(57)【要約】【課題】  患者の血清または血漿に存在するＥＢＶ  ＤＮＡを検出または測定し、その後にＥＢＶ多型サブタイピングを行うことによって、患者におけるエプスタインバーウイルスに関連する癌を診断、検出、モニター、および予後判定する方法ならびに診断キットを提供する。【解決手段】  血中にエプスタインバーウイルスＤＮＡを有する患者について、エプスタインバーウイルスに関連する癌の予後および診断についての見込みを決定する方法は、（ａ）血清または血漿試料を用いて本明細書に記載のＥＢＶ  ＤＮＡを有する前記患者を一次スクリーニングすること、次いで、（ｂ）血漿または血清中の多型に従ってＥＢＶサブタイプを決定することで前記見込みを確かめること、と規定されるステップ（ａ）および（ｂ）のうち、（ａ）と（ｂ）とを組み合わせて、または（ｂ）を単独で実施する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血中にエプスタインバーウイルスＤＮＡを有する患者について、エプスタインバーウイルスに関連する癌の予後および診断についての見込みを決定する方法であって、
（ａ）血清または血漿試料を用いて本明細書に記載のＥＢＶ  ＤＮＡを有する前記患者を一次スクリーニングすること、次いで、
（ｂ）血漿または血清中の多型に従ってＥＢＶサブタイプを決定することで前記見込みを確かめること、
と規定されるステップ（ａ）および（ｂ）のうち、（ａ）と（ｂ）とを組み合わせて、または（ｂ）を単独で実施することにより見込みを決定する方法。
【請求項２】
患者が、エプスタインバーウイルスに関連する癌を有すると診断され、癌細胞がＥＢＶの核酸を含まないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者が、エプスタインバーウイルスに関連する癌を有すると診断され、癌細胞がＥＢＶの核酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＥＢＶ  ＤＮＡスクリーニングが血漿または血清を用いて行われるのに対して、ＥＢＶ多型サブタイピングがリンパ球を含む白血球で行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＥＢＶ  ＤＮＡスクリーニングが血漿または血清を用いて行われるのに対して、ＥＢＶ多型サブタイピングが他の体組織またはウイルスが存在すると疑われる組織で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＥＢＶ多型サブタイピングが一塩基変異以外のＤＮＡレベルの他の変化（挿入または欠失（ｉｎｄｅｌ）および縦列反復配列数の変化（ＶＮＴＲ）などがあるが、これらに限定されない）により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
一塩基変異が「材料および方法」で述べられたものとは異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＢＶ多型サブタイピングを検出する方法が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイ、ＳＳＣＰに限定されず、任意の方法（ＰＣＲ−制限断片長多型分析、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイジェノタイピング、ミニシークエンシング、蛍光共鳴エネルギー転移検出、インベーダーアッセイ、および対立遺伝子特異的ライゲーションなどがあるが、これらに限定されない）でよい、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
患者におけるエプスタインバーウイルスに関連する癌を診断、検出、モニター、および予後判定する方法であって、患者の血清または血漿に存在するＥＢＶ  ＤＮＡを検出し、次いでＥＢＶサブタイプを検出するステップを含んでなる方法。
【請求項１０】
（１）患者から血液試料を得るステップ；
（２）血液試料から液体画分を得るステップ；
（３）液体画分からＤＮＡを抽出するステップ；および
（４）液体画分に存在する循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を測定するステップ
を含んでなる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（５）液体画分に存在する循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を対照と比較するステップ；
（６）ＥＢＶサブタイプ決定後に、ＥＢＶサブタイプを、概ね悪性または良性のいずれ
かに特定されているＥＢＶサブタイプと比較するステップ
をさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
血液中のエプスタインバーウイルスＤＮＡが増加した患者について、エプスタインバーウイルスに関連する癌の予後および診断についての見込みの増大を決定するキットであって、
（ａ）罹患している患者の血液中のエプスタインバーウイルスを検出するための核酸、
（ｂ）エプスタインバーウイルスが存在するか、または存在しないかを決定するために核酸を使用する説明書、およびＥＢＶサブタイピングにより確かめられた場合のエプスタインバーウイルスに関連する癌に罹患している患者について見込みの増大を説明するための説明書、
（ｃ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびＰＣＲプライマーであって、２種類のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは多型部位で異なり、一方は良性対立遺伝子に相補的であり、他方は悪性対立遺伝子に相補的であるとともに、様々な悪性サブタイプおよび良性サブタイプの数によってＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ対の数が決定されることを特徴とするプローブおよびＰＣＲプライマー
を含んでなるキット。
【請求項１３】
患者から血液試料を得るデバイスを含む、請求項１２に記載の診断キット。
【請求項１４】
血液試料または他の標本からＥＢＶ  ＤＮＡを分離する手段を含む、請求項１２に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０１］本発明は、エプスタインバーウイルスを患者血液の無細胞液体中に発見することができ、このようなウイルスが発見された時、患者がエプスタインバーウイルスに関連する癌に罹患している可能性があるという発見に関する。癌になりやすいＥＢＶサブタイプを検出する新たな方法を用いると、このような癌の予測および診断が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
