(57)【要約】  【課題】  従来の薬剤と交叉耐性を示さず、医薬品または飼料添加物として水産養殖に適用可能な薬剤を提供すること。  【解決手段】  オオイタドリの抽出物および単離した「バニコサイド(Vanicoside)Ａおよびその塩」が、強力な魚病原因菌に対する抗菌力を有すること、さらに既存薬剤に対し耐性を示すパスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)に対して抗菌活性を有することを見出し、本発明を完成した。本発明はバニコサイドＡ又はその塩を主成分とする抗菌組成物、魚病類結節症の予防剤及び/又は治療剤、及びバニコサイドＡ又はその塩を含む飼料添加物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を主成分とする抗菌組成物。
【請求項２】
病原菌が、魚病原因菌である請求項１に記載の抗菌組成物。
【請求項３】
魚病原因菌が、パスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)である請求項１又は２の抗菌組成物。
【請求項４】
バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を主成分とする、魚病類結節症の予防剤及び/又は治療剤。
【請求項５】
魚病類結節症の魚類を、バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩の濃度が10μg/ml以上の濃度の条件で飼育される、請求項４の予防剤及び/又は治療剤。
【請求項６】
魚類の養殖場に投与される請求項５の予防剤及び/又は治療剤。
【請求項７】
飼料に配合した剤型で投与される請求項６の予防剤及び/又は治療剤。
【請求項８】
魚類が養殖スズキ目である請求項４〜７に記載の予防剤及び/又は治療剤。
【請求項９】
請求項４〜８の何れか一に記載の予防剤及び/又は治療剤による、魚病類結節症の予防方法及び/又は治療方法。
【請求項１０】
バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を含む飼料添加物。
【請求項１１】
バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩が配合された飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を主成分とする抗菌組成物、魚病類結節症の予防剤及び/又は治療剤、及びバニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を含む飼料添加物に関する。
【背景技術】
【０００２】
バニコサイド(Vanicoside)は、公知の化合物であり、フェニルプロパノイド系配糖体物質であり、現在までＡ〜Ｆの６種類の存在が報告されている。バニコサイド(Vanicoside)は、生薬として、「カラツリョウ」等から単離されているが、同じ生薬である「オオイタドリ（Polygonum  sachalinense）」から単離された報告は未だない。その既知の生理作用は、抗癌作用〔バニコサイド(Vanicoside)Ｂ〕、プロテインキナーゼＣの活性阻害〔バニコサイド(Vanicoside)Ｂ〕等が知られている（非特許文献１、２、３）。しかし、これら化合物が、抗菌活性を有すること、魚病類結節症への予防及び/又は治療効果、及び飼料添加物としての有用性は知られていなかった。
【０００３】
現在、水産養殖において問題となっているスズキ目魚類の２大疾病である類結節症の治療薬には、従来からペニシリン系、クロラムフェニコール系の抗生物質又は合成抗菌剤が用いられている。しかし、水産養殖現場での抗生物質および合成抗菌剤の大量または長期使用は、これら薬剤に対する魚病菌の耐性を付与する問題を生じさせている。特に、魚類病原菌は畜産病原菌と比較しても耐性獲得が早く、実際の養殖現場ではこれらの薬剤をローテーションで使用しているのが現状となっている。
【非特許文献１】Zimmermann, M. L. and Sneden, A. T. 1994. Vanicosides A and B, protein kinase C inhibitors from Polygonum pensylvanicum. J. Nat. Prod.  57. 236-242.
【非特許文献２】Brown, L. L., Larson, S. R. and Sneden, A. T. 1998. Vanicosides C-F, new phenylpropanoid glycosides from Polygonum pensylvanicum.  J. Nat. Prod. 61. 762-766.
