(57)【要約】【課題】  本発明は、難分解性物質の分解の程度を、簡便に判定する方法を提供することを目的とする。【解決手段】  ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質の分解の程度を判定する方法であって、該物質を特定のラジカル反応又は酸化反応による分解条件下におき、該物質の分解に伴って発生する微弱光の量を測定し、該光量に基づいて、該物質の分解の程度を判定することを特徴とする、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質の分解の程度を判定する方法であって、該難分解性物質を特定のラジカル反応又は酸化反応による分解条件下におき、該難分解性物質の分解に伴って発生する微弱光の量を測定し、該光量に基づいて、該難分解性物質の分解の程度を判定することを特徴とする、方法。
【請求項２】
難分解性物質が、天然高分子、合成高分子、多環芳香族炭化水素、ハロゲン化芳香族炭化水素及びそれらの類縁物質よりなる群から選択される少なくとも１種の物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
難分解性物質がリグニン又はその類縁物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
難分解性物質が木材中に存在しているリグニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物をスクリーニングする方法であって、下記工程を含むスクリーニング方法：
(i)該難分解性物質と、候補物質又は微生物を共存させる工程、
(ii)該難分解性物質の分解に伴って発生する光量を測定する工程、及び
(iii)前記工程で測定した光量に基づいて、該難分解性物質に対して分解作用を有する候補物質又は微生物を選択する工程。
【請求項６】
難分解性物質がリグニンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質の分解反応の反応促進剤又は反応阻害剤をスクリーニングする方法であって、下記工程を含むスクリーニング方法：
(i)該難分解性物質の分解反応系に候補物質を添加する工程、
(ii) ラジカル反応又は酸化反応により分解する物質の分解に伴って発せられる光量を測定する工程、及び
(iii)前記工程で測定した光量に基づいて、反応促進剤又は反応阻害剤として作用している候補物質を選択する工程。
【請求項８】
酸化還元酵素による反応効率を評価する方法であって、酸化還元酵素による反応が、酸化還元酵素が反応助剤を介してリポーター物質に対して行うラジカル反応又は酸化反応であり、下記工程を含む評価方法：
(i)上記酵素、反応助剤、及びリポーター物質を共存させる工程、
(ii)リポーター物質のラジカル反応又は酸化反応に伴って発せられる光量を測定する工程、及び
(iii)前記工程で測定した光量に基づいて、反応効率を評価する工程。
【請求項９】
酸化還元酵素の反応助剤をスクリーニングする方法であって、酸化還元酵素によるリポーター物質のラジカル反応又は酸化反応が反応助剤を介して行われるものであり、下記工程を含むスクリーニング方法：
(i)上記酵素、反応助剤の候補物質、及びリポーター物質を共存させる工程、
(ii)リポーター物質のラジカル反応又は酸化反応に伴って発せられる光量を測定する工程、及び
(iii)前記工程で測定した光量に基づいて、反応助剤として作用している候補物質を選択する工程。
【請求項１０】
酸化還元酵素が、ラッカーゼ、チロシナーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素活性を示すものであり、リポーター物質がグリオキサールである、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質の分解の程度を判定する方法、該難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物のスクリーニング方法、及び該難分解性物質の分解反応の反応促進剤又は反応阻害剤のスクリーニング方法に関する。また本発明は、反応助剤を介した酸化還元酵素による反応の反応効率を評価する方法、及びその反応助剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、リグニン、ダイオキシン、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）等の難分解性物質を分解する技術を確立することにより、難分解性物質を除去することや、機能性材料を作り出したり、無害化することが求められている。難分解性物質を分解する技術を開発する上で、該難分解性物質を如何に効率的に分解するかという問題に加えて、該難分解性物質の分解の程度をどのように測定するかという問題があった。
【０００３】
従来、難分解性物質の分解の程度を測定には、難分解性物質が不溶性であることを利用して、難分解性物質の分解処理後の不溶性残渣の重量を測定する方法や、放射性元素で標識した難分解性物質を使用する方法が採用されていた。しかしながら、これらの方法では、操作が煩雑で精度の高い測定には熟練が必要であったり、放射線を扱うための特別な装置や施設が必要である等の欠点があった。
【０００４】
ところで、反応助剤を介した酸化還元酵素の反応効率を簡便に評価する方法についても、未だ簡便性、迅速性等の点で満足できる方法は確立されていない。
【０００５】
このような従来技術を背景として、難分解性物質の分解の程度や反応助剤を介した酸化還元酵素の反応効率を、簡便に測定する方法の開発が望まれていた。
