(57)【要約】【課題】  糸状菌由来のセラミドを含んでなる植物病害抵抗性誘導剤を提供する。また、糸状菌由来のセラミドを含んでなる植物病害防除剤により、栽培植物を処理する工程を含んでなる植物病害の防除方法を提供する。【解決手段】糸状菌由来のセラミドを含んでなる植物病害抵抗性誘導剤を栽培植物に処理することで、病害抵抗性を誘導することにより病原菌の感染を防除する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌由来のセラミドを１種または２種以上を含んでなる、植物病害抵抗性誘導剤。
【請求項２】
糸状菌由来のセレブロシドからセラミドを加水分解により変換して調製する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法により変換されたセラミドを含んでなる、請求項１記載の植物病害抵抗性誘導剤。
【請求項４】
施用濃度が、糸状菌由来のセラミドの含量として０．１〜１００ｍｇ／Ｌである、請求項１または３に記載の植物病害抵抗性誘導剤。
【請求項５】
請求項１、３または４のいずれか１項に記載の植物病害抵抗性誘導剤により栽培植物を処理する工程を含んでなる、植物病害の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌の菌糸または子実体を原料として、環境負荷が少なく、かつ使用者および消費者にとって安全な植物病害防除剤と防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物の病害防除方法としては、殺菌剤など植物病原菌に直接作用することで病害を防除する他に、植物自体が有する病害抵抗性を高めることで作物の病害を防除する農薬（抵抗性誘導型農薬）が使用されている。
【０００３】
殺菌剤など植物病原菌に対して直接作用するタイプの農薬は、病原菌に対して殺菌効果を示すものが多いが、継続的な使用により薬剤に対して耐性変異株が出現する場合がほとんどである。他方、抵抗性誘導型農薬は、直接病原菌に作用するのではなく、植物の抵抗性を誘導することで病害感染を防除することから、これまでにこれら薬剤の耐性変異株が出現した事例は認められていない。さらに、抵抗性誘導型農薬は、生物に対する殺菌作用が少ないために、植物以外の生物を含めた環境への負荷は比較的少ないと考えられている。
【０００４】
現在、農業生産においては、持続可能な農業生産技術を確立することが求められており、その目的を達成するために環境調和型の農業資材の開発が重要な課題となっている。また、近年の消費者の食品に対する安全性志向の高まりにより、農業の自然循環機能を活かして栽培された有機農産物の需要が増加してきている。有機農産物の表示に関しては、農林水産省が示すガイドラインにより、天然の有用鉱物資材、植物、動物及びそれらから摘出、抽出又は調製した天然物質であり、これらを病害虫防除等農薬としての目的で使用する場合は、当該農薬が農薬取締法に基づき登録されたものであるときに限られ、抗生物質の使用は認められないことが示されている。従って、前述の予防的に防除する抵抗性誘導型の病害防除効果を有し、かつ天然物由来の農業資材を供給することができれば、使用者である農業生産者および消費者に対して安全な農薬であるとともに、環境負荷の低減化を計ることができる。
【０００５】
これまで植物の病害抵抗性誘導を目的とした農薬は、イネいもち病防除剤として登録されているプロベナゾールとアシベンゾラル−Ｓ−メチルに限られている。これら病害抵抗性誘導を目的とした農薬は、植物病原菌に対して直接作用するのではなく、植物の抵抗性を誘導することで様々な作物病害防除効果を示すため、これまでにこれらの薬剤に対する耐性変異株の出現は報告されていない。しかしながら、いずれも化学合成の農薬であり、環境等への影響を考慮すると、過度の依存は避ける必要がある。
【０００６】
天然物由来の病害抵抗性誘導物質では、多糖体分解物（例えば、特許文献１参照）、セレブロシド類（例えば、特許文献２、特許文献３、非特許文献１及び非特許文献２参照）、ジャスモン酸（例えば、特許文献４及び非特許文献３参照）、キチンオリゴ糖（例えば、非特許文献４参照）、β-１，３およびβ-１，６-グルカンオリゴ糖（例えば、非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７参照。）などが報告されている。これら物質はエリシタ−と呼ばれており、病原菌に対して抗菌活性をもつファイトアレキシン (phytoalexins) や、病原菌の細胞壁を溶解するキチナーゼ、β-１，３-グルカナ−ゼなどのＰＲタンパク（pathogenesis-related proteins）、過敏感細胞死（hypersensitive cell death）を植物に誘導させることによって病害抵抗性を確立することが知られている（例えば、非特許文献４及び非特許文献８参照）。
【０００７】
