(57)【要約】【課題】  転移性遺伝要素を用いて偽陽性なく生体細胞内の遺伝子を破壊する方法、また該方法より細胞の機能を改変させる方法を提供すること。【解決手段】  生体の細胞内で遺伝子が破壊された場合にのみ細胞の特性を変化させることが可能である新規な転移性遺伝要素。該転移性遺伝要素を使用し、特性が変化した細胞を選抜することによって遺伝子が破壊された細胞を得る遺伝子破壊方法。該遺伝子破壊方法を使用して得られた、遺伝子破壊細胞株またはそのライブラリ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の細胞内で遺伝子を破壊可能な転移性遺伝要素。
【請求項２】
生体の細胞内で遺伝子が破壊された場合に細胞の特性を変化させることを特徴とする請求項１に記載の転移性遺伝要素。
【請求項３】
細胞の特性を変化させる遺伝子が逆向き繰り返し配列に挟まれた構造であることを特徴とする請求項１または２に記載の転移性遺伝要素。
【請求項４】
細胞の特性を変化させる遺伝子がプロモーター配列を欠失した構造であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の転移性遺伝要素。
【請求項５】
生体の細胞内で遺伝子が破壊された場合に変化する細胞の特性が薬剤耐性である請求項１から４のいずれかに記載の転移性遺伝要素。
【請求項６】
生体の細胞内で遺伝子が破壊された場合に変化する細胞の特性がテトラサイクリン耐性である請求項５に記載の転移性遺伝要素。
【請求項７】
細胞の特性を変化させる遺伝子が薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の転移性遺伝要素。
【請求項８】
細胞の特性を変化させる遺伝子がテトラサイクリン抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする請求項７に記載の転移性遺伝要素。
【請求項９】
細胞の特性を変化させる遺伝子を挟む逆向き繰り返し配列が挿入配列に由来することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の転移性遺伝要素。
【請求項１０】
配列番号１に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有することを特徴とする新規な転移性遺伝要素。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の転移性遺伝要素を染色体に組み込んだ細胞株。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の転移性遺伝要素を使用することを特徴とする遺伝子の破壊方法。
【請求項１３】
転移酵素を高効率に発現する細胞を使用することを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子の破壊方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の転移性遺伝要素を使用し、特性が変化した細胞を選抜することによって遺伝子が破壊された細胞を得ることを特徴とする遺伝子破壊方法。
【請求項１５】
遺伝子が破壊された細胞において変化した細胞の特性が薬剤耐性であることを特徴とする請求項１４に記載の遺伝子破壊方法。
【請求項１６】
遺伝子が破壊された細胞において変化した細胞の特性がテトラサイクリン耐性であることを特徴とする請求項１４に記載の遺伝子破壊方法。
【請求項１７】
配列番号１に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用し、テトラサイクリン耐性を獲得した細胞を選抜することによって遺伝子が破壊された細胞を得ることを特徴とする遺伝子破壊方法。
【請求項１８】
請求項１２から１７のいずれかに記載の遺伝子破壊方法を使用して得られた、遺伝子破壊細胞株またはそのライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移性遺伝要素を用いて生体細胞内の遺伝子を破壊する方法、該方法より細胞の機能を改変させる方法、および該方法により機能が改変された細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
転移性遺伝要素とは、染色体上で転移し得るＤＮＡ断片で、原核生物から真核生物までの広い範囲の生物に存在することが知られている。一般に、転移性遺伝要素は挿入配列（ＩＳ）とトランスポゾンに大きく分類される。ＩＳは通常、大きさが７６０〜２，０００ｂｐ程度のＤＮＡ断片であり、その両端に８〜２５ｂｐ程度の逆向きの繰り返し構造（インバーテッドリピート）を有し、内部には転移に必要な酵素であるトランスポゼースをコードする配列がみられる。一方、トランスポゾンはインバーテッドリピートおよびトランスポゼースをコードする配列に加えて、転移には直接関与しない薬剤耐性遺伝子などを併せ持つ転移因子であり、２つのＩＳの間に薬剤耐性遺伝子が挟まれた構造のものと、ＩＳ内に薬剤耐性遺伝子が挿入された構造のものが存在する（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
