(57)【要約】【課題】  コレクチンネック領域あるいはその変異体又は誘導体、もしくは同一又は同様のアミノ酸パターン及び／又は疎水性プロフィールを有するアミノ酸配列を包含し、三量体化し得るポリペプチドの提供。【解決手段】  当該ポリペプチドは例えばタンパク質ドメインを生成する、又はイムノグロブリンに由来する異種アミノ酸を含めた付加的アミノ酸を包含し、もしくはオリゴ糖のような非ペプチド部分の付着のために誘導されるアミノ酸を包含し得るか、あるいはホモ三量体又はヘテロ三量体を生成し得る。ヘテロ三量体化は、例えば50℃に低温加熱し、次いで室温に冷却することにより促進し得る。ポリペプチドの使用例としては、コラーゲン構成物の接種がある。ポリペプチドをコードする核酸及びそれらの生成方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレクチンのネック領域であるアミノ酸の第１配列であって、１以上の異種アミノ酸に融合されたものを含み、かつ、三量体を形成し得る非天然ポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸の第１配列がコレクチンSP-Dのネック領域である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記第１アミノ酸配列が、以下のヒト・ネック領域アミノ酸配列：
VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK
である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記第１アミノ酸配列が以下のウシ・ネック領域アミノ酸配列：
VNALRQRVGILEGQLQRLQNAFSQYKK
である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記第１アミノ酸配列が、以下のラット・ネック領域アミノ酸配列：
SAALRQQMEALNGKLQRLEAAFSRYKK
である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記第１アミノ酸配列がコレクチン43又はコングルチニンのネック領域である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記第１アミノ酸配列が、以下のウシ・コングルチニン・アミノ酸配列：
VNALKQRVTILDGHLRRFQNAFSQYKK
である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記第１アミノ酸配列が、以下のウシ・コレクチン43アミノ酸配列：
VDTLRQRMRNLEGEVQRLQNIVTQYRK
である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
１以上の異種アミノ酸に融合されたコレクチンSP-Dのネック領域と実質的に同一な疎水性プロフィールを有するアミノ酸の第１配列を含み、かつ、三量体を形成し得るポリペプチドであって、ここで、当該ネック領域は、以下の：
ｉ）  VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK、
ii）  VNALRQRVGILEGQLQRLQNAFSQYKK、及び
iii） SAALRQQMEALNGKLQRLEAAFSRYKK、
から成る群から選ばれるアミノ酸配列から成る、前記ポリペプチド。
【請求項１０】
前記異種アミノ酸がタンパク質ドメインを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記異種アミノ酸が免疫グロブリン由来の配列を含む、請求項１〜10のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記第１アミノ酸配列が、ペプチドリンカーを介して異種アミノ酸（単数又は複数）に連結される、請求項１〜11のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記単数又は複数の異種アミノ酸が化学的部分の付着のために誘導可能であるアミノ酸を含む、請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
非ペプチド部分と連結された、請求項１〜13のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記アミノ酸の第１配列のＮ末端側に前記異種アミノ酸（単数又は複数）と、及び前記アミノ酸の第１配列のＣ末端側に１以上のアミノ酸と、あるいは前記アミノ酸の第１配列のＣ末端側に前記異種アミノ酸（単数又は複数）と及び前記アミノ酸の第１配列のＮ末端側に１以上のアミノ酸を含む、請求項１〜14のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
コレクチンＣ型レクチン・ドメインを含む、請求項１〜15のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸。
【請求項１８】
ベクターである、請求項17に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項17又は18に記載の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項２０】
前記コーディング配列が前記ポリペプチドの発現のための調節配列に作用可能な状態で連結されている、請求項17又は18に記載の核酸。
【請求項２１】
請求項20に記載の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項２２】
前記のコードされたポリペプチドの、請求項17に記載の核酸からの発現を含む、請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドの発現のための条件下、請求項21に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２４】
請求項22又は23に記載の方法によるその発現後にポリペプチドを含む三量体を形成することを含む、請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む三量体の製造方法。
【請求項２５】
前記三量体がホモ三量体である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記三量体がヘテロ三量体である、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
コレクチンのネック領域であるアミノ酸の第１配列を含み、かつ、三量体を形成し得る非天然ポリペプチドを含むヘテロ三量体である三量体を、コーディング核酸からのポリペプチドの発現後に形成することを含む、請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む三量体の製造方法。
【請求項２８】
請求項22又は23に記載の方法によるポリペプチドの発現後にそのポリペプチドを単離することを含む、請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２９】
請求項28に記載の方法によるポリペプチドの単離後にそのポリペプチドを含む三量体を形成することを含む、請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む三量体の製造方法。
【請求項３０】
前記三量体がホモ三量体である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記三量体がヘテロ三量体である、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む三量体。
【請求項３３】
ホモ三量体である、請求項32に記載の三量体。
【請求項３４】
ヘテロ三量体である、請求項32に記載の三量体。
【請求項３５】
コレクチンのネック領域であるアミノ酸の第１配列を含み、かつ、三量体を形成し得る非天然ポリペプチドを含むヘテロ三量体である三量体を形成することを含む、請求項１〜16のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む三量体の製造方法。
【請求項３６】
コラーゲン三重らせんの形成方法であって、非天然ポリペプチドを提供し、ここで、各ポリペプチドが、三量体を形成することができる、コレクチンのネック領域であるアミノ酸の第１配列のＮ末端側に一連のコラーゲン・トリプレットを含み、そして上記ポリペプチドとして三量体を形成させる、ことを含む方法。
【請求項３７】
前記アミノ酸の第１配列がコレクチンSP-Dのネック領域である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１アミノ酸配列が、以下のネック領域アミノ酸配列：
VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK
である、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１アミノ酸配列がコレクチン−43又はコングルチニンのネック領域である、請求項36に記載の方法。
【請求項４０】
前記アミノ酸の第１配列が前記ポリペプチドのＣ末端にあるか、あるいは前記ポリペプチドが前記第１配列のＣ末端側の１以上の異種アミノ酸を含む、請求項36〜39のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
コラーゲン三重らせんの形成方法であって、非天然ポリペプチドを提供し、ここで、各ポリペプチドが、三量体を形成し得る、コレクチンSP-Dのネック領域と実質的に同一な疎水性プロフィールを有するアミノ酸の第１配列のＮ末端側の一連のコラーゲン・トリプレットを含み、そして、上記ポリペプチドをして三量体を形成せしめることを含む前記方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、そのコーディング核酸からの発現により提供される、請求項36〜41のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記三量体が、三量体化後に単離される、請求項42に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多量体、特に三量体を生成し得るポリペプチド、並びにこのようなポリペプチドの製造及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン分子の生合成は、三重らせんを形成するためにＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットから成る３つのポリペプチドの正しい整列を要する〔１〕。各鎖は、右回り三重らせん中で左回りらせん構造をとり、これは鎖間水素結合により安定化される。三重らせんの形成は、３本の鎖のＣ末端の単一核形成点から進行し、ジッパー様方式で成長する〔２〕。
【０００３】
