(57)【要約】      （修正有）【課題】ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の改変方法を提供する。具体的には、ニトリルヒドラターゼの立体構造に変化を及ぼす変異をニトリルヒドラターゼ遺伝子に導入する事によって、ニトリルヒドラターゼ本来の活性は損なう事無く、活性等の該酵素の諸性質を変化させる事を含む改変方法及び該改変酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド、細胞株、該細胞株を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法を提供する。【解決手段】改変の対象となる領域をニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列中のアミノ酸に置換・挿入・削除等の変更を加える事によってニトリルヒドラターゼを改変し、該変更によって得られた改変酵素遺伝子を含むプラスミド、形質転換された細胞株を作製し、該細胞株を用いた該酵素の産生や該細胞株を培養して得られる培養液・細胞・細胞処理物を用いたニトリル化合物からの対応アミド化合物の製造方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ａ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
（ｂ）アラインメント結果から、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列中の３６番目スレオニンより４８番目アスパラギンに至る領域、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の３１番目リジンより５１番目フェニルアラニンに至る領域、及び１１２番目リジンより１２７番目ロイシンに至る領域に相当するアミノ酸残基を特定する、
（ｃ）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。
【請求項２】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｄ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
（ｅ）アラインメント結果から、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列中の３６・４８・７１・１４８・１８８・２０４番目に相当するアミノ酸残基、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の１０・３２・３３・３７・４０・４１・４６・４８・５１・６１・７２・１１２・１１８・１２７・１４６・１５０・１６０・１６８・１７１・１７６・１８６・２１７・２１８番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
（ｆ）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。
【請求項３】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｇ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、ＰＤＢ（Protein Data Bank）番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
（ｈ）推定された立体構造に基づき、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖（Chain 1IRE:A）におけるＮ末から数えて２番目のヘリックス、及びＢ鎖（Chain 1IRE:B）におけるＮ末から数えて１番目のヘリックス、２番目のヘリックス、及びそれらにはさまれたループ部分とＣ末から数えて３番目のヘリックスに相当する領域のアミノ酸残基を特定する、
（ｉ）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。
【請求項４】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｊ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
（ｋ）推定された立体構造に基づき、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖におけるＮ末から８９番目のアミノ酸残基であるグルタミン、１６５番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸に相当するアミノ酸残基、及びＢ鎖のＮ末から３７番目のアミノ酸残基であるフェニルアラニン、４８番目のアミノ酸であるロイシンに相当する４つのアミノ酸残基を特定する、
（ｌ）特定された４つのアミノ酸残基の側鎖先端重原子を各々中心点とした立体構造上半径５Å内の範囲に側鎖先端重原子が含まれるアミノ酸残基を特定する、
（ｍ）上記ｌで特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。
【請求項５】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｎ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
（ｏ）推定された立体構造に基づき、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域を特定する、
（ｐ）特定された領域を構成するアミノ酸残基の内、それを変更する事が空洞の大きさを変化させ、延いては基質／生成物の通過し易さ／し難さを制御するアミノ酸残基を特定する、
（ｑ）上記ｐで特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。
【請求項６】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｒ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
（ｓ）推定された立体構造に基づき、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖におけるＮ末から８９番目のアミノ酸であるグルタミン（Ａ８９Ｑ）、１６５番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ａ１６５Ｅ）に相当するアミノ酸残基、及びＢ鎖のＮ末から３７番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（Ｂ３７Ｆ）、４８番目のアミノ酸であるロイシン（Ｂ４８Ｌ）に相当するアミノ酸残基の４つのアミノ酸残基を特定する、
（ｔ）Ａ１６５Ｅに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ１、Ａ８９Ｑに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ２、Ｂ３７Ｆに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ３と規定し、ｄ１から３の１つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、
（ｕ）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。
【請求項７】
（ｔ）の工程が以下の（ｔ’）のとおりである請求項６に記載の改変方法、
（ｔ’）Ａ１６５Ｅに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ１、Ａ８９Ｑに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ２、Ｂ３７Ｆに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ３、Ａ１６５Ｅに相当するアミノ酸残基とＢ３７Ｆに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ４、Ａ８９Ｑに相当するアミノ酸残基とＢ３７Ｆに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ５と規定し、ｄ１から５の１つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する。
【請求項８】
改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素が下記の［Ａ］と［Ｂ］の２種類のポリペプチドを含む事を特徴とする請求項１から７の何れか一項記載の改変方法、
［Ａ］配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、
［Ｂ］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と２５％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項９】
［Ａ］のポリペプチドが下記［Ｃ］のポリペプチドであり、［Ｂ］のポリペプチドが下記［Ｄ］ポリペプチドである事を特徴とする請求項８記載の改変方法、
［Ｃ］配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の少なくとも１箇所に関して置換、挿入又は削除を行ったアミノ酸配列、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の６・１９・３８・７７・９０・１０２・１０６・１２６・１３０・１４２・１４６・１８７・１９４・２０３番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド、
［Ｄ］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の少なくとも１箇所に関して置換、挿入又は削除を行ったアミノ酸配列、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０・２１・１０８・２００・２１２番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項１０】
［Ａ］のポリペプチドが下記［Ｅ］のポリペプチドであり、［Ｂ］のポリペプチドが下記［Ｆ］のポリペプチドである事を特徴とする請求項８記載の改変方法、
［Ｅ］配列表の配列番号７記載の塩基配列の７０４番目から１３１５番目によって成るＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）がコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
［Ｆ］配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６８０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項１１】
改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素が構成要素として含む２種のポリペプチドの内、１つが請求項１０記載の［Ｅ］のポリペプチドであり、もう１つのロリペプチドが請求項１０記載の［Ｆ］のポリペプチドである事を特徴とし、且つ以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行うことにより、該酵素の活性、基質特異性、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、（ｄ’）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
（ｅ’）アラインメント結果から、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の４８・５１番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
（ｆ’）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。
【請求項１２】
［Ａ］のポリペプチドが下記［Ｇ］のポリペプチドである事を特徴とする請求項８記載の改変方法、
［Ｇ］アミノ酸配列Ｘ１ＣＸＬＣ１ＳＣ２Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５で表される領域を含むポリペプチド
（ここにおいて、Ｃはシステインを、Ｘはセリン又はスレオニンを、Ｌはロイシンを、Ｃ１はシステインスルフィン酸（CYSTEINE SULFINIC ACID・3-SULFINOALANINE）を、Ｓはセリンを、Ｃ２はシステインスルフェン酸（CYSTEINE SULFENIC ACID・S-HYDROXY-CYSTEINE）を、Ｘ１・Ｘ２・Ｘ３・Ｘ４・Ｘ５は任意のアミノ酸を示す。）。
【請求項１３】
Ｘ１がバリン、Ｘ４がトリプトファン、Ｘ５がプロリンである事を特徴とする請求項１２記載の改変方法。
【請求項１４】
Ｘ２がチロシン、Ｘ３がプロリンである事を特徴とする請求項１３記載の改変方法。
【請求項１５】
Ｘ１ＣＸＬＣ１ＳＣ２Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５で表される領域を介して金属原子と結合している事を特徴とする請求項１２から１４の何れか一項記載の改変方法。
【請求項１６】
金属原子がコバルト原子である事を特徴とする請求項１５記載の改変方法。
【請求項１７】
請求項１から１６の何れか一項記載の改変方法により得られる事を特徴とする改変酵素。
【請求項１８】
請求項１７記載の改変酵素をコードする遺伝子。
【請求項１９】
請求項１８記載の遺伝子を含む事を特徴とするプラスミド。
【請求項２０】
微生物を請求項１８記載の遺伝子又は請求項１９記載のプラスミドを用いる形質転換をすることにより得られる事を特徴とする形質転換体。
【請求項２１】
請求項２０記載の形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物から改変酵素を回収する工程を含む事を特徴とする改変酵素の調製方法。
【請求項２２】
請求項２０記載の形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物、又は請求項２１記載の調製方法により得られる改変酵素をニトリル化合物と溶媒中で接触させる事により該ニトリル化合物を対応するアミド化合物へと転化させる工程を含む事を特徴とするアミド化合物製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の性質を改変する方法に関するものである。また、本発明は性質が改変された酵素、及びそれをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミドにより形質転換された細胞株、該細胞株を用いてニトリルヒドラターゼを産生する方法、及び該細胞株を培養して得られる培養液・細胞・細胞処理物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法に関する。本発明は、生体触媒を用いた物質生産の分野に於いて有用である。
【背景技術】
【０００２】
種々の化合物のニトリル基を水和によりアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素を産生する微生物株が多数開示されている。ニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造するためには、アミド化合物の製造コストに占める該酵素の製造コストを下げることが重要である。具体的には、酵素調製物の単位重量あたりの該酵素含有量を高くする必要がある。そこで、該酵素の遺伝子を用いて遺伝子工学の手法により該酵素を大量に発現させることを目的として、該酵素の遺伝子をクローニングする試みがなされている。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物としては、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株（ブタペスト条約に則って、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として茨城県つくば市東一丁目一番一号 中央第6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。）やシュードノカルディア サーモフィラ（本菌株は、理化学研究所微生物系統保存施設（埼玉県和光市広沢２−１）に番号ＪＣＭ３０９５として保管され、何人にも請求により自由に分譲される。また、ブタペスト条約に則って、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７９として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。）が見い出されている。また、これらの株よりニトリルヒドラターゼが単離され、同酵素が、一般的にαサブユニット及びβサブユニットと呼ばれる２種類のポリペプチドを構成要素としている事が確認されている。そして、これらの株よりニトリルヒドラターゼ遺伝子が単離され、そのアミノ酸配列及び塩基配列が明らかにされた。更に、これらのニトリルヒドラターゼを形質転換体内で発現できるプラスミド及び同プラスミドにより形質転換された細胞株（例としてＴＧ１／ｐＮＨＪ１０Ｈ及びＭＴ−１０８２２：これらはブタペスト条約に則って、前者は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２７７７、後者は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。）が作出された。加えて、これらの細胞株によるニトリルヒドラターゼの生産及び該細胞株又はそれより得られるニトリルヒドラターゼをニトリル化合物と接触させる事による対応するアミド化合物の製造が可能となっている。（特許文献１から３、非特許文献１参照）
【０００４】
