(57)【要約】      （修正有）【課題】クロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株をより簡易に検出、定量化できる方法を確立する。【解決手段】特定の塩基配列を有するとともに、PCR法におけるプライマーとして機能することでクロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株の16SrDNAの特定領域を選択的に増幅させることのできるオリゴヌクレオチド。また、前記オリゴヌクレオチドをPCR法におけるプライマーとして機能させることで検体中に存在するDNAの増幅を試みる第１のステップと、前記第１のステップにおいて検体中のDNA濃度が増加した場合に、その検体中にクロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株が存在していると判定する第２のステップと、を有するクロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株を検出する方法。【選択図】図４
2005058023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のうちいずれかに記載の塩基配列を有するとともに、ＰＣＲ法におけるプライマーとして機能することでクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の１６ＳｒＤＮＡの特定領域を選択的に増幅させることのできるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
検体中に存在するクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を検出する方法であって、
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法におけるプライマーとして機能させることで検体中に存在するＤＮＡの増幅を試みる第１のステップと、
前記第１のステップにおいて検体中のＤＮＡ濃度が増加した場合に、その検体中にクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株が存在していると判定する第２のステップと、を有することを特徴とするクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を検出する方法。
【請求項３】
検体中に存在するクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を定量化する方法であって、
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを定量的ＰＣＲ法におけるプライマーとして機能させることでＤＰＨ−１株の初期ＤＮＡ濃度と閾値を越えたときのサイクル数との相関関係を予め決定しておく第１のステップと、
検体中に存在する微生物のＤＮＡを前記第１のステップで使用したプライマーを用いて定量的ＰＣＲ法により増幅させてその増幅させたＤＮＡの量が特定の閾値を越えたときのサイクル数を決定する第２のステップと、
検体中に存在するＤＰＨ−１株の初期ＤＮＡ濃度を、前記第１のステップで決定した初期ＤＮＡ濃度と閾値を越えたときのサイクル数との相関関係に基づいて、前記第２のステップにおいて決定したサイクル数より逆算して求める第３のステップと、を有することを特徴とするクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を定量化する方法。
【請求項４】
配列表の配列番号７、配列番号８のうちいずれかに記載の塩基配列を有するとともに、ＦＩＳＨ法におけるプローブとして機能することでクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の１６ＳｒＤＮＡの特定領域に選択的にハイブリダイゼーションすることのできるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
検体中に存在するクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を検出する方法であって、
請求項４に記載のオリゴヌクレオチドをＦＩＳＨ法におけるプローブとして機能させることで検体中に存在するＤＮＡとのハイブリダイゼーションを試みる第１のステップと、
前記第１のステップにおいて検体中に存在するＤＮＡとのハイブリダイゼーションが確認された場合に、その検体中にクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株が存在していると判定する第２のステップと、を有することを特徴とするクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株に特異的なオリゴヌクレオチド、及び、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の検出方法、定量化方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、地下水や土壌などが重金属や有機化合物などによって汚染されていることが問題となっている。なかでも特に問題となっているのが、毒性が指摘され、水質汚濁防止法等により有害物質として規制されているトリクロロエチレン（ＴＣＥ）やテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）などの有機塩素化合物による汚染である。これらの有機塩素化合物はクリーニング用洗浄溶剤や金属部品の脱脂洗浄、製品の原料などとして３０年以上前から諸産業で有用な溶剤として用いられてきている。
現在までに、ＰＣＥ、ＴＣＥは以下のような毒性を持つことが分かっている。急性毒性としては中枢神経の抑圧、皮膚障害、腎臓や肝臓の障害など、微量を長期間摂取した場合の慢性毒性としては指の麻痺、呼吸器や心臓への障害、視覚・聴覚障害などである。また、発がん性も指摘されており、報告されている癌への関与は肝臓ガン、食道ガン、子宮頸部ガン、非ホジキンリンパ腫などである。また、ＰＣＥ、ＴＣＥは土壌中に浸出すると、微生物の働きにより、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ｃＤＣＥ）へ分解されることも分かってきている。
【０００３】
ＰＣＥの人工的な浄化法としては、物理化学的手法と生物学的手法の２種類が考えられる。物理化学的手法では、ＰＣＥの揮発しやすいという性質を活かした「土壌ガス吸引技術」や「地下水揚水曝気技術」が開発・実用化されている。生物学的手法では、微生物などを利用して汚染環境を浄化するバイオレメディエーション（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）や、植物を利用したファイトレメディエーション（ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）が考えられている。前者のバイオレメディエーションは、基本的には分解や変換が可能な有機汚染物質が対象となるが、重金属のように金属そのものを除去しなければならない場合には、土壌から抽出して濃縮しなくてはならない。
このような場合には後者のファイトレメディエーションの利用が可能である。ファイトレメディエーションで植物体に濃縮された重金属などは、燃焼させた後  、取り出し、最終処分を行う必要がある。
【０００４】
バイオレメディエーションは微生物利用の形態から３つの方法に分類される。
