(57)【要約】【課題】本発明の課題は、抗ウイルス剤、特にラミブジンを投与したＢ型肝炎患者で、投与中止後に劇症化するのを回避するために、Ｂ型肝炎患者の予後を予測する方法を確立することにある。【解決手段】血清中のチトクロムｃの量が高値を示す患者では、その後の予後が悪いことが見出された。血清中のチトクロムｃ量を測定することにより、Ｂ型肝炎患者の予後の予測が可能となり、Ｂ型肝炎患者の重症度を予測する検査方法、ならびに検査キットが開発された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中のチトクロムｃを定量することを特徴とする、抗ウイルス剤投与したＢ型肝炎患者の重症度を予測する検査方法。
【請求項２】
抗ウイルス剤がラミブジンである請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
以下の工程、
(1)抗ウイルス剤投与したＢ型肝炎患者の体液中のチトクロムｃを定量する工程、
(2)チトクロムｃの定量値が高い場合に重症度が高いと判断する工程、
からなる、請求項１または２に記載の抗ウイルス剤を投与したＢ型肝炎患者の重症度を予測する検査方法。
【請求項４】
チトクロムｃを免疫化学的方法により定量することを特徴とする、請求項１または２に記載の重症度の検査方法。
【請求項５】
抗ウイルス剤を投与したＢ型肝炎患者の重症度を予測するために使用するチトクロムｃ測定キット。
【請求項６】
抗ウイルス剤がラミブジンである請求項５に記載のキット。
【請求項７】
チトクロムｃを免疫化学的方法により定量する、請求項５または６に記載のチトクロムｃ測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チトクロムｃを定量することにより、ラミブジンを投与したＢ型肝炎患者の予後を予測する方法、及びその方法に用いるチトクロムｃ測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラミブジンがＢ型肝炎の治療薬として認可され、従来治療法の無かったＢ型肝炎の治療に効果を上げている（非特許文献１〜４）。
ところが、ラミブジンの投与を止めた後に肝炎が劇症化する症例（非特許文献５）、ラミブジン治療中にラミブジン耐性ウイルスが出現し肝炎が劇症化する症例（非特許文献６）が散見され、投与を中止するタイミングの難しいことがラミブジンによる治療を普及させる妨げとなっている。いずれも劇症化した場合、プレドニゾロン等のステロイドによる免疫抑制療法、インターフェロンによる抗ウイルス療法、アデフォホビル・エンテカビル等の核酸アナログによる併用療法が奏功する（非特許文献７，８，９）。しかしながら、従来から測定されている、ＨＢ抗原量及び生化学的な肝機能のマーカからは、劇症化を予測することが困難であり劇症化を予測する検査試薬が待望されていた。
【非特許文献１】Lai CL, Chien RN, Leung NWY, et al : A one-year trial of Lamivudine for chronic hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group. N Engl J Med 339 : 61-68, 1998
【非特許文献２】Dienstag JL, Schiff ER, Wright TL, et al : Lamivudine as initial treatment for chronic hapatitis B in the United States. N Eng J Med 341 : 1256-1263, 1999
【非特許文献３】Suzuki Y, Kumada H, Ikeda K, et al : Histological changes in liver biopsies after one year of lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B infection. J Hepatol 30 : 743-748, 1999
【非特許文献４】Tsubota A, Arase Y, Saitoh S, et al : Lamivudine therapy for spontaneously occurring severe acute exacerbation in chronic hapatitis B virus infection : a preliminary study. Am J Gastroenterol 96 : 557-562, 2001
【非特許文献５】Honkoop P, de Man RA, Heijtink RA, et al : Hepatitis B reactivation after lamivudine. Lancet 346(8983) : 1156-1157, 1995
【非特許文献６】岩永洋ら、肝臓41: 660-664, 2000
【非特許文献７】足立浩司ら、肝臓43:322-326, 2002
【非特許文献８】鈴木文孝ら、肝臓43:432-435, 2002
