(57)【要約】【課題】新規な蛍光試薬を提供することを目的とする。【解決手段】蛍光色素基およびインターカレート基を含有する蛍光試薬は、二本鎖DNAまたは二本鎖RNAと接触することにより該蛍光試薬分子中のインターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖DNAまたは二本鎖RNAを選択的に検出することができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出できる蛍光試薬であって、
二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中のインターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を選択的に検出することのできる、
蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出するための蛍光試薬。
【請求項２】
蛍光試薬が、蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸残基とインターカレート基で置換されたα−アミノ酸残基を含むα−アミノ酸残基からなるペプチドである、請求項１の蛍光試薬。
【請求項３】
蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸残基およびインターカレート基で置換されたα−アミノ酸残基が、2から10個のα−アミノ酸残基おきに存在する、請求項２の蛍光試薬。
【請求項４】
蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸残基およびインターカレート基で置換されたα−アミノ酸残基が、2個のα−アミノ酸残基おきに存在する、請求項３の蛍光試薬。
【請求項５】
全α−アミノ酸残基数が4から40個である、請求項２から４のいずれかの蛍光試薬。
【請求項６】
全α−アミノ酸残基数が4から25個である、請求項５の蛍光試薬。
【請求項７】
蛍光色素基がインターカレーターとしての機能を有しないものである、請求項１から６のいずれかの蛍光試薬。
【請求項８】
蛍光試薬が、下記式Ｉで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩である、請求項１から７のいずれかの蛍光試薬。
【化１】
2005289810.tif 000018
（式中、Xはインターカレート基または蛍光色素基を表し、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表し、ｎは1から8の整数を表す。但し、式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるもしくは同じ蛍光色素基またはインターカレート基であってもよく、式Iにおいては必ずインターカレート基および蛍光色素基の両者が存在する。また、式IにおけるそれぞれのYおよびZも、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい。）。
【請求項９】
式Ｉにおいて、Yが-A-W-（Aは炭素原子数1から6の直鎖もしくは分岐アルキレン基を表し、Wは単結合、NH、CO、CONH、NHCO、O、SまたはHNC(NH)NHを表す）である請求項８の蛍光試薬。
【請求項１０】
式Ｉにおいて、Zが-A-W-H（AおよびWは請求項９の定義と同じ）である請求項８または９の蛍光試薬。
【請求項１１】
インターカレート基が、置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラキノン骨格を有する基、置換基を有していてよいアントラセン骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンジイミド骨格を有する基または置換基を有していてもよいピレン骨格を有する基である請求項１から１０のいずれかの蛍光試薬。
【請求項１２】
蛍光色素基が、置換基を有していてもよいキサンテン骨格を有する基、置換基を有していてもよいインドール骨格を有する基または置換基を有していてもよい含ホウ素および窒素インダセン骨格を有する基である請求項１から１１のいずれかの蛍光試薬。
【請求項１３】
蛍光試薬が、下記式ＩＩで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩である、請求項１から１２のいずれかの蛍光試薬。
【化２】
2005289810.tif 000019
【請求項１４】
検体中の二本鎖核酸を選択的に検出する方法であって、
二本鎖核酸を含むことが疑われる検体に請求項１から１３のいずれかの蛍光試薬を接触させて、該蛍光試薬の蛍光強度の増強により、検体中の二本鎖核酸を選択的に検出する方法。
【請求項１５】
検体が、DNAチップまたはDNAマイクロアレイである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
下記式Ｉで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩。
【化３】
2005289810.tif 000020
（式中、Xはインターカレート基または蛍光色素基を表し、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表し、ｎは1から8の整数を表す。但し、式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるもしくは同じ蛍光色素基またはインターカレート基であってもよく、式Iにおいては必ずインターカレート基および蛍光色素基の両者が存在する。また、式IにおけるそれぞれのYおよびZも、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい）。
【請求項１７】
