(57)【要約】【課題】  病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性がなく、生体親和性及び生体適合性の高い生体材料（又は生体適合材料）を提供する。【解決手段】  生体材料は、少なくとも式-Pro-Y-Gly-（式中、ＹはProまたはHypを表す）で表されるアミノ酸配列を有し、かつコラーゲン様の合成ポリペプチドで構成されている。前記ポリペプチドは、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示してもよい。前記ポリペプチドの少なくとも一部は３重らせん構造を形成可能であってもよい。前記ポリペプチドはコラゲナーゼ分解性を有していてもよい。生体材料は、被覆材、埋入材、止血材、癒着防止材、接着材、塗布材、管腔材、又は膜材であってもよく、基材（生体内分解性基材など）と、この基材の少なくとも表面に適用された前記ポリペプチドとで構成してもよい。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを主構成成分とする生体材料であって、前記ポリペプチドが、少なくとも式Pro-Y-Gly（式中、ＹはPro又はHypを示す）で表されるアミノ酸配列を有し、かつコラーゲン様の構造を形成する合成ポリペプチドで構成されている生体材料。
【請求項２】
ポリペプチドが、下記式(1)〜(3)で表されるペプチドユニットで構成されたポリペプチド(I)、及び下記式(4)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、下記式(5)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとを含むポリペプチド(II)から選択された少なくとも一種のポリペプチドである請求項１記載の生体材料。
[-(OC-(CH2)m-CO)p-(Pro-Y-Gly)n-]a   (1)
[-(OC-(CH2)m-CO)q-(Z)r-]b           (2)
[-HN-R-NH-]c                        (3)
（式中、ｍは１〜１８の整数、ｐ及びｑは同一又は異なって０又は１、ＹはProまたはHypを表し、ｎは１〜２０の整数を表す。Ｚは１〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、ｒは１〜２０の整数を表し、Ｒは直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基を表す。ａとｂとの割合（モル比）はａ／ｂ＝１００／０〜３０／７０であり、ｐ＝１及びｑ＝０であるときｃ＝ａ、ｐ＝０及びｑ＝１であるときｃ＝ｂであり、ｐ＝１及びｑ＝１であるときｃ＝ａ＋ｂであり、ｐ＝０及びｑ＝０であるときｃ＝０である。）
-Pro-Y-Gly-                          (4)
（式中、Ｙは前記に同じ）
-Pro-V-Gly-W-Ala-Gly-                (5)
（式中、ＶはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＷはIleまたはLeuを表す。）
【請求項３】
ポリペプチド(I)において、ｍが２〜１２の整数、ｎが２〜１５の整数、Ｚが、Gly, Sar, Ser, Glu, Asp, Lys, His, Ala，Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された１〜１０個のアミノ酸残基から構成されているペプチド鎖、ｒが１〜１０の整数、ＲがＣ2-12アルキレン基である請求項２記載の生体材料。
【請求項４】
ポリペプチド(II)が、式(4)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、式(5)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとを、ペプチドユニット(4)／ペプチドユニット(5)＝９９／１〜３０／７０（モル比）の割合で含む請求項２記載の生体材料。
【請求項５】
ポリペプチドが、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す請求項１記載の生体材料。
【請求項６】
ポリペプチドの少なくとも一部が３重らせん構造を形成可能である請求項１記載の生体材料。
【請求項７】
ポリペプチドの分子量が５×１０3〜５００×１０4の範囲にピークを示す請求項１記載の生体材料。
【請求項８】
ポリペプチドがコラゲナーゼ分解性を有する請求項１記載の生体材料。
【請求項９】
被覆材、埋入材、止血材、癒着防止材、接着材、塗布材、管腔材、膜材である請求項１記載の生体材料。
【請求項１０】
基材と、この基材の少なくとも表面に適用された請求項１記載のポリペプチドとで構成されている請求項１記載の生体材料。
【請求項１１】
基材が生体内分解性を有する請求項１０記載の生体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性を有し、創傷被覆材などの種々の用途に利用できる生体材料（又は生体適合材料）に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体材料（特に医療用生体材料）には、生体親和性を有すること、血液などの体液や組織に対する適合性を有すること、毒性や抗原性がないことなどが要求される。このような点から、生体に由来し、生体親和性及び生体適合性に優れ、生体内で分解吸収されるコラーゲンが広く利用されている。
【０００３】
このコラーゲンは、あらゆる多細胞動物にみられる繊維状蛋白質であり、皮膚や骨の主成分として哺乳類では全蛋白質の２５％を占める。典型的なコラーゲン分子は、３本のコラーゲンポリペプチド鎖が三重らせん構造と呼ばれるロープ状の超らせん構造をとる。上記３重らせん構造を形成したポリペプチド鎖が自己集合して、直径が数ｎｍ〜数十ｎｍの原線維を形成し、さらにこれらの原線維が配列して直径が数μｍ〜数十μｍの繊維構造を形成することができる。
【０００４】
コラーゲンの生体材料としての利用方法には、例えば、ブタの皮膚組織をそのままあるいは凍結乾燥した後、火傷などによる皮膚の損傷部位に移植する方法、酵素処理などによって細胞成分を除去して用いる方法、酸性溶液や酵素処理によって可溶化したコラーゲンを、所望の形態に再構成して用いる方法などが知られている。
【０００５】
生体材料としてのコラーゲンの利用について種々の提案がなされている。例えば、特開平６−２９２７１６号公報（特許文献１）には、生体内分解吸収性材料（ポリグリコール酸、グリコール酸−乳酸コポリエステル、ポリグリコール酸とポリ乳酸との混合物など）の表面にコラーゲン（多孔質状又はスポンジ状コラーゲン）の被覆層を形成した医用材料が開示されている。この文献には、抗原性を低減するため、アルカリ可溶性コラーゲンや酵素可溶性コラーゲンが好ましいと記載されている。
【０００６】
特開２００３−１８０８２０号公報（特許文献２）には、生体内に埋め込まれて使用される材料であって、基礎材料と、この基礎材料の表面に結合し、かつ組織誘導能を有する組織誘導材料（コラーゲン含有物やコラーゲンなど）とで構成された生体材料が開示されている。
【０００７】
特開２０００−２７１２０７号公報（特許文献３）には、コラーゲン繊維の不織布層の表面に、ゼラチン又はヒアルロン酸を含む被覆層を形成した縫合可能な癒着防止膜（スポンジ状又はフィルム状膜）が開示されている。この文献には、前記被覆層が架橋されたゼラチン又はヒアルロン酸を含んでもよいこと、コラーゲン、ゼラチン及びヒアルロン酸が生体由来材料であるのが好ましいことも記載されている。
【０００８】
特開平１０−２９１９３７号公報（特許文献４）には、特定のペプチドと、アルギン酸塩ゲル、コラーゲン、フィプリン、キチン、キトサン又はこれらの誘導体から選ばれた少なくとも一種とを含む創傷被覆材が開示されている。この文献には、コラーゲンとして、牛皮又は豚皮由来のコラーゲンが適していると記載されている。
【０００９】
特開２００１−３２７５２０号公報（特許文献５）には、生体内分解吸収性ポリマーのテープ基材の少なくとも片面に、体温以上の温度で粘着性が発現又は増大する熱感応性の生体内分解吸収性粘着層、又は水分との接触で粘着性が発現又は増大する水感応性の生体内分解吸収性粘着層が形成された医療用粘着テープが開示されている。この文献には、粘着層に微繊維性コラーゲンを含有させてもよいことも記載されている。また、特開２０００−２９０６３３号公報（特許文献６）には、コラーゲン蛋白部分加水分解物（ゼラチンなど）及び水溶性キチン誘導体を主成分とする糊剤と、二官能性乃至多官能性アルデヒド（グリオキザール、スクシンアルデヒド、グルタールアルデヒド、マレアルデヒドなど）を主成分とする架橋剤とからなる生体組織用接着剤が開示されている。この文献には、ゼラチンに関し、由来が明確であること、狂牛病病原体に汚染されていないことが記載されている。
【特許文献１】特開平６−２９２７１６号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特開２００３−１８０８２０号公報（特許請求の範囲）
【特許文献３】特開２０００−２７１２０７号公報（特許請求の範囲）
【特許文献４】特開平１０−２９１９３７号公報（特許請求の範囲，段落番号［0015］）
【特許文献５】特開２００１−３２７５２０号公報（特許請求の範囲）
【特許文献６】特開２０００−２９０６３３号公報（特許請求の範囲、段落番号［0006］）。
【００１０】
これらの医用材料で使用されるコラーゲンは、哺乳動物由来であり、一般に、生体材料としてウシやブタ由来のコラーゲンを原料として用いることが多い。一方、ヒツジの振戦病やウシの海綿状脳症の原因物質がプリオンと呼ばれる伝染性蛋白質であり、この伝染性タンパク質がヒトのクロイツフェルドーヤコブ病伝染の原因の一つと言われている。プリオンは、蛋白質であり、通常の滅菌、殺菌方法では失活し難く、しかも種を越えて感染することが指摘されている（非特許文献１）。
【非特許文献１】Nature Review, Vol.2, pp.118-126, 2001年。
【００１１】
そのため、通常の滅菌、殺菌方法では除去できないプリオンなどの病原体（又は病原性因子）の感染（又は伝達）の危険性が常に存在しており、特許文献６に記載されているように、病原性の有無を確認する必要がある。
【００１２】
また、天然のコラーゲン中には種々の細胞接着サイトが含まれているため、用途に応じた細胞選択性が発揮できない。例えば、神経の軸索誘導材料としてコラーゲンを用いると、軸索の伸長速度より周囲の繊維芽細胞の遊走、増殖速度が大きく瘢痕組織化して軸索が伸長することができない。このため、繊維芽細胞の遊走を防ぐ材料でコラーゲンの周囲を覆うことなどの措置が必要となる。
【００１３】
コラーゲン類似物の化学合成の方法に関し、Pro-Ser-Glyのp-ニトロフェニルエステル、あるいはPro-Ala-Glyのp-ニトロフェニルエステルをジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミンを加えて24時間静置することにより、分子量が16,000〜21,000の可溶性ポリアミドが得られることが報告されている（非特許文献２）。これらの可溶性ポリアミドは円二色性スペクトルから３重らせん構造をとることが推定されているが、得られたポリマーの性質に関する記述はない。
【非特許文献２】J. Mol. Biol., Vol.63 pp.85-99, 1972年。
【００１４】
エラスチン由来のVal-Pro-Gly-Val-Gly配列を含む５０量体のペプチドをジメチルスルホキシドに溶解し、２当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと１当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、及び１．６当量のＮ−メチルモルフォリンを加えて１４日間静置した後、分子量カットオフが５万の透析膜で透析してポリアミドを得る方法も報告されている（非特許文献３）。
