(57)【要約】【目的】関節リウマチ疾患などの自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患（花粉症、アトピー性皮膚炎、喘息等）のIgE抗体産生を抑制することができる糖類もしくは糖鎖付加卵黄抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を提供すること。【構成】免疫増進物質を、ニワトリなどの産卵動物やその卵に接種して採卵して、糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を得ることからなる。また、この過剰自己抗体産生抑制物質を、関節リウマチ疾患などの自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患（花粉症、アトピー性皮膚炎、喘息等）のIgE抗体産生を抑制して、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療もしくは予防することからなる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項２】
請求項１に記載された過剰自己抗体産生抑制物質において、前記糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体における卵抗体が卵黄抗体（ＩｇＹ）であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項３】
請求項１または２に記載された過剰自己抗体産生抑制物質において、前記糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体における糖類もしくは糖鎖がグルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、もしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質において、）糖類もしくは糖鎖含有卵抗体に糖類もしくは糖鎖が付加並びに糖類もしくは糖鎖含有抗体の新たな結合部位に糖類もしくは糖鎖が結合されていることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質において、前記過剰自己抗体産生抑制物質が自己抗体産生抑制作用またはアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制作用を有することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質において、前記過剰自己抗体産生抑制物質が自己の臓器または自己の臓器が生産した物質に対する自己抗体の過剰産生を抑制する物質であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項７】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質において、前記過剰自己抗体産生抑制物質が外因性アレルゲンにより刺激されることによって自己において過剰に産生される抗体の過剰産生を抑制する物質であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項８】
請求項７に記載された過剰自己抗体産生抑制物質において、前記アレルゲンが動物性物質、植物性物質または化学物質であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項９】
免疫増進効果がある物質を産卵動物に接種することにより糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を産生させることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質において、前記過剰自己抗体産生抑制物質が請求項９に記載されている処理によって得られた免疫卵黄抗体分画に存在していることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質。
【請求項１１】
請求項９に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、前記産卵動物がニワトリ、ダチョウ、ガチョウ、七面鳥、アヒル等の鳥類であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１２】
請求項９ないし１１のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、前記糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体が卵黄抗体であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１３】
請求項９ないし１２のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、前記糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体における糖類もしくは糖鎖がガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、もしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１４】
請求項９ないし１３のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、アジュヴァントを前記産卵動物に接種することによって卵黄抗体にガラクトースまたはN-アセチルガラクトサミンが付加された卵黄抗体を製造することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１５】
請求項）９ないし１４のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質を含有する免疫卵黄抗体分画を分離することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１６】
請求項９ないし１５のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、前記免疫増進効果がある物質がアジュヴァントならびにその他の物質と混合されていることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１７】
請求項９ないし１６のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、前記免疫増進効果がある物質が０．０１ないし２０ｍｇの割合で接種されることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１８】
請求項９ないし１７のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、前記免疫増進効果がある物質を、アジュヴァントならびに／その他の物質との混合物として接種する場合には、前記アジュヴァントの接種量は、０．１ｍｌないし１０ｍｌ／回／羽であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項１９】
