(57)【要約】【課題】生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産するための新たな手段を提供すること。【解決手段】ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミド。ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体。前記形質転換体の製造方法。前記形質転換体をベンゼン存在下で培養する工程を含む、ベンゼンからフェノールを製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミド。
【請求項２】
前記外来遺伝子で分割された２つ領域は、いずれも、分割された領域を少なくとも含む配列が、ベンゼン資化細菌が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域において、それぞれ独立して相同組換えを起こし得る、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
前記分割された領域を少なくとも含む配列は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域のみからなるか、または、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域及びこの領域と連続して前記ベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分からなる請求項２に記載のプラスミド。
【請求項４】
前記分割された領域を少なくとも含む配列が、０．５ｋｂ以上である、請求項２または３に記載のプラスミド。
【請求項５】
前記外来遺伝子が、選択マーカー遺伝子である請求項１〜４のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項６】
前記ベンゼン資化細菌が、ベンゼンに対する耐性を有するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項７】
前記ベンゼン資化細菌が、ロドコッカス属細菌である請求項１〜６のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項８】
前記ロドコッカス属細菌がロドコッカス・オパカスＢ−４株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８１）、ロドコッカス・オパカスＢ−９株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８２）またはロドコッカス・オパカスＢ−１０株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８３）である請求項７記載のプラスミド。
【請求項９】
ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体。
【請求項１０】
ベンゼンに対する耐性を有する請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
宿主がベンゼン資化細菌である請求項９または１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
前記ベンゼン資化細菌が、ロドコッカス属細菌である請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
前記ロドコッカス属細菌がロドコッカス・オパカスＢ−４株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８１）、ロドコッカス・オパカスＢ−９株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８２）またはロドコッカス・オパカスＢ−１０株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８３）である請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子及びベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主を、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプラスミドを用いて相同組換えすることにより、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得る、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体の製造方法。
【請求項１５】
ベンゼンからフェノールを製造する方法であって、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の形質転換体または請求項１４に記載の製造方法によって製造された形質転換体を、ベンゼン存在下で培養する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記培養を、増殖基質をさらに存在させて行う、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを製造する方法、前記方法に使用される形質転換体、および、前記形質転換体を得るためのプラスミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ベンゼンのフェノールへの化学変換プロセスは、石油化学工業で最も主要な化学プロセスのひとつである。ベンゼンにひとつだけ水酸基を導入する有機合成反応の反応制御は非常に困難であり、工業的には下記に示す３段階の化学プロセスから成るクメン法がフェノール生成の主流になっている。
【０００３】
【化１】
2005058048.tif 000002
【０００４】
一方、生物は、多種多様な有機化合物に水酸基を導入する触媒機能を持っている。ベンゼンもその例外ではなく、ベンゼンに水酸基を導入してフェノールもしくはカテコールを生成する能力を持つ微生物が報告されている。例えば、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＪＩ１０４株は、ベンゼンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有し、ベンゼンからフェノールを生成することが知られている（非特許文献１）。しかし、ベンゼンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有する微生物はまれであり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースには、前述のシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＪＩ１０４株しか登録されていない。
【０００５】
ベンゼンからフェノールへの変換のバイオプロセスでは、還元力の供給が必要になる。それゆえ、ベンゼン酸化のバイオプロセスでは、菌体そのものを生体触媒として用い、還元力の供給をも菌体細胞に行わせるのが有効であると考えられる。その場合、用いる菌体細胞は有害なベンゼンが高濃度に存在する条件でも、ベンゼン酸化能及び還元力供給能を維持できるよう、有機溶媒に高度に耐性であることが望まれる。
【０００６】
一方、ベンゼン資化性菌の中には、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの有害な有機溶媒に対して強い耐性を示す菌株（例えば、ロコドッカス・オパカスＢ−４株、ロドコッカス・オパカスＢ−９株およびＢ−１０株）が存在する。しかし、これまで分離されたベンゼン資化性菌のほとんどは、ベンゼンに水酸基を二つ導入してカテコールを生成するベンゼンジオキシゲナーゼ経路でベンゼンを資化しているため、ベンゼンに水酸基を１つ導入してフェノールを生成するというバイオプロセスに用いることはできなかった。