【非特許文献３】Int. J. Peptide Protein Res., Vol.46, pp.453-463, 1995年。
【００１５】
一方、特開平６−１４２１２４号公報（特許文献７）には、微生物又は化学合成により得られた脂肪族ポリエステルで構成された生体適合性インプラント部材が開示されている。
【特許文献７】特開平６−１４２１２４号公報（特許請求の範囲）。
【００１６】
しかし、このような脂肪族ポリエステルは、動物由来のコラーゲンに比べて、生体親和性や生体適合性が劣る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明の目的は、安全性が高く、生体親和性及び生体適合性の高い生体材料（又は生体適合材料）を提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的は、病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性や好ましくない副作用の虞がなく、しかも生体内で分解して吸収可能な生体材料（又は生体適合材料）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、前記課題を達成するため鋭意検討した結果、特定の合成ポリペプチドがコラーゲン様の立体構造と組織構造を形成するだけでなく、高い生体適合性を有すること、特にコラゲナーゼ分解性を有することを見いだし、本発明を完成した。
【００２０】
すなわち、本発明の生体材料又は医用材料は、ポリペブチドを主構成成分とする生体材料であって、前記ポリペプチドが少なくとも式-Pro-Y-Gly-（式中、ＹはProまたはHypを表す）で表されるアミノ酸配列を有し、かつコラーゲン様の構造を形成する合成ポリペプチドで構成されている。前記ポリペプチドは、下記式(1)〜(3) で表されるペプチドユニットで構成されたポリペプチド(I)、及び下記式(4)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、下記式(5)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとを含むポリペプチド(II)から選択された少なくとも一種のポリペプチドであってもよい。
【００２１】
[-(OC-(CH2)m-CO)p-(Pro-Y-Gly)n-]a   (1)
[-(OC-(CH2)m-CO)q-(Z)r-]b           (2)
[-HN-R-NH-]c                        (3)
（式中、ｍは１〜１８の整数、ｐ及びｑは同一又は異なって０又は１、ＹはProまたはHypを表し、ｎは１〜２０の整数を表す。Ｚは１〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、ｒは１〜２０の整数を表し、Ｒは直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基を表す。ａとｂとの割合（モル比）はａ／ｂ＝１００／０〜３０／７０であり、ｐ＝１及びｑ＝０であるときｃ＝ａ、ｐ＝０及びｑ＝１であるときｃ＝ｂであり、ｐ＝１及びｑ＝１であるときｃ＝ａ＋ｂであり、ｐ＝０及びｑ＝０であるときｃ＝０である）。
【００２２】
-Pro-Y-Gly-                          (4)
（式中、Ｙは前記に同じ）
-Pro-V-Gly-W-Ala-Gly-                (5)
（式中、ＶはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＷはIleまたはLeuを表す）。
【００２３】
前記ポリペプチド(I)において、ｍは２〜１２の整数、ｎは２〜１５の整数、Ｚは、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、His、Ala、Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された１〜１０個のアミノ酸残基から構成されているペプチド鎖、ｒは１〜１０の整数、ＲはＣ2-12アルキレン基であってもよい。
【００２４】
さらに、ペプチドユニット(4)とペプチドユニット(5)との割合（モル比）は、(4)／(5)＝９９／１〜３０／７０程度であってもよい。
【００２５】
前記ポリペプチドは、通常、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す。このことは、ポリペプチドの少なくとも一部（一部または全部）が、３重らせん構造を形成することを示している。本発明のポリペプチドは、分子量５×１０3〜５００×１０4の範囲にピークを示してもよい。さらに、前記ポリペプチドは、生体内で分解し吸収される生体内分解性ポリペプチドであってもよい。すなわち、ポリペプチドはコラゲナーゼ分解性を有していてもよい。
【００２６】
前記ポリペプチドは、生体材料（生体適合材料）又は医用材料、例えば、被覆材（又は被覆剤）、埋入材（又は埋入剤）、止血材（又は止血剤）、癒着防止材（又は癒着防止剤）、接着材（又は接着剤）、管腔材、膜材などの構成成分として利用できる。また、前記生体材料又は医用材料は、前記ポリペプチド単独で構成してもよく、前記ポリペプチドが主構成成分であってもよく、例えば、基材と、この基材の少なくとも表面に適用された前記ポリペプチドとで構成してもよく、前記基材は、生体内で分解可能な生体内分解性を有していてもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明では、コラーゲン様の立体構造と組織構造を形成可能な特定の合成ポリペプチドを用いるため、安全性が高く、生体親和性及び生体適合性が高い。特に、病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性や好ましくない副作用の虞がない。しかも、コラゲナーゼで分解し、生体内で分解して吸収可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
【００２９】
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Hyp ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リジン残基
Met ：Ｌ−メチオニン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Sar ：サルコシン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
また、本明細書においては、常法に従って、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に位置させ、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて、ペプチド鎖のアミノ酸配列を記述する。
【００３０】
本発明の生体材料（生体適合材料）は、コラーゲン様の構造を形成する前記特定の合成ポリペプチドで構成されている。このポリペプチドは、少なくとも式Pro-Y-Gly（式中、ＹはPro又はHypを示す）で表されるアミノ酸配列を有している。前記アミノ酸配列は、３重らせん構造の安定性に寄与するため、前記ポリペプチドは、コラーゲン組織（コラーゲン状の組織）又はコラーゲン様の構造を形成する限り種々のポリペプチドが使用できる。このようなポリペプチドには、前記ポリペプチド（I）と前記ポリペプチド（II）とが含まれる。
【００３１】
前記ポリペプチド(I)において、構成するペプチドユニット(1) ［-(OC-(CH2)m-CO)p-(Pro-Y-Gly)n-］は、Pro-Y-Glyの繰返し配列を含むことが必要である。Pro-Y-Glyの繰返し数が、少ないと３重らせん構造の安定性が減少し、繰返し数が多すぎるとペプチドの合成が困難になる。従って、繰返し数ｎは、１〜２０、好ましくは２〜１５（例えば、３〜１５）、さらに好ましくは５〜１５程度である。
【００３２】
前記式(1)において、Ｙは、Pro又はHypいずれであってもよいが、３重らせん構造の安定性からHypであるのがより好ましい。なお、Hypは、通常、4Hyp（例えば、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン)残基である。
【００３３】
さらに、メチレン鎖(CH2)の繰り返し数を示すｍは、ポリペプチドの物理的及び生物学的性質を損なわない範囲であればよいが、通常、１〜１８、好ましくは２〜１２、さらに好ましくは２〜１０（特に２〜６）程度である。ｐは０又は１である。
【００３４】
前記ペプチドユニット(2)［-(OC-(CH2)m-CO)q-(Z)r-］において、Ｚは１〜１０個のアミノ酸残基で構成された任意の配列のペプチド鎖を表す。Ｚは、得られるポリペプチドの物理的及び生物学的性質を損なわない限り、どのような配列でもよい。ポリペプチドが有用な物理的及び生物学的性質を発揮するためには、例えば、ペプチド鎖Ｚは、通常、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、His、Ala、Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された１〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖（すなわち、これらのアミノ酸から選択されたアミノ酸残基、又はこれらのアミノ酸から選択された２〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖）、特に、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、Arg、Pro、Valから選択された１〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を有している場合が多い。ペプチド鎖Ｚは、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、Arg-Gly-Asp、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Ile-Lys-Val-Ala-Val、Val-Pro-Gly-Val-Gly、Asp-Gly-Glu-Ala、Gly-Ile-Ala-Gly、His-Ala-Val、Glu-Arg-Leu-Glu、Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu、Arg-Ser-Arg-Lysで示される配列を含むのが好ましい。
【００３５】
ペプチド鎖Ｚの繰り返し数を示すｒは、得られるポリペプチドが物理的及び生物学的性質を発揮する範囲であればよい。繰返し数ｒが多すぎると合成が困難になり、また得られるポリペプチドの物理的性質が変化しやすい。従って、繰返し数ｒは、通常、１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜５程度である。
【００３６】
メチレン鎖(CH2)の繰り返し数を示すｍは、前記式(1)と同様に、１〜１８、好ましくは２〜１２、さらに好ましくは２〜１０（特に２〜６）程度である。ｑは０又は１である。
【００３７】
前記式(1)及び(2)において、ｐ及びｑのうち少なくとも一方が１であるとき、ポリペプチドは、前記式(3)で表されるユニット［-HN-R-NH-］を含んでいる。この前記式(3)で表されるユニットにおいて、Ｒで表される直鎖状又は分岐鎖状アルキレン基は、ポリペプチドの物理的及び生物学的性質を損なわない範囲であればよく、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、テトラメチレンなどのＣ1-18アルキレン基が例示できる。前記アルキレン基Ｒは、直鎖状のメチレン鎖(CH2)s（ｓは１〜１８の整数を表す）であってもよい。好ましいＲは、Ｃ2-12アルキレン基（さらに好ましくはＣ2-10アルキレン基，特にＣ2-6アルキレン基）である。