請求項９ないし１８のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質が自己抗体産生抑制作用またはアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制作用を有することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法。
【請求項２０】
糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患の抗体過剰産生を抑制するために使用することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質を、自己抗体産生抑制またはアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制のために使用することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体における卵抗体が卵黄抗体であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２３】
請求項２０ないし２２のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体における糖類もしくは糖鎖がガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、もしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖であることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２４】
請求項２０ないし２３のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質を含有する免疫卵、免疫卵黄分画として精製した状態で使用することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２５】
請求項２０ないし２４のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質を、自己抗体産生抑制のために免疫卵黄抗体の分画として使用することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２６】
請求項２０ないし２５のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質を、アレルギー疾患のIgE抗体産生抑制のために、卵黄抗体分画として使用することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２７】
請求項２０ないし２６のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質が経口、経皮または経粘膜によって投与されることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２８】
請求項２０ないし２７のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質が液状、粉状、粒状、クリーム状、コロイド状もしくは固形状の形態で投与されることを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【請求項２９】
請求項２０ないし２８のいずれか１項に記載された過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法において、前記過剰自己抗体産生抑制物質を、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の際による過剰抗体産生抑制の治療もしくは予防をするために、医薬品、食品、化粧品または飼料として投与することを特徴とする過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、糖付加卵黄抗体およびその製造方法ならびにその使用方法に関し、更に詳細には、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患によるIgE抗体産生を抑制する糖付加卵黄抗体およびその製造方法ならびにそれを用いての自己免疫疾患とアレルギー疾患との治療ならびに予防などに使用する使用方法に関するものである。
なお、本明細書に記載されている「糖類もしくは糖鎖含有」という用語は、天然状態で糖類もしくは糖鎖を含んでいる卵抗体を意味し、「糖類もしくは糖鎖付加卵抗体」という用語は、産卵動物に処理を施した結果、新たな糖類もしくは糖鎖または新たに糖類もしくは糖鎖を付加された卵抗体のことを意味している。
【０００２】
【従来の技術】
生体には、細菌やウイルス、あるいは様々な異物（抗原）が侵入すると、免疫細胞が抗体を認識して、抗体を産生し抗原の侵入を防御する免疫反応による防御システムが備わっている。この免疫細胞は自己と非自己とを識別し、自己抗原に対しては免疫寛容（トレランス）が作用して免疫反応を抑制するのに対して、非自己抗原に対しては免疫反応を誘導する。つまり、一般には、同一個体内では、自己抗原に対する免疫寛容のバランスは制御されているが、自己・非自己の識別機構が障害されると（この免疫寛容のバランスが一旦破綻してしまうと）、自己抗原に対しても自己抗体（イムノグロブリン）が産生され、自己組織などの自己抗原に対しても攻撃するという問題が起こってくる。こうした現象を自己免疫反応といい、この自己免疫反応により種々の自己免疫疾患が引き起こされる。
【０００３】
自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫応答が原因となって起こる疾患であり、その成因については不明な点が多い。また、その症例は多岐に亘っていて、主たる疾患例としては、例えば、甲状腺の自己免疫疾患、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、自己免疫性血液疾患（自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血等）などが知られている。
【０００４】
これら疾患に対する治療法としては、例えば、上述した重篤な症状をもたらすＳＬＥなどに対しては免疫抑制療法が施されている。また、慢性関節リウマチなどでは、自己免疫により自己の器官が完全に失われていることから、人工臓器や同種臓器移植が行われている。また、症状として代謝異常を引き起こすものについては欠損している代謝酵素、ホルモンなどを投与することが行われている。しかしながら、こうした治療は対処療法にすぎず、根本的な自己免疫疾患の治療が図れていないのが現状である。
【０００５】
上述したように、免疫反応は、生体が生存するためには不可欠で有益な反応であるが、この免疫反応が生体に対して不都合をもたらすことがあり、このような不利益になる免疫反応がアレルギー反応と言われている。抗体は、その分子構造の違いからいくつかのクラスに分けられるが、アレルギー反応を起こす抗体は主にIgE抗体である。
【０００６】
一般にアトピーといわれるのはIgE抗体が関与するアレルギー反応をいい、このIgE抗体が関与するアレルギー反応は、肥満細胞と結合しているIgE抗体に抗原が再結合して、肥満細胞に連鎖反応が起こり化学伝達物質が放出されて組織障害を起こすタイプであり、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などの一般的アレルギー疾患の大部分がこのアレルギー反応で起こるものである。
