(57)【要約】【課題】β−１，４−ポリグルクロン酸ユニットからなり、β−１，４−Ｄ−グルコースのユニットを含まない酸化セルロース製の止血剤、およびその製造方法を提供すること。【解決手段】再生セルロースを水に分散させる工程、水中で再生セルロースの１級水酸基を選択的に酸化して、β−１，４−ポリグルクロン酸を得る工程、およびβ−１，４−ポリグルクロン酸を精製する工程を具備する方法により、構造式（Ｉ）で表されるβ−１，４−ポリグルクロン酸からなる生体吸収性止血剤を得る。【化１】2005289883.tif 000006（式中のXは水素或いはアルカリ金属を示し、ｎは２以上の整数である）【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）で表されるβ−１，４−ポリグルクロン酸からなる生体吸収性止血剤。
【化１】
2005289883.tif 000005
（式中のXは水素或いはアルカリ金属を示し、ｎは２以上の整数である）
【請求項２】
β−１，４−ポリグルクロン酸の数平均分子量（Ｍｎ）が１０，０００〜５０，０００であることを特徴とする請求項１に記載の生体吸収性止血剤。
【請求項３】
β−１，４−ポリグルクロン酸の重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．２〜２．４であることを特徴とする請求項２に記載の生体吸収性止血剤。
【請求項４】
β−１，４−ポリグルクロン酸が非晶性であることを特徴とする請求項１〜３に記載の生体吸収性止血剤。
【請求項５】
剤形態がパウダーであることを特徴とする請求項１〜４に記載の生体吸収性止血剤。
【請求項６】
再生セルロースを水に分散させる工程、
水中で再生セルロースの１級水酸基を選択的に酸化して、β−１，４−ポリグルクロン酸を得る工程、および
β−１，４−ポリグルクロン酸を精製する工程
を具備してなる生体吸収性止血剤の製造方法。
【請求項７】
水中で再生セルロースの1級水酸基を選択的に酸化する工程が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシルと臭化アルカリ金属の存在下で、酸化剤を用いる酸化反応であることを特徴とする請求項6に記載の生体吸収性止血剤の製造方法。
【請求項８】
水中で再生セルロースの1級水酸基を選択的に酸化する工程における反応溶液のｐHを、アルカリを添加しながらｐH１０．０〜１１．５に維持することを特徴とする請求項７に記載の生体吸収性止血剤の製造方法。
【請求項９】
水中で再生セルロースの1級水酸基を選択的に酸化する工程における反応温度を、５℃以下に維持することを特徴とする請求項７〜８に記載の生体吸収性止血剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項５の生体吸収性止血剤パウダーを患部にスプレー或いは塗布する生体吸収性止血剤の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−１，４−ポリグルクロン酸からなる生体吸収性止血剤、およびその製造方法に関する。詳しくは、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシルと臭化アルカリ金属の存在下で酸化剤を用いた酸化反応により、再生セルロースの1級水酸基を選択的に酸化させて得られるβ−１，４−ポリグルクロン酸の、生体吸収性の止血剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
外科手術において、止血剤は、手術操作による出血を迅速に止めることにより、手術時間の短縮化および出血量の低減に寄与し、これは輸血量の低減に貢献するものである。特に、生体内で使用される止血剤、例えば血管の吻合部や縫合部、臓器の縫合線からの出血に対して使用される止血剤としては、生体吸収性を有するものが有用である。なぜなら、止血達成後にあえて止血剤を取り除く必要がなく、また止血の結果として形成された血栓を保持できることより、再出血のリスクを低減できるからである。
【０００３】