ＩＳをはじめとする転移性遺伝要素は、その転移により広く染色体の再編成（挿入、切断、逆位、欠失など）に関与し、生体細胞中の染色体における各種遺伝子群の配置を変化させる。この特性を利用し、近年、改良型トランスポゾンを生体細胞外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で遺伝子に挿入させる系が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、ほとんどの生物においては細胞外に取り出した染色体を再び細胞に戻すという操作は困難であり、生体細胞外でトランスポゾンを転移させる対象としてはクローニング操作によって獲得した遺伝子に限定されるため、特許文献１にも記載されているようなシークエンシングなどが主な用途となる。
【０００５】
近年、世界中で様々な生物に関するゲノム解析が行われており、それに伴って膨大な数量の未知の機能を有する遺伝子が同定されている。トランスポゾンを用いた遺伝子破壊は該遺伝子の機能を解明する上で極めて重要なツールとなり得るが、現在知られている方法ではプラスミド（染色体外ＤＮＡ）上のトランスポゾンまたは人工トランスポゾンを染色体に転移させる手法のため、細胞内に多コピー数存在するプラスミド（トランスポゾン供給元）に起因する偽陽性によって解析作業の効率が低下するという問題がある。これを解決するため、トランスポゾン供給元として温度感受性プラスミドを使用することにより偽陽性の低下を試みている例もある（例えば、特許文献２参照）。すなわち該方法は温度変化に応じて細胞内でのコピー数が変化するプラスミドを使用することによって、トランスポゾンにより破壊された遺伝子の解析作業時にプラスミドのコピー数を減少させる方策であるが、当業者間で周知の通り温度感受性プラスミドのコピー数をゼロにすることは事実上不可能であるため、偽陽性の完全な除去には至っていない。
【０００６】
その他、トランスポゾンのみのＤＮＡ断片や生体細胞内で複製できないプラスミドベクターを用いる方法もある（例えば、特許文献３参照）が、該方法は生体細胞へのトランスポゾン導入後に細胞内でＤＮＡ断片を増幅できず細胞分裂に伴ってトランスポゾンが希釈されていくため、染色体への転移効率が極めて悪いことも知られている。
【０００７】
また、生体細胞内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での遺伝子破壊の手法としては、ＵＶやα線、γ線、電子線等の放射線照射、変異原性物質の添加等の方法もあるが、これらの方法では、得られた細胞が遺伝子を破壊されたものであるか否かの特定のために得られた細胞の網羅的解析を行う必要があったり、染色体上の破壊された部位を特定のための解析作業が膨大になり、非常に効率が悪く膨大な数量の遺伝子を解析する手段としては実用的ではない。
【０００８】
【特許文献１】特表平８−５１０３８８号公報
【特許文献２】特開平９−７０２９１号公報
【特許文献３】特開平７−１０７９７６号公報
【非特許文献１】ゲノム  第２版  （メディカル・サイエンス・インターナショナル、２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、転移性遺伝要素を用いて偽陽性なく生体細胞内の遺伝子を破壊する方法、該方法より細胞の機能を改変させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討したところ、生体の細胞内で遺伝子が破壊された場合にのみ細胞の特性を変化させることが可能である新規な転移性遺伝要素を構築した。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１１】
（１）生体の細胞内で遺伝子を破壊可能な転移性遺伝要素。
【００１２】
（２）生体の細胞内で遺伝子が破壊された場合に細胞の特性を変化させることを特徴とする（１）に記載の転移性遺伝要素。
【００１３】
（３）細胞の特性を変化させる遺伝子が逆向き繰り返し配列に挟まれた構造であることを特徴とする（１）または（２）に記載の転移性遺伝要素。
【００１４】
（４）細胞の特性を変化させる遺伝子がプロモーター配列を欠失した構造であることを特徴とする（１）から（３）のいずれかに記載の転移性遺伝要素。
【００１５】
（５）生体の細胞内で遺伝子が破壊された場合に変化する細胞の特性が薬剤耐性である（１）から（４）のいずれかに記載の転移性遺伝要素。
【００１６】
（６）生体の細胞内で遺伝子が破壊された場合に変化する細胞の特性がテトラサイクリン耐性である（５）に記載の転移性遺伝要素。
