(57)【要約】【課題】活性を保持した状態でオリゴメリックタンパク質を細胞表層に提示した形質転換細胞を提供すること。【解決手段】オリゴメリックタンパク質を細胞の表層に提示する形質転換細胞による。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴメリックタンパク質を細胞の表層に提示する形質転換細胞。
【請求項２】
オリゴメリックタンパク質が、アンカリングタンパク質によって細胞の表層に固定されることを特徴とする請求項１記載の形質転換細胞。
【請求項３】
オリゴメリックタンパク質が、少なくとも２個のサブユニットからなることを特徴とする請求項１または請求項２記載の形質転換細胞。
【請求項４】
形質転換細胞が、形質転換酵母である請求項１〜３のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【請求項５】
オリゴメリックタンパク質が、ストレプトアビジンである請求項１〜４のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【請求項６】
形質転換細胞が、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【請求項７】
発現ベクターが、プロモーター、選択マーカー、分泌シグナル配列、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする請求項６記載の形質転換細胞。
【請求項８】
発現ベクターが、プロモーター、選択マーカー、分泌シグナル配列、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ、細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする請求項６記載の形質転換細胞。
【請求項９】
細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡが、酵母の凝集因子遺伝子であるＦｌｏ１またはその一部であることを特徴とする請求項８記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
プロモーター、分泌シグナル配列、選択マーカー、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、プロモーター、分泌シグナル配列、選択マーカー、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質をコードするＤＮＡ、細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとが共発現していることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【請求項１１】
オリゴメリックタンパク質が、酵素であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする物質変換方法。
【請求項１３】
請求項５記載の形質転換細胞とビオチン化化合物とを用いる診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、形質転換細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組み替え技術を応用した異種タンパク質の生産は様々な産業に用いられている。多くの場合、目的タンパク質生産のための宿主細胞として、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が用いられている。そして、宿主細胞に合わせて、発現ベクターを適宜選択することで、目的タンパク質を宿主細胞内、または細胞外に発現させることができる。
【０００３】
一方、細胞膜タンパク質の膜への結合としては、糖脂質であるグルコシルホスファチジルイノシトール（「ＧＰＩ」と略記する場合がある。）をタンパク質のＣ末端に結合させ、その脂質部分を膜に埋もれさせ（ＧＰＩアンカー）、目的タンパク質を細胞膜につなぎとめる方法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。また、目的タンパク質を細胞膜結合タンパク質と融合させることで細胞表層に固定する技術が確立している（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
これら固定化技術では、目的タンパク質と細胞膜結合タンパク質とを結合させるため、単量体タンパク質においてのみ適用されてきた。しかしながら、タンパク質は、多くの場合、複合体を形成することで、活性を発揮するため、オリゴメリックタンパク質の活性を保持したまま細胞表層に提示する技術が求められていた。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，ＥＭＢＯＪ．７，２２３３−２２４０
【非特許文献２】
Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．，１４，１１５−１２０  （１９９６）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来の技術では困難であった、活性を保持した状態でオリゴメリックタンパク質を細胞表層に提示した形質転換細胞を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた。その結果、細胞膜結合タンパク質と融合させたオリゴメリックタンパク質のサブユニットと、融合させていない単独のサブユニットとを共発現させることで、オリゴメリックタンパク質を細胞表層にその活性を保持した状態で提示できることを見出し、その知見に基づいて、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、以下の構成を有する。
【０００８】
［１］オリゴメリックタンパク質を細胞の表層に提示する形質転換細胞。
［２］オリゴメリックタンパク質が、アンカリングタンパク質によって細胞の表層に固定されることを特徴とする前記［１］項記載の形質転換細胞。
［３］オリゴメリックタンパク質が、少なくとも２個のサブユニットからなることを特徴とする前記［１］項または前記［２］項記載の形質転換細胞。
［４］形質転換細胞が、形質転換酵母である前記［１］〜［３］のいずれか１項記載の形質転換細胞。
［５］オリゴメリックタンパク質が、ストレプトアビジンである前記［１］〜［４］のいずれか１項記載の形質転換細胞。
［６］形質転換細胞が、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれか１項記載の形質転換細胞。
［７］発現ベクターが、プロモーター、選択マーカー、分泌シグナル配列、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする前記［６］項記載の形質転換細胞。
［８］発現ベクターが、プロモーター、選択マーカー、分泌シグナル配列、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ、細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする前記［６］項記載の形質転換細胞。
［９］細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡが、酵母の凝集因子遺伝子であるＦｌｏ１またはその一部であることを特徴とする前記［８］項記載の形質転換細胞。
［１０］プロモーター、分泌シグナル配列、選択マーカー、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、プロモーター、分泌シグナル配列、選択マーカー、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質をコードするＤＮＡ、細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとが共発現していることを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれか１項記載の形質転換細胞。
［１１］オリゴメリックタンパク質が、酵素であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか１項記載の形質転換細胞。
［１２］前記［１１］項記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする物質変換方法。
［１３］前記［５］項記載の形質転換細胞とビオチン化化合物とを用いる診断薬。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の形質転換細胞は、オリゴメリックタンパク質を細胞の表層に提示している。オリゴメリックタンパク質は、少なくとも２個のサブユニットからなる複合体である。本発明では、細胞膜結合タンパク質（これを、「アンカリングタンパク質」という場合がある。）と融合させたオリゴメリックタンパク質のサブユニットと、融合させていない単独のサブユニットとを共発現させることで、細胞の表層にオリゴメリックタンパク質の活性を保持した状態でオリゴメリックタンパク質を提示できる。このとき、オリゴメリックタンパク質は、アンカリングタンパク質によって細胞の表層に固定されている。形質転換細胞の原料細胞（宿主）は、その表面にタンパク質を発現させることのできるものなら何れのものであってもよい。具体的には、昆虫細胞、動物細胞、大腸菌細胞、乳酸菌細胞または酵母細胞等を挙げることができる。特に、真核生物由来のオリゴメリックタンパク質を発現させる場合には、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞であることが好ましい。なかでも取り扱いが容易なことから、原料細胞は、酵母細胞であることが最も好ましく、例えば、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ８−１を挙げることができる。酵母細胞は、酵母細胞にオリゴメリックタンパク質を発現させるための発現ベクターを導入することで形質転換され、形質転換酵母として用いられる。なお、酵母の詳細な性質については、田島（Ｔａｊｉｍａ）ら、イースト（Ｙｅａｓｔ）  １，６７−７７（１９８５）に記載されている。
