(57)【要約】【課題】免疫学分野において有用な新規重鎖抗体及び単一ドメイン重鎖抗体断片を提供する。【解決手段】カバットの番号付けによる、４５位に荷電アミノ酸でもシステインでもないアミノ酸を含み、場合により１０８位のＱと組み合わせて、１０３位にＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ及びＰよりなる群から選択されるアミノ酸を含む機能性重鎖抗体。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバットの番号付けによる、４５位に荷電アミノ酸でもシステインでもないアミノ酸を含み、場合により１０８位のＱと組合せて、１０３位にＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ及びＰよりなる群から選択されるアミノ酸を含む、機能性重鎖抗体。
【請求項２】
抗体が、人工の突然変異体である、請求項１記載の機能性重鎖抗体。
【請求項３】
配列番号１を含む、請求項１又は２記載の機能性重鎖抗体。
【請求項４】
配列番号２を含む、請求項１又は２記載の機能性重鎖抗体。
【請求項５】
配列番号３を含む、請求項１又は２記載の機能性重鎖抗体。
【請求項６】
元の配列において、場合によりカバットの番号付けによるアミノ酸１０８をＱにより置換することと組合せて、カバットの番号付けによるアミノ酸１０３をＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ及びＰよりなる群から選択される親水性アミノ酸により置換することによる、単一ドメイン重鎖抗体断片を可溶化するための方法。
【請求項７】
ラクダ科重鎖抗体又はその機能性断片をヒト化するための方法であって、場合により１つ以上の他のラクダ科に顕著な特徴であるアミノ酸の置換と組合せた、少なくとも４５位のラクダ科に顕著な特徴であるアミノ酸の置換を含む方法。
【請求項８】
４５位のラクダ科に顕著な特徴であるアミノ酸が、ロイシンにより置換される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
置換が、元の配列において、場合によりカバットの番号付けによるアミノ酸１０８をＱにより置換することと組合せて、カバットの番号付けによるアミノ酸１０３をＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ及びＰよりなる群から選択される親水性アミノ酸により置換することで代償される、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
機能性断片が、単一ドメイン重鎖断片である、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項６記載の方法により入手可能な、可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片。
【請求項１２】
請求項１０記載の方法により入手可能な、ヒト化単一ドメイン重鎖抗体断片。
【請求項１３】
請求項１１又は１２記載の１つ以上の重鎖抗体断片を含む、単一ドメイン重鎖抗体断片ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ＩｇＧアイソタイプは、血清において認められる最も豊富なイムノグロブリンである。全ての哺乳動物において、これは２つの同一の重鎖（Ｈ）及び２つの同一の軽鎖（Ｌ）からなる。よってこの構造を有するイムノグロブリンは、４鎖イムノグロブリンと称される。４鎖イムノグロブリンのＨ鎖は、４つのドメイン、及び第２と第３ドメインとの間のヒンジ領域を含む。Ｌ鎖は、２つのドメインを有する。Ｌ及びＨ鎖両方のＮ末端ドメインは、残りのドメインよりも配列の可変性が高く、Ｖドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）として知られている。ＶＨ内の３つのループ及びＶＬ内の３つのループが、ＶＨ−ＶＬドメイン対において並列して、抗原結合部位を構成している。ループは、配列が超可変性であり、相補性決定領域（Complementarity Determining Region）に因んでＣＤＲと命名されている。４鎖イムノグロブリンの一般構造の記述は、「免疫学（Immunology）」、Roitt I.ら、Ed. MEDSI/Mc GRAWHILLにおいて与えられる。
