(57)【要約】【課題】  微細な気孔にも、より容易に細胞を浸透させ、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させる。【解決手段】  密閉可能な容器２内に細胞を含む液体１を貯留し、該液体１内に多孔性の生体組織補填材３を浸漬し、容器２内を吸引して内部圧力を所定圧力まで低下させた後に、漸次大気圧まで上昇させる生体組織補填体の製造方法を提供する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
密閉可能な容器内に細胞を含む液体を貯留し、
該液体内に多孔性の生体組織補填材を浸漬し、
容器内を吸引して内部圧力を所定圧力まで低下させた後に、漸次大気圧まで上昇させる生体組織補填体の製造方法。
【請求項２】
前記容器内の内部圧力を、段階的に大気圧まで上昇させる請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項３】
前記容器内の内部圧力を、振動的に変動させる請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織補填体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、いわゆる再生医療において、術後の生体組織における欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄細胞等から間葉系幹細胞を取り出して、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）やハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）等の生体組織補填材とともに培養することにより、培養骨に代表される生体組織補填体を製造することが提案されている。生体組織補填体は、移植時に、すでに骨補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含んでいるので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家組織に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
生体組織補填体を製造するには、一般に、まず、患者の骨髄細胞等から取り出した間葉系幹細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させる。この過程において、成長した細胞は、少なくとも１回以上、培養容器から剥がされて、さらに大きな培養容器に移し替えられる。そして、最終的に必要細胞数まで増加したところで、再度、培養容器から剥離させられ、生体組織補填材に付着させられて、二次培養が行われる。これにより、生体組織補填体が製造される（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
この場合において、間葉系幹細胞は、生体組織補填材に付着して成長することにより、生体組織の形成が盛んに行われるように活性化させられるので、間葉系幹細胞を生体組織補填材に十分に付着させることが重要になる。また、生体組織補填材が比較的大きい場合には、生体組織補填材の表面だけではなく内部にまで細胞を浸透させ、生体組織補填材の内部から生体組織の形成を行うことが好ましい。
【０００５】
そこで、生体組織補填材として多孔性のものを採用し、各気孔内部にまで細胞を浸透させることで、生体組織補填材内部からの生体組織の形成を促進する技術が考えられている。従来、多孔性の生体組織補填材の気孔内にまで細胞を播種するには、細胞を含む液体（以下、細胞浮遊液という。）を所定の容器内に貯留しておき、その細胞浮遊液内に生体組織補填材を浸漬して、気孔内に細胞浮遊液を流入させることが行われている。この場合において、多孔性の生体組織補填材は、大気中から細胞浮遊液内に投入されるものであるため、各気孔内に空気が閉じこめられており、この気孔内に閉じこめられた気泡によって細胞浮遊液の気孔内への流入が阻害される。
【０００６】
そこで、細胞浮遊液内に生体組織補填材を浸漬した状態で、容器内を大気圧より低い圧力にして気孔内の空気を気孔外に放出させ、直後に容器内を大気圧に戻すことで、気孔周囲の細胞浮遊液を気孔内に吸引する技術が提案されている（例えば、非特許文献３参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【非特許文献３】Jian Dong他４名，「間葉系幹細胞の骨化をサポートするために低圧システムを用いた多孔性ハイドロキシアパタイトの長時間耐久（Long-term durability of porous hydroxyapatite with low-pressure system to support osteogenesis of mesenchymal stem cells）」，バイオメディカルマテリアルズアンドエンジニアリング（Bio-Medical Materials and Engineering），オランダ，アイオーエスプレス（IOS Press），２００２年１２月，ｐ。２０３−２０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記非特許文献３の方法によれば、容器内部を大気圧より低くすることにより、生体組織補填材の気孔内部に閉じこめられている空気は、気泡となって気孔外部に吸い出されるが、大気圧に戻すと同時に再度気孔内部に吸引されてしまい、気孔内への細胞浮遊液の導入を十分に行うことができないという不都合があった。
