(57)【要約】【課題】  本発明は、オリゴヌクレオチドに結合している有用な物質を、標的の核酸を損傷させることなく、容易に放出させる方法、及びそのための新規な塩基を提供する。【解決手段】本発明は、次式（Ｉ）【化１】2005058039.tif 000007（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（アルキル）−、−Ｓ−を示し、Ｒは機能性ユニット、レポーターユニット、または生体機能分子を示し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子、リン酸結合基、ホスホロアミダイド基、ヌクレオチドを示し、ｎは１から１０の数字を示す。）で表される、ヌクレオシド、又はヌクレオチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチド、並びに前記した本発明のヌクレオチドを含有してなるオリゴヌクレオチドを用いて、当該塩基部分におけるＲ基部分を放出させる方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）
【化１】
2005058039.tif 000005
（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（アルキル）−、−Ｓ−を示し、Ｒは機能性ユニット、レポーターユニット、または生体機能分子を示し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子、リン酸結合基、ホスホロアミダイド基、ヌクレオチドを示し、ｎは１から１０の数字を示す。）
で表される、ヌクレオシド、又はヌクレオチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ｎが２で、Ｘ及びＹが−ＮＨ−である請求項１に記載のヌクレオシド、又はヌクレオチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
Ｒが、蛍光発光残基である請求項１又は２に記載のヌクレオシド、又はヌクレオチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、１０〜１００塩基からなるオリゴヌクレオチドである請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
相補鎖中の少なくとも１個の塩基が、電子供与基を含むオリゴヌクレオチドなる２本鎖のオリゴヌクレオチドである請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを酸化して、次式（Ｉ）
【化２】
2005058039.tif 000006
（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（アルキル）−、−Ｓ−を示し、Ｒは機能性ユニット、レポーターユニット、または生体機能分子を示し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子、リン酸結合基、ホスホロアミダイド基などを示し、ｎは１から１０の数字を示す。）
で表されるヌクレオチド部分におけるＲ基部分を放出させる方法。
【請求項７】
酸化が、１電子の供与による方法である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酸化が、光の照射によるものである請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化により塩基部分に結合している機能性ユニット、レポーターユニット、または生体機能分子を放出させる方法、及びそのためのヌクレオシド、又はヌクレオチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡバイオセンサーは、標的遺伝子から必要な情報を引き出すための便利で早い手法を提供してきた。例えば、分子ビーコンのような配列特異的なシグナルを与えるＤＮＡプローブなどのような、いろいろなＤＮＡプローブが、このために用いられてきた（非特許文献１〜３参照）。しかし、有用な機能性の分子を放出することができるＤＮＡプローブはほとんどなかった（非特許文献４〜６参照）。
また、核酸からの薬剤放出手段としての従来法では、ニトロペンジル基やフェナシル基の光分解が利用されてきた。しかしながら、機能性分子をポスト合成法で導入する方法を使うための分子設計が容易ではなく、また、薬剤放出時にニトロソ基などの核酸にとって有害な反応種を生じる。
また、蛍光修飾した核酸から蛍光部位を除去する手法は、これまでに報告されていない。
【０００３】
【非特許文献１】Tyagi,S., et al., Nat. Biotechnol., 1996,14, 303-308
【非特許文献２】Tyagi,S., et al., Nat. Biotechnol., 1998,16, 49-53
【非特許文献３】Piatek,A.S., et al., Nat. Biotechnol., 1998,16, 359-363
【非特許文献４】Ma,Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 11159-11163
【非特許文献５】Ma,Z., et al., Med. Chem., 2001, 9, 2501-2510
