(57)【要約】【課題】  ＲＮＡの学問的・応用的用途が次第に広まってゆく傾向にある中で、ＲＮＡを従来よりも効率的に合成する方法が求められていた。【解決手段】  ＲＮＡを合成するための方法であって、ＲＮＡポリメラーゼ反応液中に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または、ベタインを添加することを特徴とするＲＮＡを効率的に合成する方法。さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の含有量が体積比２％以上であり、ベタインの含有量が０．２Ｍ以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡの合成方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡを合成するための方法であって、ＲＮＡポリメラーゼ反応液中に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または、ベタインを添加することを特徴とするＲＮＡを効率的に合成する方法。
【請求項２】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の含有量が体積比２％以上であり、ベタインの含有量が０．２Ｍ以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡの合成方法。
【請求項３】
ベタインが、第四アンモニウム塩、スルホニウム塩、ホスホニウム塩から選択される分子内塩である請求項１または２に記載のＲＮＡの合成方法。
【請求項４】
１ｍＭ以上のポリアミン類、１ｍＭ以上の塩、および３ｍＭ以上の還元剤を含有する請求項１または２記載のＲＮＡの合成方法。
【請求項５】
１２ｍＭ以上のヌクレオチドおよび１２ｍＭ以上のマグネシウムイオンを含有する請求項１または２に記載のＲＮＡの合成方法。
【請求項６】
ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼである請求項１または２に記載のＲＮＡの合成方法。
【請求項７】
反応温度が３７℃〜６０℃である、請求項１または２に記載のＲＮＡの合成方法。
【請求項８】
無機ピロフォスファターゼを含有することを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡの合成方法。
【請求項９】
無機ピロフォスファターゼが酵母または細菌由来のものであることを特徴とする請求項８に記載のＲＮＡの合成方法。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載のＲＮＡの合成方法を行うための、反応組成物、試薬、またはキット。
【請求項１１】
請求項１〜９に記載の方法、および／または、請求項８に記載の反応組成物、試薬、またはキットを用いて合成されたＲＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、in situ ハイブリダイゼーション、アンチセンスＲＮＡアッセイ、ＲＮＡマイクロインジェクション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｉアッセイ、リボザイムアッセイ、ＲＮＡ遺伝子アレイ、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする、ＲＮＡの利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成するための反応用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ＲＮＡポリメラーゼは遺伝子の転写発現に関するキー酵素として多くの研究がなされ、様々な機能、性質が知られてきている。なかでもＴ７、Ｔ３及びＳＰ６といったバクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼについては、大腸菌や高等生物のＲＮＡポリメラーゼとは異なり、単一のポリペプチド鎖のみで活性を発現することから、転写メカニズムを解析するための格好の材料とされている。また、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型に、ＮＴＰを基質として、プロモーター下流の鋳型ＤＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡを合成するという性質及びその際のプロモーター配列に対する認識が非常に厳密であるという性質から、これらファージ由来のＲＮＡポリメラーゼは、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＲＮＡを合成するための酵素として汎用されている。これにより合成されたＲＮＡは、多くの分子生物学的手法、例えばノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション時に用いるＲＮＡプローブ（リボプローブ）として、あるいは細胞もしくは無細胞タンパク合成（翻訳）系に加えて、翻訳される鋳型ＲＮＡとして利用されている。
【０００３】