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、微細な気孔にも、より容易に細胞を浸透させ、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させることができる生体組織補填体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、密閉可能な容器内に細胞を含む液体を貯留し、該液体内に多孔性の生体組織補填材を浸漬し、容器内を吸引して内部圧力を所定圧力まで低下させた後に、漸次大気圧まで上昇させる生体組織補填体の製造方法を提供する。
【００１０】
この発明によれば、容器内に貯留されている細胞を含む液体、すなわち、細胞浮遊液内に多孔性の生体組織補填材を浸漬すると、生体組織補填材の気孔内に空気が閉じ込められたまま液体内に配置されるため、細胞が気泡によって気孔内に入ることを阻害されるが、容器内の内部圧力を所定圧力まで低下させることにより、気圧差によって気孔内から気泡が吸い出される。
【００１１】
そして、その後に急激に大気圧まで戻すのではなく、漸次緩やかに大気圧まで戻すことにより、気泡が気孔内に戻ることなく細胞浮遊液を気孔内に引き入れることが可能となる。その結果、気孔の内部にまで細胞が付着して、内側からも生体組織の再生を行うことが可能な生体組織補填体を製造することができる。
【００１２】
上記発明においては、前記容器内の内部圧力を、段階的に大気圧まで上昇させることが好ましい。
この発明によれば、内部圧力を段階的に上昇させると、急激な圧力上昇と圧力変動停止状態とが小刻みに繰り返され、全体的には漸次緩やかに圧力上昇させられる。その結果、圧力上昇時には気泡が気孔内に戻されるが、圧力変動停止状態では、気泡が、圧力差によって気孔外に吸い出される。したがって、気泡に振動的な挙動を与えることができ、気孔内壁から引き離されるようにして気孔内から脱泡することが可能となる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記容器内の内部圧力を、振動的に変動させることにしてもよい。
この発明によれば、容器の内部圧力が全体的には漸次緩やかに上昇させられながら、振動的に変動させられることによって、より積極的に、気泡に振動的な挙動を与え、気孔内に保持されようとする気泡を気孔内壁から引き剥がして気孔外に放出させることが可能となる。気孔内に残留する空気量を少なくすることができ、生体組織補填材の全領域に細胞を浸透させ、満遍なく生体組織の再生を行わせることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体組織補填材への細胞の浸透性を高めることができる。したがって、細胞を生体組織補填材の内部においても活性化させて、十分に成長させた生体組織補填体を製造することができ、生体組織欠損部に補填された後には、早期に自家組織に置換され、欠損部を迅速に修復することが可能な生体組織補填体を製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明に係る生体組織補填体の製造方法の一実施形態について、図面を参照して説明する。
この製造方法は、図１に示されるように、まず、例えば、骨髄細胞から取り出した間葉系幹細胞を、培養容器内に所定の培養液とともに投入し、一定の培養条件に維持することにより培養する（ステップS1）。
【００１６】
培養液は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、この配合比率は任意であり、また、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。また、また、ＦＢＳがなくてもよい。さらに、培養条件は、例えば、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％である。
【００１７】
この培養の過程（ステップＳ１）においては、定期的にあるいは必要に応じて培養液を交換し（ステップＳ２，Ｓ３）、細胞の成長に合わせて、培養容器も大きいものへと変更していく（ステップＳ４，Ｓ５）。
【００１８】
また、少なくとも１回の培養容器の変更を行いつつ培養された細胞が、必要な細胞数まで増殖させられると（ステップＳ６）、再度、培養容器から剥離されるとともに、細胞どうしの結合も切り離されてバラバラに分離される（ステップＳ７）。その後、バラバラに分離された細胞は、所定の溶液と混合された後に、β―ＴＣＰ多孔体ブロックからなる生体組織補填材に播種される（ステップＳ８）。
【００１９】
図中、符号Ｓ９は分化ステップであり、ある程度増殖した間葉系幹細胞に、デキサメタゾンのような分化誘導因子を添加する。これにより、間葉系幹細胞が、所望の生体組織、例えば、骨芽細胞に分化され、生体組織補填体が製造される。分化ステップＳ９は、図１のように細胞の生体組織補填材への播種の前に、培養中に行うことにより、ある程度、生体組織へ分化誘導された細胞を生体組織補填材に播種することにしてもよく、また、生体組織補填材への播種後に行うことにより、生体組織補填材を足場として生体組織細胞を成長させることにしてもよい。また、符号Ｓ１０は、製造された生体組織補填体に含まれている細胞の状態を評価する評価ステップである。
【００２０】
