(57)【要約】【課題】  酵素反応を利用してグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、及びグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を生成する新規な方法を提供する。【解決手段】  構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、イノシトール、リビトール、エリスリトール及びグリセロールから選ばれる１種又は２種以上のポリアルコール、グルクロン酸及び／又はその塩、及び／又は、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースから選ばれる１種又は２種以上のグルコース６位糖質誘導体とにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするポリアルコール、グルクロン酸、及びグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移方法を提供することにより解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、イノシトール、リビトール、エリスリトール及びグリセロールから選ばれる１種又は２種以上のポリアルコールとにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするポリアルコールへのグルコシル基の転移方法。
【請求項２】
構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、グルクロン酸及び／又はその塩とにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルクロン酸及び／又はその塩へのグルコシル基の転移方法。
【請求項３】
構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースから選ばれる１種又は２種以上のグルコース６位糖質誘導体とにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移方法。
【請求項４】
構成糖としてグルコースを含む糖化合物が、β−Ｄ−グルコース−１−リン酸及び／又はその塩であるか、又はトレハロースである請求項１乃至３のいずれかに記載のグルコシル基の転移方法。
【請求項５】
トレハロースホスホリラーゼが、ｐＨ７．０、６０℃の条件下で１時間保持したときトレハロースを加リン酸分解する活性を８０％以上保持する温度安定性を有するものである請求項１乃至４のいずれかに記載のグルコシル基の転移方法。
【請求項６】
トレハロースホスホリラーゼが、サーモアナエロビウム・ブロッキイ起源の天然型もしくは組換え型酵素である請求項１乃至５のいずれかに記載のグルコシル基の転移方法。
【請求項７】
請求項１、４乃至６のいずれかに記載のポリアルコールへのグルコシル基の転移方法によりグルコシル転移ポリアルコールを生成させる工程と、生成したグルコシル転移ポリアルコール及び／又はグルコシル転移ポリアルコール含有物を採取する工程とを含むグルコシル転移ポリアルコール及び／又はグルコシル転移ポリアルコール含有物の製造方法。
【請求項８】
生成したグルコシル転移ポリアルコール及び／又はグルコシル転移ポリアルコール含有物を、脱色、脱塩、濾過、濃縮、クロマトグラフィー、乾燥及び結晶化から選ばれる１種又は２種以上を含む工程を経て採取する請求項７記載のグルコシル転移ポリアルコール及び／又はグルコシル転移ポリアルコール含有物の製造方法。
【請求項９】
請求項２、４乃至６のいずれかに記載のグルクロン酸及び／又はその塩へのグルコシル基の転移方法によりグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩を生成させる工程と、生成したグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩、及び／又はグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩含有物を採取する工程とを含むグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩、及び／又はグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩含有物の製造方法。
【請求項１０】
生成したグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩、及び／又はグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩含有物を、脱色、脱塩、濾過、吸着、イオン透析、濃縮、クロマトグラフィー、乾燥及び結晶化から選ばれる１種又は２種以上を含む工程を経て採取する請求項９記載のグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩、及び／又はグルコシル転移グルクロン酸及び／又はその塩含有物の製造方法。
【請求項１１】
請求項３乃至６のいずれかに記載のグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移方法によりグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を生成させる工程と、生成したグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体及び／又はグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体含有物を採取する工程とを含むグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体及び／又はグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体含有物の製造方法。