【非特許文献６】Okamoto,A., et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 2502-2504
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
酸化や光の照射などの外的刺激により特定の分子を放出させることができるシステムは、遺伝子の解析や各種の疾患に治療や診断に極めて有用な手法となる。
本発明は、オリゴヌクレオチドに結合している色素や薬剤などの有用な物質を、標的の核酸を損傷させることなく、容易に放出させ、また当該放出により標的部分に当該物質を導入することができる方法、及びそのための新規な塩基を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記のようなヌクレオシドとそれを含むオリゴヌクレオチドを用いることにより、光照射・酸化剤処理などの外部刺激により機能性ユニットを核酸から放出できるようになる。従って、特定の核酸配列での薬剤・リポーター分子の放出や核酸上の標識の着脱が可能になり、つまり以下に示すようなことが期待できる。１）蛍光性色素や放射性物質で標識された核駿の使用後の標識の分解と遺伝子などへの核酸の再生、２）ジーンセンサーとして目的塩基配列や一塩基多型の検出、３）ＤＮＡの複製、ＲＮＡへの転写、タンパクの認識など遺伝子発現制御のためのドラッグデリバリーＤＮＡ、４）ＤＮＡナノワイヤー（分子論理回路、バイオセンサーなど）の出力シグナルへの利用等が可能になる。
【０００６】
本発明者らは、ホールの発生によってグアニンが分解していく機構に基づいて薬剤放出性のヌクレオシドを設計してきた。そして、グアニンの８位を修飾する方法を検討してきたが、放出されるべき分子とグアニンの間を、ヘテロ原子を介して連結させることにより、天然のグアニンよりもホールを生じやすい、即ち酸化されやすいヌクレオチドの塩基部分を得ることができることを見出した。
【０００７】
即ち、本発明は、次式（Ｉ）
【０００８】
【化３】
2005058039.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（アルキル）−、−Ｓ−を示し、Ｒは機能性ユニット、レポーターユニット、または生体機能分子を示し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子、リン酸結合基、ホスホロアミダイド基、ヌクレオチドを示し、ｎは１から１０の数字を示す。）
で表される、ヌクレオシド、又はヌクレオチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチドに関する。
また、本発明は、前記した本発明のヌクレオチドを含有してなるオリゴヌクレオチドを用いて、当該塩基部分におけるＲ基部分を放出させる方法に関する。
【００１０】
本発明者らは、このためにグアニンの８位がヘテロ原子で置換されたグアニン誘導体を製造した。８位に導入すべきヘテロ原子を有する基としてエチレンジアミンを採用してみた。その製造例を次に示す。
【００１１】
【化４】
2005058039.tif 000003
【００１２】
８−グロモグアニンの５’位を４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基で保護した化合物（１）をエチレンジアミンで処理して、８位にエチレンジアミノ基が導入されたグアニン誘導体（２）とする。これをトリフルオロ酢酸でトリフルオロアセチル化して末端のアミノ基を保護した化合物（３）とし、次いで２位のアミノ基をジメチルアミノメチリデン基で保護した化合物（４）とした後に、シアノホスホロアミダイド法（例えば化合物（５））などにより他のヌクレオチドに結合させてオリゴヌクレオチドとして、８位の末端のアミノ基及び２位のアミノ基の保護基をはずすことにより８位にエチレンジアミノ基を有するグアニン誘導体（以下、ｅｄａＧと略す。）を含有するオリゴヌクレオチド（６）を得ることができた。
このエチレンジアミンで修飾されたグアニン誘導体の末端のアミノ基に各種の分子を導入してＮ−修飾−ｅｄａＧとした。前記の反応式ではＲ−ＣＯ−のアシル基で修飾したオリゴヌクレオチド（７）を示している。例えば、オリゴヌクレオチド（６）を安息香酸スクシンイミジルエステルでアシル化することにより、ベンゾイル−ｅｄａＧを得ることができる。
【００１３】
本発明者らは、ベンゾイル−ｅｄａＧ（Ｂｚ−ｅｄａＧ）を含有するオリゴヌクレオチド（７）、例えば、５’−ｄ（ＴＡＴＡＡＴＢｚ−ｅｄａＧＴＡＡＴＡＴ）−３’：
を用いて光酸化反応を行った。１本鎖のこのオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に、リボフラビンの存在下に３６６ｎｍの光を照射したところ、このオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は速やかに分解した（ｔ１／２＝６．２分）。この反応の分解生成物を質量分析機で分析した結果、この光酸化反応は次に示す反応式、
【００１４】
【化５】
2005058039.tif 000004
【００１５】
