(57)【要約】      （修正有）【課題】形態学的に細胞が安定に保たれた生物組織薄切試料を作製する方法および器具の提供。【解決手段】同じ形状の刃をもつ複数の刃物１１を、所定の間隔で互いに平行に、かつ刃も平行になるように保持部材１３で保持して成る組み合わせ刃物を用いて、生物組織ブロックを切断する。刃物１１はセラミックで構成する。押し出し部材１２を刃物１１の間に挿入して、切断された生物組織薄片を刃物１１の間から押し出す。【選択図】  図３
2005098702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミックで構成され、同じ直線または曲線形状の刃を持つ、２枚以上の板状の刃物を、所定の間隔で互いに平行に、かつ刃も平行になるように保持した組み合わせ刃物を用いて、生物組織ブロックを所定の厚さに切断して、生物組織薄片を得、
前記刃物の間に各々挿入できる所定の厚さの押し出し部材を、前記刃物の間にそれぞれ挿入して、前記刃物の間から前記生物組織薄片を押し出すことから成る、生物組織試料作製方法。
【請求項２】
前記刃の形状が円弧状である、請求項１の生物組織試料作製方法。
【請求項３】
円弧状の刃をもつ前記刃物を面に沿って、その面に垂直な共通の軸の周りに回転させて前記切断を行う、請求項１の生物組織試料作製方法。
【請求項４】
前記刃物が円盤状である、請求項３の生物組織試料作製方法。
【請求項５】
同じ直径の円盤状で、円周上に刃をもち、セラミックで構成された２枚以上の刃物を、所定の間隔で同軸かつ回転可能に保持し、
前記刃物を回転させ、
生物組織ブロックを、回転する前記刃物の刃に押し当てて切断するとともに、前記刃物の間に押し込み、
切断された前記生物組織薄片を前記刃物の間から押し出すことから成る、生物組織試料作製方法。
【請求項６】
セラミックで構成され、同じ直線または曲線形状の刃を持つ、４枚以上の板状の刃物と、
前記刃物を互いに平行に、かつ刃も平行になるように保持する刃物保持部材と、前記刃物の間に各々挿入できる所定の厚さの試料押し出し部材と、
この押し出し部材を互いに平行に保持する押し出し部材保持部材とを具え、
前記刃物保持部材により前記刃物は、各押し出し部材をその間に挿入できるような所定の間隔で互いに平行に保持され、
前記押し出し部材保持部材により前記試料押し出し部材は、それぞれ前記刃物の間に滑らかに挿入できるような所定の間隔で互いに平行に保持され、
前記押し出し部材が各々前記刃物の間に挿入されるように構成されたことを特徴とする、生物組織薄切試料作製器具。
【請求項７】
前記刃物が０．４ｍｍ未満の厚さを有する、請求項６の生物組織薄切試料作製器具。
【請求項８】
前記刃の形状が円弧状である、請求項６の生物組織薄切試料作製器具。
【請求項９】
前記刃物保持部材は、前記刃物をその面に垂直な軸のまわりに回転できるように保持し、円弧状の刃をもつ前記刃物がその面に沿って、前記軸の周りに回転できるように構成された、請求項８の生物組織薄切試料作製器具。
【請求項１０】
前記刃物が円盤状である、請求項８の生物組織薄切試料作製器具。
【請求項１１】
同じ直径の円盤状で、円周上に刃を有し、セラミックで構成された２枚以上の刃物と、
前記円盤状の刃物を同軸かつ回転可能に保持する刃物支持軸と、
前記刃物の間に各々挿入できるように保持された、移動可能な試料搬送部材とを具え、
前記刃物支持軸により前記刃物は、その間に各試料固定部材を挿入できるような所定の間隔で互いに平行に保持され、
前記搬送部材が、移動するにつれ前記刃物の間にそれぞれ挿入されるように構成されたことを特徴とする、生物組織薄切試料作製器具。
【請求項１２】
前記試料搬送部材が、切断すべき生物組織試料を前記刃物に向かって送り込み、
前記円盤状刃物が回転して、前記試料搬送部材により送り込まれる前記生物組織試料を円周上の刃で切断し、
