(57)【要約】【課題】  ＳＩＮＥ法により鯨種を判別する方法の提供。【解決手段】  本法は：判別しようとする１以上の鯨種からそれぞれゲノムＤＮＡライブラリーを作成し；上記各ライブラリーから、上記鯨種の中の少なくとも１種においてＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーが特異的に挿入されているオルソロガス遺伝子座を含むクローンをそれぞれ単離し；上記遺伝子座において上記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーの両端に位置するフランキング配列にアニールするＰＣＲプライマーのセットを用いて、上記鯨種のそれぞれについて上記遺伝子座の配列をＰＣＲにより増幅し；そして得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動して、上記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリー挿入遺伝子座の存在を示すバンドの有無により、上記鯨種を判別する；ことを含む方法を提供する。上記方法に使用する遺伝子座の配列及びプライマー配列も提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＮＥ法により鯨種を判別する方法であって、以下のステップ：
判別しようとする１以上の鯨種からそれぞれゲノムＤＮＡライブラリーを作成し；
上記各ライブラリーから、上記鯨種の中の少なくとも１種において或るＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーに属するＳＩＮＥが特異的に挿入されているオルソロガス遺伝子座を含むクローンを単離し；
上記遺伝子座において上記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーの両側に位置するフランキング配列にアニールするＰＣＲプライマーのセットを用いて、上記鯨種のそれぞれについて上記遺伝子座の配列をＰＣＲにより増幅し；そして
得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動して、上記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリー挿入遺伝子座の存在を示すバンドの有無により、上記鯨種を判別する；
を含み、ここで、前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号３１に示す配列に相当するＧＲＹ２０、配列番号３２に示す配列に相当ＢＲＹ５０、配列番号３３に示す配列に相当するＳｐｅｒｍ２８、配列番号３４に示す配列に相当するＨｕｍｐ４２、配列番号３５に示す配列に相当するＮａｇ１８、配列番号３６に示す配列に相当するＳＩＲ１３、配列番号３７に示す配列に相当するＳｅｉ３５、配列番号３８に示す配列に相当するＢＲＹ６３、配列番号３９に示す配列に相当するＧＲＹ８、配列番号４０に示す配列に相当するＭＮＫ３１、配列番号４１に示す配列に相当するＮＭ１、配列番号４２に示す配列に相当するＳＥＭ３、配列番号４３に示す配列に相当するｓＮＲ２、配列番号４４に示す配列に相当するｎａ１０７、配列番号４５に示す配列に相当するｎａ１０２、配列番号４６に示す配列に相当するＴｕｔｉ３５、配列番号４７に示す配列に相当するＳｐ９、及び配列番号４８に示す配列に相当するＳｐ２から成る群から選ばれる、前記方法。
【請求項２】
配列番号３１〜４８のいずれか１に示す配列を有するＤＮＡ又は上記ＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズするオルソロガスＤＮＡ。
【請求項３】
前記ＰＣＲプライマーが、配列番号４９〜８４から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号４９〜８４のいずれか１に示す配列を有するプライマーＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＩＮＥ法により鯨種を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ配列決定及び分子クローニング技術の自動化は、生物のゲノムへのアクセスを劇的に拡大している。さらに、ゲノムのディジタル情報の洪水は、多数の生物学者をコンピューターを使用したバイオ・インフォマティックスティクに惹きつけている。ヒトゲノム計画の如き包括的な努力の結果は、核酸再生試験により３０年程前に明らかにされたものを極めて詳細に示した。すなわち、真核生物のゲノムの大部分は、特定のタンパク質産物をコードしておらず、明らかな機能をもたない反復要素から構成されている  (Kazazian et al., 1998)。ゲノム解析の結果として、たんぱく質をコードしていない、いわゆる「ジャンクヤード」は、DNAタイプの転移因子やRNA性の転移因子などの活動的な要素で満ちたダイナミックな分子の「ジャングル」として新たに認識されている。レトロポゾンは、系統学の再構築及び集団分析のための分類学のツールとして利用されることができると考えられつつある興味深い遍在性の反復配列であり、上記RNA性の転移因子の一員である(Brosius, 1991; Shedlock and Okada, 2000)。これゆえ、レトロポゾンによる診断は、個体レベルあるいは種レベルにおける進化生物学の関連亜分野の間の重要な橋渡しをする。
【０００３】
用語「レトロポジション」とは、上記要素が、ＲＮＡ中間体によりゲノム内の親遺伝子座と標的遺伝子座の間でどのように移動するかをいう (Rogers, 1983)。このコピー・アンド・ペースト過程は、ＲＮＡから染色体ＤＮＡへの遺伝情報の逆流を作り出す (Weiner, et al., 1986, Schmid, 1996)。それは親遺伝子座に元のコピーを残さないような様式、則ちカット・アンド・ペースト様式で、染色体の周辺をジャンプするDNAタイプのトランスポゾン、例えば、mariner及びPエレメントとは異なる (Clark and Kidwell, 1997; Hartl et al, 1997)。レトロポゾンを分類するために使用される重要な特徴は、自己増幅のために不可欠な酵素である逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）をコードしているか否かである (Okada, 1991; Eickbush, 1994)。自己増幅しないレトロポゾンンの中で、短い散在性の要素（short interspersed elements, SINEs）は、ゲノム内に多数存在するので、真核生物の分類学の研究のためには極めて有用であると考えられる。ＳＩＮＥは、サイズが７０〜５００ｂｐの範囲にあり、そして２つのカテゴリー、tRNA由来のものと７ＳＬＲＮＡ由来のものに分類される。７ＳＬＲＮＡ由来のＳＩＮＥは、２つのＳＩＮＥファミリー、すなわち、霊長類のＡｌｕファミリーとげっ歯類のＢ１ファミリーだけを含む。それ以外のこれまで調べられた他のＳＩＮＥの全てがｔＲＮＡ由来であることが示されている。増幅のためのＲＴａｓｅをコードするＬＩＮＥも、２つのカテゴリーに分類される。すなわち、増幅のための特定の配列を必要とせずに単純なポリＡ配列のみを逆転写のために必要とする哺乳動物のＬ１、と増幅のためにＲＴａｓｅに認識されるべく3’末端に厳格な配列モチーフを必要とする、ほとんどのＬＩＮＥを含むの他のカテゴリーである。ほとんどの非哺乳動物のＳＩＮＥとＬＩＮＥは、同一の3’末端尾配列を共有し、その存在により、ＳＩＮＥは、ＬＩＮＥによりコードされるＲＴａｓｅにより増幅されることができる (Ohshima et al, 1997; Okada et al, 1997; Terai et al., 1998)。哺乳動物の場合、ｔＲＮＡと７ＳＬＲＮＡ由来のものを含むＳＩＮＥは、哺乳動物のＬ１によりコードされるＲＴａｓｅの助けを借りて増幅されるようである。それゆえ、この場合、上記の保存された配列モチーフは、ＳＩＮＥの3’末端尾には観察されない。ＳＩＮＥのレトロポジションに関する一般ダイアグラムを図１に示す。
【０００４】
レトロポジションが一方向性に常に生じると云う事実とＳＩＮＥの１０4以上のコピーが宿主ゲノムの全体にわたって散在するという事実は、ＳＩＮＥ挿入分析が分子分類学への強力な新規アプローチであることを際立たせている。このＳＩＮＥ挿入分析は、キャラクター・データをもつ他の形態の、最も顕著にはＤＮＡ配列及び形態学の分析を補う (例えば、Murata et al, 1993, Shimamura et al., 1997, Takahashi et al, 1998; Nikaido et al, 1999)。分類学のツールとしてのＳＩＮＥ進化とそれらの重要性に関する論文は入手できる (Weiner et al, 1996, Deininger and Batzer, 1993, Schmid, 1996, Rokas and Holland, 2000; Shedlock and Okada, 2000, Shedlock et al. 2000)。
【０００５】
ところで、鯨種の判別においては、ＰＣＲでミトコンドリア遺伝子の或る特定の領域を増幅した後、それらをアガロース・ゲルで電気泳動して増幅を確認し、その後シークエンス法を用いて塩基配列を決定して、その配列の違いを指標にして種判別がなされてきた。シークエンス法実験設備は高額であるため、それらの解析は現在ほとんど専門会社により行われている。したがって、膨大な数の個体数についての種を判別するためには、その解析数も当然に膨大となり、そのコストは多大なものとなる。さらに、塩基配列の解析は、以下に述べるように未だ不十分・不確実な面もあり、それらの解釈もしばしば問題視されている。
【特許文献１】特開２００３−００９８６６号公報
【非特許文献１】Shimamura M, Yasue H, Ohshima K, Abe H, Kato H, Kishiro T, Goto M, Munechika I, Okada,N. (1997) Molecular evidence that whales form a clade within even-toed ungulates. Nature 388：666-670.
【非特許文献２】Nikaido M, Rooney AP, Okada N. (1999) Phylogenetic relationships among cetartiodactyls based on insertions of short and long interpersed elements：hippopotamuses are the closest extant relatives of whales. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96：10261-10266.
【非特許文献３】Shedlock AM, Okada N (2000) SINE insertions：powerful tools for molecular systematics. BioEssays 22：148-160.
【非特許文献４】Nikaido M, Matsuno F, Hamilton H, Brownell Jr. LR, Cao Y, Ding W, Zuoyan Z, Shedlock AM, Fordyce RE, Hasegawa M, Okada N. (2001) Retroposon analysis of major cetacean lineages：the monophyly of toothed whales and the paraphyly of river dolphins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98：7384-7389.
