(57)【要約】【課題】  標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法、該方法を用いた標的核酸近傍の核酸配列の解析方法を提供すること。【解決手段】  標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを用いることを特徴とする標的核酸近傍の核酸の増幅方法。該増幅方法によって得られた核酸の配列を解析することを含んでなる標的核酸近傍の核酸配列の解析方法。該解析方法を行うための試薬またはキットまたはシステム。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを用いることを特徴とする標的核酸近傍の核酸の増幅方法。
【請求項２】
標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを使用し、一方の核酸の伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方の核酸の鋳型となることを特徴とする標的核酸近傍の核酸の増幅方法。
【請求項３】
標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを使用し、核酸Ｂの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、核酸Ａの鋳型となることを特徴とする標的核酸近傍の核酸の増幅方法。
【請求項４】
標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを使用する標的核酸近傍の核酸の増幅方法であって、下記工程
（ａ）核酸Ｂをプライマーとし、染色体および／または染色体外核酸上の不特定の領域を鋳型とする伸長反応により核酸Ｃが生成し、
（ｂ）該鋳型から核酸Ｃが解離し、
（ｃ）核酸Ａをプライマーとし、核酸Ｃを鋳型とする伸長反応により核酸Ｄが生成し、
（ｄ）核酸Ｃから核酸Ｄが解離し、
（ｅ）以後、核酸Ａをプライマーとし、核酸Ｃまたは核酸Ｄを鋳型とした伸長反応による生成物が、その相補体から分離された場合に、再び核酸Ａの鋳型となる反応を繰り返すことからなる増幅方法。
【請求項５】
伸長反応が酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性および／またはＲＮＡポリメラーゼ活性によって行われることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項６】
伸長反応が熱安定性または熱活性ＤＮＡポリメラーゼによって行われることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項７】
標的核酸が染色体および／または染色体外核酸に挿入された核酸であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項８】
標的核酸が染色体に挿入された外来遺伝子であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の増幅方法を行うための試薬またはキット。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかに記載の増幅方法によって得られた核酸の配列を解析することを含んでなる標的核酸近傍の核酸配列の解析方法。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれかに記載の増幅方法によって得られた核酸の配列を解析することを含んでなる標的核酸の挿入位置の解析方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の解析方法であって、標的核酸において核酸Ａより末端側の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸をプライマーとして使用することからなる解析方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれかに記載の解析方法であって、標的核酸において核酸Ａより末端側の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸をプライマーとして使用することによって得られた核酸配列データを、核酸配列データベースと照合することによって該標的核酸の挿入位置を同定することからなる解析方法。
【請求項１４】
標的核酸近傍の核酸配列を解析する方法において、
（イ）  少なくとも標的核酸近傍に既知配列を有する核酸を導入する工程、
（ロ）  既知配列を有する核酸もしくは既知配列を有する核酸と相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズするプライマー、および、標的核酸もしくは標的核酸と相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅反応を行う工程、
を含むことを特徴とする染色体中の外来遺伝子近傍の核酸配列を解析する方法。
【請求項１５】
標的核酸の挿入位置を解析する方法において、
（イ）  少なくとも標的核酸近傍に既知配列を有する核酸を導入する工程、
（ロ）  既知配列を有する核酸もしくは既知配列を有する核酸と相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズするプライマー、および、標的核酸もしくは標的核酸と相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅反応を行う工程、
を含むことを特徴とする標的核酸の挿入位置を解析する方法。
【請求項１６】
