(57)【要約】【課題】標準的なジムプロット手法といくつかの類似性を共有した、高分子の分画されていない溶液の分子特性を測定するための新しい方法を提供する。【解決手段】この方法は、ある範囲の濃度にわたるいくつかの試料アリコートの調製に始まる。アリコートは次に、液体クロマトグラフィにより提供されるように、流れの中に順次注入される。各アリコートはそれにより効果的な「ピーク」を作り出し、その元素は希釈されたアリコートの異なる濃度に対応する。対応するピーク全体にわたって散乱信号の角度および濃度依存性を分析することにより、重量平均モル質量、平均２乗半径、および第２ビリアル係数が導き出され得る。より初期のオンライン法とは異なり、より少量の試料を用いながらより良好な精度が達成される。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分画されていない試料の重量平均モル質量Ｍw、平均２乗半径＜ｒg2＞、および第２ビ
リアル係数Ａ2を決定する方法であって、
Ａ）  好適な溶媒手段において前記試料の一連のｎ個の希釈液を調製するステップを含み、前記希釈液は約１桁の濃度の範囲にわたっており、前記方法はさらに、
Ｂ）  溶媒手段槽を提供するステップと、
Ｃ）  前記溶媒手段を順次、多角度光散乱検出手段および濃度検出手段を通って流すようにするポンプ手段を提供するステップと、
Ｄ）  前記ｎ個の試料希釈液の各々のアリコートを順次注入するステップと、
Ｅ）  前記アリコートの各々の溶出の間中、それが前記多角度光散乱および濃度検出器手段を通過するにつれて、予め選択された流量容積測定に関する増分の間隔Δｖで、前記多角度光散乱および濃度データをコンピュータ手段に収集し、記憶させるステップと、
Ｆ）  各前記試料希釈液ｊの全濃度溶出元素ｉｊにわたって、前記収集された濃度データ値ｃijから、前記コンピュータ手段により、前記ｎ個の試料注入液に対応するｎ個の和【数１】
2005049140.tif 000033
（式中、ｊ＝１〜ｎ）を形成するステップと、
Ｇ）  各前記試料希釈液ｊの全濃度溶出元素ｉｊにわたって、前記収集された濃度データ値ｃijから、前記コンピュータ手段により、前記ｎ個の試料注入液に対応するｎ個の和
【数２】
2005049140.tif 000034
（式中、ｊ＝１〜ｎ）を形成するステップと、
Ｈ）  各前記試料希釈液ｊおよび各溶出ｉについて、各散乱角度θkでの前記収集された光散乱データから、過剰レイリー比Ｒij（θk）を計算するステップと、
Ｉ）  前記試料希釈液ｊの全光散乱溶出元素ｉにわたって、前記コンピュータ手段により、各散乱角度θkおよび試料希釈液ｊについて、ｎ個の和
【数３】
2005049140.tif 000035
（ｊ＝１〜ｎ）を形成するステップと、
Ｊ）  比率Ｄj／Ｃj＝κjを形成するステップと、
Ｋ）  すべての角度ｋおよびｎ個の試料希釈液についての前記比率κjおよび前記和
【数４】
2005049140.tif 000036
を用いて、前記分画されていない試料の前記重量平均モル質量、前記平均２乗半径、および前記第２ビリアル係数を導き出すステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記分画されていない試料の前記重量平均モル質量、前記平均２乗半径、および前記第
２ビリアル係数は、
【数５】
2005049140.tif 000037
とによって導き出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画されていない試料の前記重量平均モル質量、前記平均２乗半径、および前記ビリアル係数は、トレイノフ−ワイアットプロットから導き出され、
ａ）  各角度についてのデータは、κjの関数として、
【数６】
2005049140.tif 000038
（式中、ａl,kはフィットパラメータであり、Ｎlは濃度フィットの次数である）にフィットされ、
ｂ）  各注入液についてのデータは、
【数７】
2005049140.tif 000039
（式中、ｂj,mはフィットパラメータであり、Ｎmは角度フィットの次数である）にフィットされ、
ｃ）  フィット係数は次に
【数８】
2005049140.tif 000040
（式中、ｕmおよびｖlはフィット係数である）にフィットされ、
ｄ）  前記重量平均モル質量は、Ｍw＝［１／ｕ0＋１／ｖ0］から決定され、
ｅ）  前記第２ビリアル係数Ａ2＝ｖ1／２であり、
ｆ）  前記平均２乗半径
【数９】
2005049140.tif 000041
である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