【非特許文献５】岡田典弘（1997）クジラの起源と哺乳類の進化−哺乳類の放散は恐竜の絶滅後に起こったのか  科学 vol.67 岩波書店 pp.908-916。
【非特許文献６】岡田典弘（2000）クジラが陸にいたころは−サイン法による系統決定が明らかにしたカバとの関係  科学 vol.70 岩波書店 pp.119-125。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、塩基配列の解析を用いずに、簡易・迅速・安価に、鯨類を判別するための検定方法の必要性が未だ存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
今般、本願発明者は、ＳＩＮＥが、上述のように系統学・分類学の研究に利用できるだけでなく、鯨種判別のための簡易・迅速・安価な検定方法に利用できることを発見した。そして広範囲にわたる試料について鋭意実験を重ねた結果その確実性を証明して本願発明を完成するに至った。すなわち、以下に詳細に述べるように、ＳＩＮＥの挿入が共通にあれば、それらの共通に挿入のある種どうしが互いに単系統であるということを系統学的に明らかにできるわけであるが、それらのＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーの挿入が、ある特定の種内に特有であれば、その挿入の有無が種判別に利用できることがわかる。このような種に特有のＳＩＮＥサブファミリー配列の単離・同定方法も本願発明の範囲内にある。
従来SINEファミリーを使った系統樹作成はなされて来たが、それはSINEファミリーを用いてサブファミリーとして分類する事なく行なわれて来た。種の同定を可能にするSINEは、最近に増幅を行ったSINEでなくては行う事が出来ないので、最近に増幅したサブファミリーを特異的に単離する必要が有る。本方法はその方法を提供するものである。
【０００８】
本発明の１の態様においては、ＳＩＮＥ法により鯨種を判別する方法であって、以下のステップ：
判別しようとする１以上の鯨種からそれぞれゲノムＤＮＡライブラリーを作成し；
上記各ライブラリーから、上記鯨種の中の少なくとも１種において或るＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーに属するＳＩＮＥが特異的に挿入されているオルソロガス遺伝子座を含むクローンを単離し；
上記遺伝子座において上記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーの両側に位置するフランキング配列にアニールするＰＣＲプライマーのセットを用いて、上記鯨種のそれぞれについて上記遺伝子座の配列をＰＣＲにより増幅し；そして
得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動して、上記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリー挿入遺伝子座の存在を示すバンドの有無により、上記鯨種を判別する；
を含み、ここで、前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号３１に示す配列に相当するＧＲＹ２０、配列番号３２に示す配列に相当ＢＲＹ５０、配列番号３３に示す配列に相当するＳｐｅｒｍ２８、配列番号３４に示す配列に相当するＨｕｍｐ４２、配列番号３５に示す配列に相当するＮａｇ１８、配列番号３６に示す配列に相当するＳＩＲ１３、配列番号３７に示す配列に相当するＳｅｉ３５、配列番号３８に示す配列に相当するＢＲＹ６３、配列番号３９に示す配列に相当するＧＲＹ８、配列番号４０に示す配列に相当するＭＮＫ３１、配列番号４１に示す配列に相当するＮＭ１、配列番号４２に示す配列に相当するＳＥＭ３、配列番号４３に示す配列に相当するｓＮＲ２、配列番号４４に示す配列に相当するｎａ１０２、配列番号４５に示す配列に相当するＴｕｔｉ３５、配列番号４６に示す配列に相当するＴｕｔｉ３５、配列番号４７に示す配列に相当するＳｐ９、及び配列番号４８に示す配列に相当するＳｐ２から成る群から選ばれる、前記方法が提供される。
【０００９】
本発明の他の態様においては、配列番号３１〜４８のいずれか１に示す配列を有するＤＮＡ又は上記ＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズするオルソロガスＤＮＡが提供される。
前記ＰＣＲプライマーは、配列番号４９〜８４から成る群から選ばれることができる。
本発明の他の態様においては、配列番号４９〜８４のいずれか１に示す配列を有するプライマーＤＮＡが提供される。
【発明の効果】
【００１０】
上述の通り、本発明の効果は配列決定の作業を省略できるところである。まず配列決定に必要なシーケンサー関連機材を揃えるならば最低でも１５００万円の設備投資が必要となる。また消耗品に関しては１回の配列決定にかかるコストがおよそ１２００円であり、多量（数千サンプル）の検体を判別するとなると膨大な費用がかかってしまう。外注する場合には設備投資の必要がなくなるが、１検体につき１万円以上の費用がかかるのが現状である。また配列決定をおこなうにはＰＣＲ、電気泳動後に、５時間以上かかることから、ＳＩＮＥ法は時間的な面からも、大きな効率化を図ることが可能になる。
【００１１】
またデータの解析に関しても、ＤＮＡ塩基配列に基づく種判別には統計的な操作が必要であり、その解析方法によって、結果が異なることもしばしば見受けられ、種判別という観点から考えても理想的とは言い難い。それに対し、ＳＩＮＥ法では、ＳＩＮＥの挿入という不可逆的な現象を指標として種判別をおこなうので、その結果は明瞭であり、また特別な統計処理も必要なく、一見しただけで結果の解釈ができる。
【００１２】
以上の理由から、従来の塩基配列の比較に基づく種判別よりもＳＩＮＥの挿入を指標とした種判別の方が、金銭的、時間的な面から考えても優れており、その信頼性も高いといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
定義
本願明細書中、「ＳＩＮＥ」とは、その１次構造上の長さは約１００〜４００塩基である短い散在性の反復配列であって、その5’末端から順にｔＲＮＡ相同領域、ｔＲＮＡ非相同領域、ＡＴに富む領域を含むものをいう。その両端にはＳＩＮＥがゲノム内に挿入される際にできると考えられている約５〜２０塩基の同方向の繰返し配列(direct repeats)が存在することを特徴とする。
本願明細書中、「ＳＩＮＥファミリー」とは、同一のｔＲＮＡに由来する、お互いに配列の似通ったＳＩＮＥのメンバーをいう。
一方、本願明細書中、「ＳＩＮＥサブファミリー」とは、同じ起源（ファミリー）に由来するが、特徴的(diagnostic)な変異が見られるため、ＳＩＮＥファミリーの中の同じ祖先メンバーから増幅したようＳＩＮＥ群のメンバーをいう。サブファミリーはタイプとも互換使用される。
本願明細書中、オルソロガス遺伝子座とは、二つの遺伝子座がある共通祖先からの種分化に由来することをいう。一方，種分化ではなく遺伝子重複によって二つの遺伝子が生じたとき、それらは「パラロガス」である。分子系統樹の推定にとって必要な情報を与えるのは、パラロガス遺伝子ではなく、オルソロガス遺伝子である。
【００１４】
本願明細書中、「フランキング配列」とは、オルソロガス遺伝子座内に特異的にＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーが挿入された場合、その挿入部位の両側に位置する配列をいう。かかるフランキング配列内でＰＣＲプライマーを任意に設計することができる。
本明細書中、ストリンジェント条件とは、鋳型ＤＮＡを、ハイブリバックに入れ、そこにプレハイブリ溶液（6 X SSC, 1 % SDS ） を適当量加え、ハイブリバックをシーラーでパックし1時間以上インキュベートし、溶液を捨て、ハイブリ溶液（6 X SSC, 1 % SDS, 1 X Denhart's solution , Carrier DNA (Shared Herring Sperm DNA solution)を加えた後、さらに予め調整したプローブを95 ℃で3分間熱変性しておいたものを加え、またハイブリバックをシールし、その後42 ℃のウォーターバスで一晩（〜１５時間程度）インキュベートし、それらのメンブレンを適当量のウォッシュ溶液（2X SSC, 1 % SDS）で軽く濯いだとき、プローブが上記鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするような条件をいう。
【００１５】
本願明細書中、「外群比較」とは、系統推定論において，外群  (outgroup)，すなわち対象生物群すなわち内群  (ingroup)に対して最も近縁であると仮定される種または種群に基づく形質極性の決定法をいう。外群を解析に含めることにより、内群根(内群系統樹全体の共通祖先)の位置を決めることができる。分岐分類学の初期の理論では、まず初めに外群のもつ形質状態に基づいて内群の形質状態の極性すなわち原始的形質状態と派生的形質状態の判定を行い、次に、あらかじめ判定された形質の極性に基づいて，派生的形質状態を共有する種を単系統群としてまとめる。外群比較は、とりわけ形態形質の極性を判別する主たる方法として広く用いられる。その論理的根拠は最節約原理とよばれるもので、内群根に連なる枝での仮想的形質状態(内群での極性判別の基準)を外群の形質分布から最節約的に推定しているからである。Maddison, Donoghue  ＆  Maddison(1984)とSwofford  ＆  Maddison(1987)は、外群比較に基づく内群の系統推定が、内群と外群をあわせた群に対する極性判定を行わない最節約的な系統推定と論理的に等価であることを証明した。
したがって，特に制限酵素の切断部位や核酸の塩基配列など極性判定が困難な分子データからも分岐分類学に基づく最節約系統推定が可能になった。
【００１６】
本願明細書中、「共有派生形質」とは、外群比較などを用いて極性の推定をした結果、派生的と判定された形質状態  (apomorphy)を共有することをいう。分岐分類学の理論では共有派生形質だけが系統関係を推定する情報を与えると主張される。推定された派生形質を共有する種群を生んだ直接共通祖先を仮定できるからである。したがって、共有派生形質は単系統群(正確には完系統群)を構築する手掛かりとなる。ここで，もしも形質分布に不整合が生じたときには，いくつかの形質の派生的形質状態は，ある共通祖先からではなく別々の枝で進化したホモプラシーであると考えなければならない。共有派生形質という仮説の妥当性は，最節約原理に基づいて選択された系統仮説，すなわち分岐図との整合性によって検証される。
【００１７】
