(57)【要約】      （修正有）【課題】  非特異吸着を抑制し得る高感度核酸検出バイオプローブとその使用方法、および効率的な核酸輸送を可能にする核酸担持金属微粒子とその使用法を提供する。【解決手段】  ポリエチレングリコール・ポリカチオン共重合体をより微粒子表面を保護して粒子の分散安定化をはかり、核酸が、メルカプト基、ジチオール基、スルフィド基を介して、ポリアミンセグメントの一部に化学的に修飾され、若しくは金属微粒子表面に直接担持されている核酸担持金属微粒子の製造方法とその高感度センシング素材および遺伝子治療用キャリアとして利用する材料とその方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子表面に水溶性ポリカチオンをブロックセグメントとして有する親水性ポリマーで被覆して、水中での分散安定性を確保した表面に、オリゴ核酸を直接的または間接的に担持させ、核酸相補鎖のセンシング、または核酸輸送を行う微粒子。
【請求項２】
微粒子が金属である請求項１の微粒子
【請求項３】
親水性ポリマーが、重合度２〜１０，０００のポリエチレングリコールであるＰＥＧ／ポリカチオン共重合体である請求項１または２に記載の核酸担持微粒子。
【請求項４】
親水性ポリマーが、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有するブロックポリマーの第１のブロックを構成する親水性ポリマーセグメントであり、かつ、第２のブロックを構成するポリマーセグメントの、微粒子表面の支持体に配位能を有する官能基を介して、下記のブロックポリマーが微粒子表面に固定されている、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸担持金属微粒子。
（ａ）上記親水性ポリマーのセグメントを第１のブロック成分とする
（ｂ）金属微粒子表面の支持体に配位能を有する官能基を有するモノマーをモノマー単位とする、重合度が１〜２００のポリマーセグメントを第２のブロックとする。
【請求項５】
微粒子表面の支持体に配位能を有する官能基が、メルカプト基、ジチオール基、スルフィド基、またはアミノ基である、請求項１〜４記載の核酸担持金属微粒子。
【請求項６】
ブロックポリマーの第２のブロックが、式（１）
【化１】
2005328809.tif 000003
［式中、ｍは１〜１０の整数、ｎは１〜１００の整数を表し、Ｒ１、Ｒ２は互いに独立して、炭素原子数が１〜５のアルキル基、アミノ基、メルカプト基、または、スルフィド基を表す］で表される、メタクリル酸ポリマーのセグメント、またはペンタエチレンヘキサミン基である、請求項１〜５のいずれかに記載の金属微粒子。
【請求項７】
核酸が、メルカプト基、ジチオール基、スルフィド基を介して、ポリアミンセグメントまたは微粒子表面の一部に化学的に修飾され、金僕微粒子表面に担持されている、請求項４〜６のいずれかに記載の核酸担持金属微粒子。
【請求項８】
微粒子が金、銀、銅、白金、パラジウム、アルミニウムの内の少なくとも一種の金属から選ばれる素材で形成されている、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸担持金属微粒子。
【請求項９】
金属微粒子の粒径が１ｎｍ以上であり、１００ｎｍ未満のサイズを有する請求項１〜８に記載の核酸担持金属微粒子。
【請求項１０】
核酸が１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡから選ばれる、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸担持金属微粒子。
【請求項１１】
金属微粒子表面に直接的または間接的に担持されている核酸が、生体環境中で放出される、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸輸送用金属微粒子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の表面を持つ核酸検出用または輸送用金属微粒子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸輸送用金属微粒子の使用方法。
【請求項１４】