［０２］様々な腫瘍の癌細胞が腫瘍由来ＤＮＡを放出できることが知られている（非特許文献１を参照）。例として、膵臓癌に由来する癌遺伝子変異（アンカー（Ａｎｋｅｒ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１２：１１１４−２０（１９９７）を参照）、肺癌のマイクロサテライト変化（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１１３３−５（１９９６）を参照）、および肝臓癌に由来するエピジェネティック変化（非特許文献２を参照）が挙げられる。さらに、ウイルスＤＮＡは、ウイルス感染に関連することが知られている多くの癌の循環中に見出されている。例として、鼻咽頭癌（ムチラングラ（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：６６５−９（１９９８）、非特許文献３を参照）およびある特定のリンパ腫（非特許文献４、非特許文献５、ガラガー（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ）ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８４：４４２−８（１９９９）を参照）に由来するエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＤＮＡ、ならびに頭部癌および頸部癌に由来するヒトパピローマウイルスＤＮＡ（非特許文献６を参照）が挙げられる。
【０００３】
［０３］最近、癌患者の血漿および血清中に腫瘍由来ＤＮＡが存在することに大いに関心が集まっている（チェン（Ｃｈｅｎ），Ｘ．Ｑ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：１０３３−１０３５（１９９６）、ナウロズ（Ｎａｗｒｏｚ），Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：１０３５−１０３７（１９９６）を参照）。ウイルスに関連する癌については、無細胞の腫瘍関連ウイルスＤＮＡが患者の血漿および血清中に検出されている（ムチラングラ（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ），Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：６６５−９（１９９８）、非特許文献３、非特許文献６を参照）。多くのタイプの悪性腫瘍に関連している重要なウイルスの１つがエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）である（コーエン（Ｃｏｈｅｎ），Ｊ．Ｉ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４３：４８１−４９２（２０００）を参照）。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒト集団の大多数に感染するヒトヘルペスウイルスである。ＥＢＶは、通常、唾液により伝播し、Ｂリンパ球内で潜在性感染を確立し、ここで宿主生存中に生き続ける。この点に関して、循環ＥＢＶ  ＤＮＡが、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）患者（ムチラングラ（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ），Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：６６５−９（１９９８）、非特許文献３を参照）およびある特定のリンパ悪性腫瘍患者（非特許文献４、非特許文献５、ガラガー（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ）ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８４：４４２−８（１９９９）を参照）の血漿および血清中に検出されている。
【０００４】
［０４］ＥＢＶ感染はまた、一部の胃癌と関連することが報告されている（非特許文献７を参照）。香港では、胃癌症例の約１０％がＥＢＶ感染に関連することが分かっている（イェン（Ｙｕｅｎ），Ｓ．Ｔ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．，１８：１１５８−１１６３（１９９４）を参照）。
【０００５】
［０５］本発明は、患者血清中のＥＢＶ  ＤＮＡを検出する方法を提供する。本方法に
よりＥＢＶ  ＤＮＡが発見され、癌が臨床的に発見されなかった場合、もう１つのステップがとられ、これにより、一塩基多型を有する様々なＥＢＶサブタイプが確かめられる。良性サブタイプを有する患者は、ＥＢＶに関連する癌を発症する可能性は低い。しかしながら、ＥＢＶ癌サブタイプを有する患者は、このような癌を後で発症しやすい。
【非特許文献１】アンカー（Ａｎｋｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．第１８巻、ｐ．６５−７３（１９９９）
【非特許文献２】ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５９巻、ｐ．７１−３（１９９９）
【非特許文献３】ロー（Ｌｏ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５９巻、ｐ．１１８８−９１（１９９９）
【非特許文献４】レイ（Ｌｅｉ）ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、ｐ．２３９−４６（２０００）
【非特許文献５】ドロウエト（Ｄｒｏｕｅｔ）ら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、ｐ．３８３−９（１９９９）
【非特許文献６】カポネ（Ｃａｐｏｎｅ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６巻、ｐ．４１７１−５（２０００）
【非特許文献７】シバタ（Ｓｈｉｂａｔａ），Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，第１４０巻、ｐ．７６９−７７４（１９９２）
【非特許文献８】ロー（Ｌｏ），Ｙ．Ｍ．Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，第５９巻、ｐ．５４５２−５４５５（１９９９）
【非特許文献９】ロー（Ｌｏ），Ｙ．Ｍ．Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，第６０巻、ｐ．６８７８−６８８１（２０００）
【非特許文献１０】ボネト（Ｂｏｎｎｅｔ）ら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．第９１巻、ｐ．１３７６−８１（１９９９）
【非特許文献１１】スガワラ（Ｓｕｇａｗａｒａ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．第２５６巻、ｐ．１９６−２０２（１９９９）