本願明細書中、「極性」とは、ある形質の形質状態間の遷移順序の進化方向という。したがって、極性は遷移順序(order)のモデルに依存する。形質状態の遷移順序は、系統推定に用いる形質データの形質を反映する。質的な形態形質では直線状または分岐状の遷移順序を仮定できることもまれではない。一方、核酸塩基配列や制限酵素切断サイトなどの分子データの多くは、形質状態の間に順序付けができない無順序的(unordered)な形質である。分岐分類学や進化分類学では、系統解析に先立って形質進化の極性推定を要求している。極性を推定する規準としては、外群比較あるいは化石記録や個体発生の情報などが利用されているが、もっとも広く用いられているのは外群比較である。
【００１８】
ＳＩＮＥの進化
系統推定及び本願発明に係る単離・同定方法並びに種判別方法に、ＳＩＮＥを有効に利用する為には、ＳＩＮＥがどのように進化してきたかを理解することが重要である。ＳＩＮＥは、以下詳細に記載するように、配列類似性に基づくファミリーと特徴的なヌクレオチド存在及び／又は欠失に基づくサブファミリーとに分類されることができる。一旦ゲノム内に挿入されたＳＩＮＥがどのような運命を辿るかは、染色体環境中の様々な要因(Schmit and Maraia 1992)とＳＩＮＥに蓄積する増幅を妨げるような突然変異とのバランスによって決定される。さらに、ＳＩＮＥの増幅の為にはＬＩＮＥにコードされたＲＴａｓｅが必要であるので、ＬＩＮＥがゲノム中で増幅能力を失い死んでしまえば、それはその生物中でのＳＩＮＥの死も同時に意味するところとなる (Okada et al., 1997)。
【００１９】
ゲノム内でＳＩＮＥが進化過程でどのように増幅するかに関しては、これまでにＳＩＮＥ進化の２つの対立モデル：マスター遺伝子モデルと多数源遺伝子モデルが提唱されて来た。マスター遺伝子モデル（図２（Ａ））は、１又は数個の「マスター」遺伝子座だけが、全ての子孫コピーの元であり、この子孫コピーはそれら自身の上で複製する能力はもたない、というものである。このシナリオにおいては、時間の経過にわたるその増幅率は、そのマスター遺伝子の条件及び活性に完全に依存する。一方、多数源遺伝子モデル（図２（Ｂ））では、子孫も親コピーと同様の増幅する能力を持つ事が出来るので、進化の時間の経過にわたり「多数源遺伝子」として機能する、というものである。後者モデルにおいては、増幅率は、源遺伝子の全てに由来する合計コピー数の増加又は減少率の関数である。マスター遺伝子モデルはげっ歯類のＩＤ  ＳＩＮＥ (Kim et al, 1994)及びヒトＡｌｕ反復の初期の研究 (Shen et al., 1991) からの経験的証拠により提唱された。しかし、その後の詳細なＡｌｕ配列の研究や他の様々な分類群からの比較研究により、今では大部分のＳＩＮＥファミリーの増幅は、上記多数源遺伝子モデルにより起こると解釈することが最も妥当であると考えられている(Matera et al, 1990; Schmid and Maraia, 1992; Leeflang et al, 1992; Kido et al., 1994; Takasaki et al. 1994; Shedlock and Okada, 2000)。実際には、特徴的なヌクレオチドの存在及び／又は欠失を特徴とするサブファミリーが、それぞれの源遺伝子を表すことになる。
【００２０】
ＳＩＮＥの誕生と死の間の期間が、宿主ゲノム内のＳＩＮＥの活動の期間であり、その寿命が分類学の及び本願発明におけるツールとしてのそれらの使用に直接関連する。ＳＩＮＥサブファミリーのメンバー間の平均配列相違度が小さい場合、そのサブファミリーはかなり若く、かつ、その宿主内で未だ活動的に増幅していると推定することが妥当である。そのＳＩＮＥサブファミリーのメンバー間の平均配列相違度が大きい場合、そのサブファミリーは比較的古く、かつ、その宿主内で既に不活性又は死んでいると推定することが妥当である。しかしながら、ＳＩＮＥ挿入を用いた宿主分類群間の共通先祖の診断は、与えられたサブファミリーの活動寿命内でのみ可能である。このＳＩＮＥ法の基本原理を、以下の「手順」欄でさらに説明する。
【００２１】
ＳＩＮＥ挿入動態及び特徴理論
ＳＩＮＥがなぜ強力な分類学のツールであるかということの鍵は、それらが宿主ゲノム内に不可逆的に独立して挿入されるということである (Murata et al, 1993; Shedlock and Okada 2000)。ゲノムからＳＩＮＥを特異的に除去する既知のメカニズムは存在せず、かつ、２つの要素が全く同じ遺伝子座内に挿入され又は同一遺伝子座内から正確に切除される確率は極めて低いので、本願発明者は、２つの異なる分類群内の同一遺伝子座のＳＩＮＥの存在を、そのゲノムにおける極性化された派生表現型であるとみなすことができる。これは系統発生仮説を構築するために、共有派生形質、又は共有された派生した特性だけを使用するHennig (1966)の方法の厳格な意味において、１の分岐群又は単系統群を定める。この分岐群においては、既知の先祖条件、又は与えられた遺伝子座におけるＳＩＮＥ挿入の欠如が、周知の人工物を作り出す競合方法を介して特性極性を確立する必要とせずに外群を一義的に定める(Hendy and Penny, 1989)（図３参照）。
【００２２】
ＳＩＮＥの単離及び特徴付け方法
以下、ゲノム・ライブラリーから新規ＳＩＮＥを単離するための戦略、そのスクリーニング方法、クローンの配列決定及びＳＩＮＥのファミリーからサブファミリーへの特徴付け、代表的な宿主分類群におけるコピー数の定量、並びに系統発生学的な情報を提供するＳＩＮＥ挿入パターンの決定的な診断について説明する。
【００２３】
手順
ゲノム・ライブラリーを作成するための種の選択方法
ＳＩＮＥ法は、以下の基本ステップ：１）選択された種からのゲノム・ライブラリーの作成；２）ＳＩＮＥ遺伝子座を含むクローンの単離；３）クローンのＤＮＡ配列の決定；４）そのＳＩＮＥ遺伝子座のフランキング配列内でのポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）プライマーの設計；及び５）着目の関連種間のＳＩＮＥの存在又は非存在のＰＣＲ診断、を含む。ＳＩＮＥ法は一旦確立することができれば迅速・確実に確定的な結果を提供することができるけれども、その手順及び条件の確立及び立にはかなりの時間及び労力を要する。
【００２４】
例えば、密接に関連する種Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤの間の系統発生関係を決定する場合を考える。上記種の実際の系統樹を図４（Ａ）に示す。この場合、種Ｄが、それからＳＩＮＥを単離するための宿主として選ばれた場合、系統発生の情報を提供するＳＩＮＥ遺伝子座は得られない。なぜなら、種Ｄは、着目の４つの分類群の共通先祖内及びさらに古い起源内に挿入されたＳＩＮＥ遺伝子座を含むからである。４種の全ての先祖内に挿入された遺伝子座を図４（Ｂ）中ＳＩＮＥ３として示す。ＳＩＮＥ３の挿入の存在（＋）又は非存在（−）を示すＰＣＲの電気泳動ゲルのパターンを図４（Ｃ）の下段に示す。系統発生の情報を提供するＳＩＮＥを単離するためには、図４（Ｂ）中に示す３つのＳＩＮＥ遺伝子座、ＳＩＮＥ１、ＳＩＮＥ２、及びＳＩＮＥ３を提供することができる種Ａ又は種Ｂを選ばなければならない。これらの遺伝子座のそれぞれが、これらの種の進化の歴史において共通の先祖を共有する分岐群、又は単系統群を定める。
【００２５】
特定の種からの新規ＳＩＮＥファミリーの単離方法
特定の種、例えば、図４（Ａ）中の種ＡにおいてＳＩＮＥファミリーが全く知られていないとき、そのゲノムからＳＩＮＥファミリーを新たに単離し分析することが必要である。選択された種から新規ＳＩＮＥファミリーを単離することができる２つの方法がある。１は、インビトロにおける全ゲノムＤＮＡ転写 (Endoh and Okada, 1986)を含み、そして他は、新たな高処理量自動ＤＮＡ配列決定法により容易化された約６０Ｋｂｐ以上のゲノムＤＮＡ配列決定を含む。
【００２６】
インビトロにおける全ゲノムＤＮＡ転写
ほとんどのＳＩＮＥは、ｔＲＮＡ由来であることが知られている、それゆえ、ＳＩＮＥは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのための内部プロモーターをもっている。ＳＩＮＥはインビボにおいては極めて稀に転写されるけれども、ＳＩＮＥはインビトロにおいては裸ＤＮＡから容易に転写されることができる。放射標識された前駆体ヌクレオチド、例えば、アルファＰ３２−ＧＴＰを用いたＨｅＬａ細胞抽出物中である種の全ゲノムＤＮＡを転写するとき、通常、放射標識されたＲＮＡが転写される。いくつかの場合、これらの放射標識転写産物は、それらがゲル電気泳動に供されるときクリアなバンドを形成する(Endoh and Okada. 1986; Matsumoto et al. 1986)。
【００２７】
この放射標識されたＲＮＡは着目の選択された種からのゲノム・ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用されることができる。この転写産物がゲル内でクリアなバンドを形成する場合、それは実際のＳＩＮＥファミリーを表している。なぜなら、与えられたＳＩＮＥファミリーの各遺伝子座からの同一転写産物の全てが集合して区別されるバンドを形成するからである。ゲノムＤＮＡから不明瞭なバンドが生じた場合でさえ、スクリーニングのためのプローブとしてそれらを用いることができる。しかしながら、後者の場合には、その転写産物は多数のＳＩＮＥファミリーを表している可能性がある。
【００２８】
本願発明者のこれまでの経験から、脊椎動物及び／又は無脊椎動物のゲノム中に１０，０００以上のコピー数のＳＩＮＥが存在するとき、それらは全ゲノムＤＮＡのインビトロ転写産物により検出されることができる。図４は、選択された動物種由来の全ゲノムＤＮＡからの転写産物のいくつかのパターン例を示す(Endoh and Okada, 1986)。
【００２９】
自動シーケンサーによる６０ｋｂｐより大きなゲノムＤＮＡの配列決定
本願発明者の経験によれば、ゲノム内のＳＩＮＥファミリーのコピー数は通常１０，０００を超える。全ゲノムが長さ３ｘ１０9ｂｐであり、かつ、あるＳＩＮＥのサイズが３００ｂｐであると仮定すると、このようなＳＩＮＥファミリーはそのゲノムの０．１％を占めることになる（例えば、３００ｘ１０4＝３ｘ１０6）。したがって、６０ｋｂｐ以上にわたり配列決定することによりこの種のランダムに単離されたＤＮＡ断片内に２つの独立したＳＩＮＥ配列を見つけることができるであろう（例えば、６００ｘ１００／０．１＝６ｘ１０6）。
【００３０】
これは、高処理量自動ＤＮＡシーケンサーの最新モデルへのアクセスにより実験室において簡単に達成できるようになってきた。例えば、新規ＳＩＮＥファミリーが最近ゾウのゲノムから特徴づけされ、そしてこの新規ＳＩＮＥがＡｆｒｏｔｈｅｒｉａの全ての種間に分布していることが示された。この方法は、全ての哺乳動物及びおそらくほとんどの脊椎動物のゲノムに適用されることができる。
【００３１】
ＳＩＮＥファミリーを正確に同定し、そしてそのｔＲＮＡ構造を演繹する方法
