(57)【要約】【課題】自然凝集が起こらず分散性が良好であり、しかも感度が安定なラテックス凝集反応用試薬を提供すること。【解決手段】蛋白質固定ラテックス粒子が、３〜18mMのリン酸、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール、2-（N-モルフォリノ）エタンスルホン酸、3-（N-モルフォリノ）-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸、3-（N-モルフォリノ）プロパンスルホン酸、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸及びN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸から選ばれる緩衝液に懸濁しているラテックス凝集反応用試薬、及び蛋白質固定ラテックス粒子の自然凝集防止法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質固定ラテックス粒子が、３〜18mMのリン酸、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール、2-（N-モルフォリノ）エタンスルホン酸、3-（N-モルフォリノ）-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸、3-（N-モルフォリノ）プロパンスルホン酸、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸及びN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸から選ばれる緩衝液に懸濁しているラテックス凝集反応用試薬。
【請求項２】
上記緩衝液の濃度が３〜10mMである請求項１記載のラテックス凝集反応用試薬。
【請求項３】
ラテックス粒子がポリスチレン系ラテックス粒子である請求項１又は２記載のラテックス凝集反応用試薬。
【請求項４】
蛋白質固定ラテックス粒子を３〜18mMの緩衝液に懸濁することを特徴とする、保存中における該ラテックス粒子の自然凝集防止法。
【請求項５】
緩衝液が、リン酸、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール及びグッドの緩衝剤から選ばれる請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記グッドの緩衝剤が、2-（N-モルフォリノ）エタンスルホン酸、3-（N-モルフォリノ）-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸、3-（N-モルフォリノ）プロパンスルホン酸、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸及びN-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-2-アミノエタンスルホン酸から選ばれる請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラテックス凝集反応用試薬、更に詳しくは、良好な分散性を有する安定性に優れたラテックス凝集反応用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中の抗原又は抗体を測定することは、疾患の診断に極めて重要な手段の一つである。免疫学的測定方法の中でも、不溶性の懸濁可能な微粒子担体に、試料中の抗原（又は抗体）に対する抗体（又は抗原）を感作し、試料中の抗原（又は抗体）と該微粒子担体とを反応させ、凝集反応による濁度の変化の程度を測定するラテックス凝集反応法は、RIA、EIA等とは異なり、病院や検査センターの検査室で汎用されている自動分析装置で測定可能であり、反応系の微量化、感度の向上、反応時間の短縮等の点から有用である。
【０００３】
ラテックス凝集反応用試薬としては、様々なものが上市されているが、従来のラテックス凝集反応用試薬は、試料が存在しなくても、抗体感作ラテックス粒子が保存中に自然に凝集してしまうことが知られている。このような凝集の発生は、測定試料が存在しない状態で凝集が生じているために抗原抗体反応由来の凝集を正しく測定できず、特に長期間の保存により感度が不安定になるという問題点があった。
【０００４】
このような自然凝集を抑制する方法として、ショ糖等を添加する方法（特許文献１参照）が知られている。しかし、充分な抑制効果を得るためにショ糖を多量に添加すると、粘性が増加し、抗原抗体反応が抑制され、感度が低下するという欠点があった。