【特許文献１】特公平06-097989号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明の目的は、難分解性物質の分解の程度を、簡便に判定する方法を提供することである。また、本発明の目的は、難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物のスクリーニング方法、及び難分解性物質の分解反応の反応促進剤又は反応阻害剤のスクリーニング方法を提供することである。更に本発明の目的は、反応助剤を介した酸化還元酵素の反応の効率を評価する方法、及び酸化還元酵素の反応助剤のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質の分解に伴って微弱な光が発生し、その光量を測定することによって、該難分解性物質の分解の程度を判定できることを見出した。また、該難分解性物質の分解に伴って発する微弱な光を測定することにより、難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物のスクリーニング、或いは難分解性物質の分解反応の反応促進剤又は反応阻害剤のスクリーニングが可能となることを見出した。また、酸化還元酵素が反応助剤を介してリポーター物質に対してラジカル反応又は酸化反応を行う場合、リポーター物質が反応を受けると、これに伴って微弱な光が発生し、その光量を測定することによって、酸化還元酵素が反応助剤を介して行う反応の効率を評価できることを見出した。
【０００８】
本発明はかかる知見に基づいて、更に検討を重ねて完成されたものである。
【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる発明を提供するものである。
項１．  ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質の分解の程度を判定する方法であって、該難分解性物質を特定のラジカル反応又は酸化反応による分解条件下におき、該難分解性物質の分解に伴って発生する微弱光の量を測定し、該光量に基づいて、該難分解性物質の分解の程度を判定することを特徴とする、方法。
項２．  難分解性物質が、天然高分子、合成高分子、多環芳香族炭化水素、ハロゲン化芳香族炭化水素及びそれらの類縁物質よりなる群から選択される少なくとも１種の物質である、項１に記載の方法。
項３．  難分解性物質がリグニン又はその類縁物質である、項１に記載の方法。
項４．  難分解性物質が木材中に存在しているリグニンである、項１に記載の方法。
項５．  ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物をスクリーニングする方法であって、下記工程を含むスクリーニング方法：
(i)該難分解性物質と、候補物質又は微生物を共存させる工程、
(ii)該難分解性物質の分解に伴って発生する光量を測定する工程、及び
(iii)前記工程で測定した光量に基づいて、該難分解性物質に対して分解作用を有する候補物質又は微生物を選択する工程。
項６．  難分解性物質がリグニンである、項５に記載の方法。
項７．  ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質の分解反応の反応促進剤又は反応阻害剤をスクリーニングする方法であって、下記工程を含むスクリーニング方法：
(i)該難分解性物質の分解反応系に候補物質を添加する工程、
(ii) ラジカル反応又は酸化反応により分解する物質の分解に伴って発せられる光量を測定する工程、及び
(iii)前記工程で測定した光量に基づいて、反応促進剤又は反応阻害剤として作用している候補物質を選択する工程。
項８．  酸化還元酵素による反応効率を評価する方法であって、酸化還元酵素による反応が、酸化還元酵素が反応助剤を介してリポーター物質に対して行うラジカル反応又は酸化反応であり、下記工程を含む評価方法：
(i)上記酵素、反応助剤、及びリポーター物質を共存させる工程、
(ii)リポーター物質のラジカル反応又は酸化反応に伴って発せられる光量を測定する工程、及び
(iii)前記工程で測定した光量に基づいて、反応効率を評価する工程。
項９．  酸化還元酵素の反応助剤をスクリーニングする方法であって、酸化還元酵素によるリポーター物質のラジカル反応又は酸化反応が反応助剤を介して行われるものであり、下記工程を含むスクリーニング方法：
(i)上記酵素、反応助剤の候補物質、及びリポーター物質を共存させる工程、
(ii)リポーター物質のラジカル反応又は酸化反応に伴って発せられる光量を測定する工程、及び
(iii)前記工程で測定した光量に基づいて、反応助剤として作用している候補物質を選択する工程。
項１０．  酸化還元酵素が、ラッカーゼ、チロシナーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素活性を示すものであり、リポーター物質がグリオキサールである、項９に記載のスクリーニング方法。
【００１０】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
(I)難分解性物質の分解の程度の判定方法
本発明の方法は、ラジカル反応又は酸化反応により分解する難分解性物質の分解の程度を判定する方法であって、該物質を特定のラジカル反応又は酸化反応による分解条件下におき、該物質の分解に伴って発生する微弱光の量を測定し、該光量に基づいて、該物質の分解の程度を判定することを特徴とするものである。
【００１１】
本発明に使用される難分解性物質は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ単独の作用では分解されない物質であって、ラジカル反応又は酸化反応により分解されるものであれば、特に制限されない。当該難分解性物質の一例として、リグニン、ゴム等の天然高分子；ポリエチレン、ポリエーテル、フェノール樹脂、ポリウレタン、ナイロン、ポリカーボネート等の合成高分子；フルオレン等の多環芳香族炭化水素；ダイオキシン、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）等のハロゲン化芳香族炭化水素；及びこれらの類縁化合物等を挙げることができる。これらの中で、好ましくはリグニン及びその類縁化合物である。リグニンの類縁化合物としては、例えば、硫酸リグニン；塩酸リグニン；硝酸リグニン；糖類や脂質との複合リグニン；その他の化学、生物、酵素的に修飾を受けたリグニン等を挙げることができる。
【００１２】
当該難分解性物質として、該難分解性物質を含有する材料を使用してもよい。例えば、難分解性物質としてリグニンを使用する場合であれば、リグニンを含有する植物材料（例えば、ブナ、ユーカリ等の広葉樹材；杉等の針葉樹材；竹、藁等の維管束植物）を使用することができる。
