(57)【要約】【課題】  正しくフォールディングされたタンパク質を合成することが可能な、新たな無細胞タンパク質合成系を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明では、無細胞タンパク質合成系において、(a)目的タンパク質に対する抗体、(b)目的タンパク質がレセプターである場合のそれに対するリガンド、(c)目的タンパク質がリガンドである場合のそれに対するレセプター、(d)目的タンパク質が活性を発揮する際に他の分子との複合体を形成する場合の該他の分子、及び(e)目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造を認識してこれへ結合する分子、からなる群より選択される一つ以上の特異的結合分子の共存下で目的タンパク質を合成する。特異的結合分子が合成途中の目的タンパク質に結合することによって、目的タンパク質の正しいフォールディングが促される。【選択図】  図１１
2005160433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)目的タンパク質に対する抗体、(b)目的タンパク質がレセプターである場合のそれに対するリガンド、(c)目的タンパク質がリガンドである場合のそれに対するレセプター、(d)目的タンパク質が活性を発揮する際に他の分子との複合体を形成する場合の該他の分子、及び(e)目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造を認識してこれへ結合する分子、からなる群より選択される一つ以上の特異的結合分子の共存下、無細胞タンパク質合成系で目的タンパク質を合成することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記特異的結合分子が、ファージディスプレイ法を利用して調製された分子である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記特異的結合分子が、ネイティブ状態の目的タンパク質に対して特異的に結合する分子である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記目的タンパク質が酵素であって、且つ
前記特異的結合分子が、前記目的タンパク質の酵素活性を阻害することなく前記目的タンパク質に結合する分子である、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記無細胞タンパク質合成系が、in vitro転写／翻訳系である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記特異的結合分子が抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv及びdsFvからなる群から選択される抗体断片である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記抗体が一価の抗体である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
i)(a)目的タンパク質に対する抗体、(b)目的タンパク質がレセプターである場合のそれに対するリガンド、(c)目的タンパク質がリガンドである場合のそれに対するレセプター、(d)目的タンパク質が活性を発揮する際に他の分子との複合体を形成する場合の該他の分子、及び(e)目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造を認識してこれへ結合する分子、からなる群より選択される一つ以上の特異的結合分子の共存下、無細胞タンパク質合成系で目的タンパク質を合成するステップと、
ii)前記特異的結合分子を他の物質に結合ないし吸着させることによって、ステップi)で合成された目的タンパク質を分離するステップと、
を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
i)ファージディスプレイ法を利用して、目的タンパク質に対する抗体を調製するステップと、
ii)ステップi)で調製した抗体の共存下、無細胞タンパク質合成系で目的タンパク質を合成するステップと、
を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかの製造方法によって製造されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成系を利用してタンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムやイネゲノム等の塩基配列の解明が急速に進むポストゲノム時代の現在、ゲノム中に含まれる遺伝子の発現産物であるタンパク質の構造や機能の解明が進められている。特に、所定のコンホメーションをとることによって、又は翻訳後修飾を受けることによって固有の機能を発揮する機能性タンパク質（各種の酵素や抗体等）の解析に大きな関心がもたれている。このようなタンパク質の解析を進めるためには、解析に供し得る程度に目的のタンパク質を大量に生産しなければならない。しかも、高品質の状態のタンパク質を用意することが望まれる。しかしタンパク質の合成に関しては、核酸（遺伝子）の高品質且つ迅速な生産を可能としたＰＣＲ法に相当するような方法は未だ存在しない。
【０００３】
従来、タンパク質を合成する方法としては、大腸菌、酵母、培養細胞などの生細胞を用いる発現系（生細胞系）が広く利用されてきた。しかし、例えば細菌（例えば大腸菌）を用いた発現系で真核生物のタンパク質を発現させると封入体（inclusion body）が生じ易く、天然型（ネイティブ）の活性を保持したタンパク質が得られない場合が多い。一方、酵母などの真核生物を用いた発現系も利用されているが、効率性や操作性の面で問題を抱えているため、多種類のタンパク質の同時解析を目的とする場合など、短時間で数多くのタンパク質を合成することには好適な方法とは言えない。また、生細胞は自己の細胞機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向が強いため、発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
生細胞系が抱える上記の問題点を解決できる方法として、無細胞タンパク質合成系（以下、「無細胞系」とも呼ぶ）或いはin vitro翻訳系と呼ばれる、細胞を用いないタンパク質合成方法が開発され、近年特に注目を集めている。無細胞系は、生細胞を維持しなくてよいことから操作性に優れ系の自由度も高いこと、細胞に毒性のタンパク質も生産できること、短時間でタンパク質合成が可能なこと、多種類のタンパク質を同時にかつ迅速に合成できること（ハイスループット）、非天然型タンパク質も合成可能であること、などの利点を有する。このように数多くの優れた特徴を備える無細胞系は、生細胞系が抱える問題点を解決できる有望な手法であって、様々なタンパク質の合成に利用されるものと期待されてきた。しかし無細胞系であっても、合成されたタンパク質が適切にフォールディングされないために天然型のコンホメーションをとれず、不溶化ないし凝集が生じる場合の多いことが報告されている。凝集は、正常なフォールディング及び会合と競合し、そのタンパク質の活性の低下ないし喪失をもたらす。凝集が起こる理由は、ほどけた状態のポリペプチド鎖は疎水性アミノ酸の側鎖を表面に露出し、互いに分子間や分子内で会合する傾向があり、その結果正しくない分子間相互作用が生じ、タンパク質が天然状態になることが妨げられるからである。最終的に不均一な凝集体が形成されるとタンパク質のポリペプチド鎖は回復せずにその活性を失う。このような凝集を、合成する際のタンパク質濃度、溶媒条件、温度、イオン強度などの物理化学的パラメータの調整によって、ある程度抑制することは可能である（非特許文献１〜３等）。
【０００５】
凝集を抑制するための他のアプローチとして、分子シャペロンを利用する方法が提案されている（特許文献１）。分子シャペロンとは、細胞内におけるタンパク質の合成においてタンパク質のフォールディングを制御する分子であって、HSP60ファミリー、HSP70ファミリーなど、いくつかのグループに分類されている。
分子シャペロンを無細胞タンパク質合成系に利用した例として、翻訳反応の際に分子シャペロンを共発現させることによって、合成されるタンパク質の収量や活性を高め得ることが報告されている（特許文献２）。
【０００６】
【特許文献１】特表平８−５０８６５１号公報
【特許文献２】特開２００２−３３５９５９号公報
【非特許文献１】Jaenicke R, Rudolph R.: Methods Enzymol. 1986,131,218-250
【非特許文献２】Kiefhaber T, Rudolph R, Kohler HH, Buchner: J.Biotechnology (N Y). 1991 Sep;9(9):825-829.
【非特許文献３】Jaenicke R, Seckler R.: Adv Protein Chem. 1997;50:1-59
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように無細胞タンパク質合成系において分子シャペロンの利用が図られているが、細胞内では特定のタンパク質のフォールディングについて特定の分子シャペロンが関与することを考えれば、目的のタンパク質ごとに適切な分子シャペロンを選択する必要がある。また、分子シャペロンは他の分子と共同して作用することが多いことからも、好ましい反応環境を作り出すことが容易でない。更には、これまでに見つかっている分子シャペロンの種類には限りがあり、目的のタンパク質のフォールディングを有効に制御できる分子シャペロンを常に使用できる保証はない。特に、非天然型のタンパク質を合成しようとする場合には、有効に作用する分子シャペロンを用意できないことも十分に想定される。このことは、非天然型タンパク質（特に培養細胞にとって有毒なタンパク質）を合成できるという、無細胞系を利用する大きな利点の一つが損なわれることを意味する。
一方、現在の技術レベルでは高品質の分子シャペロンを調製することは難しく、また十分量を用意するには多くの時間及び費用を要する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは以上の背景の下、in vivo発現系の機構及びこれまでの無細胞タンパク質合成系の技術を考慮しつつ、合成されるタンパク質の好ましいフォールディングを促す新たな方法を模索した。その結果、合成されるタンパク質に特異的に結合する分子の共存下で合成反応を進行させることによって、好ましいコンホメーションのタンパク質を効率的に合成することに成功し、以下の本発明を完成するに至った。
本発明の一態様は、(a)目的タンパク質に対する抗体、(b)目的タンパク質がレセプターである場合のそれに対するリガンド、(c)目的タンパク質がリガンドである場合のそれに対するレセプター、(d)目的タンパク質が活性を発揮する際に他の分子との複合体を形成する場合の該他の分子、及び(e)目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造を認識してこれへ結合する分子、からなる群より選択される一つ以上の特異的結合分子の共存下、無細胞タンパク質合成系で目的タンパク質を合成することを特徴とする、タンパク質の製造方法である。
本発明の一態様では、前記特異的結合分子として、ファージディスプレイ法を利用して調製された分子が使用される。
また本発明の一態様では、前記特異的結合分子として、ネイティブ状態の目的タンパク質に対して特異的に結合する分子が使用される。
一方、本発明の一態様では、前記目的タンパク質が酵素であって、且つ前記特異的結合分子として、前記目的タンパク質の酵素活性を阻害することなく前記目的タンパク質に結合する分子が使用される。
また本発明の一態様では、前記無細胞タンパク質合成系としてin vitro転写／翻訳系が使用される。
また本発明の一態様では、前記特異的結合分子として抗体が使用される。ここでの抗体として、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv及びdsFvからなる群から選択される抗体断片を使用してもよい。また、前記抗体として一価の抗体を使用することが好ましい。
本発明の他の態様は、i)(a)目的タンパク質に対する抗体、(b)目的タンパク質がレセプターである場合のそれに対するリガンド、(c)目的タンパク質がリガンドである場合のそれに対するレセプター、(d)目的タンパク質が活性を発揮する際に他の分子との複合体を形成する場合の該他の分子、及び(e)目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造を認識してこれへ結合する分子、からなる群より選択される一つ以上の特異的結合分子の共存下、無細胞タンパク質合成系で目的タンパク質を合成するステップと、
ii)前記特異的結合分子を他の物質に結合ないし吸着させることによって、ステップi)で合成された目的タンパク質を分離するステップと、
を含む、タンパク質の製造方法に関する。
更に本発明の他の態様は、i)ファージディスプレイ法を利用して、目的タンパク質に対する抗体を調製するステップと、
ii)ステップi)で調製した抗体の共存下、無細胞タンパク質合成系で目的タンパク質を合成するステップと、
を含む、タンパク質の製造方法に関する。
本発明は別の局面として、上記いずれかの製造方法によって製造されたタンパク質に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明では、無細胞タンパク質合成系を利用して、それに特異的に結合する他の分子の共存下で目的のタンパク質が合成される。この共存させる分子が、合成途中のペプチドないしタンパク質に結合してその凝集や好ましくない会合などを抑制し、正しいフォールディングを促す。したがって、特異的結合分子の非共存下での合成では凝集して不溶性画分に分画されてしまっていたタンパク質を可溶性画分として回収し得る。
ネイティブ状態のタンパク質に対して特異的に結合する分子、あるいは目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造を認識してこれへ結合する分子を共存させれば、この分子のガイドによってネイティブ状態のコンホメーションをとるように合成途中のペプチドないしタンパク質がフォールディングし、本来の活性を有するタンパク質を合成できると考えられる。また、目的のタンパク質が酵素の場合において酵素活性を阻害することなくこれに特異的に結合する分子を使用すれば、これまで極めて困難であった活性型酵素の発現が可能である。
特異的結合分子として抗体を用いた場合には、抗体のバインディングポケットに目的タンパク質の正常（活性型）な構造の凹凸、あるいは目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造の凹凸を記憶させておけば、合成途中のペプチドないしタンパク質が当該凹凸にガイドされて正常な構造が誘導されると考えられ、優れたフォールディング補助（制御）作用の発揮が期待される。抗体の特徴である結合特異性の高さも、フォールディング補助（制御）作用の発揮に有利に働くものと期待される。特異的結合分子として抗体を採用する場合にはまた、免疫学的手法又はファージディスプレイ法等の遺伝子工学的手法を利用して特異的結合分子を容易に調製できることから、多種多様なタンパク質の合成に本発明を適用できることとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のタンパク質の製造方法では、目的タンパク質に特異的に結合する分子（特異的結合分子）の共存下、無細胞タンパク質合成系でタンパク質が合成される。
本発明における用語「目的タンパク質」は、本発明の製造方法によって製造することを意図されたタンパク質のことをいう。目的タンパク質の種類は特に問わない。リン酸化タンパク質、脱リン酸化タンパク質、アセチル化タンパク質、脱アセチル化タンパク質などの修飾タンパクや、制限酵素、補酵素など一般にin vivo発現系で製造することが困難なタンパク質や通常の発現法で困難な真核生物由来のタンパク質にも本発明を適用可能である。