【０００２】
事実上全ての可能性ある外来物質に対する厳密な抗原結合物質を作成するための抗体の抗原結合多様性及び成功の多くは、数千の可能性あるＶＨからの１つと数千の可能性あるＶＬからの１つとのランダムな対形成に由来する。より保存的な配列を有し、ＣＬと表示されるＬの第２のドメインは、これも保存配列を有するＨ鎖の第２のドメイン（ＣＨ１）と会合している。
【０００３】
重鎖病として知られている、ヒトにおける病的障害は、Ｌ鎖を含まない血清中の抗体の存在を特徴とする。更に、これらの抗体はまたＶＨ及びＣＨ１の重要な部分を欠いている（失われたＶＨ及びＣＨ１領域は、異なるＨＣＡｂ（重鎖抗体（Heavy Chain Antibody））間で大きく変化しうるのではあるが）。Ｈ鎖における欠失は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインの一部を伴う再配列Ｈ鎖の欠失による。これらの抗体は、ＶＬが存在せず、そしてＶＨの多くの部分も存在しないため、もはや抗原を認識しないはずである。ＣＨ１と会合するシャペロンタンパク質（ＢＩＰなど）が、ＢＩＰがＬ鎖により置換されるまで、小胞体中にＨ鎖を保持するため、ＨＣＡｂはＢ細胞から分泌されることができる。ＣＨ１ポリペプチドドメインの非存在下では、ＢＩＰは、もはや切断型Ｈ鎖を小胞体中に保持できず、そしてＬ鎖も結合できないため、結果としてＨ鎖が、ホモダイマーとして直ちに分泌される事になる。
【０００４】
同様なＨＣＡｂが、マウスモノクローナル細胞株において出現したことも報告された。
【０００５】
ラクダ科（Camelidae）（ラクダ、ヒトコブラクダ及びラマ）の血清において、我々は、４鎖イムノグロブリンの存在を発見し、更に大量の機能性ＨＣＡｂの存在を発見した。これらの機能性ＨＣＡｂは、ヨーロッパ特許出願第0656946号、並びにHamers-Castermanら（1993）、Vuら（1997）及びMuyldermansら（2001）を含む種々の刊行物において報告されている。これらは幾つかの点で、病的段階の結果として存在するヒト／マウスＨＣＡｂとは別個のものである。第１に、そして最も重要なことに、これらは抗原結合において機能性である。この点で、ラクダ科において見い出された機能性ＨＣＡｂは、機能性の正常イムノグロブリンである。第２に、欠失しているのは、常にＣＨ１ドメイン全体であり、そしてＶドメインは、無傷であるが、正常ＶＨ配列から幾つかの部位で逸脱している配列を有する。該機能性ＨＣＡｂは、ホモダイマー分子として存在する。
【０００６】
しかしＣＨ１は、ヒトコブラクダ（及びラマ）における全γ遺伝子の生殖細胞系においてコードされ、そしてヒンジエクソンの５′末端とのＶエクソンの３′末端のスプライシングにより、機能性ＨＣＡｂをコードするｍＲＮＡから除去される。即ちＣＨ１は、イントロンの一部であり、コンセンサススプライシングシグナル配列の単一の点突然変異のため、もはやエクソンとして認識されない。ラマ及びヒトコブラクダは、同じ点突然変異を元のＣＨ１エクソンに持っており、そしてこの知見は、ラマとラクダが相互に分岐する前にこれらのγ遺伝子が出現したことを示している。全ｍＲＮＡが、このスキームによりスプライシングされるため、ｍＲＮＡの異なるスプライシング活性は、複式スプライシングではない。よってこれらのγ遺伝子は常に、そのＣＨ１が除去されたＨ鎖をもたらす。他のγ遺伝子は、ＣＨ１ドメインを伴う共通のＨ鎖を産生させるために使用される。
【０００７】