により進行したものであることがわかった。即ち、Ｂｚ−ｅｄａＧの箇所で光分解反応が進行し、この部分でプリン環部分及びその糖鎖が解裂したもので、その結果５’側の分解生成物（８）と、３’側の分解生成物（９）、及びベンズアミド誘導体（１０）が生成した。このような分解は、既に報告されているグアニンのカチオンラジカルを経由した分解と考えられ、その結果ベンズアミド誘導体（１０）が放出されたものと考えられる。
図１に酸化による１本鎖のこのオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）にＨＰＬＣの結果を示す。図１の（ａ）は原料の１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のＨＰＬＣであり、図１の（ｂ）は、光の照射による分解生成物のＨＰＬＣの結果を示す。図１の（ｃ）は後述するイリジウムによる酸化の分解生成物のＨＰＬＣの結果を示すものである。
図２に光の照射による分解生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を示す。図２中の２３７０．６１のピークは、内部標準として用いた原料のオリゴヌクレオチドのピークである。１９６７．６８のピークは５’側の分解生成物（８）を示し、１８７０．１１のピークは３’側の分解生成物（９）を示す。図３は、光を照射した１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによる分析結果を示すものである。図３の上段は、ＭＳ２０７を含むの溶出物のものであり、中段はＭＳ２０７のフラグメンテーションを示したものであり、下段は、インタックＣ−１８カラム（２．０×５０ｍｍ）を用いた液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示したものである。
このＢｚ−ｅｄａＧの酸化電位（Ｅ１／２）は、０．５９Ｖ（VS  ＮＨＥ）であった。この酸化電位は、８−オキソ−グアニンの酸化電位である０．５８−０．７５Ｖ（Hickerson,R.P., et al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 9423-9428）に近い値であった。
また、８−オキソ−グアニンや８−オキソ−アデニンが部位特異的にイリジウム（IV）で酸化されることが報告されている（Muller,J.G., et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26, 2247-2249）。そこで、５’−ｄ（ＴＡＴＡＡＴＸＴＡＡＴＡＴ）−３’（Ｘは、Ｂｚ−ｅｄａＧ、又はテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）−ｅｄａＧを示す。）を、ナトリウム−ヘキサクロロイリデート（IV）を用いて酸化してみた。その結果、いずれのオリゴヌクレオチドも、修飾されたｅｄａＧの部分（Ｘの部分）で速やかに分解されて、１５分間でそれぞれ５７％及び８９％が分解した。
【００１６】
次に本発明者らは、ロングレンジのホールの移動について検討した。そのためにテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）−ｅｄａＧを含有するオリゴヌクレオチド
5'-（３２Ｐ）-ｄ（ＡＴＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＸＴＴＴＡＴＴＡＴ)-3'：
（Ｘは、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）−ｅｄａＧを示す。以下、このオリゴヌクレオチドを「ＯＤＮ１」という。）を用いた。この相補鎖として、
３’−ｄ（ＴＡＡＡＴＡＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡ）−５’：
（以下、このオリゴヌクレオチドを「ＯＤＮ２（Ｔ）」という。）、及びホールを注入するためのシアノベンゾフェノン−修飾ウリジン（Ｕ＊）を７番目のチミン（Ｔ）の変わりに導入したオリゴヌクレオチドである、
３’−ｄ（ＴＡＡＡＴＡＵ＊ＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡ）−５’：
（以下、このオリゴヌクレオチドを「ＯＤＮ２（Ｕ＊）」という。）を製造した。これらのオリゴヌクレオチドを図４に示す。
【００１７】
２本鎖のＤＮＡである、ＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）及びＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）にそれぞれ３１２ｎｍの光を照射した。オリゴヌクレオチドからの光分解物を遠心分離フィルター（ミクロンＹＭ−３）で分離し、５７６ｎｍの蛍光を測定した。ＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）のろ液から、強い蛍光を測定することができた。光照射から６０分後には、ＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）のろ液からは、対照のＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）のろ液の約７倍の蛍光が観測された。結果を図５の（Ａ）に示す。図５の（Ａ）は黒丸印（●）はＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）の場合を示し、黒四角印（■）はＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）の場合を示す。図５の（Ａ）の縦軸は蛍光強度（ａ．ｕ．）を示し、横軸は光照射からの時間（分）を示す。
