(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトおよび他の動物の軟骨または骨における病変の修復を誘導するために有効な治療法および組成物の提供。【解決手段】骨欠損を充填するマトリックスは、血管形成因子を含有し、そして適切なデリバリーシステムにおいて骨形成因子もまた含有する。軟骨形成を誘導するために、軟骨における欠損は、軟骨の修復細胞がマトリックスを占めるのに充分に大きい孔を有するマトリックスで充填される。この軟骨における欠損を充填するマトリックスは、増殖因子を含有し、そして適切なデリバリーシステムにおいてトランスフォーミング因子もまた含有する。このマトリックスはまた、軟骨の修復細胞を誘引するための走化性因子を含有し得る。骨および軟骨における欠損部位は、互いに膜によって分離される。この膜によって、上記軟骨性骨の関節はシールされ、そしてこの膜は、血管および関連した細胞がある部位から他の部位へ浸透することを妨げる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、骨における欠損の治療のための組成物：
骨における欠損を充填するために用いられるマトリックスまたはマトリックス形成物質；
該マトリックスおよび該欠損の領域中の、血管および関連した細胞の形成およびそれらの内部成長を刺激するのに適切な濃度の血管形成因子；および
デリバリーシステムと関連し、そして該マトリックスおよび欠損部分の細胞へ骨形成因子を送達するに際し適切な濃度で関連する骨形成因子；ここで、該細胞は骨を形成する骨の細胞に生長する。
【請求項２】
前記血管形成因子が、bFGF、bFGFと硫酸ヘパリンとの混合物、TGF-β、PDGF、TNF-α、アンジオトロピンまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記骨形成因子が、TGF-β、TGF-βとEGFとの混合物、オステオゲニン、BMPまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記欠損領域を充填するために用いられる前記マトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、リン酸カルシウムを含有する化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記血管形成因子が、bFGFと硫酸ヘパリンとの混合物であり、各々が前記マトリックス中に5-10 ng/mlの濃度で存在し、そして前記骨形成因子が、マトリックス溶液の100 ng/mlのTGF-β濃度を提供する適切なデリバリーシステムと関連するTGF-βである、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
前記デリバリーシステムが、 リポソーム、生物腐食性ポリマー、硫酸ヘパリンプロテオグリカンに化学的に結合したコラーゲン繊維、炭水化物ベースの小体、および水−油のエマルジョンからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
骨における欠損の治療のための組成物であって、
コラーゲン性のマトリックス溶液；
マトリックス溶液で5-10 ng/mlの濃度で存在する、塩基性のFGFおよび硫酸ヘパリン；および
リポソームに被包され、そしてマトリックス溶液で100 ng／mlの濃度で存在する、TGF-β、
を含有する、組成物。
【請求項８】
動物の骨組織中の選択された部位で、骨形成を誘導する方法であって、請求項1に記載の組成物で該部位を充填することを包含する、方法。
【請求項９】
動物の骨組織中の選択された部位で、骨形成を誘導する方法であって、請求項7に記載の組成物で該部位を充填することを包含する、方法。
【請求項１０】
動物の骨における欠損を治療する方法であって、
血管形成を刺激するために有効な量の血管形成因子および成熟した骨組織に細胞分化を誘導するのに有効な量のデリバリーシステムに関連する骨形成因子を含有するマトリックスで、該欠損を充填することを包含する、方法。
【請求項１１】
動物の関節における全層性欠損を治療するための方法であって、
第1のマトリックスで該全層性欠損の骨の部分を充填すること：ここで、該第1のマトリックスは、血管の形成および内部成長を関連した細胞で刺激するのに有効な量の血管形成因子を含有し、そして骨を形成する骨の細胞に骨の修復細胞の分化を誘導するのに充分な濃度で骨形成因子を放出するデリバリーシステムと関連する該骨形成因子を含有する；
該全層性欠損の該マトリックスで充填された骨の部分を、膜で被覆すること：ここで該膜は、該骨欠損側から軟骨欠損側への細胞の移動を妨げる；
該軟骨性骨の関節の領域における該欠損の周辺部分を該膜でシールすること：および
第2のマトリックスで該全層性欠損の軟骨の部分を充填すること：ここで、該第2のマトリックスは、修復細胞の増殖を刺激するのに有効な量の増殖因子、修復細胞を誘引するのに有効な量の走化性因子、そして修復細胞を軟骨細胞にトランスフォームするのに充分な濃度でトランスフォーミング因子を放出するデリバリーシステムと関連する有効な量の該トランスフォーミング因子を含有する；
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記全層性欠損または病変を前記第2のマトリックスで処理する前に、該欠損の前記軟骨の部分の表面をトランスグルタミナーゼで被覆する工程をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨形成因子、前記増殖因子、および前記トランスフォーミング因子が、TGF-βである、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランスフォーミング因子および前記骨形成因子の送達のための前記デリバリーシステムが、リポソーム、生物腐食性ポリマー、硫酸ヘパリンプロテオグリカンに化学的に結合したコラーゲン繊維、炭水化物ベースの小体、および水−油のエマルジョンからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
前記第1のマトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、およびリン酸カルシゥムを含有する化合物またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
前記第2のマトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
前記第1のマトリックスおよび前記第2のマトリックスが、前記欠損または病変をフィブリノーゲン溶液で充填するすぐ前に、該フィブリノーゲン溶液にトロンビンを添加することによって形成されるフィブリンである、請求項11に記載の方法。
【請求項１８】
前記血管形成因子が、bFGFと硫酸ヘパリンとの混合物であり、各々が前記第1のマトリックスで5-10 ng/mlの濃度で存在し；
前記骨形成因子が、リポソームに被包され、そして第1の生物分解性マトリックスで100 ng/mlの濃度で存在する、TGF-βであり；
前記増殖因子および前記走化性因子が、前記第2のマトリックスで2-10 ng/mlの濃度で存在するTGF-βであり；そして
前記トランスフォーミング因子が、リポソームに被包され、そして第2マトリックスで100 ng/mlの濃度で存在する、TGF-βである、 請求項11に記載の方法。
【請求項１９】
前記第1のマトリックスおよび前記第2のマトリックスが、トリペプチドArg-Gly-Aspを含む細胞接着促進因子をさらに含有する、請求項11に記載の方法。
【請求項２０】
動物の関節における全層性欠損を治療するための方法であって、
該全層性欠損の骨の部分を第1のコラーゲン性マトリックスで充填すること：ここで、該第1のコラーゲン性マトリックスは、bFGFおよび硫酸ヘパリンを含有し、各々は該第1のコラーゲン性マトリックスで5-10 ng/mlの濃度で存在し、そしてリポソーム中のTGF-βを該第1のコラーゲン性マトリックスで100 ng/mlの濃度で含有する；
該全層性欠損の該第1のコラーゲン性マトリックスで充填された骨の部分を、膜で被覆すること：ここで該膜は、該血管および細胞を透過しない：
軟骨性骨の関節の領域における該欠損の端の周辺部分を該膜でシールすること；
該全層性欠損の軟骨の部分を第2のコラーゲン性マトリックスで充填すること：ここで、該第2のコラーゲン性マトリックスは、TGF-βを該第2のコラーゲン性マトリックスで2-10 ng/mlの濃度で含有し、そしてリポソーム中のTGF-βを該第2のコラーゲン性マトリックスで100 ng/mlの濃度で含有する；
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記全層性欠損を前記第2のコラーゲン性マトリックスで充填する前に、該欠損の前記軟骨の部分の表面をトランスグルタミナーゼで被覆する工程をさらに包含する、請求項20に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨または骨における欠損または病変の治療および修復に関する。さらに詳細には、本発明は、軟骨または骨における欠損または病変（本明細書中では互換的に用いられている）を治療する方法に関し、そして新しい安定な軟骨組織を形成する軟骨修復細胞の増殖およびトランスフォーメーションを促進するための1種またはそれ以上の増殖因子ならびにトランスフォーミング因子を含有するマトリックスを含む組成物に関し、そして血管形成を刺激する血管形成促進因子および骨形成を刺激する骨形成因子を含有するマトリックスを含む組成物に関する。本発明の組成物および方法は、重篤な変形性関節症および、軟骨または骨の損傷を生じる他の疾患および外傷において見られる全層性欠損の治療に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
