(57)【要約】      （修正有）【課題】新規ＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）の開発、および、その薬学的組成物。【解決手段】  その第一鎖において５’から３’の方向に、処方物ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２の配列を含むＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）からなる特定の配列からなる群より選択される分子、および、それらを投与する炎症性疾患、免疫性疾患または自己免疫性疾患を処置する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その第一鎖において５’から３’の方向に、処方物ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２の配列を含むＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子であって、ここで、
ＣＯＲＥは、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号５）；ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号７）；ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号９）；ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）；ＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１５）；ＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号１７）；ＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）；ＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２１）；ＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号２３）；ＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号２５）；およびＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号７８）からなる群より選択され；
ＦＬＡＮＫ１は、ＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号７９）；ＡＴ；ＴＣ；ＣＴＣ；ＣＴ；ＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）、ＴＴＧＡ（配列番号８１）；ＡＧＴＴＧＣ（配列番号８２）；ＧＴＴＧＡ（配列番号８３）；Ａ；ＡＡＧＡ（配列番号８４）；ＡＴＡＴ（配列番号８５）；ＣＡＡＣ（配列番号８６）；ＣＡＧＴ（配列番号８７）；ＴＧＡ；およびＧＡからなる群より選択され；
ＦＬＡＮＫ２は、ＴＣＣ；ＧＴ；ＴＣ；ＴＧＴ；ＴＣＡ；ＴＣ；ＣＡ；ＡＧＧＣ（配列番号８８）；．ＡＧ；ＡＧＧ；Ａ；ＡＧＡＧ（配列番号８９）；ＴＴＡＡ（配列番号９０）；ＡＣＡＣ（配列番号９１）；ＡＣＴＧ（配列番号９２）；およびＡＧＧＣＴ（配列番号９３）からなる群より選択される、ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２】
請求項１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子であって、ここで、
ＣＯＲＥが、ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）；およびＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）からなる群より選択され；
ＦＬＡＮＫ１がＡＴであり、かつＦＬＡＮＫ２がＧＴであるか；またはＦＬＡＮＫ１がＴＣであり、かつＦＬＡＮＫ２がＴＣであるか；またはＦＬＡＮＫ１がＣＴＣであり、かつＦＬＡＮＫ２がＴＧＴであるか；またはＦＬＡＮＫ１がＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、かつＦＬＡＮＫ２がＡＧＧＣ（配列番号８８）である、ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項３】
ＣＯＲＥがＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）であるか；またはＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）であり、ＦＬＡＮＫ１がＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、かつＦＬＡＮＫ２がＡＧＧＣ（配列番号８８）である、請求項１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項４】
ＣＯＲＥがＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）であり、ＦＬＡＮＫ１がＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、かつＦＬＡＮＫ２がＡＧＧＣ（配列番号８８）である、請求項３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項５】
少なくとも約４０の特異性／親和性因子を有する、請求項３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項６】
前記第一鎖に少なくとも部分的に相補的な第二鎖を有する、請求項３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項７】
前記第一鎖に完全に相補的な第二鎖を有する、請求項３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項８】
ホスホジエステレート骨格を有する、請求項３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項９】
ホスホロチオエート骨格を有する、請求項３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１０】
ホスホジエステレート−ホスホロチオエート混合骨格を有する、請求項３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１１】
前記第一鎖および第二鎖が、ワトソン−クリック塩基対形成によってのみ互いに結合される、請求項３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１３】
配列番号２６〜７７からなる群より選択される配列を、５’から３’方向に含む、請求項１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１４】
配列番号２６〜７７からなる群より選択される配列から構成される鎖を、５’から３’方向に含む、請求項１３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１５】
配列番号２６〜３４からなる群より選択される配列を、５’から３’方向に含む、請求項１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１６】
配列番号２６〜３４の配列からなる鎖を、５’から３’方向に含む、請求項１５に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１７】
配列番号２６〜３１からなる群より選択される配列を、５’から３’方向に含む、請求項１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１８】
配列番号２６〜３１からなる群より選択される配列から構成される鎖を、５’から３’方向に含む、請求項１７に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項１９】
配列番号３０の配列を含む、請求項１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２０】
配列番号３０の配列からなる鎖を、５’から３’方向に含む、請求項１９に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２１】
前記第一鎖内に、前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む第二鎖をさらに含む、請求項１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２２】
前記第一鎖内に、前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列に完全に相補的な配列を含む第二鎖をさらに含む、請求項１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２３】
少なくとも１つの一本鎖オーバーハングをさらに含む、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２４】
２つの鎖が、５’末端および／３’末端で、ペプチド結合以外の共有結合によって連結される、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２５】
１２〜２８塩基長である、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２６】
１４〜２４塩基長である、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２７】
１４〜２２塩基長である、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２８】
改変ヌクレオチドまたは異常なヌクレオチドを含む、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項２９】
ホスホジエステル骨格を有する、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項３０】
ホスホロチオエート骨格を有する、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項３１】
ホスホジエステル−ホスホロチオエート混合骨格を有する、請求項２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【請求項３２】
請求項１に記載のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子を含む、組成物。
【請求項３３】
前記ｄｓＯＤＮ分子を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
炎症性疾患、免疫疾患または自己免疫疾患を処置する方法であって、必要のある哺乳動物被験体に、請求項１に記載のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記３５に記載の方法であって、前記炎症性疾患、免疫疾患または自己免疫疾患が、乾癬およびアトピー性皮膚炎；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；クローン病；潰瘍性大腸炎；外科的組織再灌流傷害；心筋梗塞；心停止；心臓手術後の再灌流；経皮経管的動脈新脈管形成後の再構築；発作；腹部大動脈瘤；発作後の大脳虚血；頭蓋外傷、血液量減少性ショック；喘息；自己免疫性糖尿病；呼吸停止；成人呼吸窮迫症候群；急性肺損傷；ベーチェット病；皮膚筋炎；多発性筋炎；多発性硬化症（ＭＳ）；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；変形性関節症；ループス腎炎；全身性エリテマドーデス；慢性関節リウマチ（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎；痛風性関節炎；シェーグレン症候群、血管炎；白血球の漏出を含む疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、アルツハイマー病；敗血症または外傷後の多臓器損傷症候群；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；糸球体腎炎を含む抗原−抗体複合体媒介性疾患；敗血症；サルコイドーシス；組織／臓器移植に対する免疫病理学的応答；胸膜炎、歯槽骨炎、血管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性肺炎症性を含む、胚の炎症；嚢胞性線維症；乾癬；胸焼け；および眼アレルギーからなる群より選択される、方法。
【請求項３７】
前記炎症性疾患または自己免疫疾患が、慢性関節リュウマチ（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎；自己免疫性糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、全身性エリテマトーデス、成人呼吸窮迫症候群、ベーチェット病、乾癬、慢性肺炎症性疾患、移植片対宿主反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アルツハイマー病、および胸焼けからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｄｓＯＤＮ  分子が、加圧法トランスフェクションによって投与される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｄｓＯＤＮ  分子が、レトロウイルストランスフェクションによって投与される請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｄｓＯＤＮ分子が、リポソームにより投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
癌を処置する方法であって、必要のある哺乳動物被験体に、請求項１に記載のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
