(57)【要約】    【課題】  環境汚染物質として亜鉛や銅を免疫学的に検出・定量するためモノクローナル抗体およびこれを用いる免疫学的方法を提供する。    【解決手段】  これら重金属の錯体をタンパク質などのキャリアと結合させ、抗原として用いてモノクローナル抗体を作製し、得られたモノクローナル抗体を用いて亜鉛や銅を錯体として検出・定量する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重金属として亜鉛および銅を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
錯体を形成した亜鉛および銅を特異的に認識する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０４として寄託されたハイブリドーマにより産生される請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
試料中の亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定する免疫学的方法において、請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする方法。
【請求項６】
試料をＳＨ基含有物質または硫化水素で前処理する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
試験試料にＳＨ基含有物質または硫化水素を添加して前処理した試料と前処理しない試料を用いて測定を行い、得られた結果を比較することにより亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定する、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、試料中の亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重金属として亜鉛および銅を特異的に認識するモノクローナル抗体、並びにその使用方法に関する。詳細には、亜鉛錯体および銅錯体を特異的に認識しうるモノクローナル抗体、および該抗体を用いる亜鉛および／または銅を定性的または定量的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境保全などの社会的な環境意識や健康に対する影響への関心の高まりから、産業や生活に伴う様々な場面における環境汚染物質の排出・蓄積の動向が注視されている。環境汚染物質の中で環境汚染が問題となっている水銀、カドミウム、鉛、６価クロム、ヒ素等の重金属については公的機関により飲料水や地下水における水質基準、土壌における環境基準、環境への排出基準が設けられている。さらに、平成１５年２月に土壌汚染対策法が施行され、水質汚濁防止法と併せて、土壌に含まれることに起因して人の健康に係る被害を生ずるおそれがある他の重金属についても法的規準が設けられつつある。銅および亜鉛ついては既に排水規準が実施されているが、亜鉛については平成１６年度中にも環境基準が策定され、これに伴い排水基準も変更されることになっている。
【０００３】
このような状況下において、これら重金属について汚染調査が必要とされる土壌や水質の大幅な増加が見込まれている。広大な敷地を対象とした調査では、簡便で低コストな簡易分析法を利用して、多大な時間と費用を要する公定法分析に供する地点を削減することが有効である。しかし、従来行われている調査は、原子吸光度計や質量分析法などを用いるものであり、これらの方法は高価な測定機器が必要であるうえ、測定も測定機器を設置した施設で行う必要がある。
【０００４】
一方、免疫反応を利用した測定法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）などの方法が知られている。また、微量物質の測定法としては、間接蛍光抗体法、競合アッセイ法の他に蛍光センサーを利用する方法（非特許文献１）などがあり、その応用範囲は広い。近年、環境汚染物質の測定にも免疫学的測定方法が適用されており、環境汚染物質として内分泌攪乱物質または環境ホルモンを簡易かつ高感度に測定する方法が報告されている（特許文献１）。しかし、測定すべき検出物質が金属元素やそのイオンの場合、一般的にはそれ自体が抗原性を持たないため、金属を検出しうる抗体を作製することは困難である。このため重金属測定用の抗体は一部の金属についてしか作製されていない（非特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１８９０２７公報
