(57)【要約】【課題】ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法および該ポリペプチドを利用したヒアルロン酸オリゴマーの製造方法を提供すること。【解決手段】ヒアルロン酸合成酵素におけるアミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄ（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）で示されるモチーフの少なくとも一部と、ＱＸＸＲＷで表されるモチーフと、それらに挟まれた領域を含み、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸合成酵素におけるアミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄ（以下、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）で示されるモチーフの少なくとも一部と、ＱＸＸＲＷで表されるモチーフと、それらに挟まれる領域を含み、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ヒアルロン酸合成酵素が動物由来のヒアルロン酸合成酵素である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ヒアルロン酸合成酵素がヒアルロン酸合成酵素−２である請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ヒアルロン酸合成酵素−２がヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２である請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸が、置換、挿入、削除、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドと異種蛋白質との融合蛋白質。
【請求項８】
異種蛋白質が糖結合蛋白質である請求項７に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
糖結合蛋白質がマルトース結合蛋白質である請求項8に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
請求項１〜6のいずれかに記載のポリペプチドあるいは請求項7〜9のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするDNA。
【請求項１１】
配列番号１で表される塩基配列からなる、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１0又は１１に記載のDNAを発現可能に含んでなる発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換体を培養し、該培養物からヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド又は融合蛋白質を採取することを特徴とするポリペプチド又は融合蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸共存下、請求項１〜6のいずれかに記載のポリペプチドあるいは請求項7〜9のいずれかに記載の融合蛋白質を作用させることを特徴とするヒアルロン酸オリゴマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドを発現するためのベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、並びに該ポリペプチドを製造する方法及び該ポリペプチドを利用したヒアルロン酸オリゴマーの製造方法に主に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（以下、「HA」ともいう）は、高分子量のグルコサミノグリカンであり、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位（GlcAβ1-3GlcNAc：GlcAはグルクロン酸を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミンを表す）のβ１，４結合による繰り返しからなる直鎖状の多糖である。HAは、脊椎動物において、硝子体、皮膚、靭帯など様々な組織の細胞外マトリックス成分として幅広く存在することが知られている。HAは、他の細胞外マトリックス成分とともに３次元構造の形成に働き、組織の水分保持や柔軟性の維持のような構造物として機能するばかりでなく、HA結合蛋白質とともに細胞表面受容体との相互作用により、細胞の接着、遊走、分化などの細胞の挙動を調節するとともに、形態形成、創傷治癒、癌の浸潤、転移などの現象にも関与している。
【０００３】
ヒアルロン酸の生合成に関しては、原核生物であるストレプトコッカス属菌を用いた研究が広く行われており、Streptococcus pyogenesからはじめてヒアルロン酸合成酵素遺伝子が単離された(非特許文献１)。その後、真核生物である哺乳動物からもヒアルロン酸合成酵素（以下、「HAS」ともいう）遺伝子が単離された。最初、HAS1(非特許文献２、非特許文献３、特許文献１、特許文献２、特許文献３)が単離され、その後HAS2(非特許文献４、非特許文献５、特許文献４)、HAS3(非特許文献６、特許文献５)が次々に単離された。これらは相同性が高く、ファミリーを形成していると考えられている。また、これら以外にもStreptococcus equisimilis(非特許文献７、特許文献６)やPasteurella multocida(非特許文献８、特許文献７)などからもHAS遺伝子がクローニングされた。さらに、既知の遺伝子の中にも上記HASと相同性の高いものが存在し、アフリカツメガエルのDG42(非特許文献９)あるいはクロレラ様の緑藻に感染するPBCV-1ウィルスのA98R(非特許文献１０)にHAS活性があることが報告されている。
【０００４】
