(57)【要約】    【課題】  微生物から高純度で且つ簡便にマルトース−１−リン酸生成酵素を製造する方法を提供する。    【解決手段】  ５０ｍＭ以上のリン酸類又はその塩を含有する培地中でマルトース−１−リン酸生成酵素生産微生物を培養し、培地中に生成されたマルトース−１−リン酸生成酵素を採取することを特徴とするマルトース−１−リン酸生成酵素の製造法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０ｍＭ以上のリン酸類又はその塩を含有する培地中でマルトース−１−リン酸生成酵素生産微生物を培養し、培地中に生成されたマルトース−１−リン酸生成酵素を採取することを特徴とするマルトース−１−リン酸生成酵素の製造法。
【請求項２】
マルトース−１−リン酸生成酵素生産微生物がコリネバクテリウム属の細菌である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
リン酸類又はその塩の濃度が５０ｍＭ以上であるマルトース−１−リン酸生成酵素生産用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物からマルトース−１−リン酸生成酵素を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マルトース−１−リン酸は、ほうれん草のクロロプラスト（例えば、非特許文献１参照）やMycobacteriumの菌体内（例えば、非特許文献２参照）に存在する。その生理活性として、各種細胞接着阻害に関与することが報告され（例えば、非特許文献３、４及び５参照）、食品や化粧品、ｐＨ緩衝剤、酵素の基質原料等として利用可能である。
【０００３】
マルトース−１−リン酸の製造には、マルトース−１−リン酸生成酵素を利用する方法が知られており、斯かるマルトース−１−リン酸生成酵素として、Actinoplanes missouriensisのマルトースキナーゼ（例えば、非特許文献６参照）やほうれん草に含まれるマルトース合成酵素（例えば、非特許文献７参照）が報告されている。しかしながら、前者はマルトースとリン酸を基質に反応する際にＡＴＰが必要であり、後者は基質にグルコース−１−リン酸が２分子必要となるため、これらを用いた方法では基質が高価であり、マルトース−１−リン酸の工業的生産に用いることは実用的ではない。
【非特許文献１】FEBS  Letters  1976, 61(2):192-3
【非特許文献２】Enzyme Microb. Technol. 1995,17,140-146
【非特許文献３】Atherroscleosis 1998、136(2):297-303
【非特許文献４】Acta Histochem. 1997、99(4):401-410
【非特許文献５】J. Immunol. 1989、143(11):3666-3672
【非特許文献６】Arch Microbiol. 2003、180(4):233-239
【非特許文献７】Planta. 1982、154:87-93
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、マルトオリゴ糖やデキストリンや澱粉等のグルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖を原料とし、大量のマルトース−１−リン酸の生成を可能とするマルトース−１−リン酸生成酵素の製造法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、自然界からマルトース−１−リン酸を培地中に生成し得る微生物及び酵素を探索したところ、グルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖とリン酸類又はその塩からマルトース−１−リン酸を生成し得る、全く新しいタイプのマルトース−１−リン酸生成酵素が存在し、当該酵素は、リン酸高濃度培地上で当該酵素生産微生物を培養することにより、培養上清中に高収率で生産されることを見出した。
【０００６】
すなわち本発明は、５０ｍＭ以上のリン酸類又はその塩を含有する培地中でマルトース−１−リン酸生成酵素生産微生物を培養し、培地中に生成されたマルトース−１−リン酸生成酵素を採取することを特徴とするマルトース−１−リン酸生成酵素の製造法を提供するものである。
【０００７】