【非特許文献１２】チェン（Ｃｈｉｅｎ）ＹＣ，「台湾人男性におけるＥＢＶ感染の血清マーカーおよび鼻咽頭癌（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ＥＢＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎｅｓｅ  ｍｅｎ）」，Ｎ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ，第３４５巻、第２６号、ｐ．１８７７−８２、２００１年１２月２７日
【非特許文献１３】グチエレズ（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ），「腫瘍に関連するＥＢＶおよび腫瘍に関連しないＥＢＶにおけるＢＺＬＦ１プロモーターの異なる変化（Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＢＺＬＦ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｎｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＥＢＶ），Ｊ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ」，第９４巻、第２３号、２００２年１２月４日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、患者の血清または血漿に存在するＥＢＶ  ＤＮＡを検出または測定し、その後にＥＢＶ多型サブタイピングを行うことによって、患者におけるエプスタインバーウイルスに関連する癌を診断、検出、モニター、および予後判定する方法ならびに診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載の発明は、血中にエプスタインバーウイルスＤＮＡを有する患者について、エプスタインバーウイルスに関連する癌の予後および診断についての見込みを決定する方法であって、（ａ）血清または血漿試料を用いて本明細書に記載のＥＢＶ  ＤＮＡを有する前記患者を一次スクリーニングすること、次いで、（ｂ）血漿または血清中の多型
に従ってＥＢＶサブタイプを決定することで前記見込みを確かめること、と規定されるステップ（ａ）および（ｂ）のうち、（ａ）と（ｂ）とを組み合わせて、または（ｂ）を単独で実施することにより見込みを決定することを要旨とする。
【０００８】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、患者が、エプスタインバーウイルスに関連する癌を有すると診断され、癌細胞がＥＢＶの核酸を含まないことを要旨とする。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、患者が、エプスタインバーウイルスに関連する癌を有すると診断され、癌細胞がＥＢＶの核酸を含むことを要旨とする。
【００１０】
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ＥＢＶ  ＤＮＡスクリーニングが血漿または血清を用いて行われるのに対して、ＥＢＶ多型サブタイピングがリンパ球を含む白血球で行われることを要旨とする。
【００１１】
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ＥＢＶ  ＤＮＡスクリーニングが血漿または血清を用いて行われるのに対して、ＥＢＶ多型サブタイピングが他の体組織またはウイルスが存在すると疑われる組織で行われることを要旨とする。
【００１２】
請求項６に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ＥＢＶ多型サブタイピングが一塩基変異以外のＤＮＡレベルの他の変化（挿入または欠失および縦列反復配列数の変化などがあるが、これらに限定されない）により行われることを要旨とする。
【００１３】
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の方法において、一塩基変異が「材料および方法」で述べられたものとは異なることを要旨とする。
請求項８に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ＥＢＶ多型サブタイピングを検出する方法が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイ、ＳＳＣＰに限定されず、任意の方法（ＰＣＲ−制限断片長多型分析、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイジェノタイピング、ミニシークエンシング、蛍光共鳴エネルギー転移検出、インベーダーアッセイ、および対立遺伝子特異的ライゲーションなどがあるが、これらに限定されない）でよいことを要旨とする。
【００１４】
請求項９に記載の発明は、患者におけるエプスタインバーウイルスに関連する癌を診断、検出、モニター、および予後判定する方法であって、患者の血清または血漿に存在するＥＢＶ  ＤＮＡを検出し、次いでＥＢＶサブタイプを検出するステップを含んでなることを要旨とする。
【００１５】
請求項１０に記載の発明は、請求項９に記載の方法において、（１）患者から血液試料を得るステップ；（２）血液試料から液体画分を得るステップ；（３）液体画分からＤＮＡを抽出するステップ；および（４）液体画分に存在する循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を測定するステップを含んでなることを要旨とする。
【００１６】
請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載の方法において、（５）液体画分に存在する循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を対照と比較するステップ；（６）ＥＢＶサブタイプ決定後に、ＥＢＶサブタイプを、概ね悪性または良性のいずれかに特定されているＥＢＶサブタイプと比較するステップをさらに含むことを要旨とする。
【００１７】
請求項１２に記載の発明は、血液中のエプスタインバーウイルスＤＮＡが増加した患者について、エプスタインバーウイルスに関連する癌の予後および診断についての見込みの
増大を決定するキットであって、（ａ）罹患している患者の血液中のエプスタインバーウイルスを検出するための核酸、（ｂ）エプスタインバーウイルスが存在するか、または存在しないかを決定するために核酸を使用する説明書、およびＥＢＶサブタイピングにより確かめられた場合のエプスタインバーウイルスに関連する癌に罹患している患者について見込みの増大を説明するための説明書、（ｃ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびＰＣＲプライマーであって、２種類のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは多型部位で異なり、一方は良性対立遺伝子に相補的であり、他方は悪性対立遺伝子に相補的であるとともに、様々な悪性サブタイプおよび良性サブタイプの数によってＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ対の数が決定されることを特徴とするプローブおよびＰＣＲプライマーを含んでなることを要旨とする。
【００１８】
