(57)【要約】【課題】  細胞にダメージを与えることなく培養容器から剥離させ、かつ、ギャップ結合を切り離すことを可能にする。【解決手段】  培養容器の表面に接着させて所定の培養条件下で培養した接着性の細胞を容器から分離する際に、コラゲナーゼ溶液を添加するコラゲナーゼ処理Ｓ７２を行い、その後に、トリプシン溶液を添加するトリプシン処理Ｓ７３を行う細胞の分離方法を提供する。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器の表面に接着させて所定の培養条件下で培養した接着性の細胞を容器から分離する際に、コラゲナーゼ溶液を添加するコラゲナーゼ処理を行い、その後に、トリプシン溶液を添加するトリプシン処理を行う細胞の分離方法。
【請求項２】
コラゲナーゼ処理が、コラゲナーゼ溶液を添加した後に、所定時間にわたって培養条件を維持し、その後、コラゲナーゼを除去する請求項１に記載の細胞の分離方法。
【請求項３】
前記コラゲナーゼを除去した後に培養容器内を洗浄する請求項２に記載の細胞の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の分離方法、特に、間葉系幹細胞のような接着性の細胞を培養容器から分離する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、いわゆる再生医療において、術後の生体組織における欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄細胞等から間葉系幹細胞を取り出して、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）やハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）等の生体組織補填材とともに培養することにより、培養骨に代表される生体組織補填体を製造することが提案されている。生体組織補填体は、移植時に、すでに骨補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含んでいるので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家組織に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
生体組織補填体を製造するには、一般に、まず、患者の骨髄細胞等から取り出した間葉系幹細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させる。この過程において、成長した細胞は、少なくとも１回以上、培養容器から剥がされて、さらに大きな培養容器に移し替えられる。そして、最終的に必要細胞数まで増加したところで、再度、培養容器から剥離させられ、生体組織補填材に付着させられて、二次培養が行われる。これにより、生体組織補填体が製造される（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
上述したように、生体組織補填体の製造工程において、細胞は、培養容器から、少なくとも１回以上剥離させられるが、間葉系幹細胞のような接着性の細胞は、培養容器の底面等に強固に接着して成長するため、物理的な方法により剥離させることが困難である。このため、細胞を培養容器から剥離する方法として、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を使用することが行われている。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
間葉系幹細胞のような接着性の細胞は、細胞外に発現するフィブロネクチンのようなタンパク質と、インテグリンのような受容体との結合により、培養容器底面に強固に接着するとともに、細胞どうしもコネクシン、カドヘリンのようなタンパク質により強固なギャップ結合を生じている。したがって、トリプシンを使用することにより、これらのタンパク質を分解して、細胞を培養容器底面から剥離させ、あるいは、細胞どうしのギャップ結合を切り離すことができる。
【０００６】
しかしながら、細胞を長期間にわたって分化誘導すると、細胞の表面に形成される細胞外マトリクスとしてのコラーゲンが、培養容器の表面に多量に付着することとなり、このコラーゲンとフィブロネクチンやインテグリンとの結合が強力になる。トリプシンはコラーゲンを分解できないので、細胞を培養容器から剥離させることが困難になる。
【０００７】
この場合において、トリプシン処理を長期間にわたって行うこととすれば、コラーゲン以外のタンパク質を分解して、細胞を培養容器から剥離させ、または細胞どうしのギャップ結合を切り離すことが可能である。しかしながら、トリプシン処理が長期間に及ぶ場合には、間葉系幹細胞の細胞膜にもダメージが与えられる不都合がある。
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、細胞にダメージを与えることなく培養容器から剥離させ、かつ、ギャップ結合を切り離すことを可能にする細胞の分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、培養容器の表面に接着させて所定の培養条件下で培養した接着性の細胞を容器から分離する際に、コラゲナーゼ溶液を添加するコラゲナーゼ処理を行い、その後に、トリプシン溶液を添加するトリプシン処理を行う細胞の分離方法を提供する。
