(57)【要約】【課題】医薬品等として使用し得る安全性が極めて高く、かつ生物活性の高い新規な低分子量ＬＰＳを提供する。【解決手段】微生物菌体から得られ、ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に染色帯を認めないこと、ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること、ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること、ｄ）リムラス活性が少なくとも１０ＥＵ／ｎｇであること、の理化学的および生物学的性質を有する新規な低分子量リポポリサッカライド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物菌体から得られ、次のａ）〜ｃ）の理化学的性質
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に染色帯を実質的に認めないこと
ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること
を有する低分子量リポポリサッカライド。
【請求項２】
微生物菌体から得られ、次のａ）〜ｆ）の理化学的および生物学的性質
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に染色帯を実質的に認めないこと
ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇであること
ｅ）タンパク質含量が、１％（重量）以下であること
ｆ）核酸含量が、１％（重量）以下であること
を有する低分子量リポポリサッカライド。
【請求項３】
微生物が、グラム陰性微生物である請求項１または項２に記載の低分子量リポポリサッカライド。
【請求項４】
グラム陰性微生物が、パントエア(Pantoea) 属に属する微生物またはサルモネラ(Salmonella)属に属する微生物である請求項３に記載の低分子量リポポリサッカライド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特定の理化学的性質および生物学的性質を有し、安全性が極めて高く（毒性が低い）、かつ生物活性の高い新規な低分子量リポポリサッカライドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リポポリサッカライド（lipopolysaccharide。以下ＬＰＳと記載することがある）は、大腸菌、サルモネラ菌、百日咳菌等のグラム陰性細菌細胞壁のペプチドグリカンを囲む外膜に存在している脂質および糖からなる複合化合物であり、Ｏ抗原およびエンドトキシンの活性成分として知られている［非特許文献１］。ＬＰＳの基本構造は、特異な脂質を有するリピドＡ、それに共有結合したＲコアと呼ばれるオリゴ糖、さらにＯ特異多糖の３成分よりなっている（非特許文献２）。
【０００３】
リピドＡの基本構造は多くの菌種に共通であり、基本骨格はβ−１、６結合のグルコサミニル・グルコサミンからなりＣ−１位およびＣ−４´位にそれぞれリン酸を結合している場合が多い。各アミノ基は３−ヒドロキシ脂肪酸を、水酸基は数種の飽和脂肪酸またはヒドロキシ脂肪酸を結合し、独特の糖脂質を形成しているが、脂肪酸の種類は菌種によって多少異なっている。少数例であるが基本骨格が全く異なり、２，３−ジアミノ−２、３−ジデオキシ−Ｄ−グルコースのみからなる例も報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
Ｒコアの構造はサルモネラ属のようにそれに属する大部分の菌種に共通である場合と、大腸菌のように部分的に異なる数種の構造が知られている場合とがある［非特許文献４］。一般にヘプトースと２−ケト−３−デオキシオクトネート（以下ＫＤＯと記載する）が多くのＲコアに共通の構成成分であり、ＫＤＯを介してリピドＡと結合しているが、菌種によっていずれか一方または双方が欠如しているＬＰＳの存在も知られている［非特許文献５］。
【０００５】
Ｏ特異多糖の構造は、構成成分の中で最も多様であり、菌種に特異的であって、いわゆるＯ抗原としての活性を示す。一般に数種の単糖からなるオリゴ糖の繰返し構造を特徴とするが、同一単糖からなるもの、または繰返し構造でないものも知られている。Ｏ特異多糖の生合成はＲコアのそれとは異なる遺伝子の支配を受けており、接合または形質導入により異なる菌種のＯ特異多糖を置換することが可能であり、菌の毒力およびワクチンの研究等に応用されている［非特許文献６］。
【０００６】
ＬＰＳは極めて多様な薬理作用を有しているが、例えば抗原およびＬＰＳを同時に投与した場合、免疫反応が増強されることから、ＬＰＳは現在ワクチン効果を高める補助剤（アジュバント）の一種として重用されている（非特許文献７）。
従来、多種多様なＬＰＳが報告されているが、一般にどのような方法で抽出したＬＰＳであっても、１０6 〜１０7 の極めて大きな分子量を有することが知られている（非特許文献８）。その後、比較的分子量の小さいＬＰＳも報告され、小麦由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量８，０００±１，０００または５，０００±２，０００、リン酸数１〜４／分子量８，０００、ヘキソサミン数６±２／分子量８，０００、脂肪酸数６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数５±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特許文献２−７、１０、１１）、クロレラ由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量４０，０００〜９０，０００、リン酸数４±１／分子量１万、ヘキソサミン数７±１／分子量１万、脂肪酸数６±１／分子量１万、ＫＤＯ数２±１／分子量１万のＬＰＳ（特許文献２−７、１０、１１）、大腸菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