(57)【要約】【課題】  物質が有するミトコンドリア毒性をより迅速かつ簡便に検定する方法等を提供すること。【解決手段】  物質が有するミトコンドリア毒性の検定方法において、（１）培養細胞を臭化エチジウムに接触させる第一工程、（２）第一工程後又は同時に、前記培養細胞に被験物質を接触させる第二工程、（３）第二工程後、前記培養細胞の細胞生存率を測定する第三工程、（４）第三工程により測定された細胞細胞生存率と対照における細胞細胞生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のミトコンドリア毒性を評価する第四工程、を有することを特徴とする方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が有するミトコンドリア毒性の検定方法において、
（１）培養細胞を臭化エチジウムに接触させる第一工程、
（２）第一工程後又は同時に、前記培養細胞に被験物質を接触させる第二工程、
（３）第二工程後、前記培養細胞の細胞生存率を測定する第三工程、
（４）第三工程により測定された細胞細胞生存率と対照における細胞細胞生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のミトコンドリア毒性を評価する第四工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
物質が有するミトコンドリア毒性を検定するための試薬としての、臭化エチジウムと接触させてなる培養細胞の使用。
【請求項３】
物質が有するミトコンドリア毒性を検定するための装置であって、請求項１記載の方法に基づくシステム工程を有することを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１記載の方法により検定して得られた毒性情報を有することを特徴とする電子情報記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質が有するミトコンドリア毒性の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の物質等による毒性或いは副作用発現の標的の一つとして近年ミトコンドリアが注目されている。特に核酸アナログ等の医薬品が、ミトコンドリアのゲノムDNA複製を司るDNAポリメラーゼγを阻害することによりミトコンドリア毒性をきたし、肝傷害を初めとする種々の副作用をヒトで発現するといわれている(Nature Medicine,1,4174-22, 1995, Antiviral Research,29,125-139,1996他)。これら核酸アナログ等によって引き起こされるミトコンドリア毒性に起因した臓器傷害については、実験動物を用いた非臨床毒性試験では検出されず(Drug Safety,17,1-7,1997)、培養細胞を被験物質に接触させることによって、培養上清中の乳酸濃度やミトコンドリアDNA含量又は透過型電子顕微鏡像観察等の指標を組み合わせてミトコンドリア毒性を検出する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
また、特許文献１では、核酸アナログ等の抗ウイルス薬によって引き起こされるミトコンドリア毒性を検出する方法として、核及びミトコンドリアのDNA量又はRNA量を定量し、両者の比を指標としてミトコンドリア毒性を評価する方法が記載されている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第02/33128号パンフレット
【非特許文献１】Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45, 229-235, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、非特許文献１に記載された前記の培養細胞を用いたミトコンドリア毒性の検定方法では、指標の一つとして用いる乳酸の測定が通常臨床検査用キットを用いて測定されるため、多数検体を処理する際には高価であること、別の指標の一つとして用いるミトコンドリアDNA含量は培養細胞からミトコンドリアを単離する作業等が必要であり、多数検体を処理するには不向きであること、さらに、t他の別の指標の一つとして用いられる透過型電子顕微鏡観察では、電子顕微鏡用の組織標本作成に時間を要すことや多数の検体を一度に処理することが困難であり、得られる結果は形態学的変化で定量化が困難であること等の課題が存在していた。
