(57)【要約】      （修正有）【課題】  複雑な温度管理を必要としない、恒温増幅法であるＮＡＳＢＡ法による、高頻度に変異の起こることが知られているHCV遺伝子型の判定と、そのためのHCVサブタイプ（1a、1b、2a、2b、3a型）に特異的なプライマーを提供すること。【解決手段】  特定の塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基を含む、HCV恒温増幅用プライマーペア、ならびに該プライマーペアを利用したHCVの検出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1〜10、21、及び22から選ばれるいずれか１に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基を含む、HCV恒温増幅用プライマー。
【請求項２】
さらにT7プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
以下の（1）〜（5）から選ばれる、HCV恒温増幅用プライマーペア。
(1)配列番号1及び配列番号2に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(2)配列番号3及び配列番号4に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア、又は配列番号3及び配列番号9に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(3)配列番号5及び配列番号6に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア、又は配列番号5及び配列番号10に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(4)配列番号7及び配列番号8に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(5)配列番号21及び配列番号22に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
【請求項４】
少なくとも一方のプライマーがさらにT7プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項３記載のプライマーペア。
【請求項５】
以下の(1)〜(5)から選ばれる１以上のプライマーペアを用いて検査試料を恒温増幅し、得られる増幅産物によりHCVサブタイプを検出することを特徴とする、HCVの検出方法。
(1)配列番号1及び配列番号2に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(2)配列番号3及び配列番号4に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア、又は配列番号3及び配列番号9に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(3)配列番号5及び配列番号6に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア、又は配列番号5及び配列番号10に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(4)配列番号7及び配列番号8に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(5)配列番号21及び配列番号22に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
【請求項６】
前記プライマーペアのうち少なくとも一方がT7プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の方法において、２以上のプライマーペアを用いて２以上のHCVサブタイプを同時検出することを特徴とする、HCVの検出方法。
【請求項８】
以下の(1)〜(5)から選ばれる１以上のプライマーペアと、前記プライマーペアによる増幅産物に相補的な配列を含み、前記増幅産物を検出するためのプローブを含む、HCV検出用キット。
(1)配列番号1及び配列番号2に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(2)配列番号3及び配列番号4に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア、又は配列番号3及び配列番号9に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(3)配列番号5及び配列番号6に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア、又は配列番号5及び配列番号10に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(4)配列番号7及び配列番号8に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(5)配列番号21及び配列番号22に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
【請求項９】
前記プライマーペアのうち少なくとも一方がT7プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載のHCV検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C型肝炎ウイルス（Hepatitis C Virus：以下「HCV」と略記）の各サブタイプを恒温増幅するためのプライマーと、該プライマーを用いたHCVの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
1988年Chiron社（米国）はHCVの遺伝子を同定した。その後、HCV約9,500塩基のゲノム配列が明らかになり、一本鎖RNAをゲノムとしてもつウイルスであることも解明された。HCVの遺伝子配列には高頻度に変異が起こることが知られ、変異の多い領域の遺伝子配列をもとに4〜6型の亜型に分類される。更にサブタイプとしてa、b、cなどを附記して1a、1b、2a、2b、3a型などと表記される（非特許文献１）。
【０００３】
HCVに感染しても、けん怠感などの自覚症状がみられるのは2〜3割にすぎず、多くは気づかないうちに慢性の炎症が続き、肝硬変、肝がんへと移行してしまう。抗体によるウイルス検出では、感染初期に検出することが難しいため、病状悪化に歯止めをかけることや、感染血液の輸血血液への混入を完全に防ぐことは困難であった。
