(57)【要約】      （修正有）【課題】造血幹細胞、間葉幹細胞、造血系列特異的細胞および間葉系統特異的細胞の増殖と分化を促進するための方法、改良された細胞培養培地ならびにキットを提供する。【解決手段】単独のまたは他の増殖因子およびサイトカインと組み合わされたアンギオテンシノゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片とその類似体、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片またはその類似体もしくはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２受容体アゴニストの存在下での生育により、造血幹細胞、間葉幹細胞、造血系列特異的細胞および間葉系統特異的細胞の増殖と分化を促進する。改良された細胞培養培地ならびにキットの提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉幹細胞を、間葉幹細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、間葉幹細胞の増殖を促進する方法。
【請求項２】
造血系列特異的細胞を、造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、造血系列特異的細胞の増殖を促進する方法。
【請求項３】
間葉系統特異的細胞を、間葉系統特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、間葉系統特異的細胞の増殖を促進する方法。
【請求項４】
造血系列特異的細胞を、造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、造血系列特異的細胞の増殖を促進する方法。
【請求項５】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞を、造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化を増進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化を増進する方法。
【請求項６】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞がマクロファージと単球からなる群より選択される請求項５の方法。
【請求項７】
活性剤がＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＩ（２−８）、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号３１からなる群より選択される請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項８】
活性剤の濃度が約０．１ｎｇ／ｋｇと約１．０ｍｇ／ｋｇの間にある請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項９】
間葉幹細胞増殖用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、間葉幹細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項１０】
造血系列特異的細胞増殖用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項１１】
間葉系統特異的細胞増殖用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、間葉系統特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項１２】
造血系列特異的細胞増殖用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項１３】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化を増進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項１４】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞が本質的にマクロファージと単球からなる群より選択される請求項１３の細胞培養培地。
【請求項１５】
活性剤がＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＩ（２−８）、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号３１からなる群より選択される請求項９、１０、１１、１２、１３または１４の改良された細胞培養培地。
【請求項１６】
活性剤の濃度が約０．１ｎｇ／ｋｇと約１．０ｍｇ／ｋｇの間にある請求項９、１０、１１、１２、１３または１４の改良された細胞培養培地。
【請求項１７】
（ａ）間葉幹細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる間葉幹細胞増殖用キット。
【請求項１８】
さらに間葉幹細胞増殖培地を含む請求項１７のキット。
【請求項１９】
（ａ）造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる造血系列特異的細胞増殖用キット。
【請求項２０】
さらに造血系列特異的細胞増殖培地を含む請求項１９のキット。
【請求項２１】
（ａ）間葉系統特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる間葉系統特異的細胞増殖用キット。
【請求項２２】
さらに間葉系統特異的細胞増殖培地を含む請求項２１のキット。
【請求項２３】
（ａ）造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる造血系列特異的細胞増殖用キット。
【請求項２４】
さらに造血系列特異的細胞増殖培地を含む請求項２３のキット。
【請求項２５】
（ａ）造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化を促進するのに有効な量の、一般式Ｉ：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ１とＲ２は全体として式：Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−の基を形成する（ここにＸはＨまたは１〜３ペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間のペプチド結合はアミノペプチダーゼＡ切断に対して不安定である）；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ１〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列（ただしＲ４を末端Ｔｙｒ基として含む配列は除く）を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化用キット。
【請求項２６】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞がマクロファージと単球からなる群より選択される請求項２５のキット。
【請求項２７】
さらに造血系列特異的細胞増殖培地を含む請求項２５または２６のキット。
【請求項２８】
さらに滅菌容器を含む請求項１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４，２５、２６または２７のキット。
【請求項２９】
活性剤がＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＩＩ（２−８）、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号３１からなる群より選択される請求項１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のキット。
【請求項３０】
活性剤の濃度が約０．１ｎｇ／ｋｇと約１．０ｍｇ／ｋｇの間にある請求項１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のキット。
【請求項３１】
間葉幹細胞を、間葉幹細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、間葉幹細胞の増殖を促進する方法。
【請求項３２】
造血系列特異的細胞を、造血系特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、造血系列特異的細胞の増殖を促進する方法。
【請求項３３】
間葉系統特異的細胞を、間葉系統特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、間葉系統特異的細胞の増殖を促進する方法。
【請求項３４】
造血系列特異的細胞を、造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、造血系列特異的細胞の増殖を促進する方法。
【請求項３５】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞を、造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化を増進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤と接触させることを含んでなる、造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化を増進する方法。
【請求項３６】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞がマクロファージと単球からなる群より選択される請求項３５の方法。
【請求項３７】
活性剤が配列番号２、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される請求項３１、３２、３３、３４、３５または３６の方法。
【請求項３８】
活性剤の濃度が約０．１ｎｇ／ｋｇと約１．０ｍｇ／ｋｇの間にある請求項３１、３２、３３、３４、３５または３６の方法。
【請求項３９】
間葉幹細胞増殖用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、間葉幹細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項４０】
造血系列特異的細胞増殖用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項４１】
間葉系統特異的細胞増殖用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、間葉系統特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項４２】
造血系列特異的細胞増殖用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項４３】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化用の改良された細胞培養培地であって、その改良が、造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化を増進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤を、その細胞培養培地に添加することを含んでなる細胞培養培地。
【請求項４４】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞がマクロファージと単球からなる群より選択される請求項４３の細胞培養培地。
【請求項４５】
活性剤が配列番号２、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される請求項３９、４０、４１、４２、４３または４４の改良された細胞培養培地。
【請求項４６】
活性剤の濃度が約０．１ｎｇ／ｋｇと約１．０ｍｇ／ｋｇの間にある請求項３９、４０、４１、４２、４３または４４の改良された細胞培養培地。
【請求項４７】
（ａ）間葉幹細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる間葉幹細胞増殖用キット。
【請求項４８】
さらに間葉幹細胞増殖培地を含む請求項４７のキット。
【請求項４９】
（ａ）造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる造血系列特異的細胞増殖用キット。
【請求項５０】
さらに造血系列特異的細胞増殖培地を含む請求項４９のキット。
【請求項５１】
（ａ）間葉系統特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる間葉系統特異的細胞増殖用キット。
【請求項５２】
さらに間葉系統特異的細胞増殖培地を含む請求項５１のキット。
【請求項５３】
（ａ）造血系列特異的細胞の増殖を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる造血系列特異的細胞増殖用キット。
【請求項５４】
さらに造血系列特異的細胞増殖培地を含む請求項５３のキット。
【請求項５５】
（ａ）造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化を促進するのに有効な量の、一般式ＩＩ：
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
［式中、Ｒ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群より選択される；
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒからなる群より選択される；
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる群より選択される；
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７はＰｒｏまたはＡｌａである；
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群より選択される］
の配列中のＲ２〜Ｒ８基のうち少なくとも３つの連続するアミノ酸からなる配列を含む少なくとも１つの活性剤、および
（ｂ）その有効量の活性剤を細胞培養培地添加物として使用するための使用説明書
を含んでなる造血幹細胞または造血系列特異的細胞の分化用キット。
【請求項５６】
