(57)【要約】【課題】  平滑筋の弛緩作用を有した生理活性物を培養が比較的簡便な微生物（真性粘菌）から抽出するため、その製造、原料の調達を容易とすることができる平滑筋弛緩剤およびその有効成分の抽出方法を提供する。【解決手段】  真性粘菌からの抽出物を有効成分とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真性粘菌からの抽出物を有効成分とすることを特徴とする平滑筋弛緩剤。
【請求項２】
酸水溶液による抽出物であることを特徴とする請求項１記載の平滑筋弛緩剤。
【請求項３】
酸水溶液とこれに続くアルコールによる抽出物であることを特徴とする請求項１または２記載の平滑筋弛緩剤。
【請求項４】
真性粘菌が、Physarum polycephalim属に属することを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の平滑筋弛緩剤。
【請求項５】
Physarum polycephalimが、Physarum polycephalim(Ng-1株)であることを特徴とする請求項４記載の平滑筋弛緩剤。
【請求項６】
薬理学的成分をさらに含有することを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の平滑筋弛緩剤。
【請求項７】
真性粘菌から平滑筋弛緩作用を有する生理活性物を酸水溶液で抽出することを特徴とする抽出方法。
【請求項８】
酸水溶液によって抽出した後に、アルコール抽出をすることを特徴とする請求項７記載の抽出方法。
【請求項９】
真性粘菌が、Physarum polycephalim属に属することを特徴とする請求項７または８記載の抽出方法。
【請求項１０】
Physarum polycephalimが、Physarum polycephalim(Ng-1株)であることを特徴とする請求項９記載の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、平滑筋弛緩剤とその有効成分の抽出方法に関するものである。さらに詳しくは、真性粘菌由来である平滑筋弛緩剤とその有効成分の抽出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む動物の平滑筋は、血管や腸管、子宮、膀胱、心臓等の各組織の壁を構成しており、また、アクトミオシン系に基づく原動力で、収縮と弛緩を繰り返して、各組織の機能に深く関与している。このように多くの組織に存在し、組織の機能において重要な役割を担っている平滑筋に対して、弛緩作用を有する弛緩剤としてクロルゾキサゾン、塩化スキサメトニウム、塩酸パパベリン等が知られている。これら弛緩剤は、平滑筋の収縮によって惹き起こされる疾患、たとえば、高血圧症、狭心症、切迫早産等の予防や治療に利用されている。たとえば、中枢性筋弛緩の効果を有する化合物（アミノケトン誘導体）を化学合成により製造し、薬剤として利用することが提案されている（特許文献１）。
【０００３】
また、たとえば、天然物である植物のフキから抽出した化学物質（イソペタシン）を利用した筋弛緩剤（特許文献２）や同じく植物である当帰由来の毒性の低い化学物質（リグステライドの二量体）を有効成分とした筋弛緩剤（特許文献３）も提案されている。
【０００４】
しかしながら、多くの平滑筋弛緩剤は、上記特許文献１記載のアミノケトン誘導体のように、製造に複雑な工程を含む化学合成によるものであったり、上記特許文献２や３記載の筋弛緩剤のように、生育（栽培）に手間のかかる植物から抽出するものであったり、その製造や原料の調達が面倒であるという問題があった。
【特許文献１】WO95/18092
【特許文献２】特開平1-283218号公報
【特許文献３】特開平9-77666号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、煩雑な化学合成の必要がなく、生育（培養）が比較的簡便な微生物を利用した平滑筋弛緩剤の製造が考慮することができるが、現状においては微生物由来の筋弛緩効果を有する生理活性物の製造に成功したという報告は知られていない。
【０００６】
この出願の発明は、このような背景からなされたものであって、平滑筋の弛緩作用を有した生理活性物を培養が比較的簡便な微生物から抽出するため、その製造、原料の調達を容易とすることができる、新しい平滑筋弛緩剤およびその有効成分の抽出方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、第1には、真性粘菌からの抽出物を有効成分とすることを特徴とする平滑筋弛緩剤を提供する。
【０００８】