関節は、骨格内の骨が接続される通常の方法の1つである。正常な関節をなす骨の末端は、関節軟骨組織により覆われており、お互いに対して実際的に摩擦のない動きをさせる[L. Weiss編、 Cell and Tissue Biology （Munchen：Urban and Schwarzenburg，1988）p．247]。
関節軟骨は、特定の構造組織により特徴付けられる。それは、プロテグリカン、主にII型のコラーゲン原線維、他のタンパク質、および水に富んでいる細胞間物質（しばしば、論文中では「軟骨マトリックス」と言う）中に埋め込まれた特定の細胞（軟骨細胞）から成っている［Buckwalterら，Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissues （Park Ridge, I11.： AmericanAcademy of Orthopaedic Surgeons Symposium，1987）p．465）中の「関節軟骨：損傷および修復（Articular Cartilage：Injury and Repair）」］。軟骨組織は、神経支配されず、血管系またはリンパ系により浸透されない。しかし、成人の成熟した関節では、骨組織と軟骨との間の狭くて連続するプレートを形成する土台となる軟骨下の骨組織は、神経支配され、血管新生される。この骨プレートの下の方に、骨組織は骨髄を有する柱を形成する。未成熟な関節では、関節軟骨は、原始骨柱のみにより強調される。関節の半月組織の一部もまた、関節軟骨と同様の構成である軟骨から成っている［Beaupre，A．ら、Clin．Orthop．Rel．Res．，pp．72-76（1986）］。
【０００３】
関節表面では、2つの型の欠損、すなわち全層性欠損および表面性欠損が認められる。これらの欠損は、軟骨への物理的損傷の程度において異なるだけでなく、各型の病変が誘起し得る修復応答の性質においても異なる。
【０００４】
関節表面の全層性欠損は、硝子軟骨（hyaline cartilage）、石灰化軟骨層、および、血管および骨髄を有する軟骨下の骨組織に対する損傷を含む。全層性欠損は、骨プレートが知覚神経終末を含むので、激痛を生じ得る。そのような欠損は、一般的には重篤な外傷から生じるか、または変形性関節症のような変性関節疾患の末期に生じる。全層性欠損は、ときどき、出血および軟骨下の骨からの修復反応の誘導を導く［Buckwalterら， Articular Cartilage and Knee Joint Function： Basic Science and Arthroscopy （New York： Raven Press，1990）pp．19−56の「関節軟骨：組成、構造、損傷に対する応答、および修復を促進する方法（Articular Cartilage：Composition, Structure, Response to Injury, and Methods of Facilitating Repair）」］。形成された修復組織は、不十分な生物機械的特性を有する血管新生線維型の軟骨であり、そして長期に基づいては持続しない［Buckwalterら、（1990）上述］。
【０００５】
関節軟骨組織の表面性欠損は、軟骨組織それ自身に限定される。そのような欠損は、それらが治癒しなく、修復反応の傾向を示さないことでよく知られている。
【０００６】
表面性欠損は、軟骨表面の亀裂、小塊または裂溝として現れ得、または冒された組織では「カニ肉（crab-meat）」の外観を有し得る。これらは、全層性欠損において見られるような出血血管（血斑）を含まない。表面性欠損は、その原因は知られていないが、しばしば、軟骨質組織の摩耗に通じる機械的な障害の結果である。機械的な障害は、関節への外傷、例えば、関節内への引き裂かれた半月組織の取り換え、半月板摘出、引き裂かれた靭帯による関節の弛緩、関節の不正列、または骨折により生じ得るか、または遺伝病により生じ得る。表面性欠損はまた、変形性関節症などの変性関節疾患の初期の特徴でもある。軟骨組織は、神経支配されていないので［Ham's Histology（第9版）（Philadelphia： J．B．Lippincott Co．1987），pp．266−272］、または血管新生されないので、表面性欠損には痛みがない。しかし、無痛性の表面性欠損は治癒せず、そしてしばしば全層性欠損に変質する。
【０００７】
関節軟骨は血管系を欠くので、損傷した軟骨組織は、修復応答を引き出すのに十分な、または適切な刺激を受けないことが、一般的に考えられている［Webberら，「ウサギ半月線維軟骨の内因性修復能：細胞培養モデル（Intrinsic Repair Capabilities of Rabbit Meniscal Fibrocartilage： A Cell Culture Model）」，（30th Ann. Orthop. Res. Soc.，Atlanta，Feb. 1984）：Webberら、J. Orthop. Res．， 3， pp.36-42（1985）］。軟骨質組織の軟骨細胞は、成長因子のような修復刺激因子および損傷した血管新生組織に典型的に存在するフィブリン塊の十分な量に通常は曝されていないことが理論付けられている。
【０００８】
損傷した軟骨組織を修復刺激に曝すために用いられてきた1つの方法には、軟骨を通って軟骨下の骨に孔を開けるか、または削って出血を引き起こすことが包含される［Buckwalterら，（1990），上述］。不運にも、そのような手術上の外傷に対する組織の修復応答は、通常、出血を起こす全層性欠損に自然に起こることが認められている修復応答と類似しており、すなわち、それは不十分な生物機械的特性を示し、長期に基づいて持続しない線維型軟骨の形成である［Buckwalterら，（1990），上述］。
【０００９】
種々の成長因子が単離され、そして現在研究および生物医学の応用のため入手可能である［例えば、Rizzino，A．，Dev. Blol．，130，pp．411-422（1988）を参照のこと］。トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）のようなこれらの成長因子のいくつかが、インビトロにおける胎児期ラット間葉細胞において、II型コラーゲンおよび軟骨特異性プロテオグリカンのような軟骨特異性分子の形成を促進することが報告された［例えば、Seyedinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，82，pp．2267-71（1985）：Seyedinら、 J. Blol. Chem.， 261， pp. 5693-95（1986）；Seyedinら、J. Blol. Chem．， 262，pp．1946-1949（1987）］。
【００１０】
さらに、明らかに骨の形成を刺激する多くのタンパク質因子が同定された。そのような骨形成因子には、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、骨形成タンパク質（BOP）、TGF-β、および組換え骨誘導タンパク質が包含される。
【００１１】
何百万もの患者が、変形性関節症であると診断されており、すなわち、かれらの関節軟骨内に変性欠損または病変を有すると診断されている。しかし、損傷した軟骨において修復応答を誘起する種々の方法の請求の範囲にもかかわらず、実質的に応用される治療法はない［Buckwalterら（1990）、上述：Knutsonら、J．Bone and Joint Surg．， 68-B， p.795（1986）；Knutsonら、J．Bone and Joint Surg．，67-B， p.47（1985）：Knutsonら、Clin. Orthop.， 191， p.202（1984）； Marquet，Clin. Orthop.，146，p．102（1980）］。そして、そのような治療法は、一般的に、一時的な軽減を与えるのみである。「軟骨保護因子」の全身的な使用はまた、変形性関節症の進行を阻止し、痛みの軽減を誘導することを意図してきた。しかし、そのような因子は、軟骨組織における病変または欠損の修復を促進することは示さなかった。
【００１２】
現在まで、変形性関節症に苦しむ患者の治療は、鎮痛剤および抗炎症剤の使用による症状の軽減に主として向けられていた。関節軟骨における表面性欠損の修復を誘起する治療なしでは、軟骨はしばしば、軟骨下の骨プレートにまで摩耗する。この疾患、すなわち重篤な変形性関節症のこの時期には、絶え間なく続く性質の痛みおよび機能の重大な譲歩が、関節全体の切除、および、金属および／またはプラスチックの人工関節との交換を指示する。関節切除および人工関節との交換を含むおよそ50万もの手技が、膝および股関節部について毎年実施されている［例えば、Graves，E．J．，1988 Summary： National Hospital Discharge Survey」，Advanced Data From Vital and Health Statistics， 185，pp.1-12 June 19, 1990）］。
【００１３】
それゆえ、例えば、変形性関節症の初期に見られるような表面性軟骨欠損の軟骨に対する信頼される治療法の必要性が存在する。さらに、重篤な変形性関節症の病変において見られるような軟骨または骨の欠損の治療法、ならびに他の骨欠損の治療法の必要性も存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の要旨
