(57)【要約】【課題】  本発明は、ピラゾール誘導体を有効成分とするＨＳＰ９０阻害剤に関する。【解決手段】下記一般式（１）【化１】2005225787.tif 000014［式中、Ｘは、水素原子、または、低級アルキル基を示し、Ｙは、水素原子、または、低級アルキル基を示し、Ｚは、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、または、ハロゲン原子を示す。］で表されるピラゾール誘導体、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＳＰ９０阻害剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2005225787.tif 000013
［式中、Ｘは、水素原子、または、低級アルキル基を示し、Ｙは、水素原子、または、低級アルキル基を示し、Ｚは、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、または、ハロゲン原子を示す。］で表されるピラゾール誘導体、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＳＰ９０阻害剤。
【請求項２】
Ｘが、水素原子、または、炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｙが、水素原子、または、炭素数１〜３のアルキル基である請求項１に記載のＨＳＰ９０阻害剤。
【請求項３】
Ｘが水素原子またはエチル基であり、Ｙが水素原子またはメチル基であり、Ｚが水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ニトロ基、または、ハロゲン原子である請求項１または２に記載のＨＳＰ９０阻害剤。
【請求項４】
一般式（１）で表される化合物が、３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（２−フルオロフェノキシ）−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−エトキシフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−フェノキシ−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール 、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ニトロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ｎ−プロピルフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−フルオロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−クロロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール または３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ｎ−プロピルフェノキシ）−１Ｈ−ピラゾールである請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＳＰ９０阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のピラゾール誘導体、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラゾール誘導体を有効成分とするＨＳＰ９０阻害剤に関する。ＨＳＰ阻害剤は、ＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合することで、その機能を阻害し、ＨＳＰ９０と標的蛋白質の結合を阻害し、最終的に細胞増殖を抑制する。
【背景技術】
【０００２】
分子シャペロンとは、蛋白質の機能的高次構造形成を促進するために標的蛋白質と一時的に複合体を形成する蛋白質の総称である。蛋白質の折り畳みや会合を助け、凝集を抑止する活性を持つ蛋白質を幅広く指して分子シャペロンと呼んでおり、その分子量によって幾つかのファミリーに分類される（ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、ｓｍａｌｌ  ＨＳＰｓなど）。特にＨＳＰ９０は細胞内のシグナル伝達系に関わる多数の分子と相互作用することが知られており、ＨＳＰ９０が細胞周期制御および癌化・増殖・生存シグナルに深く関与していることが明らかになりつつある。
【０００３】
ＨＳＰ９０は細胞内に豊富に存在する（全可溶性蛋白質の１〜２％を占めている）分子シャペロンであり、細胞質に一様に分布しており、おもに２量体として存在する。蛋白質の折り畳みにおけるＨＳＰ９０単独の活性は弱く、折り畳み活性を持つ他の分子シャペロン（以下ｃｏ−シャペロンという。ＨＳＰ７０、ｐ２３など）と共同で機能している。ＨＳＰ９０は複合体を形成した標的蛋白質の機能発現に必要な場合が多く、ＨＳＰ９０が不安定な折り畳み状態にある蛋白質を特異的に認識して結合するという生化学的特性に基づいている。ＨＳＰ９０はＡＴＰに依存して変性または折り畳み状態にない蛋白質の（再）折り畳みを行う。特に、癌関連のシグナル伝達に関わる多様なｋｅｙシグナル分子（ｓｔｅｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｒａｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ）の構造構築に必要とされる。最近の知見によると、ヒト腫瘍では多くのｋｅｙシグナル分子の調節が失われており、これらは機能を維持するためにＨＳＰ９０を必要としている。（非特許文献１）
【０００４】
Ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ（ＧＭ）は当初チロシンキナーゼ阻害剤として微生物から見出されたアンサマイシン系天然物であるが、チロシンキナーゼに対する直接の阻害活性は弱く、その後この薬剤がＨＳＰ９０に特異的に作用することが見出された。ＧＭとは構造の異なるマクロライド系天然物であるＲａｄｉｃｉｃｏｌ（ＲＤ）もやはりＨＳＰ９０に作用しその機能を阻害する。ＧＭやＲＤはｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌関連のシグナル伝達にかかわる多様なｋｅｙ蛋白質（ｓｔｅｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒやＲａｆ、Ｈｅｒ２など）の分解を引き起こすこと、各種癌細胞の増殖抑制を引き起こすことが知られている。ＨＳＰ９０はＮ末端にシャペロン機能の調節に重要な役割を果たすＡＴＰ／ＡＤＰ結合部位を含んでいる。この部位はＨＳＰ９０  ｆａｍｉｌｙに特異的でよく保存されており、他の分子シャペロンには存在しない。ＧＭやＲＤなどはこのＡＴＰ／ＡＤＰ結合部位に直接結合することが結晶構造解析において明らかにされている。（非特許文献２、３）ＧＭやＲＤなどはＡＴＰ／ＡＤＰ結合領域へ結合することにより、ｐ２３などのｃｏ−シャペロンとの会合を阻害する、ＨＳＰ９０阻害剤である。これらＨＳＰ９０阻害剤はＡＴＰ／ＡＤＰ結合領域へ結合し、その結果、標的蛋白質とＨＳＰ９０を含むシャペロン複合体の構成が変化して標的蛋白質は複合体から離脱し、主にユビキチン・プロテアソ−ム系で分解される。したがって、ＨＳＰ９０阻害剤による癌細胞の増殖抑制作用は、ＨＳＰ９０の標的蛋白質量であるｋｅｙシグナル分子の減少とそれに伴う下流へのシグナル伝達の遮断によるものと考えられる。
