(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、無細胞タンパク質合成系において、生物学的機能を担持した（native状態）膜タンパク質の合成及び回収のために有効な方法を提供することである。また、発現タンパク質から目的タンパク質のみを容易に分離・精製可能な新規精製法を提供することである。【解決手段】  リポソームに、無細胞タンパク質合成系で発現されたリポソームと相互作用するタンパク質を接触させ、その後リポソームから生物学的機能を担持したタンパク質を回収する。リポソームと相互作用するタンパク質は、膜タンパク質、膜タンパク質結合部位を含むタグを融合したタンパク質などに利用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成系にリポソームを共存させ、無細胞タンパク質合成系により合成されたリポソームと相互作用可能なタンパク質とリポソームを接触させる工程を含むことを特徴とするタンパク質の回収方法。
【請求項２】
リポソームを無細胞タンパク質合成系から回収する工程を含む請求項１に記載のタンパク質の回収方法。
【請求項３】
リポソームと相互作用可能なタンパク質をリポソームから溶離させる工程を含む請求項１又は２に記載のタンパク質の回収方法。
【請求項４】
タンパク質をリポソームから溶離させる工程を、簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法で行うことを特徴とする請求項３に記載の膜タンパク質の回収方法。
【請求項５】
リポソームと相互作用可能なタンパク質が、膜蛋白質である請求項１〜４の何れか一に記載の回収方法。
【請求項６】
リポソームと相互作用可能なタンパク質が、疎水性タグ融合タンパク質である請求項１〜４の何れか一に記載の回収方法。
【請求項７】
疎水性タグ融合タンパク質をエンドペプチターゼで処理することにより、タンパク質と疎水性タグを分離する工程を含む請求項６に記載の回収方法。
【請求項８】
疎水性アミノ酸配列を有し、かつリポソームと相互作用可能であることを特徴とする疎水性タグ。
【請求項９】
疎水性アミノ酸を５個〜５０個含むポリペプチド又は膜タンパク質結合部位を含むことを特徴とする疎水性タグ。
【請求項１０】
以下のいずれか１から選ばれる配列を含むことを特徴とする疎水性タグ。
（１）配列番号１又は配列番号２の配列
（２）配列番号１又は配列番号２と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有し、かつ膜タンパク質結合能を担持する配列
（３）上記（１）又は（２）の配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、かつ膜タンパク質結合能を担持する配列
【請求項１１】
疎水性タグに、さらにエンドペプチターゼ認識配列を連結することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１に記載の疎水性タグ。
【請求項１２】
疎水性タグ融合タンパク質の疎水性タグが、請求項８〜１１のいずれか１から選択されることを特徴とする請求項６又は７に記載の回収方法。
【請求項１３】
請求項１〜７、１２のいずれか１に記載の回収方法を利用するタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜７、１２のいずれか１に記載の回収方法に使用する試薬の少なくとも１を含む無細胞タンパク質合成手段用試薬キット。  
【請求項１５】
請求項１３に記載のタンパク質の製造方法又は請求項１４に記載の無細胞タンパク質合成手段用試薬キットによって調製されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成手段によるリポソームを用いたタンパク質の製造方法
に関する。詳しくは、無細胞タンパク質合成系にリポソームを共存させ、無細胞タンパク
質合成系によって発現されたリポソームと相互作用するタンパク質をリポソームと接触さ
せる工程を含むタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜タンパク質は、その疎水的性質の故に、精製自体が困難なばかりでなく、膜を介した「物質・情報・エネルギーのやりとり」という「機能」は、通常の「生化学反応を触媒する」という可溶性タンパク質の酵素反応に比べて測定が困難であり、膜タンパク質の真の機能・活性を明らかにする事は非常な困難が伴っている。
【０００３】
膜タンパク質は、大きく以下の表在性タンパク質と内在性タンパク質とに分類される。
（a）膜表在性タンパク質（extrinsic  protein,  peripheral  protein）：脂質二重層の疎水性部分に入り込まず、脂質の親水性部または他の膜タンパク質と非共有結合（イオン結合、疎水結合、または他の弱い相互作用）によって結合している。塩濃度を高めたり、EDTA処理をするなどの比較的温和な抽出法によって膜から分離できる。
（b）膜内在性タンパク質（intrinsic  protein,  integral  membrane  protein）：膜タンパク質の多くはこの型で、ほとんどの場合、膜の両側に親水性部を突き出し、膜内部では脂質二重層の疎水性部と相互作用する膜貫通型タンパク質（transmembrane  protein）である。これらの膜タンパク質は脂質と同じく両親媒性で、疎水性アミノ酸を含んでいる。脂質二重層内部に位置するポリペプチド鎖は多くの場合αヘリックスを形成し疎水的環境下で安定に存在している。
