(57)【要約】【課題】  培養環境ストレス応答性プロモーターを利用したタンパク質の製造方法及びRNA生産制御方法を提供することを目的とする。【解決手段】  培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNAと、前記DNAの下流に外来遺伝子又は外来DNA断片とを含むベクターによって形質転換された形質転換体を、培養環境ストレス条件下で培養する。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAと、前記DNAの下流に外来遺伝子とを含むベクターによって形質転換された形質転換体を、培養環境ストレス条件下で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
（a）配列番号１に示される塩基配列からなるDNA。
（b）配列番号１に示される塩基配列からなるDNAにおいて1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA。
(c)配列番号１に示される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA。
【請求項２】
上記培養環境ストレスは、対数増殖期後期から定常期までの培養、低グルコース濃度又は高塩濃度であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質の製造方法。
【請求項３】
宿主が酵母であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質の製造方法。
【請求項４】
上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、請求項３記載のタンパク質の製造方法。
【請求項５】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAと、前記DNAの下流に外来DNA断片とを含むベクターによって形質転換された形質転換体を、培養環境ストレス条件下で培養することを特徴とするRNA生産制御方法。
（a）配列番号１に示される塩基配列からなるDNA。
（b）配列番号１に示される塩基配列からなるDNAにおいて1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA。
(c)配列番号１に示される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA。
【請求項６】
上記培養環境ストレスは、対数増殖期後期から定常期までの培養、低グルコース濃度又は高塩濃度であることを特徴とする、請求項５記載のRNA生産制御方法。
【請求項７】
宿主が酵母であることを特徴とする、請求項５記載のRNA生産制御方法。
【請求項８】
上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、請求項７記載のRNA生産制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養環境ストレス応答性プロモーターを利用したタンパク質の製造方法及びRNA生産制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、ビール、日本酒などのアルコール飲料やパンなどの発酵を利用した食品などの製造に用いられる他、アミノ酸などの代謝産物の製造、さらには組換えDNA技術を利用して同種あるいは他種生物のタンパク質生産系の宿主として広く用いられている。
【０００３】
タンパク質生産系においては、酵母の他に大腸菌、昆虫細胞及びCHO細胞などに代表される各種生物由来の培養細胞が宿主として用いられている。大腸菌はよく用いられる宿主のひとつである。しかしながら、大腸菌を宿主として用いた場合には、ヒトなどの動物由来のタンパク質を生産させると非常に高い確率で不溶化し、変性状態のタンパク質として生産されてしまうという欠点がある。一方、CHO細胞などの培養細胞を宿主として用いた場合には、ヒトなどの動物由来のタンパク質を、比較的高い確率で正確な立体構造を有し、かつ天然のタンパク質が有する機能と同等の機能を有するタンパク質として生産することができる。しかしながら、CHO細胞などの培養細胞は、培養のコストが高く、培養スケールも大腸菌などの微生物ほど大きくできないという大きな欠点がある。
【０００４】
一方、単細胞の真核生物である酵母は、タンパク質生産系の宿主として使用した場合に、培養細胞と同様にヒトなどの動物由来のタンパク質を比較的高い確率で、正確な立体構造を有し、かつ天然のタンパク質が有する機能と同等の機能を有するタンパク質を生産することができる。さらに酵母は、大腸菌などの微生物と同様に培養設備、培養時間及び培養コストの点で培養細胞よりも経済的である。この点において、タンパク質生産系において、酵母は大腸菌や培養細胞よりも有用である。また、タンパク質生産系における酵母の特長は、従来食品産業に用いられてきた実績から推定される生物としての安全性の点である。
【０００５】
さらに、酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のゲノム情報は、1996年に解読された。よって、従来から非常に良く整備されてきた遺伝子組換え技術に加え、酵母にはゲノム情報を活用できるという優れた遺伝学的背景がある。
【０００６】
一方、これまでに、酵母を対象とした様々な酵母用発現ベクターが提供されてきた。このような酵母用発現ベクターは、プロモーターを含んでいる。プロモーターとしては、例えば、ADHプロモーター、GPDプロモーター、GAL1プロモーター、CUP1プロモーター、TEFプロモーター、MET25プロモーター及びPHO5プロモーターが挙げられる。しかしながら、これらのプロモーターは、それほど強力なプロモーターではないと考えられている(非特許文献１)。実際、これらのプロモーターは、研究室レベルで利用されるものの、外来タンパク質を商業生産レベルまで生産する目的では、ほとんど使用されていない。
【０００７】
また、これまでに酵母プロモーターとして、構成的プロモーター（特許第2795850号、特許第2723358号、特許第2694134号、特許第2572952号、特許第2528849号、特許第2509163号、特開平9-163998号）及び誘導性プロモーターが開示されている（特許文献１〜４参照）。
【０００８】
