(57)【要約】【課題】  衛生紙の新規な製造方法の提供。【解決手段】  衛生紙の製造方法であって、  （ａ）セルロース−結合ドメインのないセルラーゼを用いて製紙用パルプを処理すること及び  （ｂ）前記処理されたパルプから衛生紙を製造することを含む方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
衛生紙の製造方法であって、
（ａ）セルロース−結合ドメインのないセルラーゼファミリー５またはファミリー７を用いて製紙用パルプを処理すること及び
（ｂ）前記処理されたパルプから衛生紙を製造すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記ファミリー７のセルラーゼが、
ａ）フミコーラ．インソレンス株 DSM 1800由来のEG Ｉ、
ｂ）ａ）のアミノ酸残基21〜417 及び任意に残基 418〜435 のすべてもしくは部分、または
ｃ）上記ａ）のセルラーゼと少なくとも90％の相同性を有するセルラーゼ
である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相同性の程度が少なくとも95％である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記セルラーゼが本質的に単成分からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記製紙用パルプが５〜95％の軟木パルプ及び５〜95％の硬木パルプを含むものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記製紙用パルプが軟木漂白クラフトパルプ（SWBK）及び硬木漂白クラフトパルプ（HWBK）を含むものである請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記SWBKが18より大きい粗さを有し、前記HWBKが10より大きい粗さを有している請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記製紙用パルプが18より小さい粗さを有するSWBK及び10より小さい粗さを有するHWBKの混合物である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記製紙用パルプが水中での乾燥パルプの分解によって製造される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
製紙用パルプの叩解または精錬を包含しない請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法であって、
ａ）前記セルラーゼが１kgのパルプ乾燥物質当り50〜2,000 ECUの投与量で用いられる、
ｂ）前記処理が10〜70℃の範囲の温度で行なわれる、
ｃ）前記処理が４〜9.5 の範囲のpHで行なわれる、
ｄ）前記処理が30分〜５時間の間行なわれる、及び／または
ｅ）前記処理が 0.3〜40％のパルプ濃度で行なわれる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は衛生紙を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
衛生紙、たとえば、トイレットペーパー、化粧用薄葉紙、紙製テーブルナプキン、ふきとり紙、紙タオル、生理用ナプキン、生理帯等は通常紙製造用パルプから製造される。紙の強度を低下させずに衛生紙を軟らかくすることが一般に望ましい。
日本の公開された特許出願特開平（JP−A）5−148794号公報は、セルラーゼ調製物を用いるパルプの処理がこの目的に効果があることを開示している。上記公報に記載されているセルラーゼ調製物は、微生物の培養により生産され、セルロース結合ドメインを有しまたは有さない種々のセルラーゼ成分の混合物を含有することが公知である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、上記公知の方法を改良してより良い効果を達成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
我々は、驚くべきことに、紙強度の有意な喪失なしに（または、ある場合には紙強度を増加することですら）、紙の剛さを低下させるのに非常に効力のある特定の型のセルラーゼ成分を発見した。問題のセルラーゼ成分はセルロース結合ドメイン(CBD）を含有していないことを特徴とし、種々のセルラーゼ成分の混合物を含有する慣用のセルラーゼ調製物より効力がある。
