(57)【要約】【課題】モデル成立後慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤の無投与にもかかわらず慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を維持するモデル哺乳動物を得ることが出来、しかも簡便な作製方法を用いて、労力をかけずに所定の時期に必要頭数の上記病態モデル哺乳動物を供給すること。【解決手段】モデル成立後慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤の無投与にもかかわらず慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を維持するモデル哺乳動物の作製方法であって、非げっ歯類哺乳動物に、チオアセトアミド１０ｍｇ／ｋｇ体重／週〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／週を８週間〜１６週間間歇反復投与しながら飼育する工程を有することを特徴とする方法、及び、当該方法により作製された慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を実質的に安定に維持するモデル哺乳動物等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モデル成立後慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤の無投与にもかかわらず慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を維持するモデル哺乳動物の作製方法であって、非げっ歯類哺乳動物に、チオアセトアミド１０ｍｇ／ｋｇ体重／週〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／週を８週間〜１６週間間歇反復投与しながら飼育する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
非げっ歯類哺乳動物がイヌであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
非げっ歯類哺乳動物がビーグル種のイヌであることを特徴とする請求項１記載の方法。。
【請求項４】
請求項１〜３記載の方法により作製された慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を実質的に安定に維持するモデル哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性肝炎及び／又は肝硬変モデル非げっ歯類哺乳動物の作製方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国における原発性肝癌の大部分は慢性肝炎や肝硬変を併発していることが知られている。そのため、新たに開発される原発性肝癌治療薬が慢性肝炎や肝硬変の部位にどのような影響を及ぼすのか確認することは極めて重要であり、モデル哺乳動物による薬物の作用を長期間観察することが求められる。これを満たすためには、できるだけ簡便な作製方法を用いて、労力をかけずに所定の時期に必要頭数の上記病態モデル哺乳動物を供給できることが望ましい。
【０００３】
これまでに、慢性肝炎及び／又は肝硬変モデル哺乳動物の作製方法としては、例えば、四塩化炭素等の慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤を飲水や飼料に混ぜて、これをラット等のげっ歯類哺乳動物に長期間投与する方法が知られている。（例えば、特許文献１や非特許文献１等参照）。
【０００４】
【特許文献２】特開平５−２０２０８８号公報
【非特許文献１】SMINARS IN LIVER DISEASE, Vol.10, No.1, p.56-65 (1990) by Thieme Medical Publishers, Inc (New York), Experimental Models of Hepatic Fibrosis: A Review
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記誘発剤の投与を中止すると１ヶ月程度で正常状態又はそれに近い状態に回復してしまい、モデル成立後前記誘発剤の無投与にもかかわらず慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を長期間安定した状態で維持させることは困難であり、非モデル化してしまうことが知られている
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．モデル成立後慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤の無投与にもかかわらず慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を維持するモデル哺乳動物の作製方法であって、非げっ歯類哺乳動物に、チオアセトアミド１０ｍｇ／ｋｇ体重／週〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／週を８週間〜１６週間間歇反復投与しながら飼育する工程を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．非げっ歯類哺乳動物がイヌであることを特徴とする前項１記載の方法；