一方、特許文献１に記載されたミトコンドリア毒性の評価方法では、Real-time PCR装置が必要となること、事前に核酸を抽出する操作が必要となること、さらにまた各種薬剤によるミトコンドリア毒性を数種のパラメータで検討した結果、ミトコンドリアDNA含量の変動は培養上清中の乳酸値等と比較して必ずしも検出感度の高い指標とはなっていないこと等の課題（例えば、Antimicrobial Agents and Chemotherapy,44,496-503,2000、Biochemical Journal,52,1577-1584,1996、Journal of Clinical Investigation,95,555-563,1995等参照）が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような状況下、本発明者は、物質が有するミトコンドリア毒性をより迅速かつ簡便に検定するための方法について種々鋭意検討した結果、臭化エチジウムと接触させてなる培養細胞にミトコンドリア毒性を有する物質を接触させると、当該培養細胞の細胞生存率が低下することを見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．物質が有するミトコンドリア毒性の検定方法において、
（１）培養細胞を臭化エチジウムに接触させる第一工程、
（２）第一工程後又は同時に、前記培養細胞に被験物質を接触させる第二工程、
（３）第二工程後、前記培養細胞の細胞生存率を測定する第三工程、
（４）第三工程により測定された細胞細胞生存率と対照における細胞細胞生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のミトコンドリア毒性を評価する第四工程、を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．物質が有するミトコンドリア毒性を検定するための試薬としての、臭化エチジウムと接触させてなる培養細胞の使用；
３．物質が有するミトコンドリア毒性を検定するための装置であって、前項１記載の方法に基づくシステム工程を有することを特徴とする装置；
４．前項１記載の方法により検定して得られた毒性情報を有することを特徴とする電子情報記録媒体；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明方法により、物質が有するミトコンドリア毒性をより迅速かつ簡便に検定することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法において用いられる培養細胞としては、所謂ロー(ρ)０細胞（ミトコンドリアゲノムDNAを欠く細胞）を除けば特に限定されるものではなく、例えば、種々の初代培養細胞や株化細胞等をあげることができる。
【０００９】
本発明方法の第一工程は、臭化エチジウムと培養細胞とを接触させればよい。培養細胞と臭化エチジウムとの接触時間として、例えば、１日間程度以上を、好ましくは約１日間以上約１４日間以内をあげることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、約１０℃以上約４０℃以上を、好ましくは約２０℃以上約４０℃以下をあげることができる。
【００１０】
本発明方法の第一工程における接触系内での臭化エチジウムの濃度は、例えば、０．０１μｇ〜３０μｇ/ｍＬ、好ましくは０．１μｇ/ｍＬ〜１５μｇ/ｍＬである。
本発明方法の第一工程における接触系内での培養細胞の培養密度は、例えば、1×103cell/cm2〜1×105cell/cm2で、好ましくは3×103cell/cm2〜3×104cell/cm2である。
【００１１】
本発明方法の第二工程は、臭化エチジウムと接触させた培養細胞（即ち、本培養細胞）と被験物質とを接触させればよい。
本培養細胞と被験物質との接触時間として、例えば、１日間程度以上を、好ましくは約１日間以上約１４日間以内をあげることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、約１０℃以上約４０℃以上を、好ましくは約２０℃以上約４０℃以下をあげることができる。
【００１２】
本発明方法の第二工程における被験物質の濃度は、例えば、０．００１μＭ〜１０ｍＭで、好ましくは０．０１μＭ〜５ｍＭである。
本発明方法の第二工程における接触系内での培養細胞の培養密度は、例えば、1×103cell/cm2〜1×105cell/cm2で、好ましくは3×103cell/cm2〜3×104cell/cm2である。
【００１３】
本発明方法の第一工程（即ち、培養細胞と臭化エチジウムとを接触処理する工程）と本発明方法の第二工程（即ち、培養細胞と被験物質とを接触処理する工程）とは、当該第一工程後に当該第二工程を行ってもよいが、当該第一工程と当該第二工程とを同時に行ってもよい。
【００１４】