【非特許文献１】キタヤマ（Ｋｉｔａｙａｍａ），Ａ．、スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ），Ｅ．、カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ），Ｙ．、およびナガムネ（Ｎａｇａｍｕｎｅ），Ｔ．１９９６、「シュードモナス・エルギノーサＪＩ１０４のベンゼンモノオキシゲナーゼの芳香環への水酸基導入における遺伝子機構および低部位特異性（Ｇｅｎｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ａｒｏｍａｔｉｃ−ｒｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｅｎｚｅｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＪＩ１０４．）」  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８２：ｐｐ．４２１−４２５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の目的は、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産するための新たな手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の上記目的を達成する手段は、以下の通りである。
[請求項１]ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミド。
[請求項２]前記外来遺伝子で分割された２つの領域は、いずれも、分割された領域を少なくとも含む配列が、ベンゼン資化細菌が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域において、それぞれ独立して相同組換えを起こし得る、請求項１に記載のプラスミド。
[請求項３]前記分割された領域を少なくとも含む配列は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域のみからなるか、または、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域及びこの領域と連続して前記ベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分からなる請求項２に記載のプラスミド。
[請求項４]前記分割された領域を少なくとも含む配列が、０．５ｋｂ以上である、請求項２または３に記載のプラスミド。
[請求項５]前記外来遺伝子が、選択マーカー遺伝子である請求項１〜４のいずれか１項に記載のプラスミド。
[請求項６]前記ベンゼン資化細菌が、ベンゼンに対する耐性を有するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載のプラスミド。
[請求項７]前記ベンゼン資化細菌が、ロドコッカス属細菌である請求項１〜６のいずれか１項に記載のプラスミド。
[請求項８]前記ロドコッカス属細菌がロドコッカス・オパカスＢ−４株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８１）、ロドコッカス・オパカスＢ−９株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８２）またはロドコッカス・オパカスＢ−１０株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８３）である請求項７記載のプラスミド。
[請求項９]ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体。
[請求項１０]ベンゼンに対する耐性を有する請求項９に記載の形質転換体。
[請求項１１]宿主がベンゼン資化細菌である請求項９または１０に記載の形質転換体。
[請求項１２]前記ベンゼン資化細菌が、ロドコッカス属細菌である請求項１１に記載の形質転換体。
[請求項１３]前記ロドコッカス属細菌がロドコッカス・オパカスＢ−４株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８１）、ロドコッカス・オパカスＢ−９株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８２）またはロドコッカス・オパカスＢ−１０株（寄託番号  FERM  ＢＰ−８２８３）である請求項１２記載の形質転換体。
[請求項１４]ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子及びベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主を、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプラスミドを用いて相同組換えすることにより、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得る、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体の製造方法。
[請求項１５]ベンゼンからフェノールを製造する方法であって、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の形質転換体または請求項１４に記載の製造方法によって製造された形質転換体を、ベンゼン存在下で培養する工程を含む方法。
[請求項１６]前記培養を、増殖基質をさらに存在させて行う、請求項１５記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ベンゼンジオキシゲナーゼ経由でベンゼンを代謝する細菌から得られた形質転換体を用いて、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産するための手段を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明について、更に詳細に説明する。
ベンゼンは、ベンゼン資化細菌により、ベンゼンジオキシゲナーゼ経由で下記のとおり代謝される。
【００１１】
【化２】
2005058048.tif 000003
【００１２】
ベンゼンジオキシゲナーゼの触媒作用によって生じるベンゼン−ｃｉｓ−グリコールは化学的に不安定な物質で、容易に脱水してフェノールを生じる。そこで、本発明者らは、以下に示すように、ベンゼンジオキシゲナーゼ経由のベンゼン代謝経路において、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼの活性を抑えることができれば、ベンゼン→ベンゼン−ｃｉｓ−グリコール→フェノールの経路によるフェノールの生産が可能になると考え検討を重ねた。
【００１３】
【化３】
2005058048.tif 000004
【００１４】
そこで、本発明者らは、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベンゼン資化細菌を形質転換することにより、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得ることができれば、この形質転換体によってベンゼンからフェノールを効率的に製造することができると考えた。本発明者らは、そのような形質転換体を得るために鋭意検討を重ね、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベンゼン資化細菌のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊し得るプラスミドを得ることに成功し、さらにこのプラスミドを用いてベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得ることにも成功して、本発明を完成するに至った。
