(57)【要約】      （修正有）【課題】アルカン水酸化機構の構成成分全てをコードする遺伝子をクローニングし、タンパク質を特定し、遺伝子を宿主で過不足なく発現し、組換体を用いて微生物変換系を構築して種々のアルカンの水酸化方法を提供すること。【解決手段】アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ遺伝子、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、ルブレドキシンレダクターゼ遺伝子、ルブレドキシンの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、ルブレドキシン遺伝子。これらの遺伝子を含む組み換えベクター、これらの遺伝子またはこの組み換えベクターを含む形質転換体。この形質転換体の存在下でアルカンを水酸化させることを含む、アルコールの製造方法。前記形質転換体を培養し、培養物から上記タンパク質を採取することを含む、タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列
【請求項３】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列
【請求項４】
下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列
【請求項５】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列
【請求項６】
下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（１）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列
【請求項７】
ゴルドニア(Gordonia)属に属する微生物に由来する遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子。
【請求項８】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列
【請求項９】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列
【請求項１０】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子または請求項１１に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の遺伝子、請求項３または４に記載の遺伝子、請求項５に記載の遺伝子及び請求項６に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項１４】
宿主が大腸菌である請求項１２または１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１３に記載の形質転換体の存在下でアルカンを水酸化させることを含む、アルコールの製造方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項８〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を採取することを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカン水酸化能を有する微生物由来のアルカン−１−モノオキシゲナーゼ、ルブレドキシンレダクターゼ及び２種類のルブレドキシンの遺伝子及びこれらの遺伝子でコードされたタンパク質、並びにこれらの利用、特に、これら遺伝子で形質転換された微生物によるアルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカンは原油中に最も多量に存在する炭化水素であり、多くの植物や藻類によっても生産されている（非特許文献１）。バクテリアによる直鎖アルカンの代謝は、その末端の酸化により行われ、アルコール、アルデヒド、脂肪酸へと代謝される（非特許文献１）。多くのバクテリアが直鎖アルカン代謝能を有することが知られているが、アルカン代謝機構の分子生物学的解析は比較的なされていない。
【０００３】
最もよく解析されている直鎖アルカン代謝機構はシュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida） GPo1のそれである（非特許文献２）。この場合の初発酸化は3つの構成成分からなるアルカン水酸化機構により行われる。その構成成分はノンヘム膜タンパクのアルカン-1-モノオキシゲナーゼ(AlkB)、およびそれとNADHとの間の電子伝達に関与する二つの可溶性タンパク、ルブレドキシン(AlkG)とルブレドキシンレダクターゼ(AlkT)である。グラム陽性のバクテリアについてはロドコッカス（Rhodococcus）属細菌のQ15株と NRRL B-16531株のアルカン水酸化機構について研究されている。両菌株は、少なくとも4つのアルカン-1-モノオキシゲナーゼ遺伝子ホモログ(alkB1, alkB2, alkB3, alkB4)を有している（非特許文献３）。このうちalkB1とalkB2ホモログはアルカン水酸化遺伝子クラスター内に存在しており、それぞれ２つのルブレドキシン遺伝子(rubA1 と rubA2および rubA3 とrubA4)、さらにalkB1 クラスターにおいては, ルブレドキシンレダクターゼ遺伝子(rubB)が存在している（非特許文献３）。
【０００４】
いくつかのアルカン水酸化機構遺伝子は異種宿主で発現されている。シュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida） GPo1のアルカン水酸化機構遺伝子を含む約35-kbpのDNA領域が単離され、このDNA領域を導入した大腸菌およびアルカン代謝能の欠損したシュードモナス（Pseudomonas）属細菌は、直鎖アルカンを代謝できることが代謝増殖試験で示されている（非特許文献２）。
