(57)【要約】【課題】  新規なズブチラーゼ酵素の提供。【解決手段】  残基132 及び133 (BASBPN 番号付けによる）間に自己タンパク質加水分解性分裂部位を有し、そしてさらに、BLS309の残基129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記前駆体ズブチラーゼ酵素に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
残基132 及び133 (BASBPN 番号付けによる）間に自己タンパク質加水分解性分裂部位を有し、そしてさらに、BLS309の残基129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記前駆体ズブチラーゼ酵素に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。
【請求項２】
BLS309の残基G159, S164, I165, Y167, R176, Y171（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有し、そしてさらに、残基129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素変異体から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記位置 129〜136 のいづれかの位置で修飾されていない前駆体ズブチラーゼ変異体に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。
【請求項３】
残基192 及び193 (BASBPN 番号付けによる）間に自己タンパク質加水分解性分裂部位を有し、そしてさらに、残基189, 190, 191, 192, 193, 196 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記前駆体ズブチラーゼ酵素に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。
【請求項４】
BLS309の残基P129, P131, E136, G159, S164, I165, Y167,R170, Y171 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有し、そしてさらに、BLS309の残基189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置するは１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素変異体から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記位置 189〜196 のいづれかで修飾されていない前駆体ズブチラーゼ変異体に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。
【請求項５】
前記前駆体ズブチラーゼ酵素が、
ｉ）残基129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基で、及び
ii）BLS309の残基189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基で修飾されている請求項１〜４のいづれか１項記載のズブチラーゼ酵素変異体。
【請求項６】
前記前駆体ズブチラーゼがサブグループ・Ｉ−Ｓ１から選択される請求項１〜５のいづれか１項記載の変異体。
【請求項７】
前記前駆体ズブチラーゼがABSS168, BASBPN, BSSDY、及びBLSCAR、又はサブグループＩ−Ｓ１の特徴を保持しているそれらの機能的変異体から成る群から選択される請求項６記載の変異体。
【請求項８】
前記前駆体ズブチラーゼがサブグループＩ−Ｓ２から選択される請求項１〜５のいづれか１項記載の変異体。
【請求項９】
前記前駆体ズブチラーゼがBLS147, BLS309, BAPB92及びBYSYAB、又はサブグループＩ−Ｓ２の特徴を保持しているそれらの機能的変異体から成る群から選択される請求項８記載の変異体。
【請求項１０】
前記親ズブチラーゼが、TVTHER、又はサブグループＩ−Ｓ２の特徴を保持しているその機能的変異体である請求項８記載の変異体。
【請求項１１】
前記置換が、少なくとも１つの他の位置における置換、挿入又は欠失と組合される請求項１〜10のいづれか１項記載の変異体。
【請求項１２】
前記置換が、位置36, 222, 218, 76のいづれか１又は複数の位置における置換、挿入又は欠失と組合される請求項11記載の変異体。
【請求項１３】
次の位置：129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (BASBPN番号付けによる）のいづれか１又は複数の位置における修飾と組合して、次の修飾：
T129V, T129I, T129L, T129M, T129F, A129V, A129I, A129L, A129M, A129F,
G131V, G131I, G131L, G131M, G131F, K136V, K136I, K136L, K136M, K136F,
S159V, S159I, S159L, S159M, S159F, T164V, T164I, T164L, T164M, T164F,
K170V, K170I, K170L, K170M, K170F, Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F,
T159V, T159I, T159L, T159M, T159F, A164V, A164I, A164L, A164M, A164F,
Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F, Y171A, Y171H, Y171N, Y171P, Y171C,
Y171W, Y171Q, Y171S, Y171T, Y171G, Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F,
E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G159I, G159L, G159M, G159F,
G164V, G164I, G164L, G164M, G164F, S164V, S164I, S164L, S164M, S164F,
Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C, Y167W, Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G
Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F, R170A, R170H, R170N, R170P, R170C,
R170W, R170Q, R170S, R170T, R170Y, R170G, R170V, R170I, R170L, R170M,
R170F,
のいづれかの組合せである請求項１〜12のいづれか１項記載の変異体。
【請求項１４】
次の位置：189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 (BASBPN番号付けによる）のいづれか１又は複数の位置における修飾と組合せて、次の修飾：