【非特許文献９】井上和明ら、肝臓44:428-428, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、ラミブジンを投与しているＢ型肝炎患者の重症度を予測する診断薬を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、血球貪食症候群（HPS）、GVHD、急性リンパ性白血病及びインフルエンザ脳炎で起こっている生体内のアポトーシスを測定したWO 01/35093と同様、Ｂ型肝炎で起こっている肝臓細胞のアポトーシスが、血中チトクロムｃにより測定できるのではないかと考えた。そして、チトクロムｃを測定するELISAを確立し、血中のチトクロムｃの量が高い患者は、より重症度が高いことを見出して、本発明を完成するに到った。
【０００５】
すなわち本発明は、以下に関する。
１．体液中のチトクロムｃを定量することを特徴とする、抗ウイルス剤投与したＢ型肝炎患者の重症度を予測する検査方法。
２．抗ウイルス剤がラミブジンである１に記載の検査方法。
３．以下の工程、
(1)抗ウイルス剤投与したＢ型肝炎患者の体液中のチトクロムｃを定量する工程、
(2)チトクロムｃの定量値が高い場合に重症度が高いと判断する工程、
からなる、１または２に記載の抗ウイルス剤を投与したＢ型肝炎患者の重症度を予測する検査方法。
４．チトクロムｃを免疫化学的方法により定量することを特徴とする、１または２に記載の重症度の検査方法。
５．抗ウイルス剤を投与したＢ型肝炎患者の重症度を予測するために使用するチトクロムｃ測定キット。
６．抗ウイルス剤がラミブジンである５に記載のキット。
７．チトクロムｃを免疫化学的方法により定量する、５または６に記載のチトクロムｃ測定キット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ラミブジンを投与したＢ型肝炎患者の予後を、血清中のチトクロムｃを測定することにより予測することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書中において体液とは、生体より採取された血液・血漿・血清・脳脊髄液等を意味するものである。
チトクロムｃを測定する方法としては、免疫化学的方法・電気泳動・クロマトグラフィ等が考えられる。電気泳動としては、ポリアクリルアミド電気泳動を行ってチトクロムをバンドとして検出する方法、キャピラリー電気泳動でピークとして検出する方法等がある。また、クロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフィーでピークとして検出する方法等がある。場合によっては感度を上げるために、蛍光標識することも許されるが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
チトクロムｃを測定する方法としては、感度・簡便性から免疫化学的方法が好ましい。ここで免疫化学的方法とは、チトクロムｃに対する抗体を用いて、チトクロムｃを定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロムｃを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、チトクロムｃに対する抗体を用いた方法であれば、本発明に含まれる。抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また標識する方法にも、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。抗体の作製法及び標識法は、例えば続生化学実験講座５ 免疫生化学研究法（社団法人日本生化学会編 株式会社東京化学同人発行）または新生化学実験講座１２  分子免疫学 III（社団法人日本生化学会編 株式会社東京化学同人発行）に記載されている。
【０００８】
チトクロムｃを測定する免疫化学的方法の例として、以下にサンドイッチ法についてステップを追って説明する。
1).チトクロムｃに対する抗体をビーズあるいはカップ上に固相化する。固相化する抗体は、必要な感度、好ましくは0.5 ng/mL、更に好ましくは0.1 ng/mLのチトクロムｃが測定できる感度が得られる抗体であれば、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても許される。モノクローナル抗体としては、市販の抗体、例えばclone : 6H2.B4, (Becton Dickinson社)またはclone:2B5F8（TECHNE 社）を使っても良い。ビーズはマイクロビーズでもよく、その場合は磁性体のマイクロビーズが好ましい。固相化は、共有結合により結合させても非共有結合により結合させても構わない。通常、ビーズあるいはカップ上の非特異的な結合部位をふさぐため、ウシ血清アルブミン（BSA）・カゼイン等の蛋白質、Tween 20等の界面活性剤でブロッキング操作を行う。
2).検体を、必要であればBSA・カゼイン等の蛋白質、Tween 20等の界面活性剤を含むバッファーで希釈し、ビーズあるいはカップに加える。また、既知の量のチトクロムｃも同様に希釈して加える。
3).ビーズあるいはカップを、できればTween 20等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、できればBSA・カゼイン等の蛋白質、Tween 20等の界面活性剤を含むバッファーで希釈された標識抗チトクロムｃ抗体を加える。標識抗体は、必要な感度、好ましくは0.5 ng/mL、更に好ましくは0.1 ng/mLのチトクロムｃが測定できる感度が得られる抗体であれば、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても許される。固相化抗体がモノクローナル抗体の場合、標識モノクローナル抗体は固相化抗体と異なるcloneを使うことが好ましく、市販の抗体、例えばclone : 6H2.B4,（Becton Dicknson社）またはclone:2B5F8（TECHNE 社）を使っても良い。