【０００５】
さらにこの系を用いてロドコッカス（Rhodococcus）属細菌(非特許文献３), アルカニボラクス  ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis） AP1 (非特許文献４)、プラウセレラ  ルゴサ（Prauserella rugosa） NRRL B-2295 (非特許文献４)、マイコバクテリウム  ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis ）H37Rv  (非特許文献４)などのアルカン-1-モノオキシゲナーゼ遺伝子の発現が確認されている。
【０００６】
先の研究におけるほぼ全てのアルカン水酸化活性は、その反応生成物の検出により測定されているわけではなく、菌体の代謝増殖試験により測定されている。すなわち、アルカン水酸化活性は間接的に測定されているだけである。唯一、アルコール脱水素酵素の欠損したシュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida） PpS81にアルカン水酸化機構遺伝子を含む約29-kbpのDNA領域を導入した菌株を用いて、アルカン水酸化活性による反応生成物が検出されている（非特許文献５、６）。しかしながら、これらのアルカン水酸化機構遺伝子の発現実験は、多くの遺伝子を含む長いDNA領域にコードされる遺伝子産物の性質について研究したにすぎず、アルカン水酸化機構遺伝子について明確に解析されたものではない。
【０００７】
試験管内におけるアルカン水酸化活性試験は、大腸菌により発現され精製されたAlkBとAlkG、およびフェレドキシン（ホウレンソウ由来）とによる再構成系により行われている（非特許文献６）。しかし、ここでのアルカン水酸化活性はNADHの共酸化を測定する間接的な方法で測定されており、さらにその反応は基質と酵素の難溶性により強く限定されていると考えられる。
【０００８】
一方、バクテリアのアルカン水酸化機構を用いて化学品や医薬品の工業生産を行うことは、大きな注目を浴びている。実際、アルカン水酸化能を有するバクテリアを用いてクメン(非特許文献７)、2,5-ジメチルヘキサン(非特許文献８)、N-(2-ヘキシルアミノ-4-フェニルイミダゾール-1-イル)-アセタミド(非特許文献９)などの炭化水素の微生物変換が報告されている。しかし、これらの微生物変換の分子生物学的解析はほとんどなされていない。
【０００９】
【非特許文献１】Rehm, H. J., and Reiff, I., Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long chain alkanes. Adv. Biochem. Eng., 19, 175-215 (1981).
【非特許文献２】Eggink, G., Lageveen, R. G., Altenburg, B., and Witholt, B., Controlled and functional expression of the Pseudomonas oleovorans alkane utilizing system in Pseudomonas putida and Escherichia coli. J. Biol. Chem., 262, 17712-17718 (1987).
【非特許文献３】Whyte, L. G., Smits, T. H. M., Labbe, D., Witholt, B., Geer, C. W., and van Beilen, J. B., Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems in Rhodococcus strains Q15 and NRRL B-16531. Appl. Environ. Microbiol., 68, 5933-5942 (2002).
【非特許文献４】Smits, T. H. M., Balada, S. B., Witholt, B., and van Beilen, J. B., Functional analysis of alkane hydroxylase from gram-negative and gram-positive bacteria. J. Bacterial. 184, 1733-1742 (2002).
【非特許文献５】Bosetti, A., van Beilen, J. B., Preusting, H., Lageveen, R. G., and Witholt, B., Production of primary aliphatic alcohols with a recombinant Pseudomonas strains. Enzyme Microb. Technol., 14, 702-708 (1992).
【非特許文献６】van Beilen, J. B., Kingma, J., and Witholt, B., Substrate specificity of the alkane hydroxylase of Pseudomonas oleovorans GPo1. Enzyme Microb. Technol., 16, 904-911 (1994).
【非特許文献７】Hou, C. T., Jackson, M., A., Bagby, M. O., and Takagi, M., Microbial oxidation of cumene by octane-grown cells. Appl. Microbiol. Biotechnol., 41, (1994).
【非特許文献８】Matsui, T., and Furuhashi, K. Asymmetric oxidation of isopropyl moieties of aliphatic and aromatic hydrocarbons by Rhodococcus sp. 11B. Biosci. Biotech. Biochem., 59, (1995).
