(57)【要約】【課題】質量分析装置を用いるペプチドの定性及び定量解析を高感度に行うことができる試薬、及び方法を提供する。通常質量分析においてイオン化効率が悪いリン酸化ペプチドの定性及び定量解析を高感度に行うことができる試薬、及び方法を提供する。【解決手段】質量分析装置においてペプチドの高感度測定又は定量を行うための、一般式（Ａ）：【化１】2005049164.tif 000036（式中、Ｘは、置換基を有する３−ピリジル基、又は置換基を有してもよい前記３−ピリジル基以外の含窒素芳香族複素環基、又は置換基を有するアミノ基を有する芳香族炭化水素基を表す。）で表されるラベル化試薬。【選択図】  図６
2005049164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析装置においてペプチドの高感度測定又は定量を行うための、一般式（Ａ）：
【化１】
2005049164.tif 000029
（式中、Ｘは、置換基を有する３−ピリジル基、又は置換基を有してもよい前記３−ピリジル基以外の含窒素芳香族複素環基、又は置換基を有するアミノ基を有する芳香族炭化水素基を表す。）で表されるラベル化試薬。
【請求項２】
前記ラベル化試薬が下記式（１）：
【化２】
2005049164.tif 000030
で表される、請求項１に記載のラベル化試薬。
【請求項３】
前記ラベル化試薬が下記式（３）〜（１０）：
【化３】
2005049164.tif 000031
のうちのいずれかで表される、請求項１に記載のラベル化試薬。
【請求項４】
前記ラベル化試薬が下記式（１１）：
【化４】
2005049164.tif 000032
で表される、請求項１に記載のラベル化試薬。
【請求項５】
前記ラベル化試薬が下記式（１２）：
【化５】
2005049164.tif 000033
で表される、請求項１に記載のラベル化試薬。
【請求項６】
前記ラベル化試薬が下記式（１３）：
【化６】
2005049164.tif 000034
で表される、請求項１に記載のラベル化試薬。
【請求項７】
前記ラベル化試薬が下記式（１４）：
【化７】
2005049164.tif 000035
で表される、請求項１に記載のラベル化試薬。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラベル化試薬を用いてペプチドのＮ末端アミノ基、リジン残基の側鎖アミノ基、又は、Ｎ末端アミノ基及びリジン残基の側鎖アミノ基を修飾し、質量分析装置によってペプチドを高感度測定又は定量する方法。
【請求項９】
前記ペプチドがリン酸化されている、請求項８に記載のペプチドを高感度測定又は定量する方法。
【請求項１０】
ペプチドを修飾するためのラベル化試薬と、前記ラベル化試薬に特定の置換基が導入された他のラベル化試薬とを対で用い、質量分析装置によってペプチドの定量を行う方法。
【請求項１１】
ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか一方を用いて修飾することにより誘導体化し、誘導体化されたペプチドを得て、
別途、対照ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか他方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化された対照ペプチドを得て、
前記誘導体化されたペプチドと前記誘導体化された対照ペプチドとを混合し、
混合した誘導体化ペプチドを質量分析装置によって測定する、請求項１０に記載のペプチドの定量を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、質量分析装置を用いてペプチドの解析を行う分野において有用なラベル化試薬及びそれを用いたペプチドの定性又は定量に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の機能は、タンパク質の量的変動だけでなく、リン酸化等の翻訳後修飾による質的変動によっても調節される。タンパク質の同定、定量には、ＭＡＬＤＩ等のソフトイオン化法を用いた質量分析装置が重要な役割を果たしている。タンパク質・ペプチドを化学修飾し、質量分析装置で高感度分析をする方法は、数多く検討されており、例えば、「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １９９８，  １７，  ２５５−２７４」１９９９  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃにまとめられている。また、タンパク質・ペプチドを同位体を有するラベル化試薬で化学修飾し、定量する方法としてはＩｓｏｔｏｐｅ  Ｃｏｄｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇ  （ＩＣＡＴｓ）法（ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＶＯＬ  １７，  ＯＣＴＯＢＥＲ  １９９９，  ９４４−９９９）が知られている。
【０００３】
しかし、従来のラベル化試薬は、ペプチドの分析における検出の感度に関して不十分であり、リン酸化ペプチドなどのイオン化効率の悪いペプチドを高感度で分析するには至っていない。また、ＩＣＡＴ法ではペプチドのシステイン残基を修飾するために、タンパク質を酵素等で断片化した後、システイン残基を含まないペプチド断片の定量は行えないこと、リン酸化ペプチドが化学修飾を受けているとは限らないこと等の問題がある。
【０００４】
タンパク質・ペプチド中には様々な化学構造が存在するため、ラベル化試薬の種類もそれらに対応して種々の化学構造を有する化合物が模索され報告されている。タンパク質・ペプチドのＮ末端アミノ基に対するラベル化試薬として、ニコチノイルスクシンイミド誘導体、すなわち１−（ニコチノイルオキシ）スクシンイミド及び１−（［Ｄ４］ニコチノイルオキシ）スクシンイミドがＭｕｎｃｈｂａｃｈら（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ７２  （１７），  ４０４７−４０５７）によって合成され、ペプチドの質量分析による発現量解析及びアミノ酸配列解析のために用いられてきた。
【０００５】
