(57)【要約】【解決手段】（１）微生物を固体培養した培養物から極性溶媒で抽出した抽出物より調製され、耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物。（２）微生物を固体培養し、培養物から耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物を採取することを特徴とする耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。（３）項目（１）記載の酵素混合物を用いて分解してなる調味料。【効果】本発明によれば、耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物及びこの酵素混合物を用いた調味料を提供することができる。  そして、本発明により、蛋白質分解酵素に、グルタミナーゼを添加するという煩雑さがなく、小麦グルテンあるいは動植物蛋白質等の高温分解の際にグルタミン酸含量の高い分解物が得られ、産業上極めて有意義である。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を固体培養した培養物から極性溶媒で抽出した抽出物より調製され、耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物。
【請求項２】
微生物を固体培養し、培養物から耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物を採取することを特徴とする耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。
【請求項３】
微生物が耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼ遺伝子を組み込んだ組み換え微生物である請求項1又は２記載の酵素混合物又は耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。
【請求項４】
微生物が麹菌である請求項１又は２記載の酵素混合物又は耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。
【請求項５】
耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼがクリプトコッカス属由来のものである請求項１又は２記載の酵素混合物又は耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。
【請求項６】
粉末化された請求項１、３、４又は５記載の酵素混合物。
【請求項７】
請求項１、３、４又は５記載の酵素混合物を用いて分解してなる調味料。
【請求項８】
請求項７に記載の調味料がグルテン分解物である調味料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物及び調味料に関する。
【背景技術】
【０００２】
麹カビ(黄麹菌)であるアスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ソーヤは、蛋白質分解酵素を多種多量に生産するため、古くから醤油、味噌等の蛋白質分解調味料の製造に使用されている。
蛋白質を分解する上で麹菌を固体培養し、得られる麹から水あるいはアルコールで抽出した酵素剤も古くから利用されている(特許文献１参照)。
蛋白質を分解する際に、分解効率を上げ、処理時間を短縮し、雑菌汚染を低減させるために高温下で分解されることがある。
しかし、麹菌の酵素は、蛋白質の低分子化能力等の面では優れているが、耐熱性に劣るため、比較的低温度域で蛋白質分解工程を行うことを余儀なくされている。
特にグルタミナーゼの耐熱性は、低く、高温処理による失活は著しい。また、固体麹におけるグルタミナーゼの局在性は、ほとんどが菌体の表面に結合することが知られており、酵素剤として利用される麹抽出液中ではグルタミナーゼが不足することが知られている。そのため、現行の麹菌由来の酵素剤で蛋白質を高温分解する際には、グルタミン酸含量の低下を防ぐために耐熱性のグルタミナーゼを添加しなければならないという問題点があった(特許文献１参照)。
【特許文献１】特開昭48-58157号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物及びこの酵素混合物を用いた調味料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで、本発明者等は、鋭意検討を重ねた結果、宿主として麹カビを用い、該遺伝子を発現させ、麹菌本来の他種多量の蛋白質分解酵素分泌能を有し、かつ、高いグルタミナーゼ生産能を合わせもつ麹菌を作製した。