T129V, T129I, T129L, T129M, T129F,A129V, A129I, A129L, A129M, A129F,
G131V, G131I, G131L, G131M, G131F, K136V, K136I, K136L, K136M, K136F,
S159V, S159I, S159L, S159M, S159F, T164V, T164I, T164L, T164M, T164F,
K170V, K170I, K170L, K170M, K170F, Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F,
T159V, T159I, T159L, T159M, T159F, A164V, A164I, A164L, A164M, A164F,
Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F, Y171A, Y171H, Y171N, Y171P, Y171C,
Y171W, Y171Q, Y171S, Y171T, Y171G, Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F,
E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G159I, G159L, G159M, G159F,
G164V, G164I, G164L, G164M, G164F, S164V, S164I, S164L, S164M, S164F,
Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C, Y167W, Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G
Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F, R170A, R170H, R170N, R170P, R170C,
R170W, R170Q, R170S, R170T, R170Y, R170G, R170V, R170I, R170L, R170M,
R170F,
のいづれかの組合せである請求項１〜12のいづれか１項記載の変異体。
【請求項１５】
次の位置：
ｉ）130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (BASBPN 番号付けによる）、及び
ii）190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 (BASBPN 番号付けによる）のいづれか１又は複数の位置における修飾と組合せて、次の修飾：
T129V, T129I, T129L, T129M, T129F, A129V, A129I, A129L, A129M, A129F,
G131V, G131I, G131L, G131M, G131F; K136V, K136I, K136L, K136M, K136F,
S159V, S159I, S159L, S159M, S159F, T164V, T164I, T164L, T164M, T164F,
K170V, K170I, K170L, K170M, K170F, Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F,
T159V, T159I, T159L, T159M, T159F, A164V, A164I, A164L, A164M, A164F,
Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F, Y171A, Y171H, Y171N, Y171P, Y171C,
Y171W, Y171Q, Y171S, Y171T, Y171G, Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F,
E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G159I, G159L, G159M, G159F,
G164V, G164I, G164L, G164M, G164F, S164V, S164I, S164L, S164M, S164F,
Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C, Y167W, Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G,
Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F, R170A, R170H, R170N, R170P, R170C,
R170W, R170Q, R170S, R170T, R170Y, R170G, R170V, R170I, R170L, R170M,
R170F,
のいづれかの組合せである請求項１〜12のいづれか１項記載の変異体。
【請求項１６】
前記変異体が、位置：27，36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235 、及び274 のいづれか１又は複数の位置における追加の置換、欠失及び／又は挿入と組合される請求項１〜15のいづれか１項記載の変異体。
【請求項１７】
前記ズブチラーゼＩ−Ｓ２サブグループに属し、そして前記さらなる変更が、K27R, ＊36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L 及びT274A から成る群から選択される請求項16記載の変異体。
【請求項１８】
請求項１〜17のいづれか１項記載のいづれか１又は複数の置換、欠失及び／又は挿入と組合せて、変異体V104N+S101G, K27R+V104Y+N123S+T274A 、もしくはN76D+V104A、又はそれらの突然変異の他の組合せ（V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) のいづれかを含んで成る請求項17記載の変異体。
【請求項１９】
少なくとも次の突然変異：
Ａ：Y167I+R170L+A133P
Ｂ：Y167I+R170L+T134P
Ｃ：Y167I+R170L+A133P+T134P
Ｄ：Y167I+R170L+V104C+S132C
Ｅ：Y167I+R170L+A108C+T134C
Ｆ：Y167A+R170S+F189A
Ｇ：Y167A+R170S+Y192A
Ｈ：Y167A+R170S+Y192P
Ｉ：Y167A+R170S+Y192A+A194P
Ｊ：Y167A+R170S+Y192P+A194P
Ｋ：Y167A+R170S+F189G
Ｌ：Y167A+R170S+F189E
Ｍ：Y167A+R170S+F189R
Ｎ：Y167I+R170L
Ｍ：Y167I+R170L+A194P
Ｏ：Y167A+R170S+A194P
Ｐ：Y167A+R170L+A194P
Ｑ：Y167A+R170N+A194P
Ｒ：V104C+S132C+Y167I+R170L
Ｓ：A108C+T134C+Y167I+R170L
：V104C+S132C+Y167A+R170S
Ｕ：V104C+S132C+Y167A+R170L
Ｖ：V104C+S132C+Y167A+R170N