請求項１０から１５のいずれかに記載の解析方法を行うための試薬またはキットまたはシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法および該方法を行うための試薬またはキット、該増幅方法を用いた標的核酸近傍の核酸配列の解析方法および該方法を行うための試薬またはキットまたはシステムに関する。また、本発明は染色体上に挿入された外来遺伝子近傍の核酸配列の解析方法および挿入位置の解析方法として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数のヒト疾病についてその機構が解明され、また組換えＤＮＡ技術および細胞への遺伝子導入技術が急速に進歩したことより、特に既存の薬物療法あるいは外科的療法に抵抗性があり生命予後が不良な難治性疾患に対する新しい治療法として遺伝子治療のプロトコールの開発が進められている。また最近では、遺伝病のみならずＡＩＤＳのようなウイルス感染症やガンの治療にも遺伝子治療を適用しようという試みがなされている。
【０００３】
これまでに米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認したヒトでの遺伝子導入試験の大部分は組換えレトロウイルスベクターを用いて細胞への遺伝子導入を行うものである。レトロウイルスベクターは、開発されて以来、遺伝子治療において欠かせないものとなっているベクターであるが、その理由として、遺伝子を細胞内に導入した後の細胞毒性が極めて低い点が挙げられる。また該ベクターが細胞内に導入されると、導入遺伝子が染色体ＤＮＡに１コピー組み込まれるため該遺伝子が安定に維持され、細胞分裂後も該遺伝子が希釈されず長期に渡って安定した遺伝子の発現が期待される。したがって、上記方法は特に長期間の遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段である。
【０００４】
しかし、レトロウイルスは染色体上にランダムに挿入されるため、例えば細胞がレトロウイルスの挿入変異によって癌化するなど、該手段よって細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。一方、アデノ随伴ウイルスはヒト第１９番染色体長腕上の特定の領域に組み込まれる特徴を有するため挿入変異の可能性が低いと考えられているが、導入可能な遺伝子のサイズが小さい、組換えウイルスの調製が煩雑、効率が良くないなどの欠点を有する（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
上述のように、遺伝子治療においてレトロウイルスベクターを用いる場合には、該治療において細胞内に導入された遺伝子（外来遺伝子）がどのような遺伝子領域に挿入されたか、あるいは挿入時に染色体の異常（例えば部分的な欠失など）を伴っていないか、などを確認することが該治療を円滑に行うためにも重要となる。また同様の理由により、遺伝子治療にアデノ随伴ウイルスを用いる場合においても、予想される領域に外来遺伝子が挿入され、かつ挿入時に染色体の異常（例えば部分的な欠失など）を伴っていないことを確認することが望ましい。
【０００６】
染色体のどのような領域に外来遺伝子が挿入されたかを知るための最も一般的な方法は、該遺伝子近傍の核酸配列を解析することである。具体的な方法の１つとして、遺伝子を導入した細胞より染色体（核酸）を抽出し、得られた核酸について外来遺伝子に特異的なプライマーを用いたシークエンス解析を行えばよい。核酸抽出およびシークエンス解析は従来公知の方法（例えば、特許文献１および非特許文献２参照）で行うことができ、市販の様々な試薬またはキットを使用することができる。しかし、染色体を直接標的とするシークエンス解析では大量の抽出核酸が必要となる（例えば、非特許文献３参照）ため、大量の細胞試料を得ることが困難な遺伝子治療での上記解析方法の使用は事実上困難である。
【特許文献１】特許２９６５１３１号公報
【非特許文献１】遺伝子医療  （名古屋大学出版会、２０００）ページ
【非特許文献２】Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７、１９７７）
【非特許文献３】ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭプロトコール  （ＰＥバイオシステムズ、１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法、該方法を用いた標的核酸近傍の核酸配列の解析方法を提供することである。また、本発明は染色体上に挿入された外来遺伝子近傍の核酸配列の解析方法および挿入位置の解析方法として用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討したところ、少量の細胞試料より標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法および該方法を用いた標的核酸近傍の核酸配列の解析方法を見出した。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【０００９】
（１）  標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを用いることを特徴とする標的核酸近傍の核酸の増幅方法。
【００１０】
（２）  標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを使用し、一方の核酸の伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方の核酸の鋳型となることを特徴とする標的核酸近傍の核酸の増幅方法。
【００１１】
（３）  標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを使用し、核酸Ｂの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、核酸Ａの鋳型となることを特徴とする標的核酸近傍の核酸の増幅方法。
【００１２】
（４）  標的核酸の配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸Ａ、および既知配列を有する核酸の３’末端にランダムな配列を有する核酸を付加した核酸Ｂを使用する標的核酸近傍の核酸の増幅方法であって、下記工程
