(57)【要約】【課題】ジテルマン症候群(GS)に代謝性アルカローシスが伴っている可能性が示され、ヘテロGS変異の被験者は、サイアザイド系利尿薬の副作用に対して感受性であると考えられた。【解決手段】本発明は、サイアザイド感受性Na-Clコトランスポーター(SLC12A3)のアミノ酸残基の変異を検出するマーカーに関する。本発明のマーカーは、代謝性アルカローシスの診断、及びサイアザイド系利尿剤に対する患者の感受性を検査するために使用することができる。本発明はさらに、SLC12A3のアミノ酸残基の変異に基づいて代謝性アルカローシス又は代謝性アルカローシス素因を検出する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイアザイド感受性Na-Clコトランスポーター(SLC12A3)のアミノ酸残基の変異を検出するための代謝性アルカローシスマーカー。
【請求項２】
SLC12A3のアミノ酸残基の変異が、180、242、569、623、846、849又は955番目のアミノ酸残基の変異である、請求項1記載のマーカー。
【請求項３】
SLC12A3遺伝子の1)545位のシトシン(C)からアデニン(A)への変化、2)1712位のシトシン(C)からチミン(T)への変化、3) 1874位のチミン(T)からシトシン(C)への変化、4) 2579位のチミン(T)からアデニン(A)への変化、5)731位のチミン(T)及び732位のグアニン(G)の欠失、6) 2543位及び2544位のチミン(T)の欠失、7) 2897位のグアニン(G)からアデニン(A)への変化、並びに8)それらの相補鎖における対応する各々の変化から選択される1以上の変化の有無を検出する、請求項2記載のマーカー。
【請求項４】
配列番号1〜12及び17〜32より選択される塩基配列を有する、請求項3記載のマーカー。
【請求項５】
代謝性アルカローシスの検出においてプローブまたはプライマーとして使用される、請求項1〜4いずれかに記載のマーカー。
【請求項６】
配列番号1及び2の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号3及び4の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット。
【請求項７】
配列番号5及び6の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号7及び8の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット。
【請求項８】
配列番号9及び10の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号11及び12の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット。
【請求項９】
配列番号17及び18の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号19及び20の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット。
【請求項１０】
配列番号21及び22の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号23及び24の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット。
【請求項１１】
配列番号25及び26の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号27及び28の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット。
【請求項１２】
配列番号29及び30の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号31及び32の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット。
【請求項１３】
SLC12A3のアミノ酸残基の変異を被験者の生体試料から検出することからなる、代謝性アルカローシス又は代謝性アルカローシス素因の検出方法。
【請求項１４】
SLC12A3のアミノ酸残基の変異が180、242、569、623、846、849又は955番目のアミノ酸残基の変異である、請求項13記載の検出方法。
【請求項１５】
SLC12A3のアミノ酸残基の変異を、被験者の生体試料から得られた核酸試料中のSLC12A3遺伝子の1)545位のシトシン(C)からアデニン(A)への変化、2)1712位のシトシン(C)からチミン(T)への変化、3) 1874位のチミン(T)からシトシン(C)への変化、4) 2579位のチミン(T)からアデニン(A)への変化、5)731位のチミン(T)及び732位のグアニン(G)の欠失、6) 2543位及び2544位のチミン(T)の欠失、7) 2897位のグアニン(G)からアデニン(A)への変化、並びに8)それらの相補鎖における対応する各々の変化から選択される1以上の変化の有無により検出する、請求項14記載の検出方法。
【請求項１６】
SLC12A3遺伝子の変化を、塩基配列を決定することにより検出する、請求項13〜15いずれかに記載の検出方法。
【請求項１７】
SLC12A3遺伝子の変化を、プローブを使用して、ハイブリダイゼーションにより検出する、請求項13〜15いずれかに記載の検出方法。
【請求項１８】
プローブが545、731、732、1712、1874、2543、2544、2579又は2897番目の塩基を含むSLC12A3遺伝子断片の塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項17記載の検出方法。
【請求項１９】
SLC12A3遺伝子の変化を、変異を含む部位の増幅反応を行って検出する、請求項13〜15いずれかに記載の検出方法。
【請求項２０】
SLC12A3遺伝子の545、731、732、1712、1874、2543、2544、2579又は2897番目の塩基を含む領域についての増幅反応を行う、請求項19記載の検出方法。
【請求項２１】
SLC12A3遺伝子の変化を、請求項5〜12いずれかに記載の代謝性アルカローシスマーカーセット、及びTaqポリメラーゼを用いて検出する、請求項15記載の検出方法。
【請求項２２】
請求項13〜21いずれかに記載の検出方法により、サイアザイド系利尿剤に対する感受性を検査する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイアザイド感受性Na-Clコトランスポーター(SLC12A3)のアミノ酸残基の変異を検出するマーカーに関する。本発明のマーカーは、代謝性アルカローシスの診断、及びサイアザイド系利尿剤に対する患者の感受性を検査するために使用することができる。本発明はさらに、SLC12A3のアミノ酸残基の変異に基づいて代謝性アルカローシス又は代謝性アルカローシス素因を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液の酸塩基平衡は、肺及び腎臓により調節されている。体液、特に血液の酸塩基平衡がアルカリ側へ傾いた状態をアルカローシスと呼ぶ。[H2CO3]の減少により引き起こされるアルカローシスを呼吸性アルカローシス（または、CO2若しくはガスアルカローシス）と呼び、[HCO3-]の増大により引き起こされるものを代謝性アルカローシスと称する。代謝性アルカローシスは、体内の総体的な塩基の増加により、[HCO3-]が増加することにより起こる。原因としては、嘔吐、胃液吸引等によるHClの喪失、重曹(炭酸水素ナトリウム)の大量投与等が挙げられる。
