(57)【要約】【課題】  本発明は、新規アポトーシス誘導薬に関する。該アポトーシス誘導薬により、細胞増殖性疾患の予防または治療が可能となる。【解決手段】  IP3受容体のチャネルドメインのみからなる変異体タンパク質を発現させることにより、該発現細胞においてアポトーシスを誘導する。該変異体タンパク質は、細胞の小胞体上に局在して小胞体内のカルシウムを細胞質へと流出させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
IP3受容体タンパク質のチャネルドメインを含み、かつその制御ドメインを機能しうる形で含まないIP3受容体変異体タンパク質。
【請求項２】
IP3受容体タンパク質がIP3受容体タイプ1タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質である、請求項２記載のタンパク質。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも2216〜2749位、または2276〜2749位の配列を含み、かつ少なくとも第1〜1891位の配列は含まないタンパク質
(b)  上記(a)に規定するタンパク質において、1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質
【請求項４】
以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質である、請求項２記載のタンパク質。
(a)  配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも第2222〜2695位の配列を含み、かつ少なくとも第１〜2221位の配列は含まないタンパク質
(b)  上記(a)に規定するタンパク質において、1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に、小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子と、少なくとも80％の相同性を有する核酸分子、およびこれらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか1項に記載のIP3受容体変異体タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか1項に記載のIP3受容体変異体タンパク質を発現させた細胞内で、小胞体内のCa2+濃度が減少することを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項５または６記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させる、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか1項に記載のタンパク質を、対象とする細胞で発現させる、請求項７または８記載の方法。
【請求項１１】
請求項５または６記載の核酸分子を含む、アポトーシス誘導薬。
【請求項１２】
請求項５または６記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させ、該細胞の小胞体内のCa2+濃度を減少させることを特徴とする、請求項１１記載のアポトーシス誘導薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IP3受容体のC末端側に位置するチャネル形成ドメインのみを含むタンパク質が、アポトーシス誘導薬として作用することに関する。したがって、本発明は、該タンパク質による抗癌治療等の細胞増殖性疾患の治療にかかる分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜上のレセプターの活性化に伴いホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate)が加水分解されると、細胞内セカンドメッセンジャーであるイノシトール1,4,5-三リン酸(inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3))が生成する。IP3はIP3受容体(IP3R)に結合することにより、細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ（主に小胞体）からのCa2+流出を誘導する。このIP3/Ca2+シグナル経路において、IP3受容体は、IP3のシグナルをCa2+のシグナルへ変換する役割を担っている(1-3)。
【０００３】
IP3受容体は、4量体の細胞内IP3-誘導性Ca2+放出チャネル（IP3-gated Ca2+ release channel）である(3, 4)。哺乳動物では、3種の異なるIP3受容体が存在する(5-7)。IP3により誘発されるIP3受容体チャネル開口の詳細な機序は未だ不明であるが、IP3結合がIP3受容体の何らかの立体構造変化を誘導することによって、チャネルの開口が起こると考えられる(10)。チャネルの開口以外にも、IP3-誘導性の立体構造変化は、IP3受容体の分解にも関与していると考えられる (13, 14)。
【０００４】
