(57)【要約】要約【課題】エレクトロポレーションを利用して、ライゲーション反応産物クローンを得る方法、クローンライブラリーを調製する方法、連結ＤＮＡの効率的な調製方法を提供すること。【解決手段】インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを連結し、得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、トランスフォーマントを調製する方法。前記連結が、リガーゼを用いて行われ、前記連結により得られた連結ＤＮＡを、リガーゼを含む反応液からｔＲＮＡの共存下でエタノールを用いて塩析させ、沈殿した連結ＤＮＡをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入する。インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを連結し、得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、ベクターＤＮＡ１μｇあたり１ｘ１０8以上のトランスフォーマントを得ることを含む、クローンライブラリーを調製する方法。インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結して、連結ＤＮＡを調製する方法。【選択図】図１
2005210956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを連結し、得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、トランスフォーマントを調製する方法であって、
前記連結が、リガーゼを用いて行われ、
前記連結により得られた連結ＤＮＡを、リガーゼを含む反応液からｔＲＮＡの共存下でエタノールを用いて塩析させ、
沈殿した連結ＤＮＡをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入する
ことを特徴とするトランスフォーマント調製方法。
【請求項２】
前記反応液が、リガーゼに加えて、ＡＴＰ、ジチオスレイトール、塩化マグネシウム、ポリエチレングリコール及び緩衝液成分から成る群から選ばれる少なくとも1種を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記制限酵素切断端の一方は、ＮｏｔＩによる切断端である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
他方の制限酵素切断端は、ＮｈｅＩ、ＮｃｏＩまたはＳａｌＩによる切断端である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを連結し、得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、ベクターＤＮＡ１μｇあたり１ｘ１０8以上のトランスフォーマントを得ることを含む、クローンライブラリーを調製する方法であって、
前記連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものであり、
前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端であり、かつ
前記制限酵素切断端の一方は、ＮｏｔＩによる切断端であり、
前記連結が、リガーゼを用いて行われ、
前記連結により得られた連結ＤＮＡを、ｔＲＮＡの共存下でエタノールにより沈殿させ、
沈殿した連結ＤＮＡをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入する
ことを特徴とする前記方法。
【請求項８】
ベクターＤＮＡ１μｇあたり１ｘ１０9以上のトランスフォーマントを得る請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ライブラリーが大規模ファージディスプレイ人工抗体（single chain Fv)ライブラリーである請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結して、連結ＤＮＡを調製する方法であって、
前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端であり、かつ一方の制限酵素切断端は、Not Iによる切断端である
ことを特徴とする連結ＤＮＡの調製方法。
【請求項１１】
他方の制限酵素切断端は、ＮｈｅＩ、ＮｃｏＩまたはＳａｌＩによる切断端である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、トランスフォーマントを調製する方法。
【請求項１４】
前記連結ＤＮＡの大腸菌への導入が、ヒートショック法により行われる請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クローンライブラリーの調製方法を含むトランスフォーマントの調製方法、及び連結ＤＮＡの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［ＤＮＡライゲーション反応］
ＤＮＡを酵素的に連結するＤＮＡライゲーションは、新規のＤＮＡ分子を作製する際に必須の工程であり、モレキュラーバイオロジーのあらゆる局面で必要とされる。ＤＮＡライゲーションは、ライゲースと呼ばれる酵素を用いてＤＮＡを連結する反応であり、遺伝子工学において最も基本的かつ必要不可欠な反応である。詳しくは、５’位にリン酸基を持つＤＮＡ５’末端ヌクレオチドと、３’位に水酸基を持つＤＮＡ３’末端ヌクレオチドを、ＡＴＰ存在下で連結する反応であり、一本鎖ＤＮＡでも二本鎖ＤＮＡでも連結可能である。現在、Ｔ４などのファージ由来や、大腸菌などの細菌由来のライゲースが市販されており、制限酵素で切断したＤＮＡなどを、ライゲーションによって簡単に連結することができる。
【０００３】
これまでに、このライゲーション反応の効率を高める努力が行われ、ポリエチレングリコール、フィコール、牛血清アルブミン、グリコーゲンなどの非特異的ポリマーがライゲーション効率を高めることが発見された（非特許文献１〜３)。このポリマーによるライゲーション反応の活性化を利用して、Ｔ４ＤＮＡライゲースにより高効率でライゲーションを行えるライゲーションキットが、各社より市販されている。
【０００４】
［ライブラリー］
ｃＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡ発現ライブラリーなど、さまざまな種類のライブラリーが実用化されている。このようなライブラリーは、その中から、ある特定の性質や有用性を有するクローンを選別して利用するための、研究用資源として多用される。一般的には、何らかの配列レパートリーを有する多種類のＤＮＡ断片（インサートＤＮＡ）を、ベクターＤＮＡ（プラスミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスなど）と連結することにより作製する。この際に、一種類ないしは複数の制限酵素で切断したベクターＤＮＡと、切断したＤＮＡの末端部に相補的な断端を生成する制限酵素で切断したインサートＤＮＡを、ライゲーション反応により連結する。
インサートＤＮＡをベクターに連結する際に、インサートＤＮＡを一方向性に連結するために、二ヶ所の異なる制限酵素断端を用いることがある。
【非特許文献１】Pheiffer, B. H. et al, Nucl. Acids Res. 11, 7853-7871, 1983
【非特許文献２】Hayashi, K. et al, Nucl. Acids Res. 13, 3261-3271, 1985
【非特許文献３】Hayashi, K. et al, Nucl. Acids Res. 13, 7979-7992, 1985
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般的にライブラリーをライゲーション法で作製する場合、如何に多くの種類のインサート配列（配列レパートリー）がライブラリーに含まれるか、すなわちライブラリーのサイズがどれだけ大きいかが重要である。そして、ライブラリーのサイズは、インサートＤＮＡをベクターＤＮＡと連結させるライゲーション反応の効率と、反応産物ＤＮＡ（ライゲート）を大腸菌やファージ粒子などに導入する効率によって決まる。
【０００６】
インサートを連結したベクターＤＮＡを大腸菌に導入する方法としては、ヒートショック法とエレクトロポレーション法の二つの方法が一般的である。導入の効率は、ＤＮＡの種類や大きさ、大腸菌株などに影響される。例えば、３ｋｂ程度のプラスミドを導入する場合、ヒートショック法では１μｇＤＮＡあたり最大１０9cfu (colony forming unit)、エレクトロポレーション法では１０10cfu程度とされている。プラスミドのサイズが大きくなると、この効率は減少することも知られている(Smith, M et al, Focus 12, 38-40, 1990) 。
【０００７】
市販のライゲーションキットの仕様書には、従来のＴ４ライゲースを用いて活性化剤（ポリマー）非添加で反応を行った場合より、高い効率でのライゲーションが可能であることが記載されている。二ヶ所の異なる制限酵素切断端を持つベクターＤＮＡに、インサートＤＮＡをライゲーションして連結する場合、その効率は、１μｇのベクターＤＮＡあたり約１ｘ１０6のトランスフォーマントを生成する程度と記載されている（ＮＥＢ社、アマシャム社）。より容易な、一種類の制限酵素による切断部位へのライゲーションでも、５ｘ１０7以下である（Ｔｏｙｏｂｏ社、ＴａＫａＲａ社）。
【０００８】
