(57)【要約】【課題】本発明の目的は、多発性硬化症の罹患の有無を、被験者の負担を重くする事なく簡便かつ信頼性高く評価する方法を提供することにある。【解決手段】本発明は、多発性硬化症の患者と健常者の末梢血リンパ球における遺伝子群の発現量をDNAチップで比較解析することにより、多発性硬化症罹患に伴い発現量が変化する疾患マーカーを特定したことによって完成されたものであって、本発明の評価方法を用いることで、簡便で、精度良く多発性硬化症の罹患の有無を評価することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症の罹患の有無を評価するために、末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名がRIPK2、NFKBIE、TNFAIP3、DAXX、TNFSF10、BAG1、TOP1、ADPRT、CREB1、MYC、BAG4、RBBP4、GZMA、BCL2、E2F5の各々である遺伝子を含む遺伝子群のうち、いずれかの遺伝子の発現量を測定する工程を有することを特徴とする多発性硬化症関連遺伝子の発現測定方法。
【請求項２】
前記遺伝子群はアポトーシスの抑制、またはアポトーシスの活性化に関連するタンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の多発性硬化症関連遺伝子の発現測定方法。
【請求項３】
多発性硬化症の罹患の有無を評価するために、末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名が表１に記載された遺伝子のうち、いずれかの遺伝子の発現量を測定することを特徴とする多発性硬化症関連遺伝子の発現測定方法。
【請求項４】
多発性硬化症の罹患の有無を評価するために、末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名が表２に記載された遺伝子のうち、いずれかの遺伝子の発現量を測定することを特徴とする多発性硬化症関連遺伝子の発現測定方法。
【請求項５】
前記メッセンジャーRNAは、前記末梢血リンパ球から分離されたCD3+ T細胞由来のものであることを特徴とする請求項１乃至請求項４何れかに記載の多発性硬化症関連遺伝子の発現測定方法。
【請求項６】
シンボル名がRIPK2、NFKBIE、TNFAIP3、DAXX、TNFSF10、BAG1、TOP1、ADPRT、CREB1、MYC、BAG4、RBBP4、GZMA、BCL2、E2F5の各々である遺伝子を含む遺伝子群の少なくとも一部について、特異的に各々に結合するプローブ群を表面に固定した、多発性硬化症関連遺伝子の発現を測定するためのチップ。
【請求項７】
シンボル名が表１に記載された遺伝子群の少なくとも一部について、特異的に各々に結合するプローブ群を表面に固定した、多発性硬化症関連遺伝子の発現を測定するためのチップ。
【請求項８】
シンボル名が表２に記載された遺伝子群の少なくとも一部について、特異的に各々に結合するプローブ群を表面に固定した、多発性硬化症関連遺伝子の発現を測定するためのチップ。
【請求項９】
シンボル名がRIPK2、NFKBIE、TNFAIP3、DAXX、TNFSF10、BAG1、TOP1、ADPRT、CREB1、MYC、BAG4、RBBP4、GZMA、BCL2、E2F5の各々である遺伝子を含む、多発性硬化症の罹患を判断するための遺伝子群。
【請求項１０】
シンボル名が表１に記載された遺伝子を含む、多発性硬化症の罹患を判断するための遺伝子群。
【請求項１１】
シンボル名が表２に記載された遺伝子を含む、多発性硬化症の罹患を判断するための遺伝子群。
【請求項１２】
被験者の末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名がRIPK2、NFKBIE、TNFAIP3、DAXX、TNFSF10、BAG1、TOP1、ADPRT、CREB1、MYC、BAG4、RBBP4、GZMA、BCL2、E2F5の各々である遺伝子を含む遺伝子群から選ばれる少なくとも１種類以上の遺伝子の発現量を解析し、前記解析の結果を元に前記被験者の病状を評価する、多発性硬化症の評価方法。
【請求項１３】
被験者の末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名が表１に記載された遺伝子を含む遺伝子群から選ばれる少なくとも１種類以上の遺伝子の発現量を解析し、前記解析の結果を元に前記被験者の病状を評価する、多発性硬化症の評価方法。