また一方で、従来ＲＮＡは、遺伝子ＤＮＡから、生命活動を維持するタンパク質を合成する一連の経路における、中間物質としての役割や、リボソームの構成単位としての役割に主に注目が集まっていた。しかしながら、一部のＲＮＡ分子が酵素として機能する（ＲＮＡ酵素、リボザイム）ことが見出され、ＲＮＡが従来知られていたよりも重要な役割を果たしていることが近年になって次第に明らかになってきた。さらに最近になって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｓｅ、ＲＮＡｉ）とよばれる、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）により特異的に遺伝子の発現が抑制されるという現象が発見され、プロテオーム解析から医療分野にいたるまで様々な方面へ応用が可能な革新的な技術として非常に注目されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、ＲＮＡの学問的・応用的用途が次第に広まってゆく傾向にある中で、ＲＮＡを従来よりも効率的に合成する方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ね、反応系中にジメチルスルホキシドおよびベタインを適正な濃度で添加することによりＲＮＡ合成効率が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］  ＲＮＡを合成するための方法であって、ＲＮＡポリメラーゼ反応液中に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または、ベタインを添加することを特徴とするＲＮＡを効率的に合成する方法。
［項２］  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の含有量が体積比２％以上であり、ベタインの含有量が０．２Ｍ以上であることを特徴とする、項１に記載のＲＮＡの合成方法。
（１）上記項１または２に記載のＲＮＡの合成方法において、好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の含有量は体積比４％以上、さらに好ましくは体積比４％以上１５％以下である。
（２）あるいは、上記項１または２に記載のＲＮＡの合成方法において、好ましくは、ベタインの含有量は０．４Ｍ以上、さらに好ましくは０．４Ｍ以上１２Ｍ以下である。
［項３］  ベタインが、第四アンモニウム塩、スルホニウム塩、ホスホニウム塩から選択される分子内塩である項１または２に記載のＲＮＡの合成方法。
（１）上記項３に記載のＲＮＡの合成方法において、好ましくは、分子内塩はトリメチルグリシンである。
［項４］  １ｍＭ以上のポリアミン類、１ｍＭ以上のアルカリ金属塩、および３ｍＭ以上の還元剤を含有する項１または２記載のＲＮＡの合成方法。
（１）上記項４に記載のＲＮＡの合成方法において、好ましくは、ポリアミン類はスペルミジンである。
（２）あるいは、上記項４に記載のＲＮＡの合成方法において、好ましくは、アルカリ金属塩は塩化ナトリウムである。
（３）あるいは、上記項４に記載のＲＮＡの合成方法において、好ましくは、還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。
［項５］  １２ｍＭ以上のヌクレオチドおよび１２ｍＭ以上のマグネシウムイオンを含有する項１または２に記載のＲＮＡの合成方法。
［項６］  ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼである項１または２に記載のＲＮＡの合成方法。
（１）上記項６に記載のＲＮＡの合成方法において、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼから選択されるいずれかのＲＮＡポリメラーゼである。特に好ましくは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、さらに特に好ましくは、耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
［項７］  反応温度が３７℃〜６０℃である、項１または２に記載のＲＮＡの合成方法。
［項８］無機ピロフォスファターゼを含有することを特徴とする上記項１に記載のＲＮＡの合成方法。
［項９］無機ピロフォスファターゼが酵母または細菌由来のものであることを特徴とする上記項８に記載のＲＮＡの合成方法。
［項１０］  項１〜９に記載のＲＮＡの合成方法を行うための、反応組成物、試薬、またはキット。
（１）上記項８に記載のＲＮＡの合成方法を行うための、反応組成物、試薬、またはキットにおいて、好ましくは、反応組成物は、４０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ７．４−８．１）もしくは８０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．４−８．１）、２０−３０ｍＭの塩化マグネシウム、１−２ｍＭのスペルミジン、１−５ｍＭの塩化ナトリウム、５−１０ｍＭのジチオスレイトール、０．２−１Ｍのトリメチルグリシン、体積比１−１０％のジメチルスルホキシド、２０−３５ｍＭのＮＴＰ、２−３ｕｎｉｔ／μｌの耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、および５−１００ｎｇ／μｌのＤＮＡ鋳型からなる。
［項１１］  項１〜９に記載の方法、および／または、項８に記載の反応組成物、試薬、またはキットを用いて合成されたＲＮＡ。