請求項１３に記載の発明は、請求項１２に記載の診断キットにおいて、患者から血液試料を得るデバイスを含むことを要旨とする。
請求項１４に記載の発明は、請求項１２に記載の診断キットにおいて、血液試料または他の標本からＥＢＶ  ＤＮＡを分離する手段を含むことを要旨とする。
【００１９】
［０６］第１の態様において、本発明は、患者における頭部、頸部、およびリンパの悪性腫瘍以外のＥＢＶに関連する癌を診断、検出、モニター、および予後判定する方法を特徴とする。前記方法は、このような患者の血清または血漿に存在するエプスタインバーウイルスＤＮＡ( ＥＢＶ  ＤＮＡ) の量を検出または決定することを特徴とする。従って、本発明は、臨床医学( 特に、ある集団の９０％を超えて発生するＥＢＶ潜在性感染) において広く適用することができる。
【００２０】
［０７］本発明による方法はまた、リンパ腫を含むＥＢＶに関連する任意の癌の診断、検出、モニター、および予後判定にも適用することができる。
［０８］本発明による方法は、一般的に、（１）患者から血液試料を得るステップ、（２）血液試料からＤＮＡを抽出するステップ、（３）血液試料に存在する循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を測定するステップ、および（４）血液試料に存在する循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を対照と比較するステップを含んでなる。
【００２１】
［０９］好ましくは、血液試料は、非細胞性の液体試料である。非細胞性とは、試料が血清（血液を凝固させ、残りの液体から細胞を分離することによって細胞が抽出されている）または血漿（液体画分の凝固を阻害し、遠心分離することによって細胞が抽出されている）のいずれかであることを意味する。ＥＢＶ  ＤＮＡは液体画分から測定される。ＥＢＶが非細胞性試料の液体中に見出された場合、感染が成立して感染細胞がＥＢＶを放出していると理解される。
【００２２】
［１０］第２の態様において、本発明は、ＥＢＶを悪性サブタイプと良性サブタイプに分ける既知の多型を検出するためのジェノタイピング試験を特徴とする。
［１１］第３の態様において、本発明は、患者の血清または血漿中のＥＢＶ  ＤＮＡおよびＥＢＶサブタイプを検出するのに適した試薬を含む診断キットを特徴とする。本発明によるキットは、患者から血液試料を得るための１または複数のデバイス、血液試料からＥＢＶ  ＤＮＡを分離する手段、および血液試料に存在するＥＢＶ  ＤＮＡの量を定量する手段をさらに含んでもよい。このようなキットは、リンパ腫を含むＥＢＶに関連する癌の診断、検出、モニター、および予後判定に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
［１４］本発明は、患者におけるＥＢＶに関連する癌を予測、診断、検出、モニター、および予後判定するための方法を特徴とする。前記方法は、これらの患者の血清中に存在するＥＢＶ  ＤＮＡを検出または定量することを特徴とし、陽性であれば、第２の方法に
より、これらの患者におけるＥＢＶサブタイプの発癌性が決定される。本発明による方法は、ＥＢＶ潜在性感染が広く蔓延し、広範囲に及んでいるので臨床医学において広く適用することができる。集団によっては、集団の９０％を超える人がこのようなＥＢＶ潜在性感染を有する。
【００２４】
［１５］臨床的には、鼻咽頭癌（非特許文献３、非特許文献８）およびある特定のリンパ腫（非特許文献４、非特許文献５、ガラガー（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ），Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４：４４２−４４８（１９９９））で達成されているのと同様に、循環ＥＢＶ  ＤＮＡを、ＥＢＥＲ陽性腫瘍を有する胃癌患者の診断およびモニターに適用することができる。鼻咽頭癌における循環ＥＢＶ  ＤＮＡの予後有意性が最近証明されたことは（非特許文献９）、ＥＢＶ  ＤＮＡの測定が胃癌の予後に重要であることを示唆している。
【００２５】
［１６］本発明による方法はまた、ＥＢＶと関連している頭部、頸部、およびリンパの悪性腫瘍以外のＥＢＶに関連する癌の検出、モニター、および予後判定にも適用することができる。これらの新生物の一部は、ある特定の肝臓癌のように（非特許文献１１）、ＥＢＶ感染に関連することが以前に示されている（非特許文献１０）。
【００２６】
［１７］従来の任意のＤＮＡ増幅法またはシグナル増幅法をＥＢＶ  ＤＮＡの検出に使用することができる。ほとんどの場合、当該分野で周知の数種類の核酸増幅法のいずれかを用いて標的配列を増幅することが望ましい。詳細に述べると、核酸増幅は、増幅される核酸配列に相補的な配列を含む核酸のアンプリコン（コピー）の酵素的合成である。当該分野で実施される核酸増幅法の例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および転写関連増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＴＡＡ）が挙げられる。核酸増幅は、試料中に存在する標的配列量が非常に少ない場合に特に有益である。標的配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することによって、アッセイ感度をかなり改善することができる。なぜなら、関心対象の生物またはウイルスに属する試料中の核酸を確実に検出するために、アッセイ開始時に少量の標的配列しか必要とされないからである。
【００２７】
［１８］核酸増複法は文献に詳細に述べられている。例えば、ＰＣＲ増幅は、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らにより米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号、ならびに「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１５５：３３５−３５０（１９８７）で述べられている。ＳＤＡの例は、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、「ＰＣＲ法および応用（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，３：２５−３０（１９９３）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：１６９１−１９９６（１９９２）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：３９２−３９６（１９９１）に見られる。ＬＣＲは米国特許第５，４２７，９３０号および同第５，６８６，２７２号で述べられている。様々なＴＡＡ法が、バルグ（Ｂｕｒｇ）らの米国特許第５，４３７，９９０号；カシアン（Ｋａｃｉａｎ）らの米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号；ならびにジンゲラス（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）らの国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０１９６６号および国際公報第ＷＯ８８／０１３０２号、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１０８号および国際公報第ＷＯ８８／１０３１５号などの刊行物に示されている。