【０００４】
一方、研究又は医療において必要とされるいろいろなタンパク質を効率良く得るために、今日注目されているのが、無細胞タンパク質合成手段である。この方法には、ウサギ網状赤血球抽出液（Reticulocyte  Lysate）が良く用いられていた。しかし、最近、コムギ胚芽無細胞系（Wheat  Germ  Extract）の不安定化機構の解明をもとに、安定且つ高翻訳活性能を有するコムギ胚芽抽出液調製法と、該コムギ胚芽抽出液を用いた高効率無細胞タンパク質合成システムが提供されるようになり、様々なタンパク質合成に利用されている（非特許文献１）（特許文献１〜４）。
【０００５】
このようなコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いても膜タンパク質や糖鎖付加を含む種々の修飾（アシル化、アミド化等）を受けた活性化タンパク質の大量生産は非常に困難である。なぜなら、可溶性のタンパク質と異なり、膜タンパク質（さらに、分泌タンパク質、細胞内顆粒タンパク質）の大部分はその正常な翻訳発現のためには特殊な機構を必要とするからである。通常膜タンパク質の発現は抑制され、またタンパク質が合成されたとしてもすべて封入体として変性状態のままで細胞内に沈殿してしまう。
【０００６】
さらには、上記コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系では、タンパク質合成に関与する親水性タンパク質が抽出液中に多く存在する。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系にて合成されたタンパク質は、これらと混ざり合った環境で発現タンパク質の合成過程が進む。よって、ある発現させたタンパク質を精製しようとする場合において、従来方法では、既知タグ(His×6、GST等)を融合させた状態で合成し、そのタグに特異的に吸着するカラムやビーズで精製を行うことが有効であると考えられていた。しかし、いくつかの既知のタグを用いた精製法には、コムギ胚芽の抽出液中に存在するいくつかのタンパク質が精製後に残ってしまうという問題点がある。これは、それぞれのタグと同様な吸着性のある胚芽由来のタンパク質、担体であるカラムのレジンやビーズそのものに吸着性のある胚芽由来のタンパク質、精製の際に使われるバッファーの条件下で不溶化を起こす胚芽由来のタンパク質などが原因となると考えられている。
【０００７】
【特許文献１】特開2000-236896公報
【特許文献２】特開2002-125693公報
【特許文献３】特開2002-204689公報
【特許文献４】特開2002-204689公報
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14652-14657(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、無細胞タンパク質合成系において、生物学的機能を担持した（native状態）タンパク質回収のために有効な方法を提供、並びに目的タンパク質の分離における新規精製法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、リポソームと相互作用を有するタンパク質及びリポソームの分子機構の知識をもとに無細胞タンパク質合成系で利用可能な物質の検討を行った。その結果、リポソームを、無細胞タンパク質合成系で発現されたタンパク質と接触させ、その後リポソームから発現タンパク質を溶離させれば生物学的機能を担持したリポソームと相互作用を有するタンパク質の回収が可能であることを見出した。特に、このリポソームと相互作用を有するタンパク質として、膜タンパク質、膜タンパク質結合部位を含むタグを融合したタンパク質が有用である。
つまり、本発明は、
「１．無細胞タンパク質合成系にリポソームを共存させ、無細胞タンパク質合成系により合成されたリポソームと相互作用可能なタンパク質とリポソームを接触させる工程を含むことを特徴とするタンパク質の回収方法。
２．リポソームを無細胞タンパク質合成系から回収する工程を含む前項１に記載のタンパク質の回収方法。
３．リポソームと相互作用可能なタンパク質をリポソームから溶離させる工程を含む前項１又は２に記載のタンパク質の回収方法。
４．タンパク質をリポソームから溶離させる工程を、簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法で行うことを特徴とする前項３に記載の膜タンパク質の回収方法。
５．リポソームと相互作用可能なタンパク質が、膜蛋白質である前項１〜４の何れか一に記載の方法。
６．リポソームと相互作用可能なタンパク質が、疎水性タグ融合タンパク質である前項１〜４の何れか一に記載の方法。
７．疎水性タグ融合タンパク質をエンドペプチターゼで処理することにより、タンパク質と疎水性タグを分離する工程を含む前項６に記載の方法。
８．疎水性アミノ酸配列を有し、かつリポソームと相互作用可能であることを特徴とする疎水性タグ。
９．疎水性アミノ酸を５個〜５０個含むポリペプチド又は膜タンパク質結合部位を含むことを特徴とする疎水性タグ。
１０．以下のいずれか１から選ばれる配列を含むことを特徴とする疎水性タグ。
（１）配列番号１又は配列番号２の配列
