(57)【要約】【課題】  アカルボースの回収及び純化の方法の提供。【解決手段】  本発明は、アルコール沈殿分離、強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び固定化酵素親和クロマトグラフィーを利用し、アカルボースの発酵液中よりアカルボースの純化と回収を行ない、高純度のアカルボースを獲得する方法に関する。アカルボースは糖尿病治療薬として用いられる。【選択図】        図１
2005160463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アカルボースを含む発酵液中より高純度のアカルボースを純化及び回収するのに用いられ、アルコール類による沈殿分離、強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び固定化酵素親和クロマトグラフィーの工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項２】
請求項１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーに使用する樹脂基質はスチレンジビニルベンゼンコポリマー（Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）であり、且つメトキシメチルメタクリルアミド（Ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）成分を含まないことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項３】
請求項１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、固定化酵素親和クロマトグラフィーに用いられる酵素はαアミログルコシダーゼ（α−ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ或いはα−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）とされることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項４】
請求項２記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、アカルボースを含む溶液と樹脂の比例は、１ミリリットルの樹脂中に２０から２００ミリグラムの総糖量が含まれるものとすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項５】
請求項２記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーの工程を実行した後に、さらに溶離液で既に結合したアカルボースを溶離させる工程を具え、該溶離液は０−０．２Ｎアンモニア水とされることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項６】
請求項３記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、固定化酵素親和クロマトグラフィーの工程を実行後に、さらに溶離液で既に結合したアカルボースを溶離させる工程を具え、該溶離液は５５−７５℃の蒸留水とされ、そのｐＨ値は６から８の間とされることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項７】
請求項１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、得られたアカルボースの純度が９５％（ｗｔ／ｗｔ）より大きく、糖尿病治療薬とされうることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項８】
アカルボースの回収及び純化の方法において、
アカルボースの発酵液より遠心方式で菌糸を除去する工程、
ろ液を取り、減圧濃縮機でシロップ状に濃縮する工程、
適量のエタノール溶液を加え攪拌する工程、
遠心方式で上澄み液を取り出す工程、
上澄み液を減圧濃縮機でシロップ状に濃縮する工程、
エタノール溶液中に加える工程、
遠心方式で沈殿を取り並びに水を加え溶解させる工程、
粗アカルボース溶液を得る工程、
強陽イオン交換樹脂を加え、混合し振動させる工程、
塩化ナトリウム溶液で結合した不純物を洗い流す工程、
アンモニア水で結合した残りの不純物を洗い流す工程、
アンモニア水で結合したアカルボースを溶離させ、アカルボースを得る工程、
以上の工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項９】
請求項８記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、遠心方式による菌糸除去の工程の代わりに、アカルボースを含む発酵液を濾過することで菌糸を除去する工程を採用したことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１０】
請求項８記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、最後の工程で得られるアカルボースの純度が６０％以上であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１１】
アカルボースの回収及び純化の方法において、
粗アカルボース溶液のｐＨ値を調整する工程、
陽イオン交換樹脂を加える工程、
混合、振動させ並びに上澄み液を取る工程、
所定の比例で強陽イオン交換樹脂を加える工程、
混合、振動させてアカルボースを吸着させる工程、
塩化ナトリウム溶液で結合した不純物を洗い流す工程、
アンモニア水で結合したアカルボースを溶離させ、アカルボースを得る工程、