本発明は、ヒトおよび他の動物の軟骨または骨における病変の修復を誘導するために有効な治療法および組成物を提供することにより、上記の問題を解決する。本発明の方法および組成物の使用はまた、外傷性病変、および、予想される関節の切除および交換に通じる、有効な関節機能の喪失を他の点で招く各型の変形性関節症の治癒を促進する。
【００１５】
概略すると、関節の全層性欠損を修復する本発明の方法は、動物組織内に取り込まれて、一般的に生物分解性であるマトリックスを用いて、骨−軟骨境界面のレベルまで全層性欠損の骨部分の欠損を充填することを包含する。このマトリックスは、血管形成促進因子および骨形成因子を含有する。次に、骨欠損を充填するこのマトリックスは、膜で覆われ、細胞には不浸透性である。膜は、軟骨−骨接合部にて欠損の周縁にシールされ、例えば、熟ナイフまたはレーザーを用いる加熱接着により軟骨にシールされる。欠損の残りの軟骨部分は、軟骨形成組成物を含有し、動物組織内に取り込まれて、一般的に生物分解性であるマトリックスを用いて、軟骨表面の上部まで充填される。血管形成促進因子および骨形成因子を含有するマトリックスはまた、修復を促進するために任意の骨欠損に適用され得る。軟骨を含まない骨欠損を修復するための本発明の方法は、血管形成促進因子（または複数の血管形成促進因子）および骨形成因子（または複数の骨形成因子）を含有するマトリックスを用いて骨欠損を充填することを組み合わせる。骨形成因子（または複数の骨形成因子）は、適切なデリバリーシステム内にパッケージされる。
【００１６】
全層性欠損の治療は、関節鏡検査手技、切開手術手技、または経皮的手技時に有効であり得る。本発明の特定の方法により、欠損の同定後に、その欠損は、（1）血管形成促進因子および骨形成因子を含むマトリックスを含有し、適切なデリバリーシステム内、例えば、リポソーム内にパッケージされた組成物を用いて、欠損の骨部分を充填する工程；（2）細胞が、骨欠損側から軟骨欠損側へ移動するのを妨げる膜、好ましくは生物分解性膜を、骨欠損中のマトリックス上に配置し、そしてその膜を軟骨−骨接合部にて欠損の周縁にシールする工程；および（3）欠損の軟骨部分を、好ましくは生物分解性であり、増殖因子およびトランスフォーミング因子を含むマトリックスを含有し、適切なデリバリーシステム内にパッケージされた組成物を用いて充填する工程；により治療される。この最終工程において、マトリックスは、例えば、トランスグルタミナーゼのような接着促進因子を用いて、全層性欠損の軟骨部分の表面に結合される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明がより完全に理解され得るために、以下の詳細な説明が提供される。この説明においては、以下の用語が使用される。
【００１８】
血管形成促進因子−−本明細書中に使用されているように、血管および関連細胞（例えば、内皮細胞、血管周囲細胞、間葉細胞および平滑筋細胞）ならびに血管関連基底膜の形成を誘導または刺激する任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の任意の化合物または組成物のことである。血管形成促進因子に対するインビボおよびインビトロのアッセイは、当該分野では公知である［例えば、Gimbrone，M.A.ら、J. Natl. Cancer Inst．，52，pp．413−419（1974）；Klagsbrun，M.ら、 Cancer Res．， 36, pp.110-113（1976）； Grossら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA），80，pp．2623-2627（1983）；Gospodarowiczら、 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)， 73, pp.4120-4124（1976）； Folkmanら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA），76，pp．5217-5221（1979）；Zetter，B．R．，Nature（London），285， pp．4-43（1980）： Azizkhan， R． G．ら、 J. Exp. Med， 152， pp.931-944（1980）］。
【００１９】
関節鏡検査法−−本明細書中に使用されているように、関節上で検査または手術を行うための関節鏡の使用のことである。
【００２０】
骨−−本明細書中に使用されているように、沈積力ルシウムおよびハイドロキンアパタイトの形態のリン酸塩の網様構造、コラーゲン（主に、I型コラーゲン）および骨芽細胞および破骨細胞のような骨の細胞を主として含有する石灰化結合組織のことである。
【００２１】
骨修復細胞−−本明細書中に使用されているように、適切な刺激に曝されたときに、分化して、骨芽細胞または骨細胞のような骨の細胞にトランスフォームして、骨を形成する細胞のことである。骨修復細胞には、血管周囲細胞、間葉細胞、線維芽細胞、線維芽細胞様細胞および脱分化軟骨細胞が包含される。
【００２２】
軟骨−−本明細書中に使用されているように、コラーゲン（IX型およびXI型などの他の非主要型コラーゲンを伴った、主にII型コラーゲン）の原線維、種々のプロテオグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、およびデルマタン硫酸プロテオグリカン）、他のタンパク質、および、水を含有する細胞間物質中に埋め込まれた軟骨細胞（しばしば、「軟骨マトリックス」と言う）を含有する、1つの型の結合組織のことである。本明細書中に使用されている軟骨には、関節軟骨および半月軟骨が包含される。関節軟骨は、関節内の骨の部分の表面を覆い、そして骨と骨との直接の接触なしに関節の動きを可能にし、そしてそのことにより並置する骨に対して摩耗および損傷を防止する。最も正常で健全な関節軟骨もまた、「硝子質（hyaline）」として記載され、すなわち特徴的なつや消しガラスの外観を有する。半月軟骨は、通常、衝撃および運動に曝される関節内に認められる。そのような半月軟骨の場所には、顎関節、胸鎖関節、肩鎖関節、橈骨手根関節および膝関節が包含される［Gray's Anatomy（New York：Bounty Books，1977）］。
【００２３】
軟骨修復細胞−−本明細書中に使用されているように、適切な刺激に曝されたときに、分化して、軟骨細胞内にトランスフォームする細胞のことである。軟骨修復細胞には、間葉細胞、線維芽細胞、線維芽細胞様細胞、マクロファージおよび脱分化軟骨細胞が包含される。
【００２４】
細胞接着促進因子−−本明細書中に使用されているように、フィブロネクチンおよびトリペプチドArg-Gly-Aspを含むテトラペプチドと同じ小ささの他のペプチドを含有し、細胞外物質への細胞の接着を仲介する任意の化合物または組成物のことである［Ruoslathiら、Cell，44，pp．517-518（1986）］。
【００２５】
走化性因子−−本明細書中に使用されているように、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質およびグリコサミノグリカン鎖を含有し、標準インビトロ走化性アッセイにおいて細胞を誘引し得る任意の化合物または組成物のことである［例えば、 Wahlら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 84， pp． 5788−92（1987）： Postlewaiteら、 J. Exp. Med．， 165， pp．251−56（1987）； Mooreら、 Int. J. Tiss. Reac．， XI， pp. 301−07（1989）］。
【００２６】
軟骨細胞−−本明細書中に使用されているように、軟骨組織の成分、例えば、II型軟骨質原線維および線維ならびにプロテオグリカンを産生し得る細胞のことである。
【００２７】
繊維芽細胞成長因子(FGF) −−FGFポリペプチド族の任意のメンバー［Gimenez-Gallegoら、Biochem．Biophys. Res．Commun.，135，pp．541-548 （1986）：Thomasら、Trends Biochem. Sci．，11，pp.81-84（1986）］またはその誘導体のことであり、それらは、天然源、合成源または組換え源から得られ、インビトロにおいて種々の細胞のDNA合成および細胞分裂を刺激する能力を示す［アッセイについては、例えば、Gimenez-Gallegoら、1986，上述：Canalisら、 J. Clin. Invest. ,81，pp．1572−1577（1988）を参照のこと］。種々の細胞には、一次線維芽細胞、軟骨細胞、血管内皮細胞および角膜内皮細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、平滑筋細胞およびグリア細胞が含まれる［Thomasら、1986，上述］。FGFは、それらの等電点（pl）により酸性FGF（aFGF）または塩基性FGF（bFGF）に分類され得る。
【００２８】
マトリックス−−本明細書中に使用されているように、細胞をマトリックス中に存在させるのに十分な大きさの孔または間際を有する固体または半固体物質の多孔性コンポジットのことである。用語マトリックスには、マトリックス形成物質、すなわち軟骨または骨の欠損部位内でマトリックスを形成し得る物質のことである。マトリックス形成物質は、マトリックスを形成するために重合剤の添加を必要とし得、例えば、フィブリンマトリックスを形成するためにフィブリノーゲンを含む溶液にトロンビンを添加する。他のマトリックス物質には、コラーゲン、コラーゲンとフィブリンとの結合体、アガロース（例えば、SepharoseRや）およびゼラチンを包含される。リン酸カルシウムは、骨における欠損の治療において、単独または他のマトリックス物質と組み合わせて使用され得る。