一つ目の方法はバイオスティミュレーション（ｂｉｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）と呼ばれる方法で、リンや窒素などの無機栄養塩類やエネルギー源となる基質を添加したり、酸素を吹き込んだりすることによって汚染現場に既に生息している汚染物質分解微生物の分解能力を活性化し浄化するものである。二つ目の方法はバイオオーギュメンテーション（ｂｉｏａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）と呼ばれるもので、純粋培養した分解微生物や、集積培養した分解微生物群を外部から投入し浄化を行わせる方法である（［非特許文献１］参照）。三つ目の方法はナチュラルアテニュエーション（ｎａｔｕｒａｌ  ａｔｔｅｎｕａｉｏｎ）と呼ばれるもので、自然の浄化作用で分解されるのに任せて、どの程度分解されていくかをモニタリングするのものである。このようなバイオレメディエーション技術は現在、利用するプロセスにより以下の４種類に分類される。
●固体処理  （Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）
汚染した土壌を掘削・山積みにし、空気または酸素を通気しさらに水分や栄養塩類を添加して、土壌中の好気性微生物の活性を上げて浄化する方法。石油汚染の浄化に有効なバイオパイルに代表される。
●スラリー処理  （Ｓｌｕｒｒｙ  ｐｈａｓｅ  ｂａｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）
汚染土壌に水を加え、スラリー状にし、これを反応層中に移し、分解微生物や栄養物質を添加し、攪拌混合して処理する方法。汚染物質が難分解性でかつ高濃度である場合に適している。
●原位置処理  （Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）
有機物質で汚染された土壌に窒素やリンなどの栄養塩類さらに有機物、酸素、必要に応じて分解微生物を注入して微生物の活性を高める方法。
●バイオリアクター（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）
汚染した地下水を汲み上げて地上で反応装置を用いて処理する方法。排水および排ガスの処理に適用できる。
【０００５】
バイオレメディエーションを効率よく行なうためには、汚染現場の実態（汚染の広さ、汚染物質の量や濃度、分解菌の有無）を知る必要があり、その結果を踏まえた上で処理方法を決定する必要がある。このようなことから、ＰＣＥ等の有害物質を分解する分解菌の検出・定量化法の確立が強く求められている。
【０００６】
現在、環境中の全微生物からＤＮＡなどを抽出・増幅することができるようになったため、微生物群集の解析には、分子生物学的手法が用いられるようになっている。その基本は１６ＳリボソームＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）の解析である。１６ＳｒＤＮＡの配列を決定することで、各生物種の情報が得られることから生物系統進化・分類研究の有力な資料となっておりデータベース化されている（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ＩＩ：ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ．ｈｔｍｌ／）。これら分子生物学的手法を用いた微生物群集の解析は、大きくＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いた系統解析と遺伝子解析に基づく特定種の検出という２つの目的に分類される。
前者の系統解析を用いた方法は、環境サンプル中の混合微生物群集の遺伝子断片を増幅・分離した後、クローン化された各塩基配列から環境中に存在する微生物の系統を推察する方法で、アクリルアミドゲルに変性剤で濃度勾配をもたせて電気泳動を行ない分離するＰＣＲ−ＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｉｎｇ  Ｇｒａｇｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＰＣＲ産物を制限酵素処理し、電気泳動によりその断片を検出するＴ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）法、ＰＣＲ反応自体に定量性を持たせる定量的ＰＣＲ法などがある（例えば［非特許文献２］等を参照）。
後者の遺伝子解析をもとにした方法には、各微生物の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて特定種を検出する方法でＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法などがある。この方法は、微生物からＤＮＡを抽出することなく微生物のまま蛍光色素などで標識し、観察・検出する方法である。ＤＮＡの抽出やＰＣＲの増幅効率による影響を受けずに微生物を観察できる点でＰＣＲ法を用いた方法に比べて優れている。
【０００７】
そして、従来、ＰＣＥを分解する働きを持つ有力な微生物の一つとして、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１株）が知られている（［非特許文献３］参照）。
【０００８】
【非特許文献１】
加来伸夫，渡辺一哉，石油汚染バイオレメディエーションの安全性評価，生物工学会誌，８０，５２７−５２９（２００２）
【非特許文献２】
Ｋａｔｓｕｊｉ  Ｔａｎｉ，  Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｍｕｎｅｔａ，  Ｋａｎｊｉ  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｋａｔｓｕｔｏｓｈｉ  Ｓｈｉｂｕｙａ，  ａｎｄ  Ｍａｓａｏ  Ｎａｓｕ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＫＴ１  ｉｎ  Ｇｒｏｕｎｄｗａｔｅｒ  ｉｎ  ａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆｉｅｌｄ  ｂｙ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＣＲ      Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｒｉｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６８，４１２−４１６，２００２
【非特許文献３】
Ｃｈａｎｇ  Ｙ．  Ｃ．Ｈａｔｓｕ，Ｋ．  Ｔａｋａｍｉｚａｗａ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ    ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ，８９，４８９−４９１，２０００
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は、上述したクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株に特異的なオリゴヌクレオチドを利用することにより、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株をより簡易に検出、定量化できる方法を確立することを課題とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、以下の（１）〜（５）に記載した発明が構成される。
（１）  配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のうちいずれかに記載の塩基配列を有するとともに、ＰＣＲ法におけるプライマーとして機能することでクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の１６ＳｒＤＮＡの特定領域を選択的に増幅させることのできるオリゴヌクレオチド。