【０００３】
サイアザイド系利尿剤は、腎臓の尿細管末端付近の遠位尿細管のNa+/Cl-コトランスポーターに作用し、Na+、K+及びCl-等のイオンの排泄（利尿）を促す働きをする。それにより、体液（血液）量が減少することとなり、血圧が下がることが期待されることから降圧薬として用いられる。サイアザイド系利尿剤には、低カリウム血症等の副作用が報告されている。
【０００４】
ジテルマン症候群(GS)は、サイアザイド感受性Na-Clコトランスポーター(SLC12A3)遺伝子の機能欠失変異により起こる腎臓尿細管の常染色体劣性遺伝病である（Simon DB et al., Nature Genet. (1996) 12: 24-30）。GSの臨床的特徴はサイアザイド投与の効果と類似しており、GSにおける塩再吸収の減少は高血圧抵抗性と関連していることが考えられた。Cruzらは、ホモ変異型を有する者、及び若い(18歳未満)へテロ変異型のGSのアーミッシュ大家系の一員は、野生型を示す親戚と比べて低い血圧レベルであったことを報告している（非特許文献1）。彼等はさらに、ホモ及びヘテロの被験者両方が野生型被験者よりも、より高い自己選択(代償性)塩摂取を反映して高い24時間尿中Na+であったと報告している（非特許文献1）。これらの観察は、ヘテロGS変異群が無害ではなく、高血圧抵抗性の一因であるかもしれないことを示唆している。GSは稀な疾患であると考えられている。しかしながら、常染色体劣性変異であることから、ヘテロ型を持つ人の頻度は推定されているよりも高いとすると、GS変異は、総体人口における血圧レベルに有意な影響を与えている可能性がある。日本人については、8種類のGS変異が報告されている（非特許文献2〜5）。
【０００５】
【非特許文献１】Cruz DN et al., Hypertension (2001) 37: 1458-64
【非特許文献２】Takeuchi K et al.,J. Clin. Endocrinol. Metab. (1996) 81: 4496-9
【非特許文献３】Yahata K et al., Am. J. Kid. Dis. (1999) 34: 845-53
【非特許文献４】Monkawa T et al., J. Am. Soc. Nephrol. (2000) 11: 65-70
【非特許文献５】Tajima T et al., Endocr. J. (2002) 49: 91-6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ジテルマン症候群(GS)は、サイアザイド感受性Na-Clコトランスポーター遺伝子(SLC12A3)における機能欠失変異を原因とする先天性腎臓尿細管疾患である（Simon DB et al.,Nature Genet. (1996) 12: 24-30）。GS患者は低Mg血症を起こし、尿中Ca排泄が低下することが知られている。GSは稀な病気であると考えられているが、常染色体劣性遺伝病であるため、ヘテロ変異を持つ人の頻度は考えられているよりも高い可能性がある。そこで、本研究者らは、日本人におけるGS罹患率を評価し、血圧レベルに対するヘテロGS変異の影響を調べた。
【０００７】
ヘテロGS変異は日本人における血圧レベルに影響していなかったが、Cruzらの報告（非特許文献1）、及び、複合的なヘテロ変異(180K及び849H)を持つ被験者が低い血圧レベルを示したという今回の観察から示唆されるように、ホモGS変異は血圧レベルを下げるものと予測される。日本人について報告される8つのGS変異全てを合計した頻度は（56＋14+1+1＋47/1880×2）=0.0321である。ヘテロGS変異を持つ者の数は、15.6人に1人と算出された。この値は、推測されていた値よりも高いものである。この結果から算出すると、10000人の日本人に10.3人のGS患者の存在が予測される。GSは、日本人における低血圧の主要な要因であり得る。
【０００８】
ヘテロ型GS変異は血圧に対して有意な影響を示さなかったが、Cruzらが報告したように、ヘテロGS変異の被験者は、SLC12A3蛋白質の欠損を塩消費を増やすことによって補完しているようである（非特許文献1）。今回の調査でも、GS変異を持つ被験者でより高い尿pHが観察された。これは、GSに代謝性アルカローシスが伴っていることを示唆している可能性がある。即ち、ヘテロGS変異の被験者は、サイアザイド系利尿薬の副作用に対して感受性であると考えられた。さらに、ヘテロGS変異の被験者は、日射または下痢等を原因とする塩喪失により脱水を起こしやすい可能性がある。そこで、本発明の目的は、サイアザイド系利尿薬を投与する場合に、その投与量を調節することにより、薬剤による副作用を避ける方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明により、GSに代謝性アルカローシスが伴っていることが示唆され、ヘテロGS変異を持つ者は、サイアザイド系利尿薬の副作用に対して感受性であると考えられた。また、本発明により、GS変異を容易に検出できる方法が確立された。そこで、サイアザイド感受性Na-Clコトランスポーター(SLC12A3)遺伝子の多型を利用して検査を行うことにより、代謝性アルカローシスの診断、及びサイアザイド系利尿薬の副作用に対する感受性の診断ができると考えられた。
【００１０】
即ち、本発明は、
（１）サイアザイド感受性Na-Clコトランスポーター(SLC12A3)のアミノ酸残基の変異を検出するための代謝性アルカローシスマーカー
（２）SLC12A3のアミノ酸残基の変異が、180、242、569、623、846、849又は955番目のアミノ酸残基の変異である、上記(1)記載のマーカー
（３）SLC12A3遺伝子の1)545位のシトシン(C)からアデニン(A)への変化、2)1712位のシトシン(C)からチミン(T)への変化、3) 1874位のチミン(T)からシトシン(C)への変化、4) 2579位のチミン(T)からアデニン(A)への変化、5)731位のチミン(T)及び732位のグアニン(G)の欠失、6) 2543位及び2544位のチミン(T)の欠失、7) 2897位のグアニン(G)からアデニン(A)への変化、並びに8)それらの相補鎖における対応する各々の変化から選択される1以上の変化の有無を検出する、上記(2)記載のマーカー
（４）配列番号1〜12及び17〜32より選択される塩基配列を有する、上記(3)記載のマーカー
（５）代謝性アルカローシスの検出においてプローブまたはプライマーとして使用される、上記(1)〜(4)いずれかに記載のマーカー
（６）配列番号1及び2の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号3及び4の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット
（７）配列番号5及び6の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号7及び8の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット
（８）配列番号9及び10の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号11及び12の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット
（９）配列番号17及び18の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号19及び20の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット
（１０）配列番号21及び22の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号23及び24の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット
（１１）配列番号25及び26の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号27及び28の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット
（１２）配列番号29及び30の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号31及び32の塩基配列を有するプローブを含む、代謝性アルカローシスマーカーセット
（１３）SLC12A3のアミノ酸残基の変異を被験者の生体試料から検出することからなる、代謝性アルカローシス又は代謝性アルカローシス素因の検出方法
（１４）SLC12A3のアミノ酸残基の変異が、180、242、569、623、846、849又は955番目のアミノ酸残基の変異である、上記(13)記載の検出方法
（１５）SLC12A3のアミノ酸残基の変異を、被験者の生体試料から得られた核酸試料中のSLC12A3遺伝子の1)545位のシトシン(C)からアデニン(A)への変化、2)1712位のシトシン(C)からチミン(T)への変化、3) 1874位のチミン(T)からシトシン(C)への変化、4) 2579位のチミン(T)からアデニン(A)への変化、5)731位のチミン(T)及び732位のグアニン(G)の欠失、6) 2543位及び2544位のチミン(T)の欠失、7) 2897位のグアニン(G)からアデニン(A)への変化、並びに8)それらの相補鎖における対応する各々の変化から選択される1以上の変化の有無により検出する、上記(14)記載の検出方法。
（１６）SLC12A3遺伝子の変化を、塩基配列を決定することにより検出する、上記(13)〜(15)いずれかに記載の検出方法
（１７）SLC12A3遺伝子の変化を、プローブを使用して、ハイブリダイゼーションにより検出する、上記(13)〜(15)いずれかに記載の検出方法
（１８）プローブが545、731、732、1712、1874、2543、2544、2579又は2897番目の塩基を含むSLC12A3遺伝子断片の塩基配列を有するポリヌクレオチドである、上記(17)記載の検出方法
（１９）SLC12A3遺伝子の変化を、変異を含む部位の増幅反応を行って検出する、上記(13)〜(15)いずれかに記載の検出方法
（２０）SLC12A3遺伝子の545、731、732、1712、1874、2543、2544、2579又は2897番目の塩基を含む領域についての増幅反応を行う、上記(19)記載の検出方法
（２１）SLC12A3遺伝子の変化を、上記(5)〜(12)いずれかに記載の代謝性アルカローシスマーカーセット、及びTaqポリメラーゼを用いて検出する、上記(15)記載の検出方法
（２２）上記(13)〜(21)いずれかに記載の検出方法により、サイアザイド系利尿剤に対する感受性を検査する方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、遺伝的要因に基づいて、代謝性アルカローシス及び代謝性アルカローシス素因(代謝性アルカローシスの事前診断；病気になり易さ、病気になった場合の重症度、治療に対する反応性等)、予後等の判定を行うことができる。また、ヘテロGS変異を持つ患者は、サイアザイド系利尿薬に対して副作用を起こす可能性が考えられたことから、GS変異のスクリーニングを利尿剤処置前に行うことは臨床的に有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
[代謝性アルカローシスマーカー]
本発明により、ジテルマン症候群(GS)の原因遺伝子であるサイアザイド感受性Na-Clコトランスポーター(SLC12A3)のヘテロ変異と代謝性アルカローシスとの関連が示唆された。そこで、本発明は、SLC12A3のアミノ酸残基の変異を検出するための代謝性アルカローシスマーカーに関する。このようなアミノ酸残基の変異は、SLC12A3遺伝子における多型により起こり得る。即ち、本発明の代謝性アルカローシスマーカーとして、これに限定される訳ではないが、SLC12A3遺伝子の多型の検出を可能にするポリヌクレオチドが例示される。
【００１３】
「多型」とは、遺伝学的に、遺伝子中に存在する、人口の1％以上の頻度で存在する塩基の変化と定義されている。しかしながら、本明細書中における「多型」には、人口中1％未満の塩基の変化も含まれ、代謝性アルカローシスの原因となるようなSLC12A3の機能の低下等を引き起こす塩基の変化であれば、特にその位置、数等も限定されない。多型の種類としては、例えば、一塩基多型(SNP)から数十塩基の欠失、置換または挿入が生じている多型が挙げられる。SLC12A3については複数の多型が報告されており、それらの公知の変異を検出するためのポリヌクレオチドが本発明の代謝性アルカローシスマーカーに含まれる。特に有用なマーカーとして、SLC12A3の180、242、569、623、846、849又は955番目のアミノ酸残基の変異を検出するもの、例えば、SLC12A3遺伝子の1)545位のシトシン(C)からアデニン(A)への変化、2)1712位のシトシン(C)からチミン(T)への変化、3) 1874位のチミン(T)からシトシン(C)への変化、4) 2579位のチミン(T)からアデニン(A)への変化、5)731位のチミン(T)及び732位のグアニン(G)の欠失、6) 2543位及び2544位のチミン(T)の欠失、7) 2897位のグアニン(G)からアデニン(A)への変化、並びに8)それらの相補鎖における対応する各々の変化から選択される1以上の変化の有無を検出できるマーカーが挙げられる。
【００１４】
遺伝子を構成する塩基の変異は、変異部位を含むプローブ、または変異部位を挟むように構築されたプライマーを用いて検出することができる。従って、このようなプローブ及びプライマーが、本発明の代謝性アルカローシスマーカーに包含される。複数のプローブ及び/または複数のプライマーを組み合せることによりSLC12A3遺伝子の変異が検出される場合、この組み合せに含まれる個々のプローブ及びプライマーも、各々「代謝性アルカローシスマーカー」と呼ぶ。例えば、配列番号1〜12及び配列番号17〜32に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドを、本発明の好ましい代謝性アルカローシスマーカーとして用いることができる。
【００１５】