【００２９】
膜−−本明細書中に使用されているように、全層性欠損の骨欠損部分と軟骨欠損部分との間に位置し得、全層性欠損の、骨欠損部分から軟骨欠損部分への細胞移動および血管浸潤を妨げる任意の物質のことである。本方法に使用される膜および全層性欠損の修復のための本発明の組成物は、好ましくは生物分解性である。
【００３０】
骨形成因子−−本明細書中に使用されているように、骨の形成を誘導または刺激する任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の任意の化合物または組成物のことである。骨形成因子は、骨芽細胞または骨細胞などの骨の細胞への骨修復細胞の分化を誘導する。このプロセスは、軟骨組織の中間状態を経て達成され得る。骨の細胞から形成された骨組織は、I型コラーゲン原線維、ハイドロキンアパタイトミネラル、および種々の糖タンパク質ならびに少量の骨プロテオグリカンなどの骨特異性物質を含有する。
【００３１】
増殖(マイトジェン)因子−−本明細書中に使用されているように、インビトロで細胞の増殖を刺激し得るペプチド、タンパク質および糖タンパク質を含む任意の化合物または組成物のことである。ペプチド、ポリペプチドおよび他の化合物の増殖（マイトジェン）活性を決定するインビトロアッセイは、当該分野では公知である［例えば、Canalisら、 J. Clin. Invest.， pp．1572−77（1988）； Gimenez-Gallegoら、Biochem. Biophys. Res. Commun.，135，pp．541-548（1986）：Rizzino，「トランスフォーミング成長因子およびマイトジェンペプチドの軟寒天成長アッセイ（Soft Agar Growth Assays for Transforming Growth Fctors and Mitogenic Peptides）」， in Methods Elzymol．， 146A （New York： Academic Press，1987），pp．341−52 ; Dicksonら、「スカベンジャーに対する前駆物質の細胞取込み、デノボDNA合成および正味DNA合成のマイトジェン誘導効果のアッセイ（Assay of Mitogen-InducedEffects on Cellular Incorporation of Precursors for Scavengers， de Novo， and Net DNA Synthesis）」，in Methods Elzymol.， 146A （New York： Academic Press， 1987），pp.329−40を参照のこと］。化合物または組成物の増殖（マイトジェン）活性を決定する1つの標準的な方法は、軟寒天においてトランスフォームされていない細胞の、足場非依存性成長を誘導する能力に対して、インビトロでアッセイすることである［例えば、Rizzino，1987上述］。他のマイトジェン活性アッセイ系もまた周知である［例えば、Gimenez-Gallegoら、1986，上述；Canalisら、1988，上述：Dicksonら、1987，上述］。因子のマイトジェン効果はしばしば、非常に濃度依存性であり、そしてそれらの効果は、マイトジェン有効最適濃度範囲よりも低濃度または高濃度において減退され得る。
【００３２】
トランスフォーミング因子−−本明細書中に使用されているように、軟骨細胞への軟骨修復細胞の分化を誘導する任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または、他の任意の化合物または組成物のことである。細胞による軟骨特異性プロテオグリカンおよびII型コラーゲンの産生を誘導または刺激する化合物または組成物の能力は、当該分野で公知のインビトロアッセイにより決定され得る[Seyedinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 82， pp.2267-71（1985）；Seyedinら、Path. Immunol. Res., 7, pp. 38-42（1987）]。
【００３３】
トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）−−TGF-βポリペプチド族の任意のメンバー[Derynck,R.ら、Nature，316， pp.701-705（1985）：Robertsら，「トランスフォーミング成長因子β（The transforming growth factor-β's）」，In Peptide growthfactors and their receptors I（Berlin：Springer Verlag，1990），p．419]またはそれらの誘導体のことであって、それらは、天然源、合成源または組換え源から得られ、軟寒天アッセイにおいて正常ラット腎（NRK）を刺激し、増殖してコロニーを形成する特徴的なTGF―βの能力を示し［Robertsら，「非新生物組織からのβ型トランスフォーミング成長因子の精製（Purification of Type β Transforming Growth Factors From Nonneoplastic Tissues）」，in Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-Free Animal Cell Culture（New York： Alan R. Liss, Inc, 1984）］、そしてインビトロで細胞による軟骨特異性プロテオグリカンおよびII型コラーゲンの産生を誘導または刺激する能力により立証されるように、軟骨細胞への軟骨修復細胞のトランスフォーメーションを誘導し得る［Seyedinら、1985，上述］。
【００３４】
本発明は、軟骨または骨における欠損または病変を治療するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、マトリックス中に細胞を存在させるのに十分な大きさの孔を有するマトリックスを含有する。
【００３５】
表面性欠損または全層性欠損の軟骨層におけるような軟骨の修復における使用に対しては、マトリックスはさらに、マトリックス中の軟骨修復細胞の増殖を刺激するために増殖因子を含有する。好ましくは、増殖因子はまた、マトリックスに軟骨修復細胞を誘引する走化性因子として作用する。あるいは、マトリックスは、増殖因子に加えて走化性因子を含有し得る。本発明の1つの好ましい実施態様では、マトリックスはまた、適切な濃度のトランスフォーミング因子を含有し、このトランスフォーミング因子は、マトリックス中の増殖される軟骨修復細胞を安定な軟骨組織を産生する軟骨細胞内にトランスフォームする適切な時機に、このトランスフォーミング因子を放出するデリバリーシステム内にまたはデリバリーシステムと関連して含有される。このマトリックスはまた、細胞接着促進物質を含有し得る。
【００３６】
軟骨または骨の欠損を充填するかまたは処理するための本発明の方法および組成物に有用なマトリックス物質は、フィブリノーゲン（トロンビンにより活性化されて欠損または病変内でフィブリンを形成する）、コラーゲン、アガロース、ゼラチンおよびマトリックス内に軟骨または骨の修復細胞が存在させて増殖させるのに十分な大きさの孔を有するマトリックスを形成し、修復プロセスの間に分解して軟骨または骨に置き換わり得る他の任意の生物分解性物質を含有する。いくつかの場合には、リン酸カルシウム含有化合物は、骨欠損の治療において、単独で使用され得るか、または生物分解性マトリックス物質と組み合わせて使用され得る。
【００３７】
本発明の組成物および方法に有用なマトリックスは、例えば、フィブリンマトリックスを形成するためのフィブリノーゲンのような化合物または組成物を重合することにより実施され得るか、またはインシチュで形成され得る。実施され得るマトリックスは、コラーゲン（例えば、コラーゲンスポンジおよび羊毛状コラーゲン（collagen fleece））、化学修飾されたコラーゲン、ゼラチンのビーズまたはスポンジ、アガロースのようなゲル形成物質、および欠損を充填し、軟骨または骨の修復細胞をそのマトリックスに存在させるマトリックス物質から成るゲル形成物質またはコンポジット物質、または上記の混合物を含有する。
【００３８】
本発明の1つの実施態様では、マトリックスは、フィブリノーゲン溶液を使用して、使用直前にトロンビンを添加して重合を開始して形成される。0.5-5 mg/mlのフィブリノーゲン濃度の緩衝水溶液が使用され得る。好ましくは、1 mg/mlのフィブリノーゲン溶液の緩衝水溶液が使用される。欠損領域内のこのフィブリノーゲン溶液の重合により充分な大きさの孔（例えば、約50-200μm）を有するマトリックスを生じる。それにより軟骨または骨の修復細胞は、マトリックスに自由に存在して、そしてマトリックスが占める欠損の容積を充填するために増殖する。好ましくは、十分な量のトロンビンは、重合が完了する前に外科医が欠損領域にその物質を置くのに十分な時間を与えるために、適用直前にフィブリノーゲン溶液に添加される。典型的には、トロンビン濃度は、軟骨が長時間空気に曝されると損傷を起こすので、数分（2-4分）以内に重合が達成されるような濃度であるべきである［Mitchellら、J. Bone Joint Surg., 71A, pp. 89-95（1989）］。トロンビンは、成長因子分子を分解してそれらを不活性化にする能力を有するので、過剰量のトロンビンは使用されるべきではない。1 mlあたり10-500単位、そして好ましくは、1 mlあたり100単位のトロンビン溶液の緩衝水溶液が、フィプリノーゲン溶液に添加して調製され得る。本発明の好ましい実施態様では、欠損を充填する約200秒前に、約20μlのトロンビン（100U/ml）が、フィブリノーゲン溶液（1 mg/ml）の各1 mlと混合される。より低濃度のトロンビンが添加される場合には、重合はよりゆっくり起こる。2-4分以内にフィブリンの重合を達成するのに必要なトロンビン溶液の量は、それが、環境温度、トロンビン溶液の温度、フィブリノーゲン溶液の温度などに依存するので、単におよそで与えられ得ることが認識される。欠損を充填するトロンビン活性化マトリックス溶液の重合は、フィブリノーゲン溶液の外部試料のトロンビン誘導化重合を観察することにより、容易にモニターされ得る。好ましくは、本発明の組成物および方法においては、フィブリンマトリックスは、自己のフィブリノーゲン分子、すなわち治療される種と同じ哺乳動物種の血液由来のフィブリノーゲン分子から形成される。他の種からの非免疫原性フィブリノーゲンもまた使用され得る。