IP3受容体の活性化による細胞質Ca2+濃度の増加によって、多種多様な下流標的分子の活性が制御される。これら下流標的分子は、受精、発生、増殖、分泌、シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担っている (1-2, 15)。このような多岐に渡る細胞機能を制御するために、Ca2+シグナルは、空間、時間、および濃度の点で厳密に制御される必要がある(2, 15)。このようなCa2+シグナルの複雑な制御は、IP3受容体アイソフォームの発現の多様性、IP3受容体アイソフォームのヘテロ4量体の形成、IP3受容体の細胞内分布、ならびにCa2+自体、ATPおよびリン酸化によるIP3受容体の制御によって部分的に担われている (3-4, 16)。IP3受容体チャネルはまた、カルモジュリン(18, 19)、FKBP12 (20-22、23-24)、カルシニューリン(21、25、23-24)、アンキリン(26-28)、σ-1 受容体(28)、クロモグラニンAおよびB (29-31)、IRAG (32)、Fyn(33)ならびにBANK (34)などの該チャネルと相互作用するタンパク質によっても制御される(4, 17)。さらに、CaBPと呼ばれるファミリーが、Ca2+依存的にIP3受容体と結合し、IP3非存在下でIP3受容体を直接活性化することが示された(35)。IP3受容体はまた、タンパク質-タンパク質間相互作用によってその上流または下流のシグナル分子に物理的に会合していることが示されている。例えば、IP3受容体は、Homerファミリータンパク質を介して代謝型グルタミン酸受容体グループ１(mGluRs)と結合し(36)、また、未知の機序によってB2ブラジキニン受容体(B2Rs)と結合している(37)。mGluRsやB2Rsの活性化によって、IP3受容体に近接した位置でIP3が産生され、効率的かつ特異的にシグナルが伝播される。
【０００５】
このように、IP3分子は、様々な細胞機能を制御する重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内の濃度は時間空間的に制御された形で変化していると考えられる。
【０００６】
上述の制御ドメインのC末端側近傍にはカスパーゼ3特異的切断部位が存在する。カスパーゼ3により該切断部位で切断されると、IP3受容体のチャネルドメインのみを含むタンパク質が生じる。カスパーゼ3によりIP3受容体が切断されると細胞のアポトーシスが起こることが、種々の培養細胞系において示されている（38）。
【０００７】
しかし、カスパーゼ3により切断されたIP3受容体が、カルシウムの細胞内プールに対してどのような作用をするのかは不明である。
【０００８】
細胞質Ca2+の局在パターンの変動がアポトーシスにどの様な影響を与えるのかということは、現在論争の的であり、細胞種、アポトーシス誘導の刺激、細胞の環境等、種々の条件によって異なることが明らかにされている（2）。しかし、IP3受容体がアポトーシスに関与していることを示唆する報告がある。例えば、Jurkat細胞におけるアンチセンスRNA法によりIP3受容体の存在量を低下させた場合（39）、およびDT40ニワトリB細胞においてIP3受容体の遺伝子を欠失させた場合（40）、有意にアポトーシスが阻害されるとの報告がある。IP3受容体タイプ3（IP3R3）は、リンパ細胞のアポトーシスの際に選択的に増加し、IP3R3アンチセンスRNAを発現させることによりアポトーシスが阻害されることも報告されている（41、42）。Bcl-XLは、IP3R1およびIP3R3をダウンレギュレートするが、該ダウンレギュレートは抗アポトーシス作用の一部であると考えられる（43）。したがって、IP3受容体とそのカスパーゼ3切断産物は、条件によってはアポトーシスに必須のシグナル伝達を任っている可能性が高い。
【０００９】
しかしながら、現時点でIP3受容体のカスパーゼ3切断産物のアポトーシスに対する影響を直接的に証明した例は報告されていない。
【００１０】
【非特許文献１】Berridge, M. J. (1993) Nature 361, 315-325
【非特許文献２】Berridge, M. J.ら、(2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21
【非特許文献３】Furuichi, T.および Mikoshiba, K. (1995) J. Neurochem. 64, 953-960
【非特許文献４】Patel, S.ら、(1999) Cell Calcium 25, 247-264
【非特許文献５】Furuichi, T.ら、(1989) Nature 342, 32-38
【非特許文献６】Sudhof, T. C.ら、(1991) EMBO J. 10, 3199-3206
【非特許文献７】Blondel, O.ら、(1993) J. Biol. Chem. 268, 11356-11363
【非特許文献８】Worley, P. F.ら、(1987) Nature 325, 159-161
【非特許文献９】Furuichi, T.ら、(1993) Recept. Channels 1, 11-24
【非特許文献１０】Mignery, G. A.およびSudhof, T. C. (1990) EMBO J. 9, 3893-3898
【非特許文献１１】Miyawaki, A.ら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4911-4915
【非特許文献１２】Yoshikawa, F.ら、(1996) J. Biol. Chem. 271, 18277-18284
【非特許文献１３】Zhu, C.-C.ら、(1999) J. Biol. Chem. 274, 3476-3484
