(57)【要約】【課題】新たな用途に使用可能な、数分で終了する高速ＰＣＲを実現する。【解決手段】１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速ＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、高速ＰＣＲの実施方法、及び高速ＰＣＲ用試薬キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速ＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、高速ＰＣＲの実施方法。
【請求項２】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来である、請求項１記載の高速ＰＣＲの実施方法。
【請求項３】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来である、請求項１記載の高速ＰＣＲの実施方法。
【請求項４】
１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速ＰＣＲ用組成物。
【請求項５】
１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速ＰＣＲ用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の研究やその応用に重要な核酸増幅技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する。本発明は、遺伝子発現解析や塩基多型解析等に際して特に有用であり、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、２種類のプライマーを用いて特定配列を増幅する手法である（例えば、非特許文献１を参照。）。原理的には１コピー、現実でも数コピー相当の核酸サンプルから増幅できる感度、特定部分のみを増幅する特異性などの特徴から、広く医学・生物学の研究や臨床診断等に利用されてきた。一方、増幅された核酸を検出する手法として、広く電気泳動法やプローブハイブリダイゼーション法が用いられてきた。
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４，１９８５年
【０００３】
ＰＣＲが普及するにつれて、様々な周辺技術が開発されるようになった。例えば、「ホットスタートＰＣＲ」は、不活化されたＤＮＡポリメラーゼが高温になって初めて活性を有するように修飾することにより、試薬調製時の低温での非特異反応を抑制する技術である。また、「リアルタイムＰＣＲ」は、蛍光インターカレーターや蛍光プローブを用いて、ＰＣＲを実行しながら増幅産物を検出する技術である。一方で、最も望まれていた改良のひとつであるＰＣＲの反応時間短縮は、当初考えられていたほど進んでいなかった。
【０００４】
ＰＣＲは、２本鎖ＤＮＡを温度上昇により開裂する変性工程（概ね９０℃〜９８℃）、プライマーを開裂した１本鎖ＤＮＡに結合させるアニーリング工程（概ね５０〜７０℃）、プライマーから相補鎖を合成する伸長工程（概ね６５〜７５℃）の３段階の工程を１サイクルとして進行し、１サイクル毎にプライマーに挟まれた特定の核酸領域が２倍に増幅する。３０サイクルならば原理的に２の３０乗倍に増幅する。反応は単純であるが、反応液を１サイクルあたり３段階の温度に変化させる必要がある。この温度変化を達成するために様々な手法が考案されたが、開発の初期に採用されたブロック方式が、未だに主流となっている。これは、反応液の入ったチューブを金属のブロックに挿入し、ブロックごと温度を変化させるものである。構造的に単純であり優れた方式であるが、ブロックの熱容量が大きいため温度を高速に変化させることが困難である。ペルチェ素子や反応チューブの工夫などによりかなり高速化されてきてはいるが、４０サイクルのＰＣＲを実施するために２時間程度要する。
【０００５】
より高速なＰＣＲを実現するために、様々な手法が考案された。初期には、反応チューブを機械的に３温度の水槽間で移動させる方式が考案されたが、構造が複雑になる他、水の蒸発やコンタミネーションなどトラブルが多いため普及しなかった。液体の温媒を使う方式や、３温度のブロックを貫通するチューブを通過させる方式などは、構造の複雑さなどから構想段階で終わっている。このような状況で、空気を使って温度制御をする方法が、高速ＰＣＲとして実用化された。液体の温媒と異なり、気体は蒸発やコンタミネーションなどのトラブルが無い。ロシュ・ダイアグノスティックス社のライトサイクラーはこの方式を採用し、温風と冷風で反応液の入ったガラスキャピラリーの温度を直接変化させている。ライトサイクラーは市販のＰＣＲ装置では最速と考えられているが、これでも４０サイクルのＰＣＲに２０分程度を要する。空気の熱容量が小さいことがネックとなっている。
【０００６】
更にＰＣＲが高速化すれば、様々な用途への展開が想定される。例えば、病原体に汚染されたと疑われる地域での環境調査は、結果によっては一刻も早い対応を迫られ、また、測定者の安全を確保する観点からも、迅速な測定が求められる。また、近年は悪性腫瘍の手術中にリンパ節への転移を遺伝子検査で診断し、切除部位を判断する手法が考案されており、このような場合も迅速なＰＣＲが極めて有用となる。これらの目的を達成するためには、ＰＣＲが少なくとも１０分以内に終了することが望ましい。