３．非げっ歯類哺乳動物がビーグル種のイヌであることを特徴とする前項１記載の方法；４．前項１〜３記載の方法により作製された慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を実質的に安定に維持するモデル哺乳動物；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、モデル成立後慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤の無投与にもかかわらず慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を維持するモデル哺乳動物を得ることが出来、しかも簡便な作製方法を用いて、労力をかけずに所定の時期に必要頭数の上記病態モデル哺乳動物を供給することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において対象となる非げっ歯類哺乳動物としては、イヌを好ましいものとして挙げることができる。より好ましくはビーグル種のイヌビーグル犬が挙げられる。尚、これら動物、例えばビーグル種のイヌは、ナルク等から商業的に入手することができる。
【０００９】
本発明において慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤となるチオアセトアミドは、例えば、和光純薬社等から商業的に入手することができる。投与量は１週間に１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、２０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重とすればよい。投与に際しては、チオアセトアミドの原体を生理食塩液にて適当な濃度に希釈し、これを投与（好ましくは皮下投与）する。
【００１０】
本発明において慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤となるチオアセトアミドの投与量を上記の上限値よりも多くすると、チオアセトアミドはイヌ等の非げっ歯類哺乳動物に対して強い催吐作用を与えることになり、また、比較的高用量を連日など頻回に投与すると急性肝障害で死亡させてしまう。一方、投与量を上記の下限値よりも少なくすると、確実な病態モデル状態を誘発させることが難しくなる。
【００１１】
さらにまた肝臓の急激な状態悪化を回避させ、適確に所望のモデル哺乳動物にするためには、チオアセトアミドの投与頻度は、例えば、週に１回から２回の投与が望ましい。
【００１２】
本発明において慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤となるチオアセトアミドの投与におけるスケジュールは、例えば、間歇反復投与であればよく、非げっ歯類哺乳動物の種類、投与形態等によって適宜調整すればよい。具体的には例えば、最初の４週間が５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重を週２回に分割投与し、それ以降は１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重を週１回一括投与する方法等を挙げることができる。尚、ここで「間歇反復投与」とは、毎日投与ではなく約３〜７日の間隔をおいて複数回投与することを意味するものである。
【００１３】
チオアセトアミドの投与期間は、８〜１６週間とすればよい。好ましくは８〜１２週間を挙げることができる。
【００１４】
このような条件下でチオアセトアミドを投与しながら非げっ歯類哺乳動物を飼育することにより、所望のモデル哺乳動物を作製する。尚、前述の投与以外の飼育方法は、通常の非げっ歯類哺乳動物の飼育方法に従えばよい。
【００１５】
本発明方法により作製された非げっ歯類哺乳動物が、慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を有することを判定する方法としては、例えば、血液生化学的検査による推定診断及び肝生検による病理組織学的検査による確定診断を用いればよい。
【００１６】
具体的に、例えば、血液生化学的検査により肝機能関連の検査を行う。チオアセトアミドの投与の初期には血清中の蛋白質量の低下やＧＯＴやＧＰＴなど肝臓由来酵素量の増加がみられるが、慢性肝炎及び／又は肝硬変という慢性の病態に近づくにつれてこれらの項目における数値は正常値へと戻る現象がみられるので、これを利用すればよい。次いで血液生化学的検査において慢性の病態に近づいたと予測された個体に原則として月１回肝生検を行い、肝臓の状態を繰り返し病理組織学的に観察し、その結果として偽小葉（線維化が進行した状態）が形成されていれば慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を有すると判断すればよい。
【００１７】
本発明方法により作製された非げっ歯類哺乳動物のうち、例えば、ビーグル種のイヌでは、後述する実施例の如く、モデル成立後慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤の無投与にもかかわらず慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を長期間（例えば３年間）安定した状態で維持している。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１  （試験材料及び方法）
１）非げっ歯類哺乳動物