蛍光色素基がインターカレーターとしての機能を有しないものである、請求項１６のペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出するための蛍光試薬に関する。更に詳細には、蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出できる蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中のインターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を選択的に検出することのできる、蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出するための蛍光試薬に関する。本発明の蛍光試薬によれば、例えば、DNAチップまたはDNAマイクロアレイによりターゲットDNAを検出する際に、ターゲットDNAをラベル化することなくそのままDNAチップまたはDNAマイクロアレイに反応させて、形成される二本鎖DNAを直接かつ選択的に検出することができる。
【０００２】
【従来の技術】
生物細胞の遺伝物質であるDNAは、ある種の薬物、発ガン性物質、変異原物質、蛍光色素などと相互作用することが知られている。DNAは生物における複製とタンパク質合成という中心的な役割を果たしているため、このような相互作用による修飾は、細胞代謝を大きく変化させたり、細胞の成長を弱めたり、ある場合には停止させてしまうこともある。
21世紀に入り、30億塩基対の長さからなるヒトゲノムの全容が明らかなり、これに伴って、特定遺伝子の迅速かつ高感度な検出方法の開発が、遺伝子治療や遺伝子診断などの観点からますます重要になってきている。1cm２程度の固体表面に数百から数十万種類のプローブDNAをスポットまたはアレイ状に配列したDNAチップまたはDNAマイクロアレイに関する研究がポストゲノムとして世界的に行われている。
DNAチップまたはDNAマイクロアレイによる従来の検出法は、ターゲットDNAに蛍光試薬などのラベル化剤を導入し、これをDNAチップまたはDNAマイクロアレイに反応させて形成される二本鎖DNAをラベル化剤により検出するものである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の検出法の場合には、サンプルDNAごとにラベル化反応を行う必要があり、ラベル化剤の導入により二本鎖DNAの形成能の低下を引き起こすことになり、遺伝子の変異や多型の診断に誤った結果を導くことになる。
従って、本発明の目的は、DNAチップまたはDNAマイクロアレイによるサンプルDNAの検出の際に、サンプルDNAごとにラベル化剤を導入する必要がなく、DNAチップまたはDNAマイクロアレイ上で二本鎖形成反応（ハイブリダイゼーション）を行った後に、直接分析試薬を加えて二本鎖DNAを選択的に検出することを可能にする、全く新たな蛍光試薬を提供することにある。
本発明の他の目的は、この新たな蛍光試薬を用い二本鎖核酸を選択的に検出する方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、この新たな蛍光試薬として用いる新たなペプチドをを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記した目的を達成するための蛍光試薬を得ることを目的として鋭意研究した結果、蛍光色素基およびインターカレート基を含有する蛍光試薬は、該蛍光試薬が単独の状態では該蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングにより蛍光が消光されているが、二本鎖DNAと接触することによりインターカレート基が二本鎖DNAの塩基対間にインターカレートして、蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖DNAを選択的に検出できる、という全く新しい概念の蛍光試薬を見出し、かかる知見に基づいて更に研究を進めて本発明を完成させた。
【０００５】
従って、本発明は、蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出できる蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中のインターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を選択的に検出することのできる、蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出するための蛍光試薬に関する。
更に本発明は、検体中の二本鎖核酸を選択的に検出する方法であって、二本鎖核酸を含むことが疑われる検体に上記蛍光試薬を接触させて、該蛍光試薬の蛍光強度の増強により、検体中の二本鎖核酸を選択的に検出する方法に関する。
更にまた本発明は、上記蛍光試薬として用いることのできる、下記式Ｉで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩に関する。
【化４】
2005289810.tif 000002
（式中、Xはインターカレート基または蛍光色素基を表し、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表し、ｎは1から8の整数を表す。但し、式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるもしくは同じ蛍光色素基またはインターカレート基であってもよく、式Iにおいては必ずインターカレート基および蛍光色素基の両者が存在する。また、式IにおけるそれぞれのYおよびZも、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい）。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の蛍光試薬は、蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出できる蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中のインターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を選択的に検出することのできる蛍光試薬である。