前記被験体がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
再灌流障害または再狭窄を処置する方法であって、必要のある哺乳動物被験体に、請求項１に記載のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
前記被験体がヒトである、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイ分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（関連技術の説明）
ＮＦ−κＢは、共通の配列モチーフを認識するＤＮＡ結合タンパク質のＲｅｌファミリーのメンバーから構成される誘導性二量体転写因子のファミリーである。をの活性なＤＮＡ結合形態において、ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーのメンバーの種々の組合せから構成されるダイマーの不均質収集物である。現在のところ、このファミリーは、５個のメンバー（ｐ５２、ｐ５０、ｐ６５、ｃＲｅｌおよびＲｅｌ  Ｂと命名される）から構成される。このＲｅｌファミリーのメンバー間の相同性は、約３００アミノ酸のサイズであり、これらのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを構成するＲｅｌ相同性ドメインにわたる。
【０００３】
異なるＮＦ−κＢ二量体は、コンセンサス配列ＧＧＧＲＮＮＹＹＣＣ（配列番号１）（ここで、Ｒは、プリンであり、Ｙは、ピリミジンであり、そしてＮは、任意の塩基である）を有するＮＦ−κＢ部位に対する異なる結合親和性を示す。これらのＲｅｌタンパク質は、転写を活性化する能力が異なり、その結果、ｐ６５／ＲｅｌＡおよびｃ−Ｒｅｌのみが、哺乳動物ファミリーメンバーの中で、強力な転写活性化ドメインを含むことが見出された。ＮＦ−κＢは、細胞質中でその不活性形態で見出され、この細胞質において、このＮＦ−κＢは、ｐ６５／ｐ５０二量体の核局在シグナル領域を占める４３ｋＤａのタンパク質ＩκＢに結合している。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢのタンパク質分解性崩壊、その後のＲｅｌＡ／ｐ５０複合体の核への輸送で始まり、この核において、ＮＦ−κＢは、ＤＮＡ上のその認識部位に結合し、そして標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦκＢファミリーのさらなる総説については、例えば、Ｇｏｍｅｚら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２：４９−６０（１９９７）を参照のこと。
【０００４】
ｐ５２およびｐ５０は、トランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメインを含まない。転写活性化ドメインを欠くｐ５２および／またはｐ５０タンパク質のみから構成される二量体は、一般に、転写の活性化因子ではなく、そして転写抑制を媒介し得る。
【０００５】
Ｒｅｌ／ＮＦ−κＢファミリーの転写因子は、免疫応答および炎症応答の重要な調節因子であり、そしてリンパ球の増殖、生存および腫瘍形成に寄与する。従って、ＮＦ−κＢは、炎症、細胞増殖および免疫応答に関与するいくつかの遺伝子の発現において重要な役割を果たす（Ｄ’Ａｃｑｕｉｓｔｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１７３１−１７３７（２０００）；Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，３０６−３１３（２０００）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１８４７−１８５２（２０００））。ＮＦ−κＢにより調節される遺伝子のうちの多くが、種々の疾患および状態（例えば、いくつか挙げると、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、再狭窄、心筋梗塞、虚血再灌流障害、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、伏在静脈移植、アルツハイマー病）において重要な役割を果たす。例えば、Ｋｈａｌｅｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８６（２）：１７０−１７９（１９９８）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３（８）：８９４−８９９（１９９７）；Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １（３）：３８６−３９２（１９９９）；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１２２１−１２２９（２００２）；Ｓｈｉｎｔａｎｉら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７４：１１３２−１１３８（２００２）；およびＬｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７４（１）：１４３−１５０（２０００）を参照のこと。
【０００６】
ＮＦ−κＢデコイは、管形成術後の新内膜過形成、再狭窄および心筋梗塞の阻害のために提案された（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１６３５−１６４２（２００１）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３（８）：８９４−８９９（１９９７））。移植後の再灌流障害、急性拒絶および慢性拒絶のより大きな阻害は、同種移植片の生存の延長および移植冠状動脈疾患の減少をもたらす（Ｆｒｅｅｌｅｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７０（１１）：１５６０−１５６８（２０００））。ＮＦκＢデコイのインビボトランスフェクションは、急性心筋炎の処置のための新規のストラテジーを提供する（Ｙｏｋｏｓｅｋｉら、前出）。Ｕｅｎｏら（前出）は、ＮＦκＢデコイによりＮＦκＢをブロックすることにより、心臓における虚血再灌流障害が防止されることを報告した。
【０００７】
ヒト単球細胞株のＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６が、低用量のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）で２日間、予め処置された場合、その後のＬＰＳ刺激に対する応答は、強烈に減少することが示された（Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５５（１０：７３−８０（１９９４）；ＫａｓｔｅｎｂａｕｅｒおよびＺｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（４）：１５５３−９（１９９９））。これらのＬＰＳ耐性細胞をＬＰＳで刺激した場合、これらの細胞は、ゲルシフトアッセイにより示されるように、優勢なｐ５０ホモ二量体を示す。次いで、著者らは、レポーター遺伝子分析によって、遺伝子発現に対する変更されたＮＦ−κＢ複合体の影響を試験した。ＮＦ−κＢ依存性ＨＩＶ−１  ＬＴＲレポーター遺伝子構築物を、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞にトランスフェクトし、続いて、ＬＰＳと共にかまたはＬＰＳなしで予備培養し、そしてルシフェラーゼ活性を測定した。ＬＰＳ耐性細胞を試験した場合、ＬＰＳ刺激は、ＮＦ−κＢ依存性ＨＩＶ−１  ＬＴＲレポーター遺伝子のトランス活性化を増大しなかった。このことは、ＬＰＳ耐性細胞中に存在するＮＦ−κＢ複合体が、機能的に不活性であることを示す。このことはまた、ＮＦ−κＢ−制御ＴＮＦ遺伝子の転写に適用可能であった。ＴＮＦプロモーター制御ルシフェラーゼレポーター構築物を使用すると、ＬＰＳ耐性細胞は、ＬＰＳ刺激に対して最小の応答しか示さなかった。従って、ＬＰＳ耐性により誘導されるｐ５０ホモ二量体は、トランス活性化活性を欠くことが結論付けられた。その代わり、これらのｐ５０ホモ二量体は、同族ＮＦ−κＢ結合部位を占め、そしてｐ５０／ｐ６５複合体によるトランス活性化、すなわち転写を防止する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
項目１．  その第一鎖において５’から３’の方向に、処方物ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２の配列を含むＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子であって、ここで、
ＣＯＲＥは、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号５）；ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号７）；ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号９）；ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）；ＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１５）；ＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号１７）；ＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）；ＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２１）；ＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号２３）；ＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号２５）；およびＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号７８）からなる群より選択され；
ＦＬＡＮＫ１は、ＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号７９）；ＡＴ；ＴＣ；ＣＴＣ；ＣＴ；ＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）、ＴＴＧＡ（配列番号８１）；ＡＧＴＴＧＣ（配列番号８２）；ＧＴＴＧＡ（配列番号８３）；Ａ；ＡＡＧＡ（配列番号８４）；ＡＴＡＴ（配列番号８５）；ＣＡＡＣ（配列番号８６）；ＣＡＧＴ（配列番号８７）；ＴＧＡ；およびＧＡからなる群より選択され；
ＦＬＡＮＫ２は、ＴＣＣ；ＧＴ；ＴＣ；ＴＧＴ；ＴＣＡ；ＴＣ；ＣＡ；ＡＧＧＣ（配列番号８８）；．ＡＧ；ＡＧＧ；Ａ；ＡＧＡＧ（配列番号８９）；ＴＴＡＡ（配列番号９０）；ＡＣＡＣ（配列番号９１）；ＡＣＴＧ（配列番号９２）；およびＡＧＧＣＴ（配列番号９３）からなる群より選択される、ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【０００９】
項目２．  項目１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子であって、ここで、
ＣＯＲＥが、ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）；およびＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）からなる群より選択され；
ＦＬＡＮＫ１がＡＴであり、かつＦＬＡＮＫ２がＧＴであるか；またはＦＬＡＮＫ１がＴＣであり、かつＦＬＡＮＫ２がＴＣであるか；またはＦＬＡＮＫ１がＣＴＣであり、かつＦＬＡＮＫ２がＴＧＴであるか；またはＦＬＡＮＫ１がＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、かつＦＬＡＮＫ２がＡＧＧＣ（配列番号８８）である、ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１０】
項目３．  ＣＯＲＥがＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）であるか；またはＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）であり、ＦＬＡＮＫ１がＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、かつＦＬＡＮＫ２がＡＧＧＣ（配列番号８８）である、項目１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１１】
項目４．  ＣＯＲＥがＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）であり、ＦＬＡＮＫ１がＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、かつＦＬＡＮＫ２がＡＧＧＣ（配列番号８８）である、項目３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１２】
項目５．  少なくとも約４０の特異性／親和性因子を有する、項目３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１３】
項目６．  前記第一鎖に少なくとも部分的に相補的な第二鎖を有する、項目３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１４】
項目７．  前記第一鎖に完全に相補的な第二鎖を有する、項目３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１５】
項目８．  ホスホジエステレート骨格（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｔｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）を有する、項目３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１６】
