(57)【要約】【課題】マトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患の予防、抑制、症状の改善に有効な剤を提供する。【解決手段】  本発明は黒霊芝の特有成分（薬効成分）を含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に関する。本発明の薬効成分は、ＭＭＰの阻害作用を有し、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制または症状の改善に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の性質すなわち、
（１）主として黒霊芝又は黒霊芝の抽出物に含有する成分であって、
（２）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、約２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ−１に吸収の極大を示し、
（３）本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示し、
（４）分子内に芳香環を含有し、
（５）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、主として茶色〜赤褐色を示す。
以上の性質で特徴づけられる、薬効成分を含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
黒霊芝の溶媒抽出物を液・液分配抽出により溶媒分画精製したものであり、液・液分配抽出の方法として、
（１）溶媒抽出物（固形物）に含水低級アルコールと炭化水素溶媒を加えて抽出し、
（２）炭化水素溶媒可溶分を除去した残液にエステル溶媒を加えて抽出し、
（３）そのエステル層に含有する、
以上の操作により抽出しうる、請求項１記載の薬効成分を含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
黒霊芝の溶媒抽出物もしくはその溶媒分画精製物を、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、オクタデシル化シリカゲル（ＯＤＳ）、シリカゲル、セルロース、デキストラン、修飾デキストランから選択された吸着剤により精製しうる、請求項１又は２記載の薬効成分を含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎及び皮膚の老化に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患に対する予防、抑制または症状の改善を目的とする医薬品、医薬部外品、化粧品または食品。
【請求項５】
請求項１〜３の何れか１項記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする、ガンの転移に対する予防、抑制または症状の改善を目的とする医薬品、医薬部外品または食品。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか１項記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする、皮膚の老化に対する予防、抑制または症状の改善を目的とする医薬品、医薬部外品、化粧品または食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤に関し、詳しくは、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制または症状の改善に効果が期待でき、かつ安全性の高いＭＭＰ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、ほとんどの先進諸国における主要死亡原因の１つであり、我国では、およそ３割の人がガンで亡くなっている状況である。近年の外科療法、放射線療法の発達により、ガンの原発巣自体はほぼ取り除けるようになったが、それでも尚死亡率が高いのは、ガンが転移を起こす性質を有しているためと考えられており、転移が多発するようになったガンを治療することは現状では非常に困難であると言わざるをえない。従って、従来の原発巣の治療法に加えて、転移を抑制する方法を確立することが、ガン治療の大きな目的の１つであると考えられる。このような現況の中、徐々にではあるが転移のメカニズムが分子レベルで明らかになりつつあり、最近では、その転移プロセスの１つとして細胞外基質の分解系が注目されている。
【０００３】
ガンの転移とは、原発部位から離脱したガン細胞が血流に乗って全身に散布され、他の臓器に生着し、その組織で再び増殖をはじめることである。一般に、腫瘍組織は、密な細胞外基質に囲まれているため、ガン細胞が原発部位からの移動を行うためには細胞外基質の酵素分解を必要とする。細胞外基質はコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン等の多様な高分子によって構成されており、これら細胞外基質の分解に関わる主要な酵素群が、ＭＭＰである。ＭＭＰは、ガン組織中で血管が新生される際あるいはガンが転移する際に、発現量が上昇したり酵素の活性化が起こることが、例えば下記非特許文献１に記載されている。従って、これらの酵素の発現量の低下や活性を阻害することにより、ガン細胞の浸潤を抑制し、転移を抑えることが可能になると期待できる。
【０００４】
【非特許文献１】「腫よう湿潤およびマトリックスメタロプロティナーゼ合成のレチノイド仲介阻害」（Ｓｃｈｏｅｎｅｒｍａｒｋ  Ｍ  Ｐ等、『Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ』、Ｖｏｌ．８７８、第４６６−４８６頁、１９９９年）
【０００５】
ガン細胞による高分子群の浸潤過程において、とりわけコラーゲンの分解は重要なステップである。例えば、ガン細胞が血管内へ侵入、および血管外へ脱出するためには、血管の基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンを分解する必要があるが、Ｌｉｏｔｔａらはガン細胞が分泌するＩＶ型コラーゲン分解酵素の作用がガンの転移能を決定する重要な因子であることを、下記非特許文献２において示している。ＭＭＰに属するゼラチナーゼは、線維芽細胞や内皮細胞、ガン細胞等が産生する酵素であり、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、エラスチン等の基質を分解する。従って、例えばゼラチナーゼに対して阻害活性を有する物質は、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。
【０００６】
【非特許文献２】「転移可能性と基底膜コラーゲン酵素分解との相関」（Ｌｉｏｔｔａ  ＬＡ等、『Ｎａｔｕｒｅ』、Ｖｏｌ．２８４、第６７−６８頁、１９８０年）
【０００７】
ＭＭＰはガン疾患のみならず、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等の種々の病態での細胞外基質の分解に中心的な役割を果たすことが、以下の非特許文献３に報告されている。さらに皮膚においては、紫外線等の外部刺激によって活性の亢進したコラゲナーゼなどのＭＭＰが皮膚の構造維持に重要な成分を分解することから、紫外線によって活性化する老化促進因子として最近特に注目されている。
【０００８】
【非特許文献３】「組織破壊性プロテアーゼとしてのマトリックスメタロプロテアーゼ」（中田光俊、岡田保典  『呼吸』、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．４、第３６５−３７１頁、１９９９年）
