ９１６ａを対照に算出したビリルビン値の和とエクディアＬ‘栄研' Ｔ−ＢＩＬ（商品名：栄研化学製）による測定値(総ビリルビン値)の差から検体中のビリルビンδ画分の値を求めた。更に、ＨＰＬＣ法と本発明法測定値の相関図を作成した。
【００５６】
その結果を図３に示す。ＨＰＬＣと本発明法の相関係数は０．９９、一次回帰式の傾きは１．０２２、切片は０．０２と非常に良好な相関があることが確認された。
【００５７】
実施例７：  本発明法による測定値および総ビリルビン、抱合ビリルビン測定より算出した非抱合ビリルビン値とＨＰＬＣ法測定値の相関
実施例６で測定した本発明法の測定値と同時に測定したエクディアＬ‘栄研'Ｄ−ＢＩＬ（商品名：栄研化学製）による測定値(抱合ビリルビン値)の和とエクディアＬ‘栄研'  Ｔ−ＢＩＬ（商品名：栄研化学製）による測定値(総ビリルビン値)の差から非抱合ビリルビン値を算出した。各算出値と実施例６で測定したＨＰＬＣ法との相関図を作成した。
【００５８】
その結果を図４に示す。非抱合ビリルビンにおけるＨＰＬＣ法との相関係数は０．９９、一次回帰式の傾きは１．０３、切片は０．０４と非常に良好な相関があることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】各種ビリルビンの試薬−１の反応性をＨＰＬＣ分析した結果を示すグラフである。
【図２】各種ビリルビンの試薬−１および試薬−２の反応性をＨＰＬＣ分析した結果を示すグラフである。
【図３】本発明によるビリルビンδ画分の測定値とＨＰＬＣ法での測定値の相関を示すグラフである。
【図４】本発明によるビリルビンδ画分の測定値および抱合ビリルビン値を、総ビリルビン値より差し引くことより求めた非抱合ビリルビン値とＨＰＬＣ法での測定値の相関を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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