【非特許文献１４】Zhu, C.-C.およびWojcikiewicz, R. J. H. (2000) Biochem. J. 348, 551-556
【非特許文献１５】Berridge, M. J.ら、(1998) Nature 395, 645-648
【非特許文献１６】Thrower, E. C.ら、(2001) Trends Pharmacol. Sci. 22, 580-586
【非特許文献１７】Mackrill, J. J. (1999) Biochem. J. 337, 345-361
【非特許文献１８】Patel, S.ら、(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11627-11632
【非特許文献１９】Michikawa, T.ら、(1999) Neuron 23, 799-808
【非特許文献２０】Cameron, A. M.ら、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1784-1788
【非特許文献２１】Cameron, A. M.ら、(1997) J. Biol. Chem. 272, 27582-27588
【非特許文献２２】Dargan, S. L.ら、(2002) Biochem. J. 361, 401-407
【非特許文献２３】Bultynck, G.ら、(2000) J. Physiol. 525, 681-693
【非特許文献２４】Bultynck, G.ら、(2001) Biochem. J. 354, 413-422
【非特許文献２５】Cameron, A. M.ら、(1995) Cell 83, 463-472
【非特許文献２６】Joseph, S. K.ら、(1993) J. Biol. Chem. 268, 7290-7297
【非特許文献２７】Bourguignon, L. Y. Wら、(1993) J. Biol. Chem. 268, 7290-7297
【非特許文献２８】Hayashi, T.およびSu, T.-P. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 491-496
【非特許文献２９】Yoo, S. H.ら、(2000) J. Biol. Chem. 275, 12553-12559
【非特許文献３０】Yoo, S. H.およびJeon, C. J. (2000) J. Biol. Chem. 275, 15067-15073
【非特許文献３１】Thrower, E. C.ら、(2002) J. Biol. Chem. 277, 15801-15806
【非特許文献３２】Schlossmann, J.ら、(2000) Nature 404, 197-201
【非特許文献３３】Jayaraman, T.ら、(1996) Science 272, 1492-1494
【非特許文献３４】Yokoyama, K.ら、(2002) EMBO J. 21, 83-92
【非特許文献３５】Yang, J.ら、(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7711-7716
【非特許文献３６】Tu, J. C.ら、(1998) Neuron 21, 717-726
【非特許文献３７】Delmas, P.ら、(2002) Neuron 14, 209-220
【非特許文献３８】Hirota, J.ら、(1999)J. Biol. Chem. 274, 34433-34437
【非特許文献３９】Jayaraman, T., およびMarks, A. R. (1997) Mol.Ce..Biol.17, 3005-3012
【非特許文献４０】Sugawara, H.ら、（1997）EMBO J. 16, 3078-3088
【非特許文献４１】Khan, A. A.ら、（1996）Science 273, 503-507
【非特許文献４２】Blackshaw, S.ら、（2000）FASEB J. 14, 1375-1379
【非特許文献４３】Li, C.ら、（2002）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9830-9835
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、IP3受容体のチャネルドメインのみからなる変異体タンパク質によってアポトーシスを誘導し、細胞増殖性疾患の治療等に有用な薬剤および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、種々の長さのIP3受容体タイプ1（IP3R1）変異体タンパク質をグリーン蛍光タンパク質（GFP）で標識したものを作製し、それぞれを細胞内で発現させることにより、IP3受容体のチャネルドメインのみからなるタンパク質を発現させた場合、そのチャネルが開いた状態となるか、または少なくともCa2+イオンの透過が可能な状態であることを見出した。
【００１３】
このことから、IP3受容体のチャネルドメインのみからなるタンパク質を強制発現させた細胞では、小胞体（ER）から細胞質へとCa2+イオンが流出し、アポトーシスが誘導されることがわかった。
【００１４】
したがって、上記チャネルドメインのみを含むタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子は、アポトーシス誘導薬として細胞増殖性疾患の治療に用いることができる。
【００１５】
