(57)【要約】      （修正有）【課題】ペプチドの複雑な混合物から、修飾されたペプチドを単離する方法を提供すること。【解決手段】（ａ）生物から蛋白質性調製物を得、ここで調製物は二つ又はそれ以上の異なる蛋白質に由来する修飾されたペプチドを含み、（ｂ）調製物を少なくとも一つの固定化された修飾特異的抗体と接触させ、及び（ｃ）工程（ｂ）に於いて固定化された修飾特異的抗体により特異的に結合された少なくとも一つの修飾されたペプチドを単離する、工程を含むものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの複雑な混合物から修飾ペプチド（modified peptide）を単離する方法であって、当該方法が、
（ａ）生物から蛋白質性調製物を得、当該蛋白質性調製物が二つ又はそれ以上の異なる蛋白質由来の修飾ペプチドを含み、
（ｂ）当該蛋白質性調製物を、固定化された修飾特異的抗体の少なくとも一つと接触させ、及び
（ｃ）工程（ｂ）に於いて固定化された修飾特異的抗体により特異的に結合された、少なくとも一つの修飾ペプチドを単離する、
工程を含むものである方法。
【請求項２】
方法が、（ｄ）工程（ｃ）で単離された修飾ペプチドを、マススペクトロメトリー（ＭＳ）、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）、及び／又はＭＳ３分析により特徴付ける工程を更に含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マススペクトロメトリーがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを含むものであり、タンデムマススペクトロメトリーがＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含むものであり、そしてＭＳ３分析がＬＣ−ＭＳ３を含むものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
方法が、（ｅ）工程（ｄ）の特徴付けの間に得られた修飾ペプチドのスペクトルを、検索プログラムを使用して公知のペプチド配列のスペクトルと実質的に適合させ、それによって修飾ペプチドの親蛋白質を同定する工程を更に含むものである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
蛋白質性調製物が、消化された粗細胞抽出物、消化された組織サンプル、消化された血清サンプル、消化された尿サンプル、消化された髄液サンプル、及び消化された脊髄液サンプルからなる群より選択される消化された生物サンプルを含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
消化された調製物が、少なくとも一つの蛋白質分解酵素又は化学的な開裂を使用することで得られるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
蛋白質分解酵素が固定化されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
蛋白質分解酵素が可溶性であり、消化された調製物が接触工程（ｂ）に先だって蛋白質分解阻害剤で処理されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）が、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって蛋白質性調製物を前精製することを更に含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）の固定化された抗体が、クロマトグラフィ−樹脂に共有結合したものである、又は蛋白質−Ａ若しくは蛋白質−Ｇ−アガロースに非共有結合したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
樹脂がカラム又はマイクロピペットチップ内に含まれるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）の固定化された抗体が、カラム内のクロマトグラフィ−樹脂に固定化されたものであり、当該カラムが工程（ｄ）の特徴付けのためのマススペクトロメーターに連結されているものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
修飾が、リン酸化を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
修飾ペプチドが、ホスホペプチドを含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
修飾特異的抗体が、少なくとも一つのリン酸化されたアミノ酸を含むモチーフを認識するものである、モチーフ特異的及びコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
モチーフが単一のリン酸化されたアミノ酸からなるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
モチーフがキナーゼ共通基質モチーフ又は蛋白質−蛋白質結合モチーフの全部若しくは一部を含むものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
キナーゼ共通基質モチーフが、ＭＡＰＫ共通基質モチーフ、ＣＤＫ共通基質モチーフ、ＰＫＡ共通基質モチーフ、ＡＫＴ共通基質モチーフ、ＰＫＣ共通基質モチーフ、ホスホスレオニン−Ｘ−アルギニン及びＡＴＭ共通基質モチーフからなる群より選択されるものであり、蛋白質−蛋白質結合が１４−３−３結合モチーフ又はＰＤＫ１ドッキングモチーフである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
修飾特異的抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）で単離された修飾ペプチドが、公知の疾患マーカーに対応するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）で特徴付けられた修飾ペプチドが、親蛋白質の未知の修飾部位を含むものである、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、（ｅ）工程（ｄ）で特徴付けられた修飾ペプチドの修飾状態を、参照サンプルに於ける対応するペプチドの修飾状態と比較し、蛋白質性調製物に於ける蛋白質の活性化を参照サンプルに於けるの蛋白質の活性化と比較する工程を更に含むものである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項２３】
蛋白質性調製物が疾患生物に対応し、参照サンプルが正常生物に対応するものであり、蛋白質活性化の比較が疾患に由来する活性化変化の情報を提供するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
蛋白質性調製物が組織生検細胞又は臨床液サンプルから得られるものであり、参照サンプルが疾患生物に対応するものであり、蛋白質活性化の比較が疾患の診断のための有用な情報を提供するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
蛋白質調製物が少なくとも一つの試験化合物で処理された生物又は調製物に対応し、参照サンプルが処理されていない生物又は調製物に対応し、蛋白質活性化の比較が、試験化合物による処理によって起こる活性化変化についての情報を提供するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
蛋白質活性化の比較が、疾患に於いて修飾されていることが前もって報告されていない親蛋白質に対応するものとして、工程（ｄ）で特徴付けられた修飾ペプチドを同定するものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
疾患が癌である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２８】
試験化合物が癌治療薬を含むものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
試験化合物がキナーゼ阻害剤を含むものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ペプチドの複雑な混合物からホスホペプチドを単離する方法であって、当該方法が、
（ａ）生物から蛋白質性調製物を得、当該蛋白質性調製物が二つ又はそれ以上の異なる蛋白質由来の修飾ペプチドが含み、
（ｂ）分画化された蛋白質性調製物を産生するために、逆相クロマトグラフィーで当該蛋白質性調製物中のホスホペプチドを分画化し、
（ｃ）分画化された蛋白質性調製物を、少なくとも一つのリン酸化されたアミノ酸を含むモチーフに結合する、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の固定化された抗体の少なくとも一つと接触させ、
（ｄ）工程（ｃ）の固定化された抗体が特異的に結合している、少なくとも一つのホスホペプチドを単離し、及び
（ｅ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）、及び／又はＭＳ３分析により、工程（ｄ）で単離された修飾ペプチドを特徴付ける、
工程を含むものである方法。
【請求項３１】
方法が、（ｆ）工程（ｅ）の特徴付けで得られた修飾ペプチドのマススペクトルを、検索プログラムを用いて公知のペプチド配列のマススペクトルと実質的に合致させ、それにより修飾ペプチドの親蛋白質を同定する工程を更に含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
マススペクトロメトリーがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを含むものであり、タンデムマススペクトロメトリーがＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含むものであり、ＭＳ３分析がＬＣ−ＭＳ３を含むものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ａ）が、ペプチドの複雑な混合物を産生するために蛋白質性調製物を消化する工程を更に含むものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）のモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体が、一般的なホスホチロシン特異的抗体、一般的なホスホスレオニン特異的抗体、又は一般的なホスホセリン特異的抗体を含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｃ）のモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体が、リン酸化されたキナーゼ共通基質モチーフ又は蛋白質−蛋白質結合モチーフに特異的である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
キナーゼ共通基質モチーフが、ＭＡＰＫ共通基質モチーフ、ＣＤＫ共通基質モチーフ、ＰＫＡ共通基質モチーフ、ＡＫＴ共通基質モチーフ、ＰＫＣ共通基質モチーフ、ホスホスレオニン−Ｘ−アルギニン及びＡＴＭ／ＡＴＲ共通基質モチーフ、ｐ８５Ｐ１３Ｋ結合モチーフ、ホスホスレオニンプロリンモチーフ、Ａｒｇ−Ｘ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅ−Ｘ−ホスホセリンモチーフ、ホスホセリン／ホスホスレオニン−Ｐｈｅモチーフ、ＰＬＫ共通基質モチーフ、並びにＤＮＡ損傷誘導基質モチーフからなる群より選択されるものであって、蛋白質−蛋白質結合が、１４−３−３結合モチーフ又はＰＤＫ１ドッキングモチーフである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｂ）の逆相クロマトグラフィーがＣ１８カラムを含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
方法が、工程（ｅ）の単離されたホスホペプチドを定量する工程（ｆ）を更に含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｆ）が、細胞培養物中のアミノ酸による安定な放射性同位体標識（ＳＩＬＡＣ）を用いて、及び／又は、絶対的なペプチドの定量（ＡＱＵＡ）技術を用いて、単離されたホスホペプチドを定量することを含むものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
硬質の、無孔又はマクロ細孔樹脂に固定化された、少なくとも一つの修飾特異的抗体を含有する支持体を含む、複雑な混合物から修飾ペプチドを単離するための免疫親和性単離装置。
【請求項４１】
支持体が、内径が約５０から３００マイクロメートルの細いキャピラリーカラム及びミクロピペットチップからなる群より選択されるものである、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
修飾特異的抗体が、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体を含むものである、請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
カラムが、マススペクトロメーターの電気スプレー源に連結されているものである、請求項４１に記載の装置。
【請求項４４】
３３５位のセリンがリン酸化されているときのみ、ユビキチン融合崩壊蛋白質１（ＵＦＤ１）に結合するが、この残基がリン酸化されていないときにはＵＦＤ１に実質的に結合しない抗体。
【請求項４５】
５８８位のセリンがリン酸化されているときのみ、蛋白質チロシンホスファターゼ１ｃ（ＰＴＮ６）に結合するが、この残基がリン酸化されていないときにはＰＴＮ６に実質的に結合しない抗体。
【請求項４６】
表５のカラム５に示されるリン酸化可能な残基がリン酸化されているときのみ、表５のカラム５に挙げられる蛋白質リン酸化部位に結合するが、それらの残基がリン酸化されていないときには、リン酸化部位に実質的に結合しない、抗体。
【請求項４７】
表６のカラム５に示されるリン酸化可能な残基がリン酸化されているときのみ、表６のカラム５に挙げられる蛋白質リン酸化部位に結合するが、それらの残基がリン酸化されていないときには、リン酸化部位に実質的に結合しない、抗体。
【請求項４８】
表７のカラム４に示されるリン酸化可能な残基がリン酸化されているときのみ、表７のカラム４に挙げられる蛋白質リン酸化部位に結合するが、それらの残基がリン酸化されていないときには、リン酸化部位に実質的に結合しない、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００１年６月２１日に出願され、放棄された米国出願番号第６０／２９９８９３号、及び２００１年１１月８日に出願され、放棄された米国出願番号第６０／３３７０１２号の優先権を主張し、並びに２００２年６月１９日出願され現在係属中の米国出願番号第１０／１７５４８６号及び２０００年３月２４日出願され現在係属中の米国出願番号第０９／５３５３６４号（この出願自体が１９９８年９月４日に出願されて現在は特許されている米国出願番号第０９／１４８７１２号の部分継続出願である）の部分継続（ＣＩＰ）出願であり、その開示されている内容は参照として本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明はペプチド並びにその単離及び特徴付けの方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
修飾による蛋白質の活性化とは、成長、発達、恒常性及び細胞コミュニケーションといった生物学的機構及び制御の殆どすべてを司る重要な細胞のメカニズムであるといえる。例えば蛋白質のリン酸化は、ガン、発達障害、自己免疫疾患及び糖尿病を含む多くの症状及び疾病の原因に於いて重要な役割を果たすものである。蛋白質の修飾は、その重要性にもかかわらず、分子レベルに於ける解明は未だ十分なものとはいえない。その理由としては、第一に細胞修飾システムは非常に複雑なものであること、第二にその複雑さを解明するのに必要な技術が未だ完全には開発されていないということが挙げられる。
【０００４】
プロテオームワイドなスケールでの蛋白質修飾の複雑さは、例えばキナーゼ等のゲノムでコードされる修飾蛋白質が非常に多いこと、また、これらの酵素によって修飾される基質蛋白質上に更に多くの修飾部位があること、成長、発達、罹患及び老化を通しての蛋白質発現のダイナッミックな機能の３つの要因に由来するものである。ヒトゲノムは例えば５２０を越える種々の蛋白質キナーゼをコードしており、これらは周知の酵素の中で最も種類が豊富なものである。Hunter, Nature 411: 355-65(2001)を参照されたい。これらのキナーゼの各々は、異なる基質内に含まれる、異なるアミノ酸配列又はモチーフに位置する特異的なセリン、スレオニン又はチロシン残基をリン酸化する。殆どのキナーゼは多くの異なった蛋白質をリン酸化するものであるが、ヒトゲノムでコードされる全ての蛋白質の三分の一がリン酸化されており、その多くは複数の部位で異なるキナーゼによってリン酸化されていると推定されている。Gravesら、Pharmacol. Ther. 82: 111-21 (1999)を参照されたい。
【０００５】
多くのこの様なリン酸化部位は、重要な生物学的プロセスを制御するものであり、分子医学に於ける診断及び治療上の重大な標的となるものである。例えばこれまでに同定されている１００以上の癌遺伝子のうち、４６がプロテインキナーゼである。上述のHunterの文献を参照されたい。ＥｒｂＢ２及びＪａｋ３のような発ガン性キナーゼは、胸部腫瘍及び様々な白血病に於いて広く発現しており、細胞蛋白質をリン酸化する機能を有することから、それぞれ少なくとも部分的に、細胞を発ガン性のフェノタイプへと形質転換する。これらのキナーゼによりどの蛋白質が修飾されているかを理解することは、例えば発ガン性の形質転換に内在する分子メカニズムについての我々の理解を大きく広げるものである。従って、広範な細胞蛋白質上の、例えばリン酸化部位の修飾部位を選択的に同定するといった能力は、主要なシグナル蛋白質及びガンのような疾患に関連する経路を理解するうえで重要な新しいツールとなるものである。
【０００６】
リン酸化ペプチドを精製する数種の方法が記載されているが、これらの方法は大きく制限されており、ゲノム又は細胞ベースのペプチド複雑な混合物から修飾ペプチドを単離又は精製するには不適当なものとしている。逆相ＨＰＬＣを用いる方法では、蛋白質はインビボ又はインビトロで放射性のリンで標識され、またそのタンパク質は、分析に先だって殆ど均一になるまで（サンプル中の蛋白質の少なくとも９５％を占めるようになるまで）精製される。例えば、WettenhallらのMethods Enzymol 201: 186-199 (1991)を参照されたい。次いで、高度に精製された蛋白質はペプチドを産生するために蛋白質分解酵素で消化され、単一の蛋白質のリン酸化部位を含む放射標識されたペプチドが、逆相ＨＰＬＣにより精製される。リン酸化されたペプチドは、個々のＨＰＬＣ分画の放射活性を測定することにより、リン酸化されていないペプチドと区別され、次いで化学的に配列決定される。
【０００７】
逆相ＨＰＬＣ法には、例えば細胞消化物といったペプチドの複雑な混合物から修飾ペプチドを精製するのに適さない主要な制限が幾つかある。この方法は組織生検サンプルのような、放射性標識することができない生物サンプルには適用できない。当該方法による精製過程での選択的なペプチドの消失はバイアスを生じるので、ＨＰＬＣ過程の前と後で最も目立った修飾ペプチドが必ずしも一致しない。この問題は、蛋白質の放射活性レベルが測定できるように最初に蛋白質を精製し、全てのそれに続く精製及び分析工程でサンプルの回収を厳密にすることにより対処される。従って、修飾された部位は複雑なペプチド混合物からは同定できない。ＨＰＬＣ法は、例えば一つの部位で蛋白質の数％（１０％以下）のみがリン酸化されているような、低レベルで修飾されている蛋白質に用いられた場合には大抵不成功に終わる。これは、リン酸化されていないペプチドの高いバックグラウンドに対してリン酸化ペプチドを均一に精製することが困難であること及び化学的配列を決定するには、ほぼ完全に均一であるリン酸化ペプチドが必要とされるからである。当該方法には更なる欠点がある。
【０００８】
研究者らは、蛋白質のリン酸化部位を同定するために、固定化されたリン酸化特異的抗体をマススペクトロメトリー（ＭＳ又はＭＳ／ＭＳ）に用いている。固定化された抗ホスホチロシン抗体は、アクチン結合蛋白質であるゲルゾリンの消化物からリン酸化ペプチドを精製するために使用されてきた。De Corteら、Prot Sci 8: 234-241 (1999)を参照されたい。しかしながら、所定の単一の蛋白質であるゲルゾリンは、消化されてゲルゾリン特異的なリン酸化ペプチドを得る前に、まずインビトロで精製されリン酸化された。固定化された抗ホスホチロシン抗体は、精製されたＥｐｈＢ消化物からＥｐｈＢホスホペプチドを同定するために（Kaloら、Biochem 38: 14396-408 (1999)）、またヒトαエノラーゼの精製された消化物から、αエノラーゼホスホペプチドを精製するために（Marcusら、Electrophoresis 21: 2622-2636 (2000)）、同様に使用されてきた。しかしながら、後者の試みに於いてはその手法は失敗に終わり、著者は、抗体とホスホペプチド間の低い結合親和性が、リン酸化部位の検出をほとんど不可能なものとしたと結論付けている（上記文献、２６３５ページ）。リン酸化特異的抗体は、リン酸化ペプチドを単離するのに一般的には適さないという有力な見解（Mercusらにより公表された）が、生物学的質量分析の分野で著名なな指導者らによる「蛋白質リン酸化分析の再考（a review on protein phosphorylation analysis ）」に於いて改めて表明された。Mannら、Trends in Biotech 20: 261-268 (2002)。
【０００９】
固定化されたエピトープ特異的抗体を用いた、消化された酵母細胞抽出物に於けるＴｙ１Ｇａｇ蛋白質エピトープの同定もまた報告されている。Yuら、J.Am.Soc. Mass. Spec. 9: 208-215 (1998)を参照されたい。しかしながら、固定化された抗体はＴｙ１Ｇａｇエピトープ特異的抗体であり（即ち、一般的な修飾特異的抗体ではなかった）、リン酸特異的ではなく、Ｔｙ１Ｇａｇという単一の蛋白質由来のペプチドのみを認識した。これらの手法はいずれも、多数の未精製蛋白質由来するペプチドの複雑な混合物からリン酸化ペプチドを選択的に単離するのに適した方法ではなく、そのほとんどは、望ましい蛋白質を適時に前もって精製しておくことを要求するものである。Mannら、Ann. Rev. Biochem 70: 437-73 (2001)で再考されている。
【００１０】
その他、広く用いられている修飾ペプチドの精製方法としては、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）がある。この擬アフィニティー（psuedo-affinity)精製法は、金属イオンとリン酸のようなマイナスに荷電したペプチド部分との相互作用に基づくものである。例えばPosewitzら、Anal Chem 15: 2883-2892 (1999)を参照されたい。前もって精製されたリン酸化蛋白質はペプチドへと消化され、リン酸化されたペプチドは、次いで、例えばイミノ二酢酸又はニトリロ三酢酸などの金属キレーターと共有結合させた樹脂を充填した小型化されたクロマトグラフィーのカラムに消化物を通過させて精製される。Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋、Ｇａ３＋、又はＣｕ２＋のようないくつかの金属塩の一つで樹脂を処理して、カチオンをキレーターと非共有結合させる。蛋白質消化物がカラムにのせられると、リン酸基のような十分に高いマイナスの荷電密度を有するペプチドは、金属カチオンに結合することができる。溶出したペプチドは、次いでリン酸化部位を決定するために、化学的な配列決定又はマススペクトロメトリー（ＭＳ又はＭＳ／ＭＳ）で分析する。
【００１１】
逆相ＨＰＬＣ法と同様に、修飾ペプチドのＩＭＡＣによる精製には、例えば細胞消化物といったペプチドの複雑な混合物から修飾ペプチドを精製するのに適さない制限が幾つかある。本方法は、例えばホスホペプチドはＩＭＡＣの条件に非常に敏感であることから、それぞれ望ましいサンプルによって合致した条件下で行われなければならない。単一の、特異的なリン酸化ペプチドを精製するのに最も適した金属とｐＨの組み合わせを見いだすために、ペプチドが４つの一般に使用されるカチオン全てに結合するのを３つの異なるｐＨ条件との組み合わせで試験する（試験条件は全部で１２通りとなる）といったことは、珍しいことではない。同一又は異なる蛋白質から、二番目の異なるホスホペプチドを単離するには、最初のものとは異なった二つ目の金属とｐＨの組み合わせを見いだすことが必要となる。ＩＭＡＣ法はリン酸化ペプチドに特異的なものではなく、いくつかのリン酸化されていないマイナスに荷電したアミノ酸残基を有するペプチド（アスパラギン酸やグルタミン酸のような）はＩＭＡＣ樹脂に結合することができ、精製されたリン酸化ペプチドと混在してコンタミネートする。この欠点は、混ざったリン酸化されていないペプチドのバックグラウンドレベルがリン酸化ペプチドのレベルを圧倒する（overwhelm）ことから、例えば部分的にリン酸化された蛋白質といった、蛋白質の少ないパーセンテージのみが修飾されているときに、特に問題となる。この理由から、ＩＭＡＣによる方法は、複雑なペプチド混合物から望ましい修飾ペプチドを単離するのに適していない。更に、本方法は例えばリン酸化残基のような修飾残基の型に特異的でなく、よって、ホスホセリン、ホスホスレオニン、又はホスホチロシンを有するペプチドの全てが結合し、ＩＭＡＣ樹脂から溶出される。
【００１２】
従って、当該分野に於いて、例えば多様な修飾蛋白質を含む消化された細胞抽出物といったペプチドの複雑な混合物から修飾ペプチドを単離するのに適する容易で、なおかつタイムリーな費用のかかる前精製の工程を必要としない、ペプチド単離／精製方法の開発が必要とされている。簡単で自動化しやすい、適当なペプチド単離方法の開発は、例えば活性化の状態を迅速にゲノムスケールでプロファイリングすること及び現在進行中のプロテオミクス時代の第一線である細胞シグナリング経路内で新規な診断又は治療の標的を同定することを可能にするものである。未だ解決されていない、このようなハイスループットな方法の必要性が、最近認識されている。例えばMann, Nat Biotech 17: 954-55 (1999)を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、以下の
（ａ）二つ又はそれ以上の異なる蛋白質に由来する修飾ペプチドを含む生物から蛋白質性調製物を得て、
（ｂ）調製物を少なくとも一つの固定化された修飾特異的抗体と接触させる、及び
（ｃ）固定化された修飾特異的抗体が特異的に結合した少なくとも一つの修飾ペプチドを単離する、
工程によりペプチドの複雑な混合物（細胞抽出消化物に存在するような）から修飾ペプチドを単離する方法を提供する。
当該方法は更に、
（ｄ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）、及び／又はＭＳ３分析により、工程（ｃ）で単離された修飾ペプチドを特徴付け、  
（ｅ）工程（ｄ）の特徴付けで得られた修飾ペプチドのスペクトルを、検索プログラム（Ｓｅｑｕｅｓｔ等の）を用いて公知のペプチド配列に対するスペクトルと実質的に適合させるそれによって修飾ペプチドの親蛋白質を同定する、
工程を含むものである。
本発明は更に、リン酸化、アセチル化、メチル化、ニトロシル化、及び／又はグリコシル化残基を含むがこれらに限定されない実質的にいかなるタイプの修飾されたアミノ酸をも含む修飾ペプチドの単離を包含するものである。単一の修飾されたアミノ酸又は複数のアミノ酸を含有する保存された修飾モチーフに結合する、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体が、本発明により開示されている方法で好都合に用いられる。
【００１４】
また、本発明の方法に従って複雑な混合物から修飾ペプチドを単離する免疫親和性装置、及び開示された手法の実施により見出された新規なＵＦＤ１及びＰＴＮ６リン酸化部位に対する抗体が提供される。
【００１５】
本発明の方法は、粗細胞抽出物のような複雑な混合物から、望ましいペプチド又は蛋白質の費用のかかるタイムリーな前精製を必要とすることなく、修飾ペプチドの迅速で効率的かつ直接的な単離（およびそれに続く特徴付け）を可能とする。本方法は、一段階免疫親和性単離を可能とし、それに続いて単一の抗体で、異なる修飾された蛋白質と多数のシグナル経路に対応する複数の異なる修飾ペプチドの特徴付けを可能にする。また、当該方法は更に、シンプルな前−分画の工程を含んでいてもよい。開示された方法が単純なものであり、単一の単離工程のみが必要とされるため、容易に自動化することもできる。本発明のさらなる利点と好ましい態様が、以下に詳細に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に従って、消化された細胞溶解物のようなペプチドの複雑な混合物から、修飾ペプチド（翻訳後修飾ペプチド）を単離する一般的な方法が提供される。一般的に、本方法は、
（ａ）生物から蛋白質性調製物を得、ここで調製物は二つ又はそれ以上の異なる蛋白質に由来する修飾ペプチドを含み、
（ｂ）蛋白質性調製物を少なくとも一つの固定化された修飾特異的抗体と接触させ、及び
（ｃ）工程（ｂ）に於ける固定化された修飾特異的抗体により特異的に結合された少なくとも一つの修飾ペプチドを単離する、
工程を含む。
好ましい態様に於いて、本方法は更に、
（ｄ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）、及び／又はＭＳ３分析、又は他の同等の手法により、工程（ｃ）に於いて単離された修飾ペプチドを特徴付ける、
工程を含む。
【００１７】
他の好ましい態様では、本発明は、ペプチドの複雑な混合物からリン酸化されたペプチドを単離する方法を提供するもので、当該方法は以下の、
（ａ）生物から蛋白質性調製物を得、ここで当該蛋白質性調製物には二つ又はそれ以上の異なる蛋白質由来の修飾ペプチドが含まれるものであり、
（ｂ）蛋白質性調製物を、少なくとも一つリン酸化されたアミノ酸を含有するモチーフと結合する、固定化されたモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体の少なくとも一つと接触させ、
（ｃ）工程（ｂ）で固定化された抗体によって特異的に結合された、少なくとも一つのリン酸化されたペプチドを単離し、及び
（ｄ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）、及び／又はＭＳ３分析により、工程（ｃ）で単離された修飾ペプチドを特徴付ける、
工程を含むものである。
好ましい態様では工程（ａ）は更に、ペプチドの複雑な混合物を産生するために、蛋白質性調製物を消化することを含むものである。もう一つの好ましい態様では、工程（ｂ）のモチーフは、キナーゼ共通基質モチーフ又は蛋白質−蛋白質結合モチーフの全部又は部分を含むもの、又は単一のリン酸化されたアミノ酸からなるものである。
いくつかの好ましい態様では、本方法は更に、
（ｅ）検索プログラムを使用して、工程（ｄ）の特徴付けの間に単離され、修飾されたペプチドに対して得られたスペクトルを公知のペプチド配列のスペクトルと実質的に合致させ、それにより修飾ペプチドの親蛋白質を同定する工程を含むものである。他の好ましい態様では、本方法は更に、ペプチドレベルをベースライン又はコントロール状態と比較するために、単離されたペプチドを定量する、例えばＳＩＬＡＣ又はＡＱＵＡ等の定量工程を含むものである。
【００１８】
本発明の方法は、異なる修飾された蛋白質及びシグナル経路の多数に対応する、複数の異なる修飾ペプチドの、単一の抗体による一段階単離（及びそれに続く特徴付け）を可能にする。当該方法はそれゆえ、ゲノムスケール（例えば細胞スケール又は生物スケール）での活性化状態のプロファイリングに適しており、容易に自動化できる。当該方法は、試験細胞又は液（例えば疾患細胞）中の多くの異なる蛋白質の、例えばリン酸化のような修飾状態を、参照細胞又は液（例えば健常な生物由来の正常な液）と比較することで、迅速に、細胞スケールでプロファイリングすることができる。
【００１９】
モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）な抗体が開示されている方法に於いて有利に使用される。これらの抗体は、モチーフがゲノム中の複数のシグナリング蛋白質に於いて生じる、様々な蛋白質のコンテキスト（context）に全く依存せずに、少なくとも一つの修飾された残基を含む一つ又はそれ以上のアミノ酸を含有する修飾された短いモチーフに結合する。モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体、その産生、その適用は米国特許出願第０９／１４８７１２号、Combら、（国際公開第００／１４５３６号公報）に開示されている。モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体を使用する、ゲノムスケールでの蛋白質のプロファイリングは、一般的に記載されている。
【００２０】
本発明の単離方法は、特に以下の点に関して、蛋白質の修飾部位を同定するための慣用的な方法を越えた顕著な有利さを有している。
（ｉ）本方法は、放射標識されていない、又はできない、生物サンプルに使用される。
（ii）ペプチドの複雑な混合物は一段階で分離され、分析に先立つ費用のかかるタイムリーな精製を必要としない。
（iii）本方法は、親和性クロマトグラフィーを使用し、蛋白質のリン酸化の全体的なレベルが非常に低いときでさえ、修飾ペプチドのみが精製され、修飾されていないペプチドが、精製された修飾ペプチド画分に夾雑しないため、ＩＭＡＣのような現存する方法よりもより特異的である。
（iv）本方法は親和性の精製により標的とされる修飾された残基の型を、複雑なで未精製の混合物から特異的に単離するものであり、本方法は前決定の、オーバーラップしていない修飾ペプチドのサブセットを単離するために使用できる（例えばホスホチロシン含有ペプチドは、ホスホチロシンのための一般的な蛋白質修飾抗体を使用して精製できる）。
（v）本方法は安定な抗体−抗原相互作用に基づくことから、異なるサンプルが分析されるように調節される必要がない。
（vi）蛋白質でなくペプチドが精製されることから、修飾された蛋白質に結合して一緒に溶出される非特異的なペプチド又は蛋白質を有する、現存の蛋白質単離方法に於いて認識されている問題点を未然に防ぎ、よって本方法は望ましい修飾された蛋白質以外の非特異的で一緒に単離された蛋白質と関連するバックグラウンドを減少させる。
そして、
（vii）本方法は現存の方法よりも単純で容易に使用でき、それゆえ高スループット自動化再産生に非常によく適している。
【００２１】
本明細書で使用される用語は、以下に示されていることを意味するものである。
「ペプチド」とは、例えばプロテアーゼ分解フラグメントのような、二つ又はそれ以上のアミノ酸長の配列を有する、完全な蛋白質のフラグメントを意味する。
【００２２】
「修飾ペプチド」とは、少なくとも一つ又はそれ以上の、例えば（しかしこれらに限定されるものではないが）、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニンのようなリン酸化されたアミノ酸、アセチルリジンのようなアセチル化されたアミノ酸等の、翻訳後に修飾されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものであり、修飾ペプチドは同じ型の複数の修飾された残基を含んでいてもよく（例えば二つ又はそれ以上のリン酸化された残基）、又は複数の異なる型の修飾された残基（例えばリン酸化された残基及びグリコシル化された残基）を含んでいてもよい。
【００２３】
「ペプチドの複雑な混合物」は、通常は修飾された及び修飾されていないペプチドを含むものである、二つ又はそれ以上の異なる親蛋白質に対応する、実質的に精製されていない、異なるペプチドの複数の混合物を意味する。
【００２４】
「蛋白質性調製物」とは、精製（例えばＩＭＡＣ前精製）されているか、されていないかに関わらず、例えば粗細胞抽出物、蛋白質分解消化物、血清等のような、細胞、組織若しくは生物の生体液（biological fluid）の一つ又はそれ以上からの、蛋白質及び／又はペプチドの調製物を意味する。
【００２５】
「抗体」は、天然又は組換え抗体、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦ（ｖ）フラグメントを含むそれらの誘導体又はフラグメントを意味する。
【００２６】
「修飾特異的抗体」は、一般的な修飾特異的抗体又はモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体を含む、単一の又は複数のアミノ酸を含有する修飾されたモチーフ部分としての、少なくとも一つの修飾されたアミノ酸に結合する抗体を意味する。
【００２７】
「一般的な修飾特異的抗体」は、例えばホスホチロシンやアセチルリジンなど、単一の修飾されたアミノ酸に特異的に結合する抗体を意味し、当該用語は、一つの修飾されたアミノ酸からなるモチーフに結合する、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体を含むが、これに限定されるものではない。
【００２８】
「モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体」とは、ペプチドに於けるモチーフ周辺のアミノ酸配列とは全く無関係に少なくとも一つの修飾されたアミノ酸を含む短いアミノ酸モチーフ（典型的には１乃至６の不変のアミノ酸）を特異的に認識するが（即ち、ほとんどではないが、多くのそれが生じるペプチドに於ける、修飾されたモチーフを認識する）、モチーフの修飾されていない形態を含むペプチドは認識しない抗体であり、(そのような抗体産物は、標的となるモチーフを含むゲノム内のペプチド又は蛋白質の複数を認識するものであり、既に上述のCombら、国際公開第００／１４５３６号公報に示されている)、抗体は単一の修飾されたアミノ酸又は少なくとも一つの修飾されたアミノ酸を含有する複数のアミノ酸を含むモチーフ（例えばキナーゼ共通基質モチーフの全部又は部分）に結合するものである。
【００２９】
「親蛋白質」とは、得られたペプチドが由来する（又はその可能性がある）蛋白質を意味する。
【００３０】
「ホスホペプチド」は、少なくとも一つ又はそれ以上のリン酸化されたアミノ酸を含むペプチドを意味し、及び
【００３１】
「蛋白質−蛋白質結合モチーフ」は、シグナル伝達蛋白質が、例えば１４−３−３結合モチーフ、ＰＤＫ１ドッキングモチーフ、ＳＨ２ドメイン、ホスホチロシン結合ドメイン等のような、標的蛋白質に結合することに介在する、短い修飾されたモチーフを意味する。
【００３２】
この発明の明細書で引用される文献の全ての教示は、参照として本明細書に取り込まれる。本発明の更なる態様、利点及び使用は、以下により詳細に説明される。
【００３３】
蛋白質性調製物（proteinaceous preparations）
本発明の方法に関連する修飾ペプチドを単離するのためのペプチドの複雑な混合物を含む蛋白質性調製物は、どのような望ましい生物からでも得ることができる。調製物は、例えば、バクテリア、酵母、虫、両生類、魚、植物、寄生虫、昆虫、又は哺乳動物から得ることができる。好まし態様に於いては、生物は哺乳動物である。もう一つの好ましい態様に於いては、哺乳動物はヒトである。当該方法は、一つ又はそれ以上の細胞の型若しくは生物由来の体液サンプルからの蛋白質性調製物に適用できる。蛋白質性調製物は、例えば標準的な方法による組織培養で細胞を成長させ、細胞を遠心により培養培地から取り出し、ソニケーション又は他の標準的な細胞破壊手段により細胞を溶解させることにより得られる。
【００３４】
蛋白質性調製物はまた、組織サンプルから直接得ることができる。好ましい態様では、組織サンプルは生検サンプルである。生体組織の小片で、通常５００ミリグラムより軽いものは、生物から直接取り出され組織培養することなく直接使用される。そのような生体組織の使用は、培養に於ける成長の結果として生じるようなアーティファクト（artifacts）を誘導することなく、組織の生物学的状態の直接分析を可能にする。生物由来のいかなる望ましい細胞型も使用できる。例えば、腫瘍細胞（例えば胸、前立腺由来など）は、癌に於ける蛋白質の役割を調べるために培養又は生検により得られる。神経細胞株は、神経伝達に含まれる蛋白質を特徴付けるために使用される。肥満細胞は、脂肪堆積のホルモン機構に含まれる蛋白質を調べるために培養又は生検により得られる。組織サンプル由来の蛋白質性調製物には、複数の細胞株又は細胞型（cell lines or types）由来のペプチド又は蛋白質が含まれる。更に、特異的な好ましい特質を有する細胞株（cell lines）は、例えばＡｋｔ蛋白質を過剰発現する細胞株（cell lines）のように、特定の経路に於いて重要な制御の役割を果たしていると考えられている蛋白質を過剰発現するように遺伝子操作される。他の好ましい態様では、蛋白質性調製物は、血清、尿、脊髄液又は髄液のような体液から得られる。血液サンプルからの調製物もまた、例えば赤血球のような細胞が最初に取り除かれているか否かにかかわらず、使用できる。
【００３５】
蛋白質性調製物は、例えば細胞及び組織の、ソニケーション、ホモジナイゼーション、磨耗、酵素による消化又は化学的可溶化といった標準的な方法によって得られる。一般的に細胞を可溶化するために使用される方法は、例えばバクテリアには酵素的な溶解、植物細胞には磨耗、動物細胞にはソニケーションといった、特異な細胞型（cell tipe）に対して最も一般的に使用されるものであるが、他の望ましい方法も好適に使用される。本発明の方法で使用する蛋白質性調製物は、免疫親和性の単離工程に先だって過剰に精製されている必要はない。例えば、尿サンプル又は血清サンプルは、直接分析できる。これはより少ないサンプルプロセッシングを許容し、低レベル修飾の同定の可能性を増加させ、細分化法が実験的に割り当てられた修飾の蛋白質性調製物プロファイルをバイアス又はゆがめることをより少なくさせるものである。
【００３６】
混合物は、粗細胞溶解物（例えば、組織培養、生検、血清由来の）、部分的に分画化された溶解物（例えば高度に精製された膜又は細胞小器官）、又は公知若しくは周知の組成（例えばインビトロの修飾反応、即ち、蛋白質修飾酵素が一つ又はそれ以上の基質と反応することを許すもの）であることができる。しかしながら、所望により、簡便な精製を、非蛋白質成分及び／又は、非シグナリング、構造蛋白質を、例えば赤血球を除去するための遠心、細胞性残骸及び細胞骨格蛋白質を除去するための超遠心、又はＤＮＡおよびＲＮＡを除去するためにヌクレアーゼのようなクラス特異的酵素で処理することにより、行うことができる。好ましい態様では、蛋白質性調製物は粗細胞抽出物又は液であって、過剰に精製されていないものである。
【００３７】
好ましくは、蛋白質性調製物は、例えばリン酸化状態のようなインビボ活性化状態、例えば胸癌細胞のような与えられた細胞に於ける蛋白質のベースラインを示すために得られる。しかしながら、蛋白質性調製物は誘導剤で前処理された細胞又は生物から得られるものである。例えば、組織培養に於いて成長した細胞は、カリクリン又はオカダ酸（okadaic acid）のような、細胞性ホスファターゼを阻害することにより、細胞性ホスホプロテインレベルをかなり上昇させるような化学物質にさらされる。一方で、経路に於けるかなり狭くより特異的なホスホプロテインのセットが、上皮成長因子のような、特定のシグナル経路を活性化するホルモンで処理することにより、誘導される。生物はまた、薬剤又は病原菌により処理することができ、これらの処理の効果は生物由来の特定の組織又は液を単離及び分析することにより評価される。
【００３８】
ペプチドの複雑な混合物を得るために、非常に多様な異なる蛋白質を含む蛋白質性調製物が、例えばトリプシン又は化学開裂試薬等の適した蛋白質分解酵素で消化される。顕著に消化された蛋白質性調製物（即ち、蛋白質に対してほとんどがペプチドである）を生じる、例えばＬｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、サーモリシンなどの適したいかなる酵素でも使用できる。好ましい態様では、酵素はトリプシンである。所望により、二つ又はそれ以上の異なる蛋白質分解酵素による消化が、マススペクトルメトリー分析に適したより小さいペプチド（例えば、現在のＭＳ方法のため、長さが約３０アミノ酸又はそれ以下）を産生するために行われる。蛋白質の消化は酵素溶液中で行われるが、調製物が固定化された抗体と接触する前に、遠心又はろ過により容易に取り除くことができることから、固定化された蛋白質分解酵素（例えば、Applied Biosystems, inc., Framingham,MA から入手可能なトリプシン−ＰＯＲＯＳ−樹脂、MoBiTec、Marco Island, FLから入手可能なトリプシン−マトリックスＦ７ｍ）で蛋白質性調製物を消化することが好ましい。可溶性の蛋白質分解酵素が使用されるときには、蛋白質分解酵素が固定化された抗体分子を分解しないように、蛋白質性調製物が免疫親和性の精製装置と接触させられる前に、消化物は好ましくはＰＭＳＦ又はα−２−マクログロブリンのような阻害剤で処理される。あるいは、可溶性蛋白質分解酵素は、固定化抗体との接触に先立って、固相抽出によりペプチドの前分画により除去される。消化は、完全な消化が行われるのに十分な時間、即ち、プロテアーゼにより開裂できる全てのペプチド結合が開裂するのに十分な時間行われる。しかしながら、意図的に又はそうでなくとも、もし消化が不完全な場合には、部分的に消化されたペプチド間の重なり合いが、リン酸化部位が正しく割り当てられることのさらなる証拠を提供する。即ち、不完全な消化によるペプチドのオーバーラップにより、同じリン酸化部位が一つ以上のペプチドに於いて見出されるときには、その部位の割り当てはより信頼性が高い。好ましい態様では、例えばキモトリプシン、サーモライシン又はエラスターゼなどの非常に様々な残基を開裂できるプロテアーゼが、重なり合う配列を有するペプチドを計画的に産生するように消化に使用される。
【００３９】
好ましくは、本発明の方法で使用される蛋白質性調製物は、二つ又はそれ以上の異なる蛋白質由来の、例えばホスホペプチドのような修飾ペプチドを含んでおり、ほとんどの場合、多くの異なる蛋白質由来の修飾ペプチドを含んでいる。蛋白質性調製物は通常、修飾されていないペプチドと同様、修飾された多くの異なる型の複雑な混合物を含んでいる。例えば、そのような混合物は、リン酸化、アセチル化、メチル化、リン酸化、ニトロシル化、又はグリコシル化、その他で修飾ペプチドを含む。例えばKrishnaら、Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 67: 265-98 (1993)、Parekhら、Curr Opin Biotechnol 8: 718-23 (1997)を参照されたい。
【００４０】
好ましい態様では蛋白質性調製物は、二つ又はそれ以上の異なる蛋白質由来のホスホペプチドを含む。従って、これらの修飾ペプチドの複雑な混合物は、例えばリン酸化状態のような、ゲノムスケール又は細胞スケールでの与えられた生物又は細胞型に於けるシグナル経路の活性化状態を反映し、よってその生物に於ける活性化状態のスナップショットを提供する。蛋白質性調製物に於ける修飾ペプチドの複雑な混合物は、ベースライン、与えられた生物又はセルラインに於けるインビボ活性化状態を反映するが、上記考察のように、活性化状態に於ける処理の効果を反映するために、処理された細胞に於ける活性化状態を反映するものである。
【００４１】
ある好ましい態様では、蛋白質性調製物は、消化された粗細胞抽出物、消化された組織サンプル、消化された血清サンプル、消化された血液サンプル、消化された尿サンプル、消化された髄液サンプル、消化された髄液サンプルからなる群より選択される消化された生物サンプルを含むものである。消化された調製物は、トリプシンのような少なくとも一つの蛋白質分解酵素を使用して得られる。好ましい態様では、蛋白質分解酵素は固定化されている。他の好ましい態様では、蛋白質分解酵素は可溶性であり、消化された調製物は、接触工程（ｂ）に先立って、プロテオライシス阻害剤で処理される。
【００４２】
好ましい態様では、修飾ペプチドが同定され、同時にそれらのサンプル内でのレベルが測定されるように、本方法は定量的マススペクトロメトリー手法と共に行われる。見過ごされたのではなく、ペプチド探したけれども見出せないということであるから、定量的マススペクトロメトリー手法が使用されるときには、修飾ペプチドの欠如はより意味深い。更に、二つのサンプル中に修飾ペプチドが非常に異なったレベルで存在したとしても、この違いはたとえそれが研究されているシステムの主要なものであっても、定量的な同定研究に於いて容易に認識されない。ＳＩＬＡＣ（細胞培養物内のアミノ酸による安定な放射性同位体標識）は、例えば薬剤処理された細胞株（cell line）が、処理されていない同じ細胞株（cell line）と比較できるように、二つの細胞培養サンプルの相対的な定量に使用することができる。例えばOngら、Mol. Cell. Proteomics 5: 376-86 (2002)を参照されたい。他の定量的マススペクトロメトリー戦略は、ＡＱＵＡと呼ばれる絶対的な定量のためのものである。Gerber, Rushら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 6940-5 (2003)を参照されたい。ＡＱＵＡに於いてサンプルは、参照コントロールとなる合成ペプチド標品と比較される。ＳＩＬＡＣと異なり、ＡＱＵＡはマススペクトロメトリーに基づくアッセイの開発により適しており、細胞培養物と同様に組織サンプルに適用することができる。
【００４３】
免疫親和性単離
様々な蛋白質由来の修飾された及び修飾されていないペプチドの複雑な混合物を含む蛋白質性調製物は、殆どではないとしても、多くの固定化された抗体が特異的である修飾を含むペプチドを単離するために、固定化された修飾特異的抗体（例えば抗ホスホスレオニン抗体）と接触させられる。適切な修飾を伴うペプチドは、固定化された抗体と結合する一方、修飾されていないペプチド及び／又は他の修飾を有するペプチドは結合しない。よって、開示された方法による免疫親和性の精製は、実質的に精製されていないペプチドの複雑な混合物から、（異なる蛋白質に由来する）広範囲の所望ペプチドの一段階単離を可能にする。
【００４４】
好ましい態様では、抗体はアガロース、ポリスチレン、又はシリカのような不活性クロマトグラフィー樹脂に、標準的な技術によって共有結合される。要するに、抗体分子のカルボハイドレート基は反応性のアルデヒド基へ酸化され、それから誘導されたクロマトグラフィ−樹脂のヒドラジン基へ共有結合する。例えばHoffmanら、J. Immunol. Methods 9: 113-120 (1988)を参照されたい。抗体のカルボハイドレート基は、抗原認識には必要とされず、化学修飾はペプチドに結合するその能力を妨害しない。標準的な方法又はその他の方法を使用して、抗体は高濃度でクロマトグラフィー支持体に結合され、抗体が樹脂に共有結合されていることから、それらは支持体から浸出されず、精製されたサンプルを夾雑しない。あるいは抗体は、他の好ましい態様に於いて、前もってアガロース樹脂に共有結合された、プロテインＡ又はプロテインＧに非共有結合により固定化される。抗体をアガロースに共有結合するよりも、プロテインＡ−又はプロテインＧ−アガロースに抗体を固定化するほうが簡単である。しかしながら、プロテインＡ又はプロテインＧ支持体に固定化された抗体は、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧと抗体の相互作用が抗体からペプチドを溶出するために使用される条件によって乱されることから、たった一度しか使用できないという不利な点がある。蛋白質性調製物内のペプチドの複雑な混合物がバッチ又はカラム形態で抗体樹脂と接触させられるとき、抗体−樹脂は、低レベルで存在する場合に於いても（即ち、ピコモル量）、選択的に修飾ペプチドに結合する。
【００４５】
例えば、バッチ形態に於いて、蛋白質性調製物は抗体−樹脂とスラリーとして混合することで接触させ、結合したペプチドを有する抗体−樹脂は、それから遠心、ろ過などにより除去される。あるいは、カラム形態に於いて、共有結合した抗体−樹脂は、クロマトグラフィーカラムの内部に／パックされて含まれ、蛋白質性調製物はカラムに通され、固定化された抗体により認識されるペプチドがカラムに保持され、認識されないペプチドはカラムを通過する。抗体−樹脂は、他の好ましい態様では、マイクロピペットチップ内に含まれる。
【００４６】
カラムサイズ、流速、及び条件（例えばｐＨ、緩衝液の選択）は、標準的な技術に従って選択される。低いレベルのサンプルには、ＢＳＡのような物質、界面活性剤（detergent）、又はポリマーが、吸着による非特異的なペプチドのロスを防ぐために、固定化された抗体と接触させるのに先立って、蛋白質性調製物へ添加される。免疫親和性精製工程は、サンプル内の全ての修飾ペプチドが量的に（quantatively）抗体−樹脂へ結合及び溶出される（即ち、もしあったとしても、望ましい修飾ペプチドはほとんど結合していない）ことを確実なものとするために、所望により最適化することができる。例えば、抗体の修飾ペプチドに対するモル比率、抗体−樹脂のユニットマスあたりの抗体量、サンプルを抗体−樹脂に接触させる時間の長さ（サンプルを抗体−樹脂カラムに再循環させることを含む）、接触が生じる温度、修飾ペプチドと抗体−樹脂との相互作用を亢進させる添加剤（例えば塩、界面活性剤、有機溶媒、又はポリマー）の包含等、所望により、各々本発明の方法を実施する際に当業者により最適化することができる。一般的に最適性を評価するための測定（メトリック）は、単離された修飾されていないペプチドの数を最少化するためにいくつかの重点を与えるとともに、分析の間に観測された修飾ペプチドの数を最大化しており、修飾ペプチドに於いて方法の特異性を測定するものである。これはペプチドからリン酸基を除去し、ホスホペプチドの測定される質量を減少させる酵素であるホスファターゼによる処理の前後に於いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより査定できる。それはまたタンデムマススペクトロメトリーにより決定される実際のペプチド配列により査定できる。他の最適化、例えば同定する修飾ペプチドの数を減少させることなく、逆相ＨＰＬＣの代わりにペプチド分離のためのキャピラリーエレクトロフォレシス、分析のためのイオントラップマススペクトロメトリーの代わりにクアドロポール飛行時間ハイブリッドマススペクトロメトリーといった異なったタイプの分離システム又は分析のためのマススペクトロメーターを使用することにより、同定する修飾ペプチドの数を増加させて、サンプルを分析するために必要とされる時間を短縮することなどが可能である。
【００４７】
好ましい態様では、免疫親和性単離は、硬質で、無孔又はマクロ細孔樹脂の粒子に固定化され、内径が約５０から３００マイクロメートルの細いキャピラリーカラムへパックされた、一つ又はそれ以上の修飾特異的抗体からなる装置を使用して行われる。逆相又はイオン交換支持体を含むこのタイプのキャピラリーカラムは、本発明に先立ってすでに広く使用されているが、本明細書で開示されているような、免疫親和性支持体でパックされたキャピラリーカラムは未だ開示されていないものである。本発明の免疫親和性単離装置は、例えばシリカキャピラリーと融合され、適した物質で構築されるものである。キャピラリーの末端は、チップの内径が３マイクロメートル又はそれ以下になるように、電気マイクロキャピラリーピュラーを用いて、細かいチップへ引き込まれる。キャピラリーはそれからJorgensson and Kennedyプレッシャーボム(pressure bomb)を用いて、逆の端を通じてカラムへ樹脂スラリーを強引に通すために、クロマトグラフィー樹脂でパックされる。Gatlinら、Anal. Biochem. 263: 93-101 (1988)を参照されたい。樹脂粒子はキャピラリーチップの直径よりも大きいので、樹脂はカラム内に蓄積し、爆発（bomb）による圧力でパックされる。パックされたカラムが望ましい長さに達すると、圧力が緩められ、キャピラリーの空の反対側の端が切り取られ、カラムが貯蔵又は使用される。
【００４８】
好ましい樹脂は、ＰＯＲＯＳという、潅流クロマトグラフィーに使用するパーセプティブ  バイオシステムズ（Perseptive Biosystems）で開発された硬質のマクロ細孔樹脂である。樹脂粒子は、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosstems）(Framingham、MA）を通じて商業的に売られており、抗体のような蛋白質を共有結合するための化学的に誘導された樹脂を含んでいる。例えば、ダイナルの磁気ダイナビーズ等、当業者に知られているほかの適した型の樹脂が使用できる。
【００４９】
この免疫親和性単離カラムは、マススペクトロメーターの電気スプレー源の部分として（即ち、結合して）使用できるので、ペプチドが最小のサンプルロスで単離された後、容易に分析できる。キャピラリーカラムそれ自体は直接マススペクトロメーターに取り付けられ、ガラス原料のない電気スプレーインターフェースとして働く。例えば、標準的な低容量ＨＰＬＣフィッティングを使用して、カラムはプラスチック（ＰＥＥＫ）ミクロ−Ｔフィッティング（Ｔ字のような形の）へ挿入される。ＨＰＬＣ溶媒運搬システムからのキャピラリーラインは、異なる溶媒又は溶媒の勾配が低い流速、典型的には１μｌ／分より低い流速で運搬されるように、カラムにあわせて、カラムに結合したサンプルを溶出させるためのカラムを通じてミクロ−Ｔフィッティングの反対側の末端に結合される。マススペクトルメーターから液体−金属ジャンクションを通じて電気的接続を供給するために、溶媒運搬経路とカラムに垂直に、ミクロ−Ｔの三番目の幹に金ロッドが挿入される。全ての三つの器具は、標準的なＰＥＥＫミクロフィンガータイトフィッティングとチュービングスリーブと合致するように固定される。マススペクトロメーターで使用される源は通常取り除かれ、このミクロ−Ｔ組み立てを保持する金属台により置き換えられる。マススペクトロメーター開口部に対するスプレーカラムチップの位置を最大イオン電流シグナルに最適にするように、台上のＸＹＺマイクロマニピュレーターで調節することにより、キャピラリーカラムチップの位置を正確に制御することができる。この方法で、マイクロカラム液体クロマトグラフィーとマイクロエレクトロスプレーイオン化は一つの装置に一体化される。
【００５０】
免疫親和性カラムから結合したサンプルを溶出するために使用される溶液、例えば３０％酢酸又は０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．３は、通常はエレクトロスプレーマススペクトロメトリーによる直接分析に適合しない。しかしながら免疫親和性精製装置は二次元ＨＰＬＣシステムの最初の構成要素として使用され、当該装置に於いては免疫親和性精製カラムと逆相カラムが直接結合される。逆相カラムの上流に強イオン交換カラムを使用する二次元ＨＰＬＣシステムは、既に示されている。例えばWashburnら、Nat. Biotech. 19: 242-247 (2001)を参照されたい。
【００５１】
ＨＰＬＣシステムからの液流は、免疫親和性精製工程の間に弱く変換される。免疫親和性精製カラムからサンプルが溶出すると、サンプルは逆相キャピラリーカラムの下流に結合するが、溶出に使用された溶液成分は結合せず、廃棄へと変換される。結合したサンプルはそれからエレクトロスプレーマススペクトロメトリーによる直接分析に適合する溶媒を使用して逆相カラムから溶出されることができる。もしくは、免疫親和性工程は、以下に記載されるような、マイクロピペットチップの固相抽出カートリッジを使用して、オフラインで行われ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムの逆相キャピラリーカラムに適用することができる。両方の場合に於いて、キャピラリーカラムはマススペクトロメーターに搭載され、上述のGatlinらに記載されるように、カラムからサンプルが溶出するようにサンプルがイオン化される。
【００５２】
本明細書に開示されるようなキャピラリーカラムを含む免疫親和性単離装置は、カラムに結合し溶出されるペプチドのみならず、低い親和性で抗体に結合するペプチドで、カラムのその通過が遅いペプチドにとっても有用であり、本発明の方法の有用性は広がっている。これらのカラムは再利用でき他の型のキャピラリーＨＰＬＣカラムに相当する寿命を持っている。例えば上述のGatlinら、を参照されたい。
【００５３】
もう一つの好ましい態様では、免疫親和性単離装置は、マイクロピペットチップ内の固相抽出カートリッジである。逆相及びほかの型のＨＰＬＣ支持体で構築された器具（例えばミリポアーのジップチップ）は既に、示されている。例えばErdjument-Bromageら、J. Chromatogr. A826: 167-181 (1998)を参照されたい。これらの装置は標準的な実験ピペッティング装置に装着され、ピペットチップと同様に使用される。サンプルがチップ内に吸引され、クロマトグラフィー支持体に結合され、それからサンプルが溶出する前に、分析のために同じ容量で洗浄される。例えばこのチップは標準的なマイクロピペットチップの廃棄する末端のゲルマトリックスに於いて固定化された抗体−樹脂をはめ込むことで組み立てられる。例えばChiricaら、Anal. Chem. 72: 3605-3610 (2000)を参照されたい。抗体分子の一般的な安定性の利点を考えれば、これらの器具は乾燥状態で供給され、末端の使用者はそれから再水和して使用直前に固定化された抗体を含むゲルを調整するものである。これらの高性能、小容量チップは一つのサンプルを画分化し（即ち、望ましいペプチドを単離し）て捨てるのに使用される。免疫親和性分離はまた、極性ろ過膜又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーのサンプル支持体のような、他の型の固体支持体で行われることもできる。例えばWeller, Fresenius J. Anal. Chem. 366: 635-645 (2000)、Liangら、Anal. Chem. 70: 498-503 (1998)を参照されたい。
【００５４】
本発明の方法による免疫親和性単離は、追加のクロマトグラフィー工程（例えば逆相又はイオン交換クロマトグラフィー）を経ることなく行われる。しかしながら、いくつかの好ましい態様では、追加のクロマトグラフィー法が当該方法の一段階免疫親和性単離と共に、又はその前に行われてもよい。例えば消化された細胞溶解物は、逆相固相抽出カートリッジに供され、工程に於いてカートリッジが洗浄されるように有機溶媒濃度を高めることで分画化できる。個々の画分は、画分間の重なりを最小限として、特定のペプチドに富んでおり、分画化されたペプチドは分画化されていない消化された細胞溶解物内のペプチドよりもより濃縮することができる。同様に、消化された細胞溶解物は、イオン交換固相抽出カートリッジで前もって分画化され、塩濃度を高める工程でカートリッジを洗浄することですすめられる。
【００５５】
本方法の一つの好ましい態様では、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）が本明細書に開示される免疫親和性単離に先立って、上流の前精製／分画化段階で使用される。上記考察の通り、ＩＭＡＣはペプチド混合物由来のホスホペプチドを豊富にすることができるが、複雑な混合物からのホスホペプチドの選択的で容易な単離には不適当なものとするいくつかの重要な制限がある（特有のリン酸化された残基に特異的でないホスホペプチドの精製、リン酸化されていない酸性ペプチドの単離、ホスホペプチド精製の不完全さ（即ち、いくつかのペプチドはＩＭＡＣ支持体に結合又は当該支持体から溶出しない）、及び再現性の乏しさ（サンプルを比較することを困難にしている）というような）。しかしながら、独立した技術としてのその限定にかかわらず、ＩＭＡＣは本発明にかかる方法の上流の大きいホスホペプチドを豊富にする／前精製段階として好ましく使用されるものである。
【００５６】
例えば、ＩＭＡＣは非常に低いストリンジェンシーで行われ、このような条件下では、ホスホペプチドに較べて大幅に多くの酸性のリン酸化されていないペプチドがＩＭＡＣの支持体に結合するが、それとは無関係に、可能な限り多くのホスホペプチドを結合させるために、非常に低いストリンジェンシーで行われる。ＩＭＡＣカラムからの溶出後、ペプチドは更に本発明の方法で分画化され、ホスホペプチドから酸性のリン酸化されていないペプチドを分離し、更にホスホペプチドをリン酸化された特定の残基に基づいて別々のサブセットへ分離する。例えばホスホチロシンを含むペプチド及びＡｋｔ基質結合モチーフを含むペプチドは、互いに分離され、ＩＭＡＣで前精製された、同じ消化された細胞溶解物から単離される。本発明の方法は好ましくは他のホスホペプチド精製法と共に行われる。
【００５７】
他の好ましい態様では、本発明の方法は、単一のサンプルから明確に決定された、異なった修飾をされたペプチドの集団を抽出するために、いくつかの重複しない修飾特異的抗体とともに連続して使用される。例えばホスホチロシンを含むペプチドは最初に固定化されたホスホチロシン抗体を使用して、消化された細胞抽出物から抽出され、消化された抽出物はそれからホスホチロシン抗体―樹脂から分離され、例えばホスホスレオニン−プロリンモチーフを含むホスホペプチドを抽出するためのホスホスレオニン−プロリン抗体のような第二の固定化された抗体で処理される。本発明者らによって、「合理的な分画化」又は「修飾ペプチドの分類」と命名されたこの工程は、オーバーラップしない修飾特異的抗体が存在するかぎりこの工程が繰り返して行われる。抽出され、修飾されたペプチドの各群がマススペクトロメトリーで分析される際に、各群のペプチドの大部分は、例えばホスホチロシン又はホスホスレオニン−プロリンのような前決定された修飾を含んでいることが非常に多いことから、修飾部位の同定が、多くの中から精製された、修飾ペプチドの場合よりもより容易である。この方法で、サンプルの複雑さは分析後よりもむしろ分析前に現れ、より多くの高い信頼性のある同定を結果として生じる。
【００５８】
修飾特異的抗体
本発明に従って、免疫親和性単離は、例えばリン酸化、アセチル化、メチル化、ニトロシル化、グリコシル化等の翻訳後修飾の与えられた型を特異的に認識する、少なくとも一つの修飾特異的抗体を使用することで行われる。好ましくは、修飾特異的抗体は、（ｉ）一般的な修飾特異的抗体、即ち、例えばホスホスレオニン等修飾された単一のアミノ酸に結合するが、修飾されていないアミノ酸残基は認識しないもの、及び／又は（ｉｉ）Combら、国際公開第００／１４５３６号公報、上述（また以下に記載される）に開示される方法により製造された、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体である。多くの異なるリン酸化されたキナーゼ共通基質モチーフ及び蛋白質−蛋白質結合モチーフに対するモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体は、購入可能である（セルシグナリングテクノロジー社製、２００３−２００４  カタログ及びテクニカルレファレンス  １２−２４ページ）。
【００５９】
そのような修飾特異的抗体（一般的及び／又はモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の）の使用は、全てではないが多くの、修飾又はモチーフを含む複雑な混合物内のペプチドを、修飾又はモチーフの周辺のペプチド配列に関係なく（即ち、これらの抗体は「部位特異的」ではなく、ユニークに生じるエピトープ部位を提示する特有の長いペプチド配列の認識に限定されない）、一段階で単離することを可能にする。
【００６０】
本方法の好ましい態様では、（単離されるペプチド上の）修飾には、リン酸化が含まれ、単離された修飾ペプチドにはホスホペプチドが含まれる。特に好ましいリン酸化された残基は、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニン、又はホスホヒスチジンである。本発明はリン酸化特異的抗体を使用して実施例で説明されているが、例えばアセチル化特異的抗体のようなほかの修飾特異的抗体が容易に使用できることは当業者であれば認識できる。上述の「蛋白質性調製」に於いて記載されるように、ほとんどいかなる望ましい修飾ペプチドも単離することができる。
【００６１】
ある好ましい態様では、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体が、望ましい修飾されたモチーフを含む全てではないが多くのペプチドを単離するために開示された方法に於いて有利に使用される。これらの抗体とその製造は、既に開示されている。Combら、国際公開第００／１４５３６号公報、上述を参照されたい。抗体は短い修飾されたモチーフに結合し、その小さいサイズと変性配列により、与えられたゲノムに於いて一度より多く生じ（即ち、大きく、ユニークなエピトープ又は統計学的に一度のみ生じる「部位」とは反対に、二つ又はそれ以上の異なる蛋白質に於いて生じる）、生物学的に共通配列及び、例えばキナーゼ等の、細胞シグナル経路の多数蛋白質の結合部位として機能する。
【００６２】
本発明は、一つ又はそれ以上の修飾されたアミノ酸を含む、例えばシグナル経路モチーフのような興味ある望ましいモチーフに特異的な抗体を使用するものである。開示される方法のある好ましい態様では、ペプチドを単離するために使用される修飾特異的抗体は、少なくとも一つのリン酸化されたアミノ酸を含むモチーフを単離するために使用される、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体を含む。一つの好ましい態様では、モチーフはホスホチロシン、ホスホスレオニン、ホスホセリンのような単一のリン酸化されたアミノ酸からなる。他の好ましい態様では、モチーフはキナーゼ共通基質モチーフ又は蛋白質−蛋白質結合モチーフの全て又は部分を含む。
【００６３】
例えば、好ましい態様では、以下のキナーゼ共通又は蛋白質−蛋白質結合モチーフの全て又は部分に特異的なモチーフ抗体が免疫親和性単離に使用される。ＭＡＰＫ共通基質モチーフ、ＣＤＫ共通基質モチーフ、ＰＫＡ共通基質モチーフ、ＡＫＴ共通基質モチーフ、ＰＫＣ共通基質モチーフ、ＰＤＫ１ドッキングモチーフ（かさのある環）、ホスホスレオニン−Ｘ−アルギニン、ＡＴＭ共通基質モチーフ、１４−３−３結合モチーフ、ｐ８５  Ｐ１３Ｋ結合モチーフ、ホスホスレオニン−プロリンモチーフ、Ａｒｇ−Ｘ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅ−Ｘ−ホスホセリンモチーフ、及びホスホセリン／ホスホスレオニン−Ｐｈｅモチーフ。（例えば、セルシグナリングテクノロジー  ２００３−２００４  カタログ１４ページ参照。）望ましいキナーゼ共通基質モチーフ又は蛋白質−蛋白質結合モチーフに対する前後に非依存的な抗体は、本発明の方法に於いて有利に使用されるであろう。そしてそのようなモチーフは文献によく記述されている（例えばKempら、Trends in Biochem Sci 15: 342-46 (1990)、Kempら、Methods in Enzymology 200: 62-81 (1991)、al-Obeidiら、Biopolymers 47: 197-223 (1998)を参照されたい。またL.Cantley、セルシグナリングテクノロジー社製、２０００−２００１カタログに於ける１９８ページの概観を参照されたい）。
【００６４】
モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体の調製は、既にCombら、国際公開第００／１４５３６号公報、上述（その開示は完全に参考として挿入される）に於いて開示されており、端的には以下のように行われる。
【００６５】
（１）周囲のアミノ酸に依存せずに特定の標的残基を含む蛋白質又はペプチドと反応するモチーフ特異的抗体が、非常に縮重したペプチドライブラリーを構成することで得られる。ある好ましい態様では、ライブラリーはＸＸＸＸＸＸＪ＊ＸＸＸＸＸＸＣ、ここでＸはシステイン以外の全ての２０アミノ酸であり、Ｊ＊は、修飾された（＊）アミノ酸（Ｊ）である。周辺の全てのアミノ酸よりも短いもので、長短様々なライブラリーが産生されるのが好ましい。例えば、１乃至４つのＸ残基が選択的に１あるいは２の特異的なアミノ酸にバイアスされるであろう一方で、残りのＸ残基は非常に変化している。ある好ましい態様では、ペプチドライブラリーは約６乃至１４残基の長さである。ある好ましい態様では多様な周辺のコンテキスト内で、一つの固定化されたアミノ酸（修飾された又は修飾されていない）を使用する一方、ほかの好ましい態様では、いくつかの固定化されたアミノ酸を含むモチーフを使用する。同様に、ライブラリーの周辺配列は、同時に２カ所以上の位置で異なっていてもよいし、又は、好ましい態様にあるように、ライブラリーが固定化された残基以外の全ての位置で完全に変化しているように産生されるように、変化した分子につき一つの周辺配列の位置でのみ異なっていてもよい。ペプチドライブラリーは、ＡＢＩペプチド合成機を使用し、及び変化カップリング反応（degenerate coupling reactions)に各アミノ酸の混合物を用いて標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成法で合成することができる。
修飾されていないアミノ酸を固定化された位置に挿入することは、例えばＺｉｎｃフィンガー又は繰り替えしアルギニン残基のような保存されたモチーフを模倣するために選択される。
【００６６】
（２）個々の変化する位置に於けるそれぞれのアミノ酸の発現を可能な限り等しくするために、アミノ酸組成を変化させ、合成し、ペプチドの配列を決定するラウンドが何回か行われる。ペプチドにそったいくつかの異なる位置に於けるアミノ酸配列分析は、それぞれの位置に於いて現れるランダムなアミノ酸を確かめるために行われ、ランダムな発現は合成の間維持される。それぞれの位置に於ける全てのアミノ酸の等しい分配を達成するために、ラウンドの数が様々であることは、当業者によって認識される。
【００６７】
（３）非常に様々なペプチドライブラリーが抗原、好ましくは担体に共有カップリングすることにより使用される。好ましい態様では、フロイド（Freund’s）アジュバントに於いてエマルジョン化されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）がカップリング試薬として使用され、カップリングされたペプチドライブラリーは、メスニュージーランド白ウサギのような宿主に経皮注入される。免疫応答が得られるまで、不完全なフロイド（Freund’s）アジュバントに於いてはブースタ注射が行われる。抗体価は、モチーフ特異的ペプチドライブラリーに対するＥＬＩＳＡのような、適した方法により測定される。この方法で生じた抗血清は、以下に概説されるように未精製で又は精製されて使用される。
【００６８】
（４）例えば蛋白質Ａに於いて、最も期待できる宿主由来の抗血清が精製され、Ｊ（修飾されていない）ペプチドライブラリーカラムに吸着される。好ましい態様では、吸着されない画分（流出）はそれからＪ＊カラムに適用され、適したｐＨで溶出され、透析され、Ｊ＊およびＪを抗原として使用するＥＬＩＳＡのような適した方法によりＪ＊特異性が試験される。
【００６９】