また本発明は、リン酸類又はその塩の濃度が５０ｍＭ以上であるマルトース−１−リン酸生成酵素生産用培地を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、微生物を培養した後、培養上清の回収（細胞除去）、精製といった極めてシンプルな工程で、効率よく簡便にマルトース−１−リン酸生成酵素を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のマルトース−１−リン酸生成酵素生産微生物は、菌体内あるいは細胞内にマルトース−１−リン酸生成酵素を有する微生物であり、一定濃度のリン酸類又はその塩の存在下、培養上清中にマルトース−１−リン酸生成酵素を産生するものであればよく、例えば、コリネバクテリウム属細菌、具体的にはCorynebacterium sp. JCM1300、Corynebacteriumflavescens、Corynebacterium glutamicum、Corynebacteriumhoagii、Corynebacterium vitaeruminis、Corynebacteriumpilosum、Corynebacterium amycolatum、Corynebacterium matruchoti、Corynebacteriumminutissimum、Corynebacterium striatum、Corynebacteriumcallunae等が挙げられ、特にCorynebacterium sp. JCM1300、 Corynebacterium flavescens JCM1317、 Corynebacterium glutamicum JCM1318、 Corynebacterium hoagii JCM1319、 Corynebacteriumglutamicum JCM1321、 Corynebacterium vitaeruminis JCM1323、 Corynebacterium pilosum JCM3714、 Corynebacterium amycolatum JCM7447、 Corynebacterium matruchotii JCM9386、 Corynebacterium minutissimum JCM9387、 Corynebacterium striatum JCM9390、 Corynebacterium callunae IFO15359が好ましく、酵素の生産性の高さの点から、Corynebacterium sp. JCM1300、Corynebacterium hoagii JCM1319、Corynebacterium glutamicum JCM1321、Corynebacterium callunae IFO15359がさらに好ましい。
【００１０】
マルトース−１−リン酸生成酵素の製造は、上記マルトース−１−リン酸生成酵素生産微生物を、５０ｍＭ以上のリン酸類又はその塩を含有する培地（マルトース−１−リン酸生成酵素生産用培地）中で培養することにより行われる。
【００１１】
リン酸類又はその塩としては、例えばリン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、二リン酸、ポリメタリン酸及びこれらの塩類が挙げられ、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。特に好ましいリン酸類の塩としては、例えばリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等が挙げられる。
【００１２】
培地中のリン酸類又はその塩の濃度は、５０ｍＭ以上であるのが好ましく、より好ましくは５０ｍＭ〜２Ｍ、さらに好ましくは１００ｍＭ〜１２００ｍＭ、特に４００〜１０００ｍＭが好ましい。
【００１３】
本発明において用いられる培地は、マルトース−１−リン酸生成酵素生産微生物が生育できるものであればよく、上記のリン酸及びその塩の他に、炭素源、窒素源、金属ミネラル類、ビタミン類等を含有する液体培地等が使用できる。
ここで、培地に添加される糖（炭素源）としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖が挙げられ、これらの二種以上を混合して用いても良い。このうち、グルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖を用いるのが好ましく、例えばデンプン、アミロース、デキストリン、マルトース、マルトオリゴ糖、アミロペクチン、グリコーゲン、デンプン分解物等が挙げられる。
【００１４】
糖質以外の炭素源としては、例えば酢酸塩等の有機酸塩が挙げられ、窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機及び有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物等の窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸、アラニン、メチオニン等のアミノ酸等が挙げられ、金属ミネラル類としては、例えば塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等が挙げられ、これらを単独で又は必要に応じ混合して用いればよい。
【００１５】
培養方法は、微生物が十分に生育できる条件となるようｐＨ及び温度を適宜調整して行われる。また、培養手段は、振とう培養、嫌気培養、静置培養、醗酵槽による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