これまでにクローニングされたHASは、そのアミノ酸配列と生化学的解析から、少なくとも２種の異なったHASのクラスに分類することができると推定されている(非特許文献１１)。それによると、クラス２に含まれるHASはPasteurella multocida由来のものだけであり、それ以外はクラス１に分類されている。クラス１に属するHASは細胞質膜に存在し、そのトポロジカルな特徴として、Ｎ末端側、Ｃ末端側の双方に複数の膜貫通領域を有しており、中間の部分は細胞質側にループ状で存在するとされている。また、細胞質側のループ状の部分にヒアルロン酸合成に必要なＮ−アセチルグルコサミン転移酵素およびグルクロン酸転移酵素活性を有する領域が存在していることがマウス由来のHAS1を例に報告されている(非特許文献１２)。また、特許文献８ではマウス由来HAS1、2、3のＮ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域をそれぞれ適当に組み合わせることにより、HAS活性が変化したキメラ蛋白質を作製できることを開示している。
【０００５】
クラス１に属するヒアルロン酸合成酵素のポリペプチド鎖中には７つの共通するモチーフが存在するといわれている(非特許文献１３)。DG42を例にそのモチーフを示すと、139-147番目のＶ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄ（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）、219-223番目の(Ｇ／Ｋ／Ｒ)ＧＫＲ(Ｅ／Ｈ)、245-250番目のＤＳＤＴＸ(Ｌ／Ｉ)、292-305番目のＲＹＸＸＡＦＸ(Ｉ／Ｖ)ＥＲ(Ａ／Ｓ)(Ｃ／Ａ)ＱＳ、312-321番目の(Ｃ／Ｖ)(Ｉ／Ｖ／Ｃ)(Ｓ／Ｇ)ＧＰＬ(Ｇ／Ｓ)ＸＹ(Ｒ／Ｋ)、345-352番目のＧＤＤＲＸＬＴＮ、383-394番目のＱＱ(Ｔ／Ｎ)ＲＷ(Ｎ／Ｔ／Ｓ)ＫＳ(Ｆ／Ｙ／Ｗ)(Ｆ／Ｃ)ＲＥである。
【０００６】
また、ヒアルロン酸合成酵素を含むβ−多糖合成酵素類には６つの共通するモチーフが存在し、触媒活性に関与すると言われている(非特許文献１４)。DG42を例にこれらを示すと、135-143番目のＫＸＸＸＸＸＸＤＧ、220-222番目のＧＫＲ、244-248番目のＸＤＸＤＴ、315-321番目のＧＸＸＸＸ(Ｙ／Ｆ)Ｒ、345-351番目のＧ(Ｄ／Ｅ)ＤＸＸＬ(Ｓ／Ｔ)、383-387番目のＱＸＸＲＷであり、上述の７つのモチーフとほぼ一致している。
しかしながら、ヒアルロン酸合成酵素活性発現に必要な最小限の領域はまだ明らかにされておらず、もし明らかになれば、ヒアルロン酸の生合成機構の解明に大いに役立つ。
【０００７】
さらに、動物由来のHASとしてはDG42が酵母で発現されている以外はCOS-1細胞などの動物細胞による発現しか行われておらず、大量生産に有利な大腸菌などの微生物、特に原核生物を用いた発現はこれまでのところ報告されていない。
【特許文献１】特開平９−２２４６７４号公報
【特許文献２】国際公開９７／３８１１３号パンフレット
【特許文献３】国際公開９７／４０１７４号パンフレット
【特許文献４】国際公開９８／００５５１号パンフレット
【特許文献５】国際公開９８／００５５１号パンフレット
【特許文献６】国際公開９９／２３２２７号パンフレット
【特許文献７】国際公開９９／５１２６５号パンフレット
【特許文献８】特開２０００−４８８６号公報
【非特許文献１】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 268, 19181 (1993)
【非特許文献２】Itano, N. et al., J. Biol. Chem., 271, 9875 (1996)
【非特許文献３】Itano, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 222, 816 (1996)
【非特許文献４】Watanabe, K.et al., J. Biol. Chem., 271, 22945 (1996)
【非特許文献５】Spicer, A. P. et al., J. Biol. Chem., 271, 23400 (1996)
【非特許文献６】Spicer, A. P. et al., J. Biol. Chem., 272, 8957 (1997)
【非特許文献７】Kumari, K. et al., J. Biol. Chem., 272, 32539 (1997)
【非特許文献８】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 273, 8454 (1998)
【非特許文献９】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 271, 23657 (1996)
【非特許文献１０】DeAngelis, P. L. et al., Science, 278, 1800 (1997)
【非特許文献１１】DeAngelis, P. L. et al., Cell. Molec. Life Sci., 56, 670 (1999)
【非特許文献１２】Yoshida, M. et al., J. Biol. Chem., 275, 497 (2000)
【非特許文献１３】Cell. Mol. Life Sci., 56, 670 (1999)
【非特許文献１４】Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 11, 187 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒアルロン酸合成酵素におけるヒアルロン酸オリゴマー合成に必要な領域を解明するとともに、上記領域を有するポリペプチドを大量に且つ安価に製造する方法を提供すること、また、該ポリペプチドを用いたヒアルロン酸オリゴマーの製造方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として、ヒアルロン酸合成に関与していると考えられている７つあるいは６つのモチーフを含む種々の長さのポリペプチドを調製し、検討を重ねた結果、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有する領域を見出し、更に検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下のポリペプチド、融合蛋白質、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、並びにポリペプチド又は融合蛋白質を製造する方法及びヒアルロン酸オリゴマーの製造方法に係る。
