(57)【要約】【課題】比較的短いペプチドでナノファイバー形成能を有する新規のペプチドを提供する。【解決手段】ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。ただしXaa１、Xaa２がともにLysである場合を除く。）のアミノ酸配列からなり、Xaa１が酸性アミノ酸残基であり、Xaa２が塩基性アミノ酸残基であるペプチド。【選択図】図１２
2005328791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。ただしXaa１、Xaa２がともにLysである場合を除く。）のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
Xaa１が酸性アミノ酸残基であり、Xaa２が塩基性アミノ酸残基である請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Xaa１がGluまたはAspであり、Xaa２がLys,His,Argのいずれかである請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Xaa１及びXaa２がそれぞれAsp,Glu,Lys,His及びArgからなる群から選択される請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号３）、 Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号４）、His-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-His（配列番号６）、Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号７）、Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号８）のうち、いずれかのアミノ酸配列からなる請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。）のアミノ酸配列において、Xaa１およびXaa２以外のアミノ酸残基の１個若しくは数個のアミノ酸残基がCysに置換されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項７】
Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号９）、Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys（配列番号１０）、Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe-Lys（配列番号１１）のうち、いずれかのアミノ酸配列からなる請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載のペプチドにより構成されるナノファイバー。
【請求項９】
ナノファイバー形成能を有する請求項１乃至７のいずれかに記載のペプチドの塩。
【請求項１０】
ナノファイバー形成能を有する請求項１乃至７のいずれかに記載のペプチドの誘導体。
【請求項１１】
ナノファイバー形成能を有する請求項１０に記載のペプチドの誘導体の塩。
【請求項１２】
請求項１乃至７のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノファイバー形成能を有するペプチド、当該ペプチドにより構成されるナノファイバー、当該ペプチドの塩、当該ペプチドの誘導体、当該誘導体の塩、及び当該ペプチドをコードする核酸に関する。特に、少ない残基数のペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
1．ボトムアップテクノロジーとペプチド／タンパク質自己組織化
近年「ナノテクノロジー」の研究分野が急速に進展しており、大きな物質を削ってナノメートルにまで微細化していく「トップダウン」型の手法を用いた半導体素子や大規模集積回路（LSI）などの研究開発が盛んに行われている。しかしこれとは別に、生物の細胞に見られるような生体分子が自己組織化し、ナノメートルスケールの構造体を構成するシステムをモデルとした材料開発の研究も大変注目を集めている。
【０００３】
2．ペプチド／タンパク質の生分解性
自然界のタンパク質や核酸などの生体分子で材料を形成させる利点としては、物質自体、そしてその自発的な組織化による材料の製法が自然の営みに極めて近いこと、また生分解性であることなどから、地球環境や生物（特に人間）に対して負荷が少ないという点が挙げられる。
【０００４】
3．多様性と合成における単一性
特にタンパク質は構成するアミノ酸の種類が20種類存在し、形成される構造やその機能は多種多様であり、タンパク質を利用したナノテクノロジーは様々な分野において必要になってくると考えられる。
【０００５】
4．タンパク質／ペプチドについて
図１は、アミノ酸がペプチド結合してタンパク質を形成し、このタンパク質が最終的な立体構造をとる様子を示した図である。生体高分子であるタンパク質は、20種類のアミノ酸（比較的単純な有機分子）（図１（a））が脱水縮合により一次元的に結合した鎖状構造（図１（b））を有し、これが自発的に折り畳まって複雑な立体構造（図１（c））を形成する。タンパク質は生体中で様々な機能を担う重要な生体物質であり、例としてヒトの場合、およそ数万種類のタンパク質が生体内で機能しているといわれている。またそれぞれのタンパク質はアミノ酸配列に従って固有の立体構造をもっており、比較的規則的な二次構造から構成されている。その主な二次構造はα螺旋構造およびβ-シート構造であり、立体構造中のほとんどがα螺旋になっているもの（αタンパク質）、ほとんどがβ-シートであるもの（βタンパク質）、また両者が混ざったもの（α/βタンパク質）などがある。このようにタンパク質は多種多様な立体構造をもち、その立体構造がそれぞれのタンパク質の機能を決定している。
【０００６】
5．病原性アミロイドについて
ところが最近、１種類あるいは多種類のタンパク質が本来とるべき固有の立体構造に折り畳まれずに、間違って折り畳まれた結果、タンパク質同士が繊維状に凝集する現象が発見された。これらの多くは生体内において毒性をもち、アルツハイマー病やBSE（いわゆる狂牛病）などの疾患と関係しているといわれている。このようなタンパク質やペプチドの自己組織化によって形成されたナノサイズの繊維状集合体をアミロイド線維と呼ぶ。図２はアミロイド線維形成の様子を示す模式図である。複数のタンパク質が繊維状に凝集する現象では、多くの場合、線維を形成している部分はβ-シート構造になっており、本来天然構造においてβ-シートを持たないタンパク質であっても一度線維を形成すると、線維形成に関わる部分はβ-シート構造を持つ。結果として図２（a）、（b）に示すように、分子間の水素結合によりβ-シートが多数連なり線維を形成すると考えられており、アミロイド線維に特徴的な構造である。アミロイド線維はナノメートルスケールで非常に規則正しい構造をしており、工業的または産業的利用が期待されているにもかかわらず、いまだ確立されていないのが現状である。
【０００７】
6．アミロイド線維の性質
一般的に形成されたアミロイド線維の多くは、非常に安定であり、高温状態（百度前後）でも壊れることがない。これはアミロイド線維が形成する際に、水素結合が凝集によって水溶液から隔離され、水素結合が水分子によって壊されにくい状態になっているからであると考えられる。
【０００８】
7．アミロイド線維（ペプチドナノファイバー）の産業応用の可能性
この性質は工業的な観点から見ると、繊維状の形態を保ちつつ、さらに種々の加工を行う際に重要である。さらにタンパク質やペプチドにより形成されるナノサイズの繊維状集合体（以下、「ナノファイバー」という）は、生体分子を用いた天然素材であるという観点から生体適合材料としての医療分野、そしてナノサイズであるという観点から電子部品材料やナノスケールの構造材としてエレクトロニクス、ナノテクノロジー分野など、さまざまな応用が今後期待されると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