（２）  検体中に存在するクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を検出する方法であって、
前記（１）に記載のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法におけるプライマーとして機能させることで検体中に存在するＤＮＡの増幅を試みる第１のステップと、
前記第１のステップにおいて検体中のＤＮＡ濃度が増加した場合に、その検体中にクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株が存在していると判定する第２のステップと、を有することを特徴とするクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を検出する方法。
（３）  検体中に存在するクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を定量化する方法であって、
前記（１）に記載のオリゴヌクレオチドを定量的ＰＣＲ法におけるプライマーとして機能させることでＤＰＨ−１株の初期ＤＮＡ濃度と閾値を越えたときのサイクル数との相関関係を予め決定しておく第１のステップと、
検体中に存在する微生物のＤＮＡを前記第１のステップで使用したプライマーを用いて定量的ＰＣＲ法により増幅させてその増幅させたＤＮＡの量が特定の閾値を越えたときのサイクル数を決定する第２のステップと、
検体中に存在するＤＰＨ−１株の初期ＤＮＡ濃度を、前記第１のステップで決定した初期ＤＮＡ濃度と閾値を越えたときのサイクル数との相関関係に基づいて、前記第２のステップにおいて決定したサイクル数より逆算して求める第３のステップと、を有することを特徴とするクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を定量化する方法。
（４）  配列表の配列番号７、配列番号８のうちいずれかに記載の塩基配列を有するとともに、ＦＩＳＨ法におけるプローブとして機能することでクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の１６ＳｒＤＮＡの特定領域に選択的にハイブリダイゼーションすることのできるオリゴヌクレオチド。
（５）  検体中に存在するクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を検出する方法であって、
前記（４）に記載のオリゴヌクレオチドをＦＩＳＨ法におけるプローブとして機能させることで検体中に存在するＤＮＡとのハイブリダイゼーションを試みる第１のステップと、
前記第１のステップにおいて検体中に存在するＤＮＡとのハイブリダイゼーションが確認された場合に、その検体中にクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株が存在していると判定する第２のステップと、を有することを特徴とするクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株を検出する方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、「１．リアルタイム定量的ＰＣＲ法による解析について」、「２．ＦＩＳＨ法によるクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の検出」の２つのセクションに大別して詳細に説明する。
【００１２】
１．リアルタイム定量的ＰＣＲ法による解析について
〔ＰＣＲ法の原理について〕
まず、ＰＣＲ法及び定量的ＰＣＲ法の原理について簡単に説明する。
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法とは、特定のＤＮＡ配列を短時間で大量に増幅する技術である。原理は、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）、１本鎖ＤＮＡに相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドプライマを結合させるアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、そして、ＤＮＡの伸長反応を行なう伸長反応（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の３つのステップからなる反応を１サイクルとし、数十サイクル行ない目的とするＤＮＡ配列を増幅する。
理論的には１コピーの遺伝子が１サイクルで２倍に増えるのでｎ回のサイクルで２ｎコピーとなる。しかし、実際はサイクル初期の増幅効率の悪さや酵素の失活や基質の消費によるＰＣＲ反応効率低下（プラトー効果）が起こるため、増幅したコピー数は理論値よりも低く初期鋳型量をＩ、生成物の増幅率をＥ、サイクル数をｎとすると下記の［１式］のようになる。
ｙ＝Ｉ×Ｅｎ（１≦Ｅ≦２）  ・・・・・・［１式］
定量的ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）法には、２つの解析方法がある。１つ目は、ＰＣＲ反応で反応生成物がある程度の量までは指数関数的に増加し、その後プラトーに達するという特徴を利用し、指数関数的増加期に反応生成物量を解析し、初期鋳型量を算出する方法。２つ目は、反応生成物をリアルタイムでモニタリングすることにより、反応生成物量がある一定の値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超えるＰＣＲサイクル数（Ｃｔ）を決定する方法。どちらの解析方法にしても既知濃度のＤＮＡ量を変化させＰＣＲを行ない、各サイクル数における反応生成物を解析し、そのカイネティクスから定量性のあるＰＣＲサイクル数範囲を決定することが必要である。その結果をふまえて、未知のサンプル中における目的遺伝子の存在量を概算する。
【００１３】
〔共試菌株からのＤＮＡ抽出〕
クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株（以下、単にＤＰＨ−１株と称する場合がある）からのＤＮＡの抽出は、以下のようにして行った。
１２５ｍｌ容バイアル瓶に９５ｍｌのＭＹ培地を入れ、ビタミン溶液（ρ−アミノ安息香酸０．１ｍｇ／１００ｍｌとビオチン０．０００１ｍｇ／１００ｍｌ）と鉄溶液（硫酸鉄・７水和物  ０．０２ｇ／ｌ）をそれぞれ１％（ｖ／ｖ）ずつ添加し、ＰＣＥ分解を確認したＤＰＨ−１株の培養液を３％（ｖ／ｖ）植菌し、全量を１００ｍｌとし、３７℃のインキュベーターで１日間静置培養した。ＭＹ培地の組成は図１に示す通りである。
作成した培養液１００ｍｌを遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し、菌体をペレットとした。そこにＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ    １０ｍＭ、ＥＤＴＡ・２ＮＡ    １ｍＭ、ｐＨ  ８．０）を６ｍｌ加え再懸濁した後、細胞膜の浸透性を高めるためＦｒｅｅｚｅ−ａｎｄ−ｔｈａｗサイクル（−８０℃で凍結し、直ちに５０℃で融解）を５回繰り返し行なった。リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を１０ｍｇ添加し、穏やかに攪拌した  （ボルテックスミキサーの使用は控えた方がよい。以下の攪拌工程においても同様）  。１０％  ＳＤＳを７５０μｌ、２０  ｍｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｎａｓｅ  Ｋ  ７５μｌを添加し、攪拌し、３７℃で２時間インキュベートした。５Ｍ  ＮａＣｌ  ２．７ｍｌ、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ（２７０ｍＭ    ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ），７０ｍＭ  ＮａＣｌ）  ２．２５ｍｌを添加し、攪拌した後、６５℃で２０分間インキュベートした。反応液が常温になるまで放置し、等量のＣＩＡ（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：  Ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ＝２４：１）を添加し、１時間穏やかに攪拌した。遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）を行い、上清を別の遠心管に分取した。
