(57)【要約】【課題】  本発明は、対象物質の定量を正確に行うことができるバイオセンサを提供することを目的とする。【解決手段】  定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサであって、電極３と、前記電極３上に形成され、前記対象物質１３と結合する受容体５と、前記電極３上に形成された第１反応部９と、前記第１反応部９と結合しており、前記対象物質１３を検知する検知物質７とを含み、前記検知物質７は、前記対象物質１３及び前記受容体５が結合した複合体２１との結合強度が前記第１反応部９との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、前記第１反応部９は、前記検知物質７との結合により前記非対象物質１５との反応を阻害され、前記検知物質７との分離により前記非対象物質１５と反応する物質であるバイオセンサを提供する。【選択図】      図３Ａ
2005127910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサであって、
電極と、
前記電極上に形成され、前記対象物質と結合する受容体と、
前記電極上に形成された第１反応部と、
前記第１反応部と結合しており、前記対象物質を検知する検知物質とを含み、
前記検知物質は、前記対象物質及び前記受容体が結合した複合体との結合強度が前記第１反応部との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、
前記第１反応部は、前記検知物質との結合により前記非対象物質との反応を阻害され、前記検知物質との分離により前記非対象物質と反応する物質である、バイオセンサ。
【請求項２】
前記非対象物質が前記電極上にさらに付着された、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記第１反応部と前記非対象物質との反応により生成する生成物と反応する酵素及びメディエータをさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記受容体はアミン誘導体またはアルデヒド誘導体である、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記検知物質は、阻害剤からなるグループから選ばれる１または複数の組み合わせである、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記電極と前記受容体及び前記第１反応部との間に、少なくとも１層の脂質膜をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記脂質膜は、リン脂質、糖脂質または合成脂質である、請求項６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記電極と前記脂質膜との間に、少なくとも１層の高分子膜をさらに含む、請求項６に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサの製造方法であって、
電極の表面を覆うように少なくとも１層の脂質膜を前記電極に結合する電極形成ステップと、
前記脂質膜に、前記対象物質と結合する受容体を固定する受容体固定ステップと、
前記対象物質を検知する検知物質と結合している第１反応部を、前記脂質膜に固定する第１反応部固定ステップとを含み、
前記検知物質は、前記対象物質及び前記受容体が結合した複合体との結合強度が前記第１反応部との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、
前記第１反応部は、前記検知物質との結合により前記非対象物質との反応を阻害され、前記検知物質との分離により前記非対象物質と反応する物質である、バイオセンサの製造方法。
【請求項１０】
前記検知物質と結合している第１反応部と前記受容体とが固定された電極を、前記非対象物質を含む溶液中に浸漬する浸漬ステップをさらに含む、請求項９に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項１１】
前記第１反応部と前記非対象物質との反応により生成する生成物と反応する酵素及びメディエータを添加するステップをさらに含む、請求項１０に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項１２】
定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサであって、
電極と、
前記電極上に形成され、前記対象物質と結合する受容体と、
前記電極上に形成され、前記対象物質を検知する検知物質と結合する第１反応部とを含み、
前記第１反応部は、前記対象物質及び前記受容体が結合した複合体と前記検知物質の結合強度が前記第１反応部と前記検知物質との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、かつ
前記第１反応部は、前記検知物質との結合により前記非対象物質との反応を阻害され、前記検知物質との分離により前記非対象物質と反応する物質である、バイオセンサ。
【請求項１３】
定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサの製造方法であって、
電極の表面を覆うように少なくとも１層の脂質膜を前記電極に結合する電極形成ステップと、
前記脂質膜に、前記対象物質と結合する受容体を固定する受容体固定ステップと、
前記対象物質を検知する検知物質と結合する第１反応部を、前記脂質膜に固定する第１反応部固定ステップとを含み、
前記第１反応部は、前記対象物質及び前記受容体が結合した複合体と前記検知物質の結合強度が前記第１反応部と前記検知物質との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、かつ
前記第１反応部は、前記検知物質との結合により前記非対象物質との反応を阻害され、前記検知物質との分離により前記非対象物質と反応する物質である、バイオセンサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ及びバイオセンサの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵素の基質特異性を利用した分析法が、臨床分析化学、食品製造、環境化学等の分野で利用されている。とりわけ、臨床分析化学の分野では、従来からグルコース、尿素、尿酸などを選択的に検出できる酵素センサが知られている。従来の酵素センサでは酵素と反応する基質を定量するが、基質以外の物質の検出や定量をすることができない。そこで、酵素と反応する基質以外の物質を検出する高機能の脂質膜が開発されている（非特許文献１参照）。この脂質膜上には、定量対象である対象物質と反応する受容体及び酵素が固定化されている。酵素は、対象物質を検知する検知物質と結合しており、検知物質との結合によりその活性が阻害されている。ここで、その脂質膜に酵素と反応する基質及び対象物質を含む溶液を添加した場合、受容体と対象物質とが反応して複合体が生成される。生成された複合体は、酵素と結合している検知物質を捕捉し、酵素から検知物質を除去する。検知物質が除去された酵素は、活性となり溶液中の基質と反応する。この溶液において特定波長の吸光度の変化を測定することにより、対象物質の定量を行う。このように酵素と基質との反応による吸光度の変化を測定することにより、間接的に対象物質を定量することができる。
【非特許文献１】K.Fukuda et al. / Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic II (2001) 971-976