上記播種ステップＳ８においては、図２に示されるように、バラバラに分離された細胞が、まず、培養液と混合されることにより、所定濃度の細胞浮遊液１が構成される（ステップＳ８１）。培養液は、上述した培養に使用される培養液と同様でよい。細胞浮遊液１は、密閉可能な容器２内に貯留される。この状態で、図３（ａ）に示されるように、細胞浮遊液１内に多孔性の生体組織補填材３が投入される（ステップＳ８２）。このとき、多孔性の生体組織補填材３は大気中から細胞浮遊液１中に浸漬されるため、生体組織補填材３の各気孔内には空気Ａが充満している。ある程度の空気は、投入時に気泡となって生体組織補填材３の外部に放出されるが、気孔が微細であるため、図４に示されるように、表面張力によって気孔内に閉じこめられた状態に保持されている。
【００２１】
次いで、図３（ｂ）に示されるように、容器２の蓋４が気密状態に閉鎖される。容器２の蓋４には負圧ポンプ５が接続されており、該負圧ポンプ５を作動させることにより、容器２内部の空気が吸引される（ステップＳ８３）。図中符号６は、内部圧力調整用のバルブである。
【００２２】
吸引は、容器２の内部圧力が、例えば、６×１０３〜６×１０４Ｐａとなるまで行われる。その結果、生体組織補填材３の気孔内に閉じこめられている空気Ａと、生体組織補填材３の外部空間との間に圧力差が生じ、気孔内の空気Ａは、図５に示されるように、生体組織補填材３の外部に放出されるように移動され、生体組織補填材３の外表面に気泡Ｂとなって付着する。
【００２３】
本実施形態に係る製造方法は、この後の処理において従来の製造方法と相違している。すなわち、本実施形態に係る製造方法は、図６に示されるように、一旦、大気圧よりも低圧に設定された容器２内部の圧力を、段階的に大気圧まで上昇させる（ステップＳ８４）。具体的には、例えば、１段階で７×１０３〜７×１０４Ｐａ程度、容器２内圧が上昇するように、バルブ６を開閉する。そして、１×１０４〜２×１０４Ｐａ／ｍｉｎ程度の速度で圧力が上昇するようにする。各段階は等間隔であっても異なっていてもよい。
【００２４】
このように、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、各段階において変動する圧力差を低く抑えることにより、一旦生体組織補填材３の外部に放出された気泡Ｂが気孔内に引き戻されることを防止することができる。また、生体組織補填材３の外部の圧力を気孔内部の圧力より低い状態に維持しながら、気泡Ｂに、気孔の内外に出入りするような振動的な挙動を行わせることにより、気孔内部に残留している空気Ａを、気孔内から放出する方向に強制することができる。
【００２５】
これにより、気孔内に存在していた空気Ａをできるだけ多く生体組織補填材３の外部に放出させ、その代わりに、気孔内に細胞浮遊液１を浸透させることができる。その結果、内部まで細胞を浸透させた生体組織補填体を製造することができる。
【００２６】
なお、上記実施形態においては、容器内部の圧力変動を図６に示されるように段階的に変化させる方法を例示して説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。すなわち、例えば、図７に示されるように、容器２内部の圧力を段階的にではなく、漸次滑らかに上昇させる方法を採用してもよい。この場合においても、全体として１×１０４〜２×１０４Ｐａ／ｍｉｎ程度の速度で圧力が上昇するようにすればよい。
【００２７】
また、図８に示されるように、容器２内圧をさらに振動的に変動させることにしてもよい。このようにすることで、気孔内部に残留している空気Ａに、さらに強く振動的な挙動を行わせることが可能となり、気孔内部の空気Ａをさらに効率よく除去することが可能となる。
【００２８】
また、圧力変動による気孔内の空気Ａの放出に加えて、細胞の気孔内壁への付着性を高めることにより、細胞を気孔内部まで浸透させる方法を併用してもよい。付着性を高める方法としては、例えば、細胞浮遊液１に、ＰＲＰおよび塩化カルシウム溶液を添加した状態で、上述した容器２内部の圧力変動を生じさせる方法が考えられる。
【００２９】
ＰＲＰに含まれるフィブリノーゲンの添加量は、おおよそ２〜４５ｍｇ／ｍｌの濃度の細胞浮遊液１が構成される程度の量でよい。また、塩化カルシウム溶液は、ＰＲＰに対して、おおよそ０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．１ｍｏｌ／ｌの濃度となるように塩化カルシウムを溶解させたものである。
【００３０】
ＰＲＰにはクエン酸ナトリウムが含まれているので、添加された塩化カルシウムとクエン酸ナトリウムとが反応してゲル化が開始される。ゲル化の反応は一般に緩やかであり、粘性が高まるまでに数分程度かかるので、塩化カルシウム添加直後であれば、ゲル化は進行しておらず、細胞浮遊液１の粘性は低い状態に維持されている。したがって、細胞は、比較的容易に生体組織補填材３の気孔内に浸透していくことが可能となる。そして、細胞が生体組織補填材３の中心まで浸透する頃には、クエン酸ナトリウムと塩化カルシウムとのゲル化反応が進行し、細胞浮遊液１はゲル化させられて粘性が急激に上昇する。
【００３１】
すなわち、圧力変動による気泡の放出と、細胞浮遊液１のゲル化とのタイミングを調整することにより、気泡Ｂ放出により気孔内に進入した細胞浮遊液１が、気孔内に戻ろうとする気泡Ｂによって追い出されることなく気孔内に滞留して付着することができ、さらに効率液に細胞を気孔内に浸透させることができるという効果がある。
【００３２】