【００３８】
前記式(1)で表されるペプチドユニットと前記式(2)で表されるペプチドユニットとの割合（ａ／ｂ）は、１００／０〜３０／７０（モル比）、好ましくは１００／０〜４０／６０（モル比）、さらに好ましくは１００／０〜５０／５０（モル比）程度である。
【００３９】
さらに、前記式(3)で表されるユニットの割合は、前記式(1)のｐの値、前記式(2)のｑの値に応じて選択でき、ｐ＝１及びｑ＝０であるとき、ｃ＝ａであり、ｐ＝０及びｑ＝１であるとき、ｃ＝ｂである。また、ｐ＝１及びｑ＝１であるときｃ＝ａ＋ｂであり、ｐ＝０及びｑ＝０であるときｃ＝０である。
【００４０】
すなわち、前記ポリペプチド(I)には、（ａ）前記式(1)でｐ＝０であるペプチドユニット［-(Pro-Y-Gly)n-］の繰り返し単位で構成されたポリペプチド、（ｂ）前記式(1)でｐ＝０であるペプチドユニット［-(Pro-Y-Gly)n-］と前記式(2)でｑ＝０であるペプチドユニット［-(Z)r-］とをａ：ｂの割合（モル％）で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチド、（ｃ）前記式(1)でｐ＝１であるペプチドユニット［-(OC-(CH2)m-CO)-(Pro-Y-Gly)n-］と前記式(3)で表されるユニット［-HN-R-NH-］とを１：１の割合（モル比）で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチド、（ｄ）前記式(1)でｐ＝１であるペプチドユニット［-(OC-(CH2)m-CO)-(Pro-Y-Gly)n-］と前記式(2)でｑ＝１であるペプチドユニット［-(OC-(CH2)m-CO)-(Z)r-］と前記式(3)で表されるユニット［-HN-R-NH-］とをａ：ｂ：ａ＋ｂの割合（モル比）で含む繰り返し単位で構成されたポリペプチドが含まれる。
【００４１】
一方、前記ポリペプチド(II)は、-Pro-Y-Gly-で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニット(4)を含むことが必要である。-Pro-Y-Gly-で表される配列は、３重らせん構造の安定性に寄与するため、この配列の割合が少ないと３重らせん構造の安定性が減少する。
【００４２】
さらに、このユニット(4)は、３重らせん構造の安定性の点から、ポリペプチド中において、-(Pro-Y-Gly)d-で表される繰返し構造を形成してもよい。この配列の繰返し数ｄは、例えば、２〜５０００、好ましくは２〜４０００、さらに好ましくは３〜３０００程度である。Ｙは、ProまたはHypのいずれであってもよいが、前記と同様に、３重らせん構造の安定性からHyp［通常、４Hyp（例えば、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）残基］であるのがより好ましい。
【００４３】
また、本発明におけるポリペプチド(II)は、-Pro-V-Gly-W-Ala-Gly-で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニット(5)を含むのが有用である。この配列を含まない場合や少なすぎる場合には、コラゲナーゼによる分解性が低下する。一方、この配列が多すぎると３重らせん構造の安定性が低下する。
【００４４】
ＶはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAlaのいずれであってもよいが、Gln、Asn、Leu、Val、Ala、特にGln、Leuがより好ましい。ＷはIleまたはLeuのいずれでもよいが、Ileがより好ましい。
【００４５】
ＶとＷとの組み合わせは、例えば、ＶがGln、Asn、Leu、Ile、Val及びAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）であり、ＷがIleであるペプチドや、ＶがGln、Asn、Leu、Ile、Val及びAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）であり、ＷがLeuであるペプチドなどが挙げられる。
【００４６】
ＹとＶとＷとの組み合わせは、ＹがHyp、ＶがGln、Asn、Leu、Ile、Val及びAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）、ＷがIle又はLeuであるペプチドや、ＹがPro、ＶがGln、Asn、Leu、Ile、Val及びAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）、ＷがIle又はLeuであるペプチドなどが挙げられる。
【００４７】
さらに、得られるポリペプチドの物理的及び生物学的性質を損なわない限り、このポリペプチド(II)は他のアミノ酸残基やペプチド鎖（ユニット）を含んでいてもよい。他のアミノ酸残基又はペプチド鎖としては、前記ペプチドユニット(2)の-(Z)r-で表されるペプチド鎖などが挙げられる。すなわち、このポリペプチドが有用な物理的及び生物学的性質を発揮するためには、例えば、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、His、Ala、Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された１〜１０個のアミノ酸残基で構成されたペプチド鎖（すなわち、これらのアミノ酸から選択されたアミノ酸残基、又はこれらのアミノ酸から選択された２〜１０個のアミノ酸残基で構成されたペプチド鎖）、特に、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、Arg、Pro、Valから選択された１〜１０個のアミノ酸残基で構成されたペプチド鎖を有している場合が多い。具体的には、例えば、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、Arg-Gly-Asp、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Ile-Lys-Val-Ala-Val、Val-Pro-Gly-Val-Gly、Asp-Gly-Glu-Ala、Gly-Ile-Ala-Gly、His-Ala-Val、Glu-Arg-Leu-Glu、Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu、Arg-Ser-Arg-Lysで示されるアミノ酸残基やペプチド鎖を含むのが好ましい。
【００４８】
前記ポリペプチド(II)において、前記ペプチドユニット(4)と前記ペプチドユニット(5)との割合（モル比）は、(4)／(5)＝９９／１〜３０／７０、好ましくは９８／２〜４０／６０、さらに好ましくは９５／５〜５０／５０程度である。
【００４９】
前記ペプチドユニット(4)及び前記ペプチドユニット(5)の合計量と、他のペプチドユニットとの割合（モル比）は、前者／後者＝１００／０〜５０／５０、好ましくは１００／０〜６０／４０、さらに好ましくは１００／０〜７０／３０程度である。
【００５０】
このようなポリペプチド(I)及び(II)は、環化により６員環を形成することなく、鎖状のポリペプチドを形成しており、溶媒（水、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ-メチルピロリドンなどの親水性溶媒又はそれらの混合溶媒）に可溶である。前記ポリペプチドは、水系ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）において、球状蛋白質換算で、例えば、分子量５×１０3〜５００×１０4、好ましくは分子量１×１０4〜３００×１０4、好ましくは３×１０4〜２００×１０4、さらに好ましくは５×１０4〜１００×１０4程度の範囲にピークを示す。
【００５１】
さらに、これらのポリペプチドは、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す。そのため、ポリペプチドの少なくとも一部（すなわち、一部または全部）が３重らせん構造を形成可能であり、コラーゲン様ポリペプチドを形成する。なお、コットン効果とは、旋光性物質において特定の波長で左右の円偏光に対する吸収係数が異なるために起こる現象をいう。
【００５２】
これらのポリペプチドは、コラーゲン組織（コラーゲン状の組織）を形成可能である。上記３重らせん構造を形成したポリペプチド鎖が自己集合して、数ｎｍ〜数十ｎｍの原線維を形成し、さらにこれらの原線維が配列して数ｎｍ〜数十ｎｍの繊維構造を形成することができる。これらは、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、あるいは原子間力顕微鏡により観察することができる。
【００５３】
前記ポリペプチド（I）（II）は、生分解性、特に生体内分解性を有していてもよい。このような生分解性ポリペプチドはコラゲナーゼ分解性を有している。特に、前記ポリペプチド（II）は高い生分解性を示す。
【００５４】
これらのポリペプチドは、生理学的又は薬理学的に許容される塩であってもよく、例えば、無機酸（塩酸、硫酸、リン酸など）、有機酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属（ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムなど）、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミン、ｔ−ブチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなど）との塩であってもよい。これらの塩形成化合物は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。これらの塩は、通常の塩形成反応によって得ることができる。
【００５５】
これらのポリペプチド(I)(II)は、アミノ酸やペプチドセグメントを縮合反応に供する慣用の方法により得ることができ、最終的に前記ユニットがポリペプチド中に含まれている限り特に制限されず、例えば、アミノ酸を縮合反応する方法や、ペプチドセグメントとアミノ酸を縮合する方法により得てもよいが、予め、前記アミノ酸配列を有するペプチド又はその誘導体などのペプチド成分を調製し、このペプチド成分を縮合する方法により得るのが好ましい。
【００５６】
予め調製したペプチド成分を縮合する方法において、ペプチド成分のペプチド鎖の合成は、通常のペプチド合成方法に従って行うことができる。ペプチドは、例えば、固相合成法または液相合成法によって調製できるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日  株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁参照〕。ペプチド合成には、慣用の方法、例えば、縮合剤を用いるカップリング方法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル（ONp）、ペンタフルオロフェニルエステル（Opfp）などのフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ONSu）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミドエステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（Obt）など）、混合酸無水物法、アジド法などが利用できる。好ましい方法では、少なくとも縮合剤（好ましくは後述する縮合剤、特に後述する縮合剤と縮合助剤との組合せ）を用いる場合が多い。
【００５７】
