(57)【要約】【課題】本発明は、細胞増殖に影響を与えない安全性の高いコラーゲン合成阻害剤を提供することを課題とする。【解決手段】、グリシン、プロリンを含有する短鎖のペプチドが選択的コラーゲン合成阻害効果を有することを見い出した。これらペプチドの細胞増殖への影響を検討したところ、これらペプチドが細胞の増殖には影響を与えずコラーゲン合成のみを特異的に抑制した。さらに、ラットの肝硬変モデルにおいて、これらペプチドは、血清GOT、GPT値を改善し、肝コラーゲンの沈着を抑制した。本発明者が同定したペプチドは、コラーゲン合成阻害剤として利用でき、特に、肝硬変を始めとする繊維化疾患の予防や治療のための副作用の少ない医薬として有用であると考えられる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするコラーゲン合成阻害剤。
（ａ）Gly-Arg-Gly-Xｎ-Pro（配列番号：１）
（Xnは、1若しくは数個のアミノ酸を示す）
（ｂ）Gly-Pro-Ala（配列番号：２）
（ｃ）Gly-Pro（配列番号：３）
【請求項２】
Xnが、Glu,Ser,Thr,Aspからなる群より選択される２種のアミノ酸からなるジペプチドである、請求項１に記載のコラーゲン合成阻害剤。
【請求項３】
Xnが、Glu-Ser、Asp-Ser、およびAsp-Thrからなる群より選択されるジペプチドである、請求項１に記載のコラーゲン合成阻害剤。
【請求項４】
線維化による疾患の予防または治療のための医薬である、請求項１から３のいずれかに記載のコラーゲン合成阻害剤。
【請求項５】
線維化による疾患が、肥厚性瘢痕、瘢痕拘縮、ケロイド症、膠原病、肺線維症、糖尿病性腎症、繊維性癒着、および肝硬変からなる群より選択される、請求項４に記載のコラーゲン合成阻害剤。
【請求項６】
コラーゲン合成阻害剤の製造方法であって、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを薬理学上許容される担体と混合する工程、を含む方法。
（ａ）Gly-Arg-Gly-Xｎ-Pro（配列番号：１）
（Xnは、1若しくは数個のアミノ酸を示す）
（ｂ）Gly-Pro-Ala（配列番号：２）
（ｃ）Gly-Pro（配列番号：３）
【請求項７】
Xnが、Glu,Ser,Thr,Aspから選択される２種のアミノ酸からなるジペプチドである、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
Xnが、Glu-Ser、Asp-Ser、およびAsp-Thrからなる群より選択されるジペプチドである、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖ペプチドを有効成分とするコラーゲン合成阻害剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥厚性瘢痕、ケロイドは熱傷または創傷によりおこる傷の治癒経過の遷延が原因する疾患で、膠原線維を主とする瘢痕組織が過量に生産されて起こるとされている。この結果、皮膚の修復過程で瘢痕が周囲より隆起し、赤みや硬化が著明となり、しばしば痒みや圧痛を伴なう。また、これらの病態の外見は醜く患者の精神的負担ともなり特に未婚者にとっては重大な外見的問題となっている。
肥厚性瘢痕およびケロイドの治療剤として現在用いられている薬剤としては、ステロイド剤、ヘパリン類似物質がある。しかし、ステロイド剤はその強い抗炎症効果とともに強い副作用があり、肥厚性瘢痕、ケロイド等では創傷治癒の遅延、皮膚の萎縮、接触皮膚炎様発疹等が問題になっている。一方、ヘパリン類似物質は、これらの疾患に対して作用が弱く、これらに代る副作用の無い有用な薬剤が望まれてきた。
また、従来のコラーゲン合成阻害剤は、細胞のコラーゲン合成を抑制するだけでなく細胞増殖そのものを抑制してしまうため創傷の治癒効率をかえって低下させてしまうという問題があった。
【０００３】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に記す。
【特許文献１】米国特許第4614517号公報
【特許文献２】米国特許第4614517号公報
【特許文献３】米国特許第4589881号公報
【特許文献４】米国特許第4589881号公報
【特許文献５】米国特許第4578079号公報
【特許文献６】米国特許第4578079号公報
【特許文献７】米国特許第4517686号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞増殖に影響を与えない安全性の高いコラーゲン合成阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々の研究を重ねるうちに、グリシン、プロリンを含有する短鎖のペプチドがコラーゲン合成阻害効果を有することを見い出した。これらペプチドの細胞増殖への影響を検討したところ、これらペプチドが細胞の増殖には影響を与えずコラーゲン合成のみを特異的に抑制した。さらに、ラットの肝硬変モデルにおいて、これらペプチドは、血清GOT、GPT値を改善し、肝コラーゲンの沈着を抑制した。従って、本発明者が同定したペプチドは、コラーゲン合成阻害剤として利用でき、特に、肝硬変を始めとする繊維化疾患の予防や治療のための副作用の少ない医薬として有用であると考えられる。
即ち、本発明は、グリシン、プロリンを含有する短鎖ペプチドを有効成分とするコラーゲン合成阻害剤およびその製造方法に関し、より詳しくは、下記の発明を提供するものである。
（１） 下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするコラーゲン合成阻害剤。
（ａ）Gly-Arg-Gly-Xｎ-Pro（配列番号：１）
（Xnは、1若しくは数個のアミノ酸を示す）
（ｂ）Gly-Pro-Ala（配列番号：２）
（ｃ）Gly-Pro（配列番号：３）
（２）  Xnが、Glu,Ser,Thr,Aspからなる群より選択される２種のアミノ酸からなるジペプチドである、（１）に記載のコラーゲン合成阻害剤。
（３）Xnが、Glu-Ser、Asp-Ser、およびAsp-Thrからなる群より選択されるジペプチドである、（１）に記載のコラーゲン合成阻害剤。
（４）  線維化による疾患の予防または治療のための医薬である、（１）から（３）のいずれかに記載のコラーゲン合成阻害剤。
（５）  線維化による疾患が、肥厚性瘢痕、瘢痕拘縮、ケロイド症、膠原病、肺線維症、糖尿病性腎症、繊維性癒着、および肝硬変からなる群より選択される、（４）に記載のコラーゲン合成阻害剤。
（６）コラーゲン合成阻害剤の製造方法であって、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを薬理学上許容される担体と混合する工程、を含む方法。
（ａ）Gly-Arg-Gly-Xｎ-Pro（配列番号：１）
（Xnは、1若しくは数個のアミノ酸を示す）
（ｂ）Gly-Pro-Ala（配列番号：２）
（ｃ）Gly-Pro（配列番号：３）
（７）Xnが、Glu,Ser,Thr,Aspから選択される２種のアミノ酸からなるジペプチドである、（６）に記載の製造方法。
（８）Xnが、Glu-Ser、Asp-Ser、およびAsp-Thrからなる群より選択されるジペプチドである、（６）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、グリシン、プロリンを含有する短鎖ペプチドを有効成分とするコラーゲン合成阻害剤およびその製造方法が提供された。本発明のコラーゲン合成阻害剤は、細胞の増殖には影響を与えずコラーゲン合成のみを特異的に抑制するため、安全性が極めて高く、コラーゲンの蓄積を示す疾患、特に肥厚性瘢痕、ケロイド症、膠原病、肺線維症、糖尿病性腎症、肝硬変等の線維化疾患の予防または治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、グリシン、プロリンを含有する短鎖ペプチドを有効成分とするコラーゲン合成阻害剤を提供するものである。本発明の「コラーゲン合成阻害剤」は、医薬であってもよく、研究のための試薬であってもよいが、好ましくは上記コラーゲンの蓄積を示す疾患の治療またや予防のための医薬である。
【０００８】
