(57)【要約】【課題】  グリコサミノグリカン分解酵素の活性を簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定する方法を提供すること。【解決手段】  「担体が結合したグリコサミノグリカン」が固着された固相に検体を接触させ、当該グリコサミノグリカンに検体中のグリコサミノグリカン分解酵素を作用させるステップ、固相に固着されている前記作用後のグリコサミノグリカンに、グリコサミノグリカン結合性蛋白質を接触させるステップ、及び前記作用後のグリコサミノグリカンに結合した前記グリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出するステップを少なくとも含む、検体中のグリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法。構成成分として、「担体が結合したグリコサミノグリカン」が固着された固相、及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質を少なくとも含む、グリコサミノグリカン分解酵素の活性測定キット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）のステップを少なくとも含む、検体中のグリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法。
ステップ（Ａ）：「担体が結合したグリコサミノグリカン」が固着された固相に検体を接触させ、当該グリコサミノグリカンに検体中のグリコサミノグリカン分解酵素を作用させるステップ。
ステップ（Ｂ）：固相に固着されている前記作用後のグリコサミノグリカンに、グリコサミノグリカン結合性蛋白質を接触させるステップ。
ステップ（Ｃ）：前記作用後のグリコサミノグリカンに結合した前記グリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出するステップ。
【請求項２】
担体が物質が蛋白質であることを特徴とする、請求項１に記載の活性測定方法。
【請求項３】
グリコサミノグリカン結合性蛋白質が標識されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の活性測定方法。
【請求項４】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の活性測定方法。
【請求項５】
下記構成成分（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む、グリコサミノグリカン分解酵素の活性測定キット。
構成成分（ａ）：「担体が結合したグリコサミノグリカン」が固着された固相。
構成成分（ｂ）：グリコサミノグリカン結合性蛋白質。
【請求項６】
担体が蛋白質であることを特徴とする、請求項５に記載の活性測定キット。
【請求項７】
グリコサミノグリカン結合性蛋白質が標識されていることを特徴とする、請求項５又は６に記載の活性測定キット。
【請求項８】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸であることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の活性測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法及び活性測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中で使用する略号は以下の通りである。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin）
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）  
ＧＡＧａｓｅ: ＧＡＧ分解酵素
ＨＡ：ヒアルロン酸（hyaluronic acid）
ＨＡａｓｅ：ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）
ＨＲＰ：西洋ワサビのペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
ＩＦＮ−γ：インターフェロン−γ
ＫＬＨ：キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin）
ＭＥＳ：２−モルホリノエタンスルホン酸（2-morpholinoethanesulfonic acid）
ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水（phosphate buffer saline）
ＴＭＢ：3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン
特許文献１には、蛋白質が結合したＧＡＧが固着された固相が記載されている。しかし、ＧＡＧａｓｅの活性測定や、ＧＡＧａｓｅの活性測定キット等に関しては何らの記載も示唆もない。
【０００３】
特許文献２には、ＨＡによって被覆した固相を用いたＨＡａｓｅの活性測定方法が記載されている。しかし、「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相を用いることに関しては記載も示唆もない。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−９７９４０号公報
