(57)【要約】【課題】  ＤＰＰＨフリーラジカル消去剤、ＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去剤、スーパーオキシドアニオン消去剤、脂質酸化防止剤、酵素活性阻害剤、食品添加剤、鮮度保持剤、医薬品あるいは化粧料として有用なポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを提供すること。【解決手段】  特定のポリアミンと特定のポリフェノールを酸化酵素触媒を用いて反応させることにより、ポリフェノールを共有結合を介してポリアミンに導入し、ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを製造する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
2005105249.tif 000013
で表わされるポリフェノールであるエピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレード、クエルセチン、ヘスペリジン、タンニン酸、テアフラビン、プロシアニジン、プロアントシアニジン及びロイコアントシアニジンの少なくとも１種が、分岐ポリエチレンイミン、線状ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、タンパク質、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、キチン部分加水分解物、ポリアミドアミンデンドリマー及びポリプロピレンイミンデンドリマーからなるポリアミンの少なくとも１種と反応して得られ、且つ、下記式（２）、（３）及び（４）
2005105249.tif 000014
で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッド。
【請求項２】
下記一般式（１）
2005105249.tif 000015
で表わされるポリフェノールであるカテキン及びルチンの少なくとも１種が、線状ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、タンパク質、コラーゲン、キチン部分加水分解物及びポリプロピレンイミンデンドリマーからなるポリアミンの少なくとも１種と反応して得られ、且つ、下記式（２）、（３）及び（４）
2005105249.tif 000016
で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッド。
【請求項３】
ポリアミンがポリリジンである請求項１若しくは２に記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッド。
【請求項４】
一般式（１）
2005105249.tif 000017
で示されるポリフェノールが、ポリアミンと反応して得られ、且つ、下記式（２）、（３）及び（４）
2005105249.tif 000018
で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジルフリーラジカル消去剤（以下、ＤＰＰＨフリーラジカル消去剤と略記する）。
【請求項５】
一般式（１）
2005105249.tif 000019
で示されるポリフェノールが、ポリアミンと反応して得られ、且つ、下記式（２）、（３）及び（４）
2005105249.tif 000020
で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する２,２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）カチオンラジカル消去剤（以下、ＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去剤と略記する）。
【請求項６】
一般式（１）
2005105249.tif 000021
で示されるポリフェノールが、ポリアミンと反応して得られ、且つ、下記式（２）、（３）及び（４）
2005105249.tif 000022
で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有するスーパーオキシドアニオン消去剤。
【請求項７】
一般式（１）
2005105249.tif 000023
で示されるポリフェノールが、ポリアミンと反応して得られ、且つ、下記式（２）、（３）及び（４）
2005105249.tif 000024
で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する脂質酸化防止剤。
【請求項８】
一般式（１）
2005105249.tif 000025
で示されるポリフェノールが、ポリアミンと反応して得られ、且つ、下記式（２）、（３）及び（４）
2005105249.tif 000026
で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する酵素活性阻害剤。
【請求項９】
酵素がキサンチンオキシダーゼ、コラゲナーゼ、リポキシダーゼ、グルコロニダーゼ、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ若しくはリパーゼである請求項８に記載の酵素活性阻害剤。