病原性のアミロイド線維は、比較的大きなタンパク質（アミノ酸残基数が数十残基〜数百残基のもの）の一部あるいは全体がβ-シート構造をもって凝集したものであるが、ナノファイバーとして工業的に利用する上ではファイバー形成に必要な部分のみの短いペプチド（アミノ酸残基数が数残基〜数十残基程度連なったもの）のほうが都合良い。その理由の１つはFmoc法等を利用した現行の固相ペプチド合成法では、合成する際に配列が長いほど合成効率が指数関数的に悪くなり、また合成に要する時間も長くなるためである。従って最終的に産業展開を見据えた場合、合成効率と合成時間の点からペプチドの残基数は短いほど都合良いことになる。また２つ目の理由としては合成されたペプチドの精製分離の容易さにある。構成アミノ酸残基数が多くなればなるほど、目的とするペプチドに近い分子量の副生成物も多くなり精製分離が困難になるが、短いペプチドになると副生成物も少なくなり容易に精製分離することができる。
【００１０】
従来の合成高分子などの繊維と比較して、ペプチドナノファイバーはその製造において環境に対して負荷の高い有機溶媒など使用せず、自然環境に極めて近い水溶媒系で製造することができる。さらに外部から熱などのエネルギーを加えることなく常温で自己組織化的にナノファイバーが形成され、またその形成時における副反応もなく、100％に近い効率で目的のナノファイバーが得られることから、無駄のない製造システムであるといえる。さらにファイバーを構成するペプチド自身が生体分子で生分解性であることから、地球環境や生物に対して悪影響を与えることが非常に少ない。
【００１１】
ナノファイバーに種々の機能性分子（酵素、金属または金属イオン、有機ELなどの機能性有機分子など）を付加させる場合、付加が容易な反応性の高い側鎖をもつアミノ酸が多数存在し、それらを含んだペプチド配列からナノファイバーを製造することも可能である。またナノファイバーを単純なペプチドで作ることで、ナノファイバーの構造を比較的容易に類推することができ、ファイバー上の特定位置に機能性分子を付加させることもできると考えられる。さらにナノファイバーはβ-シートが連なった構造をしていると考えられており、これはナノスケールレベルで制御された超精密構造材と考えられ、機能性分子をナノレベルで制御して配列させることも可能であり、工業的および産業的に非常に重要なテクノロジーになると考えられる。
【００１２】
このようにファイバー形成能を有するペプチドは、ナノファイバーとしての有用性が期待される物質であり、ナノファイバー形成能を有する新規ペプチド配列の発見は、ナノファイバーの応用研究の発展に貢献するところが大きいことは明らかである。本発明は工業的な利用度が高い、比較的短いペプチドでナノファイバー形成能を有する新規ペプチド及び当該ペプチドにより構成されるペプチドナノファイバーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記目的を達成するために、次のものを提供する。
【００１４】
（１）ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。ただしXaa１、Xaa２がともにLysである場合を除く。）のアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１５】
（２）Xaa１が酸性アミノ酸残基であり、Xaa２が塩基性アミノ酸残基である（１）に記載のペプチド。
【００１６】
（３）Xaa１がGluまたはAspであり、Xaa２がLys,His,Argのいずれかである（２）に記載のペプチド。
【００１７】
（４）Xaa１及びXaa２がそれぞれAsp,Glu,Lys,His及びArgからなる群から選択される（１）に記載のペプチド。
【００１８】
（５）Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号３）、 Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号４）、His-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-His（配列番号６）、Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号７）、Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号８）のうち、いずれかのアミノ酸配列からなる（１）に記載のペプチド。
【００１９】
（６）ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。）のアミノ酸配列において、Xaa１およびXaa２を以外のアミノ酸残基の１個若しくは数個のアミノ酸残基がCysに置換されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００２０】
（７）Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号９）、Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys（配列番号１０）、Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe-Lys（配列番号１１）のうち、いずれかのアミノ酸配列からなる（６）に記載のペプチド。
【００２１】
（８）（１）乃至（７）のいずれかに記載のペプチドにより構成されるナノファイバー。
【００２２】
（９）ナノファイバー形成能を有する（１）乃至（７）のいずれかに記載のペプチドの塩。
【００２３】
（１０）ナノファイバー形成能を有する（１）乃至（７）のいずれかに記載のペプチドの誘導体。
【００２４】
（１１）ナノファイバー形成能を有する（１０）に記載のペプチドの誘導体の塩。
【００２５】
（１２）（１）乃至（７）のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。尚、本明細書において、ナノファイバーとは、長さ方向に対して垂直な断面の長径（以下、単に長径ともいう）が１００nm以下である線維をいう。長径の下限値はファイバーが形成され得る値であれば良く限定はないが、例えばナノファイバーの長径が１nmから１００nmであり得る。また、ナノファイバーの長さは限定されない。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、ナノファイバー形成能を有する、新規のペプチドを提供する。かかるペプチドは、７残基のアミノ酸配列からなるので、短く、工業的に利用度が高い。また、かかるペプチドは、広範囲に知られているFmoc法等のペプチド合成法を用いて簡単に合成でき、これは水溶液中で速やかにナノファイバーを形成する。他の高分子の場合、設計した高分子の合成方法、抽出生成方法を設計するごとに開発する必要があるが、本発明のようにペプチドの場合、構成要素であるアミノ酸の配列のみを決定すれば、アミノ酸同士の結合は一定（ペプチド結合）しているため、化学合成法について新たに開発する必要はない。
【００２７】
ペプチドナノファイバーは、生物を利用して調製することも可能であり、環境に悪影響を及ぼすことがない。また、生分解性であるため、この点からも環境に配慮した線維であるといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明のペプチドについて、実施の形態及び実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明は、ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）で表される配列を有するペプチドである。配列番号１において、Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。ただしXaa１、Xaa２がともにLysである場合を除く。Xaa１、Xaa２がともにLysであるLys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２）のアミノ酸配列を有するペプチドについての知見は、本願発明者の一人である田村らによって解明されている（特願２００３−３８５６７０）。