【００１５】
即ち、本発明のプラスミドは、ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドである。
前述のように、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールは、化学的に不安定な物質で、容易に脱水してフェノールを生じる。そこで、ベンゼンジオキシゲナーゼは発現するが、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼは発現しない細菌を、上記本発明のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを用いて形質転換し、得られた形質転換体をベンゼン存在下で培養すれば、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼの触媒作用によってベンゼン−ｃｉｓ−グリコールからカテコールが生成されるという代謝経路を取ることなく、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールが脱水されてフェノールが生成される。これにより、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを製造することができる。
【００１６】
本発明では、まず、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊するためのプラスミド（以下、「ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミド」ともいう）を調製する。次いで、このプラスミドを用いて、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主を相同組み換えすることにより、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得る。ここで、「ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊する」とは、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼを発現し得ないように、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域に改変を加えることをいう。
【００１７】
本発明のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドは、ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有するプラスミドであって、前記領域内に、この領域を分割するように外来遺伝子が挿入されたものである。
【００１８】
本発明のプラスミドが、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊するには、本発明のプラスミドが有する外来遺伝子が、上記宿主が有するベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入され、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を阻害する必要がある。本発明のプラスミドが有する外来遺伝子の、宿主が有するベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子への挿入は、相同組み換えによって行われる。そのため、本発明のプラスミドにおいては、外来遺伝子で分割された２つの領域は、いずれも、分割された領域を少なくとも含む配列が、ベンゼン資化細菌が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域において、それぞれ独立して相同組換えを起こし得るものであることが適当である。
【００１９】
「分割された領域を少なくとも含む配列」が、ベンゼン資化細菌が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域において、相同組換えを起こし得るには、「分割された領域を少なくとも含む配列」は、例えば、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域のみからなるか、または、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域及びこの領域と連続してベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分からなることができる。この点を、図８を用いてさらに説明する。
【００２０】
図８の上段に、ベンゼン資化細菌のゲノムのベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む部分を示し、上段のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子と対応するように、その下の（ａ）、（ｂ−１）及び（ｂ−２）に、本発明のプラスミドの相同組換えを起こし得る配列を示す。（ａ）、（ｂ−１）及び（ｂ−２）において各配列は、外来遺伝子によって分割されるベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域と、この領域と連続してベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分とからなる。
図８（ａ）に示す本発明のプラスミドは、ベンゼン資化細菌のゲノムに含まれるベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をすべて含むものであり、かつ、相同組換えを起こし得る２つの配列(A1及びA2)は、いずれも、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ分割された遺伝子領域とこの領域と上流または下流に連続してベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分とからなる。
本発明のプラスミドは、ベンゼン資化細菌のゲノムに含まれるベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をすべて含むものでなくてもよく、その例を（ｂ−１）及び（ｂ−２）に示す。（ｂ−１）に示す本発明のプラスミドでは、相同組換えを起こし得る一方の配列B1は、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部のみからなり、もう一方の相同組換えを起こし得る配列B2は、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部とその上流配列の一部を含む。また、（ｂ−２）に示す本発明のプラスミドでは、相同組換えを起こし得る一方の配列C1は、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部とその下流配列の一部を含み、もう一方の相同組換えを起こし得る配列C2は、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部のみからなる。
【００２１】