したがって、本発明は製紙用パルプをセルロース結合ドメインのないセルラーゼで処理する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
衛生紙
本発明により製造された衛生紙は、トイレットペーパー、化粧用薄葉紙、ふきとり紙、紙製テーブルナプキン、紙タオル、生理用ナプキン、生理帯等であり得る。
【０００６】
製紙用パルプ
衛生紙の製造に用いられるいかなる慣用の製紙用パルプも本発明により処理できる。このパルプはバージンパルプとして供給されるか、リサイクル源から由来するものであり得る。
【０００７】
製紙用パルプは、木材パルプ、非木材パルプまたはくず紙から作られたパルプであってもよい。木材パルプは、軟木、たとえば、松、アメリカ杉、もみ、とうひ、西洋杉及びアメリカつが、または硬木、たとえば、かえで、かわらはんの木、かばの木、ヒッコリー、ぶなの木、ポプラ、アカシア及びユーカリから製造することができる。非木材パルプは、たとえば、バガス、竹、木綿またはケナフから製造することができる。くず紙パルプは、くず紙、たとえば、新聞紙、混合オフィスくず紙、コンピュータープリントアウト、白元帳、雑誌、牛乳カートン、紙コップ等の再パルプ化により製造し得る。
【０００８】
好ましくは、処理される製紙用パルプは硬木パルプ及び軟木パルプの両方を含む。好都合に、本発明により用いられるセルロース結合ドメイン(CBD）のないセルラーゼは上記混合パルプを軟らかくするのに特に効力があることを、我々は発見した。したがって、前記製紙用パルプは５〜95％（好ましくは25〜75％）の軟木パルプ及び５〜95％（好ましくは25〜75％）の硬木パルプを含むことができる（パルプ乾燥物質の％）。
処理される木材パルプは機械パルプ（たとえば砕木パルプ、GP）、化学パルプ（たとえば、クラフトパルプまたは硫酸パルプ）、セミケミカルパルプ(SCP）、熱機械パルプ(TMP）、化学熱機械パルプ（CTMP）または漂白化学熱機械パルプ(BCTMP）でよい。
【０００９】
処理されるクラフトパルプは、漂白クラフトパルプであって、それは軟木漂白クラフト（SWBK, NBKPとも呼ばれる）、硬木漂白クラフト（HWBK, LBKPとも呼ばれる）またはこれらの混合物でよい。本発明による良好な軟化効果は、たとえば3:1〜1:3の範囲のNBKP：LBKPの重量比（乾燥基準）のNBKP及びLBKPの混合物で見られる。１つの好ましい混合物は18より大きい粗さのSWBK及び10より大きい粗さのHWBKからなる。他の好ましい混合物は18より小さい粗さのSWBK及び10より小さい粗さのHWBKからなる。パルプの粗さは、TAPPI 法Ｔ271(pm−91）により測定され、 100ｍ当りのmgの単位で表わされる。
【００１０】
紙くずパルプを処理する時、セルラーゼ処理は、紙くずのパルプ化の間または後に行うことができる。セルラーゼ処理は同時にセルロース繊維からインク粒子を遊離させるのに役立つことがあり、その後、特開昭59−9299号公報、特開昭63−59494 号公報、特開平２−80683 号公報及び特開平３−882 号公報に記載されているように、遊離したインク粒子を除去して脱インクパルプを得ることができる。
衛生紙は乾燥パルプから製造できる。この場合、セルラーゼ処理は乾燥パルプの製造に適用できるか、または乾燥パルプの再パルプ化（分解）の間または後に適用できる。
【００１１】
CBDのないセルラーゼ
本発明はセルロース結合ドメイン(CBD）のないセルラーゼを用いる。用語「セルラーゼ」は、セルロースの加水分解に寄与する酵素、たとえば、セロビオヒドラーゼ（酵素命名、E.C. 3.2.1.91)、エンドグルカナーゼ（この後、「EG」と略す、E.C. 3.2.1.4）またはβ−グルコシダーゼ（E.C. 3.2.1.21)をいう。
【００１２】
セルロース結合ドメインはP. Tomme他により、J. N. Saddler 及びM. H. Pener(編）「不溶性炭水化物の酵素分解（Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates）」（ACS Symposium Series, No.618, 1996年）に記載されている。多数のセルラーゼは CBDのない触媒ドメインを含有することが知られている。そのようなセルラーゼは本発明において上記のように用い得る。他のセルラーゼは触媒ドメイン及び CBDを含有することも知られている。そのようなセルラーゼは端を切り取って CBDのない触媒コアドメインを得ることができ、このコアを本発明に用い得る。
【００１３】
本発明に用いられるセルラーゼは、単一成分であってもよく、各々のセルラーゼが CBDを有してなければ、セルラーゼの混合物も用い得る。