【００３０】
また、本発明は、ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）のアミノ酸配列（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。）において、Xaa１およびXaa２以外のアミノ酸残基の１個若しくは数個のアミノ酸残基がCysに置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００３１】
例えば、本発明は、 Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号３）、 Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号４）、His-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-His（配列番号６）、Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号７）、Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号８）、Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号９）、Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys（配列番号１０）、Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe-Lys（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドが、ナノファイバー形成能を有することが実験（下記の実施例で示す）で実証された。
【００３２】
また、本発明は上記ペプチドにより構成されるナノファイバーである。
【００３３】
また、本発明は、上記ペプチドの塩であって、ナノファイバー形成能を有するものを含む。ペプチドの塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、酢酸塩、塩酸塩等が挙げられる。
【００３４】
また、本発明は上記ペプチドの誘導体であって、ナノファイバー形成能を有するものを含む。ここでいう「ペプチドの誘導体」とは、ペプチドを構成するアミノ酸の主鎖または／および側鎖に官能基が共有結合したものをいう。ペプチドの誘導体の例としては、ペプチドの主鎖または／および側鎖にメチル基、アセチル基、リン酸基、ホルムアミド基等が共有結合したものが挙げられる。
【００３５】
また、本発明は上記ペプチドの誘導体の塩である。
【００３６】
ペプチドは、液相法または固相法を用いた化学合成により調製したものであっても、目的の配列をコードするcDNAを用いて大腸菌等により発現、精製して調製したものであっても良い。この際用いるcDNAは通常の化学合成により調製すれば良い。
【実施例１】
【００３７】
（第１のペプチド配列設計法）
ナノファイバー形成能を有する7アミノ酸残基のアミノ酸配列Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２）からなるペプチドをベース配列とし、理論的にナノファイバー形成能を高めると思われる配列改変を行い、実際にナノファイバー形成能が高まるかどうかを、実験的に実証した。なお、配列番号２のアミノ酸配列自体は、自然界に存在するβシートをもつタンパク質のβシート領域の中から切り出されたものである。
【００３８】
配列番号２のアミノ酸配列の両端のLys は親水性のアミノ酸残基であり、それ以外の-Phe-Ile-Val-Ile-Phe- は、疎水性のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列で、これが凝集力を高め、ナノファイバー形成を促進すると考えられた。
【００３９】
本実施例において着目したのは、まず、配列番号２のアミノ酸配列の主鎖の両末端がもつ電荷と、両末端近傍にある残基の側鎖がもつ電荷である。ペプチドのN末端側は、アミノ基（NH3+）で正の電荷をもち、また、C末端側はカルボン酸（COO-）で負の電荷をもつ。Lys は、側鎖末端に主鎖N末端と同様のアミノ基をもち、正の電荷をもつ。よって、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys （配列番号２）のアミノ酸配列においては、N末端側では、主鎖N末端のもつ正の電荷と、側鎖のもつ正の電荷が強調する形になっており、一方、C末端側では、主鎖C末端のもつ負の電荷と、側鎖のもつ正の電荷が打ち消しあう結果となっている。ナノファイバーの形成において、両末端の電荷が影響している可能性があるという観点から、負荷電性の側鎖を持つ酸性アミノ酸残基であるGlu、または正荷電性の側鎖を持つ塩基性アミノ酸残基であるHisで配列番号２（ベース配列）の両末端を、またはＮ末端、Ｃ末端のいずれかを置換し、配列を設計した。
【００４０】
また、ナノファイバーが形成される際には、ペプチドが反平行βシートを構成していると予想され（図２（ａ）、（ｂ）参照）、この予想に基づくと凝集して隣接するペプチド対において、一方のN末端は他方のC末端の近傍にくることになる。したがって、ナノファイバー形成能を高めるためには、一方のN末端と他方のC末端の間に物理的化学的引力が働くようにすることが効果的と考えられる。かかる観点からも、中心部分の５残基の配列は -Phe-Ile-Val-Ile-Phe- で固定し、両末端を、GluまたはHisから選択し、配列を設計した。そして、設計したアミノ酸配列のペプチドに関し、ペプチドを合成し、ナノファイバー形成能を調べた。
【００４１】
ここでナノファイバー形成能を調べたペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。略号は、各アミノ酸配列を有するペプチドの略号とする。
【００４２】
1) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号３）：ベース配列のN末端をGlu に置換したもの、略号EK7aaとする。  
【００４３】
2) Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号４）：ベース配列のC末端をGlu に置換したもの、略号KE7aaとする。
【００４４】
3) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号５）：ベース配列の両末端をGlu に置換したもの、略号EE7aaとする。
【００４５】
4) His-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-His（配列番号６）：ベース配列の両末端をHisに置換したもの、略号HH7aaとする。
【００４６】
（実験方法）
1.ペプチド合成
