(57)【要約】      （修正有）【課題】オオムギににおけるアルミニウム耐性機構の解明するとともに、その知見を利用することによって、アルミニウム耐性の程度まで詳細に判定することが可能なアルミニウム耐性オオムギの判別方法およびその利用方法を提供する。【解決手段】特定の２種類の一組のプライマー、および／または他の特定の２種類の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターンと、アルミニウムを曝露させたオオムギからの有機酸（クエン酸）分泌量を指標にすることによって、アルミニウム耐性オオムギを詳細かつ高確率に判別することが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターン、
および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターンと、
アルミニウムを曝露させたオオムギからの有機酸分泌量とを指標にすることを特徴とするアルミニウム耐性オオムギの判別方法。
【請求項２】
配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターン、
および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターンと、
アルミニウムを曝露させたオオムギからの有機酸分泌量とを指標にすることを特徴とするオオムギのアルミニウム耐性の程度を判定する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の有機酸がクエン酸であることを特徴とするアルミニウム耐性オオムギの判別方法。
【請求項４】
請求項２に記載の有機酸がクエン酸であることを特徴とするオオムギのアルミニウム耐性の程度を判定する方法。
【請求項５】
請求項１または３に記載のアルミニウム耐性オオムギの判別方法を行なうためのキットであって、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマー、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーが含まれていることを特徴とするアルミニウム耐性オオムギの判別キット。
【請求項６】
請求項２または４に記載のオオムギのアルミニウム耐性の程度を判定する方法を行なうためのキットであって、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマー、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーが含まれていることを特徴とするオオムギのアルミニウム耐性の程度判定キット。
【請求項７】
オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在し、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いて増幅される、アルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子に連鎖したＤＮＡマーカー。
【請求項８】
オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在し、配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーを用いて増幅される、アルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子に連鎖したＤＮＡマーカー。
【請求項９】
請求項７および／または請求項８に記載のＤＮＡマーカーを用いてアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴とする、アルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離方法。
【請求項１０】
アルミニウムを曝露したときのクエン酸分泌量が相対的に高いオオムギから、請求項９に記載のアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離方法を用いてアルミニウム耐性の程度がより高いアルミニウム耐性因子を含むＤＮＡの単離方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の単離方法により得られたアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を、植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴とするアルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換植物の生産方法。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の単離方法により得られたアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を、オオムギのゲノムＤＮＡに導入することを特徴とするアルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換オオムギの生産方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の形質転換植物の生産方法によって生産されるアルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換植物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の形質転換オオムギの生産方法によって生産されるアルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換オオムギ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルミニウム耐性の程度を詳細に判定することが可能なアルミニウム耐性オオムギの判別方法、アルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子に連鎖したＤＮＡマーカーおよび該ＤＮＡマーカーの利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
世界の耕作地の約３割を占めているとされている酸性土壌においては、しばしば植物の生育阻害が見られ、作物生産に重大な影響を及ぼしていることが知られている。酸性土壌における作物の生育阻害の主な要因は、アルミニウムイオンによる根の伸長阻害である。アルミニウムイオンが、細胞壁、細胞膜、および生体物質と結合することによって、根の伸長が阻害される。特に重要な作物である禾穀類の中においては、オオムギがアルミニウムイオンによる根の伸長阻害が起こりやすく、酸性土壌において栽培が困難であるということが知られている。
【０００３】
このような酸性土壌で作物を栽培するには、石灰等による酸性土壌の矯正が必要となる。土壌への石灰散布は、アルミニウムによる植物の生育阻害の改善に効果的であるものの、コスト上の問題や、下層土では効果がないこと、多量の石灰散布が土壌構造に有害な影響をもたらすなど、新たな問題が生じてしまう（例えば非特許文献１参照）。したがって、酸性土壌耐性（アルミニウム耐性）品種を選抜または育種し、栽培することが得策であると考えられる。
