(57)【要約】【課題】簡便かつ高収率で安価に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの中間体であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを製造することができる方法、および、簡便かつ高収率で安価に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを製造する方法を提供することを課題とする。【解決手段】Ｌ−フェニルアラニンが、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのβ−エステル部位には求核攻撃せず、α−エステル部位を求核攻撃する反応を触媒する能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成する。さらに、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを生成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成することを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
【請求項２】
前記酵素または酵素含有物が、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、エアロモナス属、アゾトバクター属、アルカリゲネス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、エンペドバクター属、フラボバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ブレビバチルス属、ペニバチルス属、シュードモナス属、セラチア属、ステノトロホモナス属、スフィンゴバクテリウム属、ストレプトマイセス属、キサントモナス属、ウィリオプシス属、キャンディダ属、ジオトリクム属、ピヒア属、サッカロミセス属、トルラスポーラ属、セルロファーガ属、ウイークセラ属、ペドバクター属、パーシコバクター属、フレキシスリクス属、チティノファーガ属、サイクロバクテリウム属、ルネラ属、サーモネマ属、サイクロセルペンス属、ゲリディバクター属、ディアドバクター属、フラメオビルガ属、スピロソマ属、フレクトバチルス属、テナシバクラム属、ロドターマス属、ゾベリア属、ムリカウダ属、サレゲンティバクター属、タキセオバクター属、チトファーガ属、マリニラビリア属、レビネラ属、サプロスピラ属、およびハリスコメノバクター属からなる群より選ばれる属に属する微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
【請求項５】
前記微生物が、下記（Ｃ）または（Ｄ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
【請求項６】
前記微生物が、下記（Ｅ）または（Ｆ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｅ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
【請求項７】
前記微生物が、下記（Ｇ）または（Ｈ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｇ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
【請求項８】
前記微生物が、下記（Ｉ）または（Ｊ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｉ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
【請求項９】
前記微生物が、下記（Ｋ）または（Ｌ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｋ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
【請求項１０】
前記微生物が、下記（Ｍ）または（Ｎ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｍ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｎ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１１】
前記微生物が、下記（Ｏ）または（Ｐ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｏ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｐ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１２】
前記微生物が、下記（Ｑ）または（Ｒ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｑ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｒ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１３】
前記微生物が、下記（Ｓ）または（Ｔ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｓ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｔ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１４】
前記微生物が、下記（Ｕ）または（Ｖ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｕ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｖ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１５】
前記微生物が、下記（Ｗ）または（Ｘ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｗ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｘ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１６】
前記酵素が、下記（Ａ）から（Ｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｍ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｎ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｏ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｐ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｑ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｒ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｓ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｔ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｕ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｖ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｗ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｘ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法により、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステルを合成する反応工程と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステルをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する反応工程とを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル（または α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine（略称：α−ＡＲＰ）ともいう）の製造方法およびα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（α-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester（略称：α−ＡＰＭ））の製造方法に関し、より詳しくは、甘味料として大きな需要があるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（製品名：アスパルテーム）製造の重要な中間体であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法、および、前記α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法を利用したα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（「α−ＡＰＭ」と略称される場合がある）の製造法としては従来から化学合成法、酵素合成法が知られている。化学合成法としては、Ｎ保護のＬ−アスパラギン酸無水物とＬ−フェニルアラニンメチルエステルを縮合させてＮ保護ＡＰＭを合成し、このＮ保護基を脱離してＡＰＭを得る方法、酵素合成法としては、Ｎ保護のＬ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエステルを縮合させてＮ保護ＡＰＭを合成し、このＮ保護基を脱離してＡＰＭを得る方法が知られているが、両方法とも保護基の導入、保護基の脱離工程が必要で、工程が極めて煩雑になっていた。一方、Ｎ保護基を使用しないＡＰＭ製法も検討されている（特許文献１）が、収率が極めて低く工業的生産には適していない。このような背景の下、アスパルテームの更なる安価な工業的製造法の開発が望まれていた。
【０００３】
【特許文献１】特公平０２−０１５１９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの中間体であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを製造することができる方法を提供することを課題とする。また、本発明は、簡便かつ高収率で安価な、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは新たに見出した酵素、あるいは酵素含有物が、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンから、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを選択的に生成する能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕  Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成することを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
〔２〕  前記酵素または酵素含有物が、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、および、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする、上記〔１〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
〔３〕  前記微生物が、エアロモナス属、アゾトバクター属、アルカリゲネス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、エンペドバクター属、フラボバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ブレビバチルス属、ペニバチルス属、シュードモナス属、セラチア属、ステノトロホモナス属、スフィンゴバクテリウム属、ストレプトマイセス属、キサントモナス属、ウィリオプシス属、キャンディダ属、ジオトリクム属、ピヒア属、サッカロミセス属、トルラスポーラ属、セルロファーガ属、ウイークセラ属、ペドバクター属、パーシコバクター属、フレキシスリクス属、チティノファーガ属、サイクロバクテリウム属、ルネラ属、サーモネマ属、サイクロセルペンス属、ゲリディバクター属、ディアドバクター属、フラメオビルガ属、スピロソマ属、フレクトバチルス属、テナシバクラム属、ロドターマス属、ゾベリア属、ムリカウダ属、サレゲンティバクター属、タキセオバクター属、チトファーガ属、マリニラビリア属、レビネラ属、サプロスピラ属、およびハリスコメノバクター属からなる群より選ばれる属に属する微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
〔４〕  前記微生物が、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
〔５〕  前記微生物が、下記（Ｃ）または（Ｄ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
〔６〕  前記微生物が、下記（Ｅ）または（Ｆ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｅ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
〔７〕  前記微生物が、下記（Ｇ）または（Ｈ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｇ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
〔８〕  前記微生物が、下記（Ｉ）または（Ｊ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｉ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
〔９〕  前記微生物が、下記（Ｋ）または（Ｌ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｋ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
〔１０〕  前記微生物が、下記（Ｍ）または（Ｎ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｍ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｎ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつペプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１１〕  前記微生物が、下記（Ｏ）または（Ｐ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法。
（Ｏ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｐ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１２〕  前記微生物が、下記（Ｑ）または（Ｒ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｑ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｒ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１３〕  前記微生物が、下記（Ｓ）または（Ｔ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｓ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｔ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１４〕  前記微生物が、下記（Ｕ）または（Ｖ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｕ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｖ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１５〕  前記微生物が、下記（Ｗ）または（Ｘ）に示すタンパク質を発現可能な、形質転換された微生物であることを特徴とする、上記〔２〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ｗ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｘ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１６〕  前記酵素が、下記（Ａ）から（Ｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記〔１〕に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル(i.e., α-L-(β-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine)の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｍ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｎ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｏ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｐ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｑ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｒ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｓ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｔ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｕ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｖ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｗ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｘ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
〔１７〕  上記〔１〕から〔１６〕のいずれか一項に記載のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法により、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル(i.e., α-L-(β-o-methyl aspartyl)-L-phenylalanine)を合成する反応工程と、
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステルをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する反応工程とを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル(i.e., α-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester)の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、酵素を用いて簡便にα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成することができる。本発明の方法により、保護基の導入・脱離などの複雑な合成方法を軽減し、簡便かつ高収率で安価にα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを製造することができる。