上記各配列のペプチドの合成は、固相合成法に基づきペプチド合成機（peptide synthesis system, Pioneer; Applied Biosystems）で行った。固相合成で用いた支持体レジンはPEG-PS樹脂（Applied Biosystems）でNα-アミノ基の保護に9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 保護基が付加されており、リジン残基側鎖の保護にはt-butoxycarbonyl (tBoc)保護基、グルタミン酸側鎖の保護にはt-butoxy (OtBu)保護基、アルギニン残基側鎖の保護基には2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofurane-5-sulfonyl (Pbf)保護基、そしてヒスチジン残基側鎖の保護にはtrityl (Trt)保護基が付加されたものを使用した。アミノ酸のカップリングには保護基が導入されたアミノ酸（ペプチド研究所）を使用し、カップリング試薬としてN-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazole[4,5-6]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide (HATU)（Applied Biosystems）を用いた。ペプチド保護基の脱保護反応は、アルギニン残基を含むペプチドでは混合溶液A（0.75g結晶フェノール、0.25mlエタンジチオール（EDT）、0.5mlチオアニソール、0.5ml精製水、8.25トリフルオロ酢酸（TFA））、ヒスチジンやシステイン（後述する実施例４）を含むペプチドでは混合溶液B（0.25ml EDT、0.25ml精製水、9.5ml TFA）、そしてそれ以外のペプチドでは混合溶液C（0.5ml精製水、9.5ml TFA）中で、１時間半〜２時間かけて室温で行った。その後脱保護されたペプチドはt-butyl  methyl ether (MTBE)で抽出し、遠心回収後、真空乾燥により得た。
【００４７】
ペプチドの精製はDevelosil ODS column (Nomura Chemical)を用いてreverse-phase high-pressure liquid chromatography (RP-HPLC)（日立製作所）によって行われた。流速は10ml/minで、溶出の際のグラジエントは溶離液Bの濃度を30分で 20％から50％に変化させて行った。使用した溶離液Aは精製水（0.1％TFA）、溶離液Bはアセトニトリル（0.1％TFA）である。HPLCによって精製されたペプチドの確認は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization; MALDI）法を用いて飛行時間型質量分析機（AXIMA-CFR, 島津製作所）で行った。
【００４８】
2.ペプチドによるナノファイバー形成反応
両末端がHisのアミノ酸配列（配列番号６）以外のアミノ酸配列（配列番号３〜５）を有する各種ペプチドを秤量し、精製水を加えてそれを溶かし、これを3mMのペプチドストック溶液とした。さらにリン酸緩衝溶液（pH7）（溶液A）と1.11M塩化ナトリウムを含んだリン酸緩衝溶液（pH7）(溶液B)を調製した。ペプチドストック溶液から一定量分取し、溶液Aと溶液Bを加えて、ペプチド濃度を300μMに希釈してナノファイバー形成反応を開始した。この時溶液Aと溶液Bの混合比率を変えることで塩化ナトリウム濃度を調節し、0〜1000mMまで塩化ナトリウム濃度を変化させた。
【００４９】
また両末端にHisをもつアミノ酸配列（配列番号６）を有するペプチドについては、pH4でのナノファイバー形成反応は酢酸緩衝溶液を用い、pH8ではトリス-塩酸緩衝溶液を用いて上記と同様の操作で反応を開始させた。
【００５０】
3.ナノファイバー形成能の確認実験
ナノファイバー形成能の確認実験は、AFM観察、CD分光測定、およびコンゴーレッド結合アッセイにより行った。AFM観察によると、ナノファイバーが形成されている様子を画像として観察することができる。CD分光測定によると、測定されるパターンがβシート様の分光パターンであるか否かによって、ナノファイバー形成が促進されているかを確認することができる。ただし、βシート様の分光パターンをとらないナノファイバーもあるので、βシート様の分光パターンをとらないことが、ナノファイバーが形成されていないことを示すことにはならない。有機化合物のコンゴーレッド（CR）はアミロイド線維の検出に使われる染色試薬あり、CRがアミロイド線維に結合すると緑色の複屈折が偏光顕微鏡で確認される。このCRはアミロイド線維に特異的に結合することが知られている。したがって、コンゴーレッド結合アッセイにおける緑色複屈折の確認は、凝集体がアミロイド線維であるという証拠の１つとなる。アミロイド線維はナノファイバーの一種なので、CRにより染色されることが確認された場合は、ナノファイバーであるとの証拠の１つとなる。ただし、全てのナノファイバーがCRにより染色されるわけではないので、CRにより染色されなかったことが、ナノファイバーでないことの証拠とはならない。
【００５１】
3a.原子間力顕微鏡（AFM）観察
ナノファイバー形成開始から7日後に各種ペプチド溶液から2μl分取し、それを雲母基板（約1cm四方）上へ滴下し、1〜5分間室温で放置した。その後、基板洗浄のためにマイクロピペットを用いて50μl精製水を傾けた基板の上端から滴下し、これを2回行った後、室温にて完全に乾燥させ、AFM（SPM-9500J2、島津製作所）観察を行った。
【００５２】
3b.円ニ色性（CD）分光測定
各種ペプチド溶液を約200μl分取し、それを光路長0.1cmの円筒型石英セルに入れ、250nm〜190nmの遠紫外領域のCD（Jasco J-720 spectropolarimeter、日本分光）測定を行った。
【００５３】
3c.コンゴーレッド（CR）結合アッセイ
秤量したCR（ナカライテスク）に80％メタノール水溶液を加えた後、ボルテックスで溶液を懸濁し、残りのCRの塊は1分間超音波をかけて粉砕した。10分間遠心（15000rpm）した後、 その上澄み溶液を孔径0.45μmのフィルター（sartorius）に2回通してCR飽和溶液を作製した。スライドガラス（松浪硝子工業）に試料を10μl滴下し、一度乾燥させた後、先に調製したCR飽和溶液を乾燥した試料の上に10μl滴下し、再度乾燥させた。作製した試料は偏光顕微鏡（Nikon ECLIPSE E600 POL、ニコン）を用いて観察を行った。
【００５４】
（実験結果）
1.EK7aaの結果（図３）
EK7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。図３（ａ）はEK7aaを模式的に示し、図３（ｂ）はEK7aaのナノファイバー形成開始から７日後の0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図３（ｃ）はEK7aa の0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。図３（ａ）に示すように、EK7aaは、両末端の側鎖電荷が主鎖の電荷を打ち消すアミノ酸配列となっている。タンパク質の二次構造（α螺旋、βシート、ランダムコイル構造）の有無は、CD測定を行うことによって確認することができる。一般にランダムコイル構造のCDスペクトルは約200nm付近に負の極小を持つことが知られているが、このペプチドはいずれの塩濃度条件（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）でもナノファイバー形成開始直後のCDスペクトルは約200nmに正の極大、約225nmに負の極大値を示した。これはβシート構造に特徴的なスペクトルであり、反応直後のペプチドはすでに分子間相互作用によりβシート様の構造を形成している事を示している。その後時間が経過するとともにCDスペクトルも変化し、3日後にはその変化は無くなった。これは3日間かけてナノファイバーが成長していることを示している。なお、この結果は、0mM塩化ナトリウムについては、図３（ｃ）に示すグラフから読み取ることができる。
【００５５】
また、図３（ｂ）に示すように、AFM観察により形成されたナノファイバーは比較的直線性が高く、その長径は5〜20nm、また長さは1〜10μmであり、どの塩濃度条件でも同様のナノファイバーが形成されていることが確認された。それぞれのナノファイバーを詳細に観察したところ、さらに細いナノファイバーが束になってナノファイバーを形成していることがわかった。
【００５６】
全ての塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）でのEK7aaのナノファイバーをCRで染色し、偏光顕微鏡で観察してみると、全ての試料において緑色の複屈折が確認された。これはEK7aaによって形成されたナノファイバーはアミロイド線維であることを示している。
