(57)【要約】【課題】  超音波刺激による細胞の分化誘導、増殖促進などを適切に図り、培養条件に見合った超音波照射を可能とする細胞培養方法およびその装置を提供する。【解決手段】  培養する細胞及び培養液を入れる受器部及び蓋部を備えた培養槽、受器部下面から細胞に対して超音波を照射する超音波トランスデューサを備えた細胞培養装置であり、該蓋部が培養液表面に接するように受器内部に挿入される凸部を備えたシリコン製部材で構成されることを特徴とする細胞培養装置。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養する細胞及び培養液を入れる受器部及び蓋部を備えた培養槽、受器部下面から細胞に対して超音波を照射する超音波トランスデューサを備えた細胞培養装置であり、該蓋部が培養液表面に接するように受器内部に挿入される凸部を備えたシリコン製部材で構成されることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
該受器部と該蓋部の凸部との壁面間に外部と通気可能な空間を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
該蓋部の凸部の周囲に、該受器部及び該蓋部が密着するのを防止するスペーサ部を有することを特徴とする請求項１、２の何れかに記載の細胞培養装置。
【請求項４】
該スペーサ部が該凸部同士を結ぶ線上に設けられた突起部であることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
培養細胞または培養組織に超音波を照射し分化誘導を促進する細胞培養方法において、培養液表面に接するようにシリコン製凸部を有する蓋部材を設置し、細胞培養容器の受器下面から照射した超音波が、培養液表面での反射波を吸収することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波を利用して細胞培養を行う細胞培養装置およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養細胞ならびに組織培養を用い、その分化誘導、成長速度を促進する方法が見出され再生医療への応用が期待されている。照射する超音波は同定されているが、容器や培養液、空気との界面での反射の影響などは、検出が非常に困難なために余り考慮されていないのが現実である。超音波を反射させキャビテーションを起こす技術等は広く研究され、超音波洗浄等に応用されている。これに対して超音波を吸収させる技術については、殆ど行われていない。
【０００３】
様々な細胞に超音波照射実験を行う際に、細胞に照射される超音波の波形、出力値は、出来るだけ超音波出力装置から発生される原波形に近いものが理想である。細胞に超音波照射を行う従来までの実験では、超音波吸収材を用いない実験系［Stuart J.Warden et al：Biochemical and Biophysical Research Communications 286,p443-450,2001］や、EPMなどのゴムを超音波吸収材として利用されている実験系［Peter Reher et al：Ultrasound in Medoline& Biology 23,p1251-1258,1997］、［Masaya Ito et al：Ultrasound in Medline & Biology26,p161-166,2000］などがある。しかし、超音波吸収材を用いない場合には、実際に細胞に照射される超音波の波形は入射波と反射波との合成波となっており、一定条件の超音波が細胞に照射されているとは言え難い。特に培養液と空気との界面で超音波は反射させる為、多重反射を起こすため、EPMゴムなどの超音波吸収材料が使用されている。しかし、培養容器を水槽中におき、その下面にゴム板を用い、培地内に直接、超音波振動子を触れさせて超音波を照射する実験の場合、無菌状態を破る可能性があり、非常に不衛生で、細胞死の原因にもなり兼ねない。伊東らの実験で用いられている培養容器を水槽に浮かべ、水槽下部から超音波を照射すると共にゴム製の材料を用いて超音波を吸収する方法の場合、EPMゴム製の超音波吸収材は滅菌することが可能であり、無菌性は確保出来るが、細胞死などの影響は残り、また取り扱い性や超音波吸収材と培地との間に発生しうる気泡が確認できないなどの問題がある。
【０００４】