（５）このように親和性で精製された抗体は、Ｊ＊ペプチドライブラリーを認識するが、Ｊライブラリーとは反応せず、Ｊ＊に対して非常に高い特異性を示す。これらの抗体はＥＬＩＳＡのような適した方法を使用して、修飾されていない形態の標的化されたアミノ酸、Ｊ＊又はＪ＊ホモログに対して反応性の欠如が更に試験される。
【００７０】
（６）抗体は更に、蛋白質ホスホターゼ阻害剤オカダ酸のような、選択された蛋白質の修飾酵素阻害剤で処理された又は処理されていない細胞から調製された細胞抽出物を使用して、ウエスタンブロット又は他の適した方法により試験される。蛋白質修飾を増加させる処理は、反応強度と同様に抗体反応性蛋白質の数を増加させる。Ｊ＊特異的抗体はコントロール抽出物由来の比較的少数の蛋白質と反応するが、処理に続いて非常に多くと反応する。抗体はこれらの蛋白質の不活性で修飾されていない型と反応を示さず、Ｊ＊特異性の高さを示しており、蛋白質を含む多くの異なる修飾された標的との広い交差反応性を示唆している。
【００７１】
（７）コンテキスト−非依存性の度合いは、例えば混合された又は個別に試験される、個々のＪ＊ペプチドに対するＥＬＩＳＡ分析により、より注意深く調べられる。そのような分析は、例えばＪ＊がプロリンに続くような、あるモチーフで弱い反応性が生じるかどうかを示すことができる。
【００７２】
（８）Ｊ＊抗体認識のコンテキスト依存性は、更に修飾ペプチドライブラリーの固定化されたグリッド（grid）を使用して調べられる。固定化された標的残基、Ｊ＊にくわえて、Ｊ＊に対して異なる位置でさらなる固定化されたアミノ酸を含むが、全てのほかの位置はシステイン以外の全ての２０アミノ酸を含むように合成される。個々のペプチドライブラリーは例えばＥＬＩＳＡウエルの底に被覆され、Ｊ＊抗体にさらされる。グリッド上の特定のスポット（ペプチドライブラリー）と反応しない抗体は、特定のアミノ酸が特定の位置にあるときに結合しない。この分析は、Ｊ＊に対して特定の位置に特定のアミノ酸が存在することが、結合を許す又は阻害するか否かを決定する。
【００７３】
もしくは、精製された抗体は樹脂に結合され、修飾された又は修飾されていないライブラリーに結合し、結合しない配列を洗って取り除き、結合した配列を回収して、ライブラリーのそれぞれの位置に存在するアミノ酸の量を決定するためにアミノ酸配列決定に供される。この情報はそれぞれの位置に於いてどのアミノ酸が許容できるかを示す。
【００７４】
本発明の方法での使用に適した抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であり、又は例えばＦａｂフラグメントのような抗体の断片、又は例えばヒト型抗体のような抗体の誘導体であってもよい。例えば一般的なホスホスレオニン抗体のような単一の抗体が免疫親和性の工程で使用され、二つ又はそれ以上の抗体が、例えばアセチル化リジンとホスホスレオニンのような異なる修飾を含むペプチドを同時に単離するために使用される。もしくは、一つの修飾を有するペプチドの単離は、最初に一つの固定化された抗体で行われ、次いで他の修飾を有するペプチドが他の固定化された抗体及び／又は樹脂を用いて引き続き精製される。この工程は、本発明者らにより「合理的な分画化」又は「修飾ペプチドの分類」と名づけられ、オーバーラップしない修飾特異的な抗体が存在するかぎりこの工程が繰り返して行われる。
【００７５】
固定化された抗体との接触に続いて、抗体−樹脂は結合していないペプチドを除去するために完全に洗浄され、それから抗体−樹脂に結合したペプチド（即ち望ましい修飾を含むもの）は例えば３０％酢酸、又は他の適した溶出溶液等の少量の酸性溶液による溶出により樹脂から単離される。溶出されたペプチドは以下に示されるように直接分析され、又は濃縮されて逆相樹脂を含むミクロピペットチップで脱塩され、それから分析される。所望により、ペプチド配列及び／又は親蛋白質の情報がマススペクトロメトリーにより得られる。
【００７６】
ある環境に於いて、精製されたペプチドの分析（以下に記載されるような）は、標的モチーフを有さないいくつかの好ましくないペプチドが、望ましい標的モチーフを含むペプチドと共に精製されることを示す。そのような場合には、非特異的なペプチド結合を減じるために樹脂洗浄の回数及びストリンジェンシーを増加させる。洗浄のストリンジェンシーは例えば、界面活性剤（detergents）、有機溶媒又はポリマーのようなバックグラウンドの結合を減少させる添加剤を含めることにより、当該技術分野で周知の技術に従って増加させる。
【００７７】
単離されたペプチドの分析
望ましい修飾を含む単離されたペプチドは、ペプチド配列、活性化状態、質量を決定するために標準的な方法で分析される。ある好ましい態様では、本発明の方法に従って単離された修飾ペプチドは、現在ではＭＳがペプチドを分析するための最も感度の高い方法であることから、マススペクトロメトリー（ＭＳ）法で分析される。ＭＳは他の現存する方法と較べて、より少ない検体物質でペプチドに関する高品質の情報を提供する。修飾ペプチドを分析する同等の又は更に改良された方法が本発明の範囲に含まれることは、当業者には認識されていることである。例えば、現在では、約３０アミノ酸長又はそれより短いペプチドがＭＳ分析にもっとも適しているが、方法の今後の改良により、より長いペプチドの分析が可能となる。
【００７８】
従って、好ましい態様では、本発明の一般的な方法は工程（ｄ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）、及び／又はＭＳ３分析により、工程（ｃ）に於いて単離された修飾ペプチドを特徴付ける、ことを含む。ある好ましい態様では、精製されたペプチドの質量を測定するためにマトリックする支援レーザーイオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）マススペクトロメトリーが使用される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーは、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）（以下を参照）のようなより複雑な、他の方法により分析される前に、迅速にサンプルをスクリーニングするのに有用であり、感度が高く単純である。予期されるペプチドが、精製された修飾ペプチドの中に存在するかいなかを決定することが単離の目的である、原理を証明するための実験又は診断アッセイのために、精製されたペプチドの質量は公知のペプチドの配列から算出され、マススペクトルで検索される。
【００７９】
ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス分析は、急速に進化している分野であり、分析用に単離された修飾ペプチドを調製する好ましい方法であり、そのような分析を行うことはやがて変化することではあるが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は標準的な手法に従って（例えばCourchesneら、Methods in Mol Biol 112: 487-511 (1999)）行われ、これらの方法の改良点は本発明の範囲に含まれる。例えば単離されたペプチドは、非常に少量、単離（精製）された修飾ペプチドを含む画分の１乃至２０％を使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のために調製され、例えばα―シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のような飽和マトリックス溶液の等量で直接混合され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦサンプルプレート上のペプチドマトリックス溶液を乾燥させることで分析される。他の好ましいマトリックス溶液が又は使用される。必要であれば、より多くのサンプル液は濃縮され、マトリックス溶液と混合する前に逆相マトリックスを含むミクロピペットチップで脱塩することができる。
【００８０】
精製されたペプチドが望ましい修飾を含むことを確認するために、サンプルの少量が、好ましくはペプチドから修飾された基を除去する酵素を処理する前及び後に分析される。例えば精製される修飾ペプチドがホスホペプチドの場合には、例えばウシ小腸ホスファターゼなどの適したホスファターゼを使用してリン酸が除去される。例えばLarsenら、Proteomics 1: 223-238 (2001)を参照されたい。これは、ペプチドが修飾されていることを確認し、それぞれのペプチドに於いて存在する修飾された基の数を数えるための簡単で信頼できる分析である。例えばホスファターゼ処理はペプチド内の、個々のリン酸基の観測されたペプチド質量を８０まで減少させる。リン酸化されていないペプチドの質量は、ホスファターゼ処理の結果としては変化しない。同様に、当該分野で公知である、適当な修飾特異的酵素のどのようなものでも、本発明の方法に従って単離されたペプチドが望ましい修飾を含むことを確認するために選択されてもよい。例えばKrishna、上述を参照されたい。
【００８１】
ホスホペプチドが単離されると、不安定な分解がマススペクトルにピークの追加を生じる。ホスホペプチドの不安定な分解は他者らにより／すでに言及されており、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルに於けるホスホペプチドの認識及び割り当てに使用することができる（AnnanおよびCarr、Anal Chem 68: 3413-21 (1996)）。分解産物はイオン化の後に形成され、装置は分析の間に安定なイオンに焦点を当てるように設定されていることから、分解産物のピークはホスホペプチドのピークに比べてブロードである。同様の理由により、安定なイオンとは異なり、分析の間に分解産物の質量は変化することから、リン酸の除去による予期された質量シフトは−９８であるが、−８４の質量シフトが観測される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる、多数の合成されたホスホペプチドの分析は、ホスホセリン又はホスホスレオニンを含むがホスホチロシンを含まないペプチド残基が不安定な分解を起こすことを示している。従って、不安定な分解はホスホセリン又はホスホスレオニンを含むペプチドの信頼できる指標である。不安定な分解は、更なるサンプル処理工程を経ることなく、またサンプルを追加して使用することなく、ホスホセリン又はホスホスレオニンを含むいくつかのペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルに於いて観測される。
【００８２】
例えば開示された方法を用いるゲノム−ワイドな分析のような他のタイプの適用に於いて、多くの異なるペプチド配列が、単離された修飾ペプチド画分に観測される個々の質量を産生できることから、単にペプチドの質量を測定することで、蛋白質性調製物に存在する複雑な混合物から単離された修飾ペプチドを同定することは不可能であろう。従って、他の好ましい態様では、複雑な混合物（例えば粗細胞抽出物）から単離された修飾ペプチドは、マススペクトロメトリーの一段階で単離されたペプチドイオンがマススペクトロメーターに於いて衝突により計画的に断片化され、それから断片の質量が測定される、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ３）で分析される。例えばYates, Methods in Enzymology 271: 351-377 (1996)を参照されたい。それぞれのペプチドで観測された断片の質量はペプチド配列の特質であり、ペプチドの質量よりも親蛋白質に、より特異的な指標である。即ち、断片の質量はペプチド配列と関連しており、どの蛋白質にペプチドが由来していうかを同定するのに使用できる。ペプチドの親蛋白質の配列が公知の場合には、ペプチドは断片質量スペクトルから直接配列を翻訳することなく、親蛋白質に明確に適合させることができる。
【００８３】
特有のペプチドの測定された質量と部分配列は、親蛋白質にそれを明確に適合させるのに十分である。例えばEngら、J Am Soc Mass Spectrom 5: 976-989 (1994)を参照されたい。親蛋白質配列は共通の生物学的モデル生物のゲノムが知られるに連れて、益々入手可能になっている。ＭＳ／ＭＳスペクトルは迅速に（ペプチドあたり＜４００ｍｓｅｃ）、装置―コントロールソフトウエアを通じてデータ依存的に集められ、非常に複雑なサンプルの分析が可能である。ナノスプレー注入方法で、１時間又はそれ以上の間、２μｌのサンプルを分析することができる。例えばWilmら、Anal Chem 68: 1-8 (1996)を参照されたい。従って、開示された方法の好ましい態様では、工程（ｃ）で単離された修飾ペプチドは、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−ＭＳ／ＭＳ（実施例４に記載される）のようなタンデムＭＳにより特徴付けられる。
【００８４】
ホスホペプチドが単離される場合には、ＭＳ／ＭＳの断片化工程の間に、ホスホセリン又はホスホスレオニンを含むペプチドはしばしば断片化されていない親イオンよりも質量が９８低いニュートラルロスイオンを産生する、単一のリン酸のロスによるイオンを形成する。親イオンが＋１の電荷を有する場合には、ニュートラルロスイオンは親のイオン質量対電荷値よりも低い、９８／１又は９８の質量対電荷値（ｍ／ｚ）を有する。同様に、電荷＋２、＋３、＋４を有するホスホペプチド親イオンは、親イオンよりも低い４９、３２．７、２４．５のｍ／ｚ値のニュートラルロスイオンを生じる。
【００８５】
ＭＳ／ＭＳ間のニュートラルロスは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーの間の不安定な分解と同じ過程である。それゆえ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの間にニュートラルロスを示すホスホペプチドの多くが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーの間に不安定な分解を生じるホスホペプチドと同じであると予想される。それぞれのニュートラルロス  ＭＳ／ＭＳスペクトルに於いて、親イオン質量（ｍ）が親イオン質量対電荷値（ｍ／ｚ）及びニュートラルロス値から推測される電荷（ｚ）から算出される（ニュートラルロス４９で＋２、３２．７で＋３、２４．５で＋４）。いくつかの個々のペプチドが、＋２、＋３、＋４のニュートラルロスを生じることが観測される。データセットの比較により、同じペプチドが両方のマススペクトロメトリー分析方法で検出されることが確認できる。
【００８６】
ＭＳ／ＭＳの間に高いレベルのニュートラルロス及び対応するペプチドのバックグラウンド分画化の低いレベルを生じる、修飾ペプチドの同定に必要とされるさらなる工程が、本発明の方法に取り込まれる。一つの手法は、非生産的なニュートラルロス断片化の分配を生産的なペプチド骨格断片化へ変えることを期待して、異なる断片化機構を使用するマススペクトロメーターでこれらのペプチドを分析するものである。例えば断片化が相対的に長い時間でトラップされるペプチドイオンのエネルギーを徐々に増加させることにより誘導されることから、イオントラップマススペクトロメーターでの分析はニュートラルロスを悪化させ、一方で、ペプチドイオンがより突然に断片化されることから、トリプルクアドロポールマススペクトロメーターでの分析は、より骨格の断片化を許容するものである。二番目の方法は、ＭＳ／ＭＳの間にニュートラルロスを生じる基を除去するが、その基が存在した場所を示す「残骸」を残すように、本発明の方法により精製された、修飾ペプチドを化学的に処理することである。例えばリン酸基はβ除去によりホスホペプチドから化学的に除去されることができる。例えばByford, Biochem J 280：61-5 (1991)を参照されたい。ペプチドを短期間、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、又はＢａ（ＯＨ）２のような塩基にさらすことは、質量に於いてペプチド内のセリン及びスレオニン残基から区別できるデヒドロアラニン及びデヒドロアミノ酪酸を残して、ホスホセリン及びホスホスレオニンからリン酸を除去することになる。デヒドロアラニンの残基質量は６９であり、セリンは８７であり、ホスホセリンは１６７であり、デヒドロアミノ酪酸は８３であり、スレオニンは１０１であり、ホスホスレオニンは１８１である。β除去されたペプチドは、タンデムマススペクトロメトリーにより直接又はマイケル添加試薬とのさらなる反応の後に分析できる。例えばMolloy及びAndrews、Anal Chem 73: 5387-94 (2001)を参照されたい。
【００８７】
ＭＳ／ＭＳによる特徴付けの後、修飾ペプチドは、修飾ペプチドに対して得られたスペクトルと公知のペプチド配列を一致させ、修飾ペプチドの親蛋白質を同定するために、検索プログラムで産物のイオンスペクトルを分析することにより明確に同定される。例えば、最も合致するものを見出すために、実験のスペクトルを蛋白質配列データベースに由来する理論的なスペクトルのライブラリーに関連づけるプログラムであるＳｅｑｕｅｓｔが、そのような検索のために好都合に使用される。同等な検索プログラムが開示された方法の実施に用いられることは認識されている。従って、好ましい態様では、本発明の方法は更に工程（ｅ）工程（ｄ）のペプチドの特徴付けの間に得られた修飾ペプチドのスペクトルを、検索プログラムを使用して公知のペプチド配列のスペクトルと実質的に適合させ、それによって修飾ペプチドの親蛋白質を同定することを含む。
【００８８】
ある態様に於いてホスホペプチドが単離される場合に、ＭＳ／ＭＳの間に、いくつかのホスホペプチドはペプチド骨格に沿った非常に少ない残基の断片化で、非常に高度にニュートラルロスを行う（明確な割り当てのために十分高品質なスペクトルを得るのに必要である）。このような場合、リン酸化部位と個々のペプチドに対する親蛋白質を割り当てるための、検索プログラム（Ｓｅｑｕｅｓｔのような）を用いたＭＳ／ＭＳイオン産物スペクトルの分析は、明確な割り当てとはならないであろう。これはホスホセリン及びホスホスレオニンを含むペプチドのＭＳ／ＭＳ分析の間に遭遇する共通の限界である。例えばDeGnoreら、J Am Soc Mass Spectrom 9: 1175-1188 (1998)を参照されたい。ホスホペプチドがニュートラルロスによりリン酸を失う場合であっても、ニュートラルロスは、ホスホセリンがデヒドロアラニンになり、ホスホスレオニンがデヒドロアミノ酪酸になるように、リン酸化部位に普通でない残基を残すことから、十分な残基の骨格断片化がある限り、リン酸化部位は決定できる。
【００８９】
従って、開示される方法の好ましい態様では、単離された修飾ペプチドは、ＭＳ３（例えば好ましい態様に於けるようなＬＣ−ＭＳ３）分析により更に特徴付けられる。つまり、ニュートラルロスイオンは同定のための十分な骨格の断片化を生じるためにＭＳのさらなるレベルへ供される。この過程は、他のタイプのマススペクトロメトリーよりも、イオントラップマススペクトロメトリーでより簡単に実施できる。ペプチドがＬＣシステムから溶出すると、実測ＭＳスキャンが行われ、もしそれらが前もって設定した強度の閾値より上の場合、及びそれらがかねてＭＳ／ＭＳによって分析されていない場合には、ＭＳ／ＭＳスペクトルが３つの最も豊富なイオンについて集められる。しかしながら、もしＭＳ／ＭＳの間に４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出される場合には、他のＭＳ／ＭＳスペクトル又は他の実測ＭＳスキャンを集める前に、装置はまずニュートラルロスイオンを単離し、それを断片化し、産物のイオン質量を測定する。ホスホペプチドの場合、ニュートラルロスイオンがもはやリン酸を含まないときには、よりリン酸化されていないペプチドのような断片らしく、有用なイオンスペクトル産物を生じる。装置コントロールソフトウエアへの特定の修飾で、ＭＳ３スペクトルをＭＳ／ＭＳスペクトルと同じデータ依存的な様式で集めることができ、ＭＳ３スペクトルは更にＳｅｑｕｅｓｔで分析することが可能となる。Tomaino及びRushら、第５０回ＡＳＭＳ Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics、２００２年６月６日に発表された、抄録ThOE 3:00を参照されたい。
【００９０】
ＭＳ３分析に続いて、ペプチドは再びＳｅｑｕｅｓｔのような検索プログラムを使用して同定される。与えられたペプチドが明確に同定されるが、プログラムが複数の可能なリン酸化部位の間を区別できない状況では、よりそれらしいリン酸化部位が、単離に使用された修飾特異的抗体の公知の特異性に対する部位を比較することで選ばれる。例えば、二つの可能なリン酸化部位（ＰＴＮ６＿ＨＵＭＡＮのＳｅｒ５８５とＳｅｒ５８８を含む）は、ペプチドの単離に使用されたホスホ−（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフ抗体の公知の特異性に（実施例５を参照されたい）、一つの可能性のある部位の配列前後には適合するがもう一方は適合しないことに注意することで区別された。
【００９１】
複数の修飾部位を含むペプチドが単離される場合には、ペプチド骨格に沿った非常に少ない残基断片化をともなう高いレベルのニュートラルロスにより、明確な割り当てを得ることは難しい。例えば現在、複数箇所がリン酸化されたペプチドは、現在入手可能な型のＳｅｑｕｅｓｔソフトウエアを使用するＬＣ−ＭＳ３により効率的に分析されることができない。現在のデータ依存的獲得ソフトウエアは、最も豊富なニュートラルロスイオンを単離及び断片化する。これは、複数のリン酸化されたペプチドに於いては、ＭＳ３の間にニュートラルロスさせるように一つ又はそれ以上のリン酸基を残して、ニュートラルロスにより除かれた一つのリン酸を有するペプチドに対応する。しかしながら獲得ソフトウエアは複数のニュートラルロスを認識でき、最も強いイオン産物でない場合でも、ニュートラルロスのもっとも高いレベルを有するイオンを単離し断片化するように（個人的コミュニケーションを通じて）改良されている。それゆえ改良された獲得ソフトウエアで、複数個所が修飾ペプチドの分析を行うことにより、親蛋白質と、ペプチドのいくつかの修飾部位を割り当てることができる。従って、本発明の範囲には、そのような将来の改訂およびＳｅｑｕｅｓｔのような獲得ソフトウエアのバージョンが含まれる。
【００９２】
ペプチド配列とリン酸化部位をスペクトルに割り当てることにつづいて、その割り当ては、その配列とリン酸化部位を有する合成ペプチドが同じスペクトルを生じることを確立することにより確かめられる。これは、特定のホスホペプチドとそのスペクトルの間の正式な関係を確立する。これは例えば、不十分なＳｅｑｕｅｓｔの割り当てを更に評価するための、又は特に重要であると考えられる割り当てを確認するための、単純で説得力のある方法である。
【００９３】
単純な確認方法は、本発明の方法のように、リン酸化部位を全体的に割り当てようとする戦略に於いて必須である。ホスホセリン又はホスホスレオニンからのリン酸のニュートラルロスは、ペプチド配列をＭＳ／ＭＳスペクトルに割り当てることを困難にし、時としてその割り当ては曖昧になる。全体的な方法に対照的に、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより染色されたバンドとしての単離のように、単一のリン酸化された蛋白質を分析するときには、可能性のセットはより大きな蛋白質のデータベースのかわりに、同定された蛋白質に由来するペプチドへと制限されることができるので、蛋白質由来のリン酸化されていない蛋白質は、分析に於いて用いられることができ、ホスホペプチドの割り当てをより単純にすることで蛋白質の同定を助ける。しかしながら、例えばリン酸化されていないペプチドから別にホスホペプチドが単離され分析される、本明細書に開示されるような、全体的なプロテオームの手法に於いては、しばしば特定の蛋白質由来のペプチドが単離されたホスホペプチドであり、明確な割り当てを達成することは、より困難なようである。明確な割り当ては、割り当てられた配列とリン酸化部位を有するペプチドを合成し、それが生物学的ペプチドと同じスペクトルを産生するか否かを決定するために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ又はＬＣ−ＭＳ３により分析することで確認することができる。
【００９４】
上記記載のように、いくつかのホスホペプチドの、過剰なリン酸のニュートラルロスをおさえる傾向は、配列を特定のホスホペプチドのスペクトルに割り当てることを困難にする。Ｓｅｑｕｅｓｔのようなプログラムは、個々のスペクトルへの割り当てのランクされたリストを提供する。リン酸化されていないペプチドにとってはＳｅｑｕｅｓｔによる最上位のランクの割り当てはしばしば正確だが、ホスホペプチドに於いては、ニュートラルロスとＳｅｑｕｅｓｔがそのニュートラルロスピークを認識して考慮することができないことによるスペクトル内のさらなる複雑さにより、正しい割り当てが最も高いランクにはならない。しかしながら、本発明の抗体に基づく単離方法のユニークな特徴と利点は、抗体の公知の特異性が、更に追跡する価値のあるものを見つけるために、不十分な割り当て、即ち最上位でない割り当てをスクリーニングするために使用することができる。即ち、抗体に基づく単離方法は、抗体の特異性がホスホペプチドのＭＳ／ＭＳ分析に伴う限界のいくつかを部分的に補うために使用することができることから、ほかの単離方法よりも固有の利点を有している。
【００９５】
上記考察のように、本発明の免疫親和性単離方法を行う場合には、ペプチドが免疫親和性単離装置から溶出されたときに分析され、ペプチドのより複雑な混合物を分析するマススペクトロメーターを可能にするために、蛋白質性調製から修飾ペプチドを単離するための装置が、マススペクトロメーターと直接連結される。例えば液体クロマトグラフィーシステムは複雑なペプチド混合物をより単純な混合物へと画分化し、サンプルを処理する段階を介在することなくマススペクトロメーターにより直ちに分析される。このように、本発明の方法は、複雑な混合物から修飾ペプチドの効率的でハイスループットな単離を可能にするように、容易に自動化される。
【００９６】
複雑なサンプルへの許容範囲を更に増加させるために、液体クロマトグラフィーシステムはマルチモデルで、即ち、それは二つ又はそれ以上の分離モードを続けて行うことができるものである。例えば、修飾ペプチドの一つのセットは、イオン交換支持体から逆相支持体へ溶出され、逆相分離によりマススペクトロメーターへとつづき、次いでもう一つの修飾ペプチドのセットは、イオン交換支持体から逆相支持体へ、更に二番目の逆相分離からマススペクトロメーターへ、そして次のセットと反復して、より効果的な溶出により、分析される。例えばWashburn、上述を参照されたい。
【００９７】
マルチモデル液体クロマトグラフィーの一つの局面がまた、本明細書に記載されているように、翻訳後修飾ペプチドを精製するために一般的な修飾に特異的な抗体を使用することによる、免疫親和性精製であってもよいと思われる。この意味に於いて、免疫親和性カラムはいわゆる酵素反応カラム、つまり分析されるサンプルに於ける反応を触媒するために、マススペクトロメーターの上流で使用される、固定化された蛋白質のカラムと類似している。例えばAmankwaら、Protein Sci 4: 113-125 (1995)を参照されたい。
【００９８】
新規な部位の同定、抗体
本発明の免疫親和性単離方法は、複雑な混合物から蛋白質修飾部位を含むペプチドを効率よく、迅速に単離精製することを可能にする。本発明の方法に従って単離された、修飾ペプチドは、特定の蛋白質にある公知の修飾部位を含んでいるか、又は以前報告されていない新規の修飾部位を含むものである。例えば、特定の蛋白質にある未知のリン酸化部位が、本発明の方法によって同定される。同様に、本発明の方法により、修飾（例えばリン酸化）は公知であるが、特定の細胞、組織、疾患状態などに於ける修飾が公知ではないような部位を単離同定できる。よって、開示された方法は、部分的には特定の疾患状態と関係のある特定の蛋白質（即ち、蛋白質が活性化されている又は不活化されている）の修飾部位の同定を可能にするものである。
【００９９】
新規な蛋白質修飾部位の同定は、そのリン酸化された形態に於ける新規な蛋白質部位に特異的な新規抗体試薬の産生を可能にする。例えば、本発明の方法による新規なリン酸化部位（例えば特有のホスホセリン部位）の同定は、新規な部位がリン酸化されたときにのみ、蛋白質に結合する、リン酸化特異的抗体の産生を可能にする。免疫親和性単離に、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体が使用される場合には、新規な同定される部位は用いられるモチーフ−抗体の特異性と合致する。新規な部位に対する修飾特異的抗体は、診断又は治療上の使用と同様に、蛋白質修飾を検出するための非常に有用な試薬となるものである。
【０１００】
新規な修飾部位が一旦同定されれば、その部位に対する修飾特異的抗体は当業者に周知の技術により産生される。抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体である。抗ペプチド抗体は、標準的な方法に従って、新規な修飾部位を含む合成されたリン酸ペプチド抗原で、適切な宿主を免疫することにより調製される。例えばANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 5, p.75-76 Harlow&Lane Eds. Cold Spring Harbor Laboratory (1998)、Czernik, Methods In Enzymology, 201: 264-283 (1991)、Merrifield, J Am. Chem. Soc. 85: 21-49 (1962)を参照されたい。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎらの良く知られた技術に従って、モノクローナル抗体はハイブリドーマセルラインに於いて産生される。 Nature 265: 495-97 (1975)、KohlerおよびMilstein, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976) 、及び CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubelら、Eds. (1989)も参照されたい。その部位が多くの異なるシグナル蛋白質間で保存されたモチーフである場合には、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体はまた同定された新規な部位に対して産生されるであろう。Combら、国際公開第００／１４５３６号公報、上述を参照されたい。
【０１０１】
新規な部位に対して産生された修飾特異的抗体、及び／又は、本発明の免疫親和性手法により同定されたモチーフは、標準的な技術に従ってエピトープ及び修飾特異性でスクリーニングされる。例えばCzernikら, Methods In Enzymology, 201: 264-283 (1991)を参照されたい。例えば、新規なリン酸化部位の場合、（ポリクローナル又はモノクローナルのどちらでも）抗体は、望ましい抗原（即ち新規なリン酸化部位／残基を含むエピトープ）と抗原のリン酸化された形態とのみ反応性を有するという特異性を確認するために、ＥＬＩＳＡによりリン酸化された及びリン酸化されていないペプチドライブラリーに対してスクリーニングされる。ペプチド競合アッセイが、他の標的でない蛋白質のリン酸化されたエピト−プとの反応性を欠如していることを確認するために行われる。抗体はまた、望ましいリン酸化された部位との反応性を確認するために、例えば蛋白質を過剰発現するセルライン等の親蛋白質を含む細胞調製物に対してウエスタンブロッティングにより試験される。望ましいリン酸化されたエピトープに対する特異性はまた、リン酸化されることが知られている望ましいエピトープ以外の部分でリン酸化可能な残基を欠如する、親／標的蛋白質変異体を構築することにより、又は、望ましいリン酸化−エピトープを変異して反応性の欠如を確認することにより試験される。
【０１０２】
本発明に従って、開示される免疫親和性単離法の実践により、二つの新規な蛋白質リン酸化部位が同定された。（ｉ）新規なユビキチン融合崩壊蛋白質１（ＵＦＤ１）リン酸化部位（Ｓｅｒ３３５、ＧＱＳ＊ＬＲ配列を含む）がジャーカット細胞由来の修飾ペプチドの免疫親和性単離のためのホスホ−（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフ抗体を使用して同定された。そして（ｉｉ）新規な蛋白質−チロシンホスファターゼ１ｃ（ＰＴＮ６）のリン酸化部位（Ｓｅｒ５８８、ＫＧＳ＊ＬＫ配列を含む）が、ジャーカット細胞抽出物からの修飾ペプチドの免疫親和性単離のための同じＰＫＣ基質抗体を使用することにより同定された（実施例５を参照されたい）。
【０１０３】
これらの新規な部位がリン酸化されている場合にのみ、ＵＤＤ１又はＰＴＮ６のそれぞれに結合するリン酸化特異的抗体が、標準的な技術に従って容易に調製される。ホスホＳｅｒ３３５又はＳｅｒ５８８それぞれの周辺及びそれを含むＵＦＤ１又はＰＴＮ６配列を含む、合成されたリン酸ペプチド抗体が選択されて、周知の技術に従って構築され、ポリ又はモノクローナル抗体を産生するための免疫源として使用される。例えば上述のANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL、及び上述のCzernik, Methods In Enzymologyを参照されたい。これらの抗体のリン酸化及びエピト−プ特異性は、上述のように確認される。
【０１０４】
従って、好ましい態様では、本発明は３３５位のセリンがリン酸化された場合にのみユビキチン融合崩壊蛋白質１（ＵＦＤ１）と結合し、その部位がリン酸化されていない場合にはＵＦＤ１に実施的に結合しない抗体を提供する。本発明のＵＦＤ１（ｐＳｅｒ３３５）抗体はまた、ＵＦＤ１ホスホ−Ｓｅｒ３３５部位と非常に類似した部位を含む蛋白質とある限定的な交差反応性が観測されるが、ＵＦＤ１以外の蛋白質とは実質的に結合しない。
【０１０５】
他の好ましい態様では、本発明は５８８位のセリンがリン酸化された場合にのみ、蛋白質−チロシンホスファターゼ１ｃ（ＰＴＮ６）に結合するが、この残基がリン酸化されていない場合にはＰＴＮ６に実質的に結合しない抗体を提供する。本発明のＰＴＮ６（ｐＳｅｒ５８８）抗体はまた、ＰＴＮ６ホスホ−Ｓｅｒ５８８部位と非常に類似した部位を含む蛋白質とある限定的な交差反応性が観測されるであろうが、ＰＴＮ６以外の蛋白質とは実質的に結合しない。
【０１０６】
プロファイリング及び診断に於ける適用
上述したように、本発明は、望ましいペプチド又は蛋白質の、高額で時間のかかる前精製を必要とせずに、粗細胞抽出物又は生物学的液体のような複雑な混合物から修飾ペプチドを、迅速、効率的かつ直接単離することを可能にする。本発明の方法は、一つの抗体で、多くの異なる修飾された蛋白質及びシグナル経路に対応する、多くの異なる修飾ペプチドの一段階免疫親和性単離を可能にする。従って、本明細書に開示される方法は、例えば活性状態のゲノムワイドな（例えば細胞ワイドな）プロファイリングに適しており、また非常に有用である。開示される方法の単純さはまた、単一の免疫親和性単離工程が要求されるのみというように、容易に自動化を可能にする。
【０１０７】
修飾ペプチドの簡単な単離は、非常に様々な蛋白質に於ける修飾部位の同定と割り当てに於いて有用である。これらの蛋白質修飾は、細胞の生命に於いて重要な事象に応答して生じるものであり、ある場合には、修飾は、その事象を診断する又は予防する有望な標的を提供する。様々な生物のゲノム配列が公知になるにつれ、所定の生物にこれらの修飾を見出して割り当てる必要性が更に言明されるようになってきた。広範なコンテキストに於いて、本発明は明確なインビトロの複合体内の修飾部位を割り当てるのみならず、ゲノムワイド又は細胞ワイドな活性化／修飾プロファイル、即ち、ストレス、炎症、疾患、薬剤処理のような環境の変化に応答して、与えられた細胞又は組織内での全体的な蛋白質修飾がいかに変化するかを決定するのに、有用である。
【０１０８】
特定の処理に応答して、全体的な蛋白質レベルがいかに変化するかに焦点を当てる、慣用的なプロテオミクス手法と対照的に、本発明は、疾患や治療のような与えられた情況から生じる蛋白質修飾に於ける細胞性の変化に焦点をあてる。リン酸化又は脱リン酸化のような蛋白質修飾は、細胞性形質転換、ガン、プログラム化された細胞死、細胞周期の調節、代謝を含む多くの重要な生物学的工程を調節するための分子的なスイッチとして機能する。よって、本発明により提供される一つの利点は、細胞内の特定蛋白質の量的変化を伴わずに、即ち細胞性応答が特定のシグナル蛋白質の修飾状態に於ける変化によって引き起こされるもので、細胞内の蛋白質の量的変化によって引き起こされるものではない、これらの分子的スイッチング現象に焦点を当てる手段を提供する。
【０１０９】
本発明の免疫親和性単離方法は、蛋白質の与えられた修飾部位の活性化（又は不活性化）を伴うことが知られている状況の診断に於いて有用である。例えば患者に於けるマーカーのリン酸化状態（即ち活性化状態）を同定するために、本発明に従って（患者の組織又は液サンプルから）、与えられた疾患の公知のマーカーである、細胞シグナル蛋白質上のリン酸化部位が単離される。このマーカー活性化情報は、疾患の診断を助け、及び／又は、疾患の危険性がある対象を同定する。従って、開示されている方法の好ましい態様では、工程（ｃ）で単離される修飾ペプチドは、疾患の公知のマーカーに対応する。
【０１１０】