【特許文献１】特開昭54-26327号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、自然凝集が起こらず分散性が良好であり、しかも感度が安定なラテックス凝集反応用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、かかる実情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、蛋白質固定ラテックス粒子の懸濁液として特定の緩衝剤を用い、その濃度を３〜18mMに設定することにより、長期間保存しても当該ラテックス粒子の自然凝集が発生せず、感度が安定なラテックス凝集反応用試薬が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
尚、本明細書において「蛋白質固定ラテックス粒子」とは、抗原、抗体、Fab、F(ab')2等の抗体消化物などを常法によりラテックスに被覆させたものをいう。
すなわち本発明は、蛋白質固定ラテックス粒子が、３〜18mMのリン酸、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール、2-（N-モルフォリノ）エタンスルホン酸、3-（N-モルフォリノ）-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸、3-（N-モルフォリノ）プロパンスルホン酸、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸及びN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸から選ばれる緩衝液に懸濁しているラテックス凝集反応用試薬を提供する。
【０００７】
本発明はまた、蛋白質固定ラテックス粒子を３〜18mMの緩衝液に懸濁することを特徴とする、保存中における該ラテックス粒子の自然凝集防止法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のラテックス凝集反応用試薬は、自然凝集の発生を抑制し、良好な分散性を有し、かつ安定した感度が得られる。本発明のラテックス凝集反応用試薬は、疾患の発見、病態の把握、治療等に有用である。
また、本発明の自然凝集防止法によれば、長期間保存しても蛋白質固定ラテックス粒子の自然凝集を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本出願人は、蛋白質固定ラテックス粒子を３〜18mMの緩衝液に懸濁することにより、長期間保存しても当該ラテックス粒子が自然凝集しないことを見出した。尚、本明細書において、「懸濁」とは、蛋白質固定ラテックス粒子が緩衝液中に分散していることを意味し、また、「懸濁液」とは、蛋白質固定ラテックス粒子が分散してなる緩衝液を意味する。
【００１０】
本発明の蛋白質固定ラテックス粒子の自然凝集防止法において使用できる緩衝液としては特に制限されないが、リン酸、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール（トリス）又はグッドの緩衝液が好ましく、特にグッドの緩衝液が好ましい。グッドの緩衝液としては、2-（N-モルフォリノ）エタンスルホン酸（MES）、3-（N-モルフォリノ）-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPSO）、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸（BES）、3-（N-モルフォリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis-Tris）、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸（ADA）、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸（ACES）、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（HEPES）又はN-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-2-アミノエタンスルホン酸（TES）が好ましい。これらの緩衝液は単独で又は二種以上を組み合わせて使用してもよい。また、緩衝液の濃度は、自然凝集を抑制する点から、３〜18mMであるが、特に３〜10mMが好ましい。この濃度は、蛋白質固定ラテックス粒子懸濁液に試料を反応させる前の最終的な緩衝液の濃度である。
【００１１】
蛋白質固定ラテックス粒子懸濁液のpHは、４〜10が好ましく、特に６〜９が好ましい。
【００１２】