【０００７】
近年、米国Ｍｅｇａｂａｓｅ社によって、更に高速なＰＣＲが可能となる装置が開発された（例えば、特許文献１を参照。）。気体を温媒として使用する点は同じであるが、熱容量の高いガスを用い、高圧にすることで更に熱容量を高め、更に流体力学を駆使して反応液の入ったガラスキャピラリーへの熱伝導性を高めている。これにより装置の性能としては４０μＬの反応系でも１０℃／秒以上の温度変化を実現した。
【特許文献１】ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ６，４７２，１８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ここまで温度変化が高速化されると、ＰＣＲの反応時間はもはや機器の温度変化ではなく、主にＰＣＲの反応自体に制約されるようになった。本発明者らが検討した結果、変性工程やアニーリング工程は事実上一瞬でもその温度に達していればほぼその目的が達せられるが、伸長工程は増幅領域の長さに応じた時間が必要であることが判明した。つまり、ＤＮＡポリメラーゼの反応速度に制約されるのである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、高速ＰＣＲにおいてはＤＮＡポリメラーゼの反応速度、とりわけデオキシリボ核酸合成速度が重要であることを見出し、その解決手段を鋭意検討して本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速ＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、高速ＰＣＲの実施方法である。
さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来である、請求項１記載の高速ＰＣＲの実施方法である。
さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来である、請求項１記載の高速ＰＣＲの実施方法である。
さらに、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速ＰＣＲ用組成物である。  
さらに、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速ＰＣＲ用試薬キットである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、従来の方法に比べてコストや利便性をなんら犠牲にすることなく、これまでにない高速ＰＣＲを提供できることが明らかとなった。本発明の方法は様々な分野でＰＣＲを実施するものに経済的に多大の利益をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の高速ＰＣＲ実施時における温度変化とは、温度上昇、下降の各ステップに要する時間全体に対する平均の温度変化を意味する。１０℃／秒以上の温度変化を達成する手段には特に制限がないが、一例としてＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ６，４７２，１８６に記載のシステムが挙げられる。
【００１３】
本発明者らは、米国Ｍｅｇａｂａｓｅ社の高速ＰＣＲ試作機（以後、ＰＣＲ  Ｊｅｔと記載）を用いて、ＰＣＲの高速化を検討してきた。まずは１サイクルの短縮化を試み、各ステップの時間を検討したところ、変性工程は例えば９５℃  ０．２秒といったような設定でも増幅が進行することが確認された。これは変性工程では一瞬でもその温度に達していれば増幅が進行することを意味する。一方、アニーリング工程や伸長工程はある程度の時間を要する。これらの事象は、ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ６，４７２，１８６の実施例でも確認されている。本発明者らは、このアニーリング工程や伸長工程をより詳細に検討した結果、時間を要するプロセスはＤＮＡの伸長であることが判明した。つまり、物理的にプライマーが相補鎖に結合（アニール）するプロセスは比較的短時間に達成されるのに対し、結合したプライマーからＤＮＡが伸長するプロセスは時間を要するのである。増幅が良好に進行するサイクルが、見かけ上アニーリング工程に時間を配分していたとしても、実際にはそのアニーリング工程でＤＮＡポリメラーゼによる伸長が進んでいたことが要因になっているのである。
【００１４】
伸長工程に要する時間を短縮する方策は、いくつか考えられる。最も有力な方策は、ＰＣＲによる増幅領域を極限まで少なくすることである。そうすれば当然、伸長に要する時間は短縮可能になる。増幅領域は、研究目的でその部分のＤＮＡをクローニングしたい（取り出したい）場合などは短縮できないが、細菌やウイルスの存在を確認する場合やメッセンジャーＲＮＡの発現量を定量したい場合、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を判定したい場合などでは短縮が可能であり、現実にはその様な場合の方が遥かに多い。実際、最近はメッセンジャーＲＮＡ定量や一塩基多型判定を目的としたＰＣＲは極めて短い領域を増幅している。しかし、このような場合でも、プライマーが各２０〜３０ｍｅｒ程度あるので、増幅領域は２本のプライマーの部分を含めて６０塩基対程度が最低限度である。検出の目的でプローブを設定すれば、更にその部分を確保する必要があり、１００塩基対程度の増幅が必要となる。増幅領域の短縮には限界があり、その他の方策が必要である。