【０００７】
アレルギー疾患の予防には環境から抗原を除去するのが重要であるが、環境から抗原を完全に除去することは至難である。また、アレルギー疾患治療薬としてよく使用されるのは、抗ヒスタミン薬、β−交感神経刺激剤、テオフィリン製剤、ステロイド剤などである。一般に、アレルギー疾患の治療は長い期間を要し、医薬品の長期服用による副作用も懸念される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）とアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制する抗体産生抑制物質そのものを開発することは、自己免疫疾患やアレルギー疾患の原因物質の産生を抑制することから、自己免疫疾患やアレルギー疾患を原因から絶つことができ、極めて有用であり、かかる抗体産生抑制物質の開発が強く要望され続けている。
【０００９】
この発明者は、このような観点から、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）とアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制する抗体産生抑制物質について鋭意研究をした結果、アジュヴァント単独又は混合して産卵動物に接種することにより得られた卵黄抗体がノーマル卵黄抗体よりガラクトースまたはN-アセチルガラクトサミンがより多く付加されていることを見出した。さらには、この糖付加卵抗体が免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制することを見出して、この発明を完成するに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
したがって、この発明は、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を提供することを目的としている。また、好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質が、自己の臓器または自己の臓器が生産した物質に対する自己抗体の過剰産生を抑制する物質であることからなる過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。別の好ましい態様としては、過剰自己抗体産生抑制物質が、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用および／またはアレルギー疾患に関与するイムノグロブリン、特にIgE抗体の産生を抑制する抗体産生抑制作用を有している過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。なお、本明細書において、単に糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体のいずれか１方を使用する場合があるが、いずれの場合にもその用語に限定する意図は一切なく、特段の定めがない限り、いずれの意味をも有する意図で使用しているものと理解さるべきである。また、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体ならびに糖類もしくは糖鎖付加卵抗体として使用している含有および付加ならびにこれらと関連とする用語にしても、糖類もしくは糖鎖と卵抗体との共存状態を限定する意図で一切使用しているものではなく、あらゆる併存状態、例えば結合などの状態を包含する意図で使用しているものと理解さるべきである。
【００１１】
更に、この発明の好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における糖類もしくは糖鎖がガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、もしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖である過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における抗体が卵黄抗体である過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、免疫卵、免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画に存在している過剰自己抗体産生抑制物質を提供することである。
【００１２】
また、この発明は、免疫増進効果がある物質を産卵動物に接種することにより糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を産生させることからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することを別の目的としている。この発明の好ましい態様として、アジュヴァントとの混合物として使用することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することである。
【００１３】
この発明の別の好ましい態様として、過剰自己抗体産生抑制物質が自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制する作用を有する過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することを別の目的としている。また、この発明の別の好ましい態様として、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における糖類もしくは糖鎖がガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、もしくはシアル酸またはこれら糖類を含む糖鎖である過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。この発明の特に好ましい態様としては、アジュヴァントを産卵動物に接種することによって卵黄抗体にガラクトースまたはN-アセチルガラクトサミンが付加されたガラクトース等付加卵黄抗体を製造することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の製造方法を提供することである。また、この発明の別の好ましい態様としては、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質における抗体が卵黄抗体である過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。この発明の更に好ましい態様として、免疫卵、免疫卵黄または免疫卵卵黄抗体分画として過剰自己抗体産生抑制物質を製造する製造方法を提供することである。
【００１４】