比率Ｄj／Ｃj＝κjの因子Ｄjはバンド拡張が補正されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多角度光散乱検出器手段は、選択された角度θでの単一角度光散乱検出器手段によって置き換えられ、前記和
【数１０】
2005049140.tif 000042
はそれに応じて単一の角度について形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単一角度光散乱検出器手段は角度θ＝９０°である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記濃度検出器手段は差動屈折率（ＤＲＩ）検出器である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記濃度検出器手段は紫外線（ＵＶ）吸収検出器である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記濃度検出器手段は蒸発性光散乱検出器である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
溶液中の分子は一般に、それらの重量平均モル質量Ｍw、それらの平均２乗半径＜ｒg2＞、および第２ビリアル係数Ａ2によって特徴付けられる。後者は分子と溶媒間の相互作用の指標である。分画されていない溶液については、これらの特性は、それらが光を散乱させる様子を、ブルーノ・ジム（Bruno Zimm）が１９４８年に非特許文献１に発表した独創的な論文に記載した方法を用いて測定することによって決定されてもよい。少量の溶液から散乱された光が、ある範囲の角度および濃度にわたって測定される。光散乱測定から導き出される特性は、ジムによって開発された以下の式を介して関係付けられる。
【０００２】
【数１】
2005049140.tif 000003
【０００３】
式中、Ｒ（θ）は単位立体角あたりの方向θにおける測定された過剰レイリー比で、Ｒ（θ）＝［Ｉs（θ）−Ｉsolv（θ）］ｒ2／Ｉ0Ｖとして定義され、Ｉs（θ）は角度の関数としての、溶液により散乱される光の強度であり、Ｉsolv（θ）は角度の関数としての、溶媒から散乱される光の強度であり、Ｉ0は入射強度であり、ｒは散乱体積から検出器までの距離であり、Ｖは検出器により見られる照光された体積であり、Ｐ（θ）は散乱する分子の形状因子で、
【０００４】
【数２】
2005049140.tif 000004
【０００５】
として定義され、Ｋ*＝４π2（ｄｎ／ｄｃ）2ｎ02／（Ｎaλ04）であり、Ｎaはアボガドロ数であり、ｄｎ／ｄｃは屈折率増分であり、ｎ0は溶媒屈折率であり、λ0は真空中の入射光の波長である。形状因子は以下の式によって平均２乗半径に関連付けられる。
【０００６】
【数３】
2005049140.tif 000005
【０００７】
ある範囲の散乱角度にわたる光散乱データの収集は、より一般的には、多角度光散乱ＭＡＬＳ（multiangle light scattering）として言及される。データは次に式（１）にフィットされ、Ｍw、＜ｒg2＞、およびＡ2が抽出される。この目的のため、式（１）の逆数がより一般的に用いられ、それは以下のように書かれてもよい。
【０００８】
【数４】
2005049140.tif 000006
【０００９】
データを式（３）にフィットさせる方法はいくつかある。歴史的に最も一般的な方法は、ジムによって提示された図解法をソフトウェアで模倣することである。これはしばしばジムプロット法として言及される。また、これに代えて、以下に述べる包括的な非線形最小２乗フィット法を用いてもよい。
【００１０】
分子溶液を特徴付ける強力な１つの方法は、試料をまずサイズ排除クロマトグラフィＳＥＣ（size exclusion chromatography）などのクロマトグラフィ手段によって分画し、次に散乱された光および濃度を溶出容量ｖの関数として測定することである。分画が十分に分離される場合、各容量試料は本質的に単分散であると考えられ得る。Ａ2が以前の実験から公知である場合、または濃度が十分低くて散乱光に対するＡ2の影響が取るに足りない場合、データを式（１）または（３）にフィットさせて分布Ｍ（ｖ）およびｒg2（ｖ）を抽出してもよい。これは、カリフォルニア州サンタバーバラ（Santa Barbara）のワイアット・テクノロジー・コーポレイション（Wyatt Technology Corporation）により開発されたＡＳＴＲＡ（登録商標）プログラムなどの市販ソフトウェアによって、日常的に行なわれる。
【００１１】
Ａ2項がいつ無視されてもよいかを特徴付ける性能指数ＦＯＭ（figure of merit）を定義してもよい。式（１）は、Ａ2がｃ2項の前因子であることを示す。式（１）の括弧内の項の大きさを比較することにより、ＦＯＭは以下のように定義されてもよい。
