(57)【要約】      （修正有）【課題】簡単かつ高い確率でタンパク質結晶の重原子誘導体を作製し得る方法、位相情報の収集方法及びタンパク質結晶の三次元構造決定方法を提供する。【解決手段】タンパク質結晶にヨウ素を作用させて、タンパク質結晶の重原子誘導体を作製する方法。気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させて重原子誘導体を作製する。この方法により作製されたタンパク質結晶のヨウ素による重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報を収集する方法。この方法により収集した重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質結晶にヨウ素を作用させて、タンパク質結晶の重原子誘導体を作製する方法であって、
気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させて重原子誘導体を作製することを特徴とする方法。
【請求項２】
ヨウ素をヨウ素含有水溶液から気化させる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ヨウ素を固体ヨウ素から気化させる請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
タンパク質結晶の重原子誘導体化の程度を、タンパク質結晶の気化ヨウ素による着色の程度で評価する請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により作製されたタンパク質結晶のヨウ素による重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報を収集する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により収集した重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヨウ素を用いる重原子誘導体の製造方法、この製造方法により得られた重原子誘導体を用いる位相情報の収集方法、さらに、この方法により収集された位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、各種生物のＤＮＡの塩基配列が急速に明らかにされ、ゲノム配列情報から遺伝子の塩基配列が明らかにされている。そして、各遺伝子でコードされたタンパク質の立体構造を体系的に解明し、構造と機能の関係を明確にしようとする試みがなされている。タンパク質のような生体高分子の立体構造（三次元構造）は、生体高分子を結晶化し、Ｘ線回折試験に付すことにより解析される。
【０００３】
タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法として、タンパク質の重原子誘導体を作製し、この重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、位相情報を収集し、この位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定することが行われている。
【０００４】
タンパク質の重原子誘導体の作製には、白金、水銀、金などの重原子化合物溶液にタンパク質結晶を浸積（ソーキング）する方法が一般的である（特開２００２−２６２８６７号公報、特許文献１）。しかし、どの種類の重原子化合物がタンパク質結晶中に効果的に結合するかは、重原子試薬の種類、濃度、時間などのパラメーターを変化させつつ、基本的には試行錯誤するしかない。
【０００５】
また、重原子化合物としてヨウ素を用いる方法も知られている（Acta Cryst.(2002). D58, 976-991、非特許文献1）。ヨウ素を用いる方法では、ヨウ素溶液をタンパク質結晶に直接加えることにより、ヨウ素ラベルされた結晶を作製することは行われてきた。しかし、ヨウ素（ヨウ化カリウムKIと固体ヨウ素I2の水溶液）はタンパク質に対して非常に反応性が高く、ヨウ素溶液を加えた瞬間にタンパク質結晶が崩壊して、その後の解析に使えなくなる傾向があった。
【０００６】
上記方法では、崩壊を防ぐためにはヨウ素溶液の濃度を薄くしたり、加える量を少なくすることなどが効果があるものの、ヨウ素溶液を加えて結晶に導入されるヨウ素は、主にI3-やI5-またはIn-等の分子構造をとっており、分子体積が大きい状態にあり、結晶浸透時に結晶にダメージを与え易い傾向があった。また、ポリヨウ素分子イオンは鎖状分子構造をとっているが、この状態で結晶中に結合した異常分散因子は、位相計算の際に温度因子が大きくなりやすく、十分な位相情報を与えにくいという更に本質的な欠点を持つ。
