(57)【要約】【課題】  抜去された歯をそのまま移植するとアンキーローシス、歯根の炎症性吸収、上皮の根尖側の迷入等をもたらす危険性があり、予後が不安定となる可能性が高くなる。【解決手段】  抜去歯を顆粒状の多孔質担体中に抜去歯歯根を埋入、植立し、培養液と共にインキュベーションすることで抜去歯歯根面に歯根膜およびセメント質を剥離することなく再生・増殖させるができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は歯周組織を再生・増殖させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、歯の欠損部の治療方法の一つに歯牙移植が考慮されるようになってきた。また、抜去歯を保存して必要な時に移植を行うことも考えられている。歯牙移植の予後を左右する因子として、まず移植歯に残存する歯根膜の量と状態が上げられ、下野らは抜去歯歯根には約５５％の歯根膜が残存すると報告している。一方、Ａｎｄｒｅａｓｅｎらは犬を使った実験で３×３ｍｍの歯根膜の欠損を作った場合アンキローシスをおこしたと報告している。すなわち、歯牙移植の予後を左右する因子としては抜去歯に残存する歯根膜量を高めることが重要と考えられ、現状では、移植歯の適応を厳密に選別し、できるだけ歯根膜を残存させる抜去法の工夫、移植後固定方法の工夫等をして対応している。
【非特許文献１】  井上  孝、橋本貞充、下野正基、田中陽一：移植・再稙における歯周組織の病理組織反応ならびにその再生力（歯根膜）．歯科学報，９１：７７〜７９，１９９１．
【非特許文献２】  Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ＪＯ，Ｋｒｉｓｔｅｒｓｏｎ  Ｌ：Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｒｙｉｎｇ  ｏｒ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ．ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｉｎｃｉｓｏｒｓ  ｉｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ．  Ａｃｔａ  Ｏｄｏｎｔ  Ｓｃａｎｄ，３９：１〜１３，１９８１．
【非特許文献３】  別冊  ザ  クインテッセンス「歯牙移植の臨床像」，クインテッセンス出版株式会社，１９９６．東京
【非特許文献４】  別冊  ザ  クインテッセンス「アドバンス自家歯牙移植  適応症の拡大」，クインテッセンス出版株式会社，２０００．東京
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  上記のように、抜去された歯をそのまま移植した場合にはアンキーローシス、歯根の炎症性吸収、上皮の根尖側の迷入等をもたらす危険性があり、予後が不安定となる可能性が高くなる。【０００４】  本発明は抜去歯歯根面に歯根膜やセメント質を剥離することなく再生・増殖させ、歯牙移植の適応を拡大し、予後の成績を向上させることを目的とする。
【問題を解決するための手段】
【０００５】  上記の課題を解決するため、本発明は顆粒状の多孔質担体中に抜去歯歯根を埋入させて植立し、培養液と共にインキュベーションすることで残存している歯根膜及びセメント質が担体を介して増殖し、抜歯により損失した歯根膜及びセメント質を再生させる効果がある。
【０００６】  本発明は、好ましくは担体が球状であり、セメント質、歯根膜が再生しうる適切な間隙を確保する。さらに担体は多孔質であるためセメント芽細胞、歯根膜細胞が増殖するための足場となり良好な増殖とセメント質、歯根膜の産生を促す。
【０００７】  本発明は、好ましくは多孔質担体中に抜去歯歯根を埋入、植立する前に歯根にエナメルマトリックスタンパクを塗布する。これによって、より良好な歯根膜の再生が行われる。
【０００８】  本発明で用いる培養液は通常市販されているものに好ましくはＬアスコルビン酸２リン酸を１ｍＭ（ミリモル）〜１０Ｍ（モル）、血清を１０％〜５０％添加する。これにより、歯根膜細胞がより良好に歯根膜線維を産生することとなる。
【発明の効果】