更に、この発明は、糖類もしくは糖鎖含有卵抗体または糖類もしくは糖鎖付加卵抗体からなる過剰自己抗体産生抑制物質を、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患の抗体の過剰産生を抑制するために使用することからなる過剰自己抗体産生抑制物質の使用方法を提供することである。この発明の好ましい態様においては、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）および／またはアレルギー疾患の際、IgE抗体の産生を抑制する作用を有する過剰自己抗体産生抑制物質を、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の際に生じる過剰抗体の産生を抑制することによって、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療もしくは予防の為に使用する使用方法を提供することである。この発明の好ましい態様として、過剰自己抗体産生抑制物質が免疫卵、免疫卵黄もしくは免疫卵黄抗体分画としてまたは免疫卵から抽出したもしくは精製した状態で、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生および／またはアレルギー疾患のIgE抗体産生を抑制するために過剰自己抗体産生抑制物質を使用する方法を提供することである。
【００１５】
この発明の更なる目的、特長ならびに利点は、本明細書の下記記載と添付図面から明らかになるであろう。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明に係る過剰自己抗体産生抑制物質は、糖含有卵抗体または糖付加卵抗体、つまり、糖含有または糖付加卵黄抗体である。また糖類もしくは糖鎖としては、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、またはシアル酸などが挙げられるが、ガラクト−スおよびN-アセチルガラクトサミンが特に好ましい。この過剰自己抗体産生抑制物質は、特に、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生および／またはアレルギー疾患の際、IgE抗体産生を抑制する作用があることを特徴とする。
【００１７】
この発明に係る過剰自己抗体産生抑制物質は、免疫増進効果を有する物質を産卵動物に接種することによって製造することができる。かかる免疫増進効果を有する物質は、単独あるいは他の同様な効果をもつ物質との組み合わせで使用される
【００１８】
かかる免疫増進物質はアジュヴァントと総称され、死活牛酪菌、死活牛型結核菌、死活人型結核菌、アスカリス、死活百日咳菌、カリミョウバン、エンドトキシン、Muramyl dipeptide(MDP)、トキシン類、Heat-labile enterotoxin、Heat-killed Mycobacterium butyricum、あるいはプリスタン、アジュバンドペプチド、カリミョウバン、クロムミョウバン、水酸化アルミニウム、フロインドのコンプリートアジュバンド、インコンプリートアジュバンド等が挙げられる。  アジュヴァントの効果は、１）抗原を難溶化することで組織に長く留まって抗原を徐々に長期間遊離させること、２）抗原をマクロファージに貪食されやすい状態にすること，３）免疫に関する細胞を非特異的に活性化することで、上記の物質は少なくともいずれか一つの性質を持つものである。
【００１９】
これらの免疫増進物質は、１種もしくは異なる種類を２種以上混合して同時にもしくは別個に産卵動物に対して接種することができる。なお、産卵動物に対して接種することが可能であれば、いずれの形態でも適用することができ、例えば、溶液、エマルジョンなどの形態で接種するのが好都合である。産卵動物に対するかかる免疫増進物質の接種は、毎月または1ヶ月ないし２ヶ月に１回程度の割合で行なうことができる。一般には、産卵動物に対する接種は、免疫賦活剤の量を所定の間隔をおいて、例えば、２週間ないし４週間の間隔で注射などによって行うのが普通である。注射期間は、所定の間隔をおいて卵を採取後、卵黄成分中の糖付加卵黄抗体が、自己免疫疾患および／またはアレルギーモデル動物に対して抗体産生抑制効果を発現するまで接種を継続する。更に、免疫増進物質の接種量は、免疫増進物質の種類、産卵動物の種類などによって変わるが、一般には、０．０１ないし２０ｍｇ、好ましくは０．５ないし５ｍｇであるのがよい。なお、免疫増進物質の接種量は、免疫増進物質を、例えばフロインドの完全アジュバンドとして接種する場合には、一般には、０．１ｍｌないし１０ｍｌ／回／羽、好ましくは０．５ｍｌないし２ｍｌ／回／羽の範囲であればよい。
【００２０】
この発明において、接種できる産卵動物としては、産卵動物であればいずれも利用することができるが、通常産卵動物といわれているニワトリ、アヒル、ダチョウ、ガチョウ、七面鳥等などの鳥類が好ましい。これら産卵動物のうち、飼育数、産卵数などの点からしても、糖付加卵黄抗体を安定してかつ安価に供給できることから、ニワトリが特に好ましい。次ぎに、この発明に従ってアジュバンドを接種した産卵動物は、通常の飼育場で常法に従って飼育することができる。上記のようにして飼育した産卵動物から採卵した卵は、回収して、全免疫卵、免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画に必要に応じて常法に従って精製分離することができる。
【００２１】
接種した産卵動物から採卵をする時期は、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制効果および／またはアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制効果を、所定の評価方法で、この発明の過剰免疫産生抑制物質が卵中に所定濃度に達していることを確認して採卵を開始することになる。なお、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制効果の評価方法は、自己免疫疾患マウス（MRL/lpr）に一定量の糖付加卵黄抗体を経口投与し、MRL/lprマウスの血清中のリウマチ因子濃度を、非経口投与群と比較して抑制効果を確認することによって行うことができる。同様に、IgE抗体産生抑制効果の評価方法も、MRL/lprマウス血清中のIgE抗体濃度を非経口投与群と比較してIgE抗体産生抑制効果を確認することによって行うことができる。
【００２２】
上記したように、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用およびアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制作用を有している。したがって、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療ならびに予防のために使用することができる。この目的のために、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、上記のようにして常法により精製分離した免疫卵黄または免疫卵黄抗体分画は、必要に応じて加工して、それぞれの用途に使用することができる。なお、アレルギー疾患の治療ならびに予防のためにこの発明の過剰抗体産生抑制物質を使用する場合には、免疫卵黄抗体分画のみを使用するのがよい。また、この発明により得られた過剰抗体産生抑制物質は、例えば、必要に応じて他の物質と混合して、液状、粉状、粒状、クリーム状、コロイド状、固形状などの形態で使用することができる。また、この発明の過剰抗体産生抑制物質は、例えば、医薬品、例えば治療薬、予防薬など、食品、例えば機能性食品、化粧品等に使用することができる。同様に、競走馬、家畜、ペット等の餌等に含有して使用することも可能である。この態様における特に好ましい具体的な実施例としては、食品が挙げられる。この発明に係る糖付加卵黄抗体を食品に使用する場合には、例えば成人１日卵換算量として０．１個から２個程度、好ましくは０．５個から１個程度飲用すればよい。