この場合において、ゲル化可能材料としてＰＲＰを採用しているので、ＰＲＰに含まれているＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ等の成長因子の作用により、生体組織補填材に付着した細胞の活性化を促進することができる。したがって、簡易に気孔の内部に付着させて、内部から細胞を３次元的に成長させることができるとともに、細胞の活性化を促進して、組織再生を効率的に行うことができる生体組織補填体を製造することができる。
【００３３】
また、気孔内に浸透させられた細胞が、ゲル化した細胞浮遊液１によって気孔内に保持されるので、従来必要であった、細胞を生体組織補填材３に付着させるための培養工程を省略することができるという効果もある。すなわち、導入直後の細胞は生体組織補填材３の気孔内壁に付着するまでに時間がかかるため、培養容器内に静置して、所定時間培養する必要があった。しかし、上記のようにして製造された生体組織補填体は、ゲル化した細胞浮遊液１によって細胞が気孔内から流出することが禁止されるので、静置する必要がない。したがって、細胞を生体組織補填材３に付着させるための静置培養工程を不要とし、あるいは短縮することができるので、製造効率を高め、製造時間を短縮することができる。
【００３４】
なお、上記においては、細胞浮遊液１にＰＲＰに含まれる適切なフィブリノーゲンと塩化カルシウム溶液とを添加することによりゲル化させる方法を採用した。添加するＰＲＰ、塩化カルシウムの量を適宜調節することにより、ゲル化の程度、すなわち、ゲル化した後の粘性の大小、ゲル化する速度の大小を調節することができる。また、塩化カルシウムに加えて、トロンビンのような血液凝固剤を併用してもよい。すなわち、トロンビンを塩化カルシウム溶液とともに細胞浮遊液１に添加することにより、塩化カルシウムとクエン酸ナトリウムとの反応によってゲル化が行われるとともに、細胞浮遊液１内部の血液成分がトロンビンによって凝固させられることによって、細胞浮遊液１の粘性がさらに高められることになる。
【００３５】
添加する塩化カルシウムやトロンビンの量は、細胞を播種すべき生体組織補填材３の形態に応じて設定することにしてもよい。すなわち、気孔が大きく細胞が流出しやすい生体組織補填材３に対しては、比較的早期にゲル化が開始され、かつ、より高い粘性のゲル状になるように塩化カルシウムやトロンビン量を増やすことが考えられる。また、気孔が細密で粘性が高いと細胞浮遊液１が浸透して行きにくい生体組織補填材３に対しては、比較的ゆっくりしたゲル化速度でよく、最終的なゲルの粘性も低く設定してよい。したがって、このような場合には、塩化カルシウムやトロンビンの添加量は少なくてよい。
【００３６】
また、ＰＲＰ自体は患者から採取するものであるため、ゲル化速度にも個人差がある。したがって、採取されたＰＲＰの成分分析により、添加する塩化カルシウム等の量を決定してもよい。
【００３７】
また、ゲル化可能材料として、ＰＲＰを例に挙げて説明した。ＰＲＰはＴＧＦ−βのような成長因子を多く含んでいるためにゲル化可能材料として適しているが、これに限定されるものではなく、他の材料、例えば、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンのような生体吸収性のゲル化可能材料を採用することにしてもよい。
【００３８】
また、播種する細胞として、骨髄細胞から集めた間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を採用することにしてもよい。また、間葉系幹細胞を骨髄から採取することとしたが、これに代えて、抹消血や臍帯血から採取することにしてもよい。
【００３９】
また、細胞を播種する生体組織補填材３としては、β―ＴＣＰ多孔体に代えて、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組み合わせを用いてもよい。また、チタンのような金属であってもよい。また、形態もブロック状、顆粒状等任意の形態を採用してよい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法における細胞の播種ステップを説明するフローチャートである。
【図３】図２の播種ステップにおける操作を説明する模式図である。
【図４】細胞浮遊液内に投入した状態の生体組織補填材の内部に存在する気泡の様子を示す模式図である。
【図５】容器内部を吸引して低圧状態にしたときの生体組織補填材の内部に存在する気泡の動きを説明する模式図である。
【図６】本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法における容器内部の圧力変動パターンを示すグラフである。
【図７】容器内部の圧力変動パターンの変形例を示すグラフである。
【図８】容器内部の圧力変動パターンの他の変形例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４１】
１  細胞浮遊液（細胞をｓ含む液体）
２  容器
３  生体組織補填材
【図１】
2005160668.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005160668.tif 000007
【図６】
2005160668.tif 000008
【図７】
2005160668.tif 000009
【図８】
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