量３０，０００±５，０００、リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±６／分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数５±１／分子量３万のＬＰＳ（特許文献２−７）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００または９，０００±１，０００、リン酸数５／分子量８，０００、ヘキソサミン数１６±２／分子量８，０００、脂肪酸数５／分子量８，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特許文献２−７）、大腸菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量４０，０００±１０，０００または８，０００±４，０００、リン酸数１２／分子量３万、ヘキソサミン数４５±６／分子量３万、脂肪酸数１８／分子量３万、ＫＤＯ数５±１／分子量３万のＬＰＳ（特許文献１１）、セラチア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量５，０００±１，０００、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数９±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量５，０００のＬＰＳ（特許文献８、１０−１３）、エンテロバクター属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，５００±２，５００、リン酸数１〜２／分子量５，０００、ヘキソサミン数７±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数１〜２／分子量５，０００のＬＰＳ（特許文献８、１０−１３）、パントエア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，５００±２，５００、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数５±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量５，０００のＬＰＳ（特許文献８、１１−１３）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００、リン酸数４／分子量６，０００、ヘキソサミン数１２／分子量６，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量６，０００のＬＰＳ（特許文献１０、１１）、百日咳菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６，０００±１，０００または９，５００±１，５００、リン酸数５／分子量８，０００、ヘキソサミン数１６±２／分子量８，０００、ＫＤＯ数２±１／分子量８，０００のＬＰＳ（特許文献９）、アエロモナス・ヒドロフィア種菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量５，０００±１，５００、リン酸数２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数９±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数０．８±０．５／分子量５，０００のＬＰＳ（特許文献１４）、パントエア属細菌由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量５，０００、リン数２／分子量５，０００、ヘキソサミン数２／分子量５，０００、ＫＤＯ数５／分子量５，０００［非特許文献９］等が報告されている。  前記のとおり分子量５，０００前後のＬＰＳは、既に報告されているが、これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける主染色帯が、５，０００または６，０００であると同時に、分子量３万以上に相当する染色帯も存在していたのである。即ち、従来の分子量５，０００前後のＬＰＳは分子量３万以上のＬＰＳとの混合物であった。
【０００７】
ＬＰＳの用途についてはこの発明の発明者らにより、これまでに抗トキソプラズマ剤（特許文献７）、コレステロール低下剤（特許文献５）、抗ヘルペス剤（特許文献４）、抗リュウマチ剤（特許文献３）、抗糖尿病剤（特許文献６）、抗消化性潰瘍剤（特許文献２）、免疫機能活性化剤（特許文献８、１４）、経口・経皮免疫機能促進剤（特許文献９）、鎮痛剤（特許文献１１）、発育促進剤（特許文献１）、抗禁断症状剤（特許文献１２）等が提案されている。
【０００８】
しかしながら、従来のＬＰＳは、安全性の面から、臨床応用への問題点が指摘されてもいる（非特許文献１０）。
一方、細菌の細胞壁からＬＰＳを精製する方法については、従来フェノール−水抽出法［非特許文献１１］、トリクロル酢酸抽出法［非特許文献１２］、ＥＤＴＡ抽出法［非特許文献１３］等が知られているが、このようにして得られたＬＰＳは、デオキシコール酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下で、更に分子量約２０，０００程度のサブユニットに解離することが報告されている（非特許文献１４）。一方、分子量２０，０００以上のＬＰＳを含まず、分子量５，０００程度の極めて低分子量のＬＰＳのみを取得する方法については、従来報告されていなかった。例えば特許文献８には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図が示されているが、分子量６，０００付近の染色帯に加えて、分子量３０，０００以上の染色帯が明らかに存在している。また特許文献２、９、１０において分子量５，０００または６，０００の低分子量ＬＰＳが開示されているが、これらはいずれも熱フェノール法およびイオン交換において精製された標品であり、高分子量ＬＰＳを完全に排除する工程が施されておらず、高分子量ＬＰＳが混在していた。
