(57)【要約】【課題】  本発明は、ブドウ膜炎を安価かつ効果的に診断することを目的とする。【解決手段】  個体におけるブドウ膜炎を診断する方法であって、該個体由来の試料における、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを測定することを含む、上記診断方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるブドウ膜炎を診断する方法であって、該個体由来の試料における、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを測定することを含む、上記診断方法。
【請求項２】
ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも１種を測定することによって、ケモカイン受容体の遺伝子発現レベルを測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブドウ膜炎を診断するための、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか１種と特異的にハイブリダイズする１５〜１０００塩基長の核酸を含む試薬。
【請求項４】
ブドウ膜炎を診断するための、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む試薬：
（ａ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
ブドウ膜炎を診断するための、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む試薬：
（ａ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸＣＲ１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項６】
ブドウ膜炎を診断するための、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む試薬：
（ａ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸ３ＣＲ１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項７】
ブドウ膜炎を診断するための、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む試薬：
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項８】
ブドウ膜炎を診断するための、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか１種と特異的にハイブリダイズするプローブ核酸を少なくとも１種含む２０００種以下の核酸が固定化された担体。
【請求項９】
担体が、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体である、請求項８に記載の担体。
【請求項１０】
被検化合物の存在下および不在下における、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを比較することにより、ブドウ膜炎を予防または治療する化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ膜炎を診断する方法、そのための核酸および該核酸が固定化された担体、ブドウ膜炎を予防又は治療する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼病であるブドウ膜炎は、眼球にあるブドウ膜という組織が炎症を起こし、白血球やリンパ球のような炎症細胞や滲出物が硝子体中に出現して飛蚊症等の症状を発生させ、白内障や緑内障の原因ともなる疾患である。しかし、ブドウ膜炎の原因は多種多様であり、ウイルスや細菌など、様々な要因が考えられるために診断が難しく、適切な治療方法を提供することが困難な状況にある。
【０００３】
現在、ブドウ膜炎の診断は、生体顕微鏡による直接観察を始めとする様々な眼科的検査や全身検査を行い、長時間かけて経過を観察することによって行われている。眼科的検査としては、例えば、通常の視力検査・眼圧検査・細隙灯検査・眼底検査など、あるいは、網膜血管炎を合併している症例では蛍光眼底造影検査・ＯＣＴ（光干渉網膜厚測定装置）検査などが行われている。全身検査としては、例えば、胸部・腰部ｘ線撮影、心電図、ツベルクリン反応など、必要な場合は脳脊髄液検査なども行われている。このような検査により、末梢血白血球数、炎症反応（ＣＲＰ、ＥＳＲ）、自己抗体価、感染症の有無（特異抗体価）などが測定される。しかし、このような検査によって診断されるのは、患者の半分程度というのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ブドウ膜炎を安価かつ迅速に診断する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ブドウ膜炎患者由来の試料において特定のケモカイン受容体をコードする核酸が増大していること、当該核酸を検出することによりブドウ膜炎を診断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）個体におけるブドウ膜炎を診断する方法であって、該個体由来の試料における、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを測定することを含む、上記診断方法。
（２）ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも１種を測定することによって、ケモカイン受容体の遺伝子発現レベルを測定する（１）に記載の方法。
（３）ブドウ膜炎を診断するための、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか１種と特異的にハイブリダイズする１５〜１０００塩基長の核酸を含む試薬。
（４）ブドウ膜炎を診断するための、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む試薬：
（ａ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
（５）ブドウ膜炎を診断するための、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む試薬：
