(57)【要約】【課題】血糖状態に応じた赤血球膜の糖化度の変化を糖尿病コントロール評価の新しい指標とすることにより、持続性高血糖状態にある糖尿病患者の赤血球膜糖化度亢進を診断することができ、糖尿病患者の細胞障害および血管障害程度を評価することができる赤血球膜糖化度分布測定法を提供する。【解決手段】ホウ酸基導入磁気ビーズを赤血球膜表面の糖に結合させ、その磁気ビーズ結合赤血球を電気引力および磁気引力が同時に働いている環境下で移動させる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウ酸基導入磁気ビーズを赤血球膜表面の糖に結合させ、その磁気ビーズ結合赤血球を電気引力および磁気引力が同時に働いている環境下で移動させることを特徴とする赤血球膜糖化度分布測定法。
【請求項２】
透明直方体容器（１）の上面に適宜間隔をおいて陰極挿入孔（Ｈｃ）、陽極挿入孔（Ｈａ）を設けると共に、これら陰陽極挿入孔（Ｈｃ、Ｈａ）の中間部に試料注入孔（Ｈｓ）を設け、さらに前記透明直方体容器（１）の上面の適宜位置にエアバブル排出孔（Ｈｂ）を設けた泳動セルにおいて、前記透明直方体容器（１）内に生理食塩水を注入し、直流電源に接続した陰陽極線（Ｌｃ、Ｌａ）を前記陰陽極挿入孔（Ｈｃ、Ｈａ）からそれぞれ挿入して、これら陰陽極線（Ｌｃ、Ｌａ）を前記生理食塩水に浸し、前記透明直方体容器（１）の外側底面には磁気シート（Ｓ）を敷いておき、前記試料注入孔（Ｈｓ）からホウ酸基導入磁気ビーズに結合させた赤血球検体を注入するようしたことを特徴とする赤血球膜糖化度分布測定装置。
【請求項３】
前記透明直方体容器（１）の内面下部をテフロン（登録商標）シート（Ｔ）で被覆し、赤血球と透明直方体容器（１）の素材との非特異的結合反応を防止したことを特徴とする請求項２記載の赤血球膜糖化度分布測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、赤血球膜糖化度分布を測定する方法およびその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病患者の死因の大半は血管障害に起因するものであり、その発症予知が糖尿病治療に重要である。現行の糖尿病の日常検査は、主として早朝空腹時血糖およびグリコヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ）測定で行われている。このＨｂＡｌｃを測定する方法としては、比色法（特許文献１）、高速クロマトグラフィー法（特許文献２）などが提案されている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平８−１２２３３５号（第２頁）
【特許文献２】
特開平９−１７８７１９号（第２頁）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしこれらの測定結果では、糖尿病患者の細胞障害および血管障害程度を評価することはできない。そのため、新たな持続性高血糖状態にある糖尿病患者の細胞障害程度を診断する方法の開発が求められている。
【０００５】
そこで、発明者らは、糖尿病性細胞障害程度を評価する方法として赤血球膜糖化度分布を測定する方法およびその装置の開発を目指し、ここにその発明の完成に至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明の赤血球膜糖化度分布測定法は、ホウ酸基導入磁気ビーズ（以下、ホウ酸磁気ビーズという）を赤血球膜表面の糖に結合させ、その磁気ビーズ結合赤血球を電気引力および磁気引力が同時に働いている環境下で移動（以下、電磁気泳動という）させることを特徴とするものである。
【０００７】