ここで、「ポリヌクレオチド」は、SLC12A3遺伝子の多型の検出を可能とするものであればよく、複数のデオキシリボ核酸(DNA)若しくはリボ核酸(RNA)等の塩基、または塩基対からなる、一本鎖または二本鎖の重合体である。ポリヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてもよく、例えば、イノシン等の天然には存在しない塩基、またはトリチル化された塩基などを含んでいてもよい。本発明の代謝性アルカローシスマーカーとして使用されるポリヌクレオチドの長さは特に限定されない。しかしながら、プライマーとして用いられる場合には、通常、3〜100bp、好ましくは10〜50bp、より好ましくは15〜35bp程度の鎖長とすることが好ましい。3’側の領域は、標的配列に対して相補的である必要があるが、5’側の領域には制限酵素認識配列、タグ等を付加することができる。一方、プローブとして使用する場合には、検出対象の塩基(変異が予想される塩基)がプローブを構成する塩基の真中付近にくるように設計し、全体の鎖長を10bp以上、好ましくは12bp以上、より好ましくは13bp以上とする。また、必要に応じ、検出を容易にするためのラベル成分により標識されていてもよい。ラベル成分は、分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、放射化学的手段などにより検出できるものが使用できる。例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等の酵素、32P等の放射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光物質、発色物質等が挙げられる。さらに、例えば、TaqManTM5’エキソヌクレアーゼ解析で使用することを目的として、プローブの5’末端を蛍光色素で標識し、3’末端には消光剤(quencher)を修飾したプローブも本発明の代謝性アルカローシスマーカーに含まれる。
【００１６】
本発明のマーカーとして使用されるポリヌクレオチドは、既知の方法により化学合成することができる。例えば、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホスホネート法等（Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. (1989) 28:716-34参照）の方法により化学合成することができる。通常、ポリヌクレオチドの合成は、修飾された固体支持体上で行うことができる。また、自動化された合成装置を用いて行うこともできる。このような合成装置は市販されている。
【００１７】
実施例において示されるように、SLC12A3遺伝子の変異は、配列番号1〜32の塩基配列を有するプライマー及びプローブを用いて容易に検出することができた。SLC12A3の180、242、569、623、846、849又は955番目のアミノ酸残基の変異が検出された被験者は、高い尿pHを示したことから、これらの変異を検出するマーカーは代謝性アポトーシスの診断をする上で特に有用と考えられる。SLC12A3の180番目のスレオニン(T)からリシン(K)への変異を起こす545位のシトシン(C)からアデニン(A)への変化は、配列番号1の及び2記載の配列を各々有するプライマー、並びに配列番号3及び4記載の配列を各々有するプローブを用いて検出された。同様に、SLC12A3の569番目のアラニン(A)からバリン(V)への変異を起こす1712位のシトシン(C)からチミン(T)への変化は、配列番号5の及び6記載の配列を各々有するプライマー、並びに配列番号7及び8記載の配列を各々有するプローブを用いて検出された。SLC12A3の623番目のロイシン(L)からプロリン(P)への変異を起こす1874位のチミン(T)からシトシン(C)への変化は、配列番号9の及び10記載の配列を各々有するプライマー、並びに配列番号11及び12記載の配列を各々有するプローブを用いて検出された。SLC12A3の849番目のロイシン(L)からヒスチジン(H)への変異を起こす2579位のチミン(T)からアデニン(A)への変化は、配列番号17の及び18記載の配列を各々有するプライマー、並びに配列番号19及び20記載の配列を各々有するプローブを用いて検出された。SLC12A3の242番目のアラニン(A)からバリン(V)への変異を起こす731及び732位のチミン(T)及びグアニン(G)の欠失は、配列番号21の及び22記載の配列を各々有するプライマー、並びに配列番号23及び24記載の配列を各々有するプローブを用いて検出された。SLC12A3の846番目のフェニルアラニン(F)のコドンからストップコドンへの変異を起こす2543及び2544位の2つのチミン(T)の欠失は、配列番号25の及び26記載の配列を各々有するプライマー、並びに配列番号27及び28記載の配列を各々有するプローブを用いて検出された。SLC12A3の955番目のアルギニン(R)からグルタミン(Q)への変異を起こす2897位のグアニン(G)からアデニン(A)への変化は、配列番号29の及び30記載の配列を各々有するプライマー、並びに配列番号31及び32記載の配列を各々有するプローブを用いて検出された。
【００１８】
そこで、本発明は、1)配列番号1及び2の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号3及び4の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、2)配列番号5及び6の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号7及び8の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、3)配列番号9及び10の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号11及び12の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、4)配列番号17及び18の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号19及び20の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、5)配列番号21及び22の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号23及び24の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、6)配列番号25及び26の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号27及び28の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、並びに7)配列番号29及び30の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号31及び32の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセットを提供するものである。
【００１９】
必要に応じ、これらのプライマーセット同士を更に組み合せ代謝性アルカローシスマーカーセットとすることもできる。例えば、日本人において最も頻度の高い複合へテロ変異の遺伝子型は、180及び849番目のアミノ酸残基が変異した型である。そして、この複合的なヘテロ変異を持つ被験者は、本発明において、低い血圧レベルを有することが明らかにされ、GS変異が、日本人における低血圧の主要な要因である可能性が示唆された。従って、180及び849番目のアミノ酸残基の変異を検出する、上記1)及び4)の代謝性アルカローシスマーカーセットの組み合せは特に、低血圧の診断において有用であり得る。
【００２０】
[代謝性アルカローシスの診断]
本発明により、GSの原因遺伝子であるSLC12A3のヘテロ変異と代謝性アルカローシスとの関連が示唆された。そこで、本発明は、SLC12A3のアミノ酸残基の変異を被験者の生体試料から検出することからなる、代謝性アルカローシス又は代謝性アルカローシス素因（病気になり易さ、病気になった場合の重症度、治療に対する反応性等）を検出する方法に関する。代謝性アルカローシスの患者は、サイアザイド系利尿薬に対して副作用を起こす可能性があることから、代謝性アルカローシス又は代謝性アルカローシス素因を特にサイアザイド系利尿薬投与前に検査することは有用である。