【請求項１２】
生成したグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体及び／又はグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体含有物を、脱色、脱塩、濾過、吸着、イオン透析、濃縮、クロマトグラフィー、乾燥及び結晶化から選ばれる１種又は２種以上を含む工程を経て採取する請求項１１記載のグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体及び／又はグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体含有物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアルコール、グルクロン酸及び／又はその塩（以下、本明細書では「グルクロン酸及び／又はその塩」を単に「グルクロン酸」と略称する。）、及びグルコース６位糖質誘導体にグルコシル基を転移する新規な方法、より詳細には、トレハロースホスホリラーゼの作用を利用してポリアルコール、グルクロン酸、及びグルコース６位糖質誘導体にグルコシル基を転移する新規な方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴ糖をはじめとする諸種の糖質が有する機能が続々と明らかになりつつある。これに伴って、機能性糖質に対する要望は多様化し、より優れた機能を有する糖質や、全く新規な機能を有する糖質、例えば、食品・化粧品・医薬品以外の分野でも利用できる有用な機能を有する糖質などの実用化を望む声が高まっている。斯界においては、斯かる要望に応えるべく、新規な又は希少な各種糖質の工業的製造を目的とした新規な方法の確立を目指した研究と、その新規な方法で製造された糖質の機能を解析する研究が精力的に進められている。
【０００３】
糖質の一種であるポリアルコール（一般に、「糖アルコール」もしくは「多価アルコール」とも呼ばれている。）、グルクロン酸、及びグルコース６位糖質誘導体は、低う食性、難消化性、ミネラルとの塩形成など食品素材として優れた機能を有することから、それらの関連化合物、例えば、グルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、グルコシル転移グルコース６位糖質誘導体などを製造し、それらの機能の解析を進めることにより、より優れた機能や新規な機能を有する糖質が実用化できる可能性がある。
【０００４】
グルコシル転移ポリアルコールの製造方法に関しては、例えば、スクロースホスホリラーゼ、コージビオースホスホリラーゼ及びα−グルコシダーゼなどによるグルコシル基の転移作用を利用した方法が特許文献１乃至３に、また、糖転移グルクロン酸の製造方法に関しては、例えば、β−ガラクトシダーゼによる乳糖からのガラクトシル基の転移反応を利用した方法が特許文献４に開示されている。さらに、グルコシル転移グルコース６位糖質誘導体の製造方法に関しては、例えば、スクロースホスホリラーゼ、コージビオースホスホリラーゼ、α−グルコシダーゼ、デキストランスクラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼなどによるグルコシル基の転移作用を利用した製造方法が様々提案されている。これらの方法による製造物は、用いられる酵素の基質特異性の違いから、糖組成や含まれる個々の糖質の構造などの点でそれぞれに特徴を有し、したがって、これらの製造物が発揮する機能も当然異なるものと考えられる。しかしながら、本発明者等は、糖質に対する要望が多様化している現状を考慮すると、現在までに提案されているグルコシル転移ポリアルコール、糖転移酸性糖、グルコシル転移オリゴ糖の製造方法の種類は、その要望に応えるのになお不十分であり、さらに多様な製造方法の提供が必要であるという結論に達した。そして、従来の、グルコシル転移ポリアルコール、糖転移酸性糖、グルコシル転移グルコース６位糖質誘導体の製造方法の場合とは全く異なる酵素を用いてグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、及びグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を生成する方法が提供されれば、より優れた機能や新規な機能を有する糖質の多様な製造方法の確立に大きく貢献できると考えた。
【０００５】
【特許文献１】特開平５−９１８９１号公報
【特許文献２】特開２００２−６５２９３号公報
【特許文献３】特開平２−１６３０９２号公報
【特許文献４】特開平６−２５３８７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、酵素を利用してグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、及びグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を生成する新規な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明者等は、まず、ポリアルコールへの糖転移活性を有することが想定される公知の糖関連酵素を対象として、代表的なポリアルコールのひとつであるソルビトールにグルコシル基を転移する作用の有無を検討した。しかしながら、ここで検討した範囲では、上記の課題を解決する新規な方法を確立し得る酵素を見出すには至らなかった。そこで本発明者等は次に、ポリアルコールへの糖転移活性を有することが想定されるか否かに関わらずにさらに幅広い酵素群を対象として、ソルビトール以外の諸種のポリアルコールにグルコシル基を転移する作用の有無を検討した。その結果、同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８１号公報においてトレハロースホスホリラーゼがソルビトールにグルコシル基を転移しなかったことが記載されており、この事実から一般的に該酵素はポリアルコールにグルコシル基を転移する作用を有しないと考えられてきたところ、全く意外なことに、該酵素は、イノシトールをはじめとするポリアルコールには顕著にグルコシル基を転移する作用を有することが判明した。