本発明の蛍光試薬は、その分子内に蛍光色素基とインターカレート基とを有し、それらがスタッキングすることにより消光現象を起こしており、二本鎖核酸と接触することによって、インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、消光が解消し得る構造を有するものであれば、如何なるものであってもよい。このような本発明の蛍光試薬としては、例えば、反応性の官能基を有する適当なスペーサー鎖を介して蛍光色素基とインターカレート基を結合させた蛍光試薬などが挙げられる。
【０００７】
本発明の蛍光試薬としては、蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸残基とインターカレート基で置換されたα−アミノ酸残基を含むα−アミノ酸残基からなるペプチドか好ましい。即ち、α−アミノ酸残基からなるペプチドに蛍光色素基とインターカレート基とを置換させたペプチドが好ましい。更には、蛍光色素基およびインターカレート基は、2から10個、更には2から5個、特に2個のα−アミノ酸残基おきに置換されているのが好ましい。即ち、蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸残基およびインターカレート基で置換されたα−アミノ酸残基が、2から10個、更には2から5個、特に2個のα−アミノ酸残基おきに存在するのが好ましい。また、蛍光色素基で置換されたα-アミノ酸残基は、インターカレート基で置換されたα−アミノ酸残基の間に存在するのが好ましい。このような場合には、インターカレート基が、二本鎖核酸の塩基対間に効果的にインターカレートして、蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が効果的に解消して蛍光強度が著しく増強し、それによって二本鎖核酸を選択的に検出することのできる。また、本発明の蛍光試薬であるペプチドは、全α−アミノ酸残基数が、4から40個、特に4から25個であるペプチドが好ましい。更には全α−アミノ酸残基数4から16個、特に4から10個であるペプチドが好ましい。
また、本発明では、蛍光色素基は、インターカレーターとしての機能を有しない蛍光色素基が好ましい。
【０００８】
より具体的には、本発明の蛍光試薬は、下記式Ｉで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩が好ましい。
【化５】
2005289810.tif 000003
（式中、Xはインターカレート基または蛍光色素基を表し、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表し、ｎは1から8の整数を表す。但し、式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるもしくは同じ蛍光色素基またはインターカレート基であってもよく、式Iにおいては必ずインターカレート基および蛍光色素基の両者が存在する。また、式IにおけるそれぞれのYおよびZも、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい）。
上記式Ｉで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体は新規な化合物である。
【０００９】
本発明の蛍光試薬におけるインターカレート基、並びに式ＩにおけるXのインターカレート基としては、二本鎖DNAもしくは二本鎖RNAの塩基対の間に平行して挿入し得るものであればいずれの基であってもよい。かかるインターカレート基としては、例えば、置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラキノン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラセン骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンジイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいピレン骨格を有する基などが挙げられる。ここで言う置換基としては、例えば、塩素、フッ素、臭素などのハロゲン原子；メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、トリフルオロメチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1から6のアルキル基；メトキシ、エトキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどの炭素原子数1から6のアルコキシ基；ホルミル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルなどの炭素原子数1から7のアシル基；アセチルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシなどの炭素原子数2から7のアシルオキシ基；アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミメチル、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチルなどの炭素原子数1から6のアルキル基が1つもしくは2つ置換されていてもよい炭素原子数1から6のアミノアルキル基などが挙げられる。これらの置換基は、アクリジン骨格、アントラキノン骨格、アントラセン骨格等のいずれの位置に置換されていてもよく、また2つ以上の複数の置換基がこれらの骨格に置換されていてもよい。
また、アクリジン骨格、アントラキノン骨格、アントラセン骨格等には、本発明の蛍光試薬、並びに式ＩのペプチドにおけるYと結合するための官能基を有していてもよく、このような官能基としては、例えば、-CO-、-NH-、-SO2-、-PO2-、-S-、-N(NH)NH-、これらの官能基が炭素原子数1から6のアルキレン基の末端もしくは側鎖に結合した基などが挙げられる。