【請求項１４】
被験者の末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名が表２に記載された遺伝子を含む遺伝子群から選ばれる少なくとも１種類以上の遺伝子の発現量を解析し、前記解析の結果を元に前記被験者の病状を評価する、多発性硬化症の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性硬化症の診断を支援するための評価方法に関する。具体的には、多発性硬化症に関連する遺伝子の発現測定方法、および多発性硬化症関連遺伝子の発現を測定するためのチップ、さらに多発性硬化症の罹患を判断するための遺伝子群に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（Multiple Sclerosis、以下MSと略す）は、脳と脊髄の神経線維を覆う「ミエリン」と呼ばれる脂肪質のカバーが炎症を起こし、神経の情報がうまく伝わらなくなるために視覚障害、運動障害、感覚低下、平衡障害等のさまざまな症状が出る疾患であり、未だ原因がはっきりせず、現代の医学では完全に治すことができない慢性病である。免疫系が誤って自分自身を攻撃してしまう「自己免疫疾患」のひとつだと考えられているが、その発症メカニズムの詳細は解明されていない。現在、日本国内には少なくとも5000人、世界中では、凡そ100万人にのぼる患者がいるといわれている。
【０００３】
MSの特徴の一つとして、大部分の患者が再発を何度もくり返すことが挙げられる。再発の大きさや長さは人によって違うが、急性期を過ぎて寛解期に入ると比較的よく回復する。このタイプを「再発寛解型」という。再発をくり返すたびに後遺症が増えていき、進行する患者もいる。一方、発病してから、実際に病気が進行していくことがあり、このタイプを「進行型」という。日本ではこのタイプは少ないといわれている。 
障害部位からMSの多様性をみてみると、大脳、小脳、脳幹を含む中枢神経系全般を広汎に侵す通常型MS（conventional MS：C-MS）と視神経と脊髄を比較的選択的に侵す視神経脊髄型MS（opticospinal MS：OS-MS）に大別される。欧米白人のMSはC-MSが大部分でOS-MSはまれであるのに対して、日本人を含むアジア人種のMSの場合には約1/3がOS-MSである。
【０００４】
従来、検査方法として、磁気共鳴画像（MRI）検査、髄液検査等が用いられてきた。MRI検査は、造影剤の「ガドリニウム」を使うことで、活動している病巣と既に治った病巣の区別ができるなど非常に有用ではあるが、すべての病巣を写し出せるわけではない。特に、大脳、小脳にはほとんど病変がないOS-MSの場合には、MRI検査が困難となる。また、画像から罹患の有無を判断するには、十分に熟練した神経内科専門医による診断が必要となる。一方、髄液検査は脳と脊髄の周囲を流れている脳脊髄液を採取して、髄液内のリンパ球や抗体（免疫グロブリンG ; IgG）、ミエリン塩基性タンパクの量を測定する事で病巣の有無を調べるものであり有用ではあるが、背中に針を刺す必要があるなど患者に多大な負担をかけるものである。以上のように、従来の検査方法では、多発性硬化症の罹患の有無を簡便に調べることは、検出感度、被験者への負担を考えると、非常に困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、多発性硬化症の診断を補助し有用な情報をもたらす、被験者への負担が軽く簡便かつ信頼性の高い評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行った結果、被験者の末梢血リンパ球における特定の遺伝子の発現状況を解析することで、被験者に対する多発性硬化症の罹患の有無を評価できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
以下、具体的な課題の解決手段を説明する。
本発明は、被験者の末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、アポトーシスの抑制、またはアポトーシスの活性化に関連するタンパク質の遺伝子の発現量を測定することで、前記被験者に対する多発性硬化症の罹患の有無を評価する方法である。