【特許文献１】特開平３−１５５７７８号公報
【特許文献２】特開平４−４９２４０号公報
【特許文献３】特開平４−４９２４１号公報
【特許文献４】特開平４−４９２４２号公報
【特許文献５】特開平４−４９２４３号公報
【特許文献６】特開平４−４９２４４号公報
【特許文献７】特開平４−４９２４５号公報
【特許文献８】特開平４−９９４８１号公報
【特許文献９】特開平４−１８７６４０号公報
【特許文献１０】特開平５−１５５７７８号公報
【特許文献１１】特開平６−４０９３７号公報
【特許文献１２】特開平６−６５０９２号公報
【特許文献１３】特開平６−９０７４５号公報
【特許文献１４】特開平６−１４１８４９号公報
【非特許文献１】ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケンベック(J.M.Ghuysen and R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(NewComprehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(BacterialCell Wall) 、第１８ページ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年
【非特許文献２】「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第４３１ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年
【非特許文献３】野間惟道編、「医科学大辞典第４９巻」、第８２ページ、講談社、１９８４年
【非特許文献４】ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケンベック(J.M.Ghuysen and R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(NewComprehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(BacterialCell Wall) 、第２８３ページ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年
【非特許文献５】ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケンベック(J.M.Ghuysen and R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(NewComprehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(BacterialCell Wall) 、第２９４〜２９５ページ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年
【非特許文献６】ジェー・エム・ギューセンおよびアール・ハッケンベック(J.M.Ghuysen and R. Hakenbeck) 編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー(NewComprehensive Biochemistry)」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール(BacterialCell Wall) 、第２６５〜２６７ページ、エルセヴィア(Elsevea) 、１９９４年
【非特許文献７】本間遜他編、「細菌内毒素」、第３１２ページ、講談社、１９７３年
【非特許文献８】本間遜他編、「細菌内毒素」、第２１１ページ、講談社、１９７３年
【非特許文献９】バイオセラピー(BIOTHERAPY)、第６巻、第３号、第３５７ページ、１９９２年
【非特許文献１０】日本組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒｔII」、第１２１ページ、朝倉書店、１９８７年
【非特許文献１１】オー・ウエストファール(O. Westphal) 編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、１９６５年
【非特許文献１２】エー・エム・スタブ(A.M. Staub)編、メソッズ・イン・イムノロジー・アンド・イムノケミストリー(Methods in Immunology and Immunochemistry) 、第１巻、第２８ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、１９６７年
【非特許文献１３】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journalof Biological Chemistry) 、第２４３号、第６３８４ページ、１９６８年
【非特許文献１４】本間遜他編、「細菌内毒素」、第２２９ページ、講談社、１９７３年
【非特許文献１５】オー・ウエストファール(O. Westphal) 編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリー(Methods in Carbohydrate Chemistry) 、第５巻、第８３ページ、アカデミック・プレス(Academic Press)、１９６５年
【非特許文献１６】日本生化学会編、「生化学実験講座」、第４巻、第３７７〜３７９ページ、第１版、東京化学同人出版、１９７６年
【非特許文献１７】アナリティカル・バイオケミストリー(AnalyticalBiochemistry) 、第５８巻、第１号、第１２３〜１２９ページ、１９７４年
【非特許文献１８】鈴木郁生編、「医薬品の開発第１４巻、医薬品の品質管理及び試験法」、第２２７〜２４３ページ、廣川書店、１９９０年