【非特許文献９】Mikolasch, A., Hammer, E., and Schauer, F. Synthesis of imidazole-2-yl amino acids by using cells from alkane-oxidizing bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 69, 1670-1679 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、本発明者らが最近新たに分離しアルカン水酸化能を有することを見出した微生物である、ゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構の構成成分全てをコードする遺伝子をクローニングし、かつ各遺伝子によりコードされるタンパク質を特定するとともに、前記遺伝子を大腸菌のような宿主で過不足なく発現し、得られた組換体を用いて微生物変換系を構築して種々のアルカンの水酸化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の通りである。
［請求項１］  下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列
［請求項２］ 下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列
［請求項３］  下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列
［請求項４］ 下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列
［請求項５］  下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列
［請求項６］ 下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（１）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列
［請求項７］  ゴルドニア (Gordonia)属に属する微生物に由来する遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子。
［請求項８］  下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列
［請求項９］  下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列
［請求項１０］  下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列
［請求項１１］  請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
［請求項１２］   請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子または請求項１１に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。
［請求項１３］請求項１または２に記載の遺伝子、請求項３または４に記載の遺伝子、請求項５に記載の遺伝子及び請求項６に記載の遺伝子４を含む形質転換体。
［請求項１４］  宿主が大腸菌である請求項１２または１３に記載の形質転換体。
［請求項１５］  請求項１３に記載の形質転換体の存在下でアルカンを水酸化させることを含む、アルコールの製造方法。
［請求項１６］  請求項１２に記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項８〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を採取することを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の組換体を用いた微生物変換系を用いれば、これまで解析困難であったバクテリアのアルカン水酸化機構の解析が容易になるばかりか、酵素改変等も可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１４】
本発明の遺伝子
本発明者らは、新たに分離した微生物である、ゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構の構成成分全てをコードする遺伝子をクローニングした。ゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株の取得および菌学的性質についてまず説明する。
【００１５】
ゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株は神奈川県藤沢市のテニスコートの土壌からｎ−デカンの資化性を指標にして新たに分離された微生物であり、各種n-アルカン（炭素数5、8、10、12、14、16）の資化性を有している。本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成15年5月29日付けでゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6として寄託されている(FERM P-19376)。本菌株の分離及び各種n-アルカンの資化性試験には、1% n-アルカンを唯一の炭素源とした液体培地2ml（ネジロ試験管内）を用いた。培養条件は28℃、回転数220rpmで振とうして行った。炭素源以外の培地組成を次に示す。
【００１６】
（培地組成）
0.1%      (NH4)2SO4
0.01%      MgSO4・7H2O
0.05%      KH2PO4
0.1%       K2HPO4
0.5%       NaCl
0.1%       微量ミネラル溶液
（微量ミネラル溶液の組成）
0.01%      ZnSO4・7H2O
0.03%      H3BO3
0.02%      CaCl2・6H2O
0.2%       FeSO4・7H2O
0.001%     CuCl2・2H2O
0.003%     Na2MoO4・2H2O
0.002%     NiCl2・6H2O
0.003%     MnCl2・4H2O
アルカン資化微生物には一般にその資化に関与するアルカン水酸化機構の遺伝子群が存在しているため、本株についても当該遺伝子群のクローニングを行った。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
１. アルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子
本発明者らは、クローニングしたゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構の構成成分全てをコードする遺伝子の中から、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ及びそれをコードする遺伝子を取得した。
【００１９】
即ち、本発明の遺伝子は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子を挙げられる。
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列
本発明において「アルカン−１−モノオキシゲナーゼ」とは、直鎖アルカンの末端を酸化する酵素であり、「アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性」とは、直鎖アルカンの末端を酸化する酵素活性を意味する。
【００２０】
アルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子の説明における「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２１】
アルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子の説明における「配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、８０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上である。
アルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子の説明における「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００２２】
アルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子の説明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
本発明のアルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列及び配列番号２に記載した塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてゴルドニア(Gordonia)属に属する微生物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のアルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子を単離することができる。ＤＮＡライブラリーは、本発明のアルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子を発現している微生物から常法により作製することができる。
【００２５】
ＰＣＲ法により本発明のアルカン−１−モノオキシゲナーゼ関連遺伝子を取得することもできる。上記した微生物由来のＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２６】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ＤＮＡライブラリーの構築、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２７】
また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼをコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１に記載のアミノ酸配列および配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００２８】
例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２９】
２. ルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子
本発明者らは、クローニングしたゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構の構成成分全てをコードする遺伝子の中から、ルブレドキシンレダクターゼ及びそれをコードする遺伝子を取得した。
【００３０】
即ち、本発明の遺伝子は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
（１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列
【００３１】
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。
（１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列
【００３２】
本発明において「ルブレドキシンレダクターゼ」とは、ルブレドキシンを還元する酵素であり、「ルブレドキシンレダクターゼ活性」とは、ルブレドキシンを還元する酵素活性を意味する。
【００３３】
ルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子の説明における「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３４】
ルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子の説明における「配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、５０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。
【００３５】
ルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子の説明における「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００３６】
ルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子の説明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３７】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３８】
本発明のルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号３に記載したアミノ酸配列及び配列番号４に記載した塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてゴルドニア(Gordonia) 属に属する微生物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子を単離することができる。ＤＮＡライブラリーは、本発明のルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子を発現している微生物から常法により作製することができる。
【００３９】
ＰＣＲ法により本発明のルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子を取得することもできる。上記した微生物由来のＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号４に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００４０】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ＤＮＡライブラリーの構築、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４１】
また、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼをコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号３に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００４２】
例えば、配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４３】
３. ルブレドキシン関連遺伝子
本発明者らは、クローニングしたゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構の構成成分全てをコードする遺伝子の中から、ルブレドキシン及びそれをコードする遺伝子を取得した。
【００４４】
即ち、本発明の遺伝子は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列
【００４５】
本発明の遺伝子の具体例としては、 下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。
（１）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列
【００４６】