本発明のプラスミドは、図８に示すように、挿入された外来遺伝子の上流と下流に、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部を含む、ベンゼン資化細菌由来の配列を有する。このようなプラスミドを、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベンゼン資化細菌へ導入すると、外来遺伝子の上流および下流のベンゼン資化細菌由来の配列は、ベンゼン資化細菌（宿主）が有するベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域で相同組換えを起こし得る。ここで、相同組換えを効果的に起こすためには、前記プラスミドにおいて、外来遺伝子で分割され、外来遺伝子の上流側および下流側に位置する配列は、それぞれ、ベンゼン資化細菌由来の０．５ｋｂ以上の配列であることが好ましい。
このように相同組換えが起こることにより、宿主内のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域に、外来遺伝子が挿入され、宿主のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊することができる。
【００２２】
本発明のプラスミドによる相同組み換えの概略を、図５および図６に示す。図５（ａ）に示すように、宿主のゲノム上のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域と本発明のプラスミドとの相同組換えが起これば、図５（ｂ）に示すように、宿主のゲノム上のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域が外来遺伝子によって分割される。こうして、ゲノム上のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域に外来遺伝子が挿入され、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得ることができる。
なお、図６（ａ）に示すように、外来遺伝子の上流配列または下流配列のいずれか一方のみで相同組換えが生じた（相同組換えが一箇所で起きた）形質転換体では、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域が破壊されず残る。そのためこの形質転換体は、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼを発現し得る。それに対し、図６（ｂ）に示すように、外来遺伝子の上流配列および下流配列の両方で相同組換えが生じた（相同組換えが二箇所で起きた）形質転換体は、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に外来遺伝子が挿入され、その機能が破壊されるため、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼを発現し得ない。このようなベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体が本発明の形質転換体であり、後述するように、ベンゼンからフェノールを生成するために用いることができる。
【００２３】
前記プラスミドにおいて、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を分割する外来遺伝子の塩基長は、その外来遺伝子が形質転換によってベンゼン資化細菌のゲノム上に挿入されることにより、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失させることができる塩基長であればよく、原理的には、１ｂ以上で欠失させることは可能だが、挿入の容易性を考慮すると、例えば、３０ｂ以上であることができる。外来遺伝子が選択マーカー遺伝子の場合は、その長さは、通常１００ｂ以上である。
【００２４】
前記外来遺伝子は、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失させ、かつ、この機能を欠失した形質転換体の選択が容易であるという観点から、選択マーカー遺伝子であることができる。選択マーカー遺伝子としては、具体的には、薬剤耐性を有する遺伝子であることができ、例えば、カナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性を有する遺伝子であることができる。例えば、前記外来遺伝子がカナマイシン耐性を有する遺伝子であれば、その外来遺伝子を含むプラスミドによる相同組換えにより遺伝子破壊を受けて形質転換された細菌（形質転換体）は、カナマイシンを含む培地中で増殖することができるが、その遺伝子を含むプラスミドによる相同組換えを受けていない細菌は増殖しない。これにより、形質転換体（ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼを発現しない細菌）を選択的に得ることが可能になる。
【００２５】
前記ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドは、例えば、以下の方法によって得ることができる。
まず、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域を有するプラスミドを用意する。ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域を有するプラスミドは、例えば、以下のように用意できる。
ベンゼン資化細菌のゲノムDNAおよび大腸菌用クローニングベクター（例えばpUC１１８等）を、制限酵素（例えばPstＩ等）で切断し、それぞれの断片を得る。その後、ライゲーション反応を用いて、クローニングベクター中にゲノムDNA断片を挿入し、閉環させる。このプラスミドを大腸菌に導入し、寒天培地上で生育させコロニーを形成させた後、１％カテコールアセトン溶液を噴霧し黄変するコロニーを選別する。このコロニーから標準的なアルカリSDS法により、プラスミドを回収・精製し、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子及びベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の配列をクローニングする。クローニングした断片の制限酵素切断断片、例えばEcoRIおよびPstI消化断片をプローブとして、ジーンウォーキング法によりベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製することができる。
上記のようにして用意されたベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域を有するプラスミドを、制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＶ、によって切断し、切断された断片間に外来遺伝子を挿入して、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ等で連結する。これにより、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域に外来遺伝子が挿入された、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドが得られる。
【００２６】
このプラスミドを増幅するために、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを複製し得る性質を有する宿主へ導入し、形質転換を行う。このような宿主は、ベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを複製し得る性質を有するものであれば特に制限はなく、ベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを構築する上で用いた元のプラスミドの性質にあわせて適宜選択することができる。例えば、ｐＵＣ１１８由来の遺伝子機能破壊用プラスミドの場合、宿主としては、大腸菌、サルモネラ、チフィムリウム、エンテロバクター等の腸内細菌を挙げることができる。