【非特許文献１】N. Ohmura, et al., Anal. Chemistry, Vol. 73, pp.3392‐3399 (2001)
【非特許文献２】俵田啓他, 分析化学, 第52巻, 第583頁, 2003年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、環境汚染物質としての重金属である亜鉛や銅などを免疫学的に検出・定量しうる方法およびこれに用いる亜鉛や銅を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは、抗金属抗体としてこれらの錯体を特異的に認識しうる抗体は作成可能であると考えて鋭意研究を行ったところ、それ自体では抗原としては小さすぎるが該錯体とタンパク質を結合して高分子量化することにより亜鉛や銅を特異的に認識するモノクローナル抗体を作成しうることを見出した。
【０００８】
従って、本発明は、
［１］重金属として亜鉛および銅を特異的に認識するモノクローナル抗体；
［２］錯体を形成した亜鉛および銅を特異的に認識する前記［１］記載のモノクローナル抗体；
［３］寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０４として寄託されたハイブリドーマにより産生される前記［１］または［２］記載のモノクローナル抗体；
［４］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ；
［５］試料中の亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定する免疫学的方法において、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする方法；
［６］試料をＳＨ基含有物質または硫化水素で前処理する、前記［５］記載の方法；
［７］試験試料にＳＨ基含有物質または硫化水素を添加して前処理した試料と前処理しない試料を用いて測定を行い、得られた結果を比較することにより亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定する、請求項５または６記載の方法。前記［５］または［６］記載の方法；並びに
［８］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、試料中の亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定するためのキット；
に関する。
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体は、重金属として亜鉛および銅の法的規準（例えば環境基準、水質基準など）以下の検出限界を有し、これら重金属について環境基準濃度の測定が可能であることが好ましい。具体的には、亜鉛については、その検出限界が環境基準の３０ｐｐｂ以下、好ましくは１０ｐｐｂ以下であることが好ましい。銅については、検出限界が排水基準の３５ｐｐｍ以下であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明のモノクローナル抗体は、正確な測定を与えるためにマグネシウム、マンガン、カドミウム、鉄、カルシウム、鉛などのその他の金属とはほとんどまたは全く交差反応せず、亜鉛および銅以外の重金属との親和性は亜鉛や銅の１０％以下、好ましくは１％以下である。
【００１１】
本発明の抗モノクローナル抗体としては、亜鉛および／または銅を特異的に認識するモノクローナル抗体、特に錯体を形成した亜鉛および／または銅を特異的に認識するモノクローナル抗体であればいずれの抗体でもよいが、例えばＺｋ２３Ｅ７が挙げられる。モノクローナル抗体Ｚｋ２３Ｅ７を産生するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１６年２月２６日付けで寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７０４として寄託されている。
【００１２】