本発明において「ルブレドキシン」とは、ルブレドキシンレダクターゼからの電子をアルカン−１−モノオキシゲナーゼへ伝達するタンパク質であり、「ルブレドキシンの機能」とは、ルブレドキシンレダクターゼからの電子をアルカン−１−モノオキシゲナーゼへ伝達するタンパク質機能を意味する。
【００４７】
ルブレドキシン関連遺伝子の説明における「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から１０個、好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００４８】
ルブレドキシン関連遺伝子の説明における「配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、８５％以上であれば特に限定されないが、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００４９】
ルブレドキシン関連遺伝子の説明における「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から３０個、好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００５０】
ルブレドキシン関連遺伝子の説明における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５１】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００５２】
本発明のルブレドキシン関連遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号５または７に記載したアミノ酸配列及び配列番号６または８に記載した塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてゴルドニア(Gordonia) 属に属する微生物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のルブレドキシン関連遺伝子を単離することができる。ＤＮＡライブラリーは、本発明のルブレドキシン関連遺伝子を発現している微生物から常法により作製することができる。
【００５３】
ＰＣＲ法により本発明のルブレドキシン関連遺伝子を取得することもできる。上記した微生物由来のＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号６または８に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００５４】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ＤＮＡライブラリーの構築、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００５５】
また、配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号６または８に塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ルブレドキシンをコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号５または７に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００５６】
例えば、配列表の配列番号６または８に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００５７】
本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質である。
１−（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；
１−（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
１−（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列
２−（１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；
２−（２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
２−（３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列
３−（１）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；
３−（２）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列；又は
３−（３）配列表の配列番号５または７に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ルブレドキシンの機能を有するアミノ酸配列
【００５８】
本発明のタンパク質はアルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質、またはルブレドキシンの機能を有するタンパク質である。アルカン−１−モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質の存在下では、直鎖アルカンの末端を酸化することができる。ルブレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質の存在下では、ルブレドキシンを還元することができる。ルブレドキシンの機能を有するタンパク質の存在下では、ルブレドキシンレダクターゼからの電子をアルカン−１−モノオキシゲナーゼへ伝達することができる。
【００５９】
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。
【００６０】
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記に記載した当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
【００６１】
本発明の組み換えベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００６２】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００６３】
細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミス・α−アミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus subtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosidase gene)の各プロモーター、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモーター、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモーターなどが挙げられる。
【００６４】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、またはアデノウイルス２主後期プロモーターなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ2-4cプロモーターなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ＡＤＨ３プロモーターまたはｔｐｉＡプロモーターなどがある。
【００６５】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネーターに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）などの要素を有していてもよい。
【００６６】