このような宿主にベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドを導入して得られた形質転換体を培養して、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドを増幅させる。その際に、制限酵素によって切断された、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域の断片間に挿入される外来遺伝子が、選択マーカー遺伝子であれば、前述と同様に、増幅したベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドを有する形質転換体を、選択的に採取することができる。この形質転換体から、多数のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドを常法により回収することができる。培養条件は、宿主に応じて適宜決定することができ、例えば、宿主として大腸菌を用いる場合、ペプトン10g/l、酵母エキス5g/lおよびNaCl5g/lを含むLB培地に、選択マーカー遺伝子を選択できる抗生物質、例えばカナマイシン(例えば50mg/l)、テトラサイクリン(例えば10mg/l)、クロラムフェニコール(例えば50mg/l)を添加したものに、形質転換株を接種し、例えば、37℃、150往復/分の振とう培養にて16時間培養することにより、形質転換体の培養を行うことができる。
【００２７】
前記ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主へ導入して相同組み換えを伴って形質転換を行う方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法を用いることができる。このように形質転換を行うことにより、前述のように、相同組換えが一箇所で起こった形質転換体と、相同組換えが二箇所で起こった形質転換体が生成される。相同組換えが二箇所で起こった形質転換体を選択的に採取するには、遺伝子機能破壊用プラスミドを構築する上で用いた元のプラスミドが元々持っていた選択マーカー（例えばpUC１１８ではアンピシリン）に感受性を示し、ベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子間に新たに挿入した選択マーカー（例えば、カナマイシン）に耐性を示す形質転換体を選別すればよい。これは、相同組換えが一箇所で起こった形質転換体は、相同組換えによってベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミド全体が宿主のゲノムに挿入されるため、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入された選択マーカー遺伝子のほかに、プラスミドベクター自体が有するマーカーも機能することになるのに対し、相同組換えが二箇所で起こった形質転換体は、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入された選択マーカー遺伝子は機能するが、プラスミドベクター自体のマーカー機能は発揮されないという、両者の性質の違いを利用したものである。
採取した形質転換体が、相同組換えが二箇所で起こったベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体であることは、例えば、サザンブロット解析により確認することができる。
【００２８】
本発明のプラスミドは、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないプラスミドである。ここで、「自律複製できない」とは、宿主細胞中で機能できる複製開始配列を持たないためにコピーを生じることができず、娘細胞に安定に遺伝できないことを意味する。
図７に、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製可能なプラスミドを用いて形質転換を行った場合（ａ）と、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないプラスミドを用いて形質転換を行った場合（ｂ）の概要を説明する図を示す。
図７（ａ）に示すように、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製可能なプラスミドを用いてベンゼン資化細菌を形質転換すると、該プラスミドは宿主内で複製され、宿主内でプラスミドとして安定に存在することができる。その結果、相同組換えが起こってベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体のほかに、相同組換えを起こさず、プラスミドをそのままの形で含み、従って、宿主のゲノムをそのまま保持した形質転換体も形成される。このようなベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体と宿主のゲノムをそのまま保持しベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を有する形質転換体は、同じ外来遺伝子を含んでいるため、薬剤耐性の有無によって選択的に採取することは困難である。従って、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製可能なプラスミドを用いて形質転換を行うと、相同組換えが起こってベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体のみを選択的に採取することは困難になる。それに対し、図７（ｂ）に示すように、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができない本発明のプラスミドを用いて形質転換を行えば、薬剤耐性の有無等によって、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を選択的に得ることができる。
【００２９】
本発明のプラスミドが、導入される宿主内で自律複製できないものであることは、前もって検討しておくことが好ましい。一般的には、大腸菌のようなグラム陰性菌用のプラスミドベクターは、ロドコッカス属細菌のようなグラム陽性菌中では自律複製できないものであるため、この点も考慮して、使用するプラスミドベクターおよび宿主を適宜選択することが好ましい。
【００３０】
前述のように、本発明のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドは、ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有する。前記ベンゼン資化細菌は、ベンゼンに対する耐性を有するものであることができる。なお、「ベンゼンに対する耐性を有する」とは、ベンゼン濃度が水に対する飽和濃度であっても増殖することをいう。
そのような細菌としては、ロドコッカス属細菌を挙げることができ、具体的には、ロコドッカス・オパカスＢ−４株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８１）、ロドコッカス・オパカスＢ−９株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８２）、およびロドコッカス・オパカスＢ−１０株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８３）を挙げることができる。