蛋白質固定ラテックス粒子のラテックス粒子としては、ラテックス凝集反応を利用した免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体であれば特に制限されないが、工業的に大量生産することができる有機系微粒子が好ましい。このような有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単独重合体又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げられる。また、このような有機系微粒子に、カルボキシル基、第一級アミノ基、カルバモイル基、水酸基、アルデヒド基等の官能基が結合した反応性有機系微粒子も好ましく使用することができる。上記のラテックス粒子のなかでは、抗原又は抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる点から、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体等のポリスチレン系ラテックス粒子が好ましい。
【００１３】
ラテックス粒子の形状は特に制限されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の蛋白質と測定対象物質との凝集反応の結果生じる凝集体が肉眼又は光学的に検出できるに充分な大きさが望ましい。好ましい平均粒子径としては0.02〜1.6μmであり、特に0.03〜0.5μmが好ましい。
【００１４】
上記ラテックス粒子の表面には、測定対象物質に対する蛋白質、好ましくは抗体又は抗原を感作する。感作する方法としては特に制限されず、公知の方法が利用可能である。例えば、ラテックス粒子表面に抗体又は抗原を物理的に吸着させる方法、官能基を有するラテックス粒子表面に共有結合や免疫的結合によって感作する方法が挙げられる。
【００１５】
感作する抗体としては特に制限されないが、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等が挙げられる。上記モノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において作製されるモノクローナル抗体産生融合細胞株を利用して産生させ、取得することができる。抗体の形状としては、特に制限されるものではなく、IgG等の抗体そのものの他、Fab、F(ab')2等の抗体消化物も好ましく使用することができる。抗体は、単独で又は複数種を組み合わせて使用してもよい。
感作する抗原としては、自然界に存在するnative抗原の他に、遺伝子操作によって得られるリコンビナント抗原、ウシ血清アルブミン（BSA）等の高分子と結合させた抗原等が挙げられる。
【００１６】
懸濁液中の蛋白質固定ラテックス粒子の濃度としては、特に制限されるものではないが、0.1〜10mg/mLが好ましい。
【００１７】
本発明の蛋白質固定ラテックス粒子の自然凝集防止法は、本発明のラテックス凝集反応用試薬に好適に用いることができる。すなわち、本発明のラテックス凝集反応用試薬は、上記の蛋白質固定ラテックス粒子を特定の緩衝液に３〜18mMの濃度で懸濁させたものである。
【００１８】
特定の緩衝液としては、リン酸、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール（トリス）、2-（N-モルフォリノ）エタンスルホン酸（MES）、3-（N-モルフォリノ）-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPSO）、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸（BES）、3-（N-モルフォリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis-Tris）、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸（ADA）、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸（ACES）又はN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（HEPES）を使用することができる。これらの緩衝液は単独で又は二種以上を組み合わせて使用してもよい。緩衝液の濃度は、３〜18mMであるが、特に３〜10mMが好ましい。
【００１９】
本発明のラテックス凝集反応用試薬には、更に、BSA、ショ糖等の安定剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤を適宜加えてもよい。本発明のラテックス凝集反応用試薬に、更に希釈液を組み合わせてラテックス凝集反応用キットとしてもよい。この希釈液には、必要に応じて上記の安定剤や防腐剤を添加することができる。
【００２０】
試料中の測定対象物質は、測定対象物質に対する抗体（又は抗原）を感作したラテックス粒子と試料とを溶液中で混合し、抗原抗体反応によってラテックス粒子の凝集体を生じさせ、その凝集体を測定することにより、測定することができる。具体的には、試料を反応容器に分注し、インキュベートした後、本発明のラテックス凝集反応用試薬を添加・混合することにより実施することができる。抗原抗体反応の温度は、25〜40℃が好ましく、特に30〜38℃が好ましい。
【００２１】