【０００９】
それゆえＭＭＰの阻害剤は、ＭＭＰの亢進が原因で起こる上記疾患の治療及び改善に有用であると考えられることから、各方面で盛んにスクリーニングが行われてきた。こうした阻害剤については、下記の文献に記載されている。
【００１０】
【特許文献１】特開平９−４０５５２号公報
【特許文献２】特開平１１−１４７８３３号公報
【特許文献３】特開２０００−２２６３１１号公報
【００１１】
さらに、従来技術として、マンネンタケ（赤霊芝や黒霊芝）のＭＭＰ阻害剤が特許文献４に記載されている。
【００１２】
【特許文献４】特願２００２−２８０６３２号
【００１３】
この文献には赤霊芝や黒霊芝の溶媒抽出物のＭＭＰ阻害効果が記載されているが、これらの活性成分については一切記載されていない。また、他の文献においても、黒霊芝に含有するＭＭＰ阻害成分については我々が知る限り報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対して阻害活性を有し、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制または症状を改善しうるＭＭＰ阻害剤を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この様な事情により、本発明者らは鋭意研究検討した結果、主として黒霊芝に含有する特定の成分に非常に高いＭＭＰ阻害効果を示すことを発見し、また実験的肺転移モデルを用いた動物実験においても、高いガン転移抑制効果を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の特定成分（薬効成分）は、次の事項によって特徴付けられるものである。
（１）主として黒霊芝又は黒霊芝の抽出物に含有する成分である。
（２）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、約２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ−１に吸収の極大を示す。
（３）上記黒霊芝の成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示す。
（４）分子内に芳香環を含有する。
（５）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、主として茶色〜赤褐色を示す。
【００１７】
上記のうち、（４）は１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ分析により判別可能である。すなわち、溶媒を重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を用いて測定した場合、６〜８ｐｐｍ（１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（１３Ｃ−ＮＭＲ）に芳香族に置換した水素原子のスペクトル吸収が認められる。上記のスペクトル分析値は分析機器、手法、ピークの幅広さなどにより、若干数値の誤差がある場合がある。（５）については、本成分約１〜１０ｍｇに酢酸エチル１ｍＬを加えることで着色性を判別できる。
【００１８】
また、本発明の薬効成分は、定法により加水分解を行うと、ヒドロキシケイヒ酸を遊離する性質がある。例えば、水酸化ナトリウム水溶液などを用いた定法により加水分解でき、ＨＰＬＣなどで分析することで確認できる。
【００１９】
本発明の薬効成分は、以下に示した高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により確認できる（図１参照）。本分析によれば、保持時間が約１０〜２５分の幅広のピーク群が本発明の薬効成分である（分析条件により、保持時間、パターンは若干変化することがある）。
（Ａ）カラム：オクタデシル化シリカゲル（内径４．５ｍｍ×２５０ｍｍ）
（Ｂ）カラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒：０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（計４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：１０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液を２０マイクロＬ導入
【００２０】
本発明に用いられる黒霊芝は、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属し、学名は、Ｇ．ａｔｒｕｍ、Ｇ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｇ．ｓｉｎｅｎｓｅなどといわれている。また、マンネンタケ属のキノコについては、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」には、黒霊芝（黒芝）のほか、赤霊芝（霊芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている。黒霊芝は広く中国や日本市場などで流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。
【００２１】
なお、黒霊芝は紫霊芝と外観が似ているために紫霊芝として市場に流通していることもある。この場合、例えば、上記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析することにより、本発明の薬効成分の検出が可能である。また、まれに赤霊芝にも微量含有している場合もあり、何れも本発明の範囲に属するものとする。
【００２２】
本発明に用いられる黒霊芝などは、子実体、菌糸体、天産物、栽培物、及び培養物などを問わず使用することができる。また、必要に応じてそのままの状態、破砕物、或いは乾燥物などを適宜選択して抽出操作に付することができる。
【００２３】
本発明の薬効成分の抽出方法の一例として、好ましくは黒霊芝の子実体を溶媒抽出物することにより得ることができる。
【００２４】
抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど）が挙げられる。好ましくは、低級アルコール、ケトン類、アセトニトリル、エステル類などや、これらの含水溶媒が良く、特に好ましくは、安全性の面からエタノール又は含水エタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。また、塩基性にして抽出することも好ましい。
【００２５】
本発明の薬効成分をさらに精製する方法として、互いに混合しない溶媒で液・液分配抽出により溶媒分画精製することもできる。
【００２６】
液・液分配抽出に用いる溶媒としては、上記の溶媒を用いることが可能である。例えば、（水又は含水アルコール）・炭化水素系、（水又は含水アルコール）・エーテル系、（水又は含水アルコール）・エステル系、水・ブタノール系などを採用できる。上記にとらわれず、互いに混合しない溶媒系であれば採用できる。好ましくは、溶媒抽出物（固形物）に含水低級アルコールと炭化水素溶媒を加えて抽出し、炭化水素溶媒可溶分を除去した残液にエステル溶媒を加えて抽出することにより本発明の薬効成分を精製することができる。また、酸や塩基による分別抽出を行うこともできる。
【００２７】
本発明の薬効成分をさらに精製する方法として、黒霊芝の溶媒抽出物又は上記の溶媒分画物を吸着剤に吸着させ、溶媒により溶出させることにより、薬効成分を精製することができる。
【００２８】
