(57)【要約】【課題】目標とする機能をもつタンパク質を設計する際の最適なアミノ酸残基配列を推定する技術に必要なアミノ酸残基間ポテンシャルの構成法として、従来の方法で正味ポテンシャルを計算すると、構造が拡散してしまうという問題点があった。【解決手段】本発明は、ポテンシャルの構成法として、グリシンとグリシンの平均力場ポテンシャルを他の残基間の平均力場ポテンシャルを構成する際のベースとして参照することを特徴とするポテンシャル構成法である。これによって、従来できなかったタンパク質構造の計算が可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のアミノ酸残基の配列上分布、空間分布を統計処理して得られる平均力場ポテンシャルの構成法の中で、ポテンシャルを形成するアミノ酸残基の対の正味のポテンシャル値として、統計的に得られる特定の残基種からなる対の空間相対分布を、グリシンとグリシンからなる対の空間相対分布で割ったものの負の対数を用いることを特徴とする平均力場ポテンシャル構成法。
【請求項２】
前記ポテンシャル構成法において、ポテンシャルを形成する残基対の配列上での相対位置（配列分離）に依存しないことを特徴とする平均力場ポテンシャル構成法。
【請求項３】
前記請求項1から2の方法で構成された平均力場ポテンシャルを用いて、タンパク質のアミノ酸残基配列とタンパク質の立体構造との適合性評価を行うことで、与えられたアミノ酸残基配列に対して、もっとも適合した立体構造を判別することを特徴とする、タンパク質立体構造予測法。
【請求項４】
前記請求項1から2の方法で構成された平均力場ポテンシャルを用いて、目的とするタンパク質立体構造となるタンパク質の最適なアミノ酸残基配列を推定することを特徴とするタンパク質設計法。
【請求項５】
前記請求項1から2の方法で構成された平均力場ポテンシャルを用いて、特定のタンパク質のアミノ酸残基配列を変化させた場合の熱安定性の変化量を推定することを特徴とするタンパク質熱安定性制御法、及び熱安定性設計法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目標とする機能をもつタンパク質を設計する際の最適なアミノ酸残基配列を推定する技術に必要なアミノ酸残基間ポテンシャルの構成法と、そのポテンシャルの構成法を用いた、アミノ酸残基配列設計法、タンパク質熱安定性制御法、及び結合タンパク質アミノ酸残基配列設計法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分子(protein molecule)の立体構造(tertiary structure)は、そのタンパク質を構成するアミノ酸残基配列(amino-residue sequence)によって決定されている。しかし、配列と立体構造との理論的な関係については、明確にわかっておらず、配列から、立体構造を構築(modeling)する方法は、確立されたとはいいがたい。また、この逆問題にあたる、目標とするタンパク質立体構造をもつタンパク質のアミノ酸残基配列を推定する方法も確立されたとはいえない。
【０００３】
タンパク質のアミノ酸残基配列は、DNAの遺伝子情報から求めることができるほか、質量分析法などによって求めることができる。したがって、判明している遺伝子の数だけのタンパク質配列がデータとして登録されており、その数は数十万種類に及ぶ。
【０００４】
立体構造は、X線結晶解析(X-ray crystallography)や核磁気共鳴法(NMR nuclear magnetic resonance)によって求める場合、その実験、解析に多大な時間と労力と大きな設備を要する。現在までに、タンパク質立体構造データベースPDB(米国ラトガース大学に本拠地をもつ構造生物学研究連合(Research Collaboratory for Structural Biology) が管理する無償のデータベースhttp://www.rcsb.org/pdb/)には、二万以上の立体構造のデータが登録されているが、同じタンパク質を重複して登録している場合が多く、種類で考えた場合、せいぜい二千種類程度である。
【０００５】
タンパク質のアミノ酸残基配列と立体構造との明確な関係(sequence-structure correlation)がわかり、アミノ酸残基配列から立体構造が理論的に、あるいは計算によって求められるようになれば、残基配列の判明している全タンパク質の立体構造が求められるようになるし、また反対に、必要とされる機能を持つタンパク質の立体構造を想定し、その想定された立体構造をもつ人工タンパク質のアミノ酸残基配列がどのようなものであるべきかを計算によって設計することができるようになる。これは、人工タンパク質の立体構造設計技術につながり、人工タンパク質を産業利用する場合の重要な技術になる。
【０００６】
