(57)【要約】【課題】腸内細菌叢を改善して、配糖体を加水分解する能力を標準化する。【解決手段】ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株（Lactobacillus  casei  strain  Hasegawa：FERM  P-19484）を利用することを特徴とするプロバイオティクス。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配糖体を加水分解する能力を有する乳酸菌：ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株（Lactobacillus  casei  strain  Hasegawa：FERM  P-19484）。
【請求項２】
請求項１記載の乳酸菌を用いたプロバイオティクス。
【請求項３】
請求項１記載の乳酸菌を用いたプロバイオティクスの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配糖体を加水分解する能力を有する乳酸菌：ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株（Lactobacillus  casei  strain  Hasegawa：FERM  P-19484）、及びこれを用いたプロバイオティクス並びにその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方処方を構成する生薬には様々な配糖体が有効成分として含まれている。例えば、甘草（カンゾウ：Glycyrrhizae  Radix）のグリチルリチン（glycyrrhizin）、芍薬（シャクヤク：Paeoniae  Radix）のペオニフロリン（paeoniflorin）、柴胡（サイコ：Bupleuri  Radix）のサイコサポニン（saikosaponin）、人参（ニンジン：Ginseng  Radix）のジンセノサイド（ginsenoside）、黄岑（オウゴン：Scutellariae  Radix）のバイカリン（baicalin）、大黄（ダイオウ：Rhei  Rhizoma）のセンノサイド（sennoside）、山梔子（サンシシ：Gardeniae  Fructus）のゲニポサイド（geniposide）などが挙げられる。
【非特許文献１】Kobashi，K．，J．Trad．Med.，15，1-13，1998）ところがβ結合をもつ配糖体は、それ自身ヒト消化酵素によって分解されないため生体内利用率が著しく低い。そこで配糖体は、腸内細菌による代謝（加水分解）を受け、親油性が高まることによってはじめて吸収され薬効を発揮するようになる。
【０００３】
たとえば、ジンセノサイドの場合、大きく分けてアグリコン（aglycone）の構造の違いによりジオール系とトリオール系の２種類があり、アグリコンのC3、C6、C20炭素位に結合する水酸基にグルコース、アラビノース、ラムノースが結合した糖鎖を有している。経口摂取後、ジオール系とトリオール系のいずれのジンセノサイドも、生体消化酵素による分解をほとんど受けず、もっぱらBacteroides、Fusobacterium、Eubacterium、Bifidobacteriumなどの腸内細菌の働きにより、加水分解されたのち吸収される。
【非特許文献２】Hasegawa，H．et  al.，Planta  Medica，62，453-457，1996
【非特許文献３】Tawab，M．A．et  al.，Drug  Metab．Dispos.，8，1065-1071，2003
【０００４】
ところが、腸内細菌の構成は、体質、食生活、抗生物質の服用、並びにストレスの影響を受け易く、顕著な個人差が認められる。そのため、配糖体の吸収は個体差や不利益が生じてしまう。このことが、漢方治療の現場で遭遇する薬効の個人差の一因になっていることが容易に想像できる。
【０００５】
事実、本発明者は、ヒト腸内細菌が配糖体を加水分解する能力(以下、「配糖体加水分解能」という)における個体差が非常に大きいことを確認した。
【非特許文献４】Hasegawa，H．et  al.，Planta  Medica，63，436-440，1997さらに、マウスを用いた癌転移実験で、腸内細菌の配糖体加水分解能が人参の抗転移効果に影響を及ぼすことを明らかにした。
【非特許文献５】Hasegawa，H．et  al.，Planta  Medica，64，696-700，1998
【０００６】