4).ビーズあるいはカップを、できればTween 20等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、標識に応じた方法、放射性標識であれば放射活性を、酵素標識であれば酵素活性を測定する。また、ビオチン化標識であれば更に標識アビジンを加えて、標識に応じた方法で測定する。
5).既知量のチトクロムｃを含む検体の測定値から検量線を作成し、検体中に含まれるチトクロムｃ量を計算する。
以上のステップにより、検体中のチトクロムｃが定量される。
【０００９】
更に本発明は、ラミブジン投与患者の予後を予測するために使用するチトクロムｃ測定試薬にも関する。その一例として、サンドイッチ法によりチトクロムｃを測定する測定試薬は、例えば1).抗チトクロムｃ抗体コートカップ、あるいは抗チトクロムｃ抗体コートビーズ、2).標識抗チトクロムｃ抗体を含み、好ましくは更に3).既知濃度のチトクロムｃ標準溶液、4).希釈液、5).洗浄液を含有する試薬である。更に酵素標識であれば、6).発色基質、7).反応停止液が含まれてもよい。
【００１０】
本発明で開示されるチトクロムｃの測定方法ならびに測定試薬は、抗ウイルス剤、好ましくはラミブジンを投与されているＢ型肝炎患者体液中のチトクロムｃを測定して、肝炎の重症度を検査するために用いることができる。
本発明で開示されるチトクロムｃ測定方法ならびに測定試薬により測定された、チトクロムｃの定量値が高い、具体的には500 pg/mL以上の患者は重症であると判定され、更に1000 pg/mL以上の患者は、より高い確度で重症であると判定され、チトクロムｃ定量値は、インターフェロン投与、別種の抗ウイルス剤投与、あるいはステロイド剤投与等、より高度な治療法選択の目安として用いることができる。
チトクロムｃは、抗ウイルス剤投与患者の重症度を検査する良い指標であり、病態を早く的確に知るための有用な指標となり得る。
【実施例】
【００１１】
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。%は、特記しない限り質量％である。
［実施例１］チトクロムｃのELISAによる測定。
チトクロムｃの測定法は、以下の手順で実施した。
【００１２】
1)抗チトクロムｃIgGの精製
ラットのチトクロムｃ（シグマ社）をウサギに免疫し、チトクロムｃに対する抗血清を得た。その抗血清に最終濃度2 Mになるように硫安を添加し、室温（20〜30℃）で５時間撹拌した。撹拌した溶液を10000回転で30分遠心し上清を捨て、沈殿物に0.1 Mリン緩衝液pH 7.2を加え溶解後、同一緩衝液にて透析した。透析した溶液は、ウシチトクロムｃ（シグマ社）を結合したCNBr-Sepharose4B（アマシャムファルマシアバイオテク社）カラムに流した。0.15M  NaClを含む0.01Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5でカラムを洗浄後、0.1 M塩酸グアニジンで抗チトクロムｃ IgGを溶出し、0.15 M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で透析しIgG精製物とした。
【００１３】
2)抗チトクロムｃIgG F(ab')2の調製
精製したIgGを0.1 M酢酸緩衝液pH 4.2で透析した。透析したIgG溶液にペプシン（シグマ社）を濃度比で20:1の割合になるように加え、37℃で16時間反応させた。ペプシンを加えた溶液に1 N NaOHを加えpHを7.5に調整した後、0.15 M  NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で平衡化したSephacryl  S-200（アマシャムファルマシアバイオテク社）でゲル濾過を行った。ゲル濾過したフラクションの第一ピークを集め、濃縮し、抗チトクロムｃ IgG F(ab')2液とした。
3)HRP標識抗チトクロムｃ抗体の作製
4 mg/mLに調整したHRP（東洋紡）に0.1 Mメタ過ヨウ素酸ナトリウムを60μL加え、室温（20〜30℃）で20分撹拌後、0.001 M酢酸緩衝液pH 4.4で透析した。透析後、0.2 M炭酸ナトリウム液でpH 9.0〜9.5に調整した。この溶液に、0.1 M炭酸緩衝液pH 9.5で透析した抗チトクロムｃIgG F(ab')2溶液あるいは抗チトクロムｃモノクローナル抗体（clone:2B5F8, TECHNE 社）を4 mg/mL濃度になるように加え、室温（20〜30℃）で２時間撹拌した。次に、4 mg/mLに調整した水素化ホウ素ナトリウム液を50μL加え、4℃で2時間撹拌後、16時間静置保存した。この溶液を0.15 M NaClを含むリン酸緩衝液 pH 7.2で透析後、 Sephacryl S-200でゲル濾過を行った。ゲル濾過したフラクションの第一ピークを集め、25% 容量ウサギ血清（日本生物材料）を含む0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 5.4で希釈し、HRP標識抗チトクロムｃ抗体とした。
【００１４】
4）チトクロムｃに対するモノクローナル抗体の作製