【０００８】
さらに、グルコースの６位が酸化した酸性糖であるグルクロン酸や、グルコースの６位にグルコシル基や他の糖残基が結合したオリゴ糖（グルコース６位糖質誘導体）へのグルコシル基の転移を検討した結果、トレハロースホスホリラーゼがグルクロン酸やイソマルトースをはじめとするグルコース６位糖質誘導体にも顕著にグルコシル基を転移する作用を有することが判明した。そして、反応規模を拡大してトレハロースホスホリラーゼの反応によるポリアルコール、グルクロン酸、及びグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移反応を行ったところ、これら反応が、グルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸及びグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体の工業的規模での製造に有利に利用できることが確認された。本発明は、以上の本発明者等による独自の研究成果に基づいて為されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、イノシトール、リビトール、エリスリトール及びグリセロールから選ばれる１種又は２種以上のポリアルコール、グルクロン酸、及び／又はイソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースから選ばれる１種又は２種以上のグルコース６位糖質誘導体とにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするポリアルコール、グルクロン酸、及びグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の転移方法は、従来のグルコシル転移方法に比べ、高効率で副生成物が少ないという特徴を有しており、本方法によれば、従来知られていなかった又は稀少とされてきたグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸及びグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を工業的規模で製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のポリアルコール、グルクロン酸及びグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移方法（以下、単に「本発明の転移方法」又は「当該転移方法」という場合がある。）はトレハロースホスホリラーゼを利用することを特徴とする。本発明でいうトレハロースとは、α−Ｄ−グルコシルα−Ｄ−グルコシドで表される二糖を意味する。本発明でいうトレハロースホスホリラーゼとは、この二糖トレハロースを、無機リン酸及び／又はその塩の存在下で加リン酸分解してＤ−グルコース及びβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩（以下、本明細書では、不都合が生じない限り、「β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩」を単に「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と略称する。）を生成する反応ならびにこの逆反応を触媒する酵素を意味する。本発明で利用できるトレハロースホスホリラーゼは、このように定義され、下記に詳述する本発明で用いるポリアルコールの1種又は2種以上、グルクロン酸、及び／又は、グルコース６位糖質誘導体の１種又は２種以上にグルコシル基を転移する作用を有するものである限り起源や調製方法などは特定のものに限定されない。例えば、同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８１号公報に開示された、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ  ３５０４７）起源の天然型ならびに組換え型の該酵素はいずれも本発明に有利に利用できる。また、同公報に開示された同酵素をコードするＤＮＡに蛋白質工学的手法を適用して得られる変異酵素も、所期の転移作用を実質的に消失していないものである限り本発明に利用できる。さらには、所期の転移作用を有している限り、他の微生物由来のトレハロースホスホリラーゼ、例えば、特開平８−１３１１５７号公報に開示されているプレシオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）属微生物起源のトレハロースホスホリラーゼなどを用いることも有利に実施できる。
【００１２】
本発明でいうポリアルコールとは、分子中に２個以上の水酸基を有するアルコール、通常、多価アルコール又は糖アルコールとも呼ばれる化合物を意味する。本発明でグルコシル基の受容体となるポリアルコールは、イノシトール、リビトール、エリスリトール及びグリセロールから選ばれる１種又は２種以上であり、その調製方法やその存在形態には特に制限はない。例えば、市販品を含む、天然より単離された調製品、酵素的又は化学的に調製ないしは合成された調製品、さらには、本発明の転移方法における酵素反応の進行や当該転移方法による生成物の利用に悪影響を及ぼさない範囲で、該ポリアルコール以外の夾雑物質を含んでいる調製品や、以上のような調製品を組み合わせてなる組成物であってもよい。なお、イノシトールには、ミオイノシトール、Ｄ−イノシトール、Ｌ−イノシトール等の立体異性体が存在する。これらイノシトール異性体はいずれも本発明に有利に利用できるけれども、これらのうちでミオイノシトールはグルコシル転移生成物の生成割合が比較的高いのでこの発明に特に有用である。