その原理は、以下のようである。すなわち、赤血球膜表面に糖化が生じると糖分子中のジオールの数が増える。ホウ酸磁気ビーズのホウ酸基は、糖のジオールとアルカリ性ｐＨ下でカップリング反応を生じる。その結果、赤血球膜表面にホウ素を介して磁気ビースが結合する。赤血球は、赤血球膜に結合した磁気ビーズの数に比例して外部磁場の影響を強く受けるので、その電気泳動が抑制されるというものである。
【０００８】
この発明の赤血球膜糖化度分布測定装置は、透明直方体容器１の上面に適宜間隔をおいて陰極挿入孔Ｈｃ、陽極挿入孔Ｈａを設けると共に、これら陰陽極挿入孔Ｈｃ、Ｈａの中間部に試料注入孔Ｈｓを設け、さらに前記透明直方体容器１の上面の適宜位置にエアバブル排出孔Ｈｂを設けた泳動セルにおいて、前記透明直方体容器１内に生理食塩水を注入し、直流電源に接続した陰陽極線Ｌｃ、Ｌａを前記陰陽極挿入孔Ｈｃ、Ｈａからそれぞれ挿入して、これら陰陽極線Ｌｃ、Ｌａを前記生理食塩水に浸し、前記透明直方体容器１の外側底面には磁気シートＳを敷いておき、前記試料注入孔Ｈｓからホウ酸基導入磁気ビーズに結合させた赤血球検体を注入するようしたことを特徴とするものである。
【０００９】
さらに、この発明の赤血球膜糖化度分布測定装置は、前記透明直方体容器１の内面下部をテフロン（登録商標）シートＴで被覆し、赤血球と透明直方体容器１の素材との非特異的結合反応を防止したことを特徴とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の赤血球膜糖化度分布測定法およびその測定装置の実施の形態を、詳細に説明する。
【００１１】
この発明に用いる赤血球検体としては、グリコヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ）測定用（高速液体クロマトグラフィー法、正常域は４．３〜５．８％）に提出されたものを用いた。
【００１２】
この発明に用いるホウ酸磁気ビーズは、アミノ基導入磁気ビーズ（１〜４μｍ  ｉ．ｄ．  ，Ｍａｇｎａ  Ｂｉｎｄ  Ａｍｉｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  Ｂｅａｄｓ；米国ピアス社製）にホウ酸（和光純薬社製）をグルタルアルデヒド結合で導入して自家合成したものを用いた。
【００１３】
赤血球へのホウ酸磁気ビーズの結合は、血液検体にその１０倍容量の生理食塩水を加えて遠心（３，０００ｒ．ｐ．ｍ．，３ｍｉｎ）し、上清を捨てて洗浄赤血球を作成した。洗浄赤血球にトリシン緩衝液（ｐＨ９．４）を添加し、次にホウ酸磁気ビーズを添加して室温で２分間反応させた。
【００１４】
この発明に用いる泳動セルは、図２に示したように、透明直方体容器１（６×６０×４ｍｍ、ポリカーボネート製）からなり、上面に陰極挿入孔Ｈｃ、陽極挿入孔Ｈａをそれぞれ一個ずつ、試料注入孔Ｈｓを一個、エアバブル排出孔Ｈｂを二個設けた。孔の直径はいずれも３ｍｍで、陰陽極挿入孔Ｈｃ、Ｈａと試料注入孔Ｈｓの間の距離をそれぞれ２６ｍｍにした。透明直方体容器１の内面下部は、テフロン（登録商標）シートＴで被覆し、赤血球と透明直方体容器１の素材との非特異的結合反応を防止している。そして、この泳動セルを用いた泳動装置は、直流安定化電源（ＰＡ２５０−０．４２ＡＬ、ケンウッド社製）に陰陽極線Ｌｃ、Ｌａ（いずれも白金）をつなぎ、これら陰陽極線Ｌｃ、Ｌａを前記泳動セルの陰陽極挿入孔Ｈｃ、Ｈａにそれぞれ挿入し、泳動セルに注入した生理食塩水に、これら陰陽極線Ｌｃ、Ｌａを浸した。この泳動セルの外側の下に泳動セルの底面と同じサイズ（６×６０ｍｍ）の磁気シートＳ（フェライト磁石、３００ガウス、厚さ０．８ｍｍ、マグエックス社製）を敷いた。泳動像撮影用にデジタルカメラ（クールピクス９９５、ニコン社製）を用い、またそのデジタル画像保存用にパーソナルコンピュータ（ＥＤｉ  Ｃｕｂｅ  ＮＣ６１０、エプソン社製）を用いた。
