(57)【要約】      （修正有）【課題】発光性藻類由来の発光基質を高収率で安定に得る。【解決手段】発光性藻類由来の発光基質の破砕液の遠心上清を逆相ＨＰＬＣで精製することを特徴とする発光基質の精製法；及び、発光性藻類由来の発光基質の保存方法であって、発光性藻類の発光基質を酸化防止剤の存在下に保存することを特徴とする保存方法。【効果】発光性藻類由来の発光基質を精製する方法および保存方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光性藻類由来の発光基質の破砕液の遠心上清を逆相ＨＰＬＣで精製することを特徴とする発光基質の精製法。
【請求項２】
発光性藻類が渦鞭毛藻（虫）類である請求項１に記載の精製法。
【請求項３】
発光性藻類の破砕を窒素高圧破壊法またはボイル法により行い破砕液を調製する、請求項１または２に記載の精製法。
【請求項４】
発光性藻類の破砕を窒素高圧破壊法により行い破砕液を調製する、請求項１または２に記載の精製法。
【請求項５】
逆相ＨＰＬＣの移動相として緩衝液−アルコール系を使用することを特徴とする請求項１に記載の精製法。
【請求項６】
逆相ＨＰＬＣの移動相として緩衝液−エタノール系を使用することを特徴とする請求項１に記載の精製法。
【請求項７】
発光性藻類由来の発光基質の保存方法であって、発光性藻類の発光基質を酸化防止剤の存在下に保存することを特徴とする保存方法。
【請求項８】
前記発光基質を水または水−アルコール系溶媒中で保存する請求項７に記載の保存方法。
【請求項９】
前記発光基質を水または水−エタノール系溶媒中で保存する請求項８に記載の保存方法。
【請求項１０】
−８０℃以下で保存する請求項７に記載の保存方法。
【請求項１１】
酸化防止剤がジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール及びアスコルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項７に記載の保存方法。
【請求項１２】
発光性藻類由来の発光基質と酸化防止剤を含むことを特徴とする発光性藻類由来の発光基質の安定化組成物。
【請求項１３】
酸化防止剤がジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール及びアスコルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１２に記載の安定化組成物。
【請求項１４】
溶液の形態である請求項１２に記載の安定化組成物。
【請求項１５】
溶液が水または水−アルコール系溶媒中の溶液である請求項１２に記載の安定化組成物。
【請求項１６】
溶液が水溶液または水−エタノール溶液である請求項１２に記載の安定化組成物。
【請求項１７】
レポーターアッセイに使用する請求項１２〜１６のいずれかに記載の発光基質の安定化組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，哺乳類の遺伝子発現を検出するレポータ遺伝子として有用な発光性渦鞭毛藻（虫）などの藻類由来発光タンパクの基質を藻類（例えば、発光性渦鞭毛藻（虫））より簡便且つ容易に安定な基質を得る方法並びに発光酵素の保存法／保存用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発光性渦鞭毛藻Pyrocystis lunula, Lingrodinium polyhedrumや渦鞭毛虫Noctiluca scintillansは発光酵素、発光基質を持ち生物発光を行う。この際、発光基質は発光酵素を
触媒として酸素と反応、最大発光波長470nmの青色の光を発する。この際、最大発光活性
を示すｐHは５．５であり、また反応には補因子を必要としないが、他の発光系と比べて
、そのバックグラウンドが低く、発光基質は自家発光することはない。これまでに発光酵素はクローン化され、その一次構造が解明され、そのｃDNAは大腸菌内等で発現しレポー
タ遺伝子として活用可能である（非特許文献１等）。一方、発光基質は従来、中村らの精製法（非特許文献２）によりDEAE-セファデックスカラム、アルミナカラム、高速液体イ
オン交換カラムを含む３段階を経て精製されるが、精製が煩雑で長い時間を要していた。また従来の精製法はアセトニトリルといった有毒有機溶媒が使われたので、廃液処理などに労力を要していた。さらに、ルシフェリンの保存は低温かつアルゴンガスによる置換で行われたので、特別な装置を要していた。一方、本発光基質は合成が難しく、人為的な合成は容易ではない。また、生合成過程に関しても、クロロフィルから合成されるとは考えられているが、その代謝経路は不明のままである。
【０００３】
医薬、創薬分野ではタンパク発現阻害剤や分泌阻害剤などの開発及び探索が重要であり、細胞内におけるターゲットタンパクの遺伝子転写活性の変化を指標としてスクリーニングが行われている。阻害剤の効果に伴う遺伝子転写活性の変化を伝えるのがレポータ遺伝子（タンパク）の役目であり、多くの情報を得るためには異なる基質特異性を持つ発光酵素の利用が有用である。この際、発光基質の自家発光が少ないものが望まれているが、レニラやウミボタル発光酵素はバックグランドが高く、青色のレポータタンパクの実用化が望まれている。一方、これまで、発光性渦鞭毛藻由来の発光酵素のレポータ遺伝子化が試みられてきたが、容易に、短時間で、安定性の高い発光基質を精製する方法は確立されていないため、発光酵素のレポータ遺伝子化の実用化は見送られてきた。
【非特許文献１】Morishita H, Ohashi S, Oku T, Nakajima N, Kojima S, Ryufuku M, Nakamura H ＆ Ohmiya Y:Cloning and Characterization of an Active Fragment of Luciferase from a Luminescent Marine Alga, Pyrocystis lunula (2002) Photochem. Photobiol., 75:311-314.
