(57)【要約】【課題】  ＰＣＲ法でラクトバチルス属細菌を属特異的に検出できるようにする。【解決手段】  ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１乃至５に示される塩基配列(5´)CGAAGAAGTGCATCGGAAAC(3´)          （配列番号1）(5´)GGAGAAGTGCATCGGAAAC(3´)          （配列番号2）(5´)TTAGGTTAACAGAAGATGTCAAGAC(3´)    （配列番号3）(5´)TTAGGTTGGCAGAAGATGTC(3´)          （配列番号4）(5´)CTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGAC(3´)    （配列番号5）のいずれかを含むオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法を用いてラクトバチルス属を検出するときのプライマーとして使用する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１乃至５に示される塩基配列
(5´)CGAAGAAGTGCATCGGAAAC(3´)         （配列番号1）
(5´)GGAGAAGTGCATCGGAAAC(3´)          （配列番号2）
(5´)TTAGGTTAACAGAAGATGTCAAGAC(3´)    （配列番号3）
(5´)TTAGGTTGGCAGAAGATGTC(3´)         （配列番号4）
(5´)CTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGAC(3´)   （配列番号5）
のいずれかを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成された２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、少なくともその一方が請求項１記載の配列番号１乃至５のいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするラクトバチルス属検出用プライマー。
【請求項３】
２種のオリゴヌクレオチドが含む塩基配列が、配列番号１と３、１と４、１と５、２と３、２と４又は２と５の組合わせから選ばれる請求項２記載のラクトバチルス属検出用プライマー。
【請求項４】
請求項２又は３記載のプライマーを検体に加え、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うことを特徴とするラクトバチルス属の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス属細菌の検出方法に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応法（Polymerase Chain Reaction、以下ＰＣＲ法と省略する）を行い、増幅されたプライマーの伸長物を検出することによりラクトバチルス属細菌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルス属細菌（Lactobacillus）は、グラム陽性細菌の一つであり、チーズやヨーグルトの製造用の微生物として、古来から産業的に利用されていた有益菌である。一方、ラクトバチルス属細菌は、酒類の腐造原因菌としても知られており、発酵食品製造上において管理することが必要な有害菌である。ラクトバチルス属細菌の中の限られた種がこれらの有益菌又は有害菌に該当し、有益菌や有害菌を迅速に検出する方法が既に開発されている。
【０００３】
ビールの有害菌としてラクトバチルス  ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス  カゼイ(Lactobacillus casei)などいくつかの乳酸菌が指摘されており、例えば、特開平７−２８９２９５号公報（特許文献１）、特開平１０−２１０９８０号公報（特許文献２）、あるいは特開平１０−２３４３７７号公報（特許文献３）において、１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列(以下１６ＳｒＤＮＡと称する)を標的とするＰＣＲ法による迅速検出法が知られている。また、特開平６−９０７９３号公報（特許文献４）において、日本酒の有害菌(火落ち菌)検出用として、１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の間の領域を標的とする、ＰＣＲ法による迅速検出法が知られている。これらの技術はラクトバチルス属の特定の株、種、グループ(幾つかの種の集合体)を検出する技術である。また、特開平１１−１５１０９７号公報（特許文献５）においては、ラクトバチルス属の種を特定できるプライマーを複数種準備することにより、ラクトバチルス属の菌種の同定や解析が行われている。
【特許文献１】特開平７−２８９２９５号公報
【特許文献２】特開平１０−２１０９８０号公報
【特許文献３】特開平１０−２３４３７７号公報
【特許文献４】特開平６−９０７９３号公報
【特許文献５】特開平１１−１５１０９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、一般的な食品には多種の汚染微生物が見られ、ラクトバチルス属細菌が含まれることも多い。ラクトバチルス属に属する各種細菌の分離源として数多くの食品が挙げられているように(食品衛生検査指針(微生物編)  社団法人  日本食品衛生協会,p242〜245,1990)、一般的な食品からはラクトバチルス属の特定の種だけではなく、ラクトバチルス属全域から複数種が検出されるのが実状であり、ラクトバチルス属細菌を包括的に検出できる迅速な検査法の開発が望まれている。
【０００５】
本発明は、このような従来技術の課題に対し、ＰＣＲ法でラクトバチルス属全域の細菌を検出できるようにするため新規にプライマーを開発し、ラクトバチルス属細菌を迅速に検出できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＤＮＡ配列において、属レベルで保存されており、他属の配列とは異なっている領域を見出し、該領域の中の特定配列を標的とするプライマーを新規に開発し、そのプライマーをＰＣＲ法で用いることによりラクトバチルス属全域から細菌を良好に検出できること、または、ラクトバチルス属を他属から良好に識別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１乃至５に示される塩基配列
(5´)CGAAGAAGTGCATCGGAAAC(3´)         （配列番号1）
(5´)GGAGAAGTGCATCGGAAAC(3´)          （配列番号2）
(5´)TTAGGTTAACAGAAGATGTCAAGAC(3´)    （配列番号3）
(5´)TTAGGTTGGCAGAAGATGTC(3´)         （配列番号4）
(5´)CTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGAC(3´)   （配列番号5）
のいずれかを含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００８】