また、第2には、酸水溶液による抽出物であることを特徴とする平滑筋弛緩剤を提供し、第3には、酸水溶液とこれに続くアルコールによる抽出物であることを特徴とする平滑筋弛緩剤を、第4には、真性粘菌が、Physarum polycephalim属に属することを特徴とする平滑筋弛緩物質を、第5には、Physarum polycephalimが、Physarum polycephalim(Ng-1株)であることを特徴とする平滑筋弛緩剤を、第6には、薬理学的成分をさらに含有することを特徴とする平滑筋弛緩剤を提供する。
【０００９】
さらに、この出願の発明は、第7には、真性粘菌から平滑筋弛緩作用を有する生理活性物を酸水溶液で抽出することを特徴とする抽出方法を、第8には、酸水溶液によって抽出した後に、アルコール抽出をすることを特徴とする抽出方法を提供する。
【００１０】
第9には、真性粘菌が、Physarum polycephalim属に属することを特徴とする抽出方法を提供し、そして、第10には、Physarum polycephalimが、Physarum polycephalim(Ng-1株)であることを特徴とする抽出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、培養が比較的簡便な微生物である真性粘菌から、平滑筋弛緩作用を有する抽出物（生理活性物）を有効成分とした平滑筋弛緩剤を得ることができる。
【００１２】
また、この平滑筋弛緩剤に、薬理学的成分を含有させて製剤化させることにより、より効果的に平滑筋弛緩作用を発揮させることができ、さらに患者に投与、もしくは、服用しやすい平滑筋弛緩剤とすることができる。
【００１３】
さらにまた、この出願の発明によって、真性粘菌から平滑筋弛緩作用を有する抽出物（生理活性物）を効率的に抽出することが実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものである。以下にその実施の形態について詳しく説明するが、この出願の発明はこれらによって、当然に限定されるものではない。
【００１５】
この出願の発明の平滑筋弛緩剤は、この出願の発明者による鋭意研究の結果になし得たものである。この出願の発明者は、下等真核生物である真性粘菌の変形体とよばれる形態において、網目状に脈管を広げ、アクトミオシン系を原動力として収縮および弛緩を繰り返す運動が見られることに着目した。そして、ヒト等の平滑筋における収縮および弛緩においてもアクトミオシン系を原動力としていることから、この真性粘菌の収縮・弛緩運動とヒト等の平滑筋の収縮・弛緩運動とにおける共通点に着目して、真性粘菌からこの収縮、弛緩に関与する生理活性物を抽出した。
【００１６】
この生理活性物は、ヒト等の動物の平滑筋に対して弛緩効果を有している。平滑筋は、血管、腸管、子宮、膀胱、気管等をはじめとする種々の組織器官に存在する筋肉の一種であり、自分の意志の作用で随意的に収縮させることができないことから、不随意筋ともいわれている。このように種々の組織や器官に存在するため、この出願の発明の平滑筋弛緩剤の活用用途は幅広い。たとえば、平滑筋の収縮によって惹起される疾患、たとえば、動脈硬化、高血圧症、狭心症、切迫早産、月経困難症、排尿障害、気管支喘息等の予防や治療に活用することが期待できる。
【００１７】
平滑筋の収縮と弛緩は、アクトミオシン系に基づいている。たとえば、血管収縮物質や血管弛緩物質等のように細胞外（外因性）から働く場合、平滑筋細胞内でのアクチンとミオシンの活性化は、20kDaミオシン軽鎖（MLC20）のリン酸化を伴う。
【００１８】
平滑筋の収縮機構の概略を説明すると、たとえば、血管収縮物質を血管の平滑筋に作用させると、細胞内のCa2+濃度が上昇し、Ca2+がカルモジュリンに結合する。そして、Ca2+-カルモジュリン複合体が、ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）を活性化する。活性化したMLCKは、MLC20をリン酸化し、ミオシンのアクチンへの作用を増大させ、血管平滑筋の収縮が起こる。一方、平滑筋の弛緩機構の場合は、たとえば、ミオシンホスファターゼがリン酸化したMLC20を脱リン酸化することに基づいているとされている。
【００１９】
しかし、これら平滑筋の収縮および弛緩のメカニズムは、MLC20のリン酸化と発生した張力とが一致しない例もある。たとえば、子宮平滑筋は、Ca2+非存在の外溶液でアゴニストとして、子宮収縮剤であるオキシトシンを作用させると、細胞内のCa2+の上昇が起こらないため、MLC20のリン酸化を伴わずに収縮する。
【００２０】
この出願の発明の平滑筋弛緩剤の作用機序は、MLC20リン酸化状態での弛緩であり、カルシウム拮抗剤やNO作動性可溶型グアニル酸シクラーゼの阻害剤である1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン-1-オン、アドレナリンβ作用薬等のような従来の平滑筋弛緩剤の作用機序とは異なっている。