【００２１】
このようなアミノ酸残基の変異は、SLC12A3遺伝子における多型により起こり得る。よって、本発明において、代謝性アルカローシス又は代謝性アルカローシス素因は、これに限定される訳ではないが、SLC12A3遺伝子の多型を被験者の生体試料から得られた核酸試料中で検出することにより行われる。本発明の方法において検出される多型は、代謝性アルカローシスの原因となるようなSLC12A3の機能の低下等を引き起こす塩基の変化であれば特にその位置、数等は限定されず、一塩基多型(SNP)から数十塩基の欠失、置換または挿入が生じている多型等が例示される。SLC12A3については複数の多型が報告されており、それらの公知の変異を本発明の方法において検出することができる。例えば、特に日本人における代謝性アルカローシスとの関連が示された、SLC12A3の180、242、569、623、846、849又は955番目のアミノ酸残基の変異を本発明の方法において検出することができる。これらのアミノ酸残基の変異は、例えば、SLC12A3遺伝子の1)545位のシトシン(C)からアデニン(A)への変化、2)1712位のシトシン(C)からチミン(T)への変化、3) 1874位のチミン(T)からシトシン(C)への変化、4) 2579位のチミン(T)からアデニン(A)への変化、5)731位のチミン(T)及び732位のグアニン(G)の欠失、6) 2543位及び2544位のチミン(T)の欠失、7) 2897位のグアニン(G)からアデニン(A)への変化、並びに8)それらの相補鎖における対応する各々の変化から選択される1以上の変化の有無を判定することによって検出することができる。
【００２２】
検査に使用する被験者の生体試料としては、末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の組織または細胞が挙げられ、特に末梢血白血球が好ましい。これらの組織または細胞から抽出される核酸試料としては、SLC12A3をコードするヌクレオチド配列を有するものであれば特に限定されない。適当な細胞または組織由来の核酸（全ゲノムDNA及び細胞の全RNAから転写されたcDNAを含む）、例えば、ゲノムDNA、cDNA、mRNAが挙げられる。核酸試料の調製は公知の方法、例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition" (Sambrook J, Fritsch F and Maniatis T ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載の方法より行うことができる。特にcDNAを得る方法としては、岡山-Berg法（Okayama H and Berg P, Mol. Cell. Biol. (1982) 2:161-70）、Gubler-Hoffman法（Gubler U and Hoffman J, Gene (1983) 25: 263-9）等の方法が例示される。完全長クローンが必要とされる場合、効率的に得るため、キャッピング法（Kato S et al., Gene (1994) 150: 243-250）を用いることが望ましい。
【００２３】
遺伝子の変異を検出する方法としては様々な手法が知られており、本発明の方法において使用することができる。例えば、変異を持つ遺伝子を検査する方法としては、直接配列決定法、サザンブロット法、ヘテロ二本鎖ゲル移動度を調べる方法、変性HPLC法、一本鎖高次構造多型(SSCP)解析、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ジデオキシフィンガープリント、ミスマッチの化学的または酵素的切断による方法、蛋白質短縮試験(PTT)、ハイブリダイゼーションチップまたはミニシークエンスチップ等を用いたオリゴヌクレオチドのアレイ、蛍光in situハイブリッド形成法(FISH)法、RLGS(restriction landmark genomic scanning method)法、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA)法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)ハイブリダイゼーション法、対立遺伝子特異的PCR増幅法(ARMS)、リガーゼ法（LMGD法、LCR法等）、制限断片長多型(RFLP)法等が挙げられる。
【００２４】
具体的には、例えば、SLC12A3遺伝子の変化は塩基配列を決定し、対照（正常(野生型)または変異を有する配列）と比較することによって検出することができる。対照の塩基配列はデータベースに登録されている配列（GenBank Accession No. NM_000339; Unigene Hs.158462）を参照しても、また必要に応じ、検査時に一緒に配列決定してもよい。塩基配列の決定は、当業者に公知の手法により行うことができる。例えば、化学分解法(Maxam-Gilbert法)、チェーンターミネーター法(Sangerジデオキシ法)等により行うことができる。塩基配列の決定は、全長遺伝子の配列を決定してもよいが、変異を検出する塩基が特定されている場合には、該変異部位を含む領域のみについて塩基配列を決定すればよい。また、必要に応じ、変異部位を含む領域をPCR法等により増幅してから塩基配列の決定を行うこともできる。PCR法は、"PCR protocols: A guide to methods and applitaion"(Innis MA, Gelfaud DM, Snindky JJ and White TJ ed., Academic Press Inc., New York (1990))、"PCR: A practical approach"(McPherson MJ, Quirke P and Taylor GR ed., IRL Press, Oxford (1991))、Saiki RK et al., Science (1988) 239: 487-91、Frohman MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 8998-9002等に記載の方法により行うことができる。また、PCRの条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件でよい。例えば、DNA鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好ましくは20〜35回、より好ましくは25〜30回繰り返し行われる。
【００２５】
また、変異の検出には、例えば変異部位を含む適当なDNA断片をプローブに用いるハイブリダイゼーション法のような公知の変異検出方法が使用できる。変異部位を含む適当なDNA断片としては、545、731、732、1712、1874、2543、2544、2579又は2897番目の塩基を含むSLC12A3遺伝子断片の塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
このようなハイブリダイゼーションを利用した方法として、サザンブロットが例示できる。サザンブロッティングでは、被験者の生体試料より得られた核酸試料、好ましくはDNAを制限酵素処理し、電気泳動で展開し、プローブとハイブリダイゼーションさせる。ゲノミックサザン法、PCRサザン法等が知られており、本発明の方法ではどちらもが使用できる。必要に応じ、検出を容易にするためのプローブはラベル成分により標識されていてもよい。ラベル成分は、分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、放射化学的手段などにより検出できるものが使用できる。例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等の酵素、32P等の放射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光物質、発色物質等が挙げられる。さらに、例えば、TaqManTM5’エキソヌクレアーゼ解析で使用することを目的として、プローブの5’末端を蛍光色素で標識し、3’末端には消光剤(quencher)を修飾したプローブを用いてもよい。