上記の方法に従って反復単位の多数コピーの配列を決定した後、それらを整列させ、そして反復ファミリーのコンセンサス配列を演繹することができる。ＳＩＮＥ要素以外にもゲノム内には多くの反復配列が存在するので、その配列を適切に診断することが不可欠である。ほとんどのＳＩＮＥはｔＲＮＡ由来であることが知られているので、それらはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのためのプロモーターを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは保存された配列ブロックであり、そのゲノム内で互いに分離された第１プロモーターと第２プロモーターの特性を有する。この第２プロモーターは高く保存されており、そして経験的に容易に認識されることができる。
【００３２】
以下、ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥの例を考える。これらの要素のｔＲＮＡ様構造を以下のように確立することができる（図６参照）：
１．まず、ＣＨＲ−２のいくつかの配列の整列からＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのコンセンサ      ス配列を構築する（図８参照）。
２．目視により、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのための第２プロモーターのコンセンサス      配列を検索する。この配列は5’-GT(又はA)TCG(又はA)-3’である。このプロモー      ターをスクリーニングするとき、このモチーフに対する例外は存在しない。このモ      チーフが存在するとき、この第２プロモーター配列を含むステム・ループ構造を作      る。ループ内の塩基の数は７であり、そしてステム内の塩基対の数は５である。ス      テム領域内の塩基の全てが塩基対を形成しない場合でさえも、図６（Ａ）に示すよ      うに、ｔＲＮＡ内の適当な位置にそれらの塩基を配置する。
【００３３】
３．上記ステム領域から5’上流方向にある５塩基を１のユニットを考える。なぜなら      、原形質クラスＩｔＲＮＡにおいては、この余分ループ領域は５塩基から成るから      である。ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥの場合、５塩基のこのユニットの配列は3’-CAGGG-      5’である。3’-PyPyPuPuPu-5’配列がいくつかのｔＲＮＡにおけるこの余分ルー      プに典型的であり(Sprinzl et al. 1987)、そしてこれにより、上記ＳＩＮＥのｔ      ＲＮＡ起源を演繹することができる（図６（Ｂ）参照）。
４．ｔＲＮＡ構造のアミノアシル−ステム領域を形成する次の５塩基を、他のユニット      とみなす。この場合、3’-GACGT-5’である（図６（Ｃ）参照）。
５．ｔＲＮＡ構造のアンチコドン−ループ領域を形成する次の７塩基を、さらに他のユ      ニットとみなす。この場合、3’-AACCGTC-5’である。その3’末端におけるＡＡ残      基5’末端における3’-TC-5’残基はこのＳＩＮＥのｔＲＮＡ起源の良い指標であ      る。なぜなら、これらの塩基はほとんどのｔＲＮＡにおいて高く保存されているか      らである(Galli et al.,1981)。これはさらにこのＳＩＮＥのｔＲＮＡ起源を支持      する（図６（Ｄ）参照）。
６．通常、次の５塩基は他のユニットとみなし、そしてそれらはアンチコドン−ステム      領域（図６（Ｃ））に割り当てられた５塩基と塩基対を形成するはずである。この      場合、その配列は3’-CGTCT-5’であり、そしてその最初の４塩基だけが上記アン      チコドン−ステム領域の相手とよくマッチする。このユニットを正確に整列させる      ためには、上記アンチコドン−ステムの3’側の第１塩基の位置に欠失を配置する      （図６（Ｅ）参照）。
７．次に、このｔＲＮＡ様構造のＤ領域のためのステム・ループ構造を構築する。この      ステムとループの塩基の数は通常それぞれ４と８であるが、特にＳＩＮＥのｔＲＮ      Ａ様構造においては、１〜２塩基程変化することができる。明らかに、ＣＨＲ−２      次のいくつかの塩基対は意味のある二次構造を形成しない。この場合、その第１プ      ロモーター領域に注目する。第１プロモーター領域における最も目立った特徴は、      その領域内の２つのＧの存在である。他の特徴はこのループ内の１５位（tRNAのナ      ンバリングシステムによる。以下同じ。）におけるＧと１４位におけるＡである。      この１４位におけるＡは5’側上そのループ内の最初の塩基である。それゆえ、こ      れらの塩基を、このｔＲＮＡ様構造のループの対応の位置に配置する（図６（Ｆ）      参照）。図６（Ｆ）中の最初の塩基であるＴはｔＲＮＡ分子の全てにおいて高く保      存されていることは周知である。
８．ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのｔＲＮＡ様構造は、図６（Ｆ）に示す配列を、このファミ      リーのための他の配列（図７（Ａ））と併合することにより、演繹することができ      る。
９．次に、ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡデータベース中のＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて      (Altschul et al. 1990)、ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥと実際のｔＲＮＡの間の類似性に      ついて検索する。この例では、ｔＲＮＡ  ＧｌｕがＣＨＲ−２の配列に最も類似す      る。図７（Ｂ）はヒトｔＲＮＡ  Ｇｌｕの二次構造を示す。
【００３４】
ＳＩＮＥファミリーをサブファミリーに特徴付ける方法
あるＳＩＮＥファミリーが系統発生において種Ａのゲノム内に特徴付けられ、かつ、このＳＩＮＥファミリーが進化の間に最初に生成された時が知られていないと仮定する。さらに、このＳＩＮＥファミリーが図９中の分岐群Ｙの全ての分類群の古い共通先祖において最初に生成されたと仮定する。この場合、種Ａのゲノム内に存在するＳＩＮＥのコピーは、図９のｔの時に増幅された古いＳＩＮＥと、ｕの時に増幅された若いＳＩＮＥを含む。種Ａのゲノム・ライブラリーをこのＳＩＮＥファミリーのコンセンサス配列を用いてスクリーニングするとき、上記の古いＳＩＮＥと新しいＳＩＮＥの両者を単離することができる。種Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤの系統関係だけが求められているので、単離されたＳＩＮＥの増幅事件の全ての時を調べるのは効率が悪い。むしろ、種Ｄの分岐付近の時に増幅され、かつ、図９中の分岐群Ｘを含む４つの分類群の全ての分岐にわたるＳＩＮＥ遺伝子座を単離するように試みるのがはるかに効率がよい。
【００３５】
上述のように、ＳＩＮＥとＬＩＮＥは多数源遺伝子モデルに従って増幅されると信じられている (Schmit and Maraia 1992; Smit et al. 1995)。ある源遺伝子が突然変異を受け、そして進化の間に首尾よく増幅された場合、この突然変異した源遺伝子はその対応のＳＩＮＥファミリー内のサブファミリーとして認識されることができる (Britten et al. 1988; Jurka et al. 1995)。サブファミリーは進化のある段階において増幅される。それゆえ、あるサブファミリーが種Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤの共通先祖においてのみ増幅された場合、このサブファミリーのコピーは、これら４つの分岐群の系統発生関係を決定するために有効に使用されることができる。
【００３６】
種ＡにおけるＳＩＮＥファミリーのコンセンサス配列は、上記手順の一部として確立され、そしてそのＳＩＮＥ配列の5’末端における１のＰＣＲプライマー及びその3’末端付近の保存領域における他のプライマーの設計を可能にする。このプライマー・セットにより増幅される配列はそのＳＩＮＥ配列の全体を包含する。このプライマー・セットは、種Ａ由来のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによるＳＩＮＥの多くのコピーを増幅するために使用されることができる。この反応のＰＣＲ産物は適当なベクターＤＮＡ内でクローニングされ、そして配列決定されることができる。この時点で、そのＰＣＲ産物からのＳＩＮＥの１００コピーの配列決定は困難な仕事ではない。これらの配列を整列させることにより、このＳＩＮＥファミリーのサブファミリーを表す特徴的なヌクレオチド又は可能な欠失を同定することができる（図１０参照）。特徴的なヌクレオチドは、特定のサブファミリー内の３以上のヌクレオチド位置において協調的に変更されており、かつ、進化の間のＳＩＮＥ配列内でランンダムに蓄積した自然突然変異から区別されうるものとして定義される。特徴的なヌクレオチドの存在及びしばしば特異的な欠失に基づきサブファミリーを首尾よく特徴づけた後に初めて、ドット−ブロット・ハイブリダイゼーション又はＰＣＲにより与えられたサブファミリーの分類学的分布を調べることができるようになる。
【００３７】
ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのサブファミリー
図８は、クジラ目（Cetaceans）、猪豚亜目（Hippopotamuses）、及び核脚亜目（Ruminants）のゲノム中に存在すると元々特徴づけられたＣＨＲ−２  ＳＩＮＥファミリー(Shimamura  et al. 1997)のコピーのアラインメントを示す。ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥには６つのサブファミリーが存在することが容易に分かる。欠失の存在に因り、ＦＬ（完全長）、ＭＤＩ（中央欠失Ｉ）、ＭＤＩＩ（中央欠失ＩＩ）、及び最短群を特徴付けした。次に、この最短群を、ＤＴ（欠失型）、ＣＤ（クジラ欠失型）、及びＣＤＯ（クジラ欠失歯クジラ特異的）のサブファミリーに分類することができる。図１１は、これらサブファミリーのコンセンサス配列のアラインメント結果を示す。配列番号１は上位コンセンサス配列、配列番号２はＦＬコンセンサス配列、配列番号３はＭＤＩコンサンサス配列、配列番号４はＭＤＩＩコンセンサス配列、配列番号は５ＤＴコンセンサス配列、配列番号６はＣＤコンセンサス配列、そして配列番号７はＣＤＯコンサンサス配列を表す。
【００３８】