【特許文献２】特表２０００−５０４１１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＧＡＧａｓｅの活性を簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相に検体を作用させ、更にＧＡＧ結合性蛋白質を作用させることにより、検体中のＧＡＧａｓｅの活性を簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、下記ステップ（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、検体中のＧＡＧａｓｅの活性測定方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。
ステップ（Ａ）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相に検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧａｓｅを作用させるステップ。
ステップ（Ｂ）：固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに、ＧＡＧ結合性蛋白質を接触させるステップ。
ステップ（Ｃ）：前記作用後のＧＡＧに結合した前記ＧＡＧ結合性蛋白質を検出するステップ。
【０００８】
なかでも、「担体」は「蛋白質」であることが好ましい。
【０００９】
また「ＧＡＧ結合性蛋白質」は標識されたものであることが好ましい。
【００１０】
また、「ＧＡＧａｓｅ」が「ＨＡａｓｅ」であり、「ＧＡＧ」が「ＨＡ」であり、かつ、「ＧＡＧ結合性蛋白質」が「ＨＡ結合性蛋白質」であるものが好ましい。
【００１１】
また本発明は、下記構成成分（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む、ＧＡＧａｓｅの活性測定キット（以下、「本発明キット」という。）を提供する。
構成成分（ａ）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相。
構成成分（ｂ）：ＧＡＧ結合性蛋白質。
【００１２】
なかでも、「担体」は「蛋白質」であることが好ましい。
【００１３】
また「ＧＡＧ結合性蛋白質」は標識されたものであることが好ましい。
【００１４】
また、「ＧＡＧａｓｅ」が「ＨＡａｓｅ」であり、「ＧＡＧ」が「ＨＡ」であり、かつ、「ＧＡＧ結合性蛋白質」が「ＨＡ結合性蛋白質」であるものが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明方法は、これを用いることにより、簡便、迅速、安価かつ高感度に、高い再現性と高い定量性をもって検体中のＧＡＧａｓｅ活性を測定することができ、極めて有用である。さらに本発明キットは、本発明方法のより簡便かつ迅速な実施を可能にすることから非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のステップを少なくとも含む、検体中のＧＡＧａｓｅの活性測定方法である。
【００１７】
ステップ（Ａ）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相に検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧａｓｅを作用させるステップ。
【００１８】
ステップ（Ｂ）：固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに、ＧＡＧ結合性蛋白質を接触させるステップ。
【００１９】
ステップ（Ｃ）：前記作用後のＧＡＧに結合した前記ＧＡＧ結合性蛋白質を検出するステップ。
【００２０】
本発明において「担体」とは、ＧＡＧと、後述する固相との両方に化学的または物理的に結合し得る物質を意味する。
【００２１】
本発明で用いることができる担体としては、蛋白質、脂質等が例示されるが、その「担体が結合したＧＡＧ」が後述の固相に固着でき、かつ酵素反応時や洗浄時の条件下においても容易に遊離しないものである限りにおいて特に限定されない。
【００２２】
担体として、好ましくは、アミノ基を多く含有する蛋白質、又は分子量が２，０００以上の蛋白質が挙げられる。なお、これら２つの性質を併有する蛋白質、すなわちアミノ基を多く含有し、かつ分子量２，０００以上の蛋白質が特に好ましい。蛋白質として具体的には、例えば血清アルブミン（ＢＳＡ等）、卵白アルブミン、カゼイン、ＫＬＨ、アビジンなどの動物性タンパク、植物性タンパク、ポリアミノ酸（ポリリジン等）等が例示されるが、血清アルブミンが好ましく、ＢＳＡがより好ましい。また、蛋白質はいわゆるプロテオグリカンでも良い。上記蛋白質は、例えば天然材料から分離した蛋白質であってもよく、遺伝子工学的手法により製造した組換え蛋白質であってもよい。
担体として脂質を用いる場合には、動物、植物、微生物等の天然物由来の脂質や、化学的若しくは酵素的に合成され若しくは部分的に分解された複合脂質や単純脂質等を使用することができ、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の脂肪族アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セラミド等のいずれをも使用することができる。特にホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好ましい。これらのうち、リン脂質が特に好ましく、その中でもホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００２３】