本発明のラテックス凝集反応用試薬を使用して測定できる対象物質としては、血清、血漿等の生体試料に含まれる生理活性物質が挙げられる。このような対象物質としては、例えば、AFP（ヒトα-フェトプロテイン）、CEA（ガン胎児性抗原）、CA19-9（糖鎖抗原19-9）等の癌マーカー；PLG（ヒトプラスミノーゲン）、α2-PI（ヒトα2-プラスミンインヒビター）、ATIII（ヒトアンチトロンビンIII）等の血液凝固・線溶系酵素；HBs抗体、HBs抗原；その他、フェリチン、β2M（β2マイクログロブリン）、Lp(a)（リポ蛋白(a)）、CRP（C反応性蛋白）、FDP（フィブリノーゲン/フィブリン分解産物）、Dダイマー（フィブリン分解産物）、MMP-3（マトリックスメタロプロテアーゼ-3）、PSA（前立腺特異抗原）等が挙げられる。
【００２２】
本発明のラテックス凝集反応用試薬を使用して得られるラテックス粒子の凝集体を測定する方法は特に制限されず、例えば、上記凝集体を定性的又は半定量的に測定する場合には、測定対象が含まれていることを既知の試料を測定した場合の濁度との比較から目視によって判定することができる。定量的に測定する場合には、簡便性及び精度の点から、光学的に測定することが好ましい。
【００２３】
光学的測定法としては、公知の方法が利用できるが、吸光度法が好ましい。吸光度の測定は、汎用の分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置（日立7150形、7070形、7170形等（日立社製）；東芝TBA-120FR等（東芝社製））、近赤外を測定波長とした装置（LPIA等（三菱化成社製））、積分球濁度を測定原理とした装置（ELシステム等（協和発酵社製））、散乱光強度を測定する装置（BNAシステム等（ベーリンガー社製））等の光学的測定機器を用いて行うことができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
（１）β2マイクログロブリン（β2M）測定用第一試薬の調製
4％NaCl、1％牛血清アルブミン（BSA）を含有した0.05Mグリシン緩衝液（pH9.0）を調製し、第一試薬とした。
（２）β2M測定用第二試薬の調製
ヤギ抗ヒトβ2M抗体（Incstar社製）を1.4mg/mLの濃度で0.25Mグリシン緩衝液（pH9.5）に混和した液５mLに平均粒径0.1μmのポリスチレン系ラテックス（積水化学工業社製）２％懸濁液５mLを加え、４℃にて２時間撹拌し、抗体をラテックスに感作した。遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に２％BSAを含む0.05Mグリシン緩衝液（pH9.5）を加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿部を集め、これに最終懸濁液として0.02％BSAを含む５mMリン酸緩衝液（pH7.5）160mLを加えて懸濁し、第二試薬（抗β2M抗体固定化粒子懸濁液）とした。
（３）吸光度の測定
日立7150形自動分析機を用い、生理食塩液（生食）６μLに第一試薬200μLを加え、その約５分後に第二試薬200μLを添加し、攪拌した。第二試薬を添加した約５分後に、波長600nmにおける吸光度を測定した。結果を以下の実施例２、比較例１〜６と併せて表１に示す。
【００２６】
実施例２
5mMリン酸緩衝液（pH7.5）に代わりに5mMトリス緩衝液（pH7.5）を用いる以外は実施例１と同様にしてβ2M測定用第二試薬を調製し、吸光度を測定した。
【００２７】
比較例１〜３
5mMリン酸緩衝液（pH7.5）に代わりに20、50、100mMリン酸緩衝液（pH7.5）をそれぞれ用いる以外は実施例１と同様にしてβ2M測定用第二試薬を調製し、吸光度を測定した。
【００２８】
比較例４〜６
5mMトリス緩衝液（pH7.5）に代わりに20、50、100mMトリス緩衝液（pH7.5）をそれぞれ用いる以外は実施例２と同様にしてβ2M測定用第二試薬を調製し、吸光度を測定した。
【００２９】
尚、5mMリン酸緩衝液（pH7.5）の代わりに精製水を用いる以外は実施例１と同様にしてβ2M測定用第二試薬を調製し、同様に吸光度を測定した（対照例）。
【００３０】
【表１】
2005351643.tif 000002
【００３１】
表１から明らかなように、本発明のラテックス凝集反応用試薬は、抗体感作ラテックス粒子（抗β2M抗体固定化粒子）の自然凝集による吸光度の増加が認められなかったが、比較例１〜６では吸光度の増加が認められた。
【００３２】
実施例３
（１）リポ蛋白(a)（Lp(a)）測定用第一試薬の調製
１％NaCl、１％BSAを含有した0.05Mグリシン緩衝液（pH9.0）を調製し、第一試薬とした。
（２）Lp(a)測定用第二試薬の調製