【００２１】
この出願の発明の平滑筋弛緩剤は、真性粘菌からその有効成分である生理活性物を抽出したものに由来しており、真性粘菌は、Physarum polycephalim属であることが好ましく、また、培養条件や取り扱い方法等がよく研究されているPhysarum polycephalim(Ng-1株)であることがさらに好ましい。
【００２２】
さらに、この出願の発明の平滑筋弛緩剤は、薬理学的成分をさらに含有させて製剤化することもできる。このような平滑筋弛緩剤は、平滑筋の収縮によって惹起される上記のとおりの疾患、動脈硬化、高血圧症、狭心症、切迫早産、月経困難症、排尿障害、気管支喘息等に対して、より効果的に作用しうるものとなり、また患者に対して投与もしくは服用の際の利便性を向上させることのできる予防薬、治療薬等とすることができる。
【００２３】
上記の「薬理学的成分」とは、通常の薬剤製造に用いられる各種の担体を指す。「担体」は、利用目的等や薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜に選択できる。たとえば、経口投与や注射による投与等が挙げられる。経口投与では、懸濁剤やシロップ剤のような液体調整物（水、シュクロース、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油や大豆油等の油類、また防腐剤やペパーミント、ストロベリー等の各種フレーバー等から調整・製剤される）として、また散剤、丸剤、カプセル剤や錠剤（ラクトース、グルコース、マンニトール等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、マグネシウムステアレート等の潤沢剤、ゼラチン等の結合剤、また表面活性剤、可塑剤等から調整・製剤される）として投与することができる。また、注射による投与には、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等の方法を適宜に選択することができる。
【００２４】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合溶液、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化して、使用時に前記の注射用溶液担体と混合して注射液を調整してもよい。「投与量」としては、この出願の発明の平滑筋弛緩剤の効果を発揮する量であれば、特に限定されるものではないが、投与対象となる患者の体重、身長、体調等を十分に考慮することが重要である。
【００２５】
また、薬理学的成分は、この出願の発明の平滑筋弛緩剤を細胞内に導入可能な形態とするための成分であり、たとえば平滑筋弛緩剤の機能や効果等を変更することなく、かつ、薬理学的に許容される溶液にこの平滑筋弛緩剤を混合して組成物とすることができる。このような組成物は、たとえば、目的物質を細胞内に導入することができるマイクロインジェクション法や脂質を用いた細胞内導入法によって標的筋細胞に導入することができる。これによって、任意の病因箇所を効果的に標的とすることができ、平滑筋の弛緩効果を実現することができる。
【００２６】
上記のような真性粘菌、具体的には、たとえば、Physarum polycephalim属に属する真性粘菌、さらに具体的には、Physarum polycephalim(Ng-1株)から抽出される平滑筋弛緩作用を有する抽出物（生理活性物）は、酸性溶液等からなる酸水溶液を用いることにより、抽出することができる。
【００２７】
また、この抽出物をメタノールやエタノール等のアルコールを用いてさらに抽出することで、その精製度が向上する。具体的には、たとえば、酸水溶液で抽出した抽出物をアルコールで懸濁して、液体クロマトグラフィーを用いて分離抽出することで、精製度の高い目的とする抽出物（生理活性物）を得ることができる。
【００２８】
なお、このときに用いられる酸水溶液の構成物は、特に制限されるものではないが、たとえば、酢酸と塩酸の混合溶液を使用することができ、また、酢酸のみでもよい。また、アルコールについては、液体クロマトグラフィー等をはじめとする、分離抽出の工程に支障を与えるものでなければ、特に制限されるものではない。たとえば、エタノール、メタノール、n-プロパノール等の各種アルコールを利用することができるが、この出願の発明においては、エタノールを用いることが好ましい。
【００２９】
さらに、液体クロマトグラフィーを使用する場合についても、その種類等は特に制限されるものではない。たとえば、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を使用することができる。特に、逆相クロマトグラフィーの場合は、この出願の発明の平滑筋弛緩剤の有効成分である抽出物（生理活性物）を効率的に分離抽出することができるため、好ましい。
