(57)【要約】【課題】  医療用または生化学用の無菌でしかもエンドトキシンを実質的に含まないゼラチンを、容易に製造する方法を提供すること。【解決手段】  動物の組織を水酸化カルシウムと４級アンモニウム塩の溶液に浸漬して処理した後、当該処理液を除き、容器を変えずに引き続き無菌的に中和してｐＨを調整し、注射用水で洗い、さらに注射用水を加えてゼラチンを加熱抽出することを特徴とするゼラチンの製造方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の組織を水酸化カルシウム液に浸漬して処理した後、当該処理液を除き、容器を変えずに引き続き無菌的に中和してｐＨを調整し、注射用水で洗い、さらに注射用水を加えてゼラチンを加熱抽出することを特徴とするゼラチンの製造方法。
【請求項２】
前記水酸化カルシウム溶液にさらに四級アンモニウム塩を加えて浸漬処理することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は無菌でしかもエンドトキシンを実質的に含まないゼラチンを製造する方法に関し、さらに詳細には、ゼラチンの原料を水酸化カルシウム液で処理し、以降の工程を無菌的・連続的な操作で中和・洗浄し、ゼラチンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゼラチンは明治３９年の第三改正日本薬局方から今日にいたるまで日本薬局方に収載されており、医療用原料としても永い歴史がある。カプセル剤などの内用剤や皮膚への外用剤の原料として広く使用される一方、注射剤や手術用の医療用具など体内に直接適用する用途もある。体内に直接適用する用途では無菌かつ低エンドトキシンであることが要求される。
【０００３】
一般にゼラチンは原料となる動物の組織を酸またはアルカリで処理した後、水で加熱抽出して得る。この酸またはアルカリの処理にある程度の時間をかければ、原料はほぼ無菌となり、またエンドトキシン等の菌体成分もある程度は分解を受ける。このようにゼラチンの通常の製造工程では初期の段階でほぼ無菌の状態になると考えられるが、その後の水洗・抽出・乾燥の工程で細菌の汚染を受けやすいため、出回っているほとんどのゼラチンは無菌ではない。またゼラチンの製造工程で加熱やろ過などの殺菌・滅菌の工程を実施することもあるが、グラム陰性菌に由来する耐熱性の高い有害な菌体成分であるエンドトキシンは除去できない。
【０００４】
エンドトキシンは大腸菌や緑膿菌などの広く普遍的に生活環境に存在する細菌の構成成分である。また細菌が検出されない水道水や精製水からもエンドトキシンは検出される。そのため通常のゼラチンの製造工程ではその混入を防ぐことは困難である。
【０００５】
市販されているゼラチンを測定すると、10000 〜 1000 EU/g程度のエンドトキシンを含有しており、低エンドトキシンといえる製品を見出すことができなかった。
エンドトキシンを低減させる方法は数多く報告されている。たとえば、特許文献１では、0.1%の非イオン系界面活性剤を添加し、121℃、20分間の高圧蒸気滅菌を実施するという、エンドトキシンを効果的に低減させる条件を開示している。しかしこの条件ではゼラチンは低分子化してしまい、ゼリー強度が著しく低下するため、この方法はゼラチンには適用できない。
【０００６】
また、ウシの皮を苛性溶液(caustic solution)で処理することを特徴とする、発熱性物質(エンドトキシン)を含有しない無菌のゼラチンの製造方法が特許文献２に報告されている。
【０００７】
また先に本発明者らは特許文献３で、四級アンモニウム化合物をエンドトキシンの不活化剤とする発明を開示した。特許文献３では溶液状の試料を対象としている。
【特許文献１】特開平８−２５２３０１号公報
【特許文献２】米国特許4373063号明細書