これらエリシタ−の中でも、セレブロシド類はイネにおいて圃場レベルで各種病害菌に対して高い防除効果を示すことから（非特許文献２参照）、天然由来の有望な病害防除剤であると考えられている。しかしながら、セレブロシド類の病害防除効果に関する知見はイネ、トマト、レタス、メロン、サツマイモに限定されており、それら以外の植物に効果のある病害抵誘導剤が望まれている（特許文献５参照）。
【０００８】
セラミドはセレブロシドの糖の部分がはずれた構造を有し、動物由来のセラミドは動物ではアポトーシスなどのセカンドメッセンジャーであることが知られている（非特許文献９参照。）。イネにおいて、糸状菌由来セラミドがわずかにファイトアレキシンを誘導するという報告はあるものの（非特許文献２参照）、それがイネにおいて病原菌の防除作用があるという知見や、イネ以外の植物において病害性抵抗を誘導するという知見は全くない。
【０００９】
糸状菌由来のセラミドは糸状菌の菌体に含まれているが、一般にその含有量は極めて少ないために、病害抵抗性誘導剤としての実用化は、多量の糸状菌体から精製、抽出しなければならないというコスト的な困難性によって妨げられている。したがって、実用化レベルに見合う病害抵抗性誘導剤を提供するためには、糸状菌において比較的多量に含まれているセレブロシドなどから効率的に変換できるシステムが必要である。セレブロシドなどスフィンゴ糖脂質からセラミドへ変換する酵素は、細菌（非特許文献１０参照）、ひる（非特許文献１１参照）、くらげ（非特許文献１２参照）から単離されているが、糸状菌由来のセレブロシドからセラミドへ変換する酵素の報告は全くない。
【００１０】
【特許文献１】特開平５−３３１０１６号公報
【特許文献２】特許第２８４６６１０号公報
【特許文献３】国際公開９８／４７３６４号明細書
【特許文献４】特開平１１−２９４１２号公報
【特許文献５】国際公開０３／２００３２号明細書
【非特許文献１】Koga J. et al., J. Biol. Chem.,1998,48,27,p.31985−31991
【非特許文献２】Umemura K. et al., Plant Cell Physiol.,2000,41,p.676−683
【非特許文献３】Nojiri H. et al., Plant Physiol.,1996,110,p.387−392
【非特許文献４】Yamada A. et al.，Biosci. Biotech. Biochem.,1993,57,3,p.405−409
【非特許文献５】Sharp J. K. et al.，J. Biol. Chem.,1984,259,p.11312−11320
【非特許文献６】Sharp J. K. et al.，J. Biol. Chem.,1984,259,p.11321−11336
【非特許文献７】Yamaguchi T. et al.，Plant Cell,2000,12,p.817−826
【非特許文献８】Keen N. T.，Plant Mol. Biol.,1992,19,p.109−122
【非特許文献９】Perry D. K. et al.，Biochim. Biophys. Acta,1998,1436,p.233−243
【非特許文献１０】Ito M.. et al.，J. Biol. Chem.,1989,264,p.9510−9519
【非特許文献１１】Zhou B. et al.，J. Biol. Chem.,1989,264,p.12272−12277
【非特許文献１２】Horibata Y. et al.，J. Biol. Chem.,2000,275,p.31297−31304
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は上記の背景技術に鑑み、糸状菌全般を原料とし、さらに、酵素および酸分解変換技術を利用することにより有効活性成分を取得し、消費者および使用者にとって安全性の高い抵抗性誘導型の病害防除剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、植物病害抵抗性誘導物質を探索したところ、糸状菌由来のセラミドが植物において病害抵抗性を誘導することを発見した。すなわち、該物質をイネに処理することによって、抗菌物質であるファイトアレキシン（ファイトカサン）や溶菌酵素であるβ-１，３-グルカナ−ゼを誘導し、さらにはいもち病菌に対して高い防除効果を有することを見出した。本発明者らはまた、糸状菌由来のセレブロシドでは病害抵抗誘導活性のない植物、例えばエダマメ、キャベツ、ナスなどにおいて、糸状菌由来のセラミドが病害抵抗性を誘導することを見出した。
【００１３】
さらに本発明者らは、糸状菌由来のセレブロシドからセラミドへ効率良く変換できるシステムを確立した。糸状菌由来のセラミドは糸状菌の菌体に含まれているが、一般にその含有量は極めて少ないために、病害抵抗性誘導剤としての実用化は、多量の糸状菌体から精製、抽出しなければならないというコスト的な困難性によって妨げられていた。したがって、このシステムを利用することによって、コスト的に実用化レベルに見合う病害抵抗性誘導剤を提供することが可能となる。