誘導性プロモーターは、宿主において外来タンパク質の発現を制御できる点で非常に重要である。一方、構成的プロモーターは、宿主において外来タンパク質を構成的に発現させることができる。しかしながら、酵母において細胞障害や増殖阻害を起こさせるような外来タンパク質を発現させようとする場合に、上述したADHプロモーター、TEFプロモーター、GPDプロモーターなどの構成的プロモーターを用いると、酵母において上記外来タンパク質を構成的に発現させてしまい、酵母に対して細胞障害や増殖阻害を引き起こす可能性がある。また、分解されやすいタンパク質は、発現と共に分解を受けることが多い。従って、酵母においてこれらのような外来タンパク質を発現させようとする場合には、誘導性プロモーターを用いて、酵母を増殖させる段階では低い発現レベルとし、その後外来タンパク質を誘導生産させることがより適切である場合がある。
【０００９】
さらに、DNAマイクロアレイを用いた解析によりストレス応答性遺伝子を同定した文献がある（国際出願PCT/JP03/05956、及び非特許文献２〜４）。これらのストレス応答性遺伝子の上流には、ストレス応答性プロモーターが存在すると考えられる。しかしながら、通常、DNAマイクロアレイを用いた解析では、ストレス応答性遺伝子の発現を、ストレスのない状態の発現レベルに対する、ストレスを与えた場合の発現レベルの割合として検出するため、例えば元々非常に低い発現レベルの遺伝子が中程度あるいはそれ以下に発現レベルが上がっても、大きな上昇と捉えられることとなる。すなわち、マイクロアレイによるデータのみでは、これらのストレス応答性遺伝子の上流に存在するプロモーターが実際にタンパク質発現に利用可能であるか否か、さらにはタンパク質の大量生産に使用できるほど強力であるか否かは定かではない。
【００１０】
【特許文献１】特許第2641457号公報
【特許文献２】特開平11-266874号公報
【特許文献３】特開2000-78977号公報
【特許文献４】特表2003-509054号公報
【非特許文献１】M. Funk, R. Niedenthal, D. Mumberg, K. Brinkmann, V. Roenicke, T. Henkel, サッカロミセス・セレビシエにおける異性タンパク質発現のためのベクター系（Vector systems for heterologous expression of proteins in Saccharomyces cerevisiae.）, 「Methods in Enzymology」, 2002年, 第350巻, p.248-257.
【非特許文献２】T. Sahara, T. Goda, S. Ohgiya, 低温に対する酵母細胞における時間依存的遺伝的応答の包括的発現解析(Comprehensive expression analysis of time-dependent genetic response in yeast cells to low temperature.), 「Journal of Biological Chemistry」, 2002年, 第277巻, p.50015-50021.
【非特許文献３】J. Yale, H. J. Bohnert, 高塩分濃度でのサッカロミセス・セレビシエにおける転写産物発現(Transcript expression in Saccharomyces cerevisiae at high salinity.), 「Journal of Biological Chemistry」, 2001年, 第276巻, p.15996-16007.
【非特許文献４】W. H. Mager, A. J. De Kruijff, ストレス誘導性転写活性化(Stress-induced transcriptional activation.), 「Microbiology Review」, 1995年, 第59巻, p.506-531.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、例えば、酵母を用いて容易に多量のタンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、以前に酵母の優れたプロモーターを同定するため、低温をストレス刺激として与え、DNAマイクロアレイを用いてサッカロミセス・セレビシエの強力なプロモーターの探索を行い、低温によってmRNAの量が増加する遺伝子を低温誘導性遺伝子として同定し、その遺伝子の5’上流側の非翻訳領域に低温誘導性プロモーターの機能を有するDNA断片を見出した（非特許文献２及び国際出願PCT/JP03/05956）。さらにこのマイクロアレイデータおよびノーザンブロット分析などの分子生物学的手法を駆使することにより、非常に効率的な低温誘導性プロモーターを有する発現ベクターを構築し、タンパク質発現系を完成した（国際出願PCT/JP03/05956）。
【００１３】
さらに、本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、上記タンパク質発現系に改良を行い、低温誘導性プロモーターの機能を有するDNA断片として同定されたDNAが、低温誘導性プロモーターとしてタンパク質の効率的生産を可能にするのみならず、培養環境ストレス応答性プロモーターとしてもタンパク質の効率的生産を可能にすることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、以下を包含する。
【００１５】
（１）以下の(a)、(b)又は(c)のDNAと、前記DNAの下流に外来遺伝子とを含むベクターによって形質転換された形質転換体を、培養環境ストレス条件下で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
（a）配列番号１に示される塩基配列からなるDNA。
（b）配列番号１に示される塩基配列からなるDNAにおいて1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA。
(c)配列番号１に示される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA。
（２）上記培養環境ストレスは、対数増殖期後期から定常期までの培養、低グルコース濃度又は高塩濃度であることを特徴とする、（１）記載のタンパク質の製造方法。
（３）宿主が酵母であることを特徴とする、（１）記載のタンパク質の製造方法。
（４）上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、（３）記載のタンパク質の製造方法。
（５）以下の(a)、(b)又は(c)のDNAと、前記DNAの下流に外来DNA断片とを含むベクターによって形質転換された形質転換体を、培養環境ストレス条件下で培養することを特徴とするRNA生産制御方法。
（a）配列番号１に示される塩基配列からなるDNA。
（b）配列番号１に示される塩基配列からなるDNAにおいて1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA。
(c)配列番号１に示される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA。