項目９．  ホスホロチオエート骨格を有する、項目３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１７】
項目１０．  ホスホジエステレート−ホスホロチオエート混合骨格を有する、項目３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１８】
項目１１．  前記第一鎖および第二鎖が、ワトソン−クリック塩基対形成によってのみ互いに結合される、項目３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００１９】
項目１３．  配列番号２６〜７７からなる群より選択される配列を、５’から３’方向に含む、項目１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２０】
項目１４．  配列番号２６〜７７からなる群より選択される配列から構成される鎖を、５’から３’方向に含む、項目１３に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２１】
項目１５．  配列番号２６〜３４からなる群より選択される配列を、５’から３’方向に含む、項目１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２２】
項目１６．  配列番号２６〜３４の配列からなる鎖を、５’から３’方向に含む、項目１５に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２３】
項目１７．  配列番号２６〜３１からなる群より選択される配列を、５’から３’方向に含む、項目１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２４】
項目１８．  配列番号２６〜３１からなる群より選択される配列から構成される鎖を、５’から３’方向に含む、項目１７に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２５】
項目１９．  配列番号３０の配列を含む、項目１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２６】
項目２０．  配列番号３０の配列からなる鎖を、５’から３’方向に含む、項目１９に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２７】
項目２１．  前記第一鎖内に、前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む第二鎖をさらに含む、項目１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２８】
項目２２．  前記第一鎖内に、前記ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２配列に完全に相補的な配列を含む第二鎖をさらに含む、項目１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００２９】
項目２３．  少なくとも１つの一本鎖オーバーハングをさらに含む、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３０】
項目２４．  ２つの鎖が、５’末端および／３’末端で、ペプチド結合以外の共有結合によって連結される、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３１】
項目２５．  １２〜２８塩基長である、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３２】
項目２６．  １４〜２４塩基長である、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３３】
項目２７．  １４〜２２塩基長である、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３４】
項目２８．  改変ヌクレオチドまたは異常なヌクレオチドを含む、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３５】
項目２９．  ホスホジエステル骨格を有する、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３６】
項目３０．  ホスホロチオエート骨格を有する、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３７】
項目３１．  ホスホジエステル−ホスホロチオエート混合骨格を有する、項目２１に記載のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子。
【００３８】
項目３２．  項目１に記載のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子を含む、組成物。
【００３９】
項目３３．  前記ｄｓＯＤＮ分子を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物である、項目３２に記載の組成物。
【００４０】
項目３４．  炎症性疾患、免疫疾患または自己免疫疾患を処置する方法であって、必要のある哺乳動物被験体に、項目１に記載のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【００４１】
項目３５．  前記哺乳動物被験体が、ヒトである、項目３４に記載の方法。
【００４２】
項目３６．  前記３５に記載の方法であって、前記炎症性疾患、免疫疾患または自己免疫疾患が、乾癬およびアトピー性皮膚炎；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；クローン病；潰瘍性大腸炎；外科的組織再灌流傷害；心筋梗塞；心停止；心臓手術後の再灌流；経皮経管的動脈新脈管形成後の再構築（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）；発作；腹部大動脈瘤；発作後の大脳虚血；頭蓋外傷、血液量減少性ショック；喘息；自己免疫性糖尿病；呼吸停止；成人呼吸窮迫症候群；急性肺損傷；ベーチェット病；皮膚筋炎；多発性筋炎；多発性硬化症（ＭＳ）；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；変形性関節症；ループス腎炎；全身性エリテマドーデス；慢性関節リウマチ（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎；痛風性関節炎；シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、血管炎；白血球の漏出を含む疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、アルツハイマー病；敗血症または外傷後の多臓器損傷症候群；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；糸球体腎炎を含む抗原−抗体複合体媒介性疾患；敗血症；サルコイドーシス；組織／臓器移植に対する免疫病理学的応答；胸膜炎、歯槽骨炎、血管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性肺炎症性を含む、胚の炎症；嚢胞性線維症；乾癬；胸焼け（ｐｙｒｅｓｉｓ）；および眼アレルギーからなる群より選択される、方法。
【００４３】
項目３７．  前記炎症性疾患または自己免疫疾患が、慢性関節リュウマチ（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎；自己免疫性糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、全身性エリテマトーデス、成人呼吸窮迫症候群、ベーチェット病、乾癬、慢性肺炎症性疾患、移植片対宿主反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アルツハイマー病、および胸焼けからなる群より選択される、項目３６に記載の方法。
【００４４】
項目３８．  前記ｄｓＯＤＮ  分子が、加圧法トランスフェクションによって投与される項目３７に記載の方法。
【００４５】
項目３９．  前記ｄｓＯＤＮ  分子が、レトロウイルストランスフェクションによって投与される項目３７に記載の方法。
【００４６】
項目４０．  前記ｄｓＯＤＮ分子が、リポソームにより投与される、項目３７に記載の方法。
【００４７】
項目４１．  癌を処置する方法であって、必要のある哺乳動物被験体に、項目１に記載のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【００４８】
項目４２．  前記被験体がヒトである、項目４１に記載の方法。
【００４９】
項目４３．  再灌流障害または再狭窄を処置する方法であって、必要のある哺乳動物被験体に、項目１に記載のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【００５０】
項目４４．  前記被験体がヒトである、項目４３に記載の方法。
【００５１】
本発明は、二本差ＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＮＦ−κＢｄｓＯＤＮ）分子に関し、この分子は、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合し得るコア配列を含む。特定の局面において、本発明は、ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーよりもｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に優先的に結合するＮＦ−κＢデコイ分子に関する。本発明の選択的デコイ分子は、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体をブロックしないことにより、これらのホモ二量体がＮＦ−κＢ調節遺伝子のプロモーターをブロックすることを可能にし、それにより、遺伝子転写のさらなるレベルのネガティブ調節を提供する。結果として、この選択的ＮＦ−κＢデコイ分子は、インビトロおよびインビボの両方において、ＮＦ−κＢ活性の特に強力なインヒビターである。実際、単回用量の選択的デコイは、慢性関節リウマチ（ＲＡ）のインビボモデルにおいて、腫脹を有意に減少させることが示されている。
【００５２】
１つの局面において、本発明は、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体よりもｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に優勢に結合する、二本差ＮＦ−κＢデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ）分子に関する。
【００５３】
別の局面において、本発明は、少なくとも約４０、または少なくとも約５０、または少なくとも約６０、または少なくとも約７０、または少なくとも約８０の特異性／親和性率を有するＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子に関する。好ましい実施形態において、本発明のデコイ分子はさらに、ｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体に対する結合親和性の増加を示し、そして／またはインビボにおける改善された安定性を有する。
【００５４】
さらなる局面において、本発明は、第１の鎖中に、５’→３’方向で、式ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２の配列を含む、ｄｓＯＤＮ分子に関し、ここで、
ＣＯＲＥは、ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号５）；ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号７）；ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号９）；ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）、ＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１５）；ＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号１７）；ＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）；ＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２１）；ＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号２３）；ＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号２５）；およびＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号７８）からなる群から選択され；
ＦＬＡＮＫ１は、ＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号７９）；ＡＴ；ＴＣ；ＣＴＣ；ＣＴ；ＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）；ＴＴＧＡ（配列番号８１）；ＡＧＴＴＧＣ（配列番号８２）；ＧＴＴＧＡ（配列番号８３）；Ａ；ＡＡＧＡ（配列番号８４）；ＡＴＡＴ（配列番号８５）；ＣＡＡＣ（配列番号８６）；ＣＡＧＴ（配列番号８７）；ＴＧＡ；およびＧＡからなる群から選択され；そして
ＦＬＡＮＫ２は、ＴＣＣ；ＧＴ；ＴＣ；ＴＧＴ；ＴＣＡ；ＴＣ；ＣＡ；ＡＧＧＣ（配列番号８８）；ＡＧ；ＡＧＧ；Ａ；ＡＧＡＧ（配列番号８９）；ＴＴＡＡ（配列番号９０）；ＡＣＡＣ（配列番号９１）；ＡＣＴＧ（配列番号９２）；およびＡＧＧＣＴ（配列番号９３）からなる群から選択される。
【００５５】
特定の実施形態において、
ＣＯＲＥは、ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）；およびＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）からなる群から選択され；そして
