(57)【要約】【課題】            本発明は天然型２”−ヒドロキシニコチナアミンの立体構造を明らかにすると共にその簡便な合成法を提供する。【解決手段】        アミン化合物とアルデヒド化合物とを、還元剤の存在下に縮合して得られる化合物を得、次いで脱保護する式（４）2005225835.tif 000031で表される２”（S）−ヒドロキシニコチナアミンの製造方法又は式（７）2005225835.tif 000032で表される２”（R）−ヒドロキシニコチナアミンとその製造方法。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2005225835.tif 000022
（式中、Ｒ１及びＲ２はカルボキシル基の保護基を示す。）
で表されるアミン化合物と、下記式（２）
【化２】
2005225835.tif 000023
（式中、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５はそれぞれカルボキシル基、アミノ基及び水酸基の保護基を示す。）
で表されるアルデヒド化合物とを、還元剤の存在下に縮合し、下記式（３）
【化３】
2005225835.tif 000024
（式中、Ｒ１及びＲ２は式（１）と同義であり、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は式（２）と同義である。）
で表される化合物を得、次いで脱保護することを特徴とする下記式（４）
【化４】
2005225835.tif 000025
で表される２”（Ｓ）−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
【請求項２】
下記式（１）
【化５】
2005225835.tif 000026
（式中、Ｒ１及びＲ２はカルボキシル基の保護基を示す。）
で表されるアミン化合物と、下記式（５）
【化６】
2005225835.tif 000027
（式中、Ｒ６，Ｒ７及びＲ８はそれぞれカルボキシル基、アミノ基及び水酸基の保護基を示す。）で表されるアルデヒド化合物とを、還元剤の存在下に縮合し、下記式（６）
【化７】
2005225835.tif 000028
（式中、Ｒ１，Ｒ２は式（１）と同義であり、Ｒ６，Ｒ７及びＲ８は式（５）と同義である。）で表される化合物を得、次いで脱保護することを特徴とする下記式（７）
【化８】
2005225835.tif 000029
で表される２”（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
【請求項３】
下記式（７）
【化９】
2005225835.tif 000030
で表される２”（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミン。
【請求項４】
請求項３記載の２”（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な２″−ヒドロキシニコチアナミン及びその製造方法に関する。さらに詳しくは、２″−ヒドロキシニコチアナミンの新規な製造方法、及び天然物由来の２″（Ｓ）−ヒドロキシニコチアナミンとは異なる立体異性体である新規な２″（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチアナミンは、１９７１年に野間らによりタバコ葉中より発見され（非特許文献１）、その後植物界に広く存在することが知られている。野間らによりタバコ葉中から抽出されたニコチアナミンは、下記式（８）
【０００３】
【化１】
2005225835.tif 000002
で表される化合物である。ニコチアナミンはアンジオテンシン変換酵素阻害活性があることから、高血圧の治療に有効であることが知られている。即ち、人の血圧調節系として知られるレニン−アンジオテンシン系はアンジオテンシン変換酵素（Angiotensin I Converting Enzyme以下ＡＣＥと略記する）がアンジオテンシン−Iに作用して強い血圧上昇作用を有するアンジオテンシン−IIを生じさせる。それゆえ、ＡＣＥの活性を抑制する作用を有する物質が血圧降下剤として有用であり、ニコチアナミンはこのような作用を有する物質として知られている。青柳は（特許文献１）はそば粉等から式（９）
【０００４】
【化２】
2005225835.tif 000003
で表される２″−ヒドロキシニコチアナミンを抽出した。しかしながら、式（９）に示す化合物の立体構造は明らかにされていなかった。また天然物からの抽出精製は、収率が低く、複雑な精製工程を採用しなければならないという問題点を有していた。従来上記した２″−ヒドロキシニコチアナミンの合成例はなく、収率が高く、簡便な合成法は強く希求されている。