【非特許文献１】Stuart J.Warden et al：Low-intensity pulsed ultrasound stimulates a bone-forming response in UMR-106 cells；Biochemical and Biophysical Research Communications 286,p443-450,2001
【非特許文献２】Peter Reher et al：The stimulation of bone formation in vitro by therapeutic ultrasound；Ultrasound in Medoline& Biology 23,p1251-1258,1997
【非特許文献３】Masaya Ito et al：Effects of ultrasound and 1,25-dihydroxyvitamin D3 on growth factor secretion in co-cultures of osteoblast and endothelial cells；Ultrasound in Medline & Biology26,p161-166,2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、透明色かつ生体適合材料として幅広く用いられているシリコンを加工して超音波吸収材を作製する事により、超音波刺激による細胞の分化誘導、増殖促進などを適切に図り、培養条件に見合った超音波照射を可能とする細胞培養方法およびその装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、超音波吸収材の性能や利便率を改善する方法について鋭意検討を行った結果、以下の方法を見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、培養する細胞及び培養液を入れる受器部及び蓋部を備えた培養槽、受器部下面から細胞に対して超音波を照射する超音波トランスデューサを備えた細胞培養装置であり、該蓋部が培養液表面に接するように受器内部に挿入される凸部を備えたシリコン製部材で構成されることを特徴とする細胞培養装置を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、かかる受器部と該蓋部の凸部との壁面間に外部と通気可能な空間を有することを特徴とし、該蓋部の凸部の周囲に、該受器部及び該蓋部が密着するのを防止するスペーサ部を有すること、特に該スペーサ部が該凸部同士を結ぶ線上に設けられた突起部であることを特徴とする細胞培養装置を提供するものである。
【０００９】
また本発明は、培養細胞または培養組織に超音波を照射し分化誘導を促進する細胞培養方法において、培養液表面に接するようにシリコン製凸部を有する蓋部材を設置し、細胞培養容器の受器下面から照射した超音波が、培養液表面での反射波を吸収することを特徴とする細胞培養方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞培養装置は、超音波照射実験の際に発生する超音波の反射波を除去し、原波形を維持したままで、細胞または組織に照射する事ができる。また透明色のシリコンを用いて蓋を成型することで照射された超音波を吸収し、反射を防止すると共に、蓋と培地との海面に存在する気泡の有無を可視化することができる。また、シリコン成型品は非常に軽く、柔軟である為に、気泡の混入を防止しながら蓋をする際、非常に扱いやすい。更に、滅菌回数による耐性も高く、非常に生体材料として適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の細胞培養装置の断面模式図を図１に示す。本発明の細胞培養装置は、培養する細胞及び培養液を入れる受器部及び蓋部を備えた培養槽、受器部下面から細胞に対して超音波を照射する超音波トランスデューサを備え、該蓋部が培養液表面に接するように受器内部に挿入される凸部を備えたシリコン製部材で構成されることを特徴とする。
【００１２】
超音波照射に際しては、超音波トランスデューサ及び培養槽を恒温水槽に入れ、水を超音波の伝達媒体として用い、培養槽下部から培養槽内の細胞に対して照射する。培養槽は培養する細胞および培養液を入れる受器部および蓋部から構成される。何れも生体に対して毒性を示さない材質で構成される。受器部は、ポリエチレンやポリスチレンなどの透明材料乃至半透明材料を使用するのが好ましい。水との界面での反射が問題とならないよう容器受器部でも特に超音波が当たる底面は厚さ１ｍｍ程度のものが薄い形状とするのが好ましい。簡易実験用には、市販のポリスチレン製の滅菌済み６穴プレート、２４穴プレートを使用することが出来る。