一方乳酸菌は、チーズや漬物等の製造において重要な役割を果たしている以外に、発酵乳等の形で体内に摂取されることにより、整腸作用や血清コレステロール低下作用等、乳酸菌の機能性に基づく様々な生理的効用を発揮することが知られている。このような乳酸菌の効用については、近年「プロバイオティクス（probiotics）」（宿主の健康維持に有益に働く生きた微生物およびそれを含む食品）という概念が導入され、消費者の健康志向を反映して広く関心を集めており、多くの研究が行われている。この「プロバイオティクス」という言葉は当初、「腸内細菌叢のバランスを改善することによって宿主動物に有益に働く微生物添加物」
【非特許文献６】Fuller，R．，J．Appl．Bacteriol.，66，365-378，1989と定義されてきたが、現在は上記のように、広義の意味で用いられることが多い。
【０００７】
プロバイオティクスの条件として、もともとヒトの大腸内にいる常在微生物であることが前提となる。ところで、プロバイオティクスが消化管内で有効に働き保健効果を発揮するには、生きたままの状態で消化管内に到達する必要がある。しかし、消化管内に到達するまでに、温度、pH、酸素、浸透圧、胃酸や胆汁酸等、プロバイオティクスにとって様々な生育阻害環境や生育阻害物質が存在している。したがって、プロバイオティクスを利用するに際しては、そのプロバイオティクスが生育阻害環境や生育阻害物質に対して耐性能を有していることが必要条件になる。現在、プロバイオティクスとして世界的に広く利用されている微生物に、ヒト由来のラクトバチルス属乳酸菌やビフィズス菌が知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、個人差が顕著に認められるヒト腸内細菌叢の配糖体加水分解能を標準化するために、配糖体加水分解能を有する微生物(以下、「配糖体加水分解微生物」という)をプロバイオティクスとして供給することにある。
【０００９】
例えば、ジンセノサイドに対する配糖体加水分解微生物に関しては、土壌細菌
【非特許文献７】Yoshioka，I．et al.，Chem．Pharm．Bull.，20，2418，1972、アスペルギルス・ニガー
【非特許文献８】神田ら，薬学雑誌，95，246，1975、ラット腸内細菌
【非特許文献９】滝野ら，薬用人参'89，共立出版株式会社，p．267，1989、ヒト糞便由来腸内細菌
【非特許文献１０】金岡ら，和漢医薬学雑誌，11，241，1994が報告されている。また、ヒト腸内細菌分離株に関しては、プレボテーラ・オリス（Prevotella  oris）
【非特許文献１１】Hasegawa，H．et  al.，Planta  Medica，63，436-440，1997
【特許文献１】特開平10-99094号公報
【特許文献２】米国特許第5925537号、Bacteroides  JY-6、Bacteroides  HJ-15，Fusobacterium  K-60，Eubacterium  A-44
【非特許文献１１】Bae，E-A．et al.，Biol．Pharm．Bull.，25，743，2002が報告されている。
【００１０】
しかし、これらの微生物は、いずれも人体への安全性は確立されていない。さらに、細菌特有のにおい物質を含めた副産物が生成するため、精製処理を施さないまま食用として供給するには適さない。また、前記先行文献（非特許文献１１）に記載のBifidobacterium K-103株及びK-506株は、偏性嫌気性菌で、プロバイオティクスとしての条件を満たすかどうか未知数である上、加水分解能があまり高くないため、商業ベースでの製品化に限界があると考える。さらに、ラクトバシルス属乳酸菌によるジンセノサイドに対する加水分解能に関しては、本発明者の知り得る限り報告例がない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく、人体への安全性が高く、食品加工に利用されている様々な微生物（酵母、麹菌、乳酸菌、ビフィズス菌等）の中から、腸内細菌同様にジンセノサイドに対する加水分解能を有するプロバイオティクスを鋭意検索した。
【００１２】
その過程で、朝鮮民族の伝統的発酵食品から、もともとヒトの腸内に常在し、胃酸に強く、生きたままヒトの腸内に到達する、プロバイオティクスとしての条件を満たす乳酸菌：ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株（FERM  P-19484）を分離することに成功した。当該乳酸菌を用いたプロバイオティクスは、不快な副産物の産生もなく、腸内環境を改善し、免疫機能を制御することが明らかとなり、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、配糖体を加水分解する能力を有する乳酸菌：ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株（FERM  P-19484）、及びこれを用いたプロバイオティクス並びにその製造法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明における乳酸菌：ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株は、配糖体加水分解能を有することを特徴とする。