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、非特許文献１に記載の脂質膜においては、対象物質の定量を特定波長の吸光度変化を測定することで行っているため、溶液中に特定波長を吸収する物質が複数存在する場合、対象物質の正確な定量を行うことが困難である。
そこで、本発明は、対象物質の定量を正確に行うことができるバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願第１発明は、上記の課題を解決するために、定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサであって、電極と、前記電極上に形成され、前記対象物質と結合する受容体と、前記電極上に形成された第１反応部と、前記第１反応部と結合しており、前記対象物質を検知する検知物質とを含み、前記検知物質は、前記対象物質及び前記受容体が結合した複合体との結合強度が前記第１反応部との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、前記第１反応部は、前記検知物質との結合により前記非対象物質との反応を阻害され、前記検知物質との分離により前記非対象物質と反応する物質であるバイオセンサを提供する。
【０００５】
上記のバイオセンサを、対象物質及び非対象物質を含む試料溶液に浸漬した場合、対象物質と受容体とが結合して複合体が生成される。生成された複合体と検知物質とが結合することで、第１反応部から検知物質が除去される。このとき、上記のバイオセンサにおいては、第１反応部から検知物質が除去されることで第１反応部が活性化され、非対象物質との反応が可能となる。この第１反応部と非対象物質との反応により生じる生成物を直接電極反応で検出するか、生成物を基質とする酵素反応と組み合わせて検出する。前記のような過程で反応が行われるため、受容体と反応して複合体を生成する対象物質の量と、生成された複合体により第１反応部から除去される検知物質の量とは相関関係を有している。よって、検知物質が除去された第１反応部と非対象物質との反応に由来する電流の電流値は対象物質の量と相関関係を有している。この相関関係に基づいて対象物質の定量を行うため、対象物質が微量であっても非対象物質が所定量存在していれば、有効な電気的応答を得て対象物質の定量を正確に行うことができる。つまり、微量の対象物質が、第１反応部から検知物質を除去する。そして、検知物質が除去された第１反応部が、所定量存在する非対象物質と次々に反応する。そのため、第１反応部と非対象物質との反応により検出される電流は、対象物質の量に比例し、かつ非対象物質の量に応じて増幅される。
【０００６】
本願第２発明は、本願第１発明において、前記非対象物質が前記電極上にさらに付着されたバイオセンサを提供する。
バイオセンサが非対象物質を有するため、対象物質の定量を行う際に、対象物質を含む試料にバイオセンサを浸漬するのみで良い。よって、定量者が非対象物質を準備する必要が無く、定量を容易に行うことができる。
【０００７】
本願第３発明は、本願第１発明において、前記第１反応部と前記非対象物質との反応により生成する生成物と反応する酵素及びメディエータをさらに含むバイオセンサを提供する。生成物とこの酵素との反応により酸化還元されるメディエータを電極反応で検知できるので、生成物が直接電極反応で検出困難な場合に有効である。
本願第２発明は、本願第１発明において、前記受容体はアミン誘導体またはアルデヒド誘導体であるバイオセンサを提供する。
【０００８】
受容体がアミン誘導体の場合は、受容体のアミン基がアルデヒド基を有する物質と反応しシッフ塩基を形成する。検知物質が金属イオン等である場合、形成されたシッフ塩基部分と金属等の検知物質とが錯形成する。よって、検知物質を容易に受容体と結合させることができる。また、受容体がアルデヒド誘導体の場合は、受容体のアルデヒド基がアミン基を有する物質と反応しシッフ塩基を形成する。よって、同様に受容体と検知物質とが錯形成するため、容易に受容体と検知物質を結合させることができる。
【０００９】
本願第５発明は、本願第１発明において、前記検知物質は、阻害剤からなるグループから選ばれる１または複数の組み合わせであるバイオセンサを提供する。阻害剤を検知物質に用いることにより、検知物質によって第１反応部と非対象物質との間の酵素反応を制御することができる。
本願第６発明は、本願第１発明において、前記電極と前記受容体及び前記第１反応部との間に、少なくとも１層の脂質膜をさらに含むバイオセンサを提供する。
【００１０】
電極上の脂質膜は流動性を有するので、脂質膜中または脂質膜上に存在する受容体および第１反応部が移動し、近接することができる。よって、受容体と第１反応部との間の検知物質の授受を高速に行うことができる。さらに、複数の受容体が互いに近接するように移動することにより検知物質を捕捉するための捕捉部位を複数形成することができる。また、受容体と対象物質との結合に疎水性場が必要である場合や、第１反応部と検知物質との相互作用、または対象物質及び受容体が結合した複合体と検知物質との相互作用に疎水性場が必要な場合には、脂質膜により疎水性場を提供することができる。
【００１１】
本願第７発明は、本願第６発明において、前記脂質膜は、リン脂質、糖脂質または合成脂質であるバイオセンサを提供する。
本願第８発明は、本願第６発明において、前記電極と前記脂質膜との間に、少なくとも１層の高分子膜をさらに含むバイオセンサを提供する。バイオセンサに高分子膜を設けることで、疎水性の電極表面を親水性の高分子膜で覆い、脂質膜を固定し易くすることができる。さらに、平坦な電極を高分子膜で被覆して電極表面に凹凸を作ることにより、電極上の脂質膜量、受容体数、および第１反応部数を増加することができる。
【００１２】
本願第９発明は、定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサの製造方法であって、電極の表面を覆うように少なくとも１層の脂質膜を前記電極に結合する電極形成ステップと、前記脂質膜に、前記対象物質と結合する受容体を固定する受容体固定ステップと、前記対象物質を検知する検知物質と結合している第１反応部を、前記脂質膜に固定する第１反応部固定ステップとを含み、前記検知物質は、前記対象物質及び前記受容体が結合した複合体との結合強度が前記第１反応部との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、前記第１反応部は、前記検知物質との結合により前記非対象物質との反応を阻害され、前記検知物質との分離により前記非対象物質と反応する物質であるバイオセンサの製造方法を提供する。
【００１３】
上記の製造方法により製造されたバイオセンサを、対象物質及び非対象物質を含む試料溶液に浸漬した場合、対象物質と受容体とが結合して複合体が生成される。生成された複合体と検知物質とが結合することで、第１反応部から検知物質が除去される。検知物質が除去された第１反応部は活性化され、非対象物質との反応が可能となる。この第１反応部と非対象物質との反応により生じる電流を電極で検出する。このとき、検出される電流の電流値と対象物質の量とが相関関係を有している。この相関関係に基づいて対象物質の定量を行うため、対象物質が微量であっても非対象物質が所定量存在していれば、有効な電気的応答を得て対象物質の定量を正確に行うことができる。
【００１４】
また、電極上の脂質膜は反応に疎水性場を提供することができる。また、脂質膜は、その流動性により検知物質を捕捉するための捕捉部位を複数提供することができる。
本願第１０発明は、本願第９発明において、前記検知物質と結合している第１反応部と前記受容体とが固定された電極を、前記非対象物質を含む溶液中に浸漬する浸漬ステップをさらに含むバイオセンサの製造方法を提供する。
【００１５】
受容体、第１反応部、検知物質が固定された電極を、非対象物質を含む溶液中に浸漬することで、非対象物質を有するバイオセンサを得ることができる。このように製造されたバイオセンサを用いて対象物質の定量を行う場合、対象物質を含む試料にバイオセンサを浸漬するのみで良い。よって、定量者が非対象物質を準備する必要が無く、定量を容易に行うことができる。