本発明のモノクローナル抗体を用いる亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定する免疫学的方法において、亜鉛と銅はキレート剤に配位させ、形成された錯体を本発明のモノクローナル抗体により検出・測定する。故に、本発明は、（ｉ）試験試料にキレート剤を添加して錯体を形成させ、（ii）該錯体を特異的に認識する抗体を用いる免疫学的手法により亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定する方法に関する。本発明のモノクローナル抗体は、前述のように亜鉛や銅に対して親和性が高く、且つ他の金属との交差反応性が低いため、試験試料中の亜鉛や銅をより正確に測定することができる。その中でも、本発明のモノクローナル抗体Ｚｋ２３Ｅ７は、亜鉛と銅に対して非常に高い親和性・特異性を有している。そこで、試験試料にあらかじめＳＨ基含有物質（例えば、メルカプトエタノールやグルタチオンなどのＳＨ基を有する化合物、あるいは牛血清アルブミンなどシステイン残基を含むタンパク質）または硫化水素を添加して、そのＳＨ基または硫化水素と銅を反応させて沈殿させる。次いで、ＳＨ基含有物質または硫化水素で前処理した試料と前処理しない試料についてＺｋ２３Ｅ７抗体を用いて測定することにより、試験試料中に亜鉛と銅が存在するか否かを区別して判定し、かつ２つの測定値から亜鉛と銅の各々の濃度を算出することができる。従って、本発明は、試験試料にＳＨ基含有物質または硫化水素を添加して前処理すること、およびその前処理した試料と前処理しない試料について、モノクローナル抗体Ｚｋ２３Ｅ７を用いて金属イオン濃度を測定し、その測定結果から試験試料中に亜鉛および銅の存在・不存在を判定し、かつ亜鉛および銅の各々について同時に濃度を測定する方法に関する。
【００１３】
本発明において用いる免疫学的手法としては、本発明のモノクローナル抗体を用いればいずれでも良いが、例えば免疫クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）、蛍光センサー法などの方法が挙げられる。
【００１４】
本発明の亜鉛および／または銅を定性的または定量的に測定するためのキットは、本発明のモノクローナル抗体のみから構成されていてもよいが、他の試薬例えばキレート剤、キレート剤−タンパク質複合体、ポジティブコントロール試料、ネガティブコントロール試料などを包含してもよい。また、モノクローナル抗体、キレート剤−タンパク質複合体のいずれか、または両方が標識されていてもよい。さらに、本発明のキットは、モノクローナル抗体を含め必要な試薬がフィルターなど吸着されている免疫クロマトグラフィー装置（例えば、試験紙）の形態でもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、環境汚染物質として注目されつつある重金属の亜鉛や銅を特異的に認識するモノクローナル抗体およびこれを用いる亜鉛および／または銅を検出・定量するための免疫学的方法、該方法に用いるキット（装置）が提供される。本発明のモノクローナル抗体は亜鉛および／または銅に対して高い親和性・特異性を有するため微量のこれら重金属を検出することができ、環境への排出基準のみならず、高い検出感度が要求される水質基準や環境基準に対する判定にも用いることができる。また、この方法は免疫学的手法を用いるため、環境調査の現場で亜鉛および／または銅を迅速且つ簡便に測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
＜抗原＞
本発明では、亜鉛イオン、銅イオン単独では抗原性を持たないため、これら金属を認識する抗体を作成するためこれら重金属をキレート剤に配位させ、形成された金属錯体を抗原として用いた。キレート剤としては、亜鉛や銅を配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができるが、好ましくはＤＴＰＡおよびＥＤＴＡである。
【００１７】
また、例えば亜鉛とＤＴＰＡの錯体（以後、Ｚｎ−ＤＴＰＡと略記する）では免疫応答を誘導するには分子として小さすぎるため、キャリアとなる高分子量物質に結合させ、これを抗原または免疫源として用いる。キャリアとして用いることができる高分子量物質の例としては多糖類、タンパク質などが挙げられるが、タンパク質が好ましい。アルブミン、オバルブミン、ヘモシアニン、グロブリン、ゼラチン、コラーゲンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
これら金属錯体とタンパク質の複合体を作成するには、タンパク質と結合しうる官能基を有するキレート剤または該官能基を導入したキレート剤を用いるか、あるいはリンカーを介してタンパク質とキレート剤を結合させることができる。そのようなキレート剤は市販されており、例えばイソチオシアノベンジル−ＤＴＰＡ（同仁化学）が挙げられる。複合体の形成は常法により行うことができる。
【００１９】
＜抗金属モノクローナル抗体の作製＞