【０００５】
ＨＳＰ９０阻害剤はＨＳＰ９０に折り畳まれ、機能を発現する標的蛋白質に対して選択的に作用し、それ以外の蛋白質の機能および発現量には全く影響を及ぼさない。癌化する過程では複数の遺伝子異常が蓄積されており、腫瘍細胞では変異蛋白質は正常蛋白質よりもシャペロン活性を必要としているという報告、ＨＳＰ９０の発現量が種々の癌で増加しているという報告、ＧＭ誘導体である１７−ＡＡＧの動物モデルにおける薬物動態の解析からは、正常組織と比較して癌部により１７−ＡＡＧの蓄積性が高いという報告がなされている。これらのことから、ＨＳＰ９０阻害剤は正常細胞ではなく癌細胞に特異的に作用することが期待できる。また、異常な蛋白質発現や低酸素、栄養飢餓といった一種ストレス状態下にある癌細胞がＨＳＰ９０に依存している度合いが高いため、癌細胞の感受性がより高いと考えられる。
【０００６】
ＨＳＰ９０阻害剤のうち、１７−ＡＡＧは第Ｉ／ＩＩ層臨床試験進行中であり、ＲＤ誘導体研究も行われているが（非特許文献４）、医薬品として使用するには、何れも分子量、安定性、水溶性等の物性面で問題があるため医薬品として有用な水溶性低分子ＨＳＰ９０阻害剤が求められている。低分子のＨＳＰ９０阻害剤として、アデノシン誘導体であるＰＵ３（特許文献１、非特許文献５）および３位及び４位に芳香環を有するピラゾール誘導体（特許文献２）が報告されているが、４位にアリールオキシ基を有するピラゾール誘導体については、ＨＳＰ９０阻害活性は知られていない。
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／０３６０７５号公報
【特許文献２】国際公開第０３／０５５８６０号公報
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００２；  ８（４  Ｓｕｐｐｌ．）：  ｐ．Ｓ５５−６１．
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９４；  ９１（１８）：  ｐ．８３２４−８３２８．
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ  １９９７  Ａｐｒ  １８；  ８９（２）：  ｐ．２３９−２５０．
【非特許文献４】Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２００３  Ｏｃｔ；．３（５）：  ｐ．３８５−３９０．
【非特許文献５】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００１  Ｍａｒ；  ８（３）：  ｐ．２８９−２９９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、医薬として有用なＨＳＰ９０阻害剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、ピラゾール誘導体またはその薬理学的に許容されうる塩がＨＳＰ９０を阻害することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）下記一般式（１）
【００１１】
【化１】
2005225787.tif 000002
［式中、Ｘは、水素原子、または、低級アルキル基を示し、Ｙは、水素原子、または、低級アルキル基を示し、Ｚは、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、または、ハロゲン原子を示す。］で表されるピラゾール誘導体、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＨＳＰ９０阻害剤、
（２）Ｘが、水素原子、または、炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｙが、水素原子、または、炭素数１〜３のアルキル基である（１）に記載のＨＳＰ９０阻害剤、
（３）Ｘが水素原子またはエチル基であり、Ｙが水素原子またはメチル基であり、Ｚが水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ニトロ基、または、ハロゲン原子である（１）または（２）に記載のＨＳＰ９０阻害剤、
（４）一般式（１）で表される化合物が、３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（２−フルオロフェノキシ）−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−エトキシフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−フェノキシ−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ニトロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ｎ−プロピルフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−フルオロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール、３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−クロロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾールまたは３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ｎ−プロピルフェノキシ）−１Ｈ−ピラゾールである（１）〜（３）のいずれか１項に記載のＨＳＰ９０阻害剤、
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のピラゾール誘導体、またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする癌治療剤、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する薬剤組成物は癌治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明の詳細を述べる。一般式（１）中、Ｘは水素原子又は低級アルキル基である。低級アルキル基としては、例えば炭素数１〜１５の直鎖もしくは分岐状アルキル基が挙げられ、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐状アルキル基が好ましい。具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デキル基等が挙げられ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基が好ましく、なかでもエチル基が特に好ましい。Ｘとしては、水素原子、またはエチル基が特に好ましい。