以上の知見より、本発明は、以下の態様：
１．  IP3受容体タンパク質のチャネルドメインを含み、かつその制御ドメインを機能しうる形で含まないIP3受容体変異体タンパク質；
２．  IP3受容体タンパク質がIP3受容体タイプ1タンパク質である、上記１記載のタンパク質；
３．  以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質である、上記２記載のタンパク質；
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも2216〜2749位、または2276〜2749位の配列を含み、かつ少なくとも第1〜1891位の配列は含まないタンパク質
(b)  上記(a)に規定するタンパク質において、1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質
４．  以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質である、上記２記載のタンパク質；
(a)  配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも第2222〜2695位の配列を含み、かつ少なくとも第１〜2221位の配列は含まないタンパク質
(b)  上記(a)に規定するタンパク質において、1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に、小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質
５．  上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸分子；
６．  上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸分子と、少なくとも80％の相同性を有する核酸分子、またはこれらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
７．  上記１〜４のいずれかに記載のIP3受容体変異体タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法；
８．  上記１〜４のいずれかに記載のIP3受容体変異体タンパク質を発現させた細胞内で、小胞体内のCa2+濃度が減少することを特徴とする、上記７記載の方法；
９．  上記５または６記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させる、上記７または８記載の方法；
１０．  上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質を、対象とする細胞で発現させる、上記７または８記載の方法；
１１．  上記５または６記載の核酸分子を含む、アポトーシス誘導薬；
１２．  上記５または６記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させ、該細胞の小胞体内のCa2+濃度を減少させることを特徴とする、上記１０記載のアポトーシス誘導薬；
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
以上より、本発明により、細胞内Ca2+ストアから細胞質へのCa2+の流出を誘導することにより細胞のアポトーシスを誘導するタンパク質、およびそれによるアポトーシス誘導方法が提供される。また、IP3受容体のチャネルドメインからなるアポトーシス誘導薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１８】
IP3受容体は、4量体の細胞内IP3-誘導性Ca2+放出チャネル（IP3-gated Ca2+ release channel）である(3, 4)。哺乳動物では、3種の異なるサブタイプのIP3受容体が存在する(5-7)。いずれのサブタイプも、N末端近傍にIP3結合ドメイン、C末端近傍に６回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら2つのドメインの間に制御ドメインが存在する(10, 11)。
【００１９】
マウスIP3受容体タイプ1（IP3R1）では、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。N末端側（1〜610残基）がリガンド結合ドメインで、C末端側（2276〜2749残基）がチャネル形成ドメインであり、これらの間に制御ドメイン（611〜2275残基）が存在する。該タンパク質の1891残基と1892残基の間のペプチド結合は、カスパーゼ3特異的切断部位である。上述のとおり、カスパーゼ3切断断片がアポトーシスを促進することが報告されていることから、カスパーゼ3切断部位よりC末端側がアポトーシスの誘導に重要であると考えられる。
【００２０】
この知見に基づいて、本発明者らは、アポトーシス誘導に関与するIP3受容体部位をさらに限定するために、マウスIP3R1のカスパーゼ3切断C末端側断片よりさらに短い、配列番号1に示すマウスIP3R1のアミノ酸配列のうち2216〜2749位の配列のみを含むタンパク質にGFPタグを付したもの(GFP-IP3R1-ES)を作製した。すなわち、該タンパク質は、IP3R1のC末端に存在するチャネルドメインとそのN末端側の制御ドメインのC末端配列60残基を含むものであり、これにはリガンド結合ドメインおよび制御ドメインは機能し得る形で含んまれていない。
