(57)【要約】【課題】  感染、特に細菌性感染を処置するためのインドリシジンアナログを提供する。【解決手段】  インドリシジンアナログであって、８〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：RXZXXZXB（ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；そしてＢは塩基性アミノ酸である）、アナログ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドリシジンアナログであって、８〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
RXZXXZXB
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；そしてＢは塩基性アミノ酸である、アナログ。
【請求項２】
インドリシジンアナログであって、８〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
BXZXXZXB
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；そして少なくとも１つのＺがバリンである、アナログ。
【請求項３】
インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
BBBXZXXZXB
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；そしてＢは塩基性アミノ酸である、アナログ。
【請求項４】
インドリシジンアナログであって、17〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
BXZXXZXBBBn(AA)nMILBBAGS
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；ＡＡは任意のアミノ酸であり；そしてｎは０または１である、アナログ。
【請求項５】
インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
BXZXXZXBB(AA)nM
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；ＡＡは任意のアミノ酸であり；そしてｎは０または１である、アナログ。
【請求項６】
インドリシジンアナログであって、８〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
LBBnXZnXXZnXRK
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；そしてｎは０または１である、アナログ。
【請求項７】
インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
LKnXZXXZXRRK
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；そしてｎは０または１である、アナログ。
【請求項８】
インドリシジンアナログであって、11〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
BBXZXXZXBBB
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；そして少なくとも２つのＸ残基はフェニルアラニンである、アナログ。
【請求項９】
インドリシジンアナログであって、11〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み：
BBXZXXZXBBB
ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；そして少なくとも２つのＸ残基はチロシンである、アナログ。
【請求項１０】
Ｚがプロリンであり、Ｘがトリプトファンであり、そしてＢがアルギニンまたはリジンである、請求項１、および３〜７のいずれかに記載のアナログ。
【請求項１１】
以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ：
Lys Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Lys Leu Ile;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Lys Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Leu Ile;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Ile Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
lle Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Asp Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Trp Arg Ile Trp Lys Pro Lys Trp Arg Leu Pro Lys Trp;
Ile Leu Lys Lys Trp Val Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Val Trp Trp Val Trp Arg Arg Lys; 及び
Lys Arg Arg Trp Val Trp Trp Val Trp Arg Leu Ile.
【請求項１２】
以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ：
Ile Leu Lys Lys Ile Pro Ile Ile Pro Ile Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Tyr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Tyr Pro Trp Tyr Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Phe Pro Trp Phe Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Phe Pro Phe Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Tyr Val Tyr Tyr Val Tyr Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Ile Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Met;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Ile Met;
Ile Leu Lys Lys Trp Trp Trp Pro Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Val Trp Trp Val Trp Arg Arg Lys; 及び
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Arg Arg Lys.
【請求項１３】
以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ：
Ile Leu Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Met;
Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp;
Ile Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg; 及び
Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys.
【請求項１４】
以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ：
Ala Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Ala Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Ala Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Ala Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Ala Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Ala Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Ala Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Ala Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Ala Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Ala Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Ala Lys; 及び
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Ala.
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、微生物に起因する感染の処置、ならびにより詳細には、インドリシジンアナログを含む組成物、ポリマー修飾アナログ、および感染を処置する際のそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの健常個体に対して、感染は刺激性であるが、一般に生命を脅かすことはない。多くの感染は、個体の免疫系により首尾良く撃退される。処置は、補助的であり、そして一般に先進国においては容易に利用可能である。しかし、感染性疾患は、発展途上国および免疫寛容化された個体においては深刻な問題である。
【０００３】
発展途上国において、適切な衛生設備の欠如およびそれに伴う貧弱な衛生状態は、細菌性、寄生生物性、真菌性、およびウイルス性の感染を助長する環境を提供する。貧弱な衛生状態および栄養欠乏は、感染因子による侵入に対する天然の障壁（例えば、皮膚および粘膜）の有効性、または感染因子を除去する免疫系の能力を低減させ得る。同様に、病原体の恒常的な攻撃は、抗体産生および食細胞（例えば、多型好中球）の免疫系防御に対して亜正常レベルへとストレスを与え得る。宿主防御の破壊もまた、循環系の障害、機構的障壁、疲労、喫煙、過度の飲酒、遺伝的欠損、AIDS、骨髄移植、ガン、および糖尿病のような状態に起因して起こりうる。世界で漸増的に拡がる問題は、HIV陽性である個人における日和見感染である。
【０００４】
ワクチンは、これらの機構のいくつかに対して防御するのに利用可能であり得るが、ワクチン接種は、不適切な送達機構および経済的な貧困のような因子に起因して、常に可能でもなく、かつ感染の際の遅すぎる送達、患者がワクチンに対する免疫応答を惹起することができないこと、または病原体の進化などに起因して効果的でもないこともあり得る。他の病原因子については、ワクチンは利用可能ではない。感染に対する防御が可能でない場合、感染の処置が、一般に探求される。処置の兵器において主要な武器は抗生物質である。抗生物質は、多くの細菌に対して効果的であり、そして数え切れない生命を救ってきたが、それらは万能ではない。特定の状況での抗生物質の過度の使用により、耐性細菌株の拡散が促進されてきている。そして非常に重要なことに、抗細菌剤はウイルス感染には有用ではない。
【０００５】
種々の生物は、微生物に対する非特異的な防御機構の一部として使用されるカチオン性（正に荷電した）ペプチド、分子を産生する。単離される場合、これらのペプチドは、広範な種々の微生物（細菌、真菌、および特定のエンベロープウイルス）に毒性である。好中球において見い出される一つのカチオン性ペプチドはインドリシジンである。インドリシジンは、多くの病原体に対して作用するが、顕著な例外および種々の程度の毒性が存在する。
【０００６】
カチオン性ペプチドは、種々の病原性細胞（グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、および真菌）に対してインビトロにおいて効力を示すが、これらのペプチドは、一般に、注入される場合、哺乳動物に対して毒性であり、そして治療指標は通常非常に小さい。毒性を低減させるアプローチには、毒性応答に関与する構造要素を遮蔽するかまたは低用量での効力を改善する誘導体または送達系の開発が挙げられる。評価中の他のアプローチには、ペプチド、タンパク質、および疎水性薬物の臨床影響を改善するリポソーム系およびミセル系、ならびに水性培地中の投与の間の疎水性表面を隔絶するためのシクロデキストリンが挙げられる。例えば、ポリエチレングリコール（PEG）ポリマーの結合（最も頻繁にはアミノ基の修飾による）は、アスパラギナーゼおよびアデノシンデアミナーゼのようないくつかのタンパク質の医学的価値を改善し、そしてインターロイキンのようなペプチドの循環器半減期を増大させる。
【０００７】
これらのアプローチでカチオン性の投与を改善するものは示されていない。例えば、アシル化反応によりペプチドを修飾し得るポリソルベート誘導体の段階的な合成のための方法が開発されてきているが、アシル化は、修飾カチオン性ペプチドの電荷を変化させ、そしてしばしば、化合物の抗微生物活性を低減または消長させる。従って、カチオンペプチドならびに他のペプチドおよびタンパク質の送達について、増大された循環系半減期の特性とミセル構造を形成する能力の特性とを組み合わせた系への需要が存在する。
【０００８】
本発明は、範囲および効果を拡張しそして、さらに、他の関連する利点を提供するように設計されたインドリシジンのアナログを開示する。本発明はまた、毒性を低減させるためにペプチド、タンパク質、抗生物質などを修飾し、かつ他の利点を提供するための方法および組成物を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、一般に、インドリシジンアナログを提供する。関連する局面において、25アミノ酸までを含み、そして以下の式を含むインドリシジンアナログが提供される：RXZXXZXB；BXZXXZXB（ここで、すくなくとも１個のＺはバリン）；BBBXZXXZXB；BXZXXZXBBBn(AA)nMILBBAGS；BXZXXZXBB(AA)nM；LBBnXZnXXZnXRK；LKnXZXXZXRRK；BBXZXXZXBBB、（ここで、少なくとも２個のＸ残基がフェニルアラニンである）；BBXZXXZXBBB（ここで、少なくとも２個のＸ残基がチロシンであり；そしてここでＺがプロリンまたはバリンであり；Ｘが疎水性残基であり；Ｂが塩基性アミノ酸であり、AAは任意のアミノ酸であり、そしてｎは０または１である）。好ましい実施態様において、Ｚはプロリンであり、Ｘはトリプトファンであり、そしてＢはアルギニンまたはリジンである。他の局面において、特定の配列を有するインドリシジンアナログが提供される。特定の実施態様において、インドリシジンアナログは、カップリングされて分枝ペプチドを形成する。他の実施態様において、アナログは、対応するD-アミノ酸に変換された１つ以上のアミノ酸を有し、そして特定の好ましい実施態様において、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸は、D-アミノ酸である。他の好ましい修飾は、Ｎ末端アミノ酸がアセチル化されているアナログ、Ｃ末端アミノ酸がアミド化されているアナログ、Ｃ末端アミノ酸がエステル化されているアナログ、ホモセリン／ホモセリンラクトンのＣ末端アミノ酸における組込みより修飾されているアナログ、およびポリエチレングリコールまたはその誘導体と結合されているアナログを含む。
他の局面において、本発明は、単離された核酸分子（その配列は、１つ以上のインドリシジンアナログのコード配列を含む）、発現ベクター、および発現ベクターでトランスフェクトされているかまたは形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１０】
他の局面は、少なくとも１つのインドリシジンアナログおよび生理学的に受容可能な緩衝液、必要に応じて抗生物質を含む薬学的組成物を提供する。好ましい組合せは、ILKKFPFFPFRRKおよびシプロフロキサシン；ILKKFPFFPFRRKおよびムプロシン；ILKKYPYYPYRRKおよびムピロシン；ILKKWPWWPWRKおよびムピロシン；ILRRWPWWPWRRRおよびピペラシリン；WRIWKPKWRLPKWおよびシプロフロキサシン；WRIWKPKWRLPKWおよびムピロシン；WRIWKPKWRLPKWおよびピペラシリン；ILRWVWWVWRRKおよびピペラシリン；ならびにILKKWPWWPWKおよびムピロシン。他の実施態様において、薬学的組成物は、さらに、抗ウイルス剤（例えば、アシクロビル；塩酸アマンタジン；ジダノシン；エドクスジン；ファムシクロビル；ホスカルネット；ガンシクロビル；イドクスウリジン；インターフェロン；ラミブジン；ネビラピン；ペンシクロビル；ポドフィロトキシン；リバビリン；リマンタジン；ソリブジン；スタブジン；トリフルリジン；ビダラビン；ザルシタビン、およびジドブジン）；駆虫剤（例えば、8-ヒドロキシキノリン誘導体；キナ皮アルカロイド；ニトロイミダゾール誘導体；ピペラジン誘導体；ピリミジン誘導体；およびキノリン誘導体。アルベンダゾール；アトパクオン；リン酸クロロキン；クエン酸ジエチルカルバマジン；エフロルニチン；ハロファントリン；ヨードキノール；イベルメクチン；メベンダゾール；塩酸メフロキン；メラルソプロールＢ；メトロニダゾール；ニクロサミド；ニフルチモックス；パロモマイシン；ペンタミジンイセチオネート；ピペラジン；プラジカンテル；リン酸プリマキン；プログアニル；パモ酸ピランテル；ピリメタシン；パモ酸ピルビニウム；グルコン酸キニジン；硫酸キニン；スチボグルコン酸ナトリウム；スラミン；およびチアベンダゾール）；抗真菌剤（例えば、アリルアミン；イミダゾール；ピリミジン；およびトリアゾール、5-フルオロシトシン；アムホテリシンＢ；ブトコナゾール；クロルフェネシン；シクロピロックス；クリオキノール；クロトリマゾール；エコナゾール；フルコナゾール；フルシトシン；グリセオフルビン；イトラコナゾール；ケトコナゾール；ミコナゾール；塩酸ナフチフィン；ナイスタチン；硫化セレン；スルコナゾール；塩酸テルビナフィン；テルコナゾール；チオコナゾール；トルナフテート；およびウンデシレン酸）を含む。さらに他の実施態様において、組成物は、リポソームまたは徐放ビヒクルに取り込まれる。
【００１１】