安定同位体を含有する化合物は一般に、安定同位体を含有する原料化合物［Ｄ４］ニコチン酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ａｎｄｏｖｅｒ，  ＭＡ））を用いて目的の構造を有する化合物へと誘導することによって合成されている。Ｍｕｎｃｈｂａｃｈらによる合成においても、重水素を含有する出発原料が用いられている。しかし、重水素等の安定同位体を含有する原料は高価であること、また、煩雑な工程を必要とすること等の問題がある。
【０００６】
【非特許文献１】
「マススペクトロメトリー・レヴュー（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）１９９８年、第１７巻、ｐ．２５５−２７４」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ）、１９９９年
【非特許文献２】
「ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）」、第１７巻、１９９９年１０月、ｐ９４４−９９９
【非特許文献３】
ミュンヒバック・Ｍ（Ｍｕｎｃｈｂａｃｋ  Ｍ）、クアドロニー・Ｍ（Ｑｕａｄｒｏｎｉ  Ｍ）、ミオット・Ｇ（Ｍｉｏｔｔｏ  Ｇ）、ジェームズ・Ｐ（Ｊａｍｅｓ  Ｐ）著、断片化を促進する成分を用いたペプチドＮ末端の同位体標識によるタンパク質の定量化及び簡便なｄｅ  ｎｏｖｏシーケンス（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）、「アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０００年９月１日、第７２巻、第１７号、ｐ．４０４７−４０５７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、質量分析装置を用いるペプチドの定性及び定量解析を高感度に行うことができる試薬、及び質量分析装置を用いるペプチドの定性及び定量解析を高感度に行う方法を提供することにある。特に本発明の目的は、通常質量分析においてイオン化効率が悪いリン酸化ペプチドの定性及び定量解析を高感度に行うことができる試薬、及び質量分析装置を用いるリン酸化ペプチドの定性及び定量解析を高感度に行う方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の発明を含む。
１．質量分析装置においてペプチドの高感度測定又は定量を行うための、一般式（Ａ）：
【０００９】
【化８】
2005049164.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｘは、置換基を有する３−ピリジル基、又は置換基を有してもよい前記３−ピリジル基以外の含窒素芳香族複素環基、又は置換基を有するアミノ基を有する芳香族炭化水素基を表す。）で表されるラベル化試薬。
【００１１】
２．前記含窒素芳香族複素環基が、２−ピリジル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
３．前記ラベル化試薬が下記式（１）で表される、上記１．又は２．に記載のラベル化試薬。
【化９】
2005049164.tif 000004
【００１２】
４．一般式におけるＸが３−ピリジル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
５．前記ラベル化試薬が下記式（３）〜（１０）のうちのいずれかで表される、上記１．又は４．に記載のラベル化試薬。
【化１０】
2005049164.tif 000005
【００１３】
６．前記含窒素芳香族複素環基が４−ピリジル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
７．前記ラベル化試薬が下記式（１１）で表される、上記１．又は６．に記載のラベル化試薬。
【化１１】
2005049164.tif 000006
【００１４】
８．前記含窒素芳香族複素環基がベンズイミダゾリル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
９．前記ラベル化試薬が下記式（１２）で表される、上記１．又は８．に記載のラベル化試薬。
【化１２】
2005049164.tif 000007
【００１５】
１０．前記芳香族炭化水素基がフェニル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
１１．前記ラベル化試薬が下記式（１３）で表される、上記１．又は１０．に記載のラベル化試薬。
【化１３】
2005049164.tif 000008
【００１６】
１２．前記含窒素芳香族複素環基がイミダゾリル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
１３．前記ラベル化試薬が下記式（１４）で表される、上記１．又は１２．に記載のラベル化試薬。
【化１４】
2005049164.tif 000009
【００１７】
１４．上記１．〜１３．のいずれかに記載のラベル化試薬を用いてペプチドのＮ末端アミノ基、リジン残基の側鎖アミノ基、又は、Ｎ末端アミノ基及びリジン残基の側鎖アミノ基を修飾し、質量分析装置によってペプチドを高感度測定又は定量する方法。
１５．前記ペプチドがリン酸化されている、上記１４．に記載のペプチドを高感度測定又は定量する方法。
【００１８】
１６．ペプチドを修飾するためのラベル化試薬と、前記ラベル化試薬に特定の置換基が導入された他のラベル化試薬とを対で用い、質量分析装置によってペプチドの定量を行う方法。
【００１９】
１７．ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか一方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化されたペプチドを得て、
別途、対照ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか他方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化された対照ペプチドを得て、
前記誘導体化されたペプチドと前記誘導体化された対照ペプチドとを混合し、混合した誘導体化ペプチドを質量分析装置によって測定する、上記１６．に記載のペプチドの定量を行う方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。なお、本発明においてペプチドとは、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む意味で用いる。