以上の工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１２】
請求項１１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、ｐＨ値の調整の工程の後、一グラムの樹脂が２５０ｍｇの総糖量（２５０ｍｇ  ｓｕｇａｒｓ／ｇ  ｒｅｓｉｎ）の比例で、陽イオン交換樹脂を加えることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１３】
請求項１１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、上澄み液を取る工程の後、１ミリリットルの樹脂に対して８０ミリグラムの総糖量（８０ｍｇ  ｓｕｇａｒｓ／ｍＬ）の比例で、強陽イオン交換樹脂を加えることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１４】
請求項１１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、最後の工程で得られるアカルボースの純度が７８％以上であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１５】
アカルボースの回収及び純化の方法において、
強陽イオン交換樹脂で処理後のアカルボース上澄み液のｐＨ値を調整する工程、
所定の流速で強陽イオン交換樹脂カラムを通過させる工程、
脱イオン水で洗い流して吸光値を０とするか、安定させる工程、
アンモニア水でアカルボースを溶離させ、並びにアカルボースを含む部分を収集する工程、
減圧濃縮機で所定の体積まで濃縮する工程、
アルコールでアカルボースを沈殿させ、アカルボースを得る工程、
以上の工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１６】
請求項１５記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、強陽イオン交換樹脂カラムを通過させる流速を毎分２．５ｍＬとすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１７】
請求項１５記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、アンモニア水でアカルボースを溶離させる工程のアンモニア水勾配は、０．５から１．５Ｎ勾配であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１８】
請求項１５記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、最後の工程で得られるアカルボースの純度が８５％以上であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項１９】
アカルボースの回収及び純化の方法において、
純度が８３％から８７％のアカルボース粉末に水を加えて溶解させる工程、
所定の流速で固定化αアミログルコシダーゼカラムを通過させる工程、
カラム体積の倍数体積の脱イオン水で洗い流す工程、
蒸留水でアカルボースを溶離させ、アカルボースを含む部分を収集する工程、
減圧濃縮機で所定の体積まで濃縮する工程、
アルコールを利用してアカルボースを沈殿させ、アカルボースを得る工程、
以上の工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項２０】
請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、固定化αアミログルコシダーゼカラムを通過させる流速を毎分１．５ｍＬとすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項２１】
請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、脱イオン水の体積をカラム体積の２倍とすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項２２】
請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、カラム体積の倍数体積の脱イオン水で洗い流す工程の代わりに、脱イオン水で洗い流して２１０ｎｍの吸光値を平穏とする工程を採用することを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項２３】
請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、蒸留水でアカルボースを溶離させる時の蒸留水温度を６５℃とすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【請求項２４】
請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、最後の工程で得るアカルボースの純度が９５％以上であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール沈殿分離、強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び固定化酵素親和クロマトグラフィーを利用し、アカルボースの発酵液中よりアカルボースの純化と回収を行ない、高純度のアカルボースを獲得する方法に関する。アカルボースは糖尿病治療薬として用いられる。
【背景技術】
【０００２】