核酸検出用の金属微粒子と核酸試料を接触させて、当該金属微粒子の固定化核酸とのハイブリダイズを検出する、請求項１３に記載の核酸検出用金属微粒子の使用方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の核酸検出用金属微粒子の使用方法において、核酸同士のハイブリダイズの検出が、表面プラズモン共鳴を利用するセンサによって行われる、核酸検出用金属微粒子の使用方法。
【請求項１６】
表面プラズモンセンサーのセンサチップが請求項１〜１１記載の表面を持つセンサチップを使用する請求項１４記載の核酸検出用金属微粒子の使用方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の核酸検出用金属微粒子の使用方法において、核酸同士のハイブリダイズの検出が、光学的手法によって行われる、核酸検出金属微粒子の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明はバイオプローブまたはバイオキャリアにおいて用い得る、核酸・微粒子複合体に関する発明であり、特に核酸検出および核酸輸送用の微粒子に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】  バイオプローブは、例えば、生物学的な試料を検体とした、特定の被検物質の検出に適しており、現在、様々なバイオプローブが提案されている。核酸を検知するバイオプローブの典型的な態様として、センサー表面や微粒子表面に担持された核酸におけるハイブリダイズまたはその解離等を感知したセンサーの信号を、大幅に増幅して検出させるもの等が挙げられる。【０００３】  核酸検出用センサーとしても好適に用い得る、主要なバイオセンサーの一つとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用するバイオセンサー（以下、ＳＰＲセンサーともいう）が提供されている。このＳＰＲセンサーは、プリズムの底面に金や銀等の金属薄膜を形成し、金属薄膜の裏面からレーザーなどの光を、入射角度を変えながら入射して、その反射光を測定し、金属表面プラズモンと共鳴して吸収される、特定入射角度の光を指標として、当該金属表面で起きている、核酸のハイブリダイゼーション等の反応を標識無しで高感度に検出することが可能なバイオセンサーであり、金属薄膜の表面およびその近傍における屈折率の変化に対して鋭敏であることが知られている（例えば、Ａ．Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｎｃｔ．Ｂｉｏｌ．５（１９９５）６９９−７０５）【０００４】  現在、微量検体の検出感度を向上させる目的で、バイオプローブとして蛍光標識や放射性同位体などが使用されている。ＳＰＲセンサーでは金属薄膜の表面およびその近傍における屈折率の変化を表面プラズモン共鳴の変化として測定する装置であることから、屈折率を増大し、表面プラズモン共鳴に影響を与える金属微粒子は、高感度であるとされるＳＰＲセンサー検出感度をさらに大幅に増幅することができ、試料中に極微量しか含まれていない検体を高感度に検出するのに適している。【０００５】  特に、近年、遺伝子の解読が進み、一塩基置換変異等の、核酸の微妙な変異を感度よく検出することが要求されており、非特異的な反応が抑制され、簡便、かつ、鋭敏に、所望する核酸の変異を検出可能な核酸検出バイオプローブの提供が待ち望まれている。【０００６】  またバイオキャリアとしては治療を目的とした薬物を体内の目的部位に送り届けるものであり、典型的な様態としてはリポソームや高分子ミセル、ポリカチオン、デンドリマー等に薬物を複合したバイオキャリア等が挙げられる。【０００７】  後述する本発明に関連する先行文献としては、例えば、以下に掲げる文献が挙げられる
１．特開平７−３１６２８５号公報（特許文献１）
特許文献１には、ＳＰＲセンサーのチップの表面において用い得る、ポリアルキレンオキシド誘導体の製造方法が記されているが、この文献自体には、ポリアルキレンオキシド誘導体のバイオセンサーへの応用に関する開示はなされていない【０００８】  ２．特開平１１−３２２９１６号公報（特許文献２）
