(57)【要約】【課題】カロテノイド、とりわけアスタキサンチンを大量に生産することができる、海洋性微生物を提供する。【解決手段】カロテノイド生産性海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３として寄託されている）の育種により得られる、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌。具体例としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６として寄託された菌株ＴＳＵＧ１Ｃ１１、およびＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６として寄託された菌株ＴＳＮ１８Ｅ７をあげることができる。【選択図】    選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド生産性海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株の育種により得られることを特徴とする、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌。
【請求項２】
請求項１において、カロテノイドがアスタキサンチンであることを特徴とする細菌。
【請求項３】
請求項１又は２において、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６として寄託された菌株ＴＳＵＧ１Ｃ１１であることを特徴とする細菌。
【請求項４】
請求項１において、細胞内にカロテノイドを１．８重量％以上蓄積することを特徴とする微生物。
【請求項５】
請求項１又は２において、細胞内にアスタキサンチンを０．９重量％以上蓄積することを特徴とする微生物。
【請求項６】
請求項１，２，４，又は５において、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６として寄託された菌株ＴＳＮ１８Ｅ７であることを特徴とする細菌。
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載の細菌を培養し、菌体又は培養液からカロテノイドを回収することを特徴とする、カロテノイドの製造法。
【請求項８】
請求項７において、カロテノイドがアスタキサンチンであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は飼料・食品用色素、抗酸化剤として有用なカロテノイド、特にアスタキサンチンを産生する微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは従来よりサケ・マス・マダイなどの養殖魚類の色揚げに用いられており、また近年ではその抗酸化作用から健康食品などへの利用が検討されている化合物である。南極オキアミ等の甲殻類から抽出、或いは酵母や微細藻類などの培養により天然から得られるが、供給の安定性やコストの問題から現在では化学合成品が広く用いられている。しかしながら化学合成品には製法由来の不純物、とくに合成反応に用いられる劇薬類の混入の不安があり、安全性の面から天然品の供給が望まれている。一方で天然品には先に延べた供給の安定性やコストの問題があり、特に酵母や微細藻類の培養によって得られたものには副産物として脂肪酸エステル体が混在する問題があり、また細胞壁が硬いため、抽出に複雑な工程を経る必要があるという問題があった。
【０００３】
その改良として海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３号）の培養により得る方法が開示されている（例えば特許文献１参照）。当該発明によれば、この海洋性細菌を培養した後の菌体を回収した後、アセトンなどの有機溶媒と菌体を混和・攪拌するだけで容易にアスタキサンチンを抽出できるという利点がある。しかしながら当該細菌を培養して得られるアスタキサンチンは培養液１リットルあたり０．１ｍｇ程度であり、製造量の向上が望まれていた。また細菌の培養によるアスタキサンチンの製法としては土壌細菌を用いた製造法の記述があり、当該発明では１リットルあたり１２８ｍｇの製造例が報告されている（例えば特許文献２参照）。しかしながら、マスやマダイなど海産物の養殖に使用するためには、それらが生育する環境から得られた微生物を用いることが安全性の面から好ましいと考えられ、前述の海洋性微生物による製造法の改良が望まれていた。
【０００４】
【特許文献１】特開平７−１８４６６８号公報
【０００５】
【特許文献２】特開２００１−３５２９９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、カロテノイド、特にアスタキサンチンを大量に生産することができる海洋性微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、カロテノイド生産性海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株の育種により得られることを特徴とする、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌である。また本発明は、そのようなカロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌を培養し、菌体又は培養液からカロテノイドを回収することを特徴とする、カロテノイドの製造法である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【０００８】
本発明の微生物は海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株の育種により誘導された新規な微生物である。Ｎ−８１１０６株は海洋バイオテクノロジー研究所により発見された微生物であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３号として寄託されている。Ｎ−８１１０６株は細胞中にアスタキサンチンを主なカロテノイドとして蓄積するが、その他にβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、シス−アドニキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチンなどの多様なカロテノイドを蓄積することも知られている（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ＆  Ｍｉｋｉ  （１９９５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２８、１３９−１４４）。
