(57)【要約】【課題】  微細な気孔にも細胞を浸透し易くしながら、気孔内から流出し難くして、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させる。【解決手段】  細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し（Ｓ８）、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法を提供する。さらに具体的には、細胞と多血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加する（Ｓ８３）生体組織補填体の製造方法を提供する。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法。
【請求項２】
前記液体が、フィブリン、多血小板血漿、ゼラチンまたはコラーゲン等のゲル化可能材料を含む請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項３】
前記液体が、多血小板血漿溶液と塩化カルシウム溶液とを含む請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項４】
細胞と多血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加する請求項３に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項５】
塩化カルシウムとともにフィブリノーゲンを添加し、
生体組織補填材の形態に合わせて、添加するフィブリノーゲンの量を調節する請求項４に記載の生体組織補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織補填体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、いわゆる再生医療において、術後の生体組織における欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄細胞等から間葉系幹細胞を取り出して、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）やハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）等の生体組織補填材とともに培養することにより、培養骨に代表される生体組織補填体を製造することが提案されている。生体組織補填体は、移植時に、すでに骨補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含んでいるので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家組織に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
生体組織補填体を製造するには、一般に、まず、患者の骨髄細胞等から取り出した間葉系幹細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させる。この過程において、成長した細胞は、少なくとも１回以上、培養容器から剥がされて、さらに大きな培養容器に移し替えられる。そして、最終的に必要細胞数まで増加したところで、再度、培養容器から剥離させられ、生体組織補填材に付着させられて、二次培養が行われる。これにより、生体組織補填体が製造される（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
この場合において、間葉系幹細胞は、生体組織補填材に付着して成長することにより、生体組織の形成が盛んに行われるように活性化させられるので、間葉系幹細胞を生体組織補填材に十分に付着させることが重要になる。従来、生体組織補填材に細胞を十分に付着させる方法として、生体組織補填材の材質を改善し、生物活性ガラス材料あるいは生物活性セラミック材料により構成し、       特有のイオンを含む水溶液により処理することが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【特許文献１】特表２０００−５０６７３８号公報（第１０頁２０〜２３行等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、例えば、β−ＴＣＰのような材質からなる生体組織補填材は、骨のように、再生後の強度を高く保つ必要がある生体組織を補填する場合には、気孔率を小さくしていく必要があるが、気孔率が小さくなればなるほど、播種された細胞は気孔内部に入り込み難くなるという問題がある。すなわち、気孔が小さくなると、細胞自体の粘性や接着性により気孔内に細胞が入って行き難くなる。したがって、例えば、所定の大きさの生体組織欠損部を補填するために、該欠損部に合致するような比較的大きなブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体からなる生体組織補填材においては、播種された細胞を生体組織補填材の内部まで浸透させることが困難であった。
【０００６】
一方、細胞を気孔内に進入させ易くするために、細胞を含む液体の粘性を低くすることも考えられるが、粘性が低いと細胞が気孔内に留まり難くなり、細胞が生体組織補填材の気孔内壁に付着する前に生体組織補填材の外部に流れ出てしまうことにもなる。細胞が気孔内に入り込み易く、かつ、流出し難いように細胞を含む液体の粘性を調整することは極めて困難であった。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、微細な気孔にも細胞を浸透し易くしながら、気孔内から流出し難くして、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させることができる生体組織補填体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法を提供する。