【０００８】
また、本発明は、被験者の末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名がRIPK2、NFKBIE、TNFAIP3、DAXX、TNFSF10、BAG1、TOP1、ADPRT、CREB1、MYC、BAG4、RBBP4、GZMA、BCL2、E2F5から選択されるいずれかの遺伝子の発現量を測定することで、前記被験者に対する多発性硬化症の罹患の有無を評価する方法である。
【０００９】
また、本発明は、被験者の末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名が表１に記載された遺伝子のうち、いずれかの遺伝子の発現量を測定することで、前記被験者に対する多発性硬化症の罹患の有無を評価する方法である。
【００１０】
また、本発明は、被験者の末梢血リンパ球由来のメッセンジャーRNAから、シンボル名が表２に記載された遺伝子のうち、いずれかの遺伝子の発現量を測定することで、前記被験者に対する多発性硬化症の罹患の有無を評価する方法である。
【００１１】
また、本発明は、被験者の末梢血リンパ球からCD3+ T細胞を分離し、前記T細胞の遺伝子発現を解析することで、前記被験者に対する多発性硬化症の罹患の有無を評価する方法である。
【００１２】
また、本発明は、前記多発性硬化症の罹患の有無を評価する方法において、遺伝子発現の解析手段として、DNAチップを用いることを特徴とする、評価方法である。
【００１３】
さらに、本発明は、前記遺伝子を搭載していることを特徴とする、多発性硬化症の罹患の有無を評価するための、DNAチップである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、被験者の末梢血リンパ球における特定の遺伝子群の発現量をDNAチップ等の簡便な方法で測定することにより、多発性硬化症の罹患の有無を評価できる方法に関する検討結果をもとに完成されたものであって、本発明の評価方法を用いることで、簡便で、精度良く多発性硬化症を診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
多発性硬化症（MS）は、自己免疫疾患であり、免疫システムの誤動作が原因と推測されている。T細胞、B細胞を中心に、それら複数の細胞間の信号のやり取りがネットワーク状に広がっている極めて複雑系である免疫システムの異常あるいはその修復状況を、リンパ球の一種であるサプレッサーT細胞、サイトカインの一種であるリンホトキシン、  腫瘍壊死因子（TNF）、インターフェロン・ガンマ（INFγ）、トランスホーミンググロースファクター・ベータ（TGFβ）等の個々の動きを見ただけで判断する事は非常に危険であると考えられる。そこで、発明者らは、より広範に遺伝子群の動きを見ることで免疫システムの状況を知る方法の開発を行った。
【００１６】
最近、DNAチップあるいはDNAアレイとよばれる、配列の異なる多数のDNA断片を基板のそれぞれ異なる個所に固定したものに、遺伝子の発現状態を調べたい細胞から取り出したメッセンジャーRNAの逆転写物（蛍光標識あるいはラジオアイソトープ標識をしたもの）をふりかけ、ハイブリダイゼーションを行った後、それぞれの配列のDNA断片固定箇所にどの程度逆転写物がハイブリダイゼーションしたかを調べ、試料細胞中の遺伝子発現を調べる方法が注目されている。発明者らは、このDNAチップの技術を用いて、健常者とMS患者の末梢血リンパ球における遺伝子発現パターンの差異を網羅的に調べた。
【００１７】
サンプルとして免疫システムを担うリンパ球を末梢血より採取する事にした。末梢血より得られるサンプルを用いる事は、被験者の負担を大きく緩和する意味で重要である。MRI検査、誘発電位検査、髄液検査及び臨床所見により総合的に判断して再発寛解型MSと認められた患者７２名、及び健常ボランティア２２名の協力を仰ぎ、末梢血リンパ球における遺伝子発現パターンの比較検討を詳細に行った。DNAチップとして、サイトカイン、信号伝達、グロースファクター、オンコジーン、アポトーシス等に関連するヒト遺伝子約1260種類を搭載したDNAチップ（日立製作所社製薬物応答解析用DNAチップ）を使用した。被験者から約10cc採血した後、密度勾配遠心用媒体（Ficoll-Paque PLUS(登録商標), Amersham Biosciences 社製）を用いてリンパ球を分離し、磁気細胞分離システムAutoMACS(登録商標)（Miltenyi社製）を用いてCD3+ T細胞とCD3- non-T細胞（単球、B細胞、NK細胞）に分離した。次に、分離した各細胞分画より、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）を用いてトータルRNAを抽出した。各被験者１名当たりのトータルRNAの収量は、CD3+ T細胞由来が３−６マイクログラム、CD3- non-T細胞由来が２−４マイクログラムであった。患者群からの採血の時期は、インターフェロンβ治療開始前とした。