【００１６】
本願第１１発明は、本願第１０発明において、前記第１反応部と前記非対象物質との反応により生成する生成物と反応する酵素及びメディエータを添加するステップをさらに含むバイオセンサの製造方法を提供する。生成物とこの酵素との反応により酸化還元されるメディエータを電極反応で検知できるので、生成物が直接電極反応で検出困難な場合に有効である。
【００１７】
本願第１２発明は、定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサであって、電極と、前記電極上に形成され、前記対象物質と結合する受容体と、前記電極上に形成され、前記対象物質を検知する検知物質と結合する第１反応部とを含み、前記第１反応部は、前記対象物質及び前記受容体が結合した複合体と前記検知物質の結合強度が前記第１反応部と前記検知物質との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、かつ前記第１反応部は、前記検知物質との結合により前記非対象物質との反応を阻害され、前記検知物質との分離により前記非対象物質と反応する物質であるバイオセンサを提供する。
【００１８】
上記のバイオセンサを用いて対象物質の定量を行う場合、定量に先立ってまず、検知物質を含む試料溶液にバイオセンサ浸漬し、第１反応部と検知物質とを結合させる。第１反応部に検知物質が結合したバイオセンサを用い、前述と同様にして対象物質の定量を行うことで、本願第１発明と同様の効果を得ることができる。
本願第１３発明は、定量対象である対象物質の定量を前記対象物質とは異なる物質（以下、非対象物質という）により定量するバイオセンサの製造方法であって、電極の表面を覆うように少なくとも１層の脂質膜を前記電極に結合する電極形成ステップと、前記脂質膜に、前記対象物質と結合する受容体を固定する受容体固定ステップと、前記対象物質を検知する検知物質と結合する第１反応部を、前記脂質膜に固定する第１反応部固定ステップとを含み、前記第１反応部は、前記対象物質及び前記受容体が結合した複合体と前記検知物質の結合強度が前記第１反応部と前記検知物質との結合強度よりも高くなるように選ばれた物質であり、かつ前記第１反応部は、前記検知物質との結合により前記非対象物質との反応を阻害され、前記検知物質との分離により前記非対象物質と反応する物質であるバイオセンサの製造方法を提供する。上記の製造方法により製造されたバイオセンサを用いることにより、本願第１２発明と同様の効果を得ることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明を用いれば、対象物質の定量を正確に行うことができるバイオセンサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
＜基本構成＞
図１は、本発明のバイオセンサの模式図、図２はバイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の模式図である。本発明のバイオセンサ１は、電極３、受容体５、検知物質７及び第１反応部９を有している。受容体５および第１反応部９は、電極３上に固定されている。受容体５は後述の定量対象である対象物質１３と結合する性質を有している。また、第１反応部９は検知物質７と結合しており、検知物質７との結合により不活性化されている。
【００２１】
上記のバイオセンサ１を図２に示すように試料溶液１１中に浸漬する。試料溶液１１は、対象物質１３及び対象物質１３とは異なる物質（以下、非対象物質という）１５を含んでいる。非対象物質１５は、第１反応部９と特異的に反応する物質である。検知物質７を有する第１反応部９は、検知物質７との結合により不活性化されており、非対象物質１５と反応しない。
【００２２】
図３Ａ及び図３Ｂは、バイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子を示す模式図である。試料溶液１１に浸漬されたバイオセンサ１の受容体５は対象物質１３と結合し、図３Ａに示す複合体２１が生成される。生成された複合体２１は、図３Ｂに示すように検知物質７と結合する。このとき、生成された複合体２１と検知物質７との結合強度は、第１反応部９と検知物質７との結合強度よりも大きいため、検知物質７は第１反応部９から除去され複合体２１と結合する。第１反応部９は、検知物質７の除去により活性化され、非対象物質１５と特異的に反応し生成物１９を生じる。このとき非対象物質１５と第１反応部９との反応に由来する電流を電極３により検出し、電流測定部（図示しない）により検出された電流の電流値を測定する。この測定された電流値に基づいて対象物質１３の定量を行う。上記のバイオセンサ１では、受容体５が対象物質１３を認識したことに応じて検知物質７が複合体２１を認識する。さらに検知物質７が複合体２１を認識したことに応じて第１反応部９と非対象物質１５とが反応する。このように、対象物質１３の情報が検知物質７を介して第１反応部９に伝達される。
【００２３】
受容体５及び第１反応部９は必ずしも電極３上に固定されている必要はなく、電極３が第１反応部９と非対象物質１５との反応により生じる電流を検出できれば良い。受容体５及び第１反応部９が電極３上に固定されていると、第１反応部９の反応に由来する電流を高速に検出することができるので好ましい。
上記のようなバイオセンサ１では、対象物質１３と受容体５との反応により生じる複合体２１が、第１反応部９と結合している検知物質７を第１反応部９から除去し、検知物質７と結合する。このとき、検知物質７が除去されることにより第１反応部９が活性化され、第１反応部９と非対象物質１５との反応が特異的に行われる。よって、第１反応部９と検知物質７との反応により生じる電流の電流値は、対象物質１３の量と相関関係を有している。この相関関係に基づいて対象物質１３の定量を行うため、対象物質１３が微量であっても非対象物質１５が所定量存在していれば、有効な電気的応答を得て対象物質１３の定量を正確に行うことができる。つまり、微量の対象物質１３が第１反応部９から検知物質７を除去し、検知物質７が除去された第１反応部９が所定量存在する非対象物質１５と次々に反応する。そのため、第１反応部９と非対象物質１５との反応により検出される電流は、対象物質１３の量に比例し、かつ非対象物質１５の量に応じて増幅される。また、非対象物質１５は第１反応部９と特異的に反応するため、電極３により検出される電流により対象物質１３を正確に定量することができる。
＜第１実施形態例＞
図４Ａ、図４Ｂは、第１実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。図４Ａ、図４Ｂを参照して第１実施形態例のバイオセンサを説明する。
［バイオセンサの構成］
第１実施形態例の図４Ａに示すバイオセンサ１は、電極３、受容体５、検知物質７、第１反応部９及び脂質膜３０を有している。脂質膜３０は、親水性部３２と疎水性部３４とを有しており、疎水性部３４が対向するような二分子膜から構成されている。脂質膜３０は、親水性部３２と電極３とが対向するように電極３上に固定されている。受容体５は、図４Ｂに示すように親水性部５ａと疎水性部５ｂとを有しており、疎水性部５ｂが脂質膜３０の疎水性部３４に埋め込まれることで脂質膜３０に固定される。また、第１反応部９は、脂質膜３０上に固定されており、検知物質７と結合している。第１反応部９は検知物質７との結合により不活性化されている。受容体５は、後述の定量対象である対象物質１３と結合する。また、検知物質７は、対象物質１３と受容体５との結合に応答し、第１反応部９から除去される物質である。
【００２４】
バイオセンサ１に使用される電極３は、白金、金、銀等の金属電極、カーボン電極、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ−Ｔｉｎ−Ｏｘｉｄｅ）、ガラス電極等、酵素の活性に影響を及ぼさないものであれば特に限定されない。