コラーゲンＩＩＩ型に関する再生実験は、Ｃ末端球状タンパク質構造間に形成される特異的鎖間ジスルフィド架橋は三重らせんのin vitro再生のための核として機能するのに十分であるが、一方還元はこの工程を完全に阻害する、ということを示した〔３〕。しかしながら、コラーゲン配列を含有するタンパク質族が大きく、異なる型のＣ末端非コラーゲン様領域の配列比較によってはＦＡＣＩＴ（三重らせん遮断を伴う細繊維関連コラーゲン、ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ及びＸＶＩ型）、横紋細繊維のコラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ及びＸＩ型）、又はＣｌｑ様Ｃ末端ドメイン（ＶＩＩＩ及びＸ型）が共有する一般的モチーフが明らかにされなかったため、コラーゲンの会合及び整列登録を導く分子メカニズムは、依然としてはっきり分かっていない。鎖間ジスルフィド結合の高頻度の形成は、鎖間会合及びその後の三重らせん形成の核形成に関与するタンパク質モジュールに関する調査をさらに複雑にした。
【０００４】
「コレクチン collectin」として公知のコラーゲンタンパク質の一族は、血清タンパク質マンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）、コレクチン−４３及びウシコングルチニン、並びに肺界面活性剤タンパク質ＳＰ−１０及びＳＰ−Ａで構成される〔５〕。コラーゲンポリペプチド鎖は短Ｎ末端領域、即ち短い一続きの３４〜３９アミノ酸（「ネック」領域を形成する）によりＣ末端Ｃ型レクチンドメイン（１１３〜１１８アミノ酸）に連結されるコラーゲン様領域（２０〜５９のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット）を含有する（図１ａ）。
【０００５】
本発明は、コレクチンタンパク質の「ネック領域」が３つのコラーゲンポリペプチド鎖の鎖間認識、三量体化及び整列登録を媒介し得ることを示す結果から生じた〔７〕。その結果により、選択したポリペプチドを三量体化する簡単な方法が利用できる。
【発明の開示】
【０００６】
本発明によれば、コレクチンのネック領域あるいはそのアミノ酸配列変異体又はその誘導体を包含するポリペプチドが提供される。このようなポリペプチドは適切な条件下で三量体を生成する。ポリペプチドは非天然性である。即ち自然には見出されないものである。
【０００７】
それは、ネック領域あるいはその変異体又は誘導体と接合した１つ又はそれ以上の異種アミノ酸を包含し得る。それは、それが得られる分子からの１つ又はそれ以上のアミノ酸を保持する。例えば、ポリペプチドはコレクチンＣ型レクチンドメインを包含し得る。
【０００８】
一定義によれば、本発明は、次式：
Ｘ−Ｎ−Ｙ
（式中、Ｎはコレクチンネック領域ペプチド、あるいはその変異体又は誘導体、あるいは三量体を形成し得る、コレクチンネック領域と同一の又は同様のアミノ酸パターン及び／又は疎水性プロフィールを有するアミノ酸の配列であり；Ｘは存在しないか又は１つ又はそれ以上のアミノ酸であり；Ｙは存在しないか又は１つ又はそれ以上のアミノ酸である。Ｘ及びＹがともに存在しない場合、ポリペプチドは本質的にＮで構成される。Ｘ及び／又はＹは１つ又はそれ以上の異種アミノ酸を包含し、そのいずれもが誘導化できるか、あるいは化学的部分の付着に関して「キメラ修飾可能」である）にしたがってアミノ酸で本質的に構成される非天然ポリペプチドを提供する。
【０００９】
化学的部分は、特異的化学的修飾可能な残基（単数又は複数）に導入し得る。化学的修飾可能アミノ酸残基は、特定の条件下で選択された化学試薬による修飾を受け易いアミノ酸残基である。そのアミノ酸はポリペプチド中に唯一であるか、又はそれは独自に修飾可能であるか、あるいは選択的に又は存在する他のアミノ酸より優先的に修飾可能である。例えば、システイン残基は結合部位に導入し得るし、そのチオール基を介して化学的修飾に用い得る。それはさらに、その環境を工学的処理することにより、例えば特定の特性を有する別のアミノ酸に隣接する分子内にそれを位置調節することにより、アミノ酸を分子内の同一種類の他のアミノ酸に比較して優先的に修飾可能にさせ得る。例えば、カルボキシラート基の隣のアミノ基は、結合部位内に唯一でない場合でも、より求核性にそして選択的修飾可能性にされる。
【００１０】
他の化学的修飾可能アミノ酸としては、リシン、グルタミン酸、ヒスチジン及びチロシンが挙げられる。共有修飾は、広範な部分、特にリポーター基又は触媒作用のための補因子を組み入れ可能にする。本発明の一実施態様において、特異的に修飾可能な１つ又はそれ以上のアミノ酸が組み入れられる。これは大きな有機基、例えば蛍光性リポーター基、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）の相互作用を可能にする。他の大型基、例えば触媒作用のためのフラビン補因子、ＦＭＮ及びＦＡＤも組み入れ得る。
【００１１】
さらに、同一試薬又は２つ（又はそれ以上）の異なる試薬による修飾のために２つ（又はそれ以上）の残基を組み入れる可能性があるし、あるいはさらに好ましくは異なる残基を異なる試薬で修飾して異なる化学的部分を結合部位に組み入れ得る。これは、例えばフラビン及びヘムのような２つの化学的部分の存在が酸化還元反応の触媒作用を促し得る触媒作用に有用である。
【００１２】
他にもポリペプチドの修飾方法が考えられる。特異的官能基を含有する分子を用いて特異的に誘導される多数のアミノ酸残基がある。例えば、アミノ基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、カルボキシル基はカルボジイミドで、ヒスチジン及びシステインはハロメチルケトンで、アルギニンはグリオキサルで修飾し得る（例えば、A. R. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism 2nd edn, 1985 pp248-251, W. H. Freeman, New York ）。
【００１３】
特定のアミノ酸残基を修飾するために用いられるいくつかの試薬が、T. Imoto及びH. Yamada （" Protein Function: a Practical Approach ", pp247-277, 1989 ）により示されている。特異的官能基をポリペプチドに導入するために、これらの試薬の反応基を修飾試薬中の官能基と組合せ得る。例えば、フルオロフォア  ７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸でタンパク質を修飾するのが望ましい場合、分子のＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルを用いてアミノ酸基を修飾し、一方Ｎ−〔６−（アミノ−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）ヘキシル〕−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミドを用いてシステイン基を修飾し得る。
考えられる別の方法は、グルタミン酸残基のγ−カルボキシアミド基と第一アミンとの間のアシル転移反応を触媒するトランスグルタミナーゼを用いることである（E. Bendixen et al., J. Biol. Chem. 268 21962-21967, 1993; K. N. Lee et al., Biochem. Biophys. Acta 1202 1-6 1993; T. Kanaji et al., J. Biol. Chem. 268 11565-11572 1993 ）。したがって、この酵素はペプチドからのアミノ酸残基をペプチドリシンエプシロンアミノ基を介してグルタミン残基中へ、又はペプチドグルタミン基を介してリシン基中ヘ導入し得た。本酵素はさらに、第一アミンを用いてグルタミン残基の誘導化を触媒し得た。
【００１４】
さらに別のアプローチは、逆タンパク質分解又は化学的共役、あるいはその２つの組合せを用いて、ポリペプチドのＮ又はＣ末端に化学的部分を導入することである（I. Fisch et al., Bioconj. Chem. 3, 147-153, 1992; H. F. Gaertner et al., Bioconjug. Chem. 3, 262-268, 1992; H. F. Gaertner et al., Biol. Chem. 269, 7224-7230, 1994; J. Bongers et al., Biochem. Biophys. Acta, 50, S57-162, 1991; R. Offord, Protein Engineering, 4, 709-710, 1991 ）。これらの方法を用いて非コード化要素がタンパク質及びペプチド分子に導入された。
【００１５】
導入され得るフルオロフォアの例としては、フルオレセイン、フィコエリトリン、クマリン、ＮＢＤ、テキサスレッドＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ及びキレート化ランタニドイオンが挙げられる。導入し得る触媒基の例としては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、シトクロム及びキレート化金属イオン、例えば亜鉛及び銅が挙げられる。
【００１６】
一実施態様において、ネック領域は、コレクチンＳＰ−Ｄ（あるいはその変異体又は誘導体）に属するものである。その他の可能性としては、コレクチン−４３及びコングルチニンが挙げられる。マンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）及びＳＰ−Ａも本発明に使用し得るが、しかしその場合、それぞれのレクチンドメインからの付加的アミノ酸を要する。しかしながらそれらの付加的アミノ酸はαらせん構造を有するため、天然分子中では、必要なアミノ酸配列は依然としてコレクチンの「ネック領域」であると考えられる。
【００１７】
図１（ａ）は、Ｖ／Ｌ反復を有するＳＰ−Ｄのネック領域を示す。ある実施態様では、図示されているように、すぐ上流のＧ残基を、そしてリンカー間及び／又は下流にアミノ酸を、ネック領域に含むのが好ましい。リンカーは、三量体中の折り畳まれたドメインを一定間隔に置くために重要である。例えば、「．．．ＦＰ．．．」は鎖中によじれを提供する。
【００１８】
ＳＰ−Ｄのネック領域でない場合、本発明のポリペプチド中のネック領域は、三量体化する能力が保持されさえすれば、ＳＰ−Ｄのネック領域と同一の又は同様のアミノ酸パターン及び／又は疎水性プロフィールを有する。
【００１９】
以下に種々のコレクチンネック領域のアミノ酸の列を示す：
位  置          -  - abcdefgabcdefgabcdefgabcdef
ヒトＳＰ−Ｄ       - VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK
ウシＳＰ−Ｄ       - VNALRQRVGILEGQLQRLQNAFSQYKK
ラットＳＰ−Ｄ  -  - SAALRQQMEALNGKLQRLEAAFSRYKK
ウシコングルチニン   VNALKQRVTILDGHLRRFQNAFSQYKK
ウシコレクチン４３   VDTLRQRMRNLEGEVQRLQNIVTQYRK
【００２０】
