(57)【要約】【課題】  リポソームの安定化とヨウド化合物の保持安定性を図るとともに造影化合物の血中滞留性を高め、造影剤の効率的送達および良好なターゲティングを達成する、特に腫瘍描出性の優れたＸ線造影剤を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明のＸ線検査用造影剤は、超臨界二酸化炭素法により作製されるリポソームを含有する。そのリポソームの脂質膜中には、カチオン性脂質、ステロール類、グリコール脂質およびグリセロール脂質のうち少なくとも1種を含有させ、その水相中には水溶性ヨウド系化合物を内包させている。この構成によりリポソームの安定化とヨウド化合物の保持安定性が図られている。本発明のＸ線検査用造影剤は、超臨界二酸化炭素法により作製されるためクロル系溶剤などの有毒な溶剤を含まないため安全性が高い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質膜を有するリポソームを含み、
該リポソームはその脂質膜にステロール類をリン脂質１重量部に対し0.2〜1重量部の割合で含有し、かつその脂質膜内の水相にヨウド系化合物を含有し、
しかも該リポソームが超臨界二酸化炭素法により製造されることを特徴とするＸ線検査用造影剤。
【請求項２】
脂質膜を有するリポソームを含み、
該リポソームはその脂質膜にカチオン性脂質を全脂質量に対し0.3〜3質量％の割合で含有し、かつその脂質膜内の水相にヨウド系化合物を含有し、
しかも該リポソームが超臨界二酸化炭素法により製造されることを特徴とするＸ線検査用造影剤。
【請求項３】
脂質膜を有するリポソームを含み、
該リポソームはその脂質膜にグリコール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合で
含有し、かつその脂質膜内の水相にヨウド系化合物を含有し、
しかも該リポソームが超臨界二酸化炭素法により製造されることを特徴とするＸ線検査用造影剤。
【請求項４】
脂質膜を有するリポソームを含み、
該リポソームはその脂質膜にグリセロール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合
で含有し、かつその脂質膜内の水相にヨウド系化合物を含有し、
しかも該リポソームが超臨界二酸化炭素法により製造されることを特徴とするＸ線検査用造影剤。
【請求項５】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにカチオン性脂質を全脂質量に対し0.3〜3質量％の割合で含有することを特徴とする請求項１に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項６】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにグリコール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量
％の割合で含有することを特徴とする請求項１に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項７】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにグリセロール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質
量％の割合で含有することを特徴とする請求項１に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項８】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにグリコール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量
％の割合で含有することを特徴とする請求項２に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項９】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにグリセロール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質
量％の割合で含有することを特徴とする請求項２に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項１０】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにグリセロール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質
量％の割合で含有することを特徴とする請求項３に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項１１】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにステロール類、カチオン性脂質、グリセロール脂質のうち、いずれか２種を含有することを特徴とする請求項３に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項１２】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにステロール類とカチオン性脂質とを含有することを特徴とする請求項４に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項１３】
前記リポソームは、その脂質膜にさらにステロール類とカチオン性脂質とグリコール脂質とを含有することを特徴とする請求項４に記載のＸ線検査用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線検査用造影剤に関し、詳しくは内部に造影物質を内包したリポソームを含むＸ線検査用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線単純撮影やＣＴ撮影法（コンピュータ断層撮影法）は、今日の画像診断の中核を占めている。骨、歯などのいわゆる硬組織はＸ線を良好に吸収するために容易に高コントラスト像を得ることができる。これに対し、軟組織間ではＸ線吸収の差が小さいため高いコントラスト像を得ることは困難である。このような場合、コントラストの高い画像を得るために造影剤を使用することが一般に行なわれている。
【０００３】