【０００４】
しかし、近年の研究成果の蓄積により、遺伝子を増幅して検出する遺伝子検査によって、感染初期にも感染が検出できるようになったり、遺伝子型判定も可能となった。遺伝子型判定により急性肝炎の発症率や慢性肝炎への進展率、肝炎から肝硬変を経て肝がんへ移行するかどうかを予測することが可能となったり、HCV関連の治療薬として知られるインターフェロンなどのサブタイプによる投薬治療効果も予測することができるようになった。更に感染源や感染ルートの特定ができるようになったことなどから、抗体検査に比べて遺伝子検査によるウイルス検出の優位な点が多くなっている。
【０００５】
既にいくつかのHCVの遺伝子型判定方法が報告されている。例えばOkamotoらは、HCVのコア領域を標的として7種のプライマーを作成し、これらのプライマーを組み合わせ、逆転写酵素を用いたRT-PCRによる遺伝子型を判定する方法を報告している（非特許文献２）。また、HCVのNS5領域で遺伝子型を判定する方法も報告されている。更に、HCVの5'-非翻訳領域の遺伝子増幅産物を制限酵素により切断して遺伝子型の判定を行う試み（非特許文献３及び特許文献１等参照）、同増幅産物を直接遺伝子配列決定して得られる塩基情報に基づいて遺伝子型を判定する方法（非特許文献４〜６参照）なども報告されている。
【０００６】
これまでに報告されたHCV遺伝子型を判定するオリゴヌクレオチドプライマーは全てPCR法で増幅されるものであり、恒温増幅法よりHCV遺伝子型を判定するオリゴヌクレオチドプライマーは報告されていない。これは、HCV RNAが鎖内結合等で複雑な高次構造をとるため、恒温増幅法で増幅可能な領域が限定され、しかもその領域内で遺伝子型判定が可能な特異的プライマーを設計することは極めて困難なためと考えられる。例えば、恒温増幅法であるNASBA法によってHCVを定量する方法は報告されているが（非特許文献７参照）、この方法ではHCV遺伝子を増幅することはできてもその遺伝子型を判定することはできない。すなわち、現在行なわれているオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われるHCV遺伝子型判定は全てPCR法の複雑な温度管理を必要とし、操作の煩雑さ、判定に要する時間、コストなどの点において、充分に満足できるものではない。この問題を解決する為にも恒温増幅法によりHCV遺伝子型判定が可能なオリゴヌクレオチドプライマーの開発が望まれている。
【０００７】
【特許文献１】特開平9-75100号公報
【非特許文献１】P. Simmonds, et al., J. Gen Virol., 74, p661-668 (1993)
【非特許文献２】H. Okamoto, et al., J. Gen. Virol., 73, p673-679 (1992)
【非特許文献３】F. McOmish, et al., Transfusion, 33, p7-13 (1993)
【非特許文献４】Germer J. J., et al., J. Clin. MiCrobiol., 37(8), p2625-2630 (1999)
【非特許文献５】Holland J., et al., Pathology, 30(2), p192-195 (1998)
【非特許文献６】Doglio A., et al., Res. Virol., 149(4), p219-227 (1998)
【非特許文献７】Guichon A., et al., J. Clin. Virol., 29, p84-91 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、恒温増幅法によるHCV遺伝子型判定と、そのためのHCVサブタイプ（1a、1b、2a、2b、3a型）特異的プライマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、HCV遺伝子のサブタイプ1a、1b、2a、2b、3a型に属する各遺伝子配列中のコア領域内で、遺伝子型選択的に恒温増幅可能なプライマーの設計に成功した。このプライマーを用いてHCV検体を恒温増幅すると、遺伝子型特異的な増幅が生じ、したがってその増幅の有無によりHCV遺伝子のサブタイプ1a、1b、2a、2b、3a型の検出及び遺伝子型判定が可能になる。
【００１０】
すなわち、本発明は、配列番号1〜10、21、及び22から選ばれるいずれか１に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基を含む、HCV恒温増幅用プライマーを提供する。
【００１１】
ある態様（NASBA法に用いられる場合）において、前記プライマーは、その5'末端側にT7プロモーター配列を含む。
【００１２】
本発明はまた前記プライマーを組み合わせて構成される、以下の（1）〜（5）から選ばれる、HCV恒温増幅用プライマーペアを提供する。
(1)配列番号1及び配列番号2に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(2)配列番号3及び配列番号4に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア、又は配列番号3及び配列番号9に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(3)配列番号5及び配列番号6に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア、又は配列番号5及び配列番号10に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(4)配列番号7及び配列番号8に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
(5)配列番号21及び配列番号22に示される塩基配列中の3’末端側の連続した少なくとも18塩基をそれぞれ含むプライマーペア
NASBA法に用いられる場合、前記プライマーペアの少なくとも一方はその5’側にさらにT7プロモーター配列を含む。
【００１３】
本発明はまた、１組以上の本発明のプライマーペアを用いて検査試料を恒温増幅し、得られる増幅産物によりHCVサブタイプを検出することを特徴とする、HCVの検出方法を提供する。このHCVの検出方法により、HCVサブタイプの遺伝子型判定ができる。またNASBA法を用いて恒温増幅を行う場合、前記プライマーペアのうち少なくとも一方は、T7プロモーター配列を含む。
【００１４】
本発明の検出方法では、２以上のプライマーペアを用いることにより、２以上のHCVサブタイプを同時検出することができる。
【００１５】