現在、臨床実績がある生体吸収性止血剤には、生体由来材料（生体材料のうち、ヒトや動物の生体から得られる材料）であるコラーゲン、ゼラチンが利用されている。これら材料に血小板が積極的に粘着することにより、血液凝固が亢進される。また、これらの生体由来材料が生体代謝系にて吸収されることはよく知られている。このような止血剤の製造工程においては、原料管理や、ウィルスの不活性化および除去処理等の安全対策が行われているが、生体由来材料を用いることによるウィルス感染のリスクを完全には否定できないため、その使用には慎重にならざるを得ない。
【０００４】
一方、ウィルス感染のリスクが小さい合成材料である酸化セルロースがよく利用されている。この場合、酸化セルロースの赤血球凝集作用により血液凝固が亢進される。また、生理条件下では徐々に水溶性となるので、３０日間程度で適用箇所から消失し、また酸化セルロース自体が元々低分子量であるため、最終的には腎臓を通過して排泄される。この止血剤に使用されている従来の酸化セルロースは、二酸化窒素による酸化反応を利用して、再生セルロース（β−１，４−Ｄ−ポリグルコース）を酸化して得たものである。この酸化反応は不均一反応であるため、完全な再生セルロースの酸化は不可能であり、その結果、得られる酸化セルロースは、少なくともβ−１，４−Ｄ−グルコースのユニットを含んだ、β−１，４−グルクロン酸およびβ−１，４−Ｄ−グルコースからなる多糖類となる。生体代謝系、特に肝臓代謝の点においては、β−１，４−Ｄ−グルコースのユニットを含まない、β−１，４−ポリグルクロン酸ユニットからなる酸化セルロースであることが好ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記事情に鑑み、本発明の課題は、β−１，４−ポリグルクロン酸ユニットからなり、β−１，４−Ｄ−グルコースのユニットを含まない酸化セルロース製の止血剤、およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題は、構造式（Ｉ）で表されるβ−１，４−ポリグルクロン酸からなる生体吸収性止血剤によって達成される。
【化２】
2005289883.tif 000002
【０００７】
（式中のXは水素或いはアルカリ金属を示し、ｎは２以上の整数である）
また、上記の止血剤は、再生セルロースを水に分散させる工程、水中で再生セルロースの１級水酸基を選択的に酸化して、β−１，４−ポリグルクロン酸を得る工程、およびβ−１，４−ポリグルクロン酸を精製する工程を具備してなる、生体吸収性止血剤の製造方法によって得られる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の生体吸収性止血剤は、これを構成する酸化セルロースがβ−１，４−Ｄ−グルコースのユニットを含まないため、その生体代謝、特に肝臓クリアランスを改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の生体吸収性止血剤は、化学構造が明確、かつ均一であることを最大の特長とする。
【００１０】
本発明の生体吸収性止血剤は、下記化学式（Ｉ）で表されるβ−１，４−ポリグルクロン酸からなる。ここで式中のＸはほぼ水素であるが、製造方法由来のナトリウム等のアルカリ金属やアルカリ土類金属等を含むものである。つまり、グルクロン酸の塩を含むものである。
【化３】
2005289883.tif 000003
【００１１】
（式中のXは水素或いはアルカリ金属を示し、ｎは２以上の整数である）
β−１，４−ポリグルクロン酸自体は水への溶解性は高くないが、そのアルカリ金属塩は２５℃の蒸留水に対して１０％以上の溶解性を示す。従って、ナトリウム塩にして重水に溶解させることで、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）による分析が可能である。重水に溶解させたβ−１，４−ポリグルクロン酸ナトリウム塩の１３Ｃ−ＮＭＲのピークは、Ｃ１：δ＝１０５．２ｐｐｍ、Ｃ２：δ＝７５．６ｐｐｍ、Ｃ３：δ＝７７．０ｐｐｍ、Ｃ４：δ＝８３．７ｐｐｍ、Ｃ５：δ＝７８．１ｐｐｍ、Ｃ６：δ＝１７７．８ｐｐｍと帰属できる。本発明の生体吸収性止血剤は、ＮＭＲ分析により明確な上記の化学シフト値をもった６本のピークを示し、これによって均一な化学式（Ｉ）の構造が裏付けられる。
【００１２】
従来から二酸化窒素酸化セルロースが止血剤として使われているが、二酸化窒素酸化の場合、１３Ｃ−ＮＭＲの分析結果から、未酸化のＣ６つまりβ−１，４−グルコピラノースの６位炭素由来のδ＝６３ｐｐｍ付近にピークが検出されたり、また副反応による分解物のピークが多数見られる。これに対して、本発明の生体吸収性止血剤ではそれらのピークは実質的に検出されない。