アカルボース（Ａｃａｒｂｏｓｅ；Ｏ−４，６−Ｄｉｄｅｏｘｙ−４−〔〔〔１Ｓ−（１α，４α，５β，６α）〕−４，５，６，−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−２−ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎ−１−ｙｌ〕ａｍｉｎｏ〕−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ；Ｃ25Ｈ43ＮＯ18，分子量６４５．６３）は、一種のオリゴ糖誘導体であり、可逆的に小腸刷子縁内のαグルコシダーゼ酵素活性を抑制し、炭水化物複合体と二糖を吸収されやすい単糖に変換する消化工程を遅延させるため、食後血糖、血中トリグリセライドとインシュリンのピーク濃度を低減することができる。早期（７０年代）はその肉質／脂肪比例を改善する特性により、動物（例えば豚）飼料添加物に常用された。近年、アカルボースがダイエット（或いは降糖薬を併用）が理想的でないインシュリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者の血糖コントロールに使用でき、直接インシュリン抵抗性を直接に改変はできないが、食後のインシュリン値を下げることができ、これにより糖尿病心血管併発症を緩和或いは予防できることが研究により分かった。アカルボースは僅かに全身性の不良反応を有するが、腹部膨張、腹部が鳴る、腹下し等の副作用は、ある時間続けて使用すると消える。Ｂａｙｅｒ社の糖尿病治療薬（グルコバイ（Ｒ））は、既に１９９５年に米国ＦＤＡで販売許可された。現在アカルボースの生産菌種のほとんどは放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．）が主要な研究対象とされている。このほか、Ｓｔｅｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ菌もまたアカルボース生産の能力を有するが、その研究報告は比較的少ない。
【０００３】
現在台湾衛生署は「健康食品の血糖調整機能評価方法」をすでに公布し制定し、これにより「血糖調整」類の保健食品は期待できる健康食品の一つと見なされる。
【０００４】
このほか、東洋人の肥満の主因である澱粉類は、西洋人の脂肪類とは異なり、このためロッシュ社製の脂肪吸収抑制剤であるゼニカル（Ｒ）のようなものに対して、アカルボースは糖尿病治療薬のほか、関係ダイエット薬としても期待される。
【０００５】
アカルボースの回収と純化の方法に関しては、特許文献１に記載の技術があり、それは、酸性環境下で、活性炭或いは陰イオン樹脂を利用して脱色を行ない、続いて中性環境下で活性炭にアカルボースを吸着させ、続いてエタノール或いはアセトン溶液を使用し酸性環境下でアカルボースを洗い流し、洗い流した液を中和、真空濃縮後に有機溶剤でアカルボースを沈殿させる、というものである。その純度は８５％にしかならず（高圧液相クロマトグラフィー；ＨＰＬＣによる）、純度が更に高いアカルボースを得ようとすれば、セルロースを基質とするイオン交換クロマトグラフィーにより、アカルボースを部分分割後に、さらに濃縮し及び有機溶剤を用いて沈殿させなければならない。しかしこの方法は活性炭吸着と数回のイオン交換クロマトグラフィーを行なうために工程が複雑となり、製造コストが経済性に符合しなくなった。
【０００６】
周知の技術中、特許文献２によると、陰、陽イオン樹脂を混合して直接発酵液と作用させ、アカルボースを吸着させ、続いて流水でアカルボースを洗い流し、アカルボース溶液にさらに２次陰、陽イオン交換樹脂を通過させた後、塩酸でアカルボースを洗い流し、さらに陰イオン交換樹脂で中和処理し及び冷凍乾燥し、純度５２％−５８％のアカルボースを得る。
【０００７】
また、別の周知の技術（特許文献３、及び特許文献４）も、特許文献２に記載の方式を利用し、更に強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行ない、最後に塩酸でアカルボースを洗い流し、更に陰イオン交換樹脂で中和処理し及び冷凍乾燥し、純度７９％−８２％のアカルボースを得る。
【０００８】
以上の周知の技術のアカルボース純化の方法は、いずれも重複して陰、陽イオン交換クロマトグラフィー処理を行なうことでアカルボースの糖液を得て、最後に陽イオン交換クロマトグラフィーで比較的高濃度のアカルボースを得る。しかし、それにより得られるアカルボースの純度は医薬用の糖尿病薬とするには不十分である。
【０００９】
また、特許文献５には、アカルボースを含み純度が高くない溶液にカルボニル官能基を通過させ、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、デキストリン（ｄｅｘｔｒａｎ）を担体とする弱陽イオン交換クロマトグラフィーを行ない、特定温度及びｐＨ値環境下で、純度が９０％のアカルボースを得る技術が記載されている。この方法は工程が複雑な欠点があり、且つ最後に使用する弱イオン交換樹脂価格が高価であり、全体の工程が商業化に見合う経済性を有していない。
【００１０】
このほか、特許文献６に記載の方法は、先に純度が高くないアカルボース溶液を製造し、最後に非芳香族（Ｎｏｎ−ａｒｏｍａｔｉｃ）の強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーにより高純度のアカルボースを得ているが、工程が複雑で使用する樹脂価格が高いという欠点を有している。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，０６２，０９２号明細書
【特許文献２】米国特許第４，１７４，４３９号明細書
【特許文献３】米国特許第４，６６６，７７６号明細書
【特許文献４】米国特許第４，７６７，８５０号明細書
【特許文献５】米国特許第４，９０４，７６９号明細書
【特許文献６】ＷＯ９９／０７７２０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は従来の技術の工程が複雑で樹脂が高価格であるという欠点に対して改善を行なったものである。上述の従来の技術の採用する方法は、いずれも工程が複雑で、使用するイオン交換樹脂価格が高く、このためコストパフォーマンスが低いという欠点を有している。本発明は、これらの欠点に対して改善を行ない、且つ治療薬として使用できる高純度のアカルボースを得ることができる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