さらに、ペプチドの合成では、アミノ酸又はペプチドフラグメントの種類に応じて、アミノ基、カルボキシル基、他の官能基（グアニジノ基、イミダゾリル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、ω−カルボキシル基など）の保護基による保護と、接触還元や強酸処理（無水フッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸など）による保護基の脱離・除去とが繰り返し行われる。例えば、アミノ基の保護基には、ベンジルオキシカルボニル基(Z)、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基(Z(OMe))、９−フルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc)、ｔ−ブトキシカルボニル基(Boc)、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基(Npys)などが利用でき、カルボキシル基の保護基には、ベンジルオキシ基(OBzl)，フェナシルオキシ基(OPac)、ｔ−ブトキシ基(OBu)、メトキシ基(OMe)、エトキシ基(OEt)などが利用できる。なお、ペプチド合成には自動合成装置を利用してもよい。
【００５８】
より具体的には、前記ペプチド鎖の固相合成法による調製は、慣用の方法で行うことができる。固相樹脂（又は担体）としては、反応溶媒に不溶性の重合体、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、例えば、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂などが利用できる。
【００５９】
固相合成法では、通常、(i)前記重合体（樹脂）に対して、目的とするペプチドのＣ末端からＮ末端の方向に向かって、遊離のα−COOH基を有するとともに官能基（少なくともＮ末端のα−アミノ基など）が保護基で保護されたアミノ酸又はペプチド断片を結合させる操作と、(ii)結合したアミノ酸又はペプチド断片のうちペプチド結合を形成するα−アミノ基の保護基を除去する操作と、(iii)上記結合操作と除去操作とを順次繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させて目的ペプチドに対応するペプチド鎖を形成する工程と、(iv)ペプチド鎖を重合体（樹脂）から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより、目的とするペプチドを生成させ、生成したペプチドを精製することにより、ペプチドを製造できる。前記アミノ酸又はペプチド断片を結合させる操作(i)では、前記ペプチド鎖のＣ末端に対応し、かつ遊離のα−COOH基を有するとともに少なくともＮ末端が保護基で保護されたアミノ酸（例えば、Fmoc−アミノ酸、Boc−アミノ酸など）が使用される。なお、ペプチド鎖の重合体からの脱離及び保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、生成したペプチドの精製は、逆相液体クロマトグラフィーやゲルパーミエイションクロマトグラフィーなどの分離精製手段を利用して行うことができる。
【００６０】
ポリペプチド(I)は、例えば、少なくとも下記式(1a)で表されるペプチド又はその誘導体(A)を縮合し、ポリペプチドを調製する。
【００６１】
X-(Pro-Y-Gly)n-OH      (1a)
（式中、ＸはＨ又はHOOC-(CH2)m-CO-（ｍは前記に同じ）を表し、Ｙ及びnは前記に同じ）。
【００６２】
前記式(1a)で表されるペプチド又はその誘導体(A)は、下記式(2a)で表されるペプチド又はその誘導体(B)と共縮合させて、ポリペプチドを調製してもよい。
【００６３】
X-(Z)r-OH      (2a)
（式中、ＸはＨ又はHOOC-(CH2)m-CO-（ｍは前記に同じ）を表し、Ｚ及びｒは前記に同じ）。
【００６４】
なお、前記Ｘ＝HOOC-(CH2)m-CO-に対応する化合物としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などのＣ3-20の脂肪族ジカルボン酸又はそれらの酸無水物などが例示できる。これらの化合物は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。これらの化合物も慣用のアミド結合生成法（例えば、後述する第三級アミンなどを触媒とする反応など）反応や前記ペプチド合成法に従って反応させることにより、前記(1a)及び(2a)で示される化合物を得ることができる。
【００６５】
ペプチド又はその誘導体(A)とペプチド又その誘導体(B)との使用割合は、例えば、前者(A)／後者(B)＝１００／０〜３０／７０（モル％）、好ましくは１００／０〜４０／６０（モル％）、さらに好ましくは１００／０〜５０／５０（モル％）程度である。
【００６６】
さらに、前記式(1a)及び／又は式(2a)においてＸがＨである場合には必要ではないが、ＸがHOOC-(CH2)m-CO-（ｍは前記に同じ）であるとき、前記ペプチド又はその誘導体(A)及び／又はペプチド又はその誘導体(B)は、アミド基を形成するため、下記式(3a)で表される化合物(C)との共縮合反応に供される。
【００６７】
H2N-R-NH2      (3a)
（式中、Ｒは前記に同じ）。
【００６８】
前記式(3a)で表される化合物としては、前記式(3)に対応するジアミン類、例えば、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、プロピレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどのＣ1-18アルキレンジアミン、ジエチレントリアミン、ヘキサメチレンテトラミンなどのポリアルキレンポリアミン類などが例示できる。これらの化合物は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００６９】
前記ジアミン化合物(C)の使用量は、例えば、前記ペプチド又はその誘導体(A)(B)のうち一方のペプチド又はその誘導体がＸ＝HOOC-(CH2)m-CO-（ｍは前記に同じ）を有する場合、このような基を有するペプチド又はその誘導体１モルに対して、前記ジアミン化合物(C)の使用量は、実質的に１モル（例えば、０．９５〜１．０５モル程度）用いる必要がある。
【００７０】
ポリペプチド(II)の調製において、前記アミノ酸配列を有するペプチドを少なくとも含むペプチド成分を反応させる方法には、（ａ）式(4)及び(5)で表される双方のアミノ酸配列を有するペプチド（すなわち、式(4)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、式(5)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとの双方のユニットを有するペプチド）を少なくとも含むペプチド成分を縮合する方法と、（ｂ）式(4)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと、式(5)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとを少なくとも含むペプチド成分を縮合する方法とが含まれる。
【００７１】
前者の方法（ａ）において、式(1)及び(2)で表される双方のアミノ酸配列を有するペプチドは、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。また、この方法において、ペプチド成分としては、前記ペプチドに加え、目的のポリペプチドに応じて他のペプチドを用いてもよい。他のペプチドとしては、例えば、式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの他、前述の他のアミノ酸残基やペプチド鎖を含むペプチドなどが挙げられる。これらの他のペプチドも、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。なお、この方法において、式(1)又は(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを共縮合することにより、容易にユニット(1)又は(2)の割合を調整することができる。
【００７２】
後者の方法（ｂ）においても、式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、それぞれ、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。また、この方法においても、ペプチド成分として、これらのペプチド(1)及び(2)に加え、目的のポリペプチドに応じて他のペプチド、例えば、前述の他のアミノ酸残基やペプチド鎖を含むペプチドなどを用いてもよい。これらの他のペプチドも、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００７３】
これらのペプチド成分の縮合反応は、通常、溶媒中で行われる。溶媒は、上記ペプチド成分を溶解又は懸濁（一部または全部を溶解）可能であればよく、通常、水及び／又は有機溶剤が使用できる。溶媒としては、例えば、水、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミドなど）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシドなど）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジンなど）、ニトリル類（アセトニトリルなど）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフランなど）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコールなど）、及びこれらの混合溶媒が例示できる。これらの溶媒のうち、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが繁用される。
【００７４】
これらのペプチド成分の反応は、通常、少なくとも脱水剤（脱水縮合剤）又は縮合剤の存在下で行うことができ、脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で反応させると、二量化や環化を抑制しつつ、円滑にポリペプチドを生成できる。
【００７５】
脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に制限されず、例えば、カルボジイミド系縮合剤［ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド(EDC=WSCI)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)など］、フルオロホスフェート系縮合剤［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩(BOP)など］、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)などが例示できる。これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩］である。
【００７６】
縮合助剤は、上記縮合剤の反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類［例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド(HONSu)、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（HONB）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類］、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類［例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)などのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類］、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン(HOObt)などのトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルなどが例示できる。これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類［HONSuなど］、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類［HOBtなど］である。