また、ＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）のｅｄａＧサイトでの分解率をＰＡＧＥでの分析により調べた。結果を図５の（Ｂ）に示す。図５の（Ｂ）の縦軸は分解率（％）を示し、横軸は光照射からの時間（分）を示す。また、図６に２本鎖のＤＮＡであるＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）に３１２ｎｍの光を照射した結果の蛍光強度の変化を示す。図６の縦軸は蛍光強度（ａ．ｕ．）を示し、横軸は波長（ｎｍ）を示す。
このことから、蛍光強度の変化は、オリゴヌクレオチドのｅｄａＧサイトでの分解率と非常によい相関があることがわかった。加えて、５’側のＧＧＧの部分が光の照射により障害を受けていることがＰＡＧＥ分析により判明した。
図７は、２本鎖のＤＮＡであるＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）に３１２ｎｍの光を照射したときの分解生成物のＰＡＧＥ分析の結果を示す。光照射後のＯＤＮを１０％ピペリジン（ｖ／ｖ）５０μＬ中で９０℃で２０分間加熱処理した。図７中のＸはＴＡＭＲＡ−ｅｄａＧを示す。図７のレーン１はマキサム−ギルバート法によるＧ＋Ａ配列の場合を示し、レーン２は全長のＯＤＮ１を示し、レーン３は光照射直後のものを示し、レーン４は光照射３０分のものを示し、レーン５は光照射６０分のものを示す。
これは、光の照射により、２本鎖のＵ＊の部分に発生したホールが、２本鎖を通してｅｄａＧのサイトまで伝達されていることを示すものである。これらのことから、初期の段階における試料のろ液の蛍光は、ロングレンジのホールの移動により、ｅｄａＧの分解により誘発されたものと考えられる。
【００１８】
光を照射した試料の蛍光は、目視によっても確認できる。この結果を図８に図面に変わる写真で示す。図８の左側はＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）からの試料によるものであり、右側はＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）からの試料によるものである。図８の右側のＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）からのものには強い蛍光が観察されたが、図８の左側のＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）からの試料にはほとんど蛍光を観察することはできなかった。
このように、２本鎖ＤＮＡの中にＴＡＭＲＡ−ｅｄａＧのような分解してレポーターユニットとなる蛍光発光分子を有するグアニン誘導体を導入しておくことにより、ＰＡＧＥ分析を行うことなくＤＮＡ中のホールの移動を検出することができることになる。
【００１９】
以上のように、本発明の８位がヘテロ原子で結合された分子を有するグアニン誘導体は、酸化、即ち電子の供与により結合された分子種を放出することが判明した。本発明はこのようなグアニン誘導体、及びそれを含有するオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のグアニン誘導体における分子種の放出は比較的温和な酸化により誘発されるものであり、このような分子種の放出は蛍光タグの放出による遺伝子の解析だけでなく、生体内における特定の部位で薬物を放出させるベクターとしても極めて有用なものである。
【００２０】
本発明の８位がヘテロ原子で結合された分子を有するグアニン誘導体は、放出分子種−ヘテロ原子又は原子団−プリン環の構造を有するものであり、好ましくは前記一般式（Ｉ）で表されるものである。
一般式（Ｉ）中の−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−の部分がプリン環と放出分子種を結合させるリンカー部分に相当し、ヘテロ原子の存在によりグアニンの分解が生起し、結合していた分子種が放出される。したがって、当該リンカー部分は、グアニンの分解が可能なヘテロ原子を含有し放出分子種を固定させることができるものであれば特に制限はないが、好ましいリンカー部分としては、前記した一般式（Ｉ）で表されるものが挙げられる。ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して同一又は異なるヘテロ原子であり、例えば、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（アルキル）−、−Ｓ−などが挙げられる。−Ｎ（アルキル）−におけるアルキル基としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖又は分枝状のアルキル基、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基などのアルキル基が挙げられる。また、ｎは１から１０、好ましくは１〜５の整数を示すが、−（ＣＨ２）ｎ−は必ずしも直鎖のアルキレン基でなくてもよく、分枝状のアルキレン基であってもよい。また、当該アルキレン基のなかの１個又は２個以上のメチレン基が酸素原子、窒素原子などのヘテロ原子で置換されたアルキレン基であってもよい。