本発明のコラーゲン合成阻害剤の好ましい態様において、グリシン、プロリンを含有する短鎖ペプチドは、下記の一般式からなるアミノ酸配列を含むペプチドである。
Gly-Arg-Gly-Xｎ-Pro（配列番号:1）
ここで、Xnは、1若しくは数個のアミノ酸である。例えば、10以下、5以下、3以下の鎖長のアミノ酸であり、最も好ましくは2の鎖長のアミノ酸である。Xnのアミノ酸の種類は、短鎖ペプチドのコラーゲン合成抑制活性に阻害的に機能しない限り特に制限はない。好ましくはGlu,Ser,Thr,Aspから選択されるアミノ酸である。
本発明のコラーゲン合成阻害剤として特に好ましいペプチドとしては、例えば、Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro（配列番号:4）Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro（配列番号:5）、Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro（配列番号:6）、Gly-Pro-Ala（配列番号:2）、Gly-Pro（配列番号:3）が挙げられる。
このように本発明のペプチドは、短鎖で低分子量であるため、経皮的に吸収させることができるという大きな利点があり、さらに、アレルギーを生じにくく、体内や血中において害になりにくいという利点をも有する。
【０００９】
本発明のコラーゲン合成阻害剤の有効成分である上記短鎖ペプチドは、一般的な医薬製剤の形態で用いることができる。製剤は通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて調製される。
【００１０】
この医薬製剤としては各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、外用剤、パップ剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来よりよく知られている各種のものを広く使用することができる。
その例としては、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カリシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。その例としては、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用できる。その例としては、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。カプセル剤は常法に従い通常有効成分化合物を上記で例示した各種の担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
注射剤として調製される場合、液剤、乳剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものをすべて使用でき、例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。なお、この場合等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有させることもできる。
【００１１】
本発明の医薬製剤中に含有されるべき有効成分化合物の量としては、特に限定されず広範囲から適宜選択されるが、通常製剤組成物中に約1〜70重量％、好ましくは約1〜30重量％とするのがよい。
【００１２】
本発明の医薬製剤の投与方法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じた方法で投与される。投与剤形としては、例えば静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射等用の注射剤、懸濁注射剤、凍結乾燥などの用時溶解型注射剤、座剤、経鼻剤等の経皮粘膜投与剤、あるいは錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤等の経口剤をあげることができる。これらの剤形の製剤化には、通常知られた方法が適用され、目的に応じて医薬品として許容される保存剤、安定化剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、剤皮、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、塑性剤、界面活性剤、無痛化剤等を含有させてもよい。
【００１３】
本発明の医薬製剤の投与量は、用法、患者の 年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常有効成分の量が、1日当り体重1kg当り、約0.01〜100mgの範囲程度とすることが好ましい。また、投与単位形態の製剤中には有効成分化合物が約1〜200mgの範囲で含有されることが好ましい。
【００１４】
本発明のコラーゲン合成阻害剤には、サイトカイン並びにロイコトリエンの合成を抑制する薬剤を含有する成分及びフィブリン糊等のケロイド形成抑制に有効な薬剤を併用することもできる。
【００１５】
本発明に併用可能なサイトカイン並びにロイコトリエンの合成を抑制する薬剤は、ウリナスタチン、メシル酸ガベキサート、メシル酸ナファモスタット、メシル酸カモスタット、サラゾスルファピリジン、メトロニダゾール、5ASA、プラウノトールなどから選択され、これらは容易に入手可能である。
例えば、ウリナスタチンは、ミラクリッドの商標で持田製薬株式会社より市販されている。メシル酸ガベキサートは、エフオーワイの商標で小野薬品工業株式会社より市販されている。メシル酸ナファモスタットは、フサンの商標で鳥居薬品株式会社より市販されている。メシル酸カモスタットは、フオイパンの商標で小野薬品工業株式会社より市販されている。サラゾスルファピリジンは、サラゾピリンの商標で株式会社ミドリ十字より市販されている。メトロニダゾールは、メトロニダゾールの商標で株式会社科薬より市販されている。5ASAは、メサラジンの商標で日清製粉株式会社より市販されている。プラウノトールは、ケルナックの商標で三共株式会社より市販されている。
【００１６】
本発明に併用可能なフィブリン糊は、フィブリノーゲン、フィブリノーゲン溶解液(例えば、アプロチニン液)、トロンビン、トロンビン溶解液(例えば、カルシウム液)から構成される。
フィブリン糊は、上述のフィブリノーゲンとトロンビンによるフィブリン生成反応を利用した二成分系の組織接着剤である。すなわち、フィブリノゲンは、トロンビンの作用を受けてフィブリンモノマーとなり、次第に重合してフィブリンポリマーを形成し、さらに血液凝固第XIII因子の作用により架橋形成され安定化フィブリン塊となる。
フィブリン糊は、外科手術の際の組織の接着・閉鎖を目的に幅広く使用されている。例えば、脳硬膜縫合部、胃切除後の縫合部、肝切離断端部、腸吻合部、血管や神経の吻合部、鼓膜形成部などに塗布され、塗布面にてフィブリンを生成し、固化することにより、体液や血液の漏出を防止する役割を果たす。フィブリン糊は、例えば、ボルヒールの商標により化学及血清療法研究所より販売されている。
【００１７】
本発明に併用可能なケロイド形成の抑制に有効な薬剤の使用は、例えば炎症性腸疾患の回腸肛門吻合術後に残存する直腸粘膜を含む吻合部周辺に塗布、または噴霧すればよい。また、ケロイド体質による吻合部狭窄、皮膚ケロイド形成などにも同様な使用方法で有用である。さらに、術前・術後にサイトカイン合成抑制剤もしくはステロイドを併用して静脈内もしくは動脈内に投与することで本願発明の薬剤の効果を助長することもできる。
本発明は既にケロイド抑制効果の知られている、ケトチフェンまたはその塩、ロベンザリット塩、DADA、シメチジンまたはパンテノールと併用することもできる。
【００１８】
本発明は、また、上記本発明のコラーゲン合成阻害剤の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、上記短鎖ペプチドを薬理学上許容される担体と混合する工程、を含む。短鎖ペプチドは、合成ペプチドでもよく、また組み換えペプチドでもよい。組み換えペプチドは、短鎖ペプチドをコードするDNAが導入された形質転換体を調製し、該形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培池から、発現させたペプチドを回収することにより調製することができる。