前記試料搬送部材が、この切断された前記生物組織試料を前記刃物の間から押し出すように構成された、請求項１１の生物組織薄切試料作製器具。
【請求項１３】
同じ直径の円盤状で、円周上に刃を有し、セラミックで構成された２枚以上の刃物と、
前記円盤状の刃物を同軸かつ回転可能に保持する、移動可能な刃物支持軸と、前記刃物の間に各々挿入できるように保持された試料固定部材とを具え、
前記刃物支持軸により前記刃物は、その間に各試料固定部材を挿入できるような所定の間隔で互いに平行に保持され、
前記刃物支持軸の移動とともに前記試料固定部材が前記刃物の間をそれぞれ通過するように構成されたことを特徴とする、生物組織薄切試料作製器具。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生物組織薄切試料を作製する方法およびそのために用いる器具に関するものである。特に、細胞が少なくとも形態学的に安定に保たれるような生物組織薄切試料の作製方法およびそのために用いる器具に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物組織薄切試料を作製するため、同じ直線または曲線形状の刃を持つ、４枚以上の板状刃物を、所定の間隔で互いに平行に、かつ刃も平行になるように固定した組み合わせ刃物を用いて、生物組織ブロックを所定の厚さに切って、生物組織薄片を得、刃物の間に各々挿入できる所定の厚さの、平行に固定された平板状の押し出し部材を、刃物の間隙にそれぞれ挿入して、刃物の間隙から生物組織薄片を押し出す方法およびそのための器具が、特開平７−号に開示されている。この方法により、氷点付近に保たれた生物組織からその薄切試料を作製することができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、刃物として剃刀用の鋼ブレードを用いてこの方法により作製した生物組織薄切試料は、室温で緩衝液中に２０分程度置いたとき、切断面から約０．１ｍｍの深さまでの細胞の一部に核濃縮を生じ、さらに培養液中で１時間近く経過すると、この部分の細胞は活性が失う。
【０００４】
生物組織の生物活性についての実験を可能にするためには、常温緩衝液中で少なくとも１時間は、細胞死はもとより核濃縮を生ずることなく、少なくとも形態学的に細胞が安定に、すなわち微細構造体および半透性膜構造が正常の状態に、保たれなければならない。
【０００５】
細胞が少なくとも形態学的に安定に保たれるような生物組織薄切試料の作製方法の実現が切望されていた。
【０００６】
本発明の目的は、細胞が少なくとも形態学的に安定に保たれるような生物組織薄切試料の作製方法の実現にある。本発明の他の目的は、細胞が少なくとも形態学的に安定に保たれるように、生物組織薄切試料を作製するための器具の実現にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の上記目的は、セラミックで構成され同じ直線または曲線形状の刃を持つ、２枚以上の板状の刃物を、所定の間隔で互いに平行に、かつ刃も平行になるように保持した組み合わせ刃物を用いて、生物組織ブロックを所定の厚さに切って、生物組織薄片を得、刃物の間に各々挿入できる所定の厚さの押し出し部材を、刃物の間隙にそれぞれ挿入して、刃物の間から生物組織薄片を押し出すことから成る生物組織試料作製方法により、達成された。
【０００８】
本発明の上記目的は、また、セラミックで構成され、同じ直線または曲線形状の刃を持つ、２枚以上の板状の刃物と、これらの刃物を互いに平行に、かつ刃も平行になるように保持する刃物保持部材と、刃物の間に各々挿入できる所定の厚さの押し出し部材とを具え、刃物保持部材により刃物は、その間に各押し出し部材を挿入できるような所定の間隔で互いに平行に保持（固定を含む）され、押し出し部材は、それぞれ刃物の間に滑らかに挿入できるような所定の間隔で保持され、押し出し部材が刃物の間に各々挿入されるように構成されたことを特徴とする、生物組織薄切試料作製器具により、達成された。