機能性ＨＣＡｂのＨ鎖のＶドメイン（正常、即ち免疫学的に機能性のＨＣＡｂのＨ鎖の可変（Variable）ドメインに因んで、ＶＨＨと呼ぶ）は、もはやＶＬ（又はＣＨ１）ドメインと接触していない領域において、及び抗原結合に関与している領域（即ち、パラトープ）において、ＶＨ（即ち、従来の４鎖抗体のＨ鎖のＶドメイン）に対する適応を獲得していると予想される。
【０００８】
例えば、Vuら（1997）は、上記参考文献において、結晶学的データにより、従来の４鎖ＩｇＧでは保存Ｖａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５及びＴｒｐ４７が、空間的に密集して、ＶＬとの重要な疎水性接触を作っていることを明らかにした。彼らは、ＶＨアミノ酸のＧｌｎ３９、Ｔｙｒ９１、Ｔｒｐ１０３及びＧｌｕ１０５もまたＶＬ会合のために重要と認識されることを加えた。Vuら（1997）は更に、ラクダ科に存在し、そしてＶＬと相互作用する従来のＩｇＧのＶＨ側に対応する、ＶＨＨドメインの表面が、ラクダ科ＶＨＨでは大きく造り直されていることを観察した。本特許出願においてアミノ酸残基の番号付けは、http://www.bioinf.org.uk/absで利用可能なカバットのデータベースにしたがって使用される、カバットの番号付けを参照して与えられる。
【０００９】
ＶＬと相互作用することが知られている１２個のＶＨ位置に最も出現しやすいアミノ酸残基の頻度を、３３２個の脊椎動物ＶＨセグメントに関して測定した。本出願の目的のために、可変重鎖ポリペプチドのタンパク質ドメインは「ＶＨ」と呼び、そして対応するＤＮＡはＶＨと称されることに言及しておく。実際にはＣＤＲ３及びＦＲ４は、元の遺伝子配列中のＶＨにはコードされないが、ＶＨに組換えられるＤ及びＪミニ遺伝子により提供される。
【００１０】
比較のため、アミノ酸コンセンサスは、対応する位置の４２個のヒトコブラクダ生殖細胞系ＶＨＨ配列に関して計算した。４つの位置（３９、４３、６０及び９１、カバットの番号付け）の好ましいアミノ酸残基は、ＶＨとＶＨＨで不変である。対照的に、４つの他の部位（３３、３５、５０及び５８）ではＶＨでもＶＨＨ配列でも明白なアミノ酸選択性は示さない。後者のＶＨ部位では、ＶＬとの接触可能性は、ＶＨとＶＬドメインとの間の実際の角度に依存しており、そしてこのことが、観察されるアミノ酸縮重を説明する。この領域におけるＶＨとＶＨＨタンパク質の間の唯一の決定的に重大な差は、３７、４４、４５及び４７位に関わる。これらは、ＶＨ表現型の中で非常に保存されたアミノ酸残基（即ち、Ｖａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５及びＴｒｐ４７）であるが、ＶＨＨでは、本発明者らは、Ａｒｇ４５（又はＣｙｓ）、Ｇｌｕ４４、Ｐｈｅ３７（又はＴｙｒ）及びＧｌｙ４７（又はＬｅｕ）を最も頻繁に観察した。これらの比較は、Ｌ鎖の非存在に応答して生じる、前述のラクダＶＨＨ特異的「顕著な特徴（ホールマーク）」残基の同定を立証する。
【００１１】
Nguyenら（2000）により発表された結果から、ＶＨＨとＶＨ遺伝子が、ヒトコブラクダゲノムにインプリンティングされていることは明白である。ＶＨ及びＶＨＨ遺伝子は、おそらく同じ遺伝子座に存在する。ＶＨ及びＶＨＨ生殖細胞系遺伝子は、従来の４鎖抗体のＨ鎖と共に、同じＤ及びＪ遺伝子を利用することが認められる。ＰＣＲにより、約５０個のＶＨと約４０個のＶＨＨ生殖細胞系遺伝子をヒトコブラクダにおいて同定した。各ＰＣＲ断片は、リーダーシグナルエクソンと、ＣＤＲ３が開始すべきところで終わるＶエクソンを含む。ＣＤＲ３及びＦＲ４は、組換えＤ−Ｊセグメントにより提供される。ＶＨ生殖細胞系セグメントは、Ｖａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５及びＴｒｐ４７のコドンを含み、そしてＶＨＨ生殖細胞系ミニ遺伝子は、Ｐｈｅ３７（１１×）、Ｔｙｒ３７（３０×）又はただ１ケースのＶａｌ３７；Ｇｌｕ４４又はＧｌｎ４４（８×）；Ａｒｇ４５（３７×）又はＣｙｓ４５（５×）及びＧｌｙ４７（６×）又はＬｅｕ４７（２４×）又はＴｒｐ４７（８×）又はＰｈｅ４７（３×）に対するコドンを有する。