これらは、いずれもヒートショック法により大腸菌に導入されている。しかし、より多数のトランスフォーマントを得るためには、より効率良く大腸菌への導入を行えるエレクトロポレーション法を用いる方が好ましい。ところが、市販のライゲーションキットには、エレクトロポレーションによる大腸菌への連結クローンの導入を、著しく阻害する物質が含まれており、実際に本発明者らの実験でも、反応液を直接エレクトロポレーションした場合、トランスフォーマントは全く得られなかった。また、反応液を通常の方法によりエタノール沈殿を行い、反応産物ＤＮＡを抽出しても、エレクトロポレーションによる導入の効率は著しく低かった。
【０００９】
本発明者らは、大規模ファージディスプレイ人工抗体（single chain Fv)ライブラリー（田中寅彦、笹岡俊邦  「人工抗体テクノロジーの基本と医学への応用」生化学、７５巻、１２号、ｐ１５５１−１５５５参照）の作製を必要としている。このライブラリーの作製には、二種類の制限酵素で切断したベクターに目的のインサートＤＮＡを連結する際に、ファージミドＤＮＡ１μｇあたり、最低でも１０8、可能なら１０9以上のトランスフォーマントが得られる事が好ましい。しかし、従来のトランスフォーマントの作製方法では、そのような大規模のトランスフォーマントを一度に作製することはできなかった。
【００１０】
そこで本発明の目的は、より効率良く大腸菌への導入を行える可能性が有るエレクトロポレーションを利用して、ライゲーション反応産物クローン（大腸菌へのトランスフォーマント）を得ることができる方法を提供することにある。
さらに本発明の目的は、１μｇベクターＤＮＡあたり、従来法の数十から数百倍にあたる、１ｘ１０8、好ましくは１ｘ１０9以上のライゲーション反応産物クローン（大腸菌へのトランスフォーマント）を得ることができる方法を提供することにある。特に本発明は、diversity （配列多様性）１ｘ１０9以上の大規模ファージディスプレイ人工抗体ライブラリーを容易に作製できる方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明の目的は、上記大規模トランスフォーマントの作製に有用な、連結ＤＮＡの効率的な調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決する本発明は以下の通りである。
［請求項１］
インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを連結し、得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、トランスフォーマントを調製する方法であって、
前記連結が、リガーゼを用いて行われ、
前記連結により得られた連結ＤＮＡを、リガーゼを含む反応液からｔＲＮＡの共存下でエタノールを用いて塩析させ、
沈殿した連結ＤＮＡをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入する
ことを特徴とするトランスフォーマント調製方法。
［請求項２］
前記反応液が、リガーゼに加えて、ＡＴＰ、ジチオスレイトール、塩化マグネシウム、ポリエチレングリコール及び緩衝液成分から成る群から選ばれる少なくとも1種のを含む請求項１に記載の方法。
［請求項３］
前記連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものである請求項１または２に記載の方法。
［請求項４］
前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項５］
前記制限酵素切断端の一方は、ＮｏｔＩによる切断端である請求項４に記載の方法。
［請求項６］
他方の制限酵素切断端は、ＮｈｅＩ、ＮｃｏＩまたはＳａｌＩによる切断端である請求項５に記載の方法。
［請求項７］
インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを連結し、得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、ベクターＤＮＡ１μｇあたり１ｘ１０8以上のトランスフォーマントを得ることを含む、クローンライブラリーを調製する方法であって、
前記連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものであり、
前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端であり、かつ
前記制限酵素切断端の一方は、ＮｏｔＩによる切断端であり、
前記連結が、リガーゼを用いて行われ、
前記連結により得られた連結ＤＮＡを、ｔＲＮＡの共存下でエタノールにより沈殿させ、
沈殿した連結ＤＮＡをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入する
ことを特徴とする前記方法。
［請求項８］
ベクターＤＮＡ１μｇあたり１ｘ１０9以上のトランスフォーマントを得る請求項７に記載の方法。
［請求項９］
前記ライブラリーが大規模ファージディスプレイ人工抗体（single chain Fv)ライブラリーである請求項７または８に記載の方法。
［請求項１０］
インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結して、連結ＤＮＡを調製する方法であって、
前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端であり、かつ一方の制限酵素切断端は、Not Iによる切断端である
ことを特徴とする連結ＤＮＡの調製方法。
［請求項１１］
他方の制限酵素切断端は、ＮｈｅＩ、ＮｃｏＩまたはＳａｌＩによる切断端である請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］
前記連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１３］
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、トランスフォーマントを調製する方法。
［請求項１４］
前記連結ＤＮＡの大腸菌への導入が、ヒートショック法により行われる請求項１３に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明では、市販のライゲーションキットを用いつつ、改良した方法論でライゲーション反応を行うことにより、ライゲーション効率を高め、さらにライゲーション反応産物ＤＮＡを最適条件下で大腸菌にエレクトロポレーションすることにより、ライゲーションからトランスフォーメーション（大腸菌への連結クローンの導入）までの効率を、従来法の数十倍から数百倍に高めた。これにより、二ヶ所の異なる制限酵素断端を持つベクターＤＮＡにインサートＤＮＡをライゲーションして連結する、一方向性のサブクローニングにおいて、１μｇベクターＤＮＡあたり、１ｘ１０9以上のインサート連結クローンを生成することができる方法を実現した。本発明は、市販の多くのライゲーションキットを用いて実施可能であり、簡便、低コスト、かつ汎用性・実用性が極めて高い。以下この方法を「効率的ライゲーション法」と略称する。
【００１３】
この「効率的ライゲーション法」を用いれば、モレキュラーバイオロジーの基本的工程であるサブクローニングに大いに資することはもとより、特に1 x 109クローン以上の配列レパートリーを持つ大規模ライブラリーを、簡便に作製することができる。本発明により、大規模ライブラリー作製の手間や労力を、従来法の数十分の一以下に減じることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．「効率的ライゲーション法」の概要
本発明は、インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを、リガーゼを用いて連結して、連結ＤＮＡを調製する方法であって、前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端であり、かつ少なくとも一方の制限酵素切断端は、Not Iによる切断端であることを特徴とする連結ＤＮＡの調製方法に関する。
本発明の連結ＤＮＡの調製方法、即ち、ライゲーション法は、二種類の異なる突出末端を生成する制限酵素により、ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡを各々二ヶ所切断し、該ベクターＤＮＡと該インサートＤＮＡを連結するものであり、得られた連結ＤＮＡは、大腸菌に導入（トランスフォーメーション）される。図１にライゲーション反応の例を示す。
【００１５】
一般的なサブクローニング（図１のように、ライゲーションによってベクターにインサートＤＮＡを連結し、新規のＤＮＡ分子を作製すること）において、ライゲーション−トランスフォーメーションの効率は高いほど良い。殊に、プラスミドを用いてライブラリーを作製する場合に、高効率なサブクローニングは必須である。この場合、ライブラリーは、多種類の配列レパートリーを持つ特定なＤＮＡの集合をインサートＤＮＡとして、ライゲーション反応によりベクターに連結することによって作製するので、ライブラリーの多様性、即ちインサートＤＮＡとベクターＤＮＡが結合したクローンが如何に多種類形成されるかは、ライゲーション反応の効率に依存する。従って、ライゲーション−トランスフォーメーションにおける高い効率が要求される。
【００１６】
本発明の連結ＤＮＡの調製方法では、サブクローニングを高効率で行うために、インサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端であり、かつ一方の制限酵素切断端をNot Iによる切断端としている。即ち、インサートＤＮＡ及びベクターＤＮＡは、いずれも、一方の制限酵素切断端はNot Iによる切断端である。また、他方の制限酵素切断端は、特に制限されないが、サブクローニング対象が人工抗体配列レパートリーである場合、当該レパートリー中に切断配列がないという観点から、例えば、ＮｈｅＩ、ＮｃｏＩまたはＳａｌＩによる切断端であることが好ましい。図１では、ＮｈｅＩを他方の制限酵素切断端として記載している。