【００１９】
短鎖ペプチドをコードするDNAとしては、特に制限はなく、コドンの縮重を考慮した複数のDNAが含まれる。短鎖ペプチドをコードするDNAは、DNA合成機を利用して、合成により調製することができる。また、以下の方法に従って生物試料から調製することもできる。
【００２０】
例えば、まず、ヒトあるいはラットの組織好ましくは肝臓、あるいは、培養細胞株好ましくは肝臓由来の培養細胞株からRNAを単離し、RNAを鋳型としてcDNAを合成し、該cDNAを適当なプラスミドベクターに組み込む。次いで、得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換してcDNAライブラリーを調製し、cDNAライブラリーより目的のクローンを選択して、DNAを調製する。
ヒトあるいはラットの組織好ましくは肝臓、あるいは、培養細胞株好ましくは肝臓由来の培養細胞株からRNAを分離してcDNAライブラリーを作製する工程およびクローニングの工程は、バイオケミストリー［Biochemistry,18,5294(1977)］、特開平2-227075あるいは市販の実験書、例えば、遺伝子操作実験法（高木康敬編、講談社）、遺伝子マニュアル（高木康敬編、講談社）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第2版）等に記載された方法、あるいは市販のキットを用いて行うことができる。
ヒトあるいはラットの組織、好ましくは肝臓、あるいは、培養細胞株好ましくは肝臓由来の培養細胞株から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol.,154,3(1987)］、また全RNAからポリ(A)+RNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）］などがあげられる。また、ヒトあるいはラットの組織好ましくは肝臓、あるいは、培養細胞株好ましくは肝臓由来の培養細胞株からｍＲＮＡを調製するキットとして、ファースト・トラック・mRNA・アイソレーション・キット（Fast Track mRNA Isolation Kit;インビトロジェン社製）、クイック・プレップ・mRNA・ピュリフィケーション・キット（Quick Prep mRNA Purificatlon Kit；ファルマシア社製）などが挙げられる。
poly(A)+RNA或いはmRNAからのcDNAの合成法としては、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第2版）やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメント1-34等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プリアンプリフィケーション・システム・フォー・ファースト・ストランド・cDNA・シンセシス［Super ScriptTMPre amplification System for First Strand cDNA Synthesis；ライフテクノロジーズ社製(Life Technologles)］を用いる方法などがあげられる。
cDNAライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第2版）やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメント1-34等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・cDNA・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング（Super ScriptTMPlasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning、ライフテクノロジーズ社製）やザップ-cDNA・シンセシス・キット［ZAP-cDNA Synthesis Kit、ストラタジーン（Stratagene）社製］を用いる方法などがあげられる。
cDNAライブラリーからの本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAのクローニングは、例えば、オオタケらの報告したラットアルギナーゼをコードするDNA［J.Biol.Chem．263，2245，(1988)］やタキグチらの報告したヒトアルギナーゼをコードするDNA〔Nucleic Acid Res.，16，8789，(1988)〕をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル 第2版］を用いて選択される。
また、オオタケらの報告したラットアルギナーゼの塩基配列やタキグチらの報告したヒトアルギナーゼの塩基配列をもとにプライマーを調製し、poly(A)+RNAあるいはmRNAから合成したcDNAやcDNAライブラリーを鋳型として、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)法[モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第弐版）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメント1-34]により、本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAを調製することもできる。
このようにして単離した短鎖ペプチドをコードするDNAについて、その変異体を調製するには、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第2版）やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメント1-34等に記載された方法に従えばよい。
【００２１】
上記方法により選択されたcDNAクローンを、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript KS(+)（ストラタジーン社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばSangerらのジデオキシ法［Proc．Natl．Acad．Scl.,U.S.A.,74，5463(1977)］等によって分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。塩基配列の分析は、塩基配列自動分析装置、例えば373A・DNAシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社製）等を用いて行うことができる。
【００２２】
本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAを適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより、本発明の短鎖ペプチドを発現する形質転換体を得ることができる。
【００２３】
宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであれば、いずれでもよい。細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリクエファシネス（Bacillus amyloliquefaciens）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）等のエシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等の微生物が例示される。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等が例示される。動物細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞等が例示される。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵母細胞であるSf9、Sf21［バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル(Baculovirus Expression Vectors、A Laboratory Manual)、オレリー(Oreilly)、ミラー(Miller)、ルーコウ(Luckow)著、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W.H.Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、1992年版 （以下、バキュロウイル・スイクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアルと略記する）］、Trichoplusia niの卵細胞であり、ファーミンジェン（Pharmingen）社からHigh5として市販されているTn5等が例示される。
本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAを導入するベクターとしては、本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAを組み込むことができ、宿主細胞で発現できるものであればいかなるベクターでも用いることができる。
細菌、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を宿主として用いる場合には、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の短鎖ペプチドをコードするDNA、転写終結配列、場合によってはプロモーターの制御配列より構成されているのが好ましい。
発現ベクターとしては、例えば、pKYP10（特開昭58-110600）、pLSA1〔アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.),53,277，(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82,4306,(1985)〕pNS等が用いられる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、T7lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。Ptrpを2つ直列させたプロモーター（Ptrp×2）、tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等を用いてもよい。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列（以下、SD配列と略記する）と開始コドンの間を適当な距離（例えば、6〜18塩基）に調節して用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAの塩基配列を宿主での発現に最適なコドンとなるように、必要に応じて塩基を置換して用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl．Acad．Sci.，USA,69，2110-2114(1972)］、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）等、いずれの方法も用いられる。
酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Yep13（ATCC37115）、Yep24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）等が用いられる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよいが、、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal １プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα１プロモーター、CUP １プロモーター等があげられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法［Methods．Enzymol.,194，182-187(1990)］、スフェロプラスト法［Proc．Natl．Acad．Sci.，USA,84，1929-1933(1978)］、酢酸リチウム法［J．Bacteriol.,153，163-168(1983)］等、いずれの方法も用いられる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pAGE107〔特開平3-22979；サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133,(1990)〕，pAS3-3（特開平2-227075），pAMoERC3Sc，pcDM8〔ネイチャー(Nature),329,840，(1987)〕、pcDNAＩ/Amp、pcDNAＩ（いずれもフナコシ社製）等が用いられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいかなるものを用いてもよいが、例えば、ヒトサイトメガロ・ウィルス(CMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40あるいはメタロチオネインのプロモーター等があげられる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology，3，133(1990)］、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法［Proc．Natl．Acad．Sci.，USA,84，7413(1987)］等、いずれの方法も用いられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメント1-34、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。すなわち、以下に述べる組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得たのち、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質発現昆虫細胞を取得する。
遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（いずれもインビトロジェン社製）等が用いられる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)などが用いられる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法［Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，84，7413（1987）］等が用いられる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産、融合タンパク質発現等が開発されており、いずれの方法も用いることができる。例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）に記載されている方法に準じて行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、エキソあるいはエンドグリコシダーゼによる糖あるいは糖鎖が付加された本発明の短鎖ペプチドを得ることができる。
【００２４】