【特許文献１】特開２００２−２６２８６７号公報
【非特許文献１】Acta Cryst.(2002). D58, 976-991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、簡単かつ高い確率でタンパク質結晶の重原子誘導体を作製し得る方法を提供することにある。
さらに本発明の目的は、この方法を用いて作製したタンパク質結晶の重原子誘導体を用いた、位相情報の収集方法及びタンパク質結晶の三次元構造決定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［請求項１］タンパク質結晶にヨウ素を作用させて、タンパク質結晶の重原子誘導体を作製する方法であって、
気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させて重原子誘導体を作製することを特徴とする方法。
［請求項２］ヨウ素をヨウ素含有水溶液から気化させる請求項１に記載の製造方法。
［請求項３］ヨウ素を固体ヨウ素から気化させる請求項１に記載の製造方法。
［請求項４］タンパク質結晶の重原子誘導体化の程度を、タンパク質結晶の気化ヨウ素による着色の程度で評価する請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
［請求項５］請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により作製されたタンパク質結晶のヨウ素による重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報を収集する方法。
［請求項６］請求項５に記載の方法により収集した重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ヨウ素溶液（またはヨウ素固体）中からヨウ素分子気化する性質を利用し、非常に高い確率で効果的な重原子誘導体を作製することができる。そして、この方法で作製した重原子誘導体を用いることで、 単一波長異常分散法 (SAD法)、多波長異常分散法 (MAD法)、多重同型置換法 (MIR法)等の方法による、結晶構造解析に費やす時間を大幅に短縮化することができる。
【００１０】
目的とするタンパク質結晶が沈殿剤由来の低分子結晶か判断つかないことがあるが、原則として低分子結晶にはヨウ素は浸透しない。従って、Ｘ線回折実験を行う前に、着色の有無により、タンパク質結晶であるか否かを判断することができる。
【００１１】
ヨウ素溶液を直接タンパク質結晶に加える方法と異なり、本発明の方法では、ヨウ素溶液をタンパク質結晶の近傍に置くだけであるので、充分なヨウ素が導入されたと判断された段階でヨウ素溶液を取り除くことにより、ヨウ素の導入を停止することができ、過剰量のヨウ素が導入されて結晶が崩壊する危険を回避することができる。また、ヨウ素の導入が不足していると判断された場合は、再度、ヨウ素溶液をタンパク質結晶の近傍に配置し、ヨウ素の導入を再度行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法では、従来法であるヨウ素溶液を直接結晶に加える方法と異なり、ヨウ素が２原子分子であるI2の状態で結晶中に導入されるため温度因子が上がりにくく、位相計算の際に十分な位相情報が得られる確率が高くなる。また、I2は気化によって結晶に導入されるため、ヨウ素溶液の濃度、分量、周囲の温度等のパラメーターを変化させることによって自由に結合速度を調節して、結晶へのダメージを最小化することが容易に可能である。また、ヨウ素が結晶に結合した割合を、ヨウ素置換に伴って徐々に結晶が無色→黄色→茶色に変色していく現象を利用して、容易に追跡することが可能であることも、本発明の方法の大きな特徴である。
【００１３】
[タンパク質結晶の重原子誘導体作製方法]
本発明のタンパク質結晶の重原子誘導体作製方法は、タンパク質結晶にヨウ素を作用させて、タンパク質結晶の重原子誘導体を作製する方法であって、気化したヨウ素をタンパク質結晶に作用させて重原子誘導体を作製することを特徴とする。
本発明の方法において重原子誘導体を作製する対象となるタンパク質結晶は、特に限定されず、どのようなタンパク質結晶にも適用できる。
【００１４】
本発明の方法は結晶に対して、重原子誘導体作製時に通常見られるような浸透圧変化に伴う物理的な衝撃をほとんど与えないために、適用可能な結晶の種類は、通常の可溶性タンパク質結晶は勿論のこと、膜タンパク質や、超分子複合体結晶、あるいはウイルス結晶などの、浸透圧変化に対して脆弱な結晶にも適用できる。