分取した上清と等量のＰＣＩ（ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｈｅｎｏｌ：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：Ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｈｏｌ＝２５：２４：１）を加えて攪拌し、上清を別の遠心管に分取した。分取した上清Ｘｍｌに対して１０％（ｖ／ｖ）にあたる０．Ｘｍｌの３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．２）を加え攪拌した後、等量のイソアミルアルコールを添加し、室温で１０ｍｉｎ放置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）を行ない、上清を取り除いた。冷却した７０％  エタノール  ３ｍｌを添加し、遠心管の内部を洗浄するように静かに攪拌した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，２ｍｉｎ，４℃）を行ない上清を取り除いた。デシケーターを用いてペレットを乾燥し、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  １．５ｍｌを添加し４℃で一晩放置し、溶解させた。
【００１４】
〔電気泳動による抽出したＤＮＡの確認〕
抽出されたＤＮＡ  １μｌを含む電気泳動サンプル（ＤＮＡ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  （−ＸＣ：キシレンシアノール）２μｌ、ｄｄＨ２Ｏ  ９μｌ）を調整し、電気泳動槽に電気泳動アガロースゲル（０．７％  アガロース、０．５μｌ／ｍｌ  臭化エチジウム）を設置した後、分子量マーカーとしてλＥｃｏＴ１４Ｉｄｉｇｅｓｔを１０μｌ、サンプルを１２μｌずつウェルに入れた。１００Ｖで３０分間電気泳動を行ない、ＵＶトランスイルミナーター  ＦＡＳＩＩＩ（東洋紡績株式会社）により、画像解析を行なった。
【００１５】
〔ＲＮＡの処理〕
得られたＤＮＡにはＲＮＡが含まれているため、ＲＮＡの除去を行なった。上述の操作により得られたＤＮＡに対し、１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａを１％（ｖ／ｖ）添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、等量のＰＣＩを加えて、５〜１０分間穏やかに攪拌した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃）を行ない水相を新しいエッペンドルフチューブに分取した。分取した水相Ｘｍｌに対して１０％（ｖ／ｖ）にあたる０．Ｘｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと等量のイソアミルアルコールを加えてよく攪拌し、室温で２分間放置した後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃）し、上清をマイクロピペッターで取り除いた。７０％冷エタノールを１ｍｌ加えてエッペンドルフチューブ内を洗浄するように攪拌した後、  遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，２ｍｉｎ，４℃）し、上清をマイクロピペッターで取り除いた。得られたペレットを凍結遠心乾燥機で乾燥させ、等量のＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを加えて一晩放置し、溶解させた。
【００１６】
〔ＰＥＧ沈殿〕
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨの構造を持つ高分子エーテルアルコールで、重合度ｎによって様々な分子量を持つものが存在する。ＰＥＧはＤＮＡの水和水を奪うことで、ＤＮＡ分子の凝集を促進して沈殿させるものと考えられる。このとき、ＲＮＡはＤＮＡに比べ、リボースの２位の水酸基の分だけ親水性が高い。そのため凝集が起きにくく沈殿しないため溶液と共にＲＮＡを除去することが可能となる。
Ｒｎａｓｅ処理を行なったＤＮＡサンプルに等量のＰＥＧ溶液（１３％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００；平均分子量７，０００〜９，０００），  １．６Ｍ  ＮａＣｌ）を添加し、よく攪拌し、氷中にて４℃で一晩放置した。その後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，２ｍｉｎ，４℃）し、上清をマイクロピペッターで取り除いた。７０％冷エタノールを１ｍｌ加えてエッペンドルフチューブ内を洗浄するように攪拌した後、  遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，２ｍｉｎ，４℃）し、上清をマイクロピペッターで取り除いた。得られたペレットを凍結遠心乾燥機で乾燥させ、等量のＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを加えて一晩放置し、溶解させた。
【００１７】
〔ＤＮＡ濃度の測定〕
核酸溶液（ここではＤＮＡ）の濃度測定を行なう場合、測定するサンプル量が極めて微量であるためサンプルを適当な濃度になるように希釈したものを試料溶液として測定する。通常核酸溶液は、分光光度計により２６０ｎｍという短波長で測定されるが、その際、溶液中のタンパク質の混入も無視できないため、同時に２８０ｎｍでの吸光度も測定する必要がある。測定されたＯ．Ｄ．２６０  （ｑとする）  Ｏ．Ｄ．２８０（ｐとする）を用いて、下記の［２式］式により溶液中のタンパク質、フェノールの混入を確認することができる。このことは、例えば、文献「中山広樹著、バイオ実験イラストレイテッド  １、１９９５、秀潤社」等に開示されている。
ｐ／（ｒ−ｑ）＝１．８〜２．０    ・・・・・・［２式］
（１．８≦の場合、タンパク質・フェノールの混入）
また、試料とした核酸の性状により吸光係数が異なるため、試料中の核酸の性状に適した吸光係数を考慮する必要がある。２本鎖ＤＮＡの場合、吸光係数は０．０５であり、その際の濃度単位はμｇ／μｌである。そのため、核酸濃度は［３式］によって得られる。
核酸濃度（μｇ／μｌ）＝得られたＯ．Ｄ．２６０×希釈倍率×０．０５  ・・・・・・［３式］核酸測定用石英セル（容量４００μｌ）及びＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを用いて、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により、波長２６０ｎｍの校正を行なった。校正後、直ちに波長２８０ｎｍに変え、その際の吸光度を確認した。ＲＮａｓｅ処理、ＰＥＧ沈殿によりＲＮＡを除去したＤＮＡ溶液をＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを用いて、５０倍、１００倍、２００倍希釈したものを試料溶液とし、各試料溶液についてＯ．Ｄ．２６０を測定し、直ちに波長を２８０ｎｍに変え、Ｏ．Ｄ．２８０を測定した。測定されたＯ．Ｄ．２６０  （ｑとする）  Ｏ．Ｄ．２８０（ｐとする）の比から、溶液中のタンパク質、フェノールの混入を確認し、核酸濃度を算出した。