【００３９】
フィブリンおよびコラーゲンを含有するマトリックスもまた、本発明の組成物および方法に用いられ得る。本発明の好ましい実施態様では、コラーゲンのマトリックスが、骨欠損を修復するのに用いられる。
【００４０】
コラーゲンがマトリックス物質として用いられるとき、十分に粘性の溶液が用いられ得、例えば、Collagen-VliessR （「羊毛状（fleece）」），SpongostanR，またはゼラチン−血液−混合物を用い、そして重合剤を用いる必要はない。コラーゲンマトリックスもまた、重合剤で活性化されたフィブリノーゲン溶液とともに用いられ得、その結果結合したマトリックスとなる。
【００４１】
他の生物分解性化合物がマトリックスを形成するために用いられるとき、重合剤もまた不要であり得る。例えば、SepharoseR溶液が選択され得、それは39〜42℃で液状マトリックス溶液であり、35〜38℃で固状（すなわち、ゲル状）となる。このSepharoseはまた、ゲルが欠損を充填するような濃度であるべきであり、骨あるいは軟骨修復細胞が自由にマトリックスおよび欠損領域に集まるのを可能とするメッシュサイズを有する。
【００４２】
軟骨修復に用いられる本発明の組成物中に、1種またはそれ以上の増殖（マイトジェン）因子をマトリックス溶液に添加し得る。増殖因子は、欠損を充填するマトリックス中で軟骨修復細胞に増殖作用を有するような適切な濃度範囲で存在すべきである。好ましくは、この増殖因子はまた、細胞（TGF-βの場合）に対して走化性作用を有すべきであるが；排他的に増殖作用を有する因子を用い得る。あるいは、走化性の細胞移動次いで細胞増殖の誘導を起こすために、2種の異なった因子を用い得、各々はこれらの特定の作用（走化性または増殖性のいずれか）の1つのみを有する。
【００４３】
軟骨修復細胞の増殖を刺激するための本発明の組成物および方法に有用な増殖（マイトジェン）因子は、TGF-αおよびTGF-βのようなトランスフォーミング成長因子（「TGFs」）：インシュリン様成長因子（「IGF I」）；酸性または塩基性の線維芽細胞成長因子（「FGFs」）；血小板由来成長因子（「PDGF」）；表皮成長因子（「EGF」）；および造血成長因子、例えばインターロイキン 3（「IL-3」）を包含する［Rizzino，1987，上述； Canalisら，上述、1988： Growth factors in biology and medicine，Ciba Foundation Symposium， 116（New York： John Wiley ＆ Sons, 1985）； Baserga，R．編、 Cell growth and division（Oxford： IRL Press, 1985）； Sporn，M．A．およびRoberts，A．B．編、 Peptide growth factors and their receptors IおよびII巻（Berlint: Springer-Verlag，1990）］。しかしながら，これらの特定の例に限定されない。細胞増殖のためのインビトロでのアッセイで示されるように、細胞の増殖を刺激することができる任意の化合物または組成物が、本発明の増殖因子として有用である。そのようなアッセイは当該技術で公知である［例えば、Canalisら，1988，上述； Gimenez-Gallegoら，1986，上述： Dicksonら，1987， 上述： Rizzino，1987，上述］。
【００４４】
軟骨修復細胞を軟骨欠損に誘引するための本発明の組成物および方法に有用な走化性因子は、例えば、TGP-β、FGPF（酸または塩基）、PDGF、腫瘍壊死因子（例えば、TNF-α、TNF-β）およびグリコサミノグリカン鎖のようなプロテォダリカン分解産物を包含する［Robertsら，（1990）、上述； Growth factors in biology and medicine， Ciba Foundation Symposium，116（New York： John Wiley ＆ Sons，1985）； R．Baserga，編、 Cell growth and division（Oxford：IRL Press，1985）］。 ポリペプチドおよび他の化合物の走化能を測定するアッセイは、当該技術では公知である［例えば、Postlewaite ら，1987，上述；Wahlら，1987，上述；Mooreら，1989，上述］。
【００４５】
本発明の好ましい実施態様では、軟骨修復に用いられるマトリックスは、TGF-βを、増殖因子としておよび走化性因子として含有する。特に、TGF-βIまたはTGF-βIIが、増殖因子および走化性因子として用いられ得る。他のTCP-β形態（例えば、TGF-β III、TGF-β IV、TG-βV、など）またはTGF-β活性を有するポリペプチド［Roberts，1990，上述を参照のこと］と同様に、将来検出され得るこの物質の他の形態、および他の成長因子もまた、この目的に有用であり得る。増殖因子および走化性因子としての使用のために、TCF-β分子は、好ましくはマトリックス溶液の2〜50 ng/ml、そして最も好ましくはマトリックス溶液の2〜10 ng/mlの濃度で、マトリックス中に溶解または懸濁される。軟骨修復細胞の増殖を刺激し得るTCP-βの好ましい濃度は、治療される特定の動物によって変化し得ることが認められ得る。
【００４６】
1種のまたは複数のトランスフォーミング因子がまた、軟骨修復に用いられるマトリックス溶液中に存在し得、その結果、軟骨修復細胞がマトリックスに集まった後、軟骨修復細胞の軟骨細胞（新しい安定な軟骨組織を形成する）への分化（すなわち、トランスフォーメイション）を促進するのに十分な濃度で、トランスフォーミング因子が、欠損部位に放出され得る。トランスフォーミング因子が、増殖因子の有効性を阻害または妨害し得るのであれば、トランスフォーミング因子の適切な放出の時機が特に重要である［Robertsら，（1990），上述］。
【００４７】
軟骨修復を促進する本発明の組成物および方法に有用なトランスフォーミング因子は、軟骨修復細胞の軟骨細胞（これは軟骨特異性プロテグリカンおよびII型コラーゲンを生成する）への分化を誘導する任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または任意の他の化合物または組成物を包含する。細胞内で軟骨特異性プロテグリカンおよびII型コラーゲンの生成を誘導または刺激する、化合物または組成物の活性は、当該技術で公知のアッセイを用いて測定され得る［例えば、Seyedinら，1985，上述：Seyedinら，1987，上述］。本発明の組成物および方法で有用なトランスフォーミング因子は、例えば、TGF-β、TGF-α、およびFGF（酸性または塩基性）を包含する。これらのトランスフォーミング因子は、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。さらに、TGF-β は、EGFと組み合わせて用いられ得る。
【００４８】
トランスフォーミング因子の適切な時機での放出は、トランスフォーミング因子を適切なデリバリーシステムの中にまたはデリバリーシステムと共にパッケージすることによってなされ得る。本発明の組成物および方法に有用なデリバリーシステムは、リポソーム、生物腐食性ポリマー、炭水化物ベースの小体、水−油エマルジョン、硫酸ヘパリンプロテグリカンまたはトランスフォーミング因子が自然に結合するような他の分子に化学的に結合されたコラーゲンのような繊維、および浸透圧ポンプを包含する。リポソーム、生物腐食性ポリマー、結合されたトランスフォーミング因子を含む繊維、およびトランスフォーミング因子を含有する炭水化物ベースの小体は、欠損を充填するために用いられるマトリックス溶液と混合され得る。これらのシステムは、当該技術では公知であり利用できる［P．JohnsonとJ．G．Lloyd-Jones編、Drug Delivery Systems （Chichester， England： Ellis Horwood Ltd，1987）を参照のこと］。Kimら，Biochem．Blophys．Acta，728，339〜348頁（1983）の手順に従って、リポソームは調製され得る。他のリポソーム調製手順もまた、用いられ得る。軟骨細胞を刺激して軟骨組織成分を合成する付加的因子が、このデリバリーシステムのトランスフォーミング因子とともに包含され得る。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、軟骨修復に用いられるマトリックスは、TGF-βを増殖因子および走化性因子として含有し、 デリバリーシステム内にパッケージされたTGF-βをトランスフォーミング因子として含有する。特に、TGF-βIまたはTGP-βIIは、増殖因子および走化性因子として、そしてトランスフォーミング因子として用いられ得る。他のTGF-β形態（例えば、TGF-βIII、TGF-β IV、TGF-βV、など）またはTGF-β活性を有するポリペプチド［Roberts，1990，上述を参照のこと］と同様に、将来検出され得るこの物質の他の形態、および他の成長因子もまた、この目的に有用であり得る。