（ａ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸＣＲ１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
（６）ブドウ膜炎を診断するための、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む試薬：
（ａ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸ３ＣＲ１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
（７）ブドウ膜炎を診断するための、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む試薬：
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
（８）ブドウ膜炎を診断するための、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか１種と特異的にハイブリダイズするプローブ核酸を少なくとも１種含む２０００種以下の核酸が固定化された担体。
（９）担体が、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体である、（８）に記載の担体。
（１０）被検化合物の存在下および不在下における、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを比較することにより、ブドウ膜炎を予防または治療する化合物をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ブドウ膜炎を安価かつ迅速に診断することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明においてケモカインとは、白血球に対する走化活性をもつ低分子タンパク質を意味する。ケモカインは構造的に類似し、４つのシステインが保存されている。これらのシステインのうち、Ｎ末端側の２残基の位置関係により、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、Ｃケモカインの４つのサブファミリーに分類される。
【０００９】
ケモカイン受容体は、７回膜貫通型Ｇタンパク共役型受容体であり、特異的に結合するケモカインのサブファミリーにより、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、Ｃケモカイン受容体に分類される。
【００１０】
本発明者らは、ブドウ膜炎に罹患した個体に由来する試料において、上記のケモカイン受容体のうち、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４の４種のケモカイン受容体の遺伝子発現レベルが、ブドウ膜炎に罹患していない個体と比較して有意に増大していることを見出した。
【００１１】
ブドウ膜とは、眼球の脈絡層、色素層または中層で脈絡膜、毛様体、虹彩からなる組織を意味し、ブドウ膜炎とはこれらが炎症状態にある症状を意味する。
【００１２】
すなわち本発明は、個体におけるブドウ膜炎を診断する方法であって、（ａ）該個体由来の試料における、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを測定し、（ｂ）（ａ）で測定したケモカイン受容体の遺伝子発現レベルを、対応するケモカイン受容体の標準の遺伝子発現レベルと比較し、標準の遺伝子発現レベルと比較した該個体のケモカイン受容体遺伝子の発現レベルにおける減少または増加がブドウ膜炎の存在を示すものとする、上記診断方法に関する。
【００１３】
ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４の塩基配列およびアミノ酸配列については、SWISS-PROT Protein Sequence Database (http://www.expasy.ch/sprot /sprot-top.html）に登録されている。
【００１４】
診断の対象となる個体は、ケモカイン受容体を発現する動物であれば特に制限されず、哺乳動物、特にヒトである。
【００１５】
ケモカイン受容体遺伝子の発現レベルを測定するとは、直接的に（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを検出することによって）または相対的に（例えば、ケモカイン受容体タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを第２の試料と比較することによって）第１の試料において、ケモカイン受容体タンパク質のレベルまたはケモカイン受容体をコードするｍＲＮＡのレベルを定性的または定量的に測定することを意味する。好ましくは、第１の試料におけるケモカイン受容体タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定し、ブドウ膜炎に罹患していない個体由来の第２の試料から得られたものであるか、またはブドウ膜炎に罹患していない個体の集団からレベルを平均化することによって決定されている標準のケモカイン受容体タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較する。標準ケモカイン受容体タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルがいったん判ると、比較の標準として繰り返し使用することができる。
【００１６】
標準の遺伝子発現レベルと比較したブドウ膜炎に罹患した個体における上記ケモカイン受容体遺伝子の発現レベルの減少または増加は、各ケモカイン受容体によって異なる。すなわち、ＣＣＲ４については、個体におけるその発現レベルが標準の遺伝子発現レベルと比較して減少した場合、ＣＸＣＲ１については、個体におけるその発現レベルが標準の遺伝子発現レベルと比較して増加した場合、ＣＸ３ＣＲ１については、個体におけるその発現レベルが標準の遺伝子発現レベルと比較して減少した場合、ＣＸＣＲ４については、個体におけるその発現レベルが標準の遺伝子発現レベルと比較して減少した場合に、その個体はブドウ膜炎に罹患していると診断することができる。
【００１７】
ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを測定するとは、４種のケモカイン受容体ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４のうちの１種、好ましくは２種、より好ましくは３種、最も好ましくは４種の遺伝子発現レベルを測定することを意味する。
【００１８】