【００１０】
上記した置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラキノン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラセン骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンジイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいピレン骨格を有する基の具体的な例として以下のものが挙げられる。
【００１１】
置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基
【化６】
2005289810.tif 000004
置換基を有していてもよいアントラキノン骨格を有する基
【化７】
2005289810.tif 000005
置換基を有していてもよいアントラセン骨格を有する基
【化８】
2005289810.tif 000006
置換基を有していてもよいナフタレンイミド骨格を有する基
【化９】
2005289810.tif 000007
置換基を有していてもよいナフタレンジイミド骨格を有する基
【化１０】
2005289810.tif 000008
置換基を有していてもよいピレン骨格を有する基
【化１１】
2005289810.tif 000009
【００１２】
本発明の蛍光試薬における蛍光色素基、並びに式ＩにおけるXの蛍光色素基としては、蛍光を発する基であれば特に限定されず、いずれの基であってもよい。本発明では、蛍光色素基は、インターカレーターとしての機能を有しない蛍光色素基が好ましい。このような蛍光色素基としては、例えば、置換基を有していてもよいキサンテン骨格を有する基、置換基を有していてもよいインドール骨格を有する基、置換基を有していてもよい含ホウ素および窒素インダセン骨格を有する基などが挙げられる。ここで言う置換基としては、上記したインターカレート基の場合の置換基と同様のものが挙げられる。更には、カルボキシ基、スルフォン酸基、イミノ基、あるいはこれらの官能基が炭素原子数1から6のアルキレン基の末端もしくは側鎖に結合した基などが挙げられる。また、キサンテン骨格を有する基の場合には、キノリジジン環、ピロール環などが縮合する形態の置換基が挙げられる。インドール骨格を有する基の場合には、2つのインドール骨格が炭素原子数1から6のアルキレン基、アルケニレン基などを介して結合したものでもよい。含ホウ素および窒素インダセン骨格を有する基の場合には、フェニル基、あるいは上記したインターカレート基の場合の置換基と同様の置換基が置換したフェニル基などが置換していてもよい。
また、上記したインターカレート基の場合と同様に、本発明の蛍光試薬、並びに式ＩのペプチドにおけるYと結合するための官能基を有していてもよい。
このような蛍光色素基としては、具体的には、以下のようなものが好ましいものとして挙げられる。
【００１３】
置換基を有していてもよいキサンテン骨格を有する基
【化１２】
2005289810.tif 000010
置換基を有していてもよいインドール骨格を有する基
【化１３】
2005289810.tif 000011
置換基を有していてもよい含ホウ素および窒素インダセン骨格を有する基
【化１４】
2005289810.tif 000012
【００１４】
式Ｉにおいて、それぞれのXは、お互いに異なるもしくは同じ蛍光色素基またはインターカレート基であってもよく、式Iにおいては必ずインターカレート基および蛍光色素基の両者が存在する。特に、式Ｉのペプチドにおいては、蛍光色素基とインターカレート基とはお互いに隣接して存在するのが好ましく、特に蛍光色素基の両側にインターカレート基が存在するような構造のペプチドが好ましい。式Ｉにおいて、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基（結合手を2つ持つ）を表し、Zはα−アミノ酸を構成する1価の基（結合手を1つ持つ）を表す。即ち、Yはα−アミノ酸から-CH(NH2)COOHを除いた残りの該α−アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zは１価の基を表す。具体的には、Yは-A-W-で表される基であり、ここで、Aはメチレン、エチレン、プロピレン、メチルメチレンンなどの炭素原子数1から6の直鎖もしくは分岐アルキレン基を表し、Wは単結合、NH、CO、CONH、NHCO、O、SまたはHNC(NH)NHを表す。ZはA-W-Hで表される基である。これらのYおよびZは、α−アミノ酸である、例えばアラニン、リシン、ノルリシン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、システインなどから-CH(NH2)COOHを除いた残りの該α−アミノ酸を構成するそれぞれ2価の基あるいは1価の基を表す。式IにおけるそれぞれのYおよびZは、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい。式Ｉのペプチドにおいて、ｎは1から8の整数を表す。好ましくは、nは1から5、特に好ましくは、nは1から3の整数である。
【００１５】