本発明は、質量分析装置を用いたペプチドの高感度測定及び定量のためのラベル化試薬であり、下記一般式（Ａ）で表される窒素を含有する芳香族化合物のカルボン酸誘導体である。
【００２１】
【化１５】
2005049164.tif 000010
【００２２】
式中、Ｘは、置換基を有する３−ピリジル基、又は置換基を有してもよい前記３−ピリジル基以外の含窒素芳香族複素環基、又は置換基を有するアミノ基を有する芳香族炭化水素基を表す。また、前記含窒素芳香族複素環基としては、２−ピリジル基、４−ピリジル基、ベンズイミダゾリル基、イミダゾリル基などが挙げられる。前記芳香族炭化水素基としては、フェニル基などが挙げられる。
【００２３】
前記Ｘが２−ピリジル基であるラベル化試薬としては、下記式（１）が挙げられる。
【００２４】
【化１６】
2005049164.tif 000011
【００２５】
前記Ｘが３−ピリジル基であるラベル化試薬としては、下記式（３）〜（１０）が挙げられる。
【００２６】
【化１７】
2005049164.tif 000012
【００２７】
前記Ｘが４−ピリジル基であるラベル化試薬としては、下記式（１１）が挙げられる。
【００２８】
【化１８】
2005049164.tif 000013
【００２９】
前記Ｘがベンズイミダゾリル基であるラベル化試薬としては、下記式（１２）が挙げられる。
【００３０】
【化１９】
2005049164.tif 000014
【００３１】
前記Ｘがフェニル基であるラベル化試薬としては、下記式（１３）が挙げられる。
【００３２】
【化２０】
2005049164.tif 000015
【００３３】
前記Ｘがイミダゾリル基であるラベル化試薬としては、下記式（１４）が挙げられる。
【００３４】
【化２１】
2005049164.tif 000016
【００３５】
本発明のラベル化試薬は、塩基性の異なるピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール等のカルボン酸類から当業者が適宜選択し、選択されたカルボン酸類を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、例えば乾燥テトラヒドロフラン（ｄｒｙ  ＴＨＦ）中で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で縮合させることによりスクシンイミド化して合成することができる。上記ラベル化試薬（３）を一例に挙げ、本発明のラベル化試薬の合成例を下記化学反応式Ｂに示す。
【００３６】
【化２２】
2005049164.tif 000017
【００３７】
このとき、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドは前記カルボン酸類に対して例えば１〜２０当量用いることができる。縮合剤としては、上記ＥＤＣの他にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いることもできる。縮合剤の量としては、前記カルボン酸に対して例えば１〜１０当量用いることができる。また溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。溶媒の量としては、全試薬の濃度が１〜３０重量％になるように用いることができる。スクシンイミド化の反応条件としては、例えば０〜５０℃で、０．５時間〜１０日間の条件下で行うことができる。
【００３８】
また、上記ラベル化試薬４及び７として表される化合物、すなわち、１−［６−（Ｄ３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミド（４）及び１−｛２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミド（７）は、新規な化合物である。
【００３９】
１−［６−（Ｄ３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミド（４）は、下記化学反応式Ｃに示すように、新規化合物６−（Ｄ３）メチルニコチン酸を中間体として６−メチルニコチン酸から合成することができる。
【００４０】
【化２３】
2005049164.tif 000018
【００４１】
１−｛２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミド（７）は、下記化学反応式Ｄに示すように、新規化合物２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチン酸（１６）を中間体として２，６−ジメチルニコチン酸から合成することができる。
【００４２】
【化２４】
2005049164.tif 000019
【００４３】
上記式Ｃ及びＤの合成経路によって合成することは、出発物質に安定同位体を含まない、一般に入手が容易なものを用いる点で好ましい。
【００４４】
以下、これら新規化合物の合成法について述べる。
出発物質であるニコチン酸は、メチル基の水素が重水素化される。重水素化には、金属水酸化物の重水素置換体の重水溶液を用いることができる。金属水酸化物の重水素置換体の重水溶液としては、ＮａＯＤ−Ｄ２Ｏ、ＫＯＤ−Ｄ２Ｏ、ＬｉＯＤ−Ｄ２Ｏ等が挙げられる。上記重水溶液は、金属水酸化物の重水素置換体が０．５〜３０重量％のものを用いることができる。また上記重水溶液の量は、例えば反応溶液全体に対して上記ニコチン酸が１〜３０重量部程度含まれるように用いることができる。
【００４５】
重水素化反応は、例えば封管中で、１００〜２００℃、１〜１０時間の条件下で行うことができる。反応後は希塩酸などを用いて中和を行うとよい。このようにして、６−メチルニコチン酸からは６−（Ｄ３）メチルニコチン酸（１５）を得る。また、２，６−ジメチルニコチン酸からは２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチン酸（１６）を得る。本発明においては、これら重水素化ニコチン酸（１５）又は（１６）を特に精製しなくとも次の反応に用いることができる。
【００４６】