図１２に、ＣＤ，ＣＤＯ，及び他のサブファミリーに特異的なプローブを、それぞれ、用いたドット−ハイブリダイゼーション実験の結果を示す。この結果はＣＤサブファミリーがクジラ目（歯クジラ及び髭クジラ）のゲノムに特異的であり、そしてＣＤＯサブファミリーが歯クジラのゲノムに特異的であることをはっきりと示している。それゆえ、ＣＤサブファミリーに属するＳＩＮＥは、クジラ目の、特に髭クジラの系統関係を推定するために有用であり、一方、ＣＤＯサブファミリーに属するＳＩＮＥは、歯クジラの系統関係を推定するために有用である。ＣＤＯサブファミリーのコピーの分布は、哺乳動物の分類生物学において最も争いのある点の中の１つであったマッコウクジラを含む歯クジラ亜目の単系統性をも示唆する。
【００３９】
フランキングＳＩＮＥ  ＰＣＲ
図９中に示す分岐群Ｘの共通先祖において生成されたサブファミリーに属する、種ＡからのＳＩＮＥ遺伝子座を単離し、そしてそれらの配列を決定した後、与えられた遺伝子座における挿入の存在又は非存在を診断するために、ＰＣＲ実験を行うことができる。そのフランキング（隣接）配列を見て、プライマー配列を選択する。プライマーの設計に際しては、二次構造の折り畳みの形成に対して及び上流プライマーと下流プライマーの間のタンデム・アニーリンングに対して注意しなければならない。これは、商業的に又はインターネットを通して入手できるＰＣＲプライマー設計を容易にするために書かれたさまざまな標準的なソフトウェア・プログラムを用いて容易にチェックすることができる。オリゴヌクレオチド・プライマーの溶融温度は５５℃付近に設定する。それゆえ、ＰＣＲのためのアニーリング温度は、種Ｂ，Ｃ，及びＤからのオルソロガスな遺伝子座の増幅を最適化するとき、この温度に基づかなければならない。ときに種Ｂ，Ｃ，及びＤについてのプライマー結合領域内の突然変異の蓄積が、この反応の間の効率的なプライマー−鋳型アニーリングを阻害する。この場合、アニーリング温度は、約４５〜５０℃まで低下されなければならない。ＰＣＲ産物が最初のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されない場合、ＰＣＲの効率を低下させるかもしれない潜在的な人工物に関してさらに注意して、新たなＰＣＲプライマーを設計すべきである。図１３にフランキングＳＩＮＥ  ＰＣＲの原理を模式的に示す。
【００４０】
図１４は、ＰＣＲ結果の１例を示す。また、２つの異なるプローブを用いた同一フィルターを用いて行ったハイブリダイゼーション実験結果を同時に示す。図１４（Ａ）は、海イルカが単系統である証拠を提供するＰＣＲパターンである。なぜなら、海イルカからのＰＣＲ産物は挿入された要素を含む予想断片サイズをもっており、一方、他の歯クジラからの断片はMago 19における挿入を欠く予想断片サイズをもつからである。図１４（Ｂ）は、ＳＩＮＥプローブを使用したハイブリダイゼーション実験を示し、一方、図１４（Ｃ）は、上記遺伝子座のフランキングＤＮＡを使用したハイブリダイゼーション実験を示す。この後者の実験は、オルソロガスな遺伝子座が、それから上記遺伝子座が元々単離されかつ特徴付けられたところのマゴンドウ以外の種においてＰＣＲにより忠実に増幅されたことを証明するために行われた。
【００４１】
ＰＣＲデータの解釈
比較的最近分岐した種を調べる場合、オルソロガスなＳＩＮＥ遺伝子座におけるフランンキング配列は忠実に保存され、そして典型的には、ＰＣＲ診断を阻害する問題を引き起こさない。しかしながら、比較的古く分岐した分類群を調べる場には、ＰＣＲはより頻繁に失敗し、そして実験結果の解釈を困難にする。不成功のＰＣＲにおいては、ＳＩＮＥ−マイナス・データが現れる。すなわち、ＳＩＮＥ挿入の非存在を示す与えられた遺伝子座における成功したＰＣＲ増幅がある。不成功のＰＣＲは、失われたデータを表し、そして挿入の存在又は非存在のパターンをコードするＳＩＮＥキャラクター・マトリックスの最節約分析を行うとき、そのまま（例えば、「？」）コードされる。
調べた独立した遺伝子座の間に矛盾した挿入パターンが存在するとき、先祖の多型性及びその後の不完全な系統分類が、あるはずである。
【００４２】
哺乳類ゲノム中のＳＩＮＥの分布
一般にほとんどの哺乳動物は大量のＳＩＮＥをもっている。それらは、調べた種間のハイブリダイゼーション・パターン（例えば、図１２中のＣＨＲ−２  ＳＩＮＥの分布）に基づき、明らかに目、亜目、上科、科、属、又は種に特異的である。このような経験的な証拠は、ＳＩＮＥファミリーが多くの先祖哺乳動物系統において新たに生成したことを示している。但し、その生成メカニズムは十分に理解されていない。哺乳動物のゲノム中にこのように多数のＳＩＮＥ又はレトロポゾンが存在する理由は、哺乳動物のＬ１によりコードされるＲＴａｓｅが哺乳動物の共通先祖においてその鋳型認識の特異性を変更したためであると思われる。これは、ステム−ループ構造の形成に責任を負う3’尾を厳格に認識する多くのＬＩＮＥ内に存在するレトロポジションのために要求されるポリＡ尾の認識を可能 (Ohshima et al. 1996; Okada et al. 1997; Kajikawa et al.)。このようなシナリオは、哺乳動物ゲノム内のＬ１  ＲＴａｓｅを介してポリＡ含有ＲＮＡが擬似遺伝子となることを可能にすることができたのであろう。
【００４３】
図１５は、最近提案された哺乳動物の系統樹を示す (Waddell et al. 1999; Cao et al. 2000; Nikaido et al. 2000)。現在まで特徴付けられた哺乳動物ＳＩＮＥファミリーを図１５上に記す。簡単に言えば、全哺乳動物ゲノム中に分布する最も古いＳＩＮＥファミリーはＭＩＲである (Smit and Riggs 1995; Jurka et al. 1995)。Ａｌｕファミリーは明らかに霊長類ゲノムに特異的であるが、その近縁種、例えば、ヒヨケザル間のその分布は詳細に調べられていない。げっ歯類Ｂ１，Ｂ２，及びＩＤはげっ歯目のゲノムに特異的である。ウサギのＣファミリーはウサギ目のゲノム内に報告されているが、その近縁種間の分布は報告されていない。鯨偶蹄目ゲノム内に存在するＳＩＮＥファミリー、例えば、ＣＨＲ−１,ＣＨＲ−２，ＣＨＲＳ，ＣＨＲＳ−Ｓ，ＰＲＥ−１，及びＢｏｖ-ｔＡは、詳細に調べられている (Shimamura et al. 1997; Shimamura et al. 1999; Nikaido et al. 1999)。ＣａｎＳＩＮＥＡはCanidaeゲノムから最初に報告されたが(Minnick et al. 1992; Coltman and Wright 1994)、多くの他の食肉目ゲノム内の進化の間に生じたことがその後示された (van der Vlugt and Lenstra 1995)。ＥＲＥファミリーと命名されたウマＳＩＮＥが報告され、そしてその分布が調べられた (Sakagami et al. 1994; Gallagher et al. 1999)。コウモリＳＩＮＥファミリーがBorodulina and Kramerov (1999)により単離され、そしてＶＥＳと命名され、そして他のコウモリＳＩＮＥファミリーも最近特徴付けられた (Kawai et al. )。ゾウＳＩＮＥファミリーが最近単離され、Ａｆｒｏｔｈｅｒｉａの種間に分布していることが示された (Nikaido and Okada)。ここで、由来するtRNAが異なっていたり、まったく違った配列であるSINEをfamilyとして区別し、同じ起源に由来するがdiagnosticな変異が見うけられるようなSINEをTypeまたはsubfamilyとして区別している。あるSINEはある時期に爆発的にそのコピー数を増やし、その爆発的増幅時期と生物全体の進化における時間軸がそれらの系統関係とSINEの分布との関連性につながっていると考えられる。
【００４４】
重要なことは、哺乳動物ゲノム内に多くのＳＩＮＥファミリーが今日まで単離されてきたけれども、それらは未だそのサブファミリー構造まで特徴付けられていないということである。したがって、本願発明に従って、今後、そのサブファミリー構造が明らかにされるであろうし、新たな哺乳動物ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーもさらに獲得されることができる。
【００４５】
ＳＩＮＥの新しい増幅：固定及び短期間の種分岐
ＳＩＮＥがゲノムの進化においてひじょうに新しく増幅され、そして１の種の集団の間で固定されていない場合、共通派生形質としての地位は不安定であり、そしてそれは系統樹作成のために使用されるべきではない。しかしながら、このようなＳＩＮＥの分布は、集団構造の分析のためには使用されることができる (例えば、Hamada et al. 1998)。種分岐が短期間に生じた場合、すなわち、大部分のＳＩＮＥが遺伝的浮動を介して集団の間に固定される前には、先祖の多型性その後の不完全な系統分類は矛盾したＳＩＮＥ挿入パターンを作り出す。この現象は、ＳＩＮＥレトロポジションの不可逆な性質と結合して、爆発的に派生した分類群における系統分類の歴史的パターンを調べるためにＳＩＮＥを使用するためのバイアスを提供する。先祖に多型性があり、その後不完全にSINEが子孫に分配され、矛盾する挿入パターンを作り出した場合には、系統樹作成法の一つである最節約法を用いて、各遺伝子座における挿入の存在又は非存在についてのＳＩＮＥキャラクター・マトリックスを評価することが有用である。固定されていない、多形性ＳＩＮＥは、高レベルの系統関係のためには有用ではないけれども、それらは、集団分析のための優れた分類学的ツールとなることが知られている(Deininger and Batzer, 1994, Stoneking et al, 1997; Hamada et al, 1998)。したがって、本願明細書に記載する方法に従って、ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーを同定し、かつ、特徴付けすることにより、かかるＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーを利用して動物の種判別方法を行うことができる。
【００４６】
フランキング配列の機能及び価値（有用性）
ＳＩＮＥ挿入について調べられた遺伝子座内のヌクレオチド・フランキング配列の情報は有用である。もちろん挿入データは系統樹の作成及び本願発明に係る方法に使用するために有用であるけれども、フランキング配列との挿入配列の統合は、独立したＳＩＮＥ挿入事件により定められる分岐群間の枝の長さについての情報を提供する (Lum et al, 2000; Shedlock and Okada, 2000)。さらに、与えられた挿入要素と会合したフランキング配列は文字通り連結されているので、ＳＩＮＥ由来のトポロジー対フランキング配列の間の一貫性は、各遺伝子座における不可逆挿入の基本的仮定の評価への数多くのアプローチを提供する (Lum et al, 2000)。独立したＳＩＮＥ遺伝子座にホモプラシー（成因的相同）、又は形質矛盾が存在する場合、系統発生樹の間には明らかに矛盾があるかもしれない。このようなアプローチはＳＩＮＥ分析の新たな次元として始まりつつあり、そしてＳＩＮＥ法の統計学的評価を高めるための基礎を提供する。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、以下の実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【００４８】