【００１５】
そして、前記ホウ酸磁気ビーズ結合反応後、直ちにその赤血球検体（３μＬ）を試料注入孔Ｈｓより前記泳動セル（泳動液は生理食塩水、ｐＨ７．４）に入れ、室温で７分間通電（４〜５Ｖ、２０ｍＡ）した。
【００１６】
ホウ酸磁気ビーズ結合赤血球の泳動像は、前記デジタルカメラのマクロモードを用いてセルの上面から撮影した。撮影した画像データの解析は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｍ２６０ＲＢ、ソーテック社製）と、二本の画像解析ソフト（ＣＳアナラーザー、アトーとＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＬＥ、アドビー社製）を用いて行った。泳動像上での赤血球の認定は、カラー泳動像から赤色輝度抽出後モノクロ再描画して行った。
【００１７】
次に、この発明において、磁気ビーズ結合赤血球泳動の制動用至適外部磁力を選択するために、三種の外部磁力（０、３００、８５０ガウス）を検討した。
【００１８】
３００ガウス磁気は、フェライトシートを前記泳動セル全下面に敷いたものとし、８５０ガウス磁気は、強力マグネピース（直径１ｃｍ；商品名「Ｍ−７」、新潟精機社製）の中央部を前記試料注入孔Ｈｃの中心に一致させて設置したものとした。被検赤血球検体はいずれも同一検体（ＨｂＡｌｃ５．４％）とした。このような条件で、磁気泳動を行うと図３〜５に示したような泳動像が得られ、画像解析すると、試料注入孔Ｈｃ位置に残存した赤血球の相対輝度量は、０ガウスでは７．６％、３００ガウスでは１０．１％、８５０ガウスでは１１．２％であった。
【００１９】
以上の結果より、外部磁力の強度に応じて磁気ビーズ結合赤血球が、試料注入孔Ｈｃの位置に強く引きつけられていることが判明した。この発明では、外部磁力として３００ガウス（フェライトシート）を選択したが、３００ガウス程度または３００ガウス以上であれば十分であることが判った。
【００２０】
さらに、この発明において、電磁気泳動を採択するにあたり、赤血球の電気泳動と電磁気泳動との移動像を比較した。なお、電磁気泳動像を測定するには、前記泳動装置を用いたが、電気泳動像を測定するには、前記泳動装置において、泳動セルの外側の下に敷いた磁気シートを取り外したものを用いた。
【００２１】
ＨｂＡｌｃ５．４％赤血球（正常血糖状態）では、電気泳動により図６に示すような泳動像が得られ、画像解析すると、陰極側最先端距離は−２７．８％（輝度５８．９％）、陽極側最先端距離は＋１６．７％（輝度３３．６％）であった。一方、電磁気泳動により図７に示すような泳動像が得られ、画像解析すると、陰極側最先端距離は−２６．７％（輝度７１．４％）、陽極側最先端距離は＋１４．４％（輝度１８．５％）であった。
【００２２】
ＨｂＡｌｃ１１．３％赤血球（過血糖状態）では、電気泳動により図８に示すような泳動像が得られ、画像解析すると、陰極側最先端距離は−１８．３％（輝度３２．２％）、陽極側最先端距離は＋１５．０％（輝度５３．９％）であった。一方、電磁気泳動により図９に示すような泳動像が得られ、画像解析すると、陰極側最先端距離は−２２．２％（輝度５８．９％）、陽極側最先端距離は＋１６．６％（輝度２１．２％）であった。
【００２３】
以上の結果より、血糖状態が異なる二種類の赤血球ともに、電磁気泳動では電気泳動よりも両極方向への移動度が減少した。この傾向は、ＨｂＡｌｃ１１．３％赤血球で一層顕著に見られた。その原因として、電気泳動では赤血球表面電荷度の分布を表しているのに対して、電磁気泳動では赤血球膜糖化度の分布を表していることが考えられる。
【００２４】
次に、この発明において、血糖の程度（ＨｂＡｌｃ：５．４％、７．７％、８．６％、９．３％、１１．３％）が磁気ビーズ結合赤血球の電磁気泳動に及ぼす影響を検討した。