また、ニトリルヒドラターゼの立体構造を解析する試みもなされており、その解析結果は、ＰＤＢ番号１ＡＨＪ、２ＡＨＪ、１ＩＲＥとして公開されている。該酵素は、αサブユニットとβサブユニットが会合した２量体がその基本構造単位となっており、その２量体が更に会合して４量体や８量体、１２量体（由来となる生物種によって異なる。）を形成してその活性を発揮している事が明らかとなっている。更に、その活性中心を形成する領域や構造も明らかになっており、活性中心は、反応溶媒に直接接触する酵素外側に露出した位置ではなく、酵素内部に包埋される様な位置に存在する事が知られている。活性の発揮に必須である金属原子（コバルト原子又は鉄原子：由来となる生物種によって異なる。）の活性中心への配位の様子も知られており、金属原子の配位に伴う現象として、活性中心を形成する領域を成すアミノ酸配列中のシステイン残基が翻訳後酸化を生じる事も明らかになっている。具体的には、αサブユニットのアミノ酸配列中のＸ１ＣＸＬＣ１ＳＣ２Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（Ｃはシステインを、Ｘはセリン又はスレオニンを、Ｌはロイシンを、Ｃ１はシステインスルフィン酸（CYSTEINE SULFINIC ACID・3-SULFINOALANINE）を、Ｓはセリンを、Ｃ２はシステインスルフェン酸（CYSTEINE SULFENIC ACID・S-HYDROXY-CYSTEINE）を、Ｘ１・Ｘ２・Ｘ３・Ｘ４・Ｘ５は任意のアミノ酸を示す。）という配列で表される領域が活性中心への金属原子の配位を担う領域とされている。（非特許文献２から４参照）
【０００５】
しかし、ニトリルヒドラターゼ本来の活性は損なう事無く、活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性等の性質を改変する方法に関しては、具体的な手法を開示した発明は未だなされていない。特に、ニトリルヒドラターゼの立体構造に注目し、その構造を変化させる事によって上記の性質を改変する方法に関しては、その試み自体がなされていない。
【０００６】
尚、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を宿主細胞で発現させて酵素活性のあるニトリルヒドラターゼを生産する場合に該酵素の活性化に関与するタンパク質が存在する点が特許文献４に開示されている。
【０００７】
【特許文献１】特許第１９２７１６２号公報
【特許文献２】特許第３１６２０９１号公報
【特許文献３】特許第３３８０１３３号公報
【特許文献４】特許第３４０８７３７号公報
【非特許文献１】Kobayashi M, Nishiyama M, Nagasawa T, Horinouchi S, Beppu T,Yamada H. Cloning, nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of two cobalt-containing nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous J1. Biochim Biophys Acta. 1991 Dec 2;1129(1):23-33.
【非特許文献２】Huang W, Jia J, Cummings J, Nelson M, Schneider G, Lindqvist Y. Crystal structure of nitrile hydratase reveals a novel iron centre in a novel fold. Structure. 1997 May 15;5(5):691-9.
【非特許文献３】Nagashima S, Nakasako M, Dohmae N, Tsujimura M, Takio K, Odaka M, Yohda M, Kamiya N, Endo I. Novel non-heme iron center of nitrile hydratase with a claw setting of oxygen atoms. Nat Struct Biol. 1998 May;5(5):347-51.
【非特許文献４】Miyanaga, A., Fushinobu, S., Ito, K., and Wakagi, T. Crystal structure of cobalt-containing nitrile hydratase. Biochem. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Nov 16;288(5):1169-74.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ニトリルヒドラターゼ本来の活性は損なう事無く、活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性等の性質のうちの一つ以上を変化させる事を含む方法に関する具体的手法を提供する事である。具体的には、ニトリルヒドラターゼの立体構造に変化を及ぼす変異をニトリルヒドラターゼ遺伝子に導入する事によって上記の性質を改変する方法を提供する事である。更に、改変方法によって得られたニトリルヒドラターゼ、該ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド、該遺伝子乃至該プラスミドにより形質転換された細胞株、該細胞株を用いた該ニトリルヒドラターゼの産生方法、及び該細胞株を培養して得られる培養液・細胞・細胞処理物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法をも提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはかかる状況の下、特許文献２、特許文献３に開示されているニトリルヒドラターゼ遺伝子を例として、新規な観点に基づいて変異の対象となる領域を特定し、該領域を形成するアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸に、置換、挿入又は削除等の変更を加える事によってニトリルヒドラターゼの改変方法を実施した。具体的には、非特許文献２から４やＰＤＢ番号１ＡＨＪ・２ＡＨＪ・１ＩＲＥとして公開されているニトリルヒドラターゼの立体構造を参照し、鋭意解析を実施する事によって、目的に適う変更対象領域を特定した。より具体的には、立体構造の解析により、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域、及び２量体形成に関与するαサブユニットとβサブユニット間の会合界面や２量体同士の会合に関与する界面を形成する領域を特定した。アミノ酸配列に置換、挿入又は削除等の変更を加える方法としては、特に限定されないが、遺伝子組換えの技法を用いた変異導入法を、その例として挙げる事が出来る。
【００１０】
更に、該変更後の該遺伝子の塩基配列を決定し、該遺伝子を含むプラスミド、該遺伝子乃至該プラスミドにより形質転換された細胞株を作製し、該細胞株を用いた該酵素の産生や該細胞株を培養して得られる培養液・細胞・細胞処理物を用いたニトリル化合物からの対応アミド化合物の製造を実施する事によって改変方法がニトリルヒドラターゼの性質にいかなる変化を及ぼしているかを観察した。改変対象となるニトリルヒドラターゼを構成するアミノ酸配列の様々な位置への変更及びそれによって得られた様々な改変酵素に関して鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記〔１〕から〔２２〕に示す通りである。
〔１〕   ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ａ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
（ｂ）アラインメント結果から、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列中の３６番目スレオニンより４８番目アスパラギンに至る領域、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の３１番目リジンより５１番目フェニルアラニンに至る領域、及び１１２番目リジンより１２７番目ロイシンに至る領域に相当するアミノ酸残基を特定する、
（ｃ）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔２〕   ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｄ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
（ｅ）アラインメント結果から、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列中の３６・４８・７１・１４８・１８８・２０４番目に相当するアミノ酸残基、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の１０・３２・３３・３７・４０・４１・４６・４８・５１・６１・７２・１１２・１１８・１２７・１４６・１５０・１６０・１６８・１７１・１７６・１８６・２１７・２１８番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
（ｆ）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔３〕   ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｇ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、ＰＤＢ（Protein Data Bank）番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づ
いたアラインメントを行う事により推定する、
（ｈ）推定された立体構造に基づき、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖（Chain 1IRE:A）におけるＮ末から数えて２番目のヘリックス、及びＢ鎖（Chain 1IRE:B）におけるＮ末から数えて１番目のヘリックス、２番目のヘリックス、及びそれらにはさまれたループ部分とＣ末から数えて３番目のヘリックスに相当する領域のアミノ酸残基を特定する、
（ｉ）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔４〕   ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｊ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
（ｋ）推定された立体構造に基づき、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖におけるＮ末から８９番目のアミノ酸残基であるグルタミン、１６５番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸に相当するアミノ酸残基、及びＢ鎖のＮ末から３７番目のアミノ酸残基であるフェニルアラニン、４８番目のアミノ酸であるロイシンに相当する４つのアミノ酸残基を特定する、
（ｌ）特定された４つのアミノ酸残基の側鎖先端重原子を各々中心点とした立体構造上半径５Å内の範囲に側鎖先端重原子が含まれるアミノ酸残基を特定する、
（ｍ）上記ｌで特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔５〕   ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｎ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
（ｏ）推定された立体構造に基づき、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域を特定する、
（ｐ）特定された領域を構成するアミノ酸残基の内、それを変更する事が空洞の大きさを変化させ、延いては基質／生成物の通過し易さ／し難さを制御するアミノ酸残基を特定する、
（ｑ）上記ｐで特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔６〕   ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｒ）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
（ｓ）推定された立体構造に基づき、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖におけるＮ末から８９番目のアミノ酸であるグルタミン（Ａ８９Ｑ）、１６５番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ａ１６５Ｅ）に相当するアミノ酸残基、及びＢ鎖のＮ末から３７番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（Ｂ３７Ｆ）、４８番目のアミノ酸であるロイシン（Ｂ４８Ｌ）に相当するアミノ酸残基の４つのアミノ酸残基を特定する、
（ｔ）Ａ１６５Ｅに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ１、Ａ８９Ｑに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ２、Ｂ３７Ｆに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ３と規定し、ｄ１から３の１つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、
（ｕ）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔７〕   （ｔ）の工程が以下の（ｔ’）のとおりである〔６〕に記載の改変方法、
（ｔ’）Ａ１６５Ｅに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ１、Ａ８９Ｑに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ２、Ｂ３７Ｆに相当するアミノ酸残基とＢ４８Ｌに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ３、Ａ１６５Ｅに相当するアミノ酸残基とＢ３７Ｆに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ４、Ａ８９Ｑに相当するアミノ酸残基とＢ３７Ｆに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をｄ５と規定し、ｄ１から５の１つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、
〔８〕   改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素が下記の［Ａ］と［Ｂ］の２種類のポリペプチドを含む事を特徴とする〔１〕から〔７〕の何れか一項記載の改変方法、
［Ａ］配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、
［Ｂ］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と２５％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、
〔９〕   ［Ａ］のポリペプチドが下記［Ｃ］のポリペプチドであり、［Ｂ］のポリペプチドが下記［Ｄ］ポリペプチドである事を特徴とする〔８〕記載の改変方法、
［Ｃ］配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の少なくとも１箇所に関して置換、挿入又は削除を行ったアミノ酸配列、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の６・１９・３８・７７・９０・１０２・１０６・１２６・１３０・１４２・１４６・１８７・１９４・２０３番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド、
［Ｄ］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の少なくとも１箇所に関して置換、挿入又は削除を行ったアミノ酸配列、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０・２１・１０８・２００・２１２番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド、
〔１０〕   ［Ａ］のポリペプチドが下記［Ｅ］のポリペプチドであり、［Ｂ］のポリペプチドが下記［Ｆ］のポリペプチドである事を特徴とする〔８〕記載の改変方法、
［Ｅ］配列表の配列番号７記載の塩基配列の７０４番目から１３１５番目によって成るＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）がコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
［Ｆ］配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６８０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
〔１１〕   改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素が構成要素として含む２種のポリペプチドの内、１つが〔１０〕記載の［Ｅ］のポリペプチドであり、もう１つのロリペプチドが〔１０〕記載の［Ｆ］のポリペプチドである事を特徴とし、且つ以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行うことにより、該酵素の活性、基質特異性、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる改変方法、
（ｄ’）改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
（ｅ’）アラインメント結果から、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の４８・５１番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
（ｆ’）特定されたアミノ酸残基の内の１箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔１２〕   ［Ａ］のポリペプチドが下記［Ｇ］のポリペプチドである事を特徴とする〔８〕記載の改変方法、
［Ｇ］アミノ酸配列Ｘ１ＣＸＬＣ１ＳＣ２Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５で表される領域を含むポリペプチド
（ここにおいて、Ｃはシステインを、Ｘはセリン又はスレオニンを、Ｌはロイシンを、Ｃ１はシステインスルフィン酸（CYSTEINE SULFINIC ACID・3-SULFINOALANINE）を、Ｓはセリンを、Ｃ２はシステインスルフェン酸（CYSTEINE SULFENIC ACID・S-HYDROXY-CYSTEINE）を、Ｘ１・Ｘ２・Ｘ３・Ｘ４・Ｘ５は任意のアミノ酸を示す。）、