【０００４】
ところで、植物には酸性土壌に高い耐性を示す品種が存在する。このような高い耐性を示す品種では、クエン酸やリンゴ酸などの有機酸の分泌が観察される（例えば非特許文献２，３又は４参照）。また、実際にリンゴ酸の分泌量が高い品種では、アルミニウム耐性が強くなっている（例えば非特許文献５）。
【０００５】
このような現象から、植物の有機酸分泌と、酸性土壌耐性（アルミニウム耐性）との間には何らかの関係があると考えられている。例えば、植物から分泌された有機酸が土壌中のアルミニウムと結合して、無毒な形態に変化させた結果、アルミニウム耐性を示すと考えられている。
【０００６】
また、有機酸とアルミニウムとがキレートを形成することによって、アルミニウムイオンが植物体内に吸収されることを防止する結果、アルミニウム耐性を示すとも考えられている。
【０００７】
発明者等は、これまでにオオムギのアルミニウム耐性機構について研究を重ねてきた。その結果、オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在するアルミニウム耐性因子（アルミニウム耐性を付与する因子）に強連鎖するＤＮＡマーカーを発見し、このＤＮＡマーカーの有無を指標にしてオオムギのある品種がアルミニウム耐性を有するか否かを判定する方法を開発した（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
またオオムギのアルミニウム耐性とクエン酸分泌量との間に正の相関がある事、およびアルミニウムに曝露されたオオムギが示す独特の有機酸（クエン酸）分泌パターンを明らかにした（例えば、非特許文献６参照）。
【０００９】
【特許文献１】
特開２００２−２９１４７４号公報（公開日：平成１４（２００２）年１０月８日）
【００１０】
【非特許文献１】
Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ  ．Ｂｉｏｓｃｉ  （１９９３）  ４３，４５４−４６４．
【００１１】
【非特許文献２】
Ｍｉｙａｓａｋａ  Ｃ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９１）  ９６，７３７−７４３．
【００１２】
【非特許文献３】
Ｄｅｌｈａｉｚｅ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９３）  １０３，６９５−７０２
【００１３】
【非特許文献４】
Ｋｏｃｈｉａｎ  Ｌ．Ｖ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  （１９９５）  ４６，２３７−２６０．
【００１４】
【非特許文献５】
Ｒｙａｎ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９５）  ２２，５３１−５３６．
【００１５】
【非特許文献６】
Ｚｈｕｑｉｎｇ  Ｚｈａｏ，  Ｊｉａｎ  Ｆｅｎｇ  Ｍａ，  Ｋａｚｕｈｉｒｏ  Ｓａｔｏ  ａｎｄ  Ｋａｚｕｙｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｄａ．  ”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｒｌｅｙ  （Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ）  ”Ｐｌａｎｔａ，  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００４２５−００３−１０４３−２，  ［ｏｎｌｉｎｅ］，  Ｍａｙ  ７，  ２００３，  ［Ｍａｙ  ２１，  ２００３  ：  ｓｅａｒｃｈ  ｄａｔｅ］，  ｉｎｔｅｒｎｅｔ，  ＜ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００４２５−００３−１０４３−２＞
【００１６】
【非特許文献７】
育種学研究第３巻別冊２号（２００１）Ｐ．２４２．
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述の本発明者等が既に開発したアルミニウム耐性オオムギの判定方法（特許文献１参照）は、当該発明にかかるＤＮＡマーカーの有無を電気泳動等で確認するだけでよいため、アルミニウム耐性の有無のみについては、簡便にかつ高確率で判定できるものの、アルミニウム耐性の程度まで詳細に判定することができなかった。その結果、例えば品種改良において多数のアルミニウム耐性オオムギ候補個体から最もアルミニウム耐性の高い個体を選抜する場合には、最終的に栽培試験を行なってアルミニウム耐性が最も高い個体を選抜する必要があり、アルミニウム耐性オオムギの判別方法としては必ずしも十分とはいえなかった。
【００１８】
また植物（オオムギ）におけるアルミニウム耐性と有機酸（クエン酸）分泌量との間に正の相関があり、何らかの関連性は示唆されているものの、詳細な耐性機構の解明にはいまだ至っておらず、両者のファクターを直接的に関連付けて比較する具体的根拠に乏しかった。
【００１９】
そこで本発明の課題は、植物におけるアルミニウム耐性機構、特にオオムギにおけるこれを解明するとともに、その知見を利用することによって、アルミニウム耐性の程度まで詳細に判定することが可能なアルミニウム耐性オオムギの判別方法およびその利用方法を提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アルミニウム耐性遺伝子とクエン酸分泌に関与する遺伝子は、染色体上のほぼ同位置に座乗し、同じＤＮＡマーカーに連鎖していること、つまり、クエン酸の分泌に関与する遺伝子が、アルミニウム耐性と密接に関与しているか、あるいはアルミニウム耐性遺伝子そのものであるという新規知見を得た。さらに、これまで具体的根拠が不明であったアルミニウム耐性の高いオオムギは、有機酸（クエン酸）分泌量が高いという現象論を、遺伝子工学的（分子生物学）に初めて証明することができた。
【００２１】
本発明はこれらの新規知見をもとに完成されたものであり、本発明は、以下の発明を包含する。
【００２２】
（１）配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターン、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターンと、アルミニウムを曝露させたオオムギからの有機酸分泌量とを指標にすることを特徴とするアルミニウム耐性オオムギの判別方法。
【００２３】
（２）配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターン、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行った場合の増幅パターンと、アルミニウムを曝露させたオオムギからの有機酸分泌量とを指標にすることを特徴とするオオムギのアルミニウム耐性の程度を判定する方法。
【００２４】
（３）上記（１）の有機酸がクエン酸であることを特徴とするアルミニウム耐性オオムギの判別方法。
【００２５】
（４）上記（２）の有機酸がクエン酸であることを特徴とするオオムギのアルミニウム耐性の程度を判定する方法。
【００２６】