【００１１】
項１：ヒアルロン酸合成酵素におけるアミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄ（以下、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）で示されるモチーフの少なくとも一部と、ＱＸＸＲＷで表されるモチーフと、それらに挟まれる領域を含み、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド。
【００１２】
好ましくは、ヒアルロン酸合成酵素におけるアミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄ（以下、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）で示されるモチーフの少なくとも一部と、ＱＸＸＲＷで表されるモチーフと、それらに挟まれる領域からなり、かつヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドである。
【００１３】
項２：ヒアルロン酸合成酵素が動物由来のヒアルロン酸合成酵素である項１に記載のポリペプチド。
【００１４】
項３：ヒアルロン酸合成酵素がヒアルロン酸合成酵素−２である項２記載のポリペプチド。
【００１５】
項４：ヒアルロン酸合成酵素−２がヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２である項３記載のポリペプチド。
【００１６】
項５：配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド。
【００１７】
項６：配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸が、置換、挿入、削除、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド。
【００１８】
項７：項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドと異種蛋白質との融合蛋白質。
【００１９】
項８：異種蛋白質が糖結合蛋白質である項７に記載の融合蛋白質。
【００２０】
項9：糖結合蛋白質がマルトース結合蛋白質である項8に記載の融合蛋白質。
【００２１】
項１0：項１〜6のいずれかに記載のポリペプチドあるいは項7〜9のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするDNA。
【００２２】
項１１：配列番号１で表される塩基配列からなる、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００２３】
項１２：項１0又は１１に記載のDNAを発現可能に含んでなる発現ベクター。
【００２４】
項１３：項１２に記載の発現ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【００２５】
項１４：項１３に記載の形質転換体を培養し、該培養物からヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド又は融合蛋白質を採取することを特徴とするポリペプチド又は融合蛋白質の製造方法。
【００２６】
項１５：ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸共存下、項１〜6のいずれかに記載のポリペプチドあるいは項7〜9のいずれかに記載の融合蛋白質を作用させることを特徴とするヒアルロン酸オリゴマーの製造方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によりヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドが提供される。該ポリペプチドは、ヒアルロン酸オリゴマー形成工程に関与するものであり、ヒアルロン酸合成機構の解明に有用である。
【００２８】
また、本発明により前記ポリペプチドの発現ベクターおよび該発現ベクターにより形質転換された形質転換体が提供される。これらを利用することにより、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチド又は融合蛋白質を安価に大量に得ることができる。
【００２９】
また、該ポリペプチド又は融合蛋白質を利用してヒアルロン酸オリゴマーを効率よく容易に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明を更に具体的に説明する。
ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ヒアルロン酸合成酵素において、アミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄ（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）で示されるモチーフの少なくとも一部と、ＱＸＸＲＷ（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）で表されるモチーフと、それらに挟まれた領域を含み、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドである。
【００３１】
好ましくは、ヒアルロン酸合成酵素において、アミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄ（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）で示されるモチーフの少なくとも一部と、ＱＸＸＲＷ（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）で表されるモチーフと、それらに挟まれた領域からなり、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドである。
【００３２】