特許文献２には、ＳＰＲセンサーの表面において、さらに好適に用い得る、ビオチン残基をω末端に有する、ポリオキシエチレン誘導体について開示されているが、この文献自体には、このヘテロポリオキシエチレン誘導体のバイオセンサーへの応用に関する開示はなされていない。【０００９】  ３．特開２００１−２０００５０号公報（特許文献３）
特許文献３にはポリエチレングリコール誘導体が担持された、金等の金属微粒子が、分散性が良好である旨等が記載されているが、この文献自体には、この金属微粒子のバイオセンサーへの応用に関する開示はなされていない。【００１０】  ４．特開２００２−８０９０３号公報（特許文献４）
特許文献４には、ポリエチレングリコールをブロックとして有し、かつ、特定のメタクリル酸ポリマーを他のブロックとして有する、ブロックポリマー誘導体が担持された、金等の金属微粒子について開示されているが、この文献自体には、この金属微粒子のバイオセンサーへの応用に関する開示はなされていない。なお、この特許文献４のブロックポリマーは、本発明においても用い得るブロックポリマーである。【００１１】  ５．特許第２８１５１２０号公報（特許文献５）
特許文献５には、ＨＳ−Ｒ−Ｙ（Ｒは炭素原子数が１０を超える、ヘテロ原子で中断されていても良い炭化水素基であり、Ｙは、リガンドまたは生体適合性多孔質マトリックスを共有結合させるための活性基である）で表される有機分子を用いて、そのチオール基を介して、金、銀等の自由金属の巻く表面へ結合させて、この有機分子が密に詰め込まれた単層を設け、ついで、生体適合性多孔質マトリックスとして、アガロース、デキストラン、ポリエチレングリコールなど等からなるヒドロゲルを共有結合した表面が記載されている。【００１２】  ６．特許第３０７１８２３号公報（特許文献６）
特許文献６には保持基材上へチオール基の硫黄原子を介して結合したスペーサー分子に、親水性リンカー部とビオチン残基の固層反応物質が順に共有結合した表面が記載されている。【００１３】  ７．特開２００１−１７８４４２号公報（特許文献７）
特許文献７には、末端部にチオール基を有するＤＮＡ断片と、当該チオール基と反応して共有結合を形成しえる反応性置換基を有する鎖状分子が、一方の末端で表面に固定された固相担体とを液相にて接触させることにより、当該ＤＮＡ断片と鎖状分子との間で共有結合を形成させることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法が記載されている。【００１４】  ８．特表２００４−５０１３４０号公報（特許文献８）
特許文献８には一方の末端をチオール修飾したオリゴ核酸を金微粒子表面に固定化し、金微粒子の分散安定化を図るとともに、固定したオリゴ核酸の配列の組み合わせにより相補的なオリゴ核酸を認識し、様々な検出方法に応用可能であることを示しているが、水溶性ポリマーと核酸が同時に固定されているとの記載はない。また、金属微粒子表面に一端固定化した核酸を、メルカプトエタノールなどの低分子化合物を用いることによってはがすことが可能であることを示しているが、はがした核酸を生体内の目的の箇所で放出する核酸輸送用の微粒子として応用可能であることは記載されていない。【００１５】  ９．特表２００３−５１４２２４号公報（特許文献９）
特許文献９にはオリゴ核酸やタンパク質等を表面に修飾した、金、銀、銅、アルミニウム等の金属微粒子プローブが、ＳＰＲセンサーとの組み合わせにより、その測定感度を飛躍的に向上できると示しているが、核酸またはタンパク質等と水溶性ポリマーが同時に表面に固定されているとの記載はない。【００１６】  １０．「Ｒｏｖｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，６５４８−６５５５」（非特許文献１）
非特許文献１にはＨＳ−スペーサー分子−親水性リンカーをベースとする化合物を用い、チオール基を介して、金表面に自己集積した炭層が記載されている。また、親水性リンカー部が、エチレンオキシド単位３個の化合物と、エチレンオキシド単位６個の化合物との混合物から形成された表面は、細胞のリガンド特異的結合を促進するが、付着した細胞によるタンパク質の体積を低減することも教示されている。【００１７】  １１．「Ｐａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０（１９９９）８８５−８９０」（非特許文献２）
