(57)【要約】【課題】  本発明は、細胞内に天然に存在するRNAiを迅速且つ確実に検出および同定する方法を提供することを課題とする。【解決手段】  試料中に存在する少なくとも1の特定遺伝子に対して特異的なsiRNAの検出、同定及び/又は定量方法であって、(i)その上に、或る細胞の、少なくとも1の遺伝子および/または転写物に対応するポリヌクレオチドが固定化されているアレーを用意し、ここで当該ポリヌクレオチドは前もって定められた位置に配置されており；(ii) 標的細胞からsiRNAを単離し；(iii)アレー上に存在する捕捉分子とsiRNAがハイブリダイズ可能な条件下で、前記siRNAを該アレーに接触させ；(iv) アレーの特定位置に存在するシグナルまたはシグナルの変化を検出する；という工程を含み、ここでアレー上のシグナルの位置及び/又はシグナルの変化は、細胞中のsiRNAの存在の指標となる、方法、を提供する。【選択図】      図１
2005058235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する少なくとも1の特定遺伝子に対して特異的なsiRNAの検出および/または同定および/または定量のための方法であって、
(i) その上に、或る細胞の、少なくとも1の遺伝子および/または転写物に対応するポリヌクレオチドが固定化されているアレーを用意し、ここでそのポリヌクレオチドは前もって定められた位置に配置されており；
(ii) 標的細胞からsiRNAを単離し；
(iii) 前記アレー上に存在する捕捉分子と前記siRNAがハイブリダイズ可能な条件下で、siRNAを該アレーに接触させ；
(iv) アレーの特定位置に存在するシグナルまたはシグナルの変化を検出する；
という工程を含み、ここで、アレー上のシグナルの位置および/またはシグナルの変化は、細胞中のsiRNAの存在を指標する方法。
【請求項２】
工程(iii)の前に、siRNAを標識し、及び/または酵素的にコピーし、そして所望により増幅し、及び/または、
siRNAの検出を、該siRNAの伸長後にその相補的配列のうち1の上で実施し、及び/または、
工程(iii)の後、このRNA-DNAハイブリッドを切断し、捕捉分子の喪失を測定する、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
捕捉分子の喪失を、対照と比較した特定位置におけるシグナルの低下として測定する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
放出された捕捉分子のフラグメントを測定し、所望により同定または配列決定する、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
捕捉プローブとして、
mRNAと同一の配列を持つポリヌクレオチド；または、
mRNAに対し相補的な配列を持つポリヌクレオチド；または、
少なくとも一部がmRNAと同一の配列を持つポリヌクレオチド；および/または、
DNA、PNAもしくはRNAから選ばれる分子、
を用いる、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
マイクロアレーが、同じmRNA配列の少なくとも異なる別々の部分と同一である配列を有する幾つかの捕捉プローブを持っている；または、
マイクロアレーが、同じmRNA配列の少なくとも異なる別々の部分に対し相補的な配列を有する幾つかの捕捉プローブを持っている、
請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
マイクロアレーが、アポトーシス、細胞接着、細胞周期、増殖因子およびサイトカイン、細胞シグナル伝達、染色体プロセシング、DNA修復/合成、中間体代謝、細胞外マトリックス、細胞構造、蛋白代謝、酸化的代謝、転写およびハウスキーピング遺伝子を包含する13の主要細胞機能のうち少なくとも9つに関与する異なる蛋白に対応する遺伝子に対して特異的なsiRNAの測定のための捕捉プローブを持っている、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
マイクロアレーが、アポトーシス、細胞接着、細胞周期、増殖因子およびサイトカイン、細胞シグナル伝達、染色体プロセシング、DNA修復/合成、中間体代謝、細胞外マトリックス、細胞構造、蛋白代謝、酸化的代謝、転写、細胞分化、腫瘍遺伝子/腫瘍サプレッサー、ストレス反応、脂質代謝、プロテアソーム、循環およびハウスキーピング遺伝子を包含する細胞機能のうち少なくとも1つに関与する蛋白に対応する少なくとも5個の遺伝子に対して特異的なsiRNAの測定のための捕捉プローブを持っている、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
マイクロアレーが、少なくとも20種の遺伝子に対して特異的なsiRNAの測定のための、少なくとも20種の異なる捕捉プローブを持ち、そして/または、
マイクロアレーが、同定され得るために捕捉分子に特有の少なくとも1つの特徴を有する幾つかの支持体上に配置されている、
請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
検出を、蛍光、比色分析、化学もしくは生物発光、電気的または磁気的装置によって実施する、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子の転写調節に利用可能な化合物についてのスクリーニングのための、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
mRNAもしくはその一部と同一であるまたはこれと相補的な配列を有し且つアレーの特定位置に存在する捕捉プローブ、を含むアレー、ならびに、
所望により緩衝剤および標識、
を含む、試料中に存在する少なくとも1の遺伝子に対して特異的な複数のsiRNAを検出および/または同定および/または定量するためのキット。
【請求項１３】