本発明において、ヒアルロン酸合成酵素とは、ヒアルロン酸合成活性を有し、Ｎ末端側およびＣ末端側にそれぞれ複数の膜貫通領域を有し、その中間に細胞質内ループを形成する領域を有するものであれば、特に限定されないが、動物由来のものが好ましい。動物由来の酵素としては、例えば、キセノポス  ラエビス（Xenopus laevis）由来ヒアルロン酸合成酵素DG42が挙げられる。また、マウス由来ヒアルロン酸合成酵素１、２又は３、又は、ヒト由来ヒアルロン酸合成酵素１、２又は３などの哺乳動物由来の酵素が挙げられる。
【００３３】
動物由来のヒアルロン酸合成酵素には１、２、３の３種類があるが、ヒアルロン酸合成酵素−２が特に好ましい。さらに、ヒト由来のヒアルロン酸合成酵素−２が好ましい。
【００３４】
ヒアルロン酸オリゴマー合成活性とは、ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、UDP-GlcNAcと略することがある）およびウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸 （以下、UDP-GlcAと略することがある）を糖供与体として、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位（GlcAβ1-3GlcNAc：GlcAはグルクロン酸を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミンを表す）のβ１，４結合による繰り返し構造を有するオリゴ糖を合成する能力をいう。
【００３５】
本発明におけるポリペプチド、即ち、ヒアルロン酸合成酵素において、アミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄ（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）で示されるモチーフの少なくとも一部と、ＱＸＸＲＷ（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）で表されるモチーフと、それらに挟まれた領域を含み、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドとしては、具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号４を有するヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２においてアミノ酸番号１２２〜３５５で示される領域に相当する。
【００３７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸が、置換、挿入、削除、又は付加されていても、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドであれば、本発明のポリペプチドに含まれる。
ここで、少なくとも１つのアミノ酸が置換、挿入、削除又は付加とは、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を失わない程度の変異が導入されることを意味する。このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。変異するアミノ酸の数は、上記活性又は作用を失わない限り、その個数は制限されないが、通常１又は数個である。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドに本来のヒアルロン酸合成酵素でさらにＮ末端側および／またはＣ末端側に存在する部分、例えば膜貫通領域などが付加されていても構わない。
【００３９】
融合蛋白質
本発明の融合蛋白質は、上記ポリペプチドと異種蛋白質との融合蛋白質である。一般に、遺伝子組換え手法を利用して、ポリペプチドを生産するときには、その発現に適した発現ベクターを利用するが、利用する発現ベクターによっては、意図したポリペプチドは発現ベクターに応じて異種蛋白質との融合蛋白質の形で発現されることがしばしばある。これは、発現したポリペプチドがインクルージョンボディになるのを防いだり、発現したポリペプチドの検出や精製を容易にするためである。該異種蛋白質は、上記ポリペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側いずれに適当なペプチドあるいは蛋白質が連結されていても構わないが、好ましくはＮ末端側に連結されたものである。さらに好ましくは異種蛋白質と上記ポリペプチドとの融合部位に酵素学的または化学的手段により容易に切断できる構造を有するものである。
【００４０】
異種蛋白質はペプチドであってもよい。異種蛋白質としては、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Glutathion-S-transferase）、グリーン蛍光蛋白質（Green Fluorescent Protein）、チオレドキシン（Thioredoxin）、糖結合蛋白質、また次のアミノ酸配列で表されるペプチド
His-His-His-His-His-His(アミノ酸一文字表記でHHHHHH)、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)、Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(EQKLISEEDL)、Met-Lys-Ala-Glu-Phe-Arg-Arg-Gln-Glu-Ser-Asp-Arg(MKAEFRRQESDR)、Met-Arg-Asp-Ala-Leu-Asp-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Ala(MRDALDRLDRLA)、Met-Lys-Asp-Gly-Glu-Glu-Tyr-Ser-Arg-Ala-Phe-Arg(MKDGEEYSRAFR)、Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala(YPYDVPDYA)、Cys-Thr-Pro-Thr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Leu(CTPTDVPDYASL)、Glu-Glu-Glu-Glu-Tyr-Met-Pro-Met-Glu(EEEEYMPME)、Thr-Asp-Phe-Tyr-Leu-Lys(TDFYLK)、Pro-Pro-Glu-Pro-Glu-Thr(PPEPET)、Met-Ala-Ser-Met-Tyr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly(MASMTGGQQMG)、Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr(GKPIPNPLLGLDST)、Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys(YTDIEMNRLGK)などが挙げられる。