【００１３】
本発明でいうグルクロン酸とは、グルコースの６位がカルボキシル基に酸化された構造を有する酸性糖を意味し、その調製方法やその存在形態には特に制限はない。例えば、市販品を含む、天然より単離された調製品、酵素的又は化学的に調製ないしは合成された調製品、さらには、本発明の転移方法における酵素反応の進行や当該転移方法による生成物の利用に悪影響を及ぼさない範囲で、該グルクロン酸以外の夾雑物質を含んでいる調製品や、以上のような調製品を組み合わせてなる組成物であってもよい。
【００１４】
本発明でいうグルコース６位糖質誘導体とは、グルコース分子の６位が他の糖質と結合した誘導体を意味する。本発明でグルコシル基の受容体となるグルコース６位糖質誘導体は、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースから選ばれる１種又は２種以上であり、その調製方法やその存在形態には特に制限はない。例えば、市販品を含む、天然より単離された調製品、酵素的又は化学的に調製ないしは合成された調製品、さらには、本発明の転移方法における酵素反応の進行や当該転移方法による生成物の利用に悪影響を及ぼさない範囲で、該グルコース６位糖質誘導体以外の夾雑物質を含んでいる調製品や、以上のような調製品を組み合わせてなる組成物であってもよい。
【００１５】
本発明の転移方法で用いる、構成糖としてグルコースを含む糖化合物とは、トレハロースホスホリラーゼの作用によるグルコシル転移反応においてグルコシル基供与体となる、構成糖としてグルコースを含有するグルコースの誘導体、オリゴ糖ならびにその誘導体を意味する。斯かる糖化合物の調製方法や存在形態に特に制限はなく、例えば、市販品を含む、天然より単離された調製品、酵素的又は化学的に調製ないしは合成された調製品、さらには、本発明の転移方法における酵素反応の進行や当該転移方法による生成物の利用に悪影響を及ぼさない範囲で、斯かる糖化合物以外の夾雑物質を含んでいる調製品や、以上のような調製品を組み合わせてなる組成物であってもよい。斯かる糖化合物として比較的望ましいものはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸である。β−Ｄ−グルコース−１リン酸を酵素的に調製するには、例えば、トレハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用させたり、マルトースにマルトースホスホリラーゼ（オリエンタル酵母株式会社販売等）を作用させたり、グルコースがα−１，２結合で連結してなるコージビオースやコージトリオースなどのコージオリゴ糖にコージビオースホスホリラーゼ（同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８２号に記載のもの等）を作用させることなどによりβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成させ、これを、必要に応じて常法により所望のレベルにまで精製すればよい。また、本発明においては、酵素の作用を受けてβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成しうる、構成糖としてグルコース含む以上のようなオリゴ糖類をそのまま利用することもできる。例えば、トレハロースを利用する場合、トレハロースホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸の生成と、生成したβ−Ｄ−グルコース−１リン酸からのポリアルコール、グルクロン酸、及び／又はグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移反応とが同時に進行することとなる。また、マルトース及び／又はコージオリゴ糖を利用する場合には、それぞれからβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する上述のマルトースホスホリラーゼ及び／又はコージビオースホスホリラーゼを本発明の転移方法を行う反応系に共存させれば、所期の転移反応を進行させることができる。
【００１６】
上述のような、トレハロースホスホリラーゼとともに、ポリアルコール、グルクロン酸、及び／又はグルコース６位糖質誘導体、及び構成糖としてグルコースを含む糖化合物（以下、ポリアルコール、グルクロン酸、グルコース６位糖質誘導体及び構成糖としてグルコースを含む糖化合物のいずれか又は二者又はすべてを指して「基質」という場合がある。）を、通常は水溶液中で混合し、用いるトレハロースホスホリラーゼの酵素学的性質に応じて適宜選ばれる条件下で保持すれば、トレハロースホスホリラーゼの作用によりポリアルコール、グルクロン酸及び／又はグルコース６位糖質誘導体にグルコシル基を転移させることができる。同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８１号公報に開示されたトレハロースホスホリラーゼを利用する場合、該酵素が完全には失活しない条件、すなわち、温度は、通常、７０℃以下、望ましくは、６５℃以下が好適であり、ｐＨは、通常、ｐＨ４．０乃至９．０、望ましくは、ｐＨ５．０乃至７．５が好適である。反応混合物中の基質の濃度は所期の反応が進行する限り特に制限はなく、例えば、ポリアルコールと構成糖としてグルコースを含む糖化合物とを、それぞれ、通常、０．１乃至４０質量％、望ましくは、０．２乃至２０質量％の範囲とし、両者の比を、通常、１：０．１乃至４００、望ましくは、１：１乃至１００、さらに望ましくは、１：２乃至５０の範囲とするのが好適である。なお、構成糖としてグルコースを含む糖化合物として、トレハロース、マルトース及び／又はコージビオースを用い、必要に応じて、マルトースホスホリラーゼ及び／又はコージビオースホスホリラーゼを併用する場合には、適宜の濃度の無機リン酸及び／又はその塩、例えば、リン酸二水素ナトリウムなどを適宜の濃度、通常、０．