【００２７】
また、プローブを必要に応じ基板上に固定して検出を行ってもよい。このような方法として、例えば、DNAアレイ法(松原謙一及び榊佳之「SNP遺伝子多型の戦略」中山書店、p128-135参照)が挙げられる。基板の形状、材質等は特に限定されず、プローブとなるポリヌクレオチドを固定でき、ポリヌクレオチドと核酸試料中の標的核酸とのハイブリダイゼーションを妨げるものでなければよい。例えば、ガラス、透過性の膜（ニトロセルロース膜等）を材質とした板状の材料にプローブを固定することができる。固定方法は特に限定されないが、例えば、Affymetrix社により開発されたphotolithographic技術、またはRosetta Inpharmatics社の化学物質を固定されるためのインクジェット技術によりin situでプローブとなるポリヌクレオチドの合成を行うことができる。一般に、基板上に固定する場合、プローブは約10〜100bp、好ましくは10〜50bp、より好ましくは15〜25bpとする。
【００２８】
塩基配列の変異を検出するためのハイブリダイゼーションを利用したさらに別の方法として、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)ハイブリダイゼーション法が挙げられる。この方法は、点変異を特定する一般的な方法である。まず、変異が存在すると考えられる塩基を含む18mer程度のポリヌクレオチドを作成する。必要に応じポリヌクレオチドを標識してもよい。被験者より得た生体試料より、PCR等により核酸試料に対するハイブリダイゼーションを行う。このとき、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを適切に調整し、ポリヌクレオチドに完全に相補的な配列のみがハイブリダイズするようにする。そうすると変異が存在する場合には、ハイブリッド形成の効率が低下するので、サザンブロット法、またはインターカレーションにより消光する特殊な蛍光試薬を用いた方法等によりハイブリッド形成効率を測定することにより、塩基の変異を検出することができる。
【００２９】
さらに別の方法として、ミスマッチ切断法が挙げられる。ミスマッチ切断法としては、酵素(RNase)を用いた方法と、化学切断法が公知である。どちらの方法においても、まず、SLC12A3遺伝子の変異が存在すると考えられる塩基を含む標的領域をPCR法等により増幅する。次に、標識プローブ（RNaseを使用する場合は標識RNA）とのハイブリダイゼーションを行う。標識プローブは、変異が存在する部分のみにおいて、ハイブリッドが一本鎖構造を取るように設計する。続いて、RNaseを用い一本鎖構造部分を切断する。これは、RNaseが二本鎖のRNA及びRNA/DNA複合体を分解せず、一本鎖のRNAのみを分解する特性を利用したものである。一方、化学切断法では、一本鎖構造部分のシトシン(C)はヒドロキシルアミン、チミン(T)はオスミウムテトラオキシドにより修飾し、ピペリジン処理をすることによりヌクレオチド鎖を切断する。切断処理を行った後、電気泳動により検出されるバンド数（変異が存在する場合には、2本）を確認することにより、塩基の変異の有無を判定することができる。
【００３０】
さらに、本発明の検出方法においては、SLC12A3遺伝子の変化を、変異を含む部位の増幅反応(PCR)を行うことによって検出してもよい。変異を含む適当な部位としては、例えば、SLC12A3遺伝子の545、731、732、1712、1874、2543、2544、2579又は2897番目の塩基を含む領域が挙げられる。PCRを利用した方法としては、制限断片長多型(RFLP)法、一本鎖高次構造多型(SSCP)解析、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA)法、対立遺伝子特異的PCR増幅法(ARMS)等が挙げられる。特に、特定の変異を検査するのに適した方法として、RFLP法、ARMS、OLA法が例示される。
【００３１】
RFLPを利用した方法では必ずしもPCRを行う必要はないが、PCRを行うことにより、より高感度の検出が可能となる。RFLP法によって、塩基配列の変異が制限酵素の認識部位を作り出したり、消失させたりするような変異を検出することができる。具体的には、遺伝子内の制限酵素の認識部位に変異が存在するか、または制限酵素処理によって生じる断片内に塩基挿入若しくは欠失が存在する場合には、該遺伝子を制限酵素処理して得られるDNA断片の大きさを、被験者由来のものと対照由来のものとで比較することにより、塩基配列の変異を検出することができる。例えば、この変異を含む遺伝子領域を増幅し、増幅産物を制限酵素により処理した後、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル上の電気泳動等に付すことにより、塩基の変異をバンドの移動度の差として検出することができる。または、電気泳動後、変異部位を含むプローブを用いたサザンブロッティングにより変異の有無を検出してもよい。この方法では、ゲノムDNA以外にも、被験者から得たRNAを元に逆転写酵素等を用いて調製されたcDNA、該cDNAを鋳型としてPCRにより増幅された増幅産物等を試料として用いてもよい。また、検出対象の変異が、制限酵素認識部位の変化を生じさせない場合には、次のようにして制限酵素認識部位を導入し、RFLPによる塩基の変異の検出を行うことができる。まず、変異した塩基の直前に位置し、ミスマッチを含むプライマーを構築する。ミスマッチの塩基置換部位は、正常配列と変異配列のハイブリダイゼーション反応及び増幅反応に重要でない部位とする。プライマーは、変異した塩基を有する場合または正常型の塩基のどちらか一方の場合にのみ、該プライマーを用いた転写反応により産生されるPCR産物に制限酵素認識部位が導入されるように設計する。後は、該プライマーを用いて、上述と同様にPCR反応、電気泳動等の工程を行うことにより、塩基配列の変異を検出することができる。
【００３２】