担体を結合させるＧＡＧは、活性測定の対象となるＧＡＧａｓｅの基質となり得るＧＡＧである限りにおいて特に限定されない。「ＧＡＧ」としてはＨＡ、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン等が例示されるが、例えばＨＡａｓｅを活性測定の対象とする場合には、ＧＡＧとしてＨＡを用いる。同様に、例えば、ヘパラン硫酸分解酵素を活性測定の対象とする場合には、ＧＡＧとしてヘパラン硫酸を用いればよい。活性測定の対象とするＧＡＧａｓｅは特に限定されないが、ＨＡａｓｅが好ましく、したがって担体を結合させるＧＡＧもＨＡが好ましい。また、担体を結合させるＧＡＧの分子量も特に限定されない。例えば、ＨＡを担体に結合させる場合、当該ＨＡは８糖以上のものが好ましく、重量平均分子量が１万〜２００万程度のものがより好ましく、２万〜１２０万程度のものが特に好ましい。
【００２４】
このようなＧＡＧは、公知の方法で製造することができ、また市販のものを用いることもできる。
【００２５】
担体とＧＡＧとを結合させる方法（「担体が結合したＧＡＧ」の製造方法）は、担体とＧＡＧとを結合させることができる方法である限りにおいて限定されず、公知の方法を適宜採用することができる。担体とＧＡＧとの結合の様式も特に限定されないが、共有結合であることが好ましい。
【００２６】
ＧＡＧと担体とを共有結合させる方法としては、例えば、特開平３−２８４６９８号公報、特開２０００−９７９４０号公報、特開２０００−６５８３７号公報に記載された方法等を例示することができる。
【００２７】
例えば、ＧＡＧと担体である蛋白質とを共有結合させる具体的な方法としては以下のような方法が例示される。
【００２８】
例示（１）：ＧＡＧの還元末端のホルミル基と蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成後、トリメチルアミンボラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アルキルアミノ結合(-CH2-NH-)である。
【００２９】
例示（２）：ＧＡＧの還元末端を還元した後過ヨウ素酸酸化して遊離ホルミル基を導入し、これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成後、トリメチルアミンボラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アルキルアミノ結合(-CH2-NH-)である。
【００３０】
例示（３）：ＧＡＧのカルボキシル基と蛋白質のアミノ基とをカルボジイミド等を用いて共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アミド結合(-CO-NH-)である。
【００３１】
例示（４）：ＧＡＧと蛋白質のアミノ基とをベンゾキノン等を用いて共有結合させる方法。
【００３２】
また、ＧＡＧと担体である脂質とを結合させる方法としては、例えば、特開２０００−６５８３７号公報に記載された方法、還元末端限定酸化法、還元末端ラクトン法（特許第２９９７０１８号公報、特許第２９８６５１９号公報、特許第２９８６５１８号公報及び特開平９−３０９７９号公報）、ヘミアセタール法（特開２００３−３３５８０１号公報）等を例示することができる。
【００３３】
このような方法で製造される「担体が結合したＧＡＧ」は、固相に固着して用いられる。
【００３４】
固相は、「担体が結合したＧＡＧ」が固着可能な水不溶性の固相である限りにおいて、その形状、材質等を含め特に限定されない。
【００３５】
固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、ラテックス等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
【００３６】
これらの固相に「担体が結合したＧＡＧ」を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等の固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
【００３７】
物理的吸着法として具体的には、例えば次の方法が挙げられ、かつ好ましい。
【００３８】
「担体が結合したＧＡＧ」を、ｐＨ７〜１０程度の緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等）に溶解して固相に加え、４℃で一晩静置して固着させる方法。
【００３９】
なお、この後にブロッキング物質を固相に添加して、「担体が結合したＧＡＧ」が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、植物タンパク分解物等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００４０】
以上の方法で、「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相を製造することができる。
【００４１】
ステップ（Ａ）は、このようにして製造された固相に、検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧａｓｅとを作用させるステップからなる。
【００４２】
検体としては、活性測定の対象とするＧＡＧａｓｅが含有されているか、含有されている可能性があるものである限りにおいて特に限定されない。また、検体は、予め精製されている必要もない。すなわち、検体中に、活性測定の対象とするＧＡＧａｓｅ以外のＧＡＧａｓｅや、その他の各種蛋白質等が含有されていても、本発明方法では活性測定の対象とするＧＡＧａｓｅを特異的に測定することができる。