ＦＬＡＮＫ１は、ＡＴであり、かつＦＬＡＮＫ２が、ＧＴであるか；またはＦＬＡＮＫ１が、ＴＣであり、かつＦＬＡＮＫ２が、ＴＣであるか；またはＦＬＡＮＫ１が、ＣＴＣであり、かつＦＬＡＮＫ２が、ＴＧＴであるか；またはＦＬＡＮＫ１が、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、かつＦＬＡＮＫ２が、ＡＧＧＣ（配列番号８８）である。
【００５６】
別の特定の実施形態において、ＣＯＲＥは、ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；またはＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）であり、ＦＬＡＮＫ１は、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、そしてＦＬＡＮＫ２は、ＡＧＧＣ（配列番号８８）である。
【００５７】
さらに別の特定の実施形態において、ＣＯＲＥは、ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）であり、ＦＬＡＮＫ１は、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、ＦＬＡＮＫ２は、ＡＧＧＣ（配列番号８８）である。
【００５８】
このＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子は、この第１の鎖に少なくとも部分的に相補的な第２の鎖を含み、そしてホスホジエステレート骨格、ホスホロチオエート骨格、ホスホジエステレート−ホスホロチオエート混合骨格、または任意の他の改変された骨格を有し得る。
【００５９】
これらの２つの鎖は、単に、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成によって、および／または共有結合によってのみ、互いに連結され得る。
【００６０】
さらなる局面において、本発明は、配列番号２６〜７７からなる群から選択される配列を、５’→３’方向で含む、ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子に関する。
【００６１】
なおさらなる局面において、本発明は、配列番号２６〜３４からなる群から選択される配列を、５’→３’方向で含む、ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子に関する。
【００６２】
別の局面において、本発明は、配列番号２６〜３１からなる群から選択される配列を、５’→３’方向で含む、ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子に関する。
【００６３】
さらに別の局面において、本発明は、配列番号３０の配列を含む、ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子に関する。
【００６４】
特定の実施形態において、このＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子は、１２〜２８塩基対長、または１４〜２４塩基対長、または１４〜２２塩基対長であり、そして改変されたかまたは異常なヌクレオチドを含み得る。
【００６５】
別の局面において、本発明は、上記のようなＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を含む組成物に関する。この組成物は、例えば、薬学的組成物であり得る。
【００６６】
さらに別の局面において、本発明は、炎症疾患、免疫疾患または自己免疫疾患の処置のための方法に関し、この方法は、このような処置を必要とする哺乳動物被験体に、有効量の上記のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子を投与する工程を包含する。
【００６７】
本発明はさらに、癌の処置のための方法に関し、この方法は、このような処置を必要とする哺乳動物被験体に、有効量の本明細書中のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子を投与する工程を包含する。
【００６８】
さらなる局面において、本発明は、再灌流障害または再狭窄の処置のための方法に関し、この方法は、このような処置を必要とする哺乳動物被験体に、有効量の本明細書中のＮＦ−κＢ二本鎖デコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子を投与する工程を包含する。
【００６９】
全ての局面において、哺乳動物被験体は、好ましくはヒトである。
【００７０】
（発明の詳細な説明）
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）は、本願で使用される用語の多くに対する一般的な説明を当業者に提供する。
【００７１】
用語「二本鎖」は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成によってのみ互いに連結される２つの相補ヌクレオチド鎖を含む核酸分子をいうために使用される。この用語は、特に、２つの相補鎖により形成される二本鎖領域に加えて、一本鎖オーバーハングを含む分子を含む。
【００７２】
用語「オリゴヌクレオチドデコイ」、「二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ」、「オリゴデオキシヌクレオチドデコイ」および「二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドデコイ」は、交換可能に使用され、そして標的転写因子に結合し、そしてこの標的転写因子の生物学的機能を妨害する二本鎖領域を含む、短い核酸分子をいう。従って、用語「ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイ」、「二本鎖ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイ」、「ＮＦ−κＢオリゴデオキシヌクレオチドデコイ」および「二本鎖ＮＦ−κＢオリゴデオキシヌクレオチドデコイ」は、交換可能に使用され、そしてＮＦ−κＢ転写因子に結合し、そしてこのＮＦ−κＢ転写因子の生物学的機能を妨害する二本鎖領域を含む、短い核酸分子をいう。用語「二本鎖」は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成により互いに連結される２つの相補ヌクレオチド鎖を含む核酸分子をいうために使用される。この用語は特に、２つの相補鎖により形成される二本鎖領域に加えて、一本鎖オーバーハングを含む、ＮＦ−κＢオリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子を含む。さらに、この用語は、特に、この二本鎖領域に加えて、２つの鎖が、その３’末端および／または５’末端で互いに共有結合されているＮＦ−κＢオリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子を含む。
【００７３】
用語「ＮＦ−κＢ」は、本明細書中において最も広い意味で使用され、そして任意の動物種の全ての天然に存在するＮＦ−κＢ分子（ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーのメンバー（例えば、ｐ５２、ｐ５０、ｐ６５、ｃＲｅｌおよびＲｅｌ  Ｂ）の全ての組合せを含む）を含む。
【００７４】
用語「転写因子結合配列」は、転写因子が結合する短いヌクレオチド配列である。この用語は、特に、その転写が１つ以上の転写因子により調節される遺伝子の調節領域において代表的に見出される天然に存在する結合配列を含む。この用語はさらに、人工（合成）配列（これは、天然には存在しないが、内在性遺伝子中の結合部位への転写因子の結合を競合的に阻害し得る）を含む。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、成句「改変されたヌクレオチド」とは、組成および／または構造が、天然のヌクレオチドおよびヌクレオチド三リン酸とは異なるヌクレオチドまたはヌクレオチド三リン酸をいう。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「５プライム」または「５’」、および「３プライム」または「３’」は、核酸に対する特定の方向をいう。核酸は、個々の化学的方向を有し、その結果、これらの２つの末端は、５プライム（５’）または３プライム（３’）のいずれかとして区別される。核酸の３’末端は、末端ペントース糖の３’炭素に結合した遊離ヒドロキシル基を含む。核酸の５’末端は、末端ペントース糖の５’炭素に結合した遊離ヒドロキシル基またはホスフェート基を含む。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、用語「オーバーハング」とは、平滑末端を有さない二本鎖核酸分子をいい、その結果、これら２つの鎖の末端は、同一の長さを有さず、そしてその結果、一方の鎖の５’末端は、反対の相補鎖の３’末端を越えて伸長する。線状核酸分子が、０、１または２個の５’オーバーハングを有することが可能である。
【００７８】
本明細書中において使用される場合、用語「優先的結合」、「優先的に結合する」およびこれらの文法的等価物は、特異性／親和性因子が少なくとも約４０であることを意味するように使用され、ここで、特異性／親和性の比は、以下のように定義される：
特異性／親和性因子＝（Ｓｐ５０／ｐ５０−ＳＰ６５／ｐ５０）×Ｓｐ５０／ｐ５０／Ｓｐ６５／ｐ５０
ここで、Ｓｐ５０／ｐ５０は、ＨＩＶ由来の非哺乳動物ＮＦ−κＢプロモーター（配列１１３／１１４）に対するｐ５０／ｐ５０の結合の５０％を完了するために必要とされるデコイのモル過剰に等しく、そしてＳＰ６５／ｐ５０は、ＨＩＶ由来の非哺乳動物ＮＦ−κＢプロモーター（配列１１３／１１４）に対するｐ６５／ｐ５０の結合の５０％を完了するために必要とされるデコイのモル過剰に等しい。スコア（Ｓ）は、試験されるいずれのモル比においてもデコイが結合の少なくとも５０％を完了し得ない場合に、１００とみなされる。
【００７９】
本明細書中において使用される場合、用語「炎症性疾患」または「炎症性障害」とは、代表的に好中球走化性によって引き起こされる、炎症を生じる病理学的状態をいう。このような障害の例としては、炎症性皮膚病（乾癬およびアトピー性皮膚炎が挙げられる）；全身性強皮症および全身性硬化症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）に関連する応答；虚血性再灌流障害（手術組織再灌流障害、心筋虚血状態（例えば、心筋梗塞、心拍停止、心臓手術後の再灌流および経皮的経管的冠状動脈形成術後の狭窄、発作、ならびに腹大動脈の動脈瘤）が挙げられる）；発作に続発する脳水腫；頭側の外傷、循環血液量減少性ショック；仮死；成人呼吸促進症候群；急性肺傷害；ベーチェット病；皮膚筋炎；多発性筋炎；多発性硬化症（ＭＳ）；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；変形性関節症；ループス腎炎；自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、脈管炎）；白血球漏出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、敗血症または外傷に続発する多発性器官傷害症候群；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；抗原−抗体複合体媒介疾患（糸球体腎炎が挙げられる）；セプシス；サルコイドーシス；組織／器官移植に対する免疫病理学的応答；肺の炎症（胸膜炎、肺胞炎、脈管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺臓炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、および嚢胞性線維症が挙げられる）などが挙げられる。好ましい適応症としては、限定されないが、炎症および関連する障害に関連する任意の疾患または障害と共に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎および他の関節炎状態、慢性炎症、自己免疫糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、全身性エリテマトーデス、成人呼吸促進症候群、ベーチェット病、乾癬、慢性肺炎症性疾患、対宿主性移植片反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アルツハイマー病、および胸焼け（ｐｙｒｅｓｉｓ）が挙げられる。
【００８０】
用語「アポトーシス」および「アポトーシス活性」は、広い意味で使用され、そして代表的には１つ以上の特徴的な細胞変化（細胞質の濃縮、原形質膜の微小絨毛の損失、核の分裂、染色体ＤＮＡの分解またはミトコンドリア機能の損失が挙げられる）を伴う、哺乳動物における細胞死の秩序立った形態または制御された形態をいう。この活性は、例えば、細胞生存度アッセイ、ＦＡＣＳ分析またはＤＮＡ電気泳動によって、決定および測定され得る。
【００８１】
用語「癌」および「癌性」とは、調節されていない細胞増殖によって代表的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態をいうか、または記載する。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、および肉腫が挙げられる。このような癌の特定の例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸部癌、膵臓癌、多形性膠芽腫、頸部癌、胃癌、膀胱癌、ヘパトーム、結腸癌腫、ならびに頭部および頸部の癌が挙げられる。好ましい実施形態において、癌としては、胸部癌、卵巣癌、前立腺癌、および肺癌が挙げられる。
【００８２】