【００１６】
斯くして、本発明のマルトース−１−リン酸生成酵素は、培養上清中に生産蓄積され、これを採取すれば当該酵素を容易に得ることができる。また、固定化酵素を作製する際にも菌体外へ産生させることにより煩雑な操作をすることなく可能である。
【００１７】
培地中からマルトース−１−リン酸生成酵素を採取する方法は、公知の方法に従って行えば良く、例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を分離除去し、限外濾過、塩析、溶剤沈殿、イオン交換、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過、乾燥などを組み合わせることによって、酵素を濃縮することができる。塩析法としては例えば硫酸アンモニウム、溶剤沈殿としては例えば冷アセトン等が用いられ、酵素を沈殿させた後、遠心分離、脱塩処理を行い凍結乾燥粉末や噴霧乾燥粉末を得ることができる。脱塩方法としては透析、セファデックスＧ−１０（ファルマシア）等を用いるゲル濾過、限外濾過等が用いられる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるがさらに公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１８】
斯くして得られる本発明のマルトース−１−リン酸生成酵素は、グルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖とリン酸類又はその塩からマルトース−１−リン酸を生成し得る従来知られていない全く新しいタイプのマルトース−１−リン酸生成酵素である。その酵素学的性質について、以下に説明する。
尚、酵素活性の測定は、基質に２％デキストリンマックス１０００及び１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用い、適宜希釈した酵素を加え、３７℃にて1時間保温後、生成したマルトース−1−リン酸をＨＰＬＣにて定量することにより行った（実施例１参照）。
１）作用
グルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖及びリン酸類又はその塩からマルトース−１−リン酸を生成する。
すなわち、本発明酵素は、リン酸類又はその塩の存在下において、グルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖に作用して、マルトース単位を認識して加リン酸分解をするホスホリラーゼ活性を有する。ホスホリラーゼは、これまでグルコース等、単糖を認識してグルコース−1―リン酸等を生成する酵素しか報告されておらず、このように二糖を認識して二糖リン酸を生成するタイプものはこれまでに全く知られていない。
一方、本発明酵素は、リン酸類の非存在下においては、マルトオリゴ糖に作用して、マルトース単位で転移をする。すなわち、マルトヘキサオース（ＤＰ＝６）に作用させることにより、マルトオリゴ糖（ＤＰ＝４、ＤＰ＝６、ＤＰ＝８、ＤＰ＝１０等）が、また、マルトヘプタオース（ＤＰ＝７）に作用させることにより、マルトオリゴ糖（ＤＰ＝５、ＤＰ＝７、ＤＰ＝９、ＤＰ＝１１等）が生成するように、マルトペンタオース以上のオリゴ糖に作用してマルトース単位で転移する活性を有する。従来、マルトシルトランスフェラーゼは、Eur. J. Biochem. (1998) 250, 1050-1058に報告があるが、当該酵素に、マルトース−１−リン酸を生成するという報告は無い。また、従来のマルトシルトランスフェラーゼは、マルトトリオース（ＤＰ＝３）等の低分子に作用し、ＤＰ＝３以上のオリゴ糖に作用させたとき、低分子のＤＰ＝１〜３の低重合度オリゴ糖を生成するが、本発明の酵素は、マルトオリゴ糖ＤＰ＝３，４にはほとんど作用せず、マルトオリゴ糖ＤＰ＝５には作用しにくい。また、ＤＰ＝５以上のマルトオリゴ糖に作用させてもＤＰ＝１〜３の低重合度のオリゴ糖をほとんど生成しない。従って、本発明酵素は従来のマルトシルトランスフェラーゼとは異なる酵素である。
かように、本発明の酵素は、グルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖に作用して、マルトース単位を認識して加リン酸分解をするホスホリラーゼ活性とマルトース単位で伸長していくマルトース転移活性を有するこれまでに知られていない全く新しいタイプの酵素である。以上より、本発明酵素は、マルトデキストリン・マルトシルホスホリラーゼ、マルトデキストリン：オルトリン酸−α−１−マルトシルトランスフェラーゼ、又はマルトシルトランスフェラーゼのように命名できる。
【００１９】
本発明酵素の基質である、グルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖としては、５糖以上のオリゴ糖及び多糖類のいずれでもよく、例えばデンプン、アミロース、デキストリン、マルトース、マルトオリゴ糖、アミロペクチン、グリコーゲン、デンプン分解物等が挙げられる。