検出の対象となる個体の試料としては、ケモカイン受容体が発現されうる試料であれば特に限定されないが、例えば、血液等の体液、ならびに白血球、リンパ球、単球、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、ＮＫ細胞、好塩基球、Ｔｈ２細胞、Ｔｃ１細胞、Ｔｃ２細胞、成熟樹状細胞、ナイーブＴ細胞、好中球等の細胞などが挙げられ、血液を使用するのが好ましい。
【００１９】
ケモカイン受容体遺伝子の発現の増加または減少を、ｍＲＮＡレベルで測定する場合は、当業界で公知の核酸の定量法、例えば核酸増幅（例：ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロッティング、その他のハイブリダイゼーション法により測定することができる。ノーザン・ブロット分析は、Haradaら、Cell, 63:303-312(1990)に記載のように行うことができる。また、Ｓ１マッピングは、Fujitaら、Cell, 49:357-367(1987)に記載のように行うことができる。
【００２０】
本発明の診断方法の好ましい実施態様では、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４のうちのいずれか１種をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするプローブ核酸の少なくとも１種を担体上に固定化し、該固定化プローブ核酸と、該個体由来のｍＲＮＡを逆転写することにより得られる試料ｃＤＮＡとを接触させ、プローブ核酸とハイブリッド形成する試料ｃＤＮＡを検出することによって、試料中の対応するケモカイン受容体をコードするｍＲＮＡレベルを測定する。
【００２１】
試料ｃＤＮＡは、当技術分野で公知の方法によって調製できる。例えば、試料から単離された全ＲＮＡをＲＴプライマーおよび適当なバッファーを含む反応混合物中に添加する。プライマーアニーリングのためのインキュベート後、ＲＴバッファー、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビターおよび逆転写酵素をさらに添加する。ＲＮＡの逆転写が完了するようにインキュベーション後、ＲＴ産物を標識化プライマーを用いるＰＣＲ反応に付す。別法では、プライマーを標識せずに、標識化ｄＮＴＰをＰＣＲ反応混合物中でインキュベートしてもよい。ＰＣＲ増幅は、従来の技術に従って、ＤＮＡサーマルサイクラー中で行うことができる。
【００２２】
標識としては、核酸に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなど）、放射能標識（α−３２Ｐ、γ−３２Ｐ、３５Ｓなど）などが挙げられる。
【００２３】
この試料ｃＤＮＡは、濃度が通常０．００２〜５０μＭ、好ましくは０．２〜０．５μＭとなるようにスポッティング用バッファーに溶解することによって、スポッティング溶液として調製する。このスポッティング溶液を、上記で調製したプローブＤＮＡが固定化された担体上に滴下し、インキュベーションを行うことによりハイブリッド形成させる。ハイブリッド形成は、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning ２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行うことができる。
【００２４】
本発明の一実施態様において、インキュベーションは、通常２５〜９５℃、好ましくは４０〜６５℃で、通常０．０１〜１００時間、好ましくは１〜１６時間で行う。ハイブリダイゼーション工程においても、高湿度雰囲気下でインキュベーションを行うのが好ましい。最後に、担体を洗浄し、乾燥後、ハイブリッド形成した核酸に由来する標識を読みとることによりハイブリッド形成を検出することができる。
【００２５】
本発明はまた、ブドウ膜炎を診断するための、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか１種と特異的にハイブリダイズする核酸を含む試薬に関する。このような核酸は、ブドウ膜炎を診断するためのプローブ核酸、例えば、上記のｍＲＮＡレベルによって遺伝子発現レベルを測定するためのプローブ核酸として有用である。以下、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか１種と特異的にハイブリダイズする核酸をプローブ核酸と称する。
【００２６】
特異的にハイブリダイズするとは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ケモカイン受容体をコードする核酸とハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１９〜４０ｍＭ、好ましくは１９〜２０ｍＭで、温度が５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が１９ｍＭで温度が６５℃の場合が最も好ましい。
【００２７】
本発明のプローブ核酸としては、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４のいずれか１種をコードする核酸と相補的な塩基配列の少なくとも一部を含む、少なくとも１５塩基長、好ましくは１５〜１００塩基長の核酸が挙げられる。少なくとも一部とは、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４のいずれか１種をコードする核酸と相補的な塩基配列からなる核酸における、少なくとも１５塩基長、より好ましくは少なくとも２０塩基長、最も好ましくは３０〜７０塩基長の連続した塩基配列からなる核酸部分を意味する。ここで、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４のいずれか１種をコードする核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡの双方が含まれ、好ましくはｃＤＮＡである。プローブ核酸も同様にＤＮＡおよびＲＮＡの双方を含むが、好ましくはＤＮＡである。
【００２８】
本発明のプローブ核酸には、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４のいずれか１種をコードする核酸と相補的な塩基配列の少なくとも一部を含む上記プローブ核酸と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４をコードする核酸のうちの対応する核酸と特異的にハイブリダイズする核酸も包含される。
【００２９】