【００１０】
オリゴメリックタンパク質をコードするＤＮＡを原料細胞に導入し、該原料細胞の表面にオリゴメリックタンパク質を発現させるためには、まず、表層発現用のベクターを原料細胞に合わせて適宜選択し、選択された発現ベクターにオリゴメリックタンパク質をコードするＤＮＡを導入する必要がある。このオリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡの組み込みに用いる発現ベクターは、プロモーター、選択マーカー、分泌シグナル配列（疎水性アミノ酸配列）、発現目的のオリゴメリックタンパク質をコードするＤＮＡを導入するためのクローニング部位、ターミネーター等からなり、必要に応じて、細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡが含まれていてもよい。
【００１１】
本発明に用いる発現ベクターは、プロモーター、選択マーカー、分泌シグナル配列、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含み、また、プロモーター、選択マーカー、分泌シグナル配列、ターミネーター、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ、細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡを含む。このようなベクターは、例えば、アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ  ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）（２００１年）５７５７巻：５００〜５０５頁にあるようなプラスミドｐＭＷＩＺ１等である。プラスミドｐＭＷＩＺ１の場合には、該プラスミドのＺＺをコードするＤＮＡの代わりにオリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを導入すればよい。
【００１２】
本発明に用いる発現ベクターのプロモーターは、宿主の発現系で一般的に使用されるものであれば特に限定されない。酵母の場合、形質転換酵母内で導入した目的タンパク質を発現させることができるプロモーターであれば何れでもよく、例えば、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ２またはＵＰＲ−ＩＣＬ（アーカイブズオブマイクロバイオロジー（Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９５  Ｍａｙ；１６３（５）：３２２−８））であり、なかでもＧＡＰおよびＵＰＲ−ＩＣＬが特に好ましい。
【００１３】
本発明に用いるターミネーターは、宿主の発現系で一般的に使用されるものであれば特に限定されない。例えば、酵母の場合、ＡＤＨ１、ＴＤＨ１、ＴＦＦ、ＴＲＰ５またはＴＥＲＭ−ＩＣＬ（アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９６  Ｆｅｂ；４４（６）：７５９−６５））である。
【００１４】
本発明に用いる分泌シグナル配列は、宿主において一般的に用いられるものであれば特に限定はされない。例えば、酵母の場合、リゾプスオリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列またはαファクターである。
【００１５】
本発明に用いる選択マーカーのＤＮＡは、宿主において一般的に用いられるものであれば特に限定されず、栄養要求性や薬剤耐性によってクローンを選択できる。酵母の場合、例えば、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、ＣＡＮ１、ＳＵＣ２、ＬＹＳ２またはＣＵＰ１である（大島泰治編著、生物化学実験法３９、酵母分子遺伝学実験法、１１９−１４４（１９９６））。ただし、本発明において、複数のベクターで共発現させる場合には、各々のベクターの選択マーカーとしては異なるＤＮＡを用いる必要がある。また、宿主として大腸菌を用いる場合には、大腸菌内部で増殖できるシャトルベクターを用いてもよく、そのため選択マーカーは、アンピシリン耐性のＤＮＡでもよい。
【００１６】
本発明に用いる細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡは、当該分野で一般的に用いられるものであれば特に限定されない。例えば、酵母の場合、αアグルチニン、ａアグルチニンまたは凝集性酵母の凝集に関与しているＦｌｏである。アンカリングタンパク質をコードするＤＮＡの全配列を用いてもよいし、細胞の表層にタンパク質が発現できるように細胞の表層内在領域を含む断片であってもよい。
【００１７】