〔１３〕   Ｘ１がバリン、Ｘ４がトリプトファン、Ｘ５がプロリンである事を特徴とする〔１２〕記載の改変方法、
〔１４〕   Ｘ２がチロシン、Ｘ３がプロリンである事を特徴とする〔１３〕記載の改変方法、
〔１５〕   Ｘ１ＣＸＬＣ１ＳＣ２Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５で表される領域を介して金属原子と結合している事を特徴とする〔１２〕から〔１４〕の何れか一項記載の改変方法、
〔１６〕   金属原子がコバルト原子である事を特徴とする〔１５〕記載の改変方法、
〔１７〕   〔１〕から〔１６〕の何れか一項記載の改変方法により得られる事を特徴とする改変酵素、
〔１８〕   〔１７〕記載の改変酵素をコードする遺伝子、
〔１９〕   〔１８〕記載の遺伝子を含む事を特徴とするプラスミド、
〔２０〕   微生物を〔１８〕記載の遺伝子又は〔１９〕記載のプラスミドを用いる形質転換をすることにより得られる事を特徴とする形質転換体、
〔２１〕   〔２０〕記載の形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物から改変酵素を回収する工程を含む事を特徴とする改変酵素の調製方法、
〔２２〕   〔２０〕記載の形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物、又は〔２１〕記載の調製方法により得られる改変酵素をニトリル化合物と溶媒中で接触させる事により該ニトリル化合物を対応するアミド化合物へと転化させる工程を含む事を特徴とするアミド化合物製造方法、
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を変化させる事を特徴とする手法を用いて、改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素を改変する方法が提供される。この方法を用いる改変方法としては、活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性等といった性質のうちの一つ以上が改変される事を特徴とする効果が得られる事がその効果として挙げられる。また本発明により、新規な変異点を有するニトリルヒドラターゼ、該酵素を構成するポリペプチド鎖をコードする遺伝子が提供される。更に、該遺伝子を含むプラスミド、該遺伝子乃至該プラスミドを含む形質転換体、該形質転換体を用いた該酵素の産生方法、及び該形質転換体を用いたニトリル化合物からの対応するアミド化合物の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、ニトリルヒドラターゼ活性とは、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に水和する活性を言う。該活性を有する酵素とは、一般的にはαサブユニット、βサブユニットと称される２種のポリペプチド鎖を構成要素とする事を特徴とし、ニトリルヒドラターゼ遺伝子とは、これら２種のポリペプチド鎖を形成する事を特徴とする２つのアミノ酸配列乃至それらをコードする事を特徴とする２つのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を成す塩基配列を指す。
【００１４】
シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼ（配列表の配列番号１及び２、特許文献３、非特許文献４、ＰＤＢ番号：１ＩＲＥ参照）を例にして具体的に述べると、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列から成るポリペプチド及びＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖がαサブユニット、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列から成るポリペプチド及びＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＢ鎖がβサブユニットである。また、配列表の配列番号３記載の塩基配列から成るＯＲＦと配列表の配列番号４記載の塩基配列から成るＯＲＦとをニトリルヒドラターゼ遺伝子と言う。
【００１５】
また、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼ（配列表の配列番号７、特許文献２、非特許文献１参照）の場合、配列表の配列番号７記載の塩基配列の７０４番目から１３１５番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列から成るポリペプチドがαサブユニット、配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６９０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列から成るポリペプチドがβサブユニットである。また、配列表の配列番号７記載の塩基配列がコードする２つのＯＲＦをニトリルヒドラターゼ遺伝子と言う。
【００１６】
本発明における改変方法とは、ニトリルヒドラターゼ本来の活性は損なう事無く、該酵素の活性・基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか１つ以上の性質を変化させる目的の下、改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を変化させる事を志向する手法であり、その特徴として、立体構造の解析により、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域、及び／又は、２量体形成に関与するαサブユニットとβサブユニット間の会合界面や２量体同士の会合に関与する界面を形成する領域を特定し、該領域に存在するアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸の何れか１箇所以上に、置換、挿入又は削除等の変更を加える工程を含む事が挙げられる。
【００１７】
シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼ（配列表の配列番号１及び２・特許文献３・非特許文献４・ＰＤＢ番号：１ＩＲＥ参照）を例にして具体的に述べると、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域に存在するアミノ酸残基に相当するのは、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＢ鎖におけるＮ末から数えて１番目のヘリックス・２番目のヘリックス・それらにはさまれたループ部分に相当する領域を形成するアミノ酸残基、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖におけるＮ末から８９番目のアミノ酸残基であるグルタミン・１６５番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸に相当するアミノ酸残基、及びＢ鎖のＮ末から３７番目のアミノ酸残基であるフェニルアラニン・４８番目のアミノ酸であるロイシンに相当する４つのアミノ酸残基の側鎖先端重原子を各々中心点とした立体構造上半径５Å内の領域に側鎖先端重原子が含まれるアミノ酸残基、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列中の３６番目スレオニンより４８番目アスパラギンに至る領域、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の３１番目リジンより５１番目フェニルアラニンに至る領域、及び１１２番目リジンより１２７番目ロイシンに至る領域に相当するアミノ酸残基、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の３７・４０・４１・４６・４８・５１・６１・７２・１１２・１１８・１２７番目に相当するアミノ酸残基等が挙げられる。
【００１８】
また、２量体形成に関与するαサブユニットとβサブユニット間の会合界面や２量体同士の会合に関与する界面を形成する領域に存在するアミノ酸残基に相当するのは、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖におけるＮ末から数えて２番目のヘリックス、Ｂ鎖におけるＮ末から数えて２番目のヘリックス、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列中の３６番目スレオニンより４８番目アスパラギンに至る領域、配列表の配列番号２記載の１１２番目リジンより１２７番目ロイシンに至る領域に相当するアミノ酸残基、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列中の３６・７１・１４８・１８８・２０４番目に相当するアミノ酸残基、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の１０・３２・３３・１１２・１１８・１２７・１４６・１５０・１６０・１６８・１７１・１７６・１８６・２１７・２１８番目に相当するアミノ酸残基等が挙げられる。
【００１９】
更に、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域を構成するアミノ酸残基の内、それを変更する事が空洞の大きさを変化させ、延いては基質／生成物の通過し易さ／し難さを制御するアミノ酸残基を特定する方法としては、ＰＤＢ番号１ＩＲＥ記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のＡ鎖におけるＮ末から８９番目のアミノ酸であるグルタミン（Ａ８９Ｑ）、１６５番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ａ１６５Ｅ）に相当するアミノ酸残基、及びＢ鎖のＮ末から３７番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（Ｂ３７Ｆ）、４８番目のアミノ酸であるロイシン（Ｂ４８Ｌ）に相当する４つのアミノ酸残基を特定し、Ａ１６５ＥとＢ４８Ｌとの最短重原子間距離をｄ１、Ａ８９ＱとＢ４８Ｌとの最短重原子間距離をｄ２、Ｂ３７ＦとＢ４８Ｌとの最短重原子間距離をｄ３、Ａ１６５ＥとＢ３７Ｆとの最短重原子間距離をｄ４、Ａ８９ＱとＢ３７Ｆとの最短重原子間距離をｄ５と規定し、ｄ１から５の１つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、該ｄ１から３の１つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する等が挙げられる。
【００２０】
従って、対象となるニトリルヒドラターゼ（シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のものをその代表例として挙げる事が出来る。）に対して、上記の様にして特定した何れか1つ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸に、置換、挿入又は削除等の変更を加える工程から成る改変方法は、本発明に含まれる。
【００２１】
また、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５以外の生物種由来のニトリルヒドラターゼ（例えばロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼ）をシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼの立体構造やアミノ酸配列とアラインメントし、上記のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を見出し、相当するアミノ酸配列中のアミノ酸を変更する事による改変方法も本発明に含まれる。
【００２２】
以上に列挙した内容を実施するに当って、立体構造乃至アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行うに際して、それに用いる手段は特に限定されないが、アミノ酸配列のアラインメントの手段としては日立ソフト社製のＤＮＡＳＩＳやフリーソフトのＣＬＵＳＴＡＬＷやＢＬＡＳＴ等の遺伝子配列解析ソフトが、アミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングの手段としてはアクセルリス社製のモデラーやホモロジー等の蛋白質立体構造予測ソフトが、各々例として挙げられる。
【００２３】
一例を述べると、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼ（配列表の配列番号７・特許文献２・非特許文献１参照）の場合、アラインメントの結果、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の４８番目に相当するアミノ酸残基：Ｌｅｕに相当するアミノ酸残基は、配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６９０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列の４８番目に相当するアミノ酸残基：Ｔｒｐであり、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列中の５１番目に相当するアミノ酸残基：Ｐｈｅに相当するアミノ酸残基は、配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６９０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列の５１番目に相当するアミノ酸残基：Ｓｅｒである。これは、アミノ酸配列に基づいたアラインメントと立体構造に基づいたアラインメントとで一致する結果である。この２つのアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸の何れか一方又は両方を変更する事による改変方法も本発明に含まれる。
【００２４】
尚、以上の改変方法を実施するに当って、アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸を変更する為の変異導入手段に関しては、特に限定されないが、遺伝子組換えの技法を用いてアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する変異導入法を、その例として挙げる事が出来る。
【００２５】
また、意図して導入した変異以外に副次的に導入される変異によるアミノ酸配列や塩基配列の変化については、意図した変異導入による目的のニトリルヒドラターゼ活性を損なわない範囲内で、アミノ酸や塩基の置換、挿入又は削除が生じてもよい。
【００２６】
この様な副次的に導入される変異については以下の様な例を挙げる事が出来る。ある一定の塩基配列を有する遺伝子を鋳型として転写・翻訳された場合であっても、それを導入する宿主細胞の種類や培養に使用する栄養培地の成分や組成又は培養時の温度やｐＨ等によっては、遺伝子発現後の宿主細胞内酵素による修飾などにより、初期の酵素作用は保持しているものの配列表におけるＮ末端付近のアミノ酸の１個又は２個以上が欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した異型体を産生する事があり得る。その為、そのような異型なニトリルヒドラターゼをもたらす改変方法も本発明に含まれる。
【００２７】
本発明における改変方法の対象となる、改変前のニトリルヒドラターゼの例としては、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼとシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼとを挙げる事が出来る。具体的には、配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６９０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列によって形成されるポリペプチド鎖と配列表の配列番号７記載の塩基配列の７０４番目から１３１５番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列によって形成されるポリペプチド鎖とを構成要素とするニトリルヒドラターゼと、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列によって形成されるポリペプチド鎖と配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列によって形成されるポリペプチド鎖とを構成要素とするニトリルヒドラターゼと、を挙げる事が出来る。
【００２８】
本発明における改変方法の対象となる、改変前のニトリルヒドラターゼには、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチドと配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と２５％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチドとを構成要素とするニトリルヒドラターゼも含まれる。
【００２９】
配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチドの例としては、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列から成るポリペプチド、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の少なくとも１箇所に関して置換、挿入又は削除の何れかの変更を施したアミノ酸配列から成るポリペプチド、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の６・１９・３８・７７・９０・１０２・１０６・１２６・１３０・１４２・１４６・１８７・１９４・２０３番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列から成るポリペプチド、配列表の配列番号７記載の塩基配列の７０４番目から１３１５番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド等を挙げる事が出来る。
【００３０】