次に重水素化ニコチン酸（１５）又は（１６）がスクシンイミド化される。スクシンイミド化は、重水素化ニコチン酸（１５）又は（１６）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと縮合させることによって行うことができる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドは、重水素化ニコチン酸（１５）又は（１６）に対して例えば１〜２０当量用いることができる。縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等を用いることが好ましい。縮合剤は、重水素化ニコチン酸に対して例えば１〜１０当量用いることができる。また溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。溶媒の量としては、全試薬の濃度が１〜３０重量％となるように用いることができる。
【００４７】
スクシンイミド化は、例えば０〜５０℃で０．５時間〜１０日間の条件下で行うことができる。このようにして、６−（Ｄ３）メチルニコチン酸（１５）からは１−［６−（Ｄ３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミド（４）を得る。また、２，６−ジ（Ｄ３）メチルニコチン酸（１６）からは１−｛２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミド（７）を得る。得られたニコチン酸誘導体（４）又は（７）は、必要に応じカラムクロマトグラフィー、再結晶等によって精製を行うとよい。以上のようにして、ペプチドのラベル化試薬として有用な新規ニコチン酸誘導体（４）及び（７）を得ることができる。
【００４８】
また、上記ラベル化試薬６として表される化合物、すなわち、１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（６）も、新規な化合物である。この化合物は、下記化学反応式Ｅに示すように、２，６−ジメチルニコチン酸をスクシンイミド化することにより合成することができる。スクシンイミド化は、上記ニコチン酸誘導体（４）又は（７）の合成におけるスクシンイミド化と同様にして行うことができる。
【００４９】
【化２５】
2005049164.tif 000020
【００５０】
本発明のラベル化試薬は、ペプチドのＮ末端を効率よく化学修飾することにより誘導体化することができる。特にペプチドのＮ末端残基が塩基性のもの（アルギニン、ヒスチジン）、酸性のもの（アスパラギン酸）、水酸基を有するもの（トレオニン、チロシン）の場合はほぼ定量的に誘導体化することが可能である。なお、ペプチドのＮ末端以外に塩基性アミノ酸のアルギニン、リジンがある場合、リジンは修飾され、アルギニンは修飾されない。
【００５１】
ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）のＮ末端の誘導体化（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）は、下記化学反応式Ｆであらわされる。式Ｆにおいては、ラベル化試薬（Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ）の一例として１−ニコチノイルスクシンイミド類を挙げている。
【００５２】
【化２６】
2005049164.tif 000021
【００５３】
本発明のラベル化試薬は、スクシンイミド基で活性化されているために、弱塩基性下でペプチドのアミノ基と縮合反応し、ペプチドのＮ末端が誘導体化される。誘導体化は、例えば次のようにして行うことができる。ペプチド溶液と、適切なｐＨに調整されたラベル化試薬溶液とを混合し、室温で２０分程度置く。さらに上述で用いたものと同量のラベル化試薬溶液を加え、さらに２時間程度置く。さらに、適切なｐＨに調製されたヒドロキシルアミン溶液を加え、一晩程度放置する。反応停止後、脱塩を行う。
【００５４】
本発明の試薬を用いてペプチドのＮ末端を修飾すると、ペプチドが正電荷に荷電しやすくなるためにイオン化効率が良くなり、質量分析におけるペプチドのピークが高感度に検出される。すなわち、本発明の試薬を用いることによって高感度分析が可能となる。特にリン酸化ペプチドのように負電荷を有するためにイオン化効率が悪いペプチドにおいても、本発明の試薬を用いるとイオン化効率を良くすることができるため、高感度分析が可能となる。また、硫酸化ペプチドもイオン化効率が悪いが、本発明の試薬を用いると、誘導体化によって脱硫酸化されたペプチドのピークが高感度に検出される。
【００５５】
また本発明は、ペプチドを修飾するためのラベル化試薬と、前記ラベル化試薬に特定の置換基が導入された他のラベル化試薬とを対で用い、質量分析装置によってペプチドの定量を行う方法である。前記特定の置換基としては、低分子量のものが好ましく、メチル基が特に好ましい。例えば、前記ラベル化試薬として１−（ニコチノイルオキシ）スクシンイミド、及び前記他のラベル化試薬として１−（６−メチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（前記試薬３）を対にして用いることができる。また例えば、前記ラベル化試薬として前記試薬３、及び前記他のラベル化試薬として１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（前記試薬６）を対にして用いることができる。
【００５６】
具体的には、次のようにしてペプチドの定量を行うことができる。（ｉ）ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか一方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化されたペプチドを得る。（ｉｉ）別途、対照ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか他方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化された対照ペプチドを得る。（ｉｉｉ）前記誘導体化されたペプチドと前記誘導体化された対照ペプチドとを混合する。（ｉｖ）誘導体化ペプチドの混合物を質量分析装置によって測定する。得られたスペクトルにおいて、ラベル化試薬の分子量の差だけずれた対ピークを確認し、そのイオン強度比から対ピークに由来するペプチドの比率を知ることができる。
【００５７】
なお、誘導体化されるペプチド、すなわち前記ペプチドと前記対照ペプチドとの組み合わせとしては、病細胞に由来するタンパク質と正常細胞に由来するタンパク質との組み合わせ等が挙げられる。
【００５８】
本発明のペプチドの定量方法は、ペプチドに対して同程度のイオン化効率を有するラベル化試薬同士を対にして用いることができるため、安定同位体を含むラベル化試薬を用いなくともペプチドの定量が可能であり、簡便かつ安価である。