【００１２】
【数５】
2005049140.tif 000007
【００１３】
ジム数式の微分において仮定されたように、ＦＯＭ＜＜１の場合、第２ビリアル係数は光散乱信号に若干の影響しかもたらさない。光散乱によって第２ビリアル係数を測定したい場合、ＦＯＭは、影響が良好な精度で測定可能となるのに十分なほど大きくなければならないが、式（１）においてより高次の濃度の項が必要となるほど大きくなってはならない。ＳＥＣカラムは試料をカラムあたり約１桁希釈するため、クロマトグラフィ分離から生じる濃度はＡ2が通常無視され得るのに十分なほど低いというのが通例である。クロマトグラフィ分離法の詳細、質量およびサイズモーメントの定義と計算、および関連する分布を説明するために用いられる用語の説明は、非特許文献２のワイアットによる１９９３年総論に見られる。
【００１４】
要約すると、光散乱測定には２つのモードがある。バッチモードでは、単一の試料の一連の光散乱測定が異なる濃度で行なわれる。散乱信号の濃度および角度依存性によって、Ｍw、＜ｒg2＞、およびＡ2が決定される。クロマトグラフィモードでは、試料が溶出するにつれて試料の組成が変わるため、Ａ2の先験的知識が要求されるが、分布Ｍ（ｖ）およびｒg2（ｖ）は測定可能である。これらの分布から、平均値Ｍwおよび＜ｒg2＞が計算されてもよい。なお、分画された試料測定から計算された値は、バッチ試料から測定された値と同一であるべきである。Ａ2＝０という仮定、および検出器間のバンドの拡張による歪みから、差異が生じる。
【００１５】
Ａ2はバッチ測定から決定され得るが、試料濃度がクロマトグラフィ溶出の場合と同様に連続的に時間とともに変動する場合、第２ビリアル係数が正確に測定できるのかという疑問が残る。ハウイー（Howie）、ジャクソン（Jackson）、およびワイアットによる米国特許第５，１２９，７２３号には、溶出および完全な混合に続いて、分画されていない試料をＭＡＬＳ検出器に注入する方法が記載された。この手順により、光散乱検出器を通過する試料ピークが作り出され、そのプロファイルは、溶出されてはいるがまだ分画されていない試料の濃度プロファイルに比例すると仮定された。各薄片での質量分布は同じであるため、プロファイルの各点は、その点で、試料の濃度×重量平均モル質量に比例するということが、式（３）を参照し、Ａ2＝０と設定することによって仮定された。これに基づき、１組のこれらの点を用いてジムプロットが作成可能であり、関連する重量平均モル質量、平均２乗半径、および第２ビリアル係数が次に導き出された。試料ピーク曲線を濃度プロファイルに変換するには、注入された総質量の知識で十分であったため、濃度検出器は必要ないと考えられた。しかしながら、この方法には欠陥があった。なぜなら、Ａ2が０であるという仮定は、そうではないという導き出された結果に矛盾していたからである。
【００１６】
第２の方法はクロマトグラフィ構成を用いることであり、その場合、光散乱および濃度検出器の双方が使用される。単分散の試料を注入し、またはクロマトグラフィ法を開発して単量体のピークを分画する場合、各溶出留分での重量平均モル質量は各ピーク全体にわたって一定でなければならない。ＭＡＬＳおよび濃度データから、ジムプロット分析が、溶出プロファイルのいくつかの異なる薄片、または薄片の組での値から行なわれてもよい。重量平均モル質量、平均２乗半径、および第２ビリアル係数が次に導き出されてもよい。しかしながら、大抵のタンパク質については、平均２乗半径は小さすぎて正確には測定できない。
【００１７】
この方法は原則としては機能するかもしれないが、一般的に適用可能となるのを妨げる実用上の困難がある。上述の実験装備は２つの検出器を必要とする。流体は、検出器間を移動する際に毛細管および継手を通過しなければならないため、混合および拡散が「検出器間のバンドの拡張」をもたらす。下流ピークは上流ピークよりも「幅広い」。これは、拡張の影響を考慮に入れない限り、単分散の試料が多分散に見える測定された質量分布を作り出すことを意味する。この影響はタンパク質にとって特に問題である。なぜなら、それらのＦＯＭは通常１よりもはるかに小さく、第２ビリアル係数が散乱光に少々寄与するためである。バンド拡張に関連するエラーは普通、優位を占め、導き出された第２ビリアル係数は著しく歪んでいる。バンド拡張のさまざまな分析的補正が長年にわたって開発されてきたが、光散乱信号へのＡ2の寄与が非常に小さいため、結果として生じるＡ2の値は、使用されたバンド拡張の正にそのモデルに敏感に依存する。モデルに対するこの敏感な依存性により、この方法は信頼できなかった。
【００１８】