【００１５】
本発明において配糖体とは、「環状構造をとった糖のアセタール誘導体」として定義される一連の化合物、つまり糖と、他のアルコールやフェノール等の水酸基を持つ有機化合物が酸素原子を挟んで結合したものを指す。
【００１６】
本発明における乳酸菌の１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列（GenBank/EMB/DDBJ登録番号AB126872）は、ラクトバチルス パラカゼイ サブスピーシーズ パラカゼイ（Lactobacillus  paracasei  subsp．paracasei）基準株ＪＣＭ8130Ｔの塩基配列（GenBank/EMB/DDBJ登録番号Ｄ79212）と最も良い相同性（９９.９３４％）を示した。このことから、分類学的にはラクトバチルス パラカゼイ サブスピーシーズ パラカゼイに属すると考えられる。しかし、基準株ＪＣＭ8130Ｔには、ジンセノサイドを資化して加水分解物20S-プロトパナキサジオール20-O-β-D-グルコピラノサイド（20S-protopanaxadiol  20-O-β-D-glucopyranoside）（以下、「M1」という）並びに20S-プロトパナキサトリオール20-O-β-D-グルコピラノサイド（20S-protopanaxatriol  20-O-β-D-glucopyranoside）（以下、「M11」という）を産生する能力は全く認められなかった。したがって、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株は変異株と見做される。
【００１７】
本発明における乳酸菌の配糖体加水分解能をより詳細に説明すれば、人参（Panax）属植物の有効成分であるジンセノサイドを資化して、加水分解物、すなわち、M1並びにM11を産生することを特徴とする。
【００１８】
ここで、人参属植物に含まれる植物として、高麗人参（Korean  ginseng：Panax  ginseng  C．A．Meyer）、三七人参（Sanchi  ginseng：Panax  notoginseng  (Burk.)F．H．Chen）、アメリカ人参（American  ginseng：Panax  quinquefolium  L.）、竹節人参（Chikusetsu  ginseng：Panax  japonicus  C．A．Meyer）、ヒマラヤ人参（Himalayan  ginseng：Panax  pseudo-ginseng  Wall．subsp．himalaicus  Hara）、及びベトナム人参（Vietnamese  ginseng：Panax  vietnamensis  Ha  et  Grushv.）等が挙げられる。
【００１９】
また、本発明における乳酸菌は、ジンセノサイド以外に甘草のグリチルリチン、柴胡のサイコサポニン、大豆（Glycine  max）のイソフラボン配糖体、及び遠志（オンジ：Polygalae  Radix）のオンジサポニオン（onjisaponin）等の生薬配糖体、並びに樹皮、葉、及び茸等の細胞繊維も加水分解する特徴を有する。
【００２０】
したがって、本発明における乳酸菌を用いたプロバイオティクスは、配糖体含有生薬類（人参、甘草、柴胡、及び遠志等）、穀類（米糠、米粉、ふすま、とうもろこし、及び麦芽等）、樹皮類〔タヒボ（Tabebuia  avellanedae）等〕、葉類〔茶（Camellia  sinensis）等〕、並びに茸類〔霊芝（Ganoderma  lucidum）、アガリクス（Agaaricus  blazei  Murril）、及び桑黄（ソウオウ：Phellinus  linteus）等〕を単独で、あるいは２種以上組み合わせて栄養源（以下、「培地」という）として用いて培養することによって製造することができる。
【００２１】
また、本発明のプロバイオティクスの製造は、乳酸菌：ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株を用いる以外は常法により行えばよい。例えば、まず栄養源としての培地を殺菌処理した後、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株を０.５重量％〜10.０重量％程度接種して培養を行い、これを加工処理することによりプロバイオティクスを得ることができる。
【００２２】
培養する際の条件は、固形分換算で１〜４０％濃度の培地で、２５℃〜３７℃で、２４時間〜３０日程度培養すればよい。この培養にあたり、培地に各種糖質等、例えば、ぶどう糖、蔗糖、果糖、乳糖等であれば０.５重量％〜１０.０重量％程度添加してもよい。