【００１５】
別の方策として、当然のことながら反応速度の向上が考えられる。変性やアニーリングは温度変化により物理的に乖離や結合を起こさせるので、反応が速やかに完了するが、伸長はＤＮＡポリメラーゼという酵素により複雑な化学反応を触媒して進行させるため、どうしても時間を要する。温度変化の高速化が達成された今、サイクル短縮の最後の鍵は伸長工程の短縮であり、伸長工程の時間は増幅領域の長さと伸長反応の速さによって決まる。
【００１６】
本発明はこのような反応速度の向上により達成される。
反応速度の向上に関与する因子としては、反応を触媒する酵素であるＤＮＡポリメラーゼの選択、反応に直接関与するあるいは共存する種々の酵素や試薬の組成、あるいはｐＨや温度などの反応条件などが挙げられる。
最も重要な因子の１つは、反応を触媒する酵素であるＤＮＡポリメラーゼの選択である。
【００１７】
ＰＣＲには通常、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが使用される。これは、真正細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）の一種Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼであり、耐熱性を有するためＰＣＲに好適である。ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ６，４７２，１８６の実施例でもＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが使用されており、特に「Ｚ−Ｔａｑ」と記載されているものは、高速な伸長反応に最適化されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）である。しかし、本発明者らが検討したところ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、７５塩基対のＰＣＲにおいてアニーリング・伸長工程は少なくとも７秒、明瞭なバンドを得るためには１０秒程度必要であることが判明した。これでは、４０サイクルで１０分程度を要する。
【００１８】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの合成速度は約６０塩基／秒である。数値上は、７５塩基対の増幅は１秒で終了するはずであるが、プロセッシビティー（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ、継続して合成する能力）やプライミングの能力などから、現実には７秒以上を要すると考えられる。
本発明者らはこの部分に着目し、鋭意研究の結果、より性能の高いＤＮＡポリメラーゼを用いれば、伸長工程を短縮できることを見出した。具体的には１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いれば明らかに伸長工程を短縮でき、特に超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを用いた場合に顕著な効果を得られた。始原菌は古細菌（ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）とも呼ばれ、通常に「細菌」と呼ばれる真正細菌とはまったく別のグループを形成する生物群である。高圧や好熱などの極限環境に生息することが多く、優れた性質を持つ酵素を保有している場合がある。
【００１９】
本発明者らは硫気孔より単離された超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（以下、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼと呼ぶ）を用いた場合に最高の効果を得ることができ、上記の７５塩基対のＰＣＲにおいてアニーリング・伸長工程は最低３秒、明瞭なバンドを得るためには５秒程度でよいことを確認、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの約半分の時間に短縮することができた。これにより、４０サイクルを５分強で終了するＰＣＲを実現することができ、核酸増幅に新たな領域を創造することができた。
【００２０】
すなわち、本発明の実施態様の一つは、１０℃／秒以上の温度変化で実行される高速ＰＣＲにおいて、１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする、高速ＰＣＲの実施方法である。
本発明において「塩基／秒」で表示されるデオキシリボ核酸合成速度とは、単位時間あたりのＤＮＡ合成数をいう。その測定法は以下の通りである。