また、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチドは、その配列中にＸ１ＣＸＬＣ１ＳＣ２Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（ここにおいて、Ｃはシステインを、Ｘはセリン又はスレオニンを、Ｌはロイシンを、Ｃ１はシステインスルフィン酸（CYSTEINE SULFINIC ACID・3-SULFINOALANINE）を、Ｓはセリンを、Ｃ２はシステインスルフェン酸（CYSTEINE SULFENIC ACID・S-HYDROXY-CYSTEINE）を、Ｘ１・Ｘ２・Ｘ３・Ｘ４・Ｘ５は任意のアミノ酸を示す。）で表される領域を含むポリペプチドである事を特徴とする場合がある。加えて、Ｘ１がバリン、Ｘ４がトリプトファン、Ｘ５がプロリンであるポリペプチドである事を特徴とする場合がある。更に加えて、Ｘ２がチロシン、Ｘ３がプロリンであるポリペプチドである事を特徴とする場合がある。
【００３１】
上記の場合、Ｘ１ＣＸＬＣ１ＳＣ２Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５で表される領域を介して金属原子と結合している事を特徴とする場合がある。加えて、該金属がコバルトである事を特徴とする場合がある。
【００３２】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と２５％以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチドの例としては、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列から成るポリペプチド、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の少なくとも１箇所に関して置換、挿入又は削除の何れかの変更を施したアミノ酸配列から成るポリペプチド、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０・２１・１０８・２００・２１２番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列から成るポリペプチド、配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６９０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド等を挙げる事が出来る。
【００３３】
一例を述べると、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼの場合、配列表の配列表の配列番号７記載の塩基配列の７０４番目から１３１５番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列から成るポリペプチドと配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６９０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列から成るポリペプチドとを構成要素とするニトリルヒドラターゼであるので、本発明における改変方法の対象となる、改変前のニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００３４】
また、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼは、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドと配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドとを構成要素とするニトリルヒドラターゼであるので、本発明における改変方法の対象となる、改変前のニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００３５】
更に、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼから派生したニトリルヒドラターゼの例として、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼの構成要素の内、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドが、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の少なくとも１箇所に関して置換、挿入又は削除の何れかの変更を施したアミノ酸配列から成るポリペプチド、或いは配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の６・１９・３８・７７・９０・１０２・１０６・１２６・１３０・１４２・１４６・１８７・１９４・２０３番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列から成るポリペプチドに置き換わったニトリルヒドラターゼである事、及び配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列から成るポリペプチドが、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の少なくとも１箇所に関して置換、挿入又は削除の何れかの変更を施したアミノ酸配列から成るポリペプチド、或いは配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の２０・２１・１０８・２００・２１２番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列から成るポリペプチドに置き換わったニトリルヒドラターゼである事の、何れか一方又は両方の条件を満たすニトリルヒドラターゼを挙げる事が出来る。
【００３６】
シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼから派生したニトリルヒドラターゼも、本発明における改変方法の対象となる、改変前のニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００３７】
本発明において、改変酵素とは、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素を対象として改変方法を実施する事によって得られるニトリルヒドラターゼを言う。その例としては、上述の改変方法を用いて改変前のニトリルヒドラターゼの形質を変化させて得られる事を特徴とする改変酵素を、その例として挙げる事が出来る。
【００３８】
形質の変化としては、改変前のニトリルヒドラターゼと比較した場合、基質特異性・Ｖｍａｘ・Ｋｍ・熱安定性・基質（：該酵素が触媒として機能し、対応するアミド化合物に変換する事が可能な任意のニトリル化合物が例として挙げられる。）に対する安定性・生成物（：該酵素が触媒として機能し、任意のニトリル化合物を変換する事で得られる対応するアミド化合物が例として挙げられる。）に対する安定性等といった性質の何れか１つ以上の性質に関する変化を挙げる事が出来る。具体的な例としては、
１）相対的に、より嵩高いニトリル化合物を基質とし易くなる。
２）相対的に、より嵩の小さいニトリル化合物を基質とし易くなる。
３）任意のニトリル化合物を基質とする場合のＶｍａｘが向上する。
４）任意のニトリル化合物を基質とする場合のＫｍが低減する。
５）酵素を任意の熱量に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
６）酵素を任意濃度の基質に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
７）反応中に任意濃度の生成物が存在する事による反応阻害率が軽減する。
８）酵素を任意濃度の生成物に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
等を挙げる事が出来る。
【００３９】
本発明における改変前のニトリルヒドラターゼを対象とした改変方法がもたらす形質変化の指標としては、基質特異性の変化をその代表例の１つに挙げる事が出来る。本発明における改変方法によって得られる改変酵素が、基質特異性の変化したものである場合、その改変酵素は、本発明における改変酵素に含まれる。
【００４０】
得られる改変酵素の基質特異性の変化を観察する方法としては、嵩高さの異なる複数種のニトリル化合物を基質とする反応を行い、生成する対応アミド化合物量の違いを測定する方法が挙げられる。その一例としては、アクリロニトリルを基質とする反応で生成するアクリルアミドとメタクリルニトリルを基質とする反応で生成するメタクリルアミドとのモル比を比較する方法がある。この場合、改変前の対象と比較して［生成するメタクリルアミドのモル量］÷［生成するアクリルアミドのモル量］の値が大きくなる方向に変化した改変酵素は、より嵩高いニトリル化合物を基質とし易くなる形質の変化を示したと言え、その値が小さくなる方向に変化した改変酵素は、より嵩の小さいニトリル化合物を基質とし易くなる形質の変化を示したと言える。
【００４１】
シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼ、及びシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼから派生したニトリルヒドラターゼを対象とした例においては、立体構造の解析により、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域、及び／又は、２量体形成に関与するαサブユニットとβサブユニット間の会合界面や２量体同士の会合に関与する界面を形成する領域を特定し、該領域に存在するアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列中のアミノ酸の何れか１箇所以上に、置換、挿入又は削除等の変更を加える工程を含む改変方法を実施した場合、改変前の対象と比較して、アクリロニトリルを基質とする反応で生成するアクリルアミドとメタクリルニトリルを基質とする反応で生成するメタクリルアミドとのモル比が変化した改変酵素が得られた。この事は基質特異性すなわち形質の変化したものであると言えるので、得られた改変酵素は、本発明における改変酵素に含まれる。
【００４２】
ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼを対象とした例においては、配列表の配列番号７記載の塩基配列の１番目から６９０番目によって成るＯＲＦがコードするアミノ酸配列の４８番目に相当するアミノ酸残基：Ｔｒｐを他のアミノ酸残基に変更する事による改変方法を実施した場合、改変前の対象と比較して、より嵩高いニトリル化合物を基質とし易くなる形質の変化を示した。従って、獲得した形質変化を示す蛋白質は、本発明における改変酵素に含まれる。
【００４３】
尚、得られる改変酵素が有する変異部位を組み合せる事によって、更なる形質の変化がもたらされる事は容易に類推される。従って、その様な変異部位の組み合せによって得られる改変酵素も、本発明における改変酵素に含まれる。
【００４４】
本発明において、改変酵素をコードする遺伝子とは、改変酵素を構成する２種のポリペプチド鎖を形成する事を特徴とする２つのアミノ酸配列乃至それらをコードする事を特徴とする２つのＯＲＦを成す塩基配列を指す。
【００４５】
本発明において、遺伝子を含む事を特徴とするプラスミドとは、改変酵素を構成する２種のポリペプチド鎖を形成する事を特徴とする２つのアミノ酸配列をコードする事を特徴とする２つのＯＲＦを成す塩基配列をその配列中に含有する事を特徴とするプラスミドを指す。
【００４６】
上記のプラスミドは、本発明における遺伝子に加え、各遺伝子の発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域等の、任意の宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体や細胞株による改変酵素の産生を可能せしめる構成を有する事が出来る。ここでいう任意の宿主細胞とは、後述の実施例の様にその一例として大腸菌が挙げられるが、これに限定されるのものではなく、枯草菌等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物も用いる事が出来る。
【００４７】
発現に必要な制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げる事が出来る。
【００４８】
具体的なプロモーター配列の例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターやｔｒｃプロモーターのように人為的に設計・改良された配列も利用出来る。
【００４９】
リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来や枯草菌由来又はロドコッカスやシュードノカルディア本来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用出来る。これら制御領域のプラスミド上での配列順序は、プロモーター配列とリボゾーム結合配列は本発明における遺伝子より５’末端側上流に位置する事が望ましく、転写終結配列は本発明における遺伝子より３'末端側下流に位置する事が望ましい。また、その様な制御領域により本発明における遺伝子を構成する各々のＯＲＦをコードする塩基配列が各々独立のシストロンとして発現されてもよいし、共通の制御領域によりポリシストロンとして発現されてもよい。
【００５０】
以上の要件を満たしているプラスミドベクターの例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等を挙げる事が出来る。また、２種類以上の宿主細胞内での自律複製が可能なプラスミドベクターの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７を挙げる事が出来る。
【００５１】
本発明における遺伝子を発現させて所望の活性を有するニトリルヒドラターゼを生産するに際しては、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与する蛋白質が必要となる場合がある。
【００５２】
ニトリルヒドラターゼの活性化に関与する蛋白質とは、該蛋白質の発現の有無が、ニトリルヒドラターゼの活性化を直接左右する性質を有している蛋白質の事であり、特許文献４に記載されるシュードノカルディア サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼ活性化に関与する蛋白質（ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質）をその例として挙げる事が出来る。具体的には、ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質としては、配列番号：５のアミノ酸配列に示される１４４個のアミノ酸の配列により構成されるものをその例として挙げる事が出来る。また、配列番号：５のアミノ酸配列の一部でのアミノ酸の置換、挿入又は削除等により得られた異型蛋白質も、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するものであれば、ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質に含まれるものとする。この異型蛋白質としては、配列番号５のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の置換、挿入又は削除等による変異を有し、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与する性質を維持しているものを挙げる事が出来る。
【００５３】
ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子としては、ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではない。この遺伝子としては、上記の配列番号：５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子及び上記の異型蛋白質をコードする遺伝子を挙げる事が出来る。更に、このニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子の好ましい例としては、配列番号：６の塩基配列を有する遺伝子を挙げる事が出来る。更に、ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子には、配列番号：６に記載の塩基配列配列の１個または２個以上について塩基の置換・挿入・削除が行われた配列であっても、それがニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子として機能する場合には、ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子の範囲に含まれるものとする。
【００５４】
ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子を用いる場合としては、そのＯＲＦを本発明における遺伝子を成す２つのＯＲＦと共に、本発明におけるプラスミド中に含める例を挙げる事が出来る。その場合、これらＯＲＦのプラスミド上における順序は特に限定されず、また、３つのＯＲＦが同一の制御領域により制御されてもよく、２つのＯＲＦが同一の制御領域により制御され、残る１つのＯＲＦが他の２つとは異なる制御領域により制御されてもよく、３つのＯＲＦが各々異なる制御領域により制御されてもよい。
【００５５】
この様なベクタープラスミドに本発明における遺伝子を本発明における改変酵素の活性発現に必要な領域と共に挿入して本発明のプラスミドを構築する方法や該プラスミドを所望の宿主細胞に形質転換する方法及び該形質転換体内でニトリルヒドラターゼを産生させる方法には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１）等に記載されている分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法と宿主細胞が利用出来る。
【００５６】
本発明において、形質転換により得られる事を特徴とする形質転換体としては、本発明における遺伝子乃至プラスミドを用いて宿主細胞を形質転換する事により得られたものを含む。該形質転換体を培養する例としては、培養用の培地に植えた後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃）で生育させる事を特徴とする方法が挙げられる。
【００５７】