【０００８】
また、本発明によれば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを、簡便かつ高収率で安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について、
＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法
１．α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法
２．本発明で用いられる微生物
３．本発明で用いられる酵素
＜２＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法、
の順に説明する。
【００１０】
＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法１．α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法
本発明のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを製造する方法（以下、「本発明のペプチド製造方法」ともいう）は、所定のペプチド生成活性を有する酵素の存在下で、Ｌ−フェニルアラニンとＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとを反応させる。すなわち、本発明のペプチド製造方法では、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる能力を有する酵素または酵素含有物を用いて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成せしめるものである。Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる能力を有する酵素または酵素含有物とは、実質的に、Ｌ−フェニルアラニンがＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのβ−エステル部位には求核攻撃できず、α−エステル部位のみを求核攻撃するような反応を触媒する能力または活性を有する酵素または酵素含有物のことをいう。なお、下記参考例に示したように、上記能力とは全く逆に、Ｌ−フェニルアラニンが、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位には求核攻撃できず、β−エステル部位のみを求核攻撃する反応を触媒する能力を有し、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとからβ−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−エステル（または β-L-(α-o-substituted aspartyl)-L-phenylalanine(略称：β−ＡＲＰ）ともいう）を生成する酵素または酵素含有物も得られている。
【００１１】
Ｌ−フェニルアラニンが、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位を求核攻撃して、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル（α−ＡＲＰ）が生成する反応式を、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとしてＬ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルを用いた場合の例を例にとって下記式（Ｉ−α）に示す（式中「Ｍｅ」はメチル基を表す。）式（Ｉ−α）に示すように、本発明のペプチド製造方法では、Ｌ−フェニルアラニンのアミノ基が、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルのα−メチルエステル部位と反応して、ペプチド結合を形成する。これに対し、下記式（Ｉ−β）は、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルのβ−メチルエステル部位が求核攻撃されて、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（またはβ-L-(α-o-methyl aspartyl)-L-phenylalanine（略称：β−ＡＭＰ）が生成する反応を示す。β−ＡＭＰにおけるペプチド結合は、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルのβ−メチルエステル部位で形成される。本発明で用いられる酵素または酵素含有物は、実質的に式（Ｉ−α）のような反応のみを促進し、式（Ｉ−β）のような反応を実質的に生じさせない。α−ＡＭＰからは、簡便な反応工程により、α−ＡＰＭを製造することができるが（式（II））、β−ＡＭＰからは直接的にα−ＡＰＭを製造することはできない。すなわち、本発明の方法は、α−ＡＰＭの中間体製造方法として極めて効率が良く、工業生産上有用である。
【００１２】
【化１】
2005058212.tif 000002
【００１３】
【化２】
2005058212.tif 000003
【００１４】
【化３】
2005058212.tif 000004
【００１５】
酵素または酵素含有物を、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンに作用せしめる方法としては、当該酵素または酵素含有物と、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルと、Ｌ−フェニルアラニンとを混合すればよい。より具体的には、酵素または酵素含有物をＬ−アスパラギン酸ジエステルとＬ−フェニルアラニンを含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いてもよいし、当該酵素含有物として当該酵素を生産する微生物を用いる場合には、上記のように反応してもよいし、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵素を生成・蓄積せしめ、培養液中にＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンを添加する方法などを用いてもよい。生成されたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。
【００１６】
「酵素含有物」とは、当該酵素を含有するものであればよく、具体的形態としては、当該酵素を生産する微生物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよい。また、これら酵素含有物を共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
【００１７】
また、当該酵素を含む微生物としては野生株を用いても良いし、本酵素を発現した遺伝子組換え株を用いてもよい。当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、固定化菌体処理物を使用してもよい。
【００１８】
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成する活性のあるペプチド生成酵素を生産できる野生株を用いる場合には、遺伝子組み換え株などを作製する手間なしに、より簡便にペプチド生産を行える点などで好適である。他方、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成する活性のあるペプチド生成酵素を発現可能なように形質転換した遺伝子組み換え株はペプチド生成酵素をより大量生成するように改変することが可能であるため、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの合成も大量により速く行うことが可能となり得る。野生株または遺伝子組み換え株の微生物を培地中で培養し、培地中および／または微生物中に、当該ペプチド生成酵素を蓄積させて、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンに混合して、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成することができる。
【００１９】
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を用いる場合には、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの生成に関与せずに生成α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを分解する酵素が存在することが多く、この場合には、エチレンジアミン四酢酸  （ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから３００ｍＭ  の範囲で、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭである。
【００２０】
酵素または酵素含有物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよい。この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合には、０．０１から１００ユニット（Ｕ）程度、洗浄菌体を用いる場合は０．１〜５００ｇ／Ｌ程度である。なお、１Ｕは、２５℃の温度条件下で、１分間に１００ｍＭのＬ−アスパラギン酸-α,β-ジメチルエステルと２００ｍＭのＬ−フェニルアラニンより１μｍｏｌｅのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（または α-L-(β-o-methyl aspartyl)-L-phenylalanine（略称：α−ＡＭＰ）ともいう）を生成せしめる酵素量とする。
【００２１】
反応に用いられるＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとしては、Ｌ−フェニルアラニンと縮合してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとしては、例えば、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエチルエステル等が挙げられる。Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステルとＬ−フェニルアラニンを反応させた場合には、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）が、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエチルエステルとＬ−フェニルアラニンを反応させた場合には、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エチルエステル（または α-L-(β-o-ethyl aspartyl)-L-phenylalanine （略称：α−ＡＥＰ）ともいう）が生産される。
【００２２】
出発原料であるＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルおよびＬ−フェニルアラニンの濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、どちらかの基質を等量以上添加したほうが好ましい場合もあり、必要に応じて選択される。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
【００２３】
反応温度は０〜６０℃で、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル生成が可能であり、好ましくは５〜４０℃である。また反応ｐＨはｐＨ６．５〜１０．５で、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル生成が可能であり、好ましくはｐＨ７．０〜１０．０である。
【００２４】
２．本発明で用いられる微生物
本発明に使用される微生物としては、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成する能力を有する微生物を特に限定なく使用することができる。Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成する能力を有する微生物としては、例えば、エアロモナス属、アゾトバクター属、アルカリゲネス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、エンペドバクター属、フラボバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ブレビバチルス属、ペニバチルス属、シュードモナス属、セラチア属、ステノトロホモナス属、スフィンゴバクテリウム属、ストレプトマイセス属、キサントモナス属、ウィリオプシス属、キャンディダ属、ジオトリクム属、ピヒア属、サッカロミセス属、トルラスポーラ属、セルロファーガ属、ウイークセラ属、ペドバクター属、パーシコバクター属、フレキシスリクス属、チティノファーガ属、サイクロバクテリウム属、ルネラ属、サーモネマ属、サイクロセルペンス属、ゲリディバクター属、ディアドバクター属、フラメオビルガ属、スピロソマ属、フレクトバチルス属、テナシバクラム属、ロドターマス属、ゾベリア属、ムリカウダ属、サレゲンティバクター属、タキセオバクター属、チトファーガ属、マリニラビリア属、レビネラ属、サプロスピラ属、およびハリスコメノバクター属に属する微生物を挙げることができるが、具体的には以下のものを例示することができる。
【００２５】
エアロモナス  ハイドロフィラ  ATCC 13136
(Aeromonas hydrophila)
アゾトバクター  ビネランディ IFO 3741
(Azotobacter vinelandii)
アルカリゲネス  フェカリス  FERM P-8460
(Alcaligenes faecalis)
ブレビバクテリウム  ミヌティフェルナ  FERM BP-8277
(Brevibacterium minutiferuna)
コリネバクテリウム  フラベッセンス  ATCC 10340
(Corynebacterium flavescens)
エシェリヒア  コリ  FERM BP-8276
(Escherichia coli)
エンペドバクター  ブレビス  ATCC 14234
(Empedobacter brevis)
フラボバクテリウム  レジノボラム  ATCC 14231
(Flavobacterium resinovorum)
ミクロバクテリウム  アルボレッセンス  ATCC 4348
(Microbacterium arborescens)
プロピオニバクテリウム  シェルマーニ  FERM BP-8100
(Propionibacterium shermanii)
ブレビバチルス  パラブレビス ATCC 8185
(Brevibacillus parabrevis)
ペニバチルス  アルベイ  IFO 14175
(Paenibacillus alvei)
シュードモナス  フラジ  IFO 3458
(Pseudomonas fragi)
セラチア  グリメシイ  ATCC 14460
(Serratia grimesii)
ステノトロホモナス  マルトフィリア  ATCC 13270
(Stenotrophomonas maltophilia)
スフィンゴバクテリウム  エスピー  FERM BP-8124
(Sphingobacterium sp.)
ストレプトマイセス  グリセオラス  NRRL  B-1305
(Streptomyces griseolus、別名；Streptomyces lavendulae)
キサントモナス  マルトフィリア  FERM BP-5568
(Xanthomonas maltophilia)
ウィリオプシス  サターナス IFO 0895
(Williopsis saturnus)
キャンディダ  マグノリアエ  IFO 0705
(Candida magnoliae)
ジオトリクム  フラグランス  CBS 152.25
(Geotrichum flagrance、別名；Geotrichum amycelium)
ジオトリクム  アミセリウム  IFO 0905
(Geotrichum amycelium)
ピヒア  シフェリイ  IFO 0905
(Pichia ciferrii)
サッカロミセス  ユニスポーラス  IFO 0724
(Saccharomyces unisporus)
トルラスポーラ  デルブルッキ  IFO 0422
(Torulaspora delbrueckii)
セルロファーガ  リティカ  NBRC 14961
(Cellulophaga lytica)
ウイークセラ ビロサ  NBRC 16016
(Weeksella virosa)
ペドバクター ヘパリナス  NBRC 12017
(Pedobacter heparinus)
パーシコバクター ディフルエンス  NBRC 15940
(Persicobacter diffluens)
フレキシスリクス ドロテア  NBRC 15987
(Flexithrix dorotheae)
チティノファーガ ピネンシス  NBRC 15968
(Chitinophaga pinensis)
サイクロバクテリウム マリナム  ATCC 25205
(Cyclobacterium marinum)
ルネラ  スリシフォルミス  ATCC 29530
(Runella slithyformis)
サーモネマ  ラプサム  ATCC 43542
(Thermonema lapsum)
サイクロセルペンス ブルトネンシス  ATCC 700359
(Psychroserpens burtonensis）
ゲリディバクター アルゲンス  ATCC 700364
(Gelidibacter algens)
ディアドバクター ファーメンタンス  ATCC 700827
(Dyadobacter fermentans)
フラメオビルガ アプリカ  NBRC 15941
(Flammeovirga aprica)
スピロソマ リングアレ  DSMZ 74
(Spirosoma linguale)
フレクトバチルス  マジョール  DSMZ 103
(Flectobacillus major)
テナシバクラム マリティマム  ATCC43398
(Tenacibaculum maritimum)
ロドターマス  マリナス  DSMZ 4252
(Rhodothermus marinus)
ゾベリア  ガラクタニボランス  DSMZ 12802
(Zobellia galactanivorans)
ムリカウダ ルエストリンゲンシス  DSMZ 13258
(Muricauda ruestringensis)
サレゲンティバクター サレゲンス  DSMZ 5424
(Salegentibacter salegens)
タキセオバクター ゲルプルプルアッセンス  DSMZ 11116
(Taxeobacter gelupurpurascens)
チトファーガ フッチンソニイ  NBRC 15051
(Cytophaga hutchinsonii)
マリニラビリア  サルモニカラー  NBRC 15948
(Marinilabilia salmonicolor)
レビネラ  コハエレンス  ATCC 23123
(Lewinella cohaerens)
サプロスピラ グランディス  ATCC 23119
(Saprospira grandis)
ハリスコメノバクター ヒドロシス  ATCC 27775
(Haliscomenobacter hydrossis)
【００２６】
上記菌株のうち、ＦＥＲＭ番号が記載されているものは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
上記菌株のうち、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, the UnitedStates of America）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
上記菌株のうち、ＩＦＯ番号が記載されているものは、財団法人発酵研究所（日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
上記菌株のうち、ＮＢＲＣ番号が記載されているものは、独立行政法人製品評価機構生物遺伝資源部門（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
上記の菌株のうち、ＤＳＭＺ番号が記載されているものは、Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)（Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００２７】