請求項１の発明は、アカルボースを含む発酵液中より高純度のアカルボースを純化及び回収するのに用いられ、アルコール類による沈殿分離、強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー及び固定化酵素親和クロマトグラフィーの工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項２の発明は、請求項１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーに使用する樹脂基質はスチレンジビニルベンゼンコポリマー（Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）であり、且つメトキシメチルメタクリルアミド（Ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）成分を含まないことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項３の発明は、請求項１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、固定化酵素親和クロマトグラフィーに用いられる酵素はαアミログルコシダーゼ（α−ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ或いはα−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）とされることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項４の発明は、請求項２記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、アカルボースを含む溶液と樹脂の比例は、１ミリリットルの樹脂中に２０から２００ミリグラムの総糖量が含まれるものとすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項５の発明は、請求項２記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーの工程を実行した後に、さらに溶離液で既に結合したアカルボースを溶離させる工程を具え、該溶離液は０−０．２Ｎアンモニア水とされることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項６の発明は、請求項３記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、固定化酵素親和クロマトグラフィーの工程を実行後に、さらに溶離液で既に結合したアカルボースを溶離させる工程を具え、該溶離液は５５−７５℃の蒸留水とされ、そのｐＨ値は６から８の間とされることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項７の発明は、請求項１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、得られたアカルボースの純度が９５％（ｗｔ／ｗｔ）より大きく、糖尿病治療薬とされうることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項８の発明は、アカルボースの回収及び純化の方法において、
アカルボースの発酵液より遠心方式で菌糸を除去する工程、
ろ液を取り、減圧濃縮機でシロップ状に濃縮する工程、
適量のエタノール溶液を加え攪拌する工程、
遠心方式で上澄み液を取り出す工程、
上澄み液を減圧濃縮機でシロップ状に濃縮する工程、
エタノール溶液中に加える工程、
遠心方式で沈殿を取り並びに水を加え溶解させる工程、
粗アカルボース溶液を得る工程、
強陽イオン交換樹脂を加え、混合し振動させる工程、
塩化ナトリウム溶液で結合した不純物を洗い流す工程、
アンモニア水で結合した残りの不純物を洗い流す工程、
アンモニア水で結合したアカルボースを溶離させ、アカルボースを得る工程、
以上の工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項９の発明は、請求項８記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、遠心方式による菌糸除去の工程の代わりに、アカルボースを含む発酵液を濾過することで菌糸を除去する工程を採用したことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１０の発明は、請求項８記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、最後の工程で得られるアカルボースの純度が６０％以上であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１１の発明は、アカルボースの回収及び純化の方法において、
粗アカルボース溶液のｐＨ値を調整する工程、
陽イオン交換樹脂を加える工程、
混合、振動させ並びに上澄み液を取る工程、
所定の比例で強陽イオン交換樹脂を加える工程、
混合、振動させてアカルボースを吸着させる工程、
塩化ナトリウム溶液で結合した不純物を洗い流す工程、
アンモニア水で結合したアカルボースを溶離させ、アカルボースを得る工程、