【００１７】
さらに、連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものであることが、サブクローニングを高効率で行うという観点からより好ましい。アルカリホスファターゼにより５’末端部の脱リン酸化は、常法により行うことができる。
【００１８】
本発明でライゲーションに用いるベクターＤＮＡには特に制限は無く、実施者の目的（例えばライブラリー作製などの）に適応したものを選択することができる。本発明者らは、後述する人工抗体ライブラリーを作製する目的で、３種類のベクター（ファージミド）を開発した（ＴＦＶ３，ＴＦＶ４，ＴＦＶ５）。これらのベクターは類似した構造を持つが、ライゲーションを行う制限酵素部位に一部違いがある（図２）。また、ＶＨ，ＶＬと記載されている部分には、あらかじめダミー配列が挿入してある。
【００１９】
また、インサートＤＮＡにも特に制限は無く、実施者が目的に応じて適宜選択し、作製することができる。インサートＤＮＡは、配列多様性を持つＤＮＡ断片の集合体であることもできる。本発明者らは、大規模ファージディスプレイ人工抗体（single chain Fv)ライブラリーの作製を目的としているので、ＶＨ（免疫グロブリン重鎖可変領域）、ＶＬ（免疫グロブリン軽鎖可変領域）、あるいはＦＶ（ＶＨとＶＬを連結したもの）をインサートＤＮＡとして作製した。インサートＤＮＡは、例えば、ＰＣＲで作製することができ、ＰＣＲプライマーに制限酵素部位を含ませることにより、インサートＤＮＡの５’末端及び３’末端に、ベクターＤＮＡの制限酵素部位と連結可能な制限酵素部位を含ませることができる。
【００２０】
本発明の連結ＤＮＡの調製方法（ライゲーション）で使用するリガーゼやライゲーション条件には特に制限はなく、常法で利用されているリガーゼやライゲーション条件をそのまま用いることができる。
【００２１】
上記方法により得られた連結ＤＮＡは大腸菌に導入してトランスフォーマントを調製することができ、連結ＤＮＡの大腸菌への導入は、ヒートショック法により行うことができる。また、連結ＤＮＡの大腸菌への導入を、エレクトロポレーション法により行う場合は、以下の本発明の方法を用いることが適当である。
【００２２】
即ち、インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを連結し、得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、トランスフォーマントを調製する方法であって、前記連結が、リガーゼを用いて行われ、前記連結により得られた連結ＤＮＡを、ｔＲＮＡの共存下でエタノールにより沈殿させ、沈殿した連結ＤＮＡをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入することを特徴とするトランスフォーマント調製方法である。
【００２３】
市販のライゲーションキットには、リガーゼに加えて、ＡＴＰ、ジチオスレイトール、塩化マグネシウム及びトリス−ＨＣｌ等の緩衝液成分、さらにはポリエチレングリコール、塩化カリウム、グリセロール、ＥＤＴＡなどが使用されており、これらの中でも、酵素(リガーゼ)が、連結ＤＮＡをエタノール沈殿した後に、エレクトロポレーション法により大腸菌に導入する際の妨げとなっていると考えられる。それに対して、本発明では、リガーゼにより得られた連結ＤＮＡを、リガーゼを含む反応液からｔＲＮＡの共存下でエタノールを用いて塩析させ、沈殿した連結ＤＮＡをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入する。これにより、著しくトランスフォーメーションにおける効率を増大できる。
【００２４】
尚、本発明の方法におけるエタノールを用いての塩析において、反応液には、ｔＲＮＡ及びエタノールを添加する以外に、塩析のための物質を添加する必要はない。これは、ライゲーション用の緩衝液及び酵素液に塩類等が含まれ、反応液にｔＲＮＡ及びエタノールを添加することで、良好に連結ＤＮＡの沈殿が生じるからである。しかし、塩析のための物質を添加することを排除する意図はなく、ライゲーション反応の条件によっては、塩析のための物質を反応液に添加した後に、ｔＲＮＡ及びエタノールを添加して、塩析させることもできる。塩析のための物質としては、沈殿(ＤＮＡ)の洗浄操作の後にエレクトロポレーションを阻害しない公知の物を適宜使用でき、例えば、ライゲーション用の緩衝液及び酵素液に含まれる塩類等をそのまま塩析のための物質として作用させることができ、あるいは実施例で示すような酢酸ナトリウムを使用することもできる。
【００２５】
本発明の上記トランスフォーマント調製方法で使用するエレクトロポレーション法は、常法により行うことができる。また、エレクトロポレーション法に使用する大腸菌は、特に限定はないが、実施者の目的に従って、サプレッサーｔＲＮＡやＦ因子の有無等を勘案して適宜決定できる。
【００２６】
連結ＤＮＡのｔＲＮＡの共存下でのエタノールによる沈殿は、例えば、５０ｎｇの連結ＤＮＡ当たり２０μｇのｔＲＮＡを共存させて行うことができる。それ以外の条件は、通常のエタノール沈殿法と同様に行うことができる。
【００２７】
また、ライゲーション−トランスフォーメーションの効率を高めるという観点からは、（１）前記連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものであること、
（２）前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、両末端が突出末端であり、かつ異なる制限酵素切断端であること、
（３）前記制限酵素切断端の一方は、Not Iによる切断端であること、
が好ましい。
前述のように、他方の制限酵素切断端は、特に制限されないが、サブクローニング対象が人工抗体ライブラリーである場合、ライブラリー中に切断配列がないという観点から、例えば、ＮｈｅＩ、ＮｃｏＩまたはＳａｌＩによる切断端であることが好ましい。
【００２８】
特に本発明は、インサートＤＮＡとベクターＤＮＡを連結し、得られた連結ＤＮＡを大腸菌に導入して、ベクターＤＮＡ１μｇあたり１ｘ１０8以上、好ましくは１ｘ１０9以上のトランスフォーマントを得ることを含む、クローンライブラリーを調製する方法に関する。この方法は、前記連結に供されるインサートＤＮＡは、アルカリホスファターゼにより５’末端部を脱リン酸化したものであり、前記連結に供されるインサートＤＮＡとベクターＤＮＡは、ともに、二種類の異なる制限酵素切断端（いずれも突出末端）を持ち、かつ前記制限酵素切断端の一方は、Not Iによる切断端であり、前記連結が、リガーゼを用いて行われ、前記連結により得られた連結ＤＮＡを、ｔＲＮＡの共存下でエタノールにより沈殿させ、沈殿した連結ＤＮＡをエレクトロポレーション法により大腸菌に導入することを特徴とする。
【００２９】
上記ライブラリーは、大規模ファージディスプレイ人工抗体（single chain Fv)ライブラリーであることができる。
【００３０】
２．「効率的ライゲーション法」のプロトコールの概要を示す。
以下に、本発明の効率的ライゲーション法のプロトコール・概要を示す。
１）ベクターＤＮＡを、目的の制限酵素によって二ヶ所切断する。
２）同様にインサートＤＮＡの両端を、切断したベクターに連結可能な制限酵素で切断する。このとき、必ずしもベクターを切断した制限酵素と同一である必要は無い。
３）インサートＤＮＡは、切断後、子牛小腸アルカリホスファターゼにて５’末端のヌクレオチドの５’リン酸部位を脱リン酸化する。
４）ベクターＤＮＡ，インサートＤＮＡとも、定法にてフェノール−クロロホルム抽出を行う。ＤＮＡ溶液に溶け込んでいるクロロホルムを除去するため、溶液を２乃至３分間真空乾燥させる（このとき、溶液を全て乾燥させる必要は無い）。
５）ベクターＤＮＡをアガロース電気泳動し、二ヶ所で切断されたＤＮＡ断片のバンドのみを注意深く切り出す。このとき、ベクターの当該制限酵素部位にあらかじめダミー配列（スタッファー）が入れてあれば、一ヶ所で切断されたベクターＤＮＡと二ヶ所で切断されたベクターＤＮＡを、ＤＮＡのサイズの違いにより容易に区別できる。
６）同様に、インサートＤＮＡをアガロース電気泳動し、インサートＤＮＡのバンドを切り出す。
７）ベクターＤＮＡ，インサートＤＮＡ、それぞれを市販の抽出キットを用いて、アガロースゲルより抽出する。
８）抽出したベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡをそれぞれ定法によりエタノール沈殿する。このとき、共沈剤としてグリコーゲンを加える。
９）沈殿させたＤＮＡを７５％エタノールで定法により洗浄したのち、乾燥させ、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解する。
１０）微量で測定可能なＵＶスペクトロメーターを用いて、それぞれのＤＮＡの濃度を定量する。ＴＥ緩衝液により、ＤＮＡ濃度を５０ナノグラム／μｌに調整する。
１１）ベクターＤＮＡ２５ナノグラムと、至適モル比（インサートＤＮＡのサイズなどにより異なるが、通常ベクター１に対し、２ないし３程度）のインサートＤＮＡを混合し、市販のライゲーションキットを用いて、キット仕様書の指示に従いライゲーション反応を行う。なお、Ｔｏｙｏｂｏ社のキットであるLigation highを用いる場合は、ＤＮＡ溶液１容に対し、Ligation highを２容加える。
なお、ＤＮＡ量はモル比を保ちつつ、スケールアップすることができる。
１２）反応終了後、キットの溶液の5ないし１０倍容の水（または緩衝液）にて反応液を希釈する。
１３）共沈剤として、２μｌのｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加える。