【００１７】
（７）細胞の特性を変化させる遺伝子が薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする（１）から（６）のいずれかに記載の転移性遺伝要素。
【００１８】
（８）細胞の特性を変化させる遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子であることを特徴とする（７）に記載の転移性遺伝要素。
【００１９】
（９）細胞の特性を変化させる遺伝子を挟む逆向き繰り返し配列が挿入配列に由来することを特徴とする（１）から（８）のいずれかに記載の転移性遺伝要素。
【００２０】
（１０）配列番号１に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有することを特徴とする新規な転移性遺伝要素。
【００２１】
（１１）（１）から（１０）のいずれかに記載の転移性遺伝要素を染色体に組み込んだ細胞株。
【００２２】
（１２）（１）から（１１）のいずれかに記載の転移性遺伝要素を使用することを特徴とする遺伝子の破壊方法。
【００２３】
（１３）転移酵素を高効率に発現する細胞を使用することを特徴とする（１２）に記載の遺伝子の破壊方法。
【００２４】
（１４）（１）から（１３）のいずれかに記載の転移性遺伝要素を使用し、特性が変化した細胞を選抜することによって遺伝子が破壊された細胞を得ることを特徴とする遺伝子破壊方法。
【００２５】
（１５）遺伝子が破壊された細胞において変化した細胞の特性が薬剤耐性であることを特徴とする（１４）に記載の遺伝子破壊方法。
【００２６】
（１６）遺伝子が破壊された細胞において変化した細胞の特性がテトラサイクリン耐性であることを特徴とする（１４）に記載の遺伝子破壊方法。
【００２７】
（１７）配列番号１に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用し、テトラサイクリン耐性を獲得した細胞を選抜することによって遺伝子が破壊された細胞を得ることを特徴とする遺伝子破壊方法。
【００２８】
（１８）（１２）から（１７）のいずれかに記載の遺伝子破壊方法を使用して得られた、遺伝子破壊細胞株またはそのライブラリ。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、従来の技術では困難であった、転移性遺伝要素を用いて偽陽性なく簡便に生体細胞内の遺伝子を破壊することができる。また本発明により、遺伝子破壊株ライブラリーの作製に限らず、細胞の環境により誘導される機能未知遺伝子の細胞内での働きを調べたり、機能改変された細胞株を創世するために強力なツールを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、新規な転移性遺伝要素として配列番号１に示される核酸配列を、また生体細胞として大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を用いることを例に挙げて、本実施形態について詳細に説明する。なお、現在では様々な生物種において多様な転移性遺伝要素の存在が知られているため、本発明の新規な転移性遺伝要素の構造の一部を、用いる生体細胞に最適な形に変更することは当業者にとって容易である。
【００３１】
図１は、本発明の新規な転移性遺伝要素の構造について好ましい一例を簡略化して示す図であり、その核酸配列は配列番号１に相当する。図２は、生体細胞内の染色体に組み込まれた本発明の新規な転移性遺伝要素が、該染色体上の別の部位に転移する様子を簡略化して示す図である。ただし、これらの図面は、本発明の内容を何ら限定するものではない。
【００３２】
図１のＩＲＬおよびＩＲＲは、挿入配列の両端に存在する逆向き繰り返し構造（インバーテッドリピート）であり、配列番号２（本発明者らが特開平１１−２８５３８３号公報においてすでに公表した配列）が例として挙げられ、その転移反応を触媒する酵素（トランスポゼース）が該反応において認識する部位である。なお、２００１年（平成１３年）に完了した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノム解析により、該挿入配列が該ゲノム上に最多コピー数存在することが判明している。
【００３３】
なお、その他のインバーテッドリピートとしては、IS1 transposaseが認識するものとして、
IRL : GGTGATGCTG CCAACTTACT GAT
IRR : GGTAATGACT CCAACTTATT GAT
IS2 transposaseが認識するものとして、
IRL : TGGATTTGCC CCTATATTTC CAGACATCTG TTATCACTTA A
IRR : TAGACTGGCC CCCTGAATCT CCAGACAACC AATATCACTT AA