本発明の蛍光試薬であるペプチド並びに式Ｉのペプチドは、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩であってもよい。N末端が置換された誘導体としては、例えば、ホルミル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルなどの炭素原子数1から7のアシル基；メトキシカルボニル、ブトキシカルボニル、t-ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニルなどの炭素原子数2から7のアルコキシカルボニル基等がN末端のアミノ基に置換された誘導体などが挙げられる。C末端が置換された誘導体としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、トリフルオロメチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1から6のアルキル基；アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチルなどの炭素原子数1から6のアミノアルキル基；アミノ基等がC末端のカルボニル基に置換された誘導体などが挙げられる。本発明の蛍光試薬であるペプチドおよび式Ｉのペプチドの塩あるいはそれらののN末端もしくはC末端が置換された誘導体の塩としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸；塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸等との酸付加塩が挙げられる。また、本発明の蛍光試薬であるペプチドまたは式Ｉのペプチドのカルボキシル基とのナトリウム塩、カリウム塩なども挙げられる。
【００１６】
本発明の式Ｉのペプチドの特に好ましい例としては、以下の式ＩＩで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩が挙げられる。
【化１５】
2005289810.tif 000013
【００１７】
本発明の蛍光試薬は、反応性の官能基を有する適当なスペーサー鎖を介して蛍光色素基とインターカレート基を結合させることにより合成することができる。これらの合成反応は、それ自体周知の方法によって行うことができる。
本発明の蛍光試薬が、蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸残基とインターカレート基で置換されたα−アミノ酸残基を含むα−アミノ酸残基からなるペプチドである場合には、そのようなペプチドの合成は、α−アミノ酸、蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸およびインターカレート基で置換されたα−アミノ酸のそれぞれのアミノ基もしくはカルボキシ基の保護誘導体を、合成しようとするペプチドに対応させて、順次ペプチド結合により連結して行うこともでき、また周知の固相法もしくは液相法により合成することもでき、ペプチド合成機により合成することもできる。これらの合成法はそれ自体周知であり、周知の合成法を利用できる。あるいは、α−アミノ酸の保護誘導体と蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸の保護誘導体またはインターカレート基で置換されたα−アミノ酸の保護誘導体とを反応させてペプチドを合成した後に、蛍光色素基またはインターカレート基を導入する反応を行って、本発明のペプチドを合成することもできる。これらの合成に用いるアミノ基もしくはカルボキシ基の保護基としては、上記したペプチドのN末端もしくはC末端が置換された誘導体について例示した官能基が挙げられる。
【００１８】
本発明の式Iのペプチドは、下記式IIIの蛍光色素基置換α−アミノ酸あるいはインターカレート基置換α-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体と下記式IVのα-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体とを用いて、周知のペプチド合成反応を行うことによって合成することができる。
【００１９】
【化１６】
2005289810.tif 000014
ペプチド合成は、上記したと同様に、両者の保護誘導体を順次ペプチド結合により連結して行うこともでき、また周知の固相法もしくは液相法により合成することもでき、ペプチド合成機により合成することもできる。あるいは、式IVのα−アミノ酸の保護誘導体と式IIIの蛍光色素基で置換されたα−アミノ酸の保護誘導体またはインターカレート基で置換されたα−アミノ酸の保護誘導体とを反応させてペプチドを合成した後に、蛍光色素基またはインターカレート基を導入する反応を行って、式Iのペプチドを合成することもできる。
【００２０】
上記式IIIの蛍光色素基置換α-アミノ酸あるいはインターカレート基置換α-アミノ酸および上記式IVのα-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体としては、上記した保護基で保護されたものが挙げられる。上記式IIIの蛍光色素基置換α-アミノ酸あるいはインターカレート基置換α-アミノ酸は、下記式Vで表されるα-アミノ酸と下記式VIで表される蛍光色素誘導体あるいはインターカレーター誘導体(式VIにおいてDは、ハロゲン原子などの反応性基を表す)とを反応させることにより得ることができる。
【００２１】
【化１７】
2005289810.tif 000015
式IVまたはVのα-アミノ酸としては、上記したアラニン、リシン、ノルリシン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、システインなどが挙げられる。
かくして式Iのペプチドを得ることができる。式IのペプチドのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩は、式Iのペプチドの合成の段階で得ることもでき、また式Iのペプチドからそれ自体周知の方法で得ることもできる。
式Iで表されるペプチド以外の本発明の蛍光試薬であるペプチドも、式Iのペプチドと同様に合成することができる。
【００２２】
本発明の蛍光試薬は、二本鎖DNA、二本鎖RNAなどの二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中のインターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を高感度で選択的に検出することのできる。