以上の工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１２の発明は、請求項１１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、ｐＨ値の調整の工程の後、一グラムの樹脂が２５０ｍｇの総糖量（２５０ｍｇ  ｓｕｇａｒｓ／ｇ  ｒｅｓｉｎ）の比例で、陽イオン交換樹脂を加えることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１３の発明は、請求項１１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、上澄み液を取る工程の後、１ミリリットルの樹脂に対して８０ミリグラムの総糖量（８０ｍｇ  ｓｕｇａｒｓ／ｍＬ）の比例で、強陽イオン交換樹脂を加えることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１４の発明は、請求項１１記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、最後の工程で得られるアカルボースの純度が７８％以上であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１５の発明は、アカルボースの回収及び純化の方法において、
強陽イオン交換樹脂で処理後のアカルボース上澄み液のｐＨ値を調整する工程、
所定の流速で強陽イオン交換樹脂カラムを通過させる工程、
脱イオン水で洗い流して吸光値を０とするか、安定させる工程、
アンモニア水でアカルボースを溶離させ、並びにアカルボースを含む部分を収集する工程、
減圧濃縮機で所定の体積まで濃縮する工程、
アルコールでアカルボースを沈殿させ、アカルボースを得る工程、
以上の工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１６の発明は、請求項１５記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、強陽イオン交換樹脂カラムを通過させる流速を毎分２．５ｍＬとすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１７の発明は、請求項１５記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、アンモニア水でアカルボースを溶離させる工程のアンモニア水勾配は、０．５から１．５Ｎ勾配であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１８の発明は、請求項１５記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、最後の工程で得られるアカルボースの純度が８５％以上であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項１９の発明は、アカルボースの回収及び純化の方法において、
純度が８３％から８７％のアカルボース粉末に水を加えて溶解させる工程、
所定の流速で固定化αアミログルコシダーゼカラムを通過させる工程、
カラム体積の倍数体積の脱イオン水で洗い流す工程、
蒸留水でアカルボースを溶離させ、アカルボースを含む部分を収集する工程、
減圧濃縮機で所定の体積まで濃縮する工程、
アルコールを利用してアカルボースを沈殿させ、アカルボースを得る工程、
以上の工程を具えたことを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項２０の発明は、請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、固定化αアミログルコシダーゼカラムを通過させる流速を毎分１．５ｍＬとすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項２１の発明は、請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、脱イオン水の体積をカラム体積の２倍とすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項２２の発明は、請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、カラム体積の倍数体積の脱イオン水で洗い流す工程の代わりに、脱イオン水で洗い流して２１０ｎｍの吸光値を平穏とする工程を採用することを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項２３の発明は、請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、蒸留水でアカルボースを溶離させる時の蒸留水温度を６５℃とすることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
請求項２４の発明は、請求項１９記載のアカルボースの回収及び純化の方法において、最後の工程で得るアカルボースの純度が９５％以上であることを特徴とする、アカルボースの回収及び純化の方法としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は後に述べる四つの実施例により糖尿病治療薬として運用できる純度の高いアカルボースを製造でき、並びにその製造過程は簡易化され、使用する樹脂のコストが低く、生産コストを下げることができる。
【００１５】
総合すると、本発明はその目的及び機能上、いずれも実施上の進歩性を有しており、産業上の利用価値を有し、且つこれまでにない新発明であり、特許の要件に符合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
上述の従来の技術の工程及び原料に対する考察に基づき、本発明は先ずアカルボースを含む粗純液の製造を改良する。我々はアカルボースのメタノール或いはエタノール溶液の溶解度生化学特性及び工業レベルの強陽イオン交換樹脂を用いてアカルボースを吸着させ、続いて高濃度の塩化ナトリウム及び特定濃度のアンモニア水でアカルボースに類似の糖類を除去し、最後に特定の特定の高濃度のアンモニア水でさらにアカルボースを溶離させ、これにより７５％−８０％の純度を達成し、この二つの工程を以て従来の方法における活性炭を利用し及び５から６個のイオン交換樹脂による処理の代わりとし、最後に一次固定化αアミログルコシダーゼ（α−ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ或いはα−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）カラムを通過させて、９５％以上の純度のアカルボースを得る。以上は本発明の独創である。本発明は全工程で使用する溶剤が価格の安いアルコール類、工業レベルのイオン交換樹脂及び酵素であり、前述の従来の技術の方法の、工程が複雑でコストが高い欠点を克服する。