塩基配列の変異を検出する別の方法として、被験者から得た核酸試料を元にSLC12A3遺伝子を含むDNA増幅し、増幅したDNAを一本鎖に解離させ、非変性ゲル上の移動度を対照と比較する方法が挙げられる。これは、二本鎖DNAを一本鎖に解離した場合に、各一本鎖がその塩基配列に依存した高次構造を形成する性質を利用した方法である。一塩基置換によっても一本鎖DNAの高次構造が変化し、ゲル電気泳動において異なる移動度を示すことが知られている。このような方法として、例えば、SSCP法（Genomics (1992) 12: 139-46; Oncogene (1991) 6: 1313-8; PCR Methods Appl. (1995) 4: 275-82）を挙げることができる。操作の簡便性、少量の被験試料で実施可能である点等から、特に多数の試料についての検査を行う場合に適した方法である。SSCPでは、まず、SLC12A3遺伝子を含むDNAをPCR法等によって増幅する。通常、標的となる変異塩基を含む約200〜400bpの長さのDNA断片を増幅する。逆転写PCR産物としてDNA断片を増幅してもよい。また、必要に応じ、PCR時にアイソトープ、蛍光色素若しくはビオチン等によって標識されたプライマーまたは基質塩基を使用し、増幅DNA断片を標識してもよい。次に得られたDNA断片を変性させる。変性は、好ましくは熱を加えることにより行う。続いて、変性されたDNA断片を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。ポリアクリルアミドゲルのDNA断片を分離する能力を上げるために、5〜10％程度のグリセロールを添加しても良い。電気泳動の条件は特に限定されないが、20〜25℃の室温で行って好ましい分離が得られない場合には、4〜30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行うことができる。電気泳動後、DNA断片の移動度は、DNA断片を標識するのに用いた物質に応じ、オートラジオグラフィー、蛍光検出等により測定することができる。また、標識したDNAを使わない場合でも、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色法、銀染色法等により染色することによって、DNA断片のバンドを検出し、塩基の変異の有無を検出することができる。さらに、必要に応じ、移動度に差のあったバンドをゲルから切出し、PCRによって増幅して配列決定を行い、具体的な変異を確認することもできる。
【００３３】
さらに別の方法として、DGGE法が挙げられる。この方法は、PCR産物中のミスマッチを持つヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりもその解離が容易であることを利用する。解離が進むにつれて、ゲル電気泳動の移動度が落ちるので、展開するポリアクリルアミドゲルに尿素及びホルムアミドの密度勾配をつけることにより、移動度の差がさらに強調され、ミスマッチを含む2本鎖DNAの存在、即ち、変異の存在を検出することができる。
【００３４】
その他のPCRを利用した塩基の変異を検出する方法として、対立遺伝子特異的PCR増幅法(ARMS)等が挙げられる。PCRにおいては、鋳型DNAにプライマーがアニールした後、DNAポリメラーゼにより5’から3’に相補鎖DNAが合成される。プライマーの3’末端塩基にミスマッチがあると、PCRの効率が低下することが知られている。即ち、PCR産物の電気泳動による観察が不可能となる。ARMSは、この原理を利用したものであり、3’末端塩基が検出したい変異塩基に相補的なプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物の有無を検出することにより行われる。基本的には、2つのPCR反応を行う。一方のプライマー(共通プライマー)は両反応系で同じものを用いる。もう1つのプライマーはわずかに異なるようにし、一方は正常な塩基配列に特異的とし、他方は変異型の配列に特異的とする。さらに、必要に応じ対照プライマーとして、無関係な配列を増幅させるためのプライマーを加え、PCR反応がうまく作動しているかを確認することができる。共通プライマーの位置は、変異が存在すればPCR産物の大きさが対照となる正常な塩基配列のものと異なるようにしておく。これらのプライマーを用いたPCRの産物を電気泳動すると、複数の産物がゲル上ではしご状になって現れる。このとき、各変異特異的プライマーを用いて得られるPCR産物を区別できるように、各プライマーに異なる標識を付しておき、増幅されたPCR産物がどのプライマーにより増幅されたかを検出することにより、試料DNA中の塩基の変異を確認することができる。
【００３５】
ARMSの原理をリアルタイムで追跡できるように応用した方法として、TaqManTM法(蛍光退色法とも呼ばれる)が挙げられ、これは、本発明の代謝性アルカローシス及び代謝性アルカローシス素因の検出方法に特に適した方法である。具体的な方法については、実施例を参照することができる。好ましくは、1)配列番号1及び2の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号3及び4の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、2)配列番号5及び6の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号7及び8の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、3)配列番号9及び10の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号11及び12の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、4)配列番号17及び18の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号19及び20の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、5)配列番号21及び22の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号23及び24の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、6)配列番号25及び26の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号27及び28の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、または7)配列番号29及び30の塩基配列を有するプライマー、並びに配列番号31及び32の塩基配列を有するプローブを含む代謝性アルカローシスマーカーセット、並びにTaqポリメラーゼを使用して反応を行い、1)545位のシトシン(C)からアデニン(A)への変化若しくはその相補鎖における対応する変化、2)1712位のシトシン(C)からチミン(T)への変化若しくはその相補鎖における対応する変化、3) 1874位のチミン(T)からシトシン(C)への変化若しくはその相補鎖における対応する変化、4) 2579位のチミン(T)からアデニン(A)への変化、5)731位のチミン(T)及び732位のグアニン(G)の欠失若しくはその相補鎖における対応する変化、6) 2543位及び2544位のチミン(T)の欠失若しくはその相補鎖における対応する変化、または7) 2897位のグアニン(G)からアデニン(A)への変化若しくはその相補鎖における対応する変化を検出する。
【００３６】
その他の変異塩基の検出方法としてリガーゼ法が挙げられる。リガーゼ法は、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA)とも呼ばれる。2つのオリゴヌクレオチドをDNAリガーゼで連結するとき、結合位置に鋳型DNAとの間にミスマッチがあると結合できないことを利用した方法である。OLAとしては、例えば、LMGD(ligase-mediated gene detection)法、及びLCR(ligase chain reaction)が挙げられる。LMGD法では、一方のオリゴDNAを例えば32P等の放射性ラベルで標識し、他方をビオチン標識する。ライゲーション後、ストレプトアビジン吸着により回収する。これらが連結する（即ち、ミスマッチでない）ならば、32Pの放射線量が高値を示すので、検出することができる。一方、LCRでは、上記ライゲーション反応を、耐熱性リガーゼを用いて繰り返し行う。PCRと同様にDNA鎖に対してもオリゴDNAがアニールするので、高感度に変異の検出を行うことができる。
【００３７】