本発明は、前記HCVの検出方法に用いられるキットを提供する。前記キットは、１組以上の本発明のプライマーペアと、このプライマーペアによる増幅産物に相補的な配列を含み、該増幅産物を検出するためのプローブを必須構成要素とし、必要に応じて遺伝子増幅及び増幅産物の確認に利用可能な分子量マーカー、酵素、dNTP、NTP、減菌水等を含んだものとして構成される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のプライマーを用いれば、恒温増幅法によるHCVサブタイプの検出及び遺伝子型判定が可能となる。したがって、本発明によれば、PCR法のような複雑な温度管理を必要とせず、簡便かつ迅速にHCVを検出し、遺伝子型判定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１．HCV恒温増幅用プライマー
発明者らは、各HCVサブタイプ：1a、1b、2a、2b、3a型について、そのコア領域内の特定領域（それぞれ配列番号40、41、42、43、及び44）に種々のプライマーを設定し、当該サブタイプを選択的に恒温増幅できるかどうかを検討した。
【００１８】
HCV1a型を例として、本発明のプライマー設計について説明する。図９はHCV1a型RNAの5’NTR〜コア領域の配列を示したものである。図９に示される配列中、318番目〜676番目の塩基で示される領域（配列番号40）がタイピングに適した領域である。この領域内に設定した種々のプライマーのうち、33及び34で示される部位をプライミングサイトとして設定されたプライマーが、HCV1a型の選択的恒温増幅に最適であることが確認された。このプライミングサイトに対応するプライマーは、具体的には配列番号1及び配列番号2で示される塩基配列を有する。
【００１９】
同様にして特定された、各サブタイプの選択的恒温増幅用プライマー配列を表１に示す。
【００２０】
【表１】
2005328745.tif 000002
【００２１】
表１に示されるように、HCV1a型RNAの増幅に際しては、配列番号1で示すオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、配列番号2で示すオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いることができる。HCV1b型RNAの増幅に際しては、配列番号3で示すオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、配列番号4もしくは9で示すオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いることができる。HCV2a型RNAの増幅に際しては、配列番号5で示すオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、配列番号6もしくは10で示すオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いることができる。HCV2b型RNAの増幅に際しては配列番号21で示すオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、配列番号22で示すオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いることができる。HCV3a型RNAの増幅に際しては、配列番号7で示すオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、配列番号8で示すオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いることができる。
【００２２】
しかしながら、前記配列に限定されず、そのプライマーがハイブリダイズする部位からプライマーの5’末端を数塩基、約1〜5塩基、選択性を考慮すると約1〜3塩基、5’側（プライマー配列からみて5’側、すなわちプライマーの伸長方向ではない方向）に伸ばしたり縮めたりして設定したプライマーも、同様にHCV1a型を恒温増幅できると考えられる。また、前記配列中の全ての配列を含まなくても、その3’末端側からの連続した少なくとも18塩基を含むプライマーであれば、同様にHCV1a型を選択的に恒温増幅できると考えられる。
【００２３】
本発明のプライマーは、前記配列番号に示される鋳型特異的（鋳型にハイブリダイズする）配列のほか、目的に応じてその5’側に適宜他の配列を有していてもよい。例えば、NASBA法（J. Compton: Nucleic acid sequence-based amplification. Nature, 1991, 350, p91-92）に用いられる場合、プライマーペアの少なくとも一方は5’側にT7プロモーター配列を有することになる。またプライマーは、放射性同位体、酵素、蛍光物質等の標識物質などによって適宜修飾されていてもよく、そのような修飾されたプライマーも本発明のプライマーに含まれる。
【００２４】
本発明のプライマーは、鋳型にハイブリダイズする部分の長さが18〜30塩基長であることが好ましい。この18〜30塩基長には鋳型にハイブリダイズしない部分の長さは含まれず、例えば、前述したNASBA法に用いられるプライマーのT7プロモーター配列部分はこの18〜30塩基長には含まれない。
【００２５】
本発明のプライマーは、本発明の目的の範囲内において、１又は数個の塩基置換（鋳型に対するミスマッチ）を含んでいてもよい。但し、塩基置換はプライマーの3’末端側に存在するとジェノタイピングの精度に影響するため、特にプライマーの5’末端側において許容される。
【００２６】
本発明のプライマーは、NASBA法のような恒温増幅法において利用可能なことを特徴とするが、恒温増幅以外の他のプライマー伸長増幅法、例えば、PCR法（R. K. Saiki, et al., Science, 239, 487-491 (1988)）、3SR法 (J.C. Guatelli, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87, 1874-1878 (1990))、TAS法 (D.Y. Kwoh, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86, 1173-1177 (1989))等にも利用できる。
【００２７】
２．HCVの検出方法（HCV遺伝子型判定）
本発明は、前記プライマーを用いた恒温増幅法によるHCVの検出方法（遺伝子型判定）を提供する。本発明のHCVの検出方法又は遺伝子型判定のフローを図1に示す。検体1からウイルスRNA2を抽出し、dNTP、NTP及び緩衝液からなる増幅試薬と、配列番号1、3、5、7、21で示すプライマーと配列番号2、4、6、8、9、10、22で示すプライマー混合液を混ぜ合わせたプライマー増幅試薬5を検体と混合し、増幅装置3により増幅し、検出装置4で検出する。検出は増幅産物を電気泳動で泳動する増幅断片長を比較する方法、又は増幅産物を蛍光標識されたプローブ等によってリアルタイムに検出する方法等を用いることが可能である。
