(57)【要約】    【課題】  低環境負荷型手段によって、バクテリアセルロース様多糖を機能化する方法を提供すること。    【解決手段】  炭素源としてカルボキシメチルキチンポリマーまたはオリゴマーおよびグルコースを含むことを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産培地、および該培地を用いて得られる新規な生分解性多糖を提供する。また、炭素源として導入すべき基を有するカルボキシメチルキチン誘導体のポリマーまたはオリゴマーおよびグルコースを含む培地でセルロース生産菌を培養することを特徴とする、バクテリアセルロース様多糖に所望の基を導入する方法および該方法によって所望の基が導入されたバクテリアセルロース様多糖を提供する。【選択図】図６
2005058042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物培養用標準培地において、炭素源として、カルボキシメチルキチンのポリマーまたはオリゴマーおよびグルコースを含むことを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産培地。
【請求項２】
微生物培養用標準培地において、炭素源として、カルボキシメチルキチンオリゴマーおよびグルコースを含むことを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
請求項１または２に記載の培地でセルロース生産菌を培養することを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産方法。
【請求項４】
セルロース生産菌が酢酸菌であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法により生産されたバクテリアセルロース様多糖。
【請求項６】
微生物培養用標準培地において、炭素源として導入すべき基を有するカルボキシメチルキチン誘導体のポリマーまたはオリゴマーおよびグルコースを含む培地でセルロース生産菌を培養することを特徴とする、バクテリアセルロース様多糖に所望の基を導入する方法。
【請求項７】
微生物培養用標準培地において、炭素源として導入すべき基を有するカルボキシメチルキチン誘導体のオリゴマーおよびグルコースを含む培地でセルロース生産菌を培養することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
セルロース生産菌が酢酸菌であることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
導入すべき基が色素、酵素、フェロモンおよび忌避剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
色素がＦＩＴＣであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項６から１０のいずれかに記載の方法により導入した基を有するバクテリアセルロース様多糖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物により生産されるバクテリアセルロース様の新規な多糖およびバクテリアセルロース様多糖に所望の基を導入することによる多糖の機能化に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは主に高等植物によってつくられるが、微生物の中にもセルロースをつくるものが知られている。そのような微生物としては、Acetobacter属、Agrobacterium属、Rhizobium属、Sarcina属、Pseudomonas属、Achromobacter属、Alcaligenes属、Aerobacter属、Azotobacter属などがある。このなかでも酢酸菌、Acetobacter属の一種はセルロースを菌体外に大量に生産することが知られている。
【０００３】
これらの微生物により産生されるセルロースは、微生物セルロースまたはバクテリアセルロースとよばれている。バクテリアセルロースは、木材中のセルロースと異なりヘミセルロースやリグニンをまったく含まない純粋なセルロースである。また、高結晶性、高弾性、高吸水性等すぐれた物理的性質をもち、さまざまな工業材料としての可能性や食品材料としての応用が期待されている。