【０００９】
本発明の微生物は、Ｎ−８１１０６株の育種により誘導されカロテノイド生産性が向上したものであるが、育種の方法としては自然突然変異により派生した優良菌株を選別していく方法などの他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することによって変異を加速させたのちに生産性が向上した菌株を選別していく方法や、以上の様な方法で得られた性質の異なる菌株同士を細胞融合させる方法など様々な方法を行なうことが出来る。特に変異原物質や紫外線を用いる方法は短期間に有用な菌株を得る方法として好ましく用いることが出来る。変異原物質としてはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル等の化合物を用いることができる。
【００１０】
一例をあげると、予め培養して得たＮ−８１１０６株の菌体を変異原物質の水溶液に懸濁して一定時間放置した後に、遠心分離などの方法で菌体を回収して変異原物質を除去した後に平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する。コロニーの選択は任意に多数のコロニーを選択、分離・液体培養を行ない、回収した菌体からカロテノイドを溶媒抽出し、抽出液の４８０ｎｍ付近の吸光度を測定することで行われる。この様にして一次選抜を行ない、次いで抽出液の組成をＨＰＬＣなどで分析してカロテノイド生産性の向上した菌株を絞り込むことにより優良な菌株を得ることができる。
【００１１】
このようにして本発明では、カロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌として、とりわけアスタキサンチン生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌として、ＴＳＵＧ１Ｃ１１を得た。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６として寄託されている。
【００１２】
またカロテノイド生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌としては、細胞内にカロテノイドを１．８重量％以上蓄積するものが好ましく、とりわけアスタキサンチン生産性が向上したアグロバクテリウム属細菌として、細胞内にアスタキサンチンを０．９重量％以上蓄積するものが更に好ましい。本発明では、このような細菌としてＴＳＮ１８Ｅ７を得た。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６として寄託されている。
【００１３】
本発明では、上述の細菌を培養してカロテノイドを製造することができる。培養の条件については特に限定はないが、振とう培養や通気攪拌培養等の好気的な条件が好ましく、培養時間としては２４時間〜２００時間程度、培養温度としては１５〜３５℃付近が好ましく、ｐＨとしては６〜９が好ましい。
【００１４】
用いられる培地としては、細菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであればいずれを使用してもよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・２水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００１５】
次に培養された菌体又は培養液からアスタキサンチンを回収する。回収の方法には特に限定はなく、アスタキサンチンが安定に効率よく回収されればいずれの方法でもよい。例えばアスタキサンチンを菌体から抽出する場合、抽出溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等を用いればよい。更に高速液体クロマトグラフィーなどによる精製を行ってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、カロテノイド生産性、とりわけアスタキサンチン生産性に優れたアグロバクテリウム属細菌が得られる。従って養殖魚類の色揚げ用飼料などとして有用なアスタキサンチンを効率よく製造することが可能になる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される物ではない。
【００１８】
（実施例１）  菌株の取得
表１に示す培地４０ｍｌにＮ−８１１０６株を植菌し、１００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコ中、２５℃、１００ｒｐｍで３日間振盪培養を行なった。この培養液のうち、０．５ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに回収し、１５０００回転、１０分間の遠心分離を行なって微生物菌体を回収した。この菌体をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（緩衝液Ａ）０．５ｍｌに懸濁し、次いで１．５ｍｇ／ｍｌのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略記する）水溶液１０μｌを加え、室温で１０分間放置した。１５０００回転、１０分間の遠心分離で菌体を回収し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰返してＮＴＧを除去した。さらに０．５ｍｌの緩衝液Ａに菌体を懸濁し、表２に示す組成の平板培地上に塗布して、２０℃で１週間静置培養を行なった。生じた微生物コロニーのうち赤色の強いものを選別し、表１に示す組成の培地で２０℃、１００ｒｐｍで５日間振盪培養を行なった。この培養液より経時的に培養液を採取して、その６６０ｎｍの濁度及びアスタキサンチン量を定量し、アスタキサンチン生産性が向上した菌株の選定を行なった。
【００１９】