なお、本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAを組み込むためのプラスミドベクターとしては、本発明の短鎖ペプチドをコードするDNAを組み込めるプラスミドベクターであればいかなるものでも用いることができ、例えば、本発明の短鎖ペプチドの一つの態様であるヒトアルギナーゼの発現プラスミドベクターであるpNS-hArg1や、他の態様であるラットアルギナーゼの発現プラスミドベクターであるpNS-rArg1があげられる。プラスミドベクターpNS-hArg1を含む大腸菌であるEscherichia coli BL21/pNS-hArg1とプラスミドベクターpNS-rArg1を含む大腸菌であるEscherichia coli BL21/pNS-rArg1は、平成8年7月24日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東1丁目１番3号）にそれぞれFERM BP-5605およびFERM BP-5606として寄託されている。
【００２５】
以上のようにして得られる形質転換体を培養し、培養物中に本発明の短鎖ペプチドを生成蓄積させ、該培養物から回収することにより、本発明の短鎖ペプチドを製造することができる。
【００２６】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００２７】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、糖蜜、デンプン、デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体またはその消化物等が用いられる。
無機物としては、りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下、15〜40℃で16〜96時間行う。培養期間中、pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
培養中は必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lac プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trp プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常5％二酸化炭素存在下、35〜37℃で3〜7日間行い、培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地［ファーミンジェン（Pharmingen）社製］、Sf900IISFM［ライフテクノロジーズ（Life Technologies）社製］、ExCell400、ExCell405［いずれもJRHバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）社製］等が用いられる。培養は、25〜30℃で1〜4日間行い、培養中は必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の短鎖ペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合または細胞内に不溶体を形成した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離し、水系緩衝液にけん濁後、超音波法、フレンチプレス法などにより細胞を破砕し、その遠心分離上清に本発明のコラーゲン合成阻害ポリペプチドを回収する。
さらに、細胞内に不溶体を形成した場合には、不溶体をタンパク質変性剤で可溶化後、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、或いは透析し、タンパク質の立体構造を形成することができる。
本発明の短鎖ペプチドあるいはそれらの糖あるいは糖鎖付加体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に本発明の短鎖ペプチドあるいはそれらの糖あるいは糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。
【００２８】
単離精製については、溶媒抽出、有機溶媒による分別沈殿、塩析、透析、遠心分離、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行うことができる。
【００２９】
精製後のタンパク質は新生化学実験講座、第１巻タンパク質II、一次構造（千谷晃一ら、東京化学同人）に記載されている方法に従って一次構造解析することができる。例えば自動アミノ酸配列分析装置を用いてＮ末端アミノ酸配列を決定したり、トリプシン等のプロテアーゼによってタンパク質を加水分解後に得られたペプチド断片を質量分析装置や自動アミノ酸配列分析装置を用いてアミノ酸配列を決定することができる。決定したアミノ酸配列はPIR-インターナショナル・プロテイン・シークエンス・データベース(PIR-International Protein Sequence Database)［プロテイン・アイデンティフィケイション・リソース(Protein Identification Resource)］等のプロテインデータベース内のアミノ酸配列と相同性検索を行うことにより帰属できる。
【００３０】
本発明の短鎖ペプチドを糖、糖鎖、多価化糖複合体あるいは高分子物質などで修飾することもできる。糖、糖鎖あるいは多価化糖複合体の修飾体の調製方法には、糖タンパク質として動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞等により生産する方法や、あらかじめ糖、糖鎖あるいは多価化糖複合体を調製し、酵素的あるいは化学的に付加する方法などがあげられる。
糖および糖鎖を調製する方法としては、化学合成による方法、多糖を分解する方法、糖タンパク質から糖鎖を遊離し必要に応じて特定の構造の糖あるいは糖鎖を精製する方法等がある。また、多価化糖複合体を調製する方法としては、糖あるいは糖鎖をオリゴあるいはポリリジン等の多価化担体に結合する方法がある［ジャーナル・オブ・ドラッグ・ターゲッティング(以下Ｊ．Drug Targettingと略記する)，3，111，(1995)］。
得られた糖、糖鎖、あるいは多価化糖複合体は糖転移酵素等を利用して付加することもできる。また、例えば、ジアゾカップリング法、イソチオシアネートカップリング法、グアニジネーション法、アミジネーション法等を利用して付加することもできる。ジアゾカップリング法およびイソチオシアネートカップリング法では、タンパク質のチロシン、フェニルアラニンのベンゼン環やヒスチジンのイミダゾール基に結合できる。グアニジネーション法およびアミジネーション法ではリジン側鎖のアミノ基やタンパク質Ｎ末端のアミノ基に結合できる［J．Drug Targetting，3，111,(1995)］。
高分子物質としては、抗原性、毒性が低いものであればいかなるものでもよい。例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アルブミン、ガンマーグロブリン、ポリアミノ酸、スチレンマレイン酸共重合体、抗体等があげられる（医薬品の開発第13巻薬物送達法、広川書店、1989年）、（稲田祐二編、タンパク質ハイブリッド−ここまできた化学修飾−、共立出版、1987年）。
高分子物質あるいは多価化糖複合体の修飾方法としては、酸アミド結合法、チオアミド結合法、エステル結合法、ジスルフィド結合法、ジアゾ結合法、アルキル化法、トリアジン環を介した結合法、イソ尿素結合法、イミドカルボン酸結合法、カルバミル酸結合法等が開発されており（稲田祐二編、タンパク質ハイブリッド−ここまできた化学修飾−、共立出版、1987年）、（千畑一郎編、固定化生体触媒、講談社、1986年）、（大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、蛋白質の化学修飾＜上＞＜下＞、瓜谷郁三、志村憲助、中村道徳、船津勝編、生物化学実験法12、学会出版センター、1981年）、いずれの方法も用いることができる。また、高分子物質と本発明のコラーゲン合成阻害ポリペプチドを架橋剤を介して上記の結合法により結合することもできる（千畑一郎編、固定化生体触媒、講談社、1986年）、（大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、蛋白質の化学修飾＜上＞＜下＞、瓜谷郁三、志村憲助、中村道徳、船津勝編、生物化学実験法12、学会出版センター、1981年）。