【００１４】
一般式（１）中、Ｙは水素原子又は低級アルキル基である。低級アルキル基としては、例えば炭素数１〜５の直鎖もしくは分岐状低級アルキル基が挙げられ、炭素数１〜３の直鎖もしくは分岐状低級アルキル基が好ましい。具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、なかでもメチル基が特に好ましい。Ｙとしては、水素原子、またはメチル基が特に好ましい。
【００１５】
一般式（１）中、Ｚは水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはハロゲン原子である。低級アルキル基としては、例えば炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐状アルキル基が挙げられ、炭素数１〜５の直鎖もしくは分岐状アルキル基が好ましい。具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基が好ましく、なかでもプロピル基が好ましい。低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐状アルコキシ基が挙げられ、炭素数１〜５の直鎖もしくは分岐状アルコキシ基が好ましく、さらに炭素数１〜３の直鎖もしくは分岐状アルコキシ基が好ましい。具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基等が挙げられ、なかでもエトキシ基が好ましい。ハロゲン原子の具体例としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子などを挙げることができ、なかでもフッ素原子、塩素原子が特に好ましい。Ｚの置換位置は、酸素原子のオルト位でも、メタ位でも、パラ位でも良い。Ｚとしては、水素原子、プロピル基、エトキシ基、ニトロ基、フッ素原子、塩素原子が特に好ましい。
【００１６】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤であるピラゾール誘導体は酸、または塩基と塩を形成する場合もあり、本発明は一般式（１）で表される化合物の塩を有効成分とするＨＳＰ９０阻害剤および癌治療薬も含有する。酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩等の無機酸塩や、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩を挙げることができる。塩基との塩としては、例えばナトリウム塩等を挙げることができる。これらの塩は、定法によって製造することができる。
【００１７】
一般式（１）で表される化合物としては、例えば、以下の様な化合物が挙げられる。
３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール （１８０７６）
３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール （１８０３２）
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（２−フルオロフェノキシ）−１Ｈ−ピラゾール （１８０４９）
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−エトキシフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール （１８０７１）
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール 
（１８０４２）
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−フェノキシ−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール （１８０４８）
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ニトロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール （１８０７３）
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ｎ−プロピルフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール （１８０４４）
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−フルオロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール （１８０３９） 
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−クロロフェノキシ）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール （１８０６４） 
３−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（４−ｎ−プロピルフェノキシ）−１Ｈ−ピラゾール （１８０２６）
【００１８】
なかでも、次の化合物が特に好ましい。
３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール （１８０７６）
３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール （１８０３２）
【００１９】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤は、例えば以下のスキーム（１）に従って製造することができる。
【００２０】
【化２】
2005225787.tif 000003
【００２１】