本発明の方法は、疾患又は薬剤処理のような環境変化に応答して、ゲノムワイド又は経路ワイドベースで、標的細胞又は液に於ける蛋白質活性化（即ち修飾）状態をプロファイリングするのに有用である。例えばガン患者から生検サンプルが得られ、同じ患者由来の正常な参照組織又は細胞に対して分析される。もしくは、本方法は、ガンの特別な型の修飾された蛋白質マーカーを発見するため、それらのガンの診断アッセイとして、おそらくそれらの発達の段階をマークすることを助けることに於いて有用である。従って本方法のひとつの好ましい態様では、工程（ｄ）で特徴付けられる修飾ペプチドは、親蛋白質の未知の修飾部位を含んでいる。例えば本方法は正常組織に対して、ガンの組織で上昇した又は減少した特有の細胞シグナル蛋白質上のリン酸化部位を同定するために有利に使用されるものである。同様に、本方法は、治療用医薬が望ましい効果を有するかを正しく判断するため、又はその用量が毒性を誘発するで場合を判定するにあたって、治療用医薬の細胞性効果（即ち、蛋白質修飾に於ける変化）を評価するために使用される。例えば、ある疾患状態に関連することが知られている特有の蛋白質のリン酸化を減じる目的で試験される薬剤で処理された細胞又は組織は、その蛋白質及び／又は他の蛋白質のリン酸化状態を測定するためにモニターされる。本発明の方法はまた、疾患の間に細胞ワイドでの修飾状態に於ける変化をモニターすることにより、感染した疾患のステージと重篤度をモニターするために使用することができる。
【０１１１】
従って、好ましい態様では、本発明の単離方法は更に工程（ｅ）工程（ｄ）のペプチドの特徴付けの間に、修飾ペプチドに対して得られたスペクトルを、公知のペプチド配列に対するスペクトルと実質的に適合させる検索プログラムを使用し、それによって修飾ペプチドの親蛋白質を同定する、ことを含む。一つの好ましい態様では、蛋白質活性化の比較が疾患に由来する活性化の変化についての情報を与える場合には、蛋白質性調製物は疾患生物に対応し、参照サンプルは正常な生物に対応する。第二の好ましい態様では、蛋白質活性化の比較が疾患の診断に有用な情報を提供する場合には、蛋白質性調製物は組織生検細胞又は臨床液サンプルから得られ、参照サンプルは疾患生物に対応する。第三の好ましい態様では、蛋白質活性化の比較が試験化合物による処理に由来する活性化の変化についての情報を提供する場合には、蛋白質調製物は少なくとも一つの試験化合物で処理された生物又は調製物に対応し、参照サンプルは処理されていない生物又は調製物に対応する。
【０１１２】
他の好ましい態様では、上述された蛋白質活性化の比較は、疾患に於ける修飾について未だ報告されていない親蛋白質に対応する工程（ｄ）で特徴付けられる修飾ペプチドを同定するものである。
【０１１３】
上記に於いて概説されたような、与えられた疾患に関係のある修飾ペプチドの単離は、異常なシグナル伝達（即ち蛋白質活性化／修飾）が含まれる又は含まれることが疑われるほとんどいかなる疾患に対しても行われる。本方法の好ましい態様では、疾患はガンである。同様に修飾ペプチドの単離は、蛋白質修飾に於けるいかなる試験化合物又は薬剤のほとんどにその効果をモニターするために使用される。好ましい態様では試験化合物はガン治療薬を含む。特に好ましい態様では、試験化合物はＳＴＩ−５７１（グリーバック（商標））という白血病の治療のためにＡｂｌキナーゼの阻害剤のようなキナーゼ阻害剤を含む。
【０１１４】
本明細書に示されるプロファイリングと診断のための適用では、修飾ペプチドが単離されるであろう蛋白質性調製物は、例えば疾患細胞又は液、組織生検細胞又は臨床液サンプル、又は試験薬剤で処理された試験細胞又は試験薬剤で処理された生物由来の液等に対応し、参照サンプルは正常な細胞又は液、疾患細胞又は液、又は処理されていない細胞又は処理されていない生物由来の液に対応し、プロファイリングは例えば疾患又は薬剤処理を原因とする修飾状態に於ける変化、又は疾患の診断に於いて有用な情報を提供する。もしくは参照サンプルは異常なシグナリングの状態（即ち疾患サンプル）に対応し、蛋白質性調製物は例えば疾患マーカーの存在が試験された患者又は疾患の疑いのある正常な生物に対応する。
【０１１５】
本発明の単離及びプロファイリング方法は、ゲノム情報と蛋白質情報と実際の疾患状態間のつながりを提供するように、ゲノムワイドに公知又は未知蛋白質の修飾状態の高スループットな同定に於いて特に有用である。本方法は容易に自動化され、よって例えば診断又は治療のための疾患マーカーの効率的で迅速な同定を希望する製薬会社により有利に行われるものである。
【０１１６】
単離されたペプチドの定量
一つの好ましい態様では、方法は本発明の方法に従って調製された修飾ペプチドの定量ができる追加の工程を採用する。例えばＳＩＬＡＣ（細胞培養物中のアミノ酸による安定な放射性同位体標識）に於いて、細胞培養物は、例えばアルギニンやリジンなどの特定のアミノ酸を枯渇させてからそれらのアミノ酸を「正常な放射性同位体」又は安定な「重い放射性同位体」形態で補給した培地で成長させる。例えばOngら、Mol. Cell. Proteomics 5: 376-86 (2002)を参照されたい。重い放射性同位体培地で成長した細胞は、特定の一つの蛋白質キナーゼを阻害することが予期される薬剤候補で処理される一方、正常の放射性同位体培地で成長した同じ細胞は、処理されずに残される。これらのサンプルが本発明の方法により分析のために調製されるときには、細胞は回収され、一対一の比で混合される。全ての続きの工程に於いて、これらの二つの混合されたサンプルは、一つのサンプルとして扱われ、サンプル間のマススペクトロメトリー強度の違いは薬剤処理についてのみ帰するものであり、サンプルの扱いやラントゥーラン（run-to-run）分析の変化に帰するものではない。サンプルに於ける違いはそれぞれマススペクトロメトリーの間の分析されるペプチドに於ける重い放射性同位体の存在又は欠如に基づいて、薬剤を処理された又は処理されていないサンプルについて追跡される。ＳＩＬＡＣは相対的な定量を提供し、比較、定量マススペクトロメトリーによるバイオマーカーを発見するための期待できる重要な方法であると考えられている。定量のためのほかの方法はＡＱＵＡ（絶対的定量）である。Gerber, Rushら、Proc Natl Acad Sci U S A 100: 6940-5 (2003)を参照されたい。本方法では、定量される修飾ペプチドは、重い放射性同位体ペプチドとして合成され、内部的な定量標準として機能できる。重い放射性同位体ペプチドの公知の量が、プロテアーゼによる消化に先立ってサンプルに添加される。重い放射性同位体ペプチド標準は、定量されるべき生物学的に生じたペプチドと化学的に同一であることから、それらは本発明の方法により同時に精製され、同時に質量分析される。生物学的ペプチドのペプチド標準に対する測定される比率により、重い放射性同位体ペプチド標準の公知の量をかけ合わせることにより、サンプル内の生物学的ペプチドの絶対量が決定される。ＳＩＡＬＩＣ方法とは対照的に、ＡＱＵＡ手法は絶対量を提供し、細胞培養物以外の非常に様々なサンプルの型に於いて使用されることができる。ＡＱＵＡ手法は、マススペクトロメトリーに基づく定量分析の発展に於けるように、例えば１乃至６０の限定された数の修飾ペプチドを定量することが望まれる場合の本発明の方法の好ましい態様である。ＡＱＵＡ手法の重要な要素は、新規の（de  novo）工程に於いて選択され、存在することが予期されるが検出されることができないペプチドと対照的に、マススペクトルメトリーによる分析に於いて検出できることが知られていることから、定量されることができるペプチドを同定することである。好ましい態様では、本発明の方法は最初にＡＱＵＡ手法による測定に適したペプチドを決定するために使用され、後にＡＱＵＡに基づくマススペクトロメトリー定量分析の部分として使用される。定量のための三番目の方法は、例えばペプチドのアミノ基又はカルボン酸基と反応する試薬のような、正常な放射性同位体及び重い放射性同位体化学修飾試薬によるペプチドの化学的修飾に基づくものである。例えばZhangら、Nat Biotechnol 21: 660-6 (2003)を参照されたい。これは、サンプルが化学的な修飾工程の後に混合され、細胞培養物以外のサンプルが分析されることができるという点を除いて、ＳＩＬＡＣ法と全体的に同じ方法に従うものである。
【０１１７】
以下の実施例は本発明を更に説明するためにのみ提供されるものであって、ここで添付される請求の範囲で提供されることを除いては、発明の範囲を制限するためのものではない。本発明は当業者には自明である本明細書に教示される方法の修飾及び改変を包含するものである。
【実施例１】
【０１１８】
Ａ．ペプチド混合物からホスホチロシンを含むペプチドの単離
リン酸化されていないペプチドからコンタミネーションなしに、複雑な混合物からホスホペプチドを特異的に精製できることを確立するために、本発明の方法が、リン酸化された及びリン酸化されていない合成ペプチドの混合物から、ホスホチロシン（ｐ−Ｔｙｒ）を含むペプチドを単離するために使用された。５−ホスホチロシンを含むペプチドと５位がリン酸化されていないパートナーペプチドを含むホスホチロシンペプチド混合物が調製され（表１）、リン酸化されていないペプチドがリン酸化されているペプチドと同じ配列を有しているが、リン酸化されていない、即ち、ホスホチロシンのかわりにチロシンを含んでいるものである。ペプチドは、レイニン／プロテインテクノロジーズシンフォニーペプチド合成装置上で、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨをホスホチロシンモノマーとして用いて、Ｆｍｏｃ化学で合成された。Perich, Lett. Pept. Sci. 6: 91 (1999)を参照されたい。ペプチド混合物は、蛋白質消化物と類似させるようにデザインされた広い質量範囲にわたっている。
【０１１９】
ホスホチロシンペプチド混合物の構成
【表１】
2005225858.tif 000003
【０１２０】
免疫親和性精製前の混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルが図２に示されている。星で標識されているピークは、リン酸化されたペプチドに対応し、○で標識されているピークはリン酸化されていないパートナーペプチドに対応する。
【０１２１】
Ｐ−Ｔｙｒ含有ペプチドは、ホスホチロシンペプチド混合物（全部で４６ｎｍｏｌ）を、アガロース樹脂（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９４１９）（１００μｌ）へ固定化された、ホスホチロシンモノクローナル抗体Ｐ−Ｔｙｒ−１００と接触させることで、様々なペプチド混合物から特異的に単離された。抗体は、バッチ精製形態で、スラリーとしてペプチドとインキュベートされた。スラリーは室温で１０分間、氷上で１時間放置された。結合していないペプチドは、プラスチックフリットを通じて遠心により除去され、残った抗体−樹脂は過剰に洗浄された（０．５％のＮＰ−４０を含む氷で冷やされたリン酸緩衝生理食塩水１ｍｌで２回、氷で冷やされたリン酸緩衝整理食塩水１ｍｌで２回、水で１回）。結合したホスホペプチドを溶出させるために、抗体−樹脂は３０％酢酸の４００μｌに再懸濁され、室温で１０分間放置され、遠心された。溶出されたペプチド分画は乾燥され、８０μｌの水（抗体−樹脂を処理する前のホスホチロシンペプチド混合物の容量）に再懸濁され、１μｌの分取が希釈され、上述されるように（図３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで分析された。図４は免疫親和性による精製の前（上のパネル）と後（下のパネル）のホスホチロシンペプチド混合物のマススペクトルを表す。抗体−樹脂から溶出された分画は、全て５ホスホペプチドを含むが、リン酸化されていないペプチドパートナーは含んでいない。従って、本発明の方法は、リン酸化されたおよびリン酸化されていないペプチドの複雑な混合物から、ホスホチロシンがある配列の違いに関係なく、ホスホチロシンを含む望ましいホスホペプチドを全て特異的に単離する。
【０１２２】
Ｂ．ペプチド混合物からホスホスレオニンを含むペプチドの単離
本発明の方法は、更に第二の一般的な蛋白質修飾抗体である、ホスホスレオニンポリクローナル抗体Ｐ−Ｔｙｒ−ポリクローナルを、リン酸化された及びリン酸化されていない合成ペプチドの混合物からホスホスレオニンを含むペプチドを精製するために使用することを立証する。混合物は、２つのホスホスレオニン含有ペプチド及びそれらの二つのリン酸化されていない対応するペプチド（表２参照）という４つの合成されたペプチドからなる。上述のように得られた、本発明の免疫親和性精製の前にホスホスレオニンペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルが、図５に示されている。
【０１２３】
ホスホスレオニンペプチド混合物の構成
【表２】
2005225858.tif 000004
【０１２４】
ＡＰ−Ｔｈｒポリクローナル抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９３８１）は、ヒドラジド化学（上述の実施例１Ａに於いて使用されたＰ−Ｔｙｒ−１００アガロース樹脂を製造するために使用された化学と同じ）により、購入可能なクロスリンキングキット（バイオラド  Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  ＨＺ  免疫親和性キット、製品番号１５３−６０６０）を使用して、製造業者の説明書に従ってアガロース樹脂に結合した各々１ミリリットルの樹脂を１ミリグラムの抗体と反応させた。Ｐ−Ｔｈｒを含むホスホペプチドが、ホスホスレオニンペプチド混合物（総量２０ｐｍｏｌ）をこの抗体−樹脂（１００μｌ）と接触させて樹脂とペプチドを４℃で一晩インキュベートすることにより、混合物から特異的に単離された樹脂は再生され、洗浄され、結合したペプチドは溶出され、処理され、上述したように分析された。図６は結合していない及び結合したペプチド画分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。結合していない画分は、いくつかの単離されたホスホペプチドがカラムに結合しないような、最適化されていない、特有の使用された条件下で、ホスホペプチドを含む４つのペプチド全てを含んでいる。結合した画分は、両方のホスホペプチドを含むが、対応するリン酸化されていないペプチドは含んでいない。従って、本発明の方法は、リン酸化された及びリン酸化されていないペプチドの混合物から、ホスホスレオニンが生じる配列の違いに関係なく、ホスホスレオニンを含む望ましいホスホペプチドを全て選択的に単離する。
【０１２５】
Ｃ．低レベルのサンプルからホスホチロシンを含むペプチドの単離
低レベルのサンプル（即ち、修飾ペプチドの個々の量が約１ｐｍｏｌ又はそれ以下）から、本発明の方法に従って修飾ペプチドを単離することが、１０ペプチド混合物に由来するホスホチロシンペプチドの低ピコモル量と、上述のパートＩＡに於いて開示されるように、固定化されたホスホチロシン抗体Ｐ−Ｔｙｒ−１００を用いて行われた。Ｐ−Ｔｙｒ含有ホスホペプチドは、１０ペプチド混合物（総量２４ｐｍｏｌ）をＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂（ＣＳＴ  製品番号９４１９）（１０μｌ）と接触させることにより、複雑な混合物から単離された。吸着による非特異的なペプチドロスを減少させるために、ペプチド混合物は１００ｎｇのＢＳＡを含んだ樹脂は再生され過剰に（０．５％のＮＰ４０を含むＰＢＳ０．５ｍｌを２回、ＰＢＳ０．５ｍｌで２回、０．５ｍｌ水で５回）洗浄された。抗体−樹脂に結合したホスホペプチドは、ｐＨ２．３の５μｌの０．１Ｍグリシンで３回樹脂を洗浄することにより溶出された。三つの溶出液が合わせられ、グリシンはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス分析を妨害することから、液体はＺｉｐＴｉｐ器具（ミリポアコープ、パート番号ＺＴＣ１８Ｓ０９６）で脱塩された。
【０１２６】
図７は、本発明の方法による免疫親和性精製の前（一番上のパネル）及び後（三番目のパネル）に於ける低レベルの１０ペプチド混合物のマススペクトルを示す。星で標識されるピークはリン酸化されたペプチドに対応し、○で標識されるピークはリン酸化されていない対応するペプチドに対応する。低い（ピコモル）レベルで存在するにもかかわらず、５つのホスホペプチド全てが抗体−樹脂に結合してそこから溶出された（三番目のパネル）。混合物の１０ペプチドのうち、三つのみが結合しない画分（二番目のパネル）で検出され、それらはリン酸化されていないペプチドであった。結合したペプチドの画分は、中和され、ホスホペプチドからリン酸を取り除くことができるウシ小腸アルカリホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの割り当てを確認するために再分析された（図７、一番下のパネル）。予期されたように、ホスホペプチドは完全にホスホペプチドよりも質量が８０低いイオンを産生するように脱リン酸化された。これはホスホペプチド合成アーティファクトとして１８６９及び１５２３のピークを割り当てること、及び１８６７及び１５２１のピークをリン酸化されていないペプチドに割り当てることを助けた。従って、本発明の方法はリン酸化されたおよびされていないペプチドの低レベルの混合物から、ホスホチロシンがある配列の違いに関係なく、ホスホチロシンを含む望ましいホスホペプチドの全てを、低レベルであるにもかかわらず選択的に単離するものである。
【０１２７】
Ｄ．ペプチド混合物からのＡｋｔ基質ホスホペプチドの単離
本発明の方法は更に、ホスホＡｋｔ基質モチーフを含むホスホペプチドを、リン酸化された及びされていない合成ペプチドの混合物から単離するために、ホスホ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質抗体である、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）のポリクローナル抗体を用いて行われた。Ａｋｔ蛋白質キナーゼは、細胞成長（Marte and Downward, Trends Biochem Sci 22: 355-358 (1997)）、血管新生(Jiangら、Proc Natl Acad Sci USA 97: 1749-1753 (2000))、転写制御(Scheid and Woodgett, Curr Biol 10: R191-194(2000))に於いて中心的な役割を果たしている。Ａｋｔ蛋白質キナーゼは、標的となる残基がＲはアルギニンでＸはいかなるアミノ酸でもよく、Ｔ／Ｓが標的となるスレオニン又はセリンを示す場合に於ける共通配列モチーフＲＸＲＸＸ（Ｔ／Ｓ）内に生じる場合に、スレオニン又はセリン残基で蛋白質基質をリン酸化できる。
【０１２８】
ホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質ポリクローナル抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６１１）は、共通配列を含む蛋白質がリン酸化されている場合には、複数の異なるリン酸化をされた蛋白質を認識するが、リン酸化されていない類似のモチーフは認識しない。ホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質抗体の特異性は、−５又は−３の位置のリジン又はアルギニンを有するホスホスレオニン又はホスホセリン、即ち（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）ＸＸ（Ｔ＊／Ｓ＊）（配列番号１５）を含む蛋白質及びペプチドに、周囲のアミノ酸配列（即ちモチーフの前後に）と実質的に無関係により結合するというものである。この抗体は、リン酸化されたＡｋｔ共通基質モチーフを含むペプチドを精製するために使用できることが、今ここに示されている。
【０１２９】
Ａｋｔモチーフを含有するホスホペプチドは、本発明の方法に従って、リン酸化された及びリン酸化されていない合成ペプチドの混合物から選択的に単離された。混合物は、３つのホスホスレオニン含有ペプチド、一つのホスホセリン含有ペプチド、４つのリン酸化されていない対応するペプチド（表３）の８つの合成ペプチドからなる。ホスホ−Ａｋｔ基質共通配列は、混合物内の４つのホスホペプチド全てに存在し、これらのホスホペプチドはホスホＡｋｔ基質抗体に認識され、それに結合できることが、ＥＬＩＳＡによって知られている。
【０１３０】
ホスホ−Ａｋｔ基質ペプチド混合物の構成
【表３】
2005225858.tif 000005
【０１３１】
ホスホペプチドは、アガロース樹脂（セルシグナリングテクノロジー社製、パート番号９６１９）（２０μｌ、２μｇ／μｌ）に固定化されたホスホ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質抗体と、ホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物（個々のペプチドを５ｐｍｏｌ）を接触させることにより、ペプチド混合物から単離された。抗体はスラリーとして４℃で２時間ペプチドとインキュベートされた。結合していないペプチドは、遠心により除去され、抗体−樹脂は過剰に洗浄された（０．５％のＮＰ−４０を含む氷で冷やされたＰＢＳ０．５ｍｌで２回、氷で冷やされたＰＢＳ０．５ｍｌで２回、氷で冷やされた水０．５ｍｌで３回）。結合したペプチドはｐＨ２．３で０．１Ｍグリシンの１０μｌ液で三回溶出された。結合して溶出されたペプチドを含む画分の５μｌ部分は、上述されたようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで分析される前に、逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩および濃縮された。
【０１３２】
図８は免疫親和性精製の前（一番上のパネル）及び後（一番下のパネル）のホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物のマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドに対応し、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは不安定な分解及びリン酸のニュートラルロスを行ったリン酸化ペプチドに対応する（以下の実施例５で考察されるように）。固定化された抗体（一番下）に結合してそこから溶出されたペプチドの画分は、４つのホスホペプチド全てを含んでいるが、対応するリン酸化されていないペプチドは含んでいない。従って、本発明の方法はホスホスレオニン又はホスホセリン残基を含む、ホスホＡｋｔ基質モチーフを含む合成ペプチド混合物内の全てのペプチドを選択的に単離するものである。所望されるように、リン酸化されていない共通モチーフを含むペプチドは単離されない。
【０１３３】
Ｅ．ペプチド混合物からの１４−３−３結合モチーフ＃１ホスホペプチドの単離
本発明の方法は、リン酸化された及びリン酸化されていない合成ペプチドの混合物から１４−３−３結合モチーフを含むホスホペプチドを精製するために、ホスホ（ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体である、第二のモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）のモノクローナル抗体を用いて更に実証された。１４−３−３蛋白質は、リン酸化依存性の蛋白質−蛋白質相互作用（Muslinら、Cell 84, 889-897 (1996)）を通じて、いくつかの生物学的工程を制御する。１４−３−３蛋白質のほとんど全ての結合パートナーは、二つの異なるホスホセリン含有共通配列（Yaffeら、Cell 91, 961-971 (1997)）の少なくとも一つを含む。一つの共通配列であるモチーフ＃１は、Ｒ／Ｋはアルギニン又はリジンであり、Ｓはセリンであり、Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、Ｓ＊はホスホセリンであり、Ｐはプロリンであるところの、（Ｒ／Ｋ）ＳＸＳ＊ＸＰである。
【０１３４】
ホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフモノクローナル抗体（４Ｅ２）（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６０６）は、共通結合モチーフ＃１を含むホスホペプチドを認識するモチーフ特異的な抗体である。１４−３−３結合モチーフ抗体は、このモチーフ（＋２位でプロリンに、−３でアルギニン又はリジンに囲まれているホスホセリン、即ち、（Ｋ／Ｒ）ＸＸＳ＊ＸＰ（配列番号２４））を含むペプチド及び蛋白質に非常に特異的である。認識はモチーフのリン酸化された形態に特異的であり、実質的に周囲のアミノ酸配列（即ちモチーフの前後に）に無関係である。この抗体はこのモチーフのホスホセリンの代わりにホスホスレオニンを含む類似配列と若干交差反応する。
【０１３５】
１４−３−３蛋白質に結合するほかの蛋白質を同定するため、又はゲノムワイド（細胞ワイド）で公知の結合パートナーをプロファイルするために、固定化された１４−３−３結合モチーフ抗体は本発明の方法に従って蛋白質性調製物から免疫親和的にホスホペプチドを精製するために使用されるであろう。この実行可能性を立証するために、この抗体は最初に、ホスホペプチドが抗体の公知の特異性と合致するモチーフ配列を含む場合に、リン酸化された及びリン酸化されていない合成ペプチドの混合物からリン酸化されたペプチドを選択的に単離するために使用された。この混合物は１３の合成ペプチド（表４）からなる。混合物内の４つのペプチドは、抗体の公知の特異性に合致する配列を含み、ホスホセリンを含むものが３つ（配列番号２６，２８，２９）、ホスホスレオニンを含むものが一つ（配列番号２７）である。３つのホスホセリン含有ペプチドが１４−３−３モチーフ＃１抗体により認識され、結合できることがＥＬＩＳＡにより知られている。ペプチド混合物は、２つのホスホチロシン含有ペプチド、２つのホスホＡｋｔ基質モチーフペプチド、５つのリン酸化されていない対応するペプチドからなる、１４−３−３結合モチーフ抗体に結合すべきでない９つのほかのペプチドを含んでいた。
【０１３６】
１４−３−３結合モチーフペプチド混合物の構成
【表４】
2005225858.tif 000006
【０１３７】
１４−３−３結合モチーフ＃１抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６０６）はヒドラジド化学（上述の実施例１Ａに於いて使用されたＰ−Ｔｙｒ−１００アガロース樹脂を製造するために使用された化学と同じ）により、購入可能なクロスリンキングキット（バイオラド  Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  ＨＺ  免疫親和性キット、製品番号１５３−６０６０）を使用して、製造指示書に従ってアガロース樹脂に結合させられた樹脂１ミリリットル当たり１ミリグラムの抗体と反応させた。ホスホペプチドが、ペプチド混合物（個々のペプチドが１０ｐｍｏｌ）をこの抗体−樹脂（１０μｌ、１μｇ／μｌ）と接触させて、１４−３−３結合モチーフペプチド混合物から選択的に単離された。抗体はスラリーとして室温で１時間と４℃で１時間、ペプチドとインキュベートされた。結合していないペプチドは遠心により取り除かれ、抗体−樹脂は過剰に洗浄された（１ｍｌの氷で冷やされたＰＢＳで二回と、１ｍｌの氷で冷やされた水で一回）。結合したペプチドは、ｐＨ２．０で０．１Ｍのグリシンの３０μｌ液で溶出された。溶出されたペプチドの９μｌ部分は、上述したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析の前に逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩および濃縮された。
【０１３８】
免疫親和性精製の前（一番上のパネル）及び後（一番下のパネル）のペプチド混合物のマススペクトルが図９に示されている。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドに対応し、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応する。黒い星印で標識されたピークはその配列が抗体の公知の特異性と合致しないことから、１４−３−３結合モチーフ抗体に結合することが予想されないホスホペプチドである。１４−３−３結合モチーフを含む混合物内の４つのホスホペプチド中、三つが１４−３−３結合モチーフ抗体により単離され、それらは固定化された抗体に結合し、そこから溶出されたペプチドの画分に於ける主要なピークに対応している（図９、一番下のパネル）。ある１４−３−３結合モチーフホスホペプチドは単離されなかったが（配列番号２９、計算されるプロトン化された質量は１７３８．９）、それはまた未処理のペプチド混合物に於いても検出されず、即ちおそらく弱くイオン化されるペプチドであろう。わずかに様々なモチーフを含む（ホスホセリンのかわりにホスホスレオニン）ホスホスレオニン含有ペプチドがまた単離され（配列番号２７、計算されるプロトン化された質量は１７７７．８）、実際抗体と弱く交差反応することが期待されたものである。抗体の特異性と合致しない配列を含む二つのペプチドが単離され、一つはホスホＡｋｔ基質モチーフ（配列番号３５、計算されるプロトン化された質量は１６０８．６）を含むホスホペプチドであり、もう一方はリン酸化されていないもの（配列番号２５、計算されるプロトン化された質量は１９１０．９）であった。結合して溶出された画分に於けるいくつかのピーク（１９４１、１７７０、１６４２、１５２６）はまた、ペプチド混合物のかわりに緩衝液で処理された抗体−樹脂である陰性コントロールの結合して溶出された画分にも存在した。これらのアーティフィシャルなピークは抗体−樹脂調製に由来するようにみえ、これはおそらく高度に精製された抗体から抗体−樹脂を新規に製造することにより、又は、ペプチド混合物を載せる前に抗体−樹脂を前溶出させることにより、防ぐことができる。
【０１３９】
この結果は更に、本明細書に記載されているように、免疫親和性精製により望ましいホスホペプチドが単離／濃縮されることができることを示すことにより、本発明の方法の一般性を確立する。上記考察のように、ここではある場合には、理由は定かでないが、標的配列モチーフを含むいくつかのペプチドは単離されず、及び／又は、他の標的モチーフを含まないペプチドが不注意に又はアーティファクトとして精製されるであろう。にもかかわらず、開示された方法の完全さと特異性は、それ以外のホスホペプチド精製方法よりも実質的に有利である。上述のように、標的モチーフを含まない望ましくないペプチドが望ましいペプチドと共に単離される場合には、望ましくないペプチドは、非特異的な結合ペプチドを除去するために樹脂洗浄の数とストリンジェンシーを増加させることにより避けられる。
【実施例２】
【０１４０】
Ａ．消化された粗細胞抽出物から、ホスホチロシン含有及びホスホＡｋｔ基質ペプチドのサブセットの単離
実施例１は、いくつかのリン酸化特異的抗体が、本発明の方法に於いてリン酸化されていないペプチドから望ましいリン酸化されたペプチドを選択的に分けるために使用できることを示している。抗体は一般的な修飾特異的抗体又は、モチーフがゲノム内の多くの異なるペプチド又は蛋白質にある、いくつかの不変の残基を含む、短いユニークでないモチーフを認識する、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体である。実施例１に於いて示されるように、抗体はペプチド間の違いがリン酸基の有無のみによる場合でも、リン酸化されていないペプチドからリン酸化されたペプチドを区別できる。この実施例では、望ましいホスホペプチドが本発明の方法により、異なる型のホスホペプチドを含む複雑な混合物から選択的に単離される。本発明の方法は抗体の特異性に基づいて予期されるであろうホスホペプチドサブセットを単離する。また本発明の方法を粗細胞抽出物に適用して得られた結果が、本発明の方法をよく決定されている合成混合物に適用して得られた結果と非常に類似していることが示されている。
【０１４１】
本明細書で示される単離のための模範的な調製物は、ホスホチロシンペプチド混合物とホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物が添加された、消化された粗細胞抽出物から成っていた。粗細胞抽出物は活性Ａｋｔ蛋白質キナーゼを構成として発現するように安定に形質転換され、５０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）で１５分間処理された、３Ｔ３マウス線維芽細胞から調製された。細胞は洗浄され、回収され、ソニケーションにより溶解され、溶解物中の蛋白質は変性され、溶解物は遠心により透明にされた。抽出物はそれから、ポリビニルマトリックスビーズ（ＭｏＢｉＴｅｃ、部分番号Ｐ５１０１）であるＦ７ｍに固定化されたエンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃによりペプチドへと消化され、固定化されたＧｌｕ−Ｃは遠心により除去された。消化された抽出物は抗体により認識される外来性ペプチドを除去するために、ホスホ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ共通基質モチーフ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６１１）で処理された。
【０１４２】
この劣化した消化された抽出物は、個々のペプチドが１０ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度で存在し、消化された抽出物由来のペプチドのバックグラウンドが２５０μｇ／ｍｌとなるように、ホスホチロシンペプチド混合物（表１）及びホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物（表３）と混合された。このペプチド−抽出物混合物（１ｍｌ）は固定化されたＰ−Ｔｙｒ−１００抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、部分番号９４１９）又は固定化されたホスホＡｋｔ基質抗体（２０μｌ、２μｇ／μｌ）で処理された。４℃で二時間後、個々の抗体−樹脂は遠心により集められ、過剰に洗浄された（１ｍｌの氷で冷やされたＰＢＳで三回、１ｍｌの氷で冷やされた水で２回）。結合したペプチドはそれからｐＨ２．３で０．１Ｍグリシンの液１５μｌを二回で溶出された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析の前に、上述したように結合して溶出されたペプチドを含む画分の９μｌが逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩され濃縮された。
【０１４３】
一般的な修飾特異的抗体であるＰ−Ｔｙｒ−１００抗体では、スペクトルは、抗体の特異性から予期されるように、抗体が５つのホスホチロシンペプチドのうち３つを単離したが、ホスホチロシンを含まない４つのホスホＡｋｔ基質ホスホペプチドは一つも単離せず、９つのリン酸化されていないペプチドも単離しなかったことを示している（図１０、一番上のパネル）。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドに対応し、○で標識されたペプチドはリン酸化されていないペプチドに対応する。図４との比較は、ペプチド抽出物混合物から同定されなかった二つのホスホチロシン含有ペプチドは、比較的単純な合成ペプチドの混合物で低いシグナルを生じたことを示している。これらのペプチドは、プロトンに弱く競合するため、ほかのペプチドが存在する場合にはあまりイオン化されないのであろう。
【０１４４】
モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体である、ホスホＡｋｔ基質抗体では、スペクトルは、抗体がホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物由来の４ホスホペプチドのうち３つを単離したが、５つのホスホチロシンペプチドはいずれも単離しなかったことを示している（図１１、一番上のパネル）。図８との比較は、ペプチド抽出物混合物から同定されない一つのホスホＡｋｔ基質ペプチドは、合成ペプチド混合物由来で低いシグナルをあたえていたことを示している。
【０１４５】
図１０及び図１１に示されるホスホペプチドの割り当ては、結合したペプチド画分の一部を、ホスホペプチドからリン酸を除去できるウシ小腸ホスファターゼで処理することにより確認された。予期されたように、ほとんどの割り当てられたホスホペプチドは、ホスホペプチドよりも質量が８０低いイオンを産生するように脱リン酸化された（図１０、図１１、一番下のパネル）。従って、望ましいホスホペプチドは、本発明の方法に従って複雑な混合物から選択的に単離されるであろう。
【０１４６】
Ｂ．消化された粗細胞抽出物から、１４−３−３結合モチーフを含むホスホペプチドの単離
粗細胞抽出物で得られた結果が、よく決定されている合成されたペプチド混合物で得られた結果と非常に類似していることを確認するもう一つの実施例として、本発明の方法が、細胞抽出物と合成ペプチドを含む複雑な混合物から１４−３−３結合モチーフ含有ホスホペプチドを単離するために使用された。
【０１４７】
本明細書に示される単離のための模範的な調製物は、１４−３−３結合モチーフ＃１ペプチド混合物（表４）が添加された、消化された粗細胞抽出物から構成される。エンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃで消化された粗細胞抽出物が、実施例２（Ａ）に於いて記載されるように、構成として活性なＡｋｔ蛋白質キナーゼを発現するように安定に形質転換された３Ｔ３マウス線維芽細胞から調製された。個々のペプチドが１０ｐｍｏｌ／ｍｌで存在し、消化された抽出物由来のペプチドのバックグラウンドが０．５ｍｇ／ｍｌとなるように、消化された抽出物は１４−３−３結合モチーフペプチド混合物（表４）と混合された。
【０１４８】
固定化された１４−３−３結合モチーフ抗体が、１ｍｇの１４−３−３結合モチーフ抗体と０．１ｍｌの蛋白質Ａ−アガロース樹脂（ロシュ、製品番号１１３４５１５）と４℃で一晩混合することにより調製された。結合していない抗体は樹脂を冷たいＰＢＳで三回洗浄することにより除去された。蛋白質Ａ−アガロースに結合した抗体の量は、固定化の前後に抗体溶液の２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、４ｍｇ抗体／ｍｌ樹脂であることが示された。