【００４１】
中でも糖結合蛋白質が好ましい。
【００４２】
糖結合蛋白質とは、単糖類並びに糖残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持する蛋白質であって、例えば、各種レクチン、マルトース結合蛋白質、セルロース結合蛋白質、キチン結合蛋白質などが挙げられる。この中、マルトース結合蛋白質、セルロース結合蛋白質、キチン結合蛋白質等が好ましく、マルトース結合蛋白質（以下MBPと省略することがある。）がより好ましい。
【００４３】
糖結合蛋白質は、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。また、該MBPは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する限り、必ずしも全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。
【００４４】
ポリペプチド又は融合蛋白質の製造方法
本発明において、上記ポリペプチドあるいは融合蛋白質は、上記ポリペプチドあるいは融合蛋白質をコードするＤＮＡが上記性質を有する形で転写・翻訳されるように挿入された発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を適当な培地中で培養し、得られた培養物より採取することにより、得ることができる。
【００４５】
宿主細胞としては、大腸菌、酵母、細菌などの微生物細胞、昆虫細胞、COS-1細胞、CHO細胞などの動物細胞やアラビドプシス細胞などの植物細胞などが挙げられる。ポリペプチドの場合には、宿主細胞として動物細胞を用いることが好ましい。また、上記融合蛋白質の場合には、宿主細胞として大腸菌などの微生物細胞を用いることが好ましい。
【００４６】
ベクターは、形質転換する宿主に応じて、種々のものが利用できる。例えば、大腸菌では、pMAL-p2、pUC19などが挙げられる。酵母では、pYEUra3TMなどが挙げられる。昆虫細胞では、pBLUE Bac4などが挙げられる。COS-1細胞ではpSVK3、pFLAG-CMV-2、pcDNA3.1、pRc/CMV2などが挙げられる。アラビドプシス細胞ではpBIなどが挙げられる。
【００４７】
上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知のヒアルロン酸合成酵素遺伝子配列（例えば、ヒトHAS2の場合Watanabe, K.et al., J. Biol. Chem., 271, 22945 (1996)） に基づいて、公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のヒアルロン酸合成酵素をコードする領域の全部または一部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、ヒアルロン酸合成能を有する細胞あるいは組織より得られたｃＤＮＡライブラリーを鋳型にＰＣＲを行うことによりクローニングできる。このとき、その後のベクターヘのクローニングを容易にするために、用いるオリゴプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加することもできる。
【００４８】
あるいは、公知のヒアルロン酸合成酵素遺伝子配列をもとに適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてヒアルロン酸合成酵素を発現する細胞または組織から常法により調製したcＤＮＡライブラリーをプラーク（またはコロニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００４９】
さらに、ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡは、部分または完全精製されたヒアルロン酸合成酵素の全部または一部を抗原として常法により抗体を作製し、これを用いてヒアルロン酸合成酵素を発現する細胞または組織から常法により調製したcＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００５０】
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のヒアルロン酸合成酵素遺伝子配列をもとにＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲ法によってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
【００５１】
本発明のポリペプチドをコードするDNAとしては、具体的には、配列番号１で示される塩基配列からなり、且つ、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。配列番号１で示される塩基配列からなるDNAは、配列番号２で示されるポリペプチドをコードするDNAである。
【００５２】
本発明において、融合蛋白質を形成する適当な異種蛋白質をコードするＤＮＡとしては、上述のポリペプチドあるいは蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられ、好ましくは上述の各種糖結合蛋白質をコードするＤＮＡが例示される。
【００５３】
各種糖結合蛋白質をコードするＤＮＡとしては、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、セルロース結合蛋白質またはキチン結合蛋白質をコードするＤＮＡが例示される。好ましくは、マルトース結合蛋白質をコードするＤＮＡである。また、該ＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