【００１３】
本発明において、難分解性物質として、木材中に含有されているリグニンを好適に使用することができる。
【００１４】
本発明では、上記難分解性物質をラジカル反応又は酸化反応による分解条件下におき、該物質の分解に伴って発生する微弱光の量を測定することにより、当該条件における上記難分解性物質の分解の程度を判定する。上記難分解性物質を特定のラジカル反応又は酸化反応による分解条件下におくには、例えば、上記難分解性物質を分解する作用を有する酵素や微生物と上記難分解性物質を共存させればよい。かかる酵素や微生物と上記難分解性物質を共存させる方法としては、後述の(I-1)や(I-2)の項に記載の通りである。
【００１５】
上記難分解性物質の分解に伴って発する光は極めて微弱であるので、その光量の測定は、難分解性物質の分解条件下で発する光を不連続な光子として観察できる程度にまで増感して、光子の個数を計測することによって行うことができる。上記分解条件下で発する光を不連続な光子として観察するには、例えば、目的の分解条件下に上記難分解性物質を遮光した環境において、光電子増倍管、或いはイメージインテンシファイヤーを具有する超高感度カメラ等によって１０3倍程度以上、好ましくは１０4倍程度以上、更に好ましくは１０5倍程度以上に増感すればよい。なお、当該倍率の上限は、光子の検出性に対しては影響を与えないため、特に制限されないが、該上限一例として、１０20倍程度を挙げることができる。光子は、光電子増倍管であればパルスとして、高感度カメラであればドットとして検出（観察）される。よって、光子の個数は、光電子増倍管であればパルス数として、また高感度カメラであれば画面のドット数として計測される。本発明に使用できる高感度カメラの一例として、浜松ホトニクス社製の高感度カメラ（ARGUS50/VIM）が挙げられる。
【００１６】
測定される光量が多い程、該難分解性物質の分解が進んでおり、一方、測定される光量が少ない程、該難分解性物質が分解されていないことを示す。故に、該光量を指標として、上記難分解性物質の分解の程度を判定することができる。また、上記難分解性物質の分解の程度と発せられる光量との相関関係を予め求めておき、測定した光量を上記相関関係に照合することによって、上記難分解性物質の分解の程度をより具体的に判定することが可能である。
【００１７】
このように、本発明の方法によれば、上記難分解性物質の分解に伴って発せられる光量を指標にすることによって、該難分解性物質の分解の程度を判定することができる。故に、後述するように、当該方法を利用して、難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物のスクリーニングや、難分解性物質の分解反応の反応促進剤又は反応阻害剤のスクリーニングが可能である。また、当該方法を利用して、各種の分解条件下で上記難分解性物質の分解に伴って発せられる光量を測定することによって、該難分解性物質の分解条件の最適化を行うこともできる。
【００１８】
(I-1)難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物のスクリーニング方法
また、本発明は、上記(I)の方法を利用して、上記難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１９】
当該スクリーニング方法において、スクリーニングの対象は、難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は該作用を有する微生物である。スクリーニングの対象となる物質は、単一の成分のみからなるものであってもよく、また複数の成分からなる組成物であってもよい。スクリーニングの対象となる候補物質として、具体的には、精製された酵素、粗酵素、菌体、菌体抽出物、これらの化学修飾物、これらを担体に担持させたもの等を挙げることができる。また、スクリーニングの対象となる候補微生物としては、特に制限されないが、一例として、セリポリオプシス属（Ceriporiopsis）トラメテス（Trametes）属、レンチナス（Lentinus）属等の白色腐朽菌、ダエダレア（Daedalea）属、チロマイセス（Tyromyces）属、グロエオフィラム（Gloeophyllum）属等の褐色腐朽菌、アスペルギルス属等の真菌；ストレプトマイセス属、バチルス属、シュードモナス属等の真性細菌を挙げることができる。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法は、第一工程として、上記難分解性物質と候補物質又は微生物とを共存させる（工程(i)）。上記難分解性物質と被検体とを共存させる方法は、難分解性物質の種類や被検体の種類に応じて適宜調整することができる。
【００２１】
例えば、スクリーニング対象が物質の場合であれば、以下のようにして、上記難分解性物質と候補物質とを共存させることができる。まず、共存時に上記難分解性物質が０．００１〜９９．９重量％、好ましくは０．０１〜９０重量％、更に好ましくは０．１〜１０重量％の割合で存在するように水を添加し、必要に応じてｐＨが２〜１２、好ましくは２．５〜９となるように調製する。これに候補物質を０．０００１〜８０重量％、好ましくは０．００１〜１０重量％、更に好ましくは０．０１〜１重量％となるように添加し、０〜１００℃、好ましくは２０〜８０℃、更に好ましくは３０〜６０℃の温度条件下で、上記難分解性物質と候補物質とを共存させる。また、必要に応じて、更に、1-hydroxybenzotriazole（ＨＢＴ）、1-nitroso-2-naphthol-3,6-disulfonic acid（ＮＮＤＳ）、ビオルル酸、プロマジンンなどメディエーターや、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｃｕ、Ｃｏ等の金属塩等を共存させておいてもよい。
【００２２】