さらに別の局面において、本発明は、感染を処置する方法を提供し、この方法は、治療的有効量の薬学的組成物を患者に投与する工程を含む。感染は、例えば、微生物（例えば、細菌（例えば、グラム陰性細菌もしくはグラム陽性細菌または嫌気性菌；例としては、Actinetobacter spp.、Enterobacter spp.,E.coli、H.influenzae、K.pneumoniae、P.aeruginosa,.S,marcescensおよびS.maltophilia、Bordetella pertussis；Bricella spp.；Campylobacter spp.；Haemophilus ducreyi；Helicobacter pylori；Legionella spp.；Moraxella catarrhalis；Neisseria spp.；Salmonella spp.；Shigella spp.およびYersinia spp.；E．faecalis、S.aureus、E.faecium、S.pyrogenes、S.pneumoniaeおよび凝固酵素陰性staphylococcus；Bacillus spp.；Corynebacterium spp.；Diphtheroids；Listeria spp.およびViridans Streptococcus；Closteridium spp.;Bacteroides spp.およびPeptostreptococcus spp.；Borrelia spp.；Chlamydia spp.；Mycobacterium spp.；Mycoplasma spp.；Propionibacterium acne；Rickettsia spp.；Treponema spp.およびUreaplasma spp.）、真菌（例えば、酵母および／またはカビ）、寄生生物（例えば、原生動物、線形動物、条虫類、および吸虫類（例えば、Babesia spp.；Balantidium coli；Blastocystis hominis；Cryptosporidium parvum；Encephalitozoon spp.；Entamoeba spp.；Giardia lamblia；Leishmania spp.；Plasmodium spp.；Toxoplasma gondii；Trichomonas spp.；Trypanosoma spp、Ascaris lumbricoides；Clonorchis sinensis；Echincoccus spp.；Faschiola hepatica；Fasciolopsis buski；Heterophyes heterophyes；Hymenolepis spp.；Schistosoma spp.；Taenia spp.；およびTrichinella spiralis））あるいはウイルス（例えば、αウイルス；アレナウイルス；ブンヤウイルス；コロナウイルス；エンテロウイルス；フィロウイルス；フラビウイルス；ハンタウイルス；HTLV-BLV;インフルエンザウイルス；レンチウイルス；リッサウイルス；パラミクソウイルス；レオウイルス；ライノウイルス；およびロタウイルス、アデノウイルス；サイトメガロウイルス；ヘパドナウイルス；モラシポックスウイルス（Molluscipoxvirus）：オルトポックスウイルス：パピローマウイルス；パルボウイルス；ポリオーマウイルス；単純ヘルペスおよびバリセロウイルス（Varicellovirus））により発症し得る。
【００１２】
他の局面において、組成物が提供され、この組成物はインドリシジンアナログおよび抗生物質を含む。さらに、デバイス（医療用デバイスであり得る）が提供され、このデバイスはインドリシジンでコーティングされそしてさらに抗生物質を含み得る。
【００１３】
他の局面において、本明細書中に記載されるいずれか一つと特異的に反応する抗体が提供される。抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体または単鎖抗体である。
【００１４】
好ましい局面において、本発明は、活性化ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸を含む結合体でのアミノ基の誘導体化により修飾された化合物を含む組成物を提供する。好ましい実施態様において、この結合体は、さらに、ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸を連結するソルビタンを含み、より好ましくは、ポリソルベートである。好ましい実施態様において、脂肪酸は、12〜18炭素であり、そしてポリオキシアルキレングリコールは、ポリオキシエチレン（例えば、鎖長が２〜100）である。特定の実施態様において、化合物は、ペプチドまたはタンパク質（例えば、カチオン性ペプチド（例えば、インドリシジンまたはインドリシジンアナログ））である。好ましい実施態様において、ポリオキシアルキレングリコールは、紫外光での照射により活性化される。
【００１５】
本発明はまた、活性化ポリオキシアルキレンおよび脂肪酸の結合体で修飾された化合物を作製する方法を提供する。この方法は以下：（a）活性化ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸の結合体とこの化合物との混合物を凍結させる工程；および（b）凍結混合物を凍結乾燥する工程を包含し；ここでその化合物は、遊離のアミノ酸を有する。好ましい実施態様において、化合物は、ペプチドまたは抗生物質である。他の好ましい実施態様において、工程（a）における混合物は、酢酸緩衝液中である。関連する局面において、この方法は、活性化ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸の結合体とこの化合物とを、修飾化合物を形成するのに充分な時間混合する工程（ここでこの混合物は8.5より大きいpHを有する炭酸緩衝液に存在し、そしてこの化合物は遊離アミノ基を有する）
を含む。修飾化合物は、逆相HPLCおよび／または有機溶媒からの沈降により単離され得る。
【００１６】
本発明はまた、少なくとも１つの修飾化合物および生理学的に受容可能な緩衝液を含む薬学的組成物を提供し、そして特定の実施態様において、本発明は、さらに、抗生物質、抗ウイルス剤、駆虫剤、および／または抗真菌剤を含む。この組成物は、感染（例えば、微生物（例えば、細菌、真菌、寄生生物、およびウイルス）により発症する）を処置するために使用され得る。
【００１７】
本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかになる。さらに、種々の参考文献が以下に示されており、これらは、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳述し、それゆえそれらの全体が参考として援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明を呈示する前に、その理解のために、本明細書で用いられる特定の用語の定義を呈示することが有用であり得る。
【００１９】
本明細書中のアミノ酸の名称は、標準の１つまたは３文宇コードのいずれかとして呈示される。大文字はＬ型アミノ酸を示し；小文字はＤ型アミノ酸を示す。
【００２０】
本明細書で用いられる「インドリシジン」は、抗微生物性のカチオン性ペプチドをいう。インドリシジン類は種々の生物から単離され得る。１つのインドリシジンは、ウシ好中球から単離され、そしてその天然形態中のカルボキシ末端でアミデート化された13アミノ酸のペプチドである(Selstedら、J．Biol．Chem．267:4292，1992)。インドリシジンのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。
【００２１】
本明細書で用いられる、インドリシジンの「ペプチドアナログ」、「アナログ」、または「改変体」は、長さが少なくとも５アミノ酸であり、少なくとも１つの塩基性アミノ酸(例えばアルギニンおよびリジン)を有し、そして抗微生物活性を有する。特に指示がなければ、命名されたアミノ酸はＬ型を意味する。塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、および誘導体を含む。疎水性残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、および誘導体を含む。
【００２２】
本発明の範囲内にはまた、メチル化(例えばαメチルバリン)、(特にアルキルアミンによるＣ末端アミノ酸の)アミデート化(例えばエチルアミン、エタノールアミン、およびエチレンジアミン)およびアミノ酸側鎖の修飾(リジンのεアミノ基アシル化など)のような化学的手段により修飾されたアミノ酸誘導体が含まれる。アナログに取り込まれ得る他のアミノ酸には、タンパク質中に一般に見出される20のＬアミノ酸、イミノアミノ酸、ヒドロキシリジンのような稀少アミノ酸、またはホモセリンおよびオルニチンのような非タンパク質アミノ酸に相当する任意のＤアミノ酸が含まれる。ペプチドアナログは、これら誘導体、およびＤアミノ酸を有さずまたは１つ以上を有し得る。さらに、ペプチドはまた、レトロ、インベルトまたはレトロ-インベルトペプチドとして合成され得る。
【００２３】
Ａ．インドリシジンアナログ類
上記のように、本発明はインドリシジンアナログを提供する。これらのアナログは、化学的方法、特に自動化ペプチド合成器を用いる方法により合成され、または組換え法により産生され得る。アミノ酸配列の選択は、本明細書に呈示される一般式により案内される。
【００２４】
１．ペプチドの特性
本発明はインドリシジンアナログを提供する。このアナログは、長さが少なくとも５または７アミノ酸であり、そして好ましくは15、20、25、27、30、または35アミノ酸を超えない。９〜14残基のアナログが好ましい。
【００２５】
本発明の範囲にあるペプチドアナログの一般式は以下のように呈示され得る：
ＲＸＺＸＸＺＸＢ (1)
ＢＸＺＸＸＺＸＢ (2)
ＢＢＢＸＺＸＸＺＸＢ (3)
ＢＸＺＸＸＺＸＢＢＢn(ＡＡ)nＭＩＬＢＢＡＧＳ (4)
ＢＸＺＸＸＺＸＢＢ(ＡＡ)nＭ (5)
ＬＢＢnＸＺnＸＸＺnＸＲＫ (6)
ＬＫnＸＺＸＸＺＸＲＲＫ (7)
ＢＢＸＺＸＸＺＸＢＢＢ (8)
ＢＢＸＺＸＸＺＸＢＢＢ (9)
【００２６】
ここで、標準の１文字アミノ酸略語が用いられ、そして；Ｚはプロリン、グリシンまたは疎水性残基であり、そして好ましくはＺはプロリンまたはバリンであり；Ｘはトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンのような、そして好ましくはトリプトファンである疎水性残基であり；Ｂは塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンまたはリジンであり；ＡＡは任意のアミノ酸、そしてｎは０または１である。式(2)において、少なくとも１つのＺはバリンであり；式(8)において、少なくとも２つのＸはフェニルアラニンであり；そして式(9)において、少なくとも２つのＸはチロシンである。さらなる残基が、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方に存在し得る。
【００２７】
上記のように、ＮまたはＣ末端を含む任意の残基の修飾は本発明の範囲内にある。Ｃ末端の好ましい修飾はアミデート化である。Ｃ末端のその他の修飾は、エステル化およびラクトン形成を含む。Ｎ末端修飾は、アセチル化、アシル化、アルキル化、ＰＥＧ化、ミリスチル化などを含む。さらに、ペプチドは、以下に記載されるように、修飾されてAPSペプチドを形成し得る。ペプチドはまた、放射活性標識、蛍光標識、マススペクトルタグ、ビオチンなどによるように標識され得る。
【００２８】
２．ペプチド合成
ペプチドアナログは、自動化手順による合成を含む標準的な化学的方法により合成され得る。一般に、ペプチドアナログは、カップリング試薬としてのHATUを用いる標準の固相Fmoc保護戦略を基に合成される。ペプチドは、これもまた側鎖官能基を脱保護する適切なスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸を用いて固相樹脂から切断される。粗製ペプチドは、調製用逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製される。分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動、またはイオン交換クロマトグラフィーのようなその他の精製方法が使用され得る。
【００２９】
tBoc保護戦略のような当該分野で公知のその他の合成手順、または異なるカップリング試薬などの使用が、等価なペプチドを産生するために採用され得る。
【００３０】
ペプチドは線状分子として、または分枝分子として合成され得る。代表的には、分枝ペプチドは、さらなるペプチドに対して多くの付着点を提供するコアペプチドを含む。リジンは、コアペプチド用に最も普通に用いられる。なぜなら、それは１つのカルボキシル官能基と２つ(αおよびε)のアミン官能基を有するからである。その他のジアミノ酸もまた用いられ得る。好ましくは、２または３レベルのいずれかで幾何学的に分枝したリジンが用いられる；これらのコアは、それぞれ、テトラマーおよびオクタマーのコア構造を形成する(Tam，Proc．Natl．Acad. Sci．USA 85:5409，1988)。図示すれば、これらのコアの例は以下のように表される：
【００３１】
2005225857.tif 000002
【００３２】
代表的には、ペプチドに対する付着点は、それらのカルボキシル官能基からリジンのαまたはεアミン基のいずれかまでにある。これらのマルチマーペプチドを合成するために、固相樹脂はコアマトリックスで誘導体化され、そして次の合成および樹脂からの切断は標準的な手順に従う。代表的には、次いで、マルチマーペプチドは、マルチマーのみを保持するポアサイズの膜を用いる、４Ｍグアニジン塩酸、次いで水に対する透析により精製される。マチルマーペプチドは、本発明の文脈内では、任意の線状ペプチドに関して使用され得、そしてこのペプチドに対する抗体を生成する使用に好適である。
【００３３】
３．ペプチド類の組換え産生
あるいは、ペプチドアナログは組換え産生により合成され得る(例えば米国特許第5,593,866号を参照のこと)。ペプチドアナログの産生には種々の宿主系が好適であり、細菌(例えばE.coli)、酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae)、昆虫（例えばSf9）、および哺乳動物細胞(例えばCHO、COS-7)を含む。多くの発現ベクターが開発され、そしてこれらの宿主の各々について利用可能である。一般に、細菌細胞および細菌で機能的であるベクターが本発明で用いられる。しかし、しばしば他の宿主で機能的であるベクターを有することが好ましい。E.coli中のクロ−ニングおよび発現のためのベクターおよび手順は、本明細書中、そして、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1987)およびAusubelら(Current Protocols in Molecular Biology，Greene Puslishing Co.，1995)で論議される。
【００３４】
１つ以上のインドリシジンアナログをコードするDNA配列は、宿主に適切な発現ベクター中に導入される。好適な実施態様では、アナログ遺伝子は、ベクター中にクローン化され融合タンパク質を作成する。融合パートナーは、細菌宿主がペプチドの毒性効果から保護されるようなアニオン性領域を含むために選択される。この保護領域は、ペプチドの抗微生物効果を効果的に中和し、そしてまた宿主プロテアーゼによるペプチド分解を防ぎ得る。本発明の融合パートナー(キャリアタンパク質)は、融合タンパク質を、封入体、ペリプラズム、外膜、または細胞外環境に輸送するためにさらに機能し得る。本発明の分脈において適切なキャリアタンパク質は、制限されないが、特に、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡ、プロテインＡの２つの合成IgG結合性ドメイン（ZZ）、外膜プロテインＦ、βガラクトシダーゼ(lacZ)、およびバクテリオファージλおよびバクテリオファージT7の種々の産物を含む。本明細書中で提供される教示から、キャリアとして他のタンパク質が用いられ得ることは明らかである。さらに、保護的アニオン性領域が存在する限り、完全なキャリアタンパク質を用いる必要はない。ペプチド配列の単離を容易にするために、化学的切断(例えばCNBr)または酵素的切断(例えばV8プロテアーゼ、トリプシン)を受けるアミノ酸を用いてペプチドおよび融合パートナーを架橋する。E.coli中の発現には、好ましくは、融合パートナーは、封入体形成に向けた発現を行う通常の細胞内タンパク質である。このような場合、最終産物を放出するための切断の後は、ペプチドの再生の必要はない。本発明では、融合パートナーおよびペプチド遺伝子を含むDNAカセットが、プラスミド、ウイルスまたは当該分野で公知の他のビヒクルであり得る発現ベクター中に挿入され得る。好ましくは、発現ベクターは、誘導的または構成的プロモーターを含むプラスミドであり、宿主中で挿入されたDNA配列の効果的な転写を容易にする。組換えDNAを用いた宿主細胞の形質転換は、Ca++介在技法により、エレクトロポーレーション、または当業者に周知のその他の方法により実行され得る。
【００３５】
簡単に述べれば、ペプチドアナログをコードするDNAフラグメントは、存在するcDNAまたはゲノムクローンまたは合成に由来する。便利な方法は、一本鎖テンプレートからの遺伝子の増幅である。一般に、テンプレートは、自動化オリゴヌクレオチド合成の産物である。増幅プライマーは、テンプレートの５'および３'末端に由来し、そして代表的には、ベクターのクローニング部位に関して選択された制限部位を取り込んでいる。必要であれば、翻訳開始および停止コドンをプライマー配列中に加工し得る。タンパク質をコードする配列は、特定宿主における発現にコドンが最適化され得る。従って、例えば、アナログ融合タンパク質が細菌中で発現される場合、コドンは細菌の使用に最適化される。コドン最適化は、全長遺伝子または遺伝子領域の自動化合成、複数オリゴヌクレオチドの連結、天然配列の変異誘発、または当業者に公知のその他の技術により成し遂げられる。
【００３６】
最小限、発現ベクターはプロモーター配列を含むべきである。しかし、その他の調節配列もまた含まれ得る。このような配列は、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル配列、分泌シグナル配列、複製起点、選択マーカーなどを含む。調節配列は、互いに作動可能に連結され転写および次の翻訳を可能にする。好適な局面では、本明細書で発現に用いられるプラスミドは、細菌におけるタンパク質の発現のために設計されたプロモーターを含む。適切なプロモーターは、構成的および誘導性プロモーターの両方を含み、広く入手可能でありそして当該分野で周知である。細菌における発現に一般に用いられるプロモーターは、T7、T3、T5、およびSP6ファージ、およびtrp，lpp、およびlacオペロンからのプロモーターを含む。tacおよびtrcのようなハイブリッドブロモーター(米国特許第4,551,433号を参照のこと)もまた用いられ得る。