IS3 transposaseが認識するものとして、
IRL : TGATCTTACC CAGCAATAGT GGACACGCGG CTAAGTGAG
IRR : TGATCCTACC CACGTAATAT GGACACAGGC CTAAGCGAG
などが例として揚げられ、その他にも数々のものが報告されている。本発明においてはこれらの配列のいずれも制限なく用いることができる。
【００３４】
図１においてＴｃはテトラサイクリン耐性遺伝子、ＳＤはタンパク質の翻訳に必要なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（リボゾーム結合部位）を示し、該転移性遺伝要素にはｍＲＮＡの転写に必要なプロモーター配列は存在しない。本発明においては、転移性遺伝要素が転移した際に初めて機能が発現することが好ましく、そのためには、このようにプロモーター配列が存在しないことが好ましい。プロモーター配列を存在しないようにするためには、例えば配列のプロモーター部分の配列、またはその一部を人為的に除去したり、破壊すれば良く、特にその方法に制限はない。
【００３５】
また、図１はテトラサイクリン耐性遺伝子の例であるが、挿入されてその遺伝子の機能が発現した際に細胞の特性に変化を与えるものであれば、該転移性遺伝要素上の遺伝子の種類は特に限定されず、上記テトラサイクリン耐性遺伝子のほか、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、等の薬剤、特に抗生物質耐性遺伝子、各種金属類の耐性遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など、色素、特に蛍光や発光遺伝子、など様々な使用環境に合致したものを適宜選択できる。
【００３６】
上述のように、本発明の転移性遺伝要素自体にはｍＲＮＡの転写に必要なプロモーター配列が存在しないため、該転移性遺伝要素を保有する細胞ではテトラサイクリン耐性を引き起こすタンパク質が発現せず、該細胞はテトラサイクリンに対して感受性を示す。しかし、該転移性遺伝要素が何らかのターゲット遺伝子に挿入された場合は該ターゲット遺伝子のプロモーターの働きで転写されたｍＲＮＡと融合する形でテトラサイクリン耐性遺伝子由来のｍＲＮＡが形成されるため、転移が起こった細胞ではテトラサイクリン耐性を引き起こすタンパク質が発現し、該細胞はテトラサイクリンに対して耐性を示す。すなわち本事例ではテトラサイクリンを用いて細胞を選抜することにより、本発明の転移性遺伝要素が何らかの遺伝子に挿入した（該遺伝子が破壊された）細胞を得ることができる。
同様に、転移性遺伝要素上の遺伝子が他の機能を与える遺伝子であれば、その機能を持った細胞を選択することにより、転移性遺伝要素が何らかの遺伝子に挿入した（該遺伝子が破壊された）細胞を得ることができる。
【００３７】
したがって本発明において、転移が起こる前の段階で細胞の特性変化のマーカーとなる遺伝子（例えば、図１のテトラサイクリン耐性遺伝子）からｍＲＮＡが転写されていない、すなわち該遺伝子からタンパク質が発現していないことが好ましい。このため、本発明の転移性遺伝要素を生体細胞内の染色体に組み込む際には、転移が起こる前の段階で該マーカー遺伝子が発現していないことを確認することが好ましい。より好ましくは、該転移性遺伝要素の前後に図２に示すようなターミネーターを備えることにより、該マーカーによる選抜の信頼性を向上させることができる。ターミネーターは遺伝子の転写を阻害する核酸配列（転写終結因子）であり、例えばオメガターミネーター、Ｔ１−Ｔ２ターミネーターなど、使用環境に合致したものを適宜選択できる。
【００３８】
上述の通り、図１で示した転移性遺伝要素の両端のインバーテッドリピートは大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノム上に最多コピー数存在する挿入配列に由来している。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の細胞内では該挿入配列のトランスポゼースが発現しているため、該トランスポゼースによって該インバーテッドリピートが認識され、該転移性遺伝要素の転移が起こることが予想できる。
【００３９】
このように本発明は、目的とする細胞で発現しているトランスポゼースが認識するインバーテッドリピートを用いて転移性遺伝要素を構築することにより、トランスポゼースを過剰発現させることなく目的を達成することができる。
【００４０】
また、図２のようにトランスポゼースを発現プラスミドに組み込み過剰発現させることにより、転移反応が促進されより多くの遺伝子破壊細胞を得ることが可能になる。該プラスミドとしては、ｐＵＣ、ｐＢＲ、ｐＥＴ、ｐＡＣＹＣ、ｐＺＣなど、使用環境に合致したものを適宜選択できる。
【００４１】