【００１４】
従って、本発明は、糸状菌由来のセラミドを含有する植物病害抵抗性誘導剤、およびセレブロシドからのセラミド調製法、並びにそれら剤による植物病害防除法を提供することをその目的とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は環境への負荷が少ない、糸状菌由来のセラミドを含んでなる、植物病害抵抗性誘導剤であって、本病害抵抗性剤を施用することで栽培植物に対して、高い防除効果を示すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において糸状菌由来のセレブロシドとは、下記の構造式（１）のように長鎖塩基、脂肪酸、およびグルコースからなるスフィンゴ糖脂質をいい、長鎖塩基の部分の９位にはメチル基が入っているものを指し、長鎖塩基のその他の部分の構造には限定されない。例えば、長鎖塩基の４位、８位の２重結合は入っていてもいなくても良い。また、脂肪酸の種類には特に限定されない。さらに、糸状菌由来のセラミドとは糸状菌由来のセレブロシドのグルコースがはずれた長鎖塩基と脂肪酸からなる化合物のことを指す。
【００１７】
【化１】
2005298349.tif 000002
【００１８】
例えば、糸状菌由来のセレブロシド類としては、下記のものが挙げられる：
セレブロシドＡ（（４Ｅ，８Ｅ）−Ｎ−Ｄ−２’−ヒドロキシ−（Ｅ）−３’−ヘキサデセノイル−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−９−メチル−４，８−スフィンガジエニン）、
セレブロシドＢ（（４Ｅ，８Ｅ）−Ｎ−Ｄ−２’−ヒドロキシパルミトイル−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−９−メチル−４，８−スフィンガジエニン）、
セレブロシドＣ（（４Ｅ，８Ｅ）−Ｎ−Ｄ−２’−ヒドロキシ−（Ｅ）−３’−オクタデセノイル−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−９−メチル−４，８−スフィンガジエニン）、および  セレブロシドＤ（（４Ｅ，８Ｅ）−Ｎ−Ｄ−２’−ヒドロキシステアロイル−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−９−メチル−４，８−スフィンガジエニン）。
【００１９】
本発明における植物病害抵抗性誘導剤（以下、剤と略す）は、例えば、セレブロシドＡ、セレブロシドＢ、セレブロシドＣ、またはセレブロシドＤ由来のセラミドを単独で含んでいても、またはそのうちの２種以上を組み合わせて含んでいてもよい。
【００２０】
本発明における剤に有効成分として含まれる糸状菌由来のセラミドは、糸状菌の菌糸または子実体から得るセレブロシドから加水分解により変換して得られる。
【００２１】
本発明におけるセレブロシドを得るための糸状菌は、子のう菌類、担子菌類、接合菌類、不完全菌類に分類される全ての糸状菌類を指す。
【００２２】
子のう菌類としては、Penicillium roquefortii、Nectria cinnabaria、Laboulbenia flagellata、Hyaloscypa lachnobrachya、Ustilago maydisなどが挙げられる。担子菌類としては、Lentinusedodes、Pleurotus ostreatus、Flammulina velutipes、Glifolafrondosa、Agaricus bisporus、Agaricus campestris、Auriculariapolytrichaなどが挙げられる。接合菌類としては、Rhizopus oryzae、Mucor circinelloides、Phycomycesnitensなどが挙げられる。不完全菌類としては、Aspergillus niger、Aspergillusoryzae、Humicola insolens、Trichoderma viride、Acremonium cellulolyticusなどが挙げられる。
【００２３】
糸状菌の菌糸または子実体は、生菌体、菌体の培養液、その濃縮物、乾燥菌体、あるいは醗酵残渣等を含むそれらの加工処理物等を用いることができる。好ましくは、子実体の乾燥菌体が望ましい。糸状菌の乾燥菌体を用いる場合はパワーミル等粉砕機で溶媒が浸潤しやすい程度に粉砕することにより効率よく抽出することができ、好ましくは開口部２ｍｍ程度の篩を通る程度まで細かく粉砕することによりさらに効率よく抽出することができる。本発明の好ましい態様によれば、有機溶媒に浸漬した糸状菌の菌糸または子実体を撹拌して、菌体に含まれた成分を有機溶媒に抽出させることによって、セレブロシドを効率よく抽出することができる。
【００２４】