少なくとも1の遺伝子に対して特異的なsiRNAの存在に及ぼす化合物の影響を試験するためのスクリーニング装置であって、mRNAもしくはその一部と同一であるまたはこれと相補的な配列を有し且つアレーの特定位置に存在する捕捉プローブ、を有するアレー、ならびに所望により緩衝剤および標識を含む、スクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それぞれRNAiのインデューサーである、多遺伝子特異的siRNAまたはstRNAの検出、同定および/または定量のための新たな方法に関するものである。特に本発明は、細胞中のsiRNAの存在または濃度変化を検出する方法に関するものであり、ここでこの存在や変化は環境条件によって誘導され得るものをいう。
【背景技術】
【０００２】
線虫Caenorhabditis elegans中にdsRNAを注入する実験において、送達されたdsRNAに対して配列が極めて相同な遺伝子のサイレンシングが起こることが判明した（Fire et al., Nature 391(1998), 806-811）。この発見に基づき、転写物の翻訳に影響を及ぼす、このようなdsRNA-分子の能力を指す、「RNA干渉」(RNAi）という語が創られた。
【０００３】
この領域におけるその後の研究では、dsRNAが、そのdsRNAと同一の領域内部で相同RNAの分解を引き起こすことが示された（Zamore et al., Cell 101(2000), 25-33）。見たところでは、このdsRNAはプロセシングを受けて、約21-23のリボヌクレオチド長を示すRNAフラグメントとなるようである（Zamore et al.、上記）。これらの短いフラグメントはまた、細胞溶解前にdsRNAでトランスフェクトされたDrosophila melanogaster Schneider 2細胞から調製した抽出物中に（Hammond et al., Nature 404(2000), 293-296）、または放射標識したdsRNAをD. melanogasterの胚に（Yang et al., Curr. Biol. 10(2000), 1191-1200）、もしくはC. elegans成体に（Parrish et al., Mol. Cell 6(2000), 1077-1087）注入した後にも検出された。
【０００４】
RNAiはさらに、広範囲の生細胞に天然に存在することが観察された。これらの種の分子は、例えば昆虫（Kennerdell and Carthew, Cell 95(1998), 1017-1026）、カエル（Oelgeschlager et al., Nature 405(2000), 757-763）、およびマウスを包含するその他の動物（Svoboda et al., Development 127(2000), 4147-4156；Wianny and Zernicka-Goetz, Nat. Cell Biol. 2(2000), 70-75）および人間にも存在することが見出されている。同じような大きさのRNA分子が、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）を示す植物組織に蓄積することもまた見出されている（Hamilton and Baulcombe, Sciences 286(1999), 950-952）。
【０００５】
RNAiは、植物における共抑制および真菌における抑制の、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）機構と密接に連鎖しており（Cogoni and Macino, Curr. Opin. Microbiol. 2(1999), 657-662；Catalanotto et al., Nature 404(2000), 245；Dalmay et al., Cell 101(2000), 543-553；Ketting and Plasterk, Nature 404(2000), 296-298；Mourrain et al., Cell 101(2000), 533-542；Smardon et al., Curr. Biol. 10(2000), 169-178）、また、RNAi機構の幾つかの要素は、共抑制による転写後サイレンシングに必要である（Catalanotto et al., Nature 404(2000), 245；Dernburg et al., Genes & Dev. 14(2000), 1578-1583；Ketting and Plasterk, Nature 404(2000), 296-298）。
【０００６】
RNAiと共抑制の天然の機能は、活性となった時に宿主細胞中で有害なRNAまたはdsRNAを作り出す、トランスポゾンやウイルスといった可動的遺伝要素による侵襲に対してゲノムを保護する事であると思われる（Jensen et al., Nat. Genet. 21(1999), 209-212；Ketting et al., Cell 99(1999), 133-141；Ratcliff et al., Plant Cell 11(1999), 1207-1216；Tabara et al., Cell 99(1999), 123-132；Malinsky et al., Genetics 156(2000), 1147-1155）。特異的mRNAの分解はトランスポゾンとウイルスの複製を妨げるが、幾つかのウイルスは、PTGSを抑制する蛋白を発現することにより、このプロセスを克服または防ぐことができるようである（Anandalakshmi et al., Science 290(2000), 142-144；Lucy et al., EMBO J. 19(2000), 1672-1680；Voinnet et al., Cell 103(2000), 153-167）。
【０００７】
目下存在するRNAiの機構のモデルは、導入されたdsRNAがRNアーゼIII様酵素Dicerに結合して開裂され、上述の長さを持つ生成物となるという観察に基づいている。小干渉RNA（siRNA）と命名されたこれらの分子は、RNAにより誘導されるサイレンシング複合体（RISC）の形成を引き起こす。生成したdsRNA-蛋白複合体は、相同なmRNAの選択的分解に活性なエフェクターであるように見受けられる（Hamilton and Baulcombe, Sciences 286(1999), 950-952, Zamore et al., Cell 101(2000), 25-33；Elbashir et al., Genes & Dev. 15(2001), 188-200）。Elbashir et al., は、dsRNAプロセシングの方向が、そのsiRNA-蛋白複合体によってセンスまたはアンチセンス標的RNAのいずれが開裂され得るかを決定しているとの証拠を提供している。この複合体中のへリカーゼがdsRNAをほどき、生成した一本鎖RNA（ssRNA）が、基質選択の指針として用いられると思われる。このssRNAが標的mRNAと塩基対を形成すると、恐らくは該複合体内部にあると思われるヌクレアーゼ活性が、mRNAを分解する。