層「ａ」のＶ及び層「ｄ」のＬの位置調節は、好ましくは二量体を生じると一般に考えられる。上記の配列中のＦ及びＹの存在は異常で、オリゴマー化の程度に直接影響を及ぼす。Ｇは２つの「ａｄ」反復の真ん中に正確に位置調節される。これは、三量体形成工程にとって重要である。グリシン残基はαらせんにおける他の残基とはわずかに異なった振る舞いをする。しかしながら、今までのところ、明確な規則は確立されていない。Ｇはしばしばらせんの末端に見出され、それらを終結させる。層「ａ」及び「ｄ」の残基は、αらせん束の左回り超らせん中でお互いの上部に位置調節される（「ａ２」の上部に「ａ１」、「ｄ２」の上部に「ｄ１」）ようには厳密にはならないため、中央に位置調節されたグリシン残基はらせんの超らせんのわずかな変化に関係し、したがって異なる充填行動に、又は「ａ」及び「ｄ」層の疎水性残基に関係し得る。次いでこれは、規定の配列の排他的三量体化の理由の一部となり得る。かなり大きな嵩のある疎水性残基Ｆ及びＹのＣ末端「ａｄ」層は、標準αらせん束とは異なる充填行動を要し、おそらくは二重コイルの全体的ねじれ及び形状に影響を及ぼす。「ｅ」及び「ｇ」位置のＱ残基はともにらせんを保持する力に関与し、これはヒトＳＰ−Ｄから、例えばウシコレクチン４３への観察される置換により増強されるため、Ｑ残基が豊富に存在することが重要である。この場合、「ｇ」位置でのＱからＲへの置換は「ａ−ｇ」反復直後の「ｅ」層でのＱからＥへの置換に対応し、したがってヒトＳＰ−ＤにおけるＱ残基の位置での反対の電荷とのイオン相互作用を提供する。
【００２１】
したがって、ネック領域ペプチドは、ペプチドの特性に影響を及ぼすよう変えられて三量体αらせん束を形成する多数の明確な特徴を有する。その列は、三量体を形成し、多数の置換を示すが、三量体化能力には作用しないコレクチンの天然ネック領域を示す。
【００２２】
ネック領域ペプチドの三量体化特徴は、特にＮ末端の「ａ」〜「ｄ」反復の延長により、例えばネック領域の最初の部分：
VASLRQQVEALQGQ-VASLRQQVEALQGQVQGLQAAFSQYKK
の別のコピーを付加することによりさらに増強される。
【００２３】
ヒトに投与するためには、好ましくはネック領域及び／又はアミノ酸の異種配列は、ポリペプチドを個体に投与した際に生じる免疫応答が存在する可能性を低減するために、ヒト起源であるか、又は「ヒト化」される。「アミノ酸の異種配列」という用語は、本発明のポリペプチド中の融合の位置でコレクチンネック領域と連結される、天然には見出されないアミノ酸の鎖を示す。
【００２４】
ネック領域（等）と連結されるアミノ酸は、タンパク質ドメインを形成し得る。好ましくは、アミノ酸の配列は機能的ドメインを形成する。アミノ酸はイムノグロブリンに由来する配列、例えば可変ドメイン、又は可変ドメインと不変領域を包含し得る。
【００２５】
原則として、ペプチド又はポリペプチドを含めたあらゆるアミノ酸配列、別々に折り畳まれるタンパク質ドメイン（単数又は複数）は、ネック領域ペプチドと連結し得る。これはポリペプチドのＣ末端又はＮ末端あるいは両端に認められ、同一の、同様の又は異なるタンパク質配列を包含する。「連結」は、融合ポリペプチドを生成するための組換え体ＤＮＡ技術の使用、又はネック領域（あるいはその変異体又はその誘導体）を含めたポリペプチドの化学的合成の使用、又はネック領域ペプチドへのポリペプチドの化学的付着を包含する。
【００２６】
ネック領域を含有する３つの同一又は異なるポリペプチドはすべて、適切な条件下でホモ三量体又はヘテロ三量体を形成し得る。ホモ三量体は同一の３つのポリペプチドから成る。ヘテロ三量体は３つのうち少なくとも２つが異なるポリペプチドから成る。３つのポリペプチドすべてが異なることもある。ヘテロ三量体中の１つの、２つの又は３つすべてのポリペプチドが本発明のポリペプチドであり得るが、但し各ポリペプチドは三量体化可能な領域を有する。
【００２７】
ネック領域αらせん束は一般に、よく似た又は適切な生理学的条件で三量体分子としてのみ存在する。三量体の安定性は、溶液のイオン強度により増強される。三量体会合は変性（例えば熱変性）により可逆的に中断され、その分子は、条件が生理学的条件（冷却）に戻るとすぐに、三量体に再会合し得る。ネック領域ペプチドの三量体化する能力は、隣接タンパク質配列とは無関係である。各々がネック領域を含有する異なるポリペプチドを用いる場合には、可逆的変性−再会合工程を用いてヘテロ三量体分子を生成し得る。好ましくは、変性のための条件は、隣接する異種タンパク質ドメインのあらゆる特性を損失しないよう選択される。ヘテロ三量体生成の一方法は実施例３に詳述されており、加熱（この場合、約50℃に加熱）及び冷却を伴う。
【００２８】
約50℃を用いたヘテロ三量体化は、あるイオン強度での一例に過ぎない：ヘテロ三量体化の他の手段が選ばれることもある。用いる方法は、適用によって変わり得る。異なるネック領域ペプチド構築物は、化学的に合成し、修飾し、又は発現系で生成し得る。反応基がネック領域ペプチドのＮ末端又はＣ末端（又はほとんど有りそうもないがしかし可能性としては中央）部の特異的位置に置かれるため、化学的付着部位は、融合タンパク質と同じくらい特異的である。これらの部位に付着される分子は、ペプチド又は有機化合物である。
【００２９】
本発明は一般的に適用可能であるが、ネック領域を有するタンパク質ドメインのすべてを同じように十分に用い得るわけではない。非常に大きなドメインは、特別に適合させたリンカー配列を要し、最も重要なのは、二量体形成又はオリゴマー形成特性を示すドメインは、全く不溶性であるか、そうでなければそれらが意図される使用に適していない大きな集塊を生成することである。さらに、ペプチドを含有するネック領域は、好ましくは逆相クロマトグラフィーに使用されるアセトニトリルのような有機溶媒を使用せずに精製されるべきである。例えば化学合成後に用いられる場合、これらの化合物は、三量体化を妨害するため、完全に除去されるべきである。同様に、（ヘテロ）三量体化中にドデシル硫酸ナトリウム又は同様の強力なイオン洗剤が存在しないようにすべきである（しかしながら、これらの化合物は、一緒にネック領域のらせんを保持する疎水性力を乱すので、それらは、制御された情況では、低温でのヘテロ三量体化における有用な試薬であり得る）。
【００３０】
アミノ酸配列変異体は、野性型と比較して、例えば１つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、置換、挿入又は欠失により、１つ又はそれ以上の変化を包含する。このような変化はすべて、三量体を形成するポリペプチドの能力をなくすべきではないが、変化の性質によってこの能力を増大又は低減することがある。誘導体は天然ネック領域に比して、いくつかの化学的修飾を有する。この例としては、炭化水素構造、核酸、又は他の化学化合物、特に抗原として用いられるもの、あるいは他の化学的又は生物学的相互作用、例えば配位子−受容体相互作用に用いられるものの化学的又は酵素的付着が挙げられる。
【００３１】
発現系においてポリペプチドの産生に用いられる適切なコード化核酸を提供し、操作することにより、野性型と比較して、アミノ酸配列に対する変化がもたらされる。本発明はさらに、本明細書に開示したように、三量体を形成し得るポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を包含し、コレクチンのネック領域、そのアミノ酸配列変異体又はその誘導体、あるいはコレクチンＳＰ−Ｄのネック領域と同じであるか又は同様のアミノ酸パターン及び／又は疎水性プロフィールを有し、異種配列のアミノ酸と融合するアミノ酸の配列を包含する核酸を提供する。
【００３２】
核酸は、ポリペプチドの発現のためのコード化配列と操作可能的に連結した適切な調節配列を包含し得る。コード化配列からの発現は、調節配列の制御下にあると言われている。
【００３３】
さらに本発明は、上記のような核酸を包含するベクター、特にコード化ポリペプチドが適切な条件下で発現されるあらゆる発現ベクター、及びこのようなあらゆるベクター又は核酸を含有する宿主細胞を提供する。
【００３４】
本発明のポリペプチドを生成する便利な方法は、それをコードする核酸を発現することである。したがって、本発明はさらに、in vitro又はin vivo でポリペプチドをコードする核酸からの発現を含む本発明のポリペプチドの製造方法を包含する。核酸は、発現ベクターの一部である。発現は、ポリペプチドを発現させる又は発現を可能にする条件下で、適切な核酸を含有する宿主細胞を増殖させることにより成し遂げるのが便利である。
【００３５】
種々の異なる宿主細胞中のポリペプチドのクローニング及び発現のための系は、十分公知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳類細胞、酵母菌及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現に関する当業界で利用可能な哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター乳仔腎臓細胞及びその他多数が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００３６】
プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニール化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及びその他の配列を含めた適切な調節配列を、適宜、含有する適切なベクターを選択し、又は構築する。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス性の例えば「ファージ」、又はファージミドである。さらに詳細には、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照されたい。例えば、核酸構築物の製造における核酸の操作、突然変異誘発、シーケンシング、細胞中へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析のための多数の公知の技術及びプロトコールが、Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992 に詳述されている。Sambrook等及びAusubel 等の開示は、参照により本明細書中に含まれる。
【００３７】
したがって、本発明のさらなる局面は、本明細書中に開示されているように、核酸を含有する宿主を提供する。さらに別の局面は、このような核酸を宿主細胞中に導入することを包含する方法を提供する。導入は、利用できるあらゆる技術を用い得る。真核細胞に関しては、適切な技術としては、レトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニア、又は昆虫細胞に関しては、バキュロウイルスを用いたリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、リポソーム媒介トランスフェクション及び形質導入が挙げられる。
【００３８】
導入後は、例えば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸から発現させるか又は発現を可能にする。
一実施態様では、本発明の核酸を宿主細胞のゲノム（例えば染色体）中に組み込む。組込みは、標準技法にしたがって、ゲノムを用いて組換えを促す配列の含入により促進される。
発現後、ポリペプチドは三量体化されるか又は三量体化が可能になる。これは、単離の前後である。
【００３９】