アスタキサンチンの定量は以下の様に行なった。まず培養液１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに回収し、トミーＣＲ−１５型遠心分離器で１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行ない、菌体を得た。この菌体を２０μｌの純水に懸濁し、次いで２００μｌのジメチルホルムアミドを加えて振盪し、さらにアセトン５００μｌを加えてアスタキサンチンの抽出を行なった。抽出残渣をトミーＣＲ−１５型遠心分離器で１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行なって除去した後、ＴＳＫ  ｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）でアスタキサンチンを定量した。なお、アスタキサンチンの分離はＡ溶媒として純水とメチルアルコールの５対９５の混合溶媒、Ｂ溶媒としてメチルアルコールとテトラヒドロフランの７対３の混合溶媒を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＡ溶媒を５分間カラムに通過させた後、同じ流速でＡからＢへ５分間の直線濃度勾配を行ない、さらにＢ溶媒を５分間通過させることにより行った。アスタキサンチン濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のアスタキサンチン試薬（シグマ社製）で作成した検量線より濃度を算出した。
【００２０】
以上の操作で選定したアスタキサンチン生産性が向上した菌株に対し、二回目のＮＴＧ処理を実施した。ＮＴＧ処理及び菌株の選定の方法は、ＮＴＧ濃度を５μｇ／ｌとしたことのほかは、一回目の処理と同様に行なった。この操作で得られた菌株に対し、さらに紫外線処理を実施した。紫外線処理の方法は以下の通りである。すなわち、培養液約５ｍｌをシャーレにとり、安全キャビネット中の滅菌ランプから４０ｃｍ離れた位置に本シャーレを固定した。この状態で滅菌ランプを点灯し、１分間紫外線にさらした。その後、表２に示す平板培地に培養液を塗布し、以降ＮＴＧ処理の際と同様に菌株を選定した。この操作で選別した菌株に対し再度同じ条件で紫外線処理を実施し、菌株の選定をもう一度実施した。この操作では平板培地として表３に示す組成の培地を利用したが、その他の操作は前回と同様に実施した。この操作によりカロテノイド生産性が向上した菌株ＴＳＵＧ１Ｃ１１株を取得した。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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【００２３】
【表３】
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（実施例２）
表１に示す培地３００ｍｌにＴＳＵＧ１Ｃ１１株を植菌し、５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコ２５℃、１００ｒｐｍで４日間振盪培養を行なった。培養終了後の菌体量は６６０ｎｍの濁度測定により表した。培養終了後培養液１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに回収し、トミーＣＲ−１５型遠心分離器で１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行ない沈澱した菌体を得た。回収した菌体からのアスタキサンチンの抽出及びＨＰＬＣによるアスタキサンチンの定量は実施例１と同様に実施した。結果を表４に示す。本菌株の菌体収量は比較例１に示す元株であるＮ−８１１０６と同等であった。一方、培地１リットルあたり約１９ｍｇのアスタキサンチンを生産した。
【００２４】
（比較例１）
Ｎ−８１１０６株を用い、培養温度を２０℃、培養時間を５日とした他、実施例２と同様に培養及びアスタキサンチンの定量を行なった。その結果を表４に示した。実施例２に示す菌株の元株を用いたこの培養では実施例２とほぼ同等の菌体収量が得られたものの、アスタキサンチン生産量は培地１リットルあたり約１ｍｇにすぎなかった。
【００２５】
【表４】
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（実施例３）
実施例１と同様にして２回目のＮＴＧ処理まで行い、アスタキサンチン生産性が向上した菌株を得た。このようにして得られた菌株に対して２回目と同様な条件にてさらに３回目のＮＴＧ処理を実施し、そのうちの約１０００菌株について評価を行い、アスタキサンチン生産性が向上した菌株を得た。このようにして得られた菌株に対して２回目と同様な条件にてさらに４回目及び５回目のＮＴＧ処理を実施し、それぞれ約１０００菌株について評価を行い、アスタキサンチン生産性が向上した菌株のうち、最も生産性に優れた菌株ＴＳＮ１８Ｅ７を取得した。
【００２６】
（実施例４）  新規微生物の培養およびカロテノイドの定量
表５に示した組成の培地３００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、ＴＳＮ１８Ｅ７を植菌、２５℃で１日間、毎分１００回転の振とう速度にて培養を行なった。次いで表６に示した組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌、上記培養液５ｍｌを植菌、２５℃で約１８時間、毎分１００回転の振とう速度にて培養を行なった。さらに、表７に示す組成の培地約２．３Ｌを５Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた上記培養液１２５ｍｌを植菌、約１４４時間培養した。培養条件は温度が２２℃、ｐＨ７．０〜７．２、溶存酸素は飽和の２％の濃度になるよう攪拌により制御、通気は空気を１ＶＶＭにて供給した。ｐＨの制御はアルカリに１５％アンモニア水、酸に２Ｎの塩酸を使用した。またグルコースは５０％濃度を使用してアルカリのポンプと連動により供給し、６日間培養を行った。このようにして最終的には約２１ｇの乾燥菌体を得た。
【００２７】
菌体の一部からカロテノイドを抽出しＨＰＬＣにてカロテノイド量を定量し、結果を表８に示した。ＴＳＮ１８Ｅ７株は、菌体内にカロテノイドを１．９０重量％、アスタキサンチンを１．０４重量％蓄積した。
【００２８】
【表５】
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【００２９】
【表６】
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【００３０】
【表７】
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【００３１】
【表８】
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