【０００８】
siRNAを生成する酵素は、マイクロRNA（miRNA）と呼ばれる別のタイプの小RNA分子をも生成する。これらのmiRNAは、ヘアピン構造由来の内因性転写物からプロセシングされる。生成したmiRNAは、動物においてそれらのメッセンジャーRNAの3'末端と結合することにより、他の遺伝子の調節に関与するようになる（Chi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100(2003), 6343-6346）。
【０００９】
このようにRNAiは、植物と動物の両細胞において、siRNAに相同なmRNAの分解を指令する、進化の上で保存された機構であると思われる。哺乳動物細胞において遺伝子サイレンシングを指令するsiRNAの能力は、遺伝子機能を高スループット方式で研究するため、または、人間の疾病における遺伝子発現を特異的に調節するために、siRNAを利用できるかも知れないという可能性を提起した。
【００１０】
米国特許第6506559号において、生細胞中にdsRNAを導入して当該細胞中の標的遺伝子の遺伝子発現を阻害する方法が記載されている。該RNAの二本鎖領域のヌクレオチド配列および標的遺伝子の一部のヌクレオチド配列が同一であるという点で、阻害は配列特異的である。
【００１１】
WO-02/44321では、有効な標的mRNA開裂を仲介するために、突出した3'末端を有する19-25ヌクレオチドより成る化学合成siRNA二本鎖が提供されている。
【００１２】
WO-03/006477では、遺伝子サイレンシングを誘導する別の方法が開示されている。作り替えられたdsRNA前駆体が提供されているが、これは、細胞で発現される時、その細胞によるプロセシングを受けて、その細胞自身のRNAi経路を用いて標的遺伝子を選択的にサイレンシングするsiRNAを生成する。
【００１３】
US-A-20020173478および20030084471は、ヒトの細胞および細胞系を包含する哺乳動物細胞に対するRNAiの応用可能性を示しており、人間の患者へのこれらの分子の投与を提唱している。
【００１４】
RNAi経路活性を調節するためのその他の方法が記載されている。WO-01/29058では、発現生成物がRNAiの仲介に関わっている遺伝子が提供されている。RNAiは、遺伝子発現を抑制するために、一組の保存された細胞因子を必要とする。これらの因子はRNAi経路の成分（例えば、RDE-1、RDE-4）であり、干渉に必要な活性を提供する。これらの活性は、RNAiを誘導する多くの細胞型においては存在しないか、または十分活性化していないのかも知れない。
【００１５】
殆どの実験において、天然に存在するsiRNAについての知識無く、遺伝子の転写を阻害するために細胞中にsiRNAが導入されていた。
【００１６】
天然に存在するsiRNAの検出は、それらの数、小さなサイズ、および細胞中に数が少ない事からすると、遂行は困難である。T4リガーゼを用いてそれらの5'-および3'-末端にリンカーセグメントを付加し、伸長したRNAを増幅してからsiRNAをクローニングするという事に基づく方法が提起された（Elbashir et al., Gene & Dev. 15(2001), 188-200）。クローニングしたフラグメントの分析は配列決定により実施されている。このクローニング方法は、siRNAを1個1個分析する事を見込んでおり、故に時間と費用がかかる。天然に存在するsiRNA、RNAiのインデューサーを多重分析するための容易な方法を提供している先行文献は無い。
【非特許文献１】Gene & Dev.15(2001), 188-200
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、細胞内に天然に存在するRNAiの検出および同定をするための改善法に対する必要性がある。
【００１８】
故に本発明の1つの目的は、細胞内に天然に存在するRNAiを迅速且つ確実に検出および同定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、特定の遺伝子に特異的な、細胞または細胞抽出物中に存在するsiRNA分子を特異的に検出するためのマイクロアレーの使用に基づく方法を提供するものである。特に本発明は、試料中に存在する少なくとも1の特定遺伝子に対して特異的なsiRNAの検出、同定および/または定量を意図しており、この方法は(i) その上に、或る細胞の少なくとも1の遺伝子およびまたは転写物に対応する幾つかのポリヌクレオチドが、前もって定められた位置に配置されている、アレーを用意し；(ii) 標的細胞からsiRNAを単離し；(iii) アレー上に存在する捕捉分子とsiRNAがハイブリダイズ可能な条件下で、siRNAを該アレーに接触させ；(iv) アレーの特定の位置に存在するシグナルまたはシグナルの変化を検出する［ここで、アレー上のシグナルの位置および/またはシグナルの変化は、該細胞中のsiRNAの存在の指標となる］、という工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
「遺伝子」という語は、mRNAに転写され、その後ペプチドまたは蛋白へと翻訳されるゲノムDNAを意味する。発現された遺伝子の測定は、このプロセス内のいずれかの分子上で、最も一般的には当該mRNAまたは当該ペプチドもしくは蛋白の検出で実施する。この検出はさらに、当該蛋白の特異的性質、例えばその酵素活性を基礎とすることができる。
【００２１】
「核酸、アレー、プローブ、標的核酸、実質的に結合する、特異的にハイブリダイズする、バックグラウンド、定量する」という語は、国際特許出願WO97/27317に記載の通りであり、これを引用により本明細書の一部とする。詳しくは、以下の通りである。