現在実用化されているＸ線造影剤の大部分は、トリヨードフェニル基を含有し水溶性化した化合物を造影物質とするものである。これらの造影剤は、血管、尿管、輸卵管などの管腔部位に投与され、管腔の形状、狭窄などの診断に使用されている。しかしながら、これらの化合物は組織や疾患部位と相互作用をすることなく管腔部位から速やかに排出されるために、組織や疾患部位、特に癌組織をより詳細に診断する目的には役立たない。このため目標とする組織もしくは疾患部位に選択的に集積し、その周囲またはその他の部位と明瞭なコントラストで区別できる画像を提供するＸ線造影剤が望まれている。そのようなＸ線検査用造影剤であれば、微細な癌組織であっても精度良く検出することが可能となる。腫瘍発見のための検査方法として、Ｘ線撮影法だけでなく測定原理を異にする他の方法も開発されている。たとえばＭＲＩ（磁気共鳴造影法）では、癌組織、特に微小な癌組織を精度よく撮像するには感度の面から限界があり、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）では、被爆と稼動コストの点で一般的でなく、いずれも大規模な設備と高額の装置を必要としており、今のところ一般的に広く利用される検査法ではない。
【０００４】
国際公開ＷＯ98/46275、同ＷＯ95/31181、同ＷＯ94/19025、同ＷＯ96/28414、同ＷＯ96/00089、米国特許4873075号、同4567034号などには、疎水性ヨウド化合物を界面活性剤や油脂の存在下で水中に分散させたものを投与して、肝臓、脾像、副腎皮質、腫瘍、動脈硬化巣、血液プール、リンパ系などを造影する方法が開示されている。これらの方法は、造影剤を微粒子化することにより体内での滞留時間を長くして疾患部位を選択的に造影しようとするものである。その目的のために提案された製剤方法は、造影の効率および選択性とも充分でない。さらに使用するヨウド化合物が疎水性であるために、造影後、体外へ排出する速度が遅く、患者への負担が大きいという問題点もあった。
【０００５】
一方、造影剤を微粒子状にする別の方法として、生体膜類似の脂質から構成され、低い抗原性ゆえに安全性が高いとされているリポソームに造影化合物を内包させる手法も検討されてきた。たとえば国際公開ＷＯ88/09165、同ＷＯ89/00988、同ＷＯ90/07491、特開平07-316079、特開2003-5596では、イオン性または非イオン性の造影剤を含有するリポソームが提案されている。これらの方法では、素材としての安全性が高く、生体内で適度な分解性を有するリポソームを使用するにもかかわらず、実用化に至っていない（たとえば、特許文献１参照）。製造過程においてリポソーム膜を構成するリン脂質の溶剤として、有機溶媒、特にクロロホルム、ジクロロメタンといったクロル系溶剤を使用することから、どうしても残存する溶剤の毒性が懸念されるためである。
【０００６】
他方、脂質可溶性の薬剤は容易にリポソーム中に封入されるが、その封入量は他の要因にも左右されることから必ずしもそれほど多くはない。また水溶性電解質である薬剤は、その薬剤の電荷と荷電した脂質の電荷との相互作用を通じてリポソーム内部の水相に封入
できるが、薬剤が水溶性の非電解質である場合には、そうした手段を採ることはできない。Ｘ線造影剤についても、一般にイオン性造影化合物よりも実質的に毒性の低い非イオン性ヨウド化合物をリポソーム内に封入することが望まれるが、上記の理由から容易ではない。さらに形成されたリポソームは多重層になりやすく、ヨウド化合物の内包率も低いために効率が悪くなる。このような水溶性の非電解質を効率的にリポソーム中に封入する手段として、逆相蒸発法、エーテル注入法が挙げられるが、有機溶剤を使用するためにやはり安全性の問題が残る。
【０００７】
特開2003-119120（特許文献２）では、リポソームを含有する化粧料、皮膚外用剤を、
超臨界二酸化炭素を用いて製造する方法が開示されており、親水性薬効成分や親油性薬効成分をリポソームに内包する皮膚外用剤の製造例が示されている。しかし、親水性薬効成分として、水溶性電解質の例は示されているが、同法により水溶性非電解質をリポソームに効率よく内包できるか不明であった。
【０００８】
さらに首尾良く造影物質をリポソーム内部に内包させても、時間経過とともに外部へ漏出する問題、あるいはリポソームそのものが、加工処理時または保存中に不安定になる事態も考慮されねばならない。さらにリポソームを生体内へ投与しても、その多くが肝臓、脾臓などの網内系組織で捕捉されるため、所期の効果が得られないことも指摘されている（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。
【特許文献１】特開平7-316079号公報
【特許文献２】特開2003-119120号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、造影物質をリポソーム内に良好に保持させることによりその送達効率が向上したＸ線検査用造影剤を提供することを目的とする。すなわちリポソーム内に毒性のある有機溶媒を使用しないで内包させた水溶性ヨウド系化合物が良好に保持されており、かつ、造影力にも優れるＸ線造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決する本発明は、以下の構成を有する。
【００１１】
(1)  本発明は、脂質膜を有するリポソームを含み、該リポソームはその脂質膜にステ
ロール類をリン脂質１重量部に対し0.2〜1重量部の割合で含有し、かつその脂質膜内の水相にヨウド系化合物を含有し、しかも該リポソームが超臨界二酸化炭素法により製造されることを特徴とするＸ線検査用造影剤である。
【００１２】
(2)  また、本発明は、脂質膜を有するリポソームを含み、該リポソームはその脂質膜
にカチオン性脂質を全脂質量に対し0.3〜3質量％の割合で含有し、かつその脂質膜内の水相にヨウド系化合物を含有し、しかも該リポソームが超臨界二酸化炭素法により製造されることを特徴とするＸ線検査用造影剤である。
【００１３】
(3)  さらに、本発明は、脂質膜を有するリポソームを含み、該リポソームはその脂質
膜にグリコール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合で含有し、かつその脂質膜内
の水相にヨウド系化合物を含有し、しかも該リポソームが超臨界二酸化炭素法により製造されることを特徴とするＸ線検査用造影剤である。
【００１４】
(4)   本発明は、脂質膜を有するリポソームを含み、該リポソームはその脂質膜にグリセロール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合で含有し、かつその脂質膜内の水相
にヨウド系化合物を含有し、しかも該リポソームが超臨界二酸化炭素法により製造される
ことを特徴とするＸ線検査用造影剤である。
【００１５】
前記(1)のリポソームは、その脂質膜にさらにカチオン性脂質を全脂質量に対し0.3〜3
質量％の割合で含有してもよい。
【００１６】