セルラーゼは、Henrissat 他「Biochem. J. 」280, p.309〜16 (1991年）及びHenrissat 他「Biochem. J. 」293, p.781〜788(1993年）に記載された分類システムにしたがって、アミノ酸配列類似点の基準に関するファミリーに分類できる。いくつかの好ましいセルラーゼはファミリー５，７，12及び45に属するものである。
【００１４】
ファミリー５セルラーゼ
好ましい CBDのないファミリー５セルラーゼは、バシラス属の株由来のアルカリ性セルラーゼである。上記ファミリー５セルラーゼの１つは、バシラス属株 KSM−64(FERM BP−2886）からのエンドグルカナーゼである。そのセルラーゼ及びアミノ酸配列は、特開平４−190793号公報（花王）及び住友他「Biosci. Biotech. Biochem.」56 (6), p.872 〜877(1992年）に記載されている。
【００１５】
他のバシラス属からのファミリー５セルラーゼは、 KSM−635 株(FERM BP−1485）からのエンドグルカナーゼである。そのセルラーゼ及びアミノ酸配列は、特開平１−281090号公報（花王）、米国特許第4,945,053 号明細書及びY. Ozaki他「Journal of General Microbiology 」vol.136, 1973 〜1979頁（1990年）に記載されている。
【００１６】
第３のバシラス属からのファミリー５セルラーゼは1139株からのエンドグルカナーゼである。そのセルラーゼ及びアミノ酸配列は、Fukumori F. 他の「J. Gen. Microbiol.」132, p.2329 〜2335 (1986年）及び特開昭62−232386号公報（理研）に記載されている。
なお、他の好ましい CBDのないファミリー５セルラーゼはアスペルギルス属の株、好ましくはＡ．アキュレツス(aculeatus）、最も好ましくは、国際特許出願公開第93／20193 号明細書（ノボ  ノルディスク）に記載されているCBS 101.43株由来のエンド−β−１，４−グルカナーゼである。
【００１７】
ファミリー７セルラーゼ
ファミリー７セルラーゼはフミコーラ（Humicola）属の株、好ましくは、Ｈ．インソレンス（insolens）に由来し得る。１つの例は、国際特許出願公開第91／17244 号明細書（ノボ  ノルディスク）に記載された、Ｈ．インソレンス株 DSM 1800 由来のエンドグルカナーゼEG Ｉである。成熟セルラーゼは前記文献の図14の位置21〜435 に示された 415アミノ酸の配列を有し、（純粋な酵素タンパク質に基づいて） 200 ECU／mgの特異的活性を有する。
【００１８】
このセルラーゼはさらにＣ末端で18アミノ酸まで端を切り取って少なくとも 397のアミノ酸を含有させるようにすることができる。例として、セルラーゼの端を切り取って 402, 406, 408または 412アミノ酸とすることができる。他の例は国際特許出願公開第95／24471 号明細書（ノボ  ノルディスク）に記載されており、その図３に示されている 402のアミノ酸の配列を有するエンドグルカナーゼEG Ｉ*というその変異体である。
【００１９】
代りに、ファミリー７セルラーゼはマイセリオフトラ（Myceliophthora）属の株、好ましくはＭ．テルモフィラ(thermophila）、最も好ましくはCBS 117.65株に由来し得る。１つの例は、国際特許出願公開第95／24471 号明細書（ノボ  ノルディスク）に記載されているエンドグルカナーゼであり、その図６に示された配列のアミノ酸21〜420 及び任意にアミノ酸１〜20及び／または 421〜456 も含む。
【００２０】
他の代替物として、ファミリー７セルラーゼはフサリウム（Fusarium）属の株、好ましくは、Ｆ．オキシスポルム(oxysporum）に由来し得る。１つの例は、国際特許出願公開第91／17244 号明細書（ノボ  ノルディスク）及びSheppard P.O. 他「Gene. 」150, p.163〜167(1994年）に記載されたＦ．オキシスポルム由来のエンドグルカナーゼである。正しいアミノ酸配列は後者の参考文献に示されいる。このセルラーゼは 350 ECU／mgの特異的活性を有する。
【００２１】
ファミリー12セルラーゼ
好ましい CBDのないファミリー12セルラーゼは、国際特許出願公開第93／11249 号明細書（ノボ  ノルディスク）に記載されたフミコーラ．インソレンス DSM 1800 由来のCMC １である。
他の好ましい CBDのないファミリー12セルラーゼは、トリコデルマ属(Trichoderma）、特に国際特許出願公開第92／06184 号明細書（Genencor）に記載された、トリコデルマ・ビリデ（viride）またはトリコデルマ・リーセイ（reesei）からのEG  III   セルラーゼである。
【００２２】