【００２２】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを示し、別記しない限り、天然ヌクレオチドと同様に機能し得る天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。
【００２３】
オリゴヌクレオチドは、約２〜約１０００ヌクレオチド、さらに典型的には約２〜約５００ヌクレオチドの長さの範囲の一本鎖核酸である。
【００２４】
本明細書中で用いる場合、「プローブ」は１つ又はそれ以上の型の化学結合により、通常は相補的塩基対合により、通常は水素結合形成により相補的配列の標的核酸と結合し得るオリゴヌクレオチド、と定義される。本明細書中で用いる場合、オリゴヌクレオチドプローブは、天然塩基（即ちＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を包含し得る。さらに、オリゴヌクレオチドプローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により連結される。したがって、オリゴヌクレオチドプローブは、構成塩基がホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合により連結されるペプチド核酸である。
【００２５】
「標的核酸」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブが特異的にハイブリダイズする核酸（しばしば生物学的試料に由来し、したがって試料核酸とも呼ばれる）を示す。標的核酸は本質的に核酸のあらゆる供給源（例えば化学合成、増幅反応、法試料等が挙げられるが、これらに限定されない）から得られる、と認識される。それは、検出されるべき１つ又はそれ以上の標的核酸の存在又は非存在であるか、あるいは定量されるべき１つ又はそれ以上の標的核酸の量である。
【００２６】
検出される標的核酸は、それらが特異的に結合する（ハイブリダイズする）対応するプローブ（単数又は複数）の核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を優先的に有する。標的核酸という用語は、プローブが特異的にハイブリダイズする大型核酸の特異的サブ配列を、あるいは存在量（濃度）および／または発現レベルを検出するのが望ましい全配列（例えば遺伝子又はｍＲＮＡ）を示す。
【００２７】
「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを示し、標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低減することにより適応され得る小ミスマッチを包含する。
【００２８】
「特異的にハイブリダイズする」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（例えば全細胞性）ＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在する場合にストリンジェント条件下でその配列と優先的にある分子が結合、二本鎖化又はハイブリダイズすることを示す。
【００２９】
「ストリンジェント条件」という用語は、プローブがその標的配列と優先的にハイブリダイズし、他の配列とは少ししか、又は全くハイブリダイズしない条件を示す。
ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる環境では異なる。配列が長いほどより高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、限定イオン強度及びｐＨでの特異的配列に関する融点（Ｔm）より約５℃低いように選択される。Ｔmは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡状態（標的配列は一般に余分に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％は平衡状態で占められる）で標的配列とハイブリダイズする温度である（限定イオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下）。典型的には、ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が少なくとも約０．０１〜１．０M Ｎａイオン濃度（又はその他の塩）であり、温度は短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃である。ストリンジェント条件はさらに、脱安定化剤、例えばホルムアミドの付加により達成され得る。
【００３０】
「バックグラウンド」という用語は、標識標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイの成分（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、アレイ基質等）との間の非特異的結合又はその他の相互作用に起因するハイブリダイゼーションシグナルを示す。バックグラウンドシグナルは、アレイ成分それ自体の固有の蛍光によっても生成される。単一バックグラウンドシグナルが全アレイに関して算出されるか、あるいは異なるバックグラウンドシグナルがアレイの各々の領域に関して算出される。好ましい実施態様では、バックグラウンドはアレイ又はアレイの領域中の最低１％〜１０％のプローブに関する平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として算出される。発現モニタリングアレイ（即ち、ここではプローブは特異的核酸（遺伝子）とハイブリダイズするよう予選択される）では、異なるバックグラウンドシグナルが各々の標的核酸に関して算出される。異なるバックグラウンドシグナルが各標的遺伝子に関して算出される場合、バックグラウンドシグナルは各遺伝子の最低１％〜１０％のプローブに関して算出される。
【００３１】