本抽出工程において、糸状菌に有機溶媒を加えて撹拌し、有効成分を抽出した液を固液分離して、有機溶媒抽出液と残渣に分離して、有機溶媒抽出液を得る。抽出工程において用いる有機溶媒は、エタノール、メタノール、ヘキサン、石油エーテル、エチルエーテル、酢酸エチル、クロロホルム、アセトン等が挙げられる。抽出効率のよい溶媒として、好ましくは酢酸エチル、クロロホルムが挙げられるが、有機農産物の栽培に使用可能な病害防除剤とする場合はエタノールを使用することが好ましい。
【００２５】
本発明でいう加水分解とは、水１分子が反応して結合が開裂し、生成物の分子式の総和にＨ２Ｏが加わる形式の反応であり、酵素変換や酸分解も含まれる。
【００２６】
本発明における剤に有効成分として含まれる糸状菌由来のセラミドは、糸状菌由来のセレブロシドから酵素変換により得ることができる。糸状菌由来のセレブロシドをセラミドに変換する酵素は、糸状菌の菌体または子実体用いることによって抽出することができる。糸状菌は、子のう菌類、担子菌類、接合菌類、不完全菌類に分類される全ての糸状菌類が挙げられる。例えば、子のう菌類としては、Penicillium roquefortii、Nectria cinnabaria、Laboulbenia flagellata、Hyaloscypa lachnobrachya、Ustilagomaydis、担子菌類としては、Lentinus edodes、Pleurotus ostreatus、Flammulinavelutipes、Glifola frondosa、Agaricus bisporus、Agaricuscampestris、Auricularia polytricha、接合菌類としては、Rhizopus oryzae、Mucorcircinelloides、Phycomyces nitens、不完全菌類としては、Aspergillusniger、Aspergillus oryzae、Humicola insolens、Trichoderma viride、Acremonium cellulolyticusなどが挙げられる。
【００２７】
糸状菌由来のセレブロシドをセラミドに変換する酵素は、細菌の菌体および培養液を用いることによって抽出することができる。例えば、細菌としては、Rhodococcus sp. などが挙げられる。
【００２８】
また、糸状菌由来のセレブロシドをセラミドに変換する酵素は、植物体の根、葉、茎、花びら、おしべ、めしべを用いることによっても抽出することができる。その植物体としては、植物すべてが挙げられ、例えば、イネ科植物（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、エンバクなど）、ナス科植物（トマト、ナス、ジャガイモなど）、ウリ科植物（キュウリ、メロン、カボチャなど）、マメ科植物（エンドウ、ダイズ、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ、ソラマメなど）、アブラナ科植物（ダイコン、ハクサイ、キャベツなど）、バラ科植物（イチゴ、リンゴ、ナシなど）、クワ科（クワなど）、アオイ科（ワタなど）、セリ科（ニンジン、パセリ、セロリーなど）、キク科（ゴボウ、ヒマワリ、キク、レタスなど）、ブドウ科（ブドウなど）などである。
【００２９】
本発明で使用する酵素は糸状菌、細菌の菌体、植物体を液体窒素などで粉砕した後、ｐＨ５．５の酢酸緩衝液などにより効率良く抽出することができる。ここで抽出された酵素抽出物は上記のように有機溶媒抽出された糸状菌由来のセレブロシドと反応させることにより、容易に糸状菌由来のセラミドを得ることができる。この酵素抽出物は公知の技術により一旦粉状や粒状のような固形物としたものも使用できる。
【００３０】
よって、本発明の態様によれば、糸状菌、細菌、植物体から抽出された酵素と反応させることにより、糸状菌由来のセレブロシドから糸状菌由来のセラミドを効率的に変換させる酵素変換工程を含んでなる植物病害抵抗性誘導剤の調製方法が提供される。
【００３１】
また、本発明における剤に有効成分として含まれる糸状菌由来のセラミドは、糸状菌由来のセレブロシドから酸分解により得ることができる。酸分解の方法はCarterらの方法（CarterH.E. et al., J. Lipid Res., 1961，2, p.228-234）に従って実施することができる。
【００３２】
よって、本発明の態様によればまた、糸状菌由来のセレブロシドから糸状菌由来のセラミドを酸分解により効率的に変換させる工程を含んでなる植物病害抵抗性誘導剤の調製方法が提供される。
【００３３】
さらに、本発明の別な態様によれば、糸状菌、細菌、植物体から抽出された酵素と反応させることにより、糸状菌由来のセレブロシドから糸状菌由来のセラミドを効率的に変換させる酵素変換工程および、糸状菌由来のセレブロシドから糸状菌由来のセラミドを酸分解により効率的に変換させる工程を含んでなる植物病害抵抗性誘導剤の調製方法が提供される。
【００３４】