【００５０】
軟骨修復のための好ましい実施態様では、好ましくはマトリックス溶液の2〜50 ng/ml、そして最も好ましくはマトリックス溶液の2〜10 ng/mlのTGF-β濃度が、増殖因子および走化性因子として用いられる。TGF-βの実質的により高い濃度がまた、マトリックス組成物中で引き続いて放出可能な形態でトランスフォーミング因子として存在し得る。好ましくは、TGF-βの引き続く濃度は、マトリックスの200 ng/mlよりも大きく、最も好ましくはマトリックスの500 ng/mlよりも大きい。軟骨修復細胞の分化を誘導するためのTGF-βの好ましい濃度は、治療される特定の動物によって変化し得ることが認められ得る。
【００５１】
軟骨修復細胞をTGF-βの2種の濃度範囲に曝すことが必要である。なぜなら、TGF-βは、比較的高い濃度（例えば、マトリックス溶液の200 ng/mlよりも大）では、軟骨修復細胞を軟骨細胞にトランスフォームし得るだけでなく、軟骨修復細胞の走化的誘引を阻害し得る；これに対して、比較的低い濃度（例えば、 2〜10 ng/ml）では、TGF-βは軟骨修復細胞を誘引してその増殖を刺激するが、軟骨修復細胞の軟骨細胞（これは軟骨組織を生成する）へのトランスフォーメイションを誘導しない。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様では、走化性および増殖、続いてトランスフォーメイションの順序を得るために、TGF-βは、遊離の被包されていない形態および被包された形態の両方、または他の隔離された形態で、マトリックス内に存在する。好ましくは、マトリックスおよび欠損領域の軟骨修復細胞の増殖を誘引または誘導する目的のために、TGF-β分子は、マトリックス溶液の2〜10 ng/mlの濃度で、マトリックス内に溶解または懸濁される。マトリックス内の軟骨修復細胞の軟骨細胞へのトランスフォーメイションを促進するために、TGF-β分子はまた、Kimら，1983，上述、の方法による多胞リポソーム内の隔離されたマトリックス内に、マトリックス溶液の200 ng/mlよりも大きい濃度で、そして好ましくは500 ng/mlよりも大きい濃度で存在する。誘引された軟骨修復細胞がマトリックスに集まり、マトリックスを分解し始めるとき、TGF-βを装填したリポソームは破壊される。マトリックスの分解の間に、軟骨修復細胞は、リポソームを摂取および／または劣化させ、その結果、軟骨修復細胞の軟骨細胞への形質変換を誘導するのに十分な濃度でTGF-βの放出する。
【００５３】
TGF-βのトランスフォーミング濃度に対する必要な走化性および増殖性の2段階送達はまた、TGF-βのトランスフォーミング濃度と生物腐食性ポリマーを組み合わせることによってなされる。あるいは、ポンプ、そして好ましくは、移植された浸透圧ポンプが、欠損およびマトリックス内でTGF-βの濃度を調節するために用いられ得る。本発明のこの実施態様では、このポンプは、マトリックス内で、TGF-βの濃度を調節する、すなわち、このポンプは、初期の走化性および増殖性を刺激する濃度でそして引き続きトランスフォーミング濃度でTGF-βを放出する。好ましくは、TGF-βのトランスフォーミング濃度は、このポンプによって、約1〜2週間後に効能があるように、送達される。トランスフォーミング因子の欠損容積への送達は、好ましくは、欠損部位内のマトリックスに局在化される。
【００５４】
本発明の組成物中の増殖因子およびトランスフォーミング因子は、使用されるとき、マトリックス内の欠損部位内に適用される。従って、これらの存在は、非常に局在化された部位に制限される。これは、それらの関節空間へのフリーの注射または注入を避けるためになされる。そのようなフリーの注入は、滑膜の細胞を刺激して、関節滲出を起こすという反対の作用を生じ得る。
【００５５】
骨修復に用いられる本発明の組成物中には、血管および関連した細胞（例えば、内皮細胞、血管周囲細胞、間葉細胞および平滑筋細胞）および骨欠損の領域内の基底膜の形成および内部成長を刺激するために、1種またはそれ以上の血管形成因子がマトリックス溶液に添加される。骨欠損の領域内に浸漬されたマトリックスを介する血管新生を刺激する本発明の組成物および方法に有用な血管形成因子は、bFGF、TGF-β、PDGF、TNF-α、アンジオゲニンまたはアンジオトロピンを包含する。硫酸ヘパリンは、bFGFの血管形成活性を高めることが分かった。本発明の好ましい実施態様では、bFGFおよび硫酸ヘパリンは、マトリックス溶液の約10 ng/mlの濃度でマトリックス内に、溶解、懸濁または結合されている。他の血管形成因子の好ましい濃度は：TGF-βについてはマトリックス溶液の5 ng/ml、TNF-αについてはマトリックス溶液の10ng/ml、そしてPDGFについてはマトリックス溶液の10 ng/mlである。しかしながら、硫酸ヘパリンと組み合わせたbFGFが、上に挙げた血管形成因子の中で最も好ましい血管形成因子である。
【００５６】
骨形成因子もまた、骨修復に用いられるマトリックス溶液中に存在し、血管および関連した細胞がマトリックスに集まった後、このマトリックスが最終的な骨芽細胞および骨細胞の成長に導く工程を促進するのに十分な濃度で劣化するにつれ、骨形成因子が骨欠損部位に放出される。この骨形成因子は適切なデリバリーシステム内に隔離またはパッケージされ、このマトリックスが劣化するにつれ、放出される。この軟骨修復組成物で用いられるデリバリーシステムは、本発明の、例えば、リポソームまたは炭水化物ベースの小体である（上述を参照のこと）骨修復組成物で有用である。本発明の1つの実施態様では、骨修復に用いられるこのマトリックスは、骨形成因子としてのデリバリーシステム内でパッケージされたTGF-βを、マトリックス溶液の100 ng/mlの濃度で含有する。TGF-βのより低いおよびより高い濃度が用いられ得る。
【００５７】
本発明の骨修復組成物に有用な骨形成因子は、骨芽細胞および骨細胞のような骨の細胞（これは骨組織を生成する）への骨修復細胞の分化を誘導する、任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または任意の他の化合物または組成物を包含する。本発明で有用な骨形成因子は、TGF-β［Sampath，T．R．ら， J. Biol. Chem．， 265（22）， 13198〜13205（1990）］、オステオゲニン（osteogenin）にLuyten，F．P．ら，J. Biol. Chem．，264（15），13377〜80頁（1989）］、骨形態発生タンパク質（BMP）［Wang，E．ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 87，2220〜24頁（1990）］のようなタンパク質、および表皮成長因子（EGF）と組み合わせたTGF-βを包含する。
【００５８】
骨形成因子によって誘導された間葉細胞の分化は、繊維軟骨、硝子軟骨および石灰化軟骨のような中間体組織；および網状骨組織（これは作り替えられて成熟した層板状骨組織へトランスフォームされる）の形成に至る軟骨内骨化を包含し得る。ある例では、中間体組織の出現なしに、骨が直接に間葉細胞から形成され得、骨組織形成の工程は、通常、血管が形成され、そしてマトリックス内に存在する血管形成因子に反応してこのマトリックスを浸した後、3〜4週間で起こる。
【００５９】
関節の全層性欠損の骨部分の修復のための、本発明に記載されたマトリックス組成物はまた、所望されるように、骨組織の任意の欠損を治療するのに有用である。そのような欠損は、骨折、関節破損、偽関節、遅延された癒合、経皮関節固定、疑似関節症、および先天的な欠陥から生ずる骨欠損、傷害、腫瘍感染、成人病ならびに骨格組織の損失の他の病因を包含する。この骨修復マトリックス組成物はまた、人工補綴物移植および人工補綴物安定性の増強、内部固定の方法に用いられる移植物質の骨生成の増強、歯科移植物質の安定化、靭帯挿入の治癒促進、および脊椎固定または他の関節固定の方法に有用である。
【００６０】
アミノ酸配列Arg-Gly-Aspを含有するテトラペプチドのような小さいペプチドを含む、フィブロネクチンまたは任意の他の化合物が、欠損部位へ置かれたマトリックスへの軟骨または骨修復細胞への初期の接着を増強するために、細胞接着促進因子として用いられ得る［Ruoslathiら，Cell，44，517〜18頁（1986）］。フィブリンおよび特定のコラーゲンマトリックスはすでにこの配列を含有する［Ruoslathiら，1986，上述］。他の生物腐食性マトリックスが用いられるとき、そのような細胞接着促進因子は、マトリックスが欠損を充填または手当するのに用いられる前に、マトリックス物質と混合され得る。Arg-Gly-Aspを含有するペプチドはまた、マトリックス物質（例えばその繊維または網目）またはマトリックスに添加されたアルブミンのような化合物に、化学的に結合され得る。
【００６１】
本願明細書にすでに記載された組成物は、動物の軟骨または骨組織の選択された欠損部位で軟骨または骨形成を誘導する方法に有用である。
【００６２】
本発明の方法は、ヒトを含む動物の軟骨および骨の欠損の治療のために認められ、この方法は、投与が簡単であり、患部関節領域への位置に限定される。全治療は、関節鏡検査手技、切開手術手技または経皮的手技により実施され得る。