【００１８】
〔１６ＳｒＤＮＡの増幅〕
Ｒｎａｓｅ処理、ＰＥＧ沈殿処理によりＲＮＡを除去したＤＮＡ溶液を鋳型とし、１６ＳｒＤＮＡの増幅を行なった。４μＭに調整したバクテリアｆｏｒｗａｒｄプライマー２７Ｆとユニバースｒｅｖｅｒｓｅプライマー１５２５Ｒを２μｌずつ、ｄｄＨ２Ｏを２０．５μｌ、鋳型を０．５μｌ入れ全量２５μｌの反応系を調整した。このときに用いたプライマーの塩基配列を図２に示す（配列番号５及び配列番号６）。調整した反応系の中に、ＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘ  Ｔａｑ  ｐｒｅｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ）を２５μｌ入れＰＣＲを行なった。このときのＰＣＲ反応条件は、図３に示す通りである。反応終了後、核酸精製用スピンカラムを用いて、ＰＣＲ産物の精製を行なった。精製されたＰＣＲ産物は、電気泳動を行い（但し、ＤＮＡ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒは、−ＸＣではなく−ＢＰＢを用いた。）、目的とする遺伝子の増幅がなされていることを確認した。
【００１９】
〔塩基配列の決定について〕
本実施の形態では、塩基配列の決定にオートシークエンサーＡＢＩ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲ産物３μｌ、１０×シークエンシングプライマー１μｌ、Ｄｙｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １μｌ、希釈液（１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．８  ２６７μｌ、３Ｍ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ、Ｈ２Ｏ  ７３０μｌ）  ３．５μｌ、ジメチルスルホン酸（ＤＭＳＯ）  １μｌ、ｄｄＨ２Ｏ  １０．５μｌを混合し、全量２０μｌの反応系を調整し、シークエンス反応を行なった。シークエンス反応産物は、余分な塩・色素などを取り除くため、シークエンス反応精製スピンカラムを用いて精製を行なった。凍結遠心乾燥機を用いてシークエンス反応産物を凍結乾燥した。Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）を１２μｌ加え、１時間振とうした。その後、９５度で２分間ｄｅｎａｔｕｒｅを行なった後、サンプルを０．５ｍｌシークエンス用チューブに入れ、オートシークエンサーＡＢＩ３１０にて塩基配列を決定した。
【００２０】
〔プライマーデザイン〕
オートシークエンサーにて得られた塩基配列は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ＲＤＰ／）  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ＲＤＰ／）のＣＨＩＭＥＲＡ  ＣＨＥＣＫを行なった後、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴにより多重アライメントを行い、その結果から類縁種の１６ＳｒＤＮＡ配列を選択した。そして、得られた配列をＤＮＡＳＩＳ、  Ｓｅｑ  ｐｏｐ及びＣｌａｓｔａｌ  Ｗ１．６．１により多重アライメントを行なった。アライメントを行なった配列を目視にて、目的菌株と類縁種において異なる塩基配列を示す場所をプライマーの長さ及びＴｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値に注意し、２０ｍｅｒ程度の領域をいくつか選択した。また、Ｏｌｉｇｏ  ４．０−ｓを用いて、１６ＳｒＤＮＡの配列から最適プライマー領域を検索した。その際、Ｔｍ値、ヘアピン構造の有無に注意した。
リアルタイム定量的ＰＣＲでは、伸長反応のとき、増幅産物は完全な長さで増幅されて増えていくことを前提条件としているため、伸長反応時間内で完全に増幅できるように増幅産物の長さは２００ｂｐ以下になるように増幅産物の長さにも注意した。そして、最終的にＤＮＡＳＩＳ、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによる多重アライメントの結果、アライメント配列の目視及びＯｌｉｇｏ  ４．０−ｓによる最適プライマー領域の検索結果を総合的に評価してプライマーの設計を行なった。
【００２１】
〔プライマー評価〕
抽出・精製されたＤＰＨ−１株のＤＮＡを用いて、設計したプライマーの評価を行なった。設計したプライマーは、１１３０Ｆ（ｆｏｒｗａｒｄ）、１２２６Ｒ（ｒｅｖｅｒｓｅ）、１２９４Ｒ（ｒｅｖｅｒｓｅ）、１２１１Ｆ（ｆｏｒｗａｒｄ）の４種類であり、それぞれの塩基配列は図４に示す通りである（配列番号１〜配列番号４）。プライマーの組合せは、１１３０Ｆ＋１２９４Ｒ、１２１１Ｆ＋１２９４Ｒ、１１３０Ｆ＋１２３０ＲでＰＣＲを行なった。このときのＰＣＲ反応条件は図５に示す通りである。反応終了後、電気泳動を行ないＵＶトランスイルミネーターＦＡＳＩＩＩにより画像解析を行なった。各プライマーセットにおける増幅産物を比較し、各プライマーの評価を行なった。プライマーの評価を行なった後、ＤＰＨ−１株のときと同様の手順で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＲＨＴ−３、Ｃ．ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＲＨＴ−４よりＤＮＡ抽出・精製を行ない、各プライマーセットによりＰＣＲを行なった。反応終了後、電気泳動を行ないＵＶトランスイルミネーターＦＡＳＩＩＩにより画像解析を行なった。
【００２２】
〔リアルタイム定量的ＰＣＲによるＤＰＨ−１の検出〕
本実施の形態では、リアルタイム定量的ＰＣＲはＡＢＩ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。そして、検出色素には、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １を使用した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １は、２本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発する性質を持つ物質である。
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １を用いたアッセイの原理は、最初に鋳型となる２本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発する。次に、ｄｅｎａｔｕｒｅにより２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡになるとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １はＤＮＡから外れ、蛍光が減弱する。Ａｎｎｅａｌｉｎｇとｅｘｔｅｎｓｉｏｎ反応を経て、ＰＣＲ産物の増幅が起こり、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ反応終了後にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １が再び２本鎖ＤＮＡに結合することによって全体の蛍光が増加する。
ＡＢＩ７７００では、各サイクルの反応終了後にＣＣＤカメラにより蛍光を記録し、プロットしていくことでリアルタイムでの増幅産物の定量を行なっている。
【００２３】
〔純粋培養におけるＤＰＨ−１株の検出、標準曲線の作成〕