吸着剤としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、オクタデシル化シリカゲル（ＯＤＳ）、シリカゲル、セルロース、デキストラン、修飾デキストランなどの吸着剤が挙げられる。中でも、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂やＯＤＳが好ましい。
【００２９】
吸着方法としては、吸着剤をカラムに充填し、これに抽出物の溶液を通す方法や、抽出物の溶液に吸着剤をそのまま混合する方法などがあるが、特に限定されない。
【００３０】
吸着剤の溶出溶媒としては、各吸着剤の特性により選択できるが、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコールなどの溶媒が良く、特に好ましくは、水やエタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。更に、上記溶出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いても良い。
【００３１】
上記抽出物や精製物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、ろ過、活性炭などによる脱色、脱臭、エタノール沈殿などの処理をして用いても良い。更には、抽出や精製した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【００３２】
特に好ましい例を挙げると、溶媒抽出を行った後、上記の液・液分配抽出（上記の好ましいとされる溶媒系で抽出）で精製する方法や、溶媒抽出を行った後、合成吸着樹脂（スチレン−ジビニルベンゼン系、上記の好ましいとされる溶媒で溶出）で精製する方法や、溶媒抽出を行った後、ＯＤＳ系の吸着剤で精製する方法が良い。
【００３３】
本発明の薬効成分は、使用目的に応じ、液・液分配抽出や吸着剤による精製を単独又は組み合わせて製造することができる。
【００３４】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品または食品いずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、座剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、錠菓、飲料等が挙げられる。また、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常の医薬品、医薬部外品、化粧品、食品に用いられる成分である賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、油脂類、ロウ類等の成分を配合することもできる。
【００３５】
本発明に用いる薬効成分の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重などによって異なるが、０．１〜５，０００ｍｇ／日、好ましくは１〜５００ｍｇ／日の範囲で１日１回から数回経口投与できる。もちろん前記したように、投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要がある場合もある。また、本発明に用いる薬効成分を化粧品に配合する場合、化粧品全量に対し、固形物に換算して０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％が良い。０．０００１重量％未満では十分な効果は発揮されにくい。１０重量％を超えて配合した場合、効果の増強はみられにくく不経済である。また、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の新規な薬効成分は、マトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害効果を有し、マトリックスメタロプロテアーゼが関与して起こるガンの転移に対しても抑制効果を示した。本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制、症状の改善に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、本発明の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部をし、％は重量％を示す。
【実施例１】
【００３８】
製造例１  黒霊芝の薬効成分の製造１
黒霊芝子実体の乾燥物１Ｋｇにエタノール１５Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物を２０ｇ得た。このうち、黒霊芝のエタノール抽出物０．５０ｇを分取ＨＰＬＣにより精製し、黒霊芝の薬効成分を０．２１ｇ得た。なお、ＨＰＬＣの分画範囲は、「００１９」段落に記載の範囲とした。
＜ＨＰＬＣ分画条件＞
（Ａ）充填剤：ＯＤＳ（内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）
（Ｂ）展開溶媒
０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する。
（Ｃ）流速：１０ｍＬ／分
（Ｄ）検出：３５０ｎｍ
【００３９】
製造例２  黒霊芝の薬効成分の製造２
製造例１の黒霊芝のエタノール抽出物２．０ｇをエタノール３５０ｍＬに溶解し、同容量の精製水とヘキサンを加えて抽出した。水層部分を１／２に濃縮し、同容量の酢酸エチルを加えて抽出した後、濃縮乾固し、酢酸エチル画分０．５６ｇを得た。これを５０％エタノールに溶解し、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂１００ｍＬを充填したカラムに通液した。次いで、精製水、１０、２０、５０、８０、９０、１００％エタノール各１Ｌで溶出させた後、８０％以上のエタノール画分をまとめ、黒霊芝の薬効成分を０．２４ｇ得た。
【００４０】
＜製造例１及び２のスペクトル解析＞
赤外吸収スペクトル分析
製造例１及び２の黒霊芝の溶媒分画物をＫＢｒ法で赤外吸収スペクトルを測定した（図２）。その結果、約３２９４、２９２６、１６９８、１６０４、１４５６、１１６９、８２３ｃｍ−１に吸収の極大を示した。
紫外吸収スペクトル分析
製造例１及び２の黒霊芝の溶媒分画物５ｍｇを１００ｍＬのエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定した（図３）。その結果、２９５、３１３ｎｍに吸収の極大を示した。
ＮＭＲスペクトル分析
製造例１及び２の黒霊芝の溶媒分画物を用い、定法により１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、６．６〜７．６ｐｐｍ（１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（１３Ｃ−ＮＭＲ）にスペクトル吸収を認め、芳香環の存在が確認された。なお、溶媒は重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を用いた。
【００４１】
比較製造例１  黒霊芝のエタノール抽出物
製造例１で製造した抽出物を用いた。
【実施例２】
【００４２】
本発明の薬効成分は、処方例として下記の製剤化を行うことができる。
【００４３】
処方例１  散剤
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例１）                      ２０部
２．乾燥コーンスターチ                                ３０
３．微結晶セルロース                                  ５０