【０１４９】
ペプチド抽出物混合物（１ｍｌ）は固定化された１４−３−３結合モチーフ＃１抗体（２０μｌ、１μｇ／μｌ）で処理された。４℃で二時間後、固体樹脂は遠心により集められ、過剰に洗浄された（１ｍｌの氷で冷やされたＰＢＳで２回、氷で冷やされた１ｍｌの水で１回）。結合したペプチドはそれから０．１％トルフルオロアセティックアシドの３０μｌ液で溶出された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析の前に、上述したように結合して溶出したペプチドを含む画分の９μｌ部分が逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩及び濃縮された。
【０１５０】
図１２は、１４−３−３抗体−樹脂に結合して、溶出されたペプチドを示す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドに対応し、○で標識されたペプチドはリン酸化されていないペプチドに対応する。図１２と図９の比較は、本方法が、混合物が、潜在的に妨害する、消化された細胞抽出物由来の非結合ペプチドの大きなバックグラウンドで薄められる場合に於いても、合成ペプチド由来の同じ４つの１４−３−３モチーフホスホペプチドが単離されたことを示している。従って、望ましいリン酸化されたペプチドは、本発明の方法に従って複雑な混合物から選択的に単離されるであろう。
【実施例３】
【０１５１】
上皮成長因子受容体を過剰発現する細胞の抽出物から、ホスホチロシン含有ペプチドの単離
本発明による複雑な混合物から修飾ペプチドの選択的単離は、更に消化された前細胞抽出物と、公知のホスホペプチドを単離する一般的なホスホチロシン抗体を使用することにより示される。蛋白質上の修飾（リン酸化）部位がよく研究されていることから、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現するＡ４３１上皮ガンセルラインがモデルシステムで選択された。ＥＧＦＲファミリーメンバーの活性化は多くの腫瘍と関連がある。インビボで自動リン酸化される、三つの主要な部位（Ｔｙｒ１０６８、Ｔｙｒ１１４８、Ｔｙｒ１１７３）と二つのマイナーな部位（Ｔｙｒ９９２とＴｙｒ１０８６）の５つの部位が、ＥＧＦＲに於いて同定されている（Downwardら、J Biol Chem 260: 14538-546 (1985), Hsuanら、Biochem J 259: 519-27 (1989), Margolisら、EMBO J 9: 4375-380 (1990), Waltonら、J Biol Chem 265: 1750-54 (1990)）。ＥＧＦＲはこのセルラインで発現していることが予期される、主要なリン酸化された蛋白質である。
【０１５２】
細胞調製物は以下のように得られた。Ａ４３１細胞は５分間２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで処理され、それから洗浄されて回収された。細胞はソニケーションで溶解され、溶解物内の蛋白質は変性され、溶解物は遠心により透明にされた。細胞抽出物はリン酸化されたＥＧＦＲのレベルを示すために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングにより分析された（図１３）。処理されていない細胞に比較して（図１３、レーン１）、ＥＧＦ処理された細胞に於いてＰ−Ｔｙｒ−１００抗体により認識された主要な蛋白質はＥＧＦＲ（レーン２）である。抽出上清内の蛋白質はＰＯＲＯＳ樹脂（アプライドバイオシステムズ、部分番号２−３１２７−００）に固定化されたトリプシンでペプチドへと消化され、固定化されたトリプシンは遠心により除去された。
【０１５３】
蛋白質性調製物に含まれるペプチドの複雑な混合物から、ホスホチロシン含有ペプチドを選択的に単離するために、トリプシンで消化された粗抽出物（約２．５ｍｇ蛋白質／ｍｌ）が固定化された一般的なチロシン修飾抗体であるＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９４１９）（２０μｌ）と接触させられた。最初の洗浄が０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む０．５ｍｌのＰＢＳで行われることを除いて、スラリーは上述したようにインキュベートされ処理された。図１４（一番上のパネル）は、この複合混合物（消化）由来の、結合したペプチド画分のマススペクトルを示す。星で標識されたピークはＥＧＦ受容体の二つのホスホチロシン部位に対応し、プロトン化されたｐＴｙｒ１１４８を含むトリプシン分解ペプチドは２３１６．０の予想される質量を有し、ｐＴｙｒ１０８６は２４７９．２の予想された質量を有している。セルラインがＥＧＦ受容体を過剰発現していることから、ＥＧＦ受容体ペプチドは結合した画分の中の主要なホスホチロシンペプチドであることが予期されたことに留意されたい。
【０１５４】
この割り当てを確かめるために、単離された（即ち結合した）ペプチドは上述したようにホスファターゼ酵素で処理され、処理された画分は上述したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで再分析された（図１４、一番下のパネル）。予期されたように、これらの二つのホスホペプチドは、個々のペプチドからの一つのリン酸基の除去に相当する、ホスホペプチドよりも質量が８０低い新しいイオンを産生するように、完全に脱リン酸化された。従って、本発明の方法は選択的に、例えばホスホチロシンを含むような修飾ペプチドを、蛋白質性調製物（消化された粗細胞抽出物）に存在する複雑な混合物から選択的に単離するものである。
【実施例４】
【０１５５】
活性化されたＳｒｃ蛋白質キナーゼ又は活性化されたＡｂＩ蛋白質キナーゼを発現する細胞の抽出物から、ホスホチロシン含有ペプチドの単離
一般的なホスホチロシン抗体により単離されるホスホペプチドのセットが、細胞抽出物の特質であることを示すために、本発明の方法は実施例３に於いて使用されたものとは異なる、消化された完全な細胞抽出物に適用された。ここで、模範的なシステムは、活性なＳｒｃ蛋白質キナーゼを構成として発現するように安定に形質転換された３Ｔ３マウス繊維芽細胞である。蛋白質キナーゼのＳｒｃファミリーは、細胞の成長と分化の制御に於いて重要である（Thomas and Brugge, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 13, 513-609 (1997)）。Ｓｒｃ蛋白質キナーゼは、多くの異なるシグナル経路に関連しており、様々な生物学的工程に影響をあたえることができる。Ｓｒｃはその標的蛋白質をＴｙｒ残基に於いてリン酸化する、即ち、チロシン特異的キナーゼであることが知られている。
【０１５６】
消化された細胞抽出物は、Ｓｒｃ蛋白質キナーゼを発現する３Ｔ３細胞を回収することにより調製された。細胞はソニケーションで溶解され、溶解物内の蛋白質は変性され、溶解物は遠心により透明にされた。細胞抽出物は、活性化されたＳｒｃ蛋白質キナーゼがリン酸化された多くの標的蛋白質を有していたことを示すために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングにより分析された（図１５）。Ｓｒｃ蛋白質キナーゼの活性化は、処理されていない抽出物（レーン１）をＳｒｃで形質転換された（レーン２）３Ｔ３細胞の抽出物をブロッティングして、ブロットをＰ−Ｔｙｒ−１００抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９４１９）によりプローブすることで示された。チロシンリン酸化のレベルと範囲は、処理されていない細胞に於けるよりも、Ｓｒｃ蛋白質キナーゼで安定に形質転換された細胞に於いて非常に大きかった。
【０１５７】
抽出物中の蛋白質は固定化されたトリプシンでペプチドへと消化され、固定化されたトリプシンは遠心により除去された。固定化されたＰ−Ｔｙｒ−１００抗体は、１ｍｇのＰ−Ｔｙｒ−１００と０．１ｍｌの蛋白質Ｇ−アガロース樹脂（ロシュ、製品番号１２４３２３３）を一晩４℃で混合することで調製された。結合していない抗体は冷たいＰＢＳで三回樹脂を洗浄することで除去された。蛋白質Ｇ−アガロースに結合した抗体の量は、固定化の前及び後に抗体溶液の２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、１ｍｌ樹脂あたり５ｍｇの抗体であることが示された。
【０１５８】
蛋白質性調製物に含まれるペプチドの複雑な混合物から、ホスホチロシン含有ペプチドが、トリプシンで消化された粗抽出物（約２．５ｍｇ蛋白質／ｍｌ）を、プロテインＧ−樹脂に固定化されたホスホチロシンＰ−Ｔｙｒ−１００抗体（２０μｌ、５ｍｇ抗体／ｍｌ樹脂）と、４℃、１６時間バッチ形式で接触させることにより単離された。結合していないペプチドは遠心により除去され、抗体−樹脂は過剰に洗浄された（１ｍｌの氷で冷やされたＰＢＳで３回と、氷で冷やされた１ｍｌの水で２回）。結合したペプチドと抗体はそれから１００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸で溶出され、溶出されたペプチドは、質量が１００００より大きい分子を保持する、ミクロコンＹＭ−１０膜（ミリポア、製品番号４２４０７）を通じて遠心により溶出した抗体から分離された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析の前に、ＹＭ−１０通過画分の９μｌ部分が逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩及び濃縮された。
【０１５９】
溶出されたペプチドがリン酸化されていることを確かめるために（図１６、一番下のパネル）、ホスホペプチドからリン酸基を除去し、ペプチドからの一つのリン酸基の除去に相当する、ホスホペプチドよりも質量が８０低い新しいイオンを産生する、えびアルカリホスファターゼでペプチド画分を処理する前（図１６、一番上のパネル）及び後（一番下のパネル）にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで、ホスホチロシン抗体に結合して溶出されたペプチドの質量が測定された。ホスホチロシン抗体−樹脂に結合して溶出された８つのペプチドの質量は、ホスファターゼ処理後にホスホペプチドよりも質量が８０低い新しいイオンを生じ、これはそれらがホスホペプチドであることを示している。
【０１６０】
ホスホチロシン抗体に結合して溶出されたペプチドは、更にＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。ペプチド画分の２５μｌが逆相ＺｉｐＴｉｐで脱塩及び濃縮され、２μｌの０．１％トリフルオロ酢酸、４０％アセトニトリルで溶出された。溶出された画分の０．４μｌ分取はＡＣＨＡマトリックス溶液と混合され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで分析され、図１６に於いて示されるものと同様のスペクトルを生じた。溶出された画分の残りは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。
【０１６１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、サーモフィネガンＬＣＱデカイオントラップマススペクトロメーターとカップルしたサーモフィネガンサーベイヤーＨＰＬＣシステムで行われた。ペプチドが逆相支持体に結合できるようなレベルにまでアセトニトリルの濃度を減少させるために、サンプルは０５％酢酸、０．００５％ＨＦＢＡ（ヘプタフルオロブチリックアシド、ピアースエンドジェン、部分番号２５００３）、１％のホルミックアシドを含むアセトニトリルで１０倍に希釈された。圧力セルを使用して、希釈されたサンプルは、マジックＣ１８ＡＱ逆相樹脂（５μｍ粒子、１００オングストローム穴、ミクロムバイオリソース、部分番号９９９６６１００００）とパックされているキャピラリーカラム（７５μｍの内径、１５μｍチップ、シリカピコチップ、ニューオブジェクティブと融合されている、部分番号ＦＳ３６０−７５−１５−Ｎ）にロードされ、０．５％酢酸、０．００５％ＨＦＢＡ、５％アセトニトリルで平衡化された。ペプチドは２５０ｍｌ／分の名目上の流速でアセトニトリル濃度を上昇させる線上の勾配により、カラムから溶出された。
【０１６２】
カラムのチップで電気スプレーを誘導するために、Gatlinら、上述に於いて開示されるように、ＨＰＬＣポンプからの流速を調節するために使用されるクロスでのカラムの液体ジャンクション上流に、２０００Ｖが適用された。サーモフィネガンエックスキャリバーソフトウエアが器具のコントロールとデータ獲得のために使用された。ペプチドがＬＣカラムから溶出されると、ＭＳ／ＭＳスペクトルが「トップ３」データ依存様式で収集された。この方法はサーベイＭＳスキャンを行い、イオン強度が前もって設定された強度の閾値を超えて、既にＭＳ／ＭＳにより最近分析されたものではない（エックスキャリバーソフトウエアのダイナミックな除外特徴を使用することで認識された）場合には、３つの最も豊富なイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを集めた。
【０１６３】
ペプチドは全てのＭＳ／ＭＳ産物イオンスペクトルをＳｅｑｕｅｓｔという実験的なスペクトルを最も合致した適合を見つけるために、蛋白質配列データベース由来の理論的なスペクトルのライブラリーと関連付けるプログラムで分析することにより同定された。一つの曖昧さ無く同定されたホスホペプチドは、豊富な酵素であるエノラーゼＡ（図１７）由来のホスホチロシン含有ペプチドである。この方法でリン酸化部位として同定された残基は、Ｓｒｃで形質転換された細胞でリン酸化されることが知られている（例えばTanakaら、J Biochem (Tokyo) 117: 554-559 (1995), Cooperら、J Biol Chem 259: 7835-7841 (1984)を参照されたい）。このホスホペプチドはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー間に検出される顕著なピークである、図１６に於いて「１８８５．２」と標識されるピークに対応しており、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析されたホスホペプチドと同じものが更にＬＣ−ＭＳで分析されることができることを示している。
【０１６４】
従って、開示された方法による修飾ペプチドの免疫親和性単離は、これらの細胞の培養条件下でリン酸化されることが知られている部位を検出し、また予期されたように割り当てられた部位は抗体の公知の特異性と合致する。消化されたマウス細胞抽出物由来の公知エノラーゼホスホペプチドの単離というこの結果は、ゲルで精製されたヒトエノラーゼ（同じ蛋白質）からホスホチロシン含有ペプチドを単離することに失敗し、ホスホペプチドの免疫親和性精製はほとんど不可能であると結論づけた、Marcusら、上述に於いて報告された結果と全く対照的である。
【０１６５】
別の研究で、本発明の方法は、ｖ−Ａｂｌとｃ−Ｓｒｃ  Ｙ５２７Ｆという二つの活性チロシンキナーゼを構成として発現しているＮＩＨ／３Ｔ３細胞からホスホチロシンペプチドを抽出するために使用された。これらのセルラインは細胞培養の間未処理であったことから、細胞内に於けるチロシンリン酸化の多くが、細胞内に於いて構成として発現される活性キナーゼの活動に由来していることが予想される。この目的は、本発明の方法が、同じ細胞性バックグラウンドでのＡｂｌ又はＳｒｃの活性化のリン酸化指標を検出するために使用できるか否かを決定するためであった。
【０１６６】
溶解物は両方のセルラインについて２ｘ１０８細胞から調製され、ＤＴＴとヨードアセタミドをアルキレートシステイン残基に処理した後に、トリプシンにより２Ｍウレア内で消化された。免疫親和性工程の前に、ペプチドは他の細胞性構成物からペプチドを分離するために、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラム（２ｘ１０８細胞について１ｍｌのカラム容量）を使用して、逆相固相抽出により分画化された。固相抽出カートリッジは５、１５、２５、４０％のアセトニトリルの工程で溶出された。個々のリオフィライズ（lyophilize）されたペプチド分画は１ｍｌのＰＢＳに再溶解され、蛋白質Ｇ−セファロース（ロシュ）（６０μｇ抗体、１５μｌ樹脂）上に固定化されたホスホチロシン抗体（Ｐ−Ｔｙｒ−１００、セルシグナリングテクノロジー、製品番号９４１１）で、一晩中４℃で処理された。抗体―樹脂は完全に洗浄され、免疫親和性で精製されたペプチドは、０．１％ＴＦＡ７５μｌで溶出された。この分画の一部（４０μｌ）はＳｔａｇｅチップで濃縮され、サーモフィネガンＬＣＱデカＸＰプラスイオントラップマススペクトロメーターを使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。ペプチドは、２８０ｎｌ／ｍｉｎの速度で４５分間のアセトニトリル線形グラジエンドで１０ｃｍｘ７５μｍ逆相カラムから溶出された。ＭＳ／ＭＳスペクトルはＮＣＢＩマウス蛋白質データベースとＳｅｑｕｅｓｔプログラムを使用して評価された。
【０１６７】
より多くのホスホペプチドが、３Ｔ３−Ａｂｌに於いてよりも３Ｔ３−Ｓｒｃ（１７９）に於いて見出され、これはウェスタンブロッティングで検出されたホスホチロシンのレベルと合致していた。３Ｔ３／Ｓｒｃで見出される１８６ホスホチロシン部位のうちの６２は、３Ｔ３−ＡＢｌに於いても見出されたというように、３Ｔ３−Ａｂｌと３Ｔ３−Ｓｒｃに於いて見出されるチロシンリン酸化部位には、実質的な重なりが観測された。この重なりはＩＩＥＤＮＥｐＹＴＡＲ、Ｓｒｃ−ファミリーメンバーＨｃｋ及びＬｙｎ由来の活性ループホスホペプチド、又は、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｓｒｃ、ＹｅｓのようなほかのＳｒｃ−ファミリーメンバーに於いて見出されるＩＥＤＮＥｐＹＴＡＲを含むことが見出された３Ｔ３−Ａｂｌ細胞内でのＳｒｃ−様キナーゼの活性化に帰するものであろう。少なくとも一つのＳｒｃ−ファミリーキナーゼが３Ｔ３−Ａｂｌ細胞に於いて活性化されることは明らかであるが、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼは非常に近接に関係しており、これらの二つのペプチドは同一の質量を有することから、我々は活性化された酵素を特定できない。３Ｔ３−Ａｂｌ及び３Ｔ３−Ｓｒｃに於いて見出される公知の細胞シグナリング蛋白質由来のいくつかのホスホチロシン部位が表５に示されている。
【０１６８】
３Ｔ３−Ａｂｌ及び３Ｔ３−Ｓｒｃで見出された、選択されたホスホペプチド
【表５】
2005225858.tif 000007
【０１６９】
３Ｔ３−Ｓｒｃ細胞では、おそらくＳｒｃのＴｙｒ−４２４である、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼの活性ループに於いて検出された。チロシンリン酸化はまた、例えば非受容体チロシンキナーゼＦＡＫ、アダプター蛋白質ｐ１３０Ｃａｓ、アクチン結合蛋白質コータクチン、リン脂質結合蛋白質アネキシンＡ２、ＳＴＡＭ−インタラクティング蛋白質ＨｒｓのようなＳｒｃの基質として知られている蛋白質に於いて見出された。ＦＡＫはＳｒｃ−ファミリーキナーゼの結合部位を構成するＴｙｒ−３９７と、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼによりリン酸化されることが知られている活性ループ部位Ｔｙｒ−５７６及びＴｙｒ−５７７に於いてリン酸化された。７つのチロシンリン酸化部位がｐ１３０Ｃａｓに於いて見出され、それらは全て、リン酸化された際にｐ１３０Ｃａｓがいくつかのシグナリング蛋白質と相互作用を生じるものであるｐ１３０ＣａｓのＳｒｃ−基質領域と６つのＹＸＸＰモチーフを含む領域であった。いくつかのリン酸化部位が仮のＳｒｃ基質にマップされ、例えばＳＣＡＰ２はＳｒｃ−関連ホスホプロテインＳＫＡＰＰ５５のホモログであり、ＳＫＡＰＰ５５に於いてＳｒｃ−ファミリーキナーゼＦｙｎによりリン酸化されると考えられているＴｙｒ２６０に於いてリン酸化されることが見出された。
【実施例５】
【０１７０】
テトラデカノイルホルボール酢酸で処理されたジャーカット細胞の抽出物からホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフを含むペプチドの単離
本発明の方法は更に、消化された全細胞抽出物から、ホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフを含むホスホペプチドを精製するために、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）のポリクローナル抗体である、ホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフ抗体を使用することを示した。蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーメンバーは、分泌、遺伝子発現、増殖及び筋肉contraction（例えばNishikawaら、J Biol Chem 272: 952-960 (1997)、Pearson and Kemp Methods Enzymol 200: 62-81 (1991)を参照されたい）のような多くの細胞性工程に関与している。慣用的なＰＫＣアイソザイムは、標的残基がＲ／Ｋがアルギニン又はリジンであり、Ｘがいかなるアミノ酸でもよく、Ｓ／Ｔが標的セリン又はスレオニンであり、ｈｙｂが疎水性アミノ酸である、共通モチーフ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）Ｘ（Ｓ／Ｔ）（ｈｙｂ）（Ｒ／Ｋ）（配列番号３８）内に生じるときに、セリン又はスレオニン残基に於いて蛋白質基質をリン酸化する。
【０１７１】
ホスホ−（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品ｂ号２２６１）は、共通配列モチーフを含む多くの異なるリン酸化された蛋白質を、リン酸化されている場合には認識するが、リン酸化されていない類似モチーフは認識しない。ホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質抗体の特異性は、−２及び＋２位にアルギニン又はリジン、＋１の位置の疎水性残基で先導されるホスホセリンを含む、即ち（Ｒ／Ｋ）ＸＳ＊（ｈｙｂ（Ｒ／Ｋ）（配列番号３９）の蛋白質及びペプチドに、周囲のアミノ酸配列とは実質的に依存しない様式で、好ましく結合するというものである。抗体はリン酸化されていないモチーフやホスホスレオニンを含むモチーフを認識しない。ここで、この抗体が本発明のホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフを含むペプチドを精製する方法に従って、ゲノムワイド（細胞ワイド）で慣用的なＰＫＣアイソザイムによりリン酸化されるであろう他の蛋白質を同定するために、使用できることが明示される。
【０１７２】
この例のために、モデルシステムは、１０分間蛋白質キナーゼＣの潜在的な活性化剤であるテトラデカノイルフォルボール酢酸（ＴＰＡ）で処理された、急性Ｔ細胞白血病由来のヒトセルラインであるジャーカット細胞であった。細胞は洗浄され、回収され、ソニケーションにより溶解され、溶解物内の蛋白質は変性され、溶解物は遠心により透明にされた。
ＴＰＡが蛋白質キナーゼＣを活性化し、ＰＫＣ特異的蛋白質リン酸化のレベルを上昇させる原因となったことを示すために、細胞抽出物はＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェウタンブロッティング（図１８）により分析された。ＰＫＣ基質リン酸化の誘導は、ＴＰＡ処理された細胞抽出物（レーン２）のブロットと処理されていない細胞抽出物（レーン１）のブロットを、ホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号２２６１）でプローブすることにより示された。これはＴＰＡ処理がホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフを含む多くの異なる蛋白質のリン酸化状態を変化させることを示した。
【０１７３】
抽出物中の蛋白質は、ポリビニルマトリックスビーズ（ＭｏＢｉＴｅｃ、部分番号Ｐ５１０１）であるＦ７ｍに固定化されたエンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃによりペプチドへと消化され、固定化されたＧｌｕ−Ｃは遠心により除去された。固定化されたホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質抗体は、固定化されたＰ−Ｔｙｒ−１００抗体（実施例４）について上述したように調製された。固定化された抗体は上述したように評価され樹脂１ｍｌあたり４ｍｇの抗体を含んでいることが見出された。
【０１７４】
ホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフを含むホスホペプチドが蛋白質Ｇ−アガロース樹脂に固定化された抗体で、Ｇｌｕ−Ｃで消化された粗細胞抽出物から精製された。消化物（約４０ｍｇ、１ｍｇ／ｍｌ蛋白質）は固定化された抗体−樹脂（４０μｌ、４ｍｇ／ｍｌ）とバッチ形態で４℃、１６時間接触され、結合していないペプチドは遠心により除去された。抗体−樹脂は過剰に洗浄された（氷で冷やされたＰＢＳ１ｍｌで三回と、氷で冷やされた水１ｍｌで二回）。結合したペプチドは、１５０μｌの０．１％トリフルオロ酢酸で溶出され、溶出されたペプチドは、質量が１００００より大きい分子を保持する、ミクロコンＹＭ−１０膜（ミリポア、製品番号４２４０７）を通じて遠心により溶出した抗体から分離された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析の前に、ＹＭ−１０通過画分の９μｌが、逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩及び濃縮された。
【０１７５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
ホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質抗体に結合して溶出されたペプチドの質量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより測定された（図１９、一番上のパネル）。ホスファターゼ処理と不安定な分解（一番下のパネル）は、抗体で精製されたペプチド画分が、抗体の特異性に基づいて予期されるように、ホスホセリン又はホスホスレオニンを有するいくつかの候補となるフォフォペプチドを含むことを示した。図１９に於いて、星で標識されたピークはホスホペプチドに対応し、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは不安定な分解とリン酸のニュートラルロスを生じたホスホペプチドに対応する。
【０１７６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーに於いて検出されたホスホペプチドピーク（図１９、一番上のパネル）は、例えば質量１９８９のピークが１９０５のパートナーピークを有しているなど、質量に於いてよりブロードで、明らかに８４低いコンパニオンピークを伴う。これらのコンパニオンピークは、ホスホペプチドイオンがマススペクトロメーターの検出器まで移動する間に、リン酸のニュートラルロスにより形成された、ホスホペプチドの不安定な分解物に対応する。分解産物はイオン化後に形成され、装置は分析の間に安定なイオンに焦点を当てるように設定されていることから、分解産物のピークは、ホスホペプチドのピークよりもブロードである。同様の理由により、安定なイオンとは異なり、分解産物の質量は分析の間に変化することから、リン酸のロスのための予期される質量シフトは−９８であるが、−９４の質量シフトが観測された。ホスホペプチドの不安定な分解物は、他者らによって注目され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル（Annan及びCarr、上述）に於いてホスホペプチドを認識して割り当てるために使用されることができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる多くの合成ホスホペプチドの分析は、いくつかのホスホセリン又はホスホスレオニン（しかしホスホチロシンでない）残基を含むペプチドが不安定なに分解されることを示している。この理由から、不安定な分解は、ホスホセリン又はホスホスレオニンを含むペプチドの信頼できる指標である。
【０１７７】
ペプチド画分のリン酸化部位はまた、ホスホペプチドからリン酸基を除去し、ペプチドからの一つのリン酸基の除去に相当する、ホスホペプチドよりも質量が８０低い新しいイオンを産生する、えびアルカリホスファターゼでペプチド画分を処理することにより評価された。全てのホスホペプチド候補は、ホスファターゼ処理による影響を受け、４つのホスホペプチドが処理前のペプチドよりも質量が８０低い脱リン酸化されたペプチド（図１９、一番下のパネル）を生じた。
【０１７８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフ抗体に結合し、そこから溶出されるペプチドは更にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析された。ペプチド画分の４０μｌが、逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩及び濃縮され、２μｌの０．１％トリフルオロ酢酸、４０％アセトニトリルで溶出された。溶出画分の０．４μｌ分取は、ＡＣＨＡマトリックス溶液と混合され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで分析され、図１９に示されるものと同様のスペクトルを生じた。溶出画分の０．８μｌ分取は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。
【０１７９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は上述したように（実施例４）行われた。このサンプルを分析することで得られたクロマトグラムは、図２０に示されている。図２０の最初のパネルは、実測  ＭＳスキャンが集められるところを示し、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められるところを示す。三番目、四番目、五番目のパネルは、それぞれ４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されるところを示す。ＭＳ／ＭＳの断片化工程の間、ホスホセリン又はホスホスレオニンを含むペプチドは、しばしば断片化されていない親イオンより質量が９８低いニュートラルロスイオンを産生するように、単一のリン酸基のロスによるイオンを形成する。親イオンが＋１の電荷ならば、ニュートラルロスイオンは質量対電荷値（ｍ／ｚ）は、親イオンの質量体電荷値よりも９８／１又は９８低い。同様に、＋２、＋３、又は＋４の電荷ホスホペプチド親イオンは、おやイオンよりも４９、３２．７、２４．５低いｍ／ｚ値のニュートラルロスイオンを与える。ニュートラルロスイオンの発生と強度は、候補ホスホペプチドを示すのを助ける為に、図２０の第三、第四、第五のパネルにプロットされる。ニュートラルロスプロットは、ホスホペプチド候補がリン酸基の疎水性による、ホスホペプチドに於いて予期されるように、クロマトグラムに於いて早く溶出する傾向にあり、ニュートラルロスはＭＳ／ＭＳスペクトルの多くで観測され、このサンプルがホスホペプチドに非常に富んでいることを示唆していることを示している。
【０１８０】
考察のように、ＭＳ／ＭＳ間のニュートラルロスはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー間の不安定な分解と同様の工程である。予期されるように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの間のニュートラルロスを示すホスホペプチド（図２０、パネル３−５）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー間に不安定な分解を生じるホスホペプチド（図１９、一番上のパネル）と同じである。図２１を参照されたい。個々のニュートラルロス  ＭＳ／ＭＳスペクトルに於いて、親イオンの質量（ｍ）は親イオン質量対電荷値（ｍ／ｚ）から算出され、ニュートラルロス値が電荷（Z）により推測された（４９のニュートラルロスが＋２、３２．７は＋３、２４．５は＋４）。いくつかのペプチドが＋２、＋３、＋４イオンのニュートラルロスを起こすことが観測された。例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトル５３３，５３４，５３５はニュートラルロスを示し、それぞれ図１９で「２４１３．３」と標識された候補ホスホペプチドの＋４、＋３、＋２イオンに対応する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーとＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、このペプチドに質量２４１３を与え、両方の質量分析方法の間に観測されたニュートラルロスはひとつのリン酸を含んでいることを示している。データセットの比較は、同じペプチドが両方の質量分析方法によって検出され、全てのニュートラルロス  ＭＳ／ＭＳスペクトルは一つのリン酸基を含むことを示している（図２１）。
【０１８１】
全てのＭＳ／ＭＳ産物イオンスペクトルは、リン酸化部位と親蛋白質を個々のペプチドに割り当てるためにＳｅｑｕｅｓｔで分析されたが、これは明確な割り当てを生じなかった。ＭＳ／ＭＳの間に、ほとんど全てのホスホペプチドは、明確な割り当てにとって十分な高品質のスペクトルを産生するのに必要とされる、ペプチド骨格に沿った非常に小さい残基断片の非常に高い程度にニュートラルロスした。一般的な骨格断片化は、ペプチドを同定するために必要な特徴を曖昧にする、化学的な夾雑と同じレベルであった。上述したように、これはホスホセリンおよびホスホスレオニンを含むペプチドのＭＳ／ＭＳ分析の間に遭遇する共通の制限である。例えばDeGnoreら、上述を参照されたい。ホスホペプチドがニュートラルロスによりリン酸を失う場合に於いても、ニュートラルロスはリン酸化部位に通常でない残基を残す、即ちホスホセリンはデヒドロアラニンとなり、ホスホスレオニンはデヒドロアミノ酪酸となることから、リン酸化部位の位置は十分な残基骨格断片がある限り決定されることができる。
【０１８２】
ＬＣ−ＭＳ３分析
このサンプル内のいくつかのホスホペプチドは、ＬＣ−ＭＳ３により同定され、つまりニュートラルロスイオンは同定のために十分な骨格断片を生じるためにＭＳのさらなるレベルに供された。この工程はほかのタイプのマススペクトロメーターよりもイオントラップマススペクトロメーターの補足に於いてより単純である。ペプチドがＬＣシステムから溶出されると、実測ＭＳスキャンが行われ、前もってセットされた強度閾値よりも大きく、すでにＭＳ／ＭＳにより最近分析されているものでない場合には、ＭＳ／ＭＳスペクトルが三つの豊富なイオンについて集められる。しかしながら、４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが観測される場合には、ほかのＭＳ／ＭＳスペクトルの収集又はほかの実測ＭＳスキャンの前に、装置ははじめにニュートラルロスイオンを単離し、断片化し、イオン産物の質量を測定する。ニュートラルロスイオンがもはやリン酸基を含まない場合には、リン酸化されていないペプチドのような断片であり、有用な産物イオンスペクトルをより与えるようである。装置制御ソフトウエアへのある修飾で、ＭＳ３スペクトルはＭＳ／ＭＳスペクトルと同じデータ依存的な様式で集められ、ＭＳ３スペクトルは更にＳｅｑｕｅｓｔで分析されることができる。Tomaino及びRushら、上述を参照されたい。
【０１８３】
データ依存性ＬＣ−ＭＳ３は、溶出した画分、０．８μｌ分取に注目して行われた。図２２は、本方法により同定された三つのホスホペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル（左パネル）とＭＳ３スペクトル（右パネル）を比較している。個々のＭＳ／ＭＳスペクトルは主に一つの産物イオンを含み、ピーク強度は親イオン質量と３２．７異なり、電荷＋３のホスホペプチドイオンからの一つのリン酸のロスと一致している。スペクトル内のほとんど全てのほかのピークは、ニュートラルロスイオンよりも少なくとも２０倍弱い強度である。このサンプルのＬＣ−ＭＳ３分析の間に収集されたＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間に集められたＭＳ／ＭＳスペクトルと非常に類似しており、上述したようにホスホセリン又はホスホスレオニンを含むペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを、ニュートラルロスがいかに特徴付けられるかを示している。３２．７のニュートラルロスがＭＳ／ＭＳの間に検出されたことから、マススペクトロメーターは自動的に右パネルに於いて示されるスペクトルを産生するためにニュートラルロスイオンをＭＳ３に供した。これらはスペクトルを通じて割り当てられた強度の異なるいくつかのイオン産物を示しており、予期されたようにそれらはリン酸化されていないペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルと類似している。
【０１８４】