一般式（Ｉ）における−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−の部分の例としては、前記してきた−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−基などが挙げられる。
【００２１】
一般式（Ｉ）におけるＲ基は、酸化により放出される分子種の部分を示し、放出されて当該分子種が有する機能を発現することができるものであればよい。このような機能を発現することができる分子種を本明細書では「機能性ユニット」と称する。このような「機能性ユニット」としては、蛍光発色するユニットやアビジンのような結合性の分子や、抗原や抗体などのレポーターとして機能するレポーターユニット、医薬品や抗体などの生体内で生体機能を調節する生体機能分子などが挙げられる。例えば、当該「機能性ユニット」として医薬品を用いた場合には、使用するオリゴヌクレオチドが特定の遺伝子とハイブリダイズすることから、特定のｍＲＮＡなどが発現している細胞に当該オリゴヌクレオチドが局在することになり、酸化剤や光の照射により当該部位において当該医薬品が選択的に放出されることになり、部位選択的なＤＤＳ製剤とすることも可能となる。
【００２２】
一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２は、ヌクレオシドの糖部分における連結用の基であることを示し、ヌクレオシドの場合にはＲ１、Ｒ２は、それぞれ水素原子であるが、ヌクレオチドを形成するためのリン酸結合基であってもよいし、そのための中間体として使用される保護基やホスホロアミダイド基などであってもよい。
また、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、オリゴヌクレオチドであってもよく、当該オリゴヌクレオチドは、前記したような放出される分子種を有する修飾されたグアニン誘導体を含有するオリゴヌクレオチドであるということができる。本発明のこのようなオリゴヌクレオチドは、放出される分子種を有する修飾されたグアニン誘導体を少なくとも１個有するものであり、必要に応じて２個以上有しているものであってもよい。このような場合には前記一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２は、各種のヌクレオチド示すことになる。このようなヌクレオチドは、１個又は２個以上の塩基を有するものであってよい。
本発明のこのようなオリゴヌクレオチドは、非常に長いものであってもよく、特に長さに制限はないが、好ましくは１０〜１００塩基、１０〜５０塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドには、格別の電子供与基は必要ではないが、少なくとも１個の塩基が、電子供与基として機能する塩基であるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、前記してきたように本発明の修飾グアニンはロングレンジのホールの移動によっても分解することができるので、相補鎖中の少なくとも１個の塩基が、電子供与基を含むオリゴヌクレオチドなる２本鎖のオリゴヌクレオチドも本発明の好ましいオリゴヌクレオチドとして挙げることができる。
また、本発明は、前記した本発明のオリゴヌクレオチドを酸化して、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオチド部分におけるＲ基部分を放出させる方法を提供する。
本発明のＲ基部分の放出の概要を図９に示す。図９では、Ｘ部分に機能性ユニットが結合されており、１電子の放出によりホールが発生し、これがロングレンジで移動してＸ部分に伝達され、Ｘ部分の機能性ユニットがオリゴヌクレオチドから放出される様子を模式的に示したものである。
また、図１０は、本発明の方法におけるオリゴヌクレオチドからの機能性ユニットとして染料分子が放出される様子を模式的に示したものである。
本発明のこの方法における酸化としては、比較的温和な酸化であればよく、例えば、１電子の供与による方法や、光の照射による酸化、イリジウム（IV）やＯｓ（III）による酸化などが挙げられる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のヌクレオシドでは、オリゴヌクレオチドに組み込んだ後、アミドやエステル結合生成による機能性ユニットの導入、光照射を含む穏和な酸化反応によるオリゴヌクレオチドの分解・機能性ユニットの放出が容易である。従って、核酸合成条件にとらわれずに様々な機能性ユニットを導入することができ、加えて、望む段階で機能性ユニットをオリゴヌクレオチドから切りはずすことができる。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などの蛍光測定を行った後の蛍光部位の除去、標的配列でのドラッグの放出、使用済み標識オリゴヌクレオチドの分解などが期待される。機能性ユニットを放出させる酸化手法として、リボフラビンなどの色素を用いて光酸化、Ｉｒ（IV）やＯｓ（III）などの金属酸化剤による酸化反応、西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素酸化反応が可能である。