（６）上記培養環境ストレスは、対数増殖期後期から定常期までの培養、低グルコース濃度又は高塩濃度であることを特徴とする、（５）記載のRNA生産制御方法。
（７）宿主が酵母であることを特徴とする、（５）記載のRNA生産制御方法。
（８）上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする、（７）記載のRNA生産制御方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、既に低温誘導性プロモーターの機能を有するものとして知られていた配列番号１に示される塩基配列からなるDNAを培養環境ストレス応答性プロモーターとして利用したタンパク質の製造方法及びRNA生産制御方法が提供される。本発明に係るタンパク質の製造方法によれば、タンパク質を製造する際に、タンパク質の性質や培養施設の能力などの理由により低温ストレスを利用することが最適ではない場合に、低温ストレス以外の培養環境ストレスを利用してタンパク質を生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明に係るタンパク質の製造方法により、培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNAと前記DNAの下流に外来遺伝子とを含むベクターによって形質転換された形質転換体を、培養環境ストレス条件下で培養することで、外来タンパク質を多量に生産することができる。一方、本発明に係るRNA生産制御方法により、培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNAと前記DNAの下流に外来DNA断片とを含むベクターによって形質転換された形質転換体を、培養環境ストレス条件下で培養することで、宿主に内在する特定の遺伝子のRNA生産を制御することができる。
【００１９】
なお、「培養環境ストレス応答性プロモーター」とは、酵母の至適培養環境条件下(すなわち、通常用いられる適切な培地中で酵母が良く増殖している条件)におけるプロモーター活性と比較して、培養環境ストレス条件下で高い活性を示すプロモーターを意味する。
【００２０】
「培養環境」とは、細胞密度、温度、光及び浸透圧などの物理的環境条件、並びに酸素、炭酸ガス、栄養物質、pH、塩濃度及び酸化還元電位などの化学的環境条件を含めた、培養における環境要因を意味する。従って、「培養環境ストレス」とは、上記に示した培養における環境要因のうち少なくとも1つが至適でないことによるストレスを意味する。培養環境ストレスとしては、対数増殖期後期から定常期までの培養、低グルコース濃度、高塩濃度、高温、高重金属イオン濃度、高エタノール濃度、高DTT(還元剤)濃度、低酸素、低窒素源濃度、高浸透圧、高菌密度、低炭素源濃度、グルコース以外の高炭素源濃度及び低ミネラル分濃度が挙げられる。例えば、酵母を対数増殖期後期から定常期まで培養することにより、細胞密度は過剰となり、又は培地中の炭素源などの栄養物質濃度が低下することで、酵母にはストレスがかかる。なお、対数増殖期後期から定常期とは、例えば培養物の吸光度又は細胞密度が対数増殖期に比較して継時的に増加しなくなった時期を意味する。低グルコース濃度が培養環境ストレスである場合には、培地中、グルコース濃度が0〜0.5％、特に0〜0.2％であることが好ましい。さらに、高塩濃度が培養環境ストレスである場合には、培地中、塩濃度が0.1M以上、特に0.5〜1Mであることが好ましい。
【００２１】
培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(以下、「本発明に係るDNA」と呼ぶ)は、配列番号１に示される塩基配列からなるDNAである。本発明者らが、以前、DNAマイクロアレイを用いて、酵母の至適培養温度である30℃から10℃に培養温度を低下させた際にmRNA量が増加する遺伝子を低温誘導性遺伝子として同定した(国際出願PCT/JP03/05956を参照)。配列番号１に示される塩基配列からなるDNAは、上記において低温誘導性遺伝子として同定したHSP12遺伝子の5’上流側の非翻訳領域に存在し、低温誘導性プロモーターとして機能するものである。なお、低温誘導性プロモーターとは、酵母の至適培養温度におけるプロモーター活性と比較して、酵母の至適培養温度よりも低い温度で高いプロモーター活性を示すプロモーターを意味する。また、5'上流側の非翻訳領域とは、上述したように特定された遺伝子のコーディング鎖における5'末端側に存在し、且つ、タンパク質へ翻訳されない領域を意味する。言い換えれば、非翻訳領域とは、いわゆるORF（open reading frame）に含まれない領域を意味する。ただし、HSP12遺伝子の5’上流側に位置するYFL015C遺伝子とHSP12遺伝子とは、互いに相補鎖にコーディング領域があり、配列番号１に示される塩基配列には、YFL015C遺伝子の相補鎖の一部を含む。
【００２２】
このように特定された配列番号１に示される塩基配列からなるDNAは、酵母ゲノムデータベースに登録された酵母ゲノム全塩基配列情報を検索することによって得ることができる。また、上記DNAは、該領域の両端の塩基配列に相補的なプライマーを用い、酵母から抽出したゲノムを鋳型としたPCRによって容易に得ることができる。
【００２３】
さらに本発明に係るDNAは、配列番号１に示される塩基配列からなるDNAにおいて１又は数個(例えば1〜10個、1〜5個)の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNAであっても良い。従って、本発明に係るDNAは、配列番号１に示される塩基配列からなるDNAの全部であっても良いし、培養環境ストレス応答性プロモーターとしての機能を示す限り、配列番号１に示される塩基配列からなるDNAの一部であっても良い。
【００２４】
さらに配列番号１に示される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNAも、本発明に係るDNAに含まれる。
【００２５】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばリン32で標識したプローブDNAを用いる場合には、5 X SSC(0.75M NaCl、0.75Mクエン酸ナトリウム)、5 X デンハルト試薬(0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン)および0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)からなるハイブリダイゼーション溶液中で、温度が45℃〜65℃、好ましくは55℃〜65℃である。また洗浄ステップにおいては、2 X SSCおよび0.1％SDSからなる洗浄溶液中で温度が45℃〜55℃、より好ましくは0.1 X SSCおよび0.1％SDSからなる洗浄溶液中で温度が45℃〜55℃である。AlkPhos direct labeling module(アマシャムバイオテク)のキットを用いて酵素標識したプローブDNAを用いる場合には、該キットのマニュアルに記載されている組成のハイブリダイゼーション溶液(0.5M NaClおよび4％ブロッキング試薬を含む)中で温度が55℃〜75℃である。また洗浄ステップにおいては、該キットのマニュアルに記載されている一次洗浄液(2M 尿素を含む)中で55℃〜75℃、かつ二次洗浄液中で室温である。また、他の検出法であってもよく、その場合にはその検出法の標準的な条件であってよい。
