(57)【要約】【課題】本発明は、比較的硬い卵細胞に対しても安定して挿入することが可能な遺伝子挿入用針及び当該遺伝子挿入用針の製造方法を提供することにある。【解決手段】本発明の遺伝子挿入用針は、針の太さが50μmになるまでの針先からの距離が450μm未満であることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
針の太さが50μmになるまでの針先からの距離が450μm未満である遺伝子導入用針。
【請求項２】
前記遺伝子導入針が、略くびれ型で構成されている請求項1記載の遺伝子導入用針。
【請求項３】
前記遺伝子導入用針が、ガラス管を挿入する際に重要な部位、ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位、ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位から構成される請求項１又は2項に記載の遺伝子導入用針。
【請求項４】
前記ガラス管を挿入する際に重要な部位のガラス管の太さが、10μｍ以下である請求項3記載の遺伝子導入用針。
【請求項５】
ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位のガラス管の太さが、25μm以下である請求項3記載の遺伝子導入用針。
【請求項６】
ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位のガラス管の太さが、40〜60μmの範囲である請求項3記載の遺伝子導入用針。
【請求項７】
前記ガラス管を挿入する際に重要な部位の長さが、針先端から90〜120μmの範囲である請求項3記載の遺伝子導入用針。
【請求項８】
ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位の長さが、針先端から150〜200μmである請求項3記載の遺伝子導入用針。
【請求項９】
ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位のガラス管の長さが、針先端から210〜280μmの範囲である請求項3記載の遺伝子導入用針。
【請求項１０】
請求項１〜9記載の遺伝子導入用針を製造するに際し、前記ガラス管を複数回加熱して引き伸ばすことを特徴とする遺伝子導入用針の製造方法。
【請求項１１】
一段目の引き伸ばし温度が、二段目の引き伸ばし温度より高いことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入用針に関し、特に、形状を規定した遺伝子導入用針に関する。
【背景技術】
【０００２】
IMF(顕微受精)をはじめとするマイクロインジェクションでは、卵や細胞内部の意図する部位までガラス針を刺入して、初めて安定したインジェクションを可能とする。
【０００３】
従来からある遺伝子導入用のガラス針の特徴として、十分に細かい先端を有し、シャンクが長いものであった。これは主として、このようなガラス針は、一段引き、すなわち、一度熱を与えてガラスを溶かしたのち1度のプルでガラスを切断する方法が取られていることに起因すると考えられていた。
【特許文献１】なし
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、遺伝子挿入用ガラス針は市販されているものの、既存の形状は動物細胞等に最適化された形状であり、ワムシ類などの固い殻を有する卵には不適であるという問題があった。
【０００５】
すなわち、上述のようなシャンクの長い針は、一般に腰が弱く、研磨に多くの時間を割かねばならないという問題点を有していた。
【０００６】
また、一般にガラス針の作製には、常に同じ形状のガラス針を作製するのが困難であるという、いわゆる再現性の問題を有している。これは、融点の非常に高いガラスから微小な針を安定して作製しようとすれば、1000分の1秒単位での細かいコントロールが必要だからである。例えば、ガラスを最終的にプルするタイミングをわずか数ミリ秒変えただけで、あるいは強制冷却の時間を数ミリ秒変えただけで、もうガラス針の形状が変化してしまう。なぜなら、ガラスは、１０００分の1秒単位で急速に冷却してしまうためである。
【０００７】
また、上述のように、販売されているガラス針は、シャンクが長く、動物細胞や哺乳類の卵細胞等比較的柔らかい細胞に対して挿入が可能であったが、固い膜や殻を有するサンプルには挿入が困難であるという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、比較的硬い卵細胞に対しても安定して挿入することが可能な遺伝子挿入用針及び当該遺伝子挿入用針の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、発明者らは、ガラスの形状に着目し、腰の強い形状であって、かつ、試料もスムーズに刺入可能な本発明の遺伝子挿入用針及び当該遺伝子挿入用針の製造方法を見出すに至った。
【００１０】
本発明の遺伝子挿入用針は、針の太さが50μmになるまでの針先からの距離が450μm未満であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の遺伝子挿入用針の好ましい実施態様において、前記遺伝子導入針が、略くびれ型で構成されていることを特徴とする。
【００１２】