Ｓｅｑｕｅｓｔを使用して、リン酸化部位と親蛋白質は図２２に示される三つのＭＳ３スペクトルの各々に割り当てられることができる。図２１に於いて示されるように、三つのわれ当てられたホスホペプチドはすべて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーの間に同定されたホスホペプチド候補と対応している。パネル１はＰＴＮ６＿ＨＵＭＡＮの、５８５位のＳｅｒと５８８位のＳｅｒでリン酸化された５７６−５９５残基に対応する。Ｓｅｑｕｅｓｔはこの例に於いては曖昧でなくペプチドを同定したが、二つの可能性のあるリン酸化部位を区別できなかった。しかしながら部位は、Ｓｅｒ−５８８（ＫＧＳ＊ＬＫ）の配列前後には抗体の特異性と合致するが、Ｓｅｒ−５８５（ＥＫＳ＊ＫＧ［下線のひかれた残基は、特異性モチーフ（Ｒ／Ｋ）ＸＳ＊（ｈｙｂ）（Ｒ／Ｋ）に合致する］）の配列コンテキスストとは合致しないという、ホスホ（Ｓｅｒ）基質抗体の公知の特異性に基づいて区別されることができる。
【０１８５】
ＰＴＮ６は蛋白質チロシンホスファターゼ１ｃであり、また造血細胞蛋白質チロシンホスファターゼとして知られており、本実験に於けるホスホペプチドは急性Ｔ細胞白血病（ジャーカット細胞）から生じたヒトセルラインから精製されたものであることから関係している。Brumellら(J Biol Chem 272: 875-882 (1997))は、この特異的なチロシンホスファターゼは、ＰＫＣ−仲介のセリンリン酸化により阻害されることを示唆しているが、特異的なリン酸化部位は同定されていない。今回、本発明の方法はＰＫＣ仲介性セリンリン酸化の可能性のある部位として、Ｓｅｒ−５８８を同定した。
【０１８６】
パネル２および３は、同じリン酸化部位を含むＵＤＦ１＿ＨＵＭＡＮ由来の二つの重なるペプチドに対応する。ＳｅｑｕｅｓｔはＳｅｒ３３５でリン酸化される残基３２２−３４３を、パネル２のスペクトルに割り当て、Ｓｅｒ３３５でリン酸化される３３３−３４３残基をパネル３のスペクトルに割り当てた。より長いペプチドが不完全な蛋白質開裂、つまりＧｌｕ−ＣはＧｌｕ−３３２を完全に切断できなかったことから、より短いペプチドと関連している。両方のケースに於いて、Ｓｅｑｕｅｓｔ割り当ての質は良好で、リン酸化された残基の位置は曖昧ではない。Ｓｅｒ−３３５の配列前後に（ＧＡＱＳ＊Ｒ）は部分的に抗体特異性と合致する。ＵＤＦ１はユビキチン融合分解蛋白質１である。この蛋白質は以前リン酸化されることが示されていない。今回、本発明の方法により新規なリン酸化部位としてＳｅｒ−３３５が同定された。
【０１８７】
配列の確認
実証する目的のために、割り当てられた配列とリン酸化部位を有する合成ペプチドが、生物学的ペプチド即ち本発明の方法により、Ｇｌｕ−Ｃ消化されたジャーカット細胞から精製されたペプチドのＭＳ／ＭＳおよびＭＳ３スペクトルと同一のＭＳ／ＭＳおよびＭＳ３スペクトルを生じることを示すことにより確認された。ＵＤＦ１３３３−３４３ホスホＳｅｒ−３３５はＦｍｏｃ化学を使用してセルシグリングテクノロジーで合成された。全長ペプチドはＨＰＬＣで精製され、上述したのと同じＬＣ−ＭＳ３を使用して分析された。
【０１８８】
生物学的ペプチドのＭＳ／ＭＳ及びＭＳ３スペクトル（一番上のパネル）と合成ペプチド（一番下のパネル）は、図２３に於いて比較される。ＭＳ／ＭＳスペクトルの部分は、ニュートラルロスイオンよりもほかのイオンをより鮮明に示すために、ファクター１０で増幅された。ＭＳ３スペクトル間での対応は、割り当てられたペプチド配列とリン酸化部位が正しいことを示している。ＭＳ／ＭＳスペクトルの質が主要なニュートラルロスイオンにより汚される場合でも、二つのスペクトルのマイナーなピークの間で良好の対応がみられる。
【０１８９】
この例では、Ｓｅｑｕｅｓｔがペプチド配列とリン酸化部位をスペクトルに割り当て、その割り当てはその配列とリン酸化部位を有する合成ペプチドが同じスペクトルを生じたことを示すことにより確認された。これは特定のホスホペプチドとそのスペクトルの間の正式な関係を確立する。これは不十分なＳｅｑｕｅｓｔ割り当てを更に評価する、又は特に重要であると考えられる割り当てを確認するための単純で説得力のある方法である。
【０１９０】
不十分な割り当て
上記考察のように、ホスホセリン又はホスホスレオニンからのリン酸のニュートラルロスは、ペプチド配列をＭＳ／ＭＳスペクトルに割り当てることを困難にし、時には割り当てが曖昧となる。ホスホペプチドがリン酸化されていないペプチドとは別に単離され分析される全体的なプロテオーム手法では、しばしば特有の蛋白質由来のペプチドのみが精製されたホスホペプチドであり、明確な割り当ては達成するのがより難しいようである。従って、不十分な割り当てはより高い価値があり、更に追及する価値がある。更に研究する価値のある不十分な割り当ては、ホスホペプチドを単離するために使用された抗体の基地の特異性と合致する、割り当てのために多くの結果をスクリーニングする単純なコンピュータプログラムを使用することにより、同定することができる。
【０１９１】
この例として、本明細書に示されるサンプルのＭＳ／ＭＳスペクトルが、抗体の特異性及び信頼性の高い本発明者らによるＭＳ３の結果を指針として使用して、更に不十分な割り当てをスクリーニングされた。上述したように、ＭＳ３分析は三つの異なるペプチド内で二つの新規なリン酸化部位を同定した。一つはＰＴＮ６にマップされ、公知のホスホ（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質モチーフと合致し、ほかの二つはＵＦＤ１にマップされ、部分的にそのモチーフに合致している。ペプチド配列の比較は、様々なモチーフが抗体認識に十分であろうことを示した。ＰＴＮ６は配列Ｓ＊ＬＫＲＫを含み、ＵＦＤ１部位は配列Ｓ＊ＬＲＫＫを含んでいた。これに基づいて、個々のスペクトルに上位２０の候補ペプチド配列を列挙する全てのＳｅｑｕｅｓアウトプットファイルが、共通配列Ｓ＊Ｌ（Ｒ／Ｋ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）（配列番号４０）にフィットする不十分な結果のために検索された。
【０１９２】
この検索は、ＭＳ／ＭＳスペクトルに於いて四番目の候補となる、ＢＲＢ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｓｅｒ２２８がリン酸化されている残基２０６−２３３というホスホペプチドを見つけ出した。この配列はＳ＊ＬＲＴＲを含む。このペプチドは質量３２９７であり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーに於いて観測されたピークに対応している（図２１で質量３２９４と割り当てられた）。これは不十分なホスホペプチドの割り当てのよい例であり、最初のラウンドのＳｅｑｕｅｓｔスコアでは１４番目にランクされたペプチドであり、最後のスコアリングラウンド後には８番目にランクされたものである。最後のラウンドの後により高くランクされたペプチドがあるが、それらは全てはじめのラウンドでは９４又はそれ以下にランクされる、とても低いスコアを受けたものであった。にもかかわらず、割り当てられたペプチドは抗体の公知の特異性と合致し、ＭＳ３スペクトルに基づいて行われたより高い信頼性できる割り当てとよく合致していることから、この結果は更に追求する価値がある。
【０１９３】
ＢＲＢ１はＢ１ブラジキニン受容体である。Ｂ１ブラジキニン受容体は蛋白質キナーゼＣを活性化することが知られている（Christopherら、Hypertension 38: 602-605 (2001)を参照されたい）。Ｂ１ブラジキニン受容体には公知のリン酸化部位がないが、Ｂ２ブラジキニン受容体は蛋白質キナーゼＣの活性化に応答してＳｅｒ残基でリン酸化される（Blaukatら、J Biol Chem 276: 40431-40 (2001)を参照されたい）。更に、受容体の蛋白質キナーゼＣリン酸化は、受容体の脱感作の一般的な機構として提唱されている。それゆえ、蛋白質キナーゼＣが同様にＢ１受容体をリン酸化できると仮定することは合理的である。加えて、ＢＲＢ１受容体の発現は、多くの硬化症患者の抹消血液由来Ｔ細胞で亢進されることが知られており、このホスホペプチドが急性Ｔ細胞白血病に由来するヒトセルラインから精製されたことから妥当である（例えばPratら、Neurology 53: 2087-2092 (1999)を参照されたい）。ここで仮に割り当てられるリン酸化部位は、細胞質であると予想される蛋白質のドメインにある。この仮の割り当ては、更に割り当てられた配列とリン酸化部位を有する合成ペプチドを上述のように分析することにより調査される。
【０１９４】
割り当てをフィルターし、更に調べる価値のある不十分な割り当てを抽出する能力は、抗体を基礎とする精製方法のユニークな利点である。抗体の使用及び抗体の公知特異性の知識がなければ、これらの不十分な割り当ては見落とされる。
【実施例６】
【０１９５】
活性化されたＡｋｔ蛋白質キナーゼを発現する細胞の抽出物からＡｋｔ基質モチーフを含むペプチドの単離
Ａｋｔ基質モチーフ（Ｔ＊はホスホスレオニンであり、Ｓ＊はホスホセリンである、ＲＸＲＸＸＴ＊／Ｓ＊）を含むペプチドは、消化された細胞溶解物のようなペプチドの複雑な混合物から選択的に単離されることができる。Ａｋｔ蛋白質キナーゼは細胞の生存とインシュリンシグナリングの重要な制御因子であるが、そのインビボの標的はほとんど同定されていない。ＧＳＫ−３（Frankeら、Cell 88: 435-437 (1997)）、Ｂａｄ（Papら、J Biol Chem 273: 19929-19932 (1998)）、およびキャスパース−９（Cardoneら、Science 282: 1318-1321 (1998)）上の公知Ａｋｔリン酸化部位の分析と同様に、Ａｋｔ基質の合成ペプチドを用いる研究が（Alessiら、FEBS Lett 399: 333-338 (1996)）、Ａｋｔはアルギニンが−５および−３位の特徴付けられた保存モチーフ内のセリンあるいはスレオニンに於いてのみその基質をリン酸化することを示している。
【０１９６】
ホスホ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質ポリクローナル抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６１１）は、ＲがアルギニンでＸがいかなるアミノ酸でもよく、Ｔ＊／Ｓ＊がホスホスレオニン又は又はホスホセリンである共通基質モチーフＲＸＲＸＸ（Ｔ＊／Ｓ＊）を有するホスホペプチドを認識する、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体である。ホスホ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質抗体の特異性は、−５および−３の位置のリジン又はアルギニンでprecedeされるホスホスレオニン又はホスホセリンを含む、即ち（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）ＸＸ（Ｔ＊／Ｓ＊）（配列番号１５）蛋白質又はペプチドに、周囲のアミノ酸配列には実質的に依存せずに好ましく結合するものである。ゲノムワイド（細胞ワイド）で潜在的な基質を同定するために、固定化されたホスホＡｋｔ基質抗体が以下に記載されるように、本発明の方法に従って蛋白質性調製物からのホスホペプチドの免疫親和性精製に使用された。
【０１９７】
この実施例では、モデルシステムは活性Ａｋｔ蛋白質キナーゼを構成として発現するように安定に形質転換され、１５分間５０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）で処理された３Ｔ３マウス繊維芽細胞であった。細胞は洗浄され、回収され、ソニケーションにより溶解され、溶解物内の蛋白質は変性され、溶解物は遠心により透明にされた。
【０１９８】
活性化されたＡｋｔ蛋白質キナーゼが多くの標的蛋白質をリン酸化したことを示すために、細胞抽出物はＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングにより分析された（図２４）。Ａｋｔ蛋白質キナーゼの活性化はＰＤＧＦ−処理された形質転換細胞抽出物（レーン２）と未処理の形質転換されていない細胞抽出物（レーン１）のブロットを、Ａｋｔ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９２７２）、ホスホＡｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９２７５）、ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９２７１）でプローブすることにより示された。これはＰＤＧＦ処理がＡｋｔ蛋白質キナーゼのリン酸化部位を変化させ（パネル２及び３）るが、その全体の細胞性発現レベルは変化させないことを示した（パネル１）。ＰＤＧＦ処理はまた、ホスホＡｋｔ基質モチーフを含む多くの異なる蛋白質のリン酸化状態を変化させたことが、ホスホＡｋｔ基質抗体（パネル４）でブロットをプローブすることにより示された。別の実験では、ＰＤＧＦ処理後のホスホＡｋｔ基質抗体で認識される主要蛋白質（パネル４の一番下に近い暗いバンド、レーン２）が、成長因子の処理に応答してリン酸化されることが知られているリボゾーマル蛋白質Ｓ６（Ferrari and Thomas, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 29: 385-413 (1994) ）であることを示した。
【０１９９】
抽出物中の蛋白質は、ポリビニルマトリックスビーズであるＦ７ｍ（ＭｏＢｉＴｅｃ、部分番号Ｐ５１０１）に固定化されたエンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃで、ペプチドへと消化され、固定化されたＧｌｕ−Ｃは遠心により除去された。ホスホＡｋｔ基質モチーフを含むホスホペプチドは、上記に於いてＰ−Ｔｙｒ−１００モノクローナル抗体について記述したのと同様に樹脂１ミリリットル当たりを抗体２ミリグラムと反応させる。ヒドラジド化学によりアガロースへと固定化されたホスホＡｋｔ基質抗体で、消化物から精製された。Ｇｌｕ−Ｃで消化された粗細胞抽出物（約３．５ｍｇ、０．２５ｍｇ／ｍｌ蛋白質）はバッチフォーマットで４℃、１６時間、固定化されたホスホＡｋｔ基質抗体−樹脂（４０μｌ、２μｇ／μｌ）と接触させられ、結合していないペプチドは遠心により取り除かれた。抗体−樹脂は過剰に洗浄された（０．５ｍｌの氷で冷やされたＰＢＳで４回、氷で冷やされた０．５ｍｌの水で３回）。結合したペプチドはそれからｐＨ２．３の０．１Ｍグリシン１２０μｌで溶出された。上述したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで分析する前に、溶出画分の９μｌは逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩及び濃縮された。
【０２００】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
ホスホＡｋｔ基質抗体に結合しそこから溶出されたペプチドの質量は、溶出されたペプチドがリン酸化されていることを確認するために、ホスホペプチドからリン酸基を除去でき、ペプチドに於ける個々のリン酸基についてホスホペプチドよりも質量が８０低いイオンを産生する、ウシ小腸ホスファターゼでペプチド画分を処理する前（図２５、一番上のパネル）及び後（一番下のパネル）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより測定された。図２５に於いて、星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドに対応し、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークはリン酸の不安定な分解とニュートラルロスを生じたリン酸化されたペプチドである。
【０２０１】
四つの候補ホスホペプチドピーク（図２５、一番上のパネル）がそれぞれ、例えば質量２４０４のピークが、２３２０のパートナーピークを有し、同様の２３３４、２３２４、２２５４がそれぞれ２２５０、２２４１、２１７１にパートナーピークを有するように、よりブロードで明らかに質量が８４低いコンパニオンピークを伴っている。これらのコンパニオンピークは、ホスホペプチドがマススペクトロメトリーの検出器へ移動する間のリン酸のニュートラルロスにより形成された、ホスホペプチドの不安定な分解産物に対応する。ホスホペプチドの不安定な分解は他者らにより注目されており、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルに於いてホスホペプチドを認識して割り当てるために使用できる（Annan and Carr, Anal Chem 68: 3413-21 (1996)）。前の実施例に於いて記載されたように、ホスホセリン又はホスホスレオニンを含むがホスホチロシン残基を含まないいくつかの合成ペプチドが不安定な分解を行ったことが観測されている。図２５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルは、抗体の公知の特異性に従って、これらの候補ホスホペプチドがおそらくホスホセリン又はホスホスレオニンを含んでいることを示している。
【０２０２】
結合したペプチド画分がウシ小腸ホスファターゼで処理されたとき、４つの候補ホスホペプチドのうち３つは処理される前のペプチド（図２５、一番下のパネル）よりも質量が８０（一つのリン酸基分）又は１６０（二つのリン酸基分）低い脱リン酸化されたペプチドを生じた。２４０２と２３２４は２２５５からそれぞれ二つ又は一つのリン酸基分異なり、２３３４は２２５４から一つのリン酸基分異なる。ホスファターゼ処理後の不安定な分解ピークの存在は、これらのペプチドが未だにリン酸化されていること、即ち質量２４０４のペプチドはおそらく少なくとも三つのリン酸基を含み、質量２３３４のペプチドはおそらく少なくとも二つのリン酸基を有することを示している。これは以下に記述される、これらのペプチドのリン酸含有をより詳細に決定したＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により支持されている。
【０２０３】
４つの免疫親和性で精製されたペプチドのうち二つ（図２５、一番上のパネル）は、ホスホＡｋｔ基質抗体によるウェスタンブロッティングで認識されたＰＤＧＦ処理された細胞抽出物に於ける主要な蛋白質である（図２４）、リボゾーマル蛋白質Ｓ６（アクセション番号Ｐ１０６６０）由来の公知のホスホペプチドに対応し、観測された質量が２２５４．５及び２３３４．４のホスホペプチドは、それぞれ一つ及び二つのリン酸基を有するＳ６蛋白質ＱＩＡＫＲＲＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＥ（配列番号４１）由来のＧｌｕ−Ｃペプチドの予期された質量に合致する（計算されたプロトン化されたペプチドの質量が２２５４．２及び２３３４．２である）。本実験に於けるＰＤＧＦ処理の継続とリン酸化の順序に関する出版されている報告（Ferrariら、J Biol Chem 266: 22770-5 (1991)）に基づいて、このペプチドの５つのリン酸化部位中、上述のペプチド配列で下線が引かれているＳｅｒ２３５とＳｅｒ２３６の二つのみがリン酸化されていることが予想される。更にペプチド内のこれら二つの部位は、ホスホＡｋｔ基質抗体の公知の特異性に合致しており、Ｓｅｒ２３５はＫＸＲＸＸＳ＊に、Ｓｅｒ２３６はＲＸＲＸＸＳ＊に合致している。
【０２０４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ホスホＡｋｔ基質抗体に結合しそこから溶出されたペプチドは更にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析された。ペプチド画分の２５μｌ分が逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩及び濃縮され、２μｌの０．１％トリフルオロ酢酸、４０％のアセトニトリルで溶出された。溶出された画分の０．４μｌはＡＣＨＡマトリックス溶解物と混合され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで分析され、図２５に於いて示されるものと同様のスペクトルを生じた。溶出された画分の残りは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。
【０２０５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は上述したように（実施例４）行われた。このサンプルを分析することで得られたクロマトグラムは、図２６に示されている。図２６の最初のパネルは実測ＭＳスキャンが集められたところを示し、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められたところを示す。三番目、四番目、５番目のパネルはそれぞれ、リン酸のニュートラルロスが行われた電荷＋２、＋３、＋４のイオンの特徴である、４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されたところを示す。ニュートラルロスイオンの発生と強度は、候補ホスホペプチドを示すことを助けるために、図２６の第３、第４、及び第５のパネルにプロットされている。ニュートラルロスプロットは、リン酸基の疎水性によりホスホペプチドについて予期されるように、ホスホペプチド候補はクロマトグラムに於いて早く溶出する傾向にあり、多くのＭＳ／ＭＳスペクトルに於いてニュートラルロスが観測され、これはこのサンプルが非常にホスホペプチドに富んでいることを示唆している。
【０２０６】
前に言及しているように、ＭＳ／ＭＳ間のニュートラルロスは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー間の不安定な分解と同じ工程である。予期されるように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ間にニュートラルロスを示すホスホペプチドの多くは（図２６、パネル３−５）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーの間に不安定な分解を生じるホスホペプチド（図２５、一番上のパネル）と同じである。図２７を参照されたい。ＭＳ／ＭＳ間にニュートラルロスを示すほとんどのペプチドは、一つよりも多いリン酸基を含んでいた。ＭＳ／ＭＳスペクトルはしばしば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス分析がペプチドをホスファターゼで処理した後に於いても提供しなかった、個々のペプチドイオンに於いて存在するリン酸基の数の明快な指標を提供する。
【０２０７】
リボゾーマル蛋白質Ｓ６由来のホスホペプチドは、上述したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果とよく合致して、一つ、二つおよび三つのリン酸とともに観測された。図２８は１（パネル１）、２（パネル２）、３（パネル３）リン酸を有するＳ６ホスホペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルの部分を示しており、三つのスペクトル全ての親イオンは、＋３の電荷を有している。パネル１は電荷＋３のイオンから９８のロスである３２．６６の理論的なｍ／ｚの差異と近い、３２．６５異なる、７１９．８６のｍ／ｚ値を有するイオン産物を精製するニュートラルロスを生じる、７５２．５１のｍ／ｚ値の親イオンのスペクトルを示す。このｍ／ｚ値のたった一つのロスが観測され、即ち二つのリン酸基（ｍ／ｚが６８７．２０）に対応するイオン産物は検出されない。これをもとに、ペプチドの質量は２２５４．５であり、それは一つのリン酸基を含んでいる。同様にパネル２は、二つのリン酸基を割り当てることを許容する、このｍ／ｚ値を一度及び二度失ったイオン産物を示しており、パネル３は３つのリン酸基に対応する、一度、二度及び三度のロスを示す。これと合致して、親イオンマスは個々の追加のリン酸基で８０ずつ増加する。予期されるように、リン酸含量が増加するにつれ、逆相ＨＰＬＣ間にホスホペプチドはより早く溶出し、３，２又はいリン酸基を有するペプチドはそれぞれ、７．３、７．６、及び７．８分に溶出した。
【０２０８】
リボゾーマル蛋白質Ｓ６ホスホペプチドのこのグループのように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は図２７で「ペプチドＡ」と標識される、関連したホスホペプチドの第二のグループがあるであろうことを示している。観測された質量は２３２４．５（二つのリン酸基を有する）及び２４０４．６（三つのリン酸基を有する）である。
【０２０９】
全てのＭＳ／ＭＳ産物イオンスペクトルは、個々のペプチドの親蛋白質とリン酸化部位を割り当てる為にＳｅｑｕｅｓｔで分析された。ペプチド骨格に沿った非常に小さい残基断片の高レベルのニュートラルロスにより、これは明確な割り当てを生じなかった。今回、複数箇所リン酸化されたサンプルのこのタイプは、最近入手可能なバージョンのソフトウエアを使用してＬＣ−ＭＳ３により効率的に分析されることができる。最近のデータ依存獲得そるとウエアは、もっとも豊富なニュートラルロスイオンを単離し、断片化する。複数箇所リン酸化されたペプチドに於いて、これはＭＳ３の間にニュートラルロスを生じる一つ又はそれ以上のリン酸基を残す、ニュートラルロスにより除去されたひとつのリン酸を有するペプチドに対応する。獲得ソフトウエアはニュートラルロスの複数を認識し、もっとも強いイオン産物でない場合でも、ニュートラルロスのもっとも高いレベルを有するイオンを単離し、断片化するように、（個人的な関係を通じて）改良されている。例えば図２８のパネル２のスペクトルでは、現在のソフトウエアは、ｍ／ｚ値が７４６．３３のイオンを、それがもっとも強いニュートラルロスイオンであることから、ＭＳ３分析のために選択するであろう。しかしながら改良されたソフトウエアは、ｍ／ｚ値が７１３．８７であるイオンを、それがより高いニュートラルロスを示すことから、選択するであろう。このサンプルの改良された獲得ソフトウエアによるさらなる分析は、ペプチドのいくつかの親蛋白質とリン酸化部位を曖昧でなく割り当てるようにすることが期待される。
【０２１０】
明確な断片スペクトルなくしても、これらのペプチドのいくつかを仮にリボゾーマル蛋白質Ｓ６由来のホスホペプチドに割り当てることは、Ｓ６がホスホＡｋｔ基質抗体により検出される主要なホスホプロテインであり、観測された質量とリン酸含有量が成長因子の処置の後のこの蛋白質のリン酸化に関する刊行されている報告と一致するというウェスタンブロッティングの結果を一致している。
【実施例７】
【０２１１】
サイクリックＡＭＰアナログ及びインシュリンで処理された細胞の抽出物から１４−３−３結合モチーフを含むペプチドの単離
本発明の方法は更に消化された細胞溶解物に存在するペプチドの複雑な混合物から１４−３−３結合モチーフを含むホスホペプチドを単離するために使用された。１４−３−３蛋白質は、リン酸化依存性の蛋白質−蛋白質相互作用を通じて、いくつかの生物学的プロセスを制御する。ホスホセリン含有共通配列であるモチーフ＃１、（Ｒ／Ｋ）ＳＸＳ＊ＸＰは、１４−３−３蛋白質のいくつかの結合パートナーに存在する。ＡｋｔおよびｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ（ＰＫＡ）のような多くの蛋白質キナーゼは、１４−３−３蛋白質の結合を開始するようにこのモチーフをリン酸化できる。
【０２１２】
ホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフモノクローナル抗体（４Ｅ２）（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６０６）は、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の、共通結合モチーフ＃１を含むホスホペプチドを認識する抗体である。この抗体はＲがアルギニンでＰがプロリンでＸはいかなるアミノ酸でもよく、Ｓ＊はホスホセリンである、共通モチーフ（Ｒ／Ｋ）ＸＸＳ＊ＸＰを含むペプチド及び蛋白質に非常に特異的である。この抗体はこのモチーフのホスホセリンのかわりにホスホスレオニンを含む類似配列に若干交差反応する。この抗体は、以前認識されていない１４−３−３蛋白質の結合パートナーであろう蛋白質を同定するために、蛋白質性調製物からモチーフ＃１を含むホスホペプチドを免疫親和的に単離するために使用された。
【０２１３】
この実施例では、モデルシステムはインシュリン及び８−（４−クロロフェニルチオ）−ｃＡＭＰ（ｃｐｔ−ｃＡＭＰ）で処理された、形質転換されたサル腎細胞由来のセルラインであるＣＯＳ１細胞であった。インシュリンはＡｋｔ蛋白質キナーゼを誘導し、膜透過性で代謝的に安定なｃＡＭＰ類似体はＰＫＡキナーゼを誘導する。誘導されたキナーゼは多くの蛋白質部位をリン酸化し、これらの間の多くは１４−３−３結合部位であり、即ちいくつかの蛋白質はＡｋｔ、ＰＫＡ及びほかの誘導された蛋白質キナーゼによりリン酸化された結果として１４−３−３蛋白質の結合パートナーとなる。ＣＯＳ−１細胞の培養物は１μｇ／ｍｌのインシュリンと１ｍＭの８−（４−クロロフェニルチオ）ｃＡＭＰ（ｃｐｔ−ｃＡＭＰ）で１０分間処理された。細胞は洗浄され、回収され、ソニケーションにより溶解され、溶解物内の蛋白質は変性され、溶解物は遠心により透明にされた。
【０２１４】
インシュリンとサイクリックＡＭＰ類似体での処理が潜在的な１４−３−３結合部位での蛋白質リン酸化のレベルを上昇させる原因となったことを示す為に、細胞抽出物はＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングで分析された（図２９）。処理された細胞の抽出物（レーン２）及び処理されていない細胞の抽出物（レーン１）を、ホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６０６）でプローブすることにより、この処置が１４−３−３結合モチーフ＃１を含む多くの異なる蛋白質のリン酸化状態を変化させることが示された。
【０２１５】
抽出物内の蛋白質は、ポリビニルマトリックスビーズ（ＭｏＢｉＴｅｃ、部分番号Ｐ５１０１）であるＦ７ｍに固定化されたエンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃによりペプチドへと消化され、固定化されたＧｌｕ−Ｃは遠心により除去された。固定化されたホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフモノクローナル抗体（４Ｅ２）は実施例２Ｂに於いて記載されるように調製され、１ｍｌ樹脂あたり４ｍｇの抗体を含むことが見出された。
【０２１６】
１４−３−３結合モチーフを含むホスホペプチドは、蛋白質Ｇ−アガロース樹脂に結合したホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフモノクローナル抗体により、Ｇｌｕ−Ｃで消化された粗細胞抽出物から精製された。消化物（約１２ｍｇ、０．５μｇ／μｌ蛋白質）は固定化された抗体−樹脂（４０μｌ、４μｇ／μｌ）とバッチ形態、４℃で１６時間接触させられ、結合していないペプチドは遠心により除去された。
抗体−樹脂は過剰に洗浄された（１ｍｌの氷で冷やされたＰＢＳで３回、１ｍｌの氷で冷やされた水で２回）。結合したペプチドはそれから１５０μｌの０．１％トリフルオロ酢酸で溶出され、溶出されたペプチドは、１００００よりも大きい質量を有する分子を保持するミクロコンＹＭ−１０膜（ミリポア、製品番号４２４０７）で遠心により溶出された抗体と分離された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析の前に、ＹＭ−１０通過画分の９μｌが逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩及び濃縮された。
【０２１７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
ホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体に結合しそこから溶出されたペプチドのマスは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより測定された（図３０）。図３０に於いて、星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドに対応し、四角で標識されたピークは不安定な分解及びリン酸のニュートラルロスを生じたペプチドである。
不安定な分解は、抗体で精製されたペプチド画分が、抗体の特異性に基づいて予期されるように、ホスホセリン又はホスホスレオニンを有する候補ホスホペプチドのいくつかを含むことを示した。不安定な分解は、装置の検出器へと移動する間にホスホペプチドイオンがリン酸のニュートラルロスを生じる時に生じ、正常なフォスフよりも約８４質量が低いブロードなコンパニオンピークの存在により示される。実施例５及び６で記述されるように、合成ペプチドを用いる実験は、不安定な分解が特異的でホスホセリン又はホスホスレオニンを含むペプチドの特異的で信頼できる指標であることを示し、このスペクトル内の不安定な分解の出現は、精製に使用される抗体の公知の特異性と合致している。
【０２１８】
このサンプル（図３０）と実施例６（図１９）に記載されるＡｋｔ基質サンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルの比較は、二つのサンプルセット間にいくつかのオーバーラップが生じるであろうことを示す。両方のサンプルで、Ａｋｔ蛋白質キナーゼが誘導され、ホスホペプチド精製に使用される抗体の特異性がオーバーラップ[ホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフモノクローナル抗体４Ｅ２の（Ｒ／Ｋ）ＸＸ（Ｓ＊）ＸＰ対、ホスホ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質モチーフポリクローナル抗体の（Ｒ／Ｋ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）ＸＸ(Ｓ＊／Ｔ＊)]することから、このことが予測される。サンプルセットの二つのペプチドは、リボゾーマル蛋白質Ｓ６由来のＧｌｕ−Ｃペプチドである、一つのリン酸基を有する及び二つのリン酸基を有する、ＱＩＡＫＲＲＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＥ（配列番号４１）に共通して対応する（図２７を参照）。上記のペプチド配列で下線がひかれているＳｅｒ２３５とＳｅｒ２３６は、Ａｋｔ基質モチーフに完全に、そして１４−３−３結合部位モチーフに部分的に合致する。
【０２１９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体に結合し、そこから溶出されたペプチドは更にＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。ペプチド画分の２０μｌは逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで脱塩及び濃縮され、２μｌの０．１％トリフルオロ酢酸、４０％アセトニトリルで溶出された。溶出された画分の０．４μｌ分取はＡＣＨＡマトリックス溶液と混合され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで分析され、図３０に於いて示されたものと同様のスペクトルを生じた。溶出された画分の残りは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。
【０２２０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は上述したように（実施例４）行われた。このサンプルを分析することで得られたクロマトグラムは、図３１に示されている。図３１の最初のパネルは実測ＭＳスキャンが集められたところを示し、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められたところを示す。三番目、四番目、５番目のパネルはそれぞれ、リン酸のニュートラルロスが行われた電荷＋２、＋３、＋４のイオンの特徴である、４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されたところを示す。ニュートラルロスイオンの発生と強度は、候補ホスホペプチドを示すことを助けるために、図３１の第３、第４、及び第５のパネルにプロットされている。ニュートラルロスプロットは、リン酸基の疎水性によりホスホペプチドについて予期されるように、ホスホペプチド候補はクロマトグラムに於いて早く溶出する傾向にあり、多くのＭＳ／ＭＳスペクトルに於いてニュートラルロスが観測され、これはこのサンプルが非常にホスホペプチドに富んでいることを示唆している。
【０２２１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ間にニュートラルロスを示すホスホペプチドの多くは（図３１、パネル３−５）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーの間に不安定な分解を生じるホスホペプチド（図３０）と同じである。図３２を参照されたい。実施例６に記載されるＡｋｔ基質サンプルと同様に、ＭＳ／ＭＳの間にニュートラルロスを示すほとんどのペプチドは、一つよりも多いリン酸基を含んでいた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルに基づく、リボゾーマル蛋白質Ｓ６由来の、仮に割り当てられた複数箇所リン酸化されたペプチドを含む、Ａｋｔ基質抗体と１４−３−３結合モチーフ抗体で精製されたペプチドのセット間にかなりのオーバーラップがあるであろうという解釈を支持するものである。