【００３７】
好適な実施態様では、ベクターは転写ターミネーター配列を含む。「転写ターミネーター領域」は、選択されたプロモーターを認識するポリメラーゼによる転写を終結するシグナルを提供する配列である。転写ターミネーターは、それが宿主中で機能的である限り、融合パートナー遺伝子または別の遺伝子から得られ得る。
【００３８】
好適な実施態様では、ベクターは細菌細胞中で複製し得る。従って、ベクターは、細菌複製起点を含み得る。好適な細菌複製起点は、fl-oriおよびcol E1 ori、特にpUCプラスミド由来のoriを含む。低コピー数ベクター(例えばpPD100)もまた、特に産物が宿主に対して有害であるとき用いられ得る。
【００３９】
好ましくは、プラスミドはまた、宿主中で機能的である少なくとも１つの選択マーカーを含み得る。選択マーカー遺伝子は、宿主に対して、形質転換された細胞が同定および/または選択的に増殖し得る表現型を与える。細菌宿主に対する適切な選択マーカー遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cmr)、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tcr)、カナマイシン耐性遺伝子(Kanr)、および当該分野で公知のその他を含む。選択において機能するために、いくつかのマーカーは、宿主に相補的な欠陥を必要とし得る。
【００４０】
いくつかの局面では、ペプチドアナログをコードするヌクレオチドの配列はまた、得られるペプチドが前駆体タンパク質として合成され、次いでプロセッシングされそして分泌されるように、分泌シグナルをコードし得る。得られる分泌タンパク質はまた、ペリプラズム空間または発酵培地から回収され得る。使用に適切な分泌シグナルの配列は、広く入手可能であり、そして周知である(von Heijne，J．Mol．Biol．184:99-105，1985)。
【００４１】
ベクターはまた、リプレッサー結合部位を含むプロモーターの転写を抑制し得るリプレッサータンパク質をコードする遺伝子を含み得る。細胞の生理学的条件を変えることにより、プロモーターを脱抑制し得る。例えば、リプレッサーに競合的に結合する分子が添加され得、または増殖培地の温度が改変され得る。リプレッサータンパク質は、制限されないが、E.coli lacIリプレッサー(IPTGによる誘導に反応性)、温度感受性λcI857リプレッサーなどを含む。
【００４２】
細菌における発現のためのプラスミドの例は、pET発現ベクターpET3a、pET11a、pET12a-c、およびpET15bを含む(米国特許第4,952,496号；Novagen，Madison，WIから入手可能、参照のこと)。低コピー数ベクター(例えばpPD100)もまた、E.coli宿主に有害なペプチドの効果的な過剰生産に用いられ得る(Derschら、FEMS Microbiol．Lett．123:19，1994)。
【００４３】
T7発現ベクター用の細菌宿主は、E.coli株HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS,HMS174(DE3)およびBL21(DE3)中に見出されるような、誘導性プロモーター（例えばlacUVプロモーター；米国特許第4,952,496号を参照のこと）に作動可能に連結されたT7 RNAポリメラーゼをコードするDNAの染色体コピーを含み得る。T7 RNAポリメラーゼはまた、T7発現ベクターと適合するプラスミド上に存在し得る。このポリメラーゼは、λプロモーターおよびリプレッサーの制御下に存在し得る(例えばpGP1-2;TaborおよびRichardson，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:1074，1985)。
【００４４】
ペプチドアナログタンパク質は、アフィニティー、サイズ排除、またはイオン交換クロマトグラフィー、HPLCなどのような標準的な技法により単離される。好ましくは、単離されたペプチドは、SDS-PAGEのクマシーブルー染色により、少なくととも物質の90％である主要バンドを示すべきである。
【００４５】
４．増幅を基礎にする半ランダム変異誘発によるアナログの生成
インドリシジンアナログは、プライマーが、コードされた親ペプチド、例えばインドリシジンの５'および３'末端の標的配列に設計される増幅(例えばPCR)を基礎にする手順を用いて生成され得る。増幅条件は、合成の間に熱安定性ポリメラーゼによるヌクレオチドの誤取り込みを促進するよう選択される。従って、ランダム変異が元の配列中に導入され、そのいくつかはアミノ酸改変を生じる。増幅産物は、受容可能な宿主中でパッケージ化されかつ増幅され提示ライブラリーを生成する、ファージミドベクターのようなファージベクターのコートタンパク質中にクローン化され得る。
【００４６】
次いで、これらのライブラリーは、ペプチドの抗生物活性についてアッセイされ得る。簡単に述べれば、ライブラリーで感染された細菌が、プレートに播かれ、増殖させ、そしてファージが感染し得ない細菌株を含むアガロースで重層される。アガロース重層中の増殖阻害のゾーンが、抗細菌活性を有するアナログを発現するファージの領域中で観察される。これら阻害性ファージが単離され、そしてクローン化されたペプチド配列がDNA配列分析により決定される。次いで、ペプチドは独立に合成され得、そしてその抗生物活性がさらに調査される。
【００４７】
５．インドリシジンアナログに対する抗体
代表的には、小さな非免疫原性ペプチジルコアに連結されたペプチドの約８コピーを含み、免疫原を形成する多重抗原性ペプチド(MAP)を用いて、特定のペプチドアナログに対する抗体が生成される。（一般に、HarlowおよびLane、前述、を参照のこと）MAPは、ウサギまたはマウスまたはその他の齧歯類中に皮下注射され、そこで、それらは、抗体産生を容易にするに十分長い半減期を有し得る。12週間後、血液サンプルを採取し、血清を分離し、そして元のペプチドに対してELISAアッセイ中で試験され、陽性の結果は、標的ペプチドに対して特異的な抗体の存在を示す。次いで、この血清を貯蔵し、そしてELISAアッセイ中で使用し得、特定のアナログの量を特異的に測定する。あるいは、抗体産生の他の標準的方法、例えばモノクローナル抗体の生成を使用し得る。
【００４８】
本発明の分脈において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント(例えばFab、およびF(ab')2、Fv可変領域、または相補性決定領域)を含むことが理解される。一般に、抗体は、それらが、10-7Ｍより大きいか等しい、好ましくは10-8Ｍより大きいか等しいKdで結合する場合、インドリシジンアナログに対して特異的として受容される。モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性は、当業者により容易に決定され得る(Scatchard，Ann．N.Y．Acad．Sci．51:660-672，1949を参照のこと)。一旦適切な抗体が得られたなら、それらは、当業者に周知の多くの技法により単離または精製され得る。
【００４９】
モノクローナル抗体はまた、従来技法(米国特許第RE32,011号，第4,902,614号，第4,543,439号，および第4,411,993号を参照のこと；Antibodies:A Laboratory Manual，HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988もまた参照のこと)。簡単に述べれば、１つの実施態様では、一般に、ラットまたはマウスのような被験体動物に、ペプチドを、免疫応答を増大するために、フロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバント中のエマルジョンとして注射する。一般に、動物は、脾臓および/またはリンパ節の回収ならびにこれら細胞の不死化の前に、少なくとも１回追加免疫される。エプスタインバールウイルスまたは融合により介在されるようなハイブリドーマを生成するための種々の不死化技法が用いられ得る。好適な実施態様では、不死化は、適切なミエローマ細胞株との融合により生じ、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成する。適切なミエローマ株は、例えば、NS-1(ATCC No．TIB 18)、およびP3X63‐Ag8.653(ATCC No．CRL 1580)を含む。好適な融合パートナーは、内因性の抗体遺伝子を発現しない。約７日後、ハイブリドーマを、テロメラーゼタンパク質に反応性の抗体の存在についてスクリーニングし得る。広範な種類のアツセイが利用され得る(Antibodies:A Laboratory Manual，HarlowおよびLane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988を参照のこと)。
【００５０】
モノクローナル抗体を構築するためにその他の技法もまた利用され得る(組換え技法を記載する、Huseら、Science 246:1275-1281，1989;Sastryら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:5728-5732，1989;Alting-Meesら、Strategies in Molecular Biology 3:1-9，1990;を参照のこと)。これらの技法は、λImmunoZap(H)およびλImmunoZap(L)のような適切なベクター中の重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNAのクローニングを含む。これらの組換え体は、個々にスクリーニングされるか、または同時発現されてFabフラグメントまたは抗体を形成し得る(Huseら、前述；Sastryら、前述、を参照のこと)。次いで、陽性プラークを、E.coliからモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にする非溶菌性のプラスミドに転換し得る。
【００５１】
同様に、抗体のFabおよびFvフラグメントのような部分またはフラグメントがまた、従来の酵素的消化または組換えDNA技法を利用して構築され、単離された抗体の可変領域を生じ得る。１つの実施態様では、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからの可変領域をコードする遺伝子が、可変領域に対するヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。さらに、抗体の結合特異性を改変することなく、「マウス」抗体を「ヒト」抗体に変化するための技法を利用し得る。
【００５２】
Ｂ．試験
本発明のインドリシジンアナログは、単独または抗生物質もしくは別のアナログとの組合せで、抗生物質治療薬剤としての可能性について、一連のアッセイを使用して評価される。好ましくは、すべてのペプチドは、最初に、インビトロで評価され、最も見込みのある候補がインビボでのさらなる評価のために選択され、そしてこれらアッセイの結果を使用して、前臨床試験のための候補が選択される。インビトロアッセイには、抗生物質活性、毒性、溶解性、薬理学、二次構造、リポソーム透過などの測定が含まれる。インビボアッセイには、動物モデルにおける効力、抗原性、毒性などの評価が含まれる。一般に、インビトロアッセイがまず実施され、続いてインビボアッセイが実施される。
【００５３】
１．インビトロアッセイ
インドリシジンアナログは、抗生物質活性について、アガロース希釈MICアッセイまたはブロス希釈もしくはタイムキル(time-kill)アッセイのようなアッセイによって評価される。抗生物質活性は、微生物(例えば、細菌、真菌)の増殖の阻害または死滅として測定される。簡単に述べると、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMueller Hintonブロス中の候補アナログを、溶融アガロースと混合する。ブロスと寒天との他の処方物は、ペプチドアナログが培地全体を自由に拡散し得る限り、使用され得る。アガロースをペトリ皿またはウェルに注ぎ、凝固させ、そして試験株をアガロースプレートに塗布する。試験株は、アナログの意図される適用に一部基づいて選択される。したがって、例として、S.aureusに対する活性を有するアナログが所望される場合、S.aureus株が使用される。試験種のいくつかの株および/または臨床単離株について、アナログをアッセイすることが所望され得る。プレートを一晩インキュベートし、そして翌日、細菌増殖について視覚的に検査する。アナログの最小阻害濃度(MIC)は、生物の増殖を完全に阻害する、アナログの最低濃度である。試験株または株の群に対して良好な活性を示す(代表的には、16μｇ/ml以下のMICを有する)アナログを、さらなる試験のために選択する。
【００５４】
選択されたアナログは、正常哺乳動物に対する毒性についてさらに試験され得る。例示的なアッセイは、赤血球(RBC)溶血アッセイである。簡潔には、赤血球を、代表的には遠心分離によって全血から単離し、そして血漿成分を含まないように洗浄する。等張生理食塩水中の赤血球の１％(v/v)懸濁物を、異なる濃度のペプチドアナログとともにインキュベートする。一般に、アナログは適切な処方緩衝液に存在する。約１時間で37℃にてのインキュベーション後、細胞を遠心分離し、そして上清の540nmの吸光度を測定する。溶解の相対的測定値は、NH4Clまたは等価物(100％値を確立する)を使用する赤血球の完全な溶解後の吸光度との比較によって決定される。実施例８に例示するような、細胞溶解性でないかまたは僅かに中程度に細胞溶解性であるアナログが所望され、そしてさらなるスクリーニングに適切である。他のインビトロ毒性アッセイ(例えば、培養哺乳動物細胞に対する毒性の測定)が、インビトロ毒性を評価するために使用され得る。
【００５５】
処方緩衝液中ペプチドアナログの溶解性は、検査され得るさらなるパラメータである。いくつかの異なるアッセイ(例えば、緩衝液中での出現)が使用され得る。簡潔には、ペプチドアナログを、溶液(例えば、ブロスまたは処方緩衝液)中に懸濁する。出現を、(ａ)透明(沈澱物なし)から、(ｂ)軽微(拡散した沈澱物)、(ｃ)白濁(激しい沈澱物)までに及ぶスケールに従って評価する。より細かい格付けを使用し得る。一般に、沈澱物が少ないほどより望ましい。しかし、いくらかの沈澱物は許容され得る。
【００５６】
アナログの治療薬としての可能性を評価するために、さらなるインビトロアッセイが実行され得る。このようなアッセイには、処方物中のペプチドの溶解性、血中もしくは血漿中の薬理学、血清タンパク質結合、(例えば、円偏光二色性による)二次構造の分析、リポソーム透過、および細菌内膜透過が含まれる。一般に、アナログは溶解性であり、そしてインドリシジンより良好に実施することが望ましい。
【００５７】
２．インビボアッセイ
インビトロアッセイの結果に基づいて選択されたアナログは、効力、毒性などについてインビボで試験され得る。
【００５８】
選択されたアナログの抗生物質活性は、動物モデルを使用して、微生物の感染を改善する能力についてインビボで評価され得る。これらのアッセイにおいて、ビヒクル単独での阻害に比べて微生物増殖の阻害が統計学的に有意であれば、アナログは治療薬として有用である。これらの測定は、体液または身体部位から単離した培養物から直接的に、または感染した動物の生存率を評価することによって間接的になされ得る。抗菌活性の評価のためには、いくつかの動物モデル、例えば、(ａ)正常マウスに致死用量の微生物を投与するか、(ｂ)好中球減少性マウスに致死用量の微生物を投与するか、または(ｃ)ウサギの心臓に接種物を投与するモデルを含む急性感染モデル、および慢性感染モデルが利用可能である。選択されるモデルは、アナログの意図される臨床適応症に一部依存する。
【００５９】
例として、１つのこのような正常マウスモデルにおいて、マウスは、致死用量の細菌をipまたはiv接種される。代表的には、用量は、90〜100％の動物が２日以内に死亡する用量である。このアッセイのための微生物株の選択は、アナログの意図される適用に一部依存し、そして記載した実施例においては、３つの異なるStaphylococcus株を用いるアッセイが実行される。簡潔には、接種の直前もしくは直後(一般には、60分以内)に、適切な処方緩衝液中のアナログを注射する。アナログの複数注射を行い得る。感染後８日間まで動物を観察し、そして動物の生存を記録する。首尾よい処置は、動物を死亡から救済するか、または無処置コントロール動物と比較して統計学的に有意なレベルまで、死亡を遅延させるかいずれかする。インドリシジン自体より良好な効力を示すアナログが好ましい。
【００６０】
意図される臨床的使用によって一部分規定される経路により、動物(代表的には、マウス)に所定の範囲の用量を投与することによって、アナログのインビボ毒性が測定される。動物の生存が記録され、そしてアナログ間の比較を可能にするために、LD50、LD90-100および最大寛容用量(MTD)が計算され得る。インドリシジンより毒性の少ないアナログが好ましい。
【００６１】
臨床的開発についてのアナログの選択を補助するために、さらなるインビボアッセイが実行され得る。例えば、代表的には、処方緩衝液中のアナログを正常動物(一般的には、マウス、ラット、またはウサギ)に注射することによって、アナログの免疫原性が評価され得る。注射後種々の時間で、血清が得られ、そしてアナログと結台する抗体の存在について試験される。複数注射後の試験、処置プロトコルの模擬もまた実施され得る。アナログに対する抗体は、ELISA、免疫沈降アッセイ、ウェスタンブロット、および他の方法により同定され得る。(HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1988を参照)。抗体産生を惹起しないかまたは最小限の抗体産生を惹起するアナログが好ましい。さらに、動物におけるアナログの薬物動態およびアナログで処置した動物の組織病理学が測定され得る。
【００６２】
潜在的治療薬としてのインドリシジンアナログの選択は、インビトロおよびインビボアッセイの結果に基づく。一般に、高用量レベルで低い毒性を示しそして低用量レベルで高い効力を示すペプチドアナログが好ましい候補である。
【００６３】
３．相乗作用アッセイ
抗生物質または別のアナログとの組合せでアナログを評価するために、組合せが上記の一連のアッセイにかけられ得る。抗生物質には、生命を妨げるか、阻害するか、または破壊する傾向があるいずれの化学物質などが含まれ、抗生物質には、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および駆虫剤が含まれる。単に例として、抗菌性抗生物質が議論される。成分を混合および投与する方法は、組合せの意図される臨床的使用に依存して変化する。
【００６４】