【非特許文献１９】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ(Journalof Biological Chemistry) 、第１９３巻、第６５ページ、１９５１年
【非特許文献２０】福井作蔵、「還元糖の定量法・第２版」、第５０〜５２ページ、学会出版センター、１９９０年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記の通り、従来報告されている低分子量のＬＰＳは、高分子量ＬＰＳを含む混合物であって、例えば免疫機能活性化剤等の薬剤成分として臨床的に用いるには、安全性の面からも、あるいは薬効性能の面からも必ずしも満足のいくものではなかった。
【００１０】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来のＬＰＳに比して安全性が高く（すなわち、毒性が低く）、かつ生物活性の優れた新規なＬＰＳを提供することを目的としている。  
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明の発明者らは、前記のような課題を解決するため、鋭意研究をおこなった結果、従来報告されているＬＰＳとは異なる新規な低分子量ＬＰＳを発見し、しかもこの新規な低分子量ＬＰＳが、従来のＬＰＳに比べて極めて安全性が高く、かつ生物活性も従来のＬＰＳに比して優れていることを見い出し、この発明を完成した。
【００１２】
すなわち、この発明は、微生物菌体から得られ、次のａ）〜ｃ）の理化学的性質
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に染色帯を実質的に認めないこと
ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること
を有する低分子量リポポリサッカライドを提供する。
【００１３】
さらにこの発明は、微生物菌体から得られ、次のａ）〜ｆ）の理化学的および生物学的性質
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に染色帯を実質的に認めないこと
ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇであること
ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること
ｆ）核酸含量が、１％以下であること
を有する低分子量リポポリサッカライドをも提供する。
【００１４】
また、この発明においては、前記の微生物が、グラム陰性の微生物であることさらにはそのグラム陰性微生物が、パントエア(Pantoea) 属に属する微生物またはサルモネラ(Salmonella)属に属する微生物であるを望ましい態様としてもいる。
【発明の効果】
【００１５】
以上詳しく説明したとおり、この発明により、医薬品等として使用し得る安全性が極めて高く、かつ生物活性の高い低分子量ＬＰＳが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
次にこの発明について詳述する。
なお、以下の説明において、百分率の表示は、特に断りのない限り、重量による値である。
【００１７】
この発明の低分子量ＬＰＳは、グラム陰性の微生物、例えば、パントエア属に属する微生物またはサルモネラ属に属する微生物等を、常法により培養し、培地から菌体を集め、集めた菌体から公知の方法、例えば、熱フェノール法［非特許文献１５］、により抽出し、さらに、陰イオン交換樹脂により精製して製造できる。すなわち、微生物の菌体を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を蒸留水および等容量の熱フェノールの混合液に添加して撹拌し、次いで遠心分離して水層を回収し、この水層を透析してフェノールを除去し、限外瀘過法により濃縮して粗ＬＰＳ画分を採取し、この画分を常法の陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、モノＱ−セファロースまたはＱ−セファロースを使用する）により精製し、常法により脱塩する。
【００１８】
このようにして得られた精製ＬＰＳは特許文献２、８−１０に開示される分子量５，０００から６，０００程度のＬＰＳと実質的に等しい。
さらに、得られた精製ＬＰＳを、例えばデオキシコール酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下でゲル瀘過し、低分子量ＬＰＳを含有する画分のみを回収し、混在する高分子量ＬＰＳを除去することによって、高度に精製されたこの発明の新規な低分子量ＬＰＳを得ることができる。この界面活性剤存在下でのゲル瀘過の工程は、特許文献２、９、１０に開示される分子量５，０００から６，０００程度のＬＰＳを更に高度に精製するためのものであり、この工程により混在する高分子量ＬＰＳが完全に排除されるのである。
【００１９】
以上の方法により製造されたこの発明の新規な低分子量ＬＰＳは、後記する試験例１に示すとおり、
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に染色帯を実質的に認めないこと
ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇであること
ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること
ｆ）核酸含量が、１％以下であること
という理化学的および生物学的性質を有し、かつ少なくとも９８％の純度を有している。しかしながら、使用目的によっては、精製の程度を低く（例えば、９０％）することもできる。
【００２０】
この発明の新規な低分子量ＬＰＳは、免疫機能活性化作用を有する医薬品、動物用薬品等として使用することもできる。
次に試験例を示し、この発明の低分子量ＬＰＳについてさらに詳しく説明する。
【００２１】
試験例１
この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの理化学的および生物学的性質を調べるために行った。
【００２２】