代りに、ファミリー12セルラーゼは、マイセリオフトラ属の株、好ましくはＭ．テルモフィラ、最も好ましくはCBS 117.65株に由来し得る。このようなセルラーゼ（C173 という）はCBS 117.65からの DNAをクローン化し、次いで非セルロース分解性宿主生物であるアスペルギルス・オリザエ（oryzae）を形質転換し、その形質転換された宿主の培養によりセルラーゼを発現させ、培養ブロスからセルロース分解性活性成分のみを分離することによって生産することができる。C173 はpH４〜6.5 で最適活性、すなわちタンパク質１mg当り 226 ECUの特異的活性及び26KDa の分子量（成熟タンパク質について）を有する。C173 をコードするcDNAの配列（開始コドンから停止コドンまで）及びC173 の成熟タンパク質のアミノ酸は配列番号１及び２として列挙している配列に示されている。
【００２３】
ファミリー45セルラーゼ
好ましい CBDのないファミリー45セルラーゼは、Boisset, C., Borsali, R., Schulein, M.及びHenrissat. Bの「FEBS Letters. 」376, p.49 〜52 (1995年）に記載された、フミコーラ・インソレンス由来のEG  Ｖ−コアである。それは、国際特許出願公開第91／17243 号明細書（ノボ  ノルディスク）の配列番号１の位置１〜213に示されたアミノ酸配列を有する。
他の好ましい CBDのないファミリー45セルラーゼは、Ooi 他により「Nucleic Acids Research」Vol.18, No.19, p.5884(1990年）に記載されたアスペルギルス・アキュリツスからのFI−CMC アーゼである。
【００２４】
単成分セルラーゼ
単成分酵素は組換え DNA技術により経済的に製造できる。すなわち、単成分をコードする DNA配列のクローン化、続いて、その DNA配列を用いる適切な宿主細胞の形質転換及びその宿主中でのその成分の発現により生産できる。したがって、有用なセルラーゼをコードする DNA配列が、
−  適切なベクター中で、たとえば、この明細書において、後で述べる微生物の１つからの DNAライブラリーをクローン化すること、
−  前記ベクターを用いて適切な酵母宿主細胞を形質転換すること、
−  前記 DNAライブラリー中のクローンをコードされた注目の任意の酵素を発現するために前記宿主細胞を適切な条件で培養すること、
−  上記クローンにより生産された酵素の任意のセルラーゼ活性を測定することによって陽性クローンをスクリーニングすること、及び
−  上記クローンから DNAをコードする酵素を単離することを包含する一般的方法により単離することができる。
【００２５】
一般的方法はさらに国際特許出願公開第94／14953 号明細書に開示され、その内容は参考文献により本明細書に組み入れる。
有用なセルラーゼをコードする DNA配列は、たとえば、問題の微生物のcDNAライブラリーをスクリーニングし、適当な酵素活性（すなわち、セルラーゼ活性）を発現するクローンについて選択することによって単離することができる。
【００２６】
相同性酵素をコードする DNA配列、すなわち、類似の DNA配列は他の微生物から得ることができるかもしれない。たとえば、その DNA配列は、他の真菌、たとえば、アスペルギルス種の株、特にＡ．アキュリツスまたはＡ．ニガーの株、トリコデルマ種の株、特にＴ．リーセイ、Ｔ．ビリデ、Ｔ．ロンギブラキアツム(longibrachiatum）、Ｔ．ハルチアヌム(harzianum）もしくはＴ．コニンギー（koningii）の株またはネオカリマスチクス（Neocallimastix）種の株、ピロマイセス(Piromyces）種、ペニシリウム種、アガリクス（Agaricus）種またはファネロカエテ(Phanerochaete）種のcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより得ることができる。
【００２７】
代りに、有用なセルラーゼをコードする DNAは周知の手順にしたがって、便利に、適切な源、たとえば、上記生物体の任意のものから、公知の DNA配列を基礎に調製された合成オリゴヌクレオチドプローブを用いることにより DNAを単離することができる。
続いて DNA配列は組換え発現ベクターに挿入し得る。これは組換え DNA手順を慣用に受け得るいかなるベクターでもよく、ベクターの選択はしばしば導入されるべき宿主細胞に依存する。したがって、そのベクターは自律性に複製するベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり得、その複製は染色体複製、たとえばプラスミドと独立している。代りに、そのベクターは、宿主細胞に導入した時、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体といっしょに複製されるものであり得る。