【００７７】
前記脱水縮合剤と縮合助剤とは適当に組み合わせて使用できる。前記脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、DCC-HONSu(HOBt又はHOObt)、WSCI-HONSu(HOBt又はHOObt)などが例示できる。
【００７８】
脱水縮合剤の使用量は、前記ペプチド成分（前記ジアミン化合物も含む）の総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）程度である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、前記ペプチド成分の総量１モルに対して、通常、２〜５００モル（例えば、２〜５０モル）、好ましくは５〜２５０モル（例えば、５〜２５モル）、さらに好ましくは１０〜１２５モル（例えば、１０〜２０モル）程度である。縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、前記ペプチド成分の総量１モルに対して、例えば、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モル程度である。
【００７９】
前記縮合反応において、反応系のｐＨを調節してもよく、反応に関与しない塩基を添加してもよい。ｐＨの調節は、通常、無機塩基［水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど］、有機塩基、無機酸［塩酸など］や有機酸を用いて行うことができ、通常、反応溶液が中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）にｐＨ調整される。前記反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、ペプチドの総モル数の１〜２倍程度の範囲から選択できる。
【００８０】
前記ポリペプチドが３重らせん構造を形成することは、通常、ポリペプチドの溶液について、円二色性スペクトルを測定することにより立証できる。特に、円二色性スペクトルにおいては、３重らせん構造を形成する天然のコラーゲン及びペプチド鎖が、波長２２０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果、及び波長１９５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を特徴的に示すことが報告されている（J. M. Biol., Vol.63 pp.85-99, 1972年）。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、哺乳動物由来のコラーゲンと異なり、病原体や病原性因子［例えば、病原性に転化したタンパク質（例えば、異常型プリオンなど）など］の感染や伝達の危険性がなく、安全性が高い。また、コラーゲン様組織を形成可能であり、細胞親和性や生体適合性にも優れている。そのため、本発明のポリペプチドは、人工コラーゲンなどとして生体材料又は生体適合材料（又は医用材料）に好適に適用される。
【００８２】
前記ポリペプチドは、成膜性又は成形性が高く、所望の形状に容易に成形できる。そのため、生体材料又は医用材料は、前記ポリペプチド単独で構成してもよい。例えば、生体材料は、前記ポリペプチドで構成された種々の形態、例えば、液状（溶液又は懸濁液など）、粉粒状、二次元的形態（フィルムやシートなど）や三次元的形態で使用できる。液状のポリペプチドは、水、有機溶媒（ジメチルスルホキシド、ヘキサフルオロイソプロパノールなど）又はこれらの混合溶媒との混合液として調製できる。粉粒状ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドを粉砕したり、ポリペプチドの溶液又は懸濁液を噴霧乾燥することにより調製できる。ポリペプチドの溶液又は懸濁液を、剥離性支持体（例えば、フッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン）シート）上に流延して、乾燥することにより、ポリペプチドのシートやフィルムが得られる。また、高濃度の塩を含む溶液又はポリペプチドを溶解しない溶剤中に、ポリペプチドの溶液又は懸濁液をノズルから押し出し、凝固させることにより繊維状物が得られる。さらに、湿式又は乾式抄造法を利用して繊維状ポリペプチドから不織布を調製することもできる。さらには、ポリペプチドの水溶液又は懸濁液をそのまま静置したり、必要により架橋剤を添加して靜置し架橋させることによりゲル状物を得ることができる。この生成したゲル状物を凍結乾燥することにより、スポンジ状の多孔質体を得ることができる。さらには、ポリペプチドの水溶液または懸濁液を撹拌発泡して乾燥することによっても多孔質体を得ることもできる。
【００８３】
なお、ゲル状物や多孔質体に限らず、粉粒状物、繊維状、シートやフィルム状ポリペプチドも、必要により、架橋剤で架橋していてもよい。前記架橋剤としては、例えば、グリオキザール、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒドなどなどのジアルデヒド類、デキストランジアルデヒド、アルデヒドデンプンなどの生理学的に許容可能な架橋剤が例示できる。架橋剤の割合は、ポリペプチド１００重量部に対して１〜２０重量部、好ましくは１〜１０重量部程度であってもよい。
【００８４】
本発明の生体材料又は医用材料は、前記ポリペプチドを含む組成物であってもよい。前記組成物は、例えば、活性成分（生理学的又は薬理学的に許容される活性成分）、担体又はキャリア、添加剤などを含んでいてもよい。前記活性成分としては、例えば、殺菌剤又は消毒剤、抗炎症剤、消炎・鎮痛剤、鎮痒剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、抗ウィルス剤、抗真菌剤、抗生物質、皮膚軟化剤、褥瘡・皮膚治療剤、ビタミン剤、漢方薬などが例示できる。また、活性成分として、止血成分（血液凝固因子により止血するためのフィブリンなど）、細胞増殖促進作用、血管新生作用及び／又は細胞接着作用を有するポリペプチド又はその塩（特開平１０−３１６５８１号公報）などを含んでいてもよい。これらの成分は単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００８５】
担体又はキャリアとしては、生体材料の剤形（固形剤、半固形剤、液剤など）に応じて、生理学的に許容される種々の担体やキャリアが使用できる。例えば、固形剤の担体としては、結合剤（例えば、下記有機基材を構成する成分の他、セルロース誘導体（メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロースエーテル類、セルロースアセテートなどのセルロースエステル類など）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、多糖類（アラビアゴム末、プルラン、アルギン酸ナトリウム、グアーガムなど）など）、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、マンニトール、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸など）、崩壊剤（クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチなど）などが例示できる。
【００８６】
半固形剤の担体としては、基剤（ワセリン、流動パラフィン、パラフィン、プラスチベース、ラノリン、植物油、ワックス、シリコーン、ポリエチレングリコールなど）が例示でき、含水基剤であってもよい。
【００８７】
液剤では、担体として、例えば、水、アルコール（エタノールなど）、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体、油脂（トウモロコシ油、オリーブ油など）などが挙げられる。液剤は、種々の添加剤、例えば、懸濁化剤（アニオン性、カチオン性、ノニオン性又は両性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーなどの界面活性剤；水溶性高分子、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、水溶性セルロースエーテル類（メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）など）、緩衝剤（例えば、リン酸塩、ホウ酸塩などの緩衝液など）、溶解補助剤（例えば、ポリエチレングリコール、エタノール、トリスアミノメタン、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢酸、ソルビン酸又はその塩、クロロブタノール、ベンジルアルコールなど）、抗酸化剤（例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールなど）などが挙げられる。
【００８８】
さらに必要により、酸成分（例えば、酢酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸など）、塩基成分（アンモニア、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどの無機塩基、トリエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミンなどの有機塩基）を含んでいてもよい。
【００８９】
また、生体材料又は医用材料は、前記ポリペプチド（又はポリペプチドを含む組成物）と有機又は無機基材との複合材料であってもよい。基材は、通常、生体親和性、生体適合性を有している場合が多い。
【００９０】
無機基材としては、シリカ、ジルコニア、チタニアなどの金属酸化物、ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム、アルミニウム、ステンレススチール、チタン又はチタン合金などの金属、セラミックスなどが例示できる。
【００９１】
有機基材としては、例えば、多糖類又はその誘導体（アルギン酸塩、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリガラクトサミン、カードラン、プルラン、キサンタン、デキストランなどの多糖類、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はその塩、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロースエーテル類、セルロースアセテートなどのセルロースエステル類など）、タンパク質（ゼラチン、カゼイン、アルブミンなど）、ポリペプチド（ポリリジン、ポリグルタミン、ポリグルタミン酸など）、ビニルアルコール系樹脂（ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン−ビニルアルコール共重合体など）、ポリビニルピロリドン系樹脂、アクリル系樹脂（ポリ（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸共重合体などの（メタ）アクリル酸系樹脂など）、ハロゲン含有樹脂（ポリテトラフルオロエチレンなどのフッ素系樹脂、ポリ塩化ビニルなどの塩化ビニル系樹脂など）、ポリウレタン系樹脂、シリコーン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリアミド系樹脂（ナイロン６，ナイロン６６など）などが例示できる。