５乃至１００ｍＭ、望ましくは、１乃至５０ｍＭの範囲で共存させるのが好適である。また、マルトースホスホリラーゼ及び／又はコージビオースホスホリラーゼを併用する場合には、併用する酵素の酵素学的性質を考慮して、使用する全ての酵素がいずれも完全には失活しない条件を選定するのが望ましい。トレハロースホスホリラーゼの使用量に関しては、反応混合物中の基質の乾燥重量換算での総量１ｇに対し、通常、０．１乃至５００単位、望ましくは、０．５乃至２００単位とするのが好適である。なお、ここでいうトレハロースホスホリラーゼ活性の１単位とは、同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８１号公報に記載の方法にしたがって、ｐＨ５．５、６０℃でトレハロースを基質として反応させたとき、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量を意味する。以上のような反応混合物を用いて反応させる時間は、反応の進行の度合いに応じて適宜選択することができ、通常、２乃至２００時間、望ましくは、４乃至１００時間が好適である。
【００１７】
一般に、酵素的に糖質を製造する場合には、その反応温度は可能な限り高く設定することが望ましい。これにより、反応中の雑菌汚染を防いだり、反応速度を高めたり、基質濃度を高めることができ、その結果、目的とする反応をより効率的に進行させることができることなどがその理由である。本発明の転移反応を実施する場合にも同様であり、反応温度は、通常、常温以上、望ましくは、４０℃以上、より望ましくは、５０℃以上とするのが好適である。したがって、本発明の転移方法の実施においては、このような好適な温度条件下で利用できる温度安定性、例えば、至適ｐＨの条件下で６０℃で１時間保持したときに本来の活性を、通常、８０％以上、望ましくは、８５％以上、より望ましくは、９０％以上保持する温度安定性を有するトレハロースホスホリラーゼを利用することが望ましい。同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８１号公報に開示されたトレハロースホスホリラーゼはこのような望ましい温度安定性を有するので、本発明の実施にとりわけ有用である。
【００１８】
以上のような本発明の転移方法を実施すると、反応混合物中にグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸及び／又はグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体が生成する。この発明でいうグルコシル転移ポリアルコールとはポリアルコールとグルコシル基が共有結合した糖化合物全般を意味する。また、この発明でいうグルコシル転移グルクロン酸とはグルクロン酸とグルコシル基が共有結合した糖化合物を意味する。さらに、この発明でいうグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体とはグルコース６位糖質誘導体とグルコシル基が共有結合した糖化合物全般を意味する。本発明の転移方法により生成するグルコシル転移ポリアルコールは、構成単位として、ポリアルコールとともに１個のグルコシル基を含む。また、本発明の転移方法により生成するグルコシル転移グルクロン酸は、構成単位として、グルクロン酸とともに１個のグルコシル基を含む。本発明の転移方法により生成するグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体は、グルコース６位糖質誘導体の分子中にグルコシル基が存在しない場合、１個のグルコシル基を含み、該分子中に１個又は２個以上のグルコシル基が存在する場合、そのグルコース６位糖質誘導体のグルコース基以外に１個のグルコシル基を含む。また、本発明の転移方法により生成するグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、又はグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体における構成単位どうしの結合様式には、トレハロースホスホリラーゼ以外の酵素を用いる転移方法の場合には通常見出されない、本発明に特徴的な結合様式が含まれる場合がある。例えば、当該転移反応で用いるポリアルコールが炭素数６の環状ポリアルコールのイノシトールである場合、生成するグルコシル転移ポリアルコールは、構成単位どうしの結合様式としてα−１，１′グルコシド結合を含む場合がある。
【００１９】
以上のような本発明の転移方法で生成するグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、及び／又はグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体は、目的に応じて、反応混合物そのままの状態で、あるいは、慣用の方法により所望のレベルにまで精製した状態で諸種の用途に利用することができる。したがって、本発明の転移方法は、グルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、グルコシル転移グルコース６位糖質誘導体、及び／又はこれらグルコシル転移生成物含有物の製造方法における一工程として有利に実施できる。本発明は斯かるグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、グルコシル転移グルコース６位糖質誘導体、及び／又はこれらグルコシル転移生成物含有物の製造方法を提供するものでもあり、当該製造方法は、本発明の転移方法を実施する工程と、この工程で生成したグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、グルコシル転移グルコース６位糖質誘導体、及び／又はこれらグルコシル転移生成物含有物を採取する工程を含んでなる。