【非特許文献３】Sneden, A. T. 2000. Protein kinase C inhibitory phenylpropanoid glycosides from Polygonum species.  Biologically Active Natural Products. 163-171.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の解決しようとする課題は、従来の薬剤と交叉耐性を示さず、上記の問題点を改善し得る医薬品または飼料添加物として水産養殖に適用可能な薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を達成するため鋭意研究を推進し、オオイタドリの抽出物および単離した「バニコサイドＡおよびその塩」が、強力な魚病原因菌に対する抗菌力を有すること、さらに既存薬剤に対し耐性を示すパスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)に対して抗菌活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
つまり、本発明は以下よりなる；
１．バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を主成分とする抗菌組成物。
２．病原菌が、魚病原因菌である前項１に記載の抗菌組成物。
３．魚病原因菌が、パスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)である前項１又は２の抗菌組成物。
４．バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を主成分とする、魚病類結節症の予防剤及び/又は治療剤。
５．魚病類結節症の魚類を、バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩の濃度が10μg/ml以上の濃度の条件で飼育される、前項４の予防剤及び/又は治療剤。
６．魚類の養殖場に投与される前項５の予防剤及び/又は治療剤。
７．飼料に配合した剤型で投与される前項６の予防剤及び/又は治療剤。
８．魚類が養殖スズキ目である前項４〜７に記載の予防剤及び/又は治療剤
９．前項４〜８の何れか一に記載の予防剤及び/又は治療剤による、魚病類結節症の予防方法及び/又は治療方法。
１０．バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を含む飼料添加物。
１１．バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩が配合された飼料。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の組成物は、強力な魚病原因菌に対する抗菌力を有すること、さらに既存薬剤に対し耐性を示すパスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)に対しても抗菌活性を有することにより、新規な抗菌剤、飼料添加物、及び、魚病類結節症の予防剤及び/又は治療剤の提供に成功した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の抗菌剤、飼料添加物、及び、魚病類結節症の予防剤及び/又は治療剤の主成分は、公知のバニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩である。その構造式は以下の化学式１に示す。
化学式１：
【化１】
2005289858.tif 000002
バニコサイド(Vanicoside)は、オオイタドリから実施例に示すように調製される。抽出成分中では、バニコサイド(Vanicoside)Ａ及びＢの混合物がとれるが、これを分離してバニコサイド(Vanicoside)Ａのみが抗菌活性を有することを確認した。なお、バニコサイド(Vanicoside)Ｂは、バニコサイド(Vanicoside)Ａのアセチル基をなくした化合物であり、その構造式を以下の化学式２に示す。
化学式２：
【化２】
2005289858.tif 000003
【０００８】
本発明のバニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩は、実施例に示すようにブリ由来魚病菌パスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)に対して、ＭＩＣ値25μg/mlの抗菌活性を示した。また、その他の魚由来菌としてAeromonas salmonicida、Aeromonas hydrophila、Enterococcus seriolicida、Edwarsiella tarda、及び畜産由来病原菌Mannheimia haemolytica、Staphylococcus aureus等に抗菌活性を認めた。よって、本発明のバニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を主成分とする組成物は、広く抗菌力が期待できる抗菌組成物である。その抗菌組成物としての抗菌力は、5μg/ml以上、より好ましくは10μg/ml以上、さらに好ましくは20μg/ml以上の濃度で用いられる。上限は、経済性、副作用及び抗菌力との相関から適宜設定可能である。製剤化の場合は、この数値を基礎として、飼料中に0.001〜10％W/Wの割合で含有させ、製剤化を達成する。配合する場合は、ペレット状の配合飼料に吸収させて用いる方法が簡単である。