【０００４】
バクテリアセルロースは膜の網目構造を利用した分離膜や高強度を利用した音響振動板、分散化したセルロースの水分保持機能を利用した添加剤などへの利用が可能であることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
生分解性高分子化合物であるセルロースは生活に密接な関係があるため生産量が増えつつあるが、地球環境保全の観点からセルロース生産の樹木依存性を低め、バイオマスによるセルロース生産を増やすことが望まれている。しかし、酢酸菌などのバクテリアにより生産されるセルロースは、生産コストが高く、商品化することは難しい。
【０００６】
生産性を改善するために、糖蜜蝋やパルプスラッジなどの安価に入手できる原料の利用や遺伝子組換えによる育種改良が検討されているが、いまだに生産性に見合う手段は見出されていない。また、採算をとるために化学修飾によりセルロースに他の糖残基を導入して機能化する試みもなされている。
【０００７】
化学修飾によらずバイオマスにより糖残基を導入する方法として、培地にグルコサミンを添加することによりバクテリアセルロース中にアミノ基を導入することでセルラーゼのみならず、自然界に広く分布するキチナーゼ類でも加水分解される多糖が生合成されることを示唆する報告がなされている。また、培地にカルボキシメチルセルロースを添加することによりバクテリアセルロース中にカルボキシメチル基を導入し、金属イオン吸着特性が変化することも報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
しかし、医薬のように嵩高い基を有する糖誘導体をセルロース分子中に導入することは、セルロース本来の生分解性を失うことにもなり得るため、単純なバクテリア培養だけでは困難とされていた。
【特許文献１】特開平１０−６０００１号公報
【非特許文献１】セルロース学会編、「セルロースの事典」、初版、朝倉書店、２０００年１１月１０日、ｐ．４３−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、環境への負荷が高い化学修飾ではなく、低負荷型の反応で、バクテリアセルロースに所望の基を導入することによる多糖を機能化することにより、生分解性の速い多糖誘導体を得ることを目的とする。また、バクテリア培養によって嵩高い基を導入することによりセルロースを高度に機能化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様は、微生物培養用標準培地において、炭素源として、カルボキシメチルキチンのポリマーまたはオリゴマーおよびグルコースを含むことを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産培地を提供する。
【００１１】
「カルボキシメチルキチン（以下ＣＭ−キチンと称する）ポリマーまたはオリゴマー」とは、Ｎ−アセチルグルコサミンの６位の水酸基がカルボキシメチル化されたモノマーを構成単位とするポリマーまたはオリゴマーをいう。本明細書において、「ＣＭ−キチンポリマーまたはオリゴマー」は、該ポリマーまたはオリゴマーにおいて、Ｎ−アセチル基および／またはカルボキシメチル基が一部脱離して水酸基となっているものもまた含むものとする。
【００１２】
Ｎ−アセチル基および／またはカルボキシメチル基が脱離していないＣＭ−キチンの構造を下記式１に示す。
【化１】
2005058042.tif 000003
【００１３】
例えば、その一部として下記式２の構造を有するポリマーまたはオリゴマーもＣＭ−キチンに含まれる。
【化２】
2005058042.tif 000004
【００１４】
本発明において用いるＣＭ−キチンの供給源は特に限定されない。例えば、甲陽ケミカル社製のものなど、市販のものであってもよいし、キチンからアルカリキチンを経由してモノクロル酢酸と縮合させて製造したものを用いてもよい。
【００１５】
また、本発明は上記第一の態様による本発明の培地でセルロース生産菌を培養することを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産方法および該方法により生産されたバクテリアセルロース様多糖を提供する。