【００５７】
2.KE7aaの結果（図４）
KE7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。図４（ａ）はKE7aaを模式的に示し、図４（ｂ）はナノファイバー形成開始から７日後の1000mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図４（ｃ）は0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。図４（ａ）に示すように、KE7aaは、両末端の側鎖電荷が主鎖の電荷を強調するアミノ酸配列となっている。KE7aaの反応直後のCDスペクトルは、どの塩濃度条件下でもEK7aaで確認されたもの（図３（ｃ）参照）と同様の特徴を持つスペクトルを示し、反応直後からβシート様の構造が形成されていると考えられる。しかし7日後のCDスペクトルはその強度が小さく、0ラインに近い波形を示している。0mM塩化ナトリウムについてのかかる結果は、図４（ｃ）のグラフで確認できる。これはペプチドの両末端の静電相互作用が非常に強いためにペプチド同士が速やかに凝集し、その凝集体が沈澱として溶媒から析出したためと考えられる。
【００５８】
またAFMで形成された凝集体を観察したところナノファイバーを確認することはできたが、その長径や長さは非常に不均一なもので、塩濃度が高くないとそれらナノファイバーを顕著に確認することができなかった。図４（ｂ）のAFM像で確認されるように、1000mM塩化ナトリウムの場合は細くて短いナノファイバーが形成される。またCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。
【００５９】
3.EE7aaの結果
ベース配列の両末端ともにGluに置換したEE7aaの配列では、ペプチド合成抽出の条件が難しく、ナノファイバー形成実験を行うまでにはいたらなかった。
【００６０】
4.HH7aaの結果（図５、図６）
HH7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。Hisの側鎖であるイミダゾール基は他の塩基性アミノ酸側鎖（Arg、Lys）とは異なり、中性付近（pH6）にpKaを持つため比較的中性に近いpH領域でその電荷の有無を制御することができる。そのためナノファイバー形成はpH4（Hisの電荷は＋）とpH8（Hisの電荷はなし）の２つの条件において行った。図５（ａ）はpH4.0におけるHH7aaを模式的に示し、図５（ｂ）は、pH4.0におけるナノファイバー形成開始から７日後の0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図５（ｃ）はpH4.0における0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。また、図６（ａ）は、pH8.0におけるHH7aaを模式的に示し、図６（ｂ）は、pH8.0におけるナノファイバー形成開始から７日後の0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図６（ｃ）はpH8.0における0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。
【００６１】
pH4.0での反応直後のCDスペクトルは、どの塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）においてもランダムコイル様のスペクトルとは異なり、210nm付近に正の極大、220nm付近に正の値の肩、そして230nm付近に負の極大を示した。0mM塩化ナトリウムに関しては、図５（ｃ）のグラフで確認できる。この結果は反応直後のペプチドはランダムコイル構造ではなく、分子間相互作用によりなんらかの構造を形成していることを示している。
【００６２】
また形成された凝集体をAFMで観察したところ特徴的な螺旋状のナノファイバーが確認された。0mM塩化ナトリウムに関しては、図５（ｂ）のAFM像で確認できる。これらのナノファイバーの長径は5〜10nmで、長さは10μmに達するものも存在する。また塩濃度が高くなるにつれてそのナノファイバーの長さは短くなり、ナノファイバー同士が不規則に凝集する傾向が確認された。これは塩濃度が増加するとともに塩化物イオンによってHisの正電荷が遮蔽され、正電荷同士の反発を抑えたためと考えられる。さらにCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。
【００６３】
pH8.0での反応直後のCDスペクトルはどの塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）においてもランダムコイル構造とは異なるスペクトルを示し、pH8.0においても反応直後から分子間相互作用により凝集が起こっていることがわかる。0mM塩化ナトリウムに関しては、図６（ｃ）のグラフで確認できる。
【００６４】
また形成された凝集体のAFMでの観察から、pH8.0でのナノファイバーにはpH4.0で確認されたような目立った螺旋構造はなく、ナノファイバーの長径は非常に不均一なものであった。0mM塩化ナトリウムに関しては、図６（ｂ）のAFM像で確認できる。またどの塩濃度においてもナノファイバー同士の不規則な凝集があり、これはHis側鎖の電荷がはじめからないために起こったものと考えられる。さらにCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーが緑色の複屈折を示すことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。
【００６５】
5.1〜5の結果について
また、これらの実験でAFMによって、EK7aa，KE7aa，HH7aaのそれぞれのペプチドでは、形成されるナノファイバーの形状が異なることも確認できた。配列番号３のアミノ酸配列を有するEK7aaでは、ナノファイバーは針状の太く直線的なものであり、配列番号４のアミノ酸配列を有するKE7aaについては、短いナノファイバーしか確認できなかった。以上により、ナノファイバー形成能、およびナノファイバーの形状はペプチド配列に大きく依存することがわかり、一箇所の改変でも、形成能、形状ともに大きく変化することがわかった。
【００６６】
（実験結果の解析）
本実施例における第１のペプチド配列設計法によって設計した配列においては、配列番号５のアミノ酸配列を有するEE7aa以外のペプチドは、１日目よりナノファイバーの形成がみられ、いずれの場合もナノファイバーがAFMにより確認できた。EK7aa，KE7aa，HH7aaのそれぞれのペプチドでは、いずれの場合も、塩濃度がゼロの溶媒中で、速やかにナノファイバー形成があることが、CD測定の結果判明した。
【実施例２】
【００６７】
（第２のペプチド配列設計法）
実施例１の実験結果で得られた定性的な知見を、理論的に解明すべく、タンパク質の立体構造データベースを用い、アミノ酸残基間の相対距離に関する分布を調べた。アミノ酸残基側鎖の末端部分の原子集団間の距離が、7Å以内にある率を、それぞれの側鎖末端原子群の対ごとに測定した。その結果、タンパク質立体構造データベース中から抽出されたおよそ1500種類のタンパク質についての統計的な結果として、Cys側鎖の-CSH 同士（Cβを中心残基とした場合のCβ-Cβ間距離）は、この対のおよそ15％が、7Å内にあることがわかり、またそのほとんどは、3.8Åを中心にした鋭い局所分布の中にあることがわかった。これは、Cysの側鎖の硫黄原子がジスルフィド結合をしていることを表している（ここでの距離は、両残基のCβ間距離であるため、ジスルフィド結合の硫黄原子間距離よりは大きい）。
【００６８】