【００５９】
【実施例】
本実施例では、下記式で表されるラベル化試薬２を含む、ラベル化試薬１〜１４をそれぞれ合成した。
【００６０】
【化２７】
2005049164.tif 000022
【００６１】
［１−（ニコチノイルオキシ）スクシンイミド（試薬２）の合成］
市販のニコチン酸４ｍｍｏｌを乾燥テトラヒドロフラン８０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド４．８ｍｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）５．２ｍｍｏｌを加えて室温で２日撹拌した。反応後、溶液部分を分離し、減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルム８０ｍｌに溶解し、８０ｍｌの飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。再結晶を酢酸エチルを用いて行い、無色板状晶を得た。
【００６２】
［実施例１：１−（６−メチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（試薬３）の合成］
市販の６−メチルニコチン酸を用いた以外は上述の試薬２の合成と同様にして行った。
【００６３】
［実施例２：１−［６−（Ｄ３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミド（試薬４）の合成］
市販の６−メチルニコチン酸０．５ｍｍｏｌを１重量％ＮａＯＤ−Ｄ２Ｏ  １．０ｍｌに溶解し封管中、１８０℃で３時間反応させた。反応後、希塩酸を加えて中和し、減圧下濃縮乾固し、６−（Ｄ３）メチルニコチン酸を生成物として得た。この生成物は精製せずに次の反応に用いた。
【００６４】
得られた６−（Ｄ３）メチルニコチン酸を乾燥テトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．６ｍｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）０．６５ｍｍｏｌを加え、室温で２日撹拌して反応させた。反応後、溶液部分を分離し、減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルム１０ｍｌに溶解し、飽和食塩水１０ｍｌで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。酢酸エチルを用いて再結晶を行い、無色板状晶の１−［６−（Ｄ３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミドを収率７５％で得た。
【００６５】
（１−［６−（Ｄ３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミドの同定データ）
ｍｐ：１６５〜１６７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，  ４００ＭＨｚ）：δ  ２．９２（ｂｒ．  ｓ，  ４Ｈ，  ＣＨ２＊２），  ７．３２（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．１Ｈｚ，  ５−Ｈ），  ８．２７（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２，  ８．１Ｈｚ，  ４−Ｈ），  ９．２２（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２Ｈｚ，  ２−Ｈ）
ＭＳ：ｍ／ｚ  ２３７（Ｍ＋）
【００６６】
［実施例３：１−｛２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミド（試薬７）の合成］
２，６−ジメチルニコチン酸は、文献：Ｋａｔｏ  Ｔ．，  Ｎｏｄａ  Ｍ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．，２４，  ３０３−３０９  （１９７６）に従って合成した。得られた２，６−ジメチルニコチン酸０．５ｍｍｏｌを１重量％ＮａＯＤ−Ｄ２Ｏ  １．０ｍｌに溶解し封管中、１８０℃で８時間反応させた。反応後、希塩酸を加えて中和し、減圧下濃縮乾固し、２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチン酸を生成物として得た。この生成物は精製せずに次の反応に用いた。
【００６７】
得られた２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチン酸を乾燥テトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．６ｍｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）０．６５ｍｍｏｌを加え、室温で２日撹拌して反応させた。反応後、溶液部分を分離し、減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルム１０ｍｌに溶解し、飽和食塩水１０ｍｌで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で精製し、１−｛２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミドを収率７０％で得た。酢酸エチルを用いて再結晶を行い、無色板状晶を得た。
【００６８】
（１−｛２，６−ジ［（Ｄ３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミドの同定データ）
ｍｐ：１３５〜１３７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，  ４００ＭＨｚ）：δ  ２．９２（ｂｒ．  ｓ，  ４Ｈ，  ＣＨ２＊２），  ７．１４（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．１Ｈｚ，  ５−Ｈ），  ８．２７（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．１Ｈｚ，  ４−Ｈ）
ＭＳ：ｍ／ｚ  ２５４（Ｍ＋）
【００６９】