第一工程：一般式（２）で表されるレゾルシノール誘導体と、一般式（３）で表されるフェノキシ酢酸誘導体とを、ルイス酸の存在下縮合させることにより、一般式（４Ａ）で表されるアシル置換レゾルシノール誘導体を合成する工程である。上記反応式中Ｘは、水素原子、または、低級アルキル基を示し、Ｙは、水素原子、または、低級アルキル基を示し、Ｚは、水素原子、低級アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、または、ハロゲン原子を示す。一般式（３）中、Ｌは、水酸基、または、ハロゲン原子を示し、塩素原子が特に好ましい。本反応で使用可能なルイス酸としては、塩化アルミニウム、塩化第二鉄、四塩化チタン、三フッカホウ素、塩化亜鉛等が挙げられ、なかでも塩化アルミニウム、三フッカホウ素が特に好ましい。本反応で使用可能な溶媒としては、１，２−ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、ニトロベンゼン等が挙げられ、なかでも、１，２−ジクロロエタンが好ましい。反応温度は、−２０度から溶媒の沸点で実施でき、なかでも、０度から５０度で実施するのが好ましい。反応時間は５分から２４時間であり、なかでも、１０分から５時間が好ましい。第一工程は、一般式（２）で表されるレゾルシノール誘導体と、Ｌが塩素原子である一般式（３）で表されるフェノキシ酢酸クロリド誘導体とを、塩化アルミニウムの存在下、１，２−ジクロロエタン中室温で撹拌することにより実施するのが、特に好ましい。
【００２２】
第二工程：一般式（４Ａ）で表されるアシル置換レゾルシノール誘導体のカルボニル基に隣接するメチレン部位にアシル基（−（Ｃ＝Ｏ）Ｙ）を導入し、同時に一般式（５Ａ）で表されるイソフラボン誘導体に変換する工程である。本反応で使用可能なアシル基（−（Ｃ＝Ｏ）Ｙ）を導入する試薬としては、無水酢酸等の酸無水物、アセチルクロライド等の酸ハライド、ジメチルホルムアミドジメチルアセタール、ジメチルアセトアミドジメチルアセタール等のアミドジメチルアセタール等が挙げられる。なかでも、ジメチルホルムアミドジメチルアセタール、ジメチルアセトアミドジメチルアセタール等のアミドジメチルアセタールが好ましい。アミドジメチルアセタールを用いてアシル化する場合、本反応で使用可能な溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、テトラヒドロフラン、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、１，２−ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等が挙げられ、なかでも、トルエンが好ましい。反応温度は、−２０度から溶媒の沸点で実施でき、なかでも、１０度から１２０度で実施するのが好ましい。反応時間は１０分から２４時間であり、なかでも、２０分から５時間が好ましい。第二工程は、トルエン中、アミドジメチルアセタールと８０度に加熱することにより実施するのが、特に好ましい。
【００２３】
第二工程は、一般式（４Ａ）で表されるアシル置換レゾルシノール誘導体の水酸基を保護して一般式（４Ｂ）で表される誘導体に変換後実施し、一般式（５Ｂ）で表される水酸基が保護されたイソフラボン誘導体に変換後、脱保護することにより実施しても良い。一般式（４Ｂ）、（５Ｂ）中のＰｒｏは水酸基の保護基を示す。本反応で使用可能なＰｒｏは（４Ｂ）から（５Ｂ）への変換中に脱保護されず、（５Ｂ）から（５Ａ）へ円滑に脱保護できる保護基であれば何でもよい。なかでも、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等のシリル基が好ましく、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基がなかでも特に好ましい。
【００２４】
第三工程：一般式（５Ａ）で表されるイソフラボン誘導体とヒドラジン類との反応により、一般式（１）で表される、ＨＳＰ９０阻害作用を有するピラゾール誘導体を製造する工程である。本反応で使用可能なヒドラジン類としては、ヒドラジン、ヒドラジン水和物、ヒドラジン塩酸塩のいずれを用いても良く、なかでもヒドラジン塩酸塩を５から３０当量用いるのが好ましい。ヒドラジン塩酸塩を用いた場合には、塩酸塩を中和するために十分な量の塩基の共存下反応を行う。本反応で使用可能な塩酸塩を中和するための塩基としては、ピリジン、トリエチルアミン等の有機アミン、または、炭酸ナトリウム等の無機塩基が使用でき、なかでもトリエチルアミンが特に好ましい。本反応で使用可能な溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒、テトラヒドロフラン、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、またはこれらの混合溶媒等が使用でき、なかでもエタノールが特に好ましい。反応温度は０度から溶媒の沸点で実施でき、なかでも、２０度から１００度で実施するのが好ましい。反応時間は３０分から５０時間であり、なかでも、１時間から２４時間が好ましい。第三工程は、一般式（５Ａ）で表されるイソフラボン誘導体、塩酸ヒドラジン、トリエチルアミン、およびエタノールの混合物を加熱還流することにより実施するのが特に好ましい。
【００２５】
一般式（１）で表されるピラゾール誘導体または製薬上許容し得る塩を制癌剤として使用する場合は、単独または担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動化剤、コーティング剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、矯味剤、着香剤、希釈剤、溶解補助剤等の製薬上許容し得る添加剤と混合して粉剤、顆粒剤、錠剤、カブレット剤、カプセル剤、注射剤、座剤、軟膏剤等の製剤形態で、経口または非経口的（全身投与、局所投与等）に安全に投与される。製剤中の本発明化合物または製薬上許容し得る塩の含量は、製剤により種々異なるが、通常０．１〜１００重量％であることが好ましい。投与量は投与経路、患者の年齢並びに予防または治療すべき実際の症状等により異なるが、例えば成人に経口投与する場合、有効成分として１日０．０１  ｍｇ〜２０００  ｍｇ、好ましくは０．１  ｍｇ〜１０００  ｍｇとすることができ、１日１回又は数回に分けて投与できる。
【００２６】
一般式（１）で表されるピラゾール誘導体または製薬上許容し得る塩は、ＨＳＰ９０阻害作用を有し、癌治療剤として有用である。
【実施例】
【００２７】
次に本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら制限されるものではない。また、本発明のＨＳＰ９０阻害剤の有効性を示す本発明の代表的な化合物の薬理試験結果を示す。なお、ＭＳ（ＥＳＩ）は、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣＭＳ−ＱＰ８００αを使用し測定した値である。
【００２８】
３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール（１８０７６）の製造
実施例１  １−（５−エチル−２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−フェノキシエタノンの製造