非特許文献２には、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドのトリブロックポリマーの様々な２種の組み合わせ物を、ＳＰＲの検出用金属薄膜上に付着させた表面が記載されている。また、当該表面においては、溶液中に、ポリエチレンオキシドさが伸張し、ブラシ様構造物（Ｂｒｕｓｈ−ｌｉｋｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を形成しえることが示唆されている。【００１８】  １２．特開２００１−５６３１１号公報（特許文献１０）
特許文献１０には導電性基板上にチオール基を介してオリゴ核酸を固定し、その固定領域外に、２−メルカプトエタノールや、６−メルカプトヘキサノールなどの低分子チオール化合物を固定することで、オリゴ核酸の高感度な定量が可能になると示しているが、金属微粒子表面であるとの記載はなく、さらにオリゴ核酸の固定領域外に固定した物質に水溶性ポリマーとの記載もない。【００１９】  １３．「Ｂ．Ｓｉｈｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５５（２００３）１６３１６４０」（非特許文献３）
非特許文献３にはポリカチオンで被覆した金コロイドに核酸を静電的に吸着させているが、表面上での水溶性ブロックポリマーとの共存についての記載はなく、高イオン強度水溶液中でゆるい会合体を形成すると記載されている。また、低分子化合物との競争的な反応により金微粒子表面に担持した核酸が放出されるとの記述もない。
【特許文献１】特開平７−３１６２８５号公報
【特許文献２】特開平１１−３２２９１６号公報
【特許文献３】特開２００１−２０００５０号公報
【特許文献４】特開２００２−８０９０３号公報
【特許文献５】特許第２８１５１２０号公報
【特許文献６】特許第３０７１８２３号公報
【特許文献７】特開２００１−１７８４４２号公報
【特許文献８】特表２００４−５０１３４０号公報
【特許文献９】特表２００３−５１４２２４号公報
【特許文献１０】特開２００１−５６３１１号
【非特許文献１】Ｒｏｖｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，６５４８−６５５５
【非特許文献２】Ｐａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０（１９９９）８８５−８９０
【非特許文献３】Ｂ．Ｓｉｈｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５５（２００３）１６３１６４０
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】  このように核酸を担持させた微粒子はセンサーや遺伝子治療のコアテクノロジーとして期待されているものの、その生体環境下での非特異吸着、低い分散安定性とともに不十分な遺伝子ハイブリ能などの問題点があった。
発明者らは以前、ＰＥＧのような水溶性高分子とポリカチオンを結合させ、負電荷を有する表面に静電的に結合させることにより、ポリカチオンが最表面、水溶性高分子がブラシ状に構築された表面を形成させた後、オリゴ核酸を静電的に表面に吸着、結合させることにより高い認識能を有する表面を構築し、センサーとして利用できることを示した（特願２００３−１８０８１、特願２００３−１８０８５）。このような表面構築法を微粒子表面に適応することにより、高い認識能だけでなく、分散安定性をも付与した高機能微粒子の調製に成功した。このような微粒子は高感度センシングの基盤粒子になるだけでなく、遺伝子治療用のキャリアとしても利用される基盤材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】    本発明者は、この課題を解決するために、さらに、非特異的な反応が抑制されえる、核酸検出用のバイオプローブの表面構造について検討を行った。その結果、微粒子の表面に、親水性ポリマーとポリカチオンの共重合体を静電的あるいは共有結合的に結合させ、親水性高分子のブラシ状構造を設け、核酸をこのブラシ状構造の間隙に担持させることによって、金属微粒子の水中での分散安定性が向上するだけでなく、容易に核酸を金属微粒子表面に担持することができ、核酸をハイブリダイズさせる際の非特異的な反応が著しく抑制され、ＳＰＲセンサー表面における核酸のハイブリダイズ検出感度が著しく向上することを見出した。さらにはこの核酸・微粒子複合体が、体内環境下で担持した核酸をリリースすることを見出した。これらは高感度センサーや遺伝子治療用基盤材料として利用することが可能である。