ジスルフィド結合は、ナノファイバーを形成するものとしてはその原子群間距離からしてふさわしくない。また、Cysは、一般に残基数の少ない小さいタンパク質において頻繁に出現し、構造安定化のためにジスルフィド結合を作るが、残基数の多い大きいタンパク質においては、出現頻度が小さいため、他の残基にくらべて、空間的にも近傍にあることが多い。このことを考えると、Cys-Cysが互いに近傍にある頻度は相対的にみると、それほど高いとはいえない。
【００６９】
そこで、Cys-Cys 間結合以外の原子群間で互いに７Å以内にある率がもっとも高いものを求めると、Phe側鎖同士がもっとも接近しやすいものであることがわかった。この場合、PheとPheの全ての対のうち、およそ4% が7Å内にある。同じく、Ile側鎖末端の -CH2CH3  同士の場合や、Leu または、Val の側鎖である -CHCH3CH3 同士の場合も互いに近傍にいることが多いことがわかった。これらは、疎水性相互作用によって、側鎖が互いに接近するものであることは明らかである。
【００７０】
以上のことから、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２） というアミノ配列における、中央5残基の配列は、疎水性相互作用として、もっとも強いPhe-Phe、 二番目に強いIle-Ile、 そして、三番目に近い Val-Val(あるいはLeu-Leu) を用いていることになり、この部分がナノファイバー形成能の疎水性相互作用による核となっていることが判明した。また、疎水性相互作用以外に強い引力であることが考えられる静電相互作用についてみてみると、データベースからの解析結果では、Arg  側鎖とカルボン酸(COO-、Asp,Gluの側鎖末端)がもっとも相互作用が強く、次に、Lys  側鎖とカルボン酸の間の相互作用が強いことがわかった。
【００７１】
実験結果とデータベースからの統計解析の結果は互いに矛盾せず、これまで実験的に調べた配列番号３〜６の配列の中では、配列番号３（EK7aa）の配列（あるいは、配列番号４の配列（KE7aa））がもっともナノファイバー形成能が高いことが、実験から判明し、かつデータベースからの統計解析の結果からも裏付けられた。
【００７２】
以上により、ナノファイバー形成能の高いペプチド配列の設計法として、Phe,Ile,Val(Leu) を疎水性コア形成のためにもち、ペプチド自体がナノファイバー形状をもつように凝集するために、親水性の側鎖をもつ必要性からして、正電荷をもつLysあるいはArgと、負電荷をもつGluあるいはAspによって、静電相互作用によって親水性を保ちながら互いに凝集することが必要とされることがわかった。以上より、理論的にもっともナノファイバー形成能が高いと考えられるのは、7残基からなるペプチドの場合、Glu-Phe-Phe-Phe-Phe-Phe-Arg である。
【００７３】
そこで、これまでナノファイバー形成能があると判断された配列の中央部の-Phe-Ile-Val-Ile-Phe- を変えず、ナノファイバー形成能が高いと判断される Argで末端を置換したアミノ酸配列を設計した。そして、設計したアミノ酸配列のペプチドに関し、ペプチドを合成し、ナノファイバー形成能を調べた。ここでナノファイバー形成能を調べたアミノ酸配列は、以下のとおりである。
【００７４】
5) Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号７）：ベース配列の両末端を Arg に置換したもの、略号RR7aaとする。
【００７５】
6) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号８）：配列番号３（EK7aa）のＣ末端のLysをArg  に置換したもの、略号ER7aaとする。
【００７６】
（実験方法）
実験方法は実施例１と同様である。
【００７７】
（実験結果）
1.RR7aaの結果（図７、図８）
RR7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。図７（ａ）はRR7aaを模式的に示し、図７（ｂ）は250mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。また、図８（ａ）は500mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図８（ｂ）は500mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。
【００７８】
RR7aaの場合、0mM以上からβシート様のスペクトルを示しており、さらに250mM以上の塩濃度では明確なβシート様のスペクトルが見られた。この結果はアミノ酸配列の両末端をArgにすることで、Lysの場合と比べて凝集速度が促進されたことを示している。さらにAFM観察からナノファイバー同士が絡み合って凝集していることが確認され、この結果からも非常に凝集力が増加したことが伺える。またCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。
【００７９】
2.ER7aaの結果（図９、図１０）
ER7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。統計解析からArg側鎖末端とGlu側鎖末端の相互作用がもっとも強い静電相互作用であると予想された。このペプチドの場合、配列番号３のアミノ酸配列を有するEK7aaよりも凝集力、凝集速度が増加すると予想された。図９（ａ）はER7aaを模式的に示し、図９（ｂ）は0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図９（ｃ）は0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。また、図１０（ａ）は100mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図１０（ｂ）は100mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。CDスペクトル（図９（ｃ）、図１０（ｂ）参照）から、全ての塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）において反応開始直後から、βシート様の構造を形成していることがわかる。AFM像により形成された凝集体を観察してみると（図９（ｂ）、図１０（ａ）参照）、ナノファイバー同士が束に会合し、さらに太いナノファイバーを形成していることが確認された。これらの結果はＮ末端をArgに置換することでGlu側鎖との静電相互作用が強まり、凝集力が増大したものと考えられ、統計的な解析結果を支持するものである。またCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。
【００８０】
3.1,2の結果について
上記RR7aa、ER7aa の実験結果から、RR7aa、ER7aa のナノファイバー形成能は、RR7aa、ER7aaのアミノ酸配列中のArgの代わりにLysを持つEK7aa（配列番号３）と比べて高いことがわかった。
【実施例３】
【００８１】
（第３のペプチド配列設計法）
実施例１及び実施例２の実験結果、解析結果の双方から好ましいアミノ酸配列設計法のとして、以下の4点を考慮した設計法を挙げることができる。
【００８２】
1）１５残基以下のペプチド配列で、特にN末端側に負電荷をもつアミノ酸残基（Asp,Glu）、C末端側に正電荷をもつアミノ酸残基（Lys,Arg）を配し、静電引力によってナノファイバー形成能を高める。
【００８３】
2）ペプチドの残基数をNとした場合、ペプチド全体の水溶性をたかめ、ナノファイバー形成を促進させるために、配列全体の20％から50％（両末端を含む）を親水性残基にし、とくに、親水性残基を電荷のある側鎖をもつアミノ酸残基（Asp,Glu,Lys,Arg）にし、k番目の残基と(N+1-k)番目の残基の電荷を逆にする。
【００８４】
3）ペプチド配列において、親水性残基以外の残基を疎水性残基とし、疎水性相互作用による凝集力をたかめるためにPhe,Ile,Valを用いる。
【００８５】