タンパク質のアミノ酸残基配列と立体構造との関係から、タンパク質のアミノ酸残基配列のみが与えられた場合に、そのタンパク質の立体構造を推定するのが、タンパク質立体構造予測である。1970年代から研究されはじめ、当初は、タンパク質中の二次構造(secondary structure. helix,strand/sheetなどの規則的構造とcoilなどの不規則構造を指す)を予測することから始まった(非特許文献1,2)。1980年代には、タンパク質が、折り畳まれていない状態から安定した折り畳み構造をとるまでの物理的なメカニズムの研究がなされた（非特許文献3)。
【０００７】
1990年代に入り、タンパク質のアミノ酸残基配列と立体構造との互換性(sequence-structure compatibility)を評価することによる折り畳み認識法(fold recognition)が開発され(非特許文献4、非特許文献5、および非特許文献6)、その後、配列解析技術(sequence analysis technique)が大幅に進歩したのをうけて(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、今日、タンパク質の概略の構造を推定することは、実用段階を迎えた。しかし、これらの方法は、予測しようとするタンパク質の立体構造が、タンパク質立体構造データベースに登録されている構造既知のタンパク質と非常に類似していることを前提としており、データベースにない新規構造を求めることはできない。また、構造既知のタンパク質と類似していたとしても、細かくみれば、かなり異なる構造であることも多く、正確なタンパク質立体構造予測ができるとはいいがたい。
【０００８】
そこで、構造既知構造と全くことなる新規構造をも予測可能な方法として、自元構造予測法(structure prediction ab initio, ab initio = from beginning)がある。これは、1980年代以来考えられてきた、タンパク質の折り畳みシミュレーションの発展型であり、与えられたアミノ酸残基配列からなるタンパク質をシミュレーションによってエネルギー最小化し、その最小のエネルギーをもつ構造をもって予測結果とするものである。1990年代も終りになって、断片組み立て法(segment assembly) 法が開発され(非特許文献7)、かなり効率よく、また精度の高い立体構造予測が可能になった。
【０００９】
断片組み立て法は、数残基からなる立体構造断片のとり得る部分立体構造を、タンパク質立体構造データベースからサンプリングし、この断片を連結することで、全体構造を構築しつつ、その分子動力学的、あるいは統計的ポテンシャルエネルギーが最小になるようにするものである。この方法によって、100残基程度からなる比較的小さなタンパク質については、実用的な時間で立体構造がかなり正確に予測できるようになった。しかし、その計算量は、まだ莫大であり、100CPU程度の並列計算機で、数十時間を要するものである。
【００１０】
また、従来から指摘されていた問題として、エネルギー最適化を行なう場合のポテンシャルエネルギーとしてどのようなものを用いるか、という問題があった。
【００１１】
エネルギー関数として、従来は、原子間ポテンシャルを用いていたが、この場合水分子の影響を考慮する必要があり、タンパク質分子を包み込むだけの水分子をおよそ数万個を計算する際に導入する必要があった。この計算量が非常に大きく、エネルギー最適化が難しいものになっていた。そこで導入された統計的なポテンシャルとして、Sipplらの定義(非特許文献8)による平均力場ポテンシャルがあった。これを多次元に拡張した多次元平均力場ポテンシャル(非特許文献9)は非常に精度の高いものであったが、エネルギー最適化において利用する上では、大きな課題が存在した。
【００１２】
このようなタンパク質立体構造予測法が研究されるのと並行して、タンパク質設計法についても研究がなされてきた。目的の機能をもつ人工タンパク質を設計することは、目的の機能をもつタンパク質のアミノ酸残基配列を設計することである。現状においては、このような研究の多くは、残基間相互作用に関する研究者のさまざまな知見を総動員して、配列を試行錯誤的に作っていくものであり、タンパク質立体構造予測法、あるいは立体構造構築法を逆に応用して、与えられたタンパク質立体構造に最適な配列を推定することによってタンパク質配列を設計することは、少数の例外 (非特許文献10,11, 12) を除いて行われていない。
【非特許文献１】Fasman G.D.,(1989) Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, New York: Plenum Publishing Corporation
【非特許文献２】RostB., Sander C., (1993) Prediction of Protein Secondary Structure at better than 70% Accuracy. J. Mol. Biol., 232,584-599.