（ａ）核酸Ｂをプライマーとし、染色体および／または染色体外核酸上の不特定の領域を鋳型とする伸長反応により核酸Ｃが生成し、
（ｂ）該鋳型から核酸Ｃが解離し、
（ｃ）核酸Ａをプライマーとし、核酸Ｃを鋳型とする伸長反応により核酸Ｄが生成し、
（ｄ）核酸Ｃから核酸Ｄが解離し、
（ｅ）以後、核酸Ａをプライマーとし、核酸Ｃまたは核酸Ｄを鋳型とした伸長反応による生成物が、その相補体から分離された場合に、再び核酸Ａの鋳型となる反応を繰り返すことからなる増幅方法。
【００１３】
（５）  伸長反応が酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性および／またはＲＮＡポリメラーゼ活性によって行われることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載の増幅方法。
【００１４】
（６）  伸長反応が熱安定性または熱活性ＤＮＡポリメラーゼによって行われることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載の増幅方法。
【００１５】
（７）  標的核酸が染色体および／または染色体外核酸に挿入された核酸であることを特徴とする（１）から（６）のいずれかに記載の増幅方法。
【００１６】
（８）  標的核酸が染色体に挿入された外来遺伝子であることを特徴とする（１）から（６）のいずれかに記載の増幅方法。
【００１７】
（９）  （１）から（８）のいずれかに記載の増幅方法を行うための試薬またはキット。
【００１８】
（１０）  （１）から（８）のいずれかに記載の増幅方法によって得られた核酸の配列を解析することを含んでなる標的核酸近傍の核酸配列の解析方法。
【００１９】
（１１）  （１）から（８）のいずれかに記載の増幅方法によって得られた核酸の配列を解析することを含んでなる標的核酸の挿入位置の解析方法。
【００２０】
（１２）  （１０）または（１１）に記載の解析方法であって、標的核酸において核酸Ａより末端側の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸をプライマーとして使用することからなる解析方法。
【００２１】
（１３）  （１０）から（１２）のいずれかに記載の解析方法であって、標的核酸において核酸Ａより末端側の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸をプライマーとして使用することによって得られた核酸配列データを、核酸配列データベースと照合することによって該標的核酸の挿入位置を同定することからなる解析方法。
【００２２】
（１４）標的核酸近傍の核酸配列を解析する方法において、
（イ）  少なくとも標的核酸近傍に既知配列を有する核酸を導入する工程、
（ロ）  既知配列を有する核酸もしくは既知配列を有する核酸と相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズするプライマー、および、標的核酸もしくは標的核酸と相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅反応を行う工程、
を含むことを特徴とする染色体中の外来遺伝子近傍の核酸配列を解析する方法。
【００２３】
（１５）  標的核酸の挿入位置を解析する方法において、
（イ）  少なくとも標的核酸近傍に既知配列を有する核酸を導入する工程、
（ロ）  既知配列を有する核酸もしくは既知配列を有する核酸と相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズするプライマー、および、標的核酸もしくは標的核酸と相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅反応を行う工程、
を含むことを特徴とする標的核酸の挿入位置を解析する方法。
【００２４】
（１５）  （１０）から（１４）のいずれかに記載の解析方法を行うための試薬またはキットまたはシステム。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、従来の技術では困難であった、少量の細胞試料より標的核酸近傍の核酸配列を増幅することができる。また本発明により、簡便に標的核酸の挿入位置を解析することができるため、遺伝子治療においては遺伝子が導入された領域の確認による治療効果の向上が期待でき、また研究においては特定の遺伝子の分布状況を迅速に同定できるなど、種々の応用が可能なツールを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本実施形態について図１を用いて詳細に説明する。図１は、本発明の標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法のうち、該標的核酸の下流側近傍の核酸配列を増幅する方法について好ましい一例を簡略化して示す図である。ただし、この図面は、本発明の内容を何ら限定するものではない。なお、標的核酸とは、存在の有無を調べたい核酸であって、例としては外来遺伝子の特徴的配列を有する核酸であることが好ましい。
【００２７】
本発明の標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法における最初の工程は、核酸Ｂをプライマーとし、染色体および／または染色体外核酸上の不特定の領域を鋳型とする伸長反応である（図１の工程１を参照）。該反応の前に、例えば鋳型となる核酸が２本鎖の場合などは、必要に応じて該鋳型を熱変性などによって１本鎖に変換することが好ましい。
【００２８】
核酸Ｂは、既知配列を有する核酸の３’末端側にランダムな配列を設けたものである。
既知配列を有する核酸はその配列が明かであるものであれば、特にその配列に限定はないが、後の増幅行程でのプライマーが１種類で済む、エキストラバンドが出にくく正確性が高い、等の点で、核酸Ａであることが好ましい。なお、核酸Ａとランダム配列の間および核酸Ａの５’末端側には以下の増幅反応を阻害しない範囲で他の配列が結合されていても良い。