用語「処置」とは、治療処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）手段または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいい、ここで、その目的は、標的の病理学的状態または障害を予防するか、または遅く（少なく）することである。本発明の目的で、有用または望ましい臨床的結果としては、限定されないが、検出可能であっても検出不可能であっても、症状の軽減、疾患の程度の減少、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の軽減または緩和、および寛解（部分的であっても全身的であっても）が挙げられる。処置が必要なヒトとしては、障害を既に有するヒト、および障害を有しやすいヒトまたは障害が予防されるべきヒトが挙げられる。腫瘍（例えば、癌）の処置において、治療剤は、腫瘍細胞の病理を直接減少させ得るか、または腫瘍細胞を他の治療剤（例えば、放射線および／もしくは化学療法）による処置に対してより感受性にし得る。
【００８３】
「被験体」とは、脊椎動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトである。
【００８４】
用語「哺乳動物」は、本明細書中で、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、限定されないが、ヒト、高等霊長類、げっ歯類、家畜および飼育動物、および動物園、スポーツまたはペットの動物（例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が挙げられる。好ましくは、本明細書中において、哺乳動物は、ヒトである。
【００８５】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明の基礎にある１つの概念は、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーおよび／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマーを結合し得るがｐ５０／ｐ５０ホモダイマーを結合し得ないデコイ分子、あるいはｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーおよび／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマーを優先的に結合するデコイ分子を設計することによって、ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーがこれらの部位を占めたままにすることにより、ＮＦ−κＢに駆動されるプロモーターの余分な遮断を提供し得ることである。その結果、このような選択的デコイ分子は、当該分野において公知のＮＦ−κＢデコイよりもＮＦ−κＢ活性をブロックする可能性を有する。
【００８６】
（改良された特性を有するＮＦ−κＢデコイの設計）
（１．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の設計）
本発明のオリゴヌクレオチドデコイは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子（Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１（６６６５）：４１０−３（１９９８））に結合する、５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号２）のコンセンサス配列を含むｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーの結晶構造を利用して、設計された。この著者らは、ｐ５０が５塩基対のサブサイト５’−ＧＧＧＡＣ−３’（配列番号３）に接触すること、およびｐ６５が４塩基対のサブサイト５’−ＴＴＣＣ−３’（配列番号４）に接触することを示した。ｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーによるＤＮＡ接触は、ホモダイマー構造におけるＤＮＡ接触と類似である（Ｇｈｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３（６５１２）：３０３−１０（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６９（１）：１１３−７（１９９５））。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子は、ワトソン−クリック塩基対合によって互いに結合した、２つのオリゴヌクレオチド鎖からなる。代表的に、これら２つの鎖における全てのヌクレオチドが、この塩基対合に関与するが、このことは必要条件ではない。１つ以上（例えば、１〜３ヌクレオチドまたは１もしくは２ヌクレオチド）が塩基対合に関与しないオリゴヌクレオチドデコイ分子もまた、包含される。さらに、二本鎖デコイは、３’および／または５’の一本鎖突出部を含み得る。
【００８８】
別の実施形態において、本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子は、ワトソン−クリック塩基対合によって互いに結合し、そしてさらに、３’末端もしくは５’末端、またはその両方で互いに共有結合して、ダンベル構造または円形分子を生じる、２つのオリゴヌクレオチド鎖を含む。この共有結合は、例えば、ホスホジエステル結合または他の連結基（例えば、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、またはホスホロアミデート結合など）によって提供され得る。
【００８９】
一般に、本発明のｄｓＯＤＮ分子は、５’配列および／または３’配列に隣接した、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合し得る、コア配列を含み、ここで、このコア配列は、約５〜１４塩基対、または約６〜１２塩基対、または約７〜約１０塩基対からなり；そしてこの隣接配列は、約２〜８塩基対長、または約２〜６塩基対長、または約２〜４塩基対長である。代表的には、この分子は、完全にかまたは部分的に相補的な２本の鎖からなる領域約１２〜２８塩基対長、好ましくは約１４〜２４塩基対長の二本鎖領域（コア配列および隣接配列を含む）を含む。
【００９０】
コア配列（その長さ、配列、塩基改変および骨格構造を含む）を変化させることによって、ＮＦ−κＢデコイ分子の結合親和性、安定性および特異性を変化させることが可能である。実際に、本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子（これは、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーおよび／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマーを高い親和性で結合し、そしてｐ５０／ｐ５−ホモダイマーに対する結合親和性を全く示さないか、もしくは低い親和性のみを示す）は、ＤＮＡに結合するｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーの結晶構造に基づいて、コンセンサスオリゴヌクレオチドデコイの結合部位（コア）における標的化残基を欠失または変化させることによって、設計された。
【００９１】
さらに、隣接配列における変化は、ＮＦ−κＢデコイ分子のインビボでの安定性に対して本来の影響を有し、そしてその安定性を有意に増加させ得、そして結合親和性および／または結合特異性に影響を与え得る。特に、ＮＦ−κＢデコイ分子の形状／構造は、コア結合配列に隣接する配列を変化させることによって変化され得、これは、改善された安定性および／または結合親和性を生じ得る。ＤＮＡの形状および構造は、塩基対配列、ＤＮＡの長さ、ヌクレオチドの骨格および性質（すなわち、改変された糖または塩基に対するネイティブのＤＮＡ）によって影響を受ける。従って、分子の形状および／または構造はまた、他のアプローチによって（例えば、全長を変化させることによって、その分子内の完全な相補性の二本鎖領域の長さを変化させることによって、コア配列および隣接配列内の変化によって、骨格構造を変化させることによって、ならびに塩基改変によって）変化され得る。
【００９２】
本発明のデコイ分子に存在するヌクレオチド配列は、改変されたヌクレオチドまたは通常でないヌクレオチドを含み得、そして変化した骨格化学を有し得る。合成ヌクレオチドは、種々の様式で改変され得る。例えば、Ｂｉｅｌｉｎｓｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：９９７−１０００（１９９０）を参照のこと。従って、酸素が、窒素、硫黄または炭素で置き換えられ得るか；リンが炭素で置き換えられ得るか；デオキシリボースが他の糖で置き換えられ得るか、あるいは個々の塩基が非天然塩基で置き換えられ得る。従って、ヌクレオチド間連結の非架橋酸素原子の、硫黄基との置換（ホスホロチオエート結合を得るため）は、ｄｓＯＤＮ分子のヌクレアーゼ抵抗性を増加させる際に有用である。硫黄改変の数とＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の安定性および特異性との間の関係を決定する実験は、本明細書中で、以下の実施例に記載されている。
【００９３】
各場合において、任意の変化が、ＮＦ−κＢ転写因子に対するオリゴヌクレオチドデコイの結合能力および親和性に対する改変の影響、融点およびインビボでの安定性に対する影響、ならびに任意の有害な生理学的影響について評価される。このような改変は、当該分野において周知であり、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドについて広範な適用を見出しており、従って、これらの安全性および結合親和性の保持は、十分に確立されている（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１５１０−１５１３（１９９３）を参照のこと）。
【００９４】
改変されたヌクレオチドの例は、限定されないが、以下である：４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β，Ｄ−ガラクトシルキューオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボナールメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステルウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウリジンキューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）−カルバモイルスレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、３−（３，３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ウリジン（ａｃｐ３）ｕ、およびワイブトシン。
【００９５】
さらに、ヌクレオチドは、例えば、ホスホロアミデート結合によって、互いに連結され得る。この結合は、結合酸素（−Ｏ−）がアミノ基（−ＮＲ−）で置き換えられるような、天然のホスホジエステル結合のアナログであり、ここで、Ｒは、代表的に、水素または低級アルキル基（例えば、メチルまたはエチル）である。他の結合（例えば、ホスホチオエート、ホスホジチオエートなど）もまた、可能である。
【００９６】
本発明のデコイはまた、ポリヌクレオチド構造に一般的に存在する、リボース糖またはデオキシリボース糖の改変形態または類似形態を含み得る。このような改変としては、限定されないが、２’−置換糖（例えば、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロリボースおよび２’−アジドリボース）、カルボキシル糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロース、リキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび無塩基ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド））が挙げられる。
【００９７】
一般に、本発明のオリゴヌクレオチドデコイは、好ましくは約５０％より多い、より好ましくは約８０％より多い、最も好ましくは約９０％より多い、従来のデオキシリボースヌクレオチドからなる。
【００９８】
本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮデコイは、それらの局在化、精製を容易にするため、またはその特定の特性を改善するために、さらに改変され得る。例えば、細胞核へのデコイ分子の送達を改善するために、核局在化シグナル（ＮＬＳ）が、デコイ分子に付着され得る。ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌタンパク質は、通常のＲｅｌ相同性ドメインを含み、これは、ＮＬＳを含む。好ましい実施形態において、このような天然に存在するＮＬＳ、またはその改変体は、本発明のデコイ分子において使用される。
【００９９】
さらに、本発明のＮＦ−κＢデコイ分子は、例えば、以下の参考文献に記載されるように、キャリア分子（例えば、ペプチド、タンパク質または他の型の分子）と結合体化され得る：Ａｖｒａｍｅａｓら、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  １６、３８３−３９１（２００１）；Ａｖｒａｍｅａｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：８７−９３（１９９９）；Ｇａｌｌａｚｚｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４，１０８３−１０９５（２００３）；Ｒｉｔｔｅｒ，Ｗ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１，７０８−７１７（２００３）。
【０１００】
本発明のＮＦ−κＢデコイ分子は、送達、分配、標的特異的細胞型を改善するか、または細胞障壁を通る遷移を容易にする、送達ビヒクルを含むようにさらに誘導体化され得る。このような送達ビヒクルとしては、限定されないが、細胞貫入エンハンサー、リポソーム、リポフェクチン、デンドリマー、ＤＮＡインターカレーター、およびナノ粒子が挙げられる。
【０１０１】
（２．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の合成）