［項１２］  項１１に記載のＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、in situ ハイブリダイゼーション、アンチセンスＲＮＡアッセイ、ＲＮＡマイクロインジェクション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｉアッセイ、リボザイムアッセイ、ＲＮＡ遺伝子アレイ、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする、ＲＮＡの利用方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により提供されるＲＮＡ合成方法により、従来法に比べてＲＮＡの合成効率が向上しており、効率的にＲＮＡを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明はＲＮＡを合成する方法およびそのためのＲＮＡポリメラーゼ反応用組成物である。ここでいうＲＮＡとは、リボースを糖成分とするヌクレオチドがホスホジエステル結合したものを指し、その形態は特に限定されないが、好ましくはｒＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）、５Ｓ  ＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ、リボザイムなどが挙げられる。特に近年注目されている無細胞蛋白合成に用いるには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡが有用である。
【００１０】
本発明のＲＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する酵素を指し、その形態は特に限定されないが、好ましくは生体由来のタンパク質、または生体由来のタンパク質の遺伝子を用いて人工的に合成したタンパク質が用いられ、さらに好適には、バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼタンパク質、さらに好適にはバクテリオファージ由来のＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼタンパク質が用いられる。特に好ましくは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、さらに特に好ましくは、耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。また、これらのタンパク質を本願発明の本質を失わない範囲内で改変し、そのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加させたもの、あるいは、化学修飾されたものも含まれる。
【００１１】
本発明で用いられるＲＮＡ合成方法としては、ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡあるいはＲＮＡ鋳型からの相補的な一本鎖ＲＮＡの合成方法が挙げられる。
具体的には、各ＲＮＡ合成酵素に特異的な認識配列（プロモータ配列）を持つ鋳型核酸、４種類のリボヌクレオシド三リン酸、およびＲＮＡ合成酵素の存在下で、ＲＮＡ合成酵素の特異的プロモータ配列への結合、転写開始、伸長、ターミネータ配列での転写反応の終止（必須ではない）という反応により、ＲＮＡが合成される。
【００１２】
本発明は、上記のＲＮＡ合成方法において、ＲＮＡポリメラーゼ反応液中に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または、ベタイン（別名：トリメチルグリシン）を添加することを特徴とするＲＮＡの合成方法である。
【００１３】
本願発明に用いるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の含有量は好ましくは体積比２％以上であり、さらに好ましくは体積比４％以上、さらに好ましくは体積比４％以上１５％以下である。あまり含有量が低いとＲＮＡ合成効率向上に対する効果がなく、あまり含有量が高いとＲＮＡ合成に対して阻害的に作用する。
いずれも、市販品などを用いることができる。ＤＭＳＯの定量はＪＩＳ  Ｋ９７０２に記載のガスクロマトグラフ分析など、種々の公知の方法で行なうことができる。
【００１４】
本願発明に用いるベタインの含有量は好ましくは０．２Ｍ以上であり、さらに好ましくは０．４Ｍ以上、さらに好ましくは０．４Ｍ以上１２Ｍ以下である。あまり含有量が低いとＲＮＡ合成効率向上に対する効果がなく、あまり含有量が高いとＲＮＡ合成に対して阻害的に作用する。  また、好ましくはベタインは、第四アンモニウム塩、スルホニウム塩、ホスホニウム塩から選択される分子内塩である。さらに好ましくは、分子内塩はトリメチルグリシンである。
いずれも、市販品などを用いることができる。ベタインの定量はキャピラリー電気泳動など種々の公知の方法で行なうことができる。
【００１５】
本願発明において、上記ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と、ベタインの、両方を添加し最適な組合せとすることにより、さらに効果が増強することが期待できる。好ましい組み合わせの１つは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の含有量が体積比２％以上であり、かつ、ベタインの含有量が０．２Ｍ以上である。
【００１６】