【請求項１０】
ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである請求項４に記載のＤＰＰＨフリーラジカル消去剤。
【請求項１１】
ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである請求項５に記載のＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去剤。
【請求項１２】
ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである請求項６に記載のスーパーオキシドアニオン消去剤。
【請求項１３】
ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである請求項７に記載の脂質酸化防止剤。
【請求項１４】
ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである請求項８に記載の酵素活性阻害剤。
【請求項１５】
請求項１〜３の何れかに記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する食品。
【請求項１６】
請求項１〜３の何れかに記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する鮮度保持剤。
【請求項１７】
請求項１〜３の何れかに記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する医薬品。
【請求項１８】
請求項１〜３の何れかに記載のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアミン−ポリフェノールハイブリッド並びにそれを用いた１,１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジルフリーラジカル消去剤（以下、ＤＰＰＨフリーラジカル消去剤と略記する）、２,２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）カチオンラジカル消去剤（以下、ＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去剤と略記する）、スーパーオキシドアニオン消去剤、脂質酸化防止剤、酵素活性阻害剤、鮮度保持剤、食品添加剤、医薬品及び化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、植物に含まれるカテキン、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、ルチン等のポリフェノール類には抗酸化性や殺菌作用があることが知られている。さらに抗ガン作用、抗炎症作用、紫外線吸収作用、毛細血管の強化、血圧上昇抑制、血圧降下作用、記憶力向上、肝機能向上、脂肪吸収抑制、ストレス抑制、女性ホルモンバランス調整、抗腫瘍作用、突然変異抑制、血中コレステロール抑制、整腸作用等の効果も知られており、生医学分野への応用が期待されている。さらに、これらポリフェノールの内、低分子量のポリフェノールを高分子と結合させることで、細胞内での滞在時間を延長させ、これらの生化学活性を長時間継続させることにより、結果としてそれらの該活性が増大することが期待されている。
ポリフェノールを高分子に結合させた例としては、ポリアクリルアミドあるいはポリメタクリルアクリルアミドにカテキン等のポリフェノールを結合させたポリマー及びその製造方法が知られている(特許文献１参照)。
【特許文献１】特開平８−２７２２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、生化学活性の向上を目的としてポリフェノールを高分子に共有結合させたハイブリッド材料は殆ど知られていない。上述のポリアクリルアミドにカテキン等のポリフェノールを結合させたポリマーは、高分子化による非水溶性化が主題であり、かつ、ポリアクリルアミドあるいはポリメタクリルアクリルアミドに限定される手法である。しかもポリマー（またはモノマー）とポリフェノールを結合させるためにポリマーまたはモノマーに特殊な誘導化が必要であるため一般性が欠如しているという問題がある。
【０００４】
天然に存在するポリフェノール類には水溶性で分子量１万以上のものも知られているがその構造は明らかではない。一方、生化学活性が詳細に調べられているカテキン、エピガロカテキンガレート、ルチンといった低分子量ポリフェノールを既存の幅広い高分子に導入して高分子化する技術開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、新規なポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを見出すと共にその新たな用途を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、下記一般式（１）
2005105249.tif 000002
で表わされるポリフェノールであるエピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレード、クエルセチン、ヘスペリジン、タンニン酸、テアフラビン、プロシアニジン、プロアントシアニジン及びロイコアントシアニジンの少なくとも１種が、分岐ポリエチレンイミン、線状ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、タンパク質、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、キチン部分加水分解物、ポリアミドアミンデンドリマー及びポリプロピレンイミンデンドリマーからなるポリアミンの少なくとも１種と反応して得られ、且つ、下記式（２）、（３）及び（４）
2005105249.tif 000003
で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッドである。
【０００６】
本発明の別のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、前記一般式（１）で表わされるポリフェノールであるカテキン及びルチンの少なくとも１種が、線状ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、タンパク質、コラーゲン、キチン部分加水分解物及びポリプロピレンイミンデンドリマーからなるポリアミンの少なくとも１種と反応して得られ、且つ、前記式（２）、（３）及び（４）で示される構造の内の少なくとも１種の構造を含むポリアミン−ポリフェノールハイブリッドである。
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの好ましい実施態様は、ポリアミンがポリリジンである場合である。
【０００７】
本発明おける別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有するＤＰＰＨフリーラジカル消去剤である。
本発明のＤＰＰＨフリーラジカル消去剤の好ましい実施態様は、ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する場合である。
【０００８】
更に、本発明における別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有するＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去剤である。
本発明のＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去剤の好ましい実施態様は、ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する場合である。
【０００９】
更に、本発明における別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有するスーパーオキシドアニオン消去剤である。
本発明のスーパーオキシドアニオン消去剤の好ましい実施態様は、ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する場合である。
【００１０】
更に、本発明における別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する脂質酸化防止剤である。
本発明の脂質酸化防止剤の好ましい実施態様は、ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する場合である。
【００１１】
更に、本発明における別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する酵素活性阻害剤である。
本発明の酵素活性阻害剤の好ましい実施態様は、酵素がキサンチンオキシダーゼ、コラゲナーゼ、リポキシダーゼ、グルコロニダーゼ、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ若しくはリパーゼである場合である。
本発明の酵素活性阻害剤の別の好ましい実施態様は、ポリアミンがε−ポリリジンであるか、ポリフェノールがカテキンであるか、またはポリアミンがε−ポリリジンであると共にポリフェノールがカテキンであるかの何れかである前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する場合である。
【００１２】
更に、本発明における別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する食品である。
更に、本発明における別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する鮮度保持剤である。
更に、本発明における別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する医薬品である。
更に、本発明における別の発明は、前記ポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを含有する化粧料である。
【発明の効果】
【００１３】