【０００９】
本発明の抗菌組成物、予防剤及び/又は治療剤の投与対象は、魚類、特にスズキ目魚類、例えばブリ、マダイ、カンパチ等が挙げられ、特にブリに有効であるがこれに限定されるものではない。各種魚類用或いは動物用飼料中にバニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を、適量（例えば0.001〜10％W/W）含有させておけば、広く魚類或いは動物用飼料添加物として適用可能である。バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩が配合された飼料は、広く魚類或いは動物用飼料として適用可能である。
【００１０】
本発明の抗菌剤、予防剤及び/又は治療剤の投与量及び投与方法は、その摂取手段によって異なるが、例えば疾患を持った魚類であれば、魚類を水槽中に移し、水槽中のバニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩の濃度を有効濃度にすることによって治療することができる。その濃度としては、最小発育阻止濃度（MIC値）を元にして設定され、例えば5μg/ml以上、より好ましくは10μg/ml以上、さらに好ましくは20μg/ml以上の濃度で用いられる。これ以上多くても特に障害はないが、対費用効果を考えれば、この範囲で必要十分である。投与期間は、その疾患の治癒程度によって異なるが、一般的には約3〜14日間程度摂取される。早期に治癒されれば、数日というような短期間摂取でも十分である。
バニコサイド(Vanicoside)Ａ又はその塩を飼料添加物として使い、飼料とともに摂取させる場合は、より効率的に効果が期待できる。つまり、飼料中に固形として、0.001〜10％W/W含有させ、食餌に併せて摂取させる。投与は毎日連続でも、隔日でも、不連続でもよい。具体的には、例えば約3〜14日間程度摂取される。早期に治癒されれば、数日というような短期間摂取でも十分である。なお、予防剤として投与する場合は、投与量及び投与頻度は、適宜減少させることが当然に可能である。例えば、上記一般的な投与量の半分量を数日毎に数ヶ月投与することが可能である。本発明の飼料は、毎日給餌しても良いが、少なくとも１週間に１〜３回給餌することにより効果を発揮する。
【００１１】
本発明の抗菌剤、予防剤及び/又は治療剤の投与方法は、経口、薬浴或いは注射のいずれでも良い。
【００１２】
本発明の抗菌剤、予防剤及び/又は治療剤は、他剤との併用も可能である。広く既知の抗菌剤或いは抗生物質との併用が可能である。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、これらは本発明の抗菌剤、飼料添加物、飼料、予防剤及び/又は治療剤としての好適な一例を示すものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００１４】
実施例１
バニコサイド(Vanicoside)Ａは、「オオイタドリ」から次のようにして得られる。蓼科の植物「オオイタドリ」の根茎（水洗後、乾燥細切したもの）を約20倍量のメタノールに浸漬（一ヶ月）し、浸出液を濾過（東洋ろ紙No.5A）し、その濾液をエバポレートし凍結乾燥、メタノール抽出物を得た。得られたメタノール抽出物10gを1000mlの蒸留水（D.W.）に懸濁（分液漏斗使用）し、同量のヘキサンを加えよく攪拌、一晩放置した。ヘキサン層のみを濾過（Whatman  １PS）後、エバポレートしヘキサン画分を得る。残った水層にクロロホルムを加え同様に操作し、クロロホルム画分を得た。残った水層に酢酸エチルを加え同様に操作し、酢酸エチル画分を得た。
残った水層に１-ブタノール加え同様に操作し、ブタノール画分を得た。残った水層はエバポレート後凍結乾燥し、水画分を得た。
上記の抽出された酢酸エチル抽出画分400mgを少量の開始溶媒に懸濁し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりゲル上部にアプライし、以下の混合比（v/v）で溶媒を作成し溶出した。カラムは2.1×23cmを使用し、ゲルはWako gel Ｃ-100を用いた。溶出溶媒液量は160mlとした。
【００１５】
Fraction 1  (hexane-ethyl acetate=20:80)
Fraction 2  (hexane-ethyl acetate=15:85)
Fraction 3  (hexane-ethyl acetate=10:90)
Fraction 4  (ethyl acetate-ethanol=85:15)
Fraction 5  (ethyl acetate-ethanol=80:20)
Fraction 6  (methanol-acetic acid=70:30)
【００１６】