純粋培養したクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株からＤＮＡを抽出・精製し、ＤＮＡ濃度の測定を行なった。このＤＮＡを既知濃度のサンプルとして標準曲線を作成した。また、定量的ＰＣＲには、ｑＰＣＲＴＭＭａｓｔｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  ＳｙｂｒＴＭ  Ｇｒｅｅｎ１（ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ）を使用した。ｄｄＨ２Ｏを６．２５μｌ、１１３０Ｆと１２９４Ｒを２．５μｌずつ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１を０．７５μｌ、鋳型をＤＮＡ  ０．５μｌ、２×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ｄＮＴＰｓ（ｄＵＴＰを含む），Ｈｏｔ  Ｇｏｌｄｓｔａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ  ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ＲＯＸ）を１２．５μｌを加えて、全量２５μｌの反応系を調整した。調整した反応液を９６ｗｅｌｌ  プレートに移し、ＡＢＩ７７００を用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行い、データの解析を行なった。このときの定量的ＰＣＲの反応条件は図６に示す通りである。
【００２４】
〔リアルタイム定量的ＰＣＲ条件下でのプライマー評価〕
Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１、Ｃ．ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＲＨＴ−４、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．のゲノムをそれぞれ１０ｎｇずつ用意し、リアルタイム定量的ＰＣＲを行い、プライマーの特異性の評価を行なった。
また、環境中には、数多くの種の微生物が住んでおり、共存関係を取りながら生きており、単独で生活していることは稀である。そのため、その他の微生物との共生関係が定量的ＰＣＲの結果にどのような影響を与えるかを調べるため、Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１株と他の微生物１種類の培養液を混合し、一緒にＤＮＡ抽出を行なった。そして、リアルタイム定量的ＰＣＲを行ない、その影響について調べた。なお、各微生物の菌数は、図７（Ｃ．ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍ２１）、図８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、図９（Ｅ．ｃｏｌｉ）に示す培地を用いてそれぞれプレートカウント法によって確認した。
【００２５】
〔結果〕
（１）ＦＩＳＨ法及びリアルタイム定量的ＰＣＲには、オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブが必要であるため、これらがＤＰＨ−１株に対して特異的に作用する領域を決定する必要がある。
そこで、本実施の形態では、初めに全１６ＳｒＤＮＡについて検討を行ない、次いでＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌に特異的な領域を検討した。本実施の形態では、主に、１６ＳｒＤＮＡ配列における発現領域（Ｖ領域：ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ、Ｖ１〜Ｖ１０まで存在）に注目し、中でも細菌属に特異的な配列多く存在するといわれているＶ２、細菌種に特異的な配列が多く存在しているといわれるＶ３という２つの領域（３３９〜５３９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）をターゲットとし特異的領域を検討した。その結果、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株に特異的であろうと推測される幾つかの領域が得られた。得られた領域をもとに、これらの領域を増幅できるプライマー領域を検討した。その結果、ＤＰＨ−１株に特異的であると思われるプライマーを４つ設計することができた（配列番号１〜配列番号４）。設計されたプライマーの評価として、プライマーセット（１１３０Ｆ＋１２９４Ｒ）により、供試菌株、グラム陰性菌とその他のグラム陽性菌を用いてＰＣＲを行なった。このＰＣＲにより増幅させた１６ＳｒＤＮＡの電気泳動による解析結果を図１０に示した。図１０に示す写真において、上側に付された１〜６の番号及びＭの記号は、１：ＤＰＨ−１株、２：Ｃ．ｐｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、３：Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＲＨＴ−３、４：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＲＨＴ−４、５：Ｅ．ｃｏｌｉ、６：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｍ：１００ｂｐ  ｍａｒｋｅｒによる結果であることをそれぞれ示している。この結果より、ＤＰＨ−１株で目的とするサイズのバンド（約１５０ｂｐ）が増幅されていることが確認された。また、それ以外の微生物では増幅が見られなかったことから、設計したプライマーはＤＰＨ−１株に特異的なものであることが判明した。
【００２６】
（２）また、プライマーセットの一例として、プライマーセット（１１３０Ｆ＋１２９４Ｒ）を使用し、リアルタイム定量的ＰＣＲにより標準曲線を描いた。得られた標準曲線の一例を図１１に示す。標準曲線の式は、
Ｃｔ＝−２．９６９（ＬｏｇＣ０）＋２２．４２８      ｒ２＝０．９９６１
Ｃ０：初期ＤＮＡ濃度
Ｃｔ：閾値を越えたときのサイクル数
となった。これにより、検体中に存在するＤＮＡを１３０Ｆと１２９４Ｒのプライマーセットを用いて増幅させ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １を用いて１１３０Ｆと１２９４Ｒのプライマーセットを使用してＤＰＨ−１株を定量化することが可能であることが判明した。
【００２７】
すなわち、本実施の形態では、検体中に存在するＤＰＨ−１株の存在量を、以下の（ａ）〜（ｃ）のステップにより定量化する方法を確立することができた。
（ａ）リアルタイム定量的ＰＣＲにより、ＤＰＨ−１株の初期ＤＮＡ濃度Ｃ０と閾値を越えたときのサイクル数Ｃｔとの相関関係を、標準曲線を示す式やグラフなどの形で予め決定しておく。このとき、ＰＣＲ反応には、ＤＰＨ−１株の１６ＳｒＤＮＡの特定領域を特異的に増幅させるプライマーとして機能する、配列番号１〜配列番号４のいずれかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる。このようなプライマーとして、例えば図４に記載した４つのプライマー（１１３０Ｆ、１２２６Ｒ、１２９４Ｒ、１２１１Ｆ）を用いることができる。
（ｂ）検体中に存在する微生物のＤＮＡを、（ａ）のステップで使用したプライマーを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲにより増幅させる。そして、増幅させたＤＮＡの量が特定の閾値を越えたときのサイクル数Ｃｔを決定する。
（ｃ）検体中に存在するＤＰＨ−１株の初期ＤＮＡ濃度Ｃ０を、（ａ）で決定したＣ０とＣｔとの相関関係（標準曲線を示すグラフや式）に基づいて、（ｂ）で決定したサイクル数Ｃｔより逆算して求める。
【００２８】