【００１０】
この発明によれば、トリプシン処理に先立ってコラゲナーゼ溶液を添加するので、トリプシンによって分解されないコラーゲンを予め分解することができる。したがって、その後に行われるトリプシン処理によって、細胞が培養容器との接着状態および細胞どうしのギャップ結合を容易に切り離されて分離されることになる。すなわち、トリプシン処理による細胞の分離を容易にするので、トリプシン処理に要する時間を短縮し、あるいは、トリプシン溶液の濃度を薄くすることが可能となる。その結果、細胞膜がダメージを受けないように細胞を分離することができる。
【００１１】
上記分離方法において、コラゲナーゼ処理は、コラゲナーゼ溶液を添加した後に、所定時間にわたって培養条件を維持し、その後、コラゲナーゼを除去する処理であることが好ましい。
トリプシン処理を行う前にコラゲナーゼを除去するので、添加されるトリプシンが、残存しているコラゲナーゼによって中和されることが防止され、トリプシンの効果の低減を防止することができる。
【００１２】
また、上記分離方法においては、前記コラゲナーゼを除去した後に培養容器内を洗浄することが好ましい。
コラゲナーゼ処理によってはコラーゲンが分解されるが、他のタンパク質は残存するので、細胞の接着状態は維持されている。したがって、洗浄処理を行っても細胞が失われることがなく、洗浄作業は容易である。また、残存するコラゲナーゼの量をさらに低減するので、コラゲナーゼによるトリプシンの効果の低減をさらに効果的に抑制することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、接着性の細胞の細胞膜にダメージを与えることなく、培養容器から剥離し、かつ、細胞どうしも分離することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明に係る細胞の分離止方法の一実施形態について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞の分離方法の説明に先立って、この分離方法を利用する生体組織補填体の製造方法について説明する。この製造方法は、図１に示されるように、まず、例えば、骨髄細胞から取り出した間葉系幹細胞を、培養容器内に所定の培養液とともに投入し、一定の培養条件に維持することにより培養する（ステップS1）。
【００１５】
培養液は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、抗生剤を任意の配合比率で混合したものである。また、培養条件は、例えば、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％である。
【００１６】
この培養の過程（ステップＳ１）においては、定期的にあるいは必要に応じて培養液を交換し（ステップＳ２，Ｓ３）、細胞の成長に合わせて、培養容器も大きいものへと変更していく（ステップＳ４，Ｓ５）。この培養容器の変更の際に、本実施形態に係る細胞の分離方法が使用される。
【００１７】
また、少なくとも１回の培養容器の変更を行いつつ培養された細胞が、必要な細胞数まで増殖させられると（ステップＳ６）、再度、培養容器から剥離されるとともに、細胞どうしの結合も切り離されてバラバラに分離される（ステップＳ７）。この剥離ステップＳ７においても、本実施形態に係る細胞の分離方法が使用される。その後、バラバラに分離された細胞は、その状態で、β―ＴＣＰ多孔体ブロックからなる生体組織補填材に播種される（ステップＳ８）。
【００１８】
図中、符号Ｓ９は分化ステップであり、ある程度増殖した間葉系幹細胞に、デキサメタゾンのような分化誘導因子を添加する。これにより、間葉系幹細胞が、所望の生体組織、例えば、骨芽細胞に分化され、生体組織補填体が製造される。分化ステップＳ９は、図１のように細胞の生体組織補填材への播種の前に、培養中に行うことにより、ある程度、生体組織へ分化誘導された細胞を生体組織補填材に播種することにしてもよく、また、生体組織補填材への播種後に行うことにより、生体組織補填材を足場として生体組織細胞を成長させることにしてもよい。また、符号Ｓ１０は、製造された生体組織補填体に含まれている細胞の状態を評価する評価ステップである。
【００１９】
次に、上述した生体組織補填体の製造方法において、細胞を培養容器から剥離し、あるいは、細胞どうしのギャップ結合を切断するために使用される細胞の分離方法について説明する。本実施形態に係る細胞の分離方法は、図２に示すように、前処理Ｓ７１と、コラゲナーゼ処理Ｓ７２と、該コラゲナーゼ処理Ｓ７２の後に行われるトリプシン処理Ｓ７３とを備えている。
【００２０】
前処理ステップＳ７１は、図３に示されるように、培養容器内の培養液を除去するステップＳ７１１と、培養容器内に付着している細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水：Phosphate Buffer Saline）により洗浄する洗浄ステップＳ７１２と、ＰＢＳを除去するステップＳ７１３とを含んでいる。
【００２１】