ＳＰ−Ｄのネック領域に認められるαらせんのピッタリ会合された三量体は、われわれの知る限り、セルフアッセンブリー構造モチーフ、即ちコラーゲン三重らせん構造に対するＣ末端の最初の例であり、これはジスルフィド架橋の形成を伴わない。さらに、われわれの知見は、反復するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットのコラーゲン配列は鎖間認識のための付加的タンパク質配列、及び無傷三重らせんへの折り畳みを開始するためにそのＣ末端での会合を要するが、ねじれ形のコラーゲンらせんを形成するために正しい登録簿で３つの鎖を並べるために、この会合それ自体はねじれ形方式であらねばならないというわけではない。本発明は、三量体の他に二量体及び四量体を形成するペプチドを多量体化する従来技術を上回る利点を有するとも考えられる。
【００４０】
このセルフアッセンブリドメインのサイズの小ささ、並びにジスルフィド架橋の要件の欠如は、そのコラーゲン配列の起源と無関係な、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットで構成されるあらゆるコラーゲンポリペプチド配列の会合及び登録された整列における「ネック領域」ペプチドの使用を特に可能にする。Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットのコラーゲン三重らせん配座の形成を開始するためのあらゆるコラーゲンポリペプチド配列のＣ末端でネック領域ペプチドを用いることは実行可能である〔３〕。しかしながら、コラーゲン構造の安定性は、トリプレットの数及び三重らせん領域のＮ末端でのペプチド構造の性質に依っている。さらに、三重らせんの安定性を大いに増強するためのＹａａ位置におけるプロリン残基のヒドロキシル化が示されている〔２４〕。三重らせん形成を開始するためのネックペプチドの使用により、コラーゲン構造の安定性に影響を及ぼすこれらの因子の相対的重要性が分析できるようになる。
【００４１】
したがって、本発明は、コラーゲン三重らせんの「播種」の方法におけるコレクチンのネック領域あるいはそのアミノ酸配列変異体又はその誘導体を本質的に包含するか又はそれから成るポリペプチドの使用を提供する。好ましくは、ポリペプチドは、Ｃ末端で（おそらくはリンカーを介して）コレクチンの「ネック領域」あるいはそのアミノ酸配列変異体又はその誘導体に融合される一連のコラーゲントリプレット（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ）、もしくはコレクチンＳＰ−Ｄのネック領域と同一の又は同様のアミノ酸パターン及び／又は疎水性プロフィールを有し、ネック領域に対するアミノ酸Ｃ末端を有さず又はネック領域に対する異種アミノ酸Ｃ末端を有するアミノ酸の配列から成る。「ネック領域」（即ち、本明細書に開示されているような「アミノ酸の一次配列」）は、ポリペプチドのＣ末端に存在するか、又は付加的Ｃ末端アミノ酸が存在するが、但し、ポリペプチドは全体として非天然性である。
コラーゲン三重らせんの播種方法は、このようなポリペプチドを三量体化させるか又は三量体化を可能にすることを包含する。それは先ず、そのコード化ヌクレオチドからの発現によるポリペプチドの産生を包含する。本発明は、このような核酸、ポリペプチドが発現される発現ベクターを含めたこのような核酸を包含するベクター、及びこのようなベクター又は核酸でトランスフェクトされる宿主細胞を提供する。ポリペプチドの産生は、ポリペプチドが発現される条件下でポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞を増殖させることを含む。クローニング及び発現等のための系は、上記で考察されている。
【００４２】
三量体化後に、例えばその後の使用及び／又は操作のための三量体の単離を行う。
本明細書中で実験により立証されたように、ネック領域ペプチドを用いてネック領域のどちらかの末端で明瞭な特性を保有する１つ又はそれ以上のアミノ酸を有するポリペプチドを生成し得るし、ヘテロ三量体化を用いて、これらの特性を、ネック領域を含有する別々に生成されたポリペプチド中の他のドメインにより保有されるものと併合し得る。
【００４３】
例えば、一本鎖抗体は、発現系中でネック領域を有する融合ポリペプチドとしてそれを生成することにより三量体化し得る。抗体又はその断片の融合は、ｓｃＦｖを含めて、細胞表面分子、例えばＣＤ８、ＣＤ４又はＴＣＲδに対して指示される。三量体分子は、ネック領域を含有しない単量体形態より高いそのそれぞれの配位子に対する結合活性を有するべきである。加熱（例えば約50℃に）及び冷却（例えば周囲温度）の穏やかなヘテロ三量体化技術を用いて、個々の三量体を解離し、再会合して、ヘテロ三量体複合体を産生し得る。これらの複合体は、個々の個体配位子に対して弱い親和性を有するが、しかし２つ又はそれ以上のそれぞれの配位子を示す実体に対する強い結合活性を有する。例えば、三量体化抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗γδ  ＴＣＲ  ｓｃＦｖ分子は、ＣＤ４、ＣＤ８及びγδ  ＴＣＲ陽性である実体に対して強結合活性を有する。したがって、一次、二次及び三次結合特異性のあらゆる組合せを有する分子を用いて、ヘテロ三量体を生成し得る。
【００４４】
特異的認識がポリペプチド中のネック領域の一端、例えばＣ末端に関与するだけである場合、ネック領域の他端、例えばＮ末端は、付加的機能のために、例えば薬剤の標的化又は診断的検出に用い得る。
【００４５】
ホモ又はヘテロ三量体化のさらなる適用としては、以下のいずれの使用をも含み得る：
（ｉ）受容体のための、ペプチド−配位子、特に低親和性結合（例えば、ニューロペプチド、インターロイキン）。
（ｉｉ）抗原。
（ｉｉｉ）活性化時に反応性である化学的化合物、例えば近接した場合に特異的に又は一般的にタンパク質のようなあらゆる分子と反応する光活性化可能な化学的架橋剤。ネック領域ペプチドは、未知の受容体に対する特異性を有する配位子を保有する三量体の一部である。受容体との特異的結合後、架橋剤はＵＶ活性化され、配位子−受容体複合体に隣接する分子だけが架橋され、したがって同定される。
（ｉｖ）有機化合物、例えばカフェイン、モルヒネ（例えば研究、診断又は治療的使用のための）。
（ｖ）特に薬剤研究における有力な阻害剤のスクリーニングのための低親和性結合ドメイン。
（ｖｉ）pH、ＣａＣｌ2 濃度又は診断及び研究に関連したその他のもの。
（ｖｉｉ）炭化水素結合ドメイン。
（ｖｉｉｉ）例えばレクチンに関する結合及び／又は研究のための炭化水素。
（ｉｘ）脂質含有構造（これらは、例えば活性分子を含有するリポソーム中への取込みのためにＮ末端にあり、三量体化ポリペプチドはネック領域の末端、例えばＣ末端に特異性指示ドメインを有する）。
【００４６】
（ｘ）ＤＮＡ又はＲＮＡあるいは誘導体（これは、一つ以上のタンパク質が例えば染色体中の特異的部位で作用するよう指示される場合、又はのエフェクター酵素へのＤＮＡの簡単な化学的付着ガその機能に影響を及ぼす場合に有用である。ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用（ネック領域の末端のＤＮＡ及び染色体中のＤＮＡ）がネック領域ペプチドより高い解離温度を有する場合（これは大いに考えられる）には、異なる機能性ポリペプチドを初期ＤＮＡ認識後に付加し得る。これはin situ ハイブリダイゼーションと同様の方法で用い得る。この場合、蛍光タッグヲオリゴヌクレオチドに付加して染色体上の遺伝子の位置を顕微鏡で見えるようにする。したがって、ネック領域ＤＮＡプローブを、通常約65〜75℃で規定遺伝子の位置で例えばヒト染色体とハイブリダイズする。次いで、溶液を約50℃に冷却し、未ハイブリダイズプローブを洗い落とす。その後、約50℃のままで、適切な条件がもたらされた場合にはどこでも切断するＤＮＡ切断ポリペプチドを含有する別のネック領域ポリペプチドを付加する。例えばＡＴＰ及びＳ−アデノシルメチオニンの付加。可溶性付加ネック領域酵素融合タンパク質及び「固定化」ＤＮＡネック領域分子を次に溶液を冷却してヘテロ三量体化させ、十分洗浄後、補因子を付加する。ここで酵素は活性であるが、しかしハイブリダイゼーションの部位で切断するだけである。これは、特に問題の酵素がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを実施するのに必要な温度を保てないが、しかし穏やかにヘテロ三量体化される場合にはその活性を保持し得る場合に、非常に有用である。あるいは、二次ネック領域融合タンパク質も、特異的ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡの単離のための精製タッグを含有し得る。機能性タンパク質ドメインのその認識部位への供給遅延による特異的ＤＮＡ認識系は、他の環境、例えばin situ ハイブリダイゼーション、ゲノムライブラリー構築（ヒトゲノムプロジェクト）、in vitro検定又は非放射性診断で用い得る）。
【００４７】
（ｘｉ）ネック領域は固体マトリックスに付着される（来れは例えば、ネック領域を含有する組換え体タンパク質を可逆的に固定化するための調査道具として有用である）。固定化（好ましくはＮ末端を介して）ネック領域を含有する樹脂を、約25℃で亜生理学的イオン強度で、例えば一本鎖抗体を含有する組換え体ネック領域融合ポリペプチドと混合し、ヘテロ三量体化し得る。樹脂上のネック領域分子当たり２個の一本鎖抗体分子を結合させて、溶媒に対して配向させる。その時、樹脂は正常親和性マトリックスと同様に用い得るが、しかし、例えば約50℃で一本鎖抗体ネックペプチドを放出し、新規のネック領域ペプチド含有分子で再負荷することにより、異なる分子にも用い得る。）
【００４８】
（ｘｉｉ）酵素（特に、ある反応の生成物が次の酵素のための基質であるように、その後含まれる同一反応経路の酵素）。酵素の近くに位置すると、拡散路が短いために利点が生じて、副作用の可能性が低減される。さらに、３つのポリペプチドのうち１つのネック領域を介した酵素の固定化も、例えば酵素又はカラム上の反応物を容易に除去できる利点を生じる。この利点は、約50℃で余分量のネック領域−樹脂と混合し、冷却し、樹脂を除去することにより、溶液の残りから取り出すことができるヘテロ三量体又はホモ三量体酵素複合体によっても得られる。適用例としては、分子生物学に用いられる酵素がある。というのも、基質及びその作用の生成物が主として非常に（熱）安定性のＤＮＡ分子であるためである。
（ｘｉｉｉ）共有結合三量体を生成するために、システイン残基を配列のどちらかの末端又は両端に付加し得る。システインを含有する正しい配列は、ＦＡＣＩＴコラーゲンから得られる。このうちのいくつかは、コラーゲン構造の直後でジスルフィドを介して三量体に結合され、したがってそれらの配列の１つをネック領域のＮ末端に転移させ得る。これは、全体的形状に影響を与えずにペプチド三量体の安定性をさらに増大するための使用である。
【００４９】
以下の図面を参照しながら、実施例により本発明をさらに説明する。
本文に記載した文献はすべて、参照により本明細書中に含まれる。
【実施例】
【００５０】
実施例１
コレクチンネック領域の三量体化