（２）配列番号１又は配列番号２と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有し、かつ膜タンパク質結合能を担持する配列
（３）上記（１）又は（２）の配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付
加あるいは挿入といった変異を有し、かつ膜タンパク質結合能を担持する配列
１１．疎水性タグに、さらにエンドペプチターゼ認識配列を連結することを特徴とする前項８〜１０のいずれか１に記載の疎水性タグ。
１２．疎水性タグ融合タンパク質の疎水性タグが、前項８〜１１のいずれか１から選択されることを特徴とする前項６又は７に記載の回収方法。
１３．前項１〜７、１２のいずれか１に記載の回収方法を利用するタンパク質の製造方法。
１４．前項１〜７、１２のいずれか１に記載の回収方法に使用する試薬の少なくとも１を含む無細胞タンパク質合成手段用試薬キット。
１５．前項１３に記載のタンパク質の製造方法又は請求項１４に記載の無細胞タンパク質合成手段用試薬キットによって調製されたタンパク質。」
からなる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、無細胞タンパク質合成系のタンパク質発現の場に、リポソームを共存させて
おくことで、発現されたリポソームと相互作用しえるタンパク質例えば膜タンパク質を
変性の極力少ないnative状態で選択的にリポソームと相互作用が可能であり、その後リポ
ソームを溶液から分離することで容易に膜タンパク質のみを回収できる。さらには、リポ
ソームと相互作用しえるタンパク質例えば膜タンパク質結合部位を含むタグを融合した
発現タンパク質をリポソーム存在下コムギ胚芽無細胞系で発現させ、エンドペプチターゼ
を用いると、目的タンパク質のみが精製可能であることを見出した。以上により、無細胞
タンパク質合成系によるリポソームと相互作用しえるタンパク質の製造方法並びに目的
タンパク質の精製法として大きな技術的進歩をもたらした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１）リポソーム
本発明において用いられるリポソームは特に限定されない。好ましくは実際に生体膜を構成する分子からなり、かつ常温にて液晶相にあるもの（脂質二分子膜は純物質から形成した場合、温度によってかたいゲル相とやわらかい液晶相の二つの相を持ち、温度変化による相転移を示す。生細胞の膜は混合物であるが、液晶状態にあるとみなされている。）が良い。リポソームのサイズは、一般的には20nm〜100μmのものが使用でき、好ましくは200nm〜10μmであり、より好ましくは後述する遠心操作による分離が簡便に行えるＧＶが好ましい。ＧＶ（Giant Vesicle）とは、直径1μm以上のリン脂質二分子膜小胞である。
リポソームは脂質人工膜で構成される粒子でリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から脂質二重層としてつくられる。その調製には、界面活性剤除去法、水和法、超音波法、逆相蒸留法、凍結融解法、エタノール注入法、押し出し法、及び高圧乳化法等広く公知方法が適用される。リポソームの調製の詳細は特開平９−２０８５９９号公報等に詳しい。例えば、界面活性剤除去法としては、ゲル濾過、透析および限外濾過等が一般的に用いられる。
リポソーム調製に使用するリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ジセチルホスフェート、カルジオリピンおよびリゾホスファチジルコリン等が挙げられる。また、これらの脂質は大豆油または卵黄など天然の材料から抽出・精製したものでも、それらを水素添加して構成脂肪酸を飽和化したもの（水素添加リン脂質）でも、また更に構成脂肪酸を特定の脂肪酸、例えば、パルミチン酸またはミリスチン酸に置き換えたもの（ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルグリセロール等）であってもよい。具体的には、精製卵黄レシチン、水素添加精製大豆レシチン、卵黄由来ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアリルホスファチジルコリンおよびジミリスチルホスファチジルコリン等が例示される。
【００１２】
２）膜タンパク質
本発明の対象とする膜タンパク質は特に限定されるものではない。リポソームとの親和性を調整して種々の膜タンパク質に適合可能である。当面の好適な事例として、チトクロムb5（C末アンカー型）、チトクロムb561及びムスカリン性アセチルコリン受容体（数回膜貫通型）、P450-レダクターゼ（N末一回膜貫通型）等が挙げられる。
本発明で例示したチトクロムb5は、133個のアミノ酸残基から成るポリペプチドとそれに非共有結合で結合したヘムから構成されている(分子量約１６，０００)。典型的な膜内在性タンパク質であり、ヘムを含む親水性領域(N末端の97残基)と膜との結合に関与する疎水性領域(C末端の35残基)からなる両親媒性分子で、これら二つの領域は相互に独立な高次構造をとる。また、チトクロムb5の機能は、ミクロソーム電子伝達系の成分として、NADH−チトクロムb5レダクターゼを経てNADHから、またNADPH−フェリヘモプロテインレダクターゼを経てNADPHからそれぞれ電子を受け取り、これを各種のシアン感受性末端酵素に供給することである。