【００１５】
本発明の作製方法において、ヨウ素はヨウ素含有水溶液から気化させて、タンパク質結晶にヨウ素を作用させることができる。ヨウ素含有水溶液は、例えば、KI/I2溶液であることができ、KI及びI2の濃度は、例えば、結晶の気化ヨウ素に対する感受性に応じて、例えば、数μ(micor) M(マイクロモル/リットル)〜数M (モル/リットル)とすることができる。
また、ヨウ素含有水溶液は、例えば、上記KIの代わりに、ヨウ化ナトリウムNaIを用いることもできる。
【００１６】
ヨウ素を、ヨウ素含有水溶液から気化させる場合、温度は、結晶の気化ヨウ素に対する感受性に応じて、０℃〜３０℃とすることができる。温度が高い方が結合は早い。時間は、数分〜数日とすることができる。置換の程度は、結晶の黄色あるいは茶色の着色により見積りが可能である。
【００１７】
本発明の作製方法において、ヨウ素は固体ヨウ素から気化させて、タンパク質結晶にヨウ素を作用させることができる。固体ヨウ素を用いる場合、ヨウ素含有水溶液を用いる場合に比べて、ヨウ素の気化（昇華）速度が速い。固体ヨウ素量を数マイクログラムに抑えるなどして、固体ヨウ素からの気化（昇華）速度は、適宜調整することができる。尚、ヨウ素の気化速度は、一般には、溶液を用いた方がコントロールしやすい場合が多い。ヨウ素を固体ヨウ素から気化（昇華）させる場合には、温度は０℃〜室温とすることができる。時間は、数分から、数日とすることができる。
【００１８】
タンパク質結晶の重原子誘導体化の程度は、タンパク質結晶の気化ヨウ素による着色の程度で評価することができる。
【００１９】
本発明によるタンパク質結晶の重原子誘導体の作製方法は、例えば、タンパク質結晶と、ヨウ素含有水溶液及び/または固体ヨウ素を密閉系中に共存させることで行うことができる。ヨウ素溶液の量、濃度などは、あらかじめ予備実験で密閉空間に１マイクロリットルほどのヨウ素溶液を結晶と共存させ、結晶が直ちに崩壊しない程度のヨウ素溶液濃度を見積もっておくことができる。例えば、1M(モル/リットル)で直ちに崩壊する場合には、0.1Mに希釈するなどして、適宜調整できる。結晶のヨウ素との親和性、重原子誘導体の形成のし易さ、ヨウ素との反応による崩壊が起きるヨウ素濃度等は、タンパク質の種類により異なるので、ヨウ素含有水溶液及び/または固体ヨウ素の密閉系中への共存量等は、タンパク質結晶ごとに適宜する。
【００２０】
(位相情報収集方法)
本発明は、上記本発明の方法により作製されたタンパク質結晶のヨウ素による重原子誘導体をＸ線回折試験に付し、重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報を収集する方法を包含する。
重原子誘導体のＸ線回折試験及びＸ線回折試験からの位相情報の収集は、常法により行うことができる。例えば、重原子誘導体からのX線回折試験及びX線回折試験からの位相情報の収集は、ヨウ素の異状分散効果が高まる、長波長領域のX線を用いると位相情報が格段に得られやすくなる。例えば、理学電機（株）社製Cr-Kα回転陰極型高輝度X線発生装置から得られる、2.2908AのX線を用いる。検出器は２次元のものが適しており、例えば、理学電機（株）社製R-AXISIVなどのイメージングプレートタイプのものを用いて回折点を測定する。
【００２１】
(タンパク質結晶の三次元構造決定方法)
本発明は、上記本発明の方法により収集した重原子誘導体からの回折Ｘ線の位相情報に基づいて、タンパク質結晶の三次元構造を決定する方法を包含する。位相情報に基づいたタンパク質結晶の三次元構造の決定方法は、常法により行うことができる。例えば、SHELXDやSnB、SOLVEなどの、ヨウ素位置を決定するプログラムを用いて初期ヨウ素位置を決定し、autoSHARPなどの位相計算プログラムにそれらの位置を入力して計算することにより、電子密度図を得ることができ、分子構造を決定することができる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例1
(ヨウ素誘導体結晶作製法)
図1に本発明の方法によるヨウ素誘導体結晶作製法の概略図を示す。この方法に基づいて、(1)トリプシン、(2)プロテインX、(3)グルコースイソメラーゼ、(4)リゾチーム、(5)サウマチンの各結晶について結晶化ウエル(コーニング社、24ウエル)中で、ヨウ素誘導体結晶を作製した。
気化用の試薬として、KI/I2溶液(250 mg KI, 135 mg I2, 5μl EtOH/1ml H2O)を用いた。
【００２３】