【００１３】
さらに、本発明の生体吸収性止血剤は、高分子量でありながら分子量分布が狭いことを特徴としており、分子量分布の点からも均一性が高いと言える。前記の二酸化窒素酸化セルロースの場合、β−１，４−グルコピラノースの６位炭素を完全に酸化すると、副反応による分解も多くなり、分子量低下が激しくなる。また酸化反応の不均一さなどから分子量分布は広くなりやすく、分子量分布の狭い酸化セルロースを得ることは難しい。これに対して本発明の生体吸収性止血剤は、β−１，４−ポリグルクロン酸の数平均分子量（Ｍｎ）が１０，０００〜５０，０００であることを特徴とし、また、分子量分布の幅の指標となる重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．２〜２．４であることを特徴とするものである。
【００１４】
ここに記載した数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ）とは、標準物質としてプルランを用い、サイズ排除クロマトグラフィー法により測定したプルラン換算の平均分子量である。
【００１５】
さらに、本発明の生体吸収性止血剤は、β−１，４−ポリグルクロン酸が非晶質であることを特徴とする。即ち、その粉末サンプルのＸ線回折を測定した結果、この粉末はアモルファスであることが示された。結晶性の高いセルロースを酸化した場合、生成物中に結晶性が認められることがあるが、本発明の方法によって生成したβ−１，４−ポリグルクロン酸がアモルファスであることは、均一に効率よく酸化反応が進行し、均一構造のポリグルクロン酸が得られたことを表している。また、非晶質であることにより、本発明におけるポリグルクロン酸は、生体内においても完全に吸収されて消失し易いと言うことができる。
【００１６】
さらに本発明の生体吸収性止血剤は、剤形態がパウダーであることを特徴とする。パウダーであるため保管しやすく、またパウダーを患部にスプレー或いは塗布する等の使用方法を採用することができる。さらに本発明では、後述する本発明の生体吸収性止血剤の製造方法を用いることにより、粉砕等の物理的処理によりパウダー状にするのではなく、生成物を直接パウダーとして回収できるため、極めて効率が良い。
【００１７】
続いて、本発明の生体吸収性止血剤の製造について説明する。
【００１８】
本発明の生体吸収性止血剤の製造方法は、再生セルロースを水に分散させる工程（分散工程）、水中で再生セルロースの１級水酸基を選択的に酸化して、β−１，４−ポリグルクロン酸を得る工程（酸化工程）、およびβ−１，４−ポリグルクロン酸を精製する工程（精製工程）を具備する。
【００１９】
従来止血剤に用いられる二酸化窒素酸化セルロースは、セルロース原料をガスで酸化して得られるのに対し、本発明の生体吸収性止血剤の製造方法では、水中で酸化させることが特徴である。前記したようにβ−１，４−ポリグルクロン酸のアルカリ金属塩は水溶性が高く、再生セルロースが完全にβ−１，４−ポリグルクロン酸まで酸化されると、反応溶液は均一な水溶液となる。
【００２０】
この生体吸収性止血剤の製造方法の原料としては、β−１，４−D−グルコースからなるセルロースが好ましく用いられる。原料に用いるセルロースは、木材やコットン由来の一般的なセルロースからバクテリアセルロース等まで、特に限定なく利用できるが、一旦溶解再生処理したセルロースを用いると副反応が抑えられ、高分子量の完全水溶性ポリグルクロン酸が得られることから、再生セルロースを原料とすることが望ましい。ここで、セルロースの再生処理法としては、キュプラアンモニウム法、ビスコース法、塩化リチウム／ジメチルアセトアミド法等の公知の再生処理法が利用できる。
【００２１】
本発明の生体吸収性止血剤の製造方法では、まず再生セルロースを水に分散させる工程において、反応溶媒となる水中に前記再生セルロースを分散させる。ここで、再生セルロースの繊維長を２ｃｍ以下に調整し、分散液を５℃以下に冷却しておくと、次工程での酸化反応が均一に進みやすく好ましい。
【００２２】