【０００９】
板状刃物を構成するセラミックとして、ジルコニアセラミック等が適する。例えば、エヌティー株式会社の同種セラミックを用いることができる。
【００１０】
板状の刃物（以下、ブレードという）は２枚以上何枚でもよいが、ある程度枚数が多い方が（例えば４枚）均一な厚さの薄片が得られる。ブレードの寸法は、薄切する対象物の寸法に依存し、特に制限はないが、刃幅（刃に垂直の方向）は２ないし１５ｍｍ、刃の長さは１０ないし３００ｍｍである。ブレードの厚さは、通常０．０５ないし１ｍｍであるが、０．４ｍｍ未満とすることが好ましい。ブレードの厚さが大きいと、組織の損傷が大きくなるからである。ブレードの厚さの最小限度は、機械的強度の点より自ずから決まり、通常０．０５ｍｍが限度である。複数のブレードの刃の方向（接線）は互いに平行とする。刃は刃物の片面のみに付けてもよく、両面に付してもよい。
【００１１】
刃の形は直線状、曲線状（例えば円弧）いずれでもよいが、円弧状とすることが好ましい。さらに、円弧状の刃をもつ刃物がその面に沿って回転するように、刃物をその面に垂直な共通の軸の回りに回転できるように保持することが好ましい。特に、刃物を円周上に刃をもつ円盤状とし、共通の軸の回りに回転させる構造が好ましい。回転運動は往復運動でもよいが、一方向に連続または断続回転してもよく、回転速度は毎分１０ないし６０回転程度が適当である。
【００１２】
各ブレードの刃が、ブレードに垂直な一つの面内に位置するのが好ましいが、刃先がブレード面の方向にずれて（雁行して）もよい。ブレードの間隔は、薄片の望みの厚さにより決まるが、通常０．２ないし５ｍｍである。組織が特に柔かい場合にはブレードの間隔を広くする必要があり、例えば、脳の場合０．８ｍｍ以上とするのが好ましい。
【００１３】
押し出し部材は各々ブレードの間に容易に挿入され、かつ薄片をなるべく変形しないように押し出すことができなければならない。従って、ブレードの間隔より若干小さい厚みとするが、通常０．１５ないし４．９ｍｍである。押し出し部材の幅も、ブレードの刃渡りより若干小さい寸法とするが、通常８ないし２５０ｍｍである。押し出し部材の長さ（ブレードの刃に垂直の方向）は、薄片を完全に押し出すことができるよう、ブレードの幅より若干大きく、通常５ないし６０ｍｍとする。
【００１４】
押し出し部材は組織材料により錆を生じたり、腐食されたりしない、また組織の生物的特性や機能に影響を与えない材料で構成されることが望ましい。電導性の低いプラスチック、ガラス、セラミック等を用いることができる。刃物保持部材や押し出し部材保持部材も、組織材料と接触する可能性があるので、同様な材質とすることが好ましい。
【００１５】
薄片は、ブレードの刃の方から押し出してもよいし、刃と反対の方から押し出してもよい。刃の方向から試料薄片を押し出す場合、薄片は刃物の間を通過することになる。刃物が円盤状である場合、この方が有利である。刃物を固定し、押し出し部材を動かしてもよいが、特に刃物が円盤状である場合、押し出し部材を固定して、試料固定部材を兼ねさせ、刃物の方を移動させて切断、押し出しを行ってもよい。
【００１６】
ブレードにより作製された生物組織薄切片は、押し出し部材によりブレードの間から押し出し、冷水中に浮遊させる。薄切および押し出しの操作は、組み合わせ刃物を冷水中に浸し、器具の周囲を氷、保冷材等で低温に保ちながら行うことが好ましい。
【００１７】
本発明の方法及び器具は、切断による影響なく、組織ブロックから生物活性を保った組織薄片を短時間に多数得ることができる。
【００１８】