【００６３】
本発明による軟骨または骨の欠損または病変の治療方法を実行するために、欠損または病変が同定され、準備され、そして本発明によるマトリックス組成物で充填される。
【００６４】
骨組織の欠損を修復する場合には、骨欠損を充填するマトリックス内に血管の形成を刺激するのに適切な濃度で、血管形成因子が骨修復組成物中に存在する。血管が形成されるとき、骨形成の工程を誘導するために、骨形成因子がそのデリバリーシステムから放出される。
【００６５】
軟骨修復のために、マトリックス、および欠損または病変内の軟骨修復細胞の増殖を刺激するのに適切な濃度で、増殖（マイトジェン）因子が、マトリックス組成物内に存在する。この濃度において同じ増殖因子がまた、使用される因子が（TGF-βがマトリックスの2〜10 ng/mlで行うように）細胞増殖および走化性に関して組み合わされた作用を有するならば、軟骨修復細胞を誘引する走化性因子として作用し得る。あるいは、2種の異なった因子がマトリックス内に存在し得、1つは特異的な増殖作用を有し、そして他は特異的な走化性作用を有する。他の実施態様では、欠損領域がマトリックスで手当された後、増殖因子、および必要ならば、走化性因子が直接マトリックスが充填された欠損領域に注入され得る。
【００６６】
軟骨修復の引き続く段階で、軟骨修復細胞が、マトリックス内で、トランスフォーミング因子に、適切な時間、軟骨修復細胞を軟骨細胞（これは安定な軟骨組織を生成する）へトランスフォームさせるのに十分な濃度で、晒される。これは、上に記載したように、マトリックス組成物中にトランスフォーミング因子を含有する適切なデリバリーシステムを含有することによって達成され得る。あるいは、トランスフォーミング因子は、適切な時間で、マトリックスで充填された欠損領域へ直接注入することによって送達され得る。トランスフォーミング濃度は、欠損領域へのマトリックスの初期の移植に続いて、約1〜2週間、細胞に有効であるようにされるべきである。この時点において、追加の因子が、軟骨マトリックス成分の合成をより良く促進するために、デリバリーシステムに添加され得、または直接注入され得る。
【００６７】
動物の軟骨または骨の欠損は、関節の関節鏡検査または切開手術による病変または欠損の簡単な検査によって、容易に視覚的に同定され得る。軟骨または骨の欠損はまた、コンピューターで支援された断層撮影法（CATスキャニング）X線検査、関節液または血清マーカーの磁気共鳴画像（MRI）分析、または任意の他の当該技術で公知の方法で、推論的に同定され得る。
【００６８】
本発明の方法に従って、全層性欠損の骨欠損部位は、骨−軟骨界面で骨修復マトリックス組成物を用いて、石灰化軟骨層へ充填されて、平らな平面が形成される。その後、膜は、好ましくは、細胞が透過不能（例えば、孔サイズは5μm未満）な生物分解性膜がマトリックスで充填された骨欠損上に置かれ、そしてこの膜の周縁が、軟骨-骨接合部領域内の欠損の周囲をシールする。好ましくは、この膜は熱ナイフまたはレーザーを用いる熱結合によって、接合部で軟骨にシールされる。マトリックス組成物は、マトリックス物質、血管形成因子、および適切なデリバリーシステムにパッケージされた、骨形成因子を含有する。
【００６９】
この膜の目的は、全層性欠損の場合に、血管が軟骨の層を浸入するのを防ぐことである。軟骨内の血管形成は、軟骨内の骨形成を刺激し、そして軟骨層の完全な修復を阻害する。骨欠損のみが修復されるのが必要であれば、膜を適用する必要はない。
【００７０】
膜が、マトリックスで充填された骨欠損上に置かれ、そして軟骨−骨接合部の領域内の欠損の周辺にシールされた後、欠損の残りの部分が、軟骨修復を刺激するのに用いられたマトリックス組成物で完全に充填される。軟骨修復のためのこの組成物は、マトリックス物質および増殖因子、そして必要であれば、走化性因子を含有する。この段階で用いられる組成物はまた、適切なデリバリーシステム内にパッケージされたトランスフォーミング因子を含有し得る。本発明の軟骨修復の最も好ましい方法では、このマトリックスは、増殖因子、走化性因子（これは増殖因子と同じでもよい）およびトランスフォーミング因子を含有する。このトランスフォーミング因子は、トランスフォーミング因子を放出するデリバリーシステム内にパッケージされまたは組み合わされ、マトリックスに集まる修復細胞が細胞間の物質を作り替え始めたとき、軟骨修復細胞を軟骨細胞へトランスフォームさせる濃度で、トランスフォーミング因子を放出する。好ましい組成物は上記に記載されている。
【００７１】
表面性欠損にある軟骨へのあるいは全層性欠損の軟骨部分へのマトリックスの接着は、軟骨欠損をトランスグルタミナーゼで処理することによって増強され得る［例えば、Ichinoseら， J. Biol. Chem．， 265（3）， 13411〜14（1990）：Najjar，V.A.およびLorand，L.編、Transglutaminases（Boston：Martinus-Nijhoff，1984）を参照のこと］。本発明のこの実施態様では、軟骨欠損は、例えば、コットノイド（cottonoid）を用いて乾燥され、そしてトランスグルタミナーゼの溶液で満たされる。次いで、この溶液を、例えば吸引により除去し、トランスグルタミナーゼを含有するフィルムを軟骨上に残す。次いで、この欠損は、軟骨修復のために上記のマトリックス組成物で充填される。
【００７２】
軟骨内の欠損の治療および修復のための方法および組成物を記載する、付加的な詳説および例は、共に所有された米国特許出願第648,274号に記載されており、そして本明細書中に参照により援用されている。
【００７３】
本明細書に記載された発明がさらに十分に理解され得るために、以下の実施例が提示される。これらの実施例が説明の目的のためであり、そしていかなる方法でも本発明を限定するように解釈されるべきではないことを理解されるべきである。
【実施例】
【００７４】
関節軟骨の全層性欠損の修復
幅0.7 mmの全層性関節軟骨欠損を、成体ミニ豚（mini-pig）膝関節の内側顆関節および膝蓋骨溝に作った。かんな（planing instrument）を用いて、一般的な麻酔下で、4匹の動物の群に病変がもたらされた。各々の病変の肋軟骨下の骨（血管および骨の骨髄細胞を含む）への縦の伸長は、関節内に全層性病変が形成されたことを保証する出血の発生により肉眼的にコントロールした。欠損の深さは、マトリックス溶液の約４ng/ml濃度で遊離のTGF-β、およびマトリックス容積の約100 ng/ml濃度でリポソーム−被包されたTGF-βを含有するコラーゲンのマトリックスで充填された。この骨形成マトリックス組成物が、欠損領域の軟骨−骨接合部の周辺によく適合したセルロース膜（孔サイズ0.2 μm）が挿入されたレベルで軟骨−骨接合部にまで適用された。残りの欠損空間は、隣接する関節軟骨の表面レベルまで、本出願の第15頁、第15〜21行目；第16頁、第7〜11行目；および第22頁、第1〜17行目に記載されたように軟骨形成マトリックス組成物で充填された。
【００７５】
手術および治療の後、約10週後、この動物を殺し、そして膝関節成分は2.5％のセチルピリジニウムクロライドを含有するグルタルアルデヒド（4％）緩衝溶液で化学的に固定された。増加するエタノール濃度の度合をつけたシリーズ中での脱水およびメタクリル酸メチル中での浸漬に続いて、組織学的切片を生成し、光学的顕微鏡検査の調製物中でMcNeil TetrachromeおよびToluidine Blue Oで染色した。
【００７６】
肋軟骨下の骨、すなわち、骨形成マトリックスが置かれたレベルに対応する欠損空間の部分が、新しく形成された骨組織で十分に充填された。同様に、関節軟骨組織に隣接する欠損空間、すなわち、軟骨形成マトリックス組成物で充填されたセルロース膜の上の領域内、は関節の軟骨修復組織で充填された。
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月7日(2004.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨における欠損を充填するために用いられるマトリックスまたはマトリックス形成物質；
該マトリックスおよび該欠損の領域中の、血管および関連した細胞の形成およびそれらの内部成長を刺激するに適切な濃度の血管形成因子；および
デリバリーシステムと関連した骨形成因子であって、該マトリックスおよび欠損中の細胞への該骨形成因子の送達に際し、該細胞が骨を形成する骨の細胞に成長するに適切な濃度の骨形成因子、を含み、
前記骨形成因子がＴＧＦ−βのスーパーファミリーのメンバー、TGF-βとEGFとの混合物、オステオゲニン、BMP、およびこれらの組合せからなる群より選択される、
骨における欠損の治療のための組成物。
【請求項２】
前記血管形成因子が、ｂＦＧＦ、ｂＦＧＦと硫酸ヘパリンとの混合物、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ−β、アンジオゲニン、アンジオトロピン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記欠損領域を充填するために用いられる前記マトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、リン酸カルシウム含有化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記血管形成因子が、前記マトリックス中に５〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するｂＦＧＦであり、そして前記骨形成因子が、デリバリーシステムと関連するＴＧＦ−βであり、そしてマトリックス溶液１ｍｌあたり１００ｎｇのＴＧＦ−β濃度である、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記デリバリーシステムが、リポソーム、生物腐食性ポリマー、硫酸ヘパリンプロテオグリカンに化学的に結合したコラーゲン繊維、炭水化物ベースの小体、および水−油エマルジョンからなる群より選択される、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記マトリックスがコラーゲンを含み、そして前記デリバリーシステムがリポソームを含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