【００９２】
基材は非生体内分解性又は生体内崩壊性であってもよいが、生体材料として利用する場合、生体内で分解吸収性を有するのが有利である。このような生体内分解性基材は生体内分解性樹脂で構成できる。生体内分解性樹脂としては、種々の樹脂、例えば、前記多糖類又はその誘導体、ポリエステル（グリコール酸、乳酸、３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸などのヒドロキシカルボン酸の単独又は共重合体（乳酸−グリコール酸コポリエステルなど）、ヒドロキシカルボン酸と、プロピオン酸、ラクトン（ブチロラクトン、カプロラクトンなど）とのコポリエステルなど）が例示できる。
【００９３】
これらの基材用材料は単独で又は二種以上組み合わせて使用でき、二種以上の材料を用いた複合基材であってもよい。
【００９４】
基材の形態は特に制限されず、用途に応じて、粉粒状基材（例えば、１〜３００μｍ程度の粉粒体）、一次元的形状の基材（繊維状又は糸状基材、線状基材、ロッド状基材など）、二次元的形状の基材（フィルム（又はシート）又は板状基材など）、三次元的形状の基材（チューブ状基材など）などが利用できる。さらに、基材は、非多孔質体であってもよく多孔質体（例えば、粉粒状多孔質体、セルロース繊維紙、不織布や織布などの二次元的多孔質体、円筒状などの三次元的多孔質体）であってもよい。これらの基材は、必要であれば、表面処理剤（例えば、生理学的に許容可能な表面処理剤）で表面処理してもよい。
【００９５】
このような基材の少なくとも表面に前記ポリペプチドを適用することにより、本発明の生体材料を調製できる。前記ポリペプチドは、基材のうち生体に対する適用部位（体組織に限らず体液や血液と接触する部位）に適用すればよく、粉粒状や一次元的形状の基材では、基材全体に適用してもよく、二次元的形状の基材では少なくとも一方の面に適用してもよく、三次元的形状の基材では、生体に対する適用部位（全面、内面、外面など）に適用すればよい。例えば、前記ポリペプチドの溶液又は懸濁液を、基材の表面に塗布又は散布（又は含浸）した後、乾燥することにより、基材の表面がポリペプチドで被覆された生体材料を得ることができる。また、多孔質基材にポリペプチドの溶液又は懸濁液を含浸させ、ポリペプチドを保持した生体材料を調製してもよい。
【００９６】
さらに、ポリペプチドと架橋剤とを含む組成物を用いることにより、基材に担持されたポリペプチドは、必要により、架橋剤（特に、グリオキザール、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、マレアルデヒドなどのジアルデヒド類、デキストランジアルデヒド、アルデヒドデンプンなどの生理学的に許容可能な架橋剤）により架橋していてもよい。架橋剤の割合は、前記と同様、ポリペプチド１００重量部に対して１〜２０重量部、好ましくは１〜１０重量部程度であってもよい。
【００９７】
基材に対するポリペプチドの適用量は、生体材料の形態により大きく異なり一概に特定できないが、通常、基材１００重量部に対して、０．１〜５００重量部（例えば、１〜３００重量部）、好ましくは５〜２００重量部（例えば、１０〜１００重量部）程度であってもよい。
【００９８】
本発明の生体材料又は医用材料を医療用途に用いる場合には、殺菌又は滅菌して用いることが好ましい。殺菌、滅菌方法としては、種々の殺菌・滅菌方法、例えば、湿熱蒸気滅菌、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、薬剤殺菌、紫外線殺菌などが例示できる。これらの方法のうち、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌は、滅菌効率と材料に与える影響が少なく好ましい。なお、基材に適用したポリペプチドの表面は、保護フィルムなどで剥離可能に保護してもよい。
【００９９】
本発明の生体材料（生体適合材料）又は医用材料は、例えば、組織工学や再生医療における担体や支持体（人工皮膚、血管再生基材、管腔再生基材、神経再生基材、骨・軟骨再生基材、筋再生基材、腎再生基材、肝再生基材、人工鼓膜材など）として利用できるだけでなく、体液、血液や組織と接触する人工器官や人工臓器（生体内に埋設される人工心臓、人工血管、膀胱、消化管、腸膜、胸壁、縦隔、気管、人工肛門、関節など）の処理剤又は被覆剤としても利用できる。さらに、生体材料は、例えば、患部［例えば、疾病部や損傷部（例えば、擦傷及び火傷などの損傷部）など］や、切開部［例えば、手術などの切開部など］において、例えば、被覆材（又は被覆剤）又は塗布剤、埋入材（又は埋入剤）、止血材（又は止血剤）、癒着防止材（又は癒着防止剤）、接着材（又は接着剤）、管腔材（血管、尿管、腸管など）、膜材（腹膜、脳硬膜、人工皮膚や補綴膜材など）などとして有効に利用できる。なお、生体材料は、用途に応じて、含水ゲル又は非含水ゲルの形態で使用してもよく、吸収性パッドの形態で使用してもよい。
【０１００】
被覆材（又は被覆剤）には、擦過創、切創、挫創などの外傷、熱創、潰瘍などに対する創傷被覆材（創傷被覆剤）の他、採皮創、削皮創などの手術創に対する術創被覆材（術創被覆剤）も含まれる。被覆材（又は被覆剤）は、創傷部の形態や創傷の程度に応じて、種々の形態、紐状、フィルム又はシート状の他、塗布剤の形態でも使用できる。塗布剤は、患部や創傷部に塗布可能な液剤や軟膏剤などであってもよい。また、被覆材は、包帯、ガーゼ、脱脂綿などの形態で使用してもよい。被覆材として生体材料を創傷部に適用すると、創傷部からの滲出液を吸収して保持し、水分の揮散を抑制するとともに、創傷部の細菌による汚染・感染や繁殖を防止し、治癒に適した環境を整えることができる。
【０１０１】
埋入材（又は埋入剤）としては、創傷部を充填するための創傷充填材（又は創傷充填剤）、皮下に注入するための皮下埋入剤（又はインプラント剤）、補綴充填材（又は補綴充填剤）などが例示できる。皮下埋入剤は、胸部補修や体型補修などとして、乳房、鼻、頬、顎などに美容整形剤として利用できる。このような用途に生体材料を利用すると、ポリペプチドに起因して、シリコーンなどに比べて、高い生体適合性及び安全性を高めることができる。
【０１０２】
前記ペプチドはコラーゲン様組織を形成可能であり、止血作用も備えている。そのため、本発明の生体材料は、止血材（又は止血剤）としても利用できる。なお、止血材は、絆創膏、ガーゼ、包帯などの形態であってもよい。
【０１０３】
生体材料は、癒着防止材（又は癒着防止剤）としても有用である。すなわち、患部の切除部又は切断面や欠損部に生体材料を適用すると、ポリペプチドが高い生体適合性を備えているとともに、哺乳動物由来のコラーゲンと異なり、細胞接着サイトが少ないため、切除部などの癒着を有効に防止できる。特に、生体内分解性を有するポリペプチドを用いると、切除部などの癒着を有効に防止しつつ、生体内で吸収でき、手術などにより適用部位から癒着防止材を取り出す必要もない。癒着防止材は、種々の形態、紐状、フィルム又はシート状の他、塗布剤の形態でも使用できる。
【０１０４】
さらに、本発明の生体材料は、ポリペプチドが生体適合性が高く接着能を有しているため、切開部などの接着材（又は接着剤）としても有用である。接着材（又は生体組織接着剤）も、種々の形態、紐状、テープ状、フィルム又はシート状の他、塗布剤の形態でも使用できる。接着材は、骨折部を整復固定したり他の組織を固定又は仮止めしたまま、生体内に埋設してもよい。
【０１０５】
さらに本発明の生体材料は、縫合面の補強材として利用できるだけでなく、生体適合性が高いので、骨補強材、軟骨再生材などとしても利用できる。
【０１０６】
本発明の生体材料又は医用材料は、種々の被検体（被験体）の組織（例えば、表皮組織及び真皮組織など）へ適用できる。被検体は、ヒトに限らず、非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物）であってもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、生体に対する高い親和性及び適合性を有するポリペプチドを含むため、種々の生体材料（又は生体適合材料）又は医用材料、例えば、被覆材又は塗布剤、埋入材、止血材、癒着防止材、接着材、管腔材、膜材などとして有用である。
【実施例】
【０１０８】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１０９】
製造例１
式：H-(Pro-Pro-Gly)10-OH（配列番号：１）で示されるペプチド((株)ペプチド研究所)5mg（0.002mmol）を2mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.31mg（0.0024mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.32mg（0.0024mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.46mg（0.0024mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに室温で７日間撹拌を続けた。
【０１１０】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が4万〜20万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１１１】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、227nmに正のコットン効果、199nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。得られたポリペプチドをポリペプチド(Ia)とする。
【０１１２】
製造例２
式：H-(Pro-Pro-Gly)5-OH（配列番号：２）で示されるペプチド鎖をペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g (樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕を、各結合ステップについてそれぞれ1mmolずつ用いた。
【０１１３】
得られたペプチド樹脂（ペプチドを結合した樹脂）を、10mLのジメチルホルムアミドに懸濁し、50mg（0.5mmol）の無水コハク酸と13mg（0.1mmol）のジイソプロピルエチルアミンを加えて、室温で１２時間反応した。その後、メチルアルコールとジクロロメタンで交互に洗浄し、減圧乾燥した。
【０１１４】
得られたペプチド樹脂を、５％の水を含むトリフルオロ酢酸10mLで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物を、ＰＤ１０カラム(アマシャム・バイオサイエンス（株）製)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをアマシャム・バイオサイエンス（株）製「AKTA explorer10XT」〔カラム：ミリポア（株）製「ノバパックＣ１８」  3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に付したところ、リテンションタイム14.5minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は1375であった(理論値：1374.52)。
【０１１５】
1.4mg(0.001mmol)のHOOC-(CH2)2-CO-(Pro-Pro-Gly)5-OHと、0.06mg (0.001mmol)のエチレンジアミンとを0.05mLの水に懸濁し、混合液に、0.32mg（0.0024mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、4.6mg（0.024mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、室温で３日間振盪した。