本発明方法の第三工程において、第二工程後、前記培養細胞の細胞生存率を測定するには、例えば、Chemical and Pharmaceutical Bulletin,41,1118-1122,1993等に記載されるような公知な方法を用いればよい。具体的には例えば、WST-1を用いた方法等を使用することができる。当該方法では、まず市販の生細胞数測定用キット（Cell Counting Kit、同仁化学）のＡ液及びＢ液を使用時に混合した後、当該混合液を各種培養液と１：９の割合で混合する。次いで、このようにして得られた混合液を培養細胞に添加した後、例えば、１時間以上４時間以内、３７℃で保温する。保温後、450nmの吸光度（参照波長650nm）を測定し、下記の計算式１に従って細胞生存率を求めることができる。
【００１５】
（計算式１）
細胞生存率（％）＝｛被験物質における吸光度−ブランク（細胞を含まない条件）における吸光度｝×１００／｛対照（ネガティブコントロール）における吸光度−ブランク（細胞を含まない条件）における吸光度｝
【００１６】
本発明方法の第三工程において、上記のようにして測定された細胞生存率と対照における細胞生存率（即ち、基準物質等のポジティブコントロール、ネガティブコントロール等）における細胞生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質のミトコンドリア毒性を評価する。この場合には、被験物質における細胞生存率が対照（基準物質等のポジティブコントロール）における細胞生存率よりも低い値であれば、当該被験物質は当該基準物質よりもミトコンドリア毒性が高いと評価する。このようにして被験物質が有するミトコンドリア毒性の検定を簡便に行うことができる。
本発明方法において、測定された細胞生存率と対照における細胞生存率とを比較する場合には、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がミトコンドリア毒性を有さない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等のネガティブコントロールであってもよい。）とすることで、他方の被験物質が有するミトコンドリア毒性を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質（例えば、基準物質等のポジティブコントロール）が有するミトコンドリア毒性を基準としながら他方の被験物質が有するミトコンドリア毒性を評価してもよい。もちろん両者で評価してもよい。
【００１７】
より具体的には、例えば、下記の計算式２に従って求められた細胞生存率を直接比較すればよい。
【００１８】
（計算式２）
細胞生存率（％）＝｛被験物質における吸光度−ブランク（細胞を含まない条件）における吸光度｝×１００／｛対照（ネガティブコントロール）における吸光度−ブランク（細胞を含まない条件）における吸光度｝
【００１９】
また他の具体的な例としては、下記の計算式３に従って細胞生存率に係る増加減少率等を求めるとよい。そして算出された増加減少率によりミトコンドリア毒性を評価すればよい。
【００２０】
（計算式３）
細胞生存率に係る増加減少率（％）＝｛被験物質における細胞生存率−対照（ネガティブコントロール又はポジティブコントロール）における細胞生存率｝×１００／対照（ネガティブコントロール又はポジティブコントロール）における細胞生存率
【００２１】
尚、ミトコンドリア毒性を評価するための指標となる細胞生存率に係る増加減少率が統計学的に有意な値を示す物質、例えば具体的には、対照としてネガティブコントロールを用いた場合には、上記の式における細胞生存率に係る増加減少率がマイナス値であり、かつその絶対値が３０％以上を示す物質を、好ましくは５０％以上を示す物質を、ミトコンドリア毒性を有する物質として選抜すればよい。一方、対照としてポジティブコントロールを用いた場合には、上記の式における細胞生存率に係る増加減少率がプラス値であり、かつその絶対値が３０％以上を示す物質を、好ましくは５０％以上を示す物質を、軽減されたミトコンドリア毒性を有する物質として選抜すればよい。
【００２２】
ミトコンドリア毒性物質を探索するには、本発明方法結果に基づきミトコンドリア毒性を有する物質を選抜すればよい。尚、当該物質は、ミトコンドリア毒性を有する限り、低分子化合物、蛋白質又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
【００２３】
本発明方法において、臭化エチジウムと接触させた培養細胞は、上記のように、ミトコンドリア毒性を検定するための試薬として使用することができる。
【００２４】