造血幹細胞または造血系列特異的細胞がマクロファージと単球からなる群より選択される請求項５５のキット。
【請求項５７】
さらに造血系列特異的細胞増殖培地を含む請求項５５または５６のキット。
【請求項５８】
さらに滅菌容器を含む請求項４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または５７のキット。
【請求項５９】
活性剤が配列番号２、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される請求項４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または５７のキット。
【請求項６０】
活性剤の濃度が約０．１ｎｇ／ｋｇと約１．０ｍｇ／ｋｇの間にある請求項４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または５７のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、１９９８年１月２３日に提出された出願番号の指定される予定の米国出願の継続出願であり、１９９７年１月２８日に提出された米国仮出願番号６０／０３６，５０７号；１９９７年５月８日に提出された米国仮出願番号６０／０４６，８５９号；１９９７年１０月２８日に提出された米国仮出願番号６０／０６３，６８４号；１９９７年１０月３１日に提出された米国仮出願番号６０／０６３，９１０号；１９９７年１１月１８日に提出された米国仮出願番号６０／０６５，６１２号；および１９９７年１１月２６日に提出された米国仮出願番号６０／０６６，５９３号の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、造血および間葉細胞の増殖および分化を増進する時の方法および使用のためのキットに関する。
【０００３】
（発明の背景）
骨髄は、造血系または広範な間葉組織のいずれかを再構築する能力のある多能性幹細胞を含む。造血および間葉幹細胞が広範な系列特異的細胞タイプを生ずる機構は、まったく類似しない。
【０００４】
ａ．造血系
造血系は、長期再集団化許容性を示す多能性の自己更新の造血幹細胞（HPC）を含めた、末端で分化したものから非常に初期の系列特異的細胞までに及ぶ多数の細胞世代から構成される。（Ｔｒａｙｃｏｆｆら、エックスペリメンタル・ヘマトロジー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ） ２４巻：２９９−３０６頁、１９９６年）。ＨＰＣは、多能性系列特異的細胞（ＨＬＳＣ）に末端で分化する能力を保有する多能性系列特異的細胞である。造血は、継続プロセスであり、したがって、ＨＰＣは、すぐに赤血球、血小板、単核細胞、顆粒球およびリンパ球に分化できるＨＬＳＣの継続的源を提供するに違いないる（Ｐｒｏｃｋｏｐ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２７６巻：７１−７４頁、１９９７年）。ＨＰＣは、「自己更新」によって増殖させて、ＨＰＣ型子孫細胞を生成するか、または付随する分化で増殖させて、ＨＬＳＣを生成する。（Ｔｒａｙｃｏｆｆら、ｓｕｐｒａ）。
【０００５】
ＨＰＣ移植療法は、様々の悪性および遺伝性疾患で成功してきたが、高用量化学療法または放射線療法を継続中の患者のための骨髄造血支持体をも供する。（Ｅｍｅｒｓｏｎ、ブラッド（Blood）８７巻、３０８２−３０８８頁、１９９６年）。しかし、幹細胞移植は、数種の特徴によって限定されてきた。最初に、輸血後利益に達するのに十分な品質の幹細胞を要求すると、広範囲な効力のある骨髄収穫物または広範なフェレーシス手段のいずれかが必要になる（Ｅｍｅｒｓｏｎ、ｓｕｐｒａ）。次に、これらの条件下でさえ、限定された数の有用な細胞のみが得られる。最終的に、輸血後の成熟血液細胞再生は、ゆっくりであり、その結果１から３週の期間で直接的利益はほとんど見られない（Ｅｍｅｒｓｏｎ、ｓｕｐｒａ）。
【０００６】
比較的純粋な集団のＨＰＣおよびＨＬＳＣを単離する技術と組合せた造血細胞のインビトロ培養技術の開発は、それらのｅｘ  ｖｉｖｏ拡張を可能にした（ＡｌｃｏｒｎおよびＨｏｌｙｏａｋｅ、ブラッド・リビューズ（Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ）１０巻：１６７−１７６頁、１９９６年、これは、ここに参照して組込まれる）。自己更新および分化を伴う増殖の両方による成功したＨＰＣのｅｘ  ｖｉｖｏ拡張は、自家移植に必要とされる白血球フェレーシス手段の回数および期間を減少させること、したがってアフェレーシス製品中に疾患が混入する危険性を減少させることのような多くの医療上の利点を約束する（ＡｌｃｏｒｎおよびＨｏｌｙｏａｋｅ、ｓｕｐｒａ）。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏ拡張は、それぞれ自家移植および成体の同種異型の移植に十分な末梢血および臍帯血中でＨＰＣ集団を不適切にする。最終的に、ＨＰＣのｅｘ  ｖｉｖｏ拡張は、一般に遺伝子療法ベヒクルとしてのそれらの有用性を増加させる（ＡｌｃｏｒｎおよびＨｏｌｙｏａｋｅ、ｓｕｐｒａ）。同等に、ＨＰＣのｅｘ  ｖｉｖｏ拡張は、自家移植に続く偏性好中球減少症の期間を減少させる拡張集団の骨髄性前駆体を再注入すること、養子免疫療法プロトコールに使用するためのナチュラルキラー細胞の発生、後期移植関連血小板減少症を軽減する巨核球前駆体の発生、および遺伝子療法のための送出系のさらに充分な発生のような実質的な臨床上の利益を約束する（ＡｌｃｏｒｎおよびＨｏｌｙｏａｋｅ、ｓｕｐｒａ）。
【０００７】
化学療法および／またはサイトカイン治療によって動員されるヒト骨髄、臍帯血および末梢血系列特異的細胞は、悪性疾患を治療する高用量療法の投与を伴う移植のためのＨＰＣの有効な源であると見なされた。（Ｈｏｌｙｏａｋｅら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）８７巻、４５８９−４５９５頁、１９９６年）。いかなる造血細胞の源でも、ほとんどの研究は、ＣＤ３４のようなＨＰＣ−特異的表層抗原の点で選択された培養細胞集団を使用した。これらの細胞は、多くの技術によって容易に得ることができる（ＡｌｃｏｒｎおよびＨｏｌｙｏａｋｅ、ｓｕｐｒａ）。ｅｘ  ｖｉｖｏ拡張造血細胞を使用した数種の臨床試験の結果は、適切な条件下ｅｘ  ｖｉｖｏで培養されたかなり少数のＨＰＣが、血液学上の再構築を開始する可能性があることを示唆する（Ｅｍｅｒｓｏｎ、ｓｕｐｒａ）。
【０００８】
ｅｘ  ｖｉｖｏ培養物中のＨＰＣの生存および増殖は、成長因子を共同作用する組合せを必要とする。使用されるサイトカイン／成長因子組合せおよび培養系の選択は、主として培養を開始するのに使用される細胞の発生運命を決定する（ＡｌｃｏｒｎおよびＨｏｌｙｏａｋｅ、ｓｕｐｒａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏで、血液細胞生成は、隣接骨髄支質細胞によって生成される多様な細胞結合および分泌因子を伴う造血幹細胞の作用によって局所的に調節されると考えられる（ＡｌｃｏｒｎおよびＨｏｌｙｏａｋｅ、ｓｕｐｒａ）。培養用培地に成長因子およびサイトカインを添加するのは、支質関連活性の不在を補足することが意図される。ＨＰＣの生成（様々な組み合わせで）を増加させることが示された成長因子およびサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、およびインターロイキン１、３、６および１１（Ｔａｋａｋｕ、ジェイ．キャンサー・レス．クリン．オンコロ．（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）１２１巻：７０１−７０９頁、１９９５年；Ｈｏｌｙｏａｋｅら、上記で検討された）が挙げられる。反対に、今日までのところ報告されたほとんどの拡張培養物中のマクロファージ阻害タンパク−１α（ＭＩＰ−１α）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）または形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の封入は、ＨＰＣおよびＨＬＳＣ収量を減少させる結果になる（Ｅｍｅｒｓｏｎ、ｓｕｐｒａ）。
【０００９】
造血細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養に最適な条件を明示するのに多くの努力が注がれた。ＨＰＣのｅｘ  ｖｉｖｏ増殖速度を増加させる改善法は、ＨＰＣ移植の臨床上の利益を大いに増大させる。これは、全造血系を再構築する能力のあるＨＰＣのより多量の供給を提供する増大した「自己更新」について、そしてより多量の系列特異的細胞の供給を提供する分化をともなう増殖についての両方について当てはまる。同様に、ＨＰＣのｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を増大させる方法は、骨髄中のＨＰＣ（およびＨＬＳＣ）の局所濃度を迅速に増大させることによりＨＰＣ移植療法の利用性を増強させる。さらに、ＨＰＣおよびＨＬＳＣの分化を生じる方法は、細胞療法で使用するための特異的細胞型の集団を供するのに有用である。
【００１０】
哺乳類ＨＰＣのトランスフェクションが、達成された（Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅら、ネーチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）２巻、１３２９−１３３７頁、１９９６年）。したがって、ＨＰＣおよびＨＬＳＣの増殖を増大させる方法は、遺伝子療法で使用するための大きな集団の遺伝子導入細胞を迅速に供するのにも有用である。
【００１１】
ｂ．間葉幹細胞
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、ヒトを含めた多くの生物で示されるとおり、骨、軟骨、腱、筋肉、骨髄支質、脂肪および真皮のような様々の間葉組織に分化する能力を保持する多能性前駆細胞である（Ｂｒｕｄｅｒら、ジェイ．セルル．バイオケム．（Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）５６巻、２８３−２９４頁（１９９４年））。間葉組織の形成は、生涯を通して継続するが、胚芽より成体でさらにいっそうゆっくりと進行するメッセンジェニック過程として知られる（Ｃａｐｌａｎ、クリニックス・イン・プラスチック・サージェリー（Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ）２１巻、４２９−４３５頁（１９９４年））。成体でのメッセンジェニック過程は、修復過程であるが、しかし胚芽発生の間に生じる同じ細胞現象を包含する（Ｃａｐｌａｎ、１９９４年、上記で検討された）。修復過程の間中、化学親和力は、ＭＳＣを、それらが裂け目を補う多量の細胞に増殖する修復部位に運ぶ。その後、これらの細胞は、関わり合いを受け、そして特定の系列経路（分化）に入り、そこで、それらは増殖する能力を残す。結局、様々な経路での細胞は、末端で分化し（そしてもはや増殖できない）、そして組織特異的サイトカインおよび成長因子の局所濃度によって制御されたプロセスで、合せて適切な骨格組織を形成する（Ｃａｐｌａｎ、１９９４年、ｓｕｐｒａ）。
【００１２】
最近、ＭＳＣ−基礎修復プロセスのための限定因子が、修復部位で適当な数の反応性ＭＳＣの欠乏であるという仮説がたてられた（Ｃａｐｌａｎ、１９９４年、ｓｕｐｒａ）。したがって、修復部位が系列特異的成長因子および分化分子への適切な露出を供するので、十分量のＭＳＣを特定組織部位に供給することによって、修復プロセスが、制御できることが示唆された（Ｃａｐｌａｎ、１９９４年、ｓｕｐｒａ）。この結末に対して、いくつかの動物研究は、間葉組織と結合した様々の欠陥を修復するための自己ＭＳＣを用いる実現可能性を示した。（検討のために、Ｃａｐｌａｎら、前十字靭帯（Ｔｈｅ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｃｒｕｃｉａｔｅ Ｌｉｇａｍｅｎｔ）：現在および未来の構想（Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ）、Ｄ．Ｗ．Ｊａｃｋｓｏｎ編、ラベンプレス社、ニューヨーク、４０５−４１７頁（１９９３年）参照）。最近の研究は、収集、培養でのｅｘ  ｖｉｖｏ拡張、およびヒトでのＭＳＣの静脈注入の実行可能性について示した（Ｌａｚａｒｕｓら、ボーン・マロウ・トランスプランテーション（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、１６巻、５５７−５６４頁（１９９５年）；ＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ、米国特許番号第５，４８６，３５９号、その全体で参照してここに組込まれる）。さらに、動物起源のＭＳＣは、レトロウイルスと共に遺伝子導入され、そしてインビトロおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で高いレベルの遺伝子発現を達成した（Ａｌｌａｙら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、８２巻、４７７Ａ（１９９３年））。したがって、このような技術によるＭＳＣの増幅は、再構築療法のための期待できる道具のようであり、そして遺伝子療法に有用である可能性がある。
【００１３】
適切な量のＭＳＣおよびＭＳＣ系列特異的細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、特に順次および／または疾病に罹った患者で存在しない場合、ＭＳＣ療法は、高密度の修復成分細胞を欠陥部位に送出する手段として役割を果たすことができる。高密度のＭＳＣを欠陥部位に有効に送出するために、多数のＭＳＣを迅速に生成する方法が必要である。ＭＳＣは、インビトロで多数の成長因子に露出されたが、しかし、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）のみが有糸分裂活性を示した（Ｃａｐｌａｎら、１９９４年、ｓｕｐｒａ）。ＭＳＣのｅｘ  ｖｉｖｏ増殖速度を増加させる方法は、ＭＳＣ療法の有用性を大いに増加させる。同様に、ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏ増殖速度を増加させる方法は、修復部位でＭＳＣの局所濃度を迅速に増加させることによって、ＭＳＣ療法の有用性を増強させる。
【００１４】
さらに、骨髄支質細胞、破骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を含むがそれに限定されないＭＳＣの系列特異的子孫の増殖速度を増強する方法は、適切な修復部位で系列特異的細胞型の濃度を増加させることによって、ＭＳＣ療法の治療上の有用性を増強する。
【００１５】
（発明の概要）