図１（ａ）は、ヒトＳＰ−Ｄの構造を示す。１６８bpＤＮＡ断片は、７つのＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット及びＣ型レクチンドメインへと続くネック領域の３５の非コラーゲン様残基をコードした。それはｐＧＥＸ−２Ｔ細菌発現ベクター中でクローニングされ〔９〕、挿入物の正しい配向は制限消化により確認された。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ネック領域ペプチド融合タンパク質の高レベルの発現は、ＩＰＴＧによる誘導の６時間後に得られた。親和性精製融合タンパク質のトロンビン消化は、Ｎ末端に付加的Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏトリプレットを、Ｃ末端にＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐを有し、ｐＧｅｘ−２Ｔ中に存在するポリリンカーを示す２つのポリペプチド、即ちグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及びネック領域ペプチドを生じた。培養１リットル当たり組換え体ペプチド14mgを３工程精製手順で精製した。ペプチドは、800 mM  ＮａＣｌでHighLoad-Sカラムから単一ピーク中に溶離した。ペプチドの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、残基１〜４６のＮ末端配列、及びレーザー脱着質量分光（データは示さず）により確証した。
【００５１】
ペプチドの二次構造を測定するために、遠紫外線ＣＤ測定をコラゲナーゼ処理ネックペプチドに関して実施した（図２（ａ））。スペクトルは193 nmで強い正の値を示し、208 及び223 nmで２つの負の値を示し、これはαらせん構造の予測プロフィールと一致した〔１０〕。構造は温度の上昇に伴って消失し、55℃で熱変性遷移が観察された。
【００５２】
ＳＰ−Ｄタンパク質内のネック領域の位置はαらせんの平行配向を示唆し、ペプチドのアミノ酸配列は疎水性残基を反復７つ組パターンで含有するので、３つのαらせんは二重コイルで会合し、疎水性残基はらせん間に界面を形成する（図１（ｂ））〔１１〕。
【００５３】
非解離条件下でサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、６５残基長ペプチドは、21〜24kDa の見かけの分子量を有する単一ピークとして動いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、6 kDa の一本鎖サイズを示したが、しかしながら架橋試薬との反応に際しては、反応完了時に21kDa の単一タンパク質種が検出されたが、一方6 、13及び21kDa に対応するタンパク質バンドは特に架橋反応で観察された（図３及び４）。高度オリゴマーは観察されなかった。したがって、発現される領域は、三量体を生成するのに十分である。
【００５４】
ペプチドの３番目のＮ末端の７つのＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットが三量体の生成にいかに関与しているかを調べるために、コラゲナーゼ消化を実施し、その結果生じたペプチドの分子量は4kDaに低減していた。Ｎ末端シーケンシングにより、コラーゲントリプレットはすべて除去されていたことが示された。しかし、これは残りのペプチドが溶液中で安定三量体を形成する能力を低減しなかった（図４）。
【００５５】
両ペプチドは、熱変性（リン酸緩衝化食塩水中で98℃で20分間）後でさえ三量体複合体中に再集合することが判明した。消化されたコラゲナーゼの種々の部分と無傷ネットペプチドを混合した後、熱変性し、冷却すると、複合体に対するヘテロ三量体化を予測化学量で生じた（図５及び６）。したがって、Ｃ末端３５残基は、三量体複合体中での安定非共有可逆的会合を媒介するのに十分であった。
【００５６】
ネック領域ペプチド不均一核単一量子コヒーレンスの完全構造測定を得るために、15Ｎ標識化ペプチドに関する（1 Ｈ，15Ｎ）ＮＭＲスペクトルを収集し、各残基に対して一磁気環境のみを示した。ペプチドは三量体として存在するので、そして３つのαらせんのいずれかの内の各残基は他の鎖における対応する残基として同一磁気環境を示すので、αらせん束の構造は３倍対称性を示さねばならない。したがって、ネックペプチドはインフルエンザヘマグルチニンの三量体柄と同じオリゴマー構造をとる〔１３〕が、しかしウイルス柄領域ペプチドと異なって、ＳＰ−Ｄペプチドは広範囲に及ぶpH値（3.0 〜9.5 ）で三量体構造を形成した。観察された３倍対称性は、３つのらせんの非ねじれ形及び平行会合を立証し、スペクトリン分子に関して最近立証された抗平行らせんのねじれ形整列〔１４〕に対比される。したがって、意外にも、平行及び非ねじれ形左回り超らせん中の３つの右回りαらせんは、左回りらせんの右回りコラーゲン超らせんの形成のための核形成部位として役立つ。関与する３つのポリペプチド鎖は同一であり、コラーゲンらせん及びαらせん束は直接連接して位置するので、ＳＰ−Ｄ分子のこの領域はペプチド構造の急な屈曲を含有する必要がある。
【００５７】
実施例２
ネック領域ペプチドのＮ末端との融合によるヒトＳＰ−ＤのＮ末端ドメインの三量体化
緩衝液Ｎｒｕ１中の４単位のＮｒｕ１（New England Biolabs ）で、次いで緩衝液Ｊ中の５単位のＳｍａ１（Promega ）で、25℃で４時間、制限酵素消化によりプラスミドを含有する元のｃＤＮＡ  10μg からヒトＳＰ−Ｄのコラーゲン領域をコードするＤＮＡ配列を取り出し、４５６bp断片を切り出して、この融合ペプチドのための発現プラスミドを生成した。マジックｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ精製樹脂（Promega ）を用いて残りのプラスミドを精製し、再結紮して、大腸菌のＢＬ２１菌株のコンピテント細胞中で形質転換させた。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ＳＰ−ＤのＮ末端ドメインのＮ末端にＢａｍＨ１制限酵素部位を生成した。その結果生じたＰＣＲ生成物をＢａｍＨ１及びＢａｌ１で切断して、８４アミノ酸（Ｎ末端ドメインの２８及びネック領域の５６。２つのドメイン間の７トリプレットコラーゲンリンカーを含む）をコードする開放読取り枠を生じた。ポリペプチドを、図７に示したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｎ末端−ネック領域融合タンパク質として生成した。
【００５８】
組換え体プラスミド  ｐＧｅｘ−２Ｔ−Ｎ末端−ネックを有するＢＬ２１の個々のコロニーを同定して、ＩＰＴＧによるタンパク質発現の誘導後に予測サイズ（34kDa ）の組換え体融合タンパク質を発現させた（実施例１参照）。Highload S  陰イオン交換クロマトグラフィー上でのＮ末端- ネック領域タンパク質の同様の振る舞いにより、ネック領域ペプチドに関して概略を上記したように、大規模タンパク質生成を実施した。
【００５９】
要するに、ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。６１の細菌培養の細胞を０℃で５k rpm での遠心分離により収穫し、100mM Tris-Cl, pH 8.0、200 mM  ＮａＣｌ、20mM  ＥＤＴＡから成る緩衝液中に再懸濁し、氷上で２分間の音波処理により細胞を溶解した。細胞屑を０℃で30分間19k rpm で回転させて沈め、上清をグルタチオン−アガロースアフィニティーカラムに入れて、溶解緩衝液で平衡させた。0.2 % （w/v ）Emulphogen（ポリオキシエチレン−１０−トリデシルエーテル）を含有する溶解緩衝液を用いて、280 nmでの吸光度が再び開始値に達するまで、樹脂を洗浄した。溶解緩衝液中の20mMグルタチオン（還元形態）を用いて結合タンパク質を溶離し、融合ペプチド１ mg 当たり10単位のトロンビンを付加して、37℃で10時間この緩衝液中でトロンビン消化を実施した。次に、１M クエン酸ナトリウム緩衝液を、次いで１M ＨＣｌを加えてpHを3.0 に調整して、pH 3.0の100 mM  クエン酸緩衝液を生じた。この段階で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含有する白色沈殿を遠心分離（０℃で30分間19k rpm ）により除去し、Waters FPLC systemを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィーのために上清をPharmacia Highload S  カラムに適用した。Ｎ末端ネック領域ペプチドは単一対称性ピークで450 mM  ＮａＣｌで溶離し、ＳＤＳ- ＰＡＧＥ分析及びクーマシーブルー  Ｒ−２５０染色で判定して夾雑タンパク質を含有しないことが示された。精製ペプチドをＰＢＳに対して透析して、３kDa cut-off centricon cartridge を用いて濃縮した。ＰＢＳに溶解した最終濃度１mg/ml のペプチドの溶液25mlを回収した。これは、細菌培養１ml当たり４mgの組換え体タンパク質分解処理ペプチドの収率を示す。ペプチドの純度並びにそのサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて測定し、分子量約８kDa という値を得た。
【００６０】
ネック領域ペプチド単独に関して上記したように架橋実験を実施した。その結果を図８に示す。共有結合架橋剤の非存在下で、ペプチドは約９kDa の単一ポリペプチド種として振る舞うが、しかしながら、架橋条件下では、部分的架橋化複合体中の二量体及び三量体ポリペプチドに対応して、そして溶液中に存在する完全架橋化三量体複合体に対して、18kDa 及び約29kDa の付加的バンドが見える。したがって、ネック領域は、ネック領域配列のＮ末端に融合去れた異種タンパク質ドメインを三量体化した。
【００６１】
実施例３
ネック領域のＣ末端に位置するヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメインの三量体化
これらの試験の他に、非融合ポリペプチドを生成するタンパク質発現系を用いて、ネック領域ペプチドの三量体化特徴のさらに正確な図を示した。
【００６２】
ｐＥＴシリーズの発現ベクター（Studier and Moffat, 1986）を用いて、タンパク質発現の誘導物質としてＩＰＴＧを用いて大腸菌における非融合タンパク質の高レベル細胞内産生を生じた。ＳＰ−Ｄ−ネック−レクチン及びＳＰ−Ｄ−レクチンタンパク質の産生のためのプラスミドｐＥＴ  ３ａを用いるために、ＳＰ−Ｄ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ挿入物を、制限酵素ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１を用いてｐＧｅｘ−２Ｔベクターから切り出して、その結果生じた断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのクロラムフェニコール耐性保有型  ｐＢＣＳＫに結紮し、ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１で線状化し、ホスファターゼ処理した。その結果生じたプラスミド（マジックミニプレップ法及び制限酵素消化を用いてそれぞれの挿入物を含有することを確認された）を制限酵素の組合せＸｂａ１及びＥｃｏＲＶで消化した。これにより、Ｎｈｅ１及びＥｃｏＲＶで消化されたｐＥＴ−３ａプラスミドに対する適合性末端を有する断片が生じた。したがって、ネック領域及びレクチンドメイン又はＳＰ−Ｄのレクチンドメインのみをコードする両ＤＮＡ断片を融合タンパク質から転移させて、２工程手順でｐＥＴ系に対する発現系を生成した。各構築物のＮ末端に導入された別の残基は、組換え体タンパク質のオリゴマー化又は炭化水素構造との結合に影響を及ぼさないと思われるため、最小の影響を有すると考えられる（図９）。ＩＰＴＧを用いて両ポリペプチドを誘導し、慣用的ＦＰＬＣクロマトグラフィーによる細胞の溶解後に精製した。組換え体ポリペプチドはどちらも最初の精製工程中にpH9.0 でＦａｓｔＦｌｏｗ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Pharmacia ）と結合することが判明しているため、ＭｏｎｏＱ（レクチンドメイン）及びＭｏｎｏＳ（ネック−レクチンドメイン）カラム（Pharmacia ）上でさらに次の精製を成し遂げた。