また、例えば、スクリーニング対象が微生物の場合であれば、以下のようにして、上記難分解性物質と候補微生物とを共存させることができる。共存時の水分含量が０．２〜９９．９重量％、好ましくは２０〜９０重量％、更に好ましくは５０〜８０重量％となるように上記難分解性物質に水を添加し、更に必要に応じて、該微生物の成育に必要とされる塩や栄養素（例えば、稲、麦藁等の植物、木材、木材成分、フスマ、ペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキス、肉エキス、モルトエキス、ポテトエキス、等）を加える。これに候補微生物を植菌し、４〜９９℃、好ましくは１０〜４５℃、更に好ましくは２０〜４５℃の温度条件下で、上記難分解性物質と候補微生物とを共存させる。
【００２３】
次いで、第二の工程として、上記共存条件下において、上記難分解性物質の分解に伴って発生する光量を測定する（工程(ii)）。当該光量の測定方法は、前記(I)の項に記載の通りである。
【００２４】
そして、第三の工程として、工程(ii)で測定した光量に基づいて、該難分解性物質に対して分解作用を有する候補物質又は微生物を選択する（工程(iii)）。当該光量が大きい程、上記難分解性物質に対する分解作用が高いことを示しているので、当該光量が大きな値を示す候補物質又は微生物を選択することによって、上記難分解性物質に対して優れた分解作用を有する物質又は微生物をスクリーニングすることができる。また、上記難分解性物質に対する分解作用の強度が既知の物質又は微生物を用いた場合に得られる上記光量を予め求めておき、これを指標とすることによって、既知の物質又は微生物の分解作用の強度と相対比較して、目的の強度の物質又は微生物を選択することができる。
【００２５】
(I-2)上記難分解性物質の分解反応の分解促進剤又は分解阻害剤のスクリーニング方法
更に、本発明は、上記(I)の方法を利用して、上記難分解性物質の分解反応の分解促進剤又は分解阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００２６】
当該スクリーニング方法において、スクリーニングの対象である分解促進剤又は分解阻害剤は、上記難分解性物質の分解反応を促進又は阻害する作用を示す物質である。
【００２７】
スクリーニングに使用される分解促進剤又は分解阻害剤の候補物質は、単一の成分のみからなるものであってもよく、また複数の成分からなる組成物であってもよい。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法では、第一工程として、上記難分解性物質の分解反応系に候補物質を添加する（工程(i)）。ここで、上記難分解性物質の分解反応系とは、上記難分解性物質が分解される環境条件下にある反応系であれば、特に制限されない。該反応系としては、例えば、上記難分解性物質とこれを直接分解する酵素が共存している分解反応系であってもよく、また上記難分解性物質、反応助剤を介して上記難分解性物質を分解する酵素、及び反応助剤が共存している分解反応系であってもよい。具体的には、ラッカーゼ／メディエーター／リグニンの分解反応系において、リグニンの分解反応の分解促進剤又は分解阻害剤をスクリーニングする場合であれば、該分解反応系として、例えば、ラッカーゼ０．０００５〜１０Ｕ／ｍｌ、メディエーター０．０００１〜３重量％、リグニン０．００１〜５重量％及び硫酸マンガン０．００００１〜２重量％を含む酢酸又は酒石酸緩衝液（０．５〜１００ｍＭ、ｐＨ２．６〜６．８）を例示できる。ここで、ラッカーゼの活性単位１Ｕは、2.6-DMP(0.4mM)を含有する酒石酸緩衝液(10mM、pH4.5)１ｍｌにおいて、２５℃、１分間で、470nmでの吸光度を１上昇させる酵素量を示す。
【００２９】
上記分解反応系に添加する候補物質の割合は、特に制限されないが、例えば、該反応系における該候補物質の割合が、０．０００５〜１５重量％、好ましくは０．００１〜１０重量％、更に好ましくは０．００５〜５重量％となる範囲を挙げることができる。
【００３０】
次いで、第二の工程として、上記分解反応系において、上記難分解性物質の分解に伴って発せられる光量を測定する（工程(ii)）。当該光量の測定方法は、前記(I)の項に記載の通りである。
【００３１】
そして、第三の工程として、工程(ii)で測定した光量に基づいて、反応促進剤又は反応阻害剤として作用している候補物質を選択する（工程(iii)）。具体的には、候補物質を添加しない以外は同様の方法で測定した光量と比較して、少ない光量を示すものは、候補物質が反応阻害剤であると同定され、その光量が少ない程、反応阻害剤の作用が強いことを示している。一方、候補物質を添加しない以外は同様の方法で測定した光量と比較して、多い光量を示すものは、候補物質が反応促進剤であると同定され、その光量が多い程、反応促進剤の作用が強いことを示している。
【００３２】
(II)反応助剤を介した酸化還元酵素の反応の効率を評価する方法
更に、本発明は、反応助剤を介してリポーター物質に対して行うラジカル反応又は酸化反応の反応効率を評価する方法を提供する。
【００３３】
本発明において、反応助剤とは、酸化還元酵素の作用によりそれ自身はラジカル又は酸化剤となる性質を持つ化合物であり、該酵素単独では通常反応され難いか或いは反応され得ないリポーター物質に作用して、ラジカル反応又は酸化反応を行うことができる物質を意味する。このような反応助剤の一例として、メディエーターを例示することができる。
【００３４】
本発明で使用される酸化還元酵素は、特に制限されないが、具体例として、ばラッカーゼ、チロシナーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素活性を示す酵素（以下、単に、ラッカーゼ等ともいう。）を例示できる。好ましくはラッカーゼである。
【００３５】
また、本発明において、リポーター物質とは、上記酵素単独では通常反応され難いか或いは反応され得ないものであり、反応助剤を介してラジカル反応又は酸化反応を受けるものを意味する。例えば、酵素としてラッカーゼ等を用いる場合であれば、上記リポーター物質として、グリオキサール、メチルグリオキサール、ジメチルグリオキサール、マロンアルジデヒド、エチルグリオキサール等を使用することができる。好ましくはグリオキサール及びメチルグリオキサールである。これらのリポーター物質は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３６】