好適な緩衝溶媒における単分散の試料についてのタンパク質のモル質量は、ＭＡＬＳ、質量分光学、またはダイレクトシークエンシングによりしばしば容易に測定されるため、ワイアットによる特許文献１「第２ビリアル係数を測定するための方法（“Method for measuring the second virial coefficient”）」は、ジムプロット全体を作成するのに必要な多数の濃度の生成を回避することの有用性を強調した。しかしながら、そこに記載された方法がより一般的な多数の濃度アリコートの場合に拡張されると、その方法はもはやモル質量の先験的知識を必要としない、ということが示されるであろう。加えて、拡張された方法により達成された平均化のため、精度が向上する。
【００１９】
多くの科学者達はジムプロットを作成するためにオンライン方法を利用しており、前述のＡＳＴＲＡ（登録商標）プログラムは、より初期の手動の方法よりもはるかに簡単に決定を行なう。現在、分画されていない試料のＡ2を測定するための最良の手段は、アリコートを異なる濃度で調製し、それらを、シリンジまたはシリンジポンプを用いて、ＭＡＬＳ計器の光散乱セルに直接、連続して注入することである。注入液がセルを充填するにつれて、各アリコートは、純溶媒の基線散乱に対し、プラトーに至るまでの傾斜を作り出す。プラトーの各々の上の、一括してピークとして言及される選択された範囲の点から、ソフトウェアは調製された濃度の対応する入力を受付け、ジムプロットを作成する。このアプローチにはいくつかの欠点があり、そのうち最も重大なものは、比較的大量の試料を調製し使用する必要性である。フローセルに注入する場合、平坦なプラトーを生成する必要性は、セルを数回過充填しなければならないことを意味する。内部容量が８０μｌのフローセルに対し、５００μｌを上回る試料が各アリコートについて必要とされる。現在の製薬研究にとって、この要件は現在の手法を実行不可能にする。しばしば、この量の試料は実際には合成できない。加えて、タンパク質および同様のバイオポリマーについては、注入された各試料は注入前に透析されなければならない。これは、測定を行なうために必要な調製時間および労力を著しく増加させる。
【００２０】
最後に、この発明において、ピーク間で統合することにより、ピーク形状への依存性がなくなり、バンド拡張の補正が単一のパラメータへ減少することを示す。拡張のモデルへの敏感な依存性は取除かれ、この方法を実際的に、かつ信頼性の高いものにする。Ａ2は、タンパク質などの単分散の試料に対するバンド拡張の存在下だけでなく、分画されていない試料が光散乱測定セルに直接注入される場合についても、非常に簡単に測定され得る。
【特許文献１】
米国特許第６，４１１，３８３号明細書
【非特許文献１】
ブルーノ・ジム（Bruno Zimm）、「化学物理学会誌（“Journal of Chemical Physics”）」、１９４８年、第１６巻、１０９３〜１０９９頁
【非特許文献２】
ワイアット（Wyatt）、「アナリチカ  チミカ  アクタ（“Analytica Chimica Acta”）」、１９９３年、第２７２巻、１〜４０頁
【考案の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
発明の要約
この発明の主な目的は、親発明に記載された方法を拡張して、異なる濃度を有する一連の注入液からＭw、＜ｒg2＞、およびＡ2を直接抽出する方法を提供し、これによりＭwを先験的に知る必要性をなくすことである。また、これらのパラメータを抽出する２つのフィット手法も開示する。１つの方法は包括的な非線形最小２乗フィットデータに基づく。第２の分析手法はジムの図解法の後でモデル化されている。ジムプロットと明確に区別するため、結果として生じるプロットを、トレイノフ（Trainoff）−ワイアット（ＴＷ）プロットと呼ぶ。この発明の目的は、プロセスを自動化し、手動による試料調製をできるだけなくすことである。この発明の別の目的は、多数注入手法において暗に示された平均化を活用することにより、より正確に測定を行なうことである。最後に、この発明の目的は、そのような決定を最少量の試料を用いて行なうことである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
ワイアットによる前述の米国特許第６，４１１，３８３号は、溶媒中の単分散のモル質量分布で構成される試料の第２ビリアル係数を単一の注入液から直接決定することを可能にする方法に関する。同じ方法は、或る部類の分画されていない試料にも適用可能である。この発明は、一連の濃度注入液を使用する、より一般的な用途向けである。ワイアット特許は、試料の重量平均モル質量の先験的知識を必要とする。この発明は、ジムにより提示されたものと類似する分析手法を用いてＭw、＜ｒg2＞、およびＡ2を決定する。
【００２３】