【００２６】
一旦、本発明に係るDNAの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたプローブを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって本発明に係るDNAを得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明に係るDNAの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。
【００２７】
なお、本発明に係るDNAに変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製)）などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００２８】
プロモーター活性は、定法に従って測定することができる。例えば、本発明に係るDNAの下流に発現可能にレポーター遺伝子を連結した発現ベクターを構築する。次に、発現ベクターで適当な宿主（例えば、酵母）を形質転換する。得られた形質転換体を培養環境ストレス条件下で培養し、レポーター遺伝子の発現量をmRNAレベル或いはタンパク質レベルで定量することによって、当該条件下におけるプロモーター活性を測定することができる。
【００２９】
一方、本発明に係るDNAの下流に外来遺伝子又は外来DNA断片とを含むベクター(以下、「本発明に係る発現ベクター」と呼ぶ)は、適当なベクターに本発明に係るDNAと、本発明に係るDNAの下流に外来遺伝子又は外来DNA断片とを挿入することにより得ることができる。使用するベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染色体に挿入することなどによって複製可能となるDNA断片であってもよい。
【００３０】
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13などのYEp系、YCp50などのYCp系等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３１】
ベクターに本発明に係るDNAを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。またベクターと本発明に係るDNAのそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、PCRなどを用いたin vitro法または酵母などを用いたin vivo法によって両者を連結する方法であってもよい。
【００３２】
さらに、本発明に係るDNAの下流にさらに外来遺伝子又は外来DNA断片をベクターに挿入する。外来遺伝子又は外来DNA断片を挿入する方法は、ベクターに本発明に係るDNAを挿入する方法と同様である。
【００３３】
本発明に係る発現ベクターにおいて、本発明に係るDNAの下流に置かれる外来遺伝子としては、いかなるタンパク質、ペプチドであっても良いが、例えば宿主が酵母である場合に、酵母に対して細胞障害又は増殖阻害を起こすようなタンパク質などが挙げられる。あるいは、低温での生産が困難なタンパク質であってもよい。さらに本発明に係る発現ベクターにおいて、本発明に係るDNAの下流に置かれる外来DNA断片としては、RNA自体が機能するアンチセンスRNAリボザイム、又はRNAiのようなRNAの機能や量を変化させる機能性RNAをコードする外来DNA断片などが挙げられる。
【００３４】
さらに、本発明に係る発現ベクターを宿主中に導入することにより形質転換体を得ることができる。ここで、宿主としては、本発明に係るDNA及び外来遺伝子又は外来DNA断片を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、酵母が挙げられる。また酵母としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ、実験酵母、醸造用酵母、食用酵母および工業用酵母などが挙げられる。特にサッカロミセス・セレビシエが好ましい。
【００３５】
酵母への本発明に係る発現ベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えば電気穿孔法(エレクトロポレーション法)、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、YIp系などのベクターあるいは染色体中の任意の領域と相同なDNA配列を用いた染色体への置換・挿入型の酵母の形質転換法であっても良い。さらに酵母細胞への本発明に係る発現ベクターの導入方法は、一般的実験書または学術論文などに記載されたいかなる方法によってもよい。
【００３６】
本発明に係る発現ベクターを、上記酵母に導入するのみならず、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属等に属する細菌、COS細胞等の動物細胞、Sf9等の昆虫細胞、あるいはアブラナ科等に属する植物などに導入して形質転換体を得ることもできる。細菌を宿主とする場合は、本発明に係る発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、本発明に係るDNA、リボソーム結合配列、外来遺伝子又外来DNA断片、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３７】
細菌への本発明に係る発現ベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３８】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への本発明に係る発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３９】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への本発明に係る発現ベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４０】