本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子は、標準的なホスホジエステル化学またはホスホロアミデート化学によって、市販の自動合成機を使用して、合成され得る。実施例に記載される特定のｄｓＯＤＮ分子は、自動ＤＮＡ合成機（Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して合成された。これらのデコイは、カラムクロマトグラフィーによって精製され、凍結乾燥され、そして培養培地中に溶解された。各デコイの濃度は、分光光度法により決定された。
【０１０２】
（３．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の特徴付け）
本発明のＮＦ−κＢデコイ分子は、ゲルシフトアッセイ、または電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイにおいて、好都合に試験および特徴付けされ得る。このアッセイは、ＤＮＡに対する転写因子の結合の検出のための、迅速かつ高感度の方法を提供する。このアッセイは、タンパク質とＤＮＡとの複合体が、遊離二本鎖オリゴヌクレオチドより遅く、非変性ポリアクリルアミドゲルを通って移動するという観察に基づく。ゲルシフトアッセイは、精製されたタンパク質、またはタンパク質の複雑な混合物（例えば、核抽出物）を、転写因子結合部位を含む、３２Ｐで末端標識されたＤＮＡフラグメントと共にインキュベートすることによって、実施される。次いで、この反応生成物は、非変性ポリアクリルアミドゲルで分析される。結合部位に対する転写因子の特異性は、目的のタンパク質に対する結合部位またはスクランブルＤＮＡ配列のいずれかを含む、過剰量のオリゴヌクレオチドを使用する競合実験によって確立される。複合体に含まれるタンパク質の同定は、タンパク質を認識する抗体を使用し、次いでＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体の減少した移動度、または放射線標識されたオリゴヌクレオチドプローブに対するこの複合体の結合の妨害を探すことによって、確立される。
【０１０３】
ＤＮＡに結合するｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーの結晶構造に基づいて、本明細書中の選択的ＮＦ−κＢデコイを設計する際に、コンセンサスオリゴヌクレオチドデコイの結合部位（コア）における標識された残基を欠失させた。最終目的は、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーおよび／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマー、好ましくは、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーとｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマーとの両方を、高い親和性で結合し得、そしてｐ５０／ｐ５０ホモダイマーに対して低い親和性を示す、二本鎖オリゴヌクレオチドを設計することであった。この目的を達成するために、以下の実施例１に記載されるように、種々のＮＦ−κＢデコイを、ゲルシフトアッセイにおいて、それらが異なるＮＦ−κＢタンパク質に結合する能力について試験した。
【０１０４】
（４．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の使用）
ＮＦ−κＢは、多数の遺伝子の転写の調節に関与する。ＮＦ−κＢによって転写的に活性化される遺伝子の代表的な分類および列挙が、以下に提供される。
【０１０５】
サイトカイン／ケモカインおよびそれらのモジュレーター（例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５）、リンフォトキシン−α、リンフォトキシン−β、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ。
【０１０６】
免疫調節因子（例えば、ＢＲＬ−１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド、ＣＤ４８、ＣＤ８３、ＣＤ２３、ＩＬ−２レセプターα鎖、特定の免疫グロブリン重鎖および軽鎖、ＭＨＣクラスＩ抗原、Ｔ細胞レセプターサブユニット、ＴＮＦ−レセプター（ｐ７５／８０）。
【０１０７】
抗原提示に関与するタンパク質（例えば、補体Ｂ、補体成分３、ＴＡＰ１、およびタパシン（ｔａｐａｓｉｎ））。
【０１０８】
細胞接着分子（例えば、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびテネイシン−Ｃ）。
【０１０９】
急性期タンパク質（例えば、アンギオテンシノゲン、β−ディフェンシン−２、補体因子、組織因子−１（ＴＦ−１）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子。
【０１１０】
ストレス応答遺伝子（例えば、アンギオテンシン−２、ＣＯＸ−２、ＭＡＰ４Ｋ１、ホスホリパーゼＡ２）。
【０１１１】
細胞表面レセプター（例えば、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＥＧＦ−Ｒ、Ｌｏｘ−１、Ｍｄｒ１）。
【０１１２】
アポトーシスの調節因子（例えば、Ｂｆｌ１、Ｂｃｌ−ｘＬ、カスパーゼ−１１、ＣＤ９５、（Ｆａｓ）、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−２）。
【０１１３】
増殖因子およびその調節因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ）。
【０１１４】
初期応答遺伝子（例えば、ＴＩＥＧ、Ｂ９４、Ｅｇｒ−１）。
【０１１５】
さらに、ＮＦ−κＢは、他の転写因子（例えば、ｃ−ｍｙｃ−、ｃ−ｍｙｂ、Ａ２０、ｊｕｎＢ、ｐ５３、ＷＴ１およびウイルス）の転写を調節する。
【０１１６】
従って、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）および免疫調節因子の、ＮＦ−κＢ誘導性の発現の阻害は、炎症、免疫および自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）（Ｒｏｓｈａｋら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２：３１６−３２１（２００２））；クローン病および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（Ｄｉｊｋｓｔｒａら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊ．  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌ．２３６：３７−４１（２００２））、膵炎（Ｅｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ａｄｌｅｒ，Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ  １：３５６−３６２  （２００１））、歯周炎（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ  ６：２０−２９（２００１））；狼瘡（ＫａｍｍｅｒおよびＴｓｏｋｏｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：１３１−１５０（２００２））；喘息（ＰａｈｌおよびＳｚｅｌｅｎｙｉ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：２７３−２８２（２００２））；および眼のアレルギー（Ｂｉｅｌｏｒｙら、Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：４３５−４４５（２００３））の処置において有用である。
【０１１７】
ＮＦ−κＢは、サイトカインおよび接着分子の遺伝子（これらの遺伝子は、以下に関与する：アテローム硬化症および欠陥損傷後の病変形成（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１６３５−１６４２（２００１））；大脳虚血後の神経損傷（Ｕｅｎｏら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １２２（４）：７２０−７２７（２００１））；慢性気道炎症（Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，３０６−３１３（２０００））；自己免疫心筋炎の進行（Ｙｏｋｏｓｅｋｉら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９：８９９−９０６（２００１））；心臓移植における急性拒絶および移植片動脈症（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１８４７−１８５２（２０００））；ならびに心筋梗塞（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３（８）：８９４−８９９（１９９７）））の協調された転写において重要な役割を果たすので、ＮＦ−κＢデコイ分子はまた、このような疾患および傷害の処置において有用性を見出す。
【０１１８】
最近の証拠は、ＮＦ−κＢおよびその活性化に関与するシグナル伝達経路がまた、腫瘍発症に重要であることを示す。例えば、Ｋａｒｉｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２（４）：３０１−１０（２００２）を参照のこと。従って、本発明のデコイ分子によるＮＦ−κＢの遮断は、癌の予防および処置において有用性を見出し、単独でかまたは他の処置の選択肢と組み合わせてかのいずれかで、新規の抗癌ストラテジーを提供する。
【０１１９】
（５．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の送達）
本発明のＮＦ−κＢデコイを送達する好ましい様式は、圧力媒介性のトランスフェクション（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号および同第６，３９５，５５０（これらの全開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載される）である。簡潔には、このＮＦ−κＢデコイ分子は、細胞の細胞外環境中にデコイ核酸を配置し、そして細胞および細胞外環境の周りのインキュベーション圧力を確立することによって、組織中の細胞に送達される。インキュベーション圧力の確立は、細胞による核酸の取り込みを容易にし、そして細胞の核への局在を増強する。
【０１２０】
より具体的には、組織および細胞外環境を含む密封封入体が規定され、そしてインキュベーション圧力が、この密封封入体内で確立される。好ましい実施形態において、この封入体の境界は、封入手段によって実質的に規定され、その結果、標的組織（標的細胞を含む組織）が、等方性の圧力に供され、そして膨張せず、また外傷を受けることもない。別の実施形態において、封入体境界の一部は、組織によって規定される。次いで、非弾性シースのような保護的手段が、この組織の周りに配置されて、組織における膨張および外傷を防止する。インキュベーション圧力は、用途に依存するが、多くの用途について、大気圧よりも約３００ｍｍＨｇ〜１５００ｍｍＨｇ高いインキュベーション圧力、または大気圧よりも少なくとも約１００ｍｍＨｇ高いインキュベーション圧力が、一般に適切である。
【０１２１】
最大のトランスフェクション効率を達成するために必要なインキュベーション期間は、インキュベーション圧力および標的組織型のようなパラメータに依存する。いくつかの組織（例えば、ヒト静脈組織）について、低圧（約０．５気圧）で分単位の（１０分より長い）のインキュベーション期間が、８０〜９０％のトランスフェクション効率を達成するために充分である。他の組織（例えば、ラットの大動脈組織）について、高圧（約２気圧）で数時間単位の（１時間より長い）インキュベーション期間が、８０〜９０％のトランスフェクション効率を達成するために充分である。
【０１２２】
この型の送達のために適切な哺乳動物標的組織としては、血管組織（特に、動脈における移植片として使用される静脈）、心臓、骨髄、ならびに正常な結合組織および腫瘍結合組織、肝臓、生殖−泌尿系、骨、筋肉、胃腸器官、内分泌および外分泌器官、滑膜組織ならびに皮膚が挙げられる。本発明の方法は、器官の一部、器官全体または生物全体に対して適用され得る。１実施形態において、核酸溶液は、患者の標的領域（例えば、腎臓）へと灌流され得、そしてこの患者は、加圧チャンバにおいて圧力に供される。
【０１２３】
他の適用について、本発明のＮＦ−κＢデコイは、他の従来技術によって投与され得る。例えば、トランスフェクションに適切な公知の方法の中には、レトロウイルストランスフェクション、リポソーム形態でのトランスフェクションがある。詳細については、Ｄｚａｕら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １１：２０５−２１０（１９９３）；またはＭｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８４７４−８４７８  （１９９３）もまた参照のこと。リポソームで投与される場合、管腔内のデコイ濃度は、一般に、約０．１μＭ／デコイ〜約５０μＭ／デコイの範囲内、より通常は約１μＭ／デコイ〜約１０μＭ／デコイ、最も通常には約３μＭ／デコイである。
【０１２４】
他の技術について、最も適切な濃度は、実験的に決定され得る。適切な濃度および用量の決定は、充分に当業者の技術範囲内である。任意の処置パラメータは、適応症、デコイ、患者の臨床的状態などに依存して変動し、そして本明細書中に提供される指示および当該分野における一般知識に基づいて、実験的に決定され得る。
【０１２５】
これらのデコイは、個々のデコイを含む組成物としてか、またはデコイ混合物として投与され得る。通常、混合物は、６デコイ分子まで、より通常は４デコイ分子まで、より通常は２デコイ分子までを含む。
【０１２６】
多くの抗炎症薬物および抗リウマチ薬物（グルココルチコイド、アスピリン、サリチル酸ナトリウムおよびスルホサラジン（ｓｕｌｆｏｓａｌａｚｉｎｅ）を含む）は、ＮＦ−κＢの活性化のインヒビターである。炎症疾患および炎症状態ならびに自己免疫疾患および自己免疫状態の処置について、本発明のＮＦ−κＢデコイ分子は、必要に応じて、このような薬物処置と組み合わせて投与され得る。併用処置としては、同時投与、および２つ以上の薬物の任意の順序での連続投与が挙げられる。
【０１２７】