この発明によれば、細胞を含む液体が生体組織補填材に導入された後にゲル化させられるので、生体組織補填材への導入時、すなわち、細胞を含む液体が生体組織補填材の気孔内に浸透するときには、比較的低い粘性に抑えることができる。したがって、導入時には、比較的高い流動性により気孔内への浸透を促進し、一旦導入された後には、粘性の高いゲル状に変化させて、気孔内に細胞を留まらせることが可能となる。細胞は、気孔内に滞留させられることによって、付近の気孔内壁に付着し、活性化させられて、十分に生体組織へと分化することができる。その結果、比較的大きなブロック状の生体組織補填材においても、内部まで十分に成長した細胞を有する生体組織補填体を製造することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記液体が、フィブリン、多血小板血漿、ゼラチンまたはコラーゲン等のゲル化可能材料を含むことが好ましい。
これらのゲル化可能材料は、生体吸収性の材料であり、生体内に補填された後には消滅するので、体内に異物を残すことがなく、補填材料として適している。特に、多血小板血漿（Platelet Rich Plasma：以下、単にＰＲＰとも言う。）は、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＩＧＦなどの種々の自家成長因子を多く含んでいるため、この多血小板血漿を用いることが、生体組織の再生をさらに促進することになり、好ましい。
【００１０】
また、上記発明においては、前記液体が、多血小板血漿と塩化カルシウムとを含むことが好ましい。
この発明によれば、クエン酸ナトリウムを含むＰＲＰは、塩化カルシウムが添加される前にはゲル化が起こらないが、塩化カルシウムが添加されると、緩やかにゲル化を開始する。したがって、この性質を利用すれば、生体組織補填材への導入時には粘性を低く、導入後には粘性を高くすることができ、上記効果を簡易に達成することが可能となる。
【００１１】
さらに、上記発明においては、細胞と多血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加することが好ましい。このようにすることで、塩化カルシウムが添加されると、緩やかにゲル化を開始する多血小板血漿を含む液体の性質を利用して、細胞が生体組織補填材の内部に浸透するまで流動性を保ち、気孔内に到達した適当な時期に流動性をなくして留まらせることが可能となる。
【００１２】
また、塩化カルシウムとともにＰＲＰ内に含まれるフィブリノーゲンを添加し、生体組織補填材の形態に合わせて、添加するフィブリノーゲンの量を調節することにしてもよい。これにより、例えば、気孔が細かい生体組織補填材に対しては、フィブリノーゲンの量を少なくして凝固反応を少なくすることにより、ゲル化速度を遅くすることができ、気孔が比較的大きな生体組織補填材に対しては、フィブリノーゲンの量を多くして凝固反応を促進し、ＰＲＰと塩化カルシウムとの反応によるゲル化を早めることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生体組織補填材への細胞の浸透性を高めかつ生体組織補填材内部に細胞を滞留させることを可能として、細胞を生体組織補填材の内部においても活性化させて、十分に成長させた生体組織補填体を製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明に係る生体組織補填体の製造方法の一実施形態について、図面を参照して説明する。
この製造方法は、図１に示されるように、まず、例えば、骨髄細胞から取り出した間葉系幹細胞を、培養容器内に所定の培養液とともに投入し、一定の培養条件に維持することにより培養する（ステップS1）。
【００１５】
培養液は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、抗生剤を任意の配合比率で混合したものである。また、培養条件は、例えば、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％である。
【００１６】
この培養の過程（ステップＳ１）においては、定期的にあるいは必要に応じて培養液を交換し（ステップＳ２，Ｓ３）、細胞の成長に合わせて、培養容器も大きいものへと変更していく（ステップＳ４，Ｓ５）。
【００１７】
また、少なくとも１回の培養容器の変更を行いつつ培養された細胞が、必要な細胞数まで増殖させられると（ステップＳ６）、再度、培養容器から剥離されるとともに、細胞どうしの結合も切り離されてバラバラに分離される（ステップＳ７）。その後、バラバラに分離された細胞は、所定の溶液と混合された後に、β―ＴＣＰ多孔体ブロックからなる生体組織補填材に播種される（ステップＳ８）。
【００１８】
図中、符号Ｓ９は分化ステップであり、ある程度増殖した間葉系幹細胞に、デキサメタゾンのような分化誘導因子を添加する。これにより、間葉系幹細胞が、所望の生体組織、例えば、骨芽細胞に分化され、生体組織補填体が製造される。分化ステップＳ９は、図１のように細胞の生体組織補填材への播種の前に、培養中に行うことにより、ある程度、生体組織へ分化誘導された細胞を生体組織補填材に播種することにしてもよく、また、生体組織補填材への播種後に行うことにより、生体組織補填材を足場として生体組織細胞を成長させることにしてもよい。また、符号Ｓ１０は、製造された生体組織補填体に含まれている細胞の状態を評価する評価ステップである。
【００１９】
上記播種ステップＳ８においては、図２に示されるように、バラバラに分離された細胞が、まず、培養液と混合される（ステップＳ８１）ことにより、所定濃度の細胞浮遊液が構成される。培養液は、上述した培養に使用される培養液と同様でよい。細胞浮遊液は、その後に添加されるＰＲＰ等の他のゲル化可能材料の量を考慮して、細胞を多く含む高い濃度に設定されている。次いで、この細胞浮遊液に、ＰＲＰを添加する（ステップＳ８２）。ＰＲＰに含まれるフィブリノーゲンの添加量は、おおよそ２〜４５ｍｇ／ｍｌの濃度の細胞浮遊液が構成される程度の量でよい。
【００２０】
次に、細胞の播種に先立って、細胞を播種する生体組織補填材を準備しておく。生体組織補填材は、例えば、ブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体である。そして、上記のようにして構成されたＰＲＰを含む細胞浮遊液に、塩化カルシウム溶液を添加する（ステップＳ８３）。添加する塩化カルシウム溶液は、ＰＲＰに対しておおよそ０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．１ｍｏｌ／ｌの濃度となるように塩化カルシウムを溶解させたものである。
【００２１】