尚、宿主細胞が微生物の場合、上記の形質転換体を培養する培地としてＬＢ培地やＭ９培地などが一般的に用いられるが、そのような培地成分に金属イオンを添加しても良い。添加する金属イオンとしては、Ｆｅイオン及びＣｏイオンが挙げられる。また、添加量としては、０．１μｇ／ｍＬ以上の添加が例として挙げられる。
【００５８】
本発明において、形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物から改変酵素を回収する工程を含む事を特徴とする改変酵素の調製方法としては、上記の形質転換体、該形質転換体の培養液、又は該形質転換体や該培養液の処理物からニトリルヒドラターゼ活性を回収する工程を有する特徴のある例を挙げる事が出来る。
【００５９】
本発明において、ニトリル化合物を対応するアミド化合物へと転化させる工程を含む事を特徴とするアミド化合物製造方法としては、上記の形質転換体、該形質転換体の培養液、または該形質転換体や該培養液の処理物、又は上記調製方法によって回収したニトリルヒドラターゼ活性を触媒として用いて、ニトリル化合物を対応するアミド化合に変換する工程を有する特徴のある例を挙げる事が出来る。
【００６０】
本発明における改変酵素又は該酵素活性を有する形質転換体を利用して、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する例としては、所望のニトリル化合物を、該酵素精製物や粗酵素調製物、本発明における形質転換体の培養液、培養液から得られる形質転換体、又は形質転換体の処理物と溶媒中で接触させる工程を含む方法が挙げられる。ここでいう処理物とは、該形質転換体からの抽出物や磨砕物、これらの抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離して得られる粗酵素調製物、更に精製して得られる酵素精製物などの後分離物、該形質転換体や該形質転換体の抽出物、磨砕物または後分離物を適当な手段を用いて固定化した固定化物を含む。接触させる温度は特に限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲内であり、より好ましくは氷点以上６０℃以下である。
【００６１】
ニトリル化合物としては、本発明の改良酵素が基質として作用できる化合物であれば特に限定されないが、アセトニトリル・プロピオニトリル・アクリロニトリル・メタクリロニトリル・ｎ−ブチロニトリル・イソブチロニトリル・クロトノニトリル・α−ヒドロキシイソブチロニトリル等といった炭素数２〜４のニトリル化合物がその例として挙げられる。該ニトリル化合物の溶媒中での濃度は、特に限定されるものではなく、また、反応温度も特に限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲内であり、より好ましくは氷点以上５０℃以下である。
【００６２】
以下に記載する実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。尚、各実施例及び比較例におけるＨＰＬＣ分析は、カラムとして日本分光製のＦｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８−５（２５０×４．６φｍｍ）を用い、４体積％のアセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用した。また、アクリルアミド、アクリロニトリル・アクリル酸・メタクリルアミド・メタクリロニトリル・メタクリル酸は２１０ｎｍの吸光度により検出した。
【実施例１】
【００６３】
ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株からのゲノムＤＮＡ調製
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。
培地組成；
グルコース：１０．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素一カリウム：０．５ｇ／Ｌ、リン酸一水素二カリウム：０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物：０．５ｇ／Ｌ、酵母エキストラクト：１．０ｇ／Ｌ、ペプトン：７．５ｇ／Ｌ、尿素：７．５ｇ／Ｌ、塩化コバルト・六水和物：１０．０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．２
この培地に特許文献１記載のロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として、前記の寄託機関に特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されており、万人に対し請求により分譲される）を一白菌耳植菌し、３０℃・１３０ｒｐｍにて７２時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００６４】
上記で得た湿菌体２ｇに０．１５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａ水溶液（ｐＨ８．０）を４０ｍｌ加えて菌体を懸濁し、９０℃で１０分間煮沸処理した。該処理液を３７℃まで冷却した後に、卵白リゾチームを１００ｍｇ加えて３７℃で１時間保温した。次に２００００Ｕ／ｍｇのザイモリレースを３０ｍｇ加えて３７℃で１時間保温した。続いて２０Ｕ／ｍｇのプロテイネースＫを５ｍｇ加えて３７℃で１時間保温した。更に、１０％ＳＤＳ溶液を２ｍｌ添加して６５℃で１時間保温した後、直ちにフェノール／クロロホルム抽出を行った。まず、ＴＥ（１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭのトリス塩酸水溶液；ｐＨ８．０）で飽和させたフェノール液４２ｍｌを加え緩やかに攪拌した。遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を分離し、水相のみを分取した。この水相に上記のＴＥ飽和フェノール液２１ｍｌとクロロホルム２１ｍｌを加えて再び緩やかに攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを再分取した。この水相にクロロホルム４２ｍｌを加えて再び緩やかに攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを分取した。この水相に１．１ＭのＮａＣｌを含むＴＥ溶液４ｍｌとエタノール９２ｍｌを加えてしばらく室温で放置した後、析出した糸状のＤＮＡをガラス棒を用いて巻取った。７０％・８０％・９０％のエタノール水溶液で順次脱水を行った後に風乾させた該ＤＮＡを４０ｍｌのＴＥ溶液に再溶解させた。ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、制限酵素ＢａｍＨＩにより部分切断した。フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって部分切断された該ＤＮＡを再精製し、最終的に１．０μｇ／ｍｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。
【実施例２】
【００６５】
ＰＣＲを用いたロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株ゲノムＤＮＡからのニトリルヒドラターゼ遺伝子の調製
特許文献２及び非特許文献１において明らかになっているニトリルヒドラターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて、配列表の配列番号８及び９記載のプライマーを合成した。実施例１にて調製した部分切断された染色体ＤＮＡ３μｇを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応では、各プライマーを各々２００ｎｇとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績社製）を１Ｕを含む全量５０μｌの系で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５８℃）１５秒・伸長反応（６８℃）２分間のサイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ反応の終了液をアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約１．３ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
【００６６】
続いて、アガロースゲルから約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った。まず、ＴＥ（１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭのトリス塩酸水溶液；ｐＨ８．０）で飽和させたフェノール液１ｍｌを加え緩やかに攪拌した。遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を分離し、水相のみを分取した。この操作を３回繰り返した後、得られた水相に上記のＴＥ飽和フェノール液０．４ｍｌとクロロホルム０．４ｍｌを加えて再び緩やかに攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを再分取した。この水相にクロロホルム０．８ｍｌを加えて再び緩やかに攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを分取した。この水相に１．１ＭのＮａＣｌを含むＴＥ溶液８０μｌとエタノール１．７ｍｌを加えて−８０℃で３０分間放置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ・２０分間・４℃）によりＤＮＡ断片の沈殿を回収した。該ＤＮＡ断片を風乾後、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【００６７】
精製した約１．３ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｃａＩにより切断した後、アガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約１．３ｋｂｐのＤＮＡの存在が確認できた。アガロースゲルからこの約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った。まず、ＴＥ（１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭのトリス塩酸水溶液；ｐＨ８．０）で飽和させたフェノール液１ｍｌを加え緩やかに攪拌した。遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を分離し、水相のみを分取した。この操作を３回繰り返した後、得られた水相に上記のＴＥ飽和フェノール液０．４ｍｌとクロロホルム０．４ｍｌを加えて再び緩やかに攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを再分取した。この水相にクロロホルム０．８ｍｌを加えて再び緩やかに攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを分取した。この水相に１．１ＭのＮａＣｌを含むＴＥ溶液８０μｌとエタノール１．７ｍｌを加えて−８０℃で３０分間放置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ・２０分間・４℃）によりＤＮＡ断片の沈殿を回収した。該ＤＮＡ断片を風乾後、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【実施例３】
【００６８】
ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現させる為のプラスミドベクターの調製
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の４０μｇ／ｍＬの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍＬの塩化コバルト・六水和物を含むＬＢ液体培地を１００ｍｌ調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。
培地組成；
酵母エキストラクト：５．０ｇ／Ｌ、ポリペプトン：１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５．０ｇ／Ｌ、塩化コバルト・六水和物：１０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・七水和物：４０．０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．５
この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、特許文献３記載のＭＴ１０８２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて１６時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体よりアルカリＳＤＳ抽出法によりｐＰＴ−ＤＢ１（図１）のプラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。
【００６９】
精製したプラスミド１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７IIIにより切断した後、アガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約３．３ｋｂｐと約１．３ｋｂｐのＤＮＡの存在が確認できた。アガロースゲルから約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った。まず、ＴＥ（１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭのトリス塩酸水溶液；ｐＨ８．０）で飽和させたフェノール液１ｍｌを加え緩やかに攪拌した。遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を分離し、水相のみを分取した。この操作を３回繰り返した後、得られた水相に上記のＴＥ飽和フェノール液０．４ｍｌとクロロホルム０．４ｍｌを加えて再び緩やかに攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを再分取した。この水相にクロロホルム０．８ｍｌを加えて再び緩やかに攪拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを分取した。この水相に１．１ＭのＮａＣｌを含むＴＥ溶液８０μｌとエタノール１．７ｍｌを加えて−８０℃で３０分間放置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ・２０分間・４℃）によりＤＮＡ断片の沈殿を回収した。該ＤＮＡ断片を風乾後、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【実施例４】
【００７０】
ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼを活性発現させる為の形質転換体の構築
実施例２にて調製したＥｃｏＲＩ及びＳｃａＩにより切断された約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片と実施例３にて調製したＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７IIIにより切断された約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、ＤＮＡ連結反応に供した。反応産物により大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．２００を得た。
【００７１】
５００ｍＬのバッフル付三角フラスコに４０μｇ／ｍＬの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍＬの塩化コバルト・六水和物を含む１００ｍＬのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、形質転換体Ｎｏ．２００を一白金耳植菌し、３７℃・1３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液から遠心分離（５０００Ｇ×１５分間）により該形質転換体を分離した。続いて、分離した該形質転換体を５０ｍＬの生理食塩水に再懸濁した後に、再度遠心分離（５０００Ｇ×１５分間）により該形質転換体を分離した。
【００７２】
分離した該形質転換体０．１ｇを２０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに０．５ｍＬのアクリロニトリル又はメタアクリロニトリルを添加して３０℃で緩やかに攪拌しながら１時間反応させた。反応終了後、ＨＰＬＣを用いて反応終了液の分析を行った結果、該液中には、添加したニトリル化合物（アクリロニトリル又はメタアクリロニトリル）に相当するモル量のアミド化合物（アクリルアミド又はメタクリルアミド）のみが存在しており、ニトリル化合物（アクリロニトリル又はメタクリロニトリル）及び対応する有機酸（アクリル酸又はメタクリル酸）の存在は認められなかった。すなわち、転化率及び選択率は１００％であった。
【００７３】
また、分離した該形質転換体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。その結果、該プラスミドはその配列中に配列表の配列番号６記載のニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質をコードするＯＲＦと配列表の配列番号７記載のロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦとを含んでいる事が確認された。このプラスミドをｐＪ１Ｈ−ＤＢ１（図２）と名付けた。
【実施例５】
【００７４】
改変前のニトリルヒドラターゼからの変異導入標的の抽出（１）
改変方法の対象として、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼを例として用いた。請求項１から７に記載された変異導入の標的となるアミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、標的の抽出を行った。請求項１・２記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントには、日立ソフト社製のＤＮＡＳＩＳを用いた。請求項３から７記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングには、アクセルリス社製のモデラー乃至ホモロジーを用いた。