ブドウ膜炎を診断するための、ＣＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸は、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである：
（ａ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
【００３０】
ブドウ膜炎を診断するための、ＣＸＣＲ１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸は、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである：
（ａ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸＣＲ１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
【００３１】
ブドウ膜炎を診断するための、ＣＸ３ＣＲ１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸は、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである：
（ａ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸ３ＣＲ１をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
【００３２】
ブドウ膜炎を診断するための、ＣＸＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸は、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである：
（ａ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡの少なくとも１部を含み、ＣＸＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ。
【００３３】
上記（ｂ）のＤＮＡにおいて、少なくとも一部とは、それぞれ配列番号６、１２、１５及び１７のいずれかで表される塩基配列において、少なくとも１５塩基長、より好ましくは少なくとも２０塩基長、なおより好ましくは少なくとも３０塩基長、最も好ましくは３０〜６０塩基長の連続した塩基配列からなる核酸部分を意味する。
【００３４】
また、（ｂ）のＤＮＡは、通常５〜１０００塩基長、好ましくは１０〜１００塩基長、最も好ましくは３０〜７０塩基長のＤＮＡである。
【００３５】
本発明はまた、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか１種と特異的にハイブリダイズする上記プローブ核酸を少なくとも１種含む２０００種以下の核酸が固定化された担体に関する。当該核酸固定化担体は、本発明のブドウ膜炎の診断方法において、個体由来の試料におけるケモカイン受容体の遺伝子発現レベルを測定するために有用である。
【００３６】
ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか１種と特異的にハイブリダイズする上記プローブ核酸を少なくとも１種含むとは、４種のケモカイン受容体ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４のいずれか１種をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする４種のプローブ核酸のうちの１種、好ましくは２種、より好ましくは３種、最も好ましくは４種を含むことを意味する。本発明の担体においては、これらの４種のプローブ核酸以外の核酸がさらに固定化されていてもよいが、コスト上の理由から担体上に固定化される核酸は合計で２００種以下、好ましくは１００種以下とする。本発明の担体に固定化されるプローブ核酸は、好ましくはＤＮＡである。
【００３７】
プローブ核酸の担体への固定化は、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。固定化するプローブ核酸がｃＤＮＡやＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合には、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッター装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した担体表面にスポッティングして、ＤＮＡの荷電を利用して担体上に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。
【００３８】
固定化するプローブ核酸が合成オリゴヌクレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した担体表面に該オリゴヌクレオチドをスポッティグし、共有結合させることができる。例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法などがある。
【００３９】
プローブ核酸を固定化する担体としては、当技術分野で通常用いられるものを使用できる。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれら半導体材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。
【００４０】
本発明においては、プローブ核酸を固定化する担体として、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体である担体を用いるのが好ましい。
【００４１】
上記固体支持体に用いられる基板の材料としては、例えば、シリコーン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ 樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂をバインダーとして混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられる。
【００４２】
本発明の固体支持体は、基板上に表面層を有する。この表面層により、核酸と共有結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定化することができる。
【００４３】