［製法］成分１〜３を混合し、散剤とする。
【００４４】
処方例２  錠剤
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例２）                        ５部
２．乾燥コーンスターチ                                ２５
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム              ２０
４．微結晶セルロース                                  ４０
５．ポリビニルピロリドン                                ７
６．タルク                                              ３
［製法］成分１〜５を混合し、次いで１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後乾燥する。成形した顆粒に成分６を加えて混合し打錠する。１錠０．５２ｇとする。
【００４５】
処方例３  錠菓
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例２）                        １．５部
２．乾燥コーンスターチ                                ５０．０
３．エリスリトール                                    ４０．０
４．クエン酸                                            ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル                                ３．４
６．香料                                                ０．１
［製法］成分１〜４を混合し、１０％の水を結合剤として加え流動層造粒する。成形した顆粒に成分５および６を加えて混合し打錠する。１粒１．０ｇとする。
【００４６】
処方例４  飲料
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例２）                        ０．０５部
２．ステビア                                            ０．０５
３．リンゴ酸                                            ５．０
４．グリセリン脂肪酸エステル                            ０．５
５．香料                                                ０．１
６．水                                                ９４．３
［製法］成分１〜５を成分６の一部の水に撹拌溶解する。次いで、成分６の残りの水を加えて混合する。
【００４７】
処方例５  ローション
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例１）                        ０．１部
２．１，３−ブチレングリコール                          ８．０
３．グリセリン                                          ２．０
４．キサンタンガム                                      ０．０２
５．クエン酸                                            ０．０１
６．クエン酸ナトリウム                                  ０．１
７．エタノール                                          ５．０
８．パントテン酸エチルアルコール                        ０．１
９・パラオキシ安息香酸メチル                            ０．１
１０．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）    ０．１
１１．香料                                              ０．１
１２．精製水                                          ８４．３７
［製造方法］成分１〜６および１２と、成分７〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００４８】
処方例６  クリーム
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例２）                        ２．０部
２．スクワラン                                          ５．５
３．オリーブ油                                          ３．０
４．ステアリン酸                                        ２．０
５．ミツロウ                                            ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル                        ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）    ３．０
８．ベヘニルアルコール                                  １．５
９．モノステアリン酸グリセリン                          ２．５
１０．香料                                              ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル                          ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル                          ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール                        ８．５
１４．精製水                                          ６６．１５
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１および成分１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。
【００４９】
比較例１    従来のクリーム
処方例６において、黒霊芝の薬効成分（製造例２）を精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。
【００５０】
処方例７  乳液
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例２）                        ０．００１部
２．スクワラン                                          ５．０
３．オリーブ油                                          ５．０