ポリアミンとポリフェノールの反応を酸化酵素触媒存在下に行うことにより得られた本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、ポリフェノールの有する生化学活性を殆ど損なうことなく高分子化することができる。それにより、生体内での滞在時間を長くすることができるため生化学活性が長時間継続することになり、実質的に該活性を向上させることができる。さらに、ポリアミンとポリフェノールの相互作用による酵素活性阻害能の向上という予期できない効果が見出された。従って、本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、ＤＰＰＨフリーラジカル消去剤、ＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去剤、スーパーオキシドアニオン消去剤、脂質酸化防止剤、酵素活性阻害剤、食品添加剤、鮮度保持剤、医薬品あるいは化粧料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、チロシナーゼ等の酵素触媒の存在下、ポリアミンとポリフェノールとを反応させることにより得られる。
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、ポリフェノールが前記一般式（２）〜（４）の少なくとも何れか１つの構造でポリアミンと結合していることを特徴とするものである。
【００１５】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを合成する原料であるポリアミンは一級および／または二級アミノ基を有する高分子であることが好ましい。式（２）〜（４）で示される構造は、例えばAdvances in Insect Physiology,Vol.21, 179 (1988)に記載されているようにカテコールやドーパから得られるキノン誘導体とアミンの反応で観測されるものである。
ポリアミンの好ましい分子量範囲は５００〜１０,０００,０００である。
【００１６】
本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドを合成するための別の原料であるポリフェノールはフェノール性水酸基を四つ以上有するフェノール類であることが好ましく、その構造はフラボノイド骨格を有することが好ましい。
【００１７】
本発明において前述した様に式（２）〜（４）で示される構造の少なくとも何れか１つの構造でポリアミンと結合している。すなわち、ポリフェノールとポリアミンとは、式（２）で示される構造のみ、式（３）で示される構造のみあるいは式（４）で示される構造のみで結合していてもよく、式（２）〜（４）で示される構造のいずれか１つを含んでいればよい。また、式（２）〜（４）で示される構造の種々の組み合わせによる結合構造により、ポリアミンとポリフェノールとがハイブリッドを形成してもよい。即ち、式（２）、（３）及び（４）で示される構造のすべて含んでいてもよく、式（２）と（３）との組み合わせ、式（２）と（４）との組み合わせ、式（３）と（４）との組み合わせで形成されていてもよい。
【００１８】
本発明のハイブリッドを構成するポリアミンは、ポリフェノールと酵素の反応によって生じるキノン中間体に対する高い反応性という観点から、一級および／または二級アミノ基を含むポリマーが好ましい。また、これらアミノ基はポリマー主鎖、側鎖、末端いずれに導入されていても良い。ポリアミンの具体例として、分岐ポリエチレンイミン、線状ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、タンパク質、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、キチン部分加水分解物、ポリアミドアミンデンドリマー及びポリプロピレンイミンデンドリマーを挙げることができる。
【００１９】
また、ポリフェノールは、ハイブリッドの生医学分野での応用に必要な水溶性付与という観点から、フェノール性水酸基を四つ以上含む化合物が好ましい。また、生成ハイブリッドへの高い抗酸化性付与という観点から、ポリフェノールは、フラボノイド骨格を有すること好ましい。ポリフェノールの具体例としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、タンニン酸、テアフラビン、プロシアニジン、プロアントシアニジン、ロイコアントシアニジン及びルチンが挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用され、ポリアミン１ｇに対して、１mg〜３０ｇの範囲で用いることが望ましい。
【００２０】
次に、本発明のポリアミン−ポリフェノールハイブリッドの製造方法について、説明する。本発明のハイブリッドの製造方法は、酵素触媒の存在下、ポリアミンとポリフェノールとを反応させる。反応は以下の通りである。
2005105249.tif 000004
【００２１】
酵素触媒とは酵素を利用した触媒を意味する。酵素とは生体における化学反応の触媒をいい、本発明のハイブリッド合成においては、これらの酵素を触媒に利用する。酵素触媒としては、例えば、酸化酵素、加水分解酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素等を例示することができる。ポリフェノール類の酸化触媒機能という観点から、触媒としては好ましくは酸化酵素である。
【００２２】