また、本発明は、ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成された２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、少なくともその一方がの配列番号１乃至５のいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるラクトバチルス属検出用プライマーを提供し、特に、２種のオリゴヌクレオチドが含む塩基配列が、配列番号１と３、１と４、１と５、２と３、２と４又は２と５の組合わせから選ばれる態様を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、上述のプライマーを検体に加え、ＰＣＲ法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うラクトバチルス属の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＰＣＲ法でラクトバチルス属細菌を検出するにあたり、高い検出感度と選択性を得ることができる。また試料中に存在する異属の細菌の増殖を考慮にいれる必要がなくなり、熟練を必要とすることなく、簡易にラクトバチルス属細菌を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明がラクトバチルス属細菌の検出のために行うＰＣＲ法は、Saikiが開発したPolymerase Chain Reaction法（Science,230,1350(1985)）に基づくものである。
【００１２】
本発明において、ラクトバチルス属細菌の特定は、標準菌株を用いた場合は、その標準菌株の属名及び種名による。また標準菌株でないものを用いた場合は、常法によりラクトバチルス属細菌に特有の形態（グラム陽性桿菌）及び性状（カタラーゼ陰性、芽胞非形成若しくは嫌気性）を確認した後、市販の同定キットである「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」を用いた同定による。
【００１３】
具体的同定方法としては、前記同定キットに従い細菌液を調製し、この細菌液を「アピ５０CHL培地（日本ビオメリュー（株）販売）」に添加して接種菌液を調製する。次に、この接種菌液を「アピ５０CHLプレート（日本ビオメリュー（株）販売）」のチューブ部分に接種した後、ミネラルオイルを重層する。プレートに蓋をし、３５℃で４８時間培養する。培養後、培地の色の変化により各生化学性状を判定し、解析ソフトであるAPILAB Plus（日本ビオメリュー（株）販売）で同定する。
【００１４】
なお、「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」同定キットを用いて同定した種名と、相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いた１６ＳｒＤＮＡ解析より推定した群が異なる場合は、本発明では、「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」同定キットを用いて同定した種名を基準とする。
【００１５】
相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いた１６ＳｒＤＮＡ解析による群の具体的な推定方法は、まず、単一コロニーの分離と純粋培養を行った後、ＤＮＡの熱水抽出を行うため、滅菌精製水にコロニーを懸濁し、１００℃で１０分間の湯せんで加熱する。次に、１６ＳｒＲＮＡをコードする全領域に対する共通のプライマーである下記に示す２種のオリゴヌクレオチド[Journal of Bacteriology, 173 (2), p697-703 (1991)]を用い、
(5´)AGAGTTTGATCATGGCTCAG(3´)         （配列番号６）
(5´)GGTTACCTTGTTACGACTT(3´)          （配列番号７）
前記熱水抽出物をＤＮＡの鋳型としてＰＣＲを行った後（細菌で保存性が高い配列部分をプライマーとしているので、未知の細菌であっても１６ＳｒＲＮＡをコードする約１４００塩基対のＤＮＡが増幅される。）、ＰＣＲ産物を電気泳動し、１６ＳｒＲＮＡをコードする約１４００塩基対のＤＮＡの増幅を確認する。次に、ＰＣＲ産物の塩基配列を「DNA Sequencer ABI PRISM 16キャピラリー（ABI社）」で解読する。日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）の相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）により、当該塩基配列と相同性の高い塩基配列を検索し、群を推定する。
【００１６】
本発明では、ＰＣＲ法によりラクトバチルス属細菌を検出するに際して使用するプライマーとして、特定の塩基配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、即ち、ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１乃至５に示される塩基配列
(5´)CGAAGAAGTGCATCGGAAAC(3´)         （配列番号1）
(5´)GGAGAAGTGCATCGGAAAC(3´)          （配列番号2）
(5´)TTAGGTTAACAGAAGATGTCAAGAC(3´)    （配列番号3）
(5´)TTAGGTTGGCAGAAGATGTC(3´)         （配列番号4）
(5´)CTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGAC(3´)   （配列番号5）
のいずれかを含むオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１７】
これら配列番号１乃至５のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドの配列は、ラクトバチルス属細菌及び異属の細菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を詳細に解析した結果、ラクトバチルス属細菌の異株間に保存され、異属と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものである。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１乃至５で示されるいずれかの塩基配列を含む限り、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものも含まれる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドには、ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法で増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5´末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したものが含まれる。この他、5´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものや、デオキシリボース骨格間を結合しているリン酸の中の酸素をイオウ原子に置き換えることによりアンチセンス化したもの等が含まれる。
【００１９】
本発明の配列番号１乃至５の塩基配列を含むプライマーのうち、配列番号１又は配列番号２を含むものは正規鎖側プライマーであり、配列番号３、配列番号４又は配列番号５を含むものは、逆鎖側プライマーである。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法でラクトバチルス属を検出する場合の１組のプライマーの一方として使用する場合に、これと組み合わせて使用するもう一方のプライマーに関し、本発明の配列番号１又は配列番号２を含むプライマーは、公知の逆鎖側プライマーと組合せ、配列番号３、配列番号４又は配列番号５を含むプライマーは、公知の正規鎖側プライマーと組み合わせて使用できるが、前述の配列番号１と３、１と４、１と５、２と３、２と４又は２と５に示されるいずれかの組合わせとして使用することが好ましい。
【００２１】