【００２３】
また、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患の自己抗体の過剰産生を抑制するためまたはアレルゲン、例えば、動物性物質、植物性物質または化学物質により外部から刺激されることによって自己において過剰に産生される抗体の過剰産生を抑制するために使用することができる。上記したように、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、上記のような抗体の過剰産生を抑制する作用、特に自己免疫疾患の自己抗体（イムノグロブリン）産生抑制作用ならびにアレルギー疾患のIgE抗体産生抑制作用を有しているので、神経系、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、血液系、眼系、耳鼻咽喉系または皮膚系疾患、特に自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の治療ならびに予防のために使用することができる。したがって、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質が適用できる疾患の例としては、例えば、リウマチ並びにアレルギー症状である関節の痛み、鼻汁、くしょみ、鼻のかゆみ、咳、喘鳴、呼吸器困難、喉頭浮腫、嗄声、チアノーゼ、紅班、紫班、そう痒、蕁麻疹、湿疹、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、目のかゆみ、流涙、眼球結膜充血、眼臉浮腫、悪心、嘔吐、下痢、血便、腹痛、便秘、吸収不良、体重増加不良、蛋白尿、血尿、浮腫、亀頭炎、夜尿、頭痛、めまい、行動異常、貧血、血小板減少、ショック、アレルギ−性緊張（allergic tension）、疲労シンドローム（fatigue syndrome）、糖尿病などがあげられ、かかる症状の改善もしくは完治に有用である。更に、この発明に係る過剰抗体産生抑制物質は、自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の検査薬としても応用可能であり、例えば、各種の自己免疫疾患ならびにアレルギー疾患の検査に使用することができる。かかる検査としては、例えば、自己免疫疾患検査、アレルギー検査、抗膵島細胞抗体検査などが挙げられる。
【００２４】
以下、この発明を実施例により更に詳細に説明する。
（実施例１）
接種アジュヴァント：
メーカー名：株式会社ヤトロン
製品名：コンプリートアジュヴァント(Freund)
組成： 界面活性剤：          1.5ml/10ml
流動パラフイン：              8.5ml/10ml
免疫賦活剤：          BCG死菌（加熱死菌）
コントロール：注射用生理食塩水（大塚製薬製）
産卵動物：ニワトリ（白色レグホン）
雌雄：  雄
体重：  平均２Kg
餌：    くみあい配合飼料セレクトハイ（成鶏飼育配合飼料）、全農（JA）供給給水：  水道水
接種：
エマルジュン作製方法：
エマルジョン量：アジュヴァント  1ml/羽  ＋ 生理食塩水  1ml/羽
接種部位：      皮下
接種量：        １回／月、２回接種
接種期間：      ２ヶ月
採卵期間：１３日間
採卵数（鶏数  各群N＝２の平均値,単位は個）
A)アジュヴァント接種群（アジュヴァントのみを接種した）
採卵数: 計１１個（１−８日目、１０−１２日目）
B)アジュヴァント＋免疫賦活剤量を増量群
採卵数: 計５個（８−１０日目、１２−１３日目）
C)注射用生理食塩水接種群
採卵数: 計１３個（１−１３日目まで連続）
採卵した卵は、全採卵が終了するまで家庭用冷蔵庫に保管した。
実施例１の試験結果より経済的に産卵率を落とさず回収可能な上記アジュヴァント接種群の卵を以下の試験に使用した。
【００２５】
（実施例２）
実施例１のアジュヴァント接種群の卵を次のようにして分画した。
分離精製工程：
全卵（ノーマル卵）（以下、ニワトリにアジュヴァントを接種後、回収した卵を免疫卵と言う。）を割って卵黄を分離した。次いで、卵黄をデキストラン（シグマ社製；添加量：最終濃度0.1%）で吸着して脱脂し、この脱脂した卵黄を遠心分離してその上清を回収した。この回収した上清をゲルろ過カラムクロマトグラフィに付した。ゲルろ過カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム：        Sephacryl S-300 クロマトグラフィ(アマシャム・ファルマシア社製)
バッファ：      10mM リン酸バッファ：pＨ7.2；0.15M NaＣl
フローレート：  0.7ml/min
波長：          254ｎｍ、280ｎｍ
測定機器：      AKTA explorer(アマシャム・ファルマシア社製)
ゲルろ過カラムクロマトグラフィの測定結果は図１に示すとおりである。
【００２６】
（実施例３）
実施例２で得られたゲルろ過カラムクロマトグラムから免疫卵の分画１、２、３および４を回収した。
つぎに、この免疫卵分画１をゲルろ過カラムクロマトグラフィによって処理した。ゲルろ過カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム：          Sephadex G-75 クロマトグラフィ(アマシャム・ファルマシア社製)
バッファ：        10mM リン酸バッファ；pＨ7.2、0.15M NaＣl
フローレート：    0.7ml/min
波長：            254ｎｍ、280ｎｍ
測定機器：        AKTA explorer(アマシャム・ファルマシア社製)
上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られたメインピークを回収して、イオン交換カラムクロマトグラフィによって処理した。イオン交換カラムクロマトグラフィの条件は次のとおりである。
カラム：          Resource S クロマトグラフィ(アマシャム・ファルマシア社製)
バッファA：      10mM Tris-HCl, pH8.0
バッファB：      10mM Tris-HCl, pH8.0, 0.3M NaCl
バッファA→バッファB：  Linear gradient
フローレート：    0.7ml/min
波長：            254ｎｍ、280ｎｍ
測定機器：        AKTA explorer(アマシャム・ファルマシア社製)
【００２７】
上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られた免疫分画１をイオン交換カラムクロマトグラフィに掛けた結果は図３に示す通りである。同様に、上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られたノーマル卵分画１をイオン交換カラムクロマトグラフィに掛けた結果は図４に示す通りである。
【００２８】
次ぎに、上記イオン交換カラムクロマトグラフィで得られたメインピークを回収した。さらに、回収したメインピークをSDS-PAGE試験によって処理した。SDS-PAGE試験条件は次のとおりである。
電気泳動装置：  テフコ社製 SDS-PAGE電気泳動装置
電気泳動条件：  １８mA定電流,６０分
サンプル量：  非還元処理  １μg/lane