【非特許文献３】Fasman G.D., (1989) Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, New York: Plenum Publishing Corporation
【非特許文献４】Sippl M.J. (1990) Calculation of Conformational Ensembles from Potentials of Mean Force: An Approach to the Knowledge-based Prediction of Local Structure in Globular Proteins. J. Mol. Biol., 213,859-883
【非特許文献５】Bowie J.U. Luthy R.L., Eisenberg D. (1991)A Method to Identify Protein Sequences That Fold into a Known Three-Dimensional Structure. Science,253, 164-170.,YueK.,
【非特許文献６】Dill K. (1991)  Inverse protein folding problem: Designing polymer sequences.  Proc Natl Acad Sci USA, 89,4163-4167.
【非特許文献７】Simons KT, Kooperberg C, Huan ES,Baker D, (1997) Assembly of protein tertiary structures from fragments with similar local sequences using simulated annealing and Bayesian scoring functions.  J. Mol. Biol. 268,209-225.
【非特許文献８】Sippl M.J. (1990) Calculation of Conformational Ensembles from Potentials of Mean Force: An Approach to the Knowledge-based Prediction of Local  Structure in Globular Proteins. J. Mol. Biol., 213,859-883.
【非特許文献９】Onizuka K., Noguchi T., Akiyama Y., Matsuda H., (2002) ``Using Data Compression for Multidimensional Distribution Analysis Intelligent SystemsMay/June2002, 48-54.
【非特許文献１０】Ota M, Isogai Y, Nishikawa K.(2001) “Knowledge-based potential defined for a rotamer library to design protein sequences.” Protein Eng. 2001 Aug;14(8):557-64.
【非特許文献１１】Isogai Y, Ishii A, Fujisawa T, Ota M, Nishikawa K. “Redesign of artificial globins: effects of residue replacements at hydrophobic sites on the structural properties.” Biochemistry. 2000 May 16;39(19):5683-90.
【非特許文献１２】Jin W., Kambara O., Sasakawa H., Tamura A., and Takada S. (2003) “De Novo Design of Foldable Proteins with Smooth Folding Funnel: Automated Negative Design and Experimental Verification” Structure, May 2003, 581-590.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