表面層は、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種から形成される。ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物としては、例えば、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたもの、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を挙げることができる。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。本発明においては、軟ダイヤモンドを用いるのが好ましい。
【００４４】
基板が、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種の材料で形成されている場合は、基板上に新たに表面層を形成させる必要はないが、基板がそれ以外の材料で形成されている場合は、表面処理を施すことによりダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種の材料で形成される表面層を形成させる。
【００４５】
表面処理を施した基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
表面処理によって形成される表面層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００４６】
基板への表面処理は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００４７】
また、前記の基板材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体（例えば２相体））を形成することにより、表面層としてもよい。
【００４８】
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００４９】
また、基板の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００５０】
基板としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（ＪＩＳ Ｂ ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のプローブ核酸を高密度で固定化できる点で好都合である。
【００５１】
本発明の固体支持体には、核酸を静電的に引き寄せるために静電層が設けられていてもよい。
【００５２】
静電層としては、核酸を静電的に引き寄せ、核酸の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００５３】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００５４】
静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。また、静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と表面層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００５５】
静電層を表面層と共有結合させて形成する場合には、例えば、表面層を有する基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
【００５６】
また、静電層が施された基板に核酸と共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。
【００５７】
静電層が施された基板に、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。
【００５８】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸の固定化量がより向上する。
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００５９】
本発明の固体支持体は、核酸と共有結合しうる官能基を有する。該官能基は、基板表面に化学修飾を施すことにより形成することができる。
【００６０】
前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。
【００６１】
官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ２は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ３−ＣＯ−Ｒ４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００６２】
前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる。
【００６３】
官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。
【００６４】
官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸又はフェノール酸が挙げられる。
【００６５】
官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。
【００６６】
前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。
【００６７】
担体として上記のような固体支持体を用いることにより、プローブ核酸を強固に固定化することができるため、検出感度と信頼性の高い診断が可能になる。
【００６８】
また、本発明の診断方法では、ケモカイン受容体遺伝子の発現レベルを測定する方法として、個体から得られた試料中のケモカイン受容体タンパク質のレベルを直接測定する方法を使用することができる。試料におけるケモカイン受容体タンパク質レベルのアッセイは、いずれかの当該分野で周知の方法を用いて行うことができる。試料におけるケモカイン受容体タンパク質レベルのアッセイについて好ましいものは、抗体に基づく技術である。例えば、ケモカイン受容体タンパク質レベルを検出するのに有用な抗体に基づいた方法としては、固相酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの免疫アッセイが挙げられる。例えば、ケモカイン受容体タンパク質−特異的モノクローナル抗体は、免疫吸着剤としておよび酵素標識プローブの両方として使用でき、ケモカイン受容体タンパク質を検出および定量できる。ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４タンパク質のそれぞれ対する抗体は、市販のものを使用してもよいし、当技術分野で公知の方法によって動物を免疫することによって得ることができる。また、ブドウ膜炎発症の要因であるベーチェット病では、タンパク質検出レベルにおいて、ＣＸＣＲ２に変化が見られ、ベーチェット病患者のＣＸＣＲ２発現レベルは、健常者に於ける発現レベルに比較して強い。