本願発明の方法において、好ましくはさらに、１ｍＭ以上のポリアミン類、１ｍＭ以上のアルカリ金属塩、および３ｍＭ以上の還元剤を含有することができる。あまり含有量が低いとＲＮＡ合成効率向上に対する効果がなく、あまり含有量が高いとＲＮＡ合成に対して阻害的に作用する。さらに好ましくは、ポリアミン類はスペルミジンである。あまり含有量が低いとＲＮＡ合成効率向上に対する効果がなく、あまり含有量が高いとＲＮＡ合成に対して阻害的に作用する。あるいは、さらに好ましくは、アルカリ金属塩は塩化ナトリウムである。あまり含有量が低いとＲＮＡ合成効率向上に対する効果がなく、あまり含有量が高いとＲＮＡ合成に対して阻害的に作用する。あるいは、さらに好ましくは、還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。あまり含有量が低いとＲＮＡ合成効率向上に対する効果がなく、あまり含有量が高いとＲＮＡ合成に対して阻害的に作用する。
あるいは本願発明の方法において、好ましくはさらに、１２ｍＭ以上のヌクレオチドおよび１２ｍＭ以上のマグネシウムイオンを含有することができる。あまり含有量が低いとＲＮＡ合成効率向上に対する効果がなく、あまり含有量が高いとＲＮＡ合成に対して阻害的に作用する。いずれも、市販品などを用いることができる。
【００１７】
従来、ＲＮＡ合成速度を上げる目的で、反応組成中のＭｇイオンを１２ｍＭ以上に、および／またはＮＴＰの濃度を１２ｍＭ以上に上げることが行われてきており、収量が上がるなど一定の成果を得ていたが、本発明は、Ｍｇイオン、および／またはＮＴＰの濃度を上げることとは独立して効果があり、Ｍｇイオン、および／またはＮＴＰの濃度を上げた反応系に本発明を用いることで、さらに収量を上げることができ、優れている。
【００１８】
本願発明において好ましい反応温度は、３７℃〜６０℃である。
【００１９】
本願発明はまた、ＲＮＡの合成方法を行うための、反応組成物、試薬、またはキットである。
【００２０】
本願発明の反応組成物は、ＲＮＡ合成酵素、リボヌクレオチド、ＲＮＡ合成酵素が特異的に結合する認識配列（プロモータ配列）を含む鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００２１】
本願発明の反応液組成物は、ＲＮＡポリメラーゼに加えて、さらに、ＲＮＡ合成酵素が特異的に結合する認識配列（プロモータ配列）を含む鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡ、1種以上のリボヌクレオチド又はそれらの誘導体、緩衝剤、マグネシウム塩、アルカリ金属塩、ＲＮＡ合成に有用な添加剤から成る群の少なくとも1つを含有することができる。
【００２２】
具体的には、本発明の反応液組成物は、ＲＮＡポリメラーゼに加えて、４種のｒＮＴＰ（ＮＴＰ）、２価陽イオン、緩衝液などを含むことができる。２価陽イオンとしては、マグネシウムイオンが挙げられる。その濃度は１〜４０ｍＭ程度であることが好ましい。また緩衝液としては、トリス緩衝液 (ｐＨ７．０〜９．０ 、２５℃) 、ＨＥＰＥＳ緩衝液 (ｐＨ７．０〜９．０、２５℃) などが挙げられる。
【００２３】
本願発明の反応組成物の具体的な好ましい例は、４０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ７．４−８．１）もしくは８０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．４−８．１）、２０−３０ｍＭの塩化マグネシウム、１−２ｍＭのスペルミジン、１−５ｍＭの塩化ナトリウム、５−１０ｍＭのジチオスレイトール、０．２−１Ｍのトリメチルグリシン、体積比４−１５％のジメチルスルホキシド、２０−３５ｍＭのＮＴＰ、２−３ｕｎｉｔ／μｌの耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、および５−１００ｎｇ／μｌのＤＮＡ鋳型からなる組成である。
【００２４】
あるいは、本発明の反応液組成物は、ＲＮＡ合成酵素に加えて、４種のｒＮＴＰ（ＮＴＰ）、２価陽イオン、緩衝液、発色試薬、発光試薬などを含んでもよい。
【００２５】
本発明の反応液組成物に含まれる1種以上のヌクレオチド又はその誘導体には、特に制限がないが、ホスホヌクレオチド又はその誘導体が挙げられる。具体的な好ましい組成としては、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、２’―フッ化ＣＴＰ、２’―フッ化ＵＴＰ、イノシン三リン酸、リボチミジン三リン酸から成る群から選択される物質が例示される。
【００２６】
本発明の反応液組成物に含まれるマグネシウム塩は、特に制限がないが、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムから成る群から選択される物質が例示される。これらのマグネシウム塩は市販品を容易に入手することができる。
【００２７】
本発明の反応液組成物に含まれるアルカリ金属塩は、特に制限がないが、塩化カリウム、酢酸カリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムから成る群から選択される物質が例示される。これらのアルカリ金属塩は市販品を容易に入手することができる。
【００２８】
本発明の反応液組成物には、さらに、ＲＮＡ合成の副生成物であるピロリン酸による反応液中のマグネシウムイオンのキレート化を防ぐため、無機ピロリン酸分解酵素等を添加することができる。
【００２９】
従来より、ＲＮＡ合成の副生成物であるピロリン酸により、反応液中のマグネシウムイオンがキレート化されてＲＮＡポリメラーゼの活性が低下することが知られており、このことを防ぐため、無機ピロリン酸分解酵素等を添加してマグネシウムイオンのキレート化を防いで、ＲＮＡポリメラーゼの活性を高く保つという方法が用いられてきたが、本発明は、無機ピロリン酸分解酵素等を添加することとは独立して効果があり、無機ピロリン酸分解酵素等を添加した反応系に本発明を用いることで、さらに収量を上げることができ、優れている。