また、P450-レダクターゼ(NADPH-シトクロムP-450レダクターゼ)は、ミクロソーム電子伝達系を構成するフラビン酵素の一つである。NADPHの還元力をシトクロムP-450,ヘムオキシゲナーゼ,スクアレンエポキシダーゼなどの末端オキシゲナーゼとチトクロムb5へ電子伝達する。分子量7〜8万のポリペプチドで、FADとFMNを1個ずつ含んでおり、構成的にはフラボトキシンとフェレドキシン：NADP+オキシドレダクターゼの融合タンパク質と見なすことができる。両親媒性タンパク質で、シトクロムcなどの非生理的電子受容体を還元する活性を保持しているが、シトクロムP-450やb5を還元できず、膜への結合能も欠けている。
【００１３】
３）無細胞タンパク質合成系
本発明で使用される無細胞タンパク質合成系は、広く公知の無細胞タンパク質合成手段が用いうる。例えば、Rapid Translation System RTS500（Roshe Diagnostics社）やProc.Natl.Acad.Sci.USA,97:559-564(2000)，特開2000-236896，特開2002-125693，特開2002-204689に従って調製された小麦胚芽抽出液およびその無細胞タンパク質合成系｛特開2002-204689，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14652-14657(2002)｝を使用することが出来る。特に、小麦胚芽抽出物（商品名プロティオス）を用いる系が好ましい。
【００１４】
４）リポソームと無細胞タンパク質合成手段によって調製されるタンパク質の相互作用
リポソームは予め調製された後、タンパク質の合成前或は合成後の適当な時期に、より好ましくは、タンパク質合成前に、無細胞タンパク質合成系に添加される。添加量は、タンパク質の合成量に応じて適宜調整可能であるが、一般的には0.1〜100ｍM程度である。反応の進展に伴い、リポソームを適宜補充していくことも有効である。添加後約３〜１００時間、無細胞タンパク質合成系の活性な間中、接触させておくことが好ましい。温度条件は、約２０〜３０℃のタンパク質合成の至適温度で十分である。また、本発明におけるリポソームとタンパク質の相互作用とは、リポソームと無細胞合成系で発現したタンパク質の全部又は一部がリポソーム中に取り込まれることを意味するが、しかしこれに限らず表面あるいは内部に局在する等の場合をも意味する。
【００１５】
５）リポソームからの膜タンパク質回収方法  
リポソームからの膜タンパク質の回収は、無細胞タンパク質合成反応が完了し、十分なリポソームと膜タンパク質の相互作用が完了した後、無細胞タンパク質合成系とリポソームを分離する。分離には、遠心分離、ゲルろ過、ショ糖不連続密度勾配遠心法等の一般的な方法で十分であり、特に限定されるものではない。分離されたリポソームは、対象とするタンパク質の性状を考慮して条件調整された緩衝液に懸濁される。懸濁後、例えば界面活性剤等を加えて、リポソームを溶解し、目的タンパク質を回収して、後に界面活性剤を除去する等の方法の適用が可能である。
また次の方法も有用である。例えば、目的の膜タンパク質の末端に親水性のタグを遺伝子操作でつけておき、リポソーム共存下で発現させる。そのタグの抗体が高密度で表面に付いた容器を用意し、そこにリポソームを入れると、膜タンパクに付いたタグと、容器表面の抗体との接着作用でリポソームが容器表面にトラップされる。その膜タンパクが界面に固定化された状態で、リポソームを構成する脂質分子を他の界面活性剤などを用いてゆっくりと除去すると、膜タンパク同士が疎水部分を寄せ合ってくっつき、膜タンパク質が一層のみで界面にくっついたフレーク状態が形成される。ここに高濃度の単独タグ分子を添加すると特異吸着の平衡がずれて、容器表面上に形成された膜タンパク質フレークがはがれて出てくる。よって、この膜タンパク質フレークは上下の面が親水的であるため水溶液中に存在でき、濃縮による結晶化が可能となることで回収することが可能である。
【００１６】
６）目的タンパク質の新規回収法
本発明は、リポソームと相互作用しえるタンパク質として、特定のタグを目的タンパク質に結合させることによってタグ融合タンパク質とし、目的タンパク質の回収に利用できる。この目的のために用いるタグは、疎水性タグが好適である。本発明における疎水性タグとは、疎水性アミノ酸を３個〜１００個含み、好ましくは５個〜５０個含むポリペプチドである。又は、膜タンパク質結合能（膜結合部位）を担持するアミノ酸配列を含むものである。さらに、後段で述べるが疎水性アミ酸配列の一部にエンドペプチダーゼ認識配列を連結しても良い。また、本発明における疎水性タグの例として、疎水性アミノ酸配列数個にエンドペプチダーゼ認識配列を連結したものが挙げられる。
疎水性タグによる目的タンパク質の回収法の例としては、本来細胞内で脂質２重膜内に存在する部分を利用して、リポソームと疎水性タグ融合タンパク質を相互作用させるものである。例えば、チトクロムb5は酵素活性を有するN末部分と膜結合能を持つC末部分から構成される。この膜結合部分をタグとして用いれば、疎水性タグを融合した親水性タンパク質をリポソーム存在下コムギ胚芽無細胞系で発現させて分離・精製することが可能となる。また、この方法によって分離・精製された目的タンパク質―疎水性タグ―リポソーム複合体は、既知のさまざまなエンドペプチターゼを作用させることで目的タンパク質と疎水性タグ―リポソーム複合体とを分離することが可能である。
【００１７】