【００２２】  本発明における微粒子としては特に限定されるものではないが、ポリスチレンやポリブラジエン等のラテックス、シリカやクレイなどの無機粒子、強いプラズモン吸収を有する金、銀、銅、アルミニウム、あるいはこれの合金、またあるいはこれらの金属を微粒子の構造中の一部に含むものが好ましく、特に金、銀、銅はメルカプト基あるいはジスルフィド基あるいはアミノ基と極めて安定に結合するため最も好適な金属である。
【００２３】  微粒子表面に一方の末端をチオール修飾した核酸を担持する方法は、一度に多量の核酸を微粒子の表面に担持できる上、通常の体内環境の下においては、担持した核酸が金属微粒子表面からはがれることなく、金属微粒子が一定の大きさを有しているため、腎臓などにおける体外排出を免れることが可能である。そのうえ、細胞内に取り込まれた核酸担持金属微粒子は、細胞内に大量に存在しているグルタチオンに代表される低分子チオール化合物などにより、金属微粒子表面に担持していた核酸の末端チオールが競争的に交換されることにより細胞内に放出され、核酸輸送微粒子として働くことが可能であることを見出した。強調すべき点は核酸が全てはがれ落ちた後も、金属微粒子表面には親水性ポリマーが残存しており、やがて細胞外に排出されるまで、金属微粒子同士の凝集を防止でき、細胞毒性も示さないことを特徴として有する。
【００２４】  すなわち本発明は、ポリエチレングリコール・ポリカチオン共重合体Ｒ１−ＰＥＧ−Ｒ２（Ｒ１は、アセタール、アルデヒド、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、活性エステルアジド基、ビオチン基、単糖、オリゴ糖、アミノ酸、核酸、アリル基、ビニルベンジル基、メタクリロイル基およびアクリロイル基からなる群から選択される官能基であり、ＰＥＧは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−であり、Ｒ２はポリカチオン（たとえばテトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ポリ（メタクリル酸、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）、ポリ（リジン）、キチン、キトサン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルスチレン）が固定されている微粒子表面に、一方の末端をチオール修飾したオリゴ核酸を直接的または間接的に担持させ、核酸のハイブリダイズ等の反応を行う際の効率的な配列認識、および非特異的な反応を可能な限り抑制した、核酸相補鎖のセンシング、または効率的な核酸輸送を行う金属微粒子（以下、本微粒子ともいう）の製造、および、本金属微粒子の使用方法（以下、本使用方法ともいう）を提供する発明である。
【００２５】  なお、上述した特許文献（特願２００３−１８０８１、特願２００３−１８０８５）においては、本発明のように、親水性ポリマーのブラシ状構造物を設けた金属微粒子の表面に、核酸を担持することについては記載も示唆もなされていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】      本金属微粒子は、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーにおける検出に用いるのが好適であるが、これに限定されるものではなく、リガンドとレセプターの組、例えば、抗原もしくはハプテンと抗体、糖とレクチン、基質と酵素、ホルモンとその受容体、オリゴヌクレオチドとその相補鎖、等の組における結合対の形成により、チップ表面に生ずる何らかの変化を検出し、その信号を本微粒子をもって増幅し得るセンサーであれば、いかなる範疇のセンサーにおいても用いることができる。検出対象となる変化としては、上記の表面プラズモン共鳴以外に、放射能、接触角、沈降、凝集、紫外可視光分光、蛍光、化学発光、電気化学発光等を挙げることができる。