【００２５】
電磁気泳動により図１０〜１４に示すような泳動像が得られ、画像解析すると、原点の赤血球輝度は、１０．１％（ＨｂＡｌｃ５．４％）、５５．０％（ＨｂＡｌｃ７．７％）、５８．８％（ＨｂＡｌｃ８．６％）、５９．１％（ＨｂＡｌｃ９．３％）、６９．７％（ＨｂＡｌｃ１１．３％）であった。陰極側最先端距離は、−２６．７％（ＨｂＡｌｃ５．４％）、−２３．９％（ＨｂＡｌｃ７．７％）、−２５．０％（ＨｂＡｌｃ８．６％）、−２２．２％（ＨｂＡｌｃ９．３％）、−２２．２％（ＨｂＡｌｃ１１．３％）とＨｂＡｌｃ値増加につれて次第に減少した。陽極側最先端距離も、＋４．９％（ＨｂＡｌｃ５．４％）、＋３．０％（ＨｂＡｌｃ７．７％）、＋２．０％（ＨｂＡｌｃ８．６％）、＋２．９％（ＨｂＡｌｃ９．３％）、＋２．７％（ＨｂＡｌｃ１１．３％）とＨｂＡｌｃ値増加につれて次第に減少した。
【００２６】
以上の結果より、電磁気泳動では、糖尿病過血糖状態に応じて赤血球膜表面への糖付着量が増加していることが判明した。
【００２７】
【発明の効果】
したがって、この発明の赤血球膜糖化度分布測定法では、血糖状態に応じた赤血球膜の糖化度の変化を糖尿病コントロール評価の新しい指標とすることにより、持続性高血糖状態にある糖尿病患者の赤血球膜糖化度亢進を診断することができ、糖尿病患者の細胞障害および血管障害程度を評価することができるものとなった。
【００２８】
また、この発明の赤血球膜糖化度分布測定装置は、血糖状態に応じた赤血球膜の糖化度の変化を容易に測定することを可能とした。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明における糖へのホウ酸磁気ビーズ結合の原理図である。
【図２】この発明における電磁気泳動装置の模式図である。
【図３】磁気ビーズ結合赤血球への外部磁力の影響を示す図である。
【図４】磁気ビーズ結合赤血球への外部磁力の影響を示す図である。
【図５】磁気ビーズ結合赤血球への外部磁力の影響を示す図である。
【図６】赤血球の電気泳動像と電磁気泳動像の比較を示す図である。
【図７】赤血球の電気泳動像と電磁気泳動像を比較を示す図である。
【図８】赤血球の電気泳動像と電磁気泳動像を比較を示す図である。
【図９】赤血球の電気泳動像と電磁気泳動像を比較を示す図である。
【図１０】糖化度の異なる赤血球の電磁気泳動像を示す図である。
【図１１】糖化度の異なる赤血球の電磁気泳動像を示す図である。
【図１２】糖化度の異なる赤血球の電磁気泳動像を示す図である。
【図１３】糖化度の異なる赤血球の電磁気泳動像を示す図である。
【図１４】糖化度の異なる赤血球の電磁気泳動像を示す図である。
【符号の説明】
１  透明直方体容器
Ｈｃ  陰極孔
Ｈａ  陽極孔
Ｈｓ  試料注入孔
Ｈｂ  エアバブル排出孔
Ｌｃ  陰極線
Ｌａ  陽極線
Ｓ  磁気シート
Ｔ  テフロン（登録商標）シート
【図１】
2005049156.tif 000002
【図２】
2005049156.tif 000003
【図３】
2005049156.tif 000004
【図４】
2005049156.tif 000005
【図５】
2005049156.tif 000006
【図６】
2005049156.tif 000007
【図７】
2005049156.tif 000008
【図８】
2005049156.tif 000009
【図９】
2005049156.tif 000010
【図１０】
2005049156.tif 000011
【図１１】
2005049156.tif 000012
【図１２】
2005049156.tif 000013
【図１３】
2005049156.tif 000014
【図１４】
2005049156.tif 000015