【００４３】
検体として具体的には、ＧＡＧａｓｅ溶液、細胞培養上清、組織抽出物、体液（例えば血液、尿等）等が例示される。
【００４４】
「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相への検体の接触方法は、当該固相に固着された「担体が結合したＧＡＧ」分子と、検体中のＧＡＧａｓｅ分子とが接触し、酵素反応が惹起される限りにおいて特に限定されない。具体的な例示としては、下記の態様が挙げられる。なお下記の態様はあくまで例示であり、本発明方法がこれらに限定されるものではない。固相と検体とを接触させる方法は、例えば下記の態様を参考にして当業者が適宜決定することができる。態様（１）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相に検体を添加して接触させる。態様（２）：検体に、「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相を添加して接触させる。態様（３）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相と検体とを、同時に添加して接触させる。
【００４５】
なお、これら両者を接触させた後、酵素反応させるために、インキュベートすることが好ましい。インキュベートの条件は、ＧＡＧａｓｅが、担体を介して固相に固着されたＧＡＧに作用してＧＡＧを分解する反応が惹起される条件である限りにおいて特に限定されないが、例えばインキュベートの温度は０℃〜４５℃（例えば３７℃程度）とすることが好ましい。またインキュベートの時間も特に限定されないが、３０分〜２４時間程度を例示することができる。
【００４６】
また酵素反応後、固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄は、固相に固着した「担体が結合したＧＡＧ」が実質的に遊離しない条件で行われる。洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Tween）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）を用いることが好ましい。
【００４７】
以上の操作により、固相に固着された「担体が結合したＧＡＧ」の「ＧＡＧ」部分が検体中のＧＡＧａｓｅの作用によって分解され、分解された後のＧＡＧ（作用後のＧＡＧ）は担体を介して固相に固着されたまま残ることとなる。
【００４８】
以上のステップ（Ａ）を経た後、ステップ（Ｂ）に移行する。
【００４９】
ステップ（Ｂ）は、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに、ＧＡＧ結合性蛋白質を接触させるステップである。
【００５０】
本出願書類において「ＧＡＧ結合性蛋白質」とは、ＧＡＧ（又はその分解物）に結合する性質を有する蛋白質を意味する。同様に本出願書類においては、例えば、ＨＡに結合する性質を有する蛋白質を「ＨＡ結合性蛋白質」、ヘパラン硫酸に結合する性質を有する蛋白質を「ヘパラン硫酸結合性蛋白質」のように記載する。
【００５１】
本発明方法において、ＧＡＧ結合性蛋白質は、「担体が結合したＧＡＧ」の「ＧＡＧ」部分に結合する性質を有する蛋白質を用いる。当該ＧＡＧ結合性蛋白質には、ネイティブなＧＡＧを認識する蛋白質や、例えばリアーゼ等によるＧＡＧの分解物を認識する蛋白質等が包含される。
【００５２】
例えば、当該ＧＡＧがＨＡである場合にはＨＡ結合性蛋白質を用いる。同様に、例えば当該ＧＡＧがヘパラン硫酸である場合には、ヘパラン硫酸結合性蛋白質を用いる。
【００５３】
このようなＧＡＧ結合性蛋白質として、具体的には以下のものが例示されるが、所定のＧＡＧに結合する性質を有する蛋白質である限りにおいて、これらに限定されるものではない。
（１）ＨＡ結合性蛋白質：
ＨＡ結合性のプロテオグリカン（例えば、軟骨プロテオグリカン、軟骨プロテオグリカンのトリプシン消化物、軟骨プロテオグリカンのコンドロイチナーゼＡＢＣ消化物（特許第２７３２７１８号公報）等）、プロテオグリカンのコア蛋白質（例えば、軟骨プロテオグリカンのコア蛋白質等）、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン、ＣＤ４４、これらの蛋白質のＨＡ結合部位を含む部分蛋白質、あるいは該部分蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質、ＨＡを認識する抗体（特開平９−１２６００号公報参照）等。特に軟骨プロテオグリカンのトリプシン消化物、さらにはウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物が好ましい。なお、ウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物については、「ＨＡバインディングプロテイン」として生化学工業株式会社から販売されている。
（２）ＨＡ以外のＧＡＧに結合性の蛋白質：