統計的手法で、残基間ポテンシャルを構成しようとした場合、残基対の正味のポテンシャル値をどのように計算するかが、問題となる。単純に残基対の相対分布を考えた場合、その分布が、その対を構成する残基の正味の物理化学的力場による部分と、周囲の残基からの間接的な誘導によって、その分布をとるようになった部分が混ざり合った状態になり、ここから得られるポテンシャルの値を、立体構造を構成する全ての残基対について和をとった場合、特定の対について、周囲の残基から間接的に誘導されるポテンシャル値の部分が重複し、結果として、ポテンシャル値はその対の正味の相互作用を表しているとはいえない。
【００１４】
このポテンシャル値を使って、立体構造を最適化しようとすると、この重複により、全体的に高密度な構造が得られる。Sipplらは、この問題を避けるために、残基種を問わないあらゆる対についてその分布統計をとり、その相対頻度で、割った相対分布比の負の対数を正味のポテンシャルとすることを考えた。この方法は、構造認識法に用いると、かなりうまく働くことがわかっている。しかしながら、この正味ポテンシャルを、構造最適化に用いると、今度は、構造全体が拡散したものになり、まとまった構造をとることができない。
【００１５】
よって、高密度化していしまう絶対値ポテンシャルと、構造が拡散してしまう正味ポテンシャルの中間的なものを想定する必要がある。
【００１６】
統計的手法でのポテンシャル計算法について、数学的な定義を与え、その上で、本発明において解決すべき課題を明確化する。
【００１７】
二つのアミノ酸残基が、X線結晶解析やNMRなどの立体構造解析法で解明された固定的なタンパク質立体構造中で、空間的にどのような相対配置にあるかを調べ、アミノ酸残基種の対ごとに、その相対配置の分布を観測する。その際、対を成すアミノ酸残基が、タンパク質の配列中でどれだけ離れているかも重要な要素になるので、その配列上で相対位置（配列分離）も考慮して統計を取る。アミノ酸残基の種類を、a,b とし、配列分離を  k とすると、相対配置Ｒの分布は、残基種  a, b と、配列分離k と、相対配置によって与えられる。ここで配列分離 k は、残基種が  a であるアミノ酸残基の配列上の位置がN 末端側からみてi であり、残基種がb であるアミノ酸残基がN末端側から見て  j である場合のその位置の差k=j-i をいう。よって配列分離k は、正の数の場合（a がbよりもN末端側）と負の場合（a が  b よりもC末端側）がある。
【００１８】
相対配置Rは、Sipplらが行ったものは、対を構成するアミノ酸残基のCα原子間距離、ないしは、Cβ原子間距離であったが、アミノ酸残基は三次元的構造をもつものであるから、配置としては、最低でも六自由度をもつものであり、距離のみによるものであるとは限らない。相対配置R のa,b,kについての分布を正規化したもの(Rのとり得る空間で積分した結果が１になるようにしたもの)を、相対頻度  fabk(R)とする。この相対頻度f ab(R) の負の対数 -log f abk(R) を、平均力場ポテンシャルという。アミノ酸残基配列S が、立体構造Ｃをとる確率尤度として、この平均力場ポテンシャルを用いることができる。すなわちこの配列Sが、立体構造Ｃとなった場合の、構造中の全ての可能なアミノ酸残基の対について、その対を構成する残基種（配列Ｓによって決まる）と、その対をなす残基の空間的な相対配R 、及び、その残基の配列分離 k から、平均力場ポテンシャル-log f abk(R) を計算し、全ての対についてこのポテンシャルの和をとると、配列Ｓが構造Ｃをとる確率尤度Eabsが計算できる。
【００１９】
【数１】
2005049188.tif 000002
【００２０】
この値が、小さいほど、配列Ｓがこの構造Ｃをとる可能性が高いと判断できる。ここで用いた平均力場ポテンシャル -log f abk(R)を、絶対値ポテンシャルと呼ぶ。しかし、このポテンシャルを用いて、配列Ｓと構造Ｃの確率尤度Eabsを計算すると、確率的な前述のように対以外の残基からの相互作用相当分が交じり合い、望ましい確率尤度にならない。すなわち、どのような配列であっても、Eabs が小さくなるような構造は、非常に密度の高い構造になってしまう。
【００２１】
そこで、Sippl らは、アミノ酸残基の種類を問わない相対頻度  fk(R) を用い、-log f abk(R)/fk(R) を平均力場ポテンシャルとして用いることを提唱した。これを、正味ポテンシャルという。正味ポテンシャルを用いて、配列Ｓと構造Ｃの確率尤度を計算すると（これを、Enetとする）、今度は、どのような配列Ｓについても、構造Ｃとして確率尤度が高いのは、拡散した構造であり、この正味ポテンシャルも、正しい確率尤度を与えているとは考えられない。
【００２２】
【数２】
2005049188.tif 000003
【００２３】