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００６７】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤に対する耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモーター、および所望によりターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００６８】
本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換えタンパク質の製造
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
【００６９】
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００７０】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
【００７１】
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００７２】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００７３】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００７４】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００７５】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００７６】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
【００７７】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００７８】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
【００７９】
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、SP-Sepharose FF(アマシャムバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００８０】
アルコールの製造方法
本発明は、アルカン-1-モノオキシゲナーゼ、二つのルブレドキシン及びルブレドキシンレダクターゼの全ての遺伝子を１つの宿主に導入した形質転換体を用い、この形質転換体の存在下でアルカンを水酸化させることを含む、アルコールの製造方法を包含する。
アルカン-1-モノオキシゲナーゼ、二つのルブレドキシン及びルブレドキシンレダクターゼの全ての遺伝子を１つの宿主に導入した形質転換体は、前述の本発明のアルカン-1-モノオキシゲナーゼ関連遺伝子、二つのルブレドキシン関連遺伝子及びルブレドキシンレダクターゼ関連遺伝子を、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌等の宿主に常法によって導入することで得ることができる。
【００８１】
より具体的には、以下のように上記形質転換体は得ることができる。
例えば、エレクトロポレーション法は以下のように行うことができる。
外来遺伝子が挿入されたプラスミドをコンピテント細胞の懸濁液に加え、この懸濁液をエレクトロポレーション法専用のキュベットに入れ、そのキュベットに高電圧の電気パルスをかける。その後SOC培地で培養し、平板寒天培地上で形質転換体を単離する。
得られた形質転換体の存在下でアルカンを水酸化させる。
【００８２】
本発明の形質転換体で水酸化できるアルカンは、炭素数5〜13、好ましくは炭素数6〜10の直鎖状のアルカンであるか、または、シクロアルカンであることもでき、シクロアルカンは、例えば、炭素数6〜8のシクロアルカンであることができる。直鎖状アルカンの例としては、例えば、n-ヘキサン(1-ヘキサノール)、n-ヘプタン(1-ヘプタノール)、n-オクタン (1-オクタノール)、n-ノナン(1-ノナノール)、n-デカン(1-デカノール)等を挙げることができる。シクロアルカンとしては、例えば、シクロヘキサン(シクロヘキサノール)等、を挙げることができる。尚、括弧内は水酸化生成物であるアルコールである。
形質転換体の存在下でアルカンを水酸化させる条件は、以下の通りである。
【００８３】
まず形質転換体中のアルカン水酸化機構の遺伝子群をIPTG等の誘導物質により菌体内で発現させる。この当該酵素が発現した菌体を基質であるアルカンと反応させる。アルカンとの反応温度は、形質転換体の至適温度を考慮して、適宜決定できる。また、アルカンとの反応時間も、アルカンのアルコールへの変換率（反応の進行度合い）等を考慮して、適宜決定することができる。さらに、アルカンとの反応は、バッチ式でも連続式でも、いずれの形式でも実施することができる。アルカンとの反応には、アルカン水酸化活性に必要なFeをさらに添加しておくことが好ましい。
【００８４】
生成したアルコールの単離及び精製は、例えば、溶媒抽出法及び蒸留法により行うことができる。但し、溶媒抽出法及び蒸留法に限定される意図はない。溶媒抽出法及び蒸留法は、例えば、以下のようにして行うことができる。反応液に酢酸エチルやアルカン等の有機溶媒を加えて攪拌し、アルコールを抽出する。このとき、反応液に塩類(塩化ナトリウム等)や酸類(塩酸等)を加えて反応液のイオン強度を高めるとアルコールの有機溶媒への抽出率が向上するこので好ましい。その後、用いた溶媒とアルコールの沸点の差を利用して蒸留し、目的のアルコールを精製することができる。
【００８５】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８６】
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
ゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構をコードする遺伝子のクローニング
ゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株（FERM P-19376）をL-brothを用いて28℃で3日間培養し、染色体DNAをISOPLANT (NIPPON GENE)を用いて調製した。次にTheo. H. M.らの方法 (Smits, T. H. M., Rothlissberger, M., Witholt, B., and van Beilen, J. B., Molecular screening for alkane hydroxylase genes in gram-negative and gram-positive strains. Environ. Microbiol. 1, 307-317 (1999)) に従い、TS2S primerとDeg1RE primerを作製した(表２)。これらとLA Taq (TaKaRa)を用い、TF6株のgenome DNAをテンプレートにして、PCR反応を行った。反応条件は98℃ 20 sec., 40℃ 1 min., 68℃ 1 min.の25cycleで行った。この結果、約550 bpのDNA断片が増幅した。これをシークエンスした結果、ここに存在する遺伝子のコードする蛋白質は、alkB2のコードするアルカン-1-モノオキシゲナーゼに相同性を有していた。そこでこの遺伝子断片の周辺領域を取得し、シークエンスするために、Inverse PCRを行った（Ochman, H., Gerber, A.S., and Hartl, D.L. Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics, 120, 621-623 (1988)）。TF6株の染色体DNAを制限酵素SalIあるいはBamHIで消化し、それぞれT4 DNA ligase を用いて自己連結反応を行った。これをテンプレートDNAとして、約550 bpのDNA断片の塩基配列から作製したプライマーInv1 primerとInv2 primer (表２)とを用いてPCRを行った。反応条件は98℃ 20 sec., 68℃ 4 min.の30cycleで行った。これらのPCR産物をpT7 Blue T-vector (Novagen)に連結してDNAシークエンスを行った。