植物を宿主とする場合は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞などが用いられる。植物への本発明に係る発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法およびPEG法等が挙げられる。
【００４１】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００４２】
本発明に係るタンパク質の製造方法に従えば、以上のように説明した本発明に係る発現ベクターによって形質転換された形質転換体（以下、「本発明に係る形質転換体」と呼ぶ）を、上述した培養環境ストレス条件下で培養することにより、本発明に係るDNAの下流に存在する外来遺伝子によってコードされたタンパク質を生産することができる。例えば、ある種のタンパク質は酵母の増殖を阻害してしまうために、遺伝子組換えにより生産することが困難である。このような場合において、本発明に係るDNAの下流に酵母の増殖を阻害してしまうタンパク質をコードする遺伝子を連結した本発明に係る発現ベクターを酵母に導入することで、酵母を適当な量まで増殖させておいてから、所定の培養環境ストレス条件下で培養することで、タンパク質を効率よく生産することが可能になる。
【００４３】
また本発明に係るRNA生産制御方法に従えば、本発明に係る形質転換体を上述した培養環境ストレス条件下で培養することにより、本発明に係るDNAの下流に外来DNA断片を連結した本発明に係る発現ベクターによって、宿主に内在する特定の遺伝子からのRNA生産を制御することができる。例えば、本発明に係るDNAの下流に宿主に内在する特定の遺伝子に対するアンチセンスRNA、siRNA又はmiRNAのようなRNAの機能や量を変化させる機能性RNAをコードする外来DNA断片を連結した本発明に係る発現ベクターを酵母に導入し、酵母を適当な量まで増殖させておいてから、所定の培養環境ストレス条件下で培養することで、上記外来DNA断片に対応するアンチセンスRNA、siRNA又はmiRNAのようなRNAの機能や量を変化させる機能性RNAの含量を増加させることで、酵母に内在する特定の遺伝子の発現を制御することが可能となる。一方、機能性RNAの含量を増加させる前後における細胞の増殖や機能などを比較することにより、該機能性RNAの機能を解析することが可能となる。
【００４４】
本発明に係るタンパク質の製造方法によれば、タンパク質を製造する際に、タンパク質の性質や培養施設の能力などの理由により低温ストレスを利用することが最適ではない場合に、低温ストレス以外の培養環境ストレスを利用してタンパク質を生産することができる。すなわち、本発明により、本発明者らが既に見出したタンパク質発現系(PCT/JP03/05956)において、多様な制御方法を提供することができる。本発明において、培養環境ストレスの1つは、対数増殖期後期から定常期までの培養である。このような期間まで形質転換体を培養することで、細胞密度が過剰となり、又は培地において炭素源などの栄養物質濃度が低下する。この細胞密度過剰又は栄養物質濃度の低下が培養環境ストレスとなり、本発明に係るDNA、すなわち培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNAが活性化される。この場合、単純に培養を長時間続けるだけでタンパク質を生産することが可能となる。あるいは、本発明によれば、培地中のグルコース濃度を低下させる、又は培地中の塩濃度を高くするなどの培養環境ストレスを与えることにより、タンパク質を生産することが可能である。いずれの場合においても、培養環境ストレスを与える前にはタンパク質の発現が低く抑えられるために、形質転換体自体の増殖とタンパク質生産の段階を分離することが可能となる。
【００４５】
また、本発明の最大の特長として、本発明に従った発現系が極めて強力であることである。例えば、従来の酵母発現系においては、ウエスタンブロット分析や活性測定など、発現させたタンパク質のみを測定できる系でその発現量を評価していた。本来、発現系の評価は、全タンパク質に占める発現タンパク質の割合で考えるべきものであるが、従来の酵母発現系は、SDS-PAGEなどによって全タンパク質分析を行っても発現タンパク質の割合が極めて小さく、分析が困難であった。本発明に従った発現系は、以下の実施例１〜３に示すように、SDS-PAGE分析の結果、目的のタンパク質が細胞内可溶性タンパク質の最大量を占めるまでに至り、50%を超える場合もある。このように、本発明に従った発現系は、従来の発現系を圧倒的に凌駕するものであり、例えば、酵母を利用したタンパク質生産において商業利用可能なレベルの生産量を提供できる画期的な技術である。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４７】
〔実施例１〕
HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)による外来遺伝子の発現（30℃で対数増殖期後期から定常期までの培養）
HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)を用い、その下流に外来遺伝子を連結した発現ベクターによって形質転換された形質転換体を、30℃で対数増殖期後期から定常期まで培養することにより、下流の外来遺伝子にコードされたタンパク質を生産できることを以下のように確認した。
【００４８】
HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)を有する発現ベクターpLTex321sを図１Ａ及びＢに示すステップを経て作製した。なお、図１Ａ及びＢにおいて、MET25pはMET25プロモーター、GはEGFP3、CtはCYCターミネーター、HpはHSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)、CpはCUP1プロモーターを意味する。
【００４９】
ステップ1(図１Ａにおいて、「S-1」と記載。以下、同様。)において、pUG35プラスミド（http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/yeast/info/tools/hegemann/gfp.html参照）をXba IとSac Iで切断することで、MET25プロモーターを除去し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した後、自己環状化させることによってpUG35-MET25プラスミドを作製した。得られたpUG35-MET25プラスミドをHpa IおよびMlu Iで切断し、アガロース電気泳動によるDNA断片の分画を行い、約5.4 kbのベクター断片を回収した。これをDNA断片Ａとする。
【００５０】