１つの局面で、本発明は、造血幹および系列特異的細胞の増殖および分化を、そして細胞をアンギオテンシノジェン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩフラグメントおよびそれらの類似体、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩフラグメントまたはそれらの類似体、またはＡＩＩＡＴ２タイプ２レセプター作動薬と、単独または他の成長因子およびサイトカインと組合せて接触させることによって、間葉幹および系列特異的細胞増殖を促進する方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の局面で、改善細胞培養培地が、造血幹および系列特異的細胞の増殖および分化に、そして間葉幹および系列特異的細胞の増殖に供給され、ここで改善は、有効量のアンギオテンシノジェンの細胞培養培地に、ＡＩ、ＡＩ類似体、ＡＩフラグメントおよびそれらの類似体、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩフラグメントまたはそれらの類似体、またはＡＩＩＡＴ２タイプ２レセプター作動薬を加えることを包含する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、造血および間葉幹および系列特異的細胞の繁殖用のキットを提供し、ここでそのキットは、細胞を有効量のアンギオテンシノジェン、ＡＩ、ＡＩ類似体、ＡＩフラグメントおよびそれらの類似体、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩフラグメントまたはそれらの類似体、またはＡＩＩＡＴ２タイプ２レセプター作動薬で包含し、細胞培養培地補足物として有効量の活性剤を使用するための指示する。好ましい具体例では、キットは、さらに細胞培養用培地を包含する。別の好ましい具体例では、キットは、さらに細胞を培養するための滅菌容器を包含する。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
ここに定義されるとおり、語句「ＨＰＣ」は、広範な分化造血細胞型を生じさせる能力のあるあらゆる造血多能性前駆細胞に該当する。この定義内の細胞型としては、それに限定されないが、ＣＤ３４＋骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）（Ｂｅｒａｒｄｉら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）８６巻、２１２３−２１２９頁、１９９５年）、ＰＢＳＣ（Ｆｒｉｔｓｃｈら、ボーン・マロウ・トランスプランテーション（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、１７巻、１６９−１７８頁（１９９６年）、玉石領域形成細胞（ＣＡＦＣ）（Ｌｅｍｉｅｕｘら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）８６巻、１３３９−１３４７頁、１９９５年）および５−ＦＵ ＢＭ細胞（ＡｌｃｏｎおよびＨｏｌｙｏａｋｅ、ブラッド・レビューズ（Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、１０巻：１６７−１７６頁、１９９６年）が挙げられる。ここに定義されるとおり、語句「ＨＬＳＣ」は、造血系列特異的細胞に該当し、そして十分に分化した造血細胞と同様に、細胞特異的分化経路にゆだねられるＨＰＣの子孫を包含する。ここに定義されるとおり、間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、骨、軟骨、腱、筋肉、骨髄支質、脂肪および真皮のような様々の間葉組織に分化する能力を保持する多能性前駆細胞であり、それに限定されないが、ＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ、米国特許番号第５，４８６，３５９号に記載されるもののような細胞が挙げられる。ここに定義されるとおり、「増殖」は、付随する分化を伴う細胞自己更新および細胞増幅の両方を包含する。ここに定義するとおり、「分化」は、特異的系列経路に入ることおよび分化細胞の機能の活性化を包含する。
【００１９】
ＤｉＺｅｒｅｇａに対する米国特許番号第５，０１５，６２９号（その全開示は、参照されここに組込まれる）には、創傷組織を癒す速度を増加させる方法が記述され、それにより上記増加に十分である量で、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）のこのような組織に適用することを包含する。創傷組織にＡＩＩを適用することは、明らかに創傷治癒の速度を増加させ、それによりさらに迅速な再上皮形成および組織修復にいたる。語句ＡＩＩは、ヒトに存在するオクタペプチド、および配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１］を示す他の種に該当する。アンギオテンシンの生物学的形成が、血漿基質アンギオテンシノジェンでのレニンの作用によって開始される（Ｃｌｏｕｓｔｏｎら、ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）２巻、２４０−２４８頁（１９８８年）；Ｋａｇｅｙａｍａら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２３巻、３６０３−３６０９頁；Ｏｈｋｕｂｏら、プロク．ナトル．カカデ．サイ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）８０巻、２１９６−２２００頁（１９８３年）；おのおのの文献は、全体にここに組込まれる）。そのように形成された物質は、ＡＩからＣ末端Ｈｉｓ−Ｌｅｕ残基を除去する酵素アンギオテンシナーゼ［配列番号：３８］を変換することによってＡＩＩに変換されるアンギオテンシンＩ（ＡＩ）と称されるデカペプチドである。ＡＩＩは、公知プレッサー剤であり、そして市販で入手できる。
【００２０】
研究は、ＡＩＩが、創傷修復に含まれる培養細胞中で有糸分裂誘発および走化性を増加させ、そして成長因子および細胞外マトリックスのそれらの放出を増加させることを示した（ｄｉＺｅｒｅｇａ、米国特許番号第５，０１５，６２９号；Ｄｚａｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、２１巻、Ｓ７（補足ＩＩＩ）１９８９年；Ｂｅｒｋら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１３巻、３０５−１４頁（１９８９年）；Ｋａｗａｈａｒａら、ＢＢＲＣ１５０巻、５２−９頁（１９９８年）；Ｎａｆｔｉｌａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３巻、１４１９−２３頁（１９８９年）；Ｔａｕｂｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻、５２６−５３０頁（１９８９年）；Ｎａｋａｈａｒａら、ＢＢＲＣ１８４巻、８１１−８頁（１９９２年）；ＳｔｏｕｆｆｅｒおよびＯｗｅｎｓ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７０巻、８２０頁（１９９２年）；Ｗｏｌｆら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０巻、９５−１０７頁（１９９２年）；ＢｅｌｌおよびＭａｄｒｉ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３７巻、７−１２頁（１９９０年））。さらに、ＡＩＩは、ウサギの角膜眼およびニワトリの雛の漿尿膜モデルで脈管形成性があることが示された（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０５巻：１４１頁（１９８５年）；ＬｅＮｏｂｌｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９５巻：３０５−６頁（１９９１年））。したがって、ＡＩＩは、新生血管形成の増加、成長因子放出、再上皮形成および／または細胞外マトリックスの生成によって、創傷修復を促進する可能性がある。しかし、アンギオテンシノジェン、ＡＩ、ＡＩ類似体、ＡＩフラグメントおよびそれらの類似体、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似体およびそれらのフラグメント、またはＡＩＩレセプター作動薬が、造血および間葉幹および系列特異的細胞の増殖および分化を促進するのに有用であるかどうかについて、文献では知れられていない。
【００２１】
ＡＴ２受容体用に選択されたペプチド作動物質（ＡＩＩはＡＴ１よりもＡＴ２に対して１００倍高い親和性を有する）が同定されてきている。このペプチドはｐ−アミノフェニルアラニン６−ＡＩＩ［すなわち（ｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅ）６−ＡＩＩ］であり、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−[配列番号３６]において、Ｘａａはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅである（Ｓｐｅｔｈ ａｎｄ Ｋｉｍ，ＢＢＲＣ１６９：９９７−１００６（１９９０年））。このペプチドは、実験モデル（Ｃａｔａｌｉｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ ２５６：９３−９７（１９９４年）；Ｂｒｙｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ．２２５：１１９−１２７（１９９２年））において、ＡＴ２に匹敵する結合特性を有していた。
【００２２】
ＡＩＩ受容体およびＡＩＩ受容体作動物質の効果は、脈管損傷とその修復を扱った２つの実験モデルにおいて検討されており、これら実験は、共に、ＡＩＩ受容体のサブタイプ（ＡＴ１およびＡＴ２）が創傷治癒において役割を担っていることを示唆した（Ｊａｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ２０：７３７−４５（１９９２年）；Ｐｒｅｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３９：１２９１−１２９６（１９９１年））；Ｋａｕｆｆｍａｎ  ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ４９：２２３−２８(１９９１年）；Ｖｉｓｕａｎａｔｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １３：７８３−７８６（１９９２年）；Ｋｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ  １８７：１０８３−１０９０（１９９２年）。
【００２３】
多数の研究は、ＡＩＩ（１−７）（すなわちＡＩＩ残基１−７）又は、ＡＩＩのその他のフラグメントに焦点をあて、これらの活性を評価していた。ＡＩＩ（１−７）は、ＡＩＩによって引用される範囲の全部ではなく一部を対象に引用していた(Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２５：５７−６２（１９９２年）；Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９（Ｓｕｐｐ．ＩＩ）：ＩＩ−４９−ＩＩ−５５（１９９２年）；Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｓｔａｃｋ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐｅｒ Ｔｈｅｒ ２６６：５０６−５１０（１９９３年）；Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．２６５：６６４−６７３（１９９１年）；Ｊａｉｓｗａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １７：１１１５−１１２０（１９９１年）；Ｐｏｒｔｓｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１１：６５２−６５４（１９９４年）。
【００２４】
ここで定義するように、本発明に従って使用するＡＴ２作動物質の好適なクラスは、ＡＩＩ、ＡＩＩ誘導体、又はこれの活性フラグメントから成り、この活性フラグメントは、ＡＩＩにおける６の位置にｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅを有する。ペプチド試薬に加えて、欠かすことのできないＡＴ２作動物質活性を有するペプチド試薬（すなわちペプチド擬態物質）は、さらに本発明に従って使用されるよう意図されている。
【００２５】
本発明において特に興味のもたれる、活性を有するＡＩＩ作動物質、ＡＩＩフラグメント及びこれらの誘導体は、式１において配列するＲ１−ＲＲ基のように少なくとも３つの連続するアミノ酸から構成されており、
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
ここでＲ１およびＲ２は共に以下の式で示す基
Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−
を形成し、
ここでＸはＨまたは１個から３個のペプチド基であり、ＲＡとＲＢの間の結合はアミノペプチダーゼＡによって断裂されやすい。
【００２６】
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、Ａｃｐｃ及びＴｙｒから構成される基より選択される。
【００２７】
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ｈｏｍｏＳｅｒ及びａｚａＴｙｒから構成される基より選択される。  
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｖａｌ、及びＧｌｙから構成される基より選択される。
【００２８】
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇ又は６−ＮＨ２−Ｐｈｅであり、
Ｒ７はＰｒｏ又はＡｌａであり、
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、Ｉｌｅ、及びＴｙｒから構成される基より選択され、Ｒ４を含有する配列は末端Ｔｙｒ基より除外される。
【００２９】
本発明の実施時に有用なＡＴ２作動物質の範疇に含まれる化合物には、Ｒ６がｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅであるとの制限を受けやすいＡＩＩの誘導体が含まれる。
