(57)【要約】【課題】  ＰＣＲ法でラクトバチルス・ブレビスを種特異的に検出できるようにする。【解決手段】  ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列(5´)CGTCTCCGTTGATGATTTTAG(3´)         （配列番号１）(5´)GGTGGTTTTGGTTGTTATACG(3´)         （配列番号２）からなるオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法を用いてラクトバチルス・ブレビスを検出するときのプライマーとして使用する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)CGTCTCCGTTGATGATTTTAG(3´)       （配列番号1）
(5´)GGTGGTTTTGGTTGTTATACG(3´)       （配列番号2）
からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成された２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、少なくともその一方が請求項１記載の配列番号１又は２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするラクトバチルス・ブレビス検出用プライマー。
【請求項３】
２種のオリゴヌクレオチドが、配列番号１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなる請求項２記載のラクトバチルス・ブレビス検出用プライマー。
【請求項４】
請求項２又は３記載のプライマーを検体に加え、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うことを特徴とするラクトバチルス・ブレビスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス・ブレビスの検出方法に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応法（Polymerase Chain Reaction、以下ＰＣＲ法と省略する）を行い、増幅されたプライマーの伸長物を検出することによりラクトバチルス・ブレビスを特異的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus fructivorans）は、耐酸性及び耐塩性を持つ乳酸桿菌であり、従来より、酸性食品等で細菌的事故を散発させている。ラクトバチルス・ブレビスの中には通常の細菌試験で行われている平板培地での増殖が遅く、検出までに時間を要するものもある。そこで、以前より増殖培地の検討がなされてきたが、増殖が遅いことはこの菌の固有の性質であるために、抜本的な解決は困難であった。
【０００３】
このような状況下、１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（以下１６ＳｒＤＮＡと称する）を標的とするＰＣＲ法による迅速な検出法が知られており、この検出法を用いてラクトバチルス属の特定の菌種の同定や解析が行われている。例えば、特開平７−２８９２９５号公報（特許文献１）、特開平１０−２１０９８０号公報（特許文献２）には、ビールの有害菌であるラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、特開平１０−２３４３７７号公報（特許文献３）には、ビールの有害菌であるラクトバチルス・スピーシーズ(Lactobacillus sp.)のＰＣＲ法による迅速検出法が開示されている。
【特許文献１】特開平７−２８９２９５号公報
【特許文献２】特開平１０−２１０９８０号公報
【特許文献３】特開平１０−２３４３７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ラクトバチルス属細菌の特定の菌種であるラクトバチルス・ブレビスに関しては、さらに高い検出感度と選択性をＰＣＲ法で得られるようにする新規なプライマーの開発が望まれている。
【０００５】
本発明は、このような従来の状況に対し、ＰＣＲ法でラクトバチルス・ブレビスを検出するために新規にプライマーを開発し、ラクトバチルス・ブレビスを迅速に検出できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ラクトバチルス・ブレビスにおいて、１６ＳｒＤＮＡ配列が種のレベルで保存されており、他種の株の配列とは異なっている領域を探索し、当該領域の中の特定配列を標的とするプライマーを新規に開発し、そのプライマーをＰＣＲ法で用いることによりラクトバチルス・ブレビスを良好に検出できること、または、ラクトバチルス属の他種から良好に識別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus fructivorans）の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)CGTCTCCGTTGATGATTTTAG(3´)         （配列番号１）
(5´)GGTGGTTTTGGTTGTTATACG(3´)         （配列番号２）
からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００８】
また、本発明は、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成された２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーであって、少なくともその一方がの配列番号１又は２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるラクトバチルス・ブレビス検出用プライマーを提供し、特に、２種のオリゴヌクレオチドが、配列番号１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるラクトバチルス・ブレビス検出用プライマーを提供する。
【０００９】