一方、ステップ2（S-2）において、PCR法によってEGFPの翻訳領域を増幅した。プライマーの配列は以下の通りである。EGFP3 ORF Fは、上記で用いたpUG35プラスミド中EGFP開始コドンATGを含めて下流29 bpであり、EGFP3 ORF RはEGFP終止コドンを含めて上流29bpに相補的な配列である。
【００５１】
EGFP3 ORF F：ATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTCACTGG（配列番号２）
EGFP3 ORF R：TTATTTGTACAATTCATCCATACCATGGG（配列番号３）
【００５２】
PCRは各々のプライマー300nM、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液)200μM、pUG35 1 ngならびにExpand High Fidelity PCR systemに添付されたバッファー(1 X)およびExpand HiFi DNAポリメラーゼ2.6Uを含む反応溶液100μlを用いて、第1ステップ：95℃で2分、第2ステップ：95℃で30秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)および72℃で1分(伸長)のサイクルを30サイクルおよび第3ステップ：72℃で5分で行った。増幅したDNAをT4 polynucleotide kinase (TakaRa)でリン酸化した。一方、pYES2(Invitrogen社より購入)をEcoRIで切断したのち、DNA blunting kitを用いて末端を平滑化し、さらにbacterial alkaline phosphataseで脱リン酸化した。これらのDNAをDNA Ligation Kit ver.2を用いて結合させた後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体を一晩培養後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミド（pYES2+EGFP3）を調製した。次いで、pYES2+EGFP3をHpaI、MluIで切断し、約450 bpからなるDNA断片を回収した。これをDNA断片Ｂとする。なお、DNA断片Ｂには、制限酵素部位XhoIが含まれている。
【００５３】
次いで、ステップ3(S-3)において、上記DNA断片ＡとDNA断片ＢをDNA ligation kit ver.2を用いて接続し、大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミド（pUG35-MET25+MCS）を調製した。
【００５４】
このpUG35-MET25+MCSをCla IおよびXho Iで切断し、アガロース電気泳動によりベクター断片（約5.1 kb)を回収した。次いで、このベクター断片を環状化させるため、下記のオリゴDNAを合成し、リンカーとして用いた。
【００５５】
MCSリンカーF：CCGCTCGAGCGGCCGCGAGCTCGTCGACATCGATGG（配列番号４）
MCSリンカーR：CCATCGATGTCGACGAGCTCGCGGCCGCTCGAGCGG（配列番号５）
【００５６】
該リンカーDNAは、Xho I-Not I-Sac I-Sal I-Cla Iの制限酵素サイトを含んでいる。両オリゴDNAをアニーリングした後、Xho IおよびCla Iで該リンカーDNAの両末端を切断した。上記ベクター断片とリンカーDNAとを、DNA ligation kit ver.2を用いて連結させ、大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミドを調製した。このようにして得られたプラスミドは、EGFP3が除かれているとともに、マルチクローニングサイトを有する。
【００５７】
得られたプラスミドを、さらに、Spe IおよびBamH Iで切断し、アガロース電気泳動でベクター断片（約5.1 kb）を回収した。これをDNA断片Ｃとする。
【００５８】
次いで、ステップ4(S-4)において、HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)を単離した。プライマーの配列は以下の通りであった。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/）を参照されたい。
【００５９】
-610-HSP12 IGR SpeI F：GGACTAGTGATCCCACTAACGGCCCAG（配列番号６）
-610-HSP12 IGR BamHI R：CGGGATCCTGTTGTATTTAGTTTTTTTTGTTTTGAG（配列番号７）
【００６０】
PCRは、各々のプライマー300nM、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液)200μM、サッカロミセス・セレビシエYPH500株のゲノムDNA 100ngならびにExpand High Fidelity PCR systemに添付されたバッファー(1 X)およびExpand HiFi DNAポリメラーゼ2.6Uを含む反応溶液100μlを用いて、第1ステップ：95℃で2分、第2ステップ：95℃で30秒(変性)、55℃で30秒(アニーリング)および72℃で1分(伸長)のサイクルを35サイクルおよび第3ステップ：72℃で5分で行った。
【００６１】
次いで、得られたPCR産物をSpe IおよびBamH Iで切断処理した後、アガロース電気泳動によって分画し、HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)（約600bp）を回収した。これをDNA断片Ｄとする。
【００６２】
次いで、ステップ5(S-5)において、上記のDNA断片ＣとDNA断片Ｄとを、DNA ligation kit ver.2を用いて連結させ、大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミドを調製した。
【００６３】
得られたプラスミドをSpe IおよびKpn Iで切断し、アガロース電気泳動により、HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)、マルチクローニングサイトおよびCYC1ターミネーターを含むDNA断片（約1 kb）を回収した。これをDNA断片Ｅとする。
【００６４】
一方、ステップ6(S-6)において、pYEX-BX発現ベクター（AMRAD Biotech社より購入）をSpe IおよびKpn Iで切断し、アガロース電気泳動により、ベクター断片（約6.4 kb）を回収した。これをDNA断片Ｆとする。
【００６５】