本発明では、セラミックで構成され同じ直線または曲線形状の刃を持つ、２枚以上の板状の刃物を、所定の間隔で互いに平行に、かつ刃も平行になるように固定した組み合わせ刃物を用いる。この組み合わせ刃物を用いて組織ブロックを押し切ると、ブレードの間隔に応じた厚さで、ブレードの数に応じた複数の組織薄片がブロックから一挙に切り取られ、薄片は一旦ブレードの間に位置する。各ブレードの間に挿入できる厚さをもち、互いに平行に固定された押し出し部材は、各ブレードの間に挿入することができる。この押し出し部材をブレードの間に挿入すると、ブレードの間に入っている薄片は押し出される。排出された薄片は、ブレードの間隔にほぼ等しい厚さを有する。すなわち、ブレードの間隔に対応した厚さの組織薄片が得られる。
【００１９】
ブレードはセラミックで構成されているので、切断された組織試料の切断面付近の約１００ミクロンの層の損傷が少なく、組織薄片は正常に近い生物活性を有する。これは、ブレードがステンレス鋼などの電気良導体で成る場合に、切断面の細胞の正電位が失われるのに対し、ブレードがセラミックで構成される場合には、この電位が保たれるからであろう。
【００２０】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明に用いる組み合わせ刃物を示す。
図１Ａは平面図、図１Ｂは正面図、図１Ｃは切断線Ｘ−Ｘに沿った断面図である。組み合わせ刃物は、各々同じ直線形状の刃を持つ５枚のブレード１と、ブレード１を互いに平行に固定するブレード保持部材３から成る。ブレード１の間には押し出し板２を設け、押し出し板２は押し出し板保持部材４により互いに平行に固定されている。ブレード１は、ブレード保持部材３により一定の間隔で互いに平行に、そして刃も平行になるように固定されている。ブレード保持部材３で連結された５枚のブレード１が組み合わせ刃物を構成する。ブレード１および押し出し板２の間隔は、押し出し板２がブレード１に接しながらその間に挿入されるような間隔にしてある。ブレード１の間隙に挿入された押し出し板２は、図中矢印の方向に移動することができ、図中鎖線で示す位置まで達する。
【００２１】
ブレード１は厚さ０．２５ｍｍのジルコニアセラミックから成る。押し出し板２は厚さ約１．９ｍｍのプラスチック製である。ブレード保持部材３の厚さ、従ってブレード１の間隙は、約２ｍｍである。
【００２２】
ブレード１とブレード固定部材３から成る組み合わせ刃物を用いて生物組織ブロックを押し切ると、ブレード１の間隔に応じた厚さで、ブレード１の数に応じた複数の組織薄片がブロックから一挙に切り取られる。薄片は一旦ブレード１の間隙に位置するが、押し出し板２を挿入し、図中矢印の方向に押し進めると、薄片は組み合わせ刃物の外に押し出される。その厚さは、ブレード１の間隔にほぼ等しい。こうしてブレード１の間隔に対応した厚さの４枚の組織薄片が一挙に得られる。ブロックの残りを同様の操作で切断すれば、多数の組織薄片が短時間で得られる。得られた組織薄片は、表面層を含めて生物活性を保持している。
【００２３】
図２、図３、および図４は、本発明の生物組織薄切試料作製器具を示す。
図２Ａ，２Ｂ，２Ｃは立面図、図３は図２Ａの状態における平面図、図４は側面図である。組み合わせ刃物は、各々円周上に刃を持つ５枚の円盤状ブレード１１と、円盤状ブレード１１を互いに平行かつ回転自在に保持するブレード支持軸１３とから成る。円盤状ブレード１１は、ブレード支持軸１３により一定の間隔で互いに平行に固定され、ブレード支持軸１３で連結された５枚の円盤状ブレード１１が組み合わせ刃物を構成している。
【００２４】