【００２８】
本発明にかかる恒温増幅法としては、前述したNASBA法のほか、LAMP法（T. Notomi et al.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA.， Nucleic Acids Res., Vol.28, No.12: e63, (2000)）、ICAN法(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids:特許3433929号)等を挙げることができる。
【００２９】
本発明のHCV検出方法は、2種以上のHCVサブタイプに対する恒温増幅用プライマーを用いることにより、2種以上のHCVサブタイプを同時検出することも可能である。
【００３０】
３．HCV検出用（HCV遺伝子型判定）キット
本発明は、前記HCV検出（遺伝子型判定）のためのキットを提供する。前記キットは、本発明のプライマーペアの全部又は一部と、該プライマーペアによって増幅される各HCVサブタイプ特異的増幅産物の検出用プローブを必要構成要素とする。
【００３１】
前記HCVサブタイプ特異的増幅産物の検出用プローブは、本発明のプライマーによって特異的増幅されるHCV遺伝子断片上の約18〜30塩基長の配列に相補的な配列を含み、放射性同位体、酵素、蛍光物質等によって適宜標識される。そのようなプローブの一例として、配列番号19、20に示される塩基配列を有するプローブを挙げることができる。前記プローブは、モレキュラービーコンプローブとして用いる場合、その一端を例えばFAM、ROX等の蛍光体により、他の一端を例えばBHQ1、BHQ2等の消光体により標識される。
【００３２】
本発明のHCV検出用（遺伝子型判定）キットは、前記プライマーとプローブのほか、必要に応じて遺伝子増幅及び増幅産物の確認に利用可能な分子量マーカー、酵素、dNTP、NTP、減菌水等を含んだものとして構成される。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：NASBA法によるHCV遺伝子のサブタイプ1a型判別可能なプライマーの検討
HCV遺伝子のサブタイプ1a型のコア領域のタイピング可能な特異性の高い領域に、表２に示される配列番号1、24、25、26、27、28、29、30、31、32で示すオリゴヌクレオチドプライマーをセンスプライマー、T7のプロモーター配列を含む配列（AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG：配列番号45）を5'側に含む配列番号11、33、34、35、36、37、38、39で示すオリゴヌクレオチドプライマーをアンチセンスプライマーとして設計し、それぞれ組み合わせて遺伝子型選択的に恒温増幅するのに最も適したオリゴヌクレオチドプライマーペアをNASBA法により検討した。
【００３４】
【表２】
2005328745.tif 000003
【００３５】
図2にNASBA法による増幅フローを示す。NASBA法は、市販のキット（例えば、「NUCLISENSTM Basic Kit」（BioMerieux）等）を利用することにより好適に実施できる。反応に用いる反応液6はHCV遺伝子のサブタイプ1a型検体、プライマー、試薬等の反応液を含んでいる。反応液6はNASBA法により反応させた。65℃ 5分の過程と41℃ 5分の過程を経て、その後酵素9を添加し、41℃ 90分間恒温増幅装置7で反応を行なった。得られた反応生成物を検出装置8で検出した。ここでは検出装置8としてSV1210 コスモアイ（日立ハイテクノロジーズ）により電気泳動し増幅の有無、位置を確認した。
【００３６】
図7に配列番号1をセンスプライマー、配列番号11、33、34、35、36、37、38、39をアンチセンスプライマーとして用いた増幅反応によって得られた反応産物の電気泳動結果を示す。配列番号1及び11で示すオリゴヌクレオチドプライマーを反応に用いることによって、増幅長217 bpの増幅産物が生じるように設計されている。同様に配列番号1及び33、1及び34、1及び35、1及び36、1及び37、1及び38、1及び39で示すオリゴヌクレオチドプライマーによってそれぞれ増幅長84 bp、116 bp、217 bp、64 bp、200 bp、194 bp、224 bpの増幅産物を生じるように設計されている。
【００３７】
レーン1には配列番号１及び33で示すオリゴヌクレオチドプライマーによる反応産物を電気泳動した。同様に、レーン2、3、4、5、6、7、8にはそれぞれ配列番号1及び34、1及び35、1及び11、1及び36、1及び37、1及び38、1及び39で示すオリゴヌクレオチドプライマーによる反応産物を電気泳動した。
【００３８】
レーン1には増幅産物21が塩基長317 bpの位置に、また増幅産物22が塩基長78 bpの位置に検出された。つまり、84 bpに近い78 bpの以外にも非特異的な増幅産物が検出された。レーン2には増幅産物23が塩基長116 bpの位置に検出された。レーン3には増幅産物24が塩基長217 bpの位置に検出された。レーン4には増幅産物25が塩基長217 bpの位置に検出された。レーン5には増幅産物26が塩基長64 bpの位置に検出された。レーン6には増幅産物27が塩基長51 bpの位置に検出された。つまり設計した塩基長200 bpの位置には増幅産物は検出されなかった。レーン7には増幅産物28が塩基長167 bpの位置に、また増幅産物29が塩基長210 bpの位置に検出された。つまり、設計した塩基長194 bpの位置には増幅産物は検出されず、非特異的な増幅産物が検出された。レーン8には増幅産物30が塩基長224 bpの位置に検出された。
【００３９】
以上より、配列番号1及び33、1及び37、1及び38で示すオリゴヌクレオチドプライマーペアを用いると、レーン1、6、7で示すように非特異的な増幅産物が確認されたのに対し、配列番号１及び34、1及び35、1及び36、1及び39、1及び11で示すオリゴヌクレオチドプライマーペア用いると、レーン2、3、4、5、8で示すようにHCVのサブタイプ1a型の検体から特異的な増幅産物が生じることが確認できた。
【００４０】
次に、上記で得られた配列番号1及び34、1及び35、1及び36、1及び39、1及び11で示すオリゴヌクレオチドプライマーペアを用いて、HCVのサブタイプ1b型の検体を用いてNASBA法により増幅産物を検討した。オリゴヌクレオチドプライマーはいずれもHCVのサブタイプ1a型ジェノタイピング用であるため、それ以外のサブタイプでは増幅されないように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーであるが、設計通りにHCVのサブタイプ1a型のみに特異的な増幅が起こるかを調べた。