試験管に、塩化アルミニウム（８０  ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、４−エチルレゾルシノール（１３８  ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、１，２−ジクロロエタン（１  ｍｌ）の順で加え、撹拌した。その溶液にフェノキシアセチルクロライド（１７１  ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、室温で３０分撹拌した。反応液に氷、２Ｎ塩酸を加え、しばらく撹拌した後、酢酸エチルで抽出し、シリカゲルカラム（酢酸エチル）、分取ＨＰＬＣにて精製し、標題化合物（１０３  ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ、ＰＯＳ）ｍ／ｚ：２７３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００２９】
実施例２  ６−エチル−７−ヒドロキシ−３−フェノキシクロメン−４−オンの製造
試験管にジメチルホルムアミドジメチルアセタール（２３．８  ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、１−（５−エチル−２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−フェノキシエタノン（実施例１の化合物、２７．２  ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、トルエン（１  ｍｌ）を加え、８０度に加熱しながら１時間撹拌した。反応液を濃縮後、分取ＨＰＬＣにて精製し、標題化合物（４．３  ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ、ＰＯＳ）ｍ／ｚ：２８３［Ｍ＋Ｈ］＋。
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
８．０４（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），７．９５（１Ｈ，ｓ，＝ＣＨ），７．２２−７．３５（２Ｈ，ｍ，ＡｒＨｏ），  ６．９７−７．１１（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨｍ，ｐ），６．８５（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），２．７２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨ２），１．２９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨ３）．
【００３０】
実施例３  ３−（２，４−ジヒドロキシ−５−エチルフェニル）−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール（１８０７６）の製造
試験管に６−エチル−７−ヒドロキシ−３−フェノキシクロメン−４−オン（実施例２の化合物、２３．５  ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）、エタノール（１．５  ｍｌ）、トリエチルアミン（０．２９  ｍｌ）、塩酸ヒドラジン（８７  ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を加え、４時間、加熱還流を行った。反応液を大部分濃縮後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。酢酸エチルで抽出後、分取ＨＰＬＣにて精製し、標題化合物（１５．７  ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ、ＰＯＳ）ｍ／ｚ：２９７［Ｍ＋Ｈ］＋。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１０．５２（１Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ），９．８０（１Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ），７．６１（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），７．４９（１Ｈ，ｓ，＝ＣＨ），７．２５−７．３１（２Ｈ，ｍ，ＡｒＨｏ），７．００−７．０４（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨｍ，ｐ），６．４４（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），４．８５（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），２．４４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨ２），１．０２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨ３）  
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１７５．５，１５８．３，１５５．１，１５４．１，１２９．７，１２７．５，１２２．８，１２１．０，１２０．１，１１５．９，１０８．７，１０３．３，２２．０，１３．８
【００３１】
前記のその他の本発明のＨＳＰ９０阻害剤（化合物番号：１８０２６、１８０３２、１８０３９、１８０４２、１８０４４、１８０４８、１８０４９、１８０６４、１８０７１、１８０７３）も同様に合成される。
【００３２】
実施例４  蛍光標識した１７−（６−アミノヘキシルアミノ）ハービマイシンＡの製造
蛍光標識した１７−（６−アミノヘキシルアミノ）ハービマイシンＡ（６）を以下のスキーム（２）従って合成した。
【００３３】
【化３】
2005225787.tif 000004
【００３４】
ハービマイシンＡ（７）（４７２  ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（４２  ｍｌ）に溶かし、これにヘキサメチレンジアミン（６９１  ｍｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を加え室温にて１８時間、撹拌した。反応液に水（５０  ｍｌ）とクロロホルム（５０  ｍｌ）を加え分液し、クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５０  ｍｌ、クロロホルム：メタノール：酢酸＝３０：６：１）を行い粗化合物（８０  ｍｇ）を得た。さらに、ＮＨ−シリカゲルカラムクロマトグラフィー（４０  ｍｌ、クロロホルム、富士シリシア化学株式会社）を行い１７−（６−アミノヘキシルアミノ）ハービマイシンＡ（８）（４８  ｍｇ、収率８．５％）を得た。
【００３５】
ＭＳ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）ｍ／ｅ：６８９（Ｍ＋Ｈ）＋