１４）全溶液量の３倍容のエタノールを加えて、−８０℃にて３０分間以上静置し、４℃１５０００ｒｐｍにて１５分間遠心する。
１５）沈殿を５００μｌの７５％エタノールにて洗浄し、沈殿を真空乾燥機にて乾燥させる。
１６）沈殿を5μｌの水で溶解する。
１７）エレクトロポレーション用に調製した大腸菌５０μｌと混合する。大腸菌の菌株はＴＧ１その他、目的に応じて選択する。
１８）１ｍｍギャップのエレクトロポレーション用キュベットにＤＮＡ−大腸菌混合物を入れ、エレクトロポレーターにてエレクロトポレーションを行う（電圧１８００Ｖ）。
１９）通電後直ちに、0．９５ｍｌのＳＯＢ培地（１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２０ｍＭ  グルコースを含む）を加え、培養用チューブに移した後、３７℃６０分間、振盪培養を行う。
２０）必要な量を、適切な選択薬剤（アンピシリンなど）を含む寒天プレートにまき、３７℃にてインキュベーションし、トランスフォーマント（ＤＮＡクローンが導入された大腸菌）のコロニーを形成させる。
【００３１】
３．「効率的ライゲーション法」のプロトコール・詳細
以下に効率的ライゲーション法のプロトコールの詳細を示す。
３−１  各ベクターの制限酵素消化と断片の精製
（１）ベクターの制限酵素消化
下記のような反応液、反応条件で行う。
ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ
ＴＦＶ５（又はＴＦＶ４）２０μｇ
Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ        １０μｌ
ＮｈｅＩ                ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                  反応液総量９０μｌ
これらを混合して３７℃２時間反応したのち、
５Ｍ  ＮａＣｌ          ２μｌ
ＮｏｔＩ                ４μｌ＝４８ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                      ４μｌ
を加え、３７℃でさらに２時間反応する。
【００３２】
ＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ
ＴＦＶ３（又はＴＦＶ４）２０μｇ
Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ        １０μｌ
ＮｏｔＩ                ４μｌ＝４８ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
ＮｃｏＩ                ４μｌ＝３６ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                      反応液総量１００μｌ
混合して、３７℃２時間反応する。
【００３３】
ＮｏｔＩ−ＳａｌＩ
ＴＦＶ５          ２０μｇ
Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ
ＮｏｔＩ          ４μｌ＝４８ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
ＳａｌＩ          ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                反応液総量１００μｌ
混合して、３７℃２時間反応する。
【００３４】
ＮｈｅＩ−ＮｃｏＩ
ＴＦＶ３              ２０μｇ
Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ      １０μｌ
ＮｈｅＩ              ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                    反応液総量９０μｌ
これらを混合して３７℃２時間反応したのち、
５Ｍ  ＮａＣｌ        ２μｌ
ＮｃｏＩ              ４μｌ＝３６ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                    ４μｌ
を加え、３７℃でさらに２時間反応する。
【００３５】
ＮｈｅＩ−ＳａｌＩ
ＴＦＶ５              ２０μｇ
Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ      １０μｌ
ＮｈｅＩ              ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                    反応液総量９０μｌ
これらを混合して３７℃２時間反応したのち、
５Ｍ  ＮａＣｌ        ２μｌ
ＳａｌＩ              ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                    ４μｌ
を加え、３７℃でさらに２時間反応する。
【００３６】
ＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ
ＴＦＶ３              ２０μｇ
Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ      １０μｌ
ＳａｌＩ              ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
ＢｇｌＩＩ            ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                    反応液総量１００μｌ
混合して、３７℃２時間反応する。
【００３７】
ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
ＴＦＶ４              ２０μｇ
Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ      １０μｌ
ＨｉｎｄＩＩＩ        ４μｌ＝３２ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                    反応液総量９０μｌ
これらを混合して３７℃２時間反応したのち、
５Ｍ  ＮａＣｌ        ２μｌ
ＳａｌＩ              ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                    ４μｌ
を加え、３７℃でさらに２時間反応する。
【００３８】
ＡａｔＩＩ−ＮｈｅＩ
ＴＦＶ４              ２０μｇ
ＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ    １０μｌ（Ｔｏｙｏｂｏ）
ＡａｔＩＩ            ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
ＮｈｅＩ              ４μｌ＝４０ユニット（Ｔｏｙｏｂｏ）
１０ｘＢＳＡ          １０μｌ（Ｔｏｙｏｂｏ）
水                    反応液総量１００μｌ
混合して、３７℃２時間反応する。
【００３９】
（２）制限酵素消化したベクター断片の精製
概説：上記の制限酵素反応産物の主成分は二ヶ所で切断されたベクターＤＮＡであるが、一ヶ所でのみ切断されたベクターＤＮＡも微量混入している。この一ヶ所切断産物を除去するために、アガロースゲル電気泳動にて両者を分離し、二ヶ所切断産物のみをゲルから抽出する。ベクターのＶＨ、ＶＬクローニング部位には、あらかじめスタッファーと呼ばれるダミー配列（各約１ｋｂｐ）が挿入してあり、二ヶ所切断産物ではこれが切り取られるため、一ヶ所切断産物よりも約２ｋｂｐ（Ｆｖのクローニングの場合）又は１ｋｂｐ（ＶＨ、ＶＬのクローニングの場合）小さなサイズとなる。これを利用して、二ヶ所切断産物のみをゲルより抽出する。
【００４０】
プロトコール：まず、上記の制限酵素反応産物を定法にてフェノール−クロロフォルム抽出した後、１％のアガロースゲル電気泳動を行う。このとき、低い電圧（ゲル１ｃｍあたり、１０Ｖ以下）で泳動する方が、上記の分離には好ましい。泳動後、定法にてＤＮＡをエチジウムブロマイド染色し、二ヶ所切断ベクターＤＮＡのバンドのみをメスにて切り出し、MinEluteTM Gel Extraction Kit （キアゲン社）を用いて、ゲルよりＤＮＡを抽出する。最後はキットのＥＢバッファで２回溶出を行い（１０μl x 2)、下記のようにエタノール沈殿を行う。
【００４１】
溶出液              ２０（単位：μｌ）
グリコーゲン        ０．５  （１０μg)
3M 酢酸ナトリウム   ２．２
エタノール          ６６
を混合し、−８０℃にて３０分間冷却した後、15,000 rpm １５分遠心する。沈殿（すなわち二ヶ所切断ベクターＤＮＡ）を５００μlの７５％エタノールで洗浄した後、沈殿をエバポレーターで乾燥させる。これを１０μlのＴＥバッファで溶解し、一部を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ＤＮＡ濃度５０ｎｇ／μlになるようＴＥバッファにて希釈する。約１０μgの制限酵素消化ベクターＤＮＡから、１乃至２μgの二ヶ所切断ベクターＤＮＡが回収される。
【００４２】
３−２  インサートＤＮＡの作製