構築したベクターを宿主に導入する場合には、当該分野で周知の方法に従えばよい。例えば、酵母の場合、酢酸リチウム法、エレクトロポーレイション法またはプロトプラスト法である。
【００１８】
オリゴメリックタンパク質は、その発現方法の違いによって２種類に分類できる。１つは同じサブユニットからなるホモオリゴマーであり、もう１つは異なるサブユニットからなるヘテロオリゴマーである。
オリゴメリックタンパク質が、ホモオリゴマーの場合には、用意する発現ベクターは、サブユニットをコードするＤＮＡ及び細胞の表層に固定するためのオリゴメリックタンパク質（Ｉ）をコードするＤＮＡを連結したベクターと、サブユニットをコードするＤＮＡを連結したベクターの２種類である。
オリゴメリックタンパク質が、ヘテロオリゴマーの場合には、ホモオリゴマーと同様にサブユニットをコードするＤＮＡが連結されたベクターと、されていないベクターの２種類を用意する必要があるが、どのサブユニットをタンパク質（Ｉ）との融合タンパク質にするかについては、そのタンパク質（Ｉ）の種類によって異なるものの、少なくとも１種類のサブユニットは、固定化のために、細胞の表層に固定するためのタンパク質（Ｉ）との融合タンパク質の形にする必要がある。なお、オリゴメリックタンパク質は、酵素であってもよい。
【００１９】
すなわち、本発明において、活性を保持した状態でオリゴメリックタンパク質を細胞の表層に提示するためには、少なくとも２種類のベクターを用意し、両者を細胞中で共発現させることが必要である。例えば、ホモオリゴマー（αｎ）の場合、サブユニット（α）と、サブユニットを表層に固定するためのタンパク質（α−Ｉ）とを同時に細胞中で発現させることにより、αｎが活性を保持したまま細胞の表層で発現することになる。サブユニット（α）のみを発現させた場合はホモオリゴマー（αｎ）が培地中に放出され、タンパク質（α−Ｉ）のみを発現させた場合は、活性を示すように高次構造を維持したまま細胞の表層で発現することが困難になる。このためには、形質転換細胞中で、プロモーター、分泌シグナル配列、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、プロモーター、分泌シグナル配列、オリゴメリックタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ、細胞の表層にオリゴメリックタンパク質を固定するためのアンカリングタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとを共発現させることで行える。
【００２０】
一方、例えば、２種類のサブユニットを有するヘテロオリゴマー（αｎβｎ）の場合には、▲１▼（α−Ｉ）及び（β）、▲２▼（α）及び（β−Ｉ）、▲３▼（α−Ｉ）、（β−Ｉ）、（α）及び（β）等を共発現させることにより、（αｎβｎ）が活性を保持したままで細胞の表層に提示される。この場合においても（α）及び（β）のみを発現させた場合には、（αｎβｎ）が培地中に放出され、（α−Ｉ）、（β−Ｉ）のみを発現させた場合は、活性を示すように高次構造を維持したまま細胞表層で発現することが困難になる。上記記載の通り、細胞の表層に固定するためのタンパク質（Ｉ）と各サブユニットを融合させたもの、及びフリーのものとを共発現させることにより、オリゴメリックタンパク質を細胞の表層で活性を保持したまま発現させることが可能となる。
【００２１】
本発明では、ストレプトアビジンを細胞の表層に提示する形質転換細胞または酵母と、ビオチン化化合物とを用いることで、診断薬として利用できる。具体的には、直径が数μｍのビーズ上にストレプトアビジンを固定し、そこへビオチン化された抗体等のビオチン化化合物を結合させることによって、様々な診断薬として用いられる。これは、クリニカルケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３７，  ｐ１５３４−１５３９  （１９９１））等で報告されている。本発明では、酵母表層に提示するストレプトアビジンが、活性を保持していることから、ビーズ上へ化学的に結合させる方法と比較して、より活性を保持できるので、効果的である。
【００２２】
【実施例】
以下、具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、測定方法、用いた材料の組成は以下の通りである。
なお、本発明では、特に断らない限り、％は、重量（ｇ）／容量（ｌ）×１００である。
【００２３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：アクリルアミド、ビスアクリルアミドから作られた１０％のポリアクリルアミドゲルからなる電気泳動装置を用いて、２５ｍＡの電流で電気泳動を行った。なお、マーカーは、アマシャムバイオサイエンス社製タンパク質電気泳動用有色分子量マーカーを使用した。電気泳動を行った後、０．５％のクーマシーブリリアントブルーによって染色を行った。
【００２４】