４．ホホバ油                                            ５．０
５．セタノール                                          １．５
６．モノステアリン酸グリセリン                          ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）    ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
（２０Ｅ．Ｏ．）                                    ２．０
９．香料                                                ０．１
１０．プロピレングリコール                              １．０
１１．グリセリン                                        ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル                          ０．２
１３．精製水                                          ７３．１９９
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１および１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。
【００５１】
処方例８  ゲル剤
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例１）                        １．０部
２．エタノール                                          ５．０
３．ビタミンＥ                                          ０．１
４．パラオキシ安息香酸メチル                            ０．１
５．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）      ０．１
６．香料                                                ０．１
７．１，３−ブチレングリコール                          ５．０
８．グリセリン                                          ５．０
９．キサンタンガム                                      ０．１
１０．カルボキシビニルポリマー                          ０．２
１１．水酸化カリウム                                    ０．２
１２．精製水                                          ８３．１
［製造方法］成分２〜６と、成分１および７〜１２をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
【００５２】
処方例９  パック
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例２）                        ０．２
２．ポリビニルアルコール                              １２．０
３．エタノール                                          ５．０
４．１，３−ブチレングリコール                          ８．０
５．パラオキシ安息香酸メチル                            ０．２
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）      ０．５
７．クエン酸                                            ０．１
８．クエン酸ナトリウム                                  ０．３
９．香料                                                ０．１
１０．精製水                                          ７３．６
［製造方法］成分１〜１０を均一に溶解し製品とする。
【００５３】
処方例１０  ファンデーション
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例２）                        １．０部
２．ステアリン酸                                        ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート
（２０Ｅ．Ｏ．）                                    １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）    ２．０
５．セタノール                                          １．０
６．液状ラノリン                                        ２．０
７．流動パラフィン                                      ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル                            ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム                ０．１
１０．ベントナイト                                      ０．５
１１．プロピレングリコール                              ４．０
１２．トリエタノールアミン                              １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル                          ０．２
１４．二酸化チタン                                      ８．０
１５．タルク                                            ４．０
１６．ベンガラ                                          １．０
１７．黄酸化鉄                                          ２．０
１８．香料                                              ０．１
１９．精製水                                          ６０．１
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１および１０〜１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４〜１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この水相に油相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００５４】