4）k番目を親水性で電荷をもつアミノ酸残基とした場合、k+1番目を同じ電荷を持たせるか、あるいは、疎水性残基にすることで、k番目とk+1番目の側鎖間に反発力をもたせ、ナノファイバー形成時に、側鎖がベータシートの逆の面に来るようにする。
【実施例４】
【００８６】
（機能性分子付加方法）
ペプチドナノファイバーには反応性の高い側鎖をもつアミノ酸を導入することができ、機能性分子を付加することで様々な機能をもつペプチドナノファイバーを実現することができる。ナノファイバーになんらかの機能性分子を付加する方法としては、次の２つが考えられる。
【００８７】
１）すでに機能をもつタンパク質のN末端、あるいはC末端側にナノファイバー形成能をもつペプチドを追加し、その部分でファイバー形成をさせつつ、機能をもつタンパク質をナノファイバーに固定する方法。
【００８８】
２）ファイバー形成するペプチドのうち、ファイバー形成に直接かかわりのないN、C両末端あるいは側鎖の一部に、機能をもつ分子を結合させる方法。図１１にペプチドのN末端、Cys残基側鎖のスルフヒドリル基、そしてリジン残基側鎖のアミノ基に機能性分子を付加した場合の模式図を示す。尚、図１１において、機能性分子１は、主鎖のN末端及びLys残基の側鎖のアミノ基に化学的に結合する分子であり、機能性分子２は、Cys残基の側鎖のスルフヒドリル基に化学的に結合する分子であるとする。
【００８９】
１）の方法では、ナノファイバーはファイバー形成している部分のペプチド鎖間距離（β-ストランド間距離）が4Å〜５Åと短いため、機能をもつタンパク質の大きさも比較的小さいものに限られる。これを回避するためには、ファイバー形成部分のペプチドがヘアピンターンによってファイバー方向に長く連なるような方法をとるしかない。しかしこの場合、ナノファイバーを形成する部分の配列は数十残基の長さに及び、設計が大変困難になる。また付加されたタンパク質がペプチドのファイバー形成に悪影響を与えることもあり得る。さらに付加される機能自身がタンパク質によって実現されるものに限られるため、あまり実用的ではない。
【００９０】
２）の方法は、ナノファイバーを形成するペプチドの主鎖あるいは側鎖に機能性分子と結合する部分を見い出すことになる。比較的結合性の高い官能基としては、アミノ基（NH3+）やスルフヒドリル基（SH）がある。スルフヒドリル基はCys残基の側鎖末端に存在し、これを用いて様々な機能性分子を付加し、機能性ナノファイバーを作ることができる。またN末端およびLys残基の側鎖末端のアミノ基を利用し、ここに機能をもつ分子を付加することもできる。
【００９１】
（第４のペプチド配列設計法）
機能性分子の付加法、及び第３の配列設計法を考慮して、下記の配列設計法が導き出される。機能性分子付加が可能なナノファイバー形成能をもつペプチドとして、統計解析からも、また機能性分子を合理的に行ううえでも、7残基の場合は、Glu-Phe-Xaa３- Xaa４- Xaa５-Phe-Lys がもっとも良いことがわかる。ここで、Xaa３、 Xaa４、 Xaa５には、Phe,Ile,Valのいずれかを用いる。また、残基数が6残基以下の場合は安定性の上で問題が残り、また８残基以上では、ペプチド自体の合成に時間がかかり、また収量が悪くなるため、最大でも10残基以下にすることが望ましい。この場合、全体の親水性をコントロールする意味で、全配列中のアミノ酸残基のうち20から40％を親水性アミノ酸にする必要があり、また、その際、凝集力を高めるためには、電荷の正負で側鎖間に引力が働くようにする必要がある。以上の条件から、N残基のナノファイバー形成能をもつペプチドにおいては図１２の概略図にそって、以下の方法で、配列を設計する。
【００９２】
1)１番目の残基をGlu、N番目の残基をLys とする。この場合、N末端のアミノ基、およびN番目（C末端）のLys  側鎖のアミノ基は、機能付加のために利用される。
【００９３】
2) k(1<k<N)番目の残基と(N-k+1)番目の残基は、これを疎水性残基にするならば、Phe,Ile,Val のいずれかにする（Pheであることが望ましい）。
【００９４】
3) k(1<k<N)番目の残基と(N-k+1)番目を親水性残基とする場合には、k番目と(N-k+1)番目を、電荷が反対であるアミノ酸残基を用いる。この場合、用いるアミノ酸残基として正の電荷では、Arg,Lys で、凝集力から考えて、Arg が望ましく、負電荷の場合は、Glu、Asp を用いるが、Asp では、側鎖が短いため、側鎖の長い正の電荷をもつArg,Lys との側鎖結合においてペプチドにゆがみが生ずる可能性がありこれを避けるためには、Glu が望ましい。
【００９５】
4)また、ペプチド内部において電荷による側鎖の結合が起こらないようにするために、βシート構造では、側鎖がkとk+1 ではβシートの面を中心に互いに逆方向に伸びることを考慮し、ここに側鎖間の反発力を入れ、βシート構造が作りやすくなるように電荷を同じにするか、一方を疎水性、一方を電荷をもつアミノ酸残基とすることで、親水基と疎水基間の弱い反発力を用いることが望ましく、また、kとk+2 番目を電荷をもつアミノ酸残基にした場合は、両者が側鎖結合を起こさないために、電荷を同じにした方が良い。
【００９６】
5)全体として、ナノファイバー形成が障害なく行われるためには、電荷をもつ残基が、全体の20％から50%を占めるようた方が良い。
【００９７】
6)ペプチド合成の容易性から考えて、全体の残基数Nを、最大で15以下にする。
【００９８】
（機能性分子付加の例）
機能性分子付加の一つの例として、蛍光、あるいは発光素子の固定がある。蛍光分子は、互いに接触して、π電子が重なると蛍光特性を失う。そこで、ナノファイバー上に、広く分散させて、これを固定することで、蛍光特性を保たせることができる。その上で、不織布のようにして、フィルム化することで、蛍光膜を構成することができる。蛍光分子の例として、赤色に蛍光するローダミンが挙げられる。蛍光分子は、部分的に、正または負に荷電する基を持たせることができるので、前記のペプチドナノファイバーのアミノ基に静電相互作用で結合させることが可能である。蛍光分子間距離を長くするために、あらかじめ、ナノファイバーの中の多くのアミノ基をナノファイバー形成後に負イオンで中和しておき、わずかに残った中和されていないアミノ基に蛍光分子が結合するようにする。産業応用としては、LED照明における白色蛍光フィルムとして大きな市場価値がある。
【００９９】
（機能性分子付加の実験方法）
1)Lys側鎖末端、またはN末端のアミノ基に付加させる場合
ペプチドの遊離のアミノ基（Lys側鎖末端のε−アミノ基やN末端のアミノ基） に機能性分子を結合させるために、弱塩基性（pH7〜8.5）の溶媒条件下で官能基 sulfo-N-hydroxy-succinimide esterを 付加させた機能性分子とペプチドを混合し、数時間（1〜12時間）室温または低温 （〜４℃）で結合 反応を起こさせる。これにより、機能性分子はペプチドのアミノ基に特異的に結合される。
【０１００】
2)Cys側鎖末端のスルフヒドリル基（SH基）に付加させる場合
ペプチドの遊離のスルフヒドリル基（Cys側鎖末端のSH基）に機能性分子を結合させるために、弱酸性（pH6〜7）の溶媒条件下で官能基マレイミドを付加させた機能性分子とペプチドを混合し、数時間（1〜12時間）室温または低温（〜４℃）で結合反応を起こさせる。これにより、機能性分子はペプチドのSH基に特異的に結合される。
【０１０１】
（アミノ酸配列設計）
上記機能性分子付加法の2)によりペプチドナノファイバーに機能性分子を付加しうる配列を、第４のアミノ酸配列設計法に従って設計した。比較的均一で分散したナノファイバーを形成する配列番号３の配列を基に、3番目、4番目、そして5番目のアミノ酸残基をそれぞれCysに置換した変異体を３種類設計した。そして、設計した配列のペプチドを合成し、そのナノファイバー形成能を調べた。ここでナノファイバー形成能を調べた配列は、以下のとおりである。
【０１０２】
7)Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号９）：略号EK7aaI3Cとする。
【０１０３】