本発明で使用される酸化酵素は、フェノール類の酸化を起こすのに十分な酸化能を有するものであればよく、特に制限はない。具体例としては、チロシナーゼ（ＥＣ  １.１４.１８.１）、フェノラーゼ、ラッカーゼ（ＥＣ  １.１０.３.２）、ビリルビンオキシダーゼが挙げられる。これらの酸化酵素は種々の起源のものが使用でき、特に制限はないが、例えば植物由来、細菌由来、坦子菌類由来の酸化酵素を挙げることができる。
上記酸化酵素の中でも、ラッカーゼ、特にカビ由来のラッカーゼが酸化能も非常に高く、量産されているため安価であり、好ましく使用することができる。
また、マッシュルーム由来のチロシナーゼもカテキン類に対する酸化能が高く、比較的安価で市販されており、好ましく使用することができる。
酵素量はポリアミン１ｇに対して１〜１,０００,０００ユニット、好ましくは３〜５００,０００ユニット、さらに好ましくは５〜２００,０００ユニットである。
【００２３】
反応に用いる溶媒としては、ポリアミンとポリフェノールと酵素触媒が共に溶解するものが好ましく、水または有機溶媒と水の混合溶媒が挙げられる。水は蒸留水や脱イオン水でもよいが、水の代わりに緩衝液を用いてもよい。緩衝液を用いる場合はpＨ２〜１２の範囲が望ましい。緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等が望ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
混合溶媒を用いる場合の有機溶媒は水と相溶する溶媒がより好ましい。水と相溶する有機溶媒として、メタノール、エタノール、２,２,２−トリフルオロエタノール、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ピリジン、１,４−ジオキサン、アセトン及びメチルエチルケトン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用される。また、有機溶媒−水の混合比（重量比）はポリアミンとポリフェノールと酵素触媒が共に溶解する任意の量を用いることができる。好ましくは０.０１：９９.９９〜９０：１０、特に好ましくは１：９９〜８０：２０の範囲が望ましい。
【００２５】
反応温度は酵素触媒が不活性化しない温度が望ましい。好ましくは−２０〜１００℃の範囲であり、より好ましくは０〜６０℃の範囲である。反応温度が高い場合は、一般に酵素は失活するが、混合溶媒系によっては酵素を安定化するので、その場合は高い反応温度も採用可能となる。
【００２６】
本発明によって得られるポリアミン−ポリフェノールハイブリッドのポリフェノール含有量は、原料ポリアミンのアミノ基に対して０.０１〜１００mol％の範囲であるが、好ましくは０.０５〜１００mol％、より好ましくは０.１〜１００mol％である。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
１．ポリリジン−カテキンハイブリッドの合成
ポリリジン塩酸塩（チッソ社製）０.８２g（ポリリジン塩酸塩のモノマーユニットとして５mmol）を水１０mLに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて所定のｐＨ(ｐＨ７または８)にあわせる。メタノール３mLにカテキン０.１４５g（０.５mmol）を溶解させ、ポリリジン塩酸塩水溶液に加える。カビ由来のラッカーゼ５ユニットを加え、室温、大気下、２４時間攪拌する。反応後、６Ｎ塩酸を数滴加え、排除分子量５００の透析チューブを用いて、透析を行う。透析チューブ内の溶液を凍結乾燥し、ハイブリッドを得る。カテキンの導入量は元素分析により求めた結果、ｐＨ７及び８の場合それぞれ３.１３×１０-2及び５.２６×１０-2（mol／ポリリジンのモノマーユニットmol）であった。
ｐＨ７の条件下でのポリリジン−カテキンハイブリッドのカテキンの導入量は元素分析により求めた結果、３.４×１０-2（mol／ポリリジンのモノマーユニットmol）であった。
【実施例２】
【００２８】
２．ポリリジン−エピガロカテキンガレートハイブリッドの合成
ポリリジン塩酸塩０.８２g（ポリリジン塩酸塩のモノマーユニットとして５mmol）を水１０mLに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７にあわせる。メタノール３mLにエピガロカテキンガレート（以下、ＥＧＣＧと略記する）０.２２９g（０.５mmol）を溶解させ、ポリリジン塩酸塩水溶液に加える。カビ由来のラッカーゼ５ユニットを加え、室温、大気下、２４時間攪拌する。反応後、６Ｎ塩酸を数滴加え、排除分子量５００の透析チューブを用いて、透析を行う。透析チューブ内の溶液を凍結乾燥し、ハイブリッドを得る。カテキンの導入量は元素分析により求めた結果、３.８×１０-2（mol／ポリリジンのモノマーユニットmol）であった。
このようにして合成したｐＨ７、ｐＨ８のポリリジン−カテキンハイブリッド、ポリリジン−エピガロカテキンガレートハイブリッド、または再度合成したｐＨ７のポリリジン−カテキンハイブリッド（以下、それぞれハイブリッド（ｐＨ７）、ハイブリッド（ｐＨ８）、ハイブリッド（ＥＧＣＧ）、およびハイブリッド（ｐＨ７）−２と略記する）を用いて以下の実験を行った。
【００２９】
ＤＰＰＨフリーラジカル消去能の測定
１．試薬の調製
濃度１００μMのＤＰＰＨエタノール溶液を調製する。
２．サンプル溶液の調製