簡潔には、インビトロ抗菌活性についての１つのアッセイ(アガロース希釈アッセイ)を、それぞれが種々の濃度のペプチドアナログと抗生物質との組合せを含む一連のプレートを使用してセットする。プレートに細菌単離物を接種し、プレートをインキュベートし、そしてその成分のMICを記録する。次いで、これらの結果を使用して、FICを計算する。試験に使用する抗生物質には、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、およびフルオロキノロンが含まれるが、これらに限定されない(下記の表１を参照)。
【００６５】
抗生物質の例には、ペニシリンＧ(CAS登録番号61-33-6)；メチシリン(CAS登録番号61-32-5)；ナフシリン(CAS登録番号147-52-4)；オキサシリン(CAS登録番号66-79-5)；クロキサシリン(CAS登録番号61-72-3)；ジクロキサシリン(CAS登録番号3116-76-5)；アンピシリン(CAS登録番号69-53-4)；アモキシシリン(CAS登録番号26787-78-0)；チカルシン(CAS登録番号34787-01-4)；カルベニシリン(CAS登録番号4697-36-3)；メズロシリン(CAS登録番号51481-65-3)；アズロシリン(CAS登録番号37091-66-0)；ピペラシリン(CAS登録番号61477-96-1)；イミペネム(CAS登録番号74431-23-5)；アズトレオナム(CAS登録番号78110-38-0)；セファロチン(CAS登録番号153-61-7)；セファゾリン(CAS登録番号25953-19-9)；セファクロール(CAS登録番号70356-03-5)；セファマンドールフォルメートナトリウム(CAS登録番号42540-40-9)；セフォキシチン(CAS登録番号35607-66-0)；セフロキシム(CAS登録番号55268-75-2)；セフォニシド(CAS登録番号61270-58-4)；セフメタゾール(CAS登録番号56796-20-4)；セフォテタン(CAS登録番号69712-56-7)；セフプロジル(CAS登録番号92665-29-7)；ロルカルベフ(CAS登録番号121961-22-6)；セフェタメト(CAS登録番号65052-63-3)；セフォペラゾン(CAS登録番号62893-19-0)；セフォタキシム(CAS登録番号63527-52-6)；セフチゾキシム(CAS登録番号68401-81-0)；セフトリアキソン(CAS登録番号73384-59-5)；セフタジジム(CAS登録番号72558-82-8)；セフェピム(CAS登録番号88040-23-7)；セフィキシム(CAS登録番号79350-37-1)；セフポドキシム(CAS登録番号80210-62-4)；セフスロジン(CAS登録番号62587-73-9)；フレオキサシン(CAS登録番号79660-72-3)；ナリジクス酸(CAS登録番号389-08-2)；ノルフロキサシン(CAS登録番号70458-96-7)；シプロフロキサシン(CAS登録番号85721-33-1)；オフロキサシン(CAS登録番号82419-36-1)；エノキサシン(CAS登録番号74011-58-8)；ロメフロキサシン(CAS登録番号98079-51-7)；シノキサシン(CAS登録番号28657-80-9)；ドキシサイクリン(CAS登録番号564-25-0)；ミノサイクリン(CAS登録番号10118-90-8)；テトラサイクリン(CAS登録番号60-54-8)；アミカシン(CAS登録番号37517-28-5)；ゲンタマイシン(CAS登録番号1403-66-3)；カナマイシン(CAS登録番号8063-07-8)；ネチルマイシン(CAS登録番号56391-56-1)；トブラマイシン(CAS登録番号32986-56-4)；ストレプトマイシン(CAS登録番号57-92-1)；アジスロマイシン(CAS登録番号83905-01-5)；クラリスロマイシン(CAS登録番号81103-11-9)；エリスロマイシン(CAS登録番号114-07-8)；エストル酸エリスロマイシン(CAS登録番号3521-62-8)；エチルコハク酸エリスロマイシン(CAS登録番号41342-53-4)；グルコヘプトン酸エリスロマイシン(CAS登録番号23067-13-2)；ラクトビオン酸エリスロマイシン(CAS登録番号3847-29-8)；ステアリン酸エリスロマイシン(CAS登録番号643-22-1)；バンコマイシン(CAS登録番号1404-90-6)；テイコプラニン(CAS登録番号61036-64-4)；クロラムフェニコール(CAS登録番号56-75-7)；クリンダマイシン(CAS登録番号18323-44-9)；トリメトプリム(CAS登録番号738-70-5)；スルファメトキサゾール(CAS登録番号723-46-6)；ニトロフラントイン(CAS登録番号67-20-9)；リファンピン(CAS登録番号13292-46-1)；ムピロシン(CAS登録番号12650-69-0)；メトロニダゾール(CAS登録番号443-48-1)；セファレキシン(CAS登録番号15686-71-2)；ロキシスロマイシン(CAS登録番号80214-83-1)；コ−アモキシクラブラネート；ピペラシリンとタゾバクタムの組合せ；ならびにそれらの種々の塩、酸、塩基、および他の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
【表１−１】
2005225857.tif 000003
【００６７】
【表１−２】
2005225857.tif 000004
【００６８】
相乗作用は下記の式に従って計算される。0.5以下のFICは相乗作用の証拠であるが、より高い値を有する組合せも治療上有用であり得る。
【００６９】
2005225857.tif 000005
【００７０】
例えば、ペニシリン群、セファロスポリン群、カルバセフェム群、セファマイシン群、カルバペネム群、モノバクタム群、アミノグリコシド群、グリコペプチド群、キノロン群、テトラサイクリン群、マクロライド群、フルオロキノロン群、および他の雑多な抗生物質群からの抗生物質が、本明細書に開示した任意のペプチドとの組合せで使用され得る。例えば、MBI 11A1CNまたはMBI 11D18CNとシプロフロキサシン、MBI 11A1CN、MBI 11A3CN、MBI 11B4CN、MBI 11D18CNまたはMBI11G13CNとムピロシン、MBI 11B9CN、MBI 11D18CNまたはMBI 11F4CNとピペラシリンが好ましい組合せである。
【００７１】
Ｃ．ペプチドおよびタンパク質のポリマー修飾
本明細書中に明記したように、本発明は、遊離アミン基を有する化合物(例えば、ペプチド、タンパク質、特定の抗生物質など)を、活性化されたポリソルベートエステルおよび誘導体で修飾するための方法および組成物を提供する。化合物がペプチドまたはタンパク質である場合、修飾されたかまたは誘導体化された形態は、本明細書中で「APS修飾ペプチド」または「APS修飾タンパク質」と呼ばれる。同様に、修飾された形態の抗生物質は、「APS修飾抗生物質」と呼ばれる。APS修飾化合物(例えば、APSカチオン性ペプチド)は、改善された薬理学的特性を有する。
【００７２】
ペプチドおよびタンパク質に加えて、抗生物質、抗菌剤、抗不整脈薬(anti-rythmic)、および遊離の一級もしくは他のアミンを有する他の任意の化合物が、修飾に適切である。例えば、セファロスポリン、アミノペニシリン、エタンブトール、ピラジンアミド、スルホンアミン、キノロン(例えば、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン(clinafloxacin))、アミノグリコシドおよびスペクチノマイシン(ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシンを含むがこれらに限定されない)は、修飾のための遊離アミンを有する。抗真菌剤(例えば、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、5-フルオロサイトシンなど)は、誘導体化に利用可能なアミンを有する。抗ウイルス剤(例えば、三環系アミン(例えば、アマンタジン))；および駆虫剤(例えば、ダプソン)はすべて誘導体化され得る。単に例示のために、本明細書での議論は、修飾されたペプチドおよびタンパク質に関する。
【００７３】
１．試薬の特徴付け
本明細書に記載のように、APS修飾化合物(例えば、ペプチドおよびタンパク質)の生成に適切な試薬は、疎水性領域および親水性領域、ならびに随意にリンカーを含む。疎水性領域は、親水性領域またはリンカーとの結合に適切な官能基を有する脂肪親和性化合物である。親水性領域はポリアルキレングリコールである。本明細書で使用する場合、「ポリアルキレングリコール」とは、２炭素ポリマーまたは３炭素ポリマーのグリコールをいう。２炭素ポリアルキレンには、種々の分子量のポリエチレングリコール(PEG)およびその誘導体(例えば、ポリソルベート)が含まれる。３炭素ポリアルキレンには、ポリプロピレングリコールおよびその誘導体が含まれる。
【００７４】
疎水性領域は一般には脂肪酸であるが、脂肪アルコール、脂肪チオールなど(これらは脂肪親和性化合物でもある)であり得る。脂肪酸は飽和または不飽和であり得る。鎖長は重要ではないようであるが、代表的には、市販の脂肪酸が使用され、そしてこれらはＣ12-18の鎖長を有する。しかし、鎖長は、化合物の溶解性または固体性(solidity)によって制限され得る。すなわち、より鎖長の長い脂肪酸は室温で固体である。12個の炭素の脂肪酸(ラウリル)、14個の炭素の脂肪酸、16個の炭素の脂肪酸(パルミテート)、および18個の炭素の脂肪酸(モノステアレートまたはオレエート)が好ましい鎖長である。
【００７５】
親水性領域は、ポリアルキレングリコール(ポリエチレンまたはポリプロピレンのいずれかのグリコールモノエーテル)である。エーテル官能基は、ポリオキシエチレン鎖(好ましくは、２〜100モノマー単位の鎖長を有する)とソルビタン基との間の結合によって形成される。ポリメチレングリコールは、ホルムアルデヒドを形成するため、動物への投与には適切でない。そして、４以上の鎖長を有するグリコールは不溶性であり得る。混合されたポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン鎖もまた適切であり得る。
【００７６】
親水性領域および疎水性領域を架橋するためのリンカーは必要ではないが、使用する場合には、ポリアルキレングリコールおよび疎水性領域の両方と反応し得る二官能性求核試薬であるべきである。リンカーは、ポリアルキレングリコール(代表的には、エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドとの反応によって生成される)に求核反応のための電子を提供する。適切なリンカーには、ソルビタン、糖アルコール、エタノールアミン、エタノールチオール、2-メルカプトエタノール、1,6ジアミノヘキサン、アミノ酸(例えば、グルタミン、リジン)、他の還元糖などが含まれる。例えば、ソルビタンは、ポリソルベートにおいて脂肪酸とエステル結合を形成する。
【００７７】
適切な化合物には、ポリオキシエチレンソルビタン(例えば、モノラウレート、モノオレエート、モノパルミテート、モノステアレート、トリオレエート、およびトリステアレートエステル)が含まれる。これらおよび他の適切な化合物は、標準的な化学的方法によって合成され得るか、または市販のもの(例えば、Sigma Chemical Co.，MO；Aldrich Chemical Co.，WI；J.B.Baker，NJ)を入手し得る。
【００７８】
２．試薬の活性化
試薬(一般には、ポリソルベート)は、空気を自由に交換しながらUV光に曝露することによって活性化される。254nmまたは302mnで照射するランプを使用して活性化が達成される。好ましくは、出力は254nmが中心である。より長い波長は、より長い活性化時間を必要とし得る。蛍光室内灯がポリソルベートを活性化し得るという、いくつかの証拠が存在するが、実験は、室内灯が検出可能なレベルの活性化を生じる前に、254nmのUV光の使用は最大の活性化を生じることを示している。
【００７９】
空気は、ポリソルベートの活性化において重要な役割を演じる。空気へのアクセスは、密封容器中で実施される活性化に比して、活性化の速度を二倍にする。どの気体が原因であるのかはなお未知である。酸素誘導体である可能性が高いが、過酸化物は関与していない。エーテル結合を有する化合物のUV曝露は、過酸化物を生じることが知られている。過酸化物は、過酸化物試験片を使用して検出および定量され得る。反応において、UV活性化した物質中に見出されるレベルより１〜10倍高いレベルの過酸化水素を、遮光下でポリソルベート溶液に添加した。活性化は得られなかった。
【００８０】
試薬は照射に適切な容器中に置かれる。容器について考慮すべきことは、均一な照射を達成可能であることである。したがって、経路長が長い場合、試薬は混合され得るか、または攪拌され得る。活性化には空気が必要である。過酸化物は活性化に関与しない。試薬は任意の水溶液中で活性化され得、そして緩衝化は必要ではない。
【００８１】
例示的な活性化は、１cmの液厚のキュベット中で起こる。試薬は、９cm未満の距離で1500μｗ/cm2(光源の最初の出力)にて、約24時間照射される。これらの条件下で、活性化された試薬は、ペプチドの最低85％をAPSペプチドに変換する。
【００８２】
３．活性化試薬でのペプチドまたはタンパク質の修飾
ペプチドまたはタンパク質は、液相または固相のいずれかでAPS試薬とともに反応され、そしてAPS誘導体の結合によって修飾される。結合のための本明細書中に記載される方法は、ペプチドまたはタンパク質上の電荷を維持する利点を提供する。ペプチドの電荷がその機能（例えば、本明細書中に記載されるカチオン性ペプチドの抗生物質活性）にとって重要である場合、これらの結合方法は、更なる利点を提供する。基をアシル化を介して結合する方法は、アミノからアミド基への変換を介して正電荷の損失を生じる。さらに、いかなるかさばったリンカーまたは潜在的に抗原性のリンカー（例えば、トリアジン基）も、本明細書中に記載される方法によって導入されることは知られていない。
【００８３】
上記のように、APSペプチド形成は、固相または水溶液中で起こる。簡単には、固相方法において、ペプチドは、適切な緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）中に懸濁される。APSペプチド形成を支持する他の適切な緩衝液もまた使用され得る。酢酸緩衝液は、ナトリウム、ルビジウム、リチウムなどであり得る。他のアセテート溶液（例えば、HAcまたはHAc-NaOH）もまた適切である。緩衝液についての好ましいpH範囲は、２〜8.3であるが、広範な範囲が使用され得る。酢酸-NaOH緩衝液の開始pHが変化する場合、200mM酢酸緩衝液からの引き続く凍結乾燥は、Ｉ型修飾ペプチドのみを生じる（実施例14を参照のこと）。アルカリ緩衝液成分の存在は、II型修飾ペプチドの形成を生じる。代表的なペプチド濃度は、１mg/mlであり、これは、85〜95％の修飾ペプチドを生じるが、他の濃度が適切である。濃度を決定するために主に考慮するのは、経済面であるように見える。活性化ポリマー（APS）は、APS修飾ペプチドの１：１のモル比が生成されるように、ペプチドに対してモル過剰で添加される。一般に、約2.5:1（APS:ペプチド）〜5:1（APS:ペプチド）の開始比は、1:1 APS修飾ペプチドを生じる。
【００８４】
次いで、反応混合物は、凍結され（例えば、-80℃）そして凍結乾燥される。酢酸ナトリウムは、凍結乾燥の間に酢酸とNaOHとに不均一にされる；減圧による揮発性の酢酸の除去により、NaOHは、生じる固体マトリックス全体に分散される。この酢酸の損失は、凍結乾燥物の溶解に際して検出されるpHの増加によって確認される。APS修飾ペプチドは、サンプルが凍結され次いで解凍されるだけの場合には、酢酸緩衝液中で形成されない。
【００８５】
修飾反応はまた、水溶液中で起こり得る。しかし、APS修飾は、pHに関わらず試験される任意の酢酸緩衝系において、周囲温度では起こらない。APS修飾はまた、pH11.5程度のリン酸緩衝液において形成されない。APS修飾は、約8.5より高いpHでは、炭酸ナトリウム緩衝液中で起こらない。他の緩衝液はまた、それらが誘導体化を支持する場合には、使用され得る。９〜11のpH範囲はまた、適切であり、そしてpH10が最も一般的に使用される。反応は、２相で起こる：Ｉ型ペプチドがまず形成され、続いてII型ペプチドが形成される。
【００８６】
本発明において、アミノ基で連結が起こる。ペプチドについて、連結は、Ｎ末端アミノ酸のα-NH2で、またはリジンのε-NH2基で生じ得る。他の１級および２級アミンもまた、修飾され得る。アシル化による全てのアミノ基の完全なブロッキング（MBI 11CN-Y1）は、APSペプチドの形成を阻害する。従って、アルギニンまたはトリプトファン残基の修飾は起こらない。利用可能な唯一のアミノ基が、αアミノ基（例えば、MBI 11B9CNおよびMBI 11G14CN）である場合、Ｉ型形態が観察される。単一のリジンの包含（例えば、MBI 11B1CN、MBI 11B7CN、MBI 11B8CN）によって、εアミノ基が提供され、II型形態もまた生じる。形成されるII型の量は、より多くのリジン残基を有するペプチドについて増加する。
【００８７】
４．APS修飾ペプチドの精製および物理特性
APS修飾ペプチドが精製され得る。遊離のペプチドが毒性である状況では、未修飾ペプチドおよび/または未反応ポリソルベートを除去するための精製が必要であり得る。任意の種々の精製法が使用され得る。このような方法には、逆相HPLC、ポリソルベートを除去するための有機溶媒による沈澱、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過などが含まれる。RP-HPLCが好ましい。これらの分離方法についての手順は、周知である。
【００８８】
APSペプチド（または、タンパク質）形成により、親ペプチドよりも疎水性であるペプチド含有生成物が生成される。この特性は、RP-HPLCによって遊離のペプチドから結合体を分離させるために利用され得る。結合体は、RP-HPLCによって決定されるその疎水性に基づいて、２つの集団に分離される；Ｉ型集団は、II型集団よりもわずかに早く溶出する。
【００８９】
ペプチドのMBI 11シリーズは、1600と2500との間の分子量を有する。サイズ排除カラムであるSuperose 12カラム上で溶出した場合、これらのペプチドは、ベッド容量よりも早くは溶出せず、これは分子量が20kDa未満であることを示す。対照的に、APS修飾ペプチドは50kDaで溶出し、したがって見かけの分子量の大きな増加を示す。
【００９０】
見かけの分子量の増加は、カチオン性ペプチドの薬物動力学を増強し得る。なぜなら、分子量の増大は、ペプチドおよびタンパク質が血液から除去される速度を減少させるからである。ミセル形成は、単一のペプチド分子の複数の結合に依存するのではなくむしろ、ペプチド分子の「束(packet)」を微生物に送達することによってさらなる利点を提供し得る。さらに、APS修飾ペプチドは、塩化メチレンまたはクロロホルムに可溶性である。一方、親ペプチドは、本質的に不溶性である。この増加した有機可溶性は、組織の壁を貫通する能力を有意に増強し得る。
【００９１】