【００１１】
本発明において、タンパク質合成中に共存させる特異的結合分子は、(a)目的タンパク質に対する抗体、(b)目的タンパク質がレセプターである場合のそれに対するリガンド、(c)目的タンパク質がリガンドである場合のそれに対するレセプター、(d)目的タンパク質が活性を発揮する際に他の分子との複合体を形成する場合の該他の分子、及び(e)目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造を認識してこれへ結合する分子、のいずれかから選択される。特異的結合分子を二種類以上併用することも可能である。例えば、目的タンパク質に対する抗体と、目的タンパク質に対するリガンドとを使用するなど、異なるカテゴリーの分子を組み合わせてもよい。この場合において、同一のカテゴリー内の分子を二種類以上使用することにしてもよい。一方、例えば目的タンパク質に対する２種類の抗体を使用するなど、同一のカテゴリーに含まれる特異的結合分子を組み合わせてもよい。
【００１２】
本発明の一態様では、目的タンパク質に対する抗体を特異的結合分子として使用する。このような態様では、抗体の特徴である高い結合特異性によって優れたフォールディング補助（制御）作用を期待できる。また、このような態様では、目的タンパク質を抗原とした免疫学的手法又は遺伝子学的手法によって、本発明に使用できる特異的結合分子（この場合には抗体）を原則として用意することが可能である。従って、適用範囲の広い、即ち多種多様なタンパク質の合成に適用できる製造方法が提供されることとなる。さらに、特異的結合分子として抗体を使用した場合には、抗体とそれに結合性を有するProtein AやProtein Gなどとの結合を利用して目的タンパク質の分離・精製を容易に行なえることから、分離・精製操作の面でも有利となる。
ここで「目的タンパク質に対する抗体」とは、目的タンパク質を特異的に認識して結合する抗体をいう。このような特性を有する限りにおいて、その種類や由来などは特に問わない。ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法などの常法で調製することが可能である。
【００１３】
Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片を特異的結合分子として使用してもよい。
Fabとは、IgGをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。例えば、目的タンパク質を抗原とした免疫操作によって得られた抗体をパパイン消化することによってFabを調製することができる。また、ファージディスプレイ法など遺伝子工学的手法を用いてFabを調製することもできる。
【００１４】
Fab'とは、後述のF(ab')2のH鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。例えば、目的タンパク質を特異的に認識する抗体を免疫操作によって得た後、これをペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Fab同様に遺伝子工学的に調製することもできる。
【００１５】
F(ab')2とは、IgGをペプシン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される断片（Fab'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。例えば、目的タンパク質を特異的に認識する抗体を免疫操作によって得た後、これをペプシン消化することにより得られる。また、Fab同様に遺伝子工学的に調製することもできる。
【００１６】
scFvは、H鎖可変領域とL鎖可変領域とからなるFvを、片方の鎖のC末端と他方のN末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば、柔軟性の高い（GGGGS）3などを用いることができる。例えば、Fab同様に遺伝子工学的に調製することができる。
【００１７】
dsFvとは、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の適切な位置にCys残基を導入し、H鎖可変領域とL鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたFv断片である。各鎖におけるCys残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。例えば、Fab同様に遺伝子工学的に調製することができる。
【００１８】
本発明の好ましい一態様では、特異的結合物質として一価の抗体を用いる。一価の抗体とは、抗原結合部を一つ有する抗体をいう。例えばFab、Fab’及びscFvが一価の抗体に該当する。一価の抗体の別の形態として、ラクダ科のH鎖単独抗体の可変領域なども用いることができ、十分な結合力が得られる場合にはFabのH鎖、或いは可変領域のみを使用することもできる。一価の抗体を用いることによって、抗体の架橋による免疫沈降を抑制できる。
【００１９】
目的タンパク質がレセプターとして機能するものであれば、それに対するリガンドを特異的結合性分子として使用することができる。これとは逆に目的タンパク質がリガンドとして機能するものであれば、それに対するレセプターを特異的結合性分子として使用することができる。一方、目的タンパク質が活性を発揮する際に他の分子と複合体を形成する必要がある場合においては、当該他の分子を特異的結合性分子として使用することができる。ここでの他の分子としては例えば、ペプチド、タンパク質、金属を挙げることができる。
【００２０】
本発明における特異的結合分子として、ネイティブ状態の目的タンパク質に対して特異的に結合する分子を使用することが好ましい。このような特異的結合分子を用いれば、目的タンパク質がネイティブ状態へとフォールディングすることを特異的結合分子が積極的に補助（制御）することを期待でき、ネイティブ状態の目的タンパク質を調製できると考えられる。
【００２１】
本発明の一態様では特異的結合分子として、目的タンパク質が正しいフォールディングを形成する過程で一時的に存在する構造を認識してこれへ結合する分子が使用される。ここでの「正しいフォールディング」とは、ネイティブ状態の目的タンパク質に認められる構造へのフォールディングを意味する。一方ここでの「一時的に存在する構造」とは、ネイティブ状態の目的タンパク質においては分子内部に覆い隠されるか又は最終構造への変換により失われる構造をいう。フォールディング過程においてのみ存在するこのような構造を認識する抗体の共存下で目的タンパク質の合成を実施すれば、抗体が作用することで当該構造が保持され、その結果正しいフォールディングへの進行が促されると考えられる。また、抗体を共存させることによって、合成途中のペプチドないしタンパク質がこのような一時的構造を採るように導かれることも期待できる。
尚、この態様で使用される分子（特異的結合分子）は例えばペプチドやタンパク質であって、好ましくは抗体（抗体断片を含む）である。
【００２２】
目的タンパク質が酵素の場合には、目的タンパク質の酵素活性を阻害することなくこれに特異的に結合する分子を、本発明における特異的結合分子として採用することが好ましい。このような合成系によれば、活性型酵素の発現（即ち合成）が可能となる。これまでのタンパク質合成系では活性型酵素の発現が極めて困難であったことから、この点において本発明の製造方法は大きな意義をもつ。
【００２３】
予め標識化した特異的結合分子を使用してもよい。このような態様では、特異的結合分子を介して標識物質が結合した目的タンパク質を得られることから、標識物質を指標として目的タンパク質を確認ないし検出したり、目的タンパク質の合成量を測定したりすることが可能となる。特異的結合分子の標識化に使用することができる標識物質としては例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、 125I等の放射性同位体、及びビオチンを挙げることができる。
特定の物質に結合性を有する標識（例えばヒスチジンタグ）を結合させた特異的結合分子を使用してもよい。このような態様では、目的タンパク質と特異的結合分子との結合体を、標識を利用して容易に分離・精製することが可能となる。従って、より簡便な操作で目的タンパク質を調製することができる。しかも、高純度の目的タンパク質を調製することが容易となる。
【００２４】
本発明における特異的結合分子はその種類や性状に応じて免疫操作、遺伝子工学的操作、或いは化学合成などによって調製することができる。
所望の特異的結合分子がペプチドないしタンパク質（抗体や断片抗体を含む）である場合には、化学合成法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して特異的結合分子を調製することができる。例えば、ペプチドの化学合成は公知の方法（Boc法、Fmoc法などを利用した固相法又は液相法）によって行なうことができる。一方、ファージディスプレイ法とは、M13などの繊維状ファージのコードタンパク質（cp3、cp8）との融合タンパク質として外来遺伝子を発現させるシステムである。ファージディスプレイ法では、異なるタンパク質又はペプチドの混合物の遺伝子をファージDNAに組みことによって、106〜1012程度のファージライブラリーが構築される。ファージライブラリーからの標的タンパク質（ペプチド）の選定はパンニングと呼ばれる操作によって行われる。パンニングは、典型的には、標的タンパク質に結合性を有する分子とファージライブラリーとの反応（接触）、非結合ファージの除去（洗浄）、結合ファージの溶出、及び回収されたファージの大腸菌への感染（ファージの増殖）の一連のステップから構成される。パンニングによって、標的タンパク質を提示するファージが濃縮される。パンニングは標的タンパク質を提示するファージの十分な濃縮が確認されるまで繰り返される。このようにして選別・濃縮されたファージを適当な宿主細胞に感染させることによって、当該ファージが提示していた標的タンパク質（ペプチド）を可溶性分子として発現させることができる。または、選別・濃縮されたファージから外来遺伝子を切り出し、回収された外来遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、そして適当な発現系を利用して当該外来遺伝子を発現させることによって標的タンパク質（ペプチド）を可溶性に得てもよい。以上のようにして得られた標的タンパク質を、本発明における特異的結合分子として用いることができる。発現産物の回収は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
一方、ファージ上に提示された状態の標的タンパク質（ペプチド）を、本発明における特異的結合分子として用いてもよい。
ファージディスプレイ法を利用することによって、多種多様な目的タンパク質に対する特異的結合分子を調製することが可能となる。
【００２５】
リボソームディスプレイ法とは、終止コドンを変異させることによって鋳型DNAの転写産物と翻訳産物とをリボソームに結合させた状態とし、このようにして得られたタンパク質／mRNA／リボソーム複合体（ARM）を用いて、例えばターゲットに対するスクリーニングなどを行う方法をいう。リボソームディスプレイを抗体ライブラリーの製造に適用した例が米国特許第5,643,768号、及び同第5,658,754号に開示されている。
【００２６】
ファージディスプレイ法やリボソームディスプレイ法などの遺伝子工学的手法を用いて特異的結合分子としての抗体を調製する場合には例えば、目的タンパク質を抗原として動物を免疫した後、免疫系細胞よりmRNAやDNAを取り出してPCR、RT-PCR等の遺伝子増幅法によって抗原結合ドメインを含む抗体遺伝子を取得し、これを用いてファージディスプレイライブリー等を構築する。次に、このようにして構築されたライブラリーの中から目的タンパク質に特異的結合性を有するクローンを選択する。尚、特異的結合性分子を有する（又は発現する）クローンを含む限りにおいて、ポリクローン、オリゴクローン、及びモノクローンのいずれの状態であってもよい。目的のクローンが選択されたら、それが提示する抗体を上記の手順で可溶性分子として得て（提示された状態のまま使用してもよい）、本発明の製造方法への利用に供する。
【００２７】
遺伝子工学的手法を用いることによって非天然型抗体を調製することも可能であり、本発明ではこのような非天然型抗体を特異的結合分子として用いてもよい。例えば、ある抗体の相補鎖決定領域（CDR：complementarity determinig region）にランダムな配列や他の動物種由来の配列を導入して構築される人工抗体を用いることができる。
尚、ランダムな配列のペプチドを提示させたライブラリーを構築し、当該ライブラリーから単離したペプチドを本発明の特異的結合分子として用いてもよい。
【００２８】
特異的結合分子が抗体である場合には、古典的な免疫学的手法を利用して特異的結合分子を調製することもできる。具体的には、例えばモノクローナル抗体は以下の手順に従って調製できる。まず、本発明で製造することを目的とするタンパク質（目的タンパク質）を抗原としてマウス等の動物に免疫を施す。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。
【００２９】
本発明における用語「無細胞タンパク質合成」とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型であるDNA或いはmRNAからそれがコードするタンパク質をin vitroで合成することをいう。無細胞タンパク質合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
【００３０】
タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成したタンパク質合成系の開発も報告されている（Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる２０種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。
【００３１】
用語「無細胞タンパク質合成系」は、in vitro翻訳系又はin vitro転写／翻訳系と交換可能に使用される。in vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型DNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などを使用することができる。他方のin vitro転写／翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAとしては、目的タンパク質をコードする遺伝子を転写プロモーターと翻訳開始点の下流位置に挿入して構築したベクター或いは、PCRやRT-PCRの産物を使用することができる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。予めin vivo増幅が必要なベクターを使用する場合には、宿主での自己複製及び選択を可能とすべく、宿主に対応した複製起点及び選択マーカーを備えるベクターとする。遺伝子工学的操作を容易にするため、ベクターには通常、複数の制限酵素認識部位が設けられる。尚、in vitro転写／翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
【００３２】
無細胞タンパク質合成系には以下の利点がある。まず第１に、生細胞を維持する必要がないため操作性が良好で系の自由度も高い。したがって、目的のタンパク質の性質に応じて様々な修正や修飾を施した合成系を設計することが可能となる。次に、細胞系の合成では使用する細胞に毒性のあるタンパク質の合成は基本的にできないが、無細胞系ではそのような毒性のタンパク質であっても生産することができる。さらに、多種類のタンパク質を同時にかつ迅速に合成できることからハイスループット化が容易である。生産されるタンパク質の分離・精製が容易であるという利点も備え、これはハイスループット化に有利に働く。加えて、非天然型のアミノ酸を取り込ませるなどして非天然型タンパク質を合成することも可能であるという利点も併せ持つ。