カテキン、ハイブリッド（ｐＨ７）およびハイブリッド（ｐＨ８）について、６mMのジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと略記する）溶液を調製する。各溶液を蒸留水にて適宜希釈し、測定時に表１に示した濃度となるようにサンプル溶液を調製する。
３．測定
９６wellマイクロプレートを用いる。
サンプル溶液５μLとＤＰＰＨエタノール溶液１９５μLを混合し、１０分後の５１７nmにおける吸光度を測定する。この吸光度を用いて下記式により各濃度における消去率を計算し、各濃度における消去率を表１及び図１に示した。
(数１)
消去率(％)＝１００×（吸光度（コントロール）−吸光度（サンプル））
／吸光度（コントロール）                        （１）
【００３０】
【表１】
2005105249.tif 000005
【００３１】
ＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去能の測定
１．試薬の調製
Buffer：１００mMのＫＨ2ＰＯ4水溶液を調製する。この水溶液２００mLに対してエチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略記する） ２．９mg(０.０１mmol)を加える。
ＡＢＴＳカチオン−ラジカル溶液：ＡＢＴＳ二アンモニウム２７.４mg(０.０５mmol)を蒸留水１０mLに溶解させる。ここにＭｎＯ2約１.５ｇを加えて、３０分間攪拌する。その後ろ紙で濾過してＭｎＯ2を取り除く。生成した溶液は褐色瓶に入れ冷蔵庫で保存する。
【００３２】
２．サンプル溶液の調製
カテキン、ハイブリッド（ｐＨ７）およびハイブリッド（ｐＨ８）について、６mMのＤＭＳＯ溶液を調製する。各溶液を蒸留水にて適宜希釈し、測定時に表２に示した濃度となるようにサンプル溶液を調製する。
３．測定
９６wellマイクロプレートに濃度の異なるサンプル溶液を１０μLとBuffer１５０μLを加える。
ここに、蒸留水を用いて２倍に希釈したＡＢＴＳカチオン−ラジカル溶液を４０μL加え、３０℃で５分間インキュベーションした後の７３４nmにおける吸光度を測定する。この吸光度を用いて前記式（１）により消去率を計算した。各濃度における消去率を表２及び図２に示した。
【００３３】
【表２】
2005105249.tif 000006
【００３４】
スーパーオキシドアニオン消去能の測定
１．試薬の調製
Buffer：１００mMのＫＨ2ＰＯ4水溶液を調製する。この水溶液２００mLに対してＥＤＴＡ ２．９mg(０.０１mmol)を加える。
ＸＯ溶液：Xanthine oxidase (from Butter milk, 0.25U/mg、和光純薬工業)３０mgを先に調製したBuffer５０mLに溶かす。これを常温保存して使用に供した。
Xathine溶液：Xanthine７.５mg（０.０５mmol）を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液６００μLに溶解させる。蒸留水７.５mLを加えた後、さらにBuffer１６.９mLを加えて全量を２５mLとする。これを冷蔵庫中で保存して使用した。
ＭＰＥＣ溶液：ＭＰＥＣ(2-methyl-p-methoxyphenylethynylimidazopyrazinon)２.８mgをメタノール１０mLに溶解させる。これを水で３倍に希釈して使用した。
【００３５】
２．サンプル溶液の調製
カテキン、ハイブリッド（ｐＨ７）およびハイブリッド（ｐＨ８）について、６mMのＤＭＳＯ溶液を調製する。各溶液をBufferにて適宜希釈し、測定時に表３に示した濃度となるようにサンプル溶液を調製する。
３．測定
まず、発光測定装置（フォトンカウンタMTP-700CL（コロナ電気(株)社製））にXanthine溶液を導入する。９６wellマイクロプレートにサンプル溶液１０μLとBuffer１７０μL、ＸＯ溶液６０μL、ＭＰＥＣ溶液１０μLを混合する。マイクロプレートの各well に、Xanthine溶液を５０μL分注した直後からの発光量を３０秒間測定する。この発光量を用いて下記式にて消去率を計算した。
(数２)
消去率(％)＝１００×（発光量（コントロール）−発光量（サンプル））
／発光量（コントロール）                        （２）
各濃度における消去率を表３及び図３に示した。
【００３６】
【表３】
2005105249.tif 000007
【００３７】
キサンティンオキシダーゼ阻害能の測定
１．試薬の調製
Buffer：１００mMのＫＨ2ＰＯ4水溶液を調製する。Buffer２００mLに対してＥＤＴＡ ２．９mg(０．０１mmol) を加える。
ＸＯ溶液：Xanthine oxidase (from Butter milk, 0.25U/mg、和光純薬工業)３０mgを上で調製したBuffer５０mLに溶かす。これを常温保存して使用に供した。
Xanthine溶液：Xanthine７.５mg（０．０５mmol）を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液６００μLに溶解させる。蒸留水７.５mLを加えた後、さらにBuffer１６.９mLを加えて全量を２５mLとする。これを冷蔵庫中で保存して使用した。
【００３８】
２．サンプル溶液の調製