【００２０】
リン酸類又はその塩としては、例えばリン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、二リン酸、ポリメタリン酸及びこれらの塩類が挙げられ、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。特に好ましいリン酸類の塩としては、例えばリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等が挙げられる。
上記基質の濃度は特に規定しないが、リン酸類及びリン酸塩は５０ｍＭ〜２Ｍが好ましく、さらに１００ｍＭ〜１２００ｍＭ、特に４００〜１０００ｍＭが好ましい。グルコース重合度５以上のα−１，４グルコシル結合を含むオリゴ糖又は多糖は、１〜７０質量％が好ましい。
【００２１】
２）基質特異性
リン酸類又はその塩との存在下で、グルコース重合度６以上のα−１，４グルコシド結合を含むオリゴ糖、多糖又はそれらの分解物によく作用してマルトース−１−リン酸を生成する。グルコース重合度５のオリゴ糖に若干作用し、重合度２〜４のオリゴ糖には殆ど作用しない。ここで、多糖としては、例えばアミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、澱粉等が挙げられる。
【００２２】
３）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量は約７５ｋＤａ（但し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法では測定条件により５ｋＤａ程度上下することがある）である。
【００２３】
４）至適ｐＨ
基質としてｐＨ５．５〜８．５の各ｐＨの７００ｍＭリン酸緩衝液及び２％マルトヘプタオース（Ｇ７：生化学工業）を用い、精製酵素を０．２８Ｕ／ｍＬとなるように加え、３７℃、１時間反応させ、酵素活性を測定した場合、至適ｐＨは６．５〜８．０付近であり、ｐＨ５．５〜８．５範囲で、ｐＨ７．５（最大活性）との相対活性５０％を示す。
【００２４】
５）至適温度
基質として１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）及び２％マルトヘプタオース（Ｇ７：生化学工業）を用い、精製酵素０．１６８Ｕ／ｍＬとなるように加え、３０℃〜７０℃の各温度にて１時間反応させ、９５℃で１０分間処理し酵素を失活させ、反応液を１０１倍希釈して酵素活性を測定した場合、至適温度は３５〜５０℃であり、３０℃〜５５℃の広い範囲で活性を有する。
【００２５】
本発明の製造法によれば、直接菌体外にマルトース−１−リン酸生成酵素を生産させることが可能であり、菌体破砕など煩雑な操作がなく当該酵素を得ることが可能である。さらに、低分子化合物であるリン酸類を培地に添加するだけなので、精製工程への負荷も大きく低減され、当該酵素高純度品の調製も容易である。
そして、本発明によれば、培養液中に、特別な操作なく、マルトース−１−リン酸を生産させることが可能である。さらに、アグリコンとなる化合物及びマルトース−１−リン酸を培養液と直接作用させることによって、特別な操作なく配糖体を得ることも可能である。
【実施例】
【００２６】
実施例１  マルトース−１−リン酸生成酵素の活性測定法
マルトース−１−リン酸生成酵素の活性測定を検討し、次の反応条件を設定した。
基質には２％デキストリンマックス1000及び１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）の条件下、適宜希釈した酵素を加え、３７℃にて1時間保温後、生成したマルトース−1−リン酸を実施例１で示したHPLCにて定量した。すなわち、マルトース−１−リン酸は、DIONEX社のDX５００クロマトグラフィシステムにて定量した。カラム：CarboPac PA1（４×２５０ mm）、検出器：ED４０パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ ｍＭ水酸化ナトリウム溶液Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ ｍＭ水酸化ナトリウムを用いた。注入から初期濃度Ａ液９０％：Ｂ液１０％、０〜１７分Ａ液１８．５％：Ｂ液８１．５％のリニアグラジエントにより分析した。標準として１００ ｍＭ、５０ ｍＭのSIGMA社マルトース−１−リン酸を用いた。約１５．５分にピークが現れた。1分間で１μＭのマルトース−1―リン酸を生成する量を１Ｕ（ユニット）とした。
【００２７】
実施例２  マルトース−１−リン酸生成酵素の生産