現在広く利用されている無細胞系には以下のものがある。即ち、大腸菌S30画分抽出液の系（原核細胞の系）、コムギ胚芽抽出液の系（真核細胞の系）、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系（真核細胞の系）である。これらの系はキットとしても市販されており、容易に利用することが可能である。
【００３３】
歴史的には大腸菌S30画分抽出液の系の開発が最も古く、この系を利用して様々なタンパク質の合成が試みられてきた。大腸菌30S画分は、大腸菌の集菌、菌体破砕、精製の工程を経て調製される。大腸菌30S画分の調製及び、無細胞転写・翻訳共役反応はPrattらの方法（Pratt, J. M.: Chapter 7, in “Transcription and Translation: A practical approach”, ed. by B. D. Hames & S. J. Higgins, pp. 179-209, IRL Press, New York (1984)）やEllmanらの方法（Ellman, J. et al.: Methods Enzymol., 202, 301-336(1991)）を参考にして行うことができる。
コムギ胚芽抽出液の系は、高品質の真核生物タンパク質を効率的に合成できるという利点を有し、大腸菌S30画分抽出液の系では合成が困難な真核生物のタンパク質を合成する際によく利用される。最近になって、種子胚乳成分を洗浄除去した胚芽から抽出液を調製することによって高効率かつ安定な合成系が構築されることが報告され注目を集めている（Madin, K. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 559-564, 2000）。その後、高翻訳促進能を有するmRNA非翻訳配列、PCRを利用した多品目機能解析用のタンパク質合成法、専用高発現ベクターの構築などの技術開発が行われ（Sawasaki, T. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14652-14657, 2002）、様々な分野への応用が期待されている。
コムギ胚芽抽出液は、コムギ胚芽をすり潰して遠心分離した後、上澄み液をゲルろ過で分離することによって得ることができる。翻訳反応については、Andersonらの方法（Anderson, C. W. et al.: Methods Enzymol., 101, 638-644(1983）)を参考にできる。改良法についても報告されており、例えば河原崎らの方法（Kawarasaki, Y. et al.: Biotechnol. Prog., 16, 517-521(2000)）やMadinらの方法（Madin, K. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 559-564, 2000）等を参考にできる。
ウサギ網状赤血球可溶化物の系はグロブリン生産に適する。ウサギ網状赤血球可溶化物は、ウサギにフェニルヒドラジンを数日間静脈注射して貧血状態とし、所定期間後（例えば第８日目）に採血し、その後溶血させた液から超遠心分離処理などを経て得られる。ウサギ網状赤血球可溶化物の調製法は、JacksonとHuntの方法（Jackson, R. J. and Hunt, T.: Methods Enzymol., 96, 50-74(1983)）を参考にして行うことができる。
尚、本発明の実施に際して利用できる無細胞系は上記のもの限られるものではなく、例えば大腸菌以外のバクテリアやコムギ以外の植物の抽出液又はゲノム情報を基に構築した系などを利用してもよい。
【００３４】
無細胞系におけるタンパク質合成反応はバッチ式又は連続式で行われる。ここでの「バッチ式」とは、典型的には、反応に必要な全ての成分を混合して反応を行い、所定時間経過後に産物を回収する方式をいう。複数回の合成反応を一の容器内で行う場合を例に採れば、次の合成反応の際には先の合成反応に使用した反応溶液を廃棄し、新たな反応溶液を容器内に準備することとなる。反応開始時に全ての成分を混合するのではなく、所定時間経過した後に特定の成分を添加したり（例えば、プレインキュベーションしてリボソーム複合体を形成させた後に鋳型を添加する）、合成反応中にATP、GTPなどの物質を適宜添加したりして合成反応を進行させる場合についてもバッチ式ということとする。尚、使い捨てタイプの容器を使用して一回のみの合成反応を行う場合もバッチ式の典型例である。
一方「連続式」とは、長時間に亘ってタンパク質が合成されるように、溶媒、核酸鋳型、合成基質、エネルギー源（ATPやGTP）などを合成反応中に連続して供給ないし交換しつつタンパク質合成を行う方式をいう。所定の間のみに上記のごとき供給ないし交換が行われるようにしてもよく、このような場合についても連続式と呼ぶこととする。連続式の無細胞タンパク質合成系についてはspringらによって最初に報告されている（Spring, A. S. et al: Science, 242:1162-1164, 1998など）。連続式にはCFCFシステムとCECFシステムがある。前者では一部（例えば底部）に限外ろ過膜を設けた反応容器を用い、これにアミノ酸、ATP、GTPなどタンパク質合成に必要なすべての成分を含む液を連続的に供給する。反応液は限外ろ過膜によって分離される。合成されたタンパク質はろ液に含まれ、フラクションコレクターなどによって他の成分から分離、回収される。このようにCFCFシステムでは、反応溶液の供給と限外ろ過による目的タンパク質及び不要物の取り出しを同時に行う。他方のCECFシステムでは、アミノ酸類、ATPなど必要な低分子を含む循環液が透析膜を隔てて反応液中を循環するようにし、透析の原理を利用してアミノ酸類、ATPなど必要な低分子の供給と不要物の除去を同時に行い、合成されたタンパク質が反応溶液中に留まるようにする。このシステムの利点の一つは、反応液と循環液とが独立しているので循環液について様々な修正が容易に行なえることである。また、反応液量に対する透析膜の面積を大きくできることから、透析膜を介した効率的な物質の交換を行えるという利点も有する。尚、Reaction mix層及びBuffer mix層と呼ばれる二層を形成させ、これら二層を徐々に混合させることによって、アミノ酸、ATPなどをはじめとする低分子物質が補給される重層法が開発されている（PROTEIOS?キット、TOYOBO）。かかる方法では、単純なバッチ法の5〜10倍のタンパク質合成効率が得られ、ハイスループットに目的タンパク質を効率的に合成することが可能となる。
【００３５】
本発明のタンパク質の製造方法では、目的タンパク質に対する特異的結合分子の共存下、上記のごとき無細胞系を利用してタンパク質を合成する。したがって、典型的には合成に先立って反応液に必要な特異的結合分子を添加しておく。本発明の製造方法では、タンパク質合成反応中に特異的結合分子が存在していればよく、例えば合成反応直前や、合成反応初期、合成反応中期、又は合成反応後期に特異的結合分子を添加してもよい。好ましくは、合成反応開始前に特異的結合分子を添加し、特異的結合分子による良好なフォールディング補助（制御）作用が発揮されるようにする。
【００３６】
特異的結合分子の添加量（濃度）は特に限定されないが、想定されるタンパク質合成トータル量、反応液中のタンパク質濃度、特異的結合分子の結合定数等を考慮して適当な量を設定することができる。想定されるタンパク質合成トータル量よりも多くなるように、特異的結合分子の添加量を設定することが好ましい。十分なフォールディング補助（制御）作用が発揮されるようにするためである。尚、ここでの「想定されるタンパク質合成トータル量」は、特異的結合分子を添加しないこと以外は同条件で合成した場合に得られるタンパク質量を基準に推測することができる（典型的には、当該条件で合成した場合に得られるタンパク質量を、想定されるタンパク質合成トータル量とする）。
特異的結合分子の添加量の設定に際しては、その解離定数（Kd）を考慮することが好ましく、例えばKdの値と同じ濃度となるように特異的結合分子を添加しておけば理論上、生成する合成分子の半分の分子には特異的結合分子が作用することになるので、充分な効果が期待できる。しかしこの添加量は、特異的結合分子として抗体を用いた場合において抗体がポリクローナルやオリゴクローナルのときには、実質的に効果を奏する抗体は一部であると予想されるため、十分な効果を得るためには、上記の添加量よりも多い添加量とすることが好ましい。
結合特異性の高い特異的結合分子を使用することが好ましい。特異的結合分子の添加量を減少でき、タンパク質合成反応を無用に阻害してしまうなどの好ましくない作用の発生を抑制できるからである。
【００３７】
タンパク質合成反応は、反応が良好に進行するように例えば30℃前後の温度条件で実施される。例えば、大腸菌のライセートを利用したロシュ社のキットRTSでは、30℃の温度条件が最適とされるが、凝集しやすいタンパク質に関しては30℃以下の温度条件で実施される。また、小麦胚芽抽出液を利用した東洋紡績株式会社のキットPROTEIOSでは、26℃の温度条件が最適とされるが、タンパク質によっては23℃の温度条件が最適な場合もある。目的とするタンパク質によって、実施温度を最適化することが好ましい。
【００３８】
特に記載のない限り、本明細書における遺伝子工学的操作は、例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或いはCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参考にして行うことができる。
【実施例】
【００３９】
以下の各実験（1.〜4.）に先立ち、vSrc（トリのラウス肉腫ウイルス遺伝子v-srcの遺伝子産物）、cSrc（ガン原遺伝子c-srcの遺伝子産物）のin vivo合成を行った。尚、vSrcとcSrcは以下の特徴を有する。（１）両者ともにチロシンキナーゼ活性を有する。（２）両者ともにミリストイル化（翻訳後脂肪酸修飾）されている。（３）両者を比較すると、いくつかのアミノ酸残基の置換のほかにＣ末端の大きな変化が見られる。（４）vSrcは常に活性型として存在する。（５）cSrcは自己リン酸化部位を二ヵ所有し、一方は抑制化に、一方は活性化に機能する。このことから、vSrcの方が活性型を調製しやすいと予想される。
【００４０】
組換えvSrc及びcSrcをin vivo合成したところ（データ示さず）、以下の現象が認められた。
1) vSrcとcSrcをそれぞれ単独でin vivo発現させたところ大量発現には成功したが、両者とも不溶化した。
2) ミリストイル化を施すために、1)で作製した発現系にさらにミリストイル基転移酵素の遺伝子も導入して共発現系とした。vSrcに関しては共発現したが生成産物は不溶化した。cSrcに関しては、発現宿主として使用した大腸菌が死滅した（lethal）。
3) 不溶化の問題を解決するために、2)で作製したvSrcの系に、さらにシャペロニン(GroESL）の遺伝子を導入したが、宿主細胞が死滅した。尚、宿主細胞の死滅は、導入遺伝子が機能型（可溶化）で発現したことを意味すると考えられた。
尚、2)における共発現系は以下のように構築した。
【００４１】
A．  大腸菌を宿主として用いた、vSrc又はcSrcと、ミリストイル基転移酵素との共発現系の構築
A-1.  pETvSrc及びpETcSrcの作製（図１を参照）
pBluescriptベクターの制限酵素サイトSmaIとEcoRIの間に組み込まれたvSrc(Rous sarcoma virus src gene, complete cds. , GenBank Accession Number M11753)及びcSrc(Chicken c-src gene, complete cds, GenBank Accession Number J00844)のcDNAは、名古屋大学医学部浜口道成教授より恵与された。
このベクター1μgと、制限酵素NcoI(TAKARA)を1ユニット、及び0.01％BSA(TAKARA)を含み、塩、その他はＫバッファー(TAKARA)の組成になるように反応系を調製し（総量30μL）、37℃、2時間、保温することでベクターの制限酵素処理を行った。1％アガロースゲルゲルを用いてこれを電気泳動し、バンドを切り出すことでNcoIにより切断された目的のDNA断片の精製を行った。得られたものと、XhoI(TAKARA)を各々1ユニット含み、塩、その他はＨバッファー(TAKARA)の組成になるように反応系を調製し（総量30μL）、37℃、2時間、保温することでベクターの制限酵素処理を行った。1％アガロースゲルを用いてこれを電気泳動し、バンドを切り出すことで目的のDNA断片の精製を行った（インサート断片）。pET14b（Novagen）を同様に処理してベクター断片を得た。
ベクター断片とインサート断片をモル比が1:10になるように混和し、これに同体積のDNAリガーゼ溶液（TOYOBO Ligation Kit Version 2）を加えて混合し（総量10μL）、16℃で14時間、保温した。この半量（5μL）を用いて、大腸菌JM109株（TOYOBO）を形質転換し、得られた形質転換体10個からプラスミドを抽出した。1％アガロースゲル電気泳動により、インサート導入処理を行っていないpET14bよりもサイズが大きいものを選び、そこに組み込まれたDNA断片の塩基配列を、T7プロモーターと同じ配列を持つDNAプライマーを用いて決定した。v-src及びc-srcがpET14bに組み込まれたものをそれぞれpETvSrc及びpETcSrcとした。
【００４２】
A-2.  ミリストイル基転移酵素（N-myristoyl transferase; NMT）とvSrc及びcSrcの共発現系の構築（図１を参照）
NMTのcDNAを組み込んだpBB131ベクター（(Duronio, R. J., Jackson-Machelski, E., Heuckeroth, R. O., Olines, P. O., Devine, C. S., Yonemoto, W., Slice, L. W., Taylor, S. S., and Gordon, J. I. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 1506-1510.)）は、Dr. J.I.Gordonより恵与された。
pBB131を用いて、大腸菌BL21(DE3)株（Novagen）を形質転換し、カナマイシン耐性により目的遺伝子が導入されたものの選択を行った。得られた形質転換体をさらにpETvSrc（又はpETcSrc）で形質転換し、カナマイシンとアンピシリンを同時に用いてNMT遺伝子とvSrc遺伝子（又はcSrc遺伝子）の両方が導入されたものの選択を行った。以上のようにして共発現系を構築した。尚、図１にはミリストイル基転移酵素と組換えvSrcの共発現系を模式的に示した。
【００４３】
以上の結果を踏まえて、ミリストイル化されたvSrcを得ることを目的として以下の各実験を実施した。
1．  抗血清由来ウサギFabの作製（シャペロン様活性を調べるための抗Src抗体の作製）
上記のように、大腸菌で大量発現したvSrcは不溶性となるので、次のように精製を行った。3リットルの培養を行い、0.4mM IPTGにより発現誘導を行い、6時間培養したのちに菌体を回収し、これをCelLyticTM B II Bacterial Cell Lysis Extraction Reagent(SIGMA社 B 3678)で懸濁して遠心にて可溶性画分を除いた後、沈殿をBuffer 1に可溶化し、Buffer 2の組成に徐々に連続的に変化するように（直線濃度勾配変化）透析を行った。
Buffer 1：20mM Tris-HCl(pH8), 120mM NaCl, 6Mグアニジン塩酸塩, 1M L-アルギニン, 20mM DTT
Buffer 2：20mM Tris-HCl(pH8), 120mM NaCl, 2 Mグアニジン塩酸塩, 1M L-アルギニン,1mM DTT