検知物質７は、対象物質１３と相互作用せず、かつ受容体５が対象物質１３と結合した場合に、受容体５と結合した対象物質１３の量と第１反応部９から放出される量とが相関関係を有する物質であれば良い。検知物質７が第１反応部９から放出されることにより、第１反応部９は活性化される。このような検知物質７として、例えば第１反応部９が酵素の場合には、阻害剤などが挙げられる。検知物質７がこのような物質であると、検知物質７によって第１反応部９と非対象物質１５との間の酵素反応を制御し、対象物質１３の定量を行うことができる。
【００２５】
第１反応部９は、検知物質７と結合している場合に不活性化される触媒作用を有するものであれば特に限定されない。第１反応部９が酵素であると、酵素反応を利用して対象物質１３の定量を行うことができる。
また受容体５は、例えばアミン誘導体またはアルデヒド誘導体であると好ましい。受容体５がアミン誘導体の場合は、受容体５のアミン基がアルデヒド基を有する物質とシッフ塩基（＞Ｃ＝Ｎ−）を形成する。検知物質７が金属イオン等である場合、形成されたシッフ塩基部分と金属イオン等の検知物質７とが錯形成する。よって、検知物質７を容易に受容体５と結合させることができる。また、受容体５がアルデヒド誘導体の場合は、受容体５のアルデヒド基がアミン基を有する物質とシッフ塩基を形成する。よって、同様に受容体５と検知物質７とが錯形成するため、容易に受容体５と検知物質７を結合させることができる。
【００２６】
非対象物質１５としては、第１反応部９と特異的に反応する物質であり、例えば第１反応部９が酵素である場合には、その酵素の基質である。
電極３上に脂質膜３０を必ずしも設ける必要はないが、脂質膜３０を設けると次の点で好ましい。図４Ａに示すように脂質膜３０中に受容体５を埋め込んだ場合、脂質膜３０の流動性により脂質膜３０中または脂質膜３０上に存在する受容体５および第１反応部９が移動し、近接することができる。よって、受容体５と第１反応部９との間の検知物質７の授受を高速に行うことができる。さらに、複数の受容体５が互いに近接するように移動することにより検知物質７と結合する結合部位４０が複数集まり、検知物質７を捕捉するための捕捉部位を複数形成することができる。また、受容体５と対象物質１３との結合に疎水性場が必要である場合や、第１反応部９と検知物質７との相互作用及び／または対象物質１３及び受容体５が結合した複合体２１と検知物質７との相互作用に疎水性場が必要な場合には、脂質膜３０により疎水性場を提供することができる。また、脂質膜３０の親水性部３２がプラスの極性を有するときは、マイナスに帯電した第１反応部９を容易に脂質膜３０を介して電極３に固定することができる。同様に、親水性部３２がマイナスの極性を有するときは、プラスに帯電した第１反応部９を容易に脂質膜３０を介して電極３に固定することができる。さらに、アルデヒド基とアミン基間に形成されるシッフ塩基は通常塩基性下で形成されるが、疎水性環境におくと中性でもシッフ塩基形成が可能となる。よって、脂質膜３０の疎水性部３４により受容体５の周囲が疎水性環境となり、中性溶液中でも対象物質１３と受容体５とがシッフ塩基を形成することができ好ましい。
【００２７】
脂質としては、例えばリン脂質、糖脂質および合成脂質などが挙げられる。また、脂質膜３０は単分子膜、二分子膜、多重膜のいずれでもよい。さらに、受容体５、第１反応部９及び検知物質７は、各々脂質膜３０上に存在しても良いし、脂質膜中に埋包されていても良い。
また、受容体５及び／または第１反応部９は必ずしも電極３上または脂質膜３０を介した電極３上に固定されている必要はなく、電極３が第１反応部９と非対象物質１５との反応により生じる電流を検出できれば良い。受容体５及び第１反応部９が電極３上または脂質膜３０を介した電極３上に固定されていると、第１反応部９で生じる電流を高速に検出することができるので好ましい。
［バイオセンサの製造方法］
次に、第１実施形態例におけるバイオセンサ１の製造方法を説明する。図５は、バイオセンサの製造方法を示す模式図である。図５Ａに示すように、まず電極３上に脂質膜３０を固定化する。脂質膜３０は、二分子膜で構成されており、その疎水性部３４どうしが疎水相互作用により結合している。電極３と脂質膜３０とは、主に静電相互作用または共有結合により結合する。このように形成された脂質膜３０を有する電極３を、図５Ｂに示すように検知物質７と結合している第１反応部９と受容体５とを含む溶液６０に浸漬する。受容体５は、親水性部５ａと疎水性部５ｂとを有しているため、疎水及び／または親水相互作用によりその疎水性部５ｂが脂質膜３０の疎水性部３４に埋め込まれるように脂質膜３０内に固定される。検知物質７を有する第１反応部９は、脂質膜３０上に固定される。このとき、第１反応部９と脂質膜３０とは、主に静電相互作用または共有結合等により結合され、図４Ａに示すバイオセンサ１が生成される。
［定量方法］
上記の第１実施形態例におけるバイオセンサ１を用いた対象物質１３の定量方法について説明する。上記のバイオセンサ１を、例えば図６に示す試料溶液１１中に浸漬する。試料溶液１１は、対象物質１３及び対象物質１３とは異なる物質（以下、非対象物質という）１５を含んでいる。
【００２８】
図７Ａ及び図７Ｂは、バイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子を示す一例である。試料溶液１１に浸漬されたバイオセンサ１の受容体５は、対象物質１３と結合し複合体２１を生成する。このとき、複合体２１は、図７Ａに示すように検知物質７と結合する結合部位４０を有している。さらに、一対の複合体２１は、図７Ｂに示すように流動性を有する脂質膜３０内を移動し互いに集まる。そして、互いに集まった複合体２１により検知物質７を捕捉する。このとき、生成された複合体２１と検知物質７との結合強度は、第１反応部９と検知物質７との結合強度よりも大きいため、検知物質７は第１反応部９から除去され複合体２１に捕捉される。検知物質７と受容体５、検知物質７と第１反応部９及び検知物質７と複合体２１は、例えば共有結合、イオン結合、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用またはπ一π相互作用により結合する。第１反応部９は、検知物質７が除去されることにより活性化され、非対象物質１５と特異的に反応し生成物１９を生じる。このとき非対象物質１５と第１反応部９との反応に由来する電流を電極３により検出し、図７Ｂに示す電流測定部５０により検出された電流の電流値を測定する。そして、電流測定部５０により測定された電流値に基づいて対象物質１３の定量を行う。
【００２９】
上記のバイオセンサ１において、複合体２１が２つ集まることにより捕捉部位が形成され、その２つの複合体２１の捕捉部位に１つの検知物質７が捕捉される構成を示しているが、この構成に限定されない。例えば、複合体２１が３つ集まることにより形成された捕捉部位により１つの検知物質７が捕捉される構成であっても良い。
上記のバイオセンサ１において検出される電流は、例えば次に記載のように、受容体５と反応する対象物質１３の量に比例しつつ増幅される。対象物質１３と受容体５とが１：１で結合し、複合体２１と検知物質７とが２：１で結合するとする。また、２個の複合体により検知物質７が除去された第１反応部９が、１分間に１０５，０００個の非対象物質１５を生成物１９に変換する場合、対象物質１個あたりでは１分間に５２，５００個の非対象物質１５を生成物１９に変換する。よって、１個の対象物質１３に対して、５２，５００個非対象物質１５が反応するため、反応に得られる応答が５２，５００倍に増幅される。例えば、第１反応部９が１００％活性化されず、１／１００しか活性されない場合であっても、その増幅率は５２５倍となる。そのため、本発明のバイオセンサ１は、対象物質が微量の場合であっても、非対象物質１５と第１反応部９とが反応することにより対象物質を定量するバイオセンサよりも感度良く対象物質を定量することができる。