【００３０】
本願発明はまた、上記記載のＲＮＡ合成方法、および／または、上記記載の反応組成物、試薬、またはキットを用いて合成されたＲＮＡである。
【００３１】
本願発明はまた、そのようにして合成されたＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、in situ ハイブリダイゼーション、アンチセンスＲＮＡアッセイ、ＲＮＡマイクロインジェクション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｉアッセイ、リボザイムアッセイ、ＲＮＡ遺伝子アレイ、無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする、ＲＮＡの利用方法である。
【００３２】
本願発明の方法により得られたＲＮＡは、ノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、in situ ハイブリダイゼーション、アンチセンスＲＮＡアッセイ、ＲＮＡマイクロインジェクション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｉアッセイ、リボザイムアッセイ、ＲＮＡ遺伝子アレイ、無細胞タンパク質合成のいずれにも適している。
【００３３】
本発明において、ＲＮＡの合成が「効率的である」とは、ＲＮＡ合成の速さと正確性の両方に優れていることをいう。後工程が無細胞蛋白質合成である場合は、さらに該工程における蛋白質合成の速さにおいて優れていることを含むことが好ましい。
【００３４】
ＲＮＡの合成の速さを測定する方法は、当業者が知りうるものであれば特に限定されないが、本願では、Ｔ７プロモータを含有する全長３ｋｂ程度の２本鎖ＤＮＡ基質として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれの本発明の反応組成物と従来法の反応組成物にて反応させ、その一定の反応時間において合成されるＲＮＡの合成量から算出した。
【００３５】
ＲＮＡ合成の正確性を測定する方法は、当業者が知りうるものであれば特に限定されないが、合成されたＲＮＡを鋳型として逆転写酵素によりＤＮＡを合成し、さらに合成されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲの正確性算出法を用いてＲＮＡ合成の正確性を算出する方法が挙げられる。
【００３６】
ＤＮＡ合成時の正確性を評価する方法の一例として、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（rpsL）遺伝子を用いた方法が挙げられる。ストレプトマイシンは原核細胞のタンパク質合成を阻害する抗生物質であり、細菌の３０ＳリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合してタンパク質合成の開始複合体形成反応を阻害し、また遺伝子暗号の誤読を引き起こす。ストレプトマイシン耐性変異株ではリボゾームタンパク質Ｓ１２に変異が見られる。この変異はリボゾームの翻訳忠実度を上げるため、サプレッサーｔＲＮＡによる終始コドンの読み取りを抑制するなど多面的効果(pleiotropic effect）を示すことが知られている。したがって、rpsL遺伝子を鋳型としてＰＣＲにより増幅を行うと、ある確率で変異が導入され、それがアミノ酸レベルの変異であった場合、rpsLタンパク質の構造が変化し、ストレプトマイシンが３０ＳリボゾーマルＲＮＡに作用できなくなるようなことが起こる。したがって、増幅したプラスミドＤＮＡによって大腸菌を形質転換した場合、変異が多く導入されるほどストレプトマイシン耐性菌の出現頻度が増すこととなる。
【００３７】
プラスミドpMol 21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850に記載)は、rpsL遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドである。このプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子上にＰＣＲ増幅用プライマーセット（片方をビオチン化、MluI制限酵素サイトを導入）を設計し、プラスミドの全長を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をストレプトアビジンビーズを用いて精製し、制限酵素MluIを用いて切り出した後、ＤＮＡリガーゼを用いて結合して大腸菌を形質転換した。アンピシリンとアンピシリン及びストレプトマイシンを含有する２種類のプレートに接種して、それぞれのプレートに出現したコロニーの比を算出することによりＤＮＡ合成時の正確性を求めることができる。
【００３８】
ＲＮＡの正確性を算出するに際して、逆転写したＤＮＡからのＰＣＲの条件を同一にすることによって、ＲＮＡの変異導入率の高さ、すなわちＲＮＡ合成の正確性を算出することができる。
【実施例】
【００３９】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
従来品バッファとの性能比較