この問題は、基本的には、多体問題であるタンパク質立体構造配列相関を、二体問題の組み合わせとして考えていることに起因する。絶対値ポテンシャルにおいて、高密度構造ができてしまう理由は、本来ほとんど相互作用していない残基間にも、統計的には、相互作用があるかのように見えてしまうことが原因である。構造中に三つの残基  a,b,c があって、これらが、互いに空間的にも近傍によりそっているとする。その場合、a と  c が近くにあるのが、a と  c が互いに相互作用しているからなのか、それとも、a と  b   が相互作用し、b と  c が相互作用している間接的な誘導の結果として、近くにあるのかが、不明である。タンパク質の立体構造と配列との相関は、多体問題であるから、特定の残基間に働く正味の相互作用を反映したポテンシャルを計算するには、周囲からの影響を排除しないといけない。しかし、実際に統計をとるためのデータとしては、多体の立体構造であるため、単純な統計処理では正味の相互作用を反映したポテンシャルを導くことはできない。
【００２４】
Sipplらの導入した正味ポテンシャルは、アミノ酸残基の種類を問わない平均的な残基対の相対配置の相対頻度で fk(R) で、残基種ごとの相対頻度f abk(R) を割ることで、正味の相対頻度を計算しようとしている。しかし、この場合、アミノ酸残基間の相互作用で、立体構造を高い密度で硬いものに纏めようとする引力に対応する分布が消えてしまい、結果として、残基間の相互作用のうちの引力的項目が排除されてしまう。これが、立体構造が拡散してしまう原因である。実際、生体アミノ酸20種類のうち、立体構造を強固な形で支えているのは、疎水性残基であり、疎水性残基間には、強い引力が働くことが知られている。そして、これら疎水性残基の頻度は、他の親水性残基に比べて多く、残基種を問わない相対頻度 fk(R) を計算すると、相対的に頻出するこれら疎水性残基の対の影響が強く出る。そこで、fk(R) の部分を差し引いた正味ポテンシャル -log f abk(R)/fk(R) では、疎水性相互作用に関する部分がほぼ完全に差し引かれてしまい、この正味ポテンシャルを用いて確率尤度を計算し、この確率尤度を小さくするように構造を最適化すると、構造が拡散してしまうのである。
【００２５】
タンパク質の立体構造と配列との相関を統計的に解析する場合の課題は、すなわち、絶対値ポテンシャル -log f abk(R) や正味ポテンシャル  -log f abk(R)/fk(R) よりもより残基間の正味の相互作用を反映したポテンシャル構成法を構築し、より高い精度で、配列Sと構造Cとの間の確率尤度を計算できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、正味ポテンシャルを改良し、より望ましい確率尤度を計算しようとするものである。
【００２７】
本発明では、この正味のポテンシャルをより精密に導くために、互いに相互作用をほとんど持たない残基対というものを考えた。もし、物理化学的にみて、まったく相互作用のない残基種の対（残基種を  x,y とする）が存在したと仮定すると、この残基種からなる対は、相互作用がないので、その相対配置がなんであっても力を及ぼしあわない。したがって他の残基がない場合、この正味の相対配置の分布は場所に依存せず一定になるはずである。よって他の残基を含む条件で観測される相対配置の相対頻度 f xyk(R)  は、周囲の残基からの影響によって仮想的に現れた相互作用によって形成されたもののみであるといえる。
【００２８】
したがって、相互作用を有すると思われる残基対  a,b に関して観測された相対頻度から導かれる絶対値ポテンシャル-log f abk(R)から、この相互作用を起こさない残基対の観測された相対頻度から得られる絶対値ポテンシャル -log f xyk(R) を差し引けば、正しい正味のポテンシャルが計算できるはずである。
【００２９】
つまり、Sippl らの正味ポテンシャルで、残基種を問わない対の相対頻度  fk(R) を用いた部分に、fxyk(R) を用いて、新たな正味ポテンシャル -log f abk(R) /f xyk(R) を計算するわけである。
【００３０】
物理化学的にみて、まったく相互作用をしないと考えられる残基種の対  x,y というものをどう考えるかが次に重要になる。20種類の生体アミノ酸の中には、側鎖が、水素原子一つだけであるグリシンが存在する。グリシン残基は、比較的に他のアミノ酸残基に比べて頻出すると同時に、親水的でも疎水的でもない。また、側鎖が存在しないことにより、周囲の影響でどのような局所構造にも存在する。グリシンを多数結合した、ポリグリシンは、計算機シミュレーションによると、まとまった構造をとらず、α螺旋構造でもβシート構造でも、あまり安定性がない。このことから考えると、グリシン残基そのものには、構造形成能力はなく、グリシン残基とグリシン残基の間の相互作用も、非常に小さいと考えられる。したがって、グリシンの対  GG  は、相互作用のないアミノ酸残基対x,yの候補としては、かなり相応しいと考えられる。そこで、本発明における、平均力場ポテンシャルにおける課題解決の方法は、まず、グリシンの対からなる相対頻度を用いた、正味ポテンシャル計算法である。