【００１６】
ＣＭ−キチンポリマーを培地に添加した場合、該ポリマーは、セルロース生産菌により分泌されたキチナーゼにより加水分解され、菌体が取り込みやすいより低分子量のオリゴマーとなると推定される。したがってＣＭ−キチンポリマーを添加してもＣＭ−キチンオリゴマーを添加しても、ある程度低分子量（例えば、分子量６００〜３０００）のＣＭ−キチンオリゴマーブロックとして菌体に取りこまれる。
【００１７】
したがって、本発明において用いるＣＭ−キチンポリマーまたはオリゴマーの分子量は特に限定されない。菌体に取りこまれやすいため、好ましくは分子量１０００〜２０００程度のＣＭ−キチンオリゴマーを用いる。
【００１８】
本発明の第１の態様において生産される多糖は、ＣＭ−キチンオリゴマーとグルコースとを構成単位とするヘテロ多糖となる。該多糖は、ＣＭ−キチンオリゴマーブロックとグルコースとがβグルコシド結合によって安定に結合したものであると推定される。よって該多糖はセルロース分解酵素であるセルラーゼによってもキチン分解酵素であるキチナーゼによっても分解される新規な生分解性多糖である。また、本発明によって得られるバクテリアセルロース様多糖は、ＣＭ−基を有することにより、イオン交換体として利用することができる。
【００１９】
このように、本発明の方法は、グルコースに代わる新炭素源として、ＣＭ−キチンポリマーまたはオリゴマーを用いるものである。この方法により、新規な構造および物性を有するバクテリアセルロース様多糖が得られる。
【００２０】
本発明の第２の態様は、微生物培養用標準培地において、炭素源として導入すべき基を有するカルボキシメチルキチン誘導体のポリマーまたはオリゴマーおよびグルコースを含む培地でセルロース生産菌を培養することを特徴とする、バクテリアセルロース様多糖に所望の基を導入する方法、および該方法により導入した基を有するバクテリアセルロース様多糖を提供する。
【００２１】
本発明の第２の態様において用いられる、ＣＭ−キチン誘導体とは、ＣＭ−キチンのポリマーまたはオリゴマーのＮ−アセチル基またはカルボキシメチル基部分に所望の基を導入したポリマーまたはオリゴマーのことをいう。
【００２２】
本発明のこの態様において用いるＣＭ−キチン誘導体ポリマーまたはオリゴマーの分子量は特に限定されず、上述の通りポリマーであっても菌体の生産するキチナーゼにより低分子化され、取りこまれる。菌体に取りこまれやすいため、好ましくは１０００〜２０００の分子量のＣＭ−キチンオリゴマーに所望の基を導入したＣＭ−キチン誘導体オリゴマーを用いる。
【００２３】
「導入すべき基」とは、バクテリアセルロースに導入しようとするあらゆる機能性の基を指し、例えば、色素、酵素、フェロモン、または忌避剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「導入すべき基」には具体的には、アクリジンなどが含まれる。導入すべき基としては例えばＦＩＴＣのごとき嵩高い基であってもよい。ＦＩＴＣのごとき嵩高い基を導入したバクテリアセルロースは今まで得られていなかった。
【００２４】
したがって、本発明の第２の態様により、所望の基、特に嵩高い基を導入したバクテリアセルロース様多糖が提供される。
【００２５】
本発明の方法によって得られる所望の基を有する多糖は、バクテリアセルロースを構成するグルコース残基の間に、βグルコシド結合によって該基を有するＣＭ−キチンオリゴマーがオリゴマーブロックとして導入された新規な構造を有する。該多糖は、グルコース残基間のβグルコシド結合を切断するセルラーゼによっても、Ｎ−アセチルグルコサミン残基間のβグルコシド結合をキチナーゼによっても分解される幅広い生分解性を有するヘテロ多糖である。
【００２６】
本発明により、バクテリアによって低環境負荷条件で所望の基、特に嵩高い基を多糖に導入することが可能になり、高機能性のバクテリアセルロース様多糖が得られる。このような多糖の用途としては、例えば、農・医学方面では、薬物の輸送、繊維業界では染色、電導性、紫外線防御などの様々な分野での利用が期待できる。その他にも、防虫、抗菌、殺菌、殺虫、動物忌避剤、集虫、集魚などの目的に利用できる。
【発明の効果】
【００２７】