【００２７】  このように、本発明は、微粒子をバイオプローブとして使用し、被検対象物中の被検物質が、センサー表面に結合したことを高感度に知らせる、本金属微粒子の使用方法を、本使用方法として提供する発明であり、本微粒子の本使用方法の好適な様態として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して、本微粒子の状態を検出可能な機器による検出が挙げられる。また本発明における本金属微粒子の製造方法により、生体環境下でも安定に分散し、細胞内でｓｉ−ＲＮＡやアンチセンス治療が可能な核酸を放出し得る微粒子の使用方法を提供する発明でもある。【００２８】  ＰＥＧ・ポリカチオン共重合体中のカチオンの量は一分子あたり１〜１００，０００の範囲が使われる。好適には、３〜１０，０００の範囲であり、さらに好ましくは４から１，０００の範疇がよい。
【発明の効果】
本発明で得られた微粒子分散液は高濃度で安定しており、また高いイオン強度下でも凝集せずに安定である。また、当該金属微粒子はオリゴ核酸のみで表面修飾した金属微粒子と比較すると、粒子表面における負の電荷密度を低下させても、分散安定性に支障はなく、むしろ核酸相補鎖の認識能を向上させることが可能である。そして本微粒子を用いることにより、ＳＰＲセンサー表面における表面プラズモン波と金属微粒子のプラズモン吸収が相互作用することで、ＳＰＲセンサーにおける検出感度を著しく向上させることが可能であり、高感度な核酸等の医療診断に好適に使用することが可能である。
また、本微粒子は粒子表面に固定された核酸が、周囲の環境に影響されて放出され、核酸放出後の金属微粒子がＰＥＧ誘導体により分散安定性を維持し得ることから、核酸輸送用材料としても好適に使用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】    以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。
【実施例】
【００３０】  実施例１
金コロイド溶液の調製（ＰＥＧ／ＰＡＭＡを粒子表面に有する金属微粒子）
ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ／ＰＡＭＡ（５７００／３８００）３０ｍｇを超純水５ｍｌに溶解し、２．５ｍｇ／ｍｌ塩化金酸１ｍｌを加えて一晩激しく攪拌し、ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ／ＰＡＭＡで表面を修飾した金微粒子を得た。遊離しているブロックポリマーとＤＮＡがコンプレックスをするため、ここで滅菌水を使用して遠心精製（６５，０００×ｇ，３０ｍｉｎ，２０℃×３）を行った。得られた粒子の平均粒径はＴＥＭ画像より求めた。また、金原子の濃度を原子吸光測定法によって求め、ＴＥＭ画像より求めた平均粒径を用いて、溶液中の金微粒子濃度を決定した。
５’末端チオール修飾核酸（以下、ＳＨ−ＤＮＡともいう）は滅菌水に溶解して濃度を１００μＭとし、所定のＳＨ化処理を行った後、金微粒子に対しての５０倍量加え、一晩振盪した。精製は超遠心（８０，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，１５℃×５）により行い、同時に３０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（１Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７）ｓｏｌｕｔｉｏｎに溶媒置換した。また、粒子の濃度を原子吸光測定法により決定した。ＳＨ−ＤＮＡ添加前と後で紫外可視光吸収を測定し、粒子の分散安定性と、イオン強度に対する安定性を評価した。（図１）これにより、従来の末端チオール化オリゴ核酸のみで安定化した金微粒子、もしくはＰＥＧ／ＰＡＭＡのみで安定化した金微粒子と同等の分散安定性を有するものが調製されたことが明らかにされた。【００３１】  実施例２
核酸担持後の微粒子表面構造の評価１
実施例１の手法でＰＥＧ／ＰＡＭＡ修飾金微粒子を調製した後、３’末端を蛍光ラベルしたＳＨ−ＤＮＡ−ＦＩＴＣを実施例１と同様の手法で担持、精製した後、溶媒を１０ｍＭ  ｐＨ８のリン酸バッファーに置換後、４５０μｌを分取し、ｐＨを８に調整した１．０Ｍ  ＮａＣＮ  ５０μｌを添加しピペッティング操作で金を完全に溶解した後、蛍光スペクトルを測定したところＳＨ−ＤＮＡ−ＦＩＴＣに由来する蛍光、スペクトルが観察された。（図２）これにより、ＳＨ−ＤＮＡがＰＥＧ／ＰＡＭＡで被覆された金微粒子表面に担持されていることが明らかにされた。【００３２】  実施例３