［実施例４：１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（試薬６）の合成］
２，６−ジメチルニコチン酸は、文献：Ｋａｔｏ  Ｔ．，  Ｎｏｄａ  Ｍ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．，２４，  ３０３−３０９  （１９７６）に従って合成した。得られた２，６−ジメチルニコチン酸４ｍｍｏｌを乾燥テトラヒドロフラン８０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド４．８ｍｍｏｌ及びＥＤＣ５．２ｍｍｏｌを加え室温で２時間撹拌した。粘凋な残渣と溶液部分とを分離した後、溶液部分を減圧濃縮した。ここにクロロホルム８０ｍＬを加え、飽和食塩水８０ｍＬで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮乾固した。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で精製し、６６％の収率で１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミドを得た。再結晶を酢酸エチルから行い、無色板状晶を得た。
【００７０】
（１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミドの同定データ）
ｍｐ：１３４−１３６℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，  ４００ＭＨｚ）：δ  ２．６１（ｓ，  ３Ｈ，  ６−ＣＨ３），  ２．８２（ｓ，  ３Ｈ，  ２−ＣＨ３），  ２．９２（ｂｒ．  ｓ，  ４Ｈ，  ＣＨ２＊２），  ７．１９（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．１Ｈｚ，  ５−Ｈ），  ８．２８（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．１Ｈｚ，  ４−Ｈ）
ＥＩＭＳ：ｍ／ｚ  ２４８（Ｍ＋）
【００７１】
その他のラベル化試薬に関しては、原料に相当するカルボン酸をそれぞれ選択して用いた以外は、実施例４と同様にしてそれぞれ合成した。
【００７２】
本実施例においては、表１に表すペプチドを用いた。表１においては、用いたペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）、アミノ酸の１文字略号で表されたペプチドの構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、及びそれぞれのモノアイソトピック（Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）質量を表す。
【００７３】
【表１】
2005049164.tif 000023
【００７４】
これらペプチドは、以下に述べる方法を用いてＮ末端を化学修飾することにより誘導体化した。
５０ｐｍｏｌ／μｌのペプチド水溶液３０μｌに合成したラベル化試薬溶液３０μｌ（１ｍｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５に溶解した溶液）を加え、２０分間放置した。次に上記のラベル化試薬溶液３０μｌを加え２時間放置した。さらにヒドロキシルアミン３０μｌ（３４．８ｍｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５に溶解した溶液）を加え一晩反応させた。反応終了後ギ酸３０μｌを加え反応を停止し、ＺｉｐＴｉｐＣ１８（ミリポア社）で脱塩を行った。
【００７５】
［実施例５：ラベル化試薬のペプチド修飾率］
モデルペプチドとしてＰ１のブラジキニン（Ｂｙａｄｙｋｉｎｉｎ；ＲＰＰＧＦＳＰＦＲ；配列番号１）を用い、合成したそれぞれのラベル化試薬を用いてＮ末端を化学修飾し、ペプチドの誘導体化を行った。用いた試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）、誘導体化されたペプチドのモノアイソトピック（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）質量、及び修飾率（％）を表２に示す。
【００７６】
【表２】
2005049164.tif 000024
【００７７】
ラベル化試薬３を用いた場合の、Ｐ１ブラジキニン（Ｂｙａｄｙｋｉｎｉｎ）の誘導体化前後のＭＡＬＤＩの分析結果を図１に示す。図１においては、横軸に質量数（Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（％、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を表す（以下、全てのスペクトルチャートにおいて同じ）。なお、図１のスペクトルの測定においては、内部標準試料（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃａｒｉｂｒａｔｉｏｎ）にＡＣＴＨ（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  Ｈｏｒｍｏｎ  Ｈｕｍａｎ，  １−２４、モノアイソトピック質量２４６５．２０）を用いた。図１上のスペクトルは、Ｂｙａｄｙｋｉｎｉｎが試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ３）を受ける前のものであり、質量数１１６０．１８（ｍ／ｚ）のピークとして検出された。図１下のスペクトルは、ブラジキニンが誘導体化を受けた後のものであり、質量数１１７９．２４（ｍ／ｚ）のピークとして検出されていることから、誘導体化が行われたことが確認された。
【００７８】
［実施例６：リン酸化ペプチドの誘導体化］
分子中に２個のアミノ基（Ｎ末端アミノ基とリジン残基の側鎖アミノ基）を有する合成ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）Ｐ９（ＴＮＡＳＹＳＰＲＡＫ；配列番号３）を用い、試薬３を用いて誘導体化を行った。Ｐ９の誘導体化前後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図２に示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定においては、内部標準試料にＡＣＴＨを用いた。