上記菌株のように、ＦＥＲＭ番号が記載されているものは、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託され、受託番号が付与された微生物である。アルカリゲネス  フェカリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−８４６０は、１９８５年９月３０日に寄託がされ、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−８４６０が付与された微生物である。プロピオニバクテリウム  シェルマーニ  ＦＥＲＭ  Ｐ−９７３７は、１９８７年１２月４日に原寄託がされ、２００２年７月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１００が付与された微生物である。キサントモナス  マルトフィリア  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５６８は、１９９５年６月１４日に原寄託がなされ、１９９６年６月１４日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。ブレビバクテリウム  ミヌティフェルナ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７７は、２００２年１月２０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に委託されている。エシェリヒア  コリ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２７６は、２００２年１月２０日にブダペスト条約に基づく国際機関に委託されている。
【００２８】
エンペドバクター  ブレビス  ＡＴＣＣ  １４２３４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株）は、２００１年１０月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４５の受託番号が付与され、さらに平成１４年７月８日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許寄託センターにおいて、ブダペスト条約に基づく寄託へ移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３が付与された微生物である（微生物の表示：Empedobacter brevis AJ 13933株）。
【００２９】
スフィンゴバクテリウム  エスピー  ＡＪ  １１０００３株は、２００２年７月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４の受託番号が付与されている。
【００３０】
尚、ＡＪ  １１０００３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４）株は、以下の分類実験により、上述のスフィンゴバクテリウム  エスピーであることが同定された。ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株は、桿菌（０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ）、グラム陰性、胞子形成なし、運動性なし、コロニー形態は円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色、３０℃で生育、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、ＯＦテスト（グルコース）陰性の性質より、スフィンゴバクテリウムに属する細菌と同定された。更に、硝酸塩還元陰性、インドール産生陰性、グルコースからの酸生成陰性、アルギニンジヒドロラーゼ陰性、ウレアーゼ陽性、エスクリン加水分解陽性、ゼラチン加水分解陰性、β―ガラクトシダーゼ陽性、グルコース資化陽性、Ｌ−アラビノース資化陰性、Ｄ−マンノース資化陽性、Ｄ−マンニトール資化陰性、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化陽性、マルトース資化陽性、グルコン酸カリウム資化陰性、ｎ−カプリン酸資化陰性、アジピン酸資化陰性、ｄｌ−リンゴ酸資化陰性、クエン酸ナトリウム資化陰性、酢酸フェニル資化陰性、チトクロームオキシダーゼ陽性の性質より、スフィンゴバクテリウム  マルチボーラムあるいはスフィンゴバクテリウム  スピリチボーラムの性状に類似することが判明した。更に１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のホモロジー解析の結果、スフィンゴバクテリウム  マルチボーラムと最も高いホモロジー（９８．８％）を示したが、完全に一致する株はなかったことより、本菌株をスフィンゴバクテリウム  エスピー（Sphingobacterium sp.）と同定した。
【００３１】
これらの微生物としては、野生株または変異株のいずれを用いてもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み換え株等も用いることができる。
【００３２】
このような微生物の菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００３３】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭化水素類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００３４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００３５】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００３６】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ５〜８、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００３７】
３．本発明で用いられる酵素
上記本発明のペプチド製造方法では、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる能力を有する酵素が用いられる。本発明のペプチド製造方法では、このような活性を有する酵素であれば、その由来、取得方法などに限定されるものではない。以下に、本発明で用いられる酵素の精製、遺伝子工学的な手法の利用などについて説明する。
【００３８】
（３−１）本発明の製法に用いることができる酵素を有する微生物
本発明の酵素を生産する微生物としては、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成する能力を有する微生物であれば全て使用できる。例えばエアロモナス属、アゾトバクター属、アルカリゲネス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、エンペドバクター属、フラボバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ブレビバチルス属、ペニバチルス属、シュードモナス属、セラチア属、ステノトロホモナス属、スフィンゴバクテリウム属、属、ストレプトマイセス属、キサントモナス属、ウィリオプシス属、キャンディダ属、ジオトリクム属、ピヒア属、サッカロミセス属、トルラスポーラ属、セルロファーガ属、ウイークセラ属、ペドバクター属、パーシコバクター属、フレキシスリクス属、チティノファーガ属、サイクロバクテリウム属、ルネラ属、サーモネマ属、サイクロセルペンス属、ゲリディバクター属、ディアドバクター属、フラメオビルガ属、スピロソマ属、フレクトバチルス属、テナシバクラム属、ロドターマス属、ゾベリア属、ムリカウダ属、サレゲンティバクター属、タキセオバクター属、チトファーガ属、マリニラビリア属、レビネラ属、サプロスピラ属、およびハリスコメノバクター属からなる群より選ばれる属に属する細菌などが挙げられ、より具体的にはエンペドバクター  ブレビス（Empedobacter brevis）ＡＴＣＣ  １４２３４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株）、スフィンゴバクテリウム  エスピー（Sphingobacterium sp.）ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４  株、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）ＩＦＯ  １２０１７株、タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス（Taxeobacter gelupurpurascens）ＤＳＭＺ  １１１１６株、サイクロバクテリウム  マリナム（Cyclobacterium marinum）ＡＴＣＣ  ２５２０５株、サイクロセルペンス  ブルトネンシス（Psycloserpens burtonensis）ＡＴＣＣ  ７００３５９株などが挙げられる。エンペドバクター  ブレビス  ＡＴＣＣ  １４２３４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５４５株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株）およびスフィンゴバクテリウム  エスピー（Sphingobacterium sp.）ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）ＩＦＯ  １２０１７株、タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス（Taxeobacter gelupurpurascens）ＤＳＭＺ  １１１１６株、サイクロバクテリウム
マリナム（Cyclobacterium marinum）ＡＴＣＣ  ２５２０５株、サイクロセルペンス  ブルトネンシス（Psycloserpens burtonensis）ＡＴＣＣ  ７００３５９株などは、本発明者らが、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルとＬ−フェニルアラニンからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果に選出した微生物である。
【００３９】
（３−２）酵素の精製
上記のように、本発明で用いられるペプチド生成酵素は、例えばエンペドバクター属に属する細菌から精製することができる。当該酵素を精製する例として、エンペドバクター  ブレビスからペプチド生成酵素を単離・精製する方法を説明する。
【００４０】
まず、エンペドバクター  ブレビス、例えばＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株の菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。このようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、ペプチド生成酵素を精製することができる。
【００４１】
陰イオン交換クロマトグラフィー用の担体としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＨＰ（アマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させると当該酵素はｐＨ８．５の条件下で非吸着画分に回収される。
【００４２】
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、ＭｏｎｏＳ  ＨＲ（アマシャム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液させて本酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ＭｏｎｏＳ  ＨＲを用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、０．２〜０．５  Ｍ程度のＮａＣｌで溶出される。
【００４３】
上記のようにして精製された本酵素は、さらにゲル濾過クロマトグラフィー等により均一に精製できる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００ｐｇ（アマシャム社製）が挙げられる。
【００４４】
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する実施例に示される方法等により、各画分のペプチド生成活性を測定することにより、確認することができる。上記のようにして精製された本酵素の内部アミノ酸配列を、配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。
【００４５】
（３−３）ＤＮＡの単離、形質転換体の作製およびペプチド生成酵素の精製
（３−３−１）ＤＮＡの単離
本発明者らは、まずエンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株などから、本発明のペプチド製造方法で用いることができるペプチド生成酵素のＤＮＡの１種を単離することに成功した。
【００４６】
本発明のＤＮＡである配列番号５に記載の塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、エンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）より単離されたものである。なお、塩基番号６１〜１９０８の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９０８の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２６の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２７〜１９０８の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号５に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、リーダー配列がコードするリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２７〜１９０８でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００４７】
また、本発明のＤＮＡである配列番号１１に記載の塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡは、スフィンゴバクテリウム  エスピー ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）より単離されたものである。配列番号１１に記載の塩基番号６１〜１９１７の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９１７の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２０の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２１〜１９１７の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号１１に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２１〜１９１７でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００４８】
また、本発明のＤＮＡである配列番号１７に記載の塩基番号６１〜１９３５の塩基配列からなるＤＮＡは、ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株（寄託機関；財団法人発酵研究所、寄託先住所；日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５）より単離されたものである。配列番号１７に記載の塩基番号６１〜１９３５の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９３５の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２６の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２７〜１９３５の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号１７に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２７〜１９３５でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００４９】
また、本発明のＤＮＡである配列番号２２に記載の塩基番号６１〜１９９５の塩基配列からなるＤＮＡは、タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株（寄託機関；Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures、寄託先住所；Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany）より単離されたものである。配列番号２２に記載の塩基番号６１〜１９９５の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９９５の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１２６の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１２７〜１９９５の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号２２に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１２７〜１９９５でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００５０】
本発明のＤＮＡである配列番号２４に記載の塩基番号２９〜１８８８の塩基配列からなるＤＮＡは、サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５株（寄託機関；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、寄託先住所；P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America）より単離されたものである。配列番号２４に記載の塩基番号２９〜１８８８の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号２９〜１８８８の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号２９〜１０３の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１０４〜１８８８の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号２４に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１０４〜１８８８でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００５１】
本発明のＤＮＡである配列番号２６に記載の塩基番号６１〜１９９２の塩基配列からなるＤＮＡは、サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株（寄託機関；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、寄託先住所；P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America）より単離されたものである。配列番号２６に記載の塩基番号６１〜１９９２の塩基配列からなるＤＮＡは、コードシーケンス（ＣＤＳ）部分である。塩基番号６１〜１９９２の塩基配列には、シグナル配列領域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号６１〜１１１の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号１１２〜１９９２の領域である。すなわち、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号２６に記載の配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させることにあると推定される。塩基番号１１２〜１９９２でコードされるタンパク質、すなわちリーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示すと推定される。