「定量する」という用語は、核酸の存在量又は濃度（例えば、遺伝子の転写レベル）を定量する情況で用いられる場合、絶対又は相対定量化を示す。絶対定量化は、公知濃度の１つ又はそれ以上の標的核酸（例えば対照核酸、例えばＢｉｏＢ又は公知量での標的核酸それ自体）を含入し、そして非公知物のハイブリダイゼーション強度を公知の標的核酸に照会することにより（例えば、標準曲線の生成により）、成し遂げられる。あるいは、相対定量化は、２つ又はそれ以上の遺伝子間、あるいは２つ又はそれ以上の処理間のハイブリダイゼーションシグナルを比較して、ハイブリダイゼーション強度の変化を、そして含蓄的に転写レベルを定量することにより成し遂げられる。
【００３２】
「ヌクレオチド三リン酸」という語は、DNAまたはRNAのいずれかとして存在するヌクレオチドを指し、したがって、塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを含み、糖部分はデオキシリボースまたはリボースである、ヌクレオチドを包含する。常套的塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルのうちの1個と塩基対形成できるその他の修飾塩基が使用できる。このような修飾塩基は、例えば8-アザグアニンおよびヒポキサンチンを包含する。
【００３３】
本明細書で使用する「ヌクレオチド」という語は、核酸の塩基と比較した時に当該核酸（DNAまたはRNAのいずれか）中に存在するヌクレオチドを指し、通常の、または上記のような修飾塩基を含むヌクレオチドを包含する。
【００３４】
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等への言及は、そのハイブリダイズ性が破壊されていない限り、糖-燐酸バックボーンが修飾され、そして/または置換されている類似の種を包含する。一例として、このバックボーンはペプチド核酸（PNA）と呼ばれる等価な合成ペプチドで置換されていてよい。
【００３５】
「ヌクレオチド種」という語は、塩基対形成ハイブリダイゼーションによって、所定の配列の検出を行うための関連ヌクレオチドの組成物であり；ヌクレオチドは化学的または酵素的に合成するが、この合成は常に完璧である訳ではなく、主たる配列は、より短い配列、または1個もしくは個のヌクレオチドが置換、付加、欠失により相違している配列といったように、別の関連配列が混在している。本発明のための1つのヌクレオチド種の本質的特徴は、その種が全体として所定の配列の捕捉に利用できるということにある。
【００３６】
本明細書に記載のsiRNAの1またはそれ以上に相補的である「ポリヌクレオチド」配列とは、ストリンジェント条件下で該RNAまたはRNAコピーのヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイズできるポリヌクレオチドを指す。siRNAのサイズが小さい事を考えれば、この捕捉分子は、他の考えられる隣接領域に比して当該siRNAを特異的に検出するため、同一であるか、または少なくとも90%以上、より好ましくは95%以上同一である配列であるべきである。
【００３７】
「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的ポリヌクレオチド配列の望ましい検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒質のストリンジェントを低下させることによって含まれることになる、多少のミスマッチを包含する。
【００３８】
「捕捉プローブ」という語は、所定のポリヌクレオチドに特異結合できる分子を意味する。ポリヌクレオチドの結合は2個のポリヌクレオチド間の塩基対形成によって達成でき、このうち一方は固定化した捕捉プローブであり、他方は検出すべき標的である。
【００３９】
本発明は、特定の、前もって定められたアレー上の位置に配置した、遺伝子配列と同一またはそれと相補的な複数の単一ヌクレオチド配列を有する、またはsiRNAを測定しようとする細胞内に存在する遺伝子に対応するmRNAを有する、アレーの使用に基づくものである。
【００４０】
本発明の主たる特徴は、細胞内に天然に存在するsiRNAを介した調節によって本質的に影響を受ける遺伝子の直接分析および全体像を得ることである。各遺伝子に関連する異なったスポットのシグナルは、分析する細胞または組織中のsiRNAの数および濃度の直接指標である。また、本発明はスクリーニングする遺伝子の数に限定されない。このアレーは、2から100個まで、より好ましくは1000個まで、そして細胞に存在する遺伝子プール全体までの分析を行うことができる。この数は、種および当該細胞の分化にもよるが、ヒトゲノムでは40000前後もの数とすることができる。
【００４１】
本発明は、アレー上の特定の位置に存在するシグナルまたはシグナルの変化（ここで、係る位置におけるこのシグナルまたはシグナル変化は、特定のmRNAに対して特異的なsiRNAの存在に関連している）を検出することにより、試料中に存在し、そして少なくとも1個の遺伝子またはmRNAまたはそれらの相補配列に対して特異的な、複数のsiRNAの検出および/または同定および/または定量を行うための方法を提供する。
【００４２】
原則として本方法は、或る細胞の幾つかの遺伝子および/または転写物を前もって定められた位置に配置させたアレーを含む支持体を提供する工程を含む。
【００４３】
支持体は一般に、ガラス、電子機器、珪素支持体、シリカ、金属またはそれらの混合物より成る群から選択できる固体表面で構成され、スライド、ディスク、ゲル層および/またはビーズより成る群から選ばれる形式に製造する。相互識別を可能にする性質を持ち、その結果、ビーズの同定が、与えられた捕捉プローブおよび標的配列の同定と相関する限り、ビーズは、本発明の状況においてアレーと考えられる。
共有結合によって幾つかの捕捉分子を支持体上に固定化するが、各々の捕捉分子は、特定の場所に位置させ、そしてsiRNAの存在をスクリーニングするための遺伝子と一致する一本鎖型の配列を少なくとも部分的に有する。
siRNAは(+)または(−)鎖の両者を含むことから、原則としてsiRNAの検出は、対応遺伝子配列の両方の鎖上で実施できる。しかしながら殆どの適用では、相補配列の使用は天然mRNAの結合をも同様に導き、これが分析を妨害する可能性がある。これが図3に示す検出方法の場合である。この場合、mRNAと同一である配列がアレー表面に存在せねばならない。図1に提起した方法では、2本鎖が使用できる。