生成したグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、グルコシル転移グルコース６位糖質誘導体、及び／又はこれらグルコシル転移生成物含有物は、目的に応じて、慣用の方法、例えば、活性炭処理等による脱色、イオン交換樹脂処理等による脱塩、けい藻土等の助剤を用いる濾過、イオン交換樹脂等を用いるクロマトグラフィー、エバポレーター等を用いる濃縮、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などの乾燥、水・アルコール等の適宜の溶媒中で行う結晶化などから選ばれる適宜の工程を経て採取することができる。以上のような本発明の製造方法により製造される製品は、目的に応じて、グルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、又はグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を結晶等の純粋な状態から他の成分を含む組成物に至るまでの諸種の純度で含む、粉末状、結晶粉末状、顆粒状、ブロック状、シラップ状など適宜の形状で提供される。本発明の製造方法により製造される製品は、本発明で用いられるポリアルコール、グルクロン酸、又はグルコース６位糖質誘導体と同様に、例えば、甘味料、難消化性甘味料、低う食性甘味料、保湿剤、澱粉老化防止剤、整腸剤、ミネラル吸収促進剤などとして健康食品・飲料を含む飲食品分野、化粧品分野、医薬品分野、飼料分野などの諸種の分野で有利に利用することができる。また、本発明の方法で製造される製品は、その機能性を解析するための研究用試薬として利用することもでき、斯かる解析の結果に基づいて、本発明の製造方法によるグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、グルコシル転移グルコース６位糖質誘導体、及び／又はこれらグルコシル転移生成物含有物は、例えば、防腐剤、保存剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、生体機能調節剤などの各種機能剤の一成分として上記のような諸種の分野で利用できる。
【００２０】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００２１】
＜ポリアルコールへのグルコシル基の転移＞
【００２２】
＜実施例１−１：トレハロースホスホリラーゼの調製＞
同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８１号公報に記載された方法にしたがって、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ  ３５０４７）を、トレハロースを炭素源として含む培地中で４０ｌの培養規模で培養した。引き続き上記公報に記載の方法にしたがって、培養物より採取した菌体を超音波破砕し、その破砕物上清を採取した。上記公報に記載のトレハロースホスホリラーゼ活性の測定法に供して、この菌体破砕物上清がトレハロースホスホリラーゼ活性を示すことを確認した。
【００２３】
上記の菌体破砕物上清をＵＦ膜濃縮し、１ｍｌ当り約３０単位のトレハロースホスホリラーゼ活性を有する酵素液３６０ｍｌを得た。このうち３００ｍｌを、引き続き上記公報に記載の方法にしたがって、『ＤＥＡＥ−トヨパールゲル』（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー、『ブチルトヨパール６５０ゲル』（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、及び『ウルトロゲル  ＡｃＡ４４』（セプラコル社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供し、７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバンドを示すトレハロースホスホリラーゼの精製標品を得た。得られた精製標品の比活性は蛋白質ｍｇ当り約７８単位であった。
【００２４】
＜実施例１−２：トレハロースホスホリラーゼの作用によるポリアルコールへのグルコシル基の転移＞
下記表１に示すポリアルコール（いずれも試薬級）のいずれかを濃度１％（ｗ／ｖ）で、試薬級β−Ｄ−グルコース−１リン酸を濃度１．４％（ｗ／ｖ）で、実施例１−１で得たトレハロースホスホリラーゼを１ｍｌ当り１単位で、及び、酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を濃度５０ｍＭで含む水溶液を調製し、これを５０℃で２４時間保持して反応させた。反応後、各溶液より一部を採取し、これを乾固した後、ピリジンに溶解して、ガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」と略記する。）により分析した。ＧＣにおいて、分析カラムは『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』（ジー・エル・サイエンス株式会社製）を充填したステンレスカラム（内径３ｍｍ×長さ２ｍ）を用いた。キャリアーガスとして窒素ガスを用い、流量は４０ｍｌ／分とした。分析カラムの温度は、試料注入後カラムオーブンを１６０℃から３２０℃まで毎分７．５℃の速度で昇温するべく制御した。検出には水素炎イオン化検出器を用いた。また、トレハロースホスホリラーゼを含まないこと以外は上記の反応溶液と同じ組成の溶液を調製し、上記と同じ条件で保持した後に、それぞれ同条件でのＧＣにより分析して、未反応のポリアルコール、ならびにβ−Ｄ−グルコース−１リン酸のクロマトグラムのパターンを確認した。反応溶液の分析により得たクロマトグラムにおける新たなピークの有無によりポリアルコールへのグルコシル基の転移が起こったか否かを判定した。また、グルコシル転移ポリアルコールの生成量は、本ＧＣ分析条件下におけるグルコシル転移ポリアルコールのピーク面積が、未反応のポリアルコールを含む全てのピークの面積の合計値に占める割合に基づいて評価し、６０％以上のものを「＋＋＋」と、３０％以上６０％未満のものを「＋＋」と、そして０％を越え３０％未満のものを「＋」として三段階で表した。それらの結果を、グルコシル転移ポリアルコールのＧＣにおける保持時間とともに表１に示す。