【００２８】
そのベクター中で、セルラーゼをコードする DNA配列は、適切なプロモーター及びターミネーター配列と操作可能に連結されるべきである。プロモーターは選択された宿主細胞中で転写活性を示す任意の DNA配列であってもよく、宿主細胞に相同性または異種性のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から由来し得る。セルラーゼ、プロモーター及びターミネーターをそれぞれコードする DNA配列を結合し、それらを適切なベクターに挿入するのに用いられる手順は当業者に周知である（たとえば、Sambrook他「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989年参照）。
【００２９】
DNA配列で形質転換される宿主細胞は、好ましくは真核細胞、特に真菌の細胞、たとえば、酵母または糸状菌の細胞である。特にその細胞はアスペルギルス属またはトリコデルマ属の種に、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエ（oryzae）またはアスペルギルス・ニガー(niger）に属することができる。真菌の細胞は、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換を包含する方法により形質転換され、その後自体公知の方法で細胞壁を再生し得る。宿主微生物としてアスペルギルス属を用いることは、欧州特許第238023号明細書（ノボ  ノルディスク  アクティーゼルスカブ）に記載されており、参考文献によりその内容を本明細書に組み入れる。
【００３０】
宿主細胞は、酵母細胞、たとえば、サッカロミセス属、特にサッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ（kluyveri）またはサッカロミセス・ウバルム（uvarum）の株、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces）種、たとえば、シゾサッカロミセス・ポンベ(pombe）の株、ハンセヌラ(Hansenula）種、ピチア（Pichia）種、ヤローウイア（Yarrowia）種、たとえば、ヤローウイア・リポリチカ（lipolytica）またはクルイベロミセス種、たとえば、クルイベロミセス・ラクチス（lactis）の株であってもよい。
【００３１】
本明細書の文脈では、用語「相同性」または「相同性配列」は、この後で示される配列表の各々に示されたものから、１または２以上のアミノ酸残基により異なっているアミノ酸を表示することを意図している。相同性の配列は、たとえば、アミノ酸配列の１または２以上の異なった部位での１または２以上のアミノ酸残基の置換、酵素のいずれか１端もしくは両端またはアミノ酸配列の１または２以上の部位での１または２以上のアミノ酸配列の欠失、またはアミノ酸配列の１もしくは２以上の部位での１もしくは２以上のアミノ酸残基の挿入を包含する、これらの配列表に示されたアミノ酸配列の修飾により生ずるものであり得る。
【００３２】
しかしながら、当業者に明らかなように、アミノ酸の変化は好ましくは小さなものであって、すなわち、タンパク質の折りたたみまたは活性に有意に影響しない保守的なアミノ酸置換、典型的には１〜約30アミノ酸という小さな欠失、小さなアミノ末端もしくはカルボキシ末端伸長、たとえば、アミノ末端メチオニン残基、約20〜25残基までの小さな連結ペプチドまたは、精製を容易にする小さな伸長、たとえば、ポリヒスチジン区域、抗原性エピトープもしくは結合ドメインである。一般的にFord他「Protein Expression and Purification 」2, p.95 〜107(1991年) 参照。
【００３３】
保守的置換の例は塩基性アミノ酸（たとえば、アルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（たとえば、グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（たとえばグルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（たとえば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（たとえば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）及び小さなアミノ酸（たとえば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）の群の内である。