更に、これらのＶＨＨ生殖細胞系遺伝子は常に（１例を除いて）、４５位又はＣＤＲ１領域（コドン３０、３２又は３３）にＣｙｓコドンを含む。ＣＤＲ２（１６又は１７アミノ酸のサイズ）の長さ及び特別のＣＹＳの位置に基づいて、ＶＨＨ生殖細胞系セグメントは、サブファミリーに分類した。幾つかのサブファミリーは、数個のメンバーを持つが、一方これら以外のものは、ゲノム中ではるかに稀である。しかし発現されるＨＣＡｂにおけるこのＶＨＨ生殖細胞系遺伝子の出現の頻度は、ゲノムにおけるこれらの出現の頻度とは少しも関連しないことに注意する必要がある。４５位又はＣＤＲ１周辺のＣｙｓは、再配列Ｖ−Ｄ−Ｊセグメントにおいて正常には維持されており、これらの再配列産物もまた、ＣＤＲ３に特別のＣｙｓを獲得している。同様に、特別のＣｙｓをそのＣＤＲ３に生成させられなかったＶ−Ｄ−Ｊ再配列は、おそらく体細胞の過剰突然変異又はＢ細胞受容体エディティングによって、Ｃｙｓ４５又はＣＤＲ１領域のＣｙｓを明らかに破壊する。Ｂ細胞受容体エディティングは、おそらく機能性でないか又は自己抗原を認識しており、存在するＶ−Ｄ−Ｊ組換え産物中に、上流の非再配列Ｖセグメントが組換えられる機序である。
【００１２】
ヒトコブラクダでは、ＶＨＨドメインもＶＨドメインのものよりも長いＣＤＲ３を有する（平均長１７〜１８対９）。長いＣＤＲ３を生じるために、３つの可能性を考えることができる。ＶＨＨが２つ以上のＤミニ遺伝子を使用してもよいが、これは２つのミニ遺伝子を異なる組換えシグナル配列（１２〜２３スペーサー定規）と組換える必要性の観点から見込みがうすい。あるいは、Ｄ−Ｊ又はＶ−ＤＪ組換えの間に活性の高い末端デオキシヌクレオチド転移酵素を幾つかの非鋳型コードヌクレオチドに加えてもよい。最後に、長さの差は単に、長いＣＤＲ３のＶＨＨドメインの画分又は短いＣＤＲ３のＶＨドメインの画分が、抗原と相互作用するためにはるかに機能性になりやすい選択のためであるということは無視できない。後者の２つの説明の組合せもまた該当しよう。
【００１３】
３７、４４、４５若しくは４７位のＶＨＨに顕著な特徴であるの存在又はＶＨＨに顕著な特徴であるへのＶＨの置換が、可溶性単一ドメイン抗体断片の形成をもたらしうることは、繰り返し提議されている。これは、Ａｒｇ４５が本質的役割を演じると考えられる、正しく折り畳まれたイムノグロブリン構造を採る。他のに顕著な特徴であるアミノ酸３７、４７及び１０３の重要性は、これらのアミノ酸及び１０３の上流の３つのアミノ酸（後者はＣＤＲ３の一部であり、通常Ｊセグメントによりコードされる）が内部疎水性クラスターを形成するため、限定されている。ＶＨ−ＶＬ会合には、疎水性相互作用が介在するため、荷電した親水性のＡｒｇによる、大きな芳香族で疎水性のＴｒｐ残基の置換が、ＶＬ及び更にサロゲート軽鎖のそれとの会合を破壊することも明らかである。WO 92/01787は、３７、３９、４５、４７、９１、９３又は１０３位の１つ以上のアミノ酸残基が改変されており、それによって、１０３位のトリプトファンがグルタミン酸、チロシン又はトレオニンに変えられている、合成可変イムノグロブリン重鎖ドメインである、単鎖可変ドメインを特許請求している。しかしアルギニン、グリシン、プロリン、セリン又はリシンによる１０３位のトリプトファンだけの置換で、機能性重鎖抗体を得るのに十分であるということを示すものはなく、またこの突然変異が、荷電アミノ酸又は４５位のシステインの非存在を埋め合わせることができるとも、該突然変異が、単一ドメイン重鎖抗体断片の溶解度の上昇を引き起こすことも示していない。
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らは、場合により１０８位の突然変異と組合せて、１０３位に突然変異を有する重鎖が、たとえ３７、４４、４５及び４７位のＶＨＨに顕著な特徴であるアミノ酸を持たないとしても、機能性重鎖抗体（ＨＣＡｂ）として挙動することを見い出した。詳細には、本発明者らは、１０３位（カバットの番号付け）に対応するアミノ酸残基を、アルギニン、グリシン、プロリン、セリン又はリシンから選択されるアミノ酸に突然変異させる突然変異が、４５位の決定的に重要なに顕著な特徴であるアミノ酸の消失（ここで、荷電アミノ酸又はシステインは、他の任意のアミノ酸（しかし好ましくはロイシン）に変えられている）を埋め合わせることができることを見い出した。これまでに、この構造で見い出されたわずかな重鎖は、当業者には古典的な４鎖抗体複合体の一部と考えられた（Harmsenら, 2000）。更に、この構造の幾つかの抗体について、軽鎖が記述されている（Ankerら, 1990；Chukwuochaら, 1999）。