染色条件
銀染色:  2D-銀染色試薬II（第一化学薬品製）
試験結果：
ノーマル卵黄ならびに免疫卵黄を、上記のようにゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行うことによって精製分離した結果、卵黄抗体の分子量に相当する１８万の部分にバンドが１本確認された。このバンドは明らかに精製された卵黄抗体であることが確認できた（図５参照）。
図５において、レーン２はHyE F-1(GGI)（ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回、イオン交換クロマトグラフィを1回行なって精製した免疫卵分画１）を示す。レーン３はNE F-1(GGI)（ゲル濾過クロマトグラフィを２回、イオン交換カラムカラムクロマトグラフィを1回行なって精製したノーマル卵分画１）を示す。レーン４はHyE F-1(GG)（ゲル濾過クロマトグラフィを２回行なって精製した免疫卵分画１）を示す。レーン５はNE F-1(GG)（ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回行なって精製したノーマル卵分画１）を示す。
【００２９】
つぎに、上記で確認された卵黄抗体をイムノドット試験によって判定した。
イムノドット作業工程
Zeta-Probe Blotting メンブレン(BIO-RAD社製)（1μl/Dot）を風乾した後、室温で１時間ブロッティング(10% Block Ace/10mM PBS)した。ブロッティングした後、３回洗浄をして抗ニワトリIgYヤギ血清（ロットIC-003：SYC社製）を10mM PBSで3000倍希釈して、室温で１時間反応した。反応後、洗浄液で３回洗浄し、抗ヤギIgG-HRPO標識（Cappel社製）を10mM PBSで5000倍希釈液を加えて室温で１時間更に反応した。洗浄液で３回更に洗浄して、発色液(BIO-RAD社製)を用いて発色して判定した。
試験結果：
上記の試験結果から、ノーマル卵黄抗体並びに免疫卵黄抗体をそれぞれ、上記のようにゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行なって精製分離した結果、卵黄抗体、全卵中卵黄抗体、卵黄中の卵黄抗体と、卵黄抗体の特異抗体とは抗原抗体反応はするが、ＰＢＳとは反応していないことが判明した。
また、ゲル濾過カラム２回とイオン交換カラム１回を通して精製分離した結果、ノーマル卵黄抗体と免疫卵黄抗体であることが確認された（図６参照）。
【００３０】
（実施例４）
自然発症自己免疫疾患マウスによる自己抗体産生抑制効果試験
使用マウス：
自然発症免疫疾患マウス：MRL/lpr（深町知博他：MRL/lprマウス自然発症関節炎；炎症と免疫、
Vol.2, No. 2, pp. 104-114, 1994）
８週令で入荷後、1週間予備飼育した。
ブリーダー名：日本エスエルシー製
雌雄：雄
投与試験：
週令：９週令より投与試験開始
N数：各群７匹
餌：  CE-2（日本クレア製：ロットNo.E2119−ｋ３）
給水：滅菌水道水
照度：午前７時から午後７時まで
投与量：全卵  ３５μl/匹／日。
免疫卵分画  全卵の７０μl相当量/匹／日。
投与方法：経口ゾンデを使用して直接投与
投与回数：３回／週
投与期間：８週間
コントロール群（対象群）：滅菌水だけを投与。
評価方法：
MRL/lprマウスが加齢とともに自の血清中に自己抗体であるIgG型リウマチ因子を大量に産生すると同時に手足関節の膨らみが観察できた。したがって、抗体投与群（ガラクトース付加卵黄抗体をMRL/lprマウスに経口投与した）と、ガラクトース等付加卵黄抗体未投与群（コントロール群）（MRL/lprマウスに滅菌水のみを投与した）とのIgG型リウマチ因子濃度を比較することにより効果判定が可能である。
測定方法：
試薬：IgG型マウスリウマチ因子測定法（市川厚編：関節炎（３）MRL/ｌマウス関節炎、炎症とアレルギー（Ｉ-2）、廣川生物薬科学実験講座１２巻、廣川書店、1993）に従って調製した。
操作方法：96 wellに固相化した抗原（IgG型マウスリウマチ因子と反応する蛋白）wellに検体（ガラクトース等付加卵黄抗体投与群MRL/lprマウスから採血した血清）を希釈後、100μl/wellを添加して室温で２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、POD標識マウスIgG抗体を100μl/wellの割合で添加して室温でさらに２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、発色液（TMB）を100μl/wellの割合で添加して室温で２０分間反応させた後、反応停止液を100μl/wellの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダー（450nm）で測定した。
評価結果
滅菌水投与群と、免疫卵分画３と免疫卵分画４とをそれぞれ投与した免疫卵分画投与群のMRL/lprマウスは、飼育加齢と共に、自己抗体濃度が上昇した。これに対して、免疫卵分画１投与群のMRL/lprマウスの自己抗体濃度は上昇しないので、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用があることが証明された。また、免疫卵分画２投与群のMRL/lprマウスの自己抗体濃度は、僅かに上昇した後、減少し、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用があることが証明された（図２参照）。更に、免疫卵全体も、MRL/lprマウスの自己抗体濃度は、対象群に比較して低く、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用を有していると言える。
したがって、ガラクトース等付加卵黄抗体は、自己免疫疾患である関節リウマチの治療並びに予防効果があることが証明された。
【００３１】
（実施例５）
IgE抗体産生抑制効果試験：
使用マウスならびに検体：
実施例３のガラクトース付加卵黄抗体をMRL/lprマウスに経口投与した投与群と、滅菌水のみをMRL/lprマウスに投与した未投与群（コントロール群）のIgE抗体濃度を比較することにより効果を判定した。
コントロール群：滅菌水  ２匹（１５週令）
免疫卵分画１を投与したMRL/lprマウス群：２匹（１５週令）
評価方法
測定キット：森永生科学研究所製：モリナガ ELISA マウス
IgE抗体キット
測定範囲：０．５ｎｇ／ｍｌ〜３２ｎｇ／ｍｌ
評価結果
MRL/lprマウス血中IgE抗体濃度測定結果（単位：ｎｇ／ｍｌ）
2005298332.tif 000002
上記の結果から、コントロール投与群（滅菌水投与群）のMRL/lprマウス１５週令のIgE抗体濃度は１６１．１ｎｇ／ｍｌであって加齢とともに上昇したが、免疫卵分画１（ガラクトース等付加卵黄抗体投与群のMRL/lprマウス１５週令のIgE抗体濃度は感度以下の０．４０６ｎｇ／ｍｌであった。この結果から、免疫卵分画１（ガラクトース等付加卵黄抗体）はMRL/lprマウスのIgE抗体産生を抑制したことを確認した。従って、ガラクトース付加卵黄抗体はアレルギー疾患の治療並びに予防に効果があることが証明された。
【００３２】
（実施例６）
実施例２で示した免疫卵並びにノーマル卵を卵黄分離して脱脂した後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行って精製をして回収した免疫卵由来卵黄抗体中のガラクトース、N-アセチルガラクトサミン（以下、NAGAと略す）結合量と、ノーマル卵由来卵黄抗体のガラクトース、NAGA結合量を比較した。