【００３４】
また、上記置換はその分子の機能に決定的な領域外に作ることができ、なお活性ポリペプチドを生じることは当業者に明らかであろう。本発明の DNA構成物によりコードされたポリペプチドの活性に必須で、したがって好ましくは置換を受けないアミノ酸は、この技術分野で公知の手順、たとえば、部位特異的変異誘発またはアラニン走査変異誘発にしたがって同定し得る（Cunningham及びWells 「Science 」244, p.1081 〜1085, 1989年）。後者の技術においては、変異は分子の各残基に導入され、生じた変異分子を生物学的（すなわち、セルラーゼ）活性について試験し、その分子の活性に決定的なアミノ酸残基を同定する。基質−酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学または光親和性標識のような技術によって決定するような結晶構造の分析によっても決定できる。たとえば、de Vos他「Science 」255, p.306〜312, 1992 年、Smith 他「J. Mol. Biol. 」224, p.899〜904,1992年、Wlodaver他「FEBS Lett.」309, p.59 〜64, 1992年参照。
【００３５】
アミノ酸配列の修飾は、たとえば、部位特異的もしくはランダム変異誘発または周知の手順にしたがったこれらの技術の組み合せにより、その酵素をコードする DNA配列を修飾することにより適切に実施することができる。代わりに、相同性の配列は、後に示す配列表の各々に示されたアミノ酸配列にそれぞれ相当するセルラーゼよりも他の起原から由来する酵素の１つであってもよい。
【００３６】
したがって、「相同」は問題のアミノ酸配列を有するセルラーゼをコードする DNAと同じプローブに特定の特異的条件下（たとえば、5×SSC 中での予備浸漬、20％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8 及び50mgの変性超音波処理した子ウシの胸腺 DNAの溶液中で約40℃での１時間ハイブリダイズ後、 100mMの ATPを補足した同じ溶液中での約40℃での18時間のハイブリダイズ）で、ハイブリダイズする DNAによりコードされるポリペプチドを表わすことができる。相同性の配列は通常、後で示す配列表の各々に示されたアミノ酸配列のそれぞれと少なくとも50％、たとえば少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％までもの相同の（同一性の用語）程度を示すだろう。
【００３７】
上記に関する相同性は、第２配列から第１の配列の誘導を示す２つの配列の間の同一性の程度として測定される。相同性は適切には、当業界で公知のコンピュータープログラム、たとえば、 GCGプログラムパッケージ中に供給されるものにより測定することができる（Needleman, S. B.及びWunsch. C. D. 「Journal of Molecular Biology」48, p.443 〜453,1970年）。
【００３８】
処理条件
処理条件は用いられるセルラーゼの特性によって選択すべきである。上記セルラーゼについて、次の条件を一般的に用いることができる。すなわち、pH４〜9.5 （たとえば、５〜9.5 、特に６〜８）、10〜70℃（特に30〜50℃）及び30〜５時間の反応時間である。パルプ濃度は一般に 0.3〜40％（典型的には２〜20％）の範囲、特に非リサイクルパルプについて２〜10％、リサイクル紙くずからのパルプについて10〜20％の範囲であろう。典型的な処理条件について、セルラーゼは50〜2,000  ECU／kgパルプ乾燥物質、特に 100〜1,000 ECU／kgの投与量で用いられる(ECU単位は下記に定義する）。
【００３９】
パルプは任意にセルラーゼ処理の前、間または後のいずれかに慣用のビーターまたは精錬機中で叩解するか、精錬してもよい。衛生紙の軟らかさを低下させる傾向があるので過剰の叩解または精錬をさけることが一般に好ましく、ある場合には叩解または精錬をはぶいてもよい。
セルラーゼ処理後、処理されたパルプから衛生紙を慣用の製紙機中で製造することができる。
【００４０】
セルラーゼ活性(ECU）についてのアッセイ
セルラーゼのエンド活性を振動粘度計においてCMC(カルボキシメチルセルロース）の粘度の低下により測定する。１ ECU（エンドセルラーゼ単位）は、 0.1Ｍリン酸塩緩衝液（pH7.5)、40℃中で30分間１mlの34.0ｇ／ｌのCMC(商品名Aqualon 7LFD）溶液とインキュベートした時に、粘度の10倍の低下を引き起こす活性の量である。
【実施例】
【００４１】
例１.