４０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ７．４−８．１）、２４ｍＭの塩化マグネシウム、１．５ｍＭのスペルミジン、２ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのジチオスレイトール、０．２−１Ｍのトリメチルグリシン、体積比４−１５％のジメチルスルホキシド（いずれも反応系での最終濃度）から成るバッファＡおよび、ＤＭＳＯをバッファＡの２倍濃度添加し、ベタインを添加せず、その他の物質の濃度がバッファＡと同一であるバッファＢ、ベタインをバッファＡの２倍濃度添加し、ＤＭＳＯを添加せず、その他の物質の濃度がバッファＡと同一であるバッファＣ、ＤＭＳＯおよびベタイン非添加でその他の物質の濃度がバッファＡと同一であるバッファＤを用いて、転写反応を行った。用いたＤＮＡ鋳型は、末端にＴ７プロモータを持つ約３．５ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡである。ＤＮＡ鋳型５００ｎｇ、ｒＮＴＰｓ ｍｉｘｔｕｒｅ(東洋紡績製)各５．６２５ｍＭ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ(東洋紡績製)４０Ｕ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(東洋紡績製)５０Ｕ、バッファＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを規定濃度、最終液量２０μｌで、３７℃で２時間インキュベートした。反応収量液を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５ Ｃｏｌｕｍｎｓ(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて精製し、バッファを水に置換した。その精製液の吸光度を測定した。
その結果を図１に示す。ＤＭＳＯもしくはベタインのどちらか一方もしくは両方ともを添加しなかったバッファＢ、Ｃ、Ｄによる反応系に比べ、バッファＡによる反応系は、明らかにＲＮＡ合成量が増加していることが確認された。
【００４１】
実施例２
無機ピロフォスファターゼを含有した条件でのＲＮＡ合成効率比較
４０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ７．４−８．１）、２４ｍＭの塩化マグネシウム、１．５ｍＭのスペルミジン、２ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのジチオスレイトール、０．２−１Ｍのトリメチルグリシン、体積比４−１５％のジメチルスルホキシド（いずれも反応系での最終濃度）から成るバッファＡおよび、ＤＭＳＯおよびベタイン非添加でその他の物質の濃度がバッファＡと同一であるバッファＤを用いて、転写反応を行った。用いたＤＮＡ鋳型は、末端にＴ７プロモータを持つ約３．５ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡである。ＤＮＡ鋳型５００ｎｇ、ｒＮＴＰｓ ｍｉｘｔｕｒｅ(東洋紡績製)各７．５ｍＭ、インビトロ転写キットＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（ＴＭ）（Ａｍｂｉｏｎ社製）付属のＴ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、無機ピロフォスファターゼ混合液２μｌ、バッファＡまたはＢを規定濃度、最終液量２０μｌで、３７℃で２時間インキュベートした。反応収量液を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５ Ｃｏｌｕｍｎｓ(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて精製し、バッファを水に置換した。その精製液の吸光度を測定した。
その結果を図２に示す。ＤＭＳＯおよびベタインの両方ともを添加しなかったバッファＤによる反応系に比べ、バッファＡによる反応系は、明らかにＲＮＡ合成量が増加していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の新規ＲＮＡ合成反応組成物、およびその合成されたＲＮＡは、ｒＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）、５Ｓ  ＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ、リボザイム等の各種ＲＮＡの合成、さらに合成されたＲＮＡを用いたノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、in situ ハイブリダイゼーション、アンチセンスＲＮＡアッセイ、ＲＮＡマイクロインジェクション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｉアッセイ、リボザイムアッセイ、ＲＮＡ遺伝子アレイ、無細胞タンパク質合成等の各種ＲＮＡアッセイに用いることができ、産業界に寄与するところが大である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】４種類のバッファを用いてＲＮＡ合成効率を比較した検討結果を示す図。
【図２】無機ピロフォスファターゼを添加した条件下で２種類のバッファを用いてＲＮＡ合成効率を比較した検討結果を示す図。
【図１】
2005160446.tif 000002
【図２】
2005160446.tif 000003