切断すべき生物組織試料を固定するための試料搬送台１２は、平坦部１２ａ，１２ｃ，１２ｅと突起部１２ｂ，１２ｄを有し、突起部１２ｂ，１２ｄ及び平坦部１２ｃには、円盤状ブレード１１が通過できる間隔の平行な溝１４を設けてある。突起部１２ｂと同１２ｄの間の平坦部１２ｃは組織試料を固定するための凹部を形成し、突起部１２ｂ，１２ｄ及び平坦部１２ｃの、溝１４の間の部分は、円盤状ブレード１１の間に僅かな間隙をもって挿入される。試料搬送台１２は、円盤状ブレード１１が溝１４を通過することにより、図中矢印の方向に移動することができる。
【００２５】
ブレード１１は厚さ０．２５ｍｍのジルコニアセラミックから成り、円周上の両面に刃が付けられている。試料搬送台１２はプラスチック製である。円盤状ブレード１１の間隙は、約２ｍｍである。
【００２６】
試料搬送台１２の突起部１２ｂ、１２ｄと平坦部１２ｃに囲まれた凹部に生物組織ブロックを固定し、ブレード支持軸１３で支持された円盤状ブレード１１を時計回りに回転させながら、試料搬送台１２を一定速度で矢印方向に移動させて、生物組織ブロックを押し切ると、ブレード１１の間隔に応じた厚さで、ブレード１１の数に応じた複数の組織薄片がブロックから一挙に切り取られる。組織薄片は一旦ブレード１１の間隙に位置するが、試料搬送台１２が移動（図中矢印の方向）するにつれ、突起部１２ｄによりブレード１１の円周外に押し出される。その厚さは円盤状ブレード１１の間隔にほぼ等しい。こうしてブレードの間隔に対応した厚さの４枚の組織薄片が一挙に得られる。新たなブロックを同様の操作で切断すれば、表面層を含めて生物活性を保持した多数の組織薄片が短時間で得られる。
【００２７】
図５（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、本発明に用いる生物組織薄切試料作製器具を示す。
図５Ａ，５Ｂ，５Ｃはそれぞれ三つの状態における平面図である。組み合わせ刃物の構造は図２のものと同じであるが、円盤状ブレード２１は、回転しつつ、試料固定具２２に沿って矢印の方向に所定の速度で移動できる。
【００２８】
切断すべき生物組織試料を固定するための試料固定台２２は、試料搬送台１２と同様に、平坦部２２ａ，２２ｃ，２２ｅ、突起部２２ｂ，２２ｄ、溝２４を有する。突起部２２ｂと２２ｄの間の平坦部２２ｃは組織試料を固定するための凹部を形成する。円盤状ブレード２１は、この凹部を囲む突起部２２ｂ，２２ｄ及び平坦部２２ｃに刻まれた溝２４に、僅かな間隙をもって挿入される。
【００２９】
試料固定台２２の突起部２２ｂ、２２ｄと平坦部２２ｃに囲まれた凹部に、生物組織ブロックを固定し、ブレード支持軸２３で支持された円盤状ブレード２１を、時計回りに回転させながら一定速度で矢印方向に移動させて、生物組織ブロックを押し切ると、ブレード２１の間隔に応じた厚さで、ブレード２１の数に応じた複数の組織薄片が、ブロックから一挙に切り取られる。組織薄片は一旦ブレード２１の間隙に位置するが、円盤状ブレード２１がさらに移動（図中矢印方向）した後は、試料固定台２２の凹部に留まって、ブレード２１の円周外に抜け出す。その厚さは円盤状ブレード２１の間隔にほぼ等しい。こうしてブレードの間隔に対応した厚さの４枚の組織薄片が一挙に得られる。新たなブロックを同様の操作で切断すれば、表面層を含めて生物活性を保持した多数の組織薄片が短時間で得られる。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例により本発明の効果を示す。説明の都合上、実施例の記述に先立ち、比較例とその結果を示す。
［比較例］
図１のブレード１として、厚さ０．３ｍｍのステンレス鋼製剃刀を用い、図１の器具を用いてラットの脳の組織の薄片（厚さ２ｍｍ）を作製した。薄片を２０分間、温度２０℃のｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中に置いた後、光学顕微鏡切片を常法により作製し、顕微鏡観察したところ、切断面から０．１ｍｍの深さまでの大部分の細胞で、核濃縮が認められた。緩衝液中で６０分経過した後には全ての細胞が死んでいた。