［効果］
上記の製造方法により製造されたバイオセンサ１では、対象物質１３と受容体５とが結合して複合体２１が生成される。生成された複合体２１と検知物質７とが結合することで、第１反応部９から検知物質７が除去される。第１反応部９から検知物質７が除去されることにより第１反応部９は活性化され、非対象物質１５との反応が可能となる。この反応により生じる電流を電極３で検出するため、受容体５と反応して複合体２１を生成する対象物質１３の量と、生成された複合体２１により第１反応部９から除去される検知物質７の量とは相関関係を有している。よって、検知物質７が除去された第１反応部９と非対象物質１５との反応により生じる電流の電流値は、対象物質１３の量と相関関係を有している。この相関関係に基づいて対象物質１３の定量を行うため、対象物質１３が微量であっても非対象物質１５が所定量存在していれば、有効な電気的応答を得て対象物質の定量を正確に行うことができる。つまり、微量の対象物質１３が第１反応部９から検知物質７を除去し、検知物質７が除去された第１反応部９が所定量存在する非対象物質１５と次々に反応する。そのため、第１反応部９と非対象物質１５との反応により検出される電流は、対象物質１３の量に比例し、かつ非対象物質１５の量に応じて増幅される。また、第１反応部９と非対象物質１５とが特異的に反応して生じる電流を直接的に測定するため、対象物質１３の定量を正確に行うことができる。
＜第２実施形態例＞
図８は、第２実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。図４Ａと同一の符号番号は第１実施形態例と同様の構成要素を表す。図８のバイオセンサ１には、図４Ａに示すバイオセンサにさらに非対象物質１５が結合している。図８のバイオセンサ１は、例えば非対象物質１５を含む溶液に図４Ａに示すバイオセンサを浸漬することで作成する。非対象物質１５は、粉末状態で結合されていても良い。
【００３０】
上記のような非対象物質１５を有するバイオセンサ１を用いて対象物質１３の定量を行う場合、対象物質１３を含む試料にバイオセンサ１を浸漬するのみで良い。よって、定量者が非対象物質１５を準備する必要が無く、定量を容易に行うことができる。
＜第３実施形態例＞
図９Ａ〜図９Ｅは、第３実施形態例に係るバイオセンサであり、第１反応部や受容体の固定方法が第１実施形態例と異なる。図４Ａと同一の符号番号は第１実施形態例と同様の構成要素を表す。本願のバイオセンサは種々の形態が考えられ、例えば次のようなバイオセンサが挙げられる。
【００３１】
図９Ａのバイオセンサ１は、例えば硫黄を末端に有する共有結合性の脂質膜３５と電極３とが共有結合されている。共有結合性の脂質膜３５上には、受容体５及び第１反応部９が電極３上に固定されている。このような共有結合性の脂質膜３５は、ＳＨ基などの金属に対する反応性感応基を有する脂質分子溶液に電極３を浸漬することにより得られる。図９Ｂのバイオセンサ１は、共有結合性の脂質膜３５上に、さらに図４Ａに示す二分子膜の脂質膜３０が積層されている。図９Ｃのバイオセンサ１は、共有結合性の脂質膜３５と二分子膜の脂質膜３０との間にさらにアニオン性またはカチオン性の高分子膜７０が設けられている。この高分子膜７０は、例えばポリイオンコンプレックス法により作製することができる。図９Ｄのバイオセンサ１は、単分子膜からなる脂質膜３０ａが疎水性相互作用により電極３上に固定されている。この単分子膜は、例えばラングミュア・ブロジット（ＬＢ法）やキャスト法により作製することができる。図９Ｅのバイオセンサ１は、図４Ａに示す二分子膜の脂質膜３０と電極３との間に高分子膜７０が設けられている。このとき、電極３と高分子膜７０とは、静電相互作用または疎水性相互作用により結合されている。
【００３２】
ここで、高分子膜７０は、疎水性の電極３表面を親水性の高分子膜７０で覆い、脂質膜３０を固定し易くすることができる。さらに、平坦な電極３を高分子膜７０で被覆して電極３表面に凹凸を作ることにより接着面積を増加させ、電極３上の脂質膜量、受容体数、および第１反応部数を増加させたり、結合を強化することができる。高分子膜７０は、２層構造の高分子膜であっても良く、例えば電極３上にカチオン性高分子膜であるＰＤＤＡ（ポリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム）を形成し、その上にアニオン性高分子膜であるＰＶＳ（ポリビニル硫酸カリウム）５４を形成しても良い。このように、高分子膜７０をアニオン性とカチオン性の２層構造とすることで、マイナスに帯電した脂質膜３０の親水性部３４の代わりにプラスに帯電した脂質膜３０も固定化することができる。また、高分子膜７０は２層以上であっても良い。
【００３３】
上記図９Ａ〜図９Ｅ及び第１実施形態例の図４Ａのバイオセンサの比較結果を表１にまとめる。
【００３４】
【表１】
2005127910.tif 000003
以下に、表１についての考察を示す。
（１）図９A〜図９Cに示すバイオセンサ
図９A〜図９Cに示すバイオセンサでは、共有結合により共有結合性の脂質膜３５が電極３に固定されているため、共有結合性の脂質膜３５の剥離が生じにくい。また、共有結合性の脂質膜３５の流動性が乏しい。さらに、共有結合であるため、電極３が金などの金属電極またはＩＴＯ電極に限定されてしまう。
（１−１）図９Aに示すバイオセンサ
図９Ａのバイオセンサは、電極３に共有結合性の脂質膜３５上に第１反応部９が固定され、共有結合性の脂質膜３５内に受容体５が埋め込まれている。よって、共有結合性の脂質膜３５の流動性が乏しく、受容体５が共有結合性の脂質膜３５内において移動しにくい。そのため、前記図７Ｂに示すような一対の複合体２１からなる捕捉部位が形成されにくい。一方、図９Ａのバイオセンサは、図９Ｂや図９Ｃのバイオセンサと比較して電極３上の膜の厚みが薄いため、共有結合性の脂質膜３５表面での反応により生じる電流を電極３表面で効率よく検出しやすい。つまり、共有結合性の脂質膜３５表面での反応により生じた分子等が、電極３表面に到達し易い。
（１−２）図９Ｂ、図９Ｃに示すバイオセンサ
図９Ｂや図９Ｃのバイオセンサは、共有結合性の脂質膜３５、二分子膜の脂質膜３０及び高分子膜７０が積層されているため、二分子膜の脂質膜３０から二分子膜の脂質膜３０を構成する分子の抜け落ちが少ない。つまり、下層で生じた分子の抜け落ちによる膜の欠陥が、その上層の脂質膜または高分子膜により補填される。よって、第１反応部９等が固定されるバイオセンサ１の最表面の欠陥が少なく、最表面に第１反応部９等をより多く固定することができる。しかし、多層の積層構造であるため、二分子膜の脂質膜３０表面での反応により生じる電流を電極３表面で効率よく検出し難い。つまり、二分子膜の脂質膜３０表面での反応により生じた分子等が、電極３表面に到達し難い。また、多層の積層構造であるため製造工程が増加してしまう。さらに、電極３に共有結合された脂質膜３５上に静電相互作用により二分子膜の脂質膜３０が結合されているため、二分子膜の脂質膜３０の流動性が図９Ａに示すバイオセンサよりも高い。よって、受容体５が脂質膜３５内において比較的移動し易く、捕捉部位が形成され易い。
【００３５】
図９Ｃに示すように高分子膜７０を設けると、上述の通り、高分子膜７０表面の凹凸により表面積が増加するため、より多くの第１反応部９等を固定することができる。さらに、図９Ｂと同様に流動性を有するため捕捉部位が形成され易い。しかし、高分子膜７０を形成する必要があるため、多層に積層するための工程がさらに増加してしまう。
（２）図９Ｄ、図４Ａ及び図９Ｅのバイオセンサ
図９Ｄ、図４Ａ及び図９Ｅのバイオセンサは、電極３に近接する単分子膜からなる脂質膜３０ａ、二分子膜の脂質膜３０または高分子膜７０と、電極３とが疎水性相互作用または静電相互作用により結合している。よって、電極３との結合に共有結合が介在している図９A〜図９Cに示すバイオセンサと比較して、電極３に近接する膜と電極３との結合力が弱い。また、電極３が金などの金属電極またはＩＴＯ電極に限定されず、カーボン電極を使用することができる。