【００７５】
その結果、何れの方法を用いた場合も、抽出されたアミノ酸残基の中に、該ニトリルヒドラターゼを構成する２種のポリペプチドの１つであるβサブユニットのアミノ酸配列中の４８番目のＴｒｐが含まれていた。そこで、変異導入標的として、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の４８番目のＴｒｐを例として用いる事とした。
【実施例６】
【００７６】
改変前のニトリルヒドラターゼからの変異導入標的の抽出（２）
改変方法の対象として、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼを例として用いた。請求項１から７に記載された変異導入の標的となるアミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、標的の抽出を行った。請求項１・２記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントには、日立ソフト社製のＤＮＡＳＩＳを用いた。請求項３から７記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングには、アクセルリス社製のモデラー乃至ホモロジーを用いた。
【００７７】
その結果、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域に存在するアミノ酸残基として抽出されたアミノ酸残基の内、該ニトリルヒドラターゼを構成する２種のポリペプチドの１つであるαサブユニットのアミノ酸配列中の３６番目のＴｈｒ、４８番目のＡｓｎを、もう１つのポリペプチドあるβサブユニットのアミノ酸配列中の３２番目のＶａｌ、３３番目のＡｌａ、３７番目のＰｈｅ、４０番目のＴｈｒ、４１番目のＰｈｅ、４６番目のＭｅｔ、４８番目のＬｅｕ、５１番目のＰｈｅ、６１番目のＡｌａ、７２番目のＴｒｐ、１１２番目のＬｙｓ、１１８番目のＰｈｅ、１２７番目のＬｅｕを、各々変異導入標的の代表例として用いる事とした。
【実施例７】
【００７８】
改変前のニトリルヒドラターゼからの変異導入標的の抽出（３）
改変方法の対象として、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼを例として用いた。請求項１から７に記載された変異導入の標的となるアミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、標的の抽出を行った。請求項１・２記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントには、日立ソフト社製のＤＮＡＳＩＳを用いた。請求項３から７記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングには、アクセルリス社製のモデラー乃至ホモロジーを用いた。
【００７９】
その結果、２量体形成に関与するαサブユニットとβサブユニット間の会合界面や２量体同士の会合に関与する界面を形成する領域に存在するアミノ酸残基として抽出されたアミノ酸残基の内、該ニトリルヒドラターゼを構成する２種のポリペプチドの１つであるαサブユニットのアミノ酸配列中の３６番目のＴｈｒ、１４８番目のＧｌｙ、１８８番目のＴｈｒ、２０４番目のＶａｌを、もう１つのポリペプチドあるβサブユニットのアミノ酸配列中の１０番目のＴｈｒ、３２番目のＶａｌ、３３番目のＡｌａ、１１２番目のＬｙｓ、１１８番目のＰｈｅ、１２７番目のＬｅｕ、１４６番目のＡｒｇ、１５０番目のＡｌａ、１６０番目のＡｒｇ、１６８番目のＴｈｒ、１７１番目のＬｙｓ、１７６番目のＴｙｒ、１８６番目のＬｅｕ、２１７番目のＡｓｐ、２１８番目のＣｙｓを、各々変異導入標的の代表例として用いる事とした。
【実施例８】
【００８０】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１）
ニトリルヒドラターゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に変異を導入する為に、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキットの原理及び操作方法に従った。
【００８１】
実施例４にて構築したロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＪ１Ｈ−ＤＢ１に、実施例５にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の４８番目のＴｒｐを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【００８２】
１０ｎｇのｐＪ１Ｈ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号１３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【００８３】
ＰＣＲ反応１及び２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、何れも増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μＬの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μＬずつ含む全量４７．５μＬのアニーリング溶液（組成はキットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。
【００８４】
アニーリング処理液にＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑを０．５μＬ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μＬとした後、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応３を行った。
【００８５】
ＰＣＲ反応３の反応終了液５μＬを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約１．９ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約１．９ｋｂのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。
【００８６】
精製した約１．９ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。同様に、ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIによりｐＪ１Ｈ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ｋｂのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。
【００８７】
この様にして得られた約１．９ｋｂと約２．７ｋｂのＤＮＡ断片をＤＮＡ連結反応に供した後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【００８８】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＪ１Ｈ−ＤＢ１と比較して、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の４８番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＴｒｐ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【００８９】
【表１】
2005160403.tif 000003
【実施例９】
【００９０】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の３６番目のＴｈｒを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【００９１】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号１４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【００９２】
ＰＣＲ反応１及び２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、何れも増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μＬの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μＬずつ含む全量４７．５μＬのアニーリング溶液（組成はキットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。
【００９３】
アニーリング処理液にＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑを０．５μＬ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μＬとした後、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応３を行った。
【００９４】
ＰＣＲ反応３の反応終了液５μＬを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約１．９ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約１．９ｋｂのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。
【００９５】
精製した約１．９ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。同様に、ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ｋｂのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。
【００９６】
この様にして得られた約１．９ｋｂと約２．７ｋｂのＤＮＡ断片をＤＮＡ連結反応に供した後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【００９７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列中の３６番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＴｈｒ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【００９８】
【表２】
2005160403.tif 000004
【実施例１０】
【００９９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（３）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の４８番目のＡｓｎを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１００】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号１５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１０１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１０２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列中の４８番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＡｓｎ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表３）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１０３】
【表３】
2005160403.tif 000005
【実施例１１】
【０１０４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（４）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の７１番目のＡｒｇを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１０５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号１６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１０６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１０７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列中の７１番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＡｒｇ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表４）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１０８】
【表４】
2005160403.tif 000006
【実施例１２】
【０１０９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（５）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の１４８番目のＧｌｙを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１１０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号１７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１１１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１１２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列中の１４８番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＧｌｙ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表５）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１１３】
【表５】
2005160403.tif 000007
【実施例１３】
【０１１４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（６）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の１８８番目のＴｈｒを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１１５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号１８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１１６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１１７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列中の１８８番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＴｈｒ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表６）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１１８】
【表６】
2005160403.tif 000008
【実施例１４】
【０１１９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（７）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の２０４番目のＶａｌを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１２０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号１９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１２１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１２２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列中の２０４番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＶａｌ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表７）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１２３】
【表７】
2005160403.tif 000009
【実施例１５】
【０１２４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（８）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１０番目のＴｈｒを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１２５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１２６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１２７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１０番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＴｈｒ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表８）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１２８】