この時得られたFraction 2（hexane-ethyl acetate=15:85）の画分はエバポレート後メタノールに溶解し、RP−HPLCカラムクロマトグラフィーにより活性物質を分画した。カラムは逆相C18（LiChrosorb  RP−18（7μｍ）;i.d. 25×250mm,Merck）を使用し、検出波長280nmにおける吸収をモニターし、バニコサイドＡ及びバニコサイドＢを単離した。（図１）。この時の条件は、溶媒メタノール−水＝0.6:0.4イソクラチック分離、流速9.0ml/minとした。各試験物質は以下のように特定した。
【００１７】
物質番号１：実施例より得られる酢酸エチル抽出画分
物質番号２：実施例より得られるバニコサイドＡ
物質番号３：実施例より得られるバニコサイドＢ
【００１８】
実施例２
日本化学療法学会標準法（Chemotherapy,29,76-79，1981，「最小発育阻止濃度（MIC値）測定法再改定について」）に準拠し、寒天平板希釈法によりMIC値を求めた。適量の検体をメタノールで溶解した後、適量の滅菌蒸留水で希釈して1000μg/ｍLの検体原液を調製した。次に予め2%Nacl添加ミュラーヒントンブロス（Mueller Hinton Broth：DIFCO社製）に25℃で24時間前培養した供試菌液を調製して最終接種菌量が106  CFU/mLとなるように調製したものを、検体を含んだ2%NaCl添加ミュラーヒントンアガー（Mueller Hinton Agar：DIFCO社製）に接種し、25℃で48時間培養したものを判定した。検体濃度は100μg/mLから0.05μg/mLまで12段階の等倍希釈したものを使用した。
【００１９】
試験結果
上記試験法に従い、物質番号１及びコントロールとして既知化合物（物質番号４〜６）について抗菌検査を実施した結果、物質番号１の組成物は、下記の通り魚病菌に対して抗菌活性を示した。最小発育阻止濃度（MIC値）は、＞100、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.05≧（μg/mL）で示した。
【表１】
2005289858.tif 000004
物質番号４：アンピシリン（SIGMA社製）
物質番号５：フロルフェニコール（第一製薬抽出）
物質番号６：チアンフェニコール（SIGMA社製）
【００２０】
表１の結果から明らかな通り、物質番号１の組成物は供した全パスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)に対して抗菌活性を示した。さらに、既存薬剤である物質４、５、６の耐性株に対しても、物質番号１の組成物は抗菌活性を示した。
【００２１】
実施例３
日本化学療法学会標準法（Chemotherapy，２９，７６−７９，１９８１，「最小発育阻止濃度（MIC値）測定法再改定について」）の微量液体希釈法及び微生物学実習提要・東京大学医科学研究所学友会編（9.抗菌作用の測定法、9・2.薬剤感受性試験法、9・2・3b.ブイヨン培地希釈法）に準拠し、比濁法により物質番号２および３のパスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)に対する抗菌活性すなわち濁度変化を測定した。
図２の通り、パスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)（DPp-1）に対して物質番号２（バニコサイドＡ）は抗菌活性を示したが、物質番号３（バニコサイドＢ）はコントロールと同等で抗菌活性を示さなかった。
【００２２】
実施例４
製剤例として以下に代表例を示す。
（１）  魚粉                          62.0重量％
（２）  小麦粉                        20.0重量％
（３）  大豆粕                          8.0重量％
（４）  ミネラル混合物                  1.5重量％
（５）  その他天然物                    2.0重量％
（６）  バニコサイドＡ                  1.0重量％
（７）  魚油                            6.0重量％
（１）、（２）、（３）、（４）、（５）を混合器で均一に混合した後、ペレッター（孔径5mmのダイ）でペレット状に成形し、長さを5〜15mm程度に切断した。このペレットに、（６）の液状物を外添し混合し、さらに、（７）を添加混合することにより、養殖魚類用、ペレット状飼料を得た。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】RP−HPLCカラムクロマトグラフィーにより活性物質を分画した図である。Compound(1)は物質番号３、Vanicoside  BはバニコサイドＢ、及びVanicoside  AはバニコサイドＡを意味する。
【図２】パスツレラ・ピシシダ（Photobacterium damselae subsp. Piscicida)に対する抗菌活性すなわち濁度変化を示す。Compound(1)は物質番号３、Vanicoside  BはバニコサイドＢ、及びVanicoside  AはバニコサイドＡを意味する。
【図１】
2005289858.tif 000005
【図２】
2005289858.tif 000006