【００３０】
なお、逆相クロマトグラフィーにおいて、シリカベースの担体を用いる場合には、酸性溶液を用いることが好ましく、特にトリフルオロ酢酸が好ましい。トリフルオロ酢酸は、試料（この出願の発明の平滑筋弛緩剤の有効成分）の溶出のテーリングを抑え、疎水性イオンペア試薬としての働きがあり、逆相クロマトグラフィーでは一般的に使用される。また、試料溶出に用いることのできる試薬としては、揮発性で水と混じり疎水基を有する溶媒であれば、特に限定されるものではなく、たとえば、アセトニトリルはもちろん、n-プロパノール、エタノール、メタノール等も用いることができる。
【００３１】
そして、上記のような分離抽出によって得られた抽出物を酸加水分解、疎水成分除去、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、そして、逆相クロマトグラフィー等を利用して分離抽出することで、粘菌特有の黄色色素等の夾雑物が大幅に除去することができ、さらに精製度を高めることができるため好ましい。このとき、１回、もしくは複数回のエタノール抽出を適宜に行うことで、さらに多くの夾雑物を除去することができる。なお、この分離抽出工程（精製工程）の合間には、分離抽出操作をスムーズに行なうために、適宜に凍結乾燥させることが好ましい。このようにして精製された平滑筋弛緩作用を有する抽出物は、乾燥状態、または、メタノール等のアルコールに溶解することによって安定に保存することができる。
【００３２】
以下に実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細、かつ、具体的に説明する。もちろん、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１：真性粘菌からの生理活性物の抽出およびその弛緩効果の確認
（１）試薬
使用した試薬は、いずれも市販の高純度なものを用いた。水溶液の調製には、Milli Q水（Milli Q Plus, Millipore, Bedford, MA, USA）を使用した。化学物質として、塩化アセチルコリン（第一製薬株式会社）、α-トキシン（Sigma, St. Louis, MO, USA）、1-フェニレフリン塩酸塩および1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン-1-オン（和光純薬工業株式会社）およびニトロプルシードナトリウム二水和物（Sodium nitroprusside dihydrate, SNP；Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA）を用いた。
【００３４】
また、平滑筋の張力測定に用いた試薬溶液は、表１にて示した。なお、G1溶液において、Ca2+-EGTAバッファー溶液により所望のCa2+濃度に調節することができる。
【００３５】
【表１】
2005289898.tif 000002
（２）材料および検体
(i) 真性粘菌（Physarum polycephalim(Ng-1株)）
真性粘菌はPhysarum polycephalim(Ng-1株)を用い、暗所にて改良型Camp法（IUBMB Life 2001;51:337-344およびInt Rev Cytol 1999;191:53-98）を利用して、オートミール（Quaker Oats Company, Chicago, IL, USA）で培養した。培養した真性粘菌Physarum polycephalim(Ng-1株)を回収して、平滑筋弛緩効果の測定実験に用いた。
(ii) ウサギ（日本白系）
体重2.5-3.0kgのウサギ（今井実験動物飼育所）から、平滑筋の組織として大腿動脈を採取した。
【００３６】
まず、ウサギを静注でペントバルビタール塩（35mg/kg）を投与して麻酔をかけた。つぎに、公知の方法に従い、大腿動脈を速やかに採取し、予め氷冷した平滑筋組織ストック溶液に浸漬し、4℃にて保存した。この大腿動脈を1週間以内に実験に供した。
(iii) ギニアピッグ（モルモット）
体重200gのギニアピッグ（今井実験動物飼育所）から、平滑筋の組織として、腸管を採取した。
【００３７】
このギニアピッグをジエチルエーテル麻酔によって屠殺した。公知の方法に従い、腸管を採取し、上記(i)と同様に氷冷した平滑筋組織ストック溶液に浸漬し、その日の内に実験に供した。
（３）平滑筋弛緩物質の抽出
図１は、真性粘菌から筋弛緩の作用を有する生理活性物、すなわち、平滑筋弛緩物質を抽出する工程の概略を例示した図である。