さらに、円偏光二色性（CD）研究により、APS修飾ペプチドは、変化した３次元コンホメーションを有することが観察される。実施例において示されるように、MBI 11CNおよびMBI 11B7CNは、リン酸緩衝液、または40％水性トリフルオロエタノール（TFE）中で無秩序の構造を有し、そしてリポソーム中への挿入の際にのみβターンコンホメーションを形成する。対照的に、APS修飾MBI 11CNおよびAPS修飾MBI 11B7CNのCDスペクトルは、リン酸緩衝液中においてβターン構造を示す。
【００９２】
Ｄ．処方および投与
上記のように、本発明は、本明細書中に記載されるインドリシジンのペプチドアナログの治療有効量を患者に投与することによって、感染を処置および防止するための方法を提供する。このような処置のために適切な患者は、十分に確立された感染の特徴（例えば、発熱、膿、生物の培養物など）によって同定され得る。ペプチドアナログで処置され得る感染には、微生物によって引き起こされるものが含まれる。微生物の例には、細菌（例えば、グラム陽性、グラム陰性）、真菌（例えば、酵母およびカビ）、寄生虫（例えば、原生動物、線虫、条虫、および吸虫）、ウイルス、ならびにプリオンが挙げられる。これらのクラスの特定の生物は、周知である（例えば、Davisら、Microbiology、第３版、HarperおよびRow、1980を参照のこと）。感染には、毒素ショック症候群、ジフテリア、コレラ、チフス、髄膜炎、百日咳、ボツリヌス中毒症、破傷風、化膿性感染、赤痢、胃腸炎、炭痘、ライム病、梅毒、風疹、敗血症、および伝染病が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
感染の有効な処置は、いくつかの異なる様式で試験され得る。患者は、熱の低下、生物の数の減少、炎症性分子のより低いレベル（例えば、IFN-γ、IL-12、IL-1、TNF）などを示し得る。
【００９４】
本発明のペプチドアナログは、好ましくは薬学的組成物として投与される。簡単には、本発明の薬学的組成物は、本明細書中に記載される１つ以上のペプチドアナログを、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。本明細書中に記載されるように、処方物緩衝液は、ペプチドアナログの効力または活性に影響し得る。適切な処方物緩衝液は、緩衝液および可溶化剤を含有する。処方物緩衝液は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、中性緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水などの緩衝液、または塩化ナトリウムのような塩を含み得る。酢酸ナトリウムが好ましい。一般に、５〜500mMの酢酸緩衝液が使用され、そして好ましくは100〜200mMである。最終処方物のpHは、３〜10の範囲であり得、そして好ましくはほぼ中性（約pH７〜８）であり得る。ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Tween 80、Tween 20）およびポリオキシエチレンエーテル（例えば、Brij 56）のような可溶化剤もまた、化合物がまだAPS修飾されていない場合には、添加され得る。
【００９５】
処方物緩衝液は、本発明のペプチドアナログとともに本明細書中に例示されるが、この緩衝液は、他のペプチドの送達のために一般に有用であり、そして望ましい。この処方物緩衝液中で送達され得るペプチドには、インドリシジン、他のインドリシジンアナログ（PCT WO 95/22338を参照のこと）、バクテリオシン、グラミシジン、バクテネシン（bactenecin）、ドロソシン（drosocin）、ポリフェムシン(polyphemusin)、デフェシン（defesin）、セクロピン(cecropin)、メリチン(melittin)、セクロピン/メリチン(cecropin/melittin)ハイブリッド、マガイニン（magainin）、sapecin（サペシン）、アピダエシン（apidaecin）、プロテグリン（protegrin）、タキプレシン(tachyplesin)、チオニン（thionin）；IL-1〜15：コルチコトロピン放出ホルモン；ヒト成長ホルモン；インスリン；エリスロポエチン；トロンボポエチン；ミエリン塩基性タンパク質ペプチド;M-CSF、GM-CSFのような種々のコロニー刺激因子、kitリガンド；ならびにこれらおよび類似のタンパク質のペプチドおよびアナログが含まれる。
【００９６】
さらなる化合物が、組成物中に含まれ得る。これらには、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストロース）、マンニトール、他のタンパク質、ポリペプチドもしくはアミノ酸、EDTAもしくはグルタチオンのようなキレート剤、アジュバント、および保存剤が含まれる。本明細書中に記載されるように、本発明の薬学的組成物はまた、１つ以上のさらなる有効成分（例えば、抗生物質（相乗効果に関する本明細書中の議論を参照のこと）またはサイトカイン）を含み得る。
【００９７】
組成物は、送達ビヒクル中にて投与され得る。例えば、組成物は、リポソーム中にカプセル化（例えば、WO 96/10585;WO 95/35094）、脂質と複合体化、徐放または持続放出ビヒクル（例えば、ポリガラクシドなど）中にカプセル化され得る。他の実施態様内で、組成物は、安定性を与えるための適切な賦形剤を利用して凍結乾燥物として調製され得る。
【００９８】
本発明の薬学的組成物は、種々の様式で投与され得る。例えば、ペプチドアナログは、静脈内注射、腹腔内注射もしくは、皮下注射もしくは移植、皮内注射、洗浄液（lavage）、吸入、移植、筋肉内注射もしくは移植、くも膜下腔内注射、膀胱洗浄、坐薬、膣坐剤、局所（例えば、クリーム、軟膏、皮膚パッチ、点眼剤、点耳薬（ear drops）、シャンプー）適用、腸内、経口、もしくは経鼻経路によって投与され得る。アナログは、注射、点滴剤、スプレー、錠剤、クリーム、軟膏、ゲルなどとして局所的に適用され得る。アナログは、ボーラスとして、または一定期間にわたる複数回用量として投与され得る。
【００９９】
投与後の血清および他の組織中のペプチドのレベルは、細菌ベース、クロマトグラフィーベース、または抗体ベース（例えば、ELISAアッセイ）のような種々の十分に確立された技術によってモニターされ得る。
【０１００】
本発明の薬学的組成物は、処置される感染または疾患に対して適切な様式で投与される。投与の量および頻度は、患者の状態、感染の原因、および感染の重篤度のような因子によって決定される。適切な投薬量は、臨床試験によって決定され得るが、一般に約0.1〜50mg/kgの範囲にある。
【０１０１】
さらに、本発明のアナログは、一般的な殺菌剤の様式で、または微生物が望ましくない任意の状況で使用され得る。例えば、これらのペプチドは、表面殺菌剤、医療用デバイスのためのコーティング（共有結合を含む）として、衣服のためのコーティング（例えば、細菌の増殖を阻害するため、または蚊よけのため）として、空気清浄のためのフィルターにおいて（例えば、飛行機上で）、浄水において、シャンプーおよび石鹸の構成要素、食物保存剤、化粧品保存剤、培地保存剤、除草剤または殺虫剤、建築材料の構成成分（例えば、シリコン、封止剤）として、ならびに動物製品プロセシングにおいて（例えば、動物の皮の治療）使用され得る。本明細書中で使用される「医療用デバイス」は、患者における使用（例えば、移植または人工補綴）のための任意のデバイスをいう。このようなデバイスには、ステント、チュービング、プローブ、カニューレ、カテーテル、合成脈管移植片、血液モニタリングデバイス、人工心臓バルブ、針などが含まれる。
【０１０２】
これらの目的のため、代表的にはペプチドを単独で、または抗生物質と組み合わせて、一般的に利用される組成物中または適切な塗布具（例えば、衣類に適用するためのようなもの）中に含める。それらは、製造中に材料に（例えば、エアフィルターに）組み込むかまたは染み込ませ得るか、そうでなければデバイスに適用され得る。ペプチドおよび抗生物質は、デバイスまたは物品に適切な溶液中に懸濁される必要があるのみである。ポリマーは、使用され得るキャリアの１つの型である。
【０１０３】
アナログ、特に標識されたアナログは、画像分析および診断アッセイにおいて、または真核生物多細胞および単細胞生物ならびに原核生物における部位を標的化するために使用され得る。標的化系として、アナログは、他のペプチド、タンパク質、核酸、抗生物質などと結合され得る。
以下の実施例は、限定のためではなく例示のために提供される。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
ペプチドアナログの合成精製および特徴付け
ペプチド合成は、標準的な固相Fmoc保護ストラテジーに基づいている。使用された装置は、9050 Plus PepSythesiser(PerSeptive BioSystems Inc.)である。ポリエチレングリコールポリスチレン（PEG-PS）移植片樹脂を、固相として使用し、Ｃ末端アミド合成のためにFmoc保護アミノ酸リンカーで誘導体化した。HATU（0-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）をカップリング試薬として使用する。合成の間、カップリング工程を連続的にモニターし、各アミノ酸が高収量で組み込まれることを確実にする。ペプチドを、トリフルオロ酢酸および適切なスカベンジャーを用いて固相樹脂から切断し、そして粗ペプチドを調製用逆相クロマトグラフィーを用いて精製する。
【０１０５】
全てのペプチドを質量分析機で分析し、生成物が予想された分子量を有することを確実にする。生成物は、分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）に供した場合に、総ピーク面積の＞95％に相当する単一のピークを有するべきである。さらに、ペプチドは、酸尿素ゲル電気泳動に供した場合に、総バンド強度の＞90％に相当する単一のバンドを示すべきである。
【０１０６】
ペプチド含有量（保持された水、塩、または溶媒ではなく、ペプチドである生成物の量）を、定量的アミノ酸分析、遊離アミン誘導体化、または分光光度計による定量によって測定する。アミノ酸分析はまた、ペプチド中に存在するアミノ酸の比についての情報（これは、そのペプチドの真正性を確認するのに役立つ）を提供する。
【０１０７】
ペプチドアナログおよびそれらの名称を、表２に列挙する。この表およびその他の箇所において、アミノ酸は、１文字アミノ酸コードによって表され、そして小文字は、アミノ酸のＤ形態を表す。
【０１０８】
【表２−１】
2005225857.tif 000006
【０１０９】
【表２−２】
2005225857.tif 000007
【０１１０】
CN接尾辞＝アミド化されたＣ末端
Ｈ接尾辞＝Ｃ末端のホモセリン
Ｒ接尾辞＝レトロ-合成されたペプチド
【０１１１】
実施例２
修飾されたペプチドの合成
インドリジンアナログを、元のペプチドの物理特性を変更するために修飾する。このような修飾には：Ｎ末端でのアセチル化、Fmoc誘導体化Ｎ末端、ポリメチル化、ペルアセチル化(peracetylation)、および分枝誘導体が含まれる。
【０１１２】
α-N-末端アセチル化。ペプチドを樹脂から切断し、そしてそれを脱保護する前に、完全に保護されたペプチドを、DMF中のＮアセチルイミダゾールで１時間室温で処理することにより、α-N-末端で選択的反応を生じる。次いで、ペプチドを脱保護/切断し、そして未修飾ペプチドに関して精製する。
【０１１３】
Fmoc-誘導体化α-N-末端。最終Fmoc脱保護工程を行わない場合、α-N末端Fmoc基は、ペプチド上に残存する。次いで、ペプチドを、側鎖脱保護/切断し、そして未修飾ペプチドに関して精製する。
【０１１４】
ポリメチル化。メタノール溶液中の精製されたペプチドを、過剰の炭酸ナトリウムで、その後過剰のヨウ化メチルで処理する。反応混合物を一晩室温で撹拌し、有機溶媒中で抽出し、中和し、そして未修飾ペプチドに関して精製する。この手順を用いて、ペプチドは完全にメチル化されない;MBI 11CNのメチル化は、平均６メチル基を生じた。従って、修飾ペプチドは、メチル化生成物の混合物である。
【０１１５】
ペルアセチル化。DMF溶液中の精製されたペプチドをＮアセチルイミダゾールで１時間室温で処理する。粗生成物を濃縮し、水に溶解し、凍結乾燥し、水に再溶解し、そして未修飾ペプチドに関して精製する。一級アミン基の完全なアセチル化が観察される。
【０１１６】
４/８分枝誘導体。分枝ペプチドを、樹脂に結合した４または８分枝コア上で合成する。合成および脱保護/切断を未修飾ペプチドに関して進行する。これらのペプチドを、４Ｍ塩酸グアニジン、次いで水に対して透析することによって精製し、そして質量分析によって分析する。
上記の手順を用いて修飾したペプチドを表３に列挙する。
【０１１７】
【表３】
2005225857.tif 000008
【０１１８】
実施例３
ペプチドアナログの組換え生成
あるいは、ペプチドアナログを細菌性宿主細胞において組換えDNA技術によって生成する。このペプチドを融合タンパク質として生成し、封入体、周辺質、外膜、または細胞外環境への融合タンパク質の移行に役立つように選択する。
【０１１９】
MBI-11融合ペプチドタンパク質をコードするプラスミドの構築
ポリメラーゼ連鎖反応による増幅を使用して、一本鎖鋳型からMBIペプチド遺伝子をコードする二本鎖DNAを合成する。MBI-11については、供給者の緩衝液中に50〜100ngの鋳型、25ピコモルの各プライマー、1.5mM MgCl2、200μＭの各dNTP、２ＵのTaqポリメラーゼを含む100μｌの反応混合物を調製する。反応を、30秒間94℃、30秒間55℃、30秒間74℃の25サイクル、続いて１分間74℃を用いて行った。増幅生成物を、BamHIおよびHindIIIで消化し、そして融合パートナーおよび適切な選択マーカーをコードするプラスミド発現ベクター中にクローン化した。
【０１２０】
E．coli中でのMBI-11ペプチド融合物の生成
T7プロモーター、高コピー複製起点、Aprマーカーを用い、そして融合タンパク質の遺伝子を含む、プラスミドpR2h-11を、E．coli株XL1-BlueにpGP1-2と共に同時エレクトロポレーションする。プラスミドpGP1-2は、λプロモーターおよびcI857リプレッサー遺伝子の制御下のT7ポリメラーゼ遺伝子を含む。融合タンパク質発現を30℃から42℃への温度移行によって誘導する。封入体を可溶化剤含有溶液で洗浄し、そして有機抽出溶媒で抽出する。サンプルのプロフィールをSDS-PAGEによって分析する。図１は、SDS-PAGE分析および全細胞由来の封入体の抽出プロフィールを示す。有機溶媒抽出物質中の主な夾雑物は、β-ラクタマーゼである（図１）。これらの細胞における発現レベルを表４に示す。
【０１２１】
【表４】
2005225857.tif 000009
【０１２２】
さらに、アンピシリンを使用する必要性を除き、それによって抽出物質中のβ-ラクタマーゼの出現を減少させるために低コピー数のベクターpPD100（これはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む）を使用して、MBI-11を発現させる。このプラスミドは、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ/T7プロモーター系を使用して、E．coli中で選択的な遺伝子発現および高レベルタンパク質過剰生成を可能にする（Derschら、FEMS Microbiol．Lett．123:19-26，1994）。pPD100は選択マーカーとしてのクロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT）、複数のクローニング部位、および低コピー数ベクタ−pSC101由来のori配列を含む。これらのプラスミドは、１宿主細胞当たり約４〜６コピーしか存在しない。MBI-11を含む得られた構築物をpPDR2h-11と呼ぶ。図２は、このベクターにおいて発現したMBI-11融合タンパク質のゲル電気泳動分析を示す。MBI-11融合タンパク質の発現レベルは、プラスミドpR2h-11から得られた発現レベルに匹敵する。CAT遺伝子生成物は、恐らくこのプラスミドの低コピー数の性質に起因して明らかではなく、CATタンパク質は、pPDR2h-11において高レベルで発現しない。
【０１２３】
実施例４
ペプチドアナログ活性を測定するためのインビトロアッセイ
アガロース希釈アッセイ
アガロース希釈アッセイは、ペプチドおよびペプチドアナログの抗菌活性を測定する。これはペプチドの最少阻害濃度（MIC）として表される。
【０１２４】
インビボ条件を模倣するために、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMueller Hintonブロスを、低EEOアガロースと組み合わせて細菌増殖培地として使用する。寒天中の荷電した基が培地を介してペプチド拡散を妨げるので、より通常に使用される寒天をアガロースと置換する。培地をオートクレーブし、次いで抗菌溶液の無菌的な付加の前に水浴中で50〜55℃まで冷却する。異なる濃度のペプチド溶液の同一容量を、冷却した溶融アガロースに添加する。次いで、これを深さ３〜４mmまで注ぐ。
【０１２５】
細菌接種物を、0.5McFarland濁度標準（PML Microbiological）に調整し、次いでアガロースプレート上への適用前に1:10に希釈する。アガロースに適用する最終接種物は、５〜８mm直径スポットで約104CFUである。アガロースプレートを、35〜37℃で16〜20時間インキュベートする。
【０１２６】
MICを、目視検査によって決定した、生物の増殖を完全に阻害するペプチドの最少濃度として記録する。種々のインドリシジンアナログについての代表的なMICを以下の表５に示す。
【０１２７】
【表５−１】
2005225857.tif 000010
【０１２８】
【表５−２】
2005225857.tif 000011
【０１２９】
【表５−３】
2005225857.tif 000012
【０１３０】
【表５−４】
2005225857.tif 000013
【０１３１】
【表５−５】
2005225857.tif 000014
【０１３２】
【表５−６】
2005225857.tif 000015
【０１３３】
【表５−７】
2005225857.tif 000016
【０１３４】
【表５−８】
2005225857.tif 000017
【０１３５】
【表５−９】
2005225857.tif 000018
【０１３６】
【表５−１０】
2005225857.tif 000019
【０１３７】
【表５−１１】
2005225857.tif 000020
【０１３８】
【表５−１２】
2005225857.tif 000021
【０１３９】
【表５−１３】
2005225857.tif 000022
【０１４０】
【表５−１４】
2005225857.tif 000023
【０１４１】
【表５−１５】
2005225857.tif 000024
【０１４２】
【表５−１６】
2005225857.tif 000025
【０１４３】
【表５−１７】