【０００５】
【特許文献１】特願２００３−１２８８３８
【非特許文献１】M.Noma et al.; Tetrahedron Lett., No.22, 2017-2020(1971)
【非特許文献２】T.Shioiri et al. ; Tetrahedron, Vol.49, No. 36, 8211-8222(1993)
【非特許文献３】T.Kitahara et al.; Tetrahedron Lett., No.39,89-92(1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明１は、式（９）に示す天然型２″−ヒドロキシニコチアナミンの立体構造を明らかにすると共に、その簡便な合成法の提供を目的とする。さらに本発明３及び２は、式（９）に示す天然型化合物とは立体異性の異なる新規な非天然型化合物を提供すると共に、該化合物の新規な合成法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明１は、  下記式（１）
【０００８】
【化３】
2005225835.tif 000004
（式中、Ｒ１及びＲ２はカルボキシル基の保護基を示す。）
で表されるアミン化合物と、下記式（２）
【０００９】
【化４】
2005225835.tif 000005
（式中、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５はそれぞれカルボキシル基、アミノ基及び水酸基の保護基を示す。）
で表されるアルデヒド化合物とを、還元剤の存在下に縮合し、下記式（３）
【００１０】
【化５】
2005225835.tif 000006
（式中、Ｒ１及びＲ２は式（１）と同義であり、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は式（２）と同義である。）
で表される化合物を得、次いで脱保護することを特徴とする下記式（４）
【００１１】
【化６】
2005225835.tif 000007
で表される２″（Ｓ）−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供する。
【００１２】
さらに本発明２は、下記式（１）
【００１３】
【化７】
2005225835.tif 000008
（式中、Ｒ１及びＲ２はカルボキシル基の保護基を示す。）
で表されるアミン化合物と、下記式（５）
か
【００１４】
【化８】
2005225835.tif 000009
（式中、Ｒ６，Ｒ７及びＲ８はそれぞれカルボキシル基、アミノ基及び水酸基の保護基を示す。）で表されるアルデヒド化合物とを、還元剤の存在下に縮合し、下記式（６）
【００１５】
【化９】
2005225835.tif 000010
（式中、Ｒ１，Ｒ２は式（１）と同義であり、Ｒ６，Ｒ７はＲ８は式（５）と同義である。）で表される化合物を得、次いで脱保護することを特徴とする下記式（７）
【００１６】
【化１０】
2005225835.tif 000011
で表される２″（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供する。
【００１７】
本発明３はさらに、下記式（７）
【００１８】
【化１１】
2005225835.tif 000012
で表される２″（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンを提供する。
【００１９】
本発明４はさらに、式（７）記載の２″（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ＡＣＥ阻害活性を有する２″−ヒドロキシニコチアナミンの新規な合成方法を提供される。さらに本発明によれば、従来の天然物から抽出された２″（Ｓ）−ヒドロキシニコチアナミンとは立体異性の異なる、かつＡＣＥ阻害活性を有する新規な２″（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明１は、前記式（１）のアミン化合物と前記式（２）のアルデヒド化合物とを、還元剤の存在下に縮合して前記式（３）の化合物を得、次いで脱保護して前記式（４）の２″（Ｓ）−ヒドロキシニコチアナミンを製造することを特徴とする。還元剤としては、ソジウムシアノボロハイドライド（NaBH3CN）等が好適に利用される。
【００２２】