この可溶性画分についてHiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HRゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Amersham 17-1195-01）を行い、精製タンパク質4ml（4.5mg/ml）を得た。
ウサギの免疫およびIgG精製は定法で行なった。即ち、アジュバンドと免疫vSrc抗原を混ぜたものを抗体価が上昇するまで１週間おきに６回免疫し、抗血清53ｍｌを得た。添付のマニュアルに従い、Protein-Ａ Sepharose（ファルマシア）を用いてIgGフラクション5mg(2.7mg /mlを1.85ml)を調製した。タンパク質合成系に抗体を加えたときに、二価抗体であると抗原が凝集して沈降する可能性があるので、これを防ぐために以下の手順に従って、調製したIgGフラクションにパパインを作用させて一価の抗体（Fab）とした。尚、パパインを除去する操作を省略するため、固定化パパイン(Immobilized papain, PIERCE, 20341)を用いた。これは、アガロースビーズにパパインが固定化されたものである。
1) 抗血清からProtein-G Sepharoseにより精製された上記IgGはPBSに溶解している。そこでIgG 5mg(2.7mg /mlを1.85ml)を以下に示すbufferへ透析したのち、アミコンウルトラ100 (Millipore, UFC801096)によって濃縮して10mg/ml(500μl)とした。
buffer: 20mM sodium phosphate, 10mM ETDA (pH7.0)
2) 固定化パパイン0.2mlを2mlのエッペンドルフチューブへ移して以下に示すdigestion bufferで2回遠心洗浄したのちに、0.4mlのdigestion bufferを加えて1）で調製したIgGを加えた。尚、酵素（パパイン）と基質（IgG）の質量比は、1：100となるよう調整した。
Digestion buffer : 20mM sodium phosphate, 20mM cystein・HCl, 10mM ETDA (pH7.0)
3) 37℃、5時間、インキュベーションした。
4) 1.2mlの10mM Tris-HCl(pH7.5)を加えて遠心し、上清をFab（Fcを含む）として回収した。タンパク質量を測定したところ、IgGに換算して5mg/2.1mlの溶液であって、Fab濃度は1.59mg/mlであった。
【００４４】
2．  抗体のシャペロン様活性の測定
2-1.  小麦胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系における、ウサギ抗vSrc抗体(Fab)存在下及び非存在下でのSrc合成
抗体のシャペロン様活性を調べるためには、愛媛大学・遠藤教授らにより開発された高効率無細胞タンパク質合成系PROTEIOS TM Wheat germ cell-free protein synthesis kit(TOYOBO CPS-601)を用いた。まず、組換えvSrc及び組換えcSrcの発現に使用するベクター（pEUvSrc及びpEUcSrc）を次の手順で作製した。
【００４５】
2-1-1.  発現ベクター（pEUvSrc（図８参照）及びpEUcSrc（図９参照））の作製
pBluescriptベクターの制限酵素サイトSmaIとEcoRIの間に組み込まれたvSrc(Rous sarcoma virus src gene, complete cds. , GenBank Accession Number M11753)及びcSrc(Chicken c-src gene, complete cds, GenBank Accession Number J00844)のcDNAは、名古屋大学医学部浜口道成教授より恵与された。尚、v-Srcの遺伝子のcDNA配列（配列番号６２）を図２及び３に、それがコードするアミノ酸配列（配列番号６３）を図４にそれぞれ示す。同様に、c-Src遺伝子のcDNA配列（配列番号６４）を図５及び６に、それがコードするアミノ酸配列（配列番号６５）を図７にそれぞれ示す。
このベクター1μgと、制限酵素SpeI(TAKARA)を1ユニット含み、塩、その他はＭバッファー(TAKARA)の組成になるように反応系を調製し（総量30μL）、37℃、2時間、保温することでベクターの制限酵素処理を行った。1％アガロースゲルゲルを用いてこれを電気泳動し、バンドを切り出すことでSpeIにより切断された目的のDNA断片の精製を行った。得られたものと、SalI(TAKARA)を各々1ユニット含み、塩、その他はＨバッファー(TAKARA)の組成になるように反応系を調製し（総量30μL）、37℃、2時間、保温することでベクターの制限酵素処理を行った。1％アガロースゲルゲルを用いてこれを電気泳動し、バンドを切り出すことで目的のDNA断片の精製を行った（インサート断片）。pEU3-NII（TOYOBO）を同様に処理してベクター断片を得た。
ベクター断片とインサート断片をモル比が1:10になるように混和し、これに同体積のDNAリガーゼ溶液（TOYOBO Ligation Kit Version 2）を加えて混合し（総量10μL）、16℃で14時間、保温した。この半量（5μL）を用いて、大腸菌JM109株（TOYOBO）を形質転換し、得られた形質転換体10個からプラスミドを抽出した。1％アガロースゲル電気泳動により、インサート導入処理を行っていないpEU3-NIIよりもサイズが大きいものを選び、そこに組み込まれたDNA断片の塩基配列を、T7プロモーターと同じ配列を持つDNAプライマーを用いて決定した。
次に、ここで得られた発現ベクター1μgと、制限酵素NcoI(TAKARA)を1ユニット、および0.01％BSA(TAKARA)を含み、塩、その他はＫバッファー(TAKARA)の組成になるように反応系を調製し（総量30μL）、37℃、2時間、保温することでベクターの制限酵素処理を行った。インサート断片に二ヶ所、pEU上に一ヶ所の計３カ所NcoIサイトが存在するので、長さの異なる三つの断片が得られる。1％アガロースゲルゲルを用いてこれを電気泳動し、一番長いもの（発現ベクター本体）と、その次に長いDNA断片（v-src遺伝子又はc-src遺伝子を含む断片）を、バンドを切り出すことで精製した（インサート断片）。
これらを、モル比が1（ベクター本体）：10（v-src遺伝子又はc-src遺伝子を含む断片）になるように混和し、これに同体積のDNAリガーゼ溶液（TOYOBO Ligation Kit Version 2）を加えて混合し（総量10μL）、16℃で14時間、保温した。この半量（5μL）を用いて、大腸菌JM109株（TOYOBO）を形質転換し、得られた形質転換体10個からプラスミドを抽出した。1％アガロースゲル電気泳動により、インサート導入処理を行っていないpEU3-NIIよりもサイズが大きいものを選び、そこに組み込まれたDNA断片の塩基配列を、T7プロモーターと同じ配列を持つDNAプライマーを用いて決定することで、正しい向きに目的の遺伝子が組み込まれているものを選択した。v-src及びc-srcがpEU3-NIIに組み込まれたものをそれぞれpEUvSrc及びpEUcSrcとした（図８及び図９を参照）。
【００４６】
2-1-2.  組換えタンパク質のin vitro合成
以下の手順でタンパク質合成を行なった。
1) pEUvSrc（又はpEUcSrc）でXL-1Blueを形質転換し、Geno Pure Plasmid Maxi Kit(Roshe 3 143 422)でプラスミドを精製した。
2) 1)で精製したプラスミドを、SrcをクローニングしたベクターpBluescript-KSマルチクローニングサイト由来のHindIIIサイトで切断し、リニアとした。
3) 2)で調製したプラスミドを用いて次のようにmRNAを合成した。
pEUvSrc  ：  pEUcSrc
miliQ水                               60.1μL  ：  64.73μL
10×T7 RNA polymerase buffer            10μL   ：  10μL
25mM NTP                                10μL   ：  10μL
RNase inhibitor (TOYOBO SIN-101)          2μL   ： 2μL
Plasmid DNA(10μg)                      11.9μL  ：  7.27μL
T7 RNA polymerase(TOYOBO TRL-201)        6μL   ：  6μL 
Total                              100μL   ：  100μL
【００４７】
以上の反応液を500μLのエッペンドルフチューブに入れ、サーマルサイクラーで37℃、4時間インキュベートした。MicroSpin G-25 columns(Amersham 27-5325-01)でmRNAを精製し、260nmにおける吸光度を測定して合成されたmRNA濃度を定量した。vSrcのmRNAは 1.272mg/mL、cSrcのmRNAは1.32mg/mLであった。調製したmRNAは、使用時まで−20℃で保存した。
4) タンパク質合成を、以下に示すように、1.で調製したFabの存在下及び非存在下でそれぞれ行なった。
vSrc(cSrc)  ：  vSrc(cSrc)+Fab
buffer#2                                  1μL   ：  1μL
buffer mix                               10.59μL  ：  4.59μL
Fab(0.934mg/mL)                              −   ：  6μL
Creatine kinase（TOYOBO CPS-6012）       0.85μL  ：  0.85μL
RNase inhibitor                           0.5μL   ：  0.5μL
Wheat germ extract                        5μL   ：  5μL
mRNA(1mg/mL)                              7.06μL  ： 7.06μL
Total                                    25μL  ：  25μL
【００４８】
以上の条件で反応液を混合した後、500μLのエッペンドルフチューブにあらかじめ分注した125μLのbuffer mixの下に、静かに重層した。これをサーマルサイクラーで26℃、20時間インキュベートしSrcをin vitro合成した。
Buffer mixの組成
Buffer#1      107μL
Buffer#2      125μL
miliQ水      768μL
Total      1000μL
【００４９】
2-2.  ウサギ抗vSrc抗体(Fab)存在下及び非存在下で合成したSrcの可溶化の検出
2-1-2.で合成した各Srcの可溶性画分、不溶性画分の分布をウエスタンイムノブロット法で調べた。total画分、可溶性画分(sup)、及び不溶性画分(ppt.)についてそれぞれ5μL相当についてアクリルアミドゲル電気泳動を行い、抗cSrcモノクローナル抗体GD11（UBI）を用いてウエスタンイムノブロットを実施した。結果を図１０に示した。左のレーンから順に、レーン1：cSrc total 、レーン２：cSrc sup.、レーン３：cSrc ppt.、レーン４：cSrc total + Fab、レーン5：cSrc sup. + Fab、レーン６：cSrc ppt. + Fab、レーン７：ネガティブ・コントロール、レーン８：ポジティブ・コントロール（組換えSrc）である。
図１０に示されるように、レーン２に比較してレーン５ではcSrc位置（矢印位置）のバンドが非常に濃く、Fabの存在下で合成を行なうことによってcSrcではタンパク質の可溶性画分の割合が著しく増加したことが判る。
【００５０】
2−3.  ウサギ抗vSrc抗体(Fab)存在下及び非存在条件でそれぞれ合成したSrcの活性測定
2-1-2.で合成した各Srcの活性測定をSrc Assay Kit(UBI 17-131)を用いて行った。タンパク質合成溶液の50μLをtotal画分としてサンプリングした後、遠心分離により上清(可溶性画分)と沈殿(不溶性画分)に分け、可溶性画分を用いて以下の手順で活性測定を行った。尚、反応は、96穴1/2マイクロタイタープレート(Costar 3695)で行った。
1) src溶液（2-1-2.の可溶性画分）を12.5μLずつ入れた。また、Srcの活性測定を行えていることを示すポジティブ・コントロールとして市販のcSrc(Src, active UBI 14-236)の1μL (5U  0.0115μg)を11.5μLのmiliQ水で希釈して入れた。
2) Manganese/ATP cocktail(75mM manganese chloride, 500μM ATP)で[γ−32P]ATPを希釈してその12.5μlを1)へ加えた。加えた[γ−32P]ATPは、2.5μCiである。
3) Substrate peptide(KVEKIGEGTYGVVYK)をSrc Kinase Reaction Buffer(SrcRB)で希釈して0.5mg/mLとし、25μLずつ加え(終濃度125μM)、反応を開始した。
4)反応開始5分後、10分後、30分後、60分後に各10μLをサンプリングし、予め用意しておいた20μLの40％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止した。
5) P81 Phosphocellulose paperへ4)の25μLを加えて0.75％の燐酸で3回洗浄した後、アセトンで1回洗浄した。風乾後、5mlの液体シンチレーターを入れたガラスバイアルへ入れて、シンチレーションカウンターでペプチドへ取り込まれた燐酸量を測定した。測定結果を図１１に示した。cSrcではFab存在下でSrc活性の上昇が見られた。また、合成したvSrcおよびcSrcに同濃度のFabを添加して同様の実験を行ったところ、活性は見られなかった（図１２）。即ち、活性測定時における抗体（Fab）の存在がSrc活性に影響しないことが判明した。これによって、Fab存在下で合成したcSrcにおける活性の上昇は、合成時におけるFabの作用によって、活性型のcSrcが生成したことによるものであることが確認された。
以上のように、タンパク質の合成時において抗体がシャペロン用の作用を発揮できることが明らかとなった。
【００５１】
3.  ウサギ抗体ファージdisplayライブラリー作製
3-1.  ファージミドベクターの作製