【００４１】
図8に、配列番号1をセンスプライマー、配列番号11、39をアンチセンスプライマーとして用いたサブタイプ1b型検体の増幅反応産物の電気泳動結果を示す。レーン1には配列番号１及び11で示すオリゴヌクレオチドプライマーによる反応産物を電気泳動した。同様に、レーン2に配列番号1及び39で示すオリゴヌクレオチドプライマーによるサブタイプ1b型検体の増幅反応産物を電気泳動した。
【００４２】
レーン1には増幅産物31が塩基長100 bpの位置に検出された。つまり検体がHCVサブタイプ1b型の場合は設計した塩基長217 bpの位置には増幅産物は検出されず、HCVサブタイプ1a型に特異的な増幅であることがわかった。レーン2には増幅産物32が塩基長219 bpの位置に検出された。これは検体がHCVサブタイプ1a型である場合の増幅塩基長224 bpと5 bpの違いしかなく、増幅産物の塩基長で遺伝子型判定を行うことは困難であると考えられた。一方、配列番号1及び11で示すオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅産物の塩基長から遺伝子がHCVサブタイプ1a型かHCVサブタイプ1b型かの判定が可能であった。
【００４３】
同様に、検体が他のHCVサブタイプの場合についても、NASBA法で推定される塩基長の増幅産物が検出されるかどうかを調べ、配列番号1及び11で示すオリゴヌクレオチドプライマーはHCVサブタイプ1a型に対して特異的増幅が起こることを確認した。表３に全ての結果を纏めて示す。
【００４４】
【表３】
2005328745.tif 000004
【００４５】
表３の結果より、配列番号1及び11に示されるオリゴヌクレオチドプライマーがHCV1a型の遺伝子型判定に適していることが確認された。この配列番号1に示されるセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に-2〜＋5塩基程度伸ばしたり縮めたりして設計してもHCV1a型の恒温増幅は可能であり、さらに5’側に-2〜0塩基以内であればHCV1a型ジェノタイピングも可能であると考えられた。また、配列番号11に示されるアンチセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に0〜＋12塩基程度伸ばしたり縮めたりしてもHCV1a型の恒温増幅は可能であり、さらに5’側に0〜＋5塩基以内であればHCV1a型ジェノタイピングも可能であると考えられた。
【００４６】
実施例２：NASBA法によるHCV遺伝子のサブタイプ1b、2a、2b、3a型判別可能なプライマーの検討
実施例１と同様にして、HCV遺伝子のサブタイプ1b、2a、2b、3a型についても、遺伝子型選択的恒温増幅に最も適したオリゴヌクレオチドプライマーペアをNASBA法により検討した。
【００４７】
（１）HCV遺伝子のサブタイプ1b
HCV遺伝子のサブタイプ1b型のコア領域のタイピング可能な特異性の高い領域、（配列番号41：HCV1b型コア領域の1〜325bpに該当）の配列に基づき、表４に示されるような各種プライマーを設計した。このプライマーを組み合わせて、HCV遺伝子のサブタイプ1b型検体を鋳型に実施例１と同様の条件でNASBA法による恒温増幅を行い、電気泳動により増幅の有無、位置を確認した。さらに、増幅が確認されたプライマーペアについて、他のHCVサブタイプの検体を用いてNASBA法による増幅の有無、位置を検討し、HCV1bのジェノタイピングが可能かどうかを検討した。プライマー設定領域及び結果を表４に纏めて示す。
【００４８】
【表４】
2005328745.tif 000005
【００４９】
表４の結果より、配列番号3、4、及び9に示されるオリゴヌクレオチドプライマーがHCV1b型の遺伝子型判定に適していることが確認された。この配列番号3に示されるセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に-2〜＋5塩基程度伸ばしたり縮めたりして設計してもHCV1b型の恒温増幅は可能であり、さらに5’側に-2〜0塩基以内であればHCV1b型ジェノタイピングも可能であると考えられた。また、配列番号4又は9に示されるアンチセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に0〜＋10塩基程度伸ばしたり縮めたりしてもHCV1b型の恒温増幅は可能であり、さらに5’側に0〜＋6塩基以内であればHCV1b型ジェノタイピングも可能であると考えられた。
【００５０】
（２）HCV遺伝子のサブタイプ2a
HCV遺伝子のサブタイプ2a型のコア領域のタイピング可能な特異性の高い領域、（配列番号42：HCV2a型コア領域の21〜295bpに該当）の配列に基づき、表５に示されるような各種プライマーを設計した。このプライマーを組み合わせて、HCV遺伝子のサブタイプ2a型検体を鋳型に実施例１と同様の条件でNASBA法による恒温増幅を行い、電気泳動により増幅の有無、位置を確認した。さらに、増幅が確認されたプライマーペアについて、他のHCVサブタイプの検体を用いてNASBA法による増幅の有無、位置を検討し、HCV2aのジェノタイピングが可能かどうかを検討した。プライマー設定領域及び結果を表５に纏めて示す。
【００５１】
【表５】
2005328745.tif 000006
【００５２】
表５の結果より、配列番号5、6、及び10に示されるオリゴヌクレオチドプライマーがHCV2a型の遺伝子型判定に適していることが確認された。この配列番号5に示されるセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に-4〜＋3塩基程度伸ばしたり縮めたりして設計してもHCV2a型の恒温増幅やジェノタイピングが可能である。また、配列番号6又は10に示されるアンチセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に-4〜＋8塩基程度伸ばしたり縮めたりしてもHCV2a型の恒温増幅は可能であり、さらに5’側に-4〜＋1塩基以内であればHCV2a型ジェノタイピングも可能であると考えられた。
【００５３】
（３）HCV遺伝子のサブタイプ2b
HCV遺伝子のサブタイプ2b型のコア領域のタイピング可能な特異性の高い領域、（配列番号43：HCV2b型コア領域の1〜305bpに該当）の配列に基づき、表６に示されるような各種プライマーを設計した。このプライマーを組み合わせて、HCV遺伝子のサブタイプ2b型検体を鋳型に実施例１と同様の条件でNASBA法による恒温増幅を行い、電気泳動により増幅の有無、位置を確認した。さらに、増幅が確認されたプライマーペアについて、他のHCVサブタイプの検体を用いてNASBA法による増幅の有無、位置を検討し、HCV2bのジェノタイピングが可能かどうかを検討した。プライマー設定領域及び結果を表６に纏めて示す。