１）試料の調製
実施例１および参考例１と同一の方法により低分子量ＬＰＳおよびＬＰＳをそれぞれ調製した。
【００２３】
２）試験方法
(1).分子量の測定
低分子量ＬＰＳおよびＬＰＳを各々蒸留水に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、その１０μｇを１．５ｍｌ容プラスチックチューブに秤取した。これとは別に、１８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの５％β−メルカプトエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素溶液、１１２．５μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）および２２．５μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤＳ処理液１０μｌを、前記各試料溶液に添加して十分混合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸し、その後直ちに氷水中に浸して急冷した。
【００２４】
１０ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１７．９ｇのトリシンおよび３．０３ｇのトリスを１リットルの蒸留水に溶解して調製した泳動緩衝液をスラブゲル電気泳動槽（マリソル社製）に入れた。２０％ポリアクリルアミドゲルを泳動槽に固定し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を５０Ｖに１時間、次いで、１５０Ｖに固定して、色素がゲルより溶出するまで泳動を継続した。泳動終了後に、銀染色キット１６１−０４４３（バイオラッド社製）により室温で銀染色を行い、挙動を確認した。
【００２５】
(2).ヘキソサミン含有量の定量
ヘキソサミン含有量を、エルソン−モルガン(Elson-Morgan)法（非特許文献１６）により次のとおり定量した。ＬＰＳを蒸留水に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、その１００μｌをスクリューキャップ付きスピッツ（イワキガラス社製）に秤取し、これに１００μｌの８ＮＨＣｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し、のち４ＮＮａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨを７に調整した。その１００μｌを秤取し、別のスクリューキャップ付きスピッツに入れ、２００μｌの試薬Ａを加え、１０５℃で１．５時間加熱し、流水で冷却した。次いで、その１００μｌを分取し、６７０μｌの９６％エタノールを加え、更に６７μｌの試薬Ｂを加え、室温で１時間放置し、５３５ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線作成用標準試料としては０〜８００μｇ／ｍｌのＮ−アセチルグルコサミン（和光純薬社製）を用いた。
試薬Ａ：７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの１．２５Ｎ炭酸ナトリウムとの混合液。
試薬Ｂ：１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒド、３０ｍｌの濃塩酸および３０ｍｌの９６％エタノールの混合液。
【００２６】
(3).ＫＤＯ含量の定量
ＫＤＯ含有量をジフェニルアミン法［非特許文献１７］により次のとおり定量した。
【００２７】
５００ｍｇのジフェニルアミン（和光純薬社製）、５ｍｌのエタノール（和光純薬社製）、４５ｍｌの氷酢酸（和光純薬社製）、５０ｍｌの濃塩酸（和光純薬社製）を混合してＫＤＯ検出試薬を調製した。その５００μｌに、０．５０ｍｇ／ｍｌの濃度で各試料を含む２５０μｌの水溶液を混合し、１００℃の沸騰水浴中で３０分間加熱し、のち恒温水（２４〜２５℃）中で３０分間冷却し、分光光度計（日立製作所製。モデルＵ２０１０）により４２０、４７０、６３０、６５０ｎｍでの吸光度を測定した（測定値を各々Ａ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０と記載する）。標準試料として、０．５μモルの濃度のＫＤＯアンモニウム塩（シグマ社製）水溶液２５０μｌを使用した。
【００２８】
検体試料および標準試料の４種の測定値から、式（１）によりＳ値を求め、検体試料および標準試料のＳ値をそれぞれＳt およびＳs とした。次いで式（２）によりＫＤＯのモル数Ｘを算出した。
Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０            （１）
Ｘ＝（０．５×Ｓs ×ＬＰＳ１モルの分子量）／（０．５×Ｓt ×１０6 ）  （２）
【００２９】
(4).リムラス活性の測定
リムラス活性とは、１９６８年にレヴィンにより創案されたカブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用いたエンドトキシン定量法であるリムラステスト（非特許文献１８）で陽性を呈することを意味し、このリムラステストはＬＰＳ検出法として知られている。標準品として、３４５ｐｇ／ＥＵのイー・コリ(E. coli) ０１１１：Ｂ４を用いてトキシカラーシステム（生化学工業社製）を使用して測定した。
【００３０】
(5).タンパク質含量
タンパク質含量を、ローリー法［非特許文献１９］により測定した。
【００３１】
(6).核酸含量
核酸含量を、ＯＤ（２６０ｎｍ−３００ｎｍ）での測定値（１ＯＤ＝４０μｇ）から定量した。
【００３２】
(7).純度
純度（％）は、次式により算出した。
純度＝［｛乾燥収量−（タンパク質含量＋核酸含量）｝／乾燥収量］×１００
【００３３】
３）試験結果
(1).分子量