（５）上記（１）または（３）のアルミニウム耐性オオムギの判別方法を行なうためのキットであって、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマー、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーが含まれていることを特徴とするアルミニウム耐性オオムギの判別キット。
【００２７】
（６）上記（２）または（４）のオオムギのアルミニウム耐性の程度を判定する方法を行なうためのキットであって、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマー、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーが含まれていることを特徴とするオオムギのアルミニウム耐性の程度判定キット。
【００２８】
（７）オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在し、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いて増幅される、アルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子に連鎖したＤＮＡマーカー。
【００２９】
（８）オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在し、配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーを用いて増幅される、アルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子に連鎖したＤＮＡマーカー。
【００３０】
（９）上記（７）および／または（８）のＤＮＡマーカーを用いてアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴とする、アルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離方法。
【００３１】
（１０）アルミニウムを曝露したときのクエン酸分泌量が相対的に高いオオムギから、（９）に記載のアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離方法を用いてアルミニウム耐性の程度がより高いアルミニウム耐性因子を含むＤＮＡの単離方法。
【００３２】
（１１）上記（９）または（１０）の単離方法により得られたアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を、植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴とするアルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換植物の生産方法。
【００３３】
（１２）上記（９）または（１０）の単離方法により得られたアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を、オオムギのゲノムＤＮＡに導入することを特徴とするアルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換オオムギの生産方法。
【００３４】
（１３）上記（１１）の形質転換植物の生産方法によって生産されるアルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換植物。
【００３５】
（１４）上記（１２）の形質転換オオムギの生産方法によって生産されるアルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換オオムギ。
【００３６】
上記本発明にかかるアルミニウム耐性オオムギの判別方法およびキットによれば、アルミニウム耐性オオムギを高確率に判別することが可能となる。また上記本発明にかかるアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離方法、並びに形質転換植物の生産方法によってアルミニウム耐性がより増強されてなる植物を生産することが可能となる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
本発明は、前述のごとくクエン酸の分泌に関与する遺伝子が、アルミニウム耐性と密接に関与しているか、あるいはアルミニウム耐性遺伝子そのものであるという新規知見に基づいて完成されたものである。
【００３９】
本発明者等は、これまでにオオムギにおけるアルミニウム耐性因子に連鎖するＤＮＡマーカーの検索を行ない、アルミニウム耐性因子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＨＶＭ３、Ｂｍａｇ０３５３、Ｂｍａｃ０３１０）を発見し、そのマッピングを行なった（例えば、特許文献１および非特許文献７参照）。特にＢｍａｇ０３５３は、アルミニウム耐性因子から約１．６ｃＭの距離に座乗しており、該因子に強連鎖するものであった。
【００４０】
アルミニウム耐性とクエン酸分泌量との間に正の相関があることより、これらの関係を明らかにすべく、クエン酸分泌に関与する遺伝子座について、かかるＤＮＡマーカーとの連鎖を利用して量的形質遺伝子座解析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｕｓ  （ＱＴＬ）解析）を行なった（後述する実施例１参照）。その結果、クエン酸分泌に関与する遺伝子は、かかるＤＮＡマーカーに連鎖しており、同一の染色体領域に座乗していた。つまりかかる結果は、クエン酸の分泌に関与する遺伝子が、アルミニウム耐性と密接に関与しているか、あるいはアルミニウム耐性遺伝子そのものであるということを示している。
【００４１】
かかる新規知見は、クエン酸分泌がオオムギのアルミニウム耐性機構であることを示すため、クエン酸分泌に関与する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーの有無、およびクエン酸の分泌量の多少を指標にしてオオムギのアルミニウム耐性の有無、およびアルミニウム耐性度の程度を判断していくことの妥当性を担保するものといえる。
【００４２】
▲１▼本発明にかかるアルミニウム耐性オオムギの判別方法
次に、上記新規知見をもとに開発されたについて具体的に説示する。本発明にかかる判別方法は、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行なうことによって、その増幅パターンからオオムギのアルミニウム耐性因子および有機酸（クエン酸）分泌に関与する遺伝子と強連鎖するＤＮＡマーカーを検出する工程（ＤＮＡマーカー検出工程）と、アルミニウムを曝露させたオオムギからの有機酸（クエン酸）分泌量を測定する工程（有機酸測定工程）とからなる。以下に各工程に分けてさらに詳細に説明する。
【００４３】
なお、ここで「アルミニウム耐性」とは、アルミニウム存在下においても成長できる植物の能力のことをいう。また、上記「アルミニウム」は、イオン化されているものでも、塩を形成しているものであってもよい。
【００４４】
また「アルミニウム耐性因子」とは、オオムギのゲノムＤＮＡ中、より具体的には４Ｈ染色体上に座乗する優性遺伝子であって、優性ホモ型およびヘテロ型の遺伝子型で、オオムギにアルミニウム耐性を付与する特性を有する遺伝子のことをいう。
【００４５】