本発明において、上記の水中で再生セルロースの１級水酸基を選択的に酸化する工程では、穏やかな反応条件下で、ピラノース環の２位や３位を酸化することなく、選択的に全てのピラノース環の６位をカルボキシル基まで酸化し、高分子量で且つ均一なβ−１，４−ポリグルクロン酸を得るために、Ｎ−オキシル化合物触媒による酸化手法が用いられる。
【００２３】
上記Ｎ−オキシル化合物触媒による酸化手法とは、水系で、Ｎ−オキシル化合物触媒の存在下、酸化剤を用いて酸化する方法であり、Ｎ−オキシル化合物としては、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル（以下ＴＥＭＰＯと称する）などが好ましく用いられ、また酸化剤としては、ハロゲン、次亜ハロゲン酸，亜ハロゲン酸や過ハロゲン酸又はそれらの塩、ハロゲン酸化物、窒素酸化物、過酸化物など、目的の酸化反応を推進し得る酸化剤であれば、いずれの酸化剤も使用できる。さらに、臭化物やヨウ化物の共存下で酸化を行うと、温和な条件下でも酸化反応を円滑に進行させ、カルボキシル基の導入効率を大きく改善できるため、より好ましい。
【００２４】
本発明において、上記の水中で再生セルロースの１級水酸基を選択的に酸化する工程では、Ｎ−オキシル化合物にはＴＥＭＰＯを用い、臭化ナトリウムの存在下、酸化剤として次亜塩素酸ナトリウムを用いて行うのが特に好ましい。
【００２５】
ここで、Ｎ−オキシル化合物は触媒としての量で済み、例えば、β−１，４−D−グルコースのモル数に対し、１０ｐｐｍ〜５％あれば充分であるが、０．０５％〜３％が好ましく、また臭化物又はヨウ化物の使用量は、酸化反応を促進できる範囲で選択でき、例えば、β−１，４−D−グルコースのモル数に対し０〜１００％、より好ましくは１〜５０％である。
【００２６】
また、１級水酸基への酸化の選択性を上げ、副反応を抑える目的で、反応温度は室温以下、より好ましくは系内を５℃以下で反応させることが望ましい。さらに、反応中は系内をアルカリ性に保つことが好ましい。この時のｐＨは１０．０〜１１．５、より好ましくはｐＨ１０．５〜１１．０に保つとよい。
【００２７】
さらにこの酸化方法は、酸化剤の量およびｐＨを一定に保つ際に添加されるアルカリの量により酸化度を制御することができる。例えば、アルカリがグルコース残基と等モル量添加されれば、ほぼ全てのピラノース環６位の一級水酸基がカルボキシル基にまで酸化される。
【００２８】
ここで、本発明の水中で再生セルロースの１級水酸基を選択的に酸化する工程では、例えば、前記の再生セルロースの分散液に、ＴＥＭＰＯと臭化ナトリウムを溶解した水溶液を加え、系内を５℃以下に冷却、ｐＨを１０に調整する。ここに先ず少量の次亜塩素酸ナトリウム溶液を加えると、一時ｐＨは上昇するが、攪拌を続けると、系内のｐＨは徐々に低下してくるので、水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、系内のｐＨを１０．０〜１１．５の範囲で一定に保つ。さらに酸化剤である次亜塩素酸ナトリウム溶液を反応の進行具合に応じて調整しながら滴下することで、系内に存在する余剰の酸化剤が作用して副反応を生じるのを抑える。また、反応中は系内の温度を５℃以下に維持する。反応の進行に伴い、系内は均一な溶液となる。この反応条件においては、添加される水酸化ナトリウムの量は、ほぼ酸化により導入されたカルボキシル基の量に対応しており、原料のグルコース残基量と当モルの添加量に達した時点で、エタノールを添加して過剰の酸化剤を失活させる。こうして再生セルロースの1級水酸基を選択的に酸化して、水溶性のβ−１，４−ポリグルクロン酸ナトリウムとすることができる。
【００２９】
続いて、β−１，４−ポリグルクロン酸の精製工程では、前記酸化反応により溶解した反応溶液中には、原料由来の未溶解分等が浮遊している場合があり、これをろ過により除いてから、ろ過液を過剰量のエタノール中に投入すると、生成物は白色沈殿となって析出する。この析出物をアセトンと水の混合溶液を用いて十分に洗浄後、アセトンで脱水してから減圧乾燥することにより、白色粉末状のβ−１，４−ポリグルクロン酸ナトリウム塩が得られる。この粉末は、２５℃の蒸留水１００ｇに対して１０ｇ以上の溶解性を示す。
【００３０】
さらに、上記により得られたポリグルクロン酸のナトリウム塩（ＣＯＯＮａ型）を水に溶解した後に酸処理し、上記のエタノールで再沈、洗浄、乾燥の操作を繰り返すことで、ＣＯＯＨ型に脱塩して、本発明の生体吸収性止血剤となる、白色粉末状のβ−１，４−ポリグルクロン酸が得られる。