【００３０】
好適な実施の態様における１つのクラスにおいて、ＲＡはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｃｐｃ（１−アミノシクロペンタンカルボキシ酸）、 Ａｌａ、Ｍｅ２Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｂｅｔ、Ｇｌｕ（ＮＨ２）、Ｇｌｙ、Ａｓｐ（ＮＨ２）及びＳａｒから適宜選択される。ＲＢはＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−Ａｒｇ及びＤ−Ｌｙｓから適宜選択される。特に好適なＲＡとＲＢの組み合わせは、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ａｒｇ及びＧｌｕ−Ｌｙｓである。
【００３１】
このクラスにおいて特に好適な組み合わせは、以下のとおりである；ＡＩＩ、ＡＩＩＩ又はＡＩＩ（２−８）、Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号２]；ＡＩＩ（３−８）、すなわちｄｅｓ１−ＡＩＩＩ又はＡＩＶとして周知、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号３]；ＡＩＩ（１−７）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ[配列番号４]；ＡＩＩ（２−７）、Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ[配列番号５]；ＡＩＩ（３−７）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ[配列番号６]；ＡＩＩ（５−８）、Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号７]；ＡＩＩ（１−６）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−[配列番号８]；ＡＩＩ（１−５）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ[配列番号９]；ＡＩＩ（１−４）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ[配列番号１０]；及びＡＩＩ（１−３）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ[配列番号１１]。その他の好適な実施の態様には、Ａｒｇ−ｎｏｒＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号１２]及びＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ｎｏｒＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号１３]が含まれる。さらにその他、本発明の目的に叶う実施の態様には、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号３１]がある。ＡＩＩ（６−８）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号１４]及びＡＩＩ（４−８）、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−ＰＲＯ−Ｐｈｅ[配列番号１５]も試験され、効果のないことが分った。
【００３２】
本発明の目的に叶う、特に興味のもたれる化合物としてのその他のクラスには、一般式ＩＩ
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
に示すクラスがあり、ここでＲ２はＨ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−Ａｒｇ及びＤ−Ｌｙｓから構成される基より選択され、
Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、Ａｃｐｃ及びＴｙｒから構成される基より選択され、
Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ｈｏｍｏＳｅｒ及びａｚａＴｙｒより構成される基より選択され、
Ｒ５はＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｖａｌ及びＧｌｙから構成される基より選択され、
Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇ又は６−ＮＨ２−Ｐｈｅであり、
Ｒ７はＰｒｏ又はＡｌａであって、
Ｒ８はＰｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、Ｉｌｅ、及びＴｙｒから構成される基より選択される。
【００３３】
一般式ＩＩの化合物において、特に好適なサブクラスは式
Ｒ２−Ｒ３−Ｔｙｒ−Ｒ５−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号１６]
を有し、ここでＲ２、Ｒ３及びＲ５は既に定義したとおりである。特に好適なものは式Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ [配列番号２]のアンギオテンシンＩＩＩであり、
その他の好適な化合物には、Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号１７]及びＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ[配列番号１８]の構造を有するペプチドが含まれる。ＡＩＩ（４−８）なるフラグメントは、反復試験において無効であるが、このような結果となる理由には、Ｎ−末端部においてチロシンが曝露されていることが挙げられる。
【００３４】
上記の式において、アミノ酸残基に対して標準的な３文字からなる略号が使われている。反対側に対する同一性が欠けている場合は、Ｌ−型アミノ酸が特に必要とされる。その他の残基は以下のように略号化される。
【００３５】
【表１】
2005160472.tif 000002
【００３６】
ＡＩＩおよびそのアナログは、γ回転又はβ回転に適合するよう提唱されている（Ｒｅｇｏｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ２６：６９（１９７４年）。一般には、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７の位置における天然型側鎖は、原則的に受容体及び／又は活性にあずかるＲ４，Ｒ６及びＲ８の位置の基における互いの距離を維持することに関与している。Ｒ３，Ｒ５及びＲ８の位置における疎水性の側鎖は、ペプチドの全体の構成、及び／又は仮説上の疎水性ポケットの形成において重要な役割を担っている。
【００３７】
Ｒ２の位置上のアミノ酸における適正な側鎖は標的受容体に対する化合物の親和性に寄与することと、ペプチドの構成において重要な役割を果たすことの両者またはいずれか一方に関与している。この理由により、Ａｒｇ及びＬｙｓは特にＲ２にとって好ましい。
【００３８】
本発明における目的のため、Ｒ３はＲ５（γ回転モデル）又はＲ６（β回転モデル）との直線的又は非直線的水素結合の形成にあずかっている。Ｒ３はβ非対象構造（可能性のある構造として提唱されている）において最初の回転に関わっている。一般式Ｉにおけるその他の位置とは対照的に、β分枝及びγ分枝はこの位置において同等に効果的である。さらには、一個の水素結合が比較的安定な構造を維持する上で有用となる。従って、Ｒ３はＶａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、Ａｃｐｃ及びＴｙｒから適宜選択される。
【００３９】
Ｒ４に関しては、構造解析によって、この位置における側鎖（Ｒ３及びＲ５における側鎖と同様に）受容体の占有及び刺激に必須と考えられている疎水性クラスターに寄与していることが示唆されている。このため、Ｒ４はＴｙｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、ｈｏｍｏＳｅｒ、Ｓｅｒ及びａｚａＴｙｒから選択されることが好ましい。この位置において、Ｔｙｒは特に好ましいが、これは、Ｔｙｒがフェノール性ヒドロキシルから水素を受け取る能力を有する受容体部位との間で水素結合を形成するからである（Ｒｅｇｏｌｉ，ｅｔ ａｌ．．（１９７４），ｓｕｐｒａ）。
【００４０】
Ｒ５の位置においては、β脂肪族又は脂環式の鎖を伴うアミノ酸が特に好ましい。このために、Ｒ５の位置にはＧｌｙが好ましい一方で、この位置におけるアミノ酸は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｇｌｙ及びＶａｌから選択されることが好ましい。
【００４１】
アンギオテンシノーゲンＡＩ、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、ＡＩＩ誘導体、本発明に従って特に興味のもたれるフラグメント及びその誘導体において、Ｒ６はＨｉｓ、Ａｒｇ又は６−ＮＨ２−Ｐｈｅである。ヒスチジンのイミダゾール環における独特な役割（生理的ＰＨにおけるイオン化、供与体又は受容体として作用できる能力、芳香族としての特徴）は、Ｒ６としての特別なユーティリティーに関与していると考えられている。たとえば、構造モデルは、Ｈｉｓが、Ｒ７の方向性に影響を及ぼすことによって、（βモデルにおける）水素結合又は非対象構造の第２回転において関わっているかのいずれかを示唆している。同様に、Ｒ８の方向性を最も適正なものとするためには、Ｒ７がＰｒｏでなくてはならないと現在考えられている。Ｒ８の位置において、疎水性の環とアニオン性カルボキシル末端部は、誘導体が受容体へ結合する上で特に有用であることがわかっている。これにより、Ｔｙｒ及び特にＰｈｅは、本発明の目的に適合している。
特に関心のもたれる誘導体には以下の表２に示すものがある。
【００４２】
【表２】
2005160472.tif 000003
【００４３】
略式発明におけるポリペプチドは、固相合成に関してのＪ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｅｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．（１９８４年）及びＪ．Ｍｅｌｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７３年）に含まれる汎用方法により合成され、溶液合成についてはＥ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９６５年）により合成されるが、これに制約されない。現在執筆中の学術論文類の開示は参考文献として本発明に含まれる。
【００４４】
一般に、保護されたアミノ酸に連続的に添加して、ペプチド鎖を伸長させる上で３つの方法が関与している（米国特許第５，６９３，６１６号であり、その全体が参考文献として含まれる）。通常は、１級アミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基並びにあらゆる反応性側鎖のいずれかが保護される。この保護アミノ酸が不揮発性固体指示相に結合されるか、又は溶液の形で利用され、配列上で次のアミノ酸もまた適宜保護され、アミド結合の形成に耐えられる条件下で添加される。すべての希望されるアミノ酸が適正な配列において結合された後、保護基及びあらゆる固体指示相が除去され、粗ペプチドが供給される。このペプチドが脱塩化されて精製され、好ましくはクロマトグラフィーによって最終産物が得られる。
【００４５】
好ましくは、ペプチドが標準的固相方法に従って合成され、アプライドバイオシステムズ・モデル４３０Ａペプチドアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）上で、製造所の指示に従って合成される。その他のペプチド又はペプチド擬態物質の合成法は、固相法又は液相法のいずれかによる方法であるが、本発明において周知である。
【００４６】
ＡＩＩはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多数のタイプの細胞増殖を増大させることが示されてきたが、必ずしもすべてのタイプの細胞増殖を増大させてきたのではない。ＡＩＩが形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）（Ｇｉｂｂｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：４５６−４６１（１９９２年）の産生を介して細胞増殖を増大させたことを示す研究がある。よって、ＰＤＧＦのみがＭＳＣに対してマイトジェニックに作用するので、ＭＳＣ増殖に対してＡＩＩが及ぼす能力は期待されない。さらには、Ｅｍｅｒｓｏｎ（ｓｕｐｒａ）が、ほとんどの拡大培養にＴＧＦ−βを入れると、その結果としてＨＰＣ及びＨＬＳＣ収量が減少し、ＡＩＩがＴＧＦ−βの作用を介してこのような条件下に利点をもたらすとは考えられない。ＡＩＩがＨＰＣ又はＭＳＣのいずれかの分化に対して影響を及ぼすとの報告をした研究はない。
【００４７】
本発明における一つの局面には、アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体、又はＡＩＩＡＴ２の２型受容体作動物質に曝露させることによってｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでＨＰＣ及びＨＬＳＣの増殖を増大させる方法が開示されている。ＨＰＣ及びＨＬＳＣの分離、精製、ｅｘ ｖｉｖｏでの生育及びｉｎ ｖｉｖｏでのモビライゼーションに関する実験条件が報告されている（Ｂｅｒａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８６（６）：２１２３−２１２９、１９９５年；Ｆｒｉｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １７：１６９−１７８，１９９６年；ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １２：１３２９−１３３７，１９９６年；Ｔｒａｙｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２４：２９９−３０６，１９９６年；Ｈｏｌｙｏａｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：４５８９−４５９５，１９９６年；Ｌｅｍｉｅｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８６：１３３９−１３４７，１９９５年；Ｔａｌｍａｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １７：１０１−１０９，１９９６年；Ｂｏｄｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８８：８９−９７，１９９６年、以上はすべて参考文献として本発明に含まれる）。