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：９．５２（１Ｈ，ｂｒ）、７．７０（１Ｈ，ｂｒ）、７．００（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ）、６５１（１Ｈ，ｔ、Ｊ＝１０．９Ｈｚ，Ｈ−４），５．８４（１Ｈ，ｄｄ、Ｊ＝１０．９ａｎｄ７．３Ｈｚ，Ｈ−５），５．４−５．６（２Ｈ，ｂｒ，Ｈ−７ａｎｄＨ９），４．７５（２Ｈ，ｂｒ，ＣＯＮＨ２），４．７１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），４．４８（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｈ−６），３．６８（２Ｈ，ｍ），３．５２（３Ｈ，ＯＭｅ），３．３５（３Ｈ，ＯＭｅ），３．３３（３Ｈ，ＯＭｅ），３．３２（３Ｈ，ＯＭｅ），２．００（３Ｈ，ｓ），１．９５−１．２２（１１Ｈ，ｍ），１．６８（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ），１．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）
【００３６】
式（８）の化合物の製造法
式（８）の化合物（２３  ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４  ｍｌ）に溶かし、これに、ＮＨＳ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（１７．６  ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え遮光下、室温にて１５時間撹拌した。反応液に１Ｎ苛性ソーダ水溶液（８０  μｌ）を加え３０分撹拌後、水（５  ｍｌ）を加えた後、クロロホルム（５  ｍｌ）で３回抽出した。クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を留去した。残渣をメタノール（４  ｍｌ）に溶かしシリカゲル（１２０  ｍｇ）を加えた後、濃縮乾固した。残渣をシルカゲルゲルカラムクロマトグラフィー（１８  ｍｌ、クロロホルム：メタノール＝２０：１）を行い式（６）の化合物（以下蛍光標識したハービマイシンＡという）（１７  ｍｇ、収率４９％）を得た。
【００３７】
ＴＬＣ  Ｒｆ：  ０．６１（ＣＤＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５：１）
ＭＳ（ＦＡＢ，ＰＯＳ）ｍ／ｅ：１０４８（Ｍ＋Ｈ）＋，１０７０（Ｍ＋Ｎａ）＋
ＭＳ（ＦＡＢ，ＮＥＧ）ｍ／ｅ：１０４６（Ｍ−Ｈ）−
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）のデータは図１に示す。
【００３８】
実施例５  ＨＳＰ９０結合阻害試験１
本発明のＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０に結合することを示すため、低分子（ＨＳＰ９０結合物質）と高分子（ＨＳＰ９０）の結合を検出する系として蛍光偏光法を用い、結合評価系を構築した。この方法は、蛍光標識したハービマイシンＡとＨＳＰ９０が結合すると蛍光偏光が上昇するが，ＨＳＰ９０に結合する物質が存在すると、蛍光標識したハービマイシンＡに競合して蛍光偏光が減少することを利用したものである。
【００３９】
ヒトＨＳＰ９０遺伝子発現ベクターの構築，および大腸菌におけるヒトＨＳＰ９０の精製
ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＮＭ＿００５３４８として登録されているヒトＨＳＰ９０遺伝子配列ｃＤＮＡクローン（ＡＢ１１４４＿Ｈ１０，ＯＲＩＧＥＮＥ  ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．，ＲＯＣＫＶＩＬＬＥ，ＭＤ）を購入し、ＧＡＴＥＷＡＹシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）により、ヒスチジンタグのついた大腸菌用発現ベクターを構築した。作成した発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１７−ＨＳＰ９０）を大腸菌ＢＬ２１株に形質転換し、ＨＳＰ９０の発現を確認後、ニッケルカラム（Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ＨＳＰ９０を精製した。
【００４０】
精製したＨＳＰ９０（５×１０−７Ｍ  （５０μｇ／ｍｌ））を、本発明のＨＳＰ９０阻害剤（１８０２６、１８０３２、１８０３９、１８０４２、１８０４４、１８０４８、１８０４９、１８０６４、１８０７１、１８０７３、１８０７６）と、さらに蛍光標識したハービマイシンＡ（１×１０−７Ｍ）と共に２時間室温でインキュベートした後、マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）にて蛍光偏光を測定した。
【００４１】
次いで下記の式（１）
【００４２】
【化４】
2005225787.tif 000005
を用いてＨＳＰ９０蛋白質と蛍光標識したハービマイシンＡの結合阻害率（％）を求めた。
【００４３】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤の濃度と阻害活性から、ＨＳＰ９０蛋白質と蛍光標識したハービマイシンＡの結合を５０％阻害する濃度をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥＸＣＥＬの関数ＧＲＯＷＴＨを用いて算出し、ＩＣ５０値とした。
【００４４】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤は用量依存的にＨＳＰ９０と蛍光標識したハービマイシンＡの結合を阻害した。表１に本発明のＨＳＰ９０阻害剤の結合阻害のＩＣ５０値を示す。
【００４５】
比較例１  ＨＳＰ９０結合阻害試験２
実施例１と同様に、精製したＨＳＰ９０（５×１０−７Ｍ  （５０μｇ／ｍｌ））を、既知のＨＳＰ９０阻害剤であるゲルダナマイシン、ハービマイシン、ラディシコール、（いずれもＳＩＧＭＡ社より購入。）、ＰＵ３、１８００９０（ＰＵ３はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，ｖｏｌｕｍｅ  ３，ｐａｇｅ  ５１８−５２０記載の方法に準じて合成した。１８００９０はＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，ｖｏｌｕｍｅ  １０，ｐａｇｅ  ３５５５−３５６４記載の方法に準じて合成した。）（以下既知のＨＳＰ９０阻害剤という。）と、さらに蛍光標識したハービマイシンＡ（１×１０−７Ｍ）と共に２時間室温でインキュベートした後、蛍光偏光を測定してＨＳＰ９０と蛍光標識したハービマイシンＡの結合阻害率（％）を求め、ＩＣ５０値を算出した。
【００４６】
既知のＨＳＰ９０阻害剤は用量依存的にＨＳＰ９０と蛍光標識したハービマイシンＡの結合を阻害した。表１に結合阻害のＩＣ５０値を示す。