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
化合物２の製造
エチレンジアミン（１００ｍＬ）中に溶解した８−ブロモ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアノシン（化合物（１））溶液（２．０ｇ，３０．８ｍｍｏｌ）を１３０℃で７時間、還流攪拌した。濃縮乾燥後、粗生成物（２）を茶色の油状物として得た。
【実施例２】
【００２７】
化合物３の製造
実施例１で得られた化合物（２）をトリフルオロ酢酸エチル１０ｍＬおよびトリエチルアミン２５ｍＬ存在下、メタノール５０ｍＬ中で、０℃で２時間攪拌した。濃縮乾燥後、次の段階へ進んだ。
【実施例３】
【００２８】
８−［２−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ）エチル］アミノ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデニル）アミノ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアノシン（化合物（４））の製造
実施例２で濃縮して得られた残渣にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（２５ｍＬ）を添加し、反応液を室温で２時間攪拌した。濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３０：１）で精製し、化合物４（１．５ｇ、６３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：
9.77 (brs, 1H), 9.56 (brs,1H), 8.54 (s,1H), 7.34-7.19 (m,8H),
6.83-6.80 (m, 5H), 6.48 (dt, 1H,J=8.0,4.0Hz), 5.83 (brs, 1H),
4.75 (d,1H,J=5.8Hz), 4.07 (d,1H,J=2.4Hz), 3.765 (s,3H), 3.763 (s,3H),
3.76-3.72 (m,2H), 3.38 (d,1H,J=8.4Hz), 3.10 (s,3H), 3.02 (s,3H),
3.01-2.95 (m,2H), 2.80-2.60 (m,3H), 2.33 (dd,1H,J=13.3,8.0Hz)；
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：
158.92, 158.91, 158.60, 157.56, 157.19, 156.55, 151.00, 143.55, 139.43,
134.61, 134.57, 130.29, 129.10, 128.42, 128.04, 127.82, 127.73, 127.55,
127.05, 120.27, 117.41, 114.55, 113.30, 113.27, 113.14, 87.01, 85.74,
82.80, 77.21,71.87, 62.87, 55.27, 55.23, 42.65, 41.30, 40.77, 38.73,
35.11；
ＭＳ  （ＦＡＢ，ＮＢＡ／ＣＨ２Ｃｌ２）  ｍ／ｚ（％）７７９［（Ｍ＋Ｈ）＋］；
ＨＲＭＳ  （ＦＡＢ）  Ｃ３８Ｈ４２Ｎ８Ｏ７Ｆ３［（Ｍ＋Ｈ）＋］として、
計算値      ７７９．３１２９，
実測値      ７７９．３１２８．
【実施例４】
【００２９】
３’−（Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−８−［２−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ）エチル］アミノ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデニル）アミノ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアノシン（化合物５）の製造
実施例３で得られた化合物（４）の溶液（７０ｍｇ，８９．９μｍｏｌ）に、２−シアノエチルテトライソプロピルジホスホロアミダイト（３１μＬ，９８．９μｍｏｌ）及びテトラゾール（７ｍｇ，９８．９μｍｏｌ）のアセトニトリル（９００μＬ）溶液を加え、室温で２時間攪拌した。析出した塩（化合物（５））を濾別した後、濾液をそのまま次の段階へ用いた。
【実施例５】
【００３０】
オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の合成及びその特性