【００３１】
本発明の形質転換体は、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体である。本発明の形質転換体は、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主を、本発明のプラスミドを用いて相同組換えすることによってベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失させることにより得ることができる。前記宿主は、ベンゼン資化細菌であることができる。
そのような細菌としては、ロドコッカス属細菌を挙げることができ、具体的には、ロコドッカス・オパカスＢ−４株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８１）、ロドコッカス・オパカスＢ−９株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８２）、およびロドコッカス・オパカスＢ−１０株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８３）を挙げることができる。
なお、ロドコッカス・オパカスＢ−４株は、寄託当初は種の特定がされていなかったため、ロドコッカス・エスピーＢ−４株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８１）として寄託されている。但し、その後の研究で、当該菌株は、オパカスに属することが判明したため、本明細書中では、ロドコッカス・オパカスＢ−４株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８１）として表記するものとする。
【００３２】
更に、本発明は、ベンゼンからフェノールを製造する方法であって、前記形質転換体を、ベンゼン存在下で培養する工程を含む方法に関する。本発明の形質転換体が、ベンゼンに対する耐性を有するものであれば、ベンゼン存在下でベンゼンを酸化することが可能となる。これにより、本発明の形質転換体をベンゼン存在下で培養することによって、ベンゼン→ベンゼン−ｃｉｓ−グリコール→フェノールの経路で、フェノールを得ることができる。
【００３３】
前記方法において、本発明の形質転換体を、ベンゼン存在下で培養する条件および方法には、特に制限はなく、例えば、本発明の形質転換体を含む培地に、ベンゼンを添加して培養を行うこともでき、または、培地中にベンゼンを添加せずに、培養容器内にベンゼンを蒸気で供給し、ベンゼン雰囲気中で培養を行うこともできる。
本発明の形質転換体が、ベンゼンを炭素源として資化して増殖できない場合は、ベンゼン以外の適当な有機溶媒を増殖基質として用いることができる。そのような増殖基質としては、例えば、ｎ−デカンを用いることができる。培養培地は、液体培地を用いることもでき、寒天培地を用いることもできる。培養は、例えば、増殖基質としてｎ−デカンを用いて、ベンゼンを蒸気で供給しながら、最少合成培地において、培養温度２８℃、培養時間２日、で行うことができる。生成されたフェノールは、例えば、蒸留によって回収することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例によって本発明を具体的に説明する。
１．  ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ベンゼンを炭素源として生育させたロドコッカス・オパカスＢ−４株（寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２８１）に、１％カテコール／エタノール溶液を噴霧すると黄変した。このことから、ロドコッカス・オパカスＢ−４株は、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有することが示唆された。
グラム陽性細菌、グラム陰性細菌に関わらずベンゼンジオキシゲナーゼ及びベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子のすぐ上流もしくは下流に位置する場合が多い。カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ活性は１％カテコール／アセトン溶液を細菌のコロニーに噴霧し、黄変の有無で容易に検出することができる。そこで、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコール遺伝子をクローニングするために、まずカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ活性を指標にクローニングを行った。
【００３５】
ロドコッカス・オパカスＢ−４株から調製したゲノムＤＮＡ（調製方法は後述参照）６０μｌ、フェルメンタス社制限酵素用緩衝液の１０倍濃縮液１２μｌ、制限酵素ＰｓｔＩ（フェルメンタス社）１μｌ、蒸留水４８μｌを混合し、３７℃に保温した。保温開始２分後にＴＥ飽和フェノール／クロロフォルム混合液（１：１［ｖｏｌ／ｖｏｌ］）１２０μｌと混合し反応を停止した。ＴＥ飽和フェノール／クロロフォルム混合液と制限酵素反応液を混合したものを１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を回収した。１．６μｇの大腸菌のクローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造）、４μｌのフェルメンタス社制限酵素用の１０ｘＯ緩衝液及び２μｌのＰｓｔＩ（フェルメンタス社）を含む反応液４０μｌを３７℃で１時間反応させた。ゲノムＰｓｔＩ部分分解反応液とｐＵＣ１１８  ＰｓｔＩ分解反応液を１％アガロースによる電気泳動で分離した。ゲノム反応液からは３〜６ｋｂの画分、ｐＵＣ１１８からは３．２ｋｂ断片を回収し、ＤＮＡ精製キット（ジーンクリーンＩＩキット（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ）、バイオ１０１社）で精製した。その後、ゲノム３〜６ｋｂ画分とＰｓｔＩ切断したｐＵＣ１１８を混合した後、混合液の半量の反応液（東洋紡製 ライゲーションハイ(Ligation High)）を添加し、１６℃に保持した。一晩ライゲーション反応を行った後、反応溶液でエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡）を形質転換し、アンピシリンナトリウム塩（１００  ｍｇ／ｌ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（２０ｍｇ／ｌ）及び０．１ｍＭイソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬ寒天培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、２．０％ 寒天）に塗布し、３７℃で一晩培養した。生じた白コロニーをアンピシリンナトリウム塩（１００ｍｇ／ｌ）を含むＬ寒天培地に爪楊枝でレプリカし、再び３７℃で一晩培養した。形成したコロニーに１％カテコールアセトン溶液を噴霧し、黄変したコロニーを選別した。
【００３６】