(i) 真性粘菌を逆浸透膜（Elix-UV： Millipore）による精製水で洗浄し、-80℃にて凍結保存した。凍結した真性粘菌は、氷上で酸水溶液（1M CH3COOHおよび20mM HCl）中にてホモジナイズした。250000×gで1時間の遠心処理を行ない、黄色に呈する上清を回収した。この上清を遠心濃縮機（CC-100、株式会社トミー精工）および0.45μm膜フィルター（Millex（登録商標）-LH： Millipore）を用いて、凍結乾燥させた。
(ii) 得られたサンプルをエタノールで懸濁して、-80℃で1時間静置した。この懸濁液を15000×gで2時間の遠心処理し、上清を凍結乾燥した。
(iii) この凍結乾燥後のサンプルを0.1%（v/v）のトリフルオロ酢酸（Trifluoroacetic acid, TFA）に溶解し、逆相カラムSephasil Protein C4 12μ ST（4.6×250mm： Amersham Pharmacia Biotech, Buckingham, UK）を利用した高速液体クロマトグラフィー（High performance liquid chromatography, HPLC）によって分離操作を行った。カラムに吸着したサンプルは、0.1%（v/v）トリフルオロ酢酸に含ませたアセトニトリルの濃度を5％-25％に上げていくことで、1時間で抽出することができた。なお、アセトニトリルの濃度変化は、リニアなグラジエントであった。
(iv) 抽出した精製分画（抽出物）は、上記(i)と同様の手順で凍結乾燥して「粗抽出物」とし、-30℃にて保存した。
（４）粗抽出物の精製
得られた粗抽出物の一部を、微量の6N塩酸で110℃、24時間、または、5N塩化ナトリウムで70℃、5時間により加水分解し、凍結乾燥した。
【００３８】
この加水分解物は、Bligh-Dyer分配法（Cell Biology, Vol.1, Sun Diego, Academic Press, 1998;466-471）で、水溶性と脂溶性とに分けることができた。
【００３９】
そして、水相の溶液を回収して、75%(v/v)のメタノールで平衡化したカラム（SP-TOYOPEARL 650S, 0.6×10cm, 東ソー株式会社）を用いたHPLCシステム（イオン交換クロマトグラフィー）にかけ、カラムのレシンに通過させ、カラムに吸着しない分画を回収して乾燥処理を行なった。乾燥させたサンプルを75%(v/v)のメタノールに溶解させ、75%(v/v)のメタノールで平衡化したカラム（Sephadex LH-20, 1.0×30cm, Amersham Pharmacia Biotech）を用いたHPLCシステム（ゲルろ過クロマトグラフィー）にかけ、得られた分画（抽出物）中に、目的とする平滑筋に対する弛緩活性を有する生理活性物（平滑筋弛緩物質）が含まれている。
【００４０】
収集量は、100g（水分を含む重量）から、13.6mg（乾燥重量）を取得することができた。
【００４１】
この抽出物を用いて、平滑筋における張力測定および20kDaミオシン軽鎖（20kDa Myosin light chain, MLC20）リン酸化のレベル測定を行った。なお、約0.14mg/mlの抽出物を便宜上、「抽出物（×1）」とし、括弧内の数字は、抽出物の濃度を意味する。
（５）抽出物中に含まれる生理活性物の特徴の確認
抽出物中に含まれる生理活性物（平滑筋弛緩物質）は、公知の方法であるゲルろ過クロマトグラフィーによって分離し、その結果から約4kDa以下の低分子量であることを確認した。
【００４２】
また、この生理活性物に6N HCl、または、5N NaOHによる加水分解処理を行なったが、後述の平滑筋に対する弛緩効果は安定に保たれており、酸やアルカリに対して安定であることが確認された。これは、以前に報告された、細胞内c-AMPを上昇させる作用を有するが、アルカリ処理によって加水分解されるPhysarum cyclic lysophosphatidic acid (PHYLPA)（Gen Pharmacol., 1983, 14,: 505-512およびBr J Pharmacol., 1991, 102: 215-221等）とは異なるものであると考えられる。
【００４３】
さらに、この生理活性物は、水、メタノール、エタノールには溶解することを確認したが、クロロホルム等の有機溶媒には溶解することができなかったことから、脂溶性物質ではないと考えられる。
（６）抽出物に含まれる生理活性物の平滑筋弛緩効果の確認
平滑筋組織として、上記（１）(ii)にて採取したウサギ由来大腿動脈条片にKESを作用させて、脱分極刺激により収縮させた。この大腿動脈条片に真性粘菌から得られた抽出物を作用させ、その変化を測定した。抽出物を加えたときに張力が減少し、その後、抽出物を含まない溶液に交換して張力が回復した抽出物を平滑筋弛緩効果を有するものとした。結果は、図２に示したとおり、大腿動脈の収縮が弛緩したことを確認することができた。なお、この弛緩効果（平滑筋組織の張力）の測定には、市販のアイソメトリックフォーストランスデューサーによる物理的な変化を電気的な変化に変換して、その変化をペンレコーダーに記録することできる測定装置を用いた。（AE801：AME, Horten, Norway）との間で、400μlのバブルチャンバー上にセットした。このアイソメトリックフォーストランスデューサーにはアンプ（ユニオン、群馬）が接続されている。