加えて、ワイアット特許は、検出器間のバンドの拡張は取るに足りないものであると仮定している。測定に使用される試料の量を最小限に抑えることは、しばしば望ましい。したがって、少量の注入液が使用され、狭いピークをもたらす。この場合、検出器間のバンドの拡張は無視できない。この発明では、この影響を勘案するいくつかの方法を提示する。
【００２４】
この方法は、ＳＥＣカラムセットへの注入用に試料の１組のｊ希釈液を調製することから始まる。オートサンプラが利用可能である場合には、単一の試料を、次に続く規定された濃度への自動希釈用に提供してもよい。希釈液を調製するのにオートサンプラを使用する方法は２つある。第１に、それは、より少量の試料を注入ループ内へ、それを充填し尽くさずに漸次注入できる。また、これに代えて、オートサンプラは注入ループを充填する前に試料を予め希釈し、次にそれを完全に充填することができる。後者の方法が好ましい。なぜなら、それは各注入液について、異なる振幅で、一致する濃度プロファイルをもたらすためである。
【００２５】
分析は、測定されるべき１組の低下する濃度の試料を必要とする。タンパク質の場合、各試料アリコートは透析されなければならない。各試料がそこを流れる１組のＳＥＣカラムを導入することは、この要件を不要にする。なぜなら、試料がカラムを通過する間に透析が起こるためである。カラムに続き、ＭＡＬＳ検出器および濃度検出器が連続して接続される。平均２乗半径が小さすぎて測定できない小さな分子については、９０°などの単一の散乱角度での測定で十分であるが、決定の精度は下がるであろう。これらはＳＥＣによる標準的な分離の従来の要素であり、試料内に存在する溶出したモル質量の絶対的な決定をもたらす。透析も分画も必要ではない場合、分離カラムは排除可能であり、試料は光散乱計器のフローセルに直接注入されてもよい。また、これに代えて、防護カラムを用いて分離なしで透析を達成してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
理論上の説明
ここで分析方法を扱う。各々が総注入質量ｍjに対応する１組の注入液ｊを考慮されたい。式（１）に戻ると、各々の連続するピークｊおよび散乱角度θkについて、過剰レイリー比と濃度ピークとを加算する。
【００２７】
【数６】
2005049140.tif 000008
【００２８】
各和はピークｊ内のすべてのｉにわたって求められる。なお、各和は異なる数の項を有するかもしれない。これはなぜなら各ピークが異なる幅を有するかもしれず、検出器間のバンドの拡張の影響によって広がっているかもしれないためである。
【００２９】
【数７】
2005049140.tif 000009
【００３０】
濃度検出器が各溶出容量でのｃijを産出するため、濃度ピークの拡張された全範囲にわたって式（６）の和ＤjおよびＣjを簡単に計算し得る。過剰レイリー比Ｒij（θk）は、まず純溶媒光散乱値を、上述の式（１）の直後に定義されたような測定された溶液値から減算することによって計算される。詳細は、前に引用されたアナリチカ  チミカ  アクタにおけるワイアットによる論文に示されている。ここで式（６）の逆数を取り、以下の式を得る。
【００３１】
【数８】
2005049140.tif 000010
【００３２】
このため、
【００３３】
【数９】
2005049140.tif 000011
【００３４】
であり、式中、κj＝Ｄj／Ｃjである。式（８）をトレイノフ−ワイアット（ＴＷ）数式と呼ぶ。
【００３５】
式（８）はこの発明の本質を提示している。特に重要なのは、溶出試料のすべての元素を含むのに十分な溶出薄片の範囲にわたったＣjおよびＤjの測定および計算である。これらの和に含まれる薄片の数は一般に、前述のバンド拡張の影響のため、和【００３６】
【数１０】
2005049140.tif 000012
【００３７】
の計算に使用される薄片の数よりも多い。
ここまで、下流の検出器に対する検出器間のバンドの拡張の影響は無視されてきた。それが式（８）に与える影響を調べる。濃度検出器が光散乱検出器の下流にあると仮定されたい。さらに、混合および拡散の影響が線形で、以下の式を書くことができると仮定されたい。
【００３８】
【数１１】
2005049140.tif 000013
【００３９】
式中、ｃm（ｔ）は測定された濃度信号であり、Ｂ（τ）は標準化された拡張カーネルであり、ｃ（ｔ）は検出器間の拡張がない場合に測定される濃度である。説明を簡単にするため、表記を連続的表示に切換えた。これが式（８）のＣおよびκに与える影響を考慮されたい。測定された信号からＣをコンピュータ計算すると、以下の式が得られる。
【００４０】
【数１２】
2005049140.tif 000014
【００４１】
Ｂ（τ）が標準化されているため、当然こうなる。これは、Ｃが注入された質量に比例し、拡張が注入された質量に影響を与えていないために予想される。しかしながら、以下の式から、拡張が測定された量Ｄmを介してκに影響を与えていることがわかる。