本発明の剤の剤型は液剤、粉剤、粒剤、乳剤、水和剤、油剤、エアゾール、フロアブル剤等の農薬としての何れの使用形態でも良い。さらに、所望により、緩衝液などを加えてｐＨを調整し、界面活性剤などを加えて、植物への浸透性、展着性などの改良を図ることもできる。
【００３５】
また、本発明の植物病害の防除方法は、病害の予防を目的としているため、病害が発生する時期に先駆けて使用することが好ましい。本発明の防除方法には、施用方法による具体的な処理工程として、植物体への散布または塗布処理や根への浸漬処理、土壌への混合処理などの処理する工程が含まれるが、これらの処理工程に限定されるわけではない。
【００３６】
本発明の剤の施用濃度は植物の種類、生育ステージ、施用方法により適切な濃度に調製することができ、特に限定されるものではないが、例えば、好ましい施用濃度は糸状菌由来のセラミド含量として０．１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１〜５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬとすることができる。
【００３７】
本発明の剤の対象となる作物は、栽培植物すべてが挙げられ、例えば、イネ科植物（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、エンバクなど）、ナス科植物（トマト、ナス、ジャガイモなど）、ウリ科植物（キュウリ、メロン、カボチャなど）、マメ科植物（エンドウ、ダイズ、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ、ソラマメなど）、アブラナ科植物（ダイコン、ハクサイ、キャベツなど）、バラ科植物（イチゴ、リンゴ、ナシなど）、クワ科（クワなど）、アオイ科（ワタなど）、セリ科（ニンジン、パセリ、セロリーなど）、キク科（ゴボウ、ヒマワリ、キク、レタスなど）、ブドウ科（ブドウなど）などである。
【００３８】
また、植物の一般的な病害抵抗反応は病原菌に対して非特異的であることから、上記作物の対象病害としては、糸状菌、細菌、ウイルスを原因とする植物病害すべてが含まれる。例えば、イネいもち病菌（Magnaporthe grisea）、イネごま葉枯病菌（Cochliobolus miyabeanus）、ジャガイモ粉状そうか病菌(Spongospora subterranea)、ジャガイモ疫病菌(Phytophthorainfestans)、ダイズべと病菌(Peronospora manshurica)、オオムギうどんこ病菌（Eryshiphe graminis f. sp. hordei）、コムギうどんこ病菌（Eryshiphe graminis f. sp. tritici）、ムギ類赤かび病菌(Gibberella zeae)、エンドウ褐紋病菌（Mycosphaerellapinodes）、ムギ類雪腐大粒菌核病菌(Sclerotinia borealis)、コムギ赤さび病菌（Puccinia recondita）、トウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）、オオムギ株腐病菌(Ceratobasidiumgramineum)、ジャガイモ黒あざ病菌（Rhizoctonia solani）、イネ紋枯れ病（Rhizoctonia solani）、ジャガイモ夏疫病菌（Alternaria solani）、ダイズ紫斑病菌（Cercospora kikuchii）、サツマイモつる割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. batatas）、メロンつる割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis）、レタス根腐病菌（Fusarium oxysporum f. sp. lactucae）、トマト萎凋病菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）、ホウレンソウ萎凋病菌（Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae）、トマト半身萎凋病菌（Verticillium dahliae）、アブラナ科根こぶ病菌（Plasmodiophora brassicae）、キュウリ苗立枯病菌（Pythium debaryanum）、イチゴ灰色かび病菌(Botrytis cinerea)、トマト炭そ病菌(Colletotrichumphomoides)、オオムギ、コムギ黒節病菌（Pseudomonas syringae pv. syringae）、ジャガイモ黒あし病菌（Erwinia subsp. atroseptica）、イネ白葉枯病菌（Xanthomonas campestris pv. oryzae）、ジャガイモそうか病菌(Streptomycesscabies)、ムギ類萎縮ウイルス(Soil-borne wheat mosaic virus)、ダイズモザイクウイルス(Soybeanmosaic virus)、アルファルファモザイクウイルス(Alfalfa mosaic virus)、ジャガイモ葉巻ウイルス(Potatoleafroll virus)による病害などが挙げられる。