インサートＤＮＡは、試験用にマウス免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）、または軽鎖可変領域（ＶＬ）を、マウス免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡよりＰＣＲで増幅し、作製する。また、ＶＨの３’末端領域とＶＬの５’末端領域に同一の配列がオーバーラップするように設計してあり、それを利用してＰＣＲによってＶＨとＶＬを連結し、Ｆｖを作製する。
【００４３】
（１）マウス脾臓ＲＮＡの調製
マウス免疫グロブリンｃＤＮＡを得るため、まずマウス脾臓より全ＲＮＡを抽出する。ＢＡＬＢ／ｃＡ，Ｃ５７ＢＬ，Ｂ６Ｃ３Ｆ１，ＢＤＦ１などの系統のマウス（日本クレア社）より、脾臓を摘出し、鋏にて細切する。メッシュ上ですりつぶすことにより遊離させた細胞から、ＲＮＡ抽出キット（ＴＲＩｚｏｌ、インビトロジェン社）を用いて、メーカー説明書に従い、ＲＮＡを抽出する。
【００４４】
（２）マウスＩｇＧ、ＩｇＭのｃＤＮＡの調製
逆転写反応により、マウス脾臓ＲＮＡ（各系統のものを混合）よりＩｇＧ重鎖、ＩｇＭ重鎖、軽鎖（κ鎖）のｃＤＮＡを合成する。
【００４５】
用いるプライマー
ＩｇＧ重鎖用プライマー・ＭＣＲ１
5' GGCTCTCGCAGGAGACGAGG 3'（配列番号１）
ＩｇＭ重鎖用プライマー・ＧＣＲ１
5' AGGGGCCAGTGGATAGAC 3'（配列番号２）
κ鎖用プライマー・ＫＣＲ１
5' GATGTTAACTGCTCACTGGATGG 3'（配列番号３）
これらのプライマーは、各鎖ｍＲＮＡの定常領域の５’末端近傍にアニールし、そのすぐ上流に位置する可変領域が、逆転写反応により逆転写される。
【００４６】
反応液（５０μl）
ReverTra Ace 添付Ｂｕｆｆｅｒ     １０μｌ（Ｔｏｙｏｂｏ社）
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）          ２０μｌ
マウス脾臓ＲＮＡ（１μｇ／μｌ）    ５μｌ
水                            １０．５μｌ
ＭＣＲ１（又はＧＣＲ１、ＫＣＲ１）１０μＭ  ２μｌ
これらを混合し、７０℃１５分間加熱してＲＮＡを変性させた後、１５分間掛けて４２℃まで徐冷する。ReverTra Ace （Ｔｏｙｏｂｏ社）２．５μｌを加え、４２℃６０分間反応させた後、９９℃５分間加熱し、反応を終了する。
【００４７】
（３）ＶＨ、ＶＬ作製のためのＰＣＲ
ここでは、多様な免疫グロブリン配列のうち、試験的に或るサブタイプの配列のみを増幅し、ＶＨ、ＶＬを作製する。プライマーの５’側には、クローニング用の制限酵素部位が設定してある。また、本発明で用いるベクターシステムにおいては、抗原との結合に最も大きな作用を及ぼすＣＤＲ３部位に合成配列を入れることも可能であり、そのためのdegenerated primerも使用している（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６）。以下に使用したプライマーについて詳述する。それぞれ免疫グロブリンのＶＨまたはＶＬを増幅するためのもので、対象領域の５’末端側にアニールするもの（Ｕ、順方向）と、３’末端側にアニールするもの（Ｒ、逆方向）がある。ＶＨに関しては、ＩｇＧ由来、ＩｇＭ由来のいずれの配列も共通のプライマーで増幅できる。各プライマーは、以後略称で記述する。ベクターのクローニング部位は、前述の図２を参照。
【００４８】
【表１】
2005210956.tif 000003
【００４９】
上記の各プライマーの配列を以下に示す。
【表２】
2005210956.tif 000004
【００５０】
上記配列にはＩＵＢに準拠したミックス塩基が含まれる。
B=T+C+G, K=T+G, R=A+G, W=A+T, D=A+T+G, M=A+C, S=C+G, Y=C+T,
H=A+T+C, N=A+C+G+T, V=A+C+G
【００５１】
ＶＨとＶＬの断片作製用ＰＣＲ  反応条件
反応液 (50μl)
Taq buffer  (TaKaRa)  5（単位：μｌ）
dNTP 2.5 mM (TaKaRa)  4
U primer 10μM        4
R primer 10μM        4
cDNA (上記反応産物)   1
水                   31.5
これらを混合し、氷冷しつつTaq polymerase (TaKaRa) 0.5 μｌ(2.5 U)を加え、98 ℃１分間denatureした後、
95 ℃        20 sec
50 ℃        20 sec
72 ℃         1 min
の反応を３０サイクル行い、最後に72 ℃３分間反応し、反応を終了する。
使用するプライマーの組み合わせ例
Ｕ１とＲ１、Ｕ２とＲ２、Ｕ３とＲ３、Ｕ３とＲ４、Ｕ４とＲ５、Ｕ４とＲ６。
【００５２】
（４）ＰＣＲ産物の制限酵素消化、脱リン酸
一種類の反応につき、上記ＰＣＲ（反応液量５０μｌ）を２本行い、Marligen社Rapid PCR purification systemにて精製する。ＰＣＲ反応液２本につき、PCR purification systemのカラムを１個使用する。制限酵素消化は、PCR purification systemの溶出液４０μlを使用し、ベクターの酵素消化と同様に行う。ただし、反応は５０μlのスケールで行う。
【００５３】
例
ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ消化反応液
Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ   5 （単位：μｌ）
精製ＰＣＲ産物    40
ＮｈｅＩ           2
これらを混合し、３７℃２時間反応した後、
ＮａＣｌ  ５Ｍ     1  (単位：μｌ）
ＮｏｔＩ           2
を加え、さらに３７℃２時間反応する。
【００５４】
脱リン酸反応
制限酵素反応産物（上記）        50  (単位：μｌ)
ＣＩＰ buffer (Toyobo)           6
ＣＩＰ（子牛小腸アルカリ         1  (3 units)
ホスファターゼ, Toyobo）
これらを混合し、３７℃１時間反応を行う。反応後は、５０μlのＴＥ緩衝液飽和フェノールにてフェノール抽出を行い、水層を３００μlのクロロフォルムでクロロフォルム抽出し、水層を回収する。２〜３分間、エバポレータ−にて水層中に溶解しているクロロフォルムを揮発させる。
【００５５】
（５）Ｆｖ断片の作製
ＰＣＲを用いて、ＶＨとＶＬを５’ＶＨ−ＶＬ３’の順になるよう連結し、Ｆｖを作製する。この場合、ＶＨの３’末端部とＶＬの５’末端部に２０残基以上の同一の配列がオーバーラップして存在している必要があり、その要件を満たすようにプライマーを設計する。ここでは、下記のプライマーセットによりＶＨ、ＶＬを作製することにより、実現される。Ｒ３とＵ４の配列が一部オーバーラップしている。
ＶＨ  ：  Ｕ３、Ｒ３    (配列は上述）
ＶＬ  ：  Ｕ４、Ｒ５      (同上）
これらのプライマーセットを用いて、上述のようにＰＣＲにてＶＨ，ＶＬを増幅し、ＰＣＲ産物をRapid PCR purification systemにより精製する。これらのＶＨとＶＬを連結するＰＣＲは、プライマーを加えずに次のように行う。
【００５６】
反応液
Taq buffer (TaKaRa)           5 μｌ
dNTP 2.5 mM                  ４μｌ
VH PCR product               0.5〜1.0μg
VL PCR product               0.5〜1.0μg
水                反応液総量  ４９.５μｌ
Taq polymerase (TaKaRa)     0.5 μｌ
これらを氷上にて混合した後、９８℃１分間denatureし、
95  ℃  20 sec
60  ℃  20 sec
72  ℃   1 min
の反応を１５サイクル行う。
【００５７】
大規模ライブラリー作製などの目的でインサートＤＮＡが大量に必要な場合は、このＰＣＲプロダクトの両端にアニールするプライマーにより、連結されたプロダクトの全長を７サイクル（約１００倍）増幅する。
【００５８】
Ｆｖ全長を増幅するプライマー
名称     略称          配列
3VHcom   Ｕ５     5' CCAACCTGCCATGGCTAGC 3'(配列番号14)
KCR3     Ｒ５        （既出）
【００５９】
Ｆｖ全長増幅の反応液      下記を１tube とし、１０tube 同一の反応を行う。
Taq buffer (TaKaRa)      5 （単位：μｌ）
dNTP   2.5 mM            4
U5  10 μM               4
R5  10 μM               4
連結プロダクト          100 ng
水で総量を49.5μl にし、氷上でTaq polymerase 0.5μl (2.5 U, TaKaRa)を加える。
【００６０】
Ｆｖ全長増幅反応
９８℃で１分間denatureしたのち、
95 ℃  20 sec
55 ℃  20 sec
72 ℃   1 min
の反応サイクルを７サイクル行う。最後に72 ℃で３分間反応し、反応を終了する。
【００６１】
なお、ライブラリー作製においては、ここで大幅な増幅を掛けると、特定のクローンのみが優先的に増幅されて、ライブラリーの各クローンの存在量に不均一性が生じる恐れがあるため、増幅は７サイクル（理論値：２7＝１２８倍）程度にとどめる。
Ｆｖ断片の精製、制限酵素消化、脱リン酸反応、フェノール−クロロホルム抽出は、ＶＨ、ＶＬの場合と同様に行う（上述、（４））。
【００６２】
ちなみに、制限酵素消化後のＶＨ、ＶＬは約０．３４ｋｂｐ、Ｆｖは０．８ｋｂｐと  なる。
【００６３】