【特許文献３】特開2000-72659号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、医療用または生化学用の無菌でしかもエンドトキシンを実質的に含まないゼラチンを容易に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために本発明者らは鋭意検討をした結果、動物の組織を水酸化カルシウム液に浸漬して処理した後に、中和、水洗、抽出等の後続工程を無菌的に操作することにより無菌でしかもエンドトキシンを実質的に含まないゼラチンを容易に製造できることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、動物の組織を水酸化カルシウム液に浸漬して処理した後、当該処理液を除き、容器を変えずに引き続き無菌的に中和してｐＨを調整し、注射用水で洗い、さらに注射用水を加えてゼラチンを加熱抽出することを特徴とするゼラチンの製造方法にある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法にしたがって製造したゼラチンは、無菌かつ低エンドトキシンであり、ゼリー強度も満足のいくものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法は、原料である動物の組織を水酸化カルシウム液で浸漬処理をし、無菌となった原料とその容器をそのまま有効に活用する方法を採用した。通常のゼラチンの製造方法では酸処理・アルカリ処理・水洗・抽出・乾燥の工程を、それぞれ別の装置に原料を移して操作している。しかもそれらの装置は開放系である。これに対して本発明の方法では密閉系の容器を使用し、さらにアルカリ処理から中和・水洗・抽出までの操作を一貫して同一の容器を用いて、無菌的に操作するように改めた。
【００１３】
ゼラチンの原料としては通常利用されるウシ・ブタ・クジラなどの骨・皮膚・腱などの他、コラーゲンを含有する動物の組織であれば哺乳類・鳥類・爬虫類・両生類・魚類はもちろん、無脊椎動物も利用できるが、産業上は家畜や家禽または大量に捕獲または養殖される魚類等から大量に発生する非食用部位を使用することが望ましい。また原料である骨・皮膚・靭帯・腱などの組織内部は新鮮な状態では無菌であるので、菌体成分の混入を回避するためには、細菌の汚染を受けないように注意した新鮮な組織を使用することがさらに望ましい。
【００１４】
水酸化カルシウムは強塩基でありながら水に対する溶解度が低く過量に使用しても沈殿し、飽和水溶液のｐＨは約１２に抑えられる。さらにゼラチン原料や炭酸ガスに消費された分は沈殿が溶解して補われ、溶液は常に飽和に保たれるため、一定のｐＨを制御しやすい。このｐＨではコラーゲンは蛋白質の主鎖を保ちながら、ゼラチン原料である動物組織の適度な分解が進み、次の工程の熱分解によるコラーゲンからゼラチンへの変性がスムーズになる。したがって、水酸化カルシウムの使用量は、浸漬処理液が飽和水溶液となるような量を使用すれば良いが、通常は１〜５%の濃度の懸濁液を使用する。一方、水酸化ナトリウムでは一定のｐＨに保つことが困難であり、強い塩基性により室温でもコラーゲンがゼラチンよりも低分子量のペプチドにまで分解する反応が進行しやすい。特にウシの皮よりも組織の構造が疎であるブタの皮をゼラチン原料として使用する場合にはこの問題は大きい。
【００１５】
さらに、浸漬処理液としての水酸化カルシウム液に四級アンモニウム塩を添加することにより、より低エンドトキシンのゼラチンを得ることができることを見出した。前述の特許文献３では溶液状の試料を対象としているが、本発明では四級アンモニウム化合物を固形の動物組織に応用して、低エンドトキシンで無菌のゼラチンを製造した。
本発明で使用する四級アンモニウム化合物は、処理後にアニオンを除去する必要がないことから、水酸化四級アンモニウムを使用するのが好ましい。本発明で使用できる四級アンモニウム化合物には、たとえば、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラペンチルアンモニウム、テトラヘキシルアンモニウム、テトラヘプチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ジメチルテトラデシルアンモニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウム、トリオクチルメチルアンモニウム、トリエチルベンジルアンモニウム等があるがこれらに限定されない。好ましくは、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムまたはテトラペンチルアンモニウムであり、より好ましくはテトラブチルアンモニウムである。四級アンモニウム化合物の添加量は、本発明の目的を達成できればいかなる量でもよいが、たとえば、水酸化テトラブチルアンモニウムでは、０．５〜２．５ 容量％が望ましい。