材料及び方法
緩衝液、酵素類その他試薬
核酸の操作に用いる種々の緩衝液、酵素、大腸菌の培養に用いる培地、その他の試薬類は、和光純薬（株）、Sigma社、Difco社、FMC社より購入したものをSambrook et al. (1989)の文献を参考にして調整した。各種制限酵素、修飾酵素、ベクターDNAは、宝酒造（株）、東洋紡績（株）、アマシャムライフサイエンス社より購入した。ラジオアイソトープは、第一化学薬品（株）より購入した。PCRプライマーに関してはOligoExpress(アマシャムファルマシアバイオテク（株）)に合成を委託注文したものを使用した。
【００４９】
ゲノムDNA
本研究に使用した各種サンプル（組織もしくはDNA）について以下に示す。尚解析に用いた鯨、偶蹄類の英名、和名、学名等について以下の表1：
【００５０】
【表１】
2005160359.tif 000002
【００５１】
に示す。
フタコブラクダは東京大学医学部の吉田穣博士より提供された筋肉組織からDNAを抽出した。ブタについては当研究室に保管されていたDNAをそのまま用いた。ペッカリーは農水省畜産試験場の安江博博士より提供されたDNAを用いた。ジャワマメジカは米国サンディエゴ動物園から提供されたDNAを用いた。アクシスジカ、アミメキリン、セーブルアンテロープ、ニホンカモシカ、マーコール、ムフロン、カバに関しては千葉市立動物公園の宗近功氏より提供されたDNAを用いた。ヒツジは長野県上田食肉衛生検査場の向井康氏より提供された肝臓から抽出したものを使用した。ウシに関しては神奈川県食肉衛生試験場相模出張所より提供された腎臓からDNAを抽出して用いた。
【００５２】
イッカク、オオギハクジラのサンプルについては、千葉県立中央博物館の宮正樹博士より筋肉と思われる組織片を入手しDNAを抽出して用いた。オオギハクジラのサンプルに関してはアカボウクジラ科オオギハクジラ属であることは判明しているが種名は不明である。カワイルカ類を除くその他のサンプルは、水産庁遠洋水産研究所大型鯨類研究室の加藤秀弘博士より提供された各種組織片からDNAを抽出して用いた。カワイルカ類のサンプルについては、アメリカ合衆国南西漁業科学センターのブラウネル博士（Dr. Robert L. Brownell, Jr.: Chief Marine Mammal Division, Southeast  Fisheries Science Center, P.O. BOX 271, La Jolla, California 92038）により日本国への入手手続きを行ってもらった。それに基づいて、アマゾンカワイルカの皮下組織片、ラプラタカワイルカの肝臓組織片についてはカリフォルニア州立大学バークレー校のHealy H. Hamilton 氏より提供を受けDNAを抽出した。ガンジスカワイルカは乾燥骨サンプルを国立科学博物館の山田格氏より提供されDNAを抽出した。ヨウスコウカワイルカに関しては中国科学院水生生物研究所の付属水族館に飼育されている個体から鮮血を採取しその場でヘパリン処理したものを研究所へ搬送し即座にDNAを抽出した。抽出したDNAは、日本への持ち込みが不可能なため現在は中国の研究所において保管されている。
【００５３】
ゲノムDNAの抽出
解析に用いた動物種の組織からのゲノムDNA抽出は、簡便法（Rapid法;ProteinaseKを用いる方法）で行った。抽出したゲノムDNAはライブラリーの作製及びPCRの鋳型として使用した。また、それらは４℃で保管している。−４０℃のフリザーに保存しておいた鯨、偶蹄類の組織（肝臓、筋肉）をメスで数ミリ角に切り出し、マイクロチューブに移してから組織の重量を測った後、そのマイクロチューブに1X TNE buffer (10mM Tris-HCl(pH8.0),100mM NaCl, 1mM EDTA (pH 8.0))を500μl加えた。チューブ内の組織片をパスツールピペットを用いて細かく粉砕したらその、組織及びTNE bufferに1X Lysis buffer (20mg/ml Proteinase K,2% SDS, 10mM Tris-HCl(pH8.0), 150mM NaCl, 10mM EDTA (pH8.0)) を加え、転倒撹拌した後、55℃のウォーターバスを用いてインキュベートし組織片を完全に溶解させた。その溶液と等量のフェノールを加え、ベリーダンサー(200〜300rpm)で１〜２時間撹拌した。遠心分離後 (室温、12000rpm, 5min), 上清を別の2.0ml マイクロチューブに移した。同様にしてフェノール／クロロホルム抽出に続きクロロホルム抽出を繰り返し、最終的な上清に0.1倍量の3M 酢酸ナトリウム及び2倍量のエタノールを加えた。この際多くの場合ファイバーが確認され、その後70%エタノールを用いてリンスした後適当量のTE bufferを加えペレットを溶解させた。ヨウスコウカワイルカの血液サンプルからのDNAの抽出は市販のカラム（QIAamp Tissue/Blood Kit Cat. No.29306: キアゲン（株）社製）を用いて行った。
【００５４】
フランキングPCR（主に相同遺伝子座の増幅に用いる）
フランキングPCRとはSINE配列を挟む様にその両側（上流及び下流）の近傍領域にプライマーを設計し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行う事を意味している。その際に用いるプライマーは長さにしておよそ17〜30ヌクレオチドでTm(Melting Temperature)値はおおよそ55℃周辺になるように設計した。その設計に関しては、マッキントッシュ版フリーソフトとしてインターネット上でダウンロードが可能なCPrimer (Ver.1.08, Bristol and Anderson(1995))を使用した。
反応組成：Template DNA (100 〜 500 ng); 10 X PCR Buffer (100 mM Tris -HCl (pH8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl2 5 μl; dNTP Mixture (2.5 mM each) 4 μl; Forward and Reverse Primer (5 pmol/μl) 2 μl each; TaKaRa TaqTM (5 U/μl) 0.25 μl; adds ddH2O up to final volume 50 μl。
反応条件： 94 ℃（Pre-denature） 2〜3 min.; and 30 cycles of 94 ℃ (Denature) 30 sec.; 45 ℃〜60 ℃(Annealing) 1 min; 72 ℃ (Extension) 30〜90sec.。この際Annealingの温度はプライマーのTm値はもちろんのこと、その遺伝子座の増えやすさなどに応じて適宜変えていき最適な温度を探した。
【００５５】
コロニーPCR
コロニーPCRはサブクローニングを行う時、目的のDNA断片がインサートとしてあるクローンに含まれているか否かを選別するのに大変簡便な方法である。従来はプラスミドDNAをMiniprepによって調整した後に、制限酵素で消化してそのインサートの有無を確認していたが、この行程をPCRによるチェックのみで済ませる事が可能となるので、時間と労力の大幅な短縮につながる。まずプレートに生えた大腸菌のコロニーを爪楊枝で軽くつつき0.5 ml PCR 用マイクロチューブに擦り付け、それを鋳型にして通常のPCRを20 μlの反応系にして行うだけである。この際用いるプライマーはベクターに特異的な配列に基づいて作製されている。PCR反応における熱変性の際に大腸菌の細胞膜が破壊され鋳型となるベクターDNAが溶液中に溶け出すことでこのPCRが可能になる。後で述べるがこのPCRによってインサートの有無を確認した後、このPCR産物を直接ABIシークエンサーを用いて配列決定の鋳型とすることが可能なので、インサートチェックの直後にそのインサートのシークエンスも可能なので時間的にもかなりの短縮になった。
【００５６】
塩基配列の決定
塩基配列の決定には以下に示すシークエンサー及びシークエンス反応キットを使用した。LI-COR dNA Sequencer (Model 4000) を用いたシークエンス：SequiTherm EXCELL（商標）II Long-ReadTM DNA Sequence Kit-LC (Cat. No. SE7701LC, EPICENTRE TECHNOLOGIES社製)；ABI PRIZM（商標） 310 Genetic Analyser を用いたシークエンス： BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (P/N 4303152, Perkin Elmer社製)。
サブクローニングしたプラスミドDNAをシークエンス反応の鋳型に用いる場合は、 SDS-Alkaline and Mg沈殿法を用いて調整したものを使用した。
スクリーニングによって単離したSINE配列を含んだ遺伝子座の塩基配列を決定する場合はベクター配列上のM4及びRV、そしてSINEのコンセンサス配列に基づいて作製した蛍光の付加しているオリゴヌクレオチドプライマー（アロカ（株）社製）を用いた。
PCR産物をダイレクトシークエンスする場合は、PCR産物にShrimp Alkaline Phosphatase (SAP) 2U/μl 0.5μl; Exonuclease I 10U/μl 0.5 μl (共にアマシャムライフサイエンス社製)を直接加え、37 ℃で30 分インキュベートしてオリゴヌクレオチドを分解した後、85 ℃で15 分間インキュベートして酵素を失活させたものをシークエンス反応の鋳型として用いた。
【００５７】
ゲノム・ライブラリーの作製
スクロース勾配
ゲノムDNA約50 μgを適当な制限酵素（本研究においては主にHind IIIを使用した）で完全消化し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った後、200 μ l の TE buffer に溶解した。15 ml の超遠心分離用プラスチックチューブ （Centrifuge Tubes - 50 Ultra - Clear（商標）Tube 14 X 89 mm, Order No. 344059: BECKMAN 社製）に10-40 %スクロース勾配を作製し、この上にDNA 溶液を加え、ローターに取り付け、超遠心分離機（L8-70M, Serial No. 7C869: BECKMAN 社製）で遠心分離（25000 rpm., 15 ℃, 15 時間）した。遠心後、1.5 ml マイクロチューブに10〜15滴ずつ滴下して分画（約250〜400 μl/フラクション）した。その分画を0.7〜1 %アガロースゲル電気泳動し、約2〜4 kbpの断片を含むフラクションを挟むように4〜6本のフラクションチューブを選別しエタノール沈殿を行った後、適当量のTE bufferに溶解した。再び0.7〜1 %アガロース電気泳動を行い、ライブラリー作製に用いるフラクションを決定した。