核酸担持後の微粒子表面構造の評価２
蛍光基ＦＩＴＣをあらかじめ末端に化学修飾したフルオレセイン−ＰＥＧ／ＰＡＭＡを用い、実施例１の手法でＰＥＧ／ＰＡＭＡ修飾金微粒子を調製した後、ＳＨ−ＤＮＡを実施例１と同様の手法で担持、精製した後、溶媒を１０ｍＭ  ｐＨ８のリン酸バッファーに置換後、４５０μｌを分取し、ｐＨを８に調整した１．０Ｍ  ＮａＣＮ  ５０μｌを添加しピペッティング操作で金を完全に溶解した後、蛍光スペクトルを測定したところフルオレセイン−ＰＥＧ／ＰＡＭＡに由来する蛍光、スペクトルが観察された。（図３）これにより、ＳＨ−ＤＮＡ担持後もＰＥＧ／ＰＡＭＡが金微粒子表面に存在していることが明らかにされた。【００３３】  実施例４
核酸担持金微粒子同士によるハイブリダイズ試験
相補対となる塩基配列を構造中に含むＳＨ−ＤＮＡ（ＳＨ  ５’−ｄＴ（２０）ＧＣＣＡＣＣＡＧＣ−３’、ＳＨ５’−ｄＴ（２０）ＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’）または相補的ではない塩基配列を構造中に含むＳＨ−ＤＮＡ（ＳＨ被覆された金微粒子表面に担持されたＳＨ−ＤＮＡがハイブリダイズ能を有していることが明らかにされた。【００３４】  実施例５
市販の１０ｎｍ金コロイド溶液５ｍｌにＭｅＯ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＭＡ（分子量：１２，０００）を約１００００倍モル量（４．０８ｍｇ）加え、一日攪拌した後、滅菌水を用いて遠心精製（６０，０００×ｇ，２０℃，１５ｍｉｎ×３）を行い、吸光度（λ＝５２０ｎｍ）を測定した。調製したＰＥＧ化金コロイド溶液について原子吸光によって粒子濃度を決定し、このＰＥＧ化金コロイド溶液４．６ｍｌを分取し、金ナノ粒子に対して結果的に９５倍量のＤＮＡを加えた後、一晩遮光して攪拌した。その後、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌを用いて遠心精製（８０，０００×ｇ，２０℃，  ２０ｍｉｎ，×５）を行い、５回の総上澄みを２０ｍｌにメスアップして蛍光強度を測定した（蛍光強度をもとにした遊離ＤＮＡの定量による、金ナノ粒子１個に対するＤＮＡ導入率の計算）。また、調製したＳＨ−ＤＮＡ−ＦＩＴＣ／ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＭＡ共固定化金ナノ粒子についてＵＶ−ｖｉｓスペクトルを測定し５２０ｎｍにおけるその吸光度と、市販金コロイドの吸光度と比較することにより金粒子濃度を決定した。そして２．００ｎＭのＳＨ−ＤＮＡ／ＰＥＧ化金コロイド溶液（ＤＮＡ：０．９８４ｎｍｏｌ）４５０μｌに１Ｍ  ＤＴＴ溶液を５０μｌ加えその濃度を１００ｍＭに調整後３７℃で６，１２，２０，４０ｈ振盪後遠心分離（８０，０００×ｇ，２０℃，２０ｍｉｎ）を行い、上澄み２００μｌを分取し蛍光強度を測定することによって金ナノ粒子表面からのＤＮＡのリリースが観測された。（図５）【００３５】  比較例１
核酸のみで安定化した金微粒子とのハイブリダイズ能比較
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ＳＨ−ＤＮＡのみで安定化した金コロイドの調製
市販金コロイド（１０ｎｍ  ｐｏｌｙ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）３ｍｌにＳＨ化処理を施したＳＨ−ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅＩ２０を２００倍モル量加え、２４時間攪拌した。時間後、２０ｍＭリン酸バッファー（０．２ＭＮａＣｌ，ｐＨ７）２倍量にメスアップし、さらに４０時間攪拌した。遠心精製（１２００００ｘｇ，４℃，１５ｍｉｎ）で精製し、同時に２×ＳＳＣ  １ｍＭ  ＥＤＴＡに置換した。粒子濃度は原子吸光ＴＥＭから求めた。【００３６】ＰＥＧ／ＰＡＭＡ，ＳＨ−ＤＮＡ共固定金基板