ＨＡ以外のＧＡＧに対する各種モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、ＨＩＰ(ヘパラン硫酸結合性蛋白質)、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）等のＧＡＧ結合性成長因子、フィブロネクチン等のＧＡＧ結合性蛋白質等。例えば、ケラタン硫酸結合性のものとしてモノクローナル抗体5D4、コンドロイチン硫酸結合性のものとしてモノクローナル抗体CS-56、MC21C、MO225、2H6、473A12、1-B-5、2-B-6及び3-B-3、デルマタン硫酸結合性のものとして、モノクローナル抗体6-B-6及びヘパリンコファクターII、ヘパラン硫酸結合性のものとして、モノクローナル抗体10E4、3G10、HepSS-1及び3G10並びにＨＩＰ（子宮上皮ヘパラン硫酸結合性蛋白質）、ＦＧＦ及びＩＦＮ−γ、ヘパリン結合性のものとして、ＦＧＦ、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンチトロンビンIII、ヘパリンコファクターII、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニン。なお、ここに挙げられているモノクローナル抗体は、生化学工業株式会社から販売されている。
【００５４】
これらのＧＡＧ結合性蛋白質の由来は特に限定されない。例えば天然材料や細胞等から分離した蛋白質であっても、遺伝子工学的手法により製造した組換え蛋白質であってもよい。
【００５５】
なお、ＧＡＧ結合性蛋白質は標識物質で標識されていることが、ステップ（Ｃ）において検出が容易であることから好ましい。
【００５６】
ＧＡＧ結合性蛋白質の標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)など）、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位元素等が挙げられるが、通常の蛋白質の標識に可能なものであれば特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等（「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法(Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照)、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭63-17843号公報記載の方法等から適宜選択できる。
【００５７】
なお、ビオチンで標識されたウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物については、「ビオチン標識ＨＡバインディングプロテイン」として生化学工業株式会社から販売されている。
【００５８】
また、ＧＡＧ結合性蛋白質が予め標識されたものでなく、ステップ（Ｃ）においてＧＡＧ結合性蛋白質を検出する際に、例えば、ＧＡＧ結合性蛋白質を認識する標識された抗体とＧＡＧ結合性蛋白質とを反応させることにより最終的に標識され得る態様であってもよい。
【００５９】
固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに、ＧＡＧ結合性蛋白質を接触させる方法は、当該固相に固着された「前記作用後のＧＡＧ」分子と、当該ＧＡＧ結合性蛋白質とが接触する限りにおいて特に限定されない。具体的には前記のステップ（Ａ）における接触方法と同様の態様が例示されるが、それらはあくまで例示であり、本発明方法がこれらの態様に限定されるものではない。接触させる順序や方法は、前記の態様を参考にして当業者が適宜決定することができる。
【００６０】
また、両者を接触させた後の反応やインキュベート等に関しても、前記のステップ（Ａ）と同様である。
【００６１】
以上のステップ（Ｂ）を経た後に、ステップ（Ｃ）に移行する。
【００６２】
ステップ（Ｃ）は、前記作用後のＧＡＧに結合した前記ＧＡＧ結合性蛋白質を検出するステップである。
【００６３】
本発明方法は、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質を検出することにより、検体中のＧＡＧａｓｅ活性を測定することができる。
【００６４】
すなわち、ネイティブなＧＡＧを認識するＧＡＧ結合性蛋白質を用いる場合には、固相ＧＡＧと検体とのインキュベーションの後、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出量が多ければ、固相に固着されたＧＡＧがあまり分解されておらず、検体中のＧＡＧａｓｅ活性が低いと判定される。逆に、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出量が少なければ、固相に固着されたＧＡＧがよく分解されており、検体中のＧＡＧａｓｅ活性が高いと判定される。
リアーゼ等によるＧＡＧの分解物を認識するＧＡＧ結合性蛋白質を用いる場合には、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出量が多ければ、固相に固着されたＧＡＧが分解されており、検体中のＧＡＧａｓｅ活性が高いと判定される。逆に、固相ＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出量が少なければ、固相に固着されたＧＡＧがあまり分解されておらず、検体中のＧＡＧａｓｅ活性が低いと判定される。固相に固着されている「前記作用後のＧＡＧ」に結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出は、ＧＡＧ結合性蛋白質に特異的に反応する抗体を用いて行ってもよく、またステップ（Ｂ）においてＧＡＧ結合性蛋白質を標識物質で標識したものを用いた場合には、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。