癌治療において、ＮＦ−κＢデコイ分子の投与は、他の処置選択肢（化学量表抗癌剤を用いる処置および／または放射線療法を含む）と組み合わせられ得る。
【０１２８】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例から明らかである。
【０１２９】
（実施例１）
（ＮＦ−κＢデコイ分子の設計および試験）
（設計）
ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮデコイ分子を設計し、そしてＮＦ−κＢに結合する能力および／またはＮＦ−κＢの結合について競合する能力について試験した。特定の局面において、本発明の目的は、ｐ５０／ｐ５０ホモロダイマーよりも、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーおよび／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマーに特異的に結合する、ＮＦ−κＢデコイ分子を設計することであった。ｐ５０／ｐ５０ホモロダイマーを遮断しないことの結果として、本発明の選択的デコイ分子は、これらのヘテロダイマーが、ＮＦ−κＢにより調節される遺伝子のプロモーターを遮断することを可能にし、さらなるレベルの遺伝子転写の負の調節を提供する。
【０１３０】
オリゴヌクレオチドデコイの設計において、結晶構造研究および既知のＮＦ−κＢ結合部位のコンピュータ分析から利用可能な情報を、利用した。
【０１３１】
上記で考察されるように、免疫グロブリン軽鎖遺伝子（これは、５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号２）のコンセンサス配列を含む）に結合したｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマー結晶構造の研究に基づいて、ｐ５０が、５塩基対のサブサイト５’−ＧＧＧＡＣ−３’（配列番号３）に接触し、そしてｐ６５が、４塩基対のサブサイト５’−ＴＴＣＣ−３’（配列番号４）に接触することが示された。ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーに対してより低い親和性を有するが、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーになお結合するデコイ分子を調製する目的で、コンセンサス結合部位の５’末端で少数のＧを含む、一連のＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイを設計した。これらのオリゴヌクレオチドデコイに、同定および表示を容易にするために、「コア」および「隣接」の文字コードを割り当てた。コアに、文字コード「Ａ」〜「Ｌ」を割り当て、そして隣接に、「Ｔ」〜「Ｚ」を割り当てた。これらのデコイを、ゲルシフトアッセイにおいて試験して、ＮＦ−κＢ結合について、高い親和性で放射標識オリゴヌクレオチドと競合するデコイの能力を決定した。ＮＦ−κＢ結合ＤＮＡコンセンサス配列を、ＮＦ−κＢ関連ＤＮＡ−タンパク質相互作用の文献から選択した。この文献としては、以下が挙げられる：Ｂｌａｎｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：４１５９−４１６７（１９９１）；Ｂｏｕｒｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６８５−６９５（１９９２）；Ｂｏｕｒｓら、Ｕ．Ｃｅｌｌ  ７２：７２９−７３９（１９９３）；Ｄｕｃｋｅｔｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：１３１５−１３２２（１９９３）；Ｆａｎ  Ｃ．−Ｍ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：３９５−３９８（１９９１）；Ｆｕｊｉｔａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：７７５−７８７（１９９２）；Ｆｕｊｉｔａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：１３５４−１３６３（１９９３）；Ｇｈｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：３０３−３１０（１９９５）；Ｇｈｏｓｈら、Ｃｅｌｌ  ６２：１０１９−１０２９（１９９０）；Ｇｒｕｍｏｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８４６０−８４７０（１９９４）；Ｈｅｎｋｅｌら、Ｃｅｌｌ  ６８：１１２１−１１３３（１９９２）；Ｉｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  １３８：１９３−１９６（１９９４）；Ｋｕｎｓｃｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１２−４４２１（１９９２）；ＬｅＣｌａｉｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８１４５−８１４９（１９９２）；Ｌｉ  Ｃ．−Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３００８９−３００９２（１９９４）；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１７２７−１７３４（１９９３）；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：３１１−３１７（１９９５）；Ｎｅｒｉら、Ｃｅｌｌ  ６７：１０７５−１０８７（１９９１）；Ｎｏｌａｎら、Ｃｅｌｌ  ６４：９６１−９６９（１９９１）；Ｐａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８２６−７８３０（１９９２）；Ｐｌａｋｓｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１６５１−１６６２（１９９３）；Ｓｃｈｍｉｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：７３３−７３６（１９９１）；Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｍ．Ｌ．，Ｂａｅｕｅｒｌｅ  Ｐ．Ａ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３８０５−３８１７（１９９１）；Ｔｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１９５−２０３（１９９２）；Ｔｏｌｅｄａｎｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：８５２−８６０（１９９３）；Ｕｒｂａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１８１７−１８２５（１９９１）。
【０１３２】
この利用可能な情報に基づいて、本発明者らは、最初のスクリーニングのためのデコイのセットを生成した。これらのデコイとしては、「変異デコイ」、スクランブルデコイ、その５’末端または３’末端で異なる長さを有するデコイ、ならびにコア領域内および／または隣接配列中に代替的塩基組成を有するデコイが挙げられる。
【０１３３】
ＮＦ−κＢのコア結合部位近傍の塩基組成をより理解するために、このコア結合部位を、既知の結合配列と、コンピュータにより整列させた（順方向の鎖のみ）。このアラインメントに基づき、僅かに異なるコア結合部位を有する、いくつかの主要な群のデコイを作製した。
【０１３４】
主要なコアおよび隣接配列を、表１に列挙する。
【０１３５】
（表１）
【０１３６】
【表１】
2005160464.tif 000002
【０１３７】
（電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
ＥＭＳＡアッセイを使用して、ＮＦ−κＢ転写因子についてのオリゴヌクレオチドデコイを特徴付けた。放射標識したオリゴヌクレオチドプローブ（非哺乳動物、ＨＩＶ由来のＮＦ−κＢプロモーター、配列１１３／１１４）（これは、ＮＦ−κＢファミリーの関連メンバーについて、高い親和性を示す）を使用して、ｐ６５／ｐ５０、ｃＲｅｌ／ｐ５０およびｐ５０／ｐ５０の結合を、活性化された単球細胞株からの核抽出物を使用して試験した。上述のＮＦ−κＢファミリーメンバーに対する結合について競合するように改変された上記オリゴヌクレオチドを使用して、高い親和性の放射標識プローブに対して、および互いに、これらのオリゴヌクレオチドの結合親和性を比較することが可能であった。このアッセイはまた、ＮＦ−κＢファミリーの特定のメンバーに選択的に結合するデコイの設計を可能にした。漸増濃度の種々のオリゴヌクレオチドを使用することによって、結合部位中の標的化残基を欠失または変化させることによって、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーおよびｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマーに対する親和性を維持したままで、ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーに対するデコイ分子の結合を特異的に低減させることが可能であることが観察された。
【０１３８】
ＮＦ−κＢゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、以下のように実施した。コンセンサスＮＦ−κＢ結合部位（５’  ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ  ３’）（配列番号２６）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、γ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。ＬＰＳ刺激したＴＨＰ−１細胞（ヒト単球細胞株）から調製した核抽出物１μｇを、競合する未標識のＮＦ−κＢ二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）またはスクランブルｄｓＯＤＮの存在下または非存在下で、３５ｆｍｏｌの放射標識プローブと共にインキュベートした。このインキュベーションを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  グリセロール、０．１％  ＮＰ−４０、０．０２５％  ＢＳＡおよび１μｇ  Ｐｏｌｙ−ｄＩｄＣから構成される、２０μｌの反応容積で、室温で３０分間実施した。これらの反応物を、６％ポリアクリルアミドゲル上にロードし、電気泳動に供し、そして乾燥した。乾燥したゲルを画像化し、そしてＴｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して、定量した。放射標識したオリゴヌクレオチドプローブに結合した複合体中に含まれるＮＦ−κＢタンパク質の正体を、放射標識プローブの添加前に、ＮＦ−κＢファミリーの各メンバーに特異的な個々の抗体と共に、５分間にわたって反応物を予めインキュベートすることによって同定した。
【０１３９】
（ヌクレアーゼ分解および化学改変）
ネイティブＤＮＡを、主に３’エキソヌクレアーゼの作用によってであるが、エンドヌクレアーゼ攻撃の結果としてでもある、細胞内部の迅速な分解に供する。従って、オリゴヌクレオチドデコイを設計し、その安定性を増強するように改変する。ヌクレオチド間連結の非架橋酸素原子を硫黄基で置換し、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドと称されるものを作製することは、非常に成功した。これらの分子は、比較的、ヌクレアーゼ耐性である；しかし、これらは、３’末端改変されたオリゴヌクレオチドデコイおよび非改変オリゴヌクレオチドデコイと比較して、非特異的なタンパク質結合を示すことが示されている（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４３）：２６８０１−５（１９９４））。従って、本発明者らは、達成された特異性を維持しながら、本発明者らのオリゴヌクレオチドデコイに対するヌクレアーゼ耐性を提供するには、３’側、５’側、または内部部位において、いくつの硫黄が必要とされるかを決定するために、１セットの実験を実施した。
【０１４０】
（ＥＭＳＡ結果の分析）
上述のように、本明細書中に開示される研究の１つの目的は、ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーと比較して、ＮＦ−κＢｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーおよび／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマーに優先的に結合するＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイ分子を開発することであった。この実験結果により、ｐ６５／ｐ５０およびｃＲｅｌ／ｐ５０に対する結合が、一般に等価であり、従って、本発明者らの分析においてｐ６５／ｐ５０のバンドのみが定量されることが示された。
【０１４１】
図１は、特定のＮＦ−κＢデコイ分子のｐ６５／ｐ５０結合を示す。図２は、特定のＮＦ−κＢデコイ分子のｐ５０／ｐ５０結合を示す。
【０１４２】
優先的結合を、特異性／親和性因子を使用して定量した。特異性／親和性因子を、以下のように計算した：
特異性／親和性因子＝（Ｓｐ５０／ｐ５０−Ｓｐ６５／ｐ５０）×Ｓｐ５０／ｐ５０／Ｓｐ６５／ｐ５０
ここで、Ｓｐ５０／ｐ５０は、ＨＩＶ由来の非哺乳動物ＮＦ−κＢプロモーター（配列１１３／配列１１４）に対するｐ５０／ｐ５０の結合の５０％を競合するために必要なデコイのモル濃度過剰に相当し、そしてＳｐ６５／ｐ５０は、ＨＩＶ由来の非哺乳動物ＮＦ−κＢプロモーター（配列１１３／配列１１４、ここで、配列１１３に対応する逆方向鎖を、「１１４」と称する）に対するｐ６５／ｐ５０の結合の５０％を競合するために必要なデコイのモル濃度過剰に相当する。スコア（Ｓ）を、試験した任意のモル比で、デコイが少なくとも５０％の結合を競合できない場合に、１００と割り当てた。
【０１４３】