（６）ＶＨ、ＶＬ、Ｆｖ制限酵素消化断片の精製
ベクター制限酵素消化断片の精製の場合と全く同様に行う（３−１、（２））。ただし、ゲル電気泳動は３％アガロースを使用し、目的のサイズのＤＮＡバンドのみを切り出す。
回収率は、５μgの制限酵素消化ＤＮＡから、１乃至２μgの精製ＤＮＡが得られる。
【００６４】
３−３  ベクター及びインサートＤＮＡのライゲーション及び大腸菌への導入
（１）ライゲーション
対応する切断端を持つベクターＤＮＡとインサートＤＮＡを、各社のライゲ  ーションキットを用いてライゲーションする。使用したキットを以下に示す。  
Ｔｏｙｏｂｏ社  Ligation high
ＴａＫａＲａ社  DNA Ligation Kit  Ver. 2
プロメガ社      LigaFastTM Rapid DNA Ligation System
ＮＥＢ社        Quick LigationTM Kit
【００６５】
上記キットの内、プロメガ社のLigaFastTM Rapid DNA Ligation System 及び  ＮＥＢ社のQuick LigationTM Kitの緩衝液及び酵素液の成分は以下の通りである。
【００６６】
プロメガ社のLigaFastTM Rapid DNA Ligation System
緩衝液（2X Rapid Ligation Buffer）
60 mM Tris-HCl (pH 7.8)
20mM MgCl2
20mM DDT(ジチオスレイトール)
2mM ATP
10% PEG(ポリエチレングリコール)
酵素液(Enzyme Storage Buffer)
T4 DNA リガーゼ
10mM Tris-HCl (pH 7.0)
50mM KCl
1mM DDT
0.1mM EDTA
50% グリセロール
【００６７】
ＮＥＢ社のQuick LigationTM Kit
緩衝液（2X Quick Ligation Buffer）  
132 mM Tris-HCl (pH 7.6)
20mM MgCl2
2mM DDT(ジチオスレイトール)
2mM ATP
15% PEG6000(ポリエチレングリコール)
酵素液(Quick T4 DNA Ligase)
T4 DNA リガーゼ
10mM Tris-HCl (pH 7.4)
50mM KCl
1mM DDT
0.1mM EDTA
200μg/ml BSA(牛血清アルブミン)
50% グリセロール
【００６８】
すべて、仕様書の指示通りにライゲーション反応を行うが、Ｔｏｙｏｂｏ社  のLigation high については、ＤＮＡ溶液の２倍容のLigation high  液を用いる。
【００６９】
反応後は、キット溶液の５乃至１０倍容の水を加え、ｔＲＮＡを共沈剤とし  て、総液量の３倍容のエタノールにてエタノール沈殿を行う。
【００７０】
反応例：Ligation high
NotI-NheI切断ＴＦＶ５  50ng/μl      ０．５（単位：μｌ）
NotI-NheI切断Ｆｖ      50ng/μl      ０．５
Ligation high                        ２．０
１６℃  ３０分間反応した後、
水                                 １２  （Ligation highの６倍容）
ｔＲＮＡ  （１０ｍｇ／ｍｌ）         ２
エタノール                         ５１
を加え、−８０℃にて３０分冷却し、エタノール沈殿を行う。
【００７１】
反応例：LigaFastTM Rapid DNA Ligation System
NotI-NheI切断ＴＦＶ５  50ng/μl      ０．５（単位：μｌ）
NotI-NheI切断Ｆｖ      50ng/μl      ０．５
水                                   ３．０
2 x buffer                           ５．０
T4 ligase 液                         １．０
室温にて５分間反応した後、
水                                   ５０  （反応液の５倍容）
ｔＲＮＡ  （１０ｍｇ／ｍｌ）           ２
エタノール                         １８６
を加え、−８０℃にて３０分間冷却し、エタノール沈殿を行う。
【００７２】
２）大腸菌への導入（トランスフォーメーション）
上記の冷却後、15,000 rpmにて１５分間遠心し、沈殿（すなわちライゲート＝ライゲーション反応産物ＤＮＡ）を５００μlの７５％エタノールで洗浄し、エバポレーターで乾燥させる。
ＤＮＡを５μlの水で溶解し、エレクトロポレーションを行う。エレクトロポレーション用の大腸菌（菌株はＴＧ１）は、定法にて作製し、５０μlずつ分注して−８０℃に凍結保存してあるものを溶解して用いる。大腸菌は氷上で溶解し、溶解したらただちに上記のＤＮＡ溶液と混合し、あらかじめ氷冷してある１ｍｍギャップのエレクトロポレーション用のキュベット（ＢＭ社）に注入する。これを１乃至３分間氷上に静置した後、エレクトロポレーター（Eppendorf Electroporator 2510）にセットし、１８００Ｖの電圧にて放電する。放電後ただちに、０．９５ｍｌのＳＯＢ培地（２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む）を添加し、１５ｍｌポリプロピレンチューブに移し変えた後、３７℃６０分間振盪培養（150 rpm）する。この培養液の一部または全部をＬＢ寒天プレート（１００μg/mlアンピシリン、１％グルコースを含む）上に均一に塗布し、３７℃８時間（または３０℃１１時間）程度培養し、コロニーを形成させる。
【００７３】
出現するコロニーの各々が、個々のライゲートクローンを含む。このコロニー数（colony forming unit, cfu）が多いほど、ライゲーション−トランスフォーメーションの効率が高いということになる。
後述するライブラリー作製の場合においては、このコロニーの数が、すなわちライブラリークローンの種類の数を表す。従って、コロニーの数が多いほど、ライブラリーの多様性が大きいことになり、好ましい。
【００７４】
３）ライゲーションからトランスフォーメーションまでの全体の効率の判定法
２５ナノグラムのベクターＤＮＡを用いてライゲーションを行い、例えば、最終培養液の５万分の１容をプレートに蒔いて、５００個のコロニー（すなわちトランスフォーマント）が出現した場合、ライゲーション−トランスフォーメーションの効率は、
５００  ｘ  ５万  ｘ  １０００／２５  ＝  １  ｘ  １０9  トランスフォーマント／μｇベクターＤＮＡ  となる。
【実施例】
【００７５】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
前述のプロトコールに従い、２５ナノグラムのベクターＤＮＡを用いて、インサートＤＮＡをライゲーションし、ＴＧ１株大腸菌に導入して得られたコロニー数を表１に示した。ライゲーションキットは、特に記載の無い限りＴｏｙｏｂｏ社 Ligation highを使用した。インサートＤＮＡの量は、2.5, 5.0, 12.5, 25, 37.5, 50 ngについて検討し、最も高い値を示したベクター：インサート比におけるデータを示した。
なお、エレクトロポレーション用の大腸菌（エレクトロセル）は、複数の標品を使用したが、そのトランスフォーマント形成能（ＤＮＡの導入効率）の平均値は(3.5 ± 0.4) x 109 cfu/μg vector (4.2 kb) DNA (n = 7) であった。全てのデータを 3.5 x 109 cfu/mg のエレクトロセル導入あたりに換算して、表示した。
【００７６】
【表３】
2005210956.tif 000005
２：従来法
３：プロメガ社キット
１のデータ：９回試行した平均値
３のデータ：５回試行した平均値
４のデータ：３回試行した平均値
その他のデータ：特に断らない限り１回試行したデータ
【００７７】
上記の表３に示したごとく、１μｇのベクターＤＮＡあたり、最大で１．４ｘ１０9のライゲートクローンの生成という、従来の成績（メーカー仕様書において５ｘ１０6 以下）をはるかに上回る高効率ライゲーション法を実現した。この効率は、どの制限酵素部位にライゲーションするかに、著しく依存していた。また、Nhe I-Not I 及びSal I-Not I のライゲーションで得られたコロニーから、プラスミドを調製し、インサートの有無を調べたところ、いずれもインサート含有割合は１００％（各１８クローンをチェック）であった。本発明に用いたものと同一のＤＮＡ標品を用いて、従来法（共沈剤としてグリコーゲンを使用）によってNhe I-Not Iライゲーションを実施した場合、効率は本発明の約３千分の１に過ぎなかった（表３、番号２）。また、本発明の条件でのNhe I-Not Iライゲーションにおいて、キットが異なっても同様な高効率を示し（表３、番号３、プロメガ社）、本発明には汎用性があることが示された。
【００７８】
以下に、本発明を、実験例を示しながら説明する。
結論を先に述べると、本発明におけるライゲーション効率（最終的に得られるクローン数）の著しい増大は、二つの重要な実験条件の最適化により達成された。一つ目は、ライゲーション反応産物（ライゲート）の大腸菌への導入法の最適化であり、二つ目は、ライゲーション反応に供するインサートＤＮＡの５’末端脱リン酸処理の実施である。
【００７９】
実施例２−１
ライゲーションしたＤＮＡを大腸菌に導入するには、現在最も高効率なエレクトロポレーション法を用いる。これは、短時間の高電圧ショックにより、大腸菌に穿孔を開け、ＤＮＡを取り込ませる手法である。ところが、ライゲーションキットを用いた際の反応産物（ライゲート）溶液には、塩類など、エレクトロポレーションによる大腸菌へのＤＮＡの導入を妨げる物質が存在している。このため、エタノールを用いた塩析（エタノール沈殿）によってライゲートＤＮＡのみを沈殿させることが重要であると考えられる。しかしながら、本発明者らがライゲーションキット溶液の存在下で、定法に従ってエタノール沈殿を実施したところ、ライゲートＤＮＡの大腸菌への導入効率は著しく低かった。