以下の手順で発現ベクターを構築した（図１３を参照）。scNcopFCAH9-E8VHdVLdベクター（WO 01/96401を参照。当該ベクターの塩基配列（配列番号６６）及びアミノ酸配列（配列番号６７）を図１４〜１６に示す） 1μg（1μL）、Revプライマー（5'-AGGAAACAGCTATGACCATG-3'(20mer)：配列番号７１）（100pmol/mL）1μL、SfiRプライマー（5'-CGGCTGGGCCGCGAGTAA-3'(18mer)：配列番号７２）（100pmol/mL）1μL、10×LA PCR buffer 10μL、25mM MgCl2 10μL、2.5mM dNTP mix 16μL、滅菌蒸留水60μL、TaKaRa LA Taq Polymerase（5U/μL宝酒造） 1μLを混合し、ミネラルオイルを2滴添加して、95℃で2分保温後、94℃1分、58℃2分、72℃1分の反応を16サイクル繰り返した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、切り出し、フェノール処理、EtOH沈殿して10μLに濃縮した（A断片）。同様にして、scNcopFCAH9-E8VHdVLd 1μg（1μL）、SfiFプライマー（5'-TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCCCTGACATCTGAGGACACT-3'(40mer)：配列番号７３）（100pmol/mL）1μL、BstRプライマー（5'-CCACCGCCGCTCGAGACGGTGACC-3'(24mer)：配列番号７４）（100pmol/mL）1μL、10×LA PCR buffer 10μL、25mM MgCl2 10μL、2.5mM dNTP mix 16μL、滅菌蒸留水60μL、TaKaRa LA Taq Polymerase(5U/μL宝酒造)1μLを混合し、ミネラルオイルを2滴添加して、95℃で2分保温後、94℃1分、58℃2分、72℃1分の反応を16サイクル繰り返した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、切り出し、フェノール処理、EtOH沈殿して10μlに濃縮した（B断片）。さらに、scNcopFCAH9-E8VHdVLd 1μg（1μl）、BstFプライマー（5'-GGTCACCGTCTCGAGCGGCGGTGG-3'(24mer)：配列番号７５）（100pmol/mL）、cp3Rプライマー（5'-GCCAGCATTGACAGGAGGTTG-3'(21mer)：配列番号７６）（100pmol/mL）1μL、10×LA PCR buffer 10μL、25mM MgCl2 10μL、2.5mM dNTP mix 16μL、滅菌蒸留水60μL、TaKaRa LA Taq Polymerase(5U/μL宝酒造)1μLを混合し、ミネラルオイルを2滴添加して、95℃で2分保温後、94℃1分、58℃2分、72℃1分の反応を16サイクル繰り返した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、切り出し、フェノール処理、EtOH沈殿して10μLに濃縮した（C断片）。A断片  5μL、B断片  5μL、Revプライマー（100pmol/mL）1μL、BstRプライマー（100pmol/mL）1μL、10×LA PCR buffer 10μL、25mM MgCl2 10μL、2.5mM dNTP mix 16μL、滅菌蒸留水51μL、TaKaRa LA Taq Polymerase(5U/μL宝酒造) 1μLを混合し、ミネラルオイルを2滴添加して、95℃で1分保温後、94℃1分、58℃4分、72℃2分の反応を17サイクル繰り返した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、切り出し、フェノール処理、EtOH沈殿して20μLに濃縮した（D断片）。C断片  5μL、D断片  5μL、Revプライマー（100pmol/mL）1μL、cp3Rプライマー（100pmol/mL）1μL、10×LA PCR buffer 10μL、25mM MgCl2 10μL、2.5mM dNTP mix 16μL、滅菌蒸留水51μL、TaKaRa LA Taq Polymerase(5U/μL宝酒造) 1μLを混合し、ミネラルオイルを2滴添加して、95℃で1分保温後、94℃1分、58℃4分、72℃2分の反応を17サイクル繰り返した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、切り出し、フェノール処理、EtOH沈殿して20μLに濃縮した。このうち、7μL、10×Ｍバッファー  10μL、滅菌蒸留水78μL、HindIII(10U/μL宝酒造)  5μLを混合して37℃で2時間反応させた。これに、5M NaCl 1μL、BstPI(5U/μL宝酒造) 5μLを添加し、さらに37℃で2時間反応させた。これをアガロースゲル電気泳動で確認後、切り出し、フェノール処理、EtOH沈殿して15μLに濃縮した（インサート断片）。同様にして、scNcopFCAH9-E8VHdVLd 1μg（1μL）、10×Ｍバッファー10μL、滅菌蒸留水86μL、HindIII(10U/μL 宝酒造)  3μLを混合して37℃で2時間反応させた。これに、5M NaCl 1μL、BstPI(5U/μL宝酒造) 3μLを添加し、さらに37℃で2時間反応させた。これをアガロースゲル電気泳動で確認後、切り出し、フェノール処理、EtOH沈殿して15μLに濃縮した（ベクター断片）。インサート断片2μL、ベクター断片1μL、10×ligation buffer 1.5μL,10mM ATP 1.5μL,DW 8μL,T4 DNA ligase （350units /μL  宝酒造）1μLを加えて混合し、16℃で3時間インキュベートした。エタノール沈殿して3μLの1/5TEに溶解し、その半分を用いてDH12Sを形質転換した。得られた形質転換体24個ずつからプラスミドを抽出し、アガロースゲル電気泳動を行って、インサートの入っているクローンについて、塩基配列を確認した。予想通りの置換の入っているクローンを選択し、pSCCA4-E8d（塩基配列（配列番号６８）及びアミノ酸配列（配列番号６９）を図１７〜１９に示す）とした。
【００５２】
さらに、XhoIサイトではライゲーション効率が低かったため、5‘側のプライマー（配列58  XhoI、NotIサイトを下線で示した）と3’側のプライマー（配列59  NcoIサイトを下線で示した）を用いてPCR反応を行い、NotIサイトで重鎖を挿入できるように変換した。このベクターpSCCA5-E8dのインサートの塩基配列に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号７０）を図２０〜２２に示した。
【００５３】
このベクターの所定の位置に重鎖と軽鎖の遺伝子を挿入することにより、実際の抗体タンパク質発現ベクターが完成することとなる。完成したベクターによって発現される抗体の形状はscFv型である。リンカー−GRGGS(GGGGS)2MA-によって重鎖と軽鎖は結合している。軽鎖遺伝子は前述のcp3遺伝子と結合されており、結果として発現タンパク質はscFv-cp3の形状となる。
【００５４】
3-2.  ウサギ抗体ライブラリーの作製
3-2-1.  ウサギ抗体遺伝子単離
ウサギ由来抗体ライブラリーを作製するためウサギを1-1.同様に免疫した。
【００５５】
3-2-2.  RNAの作製
免疫したウサギの脾臓からRNA Extraction Kit(Amersham-Pharmacia 27-9270-01)を用いて定法に従ってRNAの調製を行った。1個の脾臓から1.04mgのRNAを得た。
【００５６】
3-2-3.  cDNAの合成
Super Script II RnaseH-Reverse Transcriptase(Gibco 18064-071)を用いて30μg RNAから重鎖遺伝子，軽鎖遺伝子であるκ遺伝子とλ遺伝子のcDNAの合成を行った。プライマーは、重鎖遺伝子の取得用3'プライマー（配列46−48）を等モルずつ混ぜたもの、軽鎖κ遺伝子の取得用3'プライマー（配列49-56）を等モルずつ混ぜたもの、および軽鎖λ遺伝子の取得用3'プライマー（配列57）を用いて、それぞれについてPCRを行った。Ribonuclease H(Gibco 18021?71)を用いて鋳型のRNAを分解した。
【００５７】
3-2-4.  抗体遺伝子の増幅
得られたcDNAを鋳型にして、重鎖遺伝子の取得用5'プライマー（配列1-13）と3'プライマー（配列14-16）を用いて、PCRを行った。また、κ遺伝子の取得用5'プライマー（配列17-35）と3'プライマー（配列37-44）を用いて、PCRを行った。また、λ遺伝子の取得用5'プライマー（配列36）と3'プライマー（配列45）を用いて、PCRを行い、DNA断片を作製した。PCRの反応条件を以下に示した。
200pmol/μL  VH(Vk, VL) primer mix            10μL
200pmol/μL  JH(Jk, JL) primer mix            10μL
cDNA                                          10μL
10×LA Taq Polymerase buffer(Taqに添付)      100μL
25mM MgCl2                                    100μL
2.5mM dNTP                                    80μL
LA Taq Polymerase(TAKARA 5U/μL)              10μL
滅菌miliQ水                                  680μL
total                                      1000μL
94℃、3分→94℃、1分；65℃、2分；72℃、1分
【００５８】
あらかじめ予備実験を行い、非特異反応産物を生じない、適当なサイクル数（20サイクル前後）を決定して行った。
PCR産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して90μLのTEバッファーに懸濁し、10μLの10×sample loading bufferを加えて、0.8％のアガロースゲルで電気泳動したのち、450bp付近の目的のバンドを切り出し、QIAQuick Gel Extraction Kit (QIAGEN 28704)で精製した。重鎖遺伝子取得用プライマーの塩基配列中、VH下線部はSfiIサイト、 JH下線部はNotIサイトを示す。軽鎖遺伝子取得用プライマーの塩基配列中、Vk(VL)下線部はNcoIサイト、Jk(JL) 下線部はAscIサイトを示す。
【００５９】
以下、用いたプライマーを示す。
Rabbit VH PCR primer
[1](rabV1a1)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCGGTGGAGGAGTCCGG(G/C)GG-3’（配列番号１）
[2](rabV1a2)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGA-3’（配列番号２）
[3](rabV1a3)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCGCTGG(A/T)GGAGTCCGGGGG-3’（配列番号３）
[4](rabV1a4)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCGGTGGAGGAGTCCAGGGG-3’（配列番号４）
[5](rabV1a5)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTC(G/A)GTGAAGGAGTCCGAGGG-3’（配列番号５）
[6](rabV2)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGG-3’（配列番号６）
[7](rabV3a1)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGG-3’（配列番号７）
[8](rabV3a2)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGCAGCTGGAGCA(C/G)TCCGCAGG -3’（配列番号８）
[9](rabV4a1)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAG(C/G)AGCAGCTGATGGAGTCCGG-3’（配列番号９）
[10](rabV4a2)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGG-3’（配列番号１０）
[11](rabV4a3)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGG-3’（配列番号１１）
[12](rabV4a4)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCAGCTGGTGGAGT(C/A)CGGGGG-3’（配列番号１２）
[13](rabV4a5)
5’-ACTTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCAGCTGAAGGAGTCCGG(G/A)GG-3’（配列番号１３）
【００６０】
JH PCR  プライマー
[14] rabJH2Not
5’-AGAACCACCGCGGCCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTGCCTGGG-3’（配列番号１４）
[15] rabJH5Not
5’-AGAACCACCGCGGCCGCTCGAGAC(G/A)GTGACCAGGGTGCCCTGG-3’（配列番号１５）
[16] rabJH6Not
5’-AGAACCACCGCGGCCGCTCGAGACGGTGACGAGGGTCCCTGGG-3’（配列番号１６）
【００６１】
Vk PCR  プライマー
[17] Rabvk1
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGC(C/G)CTTGTGATGACCCAGACTCC-3’（配列番号１７）
[18] Rabvk2
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCAGCCGTGCTGACCCAGACACC-3’（配列番号１８）
[19] Rabvk3
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGACCCT(G/A)TGCTGACCCAGACTGC-3’（配列番号１９）
[20] Rabvk4
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGACCCTGTGCTGACCCAGACACC-3’（配列番号２０）
[21] Rabvk5
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCAGCCGTGATGACCCAGACTCC-3’（配列番号２１）
[22] Rabvk6
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTCGTGATGACCCAGACT(C/G)C-3’（配列番号２２）
[23] Rabvk7
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGACATTGTGCTGACCCAGACTGC-3’（配列番号２３）
[24] Rabvk8
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCTATGTCATGATGACCCAGACTCC-3’（配列番号２４）
[25] Rabvk9
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCTCAAGTGCTGACCCAGACTGA-3’（配列番号２５）
[26] Rabvk10
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCCCAAGGGCCAACCCAGACTCC-3’（配列番号２６）
[27] Rabvk11
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGACCCTGTGATGACCCAGACTCC-3’（配列番号２７）
[28] Rabvk12
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATCGATATGACCCAGACTCC-3’（配列番号２８）
[29] Rabvk13
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGATGGCGTGATGACCCAGACTCC-3’（配列番号２９）
[30] Rabvk14
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCC-3’（配列番号３０）
[31] Rabvk15
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATCAAAATGACCCAGACTCC-3’（配列番号３１）
[32] Rabvk16
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGACCCT(A/G)TGCTGACCCAGACTCC-3’（配列番号３２）