【００３１】
ここで、酸処理による脱塩操作は、エタノール中で析出させる前の反応溶液に対して行ってもよく、不溶分をろ過により除去後、塩酸水溶液等を加えて反応溶液のｐＨを下げてから過剰量のエタノール中で析出させることで、洗浄操作を少なくして、β−１，４−ポリグルクロン酸を得ることができる。また脱塩の処理は、酸処理だけに限らず、イオン交換樹脂で処理する等、いかなる手法を用いても構わない。
【００３２】
このβ−１，４−ポリグルクロン酸の精製工程では、前記の選択的な酸化反応により生じるＴＥＭＰＯ、臭化ナトリウム、塩化ナトリウムを除去することが目的であり、その目的を達成するものであれば、上記の有機溶剤を用いた精製手法に限らず、さまざまな精製手法を利用することができる。
【００３３】
さらに精製に用いた有機溶剤分を減圧乾燥だけでは除ききれない場合は、蒸留水に溶解、或いは分散させて凍結乾燥することで完全に溶剤分を除去してもよい。
【００３４】
本発明の生体吸収性止血剤パウダーを患部にスプレー或いは塗布する生体吸収性止血剤の使用は、生体の出血箇所またはその近辺にて、必要に応じて出血箇所を覆うようにスプレーする、塗る、または塗りこむことによって達成される。スプレーする場合は、圧縮空気や窒素、アルコール水溶液、リキッドプロパンやフロンなどの揮発性溶媒を使用して、本発明の生体吸収性止血剤パウダーをスプレーすれば良い。また、生体表面へのパウダーの添着を改善するために、ミリスチン酸イソプロピルなどの親油物質を添着剤として併用することもできる。
【００３５】
以下実施例により、本発明の一つの形態についてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
市販の再生セルロースであるベンリーゼ（旭化成工業（株）製）５．０ｇを、５％濃度で蒸留水に均一に分散させた。ここに、ＴＥＭＰＯ  ９６ｍｇ、臭化ナトリウム  １．２７ｇを溶解させた水溶液を加え、セルロースの固形分濃度が約２ｗｔ％になるよう調製した。反応系を冷却し、１１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液１５ｇを添加し、酸化反応を開始する。反応温度は常に５℃以下に維持した。反応中は系内のｐＨが低下するが、０．５Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を逐次添加し、ｐＨ１０．８付近に調整するとともに、さらに１１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液３５ｇを反応の進行に応じて調整しながら滴下した。グルコース残基の全モル数に対し、１００％のモル数に対応するアルカリ添加量に近づくと、アルカリの添加速度は遅くなり、系内は完全に溶解して、黄色の均一な溶液となる。アルカリ添加量が前記の１００％（６１．７３ｍｌ）に達した時点で、エタノールを添加して反応を停止させた。反応時間は２時間であった。この反応溶液は、濾過により不溶の不純物を除いてから、過剰量のエタノール中に投入して、生成物を再沈させた。さらに水：アセトン＝１：７の溶液により充分洗浄した後、アセトンで脱水して、４０℃減圧乾燥して、白色粉末状のβ−１，４−ポリグルクロン酸のナトリウム塩５．９ｇを得た。
【実施例２】
【００３７】
実施例１のβ−１，４−ポリグルクロン酸のナトリウム塩２．０ｇを８０ｍｌの蒸留水に溶解し、攪拌しながら、ｐＨ１になるまで２Ｎ−塩酸を添加した。溶液は白色の均一な分散液となった。この分散液を過剰量のエタノール中に投入し、生成物を再沈させた。さらに水：アセトン＝１：７の溶液により充分洗浄した後、アセトンで脱水して、４０℃減圧乾燥して、白色粉末状の脱塩したβ−１，４−ポリグルクロン酸１．６ｇを得た。
【実施例３】
【００３８】