【００５４】
また、該MBPをコードするＤＮＡは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。同様に、糖結合蛋白質は、結合する糖に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。例えば、MBPをコードするＤＮＡとしてpMAL−p2あるいはpMAL−c2（共にNew England Biolabs社製）に由来するものを使用することができる。
【００５５】
例えば、公知のヒト由来ヒアルロン酸合成酵素２遺伝子の配列をもとに、該酵素をコードする領域全てをカバーでき、かつその末端に制限酵素認識配列を有する配列番号５および６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ヒト小腸由来大腸菌組換え型cDNAライブラリーより抽出したプラスミドを鋳型にＰＣＲを行うことにより、ヒト由来ヒアルロン酸合成酵素−２をコードするｃＤＮＡを得る。次いで、配列番号７および８に示されるオリゴヌクレオチドを合成し、該ｃＤＮＡをサブクローニングしたプラスミドを鋳型にＰＣＲを行い、目的とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得る。このｃＤＮＡをpMAL−p2に挿入することにより、目的とする融合蛋白質の発現ベクターを得ることができる。
【００５６】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、遺伝子工学分野で通常用いられる方法により行うことができる。例えば、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、コンピテント法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００５７】
本発明のポリペプチドあるいは融合蛋白質は、上記発現ベクターを宿主細胞に導入して得られた形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物より採取することにより、得ることができる。
【００５８】
例えば、上述のpMAL-p2から得られた発現ベクターで形質転換した大腸菌JM109株の場合、用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものが好適である。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，カゼインの加水分解物，酵母抽出物，ポリペプトン，パクトトリプトン，ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源［例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム，リン酸水素二カリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンB1）、抗生物質（例えば、アンピシリン，カナマイシン）など］を培地中に添加してもよい。
【００５９】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
【００６０】
また、融合蛋白質の発現が誘導蛋白質遺伝子のプロモーター系によって制御されるので、誘導物質を添加する必要がある。添加時期は培養開始時でもよいが、対数増殖期初期が好ましい。誘導物質の添加濃度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類などによって適宜変更することができる。
【００６１】
本発明の融合蛋白質は、得られた菌体をリゾチーム処理、超音波破砕などの方法により破砕し、遠心分離することにより無細胞抽出液を得、さらに無細胞抽出液を超遠心分離することにより、膜画分として得ることができる。
【００６２】
また、得られた膜画分より、ジキトキニンやＣＨＡＰＳ(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid)などの界面活性剤を用いて、可溶化し、通常の精製方法により精製して得ることもできる。精製方法としては、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどによる塩析、遠心分離、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などが挙げられる。またこれらを適当に組み合わせて精製することもできる。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性に必要な最小限の領域からなるものであって、全長のヒアルロン酸合成酵素と比べて、ポリペプチドのサイズが小さく、特に疎水性の高い領域が減少している。これにより、ポリペプチドの製造におけるインクルージョンボディ（生理活性のない不溶性タンパク質）の形成が抑えられ、再生用緩衝液での希釈工程や、活性を有する立体構造に再び戻すリフォールディング工程における生産効率の低下が抑制される。また、プラスミドへの挿入サイズが小さくなるので、全体としての発現プラスミドのサイズが小さくなり、細胞内での安定性が高まって、発現効率も向上する。従って、本発明の技術を適用することにより、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性を有するポリペプチドが、効率よく、大量に取得できる。
【００６４】
ヒアルロン酸オリゴマーの製造方法
本発明において、ヒアルロン酸オリゴマーは上述の方法により製造された本発明のポリペプチドあるいは融合蛋白質を適当な緩衝液中、１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜１２０時間、好ましくは５〜７２時間、UDP-GlcNAcおよびUDP-GlcAと接触させることにより製造することができる。緩衝液としては中性付近、好ましくはｐＨが６〜９、さらに好ましくはｐＨが７〜８に調整し得るものであれば特に制限はないが、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などが挙げられる。また、反応液中にマグネシウムイオン、マンガンイオンなどの２価金属イオンを入れることできる。また還元的な雰囲気に保つためにジチオスレイトールや２−メルカプトエタノールなどのチオール化合物を加えても構わない。さらに、反応液中にGlcNAc、GlcAあるいはヒアルロン酸オリゴマーを受容体として加えても構わない。合成されたヒアルロン酸オリゴマーは一般的な分離精製方法、例えば、透析、ゲルろ過クロマトグラフィーを含む各種カラムクロマトグラフィーなどにより単離することができる。