[33] Rabvk17
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCCCAAGTG(A/C)TGACCCAGACTCC-3’（配列番号３３）
[34] Rabvk18
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTCGTGCTGACCCAGACTGC-3’（配列番号３４）
[35] Rabvk19
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCGCCCT(G/T)GTGATGACCCAGACTCC-3’（配列番号３５）
VL PCR  プライマー
[36] rabVL
5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGCCTGTGCTGACTCAGTCGCC-3’（配列番号３６）
Jk PCR  プライマー
[37] rab4K1J2Asc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAACCTTTGACCACCACCTCGGT-3’（配列番号３７）
[38] rab4vK1J2Asc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAACCTTTGACGACCACCTCGGT-3’（配列番号３８）
[39] rab5K1J2Asc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAAACTTCGACGACCACCTTGGT-3’（配列番号３９）
[40] rab9K1J2Asc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAACATAGGATCTCCAGCTCGGT-3’（配列番号４０）
[41] rab95K1J2Asc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAAACTTTGACCACCACCTCGGT-3’（配列番号４１）
[42] rab4K2J1Asc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAACGTTTGATTTCCACCTTGGT-3’（配列番号４２）
[43] rab4K2J2Asc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAACGTTTGATCTCCACCTTGGT-3’（配列番号４３）
[44] rab4K2J3Asc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAACGTTTGATCTCCAGCTTGGT-3’（配列番号４４）
【００６２】
JL PCR  プライマー
[45] rabLJAsc
5’-GGAGTCGACTGGCGCGCCGAACCTGTGACGGTCAGCTGGGT-3’（配列番号４５）
【００６３】
JH cDNA用プライマー
[46] rabJH2R
5’-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’（配列番号４６）
[47] rabJH5R
5’-TGAAGAGAC(G/A)GTGACCAGGGTGCC-3’（配列番号４７）
[48] rabJH6R
5’-TGAAGAGACGGTGACGAGGGTCCC-3’（配列番号４８）
Jk cDNA用プライマー
[49] rab4K1J2
5’-ACCTTTGACCACCACCTCGGTCCC-3’（配列番号４９）
[50] rab4vK1J2
5’-ACCTTTGACGACCACCTCGGTCCC-3’（配列番号５０）
[51] rab5K1J2
5’-AACTTCGACGACCACCTTGGTCCC-3’（配列番号５１）
[52] rab9K1J2
5’-ACATAGGATCTCCAGCTCGGTCCC-3’（配列番号５２）
[53] rab95K1J2
5’-AACTTTGACCACCACCTCGGTCCC-3’（配列番号５３）
[54] rab4K2J1
5’-ACGTTTGATTTCCACCTTGGTGCC-3’（配列番号５４）
[55] rab4K2J2
5’-ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3’（配列番号５５）
[56] rab4K2J3
5’-ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTTCC-3’（配列番号５６）
【００６４】
JL cDNA用プライマー 
[57] rabLJR
5’-ACCTGTGACGGTCAGCTGGGTCCC-3’（配列番号５７）
【００６５】
[58] XNSCN1B2
5’-CCACGGTCACCGTCTCGAGCGGCCGCGGTGGTTCTGGTGGTGGCGGTTCTGG-3’（配列番号５８）
[59] XNSCN1F
3’-AAGACCACCACCGCCAAGACCGCCACCACCAAGGTACCGGCTG-5’（配列番号５９）
【００６６】
3-2-5.  軽鎖ライブラリーの作製
１）  pSCCA5-E8d 6μgをNcoIで消化、Alkaline Phosphatase(E. coli C75)にて脱燐酸した。条件を以下に示した。
PSCCA5-E8d               6μg
NcoI(TAKARA 10U/ul)      6μL
10×K buffer            10μL
0.1%BSA                  10μL
滅菌miliQ水で100μLにあわせ、37℃で2時間反応させた。1M Tris-HCl(pH8) 10μLとAlkaline Phosphatase(E. coli C75)(TAKARA 0.45U/μl) 1μLを加えて37℃、30分間反応させた。このベクターDNAをフェノール、クロロホルム処理したのちに、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製し、60μLのDNA溶液を得た。
【００６７】
２）  PCRで作製したκ遺伝子ＤＮＡ断片あるいはλ遺伝子ＤＮＡ断片をNcoIで以下の条件で消化した。
PCR産物DNA断片          10μg
10×K buffer(NcoIに添付)  10μL
0.1%BSA                    10μL
NcoI(TAKARA 10U/μL)        6μL
滅菌miliQ水で100μLにあわせ、37℃で2時間反応させたのち、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製し、60μLのDNA溶液を得た。
【００６８】
２）  ２）と１）を以下の条件でligationさせた。
PSCCA5-E8d/NcoI-BAP                             60μL
PCR産物DNA/NcoI                                60μL
10×T4 DNA ligation buffer(T4 DNA ligase添付)   20μL
T4 DNA ligase(TAKARA 350U/μL)                  10μL
滅菌miliQ水で200μLにあわせ、16℃で3時間反応させた。これをフェノールクロロホルム処理し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製し、120μLのDNA溶液を得た。
【００６９】
４）  ３）をAscIで消化、self ligationさせた。条件を以下に示した。
DNA溶液                                  120μL
10×NEB4（AscIに添付）                    20μL
AscI(NEW ENGLAND Biolabs Inc. 10 U/μL)    6μL
滅菌miliQ水で200μLにあわせ、37℃で2時間反応させた。これをフェノール処理後、エタノール沈殿して90μLのTEバッファーに懸濁し、10μLの10×sample loading bufferを加えて、0.8％のアガロースゲルで電気泳動したのち、4,850bp付近の目的のバンドを切り出し、QIAQuick Gel Extraction Kit (QIAGEN 28704)で精製した。120μLのDNA溶液を得た。self ligationを行った。
DNA溶液                                        120μL
10×T4 DNA ligation buffer(T4 DNA ligase添付)   80μL
T4 DNA ligase(TAKARA 350U/μL)                   10μL
滅菌miliQ水で800μLにあわせ、16℃で3時間反応させた。これをフェノールクロロホルム処理し、ブタノールで濃縮したのち、エタノール沈殿した。
【００７０】
５）  ファージミドの大腸菌への導入
得られたligated DNAを用いて以下のように大腸菌DH12Sを形質転換した。即ち、ligated DNA を一旦エタノール沈殿し、1/5TE(TEを滅菌済MilliQで5倍希釈したもの) 5μLに溶解した。5μLをコンピテントセルElectroMax DH12S Cells (GIBCO BRL製)110μLに懸濁し、20μLずつをマイクロエレクトロチャンバー6本に分注し、以下の条件でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター
BRL社Cell-Porator(Cat.series 1600)
設定条件；voltage booster    4kΩ
capacitance        330μF
DC volts          LowΩ
charge rate        Fast
形質転換した上記の大腸菌を2×YT 10mLに懸濁し、あらかじめ37℃で保温しておいた以下の組成の培地に加え、37℃で1時間培養した。
2×YT          380mL
40％Glucose    10mL(final 1%)
37℃で1時間培養後に15μLをサンプリングし、形質転換された大腸菌の数の計測に使用するため、以下のように希釈して0.2% glucose, 100ug/mL ampiciliinを含むLBプレート（LBGAプレート）へまいた。培養液は100mg/mL  ampicillin (final 100μg/mL)を加えて30℃で一晩培養した。大腸菌からプラスミドDNAを回収した。
菌体培養液15μL
↓←2×YT培地  135μLを加えた
150μL→100μLをまいた（400mL培養液の10μL分）
↓
15μL
↓←2×YT培地  135μLを加えた
150μL→100μLをまいた（400mL培養液の1μL分）
↓
15μL
↓←2×YT培地  135μLを加えた
150μL→100μLをまいた（400ml培養液の0.1μL分）
形質転換された大腸菌の数（形質転換効率）は、κ鎖ライブラリーについては
4.32×107であり、λ鎖ライブラリーについては8.56×107であった。
【００７１】
６）  ５）で得られたκ鎖ライブラリーおよびλ鎖ライブラリーのそれぞれのプラスミドＤＮＡを９：１の割合で混合し、軽鎖ライブラリーpSCCA5-rSrcKLとした。
【００７２】
3-2-6.  軽鎖ライブラリーへの重鎖遺伝子DNA断片の組み込み
７）  ６）で得られた軽鎖ライブラリーpSCCA5-rSrcKL 6μg をNotIで消化し、Alkaline Phosphatase(E. coli C75)(TAKARA)にて脱燐酸した。条件を以下に示した。
pSCCA5-rSrcKL             6μg
NotI(TAKARA 10U/μL)      6μL
10×H buffer(NotI添付)  10μL
0.1%BSA                  10μL
0.1%tritonX-100          10μL
滅菌miliQ水で100μLにあわせ、37℃で2時間反応させた。1M Tris-HCl(pH8) 10μLとAlkaline Phosphatase(E. coli C75)(TAKARA 0.45U/μL) 1μLを加えて37℃、30分間反応させた。このベクターDNAをフェノール処理したのちに、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製し、60μLのDNA溶液を得た。 
【００７３】
８）  PCRで作製した重鎖遺伝子ＤＮＡ断片をNotIで以下の条件で消化した。
PCR産物DNA断片          10μg
NotI(TAKARA 10U/ul)        6μL
10×H buffer(NotI添付)    10μL
0.1%BSA                    10μL
0.1%tritonX-100            10μL
滅菌miliQ水で100μLにあわせ、37℃で2時間反応させたのち、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製し、60μLのDNA溶液を得た。
【００７４】
９）  ７）と８）を以下の条件でligationさせた。
pSCCA5-rSrcKL/NotI-BAP                          60μL
PCR産物DNA/NotI                                60μL
10×T4 DNA ligation buffer(T4 DNA ligase添付)  20μL
T4 DNA ligase(TAKARA 350U/μL)                  10μL
滅菌miliQ水で200μLにあわせ、16℃で3時間反応させた。これをフェノール処理し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製し、120μLのDNA溶液を得た。
【００７５】
１０）  ９）をSfiIで消化、self ligationさせた。条件を以下に示した。
DNA溶液                                120μL
10×NEB2（SfiIに添付）                  16μL
0.1%BSA                                  16μL
SfiI (NEW ENGLAND Biolabs Inc. 20U/μL)  6μL
滅菌miliQ水で160μLにあわせ、50℃で2時間反応させた。これをフェノール処理後、エタノール沈殿して90μlのTEバッファーに懸濁し、10μLの10×sample loading bufferを加えて、0.8％のアガロースゲルで電気泳動したのち、5,000bp付近の目的のバンドを切り出し、QIAQuick Gel Extraction Kit (QIAGEN 28704)で精製した。120μLのDNA溶液を得た。self ligationを行った。
DNA溶液                                        120μL
10×T4 DNA ligation buffer(T4 DNA ligase添付)  80μL
T4 DNA ligase(TAKARA 350U/μl)                  10μL
滅菌miliQ水で800μLにあわせ、16℃で3時間反応させた。これをフェノール処理し、ブタノールで濃縮したのち、エタノール沈殿した。
【００７６】
3-2-7.  ファージミドの大腸菌への導入およびファージライブラリーの作製
3-2-6.で得られたligated DNAを用いて3-2-5 5)と同様に 大腸菌DH12Sを形質転換して培養を行い、一部をサンプリングしてプレートへまいた。