【００５４】
【表６】
2005328745.tif 000007
【００５５】
表６の結果より、配列番号21及び22に示されるオリゴヌクレオチドプライマーがHCV2b型の遺伝子型判定に適していることが確認された。この配列番号21に示されるセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に-2〜＋17塩基程度伸ばしたり縮めたりして設計してもHCV2b型の恒温増幅が可能であり、さらに5’側に-2〜0塩基以内であればHCV2b型ジェノタイピングも可能であると考えられた。また、配列番号22に示されるアンチセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に-5〜0塩基程度伸ばしたり縮めたりしてもHCV2b型の恒温増幅は可能であり、さらに5’側に-5〜0塩基以内であればHCV2b型ジェノタイピングも可能であると考えられた。
【００５６】
（４）HCV遺伝子のサブタイプ3a
HCV遺伝子のサブタイプ3a型のコア領域のタイピング可能な特異性の高い領域、（配列番号43：HCV3a型コア領域の1〜366bpに該当）の配列に基づき、表７に示されるような各種プライマーを設計した。このプライマーを組み合わせて、HCV遺伝子のサブタイプ3a型検体を鋳型に実施例１と同様の条件でNASBA法による恒温増幅を行い、電気泳動により増幅の有無、位置を確認した。さらに、増幅が確認されたプライマーペアについて、他のHCVサブタイプの検体を用いてNASBA法による増幅の有無、位置を検討し、HCV3aのジェノタイピングが可能かどうかを検討した。プライマー設定領域及び結果を表７に纏めて示す。
【００５７】
【表７】
2005328745.tif 000008
【００５８】
表７の結果より、配列番号7及び8に示すオリゴヌクレオチドプライマーがHCV3a型の遺伝子型判定に適していることが確認された。この配列番号7に示されるセンスプライマーは、プライミング領域を5’側に-2〜＋5塩基程度伸ばしたり縮めたりして設計してもHCV3a型の恒温増幅が可能であり、さらに-2〜0塩基以内であればジェノタイピングも可能であると考えられた。一方、配列番号8に示されるアンチセンスプライマーは5’側に-5〜0塩基程度伸ばしたり縮めたりして設計してもHCV3a型の恒温増幅やジェノタイピングが可能と考えられた。
【００５９】
実施例３：NASBA法によるHCV遺伝子のサブタイプ1a、1b、2a、2b、3a型の遺伝子型判定
配列番号1、3、5、7で示すオリゴヌクレオチドプライマーをセンスプライマーとして使用し、T7のプロモーター配列を含む配列を配列番号2、4、6、8で示すオリゴヌクレオチドプライマーの5'側に付加した配列番号11、12、13、14で示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用してHCV遺伝子型判定を行った。HCV遺伝子型判定は、実施例１に従い、NASBA法による恒温増幅と電気泳動により行った。
【００６０】
HCV1a型RNAは、配列番号1及び2で示すオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅長217bpの増幅産物を生じるように設計されている。同様にHCV1b型RNAは、配列番号3、4で示すオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅長209bpの増幅産物を生じるように設計されている。HCV2a型RNAは、配列番号5、6で示すオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅長234bpの増幅産物を生じるように設計されている。HCV3a型RNAは、配列番号7、8で示すオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅長229bpの増幅産物を生じるように設計されている。
【００６１】
図3に電気泳動結果を示す。レーン1の増幅産物10はHCV1a型RNAを検体として増幅したもので、塩基長217bpの位置に検出された。レーン2の増幅産物11はHCV1b型RNAを検体として増幅したもので塩基長304bpの位置に検出された。レーン3の増幅産物12はHCV2a型RNAを検体として増幅したもので塩基長234bpの位置に検出された。レーン4の増幅産物13はHCV3a型RNAを検体として増幅したもので塩基長が229bpの位置に検出された。つまり、遺伝子型特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーによって、HCVのサブタイプ1a、1b、2a、3a型の検体から217bp、304bp、234bp、229bpとそれぞれ異なる増幅長の増幅産物が生じる。
【００６２】
以上の結果、配列番号1及び2で示すオリゴヌクレオチドプライマーにより、HCV1a型RNAを恒温増幅して得られた増幅産物が、推定される増幅遺伝子の長さに位置していることが確認できた。他のHCV遺伝子のサブタイプ1b、2a、3a型を検体として用いた場合でも、生じた増幅産物それぞれが選定したプライマーより推定される増幅遺伝子の長さに位置していることが確認できた。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーによって遺伝子型判定が可能であることが確認された。
【００６３】
実施例４：NASBA法、モレキュラービーコンによるHCV遺伝子のサブタイプ1b型、2a型のリアルタイム検出
日本で感染例の多いHCV遺伝子のサブタイプ1b型、2a型の遺伝子型判定をリアルタイム検出装置にて行った。リアルタイム検出による選択的な検出が行なえるように配列番号9、10で示すオリゴヌクレオチドプライマーの5'側にタグ配列を付加した配列番号15、16で示すオリゴヌクレオチドプライマーをアンチセンスプライマーとしてもちいた。また、T7のプロモーター配列を配列番号3、5で示すオリゴヌクレオチドプライマーの5'側に付加した配列番号17、18で示すオリゴヌクレオチドプライマーをセンスプライマーとして使用した。
【００６４】
リアルタイム検出に使用するプローブとしては、モレキュラービーコンプローブ（Molecular Beacon probe）（S. Tyagi, et al., Nature Biotechnol, 14, 303-308(1996)）を用いた。モレキュラービーコンプローブはタグ配列を識別できるように、同様のタグ配列と配列番号19、20で示される塩基配列を有するものとして設計した。配列番号19に示されるモレキュラービーコンには蛍光体としてFAM、消光体としてBHQ1を修飾したものを、配列番号20に示されるモレキュラービーコンには蛍光体としてROX、消光体としてBHQ2を修飾したものを用いて行なった。