【００２８】
［１９］リアルタイム定量ＰＣＲはＥＢＶ  ＤＮＡをモニターするのに好ましい手段であり、蛍光ＰＣＲ反応の進行を連続して光学的にモニターすることに基づいている（ハイド（Ｈｅｉｄｅ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−６９４，１９９６およびロー
（Ｌｏ）ら、Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２：７６８−７７５，１９９８）。このシステムでは、従来のＰＣＲで用いられる２種類の増幅プライマーに加えて、二重標識蛍光ハイブリダイゼーションプローブも含まれる（リバック（Ｌｉｖａｋ）ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，４３５７−３６２，１９９５）。一方の蛍光色素がレポーター（ＦＡＭ）として働き、その発光スペクトルが他方の蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）によりクエンチングされる。ＰＣＲの伸長段階の間に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（９）の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がプローブからレポーターを切断し、それによりレポーターがクエンチャーから遊離し、５１８ｎｍでの蛍光発光が増大する。
【００２９】
［２０］本発明による方法は、一般的に、（１）患者から血液試料を得るステップ、（２）血液試料からＤＮＡを抽出するステップ、（３）血液試料に存在する循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を測定するステップ、および（４）血液試料に存在する循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を対照と比較するステップを含む。好ましくは、血液試料が遠心分離され、液体画分が得られ、ＥＢＶ  ＤＮＡが液体画分から測定される。
【００３０】
［２１］当業者には当然のことであるが、当該分野で周知の多くの手段によってＤＮＡを血液試料から抽出することができる。１つの好ましい手段は、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）血液キットを使用することである。同様に、多くの既知または新規のプロトコールの１つを用いて、循環ＥＢＶ  ＤＮＡの量を測定することができる。リアルタイムＰＣＲ増幅システムを含むプロトコールが特に好ましい。得られた値の有意性を統計学的に評価するために、このように検出されたＥＢＶ  ＤＮＡ濃度を対照と比較する標準的な手順を容易に考案することができる。
【００３１】
［２２］ＥＢＶ  ＤＮＡのコピー数を経時的に測定し、疾患の進行または後退と相関させることができる。それにより、本発明は、これらのＥＢＶに関連する癌の予後をうまく測定することを可能にする非侵襲的方法を提供する。
【００３２】
［２３］他方で、ＥＢＶの溶解再活性化（ｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ならびに慢性活性ＥＢＶキャリアの形質転換が頻繁に現れるために、ＥＢＶ  ＤＮＡ濃度は、癌を有さない集団のかなりの割合で発見される。優先権を主張する特許で引用された本発明者らの研究において、常に、正常集団の３．６％が血清または血漿中のＥＢＶ  ＤＮＡについて陽性である。幸運にも、これらの症例の大部分（特に、５００コピー／ｍｌ未満のＥＢＶ  ＤＮＡコピーを有する症例）は、実際には起源が陽性である。ＥＢＶ  ＤＮＡ濃度は、これらの良性症例では１〜２週間後に０まで下がり、溶解再活性化または慢性再感染が終了する。それにもかかわらず、このようなＥＢＶ再活性化およびその結果として生じるＥＢＶキャプシド抗原に対するＩｇＡ抗体およびＥＢＶ  ＤＮアーゼに対する中和抗体の増加は、台湾のある集団において鼻咽頭癌を予測するものである（非特許文献１２）。最後に、このような低い段階のＥＢＶ  ＤＮＡ感染が見られるのはよくあることであり、患者は感染による発癌性を明らかに知りたがっている。実際に、本発明者らの血清または血漿ＥＢＶ  ＤＮＡ試験は、鼻咽頭癌などの癌を検出およびモニターするのに極めて感度が高く、有用であるが、実際には非常に短い間隔でＥＢＶを保有し、再活性化している集団の大部分を検出する原因の一部となっていた。本発明は、この極端な感度の高さを、ＥＢＶを頻繁に再活性化する人の発癌性を一回だけで測定できるような有用なツールに変えようというものである。
【００３３】
［２４］第２の態様において、本発明は、発癌性の異なる様々なＥＢＶサブタイプを検出することができるジェノタイピング方法を特徴とする。公表された方法およびジェノタイピングの１つによって、ＥＢＶ溶解調節遺伝子のＢＺＬＦ１プロモーター領域の調節配列にある多型が悪性細胞および非悪性細胞の間で示差的に分布していることが分かった。３つの多型Ｚｐ配列が検出された。悪性試料のうち、５２全ての試料がＺｐ−Ｐ（ＥＢＶ
Ｂ９５．８株と同一）またはＺｐ−Ｖ３配列のいずれかの多型を示した。良性試料の場合、５２全てがＺｐ−Ｖ４多型を示した（非特許文献１３）。
【００３４】
［２５］第３の態様において、患者の血清または血漿中のＥＢＶ  ＤＮＡおよび多型サブタイプを検出するのに適した試薬を含む診断キットが含まれる。本発明によるキットは、患者から血液試料を得るための１または複数のデバイス、血液試料からＥＢＶ  ＤＮＡを分離する手段、および血液試料に存在するＥＢＶ  ＤＮＡの量を定量する手段をさらに含んでもよい。このようなキットは、ＥＢＶに関連する癌の診断、検出、モニター、および予後判定に有用である。
【００３５】
［２４］本明細書で引用された全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参考として援用されるために詳細かつ個々に示されるように本明細書で参考として援用される。
【００３６】
［２５］前述の本発明は、はっきりと理解できるようにするために例示および実施例によっていくらか詳細に説明されたが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく特定の変化および変更を加えることができることは、本発明の教示を考慮すれば当業者に容易に明らかであろう。
【実施例】
【００３７】
［２６］以下の実施例は例示のためだけに示されるものであり、限定のために示されるものではない。当業者は、本質的に同様の結果を生じるように変化または変更を加えることができる様々な重要でないパラメーターを容易に理解するであろう。
【００３８】
（実施例１）
（材料および方法）