【実施例】
【００６５】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００６６】
実施例１：ヒト由来HAS2をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト小腸由来大腸菌組換え型cDNAライブラリー(宝酒造社製)を約5000個ずつ96穴マイクロプレートに培養し、各ウェルのプラスミドをアルカリSDS法により抽出した。既に報告されている配列番号３記載のヒトヒアルロン酸合成酵素２(human HAS2：Watanabe, K.et al., J. Biol. Chem., 271, 22945 (1996))ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号５及び６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。配列番号５に示す塩基配列は配列番号３に示される塩基配列中１〜２８で示される塩基配列の５’末端にBamHI認識部位が付加された配列を含み、配列番号６に示す塩基配列は配列番号３に示される塩基配列中１６４５〜１６５６で示される塩基配列の３’末端にHindIII認識部位が付加された配列に相補的な配列を含む。これらオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、上記プラスミドを鋳型に、Extaq DNA polymerase(宝酒造社製)を用いてPCR反応を行い、目的とするサイズのPCR産物を有するウェルを選取した。更に同様の操作により大腸菌のシブリングセレクションを3回行い、最終的に50クローンより成るプラスミドに絞りこんだ。該プラスミドを鋳型に、配列番号５および６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、Extaq DNA polymeraseを用いて、30サイクルのPCR反応を行い、PCR産物を得た。PCR産物であるＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法により決定したところ、配列番号３で示される配列を含んでいることが確認された。PCR産物を制限酵素BamHI及びHindIIIで切断し、切断断片をアガロース電気泳動により精製した。
【００６７】
一方、プラスミドpMAL-p2x(New England Biolabs社製)も制限酵素BamHI及びHindIIIで切断し、切断断片をアガロース電気泳動により精製した。これら断片をライゲーションさせ、プラスミドphHAS2ORFMALp2xを得た。
【００６８】
実施例２：human HAS2においてアミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄで示されるモチーフの一部と、ＱＸＸＲＷで表されるモチーフと、それらで挟まれた領域をコードするＤＮＡの取得
配列番号７に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列中１〜１８（配列番号３に示される塩基配列中３６４〜３８１に相当する）で示される塩基配列の５’末端にBamHI認識部位が付加された配列を含み、後者は配列番号１に示される塩基配列中１０３２〜１０４４（配列番号３に示される塩基配列中１０５０〜１０６５に相当）で示される塩基配列の３’末端にHindIII認識部位が付加された配列に相補的な配列を含むように調整した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、実施例１で得たプラスミドphHAS2ORFMALp2xを鋳型にPCR反応を行った。得られたPCR産物であるＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法により決定したところ、配列番号１で示される塩基配列中１〜７０２（配列番号３で示される塩基配列中３６４〜１０６５に相当）で示される塩基配列を含んでいることが確認された。
【００６９】
比較例：human HAS2においてアミノ酸配列Ｖ(Ｄ／Ｉ)ＤＧＸＸ(Ｎ／Ｅ／Ｄ)(Ｔ／Ｄ)Ｄで示されるモチーフの一部を含む領域をコードするが、アミノ酸配列ＱＸＸＲＷで表される領域をコードしていないDNAの取得
配列番号７に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。後者は配列番号１に示される塩基配列中６５８〜６７８（配列番号３に示される塩基配列中１０２１〜１０４１に相当）で示される塩基配列の３’末端にHindIII認識部位が付加された配列に相補的な配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、実施例１で得たプラスミドphHAS2ORFMALp2xを鋳型にPCR反応を行った。得られたPCR産物であるＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法により決定したところ、配列番号１で示される塩基配列中１〜６７８（配列番号３で示される塩基配列中３６４〜１０４１に相当）で示される塩基配列を含んでいることが確認された。
【００７０】
実施例３：発現ベクターphHAS2OSMALp2xの構築
実施例２で得たPCR産物を制限酵素BamHI及びHindIIIで切断し、切断断片をアガロース電気泳動により精製した。一方、プラスミドpMAL-p2x(New England Biolabs社製)も制限酵素BamHI及びHindIIIで切断し、切断断片をアガロース電気泳動により精製した。これら断片をライゲーションさせ発現ベクターphHAS2OSMALp2xを得た。
【００７１】
実施例４：発現ベクターphHAS2OSDMALp2xの構築