【００４２】
【数１３】
2005049140.tif 000015
【００４３】
右の３番目の積分を考慮されたい。これはそれ自体との拡張関数の重畳積分の形である。それは単にパラメータτ−τ′の関数である。重畳積分定理を用いて式（１４）の３番目の積分を書替えると以下のようになる。
【００４４】
【数１４】
2005049140.tif 000016
【００４５】
結論は、検出器間の拡張はＴＷ数式のκ項のみを歪ませる、ということである。式（１４）から、拡張の影響は、ピークの最大値を抑えること、および「ウイング」における値を増加させることということがわかる。これは、測定値Ｄm≦Ｄであることを意味する。
これは次に、Ａ2のコンピュータ計算された値が過大に見積もられていることを暗示する。拡張用データを補正するアプローチはいくつかある。概念的に最も単純で、最も有用でないものは、式（９）を逆重畳積分して、拡張されていない濃度プロファイルである以下の式を求めることである。
【００４６】
【数１５】
2005049140.tif 000017
【００４７】
より実際的な方法について、ｃ（ｔ）とＢ（τ）の双方がガウス分布である特別な場合を考慮されたい。その場合には、式（１４）は以下の定義から明示的にコンピュータ計算可能である。
【００４８】
【数１６】
2005049140.tif 000018
【００４９】
式中、ｃは総注入質量に比例し、各注入液につき異なる。式（１８）を式（９）に挿入すると、幅τcm2＝τc2＋τb2を有する別のガウス分布を産出する。また、以下の式が見出される。
【００５０】
【数１７】
2005049140.tif 000019
【００５１】
しかしながら、τcは拡張されていないピークのガウス幅であり、一般に未知であることを思い出されたい。しかしながら、拡張が小さい（τb＜＜τc）制限においては、それを光散乱ピークの幅によって近似できる。したがって以下の式を書くことができる。
【００５２】
【数１８】
2005049140.tif 000020
【００５３】
一般的な問題へ戻ろう。オートサンプラを用いて希釈液を生成する場合、注入液は、十分な近似として、同じ形状を有するが振幅は異なる。
【００５４】
それらが同じ形状を有すると仮定すると、ｊ番目の濃度プロファイルは以下のように書くことができる。
【００５５】
【数１９】
2005049140.tif 000021
【００５６】
式中、ここでもｍjはｊ番目の注入液の注入された質量である。これを式（１１）に挿入すると、以下の式が産出される。
【００５７】
【数２０】
2005049140.tif 000022
【００５８】
次に式（２０）を用いて比率Ｄm0／Ｄ0を近似できる。また、これに代えて、この比率は、ある基準試料について、Ａ2を測定する従来のプラトー法とＴＷプロットとを実行し、次に２つの方法が一致するまで比率を調節することによって測定可能である。この比率は事実上、検出器間の拡張の測定値であり、使用される試料から独立しているべきである。したがって、システムが基準試料によって一旦特徴付けられると、測定された比率を次の未知の試料の分析に使用できる。
【００５９】
実験データの収集
分子溶液の重量平均モル質量Ｍw、平均２乗半径＜ｒg2＞、および第２ビリアル係数Ａ2を決定するため、１組の異なる濃度のｊ試料が順次、図１に示すようなクロマトグラフィシステムに注入される。溶媒が、ポンプ手段１によって溶媒槽２からデガッサ３を介して引かれ、次にフィルタ手段４を通ってポンプで送り込まれる。デガッサ３は一般に、溶解されたガスを溶媒から除去するために使用される。なぜなら、そのようなガスが次に溶液中に小さな泡を生成し、それが溶液自体からの所望の測定を害するおそれがあるためである。フィルタ手段４は一般に図示されるように組込まれて、所望の測定を害するおそれのある残留粒子状物質を前記溶媒から除去する。重量平均モル質量、平均２乗半径、および第２ビリアル係数をこの発明の方法によって導き出すべき試料５のアリコートが、注入手段６によって注入され、光散乱ＭＡＬＳ検出器８を直接通過する。希釈液は事前に調製され、手動で注入されることが可能である。
【００６０】
また、これに代えて、希釈されていない試料の容量を減少させるよう、または、好ましくは試料を希釈して一定の容量を注入するようにオートサンプラをプログラムすることで、それらを生成可能である。通常、希釈液は１桁、またはそれより大きい範囲にわたる。試料が事前の透析および／または分画を要する場合、選択された分離カラムセット７をＭＡＬＳ検出器８の前に置いてもよい。集合体が存在しない場合、透析はしばしば防護カラムのみの使用によって達成されてもよく、または、透析が必要ない場合は省略されてもよい。連続する各試料５は、ＭＡＬＳ検出器８を通過した後、差動屈折率検出器ＤＲＩとして示される濃度検出器９を流れ、それにより試料濃度が各薄片間隔Δｖiで測定される。