本発明の方法では、第一工程として、上記酵素、反応助剤、及びリポーター物質を共存させる（工程(i)）。これらの成分を共存させる方法としては、特に制限されないが、例えば、各成分を以下記載する割合となるように水溶液中に混合する方法を挙げることができる：上記酵素が０．０００１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ；反応助剤が０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％、更に好ましくは０．０１〜２重量％；及びリポーター物質が０．００００１〜５重量％、好ましくは０．０００１〜１重量％、更に好ましくは０．００１〜０．５重量％。必要に応じて、上記水溶液中に酵素反応に関与する塩やその他の成分を添加したり、またｐＨを適宜調整してもよい。任意添加成分の一例として、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｍｇ、Ｃａ等の金属塩を挙げることができる。
【００３７】
また、上記各成分を共存させる際の温度条件としては、上記酵素が作用できる範囲内になるように適宜設定すればよいが、反応に供する全成分が安定に保持される温度域であることが望ましい。
【００３８】
次いで、第二の工程として、上記共存条件下において、上記リポーター物質の関与するラジカル反応又は酸化反応に伴って発せられる光量を測定する（工程(ii)）。当該光量の測定方法は、前記(I)の項に記載の通りである。
【００３９】
そして、第三の工程として、工程(ii)で測定した光量に基づいて、反応効率を評価する（工程(iii)）。測定された光量が大きい程、リポーター物質へのラジカル反応又は酸化反応の効率が高いことを示しおり、反応助剤を介して酸化還元酵素の反応が効率的に行われたと評価できる。一方、測定された光量が小さければ、リポーター物質のラジカル反応又は酸化反応の効率が低いことを示しており、反応助剤を介する酸化還元酵素の反応が十分でないと評価できる。
【００４０】
このように、本発明の方法によれば、上記リポーター物質の関与するラジカル反応又は酸化反応に伴って発せられる光量を指標にすることによって、反応助剤を介した酸化還元酵素の反応の効率を評価することができる。即ち、当該方法を利用して、酸化還元酵素の酵素活性の評価、反応助剤としての作用効率の程度の評価が可能である。故に、当該方法を利用して、酸化還元酵素の反応補助剤のスクリーニングや、反応助剤を介した酸化還元酵素の反応における反応促進剤又は反応阻害剤のスクリーニングが可能である。また、当該方法を利用して、各種の反応条件において発せられる光量を測定することによって、反応助剤を介した酸化還元酵素の反応の最適化を行うこともできる。
【００４１】
また、例えば、ラッカーゼ／ＨＢＴ（メディエーター）／グリオキサールの反応系において、該反応系の反応効率は、反応系中のラッカーゼの活性、ＨＢＴの濃度、グリオキサールの濃度、マンガン濃度、及び酒石酸等の有機酸の濃度に応じて変化する。従って、本発明の方法は、該反応系中のラッカーゼの活性、ＨＢＴの濃度、グリオキサールの濃度、マンガン濃度又は酒石酸等の有機酸濃度を定量する方法として利用することもできる。具体例として、マンガン濃度を定量する場合を挙げて以下に説明する。まず、ラッカーゼ、ＨＢＴ及びグリオキサールを特定濃度で含有する反応系（以下、ベース反応系という。）において、各種濃度となるようにマンガンを配合し、各種マンガン濃度の反応系から発せられる光量を予め測定し、マンガン濃度と光量との関係を示す検量線を作成する。次いで、被検体を含有するベース反応系を調製して、該反応系において発せられる光量を測定し、該光量の測定値を上記検量線に照合することによって、該検体中のマンガン濃度を定量することができる。
【００４２】
(II-1)酸化還元酵素の反応助剤のスクリーニング方法
更に、本発明は、上記(II)の方法を利用して、反応助剤を介して上記リポーター物質を分解する酸化還元酵素の反応助剤のスクリーニング方法を提供する。
【００４３】
当該スクリーニング方法において、スクリーニングの対象である反応助剤とは、上記(II)の項に記載の通りである。また、本発明で使用する酸化還元酵素及びリポーター物質についても、上記(II)の項に記載の通りであるが、好適には、酸化還元酵素が、ラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素活性を示すものであり、リポーター物質がグリオキサールである。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法では、第一工程として、上記酵素、反応助剤の候補物質、及びリポーター物質を共存させる（工程(i)）。これらの成分を共存させる方法としては、上記(II)の項に記載の通りである。
【００４５】
次いで、第二の工程として、上記共存条件下において、上記リポーター物質のラジカル反応又は酸化反応に伴って発せられる光量を測定する（工程(ii)）。当該光量の測定方法は、前記(I)の項に記載の通りである。
【００４６】
そして、第三の工程として、工程(ii)で測定した光量に基づいて、反応助剤として作用している候補物質を選択する（工程(iii)）。当該光量が大きい程、候補物質が反応助剤として効率的に作用していることを示しているので、当該光量が大きな値を示す候補物質を選択することによって、優れた反応助剤をスクリーニングすることができる。また、使用する酵素と上記リポーター物質との間で反応助剤として作用することが既知の物質を用いて上記光量を予め求めておき、これを指標とすることによって、既知の反応助剤の強度と相対比較して、目的の作用効率を有する反応助剤を選択することができる。
【００４７】
また、本スクリーニング方法において、反応助剤の候補物質が２以上の成分を含有するものであれば、例えば、ろ紙クロマトグラフィー等の公知の分離手段により各成分を分離させた後に、上記工程(i)〜(iii)に供すれば、候補物質中の成分の分離と各成分の助剤作用の有無の評価を行うことができる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明の方法によれば、難分解性物質が分解の際に発する微弱な光を測定することによって、該難分解性物質の分解の程度を判定することができる。かかる方法は、簡便で容易に、短時間で、検体に影響を与えることなく（検体に非接触で）、しかも連続的に、上記難分解性物質の分解の程度を判定することができるという利点がある。また、上記難分解性物質の分解の程度を非破壊的に判定できるという点でも、従来の方法と比べて優れている。