【００１５】
驚くべきことに、本発明者らは、アルギニン、グリシン、プロリン、セリン又はリシンから選択される１０３位のアミノ酸が、一方で軽鎖と相互作用する可能性を破壊するかもしれないが、重鎖の溶解度を上昇させることを証明できた。したがってこのような重鎖分子は、４５位に機能性ＨＣＡｂのに顕著な特徴であるアミノ酸がなくても重鎖抗体のように挙動する。
【００１６】
本発明は、カバットの番号付けによる、４５位に荷電アミノ酸でもシステインでもないアミノ酸を含むことを特徴とし、かつ場合により１０８位のＱと組合せて、１０３位にＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ及びＰよりなる群から選択されるアミノ酸を含むことを特徴とする、機能性ＨＣＡｂに関する。好ましくは、４５位のアミノ酸はＬである。更に好ましくは、１０３位のアミノ酸はＲである。
【００１７】
好ましい実施態様において、本発明の機能性ＨＣＡｂは、人工の突然変異体である。本明細書において使用されるとき、人工の突然変異体とは、変化が意図的に誘導され、かつ自然状態で見い出される配列とは異なることを意味する。該人工の突然変異体は、場合により１０８位（カバットの番号付け）に対応するアミノ酸残基が、グルタミンに突然変異している突然変異と組合せて、１０３位（カバットの番号付け）に対応するアミノ酸残基が、アルギニン、グリシン、プロリン、セリン又はリシンから選択されるアミノ酸に突然変異している、イムノグロブリンの重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ＶＨと称される）に由来してよい。好ましくは、該人工の突然変異体は、１０３位（カバットの番号付け）に対応するアミノ酸残基が、アルギニンに突然変異している、イムノグロブリンの重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ＶＨと称される）に由来する。更に好ましくは、該人工の突然変異体は、１０３位（カバットの番号付け）に対応するアミノ酸残基が、アルギニンに突然変異しており、かつ１０８位（カバットの番号付け）に対応するアミノ酸残基が、グルタミンに突然変異している、イムノグロブリンの重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ＶＨと称される）に由来する。あるいは、該人工の突然変異体は、場合により３７、４４及び４７位の１つ以上の他のに顕著な特徴であるアミノ酸のＶａｌ３７、Ｇｌｙ４４及びＴｒｐ４７への突然変異と組合せて、４５位のに顕著な特徴であるアミノ酸残基が、ロイシンに突然変異している、重鎖抗体の重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ＶＨＨと称される）に由来してもよい。好ましい実施態様は、３７、４４、４５及び４７位の全に顕著な特徴であるアミノ酸がＶａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５及びＴｒｐ４７に突然変異している、人工の突然変異体である。
【００１８】
本発明の好ましい人工の突然変異体は、ＶＨドメインに由来するポリペプチド配列を含むことを特徴とし、そしてこのポリペプチド内に配列ＲＧＱＧＴＱ（配列番号１）あるいは配列ＲＧＫＧＴＱ（配列番号２）を包含する。
【００１９】
本発明の別の好ましい人工の突然変異体は、ＶＨＨドメインに由来するポリペプチド配列を含むことを特徴とし、そしてこのポリペプチド内に配列ＶＸＸＸＸＸＸＧＬＸＷ（配列番号３）（ここでＸは、任意のアミノ酸であってよい）を包含する。