さらに本発明は、上述のプライマーを検体に加え、ＰＣＲ法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行うラクトバチルス・ブレビスの検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＰＣＲ法でラクトバチルス・ブレビスを検出するにあたり、高い検出感度と選択性を得ることができる。また試料中に存在する異属及び同属異種の細菌の増殖を考慮にいれる必要がなくなり、熟練を必要とすることなく、簡易にラクトバチルス・ブレビスを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明がラクトバチルス・ブレビスの検出のために行うＰＣＲ法は、Saikiが開発したPolymerase Chain Reaction法（Science,230,1350(1985)）に基づくものである。
【００１２】
本発明において、ラクトバチルス・ブレビスの特定は、標準菌株を用いた場合は、その標準菌株の属名及び種名による。また標準菌株でないものを用いた場合は、常法によりラクトバチルス属細菌特有の形態（グラム陽性桿菌）及び性状（カタラーゼ陰性、芽胞非形成若しくは嫌気性）を確認した後、市販の同定キットである「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」を用いた同定による。
【００１３】
具体的同定方法としては、前記同定キットに従い細菌液を調製し、この細菌液を「アピ５０CHL培地（日本ビオメリュー（株）販売）」に添加して接種菌液を調製する。次に、この接種菌液を「アピ５０CHLプレート（日本ビオメリュー（株）販売）」のチューブ部分に接種した後、ミネラルオイルを重層する。プレートに蓋をし、３５℃で４８時間培養する。培養後、培地の色の変化により各生化学性状を判定し、解析ソフトであるAPILAB Plus（日本ビオメリュー（株）販売）で同定する。
【００１４】
なお、「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」同定キットを用いて同定した種名と、相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いた１６ＳｒＤＮＡ解析より推定した群が異なる場合は、本発明では、「アピ５０CHL（日本ビオメリュー（株）販売）」同定キットを用いて同定した種名を基準とする。
【００１５】
相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いた１６ＳｒＤＮＡ解析による群の具体的な推定方法は、まず、単一コロニーの分離と純粋培養を行った後、ＤＮＡの熱水抽出を行うため、滅菌精製水にコロニーを懸濁し、１００℃で１０分間の湯せんで加熱する。次に、１６ＳｒＲＮＡをコードする全領域に対する共通のプライマーである下記に示す２種のオリゴヌクレオチド[Journal of Bacteriology, 173 (2), p697-703 (1991)]を用い、
(5´)AGAGTTTGATCATGGCTCAG(3´)         （配列番号３）
(5´)GGTTACCTTGTTACGACTT(3´)          （配列番号４）
前記熱水抽出物をＤＮＡの鋳型としてＰＣＲを行った後（細菌で保存性が高い配列部分をプライマーとしているので、未知の細菌であっても１６ＳｒＲＮＡをコードする約１４００塩基対のＤＮＡが増幅される。）、ＰＣＲ産物を電気泳動し、１６ＳｒＲＮＡをコードする約１４００塩基対のＤＮＡの増幅を確認する。次に、ＰＣＲ産物の塩基配列を「DNA Sequencer ABI PRISM 16キャピラリー（ABI社）」で解読する。日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）の相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）により、当該塩基配列と相同性の高い塩基配列を検索し、群を推定する。
【００１６】
本発明では、ＰＣＲ法によりラクトバチルス・ブレビスを検出するに際して使用するプライマーとして、特定の塩基配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、即ち、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１又は２に示される塩基配列
(5´)CGTCTCCGTTGATGATTTTAG(3´)         （配列番号１）
(5´)GGTGGTTTTGGTTGTTATACG(3´)         （配列番号２）
からなるオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１７】
これら配列番号１又は２で示されるオリゴヌクレオチドの配列は、ラクトバチルス・ブレビス、及び異属並びに異種の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を詳細に解析した結果、ラクトバチルス・ブレビスの異株間に保存され、異属並びに異種と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものである。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１又は２で示されるいずれかの塩基配列からなるが、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加したり、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものも含まれる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドには、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法で増幅した後、そのオリゴヌクレオチドの検出を簡略化するため、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5´末端を蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したものが含まれる。この他、5´末端にビオチンを結合し、アビジンと共有結合させたペルオキシダーゼを結合させ得るものや、デオキシリボース骨格間を結合しているリン酸の中の酸素をイオウ原子に置き換えることによりアンチセンス化したもの等が含まれる。