＜ＤＮＡマーカー検出工程＞
ＤＮＡマーカー検出工程おいて検出する「ＤＮＡマーカー」には、前述のアルミニウム耐性因子に連鎖するＤＮＡマーカーのうち、最も強連鎖するＢｍａｇ０３５３が好適である。かかるＤＮＡマーカーは、オオムギゲノムＤＮＡ上でのマッピングの結果、４Ｈ染色体上でアルミニウム耐性因子から約１．６ｃＭに座乗していることが既にわかっている（特許文献１参照）。１．６ｃＭは、アルミニウム耐性因子とマーカーとの間で染色分体あたり平均して１０００分の１６回組み換えが起こることを示している。よって、かかるＤＮＡマーカーのみの有無を判断すれば、高確率（（１−１６÷１０００）×１００＝９８．４％）にアルミニウム耐性の有無を判断することができる。
【００４６】
かかるＤＮＡマーカーは、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型として、
ＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＡＣＴＡＴＧＣＡＣＧＡ（配列番号１）、および
ＡＣＧＴＴＣＡＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧ（配列番号２）に記載のプライマーを用いて増幅することができる。アルミニウム耐性因子を有する「むらさきもち」の場合、この中の約１１０ｂｐのＤＮＡ断片が、本工程において検出しようとするのＤＮＡマーカーに相当する（後述する実施例２参照）。ただし、増幅の条件にもよるが、配列番号１および配列番号２に記載の配列を有するプライマーは比較的短いオリゴヌクレオチドであるため、長さが異なる複数種のＤＮＡ断片が増幅されてくる可能性がある。この場合であっても前述と同様のＤＮＡバンドの有無を確認すればよい。
【００４７】
「むらさきもち」との交雑に由来するオオムギ個体は、１）上記アルミニウム耐性因子をホモ型で有するか（以下、単にホモ型と称する）、２）ヘテロ型で有するか（以下、単にヘテロ型と称する）、３）劣性ホモ型となっている（すなわち、該アルミニウム耐性因子のアリールをホモ型で有する）か、のいずれかに大別されると考えられる。そして、本発明にかかるＤＮＡマーカー検出工程においては、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用いて取得される本発明のＤＮＡマーカーが、上記アルミニウム耐性因子に連鎖していることを利用する。つまり、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用い、「むらさきもち」との交雑に由来する集団で、上記ホモ型またはヘテロ型のオオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した場合には本発明のＤＮＡマーカーの増幅が確認され、劣性ホモ型のオオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には本発明のＤＮＡマーカーが増幅されないという増幅パターンの相違に基づいて、アルミニウム耐性因子の有無の判別が可能となる。
【００４８】
また、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用い、オオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅を行なうと、上記ホモ型のオオムギ個体では確認されないものの、上記ヘテロ型の個体や劣性ホモ型の個体では増幅されるアルミニウム感受性の「Ｍｏｒｅｘ」に由来する約１４０ｂｐのＤＮＡ断片の存在も確認された（後述する実施例２参照）。このことから、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用い、オオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅を行なうと、ホモ型、ヘテロ型、劣性ホモ型それぞれに特有な増幅パターンが得られる。
【００４９】
一方、本ＤＮＡマーカー検出工程において検出するＤＮＡマーカーは、Ｂｍａｃ０３１０であってもよい。かかるＤＮＡマーカーは、オオムギゲノムＤＮＡ上でのマッピングの結果、４Ｈ染色体上で前述Ｂｍａｇ０３５３とアルミニウム耐性因子を挟み込むかたちで存在している（非特許文献７参照）。Ｋｏｓａｍｂｉ関数（Ｋｏｓａｍｂｉ，  Ｄ．Ｄ．  （１９４４）  Ｔｈｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｐ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅｓ．  Ａｎｎ．  Ｅｕｇｅｎ．  １２：１７２−１７５．参照）を用いたマーカー間距離の推定によると、Ｂｍａｃ０３１０とＢｍａｇ０３５３間の距離は、約６．５ｃＭと推定される。Ｂｍａｇ０３５３とアルミニウム耐性因子間は、前述のごとく約１．６ｃＭということがわかっていることより、Ｂｍａｃ０３１０とアルミニウム耐性因子間は約５ｃＭであるといえる。５ｃＭは、アルミニウム耐性因子とマーカーとの間で染色分体あたり平均して１０００分の５０回組み換えが起こることを示している。よって、かかるＤＮＡマーカーの有無を判断することによっても、高確率（（１−５０÷１０００）×１００＝９５％）にアルミニウム耐性の有無を判断することができる。
【００５０】
さらに、Ｂｍａｇ０３５３の検出によるアルミニウム耐性の有無の判断結果と、Ｂｍａｃ０３１０の検出によるアルミニウム耐性の有無の判断結果とを併せることによって、さらに高確率（９９．９９２％）にアルミニウム耐性の有無を判断できるため好ましい。
【００５１】
なお、Ｂｍａｃ０３１０は、オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型として、
ＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＣ（配列番号３）、および
ＡＴＣＴＡＧＴＧＴＧＴＧＴＴＧＣＴＴＣＣＴ（配列番号４）に記載のプライマーを用いて増幅することができる。アルミニウム耐性因子を有する「むらさきもち」の場合、この中の約１５０ｂｐのＤＮＡ断片が、本工程において検出しようとするのＤＮＡマーカーに相当する。ただし、増幅の条件にもよるが、配列番号３および配列番号４に記載の配列を有するプライマーは比較的短いオリゴヌクレオチドであるため、長さが異なる複数種のＤＮＡ断片が増幅されてくる可能性がある。この場合であっても前述と同様のＤＮＡバンドの有無を確認すればよい。
【００５２】
また、配列番号３および配列番号４で示す一組のプライマーを用い、オオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅を行った場合においても、Ｂｍａｇ０３５３の場合と同様、上記ホモ型のオオムギ個体では確認されないものの、上記ヘテロ型の個体や劣性ホモ型の個体では増幅されるアルミニウム感受性の「Ｍｏｒｅｘ」に由来する約２００ｂｐのＤＮＡ断片の存在も確認された。このことから、配列番号３および配列番号４で示す一組のプライマーを用い、オオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅を行なうと、前述の配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーによる増幅のときと同様、ホモ型、ヘテロ型、劣性ホモ型それぞれに特有な増幅パターンが得られる。