【００６５】
例えば、標識物質としてビオチンを使用した場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加してビオチンとストレプトアビジンとを結合させ、次いでストレプトアビジン等に結合した酵素の基質や発色基質等を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質等を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光、発光、放射能等を測定する方法等が挙げられる。
【００６６】
本発明方法において、検体中のＧＡＧａｓｅ活性は、予め既知活性のＧＡＧａｓｅ標準液を用いてＧＡＧａｓｅ活性と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線や関係式等を作成しておき、未知活性の検体についての検出結果と前記検量線や関係式等とを用いることにより求めることができる。
【００６７】
また、ＧＡＧａｓｅの活性の値として、ＧＡＧａｓｅの活性の常用対数値を用いてもよい。したがって、「ＧＡＧａｓｅの活性の常用対数値」と標識物質の検出結果との関係について検量線や関係式等を作成してもよい。
【００６８】
また、測定の対象とするＧＡＧａｓｅ活性は、ＧＡＧａｓｅの濃度であってもよい。したがって、本発明における「活性測定」の語には、純然たる「活性」の測定のみならず、濃度の測定も含まれる。
＜２＞本発明キット
本発明活性測定キットは、下記構成成分（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む、ＧＡＧａｓｅの活性測定キットである。
構成成分（ａ）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相。
構成成分（ｂ）：ＧＡＧ結合性蛋白質。
【００６９】
（ａ）の固相及び（ｂ）の蛋白質についての説明は、前記の＜１＞本発明方法と同様である。
【００７０】
本発明活性測定キットは、上記の構成成分（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線や関係式等の作成のための標準となる既知活性のＧＡＧａｓｅ標準品、標識物質の検出試薬、ＧＡＧ結合性蛋白質を標識する試薬、あるいはＧＡＧ結合性蛋白質を検出する試薬（標識された、当該蛋白質に対する抗体等）等を構成成分として加えることができる。また、これらの構成成分の他に、前記ブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。
【００７１】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００７２】
本発明キットを用いたＧＡＧａｓｅの測定は、前記＜１＞の本発明方法に従って行うことができる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。 
＜１＞材料・試薬等
・ＨＡ：以下の３種類のＨＡを使用した。
【００７４】
鶏冠由来のＨＡ（１）：重量平均分子量約９０万のヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業株式会社製）
鶏冠由来のＨＡ（２）：重量平均分子量約９０万のヒアルロン酸ナトリウム（商品名：アルツ（登録商標）、生化学工業株式会社製）
ブタ皮由来のＨＡ：重量平均分子量約４万〜６万のヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業株式会社製）
・ＨＡａｓｅ：ウシ睾丸由来のＨＡａｓｅ（生化学工業株式会社製）
・ＥＤＣ溶液：ＥＤＣを０．１ Ｍ ＭＥＳ溶液に溶解して１００ ｍｇ/ｍｌとなるように調製した。
・ＭＥＳ溶液：２．１ｇのＭＥＳを１００ ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｍの水酸化カリウムでｐＨ ５．５にした後、これを０．２２ μｍ 孔径のフィルター（コーニング社製）を用いて濾過滅菌した。
＜２＞方法と結果
（１）ＢＳＡが結合したＨＡ（ＢＳＡ結合ＨＡ）の調製
１０ｍｇ／ｍｌのＨＡ（鶏冠由来のＨＡ（２））を０．１ Ｍ ＭＥＳ溶液で調製した。このＨＡ溶液 １ ｍｌに、１０ｍｇ/ｍｌ ＢＳＡ溶液（プロテアーゼを含まないもの；生化学工業株式会社製）０．５ｍｌ、ＥＤＣ溶液 ５０μｌを加え、常温（１５〜２５℃）で２４時間反応させ、ＢＳＡ結合ＨＡの溶液を得た。
（２）ＢＳＡ結合ＨＡが固着された９６ウェルプレートの調製
９６ウェルプレート（Nalgenunc社製）の各ウェルに、ＰＢＳを用いてＢＳＡ結合ＨＡ中のＢＳＡ濃度として１０μｇ/ｍｌとなるように調製したＢＳＡ結合ＨＡ（鶏冠由来のＨＡ（２））溶液を５０μｌ加えた。これを４℃で一晩静置した。溶液を除去した後に、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで２回リンスした。各ウェルにブロッキング液（２％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を２００μｌずつ加え、室温で２時間静置した。その後ブロッキング液を除去し、乾燥庫で２〜３時間静置した。
（３）ＨＡａｓｅの活性測定