（３）プライマーセットの一例として、プライマーセット（１１３０Ｆ＋１２９４Ｒ）のＤＰＨ−１株に対する特異性を調べた結果を図１２に示す。
ＤＰＨ−１株は、１０ｎｇ中９．７３ｎｇを定量することができ、その他には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＲＨＴ−４がほんの僅かに検出されただけで、それ以外は検出されないという結果となり、特異的にＣ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１株を検出できることが判明した。
【００２９】
（４）ＤＰＨ−１株と他の微生物とを混合したサンプルからＤＮＡを抽出し、プライマーセット（１１３０Ｆ＋１２９４Ｒ）を用いて定量的ＰＣＲを行なった結果を図１３に示す。Ｃ．ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＲＨＴ−４、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．を混合したすべてのケースにおいて、ＤＮＡの検出ができた。また、Ｃ．ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍを除き概ねコントロールである  ＤＰＨ−１株と同レベルぐらい検出することができた。したがって、他の微生物が共存しているような条件からでも、本実施の形態において設計した４つのプライマー（配列番号１〜配列番号４）を用いてＰＣＲを実行することにより、検体中に存在するＤＰＨ−１株を特異的に検出できることを確認することができた。
【００３０】
すなわち、本実施の形態では、検体中に存在するＤＰＨ−１株を、以下の（ａ）〜（ｂ）のステップにより検出する方法を確立することができた。
（ａ）配列番号１〜配列番号４のいずれかに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法におけるプライマーとして機能させて、検体中に存在するＤＮＡの増幅を試みる。
（ｂ）前記（ａ）の操作によって検体中のＤＮＡ濃度が増加した場合に、その検体中にクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株が存在していると判定する。
【００３１】
２．ＦＩＳＨ法によるクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の検出
以下では、ＤＰＨ−１株のＤＮＡの特定領域に特異的に作用するオリゴヌクレオチドを、ＦＩＳＨ法におけるプローブとして用いることでＤＰＨ−１株を検出する方法について説明する。
【００３２】
〔ＦＩＳＨ法の原理について〕
ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄａｉｚａｔｉｏｎ）法は、ある特定の遺伝子配列を標的として、蛍光色素などで標識した１本鎖ＤＮＡを相補性部位にハイブリダイゼーションさせて顕微鏡下で直接的に検出する方法である。本来、この方法は、染色体の遺伝子座を決定するために開発された技術である。近年では、遺伝子座の決定だけでなく細菌などの組織中のＤＮＡやＲＮＡの局在性の分析にも使われる。ＦＩＳＨ法は、Ｒ．  Ｉ．  Ａｍａｎｎの方法にしたがって行なった。この方法は、例えば文献「Ａｍａｎｎ，  Ｒ．Ｉ．：ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｃｏｌｏｇｙ  ｍａｎｕａ  ＩｎＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＥＣＯＬＯＧＹ  ＭＡＮＵＡＬ．  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ．Ｄ．Ｌ．Ａｋｋｅｒｍａｎｓ，  Ｊ．  Ｄ．  ｖａｎ  Ｅｌｓａｓ  ＆  Ｒ．  Ｊ．  ｄｅ  Ｂｒｕｊｉｎ．  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ  （１９９５）」等に開示されている。
【００３３】
〔供試菌株の固定化について〕
＜試薬＞
・  １×  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  （ＰＢＳ）
３×ＰＢＳを１×ＰＢＳとなるようにｄｄＨ２Ｏ（滅菌済み）で希釈した。
３×ＰＢＳ
３９０ｍＭ  ＮａＣｌ
３０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４
ｐＨ７．２
・４％パラホルムアルデヒド固定液
（あらかじめ調整しておいた２０％パラホルムアルデヒド（１ヶ月保存可能、要冷蔵）をｄｄＨ２Ｏ（滅菌済み）で４％に希釈した。また、２０％パラホルムアルデヒドは、ドラフトの中で粉末（パラホルムアルデヒド）にｄｄＨ２Ｏを加え、１０Ｍ  ＮａＯＨを数滴加えながら５０〜６０℃で温めて溶かした。）
ＭＹ培地において培養したＤＰＨ−１株の新鮮な培養液３００μｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移し、３倍量の４％パラホルムアルデヒドを添加し、４℃で一晩放置し、固定化した。固定化した菌体は、遠心分離（８０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，４℃）して上清をマイクロピペッターで除去した。固定化した菌体に１×ＰＢＳを５００μｌ加えて再懸濁し、遠心分離（８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）して、上清をマイクロピペッターで除去した。１×ＰＢＳを１０μｌ加えて、細胞壁浸透性の改善のため、ｆｒｅｅｚｅ−ａｎｄ−ｔｈａｗサイクルを５回繰り返した。等量のエタノール（氷冷済み）を添加し、ボルテックミキサーを用いてよく攪拌した。これを菌体固定化溶液とし、使用するまで−２０℃で保存した。
【００３４】
〔ハイブリダイゼーション用スライドガラスの調整〕
＜試薬＞
・  スライドコーティング水溶液
０．１％    ゼラチン
０．０１％    硫酸カリウムクロム（ＩＩＩ）
１０％    硫酸カリウムクロム水溶液を作成し、使用時に希釈して使用。  ８穴（φ８ｍｍ）のハイブリダイゼーション用スライドガラスを洗浄液に１時間浸し（アルカリ処理）、スライドガラスの表面の洗浄を行なった後、ｄｄＨ２Ｏですすぎ、風乾した。ウォーターバスにより、あらかじめ７０℃にしておいたスライドコーティング水溶液にスライドガラスを浸し、ゼラチンコーティングを行なった。その後、風乾した。
【００３５】
〔ゼラチンコーティングスライドガラスへの菌体固定〕
保存しておいた菌体固定液３μｌをゼラチンコーティングしたスライドガラスのウェルに添加し、風乾した。風乾した後、５０％、８０％、９９．５％エタノールの順番にそれぞれ３分ずつ浸し、固定化菌体を脱水固定し、再び風乾した。
【００３６】
〔ハイブリダイゼーション〕
＜試薬＞
・ハイブリダイゼーション緩衝液
２×ハイブリダイゼーション緩衝液（ｐＨ  ７．２）
１．８Ｍ  ＮａＣｌ
４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
１％  ＳＤＳ
ｘ％  ホルムアルデヒド
ハイブリダイゼーション緩衝液は、上記の組成の通り２×ハイブリダイゼーション緩衝液をあらかじめ調整しておいたものを用意しておき、各終濃度が１×ハイブリダイゼーション緩衝液、０．１％  ＳＤＳ、ｘ％  ホルムアルデヒド（ｘ：例．バクテリアプローブＥＵＢ３３８の場合５％、古細菌用プローブＡＲＣ９１５の場合３５％）となるように調整し、ハイブリダイゼーション緩衝液とした。
＜操作＞