【００５３】
つまり、本発明にかかるＤＮＡマーカー検出工程においては、該アルミニウム耐性因子をホモ型として有するか、ヘテロ型として有するかの判別まで可能である。耐性因子の優性程度は耐性と感受性の品種の組合せによって異なると考えられ、優性程度が小さい場合には、ホモ型でアルミニウム耐性因子を有する個体の方が、ヘテロ型よりもアルミニウム耐性の程度が高くなる。また、耐性因子とＤＮＡマーカーはゲノム上で離れた位置に存在しており、組み換えが起こった場合にはＤＮＡマーカーで耐性を選抜しても少数ながら耐性とならない個体を生ずる。さらに、本ＤＮＡマーカー検出工程においては、ＤＮＡバンドがホモ型の個体間においてアルミニウム耐性度を比較することができず、染色体４Ｈの該アルミニウム耐性因子以外のクエン酸放出によるアルミニウム耐性因子を含む多数の個体の中から、一番アルミニウム耐性度の高い個体を選抜するような用途には適用できない。よって、この課題を補完すべく後述の有機酸測定工程が必要となる。
【００５４】
ところで、増幅に際して鋳型として用いられるゲノムＤＮＡは、オオムギの植物体より従来公知の方法で抽出可能である。具体的には、植物体からゲノムＤＮＡを抽出するための一般法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｗ．Ｆ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９８０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４３２１−４３２５．  など参照）が好適な例として挙げられる。また、上記のゲノムＤＮＡは、根、茎、葉、生殖器官など、オオムギの植物体を構成するいずれの組織を用いても抽出可能である。また、場合によってはオオムギのカルスから抽出してもよい。なお、上記生殖器官には、花器官（雄性・雌性生殖器官を含む）や種子も含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、オオムギの芽生え期の葉を用いて行われる。この理由としては、組織の摩砕が比較的容易であり、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少なく、また、種子から短期間で育成可能である点が挙げられる。
【００５５】
またオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１および配列番号２に記載のプライマーを用いて増幅する方法は、従来公知のＤＮＡ増幅法を採用することができる。一般には、ＰＣＲ法（ポリメラ−ゼ連鎖反応法）や、その改変法が用いられる。ＰＣＲ法や、その改変法を用いる際の反応条件は特に限定されるものではなく、通常と同様の条件下で増幅することができる。
【００５６】
＜有機酸測定工程＞
今回得られたオオムギのアルミニウム耐性はクエン酸分泌によるという新規知見から、クエン酸分泌量を指標にアルミニウム耐性オオムギの選抜が可能であるといえる。よって本発明にかかる有機酸測定工程を採用することにより、ＤＮＡマーカー検出工程においては、その増幅パターンからホモ型、ヘテロ型、劣性ホモ型しか判断できなかったのに対して、クエン酸分泌の絶対量を比較することが可能となる。よって、クエン酸分泌の絶対量の高いオオムギ個体を選抜すれば、より詳細かつ正確にアルミニウム耐性個体を選抜することが可能となる。具体的には、後述する実施例３に記載した条件でアルミニウムを曝露したオオムギからのクエン酸分泌量が、耐性品種「むらさきもち」と同程度或いはそれ以上であれば、アルミニウム耐性オオムギと判断することが可能である。
【００５７】
また、このときＤＮＡマーカー検出工程を省略し、有機酸分泌測定工程のみによってアルミニウム耐性オオムギを選抜することも可能であるが、オオムギをアルミニウムに曝露し、そのときのクエン酸分泌量を測定するという操作が必要なため、大量のオオムギ個体を処理するという場合にはやや不向きである。
【００５８】
一方、ＤＮＡマーカー検出工程は、オオムギ個体からゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ等の増幅反応後、電気泳動等でその増幅パターンを検出すれば、ある程度のアルミニウム耐性度の判断が可能であるため、雑種集団などの大量のオオムギ個体を処理する場合には、好適である。
【００５９】
したがって、ＤＮＡマーカー検出工程および有機酸測定工程は、相互の欠点を補完する関係にあり、両者の工程を経てアルミニウム耐性オオムギを判別することの意義は大きい。
【００６０】
ここで、測定する有機酸は、特に限定されるものではなく、植物で生合成される有機酸であればよい。例えば、ＴＣＡサイクルにより生合成されるクエン酸、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸などのカルボン酸が挙げられる。これらの有機酸のうち、クエン酸が特に好ましい。前述のごとくオオムギにおけるアルミニウム耐性機構は、クエン酸分泌によるものであるからである。またクエン酸は、アルミニウムとのキレート形成能力が強いため、リンゴ酸よりも効率的にアルミニウムイオンを外部で排除することが可能である点でも好ましい。
【００６１】
なお、有機酸の他にも、アルミニウムと結合し得る化合物であれば、アルミニウム耐性植物の判別の指標となりうる。また、アルミニウムとの結合性が強いほど、アルミニウム耐性も優れていると判定できる。
【００６２】
有機酸測定工程においては、まずオオムギ個体にアルミニウムを曝露する必要があるが、曝露方法は特に限定されるものではない。例えば後述の実施例３のようにして曝露させればよい。また曝露するアルミニウムの濃度は、５μＭ以上２０μＭ以内であることが好ましく、１０μＭ以上１５μＭ以内であることが特に好ましい。
【００６３】
有機酸の測定に用いるサンプルの調製方法は、特に限定されるものではなく、例えば、後述の実施例３に示すごとく行なうことができる。
【００６４】
また有機酸（クエン酸）の測定方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法により測定すればよい。例えば、ＨＰＬＣを用いた測定、酵素法（例えば、Ｄｅｌｈａｉｚｅ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９３）  １０３，６９５−７０２参照）を用いた測定などが適用可能である。
【００６５】
さらに、有機酸の測定を行なう時期についても、特に限定されるものではないが、アルミニウム曝露後６時間にサンプルを採集して測定することが望ましい。上記６時間後にサンプルを採集して測定するのは、十分な有機酸の分泌量を取れて、安定した測定ができるためである。
【００６６】
本発明にかかるアルミニウム耐性オオムギの判別方法は、以上説示したごとく、ＤＮＡマーカー検出工程と、有機酸測定工程とからなるが、両工程を実施する順序は特に限定するものではなく、どちらか一方の工程を先に行ってもよいし、両者を並行して行ってもよい。要するに、ＤＮＡマーカー検出工程において、ホモ型の増幅パターンを示し、かつクエン酸分泌量が最も高いオオムギ個体を選抜すれば、高確率で、アルミニウム耐性オオムギを選抜することができる。
【００６７】