ｂＦＧＦの血管形成活性を増強するに充分な量の硫酸ヘパリンをさらに含む、請求項４から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
非ヒ卜動物の骨組織中の選択された部位で、骨形成を誘導する方法であって、請求項１から７のいずれかに記載の組成物で該部位を充填することを包含する、方法。
【請求項９】
非ヒト動物の関節における全層性欠損を治療するための方法であって、
第１のマトリックスで該全層性欠損の骨部分を充填する工程：ここで、該第１のマトリックスは、血管および関連した細胞の形成および内部成長を刺激するに有効な量の血管形成因子、および骨形成因子であって、骨を形成する骨の細胞ヘの骨修復細胞の分化を誘導するに充分な濃度で該骨形成因子を放出するデリバリーシステムと関連した骨形成因子を含有する；
該全層性欠損のマトリックスで充填された骨部分を、膜で被覆する工程：ここで該膜は、骨欠損側から軟骨欠損側への細胞の移動を妨げる；
軟骨−骨接合部の領域における該欠損の周辺部分を該膜でシールする工程；および
第２のマトリックスで該全層性欠損の軟骨部分を充填する工程：ここで、該第２のマトリックスは、修復細胞の増殖を刺激するに有効な量の増殖因子、修復細胞を誘引するに有効な量の走化性因子、およびトランスフォーミング因子であって、修復細胞を軟骨細胞にトランスフォームするに充分な濃度で該トランスフォーミング因子を放出するデリバリーシステムと関連した有効な量のトランスフォーミング因子を含有する；
を包含し、
前記骨形成因子がＴＧＦ−βのスーパーファミリーのメンバー、TGF-βとEGFとの混合物、オステオゲニン、BMP、およびこれらの組合せからなる群より選択される、方法。
【請求項１０】
前記全層性欠損を前記第２のマトリックスで手当する前に、該欠損の軟骨部分の表面をトランスグルタミナーゼで被覆する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖因子および前記トランスフォーミング因子がTGF-βである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスフォーミング因子および前記骨形成因子の送達のための前記デリバリーシステムが、リポソーム、生物腐食性ポリマー、硫酸へパリンプロテオグリカンに化学的に結合したコラーゲン繊維、炭水化物ベースの小体、および水−油エマルジョンからなる群より選択される、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のマトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、リン酸カルシウム含有化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、そして／または前記第２のマトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のマトリックスおよび前記第２のマトリックスが、前記欠損をフィブリノーゲン溶液で充填する直前に、該フィブリノーゲン溶液にトロンビンを添加することによって形成されるフィブリンである、請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記血管形成因子が、前記第１のマトリックス１ｍｌあたり５〜１０ｎｇの濃度で存在するｂＦＧＦであり；
前記骨形成因子が、リポソームに被包され、そして第１の生物分解性マトリックス１ｍｌあたり１００ｎｇの濃度で存在する、ＴＧＦ−βであり；
前記増殖因子および前記走化性因子が、前記第２のマトリックス１ｍｌあたり２〜１０ｎｇの濃度で存在するＴＧＦ−βであり；そして
前記トランスフォーミング因子が、リポソームに被包され、そして該第２のマトリックス１ｍｌあたり２００ｎｇより高濃度で存在する、ＴＧＦ−βである、請求項９から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のマトリックスがまた、ｂＦＧＦの血管形成活性を増強するに充分な量の硫酸ヘパリンを含有する、請求項１１から１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のマトリックスおよび前記第２のマトリックスが、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む細胞接着促進因子をさらに含有する、請求項９から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のマトリックスおよび前記第２のマトリックスが、コラーゲン性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
動物の関節における全層性欠損を治療するためのキットまたは組成物であって、
血管および関連した細胞の形成および内部成長を刺激するに有効な量の血管形成因子、および骨形成因子であって、骨を形成する骨の細胞への骨修復細胞の分化を誘導するに充分な濃度で該骨形成因子を放出するデリバリーシステムと関連した骨形成因子、を含有する、第１のマトリックス；
骨欠損側から軟骨欠損側への細胞の移動を妨げる膜であって、該全層性欠損のマトリックスを充填した骨部分を被覆するために使用され、そして軟骨−骨接合部の領域における該欠損の周辺部分にシールされる、膜；および
修復細胞の増殖を刺激するに有効な量の増殖因子、修復細胞を誘引するに有効な量の走化性因子、およびトランスフォーミング因子であって、修復細胞を軟骨細胞にトランスフォームするに充分な濃度で該トランスフォーミング因子を放出するデリバリーシステムと関連した有効な量のトランスフォーミング因子、を含有する、第２のマトリックス；
を含有し、
前記骨形成因子がＴＧＦ−βのスーパーファミリーのメンバー、TGF-βとEGFとの混合物、オステオゲニン、BMP、およびこれらの組合せからなる群より選択される、キットまたは組成物。
【請求項２０】
前記全層性欠損または病変を前記第２のマトリックスで手当する前に、該欠損の軟骨部分の表面を被覆するために用いられるトランスグルタミナーゼをさらに含有する、請求項１９に記載のキットまたは組成物。
【請求項２１】
前記増殖因子および前記トランスフォーミング因子がTGF-βである、請求項１８から２０のいずれかに記載のキットまたは組成物。
【請求項２２】
前記トランスフォーミング因子および前記骨形成因子の送達のための前記デリバリーシステムが、リポソーム、生物腐食性ポリマー、硫酸へパリンプロテオグリカンに化学的に結合したコラーゲン繊維、炭水化物ベースの小体、および水−油エマルジョンからなる群より選択される、請求項１９から２１のいずれかに記載のキットまたは組成物。
【請求項２３】
前記第１のマトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、リン酸カルシウム含有化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、そして／または前記第２のマトリックスが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１９から２２のいずれかに記載のキットまたは組成物。
【請求項２４】
前記第１のマトリックスおよび前記第２のマトリックスが、前記欠損または病変をフィブリノーゲン溶液で充填する直前に、該フィブリノーゲン溶液にトロンビンを添加することによって形成されるフィブリンである、請求項１９から２２のいずれかに記載のキットまたは組成物。
【請求項２５】
前記血管形成因子が、前記第１のマトリックス１ｍｌあたり５〜１０ｎｇの濃度で存在するｂＦＧＦであり；
前記骨形成因子が、リポソームに被包され、そして該第１の生物分解性マトリックスｌｍｌあたり１００ｎｇの濃度で存在する、ＴＧＦ−βであり；
前記増殖因子および前記走化性因子が、前記第２のマトリックス１ｍｌあたり２〜１０ｎｇの濃度で存在するＴＧＦ−βであり；そして
前記トランスフォーミング因子が、リポソームに被包され、そして該第２のマトリックス１ｍｌあたり２００ｎｇより高濃度で存在する、ＴＧＦ−βである、
請求項１９から２４のいずれかに記載のキットまたは組成物。
【請求項２６】
前記第１のマトリックスおよび前記第２のマトリックスが、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む細胞接着促進因子をさらに含有する、請求項１９から２５のいずれかに記載のキットまたは組成物。
【請求項２７】
前記第１のマトリックスがコラーゲンを含有する、請求項２３に記載のキットまたは組成物。
【請求項２８】
ｂＦＧＦの血管形成活性を増強するに充分な量の硫酸ヘパリンをさらに含有する、請求項２５または２７に記載のキットまたは組成物。
【請求項２９】
前記血管形成因子がｂＦＧＦである、請求項１９に記載のキットまたは組成物。