【０００９】  すなわち、本発明によれば、抜去歯歯根面に歯根膜やセメント質を剥離することなく再生・増殖させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  図１は本発明方法の基本構成を表す概略図を、図２には実際に実施した写真を示す。図１、２に示されるとおり、本発明は深底の培養皿と網カップ、さらには網カップを満たす顆粒状の担体で構成される。培養液は網カップと担体を通して抜去歯に供給される。培養液により湿潤状態となった顆粒状の担体に抜去歯を植立すると、ちょうど砂の中に棒をさすように安定して抜去歯歯根部のみを担体が覆うように植立することができる。これを３７°Ｃ、５％ＣＯ２、湿度１００％環境下にて一定期間インキュベーションを行う。【００１１】  担体の形状は球形であり、その直径は好ましくは直径１ｎｍ〜３ｍｍであり、より好ましくは操作性が良く、細胞の径より大きな孔を設定することのできる４０μｍ〜３ｍｍであり、更に好ましくは歯根膜腔と同じ大きさである１００μｍ〜４００μｍである。【００１２】  本発明の手順は、深底培養皿に網カップを置き、滅菌した顆粒状の担体と培養液とを混和したものを注ぎ込む。抜去歯は歯冠部をＣａ２＋、Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝液中でブラシにて洗浄後、根尖部よりセメントエナメルジャンクション部まで担体中に埋入する。その後３７°Ｃ、５％ＣＯ２、湿度１００％環境下にあるインキュベーター内に静置する。培養液は通常市販されているものに好ましくはＬアスコルビン酸リン酸塩を１ｍＭ（ミリモル）〜１０Ｍ（モル）、血清を１０％〜５０％添加し、３日〜２週間に一度の割合で交換する。【００１３】  担体中に植立された抜去歯はインキュベート中、歯根に残存した歯根膜細胞が歯根膜中に、セメント芽細胞がセメント質上に増殖する。さらに、この時、この部分に接触している担体にも細胞が播種されることとなり、担体中にもこの歯根膜細胞が増殖していく。また、培養液にはＬアスコルビン酸２リン酸が添加されているため両細胞に継続的にアスコルビン酸が供給され、コラーゲンの産生が促進される。抜去時、機械的に剥離された歯根膜セメント質部分にも同様な効果を示し、歯根膜、セメント質を再生することができる。その結果、歯根面全体を歯根膜線維で覆うことができる。
【実施例】
【００１４】  図３に本発明を実施した写真を示す。深底培養皿（１００×２０ｃａｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ：ｎｕｎｃＴＭ）に網カップ（Ｓｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ：ＦＡＬＣＯＮＴＭ）を置き、滅菌した顆粒状の担体（旭化成マイクロキャリア：旭化成工業株式会社）と培養液（Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＧＩＢＫＯＴＭ）とを混和したものを注ぎ込む。抜去歯は歯冠部をＣａ２＋、Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝液中でブラシにて洗浄後、根尖部よりセメントエナメルジャンクション部まで担体中に埋入する。その後３７°Ｃ、５％ＣＯ２、湿度１００％環境下にあるインキュベーター内に静置する。培養液はＬアスコルビン酸リン酸塩（Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｓａｌｔ  ｎ−Ｈｙｄｒａｔｅ：和光純薬）を１０ｍＭ（ミリモル）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ：ＳＩＧＭＡＴＭ）を２０％添加し、１週間に一度の割合で交換した。【００１５】  図４に本発明法にて３ヵ月間インキュベートしたヒト上顎第三大臼歯の写真を示す。この第三大臼歯は愛知学院大学倫理委員会にて承認後、矯正歯科治療上必要があり抜去されたもので、本発明を十分に本人及びその保護者に説明をし、了承を受け供与されたものである。写真のごとく抜去歯歯根面全体が顆粒状の担体に覆われた状態である。【００１６】  図５に上記と同様の手続きにおいて供与された抜去直後のヒト上顎第三大臼歯にトルイジンブルー染色を行った写真を示す。写真のように歯根膜が青く染色され、抜去直後において歯根膜が残存している部分が観察できる。また、染色されていない部分は抜去時機械的に歯根膜が剥離してしまった部分である。【００１７】  図６に図５と同様な処置を行ったヒト抜去歯３０本の頬側、舌側、近心、遠心歯根面に残存する歯根膜面積を計測し、歯根全体の面積との比を求めた表を示す。その結果、ヒト抜去歯歯根面に残存する歯根膜面積は歯根面積中の５０．４％であった。【００１８】  図７に図４に示したヒト抜去歯の電子顕微鏡写真を示す。弱拡の×５０倍では歯根表面全体に顆粒状の担体が付着しているのが観察され、強拡の×１，０００倍では担体に細胞や線維状のものが付着しているのが観察された。線維状の部分を×３０，０００で観察するとコラーゲン線維特有の縞模様が観察され、歯根膜線維であることが確認された。