【００３１】
［実施例１］
図１のブレード１として、エヌティー株式会社の販売する厚さ０．２５ｍｍのジルコニアセラミック製ブレードを用い、図１の器具を用いてラットの脳の組織の薄片（厚さ２ｍｍ）を作製した。薄片を２０分間、温度２０℃のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中に置いた後、光学顕微鏡切片を常法により作製し、顕微鏡観察したところ、切断面から０．１ｍｍの深さまでの細胞で、核濃縮が認められるものは少数であった。さらに深部の細胞像も異常は認められなかった。
【００３２】
緩衝液中で６０分経過した薄片を、組織培養液中で１２５Ｉ−ＮａＩのトレーサ量を加えて温度２２℃で１時間培養した。薄片の深さ全体にわたって、培養液が浸透していると判断され、細胞の異常は認められなかった。
【００３３】
【実施例２】
図２（Ａ，Ｂ，Ｃ）のブレード１１として、半径３０ｍｍ、厚さ０．２５ｍｍのジルコニアセラミック製ブレード（エヌティー株式会社）を用い、図２（Ａ，Ｂ，Ｃ）の器具を用いてラットの脳の組織の薄片（厚さ２ｍｍ）を作製した。薄片を２０分間、温度２０℃のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中に置いた後、常法により光学顕微鏡切片を作製し、顕微鏡観察したところ、切断面から０．１ｍｍまでの深さで核濃縮が認められる細胞は実施例１よりさらに少なかった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の方法によると、比較的長時間の培養に対してもなお、形態学的に細胞が充分安定に保たれた生物組織薄切試料を、作製することができる。また、本発明の器具により、細胞が形態学的に安定に保たれた生物組織薄切試料を、作製することができる。これは、特開平７−２１８３９８号の方法又は器具において、セラミックから成る刃物を用いることにより、組織切断面の細胞の損傷が防止されたものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いる組み合わせ刃物の平面図（図１Ａ）、正面図（図１Ｂ）および断面図（図１Ｃ）。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは本発明の生物組織薄切試料作製器具の立面図。
【図３】本発明の生物組織薄切試料作製器具の平面図。
【図４】本発明の生物組織薄切試料作製器具の側面図。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃは本発明の生物組織薄切試料作製器具の立面図。
【符号の説明】
１    ブレード
２    押し出し板
３    ブレード保持部材
４    押し出し板保持部材
１１    円盤状ブレード
１２    試料搬送台
１２ａ，１２ｃ，１２ｅ  平坦部
１２ｂ，１２ｄ          突起部
１３    ブレード支持軸
１４    溝
２１    円盤状ブレード
２２    試料固定台
２２ａ，２２ｃ，２２ｅ  平坦部
２２ｂ，２２ｄ          突起部
２３    ブレード支持軸
２４    溝
【図１】
2005098702.tif 000003
【図２Ａ】
2005098702.tif 000004
【図２Ｂ】
2005098702.tif 000005
【図２Ｃ】
2005098702.tif 000006
【図３】
2005098702.tif 000007
【図４】
2005098702.tif 000008
【図５Ａ】
2005098702.tif 000009
【図５Ｂ】
2005098702.tif 000010
【図５Ｃ】
2005098702.tif 000011