培養液は100mg/mL ampicillin (final 100μg/mL)を加えて37℃で培養した。培地の濁度(O.D.600nm)を経時的に測定し、0.7になったとき、培養液100mLを別のフラスコへ移して30℃で一晩培養し、大腸菌からプラスミドDNAを回収して、ライブラリーpSCCA5-rSrcKLHとした。残りの300mLについて37℃で培養を続け、濁度が1.6になったときに遠心により大腸菌を回収した。菌体を2×YT培地で懸濁し、5mLとし、4mLをグリセロールストックとした。残りの1mLを以下の組成の培地に加え、37℃で1時間培養した。
2×YT培地             195mL
100mg/ml ampicillin   0.2mL
M13KO7                  4mL
Total                  199mL
37℃で1時間培養したのち、以下の組成の培地を加え（最終的に800 mLとなった）、37℃で一晩（16時間）培養した後、ファージ抗体を調製した。
2×YT培地            599mL
100mg/ml ampicillin  0.6mL
70mg/ml kanamycin    0.8mL
Total                600mL
形質転換された大腸菌の数（形質転換効率）は、0.92×108であった。
【００７７】
3-2-8.  ファージ抗体の調製
菌体は４℃で8000rpm、１０分間遠心し、上清を集めた。上清に20％のポリエチレングリコール／2.5M NaCl 500mLを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で8000rpm、２０分間遠心、沈殿を100mLのPBSで溶かし、20％のポリエチレングリコール／2.5M NaCl 20mLを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で8000rpm、２０分間遠心した。上清を捨ててさらに４℃で8000rpm、３分間遠心して沈殿を回収した。沈殿は0.05％ NaN3を加えたPBS 4mlで溶解し、４℃で1000rpm、１５分間遠心し、上清を回収した後、４℃で8000rpm、３分間さらに遠心して上清を回収した。
回収したファージ溶液の力価は以下のようにチェックした。すなわち、ファージ溶液をPBSで106、107、108希釈し、その10μLをDH12S 990μLに感染させ、３７℃で１時間培養した。これをLBGAプレートに100μL播いて３０℃で１８時間培養した。コロニーの数をカウントすることにより希釈前の原液の力価を算出した。ファージ溶液原液を２％スキムミルク及び0.05％ NaN3を含むPBSに2×1014/mlになるよう懸濁した。
2×YT培地：900mLの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後5N NaOHでpHを7.0に調製し、精製水を加えて1000mLとした。オートクレーブで２０分間滅菌して使用した。
bacto-tryptone      16g
bacto-yeast extract  10g
NaCl                  5g
【００７８】
その他の試薬は以下から購入した。
メーカー名      品名
シグマ          アンピシリンナトリウム
和光純薬        フェノール
シグマ          BSA
DIFCO          ２×YT培地
和光純薬        カナマイシン硫酸塩
ナカライテスク  ポリエチレングリコール6000
ナカライテスク  Tween20
片山化学        NaCl
和光純薬        IPTG
和光純薬        スキムミルク
和光純薬        アジ化ナトリウム
和光純薬        トリエチルアミン
和光純薬        過酸化水素
和光純薬        ＯＰＤ錠
和光純薬        エタノール
【００７９】
4.  ファージライブラリーからの特定の抗原に特異的に結合するファージの選択
ファージライブラリーから特定の抗原に特異的に結合するファージを選択する操作を、本明細書ではスクリーニングと呼ぶ。抗原として1.で精製したvSrcを用い、抗体ライブラリーのスクリーニングを行った。
【００８０】
4-1.  スクリーニング用マイクロカップの作製
抗原（vSrc）は1で示したBuffer2から以下に示したBuffer3へ段階透析して変性剤を除去して500μg/mLとし、さらに以下に示したBuffer4 で50μg/mLに調製した。これをマイクロカップ2ウェル（Nunc社製Maxisorp）に100μLずつ添加して４℃で18時間インキュベートして、マイクロカップ内表面へ抗原を吸着させた。吸着後、抗原溶液を捨て、2％BSA含有PBS溶液200μLずつを加えて37℃で１時間反応させ、ファージ抗体が非特異的にマイクロカップに結合することを防ぐためにブロッキングを行った。
Buffer3; 20mM  Tris-HCl（pH 8）, 120mM  NaCl, 1mM  DTT, 10%  グリセリン, 0.01% NP-40
Buffer4; 20mM  Tris-HCl（pH 8）, 120mM  NaCl, 1mM  DTT
【００８１】
4-2.  スクリーニング操作
作製した抗原吸着済マイクロカップにファージライブラリーpSCCA5-rSrcKLHを1％BSA含有PBSになるよう溶解して1×1013CFU/100μLに調製し、この液をマイクロカップカップ2ウェルに50μLずつ添加して37℃で2時間反応させた後、PBSで5回洗浄した。
続いて抗原結合マイクロカップカップに結合したファージを以下のように回収した。すなわち、0.1M HCl-glycine（pH2.2）をマイクロカップカップ１ウェル当たり100μL添加し、室温で10分間反応させ乖離させた後、2M Tris 6μLを加えて中和し、この液を回収した。
【００８２】
4-3.  回収したファージの増幅
回収した液は（ファージの大腸菌への感染）（ヘルパーファージの感染）（ファージの回収）の処理を行い、含まれているファージを精製・増幅した。
１）  ファージの大腸菌への感染
大腸菌(DH12S)をSB(super broth)培地20mlで培養し、波長600nmの吸光度が0.5になるよう増殖させ、上記で回収したファージ液を加えて37℃で1時間振とう培養した。
SB培地  10g MOPS
30g tryptone
20g yeast extract
NaOHでpH7とし、脱イオン水で1リットルとし、滅菌した。
【００８３】
２）  ヘルパーファージの感染
１）の培養液へ、SB培地60mL、100μg/mLアンピシリン40μL (final 50μg/mL)を加えて37℃で2時間培養した後、100mg/mLアンピシリン460μLを加えたSB培地420mL(アンピシリンfinal 100μg/mL)を加え、これにヘルパーファージM13K07を1013cfu加え、37℃で1時間振とう培養した。その後、50mg/mLのカナマイシンを500μL加え（final 50μg/mL）、37℃で一晩培養した。
【００８４】
３）  ファージの回収
２）の培養液を４℃で7000rpm、１０分間遠心し、その上清に2.5Mの塩化ナトリウムを加えた20％のポリエチレングリコールを1/5量加えて室温で20分間静置した後、4℃で8000rpm、15分間遠心して沈殿を回収し、培養液の1/10量の滅菌PBSを加えて溶解し、再度2.5Mの塩化ナトリウムを加えた20％のポリエチレングリコールを1/5量加えて4℃で10,000rpm、20分間遠心して上清を捨て、さらにスピンダウンして4℃で10,000rpm、2分間遠心した。これに0.05％のNaN3を加えたPBSを培養液の3.2mL加えて沈殿を溶解してファージを回収し、5％BSAを0.8mL加えた。
【００８５】
4-4.  増幅したファージによる再スクリーニング
増幅したファージを用いて4-2.と同様に抗原吸着済マイクロカップを用いてスクリーニングを繰り返した。スクリーニングでの洗浄は、２回目のスクリーニングにおいては10回、３回目以降のスクリーニングでは15回とした。用いるマイクロカップは２回目以降は1ウェルとした。
【００８６】
4-5.  ファージのスクリーニング手技の評価法
4-4.の方法でスクリーニングを繰り返すとき、（抗原吸着済マイクロカップに投入したファージの総数）／（抗原吸着済マイクロカップから回収したファージの総数）が前回のスクリーニングに比べて明らかに小さくなれば、目的の抗体を提示しているファージが濃縮されつつあると推測できる。溶液に含まれるファージ数は、以下のように計算した。
1)ファージの希釈系列を以下のように作製した。
[1] １×10-2希釈：ファージ液10μL＋PBS990μL
[2] １×10-4希釈：[1]の希釈液10μL＋PBS990μL
[3] １×10-6希釈：[2]の希釈液10μL＋PBS990μL
[4] １×10-8希釈：[3]の希釈液10μL＋PBS990μL
[5] １×10-9希釈：[4]の希釈液100μL＋PBS900μL
[6] １×10-10希釈：[5]の希釈液100μL＋PBS900μL
[4]、[5]、および[6]の希釈系列10μLにDH12S 990μLを加えたものを作り、３７℃で１時間感染させ、これをLBGAプレートに100μLまいて３０℃で18〜24時間培養し、コロニーを計数した。上記希釈系列のうち、通常[4]のプレートが50個以上のコロニーを作る。mL当たりのファージ数は[4]のプレートのコロニー数に基づいて、以下のように算出される。
原液のファージ数＝（コロニー数／プレート）×（１×108）×103 cfu/mL
【００８７】
また、回収されたファージ数も同様に計算し、本抗原に対する抗体を提示するファージの数をスクリーニングごとに求めたところ、表1のようになった。
【００８８】
【表１】
2005160433.tif 000003
【００８９】
4-6.  スクリーニングによって得られた抗体の抗原結合活性（アフィニティー）の測定
以上のスクリーニングによって選択された抗体について、抗原結合活性（アフィニティー）を測定した。アフィニティーの測定には、ファージ型の抗体ではなく、scFv-cp3型抗体をサンプルとして用いた。測定方法は、96ウェルマイクロタイタープレートを用いたELISA法とした。scFv-cp3型抗体の発現誘導法については4-7.で述べる。
まずELISA用のプレートを以下のように調製した。抗原50μg/mLを96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社製Maxisorp）の各ウェルに50μL添加して4℃で18時間結合させたのち、5％BSA（ブロッキング液）を各ウェルに200μL添加して37℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、PBSで1回洗浄してアフィニティーの測定に用いた。4-7.の手順で採取した培養上清を各ウェルに100μL加え、25℃１時間反応させた。反応後、PBSで8回洗浄し、抗cp3マウスモノクローナル抗体（3H11） 5μg/mL（（株）医学生物学研究所製）を100μL加えて37℃で1時間反応させた。再度PBSで8回洗浄し、1000倍希釈した抗マウスIgG（H+L）ヤギ抗体Fab’−HRP標識(330)（（株）医学生物学研究所製）を100μL加えて37℃で1時間反応させた。再度PBSで8回洗浄し、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液100μLを加えて暫時反応させた後、1.5Nリン酸100μLを加えて反応を停止し、波長492nmにおける吸光度を測定した。その結果95クローン中83クローンに活性が確認された（図２３）。
【００９０】
4-7.  scFv-cp3型抗体の発現誘導
ファージの感染した大腸菌を1％グルコースと100μg/mLのアンピシリンを加えた2×YTで30℃18時間培養した後、0.1％グルコースと100μg/mLのアンピシリンを加えた2×YT 1.5mLに上記培養液を5μL加えて30℃で4時間培養した。このときの大腸菌の濃度は波長600nmの吸光度を測定するとき、約0.5であった。
これに1mMになるようIPTG（イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド）を加えてさらに30℃で18時間培養した後、培養液1.5mLをエッペンドルフチューブにとり、4℃で10,000r.p.m.  5分間遠心してその培養上清をとり、0.1％となるようアジ化ナトリウムを添加して検体とした。
scFv-cp3型抗体が発現しているか否かは4−8.で示したELISA法で確認した。4-6.で陽性だったクローン（抗原結合活性があるクローン）はすべて発現が認められた。
【００９１】
4-8.   scFv-cp3型抗体の発現確認
4-7.でscFv-cp3型抗体を発現させた培養上清を96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社製Maxisorp）の各ウェルに100μL添加して37℃で1時間結合させたのち、5％BSA（ブロッキング液）を各ウェルに200μL添加して37℃で1時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、PBSで１回洗浄してアフィニティーの測定に用いた。抗cp3マウスモノクローナル抗体（3H11） 5μg/mL（（株）医学生物学研究所製）を100μL加えて37℃で1時間反応させた。再度PBSで8回洗浄し、1000倍希釈した抗マウスIgG（H+L）ヤギ抗体Fab’-HRP標識(330)（（株）医学生物学研究所製）を100μL加えて37℃で1時間反応させた。再度PBSで8回洗浄し、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液100μLを加えて暫時反応させた後、1.5Nリン酸100μLを加えて反応を停止し、波長492nmにおける吸光度を測定した。
【００９２】
4-9.  モノクローナル化とファージミドの精製
4-5.「ファージのスクリーニング手技の評価」の項で得たシングルコロニーのプレートから大腸菌クローンを選択し、LBGA中で30℃、18時間培養した後、倉敷紡績社製DNA分離装置PI-50 File No.50を用いてファージミドを精製した。
4-10.  モノクローナル抗体の同定
本発明の抗体ライブラリーからスクリーニングによって選択された抗vSrc抗体について、その遺伝子の配列を確認した。配列は、重鎖、軽鎖について以下のプライマーを用い、CEQTMDTCS-Quick Start-KIT(Beckman Coulter)とBeckman Coulter社製CEQ2000XL DNA Analysis systemを使用したジデオキシ法によって決定した。塩基配列決定の結果、H鎖とL鎖の組み合わせから21種類の抗体が得られた。
重鎖のシークエンシング用プライマー（SDSEQプライマー）：５’-TTCTATTTCAAGGAGACAGTC-３’（配列番号６０）
軽鎖のシークエンシング用プライマー（CP3RGGGプライマー）：５’-GCCGCCGCCAGCATTGACA-３’（配列番号６１）
【００９３】
4-11.  シャペロン活性測定用ポリクローナルscFv-pp型抗体の採取
4-11-1.  ポリクローナル抗体scFv-cp3型抗体のscFv-pp型抗体への変換
2.で得られた抗体のシャペロン様活性をライブラリーの抗体で再現性を得ることを目的とし、4thスクリーニングのポリクローナル抗体を調製した。精製の便宜上、scFv-pp型抗体へ変換した。ベクターは、SalIで消化し、self-ligationさせるとcp3が切り出され、pp型抗体へ変換されるように構築されているが（図２０〜２２）、4-10.で調べたDNA配列の解析結果より、ウサギ抗体は、H鎖のFW3部分にSalI siteをもつものが21クローンのうち７クローンと1/3の割合で含まれるので、この方法は用いることができなかった。そこで、SfiI-AscI siteで抗体遺伝子を切り出し、すでにpp型へ変換したベクターに挿入する方法をとった。
【００９４】
１）  4thポリクローナル抗体の調製を行った。4thスクリーニングのグリセロールストックから、4thのパニングで回収したファージの数3.6×106を含む（4-5.参考）数の菌体量以上をとり、1％グルコースと100μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地150mLで30℃、一晩培養し、プラスミドを調製した。