【００５２】
なお、以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法については、Molecular Cloning,2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)などの記載に準じて行うことができる。
【００５３】
本発明で用いることができる酵素をコードするＤＮＡは、エンペドバクター  ブレビス、スフィンゴバクテリウム  エスピー、ペドバクター  ヘパリナス、タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス、サイクロバクテリウム  マリナム、もしくはサイクロセルペンス  ブルトネンシスなどの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（polymerase chain reacion、White,T.J. et al;Trends Genet., 5, 185(1989)参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、上記（３）の欄で説明したようにして精製されたペプチド生成酵素に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、本発明によりペプチド生成酵素遺伝子（配列番号５、配列番号１１、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６）の塩基配列が明らかになったので、これらの塩基配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、プローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本酵素のコード領域全長を増幅することができる。配列番号５に記載された、リーダー配列および成熟タンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合を例にとると、具体的には、５'側プライマーとしては配列番号５において塩基番号６１よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、３'側プライマーとしては塩基番号１９０８よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
【００５４】
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機  ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００５５】
本発明のペプチド製造方法で用いることができる酵素をコードするＤＮＡとしては、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号５に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号５に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
【００５６】
本発明のＤＮＡには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
【００５７】
本発明のＤＮＡには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号１７に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号１７に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
【００５８】
本発明のＤＮＡには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号２２に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号２２に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
【００５９】
本発明のＤＮＡには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号２４に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号２４に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
【００６０】
本発明のＤＮＡには、リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列番号２６に記載のＣＤＳからなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡも含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞などから、配列表の配列番号２６に記載のＣＤＳと相補的な塩基配列からなるＤＮＡもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが得られる。
【００６１】
プローブは、例えば配列番号５に記載の塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするＤＮＡをつり上げ、目的とするＤＮＡを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。
【００６２】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００６３】
ただし、上記のようにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、元となる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、配列番号５に記載の塩基配列のうち塩基番号１２７〜１９０８にの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合について説明すると、５０℃、ｐＨ８の条件下で、配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００６４】
配列表の配列番号５に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に示される。また、配列表の配列番号１１に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に示される。配列表の配列番号１７に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８に示される。配列表の配列番号２２に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２３に示される。配列表の配列番号２４に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２５に示される。また、配列表の配列番号２６に記載のＣＤＳによりコードされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２７に示される。
【００６５】
配列番号６に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２２までがリーダーペプチドにあたり、２３〜６１６までが成熟タンパク質領域である。
【００６６】
配列番号１１に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２０までがリーダーペプチドにあたり、２１〜６１９までが成熟タンパク質領域である。
【００６７】
配列番号１８に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２２までがリーダーペプチドにあたり、２３〜６２５までが成熟タンパク質領域である。
【００６８】
配列番号２３に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２２までがリーダーペプチドにあたり、２３〜６４５までが成熟タンパク質領域である。
【００６９】
配列番号２５に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜２５までがリーダーペプチドにあたり、２６〜６２０までが成熟タンパク質領域である。
【００７０】
配列番号２７に記載されたアミノ酸配列の全体には、リーダーペプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、アミノ酸残基番号１〜１７までがリーダーペプチドにあたり、１８〜６４４までが成熟タンパク質領域である。
【００７１】
本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、その成熟タンパク質がペプチド生成活性を有するタンパク質であり、リーダーペプチドを含むか含まないかに関わらず、配列表の配列番号６、配列番号１２、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２５もしくは配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明で用いることができるＤＮＡに含まれる（なお、ユニバーサルコドンのコードに従ってアミノ酸配列から塩基配列は特定される）。すなわち、本発明により、以下の（Ａ）から（Ｘ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
【００７２】
（Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６１６のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２１〜６１９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６２５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｇ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２３〜６４５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｉ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｊ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６〜６２０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｋ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｌ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１８〜６４４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有するタンパク質
（Ｍ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｎ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｏ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｐ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｑ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｒ）配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｓ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｔ）配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｕ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｖ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
（Ｗ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｘ）配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｌ−フェニルアラニンをＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのα−エステル部位に選択的にペプチド結合させる活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク質
【００７３】
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｊ）、（Ｌ）、（Ｎ）、（Ｐ）、（Ｒ）、（Ｔ）、（Ｖ）、（Ｘ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で、変異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。例えば、（Ｂ）の場合について説明すると、（Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００７４】
上記（Ｂ）などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、本酵素遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、本酵素をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び本酵素をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００７５】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および／または逆位等には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列表の配列番号６、１２、１８、２３、２５または２７に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００７６】
（３−３−２）形質転換体の作製およびペプチド生成酵素の生成
上記（３−３−１）で説明したＤＮＡを適当な宿主に導入し、発現させることによって、本発明のペプチド製造方法で用いることができるペプチド生成酵素を生成することができる。
【００７７】
ＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、宿主としては、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、エンペドバクター属細菌、スフィンゴバクテリウム属細菌、フラボバクテリウム細菌及びバチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア  スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。
【００７８】
ＤＮＡを宿主に導入するのに用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、導入しようとするＤＮＡを、該ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモータとしては、エンペドバクター  ブレビスなどのペプチド生成酵素遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には該プロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを本発明のＤＮＡに連結し、該プロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
【００７９】
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等が挙げられる。
【００８０】
タンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００８１】
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００８２】
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００８３】
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
【００８４】
以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いてペプチド生成酵素を製造する方法を例として、より具体的に説明する。なお、大腸菌などの微生物にペプチド生成酵素を作製させる場合、タンパク質のコード配列として、リーダー配列を含む前駆タンパク質をコードするＤＮＡを組み込こんでも、リーダー配列を含まない成熟タンパク質領域のＤＮＡのみを組み込んでもよく、作製しようとする酵素の製造条件、形態、使用条件などにより適宜選択することができる。
【００８５】
ペプチド生成酵素をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等を用いることができる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
【００８６】
ペプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ペプチド生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ  １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、γインターフェロン遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００８７】
これらの遺伝子とペプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
【００８８】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００８９】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００９０】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００９１】
プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
【００９２】
該組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア  コリ ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
【００９３】
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ペプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてペプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよい。
【００９４】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００９５】
ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりペプチド生成酵素あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ペプチド生成酵素あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００９６】
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００９７】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００９８】
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００９９】
＜２＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法