前記(1)のリポソームは、その脂質膜にさらにグリコール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合で含有してもよい。
【００１７】
前記(1)のリポソームは、その脂質膜にさらにグリセロール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合で含有してもよい。
【００１８】
前記(2)のリポソームは、その脂質膜にさらにグリコール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合で含有してもよい。
【００１９】
前記(2)のリポソームは、その脂質膜にさらにグリセロール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合で含有してもよい。
【００２０】
前記(3)のリポソームは、その脂質膜にさらにグリセロール脂質を全脂質量に対し0.5〜20質量％の割合で含有してもよい。
【００２１】
前記(3)のリポソームは、その脂質膜にさらにステロール類、カチオン性脂質、グリセ
ロール脂質のうち、いずれか２種を含有してもよい。
【００２２】
前記(4)のリポソームは、その脂質膜にさらにステロール類とカチオン性脂質とを含有
してもよい。
【００２３】
前記(4)のリポソームは、その脂質膜にさらにステロール類とカチオン性脂質とグリコ
ール脂質とを含有してもよい。
【００２４】
〔発明の具体的説明〕
本発明のＸ線検査用造影剤は、超臨界二酸化炭素法により作製されるリポソームを含有する。そのリポソームの脂質膜中には、ステロール類、および/またはカチオン性脂質、
および/またはグリコール脂質を含有させ、水相中には水溶性ヨウド系化合物を内包させ
ている。この構成によりリポソームの安定化とヨウド化合物の保持安定性が図られている。それとともに造影化合物の血中滞留性も高めており、造影物質の効率的な送達および良好なターゲティングを達成することができる。結果的に、優れた腫瘍描出性を実現し、Ｘ線造影による診断的検査の精度を高めることが可能となった。以下、本発明を造影化合物、リポソーム、Ｘ線検査用造影剤の順に詳細に説明する。
【００２５】
造影化合物
本発明における水溶性ヨウド系化合物は、造影性があればイオン性、非イオン性を問わず特に規定されない。一般的に非イオン性ヨウド化合物の方が、イオン性ヨウド化合物よりも浸透圧が低くより望ましい。水溶性の非イオン性ヨウド系化合物として、ヨウ化フェニルを含み、たとえば2,4,6−トリヨードフェニル基を少なくとも1個有する非イオン性ヨウド化合物が好適である。
【００２６】
具体的には、そのような非イオン性ヨウド化合物として、イオヘキソール、イオペントール、イオジキサノール、イオプロミド、イオトロラン、イオメプロール、N,N′−ビス
〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル〕−５−〔〔（２−ヒドロキシ−１−オキソプピル）−アミノ〕−2,4,6−トリヨード−1,3−ベンゼン−ジカルボキシアミ
ド（イオパミドール）；メトリザミドなどが挙げられる。
【００２７】
その他のヨウド系化合物として、ジアトリゾイン酸；ジアトリゾエートナトリウム；メグルミンジアトリゾエート；アセトリゾイン酸およびその可溶性塩；ジプロトリゾ酸；ヨーダミド，ヨージパミドナトリウム、メグルミンヨージパミド、ヨード馬尿酸およびその可溶性塩；ヨードメタム酸；ヨードピラセットヨード−２−ピリドン−Ｎ−酢酸、3,5−
ジヨード−４−ピリドン−Ｎ−酢酸（ヨードピラセット）；前記酸のジエチルアンモニウム塩；イオタラム酸；メトリゾイン酸およびその塩；イオパノ酸、イオセファム酸、イオフェノ酸およびそれらの可溶性塩；チロパノエートナトリウム、イオポダートナトリウムおよび他の同様なヨウ素化された化合物などを挙げることができる。
【００２８】
これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。またその例示に限定されるものではない。なお本明細書において、化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。
【００２９】
本発明のＸ線検査用造影剤に好適なヨウド系化合物として、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールなどが挙げられる。特にイオトラン、イオジキサノールといった二量体非イオン性ヨウド化合物では、同一ヨウド濃度の造影剤を調製しても全体のモル数が低いために浸透圧をさらに低下させる利点がある。
【００３０】
本発明の造影剤における水溶性ヨウド系化合物の濃度は、該造影化合物の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リポソーム内に封入されたヨウド系化合物の量は、典型的にはＸ線造影剤における全ヨウド化合物の5〜40質量％、好ましくは5〜30質量％、より好ましくは10〜25質量％であることが望ましい。この内包率はリポソーム粒子の細密充填の限界を下回るゆえ、リポソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。
【００３１】
リポソーム
本発明のＸ線検査用造影剤は、上記造影化合物を目標とする臓器、組織などといった標的部位へ選択的に効率よく送達するためにマイクロキャリヤーとしてのリポソーム内に封入した形態で使用される。本発明の造影剤は、血中安定性が改善されたリポソームを用いることにより血中滞留性を向上させて、効率的な薬物送達ならびにターゲティングの実現を図っている。特に優れた腫瘍描出性を獲得するために有効とされるＥＰＲ（Enhanced permeability and retention、透過性の亢進および滞留）効果を生じさせるためには、リ
ポソーム構造の安定化および封入物質の保持安定性という表裏をなす保持効率を改善させた上で、血中安定性、血中滞留性といった特性を有することが造影剤に求められる。
【００３２】
本発明のＸ線造影剤は、造影化合物を内包するリポソームの粒径およびその二分子膜を適切に設計することによりターゲティング機能を実現することができる。受動的ターゲティングおよび能動的ターゲティングいずれも考慮される。前者は、リポソームの粒径、脂質組成、荷電などの調整を通じてその生体内挙動を制御することができる。リポソーム粒径を狭い範囲に揃える調整は、後述する方法に基づき容易に行われる。さらにリポソーム膜表面の設計において、後述するようにリン脂質の種類と組成、共存物質を変えることにより、内包物質の保持効率の向上、リポソームの安定化という要件をも満たすことができる。
【００３３】
造影剤のより高度な集積性と選択性を可能とする能動的ターゲティングの採用もまた検討されるべきである。一例として、リポソーム表面にポリアルキレンオキシド高分子鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を導入することは、標的部位までの誘導過程を制