５０ ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ６）/１５０ ｍＭ 塩化ナトリウム溶液にＨＡａｓｅを加え、ＨＡａｓｅ活性が１００Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌ、１Ｕ／ｍｌとなるように混合溶液を調製し、これらを検体とした。上記プレートのウェルを１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回リンスし、この溶液を除いた後、この検体１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートして反応させた。反応溶液を除去した後、プレートのウェルを、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ １００ μｌで２回リンスした。
【００７５】
上記反応後のプレートの各ウェルに、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈した「ビオチン標識されたＨＡ結合性蛋白質」（ビオチン標識ＨＡバインディングプロテイン；生化学工業株式会社製）の溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートして反応させた。反応後の上清を完全に除去し、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回リンスした。
【００７６】
各ウェルに、ＰＢＳで溶解した「アビジン標識されたＨＲＰ」（Vector社製）溶液（１％ＢＳＡを含有する）１００ μl（１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。上清を除去し、各ウェルをＰＢＳで２回リンスした。各ウェルにＴＭＢ １００ μlを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。各ウェルに１Ｍの塩酸を１００ μl添加した後、４５０ ｎｍにおける吸光度（対照波長（６３０ ｎｍ）における吸光度の測定値で補正したもの）を測定した。ＨＡａｓｅ活性と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を図１に示す。
【００７７】
また、ＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を図２に示す。なお、図２中の小さなグラフは、ＨＡａｓｅ活性の常用対数値が−２〜０の範囲における直線性及びその相関係数を示すものである。
【００７８】
この結果から、少なくともＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との間に一定の相関があることが示された。さらに、少なくとも当該常用対数値が−２〜０の範囲においては両者の相関に直線性がみられ、その相関係数は０．９９と非常に高かった。このことから、本発明方法によってＨＡａｓｅの活性を簡便、迅速かつ高感度に、定量性良く測定できることが示された。
（４）再現性の確認と、他のＨＡを用いた場合の結果
再現性を確認するために、鶏冠由来のＨＡ（２）を用いて前記（１）〜（３）と同様に再度実験を行った。
【００７９】
また、鶏冠由来のＨＡ（２）に代えて、鶏冠由来のＨＡ（１）及びブタ皮由来のＨＡを用いて、前記（１）〜（３）と同様に実験を行った。これらそれぞれのＨＡを用いた場合のＨＡａｓｅ活性と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を図３に示す。
【００８０】
また、これらそれぞれについてのＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を図４に示す。なお図３及び図４中、黒丸印は鶏冠由来のＨＡ（１）を、黒四角印は鶏冠由来のＨＡ（２）を、黒菱形印はブタ皮由来のＨＡをそれぞれ用いた時の結果を示す。
【００８１】
鶏冠由来のＨＡ（２）を用いた場合、前記と同様の結果が得られた。このことから、本発明方法の高い再現性が確認された。
【００８２】
また、鶏冠由来のＨＡ（２）以外のＨＡを用いた場合でも、ＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との間に一定の相関があり、両者の相関に直線性が認められることが示された。
【００８３】
これらの結果から、本発明方法によってＧＡＧａｓｅの活性を簡便、迅速かつ高感度に、再現性・定量性良く測定できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明方法は、ＧＡＧａｓｅの簡便、迅速、高感度な活性測定に利用することができる。また本発明キットは、ＧＡＧａｓｅのより簡便かつ迅速な活性測定に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＨＡａｓｅ活性と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を示す図である。
【図２】ＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を示す図である。
【図３】種々のＢＳＡ結合ＨＡを用いた場合の、ＨＡａｓｅ活性と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を示す図である。
【図４】種々のＢＳＡ結合ＨＡを用いた場合の、ＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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