2005225857.tif 000026
【０１４４】
【表５−１８】
2005225857.tif 000027
【０１４５】
【表５−１９】
2005225857.tif 000028
【０１４６】
【表５−２０】
2005225857.tif 000029
【０１４７】
【表５−２１】
2005225857.tif 000030
【０１４８】
【表５−２２】
2005225857.tif 000031
【０１４９】
【表５−２３】
2005225857.tif 000032
【０１５０】
【表５−２４】
2005225857.tif 000033
【０１５１】
【表５−２５】
2005225857.tif 000034
【０１５２】
【表５−２６】
2005225857.tif 000035
【０１５３】
ブロス希釈アッセイ
このアッセイはまた、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMueller Hintonブロスを増殖培地として使用する。代表的には、100μｌのブロスを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウエルに分配し、そしてペプチドアナログの100μｌ容量の２倍連続希釈物を、プレート上に作製する。ウエルの１つの列にはペプチドを与えず、そして増殖コントロールとして使用する。各ウェルを約５×105CFUの細菌で接種し、そしてプレートを35〜37℃で16〜20時間インキュベートする。MICを、再び、目視検査によって決定した生物の増殖を完全に阻害するペプチドの最少濃度として記録する。
【０１５４】
例えば、MIC値をS．aureus株に対する一連のペプチドアナログについて確立した。結果を以下の表６に示す。
【０１５５】
【表６】
2005225857.tif 000036
【０１５６】
時間殺傷アッセイ
時間殺傷曲線を使用して、ある時間間隔に渡るカチオン性ペプチドの抗菌活性を決定する。簡略には、このアッセイにおいて、0.5McFarland Standardに等しい微生物の懸濁液を、0.9％生理食塩水中で調製する。次いで、この懸濁物を、カチオン調整Mueller Hintonブロスの9mlの総容量まで添加する場合、接種物サイズが１×106CFU/mlであるように希釈する。0.1mlのアリコートを、24時間まで予め決定した間隔で各チューブから取り出し、0.9％生理食塩水中に希釈し、そして３連でプレートし、生存コロニー数を決定する。各サンプル中に残っている細菌の数を経時的にプロットし、カチオン性ペプチド殺傷の割合を決定する。概して、増殖コントロールと比較して抗菌懸濁物中の細菌数における３以上のlog10減少は、適切な殺菌性応答を示す。
【０１５７】
図３に示すように、全てのペプチドが増殖コントロールと比較して抗菌懸濁物中の細菌数における３以上のlog10減少を示した。これは、これらのペプチドが殺菌応答についての基準を満たすことを示す。
【０１５８】
相乗効果アッセイ
ペプチドアナログと従来の抗生物質の組み合わせでの処置は、相乗効果を有し得る。相乗効果を、アガロース希釈技術を使用してアッセイする。ここで配列したプレート（各々は特有の濃度混合物中にペプチドと抗生物質の組み合わせを含む）を、細菌の単離物で接種する。相乗効果を多くの従来の抗生物質と組み合わせたペプチドアナログについて調べる。これにはペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、マクロライド、フルオロキノロンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
相乗効果をFractional Inhibitory Concentration（FIC）として表す。これは、以下の式に従って計算する。0.5以下のFICは、相乗効果の証拠であるが、より高い価を有する組み合わせが治療的に有用であり得る。
【０１６０】
2005225857.tif 000037
【０１６１】
表７は、インドリシジンアナログとムピロシン（Mupirocin）の組み合わせについての例示的な相乗効果のデータを示す。
【０１６２】
【表７】
2005225857.tif 000038
【０１６３】
E．coliの株、S．aureusの株、P．aeruginosaの株に対するムピロシンのMIC値は、ペプチド単独の＜1/2値である濃度のインドリシジンアナログとの組み合わせで少なくとも３倍まで減少する。
【０１６４】
表９はインドリシジンアナログとシプロフロキサシンの組み合わせについての例示的な相乗効果データを示す。
【０１６５】
【表９】
2005225857.tif 000039
【０１６６】
ペプチド単独の＜1/2値である濃度のインドリシジンアナログとの組み合わせで少なくとも２倍まで減少する。
【０１６７】
実施例５
ペプチドアナログの生化学的特徴
処方物緩衝液中における可溶性
ペプチドの可溶性に影響を与える主な因子は、そのアミノ酸配列である。ポリカチオン性ペプチドは、好ましくは、水性溶液に、特に低pH条件下で自由に可溶性である。しかし、特定の処方物においてポリカチオン性ペプチドは濾過工程によって除去される凝集を形成し得る。インビボアッセイのためのペプチド溶液は、投与される前に濾過されるので、濾過後の用量レベルの正確性および再現性を試験する。
【０１６８】
処方物に溶解させたペプチドを、親水性0.2μｍフィルターメンブレンを通して濾過し、次いで逆相HPLCを使用して総ペプチド含有量について分析する。各濃度について、100％可溶標準を、ペプチドをMilliQ水に溶解させることによって調製する。各濃度／処方物組み合わせについての相対的回収値を提供するために、各条件についての総ピーク面積を測定し、そして標準のピーク面積と比較する。
【０１６９】
MBI 11CNを４つの異なる緩衝液系（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびC1）（以下の表10）中において50、100、200、および400μｇ/mlペプチド濃度で調製した。処方物ＡまたはＢ（両方ともペプチドおよびタンパク質の溶媒和のために通常に使用される）を用いると、ペプチドは、濃度依存性様式で濾過によって失われる（図４）。回収率は、400μｇ/mlの濃度で最大70％に達したのみであった。対照的に、処方物ＣおよびClに溶解させたペプチドは完全に回収された。ポリアニオン性イオンを含む緩衝液は凝集を強めるようであり、そして凝集物は、フィルターによって補足されるマトリックスの形態をとるようである。モノアニオン性対イオンは、非凝集可溶性形態のペプチドの維持により適切であるが、他の可溶化剤の添加は処方物をさらに改善し得る。
【０１７０】
【表１０】
2005225857.tif 000040
【０１７１】
ブロスにおける可溶性
ペプチドアナログの可溶性を、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMueller Hintonブロス中で目視検査によって評価する。用いた手順は、細菌をウェルに添加しないことを除いてブロス希釈アッセイについて使用した手順である。各ウェル中の溶液の外観を以下の尺度によって評価する：（ａ）清澄、沈澱なし、（ｂ）軽い拡散性の沈澱、および（ｃ）濁り、重い沈澱。結果は、例えば、MBI-10CNが、これらの条件下でMBI 11CNより可溶性ではないこと、およびMBI 11BCNアナログがMBI 11ACNアナログより可溶性ではないことを示す。
【０１７２】
ペプチドアナログ処方物の逆相HPLC分析
逆相HPLC（これは、ペプチド定量化のための分析的方法を提供する）を使用して、２つの異なる処方物中のペプチドを調べる。処方物C1およびＤにおいて調製したMBI 11CNの400μｇ/ml溶液を、他の種からの遊離ペプチドを分離させる段階的勾配を使用して分析する。以下のような標準的クロマトグラフィー条件を使用する：
・溶媒Ａ：水中の0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）
・溶媒Ｂ：水中の0.1％ TFA/95％アセトニトリル
・培地：POROS（登録商標）R2-20（ポリスチレンジビニルベンゼン）
【０１７３】
図５に示すように、MBI 11CNを、処方物C1中の遊離ペプチド、および処方物Ｄ中の主な処方物−複合体ペプチドとして２つの形態で分離し得る。この複合体は、アセトニトリル（これは、複合体の安定性を破壊すると予想される）を含む勾配中の分離プロトコールを耐える。少量（＜10％）の遊離ペプチドに対応するピークがまた、処方物Ｄにおいて観察される。溶出勾配の形態が変化される場合、結合ペプチドは広く低いピークとして溶出する。これは処方物中のペプチドの複合体が不均一であることを示す。
【０１７４】
実施例６
円二色性分光法を使用する、インドリシジン修飾体の構造分析
円二色性（CD）は、溶液中のペプチドおよびタンパク質の二次構造を調べる分光学的技術である。例えば、R．W．Woody，（Methods in Enzymology，246:34，1995）を参照のこと。α-ヘリックスペプチドのCDスペクトルは、208nmおよび222nmでの特徴的な二重の最小値に起因して最も容易に解釈可能である。しかし、他の二次構造を有するペプチドについては、CDスペクトルの解釈は、より複雑であり、そしてより信頼性がない。ペプチドについてのCDデータを使用して、溶液構造をインビトロ活性に関連づける。
【０１７５】
インドリシジンアナログのCD測定を、３つの異なる水性環境（（１）10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）（２）リン酸緩衝液および40％（v/v）トリフルオロエタノール（TFE）ならびに（３）リン酸緩衝液および大きな（100nm直径）単層リン脂質ベシクル（リポソーム））中で行う（表11）。有機溶媒TFEおよびリポソームは、ペプチドが活性な構造をとっていると推定される細菌性膜を模倣することを意図する疎水的環境を提供する。
【０１７６】
結果は、ペプチドがMBI 11F4CNを除いてリン酸緩衝液中で主に無秩序（200nm付近でマイナスの最少値）であることを示す。MBI 11F4CNは、220nmにさらなる最少値を示す（以下を参照のこと）。TFEの存在は、MBI 11および、MBI 11G4CNにおいてβ-ターンを誘導し、そしてMBI 11F4CNにおいてα-ヘリックス性を増大させるが、ペプチドのほとんどは、無秩序のままである。リポソームの存在下で、ペプチドMBI 11CNおよびBI 11B7CN（これらは、TFEにおいて無秩序である）は、β-ターン構造を示す（230nm付近でのマイナスの最少値）（図６）。従って、リポソームは、TFEよりも秩序づけられた二次構造を誘導するようである。
【０１７７】
β-ターン構造は、疎水性環境で表れる優勢な二次構造である。これは、β-ターン構造が活性な膜結合形態での主な構造であることを示唆する。対照的に、MBI 11F4CNは、TFEの存在下で増大したα-ヘリックス構造を示す。ペプチドMBI 114FCNはまた、試験したペプチドの中で最も不溶性かつ溶血性である。これは、α-ヘリックス二次構造はこれらのアナログにおいて望ましくない特性を導入し得ることを示唆する。
【０１７８】
さらに、CDスペクトルを、APS修飾ペプチドについて記録する（表11）。結果は、これらの化合物がリン酸緩衝液中で有意なβ-ターン二次構造を有することを示す。これはTFE中でほんのわずか変化される。
【０１７９】
さらに、CDの結果は、β-ターン構造（すなわち、膜結合）は試験したインドリシジンアナログの中で好ましい活性構造であることを示唆する。
【０１８０】
【表１１】
2005225857.tif 000041
【０１８１】
【表１２】
2005225857.tif 000042
【０１８２】
実施例７
膜透過性アッセイ
リポソーム色素放出
リン脂質二重層を透過するペプチドの能力を調べるための方法は記載されている（Parenteら、Biochemistry，29，8720，1990）。簡略には、規定されたリン脂質組成のリポソームを蛍光色素分子の存在下で調製する。本実施例において、蛍光性分子8-アミノナフタレン-1,3,6-トリスルホン酸（ANTS）およびその消光剤分子p-キシレン-ビス-ピリジニウムブロミド（DPX）からなる色素対を使用する。遊離色素分子、無色素リポソーム、およびカプセル化されたANTS-DPXを含むリポソームの混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによって分離する。アッセイにおいて、試験ペプチドをANTS-DPX含有リポソームとインキュベートし、そしてリポソームの外側へのANTS放出に起因する蛍光を経時的に測定する。
【０１８３】
このアッセイを使用して、色素放出によって測定される、ペプチド活性は、多くのリポソーム対ペプチド比（L/P）でリポソームの組成に対して非常に感受性であることが示される（図７）。詳細には、エッグホスフォチジルコリン（PC）から構成されるリポソームへのコレステロールの付加は、MBI 11CNの膜透過性活性を、極めて高い脂質対ペプチドモル比でさえ（コレステロールを含まないエッグPCリポソームと比較する）実質的に消滅させる。このインビトロ選択性は、哺乳動物細胞の存在下の細菌細胞についてインビトロで観察された選択性を模倣し得る。
【０１８４】
さらに、MBI 11CNによって誘導される膜破壊にサイズ限界が存在する。ANTS/DPXを、エッグPCリポソーム中でフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン（FD-4）(分子量4,400)と置換し得る。FD-4蛍光における増大は、MBI 11CNとのインキュベーションに際して検出されない。これらの結果は、MBI 11CN媒介膜破壊は、相対的に小さなANTS/DPX分子（約400Da）の放出を可能にするが、よりかさ高いFD-4分子の放出を可能にしないことを示す。
【０１８５】
E．coli ML-35内膜アッセイ
ペプチド−膜相互作用を測定するための別の方法は、E．coli ML-35株を使用する（Lehrerら、J．Clin．Invest.，84:553，1989）。この株は、β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子の染色体性コピーを含み、そしてパーミアーゼを欠失している。この株を、周辺質へのβ-ガラクトシダーゼの放出を通じて、内膜上でのペプチドの効果を測定するために使用する。β-ガラクトシダーゼの放出を、その基質0-ニトロフェノールβ-D-ガラクトピラノシド（ONPG）の加水分解を分光光度的にモニターすることによって測定する。加水分解の最大速度（Ｖmax）を、種々の増殖時点で採取した細胞のアリコートについて決定する。
【０１８６】
中期対数期細胞（4×107CFU/mlに希釈した）に対する最大の活性に必要とされるペプチドの濃度を決定するための予備実験によって、50μｇ/mlの値が得られ、これを、全ての後の実験に使用する。細胞を、２つの異なる増殖培地（Terrific培地（TB）およびLuria培地（LB））で増殖させ、そして等量の細胞をそれらの増殖サイクルの間にアッセイする。得られるMBI 11B7CNの活性プロフィールを、図８に示す。富化したTB培地中での細胞増殖について、最大活性は、初期の中期対数期（140分）で生じるが、一方、LB培地中での細胞増殖については、中期対数期の後期（230分）で最大活性が生じる。さらに、LB中のみで140分で活性の一時的な低下が観察される。この活性の低下は、本来の供給源の枯渇に起因する新たなエネルギー源の利用の必要性のような、代謝の移行に関連し得る。これは、さらに富化したTB培地では生じない。代謝の切り替えの結果として、膜電位が変化する。
【０１８７】
膜電位がペプチド活性に対して効果を有するかどうかを試験するために、カリウムイオン透過孔バリノマイシンを使用する電気化学的勾配の破壊効果を試験する。バリノマイシンと共に予めインキュベートした細胞をペプチドで処理する。そしてMBI 10CNおよびMBI 11CNについて、バリドマイシンと共に予めインキュベートしていないものと比較して、ONPGの加水分解は約50％まで減少した（図９）。バリドマイシンに感受性ではない別のカチオン性ペプチドを、ポジティブコントロールとして使用する。
【０１８８】
膜透過活性に影響を与える因子のさらなる記載を試験する。例示的な試験において、MBI 11B7CNを、150mMの塩化ナトリウム（NaCl）または５mMのマグネシウムイオン（Mg2+）のいずれかを含有する等張性のHEPES/スクロース緩衝液と共に予めインキュベートし、そして上記のようにアッセイする。図10において、いずれの溶液でも有意な阻害が観察され、このことは、ペプチドの透過作用における静電気的な相互作用の関与を示唆する。
【０１８９】
実施例８
インドリシジンアナログによる赤血球溶解
赤血球（RBC）溶解アッセイを、MBI 11CNおよびグラミシジン-Sと比較して、標準的な条件下でRBCを溶解するペプチドの能力にしたがってペプチドを分類するために使用する。ペプチドサンプルおよび洗浄したヒツジRBCを、６と７の間に調整した最終pHを有する等張性の生理食塩水中で調製する。ペプチドサンプルとRBC懸濁物とを共に混合して、１％（v/v）RBCおよび５、50、または500μｇ/mlペプチドの溶液を得る。アッセイ混合物を、絶えず振盪しながら37℃にて１時間インキュベートし、遠心分離し、そして上清を540nmの吸光度について測定する。これによって放出されたヘモグロビンを検出する。放出されたヘモグロビンの割合を、水中に溶解した一連の既知の標準物との比較によって決定する。アッセイの各セットはまた、それぞれ「低溶解」コントロールおよび「高溶解」コントロールとしてMBI 11CN（500μｇ/ml）およびグラミシジン-S（５μｇ/ml）を含む。
【０１９０】
MBI-11B7CN-HCl、MBI-11F3CN-HClおよびMBI-11F4CN-HClをこの手順を使用して試験し、そして結果を以下の表13に示す。
【０１９１】
【表１３】
2005225857.tif 000043
【０１９２】
５μｇ/mlで、「高溶解」コントロールであるグラミシジン-Sと同等またはそれより多い程度にRBCを溶解するペプチドを、高溶解性と見なす。500μｇ/mlで「低溶解」コントロールであるMBI 11CNと同等またはそれより少ない程度にRBCを溶解するペプチドを、非溶解性と見なす。試験した３つのアナログは全て、それらがMBI 11CNより多くそしてグラミシジン-Sより少ない溶解を生じるので、「中程度に溶解性」である。さらに、アナログの１つである、MBI-11F3CN-HClは、試験した３つの濃度で他の２つの変異体よりも有意に溶解性が低い。
【０１９３】
実施例９
ペプチドアナログに対する抗体の産生