アプライドバイオシステムズ社３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて従来のホスホロアミダイト法によりオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドを逆相高速液体クロマトグラフィー［５−ＯＤＳ−Ｈカラム（１０×１５０ｍｍ）を用い、溶出は０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７．０）を含むアセトニトリルの直線勾配（５％〜２０％／３０分超）、流量３．０ｍＬ／ｍｉｎで行った。］に付した。精製したＯＤＮ溶液の画分に５０Ｕ／ｍＬの子ウシ小腸（calf intestine）アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、０．１５Ｕ／ｍＬのヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）及び５０Ｕ／ｍＬのＰ１ヌクレアーゼを加え３７℃で３時間、完全に消化されるまで反応させた。酵素分解物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ−１８ＡＲ又はＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ  ５−ＯＤＳ−Ｈ  カラム（４．６×１５０ｍｍ）を用い、溶出は０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）、（ｐＨ７．０）を含むアセトニトリルの直線勾配（０％〜２０％／２０分超）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで行った。］により分析した。  各ＯＤＮの濃度を、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びｄＴ濃度０．１ｍＭとした標準溶液のピークとの比較によって、測定した。  各ＯＤＮの特性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより解析した。
5'-ｄ（ＴＡＴＡＡＴｅｄａＧＴＡＡＴＡＴ）-3'：
m/z   ［Ｍ−Ｈ］−  として  計算値      ４０２８．７２
実測値      ４０２７．３３  ；
5'-ｄ（ＡＴＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴｅｄａＧＴＴＴＡＴＴＡＴ)-3'  ：
m/z   ［Ｍ−Ｈ］−  として  計算値      ８７３２．６９
実測値      ８７３２．８７
【実施例６】
【００３１】
実施例５で得られたオリゴヌクレオチド（６）６０ｎＭを、目的の機能分子のスクシンイミジルエステル体１ｍｇ（例えば安息香酸スクシンイミジルエステルなど）をジメチルスルホキシド１ｍＬに溶かした溶液５０μＬを加えた５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μＬ中で、５度１６時間インキュベーションすることにより、機能化されたオリゴヌクレオチド（７）が得られた。
【実施例７】
【００３２】
１本鎖のオリゴヌクレオチドの光酸化反応
１本鎖のこのオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、
５’−ｄ（ＴＡＴＡＡＴｅｄａＧＴＡＡＴＡＴ）−３’：
に、リボフラビンの存在下に３６６ｎｍの光を照射した。その結果、このオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は速やかに分解した（ｔ１／２＝６．２分）。
この結果のＨＰＬＣを図１に示す。この分解生成物を質量分析機で分析した結果を図２及び図３に示す。
分解生成物（８）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）
５’−ＴＡＴＡＡＴ−ＯＰＯ３−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ：
［Ｍ−Ｈ］−    として      計算値    １９６８．３２
実測値    １９６７．６８  ；
分解生成物（９）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）
−Ｏ−ＰＯ３−ＴＡＡＴＡＴ−３’：
［Ｍ−Ｈ］−    として      計算値    １８７０．２２
実測値    １８７０．１１  ；
分解生成物（１０）（ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）
［Ｃ１０Ｈ１５ＯＮ４］＋  として    Ｍ＋  ２０７
フラグメント  １４８，１０５，７７，５９
【実施例８】
【００３３】
ベンゾイル−ｅｄａＧの酸化電位（Ｅ１／２）の測定
ベンゾイル−ｅｄａＧ（２５０μＭ）の酸化電位（Ｅ１／２）を、ＡＬＳ電気化学分析機モデル６６０−Ａを用いて１００ｍＭのＬｉＣｌＯ４溶液中で室温で測定した。スキャン速度は１００ｍＶ／秒であり、試料用電極としてガラス炭素電極を、カウンター電極として白金ワイヤーを、そして対照電極としてＳＣＥを用いた。その結果、ベンゾイル−ｅｄａＧの酸化電位（Ｅ１／２）は０．５９Ｖ（VS  ＮＨＥ）であった。
【実施例９】
【００３４】
ＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）及びＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）のそれぞれに３１２ｎｍの光を照射したときの分解例
塩基濃度１ｍＭ に相当するオリゴヌクレオチドおよび一電子酸化剤リボフラビン５０ μＭを含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対し３６６ｎｍの光をトランスイルミネーターによって照射した。１分の照射で約９０％、５分の照射でほぼ全量の分解が認められた。酵素分解によりヌクレオシド単位まで分解し解析を行ったところ、当該修飾ヌクレオシドでのみ分解消失していることが明らかになった。