また選抜してきたオオムギ個体が、アルミニウム耐性であるか否か（すなわちアルミニウム耐性であるかアルミニウム感受性であるか）は、アルミニウムイオン存在下での栽培試験を通して実際に評価することができる。そして、本発明にかかる判別方法による結果と、アルミニウムイオン存在下での栽培試験の結果と対応することを確認することによって、本発明の有効性を確かめることができる。
【００６８】
上記の栽培試験は、例えば次のような方法で行なうことができる。
【００６９】
判定対象となるオオムギ個体の種子を所定の条件で発芽させ、発芽後の芽生えを酸性（一般にはｐＨ４〜５）に調整した水耕液に植え付けて水耕栽培を行なう。芽生えを所定期間育成した後に水耕液を交換し、アルミニウム無処理区はこの水耕液のみで育成し、一方、アルミニウム処理区には、該水耕液に所定量のアルミニウムイオンが含有されるようアルミニウム化合物の水溶液を添加して育成を行なう。アルミニウム処理区、アルミニウム無処理区ともにオオムギ個体を同一期間育成した後、得られた個体を地上部と根とに分けて秤量する。
【００７０】
なお、栽培試験において、水耕液のｐＨは試験期間を通じて常時一定の酸性条件に保たれるが、その値はオオムギ個体の種類や他の試験条件などにより適宜選択すればよい。また、試験期間（オオムギ個体の育成期間）や、アルミニウムイオン濃度などの各種試験条件についても試験毎に適宜選択すればよい。また、試験期間を通じて試験環境を一定とするために、試験は人工気象環境下で行なうことが望ましい。
【００７１】
アルミニウム耐性の評価値となる耐性スコアは、根重を地上部重で割った値の、アルミニウム無処理区に対するアルミニウム処理区の相対値として求めることができる。そして、耐性スコアがある値よりも大きければ、そのオオムギ個体はアルミニウム耐性と判定され、耐性スコアがその値よりも小さければ、そのオオムギ個体はアルミニウム感受性と判定される。
【００７２】
▲２▼アルミニウム耐性オオムギ判別キットおよびオオムギのアルミニウム耐性の程度判定キット
上記アルミニウム耐性オオムギの判別方法およびオオムギのアルミニウム耐性の程度の判定方法を行うためのキットを提供することができる。当該キットには、ＤＮＡマーカーを増幅するための配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマー、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーが含まれていることが好ましい。ただし、配列番号１および配列番号２の一組のプライマー、および／または配列番号３および配列番号４に記載の一組のプライマーに限定されるものではなく、目的とするＤＮＡマーカー（Ｂｍａｇ０３５３および／またはＢｍａｃ０３１０）を増幅することができるプライマーのセットであれば特に限定されるものではない。
【００７３】
当該キットには、このほか鋳型となるゲノムＤＮＡの調製するために必要な試薬、バッファー類、遠心チューブが含まれていてもよい。また目的のＤＮＡサイズバンドの検出に必要となるＤＮＡマーカー（Ｂｍａｇ０３５３および／またはＢｍａｃ０３１０）または、適当なＤＮＡサイズマーカーが含まれていてもよい。
【００７４】
当該キットにはさらに、有機酸（クエン酸測定）に必要な酵素、試薬類、濃度標準としての有機酸（クエン酸）が含まれていてもよい。
【００７５】
なお本発明にかかるアルミニウム耐性オオムギ判別キットおよびオオムギのアルミニウム耐性の程度判定キットには、該キットの目的を達成するために必要な試薬等が含まれていればよく、上記試薬等に限定されるものではない。
【００７６】
▲３▼アルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離方法
本発明のＤＮＡマーカーを用いてアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離する方法としては、例えば次のような方法を挙げることができる。
【００７７】
オオムギではゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーが１種類作成されており、現在複数のＢＡＣライブラリーが開発中である。そこで、このようなＢＡＣライブラリーを用いて、従来公知のマップベースクローニングの手法にしたがって、耐性遺伝子と連鎖する本発明のＤＮＡマーカーで当該マーカーを含むＢＡＣクローンを同定し、そこからＢＡＣのコンティグを作成して塩基配列を確定することにより、最終的なアルミニウム耐性遺伝子に到達することができる。なお、オオムギのゲノムサイズは５０００Ｍｂであり、マップサイズを１５００ｃＭとすると、１ｃＭは約３．３Ｍｂになるから、１．６ｃＭだと約５Ｍｂの距離になる。
【００７８】
▲４▼アルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換植物および形質転換オオムギ
本発明にかかる形質転換植物、形質転換オオムギの生産には、上記の単離方法により得られたアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を、公知の方法により、アグロバクテリウムまたはパーティクルガンを用いて植物やオオムギのゲノムＤＮＡに導入することによって作出すればよく、これにより、酸性土壌でも生育可能な品種が得られることとなる。例えば、雑誌Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９７）  １１（６），１３６９−１３７６  には、Ｓｏｎｉａ  Ｔｉｎｇａｙ等により、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  を用いてオオムギを形質転換する方法が開示されており、この方法を利用して形質転換オオムギを作出可能である。
【００７９】
またオオムギ以外に形質転換植物の候補としては、特に限定されるものではないが、例えば、食用作物、果実や野菜、花・木その他の有効樹木を含む園芸作物、工芸作物、さらには飼肥料作物等が挙げられる。なお、上述した食用作物園芸作物、工芸作物、飼肥料作物にそれぞれ含まれる具体的な作物については、例えば、農学大辞典改訂第４版（養賢堂・１９９７年４月３０日発行）の目次８〜１６頁にも詳細に記載されている。また、酸性土壌耐性は、ホウレンソウや甜菜等のアカザ科の作物、禾穀類（コムギ、ライムギ、ライコムギ、イネ、アワ、ヒエ、キビ、トウモロコシ等）の作物など広範囲の植物で問題となっており、このような植物について、本発明を適用することは好ましい。
【００８０】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８１】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８２】
〔実施例１：量的形質遺伝子座解析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｕｓ  （ＱＴＬ）解析）〕
オオムギにおけるアルミニウム耐性とクエン酸分泌との関連性を明らかにすべく、本発明者等がこれまでに発見したアルミニウム耐性因子と連鎖するＤＮＡマーカー（ＨＶＭ３、Ｂｍａｇ０３５３、Ｂｍａｃ０３１０）（特許文献１および非特許文献７参照）を用いてクエン酸分泌量についてＱＴＬ解析を行った。以下に当該解析手法を説明する。
【００８３】
＜交配組合せ＞
アルミニウム耐性種の「むらさきもち」およびアルミニウム感受性種の「Ｍｏｒｅｘ」間で交雑を行ない、Ｆ１を得る。次にＦ１を自殖してＦ２世代をつくる。
【００８４】
＜世代の養成＞