【００７９】
図２においては、誘導体化前（上図）と後（下図）とにおけるＰ９のピークのイオン強度、及び内部標準試料ＡＣＴＨのピークのイオン強度を比較することができる。試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ３）を受ける前の上図のスペクトルにおいては、質量数１０９４．１６（ｍ／ｚ）のＰ９の分子イオンピークが検出された。誘導体化を受けた後の下図のスペクトルにおいては、誘導体化によって、Ｐ９の２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されたもの（ｍｏｎｏ）が質量数１２１３．２４（ｍ／ｚ）のピーク、及び２個のアミノ基が両方とも誘導体化されたもの（ｄｉ）が質量数１３３２．３１（ｍ／ｚ）のピークとして検出された。これらのイオン強度は、ＡＣＴＨのイオン強度と比較すると、誘導体化する前に比べて強くなっている。すなわち、本発明の試薬で誘導体化することによって高感度で検出できたことが示された。
【００８０】
別途、リン酸化合成ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）Ｐ１０（ＴＮＡＳ（ＨＰＯ３）ＹＳＰＲＡＫ；配列番号４）を用い、Ｐ９と同様にして試薬３によって誘導体化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。ここで、Ｐ１０は、Ｎ末端から４番目のセリン残基がリン酸化されており、リン酸化されたセリン残基をＳ（ＨＰＯ３）と表している。誘導体化前後におけるＰ１０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図３に示す。
【００８１】
試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ３）を受ける前のスペクトル（上図）においては、Ｐ１０の分子イオンピークはＡＣＴＨのピークと比べるととても低い。誘導体化を受けた後のスペクトル（下図）のＰ１０においては、上記Ｐ９の場合と同様に２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されたもの（ｍｏｎｏ）のピークと、２個のアミノ基が両方とも誘導体化されたもの（ｄｉ）のピークとが検出されたが、これらのイオン強度も、誘導体化される前に比べて強くなっている。すなわち、リン酸化ペプチドも、本発明の試薬で誘導体化することによって高感度で検出できたことが示された。
【００８２】
［実施例７：サブスタンスＰの誘導体化］
ペプチドとしてＰ２のサブスタンスＰ（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ；ＲＰＫＰＥＥＦＦＧＬＭ−ＮＨ２；配列番号２）を用い、試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ３）を行い、内部標準試料にＡＣＴＨを用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの測定を行った。ここで、Ｐ２は、Ｃ末端残基であるメチオニン残基がアミド化されており、アミド化されたメチオニン残基をＭ−ＮＨ２と表している。誘導体化前後におけるＰ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図４に示す。誘導体化された後（下図）のＰ２においては、２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されたもの（ｍｏｎｏ）のピークと、２個のアミノ基が両方とも誘導体化されたもの（ｄｉ）のピークとが検出された。
【００８３】
［実施例８：ＰＳＤスペクトル］
ペプチドＰ９（ＴＮＡＳＹＳＰＲＡＫ；配列番号３）と、試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ３）を受けたペプチドＰ９（６−Ｍｅ−Ｎｉｃ−ＴＮＡＳＹＳＰＲＡＫ；配列番号５）とを、ＰＳＤモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを測定した。ここで、６−Ｍｅ−Ｎｉｃ−Ｔは、誘導体化によって６−メチルニコチノイル基が導入されたトレオニンを表す。誘導体化されていないペプチドＰ９のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図５上に、誘導体化されたペプチドＰ９のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図５下に示す。それぞれのスペクトルには、フラグメントイオンピークの位置が示されている。これらのスペクトルから、誘導体化により、ＰＳＤモードで得られたスペクトルにおいてはイオン強度が上昇すると共に、ピーク数も増加することが示された。
【００８４】
［実施例９：誘導体化によるリン酸化ペプチドの高感度測定］
ペプチドＰ１０に対し、試薬２及び試薬３を用いて誘導体化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで質量分析を行った。この際、１０ｐｍｏｌ／μｌのペプチドを、内部標準試料として１ｐｍｏｌ／μｌのＡＣＴＨ（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  Ｈｏｒｍｏｎ  Ｈｕｍａｎ，  １−２４、分子量２４６４．２、ペプチド研究所社製）及びマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて測定した。
【００８５】
図６に、誘導体化前（ａ）と後（（ｂ）及び（ｃ））とのＰ１０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの分析結果を示す。誘導化前のＰ１０のスペクトル（ａ）においては、Ｐ１０（質量数１１７４．７５（ｍ／ｚ））がＡＣＴＨ（質量数２４６６．７２（ｍ／ｚ））とともに検出されている。試薬２を用いて誘導体化した後のＰ１０のスペクトル（ｂ）においては、Ｐ１０の２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されて質量数が１０６増えたもの（質量数１２８０．０１（ｍ／ｚ））と、２個のアミノ基の両方が誘導体化されて質量数が（１０６×２）増えたもの（質量数１３８６．０９（ｍ／ｚ））とが検出された。試薬３を用いて誘導体化した後のＰ１０のスペクトル（ｃ）においては、Ｐ１０の２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されて質量数が１２０増えたもの（質量数１２９４．０７（ｍ／ｚ））と、２個のアミノ基の両方が誘導体化されて質量数が（１２０×２）増えたもの（質量数１４１４．０７（ｍ／ｚ））とが検出された。