【００１８】
健常者ボランティアを３名募り、採血した後、CD3+  T細胞とそれ以外のCD3-  non-T細胞に分けて、それぞれからRNAを抽出した後、３名のサンプルを等量混合し、これをインビトロ・トランスクリプションを利用して２回RNA増幅反応を行い、増幅して得たRNAを参照サンプルとした。この参照サンプルは、すべての健常者および患者サンプルに対する共通の参照サンプルとして用いた。
【００１９】
健常者群および患者群から採取したT細胞及びnon-T細胞より抽出したトータルRNAに対し、インビトロ・トランスクリプションを利用してRNA増幅反応を行った後、Cy5-dCTPを用いた逆転写反応によりCy5で標識したcDNAを合成した。一方、健常者由来の参照サンプルについてはT細胞及びnon-T細胞サンプル各々に対してCy3-dCTPを用いた逆転写反応によりCy3で標識したcDNAを合成した。これらのcDNAを等量混合した後、前記DNAチップにかけてハイブリダイゼーションを６２℃、１２時間行った。洗浄後スキャナー（GSI-Lumonics社製ScanArray 5000）により各スポットの蛍光強度を測定し、健常者あるいは患者由来サンプルと参照サンプルとの各遺伝子における発現量の比を求めた。すべてのDNAチップを用いた発現比較実験では、共通の参照サンプルに対する発現量の比を求めているため、健常者と患者間における各遺伝子の発現量の差異を求める事が容易にできる。
【００２０】
解析の方法は次の通りである。患者群と健常者群についてT検定を行い、個人間(サンプル間)の差を考慮しても２群間で統計的に見て有意にその発現量に差のある遺伝子群を抽出した。T検定には、A.  Longらが非特許文献１に報告しているベイズ推定法とT検定を組み合わせた方法を用い、偽陽性の許容値は０．２５とした。T細胞由来サンプルの場合の結果を表1に、non-T細胞由来サンプルの場合の結果を表２にまとめて示す。変動遺伝子群として選び出された遺伝子をみると、RIPK2、NFKBIE、TNFAIP3、DAXX、TNFSF10、BAG1、TOP1、ADPRT、CREB1、MYC、BAG4、RBBP4、GZMA、BCL2、E2F5等の遺伝子群が選び出されている事が分かる。すなわち、アポトーシス制御およびアポトーシス活性化に関連する遺伝子群が選び出されている事が分かる。これらの遺伝子群が、健常者とMS患者において発現量に差のある遺伝子群、すなわちMS特異的な末梢血マーカーであると判断される。健常者とMS患者の間の群間検定で抽出されたマーカー遺伝子の数は、約２倍ほどT細胞由来サンプルの場合の方が多い。このことは、non-T細胞よりもT細胞の方が健常者とMS患者を識別する上で好ましいことを示している。
【００２１】
次に、抽出した遺伝子群の発現量を基に、MS患者６６名と健常者１７名をグループ分けするクラスタ解析を試みた。解析には、階層クラスタリング法を用いた。得られた樹状図を図１及び図２に、図１に関する解析データを図５から図１５に、図２に関する解析データを図１６から図１８に、示す。縦軸（height）は、クラスタ間の距離の目安となるものである。図１及び図２より明らかのように、MS患者群と健常者群のクラスタが明瞭に分けられていることがわかる。
【００２２】
以上述べたように、特定の遺伝子群をマーカーとして、被験者の末梢血リンパ球における遺伝子発現解析を行うことで、明瞭に、健常者群と患者群と識別出来ることが明らかとなった。
【００２３】
本発明で用いられる、遺伝子の発現量を調べる方法は、DNAチップに限られるものではなく、定量的PCR法、ノーザンブロット法等も使用できる事は明白である。
【００２４】
データの解析方法としては、クラスタリングに限定されるものではなく、サポートベクターマシン等の機械学習のアルゴリズムも使用できる。
【００２５】