ろ紙パルプを銅エチレンジアミンの溶液に完全に溶解させ、中和しながら水中で再生、十分洗浄した。この湿潤再生セルロース２．０ｇを水に５％濃度で懸濁させた。ここに、ＴＥＭＰＯ  ３９ｍｇ、臭化ナトリウム  ０．５０ｇを溶解させた水溶液を加え、セルロースの固形分濃度が約２ｗｔ％になるよう調製した。反応系を冷却し、１１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液６ｇを添加し、酸化反応を開始する。反応温度は常に５℃以下に維持した。反応中は系内のｐＨが低下するが、０．５Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を逐次添加し、ｐＨ１０．５付近に調整するとともに、さらに１１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液１５ｇを反応の進行に応じて調整しながら滴下した。グルコース残基の全モル数に対し、１００％のモル数に対応するアルカリ添加量に近づくと、アルカリの添加速度は遅くなった。アルカリ添加量が前記の１００％（２４．６７ｍｌ）に達した時点で、エタノールを添加して反応を停止させた。反応時間は１時間４０分であった。この反応溶液は、濾過により不溶の不純物を除いてから、ｐＨ１になるまで２Ｎ−塩酸を添加した。溶液は白色の均一な分散液となった。この分散液を過剰量のエタノール中に投入して、生成物を再沈させた。さらに水：アセトン＝１：７の溶液により充分洗浄した後、アセトンで脱水して、４０℃減圧乾燥して、白色粉末状のβ−１，４−ポリグルクロン酸２．０ｇを得た。
【００３９】
＜比較例＞
比較例として、二酸化窒素酸化セルロースの市販の止血剤３種（ＳＵＲＧＩＣＥＬＬ（Ｆｉｂｒｉｌａｒ  綿状）、ＳＵＲＧＩＣＥＬＬ（ＮＵ−ＫＮＩＴ  織布状）（ともにＪｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ社製）、ＯＸＹＣＥＬ（ＣＯＴＴＯＮ−ＴＹＰＥ  綿状）（三共（株）製））および二酸化窒素酸化セルロースの市販の癒着防止材１種（ＩＮＴＥＲＣＥＥＤ  織布状）（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ社製）を用いた。これらのサンプルについて、以下の評価を実施した。
【００４０】
＜評価＞
（ＩＲによる構造分析）
実施例２のβ−１，４−ポリグルクロン酸、比較例の市販酸化セルロースをＫＢｒ錠剤法によりＩＲスペクトルを測定し、比較した。その結果は図１に示す通り、実施例および比較例ともに、酸化により導入されたカルボキシル基由来の１７５０ｃｍ−１付近の大きな吸収がみられた。ＩＲ分析で比較する限り、実施例と比較例の大きな違いは確認されなかった。
【００４１】
（ＮＭＲによる構造分析）
実施例１のβ−１，４−ポリグルクロン酸ナトリウム塩を重水に溶解させて、また比較例の市販酸化セルロースを重水素化水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させて、１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。ＮＭＲスペクトルを図２に示す。実施例のβ−１，４−ポリグルクロン酸は、ピラノース環６位の水酸基をもつ炭素に由来するピーク（δ＝６０−６５ｐｐｍ付近）が完全に消えて、カルボキシル基（δ＝１７０−１８０ｐｐｍ付近）に変換しており、２位、３位の炭素に由来するピークは変化せず、ケトンなどのピーク（δ＝２００−２１０ｐｐｍ付近）は確認されなかった。従って、本発明の生体吸収性止血剤は、均一な構造のβ−１，４−ポリグルクロン酸であると言える。一方で、比較例のＩＮＴＥＲＣＥＥＤおよびＳＥＲＧＩＣＥＬＬは、未酸化のピラノース環Ｃ６位の水酸基をもつ炭素に由来するピーク（δ＝６０−６５ｐｐｍ付近）の残存が認められ、完全なβ−１，４−ポリグルクロン酸とは言えない。またＯＸＹＣＥＬでは、δ＝６０−６５ｐｐｍ付近のピークは殆ど消失しているものの、副反応による分解物由来と思われるピークが大きくなっていることが認められる。
【００４２】
（平均分子量の測定）
実施例２、３のβ−１，４−ポリグルクロン酸、比較例の市販酸化セルロースの数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ）を、ＧＰＣ法により測定した。それぞれのサンプルを０．０５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、エタノールで沈殿単離し、水：アセトン＝１：７の溶液で洗浄して、アセトンで脱水した後、減圧乾燥して、ＧＰＣ測定用のサンプルとした。カラムはＴＳＫ  ｇｅｌＧ６０００ＰＷＸＬ、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷＸＬを用い、０．