本発明の遺伝子挿入用針の好ましい実施態様において、前記遺伝子導入用針が、ガラス管を挿入する際に重要な部位、ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位、ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位から構成されることを特徴とする。
【００１３】
本発明の遺伝子挿入用針の好ましい実施態様において、前記ガラス管を挿入する際に重要な部位のガラス管の太さが、10μｍ以下であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の遺伝子挿入用針の好ましい実施態様において、ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位のガラス管の太さが、25μm以下であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の遺伝子挿入用針の好ましい実施態様において、ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位のガラス管の太さが、40〜60μmの範囲であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の遺伝子挿入用針の好ましい実施態様において、前記ガラス管を挿入する際に重要な部位の長さが、針先端から90〜120μmの範囲であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の遺伝子挿入用針の好ましい実施態様において、ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位の長さが、針先端から150〜200μmの範囲であることを特徴とする。
【００１８】
本発明の遺伝子挿入用針の好ましい実施態様において、ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位のガラス管の長さが、針先端から210〜280μmの範囲であることを特徴とする。
【００１９】
本発明の遺伝子挿入用針の製造方法は、請求項１〜9記載の遺伝子導入用針を製造するに際し、前記ガラス管を複数回、加熱して引き伸ばすことを特徴とする。
【００２０】
本発明の遺伝子挿入用針の製造方法の好ましい実施態様において、一段目の引き伸ばし温度が、二段目の引き伸ばし温度より高いことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の遺伝子導入用針によれば、サンプルに挿入する際、針先にかかる力が横方向に逃げず、針先の破損も市販針よりおこりにくいため、堅いワムシ類の卵に挿入可能である。つまり、本発明の形状を有するガラス針は、ワムシ類の卵だけでなく、従来のガラス針では挿入が困難であった堅いサンプルに対してガラス針の挿入が可能であるという有利な効果を奏する。
【００２２】
本発明の遺伝子導入用針によれば、既存のガラス針で挿入不可であったワムシ類の卵に針を挿入することが可能となり、マイクロインジェクターによる遺伝子導入の道が開けた。また、ワムシ類の卵だけでなく、既存のガラス針では挿入が困難であった堅い膜や殻を有している細胞等にも挿入が可能であるという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の遺伝子挿入用針は、針の太さが50μmになるまでの針先からの距離が450μm未満である。これは、従来では、ガラス針の作製は、一段引き、すなわち、1度熱を与えてガラスを溶かしたのち1度のプルでガラスを切断する方法がとられており、シャンクが必然的に長いものであったが、これでは、硬い卵細胞などに対しては対応できないため、シャンクの長さを十分に短くしたものである。本発明の遺伝子導入用針は、いわゆるシャンクの長さが短い点特徴を有するが、シャンクの長さの正確な測定が困難なことから、一例として、針の太さが50μmになるまでの針先端から距離を450μmと規定することで、本願の特徴を芦原下ものである。また、本願の遺伝子導入用針のシャンクが短いという特徴を出すために、縦横比で規定すれば、針の太さが50μmになるまでの針先から距離との縦：横は、30〜90：1、より針の腰の強さを高めるという観点から、好ましくは、40〜60：1とすることができる。
【００２４】
ここで、シャンクについて説明すれば以下のようである。一般に、マイクロインジェクターで用いるガラス針のシャンクとは、ガラス針を引き延ばして細くなっていく箇所から、針の先端までの部位を意味する。通常は1mmのガラス管をヒーターで熱しながら引き延ばしてガラス針を作成する。シャンクとは、引き延ばすことによって、1mmより少しでも細くなった箇所から先端までを意味する。
【００２５】
また、遺伝子挿入用針は、サンプルの損傷を最小にするため挿入部位を出来る限り細くし、かつ、硬いサンプルにも挿入可能とするために腰が強い形状が必須であるという観点から、くびれ型で構成されていることが好ましい。
【００２６】
そして、本発明の遺伝子挿入用針は、主として、ガラス管を挿入する際に重要な部位、ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位、ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位から構成されることが好ましい。これらの3つの部位が、腰の強い遺伝子挿入用針を作製する上で、鍵となる部分と考えられる。針先の太さを３点で規定している意味合いは、それぞれの太さが必要であると検証して出てきた数値ではないが、おおよそこのくらい有れば大丈夫であると推定した数値である。