オゾン洗浄を施した金基板に１．６ｍｇ／ｍｌに調整したＰＥＧ／ＰＡＭＡ（５６６０／２７８０）水溶液を数滴たらし、４０℃（密閉）で１時間静置し、さらに流路系でＰＥＧ／ＰＡＭＡを流したチップに、ＳＨ−ＤＮＡ（５μＭ，ｓｅｑｕｅｎｃｅＩＩ２０）を５μｌ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ流した。このときサンプルはＩ＝０．３になるように調整した。          （３７℃，Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：ＭｉｌｌｉＱ）【００３７】ＳＨ−ＤＮＡ単独固定チップ
オゾン洗浄を施した金基板にＳＨ−ＤＮＡ（５μＭ，ｓｅｑｕｅｎｃｅＩＩ２０５μｌ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ流した。
このときサンプルはＩ＝０．３になるように調整した。          （３７℃，Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｃｒ：２×ＳＳＣ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）【００３８】各チップ条件での各金コロイドのハイブリダイゼーションおよび吸着
上記した各センサーチップにＰＥＧ／ＰＡＭＡ，ＳＨ−ＤＮＡ共固定金コロイド、ＳＨ−ＤＮＡのみで安定化した金コロイドを各々流した。金コロイド側のＤＮＡ配列はｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉ２０で、センサーチップ側と相補的なものを用いた。  （条件：２５℃，５μｌ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：
各チップ条件での各金コロイドのハイブリダイゼーションおよび吸着
上記した各センサーチップにＰＥＧ／ＰＡＭＡ，ＳＨ−ＤＮＡ共固定金コロイド、ＳＨ−ＤＮＡのみで安定化した金コロイドを各々流した。金コロイド側のＤＮＡ配列はｓｅｑｕｅｎｃｅＩ２０で、センサーチップ側と相補的なものを用いた。  （条件：２５℃，５μｌ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：２×ＳＳＣ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）【００３９】  上記の各金基板に、それぞれ機能化した金コロイドを流したところ、ＳＨ−ＤＮＡのみで安定化した金コロイドと、ＳＨ−ＤＮＡのみを修飾した金基板上でのハイブリダイズ量は、どちらか一方をＰＥＧ／ＰＡＭＡ，ＳＨ−ＤＮＡ共固定表面にしたものに比べ小さかった。これはＳＨ−ＤＮＡの導入密度が高すぎるために、ＤＮＡ鎖同士の静電反発が、ハイブリダイズ能を低下していることを示しており、ＰＥＧ／ＰＡＭＡと共固定表面にすることで、ＤＮＡのハイブリダイズ能が向上することを示している。
【発明の効果】
【００４０】  本発明により、従来の技術よりも高感度に核酸を検出することのでき、また、核酸輸送用としても機能する金属微粒子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【００４２】
【図１】  図１は実施例１に記載の金微粒子の核酸担持前後の分光スペクトルを示す。
【００４３】
【図２】  図２は実施例２に記載の金微粒子の表面に担持したＳＨ−ＤＮＡ−ＦＩＴＣに由来する蛍光スペクトルを示す。
【００４４】
【図３】  図３は実施例３に記載の金微粒子の表面に固定したフルオレセイン−ＰＥＧ／ＰＡＭＡに由来する蛍光スペクトルを示す。
【００４５】
【図４】  図４は実施例４に記載の金微粒子のＴＥＭ観察画像を示す。
【００４６】
【図５】  図５は実施例５に記載のＰＥＧ／ＰＡＭＡ修飾金コロイド表面に担持したＳＨ−ＤＮＡ−ＦＩＴＣが過剰のチオール化合物（ジチオスレイトール）を加えることで、溶液中にリリースされたことを示す蛍光スペクトルである。
【００４７】
【図６】  ＰＥＧ／ＰＡＭＡとＳＨ−ＤＮＡを適宜用いて作成した金基板表面と、金微粒子表面について、ハイブリダイズ能を比較した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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