また、本発明に係る膜タンパク質結合部位を含む疎水性タグは、チトクロムｂ５タンパク質の全長配列である配列番号１又は部分配列である配列番号２を含むことが好適である。さらには、配列番号１又は配列番号２と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有し、かつ膜タンパク質結合能を担持する配列、並びに上記（１）又は（２）の配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、かつ膜タンパク質結合能を担持する配列を含む疎水性タグも好適である。
また、本発明に係る膜タンパク質結合部位を含む疎水性タグは、配列中にエンドペプチターゼで切断処理させる配列（エンドペプチターゼ認識配列）を連結させることができる。
欠失、置換、付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，  ラボラトリーマニュアル  第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社，１９８８、エールリッヒ，ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス，１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，６６６，１９８３）を利用することができる。
上記のような変異の導入において、膜タンパク質結合能を担持する観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。
【００１８】
上記エンドペプチターゼは、疎水性タグ融合タンパク質から目的タンパク質のみを切断できるペプチターゼであればいかなるものでも良い。例えば、プレシジョンプロテアーゼ｛プレシジョンサイト（Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro）の配列を矢印の位置で選択的に切断するエンドペプチターゼ：アマシャムバイオサイエンス社製｝、Thrombin 、Factor Xa 等が利用できる。
【００１９】
本発明では、上記述べたようなタンパク質の回収方法に使用する試薬の少なくとも１を無細胞タンパク質合成手段用試薬キットとして提供することができる。該キットは、発現タンパク質から目的タンパク質のみを容易に分離・精製可能な新規精製法を提供するものである。
【００２０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
１．リポソームの調製
中性リン脂質｛好ましいリン脂質としてDMPC(dimilystoyl-phosphatidylcholine)、またはDOPC(dioleoyl-phosphatidylcholine)、またはEggPC(Egg-York Phosphatidyl Choline)を具体的に使用した｝の10 mM 溶液｛好ましくはCHCl3 / MeOH = 2/1(v/v)の体積比混合溶媒、好ましくは脱水溶媒｝をガラス試験管に500 mL加え、アルゴンガス雰囲気下で溶媒を除去し、ガラス試験管底部に脂質フィルムを調製した。この試験管をデシケーターに入れ、真空ポンプを用いて一晩真空乾燥することで、溶媒を完全に除去した。以後、この状態を「乾燥脂質フィルム」と称す。乾燥脂質フィルムに、pH緩衝溶液（好ましくはHEPES buffer 100mM，pH=7.0）を500 mL加え、アルゴンガスにて試験管内の空気を置換した後、密封し、５０℃の湯浴中で１時間保持し、室温に戻した。このとき、溶液中が白濁状態となる。この状態を「前水和状態のリポソーム」と称す。前水和状態のリポソームに、Buffer  Mix ｛和研薬（株）、インビトロテック（株）のプロティオス(TM)付属溶液により作製 ：Buffer ♯1  1.07ml  Buffer ♯2  1.25ml MilliQ-Water 7.68ml の比率で混合したもの｝を静かに4500 mL加えた。
また、この操作後、暗視野顕微鏡や蛍光顕微鏡観察により、リポソームが数〜十数μmの直径の球状構造を示すことを確認した。以下、この状態を「リポソーム調製液」と称す。
【００２２】
２．無細胞タンパク質合成系
１）使用薬品及びキット
In  vitroでの無細胞タンパク質合成系としてコムギ胚芽由来細胞抽出液を使用した。このコムギ胚芽由来細胞抽出液は市販のキットのものを使用した｛和研薬（株）、インビトロテック（株）｝｛商品名：プロティオス（TM）｝。
【００２３】
２）mRNAの調製
プラスミドベクター｛プロティオス（TM）の専用ベクターpEU3-NII｝にクローニングされた遺伝子を鋳型としてmRNAを調製した。
pEU3-NII（図１a）に、蛍光タンパク質（GFP）の遺伝子を５'側及び３'側（stop無し）にSpe1及びKpn1サイトをアダプターとして導入したプライマーを設計し、PCR反応を用いて遺伝子を増幅して、MCSに導入した。次に、融合タンパク質（膜タンパク質：実施例１ではチトクロムb5、実施例２ではP450レダクターゼ）遺伝子について、５'側及び３'側にKpn1及びBamH1サイトをアダプターとして導入したプライマーを設計し、先に作成したプラスミドに導入した（図１b）。
また、融合タンパク質が導入されていない蛍光タンパク質発現プラスミドベクターは、pEU3-NIIに蛍光タンパク質（GFP）の遺伝子を５'側及び３'側（stop無し）にSpe1及びKpn1サイトをアダプターとして導入したプライマーを設計し、PCR反応を用いて遺