【０１１６】
反応溶液を水で100倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））により分子量を測定したところ、分子量が3万〜20万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１１７】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、228nmに正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。得られたポリペプチドをポリペプチド(Ib)とする。
【０１１８】
製造例３
式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：３）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）5mg（0.0016mmol）を2mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.23mg（0.0018mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.24mg（0.0018mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.65mg（0.0034mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに室温で７日間撹拌を続けた。
【０１１９】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が６万〜20万以上の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１２０】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、225nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。得られたポリペプチドをポリペプチド(Ic)とする。
【０１２１】
得られたポリペプチド(Ic)の水懸濁液をフッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン）シート上に流延した後、風乾することによりキャストフィルムを作製した。このフィルムに金を蒸着した後、走査型電子顕微鏡で観測すると、図１に示すような繊維状の構造物が観測された。
【０１２２】
製造例４
式：H-(Pro-Pro-Gly)5-OH（配列番号：２）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）3.5mg（0.0026mmol）と、実施例２と同様の方法で合成した0.92mg（0.0011mmol）のH-(Val-Pro-Gly-Val-Gly)2-OH（配列番号：４）とを所定の割合（70モル％：30モル％）で1.5mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.52mg（0.0040mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.51mg（0.0038mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、1.45mg（0.0076mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに室温で７日間撹拌を続けた。
【０１２３】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））により分子量を測定したところ、分子量が8万〜45万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１２４】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、227nmに正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。得られたポリペプチドをポリペプチド(Id)とする。
【０１２５】
得られたポリペプチドの水懸濁液をフッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン）シート上に流延した後、風乾することによりキャストフィルムを作製した。このフィルムを、150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4）に浸漬するとシート状のゲル状物が得られた。このシート状のゲル状物は、室温では透明であったが、40℃以上の温度で可逆的に白濁した。
【０１２６】
製造例５
式：H-(Pro-Hyp-Gly)5-OH（配列番号：５）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）5mg（0.0033mmol）を2 mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.44mg（0.0034mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.46mg（0.0033mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、1.3mg（0.0068mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに室温で14日間撹拌を続けた。
【０１２７】
反応溶液を水で20倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が4万〜10万以上の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１２８】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、199nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。得られたポリペプチドをポリペプチド(Ie)とする。
【０１２９】
製造例６
5mg（0.0016mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：３）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を0.5mLの10mMリン酸塩緩衝液（8.1mMのNa2HPO4・12H2O、1.5mMのKH2PO4、2.7mMのKCl、pH 7.4）に溶解し、20℃で撹拌した。この溶液に、0.24mg（0.0018mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、31mg（0.16mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で24時間撹拌を続けた。
【０１３０】
反応溶液を水で60倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM リン酸塩緩衝液（pH 7.4））に供したところ、平均分子量４０万に相当するポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１３１】
得られた反応溶液を水で５倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去した。得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、225nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。得られたポリペプチドをポリペプチド(If)とする。
【０１３２】
製造例７
式：H-(Pro-Hyp-Gly)1-OHで示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）１ｇを２０ｍＬの１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、４７３ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３．３５ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加えて、４℃で２時間、その後２０℃で４６時間撹拌を続けた。反応液をミリＱ水（超純水）に対して４８時間透析した。
【０１３３】
得られた透析後の溶液を水で５０倍に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superdex 200 HR 10/30、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が１０万〜６０万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。
【０１３４】
また、得られた透析後の溶液を水で１００倍に希釈し、円二色性スペクトルを測定したところ、２２５ｎｍに正のコットン効果、１９８ｎｍに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【０１３５】
式：(Pro-Hyp-Gly)10（配列番号：３）で示されるペプチド（(株)ペプチド研究所）の２１５ｎｍにおける吸光度から検量線を作成し、得られた３重らせん構造を形成するポリペプチドの濃度を測定すると約２０ｍｇ／ｍＬであった。得られたポリペプチドをポリペプチド(Ih)とする。
【０１３６】
製造例８
式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：６）で示されるペプチド鎖を、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g(樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン〔Fmocグルタミン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−イソロイシン〔Fmocイソロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Fmocアラニン〕、バッケム社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン〔Fmocヒドロキシプロリン〕を、各結合ステップについてそれぞれ1mmolずつ用いた。
【０１３７】
得られたペプチド樹脂を、５％の水を含むトリフルオロ酢酸10mLで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物を、ＰＤ１０カラム(アマシャム・バイオサイエンス（株）製)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをアマシャム・バイオサイエンス（株）製「AKTA explorer10XT」〔カラム：ミリポア（株）製「ノバパックＣ１８」  3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に付したところ、リテンションタイム12.4minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は2681.3であった(理論値：2679.9)。
【０１３８】