ＰＲＰにはクエン酸ナトリウムが含まれているので、添加された塩化カルシウムとクエン酸ナトリウムとが反応してゲル化が開始される。ゲル化の反応は一般に緩やかであり、粘性が高まるまでに数分程度かかるので、塩化カルシウムを添加した後には、即座に、ピペッティングにより生体組織補填材に播種する（ステップＳ８４）。
【００２２】
塩化カルシウム添加直後であれば、ゲル化は進行しておらず、細胞浮遊液の粘性は低い状態に維持されている。したがって、細胞は、比較的容易に生体組織補填材の気孔内に浸透していくことが可能となる。そして、細胞が生体組織補填材の中心まで浸透する頃には、クエン酸ナトリウムと塩化カルシウムとのゲル化反応が進行し、細胞浮遊液はゲル化させられて粘性が急激に上昇する。
【００２３】
これにより、ゲル化された細胞浮遊液内に含まれている細胞は、生体組織補填材の気孔内に滞留させられる。その結果、細胞は、生体組織補填材外に流出することなく気孔内に留まり、近接する気孔の内壁に付着して成長する。これにより、生体組織補填材の内部にも細胞が付着した状態の生体組織補填体が製造されることになる。
【００２４】
このように、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材の気孔内に細胞を浸透させる浸透段階においては、細胞浮遊液の流動性を高く維持することにより気孔内に円滑に浸透させ、細胞が気孔内部まで到達したときに細胞浮遊液をゲル化させることにより流動性を失わせるので、簡易に、細胞を生体組織補填材の内部にも付着させることができる。
【００２５】
この場合において、本実施形態に係る製造方法によれば、ゲル化可能材料としてＰＲＰを採用しているので、ＰＲＰに含まれているＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ等の成長因子の作用により、生体組織補填材に付着した細胞の活性化を促進することができる。したがって、簡易に気孔の内部に付着させて、内部から細胞を３次元的に成長させることができるとともに、細胞の活性化を促進して、組織再生を効率的に行うことができる生体組織補填体を製造することができる。
【００２６】
また、本実施形態に係る製造方法によれば、気孔内に浸透させられた細胞が、ゲル化した細胞浮遊液によって気孔内に保持されるので、従来必要であった、細胞を生体組織補填材に付着させるための培養工程を省略することができるという効果もある。すなわち、導入直後の細胞は生体組織補填材の気孔内壁に付着するまでに時間がかかるため、培養容器内に静置して、所定時間培養する必要があった。しかし、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、ゲル化した細胞浮遊液によって細胞が気孔内から流出することが禁止されるので、静置する必要がない。したがって、細胞を生体組織補填材に付着させるための静置培養工程を不要とし、あるいは短縮することができるので、製造効率を高め、製造時間を短縮することができる。
【００２７】
さらに、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、細胞が気孔内に保持され続けるので、生体組織欠損部への補填前および補填後においても、細胞が生体組織補填材の外部に流出せず、効率よく組織再生を行うことができる。
【００２８】
なお、本実施形態においては、細胞浮遊液にＰＲＰを添加した溶液に、塩化カルシウム溶液を添加することによりゲル化させる方法を採用した。添加するフィブリノーゲン、塩化カルシウムの量を適宜調節することにより、ゲル化の程度、すなわち、ゲル化した後の粘性の大小、ゲル化する速度の大小を調節することができる。また、ＰＲＰに適度に含まれるトロンビンによって細胞浮遊液内の血液成分が凝固され、細胞浮遊液の粘性はさらに高められることになる。さらに、トロンビンを添加することにより、ゲル化の速度を調節することも可能である。
【００２９】
添加する塩化カルシウム量や適度なフィブリノーゲンの量は、細胞を播種すべき生体組織補填材の形態に応じて設定することにしてもよい。すなわち、気孔が大きく細胞が流出しやすい生体組織補填材に対しては、比較的早期にゲル化が開始され、かつ、より高い粘性のゲル状になるように塩化カルシウムを増やすことが考えられる。また、気孔が細密で粘性が高いと細胞浮遊液が浸透して行きにくい生体組織補填材に対しては、比較的ゆっくりしたゲル化速度でよく、最終的なゲルの粘性も低く設定してよい。したがって、このような場合には、ＰＲＰ自体に含まれるトロンビン量のままで、塩化カルシウムの添加量は少なくてよい。
【００３０】
また、ＰＲＰ自体は患者から採取するものであるため、ゲル化速度にも個人差がある。したがって、採取されたＰＲＰの成分分析により、添加する塩化カルシウム等の量を決定してもよい。
【００３１】
なお、上記実施形態においては、ゲル化可能材料として、ＰＲＰを例に挙げて説明した。ＰＲＰはＴＧＦ−βのような成長因子を多く含んでいるためにゲル化可能材料として適しているが、これに限定されるものではなく、他の材料、例えば、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンのような生体吸収性のゲル化可能材料を採用することにしてもよい。
【００３２】
また、播種する細胞として、骨髄細胞から集めた間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を採用することにしてもよい。また、間葉系幹細胞を骨髄から採取することとしたが、これに代えて、抹消血や臍帯血から採取することにしてもよい。
【００３３】
また、細胞を播種する生体組織補填材としては、β―ＴＣＰ多孔体に代えて、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組み合わせを用いてもよい。また、チタンのような金属であってもよい。また、形態もブロック状、顆粒状、ゲル状等任意の形態を採用してよい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法における細胞の播種ステップを説明するフローチャートである。
【符号の説明】
【００３５】
Ｓ８  播種ステップ
Ｓ８２  ＰＲＰ添加ステップ
Ｓ８３  塩化カルシウム添加ステップ
Ｓ８４  細胞播種ステップ
【図１】
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【図２】
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