比較例で得たPCR産物を用いて、実施例３と同様にして、発現ベクターphHAS2OSDMALp2xを得た。
【００７２】
実施例５：融合蛋白質の調製
常法に従い、実施例１、３及び４で得た発現ベクターphHAS2ORFMALp2x、phHAS2OSMALp2x及びphHAS2OSDMALp2xで大腸菌JM109株をそれぞれ形質転換した。形質転換体を0.2% glucoseおよび100μg/ml Ampicillinを含むLB培地5mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37℃で一晩振とう培養した。得られた培養液0.75mlを上記培地75mlの入った坂口フラスコに植菌した。37℃で振とう培養し、培養液の600nmにおける吸光度が0.6-0.8に達した時点で、終濃度100μMのイソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)を添加し、さらに37℃で4時間培養を続けた。
【００７３】
菌体を遠心分離により集め、2mlの30mM Tris-HCl(pH8.0、20%ショ糖、1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA))で菌体を懸濁し、リゾチーム処理し、10,000rpmで30分間遠心分離し、沈殿を集めた。沈殿を上記緩衝液2mlで懸濁し、超音波にて細胞壁を破砕した後、10,000rpmで30分間遠心分離し、上清を得た。上清をさらに、43,000rpm (100,000×g)で1時間超遠心を行い、融合蛋白質が局在する膜画分を集め、0.2mlの50mM Tris-HCl (pH7.4)に懸濁した。得られた膜画分をSDS-PAGE電気泳動およびウェスタンブロッティングを行うことによって目的物であるMBP融合蛋白質の発現の確認を行った。目的融合蛋白質は、SDS-PAGE電気泳動ではクマシーブリリアントブルー染色にて、ウェスタンブロッティングは一次抗体として抗MBPウサギ抗血清、二次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗ウサギヤギIgGを使用し、コニカイムノステイニングキット(コニカ社製)により検出した。形質転換体E. coli JM109 (phHAS2OSMALp2x)および形質転換体E. coli JM109 (phHAS2OSDMALp2x)から得られた膜画分には目的とする融合蛋白質が発現していることが確認されたが、形質転換体E. coli JM109 (phHAS2ORFMALp2x)から得られた膜画分には発現は確認されなかった。超音波破砕後の細胞破砕液を用いて同様に融合蛋白質の発現を調べたが、発現は認められなかった。これは発現ベクターの欠落あるいは挿入断片の欠落など細胞内での発現ベクターの安定性に問題があったものと考えられた。
【００７４】
形質転換体E. coli JM109 (phHAS2OSMALp2x)から得られた膜画分を膜画分Ａ、形質転換体E. coli JM109 (phHAS2OSDMALp2x)から得られた膜画分を膜画分Ｂとした。膜画分に含まれる蛋白質量は、牛血清アルブミンを標準として、BCA Protein Assay Reagent(PIERCE社製)により測定した。
【００７５】
参考例１：GlcUAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcUAβ1-3GlcNAcの調製
ヒアルロン酸100mgを20mM酢酸緩衝液(pH 5.7、0.15M NaClを含む)に溶解し、これに羊精巣由来ヒアルロニダーゼを加えて一晩３７℃で反応させた。反応後、Biogel P-40 (バイオラッド社製)カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィー（溶出液：0.2M 酢酸アンモニウム）で目的物を精製し、凍結乾燥し、目的物20 mgを得た。分子量をMALDI-TOF質量分析計で測定し、目的物である４糖オリゴ糖であることを確認した。
【００７６】
実施例６：ヒアルロン酸オリゴマー合成活性の測定
蛋白質として0.5mg含む実施例５で得た膜画分ＡあるいはＢ、1mMジチオスレイトール、20mM塩化マグネシウム、1mM EDTA、15%グリセロール、0.5mMウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸(UDP-GlcUA)、0.5mMウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)、参考例１で得たオリゴ糖0.1 mgを含む50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.0)0.2mlを37℃で１時間インキュベーションすることにより反応させた。反応後、反応液を10分間煮沸させることにより反応を停止させた。反応液をSuperdex Peptide HR10/30 (アマシャムバイオサイエンス社製) カラムクロマトグラフィー(溶出液：0.2M酢酸アンモニウム)で、生成物を分画し、糖を含む画分を凍結乾燥し、各分画に含まれる生成物の分子量をMALDI-TOF質量分析計で測定した。その結果、膜画分Ａを用いた反応液からは、分子量2850.17を示すピークが主生成物として観察された（図１）。また、この主生成物をストレプトコッカス  ジスガラクティアーゼ（Streptococcus dysgalactiae）由来ヒアルロニダーゼ(生化学工業社製)で処理したところ、上記ピークは消失した。このことから、分子量2850.17を示すピークはGlcUAβ1-(3GlcNAcβ1-4GlcUAβ1)6-4GlcNAcに相当し、膜画分Ａに含まれる蛋白質にヒアルロン酸オリゴマー合成活性があることが確認された。一方、膜画分Ｂを用いた反応液からは上記分子量のピークは確認されず、ヒアルロン酸オリゴマー合成活性は確認されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】実施例６における、本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質のヒアルロン酸オリゴマー合成活性を測定した結果を示す図面である。
【図１】
2005160321.tif 000003
【配列表】
2005160321000001.app