測定方法：
各卵黄抗体3μg/mlを0.1M 炭酸バッファ、pH 9.5に溶解した溶液を100オl/wellの割合で96well（ヌンク社製）の各ウエルに添加して、25℃で２時間コーティングした。コーティング後、３回洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）で洗浄した後、各ウェルにコーティング液（25% Block Ace；10mM リン酸バッファ、pH 7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）を250μl/wellの割合で添加し、25℃で２時間コーティングした。次いで、洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）で３回洗浄した後、反応液（Biotin conjugated RCA120*；*RCA120：ガラクトース、およびN-アセチルガラクトサミン残基特異結合レクチン）を100μl/wellの割合で各ウェルに添加し、25℃で１時間反応させた。次に、各ウェルにAvidin conjugated HRPを100mμl/wellの割合で添加し、25℃で1時間反応させた。反応後、各ウェルを洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH 7.2；150mM NaCl; 0.05% Tween 20）で３回洗浄した。洗浄後、発色液（TMB）を100μl/wellの割合で添加して室温で１０分間反応させた後、反応停止液（1M H2SO4）を100μl/wellの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダーで吸光度（450nm/620nm）を測定した。
測定結果：
上記のようにしてノーマル卵と免疫卵の各３個より精製した卵黄抗体結合ガラクトース・NAGA量を測定した結果、ノーマル卵由来卵黄抗体結合ガラクトース・NAGA量のAbs.値(吸光度)を１００％としたときに、免疫卵由来卵黄抗体結合ガラクトース・NAGA量は１５４％であったことが判明した。
この測定結果より、ノーマル卵と比較して、アジュヴァント接種によりガラクトース・NAGA量が１．５倍も多くなっていたことが判る（図７参照）。
【００３３】
発明の効果
この発明によって、アジュヴァントを接種して得た糖付加卵黄抗体は、関節リウマチ疾患の自己抗体（イムノグロブリン）並びにアレルギー疾患（花粉症、アトピー性皮膚炎、喘息等）のIgE抗体産生を抑制することが判明した。このことから、この発明に係る糖付加卵黄抗体は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療ならびに／もしくは予防に有効である。従って、この発明に係る糖付加卵黄抗体は、自己免疫疾患および／またはアレルギー疾患の治療もしくは予防に対して効果を付与する飲食品、医薬品,化粧品、飼料等の素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ゲル濾過カラムクロマトグラフィ（Sephacryl S-300クロマトグラフィ）での免疫卵分画１、２、３、４の分画パターンを示すパターン図である。
【図２】自己免疫疾患モデルマウス（MRL/lprマウス）に免疫卵全体を投与した免疫卵投与実験（マウスＩｇＧ型リウマチ因子測定）によるMRL/RF-IgG抗体価を示すグラフ。
【図３】自己免疫疾患モデルマウスに免疫卵分画１と２を投与した免疫卵分画投与実験（マウスＩｇＧ型リウマチ因子測定）によるMRL/RF-IgG抗体価を示すグラフ。
【図４】自己免疫疾患モデルマウスに免疫卵分画３と４を投与した免疫卵分画投与実験（マウスＩｇＧ型リウマチ因子測定）によるMRL/RF-IgG抗体価を示すグラフ。
【図５】イオン交換カラムクロマトグラフィ（Resource S クロマトグラフィ）で免疫卵分画１をさらに精製したパターンを示すパターン図である。
【図６】イオン交換カラムクロマトグラフィ（Resource S クロマトグラフィ）でノーマル卵分画１をさらに精製したパターンを示すパターン図である。
【図７】ノーマル卵分画１と免疫卵分画１に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験結果を示す電気泳動図である。
【図８】イムノドット試験結果を示す写真である。
【図９】免疫卵由来ＩｇＹ結合ガラクトース等量とノーマル卵由来ＩｇＹ結合ガラクトース量の比較を示すグラフである。
【図１】
2005298332.tif 000003
【図２】
2005298332.tif 000004
【図３】
2005298332.tif 000005
【図４】
2005298332.tif 000006
【図５】
2005298332.tif 000007
【図６】
2005298332.tif 000008
【図７】
2005298332.tif 000009
【図８】
2005298332.tif 000010
【図９】
2005298332.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成13年4月9日(2001.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られた免疫分画１をイオン交換カラムクロマトグラフィに掛けた結果は図５に示す通りである。同様に、上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィで得られたノーマル卵分画１をイオン交換カラムクロマトグラフィに掛けた結果は図６に示す通りである。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
次ぎに、上記イオン交換カラムクロマトグラフィで得られたメインピークを回収した。さらに、回収したメインピークをSDS-PAGE試験によって処理した。SDS-PAGE試験条件は次のとおりである。
電気泳動装置：  テフコ社製 SDS-PAGE電気泳動装置
電気泳動条件：  １８mA定電流,４０分
サンプル量：  非還元処理  １μg/lane
染色条件
銀染色:  2D-銀染色試薬II（第一化学薬品製）
試験結果：
ノーマル卵黄ならびに免疫卵黄を、上記のようにゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行うことによって精製分離した結果、卵黄抗体の分子量に相当する１８万の部分にバンドが１本確認された。このバンドは明らかに精製された卵黄抗体であることが確認できた（図７参照）。
図７において、レーン２はHyE F-1(GGI)（ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回、イオン交換クロマトグラフィを1回行なって精製した免疫卵分画１）を示す。レーン３はNE F-1(GGI)（ゲル濾過クロマトグラフィを２回、イオン交換カラムカラムクロマトグラフィを1回行なって精製したノーマル卵分画１）を示す。レーン４はHyE F-1(GG)（ゲル濾過クロマトグラフィを２回行なって精製した免疫卵分画１）を示す。レーン５はNE F-1(GG)（ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回行なって精製したノーマル卵分画１）を示す。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