［２６］（血漿試料からのＥＢＶ  ＤＮＡの検出）  鼻咽頭癌などの既知のＥＢＶ関連癌を有する患者を募集した。ＥＢＶ良性キャリア、血清または血漿ＥＢＶ  ＤＮＡの検出、および多型によるＥＢＶサブタイピングのための対照として健常者も募集した。
【００３９】
［２７］血漿試料からのＤＮＡ抽出は以下のように行う。末梢血（５ｍｌ）を各被験者から血漿単離用ＥＤＴＡチューブに集めるとよい。血液試料を１６００×ｇで遠心分離し、血漿を注意深くＥＤＴＡ含有チューブから取り出し、普通のポリプロピレンチューブに移す。試料をさらに処理するまで−２０℃で保存する。血漿試料由来のＤＮＡを、製造業者（２）により推奨されるように血液および体液プロトコールを用いて、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）血液キット（ＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ）（ドイツ連邦共和国ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）所在のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて抽出する。血漿試料（１３０〜８００μｌ／カラム）をＤＮＡ抽出用に使用する。正確な量を、標的ＤＮＡ濃度の計算のために記録する。５０μｌの最終溶出量を抽出カラムに使用する。
【００４０】
［２９］循環ＥＢＶ  ＤＮＡ濃度は、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ−Ｗ断片領域に対するリアルタイム定量ＰＣＲシステムを用いて測定した（非特許文献３）。リアルタイム定量ＰＣＲの原理および反応設定手順は以前に述べられたとおりであった（非特許文献３）。データを、エービーアイ（ＡＢＩ）のＰｒｉｓｍ（登録商標）７７００配列検出器を用いて収集し、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により開発された配列検出システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）ソフトウェア  （バージョン１．６．３）を用いて解析した。結果を、血清１ミリリットルあたりのＥＢＶゲノムコピーとして表した。
【００４１】
［３０］全ての血清ＤＮＡ試料を、β−グロビン遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ分
析（非特許文献３）にもかけた。これにより全ての試験試料で、抽出ＤＮＡの品質を証明する陽性シグナルが得られた。複数の陰性の水ブランクを全ての分析に含めた。
【００４２】
［３１］さらに詳細に述べると、ＥＢＶ  ＤＮＡ検出には２種類のリアルタイム定量ＰＣＲシステムが開発されている：（ａ）一方はＢａｍＨＩ−Ｗ領域に対するリアルタイム定量ＰＣＲシステム、（ｂ）他方はＥＢＮＡ−Ｉ領域に対するリアルタイム定量ＰＣＲシステム（バエル（Ｂａｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１０：２０７−２１１，１９８４）である。ＢａｍＨＩ−Ｗシステムは、増幅プライマー（配列番号：１）Ｗ−４４Ｆ（５’−ＣＣＣＡＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ−３’）および（配列番号：２）Ｗ−１１９Ｒ（５’−ＴＣＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＡＧＧＧ−３’）、ならびに二重標識蛍光プローブ（配列番号：３）Ｗ−６７Ｔ［５’−（ＦＡＭ）ＣＡＣＡＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＣ−ＣＣＧＴＣＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’］から成るものとした。ＥＢＮＡ−１システムは、増幅プライマー（配列番号：４）ＥＢＮＡ−１１６２Ｆ（５’−ＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＣ−３’）および（配列番号：５）ＥＢＮＡ−１２２９Ｒ（５’−ＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴ−ＧＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣ−３’）、ならびに二重標識蛍光プローブ（配列番号：６）ＥＢＮＡ−１１８６Ｔ［５’−（ＦＡＭ）ＣＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡ−ＧＡＡ（ＴＡＭＲＡ）−３’］から成るものとした。蛍光プローブには、ＰＣＲ中にプローブが伸長しないように３’ブロッキングリン酸基を含めた。プライマー／プローブの組み合わせは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェア（米国カリフォルニア州フォレストシティ所在のパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．））を用いて設計した。ＥＢＶゲノムの配列データはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列データベースから入手した（アクセッション番号Ｖ０１５５５）。β−グロビン遺伝子に対するリアルタイム定量ＰＣＲは、ロー（Ｌｏ）ら、Ａｍ
Ｊ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６２：７６８−７７５，１９９８で以前に述べられたようなプライマーおよびプローブからなり、血漿ＤＮＡ増幅の対照として使用した。
【００４３】
［３２］蛍光ＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲコア試薬キット（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ）（パーキンエルマー社）に付属の成分（蛍光プローブおよび増幅プライマーを除く）を使用して反応体積５０μｌで設定した。蛍光プローブは、パーキンエルマーアプライドバイオシステムズによりカスタム合成された。ＰＣＲプライマーはライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（米国メリーランド州ガイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）により合成された。各反応には、１０×緩衝液Ａ  ５μｌ；３００ｎＭの各増幅プライマー；２５ｎＭ（ＥＢＶプローブの場合）または１００ｎＭ（β−グロビンプローブの場合）の対応する蛍光プローブ；４ｍＭ  ＭｇＣｌ２；それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；４００μＭ  ｄＵＴＰ；１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ
Ｇｏｌｄ（登録商標）；ならびに０．５単位のＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシルＮ−グリコシラーゼを含めた。
【００４４】
［３３］ＤＮＡ増幅は、パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ７７００配列検出器において９６ウェル反応プレート方式で実施した。各試料を２連で分析した。複数の陰性の水ブランクを全ての分析に含めた。
【００４５】
［３４］標準としてＥＢＶ陽性細胞株Ｎａｍａｌｗａ（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）ＣＲＬ−１４３２；クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０：４４−５７，１９７２を参照のこと）から抽出されたＤＮＡを用いて、校正曲線を各分析で並行して、２連で作成した。Ｎａｍａｌｗａは、細胞１個につき２つの組込みウイルスゲノムを含む二倍体細胞株である。二倍体細胞１個あたり６．６ｐｇ
ＤＮＡを換算係数としてコピー数計算に使用した（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１，１９８８）。循環無細胞ＥＢＶ  ＤＮＡの濃度を、血
漿１ｍｌあたりのＥＢＶゲノムコピーとして表した。
【００４６】
［３５］ＥＢＶ  ＢａｍＨＩ−ＷおよびＥＢＮＡ−ＩのＰＣＲシステムには同じ熱プロフィールを使用した。熱サイクリングは、ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように５０℃２分のインキュベーションで開始し、その後に、９５℃１０分の最初の熱変性ステップ、次いで、９５℃１５秒および５６℃１分のサイクルを４０回行った。
【００４７】
［３６］次いで、７７００配列検出器により収集され、マッキントッシュコンピュータ（米国カリフォルニア州カペルティーノ（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ）所在のアップルコンピュータ）に記録された増幅データを、パーキンエルマーアプライドバイオシステムズにより開発された配列検出システムソフトウェアを用いて解析した。２連の実験の平均量をさらなる濃度計算に使用した。ＥＢＶ  ＤＮＡまたはβ−グロビン遺伝子の血漿中濃度（コピー／ｍｌで表す）を以下の式を用いて計算した。
【００４８】
［３７］
Ｃ＝Ｑ×（ＶＤＮＡ／ＶＰＣＲ）×（１／Ｖｅｘｔ）
［３８］（式中、Ｃは血漿中の標的濃度（コピー／ｍｌ）を示し、Ｑは、ＰＣＲにおいて配列検出器により決定された標的量（コピー）を示し、ＶＤＮＡは抽出後に得られたＤＮＡの総容量（一般的に、５０μｌ／キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）抽出）を示し、ＶＰＣＲはＰＣＲに使用したＤＮＡ溶液量（一般的に、５μｌ）を示し、Ｖｅｘｔは抽出された血漿／血清の容量（一般的に、０．１３〜０．８０ｍｌ）を示す）。
【００４９】
［３９］腫瘍細胞にＥＢＶが存在することは、以前に述べられたように（フイ（Ｈｕｉ），Ｐ．Ｋ．ら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，２５：９４７−９５２（１９９４））、フルオレセイン結合オリゴヌクレオチドＥＢＥＲプローブ（英国所在のノボカストラ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ））を用いたパラフィン包埋組織切片上でのｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより評価した。
【００５０】
［４０］（ＥＢＶサブタイプの検出）  患者試料ＤＮＡは、［２７］で述べられたように無細胞血漿から採取することができる。これらのＤＮＡ試料は、末梢血リンパ球から、プロテイナーゼＫ消化後に標準的なフェノール／クロロホルム抽出法を用いて単離することもできる。さらに、ＤＮＡ試料は、ＥＢＶ腫瘍または再活性化が疑われる部位から単離することもできる。
【００５１】
本発明者らは、ＰＣＲ反応中または反応後に生じた蛍光レポーターシグナルを検出するために、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイ（ＴａｑＭａｎ  Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を使用する。ＥＢＶジェノタイピングのために、一対のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび一対のＰＣＲプライマーを使用する。このアッセイは多型部位で異なる２種類のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用するが、一方のプローブは野生型対立遺伝子に相補的であり、他方はバリアント対立遺伝子に相補的である。野生型プローブまたはバリアント対立遺伝子プローブに５’レポーター色素および３’クエンチャー色素が共有結合している。プローブが完全な状態であれば、レポーター色素とクエンチャー色素が物理的に近接しているために蛍光がクエンチングされる。ＰＣＲのアニーリング段階中に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが標的多型部位にハイブリダイズする。ＰＣＲの伸長段階中に、５’レポーター色素はＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断されて、レポーター色素の特徴的な蛍光が増大する。特異的ジェノタイピングは、ＰＣＲ反応後の２種類の異なるレポーター色素のシグナル強度を測定することによって決定される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ジェノタイピング装置および試薬はアプライドバイオシステムズによりサポートされている。２００ｎｔのＺｐ  ＢＺＬＦ１プロモー
ター領域で試験されたＥＢＶ多型サブタイプを以下に（図１に示すように）列挙する：
（１）Ｚｐ−Ｐ（プロトタイプ）（ＥＢＶ  Ｂ９５−８株と同一）
（２）Ｚｐ−Ｖ３（以下の３つの点変化を有する）：
（ａ）部位−１４１でのＡ→Ｇ
（ｂ）部位−１０６でのＡ→Ｇ
（ｃ）部位−１００でのＴ→Ｇ
（３）Ｚｐ−Ｖ４（Ｚｐ−Ｖ３の全てと４番目の置換、部位−１９６でのＴ→Ｃを含む）。
【００５２】
（鼻咽頭癌（ＮＰＣ）患者試料のＶ３（悪性）およびＰ（良性）の状態の比較を使用した臨床結果）
【００５３】
【表１】
2005058218.tif 000002
【００５４】
【表２】
2005058218.tif 000003
【００５５】
【表３】
2005058218.tif 000004
以上の臨床試験から示されるように、ＮＰＣおよびＮＰＣの可能性のある（病理学的には未確認）患者２６人のうち２０人が悪性の高いサブタイプであるＶ３であり（中国系集団では、Ｖ３は優性の悪性サブタイプである）、ＮＰＣの集団のうち７７％を占めていた。ＮＰＣの可能性のある症例をこの試験から除いた場合も、Ｖ３サブタイプは同じ７７％のままであった（患者２２人中１７人）。血中を循環するＥＢＶ  ＤＮＡが存在しない正常個体については、Ｖ３もＰも検出されていない。本明細書に示す予備的試験から、ＥＢＶ  ＤＮＡのＶ３サブタイプについて個別または組み合わせて血液検査をすることは、血中ＥＢＶ  ＤＮＡが陽性の力価を示す患者について将来癌に変化するかどうかを推測するための強力なツールとなりうる、ということが実証された。