炭素源としてグルコースおよびカルボキシメチルキチンポリマーまたはオリゴマーを含む培地を用いてセルロース生産菌を培養することにより、新規な構造・物性を示す生分解性多糖が得られる。また、導入すべき基を有するカルボキシメチルキチン誘導体のポリマーまたはオリゴマーとグルコースを含む培地を用いてセルロース生産菌を培養することにより、バクテリアセルロース様多糖に安定に所望の基を導入することが可能となり、高機能性のバクテリアセルロース様多糖が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
培養に用いる微生物は、セルロースを生産する菌であれば特に限定されず、上述のセルロース生産菌のいずれを用いてもよい。特に、酢酸菌、なかでもアセトバクター・キシリナム(Acetobacter Xylinum)が好適である。
【００２９】
セルロース生産菌がＣＭ−キチンまたはその誘導体存在下で良好に増殖するものであればそのまま培養すればよい。好ましくは、セルロース生産菌をＣＭ−キチンまたはその誘導体およびグルコースを含む培地中で継代培養することにより、ＣＭ−キチンまたはその誘導体に順応したセルロース生産菌が得られる。
【００３０】
本発明において用いる微生物培養用標準培地としては、用いる微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば酢酸菌を用いる場合は、例えば、炭素源、バクトペプトン、イーストエクストラクト、第一リン酸ナトリウム、クエン酸からなるヘストリン−シュラム(Hestrin-Schramm)（以下ＨＳと称する）標準培地において、炭素源としてグルコースに加えてＣＭ−キチンまたはその誘導体を含む培地を挙げることができる。本発明の培地はこれに限定されるものではなく、従来から知られているセルロース生産菌によってバクテリアセルロースを生産させることのできる公知の微生物培養用標準培地の炭素源の一部としてグルコースおよびＣＭ−キチンまたはその誘導体を含む培地であればいずれも好適に用いられる。
【００３１】
本発明に用いるＣＭ−キチンまたはその誘導体のカルボキシメチル基による置換度は好ましくは０．１〜１．２％であり、さらに好ましくは０．３〜０．８％である。同様に、Ｎ−アセチル基による置換度は好ましくは７０〜１００％であり、さらに好ましくは９０〜９８％である。ＣＭ−キチンまたはその誘導体の分子量は好ましくは６００〜５０００＋導入する基の分子量の程度であり、さらに好ましくは６００〜２２００＋導入する基の分子量の程度である。
【００３２】
ここでカルボキシメチル基またはＮ−アセチル基による置換度（実施例においては導入率とも称する）とは、ポリマーまたはオリゴマーにおける構成糖単位の総数に対する各置換基の数の割合を百分率で表したものである。
【００３３】
ＣＭ−キチンへ基を導入する方法としては、導入しようとする基に応じてカルボキシメチル基、Ｎ−アセチル基を部分脱アセチル化したアミノ基、および水酸基のいずれに導入してもよい。カルボキシメチル基へ導入する場合は、例えば、カルボキシメチル基を酸塩化物に変え、導入する基のアミノ基または水酸基と縮合反応してアセタミド縮合やエステル縮合させる方法が挙げられる。Ｎ−アセチル基へ導入する場合は、部分脱アセチル化（約８０％）した後生成する２０％のアミノ基へ、導入基酸クロリド、導入基ジアゾニウム塩、導入基スルフェニル等を縮合させる方法が挙げられる。導入する量は、キチナーゼやセルラーゼによる加水分解反応を妨げない程度の量であればよく、好ましくは５〜２０％である。
【００３４】
培養条件としては、使用するセルロース生産菌が生育できる条件を適宜選択すればよい。例えば、酢酸菌を生産菌として用いる場合は、培地のｐＨは３〜７、好ましくは６〜７付近に制御すればよく、培養温度は室温、例えば、１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の範囲とすればよい。培養期間は、酢酸菌を用いる場合、約７日間でゲル状のバクテリアセルロース様多糖膜が得られる。
【００３５】
培地表面に生成したバクテリアセルロース様多糖は、次いで洗浄する。洗浄は、例えば、１（Ｗ／Ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液中で５時間、次いで４（Ｗ／Ｖ）％水酸化ナトリウム水溶液中で５時間洗浄することにより、充分に洗浄するのが好ましい。その後乾燥させることにより、バクテリアセルロース様多糖膜が得られる。