使用菌株はCorynebacterium glutamicum JCM1321を使用した。菌をＳＣＤ寒天培地（日本製薬）に塗末し、３０℃にて一晩生育させた。種培養としては、０．５％ 酵母エキス、４％ アミノ酸調味液Ｋ（味の素）、３％ 液糖マルトリッチ（昭和産業）、１００ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）の培地をヒダ付き三角フラスコに５０ ｍＬ仕込み、生育した菌株を１白金耳接種し、３０℃、２１０ ｒｐｍで一晩振とう培養を行った。主培養としては、０．５％ 酵母エキス、１％ アミノ酸調味液Ｋ（味の素）、０．５％ 硫酸アンモニウム、１０％ デキストリンマックス1000（松谷化学）、１０％塩化カルシウム２水和物、２００ｐｐｍ 硫酸マグネシウム、２５ｐｐｍ塩化第二鉄、４００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）の培地を１６０本のヒダ付き三角フラスコに５０ ｍＬ仕込み、種菌を１％植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養を行った。
培養上精中にマルトース−１−リン酸生成酵素が２４０Ｕ／Ｌ生産された。
【００２８】
実施例３  マルトース−１−リン酸生成酵素の単離精製
実施例２で得られた本培養液６Ｌを遠心分離後、上精を限外濾過モジュールACP-13000（旭化成）により濃縮し、１０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）にて透析を行った。濃縮透析液をDEAE−Toyopearl 650Mカラム（東ソー；５×１５ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液２Ｌで洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウム１．５Ｌにて溶出させ、粗酵素液を得た。
粗酵素液は、BIO-CAD６０システム（パーセプティブ）により精製を進めた。まず、粗酵素液１５８０ｍＬに１Ｍ硫酸アンモニウムを加え、１Ｍ硫酸アンモニウムと５０ｍＭリン酸緩衝液にて平衡化した疎水クロマトカラムPOROS PE/M（φ１０×１００ｍｍ）に添着させ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中で１０００ ｍＭから３６０ｍＭの硫安の濃度勾配で１５０ｍＬを、次いで３６０ ｍＭ〜０ ｍＭまでの硫安濃度勾配で３７５ｍＬを流速１２ｍＬ／分にて流した。その結果、約３６０ｍＭ硫安で溶出されたフラクションにマルトース−１−リン酸生成酵素のピークが認められた。活性フラクションは１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中で透析し、酵素液７４ｍＬを得た。
透析酵素溶液はさらに、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された陰イオン交換カラムPOROS HQ/M（φ１０ｘ１００ｍｍ）添着させ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中で０から５０ｍＭまでの塩化ナトリウムの濃度勾配で４５０ｍＬを流速１２ｍＬ／分で流した。その結果、非吸着画分から濃度勾配が始まった直後に活性画分が現れ、その画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中で透析を行い、９．３ｍＬの酵素液を得た。
再度本酵素液を同様な条件で陰イオン交換カラムPOROS HQ/M（φ１０ｘ１００ｍｍ）処理を行った結果、塩化ナトリウムの濃度勾配が始まった直後にマルトース−１−リン酸生成酵素と思われるピークを検出した。
ピークトップのフラクションをCentriprep YM-3（MILLIPORE）により０．６ｍＬまで１０倍濃縮し、SDS-PAGEを行った結果、ほぼ単一のバンドを検出し、分子量約７５ｋＤａと推定された。さらに、本サンプルのアミノ末端のアミノ酸配列を決定したところ、Gly-Arg-Leu-Gly-Ile-Asp-Asp-Val-Arg-Pro-Arg-Ile-Leu-Asp-Gly-Asn-Pro-Ala-Lys-Ala-Val-Val-Gly-Glu-Ile-Val-Pro-Val-Ser-Ala-Ile-Val-Trp-Arg-Glu（配列番号１）であった。
【００２９】
実施例４  菌体内外のマルトース−１−リン酸生成酵素活性
菌株としては、Corynebacteriumglutamicum JCM1318、Corynebacterium hoagii JCM1319、Corynebacteriumglutamicum JCM1321、Corynebacterium vitaeruminis JCM1323、Corynebacteriumcallunae IFO15359を用いた。菌株をSCD寒天プレート（日本製薬）に塗末し、３０℃にて一晩培養した。種培養には大試験管１０ｍL仕込みの０．６７％Yeast Nitrogen Base（Difco）に菌株を一白金耳植菌し、３０℃で一晩、２５０ｒｐｍで振とう培養を行った。