【００２３】
上記のようにして得られたプロバイオティクスは、そのままでも製品とすることもできるが、一般には、風味を改善したり、必要な形状とする等のために種々の成分を添加、配合し、更にフレーバーを添加して最終製品とすることができる。
【００２４】
本発明のプロバイオティクスに添加、混合される成分としては、各種糖質や乳化剤、甘味料、酸味料、果汁等が挙げられる。より具体的には、ぶどう糖、蔗糖、果糖、乳糖、オリゴ糖、蜂蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス、穀物成分、野菜成分、乳成分等を配合しても、優れた風味のプロバイオティクスを得ることができる。
【００２５】
また、本発明のプロバイオティクスに添加することのできるフレーバーとしては、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバーが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。フレーバーの添加量は特に限定されないが、風味面から０.０５〜２.０質量％、特に０.１〜０.５質量％程度が好ましい。
【００２６】
以上説明した本発明のプロバイオティクスは、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることも可能である。
【００２７】
次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
（プロバイオティクス顆粒の製造）米胚芽９部、高麗人参乾燥粉末（韓国産）１部、水４０部を混合し、95℃で殺菌した。これに予め本乳酸菌を培養したスターターを３％添加し、30℃で２日間培養し、乳酸菌培養物を得た。この培養物を凍結乾燥し、その１０５部に、オリゴ糖２０部、麦芽糖８部、ビタミンＣ３部、ヨーグルトフレーバー１部、乳糖６３部を加え、造粒して顆粒を得た。当該顆粒は、発酵感のある、乳酸の酸味が心地よい食品であった。
【実施例２】
【００２９】
（プロバイオティクス飲料の製造）麦芽（ドイツ産）２０部に水８０部を加え、６３℃から６７℃で糖化を行った後、残渣を濾過し、煮沸滅菌した。加熱終了１０分前にホップ０．１部を加えた。これに予め本乳酸菌を培養したスターターを6％添加し、30℃で３日間密閉培養した。培養液を濾過し、炭酸ガスを充填して麦芽乳酸発泡飲料を得た。当該飲料は酸味と炭酸が心地よいビールテイスト清涼飲料であった。
【実施例３】
【００３０】
（プロバイオティクスヨーグルトの製造）高麗人参エキス（韓国産）２部、生乳９８部を混合し、95℃で殺菌した。これに予め本乳酸菌を培養したスターターを１％添加し、30℃で３日間培養し、人参ヨーグルトを得た。当該ヨーグルトは、人参の発酵感がある、適度な酸味が心地よい食品であった。
【実施例４】
【００３１】
（固形状プロバイオティクスの製造）新鮮高麗人参根（韓国産６年根）１部、米糠１部、水４部を混合し、95℃で殺菌した。これに予め本乳酸菌を培養したスターターを１％添加し、30℃で３０日間培養し、乳酸菌培養物を得た。高麗人参根をかるく水洗し、米糠を取り除いた。これを細断して食すると、歯応えがよく、発酵感と適度な酸味が心地よい食品であった。
【実施例５】
【００３２】
（ゲル状プロバイオティクスの製造）アガリクス乾燥粉末（山梨県産）５部、高麗人参乾燥粉末（韓国産）４部、米糠１部、水２０部を混合し、95℃で殺菌した。これに予め本乳酸菌を培養したスターターを１％添加し、30℃で７日間培養し、乳酸菌培養物を得た。この培養物３０部に予め溶解したゲル溶液６９部、ヨーグルトフレーバー１部を添加し、冷却してゲルを得た。当該ゲルは、アガリクスの発酵感と乳酸の酸味が心地よい食品であった。
【実施例６】
【００３３】
（プロバイオティクス錠剤の製造）遠志乾燥粉末（中国産）４部、高麗人参乾燥粉末（韓国産）４部、米糠２部、水２０部を混合し、95℃で殺菌した。これに予め本乳酸菌を培養したスターターを３％添加し、30℃で７日間培養し、乳酸菌培養物を得た。この培養物を凍結乾燥し、その８０部に、乳糖１６部、卵殻カルシウム２部、二酸化珪素２部を加え、造粒して錠剤を得た。当該錠剤を分析した結果、オンジサポニン（onjisaponin）の加水分解によって生成するトリメトキシケイヒ酸（3,4,5-trimethoxycinnamic  acid）の存在が確認された。トリメトキシケイヒ酸は、アルツハイマー症の原因のひとつと考えられる大脳皮質のアセチルコリン合成酵素（choline  acetyltransferase）の発現低下をmRNAレベルで増加させ得る作用が報告されている。
【非特許文献１２】矢部武士，日本東洋医学雑誌，50，776-782，2000
【実施例７】
【００３４】