【００４８】
本発明の１つの実施の態様において、ＨＰＣは骨髄、末梢血又は臍帯血から分離される。ＨＰＣはこの時点でこれらの試料として選択される。ＨＰＣを豊富に含む試料は、ＡＩ、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体及び／又はＡＩＩＡＴ２の２型受容体作動物質の存在下において、適正な生育条件下で培養される。ＨＰＣ増殖は、培養中、多様な時間点において評価される。
【００４９】
好ましい実施の態様において、ＨＰＣ及びＨＬＳＣは、腸骨後方稜からの骨髄吸引物より単離される（Ｃａｐｉａｎ ａｎｄ Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈらによる米国特許第５，４８６，３５９号）。ＣＤ３４＋ＨＰＣは、ＣＤ３４に特異性を有するビオチニル化モノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡより入手）に付着させることによって、単離され、ストレプトアビジン親和性カラム（Ｃｅｐｒａｔｅ ＳＣ；Ｃｅｌｌｐｒｏ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使って、そのカラムに吸引物を通過させ、続いて、本発明における標準的技術に従い、適正なカラムを使って洗浄およびストリッピングを行う。ＣＤ３４＋ＨＰＣは培養用の培地中に懸濁させ、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲のアンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、ＡＩＩ、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体及び／又はＡＩＩＡＴ２の２型受容体作動物質の存在下において培養される。細胞は８日から２１日までの期間にわたって拡大培養され、分化を伴う細胞増殖は、位相差顕微鏡を使って標準的メチルセルロースコロニー形成アッセイ（Ｂｅｒａｒｄｉ，ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）により、この時間内における多様な時点で評価される。同様に、ＨＰＣの「自己再生」については、ＣＤ３４＋を指向する抗体への反応性によって定期的に評価される。
【００５０】
さらに好適な実施の態様において、アンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、ＡＩＩ、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体及び／又はＡＩＩＡＴ２の２型受容体作動物質の存在下において培養されたＨＰＣは、自己由来移植に使用され、枯渇した造血系が再構築される。移植に先立ち、細胞を洗浄して、すべての培養液の痕跡物が除去され、適正な培地に再度懸濁されて、ペレット化され、数回洗浄される。最終洗浄後、細胞は０．７ｘ１０６個／ｍｌから５０ｘ１０６個／ｍｌの範囲で適正な培地中に懸濁され、静脈内注入を介して患者へ再度輸血される。移植後、患者の末梢血試料はＨＰＣ、ＨＬＳＣ、さらに成熟化した血液細胞の数の増大を、標準的フローサイトメトリー及び細胞分取技術（Ｔａｌｍａｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）により多様な時点において評価される。
【００５１】
本発明におけるその他の目的において、アンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、ＡＩＩ、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体及び／又はＡＩＩＡＴ２の２型受容体作動物質に曝露することによるｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏにおけるＭＳＣ及び系統特異性の間葉織細胞増殖の増大法が開示される。骨髄由来ストロマ細胞等、系統特異性間葉織細胞の分離、精製およびｉｎ ｖｉｔｒｏ生育のための実験条件が報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｄｏｒｓｈｉｋｉｎｄ、Ｂｌｏｏｄ ６８（６）：１３４８−１３５４（１９８６年）であり、その全体が参考文献として含まれる）。その他の報告書では、系統特異性の間葉織細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける培養に向けた多様な条件を報告している（Ｂａｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｅｔ． ８４：１３９−１５１（１９８６年）；Ｂｅｎａｙａｈｕ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４０：１−７（１９８９年）であり、両者はその全体が本発明に参考文献として含まれる）。
【００５２】
本発明における１つの実施の態様において、ＭＳＣは腸骨後方稜及び／又は大腿骨頭部の海綿状骨から回収した骨髄吸引物から分離され、精製されて、適正な生育用培地に再度懸濁され、計数されて培養皿に撒くために適正な濃度に希釈される（Ｃａｐｌａｎ ａｎｄ Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ，米国特許第５，４８６，３５９号）。精製ＭＳＣは加湿された大気中で適正な生育培地及び生育条件において培養される。付着細胞は、好ましくは、アンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、ＡＩＩ、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体及び／又はＡＩＩＡＴ２の２型受容体作動物質が約０．１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲で存在する条件において、加湿した大気中において３７℃で生育培地中におかれる。細胞は２日から２１日間のあいだの期間拡大培養され、この時間内の多様な時点において、細胞増殖が評価される。初代培養物がコンフルエントに近い状態になった時点で、細胞は回収され、患者へ再度輸血される。汚染物の存在について、顕微鏡による細胞の試験が行われる。細胞は洗浄されて培養液の残留物すべてを除去され、適正な培地中に再度懸濁されてペレット化され、数回洗浄される。最終洗浄後、細胞は０．７ｘ１０６個／ｍｌから５０ｘ１０６個／ｍｌの範囲で適正な培地中に再度懸濁され、静脈内注入を介して患者へ輸血される。患者は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＳＣ増殖を、反復式骨髄吸引法及び生検の手段によって評価され、オリジナルの吸引物と生検と比較される。好適な実施の態様において、ｉｎ ｖｉｖｏの増殖は、非増殖細胞中よりも増殖細胞中において高濃度で存在することが知られているタンパクに対する抗体、たとえば増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡまたはサイクリン）への反応性をみることによって評価される。このような抗体はｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）等の多数の入手元から入手できる。
【００５３】
好適な実施の態様において、分離されたＭＳＣは、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地ＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＬＧ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）中におかれる。この細胞は一連の段階を経て精製される。最初は、細胞が回収されて完全培地中に再度懸濁される。細胞は７０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）勾配を介して４６０ｘｇで１５分間遠心分離され、勾配中の最上層の２５％が、完全培地３０ｍｌを含む試験管に移されて、細胞が遠心分離によって回収され、完全培地中に再度懸濁されて、計数され、１００ｍｍの培養皿に１枚あたり５０ｘ１０６個の脱核細胞が含まれるように撒ける状態まで希釈される。
【００５４】
さらに好適な実施の態様において、精製ＭＳＣは完全培地中で３７℃にて加湿した大気中に９５％空気及びＣＯ２を含む条件で培養され、細胞は３日間接触されて、非付着細胞は培地換えにより除去される。付着細胞の細胞増殖と正常ＭＳＣの形態の存在について、位相差顕微鏡を使用し、連続する生育期間中の多様な時点において評価が行われる。４日ごとに副次的に培地換えが行われる。初代培養がコンフルエントに近づいた時点で、細胞は０．１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）含有０．２５％トリプシンにて剥がされ、希釈されて、第２代細胞として再度おかれるか、患者への再輸血に使用される。好ましくは、細胞はＴｙｒｏｄｅ’ｓ溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使い、培養液を含まない液にて洗浄される。最終洗浄後、細胞はＴｙｒｏｄｅ’ｓ溶液中に再度懸濁され、３７℃で１時間培養されて血清タンパクが封じられるようにする。Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ溶液は除去され、細胞はＴＣ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）におかれ、１％血清アルブミンが添加されるのが好ましい。細胞はこの培地で多数回洗浄され、最終洗浄後、ＭＳＣはＴＣ１９９培地に１％血清アルブミンを添加した液中へ再度懸濁される。続いて、ＭＳＣは１５分かけてゆっくりと静脈内注入される。注入後８週間後まで、連続的な骨髄吸引物の評価が行われる。
【００５５】
好適な実施の態様において、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、ＡＩＩ、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体及び／又はＡＩＩＡＴ２・２型受容体作動物質の増殖効果の、ＭＳＣ及び間葉織系統特異性の細胞の評価が、多様な組織の組織学的評価により行われる。好適な実施の態様において、ＭＳＣ及び間葉織系統特異性の細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖は、非増殖細胞中よりも増殖細胞中において高濃度で存在することが知られているタンパクに対する抗体、たとえば増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡまたはサイクリン）への反応性をみることによって評価される。
【００５６】
本発明におけるさらなる目的において、ＨＰＣ、ＨＬＳＣ分化に対してアンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、ＡＩＩ、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体及び／又はＡＩＩＡＴ２の２型受容体作動物質の及ぼす効果は、遺伝子発現、表現型、形態、又はその他の系統特異性細胞と分化を遂げつつある細胞とを鑑別するその他あらゆる方法における変化を検討することによって評価される。好適な実施の態様において、誘導又は活性化段階へのマクロファージ分化は、前述のように、アンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ誘導体、ＡＩフラグメント及びその誘導体、ＡＩＩ、ＡＩＩ誘導体、ＡＩＩフラグメント及びその誘導体及び／又はＡＩＩＡＴ２の２型受容体作動物質へ曝露した後に評価される。マクロファージは、周知の方法のすべてにより、貪食能によって評価され、オプソニン化した酵母粒子を貪食するマクロファージの数、及び貪食したマクロファージ１個あたりの酵母粒子の数によって測定されるが、これに限定されるものではない（Ｒｏｄｇｅｒｓ ａｎｄ Ｘｉｏｎｇ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｄａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ３３：１００−１０８（１９９６年）。
【００５７】
別の望ましい実施の態様では、白血球の呼吸バースト作用が、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／または上記したようなＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬に接触させた後に評価された。白血球は、呼吸バースト作用に対して、呼吸バーストシステムを媒介として、過酸化水素を発生させる能力を含む（ただしそれに限定されない）技術において既知の何らかの方法で評価が行われた。（Ｒｏｄｇｅｒｓら、Ｉｎｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １０：１１１−１２０（１９８８）：  Ｒｏｄｇｅｒｓ，  Ｉｎ：  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（ｅｄ．  Ｇ．Ｂｕｒｌｅｓｏｎ），  Ｗｉｌｅｙ  Ｌｉｓｓ  １：６７−７７（１９９５））
本発明の化合物によるマクロファージ活性化は、活性化されたマクロファージで作られたサイトカインを生成するためマクロファージ刺激し、Ｔ細胞へのマクロファージ表示を改善し、かつ哺乳動物において抗腫瘍免疫力を増大させて、ウイルスや細菌感染を治療するために用いることができる。
【００５８】
本発明の別の局面で、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬は、生体内でＨＰＣ、ＨＬＳＣ、ＭＳＣおよび間葉性直線（直系）特定細胞増殖を高めるために用いられている。ＨＰＣ、ＨＬＳＣＰ、ＭＳＣおよび間葉性直線（直系）特定細胞の増殖増大において使用するために、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬を、従来の製剤学上承認されているキャリヤー、佐剤、賦形剤を含むユニット処方用量における経口、非経口、吸入スプレー、直腸投与、または局所的投与を含む適切な方法で投与してもよい。本文で使用する非経口という用語は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、腱内、髄腔内、頭蓋内、胸部内、点滴技術または腹膜内投与を含む。
