(57)【要約】【課題】  レプチン及びアディポネクチン代替物質として有用で、かつ安全なＡＭＰＫ活性化剤の提供。【解決手段】  カテキン類を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキン類を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤。
【請求項２】
カテキン類が、茶抽出物である請求項１記載のＡＭＰＫ活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レプチン及びアディポネクチン代替物質として有用なＡＭＰＫ(AMP-activated protein kinase)活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＭＰＫは運動のような細胞内ＡＴＰレベルが低下するような状況下において活性が上昇し、その結果代謝を促進してＡＴＰ合成を促す“metabolic sensor”として機能している。
【０００３】
ＡＭＰＫはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ(ACC)への活性制御を通してミトコンドリアでの脂肪酸酸化に影響を及ぼす事が知られている。長鎖脂肪酸をミトコンドリア内に取り込むカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT-1)は、ミトコンドリアにおける脂肪酸酸化の律速酵素であるとともに、ＡＣＣの産生物であるマロニルＣｏＡにより強い阻害を受ける。そのため、ＡＭＰＫはＡＣＣをリン酸化(Ser79)することによってＡＣＣの活性を抑制し、マロニルＣｏＡ量を低下させる結果、ＣＰＴ−１の活性が亢進して脂肪酸酸化を促進すると考えられている。このように、ＡＭＰＫは細胞内のエネルギー不足下において活性化するだけでなく、生体のエネルギー代謝あるいは栄養代謝に重要な作用を営んでいると考えられる。
【０００４】
最近の研究によって、ＡＭＰＫはレプチン（非特許文献１）やアディポネクチンのような脂肪細胞由来ホルモン（非特許文献２）によっても活性化されることが報告され、医学的にはこれらの蛋白質を投与することにより、種々の疾患の治療が試みられている。
【非特許文献１】Nature, Vol.415, pp339-343, 2002
【非特許文献２】Nature, Vol.423, pp762-769, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、レプチンやアディポネクチンを一般市民が用いることは不可能である。このような状況を鑑みれば、もし、ＡＭＰＫ活性化作用を有する化合物を見出すことが出来れば、簡便にレプチンやアディポネクチンの作用を模倣する事が出来、それらの代替物質として有用であると考えられる。
従って本発明の目的は、安全性に優れ、レプチン及びアディポネクチン代替物質として有用なＡＭＰＫ活性化剤を提供することにある。
更にまた、ＡＭＰＫの活性化はエネルギー産生を亢進することから、運動時のようなエネルギーを必要とする状況、あるいは日常生活において、本発明のカテキン類を摂取すれば、エネルギーの産生を促進することにより、運動能力の向上や疲労の軽減も可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、長期間摂取しても安全で、副作用の少ないＡＭＰＫ活性化剤の探索を行い、長い食経験を有するカテキン類にＡＭＰＫ活性化作用という全く新しい機能を発見し、レプチンやアディポネクチンの代替物質として有用であることを見出した。
すなわち、本発明は、カテキン類を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、安全性が高く、長期間摂取可能であることから、レプチン及びアディポネクチン代替物質として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明でカテキン類とは、カテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレートの個々、又はそれらの混合物の総称である。カテキン類及びカテキン類を豊富に含む茶抽出物などが本発明に有効である。
【０００９】
本発明に使用する成分であるカテキン類は、Camellia属、例えばC.sinensis、C.assamica及び、やぶきた種、又はそれらの雑種から得られる茶葉から製茶された茶葉から水や熱水、場合によってはこれに抽出助剤を添加したもので抽出することができる。当該製茶された茶葉には、（１）煎茶、番茶、玉露、てん茶、釜入り茶等の緑茶類；（２）総称して烏龍茶と呼ばれる鉄観音、色種、黄金桂、武夷岩茶などの半発酵茶；（３）紅茶と呼ばれるダージリン、ウバ、キーマン等の発酵茶が含まれる。茶を抽出する方法については、撹拌抽出など従来の方法により行うことができる。また抽出時の水に、あらかじめアスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸又は有機酸塩類を添加してもよい。また煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する方法を併用してもよい。また、茶葉から直接抽出するかわりに、茶抽出物の濃縮物又は精製物を配合してもよい。
【００１０】
ここでいう茶抽出物の濃縮物とは、茶葉から熱水もしくは水溶性有機溶剤により抽出された抽出物を濃縮したものであり、茶抽出物の精製物とは溶剤やカラムを用いて精製したものである。例としては、特開昭５９−２１９３８４号、特開平４−２０５８９号、特開平５−２６０９０７号、特開平５−３０６２７９号等に詳細に例示されている方法で調製したものが挙げられる。市販品としては、東京フードテクノ（株）「ポリフェノン」、（株）伊藤園「テアフラン」、太陽化学（株）「サンフェノン」、サントリー（株）「サンウーロン」等が挙げられる。そのほか、カテキン類は他の原料起源、例えばブドウ、及びワイン、ジュース類等のブドウを原料とする加工品やカカオ豆、及びこれを原料とする加工品由来のもの、更には化学合成品でも使用できる。茶抽出物の濃縮物及び茶抽出物の精製物の形態としては、固体、水溶液、スラリー状等種々のものが挙げられる。茶抽出物の濃縮物又は茶抽出物の精製物を溶解、希釈する液は、水、炭酸水、一般に抽出された茶類抽出液等が挙げられる。
【００１１】
カテキン類としては、一般的に茶抽出物の濃縮物又は茶抽出物の精製物を用いるが、特に緑茶抽出物の濃縮物又は緑茶抽出物の精製物を用いるのが好ましい。