【００４４】
この図２は、検出波長OD220において見られるピークから、抽出物には弛緩活性が検出され、およそ34-42分間保持することを確認することができた。なお、領域Aは、全抽出物の中で最も弛緩活性（張力の減少）が確認できた抽出物を示し、領域Bは、弛緩活性が確認できた分画（抽出物）を示している。
【００４５】
また、この抽出物に上記のとおり、6N HCl、または、5N NaOHを作用させ、加水分解を行ったところ、この弛緩効果は保持され、酸やアルカリに対して安定であることが確認できた。
実施例２：平滑筋における弛緩効果の検討
（１）ウサギ大腿動脈に対する弛緩効果
(i) 平滑筋組織の前処理
張力測定のため、実施例１にて採取したウサギ大腿動脈を条片に処理し（幅200-300μm、長さ5mm）、その両端部に絹糸を結びつけた。
【００４６】
また、他方、張力刺激によるMLC20リン酸化測定のため、大腿動脈をシート状に処理し（幅2mm、長さ5mm）、その両端部に絹糸を結びつけた。
【００４７】
なお、上記実験に供する際、抽出物による弛緩効果を純粋に検討するため、大腿動脈の結合組織、内皮細胞は取り除いた。
【００４８】
この条片、または、シート状のウサギ大腿動脈をNES中に浸し、24℃±0.5℃にて、フックとアイソメトリックフォーストランスデューサー（AE801：AME, Horten, Norway）との間で、400μlのバブルチャンバー上にセットした。実施例１と同様に、このアイソメトリックフォーストランスデューサーにはアンプ（ユニオン、群馬）とペンリコーダー（SS-100F: 株式会社セコニック）が接続されている。
(ii) 張力測定
実施例１で得られた真性粘菌からの抽出物をウサギ大腿動脈（条片）に作用させた。
【００４９】
図３の結果は、KESによる収縮の誘導前に各濃度の抽出物（×1〜×5）を加えて、NES中で24℃にて5分間のプレインキュベート処理を行った後、各濃度の抽出物（×1〜×5）を含むKESに溶液を交換して収縮を誘導させ、張力を検討したものを示している。なお、コントロールは、抽出物を含まないKESを用いて溶液の交換を行った。このコントロールにおける収縮は、1.14mNであった。
【００５０】
抽出物（×1および×2）による収縮相における張力のピークは、コントロールの値に対して、それぞれ91.4%と52.7%であった。
【００５１】
また、図３に示したとおり、抽出物の濃度を上げた場合（×3、×4および×5）では、収縮相が弱くなることが確認され、さらに15分後では、張力のピークはコントロールの値に対して、（×1）では94.3%、（×2）では86.7%、（×3）では83.9%、（×4）では74.3%、そして（×5）では3.9%であった。
【００５２】
図４の結果は、KESに溶液を交換して収縮を誘導した後に各濃度の抽出物（×2、×4、×6および×8）を加え、張力の測定を行ったものを示している。コントロールにおける張力は0.94mNであった。この値に対して抽出物を加えた場合では、図４に示したように、（×2）では86.9%、（×4）では56.1%、（×6）では14.7%、（×8）では13.1%であった。矢印に示したように抽出物の濃度が上がるにつれ、張力のピークが下がり、収縮が弛緩されることが確認できた。
（２）ギニアピッグ腸管に対する弛緩効果
(i) 平滑筋組織の前処理
張力測定のため、実施例１にて採取したギニアピッグ腸管（長さ1.5cm）をフックとアイソメトリックフォーストランスデューサー（日本光電工業株式会社）との間で、室温にて10mlのマグナス管にセットした。このアイソメトリックフォーストランスデューサーにはアンプ（日本光電工業株式会社）とポリグラフ（日本光電工業株式会社）が接続されている。
(ii) 張力測定
ギニアピッグ腸管にアセチルコリン（ACh）を作用させることにより、ギニアピッグ腸管の収縮が誘導された。なお、コントロールにおいて、0.5μMのアセチルコリンによる収縮張力は12.70mNであり、収縮時間は30分ほど続いた。
【００５３】
そして、抽出物を作用させることにより、図５に示したように各濃度の抽出物（×1、×2、×3、×4）における収縮張力が、コントロールの値に対して、（×1）では92.6%、（×2）では35.0%、（×3）では14.8%、（×4）では2.7%であり、弛緩効果を確認することができた。
実施例３：弛緩効果の作用機序の検討
（１）Ca2+非存在下における弛緩効果
ウサギ大腿動脈条片を用いて、Ca2+非存在下でもフェニレフリンによる一過性の収縮作用を誘導した。