[サイアザイド系利尿剤に対する副作用感受性の検出]
上述のようにして、被験者における代謝性アルカローシス及び代謝性アルカローシス素因を検出することにより、サイアザイド系利尿剤の副作用に対する該被験者の感受性を判定することができる。代謝性アルカローシスの患者は、サイアザイド系利尿薬に対して副作用を起こす可能性がある。そこで、本発明は、代謝性アルカローシス及び代謝性アルカローシス素因を検出することによる、サイアザイド系利尿剤に対する感受性を検査する方法を提供するものである。本発明の方法により、サイアザイド系利尿薬を投与する前に、該薬剤に対する患者の感受性を検査することにより、その投与量を調節し、薬剤による副作用を避けることができる。
【実施例】
【００３８】
1．研究母集団：吹田スタディーの選択基準及び計画は以前報告されている（Mannami T et al., stroke (1997) 28: 518-25; Iwai N et al., J. Am. Soc. Nephrol. (2002) 13: 80-5）。2002年4月から2003年3月の期間中、遺伝子分析について書面でのインフォームドコンセントを提出した1852人の被験者の遺伝子型を決定した。国立循環器病センターの倫理委員会は、実験計画書を承認した。本研究において分析された被験者の特徴は表1にまとめてある。この時点での、血漿K+レベルの測定は行わなかった。最大血圧=140mmHg、最小血圧=90mmHg、または、抗高血圧薬物を現時点で用いている被験者を高血圧と定義した。
【表１】
2005210991.tif 000002
BMI;ボディマス指数(kg/m2)、SBP;最大血圧(mmHg)、DBP;最小血圧(mmHg)、HTN;高血圧有り(%)、AHT;抗高血圧処置有り(％)
【００３９】
2．SLC12A3における候補変異の選抜：日本人について以前行われた研究より8つのGS変異を選択した（非特許文献1〜4参照）（図1）。報告された配列に基づき、変異を検出するためのTaqManTMシステムを設計した(表2)。本方法の妥当性は、ヘテロと同定された被験者の配列決定により確認した(図2)。
【表２】
2005210991.tif 000003
【００４０】
３．統計分析：数値は平均±SEで表す。全ての統計分析は、JMP統計パッケージ(SAS Institute, Inc.)を用いて行った。血圧値の誤差は、年齢及びBMIによる補正を行って算出した。誤差は、観察された各実際の血圧値と、年齢及びBMIを基とする予測値の相違を表す。
【００４１】
４．結果：1852人の被験者から、各々56人、14人、1人、1人及び47人のT180K、A569V、L623P、R642C及びL849Hへテロ遺伝子型を検出した。846X、242V及び955Q対立遺伝子は全く検出されなかった。これらの遺伝子型の妥当性は、配列決定により確認した(図2)。180K、569V、623P、642C及び849H対立遺伝子の頻度はそれぞれ、1.51%、0.38％、0.03%、0.03％及び1.27%であった。これらの変異と関連付けられた表現型を表3にまとめる。比較的低い低血圧レベルを示す、複合的なヘテロ変異（180K及び849H遺伝子型）の可能性の被験者を見つけた。
【００４２】
T180K、A569VまたはL849Hヘテロ遺伝子型の被験者の血圧レベルは、野生型被験者と比べて有意に相違していなかった。GS変異の被験者の高血圧罹患率は、野生型被験者と有意差はなかった（表3）。よって、SLC12A3のヘテロ変異は日本人における血圧レベルを減少させないようである。しかしながら、GS変異を持つ被験者は野生型被験者と比べて高い尿pHを示した。
【表３】
2005210991.tif 000004
数値は平均(SE)で表される。1人の被験者は複合へテロ遺伝子型(K180+H849)であった。BMI;ボディマス指数(kg/m2)、HTN;高血圧有り(%)、AHT;抗高血圧処置有り(%)、SBP;最大血圧(mmHg)、DBP;最小血圧(mmHg)、R-SBP;年齢及びBMIにより補正したSBP誤差、R-DBP;BMIにより補正したDBP誤差、U-pH;尿ｐH、Gitelman;GS変異を持つ被験者を一つの群にまとめた、WT；野生型の遺伝子を持つ被験者群。p値は、GS変異を持たない被験者(WT)に対して算出した。
【００４３】
以上のように、TaqManTMシステムにより測定された、180K、569V及び849H対立遺伝子の頻度は予想外に高く、各々、1.51、0.38及び1.27％であった。GS変異を持つヘテロ型被験者の血圧レベルは、野生型の被験者と有意差はなかった。この結果はCruzらによる報告と一致する（非特許文献1）。しかしながら、今回調査した集団は30歳以上の被験者から構成されていた為、CruzらのGS変異ヘテロ型の若い(18歳未満)被験者が低い血圧レベルを示したという観察は追試することはできなかった。
【００４４】
ヘテロGS変異は日本人における血圧レベルに影響していなかったが、Cruzらの報告（非特許文献1）、及び、複合的なヘテロ変異(180K及び849H)を持つ可能性がある被験者が低い血圧レベルであったという今回の観察から示唆されるように、ホモGS変異は血圧レベルを下げるものと予測される。日本人について報告される8つのGS変異全てを認めると、これらの変異を合せた頻度は（56＋14+1+1＋47/1880×2）=0.0321である。即ち、10000人に10.3人のGS患者の存在が予測されることとなる。GSは、日本人における低血圧の主要な要因であり得る。最も頻度の高い遺伝子型は、180Kと849Hの複合へテロ変異であり、それは本研究において確立されたTaqManTM法を利用した方法により容易に検出することができる。
【００４５】
ヘテロ型GS変異は、血圧に対して有意な影響を示さなかったが、全く無害であるわけではないようである。Cruzらが報告したように、ヘテロGS変異の被験者は、塩消費を増やすことによって欠損SLC12A3蛋白質を補完しているようである（非特許文献1）。今回の調査でも、GS変異を持つ被験者でより高い尿pHが観察された。これは、GSに代謝性アルカローシスが伴っていることを示唆している可能性がある。従って、ヘテロGS変異は無害ではないかもしれない。即ち、ヘテロGS変異の被験者は、サイアザイド系利尿薬の副作用に対して感受性の可能性がある。さらに、ヘテロGS変異の被験者は、日射または下痢等を原因とする塩喪失により脱水を起こしやすい可能性がある。ヘテロGS変異の被験者の数は15.6人に1人と算出された。この値は、推測されていた値よりも高いものである。よって、GS変異のスクリーニングを利尿剤処置前に行うことは、臨床的に有益と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】日本人においてジテルマン症候群を起こすSLC12A3変異（GS変異）の蛋白質上の位置を示す模式図である。T180K、A569V、L623P、R642C及びF849Hへテロ遺伝子型は、各々、56人、14人、1人、1人及び47人の被験者で見つかった。1人、複合的なヘテロ変異(K180+H849)の被験者がみつかった、846X、242V及び955Q対立遺伝子は、本集団においては発見されなかった。
【図２】TaqManTM法の妥当性について検討するため、配列決定を行った結果を示す図である。R642C(CGCからTGC)への変異は、エクソン15及び16の間のジャンクションに存在する。「CGC」および「TGC」の第3のヌクレオチド「C」はエクソン16の由来である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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