選別したコロニーからプラスミドを標準的なアルカリ−ＳＤＳ法で精製し制限酵素解析した結果、３．１  ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を持つことが判明した。このプラスミドをｐＢ４ＢＤＯ−１と命名した。Ｍ１３（宝酒造）のユニバーサル及びリバースプライマーを用いてｐＢ４ＢＤＯ−１の挿入断片の両端のＤＮＡ塩基配列を決定した。決定したＤＮＡ塩基配列をGenBank, DDBJ, EMBLのＤＮＡデータベースに対して相同検索を行ったところ、図１に示すようにベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子の一部、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子及びベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部がコードされていることが示唆された。そこで、図１の１．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片をプローブとしてロドコッカス・オパカスＢ−４株ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物２．０ｋｂ断片をｐＵＣ１１８にクローニングした（ジーンウォーキング）。得られたプラスミドをｐＢ４ＢＤＯ−２と命名した。ｐＢ４ＢＤＯ−２の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、相同性検索を行った結果、この断片にベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が存在することが示唆された。図１にベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子周辺の制限酵素地図を示す。
【００３７】
（ロドコッカス・オパカスＢ−４株のゲノムＤＮＡの調製）
１）  Ｂ−４株をＤｉｆｃｏ社製トリプティック・ソイ・ブロス（１０  ｍｌ）に植菌し、２４時間２８℃で振とう培養する。
２）  ２４時間培養液０．５  ｍｌを１．５  ｍｌマイクロ遠心チューブに入れ、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心で集菌する。培養上清は捨てる。
３）  集菌した菌体を１  ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（シグマ(Sigma)社カタログ番号Ｌ７６５１）を含むＧＴＥ緩衝液（５０  ｍＭ  グルコース、２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、３７℃５時間放置する。
４）  ２０  ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（メルク社）を３μｌ及び１０％  ＳＤＳを５０μｌ混合し、５０℃で２時間放置する。
５）  室温にまで冷却した後、ＴＥ緩衝液（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０），  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ）で飽和したフェノール／クロロフォルム混合液（１：１［ｖｏｌ／ｖｏｌ］）を６００μｌ添加し、５分間混合する。
６）  １５，０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清画分を新しいマイクロ遠心チューブに移す。
７）  ＴＥ緩衝液で飽和したフェノール／クロロフォルム混合液（１：１［ｖｏｌ／ｖｏｌ］）を６００μｌ添加し、５分間混合する。
８）  １５，０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清画分を新しいマイクロ遠心チューブに移す。
９）  ０．３Ｍ  ＣＨ3ＣＯＯＮａ  （ｐＨ  ７．０）を５０μｌ添加、混合した後、９９．５％エタノールを１  ｍｌ添加し、よく混合する。
１０）  生じた沈殿を１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心で回収する。７０％エタノールで１回洗浄する。
１１）  ５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（シグマ社）を含むＴＥ  ５０μｌに沈殿を溶解する。
【００３８】
２．  ベンゼン−ｃｉｓ−グリコール遺伝子破壊株の作製
（１）べンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの作製
ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の全領域を含むｐＢ４ＢＤＯ−２を用いてロドコッカス・オパカスＢ−４株のベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製を行った。
まず、ｐＢ４ＢＤＯ−２のＥｃｏＲＶ消化断片とカナマイシン耐性遺伝子カセット供給ベクターｐＵＣ４Ｋ（ファルマシアバイオテク）由来のカナマイシン耐性遺伝子カセット（ＨｉｎｃＩＩ  １．２  ｋｂ断片）をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセルは、形質転換後、アンピシリンナトリウム(100mg/l)およびカナマイシン(50mg/l)を添加したL寒天培地に塗布し、37℃で一晩培養した。この培養操作により、アンピシリン/カナマイシン耐性の形質転換株を選択した。
その結果得られたアンピシリン／カナマイシン耐性の形質転換株からプラスミドを回収し、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドｐＢ４ＢＤＯ−２．１を得た。
【００３９】
（２）ロドコッカス・オパカスＢ−４株のエレクトロポレーションによる形質転換
１）  ロドコッカス・オパカスＢ−４株をトリプティック・ソイ・ブロスで２８℃、２日間振とう培養する。
２）  培養液を１％グリシンを含むトリプティック・ソイ・ブロスに植菌（１％イノキュラム）し、２８℃で一晩振とう培養する。
３）  ４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心で集菌する。上清を捨て氷冷したＨＳ緩衝液（２７２  ｍＭ  スクロース、６  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ［ｐＨ  ７．０］）に菌体を懸濁し、再び遠心する。この操作をあと２回繰り返す。ＨＳ緩衝液で３回洗浄した菌体を当初の培養液の１０分の１量のＨＳ緩衝液に懸濁する。
４）  菌体懸濁液を４０℃１０分加熱処理する。その後、氷冷する。
５）  菌体懸濁液３９０μｌにＤＮＡ溶液を１０μｌ混合する。
６）  エレクトロ・セル・マニピュレーター(Electro Cell Manipulator) 630（ＢＴＸ社）でエレクトロポレーションを行う。条件は、６．５ｋＶ／ｃｍ、５０μＦとした。
７）  エレクトロポレーション後、菌体懸濁液をトリプティック・ソイ・ブロスに添加し、２８℃一晩振とう培養する。
８）  ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むトリプティック・ソイ・ブロス寒天培地に塗布し、２８℃で培養し、カナマイシン耐性の形質転換株を得る。
【００４０】
得られたカナマイシン耐性の形質転換株からゲノムＤＮＡを抽出し、カナマイシン耐性遺伝子カセット（１．２  ｋｂ  ＨｉｎｃＩＩ断片）およびｐＢ４ＢＤＯ−２の２．０  ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片をプローブとして、サザンブロット解析を行った（図２）。その結果、形質転換株１のゲノムＤＮＡでの解析において、正しく遺伝子破壊が行われたゲノムから予想されるシグナルが検出された。このことから、形質転換株１はベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株であることが示された。そこで、形質転換株１をロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢと命名した。