以前発明者等が公知（非特許文献７参照）にしたグラフ遺伝子型から推定して、アルミニウム耐性をヘテロで含むとみられるＦ２個体を選抜し、Ｆ３系統を作製した。この系統では４Ｈ染色体のアルミニウム耐性が分離していると考えられるのでＦ２と同様に解析が可能であると同時に、大量の分離集団を得ることができる。
【００８５】
＜栽培＞
水耕栽培によって耐性を評価すると共に、それぞれの個体からＤＮＡを抽出した。
【００８６】
＜量的形質の測定＞
１０μＭのアルミニウムを含む溶液にオオムギ個体を６時間曝露した際のクエン酸分泌量を測定した。
【００８７】
＜解析＞
座乗しているマーカーの遺伝子型と、クエン酸分泌量との間に連鎖関係が存在するかどうかをＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＱＴＬ（Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ，  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  Ｄ  （１９８９）  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｕｓｉｎｇ  ＲＦＬＰ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐｓ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２１：  １８５−１９９）を用いて解析した。具体的には、それぞれのＦ３個体について、ＨＶＭ３、Ｂｍａｇ０３５３、Ｂｍａｃ０３１０のマーカーの遺伝子型を電気泳動によって確認した。続いて３種類のマーカー情報をそれぞれＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＥＸＰ（Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐ，  Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ  Ｊ，  Ｂａｒｌｏｗ  Ａ，  Ｄａｌｙ  ＭＪ  （１９８７）  ＭＡＰＭＡＫＥＲ：  Ａｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １：  １７４−１８１）の入力形式に従って、通常のテキストエディターを用いて「むらさきもち」型を「Ａ」，「Ｍｏｒｅｘ」型を「Ｂ」およびヘテロ型を「Ｈ」として個体番号の順に入力した。さらに，クエン酸分泌量を個体番号の順に入力した。このデータをＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＥＸＰのマニュアルに従って解析して３種類のマーカーの遺伝地図を作製すると共に、ＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＱＴＬの解析に必要なファイルを得た。なお、マーカー間距離の推定にはＫｏｓａｍｂｉ関数を用いた（Ｋｏｓａｍｂｉ，  Ｄ．Ｄ．  （１９４４）  Ｔｈｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｐ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅｓ．  Ａｎｎ．  Ｅｕｇｅｎ．  １２：１７２−１７５．参照）。
【００８８】
次に、ＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＱＴＬのマニュアルに従って、以下のように上述のファイルを解析した。上述の３つのマーカーの近傍に「むらさきもち」に由来するクエン酸分泌に関する遺伝子が存在する場合、「むらさきもち」型の「Ａ」のＤＮＡマーカーを有する個体ではクエン酸分泌量が多くなる。もし、「むらさきもち」型のＤＮＡマーカーを持っているにもかかわらず、クエン酸分泌量が「Ｍｏｒｅｘ」と同程度である場合には、ＤＮＡマーカーとクエン酸分泌量に関する遺伝子（ＱＴＬ）との間に組み換えが起こっていることが示唆される。また、組み換えが起こる確率は、ＤＮＡマーカーとクエン酸分泌量に関する遺伝子（ＱＴＬ）の距離に比例する。この現象を用いて３つのマーカーによる地図上でＱＴＬが存在するか否かを統計的に推定し、ＬＯＤスコアと呼ばれる連鎖の尺度が２から３程度を越えた場合に、その地図の位置はＱＴＬと連鎖関係にあることが推定できる。また、本実施例で用いた一定の距離ごとに順序よく連鎖を推定し（本実施例では０．５ｃＭ単位）最大のＬＯＤスコアを示す位置にＱＴＬが存在すると推定する手法をインターバルマッピングと呼んでいる。
【００８９】
＜結果＞
図１にＤＮＡマーカー（ＨＶＭ３、Ｂｍａｇ０３５３、Ｂｍａｃ０３１０）を用いてクエン酸分泌量についてＱＴＬ解析を行った結果を示した。図１中の横軸は、Ｂｍａｃ０３１０の位置を０とした時の距離を示している。このときの縦軸（ＬＯＤ）のピークが６．５ｃＭ付近にあった。よって染色体でＢｍａｃ０３１０から６．５ｃＭの位置に、クエン酸分泌に関与する遺伝子が存在しているということが判明した。一方、上記ＤＮＡマーカーは、染色体上の短腕から長腕（５’端から３’端）にかけてＢｍａｃ０３１０、Ｂｍａｇ０３５３、ＨＶＭ３の順番で並んでおり、Ｂｍａｃ０３１０から６．６ｃＭの位置にＢｍａｇ０３５３が存在し、Ｂｍａｃ０３１０から１６．５ｃＭの位置にＨＶＭ３が存在している。
【００９０】
よってクエン酸分泌に関与する遺伝子は、Ｂｍａｇ０３５３と強い連鎖のある位置に存在することがわかった。さらにＢｍａｇ０３５３は、以前公知にした結果（特許文献１参照）からアルミニウム耐性因子から約１．６ｃＭの距離にあることがわかっているため、クエン酸分泌に関与する遺伝子とアルミニウム耐性因子にも強い連鎖があるといえる。
【００９１】
この実施例によって、クエン酸の分泌に関与する遺伝子が、アルミニウム耐性と密接に関与しているか、あるいはアルミニウム耐性遺伝子そのものであるという新規知見を得ることができた。さらに、これまで具体的根拠が不明であったアルミニウム耐性の高いオオムギは、有機酸（クエン酸）分泌量が高いという現象論を、遺伝子工学的（分子生物学）に初めて証明することができた。
【００９２】
かかる新規知見は、クエン酸分泌がオオムギのアルミニウム耐性機構であることを示すため、クエン酸分泌に関与する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーの有無、およびクエン酸の分泌量の多少を指標にしてオオムギのアルミニウム耐性の有無およびアルミニウム耐性度の程度を判断しいくことの妥当性を担保するものといえる。
【００９３】
〔実施例２：本発明にかかるＤＮＡマーカーＢｍａｇ０３５３の検出工程〕
本発明のアルミニウム耐性オオムギの判別方法におけるＤＮＡマーカー（Ｂｍａｇ０３５３）検出工程の一例を示す。
【００９４】
＜ＤＮＡ抽出＞
Ｆ２集団および両親の個体から、公知の方法（Ｐｅｔｅｒ  Ｌａｎｇｒｉｇｅ，  Ａｎｇｅｌｏ  Ｋａｒａｋｏｕｓｉｓ  ａｎｄ  Ｊａｎ  Ｎｉｅｌｄ．  （１９９７）  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｗａｉｔｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｄｅｌａｉｄｅ．参照）によってＤＮＡを抽出し、分光光度計および１％アガロースゲル電気泳動によって濃度を測定し、１００ｎｇ／μｌに調整した。