分子量測定の結果は、図１に示すとおりである。図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図であり、図中レーン１は同時に泳動させたタンパク質およびペプチド分子量マーカー［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０．１ｋＤ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、８．２４ｋＤ、６．３８ｋＤ、２．５６ｋＤ（ファルマシア社製）］、レーン２、３および４はＬＰＳ（２０μｇ、５μｇおよび１．２５μｇ）、レーン５、６、７および８は低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、１．２５μｇおよび０．３１μｇ）であり、図の縦軸は、分子量を示す。
【００３４】
一般的に糖鎖を有する物質を電気泳動した場合、レーン当たりのサンプル量が過剰の時には染色帯が幅広くなり、見かけの分子量範囲が広くなる。図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥではレーン５から８は、同一試料の低分子量ＬＰＳの量を変更して泳動したものであるが、試料の泳動量が増えるに従い染色帯の幅が広がっている。従って、正確な分子量を調べる目的では、１μｇ程度の量が適当であり、レーン８が相当する。なお、レーン２およびレーン５は、高分子量のＬＰＳの存在を確認するために多量の試料を泳動させたものである。
【００３５】
低分子量ＬＰＳの分子量（レーン８より計算）は、レーン１のサイズマーカから計算して染色帯の中心値で５ｋＤａ、染色帯幅の範囲は４ｋＤａから７ｋＤａであった。また、レーン５では、２０μｇの低分子量ＬＰＳを泳動させたにもかかわらず、レーン２のように高分子量ＬＰＳは全く認められなかった。
以上の結果から、この発明の低分子量ＬＰＳの分子量は、５，０００±２，０００であり、高分子量ＬＰＳが完全に除去されていることが判明した。
【００３６】
(2).ヘキソサミン含量
この発明の低分子量ＬＰＳのヘキソサミン数は２個／分子量５，０００であった。
【００３７】
(3).ＫＤＯ含量
この発明の低分子量ＬＰＳに含まれるＫＤＯは２．４個／分子量５，０００であった。
【００３８】
(4).リムラス活性
この発明の低分子量ＬＰＳのリムラス活性は４３．５ＥＵ／ｎｇであり、これに対して、参考例１と同様の方法で調製した従来のＬＰＳのリムラス活性は８．４ＥＵ／ｎｇであった。
【００３９】
(5).タンパク質含量
この発明の低分子量ＬＰＳのタンパク質含量は、０．６８％以下であった。
【００４０】
(6).核酸含量
この発明の低分子量ＬＰＳの核酸含量は０．５０％以下であった。
【００４１】
(7).純度
この発明の低分子量ＬＰＳの純度は９８％以上であった。
なお、微生物および製造法を変更して試験したが、ほぼ同様な結果が得られた。
【００４２】
試験例２
この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳの急性毒性を調べるために行った。
（１）試料の調製および試験方法
実施例１と同一の方法で調製した低分子量ＬＰＳおよび参考例１と同一の方法で調製したＬＰＳの毒性を、７週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールス・リバー社から購入）を用いて試験した。１群４匹からなるマウス群に、各試料を生理食塩水に溶解し、１匹あたり５．０、１０、２０および４０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与した（ただし４０ｍｇ／Ｋｇの投与は低分子量ＬＰＳのみ）。投与後７２時間マウスの生死を観察した。
【００４３】
（２）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明らかなように、静脈内投与の場合、この発明の低分子量ＬＰＳではいずれの投与量においてもマウスの死亡例は認められず、ＬＤ50は４０ｍｇ／ｋｇ以上であったが、ＬＰＳでは１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で全数が死亡し、ＬＤ50は６．０〜８．６ｍｇ／ｋｇであった。なお、微生物の種類および低分子量ＬＰＳの製造法を変更して試験したが、ほぼ同様な結果が得られた。
【００４４】
【表１】
2005042120.tif 000002
【００４５】
試験例３
この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳを試験例２よりも多量に投与した場合の急性毒性を調べるために行った。
（１）試料の調製および試験方法
試験例２と同一の低分子量ＬＰＳを１匹あたり４０、８０および１６０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与したこと、およびＬＰＳを１匹あたり５．０、または１０ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内に投与したことを除き、試験例２と同一の方法により試験した。
【００４６】
（２）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなように、ＬＰＳ５．０ｍｇ／ｋｇの投与量で２５％が、また１０ｍｇ／ｋｇの投与量では７５％が死亡した。これに対して、低分子量ＬＰＳにおいては４０ｍｇ／ｋｇの投与量で死亡せず、８０および１６０ｍｇ／ｋｇの投与量では、１００％が死亡した。  前試験例２とこの試験例３の結果から、ＬＤ50を算出すると表３のとおりである。表３から明らかなように、低分子量ＬＰＳのＬＤ50の値はＬＰＳのそれに比べて、静脈内投与では約８倍であった。
【００４７】
これらの結果は、ＬＰＳの分子量の相違が毒性に影響を及ぼすことを示しており、低分子量ＬＰＳは、従来のＬＰＳに比して極めて毒性の低いことが判明した。
【００４８】
【表２】
2005042120.tif 000003
【００４９】
【表３】
2005042120.tif 000004
【００５０】
試験例４
この試験は、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効果を確認するために行った。