つぎに、上記で確認された卵黄抗体をイムノドット試験によって判定した。
イムノドット作業工程
Zeta-Probe Blotting メンブレン(BIO-RAD社製)（1μl/Dot）を風乾した後、室温で１時間ブロッティング(10% Block Ace/10mM PBS)した。ブロッティングした後、３回洗浄をして抗ニワトリIgYヤギ血清（ロットIC-003：SYC社製）を10mM PBSで3000倍希釈して、室温で１時間反応した。反応後、洗浄液で３回洗浄し、抗ヤギIgG-HRPO標識（Cappel社製）を10mM PBSで5000倍希釈液を加えて室温で１時間更に反応した。洗浄液で３回更に洗浄して、発色液(BIO-RAD社製)を用いて発色して判定した。
試験結果：
上記の試験結果から、ノーマル卵黄抗体並びに免疫卵黄抗体をそれぞれ、上記のようにゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行なって精製分離した結果、卵黄抗体、全卵中卵黄抗体、卵黄中の卵黄抗体と、卵黄抗体の特異抗体とは抗原抗体反応はするが、ＰＢＳとは反応していないことが判明した。
また、ゲル濾過カラム２回とイオン交換カラム１回を通して精製分離した結果、ノーマル卵黄抗体と免疫卵黄抗体であることが確認された（図８参照）。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
（実施例４）
自然発症自己免疫疾患マウスによる自己抗体産生抑制効果試験
使用マウス：
自然発症免疫疾患マウス：MRL/lpr（深町知博他：MRL/lprマウス自然発症関節炎；炎症と免疫、Vol.2, No. 2, pp. 104-114, 1994）
８週令で入荷後、1週間予備飼育した。
ブリーダー名：日本エスエルシー製
雌雄：雄
投与試験：
週令：９週令より投与試験開始
N数：各群７匹
餌：  CE-2（日本クレア製：ロットNo.E2119−ｋ３）
給水：滅菌水道水
照度：午前７時から午後７時まで
投与量：全卵  ３５μl/匹／日。
免疫卵分画  全卵の７０μl相当量/匹／日。
投与方法：経口ゾンデを使用して直接投与
投与回数：３回／週
投与期間：８週間
コントロール群（対象群）：滅菌水だけを投与。
評価方法：
MRL/lprマウスが加齢とともに自の血清中に自己抗体であるIgG型リウマチ因子を大量に産生すると同時に手足関節の膨らみが観察できた。したがって、抗体投与群（ガラクトース付加卵黄抗体をMRL/lprマウスに経口投与した）と、ガラクトース付加卵黄抗体未投与群（コントロール群）（MRL/lprマウスに滅菌水のみを投与した）とのIgG型リウマチ因子濃度を比較することにより効果判定が可能である。
測定方法：
試薬：IgG型マウスリウマチ因子測定法（市川厚編：関節炎（３）MRL/ｌマウス関節炎、炎症とアレルギー（Ｉ-2）、廣川生物薬科学実験講座１２巻、廣川書店、1993）に従って調製した。
操作方法：96 wellに固相化した抗原（IgG型マウスリウマチ因子と反応する蛋白）wellに検体（ガラクトース付加卵黄抗体投与群MRL/lprマウスから採血した血清）を希釈後、100μl/wellを添加して室温で２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、POD標識マウスIgG抗体を100μl/wellの割合で添加して室温でさらに２時間反応させた。反応後、未反応部分を洗浄液で洗浄して、発色液（TMB）を100μl/wellの割合で添加して室温で２０分間反応させた後、反応停止液を100μl/wellの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダー（450nm）で測定した。
評価結果
滅菌水投与群と、免疫卵分画３と免疫卵分画４とをそれぞれ投与した免疫卵分画投与群のMRL/lprマウスは、飼育加齢と共に、自己抗体濃度が上昇した。これに対して、免疫卵分画１投与群のMRL/lprマウスの自己抗体濃度は上昇しないので、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用があることが証明された。また、免疫卵分画２投与群のMRL/lprマウスの自己抗体濃度は、僅かに上昇した後、減少し、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用があることが証明された（図３，４参照）。更に、免疫卵全体も、MRL/lprマウスの自己抗体濃度は、対象群に比較して低く、自己免疫疾患の自己抗体産生を抑制する作用を有していると言える（図２参照）。
したがって、ガラクトース付加卵黄抗体は、自己免疫疾患である関節リウマチの治療並びに予防効果があることが証明された。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
（実施例６）
実施例２で示した免疫卵並びにノーマル卵を卵黄分離して脱脂した後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィを２回とイオン交換カラムクロマトグラフィを１回行って精製をして回収した免疫卵由来卵黄抗体に結合したガラクトース量と、ノーマル卵由来卵黄抗体に結合したガラクトース量を比較した。
測定方法：
各卵黄抗体 3μg/mlを0.1M 炭酸バッファ、pH 9.5に溶解した溶液を100μl/wellの割合で96well（ヌンク社製）の各ウエルに添加して、25℃で２時間コーテイングした。コーティング後、３回洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）で洗浄した後、各ウエルにコーティング液（25% Block Ace；10mM リン酸バッファ、pH 7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）を250μl/wellの割合で添加し、25℃で２時間コーテイングした。次いで、洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH7.2；150mM NaCl；0.05% Tween 20）で３回洗浄した後、反応液（Biotin conjugated RCA120*；*RCA120：ガラクトース残基特異結合レクチン）を100μl/wellの割合で各ウエルに添加し、25℃で１時間反応させた。次に、各ウエルにAvidin conjugated HRPを100μl/wellの割合で添加し、25℃で1時間反応させた。反応後、各ウェルを洗浄液（10mM リン酸バッファ、pH 7.2；150mM NaCl; 0.05% Tween 20）で３回洗浄した。洗浄後、発色液（TMB）を100μl/wellの割合で添加して室温で１０分間反応させた後、反応停止液（1M H２SO４）を100μl/wellの割合で添加して反応を停止させた。次いで、各ウェルをイムノリーダーで吸光度（450nm/620nm）を測定した。
測定結果：
上記のようにしてノーマル卵と免疫卵の各３個より精製した卵黄抗体結合ガラクトース量を測定した結果、ノーマル卵由来卵黄抗体結合ガラクトース量のAbs.値(吸光度)を１００％としたときに、免疫卵由来卵黄抗体結合ガラクトース量は１５４％であったことが判明した。
この測定結果より、ノーマル卵と比較して、アジュバンド接種により卵黄抗体結合ガラクトース量が１．５倍も付加されたことが判る（図９参照）。