【０２２２】
二つのサンプルセット間の重なりを示唆するほかのものは、いくつかのＭＳ／ＭＳスペクトルに於いて観測された残基の骨格断片化により提供される。図３３参照。左のパネルはＡｋｔ基質抗体サンプルセット由来のＭＳ／ＭＳスペクトルであり、右パネルは１４−３−３結合モチーフ抗体サンプルセット由来の対応するスペクトルである。一番上のパネルは二つのリン酸基を有するＳ６ペプチドに対応する＋４の電荷のイオンに両方とも仮に割り当てられ、ニュートラルロスに加え、両方のスペクトルは、おそらく電荷が＋３のｂ１７−Ｈ３ＰＯ４イオン産物（ｍ／ｚが６６８．０４と算出される）である、ｍ／ｚ６６８．２のイオン産物を示す。一番下のパネルは共にマスが３２０４で電荷が＋４で、ふたつのリン酸基を有するイオンに割り当てられ、両方のスペクトルは９９０．７のｍ／ｚ値のイオン産物を示す。
【０２２３】
すべてのＭＳ／ＭＳイオン産物スペクトルは、個々のペプチドにリン酸化部位と親蛋白質を割り当てる為にＳｅｑｕｅｓｔで分析された。ここでは多くの場合に（実施例Ｖ及びＶＩに於いてまた記述されるように）、ペプチド骨格にそった非常に小さい残基の断片化でのニュートラルロスの高いレベルにより、明確な割り当てを生じなかった。ＭＳ／ＭＳは、もっとも豊富なホスホペプチドの多くは、複数箇所リン酸化されていることを示しており、現在のデータ獲得ソフトウエアが複数のニュートラルロスを認識し、ニュートラルロスがもっとも高いレベルのイオンを単離し断片化するように改良された後には（実施例６で示されているように）、ＭＳ３分析できる。
【０２２４】
曖昧でなく同定されたサンプルの一つのペプチドは、ヒートショックＳ２７ｋＤａ蛋白質由来のホスホセリン含有ペプチド（図３４）である。本方法によりリン酸化部位として同定された残基であるＳｅｒ７８は、Ｓ６キナーゼ及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼを含む、このサンプルを調製するために使用された処理により活性化されるであろう、いくつかの蛋白質キナーゼによりリン酸化されることが知られている。例えばLandryら、J Biol Chem 267: 794-803 (1992)及びBirdら、FEBS Lett 338: 31-36 (1994)を参照されたい。このホスホペプチドはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで検出された、図３０に於いて「２３８４．６」で標識される、目立ったピークに対応する。＋２の電荷を有するイオンとしてペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルは目立ったニュートラルロスイオン産物を示し、一つのリン酸基のロスと合致している（図３２参照）。Ｓｅｑｕｅｓｔにより親蛋白質とリン酸化部位を割り当てられることができたスペクトルは、＋３の電荷のイオンとして同じペプチドから産生された。予期されたように、Ｓｅｒ７８の前後に（ＲＡＬＳ＊ＲＱ）はホスホペプチドを精製するために使用されたホスホ（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体の公知の特異性と合致している[下線のひかれた残基は、特異的なモチーフ（Ｒ／Ｋ）ＸＸＳ＊ＸＰと合致する]。
【実施例８】
【０２２５】
粗細胞抽出物からホスホＰＤＫ１ドッキングモチーフを含むペプチドの単離
ホスホＰＤＫ１ドッキングモチーフ（Ｆがフェニルアラニンであり、Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、Ｓ＊／Ｔ＊はホスホセリン又はホスホスレオニンであり、Ｆ／Ｙはフェニルアラニン又はチロシンであるＦＸＸＦ（Ｓ＊／Ｔ＊）（Ｆ／Ｙ）（配列番号４２））を含むペプチドは、消化された細胞溶解物のようなペプチドの複雑な混合物から選択的に単離されるであろう。多くの蛋白質キナーゼはこのドッキングモチーフ配列を含み、この配列のリン酸化は３−ホスホイノシチド−依存キナーゼ１（ＰＤＫ１）に結合するこれらのキナーゼに必要とされる。ＰＤＫ１は、蛋白質キナーゼＢ（ＰＫＢ）、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、いくつかのＰＫＣアイソタイプ、血清及びグルココルチコイド誘導キナーゼ（ＳＧＫ）を含むいくつかの成長因子誘導性蛋白質キナーゼの活性化に於いて中心的な役割を果たしている。例えばBelhamら、Curr. Biol. 11: R93-R96(1999)を参照されたい。
【０２２６】
ホスホＰＤＫ１ドッキングモチーフ１８Ａ２（かさのある環）モノクローナル抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６３４）は、Fがフェニルアラニンで、Ｘはいかなるアミノ酸でよく、Ｓ＊／Ｔ＊はホスホセリン又はホスホチロシンであり、Ｆ／Ｖはフェニルアラニン又はチロシンを示す、共通配列ＦＸＸＦ（Ｓ＊／Ｔ＊）（Ｆ／Ｙ）を有するホスホペプチドを認識する、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（context-independent）の抗体である。このＰＤＫ１ドッキングモチーフを有するほかの蛋白質を同定するため、又は細胞ワイドに公知のＰＤＫ１基質の活性化状態をプロファイルするために、固定化されたＰＤＫ１ドッキングモチーフ（かさのある環）抗体は、消化された細胞溶解物のようなペプチドの複雑な混合物からモチーフを含むホスホペプチドを免疫親和性で精製するために使用される。例えば蛋白質性調製物は、Ａｋｔ蛋白質を過剰発現するＣＯＳセルライン（サル）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）で処理された３Ｔ３細胞（マウス）又は、ジャーカット（ヒト）細胞から得られる。抽出物は調製され、蛋白質は上述したように変性され（「蛋白質性調製物」参照）、それから固定化されたトリプシン又はほかのプロテアーゼで消化された。
【０２２７】
ＰＤＫ１ドッキングモチーフを含むホスホペプチドは、上記に於いてＰ−Ｔｙｒ−１００モノクローナル抗体及びＰ−Ｔｈｒポリクローナル抗体について記載されたように、ヒドラジド化学によりアガロース樹脂に固定化されたかさのある環モノクローナル抗体（ＰＤＫ１ドッキングモチーフ）で、消化された細胞溶解物内の複雑な混合物から単離される。消化物はバッチ形態で、４℃、１６時間抗体−樹脂と接触される。結合していないペプチドはそれから遠心により除去され、抗体−樹脂は、ｐＨ２．３、０．１Ｍグリシンで結合したペプチドを溶出する前に過剰に洗浄された。溶出されたペプチドは逆相ＺｉｐＴｉｐマイクロカラムで濃縮及び脱塩される。溶出されたペプチドの質量は、ホスホペプチドからリン酸基を除去し、ペプチド内に存在する個々のリン酸について、ホスホペプチドの質量を８０減少させることができるホスファターゼで溶出されたペプチドの分取を処理する前及び処理した後に測定される。ホスホペプチドの混合物は、上述したように個々のホスホペプチドが由来する親蛋白質を同定することを容易にする部分的なペプチド配列情報を得るために、ＭＳ／ＭＳにより分析される。個々のホスホペプチド配列は上述したＰＤＫ１ドッキングモチーフ共通配列と合致するであろうことが予期される。
【実施例９】
【０２２８】
粗細胞抽出物からアセチルリジン含有ペプチドの単離
例えばアセチルリジンのようなアセチル化された残基を含むペプチドは、本発明の方法に従って、消化された細胞溶解物のようなペプチドの複雑な混合物から選択的に単離されるであろう。アセチル化はクロマチンの構造とヒストンと転写因子の修飾を通じた遺伝子の活性化を調節し、よって、アセチル化されたペプチドの特異的な単離は、これらの生物学的に重要な蛋白質の活性化状態についての重要な情報を提供する。
【０２２９】
アセチル化されたリジンモノクローナル抗体（セルシグナリングテクノロジー社製、製品番号９６８１）は、リジンイプシロンアミノ基のアセチル化により翻訳後修飾された蛋白質を特異的に認識する。アセチル化のほかの部位を同定するために、固定化されたアセチル化されたリジン抗体が、本発明の方法に従って蛋白質性調製物から修飾された（即ちアセチル化された）ペプチドを免疫親和性で単離するのに使用されるであろう。例えばペプチドの複雑な混合物を含む消化された細胞溶解物は、リジン−４でアセチル化されるＨＩＶ  
【０２３０】
Ｎｅｆ蛋白質を過剰発現するＣＯＳセルライン（サル）から調製されるであろう。蛋白質性調製物は調製され、上述したように蛋白質は変性させられ（「蛋白質性調製物」を参照）、固定化されたトリプシン又は遠心により消化物から除去できるほかの適した固定化されたプロテアーゼで消化される。
【０２３１】
アセチル化されたペプチドは上記に於いてＰ−Ｔｙｒ−１００モノクローナル抗体やＰ−Ｔｙｒポリクローナル抗体について記述されるように、ヒドラジド化学を使用してアガロース樹脂に結合されたアセチルリジン特異的抗体（一般的な修飾特異的抗体）で、消化された細胞溶解物から単離される。アセチル化されたペプチドを単離するために、消化された粗抽出物は、４℃で一晩中固定化されたアセチル化されたリジンモノクローナル抗体と接触させられる樹脂はそれから遠心により回収され、上述したように過剰に洗浄される。結合したペプチドはそれから抗体−樹脂を０．１％トリフルオロ酢酸のような溶出溶液で処理し、プラスチックフリットを通じて遠心することで溶出される。
【０２３２】
このセルラインでは、過剰発現されたＨＩＶ  Ｎｅｆ蛋白質は、細胞内でもっとも顕著にアセチル化された蛋白質であり、本発明の方法に従ってアセチル化されたほかのペプチドと同様に、アセチル化されたＨＩＶ  Ｎｅｆペプチドは特異的に単離されるであろうことが予期される。これらのペプチドとほかのアセチル化されたペプチドは、親蛋白質を同定するために使用されることができる部分配列を得るためにＭＳ／ＭＳにより更に分析されるであろう。ＨＩＶ  Ｎｅｆ蛋白質では、例えば部分配列は粗抽出物から単離されたペプチドが実際にＨＩＶ  Ｎｅｆ蛋白質由来であることを確かめることを助けるであろう。本方法で精製されたほかのアセチル化されたペプチドの分析は、新規のいまだ知られていないアセチル化部位を同定し、これらの場合には部分配列分析が個々のアセチル化されたペプチドをその親蛋白質と合致させるために必要であろう。一般的に、ペプチドの質量とそのペプチドの部分配列は、親蛋白質の配列が公共の蛋白質配列データベースに保持されている限り、そのペプチドの親蛋白質を同定するのに十分である。Mannら、Anal Chem 66: 4390-4399 (1994)を参照されたい。
【実施例１０】
【０２３３】
粗組織抽出物から修飾ペプチドの単離により、腫瘍組織に於ける活性化された経路のプロファイリング
疾患組織に於ける重要な生物学的シグナリング経路の活性化状態は、本発明の方法に従って修飾ペプチドを選択的に単離することによりプロファイルされる。例えば特定の細胞性シグナリング経路は特定の蛋白質のリン酸化に依存する。それゆえ例えば腫瘍細胞のような標的細胞に於ける蛋白質リン酸化状態は、修飾ペプチドが選択的に単離されるであろう腫瘍組織の生検サンプル由来の細胞抽出物を調製することで、経路活性化をプロファイルするために使用されるであろう。
【０２３４】
例えば胸腫瘍細胞のような腫瘍細胞に於ける蛋白質リン酸化状態のプロファイリングは、標的腫瘍細胞から、ペプチドの複雑な混合物を含む蛋白質性調製物を得ることで行われる。蛋白質性調製物は、例えばＭＡＰキナーゼ経路、上皮成長因子受容体、エストロゲン受容体のようなステロイド受容体を含む様々な成長因子受容体経路、ＰＩ−３−キナーゼＡｋｔ経路を含む、複数のシグナル経路の活性化状態をプロファイルするために十分な細胞性抽出物を提供する、胸腫瘍由来の単一針生検から得られる。これらの経路の全ては乳ガンに於いて含まれることが示されており、現在及び今後の薬剤開発及び患者の治療に於ける重要な標的である。
【０２３５】
特定の乳ガン生検のシグナル経路に於ける変化を評価するために、蛋白質性調製物が生検サンプルから得られ、例えばホスホペプチドのようなその画分由来の望ましい修飾ペプチドは、上述したように免疫親和性で精製されＭＳで特徴付けられる。蛋白質画分はソニケーションにより凍結した生検組織から得られ、不溶性の物質と細胞骨格蛋白質は遠心により除去される。多くの細胞性蛋白質を含む上清画分は、それから熱処理により変性され、固定化されたトリプシン又はほかの特異的な蛋白質分解酵素で消化される。この蛋白質性調製物は、複数の異なる蛋白質由来の修飾されたホスホペプチドを含む。蛋白質性調製物は、免疫親和性の単離により蛋白質性調製物内の複雑な混合物由来のホスホペプチドを単離するために、例えばホスホチロシン特異的抗体のような、固定化された一般的なリン酸特異的抗体と接触させられる。抗体−樹脂の一つのタイプ又は一連の抗体−樹脂のいくつかのタイプが使用されるであろう。例えば蛋白質画分は、固定化されたホスホチロシン特異的抗体（例えばすでに記載したようにカラム内で）と接触させられ、その段階で結合しない画分は二番目の支持体に於いて固定化されたＡｋｔ基質モチーフ特異的抗体で処理されるというように行われる。固定化された抗体−樹脂は結合していない（例えばリン酸化されていない）ペプチドを除去するために過剰に洗浄され、結合したペプチド画分は抗体−樹脂を０．１％トリフルオロ酢酸のような溶出溶媒で処理することにより回収される。
【０２３６】
溶出されたホスホペプチドはそれからＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析され、リン酸化は個々のリン酸基に於いて個々のペプチド質量を８０減少させる、ホスファターゼによる結合した画分液の処理後に再びペプチド質量を測定することにより確認される。修飾ペプチドを親蛋白質に割り当てるために、結合したペプチド画分はＭＳ／ＭＳで分析される。ペプチド質量により得られた部分的な配列情報は、個々のペプチドの親蛋白質を曖昧でなく同定するために十分である。Mannら、（1994）、上述を参照されたい。理想的には、この工程は同じ患者由来の腫瘍及び正常な細胞の生検について行われる。しかしながら、あるリン酸化部位が特定の癌についての診断マーカーとして知られている場合には、方法は正常な細胞の参照なくして、これらのマーカーの存在をアッセイするためにのみ使用されることができるであろう。
【０２３７】
腫瘍組織由来の標的細胞から単離されたリン酸化されたペプチドの量は、正常組織の参照細胞からの抽出物に於いて観測されるレベルと比較される。与えられたペプチド（そしてその親蛋白質）のリン酸化に於ける変化は、参照細胞のリン酸化状態と比較される場合に、シグナル経路に対応する活性化を示すであろう。このプロファイリングから得られる情報は、標的化されたシグナル経路に於ける、例えば薬剤処理のような治療の特異的な効果をモニターするのと同様に、患者のもっともよい治療を決定するために使用されるであろう。胸腫瘍細胞のような標的疾患細胞に於けるリン酸化状態のプロファイリングはまた、特定の癌に於いてどのシグナリング蛋白質と経路が含まれているかを同定するための癌の研究と同様に、例えば試験薬の効果を評価するために、薬剤開発に於いて有用な情報を提供する。癌のような疾患状態と関係するであろう蛋白質のほかの翻訳後修飾が同様に本明細書に開示される方法により試験される。
【実施例１１】
【０２３８】
未分化大細胞リンパ腫セルラインからのホスホチロシンペプチドの精製と同定
本発明の方法は、同じ活性化されたチロシンキナーゼを発現する二つのガンセルラインからリン酸化されたチロシンペプチドを同定するために使用された。Ｋａｒｐａｓ２９９とＳＵ−ＤＨＬ−１は未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）に由来している。ＡＬＣＬの大部分は、ヌクレオホスミン（nucleophosmin）と未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の融合の原因となるｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）染色体転座（chromosomal  translocation）の存在により特徴付けられる。Morrisら、Science 263: 1281-1284 (1994)を参照されたい。二つのセルラインは異なる患者に由来するが、両方が、構成としてチロシンキナーゼを活性に保持し、非腫瘍細胞を形質転換できる、ガン性融合キナーゼＮＰＭ−ＡＬＫを発現する。
【０２３９】
溶解物は両方のセルラインについて２ｘ１０８細胞から調製され、ＤＴＴとヨードアセタミドをアルキレートシステイン残基に処理した後に、トリプシンにより２Ｍウレア内で消化された。免疫親和性工程の前に、ペプチドは他の細胞性構成物からペプチドを分離するために、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラム（２ｘ１０８細胞について１ｍｌのカラム容量）を使用して、逆相固相抽出により分画化された。固相抽出カートリッジは５、１５、２５、４０％のアセトニトリルの工程で溶出された。個々の凍結乾燥（lyophilize）されたペプチド分画は１ｍｌのＰＢＳに再溶解され、蛋白質Ｇ−セファロース（ロシュ）（６０μｇ抗体、１５μｌ樹脂）上に固定化されたホスホチロシン抗体（Ｐ−Ｔｙｒ−１００、ＣＳＴ  ＃９４１１）で、一晩中４℃で処理された。抗体―樹脂は完全に洗浄され、免疫親和性で精製されたペプチドは、０．１％ＴＦＡ７５μｌで溶出された。この分画の一部（４０μｌ）はＳｔａｇｅチップで濃縮され、サーモフィネガンＬＣＱデカＸＰプラスイオントラップマススペクトロメーターを使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。ペプチドは、２８０ｎｌ／ｍｉｎの速度で４５分間のアセトニトリル線形グラジエンドで１０ｃｍｘ７５μｍ逆相カラムから溶出された。ＭＳ／ＭＳスペクトルはＮＣＢＩマウス蛋白質データベースとＳｅｑｕｅｓｔプログラムを使用して評価された。
【０２４０】
ＳＵ−ＤＨＬ−１に於けるチロシンリン酸化部位１１７とＫａｒｐａｓ２９９に於けるチロシンリン酸化部位の８４が表れた。予期されたように、これらの二つの類似したセルラインに於いて見出されたリン酸化部位は非常に重なっていた（７２％）。公知の細胞シグナリング蛋白質に由来するＡＬＣＬセルラインに於いて見出されたいくつかのホスホチロシン部位が表６に示されている。
【０２４１】
ＡＬＣＬセルラインに於いて見出されたホスホチロシンペプチド
【表６】
2005225858.tif 000008
【０２４２】
よりリン酸化部位を同定するために、同じＳＵ−ＤＨＬ−１細胞抽出物がトリプシン、キモトリプシン、エンドプロテナーゼＧｌｕＣ、又はエラスターゼで消化され、チロシンがリン酸化されたペプチドが精製されて上述したように分析され、トリプシン消化物から９０の、キモトリプシン消化物から５８の、エンドプロテナーゼＧｌｕＣ消化物から４３の、エラスターゼ消化物から８２のホスホチロシンペプチドが同定された。プロテアーゼのパネルはトリプシンのみを使用した場合には８８から４つの全てのプロテアーゼを使用することにより１９７へと、見出される、異なるチロシンリン酸化部位の数を増加させた。エラスターゼ消化物由来のほとんど（５４のうち３５）のリン酸化部位はトリプシン消化物に於いては見出されなかった。この二つの消化物由来のリン酸化部位間での小さな結合は、異なるプロテアーゼがより完全なリン酸化プロファイルを産生したことを示している。ＡＬＫのＴｙｒ−１２８２に於ける活性ループリン酸化は、キモトリプシンによる消化の後にのみ、１２残基のペプチドとして見出され、この残基は、５−残基のトリプシンペプチド又は５７残基のエンドプロテナーゼＧｌｕＣペプチドという、両者ともＭＳ／ＭＳに基づく同定が不可能なペプチドの長さの範囲であるペプチドに於いて存在すると予想される。加えて、プロテアーゼパネルは、リン酸化部位の割り当てを確かめる、重なり合いのあるホスホペプチド配列を産生した。ＡＬＫ  Ｔｙｒ−１５０７部位は、三つのトリプシンペプチド、一つのキモトリプシンペプチド、一つのエラスターゼペプチドという５つのペプチドに於いて見出された。
【０２４３】
１９７の異なるホスホチロシン部位を表す２６４のホスホペプチドの全てがＳＵ−ＤＨＬ−１細胞に於いて同定された。ＡＬＣＬセルラインに於いて活性ループリン酸化を示した唯一のチロシンキナーゼは、ＡＬＫであった。５つの新しい部位を含む、全部で９つの異なるＡＬＫリン酸化部位が観測された。四つの公知のＡＬＫ部位は、ＡＬＫがホスホリパーゼＣガンマ、ＳＨＣ、ＩＲＳ−１のようなほかのシグナル蛋白質を相互作用することを許容するホスホチロシン残基を含んでいた。ヒトリンパ腫の間で、ＳＴＡＴ３リン酸化はＡＬＫ発現と関係があり、ＳＴＡＴ３のリン酸化がこの腫瘍の第二のマーカーとなるであろうことを示唆しており、最近の研究は、ＡＬＫを発現するがリン酸化されたＳＴＡＴ３を発言しない腫瘍を有するＡＬＣＬ患者の少数にとって、好ましい臨床結果を示している。これらのＡＬＣＬセルラインはＳＴＡＴ３アイソフォーム１とＳＴＡＴ３アイソフォーム２がＴｙｒ−７０５でリン酸化されているものの両方を含み、これはこの転写因子のダイマー化と核転座を誘導するものである。
【実施例１２】
【０２４４】
パーバンデート処理したジャーカット細胞からのホスホチロシンペプチドの精製と同定
チロシンリン酸化されたペプチドは、本発明の方法に従ってパーバンデート処理されたジャーカット細胞から同定された。ジャーカット細胞は急性リンパ芽球の白血病患者由来の確立されたＴセルラインと白血病性の形質転換された非ホジキンリンパ腫である。パーバンデートは、蛋白質チロシンホスファターゼを阻害して、顕著に蛋白質関連ホスホチロシンのレベルを増加させることで、過剰にリン酸化された細胞状態を産生する。Srivastava及びSt-Louis, Mol Cell Biochem 176: 47-51 (1997)を参照されたい。蛋白質は２×１０８細胞から変性条件下で抽出され、トリプシンにより消化され、生じた複合ペプチド混合物は非ペプチド構成物から分離され、濃縮され、逆相固相抽出により三つに分画化された。個々の分画はアガロースビーズに固定化されたホスホチロシン特異的抗体Ｐ−Ｔｙｒ−１００で処理された。完全に洗浄した後、ペプチドは固定化された抗体から希釈した酸で溶出され、イオントラップマススペクトロメーターを使用して、ナノ流ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された。ＭＳ／ＭＳスペクトルはＳｅｑｕｅｓｔプログラムを使用してペプチド配列に割り当てられ、手動で確認された。
【０２４５】
１５６ホスホチロシンペプチドに於ける１７５のリン酸化部位の全てが、このサンプルに於いて見出された。精製されたペプチドのほとんどは、リン酸化されており、Ｓｅｑｕｅｓｔ割り当ての１００番までのトップスコアのうちの８８は、ホスホチロシンペプチドに対応した。リン酸化されていないペプチドは通常疎水性であり、豊富な蛋白質に由来するもので、アガロースビーズへの非特異的な親和性により、ホスホペプチド画分に混在したようである。このサンプル内で見出された細胞シグナリング蛋白質由来のホスホペプチドのいくつかが、表７にあげられている。
【０２４６】
パーバンデート処理されたジャーカット細胞で見出されるホスホチロシンペプチド
【表７】
2005225858.tif 000009
【０２４７】
このサンプルで見出されたホスホチロシンペプチドの約三分の一（１５６中５６）が、Ｔ細胞受容体シグナリングに於いてよく記述されている役割を有する蛋白質に由来していた。これらの中にはＴ細胞受容体刺激により活性化されるチロシンキナーゼＺＡＰ７０とＬｃｋがあった。活性ループ内のＴｙｒ−４９３を含む６つのチロシンリン酸化部位がＺＡＰ７０に於いて見出され、活性ループ部位Ｔｙｒ−３９４を含む三つの部位がＬｃｋに於いて見出された。ＺＡＰ７０とＬｃｋで見出された全てのチロシンリン酸化部位は全て以前報告されている。二つのほかのチロシンキナーゼと、三つのセリン／スレオニンキナーゼの活性ループに於けるリン酸化部位が見出された。それらは、活性化セリン／スレオニンキナーゼｐ３８ＭＡＰキナーゼ、ＧＳＫ３α、ＰＲＰ４と同様に、受容体チロシンキナーゼＥｐｈＡ４と細胞質のＦｅｒチロシンキナーゼであった。加えて、ｐ６２ｄｏｋ１、ＮＣＫ、ＳＨＣ、ＳＨＰ２、ホスホリパーゼＣガンマ１及びガンマ２アイソフォームを含む、シグナル増幅に含まれる多くのホスホチロシン結合アダプター蛋白質が、チロシンのリン酸化体として同定された。
【０２４８】
これは他の蛋白質キナーゼやアダプター蛋白質を含む、それらの基質と同様に癌細胞に於いて以上に活性化されるチロシンキナーゼを同定するために使用できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】本発明の方法の作業系統説明図
【図２】αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸（hydroxycinnamic acid）をマトリックスとして使用する、１０の異なるリン酸化された及びリン酸化されていないペプチドの精製されていない混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルをあらわす。星で標識されたピークは、リン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークは、リン酸化されていないペプチドに対応する。標識されていないピークは、合成ペプチド副産物である。
【図３】本発明の方法に従って、モノクローナルＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂でリン酸化されたペプチドを単離した後の、図２で記載されたホスホチロシンペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。星で標識されたピークは、リン酸化されたペプチドであり、’がついた星で標識されたピークはＭ−７８の質量のリン酸化されたペプチドアーティファクトに対応する。これらのアーティファクトはまた、精製されていないペプチド混合物（図２）にも存在するが、リン酸化されていないペプチド（Ｍ−８０）のピークにより曖昧になる。
【図４】図４は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、図２に記載される精製された及び精製されていないホスホチロシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。上のパネルは精製前（図２に於けるような）ペプチド混合物を、下のパネルは精製後（図３）のペプチド混合物を示す。
【図５】図５は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、４つの異なるリン酸化された及びリン酸化されていないペプチドの精製されていない混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。星で標識されたピークは、リン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されてないペプチドである。標識されていないピークは合成ペプチド副産物である。
【図６】図６は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、図５に記載されるホスホスレオニンペプチド混合物の免疫親和性単離／精製後の結合した、及び結合していないペプチド画分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。上のパネルは、ポリクローナルＰ−Ｔｈｒ−抗体−樹脂に結合しなかったペプチド混合物の画分を示し、下のパネルはポリクローナルＰ−Ｔｈｒ−抗体−樹脂に結合して、そこから溶出された画分を示す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドである。
【図７】図７は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、図２に記載された精製されていない及び精製されたホスホチロシンペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。この単離は、低いレベルまで減じられたホスホチロシンペプチド混合物の量を除いて、図２から４に記載されたものと同様である。全てのパネルに於いて、星で標識されたピークは、リン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークは、リン酸化されていないペプチドであり、’がついた星で標識されたピークは、Ｍ−７８の質量のホスホペプチドアーティファクトに対応する。一番上のパネルは、精製されていない複雑なホスホチロシンペプチド混合物を表す。２番目のパネルはモノクローナルＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂に結合しなかったペプチドを表し、三番目のパネルは抗体−樹脂に結合して溶出したペプチドを表す。一番下のパネルはホスホペプチドからリン酸基を除去するためにホスファターゼ酵素で処理し、８０で観測される質量を減少させた後の、結合および溶出したペプチド画分を表す。三番目のパネルと四番目のパネルの間に引かれた線は、リン酸化ペプチドと脱リン酸化されたリン酸化ペプチドの間の関係を表す。
【図８】図８は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、精製されていないおよび精製されたホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、四角で標識されたピークは不安定な分解ホスホペプチド産物である。上のパネルは精製前のペプチド混合物を表し、下のパネルは精製後のペプチド混合物を表す。
【図９】図９は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、精製されていないおよび精製された１４−３−３結合モチーフペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドであり、四角で標識されたピークは不安定な分解ホスホペプチド産物である。黒い星で標識されたピークは、その配列が抗体の公知の特異性と合致しないことから、１４−３−３結合モチーフ抗体に結合するとは予期されないホスホペプチドである。上のパネルは精製前のペプチド混合物を表し、下のパネルは精製後のペプチド混合物を表す。
【図１０】図１０は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、消化された粗３Ｔ３細胞抽出物、ホスホチロシンペプチド混合物、ホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物を含む混合物から、固定化されたＰ−Ｔｙｒ−１００抗体により精製されたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドである。下のパネルはホスホペプチドからリン酸基を除去するためにホスファターゼ酵素で処理し、８０で観測される質量を減少させた後の、結合および溶出したペプチド画分を表す。三番目のパネルと四番目のパネルの間に引かれた矢印は、リン酸化ペプチドと脱リン酸化されたリン酸化ペプチドの間の関係を表す。
【図１１】図１１は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、消化された粗３Ｔ３細胞抽出物、ホスホチロシンペプチド混合物、ホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物を含む混合物から、固定化されたホスホ−Ａｋｔ基質抗体により精製されたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す（上のパネル）。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、四角で標識されたピークは不安定な―分解物ホスホペプチド産物である。下のパネルはホスホペプチドからリン酸基を除去するためにホスファターゼ酵素で処理し、８０で観測される質量を減少させた後の、結合および溶出したペプチド画分を表す。三番目のパネルと四番目のパネルの間に引かれた矢印は、リン酸化ペプチドと脱リン酸化されたリン酸化ペプチドの間の関係を表す。
【図１２】図１２は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、消化された粗３Ｔ３細胞抽出物と１４−３−３結合モチーフペプチド混合物を含む混合物から、固定化された１４−３−３結合モチーフ抗体により精製されたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。一番上のパネルは精製後のペプチド混合物を表し、真中のパネルは精製前のペプチド混合物を表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドである。丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは不安定な分解物ホスホペプチド産物である。下のパネルはホスホペプチドからリン酸基を除去するためにホスファターゼ酵素で処理し、８０で観測される質量を減少させた後の、結合および溶出したペプチド画分を表す。
【図１３】図１３は、上皮成長因子受容体（EGＦＲ）を過剰発現するＡ４３１細胞とＰ−Ｔｙｒ−１００抗体で標識されたウエスタンブロットを表す。ＥＧＦＲ発現の誘導は、細胞をＥＧＦで処理した後に現れる主要なバンドにより示される。
【図１４】図１４は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、Ａ４３１細胞抽出物からＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂により単離された修飾ペプチド（ホスホチロシン）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。図１３に示されるように、セルラインはＥＧＦ受容体を過剰発現し、ＥＧＦ受容体の特定の部位でのリン酸化を誘導するためにＥＧＦで処理された。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドである。丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応する。消化された溶解物からＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂で精製されたホスホペプチドは、予期されたようにＥＧＦ受容体の、二つの公知の主要なリン酸化部位に対応する（一番上のパネル）。画分はホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（下のパネル）。上と下のパネルの間に引かれた線は、ホスホペプチドと脱リン酸化されたホスホペプチドの間の関係を示す。
【図１５】図１５は、活性Ｓｒｃ蛋白質キナーゼを構成として発現するように安定に形質転換された３Ｔ３細胞とＰ−Ｔｙｒ−１００抗体でプローブされたウェスタンブロットを表す。形質転換されていない細胞との比較は、Ｐ−Ｔｙｒ−１００抗体により認識された蛋白質の数とレベルの上で、Ｓｒｃ発現の影響を示す。
【図１６】図１６は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、Ｓｒｃ蛋白質キナーゼで形質転換された３Ｔ３細胞（図１５に示されるように）の抽出物からＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂により単離された修飾ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応する。この結合して溶出したペプチド画分は、ホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（下のパネル）。
【図１７】図１７は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、Ｓｒｃ蛋白質キナーゼで形質転換された３Ｔ３細胞（図１５に示されるように）の抽出物からＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂により単離された修飾ペプチドの一つのＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを表す。スペクトルの一部は、低強度である産物のイオンを示すために増幅された。Ｓｅｑｕｅｓｔはこの特有のスペクトルを、エノラーゼAからホスホチロシンペプチドへ割り当てる。ペプチド配列と適切なＳｅｑｕｅｓｔスコアが示される。「ｂ」で標識されたピークはペプチドのアミノ末端を含む産物イオンを示し、「ｙ」はカルボキシル末端を含む産物イオンを示す。「ｂ」又は「ｙ」の標識に続く数は、そのイオンに於けるペプチド残基の数を示す。二重にプロトン化されたイオン、即ち２の電荷をもつイオンは、「＋＋」で標識される。
【図１８】図１８は、ＴＰＡで処理されたジャーカット細胞と、ホスホ−（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質抗体で標識されたウエスタンブロットを表す。未処理の細胞との比較は、ホスホ−ＰＫＣ基質抗体で認識された蛋白質の数とレベルに於けるＴＰＡ処理の影響を示す。
【図１９】図１９は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、ＴＰＡ処理されたジャーカット細胞抽出物（図１８に示されるように）から固定化されたホスホ−ＰＫＣ基質モチーフ抗体により単離された修飾ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す（一番上のパネル）。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは、不安定な分解ホスホペプチド産物である。この結合して溶出したペプチド画分は、ホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（下のパネル）。