ＤＮＡポリメラーゼの反応液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  塩化マグネシウム、７．５ｍＭ  ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８  １本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液（５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％フィコール、０．０５％ブロモフェノールブルー）を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルされたλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによってデオキシリボ核酸合成速度を求める。
【００２１】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑの倍にあたる１００〜１４０塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する。また、プロセッシビティーなども優れていることが、要因のひとつであると考えられる。勿論、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成速度は、長い領域を増幅するＰＣＲにも極めて有効であり、むしろ長鎖ＰＣＲの方が伸長工程の短縮効果も顕著であるが、高速ＰＣＲを実現したことが、産業上極めて有用である。
【００２２】
本発明で用いるＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼは、たとえば東洋紡績製のもの（製品コードＫＯＤ−１０１など）を容易に入手することができる。また、天然型のポリメラーゼのアミノ酸配列を公知の手段により、１もしくは数個が欠失、置換若しくは付加させたもの（変異体）であっても良い。あるいは、上記の酵素（天然型、変異体）に化学修飾などの手段によりさらに改変を加えたものであっても良い。
【００２３】
なお、本発明で用いる１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼあるいはその変異体さらにはそれらの改変体に限定されるものではない。
現在知られているＤＮＡポリメラーゼ（単独あるいは組みあわせ）としてのＴａｑポリメラーゼや，ＥＸ−Ｔａｑ，ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ，Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ，Ｔｂｒ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｔｈ，Ｔ１ｉ，Ｔａｃ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｔｉｈ、Ｔｆｉ（以上はＰｏｌＩ型酵素），Ｐｆｕ，Ｐｆｕｔｕｂｏ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ，Ｐｗｏ，ＫＯＤ，Ｂｓｔ，Ｓａｃ，Ｓｓｏ，Ｐｏｃ，Ｐａｂ，Ｍｔｈ，Ｐｈｏ，ＥＳ４，ＶＥＮＴ，ＤＥＥＰＶＥＮＴ（以上はα型酵素）などの中にはそのままで１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するものはないが、近年、これらの種々のＤＮＡポリメラーゼの一次構造や立体構造が知られてきており、構造と機能の関係や、各起源の酵素の類似点や相違点に関する情報が蓄積されてきている。これらの情報を参考に上記酵素にさらに変異、改変などの改良を加えて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させたもの、あるいは、組み合わせにより当該性能を達成させたもの（組合せにはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでいても良い）も、本願発明の範疇に含まれる。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼの選択は、「合成速度」「正確性」「プロセッシビティー」「プライミング能力」「耐熱性」などの性能を総合的に勘案しておこなうことが好ましい。例えばα型酵素は正確性に優れている。ＤＮＡ合成時の正確性を評価する方法の一例として、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（ｒｐｓＬ）遺伝子を用いた方法が挙げられる。ストレプトマイシンは原核細胞のタンパク質合成を阻害する抗生物質であり、細菌の３０ＳリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合してタンパク質合成の開始複合体形成反応を阻害し、また遺伝子暗号の誤読を引き起こす。ストレプトマイシン耐性変異株ではリボゾームタンパク質Ｓ１２に変異が見られる。この変異はリボゾームの翻訳忠実度を上げるため、サプレッサーｔＲＮＡによる終始コドンの読み取りを抑制するなど多面的効果（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示すことが知られている。したがって、ｒｐｓＬ遺伝子を鋳型としてＰＣＲにより増幅を行うと、ある確率で変異が導入され、それがアミノ酸レベルの変異であった場合、ｒｐｓＬタンパク質の構造が変化し、ストレプトマイシンが３０ＳリボゾーマルＲＮＡに作用できなくなるようなことが起こる。したがって、増幅したプラスミドＤＮＡによって大腸菌を形質転換した場合、変異が多く導入されるほどストレプトマイシン耐性菌の出現頻度が増すこととなる。