【表８】
2005160403.tif 000010
【実施例１６】
【０１２９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（９）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の３２番目のＶａｌを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１３０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１３１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１３２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の３２番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＶａｌ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表９）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１３３】
【表９】
2005160403.tif 000011
【実施例１７】
【０１３４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１０）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の３３番目のＡｌａを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１３５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１３６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１３７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の３３番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＡｌａ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１０）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１３８】
【表１０】
2005160403.tif 000012
【実施例１８】
【０１３９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１１）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の３７番目のＰｈｅを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１４０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１４１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１４２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の３７番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＰｈｅ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１１）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１４３】
【表１１】
2005160403.tif 000013
【実施例１９】
【０１４４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１２）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の４０番目のＴｈｒを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１４５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１４６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１４７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の４０番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＴｈｒ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１２）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１４８】
【表１２】
2005160403.tif 000014
【実施例２０】
【０１４９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１３）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の４１番目のＰｈｅを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１５０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１５１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１５２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の４１番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＰｈｅ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１３）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１５３】
【表１３】
2005160403.tif 000015
【実施例２１】
【０１５４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１４）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の４６番目のＭｅｔを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１５５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１５６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１５７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の４６番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＭｅｔ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１４）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１５８】
【表１４】
2005160403.tif 000016
【実施例２２】
【０１５９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１５）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の４８番目のＬｅｕを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１６０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１６１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１６２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の４８番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＬｅｕ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１５）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１６３】
【表１５】
2005160403.tif 000017
【実施例２３】
【０１６４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１６）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の５１番目のＰｈｅを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１６５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１６６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１６７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の５１番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＰｈｅ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１６）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１６８】
【表１６】
2005160403.tif 000018
【実施例２４】
【０１６９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１７）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の６１番目のＡｌａを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１７０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号２９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１７１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１７２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の６１番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＡｌａ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１７）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１７３】
【表１７】
2005160403.tif 000019
【実施例２５】
【０１７４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１８）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の７２番目のＴｒｐを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１７５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１７６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１７７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の７２番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＴｒｐ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１８）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１７８】
【表１８】
2005160403.tif 000020
【実施例２６】
【０１７９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（１９）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１１２番目のＬｙｓを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１８０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１８１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１８２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１１２番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＬｙｓ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表１９）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１８３】
【表１９】
2005160403.tif 000021
【実施例２７】
【０１８４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２０）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１１８番目のＰｈｅを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１８５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１８６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１８７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１１８番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＰｈｅ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２０）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１８８】
【表２０】
2005160403.tif 000022
【実施例２８】
【０１８９】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２１）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１２７番目のＬｅｕを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１９０】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１９１】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１９２】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１２７番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＬｅｕ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２１）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１９３】
【表２１】
2005160403.tif 000023
【実施例２９】
【０１９４】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２２）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１４６番目のＡｒｇを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０１９５】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０１９６】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０１９７】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１４６番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＡｒｇ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
【０１９８】
下記の（表２２）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０１９９】
【表２２】
2005160403.tif 000024
【実施例３０】
【０２００】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２３）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１５０番目のＡｌａを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０２０１】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０２０２】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０２０３】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１５０番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＡｌａ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２３）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０２０４】