2.5mg（0.0009mmol）のH-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OHを1mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.12mg（0.0009mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.34mg（0.0018mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で３倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチド(IIa)を得た。ペプチドユニット(4)と(5)の割合（(4)/(5)）は８/１（88.9/11.1）（モル比）であった。
【０１３９】
得られたポリペプチド(IIa)をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が7万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１４０】
得られたポリペプチド(IIa)の円二色性スペクトルを測定したところ、223nmに正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【０１４１】
製造例９
1.2mg（0.00045mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：３）で示されるペプチド((株)ペプチド研究所)と、1.2mg（0.00045mmol）の製造例８で得られた式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：６）で示されるペプチドを0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチド(IIb)を得た。ペプチドユニット(4)と(5)の割合（(4)/(5)）は、18/1（94.7/5.3）（モル比）であった。
【０１４２】
得られたポリペプチド(IIb)をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が14万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１４３】
得られたポリペプチド(IIb)の円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、196nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【０１４４】
製造例１０
2.2mg（0.00081mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：３）で示されるペプチド((株)ペプチド研究所)と、0.24mg（0.00009mmol）の製造例８で得られた式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：６）で示されるペプチドを0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチド(IIc)を得た。ペプチドユニット(4)と(5)の割合（(4)/(5)）は、98/1（≒99/1）（モル比）であった。
【０１４５】
得られたポリペプチド(IIc)をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が14万〜40万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１４６】
得られたポリペプチド(IIc)の円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【０１４７】
試験例１
製造例８〜１０で得られたポリペプチドのそれぞれ0.025mgを、0.05mLの50mMのNaClと10mMのCaCl2を含む50mM Tris/HCl緩衝液（pH=7.5）に溶解した。さらに、同じ緩衝液0.05mLに溶解した200ngのコラゲナーゼ（MMP-1, human rheumatoid synovial fibroblast）を添加し、３７℃で２４時間静置した。その後、0.1M HCl水溶液を0.01mL添加して、酵素反応を停止した後、150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4）で希釈して、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））で分子量分布の変化を測定した。
【０１４８】
その結果、製造例８のポリペプチドではコラゲナーゼを加えない場合のピーク分子量約100万が約54万に低下した。同様に製造例９、１０のポリペプチドでも、それぞれ約80万が約40万、約70万が約30万に低下した。
【０１４９】
製造例１１
式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：７）で示されるペプチド鎖を、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g(樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−ロイシン〔Fmocロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−イソロイシン〔Fmocイソロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Fmocアラニン〕、バッケム社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン〔Fmocヒドロキシプロリン〕を、各結合ステップについてそれぞれ1mmolずつ用いた。
【０１５０】
得られたペプチド樹脂を、５％の水を含むトリフルオロ酢酸10mLで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物を、ＰＤ１０カラム(アマシャム・バイオサイエンス（株）製)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをアマシャム・バイオサイエンス（株）製「AKTA explorer10XT」〔カラム：ミリポア（株）製「ノバパックＣ１８」  3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に付したところ、リテンションタイム15minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は2666.3であった(理論値：2664.9)。
【０１５１】
1.2mg（0.00045mmol）のH-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OHを0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチド(IId)を得た。ペプチドユニット(4)と(5)の割合（(4)/(5)）は、8/1（88.9/11.1）（モル比）であった。
【０１５２】
得られたポリペプチド(IId)をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が8万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【０１５３】
得られたポリペプチド(IId)の円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【０１５４】
実施例１（不織布状生体材料）
製造例７で得られたポリペプチド(Ih)を約２０ｍｇ／ｍＬに希釈し、その０．５ｍＬを３ｃｍ四方に切断したポリグリコール酸系不織布であるネオベール（グンゼ（株））に含浸した後、凍結乾燥して不織布状の生体材料を得た。
【０１５５】
試験例２
日本白色家兎の肝臓を露出し、その右葉の下方約１／３を切除した。切除面をガーゼで圧迫止血した後、実施例１で得られた不織布状の生体材料を切除部に密着させて、周囲を縫合糸で固定した。術後３ヶ月後に、犠死させた後切除部を含む肝臓組織を摘出して肉眼観察及び組織学的検討を行った。術後３ヶ月後において埋植した生体材料はすべて分解吸収され、肉眼的及び組織学的にも正常な肝臓組織が再生修復されており、瘢痕形成や炎症反応などの兆候は認められなかった。
【０１５６】
実施例２（創傷被覆材）
アルギン酸ナトリウム（株式会社キミカ製、９９mPa・s）の１質量％水溶液２．５ｍＬと、製造例７で得られたポリペプチド(Ih)を約２０ｍｇ／ｍＬに希釈し、その２．５ｍＬを混合し、内部寸法が３ｃｍ四方のフッ素樹脂トレイに流延し、その後凍結乾燥して、スポンジ状の創傷被覆材を得た。
【０１５７】
試験例３
日本白色家兎の耳介に直径８ｍｍの全層欠損創を作製して、実施例２で得られた創傷被覆材を密着して貼付し、その上から３ｃｍ四方のガーゼを重ねて粘着性の絆創膏で固定した。そのまま、10日間飼育した後、創部を観察したところ、実施例２の創傷被覆材を貼付した創では、８例中全例が創が閉鎖し、上皮化も完了していた。これに対して、実施例２の創傷被覆材を貼付せず、ガーゼと絆創膏で被覆した創では、８例中３例が完全に創が閉鎖せず、上皮化も不十分であった。
【０１５８】
実施例３（埋入材）
製造例１０で得られたポリペプチド(IIc)の水溶液を凍結乾燥することにより、粉末状とした。粉末状のポリペプチド(IIc)の１００ｍｇをアルギン酸ナトリウム（株式会社キミカ製、９９mPa・s）の１質量％生理食塩液溶液１０ｍＬと混合して液体状の埋入材を得た。
【０１５９】
試験例４
６週齢の雌性Wistarラット背部の毛をバリカンと除毛クリームで除去した後、背部皮内の数ヶ所に各０．３ｍＬの液体状の埋入材を注入した。その後、８週間にわたって、埋入部の外観観察を行った、さらに８週間後にラットを犠死させ、埋入部の組織を摘出して組織学的検討を行った。外観観察では、埋入部のふくらみは時間とともに徐々に縮小し、８週目にはほとんど無くなった。組織像において、埋入材は、ほぼ完全に分解吸収されており、材料の痕跡、瘢痕組織、炎症反応の痕跡は全く認められなかった。
【０１６０】
実施例４（癒着防止材）
製造例９で得られたポリペプチド(IIb)の水溶液２．５ｍＬと、アルギン酸ナトリウム（株式会社キミカ製、９９mPa・s）の１質量％水溶液を混合し、内部寸法が３ｃｍ四方のフッ素樹脂トレイに流延し、その後室温で風乾して、シート状の癒着防止材を得た。
【０１６１】
試験例５
６週齢の雄性Wistarラットの盲腸の片面を乾燥したガーゼで６回こすることにより、漿膜に擦過傷を作製した。作製した擦過傷に実施例４で得られたシート状の癒着防止材を密着貼付した。２週間後に再度開腹して生じた癒着の程度を、癒着が生じた個数で評価した。実施例４で得られたシート状の癒着防止材を貼付した時の、平均癒着個数が１．３であったのに対して、癒着防止材を用いなかった時の平均癒着個数は３．５であった。
【０１６２】
実施例５（接着材）
製造例８で得られたポリペプチド(IIa)の水溶液を凍結乾燥することにより、粉末状とした。得られた粉末９９重量部とＮ-サクシニミジル３-マレイミドプロピオナート（アルドリッチ）１重量部を良く混合して粉末状の接着剤を得た。
【０１６３】
試験例６
６週齢の雄性Wistarラットの腹膜を露出し、中央部に約１ｃｍの切開創を作製した。実施例５で得られた粉末状の接着剤を切開部に塗布し、ピンセットで切開部を閉じてそのまま５分間保持した。その後切開創を中心にして長さ４ｃｍ、幅１ｃｍの大きさで腹膜を切除し、直ちに引っ張り試験機（インストロン）で引張り破断強度を測定した。実施例５で得られた粉末状の接着剤を用いた場合には、２〜１０ＭＰａの引張り破断強度を示した。これに対して何も用いない場合にはすべて１ＭＰａ以下の破断強度であった。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１は製造例３で得られたフィルムを示す走査電子顕微鏡写真である。
【図１】
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【配列表】
2005058499000001.app