【非特許文献２】Nakamura H., Kishi Y, Shimomura O, Morse D & Hastings JW; J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 7607-7611
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、発光性渦鞭毛藻（虫）の発光基質を簡便に短時間に、且つ安定に、またその精製品が長期安定性を持ち、アッセイ試薬として実用化可能な基質の精製法及びその保存法を目的とする。これにより、細胞内のわずかに発現した発光性渦鞭毛藻発光酵素を安定に発光活性として測定できる試薬を開発できる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は，上記課題を解決するため、発光性渦鞭毛藻発光基質を持つPyrocystis lunula, Lingrodinium polyhedrumやNoctiluca scintillansなどから安定に、簡便に、且つ
短時間に発光基質を精製する方法を検討、併せて保存法を検討し、本発明の完成に至った。
【０００６】
本発明は、以下の発光性渦鞭毛藻発光基質の精製法及び製造法を提供するものである。項１．  発光性藻類由来の発光基質の破砕液の遠心上清を逆相ＨＰＬＣで精製することを特徴とする発光基質の精製法。
項２．  発光性藻類が渦鞭毛藻（虫）類である項１に記載の精製法。
項３．  発光性藻類の破砕を窒素高圧破壊法またはボイル法により行い破砕液を調製する、項１または２に記載の精製法。
項４．  発光性藻類の破砕を窒素高圧破壊法により行い破砕液を調製する、項１または２に記載の精製法。
項５．  逆相ＨＰＬＣの移動相として緩衝液−アルコール系を使用することを特徴とする項１に記載の精製法。
項６．  逆相ＨＰＬＣの移動相として緩衝液−エタノール系を使用することを特徴とする項１に記載の精製法。
項７．  発光性藻類由来の発光基質の保存方法であって、発光性藻類の発光基質を酸化防止剤の存在下に保存することを特徴とする保存方法。
項８．  前記発光基質を水または水−アルコール系溶媒中で保存する項７に記載の保存方法。
項９．  前記発光基質を水または水−エタノール系溶媒中で保存する項８に記載の保存方法。
項１０．  −８０℃以下で保存する項７に記載の保存方法。
項１１．  酸化防止剤がジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール及びアスコルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種である項７に記載の保存方法。
項１２．  発光性藻類由来の発光基質と酸化防止剤を含むことを特徴とする発光性藻類由来の発光基質の安定化組成物。
項１３．  酸化防止剤がジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール及びアスコルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種である項１２に記載の安定化組成物。
項１４．  溶液の形態である項１２に記載の安定化組成物。
項１５．  溶液が水または水−アルコール系溶媒中の溶液である項１２に記載の安定化組成物。
項１６．  溶液が水溶液または水−エタノール溶液である項１２に記載の安定化組成物。項１７．  レポーターアッセイに使用する項１２〜１６のいずれかに記載の発光基質の安定化組成物の使用。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、発光性渦鞭毛藻発光基質の由来としては特に限定されず、藻類、特に渦鞭毛藻を広く例示でき、具体的にはPyrocystis lunula, Pyrocystis fusiformis, Lingrodinium polyhedrum, Pyrodinium bahamense, Pyrodinium bahamense, Gonyaulax catenella, Gonyaulax, acatenella, Gonyaulax tamarensis.やNoctiluca scintillansなどを挙げることが
できる。これら以外の藻類も発光基質としてを用いることもできる。
【０００８】
好ましい１つの実施形態において、ルシフェリン（発光基質）を有するPyrocystis lunulaからルシフェリンを抽出・精製した。藻類の破砕はボイル法以外に低温下の窒素高圧