【００２１】
このGFP-IP3R1-ESを、細胞に強制発現させたところ、細胞の小胞体内におけるCa2+ストアからのCa2+の流出が起こり、小胞体内のCa2+濃度が低くなる。この小胞体内のCa2+濃度の低下により、細胞外から細胞質へのストア作動性Ca2+流入が起こる。これにより、IP3R1-ESを強制発現した細胞ではアポトーシスが誘導される。
【００２２】
IP3R1-ESはほぼチャネルドメインのみからなるものであり、N末端側の制御ドメイン由来の60残基は機能を有してはいない。IP3Rの制御ドメインは、リガンド結合ドメインへのIP3の結合を受けてチャネルドメインの何らかの立体構造変化を誘導してチャネルの開口をもたらすと考えられている。本明細書中、「制御ドメインを機能しうる形で含まない」とは、制御ドメインを構成するアミノ酸配列の全部を含まないか、または一部または全部を含むものの上記のようなリガンド結合部位によるチャネルドメインの開口を誘導するという制御ドメイン本来の機能を有していないことをいう。したがって、IP3R1-ESも、「制御ドメインを機能しうる形で含まない」IP3R1変異体タンパク質に含まれる。
【００２３】
マウスIP3R1のアミノ酸配列のうち2276〜2749位のチャネルドメインを構成するアミノ酸配列のみを含むタンパク質も、IP3R1-ESと同様のアポトーシス誘導作用を示し得ることが当業者であれば容易に認識し得るであろう。さらに、これらのIP3R1の2216〜2749位、または2276〜2749位のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、アポトーシス誘導作用を有する。ここで、「機能的に同等なタンパク質」とは、上記アミノ酸配列において、1〜60、好ましくは1〜20、さらに好ましくは1〜10、特に好ましくは1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、IP3R1-ESと同様に哺乳動物細胞で発現させた場合、小胞体膜上に存在して小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質をいう。
【００２４】
また、IP3受容体タイプ１に限らず、IP3受容体タイプ２およびタイプ３についても同様に、チャネルドメインを含み、かつ制御ドメインを機能し得る形で含まない変異体タンパク質は、アポトーシス誘導作用を有すると考えられるため、これらのタンパク質およびこれらと機能的に同等なタンパク質もまた本発明の範囲内である。
【００２５】
また、あらゆる哺乳動物に由来するIP3受容体についても同様である。したがって、例えば配列番号２にアミノ酸配列を示すヒトIP3受容体タイプ１では、少なくとも第2222〜2695位の配列を含み、少なくとも第596〜2221位の配列は含まないタンパク質、およびこれに機能的に同等なタンパク質もまた、アポトーシス誘導作用を有する。
【００２６】
したがって、これらのタンパク質は全て本発明の範囲内にある。
また、これらのタンパク質をコードする核酸分子もまた本発明の範囲内である。本明細書中、「核酸分子」という用語は、DNAおよびRNAを含む。また、これらの核酸分子と少なくとも80％の相同性を有する核酸分子、好ましくはBLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、90％の相同性を有する核酸分子、さらに好ましくは95％の相同性を有する核酸分子、およびこれらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子もまた、本発明に含まれる。本明細書中「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、ナトリウム濃度が10mM〜300mMであり、好ましくは37〜65℃、より好ましくは42℃である条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２７】
さらに、上記の核酸分子を含むベクター、上記核酸分子が発現可能なように該核酸分子にプロモーターが機能し得る形で連結されているベクター、および上記核酸分子の発現産物を標識化するための何らかの標識物をコードする核酸分子と上記核酸分子がインフレームで連結されているベクター、さらにはこれらのベクターを含有する宿主細胞(哺乳動物細胞が好ましいが、これらに限定はされない)も、本発明に包含される。
【００２８】
本発明のタンパク質を発現させるためには、IP3受容体のアミノ酸配列に基づいて上記タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子を作製し、これを周知の遺伝子工学的手法を用いて、適切な発現ベクターに組込むとよい。アミノ酸配列に基づいて遺伝子を作製または単離する技法、および哺乳動物細胞での発現に適切な発現ベクターは、様々なものが公知であり、当業者であれば容易に適切なものを選択することができる。
【００２９】
対象とする細胞に該発現ベクターを導入して、該細胞で上記遺伝子を発現させるための種々の方法も知られている。
【００３０】
IP3R1が細胞の小胞体膜上に存在するためには、チャネルドメインのみが必要十分であることを本発明者らは見い出しており、少なくともチャネルドメインを含む上記IP3受容体変異体タンパク質を細胞で強制発現させた場合、該変異体タンパク質は小胞体膜上に局在する。該変異体タンパク質は、制御ドメインを欠くため、正常なIP3受容体の立体構造をとることができず、チャネルが完全に閉口せず、小胞体内のCa2+を細胞質へと流出させ、細胞をアポトーシスへと導くと考えられる。