8)Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys（配列番号１０）：略号EK7aaV4Cとする。9)Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe-Lys（配列番号１１）：略号EK7aaI5Cとする。
【０１０４】
（実験方法）       
実験方法は実施例１と同様である。
【０１０５】
（実験結果）
1.EK7aa13Cの結果（図１３）
図１３（ａ）はEK7aa13Cを模式的に示し、図１３（ｂ）はナノファイバー形成開始から７日後の0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図１３（ｃ）は0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。
【０１０６】
EK7aaI3CのCDスペクトルはどの塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）でも配列番号３のアミノ酸配列を有するEK7aaで見られたCDスペクトルと同じような波形を示し、これはEK7aaに類似した構造を形成していると考えられる。このペプチドの凝集体をAFMで観察したところ、形成されたナノファイバーの形態はEK7aaのナノファイバー形態に比較的似ているが、細く短いナノファイバーが多く存在していることが確認された。さらにCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。
【０１０７】
2. EK7aaV4Cの結果（図１４）
図１４（ａ）はEK7aaV4Cの50mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図１４（ｂ）は50mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。図１４（ａ）からわかるように、EK7aaV4Cでは形成された凝集体は非常に短いナノファイバーであり、それらナノファイバーの存在はEK7aaI3Cの場合と比べて非常に減少していることがわかった。図１４（ｂ）からわかるように、EK7aaV4CのCDスペクトルは、配列番号２〜４、５〜９のアミノ酸配列を有するペプチドとは異なる波形を示した。CR結合アッセイの結果では、ナノファイバーが緑色の複屈折を示したことから、このナノファイバーも同様にアミロイド線維であることがわかった。
【０１０８】
3. EK7aaI5Cの結果（図１５）
図１５はEK7aaI5Cの0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。図１５からわかるように、EK7aaV4CのCDスペクトルは、配列番号２〜４、５〜９のアミノ酸配列を有するペプチドとは異なる波形を示した。CR結合アッセイの結果では、ナノファイバーが緑色の複屈折を示したことから、このナノファイバーも同様にアミロイド線維であることがわかった。なお、EK7aa I5Cに関し、AFMではほとんどナノファイバーらしき凝集体は確認することができなかった。
【０１０９】
4.1〜3の結果について
上記結果はナノファイバー構造形成において3〜5番目の疎水性残基が重要であることを示すものであり、上記1〜3においては、それらの残基が極性を持つCysに置換されたために疎水性相互作用が弱められナノファイバー形成が阻害されたと思われる。CysとIleの相互作用は、統計解析から見てもIle同士のものよりもかなり弱いことがわかっている。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
ペプチドナノファイバーは、そのままでもさまざまな用途が考えられる。例えば、濾過用のフィルターとして用いることができる。また、親水基を加えて、親水性のナノファイバーとして、水分を吸収する不織布としての利用価値もある。
【０１１１】
本発明にかかるナノファイバーに、機能性分子をつけることで、さまざまな機能をもったナノファイバーを作ることが可能である。アミノ酸残基の側鎖にはさまざまなものが含まれているため、これらの組み合わせ、構造の設計だけでも、十分に幅広い機能をもつものが開発可能である。
【０１１２】
例えば、蛍光分子を付加したナノファイバーは、さまざまな色の蛍光灯や、計算機、テレビのディスプレイに利用することができる。また、導電性分子を付加したナノファイバーは微細電子回路の配線に利用できる。また、酵素を付加したナノファイバーは、大規模化学プラントにおいて、酵素を利用した化学反応による化学物質製造に利用できる。
【０１１３】
本発明によって得られるペプチドナノファイバーはナノスケールであるので、量子ドット、トンネル効果、電子軌道等に関連した量子効果のコントロールが可能となる。したがって、新しい物性をもつ材料を開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】アミノ酸がペプチド結合して、最終的な立体構造をとるまでを解説した図。
【図２】βアミロイドのナノファイバー形成の様子の模式図。
【図３】EK7aaの模式図（ａ）と、ナノファイバーのAFM像（ｂ）、及びCD測定値のグラフ（ｃ）を示す図。
【図４】KE7aaの模式図（ａ）と、ナノファイバーのAFM像（ｂ）、及びCD測定値のグラフ（ｃ）を示す図。
【図５】HH7aaのpH4.0での模式図（ａ）と、ナノファイバーのAFM像（ｂ）、及びCD測定値のグラフ（ｃ）を示す図。
【図６】HH7aaのpH8.0での模式図（ａ）と、ナノファイバーのAFM像（ｂ）、及びCD測定値のグラフ（ｃ）を示す図。
【図７】RR7aaの模式図（ａ）と、250mM塩化ナトリウムでのナノファイバーのCD測定値のグラフ（ｂ）を示す図。
【図８】RR7aaの500mM塩化ナトリウムでのナノファイバーのAFM像（ａ）、及びCD測定値のグラフ（ｂ）を示す図。
【図９】ER7aaの模式図（ａ）と、0mM塩化ナトリウムでのナノファイバーのAFM像（ｂ）、及びCD測定値のグラフ（ｃ）を示す図。
【図１０】ER7aaの100mM塩化ナトリウムでのナノファイバーのAFM像（ａ）、及びCD測定値のグラフ（ｂ）を示す図。
【図１１】ペプチドのN末端、Cys残基側鎖のスルフヒドリル基、そしてリジン残基側鎖のアミノ基に機能性分子を付加した場合の模式図。
【図１２】機能性分子付加するためのナノファイバーを形成するペプチドのアミノ酸配列を設計する方法を説明するための図。
【図１３】EK7aa13Cの模式図（ａ）と、0mM塩化ナトリウムでのナノファイバーのAFM像（ｂ）、及びCD測定値のグラフ（ｃ）を示す図。
【図１４】EK7aaV4Cの50mM塩化ナトリウムでのナノファイバーのAFM像（ａ）、及びCD測定値のグラフ（ｂ）を示す図。
【図１５】EK7aaI5Cの0mM塩化ナトリウムでのナノファイバーのCD測定値のグラフを示す図。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
<210>1
<223>１番目の残基のXaaは任意のアミノ酸残基であり、７番目の残基のXaaは任意のアミノ酸残基である。
【図１】
2005328791.tif 000003
【図２】
2005328791.tif 000004
【図３】
2005328791.tif 000005
【図４】
2005328791.tif 000006
【図５】
2005328791.tif 000007
【図６】
2005328791.tif 000008
【図７】
2005328791.tif 000009
【図８】
2005328791.tif 000010
【図９】
2005328791.tif 000011
【図１０】
2005328791.tif 000012
【図１１】
2005328791.tif 000013
【図１２】
2005328791.tif 000014
【図１３】
2005328791.tif 000015
【図１４】
2005328791.tif 000016
【図１５】
2005328791.tif 000017
【配列表】
2005328791000001.app