【００１６】
ゼラチンの製造工程においては、浸漬処理の後に原料を洗って抽出するまでに大量の水を使用するが、無菌のゼラチンを製造するためには滅菌し、さらにエンドトキシンを完全に除去した水を使用する必要がある。この目的には、日本薬局方「注射用水」が望ましい。
【００１７】
水酸化カルシウムで浸漬処理した後、製造装置の下部の排出口を開いて、処理液を除く。注射用水で皮を水洗した後に、残存するアルカリを中和する。中和には塩酸・硫酸などの鉱酸、ギ酸などの有機酸、強酸性のイオン交換樹脂、塩化アンモニウムなどの酸性の塩類等を用いることができる。中和後のｐＨはアルカリ処理をした皮の等電点付近である４．５〜５．５が好ましい。
【００１８】
中和後、製造装置から液を排出し、注射用水により水洗する。水洗は、中和に使用した酸を検出しなくなるまで、たとえば塩酸を使用した場合は塩素イオンを検出できなくなるまで行う。
【００１９】
注射用水による加熱抽出は４５℃から１２１℃で実施する。
さらにゼリー強度の高いゼラチンを得るためには、加熱抽出をする際にコラーゲン分子の必要以上の分解を避け、分子量が大きくかつ分子量分布を狭くする必要がある。このためには加熱抽出の操作を極力低温、たとえば５０〜６０℃とし、抽出時間も短時間、たとえば１〜３時間にすることが望ましい。好適な分子量は、50000から200000、さらに好ましくは重量平均分子量が138000±8000、数平均分子量が125000±10000の範囲である。分子量分布は分布の幅が狭い、すなわち重量平均分子量と数平均分子量の比が１に近いことが望ましい。
【００２０】
さらに近年はゼラチンの抗原性についても問題とされることがあるが、たとえば本発明により得られたゼラチンをペプシンで処理することにより、抗原性の低いゼラチンを得ることもできる（ゼラチンをペプシンで処理する方法については、特開平１１−３４９５９９号公報、特開２００１−４５９８１号公報を参照）。
【００２１】
本発明で使用する製造装置は微生物の侵入を防ぐために密閉できる構造であり、さらに内容物を連続的に水洗し抽出するために、密閉した状態のまま液体を出し入れできる構造であることが望ましい。また水酸化カルシウム液処理を実施するので、装置の内面は使用するアルカリに耐えられる必要がある。しかも医療用の高純度のゼラチンを製造するために、溶出物が極力少ない材質でなければならない。この目的には内面を適当な樹脂、たとえばＰＦＡ（四フッ化エチレン・パーフロロアルキルビニルエーテル共重合樹脂）、またはガラス（グラスライニング製タンク：八光産業）でコーティングしたタンクが利用できる。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例を挙げて本発明を、その好適な実施態様について本発明を説明する。
(実施例１）
ブタ皮に対するアルカリの作用
ブタの生皮５ｇを約１cm角に裁断し、表１に示す濃度の水酸化カルシウム飽和水溶液および水酸化テトラn-ブチルアンモニウムの溶液10mLに漬けて室温で５日間放置した。その間、試料の皮片を毎日３枚ずつ無菌的に取り出し、各試料に0.5mol/Lの塩酸を加えて中和し（ｐＨ＝５）、注射用水10mLで５回水洗した後に注射用水10mLを加え、80℃で１時間加熱してゼラチン液を得た。
【００２３】
ゼラチン中のエンドトキシン量を測定した。エンドトキシンの測定にはリムルスES-
IIシングルテストとトキシノメーター（和光純薬工業株式会社）を使用した。ゼラチ
ンの乾燥重量あたりのエンドトキシン量を示す。それぞれの試料から抽出して得られたゼラチン液の濃度は４〜６％であった。結果を表1に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１の結果から分かるように、水酸化カルシウムの飽和溶液または四級アンモニウム液のそれぞれの単独と比較すると、両者を添加することでエンドトキシン量は顕著に減少し、エンドトキシンの分解に対して相乗的な効果が得られた。
【００２６】
(実施例２）
無菌ゼラチンの製造