【００１７】
本発明は高純度のアカルボースを純化、回収する方法であり、それは図１に示されるように、開始１０後に、アルコール類を利用して沈殿分離１５し、続いて強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー２０を実行し、その後、固定化酵素親和クロマトグラフィーを行なう。これにより、アカルボースを含む発酵液中より、アカルボースを純化、回収することができ、糖尿病治療薬として使用できる高純度のアカルボースを得ることができる。そのうち、上述の強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーに使用する樹脂基質はスチレンジビニルベンゼンコポリマー（Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）とされ、且つメトキシメチルメタクリルアミド（Ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）成分を含まない。該固定化酵素親和クロマトグラフィーに使用する酵素は、αアミログルコシダーゼ（α−ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ或いはα−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）とされる。
【００１８】
さらに、本発明の方法の詳細な工程について説明する。アカルボースを含む発酵液を、遠心方式或いは濾過により上澄み液或いはろ液を得て、回転式真空濃縮機で１／１０倍体積に濃縮し、適量のエタノール溶液或いはメタノール溶液（最終濃度８０％）を加え、均一に攪拌後、上澄み液を取り、濃縮してシロップとなし、最後にエタノールでアカルボースを沈殿させ（最終濃度は９０％エタノール）、沈殿を取り、適量の蒸留水を加えて溶解させ、総糖濃度を２００ｍｇ／ｍＬとなし、並びにそのｐＨ値を５から９の間に調整する。
【００１９】
上述中、イオン交換樹脂の処理に関しては、強陽イオン交換樹脂ＡＭＢＥＲＪＥＴ１２００Ｈ樹脂或いはＡＭＢＥＲＪＥＴ１２００Ｎａ型樹脂（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ
社製）を蒸留水で洗い、上澄み液ｐＨ値を４．０より大きくする。さらに、上述のイオン交換樹脂に２０−２００ｍｇのアカルボースを含む糖液（２０−２００ｍｇ  ｓｕｇａｒ／ｍＬ樹脂）を加え、１０−３０分間均一に混合する。樹脂部分を取り出し、蒸留水で数回洗い、さらに１．０Ｎ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）でアカルボースに類似の糖類（Ａｃａｒｂｏｓｅ−ｌｉｋｅ  ｓｕｇａｒｓ）を洗い流し、続いて０．７５Ｎアンモニア水で洗い流し、最後に１．５Ｎアンモニア水でアカルボースを溶離させる。濃縮して湿粉状としアルコールで沈殿させ、７５−８０％（ＨＰＬＣ分析方法による）の純度を達成する。
【００２０】
上述のアカルボース粉末に適量の蒸留水を加え、並びにそのｐＨ値を５から９の間に調整し、室温下で固定化酵素親和クロマトグラフィーカラムを通過させる。その充填物質はＡＭＢＥＲＪＥＴ４４００ＯＨ樹脂／αアミログルコシダーゼとする。そしてカラム体積の１から４倍の蒸留水で洗い流し、迅速に５５−７５℃の蒸留水で溶離させ、アカルボースを具えた部分を収集し、濃縮及びアルコール沈殿させ、最後に遠心方式で沈殿を取り出し冷凍乾燥して９５％以上の純度のアカルボースを得る。
【実施例１】
【００２１】
図２は本発明の実施例１の操作フローチャートである。まず、アカルボースの発酵液より遠心方式或いは濾過方式で菌糸体を除去（１００）し、１０００ｍＬのろ液或いは上澄み液（アカルボース濃度２ｇ／Ｌ）を取り、減圧濃縮機で濃縮してシロップ状とする（１０２）。その後、適量のエタノール溶液（最終濃度８０％）を加えて攪拌（１０４）し、３０分間攪拌した後、遠心方式で上澄み液を取り出し（１０６）、さらに減圧濃縮機で濃縮してシロップ状とし（１０８）、９倍体積の９９．９％エタノール溶液中に加え（１１０）、遠心方式で沈殿を取り出し、並びに適量の水を加えて溶解させる（１１２）。こうしてアカルボース粗溶液を得る（アカルボース回収量はＨＰＬＣ定量によると１５６０ｍｇ、純度約１０％）（１１４）。続いて、上述のアカルボース溶液に、１００ｍｇ  ｓｕｇａｒｓ／ｍＬ樹脂比例となるよう適量の体積の強陽イオン交換ＡＭＢＥＲＪＥＴ１２００Ｈ樹脂（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ社製）を加え、混合し１０分間振動させ（１１６）、１．０Ｎ塩化ナトリウム容積で結合した不純物を洗い流し（１１８）、続いて０．７５Ｎアンモニア水で結合した残りの不純物（１２０）を洗い流し、最後に１．５Ｎアンモニア水で結合したアカルボースを溶離させ（１２２）、１２２０ｍｇのアカルボースを得た（１２４）。その純度は約６０％であった。
【実施例２】
【００２２】