【００６５】
HCVの増幅は、実施例１に従い、NUCLISENSTM Basic Kit（bioMerieux）を使用してNASBA法により行った。
【００６６】
図4にHCV遺伝子のリアルタイム検出フローを示す。検体/プライマー/試薬等を含む反応液14に酵素16を加え、恒温増幅/検出装置15により増幅し、増幅産物をリアルタイムに検出した。恒温増幅/検出装置15にはMx3000p（stratagene）を用いた。結果を図5に示す。図5 (a)は検体にHCV1b型遺伝子RNAを用いて増幅した例17で、図5 (b)は検体にHCV2a型遺伝子RNAを用いて増幅した例18である。縦軸は蛍光強度、横軸は時間を示し、実線はHCV1b型増幅産物を認識するFAM、破線はHCV2a型増幅産物を認識するROXの蛍光強度をそれぞれ示す。図5(a)では、FAMの蛍光強度のみが時間と共に増加しており、検体がHCV1b型と判定できた。一方、図5(b)ではROXの蛍光強度のみが時間と共に増加しており、検体がHCV2a型と判定できた。これらの結果より、他のプライマーの増幅への干渉は認められず、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーが正確性の上からも十分に使用可能であった。また、蛍光の種類によって容易に遺伝子型判定でき、蛍光強度の立ち上がり時間を測定することによって定量的検出も可能であることが確認できた。
【００６７】
実施例５：NASBA法によるHCVサブタイプ1b型、2b型の複数同時検出
配列番号3、21で示すオリゴヌクレオチドプライマーをセンスプライマーとして、またT7のプロモーター配列を配列番号4、22で示すオリゴヌクレオチドプライマーの5'側に付加した配列番号12、23で示すオリゴヌクレオチドプライマーをアンチセンスプライマーとしてHCV遺伝子型判定を行った。
【００６８】
図6に電気泳動結果を示す。HCV1b型RNAは、配列番号3及び12で示すオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅長209 bpの増幅産物を生じるように設計されている。HCV2b型RNAは、配列番号21及び23で示すオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅長214 bpの増幅産物を生じるように設計されている。
【００６９】
レーン1及び2に配列番号3及び12で示すオリゴヌクレオチドプライマーにより反応を行なった結果を示す。レーン3及び4は配列番号21及び23で示すオリゴヌクレオチドプライマーにより反応を行なった結果を示す。レーン1の増幅産物19はHCV1b型RNAを検体として増幅されたもので、塩基長が209 bpの位置に検出された。一方、レーン2ではHCV2b型RNAを検体として反応を行なったが増幅産物が生じなかった。レーン4の増幅産物20はHCV2b型RNAを検体として増幅されたもので、塩基長が214 bpの位置に検出された。一方、レーン3ではHCV1b型RNAを検体として反応を行なったが増幅産物が生じなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは対応する検体の遺伝型と反応させたときのみ、推定される増幅遺伝子の長さに増幅産物が生じることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーはC型肝炎ウイルスの検出及び遺伝子型判定に利用できる。したがって、本発明はHCVの遺伝子型別の病態研究・治療効果推測・判定など、HCVの研究に広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図1は、HCV遺伝子型判定フローを示す。
【図２】図2は、NASBA法による増幅フローを示す。
【図３】図3は、本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた各遺伝子型の遺伝子型判定結果を表す電気泳動像を示す。
【図４】図4は、HCV遺伝子のリアルタイム検出フローを示す。
【図５】図5は、本発明によりオリゴヌクレオチドプライマーを用い、遺伝子型判定をリアルタイムに検出した結果を示す。（a）は検体にHCV1b型RNAを（b）は検体にHCV2a型RNAを用いて反応を行なった結果を示す。
【図６】図6は、本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーを用いたHCVのサブタイプ1b、2b型の遺伝子型判定結果を表す電気泳動像を示す。
【図７】図7は、本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーを用いたHCV1a型検体増幅結果を表す電気泳動像を示す。
【図８】図8は、配列番号1及び11に示されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いたHCV1b型検体増幅結果を表す電気泳動像を示す。
【図９】図9は、HCV1a型選択的恒温増幅プライマー設定の概略を示す。
【符号の説明】
【００７２】
1…検体
2…ウイルスRNA
3…増幅装置
4…検出装置
5…プライマー増幅試薬
6…検体/プライマー/試薬反応液を含む混合液
7…恒温増幅装置
8…検出装置
9…酵素
10…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
11…検体HCV1b型を用いた反応での増幅産物
12…検体HCV2a型を用いた反応での増幅産物
13…検体HCV3a型を用いた反応での増幅産物
14…検体/プライマー/試薬反応液等を含んでいる反応液
15…恒温増幅/検出装置
16…酵素
17…検体HCV1b型を用いた反応でのリアルタイム検出結果
18…検体HCV2a型を用いた反応でのリアルタイム検出結果
19…検体HCV1b型を用い、プライマー配列番号3及び12に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いた反応による増幅産物
20…検体HCV2b型を用い、プライマー配列番号21及び23に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いた反応による増幅産物
21…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
22…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
23…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
24…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