【００４４】
一般に捕捉プローブは様々な異なる技術によって合成できるが、好ましくはアミン化したプライマーを用いてクローン遺伝子からPCR増幅によって合成する。次いでアンプリコンのアミノ基を、例えばアルデヒド、エポキシド、アクリレート、チオシアネート、N-ヒドロキシスクシンイミドといった（但しこれらに限定されない）反応性基を有する官能基化表面と反応させる。共有結合を形成させた後、加熱またはアルカリ処理によってアンプリコンの第二鎖を除去し、その結果、一本鎖DNAまたはRNAが表面上に存在するようになり、相補的siRNAまたはsiRNAコピーといつでも結合できるようになる。
【００４５】
ヌクレオチドの化学合成の進歩を考えると、化学合成ヌクレオチドの使用もまた本発明において構想できる。合成ヌクレオチドもまた好ましくはアミン化またはチオール化し、官能基化表面に沈着させる。化学合成ヌクレオチドの利点は、それらが容易に製造できることである。
【００４６】
好ましい態様では、このアレーは、本質的に完全長mRNAと同一である配列を持つポリヌクレオチドによって表される捕捉プローブを含む。別の態様では、このアレーは、完全長mRNAと本質的に相補的な配列を有するポリヌクレオチドである捕捉プローブを含む。
【００４７】
別の態様によれば、このアレーは、同じmRNA配列の少なくとも異なる別々の部分と同一である、またはそれに対し相補的なポリヌクオレチドである、幾つかの捕捉プローブを含み、その捕捉プローブは該アレーの特定の（且つ異なる）位置に存在する。好ましくは、該アレー上に存在する異なる別々の捕捉分子は、細胞中に存在する殆どの、そして好ましくは全ての遺伝子配列またはmRNAをカバーしている。よって1の遺伝子についてのsiRNAの量を、同遺伝子の異なる部分についてのシグナルの合計として算出することができる。
【００４８】
好ましい態様では、捕捉分子は、固体支持体の表面1cm2当たり10fmole、好ましくは100fmoleを超える密度で存在する。別の態様では、捕捉分子は専ら、特異的捕捉プローブを用いる同定のための化学的または物理的性質を有するビーズであるところの異なる支持体上に存在する。最も単純なアレーは1個の捕捉プローブを含むことになる。
【００４９】
本発明はさらに、与えられたsiRNA標的分子の検出のための捕捉分子がそこに結合している支持体とその基質を包含する。
遺伝子としては、生物のゲノムから誘導した、任意の既知遺伝子配列を使用できる。或いは、前記遺伝子の一部分を用に供するが、これは好ましくはコード領域、即ちエクソンから誘導する。好ましい態様によれば、遺伝子の転写物、即ち、調査しようとする細胞のmRNAプールから誘導したヌクレオチドを使用し、アレーに配置する。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを配置する方法は当分野で周知であってBowtell, D. and Sambrook（DNA Microarrays, J. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003 Cold Spring Harbor, New York, pg 1-712）に見出すことができ、この文献は引用により本明細書の一部とする。好ましい態様では、約20ないし200ヌクレオチドの間の長さを示すポリヌクレオチドであるリンカーを介して、ヌクレオチド配列を支持体に結合させる（EP 1266034）。原理上捕捉プローブはDNA、PNAまたはRNAであってよい。
【００５０】
次の工程（工程(ii))では、目的細胞由来のsiRNAを単離する。siRNAの単離プロセスの例は、例えばTuschl et al. 1999に記載されており、この文献を引用により本明細書の一部とする。
【００５１】
単離したsiRNAは、この検定に直接使用でき、または、好ましくは検定の実施に先立ちさらなる加工を行うことができる。
【００５２】
好ましい態様によれば、siRNAを使用前に標識する。この標識化は、例えば蛍光、比色分析、化学もしくは生物発光、電気的、磁気的、または特にビオチンによって検出できる特異的分子をsiRNAに結合させることによって実施できる。ビオチン標識したヌクレオチドを結合/組み込みし、次いでこれを抗体もしくはストレプトアビジンまたは関連結合分子であるところの結合蛋白によって認識する。この結合蛋白を、任意の化学的または物理的手段によって標識し、検出および定量する。シグナルの増幅が必要である場合には、間接的標識化もまた有用である。
【００５３】
siRNAの標識化はさらに、RNA-DNAハイブリッド複合体の形成が得られる条件下でsiRNAをssDNAプローブの混合物とインキュベートすることによって実施でき、その結果、小RNAの伸長と同時標識化が達成できる。ここではssDNAをマトリックスとして使用し、標識化リボヌクレオチド/デオキシヌクレオチドを伸長のために利用する。ハイブリッド複合体の形成に利用するssDNAは、結合したsiRNAの伸長が可能である限り、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド様分子に置き換えることができる。変性の後、標識した鎖を用いて、転写物の検出および/または定量のため、アレー上に存在する捕捉プローブと共にインキュベートする。
【００５４】
これに代わる態様では、アレー上に存在する捕捉プローブが、それらの3'末端に標識を含み得る。siRNAの結合の後、RNA/DNAハイブリッドをRNaseHで開裂させ、そのようにして、siRNAが結合した捕捉プローブから標識をはずす。故に、この態様では、シグナルの低下が、試料に存在するsiRNAの存在を表す。
【００５５】
siRNAの配列はまた、放出配列のさらなる分析を行うことによって測定することができる。
【００５６】
第一の態様では、第二DNAマイクロアレー上に存在する特異的捕捉プローブ上でのハイブリダイゼーションにより、放出されたフラグメントを検出および/または定量および/または同定することができる（図3を参照されたい）。第二の態様では、放出されたフラグメントを電気泳動の後に分離、同定および/または定量する。放出されたフラグメントのサイズがsiRNAの結合位置を示し、それらの同定を可能にする。放出された配列の配列分析もまた、同じ同定につながる（図3）。