本発明のα−ＡＰＭの製造方法は、上記の「＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法」に沿ってα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステルを合成する第１の工程と、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステルをα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルに変換する第２の工程、とを含む。
【０１００】
第１の工程における好ましい条件等は、上記の「＜１＞α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法」の欄に記載の通りである。また、第２の工程については、公知の方法により行うことができ、例えば、特許公告平４−４１１５５号公報などに記載の方法、好適な条件が参照される。本発明のα−ＡＰＭの製造方法によれば、甘味料等として重要なα−ＡＰＭを簡便かつ高収率で安価に製造することができる。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例をあげて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。生成物の測定には、薄層クロマトグラムのニンヒドリン発色での確認（定性）に加え、定量的には以下に示す高速液体クロマトグラフィーにて定量した。カラム：ＩｎｅｒｔｓｉＬ  ＯＤＳ−２（ＧＬサイエンス社製）、溶離液：５．０ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液（ｐＨ２．１）：メタノール＝１００：１５〜５０、流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出  ２１０ｎｍ。
【０１０２】
（実施例１）α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステルを生成する微生物
表１−１に示す細菌、放線菌の培養には、１Ｌ中にグリセロール  ２０ｇ、硫酸アンモニウム  ５ｇ、リン酸一カリウム  １ｇ、リン酸二カリウム  ３ｇ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ、酵母エキス  １０ｇ、ペプトン  １０ｇを含む培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた（培地１）。この培地１に、１Ｌ中にグルコース  ５ｇ、酵母エキス  １０ｇ、ペプトン  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天  ２０ｇを含む斜面寒天培地（ｐＨ７．０）にて３０℃、２４時間培養した表１に示す微生物を１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分、で１７時間振とう培養を行った。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。
【０１０３】
表１−１に示す酵母の培養には、１Ｌ中にグルコース  １０ｇ、グリセロール
１０ｇ、硫酸アンモニウム  ５ｇ、リン酸一カリウム  １ｇ、リン酸二カリウム  ３ｇ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ、酵母エキス  ５ｇ、マルツエキス  ５ｇ、ペプトン  １０ｇを含む培地（ｐＨ６．０）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌したものを用いた（培地２）。この培地２に、１Ｌ中にグルコース  ５ｇ、酵母エキス  ５ｇ、寒天  ２０ｇ、マルツエキス  ５ｇ、ペプトン  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇを含む斜面寒天培地（ｐＨ６．０）にて３０℃、２４時間培養した下表に示す酵母を１白金耳接種し、２５℃、１２０往復／分、で１７時間振とう培養を行った。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。
【０１０４】
表１−２に示す微生物は以下のように培養した。Cellulophaga lytica NBRC 14961 あるいは Flexithrix dorotheae NBRC 15987 の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ １Ｌ中に、トリプトン １ｇ、酵母エキス １ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH7.2、120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養したCellulophaga lytica NBRC 14961あるいは Flexithrix dorotheae NBRC 15987 の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１０５】
Weeksella virosa NBRC 16016 の培養には、羊血液寒天培地（日水プレート、日水製薬製）を用いた。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養したWeeksella virosa NBRC 16016 を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養培養した。
【０１０６】
Pedobacter heparinus NBRC 12017 の培養には、蒸留水１Ｌ中に、ペプトン
１０ｇ、酵母エキス ２ｇ、MgSO4・7H2O １ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.0ｐ、120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養した Pedobacter heparinus NBRC 12017 の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１０７】
Persicobacter diffluens NBRC 15940 の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ １Ｌ中に、KNO3 ０．５ｇ、グリセロリン酸ナトリウム ０．１ｇ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン １ｇ、トリプトン ５ｇ、酵母エキス５ｇ、寒天 １５ｇ、微量元素溶液 1ｍｌを含む寒天固体培地（pH 7.0, 120℃で15分殺菌）を用いた(尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、H3BO4 2.85g, MnCl2・4H20 1.8g, FeSO4・7H20 1.36g, CuCl2・2H20 26.9 mg, ZnCl2 20.8 mg, CoCl2・6H20 40.4 mg, Na2MoO4・2H20 25.2 mg, sodium tartarate 1.77 gを含む)。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養した Persicobacter diffluens NBRC 15940 の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１０８】
Chitinophaga pinensis NBRC 15968 の培養には、蒸留水 １Ｌ中に、バクトカジトン ３ｇ、酵母エキス  １ｇ、CaCl2・2H20   １．３６ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.0, 120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したChitinophaga pinensis NBRC 15968の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１０９】
Cyclobacterium marinum ATCC 25205 の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ １Ｌ中に、ペプトン ５ｇ、酵母エキス  １ｇ、FeSO4・7H20   ０．２ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.0, 120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したCyclobacterium marinum ATCC 25205の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１０】
Runella slithyformis ATCC 29530 の培養には、蒸留水１Ｌ中に、ペプトン
１ｇ、酵母エキス  １ｇ、グルコース １ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.0, 120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したRunella slithyformis ATCC 29530 の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１１】
Thermonema lapsum ATCC 43542 の培養には、蒸留水 １Ｌ中に、Nitrilotriacetic acid ０．２ｇ、0.03% FeCl3溶液 ２ｍｌ、CaSO4・2H20 ０．１２ｇ、MgSO4・7H20 ０．２ｇ、NaCl ０．０１６ｇ、KNO3 ０．２１ｇ、NaNO3 １．４ｇ、Na2HPO4 ０．２２ｇ、微量元素溶液 ２ｍｌ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 8.2, 120℃で15分殺菌）を用いた(尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、H2SO4 0.5ml, MnSO4・2.2g, ZnSO4 0.5g, H3BO3 0.5g, CuSO4 0.016g, Na2MoO4 0.025g, CoCl2 0.046gを含む)。この培地にて６０℃、４８時間、シード培養した Thermonema lapsum ATCC 43542 の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１２】
Gelidibacter algens ATCC 700364 あるいは Lewinella cohaerens ATCC 23123 あるいは Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 あるいは Salegentibacter salegens DSMZ 5424 の培養には、Marine Agar 2216（Difco製）を用いた。この培地にて、Gelidibacter algens ATCC 700364 あるいはPsychroserpens burtonensis ATCC 700359 の場合には１０℃、７２時間、シード培養した菌体を同培地に塗布し、１０℃、７２時間、メイン培養培養した。Lewinella cohaerensATCC 23123 の場合には、３０℃、４８時間、シード培養した菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養培養した。Salegentibacter salegens DSMZ 5424 の場合には、２５℃、４８時間、シード培養した菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養培養した。
【０１１３】
Dyadobacter fermentans ATCC 700827 の培養には、蒸留水 １Ｌ中に、NH4Cl０．８ｇ、KH2PO4 ０．２５ｇ、K2HPO4 ０．４ｇ、KNO3 ０．５０５ｇ、CaCl2・2H20 １５ｍｇ、MgCl2・6H20 ２０ｍｇ、FeSO4・7H20 ７ｍｇ、Na2SO4 ５ｍｇ、MnCl2・4H20 ５ｍｇ、H3BO3 ０．５ｍｇ、ZnCl2 ０．５ｍｇ、CoCl2・6H20 ０．５ｍｇ、NiSO4・６H20 ０．５ｍｇ、CuCl2・２H20 ０．３ｍｇ、 Na2MoO4・２H20 １０ｍｇ、酵母エキス ０．５ｇ、ペプトン ０．５ｇ、カザミノ酸 ０．５ｇ、デキストロース ０．５ｇ、可溶性デンプン ０．５ｇ、ピルビン酸ナトリウム ０．５ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.0, 120℃で15分殺菌）を用いたこの培地にて２５℃、４８時間、シード培養した Dyadobacter fermentans ATCC 700827 の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１４】
Flammeovirga aprica NBRC 15941の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ １Ｌ中に、トリプトン ２ｇ、牛肉エキス ０．５ｇ、酵母エキス ０．５ｇ、酢酸ナトリウム ０．２ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.2, 120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したFlammeovirga aprica NBRC 15941の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１５】
Spirosoma linguale DSMZ 74 あるいは Flectobacillus major DSMZ 103の培養には、蒸留水１Ｌ中に、グルコース １ｇ、ペプトン １ｇ、酵母エキス １ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.0, 120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したSpirosoma linguale DSMZ 74 あるいは Flectobacillus major DSMZ 103の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１６】
Tenacibaculum maritimum  ATCC43398 の培養には、蒸留水３００ｍｌ、ダイゴ人工海水ＳＰ７００ｍｌ中に、トリプトン ０．５ｇ、酵母エキス ０．５ｇ、牛肉エキス ０．２ｇ、酢酸ナトリウム ０．２ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.0, 120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養したTenacibaculum maritimum  ATCC43398 の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１７】
Rhodothermus marinus DSMZ 4252 の培養には、１Ｌ中に、酵母エキス ２．５ｇ、トリプトン２．５ｇ、Nitrilotriacetic acid １００ｍｇ、CaSO4・2H20 ４０ｍｇ、MgCl2・6H20 ２００ｍｇ、0.01M Fe citrate ０．５ｍｌ、微量元素溶液 ０．５ｍｌ、リン酸バッファー １００ｍｌ、蒸留水９００ｍｌ、寒天 ２８ｇを含む寒天固体培地（pH 7.2, 120℃で15分殺菌）を用いた(尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、Nitrilotriacetic acid 12.8 g, FeCl2・4H20 1g, MnCl2・4H20 0.5g, CoCl2・4H20 0.3g, CuCl2・2H20 50mg, Na2MoO4・2H20 50mg, H3BO320mg, NiCl2・6H20 20mgを含む。リン酸バッファーは蒸留水１Ｌ中にKH2PO4 5.44g, K2HPO4 43gを含む)。この培地にて６０℃、４８時間、シード培養した Rhodothermus marinus DSMZ 4252 の菌体を同培地に塗布し、６０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１８】
Zobellia galactanivoransDSMZ 12802 の培養には、 BACTO MARINE BROTH （DIFCO 2216）を含む寒天固体培地（寒天 １．５％、pH 7.6, 120℃で15分殺菌）を用いた。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養した Zobellia galactanivoransDSMZ 12802 の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１１９】
Muricauda ruestringensis DSMZ 13258 の培養には、蒸留水１Ｌ中に、酵母エキス １．５ｇ、ペプトン ２．５ｇ、ヘキサデカン ２ｇ、NaCl １７．７ｇ、KCl ０．４８ｇ、MgCl2・6H20 ３．４ｇ、MgSO4・7H20 ４．４６ｇ、CaCｌ2 ０．９８ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.2, 120℃で15分殺菌）を用いたこの培地にて３０℃、４８時間、シード培養した Muricauda ruestringensis DSMZ 13258 の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１２０】
Taxeobacter gelupurpurascens   DSMZ 11116 の培養には、蒸留水１Ｌ中に、カジトン ３ｇ、酵母エキス １ｇ、CaCl2・2H20 １．３６ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.2, 120℃で15分殺菌）を用いたこの培地にて３０℃、４８時間、シード培養した Taxeobacter gelupurpurascens   DSMZ 11116 の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１２１】
Cytophaga hutchinsonii NBRC 15051 の培養には、蒸留水１Ｌ中に、カジトン ３ｇ、酵母エキス １ｇ、CaCl2・2H20 １．３６ｇ、セロビオース ５ｇ、寒天１５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.2, 120℃で15分殺菌）を用いたこの培地にて３０℃、４８時間、シード培養した Cytophaga hutchinsonii NBRC 15051 の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１２２】
Marinilabilia salmonicolor  NBRC 15948 の培養には、蒸留水 ２５０ｍｌ、ダイゴ人工海水ＳＰ ７５０ｍｌ中に、ペプトン １０ｇ、酵母エキス ２ｇ、MgSO4・7H20 ０．５ｇ、寒天 １５ｇを含む寒天固体培地（pH 7.2, 120℃で15分殺菌）を用いたこの培地にて３０℃、４８時間、シード培養した Marinilabilia salmonicolor  NBRC 15948 の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１２３】
Saprospira grandis ATCC 23119 の培養には、ダイゴ人工海水ＳＰ １Ｌ中に、KNO3 ０．５ｇ、グリセロリン酸ナトリウム ０．１ｇ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン １ｇ、トリプトン ２ｇ、酵母エキス ２ｇ、寒天 １５ｇ、微量元素溶液 1ｍｌを含む寒天固体培地（pH 7.0, 120℃で15分殺菌）を用いた(尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、H3BO4 2.85g, MnCl2・4H20 1.8g, FeSO4・7H20 1.36g, CuCl2・2H20 26.9 mg, ZnCl2 20.8 mg, CoCl2・6H20 40.4 mg, Na2MoO4・2H20 25.2 mg, sodium tartrate 1.77 gを含む)。この培地にて３０℃、４８時間、シード培養した Saprospira grandis ATCC 23119 の菌体を同培地に塗布し、３０℃、４８時間、メイン培養した。
【０１２４】
Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775 の培養には、蒸留水１Ｌ中に、KH2PO4 ２７ｍｇ、K2HPO4 ４０ｍｇ、Na2HPO4・2H20 ４０ｍｇ、CaCl2・2H20 ５０ｍｇ、 MgSO4・7H20 ７５ｍｇ、FeCl3・6H20 ５ｍｇ、MnSO4・H20 ３ｍｇ、グルタミン酸 １．３１ｇ、Trypticase Soy Broth without glucose ２．５ｍｇ、チアミン ０．４ｍｇ、ビタミンB12 ０．０１ｍｇ、グルコース ２ｇ、微量元素溶液 1ｍｌを含む寒天固体培地（pH 7.5, 120℃で15分殺菌）を用いた(尚、微量元素溶液は蒸留水１Ｌ中に、ZnSO4・7H20 0.1g, MnCl2・4H20 0.03g, H3BO3 0.3g, CoCl2・6H20 0.2g, CuCl2・2H20 0.01g, NiCl2 ・6H20 0.02g, Na2MoO4・H20 0.03gを含む)。この培地にて２５℃、４８時間、シード培養した Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775 の菌体を同培地に塗布し、２５℃、４８時間、メイン培養した。
【０１２５】
このようにして得られたそれぞれの菌体を寒天培地より集菌し、湿菌体として１００ｇ/Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。
【０１２６】
これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステル塩酸塩１００ｍＭ、及びＬ−フェニルアラニン２００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、２０℃にて、表１−１に示した微生物を用いた場合には３時間、表１−２に示した微生物を用いた場合には１時間、反応をおこなった。このときのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）の生成量（ｍＭ）を表１−１および表１−２に示した。なお、β−ＡＭＰは何れの微生物の場合からも検出されなかった。
【０１２７】
【表１】
2005058212.tif 000005
【０１２８】
【表２】
2005058212.tif 000006
【０１２９】
（参考例１）β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルを生成する微生物
表２に示す微生物を実施例１の表１の細菌の場合と同様に培養した。培養後菌体を遠心分離し、湿菌体として１００ｇ／Ｌになるように１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて懸濁した。これらの微生物の菌体懸濁液０．１ｍＬに、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステル塩酸塩１００ｍＭ、及びＬ−フェニルアラニン２００ｍＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍＬをそれぞれ添加し、全量を０．２ｍＬとした後、３０℃にて２時間反応をおこなった。このときのβ−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（β−ＡＭＰ）の生成量（ｍＭ）を表２に示した。なお、いずれの微生物においてもα−ＡＭＰは検出されなかった。
【０１３０】
【表３】
2005058212.tif 000007
【０１３１】
（実施例２）エンペドバクター  ブレビス  からの酵素の精製
１Ｌ中にグルコース  ５ｇ、硫酸アンモニウム  ５ｇ、リン酸一カリウム  １ｇ、リン酸二カリウム  ３ｇ、硫酸マグネシウム  ０．５ｇ、酵母エキス  １０ｇ、ペプトン  １０ｇを含む培地（ｐＨ６．２）５０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注し、１１５℃で１５分殺菌した（培地３）。培地３に、同培地で３０℃、１６時間培養したエンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、国際寄託移管日；２００２年７月８日）を２ｍｌ接種し、３０℃、１２０往復／分で１６時間振盪培養を行った。
【０１３２】
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）し、菌体を集めた。菌体１６ｇを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄後、同緩衝液４０ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して一夜透析し、超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して一夜透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＭｏｎｏ  Ｓカラム（アマシャム社製）に供し、０〜１Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分の内、夾雑タンパクの最も少ない一画分を１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  カラム（アマシャム社製）に供し、１Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液（ｐＨ４．５）を流すことによりゲル濾過を行い、活性画分溶液を得た。これらの操作により、本実施例２で得られたペプチド生成酵素は電気泳動の実験結果より均一に精製されたことが確認された。上記の精製工程における活性の回収率は１２．２％、精製度は７０７倍であった。
【０１３３】
（実施例３）エンペドバクター  ブレビス  の酵素画分を用いたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステルの生産
実施例２で得られたＭｏｎｏＳ画分酵素（約２０Ｕ／ｍｌ）１０μｌを、１０５．３ｍＭのＬ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステル塩酸塩、２１０．５ｍＭのＬ−フェニルアラニン、１０．５１ｍＭのＥＤＴＡを含む１９０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて反応した。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）の生成経過を表３に示した。尚、酵素無添加区でのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル生成はほとんど認められなかった。
【０１３４】
更に、実施例２で得られたＭｏｎｏＳ画分酵素（約２０Ｕ／ｍｌ）１０μｌを、１０５．３ｍＭのＬ−アスパラギン酸−α−メチルエステル塩酸塩または１０５．３ｍＭのＬ−アスパラギン酸−β−メチルエステル塩酸塩のそれぞれについてと、２１０．５ｍＭのＬ−フェニルアラニン、１０．５１ｍＭのＥＤＴＡを含む１９０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて反応した結果、対応するペプチドの生成は見られなかった。
【０１３５】
【表４】
2005058212.tif 000008
【０１３６】
（実施例４）スフィンゴバクテリウム  エスピー  からの酵素の精製
実施例２に示した培地を用い、実施例２と同様の方法でスフィンゴバクテリウム  エスピー  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、国際寄託日；２００２年７月２２日）を培養した。以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。得られた培養液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）し、菌体を集めた。菌体２ｇを２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて洗浄後、同緩衝液８ｍｌに懸濁し、１９５Ｗにて４５分間超音波破砕処理を行った。この超音波破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）し、破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。この超音波破砕液上清を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に対して一夜透析し、超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。この活性画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して一夜透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，３０分）にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。この透析画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（アマシャム社製）に供し、０〜１Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた活性画分を得た。
【０１３７】
（実施例５）スフィンゴバクテリウム  エスピーの酵素画分を用いたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エチルエステルの生産
実施例４で得られたＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ画分の濃縮液（約１５Ｕ／ｍｌ）１５μｌを、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（α−ＡＭＰ）生産の場合には、１０８．１ｍＭのＬ−アスパラギン酸−α，β−ジメチルエステル塩酸塩、２１６．２ｍＭのＬ−フェニルアラニン、１０．８ｍＭのＥＤＴＡを含む１８５μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて反応した。同様に、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エチルエステル（α−ＡＥＰ）生産の場合には、実施例４で得られたＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ画分の濃縮液（約１５Ｕ／ｍｌ）１０μｌを、５２．６ｍＭのＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエチルエステル塩酸塩、１０５．２ｍＭのＬ−フェニルアラニン、１０．８ｍＭのＥＤＴＡを含む１９０μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、２０℃にて反応した。ＡＭＰあるいはＡＥＰの生成経過を表４に示した。尚、酵素無添加区でのＡＭＰあるいはＡＥＰの生成はほとんど認められなかった。尚、ＡＥＰの生成はＡＭＰの標準品を用いた値を記載した。
【０１３８】
【表５】
2005058212.tif 000009
【０１３９】
（実施例６）エンペドバクター  ブレビス由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はエンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ−１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
【０１４０】
（１）決定内部アミノ酸配列に基づいたＰＣＲプライマーの作製
前述のエンペドバクター  ブレビス ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株由来のペプチド生成酵素のリジルエンドペプチダーゼによる消化物をエドマン分解法により決定したアミノ酸配列（配列番号１及び２）をもとに、配列番号３及び４にそれぞれ示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
【０１４１】
（２）菌体の取得
エンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  ペプトン、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天，ｐＨ７．０））上で３０℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で振盪培養した。
【０１４２】
（３）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【０１４３】
（４）ＰＣＲ法によるペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得エンペドバクター  ブレビスＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。エンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【０１４４】
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
【０１４５】
９４℃      ３０秒
５２℃      １分
７２℃      １分
【０１４６】
反応後、反応液３μｌを０．８％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
【０１４７】
（５）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０１４８】
上記ＰＣＲで増幅された約１．５ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【０１４９】
本実施例６（３）で取得したエンペドバクター  ブレビスの染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ  ｍｅｍｅｂｒａｎｅｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ  ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【０１５０】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約４ｋｂのバンドが検出できた。
【０１５１】
本実施例６（３）で調製した染色体ＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約４ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、ｐＵＣ１１８  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢＡＰ（宝酒造製）とを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９のコンピテント・セル（東洋紡績製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１５２】
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０１５３】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｏｎｙ  ａｎｄ  Ｐｌａｑｕｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ  ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで室温、２０分間洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで６５℃、１５分間洗浄を２回行った。
【０１５４】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを２株確認できた。
【０１５５】
（６）エンペドバクター  ブレビス由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記２菌株から、エシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９が保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ  ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ  ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【０１５６】
その結果、ペプチド生成酵素の内部アミノ酸配列（配列番号１及び２）を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、ペプチド生成酵素をコードする遺伝子であることを確認した。ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号５に示した。得られたオープンリーディングフレームをＢＬＡＳＴＰ．プログラムで相同性解析した結果、二つの酵素に相同性が見出され、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓのα−アミノ酸エステルハイドロラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., 68(1), 211-218(2002) とは、アミノ酸配列で３４％、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ (J. Bacteriol., 173(24), 7848-7855(1991) のグルタリル-７ＡＣＡアシラーゼとは、アミノ酸配列で２６％の相同性を示した。
【０１５７】
（７）エンペドバクター属由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）W３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を配列番号７、８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ―Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩにて処理して得られるＤＮＡ断片と、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴと命名した。
【０１５８】
エンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号９、１０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２と命名した。
【０１５９】
ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２を有するエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ ｇ／ｌＤ−グルコース、１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、２５℃、２４時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり０．１１Ｕのα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【０１６０】
（シグナル配列予測）
配列表に記載の配列番号６番のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ  ｖ１．１プログラム（Protein Engineering, vol12, no.1, pp.3-9, 1999）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−２２番目までがシグナルとして機能してペリプラズムに分泌すると予測され、成熟タンパクは２３番目より下流であると推定された。
【０１６１】
（分泌の確認）
ｐＴｒｐＴ＿Ｇｔｇ２を有するエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９を１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、３０℃、２４時間シード培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０ｍｌの培地（２ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコにシードし、２５℃、２４時間の本培養を行い培養菌体を得た。
【０１６２】