本発明の蛍光試薬を用いて、二本鎖核酸を含むことが疑われる検体中の二本鎖核酸を検出するには、該蛍光試薬を検体と接触させて、該蛍光試薬の蛍光強度の増強度を測定することにより検出できる。蛍光試薬と検体を接触させる際の具体的条件、蛍光強度の具体的方法等は、それ自体周知の方法を採用することができる。本発明の蛍光試薬は、DNAチップまたはDNAマイクロアレイでのDNA検索に適用できる。即ち、サンプルDNAをDNAチップまたはDNAマイクロアレイに固定されたプローブNDAに反応させて、二本鎖DNA形成させ、この二本鎖DNAを本発明の蛍光試薬で高感度でかつ選択的に検出することができる。従って、本発明の蛍光試薬によれば、従来必要とされたサンプルDNAごとにラベル化試薬でラベル化する必要がなくなり、ラベル化剤の導入による二本鎖DNA形成能の低下が引き起こされたり、遺伝子の変異や多型の診断に誤った結果を導くこともない。
【００２３】
【実施例】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
FITC-K2-Acr2の合成法
下記式で表される本発明の蛍光試薬である、インターカレート基としてアクリジン基、蛍光色素基としてフルオレセイン基が置換したリジンからなるペプチドを合成した。
【化１８】
2005289810.tif 000016
【００２５】
１. Ac-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Mtt)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-樹脂の合成
a) 方法
リアクションベッセルにFmoc-NH-SAL Resin 0.20g(0.5mmol/g)を入れ、カートリッジ1, 7にFmoc-Lys(Acr)-OHを0.21gずつ、カートリッジ2, 3, 5, 6にFmoc-Lys(Boc)-OHを0.19gずつ、カートリッジ4にFmoc-Lys(Mtt)-OHを0.25g入れた。後は、Applied Biosystems社の431Aペプチドシンセサイザーを用いて合成を行った。方法は、standard Fmoc法で行い、N末端はアセチル化した。
b) 結果
性状：黄色固体
収量：0.40g
【００２６】
２．Ac-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Mtt)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-樹脂のMtt基の脱
保護、FITCの修飾、レジンからの切り出しおよび側鎖の脱保護
a) 方法
Mtt基の脱保護：スクリュー管にレジン0.40gを入れ、これに過剰のジクロロメタン（DCM）を加えて30分かけて膨潤させた。その後、過剰のDCMを窒素ガスで除いた。その後、DCM:TFA:TIS（トリイソプロピルシラン）=94:1:5の混合溶液5mlを加えて2分攪拌し、窒素ガスで溶媒を除いた。この操作を3回繰り返して、吸引濾過しDCM、トリエチルアミン、DCMで洗浄後、減圧乾燥させた。
FITCの修飾：その後、NMP4mlを加えて30分間攪拌して膨潤させ、その後トリエチルアミン0.15mlを加えて攪拌した。それから、FITC 0.4gを加えて室温で12時間攪拌した（カイザーテスト）。その後吸引濾過し、NMP、DCMで洗浄して減圧乾燥させた。
樹脂からの切り出し及び側鎖の脱保護）：m-クレゾール 0.08ml、チオアニソール 0.48ml、TFA 3.44mlを加えて室温で1時間半撹拌した。その後、吸引濾過しTFAで洗浄した。TFAを減圧留去した後、氷浴中でエーテル15ml加えた。超音波照射後、しばらく放置し、上澄み液を取り除いた。次に、氷浴中で酢酸エチル15mlを加えて、超音波照射後、しばらく放置した。その後、吸引濾過しエーテルで洗浄後、減圧乾燥させた。
【００２７】
b) 結果
性状：黄橙色固体
収量：0.21g
【００２８】
３．Ac-Lys(Acr)-(Lys)2-Lys(FITC)-(Lys)2-Lys(Acr)-NH2 (FITC-K2-Acr2)のHPLCによる純度チェック
a) 方法
目的化合物の純度をチェックするために、HPLCによる分析を行った。条件は、以下の通りである。
検出波長：210nm
カラム：Inertsil ODS-3（4.6×250mm）
試料注入溶媒：超純水
流速：1ml/min
溶離液A:0.1%TFA水溶液
溶離液B:70%アセトニトリル/0.1%TFA溶液
グラジエント条件
【表１】
2005289810.tif 000017
【００２９】
b) 結果
HPLCの精製により、R.T.=21minとR.T.=24min付近に2つの大きなピークが検出され、TOF MASSよりR.T.=21minのピークがFITCが修飾されてない化合物、R.T.=24minのピークが目的化合物であることが分かった。FITC修飾後のカイザーテスト（樹脂上のアミノ基をニンヒドリンにより検出する方法）で99%以上FITCが反応したという結果が得られた。
精製されたFITC-K2-Acr2のHPLCチャートを図１に示した。また、精製されたFITC-K2-Acr2のTOF MASSデータを図２に示した。
【００３０】
実施例２
蛍光スペクトル測定
二本鎖DNA、一本鎖DNAを添加していった時のFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトルを測定し、二本鎖DNAに対して有効に機能するかどうかを調べた。
１. Calf thymus DNA添加に伴うFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトル測定
a) 方法
以下の条件で、本発明の蛍光試薬であるFITC-K2-Acr2に二本鎖DNAであるCalf thymus DNA添加して蛍光スペクトルを測定した。
測定溶液：10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.3), 0.2M NaCl, 25℃
セル中の色素濃度：0.16μM、[ct DNA]=0.25mM(-bp)、[dye]=0.1mM
EX Slit:10nm, EM Slit:5nm、λex=492nm
b) 結果
得られた蛍光スペクトルを図３に示した。図３から分かるように、Tris-HCl buffer(pH8.3)の場合は、約25倍の蛍光強度の増大が起きた。