組み換え技術により作製された本麹菌は、通常の液体培養ではクリプトコッカス属菌及びサッカロミセス属菌を宿主として発現させた場合と同様に菌体表面にグルタミナーゼが局在した。一方、固体培養では、グルタミナーゼが遊離型となり菌体外へと分泌するという新しい事実を知見した。
また、その酵素学的な特性、すなわち、耐熱性に関しては遊離型となった酵素においても保持していることが明らかとなった。この事実は、固体麹から水あるいはアルコールで抽出する蛋白質分解酵素液中に、これまで不足とされていたグルタミナーゼ、特に耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼが豊富に含まれることを知見し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）微生物を固体培養した培養物から極性溶媒で抽出した抽出物より調製され、耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物。
（２）微生物を固体培養し、培養物から耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物を採取することを特徴とする耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。
（３）微生物が耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼ遺伝子を組み込んだ組み換え微生物である項目（１）又は（２）記載の酵素混合物又は耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。
（４）微生物が麹菌である項目（１）又は（２）記載の酵素混合物又は耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。
（５）耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼがクリプトコッカス属由来のものである項目（１）又は（２）記載の酵素混合物又は耐塩性及び耐熱性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物の製造法。
（６）粉末化された項目（１）、（３）、（４）又は（５）記載の酵素混合物。
（７）項目（１）、（３）、（４）又は（５）記載の酵素混合物を用いて分解してなる調味料。
（８）項目（７）に記載の調味料がグルテン分解物である調味料。である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼを含有する酵素混合物及びこの酵素混合物を用いた調味料を提供することができる。
そして、本発明により、蛋白質分解酵素に、グルタミナーゼを添加するという煩雑さがなく、小麦グルテンあるいは動植物蛋白質等の高温分解の際にグルタミン酸含量の高い分解物が得られ、産業上極めて有意義である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明者等は、高温下で蛋白質分解を行う際に急速な失活を伴う麹菌由来のグルタミナーゼを補うため、クリプトコッカス属酵母由来の耐熱性及び耐塩性に優れたグルタミナーゼ遺伝子を黄麹菌アスペルギルス・ソーヤに導入し、高蛋白質分解酵素活性及び高グルタミナーゼ活性を合わせもつ麹菌を作製した。
得られた組み換え麹菌を用いて醤油麹又はフスマ麹を調製し、酵素を一晩4℃で水抽出した。得られた酵素液を固液分離し、夫々のグルタミナーゼ活性を測定した結果、酵素液中に高いグルタミナーゼ活性を検出し、菌体から遊離してグルタミナーゼが発現していることを確認した。また、酵素液中のグルタミナーゼの耐熱性を調べた結果、耐熱性を保持していることが明らかとなった。
次に、この酵素液を用いてグルテン高温分解を行った。その結果、耐熱性グルタミナーゼを添加しなくともグルタミン酸含量の高いグルテン分解物を得ることに成功したものである。
【０００８】
本発明は、異種蛋白質であるグルタミナーゼを微生物に生産せしめるため、宿主に用いる微生物は、グルタミナーゼを生産することができるものであれば特に限定されない。しかし、本発明の特徴は、蛋白質分解酵素及びグルタミナーゼを豊富に含む酵素混合物に関するものであるため、宿主に用いる微生物としては、蛋白質分解酵素生産能の優れた微生物が好ましい。それらの微生物としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられる。
【０００９】