（大豆イソフラボンアグリコン含有プロバイオティクスの製造）常法によって調製した豆乳（固形分１２％）９８部に、アガリクス乾燥粉末（山梨県産）１部、高麗人参乾燥粉末（韓国産）１部を混合し、95℃で殺菌した。これに予め本乳酸菌を培養したスターターを６％添加し、3０℃で３日間培養し、ゲル状の発酵物を得た。当該発酵物は、豆乳の青臭みと苦味が消失し、イソフラボンアグリコンを含む酸味が心地よい食品であった。
【００３５】
実施例１、３、４、５、６、及び７で製造したプロバイオティクスの含有成分を薄層クロマトグラフィー法によって分析した結果、共通してジンセノサイドの加水分解物M1及びM11の存在が確認された。
【００３６】
（参考例１：配糖体加水分解能の標準化）ボランティア１２０名に実施例１で製造したプロバイオティクスを１日３ｇ服用させた。服用前に無作為に選んだ１７名の配糖体加水分解能を調べた結果、８名に配糖体加水分解能が認められなかった。この８名に対して服用３週間後再度配糖体加水分解能を測定した結果、配糖体加水分解能は８名全員に認められ、有効率は１００％であった。なお、当該配糖体加水分解能の測定は、本発明者の方法
【非特許文献１３】Planta  Medica，62，453-457，1996
【非特許文献１４】Microb．Ecol．Health  Dis．，12，85-91，2000に従い、薄層クロマトグラフィー法によって行った。
【００３７】
（整腸作用）実施例１で製造したプロバイオティクスを１日３ｇ４週間服用したボランティア１２０名のうち、無排便日数が週に２日以上の被験者５２名に対する効果は、無排便日数が変わらなかった者（影響なし）が１１名（２１％）、減少（改善）した者が３６名（６９％）、増加（後退）した者が５名（１０％）であった。改善例数の影響ありに対する割合が８８％と、便秘症に対する排便回数が本発明によるプロバイオティクスによって顕著に改善された。
【００３８】
（人参の体感改善作用）また、実施例１で製造したプロバイオティクスを１日３ｇ４週間服用したボランティア１２０名のうち、高麗人参を服用する被験者６０名に対する効果は、人参の体感が変化なし（影響なし）の者が１８名（３０.０％）、改善した者が４０名（６６.５％）、悪化した者が２名（３.５％）であった。
【００３９】
そのうち、喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎などのアレルギー症状を持つ被験者３４名に対する効果は、変化なし（影響なし）の者が１３名（３８.２％）、改善した者が１９名（５５.９％）、悪化した者が２名（５.９％）であった（抗アレルギー作用）。また、胃弱を訴える被験者３９名に対する効果は、変化なし（影響なし）の者が１８名（４６.１％）、改善した者が２０名（５１.３％）、悪化した者が１名（２.６％）であった（胃弱改善作用）。
【００４０】
喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎などの即時型アレルギー反応は、肥満細胞あるいは好塩基球の細胞膜にある免疫グロブリンE（IgE）受容体と結合したIgE抗体と抗原との反応による脱顆粒反応によって化学伝達物質（顆粒内酵素β-hexosaminidaseもその一つである）が放出される一連の反応である。実施例１で製造したプロバイオティクスによる抗アレルギー作用の作用機序として、乳酸菌の菌体成分によるIgE抗体産生抑制作用
【非特許文献１５】Shida，K．et  al．，Int．Arch．Allergy  Immunol．，115，278-287，1998、及び加水分解物M1によるβ-hexosaminidase放出抑制作用
【非特許文献１６】Bae，E．A．et  al.，Biol．Pharm．Bull.，25，743-747，2002の相乗効果が考えられる。
【００４１】
これらの例からも分かるように、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株（FERM  P-19484）を培養して得たプロバイオティクスを摂取することによって、ヒト腸内細菌叢の配糖体加水分解能が標準化されるだけでなく、整腸作用、人参の体感改善作用、抗アレルギー作用、及び胃弱改善作用等が確認された。このことから、本発明によるプロバイオティクスが腸内環境を改善し、健康の増進に大きく寄与し得ることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によれば、乳酸菌：ラクトバチルス カゼイ ハセガワ株（FERM  P-19484）を培養することによって、ヒト腸内細菌叢の配糖体加水分解能を標準化するプロバイオティクスが得られる。そして、本発明のプロバイオティクスの摂取によって腸内環境が改善された。このように、本発明のプロバイオティクスは健康食品として極めて有用なものである。