好ましいデコイ分子は、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーについてはより低いスコアおよびｐ５０／ｐ５０ホモダイマーについてはより高いスコアを有する。ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマーに対するデコイ  対  ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーに対するデコイの特異性は、それらのスコアの差異（ｐ５０／ｐ５０のスコア−ｐ６５／５０のスコア）に比例する。上記で行われたＥＭＳＡ競合結合実験の結果を、表２にまとめる。この表では、デコイ分子は、最も特異的なデコイ（最も高い特異性/親和性因子)から列挙される。
【０１４４】
【表２】
2005160464.tif 000003
2005160464.tif 000004
【０１４５】
Ｅ−Ｚ−４は、２つの５’塩基および２つの３’塩基が欠失されたＥ−Ｚである。
Ｅ−Ｚ  ｅｖｅｎは、Ｅ−Ｚ−（２つの５’塩基）である。
Ｅ−Ｚ  ａ→Ｃ  Ｅｖｅｎは、６位のＡが、Ｃに変化したＥ−Ｚである。
Ａ−Ｚ−２は、５’塩基および３’塩基が欠失されたＡ−Ｚである。
Ｅ−Ａは、Ａが、５’末端および３’末端に付加されたＥコアである。
Ｅ−ＡＧ  Ｆｌａｎｋは、５’隣接としてＡＡＧＡおよび３’隣接としてＡＧＡＧを有するＥコアである。
Ｅ−ＡＴ  Ｆｌａｎｋは、５’隣接としてＡＴＡＴおよび３’隣接としてＴＴＡＡを有するＥコアである。
Ｅ−ＣＡ  Ｆｌａｎｋは、５’隣接としてＣＡＡＣおよび３’隣接としてＡＣＡＣを有するＥコアである。
Ｅ−ＣＡＧＴ  Ｆｌａｎｋは、５’隣接としてＣＡＧＴおよび３’隣接としてＡＣＴＧを有するＥコアである。
Ｈ−Ｚ’（−３’２ＢＰ）は、２つの５’塩基が欠失されたＨ−Ｚである。
Ｈ−Ｚ’（−３’１ＢＰ）は、２つの５’塩基が欠失され、３’末端にＴが付加されたＨ−Ｚである。
Ｅ−Ｚ−３は、５’末端からＡＧＴが欠失され、３’末端からＣが欠失されたＥ−Ｚである。
Ｅ−Ｚ−６は、５’末端からＡＧＴＴが欠失され、３’末端からＧＣが欠失されたＥ−Ｚである。
【０１４６】
表２に示されるデータセットは、より良好なｐ６５／ｐ５０特異性を有するデコイが、「Ｅ」または「Ｄ」または「Ｈ」コア配列と、「Ｚ」または「Ｗ」または「Ｖ」または「Ｕ」隣接配列とを共有する可能性が最も高いことを示唆する。より好ましい群において、そのコア配列は、「Ｅ」または「Ｄ」であり、隣接配列は、「Ｚ」である。１５３／１５４と指定されたデコイは、他のパラメーターを考慮して少数の候補が、鎖上位から最も良好なものとして選択された(以下を参照のこと)。
【０１４７】
（ＤＮＡ骨格の化学的改変の分析）
類似の分析を、試験したデコイのＤＮＡ骨格の化学的改変を評価するために適用した。
【０１４８】
【表３】
2005160464.tif 000005
【０１４９】
上記の表３において、骨格化学について２つの指定がある場合、最初の１つは、鎖１５３の化学および鎖１５４の第２の化学を示す。完全に、ホスホジエステル結合は、「ＰＯ」と称され、完全に、ホスホロチオエート骨格は、「ＰＳ」と称される。ハイブリッド骨格は、「Ｈ」と称され、３’末端から始まるホスホロチオエート骨格連結の数が続く。従って、Ｈ３は、３つの最も３’側の連結がホスホロチオエートであり、骨格連結の残りは、ホスホジエステルであることを意味する。たった１つの名称が示される場合（例えば、ただのＰＯ）、両方の鎖が、同じ骨格化学を有する。
【０１５０】
表３に示されるデータは、いずれかの鎖が、完全にホスホチオエート化される場合（例えばＰＳ／ＰＯまたはＰＯ．ＰＳ）、そのデコイは、ｐ６５／ｐ５０およびｐ５０／ｐ５０の両方に対して高い親和性を有し、従って、所望の親和性を欠くことを示す。一般に、常にではないが、より多くの数のホスホロチオエート連結は、減少した特異性を生じた。一般に、８つを超えるホスホロチオエート連結を有するハイブリッド鎖は、特異性を欠くのに対して、７つ未満のホスホロチオエート連結を有するハイブリッド鎖は、許容可能な親和性および特異性を維持した。しかし、Ｈ４／Ｈ４は、極めて低い親和性を有するが、Ｈ３／Ｈ３およびＨ５／Ｈ５は、ともに、許容可能な範囲の中であった。Ｈ１１／ＰＯおよびＰＯ／Ｈ１１は、良好な親和性および特異性を有する。半減期、特異性および親和性に基づいて、Ｈ３／Ｈ３、Ｈ５／Ｈ５、Ｈ６／Ｈ６、およびＨ７／Ｈ７は、１５３／１５４デコイについての最適な骨格として同定された。他のデコイについての最適な骨格化学は、類似の様式にて試験および決定され得る。
【０１５１】
（他の転写因子と比較した特異性）
デコイ分子はまた、標的転写因子のみを特異的にブロックしなければならず、関連しない転写因子を非特異的に結合およびブロックしてはならない。ＥＭＳＡを使用して、関連しないプロモーターに対していずれの非特異的効果も示さないＮＦ−κＢデコイ分子を設計することが可能であることがまた立証されている。具体的には、遍在性転写因子Ｏｃｔ−１についてのプロモーター配列に対応する放射性標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、１５３／１５４（ここで「１５４」は、配列「１５３」に対応する逆方向配列をいう）ＰＯおよびＨ３  ＮＦ−κＢデコイは、そのプロモーターに対していずれの結合親和性も示さなかったことが実証された（図３）。このことは、細胞中の他の重要なタンパク質に対するオリゴヌクレオチドの任意の非特異的効果が、処置個体に対する、デコイの所望でない毒性を生じ得るので、重要である。
【０１５２】
（半減期）
ネイティブＤＮＡは、主に３’エキソヌクレアーゼの作用を通じてであるが、エンドヌクレアーゼの攻撃の結果としても細胞内で迅速な分解に供される。従って、オリゴヌクレオチドデコイが設計される場合、それらは改変されて、それらの安定性が増強される。ヌクレオチド間連結の非架橋酸素原子の１つを、硫黄基で置換すること、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドといわれるものを作ることは、非常に成功した。この分子は、比較的ヌクレアーゼ耐性であり；しかし、それらは、３’末端が改変されたオリゴヌクレオチドデコイおよび非改変オリゴヌクレオチドデコイと比較して、非特異的タンパク質結合を示すことが示された（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６８０１−５（１９９４））。従って、一連の実験を行って、３’末端または５’末端にて、あるいは内部部分にてどの程度多くの硫黄が必要とされて、特異性を維持しつつ本明細書中のオリゴヌクレオチドデコイに対するヌクレアーゼ耐性を提供するかを決定した。
【０１５３】
結合特異性を、上記のゲルシフトアッセイによって評価した。３’エキソヌクレアーゼ耐性を、標準的なヘビ毒アッセイ（Ｃｕｍｍｉｎｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０１９−２４（１９９５））を使用して評価した。より関連のある哺乳動物ヌクレアーゼ活性に対するそのデコイの耐性を評価するために、アッセイを適合させ、このアッセイにおいて、細胞質抽出物および核抽出物を活性化マクロファージから調製した（Ｈｏｋｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（２０）：５７４３−８（１９９１））。これらの抽出物の活性を、各アッセイにおけるポジティブコントロールを用いて確認した。そのデコイの各鎖の３’末端を、少数の硫黄基でキャップすることにより、ヌクレアーゼ分解から保護されるに十分であることが実証された。
【０１５４】
まとめると、これらのデータは、１９マーオリゴヌクレオチド二重鎖の３’末端のｐ５０／ｐ６５選択的ＮＦ−κＢデコイ３−５硫黄が、ヌクレアーゼ分解からそのデコイを保護するに十分であることを示す。さらに、転写因子ファミリー内で特異的なサブユニット結合ならびに無関係の転写因子に対する結合の欠如を維持することが可能であった。これらのデータは、本発明が、転写因子、特にＮＦ−κＢを標的とする特異的および持続性オリゴヌクレオチドデコイを設計するための方法および手段を提供することを実証する。
【０１５５】
（実施例２：核局在シグナルを含むＮＦ−κＢデコイ分子）
核局在シグナル（ＮＬＳ）含有ペプチドが、オリゴヌクレオチドデコイの核への進入を改善する能力を決定するために、シミアンウイルス４０ラージ腫瘍抗原に基づくＮＬＳ配列を有するペプチド（ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ）（配列番号７８）を、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓにより合成し、ＮＦ−κＢ  １５３  Ｈ３オリゴヌクレオチドに、以下のように結合体化した。簡潔には、６．５ナノモル濃度のオリゴヌクレオチドを、最初に、４０倍モル濃度過剰のリンカースルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに室温にて２時間インキュベートした。ＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって過剰のリンカーを反応系から除去した後、活性化オリゴヌクレオチドを、５倍モル濃度過剰のＮＬＳペプチドとともに室温にて一晩インキュベートした。ＮＬＳペプチドにうまく結合体化したオリゴヌクレオチドの百分率を評価するために、１μｌを、２０％  ＰＡＧＥゲル(非変性)にロードすることにより、反応物を分析した。ゲルを、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により可視化した。ＮＬＳ−ペプチド結合体化一本鎖１５３  Ｈ３の濃度を、ＯＤ吸収により決定した。次いで、この結合体を、５’末端にビオチン分子を含むその相補鎖１５４  Ｈ３（等モル濃度量にて）にアニールした。ここで二本鎖になったＮＬＳデコイ上のビオチン分子の存在は、（ストレプトアビジンを介して）顕微鏡の使用による局在化の可視化を可能にする。
【０１５６】
本発明は、特定の実施形態を参照して例示されているが、そのように限定されない。改変およびバリエーションは、本発明の概念から逸脱することなく可能であり、当業者に明らかである。このような改変およびバリエーションの全ては、特に本発明の範囲内にある。
【０１５７】
本発明は、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合し得るコア配列を含む、二本鎖ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチド（ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＳＮ）分子に関する。特定の局面において、本発明は、ｐ５０／ｐ５０ホモダイマーより、優先的にｐ５０／ｐ６５および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロダイマーに結合するＮＦ−κＢデコイ分子に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、特定のＮＦ−κＢデコイ分子のｐ６５／ｐ５０結合を示すグラフである。
【図２】図２は、特定のＮＦ−κＢデコイ分子のｐ５０／ｐ５０結合を示すグラフである。
【図３】図３は、ＥＭＳＡアッセイの定量化結果を示す。「Ｅ」と称されるデコイ分子が転写因子Ｏｃｔ−１の結合について非特異的に競合する能力を、試験した。Ｏｃｔ−１デコイを、このアッセイにおいて放射性標識した。競合因子の添加の後に存在しているバンドの量を、グラフ化する。バンドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して定量化した。この結果は、試験したＮＦ−κＢデコイが、特異性を有さないプロモーターについて非特異的に競合しないことを示す。ポジティブコントロールは、コールドＯｃｔ−１プローブであった。
【図１】
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【図２】
2005160464.tif 000007
【図３】
2005160464.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月22日(2004.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【表１】
2005160464.tif 000009
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
ＮＦ−κＢゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、以下のように実施した。コンセンサスＮＦ−κＢ結合部位（５’ ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ  ３’）（配列番号１０３）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、γ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。ＬＳＰ刺激したＴＨＰ−１細胞（ヒト単球細胞株）から調整した核抽出物１μｇを、競合する未標識のＮＦ−κＢ二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）またはスクランブルｄｓＯＤＮの存在下または非存在下で、３５ｆｍｏｌの放射標識プローブと共にインキュベートした。このインキュベーションを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＫＣＬ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  グリセロール、０．１％  ＮＰ−４０、０．０２５％  ＢＳＡおよび１μｇ  Ｐｏｌｙ−ｄＩｄＣから構成される、２０μｌの反応容積で、室温で３０分間実施した。これらの反応物を、６％ポリアクリルアミドゲル上にロードし、電気泳動に供し、そして乾燥した。乾燥したゲルを画像化し、そしてＴｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトフェアを使用して、定量した。放射標識したオリゴヌクレオチドプローブに結合した複合体中に含まれるＮＦ−κＢタンパク質の正体を、放射標識プローブの添加前に、ＮＦ−κＢファミリーの各メンバーに特異的な個々の抗体と共に、５分間にわたって反応物を予めインキュベートすることによって同定した。
【外国語明細書】
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