また、既知配列を有する核酸は核酸Ａとは、増幅反応を阻害しない範囲で１〜数カ所（５箇所程度）の範囲で配列に違いがあっても良い。
【００２９】
上記伸長反応において、核酸Ｂによる鋳型の認識には核酸Ｂの３’末端側にあるランダムな核酸配列の部分が関与するため、該工程にて生成する核酸Ｃには、図１に示すように核酸Ａに相補的な核酸配列が含まれる場合と、核酸Ａに相補的な核酸配列が含まれない場合があり得る。
【００３０】
核酸Ｃに核酸Ａに相補的な核酸配列が含まれない場合とは、例えば核酸Ｂが鋳型となる染色体および／または染色体外核酸上の核酸Ａとは十分に離れた領域を認識した場合などであり、このとき核酸Ａが存在する領域まで該伸長反応が継続しないために起こる。上記のランダムな核酸配列は、核酸Ｂを合成する際に混合塩基を用いる核酸合成方法によって作製することができるが、該方法は当業者にとって容易に達成し得る。
【００３１】
上述したような本発明の標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法における最初の工程において、該工程を達成可能な試薬組成の好ましい一例としては、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、（ｂ）核酸Ｂ、（ｃ）ｄＮＴＰ、（ｄ）反応バッファー、（ｅ）試料などから成る。
【００３２】
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、Ｔ４またはＴ７ファージ、大腸菌、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属など種々の起源のＤＮＡポリメラーゼおよびその改良変異体を特に限定されることなく使用できるが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性の酵素を使用することが好ましい。中でもＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。具体的には、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼの場合は１〜２００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１０〜１００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
【００３３】
（ｂ）核酸Ｂは１〜１０００ｎＭ程度を含むが、増幅量および特異性を高めるために１００〜６００ｎＭ程度がより好ましい。
【００３４】
（ｃ）ｄＮＴＰは５０〜１０００μＭ程度を含むが、１００〜７００μＭ程度がより好ましく、２００〜４００μＭ程度がさらに好ましい。
【００３５】
（ｄ）反応バッファーについては、本発明の標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法において該増幅を効率よく行う目的で、緩衝液や金属塩の濃度、溶液のｐＨなどが適宜選択され得る。また、酵素の安定性を高める目的で、該試薬にウシ血清アルブミンなどの添加剤を適宜混合しても良い。
【００３６】
（ｅ）試料としては、細胞を含有する試料または該細胞から抽出した核酸を含有する試料など特に限定されないが、上記反応を効率よく進めるためにも、核酸以外の成分の混入量が該反応を阻害しない程度であることが好ましい。
【００３７】
本発明の標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法において前記第１工程に続く第２の工程は、前記第１工程で生成した核酸Ｃ、および該反応で鋳型となった染色体および／または染色体外核酸からなる２本鎖を熱変性などによって１本鎖に変換した後で、核酸Ａおよび既知配列を有する核酸をプライマーとし、核酸Ｃを鋳型とする伸長反応である（図１の工程２を参照）。該工程を達成可能な試薬組成としては、プライマーとして核酸Ａおよび既知配列を有する核酸を用いることを除いて前記第１工程と同様である。また前記第１工程を実施した後で、精製などを行って反応溶液より核酸Ｂを除去してから本第２工程へ移行してもよいが、前記第１工程を実施した後の反応溶液に直接、本第２工程に必要な試薬類を添加して上記反応を進めることもできる。
なお、既知配列を有する核酸が核酸Ａと同じである場合は、核酸Ａのみをプライマーとすることができる。
また、プライマーとしては、必ずしも核酸Ａや既知配列を有する核酸と完全に一致する必要はなく、増幅反応が起こる程度にハイブリダイゼーションすれば良い。即ち、プライマーとしては核酸核酸Ａおよび既知配列を有する核酸を一部に含むものであったり、核酸核酸Ａおよび既知配列を有する核酸の少なくとも一部を含むものであったり、核酸核酸Ａおよび既知配列を有する核酸の一部に相違があっても良い。
【００３８】
上記工程に続く第３の工程は、上記第２工程で生成した核酸Ｄ、および該反応で鋳型となった核酸Ｃからなる２本鎖を熱変性などによって１本鎖に変換した後で、核酸核酸Ａおよび既知配列を有する核酸をプライマーとし、核酸Ｃまたは核酸Ｄを鋳型とする伸長反応である（図１の工程３を参照）。以後、本第３工程および該工程で生成した２本鎖核酸を熱変性などによって１本鎖に変換する工程を適宜繰り返すことにより、標的核酸近傍の核酸配列を増幅することが可能である。
第３の工程のプライマーとしては、第２の工程のプライマーと同じものを用いることができる。
【００３９】
該工程の繰り返し回数は上記方法によって増幅した核酸の解析手段の感度などに合わせて適宜設定できるが、該解析手段として、上記増幅方法によって得られた核酸配列の解析（シークエンシング）を行う場合は２０〜５０回程度の回数に設定することが好ましい。
【００４０】
以上、図１を例にして本発明を説明したが、本発明の技術的上位概念は以下の通りである。