本発明は、本発明方法に基づくシステム工程を有する、物質が有するミトコンドリア毒性を検定するための装置も含み、また本発明方法により検定して得られた毒性情報を有する電子情報記録媒体等も含むものである。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例はこれらの例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
大日本製薬（株）より購入したヒト肝由来細胞株HepG2を使用した。当該培養細胞を培養器材よりトリプシン-EDTA(0.05% トリプシン、0.53mM EDTA・4Na)を用いて細胞懸濁液として回収した。回収された細胞懸濁液を低速遠心(1,000×ｇ、３分間)することにより沈殿を得て、これを10mLの下記培養液に懸濁した。細胞懸濁液中の細胞数をトリパンブルー染色により計数した後、下記培養液を用いて1.4×105cell/mLに希釈した。当該細胞懸濁液を96ウエルプレート(Iwaki)に撒いた後(100μl/ウエル)、これを37℃、5%CO2存在下で３日間培養した。一方、臭化エチジウムを添加するウエルでは、接触系内での最終濃度が２μｇ/ｍＬとなるように臭化エチジウム水溶液を培養液に添加し、上記同様に培養した。
【００２７】
培養液は、Minimum Essential Medium (Earle's)の500mLに、Fetal Bovine Serum  50mL、MEM非必須アミノ酸溶液(10mM)  5mL、MEMピルビン酸ナトリウム溶液(100mM)  5mL及びペニシリン(10,000U/mL)-ストレプトマイシン(10,000μg/mL)  5mLを添加して調製した。尚、Minimum Essential Medium (Earle's)及び下記添加物はいずれもLIFE TECHNOLOGIES社製のものを使用した。
このようにして、本試験に用いる培養細胞を調製した。
【００２８】
次に、臭化エチジウムを２μｇ/ｍＬ含有する培養液又は臭化エチジウムを含有しない培養液に、ミトコンドリア毒性を有することが知られるジドブジン(Zidovudine)を0μＭ〜1000μＭ又はザルシタビン(Zalcitabine)を0μＭ〜300μＭの濃度で添加した。
このようにして調製された培養液を、上記のようにして調製された培養細胞に添加した後、さらに37℃、5%CO2存在下で７日間培養を続けることにより、培養細胞に前記被験物質を接触させた。
培養終了後、当該培養細胞の細胞生存率を、市販の生細胞数測定用キット（Cell Counting Kit、同仁化学）を用いて、当該キットに添付される説明書に従い、測定した。その結果を図１及び図２に示した。
【００２９】
図１及び図２から明らかなように、臭化エチジウムと接触させていない培養細胞を用いる比較試験系と比べ、臭化エチジウムと接触させた培養細胞を用いる本発明試験系では、ミトコンドリア毒性を有するジドブジン又はザルシタビンを添加することにより、前記被験物質の濃度に依存して培養細胞の細胞生存率が低下することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明方法により、物質が有するミトコンドリア毒性をより迅速かつ簡便に検定することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、臭化エチジウムと接触させた培養細胞を用いる本発明試験系及び臭化エチジウムと接触させていない培養細胞を用いる比較試験系において、ミトコンドリア毒性を有するジドブジンを被験物質として用いる実験での、培養細胞の細胞生存率を示す図である。図中の黒丸は臭化エチジウムと接触させていない培養細胞を用いる比較試験系を表し、図中のバツ（エックス）では、臭化エチジウムを２μｇ/ｍＬ含有する培養液を用いて臭化エチジウムと接触させた培養細胞を用いる本発明試験系を表している。尚、各試験系における反復数は４であった。図中の数値は反復における平均値である。
【図２】図２は、臭化エチジウムと接触させた培養細胞を用いる本発明試験系及び臭化エチジウムと接触させていない培養細胞を用いる比較試験系において、ミトコンドリア毒性を有するザルシタビンを被験物質として用いる実験での、培養細胞の細胞生存率を示す図である。図中の黒丸は臭化エチジウムと接触させていない培養細胞を用いる比較試験系を表し、図中のバツ（エックス）では、臭化エチジウムを２μｇ/ｍＬ含有する培養液を用いて臭化エチジウムと接触させた培養細胞を用いる試験系を表している。尚、各試験系における反復数は４であった。図中の数値は反復における平均値である。
【図１】
2005160392.tif 000002
【図２】
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