【００３１】
次に、統計的に得られる相対頻度から計算される平均力場ポテンシャルと物理化学的な相互作用との関係について、考えてみる。タンパク質立体構造配列相関を考える上での、統計的に得られる相対頻度は、X線結晶解析やNMR（核磁気共鳴）によって得られた確定した立体構造データ内の残基対の相対配置の分布から得られるものである。したがって、時間平均という概念もなく、さらに、一種類のタンパク質については、一種類の構造しか原則として与えられない。このような構造のデータセットから得られた相対頻度は、いわゆるアンサンブル平均ではない。ある残基対は、その正味の相互作用によって特定の相対配置を取ろうとするが、他の残基との相互作用によって、その特定の相対配置から多少ずれた相対配置になっていて、そのずれの部分が他の残基との相互作用とのつりあいをとっていると考えられる。そこで、今観測している残基対全体について統計的に得られる相対頻度は、対が、本来とろうとする特定の相対配置近傍がもっとも頻度が高くなるようなものであろう。ここで、簡単な系を考えて、このようなつりあいの位置にあるものが、ほかから様々な相互作用でつりあいの位置がずれる現象について考えてみる。ある粒子が、調和振動子系のポテンシャル、すなわち平衡点から離れるにしたがってその平衡点から距離の二乗に比例するようなポテンシャルの中に存在するとする。簡単のために一次元系を考えてみる。この粒子は、周囲からなにも相互作用がない場合は、平衡点に存在するか（運動エネルギーがない場合）、平衡点を中心として調和振動するか（運動エネルギーがある場合）のどちらかである。データベースで与えられるタンパク質の立体構造データと同じ状態なのは、固定した位置関係であるから、この運動エネルギーのない場合に相当する。この場合、その調和振動子系のポテンシャル中の粒子の存在する位置の分布、相対頻度は、平衡点で無限大に発散するδ関数の形をとるであろう。つまり、いつでも平衡点にのみ存在することになる。それでは、この粒子に、外部から他の力が働いている場合はどうか。この場合、この粒子は、この外部からの力のポテンシャルと、本来の調和振動子系のポテンシャルとのつりあいの点にのみ存在するようになるであろう。すなわち、外乱のポテンシャルと本来のポテンシャルとの和で与えられるポテンシャルの平衡点に、粒子は存在することになる。では、サンプルごとに、外乱のポテンシャルが異なっている場合は、どうであろうか。外乱のポテンシャルが、ガウス分布的なゆれの分布をもつような場合、平衡点の位置もまたガウス分布的にゆれるので、結果として、この場合の粒子の分布は、本来の平衡点近傍のガウス分布になる。ガウス分布に対する確率論的なポテンシャルの形状は、調和振動子系のものと数式上は一致する（係数については一致はしない）。すなわち外乱がガウス分布的であれば、本来の物理的ポテンシャルと相似のポテンシャルが統計的にも得られることになる。もちろん、外乱のポテンシャルに偏りがあれば、その偏り分が反映した場所に分布の中心が来る。X線結晶解析やNMRで与えられた固定的な立体構造サンプルは、その形でつりあいがとれていて、それよりも低エネルギーの状態にはならないと考えられるから、��わば平衡点にある構造ということになる。そこで、様々な立体構造全体にわたって、特定の残基種について、相対配置の分布を取ることは、構造ごとに多少異なる外乱を与えた結果としての対の分布を計算していることになり、この外乱が、ガウス分布的であると仮定すれば、得られた分布は、ある程度本来の物理化学的な相互作用を反映しているといえる。だとすれば、外乱はできるだけランダムであるべきである。配列上、ｋだけ離れた二つの残基の相対配置を考える従来法では、このkによって、外乱の仕方が違うということを考慮していたことになる。しかし、実際には、本来の相互作用を反映したポテンシャルを求めようとする上では、外乱はできるだけランダムである必要があるから、ｋをいろいろに変化させて、それらを総合した結果のほうが、よりいっそうランダムな外乱から得られた結果になる。すなわち、これまで残基対の相対頻度として、配列分離  k  を考慮したf abk(R) を考えてきたが、物理化学的な相互作用をより一層反映していると考えられるのは、配列分離  k  を無視した f ab(R)である。