一方、エタノール沈殿の際、共沈物としてｔＲＮＡを添加すると、ライゲートＤＮＡの効率的な大腸菌への導入が可能になることがわかった。
【００８０】
以下表４に、ライゲーション反応液のエタノール沈殿時の条件が、ライゲートＤＮＡを大腸菌に導入して得られるコロニー数に及ぼす効果を示す。
【００８１】
２５ng/μlのベクターＤＮＡ（ＴＦＶ３Ｂ：ＴＦＶ３のＶＨ，ＶＬ部位にあらかじめ挿入してあるダミー配列を除いたもの。4.2 kbp）1μｌをＤＮＡライゲーションキットの反応液（Ｔｏｙｏｂｏ社Ligation high）２μｌと混合し、１２μｌの水で希釈した後、表示する条件下でエタノール沈殿を行い、エレクトロポレーションにより大腸菌に導入した。尚、試薬を加える順番としては、ＴＦＶ３Ｂとキットの成分を混合し、次いで水で希釈し、グリコーゲン乃至ｔＲＮＡを加え、次いで酢酸ナトリウムを加え、最後にエタノールを加える、とした。但し、グリコーゲン、ｔＲＮＡ及び酢酸ナトリウムの添加の有無は、表4に示す通りである。
【００８２】
添加量：
酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ5.2）  1.5μl
グリコーゲン（20 mg/ml)          1.0μl
ｔＲＮＡ  （10 mg/ml)            2.0μl
エタノール               全液量の３倍容
【００８３】
【表４】
2005210956.tif 000006
1〜4 従来法
5〜6 本発明
【００８４】
表４に示したごとく、ｔＲＮＡを共沈剤として用いたときにのみ、高い効率でトランスフォーマントが得られた。また、実施例２−２で述べるように、LigaFastTM Rapid DNA Ligation System（プロメガ社）を用いてこの実験を行った場合も、ほぼ同様の結果が示され、ｔＲＮＡを用いてエタノール沈殿することにより、最大の効率が得られた。
【００８５】
参考例１
実施例２−１において、ＤＮＡライゲーションキットの反応液（Ｔｏｙｏｂｏ社Ligation high）２μｌ及び１２μｌの水での希釈の代りに、１０μｌの水を用いた以外は同様にエタノール沈殿を行い、エレクトロポレーションにより大腸菌に導入した。結果を表５に示す。
【００８６】
【表５】
2005210956.tif 000007
【００８７】
この実験では、ＤＮＡライゲーションキットの反応液を用いておらず、従って、エレクトロポレーションを阻害する物質であるリガーゼが含まれない条件で、エタノール沈殿が行われ、かつエレクトロポレーションも行われた。その結果、表５に示すように、１の結果以外は、１０8〜１０9／ベクターDNA１μｇのコロニー数が得られた。この結果は、グリコーゲン、ｔＲＮＡ及び酢酸ナトリウムのいずれか１つを添加すれば、ベクターＤＮＡの塩析が促進され、エレクトロポレーションによる大腸菌への導入効率も高まることを示す。
【００８８】
実施例２−２
実施例２−１において、ＤＮＡライゲーションキットの反応液（Ｔｏｙｏｂｏ社Ligation high）の代りにLigaFast (Promega)を用い、以下の条件でエタノール沈殿を行い、エレクトロポレーションにより大腸菌に導入した。結果を表６に示す。但し、LigaFast (Promega)の緩衝液と酵素液を用いた場合（通常の使用法）と緩衝液のみを使用した場合の２通りの実験を行った。
【００８９】
キットの反応条件に従って、
ＴＦＶ３Ｂ（２５nｇ／μｌ）          １μｌ
水                                   ３μｌ
キットの緩衝液                       ５μｌ
キットの酵素液                       １μｌ
をまず混合した。
これを  水  ５０μｌ  で希釈し、さらに実施例２−１と同様に、
グリコーゲン                         １μｌ
ｔＲＮＡ                             ２μｌ
酢酸ナトリウム                       ６μｌ
エタノール                        全液量の３倍容
を添加し、エタノール沈殿を行った。
【００９０】
緩衝液のみの場合は、上記の「キットの酵素液」を水に置き換えた（つまり最初に混合する水を３μｌから４μｌに変更した（他の条件は全て同じ）。また、緩衝液のみのデータは２回の実験の平均値である。
【００９１】
【表６】
2005210956.tif 000008
【００９２】
この実験の「緩衝液＋酵素液」では、ＤＮＡライゲーションキットの反応液を用いており、１〜４のｔＲＮＡを使用しない系では１０4〜１０7／ベクターDNA１μｇのコロニー数しか得られなかったのに比べて、５及び６のｔＲＮＡを使用した系では１０8〜１０9／ベクターDNA１μｇのコロニー数が得られた。
それに対して、この実験の「緩衝液のみ」では、酵素が使用されておらず、その結果、１〜６の全ての条件で、１０9／ベクターDNA１μｇのコロニー数が得られた。この結果は、酵素液に含まれる酵素（リガーゼ）がエレクトロポレーションによる大腸菌への導入効率を阻害する要因であることを示すものである。
【００９３】
また、表５に示す結果と表６の「緩衝液のみ」の結果を対比すると、表６の１〜６の条件は、塩析の条件としては良好な条件であることが分かり、さらに、これに表６の「緩衝液＋酵素液」の結果も対比すると、塩析の条件としては良好な表６の１〜６の条件であっても、そこに酵素液を添加すると、エレクトロポレーションによる大腸菌への導入効率は阻害され（１〜４）、それに対してｔＲＮＡを使用すれば、エレクトロポレーションによる大腸菌への導入効率は阻害されないことが分かる（５及び６）。即ち、これらのデータは、酵素液により阻害されるエレクトロポレーションによる大腸菌への導入効率が、ｔＲＮＡの添加により解消されることを示す。
【００９４】
実施例３
本実施例では、ＤＮＡの５’末端ヌクレオチドのリン酸基の脱リン酸化の影響を示す。制限酵素でＤＮＡを切断すると、断端において５’末端のヌクレオチドの５’位にリン酸基が残り、３’末端のヌクレオチドの３’位は水酸基となる。従来技術によるライゲーション、特に一種類の制限酵素のみでベクターＤＮＡとインサートＤＮＡを切断し、ライゲーションする場合では、ベクターＤＮＡの５’末端を脱リン酸処理することで、ベクターの自己ライゲーションを防ぎ、良好な結果が得られていた。
【００９５】
ところが、本発明におけるような、二種類の制限酵素でベクターＤＮＡとインサートＤＮＡを切断してライゲーションする場合は、ベクターＤＮＡの５’末端にはリン酸基を残し、インサートＤＮＡの５’末端を脱リン酸処理する方が、高い効率でライゲーションが起こる事が明らかになった。
【００９６】
以下の表７に、ＤＮＡの５’末端の脱リン酸処理がライゲーション効率に及ぼす影響を示す。ちなみに、ベクターＤＮＡとインサートＤＮＡの両者を５’脱リン酸化してしまうと、ライゲーション反応は起こらない。
【００９７】
Not I-Nco Iで切断した後、表示の条件でＤＮＡを脱リン酸処理し、ベクター、インサート、各２５ngを用いてライゲーションを行い、ｔＲＮＡを添加してライゲートをエタノール沈殿し、エレクトロポレーションによって大腸菌に導入した。
【００９８】
【表７】
2005210956.tif 000009
1〜2   本発明のtRNAを添加したエタノール沈殿法を適用しているため、従来法であるにもかかわらず、効率が大幅に増大している。
3 本発明
【００９９】
表７に示したように、インサートＤＮＡを脱リン酸した場合、ベクターＤＮＡを脱リン酸した場合や、脱リン酸処理を行わない場合より、約１０倍効率が高くなる事がわかった。
【０１００】
以上、表４〜表７より、ｔＲＮＡを共沈剤としてライゲーション反応産物をエタノール沈殿することに加え、従来法のごとくベクターＤＮＡの脱リン酸ではなく、インサートＤＮＡを脱リン酸処理することにより、本発明における超高効率のライゲーション−トランスフォーメーションが実現されることがわかった。
【０１０１】
実施例4
以下、図３に各社キットによるライゲーション−トランスフォーメーション効率（ＴＦＶ５、Nhe I-Not I部位）を示す。
図３に示したように、いずれのキットもほぼ同様の高効率を示した。Not I-Nco I部位を用いたライゲーションにおいても同様の結果が得られた。
【０１０２】
以上より、本発明は現在市販されている多くのキットに適用が可能であり、汎用性、実用性の高い方法論であることが証明された。
【０１０３】
実施例5
本発明を、例えばｃＤＮＡライブラリーの作製に応用する場合には、インサートＤＮＡのサイズが、これまで述べてきたＶＨ，ＶＬ（０．３４ｋｂｐ）、Ｆｖ（０．８ｋｂｐ）よりも大きくなる。そこで、より大きなサイズのインサートのライゲーション−トランスフォーメーション効率を調べるため、ＴＦＶ５のスタッファー部分全体（２．２ｋｂｐ）をインサートＤＮＡとして用い、Nhe I-Not I 部位において、本発明によるライゲーションを行った（表８）。
【０１０４】
【表８】
2005210956.tif 000010
【０１０５】
Ｆｖ（０．８ｋｂｐ）のライゲーション−トランスフォーメーション（前述、表３）に比べて、約４０％効率が低いものの、1 x 109に迫る良好な効率が得られた。
この結果から、「効率的ライゲーション法」はインサートＤＮＡのサイズが大きく、少なくとも２ｋｂｐに及ぶような場合、例えばｃＤＮＡライブラリーの作製にも極めて好適な結果を示すことが立証された。
【０１０６】
実施例6
本発明の応用  簡便な大規模人工抗体ライブラリー作製の実施例