マウスの免疫、ハイブリドーマの作製およびその培養などモノクローナル抗体の作製は、常法に従って、例えばモノクローナル抗体作製マニュアル、多田ら著、学際企画発行、１９９５年（ISBN 4-906514-19-7）参照して適宜行うことができ、免疫するマウスの系統、脾臓細胞と融合させるミエローマなども特に限定されない。
【００２０】
＜抗体生産細胞のスクリーニング＞
抗体生産細胞のスクリーニングには一般的にはＥＬＩＳＡ法を用いるが、より少ない抗体量でスクリーニングが可能であるため、蛍光センサー法（特許文献１）を用いるのが好ましい。この方法は、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングからなり、一次スクリーニングは担体に固定化した抗原（亜鉛錯体−タンパク質複合体または銅錯体−タンパク質複合体）に抗体を含有するハイブリドーマ培養上清を添加し、固定化抗原に結合した抗体を蛍光標識した二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）を用いて蛍光センサーで検出する。二次スクリーニングでは、培養上清に適当量（例えば10μM）の金属錯体を添加して平衡化した後、錯体と結合しなかった抗体の固定化抗原との結合を一次スクリーニングと同様に測定する。一次スクリーニングと二次スクリーニングの差から所望の金属錯体と特異的に結合する抗体を特定する。
【００２１】
＜モノクローナル抗体の産生および精製＞
特定したクローンを培養し、単離したコロニーは徐々に培地量を増やしながら継代する。得られた培地は、脱塩カラムを用いて培地自体に含まれる若干の重金属を除去するのが好ましい。さらに、培地中に他のタンパク質の影響を除くために、抗体を精製する方法、例えばプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより抗体を精製するのが好ましい。
【００２２】
＜モノクローナル抗体の評価＞
得られたモノクローナル抗体は、亜鉛錯体、銅錯体と他の金属の錯体との親和性を比較することによりその抗体の抗原に対する親和性および特異性を評価する。親和性は、抗体の抗原との結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０）により評価する。そして、特異性は、カドミウムや水銀に対するＩＣ５０と他の金属に対するＩＣ５０を比較することにより評価する。ＩＣ５０はいずれの方法で算出してもよいが、測定結果をソフトウェア（例えばOrigin Version 6.0など）により解析して求めてもよい。例えば、蛍光センサー法などで得られた測定値は、抗原を加えなかったときの測定値を１００％として相対値に変換した後、抗体と抗原の結合曲線の近似式：
ｙ＝９９／（１＋（ｘ／Ｐ１）Ｐ２）＋０.５
［式中、ｘは抗体量であり、ｙは抗体と抗原の結合量（％）であり、Ｐ１およびＰ２は近似のパラメーターである］に導入する。また、Ｐ１およびＰ２はソフトフェアにより決定し、得られた結合曲線から、ｙ＝５０になるときのｘの値（＝Ｐ１）をＩＣ５０とする。また、抗体の特異性は亜鉛や銅に対するＩＣ５０と他の金属に対するＩＣ５０との比を交差反応性として求める。
【００２３】
＜免疫クロマトグラフィー＞
抗体を用いた免疫学的測定法の一例として免疫クロマトグラフィーを挙げる。この方法は、試料を試験紙上に滴下するだけで目的物質の有無を数分から数十分の間に判定できるため簡便性に優れ、かつ特別な機械装置を必要としないため非常に安価である。本発明において、免疫クロマトグラフィーは、キレート剤−タンパク質複合体を利用することにより所望の金属イオンを効果的に検出するものである。図３にその実施形態の一例を示す。プラスチックバッキングシート１の上に、メンブレン２と吸収パッド３を一部で重なるように配置し、メンブレン２の先端の試料滴下位置５に試料を滴下すると試料が吸収パッド３に向かってメンブレン２上を流動し、標識された抗金属ＥＤＴＡモノクロナール抗体あるいは標識されたＥＤＴＡ−タンパク質複合体が固定化された領域４を通過する際に、金属ＥＤＴＡ錯体が抗体に捕捉されあるいは抗金属ＥＤＴＡモノクロナール抗体がＥＤＴＡ−タンパク質複合体のＥＤＴＡと錯体を形成してその錯体に抗金属ＥＤＴＡが捕捉されて、固定化領域４が目視可能となることで検出対象物の有無を簡易に検出可能としている。なお、ＤＴＰＡなどのキレート剤を直接標識することは困難であるため、キレート剤にタンパク質を付加する前または後に、タンパク質に色素粒子を付加することで間接的にキレート剤を標識するのが好ましい。あるいは、モノクローナル抗体自体を標識することもできる。これらタンパク質の標識は通常行われている手法によって行うことができる。
【００２４】
（１）試験法１