【００３２】
本発明の課題解決の手段の二つ目としては、この配列分離  ｋ  を無視するというものである。
【００３３】
纏めると、残基対の相互作用を統計的に求める方法として、よりその残基対の正確な相互作用を求めるならば、絶対値ポテンシャルから、グリシン対の相対頻度に基づく絶対値ポテンシャルを差し引いて、さらに、配列上の分離k を無視したものがよいという結論になる。数式で表せば、-log f ab(R)/f GG(R) である。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の正味の平均力場ポテンシャル  -log f ab(R)/f GG(R) を用いることにより、従来法よりも、より精度の高い確率尤度を計算できる。また、立体構造に変異を加えて構造を最適化する場合、従来法での正味の平均力場ポテンシャル  -log f abk(R)/fk(R) では、構造が拡散し、また、絶対値ポテンシャル  -log f abk(R) では、構造が高密度化して望ましい最適化ができないが、本発明のポテンシャル  -log f ab(R)/f GG(R) では、この両者の問題点を解決することができる。よって、立体構造予測精度や、配列設計制度を高めることができ、また熱安定性制御、設計精度も高くすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明における、前記の正味の平均力場ポテンシャル -log f ab(R)/f GG(R) を計算する方法は以下に述べる通りである。
【００３６】
まず、図1にあるように、１１のタンパク質立体構造データベースPDB(Protein Data Bank) の中から、１２において、配列の類似度の指標（相同性）が、互いに一定以下になるような立体構造の代表を選び、これを、１３のデータセットとする。配列の類似度の指標（相同性）が一定以下とは、20％から50％の間で選ばれる一定の相同性よりも小さいという意味である。2003年段階のPDBで、仮に30％以下の相同性となるよう立体構造の代表を選ぶ場合、その選ばれた代表的な立体構造の数は、2000個程度になる。統計を取る上では、残基数が一定値（40から100残基）以下のものを排除して代表立体構造を選ぶほうが良い。なお、具体的な相同性の計算方法については、例えば、Noguchi et.al.,Bioinformatics. 2000 Jun;16(6):520-6に記載されている。
【００３７】
こうして選ばれた１３の2000程度の立体構造を含むデータセットの中から２２において立体構造を一つ一つ順に取り出す。次に、取り出された各立体構造において次のことを行う。２３において、取り出されたl番目立体構造の i 番目と、２４において j 番目のアミノ酸残基を取り出し、i  番目の残基の残基種aと j番目の残基の残基種b を調べる（PDBデータベース中に明示されている）。次に、２５において、i  番目の残基を構成する原子群の三次元座標値、j 番目の残基を構成する原子群の座標値を調べ（PDBデータベース中に明示されている）、i 番目と  j 番目の残基の相対配置Rijを計算する。相対配置Rijは、単純に残基間距離として、i  番目の残基とj 番目残基双方のCα原子、あるいはCβ原子の距離を用いることもできるほか、（非特許文献9）で定義されるように、i 番目の残基固有の座標系からみたj 番目の残基の位置と、i 番目の残基と同じ姿勢をとるようにj  番目の残基の姿勢を回転させる場合のオイラー角を用いて六自由度の相対配置を用いることもある。さらに、側鎖の方位なども含めれば、自由度、次元はより大きなものになる。本発明にかぎっていえば、用いる相対配置の自由度、次元と本発明は無関係である。
【００３８】
ただし、相対配置の自由度、あるいは次元が大きいほど、高い精度のポテンシャルが計算できる。次に、２６において、相対配置Rを対を構成する残基種a,b ごとに２７に蓄積する。この分布を蓄積する方法については、たとえば、相対配置が距離のみを考慮した一次元のものでは、ヒストグラムを用いることが考えられるし、多次元の場合は、（非特許文献9）にある線形展開の方法が考えられる。この分布の蓄積方法は、本発明とは無関係であるが、精度の高い方法であるほど高い精度のポテンシャルが計算できる。次に蓄積された相対配置Rの分布を正規化する。相対配置Rの分布は、残基対を構成する残基種ごとに蓄積されているので、その分布のサンプル数で分布の値を割れば、正規化できる。こうして、正規化された分布が、残基種 a,b と、相対配置Rについての、相対頻度  f ab(R) である。