図３は本発明の実施例２の操作フローチャートである。実施例１で得たアカルボース溶液を利用し、ｐＨ値を６．０〜７．０の間に調整（２００）し、さらにグラム当たり２５０ｍの総糖量（２５０ｍｇ  ｓｕｇａｒｓ／ｇ  ｒｅｓｉｎ）の比となるよう適量の体積の陽イオン交換（ＡＭＢＥＲＪＥＴ１２００Ｎａ，Ｒｈｏｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ社製）樹脂を加え（２０２）、混合し１０分間振動させて上澄み液を取り出す（２０４）。続いて８０ｍｇ総糖量／ｍＬ樹脂比となるよう適量の体積の強陽イオン交換（ＡＭＢＥＲＪＥＴ１２００Ｈ，Ｒｈｏｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ社製）樹脂を加え、混合し１０分間振動させ、アカルボースを吸着させる（２０８）。さらに１．０Ｎ塩化ナトリウム溶液で結合した不純物を洗い流し（２１０）、続いて１．５Ｎアンモニア水で結合したアカルボースを溶離させ、１１００ｍｇアカルボースを得た（２１２）。その純度は約７８％であり、これによりアカルボースの濃度をさらに高めることができた。
【実施例３】
【００２３】
図４は本発明の実施例３の操作フローチャートである。実施例２中で述べた強陽イオン交換（ＡＭＢＥＲＪＥＴ１２００Ｎａ，Ｒｈｏｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ社製）樹脂で処理した後のアカルボース上澄み液のｐＨ値を、６．０〜７．０の間に調整し（３００）、流速毎分２．５ｍＬで強陽イオン交換（ＡＭＢＥＲＪＥＴ１２００Ｈ，Ｒｈｏｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ社製）樹脂カラム（８×５０ｃｍ）を通過させ、脱イオン水で洗い２１０ｎｍの吸光値を０或いは平穏とし（３０２）、続いて０．５から１．５Ｎ勾配アンモニア水でアカルボースを溶離させ、各２０ｍＬを一区画とし、アカルボースを具えた部分を収集し（３０４）、減圧濃縮機で適当な体積まで濃縮し（３０６）、最後にアルコールでアカルボースを沈殿させ、９２０ｍｇアカルボースを得た（３０８）。その純度は実施例２よりも高かった。
【実施例４】
【００２４】
図５は本発明の実施例４の操作フローチャートである。それは実施例３で得た純度８５％（その範囲は８３％から８７％とされうる）のアカルボース粉末に、適量の水を加えて溶解させ（４０２）、ｐＨ値を６．０から７．０の間に調整し（４０４）、流速毎分１．５ｍＬで固定化αアミログルコシダーゼ〔ＡＭＢＥＲＪＥＴ４４００ＯＨ，Ｒｈｏｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ社製）／αアミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）〕カラム（８×３０ｃｍ）を通過させ、カラム体積の２倍の脱イオン水で洗い流して２１０ｎｍの吸光値を平穏とし（４０６）、続いて、６５℃蒸留水でアカルボースを溶離させ、アカルボースを含む部分を収集し（４０８）、減圧濃縮機で適当な体積に濃縮し（４１０）、最後にアルコールを利用してアカルボースを沈殿させて、６００ｍｇのアカルボースを得た（４１２）。その純度は９５％以上であった。これにより、本発明の必要とする純度の高いアカルボースを製造でき、それは糖尿病治療薬として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の高純度アカルボースを純化回収する主要な工程表示図である。
【図２】本発明の実施例１の操作フローチャートである。
【図３】本発明の実施例２の操作フローチャートである。
【図４】本発明の実施例３の操作フローチャートである。
【図５】本発明の実施例４の操作フローチャートである。
【符号の説明】
【００２６】
１０  高純度のアカルボースの純化回収
１５  アルコール類で沈殿分離
２０  強陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー
２５  固定化酵素親和クロマトグラフィー
１００  アカルボースを含む発酵液より遠心或いは濾過方式で菌糸体を除去
１０２  ろ液或いは上澄み液を減圧濃縮機で濃縮しシロップ状となす
１０４  エタノール溶液中に加え攪拌
１０６  遠心方式で上澄み液を取り出す
１０８  減圧濃縮機で濃縮してシロップ状となす
１１０  数倍体積のエタノール溶液中に加える
１１２  遠心方式で沈殿を取り出し並びに適量の体積の水を加えて溶解させる
１１４  粗アカルボース溶液を得る
１１６  強陽イオン交換樹脂を加え混合、振動
１１８  塩化ナトリウム溶液で結合した不純物を洗い流す
１２０  アンモニア水で残った不純物を洗い流す
１２２  アンモニア水で結合したアカルボースを溶離させる
１２４  アカルボースを得る
２００  実施例１で得た粗アカルボース溶液のｐＨ値を調整
２０２  適量体積の陽イオン交換樹脂を加える
２０４  混合振動後に取り出す
２０６  適量体積の強陽イオン交換樹脂を加える
２０８  混合振動によりアカルボースを吸着させる
２１０  塩化ナトリウム溶液で結合した不純物を洗い流す
２１２  アンモニア水で結合したアカルボースを溶離させる
３００  実施例２で得たアカルボース上澄み液のｐＨ値を調整
３０２  所定の流速で強陽イオン交換樹脂カラムを通過させ、脱イオン水で洗い流して吸光値を０とするかある数値で安定させる
３０４  アンモニア水でアカルボースを溶離させ、並びにアカルボースを含む部分を収集する
３０６  減圧濃縮機で適量体積まで濃縮
３０８  アルコールでアカルボースを沈殿させ純度の高いアカルボースを得る
４０２  実施例３で得た純度の高いアカルボース粉末に適当な体積の水を加え溶解させる４０４  ｐＨ値調整
４０６  所定の流速で固定化αアミログルコシダーゼカラムを通過させ、脱イオン水で吸水値が安定するまでカラムを洗う
４０８  蒸留水でアカルボースを溶離させ並びにアカルボースを含む部分を収集
４１０  減圧濃縮機で適当な体積に濃縮
４１２  アルコールでアカルボースを沈殿させて高純度のアカルボースを得る
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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