【００９５】
＜ＰＣＲ＞
ＰＣＲ反応液の組成は０．０５Ｕ／μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  １×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ，  ０．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．６ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，１ｐｍｏｌ／μｌ  Ｐｒｉｍｅｒ（ｆｏｒｗａｒｄ，  ｒｅｖｅｒｓｅ共）を全量１０．０μｌとした。
【００９６】
ＰＣＲ条件は、図２に示す。
【００９７】
図３には、アルミニウム耐性因子から約１．６ｃＭの距離に位置し、該因子と強連鎖するＤＮＡマーカーＢｍａｇ０３５３を検出するために、配列番号１および配列番号２に記載のプライマーを用いて、「むらさきもち」と「Ｍｏｒｅｘ」の交雑に由来するアルミニウム耐性オオムギおよびアルミニウム感受性オオムギから調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅を行った際の電気泳動像を示した。図中のＢＴは、アルミニウム耐性オオムギのバルクＤＮＡの結果を、ＢＳはアルミニウム感受性オオムギのバルクＤＮＡの結果を示している。また、１〜７は、アルミニウム耐性オオムギのＦ２個体、８〜１４はアルミニウム感受性のＦ２個体の結果を示す。図中の矢印は、多型のみられた１１０ｂｐ、１４０ｂｐのバンドを示す。
【００９８】
同図に示されるように、上記マーカーＢｍａｇ０３５３の場合、特徴的な２つのバンドが認められ、このうち、より短いバンド（約１１０ｂｐ）は、アルミニウム耐性のＢＴおよび１〜７で認められ、アルミニウム感受性のＢＳおよび８〜１４では認められなかった。したがって、この約１１０ｂｐのバンドの有無を確認することにより、アルミニウム耐性種か否かを高い確率で予測でき、耐性種の選抜も容易になる。
【００９９】
また、特徴的な２つのバンドのうち、より長いバンド（約１４０ｂｐ）は、アルミニウム感受性のＢＳおよび８〜１４のみならず、アルミニウム耐性の３〜５、７でも認められた。このことから、アルミニウム耐性の１〜７のうち、１、２、６はアルミニウム耐性因子についてホモ型であり、３〜５、７はヘテロ型であると推測される。
【０１００】
よって、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用い、オオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅を行なうと、ホモ型、ヘテロ型、劣性ホモ型それぞれに特有な増幅パターンが得られる。つまり、本発明にかかるＤＮＡマーカー検出工程においては、該アルミニウム耐性因子をホモ型として有するか、ヘテロ型として有するかの判別まで可能である。
【０１０１】
〔実施例３：本発明にかかる有機酸測定工程〕
以下に、本発明のアルミニウム耐性オオムギの判別方法における有機酸測定工程の一例を示す。
【０１０２】
＜アルミニウム曝露条件＞
測定対象のオオムギ個体の苗（４日齢）を、エアレーションをした１．０ｍＭＣａＣｌ２（ｐＨ５．０）入り１．２Ｌプラスチック容器に移植し、一昼夜経過後、１０μＭ  ＡｌＣｌ３を含む１．０ｍＭＣａＣｌ２（ｐＨ５．０）溶液中に６時間暴露した。
【０１０３】
＜クエン酸測定サンプルの調製＞
根の分泌液を収集した後、５ｇのアンバーライトＩＲ−１２０樹脂（Ｈ＋型）（オルガノ社製）を充填した陽イオン交換樹脂カラム（１６×１４ｍｍ）に通し、続いて、ＡＧ  １×  ８  樹脂  （１００−２００  ｍｅｓｈ；  ギ酸塩型）  （バイオラット社製）を充填した陰イオン交換樹脂カラム（１６×１４ｍｍ）に供した。続いて、陰イオン交換樹脂上に保持された有機酸を、２Ｎ塩酸を用いて溶出し、その溶出液をロータリーエバポレーター（４０℃）を用いて蒸発乾固した。残渣を１ｍｌ超純水に溶かし、有機酸分析を行った。
【０１０４】
＜クエン酸の測定＞
クエン酸は、Ｄｅｌｈａｉｚｅ等の方法にしたがって測定した（Ｄｅｌｈａｉｚｅ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｏｌ（１９９３），１０３，６９５−７０２）。簡単に説明すると、希釈サンプル（＜５０ｎｍоｌ）１ｍｌに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１２０μｌおよび１０ｍＭ  ＮＡＤＨ  １５μｌを添加した。２５℃、４０分、インキュベート後、酵素混合物（１．２５Ｕの乳酸デヒドロゲナーゼおよび０．５Ｕのリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有）２μｌを加え、反応混合物をさらに４０分、インキュベートした。この時点で、３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、続いて、シトレートリアーゼ（０．５Ｕ）１０μｌを加えて、１０分後に２回目の吸光度を測定した。標準物質の測定も同様にした。
【０１０５】
上記のようにして、アルミニウムを曝露したオオムギ個体からのクエン酸分泌量を測定し、クエン酸分泌量の高いオオムギ個体を選抜すればアルミニウム耐性の高いオオムギ個体が選抜することが可能である。
【０１０６】
【発明の効果】
以上説示したように、本発明にかかるアルミニウム耐性オオムギの判別方法は、アルミニウム耐性オオムギに強連鎖するＤＮＡマーカーの有無、およびオオムギのアルミニウム耐性を司るクエン酸分泌量を測定するというものである。これによって、アルミニウム耐性オオムギを高確率に判別することが可能となる。また本発明にかかるアルミニウム耐性因子およびクエン酸分泌に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離方法、並びに形質転換植物の生産方法によってアルミニウム耐性がより増強されてなる植物を生産することが可能となる。
【０１０７】
それゆえ、これまで酸性土壌等の原因で栽培が制限されていた、オオムギをはじめとする作物の栽培地域を拡大することができるという効果を奏する。
【０１０８】
【配列表】
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2005058022.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡマーカー（ＨＶＭ３、Ｂｍａｇ０３５３、Ｂｍａｃ０３１０）を用いてオオムギのクエン酸分泌量について量的形質遺伝子座解析（ＱＴＬ解析）を行った結果を示すグラフである。
【図２】実施例２において配列番号１および配列番号２をプライマーとしてＰＣＲ反応を行ったときのプログラムを示す図である。
【図３】アルミニウム耐性因子と強連鎖するＤＮＡマーカーＢｍａｇ０３５３を検出すべく、配列番号１および配列番号２に記載のプライマーを用いて、アルミニウム耐性オオムギおよびアルミニウム感受性オオムギから調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅を行った際のＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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