１Ｍ  ＮａＣｌを溶離液とし、ＲＩ検出器を用い測定した。分子量既知の標準プルランから検量線を作成し、プルラン換算の数平均分子量および重量平均分子量を算出した。その結果を表１に示す。また実施例２のもののＧＰＣチャートを図３に示した。比較例の酸化セルロースは、低分子量側と高分子量側に二山の分布を有し、重量平均分子量としては高い値となるが、分子量分布が広く、ピラノース環６位の１級水酸基の酸化以外にも、解重合などの副反応が激しく起こっていることが考えられた。この傾向は、ＮＭＲにより６位１級水酸基がほぼ全て酸化されていることが確認されたＯＸＹＣＥＬが、最も顕著であった。これに対し、実施例のβ−１，４−ポリグルクロン酸は、分子量分布が狭く、均一な構造を有していることが示唆される。さらにその分子量分布も、比較例の低分子量側よりも高分子量側にあることがわかる。
【表１】
2005289883.tif 000004
【００４３】
（結晶性）
実施例２、および比較例の試料を、粉末法によりリガクＲＡＤ−ｒＸ（Ｘ線源＝ＣｕＫα、電圧４０ｋＶ、電流１００ｍＡ、）を用い、結晶性を評価した。比較例の試料は凍結粉砕により粉末状とした。その結果、実施例２および比較例のＳＥＲＧＩＣＥＬＬはピークが検出されず、アモルファスであることがわかった。一方、比較例のＯＸＹＣＥＬはセルロース由来のピークが現れていた。図４に実施例２、比較例のＳＥＲＧＩＣＥＬＬ、ＯＸＹＣＥＬで得られたＸ線回折格子のスペクトルを示す。
【００４４】
（全血凝固時間測定（Ｌｅｅ−Ｗｈｉｔｅ法））
予め検体１ｍｇを入れたポリスチレンチューブ（ＲＩＡ用、栄研社製）φ１０ｍｍ、２本（試験管１，２）に全血０．７５ｍＬを分注する。０．０２５Ｍ塩化カルシウム溶液（シグマ社製）０．２５ｍＬを加え、速やかにチューブを反転混合した後、３７℃の恒温槽で温置する。３分後に試験管１本を傾けて、血液が流動して水平面を形成するかどうかを観察する。凝固していたら水平面は形成されない。再び恒温槽に戻し、３０秒おきに、同様にして凝固しているかどうかを観察する。これが凝固したら（ｔ１分）、直ちに第２の試験管を同様にし３０秒ごとに検査し、凝固したら（ｔ２分）測定を終了する。ｔ１およびｔ２の平均を凝固時間とする。また、検体を入れない以外は同様にして、ブランク測定も行った。凝固時間を下記に示す。
【００４５】
実施例２：  １１．５分
実施例３：  １２．０分
比較例
ＳＵＲＧＩＣＥＬＬ（Ｆ）：  １５．５分
ＯＸＹＣＥＬ：  １４．５分
ＩＮＴＥＲＣＥＥＤ：  １７．０分
（ブランク測定：  ２０．５分）。
【００４６】
（赤血球凝集作用の観察）
全血を遠心分離（２，０００Ｇ、１０分）した後、血漿およびバフィーコート層をピペットにて除去する。生理食塩水（テルモ社製）を加え、ゆっくりと転倒混和する。遠心分離を行い、血漿およびバフィーコート層を再度除去する。これを３回行い、最後に生理食塩水を加えて得た洗浄赤血球を試験に供した。
【００４７】
予めサンプル４５ｍｇを入れた１５ｍＬ遠沈管（イワキ社製）に、洗浄赤血球（ヘマトクリット値５％）９ｍＬを加える。ゆっくり転倒混和した後、室温で２ｈ放置した。ゆっくり転倒混和した後に血液を採取して、速やかに顕微鏡（１００倍）にて観察を行った。また、検体を入れない以外は同様にして、ブランクについても観察を行った。
【００４８】
実施例２および実施例３のβ−１，４−ポリグルクロン酸、比較例の３種の酸化セルロースでは赤血球凝集が観察され、これらには赤血球凝集作用があることを確認した。一方、ブランクには赤血球凝集は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例２および比較例のサンプルをＫＢｒ法により測定したＩＲスペクトルである。
【図２】実施例１および比較例のサンプルを重水に溶解して測定した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】実施例２および比較例のサンプルのＧＰＣチャートである。
【図４】実施例２および比較例のサンプルのＸ線回折格子のスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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