なお、形質転換株２は、相同組換えが一箇所でのみ生じた形質転換株である。
ロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢはベンゼンもしくはトルエンを唯一の炭素源として蒸気で供給して培養しても、増殖を示さなかった。このことも、ロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢでは、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることを支持するデータである。本実施例では、目的の形質を持つ形質転換体の取得効率が高く、得られた組換え体の５０％は、目的の表現型を持つ形質転換体であった。
【００４１】
３．  ロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢを用いたベンゼンからのフェノールの生産
上記２で作製したベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株ロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢを用いて、ベンゼンからのフェノール生産を行った。
ロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢは、ベンゼンを炭素源として増殖できないので、ｎ−デカンを増殖基質として用いた。まず、５０ｍｌ容のラボランスクリュー管瓶（胴径３５ｍｍ、高さ７８ｍｍ、アズワン社）中の１０ｍｌトリプティック・ソイ・ブロス（Ｄｉｆｃｏ社）にロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢを植菌し、コントロールとしてロドコッカス・オパカスＢ−４株のコロニーを植菌し、２８℃１３０ｒｐｍの振とうで２日間前培養を行った（図３）。前培養において、寒天培地を用いる場合は、トリプティック・ソイ・ブロス（ディフコ(Difco)社）に、寒天（ナカライ社）を２．０％添加すればよい。
この培養液０．１ｍｌを５０ｍｌ容スクリュー管瓶中の１０ｍｌ最少培地に植菌した。最少培地の組成を以下に示す。
［最少培地］
Ｋ2ＨＰＯ4  ４．３ （ｇ／ｌ）
ＫＨ2ＰＯ4                     ３．４（ｇ／ｌ）
（ＮＨ4）2ＳＯ4                ２．０（ｇ／ｌ）
ＭｇＣｌ2                      ０．１６（ｇ／ｌ）
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ             ０．００１（ｇ／ｌ）
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ             ０．０００６（ｇ／ｌ）
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ             ０．０２６（ｇ／ｌ）
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ          ０．００２（ｇ／ｌ）
ＺｎＣｌ2                      ０．１（ｍｇ／ｌ）
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ             ０．０１（ｍｇ／ｌ）
ＮｉＳＯ4                      ０．０１（ｍｇ／ｌ）
Ｎａ2ＳｅＯ4  １０Ｈ2Ｏ        ０．００１（ｍｇ／ｌ）
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ             ０．０１（ｍｇ／ｌ）
【００４２】
０．３ｍｌのベンゼンを入れたダーラム管（胴径６ｍｍ、長さ６０ｍｍ）と０．３ｍｌのｎ−デカンを入れたダーラム管それぞれ一本ずつを植菌したスクリュー管瓶に入れ、スクリューキャップを閉めて２８℃、１３０ｒｐｍの振とうで培養を行った（図３）。２日間培養した後、培養上清をガスクロマトグラフィーで分析した。
【００４３】
ガスクロマトグラフィーは、ＧＣ−２０１０（島津製作所）、カラムはＤＢ−ＷＡＸキャピラリーカラム（長さ３０．０ｍ、内径０．３２  ｍｍ、液層の膜厚０．２５μｍ、島津製作所）を用いた。分析条件は、キャリアガス：Ｈｅ、カラム流量：６．２５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃で５分間保持した後、５℃／ｍｉｎで２５０℃まで昇温、２５０℃で３０分保持、気化室温度：２５０℃、検出器：ＦＩＤ、検出器温度：２８０℃、メイクアップガス：Ｈｅとした。この分析条件では、フェノールの保持時間は２６．６分である。
【００４４】
ロドコッカス・オパカスＢ−４株の培養上清をガスクロマトグラフィー分析したところ、フェノールはほとんど検出されなかった（図４）。一方、ロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢの培養上清を分析したところ、フェノールが検出された。ロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢの培養上清中のフェノール濃度は１００  ｍｇ／ｌであった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
ベンゼン資化性菌のほとんどは、ベンゼンに水酸基を２つ導入してカテコールを生成するベンゼンジオキシゲナーゼ経由でベンゼンを資化しているため、ベンゼンからフェノールを生成するバイオプロセスに用いることができなかったが、本発明によれば、このようなベンゼン資化性菌を形質転換することによって得られた形質転換体を用いて、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子周辺の制限酵素地図を示す。
【図２】ベンゼン−ｃｉｓ−グルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株のベンゼン−ｃｉｓ−グルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域周辺の制限酵素地図（Ａ）およびロドコッカス・オパカスＢ−４株と、そのカナマイシン耐性形質転換株のゲノムＤＮＡのサザンブロット解析（B）を示す。
【図３】ベンゼンからフェノールを生成するための、ロドコッカス・オパカスＢ４ΔｂｎｚＢの培養方法を示す。
【図４】ベンゼンとｎ−デカンを供給した培養での培養上清のガスクロマトグラムを示す。
【図５】ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域が、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドに置換される、相同組み換えの概略を示す。
【図６】ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域が、ベンゼン−ｃｉｓ−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドに置換される、相同組み換えの概略を示す。
【図７】ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製可能なプラスミドを用いて形質転換を行った場合（ａ）と、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないプラスミドを用いて形質転換を行った場合（ｂ）の概要図を示す。
【図８】本発明のプラスミドの説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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