本発明の実施の形態について、以下具体例を示して詳細に説明する。
【実施例１】
【００２６】
MSに罹患していることが臨床的に明確になった患者群のデータ及び健常者群の遺伝子発現情報をデータベースとして持ち、MSの罹患の有無をこれから評価しようとする被験者の発現解析結果を、前記データベースと照らし合わせて解析する事で、被験者の罹患の有無を評価した例を記す。
【００２７】
データベースとして、前記した患者６６名、健常者１７名のデータを用いた。被験者には、MRI検査、誘発電位検査、髄液検査及び臨床所見により総合的に判断して再発寛解型MSと認められる患者３名と健常者２名の合計５名とし、末梢血を各１０cc採血した以降はサンプル番号だけで管理することで、どのサンプルが患者あるいは健常者由来のものかを分からないように取り扱った。
【００２８】
密度勾配遠心用媒体（Ficoll-Paque PLUS(登録商標), Amersham Biosciences 社製）を用いて各血液サンプルからリンパ球を分離した後、磁気細胞分離システムAutoMACS(登録商標)（Miltenyi社製）を用いてCD3+ T細胞とCD3- non-T細胞（単球、B細胞、NK細胞）に分離した。次に、分離した各細胞分画より、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）を用いてトータルRNAを抽出した。各被験者１名当たりのトータルRNAの収量は、CD3+ T細胞由来が３−６マイクログラム、CD3- non-T細胞由来が２−４マイクログラムであった。
【００２９】
次に、トータルRNA２マイクログラムに対して、T7プロモータ配列を付加したオリゴ(dT)24プライマーをアニールさせ、まず、First strand DNA合成を行った。次に、このFirst strand DNAを鋳型にして、T7プロモータ配列を有するSecond strand DNAを合成した。最後にSecond strand DNAを鋳型にして、T7 RNA polymeraseによるRNA合成を行った。次に、前記増幅したRNA４マイクログラムに対し、ランダムヘキサマーをアニールさせ逆転写酵素反応を行い、Cy5-dCTPを鎖中に取り込ませることで蛍光標識した。
【００３０】
コントロールサンプルは次のようにして作製した。健常者３名のボランティアを募り、各ボランティアから末梢血を１５cc採血し、前記密度勾配遠心法、磁気細胞分離システム、RNA抽出キットを用いて、CD3+ T細胞由来および、CD3- non-T細胞由来トータルRNAを抽出した。３名のトータルRNA各３マイクログラムを混合した後、前記RNA増幅反応及び逆転写反応により、Cy3で蛍光標識をしたcDNAを合成し、共通のコントロールサンプルとした。
【００３１】
それぞれの患者サンプルから作製したCy5-cDNAと、共通コントロールサンプルのCy3-cDNAを４マイクログラムずつ等量混合した後、前記DNAチップ（日立製作所社製薬物応答解析用DNAチップ）にかけハイブリダイゼーションを６２℃のもと１２時間行った。洗浄後スキャナー（GSI-Lumonics社製ScanArray (登録商標)5000）により各スポットの蛍光強度を測定し、数値化ソフトウエア（GSI-Lumonics社製QuantArray）を用いて各遺伝子におけるコントロールサンプルと各被験者サンプルとの発現強度比を求めた。
【００３２】
これら５名の被験者のデータと、前記患者６６名、健常者１７名のデータからなるデータベースとをあわせて、階層型クラスタ解析を行った。CD3+ T細胞由来サンプルの結果を図３に、CD3- non-T細胞由来サンプルの結果を図４に示す。これらの図から明らかのように、被験者A、B、C、D、Eのうち、A、D、EがMSの患者群に、被験者B、Cが健常者群に振り分けられるという結果が得られた。サンプルの由来を辿ると、確かに、被験者A、D、EはMSの患者であり、被験者B、Cは健常者であることが確かめられた。
【００３３】
この結果は、図１９から図２３に示した表１および図２４から図２５に示した表２に記載した遺伝子群を遺伝子マーカーとして発現データを解析することでMSの患者と健常者とをクラス分けすることができるということを明確に示しており、本発明の有効性が非常に高い事が示された。また、T細胞とnon-T細胞の結果を比べると、どちらもサンプルの由来どうりクラス分けが正しく得られてはいるが、T細胞の場合のほうがより明瞭に全体のクラス分けが行われていることから、末梢血リンパ球としてT細胞を用いたほうがより好ましいことが明らかとなった。