【００１９】
本発明の配列番号１又は２の塩基配列からなるプライマーのうち、配列番号１からなるものは正規鎖側プライマーであり、配列番号２からなるものは逆鎖側プライマーである。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法でラクトバチルス・ブレビスを検出する場合の１組のプライマーの一方として使用する場合に、これと組み合わせて使用するもう一方のプライマーに関し、本発明の配列番号１からなるプライマーは公知の逆鎖側プライマーと組合せ、配列番号２からなるプライマーは公知の正規鎖側プライマーと組み合わせて使用できるが、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを一対のプライマーとして使用することが好ましい。
【００２１】
正規鎖側と逆鎖側の１組のプライマーを使用し、ラクトバチルス・ブレビスに特異的なオリゴヌクレオチドを増幅するＰＣＲ法自体は公知の方法に従うことができる。即ち、まず、検体を熱処理することにより検体中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖に分離し、これに１組のプライマーを作用させて、相補的な検体のオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズさせ、次に、ＤＮＡポリメラーゼと４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）との存在下でプライマーの下流の領域を選択的に合成する。そしてこの操作を２０〜４０サイクル程度繰り返すことにより、検体中の特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーの伸長物として増幅することができる。また、この増幅は、電気泳動、クロマトグラフィー等により確認することができ、これにより検体中のラクトバチルス・ブレビスを容易にかつ確実に検出することが可能となる。
【００２２】
なお、このＰＣＲ法を適用する検体としては、マヨネーズ、ドレッシング等の酸性食品等やこれらの食品の材料、患者の吐瀉物、又は糞便等をあげることができる。
【実施例１】
【００２３】
（１）検体の調製
本発明のプライマーがラクトバチルス・ブレビスに対して特異的であることを確認するために、表１中の縦の見出し欄に示した種々の菌をそれぞれ増菌用の平板培地に接種し、培養した。菌体を掻き取り、０．８５％食塩水に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、遠心分離した上澄液を検体とした。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０7ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
【００２４】
（２）プライマーの合成
ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とする、正規鎖側又は逆鎖側プライマーとして、配列番号１又は２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをホスホアミダイト法により合成した。
【００２５】
（３）反応液の調製とＰＣＲ反応
検体液５μｌに１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μｌ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）４μｌ、表１に示すように、正規鎖側プライマーとして配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、逆鎖側プライマーとして配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ）０．２５μｌを加え、水で５０μｌとした。
【００２６】
熱変成（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返し反応させた。
【００２７】
反応液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによる染色を行った。即ち、電気泳動は３％のアガロースゲルを使用し、ＴＢＥバッファー中、１００ボルトで３０分行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この場合、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流すことにより、相対比較によって、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００２８】
結果を表１に示す。表１中の＋は、約１６０塩基対に相当する大きさの増幅物が観察されたことを示している。なお、菌株によっては１６ＳｒＤＮＡ配列の増幅され得る部分に
塩基対の挿入または欠落が起こっており、ＤＮＡ増幅物の大きさは変動し得る。
【００２９】
［表１−Ａ］
2005160432.tif 000002
【００３０】
［表１−Ｂ］
2005160432.tif 000003
【００３１】
表１中のカッコ内は、相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）を用いた１６ＳｒＤＮＡ解析により推定した群である。
【００３２】
表１の結果から、本発明によれば、ラクトバチルス・ブレビスを種特異的に検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチド、プライマー、及びこのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出方法は、酸性食品等の食品又は食品材料をはじめとする種々の検体において、ラクトバチルス・ブレビスを検出するために有用となる。
【配列表】
2005160432000001.app