さらに、糖修飾した高分子物質を本発明の短鎖ペプチドに結合することもできる。本発明の短鎖ペプチドはいかなる方法で分子間架橋してもよい。例えば、千畑一郎編、固定化生体触媒、講談社（1986年）に記載されている方法に準じて行うことができる。
本発明の短鎖ペプチドを糖、糖鎖、多価化糖複合体あるいは高分子物質などで修飾することもできる。糖、糖鎖あるいは多価化糖複合体の修飾体の調製方法には、糖タンパク質として動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞等により生産する方法や、あらかじめ糖、糖鎖あるいは多価化糖複合体を調製し、酵素的あるいは化学的に付加する方法などがあげられる。
糖および糖鎖を調製する方法としては、化学合成による方法、多糖を分解する方法、糖タンパク質から糖鎖を遊離し必要に応じて特定の構造の糖あるいは糖鎖を精製する方法等がある。また、多価化糖複合体を調製する方法としては、糖あるいは糖鎖をオリゴあるいはポリリジン等の多価化担体に結合する方法がある［ジャーナル・オブ・ドラッグ・ターゲッティング(以下Ｊ．Drug Targettingと略記する)，3，111，(1995)］。
得られた糖、糖鎖、あるいは多価化糖複合体は糖転移酵素等を利用して付加することもできる。また、例えば、ジアゾカップリング法、イソチオシアネートカップリング法、グアニジネーション法、アミジネーション法等を利用して付加することもできる。ジアゾカップリング法およびイソチオシアネートカップリング法では、タンパク質のチロシン、フェニルアラニンのベンゼン環やヒスチジンのイミダゾール基に結合できる。グアニジネーション法およびアミジネーション法ではリジン側鎖のアミノ基やタンパク質N末端のアミノ基に結合できる［J．Drug Targetting，3，111,(1995)］。
高分子物質としては、抗原性、毒性が低いものであればいかなるものでもよい。例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アルブミン、ガンマーグロブリン、ポリアミノ酸、スチレンマレイン酸共重合体、抗体等があげられる（医薬品の開発第13巻薬物送達法、広川書店、1989年）、（稲田祐二編、タンパク質ハイブリッド−ここまできた化学修飾−、共立出版、1987年）。
高分子物質あるいは多価化糖複合体の修飾方法としては、酸アミド結合法、チオアミド結合法、エステル結合法、ジスルフィド結合法、ジアゾ結合法、アルキル化法、トリアジン環を介した結合法、イソ尿素結合法、イミドカルボン酸結合法、カルバミル酸結合法等が開発されており（稲田祐二編、タンパク質ハイブリッド−ここまできた化学修飾−、共立出版、1987年）、（千畑一郎編、固定化生体触媒、講談社、1986年）、（大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、蛋白質の化学修飾＜上＞＜下＞、瓜谷郁三、志村憲助、中村道徳、船津勝編、生物化学実験法12、学会出版センター、1981年）、いずれの方法も用いることができる。また、高分子物質と本発明のコラーゲン合成阻害ポリペプチドを架橋剤を介して上記の結合法により結合することもできる（千畑一郎編、固定化生体触媒、講談社、1986年）、（大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、蛋白質の化学修飾＜上＞＜下＞、瓜谷郁三、志村憲助、中村道徳、船津勝編、生物化学実験法12、学会出版センター、1981年）。
さらに、糖修飾した高分子物質を本発明の短鎖ペプチドに結合することもできる。本発明の短鎖ペプチドはいかなる方法で分子間架橋してもよい。例えば、千畑一郎編、固定化生体触媒、講談社（1986年）に記載されている方法に準じて行うことができる。
本発明の短鎖ペプチドおよびそれらの修飾体は、生体組織の繊維化を抑制するのに有効である。本発明の短鎖ペプチドあるいはそれらの修飾体を医薬として使用する際には、上述したように、薬理学上許容される担体と混合し、投与形態に応じた種々の剤形で使用することができる。
【発明の好ましい実施の形態】
【００３１】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。
【００３２】
[実施例１]   パップ剤の製造
ソルビトール32.9ｇを予製剤１とし、ゼラチン2gとPVA（ポリビニルアルコール）1gを水13gに加え加熱溶解したものを予製剤2とする。別に、グリセリン23ｇにメタケイ酸アルミン酸マグネシウム1.2gとCMC-Na（カルボキシメチルセルロースナトリウム）1.0gおよびポリアクリル酸デンプン・アクリル酸共重合体1.1gとポリアクリル酸ナトリウム3gを加え充分分散させたものを予製剤3とした。予製剤4としてミリスチン酸イソプロピル2g、ソルビン酸脂肪酸エステル1g、ｌ−メントール0.3gの混合物を、そして予製剤5としてメトキシエチレン無水マレイン酸共重合体0.4gを水5gに溶解したものを、さらに予製剤6としてモノラウリン酸ポリエチレングリコール0.6gと本発明のペプチドGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro 0.5gを水12gに溶解したものを調製した。予製剤1に予製剤2、予製剤4、予製剤5、予製剤6を加えた後、予製剤3を加え30分間ニーダ中で撹拌混合する。これを展延しパップ剤とした。
【００３３】
[実施例２]   ゲル剤の製造
クエン酸0.3gとカルボキシビニルポリマー5gを水100gに加え加温溶解したもの30gに、エタノール30g、プロピレングリコール3g、水31.2g、本発明のペプチドGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro 0.5gを加えたのち、10％の水酸化ナトリウム液を適量加えてゲル化しゲル剤とした。
【００３４】
[実施例３]   クリーム剤の製造
製剤1としてソルビタンセスキオレエート3.0g、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油0.2g、流動パラフィン10.0g、パルミチン酸イソプロピル5.0g、ワセリン1.0g、パラヒドロキシ安息香酸プロピル0.1g、レシノール0.5g、本発明のペプチドGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro 0.5gを加温溶解した。予製剤2としてパラヒドロキシ安息香酸メチル0.1g、硫酸マグネシウム0.5g、グリセリン5.0gを加温溶解した。予製剤2を予製剤1に加え精製水で全量を100gにし、ホモミキサーにて5000rpmで10分間撹拌した後、通常撹拌で35℃まで撹拌しクリーム剤とした。
【００３５】
[実施例４]   軟膏剤の製造
予製剤1としてソルビタンセスキオレエート5.0g、ポリオキシセチルエーテル0.5g、セタノール6.0g、ミツロウ3.0g、ワセリン35.0g、パラヒドロキシ安息香酸プロピル0.1g、本発明のペプチドGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro 0.5gを加温溶解した。
また、予製剤2としてパラヒドロキシ安息香酸メチル0.1g、EDTA-2Na（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）0.2gを適量の精製水で加温溶解した。予製剤2を予製剤1に加えて撹拌し、精製水を加えて全量を100gにした後、40〜45℃で放置し軟膏剤とした。
【００３６】
[実施例５]   ローションの製造
ステアリルアルコール2.1gを水浴上で溶かし、これに5.5gのスパン20および流動パラフィン40gを加えて70℃に加温する。パラヒドロキシ安息香酸メチル0.025gとパラヒドロキシ安息香酸プロピル0.015gを沸騰水中に溶かし、ツイン20を5.5gおよびラウリン硫酸ナトリウム1.0g、本発明のペプチドGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro 0.5gを加えて溶解し70℃に加温する。油相中に水相を加え、精製水で全量を100mlとし45℃に冷えるまで撹拌しローションとした。