【００３４】
以上の結果を踏まえ、変動遺伝子群として選び出された遺伝子をみると、RIPK2、NFKBIE、TNFAIP3、DAXX、TNFSF10、BAG1、TOP1、ADPRT、CREB1、MYC、BAG4、RBBP4、GZMA、BCL2、E2F5等の遺伝子群は、多発性硬化症の罹患を判断するための遺伝子群とみなすことができる。そして、これらの遺伝子群のうち少なくとも一部について、特異的に各々に結合するプローブ群を表面に固定したチップを用意すれば、多発性硬化症関連遺伝子の発現を測定するためのチップとすることができる。
【００３５】
また、T細胞由来サンプルの場合の結果である表１に記載の遺伝子をみると、これらの遺伝子群を多発性硬化症の罹患を判断するための遺伝子群とみなすこともできる。そして、これらの遺伝子群のうち少なくとも一部について、特異的に各々に結合するプローブ群を表面に固定したチップを用意すれば、多発性硬化症関連遺伝子の発現を測定するためのチップとすることができる。
【００３６】
さらに、non-T細胞由来サンプルの場合の結果である表２に記載の遺伝子をみると、これらの遺伝子群を多発性硬化症の罹患を判断するための遺伝子群とみなすこともできる。そして、これらの遺伝子群のうち少なくとも一部について、特異的に各々に結合するプローブ群を表面に固定したチップを用意すれば、多発性硬化症関連遺伝子の発現を測定するためのチップとすることができる。
【００３７】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・バイオケミストリー２７６巻１９９３７-１９９４４頁（２００１年）
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】MS患者６６名と健常者１７名のサンプルによるT細胞由来サンプルのクラスタ解析。
【図２】MS患者６６名と健常者１７名のサンプルによるnonT細胞由来サンプルのクラスタ解析。
【図３】被験者５名のサンプルを加えたT細胞由来サンプルのクラスタ解析。
【図４】被験者５名のサンプルを加えたnonT細胞由来サンプルのクラスタ解析。
【図５】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその１。
【図６】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその２。
【図７】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその３。
【図８】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその４。
【図９】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその５。
【図１０】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその６。
【図１１】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその７。
【図１２】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその８。
【図１３】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその９。
【図１４】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその１０。
【図１５】図１に記載のクラスタ解析に関するデータのその１１。
【図１６】図２に記載のクラスタ解析に関するデータのその１。
【図１７】図２に記載のクラスタ解析に関するデータのその２。
【図１８】図２に記載のクラスタ解析に関するデータのその３。
【図１９】表１のその１。
【図２０】表１のその２。
【図２１】表１のその３。
【図２２】表１のその４。
【図２３】表１のその５。
【図２４】表２のその１。
【図２５】表２のその２。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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