小さい非免疫原性ペプチジルコアに連結した標的ペプチドの４または８つのコピーを含む多抗原性ペプチド（MAP）を、免疫原として調製する。あるいは、標的ペプチドを、ウシ血清アルブミン（BSA）またはオボアルブミンに結合する。例えば、MBI 11CN、ならびにその７アミノ酸のＮ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントを、標的ペプチド配列として使用する。免疫原を、標準的なプロトコールを使用してウサギに皮下注射する（HarlowおよびLane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988を参照のこと）。追加免疫を繰り返した（通常は１ケ月ごと）後、血液サンプルに由来する血清を、標的ペプチドに対するELISAで試験する。陽性の結果は抗体の存在を示し、そしてさらなる試験によって標的ペプチドに結合する抗体の特異性を決定する。次いで、精製した抗体をこの血清から単離し、そして研究および臨床サンプル中の標的ペプチドを選択的に同定し、そしてその量を測定するために、ELISAで使用する。
【０１９４】
実施例10
血漿および血液中のペプチドアナログの薬理学
血漿および血液中の遊離のペプチドアナログのインビトロの寿命を、一連のインキュベーション時間後に存在するペプチドの量を測定することによって決定する。血液を、抗凝固剤（ヘパリン以外）で処置したヒツジから回収し、そして血漿の調製のために、遠心分離して細胞を除去する。調剤したペプチドを、血漿画分または全血のいずれかに添加し、そしてインキュベートする。インキュベーション後、ペプチドを同定し、そして逆相HPLCによって直接定量する。遊離のペプチドのピークが血液または血漿由来のいずれのピークよりも上にない場合は、抽出は必要ではない。
【０１９５】
処方物C1およびＤ中の１mg/mLのMBI 11CNの溶液を、新たに調製したヒツジの血漿に100μｇ/mLの最終ペプチド濃度で添加し、そして37℃でインキュベートする。種々の時間で、血漿のアリコートを除去し、そして逆相HPLCによって遊離のペプチドについて分析する。各クロマトグラムから、遊離のペプチドに対応するピークの面積を積分し、そしてインキュベーション時間に対してプロットする。図11に示すように、ペプチドレベルは経時的に減少する。さらに、処方物Ｄ中に投与した場合、50％までのペプチドが、血液への添加の際に処方物−ペプチド複合体から即座に放出される。遊離のペプチドについての減衰曲線によって、処方物C1およびＤの両方について90分の血液中での見かけの半減期が得られる。これらの結果は、ヒツジの血液中では、MBI 11CNは、血漿ぺプチダーゼおよびプロテアーゼに対して比較的耐性であることを示す。インキュベーションの間に出現した新たなピークは、ペプチドの崩壊産物であり得る。
【０１９６】
インビボでの血漿中のぺプチドレベルを、処方物C1またはＤのいずれか中でのペプチドアナログの最大寛容用量の80〜100％のivまたはip投与後に測定する。処方物C1中のMBI 11CNを、マウスCD1 ICRBR株の尾静脈に静脈内注射する。注射後の種々の時点でマウスを麻酔し、そして血液を心臓の穿刺によって採取する。個々のマウス由来の血液を遠心分離して、細胞から血漿を分離する。次いで、血漿を、逆相HPLCカラムによって分析する。得られる溶出プロフィールを、280nmでのUV吸収によって遊離のペプチド含量について分析し、そしてこれらのデータを、較正した標準物に基づいて血液中の濃度に変換する。各データ点は、２匹のマウスによる平均血液レベルを示す。このアッセイにおいて、検出限界は約１μｇ/mlであり、投与された用量の３％未満である。
【０１９７】
ペプチドが測定され得る最も最初の時点は、注射後３分であり、従って、最大の観察される濃度（μｇ/mlで）はゼロ時点まで戻ると推定される（図12）。概算される開始濃度は、35〜45μｇ/mlの間の予想される濃度に充分に対応する。減衰は迅速であるが、曲線が指数的な減衰方程式に一致する場合、遊離の環状ペプチドは、2.1分の半減期を有すると計算される。遊離の環状ペプチドは、処方物Ｄ中のMBI 11CNを注射したマウスの血液中で検出不可能であり、このことは、インビトロでは、ペプチドが複合体から迅速には放出されないことを示唆する。
【０１９８】
さらに、MBI 11CNをまた、40mg/kgの有効用量レベルで単回のip注射によってマウスCD1 ICRBR株に投与する。ペプチドを、ペプチド複合体が血液レベルに対して任意の効果を有するかどうかを決定するために、処方物C1およびＤの両方中で投与する。注射後の種々の時間にマウスを麻酔し、そして血液を心臓の穿刺によって採取する。血液を回収し、そしてiv注射について分析する。
【０１９９】
この経路によって投与したMBI 11CNは、極めて異なる薬理学的プロフィールを示した（図13）。処方物C1において、ペプチドは、迅速に血流中に入り、15分後にほぼ５μｇ/mlのピーク濃度を有し、これは60分後に検出不可能なレベルまで低下する。対照的に、処方物Ｄ中のペプチドは、およそ２時間の間、２μｇ/mlを超えるレベルで存在する。従って、処方物は、血液への進入、および血液中のペプチドレベルの維持に影響を与える。
【０２００】
実施例11
インビボでのペプチドアナログの毒性
種々のインドリシジンアナログの激しい単回用量の毒性を、種々の投与経路を使用してSwiss CD1マウスで試験する。任意の処方物／送達ビヒクルの効果の非存在下でのペプチドアナログの固有の毒性を決定するために、ペプチドを、６〜７の間の最終pHを有する等張性の生理食塩水中で全て投与する。
【０２０１】
腹腔内経路。６匹のマウスの群に、500μｌの投与容量中で80〜５mg/kgの間のペプチド用量を注射する。ペプチドの投与後、マウスを５日間観察する。この時点で、50％の死亡率を生じる用量（LD50）、90〜100％の死亡率を生じる用量（LD90-100）、および最大寛容用量（MTD）レベルを決定する。LD50値を、ReedおよびMuench（J．of Amer．Hyg．27:493-497，1938）の方法を使用して計算する。表14に示す結果は、MBI 11CNおよびアナログについてのLD50値は21〜52mg/kgの範囲にあることを示す。
【０２０２】
【表１４】
2005225857.tif 000044
【０２０３】
静脈内経路。６匹のマウスの群に、100μｌの容量中で20、16、12、８、４、および０mg/kgのペプチド用量を注射する（4ml/kg）。投与後、マウスを５日間観察する。この時点で、LD50、LD90-100、およびMTDレベルを決定する。MBI 11CNおよび３つのアナログのIV毒性試験による結果を、表15に示す。LD50、LD90-100、およびMTD値は、それぞれ、5.8〜15mg/kg、８〜20mg/kg、および＜４〜12mg/kgの範囲にある。
【０２０４】
【表１５】
2005225857.tif 000045
【０２０５】
皮下経路。MBI 11CNの毒性をまた、皮下（SC）投与後に決定する。SC毒性試験のために、６匹のマウスの群に、300μＬの投与容量中で128、96、64、32、および０mg/kgの間のペプチド用量を注射する（12mL/kg）。投与後、マウスを５日間観察する。５日間の観察期間中には、いずれの用量でもマウスは死亡しなかった。従って、LD50、LD90-100、およびMTDは全て128mg/kgよりも大きいと考えられる。より高い用量レベルを受容しているマウスは、IV注射後に見られる症状に類似の症状を示し、このことは、ペプチドが全身性の循環に入ったことを示唆する。これらの症状は可逆的であり、観察の２日目までに全てのマウスで消滅する。
【０２０６】
別の処方物中でのMBI 10CNおよびMBI 11CNの単回用量の毒性をまた、非近交系ICRマウスで試験する（表16）。処方物Ｄ中でのMBI 10CNの腹腔内注射（２匹のマウスの群）は、29mg/kgまでは毒性を示さず、そして同じ条件下でMBI 11CNは40mg/kgまで毒性を示さない。
処方物Ｄ中でのMBI 10CNの静脈内注射（10匹のマウスの群）は、5.6mg/kgの最大寛容用量（MTD）を示す（表16）。11mg/kgの注射は40％の毒性を生じ、そして22mg/kgの注射は100％の毒性を生じる。処方物Ｃ（凍結乾燥した）中でのMBI 11CNの静脈内注射は、3.0mg/kgのMTDを示す。6.1mg/kgでの注射は10％の毒性を生じ、そして12mg/kgでは100％の毒性を生じる。
【０２０７】
【表１６】
2005225857.tif 000046
【０２０８】
これらの結果を、調製後に凍結乾燥し、そして水中で再構成したペプチド／緩衝液溶液を用いて得る。ペプチド溶液を注射前に凍結乾燥せずに、調製後すぐに使用する場合、毒性の増大が見られ、そして最大寛容用量は４倍まで減少し得る。例えば、非凍結緩衝溶液である処方物C1としてのMBI 11CNの静脈内注射は、1.5mg/kgで20％の毒性を生じ、そして3.0mg/kgで100％の毒性を生じる。非凍結乾燥処方物および凍結乾燥処方物のHPLC分析は、MBI 11CNがポリソルベートと複合体を形成し、そしてこのペプチドの複合体がマウス中でのその毒性を低下することを示す。
【０２０９】
さらにマウスを、MBI 11CNを静脈内経路によって複数回注射する（表17）。１つの代表的な実験では、５分の間隔で0.84mg/kgの10回の注射で投与したペプチドは、致死的ではない。しかし、10分の間隔で投与される4.1mg/kgでのペプチドの２回の注射は、60％の死亡率を生じる。
【０２１０】
【表１７】
2005225857.tif 000047
【０２１１】
ペプチドアナログのマウスへの投与の効果を評価するために、一連の組織病理学的研究を実施し得る。マウスの群に、MTD、またはMTD以下、またはMTD以上、致死用量のいずれかの用量レベルでアナログを投与する。複数回の注射を、可能性のある処置レジメを模倣するために使用し得る。コントロールマウスの群は、注射しないかまたは緩衝液のみで注射する。
【０２１２】
注射後、所定の時間にマウスを屠殺し、そしてそれらの個体を10％の平衡化ホルマリン溶液中に迅速に置く。アナログの毒性効果の結果死亡したマウスもまた、それらの個体をすぐに保存する。組織サンプルを採取し、そしてスライド上に染色した微小な切片として調製し、次いでこれを顕微鏡によって試験する。組織の損傷を評価し、そしてこの情報を使用して、改善したアナログ、改善した投与方法、または改善した投与レジメを開発し得る。
【０２１３】
実施例12
ペプチドアナログのインビボでの効果
アナログを、致死的な細菌感染からマウスを救出（rescue）するそれらの能力について試験する。使用する動物モデルは、106〜108のグラム陽性細菌でのマウスの腹腔内（ip）接種、続くペプチドの投与である。試験する３つの病原体（メチシリン感受性S．aureus（MSSA）、メチシリン耐性S．aureus（MRSA）、またはS．epidermidis）をマウスにip注射する。未処置のマウスについては、MSSAおよびS．epidermisでは12〜18時間以内に死亡し、そしてMRSAでは６〜10時間以内に死亡する。
【０２１４】
ペプチドを、２つの経路（感染の１時間後に腹腔内で、または感染前もしくは感染後の種々に時点で与えられる単回もしくは複数回の用量での静脈内で）投与する。
【０２１５】
MSSA感染。代表的なプロトコールでは、10匹のマウスの群を、５％のムチンを含有する脳−心臓注入液中で注射したLD90-100用量（5.2×106CFU/マウス）のMSSA（Smith，ATCC ♯19640）を腹腔内感染させる。S．aureusのこの株は、全ての一般的な抗生物質に対して耐性ではない。感染の60分後、処方物D中でMBI 10CNまたはMBI 11CNを一定の用量レベルで腹腔内注射する。処方物のみの注射をネガティブコントロールとして取り扱い、そしてアンピシリンの投与をポジティブコントロールとして取り扱う。マウスの生存性を、感染後１，２，３，および４時間、およびその後は１日に２回、全部で８日間モニターする。
【０２１６】
図14に示すように、MBI 10CNは、14.5〜38.0mg/kgの用量でMSSAに対して最大に活性（70〜80％の生存性）であるが、100％の生存性は達成されない。14.5mg/kg未満では、明らかな用量依存性生存が存在する。これらの低い用量レベルでは、動物−依存性閾値であるようである。なぜなら、マウスは、２日までに死亡するかまたは全８日間にわたって生存するかのいずれかであるからである。一方、図15に見られるように、MBI 11CNは、35.7mg/kgの用量レベルでMSSA感染から100％のマウスを救出した。従って、アンピシリンと同様に有効であった。全てのより低用量レベルでは、僅かに活性が存在したか、または全く活性はなかった。このことは、最低の血流ペプチドレベルが、細菌が宿主に対して危険である時間の間に達成されなければならないことを示す。
【０２１７】
上記に示すように、MBI 11CNの血液レベルは、２時間の間２μｇ/mlより大きいレベルで維持され得、これによってこれが最低レベルよりも高いことが推測される。
【０２１８】
さらに、MBI 11CNの配列に基づく８つの変異体を、上記の実験系を使用してMSSAに対して試験する。処方物Ｄ中で調製したペプチドを、12〜24mg/kgの範囲の用量レベルで投与し、そして感染させたマウスの生存性を８日間モニターする（図16〜24）。各変異体について、観察期間の終わりでの生存の割合を表18にまとめる。表に見られるように、いくつかの変異体はこれらの条件下でMBI 11CNより大きいか、または同等の効率を示した。
【０２１９】
【表１８】
2005225857.tif 000048
【０２２０】
S．epidermidis感染。ペプチドアナログは一般に、S．epidermidisに対してインビトロでより低いMIC値を有し、従ってより低い血液ペプチドレベルが感染に対してより有効であり得る。
【０２２１】
代表的なプロトコールでは、10匹のマウスの群を、５％のムチンを含有する脳−心臓注入溶液（broth）中でS．epidermidis（ATCC♯12228）のLD90-100用量（2.0×108CFU/マウス）で腹腔内注射する。このS．epidermidis株は５日後に90％が死亡する。感染の15分および60分後、処方物Ｄ中の種々の用量のMBI 11CNを尾静脈を通じて静脈内注射する。処方物のみの注射をネガティブコントロールとして取り扱い、そしてゲンタマイシンの注射をポジティブコントロールとして取り扱う。両方を感染後60分で注射する。マウスの生存率を、感染の１，２，３，４，６，および８時間後、ならびにその後は１日に２回、全部で８日間モニターする。
【０２２２】
図２５Ａおよび２５Ｂに示すように、MBI 11CNは、マウスの生存を延長する。効力は、注射15分後処理した３つの用量レベル全てにおいて観察されるが、注射30分後では活性がより低く、そして注射60分後では、有意な影響はみられない。投与時間は、このモデル系において重要であるようである。注射15分後の6.1mg/kgの単回注射が最良の生存率を与える。
【０２２３】
MRSA感染。MRSA感染は、短期間で致死であるが、MSSAよりも高い細菌充填量（load）を必要とする。代表的なプロトコルにおいては、10匹マウス群を、５％ムチンを含有する脳心臓浸出物中のLD90-100用量（4.2×107CFU/マウス）のMRSA（ATCC第33591号）で腹腔内注射する。処理プロトコルは以下の通りであり、処理時間は、感染時間に対する：
・０mg/kg           処方Ｄのみ（ネガティブコントロール）、０分で注射
・５mg/kg           ３回5.5mg/kg注射（−５分、＋55分、および＋115分）
・１mg/kg（２時間） ５回1.1mg/kg注射
（−５分、＋55分、＋115分、＋175分、および＋235分）
・１mg/kg（20分）   ５回1.1mg/kg注射
（−10分、−５分、０分、＋５分、および＋10分）
・バンコマイシン （ポジティブコントロール）、０分で注射
【０２２４】
MBI 11CNを、処方Ｄ中で、尾静脈に静脈注射する。マウスの生存を注射１、２、３、４、６、８、10、12、24および30時間後に、その後総計８日間毎日２回記録する。24時間後では、マウス生存数に何の変化もなかった（図２６）。
【０２２５】
１mg/kg（20分）処理プロトコル（感染時間を中心に５分間隔で注射した）は、マウスの死亡を有意な程度で遅延させ、研究の終わりには１匹生存していた。表１９に示した結果は、より長い期間にわたって維持された充分に高いレベルのMBI 11CNは、マウス生存数を増大させることを示唆する。５mg/kgおよび１mg/kg（２時間）結果（ここでは、ネガティブコントロールを超える生存度の改善はない）は、最も高いレベルでさえ、１時間毎の注射は、MRSAに対して有効でないことを示す。
【０２２６】
【表１９】
2005225857.tif 000049
【０２２７】
実施例１３
紫外光によるポリソルベート80の活性化
２％（w/w）ポリソルベート80の溶液を水中で調製し、そして適切な反応容器（例えば、水晶セル）中に入れる。準備が透明光路または長期の反応時間についてなされれば、UV半透過性であるかまたは褐色でさえある他のコンテナが用いられ得る。さらに、容器は、空気の交換を可能にするが、蒸発を最小に抑えなければならない。
【０２２８】
この溶液を、254nmで放射するランプを用いて、紫外光で照射する。照射はまた、302nmで放射するランプを用いて実施され得る。活性化は、コンテナ、溶液の深さ、および空気交換率に依存して１〜14日で完了する。反応を逆相HPLCアッセイによりモニターする。これは、光活性化ポリソルベートをMBI 11CNと反応させたときのAPS修飾MBI 11CNの形成を測定する。
【０２２９】
活性化ポリソルベートのいくつかの特性を決定する。過酸化物は、UV光にエーテルを曝露する既知の副産物であるので、過酸化物形成は、活性化ポリソルベートに対する還元剤の影響を介して試験される。図２７Ａに見られるように、活性化ポリソルベートは、MBI 11CNと容易に反応する。2-メルカプトエタノール（穏和な還元剤）での前処理（図２７Ｂ）は、検出可能な過酸化物を除去するが、結合体形成能の喪失を生じさせない。水素化ホウ素ナトリウムでの処理（図２７Ｃ）は過酸化物を除去し、最終的には、活性化ポリソルベートがペプチドを修飾する能力を除去する。水中でのホウ化水素の加水分解は、pHを上昇させ、そして加水分解産物としてホウ酸塩を生成する。しかし、pH変化もホウ酸塩も確実ではない。
【０２３０】
これらのデータは、過酸化物は、活性化ポリソルベートによるペプチドの修飾に関与しないことを示している。水素化ホウ素ナトリウムは、水性媒体中でエポキドにもエステルにも影響を与えず、このことから、反応基はアルデヒドまたはケトンであることが示唆される。活性化ポリソルベートにおけるアルデヒドの存在は、ホルムアルデヒド試験を用いることにより確認し、これは、ホルムアルデヒド以外のアルデヒドを含むアルデヒドに特異的である。
【０２３１】
さらに、反応基を捕獲する試みにおいて、活性化ポリソルベートを2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH）で処理する。３つのDNPH-タグ化成分を精製し、質量分析により分析する。これらの成分はポリソルベート誘導され、1000〜1400の間の分子量を有する。これは、低分子量アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒドまたはアセトアルデヒド）が関与することを示している。
【０２３２】
実施例１４
APS修飾ペプチドの形成