各群３匹の７週齢の雄Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本チャールズ・リバー社より購入）の尾静脈に、１匹あたり０．１、１．０、または１０μｇの実施例１と同様の方法で製造した低分子量ＬＰＳ、または参考例１と同じ方法で得られたＬＰＳを含む生理食塩水０．２ｍｌを注射し、その１時間後に採血し常法により血清を分離した。
【００５１】
このようにして得られた各血清中のＴＮＦ活性を、Ｌ９２９細胞に対する毒性に基づく方法で測定した。すなわち、Ｌ９２９細胞を５％ウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地で８×１０４個／１００μｌの濃度に調製し、これを９６穴平底プレートの各穴に１００μｌづつまき、３７℃で２時間、５％ＣＯ２存在下で培養した。その後アクチノマイシンＤを１μｌ／ｍｌとなるように添加し、ＭＥＭ培地で段階希釈した血清試料または陽性対照ヒトＴＮＦ−α（旭化成社製）を５０μｌづつ添加し、更に同じ条件で１８時間培養した。培地をアスピレーターで取り除いた後、３７℃のＰＢＳで洗浄し死細胞を完全に取り除き、０．１％クリスタルバイオレットを含む１％メチルアルコール溶液を加えて生細胞を染色した。この染色度をＯＤ（５９０ｎｍ）での吸光度を指標として測定し、陽性対照として用いたＴＮＦ−αの希釈率と吸光度との関係をもとにＴＮＦ活性を算定した。
【００５２】
その結果は、表４に示すとおりであった。表４においてＴＮＦ活性は各群３匹の平均値である。この結果から、この発明の低分子量ＬＰＳのＴＮＦ産生効果は、参考例１の方法で得られる従来のＬＰＳのそれを上回ることが明らかとなった。
【００５３】
【表４】
2005042120.tif 000005
【００５４】
参考例１
トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、ＮａＣｌ（和光純薬工業社製。特級）１０ｇを蒸留水１リットルに添加し、ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整し、オートクレーブで滅菌し、別に滅菌したグルコース（和光純薬工業社製。特級）を０．１％の割合で添加した培地（以下Ｌ−肉汁培地と記載する）１００ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、−８０℃で保存されているパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans) 保存菌株から単一コロニーを分離して接種し、３５℃で１夜振とう培養し、そのまま全量を１，０００ｍｌのＬ−肉汁培地の入った３リットル容の坂口フラスコに接種し、同様に培養した。
【００５５】
さらに、７リットルのＬ−肉汁培地の入った１０リットル容の卓上型ファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に培養した菌体を接種し、同条件で通気培養し、のち集菌し、約７０ｇの湿菌体を回収し、これを凍結保存した。
凍結保存菌体約７０ｇを５００ｍｌの蒸留水に懸濁し、５００ｍｌの９０％熱フェノールを添加して６５〜７０℃で２０分間撹拌し、冷却し、１０，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理し、水層を回収した。フェノール層を更に１回前記と同一の操作を反復し、回収した２回の水層を合し、１夜透析してフェノールを除去し、透析内液を限外瀘過装置（アドヴァンテック・トーヨー社製。ＵＫ−２００）を用いて分子量２０万カット−オフ膜により２気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮した。
【００５６】
得られた粗ＬＰＳ凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥し、約７０ｇの湿菌体から約３００ｍｇの精製ＬＰＳを得た。
【００５７】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
参考例１と同一の方法で得た精製ＬＰＳ１００ｍｇを５ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化緩衝液［３％デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．２Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａおよび２０ｍＭトリス−塩酸からなり、ｐＨ８．３］に溶解し、精製ＬＰＳ溶液２０ｍｌをセファクリルＳ−２００ＨＲカラム（ファルマシア社製）の上部に静かに重層し、溶出緩衝液［０．２５％デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．２Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭトリス−塩酸からなり、ｐＨ８．３］により流速１６ｍｌ／時で８００ｍｌ（５０時間）溶出した。
【００５９】
ペリスタポンプＰＩ（ファルマシア社製）を用いて流速を制御しながら、得られた溶出液を、フラクションコレクター（アドバンテック社製。ＳＦ２１２０）により分画し、最初の２４０ｍｌ（２４フラクション分）を廃棄し、その後１０ｍｌ／フラクションで８０フラクションまで分画した。溶出した各画分について原液または希釈液でフェノール／硫酸法（非特許文献２０）により糖の定量を行い、溶出状態を調べた。得られた溶出状態の結果から、ＬＰＳの存在が予想される分画（フラクション３０〜６０）のうち、フラクション３７〜５５の各フラクション０．５ｍｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＬＰＳの分画パターンを調べた。  その結果、フラクション４５−５５は低分子量（分子量約５ｋＤ）ＬＰＳのみが認められ、フラクション３７−４４は高分子分量および低分子量の両方のＬＰＳが認められたので、フラクション４５−５５の低分子量ＬＰＳ分画を次のとおりさらに精製した。