【００６３】
精製タンパク質を４℃でＰＢＳに対して透析し、標本（50μl ）を12.5% ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。ビス−（スルホスクシニミジル）−スベレートアミノ反応性架橋剤を２つの異なる濃度で加え、これらの標本に対応するレーンで検出されたタンパク質バンドから、そのオリゴマー状態の点で異なる２つのタンパク質が明示された（図１０）。Ｃ型レクチンドメインは溶液中で単量体のように振る舞うことが判明したが、ネック−レクチンドメインは溶液中の三量体分子の予測架橋パターンを示した。したがって、ネック領域は、ネック領域なしで単量体分子を生成することが示されているヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメインの三量体化を媒介する。三量体化レクチンドメインはさらに親和性マトリックスマルトース−アガロースとより強力に結合することが判明したが、一方単量体レクチンドメイン（ネック領域を含まず）は弱い親和性を示した（データは示さず）。
【００６４】
ネック−レクチン分子中の３つのレクチンドメインがヒトＳＰ−Ｄの単一「棒」中に存在するレクチンドメインとして炭化水素に対するその結合部位の同一間隔を有すると予測されるため、発現された２つのタンパク質はヒトＳＰ−Ｄに関する本来の炭化水素配位子の試験のための有益な道具を提供し得る。これらの結果は、ネック領域ペプチドと融合した異種タンパク質ドメインが三量体複合体を形成することを示す。
【００６５】
組換え体ネック−レクチンポリペプチド  20μg を25℃でネック領域ペプチド  40μg と混合した。ＰＢＳで平衡させたＦＰＬＣ  Superose 12 （Pharmacia ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて、混合物を分析した。残りの溶液を50℃に30分間加熱し、次いで20分間室温に放置して冷却した。次に溶液 100μl を同一のSuperose 12 カラム上で分析した。
【００６６】
両操作の溶離プロフィールを図１１に示す。ネック領域ペプチド及びネック−レクチンポリペプチドのそれぞれのホモ三量体のサイズに対応した２つの明白なピークが最初の操作で検出された（図１１Ａ  ａ）が、一方熱処理ペプチド混合物のプロフィールは変わらなかった（図１１Ａ  ｂ）。ネック−レクチンホモ三量体に対応する一次ピークは、小サイズに対応して後期溶離時間に移動した。ネック領域ペプチドホモ三量体により生じた二次ピークはその元の位置に留まったが、高さが低減した。このことは、ネック領域ペプチドホモ三量体の量の低減を示す。移動した一次ピークは、ヘテロ三量体複合体として一緒に保持される２つのネック領域ペプチド及び１つのネック−レクチンポリペプチドから成ることが架橋実験（データは示さず）で判明した。
【００６７】
したがって、ヘテロ三量体化は、両ポリペプチドの配列内に含まれるネック領域−αらせんを介して生じていた。ヘテロ三量体化実験の開始時にネック領域ペプチドホモ三量体が過分の大きな分子は反応を行わせて２つの三量体複合体のみ、即ちネック領域ペプチドホモ三量体及び１つのネック−レクチンポリペプチドと２つのネック領域ペプチドによる単一種のヘテロ三量体を産生した。実験開始時のネック−レクチンホモ三量体の濃度増大は、反応を他端まで進め、その結果、再形成中のネック−レクチンホモ三量体、並びに２つの分子ネック−レクチンポリペプチド及び１つのネック領域ペプチドから成る単一種のヘテロ三量体複合体を生じる（データは示さず）。
【００６８】
実施例４
コラーゲン三重らせん生成の核形成
２つのＤＮＡ構築物を作って、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を生成した（実施例１参照）。５７のトリプレットを有するネック領域ペプチド（図１２）及びヒトＳＰ−ＤのＮ末端非コラーゲン残基、並びにヒトＳＰ−Ｄ由来のネック領域ペプチドを含有しない４８のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットは、ネック領域ペプチドを伴わずにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと直接融合した。実施例１に略記したプロトコールを用いて、両融合タンパク質を生成し、精製した。
【００６９】
トロンビンでの切断前に、融合タンパク質を２M グリシン緩衝液，pH7.5 中で10倍に希釈し、次いで100 mMTris-HCl（pH 7.4）200 mM  ＮａＣｌに対して広範に透析した。溶液中のポリペプチドの熱安定性は、２ M  グリシンの付加により大いに増強される〔２４〕。
【００７０】
トロンビンによる消化及びその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、切断生成物のサイズに顕著な差が認められた。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及び４８Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットから成る融合タンパク質は、長さの異なる多数のペプチドを生じただけで、これはコラーゲン配列内にアルギニン残基を包含するペプチド結合のトロンビンによる高頻度に発生した切断を反映している（データは示さず）。これに対比して、５７Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットに対するネック領域ペプチドＣ末端及びヒトＳＰ−ＤからのＮ末端非コラーゲンペプチドを含有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、２つの生成物、即ちグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ並びにネック領域ペプチド及び付着したヒトＳＰ−ＤのＮ末端ペプチドを有する全コラーゲン領域への一回切断のみを示した（図１４）。一次構築物の４８Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットは二次構築物の５７Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット中に含まれたので、いかなるアルギニン残基でもトロンビン切断が認められないのは、コラーゲン三重らせん構造の存在と一致する。
【００７１】
コラーゲン三重らせんの形成（図１３）は、円二色性〔２５〕、多元的ＮＭＲ〔２６〕及び電子顕微鏡〔２７〕により検出し得る。
観察された三重らせんの安定性の増大におけるヒトＳＰ−ＤのＮ末端非コラーゲン領域の関与を実験した。コラーゲン配列のＮ末端の天然二重コイルがマクロファージフカベンジャー受容体中に観察されるので、タンパク質工学的処理技術を用いて、短ペプチド配列をネック領域ペプチドのコラーゲン領域Ｎ末端のＮ末端に付着させる。これは、合成されたオリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ連鎖反応、及び既にネック領域をコードするＤＮＡを保有するその後のｐＧＥＸ−２Ｔベクター中の融合タンパク質併合部位への結紮の使用を包含する（実施例１参照）。
【００７２】
その結果生じた一連の精製組換え体ペプチドを、アミノ反応性化学的架橋剤をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーと組合せて用いて、三重らせんペプチドの正しい整列に関して試験した。次に２〜３個の適切なペプチドを15Ｎ同位元素標識化して、多元性ＮＭＲを用いて熱安定性を分析した。この段階で、融解温度に及ぼすトリプレット数の影響を、同様の方法で、コラーゲンコードＤＮＡの長い一続きをその後挿入することにより調べた。
【００７３】
実施例５
ネック領域ペプチドを用いて三量体化する場合のＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメインの結合の増大
ヒトＳＰ−Ｄタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを制限酵素Ｓｍａ１及びＥｃｏＲ１、並びにＭｓｃ１及びＥｃｏＲ１で消化して、それぞれ５３２bp及び３６４bpのＤＮＡ断片を生じた。両断片をｐＧｅｘ−２Ｔ発現ベクター中でサブクローニングし、制限酵素Ｓｍａ１及びＥｃｏＲ１で線状化した。この指向性クローニング操作により、２つの発現プラスミド、即ちｐＧｅｘ−２Ｔ−ネック−レクチン及びｐＧｅｘ−２Ｔ−レクチンが生成した。これらを大腸菌ＢＬ２１株中で形質転換させた。ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導し、クローンを同定して予測サイズの、即ちｐＧｅｘ−２Ｔ−ネック−レクチンに関しては43 kDa及びｐＧｅｘ−２Ｔ−レクチンに関しては37 kDaの組換え体タンパク質を産生させ（図１５）、これらを用いて上記のように融合タンパク質を含有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの大規模生産を開始した。
【００７４】
音波処理による細胞溶解後、遠心分離により細胞屑を除去して、上清の一部（元の細菌培養100 mlに対応して）を未キレート化カルシウムに関して５mMとし、溶液を100 mMTris-Cl 、150 mMＮａＣｌ、5 mMＣａＣｌ2 、１mMＮａＮ，pH7.5 中で10倍に希釈した。その結果生じた溶液を４℃で一夜、10ｌの同一緩衝液に対して透析し、遠心分離により幾つかの付加的生成沈殿物を除去後、タンパク質溶液を10ml／時で同一緩衝液で平衡させたマルトース−アガロースカラムに通した。カラムを緩衝液  50mlで洗浄し、100 mM  Tris-Cl 、150 mM  ＮａＣｌ, pH 7.5に溶解した 20 mMＥＤＴＡを用いて、結合タンパク質を溶離した。
【００７５】