【００３１】
すなわち、上述のタンパク質は細胞のアポトーシス誘導薬として有用である。アポトーシス誘導薬は、細胞増殖性疾患の治療に有用である。
【００３２】
細胞増殖性疾患とは、特定の細胞種が異常増殖することにより発症する疾患であり、皮膚T細胞増殖性疾患、血管平滑筋細胞増殖性疾患、骨芽細胞増殖性疾患、眼内細胞増殖性疾患、甲状腺の細胞増殖性疾患等を含む各種腫瘍および慢性関節リウマチ（RA）などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３３】
かかる細胞増殖性疾患において、増殖する細胞をアポトーシスにより死滅させる治療が該疾患において有効であり得る。
【００３４】
上記アポトーシス誘導薬としてのIP3受容体変異体タンパク質をコードする遺伝子を、所望の細胞内で該タンパク質を発現し得る形で導入することにより、所望の細胞のアポトーシスを誘導し得る。IP3R受容体変異体タンパク質をコードする遺伝子が所望の細胞でのみ発現し得るように、該細胞種に特異的な発現プロモーター等の調節因子を上記遺伝子に機能し得る形で連結した発現カセットを含むベクターを用いて、対象とする生物個体に導入することができる。これらの方法は、種々のものが既に公知であり、いずれの方法を使用することも可能であるが、例えばアデノウイルス等を用いることができる。細胞種特異的な発現プロモーターも個々の細胞種について様々なものが公知であり、当業者であれば適切なものを選択することは容易である。
【００３５】
例えば、IP3受容体変異体タンパク質をコードするDNAを上記治療薬として使用する場合は、本発明のDNAを単独あるいは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴性ウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常法に従って、患者に投与することができる。該DNAは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。また、DNAを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は当業者であれば適当な用量がわかるであろう。
【００３６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなビヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート80TM、HCO-50）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００３７】
また、上記治療薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００３８】
投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより相違し、対象とする患者の健康状態、体重、併用する治療方法等の条件によって、個別に担当医によって決定される。
【００３９】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を例示として記載する。
【実施例】
【００４０】
GFPタグを付したIP3受容体タイプ1変異体DNAの構築とその発現
IP3受容体タイプ1の1892残基よりC末端側のアミノ酸配列のみからなるペプチドのN末端側にグリーン蛍光タンパク質EGFPを付したIP3受容体タイプ1変異体（GFP-IP3R1-casp）、および、IP3受容体タイプ1の2216残基よりC末端側のアミノ酸配列のみからなるペプチドのN末端側にグリーン蛍光タンパク質EGFPを付加したIP3受容体タイプ1変異体（GFP-IP3R1-ES）を作製した。
【００４１】
まず、マウスIP3R1をコードするcDNAを、Pfu turbo（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて常法に従ってPCRにより増幅した。該cDNA断片とEGFPのコード配列（Clontech, Palo Alto, CA）とを、pcDNA3.1/Zeo+（Invitrogen,Carlsbad,CA）内にEGFPcDNAがIP3R1cDNAの上流に位置するようにサブクローニングし、GFP-IP3R1-N発現ベクターを得た。該ベクター内ではEGFPcDNAとIP3R1cDNAとの間にリンカーとしてLeu-Lys（AflII制限酵素認識配列に含まれる）が挿入されている。GFP-IP3R1-Cは、EGFP分子がIP3R1のC末端側に付加されており、同様の方法で、GFP-IP3R1-C発現ベクターも作製することができる。IP3R1cDNAとEGFPcDNAとの間にリンカーとしてGly-Pro-Alaが挿入されている。
【００４２】
さらに、上記GFP-IP3R1-N発現ベクターからIP3R1の1〜610残基をコードする配列部位をAflII/SacII消化により切り出し、そこにGly-Ser-Ser-Glyをコードするオリゴヌクレオチドリンカーを挿入して、GFP-IP3R1-610発現ベクターを得た。さらに、上記GFP-IP3R1-N発現ベクターからIP3R1の1〜2216残基をコードする配列部位をAflII/EcoRI消化により切り出し、そこにGlu-Pheをコードするオリゴヌクレオチドリンカーを挿入して、GFP-IP3R1-ES発現ベクターを得た。さらに、IP3R1のArg1892〜Glu2216アミノ酸配列をコードするcDNA断片をPCRにより増幅させて、上記GFP-IP3R1-ES発現ベクターのEcoRI部位に挿入することにより、GFP-IP3R1-casp発現ベクターを得た。図１Ａ参照のこと。