【００６０】
各画分を混合して凍結乾燥し、エタノールに懸濁し、遠心分離によりエタノールに可溶なデオキシコール酸を除去し、低分子量ＬＰＳを不溶性画分に回収した。低分子量ＬＰＳ画分のエタノール処理をさらに２回反復し、デオキシコール酸を除去し、次に７０％エタノールに再度懸濁し、遠心分離で緩衝液成分を除去し、この操作をさらに３回反復し、低分子量ＬＰＳを不溶性画分に回収し、凍結乾燥し、精製した低分子量ＬＰＳを約２０ｍｇ得た。
【実施例２】
【００６１】
トリプトン（ディフコ社製）５ｇ、リン酸二水素カリウム１．６ｇおよび塩化ナトリウム８ｇを精製水１，０００ｍｌに溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した（以下これを基礎培地という）。基礎培地１００ｍｌに４０％塩化マグネシウム溶液１０ｍｌおよび０．４％マラカイトグリン溶液３ｍｌを無菌的に添加し、これをマグネシウム−マラカイトグリン培地とした。
【００６２】
マグネシウム−マラカイトグリン培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)保存菌株から単一コロニーを分離して接種し、３５℃で１夜振とう培養し、そのまま全量を１，０００ｍｌのマグネシウム−マラカイトグリン培地の入った３リットル容の坂口フラスコに接種し、同一条件で培養した。
【００６３】
さらに、７リットルのマグネシウム−マラカイトグリン培地の入った１０リットル容の卓上型ファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に培養した菌体を接種し、同一条件で通気培養し、のち集菌し、約５０ｇの湿菌体を回収し、これを凍結保存した。
凍結保存菌体約５０ｇを５００ｍｌの蒸留水に懸濁し、５００ｍｌの９０％熱フェノールを添加して６５〜７０℃で２０分間撹拌し、冷却し、１０，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理し、水層を回収した。フェノール層をさらに１回前記と同一の操作で処理した。２回の水層を合し、１夜透析してフェノールを除去し、透析内液を限外瀘過装置（アドヴァンテック・トーヨー社。ＵＫ−２００）を用いて分子量２０万カット−オフ膜により２気圧の窒素ガス下で限外瀘過濃縮をした。
【００６４】
得られた粗ＬＰＳ凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、フィルター滅菌し、緩衝液を添加し、陰イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシア社製。Ｑ−セファロース・ファースト・フロー）にかけ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料溶液をカラムに通液し、２００〜４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出させた。この溶出液を前記と同一条件で限外瀘過して脱塩および濃縮し、凍結乾燥し、約５０ｇの湿菌体から約２１０ｍｇの精製ＬＰＳを得た。
【００６５】
この精製ＬＰＳ８０ｍｇを実施例１と同一の方法で、３％デオキシコール酸ナトリウムを含有する可溶化緩衝液に溶解し、セファクリルＳ−２００ＨＲカラム（ファルマシア社製）で展開し、低分子量ＬＰＳのみを含有する画分を回収し、凍結乾燥後、エタノールに懸濁し、遠心分離によりデオキシコール酸等の緩衝液成分を除去し、凍結乾燥し、約５ｍｇの低分子量ＬＰＳを得た。
【００６６】
この低分子量ＬＰＳの分子量、ＫＤＯ数およびヘキソサミン数を前記試験例１と同一の方法で測定した結果、それぞれ６，０００、２．０１個／分子量６，０００、および２．８個／分子量６，０００であった。
なお、参考のため図２に、サルモネラ・ミネソタ菌株から精製された低分子量ＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を示す。図中レーン１は蛋白質およびペプチドマーカー［９４ｋＤ、６７ｋＤ、４３ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋＤ、１７．２ｋＤ、１４．６ｋＤ、１４．４ｋＤ、８．２４ｋＤ、６．３８ｋＤおよび２．５６ｋＤ（ファルマシア社製）］、レーン２、３および４はデオキシコール酸ナトリウム存在化でのゲル瀘過前の精製ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、および１．２５μｇ）、レーン５、６、７および８は、低分子量ＬＰＳ（２０μｇ、５μｇ、１．２５μｇ、および０．３１μｇ）である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】各ＬＰＳ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。
【図２】各ＬＰＳ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である。
【図１】
2005042120.tif 000006
【図２】
2005042120.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月29日(2004.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物菌体から得られ、次のａ）〜ｃ）の理化学的性質
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり、他に染色帯を実質的に認めないこと
ｂ）エルソン−モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１〜３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２−ケト−３−デオキシオクトネート含量が１〜３個／分子量５，０００であること
を有する低分子量リポポリサッカライド。