プラスミドｐＭｏｌ  ２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）２８９，８３５−８５０に記載）は、ｒｐｓＬ遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドである。このプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子上にＰＣＲ増幅用プライマーセット（片方をビオチン化、ＭｌｕＩ制限酵素サイトを導入）を設計し、プラスミドの全長を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をストレプトアビジンビーズを用いて精製し、制限酵素ＭｌｕＩを用いて切り出した後、ＤＮＡリガーゼを用いて結合して大腸菌を形質転換した。アンピシリンとアンピシリン及びストレプトマイシンを含有する２種類のプレートに接種して、それぞれのプレートに出現したコロニーの比を算出することによりＤＮＡ合成時の正確性を求めることができる。
【００２５】
反応速度の向上に関与する因子としては、ＤＮＡポリメラーゼの選択のほかに、反応に直接関与するあるいは共存する種々の酵素や試薬の組成、あるいはｐＨや温度などの反応条件なども重要である。高速ＰＣＲには概して、マグネシウムイオンは最終濃度３ｍＭ以上、プライマーが最終濃度４００ｎＭ以上と、通常より高マグネシウム、高プライマーが望ましい。
【００２６】
本発明の実施態様においては、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、４種のｄＮＴＰを反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法を挙げることができる。プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返すのが好ましい。本発明では、ＤＮＡポリメラーゼの活性を維持するために、例えばマグネシウムイオンのような２価のイオン、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンを共存させることが好ましい。また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液及びこれらのイオン（塩の形で含有してもよい）を含むと共に、ＢＳＡ、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤、及び緩衝液が存在してもよい。緩衝剤としては、主にトリス（ＴＲＩＳ）や、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビスートリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、キャプス（ＣＡＰＳ）などのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが挙げられる。
【００２７】
あるいは、本発明の反応液組成物は、ＤＮＡ合成酵素に加えて、さらに、標的核酸に相補的な塩基配列を有する正方向および逆方向プライマー、４種のｄＮＴＰ、２価陽イオン、緩衝液、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩなどのインターカレーター蛍光試薬、核酸プローブ、発色試薬、発光試薬などを含んでもよい。
【００２８】
本発明に含んでも良いヌクレオチドには、特に制限がないが、デオキシホスホヌクレオチド又はその誘導体が挙げられる。具体的な好ましい組成としては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＩＴＰ，ｄＵＴＰ、α−チオ−ｄＮＴＰ類、ビオチンーｄＵＴＰ、フルオレセインーｄＵＴＰ、及びシゴキシゲニンーｄＵＴＰから成る群から選択される物質が例示される。
【００２９】
本発明に含んでも良い塩としては、特に制限がないが、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムから成る群から選択される物質が例示される。これらの塩は市販品を容易に入手することができる。
【００３０】
本発明ではさらに上記以外に必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制し、あるいは、プライマーダイマーなどの副産物の産生を抑えたり、ｐｒｉｍｅｒの分解を保護するための抗体を含むことが好ましい。該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。また、公知のエンハンサー、などを含むことができる。
【００３１】
また、本発明ではさらにＤＮＡ合成の促進に効果のある物質として、次のようなものを添加することができる。
【００３２】