内面に付着する皮下組織をできるだけ削ぎ落としたブタの生皮を塩蔵した物をゼラチン原料として使用した。ブタ生皮16.4kgを約５cm角に裁断し、密閉できるタンクに入れて精製水２０Lと水酸化カルシウム６５gおよび40% 水酸化テトラブチルアンモニウム溶液 325mLを加え、蓋をして室温で７日間置いた。
【００２７】
タンクから液を排出し、注射用水２０Ｌを加えてブタ皮をすすいだ。次に注射用水を用いて調製した0.01M 塩酸２０Ｌをタンクに加えて１日置き、水酸化カルシウム分を溶かし出した。このときの液のｐＨは約５であった。その後に液を排出し、注射用水２０Ｌを加えてすすぐ工程を３回くり返した。さらに注射用水１０Ｌを加え、タンクを６５℃に３時間加温して16.7Lのゼラチン液を得た。ゼラチン液をタンクから排出し、活性炭200gを加えて、６５℃で３時間置いた。まずろ紙を用いて、次に0.2μmのメンブランフィルターを用いて、順次に加圧ろ過をおこない、無菌のゼラチン液を得た。ゼラチンの濃度は5.7%であった。
【００２８】
このゼラチン液を凍結乾燥により乾燥してゼラチンを得た。エンドトキシン量は測定限界(５EU/g)以下であった。
水酸化カルシウムを加えた以降の操作は滅菌した器具を用いて、無菌的に実施した。
【００２９】
＜分子量の測定＞
実施例２で得たゼラチンの分子量を測定したところ、数平均分子量は125,200、重量平均分子量は170,900であった。重量平均分子量と数平均分子量の比は1.37である。
【００３０】
分子量の分析はゲルクロマトグラフィーによる。分子量分布を図１のクロマトグラムに示す。図１ａは実施例２で得たゼラチン、図１ｂはコラーゲン溶液を６５℃、３０分間の加熱により変性させた試料を分析した結果である。図１ｂではコラーゲンの成分である分子量１０万のα成分と、分子量２０万のβ成分のピークが得られる。図１ａのピークは図１ｂと一致し、α成分よりも分子量の小さい成分の存在は少ないことから、実施例２で得たゼラチンは分子量が大きく分子量分布が狭い高品位のゼラチンであることがわかる。
【００３１】
また、市販のブタゼラチン(旭陽化学工業製）を同じく分析すると、数平均分子量は62,600、重量平均分子量は138,200、重量平均分子量と数平均分子量の比は2.21であった。クロマトグラムを図１ｃに示す。図１ａと比較すると、この市販のブタゼラチンはα成分のピークが小さく、分子量の小さい成分を多く含有することがわかる。
【００３２】
(実施例３）無菌試験
実施例２で製造したゼラチンに注射用水を加えて、10%の濃度に溶かし試料溶液とした。あらかじめ調製しておいた無菌試験用チオグリコール酸培地Ｉ(日本薬局方 一般
試験法 無菌試験法)およびソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地（日本薬局方 一般試験法 無菌試験法）のそれぞれ２００mLに、試料溶液を１０mLずつ加えた。無菌試験用チオグリコール酸培地Ｉは３０℃、ＳＣＤ培地は２０℃で14日間培養した。
【００３３】
14日後に培地を観察しても、いずれも菌の発育を認めず、無菌試験に適合と判定した。
(実施例４）
ゼラチンの品質を評価するために、実施例２の製造方法で製造したゼラチン１０ロットおよび各種の市販のゼラチン１０ロットについて、「JIS K 6503:2001  にかわ及びゼラチン」の規定によりゼリー強度を測定した。またゲルクロマトグラフィーにより分子量を測定した。各ロット毎にゼリー強度(g)と数平均分子量をプロットしたグラフを図２に示す。
【００３４】
図２から分かるように本発明のゼラチンは市販のゼラチンよりも分子量が大きく、ゼリー強度において優れていることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ゼラチン等の分子量分布をゲルクロマトグラフィーにより示す。図1ａは本発明のゼラチンの分子量分布を表すクロマトグラムであり、図1ｂはコラーゲンの熱分解物の分子量分布を表すクロマトグラムであり、図1ｃは市販ゼラチンの分子量分布を表すクロマトグラムである。
【図２】本発明のゼラチンおよび市販のゼラチンのゲル強度および数平均分子量をプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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