上記培養菌体を２０ｇ／ｄｌのスクロース溶液を用いた浸透圧ショック法により、ペリプラズム画分とサイトプラズム画分に分画した。２０ｇ／ｄｌのスクロース溶液に浸した菌体を5mM MgSO4水溶液に浸し、この遠心上清をペリプラズム画分（Pe）とした。また、その遠心沈殿を再懸濁し、超音波破砕したものをサイトプラズム画分（Cy）とした。サイトプラズムを分離したことを確認するために、サイトプラズムに存在することが知られているグルコース６燐酸デヒロドロゲナーゼの活性を指標とした。測定法は1mM グルコース６燐酸、０．４mM NADP、１０mM MgSO4、50mM Tris-Cl(ｐＨ８)、３０℃の反応溶液の中に適当量の酵素を添加し、３４０ｎｍの吸光度の測定によりNADPHの生成を測定することにより行った。
【０１６３】
別途調整した無細胞抽出液の活性を１００％としたときの、サイトプラズム画分、ペリプラズム画分の酵素量を図１に示す。グルコース６燐酸デヒロドロゲナーゼ活性がペリプラズム画分に混入していないことは、サイトプラズム画分にペリプラズム画分が混入していないことを示す。α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル（α-ＡＭＰ）生成活性のうち約60%がペリプラズム画分に回収され、上記ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｌ．１プログラムを用いてアミノ酸配列から予測されたように、α-ＡＭＰ生成酵素がペリプラズムに分泌していることが確認された。
【０１６４】
（実施例７）スフィンゴバクテリウム  エスピー由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はスフィンゴバクテリウム  エスピー  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
【０１６５】
（１）菌体の取得
スフィンゴバクテリウム  エスピー  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  ペプトン、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天，ｐＨ７．０）)上で２５℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、２５℃で振盪培養した。
【０１６６】
（２）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【０１６７】
（３）ＰＣＲ法によるプローブ用ＤＮＡ断片の取得
エンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１１３株由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、ＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。エンペドバクター  ブレビス  ＦＥＲＭＢＰ−８１１３株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【０１６８】
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造製）を用いて行い、以下の条件の反応を３０サイクル行った。
【０１６９】
９４℃      ３０秒
５２℃      １分
７２℃      １分
【０１７０】
反応後、反応液３μｌを０．８％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
【０１７１】
（４）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０１７２】
上記ＰＣＲで増幅された約１．５ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【０１７３】
本実施例７（２）で取得したスフィンゴバクテリウム  エスピーの染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ  ｍｅｍｅｂｒａｎｅｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ  ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０１７４】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約３ｋｂのバンドが検出できた。
【０１７５】
本実施例７（２）で調製した染色体ＤＮＡ５μｇをＳａｃＩで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約３ｋｂのＤＮＡを分離し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、SacIで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５）で３７℃、３０分、５０℃、３０分処理したｐＵＣ１１８とを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテント・セル（宝酒造社製）１００μｌとを混合して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１７６】
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０１７７】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターＮｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｏｎｙ  ａｎｄ  Ｐｌａｑｕｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＥＡＳＹ  ＨＹＢ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０１７８】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを６株確認できた。
【０１７９】
（５）スフィンゴバクテリウム  エスピー由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記６菌株から、エシェリヒア  コリ  ＤＨ５αが保有するプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （プロメガ社製）を用いて調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＣＥＱ  ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はＣＥＱ  ２０００−ＸＬ（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【０１８０】
その結果、ペプチド生成酵素をコードするオープンリーディングフレームが存在した。スフィンゴバクテリウム  エスピー由来ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号１１に示した。スフィンゴバクテリウム  エスピー由来ペプチド生成酵素は、エンペドバクターブレビス由来ペプチド生成酵素とアミノ酸配列で６３．５％の相同性を示した（ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用）。
【０１８１】
（６）スフィンゴバクテリウム属由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
スフィンゴバクテリウム  エスピー  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２４の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１３、１４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をNdeI/XbaIにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのNdeI/XbaI処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔと命名した。
【０１８２】
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔを有するエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９を３ｍｌの培地（２ｇ/l  グルコース、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、２０時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり０．５３Ｕのα-ＡＭＰ生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がエシェリヒア  コリで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【０１８３】
（シグナル配列予測）
配列表に記載の配列番号１２番のアミノ酸配列をＳｉｇｎａｌＰ  ｖ１．１プログラム（Protein Engineering, vol12, no.1, pp.3-9, 1999）にて解析したところ、アミノ酸配列の１−２０番目までがシグナルとして機能してペリプラズムに分泌すると予測され、成熟タンパクは２１番目より下流であると推定された。
【０１８４】
（シグナル配列の確認）
ｐＴｒｐＴ＿Ｓｍ＿ａｅｔを有するエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９を５０ｍｌの培地（２ｇ/l グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、２０時間の本培養を行った。
【０１８５】
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは４℃にて行った。培養終了後、これらの培養液から菌体を遠心分離し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、同緩衝液に懸濁した。１９５Ｗにて２０分間超音波破砕処理を行い、超音波破砕処理液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分）し、破砕菌体片を除去することにより可溶性画分を得た。得られた可溶性画分を１００ｍMリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて予め平衡化したCHT-IIカラム（バイオラッド製）に供し、５００ｍＭリン酸緩衝液による直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分と５倍量の２Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸緩衝液とを混合した溶液を、２Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸緩衝液にて予め平衡化したＲesource-PHEカラム（アマシャム社製）に供し、２〜０Ｍ硫酸アンモニウムによる直線的な濃度勾配で酵素を溶出させ、活性画分溶液を得た。これらの操作により、ペプチド生成酵素は電気泳動的に単一に精製されたことが確認された。
【０１８６】
上記ペプチド生成酵素をエドマン分解法によりアミノ酸配列を決定したところ、配列番号１５のアミノ酸配列を取得し、SignalP v1.1プログラムで予測されたとおり成熟タンパクは２１番目より下流であることが確認された。
【０１８７】
(実施例８）ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株（寄託機関；財団法人発酵研究所、寄託先住所；日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５）を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
【０１８８】
（１）菌体の取得
ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  ペプトン、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天，ｐＨ７．０）)上で２５℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、２５℃で振盪培養した。
【０１８９】
（２）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。QIAGEN Genomic-tip System（Qiagen社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【０１９０】
（３）ＰＣＲ法によるプローブ用ＤＮＡ断片の取得
ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、LA-Taq（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号１５及び１６に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲで増幅された約１ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をDIG High Prime（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【０１９１】
（４）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０１９２】
ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株の染色体ＤＮＡを制限酵素HindIIIで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターNylon memebranes positively charged（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０１９３】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約５ｋｂのバンドが検出できた。
【０１９４】
ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株の染色体ＤＮＡ５μｇをHindIIIで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約５ｋｂのＤＮＡを分離し、Gene CleanII Kit（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、pUC118 HindIII/BAP（宝酒造製）とを混合しとを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとEscherichia coli JM109のコンピテント・セル（宝酒造社製）１００μｌとを混合して、Escherichia coliを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１９５】
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０１９６】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターNylonMembranes for Colony and Plaque Hybridization（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０１９７】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを１株確認できた。
【０１９８】
（５）ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記１菌株から、エシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９が保有するプラスミドを調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はCEQ DTCS-Quick Start Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はCEQ 2000-XL（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【０１９９】
その結果、ペプチド生成酵素をコードするオープンリーディングフレームが存在した。ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株由来ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号１７に示した。
【０２００】
（実施例９）ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株由来のペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
ペドバクター  ヘパリナス  ＩＦＯ  １２０１７株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１９、２０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。このＤＮＡ断片をNdeI／HindIIIにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐＴのNdeI／HindIII処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でエシェリヒア      
【０２０１】
コリ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐＴ＿Ｐｈ＿ａｅｔと命名した。
ｐＴｒｐＴ＿Ｐｈ＿ａｅｔを有するエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９を３ｍｌの培地（２ｇ/l グルコース、１０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌカザミノ酸、５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｇ／ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１００ｍｇ／ｌアンピシリン）を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、２５℃、２０時間の本培養を行った。培養液１ｍｌあたり０．０１Ｕのα-ＡＭＰ生成活性を有しており、クローニングした遺伝子がエシェリヒア  コリで発現したことを確認した。なお、対照としてｐＴｒｐＴのみを導入した形質転換体には、活性は検出されなかった。
【０２０２】
(実施例１０）タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス（Taxeobacter gelupurpurascens）  ＤＳＭＺ  １１１１６株由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はタキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株（寄託機関；Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collectionof Microorganisms and Cell Cultures、寄託先住所；Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany）を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
【０２０３】
（１）菌体の取得
タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  ペプトン、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天，ｐＨ７．０）上で２５℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、２５℃で振盪培養した。
【０２０４】
（２）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。QIAGEN Genomic-tip System（Qiagen社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【０２０５】
（３）ＰＣＲ法によるプローブ用ＤＮＡ断片の取得
タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、LA-Taq（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号２１及び１６に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲで増幅された約１ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をDIG High Prime（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【０２０６】
（４）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０２０７】
タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株の染色体ＤＮＡを制限酵素PstIで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターNylon memebranes positively charged（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０２０８】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約５ｋｂのバンドが検出できた。
【０２０９】
タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株の染色体ＤＮＡ５μｇをPstIで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約５ｋｂのＤＮＡを分離し、Gene CleanII Kit（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、pUC118 PstI/BAP（宝酒造製）とを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとEscherichia coli JM109のコンピテント・セル（宝酒造社製）１００μlとを混合して、Escherichia coliを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０２１０】
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０２１１】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターNylonMembranes for Colony and Plaque Hybridization（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０２１２】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを１株確認できた。
【０２１３】
（５）タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記１菌株から、エシェリヒア  コリ ＪＭ１０９が保有するプラスミドを調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はCEQ DTCS-Quick Start Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はCEQ 2000-XL（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【０２１４】
その結果、ペプチド生成酵素をコードするオープンリーディングフレームが存在した。タキセオバクター  ゲルプルプルアッセンス  ＤＳＭＺ  １１１１６株由来ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号２２に示した。
【０２１５】
(実施例１１) サイクロバクテリウム  マリナム  （Cyclobacterium marinum）  ＡＴＣＣ  ２５２０５株由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はサイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５株（寄託機関；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、寄託先住所；P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America）を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
【０２１６】
（１）菌体の取得
サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  ペプトン、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天，ｐＨ７．０）)上で２５℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、２５℃で振盪培養した。
【０２１７】
（２）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。QIAGEN Genomic-tip System（Qiagen社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【０２１８】
（３）ＰＣＲ法によるプローブ用ＤＮＡ断片の取得
サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５株由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、LA-Taq（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号１５及び１６に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲで増幅された約１ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をDIG High Prime（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【０２１９】
（４）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０２２０】
サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５株の染色体ＤＮＡを制限酵素PstIもしくはHincIIで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、それぞれ０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターNylon memebranes positively charged（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０２２１】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズするPstI消化産物では7k、HincII消化産物では2kのバンドが検出できた。
【０２２２】
サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５株の染色体ＤＮＡ５μｇをPstIもしくはHincIIで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳
動によりそれぞれ約７ｋｂもしくは2kbのＤＮＡを分離し、Gene CleanII Kit（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、それぞれpUC118 PstI/BAP（宝酒造製）もしくはpUC118 HincII/BAP（宝酒造製）とを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとEscherichia coli JM109のコンピテント・セル（宝酒造社製）１００μｌとをそれぞれ混合して、Escherichiacoliを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０２２３】
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０２２４】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターNylonMembranes for Colony and Plaque Hybridization（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０２２５】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーをそれぞれ１株確認できた。
【０２２６】
（５）サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ２５２０５株由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
上記、標識プローブとハイブリダイズしたことが確認されたそれぞれ１菌株から、エシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９が保有するプラスミドを調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はCEQ DTCS-Quick Start Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はCEQ 2000-XL（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【０２２７】
その結果、ペプチド生成酵素をコードするオープンリーディングフレームが存在した。サイクロバクテリウム  マリナム  ＡＴＣＣ  ２５２０５株由来ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号２４に示した。
【０２２８】
(実施例１２）サイクロセルペンス  ブルトネンシス（Psycloserpens burtonensis）ＡＴＣＣ  ７００３５９由来のペプチド生成酵素遺伝子の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はサイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株（寄託機関；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、寄託先住所；P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America）を用いた。遺伝子の単離にはエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１１８を用いた。
【０２２９】
（１）菌体の取得
サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株をＣＭ２Ｇ寒天培地（５０ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  ペプトン、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、２０ｇ／ｌ寒天，ｐＨ７．０）)上で２５℃、２４時間培養した。この菌体を、５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地（上記培地より寒天を除いた培地）を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、１０℃で振盪培養した。
【０２３０】
（２）菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した。QIAGEN Genomic-tip System（Qiagen社）を用いて、説明書の方法に基づき、この菌体から染色体ＤＮＡを取得した。
【０２３１】
（３）ＰＣＲ法によるプローブ用ＤＮＡ断片の取得
サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株由来のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、LA-Taq（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により取得した。サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株から取得した染色体ＤＮＡに対し、配列番号１５及び１６に示す塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲで増幅された約１ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％アガロース電気泳動により分離した。目的のバンドを切り出し、精製した。このＤＮＡ断片をDIG High Prime（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づきプローブのジゴキシニゲンによる標識を行った。
【０２３２】
（４）遺伝子ライブラリーからのペプチド生成酵素遺伝子のクローニング
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、まず、上記ＰＣＲにおいて増幅されたＤＮＡ断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０２３３】
サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株の染色体ＤＮＡを制限酵素EcoRIで３７℃、１６時間反応させて完全に消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターNylon memebranes positively charged（ロシュ・ダイアグノティクス社製）にブロッティングし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記で作製した、ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０２３４】
プローブとハイブリダイズするバンドの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、プローブとハイブリダイズする約７ｋｂのバンドが検出できた。
【０２３５】
サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株の染色体ＤＮＡ５μｇをEcoRIで完全に消化した。０．８％アガロースゲル電気泳動により約７ｋｂのＤＮＡを分離し、Gene CleanII Kit（フナコシ社製）を用いてＤＮＡを精製し、１０μｌのＴＥに溶解した。このうち４μｌと、pUC118 EcoRI/BAP
（宝酒造製）とを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。このライゲーション反応液５μｌとEscherichia coli JM109のコンピテント・セル（宝酒造社製）１００μlとを混合して、Escherichia coliを形質転換した。これを適当な固形培地に塗布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０２３６】
ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによる染色体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)に説明されている。
【０２３７】
染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナイロンメンブレンフィルターNylonMembranes for Colony and Plaque Hybridization（ロシュ・ダイアグノティクス社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはEASY HYB（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて行った。フィルターを３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、上記ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。この後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで６０℃で洗浄を２回行った。
【０２３８】
標識プローブとハイブリダイズするコロニーの検出は、DIG Nucleotide Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して、説明書に基づき行った。その結果、標識プローブとハイブリダイズするコロニーを１株確認できた。
【０２３９】
（５）サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列
標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記１菌株から、エシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９が保有するプラスミドを調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。シーケンス反応はCEQ DTCS-Quick Start Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、説明書に基づき行った。また、電気泳動はCEQ 2000-XL（ベックマン・コールター社製）を用いて行った。
【０２４０】
その結果、ペプチド生成酵素をコードするオープンリーディングフレームが存在した。サイクロセルペンス  ブルトネンシス  ＡＴＣＣ  ７００３５９株由来ペプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配列とこれに対応するアミノ酸配列を配列表配列番号２６に示した。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】サイトプラズム画分、ペリプラズム画分についての相対活性（％）を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０２４２】
配列番号１；エンペドバクター  ブレビス由来のペプチド生成酵素の一部
配列番号２；エンペドバクター  ブレビス由来のペプチド生成酵素の一部
配列番号３；合成プライマー１
配列番号４；合成プライマー２
配列番号５；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号６；ペプチド生成酵素のアミノ酸配列
配列番号７；pTrpT調製用合成プライマー
配列番号８；pTrpT調製用合成プライマー
配列番号９；pTrpT_Gtg2調製用合成プライマー
配列番号１０；pTrpT_Gtg2調製用合成プライマー
配列番号１１；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号１２；ペプチド生成酵素のアミノ酸配列
配列番号１３；pTrpT_Sm_aet調製用合成プライマー
配列番号１４；pTrpT_Sm_aet調製用合成プライマー
配列番号１５；Aet用ミックスプライマー１
配列番号１６；Aet用ミックスプライマー２
配列番号１７；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号１８；ペプチド生成酵素のアミノ酸配列
配列番号１９；ペドバクター由来のaet発現ベクターを構築するためのプライマー１
配列番号２０；ペドバクター由来のaet発現ベクターを構築するためのプライマー２
配列番号２１；Aet用ミックスプライマー３
配列番号２２；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号２３；ペプチド生成酵素のアミノ酸配列
配列番号２４；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号２５；ペプチド生成酵素のアミノ酸配列
配列番号２６；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号２７；ペプチド生成酵素をコードする遺伝子
【図１】
2005058212.tif 000010
【配列表】
2005058212000001.app