ステップ7(S-7)において、上記のDNA断片ＥとDNA断片Ｆとを、DNA ligation kit ver.2を用いて連結させ、大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンにより、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミド（pLTex321）を調製した。pLTex321をSpe IおよびSma Iで切断し、アガロース電気泳動でベクター断片（約6.8 kb）を回収した。これをDNA断片Ｇとする。
【００６６】
さらに、pLTex321のマルチクローニングサイトを変換して、pLTex321sを以下のように作製した。まず、ステップ8(S-8)において、酵母ゲノムDNAよりSpe IおよびSma I制限酵素認識配列を含むHSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)を単離した。プライマーの配列は以下の通りであった。
【００６７】
MDJ1-HSP12 IGR +SmaI：GGGTGTTGTATTTAGTTTTTTTTGTTTTGAG（配列番号８）
【００６８】
PCRは、もう一方のプライマーとして-610-HSP12 IGR SpeI F（配列番号６）を用い、アニーリング温度を50℃とした以外は、上記HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)を単離した場合と基本的に同じ条件で行った。得られたPCR産物をSpe Iで切断処理した。これをDNA断片Ｈとする。
【００６９】
ステップ9(S-9)において、上記のDNA断片ＧとDNA断片Ｈとを、DNA ligation kit ver.2を用いて連結させ、大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンおよび塩基配列の解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミド（pLTex321s）を調製した。
【００７０】
次いで、ステップ10(S-10)において、このようにして作製したpLTex321sにEGFPをコードするDNAを挿入するため、PCR法によってEGFPの翻訳領域を増幅した。
【００７１】
プライマーとしては、上述のEGFP3 ORF Fプライマー(配列番号２)の他、以下のものを用いた。
【００７２】
pUG35-MET25+MCS #3F：TCGGTTAGAGCGGATGTG（配列番号９）
【００７３】
PCRは、テンプレートとしてpUG25-MET25+MCS 1 ngを用いた以外は上記EGFPの単離と基本的に同じ条件で行った。得られたPCR産物をXho Iで切断処理した。これをDNA断片Ｉとする。
【００７４】
一方、ステップ11(S-11)において、pLTex321sをSma IおよびXho Iで切断した。これをDNA断片Ｊとする。
【００７５】
ステップ12(S-12)において、上記のDNA断片ＩとDNA断片Ｊとを、DNA ligation kit ver.2を用いて連結させ、大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンおよび塩基配列の解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミド（pLTex321s-EGFP3）を調製した。
【００７６】
pLTex321s-EGFP3を用いて、酵母サッカロミセス・セレビシエYPH500株を形質転換した。得られた形質転換体をロイシンとウラシルを含まない合成培地（0.67% Yeast nitrogen base without amino acids, 2% グルコース, 0.02 mg/ml 硫酸アデニン, 0.02 mg/ml トリプトファン, 0.02 mg/ml ヒスチジン, 0.03 mg/ml リシン）に植菌し、30℃で振とう培養した。600 nmにおける吸光度が0.5になった時点をゼロ時間として、そのまま30℃で振とう培養を継続し、6及び12時間後に酵母の培養液を回収した。サンプリング後、遠心分離を行って回収した酵母細胞は、5 mM DTT存在下、CelLyticTM Y (Sigma)およびProtease Inhibitor Cocktail (Sigma)を使用し、それぞれのマニュアルに記載された濃度になるように添加し、4℃で1時間、vortexにより溶解させた。次いで、4℃で15,000rpm、10分間遠心した後、上澄を全タンパク質抽出液とした。次いで、得られた全タンパク質抽出液(全タンパク質10μg)を常法（タンパク質実験ノート、岡田雅人・宮崎香編、羊土社などに記載）に従いSDS-PAGE (12.5%ゲル)に供し、電気泳動後、常法によりクマジーブリリアントブルーにより染色した。結果を図２に示す。
【００７７】
図２に示すように、SDS-PAGE分析で調べた結果、30℃で培養を続けた場合、対数増殖期後期から定常期に達する12時間後には、EGFPの発現量の増大が観察された。この結果から、発現ベクターにおいてHSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)の下流に存在する外来遺伝子によりコードされるタンパク質は、30℃で対数増殖期後期から定常期まで培養を続けることによって誘導的に生産されることが判った。
【００７８】
〔実施例２〕
HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)による外来遺伝子の発現（低グルコース濃度条件下）
HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)を用い、その下流に外来遺伝子を連結した発現ベクターによって形質転換された形質転換体を培養する際に、グルコースを含まない培地に交換することによって、下流の外来遺伝子にコードされたタンパク質を誘導的に生産できることを以下のように確認した。
【００７９】
実施例１と同様にpLTex321s-EGFP3を用いて酵母サッカロミセス・セレビシエYPH500株を形質転換し、得られた形質転換体を、ロイシンとウラシルを含まない合成培地（0.67% Yeast nitrogen base without amino acids, 2% グルコース, 0.02 mg/ml 硫酸アデニン, 0.02 mg/ml トリプトファン, 0.02 mg/ml ヒスチジン, 0.03 mg/ml リシン）に植菌し、30℃で振とう培養した。600 nmにおける吸光度が0.5になった時点をゼロ時間として、菌体を遠心分離で回収し、ロイシン／ウラシル／グルコースを含まない合成培地（0.67% Yeast nitrogen base without amino acids, 5% グリセリン, 0.02 mg/ml 硫酸アデニン, 0.02 mg/ml トリプトファン, 0.02 mg/ml ヒスチジン, 0.03 mg/ml リシン）に同じ菌体密度となるように再懸濁し、そのまま30℃で振とう培養を継続し、6、12及び24時間後に酵母の培養液を回収した。実施例１と同様にしてEGFPの発現量をSDS-PAGEによって分析した。結果を図３に示す。