APS修飾ペプチドを固相または液相のいずれかで調製する。固相調製について、0.25mlの４mg/mlのMBI 11CNを0.5mlの0.4M酢酸NaOH（pH4.6）に添加し、その後0.25mlのUV光UV活性化を添加する。反応混合物を−80℃冷凍庫中に置くことにより凍結する。凍結後、反応混合物を一晩凍結乾燥する。
【０２３３】
結合体を水相中で調製するために、UV活性化ポリソルベートのサンプルをまず0.1M NaOHの添加により7.5のpHに調整する。このpH調整溶液（0.5ml）を1.0mlの100mMカルボン酸ナトリウムに添加する。このpH調整溶液（0.5ml）を1.0mlの100mMカルボン酸ナトリウム（pH10.0）に添加し、その直後に0.5mlの4mg/nlのMBI 11CNを添加する。反応混合物を室温で22時間インキュベートする。反応の進行をRP-HPLCを用いる種々の時点での分析によりモニターする（図２８）。図２８では、ピーク２は未反応ペプチドであり、ピーク３はAPS修飾ペプチドである。タイプＩはピーク３の左側の大半部であり、そしてタイプ２は、ピーク３の右側の大半部である。
【０２３４】
表２０は、いくつかの実験からのデータを要約する。表２０において他にシルされなければ、APS修飾ペプチドは、200mM酢酸-NaOH緩衝液（pH4.6）中で凍結乾燥法により調製する。
【０２３５】
【表２０】
2005225857.tif 000050
【０２３６】
アミノ基の修飾を、付着の間に喪失した第一級アミノ基の数を決定することによりさらに分析する。未修飾および修飾ペプチドを、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）で処理する（R.L．Lundblad、Techniques in Protein Modification and Analysis,151〜154頁、1995）（表２１）。
【０２３７】
簡単には、MBI 11CNのストック溶液（４mg/ml）およびAPS修飾MBI 11CNの等モル溶液を調製する。MBI 11CNまたはAPS修飾MBI 11CNの0.225mlアリコートを0.225mlの200mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.8）と混合する。１％TNBSの0.450mlアリコートを各サンプルに添加し、そして反応を37℃で30分間インキュベートする。367nmでの吸光度を測定し、そして１分子当たりの修飾された第一級アミノ基の数をトリニトロフェニル（TNP）誘導体について10,500Ｍ-1cm-1の吸光係数を用いて計算する。
【０２３８】
次いで、親ペプチドの第一級アミノ基含量を、対応するAPS修飾ペプチドと比較する。以下に示すように、単一の第一級アミノ基の喪失は、修飾ペプチドの形成の間に生じる。3,4リジン対を有するペプチドは、一貫して、予期されるより１残基低い結果を与え、これは、ダブレットの１つのメンバーのタイトレーション後の立体妨害を反映し得る。
【０２３９】
【表２１】
2005225857.tif 000051
【０２４０】
APS修飾ペプチドアナログの安定性
APS修飾ペプチドは、イオン性または疎水性の複合体の解離を促進する条件下で高度の安定性を示す。処方Ｄ中のAPS修飾ペプチドを、水、0.9％生理食塩水、８Ｍ尿素、８Ｍグアニジン-HCl、67％1-プロパノール、１Ｍ HClおよび１Ｍ NaOH中の800μｇ/ml溶液として調製し、室温で１時間インキュベートする。サンプルを逆相HPLCおよび以下のクロマトグラフィー条件を用いて遊離ペプチドの存在について分析する：
溶媒Ａ：0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）（水中）
溶媒Ｂ：0.1％TFA／95％アセトニトリル（水中）
媒体:POROS R2-20（ポリスチレンジビニルベンゼン）
溶出：０％Ｂ（５カラム容量）
０−25％Ｂ（３カラム容量）
25％Ｂ（10カラム容量）
25−95％Ｂ（３カラム容量）
95％Ｂ（10カラム容量）
【０２４１】
これらの条件下、遊離ペプチドは25％Ｂ段階でもっぱら溶出し、処方−ペプチド複合体は95％Ｂ段階でもっぱら溶出する。上記の解離条件はいずれも、APS修飾ペプチドから遊離ペプチドを遊離することに成功しない（但し、１Ｍ NaOHを除く（ここでは幾分かの分解が見られる））。追加研究を、55℃または85℃で１時間インキュベーションして実施する。APS修飾ペプチドは、55℃では同等に安定であり、そして85℃ではややわずかにより安定でない。いくらかの酸加水分解（HPLCクロマトグラムにおける新規ピークの存在により示される）は、85℃で１時間インキュベートした１Ｍ HClにおいて観察される。
【０２４２】
実施例１５
APS修飾MBI 11CNの精製
APS修飾MBI 11CNの大規模調製物を精製する。約400mgのMBI 11CNをAPS修飾し、そして20ml水中に溶解する。未反応MBI 11CNをRP-HPLCにより除去する。次いで、溶媒をAPS修飾MBI 11CNプールからエバポレートし、そして残渣をl0ml塩化メチレンに溶解する。次いで、修飾ペプチドを10mlジエチルエーテルで沈澱させる。室温で５分後、沈殿物を5000×gで10分間遠心分離することにより収集する。ペレットを、5mlのジエチルエーテルで洗浄し、そして再度、5000×ｇで10分間遠心分離することにより収集する。上清を、未反応ポリソルベート副産物の分析のためにプールする。沈殿物を6mlの水中に溶解し、次いで30分間バブリングすることにより窒素でフラッシュし、残余エーテルを除去する。出発MBI 11CNからの総収量は43％であった。
【０２４３】
実施例１６
APS修飾ペプチドを用いる生物学的アッセイ
APS修飾ペプチドと未修飾ペプチドとを比較する全ての生物学的アッセイを、等モル比で実施する。APS修飾ペプチドの濃度は、分光光度測定（これは、生物学的アッセイのために濃度を標準化するために用いる）により決定され得る。例えば、１mg/ml APS修飾MBI 11CN溶液は、１mg/ml MBI 11CN溶液と同じ量のペプチドを含有し、従って毒性および効力データの直接比較を可能にする。
【０２４４】
APS修飾ペプチドは、本明細書中に記載のように実施されるインビトロアッセイにおいて親ペプチドと少なくとも同等に強力である。グラム陽性細菌に対するMIC値は、いくつかのAPS修飾ペプチドについて示され、そして親ペプチドを用いて得られた値と比較する（表２２）。結果は、修飾ペプチドが、インビトロで親ペプチドと少なくとも同等に強力であり、そしてE．faecakis株に対して親ペプチドより強力であり得ることを示す。
【０２４５】
【表２２−１】
2005225857.tif 000052
【０２４６】
【表２２−２】
2005225857.tif 000053
【０２４７】
APS修飾MBI 11CNおよび未反応MBI 11CNの毒性をSwiss CD-1マウスにおいて試験する。６匹マウス群を、0.9％生理食塩水中0.1mlペプチドの単回用量で静脈注射する。用いた用量レベルは、０、３、５、８、10、および13mg/kgである。マウスは、第１日目には注射１、３、および６時間後にモニターし、次いで４日間毎日２回モニターする。MBI 11CNマウスについての生存データを表２３に示す。APS修飾MBI 11CNについては、マウスの100％が全ての用量（13mg/kgの最大用量を含む）で生存した。
【０２４８】
【表２３】
2005225857.tif 000054
【０２４９】
以下に要約するように、MBI 11CNについてのLD50は7mg/kgである（表２４）。全ての被験体は８mg/mlの用量で死亡する。100％生存を与えるMBI 11CNの最も高い用量は、５mg/kgであった。データは、APS修飾ペプチドが親ペプチドより有意に毒性が低いことを示す。
【０２５０】
【表２４】
2005225857.tif 000055
*入手可能なデータを用いては計算され得なかった。
【０２５１】
例示の目的のために、本発明の特定の実施態様についてのみ本明細書中で説明したが、種々の改変が本発明の意図および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲によるようなことを除いては限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】図１は、MBI-11融合タンパク質を含む全細胞由来の封入体（ib）の抽出プロフィールを示すSDS-PAGEである。融合タンパク質バンドは、矢印の先端により示される。レーン１、タンパク質標準；レーン２、プラスミドを含まないXL-1 Blueの総溶解物；レーン３、30℃で培養された、XLl Blue（pR2h-11,pGP1-2）の総溶解物；レーン４、42℃で培養された、XLl Blue（pR2h-11,pGP1-2）の総溶解物；レーン５、Triton X100洗浄後の封入体の不溶性画分；レーン６、MBI-11融合タンパク質の有機抽出物；レーン７、有機抽出溶媒に不溶性の濃縮物質。
【図２】図２は、プラスミドpPDR2h-11を使用するMBI-11融合タンパク質の発現プロフィールを示すSDS-PAGEである。レーン１、タンパク質標準；レーン２、有機溶媒抽出MBI-11；レーン３、30℃で培養された、XLl Blue（pPDR2h-11,pGP1-2）の総溶解物；レーン４、42℃で培養された、XLl Blue（pPDR2h-11,pGP1-2）の総溶解物。
【図３Ａ】図３Ａは、MBI 11CN、MBI 11F4CNおよびMBI 11B7CNについての時間殺傷（time kill）アッセイの結果を示す。コロニー形成単位数（×10-4）を時間に対してプロットする。
【図３Ｂ】図３Ｂは、MBI 11CN、MBI 11F4CNおよびMBI 11B7CNについての時間殺傷（time kill）アッセイの結果を示す。コロニー形成単位数（×10-4）を時間に対してプロットする。
【図３Ｃ】図３Ｃは、MBI 11CN、MBI 11F4CNおよびMBI 11B7CNについての時間殺傷（time kill）アッセイの結果を示す。コロニー形成単位数（×10-4）を時間に対してプロットする。
【図４】図４は、種々の緩衝液におけるMBI 11CNペプチドの可溶性の程度を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、処方物C1（左のグラフパネル）および処方物Ｄ（右のグラフパネル）MBI 11CNの逆相HPLCプロフィールである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、処方物C1（左のグラフパネル）および処方物Ｄ（右のグラフパネル）MBI 11CNの逆相HPLCプロフィールである。
【図６Ａ】図６Ａは、MBI 11CNおよびMBI 11B7CNのCDスペクトルを表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、MBI 11CNおよびMBI 11B7CNのCDスペクトルを表す。
【図７Ａ】図Ａ７は、タンパク質に対して種々の脂質の比率の卵PCリポソームのANTS/DPX染料放出の結果を表す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、タンパク質に対して種々の脂質の比率の卵PCリポソームのANTS/DPX染料放出の結果を表す。
【図８Ａ】図８Ａは、テリフィック（terrific）ブロス（TB）またはLuria-Bretaniブロス（LB）中で増殖させた対数中期細胞に対するMBI 11B7CNの活性を示すグラフを表す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、テリフィック（terrific）ブロス（TB）またはLuria-Bretaniブロス（LB）中で増殖させた対数中期細胞に対するMBI 11B7CNの活性を示すグラフを表す。
【図９】図９は、細菌をMBI 10CN、MBI 11CN、またはコントロールペプチド単独あるいはバリノマイシンと組み合わせての処置の結果を示す。
【図１０】図10は、NaClまたはMg2+の存在下のMBI 11B7CNでの細菌の処置を示すグラフである。
【図１１】図11は、経時的な血漿中の遊離MBI 11CNのインビトロ量を表すグラフである。データは、処方物C1および処方物Ｄにおけるペプチドについて示される。
【図１２】図12は、静脈内注射後の種々の時間における血液中のインビボMBI 11CNレベルにおける変化を表すグラフである。
【図１３】図13は、静脈内注射後の種々の時間における血漿中のインビボMBI 11CNレベルにおける変化を表すグラフである。
【図１４】図14は、MBI 10CN、アンピシリン、およびビヒクルの腹腔内注射後のMSSA感染を生存動物の数を示すグラフである。
【図１５】図15は、MBI 11CN、アンピシリン、およびビヒクルの腹腔内注射後のMSSA感染を生存動物の数を示すグラフである。
【図１６】図16は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11AlCNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図１７】図17は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11E3CNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図１８】図18は、S.aureus(Smih)に対するMBI 11F3CNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図１９】図19は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11G2CNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図２０】図20は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11CNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図２１】図21は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11BlCNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図２２】図22は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11B7CNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図２３】図23は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11B8CNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図２４】図24は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11G4CNインビボ試験の結果を示すグラフである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)での感染後１時間でのip注射により投与される。
【図２５Ａ】図25Aは、MBI 10CN、ゲンタマイシン、またはビヒクルの静脈内注射後にS.epidermidis感染を生存動物の数を示すグラフを表示する。パネルA、i.v.注射、注射後15分；パネルＢ、i.v.注射、注射後60分。
【図２５Ｂ】図25Bは、MBI 10CN、ゲンタマイシン、またはビヒクルの静脈内注射後にS.epidermidis感染を生存動物の数を示すグラフを表示する。パネルA、i.v.注射、注射後15分；パネルＢ、i.v.注射、注射後60分。
【図２６】図26は、MBI 11CN、ゲンタマイシン、またはビヒクルの静脈内注射後のMRSA感染マウスの生存動物の数を示すグラフである。
【図２７Ａ】図27は、還元剤での活性化ポリソルベート処置後、APS-ペプチド処方物についてのサンプルを分析するRP-HPLCの軌跡を示す。APS-MBI-11CNペプチドは、200mM酢酸−NaOH、pH4.6、1mg/ml MBI 11CN、および0.5％活性化ポリソルベート80中における凍結乾燥を介して形成される。活性化2.0％ポリソルベートのストック溶液は、（a）還元剤なし、（b）150mM 2-メルカプトエタノール、または(c)150mM水素化ホウ素ナトリウムで、使用の直前１時間処置される。
【図２７Ｂ】図27は、還元剤での活性化ポリソルベート処置後、APS-ペプチド処方物についてのサンプルを分析するRP-HPLCの軌跡を示す。APS-MBI-11CNペプチドは、200mM酢酸−NaOH、pH4.6、1mg/ml MBI 11CN、および0.5％活性化ポリソルベート80中における凍結乾燥を介して形成される。活性化2.0％ポリソルベートのストック溶液は、（a）還元剤なし、（b）150mM 2-メルカプトエタノール、または(c)150mM水素化ホウ素ナトリウムで、使用の直前１時間処置される。
【図２７Ｃ】図27は、還元剤での活性化ポリソルベート処置後、APS-ペプチド処方物についてのサンプルを分析するRP-HPLCの軌跡を示す。APS-MBI-11CNペプチドは、200mM酢酸−NaOH、pH4.6、1mg/ml MBI 11CN、および0.5％活性化ポリソルベート80中における凍結乾燥を介して形成される。活性化2.0％ポリソルベートのストック溶液は、（a）還元剤なし、（b）150mM 2-メルカプトエタノール、または(c)150mM水素化ホウ素ナトリウムで、使用の直前１時間処置される。
【図２８Ａ】図28は、水性溶液中で経時的にAPS-MBI 11CNの形成のモニタリングをトレースするRP-HPLCを示す。この反応は、200mMの炭酸ナトリウム緩衝液pH10.0、1mg/ml MBI 11CN、0.5％活性化ポリソルベート80中で起こる。アリコートを、反応容器から示された時点で取り出し、そして直ちにRP-HPLCにより分析した。
【図２８Ｂ】図28は、水性溶液中で経時的にAPS-MBI 11CNの形成のモニタリングをトレースするRP-HPLCを示す。この反応は、200mMの炭酸ナトリウム緩衝液pH10.0、1mg/ml MBI 11CN、0.5％活性化ポリソルベート80中で起こる。アリコートを、反応容器から示された時点で取り出し、そして直ちにRP-HPLCにより分析した。
【図２８Ｃ】図28は、水性溶液中で経時的にAPS-MBI 11CNの形成のモニタリングをトレースするRP-HPLCを示す。この反応は、200mMの炭酸ナトリウム緩衝液pH10.0、1mg/ml MBI 11CN、0.5％活性化ポリソルベート80中で起こる。アリコートを、反応容器から示された時点で取り出し、そして直ちにRP-HPLCにより分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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