所定量のカテキン、ポリリジン、ポリリジン／カテキン混合物、ハイブリッド（ｐＨ７）およびハイブリッド（ｐＨ８）をＤＭＳＯに溶解し、測定時に表４に示した濃度となるようにサンプル溶液を調製する。
３．測定
ＵＶ測定用の１.５mLの石英セル中でBuffer７４０μLとサンプル溶液２０μL、ＸＯ溶液２４０μLを混合し、３７℃で５分間プレインキュベートする。Xanthine溶液２００μLを加えた直後から５分間の２９５nmでの吸光度を測定し、吸光度の増加分を読みとる。コントロールには、サンプルを溶かすのに用いた溶媒のみをサンプル溶液の代わりに加えたものを用いる。この吸光度を用いて下記式より阻害率を求めた。
(数３)
阻害率(％)＝１００×（吸光度（コントロール）−吸光度（サンプル））
／吸光度（コントロール）                        （３）
各濃度における阻害率を表４及び図４に示した。
【００３９】
【表４】
2005105249.tif 000008
【００４０】
コラゲナーゼ阻害能の測定
Enzchek Gelatinase/Collagenase Assay Kit（Molecular Probes社製）を用いる。
１．試薬の調製
１Ｘ Buffer：１０Ｘ Buffer ２mLに蒸留水８mLを加えて希釈する。
ＤＱゼラチン溶液：１.３mgのＮａＮ３に蒸留水１０mLを加えてＮａＮ３溶液を調製する。付属のＤＱゼラチン１本にＮａＮ３溶液１mLを加え、５０℃で５分間超音波処理して完全に溶かす。これを１Ｘ Bufferで２倍に希釈する。これで最終的に２００mLの反応溶液中で５０mg／mLとなる。
コラゲナーゼ溶液：付属のCollagenase（Type IV from Clostridium histolyticum 500U）１本に０.５mLの蒸留水を加える。１Ｘ Bufferを用いて１００倍に希釈する。これを冷蔵庫中で保存した。
使用時には１Ｘ Bufferでさらに５０倍に希釈した(0.2U/mLとなる)。
２．サンプル溶液の調製
所定量のカテキンおよびハイブリッド（ｐＨ８）を蒸留水に溶解し、測定時に表５に示した濃度となるようにサンプル溶液を調製する。
【００４１】
３．測定
９６wellマイクロプレートに、１Ｘ Buffer ６０μLと濃度の異なるサンプル溶液２０μL、ＤＱゼラチン溶液２０μLを混合する。最後にコラゲナーゼ溶液１００μLを加えた時点から３０分間、室温暗所でインキュベートする。３０分後の蛍光強度を測定する。（吸収極大：４９５nm、放射極大：５１５nm）コントロールには、サンプル溶液の代わりにサンプルを溶かすのに用いた溶媒のみを加えたものを用いる。この蛍光強度を用いて下記式より阻害率を求めた。
(数４)
阻害率(％)＝１００×（蛍光強度（コントロール）−蛍光強度（サンプル））
／蛍光強度（コントロール）                          （４）
各濃度における阻害率を表５及び図５に示した。
【００４２】
【表５】
2005105249.tif 000009
【００４３】
ヒアルロニダーゼ阻害能の測定
１．試薬の調製
ヒアルロニダーゼ溶液：ヒアルロニダーゼ（from bovine testis，SIGMA社製）をｐＨ５酢酸緩衝液に溶かし、７．５mg／mL（3750unit／mL）とする。
活性化剤：Compound 48/80（SIGMA社製）、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌの最終濃度が、それぞれ０．１mg／mL、２．５mM、０．１５MとなるようにｐＨ５酢酸緩衝液に溶解させる。
ヒアルロン酸ナトリウム溶液：ヒアルロン酸ナトリウム（CHA type H，チッソ社製）をｐＨ５酢酸緩衝液に溶かし１mg／mLとする。
ｐ−ＤＡＢＡ溶液：ｐ−ジメチルベンゾアルデヒド１gを２．５mLの１０Ｎ塩酸に溶解させ、ｐＨ５酢酸緩衝液７．５mLを加える。
２．サンプル溶液の調製
所定量のカテキンおよびハイブリッド（ｐＨ７）を蒸留水に溶解し、測定時に表６に示した濃度となるようにサンプル溶液を調製する。
所定量のＥＧＣＧおよびハイブリッド（ＥＧＣＧ）を蒸留水に溶解し、測定時に表７に示した濃度となるようにサンプル溶液を調製する。
【００４４】
３．測定
１０mLのガラス製サンプル瓶に、サンプル溶液４０μL、ｐＨ５酢酸緩衝液２００μL、ヒアルロニダーゼ溶液４０μLを混合し、１５分間、３７℃でインキュベートする。さらに、活性化剤１６０μLを加え、２０分間、３７℃でインキュベートする。さらに、ヒアルロン酸ナトリウム溶液４００μLを加え、４０分間、３７℃でインキュベートする。さらに、０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１６０μL加え、１０分間、氷冷する。さらに、ｐＨ９．１ホウ酸緩衝液１６０μLを加え、３分間煮沸した後、１０分間氷冷し試料溶液とする。
９６wellマイクロプレートに、上記試料溶液１２０μLとｐ−ＤＡＢＡ溶液１００μLを混合し、５８５nmにおける吸光度を３７℃で１０分間測定する。この吸光度を用いて下記式より阻害率を求めた。
(数５)
阻害率(％)＝１００×（（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ））／（Ａ−Ｂ）      （５）
ここで、Ａ：サンプルは含まず、ヒアルロニダーゼのみを含む場合の吸光度。