標本（50μl ）を12.5 %  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析したが、約43 kDaのｐＧｅｘ−２Ｔ−ネック−レクチンコード化タンパク質だけがこの方法で精製できた。明らかに、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したＣ型レクチンドメインのみを含有する融合タンパク質は、用いた条件下で固定化マルトースと結合できなかった（図１６）。この観察は、３つの同一ポリペプチド鎖を、平行配向で集合させ、したがって隣接Ｃ型レクチンドメインの結合特性を増強する場合におけるネック領域ペプチドの疑わしい役割と一致する。
【００７６】
実施例６
一本鎖抗体の三量体化
ハイブリドーマ細胞株ＯＸ３５〔１５〕から調製される全ＲＮＡをｃＤＮＡ−ＰＣＲ〔１６〕のための鋳型として用いて、ハイブリドーマ細胞が分泌する抗ＣＤ４モノクローナル抗体のＬ及びＨ鎖の可変部をコードするＤＮＡを生成した。400 bp長の両断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター（Stratagene）中でクローニングし、次いで半硬質リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）3 をコードする合成ＤＮＡ断片を用いて併合し、ＶL 及びＨL ドメインの対が確実に正しくなるようにした〔１７〕。ＤＮＡのジデオキシシーケンシングにより、構築物の配列を確証した。
【００７７】
次に、ＧＧＧＧＳ−リンカーにより連結される２つの可変ＩｇＧドメインをコードするＤＮＡ断片を、既にネック領域ペプチド遺伝子を保有する（実施例１参照）ｐＧＥＸ−２Ｔベクター中でクローニングして、一本鎖抗体、並びにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及びネック領域ペプチドから成る融合タンパク質  ＧＴ−ＯＸ３５−ｓｃＡｂ−ネック（55kDa の予測分子量を有する）を生じた。一本鎖抗体コード化ＤＮＡをさらに、ネック領域ペプチド遺伝子を用いずにｐＧＥＸ−２Ｔ単独中にクローニングして、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合するＯＸ３５−ｓｃＡｂをコードする開放読取り枠を生じた（50kDa の融合タンパク質を生じる）。構築された両発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１細胞中で形質転換させた（図１７参照）。
【００７８】
発現レベルは、ネック領域ペプチド単独で得られたもの（実施例１）と同様であることが判明した（図１８参照）。しかしながら、精製プロトコール後、実施例１に略記したように、融合タンパク質のほとんどが不溶性で、可溶性にし、グルタチオン−アガロースアフィニティーカラムを用いて精製できたのは低比率の一本鎖抗体融合タンパク質だけであった。トロンビンによる切断時に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて、予測されるサイズの断片を検出した。少量の小断片も観察された。
【００７９】
ポリペプチドを含有する一本鎖抗体を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、ＯＸ３５−ｓｃＡｂに関しては25kDa 、ＯＸ３５−ｓｃＡｂ−ネックポリペプチドに関しては30kDa という見かけの分子量を得たが、しかしながらサイズ排除クロマトグラフィーを用いた場合、ＯＸ３５−ｓｃＡｂ−ネックに関して見かけの分子量の増大が観察され、一方、ＯＸ３５−ｓｃＡｂはサイズ排除カラムで25kDa ポリペプチドの予測された振る舞いを示した。
【００８０】
化学的架橋実験は、スクロース密度遠心分離分析と同様に、ＯＸ３５−ｓｃＡｂ−ネックポリペプチドのオリゴマー状態を確定する。ゲル濾過分析で観察された結果だけを基にした概算は、三量体分子の存在を示した。ＥＬＩＳＡ及びＢｉａＣｏｒｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ〔１９〕分析における固定化組換え体ＣＤ４〔１８〕を用いた三量体及び単量体ｓｃＡｂに関する親和性測定を実施し得る。発現抗体構築物の収率及び構造的均一性の実質的改良は、ジスルフィド含有分子の発現を促進することが公知の〔２１〕、細菌封入体からの組換え体タンパク質の精製〔２０〕又は酵母菌発現系の使用に関する確立されたプロトコールにしたがって得られる。
【００８１】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１（ａ）は、ヒトＳＰ−Ｄのネック領域ペプチドの位置選定を示す略図である。ヒトＳＰ−Ｄは、４つの棒様構造に集合する１２の同一ポリペプチド鎖（各々３５６アミノ酸）から成り、その棒様構造は各々、残基２６〜２０２に及ぶ三重らせんのコラーゲン構造を形成する３つの鎖で構成される。分子のＣ末端は、ネック領域を介してコラーゲンドメインに連結するＣ型レクチンドメインを含有し、一方Ｎ末端は、三量体の四量体へのオリゴマー化に関与する。ヒトＳＰ−Ｄタンパク質内のネック領域の位置及び実施例１に示したようなネック領域ペプチドの配列。ａ−らせん二重コイルの「ａ」及び「ｄ」位置を示す。（ｂ）ネック領域ペプチドのａ−らせん輪図。図は、「ａ」位置のＮ末端バリン残基で開始するらせん軸を下る。
【図２】図２は、コラゲナーゼ消化ネック領域ペプチドの二次構造の熱安定性の円二色性分光分析を示す。ペプチド溶液（210 nmでのＯＤ読取り値を1.0 となるよう調整）を含入する石英浅鉢を選定した各温度で15分間平衡させた。20℃で収集し、30mMリン酸緩衝液pH 7.4中に両ペプチドを溶解して、210 nmでＵＶ吸光度が1.0 を示すよう調整したコラゲナーゼ消化（破線）及び無傷ネック領域ペプチドの円二色性分光プロフィール。両ペプチドに関してブランクベースラインを差し引いて、その結果得られた曲線を上から重ね描きした。スペクトルはほぼ同一で、波長207 nmで約−30 mdeg 、224 nmで約−20mdegという負の値を示し、これはαらせん構造から予測されるスペクトルとよく一致する。２（ｂ）：曲線は、約55℃での熱遷移を示す。しかしながら、この遷移は広範囲の温度で生じ、ネック領域ペプチドに関するより正確な融解温度を確定するにはさらなる実験データを要する。
【図３】図３（ａ）は、７残基（リシン）でネック領域ペプチド内に存在するアミノ基と反応させ、アミド結合を形成し、したがって６ＣＨ2 基により一定の間隔を開けられるポリペプチド鎖を共有結合させるために用いられる架橋剤ビス−（スルホスクシニミジル）−スベレートを示す。図３（ｂ）は、７個のコラーゲンアミノ酸（ジグザグ形）を有する三量体化ネック領域ペプチド（管）の略図である。
【図４】図４は、漸増量のビス−（スルホスクシニミジル）−スベレートと反応させた精製コラゲナーゼ消化ペプチド（レーン５〜８）及び無傷ネック領域ペプチド（レーン１〜４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（15% （w/v ）アクリルアミドトリス−トリシン−グリセロールゲルのクーマシーブルーＲ−２５０染色）を示す。０mM（レーン１及び５）、３mM（レーン２及び６）、５mM（レーン３及び７）及び10mM（レーン４及び８）の架橋剤を、ＰＢＳ40μl に溶解した定量（10μg ）のペプチドとともに37℃で20分間インキュベートした後、標本をトリス含有ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液中で沸騰させて、反応を停止させた。両ペプチドは、大きな集塊とならずに、そのそれぞれの三量体複合体に架橋し得る。コラゲナーゼ消化ペプチドの三量体を約16 kDaで動き、一方ネック領域ペプチド三量体は約22 kDaの分子量を示す。
【図５】図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６参照）で分析した架橋実験の略図である。レーン１の図は、コラゲナーゼ消化ペプチド及び無傷ネック領域ペプチドの両方の未架橋一本鎖ポリペプチドを示す。レーン２〜５は、架橋反応を示し、部分架橋反応後に分析したネック領域ペプチドを示すレーン２は、単量体、二量体及び三量体分子量を示す。レーン３は、コラゲナーゼ消化ペプチドに関する同一の分析を表し、レーン４は、架橋工程前に加熱冷却しない場合の両ペプチドの架橋反応の予測結果を示す。架橋反応前に加熱及び冷却を実施する場合には、ヘテロ三量体複合体は検出可能であるべきであり、レーン５には中間分子量を示す。
【図６】図６は、精製コラゲナーゼ消化ペプチド及び無傷ネック領域ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（15% （w/v ）アクリルアミドトリス−トリシン−グリセロールゲルのクーマシーブルーＲ−２５０染色）を示す。ＰＢＳ中で加熱及び冷却後に個々のペプチドを架橋し、２つのペプチド種を異なる比率で混合し（加熱及び冷却前）、その後架橋する。レーン１は、架橋剤を加えないそれぞれ１及び５μg のコラゲナーゼ消化ペプチド及び無傷ネック領域ペプチドを示す。５mMビス−（スルホスクシニミジル）−スベレートと反応させたネック領域ペプチドをレーン２及び３に示す。ペプチド溶液を99℃で20分間インキュベートした後、氷上で冷却し、その後架橋剤を付加した（レーン３）。コラゲナーゼ消化ペプチドとの同一反応をそれぞれレーン４及び５に示す。レーン３及び５のペプチドを加熱し、冷却した。レーン６〜９では、異なる量の２つのペプチドを加熱、冷却前に混合し、その後５mM架橋剤で架橋した。比率（ネック領域ペプチド：消化ペプチド）は、レーン６では１：１、レーン７では４：１、レーン８では１：４、レーン９では２：１である。バンド化パターンは、先ず加熱及び冷却が三量体複合体の架橋による検出を変えなかった、第二に、混合複合体が架橋されると、異なる複合体のポリペプチドは高温で解離され、それらは混合複合体中で再アニーリングし、そして第三に、これらのヘテロ三量体化反応は濃度依存的に行われる、ということを示す。
【図７】図７：ｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｎ−末端ネック領域プラスミドは、トロンビンで切断されて図示されたペプチド配列を生じるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｎ−末端ネック領域融合タンパク質の誘導（ＩＰＴＧによる）を可能にする（下段はｐＧＥＸポリリンカー配列を示し、Ｎ末端配列に下線を付す）。ＤＮＡ構築物は、ｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｎ末端コラーゲンネック領域プラスミドのＳｍａ１及びＮｒｕ１消化及びその後の適合性部位の再結紮によって得られた。
【図８】図８は、還元（レーン４、５、６）及び非還元（レーン１、２、３）条件下で漸増量の架橋剤と反応させた精製Ｎ末端ネック領域融合ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（15% （w/v ）アクリルアミドトリス−トリシン−グリセロールゲルのクーマシーブルーＲ−２５０染色）を示す。ペプチド（50μl ）を、ＰＢＳに溶解した０mM（レーン３及び６）、２mM（レーン２及び５）及び５mM（レーン１及び４）のビス−（スルホスクシニミジル）−スベレートとともに20分間インキュベートした後、１M トリス−Ｃｌ，pH 8.0  10μl を加えて反応を中止させた。反応がほぼ完了した時点で、約29 kDaのタンパク質種が検出され、一方、二量体ペプチド（約19 kDa）及び一本鎖Ｎ末端ネック領域ペプチド（9 kDa ）に対応するバンドが不完全又は非架橋反応で検出された。非還元条件下では、ペプチドの約半分が二量体として動き、架橋反応において、還元標本と比較した場合、二量体及び三量体の量の増加が認められた。
