(57)【要約】【課題】  異種タンパク質の発現を抑制している機構を解明し、その機構を制御してタンパク質生産量を高くすることを目的として、酵母の遺伝子変異株コレクションに異種タンパク質を導入し、異種タンパク質高生産に関わる遺伝子を網羅的に探索し、これらの遺伝子を改変して異種タンパク質の高生産を行うことが課題である。【解決手段】  酵母遺伝子変異株に異種タンパク質をコードする遺伝子を導入し活性の強くなる遺伝子変異株を探索する。本発明では、異種タンパク質の発現を抑制している遺伝子を同定した。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母での異種タンパク質の高生産株とそれに関与する遺伝子。
【請求項２】
異種タンパク質の生産を抑制している遺伝子あるいはその遺伝子産物が機能していない酵母での異種タンパク質の高生産株とそれを用いた高生産法。
【請求項３】
酵母での異種タンパク質の高生産に適した酵母変異株の、BUB2, BUB3,BUL1, END3, FYV10, IKI3, MAD1, MAD2, MAD3, NCL1, PER1, PFK26, RPS24A, VHS2, VIK1, VRP1, YKL053W, YML094C-Aという遺伝子もしくはその発現の１つまたは複数を改変することにより育種されるタンパク質高生産株とこれを用いた酵母での異種タンパク質の高生産法。
【請求項４】
酵母での異種タンパク質の高生産に適した酵母変異株のうち特に異種タンパク質の高生産につながる、BUB3, END3, IKI3, MAD1, MAD2, MAD3, RSP24A, VIK1, VRP1, YKL053W という遺伝子もしくはその発現の１つまたは複数を改変することにより育種されるタンパク質高生産株とこれを用いた酵母での異種タンパク質の高生産法。
【請求項５】
請求項３にかかげる遺伝子と相同な配列や、機能的に相同な遺伝子をもつ生物において、これらの遺伝子もしくはその発現を１つもしくは複数を改変して育種される宿主生物とこれを用いた高生産法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母における異種タンパク質の高生産に関わる遺伝子の探索とその利用に関する
【背景技術】
【０００２】
異種タンパク質を発現させる多くの宿主−ベクター系が存在するが、どの系もあらゆるタンパク質を高発現できるとは限らない。実際、発明者らが、白色腐朽菌（Pycnoporus coccineus）からクローニングしたラッカーゼ遺伝子（lcc1）を、酵母（Sacchromyces cerevisiae）で分泌生産させたときの活性は弱かった。
【０００３】
定常的あるいは誘導型の高発現プロモーターが多く開発され異種タンパク質の生産に利用されているが、プロモーターが強いからといって高生産できるわけではない。
【０００４】
異種タンパク質においては、異種細胞中での構造形成の困難さが良く知られている（非特許文献１）。たとえば、小胞体上でタンパク質の３次元構造形成を助ける分子シャペロンやフォルダーゼの存在が知られている。これらのタンパク質の調整に関わる HAC1 遺伝子を過剰発現させると、異種αアミラーゼの分泌活性が上昇した。また、タンパク質の構造異常を管理している品質管理機構の働きにより、異種タンパク質の生産が抑制されている可能性があるが、この機構の詳細はほとんどわかっていない。タンパク質品質管理機構を明らかにできれば、あらゆるタンパク質を異種細胞中で高生産させることが出来る。そのためには、異種タンパク質生産に関与する遺伝子を、網羅的に探索する必要がある。
【０００５】
酵母 Kluyveromyces lactis の変異体の解析によりあきらかになった分泌抑制タンパク質は、酵母 Saccharomyces cerevisiae のユビキチン化調節に関わる YML013W 遺伝子にコードされたタンパク質と相同性が高い。酵母 Saccharomyces cerevisiae の YML013W を破壊すると 異種αアミラーゼの分泌活性が高まった。しかし、この遺伝子を破壊した酵母は増殖速度が遅くなる問題があり（非特許文献２）、増殖に影響を与えない高分泌株の取得が課題である。
【非特許文献１】Appl. Environ. Microbiol. 69, 2065-2072 (2003)
【非特許文献２】Yeast 20: 1-11 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
酵母の遺伝子変異株コレクションに異種タンパク質を導入し、異種タンパク質高生産に関わる遺伝子を網羅的に探索し、これらの遺伝子を改変して異種タンパク質の高生産を行うことが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
酵母の遺伝子変異株に異種のラッカーゼ遺伝子を導入し、ラッカーゼ活性を強く発現できる変異株を探索した。lcc1 cDNA を銅誘導型 CUP1 プロモーターの下流に挿入した CEN/ARS URA3 型プラスミドを用いて形質転換を行い、銅と活性指示薬のグアイアコールを含む培地上でラッカーゼ活性を調べた。検索された株の変異遺伝子は、異種ラッカーゼ生産に重要な役割を持ち、これらの株で今まで発現困難であった異種タンパク質の高生産が期待できるとともに、これらの遺伝子の機能解析により品質管理機構も解明できる。