【００２０】
本発明の人工の突然変異体は、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインに由来するが、このことは、本発明によりこの突然変異体が、該突然変異を導入することにより該ドメインから単離できること、あるいは該ＶＨドメイン又はＶＨＨドメインのポリペプチド配列及び突然変異を導入すべき位置の知識から出発して、化学合成を含めて合成できること、又は宿主細胞中を含めて特に組換え法により発現させられることを意味している。更に一般的には、この突然変異体は、ポリペプチド鎖の調製に利用可能な任意の方法により調製することができる。
【００２１】
ＶＨに由来し、かつ本明細書に上述のような特色を有するポリペプチド鎖は、好ましくは部位指定突然変異誘起法又はＰＣＲ（該突然変異を有するプライマーを使用）を伴う方法により、従来のＶＨ、特にライブラリーから得られるＶＨから出発して得られる。適切な方法は、Hemsleyら（1989）により報告されたものである。よって本発明は、ＶＨ生殖細胞系遺伝子から生じる、可溶性突然変異体の単一ドメイン抗体断片を産生させる可能性を提供する。
【００２２】
あるいは、ＶＨＨに由来し、かつ本明細書に上述のような特色を有するポリペプチド鎖は、好ましくは部位指定突然変異誘起法又はＰＣＲ（該突然変異を有するプライマーを使用）を伴う方法により、ＨＣＡｂ  ＶＨＨ、特にライブラリーから得られるＶＨＨから出発して得られる。この場合に、本発明は、ＶＨＨ遺伝子から生じる単一ドメイン抗体断片をヒト化する可能性を提供する。本明細書において使用されるとき、ヒト化とは、保存ヒト残基のＶａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５及びＴｒｐ４７への３７、４４、４５及び４７位の１つ以上のに顕著な特徴であるアミノ酸の置換を意味する。
【００２３】
本発明は更に、従来の４鎖イムノグロブリンに由来する単一ドメイン重鎖断片を可溶化するための方法に関する。実際、本発明者らは、１０３位の親水性アミノ酸残基、特にアルギニン、グリシン、プロリン、セリン又はリシンから選択される残基の存在が、ＶＨに由来する生じるポリペプチド配列の溶解度を、１０３位にトリプトファン残基を有する同じポリペプチドに比べて改善させうることを証明している。この効果は、１０８位のアミノ酸をグルタミンにより置換することによって、更に強化されよう。
【００２４】
本発明の別の側面は、ラクダ科重鎖抗体を「ヒト化」するための方法であって、該方法は、場合により３７、４４及び４７位の１つ以上の他のラクダ科に顕著な特徴であるアミノ酸の置換と組合せた、少なくとも４５位のラクダ科に顕著な特徴であるアミノ酸の置換を含むことを特徴とする。本明細書において使用されるとき、ヒト化とは、ＨＣＡｂ中の１つ以上のラクダ科に顕著な特徴であるアミノ酸が、該重鎖抗体がその典型的な特徴を消失することなく、ヒトのコンセンサス配列において見い出されるようなヒトの対応部により置換されることを意味する（即ち、ヒト化は、生じるＨＣＡｂ又はその断片の抗原結合能力に有害な影響を及ぼさない）。
【００２５】
本発明の別の側面は、本発明の方法により入手可能な、可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片である。本発明の更に別の側面は、本発明の方法により入手可能な、ヒト化単一ドメイン重鎖抗体断片である。
【００２６】
本発明の別の側面は、本発明の１つ以上の単一ドメイン重鎖抗体断片を含むことを特徴とするライブラリーである。
【００２７】
【実施例】
実施例１：単離ＶＨ１のラクダ化