【００４９】
また、本発明によれば、該難分解性物質が分解する際に発する微弱な光を測定することにより、難分解性物質に対して分解作用を有する物質又は微生物のスクリーニングや、難分解性物質の分解反応の反応促進剤又は反応阻害剤のスクリーニングを、簡便でしかも短時間で、連続的に実施することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００５１】
実施例１  リグニン分解能力の異なる菌株による評価
１６種の微生物菌種（Ceriporiopsis subvermispora ATCC90467； Ceriporiopsis subvermispora CBS347.63；Ceriporiopsis subvermispora FP-90031; Ceriporiopsis subvermispora ATCC90466; Ceriporiopsis subvermispora ATCC96608; Coriolus hirsutus K2617； Dichomitus squalens CBS432.34； Phanerochaete chrysosporium ATCC34541; Phanerochaete sodida ATCC90628; Phlebia radiata ATCC52891; Pleurotus ostreatus ATCC66376; Pycnoporus cinnabarinus IFO31165; Tyromyces palustris IFO30339; Coriolus versicolor K2615; Lentinus edodes IFO6654; 及びPhoriota nameko IFO30373）をそれぞれポテトデキストロース寒天培地にて培養し直径６mm、長さ４ｍｍの円形ペレット状に切り出したものを植菌用菌種とした。
【００５２】
ブナ(Fagus crenata)木材に滅菌蒸留水を十分に浸漬し、木材１g（乾燥重量）につき、前記植菌用菌種１個の割合で植菌した。ポリスチレン製滅菌シャーレ内で、２３．５℃にて４週間、暗箱内に静置して培養した。培養の間、超高感度のＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス製、ARGUGAS-50/VIM）を用いてフォトカウントモードで、暗箱内の上記シャーレ内から発せられる微弱な光を観察し、発光量を測定した。発光量は、上記ＣＣＤカメラのフォトンカウントモードで一定時間に取得した画像から測定する対象の木材が存在する部位に検出されたフォトンの数（フォトン画素数）を平均発光強度acpm(average count / hour)として表すことにより、数値化した。また、培養前と培養後の木材中のリグニンの濃度をKlasonリグニン法（硫酸法）により測定し、各微生物のリグニンの分解率を求めた。
【００５３】
得られた結果を図１に示す。図１には、１６種の微生物を木材に植菌し、培養した際に測定された発光量とリグニン分解率（％）との関係を図示する。この結果から、発光量とリグニン分解率との間には相関関係があることが確認された。
【００５４】
実施例２  リグニン分解能力の高い菌株のスクリーニング
植物が生育する環境（滋賀県大津市の公園など）から、木々や腐植土等に生育するキノコ等の微生物サンプル４５点を任意に収集した。約2mm片の微生物サンプルを次亜塩素酸０．５％〜５％含有水溶液に１０〜６０秒間浸漬した後に、ポテトデキストロース寒天（PDA）平板培地に植菌し、２３．５℃で１〜４日間培養し、半径１〜３ｃｍのコロニーを形成させた。更に、該コロニーからの菌を白金耳で分離し、再度ＰＤＡ寒天培地に培養し、半径１〜３ｃｍのコロニーを形成させた。かかる操作を少なくとも５回繰り返して、安定して同じジャイアントコロニーが形成されるまで株化操作を行い、１８０株を得た。
【００５５】
これらの菌株を用いて、実施例１と同様の方法で、ブナ木材に植菌し、培養した際に発せられる微弱な光の量を測定した。かかる測定結果に基づいて、発光量が異なる菌株を１８株選び、再度実施例１と同様の方法で、ブナ木材への植菌を行い、２週間培養を行った。培養前と培養後の木材中のリグニンの濃度をKlasonリグニン法（硫酸法）により測定し、各微生物のリグニン分解率（％）を求めた。
【００５６】
得られた結果を図２に示す。図２には、本試験において、微生物を培養した際に測定された発光量とリグニン分解率との関係を図示する。この結果から、上記実施例１と同様に、発光量とリグニン分解率との間には相関関係があることが確認された。また、本結果に基づいて、発光量の多い微生物を選択することによって、リグニン分解能の高い微生物をスクリーニングできた。
【００５７】
実施例３  培養条件変更による影響評価
Ceriporiopsis subvermispora ATCC 90467を用いて、実施例１と同様で試験を行い、植菌用の前培養を通常の１週間から２週間に長期化させた老齢菌体や、接種する量を１／５に減じる、または培養期間を２週間から４週間と変更したり、培養中に温度を２３．５℃から１８℃へ１０分間変化させ、リグニン分解への影響を調べた。実施例１と同様の方法で、上記培養によって発せられる微弱な光の量を測定し、平均発光強度acph(average count /hour)を算出した。該平均発光強度acphから、全培養時間をかけることによって、総発光強度tc（total count）を求めた。また、リグニン分解率（％）は、実施例１と同様の方法で求めた。
【００５８】
得られた結果を図３に示す。この結果、培養条件が変わるとリグニン分解率が異なり、これに総発光強度scは相関していることが確認された。総発光強度scが高くなるように培養条件を設定することによって、リグニン分解を効率的に行うことができることが明らかとなった。
【００５９】