（２−１）図９Ｄのバイオセンサ
図９Ｄのバイオセンサは、電極３上に単分子膜からなる脂質膜３０ａを結合するのみであるので、バイオセンサの製造工程が簡単である。また、電極３上の膜の厚みが薄いため、単分子膜からなる脂質膜３０ａ表面での反応により生じる電流を電極３表面で効率よく検出しやすい。さらに、電極３との結合に共有結合が介在している図９A〜図９Cに示すバイオセンサと比較して、単分子膜からなる脂質膜３０の流動性が高い。よって、受容体５が単分子膜からなる脂質膜３０において比較的移動し易く、捕捉部位が形成され易い。しかし、膜が積層されていないため、単分子膜からなる脂質膜３０ａから単分子膜からなる脂質膜３０ａを構成する分子が抜け落ち、バイオセンサ１の最表面の欠陥が比較的多い。よって、最表面に第１反応部９等を固定し難い。
（２−２）図４Ａのバイオセンサ
図４Ａのバイオセンサは、電極３上に二分子膜の脂質膜３０を結合するのみであるので、バイオセンサの製造工程が簡単である。また、二分子膜の脂質膜３０と電極３とのの結合が静電相互作用であるため、二分子膜の脂質膜３０の流動性が比較的高い。よって、受容体５が二分子膜の脂質膜３０内において比較的移動し易く、捕捉部位が形成され易い。また、脂質膜が二分子膜であり単分子膜が積層されているため、二分子膜の脂質膜３０から二分子膜の脂質膜３０を構成する分子の抜け落ちが少ない。よって、第１反応部９等が固定されるバイオセンサ１の最表面の欠陥が少なく、最表面に第１反応部９等をより多く固定することができる。また、電極３と二分子膜の脂質膜３０表面との距離が比較的短いため、二分子膜の脂質膜３０表面での反応により生じる電流を電極３表面で効率よく検出し易い。
（２−３）図９Ｅのバイオセンサ
図９Ｅのバイオセンサは、高分子膜７０と二分子膜の脂質膜３０との結合が静電相互作用であるため、二分子膜の脂質膜３０の流動性が比較的高く、捕捉部位が形成され易い。また、単分子膜が積層されているため、二分子膜の脂質膜３０から二分子膜の脂質膜３０を構成する分子の抜け落ちが少ない。さらに、高分子膜７０表面の凹凸により表面積が増加するため、多くの第１反応部９等を固定することができる。しかし、高分子膜７０を形成するための工程が増加してしまう。また、電極３と二分子膜の脂質膜３０との間に高分子膜７０が介在しているため、電極３と二分子膜の脂質膜３０表面との距離が比較的長く、二分子膜の脂質膜３０表面での反応により生じる電流を電極３表面で効率よく検出し難い。
【００３６】
本願発明においては、微量の対象物質１３の定量を非対象物質１５と第１反応部９との反応により増幅することにより行う。この場合、非対象物質１５と第１反応部９との反応により生じる生成物１９が電極３表面に到達し易いように、電極３上の積層構造の厚みは薄い方が好ましい。また、捕捉部位が形成され易いように第１反応部９が固定される膜の表面積は大きく、その表面の欠陥が少なく流動性がある方が好ましい。これらの点を考慮して、最適なバイオセンサを選択する。特に、非対象物質１５と第１反応部９との反応により生じる生成物１９が酸素や過酸化水素などの比較的小さな分子である場合は、積層された膜内を容易に通過することができるので、脂質膜または高分子膜が積層されているバイオセンサを選択すると好ましい。例えば、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｅのバイオセンサが選択される。一方、生成物１９が比較的大きな分子である場合は、電極３上に積層された膜厚が小さい、例えば高分子膜７０を有さない図９Ｂ、図９Ｄ、図４Ａが選択される。
＜第４実施形態例＞
図１０は、第４実施形態例に係る定量キットの構成を示している。図４Ａと同一の符号番号は第１実施形態例と同様の構成要素を表す。第４実施形態例に係る定量キット１００は、第１実施形態例に示すバイオセンサ１を非対象物質１５を含む溶液に浸漬し、バイオセンサ１に非対象物質１５を含有させている。対象物質１３を定量する際には、定量キット１００に設けられた注入口８０から定量対象である対象物質１３を注入する。定量キット１００が非対象物質１５を有するため、対象物質１３の定量を行う際に対象物質１３のみを含む試料を定量キット１００に注入すれば良い。よって、定量者が非対象物質１５を準備する必要が無く、定量を容易に行うことができる。
【００３７】
定量キット１００内の電極３と電流測定部は、リード線等を介して接続される。
＜第５実施形態例＞
図１１は、第５実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。図１１を参照して第５実施形態例のバイオセンサを説明する。
［バイオセンサの構成］
第５実施形態例の図１１に示すバイオセンサ１は、電極３、受容体５、第１反応部９及び脂質膜３０を有している。第１反応部９に検知物質７が結合されていない点を除いて第１実施形態例と同一の符号番号は同様の構成要素である。
［バイオセンサの製造方法］
次に、第５実施形態例におけるバイオセンサ１の製造方法を説明する。図１２は、バイオセンサの製造方法を示す模式図である。図１２Ａに示すように、まず電極３上に脂質膜３０を固定化する。この脂質膜３０を有する電極３を、図１２Ｂに示すように第１反応部９と受容体５とを含む溶液１１０に浸漬する。すると、図１１に示すように、受容体５は脂質膜３０内に埋め込まれ、第１反応部９は脂質膜３０上に固定される。その他の製造方法は、第１実施形態例と同様である。
［定量方法］
上記の第５実施形態例におけるバイオセンサ１を用いた対象物質１３の定量方法について説明する。上記のバイオセンサ１は、検知物質７を有していないため、対象物質１３の定量に先立ってまず、図１３に示すようにバイオセンサ１を検知物質７を含む溶液１２０に浸漬する。浸漬されたバイオセンサ１の第１反応部９と検知物質７とが結合し、第１反応部９が不活性化される。この溶液１２０中にさらに図１４に示すように対象物質１３と、対象物質１３とは異なる物質（以下、非対象物質という）１５とを加えて試料溶液１３０とする。ここで非対象物質１５は、第１反応部９と特異的に反応する物質である。
【００３８】
図１５Ａ及び図１５Ｂは、バイオセンサを試料溶液１３０に浸漬した場合の反応の様子を示す一例である。試料溶液１３０に浸漬されたバイオセンサ１では、前述の図７に示す反応と同様の反応が生じ、同様の方法により対象物質１３の定量を行うことができる。
このとき、溶液１２０及び試料溶液１３０中には、受容体５及び／または第１反応部９に対して過剰の検知物質７が含まれていると好ましい。バイオセンサ１を試料溶液１３０に浸漬する前に、図１３に示すように検知物質７を含む溶液１２０に浸漬した場合、第１反応部９と検知物質７との結合は平衡状態になる。次に、図１４に示すように溶液１２０に対象物質１３及び非対象物質１５を加え、試料溶液１３０とする。試料溶液１３０に浸漬されたバイオセンサ１では、図１５に示す受容体５と対象物質１３との結合により生成される複合体２１付近に存在する検知物質７が捕捉する反応が生じる。そのため、試料溶液１３０中のフリーの検知物質７が減少し、第１反応部９と検知物質７とが解離する方向に平衡が移動する。この平衡移動を利用して第１反応部９を活性化させることができる。
【００３９】
また、検知物質７と結合した第１反応部９が脂質膜３０上に固定されたバイオセンサ１を図１３に示す検知物質を含む溶液１２０から取り出し、対象物質１３と非対象物質１５とを含む溶液に浸漬しても良い。
＜第６実施形態例＞
図１６は、第６実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。図１６を参照して第６実施形態例のバイオセンサを説明する。
［バイオセンサの構成］