【００８６】
図６の（ａ）によると、誘導体化前のＰ１０の分子イオンピークは、ＡＣＴＨのピークと比べるととても低い。しかし、試薬２を用いて誘導体化した後のＰ１０のスペクトル（ｂ）、及び試薬３を用いて誘導体化した後のＰ１０のスペクトル（ｃ）によると、１０〜２０倍イオン強度が上昇している。すなわち、誘導体化によってイオン化効率が上がり、高感度で検出できたことが示された。
【００８７】
また、濃度の異なる同一ペプチドを、分子量の異なる試薬で別々に修飾し、混合後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを測定すると、試薬の分子量の差だけずれた２つのピークを確認することができた。本発明においては、そのピーク強度比とペプチドの相対量との誤差は１５〜３０％であった。本発明の試薬を用いることにより、１５〜３０％以上の発現量の差があるペプチドの変動解析へ利用できる可能性が示された。
【００８８】
［実施例１０：誘導体化による定量分析］
１、２、３、４及び５ｐｍｏｌ／μｌの５種類のＰ１に対してそれぞれ試薬２を用いて誘導体化した。一方、５ｐｍｏｌ／μｌ  のＰ１に対して試薬３を用いて誘導体化した。試薬２による誘導体化を行ったＰ１溶液の各々に対し、試薬３による誘導体化を行ったＰ１の溶液を等量混合し、５種類の混合溶液を調製した。それぞれの混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで分析した結果を図７に示す。図７中、（ａ）はＰ１（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、（ｂ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の１ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物、（ｃ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の２ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物、（ｄ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の３ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物、（ｅ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の４ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物、（ｆ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物のＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルである。
【００８９】
図７の（ｂ）〜（ｆ）のいずれのスペクトルにおいても、誘導体化ペプチドの濃度比に比例したイオン強度が得られた。このことによって、濃度の異なる試料をそれぞれラベル化試薬２及び３で誘導体化し、その後誘導体化されたそれぞれの試料を一定量混合し、ＭＡＬＤＩで分析することによって定量が行えることが示された。
【００９０】
【発明の効果】
本発明によると、質量分析装置を用いるペプチドの定性及び定量解析を高感度に行うことができる試薬、及び質量分析装置を用いるペプチドの定性及び定量解析を高感度に行う方法を提供することができる。特に本発明によると、通常質量分析においてイオン化効率が悪いリン酸化ペプチドの定性及び定量解析を高感度に行うことができる試薬、及び質量分析装置を用いるリン酸化ペプチドの定性及び定量解析を高感度に行う方法を提供することができる。
【００９１】
【配列表】
2005049164.tif 000025
2005049164.tif 000026
2005049164.tif 000027
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【図面の簡単な説明】
【図１】ブラジキニンと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化されたブラジキニンとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図２】合成ペプチドと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化された合成ペプチドとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図３】リン酸化合成ペプチドと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化されたリン酸化合成ペプチドとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図４】サブスタンスＰと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化されたサブスタンスＰとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図５】合成ペプチドと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化された合成ペプチドとの、ＰＳＤモードで測定したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図６】リン酸化合成ペプチドと、本発明のラベル化試薬２種によって誘導体化されたリン酸化合成ペプチドとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図７】本発明のラベル化試薬を用いた誘導体化によるブラジキニンの量的変動解析の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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