【００８７】
ここで明らかになったDNA約2 Kbpのさらに周辺領域をシークエンスするために、再度Inverse PCRを行った。TF6株の染色体DNAを制限酵素MluIで消化し、自己連結反応を行ったものをテンプレートDNAとして、プライマーInv3 primerとInv4 primer (表２)とを用いてPCRを行った。反応条件は98℃ 20 sec., 68℃ 3 min.の30cycleで行った。これらのPCR産物をpT7 Blue T-vectorに連結してDNAシークエンスを行った。
【００８８】
ここで明らかになったDNA配列3491bpを図１に示した。このDNA断片上にはRhodococcus erythropolis NRRL B-16531に高い相同性を示すアルカン水酸化機構、alkB2, rubA3, rubA4, rubBが存在していた (表３)。これらの遺伝子はクラスターを成し、alkB2の上流に存在するプロモーターによって転写されるものと考えられる。
【００８９】
【表２】
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【００９０】
【表３】
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【００９１】
実施例２
ゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構をコードする遺伝子の発現およびn-オクタンの微生物変換
クローニングしたゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構の構成成分をコードする遺伝子群、alkB2, rubA3, rubA4, rubBを大腸菌で発現させることを試みた。発現プラスミドpAL526、 pAL520、 pAL501、 pAL502、 pAL503及びpAL026を構築し(表４)、これらとpTrcHisAをそれぞれE.coli TOP10 (Invitrogen)に導入した。これらの株それぞれをアンピシリンナトリウム (100 μg/ml) を含むL-培地を用いて28℃で17時間培養し、この培養液1 mlをアンピシリンナトリウム (100 μg/ml)を含む50 ml L-培地（250 ml三角フラスコ入り）に植菌した。28℃で3時間培養した後、isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) (終濃度 0.1 mM)を添加してさらに5時間培養した。菌体を集菌し、0.2M リン酸緩衝液 (pH7.0) 3 mlを加え懸濁したものを菌体懸濁液とした。
【００９２】
【表４】
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【００９３】
菌体懸濁液1.5 mlに10％グリセロール溶液100 μl、100 mg/ml FeSO4.7H2O 1.5μl、100 mM IPTG 1.5μl、50 mg/ml アンピシリンナトリウム1.5μl、およびn-オクタン５00 μlを加え、遠沈管にて28℃で19時間振とう培養した。２N HCl 300 μlとn-オクタン５00 μlを加え、28℃で10分間振とうした後、28℃、3,500rpmで遠心分離した上清をGas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)で分析した。使用した装置はPerkin Elmer社製のTurbomass Gold型GC-MS装置であり、その操作条件は以下の通りである。反応産物（アルコール類）はその保持時間及び質量スペクトルを市販標準品と比較し、それらの一致度から同定した。
カラム：TC-WAX（GL Sciences社製キャピラリーカラム、内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm）
キャリアガス：ヘリウム（20mL/分で、19：1のスプリット）
カラム温度：5℃/分で120℃から160℃、10℃/分で180℃、180℃で7分、10℃/分で230℃、230℃で3分
インジェクター温度：260℃
ディテクター温度：250℃
試料注入量：1μl
【００９４】
なお、反応産物の定量はGC-MSと同様の条件でShimadzu社製のGC-17A型GC装置を用いて行った（検出器は水素炎イオン化検出器を使用）。その結果を図２に示した。E.coli TOP10 pAL526株はn-オクタンを１-オクタノールに変換した。プラスミドとしてpAL526を用いて形質転換した大腸菌TOP10の、n-オクタンの1-オクタノールへの変換を100とした場合の、プラスミドpAL520、プラスミドpAL501、プラスミドpAL502、プラスミドpAL503、またはプラスミドpAL503を用いて形質転換した大腸菌TOP10の相対的な変換能を示す。図中の矢印は、アルカンヒドロキシラーゼ系のORFを示す。太線は各プラスミドが有するDNA領域を示す。各×は、表４に示すように、Cysを停止コドンに変更したポイントを示す。
片方のルブレドキシンを破壊した場合(pAL501、pAL502)のn-オクタン変換活性は、両方を有している場合(pAL526)の1/5程度になった。また、両方のルブレドキシンを破壊した場合(pAL503)は、当該変換活性はほとんど検出できなかった。一方、ルブレドキシンレダクターゼを破壊した場合(pAL520)はその変換活性はほとんど減少しなかった。これは大腸菌の有するレダクターゼが非特異的に機能しているためと考えられる。
【００９５】
実施例３
ゴルドニア・エスピー(Gordonia sp.) TF6株のアルカン水酸化機構発現大腸菌を用いた各種アルカンの微生物変換。
ゴルドニア(Gordonia) sp. TF6株のアルカン水酸化機構を発現させた菌体懸濁液を前項と同様に調製し、この菌体懸濁液1.5 mlに10％グリセロール溶液100 μl、100 mg/ml FeSO4・7H2O 1.5μl、100 mM IPTG 1.5μl、50 mg/ml アンピシリンナトリウム1.5μl、および各種アルカン５00 μlを加え、遠沈管にて28℃で19時間振とう培養した。２N HCl 300 μlと各種アルカン５00 μlを加え、28℃で10分間振とうした後、28℃、3,500rpmで遠心分離した上清を前述の実施例２に準じてGC-MS及びGCで分析した。この結果を表５に示した。E.coli TOP10 pAL526株は炭素数5から炭素数13の直鎖アルカン、シクロヘキサン、シクロオクタンをそれぞれ対応するアルコールに変換した。一方、ネガティブコントロールのE.coli TOP10 pTrcHisA株を用いた微生物変換反応では、全てのアルカノールは検出されなかった。
【００９６】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１−１】実施例１において明らかになったDNA配列（3491bp）を示す。
【図１−２】実施例１において明らかになったDNA配列（3491bp）を示す。
【図１−３】実施例１において明らかになったDNA配列（3491bp）を示す。
【図１−４】実施例１において明らかになったDNA配列（3491bp）を示す。
【図１−５】実施例１において明らかになったDNA配列（3491bp）を示す。
【図２】実施例２で行ったGC-MSの結果を示す。プラスミドとしてpAL526を用いて形質転換した大腸菌TOP10の、n-オクタンの1-オクタノールへの変換能を100とした場合の、プラスミドpAL520、プラスミドpAL501、プラスミドpAL502、プラスミドpAL503、またはプラスミドpAL503を用いて形質転換した大腸菌TOP10の相対的な変換能を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【配列表】
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