実施例４  ラッカーゼの反応助剤成分の検索・評価
ラッカーゼ(Lac)の反応助剤成分の検索・評価のモデル試験を行うために、ラッカーゼ(Lac)の反応助剤としての作用が既に分かっているHBT、NNDS、ビオルル酸、シリンガルダジン及びプロマジン（ここでは、これらを仮に反応助剤の候補物質とする）を用いて、下記試験を行った。
【００６０】
ラッカーゼ(Lac)の反応助剤の検索を行うために、反応助剤の候補物質として、HBT、NNDS、ビオルル酸、シリンガルダジン及びプロマジンを用いて、下記試験を行った。
【００６１】
ポリスチレン製９６穴タイタープレートの各ウェル中に、以下に示す反応液（反応液１〜３）０．２ｍｌを調製した。これを暗所箱内に置き、２３．５℃で、６時間静置した。この間、超高感度のＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス製、ARUGAS-50/VIM）を用いてフォトカウントモードで、各ウェルから発せられる微弱な光を観察し、実施例１と同様の方法で、発光強度cph(count /hour)（１時間あたりにカウントされたフォトン画素数）を求めた。
＜反応液＞
反応液１：Lac（1U／ml）及び硫酸マンガン(0.5mM)を含む酒石酸緩衝液(10mM、pH4.5)
反応液２：Lac（1U／ml）、硫酸マンガン(0.5mM)及びグリオキサール(0.4mM)を含む酒石酸緩衝液(10mM、pH4.5)
反応液３：Lac（1U／ml）、硫酸マンガン(0.5mM)、反応助剤の候補物質（０．5mM）及びグリオキサール(0.4mM)を含む酒石酸緩衝液(10mM、pH4.5)
得られた結果を図４に示す。図４には、反応液２及び３の発光強度cphから、反応液１の発光強度cphをバックグラウンド値として差し引いた値を示す。反応液２では、反応助剤を含有していないため、グリオキサールが反応を受けていないため、発光強度cphが低かった。一方、HBT、NNDS及びビオルル酸を含有する反応液３は、高い発光強度cphを示した。即ち本試験結果から、HBT、NNDS及びビオルル酸は、ラッカーゼの反応助剤として、優れた作用を示すことが確認された。なお、HBT、NNDS及びビオルル酸は、ラッカーゼの反応助剤として優れていることが既に公知であり、このことは本試験結果と一致している。
【００６２】
実施例５  ホースラディッシュペルオキシダーゼの反応助剤成分の検索・評価
ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)の反応助剤成分の検索・評価のモデル試験を行うために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)の反応助剤として作用することが既に分かっているHBT（ここでは、これらを仮に反応助剤の候補物質とする）を用いて、下記試験を行った。
【００６３】
下記反応液を使用する以外は、上記実施例４と同様の方法で試験を行い、反応助剤の候補物質（HRP）の存在下又は非存在下で発せられる発光強度cphを測定した。
＜反応液＞
反応液１：ＨＲＰ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、硫酸マンガン(0.5mM)及び過酸化水素（０．１ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．８）
反応液２：ＨＲＰ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、硫酸マンガン(0.5mM)、過酸化水素（０．１ｍＭ）及びグリオキサール（０．４ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．８）
反応液３：ＨＲＰ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、硫酸マンガン(0.5mM)、過酸化水素（０．１ｍＭ）、反応助剤の候補物質（ＨＢＴ）（０．5mM）及びグリオキサール（０．４ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．８）
得られた結果を図５に示す。図５には、反応液２及び３の発光強度cphから、反応液１の発光強度cphをバックグラウンド値として差し引いた値を示す。反応液２では、反応助剤を含有していないため、グリオキサールが反応を受けていないため、発光強度cphが低かった。一方、HBTを含有する反応液３は、高い発光強度cphを示した。即ち本試験結果から、HBTは、ホースラディッシュペルオキシダーゼの反応助剤として、優れた作用を示すことが確認された。なお、HBTは、ホースラディッシュペルオキシダーゼの反応助剤として優れていることが既に公知であり、このことは本試験結果と一致している。
【００６４】
実施例６  ラッカーゼ／メディエーター反応系の阻害成分の評価
ラッカーゼ／メディエーター反応系の阻害成分の評価を行うために、反応阻害成分の候補物質としてジオキサンを用いて、下記試験を行った。
【００６５】
ポリスチレン製９６穴タイタープレートの各ウェル中に、Lac（0.8U／ml）、硫酸マンガン(0.5mM)、グリオキサール(0.4mM)、HBT（０．5mM）及びジオキサン(10重量%)を含む酒石酸緩衝液(10mM、pH4.5)（反応液４）０．２ｍｌを調製した。これを暗所箱内に置き、２３．５℃で、６時間静置した。この間、超高感度のＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス製、ARUGAS-50/VIM）を用いてフォトカウントモードで、各ウェルから発せられる微弱な光を観察し、実施例３と同様の方法で発光強度cph(average count /hour)を求めた。
【００６６】
得られた結果を図６に示す。図６には、平均発光強度のバックグランド値として実施例４の反応液１の発光強度cphを差し引いた値を示す。また、比較として、図６には、比較のために、実施例４で測定した反応液３（HBT含有）の発光強度cphについても併せて示す。
【００６７】