【００１３】
蓋部は、超音波を吸収する材料であるシリコンを成型したものを使用する。蓋をした状態で培養液表面に接する凸部を備える。６穴プレートのような円筒形状の受器部を備えたものに対しては呼吸用の空気の通路は確保する必要はあるが、受器口径よりも若干小さめの円柱状の凸部を設ける。更に蓋をした時に培養液表面に気泡が入らない状態となるように凸部の長さを設定する。但し、蓋の外表面からの超音波の反射を吸収するため、凸部の長さは少なくとも蓋外表面から13ｍｍ以上の長さとする。凸部先端は、平面よりはエッジにアールを持たせたり、あるいは球状のふくらみを持たせることにより気泡の侵入を防ぐことが出来る。
【００１４】
シリコン材料としては、透明で且つ成型時の柔軟性を維持するものが好ましく、更に気泡混入の有無を確認する為には、透明乃至半透明であるのが好ましい。例えば、室温硬化型のシリコンエラストマーであるＳＨ９５５５（東レ・ダウ・コーニング社製）を使用することが出来る。シリコン材料を用いることで、超音波振動子から発生される超音波の周波数、出力値、振幅等の条件をできる限り保った状態で、対象となる細胞、組織、再生材料等に照射することが出来る。生体材料によく利用されているシリコンを用いて超音波吸収材を作製する点が重要である。超音波照射実験において、培養液に超音波吸収材を浸し、シリコン層に超音波が透過することにより、培養液と空気層との反射を防ぐ事ができる。また、多種多様な培養皿の形状、培養液の量の相違ならびに培養皿を用いた実験系ではなく、例えば遠心管内細胞実験においても利用できる。
【００１５】
［培養槽本体］
例えば６穴プレートや２４穴プレートなどの培養皿を用いて超音波照射を伴う細胞培養を行う場合にはアクリル板で作製した型を用いて、図２（６穴培養皿）、図３（２４穴培養皿）に示すように、超音波吸収材であるシリコンエラストマー、ＳＨ９５５５（東レ・ダウ・コーニング社製）を用いて、蓋部を成型する。培養液の状態ならびに対象物体の大きさにより、凸部のシリコンの厚みなどを変化させる。細胞を培養する際には、呼吸を行わせる為に培養液を外気に触れさせる必要性があり、密閉状態となるのを防ぐため、凸部位周辺のみスペーサーを設け、１mm程度底上げする。また、細菌やゴミが外気と共に培養液内に入り込まないようにする為に、蓋には淵を設ける。
【００１６】
透明色のシリコンであるＳＨ９５５５を型に流し込み、十分に脱気処理を行い、超音波吸収機能を有する蓋部を作製する。固まったシリコン製蓋部をアクリル板から剥がしやすいように、型はネジ留め等により、側面と底面とが分離できるような構造にする。凸部の形状は、培養皿の形状に見合ったものを作製する。６穴培養皿の場合、個々の培養皿の穴の直径よりもやや小さい構造にする。凸部先端部分は、やや球面状とすることにより蓋装着時に気泡を界面から取り除きやすくなる。
【００１７】
このようにして作成した培養槽は、細胞及び培養液超音波トランスデューサーは培養槽下部から受器下面に向けて照射する。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明の細胞培養装置のシリコン製蓋部の柔軟性、超音波の反射防止、細胞への毒性、滅菌回数による劣化等の特性について、以下に実施例を挙げて説明する。なお、実験には６穴培養プレートを用いた装置で実施した。
【００１９】
［高圧蒸気滅菌および紫外線照射滅菌による蓋部の弾性変化］
本発明の細胞培養装置の超音波吸収材としてシリコンを用いた蓋部の高圧蒸気滅菌回数、および紫外線照射時間による柔軟性の変化を比較、検討した。実験に使用したのは図４に示す６穴培養プレート用のシリコン製蓋部であり、シリコンエラストマー、ＳＨ９５５５（東レ・ダウ・コーニング社製）を用いて、蓋部を成型した。図５に示すように、通常では非常に柔軟性を持つ蓋が、細胞実験の際に利用される高圧蒸気滅菌の条件下（１２０℃、２０分）ならびにクリーンベンチ内での紫外線照射によってどのように変化するのかを検討した。実験には力学試験機（マルト−社製、ＭＺ５００Ｓ）で得られた荷重変位曲線を用いて弾性率を求め、各実験前後の超音波吸収剤の強度を測定した。対象群を下記に示す。
(1) 高圧蒸気滅菌群（１回）：オートクレーブで１回滅菌したもの（n=5）。
(2) 高圧蒸気滅菌群（20回）：オートクレーブで２０回滅菌したもの（n=5）。
(3) 紫外線照射群：超音波吸収剤をクリーンベンチ内で72 時間紫外線照射を行ったもの（n=5）。
【００２０】