【００２５】
【表１】
2005210925.tif 000002
【００２６】
表１に示すとおり、また、同じ特許出願人による特開平１０−３０４８８１号公報に記載されているとおり、ソルビトールに実施例１−１で調製したサーモアナエロビウム・ブロッキイ起源のトレハロースホスホリラーゼを作用させた場合にはグルコシル基の転移は認められなかった。これとは対照的に、他のポリアルコールであるミオイノシトール、エリスリトール、リビトール及びグリセロールに対しては、上記トレハロースホスホリラーゼの作用によっていずれもグルコシル基が転移したことが確認された。これらのポリアルコールのうち、ミオイノシトールに対しては「＋＋」と、グルコシル基の転移が特に顕著であった。さらに、ミオイノシトールに対するグルコシル基の転移物としては、ＧＣにおいて２つのピーク（ＧＣの保持時間として１５．４分及び１６．６分）が認められたことから、２種類のグルコシル転移ミオイノシトールが生成することがわかった。
【００２７】
それぞれの反応液より、グルコシル転移ポリアルコールを、イオン交換樹脂を用いる調製用の高速液体クロマトグラフィーを含む糖質精製のための慣用の方法により、ＧＣ分析において他の夾雑物のピークが観察されない、実質的に単一のピークとして確認されるレベルにまで精製した。これらの精製標品を、ドウドロフ、『ザ・エンザイムズ（Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）』、第５巻、アカデミック・プレス社（１９６１年）、２２９乃至２３６頁に記載の方法に準じて、亜砒酸存在下でトレハロースホスホリラーゼを作用させ分解し、その分解物を上記のＧＣにしたがって分析したところ、いずれのクロマトグラムにおいても、ポリアルコールとＤ−グルコースに相当するピークが、モル比に換算してほぼ１：１に相当する面積比で確認された。この結果は、ここで得た精製標品が、いずれも、ポリアルコールとグルコシル基が１：１のモル比で結合したグルコシル転移ポリアルコールであることを意味している。なお、ミオイノシトールから生成した２種類のグルコシル転移ポリアルコールとも、ミオイノシトールとグルコシル基が１：１のモル比で結合したグルコシル転移ポリアルコールであることから、ミオイノシトールへのグルコシル基の転移反応においては、互いに結合様式の異なる２種類のグルコシル転移ポリアルコールが生成していることを示している。
【００２８】
＜実施例１−３：トレハロースホスホリラーゼの作用によるグルクロン酸及びグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移＞
下記表２に示すグルクロン酸及びグルコース６位糖質誘導体（いずれも試薬級）のいずれかを濃度１％（ｗ／ｖ）で、試薬級β−Ｄ−グルコース−１リン酸を濃度１．４％（ｗ／ｖ）で、実施例１−１で得たトレハロースホスホリラーゼを１ｍｌ当り１単位で、及び、酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を濃度５０ｍＭで含む水溶液を調製し、これを５０℃で２４時間保持して反応させた。反応後、実験例１−２に記載の方法でＧＣ分析し、実験例１−２と同様に、グルコシル転移生成物の生成量を、そのＧＣ分析におけるグルコシル転移生成物のピーク面積が、未反応のグルクロン酸若しくはグルコース６位糖質誘導体のピークを含む全てのピークの面積の合計値に占める割合に基づいて評価し、６０％以上のものを「＋＋＋」と、３０％以上６０％未満のものを「＋＋」と、そして０％を越え３０％未満のものを「＋」として三段階で表した。その結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
2005210925.tif 000003
【００３０】
表２に示すとおり、グルクロン酸と、グルコース６位糖質誘導体であるイソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースのいずれに対しても、トレハロースホスホリラーゼの作用によってグルコシル基が転移したことが確認された。とりわけ、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノース、即ち、還元末端側にグルコース残基を有し、且つ、そのグルコース残基の６位に糖質が結合したグルコース６位糖質誘導体に対しては「＋＋＋」と評価され、グルクロン酸の場合の「＋」に比べてグルコシル基の転移が顕著であった。加えて、トレハロースホスホリラーゼの作用により生成するグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体は、上記いずれのグルコース６位糖質誘導体の場合でも実質的に１種類であり、本グルコシル転移方法によれば、副生成物をほとんど生成しないという利点があることも判明した。
【００３１】
それぞれの反応液より、グルコシル転移グルクロン酸若しくはグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を、オクタデシルシリカゲルを用いる調製用の高速液体クロマトグラフィーを含む糖質精製のための慣用の方法により、上記のＧＣにおいて実質的に単一のピークとして確認されるレベルにまで精製した。これらの精製標品を、亜砒酸存在下でトレハロースホスホリラーゼを作用させ分解し、その分解物をＧＣ分析したところ、いずれのクロマトグラムにおいても、グルクロン酸若しくはグルコース６位糖質誘導体とＤ−グルコースに相当するピークが、モル比に換算してほぼ１：１に相当する面積比で確認された。また、これら精製標品の還元力をソモギー・ネルソン法で測定したところ、いずれも非還元性であることが判明した。これらの結果は、ここで得た精製標品が、いずれも、グルクロン酸若しくはグルコース６位糖質誘導体とグルコシル基が１：１のモル比で結合し、グルクロン酸の場合はその１位がグルコシル基と結合し、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースの場合はそれらの還元末端グルコースの１位がグルコシル基と結合したグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体であることを意味している。