収集間隔Δｖiが等距離である場合、Δｖi＝Δｖは定数である。結果として生じる光散乱信号および濃度信号が次にコンピュータ手段１０によって記憶および処理され、注入された各アリコートｊについて、測定された各散乱角度θkでの各薄片ｉに対する過剰レイリー比Ｒij（θk）が計算される。コンピュータ手段１０はまた、質量およびサイズを含む分子の特徴とその分布とをコンピュータ計算する。試料濃度検出器９は一般にＤＲＩ検出器であるが、紫外線吸収検出器に置き換えられてもよい。蒸発性光散乱検出器も各溶出試料の濃度をモニタするために使用されてもよいが、そのような装置は、その応答が一般に非線形であるため、特別の校正を必要とする場合がある。
【００６１】
データのフィットおよび分子パラメータの抽出
式（８）からＭw、＜ｒg2＞、およびＡ2を抽出するために光散乱および濃度データをフィットさせる基本的な方法は２つある。第１の方法は、ジムの図解法と、式（３）および（８）の関数形の酷似とに基づいている。それは、ゼロ散乱角度およびゼロ濃度へ代入するため、データのサブセットをフィットさせることからなる。まず、各角度のデータをκjの関数として以下の式にフィットさせる。
【００６２】
【数２１】
2005049140.tif 000023
【００６３】
式中、ａl,kはフィットパラメータであり、Ｎlは濃度フィットの次数である。Ｎl＝１の場合、線形フィットが行なわれ、Ｎl＝２の場合、２次フィットが行なわれる、などとなっている。なお、ａ0,kはｋ番目の検出器角度のゼロ濃度への代入である。次に、各注入液のデータを以下の式にフィットさせる。
【００６４】
【数２２】
2005049140.tif 000024
【００６５】
式中、ｂj,mはフィットパラメータであり、Ｎmは角度フィットの次数である。なお、ｂj,0はゼロ散乱角度へのデータの代入である。最後に、ジムに従い、フィット係数を次に以下の式にフィットさせる。
【００６６】
【数２３】
2005049140.tif 000025
【００６７】
式中、ｕmおよびｖlはフィット係数である。それらは以下の式によって分子特性に関連付けられる。
【００６８】
【数２４】
2005049140.tif 000026
【００６９】
測定されたデータの式（２４）、（２５）および（２６）の形へのフィッティングが統計的な意味において行なわれてもよく、それにより、これらのフィットを行なうために用いられるデータがそれらの測定された標準偏差によって計量されてもよいことは、明らかであるべきである。これらは標準的な手法であり、さらなる説明は必要ない。
【００７０】
式（２７）は、Ｍwが角度フィットおよび濃度フィットの双方からコンピュータ計算可能であることを暗示している。２つの方法は一致すべきであるが、実験ノイズの存在下では、それらはしばしば若干異なる。これは方法の精度を判断する一貫性チェックとして使用可能である。平均量は以下のように定義可能である。
【００７１】
【数２５】
2005049140.tif 000027
【００７２】
さらに、式（２５）および（２６）で説明されたフィットは、ジムにより提示されたプロットと同様のプロットによって良好に視覚化され得る。これらは、ジムプロットと明確に区別するため、トレイノフ−ワイアットプロットとして言及される。ＴＷプロットを作成するには、式（２５）および（２６）におけるデータおよびフィットを、図５に示すように横座標にｓｉｎ2（θk／２）＋ｋκjを、縦座標に
【００７３】
【数２６】
2005049140.tif 000028
【００７４】
をプロットすることによってグラフ化する。値ｋは「伸張因子」と呼ばれ、異なる注入液からのデータが一部重複しないように選択される。それはプロットの尺度のみに影響し、フィットによって決定されるパラメータには影響しない。
【００７５】
第２の方法は、全データセットへ包括的なフィットを行なうことである。これは、データのサブセットへ一連のフィットを行なうジム法とは異なる。ジムの方法は１９４０年代に、数値フィッティングソフトウェアを使用せずに開発された。包括的な方法は、データをモデル化するフィット関数を定義し、マルカート法などの標準アルゴリズムを用いてフィット関数へデータの非線形最小２乗フィットを行なうことである。フィットモデルを以下に示す。
【００７６】
【数２７】
2005049140.tif 000029
【００７７】
式中、ａlmはフィットパラメータであり、ＮlおよびＮmはそれぞれ角度フィットおよびκフィットのフィット次数である。フィットパラメータは以下の式によって物理量に関連付けられる。
【００７８】
【数２８】
2005049140.tif 000030
【００７９】