【００５９】
本発明のさらなる実施の態様において、生体内でのＨＰＣ、ＨＬＳＣ、ＭＳＣおよび間葉性直線（直系）特定細胞増殖をアンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬に接触させることで高める方法は、他の成長因子およびサイトカインの存在、不在のいずれかにおいて明らかにされている。そのような成長因子およびサイトカインの例としては、リンフォカイン、インターロイキン−１，  ２，  ３，  ４，  ５，  ６，  ７，  ８，  ９，  １０，  １１、顆粒性白血球コロニー刺激因子、顆粒性白血球／マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、表皮性成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板誘導成長因子、変形成長因子ベータおよび茎細胞因子を含むが、これに限定されるものではない。アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬は、固形（顆粒、粉末または座薬を含む）または液体（たとえば、溶液、懸濁液または乳濁液の形態で作られてもよい。本発明の化合物は、様々な溶液に適用させることができる。本発明に従った使用にふさわしい溶液は、無菌で、十分な量のペプチドが溶解しており、提案された適用に対して有害でないものである。この点に関して、本発明の化合物は非常に安定であるが、強酸および強塩基では加水分解する。本発明の化合物は有機溶媒およびｐＨ５〜８の水性溶液に可溶である。
【００６０】
アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬は、殺菌のような従来の製剤学的操作に付されてもよいし、および／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、等のような従来からの補助剤を含んでいてもよい。
【００６１】
アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬は、単独活性薬剤として投与することができるが、一つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて使用することも可能である。配合剤として投与される場合、治療薬を、同時にまたは別々に投与する分離組成物として処方することも可能であるし、または治療薬を単独組成物として投与することも可能である。
【００６２】
投与に対して、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬を、通常、指示された投与経路に適切な一つまたは複数の補助剤と組み合わせる。化合物は、ラクトース、蔗糖、粉末澱粉、アルカノイック酸（ａｌｋａｎｏｉｃ  ａｃｉｄｓ）のセルロースエステル、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、燐酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニールピロリジン、および／またはポリビニールアルコールと混合してもよく、従来式の投与に従って錠剤またはカプセル剤にしてもよい。代替の方法として、本発明の化合物を、塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツオイル、綿実油、ごま油、トラガカントゴム、および／または様々な緩衝剤中に溶解してもよい。その他の補助剤および投与方法が、製剤学技術において知られている。キャリヤーまたは希釈剤は、単独または蜜蝋を混合したグリセリルモノステアリン酸またはグリセリルジステアリン酸のような遅延性物質、または当業者に既知の物質を含んでもよい。
【００６３】
局所投与にふさわしい処方には、皮膚浸透に適した液体または半液体調製剤（たとえば、塗布剤、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）、および目、耳または鼻に投与するのに適した点滴剤がある。
【００６４】
生体内で、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬と共に、ＨＰＣ、ＨＬＳＣ、ＭＳＣおよび直線（直系）特定間葉性細胞の増殖または分化を促進するための投与計画は、傷害の種類、年齢、体重、性別、個人の医学的条件、状態の程度、投与経路、および使用する特殊化合物、等を含む様々な要素に基づいて行われる。したがって、投与計画は非常に広範囲なものとなりうるが、医者は標準的な方法を用いて、機械的に決定することも可能である。体重１  ｋｇ当たり、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬０．１ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの投与レベルは、本文に明記されたすべての使用方法に対して有効である。
【００６５】
治療計画は、治療を行う疾患により大きく異なり、傷害の種類、年齢、体重、性別、個人の医学的条件、状態の程度、投与経路、および使用する特殊化合物、等を含む様々な要素に基づく。たとえばアンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬は、ワンクールの放射線治療の前に、３０日間を限度として腫瘍患者に投与する。治療では、上記した投与量を１日に１回から６回投与する。別の例では、血清瀉血（プラスマフェレーゼ）による提供用に造血直線（直系）特定細胞を起動させるために、治療では、１日１〜６回で３０日までとする。
【００６６】
本発明の好ましい実施の態様では、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬を局所投与する。アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬の活性成分の好ましい局所投与量はおよそ０．１  ｎｇ／ｍｌ〜１  ｍｇ／ｍｌで、一日２度投与するのが好ましい。局所投与では、活性成分は０．０００１％〜１０％  ｗ  ／  ｗが含まれ、たとえば処方体重当たり１％〜２％であり、１０％  ｗ／ｗ含まれてもよいが、好ましくはせいぜい５％  ｗ／ｗ、さらに好ましくは処方の０．１％〜１％である。
【００６７】
本発明のもう一つの局面において、改良された細胞培養基は、造血および間葉性茎および直線（直系）特定細胞の増殖および分化のために準備されており、そこで改善されたことは、細胞培養基に、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬の有効量が加えられたことである。本発明では、造血、間葉性茎および直線（直系）特定細胞の成長を援助するどのような細胞培養基でも使用が可能である。そのような細胞培養基には、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ  Ｅａｇｌｅ（基礎的培養基Ｅａｇｌｅ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｄｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培養基）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｓｃｏｖｅの修正Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培養基）、ＭｃＣｏｙ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭｃＣｏｙの培養基）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（最小限主要培養基）、Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ（Ｆ−１０  栄養混合物）、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標)  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標)  縮小血清培養基）、ＲＰＭＩＩ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ培養基）、およびＭａｃｒｏｐｈａｇｅ−ＳＦＭ  Ｍｅｄｉｕｍ（マクロファージ−ＳＦＭ培養基）またはそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
改良された細胞培養基は、濃縮された（すなわち、１０Ｘ）または濃縮されない形態で供給されてもよく、また液体、粉末または凍結乾燥のいずれかで供給されてもよい。細胞培養物は化学的に決定されてもよく、または血清補給物を含んでいてもどちらでもよい。培養基は、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（Ｇａｉｔｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）のような多くの販売元から市販されている。
【００６９】
さらなる局面において、本発明は、造血、間葉性茎および直線（直系）−特定細胞の増殖のための用具（キット）を用意している。この用具には、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似物、ＡＩフラグメントおよびその類似物、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似物、ＡＩＩフラグメントおよびその類似物および／またはＡＩＩ  ＡＴ２タイプ２レセプター作用薬の有効量が含まれており、かつ細胞培養基として使用する場合の使用説明書が添付されている。
【００７０】
好ましい実施の態様において、この用具はさらに、細胞培養成長培養基を有している。本発明では造血、間葉性茎および直線（直系）−特定細胞の成長を援助するものであればどのような培養基を使ってもよい。このような細胞培養基の例は上記で挙げたものである。細胞培養基は濃縮（すなわち、１０Ｘ）または非濃縮形態のいずれかで供給されてもよく、液体、粉末または凍結乾燥のいずれかであってもよい。細胞培養物は化学的に決定してもよく、または血清補給物を含んでいてもよい。
【００７１】
さらに好ましい実施の態様では、用具にはさらに殺菌容器が含まれており、これは、細胞培養フラスコ、回転瓶または遠心管のような密閉容器、または細胞培養皿またはマイクロ滴定皿（Ｎｕｎｃ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，  ＩＬ）のような非密閉容器のいずれかを内包することができる。
【００７２】
別の好ましい実施の態様では、用具はさらに、再組成細胞成長培養基内への封入のための抗生物質補助剤を含んでいる。好ましい抗生物質補助剤の例としては、ａｃｔｉｍｏｎｙｃｉｎ  Ｄ、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ(登録商標)、カナマイシン、ネオマイシン、ｎｙｓｔａｒｉｎ、ペニシリン、ステレプトマイシンまたはそれらの組み合わせ（ＧＩＢＣＯ）があるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明は、ＨＰＣおよびＨＬＳＣの増殖を高めるための方法を提供することにより、ＨＰＣ移植を臨床的に大いに助けるものとなろう。これは、造血システム全体を再構成することができるＨＰＣをより多く提供する増大した「自己再生力」についても、および十分に発達した、機能的な血液細胞をより早く再生するための、直線（直系）−特定細胞をより多く供給する分化を伴った増殖についても言えることである。同様に、生体内においてＨＰＣの増殖を増大させる方法は、骨髄中においてＨＰＣ（およびＨＬＳＣ）の局所濃度を急速に高めることで、ＨＰＣ移植治療の効用を高め、その結果より速く機能血液細胞を生成することになるだろう。
【００７４】
同様に、ＭＳＣおよび間葉性直線（直系）−特定細胞の増殖を増大させる方法は、骨、軟骨、腱および靱帯のような骨格組織の修復におけるＭＳＣ治療の有効性大いに高めるだろう。数多くのＭＳＣおよび間葉性直線（直系）−特定細胞をより速く増殖させることで、これらの細胞を高密度でより有効に損傷部位に届けることができ、かつ適切な修復部位において、茎および直線（直系）−特定細胞の局所濃度における生体内でのより速い拡充を可能なものとするだろう。
【００７５】
本発明の方法はまた、造血障害における遺伝子治療のための賦形剤としてのＨＰＣおよびＨＬＳＣの潜在的有効性を高めるだけでなく、数多くのそのような細胞をトランスフェクションのために有効により多く供給することで、またトランスフェクションされたＨＰＣ、  ＨＬＳＣ、ＭＳＣおよび造血直線（直系）特定細胞を急速に拡張させるためにより有効な手段を提供することで、骨格傷害における遺伝子治療に対しても賦形剤として、ＭＳＣおよび間葉性直径−特定細胞の潜在的有効性も高めるものである。
【００７６】
本発明は、例証だけを目的とする添付の実施例を参照することによりよりよく理解することができるであろう。本実施例は、本文書に付帯されている特許請求の範囲で定義されているとおり、本発明の範囲に限るものと理解されるべきではない。
【００７７】
実施例１．  マクロファージの分化：食作用
常駐腹膜マクロファージはほとんど食作用行動は行わない。マクロファージを炎症剤または活性剤に接触させると、このマクロファージの機能を高めることになるだろう。常駐腹膜マクロファージを、Ｃ５７Ｂ１／６のネズミ群またはＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット群から採取し、燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）中に１×１０６細胞／  ｍｌの濃度で再懸濁した。五つの０．５ｍｌ細胞に等分したものを、３５ｍｍペトリ皿のカバーグラス上に配置した。定温培養前に、最終濃度が１〜１０００ｕｇ／ｍｌのＰＢＳ、ＡＩＩまたはＡＩＩ類似物またはフラグメントのいずれかの０．５ｍｌをそれぞれのカバーグラスに添加した。カバーグラスを入れた皿を３７℃で４時間培養し、その後カバーグラスをＰＢＳで３〜６回洗浄した。オプソニンを作用させた酵母菌粒子（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（その代用物と同種のものから採取した成熟血清と共にオプソニンを作用させた酵母菌）をカバーグラスに添加し２時間培養した後、カバーグラスを再びＰＢＳで洗浄し、ガラススライド上に転化した。酵母菌を摂取したマクロファージの数と、マクロファージ毎の摂取された酵母菌の数を顕微鏡で数えた。少なくとも、カバーグラス毎に１００のマクロファージが数えられた。この研究で得られたデータを表３および４、図１および２にまとめた。表５は、これらの研究で用いたＡＩＩ類似物およびフラグメントについて記述したものである。