本発明のモノクローナル抗体を試験紙の一部分に試料の流れを横切るように帯状に固定化する。次いで、試験試料中にキレート剤−タンパク質−色素粒子（キレート剤−標識タンパク質）複合体を添加して、亜鉛または銅と結合させたのち試験紙に滴下させる（図４（Ａ），（Ｂ）参照）。目的の金属イオンが存在する場合には、金属−キレート剤錯体が形成され、金属錯体と標識タンパク質複合体が試験紙上に帯状に固定化したモノクローナル抗体によって補足され、その結果として色素粒子が帯状に密集して試料中の金属イオンが可視化する（図４（Ｃ），（Ｄ）参照）。試料中に金属イオンが存在しない場合は、キレート剤−タンパク質−色素粒子複合体は試験紙上に固定化されたモノクローナル抗体に補足されないため、色素粒子により可視化されない。
【００２５】
（２）試験法２
キレート剤−タンパク質複合体を利用して金属イオンを検出する免疫クロマトグラフィーとして次の方法がある。まず、試験法１における抗体の代わりにキレート剤−タンパク質を試験紙上に帯状に固定化する（図５（Ｂ）参照）。色素粒子はモノクローナル抗体に付加する。この標識抗体と試験試料をともに試験紙に滴下させると（図５（Ａ），（Ｂ）参照）、金属イオンが試験紙上のキレート剤−タンパク質複合体に補足され、金属−キレート剤錯体が形成され、結果として標識されたモノクローナル抗体が金属−キレート剤錯体を介して試験紙上に補足され、帯状に密集した色素粒子により試料中の金属イオンが可視化される（図５（Ｃ），（Ｄ）参照）。
これら２つの試験法の利点は、タンパク質を介することでキレート剤を帯状に試験紙に固定することが容易になること、およびタンパク質１分子当たりに複数のキレート剤を付加するすることができ、単純に試験紙上にキレート剤を固定した場合に比べて表面積を大きく取ることが可能になり、結果として検出感度を上げることができることである。
【００２６】
本発明を下記の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例では抗原として亜鉛とＤＴＰＡの錯体（Ｚｎ−ＤＴＰＡ）、キャリアタンパク質としてヘモシアニンを用いて、亜鉛としてＺｎ−ＤＴＰＡを特異的に認識する抗体を作製した。
【００２７】
実施例１  抗亜鉛モノクローナル抗体
（１）抗原の作製
１ｍｇのイソチオシアノベンジル−ＤＴＰＡ（モレキュラープローブ社製）を１０ｍｇのスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）と３ｍｌの５０ｍＭシュウ酸緩衝液（ｐＨ９.５）中で３７℃、４時間反応させた。次いで、脱塩カラム（バイオラッド製、１０ＤＧパックドカラム）を用いて５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５に置換した。この溶液に５ｍＭになるように硫酸亜鉛を添加して、亜鉛錯体を形成させてＺｎ−ＤＴＰＡ−ヘモシアニン複合体を抗原として精製した。また、ヘモシアニンの代わりにニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いて同様な操作を行ってＺｎ−ＤＴＰＡとオバルブミンの複合体を作製し、これをスクリーニング用抗原とした。
【００２８】
（２）モノクローナル抗体の作製
ａ）マウスの免疫
６匹のＢＡＬＢ／Ｃ近交系のマウス（雌、５週齢、日本クレア）を１週間程度飼育環境に慣らしたのち、１回目の免疫を行った。免疫は、実施例１の免疫用抗原と等量のアジュバントを十分に混合してエマルジョンとした。１回の免疫につき、タンパク質量にして約０.３ｍｇの抗原を用いて１回につき２カ所、１００μｌずつ皮下注射した。２回目以降の免疫は２週間程度おきに３回または４回行った。３回目の免疫後、４〜７日間にマウスの尾部より数滴の血液を採取し、スクリーニング用抗原を用いて抗体価を測定し、抗体の産生を確認した。
【００２９】
ｂ）ハイブリドーマの作製
最後の免疫から４〜６日経過したマウスから、脾臓を摘出し、脾臓細胞とミエローマ細胞（ＮＳＯ株、理化学研究所）と融合させた。細胞を融合する際は、重合度１５００のポリエチレングリコールで脾臓細胞とミエローマを処理した。細胞融合に関する一連の操作は３７℃にて行った。得られたハイブリドーマは９６穴プレートに分注し、ＨＡＴ培地中で３７℃，５％ＣＯ２の条件下で培養した。ハイブリドーマは、融合後約２週間培養し、その間は３〜４日に１回培地を交換した。なお、１０日目前後まではＨＡＴ培地を用い、その後はＨＴ培地を用いた。
【００３０】
ｃ）スクリーニング
スクリーニングは、フロー式蛍光センサー（キネクサ３０００）を用いて蛍光センサー法にて行った。また、抗原を固定化する担体としてアガロースビーズ（ＮＨＳ修飾済み，ファルマシア）を用いた。２ｍｌのアガロースビーズ懸濁液に対して、実施例２で得たスクリーニング用抗原１００μｇを添加して抗原をビーズに固定化した。