【図２０】図２０は、固定化されたホスホ−ＰＫＣ基質モチーフ抗体で、ＴＰＡ処理されたジャーカット細胞抽出物（図１８に記載されるように）から精製された、修飾ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた様々なクロマトグラムを表す。一番上のパネルは、実測  ＭＳスキャンが集められたところ（ｙ軸値は、個々のスペクトルに於いて最も高いピークの高さである）であり、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められたところ（ｙ軸値は個々のスペクトルに於ける全ピークの高さの合計である）を表す。三番目、四番目、五番目のパネルは、それぞれ４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されたところ（ｙ軸値はニュートラルロスイオンの高さである）を表す。個々のクロマトグラムのピークは対応するスペクトル数で標識されている。
【図２１】図２１は、図２０に示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析間にニュートラルロスが起こったことが観測されたペプチドの、マス、リン酸含量、図１９で示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルに於けるピークとの対応のような、特質をあらわす。
【図２２】図２２は、固定化されたホスホ−ＰＫＣ基質モチーフ抗体で、ＴＰＡ処理されたジャーカット細胞抽出物（図１８に記載される）から精製された、修飾ペプチドのＬＣ−ＭＳ３分析の間に得られたＭＳ／ＭＳスペクトル（左パネル）とＭＳ３スペクトル（右パネル）のいくつかを表す。個々のＭＳ３スペクトルはその対応するＭＳ／ＭＳスペクトルとグループ化され、それによってデータ依存的なＭＳ３スペクトルが得られるようにした。Ｓｅｑｕｅｓｔは３つの示されたＭＳ３スペクトルに対してよい信頼性をもって親蛋白質を割り当てることができた。
【図２３】図２３は、図２２のスペクトルの一つにＳｅｑｕｅｓｔによる割り当てを確認するＭＳ／ＭＳスペクトル（左パネル）とＭＳ３スペクトル（右パネル）を表す。上のパネルは、生物学的ペプチドに対して集められ、Ｓｅｑｕｅｓｔにより３３５残基にホスホセリンがあるＵＳＤ１＿ヒトの３３３−３４３残基に割りあてられたスペクトルを表す。下のパネルは、この配列とリン酸化部位を有する合成されたペプチドに対して集められたスペクトルである。生物学的ペプチドスペクトルと合成ペプチドスペクトルの近接した対応は、Ｓｅｑｕｅｓｔにより作り出される整列を確かなものとしている。ＭＳ／ＭＳスペクトルの部分は、弱い強度のイオン産物を表すために増幅された。
【図２４】図２４は、活性Ａｋｔ蛋白質キナーゼを構成として発現するように安定に形質転換され、ＰＤＧＦで処理された３Ｔ３細胞のウェスタンブロットを表す。抽出物は、陰性コントロールとして形質転換されていない、処置されていない細胞を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、ブロットされ、プローブされることにより分析された。一番上のパネルは一般的なＡｋｔ抗体でプローブされており、二番目のパネルはＡｋｔのＴｈｒ３０８残基でのリン酸化に特異的な抗体で、三番目のパネルはＡｋｔのＳｅｒ４７３残基でのリン酸化に特異的な抗体でプローブされている。一番下のパネルはホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質モチーフ抗体でプローブされている。これは、Ａｋｔ蛋白質キナーゼの活性化がホスホ−Ａｋｔ基質抗体により認識される蛋白質の数とレベルの増加を伴うことを示している。他のブロッティング実験は、ホスホ−Ａｋｔ基質抗体により認識される主要な蛋白質はリボソーマル蛋白質Ｓ６であることを示した。
【図２５】図２５は、Ａｋｔ蛋白質キナーゼで形質転換された３Ｔ３細胞の抽出物から精製され、ＰＤＧＦ（図２４に示されるように）で処理された、修飾ペプチドの、マトリックスとしてα―シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を使用した（一番上のパネル）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。固定化されたホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｙｒ）Ａｋｔ基質モチーフ抗体が、消化された抽出物から修飾ペプチドを精製するために使用された。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは不安定な分解ホスホペプチド産物である。一番上のパネルのホスホペプチド４つは全てリン酸のニュートラルロスから生じる不安定な分解産物を伴う。これらのうちの二つは、リボソーマルＳ６（２，２５４．５と２，３３４．４）のホスホペプチドの予期される質量と合致する。この画分はホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（一番下のパネル）。一番上と一番下のパネル間に引かれた線は、ホスホペプチドと脱リン酸化されたホスホペプチドの間の関係を示す。
【図２６】図２６は、ＰＤＧＦ処理された３Ｔ３細胞抽出物（図２４に示される）から、固定化されたホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質モチーフ抗体で精製された、修飾ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析で得られた様々なクロマトグラムを表す。一番上のパネルは、実測ＭＳスキャンが集められたところ（ｙ軸値は、個々のスペクトルに於いて最も高いピークの高さである）であり、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められたところ（ｙ軸値は個々のスペクトルに於ける全ピークの高さの合計である）を表す。三番目、四番目、五番目のパネルは、それぞれ４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されたところ（ｙ軸値はニュートラルロスイオンの高さである）を表す。個々のクロマトグラムのピークは対応するスペクトル数で標識されている。
【図２７】図２７は、図２６に示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間にニュートラルロスが起こることが観測されたペプチドの、質量、リン酸含量、図２５に示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルのピークとの対応のような特質をあらわす。
【図２８】図２８は、図２６に示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間に獲得された三つのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す。これらの三つのスペクトルは、リボソーマル蛋白質Ｓ６由来の複数個所がリン酸化されたペプチドに、１（パネル１）、２（パネル２）、３（パネル３）リン酸基で暫定的に割り当てられた。
【図２９】図２９は、インシュリンとｃＡＭＰ類似体で処理され、ホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体でプローブされた、ＣＯＳ−１細胞のウエスタンブロットを表す。未処理の細胞との比較は、ホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体で認識された蛋白質の数とレベルに於ける処理の効果を示す。
【図３０】図３０は、（図２９に示される）処理されたＣＯＳ−１細胞抽出物から、固定化されたホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体で、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用して（一番上のパネル）単離された、修飾ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドであり、四角で標識されたピークは不安定な分解ホスホペプチド産物である。
【図３１】図３１は、処理されたＣＯＳ−１細胞から、ホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体で精製された、修飾ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた様々なクロマトグラムを表す。一番上のパネルは、実測ＭＳスキャンが集められたところ（ｙ軸値は、個々のスペクトルに於いて最も高いピークの高さである）であり、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められたところ（ｙ軸値は個々のスペクトルに於ける全ピークの高さの合計である）を表す。三番目、四番目、五番目のパネルは、それぞれ４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されたところ（ｙ軸値はニュートラルロスイオンの高さである）を表す。個々のクロマトグラムのピークは対応するスペクトル数で標識されている。
【図３２】図３２は、図３１に示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間にニュートラルロスが起こることが観測されたペプチドの、質量、リン酸含量、図３０に示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルのピークとの対応のような特質をあらわす。
【図３３】図３３は、一つはホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質モチーフ抗体（図２６）（この図の左パネル）、もう一つはホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体（図３１）（この図の右パネル）で調製された、二つの異なるサンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間に獲得された、二つのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す。目立ったニュートラルロスイオンに加えて、スペクトルは他の目立った共通のイオン産物を有している。これらのスペクトルは、同様の誘導条件および精製のために使用された抗体により認識されるモチーフの重なりから、両方のサンプルに存在するペプチドに対応すると考えられる。
【図３４】図３４は、（図２９に示される）処理されたＣＯＳ−１細胞抽出物から、固定化されたホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体で精製された、修飾ペプチドの一つのＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを表す。スペクトルの部分は、低い強度の産物イオンを示すために増幅された。Ｓｅｑｕｅｓｔはこの特有のスペクトルを、ヒートショック２７ｋＤａ蛋白質由来のホスホセリンペプチドへ割り当てた。ペプチド配列と適切な  Ｓｅｑｕｅｓｔスコアが示されている。「ｂ」で標識されたピークは、ペプチドのアミノ末端を含むイオン産物を示し、「ｙ」はカルボキシル末端を含むイオン産物を示す。「ｂ」又は「ｙ」標識につづく数は、イオン内のペプチド残基の数を示す。二重にプロトン化されたイオン、即ち２の電荷（Ｚ）を有するイオンは、「＋＋」と標識されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−Ａ】
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【図１９−Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月15日(2004.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４９】
【図１】本発明の方法の作業系統説明図
【図２】αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸（hydroxycinnamic acid）をマトリックスとして使用する、１０の異なるリン酸化された及びリン酸化されていないペプチドの精製されていない混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルをあらわす。星で標識されたピークは、リン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークは、リン酸化されていないペプチドに対応する。標識されていないピークは、合成ペプチド副産物である。
【図３】本発明の方法に従って、モノクローナルＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂でリン酸化されたペプチドを単離した後の、図２で記載されたホスホチロシンペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。星で標識されたピークは、リン酸化されたペプチドであり、’がついた星で標識されたピークはＭ−７８の質量のリン酸化されたペプチドアーティファクトに対応する。これらのアーティファクトはまた、精製されていないペプチド混合物（図２）にも存在するが、リン酸化されていないペプチド（Ｍ−８０）のピークにより曖昧になる。
【図４】図４は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、図２に記載される精製された及び精製されていないホスホチロシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。上のパネルは精製前（図２に於けるような）ペプチド混合物を、下のパネルは精製後（図３）のペプチド混合物を示す。
【図５】図５は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、４つの異なるリン酸化された及びリン酸化されていないペプチドの精製されていない混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。星で標識されたピークは、リン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されてないペプチドである。標識されていないピークは合成ペプチド副産物である。
【図６】図６は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、図５に記載されるホスホスレオニンペプチド混合物の免疫親和性単離／精製後の結合した、及び結合していないペプチド画分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。上のパネルは、ポリクローナルＰ−Ｔｈｒ−抗体−樹脂に結合しなかったペプチド混合物の画分を示し、下のパネルはポリクローナルＰ−Ｔｈｒ−抗体−樹脂に結合して、そこから溶出された画分を示す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドである。
【図７】図７は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、図２に記載された精製されていない及び精製されたホスホチロシンペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。この単離は、低いレベルまで減じられたホスホチロシンペプチド混合物の量を除いて、図２から４に記載されたものと同様である。全てのパネルに於いて、星で標識されたピークは、リン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークは、リン酸化されていないペプチドであり、’がついた星で標識されたピークは、Ｍ−７８の質量のホスホペプチドアーティファクトに対応する。一番上のパネルは、精製されていない複雑なホスホチロシンペプチド混合物を表す。２番目のパネルはモノクローナルＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂に結合しなかったペプチドを表し、三番目のパネルは抗体−樹脂に結合して溶出したペプチドを表す。一番下のパネルはホスホペプチドからリン酸基を除去するためにホスファターゼ酵素で処理し、８０で観測される質量を減少させた後の、結合および溶出したペプチド画分を表す。三番目のパネルと四番目のパネルの間に引かれた線は、リン酸化ペプチドと脱リン酸化されたリン酸化ペプチドの間の関係を表す。
【図８】図８は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、精製されていないおよび精製されたホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、四角で標識されたピークは不安定な分解ホスホペプチド産物である。上のパネルは精製前のペプチド混合物を表し、下のパネルは精製後のペプチド混合物を表す。
【図９】図９は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、精製されていないおよび精製された１４−３−３結合モチーフペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドであり、四角で標識されたピークは不安定な分解ホスホペプチド産物である。黒い星で標識されたピークは、その配列が抗体の公知の特異性と合致しないことから、１４−３−３結合モチーフ抗体に結合するとは予期されないホスホペプチドである。上のパネルは精製前のペプチド混合物を表し、下のパネルは精製後のペプチド混合物を表す。
【図１０】図１０は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、消化された粗３Ｔ３細胞抽出物、ホスホチロシンペプチド混合物、ホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物を含む混合物から、固定化されたＰ−Ｔｙｒ−１００抗体により精製されたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドである。下のパネルはホスホペプチドからリン酸基を除去するためにホスファターゼ酵素で処理し、８０で観測される質量を減少させた後の、結合および溶出したペプチド画分を表す。三番目のパネルと四番目のパネルの間に引かれた矢印は、リン酸化ペプチドと脱リン酸化されたリン酸化ペプチドの間の関係を表す。
【図１１】図１１は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、消化された粗３Ｔ３細胞抽出物、ホスホチロシンペプチド混合物、ホスホＡｋｔ基質ペプチド混合物を含む混合物から、固定化されたホスホ−Ａｋｔ基質抗体により精製されたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す（上のパネル）。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、四角で標識されたピークは不安定な―分解物ホスホペプチド産物である。下のパネルはホスホペプチドからリン酸基を除去するためにホスファターゼ酵素で処理し、８０で観測される質量を減少させた後の、結合および溶出したペプチド画分を表す。三番目のパネルと四番目のパネルの間に引かれた矢印は、リン酸化ペプチドと脱リン酸化されたリン酸化ペプチドの間の関係を表す。
【図１２】図１２は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、消化された粗３Ｔ３細胞抽出物と１４−３−３結合モチーフペプチド混合物を含む混合物から、固定化された１４−３−３結合モチーフ抗体により精製されたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。一番上のパネルは精製後のペプチド混合物を表し、真中のパネルは精製前のペプチド混合物を表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドである。丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは不安定な分解物ホスホペプチド産物である。下のパネルはホスホペプチドからリン酸基を除去するためにホスファターゼ酵素で処理し、８０で観測される質量を減少させた後の、結合および溶出したペプチド画分を表す。
【図１３】図１３は、上皮成長因子受容体（EGＦＲ）を過剰発現するＡ４３１細胞とＰ−Ｔｙｒ−１００抗体で標識されたウエスタンブロットを表す。ＥＧＦＲ発現の誘導は、細胞をＥＧＦで処理した後に現れる主要なバンドにより示される。
【図１４】図１４は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、Ａ４３１細胞抽出物からＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂により単離された修飾ペプチド（ホスホチロシン）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。図１３に示されるように、セルラインはＥＧＦ受容体を過剰発現し、ＥＧＦ受容体の特定の部位でのリン酸化を誘導するためにＥＧＦで処理された。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドである。丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応する。消化された溶解物からＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂で精製されたホスホペプチドは、予期されたようにＥＧＦ受容体の、二つの公知の主要なリン酸化部位に対応する（一番上のパネル）。画分はホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（下のパネル）。上と下のパネルの間に引かれた線は、ホスホペプチドと脱リン酸化されたホスホペプチドの間の関係を示す。
【図１５】図１５は、活性Ｓｒｃ蛋白質キナーゼを構成として発現するように安定に形質転換された３Ｔ３細胞とＰ−Ｔｙｒ−１００抗体でプローブされたウェスタンブロットを表す。形質転換されていない細胞との比較は、Ｐ−Ｔｙｒ−１００抗体により認識された蛋白質の数とレベルの上で、Ｓｒｃ発現の影響を示す。
【図１６】図１６は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、Ｓｒｃ蛋白質キナーゼで形質転換された３Ｔ３細胞（図１５に示されるように）の抽出物からＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂により単離された修飾ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応する。この結合して溶出したペプチド画分は、ホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（下のパネル）。
【図１７】図１７は、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、Ｓｒｃ蛋白質キナーゼで形質転換された３Ｔ３細胞（図１５に示されるように）の抽出物からＰ−Ｔｙｒ−１００抗体−樹脂により単離された修飾ペプチドの一つのＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを表す。スペクトルの一部は、低強度である産物のイオンを示すために増幅された。Ｓｅｑｕｅｓｔはこの特有のスペクトルを、エノラーゼAからホスホチロシンペプチドへ割り当てる。ペプチド配列と適切なＳｅｑｕｅｓｔスコアが示される。「ｂ」で標識されたピークはペプチドのアミノ末端を含む産物イオンを示し、「ｙ」はカルボキシル末端を含む産物イオンを示す。「ｂ」又は「ｙ」の標識に続く数は、そのイオンに於けるペプチド残基の数を示す。二重にプロトン化されたイオン、即ち２の電荷をもつイオンは、「＋＋」で標識される。
【図１８】図１８は、ＴＰＡで処理されたジャーカット細胞と、ホスホ−（Ｓｅｒ）ＰＫＣ基質抗体で標識されたウエスタンブロットを表す。未処理の細胞との比較は、ホスホ−ＰＫＣ基質抗体で認識された蛋白質の数とレベルに於けるＴＰＡ処理の影響を示す。
【図１９−Ａ】図１９Ａは、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、ＴＰＡ処理されたジャーカット細胞抽出物（図１８に示されるように）から固定化されたホスホ−ＰＫＣ基質モチーフ抗体により単離された修飾ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルの低分子量側を表す（上のパネルはホスファターゼ処理前のものを表す）。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは、不安定な分解ホスホペプチド産物である。この結合して溶出したペプチド画分は、ホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（下のパネルはホスファターゼ処理後のものを表す）。
【図１９−Ｂ】図１９Ｂは、αシアノ４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用した、ＴＰＡ処理されたジャーカット細胞抽出物（図１８に示されるように）から固定化されたホスホ−ＰＫＣ基質モチーフ抗体により単離された修飾ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルの高分子量側を表す（上のパネルはホスファターゼ処理前のものを表す）。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、丸で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは、不安定な分解ホスホペプチド産物である。この結合して溶出したペプチド画分は、ホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（下のパネルはホスファターゼ処理後のものを表す）。
【図２０】図２０は、固定化されたホスホ−ＰＫＣ基質モチーフ抗体で、ＴＰＡ処理されたジャーカット細胞抽出物（図１８に記載されるように）から精製された、修飾ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた様々なクロマトグラムを表す。一番上のパネルは、実測  ＭＳスキャンが集められたところ（ｙ軸値は、個々のスペクトルに於いて最も高いピークの高さである）であり、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められたところ（ｙ軸値は個々のスペクトルに於ける全ピークの高さの合計である）を表す。三番目、四番目、五番目のパネルは、それぞれ４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されたところ（ｙ軸値はニュートラルロスイオンの高さである）を表す。個々のクロマトグラムのピークは対応するスペクトル数で標識されている。
【図２１】図２１は、図２０に示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析間にニュートラルロスが起こったことが観測されたペプチドの、マス、リン酸含量、図１９で示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルに於けるピークとの対応のような、特質をあらわす。
【図２２】図２２は、固定化されたホスホ−ＰＫＣ基質モチーフ抗体で、ＴＰＡ処理されたジャーカット細胞抽出物（図１８に記載される）から精製された、修飾ペプチドのＬＣ−ＭＳ３分析の間に得られたＭＳ／ＭＳスペクトル（左パネル）とＭＳ３スペクトル（右パネル）のいくつかを表す。個々のＭＳ３スペクトルはその対応するＭＳ／ＭＳスペクトルとグループ化され、それによってデータ依存的なＭＳ３スペクトルが得られるようにした。Ｓｅｑｕｅｓｔは３つの示されたＭＳ３スペクトルに対してよい信頼性をもって親蛋白質を割り当てることができた。
【図２３】図２３は、図２２のスペクトルの一つにＳｅｑｕｅｓｔによる割り当てを確認するＭＳ／ＭＳスペクトル（左パネル）とＭＳ３スペクトル（右パネル）を表す。上のパネルは、生物学的ペプチドに対して集められ、Ｓｅｑｕｅｓｔにより３３５残基にホスホセリンがあるＵＳＤ１＿ヒトの３３３−３４３残基に割りあてられたスペクトルを表す。下のパネルは、この配列とリン酸化部位を有する合成されたペプチドに対して集められたスペクトルである。生物学的ペプチドスペクトルと合成ペプチドスペクトルの近接した対応は、Ｓｅｑｕｅｓｔにより作り出される整列を確かなものとしている。ＭＳ／ＭＳスペクトルの部分は、弱い強度のイオン産物を表すために増幅された。
【図２４】図２４は、活性Ａｋｔ蛋白質キナーゼを構成として発現するように安定に形質転換され、ＰＤＧＦで処理された３Ｔ３細胞のウェスタンブロットを表す。抽出物は、陰性コントロールとして形質転換されていない、処置されていない細胞を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、ブロットされ、プローブされることにより分析された。一番上のパネルは一般的なＡｋｔ抗体でプローブされており、二番目のパネルはＡｋｔのＴｈｒ３０８残基でのリン酸化に特異的な抗体で、三番目のパネルはＡｋｔのＳｅｒ４７３残基でのリン酸化に特異的な抗体でプローブされている。一番下のパネルはホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質モチーフ抗体でプローブされている。これは、Ａｋｔ蛋白質キナーゼの活性化がホスホ−Ａｋｔ基質抗体により認識される蛋白質の数とレベルの増加を伴うことを示している。他のブロッティング実験は、ホスホ−Ａｋｔ基質抗体により認識される主要な蛋白質はリボソーマル蛋白質Ｓ６であることを示した。
【図２５】図２５は、Ａｋｔ蛋白質キナーゼで形質転換された３Ｔ３細胞の抽出物から精製され、ＰＤＧＦ（図２４に示されるように）で処理された、修飾ペプチドの、マトリックスとしてα―シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を使用した（一番上のパネル）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表す。固定化されたホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｙｒ）Ａｋｔ基質モチーフ抗体が、消化された抽出物から修飾ペプチドを精製するために使用された。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドに対応し、四角で標識されたピークは不安定な分解ホスホペプチド産物である。一番上のパネルのホスホペプチド４つは全てリン酸のニュートラルロスから生じる不安定な分解産物を伴う。これらのうちの二つは、リボソーマルＳ６（２，２５４．５と２，３３４．４）のホスホペプチドの予期される質量と合致する。この画分はホスファターゼで処理され、ホスホペプチドの単離を確認するために再分析された（一番下のパネル）。一番上と一番下のパネル間に引かれた線は、ホスホペプチドと脱リン酸化されたホスホペプチドの間の関係を示す。
【図２６】図２６は、ＰＤＧＦ処理された３Ｔ３細胞抽出物（図２４に示される）から、固定化されたホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質モチーフ抗体で精製された、修飾ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析で得られた様々なクロマトグラムを表す。一番上のパネルは、実測ＭＳスキャンが集められたところ（ｙ軸値は、個々のスペクトルに於いて最も高いピークの高さである）であり、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められたところ（ｙ軸値は個々のスペクトルに於ける全ピークの高さの合計である）を表す。三番目、四番目、五番目のパネルは、それぞれ４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されたところ（ｙ軸値はニュートラルロスイオンの高さである）を表す。個々のクロマトグラムのピークは対応するスペクトル数で標識されている。
【図２７】図２７は、図２６に示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間にニュートラルロスが起こることが観測されたペプチドの、質量、リン酸含量、図２５に示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルのピークとの対応のような特質をあらわす。
【図２８】図２８は、図２６に示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間に獲得された三つのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す。これらの三つのスペクトルは、リボソーマル蛋白質Ｓ６由来の複数個所がリン酸化されたペプチドに、１（パネル１）、２（パネル２）、３（パネル３）リン酸基で暫定的に割り当てられた。
【図２９】図２９は、インシュリンとｃＡＭＰ類似体で処理され、ホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体でプローブされた、ＣＯＳ−１細胞のウエスタンブロットを表す。未処理の細胞との比較は、ホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体で認識された蛋白質の数とレベルに於ける処理の効果を示す。
【図３０】図３０は、（図２９に示される）処理されたＣＯＳ−１細胞抽出物から、固定化されたホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体で、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用して（一番上のパネル）単離された、修飾ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを表す。星で標識されたピークはリン酸化されたペプチドであり、○で標識されたピークはリン酸化されていないペプチドであり、四角で標識されたピークは不安定な分解ホスホペプチド産物である。
【図３１】図３１は、処理されたＣＯＳ−１細胞から、ホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体で精製された、修飾ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた様々なクロマトグラムを表す。一番上のパネルは、実測ＭＳスキャンが集められたところ（ｙ軸値は、個々のスペクトルに於いて最も高いピークの高さである）であり、二番目のパネルはＭＳ／ＭＳスペクトルが集められたところ（ｙ軸値は個々のスペクトルに於ける全ピークの高さの合計である）を表す。三番目、四番目、五番目のパネルは、それぞれ４９、３２．７、２４．５のニュートラルロスが検出されたところ（ｙ軸値はニュートラルロスイオンの高さである）を表す。個々のクロマトグラムのピークは対応するスペクトル数で標識されている。
【図３２】図３２は、図３１に示されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間にニュートラルロスが起こることが観測されたペプチドの、質量、リン酸含量、図３０に示されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルのピークとの対応のような特質をあらわす。
【図３３】図３３は、一つはホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質モチーフ抗体（図２６）（この図の左パネル）、もう一つはホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体（図３１）（この図の右パネル）で調製された、二つの異なるサンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間に獲得された、二つのＭＳ／ＭＳスペクトルを表す。目立ったニュートラルロスイオンに加えて、スペクトルは他の目立った共通のイオン産物を有している。これらのスペクトルは、同様の誘導条件および精製のために使用された抗体により認識されるモチーフの重なりから、両方のサンプルに存在するペプチドに対応すると考えられる。
【図３４】図３４は、（図２９に示される）処理されたＣＯＳ−１細胞抽出物から、固定化されたホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ抗体で精製された、修飾ペプチドの一つのＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを表す。スペクトルの部分は、低い強度の産物イオンを示すために増幅された。Ｓｅｑｕｅｓｔはこの特有のスペクトルを、ヒートショック２７ｋＤａ蛋白質由来のホスホセリンペプチドへ割り当てた。ペプチド配列と適切な  Ｓｅｑｕｅｓｔスコアが示されている。「ｂ」で標識されたピークは、ペプチドのアミノ末端を含むイオン産物を示し、「ｙ」はカルボキシル末端を含むイオン産物を示す。「ｂ」又は「ｙ」標識につづく数は、イオン内のペプチド残基の数を示す。二重にプロトン化されたイオン、即ち２の電荷（Ｚ）を有するイオンは、「＋＋」と標識されている。
【外国語明細書】
2005225858000001.pdf