【００５８】
プラスミド・ライブラリーの構築
今回の実験においてはpUC18/HindIIIもしくはpUC19/HindIIIを使用したプラスミド・ライブラリーのみを用い、ファージライブラリーは作製しなかった。それは鯨、偶蹄類ゲノム中にはSINEのコピー数が十分量存在し、ファージライブラリーを使用しなくても十分量のポジティブクローンが得られる事が、当研究室での経験上わかっていたため、時間の節約を考えて比較的操作行程の少ないプラスミド・ライブラリーを活用した。プラスミド・ライブラリーの作製は以下の様にして行った。組成はTaKaRa  Ligation Kit Ver.1 A液, 12 μl; 同 B液, 1.5 μl; Vector DNA (pUC18 or 19/HindIII〜100 ng/μl), 0.5 μl; Insert DNA (Genomic DNA Sucrose Density Gradient Fraction), 1.0 μl : 以上の溶液を0.5 mlチューブ中で混合した後、クールブロック上で16 ℃で30分以上放置した。このゲノム・ライブラリーは-20 ℃で保存している。
【００５９】
SINE配列を含むクローン単離までの流れ
図１６にＳＩＮＥ法における実験の流れを示す。
スクリーニング
スクリーニングに使用するメンブレンの作製
0.5 mlチューブに前述のゲノム・ライブラリー混合液を1 μl、大腸菌（ E.coli JM105株）のコンピテントセルを適当量加えて混合した後、氷上で30分間静置した。42〜45 ℃で 45 秒間ヒートショックした後、あらかじめ 37 ℃ でインキュベートしておいた L/amp/X-gal/IPTG プレートにプレーティングし、37 ℃インキュベーターに一晩放置した。プレート１枚当たりのコロニー数が200〜300個になるように調整し、プレート10〜20枚分のライブラリーをまいた。このプレート上に生えたコロニーをナイロンメンブレン(Colony/Plaque  Screen（商標）NEF-978:NEN Research Products 社製)にトランスファーし、変性溶液（0.4 M NaOH, 0.6 M NaCl）, 中和溶液（1 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH7.0)）の順に３分間程度放置した。そのメンブレンは水分を切った後よく乾燥させておいた。コロニーをトランスファーした後のプレートは37℃でインキュベートして再度コロニーが十分に生えた状態にしておき、後述のポジティブクローンのピックアップをしやすいようにした。
【００６０】
スクリーニングに使用するプローブの作製
スクリーニングにはオリゴヌクレオチドもしくはPCR産物を使用した。実際に使用したオリゴヌクレオチド配列を以下の表２：
【００６１】
【表２】
2005160359.tif 000003
【００６２】
に示す。その作製方法はまず、オリゴヌクレオチドの場合：ddH2O 27〜37μl; Oligo Nucleotide (5 pmol/μl) 1 μl; 10 X T4 Polynucleotide Kinase Buffer 5 μl; T4 polynucleotide Kinase 2μl; [γ-32P]ATP 5〜15μlを0.5mlチューブに混合した後、37℃でインキュベートした。プローブとして用いたオリゴヌクレオチドの配列を上記表２に示す。PCR産物を用いる場合（Primer-Extension法）： Template DNA, 500 μg; Forward primer (12.5 nmol/μl) 2 μl; Reverse primer (12.5 nmol/μl) 2 μl dDTP Mixture (dATP, dGTP, dTTP) 2.5 μl; 以上の混合液を95 ℃で5分間熱変性し、続いて55 ℃で1分間アニールさせた後氷上に移した。さらに以下の試薬を順に混合した後60 ℃で30分間インキュベートした。10XBcaBEST（商標）Buffer 2.5 μl; BcaBEST（商標）DNA polymerase 2 μl; [α- 32P] dCTP。反応後のそれぞれのプローブはNICK Column (Sephadex G-50 DNA Grade: アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製)で溶出させて精製した。RIのカウントは液体シンチレーションカウンターで測定した。（簡易的測定にガイガーカウンターも使用した。）
【００６３】
ハイブリダイゼーション
メンブレンをハイブリバックに入れ、そこにプレハイブリ溶液（6 X SSC, 1 % SDS ) を適当量加えた。ハイブリバックをシーラーでパックし1時間以上インキュベートした。溶液を捨て、ハイブリ溶液（6 X SSC, 1 % SDS, 1 X Denhart's solution , Carrier DNA (Shared Herring Sperm DNA solution)を加えた後、さらに予め調整したプローブを95 ℃で3分間熱変性しておいたものを加え、またハイブリバックをシールした。その後42 ℃のウォーターバスで一晩（〜１５時間程度）インキュベートした。それらのメンブレンを適当量のウォッシュ溶液（2X SSC, 1 % SDS)で軽くすすぎカウントを測定し確認してから、さらに新たなウォッシュ溶液を用いてウォーターバスの温度を55〜60 ℃に設定してウォッシュを行った。
【００６４】
現像
ウォッシュ溶液を捨て新たなウォッシュ溶液で軽くすすいだ後、カウントを、ガイガーカウンターを用いて確認した。暗室内で台紙、メンブレン、X線フィルム、Intensifierの順にカセットを入れ、これを−８０ ℃のフリザーに入れて感光させた。暗室内でカセットからX線フィルムを取り出し、現像液、停止液、定着液の順にX線フィルムを入れて現像した。
【００６５】
Positive Clone の単離
現像したX線フィルムとライブラリーをまいたプレートを重ね合わせる様にしてそのポジティブクローンの位置を確認した。そのポジティブクローンだと思われるコロニーについてはMiniprepを行う前に、そのクローン中におけるSINE配列の有無の確認のためにベクターの配列ではなく、スクリーニングに用いたSINE配列のコンセンサス配列に基づいて作製したプライマーを用いてコロニーPCRを行った。その後、ポジティブクローンのプラスミドを調製し、LI-CORシークエンサーを用いてその近傍領域の配列決定を行った。その後の操作に関しては上述の通りであるので、以下、簡単に述べる。
【００６６】
まず、そのフランキング配列を基にしてプライマーを作製し、種々の生物のゲノムDNAを鋳型にしてフランキングPCRを行った。そして多くの場合、スクリーニングに用いた生物種の近縁種に関しては相同遺伝子座を簡単に増幅させることが可能であるが、それとは遠縁のグループもしくは分岐が古い時代に起こったと考えられる種の相同遺伝子座については、その近傍領域における塩基置換がより多く蓄積しているのでスクリーニングに用いた１種の配列に基づいたプライマーではアニールがうまくいかず、最初のフランキングPCRでは増幅できない場合もしばしば見られた。その際には増幅した様々な種の相同遺伝子座の塩基配列を決定してそれらのコンセンサスをとりそれを考慮してまた新たなフランキングプライマーを作製し再度PCRを行った。
【００６７】
鯨・偶蹄目間の系統関係の推定の際にはアガロース・ゲル電気泳動の後、増幅されたバンドが相同遺伝子座なのか否かを確認するためにサザンハイブリダイゼーションを行った。その行程は以下に示す。アガロース・ゲル電気泳動後エチジウム・ブロマイド(EtBr)溶液で染色し、デジタルカメラによって泳動パターンを確認、撮影した。その後変性溶液（0.4 NaOH, 0.6M NaCl） に十分浸したメンブレン1枚、ろ紙2枚をこの順で、間に気泡が入らないようにゲルにのせてその上にJKワイパー、キムタオル（商標）、重しとして辞典などを載せ、一晩（〜15時間）放置した。メンブレンを中和溶液（1 M NaCl, 0.5 M Tris - HCl (pH 7.0)）に15分程度放置して中和した後十分に乾燥させた。その後のハイブリダイゼーション、現像などの操作は前述のスクリーニングの時と同じなので省略する。また鯨目内の系統関係推定の際には殆どの遺伝子座についてそれらの塩基配列を決定したので基本的にサザンハイブリダイゼーションによる確認は行わなかった。
【００６８】
実施例１：鯨偶蹄目ゲノム内におけるCHR-2各サブファミリーの分布
鯨の起源ついてはその内部系統について形態による分類と分子による分類で見解がわかれている。鯨目は現生の多くの種類を含む歯鯨亜目と髭鯨亜目、そしてこれらの祖先となったと考えられている原鯨亜目（ムカシクジラ亜目とも呼ばれている）の３つの亜目に分けられており(Fordyce et al., 1994)、現生の鯨類の分類はその分類名からも明らかなように、歯を持つか否かによって区別されている。しかし、髭鯨類も発生のかなり最後の方の段階まで歯が確認できるし原鯨類の化石種の中には当然のことながら歯鯨と髭鯨の中間段階にあると思われるような形質を備えたもの（つまり歯を持った髭鯨）も存在しているので、実際の問題として歯の存在だけで歯鯨の単系統性を主張することはできない。それは系統的に考えた時に髭鯨の「髭」はおそらく共有派生形質であるが歯鯨の「歯」という形質は原始形質とみなされるためである。しかし歯鯨のみがエコロケーションをする能力を持ち、それに付随するメロン体の存在も歯鯨の単系統性を示唆する最も有名な形質のひとつである。
【００６９】
形態的分類が歯鯨、髭鯨類のそれぞれの単系統性を強く主張しているのに対して、現在までに行われてきた分子を用いた系統解析によればその殆どが歯鯨が単系統群を形成しないことを示唆している。その中でも大きな論争の火種となったのがMilinkovith and Meyer(1993)のミトコンドリア遺伝子配列の比較解析により提唱された系統樹でこの解析によれば歯鯨に含まれているマッコウクジラ上科のグループが他の歯鯨類よりむしろ髭鯨類に近縁である（つまり歯鯨は多系統である）という。この結果に続いて多くの分子統計学的研究がなされたが多くは歯鯨が多系統もしくは解決不可能という結果となっていた(e. g., Arnason et al., 1994; Adachi et al., 1996; Smith et al., 1996：図１７参照)。そこで、以下の問題を解決すべくＳＩＮＥ法を用いて種判別を行った：問題（1）歯鯨の単系統性の問題；（２）全てのカワイルカ類を含めたそれらの鯨目における系統関係；（３）鯨類それぞれの分岐年代。本願発明により、系統関係の決定のみならず現在まで絶対的な信頼性をもって進められてきた統計学的解析の問題点なども明らかにすることができた。