【００５４】
ウサギ大腿動脈条片をNES中で20分以上静置した後、Ca2+不含NESに各濃度の抽出物を加えたものを用いて、24℃にて3分間プレインキュベートし、50μMのフェニレフリンを加えて収縮を誘導した。コントロールは、抽出物を加えていないCa2+不含NESを用いて測定し、その測定値は0.54mNであった。
【００５５】
図６に示したように、各濃度の抽出物を作用させた場合の収縮張力のピークは、コントロールに対して、（×1）では93.1%、（×2）では79.3%、（×3）では62.0%、（×4）では51.7%、（×5）では31.0%、そして（×6）では2.0%であった。
【００５６】
また、図７に示したように、抽出物の添加により、黒丸で例示した収縮張力のピークの減少（弛緩）とともに、黒四角で例示した収縮張力のピーク時間（収縮力の持続時間）が、長くなることも確認することができた。
【００５７】
コントロールでは1.56分であったのに対して、抽出物を添加した場合は、（×1）では1.77分、（×2）では2.71分、（×3）では4.69分、（×4）では6.88分、（×5）では9.48分であった。さらに、（×6）では、検出することが不可能なまでピーク時間が延びたことを確認することができた。
【００５８】
このことは、細胞外のCa2+が細胞膜を通じて、細胞内に流入することを阻害し、筋収縮を促すカルシウム拮抗剤としての作用を有するものではないことを確認することができた。
（２）1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン-1-オン（ODQ）の存在下における弛緩効果
コントロールとして、ウサギ大腿動脈条片をKESで10分間収縮させ、収縮張力を標準値に戻るまでNESに浸した。次に、NO作動性可溶型グアニルシクラーゼの阻害剤であるODQ（5μl）をKES処理によって収縮させている前記ウサギ大腿動脈条片に加えたところ、ニトロプルシードナトリウム（100μl）による弛緩効果をこのODQの添加によって阻害されることを確認した。しかしながら、このODQの存在下で実施例１にて得られた抽出物を添加することにより、収縮の阻害、すなわち弛緩効果を確認することができた（図示せず）このことから、この出願の発明の平滑筋弛緩物質の作用機序は、平滑筋拡張剤に利用される亜硝酸塩等のNOドナーではなく、その下流にあるc-GMPを介したものではないと考えられる。
（３）α-トキシン処理を施した平滑筋における抽出物の弛緩効果
（i）α-トキシン処理
平滑筋組織として、実施例１にて得られたウサギ大腿動脈の条片を用いた。抽出物中の生理活性物（筋弛緩物質）が、アクトミオシン系等に関連する細胞内伝達系に直接作用しているか確認するため、このウサギ大腿動脈条片にα-トキシン処理を施して脱膜処理をし、実験に供した。
【００５９】
ウサギ大腿動脈条片はNES中に浸し、実施例２と同様にフックとアイソメトリックフォーストランスデューサーとの間で、10℃以下に冷却したバブルチャンバー上にセットした。その後、NESを30μg/mlのα-トキシンを含むG1に溶液交換し、38℃にて30分間のインキュベート処理をした。その後、24℃、10分間の条件下にてG1による２回の洗浄操作を行った。
（ii）測定結果
ウサギ大腿動脈条片の収縮作用を誘導するため、pCa 5.0細胞内溶液（pCa 5.0）を用いた。このpCa 5.0によって収縮張力を測定したところ、1.75mNであり、コントロールとして用いた。なお、pCa 5.0溶液の組成は、表２に示した。
【００６０】
【表２】
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各濃度（×2、×4、×6）の抽出物を加えた場合の収縮張力を測定したところ、図８に示したとおり、収縮を顕著に抑制する結果を確認することができなかった。コントロールの測定値に対して、（×2）では100%、（×4）では99.0%、（×6）では96.5%であった。
【００６１】
このことは、すなわち、抽出物に含まれる生理活性物（平滑筋弛緩物質）による平滑筋弛緩作用は、アクトミオシン系には直接作用せず、細胞膜受容体受容体とその関連蛋白質を介していることが考えられる。
実施例４：平滑筋における20kDa-ミオシン軽鎖（MLC20）リン酸化レベルの測定
（１）MLC20のリン酸化レベルの測定
リン酸化MLC20は、非リン酸化MLC20からグリセロールPAGE法により分離し、MLC20に対するモノクローナル抗体（Clone MY-21, Sigma）を用いたウエスタンブロッティング法によって検出した。
【００６２】
実施例１にて作製したシート状のウサギ大腿動脈をアイソメトリックフォーストランスデューサーにセットした。濃度の異なる抽出物（×0、×2、×3および×4）を含ませたNESそれぞれに浸し、プレインキュベートをした。次いで、収縮作用を促す50μMのフェニルエレニンを含むKESに溶液交換した。KESによって、大腿動脈条片が脱分極刺激され、収縮誘起される。