破壊法で行った。抽出のフローチャートを図１に示す。ルシフェリンは不安定なので、短い工程で精製されることが望ましい。ルシフェリンは逆相HPLCカラムを用いて一段階で精製することができた。ルシフェリンは極性が高いので、通常の逆相カラムではなく、長い保持時間を有する逆相カラムでよい分離が得られた。たとえば、野村化学のODS-SR-5カラムを用いて、ルシフェリンを精製することができた。また、ルシフェリンをカラムから溶出させるとき、廃液のことを考慮し、エタノールといったプロトン性溶媒を用いて行った
。図２は逆相高速液体クロマトグラフを示す。ルシフェリンの保存は酸化防止剤を加えることにより、-80℃で長期間保存できる。酸化防止剤としては５ mM ジチオスレイトール
、５ mM 2-メルカプトエタノール、1% アスコルビン酸のうち一種以上を加えることでル
シフェリンの酸化を防止する効果があった。また、ルシフェリン保存溶液は強酸性あるいは強アルカリ性を避けることが望ましい。
【０００９】
以下の実施例で示されるように、収率に関し従来の中村法では発光基質は０．００３％でしか得られていないが、本発明では、０．００５％と約１．６７倍の収率になっている。
【００１０】
この原因は発光基質の分解が抑制できるなどが種々考えられ、明らかでないが、逆相ＨＰＬＣを使用すると１回のカラム操作で目的の発光基質を分離・精製することができ、また、藻類の破砕方法として窒素高圧破壊法を用いると、さらに収率が向上する。特に逆相ＨＰＬＣの移動相として水−アルコール（メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールまたはイソプロパノールなど）系、特に水−エタノール系を使用するのが好ましい。また、水として、リン酸緩衝液などの緩衝液を好ましく例示できる。
【００１１】
本発明の精製法により得られた発光基質は、逆相ＨＰＬＣの移動相、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールまたはイソプロパノールなどのアルコールを含む水溶液、特に水−エタノール系の溶媒に安定である。
【００１２】
本発明の発光基質は、溶液、凍結乾燥品等の固体状等の任意の形態で保存され得る。
【００１３】
本発明の発光基質は、酸化防止剤を併用することによりその保存安定性が高まる。酸化防止剤としては、例えばジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール、システイン、アスコルビン酸、及びジエチルジチトカルバミン酸などが例示され、好ましくはジチオスレイトール(DTT)、2-メルカプトエタノール及びアスコルビン酸が例示される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は，発光性渦鞭毛藻発光基質を精製する方法および保存法を提供する。この精製品は従来の発光基質と比べ、短時間に、且つ容易に精製され、且つその精製品の安定性が高い。このことより、細胞内で発現した発光性渦鞭毛藻発光酵素の遺伝子転写活性のわずかな変化もモニターすることが可能となり、安定な発光測定条件で利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
実施例１
渦鞭毛藻(湿重量300 mg)を5 mM DTTを含有する100 mM 燐酸緩衝液（5ｍｌ/pH8.5）で懸濁したのち、4度以下で窒素ガス(2000 psi)を用いて細胞を破壊し、得られた抽出液を氷
上で冷やした。2倍量のエタノールを加え、10分間遠心し(10 min, 22,000 g)、得られた
上清を濃縮した。残渣を2 ｍM燐酸緩衝液 (pH 8.5)で溶解し、HPLCカラム(ODS-SR-5, 4.6
mm x250 mm, Nomura)  に導入した。渦鞭毛藻ルシフェリンを水・エタノールの直線濃度勾配で溶出した。収率は0.005%でした。得られたルシフェリン溶液の中に5 mM ジチオス
レイトールを加え、-80℃で保存した。
実施例２
得られたルシフェリン溶液の中に5 mM ジチオスレイトールを加えることの代わりに、5
mM ジチオスレイトールと1％アスコルビン酸を加え、、-80℃で保存した。
実施例３
得られたルシフェリン溶液の中に5 mM ジチオスレイトールを加えることの代わりに、5
mM メルカプトエタノールと1％アスコルビン酸を加え、、-80℃で保存した。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】渦鞭毛藻からルシフェリンの抽出工程図。
【図２】逆相高速液体クロマトグラフによるルシフェリンの精製。
【図１】
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【図２】
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