【００４７】
【表１】
2005225787.tif 000006
【００４８】
以上の結果より、本発明のＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０と結合することは明らかである。
【００４９】
実施例６  ＨＳＰ９０結合阻害試験３
さらに、本発明のＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０に結合することを確認するため、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、以下ＳＰＲという。）を応用して、生体分子の結合をセンサーチップ上で再現し、リアルタイムに生体分子結合活性を測定するＢＩＡＣＯＲＥ装置（ビアコア株式会社）を用いたＨＳＰ９０  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ系を構築した。
【００５０】
ＨＳＰ９０  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ系はカルボキシメチルデキストランが導入してあるセンサーチップ（ＣＭ５、ビアコア株式会社）上のカルボキシル基を介して、（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡ（式（８）の化合物）を固定化し、ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘにより、センサーチップ表面に固定された（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡとｒＨＳＰ９０の結合により生じる質量変化をＳＰＲとして検出する系であり、方法は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置のプロトコールに従った。
【００５１】
ハービマイシンＡを固定化したセンサーチップ表面に５０μｇ／ｍｌのｒＨＳＰ９０（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ  Ｃａｎａｄａ）を、１２０秒間添加し、ＳＰＲシグナル（相互作用を数値化した値であり、単位はｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔ（ＲＵ））を検出した。その結果，ＳＰＲシグナル上昇が認められ、ｒＨＳＰ９０と（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡの結合が確認できた。
【００５２】
ｒＨＳＰ９０（５×１０−７Ｍ  （５０μｇ／ｍｌ））を、本発明のＨＳＰ９０阻害剤（１８０２６、１８０３２、１８０３９、１８０４２、１８０４４、１８０４８、１８０４９、１８０６４、１８０７１、１８０７３、１８０７６）と混合後、（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡを固定化したセンサーチップ表面に１２０秒間添加し、ＢＩＡＣＯＲＥ−ＸによりＳＰＲシグナル（ＳＰＲ値）を測定した。
【００５３】
次いで下記の式（２）
【００５４】
【化５】
2005225787.tif 000007
を用いて本発明のＨＳＰ９０阻害剤によるｒＨＳＰ９０とセンサーチップ上の（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡの結合阻害率（％）を求めた。
【００５５】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤の濃度と阻害活性から、ｒＨＳＰ９０とセンサーチップ上の（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡの結合を５０％阻害する濃度をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥＸＣＥＬの関数ＧＲＯＷＴＨを用いて算出し、ＩＣ５０値とした。
【００５６】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤は用量依存的にＳＰＲシグナルを低下させ、本発明のＨＳＰ９０阻害剤がｒＨＳＰ９０と（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡの結合を阻害することが示された。表２に結合阻害のＩＣ５０値を示す。
【００５７】
比較例２  ＨＳＰ９０結合阻害試験４
ｒＨＳＰ９０（５×１０−７Ｍ  （５０μｇ／ｍｌ））を、既知のＨＳＰ９０阻害剤と混合後、（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡを固定化したセンサーチップ表面に１２０秒間添加し、ＢＩＡＣＯＲＥ−ＸによりＳＰＲシグナルを測定した。実施例２と同様に結合阻害率を求め、ＩＣ５０値を算出した。
【００５８】
既知のＨＳＰ９０阻害剤は用量依存的にＳＰＲシグナルを低下させ、既知のＨＳＰ９０阻害剤はｒＨＳＰ９０と（６−アミノへキシルアミノ）ハービマイシンＡの結合を阻害することが示された。表２に結合阻害のＩＣ５０値を示す。
【００５９】
【表２】
2005225787.tif 000008
【００６０】
以上の結果より、本発明のＨＳＰ９０阻害剤がｒＨＳＰ９０のハービマイシンＡ結合部位すなわち、ＡＴＰ／ＡＤＰ結合部位に結合することは明らかである。
【００６１】
実施例７  ＨＳＰ９０標的蛋白質量の測定試験１
本発明のＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０と結合する標的蛋白質または標的ポリペプチドの細胞内の減少を誘導することを確認するため、市販のＭＣＦ７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＲＯＣＫＶＩＬＬＥ，ＭＤ）をＨＳＰ９０阻害剤および、本発明化合物の濃度を増加させて１６時間処理した。種々のＨＳＰ９０標的蛋白質量はウェスタン・ブロッティングにより評価した。
【００６２】