【００２７】
また、前記ガラス管を挿入する際に重要な部位のガラス管の太さが、10μｍ以下であることが、サンプルに針を挿入する際、この程度の太さがサンプルの損傷が最小限に抑えられる限界であろうと考えられることから、好ましい。但し、この数値は使用するサンプルによって異なり多少変動する値である。また、ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位のガラス管の太さは、この程度の太さであれば、針先をサンプルに挿入する際、針がたわまずに針先に力が集中できるという観点から、25μm以下であることが好ましい。さらに、ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位のガラス管の太さは、最低限この程度の太さがないと、曲げる事が困難であるという観点から、40〜60μmの範囲であることが好ましい。曲げ加工を容易にするという観点から、さら太い範囲で曲げ加工を行っても良い。
【００２８】
なお、針の曲げ加工の理由は、針を取り付けるホルダーに角度がついており、このホルダーは左右上下前後にしか稼動できないため、針をサンプルに垂直に挿入するにはホルダーと同じ角度に曲げる場合があるからである。したがって、何らかの曲げ加工を行なう場合には必要であるが、特に曲げ加工の必要がない場合には、このような角度は特に限定されない。
【００２９】
また、好ましい実施態様において、前記ガラス管を挿入する際に重要な部位の長さが、針先端から90〜120μmの範囲である。ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位の長さは、針先端から150〜200μmの範囲であることが好ましい。ガラス管を曲げ加工する際に重要な部位のガラス管の長さは、針先端から210〜280μmの範囲であることが好ましい。
【００３０】
次に、本発明の遺伝子挿入用針の製造方法について説明する。本発明の遺伝子挿入用針の製造方法は、ガラス管を複数回、加熱して引き伸ばすことにより得られる。
【００３１】
本針はガラスを熱して引き延ばして作成するため、室温等の微妙な温度の違いによって針の形状が異なる。このような観点から、針作製機を設置している部屋は空調を完備し、一定温度、例えば室温２５℃で作業することが望ましい。また、連続で機器を作動させることで、徐々に熱がこもってくるため多くの針を一度に作成することを控えるのが良い。
【００３２】
遺伝子挿入針は、サンプルの損傷を最小にするため、挿入部位を出来る限り細くし、かつ、硬いサンプルにも挿入可能とするために腰が強い形状が必須であるという観点から、ガラス針が急激に細くなり、しかも先端の細い部位の長さが短い形状であるくびれ型で構成されていることが好ましい。そのために、一度にガラス管を熱して引き延ばすのではなく、二段等複数回に分けて引き延ばすことでくびれ型を作成する事が好ましい。一段目でガラス管を引き伸ばす際、ヒーター電圧は1.65〜1.75 V、二段目でガラス管を引き伸ばす際は、急激に針先を細くかつ短くするという観点から、ヒーター電圧は1.4〜1.5 Vとするのが好ましい。
【００３３】
したがって、サンプルの損傷を最小にするため、挿入部位を出来る限り細くし、かつ、硬いサンプルにも挿入可能とするために腰が強い形状が必須であるという観点から、一段目の引き伸ばし温度が、二段目の引き伸ばし温度より高いことが好ましい。一段目の引き伸ばし温度とは、最初にガラス管を引き伸ばす際に要する温度であり、この引き伸ばしによって、ガラス管を曲げ加工するのに重要な部位を作製することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００３５】
実施例１
針作製はNarishige社製PC-10を用い,比較的堅いサンプルに対して挿入可能な太い筒所から急激に細くなる形状のガラス針(くびれ型)を作製するため、ヒーター設定のデフォルト値を参考に最適化を行なった。くびれ型を作製するための基本的な方法は、二回に分けてガラス管を熱して引き伸ばす二段引きである。針作製機に付属するくびれ型作製用のデフォルト値である、一段目ヒーター値６５(移動距離6mm)、二段目ヒーター値８５(移動距離3mm),ガラス管を引く重り(最大)を参考にし、ワムシ類の卵に挿入可能なガラス針の作製を試みた。
【００３６】
ここで、ヒーター値とは、ガラス針を作成する際にガラス管を熱して柔らかくするためのコイル状のヒーター温度を意味する。数値と温度は比例関係にあるが、
ヒーター値がそのまま温度を表していない。カンタル線ヒーターと温度の関係は、ヒーターの劣化具合や使用環境で異なるため、温度に置き換えることが困難であるので、ヒーター値の値を規定している。
【００３７】
針作製機を製造販売している会社によれば、ヒーター目盛りは、カンタル線ヒーターの電圧が２．５Vの時を目盛り１００として数値化している。よって、発明の概要で記載したヒーター値は、次のとおりとなる。すなわち、本実施例で使用したヒーター値と電圧値との関係は、ヒーター値５５→電圧値１．３７５V、ヒーター値５６〜５８ →電圧値１．４〜１．４５V、ヒーター値６５→電圧値１．６２５V、ヒーター値６８→電圧値１．７V、ヒーター値８５ →電圧値２．２１５Vとなる。