標準どおりに組換えＶＨドメインをｓｃＦｖライブラリーから単離した。このようなＶＨドメインは、クローニング人工産物（ＶＨ−ＶＬの代わりにＶＨをクローニング）又はクローン内の遺伝子組換え（リンカー配列の不安定さのため）から生じるため、ＶＬ遺伝子断片が欠失する。これらの分子は、通常取扱いが難しい（低い発現収量、低い溶解度）。本発明者らは、Ｔｒｐ１０３をＡｒｇに変える突然変異を導入することにより、これらのＶＨ分子が高度に発現され、高い溶解度を示すことを証明した。これは、元々DaviesとRiechmann（1994）により実施された、Ｖａｌ３７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ４４Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５Ａｒｇ及びＴｒｐ４７Ｇｌｙ又はその一部よりも、はるかに容易かつ直接的な突然変異である。更に、全ＶＨ配列で遂行しうるという利点も有する。
【００２８】
実施例２：ｓｃＦｖ抗原結合性断片からの可溶性単一ドメインの作成
最小サイズの抗原結合物質を考える場合に、存在するｓｃＦｖから単一ドメインを設計するのが有利であろう。ＶＨは、このドメインのＣＤＲ３が原則として特異性を提供し、かつ親和性に対する最も大きな誘因であるため、特別な重要性を有する。単一ドメインは更に、その小さなサイズのために利点を有する。ＶＨはそれら自体が抗原と十分に相互作用できることが繰り返し証明されたが、ＶＨの粘着性及び不溶性は改善を必要とする。本発明は、これがＴｒｐ１０３Ａｒｇ置換により改善できることを証明している。
【００２９】
実施例３：Ａｒｇ１０３Ｔｒｐ突然変異により引き起こされる溶解度の差
断片増幅ＰＣＲ：
ＷＴ：ＴＥＭ０４：Ａ４短−３８（＝ＦＷＫ４）
ＷＴ：ＣＥＡ７１：Ａ４短−３８（＝ＦＷＫ４）
突然変異型：ＴＥＭ０４：Ａ４短−ＴＥＭＶＨ：
【００３０】
【表１】
2005289809.tif 000002
【００３１】
突然変異型：ＣＥＡ７１：Ａ４短−ＣＥＡＶＨ：
【００３２】
【表２】
2005289809.tif 000003
【００３３】
ｐＨＥＮ６におけるクローニング及び突然変異の配列決定
断片及びベクターは、ＮｃｏＩ−ＢｓｔＥIIで消化して、１％アガロースゲルに装填した。断片及びベクターは、ジェットソルブ（Jetsorb）によりゲルから精製した。ベクター及び断片は、ＷＫ６コンピテント細胞中に連結及び形質転換させて、１００μg/mlアンピシリン及び２％グルコースを含むＬＢ寒天プレート上で平板培養した。Ｒ１０３からＷ１０３への突然変異を配列決定により確認した。
【００３４】
ＴＥＭ０４
【表３】
2005289809.tif 000004
【００３５】
ＡＧＡ＝野生型
ＴＧＧ＝突然変異型
【００３６】
ＣＥＡ７１
【表４】
2005289809.tif 000005
【００３７】
ＡＧＧ＝野生型
ＴＧＧ＝突然変異型
【００３８】
野生型及び突然変異型の発現
各作成体について、１００μg/mlアンピシリン及び２％グルコースを含むＬＢ中で３つのプレ培養を開始した。
【００３９】
各プレ培養について、３７℃で１００μg/mlアンピシリンを含むＴＢ中で３３０ml培養を開始した。
【００４０】
培養は、ＯＤ６００nm＝０．４で１０mM  ＩＰＴＧで誘導して、２８℃で一晩増殖させた。結果は、表１に要約した。
【００４１】
【表５】
2005289809.tif 000006
【００４２】
表１：突然変異型及び野生型のＴＥＭ０４及びＣＥＡ７１のＷＫ６における発現に関する一晩培養液のＯＤ６００nm。
【００４３】
全細胞のウェスタンブロット：ＯＤ６００nm＝０．１で１５％  ＳＤＳゲル上に装填、ニトロセルロースにブロット、抗ヒスチジン結合体、及び抗マウスアルカリホスファターゼと基質：ＮＢＴ／ＢＣＩＰで検出（図１を参照のこと）。
【００４４】
結論：細胞は同様な密度まで増殖したが、ＴＥＭ０４突然変異型の発現はＴＥＭ０４野生型よりもはるかに低かった。
【００４５】
ＴＥＳ  ４ml及びＴＥＳ／４  ６mlを含む全ての一晩培養液について、ペリプラズム抽出物を調製し、そして組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡで精製した。
【００４６】
【表６】
2005289809.tif 000007
【００４７】