９６穴プレートの培養液の上清約１０μｌずつ取り、１本の試験管にまとめた（約１ｍｌ）。一次スクリーニングでは、この試験管に固定化抗原を添加し、固定化抗原に結合した抗体は蛍光物質Ｃｙ５にて標識された二次抗体（抗マウスＩｇＧヤギ抗体）を用いて間接的に蛍光標識し、上清中の抗体と固定化抗原との結合を蛍光センサーにより検出した。二次スクリーニングでは、培養上清にＺｎ−ＤＴＰＡを１μＭとなるように加え、平衡化したのち、錯体と結合しなかった抗体のビーズへの結合を同様に測定した。二次スクリーニングによって、Ｚｎ−ＤＴＰＡと特異的に結合する抗体を含むと判定されたプレートについては，１本の試験管にまとめる培養上清を１２穴分〜１穴分と段階的に絞り込みながら、一次スクリーニング同様、上清中の抗体のビーズへの結合を測定し、目的の抗体を産生するハイブリドーマとして、Ｚｋ２３Ｅ７株を特定した。スクリーニングによって陽性と判断されたこの抗体生産細胞は、メチルセルロース培地を用いて単一の細胞に由来するコロニーを形成させた後、コロニーを液体培地に移し培養を続けた。
【００３１】
ｄ）モノクローナル抗体の生産
単離されたコロニーを９６穴プレート、２４穴プレート、２５ｃｍ２フラスコの順に培地量を増やしながら継代した。継代の後３〜５日の間に培養上清中の抗体量を蛍光センサーにて測定し、抗体量の多いものを次の培地に移した。なお、９６穴プレートの培地量は２００μｌ、２４穴プレートの培地量は１０００μｌ、２５ｃｍ２フラスコの培地量は１０ｍｌである。また、培養後の培地は脱塩カラムを用いて培地に含まれる若干の重金属を除去し、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.０）に置換した。さらに、プロテインＡアフィニティーカラムに供して、得られたモノクローナル抗体を精製した。
【００３２】
（３）モノクローナル抗体の評価
Ｚｎ−ＤＴＰＡおよび他の金属とＤＴＰＡの錯体に対する親和性を測定・比較することで得られた抗カドミウム抗体を評価した。なお、亜鉛以外の金属として、銅（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）、マグネシウム（Ｍｇ−ＤＴＰＡ）、マンガン（Ｍｎ−ＤＴＰＡ）、カドミウム（Ｃｄ−ＤＴＰＡ）、鉄（Ｆｅ−ＤＴＰＡ）、カルシウム（Ｃａ−ＤＴＰＡ）および鉛（Ｐｂ−ＤＴＰＡ）を用い、フリーのＤＴＰＡをコントロールとした。なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい（１０分の１以下の）場合にＩＣ５０値と結合解離定数がほぼ一致することが知られているため、本実施例では評価として結合解離定数を用いた。
その結果、モノクローナル抗体Ｚｋ２３Ｅ７は、Ｃｕ−ＤＴＰＡとは２１.１％の交差反応性を示したが、これはＺｎ−ＤＴＰＡとＣｕ−ＤＴＰＡの立体構造がよく似ているためであると考えられる。Ｃｕ−ＤＴＰＡ以外の錯体に対する交差反応性は０.３２％以下であり、Ｚｋ２３Ｅ７抗体がＺｎ−ＤＴＰＡとＣｕ−ＤＴＰＡに対して強い特異性を有することが確認された。これらの結果を下記の表１に示す。尚、交差反応性は、下式で表される。
交差反応性＝（Zn-DTPAの解離定数／金属-DTPAの解離定数）ｘ 100
【００３３】
【表１】
2005298395.tif 000002
【００３４】
試験例１
亜鉛に対する法規制として、環境基準が３０ｐｐｂに、排水基準が３００ｐｐｂに設定される見通しである。また、銅については排水基準３５ｐｐｍが既に実施されている。このため、本発明のモノクローナル抗体Ｚｋ２３Ｅ７がこれらの規制値の濃度の亜鉛と銅を検出しうるかを実施例１−（３）と同様に評価した。なお、本試験例では濃度をｐｐｂにて表す。
その結果、抗体のＺｎ−ＤＴＰＡに対する結合曲線は１ｐｐｂから曲線が下がっており、亜鉛錯体の検出限界が１ｐｐｂであることが確認された。また、Ｃｕ−ＤＴＰＡに対する検出限界は１０ｐｐｂ（１５０ｎＭ）であった。すなわち、Ｚｋ２３Ｅ７抗体が亜鉛の環境基準および排出基準の判定に、さらに銅の排水基準の判定に利用できることが示された（図１を参照）。尚、図１において、横軸はＺｋ２３Ｅ７抗体に加えたＺｎ−ＤＴＰＡまたはＣｕ−ＤＴＰＡの濃度を示しており、縦軸は蛍光強度の相対値を示している。蛍光強度は、ＤＴＰＡ錯体の濃度が０の時（ＤＴＰＡ錯体を抗体に加えなかった時）の蛍光強度を１００とした。曲線は各データの近似曲線を示す。
【００３５】
試験例２