-伝子を増幅して、MCSに導入した（図１c）。
また、m-RNAの合成・精製はプロティオス（TM）の取り扱い説明書に従い適宜合成・精製を行った。
【００２４】
３．チトクロムb5タンパク質の発現及び回収
PROTEIOS（プロティオス）をもちいた発現系溶液内に、最終脂質濃度が0.5〜12.5mMになるようにリポソーム調製液を加え、重層法（PROTEIOSの取扱い説明書参照）により合成を行った。さらに、GFPを組み込んだチトクロムb5タンパク質の顕微鏡観察及び新規ショ糖不連続密度勾配遠心法による分離精製の検討とSDSP-PAGEによる確認を行った。また、コントロールとしてGFPタンパク質のみ発現させたものを用いた。
【００２５】
４．重層法によるタンパク質合成
先ず、リポソーム入りReaction  mix｛10mg/mlクレアチンキナ−ゼを1.7μl,Buffer#2を2.4μl,40U/μl  Rnase Inhibitorを1.0μl, 1.3μg/μlのｍRNA溶液<２．mRNAの調製による>を10μl,２００（O.D.）wheat germ extractを10μl,リポソ−ム溶液25μl｝とリポソーム入りBuffer mix(H2Oを1.34ml,Buffer#1を0.535ml, Buffer#２を0.625ml,リポソ−ム溶液を2.5ml)を調製した。次に、調製したリポソーム入りBuffer mixを96穴プレートの一穴に250μl入れ、下層に調製したリポソーム入りReaction  mixを50μl重層した。そして、PG-MateTMにより17時間・26℃でインキュベートすることで翻訳を行い、GFPを組み込んだチトクロムb5タンパク質を合成した。さらに、コントロールとしてGFPタンパク質を合成した。
【００２６】
５．蛍光顕微鏡観察
リポソーム共存下でGFPを組み込んだチトクロムb5タンパク質を発現させた後の溶液を10 mLとり、該溶液のガラスプレパラートを作成した。高感度カメラおよび高輝度水銀ランプを装備した蛍光顕微鏡（例：顕微鏡 Nikon E600とカメラ 浜松ホトニクスAQUACOSMOS）にGFPフィルター｛Nikon GFP(R)-BP等｝および高感度対物レンズ（Nikon Plan Fluor 100x等）を用いてガラスプレパラートを通常の方法で作成し、励起蛍光顕微鏡観察した（励起波長：460-500nm, 蛍光波長510-560nm）。このとき、撮影されたサンプルの顕微鏡像について、リポソーム像の部分と、それ以外の部分との蛍光強度の比を画像解析ソフト（例：浜松ホトニクスAQUACOSMOS）を用いて算出することで、リポソーム部分へのGFPを組み込んだチトクロムb5タンパク質の局在を観察した。また、ph contrast（位相差像）によってGVの位置を確認した。
【００２７】
６．蛍光顕微鏡観察の結果
GFPの組み込まれたチトクロムb5タンパク質の発現後溶液を、リポソーム共存下で観察した結果を示す（図２）。GFPのみ発現させたタンパク質では、位相差顕微鏡観察（ph contrast）によって確認したGVの位置にかかわらず、視野一面に非局在的な蛍光が観察された（図２a）。GFPを組み込んだチトクロムb5タンパク質では、直径数〜十数mmの球状の輪郭が緑色に蛍光を発する構造が確認できる。これがリポソームの膜部分に組み込まれたGFPの蛍光である（図２b）。各々の蛍光像に対して、横軸を輝度（蛍光強度）、縦軸を出現頻度としたヒストグラムをとった（図３a,b）。GFPのみ発現させたタンパク質では、蛍光はほぼ均一な背景光が一つのピークとして認められるが（図３a）、GFPの組み込まれたチトクロムb5タンパク質では、非常に明るい蛍光部分がピークとして出現している（図３b：矢印部分）。このことがリポソーム部分へのGFPの組み込まれたチトクロムb5タンパク質の局在（相互作用）を示している。
【００２８】
７．新規ショ糖不連続密度勾配遠心法による分離精製の検討とSDS-PAGEによる確認
GFPを組み込んだチトクロムb5タンパク質を捕捉したリポソームから簡易に分離できる方法検討し、SDS-PAGEにより確認した。
発現後溶液を15,000 G×15分で遠心した際の沈澱分画のSDS-PAGEによる結果では、合成反応によって不溶化を起こした胚芽由来のタンパク質や合成タンパク質とリポソーム-合成タンパク質複合体とが分離できていない。これらを分離するために、不連続ショ糖密度勾配遠心の条件を検討し、以下の方法である新規ショ糖不連続密度勾配遠心法（以後、「簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法」と呼ぶ）を開発した。
簡易型ショ糖不連続ショ糖密度勾配遠心法
（１）0.3Mのショ糖が入ったBuffer （Buffer Mixにショ糖を加えて作製した。以後、ショ糖溶液と称する） を調製した。
（２）上記ショ糖溶液を、エッペンドルフチューブに200μl加えた。続いてタンパク質発現後溶液90μlをショ糖溶液の上に重層して2層を形成させ、15,000G×15分間で遠心した。
（３）上の層及び下層の上部分を先の太いチップを使ってリポソームをできるだけ回収し、別の新しいエッペンドルフチューブに加えた。
（４）回収した溶液に、3倍量のBuffer Mixを加えて、15,000G×15分間で遠心した。
（５）上清を捨て、Buffer Mixを同量加えた。もう一度15,000G×15分間で遠心した。
（６）（５）をもう一度繰り返し、最後に上清を捨て、ペレットを回収した。
【００２９】