【００３７】
[実施例６]   テープ剤の製造
アクリル共重合体樹脂粘着剤88.3g、水1.0g、本発明のペプチドGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro 0.5g、エマゾール0.2g、モノラウリン酸ポリエチレングリコール1.0g、クロタミトン2.0g、ｌ−メントール1.0g、グリセリン6.0g、被験薬0.5gを混合して展延しテープ剤とした。
【００３８】
[実施例７]   錠剤の製造
本発明のペプチドGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Proを5mgデンプン 132mgマグネシウムステアレート 18mg乳糖 45mg計 200mg常法により、1錠中に上記組成を含有する錠剤を製造した。
【００３９】
[実施例８]   注射剤の製造
本発明のペプチドGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Proを 500mg、ポリエチレングリコール（分子量：4000） 0.3g、塩化ナトリウム 0.9g、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート 0.4gメタ重亜硫酸ナトリウム 0.1gメチル−パラベン 0.18g、プロピル−パラベン 0.02g、注射用蒸留水 100ml上記パラベン類、メタ重亜硫酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを撹拌しながら80℃で上記の約半量の蒸留水に溶解させる。得られた溶液を40℃まで冷却し、本発明化合物、次いでポリエチレングリコール及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを、上記溶液中に溶解させ、次にその溶液に注射用蒸留水を加えて最終の容量に調製し、適当なフィルターペーパーを用いて滅菌濾過して1mlずつアンプルに分注し、注射剤を調製した。
【００４０】
[実施例９]  コラーゲン合成量の測定
コラーゲン合成量は非プロテアーゼコラゲナーゼ測定法により測定した。
ヒト表皮線維芽細胞を用いて被験薬の線維芽細胞のDNA合成に及ぼす影響を調べた。ヒト表皮由来継代24次線維芽細胞を下表の被験薬と10％子牛血清を添加したダルベコスミニマルエッセンシャル培養液（GIBCO）で23時間培養後、細胞は10μCi/molの3H-プロリン(96Ci/mmol,アマシャム社製)又は25μCi/molの35S-メチオニン(1148Ci/mmol,ICNバイオメディカル社製)で23時間処理された。その後β-アミノプロピオニトリル（50μg/ml）、アスコルビン酸（50μg/ml）、2％子牛血清を添加し培養した。培養後、培養液と細胞抽出物を分離し、細胞抽出物を10mMHClで37℃、100分処理したのちNaOHでpHを中性にした。サンプルの半分に50mMトリス、10mMCaアセテート、pH7.2を1ml添加し37℃で3時間非プロテアーゼコラゲナーゼ（III型、5BTC  units/ml、アドバンスドバイオファクチャーズ社製）で処理した。他方のサンプルにはこのコラーゲナーゼ処理を行わなかった。コラゲナーゼ処理溶液とコラゲナーゼ無処理溶液にはそれぞれ子牛血清アルブミン（最終濃度、0.25mg/ml）が加えられた。この両方のサンプル溶液はおのおの総コラーゲン量が測定された。総プロテイン合成量、総コラーゲン合成量（コラゲナーゼ感受性プロテイン量）がそれぞれ総放射性活性として測定された。
その結果を表1と2に示す。この結果より本発明の被験薬は、コラーゲン合成のみを特異的に阻害しその他の細胞由来のタンパク質の合成には影響を与えないことが示された。
【００４１】
[表１]
培養液中の総コラーゲン合成量                  （単位：1ｘ10cpm）
無添加コントロール                                  1935
Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro                              547
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro                              508
Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro                              492
【００４２】
[表２]
培養液中の総プロテイン合成量                  （単位：1ｘ10cpm）
無添加コントロール                                   3901
Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro                              3936
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro                              3824
Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro                              3982
【００４３】
[実施例１０]  線維芽細胞増殖試験
ヒト表皮線維芽細胞を用いて被験薬の線維芽細胞の増殖に及ぼす影響を調べた。ヒト表皮由来継代24次線維芽細胞を下表の被験薬と10％子牛血清を添加したダルベコスミニマルエッセンシャル培養液（GIBCO）で48時間培養した。次に被験薬無添加の培養液で24時間培養した。
この培養細胞を3mg/ml濃度のタイプI、シグマ社製コラゲナーゼで150mM NaCl，10mM Caアセテートを添加し、pH7.2、温度37℃の条件下で100分間処理し細胞を分離した。分離された細胞を0.05％トリプシン（GIBCO）と0.53mMのEDTAを添加し37℃で20分間処理した。処理した細胞サンプルはトリパンブルー染色され細胞数を測定した。
その結果を以下の表3にまとめた。
表3から明らかなように、被験薬を投与してもコントロールと線維芽細胞増殖に変化はなく本発明の被験薬の線維芽細胞に対する安全性が確認された。
【００４４】
[表３]
細胞数(×103個／well)
コントロール                43.63
Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro     44.26
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro     41.76
Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro     42.46
Mean n=3
【００４５】
[実施例１１]  DNA合成量の測定
ヒト表皮線維芽細胞を用いて被験薬の線維芽細胞のDNA合成に及ぼす影響を調べた。ヒト表皮由来継代線維芽細胞を下表の被験薬と10％子牛血清を添加したダルベコスミニマルエッセンシャル培養液（GIBCO）で21時間培養後、細胞は5μCi/molの3H-チミジン(40Ci/mmol,ICNバイオメディカル社製)で３時間処理された。処理後培養液は取り除かれ細胞はPBS(-)で2回洗浄された。この培養細胞を3mg/ml濃度のタイプI、シグマ社製コラゲナーゼで150mM NaCl，10mM Caアセテートを添加し、pH7.2、温度37℃の条件下で100分間処理し細胞を分離した。分離した細胞を4℃で10％TCAで3回洗浄した後、Budget-Solve（リサーチプロダクトインターナショナル社製）中でベックマンシンチレーションスペクトロメーターにより放射性活性が測定され細胞分裂数を比較した。
その結果を以下の表4にまとめた。表から明らかなように、被験薬を投与してもDNA量に有意な差はなくコントロールに比較し線維芽細胞分裂数に変化はなかった。
【００４６】
[表４]
（単位：1ｘ10cpm）
無添加コントロール                         19862
Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro                    19923
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro                    19831
Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro                    19870
【００４７】
[実施例１２]  コラーゲンゲル萎縮抑制試験
コラーゲンゲルの萎縮試験を行ない、表2の被験薬のコラーゲンゲルの萎縮に及ぼす影響を検討した。30％コラーゲン液と10倍濃度の培地と緩衝液の混液を6穴のマルチウエルプレート（1穴9.6cm2） に2mlずつ分注し、恒温槽（37℃，5％CO2 ）中で約１時間加温してコラーゲンゲルを作成した。各試験薬は、濃度を4mM、2mM、1mM、0.5mMに調製し、この液1mlを１穴に分注した。
次に線維芽細胞の浮遊液（3×104個/mｌ） を1mlずつ１穴に分注し（濃度はそれぞれ2mM、1mM、0.5mM、0.25mMとなる）、3日後に培地を通常培地と取り替え、7日後にコラーゲンゲルの大きさを測定した。結果を後記表5に示す。表5より、被験薬を添加した群ではコラーゲンゲルの萎縮が抑制された。
【００４８】
[表５]
萎縮面積(cm2)
被験薬濃度              0.25mM      0.5mM      1.0mM        2.0mM
コントロール            10.5
Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro 5.34       3.29±0.65 1.75±0.19    1.77±0.85
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro 3.92±1.65 2.37±1.62 0.52±0.23    0.67±0.29
Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro 2.52±1.58 2.62±0.49 2.78±1.74    1.85±0.47
【００４９】
[実施例１３]  切創傷モデル
皮膚切創傷モデルを用いてゲル剤の効果を検討した。ゲル剤としては、表3の各被験薬を0.5％の濃度で含む実施例2のゲル剤を用いた。
8週齢のWistar系雄性ラットの背部皮膚を電気バリカンで刈毛した後、アルコール綿で消毒後、外科用メスで正中線に沿って3.4cm切開した。切開創の中央部およびそこから1cm頭部側および尾部側の計3箇所で縫合を施し、3日後に縫合を除去した。
各被験薬を0.5％の濃度で含むゲル剤を作成し、皮膚切創作成の翌日から午前と午後の2回、それぞれ0.1gずつ塗布した。皮膚切創作成の4日後に、切創部の中央2cmを含む皮膚を長さ3cmの短冊型に取り、片側を固定して牽引し、レオメータで切創が開裂に要する重量、すなわち創耐張力を測定する。
その結果を表6に示した。無塗布の群に比べ、ゲル剤を塗布した群で有意な創耐張力の減少が認められた。
[表６]
被験薬剤 創耐張力(g)
無塗布 152.6±25.2
Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro 71.3±12.3＊
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro 84.4±32.4＊
Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro 85.9±26.9＊
Mean±S.E.        n=6
＊：p<0.05  無塗布との比較  t検定
【００５０】
[実施例１４]  ラット肝臓伊東細胞のコラーゲン合成に対する抑制効果
伊東細胞は、Pinzani,M.ら（J.clin.Invest.84,1786-1793(1989)）の方法に基づきラット肝臓より採取した。即ち、SD系ラットの肝臓門脈よりコラゲナーゼ添加培養液（HBSS-Ca,-Mg液）を還流し、肝臓を細切後肝細胞を分離した。細胞は洗浄後、Ficol（比重1.053）液に重層し20000回転にて遠心し、上層より伊東細胞を分離した。
細胞は培養液（Waymouth's MB752 ＋10％馬血清＋10％牛血清）にて培養10日後、試験に供した。細胞は1×105/mlにて48ウェルのプレートにまかれた。24時間後、培養液をD-MEM＋5.0％胎児牛血清に交換した。グリシン、アルギニン、プロリンを含有するペプチドであるGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro（以下「本発明化合物」という）（対照はジメチルスルホキシド）及び3H-プロリンを添加し、更に２４時間培養した。培養後、培養液及び細胞中の蛋白を分離し、その蛋白をコラゲナーゼにより処理した。コラゲナーゼにより分解した蛋白の3H-プロリン量をコラーゲンとみなし、対照を100％として本発明化合物のコラーゲン合成阻害効果を求めた。その結果、本発明化合物は60μMで55.6％のコラーゲン合成阻害効果を示した。
【００５１】
[実施例１５]  ニトロソジメチルアミン（NDMA）による肝硬変モデルにおける本発明化合物の効果
肝硬変モデルは Baraona,E.ら（Life sci.52:1249-1255(1993)）の方法により作製した。即ち、SD系ラット（雄、7週令）にNDMAを10mg/kgの用量で腹腔内に週３回投与した。本発明化合物は1％カルボキシメチルセルロースに懸濁し、20mg/kgの用量で1日2回投与した。ラットは各群13匹とした。3週間後ラットを採血後、肝臓を摘出した。摘出した肝臓は組織評価のために、ホルマリンで固定した後、アザン（Azan）染色を行った。
また、血清GOT値、GPT値を求めた。結果を表7に示す。
[表７]
GOT（U/ml）  抑制率（％）  GOT（U/ml）  抑制率（％）  
正常ラット                    79±4                      35±5
NDMAラット（対照）          825±45                    210±35
本発明化合物投与ラット      453±34      45.1           121±15      42.3
表7から、本発明化合物は20mg/kg×2回の用量で、肝臓障害の指標であるGOT値、GPT値の上昇を抑制し得ることが判る。
また、肝臓組織中のコラーゲン量を次の基準に従って分類、評価した。
スコア0：正常
スコア1：コラーゲン線維が肝小葉周囲に僅かに蓄積
スコア2：コラーゲン線維が肝小葉周囲に少量蓄積
スコア3：コラーゲン線維が肝小葉周囲にやや顕著に蓄積
スコア4：コラーゲン線維が肝小葉周囲に顕著に蓄積結果を下記表８に示す。
【００５２】
[表８]
肝繊維化スコア          抑制率（％）
NDMAラット（コントロール）              1.81±0.1
本発明化合物投与ラット                  1.29±0.4              28.7
（Mean±S.E.）  
表8から、本発明化合物は組織評価でも肝線維化の抑制効果が認められることが判る。以上のことから、本発明化合物は、伊東細胞におけるコラーゲン合成の抑制効果を示し、またラットの肝硬変モデルにおいても血清GOT、GPT値を改善し、肝コラーゲンの沈着を抑制したことから、肝硬変を始めとする繊維化疾患の予防乃至治療に有効であると考えられた。
【００５３】
[実施例１６]  手術を行なった患者における本発明の短鎖ペプチドの効果
患者(46才、男性)は、交通事故外傷により左足背に裂創を受傷、緊急手術で縫合を行なうも、術後創部の感染を起し、治癒後創部に肥厚性瘢痕の形成が認められた。瘢痕部に本発明の短鎖ペプチド0.5gを含むクリームを肥厚性瘢痕に塗布した。経過観察を行なっているが、3カ月経過し、肥厚性瘢痕には明らかに消退傾向が認められ。改善した。
【配列表】
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