御し得るため、極めて有益な手法である。本発明のＸ線造影剤に好適なリポソームとして、たとえば表面にポリアルキレンオキシドまたはＰＥＧを付加する修飾を施す結果、血中での安定性および滞留性が一層高められ、肝臓などの細網内皮系細胞に貪食されにくいリポソームの形態が挙げられる。癌組織、疾患部位などに到達しなかったＸ線造影剤は、正常部位に集積することなく、副作用が発現する前にリポソームが分解されて体外に排泄される。このことはリポソームを設計する際にその安定性を体外排出時間との関係で適切にコントロールすることにより可能である。造影物質は、水溶性ヨウド系化合物を使用するため、腎臓を経由して速やかに尿中に排泄される。したがって徒に体内に留まることによる弊害、遅発性の副作用などを防止できる。
【００３４】
本Ｘ線造影剤の送達システムに使用されるリポソームの設計、製造方法について、以下に詳述する。
【００３５】
リポソームは、通常、脂質二重膜から形成されている。その脂質膜の成分として、一般にリン脂質および／または糖脂質が好ましく使用される。
【００３６】
本発明において使用するリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリンなどで代表されるリン脂質である。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品など、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなく、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。
【００３７】
具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。
【００３８】
本発明において使用するステロール類としては、好ましくはコレステロールが用いられるが、ステロール誘導体として、ジヒドロコレステロール、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリルなどが挙げられる。これらのステロール類は、リン脂質１重量部に対して0.1〜2重量部、好ましくは0.2〜1重量部、より好ましくは0.4〜1重量部の割合で含有するように添加すればよい。
【００３９】
本発明において使用するカチオン性脂質は、１、２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシルスペ
ルミン（DOGS）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、Ｎ−［１−（２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、２、３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチ
ル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）お
よびＮ−［１−（２、３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）などが挙げられる。
【００４０】
カチオン性リン脂質として、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、例えばジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）もしくはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなどが挙げられる。これらのカチオン性脂質は全脂質量に対し0.1〜5質量％、好ましくは全脂質量に対し0.3〜3質量％、より好
ましくは全脂質量に対し0.5〜2質量％の割合で含有するように添加すればよい。
【００４１】
カチオン性脂質は単独で使用することができるが、他の脂質と組み合わせて使用することもできる。たとえばDOTMAはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）と
の調合物（1:1）で用いることができ、リポフェクチンTM（LIPOFECTIN TM）(GIBCO/BRL、ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド、ゲイサーバーグ、メリーランド州、米国)の商品名で販売されている。
【００４２】
本発明におけるグリコール脂質としては、主にポリエチレングリコールで修飾した脂質を用いる。PEG修飾脂質として、日本油脂製が製品化されており、1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルエタノールアミン−PEG2000（製品名SUNBRIGHT DSPE-020C, DSPE-020G, DSPE-020CN, DSPE-020PA, DSPE-020MA(日本油脂製)）、1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルエタノールアミン−PEG5000（SUNBRIGHT DSPE-050C, DSPE-050G, DSPE-050CN
）、ジステアロイルグリセロール−PEG2000（SUNBRIGHT GS-020）、ジパルミトイルグリ
セロール−PEG2000（SUNBRIGHT GP-020）、ジミリストイルグリセロール−PEG2000（SUNBRIGHT GM-020）などが挙げられる。これらのグリコール脂質は、に対し0.3〜30質量％、
好ましくは全脂質量に対し0.5〜20質量％、より好ましくは全脂質量に対し2〜15質量％の割合で含有するように添加すればよい。
【００４３】
本発明におけるグリセロール脂質としては、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（製品名COATSOME MG-6060LS（日本油脂製））などが挙げられる。これらのグリセロール脂質は、全脂質量に対し0.3〜30質量
％、好ましくはに対し0.5〜20質量％、より好ましくは全脂質量に対し1〜15質量％の割合で含有するように添加すればよい。
【００４４】
リポソームを作製する方法として、これまでに種々の方法が提案されている。作製方法が異なると、最終的に出来上がったリポソームの形態および特性もまた著しく異なることが多い（特開平６-８０５６０号公報）。そのため所望するリポソームの形態、特性に応