正規鎖側と逆鎖側の１組のプライマーを使用し、ラクトバチルス属細菌に特異的なオリゴヌクレオチドを増幅するＰＣＲ法自体は公知の方法に従うことができる。即ち、まず、検体を熱処理することにより検体中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖に分離し、これに１組のプライマーを作用させて、相補的な検体のオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズさせ、次に、ＤＮＡポリメラーゼと４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）との存在下でプライマーの下流の領域を選択的に合成する。そしてこの操作を２０〜４０サイクル程度繰り返すことにより、検体中の特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーの伸長物として増幅することができる。また、この増幅は、電気泳動、クロマトグラフィー等により確認することができ、これにより検体中のラクトバチルス属を容易にかつ確実に検出することが可能となる。
【００２２】
なお、このＰＣＲ法を適用する検体としては、マヨネーズ、ドレッシング、乳製品等の食品、食品等の抜き取り材料、患者の吐瀉物、又は糞便等をあげることができる。
【実施例１】
【００２３】
（１）検体の調製
ラクトバチルス属細菌として、表１中の縦の見出し欄に示したものを用い、それぞれ増菌用の平板培地に接種し、３０℃で三晩培養した。菌体を掻き取り、０．８５％食塩水に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、遠心分離した上澄液を検体とした。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０7ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
【００２４】
（２）プライマーの合成
ラクトバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とする、逆鎖側又は正規鎖側プライマーとして、配列番号１乃至５のいずれかの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをホスホアミダイト法により合成した。
【００２５】
（３）反応液の調製とＰＣＲ反応
検体液５μｌに１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μｌ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）４μｌ、表１に示すように、正規鎖側プライマーとして配列番号１又は２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、逆鎖側プライマーとして配列番号３、４又は５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）０．２５μｌを加え、水で５０μｌとした。
【００２６】
熱変成（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し反応させた。
【００２７】
反応液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによる染色を行った。即ち、電気泳動は３％のアガロースゲルを使用し、ＴＢＥバッファー中、１００ボルトで３０分行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この場合、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流すことにより、相対比較によって、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００２８】
結果を表１に示す。表１中の＋は、約３９０塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されたことを示している。なお、菌種によっては１６ＳｒＤＮＡ配列の増幅され得る部分に塩基対の挿入または欠落が起こっており、ＤＮＡ増幅物の大きさは変動し得る。
【００２９】
［表１］
2005160333.tif 000002
【００３０】
表１中のカッコ内は、相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いて１６ＳｒＤＮＡ解析により推定した群である。
【００３１】
表１の結果から、本発明によれば、ラクトバチルス属を正しく検出できることがわかる。
【実施例２】
【００３２】
実施例１の各プライマーの組合せで行ったＰＣＲ反応によるラクトバチルス属の検出結果が、ラクトバチルス属に対し選択的であることを確認するため、臨床検査、食品衛生検査等において高頻度で現れるバチルス属でコアグランス以外の種の菌を表２に示すように選び、バチルスステアロサーモフィルスは５５℃で、他種は３５℃で平板培養後、実施例１と同様にして各プライマーの組合せごとに特定の長さの塩基対が増幅された否かを調べた。
【００３３】
結果を表２に示す。表２中の−は、約３９０塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されなかったことを示している。なお、菌種によっては１６ＳｒＤＮＡ配列の増幅され得る部分に塩基対の挿入または欠落が起こっており、ＤＮＡ増幅物の大きさは変動し得る。
【００３４】
［表２］
2005160333.tif 000003
【００３５】
表２の結果から、本発明によれば、ラクトバチルス属以外の細菌は検出できないことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチド、プライマー、及びこのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出方法は、マヨネーズ、ドレッシング、乳製品等の食品をはじめとする種々の検体において、ラクトバチルス属細菌を検出するために有用となる。
[配列表]
SEQUENCE LISTING
<110> Q.P.Corporation
<120> oligonucleotides and a method for detection of Lactobacillus using the oligonucleotides as primers on the PCR method
<130> PT03-0089
<160> 7
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Inventor: Takeuchi, Akira
Inventor: Kobayashi, Kaoru
Inventor: Sashihara, Nobuhiro
<400> 1
cgaagaagtg catcggaaac
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggagaagtgc atcggaaac
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ttaggttaac agaagatgtc aagac
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttaggttggc agaagatgtc
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cttagatttg catagtatgt caagac
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<400> 6
agagtttgat catggctcag
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<400> 7
ggttaccttg ttacgactt