処方例１１    浴用剤
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例２）                        ５．０部
２．炭酸水素ナトリウム                                ５０．０
３．メントール                                          ０．１
４．黄色２０２号（１）                                  ０．０１
５．香料                                                ０．１
６．硫酸ナトリウム                                    ４４．７９
［製造方法］成分１〜６を均一に混合し製品とする。
【００５５】
処方例１２  軟膏
処方                                                    配合量
１．黒霊芝の薬効成分（製造例１）                        ０．５
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）    ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン                        １０．０
４．流動パラフィン                                      ５．０
５．セタノール                                          ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル                            ０．１
７．プロピレングリコール                              １０．０
８．精製水                                            ６６．４
［製造方法］成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１および６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【実施例３】
【００５６】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【００５７】
実験例１  ＭＭＰ阻害試験
ゼラチンザイモグラフィーを用いて、黒霊芝の薬効成分（製造例１、２）のゼラチナーゼ活性に対する阻害試験を行った。すなわち、０．６ｍｇ／ｍＬのゼラチンを含む１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１ｍｍ厚）を作製し、ＮＢ１ＲＧＢ（ヒト繊維芽細胞）の培養上清０．０１５ｍＬを非還元条件下で電気泳動した。その後ゲルを２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＳＩＧＭＡ社製）の溶液にて室温で３０分間２回洗浄してＳＤＳを除去し、２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、０．０１％ｂｒｉｊ−３５（ＳＩＧＭＡ社製）を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中にて３７℃で２４時間インキュベートした。この際、ゲルを浸した緩衝液中に黒霊芝の薬効成分（製造例１、２）を添加した。反応終了後ゲルを０．２％クマシーブリリアントブルーＲ（ＳＩＧＭＡ社製）の溶液にて染色し、５％メタノール−７．５％酢酸溶液にて脱色した。青色のゲル上で染色されないバンドとして検出される７２ｋＤａ付近のバンドにおけるゼラチナーゼ活性をデンシトメーター（アトー社製、アトーデンシトグラフ、ＡＥ−６９０５）にて定量化し、阻害率を算出した。阻害率（単位は％）の計算は、この例では、用いたデシントメータの数値を利用して、次式（１）により計算した。その結果、表１に示すように、黒霊芝の薬効成分は他の熱水、エタノール抽出物と比べて高いゼラチナーゼ阻害活性が認められた。
【００５８】
阻害率＝｛１−（Ａ／Ｂ）｝×１００      （１）
Ａ：黒霊芝の薬効成分を添加した場合のデシントメータの数値
Ｂ：黒霊芝の薬効成分を添加しない場合のデシントメータの数値
【００５９】
【表１】
2005298391.tif 000002
【００６０】
実験例２  ガン転移抑制試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、黒霊芝の薬効成分（製造例１、２）を１日１回、１００ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔経路にて１週間連続投与を行った。対照群には生理食塩水を腹腔内投与した。動物の例数は一群８匹とした。次いで、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞をマウス１匹あたり１ｘ１０５個となるように尾静脈より注入した。その後も試料の投与は継続し、ガン細胞の接種から３週間後に肺を摘出し、１０％ホルマリン溶液中で固定した。ホルマリン固定した肺を５葉に分割し、表面に形成された転移巣の数をカウントした。その結果、表２に示すように、黒霊芝の薬効成分の投与により転移巣の形成は対照群と比較して有意に抑制され、十分な転移抑制効果を有することがわかった。
【００６１】
【表２】
2005298391.tif 000003
【００６２】
以上より、黒霊芝の薬効成分は、ＭＭＰ阻害作用とガン転移抑制効果に優れていた。
【００６３】
実験例３  使用試験
処方例６のクリーム及び比較例１の従来のクリームを用いて、各々女性３０人（３１〜５０才）を対象に２ヶ月間の使用試験を行った。使用後、しわ、たるみ、肌の弾力についてのアンケート調査を行って、老化防止効果を判定した。アンケートの評価基準は、有効なものを「優」、やや有効なものを「良」、わずかに有効なものを「可」、無効なものを「不可」として評価した。
【００６４】
これらの結果を表３に示した。本発明の黒霊芝の薬効成分を含有する皮膚外用剤は優れた老化防止効果を示した。なお、試験期間中皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。
【００６５】
【表３】
2005298391.tif 000004
【００６６】
その他の皮膚外用剤について同様な使用試験を行ったところ、いずれも安全で優れた老化防止・改善効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の黒霊芝に含有する薬効成分は、高いマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有し、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎及び皮膚の老化に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ亢進性疾患に対する予防、抑制または症状の改善を目的とする医薬品、医薬部外品、化粧品または食品に配合することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】黒霊芝の薬効成分のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は強度を示す。
【図１】
2005298391.tif 000005