本発明２は、前記式（１）のアミン化合物と前記式（５）のアルデヒド化合物とを、還元剤の存在下に縮合して前記式（６）の化合物を得、次いで脱保護して前記式（７）の２″（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンを製造することを特徴とする。
【００２３】
さらに本発明３は、前記式（７）の新規化合物の提供を特徴とする。
【００２４】
前記式（１）の化合物は、例えば前記非特許文献１あるいは非特許文献３に従えば、下記に示す反応式に従って容易に製造することができる。まずＬ−アゼチジンカルボン酸のアミノ基、カルボキシル基に逐次保護基を付けて[化１２]の化合物を作成する。ついで[化１３]に示すようにＬ−アスパラギン酸のカルボキシル基、アミノ基に逐次保護基を付けて式[２]に示す化合物を作成し、これを式[1]に示す化合物と反応させることにより、式（１）に示す出発物質を得ることができる。あるいは式[２]に示す化合物を還元、酸化して式[３]に示す化合物を作成し、これを式[１]に示す化合物と反応させて、式（１）の化合物を得ることもできる。
【００２５】
【化１２】
2005225835.tif 000013
【００２６】
【化１３】
2005225835.tif 000014
2005225835.tif 000015
2005225835.tif 000016
[化１２]、[化１３]に示す上記式中、Butはtert-ブチル基を、Zはベンジルオキシカルボニル基を示す。
【００２７】
式（２）に示す出発物質は、非特許文献２（８２１４頁）に記載されている。下記式（２及び５）
【００２８】
【化１４】
2005225835.tif 000017
（２及び５）
（上記式中、Trocは２、２、２−トリクロロエトキシカルボニル基を示す。）
で表される化合物の合成例が示され、R1がMOMO、R2がHである化合物（式（２））とR1がH、R2がMOMOである化合物（式（５））とが生成し、式（２）の化合物とその異性体である式（５）の化合物との比率は１５：１であったことを示している。なお、MOMはメトキシメチル基を示す。本発明において、式（２）の化合物は非特許文献２記載の方法に従って調整した。
【００２９】
また、本発明者らは、式（５）の化合物を次の反応式に従って調整した。
【００３０】
【化１５】
2005225835.tif 000018
2005225835.tif 000019
（上記式中、Phはフェニル、Bocはtert-ブトキシカルボニル、TBSはtert-ブチルジメチルシリルを示し、But,Me,Ph,MOMは[化１２]、[化１３]と同義である）。
【００３１】
本発明において、式（１）、式（２）及び式（５）の化合物のR1,R2,R3及びR6で示すカルボキシル基の保護基としては、同一であっても異なってもよく、例えば、メチル、t-ブチル、ベンジル、パラメトキシベンジルなどのエステル系保護基、あるいはトリメチルシリル、トリエチルシリル、tert-ブチルジメチルシリルなどのシリル系保護基を挙げることができ、上記[化１２]、[化１３]等に記載したように、tert-ブチル基を好ましく例示できる。
【００３２】
式（２）及び式（５）の化合物のR４及びR7で示すアミノ基の保護基としては、例えば、tert-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、パラメトキシベンジルオキシカルボニルなどのカーバメイト系保護基、あるいはホルミル、アセチル、フェニルアセチル、ベンゾイルなどのアミド系保護基などを挙げることができ、中でもtert-ブトキシカルボニル基を好ましく例示できる。
【００３３】
式（２）、式（３）、式（５）及び式（６）の化合物のR５及びR8で示す水酸基の保護基としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、tert-ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリル、ベンジル、p-メトキシベンジル、アセチル、メトキシメチルなどを挙げることができ、中でもメトキシメチル基を好ましく例示できる。
【００３４】
式（２）又は式（５）の化合物を、還元剤例えばソジウムボロハイドライド、リチウムシアノボロハイドライド、トリブチルスズハイドライド−ＡＩＢＮ(2,2'-azobisisobutyronitirile)、ソジウムシアノボロハイドライド，好ましくはソジウムシアノボロハイドライドの存在下に縮合することにより、容易に式（３）又は式（６）の化合物を得ることができ、これらを脱保護することにより、式（４）又は式（７）で示される２″（Ｓ）又は２″（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミンを製造することができる。式（２）又は式（５）の化合物のアルデヒド１当量に対し式（１）の化合物は１〜３当量、好ましくは１当量が配合される。還元剤の使用量は、式（２）又は式（５）の化合物のアルデヒド１当量に対し１〜１．５当量、好ましくは１当量が使用される。