【００３９】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
セレブロシドからのセラミドの生成
イネ（品種：あきたこまち）の催芽種子を水稲用培土に播種して、人工気象室の中に設置したガラス栽培ケース内で栽培した。人工気象室は１日を２２℃／３０，０００Ｌｕｘで１２時間、１８℃／０Ｌｕｘで１２時間のサイクルの条件に設定した。本葉５葉齢が３０％展開したときにその本葉５葉を採取し、液体窒素にて粉砕した後、０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）の溶液にて抽出した。そしてその抽出液の遠心上清液を酵素液とした。その抽出酵素液に５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）を加え、セレブロシドＡ、Ｂ、あるいはＣ各々の最終濃度が０．０１％になるように混合後、４５℃で１時間反応させた。反応液中に生成されるグルコース量をグルコースＢテストワコー（和光純薬株式会社製）によって定量した。また、反応液には反応液の４倍量のエタノールを加え混合後、遠心上清液をＨＰＬＣ分析に供し、残存セレブロシドの量と生成セラミドの量を定量した。すなわち、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔ カラム (４．６ｍｍ ｉ．ｄ．×３０ｃｍ；東ソー株式会社製)に、エタノール８０％、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度５０℃の条件で試料を流し、ＵＶ２１５ｎｍで生成されたセラミドのピークを検出した。セレブロシドの標品はＫｏｇａらの方法（Koga J. et al., J. Biol. Chem.,  1998,48,27,p.31985−31991）に従って、セレブロシドＡ、Ｃはイモチ病菌から、セレブロシドＢはシイタケから調製し、単離精製したものを用いた。セラミドの標品はCarterらの方法（CarterH.E. et al., J. Lipid Res., 1961，2, p.228-234）に従ってセレブロシドから酸分解により調製し、単離精製したものを用いた。
この反応によって、反応液中にはグルコースが遊離することが認められた。さらに、ＨＰＬＣにおいて標品のセラミドと同じリテンションタイムにピークが生成されることが確かめられた。さらにこのピークの分子量をＦＡＢ−ＭＳにより分析したところ、標品のセラミドに相当する物質と同じ分子量であることが確認された。以上の結果から、植物抽出物質により、糸状菌由来セレブロシドＡ、Ｂ、Ｃいずれからもセラミドが生成されることが確かめられた。また、同様の反応を米ぬか由来のセレブロシド（（４Ｅ，８Ｚ）−Ｎ−Ｄ−２’−ヒドロキシエイコサノイル−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−９−メチル−４，８−スフィンガジエニン）に行ったところ、セラミドが生成されることが確かめられた。
【実施例２】
【００４１】
セレブロシドからのセラミドの大量調製
実施例１に従ってセレブロシドＡ、Ｂ、あるいはＣからイネの葉抽出物によりセラミドに変換させた反応液に等量の酢酸エチルを加え混合後、酢酸エチル層をとり乾固した。次に乾固したものに８０％エタノールを加え溶解後、遠心上清液を３０〜４０回に分けてＨＰＬＣに供し、分画した。ＨＰＬＣの条件として、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔ カラム (４．６ｍｍ ｉ．ｄ．×３０ｃｍ；東ソー株式会社製)に、エタノール８０％、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度５０℃の条件で試料を流し、ＵＶ２１５ｎｍで検出されたセラミドのピークを分取した。分取したセラミドピーク画分を乾固し、精製セラミドとした。
【実施例３】
【００４２】
各種植物抽出物のセレブロシドからのセラミドの生成能
実施例１の方法に従ってニンジン、レタス、キャベツ、ホウレンソウ、ハクサイ、ダイコン、キュウリ 、コムギ、トウモロコシ、エダマメの葉と根から酵素液を抽出し、セレブロシドＢを基質として反応させた。活性単位は、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００４３】
その結果を表１に示した。この結果から明らかなように、イネに限らず、植物全般に糸状菌由来のセレブロシドからのセラミド生成活性があることが判明した。
【００４４】
【表１】
2005298349.tif 000003
【実施例４】
【００４５】