【００７８】
１０μｇ／ｍｌまたはそれより大きなＡＩＩに接触させることで腹膜マクロファージの食作用能力が甚だしく向上した。常駐個体群において、細胞の１％未満が食細胞である（観察細胞１個毎に酵母菌０．０１）。  ＡＩＩに接触させた後、平均でマクロファージ毎に酵母菌１個の高い濃度で２５％以上の食細胞を増加させた（食菌できるマクロファージの数が２５倍に増加、食菌された粒子の数が１００倍に増加）。
【００７９】
表４に示したように、テストしたペプチド（ＧＳＤ  ２８を除く）のどの濃度も、ラットのマクロファージの食菌作用能力を高めた。しかし類似物のいずれも、ＡＩＩで観察した効果ほどの結果は出さなかった。これは、ＡＩＩおよび、より縮小した範囲で、ＡＩＩ類似物は顕在化したまたは活性化した状態までマクロファージ分化を刺激し、これがバクテリアおよび細胞のくずの摂食および浄化にまで至ったと推測される。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
【表４】
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【００８２】
【表５】
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【００８３】
実施例２  白血球分化：呼吸バースト
白血球の呼吸バースト（マクロファージおよび多形核好中球）は、バクテリアを殺すために使われる媒介システムの一つの成分（構成要素）である。食作用に関して、常駐マクロファージにおけるこの呼吸バースト作用は低い。分化により、顕現させた（炎症性）または活性化させた状態どちらに対しても、この機能作用は有意に高まった。呼吸バーストシステムを介して過酸化水素を生成する能力に対して、様々な濃度のＡＩＩにハツカネズミまたはラットの腹膜マクロファージおよびヒトの腹膜血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を生体内で接触させる効果を評価する研究が行われた。ヒトの研究については、５人のドナーを検査した。
【００８４】
ハツカネズミまたはラットの腹膜細胞は、牛血清アルブミン０．５を伴うコールドＰＢＳ  ５〜１５  ｍｌで洗浄することで採取した。ヒトＰＢＭＣは、健常応募者から静脈穿刺により採取し、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ  密度遠心分離により腹膜血液から分離した。分離後、細胞を１×１０６で再懸濁し、受け皿毎に１００μリットルの割合で９６枚の受け皿に配置した。細胞を、ＡＩＩまたはＡＩＩ類似物の様々な濃度と共に、３７℃で４時間培養した。細胞に、過酸化水素用の蛍光プローブ、２，７  ジクロロフルオレセインエステルを予備挿入した。２，７  ジクロロフルオレセインエステルは、過酸化水素不在下では非蛍光性である。１５分後、過酸化水素の生成を刺激するために、ホルボールミリスチン酸エステル（＋ＰＭＡ）または（−ＰＭＡ）１０ｎｇ／ｍｌを添加した。刺激の１時間後、生成された蛍光発光レベルを、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  ２３５０ｍｕｌｔｉｌｗｅｌｌ  蛍光メーターで測定した。この研究から導かれた主な結果は図３〜４に示した。
【００８５】
ＰＭＡまたはペプチドの不在下では、過酸化水素の生成は全く観察されなかった。ＡＩＩに対する反応では、若干の変動が見られた（すなわち、この機能のレベルを高めるために必要なＡＩＩの濃度）が、すべての研究において、ＡＩＩは、単独でおよびＰＭＡによる刺激反応においてのどちらでも過酸化水素を生成する白血球の能力を高めた。さらに、ＰＢＭＣの呼吸バースト作用に対するＡＩＩの類似物（ＧＳＤ２２Ａ、ＧＳＤ  ２４Ｂ、ＧＳＤ  ２８およびＡＩＩ（１−７））の予備接触の効果を評価した（図５〜８）。すべての類似物では、呼吸バースト作用を増大させるためにはペプチドの濃度がさらにかなり高くなければならない。これらの類似物は１００倍までの量が必要である。しかし呼吸バースト能力の増大がテストしたすべての類似物で観察された。類似物は、ＰＭＡの存在下および不在下のどちらでもその機能を促すことができた。これらのデータでは、ＡＩＩが、３種からの単核白血球／マクロファージの分化を促すことができたことが示されている。
【００８６】
実施例３．  ヒトリンパ球の増殖反応
有糸分裂促進物質または抗原によるリンパ球の刺激に対して、これらの細胞は芽体発生および増殖を起こした。そのような刺激（物質）が無い場合、増殖はほとんど観察されない。短期間評価で細胞の増殖を測定する方法の一つは、新たに合成されたＤＮＡ中に混入されているヌクレオチドチミジンの量を量る方法である。ヨウシュウヤマゴボウ有糸分裂促進物質（”ＰＷＭ”）の存在下および不在下でのヒトＰＢＭＣの増殖に対するＡＩＩの効果を評価した。
【００８７】
ヒトＰＢＭＣを健常応募者から採取し、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）密度遠心分離で分離した。淡黄褐色の膜を除いた後、細胞を３Ｘ洗浄してＦｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅを取り除き、トリパンブルー（０．０１％）内で計算を行い、牛の胎児血清１０％と抗生物質を含むＲＰＭＩ  １６４０中に、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁を行った。細胞の１００μリットル部分を各受け皿に加えた。その後は、ＦＣＳ  １０％および抗生物質を含むＲＰＭＩ  １６４０中におけるＡＩＩの様々な濃度（０．１〜最終濃度１０００μｇ／  ｍｌ）を、３枚づつにした様々な受け皿に添加した。適切な受け皿に対して、ＰＷＭ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を添加した。これらの皿をＣＯ２５％で、３７℃、４８時間培養した。続いて、３Ｈ−チミジンの０．５μＣｉを各受け皿に添加し、３７℃でさらに２４時間培養した後、自動化ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  サンプル採取器（Ｓｋａｔｒｏｎ）によりグラスファイバーフィルター上に採取した。これらのフィルターは乾燥させて、シンチレーション流体中に配置し、混入されているチミジン量をベータ計測器で測定した。結果は図９および表６に掲載している。
【００８８】
有糸分裂促進物質不在下では、ＡＩＩ接触後、混入チミジンの増加は認められなかった。しかし、分離した二つの実験では（二人の異なるドナーから採取した細胞）、ＡＩＩがＰＷＭに対する反応において混入チミジン量を増加させることが証明された。データでは、ＡＩＩは造血直線（たとえばリンパ球）から採取した細胞の増殖を促進できることを証明している。
【００８９】
【表６】
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【００９０】
実施例４  ラット間葉性茎細胞増殖
これらの研究は、ＡＩＩがＭＳＣの増殖に対して有し得る効果を測定するために行った。骨髄細胞を雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの大腿骨および脛骨から、注射器と１８径針を用いて、ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（”ＤＭＥＭ−ＨＧ”）により骨を洗うことで採取した。これらの細胞を、牛胎児血清（ＦＣＳ）の選択ロットおよび抗生物質を含む（完全培養基）ＤＭＥＭ−ＨＧ内に５×１０３細胞／ｍｍ２の割合で２４枚の受け皿  内で、空気中にＣＯ２を５％含む３７℃の培養器で培養した。培養を始めてから２４時間後、培養基および非付着性細胞を吸引して、新しい培養基を加えた。これらいくつかの受け皿のそれぞれに、ＡＩＩを伴った完全培養基（１〜１００μｇ／ｍｌ）またはＡＩＩの無い完全培養基を添加した。クローンからの細胞の移動およびそれらの増殖を顕微鏡検査で追求した。４日毎に古い培養基を取り除き、新しい培養基を培養物に加えた。
【００９１】
これらの実験から得られたデータを図１０および１１に掲載した。培養物にＡＩＩを加えることで、ＭＳＣが元にあった部位（ＣＦＵ）の数が有意に増加し、形成されたコロニーの大きさ（細胞の数）も増大した。これは、より小さな範囲であるが、それ自体の中でＭＳＣ成長を助ける血清が存在するだけで起こった。見て分かるように、二つの異なる血清ロットの存在下に検査を行ったすべての時点で、濃度依存方式において、ＭＳＣの数が増大している。これらのデータは、ＡＩＩはラットＭＳＣの増殖を高めることができるという仮説を証拠だてるものである。
【００９２】
実施例５  マウス系に特異的な細胞に対するアンギオテンシンＩＩの効果
ＨＰＣをＣ５７Ｂ１／６マウスから免疫磁気的なアフィニティクロマトグラフィーによって採取し、最適な増殖培地の半流動培養状態に置いた。培養開始後の様々な時間で、コロニー形成および形成コロニーのサイズ（コロニーあたりの細胞数）を顕微鏡で評価した。
【００９３】
雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスをＳｉｍｏｎｓｏｎから購入し、本研究における骨髄細胞の供給源として使用した。骨髄細胞を、未処理マウスから、または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（３ｍｇ／マウス；約１５０ｍｇ／ｋｇ）を採取の４８時間前に尾に注射したマウスから、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２１ゲージ針で洗い流すことによってマウスの大腿骨および脛骨から採取した。流出液を遠心分離し、ペレットを、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳおよび５％正常ラット血清を含有するＰＢＳ中に４×１０７個／ｍｌの有核細胞で再懸濁した。
【００９４】
免疫磁気標識を行うために必要な試薬をＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）から購入した。下記のマウス系に特異的な細胞の表面抗原に対するビオチン標識モノクローナル抗体がＨＰＣ濃縮用カクテルに含まれ、これらを製造者の指示に従って使用した：ＣＤ５（Ｌｙ−１）、ＣＤ４５−Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、骨髄球様分化抗原（Ｇｒ−１）および赤血球様細胞（ＴＥＲ１１９）。１０μｌの抗体カクテルを、２組の骨髄（正常および５−ＦＵ処理）のそれぞれに加え、混合して４℃で１５分間インキュベーションした。次いで、細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中に４×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。次いで、抗体カクテルを洗い出し、１００μｌの抗ビオチンテトラマーを１ｍｌの細胞のそれぞれに加えた。懸濁物を混合し、４℃で１５分間インキュベーションした。次いで、６０μｌの磁気コロイドを１ｍｌの細胞のそれぞれに加え、これらを混合し、４℃で１５分間インキュベーションして免疫磁気的に標識した骨髄細胞を得た。
【００９５】
ステンレススチールのマトリックスを含有するカラムを、ＰＢＳでマトリックスを洗浄し、その後２％タンパク質を含有するＰＢＳで洗浄することによって調製した。免疫磁気的に標識した骨髄細胞をカラムに負荷し、未標識細胞を含有する培地（濃縮ＨＰＣ）を、０．２ｍｌ／分の流速での分画により流しながら集めた。培地をカラムの頂部に加えた。８〜１０ｍｌの濃縮ＨＰＣが集められるまで液切れしなかった。カラムに負荷した細胞の約２％が濃縮ＨＰＣ画分に単離された。
【００９６】
濃縮されたＨＰＣ細胞の画分を、０．９％メチルセルロースをα最少必須培地（αＭＥＭ）（３０％ウシ胎児血清、１％ウシ血清アルブミン、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、およびコロニー刺激因子類を含有する２％馴化培地）中に含有する半流動培地に希釈した。馴化培地は、１０μｇ／ｍｌアメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０中で４８時間インキュベーションした脾臓細胞の培養（１×１０６細胞／ｍｌ）から得られた上清であった。０〜１００μｇ／ｍｌの間の様々な濃度のＡＩＩを、小容量で、マイクロタイターディッシュのウエルに対して、正常細胞に関して２×１０４細胞／ｍｌおよび５−ＦＵ処理細胞に関して２．５×１０４細胞／ｍｌの間に対して添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で１４日間インキュベーションした。１４日後においてのみ、顕微鏡で細胞コロニーを、濃縮ＨＰＣを含有するウエルにおいて観察した。１０μｇ／ｍｌで処置した未処理（正常）マウスから得られた濃縮ＨＰＣでは顕微鏡下で１８コロニーであり、１００μｇ／ｍｌのＡＩＩでは顕微鏡下で１０コロニーであった。細胞の顕微鏡下での評価を、インキュベーション開始後の様々な日数で行った。その結果を図１２〜図１７に要約して示す。
【００９７】
図１２〜図１４および図１６は、コロニーあたり一定数以上の細胞を含有するコロニーの数をＡＩＩ暴露の継続時間および濃度の関数として示す（図１２〜図１４は正常細胞に関し；図１６は５−ＦＵ処理細胞に関する）。図１５および図１７は、正常マウスまたは５−ＦＵ処理マウスから得られた骨髄を様々な濃度のＡＩＩとインキュベーションした後に見られるコロニーあたりの細胞数を時間の関数として示す。その結果は、ＨＰＣコロニーのサイズは、増大した濃度のＡＩＩへの暴露に比例して増大すること、従って、ＡＩＩはＨＰＣ増殖を増大させることを明瞭に示している。
【００９８】
実施例６  ラット間葉幹細胞の増殖に対するＡＩＩアナログおよびフラグメントの効果
これらの研究を、ＭＳＣの細胞培養においてＡＩＩアナログおよびフラグメントを含むことによってこれらの細胞の増殖に対して得られる効果を明らかにするために行った。骨髄細胞を、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの大腿骨および脛骨からダルベッコ最少必須培地−高グルコース（「ＤＭＥＭ−ＨＧ」）を用いてシリンジおよび１８ゲージ針で洗い流すことによって採取した。これらの細胞を２４ウエルプレートにおいて、５×１０３細胞／ｍｍ２で、選択されたロットのウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質を含有するＤＭＥＭ−ＨＧ（完全培地）中で、５％のＣＯ２を空気中に含有する３７℃のインキュベーターで培養した。培養開始の２４時間後に、培地および非接着性細胞を吸引し、新しく調製した培地を添加した。これらのいくつかのウエルのそれぞれに、ＡＩＩアナログおよびフラグメント（表５を参照のこと）を含む（１〜１００μｇ／ｍｌ）完全培地または含まない完全培地を添加した。クローンからの細胞の遊走およびそれらの増殖を顕微鏡によって調べた。４日毎に、古い培地を除き、新しく調製した培地を培養物に添加した。