【００４３】
50μg/mlポリリジンでコートしたガラスカバースリップ（直径18mm）またはガラス底マイクロウェルディッシュ（直径35mm、コーティングなし）上で細胞を増殖させ、リポフェクトアミン2000溶液（Invitorgen）を説明書の指示どおりの方法で、上記発現ベクターをHeLa細胞に一過性にトランスフェクトして、その細胞溶解液を抗IP3R1モノクローナル抗体18A10（IP3R1のC末端部を認識する）(14)を用いたウェスタンブロットにより各発現タンパク質の分子量を検定したところ、いずれも予想どおりの分子量を有することが確認された(図１Ｂ)。さらに、抗GFP抗体(Santa Cruz CA)によるウェスタンブロットの結果でも同様であった(図１Ｃ)。
【００４４】
なお、本明細書中に開示する実施例中の細胞培養では、COS細胞およびHeLa細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）、1.0g/lグルコース、2mM L-グルタミン、ペニシリンストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて行い、培養は37℃、5％CO2湿潤環境下で行った。
【００４５】
Ca2+イメージング
次に、これらのIP3R1変異体を強制発現させたHela細胞を用いて、シングルセルCa2+イメージングを実施した。
【００４６】
トランスフェクションの１〜２日後、HeLa細胞を5μM fura-2アセトキシメチルエステル(Molecular Probe)で45分間処理し、fura-2をロードした細胞を倒立蛍光顕微鏡(IX-70、オリンパス社製)にセットし、平衡塩類溶液(BSS；115mM NaCl、5.4mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM グルコースおよび20mM HEPES(pH7.4)を2.0ml/分の流速で灌流させた。画像処理は、Argus50/CA(浜松フォトニクス社製)を用いて、室温にて340nmと380nmとで交互に励起して、それぞれの励起に対する蛍光イメージを取得した。細胞は、100μM ATPおよびタプシガルジン(TG)それぞれで刺激して、その際の蛍光比率(F340/F380)の変化を観察した。結果を図２に示す。
【００４７】
GFP-IP3R1-NおよびGFP-IP3R1-D610は、ATP誘導性およびTG誘導性のCa2+流入にはほとんど影響を与えなかった(図２Ａ、Ｂ)。一方、GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESはATP-誘導性およびTG誘導性Ca2+流入の両方とも応答が減少した(図２Ｃ、Ｄ)。GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESの発現量の増加に従って、減少が顕著であった。
【００４８】
COS細胞を用いて同様の実験を行った場合も、同様の結果を示した(データは示していない)。
この機序を探るために、さらに実験を行った。
【００４９】
各種IP3R1変異体を発現させたCOS細胞のTG誘導性のCa2+ストアからのCa2+の漏出およびこれに伴うストア作動性Ca2+流入を調べた。GFP-IP3R1-NおよびGFP-IP3R1-D610を発現させた細胞は、TGの誘導によるCa2+ストアからのCa2+の漏出およびストア作動性Ca2+の流入ともにほとんど影響を示さなかったが、GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESを発現させた細胞では、TG処理による細胞内Ca2+濃度の上昇がほとんど認められなかった。しかし、細胞外Ca2+濃度を上げた際のストア作動性Ca2+の流入は明らかに認められた(図３Ｃ、Ｄ)。この現象は、GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESを発現させた細胞の小胞体内のCa2+濃度が低すぎ、すなわち小胞体のCa2+ストアが枯渇した状態にあり、TG刺激による細胞内Ca2+濃度の上昇が認められないことを示唆するものである。
【００５０】
このことをさらに証明するために、TGによる前処理を行わずに、細胞外Ca2+濃度を変化させてCa2+の流入を観察した(図４)。GFP-IP3R1-NまたはGFP-IP3R1-D610を発現させた細胞では、細胞内Ca2+濃度は細胞外Ca2+濃度に影響されることなくほぼ安定していたのに対し(図４Ａ、Ｂ)、GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESを発現させた細胞では、細胞外Ca2+の除去に伴い細胞内Ca2+濃度が低下し、細胞外Ca2+の増加とともに細胞内Ca2+濃度が上昇した(図４Ｃ、Ｄ)。
【００５１】
これらの結果より、GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESはいずれも、小胞体内のCa2+ストアからCa2+を漏洩させていると考えられる。GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESは、Ca2+ストア内のCa2+量が低下し、細胞外から細胞質内へのストア作動性カルシウム流入が起こり、その状態が維持されると考えられる。