【００６３】
実施例１にて作製したウサギ大腿動脈シートに、ドライアイスで冷却した反応停止液（10mM DTTを含むアセトンと10%トリクロロ酢酸（TCA）との混合溶液）と作用させ、収縮状態で瞬間凍結した。
【００６４】
このウサギ大腿動脈シートを10mM DTTを含むアセトンで２回洗浄して、TCAを除去し、試料を風乾した。そして、この試料をウレアサンプルバッファー（20mM Tris, 22mM グリシン, 10mM DTT, 8.3M 尿素, 0.1% ブロモフェノールブルー）と1時間、室温にて混合操作をした。
【００６５】
次いで、0.45mmのフィルター（Ultrafree（登録商標）-MC, Millipore）でこの試料をろ過し、グリセロールPAGEに使用した。泳動後、PVDF膜（Immobilion（登録商標） PVDF Transfer Membrane, Millipore）に泳動後のゲルをトランスバッファー（25.0mM Tris, 38.4mMグリシン, 20%メタノール）を用いて転写し、ウエスタンブロッティング法を行った。
【００６６】
転写後のPVDF膜を5%のスキムミルクを含ませた0.1% Tween20-リン酸バッファー塩（PBS-T）溶液でブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、PVDF膜に抗MLC20抗体を加え、室温で1時間の抗体反応を行ない、次にホースラディッシュパーオキシターゼ結合型ヒツジ抗ウサギIgG二次抗体（Amersham Pharmacia Biotech）と反応させた。
【００６７】
結果は図９に示したとおり、MLCは、何れの濃度（×0、×2、×3および×4）の抽出物においても、リン酸化されていることが確認された。MLC(-P)は非リン酸化、MLC(+P)はリン酸化されていることを示している。
【００６８】
そして、MLC20のリン酸化レベルの測定は、グリセロールPAGEにて分子量毎に分離させたMLC20のバンドの移動度を化学蛍光検出システム（ECL Plus Western Blotting Detection System, Amersham Pharmacia Biotech）により検出、測定した。また、ウェスタンブロットは、NIH IMAGE program, Version 1.63を用いて濃度測定を行った。
（２）測定結果
図１０の黒棒グラフに示したように、弛緩効果は濃度依存的であることが確認された。その一方で、白棒グラフに示したように、MLC20のリン酸化レベルには大きな差異は確認されなかった。このことから、真性粘菌からの抽出物による筋弛緩効果は、MLC20のリン酸化に伴う弛緩とは異なる作用メカニズムを有することが考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】この出願の発明の平滑筋弛緩物質の抽出工程の概略を例示した工程図である。
【図２】この出願の発明の平滑筋弛緩物質の活性状態を例示した図であり、Aは弛緩活性が最大である状態を示しており、Bは弛緩活性の基底である状態を示している。
【図３】ウサギ大腿動脈条片を用いて、この出願の発明の平滑筋弛緩物質で前処置した場合における平滑筋弛緩物質の弛緩効果の検討結果を示したグラフである。
【図４】ウサギ大腿動脈条片を用いて、この出願の発明の平滑筋弛緩物質で後処置した場合における平滑筋弛緩物質の弛緩効果の検討結果を示したグラフである。
【図５】ギニアピッグの腸管を用いて、アセチルコリンによる収縮に対するこの出願の発明の平滑筋弛緩物質の弛緩効果の検討結果を示したグラフである。
【図６】ウサギ大腿動脈条片を用いて、Ca2+不含NESとフェニレフリンを使用した条件下で、この出願の発明の平滑筋弛緩物質の弛緩効果の検討結果を示したグラフである。
【図７】ウサギ大腿動脈条片を用いて、Ca2+不含NESとフェニレフリンを使用した条件下で、この出願の発明の平滑筋弛緩物質の弛緩効果の検討結果を示したグラフであり、黒丸は張力の度合いを示しており、黒四角はその持続時間を示している。
【図８】ウサギ大腿動脈条片を用いて、α-トキシン処理した場合におけるこの出願の発明の平滑筋弛緩物質の弛緩効果の検討結果を示したグラフである。
【図９】ウサギ大腿動脈シートを用いて、MLC20のリン酸化の有無をウエスタンブロッティングにより検討した結果を示した図である。
【図１０】図９におけるMLCリン酸化レベルの測定結果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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