陰イオン物質として、特に制限がないが、例えばカルボキシル基を持つ物質等が挙げられる。好ましくは、ジカルボン酸塩が挙げられる。ジカルボン酸塩は、例えば無機塩の形で添加される。好ましくはシュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンの少なくとも１種類を含有する。さらに好ましくは、これらの無機塩は、アルカリ金属（好ましくはカリウム塩、あるいはナトリウム塩の形態）またはアルカリ土類金属またはアンモニウムとの塩の形態をとる。具体的には、シュウ酸亜鉛、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウム、シュウ酸ジエチル、シュウ酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル、シュウ酸ジメチル、シュウ酸すず、シュウ酸セリウム、シュウ酸鉄、シュウ酸銅、シュウ酸ナトリウム、シュウ酸ニッケル、シュウ酸ビス、シュウ酸（２，４−ジニトロフェニル）、シュウ酸（２，４，６−トリクロロフェニル）、シュウ酸マンガン、シュウ酸メチル、シュウ酸ランタン、シュウ酸リチウム、または、マロン酸イソプロピリデン、マロン酸エチル、マロン酸ジエチル、マロン酸ジベンジル、マロン酸ジメチル、マロン酸タリウム、マロン酸二ナトリウム、または、マレイン酸一ナトリウム、マレイン酸ジエチル、マレイン酸クロルフェニラミン、マレイン酸ジ−ｎ−ブチル、マレイン酸モノ−ｎ−ブチルエステルなどが挙げられ、いずれも、市販品などを用いることができる。上記陰イオン物質は、通常、０．１〜２０ｍＭの濃度範囲で用いられる。好ましくは０．１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは１〜１０ｍＭである。
グリシンを基本単位に持つ試薬として、特に制限はないが、好ましくは、トリメチルグリシン（ベタイン）などが挙げられ、市販品などを用いることができる。トリメチルグリシン（ベタイン）の有効濃度は０．５〜２Ｍであり、好ましくは０．５〜１．５Ｍであり、さらに好ましくは１〜１．５Ｍである。
さらに、ＤＭＳＯが挙げられ、市販品などを用いることができる。ＤＭＳＯの有効濃度は０．１〜１５％であり、好ましくは２〜１０％であり、さらに好ましくは５〜１０％である。
本発明において、上記陰イオン物質と、グリシンを基本単位に持つ試薬あるいはＤＭＳＯの、両方を添加し最適な組合せとすることにより、さらに効果が増強することが期待できる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例  高速ＰＣＲにおけるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの比較
１．ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子を検出するプライマーの合成
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー１と示す）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー２と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。本プライマーセットを用いたＰＣＲにより、ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子のエクソン７に存在する配列７５塩基対を増幅する。
【００３５】
２．ＰＣＲ試薬の調製
ＴａＫａＲａ  Ｚ−Ｔａｑ（高速型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、タカラバイオ株式会社）とＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、東洋紡績株式会社、コードＫＯＤ−２０１）をそれぞれ用いて、ＰＣＲ反応液を調製した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、フラクションＶグレード、ＳＩＧＭＡ社製）、プライマーとサンプル（ヒト胎盤ＤＮＡ、ＳＩＧＭＡ社製）以外は全て添付の試薬を用い、使用量なども添付の取扱説明書に従った。但し、（Ｂ）ではＺ−Ｔａｑにあらかじめ抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡績株式会社、コードＴＣＰ−１０１）を５Ｕあたり１μｇ混合している。ＫＯＤ  Ｐｌｕｓはもともと抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体が混合されており、低温での非特異的な反応を抑制している（ホットスタートＰＣＲ）。ＢＳＡは、ガラスキャピラリーへのＤＮＡや酵素の吸着を防止するために用いている。
（Ａ）Ｚ−Ｔａｑ（最終液量１０μＬ）
２．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ         １μＬ
プライマー１                     ２ｐｍｏｌ
プライマー２                     ２ｐｍｏｌ
×１０  Ｚ−Ｔａｑ用緩衝液       １μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ           ０．８μＬ
Ｚ−Ｔａｑ                       ０．２５Ｕ
ヒトＤＮＡ（２ｎｇ／μＬ）       １μＬ
（Ｂ）Ｚ−Ｔａｑ  ＋  ａｎｔｉＴａｑ抗体（最終液量１０μＬ）
２．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ         １μＬ
プライマー１                     ２ｐｍｏｌ
プライマー２                     ２ｐｍｏｌ