【図９】図９は、融合タンパク質生成ｐＧＥＸ−２Ｔ系（ａ）からのネック領域レクチン及びレクチンコードＤＮＡ断片のｐＥＴ３ａベクターへの転移を示す。ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１を用いてＤＮＡ断片を切り出して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド中でサブクローニングし、これを同一酵素を用いて線状にした。その結果生じたプラスミドをトランスフェクト化ＮＭ５５４細胞から再精製後、Ｘｂａ１及びＥｃｏＲＶを用いてＤＮＡ断片を切り出して、Ｎｈｅ１及びＥｃｏＲＶで切断したｐＥＴ３ａプラスミド中に存在する部位に対する適合性末端を生成した。Ｎｈｅ１部位をｐＥＴ３ａ開放読取り枠の開始コドンに置いた。したがって、誘導されたタンパク質はその配列のＮ末端に融合相手を有しないが、しかしｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカー配列由来の７アミノ酸だけ保有する：ＭＡＲＴＳＧＳ。
【図１０】図１０は、ヒトＳＰ−ＤのＣ型レクチンドメイン、及びｐＥＴ−３ａベクターを用いて組換え体タンパク質を発現するために誘導された細菌培養の溶解物から精製した場合のネック領域−レクチンドメインのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（12.5% （w/v ）アクリルアミドゲルのクーマシーブルーＲ−２５０染色）を示す。レーン１〜３はレクチンドメインに対応し、レーン４〜６はネック領域−レクチンドメインタンパク質を示す。漸増最終濃度のビス−（スルホスクシニミジル）−スベレートを用いて、タンパク質を架橋した。レーン１及び４の反応液は０mMの架橋剤を含有し、レーン２及び５は５mMに対応し、レーン３及び６は10mM架橋剤との反応の結果を示す。ネック領域含有タンパク質は架橋された三量体から成ることが示されるが、このような架橋可能なオリゴマーは、それ自体の上に発現されるレクチンドメインに関しては存在しない。したがって、ネック領域は三量体化を媒介し得るが、一方自己会合特性はヒトＳＰ−Ｄ単独のレクチンドメインに関しては検出されなかった。
【図１１】図１１：（ａ）Superose 12 カラムを用いたヘテロ三量体化前（Ａ）及び後（Ｂ）のネック領域ペプチド／ネック−レクチンタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー。カラムを平衡させ、ＰＢＳ中で0.3 ml／分で動かして、ＵＶ検出器を280 nm（感受性 0.02 ）に設定した。100 mlループを用いて標本に注入した。ネック−レクチン三量体複合体が先ず溶離し、その後ネック領域ペプチド三量体が溶離した。ヘテロ三量体化後、２つのネック領域ペプチド及び１つのネック−レクチンタンパク質から成る三量体タンパク質複合体に対応して、一次ピークの溶離プロフィールにおける変化が検出された。（ｂ）ヘテロ三量体化工程の略図を示す。ネック領域を含有する異なるポリペプチドは、再アニーリング工程後にヘテロ三量体を生成中で、これは、ヘテロ三量体化反応の生成物の比の測定開始時に用いられる２つのホモ三量体分子の相対量による濃度駆動性工程である。
【図１２】図１２：ｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｎ末端コラーゲンネック領域プラスミド（Ｂ）は、トロンビンで切断されて25kDa ＳＰ−Ｄポリペプチドを産生するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｎ末端コラーゲンネック領域融合タンパク質の誘導（ＩＰＴＧによる）を可能にする。ＤＮＡ構築物は、Ｎ末端配列の開始コドンにＢａｍＨ１部位を導入する５’オリゴヌクレオチド、及びプライマーとしてのＳＰ−Ｄ  ｃＤＮＡの停止コドン後にＥｃｏＲ１部位を導入する３’オリゴヌクレオチドを用いて本来のＳＰ−Ｄタンパク質（Ａ）の全タンパク質配列をコードするＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲにより得られた。次いで、遺伝子工学的処理した酵素部位を用いてＰＣＲ生成物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローニングし、その結果生じたプラスミドを制限酵素ＢａｍＨ１及びＭｓｃ１で消化して、Ｎ末端コラーゲンネック領域をコードするＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド中にクローニングし、ＢａｍＨ１及びＳｍａ１で線状化した。
【図１３】図１３は、ヒトＳＰ−Ｄの三重らせんコラーゲン様領域の生成を含めた提唱された折り畳み工程の略図を示す。ネック領域は平行ホモ三量体二重コイルとして会合し、隣接コラーゲン領域での三重らせん構造生成のための核化点を提供する。コラーゲン三重らせんは、ジッパー様方式で核化点からポリペプチド鎖のＮ末端に向かって生じる。コラーゲン配列内に存在するトロンビンに関する多数の有力な切断部位があるが、しかし、コラーゲン構造を消化し得る公知のプロテアーゼはコラゲナーゼだけであるため、三重らせんの生成はこれらの部位をタンパク質分解的消化に対して耐性にさせる。
【図１４（ａ）】図１４：（ａ）トロンビン切断（10% （w/v ）アクリルアミド）前後のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｎ末端−コラーゲン−ネック領域融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（クーマシーブルーＲ−２５０染色）。溶離された及びグリシン処理された融合タンパク質の溶液  50μl を、トロンビン消化の前（レーン１、２）及び後（レーン３〜６）に入れた。レーン５及び６の大写し（ｂ）は、25kDa グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの下を動く弱〜強染色された25kDa 組換え体ペプチドを示す。
【図１４（ｂ）】図１４：（ａ）トロンビン切断（10% （w/v ）アクリルアミド）前後のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｎ末端−コラーゲン−ネック領域融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（クーマシーブルーＲ−２５０染色）。溶離された及びグリシン処理された融合タンパク質の溶液  50μl を、トロンビン消化の前（レーン１、２）及び後（レーン３〜６）に入れた。レーン５及び６の大写し（ｂ）は、25kDa グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの下を動く弱〜強染色された25kDa 組換え体ペプチドを示す。
【図１５】図１５：Ｓｍａ１及びＥｃｏＲ１（ネック＋レクチン）又はＭｓｃ１及びＥｃｏＲ１（レクチン）を用いてｐＧＥＸ−２Ｔ−ネック領域−レクチン及びｐＧＥＸ−２Ｔ−レクチンプラスミドを生成して、ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド中にＳＰ−Ｄ  ｃＤＮＡ断片をクローニングし、Ｓｍａ１及びＥｃｏＲ１で線状にした。誘導された融合タンパク質は、予測分子量43kDa （ネック＋レクチン）及び37kDa （レクチン）であった。
【図１６】図１６は、ネック領域及びレクチン領域（Ａ）及びヒトＳＰ−Ｄ単独のレクチンドメイン（Ｂ）を含有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の細菌発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（10 %（w/v ）アクリルアミドゲル）を示す。非誘導化細菌（Ａレーン２及び３、並びにＢレーン１及び２）及び誘導化細菌（Ａレーン１並びにＢレーン３）を沸騰させて、ゲル上に載せ、還元条件下で動かした。マルトース−ＴＳＫと結合するタンパク質をＥＤＴＡを用いて溶離し、ピーク標本（50μl ）をレーン４及び５に載せたが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｌｅｃ融合タンパク質に対して溶離したタンパク質はなかった。ネック領域並びにレクチンドメインをともに含有する融合タンパク質ハ、細胞内でタンパク質溶解性分解を蒙り易いと思われる。レーンＡ  １で目立つタンパク質バンドに関しては、予測サイズ約42kDa だけでなく約30kDa で存在する。しかしながら、このタンパク質はマルトース−ＴＳＫカラムには結合しなかった。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｌｅｃ融合タンパク質は約 37 kDa の分子量を示した。
【図１７】図１７は、可動部リンカー配列により一緒に融合されるモノクローナルラット抗ＣＤ４ＩｇＧ抗体Ｈ及びＬ鎖（ｓｃａｂＯＸ３５）の可変部のイムノグロブリンドメインをコードするＤＮＡ構築物を示す（ａ）。ＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−２Ｔ−ネック領域ペプチドのＳｍａ１部位に挿入すると、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質及びネック領域に関する開放読取り枠を生じた。さらにＤＮＡをｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド（ｂ）に挿入し、Ｓｍａ１で線状化して、ｓｃａｂＯＸ３５のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ単独との融合タンパク質を生成した。
【図１８】図１８は、ＯＸ３５一本鎖抗体（レーン１）、ヒトＳＰ−Ｄのネック領域（レーン２）、及びネック領域−ＯＸ３５−一本鎖抗体（レーン３）を用いて、非誘導化細菌（レーン４）と比較して、還元条件（12.5% （w/v ）アクリルアミド）下で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を発現するために誘導された培養の細菌溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（クーマシーブルーＲ−２５０染色）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１４（ａ）】
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【図１４（ｂ）】
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【図１６】
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【図１８】
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