ヒトチトクロムｃ（GenzymeTechne社）110μg/100μLと65mMリン酸緩衝液pH7.5に溶解した2mg/mLオブアルブミン55μLを混合して、そこへ65mMリン酸緩衝液pH7.5で希釈した1mMグルタルアルデヒド42μLを加え、室温で2時間かくはんした。次に、0.15M NaClで４℃において４８時間透析し、等量のFCAとアジュバントを作製し、BALB/Cマウス腹腔に0.1mL免疫した。２週間おきに合計３回同様に免疫した。３回目の免疫の２週間後、マウスに生理食塩水に溶解したヒトチトクロムｃ50μg/100μLを尾静脈より静注した。３日後マウスから脾臓を摘出して、常法に従い、脾臓リンパ球をポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞P3X63 Ag8U.1と細胞融合した。ヒトチトクロムｃを抗原としてスクリーニングを行い、ヒトチトクロムｃに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。
樹立したハイブリドーマをエスクロンSF-B培地（三光純薬）で培養して増殖させ、BALB/Cマウス腹腔に接種した。１週間後、腹水を採取した。採取した腹水から抗チトクロムｃ抗体をプロテインＡを用いて精製した。
【００１５】
5)抗チトクロムｃ抗体固相化カップの作製
4)で作製した抗チトクロムｃモノクローナル抗体あるいは抗チトクロムｃモノクローナル抗体（clone : 6H2.B4, Becton Dicknson社）を、0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5でOD280nmが0.1になるよう調整した。調整した抗体を、ポリスチレンカップに100μL注入し4℃で16時間静置後、カップ洗浄機によって0.15 M NaCl、0.01容量% Tween 20を含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で4秒3回洗浄した。洗浄したカップに0.5% BSAを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5を200μL加え、再度4℃で16時間静置し固相化カップとした。
6)標準抗原の調製
ラットチトクロムｃ（シグマ社）を2%  BSA、0.01 M EDTA 2Na、0.1% NaN3、0.01容量% Tween 20、0.15 M NaClを含む0.05 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で溶解し、50 ng/mL〜50 pg/mLの希釈液を作製した。
【００１６】
7)測定
抗チトクロムｃモノクローナル抗体を固相化したカップに2% BSA、0.01 M EDTA 、0.1% NaN3、0.01容量% Tween 20、0.15 M NaClを含む0.05 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5を50μL注入した。そのカップに標準抗原または検体を50μL加え、室温（20〜30℃）で1時間反応させた。反応後、カップ洗浄機を用い0.01容量% Tween 20、0.15 M NaCl、0.0015% パラオキシ安息香酸メチル、0.005% ２-クロロアセトアミドを含む0.005 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で4秒3回洗浄した。洗浄後、カップに標識抗体を100μL加え室温（20〜30℃）で1時間反応させた。反応後、カップ洗浄機を用い0.01容量% Tween 20、0.15 M NaCl、0.0015% パラオキシ安息香酸メチル、0.005% ２-クロロアセトアミドを含む0.005 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で4秒3回洗浄した。洗浄後、1.5 mg/mLのABTS（2,2アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６スルホン酸）を含む 0.1 M クエン酸緩衝液pH 4.2を100μL加え室温（20〜30℃）で1時間反応させ、0.013%  NaN3液を100μL加え反応を停止した。発色した溶液の405nmの吸光度を分光光度計で測定した。
8).検体中のチトクロムｃ量の算出
標準抗原各濃度のチトクロムｃ及び検体の吸光度値からブランクの吸光度値を引いた。
横軸に標準抗原濃度、縦軸は標準抗原の吸光度をプロットし、標準曲線を描く。その標準曲線を基に、検体中に含まれるチトクロムｃ量を算出した。
【００１７】
［実施例２］ラミブジンを投与したＢ型肝炎患者血清中のチトクロムｃの定量
確立したチトクロムｃのELISA系を用いて、ラミブジンを投与し劇症肝炎を発症したＢ型肝炎患者血清中のALTピーク時のチトクロムｃ量を定量した。
その結果表１に示すように、その後の症状が重くインターフェロン、別種の抗ウイルス剤（Adefovir）、ステロイド剤（ＰＳＬ）あるいは繰り返しのインターフェロン投与を余儀なくされた患者血清中のチトクロムｃ定量値は1000 pg/mL以上、あるいは500-1000 pg/mLの高値を示し、症状が軽い６例の患者血清中のチトクロムｃ定量値は500 pg/mL以下であった。
患者血清中のチトクロムｃ定量値は、劇症Ｂ型肝炎のその後の重症度の良い目安となることが示された。
【００１８】
【表１】
2005147783.tif 000002