本発明でいうグルタミナーゼとは、耐熱性に優れたグルタミナーゼ活性を有する酵素であり、特にグルタミナーゼ活性のみを有する酵素である必要はなく、転移反応、アスパラギナーゼ反応を合わせもつ酵素であってもよい。それらのグルタミナーゼとしては、例えば、クリプトコッカス・ノダエンシスあるいはクリプトコッカス・アルビダス等のクリプトコッカス属酵母由来のグルタミナーゼ等が挙げられる。
【００１０】
グルタミナーゼの生産は、グルタミナーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結させ、グルタミナーゼ遺伝子を組み込んだベクターを微生物内に導入することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でグルタミナーゼを生産させうるものであれば如何なるものでも用いることができる。
【００１１】
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、糸状菌であれば、例えば、PyrGあるいはniaDのような宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、オリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。
また、組み換えベクターは、宿主細胞中でグルタミナーゼ遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。
プロモーターとしては、醤油麹又はフスマ麹等固体麹で効率よく発現するものが望ましく、具体的には、例えば、amyBプロモーターあるいはアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
【００１２】
組み換え微生物の作製に伴う形質転換は、宿主により公知の方法で行うことができる。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる方法〔Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995)〕等を用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法〔Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)〕を用いることができる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによる方法〔Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)〕等を用いることができる。
【００１３】
本発明でいう酵素混合物は、固体麹に水あるいはアルコール等の極性溶媒を加えて得られる蛋白質分解酵素を含有する酵素混合物である。抽出する極性溶媒は、食塩水あるいは菌体の培養液等を用いてもよい。抽出は、例えば、4℃〜常温で行い、抽出時間は、温度によっても異なり、例えば、4℃であれば一晩抽出することが望ましい。麹が固まりを形成する場合は、攪拌等を行い、よく麹をほぐし、水等の極性溶媒を麹に加えた後も何度か攪拌して麹に極性溶媒が染み込むように行うのが好適である。また、機械的な処置をしてもよく、例えば、ポリトロンのようなホモジェナイザーを使用してもよい。
抽出物は、例えば、遠心分離あるいはろ過等による固液分離を行うことにより得られる。抽出物は、更に、無菌ろ過をすることにより無菌的な酵素混合物を調製してもよい。抽出物から微生物を除去する手段としては、例えば、その他放射線照射等の処置も挙げられる。また、得られた抽出物をスプレードライ等の方法により粉末化し、酵素混合物として使用してもよい。
【００１４】
本発明で得られる酵素混合物を用いて蛋白質原料を分解する際の温度は、例えば、35〜60℃が好ましい。分解時間は、温度によって異なり、18時間〜7日間分解することが望ましい。調味料製品の官能的安定性及び色の安定性を改善するために加水分解した分解液に、塩あるいは酵母等を加えて諸味を形成し、次いで、諸味を好ましくは、好気的もしくは嫌気的条件下で1〜6週間、より好ましくは2〜4週間発酵させてもよい。
【００１５】
蛋白質原料としては、例えば、植物性蛋白質、動物性蛋白質等が用いられる。植物性蛋白質としては、例えば、大豆、コーングルテン、小麦グルテン等が挙げられる。動物性蛋白質としては、例えば、畜肉類、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。
【００１６】
グルタミナーゼ活性の測定法
グルタミナーゼの力価の測定法には、[測定法1]L-グルタミンを加水分解して生成されるL-グルタミン酸を定量する方法、[測定法2]酵素反応で生成するアンモニアを定量する方法が挙げられる。夫々市販のキットを使用してもよく、測定法１であれば、例えば、ヤマサL-グルタミン酸測定キット(ヤマサ醤油社製)、測定法２であれば、例えば、F-キット  アンモニア(ロシュ・ダイアグノシス社製)が挙げられる。