【０００８】
異種タンパク質発現系は多数存在するが、どの宿主でも宿主のタンパク質品質管理機構が、異種タンパク質を不用なものと認識し、発現を抑制していると考えられる。異種タンパク質の発現を抑制している遺伝子が明らかになれば、酵母に限らず、麹かび、昆虫細胞、ほ乳類など既存の発現系でこれらの遺伝子を改変すれば、望みの宿主で、異種タンパク質を大量に生産できる。
【０００９】
これまでのタンパク質発現量の増大を目指した研究では、細胞外プロテアーゼやシャペロンなど特定の機能に限って行われていた。多くの酵母遺伝子変異株から探索することでこれまで全く想定されていない細胞内システムが明らかになり、これらは異種タンパク質生産のブレイクスルーとなる。
【００１０】
品質管理機構に限らず、探索で明らかになった異種タンパク質の生産に関わる複数の機構を制御し、どんなタンパク質でも確実に生産できる宿主を育種する。これを用いればこれまで困難であったタンパク質の大量生産が可能になる。
【発明の効果】
【００１１】
あらゆる酵素が大量に生産できるようになれば、様々な工業生産過程のエネルギー消費を削減できる。また、これまで大量には生産できなかった、マンガンペルオキシダーゼやキシラナーゼなど複数の木材分解酵素を発現させれば、酵母自身の発酵能力と合わせて、木材からエタノールを生産することが可能になり、バイオマス資源の有効利用ができる。医薬品生産分野では、ヒトあるいは哺乳類で生産させた物質を利用することは、常に別の病気の感染拡大を心配しなければならない。しかしこれが酵母で可能になれば、安全であるだけでなく安価に生産できる。また精製など何も行わず、食品として摂取することも可能であり、その影響は計り知れない。一例として、ラッカーゼの発現量を酵母遺伝子変異株コレクションで解析した結果、１８の遺伝子変異株でラッカーゼ活性が非常に増大することが明らかになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明を実施するための最良の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明する。
【実施例】
【００１３】
工業的に有用なタンパク質を、異種タンパク質発現システムを用いて製造することは可能である。しかしながら、異種タンパク質発現システムを用いた場合には、活性型のタンパク質が得られなかったり、ごく少量のタンパク質しか製造できないことが頻繁にあるという問題がある。例えば、Pycnoporus coccineus からクローニングしたラッカーゼをコードする lcc1 cDNA を、酵母  （Saccharomyces cerevisiae）、メタノール資化性酵母（Pichia pastoris）、麹かび（Aspergillus orizae）において発現させた場合には、P. coccineus で発現させた場合に比較して、活性を有する Lcc1 タンパク質の産生量は非常に低かった。この結果は、細胞中での異種タンパク質の発現には、品質管理機構が関与していることを示している。品質管理機構を解明するために、本実施例では、酵母の遺伝子変異株コレクションを利用した。
【００１４】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）の遺伝子変異株コレクションに対してP. coccineus の lcc1 cDNA を用いて、形質転換を行った。プラスミドは CEN/ARS URA3 を用い、銅イオンにより誘導される CUP1 プロモーターの下流に lcc1 cDNA を挿入した（図１）。
【００１５】
得られた形質転換体を、活性検出用培地に植菌した。活性検出用培地には、ラッカーゼの基質であるグアイアコールと lcc1 cDNA の発現を誘導するため０.５mMの銅イオンを存在させた。植菌後２８℃で培養し、７日間観察した。ラッカーゼの酸化反応によりグアイアコールが赤茶色を示すが、この呈色の強い遺伝子変異株をピックアップした。
【００１６】
最初の試験で２９株をピックアップした後、これらの遺伝子破壊株をもう一度形質転換した。新しく得た形質転換体を２mlの液体培地で培養した後、濃度をそろえて活性検出用培地に２μl植菌した。活性の再試験を行い親株より活性の強い１８株を選抜した。詳細は表１および表２に示すとおりである。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】酵母に導入した銅誘導型プロモーターによる lcc1 cDNA 発現ベクターを示す図である。
【図２】植菌量を揃えて活性を調べたときの銅とグアイアコールを含む培地上での活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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