ＳＤＣ−ＴＲＰ培地：０．６７％アミノ酸要求性酵母用窒素源｛ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（ディフコ社）｝，２％  カザミノ酸、０．５％  グルコース、３０ｐｐｍロイシン、２０ｐｐｍヒスチジン、２０ｐｐｍアデニン、２０ｐｐｍウラシル。
ＳＤＣ−ＵＲＡ培地：０．６７％アミノ酸要求性酵母用窒素源｛ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（ディフコ社）｝，２％  カザミノ酸、０．５％  グルコース、３０ｐｐｍロイシン、３０ｐｐｍトリプトファン、２０ｐｐｍヒスチジン、２０ｐｐｍアデニン。
ＵＲＡ培地：０．６７％アミノ酸要求性酵母用窒素源｛ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（ディフコ社）｝，２％  カザミノ酸、０．５％  グルコース、３０ｐｐｍロイシン、２０ｐｐｍヒスチジン、２０ｐｐｍアデニン。
【００２５】
実験例１
発現ベクターの構築：Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ  ＩＦＯ  １３４２９  の染色体ＤＮＡを鋳型とし、２種のオリゴマー（５’−ＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣ−３’及び５’−ＡＡＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣ−３’）を用いＰＣＲによりストレプトアビジンのコア領域をコードする約６００塩基対のＤＮＡを増幅させた。これを制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩで処理し、同様に処理したプラスミドｐＵＩ３αＥＧＦＰＦｌｏ３１８（Ｓｈｉｍｏｊｙｏ  ｅｔ．ａｌ．、ジャーナルオブバイオサイエンスアンドバイオエンジニアリング（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．））のＳａｌＩ及びＳｍａＩ領域にライゲーションを行った。得られたプラスミドをプラスミドｐＵＩ３αＳＡＦｌｏ３１８と名付けた。また２種のオリゴマー（５’−ＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＧ−３’及び５’−ＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧ−３’）を用い、ＰＣＲによりストレプトアビジンのコア領域をコードする約６００塩基対のＤＮＡを増幅させ、ＡａｔＩＩ及びＸｈｏＩで処理し、同様に処理したプラスミドｐＷＩ３α（Ｓｈｉｍｏｊｙｏ  ｅｔ．ａｌ．、ジャーナルオブバイオサイエンスアンドバイオエンジニアリング（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．））のＡａｔＩＩ及びＸｈｏＩサイトにライゲーションを行った。得られたプラスミドをプラスミドｐＷＩ３αＳＡと名付けた。
【００２６】
実験例２
酵母の形質転換：得られたプラスミドｐＷＩ３αＳＡ、プラスミドｐＵＩ３αＳＡＦｌｏ３１８をそれぞれサッカロマイセス  セレビシエＭＴ８−１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ８−１）に酢酸リチウム法で導入し、プラスミドｐＷＩ３αＳＡが導入された形質転換酵母をＭＴ８−１／ＳＡ（以下、「ＳＡ」ということがある。）と名付け、プラスミドｐＵＩ３αＳＡＦｌｏ３１８が導入された形質転換酵母をＭＴ８−１／ＳＡＦｌｏ（以下、「ＳＡＦｌｏ」ということがある。）と名付けた。形質転換酵母ＳＡにさらにプラスミドｐＵＩ３αＳＡＦｌｏ３１８を用いて酢酸リチウム法により形質転換を行い、得られた形質転換酵母をＭＴ８−１／ＳＡ＆ＳＡＦｌｏ（以下、「ＳＡ＆ＳＡＦｌｏ」ということがある。）と名付けた。また比較対照として、プラスミドｐＷＩ３αをサッカロマイセス  セレビシエＭＴ８−１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ８−１）に導入した形質転換酵母ＭＴ８−１／α（以下「対象」ということがある）を調製した。
【００２７】
実験例３
培養及びタンパク質発現菌体の調製：得られた形質転換酵母ＳＡ及び対象をそれぞれＳＤＣ−ＴＲＰ培地で３０℃、９６時間培養を行った。また同時に形質転換酵母ＳＡＦｌｏをＳＤＣ−ＵＲＡ培地で３０℃、９６時間培養を行った。さらに形質転換酵母ＳＡと形質転換酵母ＳＡＦｌｏとをＳＤＣ−ＴＲＰ培地，ＵＲＡ培地で３０℃、９６時間培養を行った。培養後の菌体は５０ｍＭリン酸緩衝液で２回洗浄し、ＯＤ６００を２０に調整した各菌体懸濁液を調製した。
【００２８】
実験例４