じてその製造方法を適宜選択することが行なわれている。一般にリポソームは、リン脂質、ステロール、レシチンといった脂質成分を、ほとんど例外なくまず有機溶媒、たとえばクロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテル、四塩化炭素、酢酸エチル、ジオキサン、THFなどとともに容器中で溶解、混合することにより調製されている。揮発性物質を減
圧下で蒸発せしめた後、脂質混合物を、所定量の封入物質を含有する緩衝液中に分散させる。次いで全体を数時間撹拌し（これがリポソームの形成を引き起こす）、そうして生成したリポソーム小胞内にその分散液の一部（封入物質を含む）を封入する。次に分散液を超音波処理によるか、界面活性化剤の使用による方法あるいはその他の方法により、それらリポソームのサイズおよび分散液の粘度を減少させる。このようなリポソームの調製品は、必ず有機溶媒を含んでいる。そうした残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒は完全に除去することが困難であり、生体に及ぼす悪影響が懸念される。
【００４５】
本発明に使用するリポソームを調製するには、上記の問題点を回避できる超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法を利用する。二酸化炭素の臨界温度が31.1℃、臨界圧力が75.3 kg/cm2と比較的扱いやすく、不活性なガスゆえ残存しても人体に
無害であり、高純度流体が安価で容易に入手できるなどといった理由により好適である。本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の好適な圧力は、75〜500kg/cm2、好ましくは100〜400 kg/cm2である。また好適な臨界状態の二酸化炭素ガスの温度としては、31〜200℃、好ましくは32〜100℃、さらに好ましくは35〜80℃である。これらの範囲内で、温度および圧力を適宜選択して組み合わせることにより、超臨界状態（亜臨界状態を含む）を確立するのがよい。
【００４６】
本発明のＸ線造影剤に使用するリポソームの好適な調製方法は、具体的には以下のように行なわれる。圧力容器に液体二酸化炭素を加え、上記の好適な圧力および温度のもとにある超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。超臨界（もしくは亜臨界）状態の二酸化炭素にリポソーム膜成分を溶解する。膜脂質成分として上記リン脂質を、好ましくはカチオン性脂質、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質（好ましくはポリエチレングリコール基を有するリン脂質）、ステロール類、グリコール脂質およびグリセロール脂質から少なくとも1種選ばれた化合物とともに混合して溶解する。あるいは予めこれらの化合物を加えた
圧力容器に液体二酸化炭素を加え、次いで温度、圧力を調整して超臨界状態にして溶解する。続いて生成した脂質混合物に、ヨウド系化合物、必要に応じて後述の製剤助剤（好ましくは水溶性アミン系緩衝剤およびキレート化剤）を含む水溶液を連続的に添加して、水相／二酸化炭素エマルジョンを形成する。系内を減圧して二酸化炭素を排出すると、ヨウド系化合物を内包するリポソームが分散している水性分散液が生成する。さらに該リポソームを0.1〜0.4μの孔径を有する濾過膜を通す。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明のＸ線検査用造影剤が調製される。
【００４７】
超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法は、従来法に比べてリポソームの生成率、封入する物質の内包率、封入物質のリポソーム内残存率が高いことが示されている（上記特許文献２参照）。さらに工業的スケールでの応用も可能であり、有機溶剤を使用せずに非イオン性かつ水溶性の物質を効率よくリポソームに封入することができる本法は、本発明のＸ線造影剤の製造には有用な方法である。
【００４８】
本発明におけるリポソームの多くは、通常、多重層膜リポソームとして存在するが、一枚膜リポソームもまた混在していてもよい。ここにいう一枚膜リポソームとは、リン脂質二重層が実質的に1つの層としてなる膜（unilamellar vesicle）で構成されるリポソームである。ここで「実質的に」とは、以下の凍結かつ断（Freeze fracture ）レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察において、レプリカが概ね1つの層として認められ
るリン脂質二重層によりリポソームが構成されていることをいう。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものを一枚膜と判定し、２つ以上の段差が認められるものを「多重層膜」と判定する。多重層膜（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）からなるリポソームは、リポソーム膜の二分子膜を剥がしてその多重層をなるべく薄くすることが望ましい。そのためには、作製後に超音波の適切な適用、あるいは一定孔サイズのフィルターに通すなどの操作をさらに行なう。一枚膜リポソームの比率を高めることも望ましい。一枚膜リポソーム、特に大きい一枚膜リポソームであるＬＵＶ（Large unilamellar veislcles）は、多重層膜リポソームに比べて、大きい封入容量を提供し、リ
ポソームの投与量、換言すると投与脂質量が大きくならないという利点もある。
【００４９】
内包するヨウド化合物の重量が相対的に多過ぎるとリポソームの安定性は低下する。特にイオン強度の急激な変化には弱い傾向が観察されていた。本発明造影剤のリポソームは、比較的小さい粒径に調整し、リポソーム膜にステロール類、カチオン性脂質、グリコール脂質、グリセロール脂質を単独または数種の組合わせを含有させて、脂質膜の安定化を図っている。その結果、そうしたリポソームは、たとえば塩ショックに対しても安定的であることが判明した。
【００５０】
リポソーム粒子のサイズおよびその分布は、本発明のＸ線造影剤が目指す、高い血中滞留性、ターゲティング性、送達効率と密接に関わっている。粒径はヨウド化合物を内包するリポソームを含む分散液を凍結し、その後破砕した界面をカーボン蒸着し、このカーボンを電子顕微鏡で観察すること（凍結破砕ＴＥＭ法）により測定することができる。ここで「中心粒径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径を指している。粒径の調整は、処方またはプロセス条件で行なうことができる。たとえば、上記の超臨界の圧力を大きく
すると形成されるリポソーム粒径は小さくなる。作製するリポソームの粒径分布をより狭い範囲に揃えるには、ポリカーボネート膜で濾過してもよい。この場合、濾過膜として0.1〜0.4μの孔径のフィルターを装着したエクストルーダーに通すことにより、リポソーム膜の中心粒径として 100〜300nm以下である最適寸法のリポソームを効率よく調製するこ