25…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
26…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
27…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
28…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
29…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
30…検体HCV1a型を用いた反応での増幅産物
31…検体HCV1b型を用いた反応での増幅産物
32…検体HCV1b型を用いた反応での増幅産物
33…HCV1a型選択的恒温増幅プライマー（センス）設定部位
34…HCV1a型選択的恒温増幅プライマー（アンチセンス）設定部位
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
配列番号1−人工配列の説明：HCV1a型を増幅するセンスプライマー
配列番号2−人工配列の説明：HCV1a型を増幅するアンチセンスプライマー
配列番号3−人工配列の説明：HCV1b型を増幅するセンスプライマー
配列番号4−人工配列の説明：HCV1b型を増幅するアンチセンスプライマー
配列番号5−人工配列の説明：HCV2a型を増幅するセンスプライマー
配列番号6−人工配列の説明：HCV2a型を増幅するアンチセンスプライマー
配列番号7−人工配列の説明：HCV3a型を増幅するセンスプライマー
配列番号8−人工配列の説明：HCV3a型を増幅するアンチセンスプライマー
配列番号9−人工配列の説明：HCV1b型を増幅するアンチセンスプライマー
配列番号10−人工配列の説明：HCV2a型を増幅するアンチセンスプライマー
配列番号11−人工配列の説明：HCV1a型を増幅するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号12−人工配列の説明：HCV1b型を増幅するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号13−人工配列の説明：HCV2a型を増幅するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号14−人工配列の説明：HCV3a型を増幅するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号15−人工配列の説明：HCV1b型を増幅するタグ配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号16−人工配列の説明：HCV2a型を増幅するタグ配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号17−人工配列の説明：HCV1b型を増幅するT7プロモーター配列を有するセンスプライマー
配列番号18−人工配列の説明：HCV2a型を増幅するT7プロモーター配列を有するセンスプライマー
配列番号19−人工配列の説明：タグ配列を有するモレキュラービーコン配列
配列番号20−人工配列の説明：タグ配列を有するモレキュラービーコン配列
配列番号21−人工配列の説明：HCV2b型を増幅するセンスプライマー
配列番号22−人工配列の説明：HCV2b型を増幅するアンチセンスプライマー
配列番号23−人工配列の説明：HCV2b型を増幅するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー 
配列番号24−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号25−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号26−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号27−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号28−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号29−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号30−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号31−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号32−人工配列の説明：HCV1a型配列を有するセンスプライマー
配列番号33−人工配列の説明：HCV1a型を有するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号34−人工配列の説明：HCV1a型を有するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号35−人工配列の説明：HCV1a型を有するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号36−人工配列の説明：HCV1a型を有するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号37−人工配列の説明：HCV1a型を有するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号38−人工配列の説明：HCV1a型を有するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号39−人工配列の説明：HCV1a型を有するT7プロモーター配列を有するアンチセンスプライマー
配列番号40−HCV1a型特異的コア領域
配列番号41−HCV1b型特異的コア領域
配列番号42−HCV2a型特異的コア領域
配列番号43−HCV2b型特異的コア領域
配列番号44−HCV3a型特異的コア領域
配列番号45−人工配列の説明：T7プロモーター配列を含む配列
【図１】
2005328745.tif 000009
【図２】
2005328745.tif 000010
【図３】
2005328745.tif 000011
【図４】
2005328745.tif 000012
【図５】
2005328745.tif 000013
【図６】
2005328745.tif 000014
【図７】
2005328745.tif 000015
【図８】
2005328745.tif 000016
【図９】
2005328745.tif 000017
【配列表】
2005328745000001.app