従来は挿入遺伝子が、染色体上のどの位置に挿入されたかが不明であるため、解析のために挿入遺伝子近傍を増幅したい場合であっても、染色体上のどの位置に挿入されたかが不明であるがために、被挿入側にハイブリダイゼーションさせるプライマーを決めることができなかった。本発明は、まず染色体を構成する核酸に既知配列を有する核酸をランダムに導入し、その中から標的核酸の近傍に既知配列が導入されたもののみを、標的核酸および既知配列を認識するプライマーを用いて増幅させるものである。
既知配列を有する核酸をランダムに導入する方法としては、図１の説明では既知配列を有する核酸の３’末端側にランダムな配列を有する核酸を用いたが、特にこの方法に限定されるものではない。
【００４１】
以上のような方法によって増幅した標的核酸近傍の核酸配列は、例えば核酸配列の解析（シークエンシング）、ＰＦＧＥ、ＲＦＬＰなど従来公知の種々の技術を用いて解析することができるが、標的核酸の挿入領域を直接的に決定できるという観点からは、核酸配列の解析（シークエンシング）が好ましい。
【００４２】
シークエンシングに使用するプライマーとしては、該標的核酸において核酸Ａより末端側の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列の少なくとも一部を含有する核酸を使用することが好ましい。また、上記解析によって得られた標的核酸近傍の核酸配列データを核酸配列データベースと照合することによって、該標的核酸の挿入位置を同定することができる。さらに、このような解析を標的核酸の上流側近傍および下流側近傍の両方について行うことは、該標的核酸の挿入位置をより正確に同定できるため一層好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下に、本発明を実施例を用いて、具体的に説明する。ただし、これらの事例は、本発明の内容を何ら限定するものではない。
【００４４】
実施例１
（１）大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７へのトランスポゾンの組み込み
トランスポゾンを用いた遺伝子への外来遺伝子挿入技術（例えば、 Ｙｕ  Ｂ．−Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、１０１８−１０２３、２００２））を用いて、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＲＩＭＤ０５０９９５２株）のゲノムに、標的核酸としてテトラサイクリン耐性遺伝子を挿入した変異株ライブラリを作製した。
【００４５】
（２）標的核酸近傍の核酸配列の増幅
前記ライブラリの各変異株について、テトラサイクリン耐性遺伝子の上流側近傍および下流側近傍の両方についてそれぞれ増幅反応を行った。反応液組成は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績製）５０単位／ｍｌ、プライマー核酸Ａまたは核酸Ｂ（表１を参照）各４００ｎＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．２ｍＭ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡績製）である。実際の使用にあたっては、プライマーとして核酸Ｂを含み核酸Ａを含まない反応液を用いて（ａ）１サイクルの伸長反応を行い、核酸Ａを添加して、（ｂ）３５サイクルの増幅反応を行った。反応液量は１００μｌであり、反応条件は以下の通りである：
【００４６】
（ａ）伸長反応       熱変性：        ９４℃、５分
アニーリング：  ３０℃、５秒
伸長反応：      ７４℃、３０秒
（ｂ）増幅反応       熱変性：        ９４℃、２０秒
アニーリング：  ６５℃、５秒
伸長反応：      ７４℃、３０秒
これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００）を用いて行った。
【００４７】
【表１】
2005328770.tif 000002
【００４８】
（３）標的核酸の挿入位置の同定
増幅した核酸断片について、ＡＢＩ社製ＤＮＡシークエンサー（モデル３７００）を使用し、該機器のプロトコールに従って、テトラサイクリン耐性遺伝子の上流側近傍および下流側近傍の核酸配列を解析した。該解析に使用したプライマーの配列を表２に示す。結果として、該遺伝子の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＲＩＭＤ０５０９９５２株）ゲノムへの挿入位置を表３にまとめた。
【００４９】
【表２】
2005328770.tif 000003
【００５０】
【表３】
2005328770.tif 000004
【００５１】
表３において、ｐＯ１５７およびｐＯＳＡＫ１は本実施例で使用した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＲＩＭＤ０５０９９５２株）が保有しているプラスミドであり、該菌株の染色体と同様に核酸配列が公開されている。表３から明らかなように、本発明の方法により、すべての変異株について標的核酸の挿入位置を同定することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、従来の技術では困難であった、少量の細胞試料より標的核酸近傍の核酸配列を増幅することができる。また本発明により、簡便に標的核酸の挿入位置を解析することができるため、遺伝子治療においては遺伝子が導入された領域の確認による治療効果の向上が期待でき、また研究においては特定の遺伝子の分布状況を迅速に同定できるなど、種々の応用が可能なツールを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の標的核酸近傍の核酸配列を増幅する方法のうち、該標的核酸の下流側近傍の核酸配列を増幅する方法について好ましい一例を簡略化して示す図である。
【図１】
2005328770.tif 000005
【配列表】
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