表２：突然変異型及び野生型ＴＥＭ０４及びＣＥＡ７１に関する、精製タンパク質のＯＤ２８０nm
【００４８】
【表７】
2005289809.tif 000008
【００４９】
表３：突然変異型及び野生型ＴＥＭ０４及びＣＥＡ７１に関する、精製タンパク質の平均ＯＤ２８０nm
【００５０】
結論：ＴＥＭ０４突然変異型の発現がＴＥＭ野生型よりもはるかに低いことを確認した。
【００５１】
2005289809.tif 000009
【００５２】
【表８】
2005289809.tif 000010
【００５３】
表４：突然変異型及び野生型ＴＥＭ０４及びＣＥＡ７１に関する、精製タンパク質の濃度（μg/ml）
【００５４】
【表９】
2005289809.tif 000011
【００５５】
表５：突然変異型及び野生型ＴＥＭ０４及びＣＥＡ７１に関する、精製タンパク質の平均濃度（μg/ml）
【００５６】
突然変異型及び野生型ＣＥＡ７１のＣＥＡ結合性に関するＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートを１μg/ml  ＣＥＡでコーティングして、ＰＢＳ中の１％カゼインで一晩ブロックした。
【００５７】
全Ｎｉ−ＮＴＡ精製試料を１００００ng/mlから４．３７ng/mlに希釈して、室温（ＲＴ）で２時間結合させた。結合は、抗ヒスチジン結合体でＲＴで１時間、続いて抗マウスアルカリホスファターゼでＲＴで１時間、そして基質：ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニル−ホスファート）により検出した。ＯＤ４０５を測定した（表）。
【００５８】
【表１０】
2005289809.tif 000012
【００５９】
表６：ＣＥＡ７１野生型（ＷＴ）の３つの発現及びＣＥＡ７１突然変異型の３つの発現に関するＥＬＩＳＡ：ＯＤ４０５nm
【００６０】
結論：ＣＥＡ野生型は、突然変異型よりも１０×低い濃度のコーティングＣＥＡでも結合した。これは、突然変異型タンパク質の９０％が正しく折り畳まれていないか、又は９０％が不活性であることを意味した。
【００６１】
溶解度
我々は、硫酸アンモニウムのストック溶液を調製して、ＲＴで２時間平衡化した。この溶液を４，３００rpmで１０分間遠心分離して、上清（＝１００％硫酸アンモニウム）を使用して０〜８０％の希釈液を調製した。試料６０μlを硫酸アンモニウム溶液３００μlと混合して、４℃で１８時間インキュベートした。この混合物を１３，０００rpmで１０分間遠心分離した。上清３００μlを使用して、ＥＬＩＳＡにおいて検出（上述のとおり）して、ＯＤ２８０nmを測定した。
【００６２】
【表１１】
2005289809.tif 000013
【００６３】
表７：硫酸アンモニウム沈殿後のＯＤ２８０nm又はＯＤ４０５nm（ＥＬＩＳＡから）
【００６４】
【表１２】
2005289809.tif 000014
【００６５】
表８：硫酸アンモニウム沈殿後のＯＤ２８０nm又はＯＤ４０５nm（ＥＬＩＳＡから）の％（平均最大値から）
【００６６】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）野生型及び突然変異型ＴＥＭ０４に関する、全細胞のＯＤ６００nm＝０．１のウェスタンブロット；（ｂ）野生型及び突然変異型ＣＥＡ７１に関する、全細胞のＯＤ６００nm＝０．１のウェスタンブロット。
【図２】プールした精製タンパク質の１５％  ＳＤＳゲル（ＴＥＭレーンの余分なバンドは、共精製したβ−ラクタマーゼである；その基質との反応により確認）
【図３】（ａ）ＣＥＡ７１の野生型（ＷＴ）及び突然変異型の３つの発現に関するＯＤ４０５nm；（ｂ）ＣＥＡ７１の野生型（ＷＴ）及び突然変異型の発現に関する平均ＯＤ４０５nm。
【図４】硫酸アンモニウム沈殿法により測定される溶解度。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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