【００５７】
siRNAはさらに、対応するDNAコピーへと転写され、またはPCRによって増幅され得る。したがって、形成される鎖に標識化ヌクレオチドを組み込ませる逆転写酵素を用いてこの複製を実施できる。さらに、siRNAをPCR反応に付すことができるが、これは原則として、溶液中の複数の抽出siRNAを用いて平滑末端ライゲーションを遂行するために、3'-および5'-アダプターオリゴヌクレオチドを使用することを含む。次いでこのようにして得られた生成物を、3'-アダプターに対して相補的な3'-RTプライマーで逆転写する。しかる後、cDNAの5'-プライマー相補性を用いて、そして3'-RTプライマーの存在下でPCR増幅サイクルを実施する。このPCR反応の間に標識化ヌクレオチドをアンプリコン中に組み込む。
【００５８】
次の工程（工程(iii)）では、siRNAまたはこれから誘導した分子（例えば、DNA-コピーまたはアンプリコン）を、siRNAまたはこれから誘導した分子がアレー上に存在する捕捉プローブとハイブリダイズ可能条件の下で、該アレーと接触させる。二本鎖の形成にとって充分な時間の後、シグナルまたはシグナルの変化を該アレーの特定位置で検出する。
【００５９】
siRNAまたはこれから誘導した分子がハイブリダイゼーション工程前に標識されている場合には、固定化された標識化標的の存在が、試料中にsiRNAが存在することを示し、そして、それに結合する遺伝子を知った上で、どの転写物がこの機構によって細胞中で制御されるかが示される。アレー上の固定化標識化標的の量は、適切な条件下で実施するならば、siRNAに比例するであろう。
【００６０】
標的分子と捕捉分子の間の結合位置に形成されるシグナルの検出および/または定量装置、好ましくはさらに、該固体支持体表面に記録される情報の読み取り装置、対応する捕捉分子上に結合した標的分子を持つ別個の領域およびそれらの位置を認識するためのコンピュータープログラム、好ましくはさらに、その位置に存在するシグナルの定量プログラム、ならびに、それらの位置にあるシグナルの存在を、本発明に係る検出すべき成分の診断および/または定量と相関させるためのプログラム、を含む機器によって、固体支持体上に存在する異なる捕捉プローブに結合した標的の存在を、分析し、同定し、そして/または定量することができる。
【００６１】
本明細書に規定する原則は、遺伝子配列および/または転写物上で結合したsiRNAの正確な位置を決定する方法にも利用することができる。この目的のため、遺伝子または転写物各々の配列を異なる位置でアレー上に配置し、ハイブリダイゼーションの際に、その遺伝子および/または転写物のどの部分にsiRNAが結合するのかを決定することができる。
【００６２】
本発明により提供される知識は、RNAi配列を内包する配列を含む新しい医薬の設計を可能にする。
【００６３】
さらに、本発明は、遺伝子翻訳の調節に適した化合物についてのスクリーニングに、または、生物学的または化学的化合物の存在下で細胞反応を追跡するために好適である。
【００６４】
或る態様によれば、細胞、組織または生物を1個の分子の存在下に置き、本発明に係る分析を実施する。異なる遺伝子に特異的なスポット強度の分析は、与えられた化合物無しでインキュベートした細胞に比較した、該細胞内に存在するsiRNAの見積りおよびことによると定量をも可能にする。本発明は、1または幾つかの特定遺伝子を指向するsiRNAのトランスフェクトの有効性を決定するのにとりわけ有用である。
【００６５】
特定の遺伝子についてのsiRNAレベルの変化を測定し、その化合物によって生物、細胞または組織中に起こる変化の最初の全体像を得る。化合物には、サイトカイン、成長ホルモンといった生体分子、または細胞に影響を及ぼす任意の生体分子が含まれる。薬物、毒性分子といった化学的化合物、植物もしくは動物抽出物由来の化合物、コンビナトリアル化学を包含する有機合成に由来する化学物質もまた含まれる。本発明は、遺伝子転写の細胞調節に関してこれらの化合物をスクリーニングするのに特に適している。生物における変化の全体像は、以下のような生命維持に関わる細胞の主要機能を指向する、活性であると思われるsiRNAを求めるスクリーニングによって最もうまく取得できる：アポトーシス、細胞接着、細胞周期、増殖因子およびサイトカイン、細胞シグナル伝達、染色体プロセシング、DNA修復/合成、中間体代謝、細胞外マトリックス、細胞構造、蛋白代謝、酸化的代謝、転写およびハウスキーピング遺伝子。本発明の最良の適用は、13の主要細胞機能のうち少なくとも9つに関与する蛋白に対応する遺伝子を指向するsiRNAを検出するためのものである。さらに或る特別の態様では、上記13の生命維持に関わる機能を包含する（但し、細胞分化、腫瘍遺伝子/腫瘍サプレッサー、ストレス反応、脂質代謝、プロテアソーム、循環といった特殊機能をも包含する）1個の細胞の機能に由来する少なくとも5個の遺伝子に対応する遺伝子に対する、細胞中に存在するsiRNAを同定および/または定量するために、このアレーを利用する。さらに本発明は、生物学的、薬学的、治療学的または病理学的興味の持たれる1つの特定機能に関係する遺伝子に焦点を合わせる時、最良となる。
【００６６】
或る態様では、細胞、組織または生物を、特定の物理的、化学的または生物学的条件でインキュベートし、本発明に従って分析を実施する。特定の物理的条件とは、pH、温度、圧力といった物理的パラメータを変化させた条件のみを意味する。
【００６７】
特定の化学的条件とは、塩類、酸素、栄養分、蛋白、糖質（炭水化物）および脂質を包含する1または数種類の化学物質の濃度を、対照またはレファランス条件と比較して変化させた任意の条件を意味する。
【００６８】
特定の生物学的条件とは、細胞、組織または生物に影響を及ぼす、加齢、ストレス、トランスフォーメーション（癌）、病理、を包含する、生細胞、組織または生物における任意の変化を意味する。
【００６９】
故に、本明細書に記載の方法および支持体を診断および/または定量キットの一部として利用することができ、そのキットは、硬質支持体表面1cm2当たり少なくとも4個の異なる捕捉プローブという密度を有するアレーの形態で支持体上に存在する捕捉プローブに結合した後に検出される標的分子を含む生体試料を分析するための手段および媒質を含む。その単純な態様において、このキットはさらに、単一の捕捉プローブを有する支持体をも含み得る。