主培養は０．６７％Yeast Nitrogen Base(Difco)、１０％デキストリンマックス１０００（松谷化学）を含む培地に、４００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した培地あるいは添加しない培地にて３５℃で６日間、２５０ｒｐｍ振とう培養を行った。 
１ｍｌの培養液を遠心分離し、菌体と培養上清に分離した。菌体外のM1P生成酵素活性は培養上清をそのまま用いた。一方、菌体内の酵素活性は集められた菌体を培養液と等量の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁させ、遠心分離にて菌体を分離し洗浄した。さらに、培養液と等量の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁させ、５０μｌのトルエンを加え強く攪拌することで、菌体を破壊し、活性測定用酵素液とした。活性測定は実施例１に示した方法で行った。活性測定の結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
2005328721.tif 000002
【００３１】
以上の結果より、リン酸無添加条件では、菌体内にのみ活性が認められたが、リン酸高濃度条件化で培養することによって、マルトース−１−リン酸生成酵素活性が向上し、菌体内から培養上清にマルトース−１−リン酸生成酵素が遊離することが示唆された。
【００３２】
参考例  マルトース−１−リン酸生成酵素の酵素学的性質
（１）至適ｐＨ
基質としてｐＨ５．５〜８．５の各ｐＨの７００ ｍＭリン酸緩衝液及び２％マルトヘプタオース（G7：生化学工業）を用い、精製酵素を０．２８Ｕ／ｍＬとなるように加え、３７℃、１時間反応させた。９５℃で１０分間処理することにより反応を停止させ、反応液を１０１倍希釈して実施例１のHPLC手法によりマルトース−1−リン酸を定量した。
その結果、図１に示すように、至適ｐＨは６．５〜８．０付近であり、ｐＨ５．５〜８．５の範囲でｐＨ７．５との相対活性５０％を示し、広く反応することが判った。
【００３３】
（２）至適温度
基質として１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）及び２％マルトヘプタオース（G7：生化学工業）を用い、精製酵素０．１６８Ｕ／ｍＬとなるように加え、３０℃〜７０℃の各温度にて１時間反応させ、９５℃で１０分間処理し酵素を失活させ、反応液を１０１倍希釈して実施例１のHPLC手法によりマルトース−1−リン酸を定量した。その結果、図２に示すように、至適温度は３５℃〜５０℃付近であり、３０℃〜５５℃の広い範囲で活性を有していた。
【００３４】
（３）基質特異性
（ｉ）デキストリンとリン酸からマルトース−１−リン酸を生成する反応
０．１６Ｕ／ｍＬのマルトース−１−リン酸生成酵素と２．５％デキストリンマックス1000（松谷化学）及び２５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を３７℃にて１５時間反応させ、実施例１に示す手法にてマルトース−１−リン酸を定量した。その結果、１４５μＭのマルトース−１−リン酸を生成した。
（ii）各種マルトオリゴ糖とリン酸からのマルトース−１−リン酸を生成する反応
０．１６Ｕ／ｍＬのマルトース−１−リン酸生成酵素と２．５％の各鎖長の異なった基質（グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース（生化学工業））及び２５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を３７℃にて１５時間反応させ、実施例１に示す手法にてマルトース−１−リン酸を定量した。その結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
2005328721.tif 000003
【００３６】
(iii)マルト−ス転移反応
０．１６Ｕ／ｍＬのマルトース−１−リン酸生成酵素と２．０％の各鎖長の異なった基質（グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース（生化学工業））を３７℃にて1時間反応させ、実施例１に示す手法にてHPLC分析を行った（結果はピーク面積で示す）。マルトオリゴ糖（ＤＰ＝１〜１１）の保持時間はデキストリン（松谷化学）分析から推定した。その結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】
2005328721.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明酵素のｐＨ−活性曲線を示す図である。
【図２】本発明酵素の温度−活性曲線を示す図である。
【図１】
2005328721.tif 000005
【図２】
2005328721.tif 000006
【配列表】
2005328721000001.app