×１０  Ｚ−Ｔａｑ用緩衝液       １μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ           ０．８μＬ
Ｚ−Ｔａｑ（＋抗体）             ０．２５Ｕ
ヒトＤＮＡ（２ｎｇ／μＬ）       １μＬ
（Ｃ）ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（最終液量１０μＬ）
２．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ         １μＬ
プライマー１                     ２ｐｍｏｌ
プライマー２                     ２ｐｍｏｌ
×１０  ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ用緩衝液 １μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ               １μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４             １．２μＬ
ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ                 ０．２Ｕ
ヒトＤＮＡ（２ｎｇ／μＬ）       １μＬ
【００３６】
３．ＰＣＲの実施
米国Ｍｅｇａｂａｓｅ社より購入した高速ＰＣＲ試作機（ＰＣＲ  Ｊｅｔ）によりＰＣＲを実施した。９５℃１５秒の最初の変性工程（Ｂ，Ｃではこの工程により抗体が外れ、ＤＮＡポリメラーゼが活性化される）の後、以下のような条件で４０サイクル実施した。
（１）４０サイクルで合計約１０分２０秒
９５℃  ０．２秒  ／６０℃  ５秒  ／７２℃  ５秒
（２）４０サイクルで合計約８分１０秒
９５℃  ０．２秒  ／６０℃  ５秒  ／７２℃  ２秒
（３）４０サイクルで合計約６分５０秒
９５℃  ０．２秒  ／６０℃  ５秒
（４）４０サイクルで合計約６分１０秒
９５℃  ０．２秒  ／６０℃  ４秒
（５）４０サイクルで合計約５分３０秒
９５℃  ０．２秒  ／６０℃  ３秒
（６）４０サイクルで合計約４分５０秒
９５℃  ０．２秒  ／６０℃  ２秒
【００３７】
４．ポリアクリルアミドゲル電気泳動の実施
５％ポリアクリルアミドゲルを用い、ＴＢＥバッファーで１００Ｖ３０分電気泳動を実施した。その後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線照射で写真撮影した。
【００３８】
５．結果
結果を図１に示す。両端のレーンはサイズマーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ分解産物）。上記、ＰＣＲサイクル条件（１〜６）、ＰＣＲ反応液（Ａ〜Ｃ）を示す。
（左のレーンより）
マーカー
１−Ａ
１−Ｂ
１−Ｃ
２−Ａ
２−Ｂ
２−Ｃ
３−Ａ
３−Ｂ
３−Ｃ
４−Ａ
４−Ｂ
４−Ｃ
５−Ａ
５−Ｂ
５−Ｃ
６−Ａ
６−Ｂ
６−Ｃ
マーカー
【００３９】
図１の結果を表１にまとめた。
【００４０】
【表１】
2005328709.tif 000002
【００４１】
Ｚ−Ｔａｑ単独（Ａ）ではプライマーダイマーと思われるエキストラバンドが発生し、判断が困難な結果となっている。ａｎｔｉＴａｑ抗体の混合（Ｂ）によりエキストラバンドは消失したが、目的産物のバンドは（１）のサイクルで明瞭に、（３）のサイクルでかろうじて確認できる程度で、それより短いサイクルでは確認できない。これに対してＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（Ｃ）では（３）のサイクルでも明瞭に、（５）のサイクルでも薄く確認でき、Ｚ−Ｔａｑに比べて短いサイクルでも増幅可能であることが確認された。アニール・伸長時間はＺ−Ｔａｑでは最低７秒（十分な増幅には１０秒）必要なのに対して、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓでは最低３秒（十分な増幅には５秒）で増幅が確認できた。これにより、５分強でのＰＣＲが実現できた。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によって、細菌やウイルスの検出や定量、ＲＮＡの定量や一塩基多型のタイピングなどを迅速・正確に実施することが可能となり、現地での環境検査、ベッドサイドでの臨床診断、緊急を要する食品検査など幅広い用途分野に利用することが出来、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は実施例のポリアクリルアミドゲル電気泳動像を示す。両端のレーンはサイズマーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ分解産物）。サンプルのレーンは実施例のＰＣＲサイクル条件（１〜６）、ＰＣＲ反応液（Ａ〜Ｃ）を示す。（左のレーンより）マーカー１−Ａ１−Ｂ１−Ｃ２−Ａ２−Ｂ２−Ｃ３−Ａ３−Ｂ３−Ｃ４−Ａ４−Ｂ４−Ｃ５−Ａ５−Ｂ５−Ｃ６−Ａ６−Ｂ６−Ｃマーカー
【図１】
2005328709.tif 000003
【配列表】
2005328709000001.app