【００９５】
２）  １）で得られたプラスミドDNAをフェノール処理し、エタノール沈殿してから以下の条件でSfiI-AscI siteで消化した。
プラスミドDNA    28μg
SfiI（20U/μL）  7μL
10×NEB（ New  England  Biolabs）  Buffer2    20μL
0.1%BSA          20μL
滅菌miliQ水で200μLとし、50℃で2時間反応させ、フェノール処理しエタノール沈殿した後、以下の条件でAscI消化を行った。
プラスミドDNA
AscI（10U/μL）    14μL
10×NEB Buffer 4    20μL
滅菌miliQ水で200μLとし、37℃で2時間反応させ、フェノール処理しエタノール沈殿した後、90μLのTEで懸濁し、10μLのsample loading bufferを加えて0.8％アガロースゲルで電気泳動を行い、700bp付近の目的のバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)で精製した。120μLのDNA溶液（2μg相当）が得られた。
【００９６】
３）  H鎖およびL鎖にSalI siteを含まないクローン4007についてPI-50プラスミド抽出機（クラボウ社製）によりプラスミドDNAを調製し、20μL(20ng)にTE 40μLを加えてフェノール処理し、エタノール沈殿してから以下の条件でSalI消化、Self-ligationしてpp型変換抗体プラスミドDNAを作製した。
プラスミドDNA
10×H buffer(SalI添付)    2μL
SalI（15U/μL  TAKARA）    0.3μL
滅菌MiliQ水で20μLとし、37℃で2時間反応させて2μLを0.8％アガロースゲル電気泳動によりcp3に相当するおよそ600bpのバンドが切り出されたことを確認した後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、以下の条件でSelf-ligationさせた。
プラスミドDNA
T4 DNA ligase(TAKARA 350U/μL)                1μL
10×T4 DNA ligase buffer(T4 DNA ligase添付)  6μL
滅菌MiliQ水で60μLとし、16℃で3時間反応させた。20mg/mlのグリコーゲン（Roshe社製）3μLを加え、エタノール沈殿を行い、5μLの1/10 TEで懸濁し、2μLでDH12Sコンピテントセル20μLを形質転換し、1mlの2×YTで希釈し、20μLをLBGAプレートへまき、30℃で一晩培養した。翌日はえたコロニーを4クローンひろい、2mlの１％グルコースと100μg/ｍLのアンピシリンを含む2×YT培地で30℃、一晩培養し、培養液からPI-50プラスミド抽出機によりプラスミドDNAを回収した。このプラスミドDNAを以下の条件でAscI消化し、4,300bp付近の目的の大きさにバンドが検出されることを確認した。4クローンともpp型抗体に変換されていることが確認された。
プラスミドDNA      3μL（60ng）
AscI（10U/μL）    0.15μL
10×NEB Buffer 4    0.8μL
滅菌MiliQ水で8μLとし、37℃で2時間反応させ、全量を電気泳動した。
変換されたプラスミドDNA 1μLでDH12Sコンピテントセル20μLを形質転換し、1％グルコースと100μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地150mlで30℃、一晩培養し、菌体からプラスミドDNAを調製した。
【００９７】
４）  ３）で得られたpp型変換プラスミドDNAをSfiI-AscI siteで抗体遺伝子配列部分を切り出し、Alkaline phosphatase(E. coli C75)で脱燐酸した。条件を以下に示した。
プラスミドDNA      20μg
SfiI（20U/μL）      5μL
10×NEB Buffer2      20μL
0.1％BSA            20μL
滅菌MiliQ水で200μLとし、37℃で2時間反応させ、フェノール処理、エタノール沈殿を行った。次に以下の反応を行った。
プラスミドDNA
AscI（10U/μL）        10μL
10×NEB Buffer4        20μL
滅菌MiliQ水で200μLとし、50℃で2時間反応させ、1M Tris-HCl(pH8)20μLとAlkaline phosphatase(E. coli C75)2μLを加え、37℃で30分間反応させた後、フェノール処理、エタノール沈殿を行った。90μLのTEで懸濁し、10μLの10×sample loading bufferを加え、0.8％アガロースゲルで電気泳動を行い、stufferの切り出されたベクター部分に相当する3,800bp付近のバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製した。17μg相当のDNA溶液120μLを得た。
【００９８】
５）  ２）と４）で得られたDNAについて以下の条件でligation反応を行った。
ベクターDNA  ２）                            1μg
インサートDNA  ４）                          2μg
T4 DNA ligase(TAKARA 350U/μL)                1μL
10×T4 DNA ligase buffer(T4 DNA ligase添付)  2μL
滅菌MiliQ水で20μLとし、16℃で3時間反応させた。エタノール沈殿を行い、4μLの1/10 TEで懸濁し、2μLでDH12S (Gibco)20μLを形質転換し、10 mLの2×YTで懸濁し、10μLを2×YTで100倍希釈して100μLをLBGAプレートへまき、30℃で一晩培養した。残りの菌体懸濁液を1％グルコースと100μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地500mlで培養し、プラスミドDNAを調製した。翌日プレートからコロニーを94クローンひろい、2mlの１％グルコースと100μg/ｍLのアンピシリンを含む2×YT培地（YTA）で30℃で一晩培養した後、0.1% グルコース YTAで30℃３時間培養したのち、1M IPTGを加え、30℃で20時間培養した。10,000rpmで５分間遠心して上清をとった。このscFv-pp型抗体を含む培養上清を得て、これについて６）に示した方法でpp発現の確認を行った。結果、94クローンのうち84クローンがpp発現していた。
【００９９】
６）  pp発現の確認
4-7.でscFv-pp型抗体を発現させた培養上清を96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社製Maxisorp）の各ウェルに100μL添加して37℃で1時間結合させたのち、5％BSA（ブロッキング液）を各ウェルに200μL添加して37℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、PBSで1回洗浄してアフィニティーの測定に用いた。1000倍希釈したFc-HRP標識（Rockland社製）を100μL加えて37℃で1時間反応させた。
PBSで8回洗浄し、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液100μLを加えて暫時反応させた後、1.5Nリン酸100μLを加えて反応を停止し、波長492nmにおける吸光度を測定した。
【０１００】
こうして得た抗体タンパクを無細胞タンパク質合成系においてSrc合成の際に特異的結合分子として用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の製造方法は様々なタンパク質の合成に利用され得る。また応用分野として、タンパク質の構造及び機能解析、遺伝子の機能解析、変異遺伝子の高速スクリーニング、タンパク質の高速スクリーニング、タンパク質／タンパク質間、タンパク質／DNA間若しくはタンパク質／RNA間の相互作用解析、遺伝子変異の検出や解析、翻訳後修飾の解析、抗ウイルス剤をはじめとする様々な薬剤の開発などにも本発明の利用が図られる。
【０１０２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、組換えvSrcのin vivo合成系の概念図である。E.coli BL21(DE3) 株を宿主として利用した。pBB131 はJ.I.Gordon (Duronio, R. J., Jackson-Machelski, E., Heuckeroth, R. O., Olines, P. O., Devine, C. S., Yonemoto, W., Slice, L. W., Taylor, S. S., and Gordon, J. I. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 1506-1510.)より譲り受けた。pETvSrc は pET14 発現ベクター (Novagen Co.)を基に構築した。
【図２】図２は、v-src遺伝子のcDNA配列（一部）を示す図である。
【図３】図３は、v-src遺伝子のcDNA配列（図２の続き）を示す図である。
【図４】図４は、v-src遺伝子がコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図５】図５は、c-src遺伝子のcDNA配列（一部）を示す図である。
【図６】図６は、c-src遺伝子のcDNA配列（図５の続き）を示す図である。
【図７】図７は、c-src遺伝子がコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図８】図８は、ベクターpEU-vSrcの構成を示す模式図である。pEU3-NII 発現ベクター (TOYOBO)から構築される。cDNA はDr.Hamaguchi (Nagoya Univ.)から譲渡をうけた。Ω配列は植物 (wheat germ) 特異的翻訳エンハンストシーケンスを表す。
【図９】図９は、ベクターpEU-cSrcの構成を示す模式図である。ベクターpEU-vSrcと同様に構築される。
【図１０】図１０は、ベクターpEU-cSrcを用いて無細胞系タンパク質合成を行って得られたtotal画分、可溶性画分、及び不溶性画分の分布をウエスタンイムノブロット法で調べた結果を示す。検出には、抗cSrcモノクローナル抗体GD11（UBI）を用いた。左のレーンから順に、レーン1：cSrc total（5μl） 、レーン２：cSrc sup. （5μl）、レーン３：cSrc ppt. （5μl）、レーン４：cSrc total + Fab（5μl）、レーン5：cSrc sup. + Fab（5μl）、レーン６：cSrc ppt. + Fab（5μl）、レーン７：ネガティブ・コントロール、レーン８：ポジティブ・コントロール（組換えSrc）である。
【図１１】図１１は、ウサギ抗vSrc抗体(Fab)共存下及び非共存下でそれぞれ合成したSrcの活性測定の結果を示すグラフ図である。独立した２回の試験結果をまとめて示した。vSrc1及びvSrc1’は抗体の非共存下で合成したvSrc、(vSrc+Fab)1及び(vSrc+Fab)1’は抗体(Fab)の共存下で合成したvSrc、cSrc1及びcSrc1’は抗体の非共存下で合成したcSrc、(cSrc+Fab)1及び(cSrc+Fab)1’は抗体(Fab)の共存下で合成したcSrc、NCはネガティブ・コントロール（小麦胚芽抽出液、小麦胚芽抽出液＋Fab、又はQW（miliQ水））、PCはポジティブ・コントロール（組換えSrc）をそれぞれ表す。
【図１２】図１２は、cSrc及びvSrcの合成を抗体の非共存下で行い、合成後に抗体を添加した場合の各Src活性を測定した結果を示すグラフ図である。独立した２回の試験結果をまとめて示した。NCはネガティブ・コントロール（小麦胚芽抽出液、小麦胚芽抽出液＋Fab、又はQW（miliQ水））、PCはポジティブ・コントロール（組換えSrc）、vSrc1+Fab及びvSrc2+FabはvSrc合成後に抗体（Fab）を添加したサンプル、cSrc1+Fab及びcSrc2+FabはcSrc合成後に抗体（Fab）を添加したサンプルをそれぞれ表す。
【図１３】図１３は、ウサギ抗体ファージディスプレイライブラリー作製に使用したファージミドベクターの調製過程を説明する図である。
【図１４】図１４は、ウサギ抗体ファージディスプレイライブラリー用ベクターの構築に使用したscNcopFCAH9-E8VHdVLdベクターの塩基配列（一部）及びコードするアミノ酸配列（一部）を示した図である。
【図１５】図１５は、ウサギ抗体ファージディスプレイライブラリー用ベクターの構築に使用したscNcopFCAH9-E8VHdVLdベクターの塩基配列（図１４の続き）及びコードするアミノ酸配列（図１４の続き）を示した図である。
【図１６】図１６は、ウサギ抗体ファージディスプレイライブラリー用ベクターの構築に使用したscNcopFCAH9-E8VHdVLdベクターの塩基配列（図１５の続き）及びコードするアミノ酸配列（図１５の続き）を示した図である。
【図１７】図１７は、ウサギ抗体ファージディスプレイライブラリー用ベクターpSCCA4-E8dの塩基配列（一部）及びコードするアミノ酸配列（一部）を示した図である。
【図１８】図１８は、ウサギ抗体ファージディスプレイライブラリー用ベクターpSCCA4-E8dの塩基配列（図１７の続き）及びコードするアミノ酸配列（図１７の続き）を示した図である。
【図１９】図１９は、ウサギ抗体ファージディスプレイライブラリー用ベクターpSCCA4-E8dの塩基配列（図１８の続き）及びコードするアミノ酸配列（図１８の続き）を示した図である。
【図２０】図２０は、ベクターpSCCA5-E8dのインサートの塩基配列に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（一部）を示す図である。
【図２１】図２１は、ベクターpSCCA5-E8dのインサートの塩基配列に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（図２０の続き）を示す図である。
【図２２】図２０は、ベクターpSCCA5-E8dのインサートの塩基配列に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（図２１の続き）を示す図である。
【図２３】図２３は、抗体ファージディスプレイライブラリーからスクリーニングによって得られたサンプルの抗原結合活性を測定した結果をまとめたグラフ図である。
【図１】
2005160433.tif 000004
【図２】
2005160433.tif 000005
【図３】
2005160433.tif 000006
【図４】
2005160433.tif 000007
【図５】
2005160433.tif 000008
【図６】
2005160433.tif 000009
【図７】
2005160433.tif 000010
【図８】
2005160433.tif 000011
【図９】
2005160433.tif 000012
【図１１】
2005160433.tif 000013
【図１２】
2005160433.tif 000014
【図１３】
2005160433.tif 000015
【図１４】
2005160433.tif 000016
【図１５】
2005160433.tif 000017
【図１６】
2005160433.tif 000018
【図１７】
2005160433.tif 000019
【図１８】
2005160433.tif 000020
【図１９】
2005160433.tif 000021
【図２０】
2005160433.tif 000022
【図２１】
2005160433.tif 000023
【図２２】
2005160433.tif 000024
【図２３】
2005160433.tif 000025
【図１０】
2005160433.tif 000026
【配列表】
2005160433000001.app