【００３６】
本発明の方法で製造されたバクテリアセルロース様多糖を培地から分離回収すると同時に直接フィラメント状またはシート状に成形することにより、生産工程が簡略化され、さらにコストの低減をはかることもできる。
【００３７】
連続培養装置を用いてバクテリアセルロース様多糖フィラメントまたはシートを製造する方法を簡単に説明する。
【００３８】
培養液を培養容器に連続的に添加しつつ静置培養を行い、培養液上層にバクテリアセルロース様多糖を集積させる。ここで、培養液上層に生成したゲル状バクテリアセルロース様多糖薄層を所望の太さとなるように伸長しつつ収束することにより、フィラメントが製造される。また。所望の幅になるようにゲルを緊張下で巻き取ることにより、所望のシートが製造される。
【００３９】
このように巻き取り装置付き連続培養装置を用いると、培養器表面から直接バクテリアセルロース様多糖をフィラメントまたはシートとして収穫できるため、バクテリアセルロース様多糖フィラメントまたはシートの生産コストをさらに低くすることができる。
【００４０】
以下の実施例において本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
未修飾ＣＭ−キチンオリゴマーを含む多糖の生産
（継代培養）
野生種酢酸菌(Acetobacter xylinum ATCC23769)をグルコースを含むＨＳ培地（表１）で立ち上げた。次いで、ＣＭ−キチンオリゴマーとグルコースの混合炭素源（炭素源合計濃度２．０Ｗ／Ｖ％）を含むＨＳ培地に酢酸菌０．５ｍｌを接種した。図１に示すように、０．５ｍｌの酢酸菌培養液を５０ｍｌのエルレンマイヤーに入れた１５ｍｌの新鮮な培地に継代することを３−６回繰り返した。このように酢酸菌を繰り返し継代培養することにより、ＣＭ−キチン順化酢酸菌を得た。培養条件は以下の通りであった：温度２８℃、ｐＨ６．０、期間３日／継代。
【００４２】
【表１】
2005058042.tif 000005
【００４３】
（本培養）
表１の培地の炭素源として、グルコースとＣＭ−キチンポリマーまたはＣＭ−キチンオリゴマーを含む培地１５ｍｌを５０ｍｌのエルレンマイヤーに入れ、上記のようにして継代培養した酢酸菌０．５ｍｌを加えて２８℃で７日間静置培養した（図１を参照）。
【００４４】
培地表面に生成した多糖ゲルを１（Ｗ／Ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液中で５時間、次いで４（Ｗ／Ｖ）％水酸化ナトリウム水溶液で５時間それぞれ還流洗浄を行い、充分水洗後、ろ紙に挟んで乾燥させた。
【００４５】
（得られた多糖の分析）
得られた多糖フィルム（以下ＣＭ−キチンＢＣと称する）におけるＣＭ基の導入率は、酸アルカリ定量、灰化法などで測定したところ、約０．７４ｍｏｌ％、であり、Ｎ−アセチル基の導入率は、ＩＲスペクトル法および窒素分析から計算すると、約３．６ｍｏｌ％であった。
【００４６】
この多糖を用いて金属イオン吸着性を測定した結果を図２に示す。図２において、
□はＣＭ−キチン（ＣＭ基導入率約１．２ｍｏｌ％、Ｎ−アセチル基導入率約３８．２ｍｏｌ％）、
○はグルコースのみからなるバクテリアセルロース、
△はＮ−アセチル基のみを導入したバクテリアセルロース（Ｎ−アセチル基導入率約５．２ｍｏｌ％）、
◇は本実施例により得られたＣＭ−キチンＢＣ（ＣＭ基導入率約０．７４ｍｏｌ％、Ｎ−アセチル基導入率約３．６ｍｏｌ％）である。
【００４７】
この図から、本実施例により得られたＣＭ−キチンＢＣは、上記の他の多糖と比べて金属吸着能が上昇していることが理解される。このことにより、イオン交換能を有するＣＭ−キチンが多糖中にオリゴマーブロックとして安定に導入されていることが示唆される。該多糖は、イオン交換体として利用できる。
【００４８】
（Ｎ−アセチル基の導入率）
未修飾ＣＭ−キチンを用いた場合にバクテリアセルロース様多糖に導入されるＮ−アセチル基の導入率を調べた。結果を図３および図４に示す。
【００４９】