ストレプトアビジン発現の確認：前記の調製した菌体懸濁液４０μｌを５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１６０μｌ及びガラスビーズ５０ｍｇと混合し、激しく３０秒間攪拌した。その後、遠心分離を行い、上清２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用変性剤２０μｌと混合し、沸騰水中で５分間保温し変性処理を行った。変性処理後２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、電気泳動を行った後、ニトロセルロースメンブランにブロッティングさせた。ブロッティング後、ブロッキング溶液（ナカライ、ＰＢＳ系）中で１時間緩やかに振盪し、洗浄後、１０μｌの抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．製）と３０ｍｌのブロッキング溶液中で１時間緩やかに振盪した。再度これを洗浄し、続いて、２００μｌの抗ヤギＩｇＧ抗体（アルカリフォスファターゼコンジュゲート）と３０ｍｌのブロッキング溶液中で１時間緩やかに振盪し、洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質キット（バイオラッド社製）で発色を行った（図１）。図１より共発現を行った形質転換酵母ＳＡ＆ＳＡＦｌｏ（実施例１、図１中のレーン１）ではストレプトアビジン及びストレプトアビジンとＦｌｏの融合タンパク質が発現し、形質転換酵母ＳＡＦｌｏ（比較例１、図１中のレーン２）はストレプトアビジンとＦｌｏの融合タンパク質が発現し、形質転換酵母ＳＡ（比較例２、図１中のレーン３）ではストレプトアビジンが発現していることが明らかとなった。
【００２９】
実験例５
提示されたストレプトアビジンの活性確認：前記の調製された菌体懸濁液４０μｌを１６０μｌの５０ｍＭ  リン酸緩衝液に懸濁し、５μｌのビオチン化ペルオキシダーゼ（西洋わさび由来）と１０分間、緩やかに振盪しながら室温でインキュベートを行った。同リン酸緩衝液で３度洗浄したのち、ペルオキシダーゼ活性測定キット（バイオラッド社製）で各酵母のペルオキシダーゼを測定し、ビオチン化ペルオキシダーゼの酵母への結合を確認した。その結果は、図２に示した。これより、ビオチン化ペルオキシダーゼは、共発現させたＳＡＦｌｏ／ＳＡに特異的に結合していることが明らかとなった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のオリゴメリックタンパク質を発現した細胞の調製方法により種々オリゴメリックタンパク質を細胞表層に発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの概略図である。
【図２】本発明の酵母表層へ発現したストレプトアビジンへ結合したビオチン化ペルオキシダーゼの量を示すグラフである。
【図１】
2005058010.tif 000002
【図２】
2005058010.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月15日(2004.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
実験例１
発現ベクターの構築：Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ  ＩＦＯ  １３４２９  の染色体ＤＮＡを鋳型とし、２種のオリゴマー（５’−ＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列表の配列番号１）及び５’−ＡＡＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣ−３’（配列表の配列番号２））を用いＰＣＲによりストレプトアビジンのコア領域をコードする約６００塩基対のＤＮＡを増幅させた。これを制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩで処理し、同様に処理したプラスミドｐＵＩ３αＥＧＦＰＦｌｏ３１８（Ｓｈｉｍｏｊｙｏ  ｅｔ．ａｌ.、ジャーナルオブバイオサイエンスアンドバイオエンジニアリング（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．））のＳａｌＩ及びＳｍａＩ領域にライゲーションを行った。得られたプラスミドをプラスミドｐＵＩ３αＳＡＦｌｏ３１８と名付けた。また２種のオリゴマー（５’−ＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＧ−３’（配列表の配列番号３）及び５’−ＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧ−３’（配列表の配列番号４））を用い、ＰＣＲによりストレプトアビジンのコア領域をコードする約６００塩基対のＤＮＡを増幅させ、ＡａｔＩＩ及びＸｈｏＩで処理し、同様に処理したプラスミドｐＷＩ３α（Ｓｈｉｍｏｊｙｏ  ｅｔ．ａｌ．、ジャーナルオブバイオサイエンスアンドバイオエンジニアリング（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．））のＡａｔＩＩ及びＸｈｏＩサイトにライゲーションを行った。得られたプラスミドをプラスミドｐＷＩ３αＳＡと名付けた。
【配列表】
2005058010.tif 000004
2005058010.tif 000005