【００９９】
ＡＩＩアナログまたはＡＩＩフラグメントをこれらの培養に添加することによって、ＭＳＣの遊走元の部位数（ＣＦＵ）および形成したコロニーのサイズ（細胞数）に対する著しい効果が認められた。これらの研究から得られた結果を図１８〜図２１に見ることができる。明らかなように、ＡＩＩアナログおよびフラグメントは、試験したすべての時間においてＭＳＣ数の増大を引き起こした。これらのデータは、ＡＩＩアナログおよびフラグメントはラットＭＳＣの増殖を増大し得ることを示す。
【０１００】
実施例７  ＡＩＩの存在下におけるＭＳＣ系に特異的な細胞の増殖
骨髄から単離され、適切な条件下で増殖した間葉幹細胞は、骨、軟骨、筋肉および腱の生成に関与する細胞を含む複数の細胞タイプの特徴を発現し得る。骨形成細胞（骨組織を形成し得る細胞）は、それらをその骨形成分化の方向に向かわせる培地中で培養したときにアルカリホスファターゼ酵素を発現する。
【０１０１】
雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから得られた骨髄を、培地を用いて大腿骨を洗い流すことによって採取した。細胞を、直径が９ｃｍ２の培養ディッシュに入れ、一晩接着させ、次いで様々な濃度のＡＩＩとともに抗生物質および１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ−ＨＧ培地に入れた。培養開始後の様々な時間で、細胞をタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液で洗浄し、骨形成培地（１０％ウシ胎児血清、１００ｎＭデキサメタゾンおよび０．０５ｍＭアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ−ＨＧ）中に４日間置き、その後ウエルあたりのアルカリホスファターゼ活性のレベルを評価した。簡単に記載すると、ウエルをタイロード緩衝液で洗浄し、１ｍｌのアルカリホスファターゼ基質溶液（１ｍＭ塩化マグネシウムおよび２．５ｍＭｐ−二トロフェニルホスフェートを含有する５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）を各ウエルに加えた。この水性基質を添加した１５分後に、緩衝液を培養物から取り出し、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウムと混合して反応を停止させた。次いで、得られる混合物の４０５ｎｍでの吸光度を分光光度法によって測定した。アルカリホスファターゼ活性の値を、培養ディッシュあたりの吸光度値として表す。これらのデータを図２２に示す。これは、ＡＩＩによって、骨形成分化を誘導するのに適切な培地中に置かれたときにアルカリホスファターゼを発現する細胞の増殖が促進され得ることを示す。
実施例８  マウス系に特異的な細胞に対するアンギオテンシンＩＩの効果
ＨＰＣをＣ５６Ｂ１／６マウスから免疫磁気アフィニティクロマトグラフィーによって集め、コロニー刺激因子類の非存在下で最適な増殖培地の半流動培養状態に置いた。培養開始後の様々な時間で、コロニーの形成および形成コロニーのサイズ（コロニーあたりの細胞数）を顕微鏡下で評価した。
【０１０２】
雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスをＳｉｍｏｎｓｏｎから購入して、本研究における骨髄細胞の供給源として使用した。骨髄細胞を、マウスの大腿骨および脛骨から、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２１ゲージ針で洗い流すことによって採取した。流出液を遠心分離し、ペレットを、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳおよび５％正常ラット血清を含有するＰＢＳ中に４×１０７個／ｍｌの有核細胞で再懸濁した。
【０１０３】
免疫磁気標識を行うために必要な試薬をＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）から購入した。下記のマウス系に特異的な細胞の表面抗原に対するビオチン標識モノクローナル抗体がＨＰＣ濃縮用カクテルに含まれ、これらを製造者の指示に従って使用した：ＣＤ５（Ｌｙ−１）、ＣＤ４５−Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、骨髄球様分化抗原（Ｇｒ−１）および赤血球様細胞（ＴＥＲ１１９）。１０μｌの抗体カクテルを骨髄に加え、混合して４℃で１５分間インキュベーションした。次いで、細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中に４×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。次いで、抗体カクテルを洗い出し、１００μｌの抗ビオチンテトラマーを１ｍｌの細胞のそれぞれに加えた。懸濁物を混合し、４℃で１５分間インキュベーションした。次いで、６０μｌの磁気コロイドを１ｍｌの細胞のそれぞれに加え、これらを混合し、４℃で１５分間インキュベーションして、免疫磁気的に標識した骨髄細胞を得た。
【０１０４】
ステンレススチールのマトリックスを含有するカラムを、ＰＢＳでマトリックスを洗浄し、その後２％タンパク質を含有するＰＢＳで洗浄することによって調製した。免疫磁気的に標識した骨髄細胞をカラムに負荷し、未標識細胞を含有する培地（濃縮ＨＰＣ）を、０．２ｍｌ／分の流速での分画により流しながら集めた。培地をカラムの頂部に加えた。８〜１０ｍｌの濃縮ＨＰＣが集められるまで液切れしなかった。カラムに負荷した細胞の約２％が濃縮ＨＰＣ画分に単離された。
【０１０５】
濃縮されたＨＰＣ細胞画分を、０．９％メチルセルロースをα最少必須培地（αＭＥＭ）（３０％ウシ胎児血清、１％ウシ血清アルブミン、１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、およびコロニー刺激因子類を含有する２％馴化培地）中に含有する半流動培地に希釈した。馴化培地は、１０μｇ／ｍｌアメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０中で４８時間インキュベーションした脾臓細胞の培養（１×１０６細胞／ｍｌ）から得られた上清であった。０〜１００μｇ／ｍｌの間の様々な濃度のＡＩＩを、小容量で、ウエルあたり３，０００個の細胞またはウエルあたり３０，０００個の細胞のいずれかを含むマイクロタイターディッシュのウエルに添加した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で１４日間インキュベーションした。細胞の顕微鏡による評価を、インキュベーション開始後の様々な時間で行った。結果を図２３〜図３３に要約して示す。結果は、ＨＰＣコロニーのサイズは、増大した濃度のＡＩＩ、ＡＩＩアナログおよびＡＩＩフラグメントへの暴露に比例して増大すること、従って、ＡＩＩは、コロニー刺激因子類の非存在下でＨＰＣ増殖を増大させることを明瞭に示している
本発明は、明らかな改変および均等物が当業者には明らかであるので、示されそして説明された操作の厳密な細部、あるいは厳密な化合物、組成物、方法、手順または実施態様に限定されないことを理解しなければならない。従って、本発明は、貼付する請求の範囲の全体によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、ネズミのマクロファージの食細胞の許容性についてのＡＩＩの効果を示す図である。
【図２】図２は、ラットのマクロファージの食細胞の許容性についてのＡＩＩの効果示す図である。
【図３】図３は、ラットの腹膜のマクロファージでの呼吸バースト機能についてのアンギオテンシンＩＩの効果示す図である。
【図４】図４は、ヒトＰＢＭＣの呼吸バースト機能についてのアンギオテンシンの効果示す図である。
【図５】図５は、ラットの腹膜のマクロファージでの呼吸バースト機能についてのアンギオテンシン（１−７）の効果を示す図である。
【図６】図６は、ラットの腹膜のマクロファージでの呼吸バースト機能についてのＧＳＤ２４Ｂの効果を示す図である。
【図７】図７は、ラットの腹膜のマクロファージでの呼吸バースト機能についてのＧＳＤ２２Ａの効果を示す図である。
【図８】図８は、ラットの腹膜のマクロファージでの呼吸バースト機能についてのＧＳＤ２８の効果を示す図である。
【図９】図９は、アメリカヤマゴボウマイトジェンに対応した増殖についてのＡＩＩの効果を示す図である。
【図１０】図１０は、ラットの骨髄培養血清３でのＡＩＩの効果を示す図である。
【図１１】図１１は、ラットの骨髄培養物血清３  ９／５／９７培養物でのＡＩＩの効果を示す図である。
【図１２】図１２は、ネズミのＨＳＣ培養物でのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図１３】図１３は、ネズミのＨＳＣ培養物でのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図１４】図１４は、ネズミのＨＳＣ培養物でのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図１５】図１５は、ネズミのＨＳＣ培養物でのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図１６】図１６は、ネズミのＨＳＣ培養物でのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図１７】図１７は、ネズミのＨＳＣ培養物でのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図１８】図１８は、ＭＳＣ増殖でのアンギオテンシンＩＩ（１−７）の効果を示す図である。
【図１９】図１９は、ＭＳＣ増殖でのＧＳＤ２２Ａの効果を示す図である。
【図２０】図２０は、ＭＳＣ増殖でのＧＳＤ２４Ｂの効果を示す図である。
【図２１】図２１は、ＭＳＣ増殖でのＧＳＤ２８の効果を示す図である。
【図２２】図２２は、間葉幹細胞によるアルカリ性フォスファターゼの発現を示す図である。
【図２３】図２３は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図２４】図２４は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図２５】図２５は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩの効果を示す図である。
【図２６】図２６は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩ／類似体の効果を示す図である。
【図２７】図２７は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩ／類似体の効果を示す図である。
【図２８】図２８は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩ／類似体の効果を示す図である。
【図２９】図２９は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩ／類似体の効果を示す図である。
【図３０】図３０は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩ／類似体の効果を示す図である。
【図３１】図３１は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩ／類似体の効果を示す図である。
【図３２】図３２は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩ／類似体の効果を示す図である。
【図３３】図３３は、ネズミＨＰＣ培養物でのＣＳＦなしのアンギオテンシンＩＩ／類似体の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月24日(2005.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血系統特異細胞の増殖を促進ための薬剤を調整するための、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号３１、そしてＧＳＤ２８（ＤＲＶＹＩＨＰＩ）からなるグループから選択される少なくとも一つを含む活性物質の使用。
【請求項２】
上記薬剤が腫瘍患者を治療するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記薬剤が腫瘍患者に対し、化学療法もしくは放射線療法処理を増強するために用いられることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
上記薬剤が移植治療するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
上記薬剤がウイルス感染治療、微生物感染治療、Ｔ細胞の対するマクロファージの提示の改善、そして、抗腫瘍免疫の増強に用いられる請求項１に記載の使用。
【請求項６】
上記活性物質は配列番号３であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項７】
上記活性物質は配列番号４であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項８】
上記活性物質は配列番号５であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項９】
上記活性物質は配列番号６であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項１０】
上記活性物質は配列番号７であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項１１】
上記活性物質は配列番号８であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項１２】
上記活性物質は配列番号９であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項１３】
上記活性物質は配列番号１１であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項１４】
上記活性物質は配列番号３１であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。
【請求項１５】
上記活性物質はＧＳＤ２８（ＤＲＶＹＩＨＰＩ）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの使用。