とができる。押出しろ過法については、たとえばBiochim. Biophys.Acta 557巻,9ページ(1979)に記載されている。このような「押出し」操作を取り入れることにより、上記サイ
ジングに加えて、リポソーム外に存在するヨウド系化合物の濃度の調整、リポソーム分散液の交換、望ましくない物質の除去も併せて可能になるという利点もある。
【００５１】
上記のように受動的ターゲティング能力をリポソームに持たせるには、その粒径のサイジングが重要である。特許２６１９０３７号公報には、粒径3000nm以上のリポソームを排除することにより、肺の毛細血管における不都合な保持が回避されると記載されている。しかし、150〜3000nmの粒径範囲のリポソームは、必ずしも向腫瘍性とはならない。
【００５２】
本発明の造影剤リポソームの中心粒径は、通常50〜300nm、好ましくは50〜200nm、より好ましくは50〜130nmである。Ｘ線撮像の目的に応じて、粒径を適切に設定することがで
きる。たとえば腫瘍部分の選択的撮像目的の場合には、特に110〜130nmが好ましい。リポソームの粒径を100〜200nm、より好ましくは110〜130nmの範囲に揃えることにより癌組織へ選択的にＸ線造影剤を集中させることが可能となる。これは「ＥＰＲ効果」として知られている。固形癌組織にある新生血管壁の孔は、正常組織の毛細血管壁窓（fenestra）の孔サイズ、30〜80nm未満に比べて異常に大きく、約100nm〜約200nmの大きさの分子でも血管壁から漏れ出る。すなわちＥＰＲ効果は、癌組織にある新生血管壁では、正常組織の微小血管壁より透過性が高いことによるものである。
【００５３】
血管壁の孔から漏れ出た造影剤は、癌細胞の周辺にはリンパ管が充分に発達していないため、血管に再び戻らずその場に長く留まる。ＥＰＲ効果は、血流を利用する受動的な輸送であることから、それが有効に発現するための要件として、血中滞留性の向上が図られねばならない。つまり造影剤粒子（ヨウド化合物を内包するリポソーム粒子）が、血中に長くとどまって、癌細胞近くの血管を何度も通過することが求められる。本発明のＸ線造影剤は、特に大きい粒子でもないため、細網系内皮細胞による捕獲の対象になりにくい。またリポソームがいわば赤血球類似の姿と挙動をしていて腎臓を経由して速やかに排出されることはなく、さらにステルス（隠蔽）化されている場合には細網系内皮細胞に貪食されることもなく、血流中に比較的長くとどまる。ＥＰＲ効果により、必然的に標的の臓器、組織への造影化合物の移行性が高まり、造影剤の癌組織への選択的集中と蓄積が達成される。造影化合物の腫瘍細胞／正常細胞集積比の上昇は、Ｘ線造影剤のコントラスト性能を高める。このような腫瘍描出性の改善は、これまで検出困難であった微小転移性癌の発見すらも可能とする。
【００５４】
Ｘ線検査用造影剤
本発明のＸ線検査用造影剤は、上記のようにリポソーム自体の安定性が向上しているために、製剤化工程における処理時、貯蔵・保管期間にもリポソーム内に造影物質が安定的に保持される。さらに造影剤の血中安定性も上記リポソーム内への内包により図られている。Ｘ線造影のコントラスト性能を規定する標的臓器へのヨウ素の必要な送達量は、明らかにされている（たとえば特許２６１９０３７号公報）。本発明のようにヨウド系化合物をリポソームというマイクロキャリヤーに封入する場合には、造影物質の保持安定性および送達効率に加えて脂質の用量も考慮されねばならない。脂質量が多くなると造影剤の粘度が大きくなる。リポソーム内へのヨウド系化合物の封入量として、すなわちリポソーム内に封入された水溶液中に、ヨウド系化合物がリポソーム膜脂質重量に対して、1〜10、
好ましくは2〜8、より好ましくは3〜6の重量比で含有されていることが望ましい。
【００５５】
リポソーム水相へカプセル化されたヨウド系化合物の重量比が１未満であると、比較的多量の脂質を注入することが必要となり、結果的に造影物質の送達効率が悪くなる。特許２６１９０３７号公報の記載によると、当該比が１でも当時の技術水準からは高い値とされていた。反対に、リポソーム膜脂質重量に対するヨウド系化合物の封入重量比が10を超えると、リポソームが構造的にも不安定となり、リポソーム膜外へのヨウド系化合物の拡散、漏出は貯蔵中または生体内に注入された後でも避けられない。またリポソーム懸濁薬剤が製造され、分離した直後は100％の封入が達成されても、浸透圧効果による不安定化
に基づき、早くも短時間に封入成分が減少していくことが記載されている（特表平９−５０５８２１号公報）。
【００５６】
本発明の方法により製造されるＸ線検査用造影剤は、ヨウド含有量として、通常、想定される10〜300mlの製剤溶液の投与量では、100〜500mgI／mlであり、好ましくは、150〜300mgI／mlである。また本発明の製剤溶液の粘度は、３７℃で、６ｃPa以下、好ましくは0.9〜３ｃPaである。
【００５７】
本発明のＸ線検査用造影剤は、投与後にリポソームが体内に安定に維持されるように、体内の浸透圧に対し、等張の溶液または懸濁液の形でリポソーム中に封入される。そうした溶液もしくは懸濁液の媒質として、水、緩衝液、たとえばトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを使用することができる。
【００５８】
上記溶液もしくは懸濁液の好ましいｐＨ範囲は、室温で6.5〜8.5、さらに好ましくは6.8〜7.8である。Ｘ線造影剤が多ヒドロキシル基を有する水溶性ヨウド系化合物である場合、好ましい緩衝液は、米国特許第4278654号に記載されているような負の温度係数を有す
る緩衝液である。アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有しており、特に好ましくはトリス（TRIS）である。このタイプの緩衝液は、オートクレーブ温度で低いｐＨを有し、このことがオートクレーブ中のＸ線造影剤の安定性を増し、他方、室温では生理的に許容されるｐＨに戻る。したがって、注射用無菌造影剤を製造するために、リポソーム調製物をオートクレーブ滅菌できることは極めて便利であり、貯蔵安定性なども確保できる。しかしオートクレーブ滅菌を適用できないリポソームには、ろ過滅菌を行なうのがよい。
【００５９】
等張の溶液または懸濁液を得るには、等張液を提供する濃度で、造影剤を媒質中に溶解もしくは懸濁させる。たとえば造影剤化合物の溶解性が低いために造影剤が単独では等張液を提供できない場合、等張の溶液もしくは懸濁液が形成されるように他の非毒性の水溶性物質、たとえば塩化ナトリウムのごとき塩類、マンニトール、グルコース、ショ糖、ソルビトールなどの糖類を媒質中に添加してもよい。
【００６０】
