(57)【要約】  【課題】  超音波を用いることによる、簡単な操作で短時間に効率的に卵子の活性化を誘起し得る方法を提供する。  【解決手段】  カルシウムイオンを含む培地中で卵子に超音波を照射することにより、卵細胞膜に一時的に孔を開け、そこからカルシウムイオンを流入させて卵細胞質内カルシウムイオン濃度を上昇させることによって、活性化を誘起する。超音波を用いて、簡単な操作で短時間に効率的に卵子の活性化を誘起でき、顕微授精胚や核移植胚の作製に資することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオンを含む培地中で卵子に超音波を照射することにより、前記卵子の卵細胞膜に一時的に孔を開け、前記孔からカルシウムイオンを流入させて前記卵細胞質内におけるカルシウムイオン濃度を上昇させることによって、活性化を誘起することを特徴とする、超音波による卵子活性化法。
【請求項２】
前記培地は、Zimmermann融合培地である請求項１記載の超音波による卵子活性化法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物卵子の人為的活性化法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
卵巣から排卵された卵子は、第２減数分裂中期で休止している。精子が卵子に侵入すると卵細胞質内におけるカルシウムイオン濃度が一時的に増加し、これが引き金となって減数分裂が再開される。この現象は卵子の活性化と呼ばれている。
【０００３】
卵子の活性化は、人為的な刺激によって誘起することも可能であり、人為的活性化は顕微授精胚や核移植胚のような通常の受精以外の方法で作出された胚の発生を開始させるために広く用いられている。
【０００４】
人為的活性化法としては、各種化学物質で処理することにより、卵細胞質内におけるカルシウムイオン濃度の上昇あるいはＭ期促進因子の活性低下を促進させる方法と、電気パルスの印加により卵細胞膜に一時的に孔を開け、そこからカルシウムイオンを流入させることにより、卵細胞質内カルシウムイオン濃度を上昇させる方法がある。
【０００５】
化学物質による方法は、その物質を添加した培地中で卵子を一定時間培養するだけなので、操作が簡単であり、一度に多数の卵子を処理することができる。また、特別な装置を必要としないが、動物種によっては効果的でない。
【０００６】
電気パルスによる方法は、再現性が高いので多くの動物種で用いられているが、電気パルスを印加する装置が必要である。また、２０個前後の卵子を一群として平行電極間に一列に並べてから電気パルスを印加するので、卵子の位置を細かく調整する技術が必要であるうえに、多数の卵子の処理には長い時間を要する。
【０００７】
最近になって超音波を用いた遺伝子導入法が開発された。超音波による遺伝子導入のメカニズムはまだ完全に解明されていないが、超音波エネルギーにより発生する直径１〜１００μｍのミクロの気泡が関与していると推測されている。細胞外においてこれらの気泡の複雑な物理運動が発生し、細胞膜の透過性を促進する。また、時速６００ｋｍ以上の速さを持つ液体マイクロジェット流が気泡の周囲に発生し、これらが細胞膜に突き刺さるように衝突した際に一時的な孔が出現して細胞膜付近にある遺伝子が細胞内に取り込まれると考えられている。
【０００８】
近年、超音波診断用造影剤（マイクロバブル）を併用することにより、低い超音波エネルギーでの遺伝子導入が可能となり、導入効率も１０〜１００倍増加した。従来は、卵子の活性化と同様に、細胞に電気パルスを印加して細胞膜に一過性の孔を開けることにより、細胞内に遺伝子を導入するエレクトロポレーション法が多く用いられてきたが、超音波導入法はエレクトロポレーション法と比較して、細胞に与えるダメージの少ないことが示唆されている。
【特許文献１】特開２００１−３７４７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、遺伝子導入を目的として開発された超音波照射装置を用いて、効率的に卵子の活性化を誘起し得ることを発見した。この方法は、化学物質による活性化が困難であるブタ卵子においても有効であり、加えて簡単な操作で一度に多数の卵子を処理できる。即ち本発明は、超音波を用いることによる、簡単な操作で短時間に効率的に卵子の活性化を誘起し得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の卵子活性化法は、カルシウムイオンを含む培地中で卵子に超音波を照射することにより、卵子の卵細胞膜に一時的に孔を開け、孔からカルシウムイオンを流入させて卵細胞質内におけるカルシウムイオン濃度を上昇させることによって、活性化を誘起する。
【００１１】
この構成により、超音波を用いて、簡単な操作で短時間に効率的に卵子の活性化を誘起し得る。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の卵子活性化法は、以上のように構成したので、超音波を用いて、簡単な操作で短時間に効率的に卵子の活性化を誘起し得る。したがって、顕微授精胚や核移植胚の作製に資することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明の一実施の形態における卵子活性化装置の概念図である。
【００１４】
図１に示すように、超音波照射装置１は、超音波プローブ２と接続されている。超音波照射装置１が発生する超音波は、超音波プローブ２の先端から直線的に照射される。超音波プローブ２は、スタンド３により適当な高さに支持される。