このようにして得られた転移性遺伝要素が何らかの遺伝子に挿入した（該遺伝子が破壊された）細胞の破壊された機能および染色体上の挿入された位置を解析することにより、効率よく染色体上の遺伝子の機能解析を進めることができる。
【実施例】
【００４２】
以下に、本発明を実施例を用いて、具体的に説明する。ただし、これらの事例は、本発明の内容を何ら限定するものではない。
【００４３】
実施例１
（１）大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７染色体への転移性遺伝要素の組み込み
相同組換え技術（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．  ２００１）、文献２）を用いて、配列番号１に記載の核酸配列を大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＲＩＭＤ０５０９９５２株）のゲノム上にある一部の配列（１２７０４０３番目から１２７１６１６番目まで）と置換した大腸菌ＧＭＳＳ１０２株を作製した。
【００４４】
（２）トランスポゼース発現プラスミドの構築
遺伝子クローニング技術（上記文献２）を用いて、配列番号２の核酸配列のうち５５番目から１２６８番目をｐＵＣ１８クローニングベクターに組み込んだトランスポゼース発現プラスミドｐＴＮＰ−ＡＢを作製した。なお、配列番号２は特開平１１−２８５３８３号公報の配列番号１に記載のベロ毒素生産性Escherichia coli由来のIS配列である。
【００４５】
（３）遺伝子破壊株の取得
エレクトロポレーション法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、参照）を用いて、トランスポゼース発現プラスミドｐＴＮＰ−ＡＢで大腸菌ＧＭＳＳ１０２株を形質転換した。形質転換体ＧＭＳＳ１０２（ｐＴＮＰ−ＡＢ）がテトラサイクリン感受性である、すなわち本発明の転移性遺伝要素の転移が起こっていないことを確認した後、該形質転換体を３７℃で培養した。該培養液をテトラサイクリン含有プレート培地に塗布し、３７℃で静置培養することにより、テトラサイクリン耐性菌のコロニーを得た。
【００４６】
（４）得られた遺伝子破壊株の解析
得られたテトラサイクリン耐性菌について、ＡＢＩ社製ＤＮＡシークエンサー（モデル３７００）を使用し、該機器のプロトコールに従って、本発明の転移性遺伝要素周辺の核酸配列を確認した。結果として、該転移性遺伝要素の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＲＩＭＤ０５０９９５２株）ゲノムへの挿入部位を表１にまとめた。
【００４７】
【表１】
2005328769.tif 000002
【００４８】
表１において、ｐＯ１５７およびｐＯＳＡＫ１は本実施例で使用した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＲＩＭＤ０５０９９５２株）が保有しているプラスミドであり、該菌株の染色体と同様に核酸配列が公開されている。表１から明らかなように、本発明の方法により、薬剤耐性を指標として得られた細胞株のすべてにおいて何らかの部位に転移性遺伝要素が転移していた、すなわち偽陽性なく遺伝子破壊株を得ることができた。
【００４９】
このように本発明によれと、転移性遺伝要素を組み込んだ細胞株を一旦作製すれば、該細胞株の培養により簡便に遺伝子破壊株を得ることが可能になる。そのメリットは、遺伝子破壊株ライブラリーの作製に限らず、該細胞の培養環境条件（培地組成、温度、照度、酸素量など）や誘導条件（薬剤の添加、温度変化、ｐＨ変化、タンパク質の発現など）によって影響を受ける機能未知遺伝子のスクリーニングなど幅広い用途に適応し得る。また、この技術を用いれば、機能改変された細胞株を創世することも容易である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、従来の技術では困難であった、転移性遺伝要素を用いて偽陽性なく簡便に生体細胞内の遺伝子を破壊することができる。また本発明により、遺伝子破壊株ライブラリーの作製に限らず、細胞の環境により誘導される機能未知遺伝子の細胞内での働きを調べたり、機能改変された細胞株を創世するために強力なツールを提供することができ、遺伝子の機能解析およびそれから導き出される様々な分野の産業の発展に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の新規な転移性遺伝要素の構造について好ましい一例を簡略化して示す図である。
【図２】生体細胞内の染色体に組み込まれた本発明の新規な転移性遺伝要素が、該染色体上の別の部位に転移する様子を簡略化して示す図である。
【図１】
2005328769.tif 000003
【図２】
2005328769.tif 000004
【配列表】
2005328769000001.app