本発明のＸ線造影剤は製剤化に際し、さらに製剤助剤として必要に応じて、生理学的に許容される安定化剤、キレート剤としてＥＤＴＡNa2−Ca、ＥＤＴＡNa2など、抗酸化剤としてα‐トコフェロール、粘度調節剤なども含めてもよい。
【００６１】
本発明のＸ線検査用造影剤は、注射剤または点滴注入剤として、非経口的に、具体的には血管内投与、好ましくは静脈内投与により被験者に投与されＸ線照射により撮像される。その用量は、従来のヨウド系造影剤に準じる。リポソーム内のヨウド総量、またはそれとリポソーム外のヨウド総量の和が、従来の投与量と同程度になるようにしてもよい。実際の診断的検査においては、本発明のＸ線検査用造影剤を、コンピュータ断層撮影装置（CT）と組み合わせたＸ線撮影装置に使用することにより、その造影剤性能をさらに有効に発揮することも期待される。
【発明の効果】
【００６２】
本発明に係るＸ線造影剤は、超臨界二酸化炭素法により作製されるリポソームを含み、その脂質膜中には中性もしくはアニオン性リン脂質のほか、カチオン性リン脂質および／またはステロール類および／またはグリコール脂質を含有させている。その水相中には水溶性ヨード化合物を内包させている。その結果、リポソーム構造の安定性および封入物質の保持安定性が改善されている。
【００６３】
本発明造影剤の造影物質は血中滞留性が良好であり、ＥＰＲ効果が発揮されて目的とする疾患部位または組織、とりわけ癌組織に選択的に集中し蓄積する。造影後は、該ヨウド化合物が水溶性であるため、いずれ体外へ排泄される。
【００６４】
本発明に係るＸ線造影剤は、従来のＸ線造影剤に比べ有毒な溶媒、特に毒性の高いクロル系溶媒を使用しないため、毒性、副作用がはるかに軽減されている。したがって、その投与を受ける患者の負担は少ない。
【００６５】
〔実施例〕
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明する。本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
リポソーム試料の作製
＜試料１＞
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC；日本油脂社製）200mgと、コレステロー
ルＨＰ（日本油脂社製）80mg、カチオン性脂質としてリポフェクチンTM 5mg、グリコール脂質としてSUNBRIGHT DSPE-020CN（日本油脂社製）4mg、グリセロール脂質としてコート
ソームMG-6060LS（日本油脂社製）4mgの混合物をステンレス製オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を60℃に加熱し、次いで液体二酸化炭素13gを加えた。オートクレーブ
内の圧力を50kg/cm2から120kg/cm2まで加圧し、オートクレーブ内を撹拌して、超臨界二
酸化炭素中にDPPC混合物を溶解させた。この超臨界二酸化炭素を撹拌しながら、イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL）、添加物としてトロメタモール1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液10gを定量ポンプで連続的に注入した。その後系内を減圧して二酸化炭素を
排出し、イオパミドールを含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を60℃まで加熱し超音波３分間照射したものを、80℃まで加熱しアドバンテック社製のセルロース系フィルターで、0.45μm、0.3μm、0.1μmの順に加圧濾過した。得られた造影剤を試料
１とした。
【００６７】
＜試料２＞
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC；日本油脂社製）80mgと、コレステロールＨＰ（日本油脂社製）80mg、グリコール脂質としてSUNBRIGHT DSPE-020CN（日本油脂社製）8mg、グリセロール脂質としてコートソームMG-6060LS（日本油脂社製）4mgの混合物を
ステンレス製オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を60℃に加熱し、次いで液体二酸化炭素13gを加えた。オートクレーブ内の圧力を50kg/cm2から200kg/cm2まで加圧し、オートクレーブ内を撹拌して、超臨界二酸化炭素中にDPPC混合物を溶解させた。この超臨界二酸化炭素を撹拌しながら、イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL）、添加物としてトロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液10gを定量ポンプで連続的に注入し
た。その後系内を減圧して二酸化炭素を排出し、イオパミドールを含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を80℃まで加熱し、アドバンテック社製のセルロース系フィルターで、0.45μm、0.3μm、0.1μmの順に加圧濾過した。得られた造影剤を試料２と
した。
【００６８】
＜試料３＞
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC；日本油脂社製）200mgと、カチオン性脂
質としてリポフェクチンTM 10mg、グリコール脂質としてSUNBRIGHT DSPE-020CN（日本油
脂社製）4mg、グリセロール脂質としてコートソームMG-6060LS（日本油脂社製）40mgの混合物をステンレス製オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を60℃に加熱し、次いで液体二酸化炭素13gを加えた。オートクレーブ内の圧力を50kg/cm2から200kg/cm2まで加圧し、オートクレーブ内を撹拌して、超臨界二酸化炭素中にDPPC混合物を溶解させた。この超臨界二酸化炭素を撹拌しながら、イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL）、添加物としてトロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液10gを定量ポンプで連続的に
注入した。その後系内を減圧して二酸化炭素を排出し、イオパミドールを含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を60℃まで加熱し超音波３分間照射したものを80℃まで加熱し、アドバンテック社製のセルロース系フィルターで、0.45μm、0.3μm、0.1μmの順に加圧濾過した。得られた造影剤を試料３とした。
【００６９】
＜試料４＞