コラゲナーゼ処理Ｓ７２は、図４に示されるように、所定濃度のコラゲナーゼ溶液を添加するステップＳ７２１と、コラゲナーゼ溶液を添加した状態の細胞を上記と同様の培養条件下に配するステップＳ７２２と、残留したコラゲナーゼをＰＢＳにより洗浄するステップＳ７２３と、ＰＢＳを除去するステップＳ７２４とを含んでいる。コラゲナーゼ溶液は、細胞の状態（例えば、分化の程度等）によって濃度が定められるが、例えば、培養液に対しては０．１％以下程度でよい。
【００２２】
コラゲナーゼ処理Ｓ７２を行うことにより、間葉系幹細胞により形成されているコラーゲンが分解され、間葉系幹細胞は、コラーゲン以外のタンパク質によって培養容器の底面に接着し、細胞間のギャップ結合が維持された状態に配される。コラーゲンが分解されても細胞の培養容器への接着状態が維持されるので、ＰＢＳによる洗浄ステップＳ７２３を実施しても、細胞が流れることなく、容易にコラゲナーゼが除去されることになる。
【００２３】
前記トリプシン処理Ｓ７３は、図５に示されるように、所定濃度のトリプシン溶液を添加するステップＳ７３１と、トリプシン溶液を添加した状態で、細胞を上記と同様の培養条件下に配するステップＳ７３２と、トリプシンを除去するステップＳ７３３とを含んでいる。トリプシン溶液は、トリプシンを１ｍＭｏｌのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）に溶解させた溶液であり、その濃度は、細胞の状態（例えば、分化の程度等）によって定められるが、例えば、０．２５％以下程度でよい。
【００２４】
本実施形態に係る細胞の分離方法によれば、トリプシン処理Ｓ７３に先立ってコラゲナーゼ処理Ｓ７２が行われるので、トリプシンによって分解されないコラーゲンをコラゲナーゼによって分解し除去することができる。したがって、その後のトリプシン処理Ｓ７３による他のタンパク質の分解は、コラーゲンに邪魔されることなく容易に行われ、細胞が培養容器から容易に剥離されるとともに、細胞間のギャップ結合も容易に切断されることになる。
【００２５】
その結果、トリプシン処理Ｓ７３に要する時間を短縮でき、あるいは、トリプシン処理Ｓ７３に使用するトリプシン溶液の濃度を低減することができるので、細胞膜にダメージを与えることなく、培養容器から分離し、あるいは細胞間のギャップ結合を切り離すことができる。
【００２６】
特に、生体組織に分化させた状態では、細胞がコラーゲンを多量に産生し、細胞外においてコラーゲン網ともいうべき細胞外マトリクスのネットワークを構築してしまう。このため、比較的早期（例えば、デキサメタゾン等による分化誘導開始から４〜５日程度）であればトリプシンのみで培養容器から分離することも可能であるが、分化誘導期間がそれより長くなる場合には、トリプシンのみでは細胞は培養容器から剥離されたとしてもシート状に剥離されるだけであり、ピペッティングを十分に行ったとしても、細胞をバラバラにすることはできなくなる。分化誘導期間がさらに長期化すると、トリプシンのみでは細胞を培養容器から剥離させることさえ困難になる。
【００２７】
本実施形態に係る細胞の分離方法によれば、細胞を培養容器から容易に剥離させるとともに、細胞をバラバラに分離することができる。また、シート状に剥離した場合であっても、ピペッティングにより細胞を分離することができる。その結果、その後の生体組織補填材への播種を偏りなく均一に行うことができるという効果がある。
【００２８】
また、本実施形態に係る細胞の分離方法によれば、トリプシン処理Ｓ７３を行う前に、コラゲナーゼ処理Ｓ７２において、培養容器内に残留しているコラゲナーゼを除去し、さらに洗浄する（ステップＳ７２４）ので、その後に添加されるトリプシンがコラゲナーゼを分解するために利用されることを防止することができる。すなわち、トリプシンの効果がコラゲナーゼの分解のために用いられることによって低減されてしまうことを防止して細胞の分解の効率を向上することができるという効果がある。
【００２９】
なお、トリプシン処理Ｓ７３後においても細胞がバラバラにならずに残存している場合においては、その後に追加のコラゲナーゼ処理を行うことも可能である。具体的には、トリプシン処理Ｓ７３後にピペッティングを行って顕微鏡で観察した結果、細胞が複数個固まっている場合には、回収した細胞を遠心分離して、これにコラゲナーゼ溶液を添加して培養する。これにより細胞間に残存していたコラーゲンが分解されるので、コラゲナーゼを洗浄除去することにより、バラバラに分離された細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】この発明の一実施形態に係る細胞の分離方法を適用する生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】本実施形態に係る細胞の分離方法を示すフローチャートである。
【図３】図１の分離方法の内、コラゲナーゼ処理ステップを説明するフローチャートである。
【図４】図１の分離方法の内、トリプシン処理ステップを説明するフローチャートである。
【符号の説明】
【００３１】
Ｓ７２  コラゲナーゼ処理
Ｓ７３  トリプシン処理
Ｓ７２１  コラゲナーゼ溶液添加ステップ
Ｓ７２２  培養ステップ
Ｓ７２３  洗浄ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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