【００７０】
試料中に存在する少なくとも1の遺伝子に対して特異的な複数のsiRNAの検出および/または同定および/または定量のためのキットもまた本発明によって提供され、そのキットは、mRNAもしくはその一部と同一であるまたはこれに相補的な配列を有し且つアレーの特定位置に存在する捕捉プローブ、を有するアレー、ならびに緩衝剤および標識を含む。
【００７１】
少なくとも1の遺伝子に対して特異的なsiRNAの存在を検出することにより、或る化合物が遺伝子発現に及ぼす影響を試験するためのスクリーニング装置もまた提供され、そのスクリーニング装置は、mRNAもしくはその一部と同一であるまたはこれに相補的な配列を有し且つアレーの特定位置に存在する捕捉プローブを含むアレー、ならびに所望により緩衝剤および標識を含む。
以下の実施例は、本発明を限定することなく例示するものである。
【実施例】
【００７２】
siRNAを細胞培地から抽出し、引き続きプロテイナーゼKで処理し、変性15%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。少なくとも18-24ntのサイズ範囲を含むバンドを切り取り、次いでシリコーン処理した管中、0.3M NaCl中に4℃で一夜溶出した。このRNAをエタノール沈殿で回収し、次いで脱燐酸化した（30μl反応、50℃、30分間、10Uアルカリホスファターゼ；Roche）。
【００７３】
フェノール/クロロホルム抽出によって反応停止させ、RNAをエタノール沈殿させた。次に、3'アダプターオリゴヌクレオチド（pUUUaaccg catccttctcx（配列番号1）：大文字、RNA；小文字、DNA；p、燐酸；x、4-ヒドロキシメチルベンジル）を、脱燐酸化した〜21-nt RNAにライゲーションした（20μL反応、37℃、30分間、5μM 3'アダプター、50mM Tris-HCl（pH7.6）、10mM MgCl2、0.2mM ATP、0.1mg/mlアセチル化BSA、15% DMSO、25U T4 RNAリガーゼ；Amersham-Pharmacia)(Pan and Uhlenbeck 1992）。同体積の8M尿素/50mM EDTA stopmixを添加してライゲーション反応を停止させ、15%ゲルに直接ロードした。このライゲーション生成物をゲルから回収し、5'燐酸化した（20μL反応、37℃、30分間、2mM ATP、5U T4ポリヌクレオチドキナーゼ；NEB）。
【００７４】
フェノール/クロロホルム抽出により燐酸化反応を停止させ、RNAをエタノール沈殿により回収した。次に、5'アダプター（tactaatacgactcactAAA（配列番号2）：大文字、RNA；小文字、DNA）を、上記のようにしてこの燐酸化ライゲーション生成物にライゲーションした。この新たなライゲーション生成物をゲル精製し、担体として用いる逆転写プライマー（GACTAGCTGGAATTCAAG GATGCGGTTAAA（配列番号3）：下線字、EcoRI部位）の存在下でゲル切片から溶出した。逆転写（15μL反応、42℃、30分間、150U Superscript II逆転写酵素；Life Technologies）の後、5'プライマーCAGCCAACGGAATTCATACGACTCAC TAAA（配列番号4）（下線字、EcoRI部位）、3'RTプライマーおよびビオチン-dATP/ビオチン-dCTPミックス（各々10μM）を用いてPCRを実施した。
【００７５】
次いで、標識したPCR生成物を202の遺伝子に対して特異的なssDNA捕捉プローブを有するDual Chips Human Generalマイクロアレー上でハイブリダイズした（Eppendorf, Hamgurg, Germany）。このdual chips Human Generalは13の主要な生命維持に関わる細胞機能に属する202の遺伝子と少なくとも部分的に同一である配列を有する捕捉分子を含んでいる。ビオチンに対するCy3標識化抗体を使用し、Delongueville et al（Biochem Pharmacol. 2002, 64:137-49）に記載のようにして、結合した標的の標識化を行い、このアレーをレーザー共焦点スキャナー「ScanArray」(Packard, USA）を用いて分解能10μmでスキャンした。
【００７６】
画像を取得した後、スキャンした16ビット画像を、シグナル強度の定量に利用するソフトウェア「ImaGene4.0」(BioDiscovery, Los Angeles, CA, USA）に入れた。シグナル強度からローカルバックグラウンド強度を差し引くことによって、全遺伝子のスポットの強度を最初に補正した。
【００７７】
実験全体を評価するため、最初に幾つかの正および負の対照（ハイブリダイゼーションおよび検出に関する）を分析する。次に、試料中の特定遺伝子に特異的なsiRNAの存在時または不在時の結果を関係付けるため、各siRNAスポットに関して得られたシグナルを分析する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】アレー上でのsiRNAの検出の態様を示す。siRNAをアダプターにライゲーションし、次いでこれをプライマーの結合およびRT-PCRによる増幅に使用する。次に、増幅した標識アンプリコンを、分析を必要とする遺伝子と少なくとも部分的に同一である配列を持つマイクロアレー上で検出する。
【図２】siRNAの検出のためのもう1つの態様を示し、ここでは、まずsiRNAをそれらの相補的DNA鎖と共に溶液中でインキュベートし、伸長および標識化の後、分析を必要とする遺伝子と少なくとも部分的に同一である配列を持つアレー上でハイブリダイズすることにより、siRNAを検出する。
【図３】siRNA検出のもう1つの態様を示し、ここでは、変性したsiRNAを、分析を必要とする遺伝子と少なくとも部分的に同一である固定化標識化DNA配列を持つアレー上でインキュベートし、RNaseHによる処理後に放出されるフラグメントを決定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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