【００３１】
２. poly[d(A-T)]2添加に伴うFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトル測定
a) 方法
上記１と同様にTris-HCl buffer(pH8.3)を用い以下の条件で、poly[d(A-T)]2添加に伴うFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトルを測定した。
測定溶液：10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.3), 0.2M NaCl, 25℃
セル中の色素濃度：0.16μM、[poly[d(A-T)]2]=1.10mM(-bp)、
[dye]=0.1mM
EX Slit:10nm, EM Slit:5nm
b) 結果
得られた蛍光スペクトルを図４に示した。ほとんど図３のct DNAの場合と同様の結果が得られた。
【００３２】
３. poly[d(G-C)]2添加に伴うFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトル測定a) 方法
上記１と同様に、以下の条件で、poly[d(G-C)]2添加に伴うFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトルを測定した。
測定溶液：10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.3), 0.2M NaCl, 25℃
セル中の色素濃度：0.16μM、[poly[d(G-C)]2]=1.01mM(-bp)、
[dye]=0.1mM
EX Slit:10nm, EM Slit:5nm
b) 結果
得られた蛍光スペクトルを図５に示した。ct DNA、poly[d(A-T)]2と同様の結果が得られた。
【００３３】
４．polydT添加に伴うFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトル測定
a) 方法
以下の条件で、一本鎖DNAであるpolydTを添加してFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトルを測定した。
測定溶液：10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.3), 0.2M NaCl, 25℃
セル中の色素濃度：0.16μM、[polydT]=1.07mM(-b)、[dye]=0.1mM
EX Slit:10nm, EM Slit:5nm
b) 結果
得られた蛍光スペクトルを図６に示した。一本鎖 DNAであるpolydT添加に伴ってほとんで蛍光強度は変化しなかった。
【００３４】
５. polydA添加に伴うFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトル測定
同様に以下の条件で、一本鎖DNAであるpolydAを添加してFITC-K2-Acr2の蛍光スペクトルを測定した。
測定溶液：10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.3), 0.2M NaCl, 25℃
セル中の色素濃度：0.16μM、[polydA]=1.04mM(-b)、[dye]=0.1mM
EX Slit:10nm, EM Slit:5nm
b) 結果
得られた蛍光スペクトルを図７に示した。一本鎖DNAであるpolydA添加に伴ってもほとんで蛍光強度は変化しなかった。
【００３５】
従って、FITC-K2-Acr2は二本鎖DNAと結合することによって、その蛍光強度は20〜25倍増大するが、一本鎖DNAを添加してもほとんど蛍光強度は変化しなかった。
【００３６】
【発明の効果】
以上の結果より、二本鎖核酸を選択的に検出できる本発明の蛍光色素としてFITC-K2-Acr2が有用であるということが示された。本発明の蛍光試薬の蛍光メカニズムは従来にない概念に基くものである。本発明の蛍光試薬の蛍光メカニズムを図８の模式図に示した。即ち、本発明の蛍光色素基およびインターカレート基を含有する蛍光試薬は、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中のインターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光色素基とインターカレート基とのスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を選択的に検出することのできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の蛍光試薬である精製されたFITC-K2-Acr2HPLCチャート示す。
【図２】図２は、本発明の蛍光試薬である精製されたFITC-K2-Acr2のTOF MASSデータを示す。
【図３】図３は、本発明の蛍光試薬であるFITC-K2-Acr2に二本鎖DNAであるCalf thymus DNAを添加して測定した蛍光スペクトルを示す。
【図４】図４は、本発明の蛍光試薬であるFITC-K2-Acr2に二本鎖DNAであるpoly[d(A-T)]2を添加して測定した蛍光スペクトルを示す。
【図５】図５は、本発明の蛍光試薬であるFITC-K2-Acr2に二本鎖DNAであるpoly[d(G-C)]2を添加して測定した蛍光スペクトルを示す。
【図６】図６は、本発明の蛍光試薬であるFITC-K2-Acr2に一本鎖DNAであるpolydTを添加して測定した蛍光スペクトルを示す。
【図７】図７は、本発明の蛍光試薬であるFITC-K2-Acr2に一本鎖DNAであるpolydA を添加して測定した蛍光スペクトルを示す。
【図８】図８は、本発明の蛍光試薬の蛍光メカニズムを示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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