イネにおける糸状菌由来のセラミドによるファイトアレキシンの誘導
イネ（品種：あきたこまち）の催芽種子を水稲用培土に播種して、人工気象室の中に設置したガラス栽培ケース内で栽培した。人工気象室は１日を２２℃／３０，０００Ｌｕｘで１２時間、１８℃／０Ｌｕｘで１２時間のサイクルの条件に設定した。本葉５葉齢が１００％展開したときに、本葉４葉齢の表面１０ヶ所に実施例２に従って調製した２０μＬの２００μｇ／ｍｌの精製セラミド溶液（１ヶ所あたり２μＬ）をのせた。セラミド溶液は０．１％のＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）の溶液に溶解した。対照区として０．１％のＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）の溶液を添加した。試料を添加後、イネを人工気象室内で３日間栽培し、試料を添加した部分の葉６枚を切り取り、酢酸エチル溶液５ｍＬと０．２Ｍ ＮａＣＯ３溶液（ｐＨ１０．８）５ｍＬを加えて混合することにより、葉に含まれているファイトアレキシンを抽出した。抽出後、酢酸エチル層を乾固させてから、１．６ｍＬのエタノールを加えて溶解後、さらに２．４ｍＬの０．０２Ｍ ＨＣｌを加えて混合した。この試料を遠心した上清液０．２ｍＬをＨＰＬＣ分析に供し、イネのファイトアレキシンであるファイトカサンを定量した。ファイトカサンの定量はKogaらの方法（Koga J. et al. , Tetrahedron , 1995, 51, p.7907-7918； Koga J. et al., Phytochemistry ,1997, 44, 249-253）に従い、ＨＰＬＣ分析により行った。すなわち、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔ カラム (４．６ｍｍ ｉ．ｄ．×３０ｃｍ；東ソー株式会社製)に、アセトニトリル４５％、流速１．２ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度５０℃の条件で試料を流し、ＵＶ２８０ｎｍでファイトカサンＡとファイトカサンＢのピークを検出した。ファイトカサンＡとＢの標品は前記Kogaらの方法に従って単離精製したものを用い、稲の葉１枚あたりに誘導されるファイトカサンＡとファイトカサンＢの量を５回の繰り返し試験の平均値として求めた。
【００４６】
その結果を表２に示した。ファイトカサンなどのファイトアレキシンは、いもち病菌や紋枯れ病菌などのイネの病害糸状菌に強い抗菌活性があることが確かめられており（Koga J. et al., Tetrahedron ,1995 ，51, p.7907-7918）、イネの病害抵抗性の１つであることが知られている。表２の結果から、糸状菌由来のセラミドにイネのファイトアレキシンを誘導する活性があることが判明した。
【００４７】
【表２】
2005298349.tif 000004
【実施例５】
【００４８】
イネにおける糸状菌由来のセラミドによるβ―１，３―グルカナーゼの誘導
イネ（品種：あきたこまち）の催芽種子を水稲用培土に播種して、人工気象室の中に設置したガラス栽培ケース内で栽培した。人工気象室は１日を２２℃／２５、０００Ｌｕｘで１２時間、１８℃／０Ｌｕｘで１２時間のサイクルの条件に設定した。本葉５葉齢が１００％展開したときに、本葉４葉齢の表面１０ヶ所に実施例２に従って調製した２０μＬの２００μｇ／ｍｌのセレブロシドＢ由来の精製セラミド溶液（１ヶ所あたり２μＬ）をのせた。セラミド溶液は０．１％のＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）の溶液に溶解した。対照区として０．１％のＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）の溶液を添加した。試料を添加後、イネを人工気象室内で３日間栽培し、試料を添加した部分の葉６枚を切り取った。この葉を予め冷やしておいた０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）溶液５ｍＬの中に入れ、ポリトロンにてホモジナイズ抽出し、その遠心上清液を酵素活性測定に供した。β―１，３―グルカナーゼ活性はInuiらの方法 (Inui H. et al., Biosci. Biotech. Biochem.,1997,61,6, p.975-978) に従い行った。すなわち、１％のcurdlanを含む、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４- citric acid バッファー（ｐＨ５．０）に酵素液０．２ｍＬを入れ、全量２ｍＬの溶液として、３７℃にて６０分間振とう反応させた。反応液中に生成される還元糖量をＤＮＳ法 (Miller G.L. et al., Anal. Chem. ,1959, 31, 426-428)により測定し、β―１，３―グルカナーゼ活性とした。活性単位は、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１Ｕと定義し、葉１枚あたりに誘導されるβ―１，３―グルカナーゼ活性を、５回の繰り返し試験の平均値として求めた。