雌雄のビーグル犬（Ｃｏｖａｎｃｅ、米国）を検疫、馴化した後に試験に供した。当該非げっ歯類哺乳動物は室温２３±２℃、湿度４０〜８０％、換気回数１０回以上／時間、人工照明１２時間（８時〜２０時）に設定された飼育室で、ステンレス・アルミケージ（７００Ｗ×９００Ｌ×８００Ｈ  ｍｍ）に１頭ずつ個別に飼育された。飼育期間中に用いた飼料は、イヌ用固型飼料（ＴＣ−１、マルハペットフード）であり、これを１頭につき１日３００ｇずつを給餌した。健康状態が不良となった個体には補助食として動物用缶詰肉（健犬テシオ、マルハペットフード）を１頭あたり１日１００ｇずつ給餌した。また飼育期間中に用いた飲水は水道水であり、これを自由摂取させた。
【００２０】
２）慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤
生化学用チオアセトアミド（和光純薬）を生理食塩水に３０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させものを用いた。
【００２１】
３）慢性肝炎及び／又は肝硬変非げっ歯類哺乳動物の作製手順
（１）薬剤投与
前記の非げっ歯類哺乳動物にチオアセトアミドを２０ｍｇ／ｋｇ体重／週を９週間間歇反復投与しながら飼育した。当該投与におけるスケジュールは、投与開始４週間目までは１０ｍｇ／ｋｇ体重を週２回分割投与し、それ以降５週間２０ｍｇ/ｋｇ体重を週１回一括投与であった。
（２）推定診断
前記薬剤による肝臓への影響を予測するため、チオアセトアミドの投与開始から２週間毎に血液生化学的検査を実施し、血清中の蛋白質量及びＧＯＴやＧＰＴ等の肝臓由来酵素量を測定した。これらの数値はチオアセトアミド投与の初期（急性期）にはチオアセトアミドによる肝臓への影響が発現するとともに大きく変動するが、当該投与を継続して肝臓への影響が慢性化するに従い正常値へと戻っていった。この結果から慢性の病態に近づいた個体を推定した。
（３）確定診断
塩酸ケタミン５ｍｇ／ｋｇ体重及び塩酸キシラジン２ｍｇ／ｋｇ体重の筋肉内投与で麻酔を行った後肝生検を行った。肝臓全体を腹腔内視鏡で観察した後、所定の部位の肝組織を採取して病理組織学的検査を行った。
（４）判定方法
病理組織学的検査での肝障害の程度に応じて、Ａ：著変なし／弱い変化、Ｂ：一部に偽小葉（線維化が進行した状態）形成、Ｃ：偽小葉形成が明瞭、Ｄ：高度な障害／残存細胞が少ない、の４段階にグレード付けを行い、ヒトの慢性肝炎及び／又は肝硬変の像に類似しているＣグレードとなった個体を慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を有すると判定した。
（５）モデル成立後の経過
上記（４）により慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を有すると判定された個体は、直ちにチオアセトアミドの投与を中止し、休薬による影響を長期間に渡り調査した。その結果、休薬後３年を経過しても病理組織学的検査での肝障害の程度はＣグレードのまま維持されていた。
【００２２】
比較例１
慢性肝炎及び／又は肝硬変哺乳動物モデルの作製に適した系を検討するため、哺乳動物において肝障害を惹起することが知られている四塩化炭素を用いてモデル化を検討した。  ビーグル犬に四塩化炭素１ｍｌ／ｋｇ体重／週を１６週間間歇反復投与しながら飼育し、当該薬剤による肝臓への影響について実施例と同様な方法に基づき検討した。その結果、目的とする慢性肝炎及び／又は肝硬変を示す結果が得られた。しかしながら、肝臓の部位により像の程度が大きく異なり、同一個体の肝臓でも一部の葉では肝硬変を示すが隣の葉は正常という例がほとんどであり、肝臓全体に均一な肝障害を有するようなモデル状態である哺乳動物モデルを作製することは困難であった。
【００２３】
比較例２
慢性肝炎及び／又は肝硬変哺乳動物モデルの作製に適した系を検討するため、ジメチルニトロサミンを用いてモデル化を検討した。
ビーグル犬にジメチルニトロサミン２ｍｇ／ｋｇ体重／週２回を１０週間間歇反復投与しながら飼育し、当該薬剤による肝臓への影響について実施例と同様な方法に基づき検討した。その結果、急激に肝毒性を発現して死亡する個体が続出し、目的とする目的とする慢性肝炎及び／又は肝硬変を示す結果を得るには多数の動物を使用する必要があった。また当該薬剤は非常に毒性が強く、毒物に指定されており反復投与のために頻回に使用することは作業者にとっても不適切であり、採用を中止した。
【００２４】
比較例３
慢性肝炎及び／又は肝硬変哺乳動物モデルの作製に適した系を検討するため、ガラクトサミンを用いてモデル化を検討した。
ビーグル犬にガラクトサミン２０、５０及び１００ｍｇ各群／ｋｇ体重／週を４週間間歇反復投与しながら飼育し、当該薬剤による肝臓への影響について実施例と同様な方法に基づき検討した。その結果、２０及び５０ｍｇ各群／ｋｇ体重／週の両群では肝臓に全く変化が現れなかったが、１００ｍｇ／ｋｇ体重の群では急性肝障害で死亡したため、適切なモデルを作製することはできなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明方法により、モデル成立後慢性肝炎誘発剤又は肝硬変誘発剤の無投与にもかかわらず慢性肝炎及び／又は肝硬変の病理組織学的特徴を維持するモデル哺乳動物を得ることが出来、しかも簡便な作製方法を用いて、労力をかけずに所定の時期に必要頭数の上記病態モデル哺乳動物を供給することが可能になる。そして当該方法により作製されるモデル哺乳動物は、ＭＲＩ、ＣＴ等の肝画像診断の研究、或いは、造影剤、肝炎治療、肝硬変治療若しくは抗癌剤の開発又は安全性評価研究等に適したモデル哺乳動物として大変有用である。