2%(W/V)L-グルタミン溶液1mlに、0.2 Mリン酸緩衝液(pH 7.0) 2ml及び酵素液1mlを加え、30℃、60分間反応させた後、0.75 N過塩素酸液1mlを添加して反応を停止させ、これに1.5N水酸化ナトリウム液500 μlを加え、反応液を中和した。
上記の反応液を遠心分離(10000 rpm、10分間)し、上清100μlに、50mMのEDTA Naを含む0.1 M塩酸ヒドロキシルアミン緩衝液1.0 ml (pH 8.0)、20 mM NAD＋溶液(オリエンタル酵母社製)1.0 ml及び500単位/mlのL-グルタミン酸脱水酵素液(SIGMA社製)50 μlを添加し、37℃で30分間反応させ、分光光度計により340 nmにおける吸光度を測定した。そして、予め作成したL-グルタミン酸の検量線より、その生成量を調べておき、上記の条件下で1分間あたり1μモルのグルタミン酸を生成する酵素量を1単位(U)とした。
【００１７】
グルタミナーゼの高活性株のスクリーニング
最少培地であるツァペック・ドックス培地に、生育可能な形質転換体から胞子を白金耳でかき取り、0.01％ツィーン80溶液30μlに懸濁した。この懸濁液を予めマルツ寒天プレート(極東製薬社製)上に置いた抗生物質検定用ペーパーディスク(アドバンテック)に20μl滴下し、30℃、2日間培養した。培養後、ペーパーディスクを培地から剥ぎ取り、グルタミナーゼ活性を検出した。グルタミナーゼ活性の検出は、上記記載の方法を1.5mlスケールにスケールダウンし、一段階目の反応であるグルタミナーゼ反応を一部改変した方法で行った。
すなわち、1.5mlチューブ内に、2%(W/V)L-グルタミン溶液250μlに0.2 Mリン酸緩衝液(pH 7.0) 500μl及び滅菌水250μlを予め混合した溶液を調製し、その中に先のペーパーディスクを直接入れ、37℃、30分間グルタミナーゼ反応させた。反応後、0.75 N過塩素酸液250μlを添加して反応を停止させ、これに1.5N水酸化ナトリウム液125 μlを加え、反応液を中和した。次いで、グルタミン酸定量を上記と同様に行い、吸光度340nmにおける数値の高いものをグルタミナーゼ高活性株として選抜した。
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【実施例１】
【００１８】
１．クリプトコッカス属酵母由来のグルタミナーゼ遺伝子(CnGahA)を導入した麹菌の作製
クリプトコッカス・ノダエンシス由来のグルタミナーゼ遺伝子を含むpTKgln(FERM BP-7292、特開2002-262887号公報記載)を鋳型に配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いてグルタミナーゼ遺伝子のコード領域をPCR増幅させた。
増幅断片をEco RI及びSma Iで処理し、同処理をしたアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ遺伝子プロモーターとターミネーターを有するpAPベクターに導入し、麹菌発現プラスミドpAPCnGahAを作製した。
【００１９】
次いで、pAPCnGahAを鋳型にし、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いて、アミラーゼプロモーター、グルタミナーゼ遺伝子、アミラーゼターミネーターを含む断片をPCR増幅させた。得られた増幅断片を、アスペルギルス・ソーヤ由来の硝酸還元酵素遺伝子(niaD遺伝子)と共に硝酸資化能を欠落させたアスペルギルス・ソーヤ RIB1023株（独立行政法人  酒類総合研究所より入手）に導入した。硝酸資化能を欠落させたアスペルギルス・ソーヤRIB1023は、分生子を終濃度0.5Mの塩素酸カリウムを含む最小培地(ツァペック・ドックス培地)に撒き、生育可能かつ、硝酸のみ資化能を失った自然変異株を用いた。  形質転換株は、ツァペック・ドックス培地で生育可能な菌を選抜し、更に、グルタミナーゼ活性を測定して、高活性株を取得した。得られた形質転換株は、再度、ツァペック・ドックス培地に胞子を撒き、単胞子分離を行い、安定してグルタミナーゼ活性の高い株を選抜した。
【００２０】
２．固体麹におけるグルタミナーゼの局在性
醤油麹の調製を以下のとおり行った。
150ml容の三角フラスコに、ミール2.46g、フスマ2.7g及び水3.6mlを入れて充分混合し、綿栓をして121℃、30分間、加圧蒸気殺菌した。室温まで冷却させた後に、項目１．で得られた形質転換株の胞子105個を摂取し、湿度80％一定で30℃、3日間製麹した。