【００３８】
くびれ型の形状を具体的な数値として表現することは困難であるので、先端から3点の太さ(10μm、ガラス管を挿入する際に重要な部位；２５μｍ、ガラス管を挿入する際に針先に力を集中するのに重要な部位；５０μｍ、ガラス管を曲げ加工(30℃)するのに重要な部位)を決め,それぞれの距離を求めた。まず二段目ヒーターを55(デフォルトの値では針先が長くなりすぎるため本値に設定)に固定し一段目ヒーター値の最適化を行なった。
【００３９】
その結果(表１：A、先端からガラス管の太さが10μmになる距離、；B、10〜25μmの太さになる距離；C、25〜50μmの太さになる距離)、一段目ヒーターが68の時、Cの値が最大となった。作製した針約30℃の角度に曲げて使用するため、C付近の部位は長い方が加工しやすい。よって、一段目ヒーター値が68が最適であることを見出した。
【００４０】
【表１】
2005160393.tif 000002
【００４１】
表１は一段目ヒーターに対する針形状の変化を示す。表中、Aは、選択からガラス管の太さが10μmになる距離(μm)を示し、Bは、10から2５μmになる距離(μm)を示し、Cは、2５〜5０μmの太さになる距離(μm)を示す。このとき、団引きめのヒーター値(二段目ヒーター)は、５５に固定した。
【００４２】
その結果、一段目のヒーターは主にC値に影響を与えることが分かった。ガラス針は約30℃の曲げ加工を行い使用するため、C値が大きいほど加工しやすくなることが分かる。よって、C値が最大と成る一段目ヒーター数値を最適値とした。
【００４３】
次に一段目ヒーターを６８に固定し、二段目ヒーター値の最適化を行なった。最適値は、(1)針先をサンプルに挿入するのに必要なAの長さが約100μm、(2)Bの長さは力が横方向に逃げにくくするために短くする、以上2点とした。その結果(表2)、二段目ヒーター値は５６〜５８が前述の条件を満たし、最適値は５８であった。
【００４４】
【表２】
2005160393.tif 000003
【００４５】
表２は、二段目ヒーターに対する針形状の変化を示す。表中、Aは、選択からガラス管の太さが10μmになる距離(μm)を示し、Bは、10から2５μmになる距離(μm)を示し、Cは、2５〜5０μmの太さになる距離(μm)を示す。このとき、一段引きのヒーター値(一段目ヒーター)は、６８に固定した。
【００４６】
その結果、二段目のヒーター値は、ガラス針の先端形状(A値、B値が関与)に影響を与えることが判明した。最適値は、１）針先をサンプルに挿入するのに必要なA値が約１００μm、２）B値は力が横方向へ逃げにくくするようため小さく(短く)するのが好ましいことが判明した。よって、二段目ヒーター値は、５６〜５８が好ましく、５８値が最適であることが判明した。
【００４７】
最適化した条件で作製したガラス針と市販品の大きな違いは、ガラス針が細くなり始めてから先端までの部位である。市販品の針の先端は６〜７μmの太さが約450μm以上であり(HUMAGEN  図１A,D)、本発明のガラス針とは形状が大きく異なる(図１A,D,C,F)。この市販針はシャンクが長く針先の腰があまり強くないため、堅いサンプルに針を挿入する際、シャンク部位がしなり針挿入は困難である。また、別メーカーの針（Eppendorf社製フェムトチップ  図１B、E）は、本発明のガラス針と形状が似ており,太い部位から急速に細くなりシャンクが比較的短い形状のくびれ型である(図１B、E、C、F)。しかし、この市販針と本発明の針の形態は似ているが、針先端の形状が大きく異なる。フェムトチップのA、B,C値はそれぞれ272.5μm、132μm、66.6μm、本発明の針は約100μm、約70μm、約70μmである。フェムトチップはサンプルに挿入する針先の長さが、本発明より２〜2.5倍程度長いため、本発明の針より針先の力が横方向に逃げやすい形状となっている。また,フェムトチップは先端が非常に細く(1μm)、さらに細い部位が長いため、ワムシ類の卵に対して使用すると針先が容易に破損し挿入不可であり、固い膜や殻を有するサンプルには使用できない。
【００４８】
本発明のガラス針の形状は、１．先端の太い部位から急激に細い形状で、シャンクが短く腰が強い、２．針先の先端径が破損しにくい太さを有しているなどの特徴を有している。
【００４９】
本発明の針の作製方法
１．直径1mm、長さ90mmのガラス管をNarishige社製PC-10に取り付ける。
２．一段目ヒーター値を68、二段目ヒーター値を55〜58に設定する。
３．ガラス管を引き伸ばす重りを最大にする。
４．上記条件にて二段引きでガラス管を引き伸ばす。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、堅い膜や殻を有していたため、マイクロインジェクターを用いた遺伝子導入方法が困難であった生物種に対して形質転換体作製の第一段階をクリアさせた。これにより、現在世界中で行なわれているマイクロインジェクターを用いた遺伝子組み換え体作製に関して本ガラス針は貢献可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、従来の針と本発明の一実施態様における針との針先の形状を比較したものを示す。図１A、Dは、HUMAGEN社製の針を示し、図１B、Eは、Eppendorf社製を示し、図１C,Fが本発明の針を示す。括弧内の数値は,倍率を示す。
【図１】
2005160393.tif 000004