ハイブリダイゼーション緩衝液を浸した密閉容器をウォーターバスを用いてあらかじめ６２℃に設定し、これを恒温チャンバーとした。菌体を固定化したスライドガラスの上に５０ｎｇ／μｌに調整したプローブ（図１４参照）１．０μｌを含む９．０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を滴下し、恒温チャンバーに素早く移動し、６２℃で２時間ハイブリダイゼーションを行なった。なお、この作業以降、全ての作業は遮光して行なった。ハイブリダイゼーションが終了した後、恒温チャンバーからスライドガラスを取りだし、あらかじめ６２℃で温めておいたハイブリダイゼーション緩衝液を用いてスライドガラスからプローブを洗い流し、ハイブリダイゼーションを停止した。２重染色を行なう場合は、この作業をもう一度行なった。その時、Ｔｄ（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値に注意し、Ｔｄ値の高いものからハイブリダイゼーション行なった。ハイブリダイゼーション緩衝液５０ｍｌが入った遠心管にスライドガラスを浸し、６２℃で２０分間インキュベートした。その後、ｄｄＨ２Ｏでスライドガラスを洗浄し、余分な塩を取り除いた。スライドガラスを風乾し、グリセロールとＰＢＳを１：１で混合させたものに０．１％（ｗ／ｖ）パラフェニレンジアミンを加えたものをスライドガラスのウェルに滴下し、カバーガラスを被せた後、共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ：ＣＬＳＭ）により観察を行なった。
【００３７】
〔ハイブリダイゼーション条件の最適化〕
最適ホルムアルデヒド濃度を決めるため、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアルデヒド濃度を０％、５％、１０％と変化させてハイブリダイゼーションを行なった。共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行ない、得られた画像を用いて、各ホルムアルデヒド濃度におけるハイブリダイゼーション効率を評価した。
【００３８】
〔ハイブリダイゼーションプローブの評価〕
本実験で設計したプローブを評価するため、グラム陰性細菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、グラム陽性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＲＨＴ−４を用いてハイブリダイゼーションを行なった。
上記菌体を用いて上述と同様な手順で菌体固定化溶液を調整し、ゼラチンコーティングしたスライドガラスのウェルに菌体を脱水固定した。ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアルデヒド濃度を変化させ、ハイブリダイゼーションを行なった。そして、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、得られた画像を用いて、ハイブリダイゼーション効率を評価した。
【００３９】
〔結果〕
本実施の形態では、ＤＰＨ−１株の１６ＳｒＤＮＡの特定領域に特異的にハイブリダイズすることのできる２つのプローブ（１６ＳＣ１３５及びＤＰＨ３０２）の設計を行った。そして、ＤＰＨ−１株に特異的なオリゴヌクレオチドプローブである１６ＳＣ１３５（配列番号７）、ＤＰＨ３０２（配列番号８）、及び、ユニバーサルプローブＵＮＩ１３９２（配列番号９）を用いてＦＩＳＨ法を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細菌を観察した。これら３つのプローブを構成するオリゴヌクレオチドの塩基配列は図１４に示す通りである。なお、１６ＳＣ１３５及びＤＰＨ３０２についてはＦＩＴＣでラベルを行い、ＵＮＩ−１３９２についてはカルボキシルローダミン（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）でラベルを行った。
最初に上記プローブの最適ホルムアルデヒド濃度の検討をＤＰＨ−１株を用いて行なった。ホルムアルデヒド濃度を０％、５％、１０％と変化させてＦＩＳＨ法を行なった。
そして、ＵＮＩ１３９２との２重染色を行ない最適ホルムアルデヒド濃度を５％と決定した。プローブの感度は１６ＳＣ１３５に比べてＤＰＨ３０２の方が高かった。次に、プローブの特異性を調べるためＣｌｏｓｔｒｄｉｕｍ  ｓｐ．ＲＨＴ−４、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．を用いてＦＩＳＨ法を行なった。その結果、ＤＰＨ３０２は、今回使用した供試菌株の中ではＤＰＨ−１にハイブリダイゼーションし、他の菌にはハイブリダイゼーションしないことが分かった。
【００４０】
すなわち、本実施の形態では、検体中に存在するＤＰＨ−１株を、以下の（ａ）〜（ｂ）のステップにより検出する方法を確立することができた。
（ａ）配列表の配列番号７もしくは配列番号８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＦＩＳＨ法におけるプローブとして機能させて、検体中に存在するＤＮＡとのハイブリダイゼーションを試みる。このようなプローブとしては、例えば図１４に記載した２つのプローブ（１６ＳＣ１３５、ＤＰＨ３０２）を用いることができる。
（ｂ）前記（ａ）の操作によって検体中のＤＮＡとのハイブリダイゼーションが確認された場合に、その検体中にクロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株が存在していると判定する。
【００４１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株に特異的なオリゴヌクレオチドを利用することにより、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株をより簡易に検出できる方法及び定量化方法を確立することができた。
【００４２】
【配列表】
2005058023.tif 000003
2005058023.tif 000004
2005058023.tif 000005
2005058023.tif 000006
2005058023.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＹ培地の組成を示す図である。
【図２】１６ＳｒＤＮＡの増幅に用いたプライマーの塩基配列を示す図である。
【図３】１６ＳｒＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ条件を示す図である。
【図４】ＤＰＨ−１株に特異的な４つのプライマーの塩基配列を示す図である。
【図５】プライマー評価のためのＰＣＲ条件を示す図である。
【図６】定量的ＰＣＲの反応条件を示す図である。
【図７】Ｃ．ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍ２１用の培地組成を示す図である。
【図８】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．用の培地組成を示す図である。
【図９】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用の培地組成を示す図である。
【図１０】プライマーセット（１１３０Ｆ＋１２９４Ｒ）による１６ＳｒＤＮＡの増幅を解析するための電気泳動の結果を示す写真である。
【図１１】リアルタイム定量的ＰＣＲによる標準曲線の一例を示す図である。
【図１２】プライマーセット（１１３０Ｆ＋１２９４Ｒ）のＤＰＨ−１株に対する特異性を調べた結果を示す図である。
【図１３】ＤＰＨ−１株と他の微生物とを混合したサンプルからＤＮＡを抽出し、プライマーセット（１１３０Ｆ＋１２９４Ｒ）を用いて定量的ＰＣＲを行なった結果を示す図である。
【図１４】ＦＩＳＨ法に用いた３つのプローブを構成するオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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