精製ヒトアポリポ蛋白(a)（apo(a)）を免疫源としてマウスから常法により得られ、単独使用により免疫凝集を生じさせるモノクローナル抗体[独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）に寄託されているハイブリドーマ28205（FERM BP-3755）により産生される抗体]を1.4mg/mLの濃度で0.25Mグリシン緩衝液（pH9.5）に混和した液５mLに、平均粒径0.1μmのポリスチレン系ラテックス（積水化学工業社製）２％懸濁液５mLを加え、４℃にて２時間撹拌し、当該抗体をラテックスに感作した。遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に２％BSAを含む0.05Mグリシン緩衝液（pH9.5）を加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿部を集め、これに最終懸濁液として0.02％BSAを含む４mMリン酸緩衝液（pH7.0）を波長600nmにおける吸光度が1.6ODとなるように加えて懸濁し、第二試薬（抗Lp(a)抗体固定化粒子懸濁液）とした。
（３）吸光度の測定
日立7150形自動分析機を用い、生食５μLに第一試薬300μLを加え、その約５分後に第二試薬100μLを添加し、攪拌した。第二試薬を添加した約５分後に、波長600nmにおける吸光度を測定した（初期値）。また、37℃で２週間保存した第二試薬を用いて同様に測定を行なった。結果を以下の実施例４〜８及び比較例７〜９と併せて表２に示す。
【００３３】
実施例４〜８
４mMリン酸緩衝液（pH7.0）の代わりに、９、18mMリン酸緩衝液（pH7.0）、４、９、18mMトリス緩衝液（pH7.0）を用いる以外は実施例３と同様にして第二試薬を調製し、吸光度を測定した。
【００３４】
比較例７〜９
４mMリン酸緩衝液（pH7.0）の代わりに、36mMリン酸緩衝液（pH7.0）、45、90mMトリス緩衝液（pH7.0）を用いる以外は実施例３と同様にして第二試薬を調製し、吸光度を測定した。
【００３５】
【表２】
2005351643.tif 000003
【００３６】
実施例９
（１）C-反応性蛋白（CRP）測定用第一試薬の調製
２％NaCl、１％BSAを含有した0.02Mトリス緩衝液（pH8.5）を調製し、第一試薬とした。
（２）CRP測定用第二試薬の調製
精製ヒトCRPを免疫源として、常法によりマウスから得られ、単独使用により免疫凝集を生じさせるモノクローナル抗体[IPODに寄託されているハイブリドーマ08204（FERM P-16765）により産生される抗体]を1.4mg/mLの濃度で0.25Mグリシン緩衝液（pH9.5）に混和した液５mLに、平均粒径0.1μmのポリスチレン系ラテックス（積水化学工業社製）２％懸濁液５mLを加え、４℃にて２時間撹拌し、当該抗体をラテックスに感作した。遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に２％BSAを含む0.05Mグリシン緩衝液（pH9.5）を加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿部を集め、これに最終懸濁液として0.02％BSAを含む４mMリン酸緩衝液（pH7.0）を波長600nmにおける吸光度が２ODとなるように加えて懸濁し、第二試薬（抗CRP抗体固定化粒子懸濁液）とした。
（２）吸光度の測定
日立7150形自動分析機を用い、生食３μLに第一試薬210μLを加え、その約５分後に第二試薬70μLを添加し攪拌した。第二試薬を添加した約５分後に波長600nmにおける吸光度を測定した（初期値）。また、37℃で４週間保存した第二試薬を用いて同様に波長600nmにおける吸光度を測定した。結果を以下の実施例１０〜３４及び比較例１０〜２２と併せて表３に示す。
【００３７】
実施例１０〜３４、比較例１０〜２２
4mMリン酸緩衝液（pH7.0）の代わりに、表３の緩衝剤を表に記載の濃度で用いる以外は実施例９と同様にして第二試薬を調製し、吸光度を測定した。
【００３８】
【表３】
2005351643.tif 000004
【００３９】
表２及び３より、本発明のラテックス凝集反応用試薬は、長期間保存した場合にも安定した吸光度が保持できることが分かった。
【００４０】
実施例３５、比較例２３ [ラテックス凝集反応]
4mMリン酸緩衝液（pH7.0）の代わりに、表４の緩衝剤を表に記載の濃度で用いる以外は実施例９と同様にして第二試薬（抗CRP抗体固定ラテックス粒子懸濁液）を調製した。生食及びCRP濃度既知試料(１、５、10、20、30mg/dL)をそれぞれ実施例９と同様にして吸光度を測定した（初期値）。また、４℃で７ヶ月間保存した後の第二試薬を用いて、同様に生食及びCRP濃度既知試料を用いた場合の吸光度を測定した。
結果を表４に示す。尚、表４中のCRP濃度既知試料の測定値は生食を用いた場合の吸光度を差し引いた値である。
【００４１】
【表４】
2005351643.tif 000005
【００４２】
表４から明らかなように、本発明のラテックス凝集反応用試薬は、長期間保存した場合にも分散性が良好なために生食の吸光度の増加が認められず、試料中のCRP抗原を感度よく測定できることが分かった。一方、比較例２３では、自然凝集により生食の吸光度の増加が認められるばかりか、測定感度の低下も認められた。