図３は、培地に含まれるＣＭ−キチンの濃度および分子量を変化させた場合の、Ｎ−アセチル基の多糖への導入に対する影響を示したものである。このグラフから、培地中のＣＭ−キチン濃度を高くすると、Ｎ−アセチル基の導入率が高くなることが示唆される。ＣＭ−キチンの分子量とＮ−アセチル基の導入率との間には明確な相関関係はみられなかった。
【００５０】
図４は、培地に含まれるＣＭ−キチンのＣＭ基による置換度および分子量を変化させた場合の、Ｎ−アセチル基の多糖への導入に対する影響を示したものである。培地中のＣＭ−キチンの置換度を高くすると、Ｎ−アセチル基の導入率が低くなることが示唆される。この場合もＣＭ−キチンの分子量とＮ−アセチル基の導入率との間には明確な相関関係はみられなかった。
【００５１】
（ＣＭ基の導入率）
未修飾ＣＭ−キチンを用いた場合にバクテリアセルロース様多糖に導入されるＣＭ基の導入率を調べた。結果を図５に示す。
【００５２】
図５は、培地に含まれるＣＭ−キチンの濃度および分子量を変化させた場合の、ＣＭ基の多糖への導入に対する影響を示したものである。このグラフから、培地中のＣＭ−キチン濃度を高くすると、ＣＭ基の導入率が低くなることが示唆される。また、ＣＭ−キチンの分子量が小さいほど、ＣＭ基の導入率は高かった。
【実施例２】
【００５３】
ＦＩＴＣを導入したＣＭ−キチンオリゴマーを含む多糖の生産
（ＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンポリマーおよびＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマーの合成）
キチンをカルボキシメチル化することにより得られるＣＭ−キチンポリマーを部分的に脱アセチル化してアミノ基を遊離させ、これにＦＩＴＣ（Fluorescence Isothiosyanate）を反応させてＦＩＴＣ基を導入して、ＣＭ−キチン誘導体である、２−ＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンポリマーを得た。図６にその部分構造を示す。
【００５４】
これをキチン分解能を有する酵素であるリゾチームで分解して低分子量化することによりＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマー（分子量約２０００−９０００）を得た。
【００５５】
（継代培養）
野生種酢酸菌(Acetobacter xylinum ATCC23769)をグルコースを含むＨＳ培地（表１）で立ち上げた。次いで、上記のＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマーとグルコースの混合炭素源（炭素源合計濃度２．０Ｗ／Ｖ％（ＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマー濃度１（Ｗ／Ｖ）％、グルコース濃度１（Ｗ／Ｖ）％）を含むＨＳ培地に該酢酸菌０．５ｍｌを接種した。図１に示すように、０．５ｍｌの酢酸菌培養液を５０ｍｌのエルレンマイヤーに入れた１５ｍｌの新鮮な培地に継代することを３−６回繰り返した。このように酢酸菌を繰り返し継代培養することにより、ＦＩＴＣ−ＣＭ−キチン順化酢酸菌を得た。培養条件は以下の通りであった：温度２８℃、ｐＨ６．０、期間３日／継代。
【００５６】
（本培養）
表１の培地の炭素源として、グルコース（１（Ｗ／Ｖ）％）とＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマー（１（Ｗ／Ｖ）％）を含む培地１５ｍｌを５０ｍｌのエルレンマイヤーに入れ、上記のようにして継代培養した酢酸菌０．５ｍｌを加えて２８℃で７日間静置培養した。
【００５７】
培地表面に生成した多糖ゲルを１（Ｗ／Ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液中で５時間、次いで４（Ｗ／Ｖ）％水酸化ナトリウム水溶液で５時間それぞれ還流洗浄を行い、充分水洗後、ろ紙に挟んで乾燥させ、多糖膜を得た。
【００５８】
（得られた多糖の加水分解による分析）