【表２３】
2005160403.tif 000025
【実施例３１】
【０２０５】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２４）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１６０番目のＡｒｇを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０２０６】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０２０７】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０２０８】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１６０番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＡｒｇ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２４）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０２０９】
【表２４】
2005160403.tif 000026
【実施例３２】
【０２１０】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２５）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１６８番目のＴｈｒを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０２１１】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０２１２】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０２１３】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１６８番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＴｈｒ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２５）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０２１４】
【表２５】
2005160403.tif 000027
【実施例３３】
【０２１５】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２６）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１７１番目のＬｙｓを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０２１６】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０２１７】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０２１８】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１７１番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＬｙｓ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２６）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０２１９】
【表２６】
2005160403.tif 000028
【実施例３４】
【０２２０】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２７）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１７６番目のＴｙｒを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０２２１】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号３９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０２２２】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０２２３】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１７６番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＴｙｒ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２７）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０２２４】
【表２７】
2005160403.tif 000029
【実施例３５】
【０２２５】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２８）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の１８６番目のＬｅｕを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０２２６】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号４０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０２２７】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０２２８】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の１８６番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＬｅｕ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２８）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０２２９】
【表２８】
2005160403.tif 000030
【実施例３６】
【０２３０】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（２９）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の２１７番目のＡｓｐを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０２３１】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号４１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０２３２】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０２３３】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の２１７番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＡｓｐ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表２９）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０２３４】
【表２９】
2005160403.tif 000031
【実施例３７】
【０２３５】
改変酵素獲得を目的とした変異導入（３０）
実施例３にてＭＴ１０８２２より調製したシュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼをコードするＯＲＦを含むプラスミド：ｐＰＴ−ＤＢ１に、実施例６又は７にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の２１８番目のＣｙｓを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
【０２３６】
１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応１は、配列表の配列番号４２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒・アニーリング（５５℃）３０秒・伸長反応（７２℃）２分間の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応１と同様の操作により行った。
【０２３７】
以後、実施例９と同様な操作を行って複数の形質転換体を得た。該形質転換体から各々プラスミドを調製し、ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて３７℃で１時間保温した後、フェノール抽出／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該ＤＮＡを精製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液に溶解させた。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。
【０２３８】
その結果、得られた形質転換体の有するプラスミドは、ｐＰＴ−ＤＢ１と比較して、シュードノカルディア サーモフィラ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列中の２１８番目のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列がＣｙｓ以外のアミノ酸をコードするコドンに相当する塩基配列に変化したものである事が判明した。
下記の（表３０）に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
【０２３９】
【表３０】
2005160403.tif 000032
【実施例３８】
【０２４０】
改変前のニトリルヒドラターゼと改変後の改変酵素との形質比較（１）
５００ｍＬのバッフル付三角フラスコに４０μｇ／ｍＬの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍＬの塩化コバルト・六水和物を含む１００ｍＬのＬＢ液体培地を５つ調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。各々の培地に終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した。
【０２４１】
各々の培地に実施例４にて得られた形質転換体Ｎｏ．２００と実施例８にて得られた形質転換体Ｎｏ．２０１から２０４の計５種類の形質転換体を１種類ずつ各々５つの培地に一白金耳植菌した。３７℃・1３０ｒｐｍにて約２０時間培養した後、各々の培養終了液から遠心分離（５０００Ｇ×１５分間）により各形質転換体を分離した。続いて、分離した各形質転換体を５０ｍＬの生理食塩水に各々再懸濁した後に、再度遠心分離（５０００Ｇ×１５分間）により各形質転換体を分離した。
【０２４２】
各形質転換体０．１ｇを２０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）に各々懸濁した後、１０ｍＬ×２本に分注した。従って各形質転換体当り２本、合計１０本の懸濁液が準備された。各形質転換体の懸濁液の１本には１ｍＬのアクリロニトリルを、もう１本にはメタアクリロニトリルを添加して、３０℃で緩やかに攪拌しながら１０分間反応させた。
【０２４３】
反応終了後、ＨＰＬＣを用いて各反応終了液の分析を行った結果、各液中には反応しきれなかった基質であるニトリル化合物（アクリロニトリル又はメタクリロニトリル）と、反応によって生じた生成物である対応するアミド化合物（アクリルアミド又はメタクリルアミド）とが存在していた。尚、対応する有機酸（アクリル酸又はメタクリル酸）の存在は認められなかった。
【０２４４】
各形質転換体ごとに、アクリロニトリルを基質とする反応で生成したアクリルアミドとメタクリロニトリルを基質とする反応で生成したメタクリルアミドとのモル比を比較した結果、下記の（表３１）に示す様な違いが観察された。アクリロニトリルとメタクリロニトリルを比較した場合、メタクリロニトリルの方が嵩高いニトリル化合物である事から、この結果は、より嵩高い基質を水和し易くなった改変酵素が得られた事を示している。
【０２４５】
【表３１】
2005160403.tif 000033
【実施例３９】
【０２４６】
改変前のニトリルヒドラターゼと改変後の改変酵素との形質比較（２）
５００ｍＬのバッフル付三角フラスコに４０μｇ／ｍＬの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍＬの塩化コバルト・六水和物を含む１００ｍＬのＬＢ液体培地を５７つ調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。各々の培地に終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した。
が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した。
【０２４７】
各々の培地に、ｐＰＴ−ＤＢ１によりＨＢ１０１を形質転換して得られた形質転換体Ｎｏ．０と実施例９から３７にて得られた形質転換体の内、Ｎｏ．４０、Ｎｏ．４０ｅ、Ｎｏ．４０ｆ、Ｎｏ．４２、Ｎｏ．４２ａ、Ｎｏ．４３、Ｎｏ．４４、Ｎｏ．４５、Ｎｏ．４６、Ｎｏ．４７、Ｎｏ．４８、Ｎｏ．４９、Ｎｏ．５０、Ｎｏ．５１、Ｎｏ．５２、Ｎｏ．５４、Ｎｏ．５５、Ｎｏ．５６、Ｎｏ．５７、Ｎｏ．５８、Ｎｏ．５９、Ｎｏ．６０、Ｎｏ．６１、Ｎｏ．６２、Ｎｏ．６３、Ｎｏ．６４、Ｎｏ．６５、Ｎｏ．６６、Ｎｏ．６７、Ｎｏ．６８、Ｎｏ．６９、Ｎｏ．７０、Ｎｏ．７１、Ｎｏ．７２、Ｎｏ．７３、Ｎｏ．７４、Ｎｏ．７５、Ｎｏ．７６、Ｎｏ．７７、Ｎｏ．７８、Ｎｏ．７９、Ｎｏ．８０、Ｎｏ．８１、Ｎｏ．８２、Ｎｏ．８３、Ｎｏ．８４、Ｎｏ．８５、Ｎｏ．８７、Ｎｏ．８８、Ｎｏ．８９、Ｎｏ．９０、Ｎｏ．９１、Ｎｏ．９２、Ｎｏ．９３、Ｎｏ．９４、Ｎｏ．９５の計５６種類の形質転換体を１種類ずつを各々の培地に一白金耳植菌した。３７℃・1３０ｒｐｍにて約２０時間培養した後、各々の培養終了液から遠心分離（５０００Ｇ×１５分間）により各形質転換体を分離した。続いて、分離した各形質転換体を５０ｍＬの生理食塩水に各々再懸濁した後に、再度遠心分離（５０００Ｇ×１５分間）により各形質転換体を分離した。
【０２４８】
各形質転換体０．１ｇを２０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）に各々懸濁した後、１０ｍＬ×２本に分注した。従って各形質転換体当り２本、合計１０本の懸濁液が準備された。各形質転換体の懸濁液の１本には１ｍＬのアクリロニトリルを、もう１本にはメタアクリロニトリルを添加して、２０℃で緩やかに攪拌しながら１０分間反応させた。
【０２４９】
反応終了後、ＨＰＬＣを用いて各反応終了液の分析を行った結果、各液中には反応しきれなかった基質であるニトリル化合物（アクリロニトリル又はメタクリロニトリル）と、反応によって生じた生成物である対応するアミド化合物（アクリルアミド又はメタクリルアミド）とが存在していた。尚、対応する有機酸（アクリル酸又はメタクリル酸）の存在は認められなかった。
【０２５０】
各形質転換体ごとに、アクリロニトリルを基質とする反応で生成したアクリルアミドとメタクリロニトリルを基質とする反応で生成したメタクリルアミドとのモル比を比較した結果、下記の（表３２）（表３３）（表３４）に示す様な多様性が観察された。アクリロニトリルとメタクリロニトリルの嵩高さを比較した場合、メタクリロニトリルの方が嵩高いニトリル化合物である。この結果は、改変前のニトリルヒドラターゼと比較して、基質特異性の変化した改変酵素が得られた事を示している。
【０２５１】
【表３２】
2005160403.tif 000034
【０２５２】
【表３３】
2005160403.tif 000035
【０２５３】
【表３４】
2005160403.tif 000036
【産業上の利用可能性】
【０２５４】
本発明は、生体触媒を用いた物質生産の分野に於いて有用である。その例としては、ニトリルヒドラターゼと呼称される酵素乃至該酵素を活性発現する生体を触媒とするニトリル化合物の水和によって対応するアミド化合物に転換する物質生産を挙げる事が出来る。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】ＭＴ１０８２２より抽出したプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１の制限酵素切断点地図である。（実施例３）
【図２】ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼを活性発現させる為に構築したプラスミドｐＪ１Ｈ−ＤＢ１の制限酵素切断点地図である。（実施例４）
【符号の説明】
【０２５６】
ｂｌａ：β−ラクタマーゼをコードするＯＲＦを示す。
ＣｏｌＥ１-ｏｒｉ：ＣｏｌＥ１系の複製開始部位を示す。
ｌａｃＺ：ｐＵＣ１８由来のラクトースオペロンのプロモーターおよびオペレーター領域を示す。
ＮＨα：シュードノカルディア サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードするＯＲＦを示す。
ＮＨβ：シュードノカルディア サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードするＯＲＦを示す。
Ｐ１６：シュードノカルディア サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与する事を特徴とする蛋白質をコードするＯＲＦを示す。
ｎｈｈＡ：ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードするＯＲＦを示す。
ｎｈｈＢ：ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードするＯＲＦを示す。
【図１】
2005160403.tif 000037
【図２】
2005160403.tif 000038
【配列表】
2005160403000001.app