８．GFPを組み込んだチトクロムb5タンパク質の分離精製
上記ペレットに、そのままの状態、あるいは10％SDSで適当量に泳動用のSample Buffer を加えて前処理(100℃、5分)を行い、SDS-PAGEを行った（レーン７〜１１）。比較のために、12μl分の発現後溶液の沈澱（レーン１）と30μl分の沈澱分画（レーン２〜６）の両方を用いた。
【００３０】
９．GFPを組み込んだチトクロムb5タンパク質の分離精製の結果
以下に各レーン（図４中）での条件を示す。
レーン１：反応後溶液12μl（リポソーム無しのコントロール）
レーン２：終濃度1ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液30μl分を15,000Gで15分間遠心した沈澱分画
レーン３：終濃度2.5ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液30μl分を15,000Gで15分間遠心した沈澱分画
レーン４：終濃度5ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液30μl分を15,000Gで15分間遠心した沈澱分画
レーン5：終濃度7.5ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液30μl分を15,000Gで15分間遠心した沈澱分画
レーン6：終濃度10ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液30μl分を15,000Gで15分間遠心した沈澱分画
レーン7：終濃度1ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液60μl分を簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法による精製した分画
レーン8：終濃度2.5ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液60μl分を簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法による精製した分画
レーン9：終濃度5ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液60μl分を簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法による精製した分画
レーン10：終濃度7.5ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液60μl分を簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法による精製した分画
レーン11：終濃度10ｍMリポソ-ム中で発現させた反応後溶液60μl分を簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法による精製した分画
【００３１】
泳動結果より、簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法が、膜タンパク質をリポソームから簡易に分離できる方法であることがわかった。さらに、DOPC（GV）の場合2.5ｍM〜7.5ｍM(終濃度)でリポソームを共存させた状態でタンパク質を発現させると回収率が高いことが示された。
【実施例２】
【００３２】
１．P450レダクターゼの発現及び回収
mRNAの調製において、膜タンパク質遺伝子をP450レダクターゼ遺伝子、リポソームをReaction  mix中５ｍMに混ぜて使用した以外は実施例１と同様な方法で、P450レダクターゼの合成を行った。さらに、P450レダクターゼの簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法による分離精製とSDS-PAGEによる確認を行った。
【００３３】
２．P450レダクターゼの発現後溶液の分離精製の結果
図５から、沈澱分画と精製した分画では、GFPを組み込んだP450レダクターゼのバンドが確認できるが、精製した分画ではほぼ単一のバンドのみ（図中の矢印）であり、GFPを組み込んだP450レダクターゼが回収・精製されていることを示している。
【実施例３】
【００３４】
目的タンパク質の新規回収法
１．チトクロムb5のリポソーム結合領域の決定
EGFP-チトクロムb5融合タンパク質の発現ベクターをもとに、遺伝子工学的手法を用いて、親水性部分の配列の長さを様々に調節したチトクロムb5- EGFP融合タンパク質を発現させた。該発現させた融合タンパク質を簡易不連続密度勾配遠心法で精製し、SDSPAGEにて解析することで、チトクロムb5の部分配列とリポソームが複合体を形成したバンドを確認した。該複合体を形成したチトクロムb5の部分配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列であった。またチトクロムb5タンパク質の全長配列でも上記同様にチトクロムb5の全長配列（配列番号１）とリポソームが複合体を形成したバンドを確認した。よって、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列含む配列は疎水性タグとして利用できることがわかった。
【００３５】
２．可溶性タンパク質の回収