【００３５】
得られた式（３）又は式（６）を含む反応液を必要に応じ濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーなどにより精製することが好ましい。得られた式（３）又は式（６）の化合物のカルボキシル基、アミノ基及び水酸基の保護基を脱保護することにより、式（４）又は式（７）の２″−ヒドロキシニコチアナミンを容易に製造することができる。保護基の脱保護はこれまで一般に知られている脱保護法のいずれをも用いることができ、それぞれの保護基に特有の脱保護剤を使用することができる。例えば、式（３）の化合物のR1,R2,R3又は式（６）の化合物のR1,R2,R6の全てがtert-ブチル基である化合物の場合は、酸性条件下に全ての保護基が一気に除去できるので効果的である。
【００３６】
即ち、式（３）又は式（６）の化合物を有機溶媒の存在下、酸の存在下で反応せしめることにより、式（４）又は式（７）のヒドロキシニコチアナミンの塩が得られる。次いでイオン交換樹脂で処理することにより遊離アミノ酸である式（４）又は式（７）の２″−ヒドロキシニコチアナミンを得ることができる。使用される有機溶媒は特に限定されず、式（３）又は式（６）の化合物を溶解するものであれば好適である。このような有機溶媒としては、例えば酢酸エチル、ジオキサン、エーテル、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどを単独あるいは任意の割合で使用され、特に好ましいものとしては酢酸エチルとジオキサンが例示される。有機溶媒の使用量は、式（３）又は式（６）の重量を基準として０〜５０００モル％、好ましくは５０〜２０００モル％の範囲内を例示できる。酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸などを単独あるいは任意の割合で使用でき、特に好ましいものとしては塩化水素、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸を例示できる。塩化水素のように常温常圧で気体のものはあらかじめ有機溶媒に溶解させてから用いてもよく、また反応系に導入しながら脱保護反応を進行させてもよい。酸の使用量は、式（３）又は式（６）の化合物１モルに対し４〜１０００モル、好ましくは１０〜１００モルの範囲内を例示できる。反応は、−１０〜１００℃、好ましくは０〜３０℃の温度条件を採用できる。
【００３７】
反応終了後、溶媒系から析出してきた式（４）又は式（７）のニコチアナミンの塩を濾取するか、あるいは減圧下あるいは常圧下に反応液から溶媒と過剰の酸を回収することにより式（４）又は式（７）の２″−ヒドロキシニコチアナミンの塩を得ることができる。
【００３８】
式（４）又は式（７）の２″−ヒドロキシニコチアナミンの塩はイオン交換樹脂などにより精製され、場合によっては、更に再結晶を行い、遊離のアミノ酸である式（４）又は式（７）の２″−ヒドロキシニコチアナミンを得ることができる。
【００３９】
以下実施例により本発明を更に詳しく説明する。
【実施例１】
【００４０】
反応フラスコ中に式（１）の化合物（ただし式中、R1,R2がtert-ブチルである化合物）（1.15g,3.67mmol）、テトラヒドロフラン（10ml）、酢酸（0.147g,2.45mmol）をマグネティックスターラーで撹拌しながら加えた。この溶液を０℃に保持しながら、式（２）の化合物（ただし式中、R3がtert-ブチル,R4がtert-ブトキシカルボニル,R5がメトキシメチル）（0.82mg,2.45mmol）及びNaBH3CN(154mg,2.45mmol)５mlを加え、同温下に一夜撹拌した。重曹水溶液でクエンチ、クロロホルム抽出、濃縮後、シリカゲルクロマトにより精製し、式（３）の化合物（ただし式中、R1,R2,R3はtert-ブチル、R4tert-ブトキシカルボニルは、R5はメトキシメチル）５８１．５mgを得た。収率３８モル％。
【００４１】
得られた化合物（581.5mg,0.92mmol）を反応フラスコ中に加え、氷冷浴により０℃に保持しながら、トリフルオロ酢酸５mlを加え、同温下に保持しながらマグネティックスターラーにより一夜撹拌した。濃縮後、カラム管に詰めたDowex 50WX8（商品名、イオン交換樹脂）３０gに吸着させ、ついで２Nアンモニア水で脱着して、遊離の２″（Ｓ）−ヒドロキシニコチアナミン２９０mgを得た。収率９９モル％（淡黄色結晶）。この粗結晶に蒸留水５．８gを加え、次いでエタノールを少量加えて結晶を析出させ、精製物９０mgを得た。収率３１モル％