第６実施形態例の図１６に示すバイオセンサ１は、電極３、受容体５、検知物質７、第１反応部９及び脂質膜３０を有している。このバイオセンサ１が、試料溶液１４０内に浸漬されている。試料溶液１４０は、対象物質１３、非対象物質１５、非対象物質１５と第１反応部９との反応により生じる生成物と特異的に反応する第２反応部１３５及び第２反応部と電極３との間で電子の授受を媒介するメディエータ１３７を含んでいる。このとき、検知物質７が試料溶液１４０に含まれていると好ましい。その他、第１実施形態例と同一の符号番号は同様の構成要素である。
［定量方法］
上記の第６実施形態例におけるバイオセンサ１を用いた対象物質１３の定量方法について説明する。図１７Ａ及び図１７Ｂは、バイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子を示す一例である。試料溶液１４０に浸漬されたバイオセンサ１の受容体５は、対象物質１３と結合し、結合部位４０を有する複合体２１を生成する。さらに、一対の複合体２１は、図１７Ｂに示すように脂質膜３０内を移動して互いに集まり、検知物質７を捕捉する。このとき、生成された複合体２１と検知物質７との結合強度は、第１反応部９と検知物質７との結合強度よりも大きいため、検知物質７は第１反応部９から除去され複合体２１に捕捉される。検知物質７が除去されることにより活性化された第１反応部９は、非対象物質１５と特異的に反応し生成物１９を生じる。この生成物１９と第２反応部１３５が特異的に反応し、さらにその反応に応じて第２反応部とメディエータ１３７とが反応する。この反応により酸化または還元されたメディエータ１３７は、電極３と電極反応を生じ、還元または酸化される。ここで、メディエータ１３７が還元型メディエータであり、メディエータ１３９が酸化型メディエータである場合、電極３では酸化型メディエータが還元型メディエータに還元されるときの還元電流が測定される。測定された電流の電流値から対象物質１３の定量を行う。第２反応部１３５としては、ペルオキシダーゼまたはジアホラーゼなどの酸化還元酵素が挙げられる。メディエータとしては、フェロセンまたはキノン類などが挙げられる。
【００４０】
このように酵素及びメディエータを用いることによって、電極３と生成物１９とが直接反応しないため電極反応では直接検出できない生成物１９を検出することができる。なお、酵素及びメディエータは、生成物１９が直接電極反応で検出できる場合は必ずしも必要無い。また、図１８に示すように、第２反応部１３５及びメディエータ１３７をバイオセンサ１上に固定すると、第２反応部の量及びメディエータの量を低減することができるので好ましい。
【００４１】
＜実施例１＞
前記図４を再び参照して実施例１に係るバイオセンサの構成について説明する。実施例１に係るバイオセンサ１では、対象物質１３であるピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）の濃度を定量する。
［構成］
実施例１に係るバイオセンサ１の電極３は、ポリマーを積層またはチオール処理などを施した親水性電極から構成されている。この電極３上に脂質膜３０としてジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）が固定されている。脂質膜３０上には、下記の化学式（１）で表されるアミン型受容体（アミン誘導体）である受容体５が固定されている。
【００４２】
【化１】
2005127910.tif 000004
脂質膜３０上には、さらに乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である第１反応部９が固定されており、第１反応部９は検知物質７である銅（II）イオンを包含している。
［バイオセンサの製造方法］
実施例１のバイオセンサは以下のようにして作製される。アニオン性であるポリビニル硫酸カリウム（ＰＶＳ）の水溶液およびカチオン性であるポリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム（ＰＤＤＡ）の水溶液に交互に電極３を浸漬し、高分子膜を交互に積層し、電極３表面を親水性にする。あるいは、２−メルカプトプロピオン酸を含有するエタノール溶液に浸漬し、電極３表面を親水性にする。
【００４３】
ＤＭＰＣの貯蔵溶液［１００ｍＭ、ＣＨＣｌ3−ＣＨ3ＯＨの[１：１（ｖ／ｖ）]]と受容体の貯蔵溶液[１０ｍＭ、ＣＨＣｌ3−ＣＨ3ＯＨ[１：１（ｖ／ｖ）]]とを混合する。最終濃度が２ｍＭのＤＭＰＣと１０μＭの受容体との混合溶液となるように前述の貯蔵溶液を採取する。採取した混合溶液を窒素気流下で溶媒を留去した後、３０℃、減圧下で１時間乾燥し、薄膜を形成する。得られた薄膜に、所定量の２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加え、４０℃で３０分間インキュベートする。次いで、Ｖｏｒｔｅｘミキサで２分間激しく振盪した後、水槽温度を４０℃以上に保ったバス式ソニケータで２時間超音波を照射し、二分子膜ベシクル溶液を調製する。この溶液に、過塩素酸銅水溶液およびＬＤＨ水溶液をそれぞれ最終濃度２．０μＭおよび５００μｇ・ｄｍ-3になるように添加する。そして、この溶液に表面を親水性にしておいた電極３を浸漬し、高分子膜が固定された電極３表面に脂質膜３０として二分子膜を固定する。さらに、脂質膜３０上にアミン誘導体である受容体５と、検知物質７である銅（II）イオンと結合している第１反応部９とを固定し、バイオセンサ１を製造する。
［定量方法］
上記の第１実施例におけるバイオセンサ１を用いた対象物質１３の定量方法について説明する。上記のバイオセンサ１を、対象物質１３であるピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）と、非対象物質１５であるピルビン酸とを含む試料溶液中に浸漬する。試料溶液１１中には、補酵素ＮＡＤＨが含まれている。非対象物質１５であるピルビン酸は、第１反応部９であるＬＤＨと特異的に反応する物質である。ＬＤＨが銅（II）イオンと結合している場合には、不活性化されているため、第１反応部９は非対象物質１５と反応しない。
【００４４】
試料溶液１１中に浸漬されたバイオセンサ１において、アミン誘導体である受容体５が対象物質１３であるＰＬＰを認識し、結合する。アミン誘導体とＰＬＰとが結合した複合体２１には、検知物質７である銅（II）イオンとの結合部位が形成されている。ＬＤＨと結合している銅（II）イオンは、複合体２１が有する結合部位と銅（II）イオンとの結合強度がＬＤＨと銅（II）イオンとの結合強度より大きいため、複合体２１に捕捉される。よって、ＬＤＨから銅（II）イオンが除去され、ＬＤＨが活性化される。活性化されたＬＤＨは、非対象物質１５であるピルビン酸と下記反応式（２）に示すように特異的に反応し、生成物１９としてＮＡＤ+を生成する。生成されたＮＡＤ+を、例えば酵素としてジアボラーゼ、メディエータとしてフェロセンを用いて検出するとさらに好ましい。
【００４５】
【化２】
2005127910.tif 000005
このとき、ＬＤＨとピルビン酸との反応に由来する電流を電極３により検出し、検出された電流値に基づいてＰＬＰを定量することができる。例えば、酵素としてジアボラーゼ、メディエータとしてフェロセンを用いて、生成されたＮＡＤ+を検出するとさらに好ましい。
【００４６】
＜実施例２＞
前記図４を再び参照して実施例２に係るバイオセンサの構成について説明する。実施例２に係るバイオセンサ１では、対象物質１３であるトリプタミンの濃度を定量する。
［構成］
実施例２に係るバイオセンサ１の電極３は、ポリマーを積層またはチオール処理などを施した親水性電極から構成されている。この電極３上に脂質膜３０として下記の化学式（３）で表される脂質Ｎ+Ｃ5Ｇｌｙ2Ｃ16が固定されている。
【００４７】
【化３】
2005127910.tif 000006
脂質膜３０上には、下記の化学式（４）で表されるアルデヒド型受容体である受容体５が固定されている。
【００４８】