【００１５】
超音波プローブ２の先端は、４−ウェルディッシュ４に入れられた培地５に挿入される。４−ウェルディッシュ４は、磁気式スターラー６の上に載置される。
【００１６】
培地５には、ステープラー針７が投入され、磁気式スターラー６を作動させることによりステープラー針７が回転して培地５を撹拌する。
【００１７】
卵丘細胞を除去した卵子を培地５に投入し、以上の卵子活性化装置を用いて、磁気式スターラー６およびステープラー針７を用いて撹拌しながら、超音波プローブ２より超音波を照射する。
【００１８】
（実験例）
本発明者らは、次の実験を行った。食肉センター由来のブタ卵巣から未成熟卵を採取し、TCM-199を基礎とする成熟培地中で４０〜４２時間培養した。卵丘細胞除去後、第１極体を放出している成熟卵（排卵後の卵子と同様に第２減数分裂中期で休止している）を選出して本実験に供した。得られた卵子を無作為に４群に分け、以下の培地を入れた４−ウェルディッシュに移した。
Hepes-TLP培地
20％マイクロバブル（オプチゾン）を添加したHepes-TLP培地
Zimmermann融合培地
20％マイクロバブル（オプチゾン）を添加したZimmermann融合培地
Hepes-TLP培地は、卵子の体外操作用に広く用いられている培地であり、以下の組成からなる。1リットル中、6.66 g NaCl、0.24 g KCl、0.294 g CaCl2・2H2O、0.1 g MgCl2・6H2O、0.057 g NaH2PO4・2H2O、0.17 g NaHCO3、1.3 g Hepes (Na salt)、1.92 g Hepes (acid free)、0.9 g Glucose、0.0012 g Na pyruvate、1.85 ml Na lactate (60% syrup)、1 g PVAを加える。
【００１９】
Zimmermann融合培地は、電気パルスの印加により卵子の活性化を誘起する場合に広く用いられている培地であり、以下の組成からなる。1リットル中、45.6 g Sorbitol、0.16 g Ca Acetate、0.107 g Mg Acetate、0.119 g Hepes (acid free)、2 g BSAを加える。
【００２０】
超音波プローブ２の先端を培地５に挿入し、2.0 W/cm2、1 MHz、duty比50％の条件下で30秒間超音波を照射した。照射中は、培地５内に投入したステープラー針７を磁気式スターラー６で回転させることにより、常に培地５を撹拌した。
【００２１】
照射後、卵子は、活性化処理６時間後まで2.2 μg/mlのサイトカラシンBを添加した修正PZM3培地で培養後、サイトカラシンBを含まない同培地に移して培養を継続した。
【００２２】
修正PZM3培地は、ブタ卵子の体外培養に広く用いられている培地であり、以下の組成からなる。1リットル中、6.322 g NaCl、0.746 g KCl、0.099 g MgSO4・7H2O、0.048 g KH2PO4、2.106 g NaHCO3、0.24 g Na pyruvate、0.218 g Ca (lactate)2・5H2O、0.146 g Glutamine、0.546 g Hypotaurine、20 ml Basal Medium Eagle amino acid solution (x50)、10 ml Minimum Essential Medium nonessential amino acid solution (x100)、3 g BSAを加える。
【００２３】
培養2日後に分割率、7日後に胚盤胞形成率および胚盤胞の細胞数を観察した。
【００２４】
その結果、分割率はHepes-TLP培地、20％オプチゾンを添加したHepes-TLP培地および20％オプチゾンを添加したZimmermann融合培地では4.2〜8.7％と低かったが、Zimmermann融合培地では63.6％と高い値になった。
【００２５】
Hepes-TLP培地、20％オプチゾンを添加したHepes-TLP培地および20％オプチゾンを添加したZimmermann融合培地では胚盤胞は得られなかったが、Zimmermann融合培地では18.2％の卵子が胚盤胞にまで発生した。
【００２６】
得られた胚盤胞の平均細胞数は48.8個であった。これらの胚盤胞形成率および胚盤胞の平均細胞数は、電気パルスの印加により活性化を誘起した場合に匹敵するものであった。
【００２７】
以上の結果から、超音波の照射により、効率的に卵子の活性化を誘起し得ることが明らかとなった。また、その場合に用いる培地は、電気パルスの印加による活性化と同様に、非電解質を多く含むZimmermann融合培地が適していることおよび超音波による遺伝子導入には必須であったマイクロバブルが、超音波による卵子活性化に対してはむしろ阻害作用を持つことが示唆された。
【００２８】
なお、図１に示した卵子活性化装置は、単なる例示であり、本発明の趣旨を変更しない限りにおいて、種々変更できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施の形態における卵子活性化装置の概念図
【符号の説明】
【００３０】
１  超音波照射装置
２  超音波プローブ
３  スタンド
４  ４−ウェルディッシュ
５  培地
６  磁気式スターラー
７  ステープラー針
【図１】
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