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC；日本油脂社製）80mgと、コレステロールＨＰ（日本油脂社製）80mg、グリコール脂質としてSUNBRIGHT DSPE-020CN（日本油脂社製）38mgの混合物をステンレス製オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を60℃に加熱し、次いで液体二酸化炭素13gを加えた。オートクレーブ内の圧力を50kg/cm2から120kg/cm2まで加圧し、オートクレーブ内を撹拌して、超臨界二酸化炭素中にDPPC混合物を溶解させた。この超臨界二酸化炭素を撹拌しながら、イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL）、添加物としてトロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液10gを定量ポンプ
で連続的に注入した。その後系内を減圧して二酸化炭素を排出し、イオパミドールを含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を80℃まで加熱しアドバンテック社製のセルロース系フィルターで、0.45μm、0.3μm、0.1μmの順に加圧濾過した。得られた造
影剤を試料４とした。
【００７０】
＜試料５＞
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC；日本油脂社製）200mgと、コレステロー
ルＨＰ（日本油脂社製）40mg、カチオン性脂質としてリポフェクチンTM 15mg、グリコー
ル脂質としてSUNBRIGHT DSPE-020CN（日本油脂社製）38mgの混合物をステンレス製オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を60℃に加熱し、次いで液体二酸化炭素13gを加え
た。オートクレーブ内の圧力を50kg/cm2から120kg/cm2まで加圧し、オートクレーブ内を
撹拌して、超臨界二酸化炭素中にDPPC混合物を溶解させた。この超臨界二酸化炭素を撹拌しながら、イオヘキソール647mg/mL（ヨウド含有率300mg/mL）、添加物としてトロメタモールを1.21mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリ
ウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液10gを定量ポンプで連続的に注入した。その後系内
を減圧して二酸化炭素を排出し、イオヘキソールを含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を60℃まで加熱し超音波３分間照射したものを、80℃まで加熱しアドバンテック社製のセルロース系フィルターで、0.45μm、0.3μm、0.1μmの順に加圧濾過した
。得られた造影剤を試料５とした。
【００７１】
＜試料６＞
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC；日本油脂社製）100mgをステンレス製オ
ートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を60℃に加熱し、次いで液体二酸化炭素13gを
加えた。オートクレーブ内の圧力を50kg/cm2から200kg/cm2まで加圧し、オートクレーブ
内を撹拌して、超臨界二酸化炭素中にDPPCを溶解させた。この超臨界二酸化炭素を撹拌し
ながら、イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL）、添加物としてトロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液10gを定量ポンプで連続的に注入した。その後系内を減
圧して二酸化炭素を排出し、イオパミドールを含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を60℃まで加熱しさらに超音波３分間照射したものを、80℃まで加熱しアドバンテック社製のセルロース系フィルターで、0.45μm、0.3μm、0.1μmの順に加圧濾過し
て得られた造影剤を試料６とした。また超音波照射はせず試料５と同様の加圧濾過のみを実施して得られた造影剤を試料７とした。
【実施例２】
【００７２】
リポソームの形態および粒径
作製した造影剤中のリポソームの粒径および構造を凍結破砕法により透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で調べた。すなわち、リポソーム分散液を液体窒素にて急速に凍結し、凍結状態で破砕してリポソームの内部構造を露出させる。破砕面をカーボン蒸着し、形成されたカーボン膜を透過型電子顕微鏡で観察した。
【００７３】
粒径は、観察された造影剤粒子約２０個の径の単純平均とした。リポソーム粒子の構造は、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものを「一枚膜」と判定し、２つ以上の段差が認められるものを「多層膜」と判定した。約２０個の粒子を観察し、一枚膜構造のものが８割以上であるものを実質的に一枚膜リポソームと判定した。
リポソームに内包された造影剤量比の定量
リポソーム分散液を等張の食塩水で透析し、透析終了後にエタノールを添加してリポソームを破壊して、吸光度の測定によりリポソーム内のヨウド化合物量を求めた。
各試料中のリポソームについて、粒径などの測定結果を表１に示す。
【００７４】
【表１】
2005225791.tif 000002
【実施例３】
【００７５】
生理食塩水での安定性
試料１〜７を生理食塩水中に添加し、密閉後に42℃に加温して３日間放置した。得られたサンプルおよび加熱前の試料を光学顕微鏡で観察した。
【００７６】
加熱前の試料はすべて光学顕微鏡で微粒子が観察されなかったが、加熱後は、比較例試料６、７については、リポソーム粒子の合一と見られる数μmの微粒子が観察された。ま
た試料２、４はリポソーム粒子の合一と思われる微粒子がわずかに観察された。しかし、試料１，３，５については特に変化が認められなかった。
【実施例４】
【００７７】
実施例１で作製した試料1〜７を等張グルコース液で希釈して、50mgヨウ素／mlの濃度
とした。この液をラットに静脈内注射したところ、試料１よび２は、特に肝臓に集中して分布することがＸ線画像で観察された。
【実施例５】
【００７８】
家兎の皮下にＶＸ２カルシノーマの細胞浮遊液を移植した。移植２週間後に、実施例１で得た試料１〜７を家兎に静脈内注射し、注射後にＸ線画像で観察した。試料３、４、５を用いた場合には、家兎の移植部分の造影レベルが高く、造影レベルの低下速度は緩やかだった。