【００５６】
［４１］あるいは、ＥＢＶサブタイプの検出は、一塩基識別が可能な他の方法（ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ産物の質量分析、人工制限断片長多型、リガーゼ連鎖反応を含むが、これらに限定されない）によって行うことができる。以下のプロトコールはＳＳＣＰ分析の使用について説明している。全ての腫瘍試料および非腫瘍試料から得たゲノムＤＮＡ  ５００ｎｇを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でのテンプレートとして直接使用した。ＢＺＬＦ１プロモーター（ＥＢＶゲノムのヌクレオチド１０３４２０〜１０３１８２、ジェンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００１３４５）のヌクレオチド−２２１〜＋１２（転写開始部位を基準とする）の断片を増幅するためにＰＣＲを使用し
た。使用したプライマーは５’−ａｇｃａｔｇｃｃａｔｇｃａｔａｔｔｔｃ−３’および５’−ｔｔｇｇｃａａｇｇｔｇｃａａｔｇｔｔｔ−３’であった。ＰＣＲ条件の構成は、９５℃５分；９５℃３０秒、６０℃３０秒、および７２℃１分の３０サイクル；その後に７２℃１０分の長い伸長反応であった。［３２Ｐ］ｄＣＴＰをＰＣＲ緩衝液に含めた。ＰＣＲ産物を、１０％グリセロールを含む６％非変性アクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスが１９：１）での６Ｗ、１８時間の電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。オートラジオグラムを２〜１６時間暴露した。ＰＣＲ産物の移動パターンの差によってＳＳＣＰが識別できた。ＥＢＶ  Ｂ９５．８株から得られた増幅産物を参照対照とした。以上のプロトコールから実証されるように、他の癌の原因となるサブタイプを見出し、Ｖ３およびＰについて説明した臨床研究で示したのと同様に血液試料から試験することが可能である。
【００５７】
［４２］（結論）中国系集団におけるＮＰＣ患者のＥＢＶ試料から示されるように、Ｚｐ−Ｖ３サブタイプの患者は、Ｚｐ−Ｐサブタイプの患者よりも癌を発症しやすいと診断しうる。
【００５８】
［４３］（結果）本発明者らが過去に発表した結果では、ＥＢＶ  ＤＮＡコピー濃度が５００コピー／ｍｌを超える鼻咽頭癌の検出において感度９６％および特異性９３％を示した。健常対照者のうち３．６％が陽性ＥＢＶ  ＤＮＡ力価を示したが、その大部分が５００コピー／ｍｌ未満であった。本発明は、この健常集団の３．６％のうち何人が、ＥＢＶに関連する癌の発症につながる可能性が最も高いＥＢＶサブタイプを実際に保有するかをさらに予測することができる。患者をさらに注意深く評価し、詳細に追跡調査することにより、ＥＢＶに関連する癌を初期段階で検出することができる可能性があり、それにより治癒が期待される。
【００５９】
［４４］（考察）ＮＰＣ（非特許文献３、非特許文献８）およびある特定のリンパ腫（非特許文献４、非特許文献５、ガラガー（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ），Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４：４４２−４４８（１９９９））で達成されているのと同様に、臨床的に、循環ＥＢＶ  ＤＮＡを、ＥＢＥＲ陽性腫瘍を有する一部の胃癌患者の診断およびモニターに適用することができる。最近、鼻咽頭癌の予後における循環ＥＢＶ  ＤＮＡの価値が証明された。さらなるデータ（非特許文献９）から、ＥＢＶ  ＤＮＡの測定は胃癌の予後に重要であることも分かっている。
【００６０】
［４５］しかしながら、ＥＢＶ  ＤＮＡ濃度が低く、目に見える癌の徴候および症状を伴わずに慢性的または頻繁にＥＢＶが再活性化すると診断された患者の大きな集団が存在する。このような患者の位置付けおよび追跡調査は、ＥＢＶの発癌性が分かっていることと、この群の中では癌が実際によく見られるという捕捉情報のために、今までのところ満足できるものでない。
【００６１】
［４６］多型または他の遺伝子型異常を検出する多くの方法のうちの１つがグチエレズ（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ）の非特許文献１３により証明されている。彼女の発表から、ＥＢＶ溶解遺伝子ＢＺＬＦ１のプロモーター領域は、ＰＣＲ−ＳＳＣＰにより検出可能な多型によって３つのサブタイプに分類できることが明らかになった。全ての癌試料がＺｐ−ＰおよびＺｐ−Ｖ３の２つのサブタイプに属していた。全ての良性試料が１つのサブタイプＺｐ−Ｖ４に属していた。しかしながら中国系集団では、Ｚｐ−Ｖ３がＺｐ−Ｐに対して優性の悪性サブタイプであり、Ｚｐ−Ｖ４は見つからない。
【００６２】
［４７］本発明で述べられた非常に感度の高い方法は、上気道および胃炎での溶解再活性化などの一見良性の疾患しか見られない場合がある個体群において無細胞の血漿ＥＢＶ
ＤＮＡを検出することができる。このような個体群のＥＢＶ  ＤＮＡは、通常、５００
コピー／ｍｌ未満であり、徹底的な検査でも既知の悪性腫瘍は判明しない。ＥＢＶの確実な多型およびサブタイプを検出する本発明の第２の部分を組み合わせることによって、このような個体群の管理がさらに明確になるであろう。悪性サブタイプを有する一方の群については定期的に追跡調査し、頻繁にＥＢＶ  ＤＮＡ濃度を測定すべきである。良性サブタイプを有する他方の群は心配が取り除かれ、必要に応じて追跡調査することができる。
【００６３】
［４８］データはまた、循環ＥＢＶ  ＤＮＡが、ＥＢＶに関連する多くの他の癌タイプに有用であり得ることを示唆している。このような癌の例として、乳癌（非特許文献１０）および肝細胞癌（非特許文献１１）が挙げられる。一部の腫瘍タイプとＥＢＶの関連が依然として議論の的になっているので、このような腫瘍を有する患者の血漿中に存在する可能性のあるＥＢＶ  ＤＮＡの検出および癌性サブタイプの検出は、これらの問題の解決に寄与するかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】エプスタインバーウイルスＢＺＬＦ１遺伝子プロモーターであるＺｐ（ε）の図。グチエレズ（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ）らにより報告された異なる多型を、Ｚｐ−Ｖ３は（＊）およびＺｐ−Ｖ４は（♯）として図中に示した。Ｚｐ−ＰおよびＺｐ−Ｖ３（悪性サブタイプ）、Ｚｐ−Ｖ４（良性サブタイプ）。
【図１】
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【配列表】
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