【実施例２】
【００３２】
＜グルコシル転移ミオイノシトール含有シラップの製造＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を２％（ｗ／ｖ）、ミオイノシトールを１０％（ｗ／ｖ）、及び、実施例１−１の方法で得たトレハロースホスホリラーゼを１単位／ｍｌ含み、ｐＨを６．０に調整した水溶液を、６０℃で７２時間保持してミオイノシトールへのグルコシル基の転移反応を行った。その後、反応液を常法により脱色・脱塩し、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画した。各画分の一部を常法により分析し、上記の反応で生成したいずれかのグルコシル転移ミオイノシトールの固形分当たりの含量が、反応液における場合と比較して相対的に高まった画分を合一した。合一した画分を濃縮して、固形分濃度約７２％のグルコシル転移ミオイノシトール含有シラップを得た。本シラップの一部を実施例１−２に記載のＧＣで分析し、その結果得られたクロマトグラムにおけるピーク面積に基づいて計算したところ、本シラップにおける固形物質量当たりの全グルコシル転移ミオイノシトールの含量は約６０％と見積もられた。
【００３３】
本品は、甘味料、難消化性甘味料、低う食性甘味料、保湿剤、澱粉老化防止剤、整腸剤などとして、健康食品・飲料を含む飲食品分野、飼料・餌料分野、化粧品分野、医薬品分野などの諸種の分野で有利に利用できる。
【実施例３】
【００３４】
＜グルコシル転移グルクロン酸含有シラップの製造＞
トレハロースを２０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を１０ｍＭ、グルクロン酸ナトリウム塩を２％（ｗ／ｖ）、及び、実施例１−１の方法で得たトレハロースホスホリラーゼを２０単位／ｍｌ含む水溶液を調製し、これを５５℃で９６時間保持してグルクロン酸へのグルコシル基の転移反応を行った。その後、反応液を常法により脱色し、イオン交換樹脂へ吸着させた後、希塩酸にて溶出し、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画した。各画分の一部を常法により分析し、グルコシル転移グルクロン酸含有画分を合一した。合一した画分を中和した後濃縮して、固形分濃度約６０％のグルコシル転移グルクロン酸含有シラップを得た。本シラップの一部を実施例１−２に記載のＧＣで分析し、その結果得られたクロマトグラムにおけるピーク面積に基づいて計算したところ、本シラップにおける固形物質量当たりのグルコシル転移グルクロン酸の含量は約７０％と見積もられた。
【００３５】
本品は、酸味料、甘味料、保湿剤、ミネラル安定化剤などとして、健康食品・飲料を含む飲食品分野、、飼料・餌料分野、化粧品分野、医薬品分野などの諸種の分野で有利に利用できる。
【実施例４】
【００３６】
＜グルコシル転移イソマルトース含有シラップの製造＞
トレハロースを２０％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を５ｍＭ、イソマルトースを２０％（ｗ／ｖ）、及び、実施例１−１の方法で得たトレハロースホスホリラーゼを１０単位／ｍｌ含む水溶液を調製し、これを６０℃で７２時間保持してイソマルトースへのグルコシル基の転移反応を行った。その後、反応液を常法により脱色・脱塩し、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画した。各画分の一部を常法により分析し、上記の反応で生成したグルコシル転移イソマルトースの固形分当たりの含量が、反応液における場合と比較して相対的に高まった画分を合一した。合一した画分を濃縮して、固形分濃度約７２％のグルコシル転移イソマルトース含有シラップを得た。本シラップの一部を実施例１−２に記載のＧＣで分析し、その結果得られたクロマトグラムにおけるピーク面積に基づいて計算したところ、本シラップにおける固形物質量当たりのグルコシル転移イソマルトースの含量は約５０％と見積もられた。
【００３７】
本品は、甘味料、難消化性甘味料、抗う食性甘味料、保湿剤、澱粉老化防止剤、整腸剤などとして、健康食品・飲料を含む飲食品分野、化粧品分野、医薬品分野、飼料分野などの諸種の分野で有利に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上説明したとおり、本発明は、トレハロースホスホリラーゼがイノシトール、リビトール、エリスリトール、グリセロール、グルクロン酸、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースに極めて効率的にグルコシル基を転移する作用を有するという、本発明者等による全く独自の発見に基づくものである。本発明の転移方法によれば、従来知られていなかった、又は従来稀少とされてきたグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、及びグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を工業的規模で製造することが可能である。本発明の転移方法を利用して製造されるグルコシル転移ポリアルコール含有物、グルコシル転移グルクロン酸含有物、及びグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体含有物は、健康食品・飲料を含む飲食品分野、飼料・餌料分野、化粧品分野、医薬品分野、研究用試薬分野などの諸種の分野で有利に利用できる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。