【００５２】
GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESによる細胞死
次いで、GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESによる細胞死の誘導を調べた。GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESをトランスフェクションした後、96時間後におけるGFPの蛍光を発する細胞を計測し、GFPのみを発現させたコントロールHeLa細胞の生存率を100％として細胞生存率を算出した（図５）。
【００５３】
GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESのいずれを発現させた細胞でも、細胞死の誘導が顕著に認められた。この結果は、IP3R1のチャネルドメインのみの変異体がアポトーシスを誘導することを示唆するものである。
【００５４】
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、GFPタグを付したマウスIP3R1構築物の構造（Ａ）およびその発現産物のサイズ（ＢおよびＣ）を示す。A中、LBDはリガンド結合ドメインを示す。抗IP3R1モノクローナル抗体18A10によって認識されるエピトープ部位は、C末端部分である。BおよびCは、HeLa細胞で各GFP-IP3R1変異体を発現させ、その細胞溶解液を、それぞれ抗体18A10および抗GFP抗体によるウェスタンブロット（5％ゲルSDS-PAGE）に供した結果である。レーン１はコントロールベクター、レーン２はGFP-IP3R1-Nの発現プラスミド、レーン３はGFP-IP3R1-C、レーン４はGFP-IP3R1-D610、レーン５はGFP-GFP-R1-caspおよびレーン6はGFP-IP3R1-ESである。ネイティブなIP3R1の位置を星印で示している（Ｂ）。
【００５６】
【図２】図２は、各GFP-IP3R1変異体を発現させたHela細胞のATPおよびTGに対する細胞内Ca2+濃度の変化を調べた結果である。ＡおよびＢ中、細い実線は、各GFP-IP3R1変異体を発現させていないHela細胞（コントロール）であり、太い実線は、それぞれGFP-IP3R1-N、GFP-IP3R1-D610、をそれぞれに発現させたHela細胞である。また、ＣおよびＤ中、細い実線は、各GFP-IP3R1変異体を発現させていないHela細胞（コントロール）であり、太い実線は、それぞれGFP-IP3R1-casp、GFP-IP3R1-ESを低発現した細胞、破線はそれぞれを高発現した細胞である。発現レベルは、470〜490nmで励起しGFPによる510〜550nmの蛍光強度を指標に判断した。GFPの蛍光画像（左上のパネル）中、高発現細胞を棒付き矢印、低発現細胞を矢羽印で示している。星印はGFP-IP3R1変異体の局在が正常でないか、または凝集しているものを示す。Ｅは、Ａ〜Ｄの結果をグラフ化したものである。同じ実験を4回繰り返して実施したが同様の結果が得られた。
【００５７】
【図３】図３は、各GFP- P3R1変異体を発現させたHeLa細胞のTGに対する応答および続いて細胞外Ca2+濃度を上昇させた場合のCa2+の流入を調べた結果を示す。GFP-IP3R1-N、GFP-P3R1-D610、GFP-IP3R1-casp、GFP-IP3R1-ESをそれぞれ発現するHeLa細胞（Ａ〜Ｄ：Ca2+不含BSS中）を10分間0.3μMのTGで処理し、その後TGを含まない2mMCa2+含有BSSで処理した。細い実線はGFP-IP3R1変異体を発現させてない細胞（コントロール）、太い実線は各GFP-IP3R1変異体を発現させたものを示す。それぞれ12〜14個の細胞について観察された平均を示す。同じ実験を3回繰り返し実施したが、同様の結果が得られた。
【００５８】
【図４】図４は、各GFP-IP3R1変異体を発現させたHeLa細胞の細胞外Ca2+濃度の変化に対する細胞質内へのCa2+の流入について調べた結果を示す。細胞を2mMCa2+含有BSSからCa2+不含BSSに培地交換し、さらにその10分後に再度2mMCa2+含有BSSに培地交換した。その際のFura-2によるF340/380の蛍光変化を図に示している。細い実線はGFP-IP3R1変異体を発現させてない細胞（コントロール）、太い実線はGFP-IP3R1-N、GFP-IP3R1-D610、GFP-IP3R1-casp、GFP-IP3R1-ESをそれぞれ発現させたHeLa細胞（Ａ〜Ｄ）を示す。それぞれ10〜14個の細胞について観察された平均を示す。同じ実験を3回繰り返し実施したが、同様の結果が得られた。
【００５９】
【図５】図５は、GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESによる細胞死の誘導を確認した結果を示す。GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESを一過性発現させたHeLa細胞について、トランスフェクション後96時間におけるGFPの蛍光を発する細胞を計測し、GFPのみを発現させたコントロールHeLa細胞の生存率を100％として細胞生存率を算出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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