【００６９】
従来のブドウ膜炎の診断においては、数週間から数ヶ月という長期間を要したが、本発明の診断方法では、数時間〜数日で診断を行うことができ、迅速な診断が可能となる。
【００７０】
ブドウ膜炎患者においては、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４の発現レベルが変化していることが明らかとなったことから、ブドウ膜炎患者におけるこれらケモカイン受容体の発現レベルの変化を抑制する化合物は、ブドウ膜炎を予防又は治療する活性を有すると考えられる。従って、本発明はまた、被検化合物の存在下および不在下における、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを比較することにより、ブドウ膜炎の予防または治療する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【００７１】
ケモカイン受容体の発現レベルは、診断方法について既に記載したように、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを検出することによって測定できる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下のように実施できる。
【００７２】
正常またはブドウ膜炎モデル非ヒト哺乳動物に対して被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、動物由来の試料、好ましくは血液中に含まれるＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体のいずれか１種をコードするｍＲＮＡの少なくとも１種を測定する。
【００７３】
そして、被検化合物を投与した動物において、投与しない動物と比較して、ＣＣＲ４発現レベルの増加、ＣＸＣＲ１発現レベルの減少、ＣＸ３ＣＲ１発現レベルの増加、ＣＸＣＲ４発現レベルの増加の１つ以上、好ましくはすべてが観察された場合に、その被検化合物はブドウ膜炎を予防または治療する活性を有する化合物であると判別することができる。
【実施例】
【００７４】
（実施例１  健常者におけるケモカイン受容体の発現）
３ｍｍ角のシリコン基板にダイヤモンドライクカーボン層をコーティングし、カルボキシル基で修飾後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性エステル化し、固体支持体を作製した。この固体支持体上に、マイクロアレイ用スポッターＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフト）を使用して、ケモカイン受容体をコードするＤＮＡの６０ｍｅｒの断片２５種類をプローブＤＮＡとしてスポットした。２０％ ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液にＤＮＡ断片を１０μＭの濃度で溶解し、スポッティング溶液とした。
【００７５】
スポッティング位置を図１にそれぞれ番号で示す。各番号にスポッティングされたＤＮＡ断片を以下の表１に示す。また、スポット番号１〜２５の配列は、それぞれ配列番号１〜２５として、配列表に示す。
【００７６】
【表１】
2005328798.tif 000002
【００７７】
この基板を８０℃のオーブンに１時間入れた後に、室温の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で１５分間洗浄を行った。その後、９５℃に加熱した２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で５分間洗浄した後に、超純水で数回洗浄して、圧縮空気を吹きかけることによって基板を乾燥させた。
【００７８】
次に、健常者の血液を１０ｍｌ採取し、白血球・リンパ球を遠心分離し、ｍＲＮＡを抽出した。そして、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡに逆転写して精製を行った。その後、Ｃｙ３で蛍光標識した。
【００７９】
標識したｃＤＮＡ試料をプローブＤＮＡ固定化固体支持体に滴下し、４２℃で１８時間のハイブリダイゼーションを行った。その後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣで順次洗浄した後、蛍光スキャナーで画像撮影した。結果を図２右側に示す。
【００８０】
（実施例２  健常者とブドウ膜炎患者の比較）
ブドウ膜炎に罹患した患者の血液を１０ｍｌ採取し、白血球・リンパ球を遠心分離し、ｍＲＮＡを抽出した。そして、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡに逆転写して精製を行った後、Ｃｙ３で蛍光標識し、実施例１で使用したものと同じプローブＤＮＡ固定化固体支持体に滴下した。蛍光スキャナーで画像撮影した結果を図２左側に示す。
【００８１】
図２の左右の画像を比較すると、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４の４種のケモカイン受容体において、遺伝子発現レベルの変化が見られることがわかる。ＣＣＲ４については、ブドウ膜炎患者における発現レベルが健常者における発現レベルと比較して減少し、ＣＸＣＲ１については、ブドウ膜炎患者における発現レベルが健常者における発現レベルと比較して増加し、ＣＸ３ＣＲ１については、ブドウ膜炎患者における発現レベルが健常者における発現レベルと比較して減少し、ＣＸＣＲ４については、ブドウ膜炎患者における発現レベルが健常者における発現レベルと比較して減少していることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例１および２において、固体支持体上における各ケモカイン受容体のスポッティング位置を示す。
【図２】健常者およびブドウ膜炎患者の血液に由来するｃＤＮＡを標識し、それぞれ固体支持体上に固定されたプローブ核酸とハイブリダイズさせ、蛍光スキャナーで画像撮影した結果である。
【図１】
2005328798.tif 000003
【図２】
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【配列表】
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