Ｂ：サンプルとヒアルロニダーゼを両方とも含まない場合の吸光度。
Ｃ：サンプルとヒアルロニダーゼを両方とも含む場合の吸光度。
Ｄ：サンプルのみを含み、ヒアルロニダーゼを含まない場合の吸光度。
カテキンおよびハイブリッド（ｐＨ７）の、各濃度における阻害率を表６及び図６に示した。
ＥＧＣＧおよびハイブリッド（ＥＧＣＧ）の、各濃度における阻害率を表７及び図７に示した。
【００４５】
【表６】
2005105249.tif 000010
【００４６】
【表７】
2005105249.tif 000011
【００４７】
リパーゼ阻害能の測定
１．試薬の調製
リパーゼ溶液：ラットの膵臓から電気泳動的に単一になるまで精製した膵リパーゼを、０．１mol／L−ＮａＣｌ−０．１mol／L−ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かし、濃度４μg／Mlの溶液とする。
基質溶液：トリオレイン８０mg、ホスファチジルコリン１０mg、及びタウロコール酸ナトリウム５mgを、０．１mol／L−ＮａＣｌ−０．１mol／L−ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）９mLに混合し、超音波処理して乳化させ基質溶液を得る。
２．サンプル溶液の調製
所定量のポリリジンおよびハイブリッド（ｐＨ７）−２を０．１mol／L−ＮａＣｌ−０．１mol／L−ＴＥＳ（ｐＨ７．０）１mLに溶解し、下記測定時に基質溶液およびリパーゼ溶液と混合した後、表８に示した濃度となるようにサンプル溶液を調製する。
【００４８】
３．測定
１０mLのポリカーボネート製遠心管に、基質溶液１００μLとサンプル溶液５０μLとを混合し５分間震盪した後、リパーゼ溶液５０μLを加えて３７℃で３０分間震盪する。さらに、抽出用溶媒（クロロホルム：メタノール：ヘプタン＝４９：２：４９(容量比)）を３mL加えて１０分間震盪した後、回転数２５００rpmで５分間遠心分離する。その上層液をアスピレーターで除去した後、下層液に対して銅試薬（０．１mol／L−トリエタノールアミン−０．０６mol／L−ＮａＯＨ−０．０５mol／L−硝酸銅三水和物溶液２００mLに塩化ナトリウム６６gを溶解したもの）１mLを加え、１０分間震盪した後、回転数２５００rpmで１０分間遠心分離する。さらに、上層液０．５mLを採取し、これに発色試薬（０．１w／v％−バソクプロイン、０．０５w／v％−ブチル化ヒドロキシアニソール−クロロホルム溶液）０．５mLを加えて震盪し、試料溶液とする。波長４８０nmにおける吸光度を測定する。コントロールには、サンプルを溶かすのに用いた溶媒のみをサンプル溶液の代わりに加えたものを用いる。この吸光度を用いて上記式（３）より阻害率を求めた。
各濃度における阻害率を表８及び図８に示した。
【００４９】
【表８】
2005105249.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明において得られるポリアミン−ポリフェノールハイブリッドは、生化学活性の知られたポリフェノール類を既存のポリマーに導入したものである。ポリフェノールの高分子化により生体内での滞在時間が延長でき、生化学活性が長時間継続することから、実質的に該活性を向上させることができる。さらに、ポリアミンとポリフェノールの相互作用により酵素活性阻害能を向上させることができる。従って、ＤＰＰＨフリーラジカル消去剤、ＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去剤、スーパーオキシドアニオン消去剤、抗酸化剤、生体適合性材料、ドラッグキャリヤー、抗菌材料剤、鮮度保持剤、食品添加剤、医薬品、化粧品素材等の各種用途に幅広く適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明のポリリジン−カテキンハイブリッドのＤＰＰＨフリーラジカル消去能を示した図面である。
【図２】本発明のポリリジン−カテキンハイブリッドのＡＢＴＳカチオン−ラジカル消去能を示した図面である。
【図３】本発明のポリリジン−カテキンハイブリッドのスーパーオキシドアニオン消去能を示した図面である。
【図４】本発明のポリリジン−カテキンハイブリッドのキサンティンオキシダーゼ阻害能を示した図面である。
【図５】本発明のポリリジン−カテキンハイブリッドのコラゲナーゼ阻害能を示した図面である。
【図６】本発明のポリリジン−カテキンハイブリッドのヒアルロニダーゼ阻害能を示した図面である。
【図７】本発明のポリリジン−エピガロカテキンガレートハイブリッドのヒアルロニダーゼ阻害能を示した図面である。
【図８】本発明のポリリジン−カテキンハイブリッドのリパーゼ阻害能を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2005105249.tif 000029
【図４】
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【図５】
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【図６】
2005105249.tif 000032
【図７】
2005105249.tif 000033
【図８】
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