この多糖膜をグルコース残基間のβグルコシド結合を切断する酵素であるセルラーゼで加水分解した。加水分解産物をＨＰＬＣで分析した結果を図７に示す（ＨＰＬＣ条件；溶出：０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、流速：１．０ｍｌ／分、カラム温度：６０℃、検出：ＲＩ）。上段は、グルコースのみからなるバクテリアセルロース（標準試料）、中段は、グルコースとＦＩＴＣ−ＣＭキチンオリゴマーとを含む培地で培養して得られたバクテリアセルロース様多糖を１日加水分解したもの、下段は、グルコースとＦＩＴＣ−ＣＭキチンオリゴマーとを含む培地で培養して得られたバクテリアセルロース様多糖を７日加水分解したものについて得られた結果である。
【００５９】
クロマトパターンから、グルコースのみからなるバクテリアセルロースをセルラーゼによって加水分解した結果、グルコースおよびそのオリゴマーのみが生じていることが理解される。
【００６０】
本発明のＦＩＴＣ−ＣＭキチンオリゴマーを含む培地で得られた多糖については、グルコース、セロビオース（グルコースのダイマー）、グルコースのオリゴマーのほかに、高分子量の画分が観察された。これは、セルラーゼでは切断されないＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマーであると推定される。なお、データは示さないが、Ｎ−アセチルグルコサミン残基間のβグルコシド結合を切断する酵素であるリゾチームで本発明の多糖を加水分解すると、低分子量セルロース、グルコサミン、キトビオース（グルコサミンのダイマー）、ＦＩＴＣ−ＣＭ−グルコサミンが生じていることが示唆された。
【００６１】
本発明のグルコースおよびＦＩＴＣ−ＣＭキチンを含む培地を用いて得られた多糖には、セルラーゼによる加水分解では切断されない高分子量のＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマーがβグルコシド結合により安定に導入されていることが理解される。したがって、本発明によって新規なヘテロ多糖が得られたといえる。
【００６２】
（得られた多糖の蛍光観察）
本実施例により得られた多糖が、培地に加えたＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマーとバクテリアセルロースの単純な混合物ではないこと、即ち洗浄操作が十分であることを証明するため、落射蛍光顕微鏡で観察すると、ＦＩＴＣによると推定される均一な蛍光が観察された。対照として、事前にＦＩＴＣ−ＣＭ−グルコサミンを浸透させたバクテリアセルロース膜を、本実施例において得られた多糖に対して行ったものと同一の洗浄操作を施した後に観察すると全く蛍光は観察されなかった。このことからも、本発明により得られた多糖には、ＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンオリゴマーがグリコシド結合により安定に導入されているといえる。
【００６３】
このように、本発明の方法により、嵩高い基の例であるＦＩＴＣが導入されたバクテリアセルロース様多糖を低環境負荷型手段で生産することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明によるセルロース生産菌の継代培養および本培養の該略図である。
【図２】本発明によるＣＭ−キチンを導入したバクテリアセルロース様多糖のイオン交換能を示す図である。
【図３】培地に含まれるＣＭ−キチンの濃度および分子量と、多糖に導入されるＮ−アセチル基の導入率の関係を示す図である。
【図４】培地に含まれるＣＭ−キチンの置換度および分子量と、多糖に導入されるＮ−アセチル基の導入率の関係を示す図である。
【図５】培地に含まれるＣＭ−キチンの濃度および分子量と、多糖に導入されるＣＭ基の導入率の関係を示す図である。
【図６】ＦＩＴＣ−ＣＭ−キチンポリマーの構造の一部を示す図である。
【図７】本発明によるＦＩＴＣを導入したバクテリアセルロース様多糖のセルラーゼによる加水分解プロフィールを示す図である。
【図１】
2005058042.tif 000006
【図２】
2005058042.tif 000007
【図３】
2005058042.tif 000008
【図４】
2005058042.tif 000009
【図５】
2005058042.tif 000010
【図６】
2005058042.tif 000011
【図７】
2005058042.tif 000012