【００７０】
上述のように、本願発明者は、偶蹄目ゲノム中に存在するCHR-2には大きく分けてFL(Full Length), MD(Middle Deletion type)、DT(Deletion Type)、CD(Cetacea Deletion type)、 CDO(Cetacea Deletion type Odontoceti)のサブファミリーが存在することを発見した。それぞれのサブファミリーは進化の過程における増幅時期が異なるためそれらの分布は系統関係を反映すると考えられる。各サブファミリーのコンセンサス配列のアラインメントを図１８に示す。図１８から明らかなように各サブファミリーはそれらにDiagnosticな塩基置換や欠失が認められる。
【００７１】
これらSINE各サブファミリーの鯨、偶蹄目における分布を確認するためにドットハイブリダイゼーションを行った。用いたプローブは、CDとCDOに関してはそれらの区別が可能な位置にオリゴプローブを設計し（アラインメントの太線）、FLに関してはPCR産物を使用した。ドットハイブリダイゼーションの結果を図１２に示す。まずFLは全ての鯨目そして偶蹄目ではカバ、ウシ（反すう亜目を代表）のみに分布し、ブタやラクダ及びその他外群として加えた哺乳類ゲノム中には存在しないことが示唆された。次にCDは鯨目のみに特異的に分布し偶蹄目には分布してないと考えられ、鯨目の単系統性を強く支持している。さらにCDOに関しては、歯鯨にのみ強くシグナルが確認されることからこのサブファミリーは歯鯨亜目特異的に爆発的な増幅をしたと考えられ、分子による解析から疑問視されている歯鯨の単系統性を支持するデータである。しかしドットハイブリダイゼーションによる解析においてシグナルが確認されないだけでは、単にその系統でコピー数が少なかっただけという可能性を否定できないので、その結果だけで系統関係を推定することはできない。そこで実際にそれらのSINEが鯨目ゲノム中に挿入している様な遺伝子座を単離して系統関係の推定を行った。
【００７２】
実施例２：SINEのゲノム中への挿入を指標とした鯨目内部系統の解析
鯨目内部系統に関する研究においては、鯨目に存在するSINEの中から鯨目全体に特異的に分布しているCD及び、歯鯨亜目に特異的に増幅していると考えられるCDOに注目し、鯨目各種のゲノム・ライブラリーからこれらのサブファミリーに属するSINE配列を含む遺伝子座の単離を行った。鯨目の系統関係を示す遺伝子座の単離に用いたＰＣＲプライマーを以下の表３：
【００７３】
【表３】
2005160359.tif 000004
【００７４】
に示す。
【００７５】
遺伝子座Ａ（ＧＲＹ２０）を、ｇｒａｙ  ｗｈａｌｅ（コククジラ）の、遺伝子座Ｂ（ＢＲＹ５０）を、Ｂｒｙｄｅ’ｓ  ｗｈａｌｅ（ニタリクジラ）の、遺伝子座Ｃ（Ｓｐｅｒｍ２８）を、Ｓｐｅｒｍ  ｗｈａｌｅ（マッコウクジラ）の、遺伝子座Ｄ（Ｈｕｍｐ４２）を、ｈｕｍｐｂａｃｋ  ｗｈａｌｅ（ザトウクジラ）の、遺伝子座Ｅ（Ｎａｇ１８）を、ｆｉｎ  ｗｈａｌｅ（ナガスクジラ）の、遺伝子座Ｆ（ＳＩＲ１３）を、ｂｌｕｅ  ｗｈａｌｅ（シロナガスクジラ）の、遺伝子座Ｇ（Ｓｅｉ３５）を、ｓｅｉ  ｗｈａｌｅ（イワシクジラ）の、遺伝子座Ｈ（ＢＲＹ）を、Ｂｒｙｄｅ’ｓ  ｗｈａｌｅ（ニタリクジラ）の、遺伝子座Ｉ（ＧＲＹ８）を、ｇｒａｙ  ｗｈａｌｅ（コククジラ）の、遺伝子座Ｊ（Ｍｎｋ３１）を、ｍｉｎｋｅ  ｗｈａｌｅ（ミンククジラ）の、遺伝子座Ｋ（ＮＭ１）を、ｍｉｎｋｅ  ｗｈａｌｅ（ミンククジラ）の、遺伝子座Ｌ（ＳＥＭ３）を、ｒｉｇｈｔ  ｗｈａｌｅ（セミクジラ）の、遺伝子座Ｍ（ｓＮＲ２）を、ｒｉｇｈｔ  ｗｈａｌｅ（セミクジラ）の、遺伝子座Ｎ（ｎａ１０７）を、ｎａｒｗｈａｌ（イッカク）の、遺伝子座Ｏ（ｎａ１０２）を、ｎａｒｗｈａｌ（イッカク）の、遺伝子座Ｐ（Ｔｕｔｉ３５）を、ｂｅａｋｅｄ  ｗｈａｌｅ（オオギハクジラ）の、遺伝子座Ｑ（ＳＰ９）を、ｓｐｅｒｍ  ｗｈａｌｅ（マッコウクジラ）の、遺伝子座Ｒ（ＳＰ２）を、ｓｐｅｒｍ  ｗｈａｌｅ（マッコウクジラ）のゲノム・ライブラリーから、それぞれ、単離した。
【００７６】
これらの遺伝子座の塩基配列決定、ＳＩＮＥ近傍領域におけるプライマーの設計、鯨偶蹄目のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応、アガロースゲル電気泳動による分離を行った。その結果を図１９〜２１に示す。
【００７７】
図１９〜２１中の各レーンに対応する数字は、図２２〜２３に示す鯨種に対応する。
【００７８】
図２０Ｄに見られるように、例えば、Ｈｕｍｐ４２と名付けた遺伝子座はザトウクジラのみにＳＩＮＥの挿入が確認される。つまりこの遺伝子座を増幅するプライマーを用いて検体を解析すれば、その由来不明の鯨肉がザトウクジラなのか否かが簡便に判別できる。図１９Ｆに見られるように、ＳＩＲ１３ではシロナガスクジラか否かを判別可能である。またＳｐｅｒｍ２８やＢＲＹ５０では、検体が歯鯨類であるのか、ヒゲ鯨類であるのかを、おおまかに見分けることができる。したがって、表３に示すプライマーを用いて実験をおこなえば、市場に出回るほぼ全種類の鯨肉に関して、迅速・安価で信頼度の高い種判別をおこなうことができる。
【００７９】
要するに、検体が鯨かどうか判別するＰＣＲプライマー（Ａ）、歯鯨類か否かを判別するＰＣＲプライマー（Ｃ）、ヒゲ鯨類か否かを判別するＰＣＲプライマー（Ｂ）がそれぞれ一組ずつある。これらによって、まず検体をおおまかに振り分けることが可能になる。その後に、特定の鯨種を判別できるプライマーを使用してＰＣＲをおこなえば、それぞれの検体がどの種に対応するのかが即座にわかる。実際には、歯鯨類を判別するＰＣＲプライマーが５組（Ｎ，Ｏ，Ｐ，Ｑ，Ｒ）、ヒゲ鯨類を判別するＰＣＲプライマーが１０組（Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ）、加えて上述の３組のプライマー（Ａ，Ｂ，Ｃ）の計１８組の種判別プライマーを使用すればよいことがわかる。また市場で販売される鯨種はずっと限られたものであるので、このプライマー全てを使用する必要はなく、目的に応じてこのプライマーを使い分けることもでき、より効率的に少ない実験量で種判別をおこなうことも可能である。つまりミンク鯨か否かだけが知りたいのであれば、１組のプライマーセットで十分判別可能である。また時間としては、検体が組織であればＤＮＡ抽出に３０分、ＰＣＲに２時間半、アガロースゲルによる電気泳動に３０分、計３時間半で最終的な結論まで導くことが可能である。試験的実験をおこなった結果、その正答率は１００％であった。
【００８０】
実施例３：鯨目内部の系統樹の作成
実施例２の結果から得られたSINEの挿入パターンをマトリックスにまとめた(図２２参照)。これに基づき推定される鯨目内部の系統発生樹を図２３に示す。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＳＩＮＥのレトロポジションに関する一般ダイアグラム。
【図２】図２（Ａ）はマスター遺伝子モデルを表し、そして図２（Ｂ）は多数源遺伝子モデルを表す。
【図３】ＳＩＮＥの進化の指標としての有用性を示す。
【図４】種Ａ〜Ｄの系統樹モデルを表す。図４（C）はPCRパターンを示す。
【図５】選択された動物種由来の全ゲノムＤＮＡからの転写産物のいくつかのパターン例である。
【図６】ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのｔＲＮＡ様構造を示す。
【００８２】
【図７】図７（Ａ）はＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのｔＲＮＡ様二次構造を示し、そして図７（Ｂ）はヒトｔＲＮＡ  Ｇｌｕの二次構造を示す。
【図８】ＣＨＲ−２のいくつかの配列アラインメントからのＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのコンセンサス配列の構築を表す。
【図９】ｔの時に増幅された古いＳＩＮＥと、ｕの時に増幅された若いＳＩＮＥを含む系統分類樹。
【図１０】アラインメントによるＳＩＮＥファミリーのサブファミリーを表す特徴的なヌクレオチド又は可能な欠失の同定を表す。
【図１１】ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥファミリーのサブファミリーのコンセンサス配列のアラインメントを示す。
【図１２】ＣＤ，ＣＤＯ，及び他のサブファミリーに特異的なプローブを、それぞれ、用いたドット−ハイブリダイゼーション実験の結果を示す。
【００８３】
【図１３】フランキングＳＩＮＥ  ＰＣＲの原理を模式的に示す。
【図１４】フランキングＰＣＲ結果の１例を示す。また、図１４（Ｂ）と（Ｃ）に２つの異なるプローブを用いた同一フィルターを用いて行ったハイブリダイゼーション実験結果を同時に示す。
【図１５】哺乳動物の系統発生樹を示す。
【図１６】ＳＩＮＥ法における実験の流れを示す。
【図１７】分子統計学的研究から提唱された系統樹（歯鯨類の単系統性の問題をめぐる論争）を示す。
【００８４】
【図１８】ＣＨＲ−２各サブファミリーのコンセンサス配列のアラインメントを示す。
【図１９】遺伝子座Ａ〜Ｃ、及びＦ〜ＨのSINEの挿入結果を表すアガロース・ゲル電気泳動図。
【図２０】遺伝子座Ｄ，Ｅ，Ｋ、及びＩ，Ｊ，ＯのSINE挿入結果を示すアガロース・ゲル電気泳動図。
【００８５】
【図２１】遺伝子座Ｌ〜Ｎ、及びＰ〜ＲのSINE挿入結果を示すアガロース・ゲル電気泳動図。
【図２２】SINEの挿入パターンをまとめたマトリックスを示す。
【図２３】図２２に示すマトリックスに基づき推定される鯨目内部の系統発生樹を示す。
【図１】
2005160359.tif 000005
【図２】
2005160359.tif 000006
【図３】
2005160359.tif 000007
【図４】
2005160359.tif 000008
【図５】
2005160359.tif 000009
【図６】
2005160359.tif 000010
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2005160359.tif 000018
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2005160359.tif 000026
【図２３】
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【配列表】
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