【００４２】
【化１６】
2005225835.tif 000020
【００４３】
＜1H-NMR＞
δ2.00-2.10ppm(2H,m,H-2')
δ2.3-2.6ppm(2H,m,H-3)
δ3.13-3.35ppm(4H,m,H-1' and H-1")
δ3.71ppm(1H,dd,J=4.40Hz,J=8.39Hz,m,H-3')
δ3.79-4.0ppm(2H,m,H-4)
δ3.86ppm(1H,d,J=2.80Hz,H-3")
δ4.3-4.32ppm(1H,m,H-２″)
δ4.63ppm(1H,t,J=9.59Hz,H-2)
＜13C-NMR＞
δ 21.6ppm(C-3)
δ 25.3ppm(C-2')
δ 49.0ppm(C-1')
δ 51.1ppm(C-4)
δ 51.8ppm(C-1')
δ 58.2ppm(C-3')
δ 60.1ppm(C-3')
δ 66.1ppm(C-2')
δ 67.4ppm(C-2)
δ 171.0ppm(C-4')
δ 172.5ppm(C-4')
δ 173.7ppm(C-1)。
[α]D24＝−４６．６（C=0.51,H2O）
【実施例２】
【００４４】
反応フラスコ中に式（１）の化合物（ただし式中、R1,R2がtert-ブチルである化合物）（146mg,0.47mmol）、テトラヒドロフラン（5ml）及び酢酸(18mg,0.31mmol)をマグネティックスターラーで撹拌しながら加えた。この溶液を氷冷浴により０℃に保持しながら、式（５）の化合物（R6はtert-ブチル,R7はtert-ブトキシカルボニル,R8はメトキシメチル）（103mg,0.31mmol）及びNaBH3CN（19.6mg,0.31mmol）をマグネティックスターラーで撹拌しながら加え、同温下に一夜撹拌した。重曹水溶液でクエンチ、クロロホルム抽出、濃縮後、シリカゲルクロマトにより精製し、式（６）の化合物（R1,R2,R6はtert-ブチル、R7はtert-ブトキシカルボニル、R8はメトキシメチル）１１０．４mgを得た。収率５６モル％。
【００４５】
得られた化合物（110.4mg,0.174mmol）を反応フラスコに入れ、氷冷浴で０℃に保持しながらトリフルオロ酢酸（3ml）を加え、同温下に保持しながらマグネティックスターラーで撹拌しながら、一夜撹拌を継続した。濃縮後、カラム管に詰めたDowex 50WX8（商品名、イオン交換樹脂）３gに吸着させ、ついで２Nアンモニア水で脱着して遊離の２″（Ｒ）−ヒドロキシニコチアナミン５３mgを得た。収率９５モル％（淡黄色結晶）。この粗結晶に蒸留水２４０mgを加え、エタノールを少量加えて結晶を析出させ、精製物３０mgを得た。収率５４モル％。
【００４６】
【化１７】
2005225835.tif 000021
【００４７】
＜1H-NMR＞ 
δ1.98-2.1ppm(2H,m,H-2')
δ2.3-2.6ppm(2H,m,H-3)
δ3.08-3.34,4ppm(4H,m,H-1'and H-2")
δ3.65ppm(1H,d,J=4.80Hz,H-3")
δ3.73ppm(1H,dd,J=4.00Hz,J=8.79Hz,H-3')
δ3.79-3.99ppm(2H,m,H-4)
δ4.31-4.34ppm(1H,m,H-2″)
δ4.63ppm(1H,t,J=8.99Hz,H-2)
＜13C-NMR＞
δ 21.6ppm(C-3)
δ 25.3ppm(C-2')
δ 50.0ppm(C-1")
δ 51.1ppm(C-4)
δ 51.9ppm(C-1')
δ 57.7ppm(C-3")
δ 60.4ppm(C-3')
δ 66.2ppm(C-2")
δ 67.4ppm(C-2)
δ 171.8ppm(C-4")
δ 172.6ppm(C-4')
δ 173.7ppm(C-1)。
[α]D24＝−１３４．９（C=0.10,H2O）
【参考例】
【００４８】
特許文献１の実施例１記載の方法に従って抽出した天然型２”−ヒドロキシニコチアナミンの1H-NMRスペクトル及び13C-NMRスペクトル及び比旋光度の測定結果を次に示す。
＜1H-NMR＞
δ1.98-2.13ppm(2H,m,H-2')
δ2.3-2.6ppm(2H,m,H-3)
δ3.12-3.37ppm(4H,m,H-1' and H-1")
δ3.71ppm(1H,dd,J=4.40Hz,J=8.39Hz,m,H-3')
δ3.78-4.0ppm(2H,m,H-4)