上記得られたチトクロムb5の全長配列（配列番号１）と部分配列（配列番号２）をモチーフとした疎水性タグの配列とEGFPタンパク質配列間にプレシジョンサイト配列を含むベクターを構築した。次に、該ベクターを用いて上記に示した重層法によるタンパク質合成法と同様に、リポソ-ム存在下でタグ（チトクロムb5）- EGFP融合タンパク質（配列番号３、４）を発現させた。次に、簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法により精製して、更に、プレシジョンプロテアーゼ処理(16ｈ、4℃)でEGFPを疎水性タグから分離し、加えて疎水性タグ-リポソ-ム複合体を遠心分離で沈澱させ、上清を回収した。さらに、該上清分画をSDS-PAGEによる確認を行った（レーンＰ：プレシジョンプロテアーゼ処理画分と称する）。さらに、比較のために、発現後溶液（レーンＴ）と簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法により精製した分画（レーンＳ）の両方を用いた。
【００３６】
３．可溶性タンパク質の回収の結果
図６から、簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法により回収した分画とプレシジョンプロテアーゼ処理画分では、EGFPのバンドが確認できるが、プレシジョンプロテアーゼ処理画分ではほぼ単一のバンドのみであり、EGFPのみが回収・精製されていることを示している。
【実施例４】
【００３７】
１．DHFRを用いた可溶性タンパク質の回収
実施例３と同様に、チトクロムb5の全長配列をモチーフとした疎水性タグの配列（配列番号１）とDHFRタンパク質配列間にプレシジョンサイト配列を含むベクターを構築した。次に、該ベクターを用いて上記示した重層法によるタンパク質合成法と同様に、リポソ-ム存在下でタグ（チトクロムb5）- DHFR融合タンパク質(配列番号５)を発現させた。次に、簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法により精製して、更に、プレシジョンプロテアーゼ処理(16ｈ、4℃)でDHFRを疎水性タグから分離し、加えて疎水性タグ-リポソ-ム複合体を遠心分離で沈澱させ、上清を回収した。さらに、該上清分画のSDS-PAGEによる確認を行った（レーンＰ：プレシジョンプロテアーゼ処理画分）。さらに、比較のために、発現後溶液（レーンＴ）と簡易型ショ糖不連続密度勾配遠心法により精製した分画（レーンＳ）の両方を用いた。
【００３８】
２．可溶性タンパク質の回収の結果
図７から、プレシジョンプロテアーゼ処理画分ではほぼ単一のバンドのみであり、DHFRのみが回収・精製されていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の産業上の利用可能性は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させたリポソームと相互作用可能なタンパク質が、細胞におけるnativeな状態で簡便に濃縮・回収・精製できるということにある。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】プロティオス（TM）の専用ベクターpEU3-NIIの説明図である。aは、pEU3-NIIのマップ図。bは、GFPの組み込まれたチトクロムb5又はP450レダクターゼの発現ベクターを示す。cは、GFP発現ベクターを示す。（実施例１及び２）
【図２】GV共存下におけるGFPの組み込まれたチトクロムb5及びGFP発現後溶液の顕微鏡像である。aは、GFPタンパク質の顕微鏡観察像、bは、GFPの組み込まれたチトクロムb5の顕微鏡観察像を示す。（実施例１）
【図３】GV共存下におけるGFPの組み込まれたチトクロムb5及びGFP発現後溶液の蛍光像に対するヒストグラムを示す。aは、GFPタンパク質のヒストグラム、bは、GFPの組み込まれたチトクロムb5のヒストグラムを示す。（実施例１）
【図４】GFPの組み込まれたチトクロムb5の分離精製後のSDS PAGEの電気泳動図である。MはLMW（Low molecular weight marker: アマシャムバイオサイエンス社製、total 5.75μg、検出はCBB染色；以下の実施例において同じ）を示す。（実施例１）
【図５】GFPの組み込まれたP450レダクターゼの分離精製後のSDS PAGEの電気泳動図である。MはLMW、12Tは12μlの発現後溶液、30ｐは30μlの沈澱分画、200は200μl分を精製した分画を示している。（実施例２）
【図６】プレシジョンプロテアーゼ処理画分のSDS PAGEの電気泳動図である。MはLMW、Ｎは12μｌのネガティブコントロール、Tは12μlの発現後溶液、Ｓは60μl分の簡易ショ糖密度勾配遠心法で精製した分画、Ｐは90μl分のプレシジョンプロテアーゼ処理画分を示す。（実施例３）
【図７】プレシジョンプロテアーゼ処理画分のSDS PAGEの電気泳動図である。MはLMW、Ｎは12μｌのネガティブコントロール、Tは12μlの発現後溶液、Ｓは60μl分の簡易ショ糖密度勾配遠心法で精製した分画、Ｐは150μl分のプレシジョンプロテアーゼ処理画分を示す。（実施例４）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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