本発明の「効率的ライゲーション法」を応用することにより、著しく簡便化した大規模ライブラリーの作製法が可能になったことを示す。
【０１０７】
（１）概要
前記表１に、本発明で得られるライゲートクローンの数を示しているが、ここで重要な点は、ライゲーションの効率が、制限酵素部位の違いに依存して大きく異なること、そして、二つの切断部位のうち一つがNot Iである場合に、最も高いライゲーション効率が得られることである。
この特質を利用すれば、１ｘ１０9程度の配列レパートリーをベクターＤＮＡ（プラスミド、ファージミドなど）に挿入した大規模ライブラリーを簡便に作製することができる。
【０１０８】
「簡便」の意味するところは、短時間かつ少ない労力で、１０9程度の配列レパートリーを持つ大規模ライブラリーを作製できることである。最も労力を要するライゲーション−トランスフォーメーションの工程は、４時間程度で完了する。
【０１０９】
ライゲーションを行う制限酵素部位（クローニング部位とも言う）は、一方の切断端をNot I とし、他方は任意の制限酵素を目的に応じて選択すれば良い。このときに考慮すべきことは、実施者が目的とするインサートＤＮＡが切断されない制限酵素を選ぶことである。Not I は８ヌクレオチドを認識するため、例えばヒトゲノムなどにおいてNot I部位の出現頻度は低く、この意味からも、さまざまな種類のライブラリー作製に好適である。
【０１１０】
（２）簡便な大規模人工抗体ライブラリー作製法のプロトコール・詳細
本発明者らは、該ライブラリー作成法を、マウス人工抗体ライブラリー作製に適用した。以下にマウス人工抗体ライブラリー作製法を説明する。
本発明者らは、まず人工抗体ライブラリー作製目的で使用する新規のファージミドベクター、ＴＦＶ３，ＴＦＶ４，ＴＦＶ５を作製した（前述、図２）。これらのベクターは、ＶＨ（免疫グロブリン重鎖可変領域）とＶＬ（免疫グロブリン軽鎖可変領域）の配列レパートリー（から成るインサートＤＮＡ）を段階的にライゲーションするクローニング法と、 Fv（あらかじめＶＨとＶＬを連結した配列レパートリーで）を一回でライゲーションするクローニング法の両方が可能であるが、本発明の過程において、後者の一段階クローニングの方がより効率が高いことが判明したため、一段階クローニング法を以下採用した（図４）。
【０１１１】
（２−１）  ＶＨ、ＶＬの配列の増幅
３−２（５）に記述したように、ＶＨの３’末端部とＶＬの５’末端部に共通の配列が存在するように、タグ配列を付加したプライマーを設計した。また、ＶＨ・ＶＬを連結した後に増幅するために、ＶＨのＵ側プライマーの５’末端部に共通したタグ配列を付加した。
マウスのＶＨ、ＶＬの配列にアニールする部分は、既に発表されている配列分類に準拠して分類し、作製した。（IMGT, the international ImMunoGeneTics database http://imgt.cines.fr:8104  及びLefranc, M. -P. et al Nucl. Acids Res. 27, 209-212, 1999; Ruiz, M. et al, Nucl. Acids Res. 28, 219-221, 2000; Lefranc, M. -P. et al Nucl. Acids Res. 29, 207-209, 2001)。
【０１１２】
【化１】
2005210956.tif 000011
【０１１３】
マウスＶＨ配列の多様性に対応するため、Ｕ側は１６種類（いずれも上記の共通配列を持つ）、Ｒ側は４種類（同上）のプライマーを設定した。分類した各々の配列は、ＩＭＧＴの配列分類に準拠している。
【０１１４】
【化２】
2005210956.tif 000012
【０１１５】
マウスＶＬ（κ）配列の多様性に対応するため、Ｕ側は１６種類のプライマー（いずれも上記の共通配列を持つ）を設定した。各々の配列については、ＶＨと同様ＩＭＧＴの分類に準拠する。なお、Ｒ側は、ＶＬ領域の３’側に位置する定常領域にアニールする配列を設定したため、多様な配列を持つＶＬを一種類のプライマー（上記Ｒ５）で増幅が可能である。
【０１１６】
ＰＣＲの反応条件は、３−２（３）に従う。ただし、ＶＨのＲ側プライマーは、４種類を等モルで混合したものを、反応液中終濃度０．８μＭで用いる。ＶＨ、ＶＬそれぞれ１６種類の反応を行う。
【０１１７】
反応産物は、Marligen社 Rapid PCR purification systemにて精製し、各々を下記の量比で混合した。各分類は前述のようにＩＭＧＴに準拠しており、ゲノム上における、各サブタイプの遺伝子の数の比を、この混合比に反映させた。
【０１１８】
VH        量比                 VL(κ鎖）  量比
VH1a        5                  VK1         1
VH1b        5                  VK2         0.3
VH2         0.5                VK3          1
VH3         1                  VK4          3
VH4        0.3                 VK5,7       0.5
VH5        2.5                 VK6a        0.5
VH6        0.5                 VK6b        0.5
VH7        0.3                 VK8          1
VH8        0.5                 VK9,12       1
VH9        1                   VK10        0.3
VH10       0.5                 VK11        0.3
VH11       0.2                 VK13        0.3
VH12       0.2                 VK14        0.3
VH13       0.1                 VK15,16,19   0.3
VH14       0.5                 VK17        0.3
VH15       0.1                 VK18        0.2
【０１１９】
（２−２）連結ＰＣＲにより、ＶＨ、ＶＬを連結し、Ｆｖ断片を作製する。
１反応（５０μｌ）あたり、上記のＶＨ、ＶＫそれぞれの混合物０．６μｇを使用し、連結ＰＣＲを１０反応行った（３−２（５）に従う）。反応産物は、Marligen Rapid PCR purification systemにて精製した（全反応産物をカラム２本で処理）。
さらに、１反応あたり連結産物１００ngを用いて、増幅ＰＣＲ（７サイクル）を９反応行った（３−２（５）と同条件）。反応産物（Ｆｖ）をMarligen Rapid PCR purification systemにて精製した（全反応産物をカラム３本で処理）。
【０１２０】
（２−３）上記のＦｖ断片をNhe I-Not I 消化し、０．８ｋｂｐ断片を精製した（３−２（６））。
（２−４）「効率的ライゲーション法」により、ベクターＴＦＶ５（1μｇ）にＦｖ断片（１μｇ）をライゲーションし、大腸菌にエレクトロポレーションした（３−３）。
このとき、べクターＤＮＡ５０ngあたり５０μｌのエレクトロセルを用いてエレクトロポレーションし、全２０回行った。トランスフォーマントを、ＬＢ寒天プレート（１％グルコース、100μg/ml アンピシリン含有）５００ｃｍ2  ｘ１０枚に塗布し、コロニーを形成させた。
【０１２１】
（３）大規模人工抗体ライブラリー作製の実際
マウス脾臓よりＩｇＧ重鎖及びκ鎖cDNAを調製し、これらのcDNAを鋳型にして、ＰＣＲにてＶＨ、ＶＬ（ＶＫ）のそれぞれの配列レパートリーを増幅した。さらにＰＣＲにてＶＨ、ＶＬを連結し、Ｆｖレパートリーを得た。ベクター（ＴＦＶ５）とＦｖそれぞれについてNhe I及びNot I で切断したＤＮＡ（各１μｇ）を調製し、「効率的ライゲーション法」を実施した。最終的に、0.9 x 109のトランスフォーマントが得られ、すなわち0.9 x 109の配列レパートリーを有するマウスＩｇＧ由来人工抗体ライブラリーが得られた。
【０１２２】
このライブラリーのインサート含有率を調べたところ、４８クローン中４８クローンがインサートを有していた（含有率１００％）。また、インサート部分のみをＰＣＲで増幅し、4 base cutterであるHae IIIならびにAlu Iによる制限酵素消化パターンを調べたところ、４８クローンは全て異なるパターンを示した。従って、本発明の「効率的ライゲーション法」によって、インサート無しの「空クローン」が殆ど無い、極めて質の高い大規模ライブラリーが作製できることが示された。
【０１２３】
本発明者らの経験では、従来技術による人工抗体ライブラリー作製では、１μｇベクターＤＮＡから、最大でも１ｘ１０7トランスフォーマントに及ばなかった。従って、従来技術によって、上述のように0.9 x 109のトランスフォーマントを得ようとすると、
９０回以上同じ実験を繰り返さねばならないことになり、膨大な時間と労力を要する。つまり、本発明によって、従来技術によるライブラリー作製の労力を、約百分の一に減じることができたと言える。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ライゲーション反応例。
【図２】各ベクターの制限酵素部位。
【図３】各社ライゲーションキットの効率比較結果(Nhe I-Not I)。
【図４】Ｆｖのクローニングのスキーム。
【図１】
2005210956.tif 000013
【図２】
2005210956.tif 000014
【図３】
2005210956.tif 000015
【図４】
2005210956.tif 000016
【配列表】
2005210956000001.app