６ｃｍ  ｄｉｓｈに１００万個の細胞を散布し、２４時間後に薬剤（１８０３２、１８０７６）を添加した。薬剤処理した細胞を洗浄後、１５０μｌの溶解バッファー（ＲＩＰＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ４０，０．１％  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ），０．１％  ＳＤＳ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を添加し、４℃で３０分インキュベートした。細胞ライセートを遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間）した後、上清２０μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）に用いた。電気泳動終了後、ゲルをＰＶＤＦメンブランに転写し、ＨＳＰ９０と結合する標的蛋白質の１次抗体（Ｈｅｒ２、Ｒａｆ−１、ＥＲα抗体、いずれもＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ，ＣＡ）を反応させ、続いて二次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｄｏｎｋｅｙ）：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で処理し、化学発光試薬（ＥＣＬ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により蛋白質量を化学発光のシグナル強度として検出した。化学発光のシグナルはＭｏｄｅｌ  ＧＳ−７００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて取り込み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｔ  ２．１ソフト（ＢＩＯＲＡＤ）にてシグナル強度を測定した。薬剤未処理群（コントロール）のシグナル強度を対照として、下記の式（３）
【００６３】
【化６】
2005225787.tif 000009
を用いて本発明のＨＳＰ９０阻害剤によるＨＳＰ９０の標的蛋白質量（Ｈｅｒ２、Ｒａｆ−１、ＥＲ）のコントロールの標的蛋白質量に対する割合（％）を求めた。さらに、細胞内標準物質としてβ−アクチンを同様の方法により評価した。さらに、各阻害剤がＨＳＰ９０の標的蛋白質量を５０％まで減少せしめる濃度をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥＸＣＥＬの関数ＧＲＯＷＴＨを用いて算出し、ＩＣ５０値とした。
【００６４】
Ｈｅｒ２の蛋白質量は、５μＭの１８０３２により薬剤を処理していないコントロールに比較して、５０％減少した。また、ＨＳＰ９０の標的蛋白質Ｒａｆ−１及びＥＲαの蛋白質量も５０μＭの１８０３２により減少した。細胞内標準物質のβ−アクチンの蛋白質量は、本発明のＨＳＰ９０阻害剤により変化を受けなかった。表３に本発明のＨＳＰ９０阻害剤のＨＳＰ９０の標的蛋白質減少のＩＣ５０値を示す。
【００６５】
比較例３  ＨＳＰ９０標的蛋白質量の測定試験２
実施例７と同様に既知のＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０の標的蛋白質に及ぼす影響を検討した。
【００６６】
Ｈｅｒ２の蛋白質量は、１μＭのゲルダナマイシンの処理によりコントロールに比較して、検出できないレベルまで減少した。同様に、１μＭのハービマイシン、ラディシコールの処理により、Ｈｅｒ２の蛋白質量は著しく減少した。一方、１００μＭのＰＵ３及び５μＭの１８００９０はＨｅｒ２の蛋白質量を５０％減少させた。また、ＨＳＰ９０の標的蛋白質Ｒａｆ−１及びＥＲαの蛋白質量もＨＳＰ９０阻害剤の処理により著しく減少した。細胞内標準物質のβ−アクチンの蛋白質量は、ＨＳＰ９０阻害剤により変化を受けなかった。表３に既知のＨＳＰ９０阻害剤のＨＳＰ９０の標的蛋白質の減少をもたらした化合物と減少率を示す。
【００６７】
【表３】
2005225787.tif 000010
【００６８】
以上の結果より、本発明のＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０の標的蛋白質への結合を妨害し、これに続く標的蛋白質の減少をもたらすことで標的蛋白質を不活性化せしめることを示す。
【００６９】
実施例８  ＨＳＰ９０阻害剤の細胞増殖抑制試験１
本発明のＨＳＰ９０阻害剤が細胞増殖に与える影響を確認するため、ＭＣＦ７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＲＯＣＫＶＩＬＬＥ，ＭＤ）を本発明のＨＳＰ９０阻害剤により７２時間処理した。薬剤処理後、細胞数をメチレンブルー法により測定した。測定は、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて６６０ｎｍの吸光度により行った。
【００７０】
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＭＣＦ７細胞を２千個／ｗｅｌｌ散布し、２４時間後に薬剤を処理した。さらに７２時間後、培地を除去し、５０μｌのメタノールを添加して室温で２分インキュベートした。メタノールを除去後、２００μｌのメチレンブルー染色液を添加し、３０分染色した。２００μｌの蒸留水で３回洗浄を行い、乾燥後、３％ＨＣｌ溶液を添加し、メチレンブルーの６６０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）をマイクロプレートリーダーにて測定した。
【００７１】
次いで下記の式（４）を用いて細胞増殖阻害率（％）を求めた。
【００７２】
【化７】
2005225787.tif 000011
【００７３】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤の濃度と細胞増殖阻害率から、コントロールと比較して細胞増殖を５０％阻害する濃度をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥＸＣＥＬの関数ＧＲＯＷＴＨを用いて算出し、ＩＣ５０値とした。表４に本発明のＨＳＰ９０阻害剤の細胞増殖阻害作用のＩＣ５０値を示す。
【００７４】
比較例４  ＨＳＰ９０阻害剤の細胞増殖抑制試験２
実施例８と同様に既知のＨＳＰ９０阻害剤のＭＣＦ７細胞の増殖抑制作用を検討した。表４に既知のＨＳＰ９０阻害剤の細胞増殖阻害作用のＩＣ５０値を示す。
【００７５】
【表４】
2005225787.tif 000012
【００７６】
以上の結果より、本発明のＨＳＰ９０阻害剤はＭＣＦ７細胞に対する増殖抑制効果を有することは明らかである。
【００７７】
以上の結果より、本発明のＨＳＰ９０阻害剤はＨＳＰ９０のハービマイシンＡ結合部位すなわち、ＡＴＰ／ＡＤＰ結合部位に結合し、ＨＳＰ９０の標的蛋白質の細胞内量を減少させ、癌細胞の増殖抑制効果を有し、癌の治療薬として有用であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】蛍光標識したハービマイシンＡ（式（６））の１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）のチャートである。
【図２】本発明のＨＳＰ９０阻害剤（１８０３２、１８０７６）によるＨＳＰ９０の標的蛋白質Ｈｅｒ２、Ｒａｆ−１及びＥＲαの蛋白質量減少を示す図である。１８０３２は５、１５．８、５０μＭの３用量、１８０７６は１５．８、５０μＭの２用量をそれぞれＭＣＦ７細胞に１６時間処理した後、細胞から得たライセート中のＨｅｒ２、Ｒａｆ−１、ＥＲαの各蛋白質量をウエスタン・ブロッティングにより評価した。β−アクチンは細胞内標準物質である。
【図１】
2005225787.tif 000015
【図２】
2005225787.tif 000016