ＴＷプロットはまた、包括的フィッティング法の結果からも作成されてもよい。唯一の違いは、この場合、式（３１）からのフィットが用いられる点である。なお、前述のフィッティング法とは異なり、モル質量は式（３２）において明白にコンピュータ計算される。
【実施例１】
【００８０】
方法の実施例
この方法の有用性を実証するため、トルエン中に溶解された標準ポリスチレンの分子パラメータの測定を提示する。プレッシャーケミカル社（Pressure Chemical Corporation）からの試料は約２００ｋＤの分子量を有しており、線形ランダムコイル構造を有することが公知である。さらに、この試料は極めてほぼ単分散である。それは１．０１未満の多分散性を有しており、実質的な量の集合体が存在しないことを示している。
【００８１】
２つの方法を用いてこの試料を特徴付けた。第１の方法は伝統的なジム法である。親試料を１．８０８ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。親試料を希釈することによって、一連の公知の希釈液を調製した。結果として生じる濃度は１．８０８ｍｇ／ｍｌ、１．４５８２ｍｇ／ｍｌ、１．０７０３ｍｇ／ｍｌ、０．７３４２ｍｇ／ｍｌ、０．３７４５ｍｇ／ｍｌ、および０．１８７９ｍｇ／ｍｌであった。これらを５００μｌの注入ループを用いて、ＭＡＬＳ計器のフローセルが過充填されるように注入した。防護カラムを用いて、塵を除去し、試料から溶解されたガスを分離した。９０°光散乱検出器からの未加工の信号１１を図２に示す。プラトーがはっきりと見え、各ピークのプラトー上の狭い範囲のデータを平均化し、使用して図３に示すジムプロットを作成した。測定量は、【００８２】
【数２９】
2005049140.tif 000031
【００８３】
であった。データは高品質であるが、多量の試料を必要とする。
【００８４】
【数３０】
2005049140.tif 000032
【００８５】
最後に、検出器間のバンドの拡張補正へのガウス近似の結果を、校正方法の結果と比較する。前述の分析では、ガウス近似は各ピークに対して個別にコンピュータ計算された。拡張が１つのシステムパラメータであり、各ピークについて同一であると仮定すると、平均値Ｄm／Ｄ＝１．０９９がコンピュータ計算可能である。校正方法から、Ｄm／Ｄ＝１．０６０であることがわかる。したがって２つの方法は４％以内で一致し、それは実験誤差の範囲内である。
【００８６】
光散乱の技術の当業者には明らかであるように、発明され、記載されたこの方法には、実践のために列挙した根本的な要素から逸脱しない多くの明らかな変形がある。そのような変形はすべて、これまで記載したこの発明の全く明らかな実現であり、特許請求の範囲を参照することにより含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】この発明の好ましい実施形態の主要なクロマトグラフィ要素の接続の図である。
【図２】図３に示すトルエン中の２００ｋＤポリスチレンのジムプロットを作図するために使用される一連の注入液についての９０°光散乱信号の図である。これは、各注入液により達成されたプラトーと、ともに平均化された試料の範囲とを示す。縦軸は未加工の検出器電圧マイナス溶媒基線電圧である。
【図３】トルエン中に溶解された狭い２００ｋＤ標準ポリスチレンの伝統的なジムプロットの図である。試料は、親溶液の連続希釈によって作られた。
【図４】図５に示すトレイノフ−ワイアットプロットに使用される単一の注入液の図である。トレース１１は未加工の９０°光散乱信号である。トレース１２はＤＲＩ信号である。それは、そのピークが光散乱ピークの９０％となるよう倍率調整されており、検出器間遅延体積を補正するよう時間変更されている。ＤＲＩ信号における垂れ下がる特徴は、試料中の溶解ガスのためであり、それは防護カラムによって分離される。ピーク形状の若干の違いは検出器間のバンドの拡張によるものである。なお、それは一定状態に留まらない。これは、図５を作成するのに使用される６つの注入液のうちの１つである。
【図５】ジムフィット法を用いたトレイノフ−ワイアットプロットの図である。プロットの左の線１３は、各注入液についてのデータのゼロ散乱角度への投影である。この投影の傾斜がＡ2を決定する。プロットの底の線１４は、各検出器についてのデータのゼロκへの投影である。この投影の傾斜が＜ｒg2＞を決定する。これら２本の線の交点は１／Ｍwである。
【図６】包括的フィット法を用いたトレイノフ−ワイアットプロットの図である。図５に使用したものと同じデータが使用された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【外国語明細書】
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