結果を図５〜８に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明の１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の光の照射による分解生成物のＨＰＬＣの結果を示すものである。図１の（ａ）は原料の１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のＨＰＬＣであり、図１の（ｂ）は、光の照射による分解生成物のＨＰＬＣの結果を示す。図１の（ｃ）はイリジウムによる酸化の分解生成物のＨＰＬＣの結果を示すものである。
【図２】図２は、本発明の１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の光の照射による分解生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を示す。図２中の２３７０．６１のピークは、内部標準として用いた原料のオリゴヌクレオチドのピークである。１９６７．６８のピークは５’側の分解生成物（８）を示し、１８７０．１１のピークは３’側の分解生成物（９）を示す。
【図３】図３は、本発明の１本鎖のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に光を照射したときのＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによる分析結果を示すものである。図３の上段は、ＭＳ２０７を含むの溶出物のものであり、中段はＭＳ２０７のフラグメンテーションを示したものであり、下段は、インタックＣ−１８カラム（２．０×５０ｍｍ）を用いた液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示したものである。
【図４】図４は、本発明のＴＡＭＲＡ−ｅｄａＧを含有するオリゴヌクレオチドの概要、及びその相補鎖の概要を示すものである。
【図５】図５は、本発明の２本鎖のＤＮＡである、ＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）及びＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）にそれぞれ３１２ｎｍの光を照射した結果の蛍光強度（図５の（Ａ））及び当該オリゴヌクレオチドの分解率（図５の（Ｂ））を示す。図５の（Ａ）は黒丸印（●）はＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）の場合を示し、黒四角印（■）はＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）の場合を示す。図５の（Ａ）の縦軸は蛍光強度（ａ．ｕ．）を示し、横軸は光照射からの時間（分）を示す。図５の（Ｂ）の縦軸は分解率（％）を示し、横軸は光照射からの時間（分）を示す。
【図６】図６は、本発明の２本鎖のＤＮＡであるＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）に３１２ｎｍの光を照射した結果の蛍光強度の変化を示したものである。図６の縦軸は蛍光強度（ａ．ｕ．）を示し、横軸は波長（ｎｍ）を示す。
【図７】図７は、本発明の２本鎖のＤＮＡであるＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）に３１２ｎｍの光を照射したときの分解生成物のＰＡＧＥ分析の結果を示す。図７中のＸはＴＡＭＲＡ−ｅｄａＧを示す。図７のレーン１はマキサム−ギルバート法によるＧ＋Ａ配列の場合を示し、レーン２は全長のＯＤＮ１を示し、レーン３は光照射直後のものを示し、レーン４は光照射３０分のものを示し、レーン５は光照射６０分のものを示す。
【図８】図８は、本発明の２本鎖のＤＮＡである、ＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｔ）（図８の左側）及びＯＤＮ１／ＯＤＮ２（Ｕ＊）（図８の右側）にそれぞれ３１２ｎｍの光を照射した結果の蛍光を目視した場合の結果を示す図面に変わる写真である。
【図９】図９は、本発明の方法におけるオリゴヌクレオチドからの機能性ユニットの放出を模式的に示したものである。
【図１０】図１０は、本発明の方法におけるオリゴヌクレオチドからの機能性ユニットとして染料分子が放出される様子を模式的に示したものである。
【図１】
2005058039.tif 000008
【図２】
2005058039.tif 000009
【図３】
2005058039.tif 000010
【図４】
2005058039.tif 000011
【図５】
2005058039.tif 000012
【図６】
2005058039.tif 000013
【図７】
2005058039.tif 000014
【図８】
2005058039.tif 000015
【図９】
2005058039.tif 000016
【図１０】
2005058039.tif 000017
【配列表】
2005058039000001.app