さらに、この歯根膜線維は担体にからみついているように観察され、歯根膜線維が増殖していることが証明された。【００１９】  図８に抜去直後のヒト上顎第一小臼歯と、同じ歯を用い本発明により歯根膜、セメント質を再生、増殖させた後の状態の実態顕微鏡写真を示す。この抜去歯は抜去直後、歯根面に円筒径（直径３．０ｍｍ）の歯牙切削用のダイヤモンドバーにて歯根膜とセメント質の除去を行った（○内）。歯根面はこの歯根膜、セメント質を除去した部分を含め歯根全体が歯根膜の再生と増殖によって覆われているのが観察できる。【００２０】  図９に図８で示した歯をＨＥ染色した組織切片の光学顕微鏡写真を示す。弱拡大で歯根膜、セメント質を除去した部分も歯根膜で覆われており、濃染された二次セメント質のラインがセメント質の除去されていない部分から除去された部分へ連続的���つながっていることが観察できる。強拡大ではセメント質表面に豊富な細胞成分が存在し、セメント質からのびるシャーピー線維が再生、増殖した歯根膜へと移行していることが観察できる。これらより本発明は歯根膜のみならずセメント質も再生、増殖が可能なものと考える。
【産業上の利用の可能性】
【００２１】  ヒト上下顎第三大臼歯は萌出余地の不足、清掃が困難等の理由により抜去される頻度が高い。また、矯正歯科治療において排列余地を獲得するため歯を抜去する場合もある。現状では、これらの抜去歯は医療廃棄物として処理される場合が多い。ヒト抜去歯を長期間凍結保存しておくことは現在の技術でも十分可能である。本発明により抜去歯の歯根膜、セメント質を増殖させ、その後凍結保存を行い、将来、その個人のいずれかの歯が欠損した場合、その部にこの保存歯を歯牙移植することが可能となると考える。つまり、本発明を抜去歯保存を一元管理する施設（ｔｏｏｔｈ  ｂａｎｋ）を設立し、ここに応用した場合、適応の範囲、予後の成績においてより良好なものになるものと考える。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の基本構成を表す概略を示した平面図
【図２】本発明の基本構成の写真
【図３】本発明の基本構成を実施した写真
【図４】本発明を適用したヒト上顎第三大臼歯の写真
【図５】抜去直後のヒト上顎第三大臼歯にトルイジンブルー染色を行った写真
【図６】ヒト抜去歯３０本の頬側、舌側、近心、遠心歯根面に残存する歯根膜面積を計測し、歯根全体の面積との比を求めた表
【図７】図４に示したヒト抜去歯の電子顕微鏡写真
【図８】抜去直後のヒト上顎第一小臼歯と、同じ歯を用い本発明により歯根膜、セメント質を再生、増殖させた後の実態顕微鏡写真
【図９】図９に図８で示した歯をＨＥ染色した組織切片の光学顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００２３】
【図１】
１．深底培養皿  ２．抜去歯  ３．網カップ  ４．培養液
【図２】
１．深底培養皿  ２．抜去歯  ３．網カップ  ４．培養液
【図３】
１．培養皿に培養液を注いでおく．２．深底培養皿に網カップを置き，滅菌した顆粒状の担体と培養液と混和したものを注ぎ込んだものを用意しておく．３．抜去歯を植立する。
【図４】
１．本発明適用後の抜去歯近心面  ２．本発明適用後の抜去歯遠心面
【図５】
１．頬側面  ２．舌側面  ３．近心面  ４．遠心面
【図７】
１．×５０  ２．×１５０  ３．×３５０  ４．×１，０００  ５．×１０，０００  ６．×３０，０００
【図８】
１．抜去直後弱拡大  ２．本発明適用後弱拡大  ３．抜去直後強拡大  ４．本発明適用後強拡大
【図９】
１．弱拡大  ２．強拡大
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月2日(2004.6.2)
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抜去歯歯根面に歯根膜およびセメント質を剥離することなく再生・増殖させる方法であり、該方法は顆粒状の多孔質担体中に抜去歯歯根を埋入、植立し、培養液と共にインキュベーションすることを含む方法。
【請求項２】
顆粒状の多孔質担体の大きさが直径１ｎｍ〜３ｍｍのほぼ球形の形状を有する請求項１に記載する方法。
【請求項３】
顆粒状の多孔質担体の孔径が２ｎｍ〜２ｍｍの大きさを有する請求項１に記載する方法。
【請求項４】
抜去歯歯根にエナメルマトリックスタンパクを塗布する請求項１に記載する方法。
【請求項５】
培養液中にＬアスコルビン酸リン酸塩を１ｍＭ（ミリモル）〜１０Ｍ（モル）添加する請求項１に記載する方法。
【請求項６】
培養液中に血清を１０％〜５０％を添加する請求項１に記載する方法。