Ｚｋ２３Ｅ７抗体は亜鉛と銅に両方と結合するため、これらの金属を両方含む試料については正確な濃度を測定できない可能性がある。そこで、亜鉛と銅の化学的な性質の差を利用して一方の金属が錯体を形成することを阻害することにより、亜鉛と銅を区別して測定することを試みた。具体的には、銅イオンと硫化水素や、メルカプトエタノールのＳＨ基含有物質を接触させると沈殿を形成するため、試料にメルカプトエタノールを添加する場合と添加しない場合で測定する。亜鉛イオンが添加したメルカプトエタノールと反応せず、かつメルカプトエタノールがＺｋ２３Ｅ７抗体とＺｎ−ＤＴＰＡと結合を阻害しなければ、Ｚｋ２３Ｅ７抗体によって亜鉛と銅を区別して測定することが可能となる。
そこで、試料にメルカプトエタノールを添加した場合と添加しない場合で亜鉛と銅について結合分析を行った。その結果、亜鉛は低濃度でもメルカプトエタノールの影響をほとんど受けることなくＺｋ２３Ｅ７抗体により測定できることが確認された。また、銅についてはメルカプトエタノールによってＤＴＰＡとの錯体形成が阻害され、その結果、Ｚｋ２３Ｅ７抗体とＣｕ−ＤＴＰＡとの結合は検出されなかった（図２を参照）。これらの結果から、メルカプトエタノールで前処理した場合と全処理しない場合について測定することにより、試料中に亜鉛および銅が存在するか否かを区別して判定しうることのみならず、亜鉛と銅の各々について同時に濃度を測定しうることが示された。尚、図２において、横軸は試料中の亜鉛または銅の濃度を示している。各資料のＤＴＰＡの濃度は１００μＭで一定である。メルカプトエタノールを加えた試料のメルカプトエタノール濃度は１００μＭで一定であり、ＤＴＰＡを加える前に金属と反応させた。蛍光強度は、金属の濃度が０の試料（ＤＴＰＡ濃度は１００μＭ）の蛍光強度を１００として相対値を示した。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】モノクローナル抗体Ｚｋ２３Ｅ７と亜鉛との結合曲線において、横軸の亜鉛濃度をｐｐｂにて表したグラフである。
【図２】メルカプトエタノール添加・不添加の場合におけるモノクローナル抗体Ｚｋ２３Ｅ７と亜鉛および銅との結合強度を示す図である。
【図３】免疫クロマトグラフィー装置の構成図である。
【図４】本発明にかかる抗重属モノクローナル抗体を用いた重金属の第１の検出方法の原理図である。
【図５】本発明にかかる抗重属モノクローナル抗体を用いた重金属の第２の検出方法の原理図である
【図１】
2005298395.tif 000003
【図２】
2005298395.tif 000004
【図３】
2005298395.tif 000005
【図４】
2005298395.tif 000006
【図５】
2005298395.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月10日(2004.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2005298395.tif 000008
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2005298395.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月12日(2005.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
＜モノクローナル抗体の評価＞
得られたモノクローナル抗体は、亜鉛錯体、銅錯体と他の金属の錯体との親和性を比較することによりその抗体の抗原に対する親和性および特異性を評価する。親和性は、抗体の抗原との結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０）により評価する。そして、特異性は、亜鉛や銅に対するＩＣ５０と他の金属に対するＩＣ５０を比較することにより評価する。ＩＣ５０はいずれの方法で算出してもよいが、測定結果をソフトウェア（例えばOrigin Version 6.0など）により解析して求めてもよい。例えば、蛍光センサー法などで得られた測定値は、抗原を加えなかったときの測定値を１００％として相対値に変換した後、抗体と抗原の結合曲線の近似式：
ｙ＝９９／（１＋（ｘ／Ｐ１）Ｐ２）＋０.５
［式中、ｘは抗体量であり、ｙは抗体と抗原の結合量（％）であり、Ｐ１およびＰ２は近似のパラメーターである］に導入する。また、Ｐ１およびＰ２はソフトフェアにより決定し、得られた結合曲線から、ｙ＝５０になるときのｘの値（＝Ｐ１）をＩＣ５０とする。また、抗体の特異性は亜鉛や銅に対するＩＣ５０と他の金属に対するＩＣ５０との比を交差反応性として求める。