【００１２】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、医薬品としてヒト及び動物に投与できる。医薬品として使用する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤とすることができる。また、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、各種の医薬品や、飲食品、ペットフード等に配合することもできる。
【００１３】
尚、経口用固形製剤を調製する場合には、カテキン類に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯味剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
【００１４】
上記各製剤中のカテキン類の配合量は、その使用形態により異なるが、医薬品、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤等の場合は、通常０．０１〜９５重量％、更に５〜９５重量％、特に１０〜９５重量％とするのが好ましい。飲食品やペットフード等に配合する場合には、０．０１〜５重量％、更に０．０５〜５重量％、特に０．１〜１重量％とするのが好ましい。
【００１５】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤の投与量（有効摂取量）は、一日当り１００〜３０００mg／６０kg体重とするのが好ましく、特に２５０〜２０００mg／６０kg体重、更に２５０〜１０００mg／６０kg体重とするのが好ましい。
【実施例】
【００１６】
試験例１（カテキン類によるＡＭＰＫ活性化効果）
ＡＭＰＫの活性化は、マウス肝細胞株(Hepa1-6)を用い、ＡＭＰＫ及びＡＣＣ(acetyl-CoA carboxylase)のリン酸化を指標に評価した。
マウス肝細胞株(Hepa1-6)を２５cm2フラスコにまき、ＤＭＥＭ(＋１０％ＦＢＳ，＋抗菌剤)中３７℃で１−２日培養する。サブコンフルエントになった時点で培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＤＭＥＭ（−ＦＢＳ）に置き換え更に１日培養する。培養液を除去後、所定濃度のカテキン類又は茶抽出物を含むＤＭＥＭ（−ＦＢＳ）を加え、６０分間培養する。その後、培養液を除去、ＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞溶解液(１０mM Tris (pH７．４), ５０mM NaCl, ３０mM sodium pyrophosphate, ０．５％ Triton X-100, protease inhibitor cocktail (SIGMA P2714), phosphatase inhibitor cocktail-1 (SIGMA P2850), phosphatase inhibitor cocktail-2 (SIGMA P5726))を２００μL添加、セルスクレイパーで細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液は、２３Ｇの針付シリンジを３回通すことにより良くホモジナイズし、その後３０分間氷上に放置した。１５０００rpmで１５分間、４℃で遠心し、その上清蛋白を以下の実験に用いた。
【００１７】
上清蛋白質の濃度を測定後、サンプル間の蛋白濃度を一定に調整した。その４分の一量のＳＤＳバッファー(２５０mM Tris, １２．５％SDS, ２０％ glycerol)を加えた後、更に２−メルカプトエタノール並びにブロモフェノールブルーを加え、９５℃で熱変性、４℃で急冷し、電気泳動用のサンプルを調製した。
【００１８】
上記泳動用サンプルを、一定量（約２０−４０μg）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４又は１２％ゲル)に供し、膜へ転写後、anti-phospho-AMPKα(Thr72)抗体(Cell Signaling社製)、anti-phospho-AMPKβ(Ser108)抗体(Cell Signaling社製)又はanti-phospho-ACC(Ser79)抗体(Cell Signaling社製)を一次抗体、anti-rabbit-HRP抗体(アマシャム社製)を二次抗体、phototope-HRP Western Detection System (Cell Signaling社製)を検出試薬として用いて、phospho-AMPKα、phospho-AMPKβ及びphospho-ACCを検出した。ＡＭＰＫ活性化の度合いは、検出されたバンドの強度を画像解析(EDAS 290 画像解析システム：KODAK)により数値（ピクセル）化し、コントロール（カテキン類無添加群）を100とし、それに対する相対値として示した。尚、カテキン標品はSIGMA社又は和光純薬（株）製の物
を用いた。茶抽出物（茶カテキン）は伊藤園（株）製のテアフラン９０Ｓを用いた。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
【表２】
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【００２１】
【表３】
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【００２２】
表１〜３の結果から、カテキン類は優れたＡＭＰＫ活性化作用を有すること、特にガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、ガロカテキン又はエピガロカテキンが優れたＡＭＰＫ活性化効果を有する事が明らかとなった。また、カテキン類を含む茶抽出物も優れたＡＭＰＫ活性化効果を発揮する事が明らかとなった。
【００２３】
試験例２（カテキン類の運動能力向上作用、疲労緩和作用）：
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ系、雄、６週齢）を１週間予備飼育した後、限界遊泳時間を２回測定した。簡易プールで、マウスを流量７Ｌ／minで遊泳させ、流れに逆らって泳げなくなった時点を限界遊泳時間とし、その時間を記録した。限界遊泳時間に群間差のないように１群１０匹とし、２群に分けた。表４に示す配合で調製した餌を用いて飼育した。１０週間飼育しながら、各群の限界遊泳時間を週に１回測定した。試験開始１０週時のマウス限界遊泳時間を表５に示す。
【００２４】
【表４】
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【００２５】
【表５】
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【００２６】
表５の結果から、エピガロカテキンガレート(EGCG)を摂取することにより、運動能力が向上し、疲労しにくくなっている事がわかる。