次いで、40mlの20mMリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、ポリトロンを用いてホモジェナイズし、4℃で一晩、酵素を抽出した。抽出後、15000rpm、15分間遠心分離し、上清と沈殿物とに分離した。
更に、沈殿物に30mlの同緩衝液を加えて再度ホモジェナイズし、15000rpm、15分間遠心分離し、上清と沈殿物とに分離した。沈殿物に再度30mlの同緩衝液を加えて同様の操作を繰り返した。この3回の操作により得られた上清をまとめたものを遊離画分とした。更に、沈殿物に50mlの同緩衝液を加えてホモジェナイズして洗浄し、15000rpmで15分間遠心分離し、沈殿物を回収した。この操作を8回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に同緩衝液を加えて結合画分とした。
夫々の画分のグルタミナーゼ活性を測定した結果、対照株と比較し、形質転換株(No.259)は、グルタミナーゼ活性が高く、固体麹である醤油麹においても充分に発現していることを確認した。更に、その局在性を調べた結果、形質転換株のグルタミナーゼは、遊離画分に高い活性を示し、固体培養では遊離型として存在することが明らかとなった。
【００２１】
（表１）形質転換体のグルタミナーゼ活性と局在性
2005328738.tif 000002
【００２２】
３．遊離型CnGahAの耐熱性
上記項目２．で得られた麹抽出液を用いてグルタミナーゼの耐熱性を調べた。
対照として非耐熱性である麹菌由来のグルタミナーゼ遺伝子(AsGahA)を導入した麹菌から項目２．と同様の操作で得られた麹抽出液を用いた。4、40、50、60及び70℃で夫々30分間熱処理し、無処理の活性を100％とした際の相対値で求めた。それらの結果を図１に示した。
その結果、AsGahAを含む麹抽出液のグルタミナーゼ活性は、60℃、30分間の熱処理で20％以下まで活性が低下したのに対し、CnGahAを含む麹抽出液のグルタミナーゼ活性は、80％以上残存し、遊離型となっても耐熱性を保持していることが明らかとなった。
【００２３】
４．耐熱性グルタミナーゼを含む蛋白質分解酵素液の調製
醤油麹を上記項目２．記載のとおり調製した。
フスマ麹を以下のように調製した。
150ml容の三角フラスコに、フスマ5gを入れ、綿栓をして121℃、60分間、加圧蒸気殺菌した。室温まで冷却させた後に、項目１．で得られた形質転換株の胞子105個を接種し、湿度80％一定で30℃、3日間製麹した。
夫々の麹に、40mlの冷却水を加えゴム栓で密封後、上下に激しく振って充分に麹をほぐし、そのまま4℃で一晩酵素を抽出した。醤油麹を更にポリトロンを用いてホモジェナイズした後、10000rpm、15分間遠心分離し、上清を酵素抽出液とした。フスマ麹をフィルターペーパー２C(アドバンテック社製)を用いて固液分離し、ろ液を酵素液とした。
【００２４】
５．耐熱性グルタミナーゼを含む蛋白質分解酵素液を用いたグルテン高温分解
高いグルタミナーゼ活性を示す形質転換株のうち、3株(No.86、No.125及びNo.259)についてグルテン高温分解を行った。150ml容三角フラスコに、上記項目４．で調製した麹抽出液20ml、小麦グルテン11g、飽和食塩水12ml添加し、45℃で3日間、グルテン分解した。
グルテンが塊を形成するため、ゆるやかに旋回しながら分解した。分解後、フィルターペーパー２C(アドバンテック社製)を用いて固液分離し、ろ液をグルテン分解物とした。  対照には、耐熱性グルタミナーゼであるクリプトコッカス・アルビダス由来のグルタミナーゼを添加した。
グルテン分解物の全窒素分、グルタミン酸量を表２に示した。尚、全窒素成分は、ケルダール法により求め、グルタミン酸量は、食品発酵用分析装置AS-210(サクラ精機社製)を用いて測定した。
対照株では耐熱性のグルタミナーゼを添加しないとほとんどグルタミン酸が溶出されなかったのに対し、形質転換体の抽出液は、耐熱性のグルタミナーゼを添加しなくてもグルタミン酸含量の高いグルテン分解物が得られた。
【００２５】
（表２）醤油麹抽出液によるグルテン高温分解
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【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】耐熱性グルタミナーゼ遺伝子であるCnGahAを発現する麹菌及び非耐熱性グルタミナーゼ遺伝子であるAsGahAを発現する麹菌を夫々固体培養して、酵素抽出液を調製し、得られた抽出液中のグルタミナーゼ活性の耐熱性を比較した図である。
【図１】
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【配列表】
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