図2-1にヨウ素誘導体結晶作製の結果を示す。各図の縦軸は、時間経過を示す。
上記KI/I2溶液を結晶化ウエル中に同封すると、時間経過に伴って、ウエル内でヨウ素分子I2が気化し、結晶に浸透していった。ヨウ素の置換率は、結晶が徐々に赤茶色を呈してくるので、その色の濃さで概算可能であった。また、(2')は、プロテインXについて、より短時間でのヨウ素誘導体作製が可能であることを示す結果である。
【００２４】
図2-2に上記1 (B)本手法により作製したリゾチウムのヨウ素置換体結晶の写真を示す。結晶が崩壊することなくヨウ素による重原子誘導体が形成されていることが分かる。一方、図2-3には、従来法により、KI/I2溶液（250 mg KI, 135 mg I2/1ml H2O)を直接リゾチウム結晶ドロップに加えたる場合の結晶の様子を示す写真を示す。迅速に結晶の崩壊が進んでしまっていることが分かり、この結晶では、以後の構造解析に使用できなくなった。
【００２５】
実施例2
実施例1で作製したヨウ素誘導体(ヨウ素置換体結晶)の内、(A)プロテインX及び(B) サウマチンについて、パターソンマップを測定した。結果を図3-1に示す。
パターソンマップの測定は、以下のように行った。ヨウ素ラベルしたタンパク質結晶を、100Kの液体窒素気流で急速凍結し、測定中もこの温度を保った。理学電機（株）社製Cr-Kα回転対陰極型高輝度X線発生装置から得られる、2.2908Åの高輝度X線を、１枚のイメージ当たり、１分照射して、回折像を、理学電機（株）社製R-AXISIVにより収集した。１枚当たりのイメージ測定中の振動角は、0.5°のファインスライス法を採用した。全部で720枚のイメージを収集し、回折点の濃度を、プログラムHKL2000で積分してFデータを得た。このデータからパターソンマップを計算したところ、結晶中に良好にヨウ素が結合していることが判明した。即ち、ヨウ素由来のピークが明瞭に確認できた。プログラムＳＯＬＶＥによって、プロテインXの結晶中には１２力所のヨウ素位置を、また、サウマチンでは７カ所のヨウ素位置を自動的に決定することができた。
【００２６】
実施例3
実施例2で測定したパターソンマップ(ヨウ素位置)から位相計算をし、(A)プロテインX及び(B) サウマチンについて、立体構造を決定した。結果を図3-2に示す。立体構造の決定は、以下のように行った。まず、得られたFデータをプログラムSOLVEによって解析したところ、ヨウ素位置を容易に決定することができた。この座標を、位相計算プログラムautoSHARP/SHARPに入力して計算したところ、解釈可能な良質な電子密度図を得ることができた。この電子密度を、自動分子モデル構築・精密化プログラムARP/wARPによって自動トレースさせたところ、ほぼ完全な分子モデルが全く途中で人手を介することなく全自動で構築された。
【００２７】
即ち、決定されたヨウ素位置をプログラムautoSHARPに入力し、位相計算を行った。得られた電子密度図に対して、全自動分子モデル構築・精密化プログラムArp/wArpによって分子モデル構築を行ったところ、(A)については全アミノ酸数４８１中、側鎖も含めて４２４残基が、(B)では２２１アミノ酸残基中２０６残基(側鎖まで構築できたのは１５８残基)それぞれまったく人手を介することなく自動的に構築することができた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、簡単かつ高い確率でタンパク質結晶の重原子誘導体を作製し得る方法を提供する。さらに本発明は、この方法を用いて作製したタンパク質結晶の重原子誘導体を用いた位相情報の収集方法及びタンパク質結晶の三次元構造決定方法を提供する。これら方法により、タンパク質結晶の三次元構造決定が従来に比して容易かつ確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の方法による気化ヨウ素を用いた誘導体結晶作製法の概略図。
【図２−１】気化ヨウ素を用いた誘導体結晶作製の結果を示す。
【図２−２】気化ヨウ素を用いて作製したリゾチウムのヨウ素置換体結晶の写真。
【図２−３】従来法によりヨウ素溶液を直接リゾチウム結晶ドロップに加えて迅速に結晶の崩壊が進んだ様子を示す写真。
【図３−１】パターソンマップ。
【図３−２】決定された立体構造。
【図１】
2005298426.tif 000002
【図２−１】
2005298426.tif 000003
【図２−２】
2005298426.tif 000004
【図２−３】
2005298426.tif 000005
【図３−１】
2005298426.tif 000006
【図３−２】
2005298426.tif 000007