この結果、ジオキサンを添加した反応液４の発光強度cphは、反応液３（HBT含有）のものに比して、低い値を示すことが分かった。本試験結果から、ジオキサンは、ラッカーゼ／メディエーター反応系において反応阻害成分として作用していることが確認された。なお、ジオキサンは、ラッカーゼ／メディエーター反応系において反応阻害成分として作用することが既に公知であり、このことは本試験結果と一致する。
【００６８】
実施例７
酵素ラッカーゼ（1U／ml）、硫酸マンガン(0.5mM)、過酸化水素(0.2mM)、HBT（０．5mM）及びグリオキサール(0.4mM)を含有する酒石酸緩衝液(20mM、pH4.5)をベースとして、酵素、酒石酸、HBT、グリオキサール及びＭｎの含有割合を変化させた反応溶液を用いて、実施例５と同様の方法で、発光強度cph(count /hour)を測定した。得られた結果を図７〜１１に示す。
【００６９】
この結果、発光強度cphが高い値を示す反応条件を選択することによって、優れた酵素反応条件を選択できることが分かった。また、本試験結果から、酵素活性、酒石酸濃度、HBT濃度、マンガン濃度及びグリオキサール濃度に対応して、酵素反応の反応効率（発光強度cph）が変化していることから、該酵素反応によって測定された光量を指標として、酵素活性、酒石酸濃度、HBT濃度、マンガン濃度及びグリオキサール濃度を定量できることが確認された。
【００７０】
実施例８  白色腐朽菌培養後の抽出物に含まれるLacの反応助剤の検索
試験は、PDA培地で前培養したマイタケ（Grifola frondosa）を直径６mmのペレットに切り出し菌種として、滅菌培地（ブナ木材：グルコース：コーンスティープリカー：蒸留水＝１０：１：２：３０（重量比））５ｇにペレット菌種１つの割合で植菌し、２３．５℃にて８週間培養した。培養後、これを８倍量の蒸留水で抽出し、抽出液を得た。次いで、酵素Lac（1U／ml）、硫酸マンガン(0.5mM)、過酸化水素(0.2mM)、グリオキサール(0.4mM)及び上記抽出液（０．５５ｇ／ｌ）を含有する酒石酸緩衝液(20mM、pH4.5)を調製した。これを暗所箱内に入れ、２３．５℃で１２時間させて、実施例４と同様の方法で、発光強度cph(cont /hour)を測定した。また、比較として、微生物を培養しなかった培地からの抽出液を用いて、同様に試験を行った（コントロール）。
【００７１】
得られた結果を図１２に示す。この結果、上記微生物培養抽出液を添加したものでは、コントロールに比べて極微弱な発光が存在しており、上記微生物培養抽出液には、ラッカーゼの反応助剤となる成分が存在していることが確認された。
【００７２】
実施例９
ＨＢＴ（５ｍＭ）、ジオキサン（５容量％）、グリシン（２重量％）、コレステロール（５ｍＭ）、牛血清アルブミン（2mg/ml）を含有する混合溶液を被検体として、該被検体からのラッカーゼの反応助剤となる成分の分離同定を、以下の方法によって行った。
【００７３】
上記被検体をペーパクロマトグラフィー用ろ紙（20x400mm, Filter paper 514A, ADVANTEC社製）に20μlスポットし、蒸留水により展開を行った。展開後、ガラス製シャーレ内に置いて（この際、便宜上ろ紙を２つに分割してシャーレ内に置いた）、ろ紙中の各成分が拡散しない程度に、このシャーレ内に実施例４で使用した反応液２を添加した。これを暗所箱内で、２３．５℃で４時間静置し、超高感度のＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス製、ARUGAS-50/VIM）を用いてフォトカウントモードで、ろ紙で発せられる微弱発光の位置を確認した。
一方、被検体に含まれる各成分のろ紙上の存在位置は、別途、同様の条件での被検体を展開したろ紙を用いて紫外線ランプ下での観察とニンヒドリン反応により同定した。
【００７４】
得られた結果を図１３に示す。図１３は、ろ紙上で、検出された光量の程度を示す図である。図１３において、発光強度が高い部分ほど赤く、低いほど青くなるように擬似カラーを表示している。この結果、HBTに相当するろ紙上の相対移動度(R=0.9程度)を中心に微弱な発光が検出されたが、他の成分が存在しているスポットでは発光は認められないことが確認された（図１３参照）。本試験結果から、ラッカーゼ反応の助剤となる成分が反応阻害剤など他の成分との混合物として存在する場合に、成分の分離技術と組み合わせて本発明の方法（反応助剤のスクリーニング方法）を実施することにより、検体中の成分の分離と助剤作用の有無の評価を簡便、同時に検査することが出来ることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】実施例１において、１６種の微生物を木材に植菌して培養した際に測定された発光量とリグニン分解率との関係を図示する。
【図２】実施例２において、微生物を培養した際に測定された発光量とリグニン分解率との関係を図示する。
【図３】実施例３において、微生物を培養した際に測定された発光量とリグニン分解率との関係を図示する。
【図４】実施例４において、各種候補物質存在下又は非存在下で発する微弱光の平均発光強度cphを示す図である。
【図５】実施例５において、候補物質存在下又は非存在下で発する微弱光の発光強度cphを示す図である。
【図６】実施例６において、ジオキサンの存在又は非存在下で発する微弱光の発光強度cphを示す図である。
【図７】実施例７において、ラッカーゼ量と発光強度cphとの関係を示す図である。
【図８】実施例７において、酒石酸濃度と発光強度cphとの関係を示す図である。
【図９】実施例７において、HBT濃度と発光強度cphとの関係を示す図である。
【図１０】実施例７において、Ｍｎ濃度と発光強度cphとの関係を示す図である。
【図１１】実施例７において、グリオキサール濃度と発光強度cphとの関係を示す図である。
【図１２】実施例８において、マイタケ（Grifola frondosa）培養抽出液存在下で発する微弱光の発光強度cphを示す図である。
【図１３】実施例９において、ろ紙上で検出された微弱光の強度を示す図である。
【図１】
2005160330.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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