【００３９】
このように残基種 a,b ごとに、f ab(R) がデータとして蓄積された状態で、特定の残基種 a, b が、相対配置Rにあるときの、本発明である正味の平均力場ポテンシャルは、-log fab(R)/f GG(R) として計算される。ここで、f GG(R) は、f ab(R) のうち、a,b がともにグリシンである場合をあらわす。したがって、正味の平均力場ポテンシャルの、グリシンとグリシンのペアの場合の値は、-log f GG(R)/f GG(R) = 0から、Rに無関係にゼロになる。
【００４０】
以上が、本発明を統合した平均力場ポテンシャルの構成法である。
【００４１】
本発明のグリシン対のポテンシャル値を参照ポテンシャルとした正味の平均力場ポテンシャルを用いて、タンパク質立体構造予測を行うには、以下のような方法をとる。構造を予測しようとするタンパク質のアミノ酸残基配列Sが与えられたときに、このSをPDBデータベース中の様々な立体構造Cに当てはめて、それぞれの立体構造Cが配列Sをもった場合の、立体構造中の全ての可能な残基の対について、Sに基づいて決定される残基種a, b とその構造Cにおけるその残基対の相対配置Rから計算される、正味の平均力場ポテンシャル -log f ab(R)/f GG(R) の和を計算する。この和が、構造配列適合性度であり、確率尤度 EGGnetデータベース中の全ての構造の中でEGGnet がもっとも小さくなるものを選ぶことによって、与えられた配列Sに最も相応しい立体構造が得られる。得られた立体構造に微小変形を加えて、EGGnetが更に小さくなるように最適化することもできる。この方法の詳細は、特願2002-318193に記載のアルゴリズムをそのまま適応する。ただし、用いるポテンシャルは、-log f abk(R) や、-logf abk(R)/fk(R) ではなく、-log f ab(R)/f GG(R) に変更する。以上が、本発明の立体構造予測法である。
【００４２】
本発明のグリシン対のポテンシャル値を参照ポテンシャルとした正味の平均力場ポテンシャルを用いて本発明の配列設計は、設計しようとするタンパク質の立体構造Cが与えられたときに、様々な配列Sを構造Cに当てはめて、EGGnet を計算し、このEGGnet が最適になるSを求めることである。生体アミノ酸は20種類あるので、長さがNの構造である場合、可能な配列Sの数は20Nという膨大な数になる。そこで、これら全てについて、EGGnetを計算することは不可能である。そこで、EGGnetがゼロになるグリシンのみの配列を考慮し、各残基の位置で、それぞれの残基種について-log f ab(R)/f GG(R)の和を計算し、もっとも良い残基種を選ぶ。こうして、決まった配列をもとに、これを繰り返すことで、収束する配列を選ぶ。このアルゴリズムの詳細は、繰り返し法として知られているものであり、（非特許文献10,11）に詳しい。以上により、与えられた立体構造Cに対して、準最適な配列Cを設計することができる。
【００４３】
本発明のグリシン対ポテンシャル値を参照ポテンシャルとした正味の平均力場ポテンシャルを用いて、熱安定性を計算するには、与えられた配列Sをもち立体構造がCであるタンパク質について、EGGnet を計算すればよい。配列SをS'に変化させて、その際のEGGnet  の値が、もとのE'GGnet よりも小さければ、熱安定性が高くなり、大きければ熱安定性が低くなる。よって、要求によって、熱安定性が高くなるようにするには、配列Sを変化させて、E'GGnetが小さくなるようなものを探索すればよい。以上が本発明の熱安定性制御法、および設計法である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明にかかる平均力場ポテンシャル構成法を用いれば、従来できなかったタンパク質構造を計算することができ、タンパク質の立体構造設計に有用である。したがって、人口タンパク質の立体構造設計技術につながり、人口タンパク質を産業利用する場合に重要な技術となる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】PDBデータベース中から、データセットを選ぶ方法を示す図
【図２】平均力場ポテンシャルの統計の蓄積アルゴリズムの説明図
【図１】
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【図２】
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