【００８０】
図３に示すように、SDS-PAGE分析で調べた結果、培養液にグルコースを含まない培地に交換することにより、EGFPの発現量の増大が観察された。この結果から、発現ベクターにおいてHSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)の下流に存在する外来遺伝子によりコードされるタンパク質は、培養液にグルコースを含まない培地に交換することによって、誘導的に生産されることが判った。
【００８１】
〔実施例３〕
HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)による外来遺伝子の発現（高塩濃度条件下）
HSP12の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)を用い、その下流に外来遺伝子を連結した発現ベクターによって形質転換された形質転換体を、高塩濃度の培地中で培養することによって、下流の外来遺伝子にコードされたタンパク質を誘導的に生産できることを以下のように確認した。
【００８２】
まず、EGFPの検出を容易にするためにEGFPのN末端にHisタグを挿入したHEGFPをPCR法によって作製した。
【００８３】
プライマーとしては、上述のpUG35-MET25+MCS #3Fプライマー（配列番号９）の他、以下のEGFP3+6xHis Fを用いた。
【００８４】
EGFP3+6xHis F：ATGGGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTCACTGG（配列番号１０）
【００８５】
PCRは、鋳型としてpUG35-MET25+MCS 1ngを用いた上記EGFPの単離と基本的に同じ条件で行った。得られたPCR産物をXho Iで切断処理した。これを上記DNA断片Ｊと、DNA ligation kit ver.2を用いて連結させ、大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体を一晩培養後、QuantumPrep Plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素切断パターンおよび塩基配列の解析により、目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より、プラスミド（pLTex321s-HEGFP3）を調製した。
【００８６】
pLTex321s-HEGFP3を用いて酵母BY4743株（Research Genetics社より購入）を形質転換した。得られた形質転換体をロイシンとウラシルを含まない合成培地（0.67% Yeast nitrogen base without amino acids, 2% グルコース, 0.02 mg/ml ヒスチジン）に植菌し、30℃で振とう培養した。600 nmにおける吸光度が0.5になった時点をゼロ時間として、培地に対して1/10容量の5 M NaClを添加した。そのまま30℃で振とう培養を継続し、6、12、24、48、72及び96時間後に酵母の培養液を回収した。実施例１と同様にしてHEGFPの発現量をSDS-PAGEで分析した。結果を図４に示す。
【００８７】
図４に示すように、SDS-PAGE分析で調べた結果、培地に高濃度のNaClを添加することにより、HEGFPの発現量の増大が観察された。この結果から、発現ベクターにおいてHSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)の下流に存在する外来遺伝子によりコードされるタンパク質は、培地の塩濃度を高くすることによって、誘導的に生産されることが判った。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】図１Ａは、HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)の下流にEGFP3 cDNAを連結したプラスミドpLTex321s-EGFP3の作製工程を示すフローチャートである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)の下流にEGFP3 cDNAを連結したプラスミドpLTex321s-EGFP3の作製工程を示すフローチャートである。
【図２】図２は、HSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)の下流にEGFP3 cDNAを連結したプラスミドで形質転換した酵母を30℃で培養を長時間続けることにより、EGFPタンパク質の生産が対数増殖期後期から定常期に増加したことを示すSDS-PAGE分析の結果である。上部の数字は培養液の600nmにおける吸光度が0.5となってからの培養経過時間を示す。6時間後が対数増殖期後期、12時間後が定常期である。各レーン中の矢印で示したバンドの濃さおよび大きさがそれぞれの時間におけるEGFPタンパク質を示している。
【図３】図３はHSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)の下流にEGFP3 cDNAを連結したプラスミドで形質転換した酵母を培養する際に、グルコースを含まない培地に交換することによりEGFPタンパク質の生産が増加したことを示すSDS-PAGE分析の結果である。上部の数字は培地交換後の培養経過時間を示す。各レーン中の矢印で示したバンドの濃さおよび大きさがそれぞれの時間におけるEGFPタンパク質量を示している。
【図４】図４はHSP12遺伝子の培養環境ストレス応答性プロモーターの機能を有するDNA(配列番号１)の下流にHEGFP3 cDNAを連結したプラスミドで形質転換した酵母を培養する際に、NaClを添加することにより培地の塩濃度を高くすることで、HEGFPタンパク質の生産が増加したことを示すSDS-PAGE分析の結果である。上部の数字はNaCl添加後の培養経過時間を示す。各レーン中の矢印で示したバンドの濃さおよび大きさがそれぞれの時間におけるHEGFPタンパク質量を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号２、３及び６〜１０は、プライマーである。
【００９０】
配列番号４及び５は、オリゴDNAである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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