【化４】
2005127910.tif 000007
脂質膜３０上には、さらに乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である第１反応部９が固定されており、第１反応部９は検知物質７である銅（II）イオンを包含している。
［バイオセンサの製造方法］
実施例２のバイオセンサは以下のようにして作製される。受容体５であるアルデヒド型受容体は、ピリドキサールを用いて合成する。すなわち、ピリドキサールのアルデヒド基をメトキシ基で保護し、アミンの４級化反応によりアルキル鎖を付加し、脱保護する。
【００４９】
アニオン性であるポリビニル硫酸カリウム（ＰＶＳ）の水溶液およびカチオン性であるポリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム（ＰＤＤＡ）の水溶液に交互に電極３を浸漬し、高分子膜を交互に積層し、電極３表面を親水性にする。あるいは、２−メルカプトプロピオン酸を含有するエタノール溶液に浸漬し、電極３表面を親水性にする。
Ｎ+Ｃ5Ｇｌｙ2Ｃ16の貯蔵溶液を最終濃度が１．２ｍＭになるように採取する。採取した溶液を窒素気流下で溶媒を留去した後、３０℃、減圧下で１時間乾燥し、薄膜を形成する。得られた薄膜に、所定量の２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝溶液（ｐＨ７．０，３０℃）を加える。次いでＶｏｒｔｅｘミキサで５分間激しく振盪した後、水槽温度を３０℃以上に保ちながらソニケータで３分間超音波を照射し、二分子膜ベシクル溶液を調製する。この溶液に、Ｎ+Ｃ5Ｇｌｙ2Ｃ16、過塩素酸銅水溶液およびＬＤＨ水溶液をそれぞれ最終濃度５０μＭ、２．０μＭおよび１００μｇ・ｄｍ-3になるように添加する。そして、そして、この溶液に表面を親水性にしておいた電極３を浸漬し、高分子膜が固定された電極３表面に脂質膜３０として二分子膜を固定する。さらに、脂質膜３０上にアルデヒド誘導体である受容体５と、検知物質７である銅（II）イオンと結合している第１反応部９とを固定し、バイオセンサ１を製造する。
［定量方法］
上記の第２実施例におけるバイオセンサ１を用いた対象物質１３の定量方法について説明する。上記のバイオセンサ１を、対象物質１３であるトリプタミンと、非対象物質１５であるピルビン酸とを含む試料溶液中に浸漬する。試料溶液１１中には、補酵素ＮＡＤＨが含まれている。非対象物質１５であるピルビン酸は、第１反応部９であるＬＤＨと特異的に反応する物質である。ＬＤＨが銅（II）イオンと結合している場合には、不活性化されているため、第１反応部９は非対象物質１５と反応しない。
【００５０】
試料溶液１１中に浸漬されたバイオセンサ１において、アルデヒド誘導体である受容体５が対象物質１３であるトリプタミンを認識し、結合する。アルデヒド誘導体とトリプタミンとが結合した複合体２１には、検知物質７である銅（II）イオンとの結合部位が形成されている。ＬＤＨと結合している銅（II）イオンは、複合体２１が有する結合部位と銅（II）イオンとの結合強度がＬＤＨと銅（II）イオンとの結合強度より大きいため、複合体２１に捕捉される。よって、ＬＤＨから銅（II）イオンが除去され、ＬＤＨが活性化される。活性化されたＬＤＨは、非対象物質１５であるピルビン酸と前記反応式（２）に示すように特異的に反応し、生成物１９としてＮＡＤ+を生成する。このとき、この反応に由来する電流を電極３により検出し、検出された電流値に基づいてトリプタミンを定量することができる。生成されたＮＡＤ+を、例えば酵素としてジアボラーゼ、メディエータとしてフェロセンを用いて検出するとさらに好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明を用いれば、電流を測定することにより対象物質の定量を正確に行うことができるバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明のバイオセンサの模式図。
【図２】バイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の模式図。
【図３Ａ】バイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子を示す模式図（１）。
【図３Ｂ】バイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子を示す模式図（２）。
【図４Ａ】第１実施形態例に係るバイオセンサの構成。
【図４Ｂ】受容体の構成図。
【図５Ａ】第１実施形態例に係るバイオセンサの製造方法を示す模式図（１）。
【図５Ｂ】第１実施形態例に係るバイオセンサの製造方法を示す模式図（２）。
【図６】試料溶液中のバイオセンサを示す説明図。
【図７Ａ】第１実施形態例に係るバイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子示す模式図（１）。
【図７Ｂ】第１実施形態例に係るバイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子示す模式図（２）。
【図８】第２実施形態例に係るバイオセンサの構成図。
【図９Ａ】第３実施形態例に係るバイオセンサの構成図（１）。
【図９Ｂ】第３実施形態例に係るバイオセンサの構成図（２）。
【図９Ｃ】第３実施形態例に係るバイオセンサの構成図（３）。
【図９Ｄ】第３実施形態例に係るバイオセンサの構成図（４）。
【図９Ｅ】第３実施形態例に係るバイオセンサの構成図（５）。
【図１０】第４実施形態例に係る定量キットの構成図。
【図１１】第５実施形態例に係るバイオセンサの構成図。
【図１２Ａ】第５実施形態例に係るバイオセンサの製造方法を示す模式図（１）。
【図１２Ｂ】第５実施形態例に係るバイオセンサの製造方法を示す模式図（２）。
【図１３】検知物質を含む溶液中のバイオセンサを示す説明図。
【図１４】試料溶液中のバイオセンサを示す説明図。
【図１５Ａ】第５実施形態例に係るバイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子示す模式図（１）。
【図１５Ｂ】第５実施形態例に係るバイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子示す模式図（２）。
【図１６】第６実施形態例に係るバイオセンサの構成図。
【図１７Ａ】第６実施形態例に係るバイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子示す模式図（１）。
【図１７Ｂ】第６実施形態例に係るバイオセンサを試料溶液に浸漬した場合の反応の様子示す模式図（２）。
【図１８】第６実施形態例に係る別のバイオセンサの構成図。
【符号の説明】
【００５３】
１：バイオセンサ    
３：電極    
５：受容体    
７：検知物質    
９：第１反応部    
１１：試料溶液  
１３：対象物質  
１５：非対象物質  
１９：生成物  
２１：複合体  
３０：脂質膜  
７０：高分子膜  
１３５：第２反応部  
【図１】
2005127910.tif 000008
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2005127910.tif 000012
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2005127910.tif 000015
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
2005127910.tif 000024
【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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