【００４９】
その結果を表３に示した。ＰＲタンパク（pathogenesis-related proteins）の１種であるβ―１，３―グルカナーゼは、病害菌溶菌酵素として誘導され、植物の病害抵抗性の１つであることが知られている。この結果から明らかなように、糸状菌由来のセラミドにイネのβ―１，３―グルカナーゼを誘導する活性があることが判明した。
【００５０】
【表３】
2005298349.tif 000005
【実施例６】
【００５１】
糸状菌由来のセラミドの浸根処理によるイネいもち病菌の感染防除効果
イネ（品種：あきたこまち）の催芽種子を水稲用培土に播種して、人工気象室の中に設置したガラス栽培ケース内で栽培した。人工気象室は１日を２２℃／２５、０００Ｌｕｘで１２時間、１８℃／０Ｌｕｘで１２時間のサイクルの条件に設定した。本葉３葉齢が１００％展開した時に、人工気象室の設定を、２２℃／２０、０００Ｌｕｘで１２時間、１８℃／０Ｌｕｘで１２時間のサイクルの条件に変更した。本葉５葉齢が１０〜２０％展開したときに、イネ植物体をポットごと、実施例２で調製した各種濃度のセレブロシドＢ由来セラミドを含む溶液に浸漬し、セラミドを根から吸収させた。再び人工気象室にて２日間栽培した後、イネいもち病菌（学名：Magnaporthe grisea  レース００７株）の分生胞子懸濁液の噴霧接種による感染処理を行った。噴霧接種後、暗所、加湿条件下に３６時間放置することにより、いもち病菌を感染させた。その後、人工気象室に移して栽培し、接種６日後に各区の第４本葉に発生した罹病性病斑数を測定することにより防除価を算出した。各区２００本のイネを感染させ、防除価の算出は、防除価＝（１−各区の１葉あたりの平均病斑数／セラミド無添加区の１葉あたりの平均病斑数）×１００として求めた。
その結果を表４に示した。表４から明らかなように、浸漬処理によっても、５ｍｇ／Ｌという非常に低い濃度のセラミドによって、イネいもち病菌の感染防除効果があることが判明した。
【００５２】
【表４】
2005298349.tif 000006
【実施例７】
【００５３】
イネ以外の植物における糸状菌由来セレブロシドとセラミドの病害性抵抗誘導活性
サリチル酸は、幅広く植物において病害性抵抗のシグナル因子として知られている（MalamyJ. et al., Science, 1990, 250, p.1002-1004； Metraux J. P. et al., Science, 1990, 250, 1004-1006）。  そこで、イネ以外の植物、エダマメ、キャベツ、ナス、メロン、トウモロコシ、トマト、ニンジン、キュウリ、レタスについて、精製されたセレブロシドＢ、および、実施例２に従って単離精製されたセレブロシドＢ由来セラミドを投与したときのサリチル酸誘導量を測定し、病害性抵抗誘導活性とした。各植物の種子を園芸用育苗用培土（げんきくん１号、全農）に播種して、人工気象室の中に栽培した。人工気象室は１日を２２℃／３０，０００Ｌｕｘで１２時間、１５℃／０Ｌｕｘで１２時間のサイクルの条件に設定した。本葉５葉齢が１００％展開したときに、ポットごと２％エタノールに溶解した１０μｇ／ｍｌの精製セレブロシドＢ溶液と１０μｇ／ｍｌの精製セラミド溶液に浸漬し、セレブロシドＢおよびセラミドを根から吸収させた。対照区として２％エタノール溶液に浸漬させた。再び人工気象室にて４日間栽培した後、各植物の根を採取した。採取した根を液体窒素で粉砕した後、Malamyらの方法（MalamyJ. et al., Plant Cell, 1992, 4, p.359-366）に従ってサリチル酸を抽出した。その抽出物中のサリチル酸量はＨＰＬＣ分析により定量した。すなわち、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔ カラム (４．６ｍｍ ｉ．ｄ．×３０ｃｍ；東ソー株式会社製)に、アセトニトリル２０％−酢酸０．１６％の溶液、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃の条件で試料を流し、蛍光検出器（２９０ｎｍの励起波長、４０２ｎｍの発光波長）でサリチル酸のピークを検出した。各植物の根に誘導されるサリチル酸の量を６回の繰り返し試験の平均値として求めた。
【００５４】
その結果を表５に示した。表５の結果から、セレブロシド、セラミドいずれの添加区においても、ニンジン、キュウリ、レタスにおいてサリチル酸誘導活性が見られた。中でも、セレブロシド添加区ではサリチル酸誘導活性が認められなかったエダマメ、キャベツ、ナスについては、セラミド添加区において有意なサリチル酸誘導活性が認められた。
【００５５】
【表５】
2005298349.tif 000007