この例で用いられたパルプはNBKP及びLBKPの１：１混合物であった。NBKPは松（カリブ及びモンテレー）、ダグラスもみ及びアメリカ杉の南方軟木混合物から製造した。LBKPは、かえで、かわらはんの木、かばの木、ヒッコリー及びポプラを含有する硬木から製造した。粗さはNBKPについては19.3で、LBKPについては16.8であった。
この例で用いられたセルラーゼはフミコーラ・インソレンス DSM 1800 （ファミリー７）からのEG  Ｉであった。次の条件が用いられた。
【００４２】
パルプ濃度：５ｗ／ｗ％
pH        ：７
温度      ：40℃
反応温度  ：２時間
撹拌      ：350rpm
【００４３】
日本工業規格、JIS 8209にしたがって処理されたパルプからハンドシートを製造した。20ｇ／m2のシートを剛さ（日本工業規格、JIS P8143)について試験し、60ｇ／m2のシートを裂断長(JIS P8113）について試験した。
下表はセルラーゼなしで処理した対照についての剛さ及び裂断長の絶対値を示す。セルラーゼ処理を伴う実験については、表は対照に比較したこれらの値の相対的変化（％で）を示す。したがって、理想的には、剛さは低下するのに対して、裂断長は増加または一定のままであるべきである。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
上の結果は、本発明によるセルラーゼ処理は、低下した剛さ、すなわち、より軟らかい紙を与えたことを示している。紙の強度（裂断長）はほとんど変わらなかった。最も良い結果は 300 ECU／kgパルプ乾燥物質の投与量で得られた。
【００４６】
例２.
この実験で用いられたパルプは粗さ15.8のNBKPと粗さ 8.5のLBKPの50：50混合物であった。NBKPは、もみ、とうひ、ポンデローサ松、西洋杉及びアメリカつがの北方軟木混合物から製造され、LBKPはアカシア及びユーカリの硬木混合物から製造された。このパルプを下記の酵素投与量で例１と同じように処理した。
【００４７】
【表２】
2005042296.tif 000003
【００４８】
好都合なことに、このパルプを用いた結合は、最も高い試験された投与量で、衛生紙は顕著に軟らかくそして強くなったことを示す。
【００４９】
例３.
例１に用いられたパルプを本発明による次のセルラーゼで処理した。すなわち、マイセリオフトラ・テルモフィラ（ファミリー12）からのC173 、フミコーラ・インソレンス（ファミリー45）からのEG Ｖ−コアである。このパルプをpH６で（これがセルラーゼについての最適pHに近いから）処理した。
他の処理条件は、パルプ濃度  ３w/w％、温度  30℃、反応時間  ２時間、撹拌  400rpmであった。ハンドシートを例１のように製造し、試験した。結果は対照については絶対値で、他の実験については変化％（対照に比較して）で示されている。
【００５０】
【表３】
2005042296.tif 000004
【００５１】
上の結果は本発明による両セルラーゼが衛生紙をより軟らかくそしてより強くするのに有効であることを示す。
【００５２】
例４.
フミコーラ・インソレンス DSM 1800 （ファミリー７）からのEG  Ｉを、このセルラーゼのために適切であるとしてpH７を選択した以外は例３と同じ条件で試験した。
【００５３】
【表４】
2005042296.tif 000005
【００５４】
この例は例１と同じパルプ及びセルラーゼを用いたが、異なった条件で（温度、パルプ濃度、撹拌及び投与量）製造した。その結果はこれらの条件でも、セルラーゼ処理がほとんど未変化の強度をもった、より軟らかい紙を与えたことを示す。最も良い結果は 300 ECU／kgパルプ乾燥物質の投与量で得られた。
【配列表】
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