結果を図６に示す。２０回の高圧蒸気滅菌群、７２時間の紫外線照射群の強度変化は、１回の高圧蒸気滅菌群のものと比較してやや増加していたが、有意な差は得られなかった。高圧蒸気滅菌回数ならびに長時間の紫外線照射によるシリコン製の蓋部の柔軟性に対する影響は殆どないことが判明し、本発明の特徴でもあるシリコンを超音波吸収材として使用する蓋の扱いやすさは持続する事がわかった。
【００２１】
［高圧蒸気滅菌および紫外線照射滅菌に対する蓋部の細胞毒性への影響］
シリコンを超音波吸収材として蓋部に使用した場合の、高圧蒸気滅菌回数、紫外線照射滅菌によりシリコンから放出される物質による細胞毒性への影響を比較、検討した。下記の条件下におけるシリコン製蓋部を、ポリスチレン製6穴プレートで培養したヒト骨芽細胞様細胞(HOS-TE85)の培養液表面に、図７に示すように６０分間静置し、更に通常培養下で２４時間後培養した後、Alamer Blueを用いて細胞死を評価した。
(1) 高圧蒸気滅菌群（1回）：オートクレーブで１回滅菌したもの（n=６）。
(2) 高圧蒸気滅菌群（20回）：オートクレーブで２０回滅菌したもの（n=６）。
(3) 紫外線照射群：クリーンベンチ内で７２時間紫外線照射を行ったもの（n=６）。
(4) 滅菌水群：水の中に浸した超音波吸収剤を滅菌した後の水を細胞に負荷したもの（n=６）。
その結果、図８、図９に示すとおり、上記(1)〜(4)のすべての群において顕著な細胞死は認められなかった。
【００２２】
［滅菌に伴う超音波多重反射への影響］
シリコンを超音波吸収材として使用した蓋部のオートクレーブによる高圧蒸気滅菌の回数、および紫外線照射による超音波多重反射の変化を比較、検討した。培養槽の受器底面に超音波振動子を設置し、水を入れた培養槽受器の水面に、シリコンを超音波吸収材として使用した蓋部の凸部が接するように静置した実験モデルにおいて（図１０）、振動子から発射される超音波の波形を、オシロスコープを用いて測定した。超音波による多重反射が認められる場合には、原波形に反射波が加わった合成波が表示される。
(1) コントロール群：シリコン製蓋部がないもの。
(2) 高圧蒸気滅菌群(1回)：シリコン製蓋部をオートクレーブで１回滅菌したもの。
(3) 高圧蒸気滅菌群(20回)：シリコン製蓋部をオートクレーブで２０回滅菌したもの。
(4) 紫外線照射群：シリコン製蓋部をクリーンベンチ内で７２時間紫外線照射したもの。
【００２３】
その結果、図１１に示すように、シリコン製の超音波吸収材がない場合には顕著な多重反射が認められたが、高圧蒸気滅菌群（1回）においては殆ど認められなかった。また、２０回滅菌、７２時間紫外線照射群では、１回滅菌群の場合よりも多重反射が認められたが、超音波吸収材がないものよりも充分、超音波の反射波を抑制していた。
【００２４】
［超音波反射波の可視化］
シリコン製の超音波吸収材によって超音波の反射波が吸収される事を、シュリーレン法を用いて可視化した。また、伊東らの実験（非特許文献３）の際に用いていたエチレンプロピレンゴム製の超音波吸収材（図１２）と比較、検討した。
【００２５】
その結果、シリコン製の超音波吸収材により、下部から照射された超音波が充分吸収されており、多重反射は殆ど認められなかった。また、伊東らが用いていたエチレンプロピレンゴム製の超音波吸収材と比較しても、その超音波吸収性能が高いことが明らかになった（図１３）。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の細胞培養装置の断面模式図。
【図２】６穴プレート用のシリコン製蓋部の概観図。
【図３】２４穴プレート用のシリコン製蓋部の概観図。
【図４】６穴プレート用のシリコン製蓋部。
【図５】シリコン製蓋部の柔軟性を示した図。
【図６】力学試験機を用いて測定した、シリコン製蓋部の強度変化。
【図７】シリコン製蓋部を培養皿に静置した概観図。
【図８】ヒト骨芽細胞様細胞(HOS-TE85)の位相差像の図。
【図９】Alamer Blue染色を用いて細胞死を比較したグラフ。細胞活性を測定してる為、Alamer Blue値が極端に低い場合には、多量の細胞死が起こっている可能性を示唆している。
【図１０】超音波照射実験装置の概観図。
【図１１】オシロスコープを用いて検出した超音波波形。
【図１２】伊東らが用いたＥＰＭゴム製の超音波吸収材の概観図。
【図１３】シュリーレン法を用いて超音波の多重反射を可視化した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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