δ3.86ppm(1H,d,J=2.80Hz,H-3")
δ4.28-4.32ppm(1H,m,H-２″)
δ4.63ppm(1H,t,J=9.59Hz,H-2)
＜13C-NMR＞
δ 21.6ppm(C-3)
δ 25.3ppm(C-2')
δ 48.9ppm(C-1')
δ 51.2ppm(C-4)
δ 51.8ppm(C-1')
δ 58.3ppm(C-3')
δ 60.2ppm(C-3')
δ 66.1ppm(C-2')
δ 67.4ppm(C-2)
δ 171.0ppm(C-4')
δ 172.5ppm(C-4')
δ 173.7ppm(C-1)。
[α]D24＝−４０（C=0.4,H2O）
【００４９】
実施例１及び実施例２で得られた精製物について、1H-NMRスペクトル、13C-NMRスペクトル測定結果を図１〜図４に示した。これらの１H,13C-NMRスペクトル及び比旋光度を参考例で測定した抽出物の測定結果を比較すると、実施例１で得られた精製物は抽出物の測定結果と一致した。参考例で得られた抽出物の測定結果を図５、図６に示した。
【００５０】
実施例１及び２で得られた精製物のACE阻害活性を下記方法で測定した。
[ACE阻害活性の測定]
ACE活性の測定は、Cushman & Cheungの方法に従い、下記のようにして行った。
（１）  試薬の調製
（i） 実施例１及び実施例２で得られた無色結晶物質をそれぞれ1.6mg,0.8mg,0.4mgを水10mlに加えて、それぞれの濃度が50μmol/L,25μmol/L,12.5μmol/Lである試料液、試料液２、試料液３を調製した。
（ii） ホウ酸濃度0.2mol/Lの緩衝液（pH8.3）を調製した。
（iii）  Hippuryl-L-histidyl-leucineを7mmol/L濃度となるように、前記緩衝液に溶解し、基質溶液を調製した。
（iv） 2mol/LのNaCl水溶液を調製した。
（v）  ACEはSigma社のウサギ肺からの凍結乾燥品を使用し、該ACE 11Uを、前記緩衝液6.67mlに加えて、ACE活性150mIU/mlの酵素溶液を調製した。
（２）  反応組成液
(i)  基質溶液；500μL
(ii)  2mol/L NaCl溶液；400μL
(iii)  試料液１〜３；それぞれ30μL
(iv)  水；40μL
(v)  酵素溶液；30μL
（３）  反応条件
上記反応組成液の(i),(ii),(iii)及び(iv)を混和した後ブレインキュベーションなしに、（v）の酵素液を加え、３７℃で３０分反応（インキュベーション）させる。ついで1mol/Lの塩酸を５００mL加え、反応を停止する。その後、酢酸エチル３mLで遊離した馬尿酸を抽出した。抽出液を遠心エバポレーターで蒸発乾固し、水１mLに溶解して２２８nmでの吸光度を分光光度計によって測定した。測定した吸光度をODs（試料液１〜３を用いた反応についてそれぞれODs1,ODs2,ODs3）とした。
（４）  コントロール測定
上記（３）の反応液の(iii)試料液の代りに水３０μLを用い、その他は（３）と全く同じ条件で反応を行い、得られた２２８nmでの吸光度をODcとした。
（５）  ブランク測定
上記反応組成液の（i）〜(iv)を混和して、３７℃で３０分間反応させ、１mol/LHClで反応を停止させた後、(v)の酵素液を加えた。これを（３）と同様に酢酸エチルで抽出した。それ以後の操作は（３）と同じである。得られた２２８nmの吸光度をODbとした。
（６）  ACE阻害率５０％（IC50）を示す本発明の物質の濃度の測定
ODs1,ODs2,ODs3の阻害率を下記式
ACE阻害率（％）＝｛１−（ODs-ODb）/(ODc-ODb)｝×100      
によって求め、グラフに外挿することにより阻害率５０％を示す本発明の物質の濃度を決定した。実施例１及び２で得られた物質の濃度は、それぞれ0.08μmol,0.37μmolであった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１の化合物の1H-NMR測定スペクトルを示す図である。
【図２】実施例２の化合物の1H-NMR測定スペクトルを示す図である。
【図３】抽出物の1H-NMR測定スペクトルを示す図である。
【図４】実施例１の物質の１３C-NMR測定スペクトルを示す図である。
【図５】実施例２の物質の１３-NMR測定スペクトルを示す図である。
【図６】抽出物の１３C-NMR測定スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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