Ｘ：A133D+Y167I+R170L
Ｙ：P129K+Y167I+R170L
Ｚ：A133P+Y167A+R170S+A194P
AA：T134P+Y167A+R170S+A194P
BB：A133P+T134P+Y167A+R170S+A194P
CC：A133P+Y167A+R170N+A194P
DD：T134P+Y167A+R170N+A194P
EE：A133P+T134P+Y167A+R170N+A194P
FF：A133P+Y167A+R170L
GG：P129K+P131H+Y167I+R170L
HH：A133P+Y167A+R170S
II：A133P+Y167A+R170N
JJ：Y167A+R170S+F189K
KK：V104C+T134C+Y167A+R170S
を含んで成る変異体の群から選択される請求項１〜12のいづれか１項記載の変異体。
【請求項２０】
自己タンパク質加水分解安定性を示すプロテアーゼ変異体の同定方法であって、BLS309のアミノ酸P129, P131, E136, G159, S164, I165, Y167, R170, Y171 (BASBPN番号付けによる）に対応する１又は複数の位置で、ズブチラーゼ酵素又はそのプレ−又はプレプロ酵素をコードするDNA の突然変異をもたらし；
前記突然変異誘発されたDNA によりバシラス株を形質転換し；
そのようなプロテアーゼ変異体を生成する株を選択し；
そのような株を発酵し／増殖せしめ；
前記プロテアーゼ変異体を回収し；そして
洗剤における改良された貯蔵安定性及び／又は洗浄性能について試験する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２１】
変異体ズブチラーゼ酵素の生成方法であって、請求項20記載の方法に従っての同定に続いて、所望する高められた自己タンパク質加水分解安定性を有する変異体ズブチラーゼ酵素を製造することを含んで成る方法。
【請求項２２】
請求項１〜19のいづれか１項記載のズブチラーゼ変異体をコードするDNA 配列。
【請求項２３】
請求項22記載のDNA 配列を含んで成るベクター。
【請求項２４】
請求項23記載のベクターにより形質転換された微生物宿主細胞。
【請求項２５】
細菌、好ましくはバシラス、特にＢ．レンタスである請求項24記載の微生物宿主細胞。
【請求項２６】
菌類又は酵母、好ましくは糸状菌、特にアスペルギラスである請求項24記載の微生物宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１〜19のいづれか１項記載の変異体の生成方法であって、請求項24〜26のいづれか１項記載の宿主を、前記変異体の発現及び分泌の助けとなる条件下で培養し、そして前記前駆体を回収することを含んで成る方法。
【請求項２８】
請求項１〜19のいづれか１項記載のズブチラーゼ変異体を含んで成る組成物。
【請求項２９】
セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、他のプロテアーゼ又はアミラーゼをさらに含んで成る請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
洗剤組成物である請求項28又は29記載の組成物。
【請求項３１】
洗濯用及び／又は皿洗い用洗剤への請求項１〜19のいづれか１項記載のズブチラーゼ変異体又は請求項28〜30のいづれか１項記載の酵素組成物の使用。
【請求項３２】
１又は複数の突然変異A194P 及び／又はA133P と組合して、少なくとも下記突然変異：
R170A；R170C；R170F；R170G；R170H；R170I；R170L；R170N；R170M；R170P；
R170Q；R170S；R170T；R170V；R170Y
Y167A+R170A；Y167C+R170A；Y167F+R170A；Y167G+R170A；Y167H+R170A；
Y167I+R170A；Y167L+R170A；Y167M+R170A；Y167N+R170A；Y167P+R170A；
Y167Q+R170A；Y167S+R170A；Y167T+R170A；Y167V+R170A；Y167A+R170C；
Y167C+R170C；Y167F+R170C；Y167G+R170C；Y167H+R170C；Y167I+R170C；
Y167L+R170C；Y167M+R170C；Y167N+R170C；Y167P+R170C；Y167Q+R170C；
Y167S+R170C；Y167T+R170C；Y167V+R170C；Y167A+R170F；Y167C+R170F；
Y167F+R170F；Y167G+R170F；Y167H+R170F；Y167I+R170F；Y167L+R170F；
Y167M+R170F；Y167N+R170F；Y167P+R170F；Y167Q+R170F；Y167S+R170F；
Y167T+R170F；Y167V+R170F；Y167A+R170G；Y167C+R170G；Y167F+R170G；
Y167G+R170G；Y167H+R170G；Y167I+R170G；Y167L+R170G；Y167M+R170G；
Y167N+R170G；Y167P+R170G；Y167Q+R170G；Y167S+R170G；Y167T+R170G；
Y167V+R170G；Y167A+R170H；Y167C+R170H；Y167F+R170H；Y167G+R170H；
Y167H+R170H；Y167I+R170H；Y167L+R170H；Y167M+R170H；Y167N+R170H；
Y167P+R170H；Y167Q+R170H；Y167S+R170H；Y167T+R170H；Y167V+R170H；
Y167A+R170I；Y167C+R170I；Y167F+R170I；Y167G+R170I；Y167H+R170I；
Y167I+R170I；Y167L+R170I；Y167M+R170I；Y167N+R170I；Y167P+R170I；
Y167Q+R170I；Y167S+R170I；Y167T+R170I；Y167V+R170I；Y167A+R170L；
Y167C+R170L；Y167F+R170L；Y167G+R170L；Y167H+R170L；Y167I+R170L；
Y167L+R170L；Y167M+R170L；Y167N+R170L；Y167P+R170L；Y167Q+R170L；
Y167S+R170L；Y167T+R170L；Y167V+R170L；Y167A+R170M；Y167C+R170M；
Y167F+R170M；Y167G+R170M；Y167H+R170M；Y167I+R170M；Y167L+R170M；
Y167M+R170M；Y167N+R170M；Y167P+R170M；Y167Q+R170M；Y167S+R170M；
Y167T+R170M；Y167V+R170M；Y167A+R170N；Y167C+R170N；Y167F+R170N；
Y167G+R170N；Y167H+R170N；Y167I+R170N；Y167L+R170N；Y167M+R170N；
Y167N+R170N；Y167P+R170N；Y167Q+R170N；Y167S+R170N；Y167T+R170N；
Y167V+R170N；Y167A+R170P；Y167C+R170P；Y167F+R170P；Y167G+R170P；
Y167H+R170P；Y167I+R170P；Y167L+R170P；Y167M+R170P；Y167N+R170P；
Y167P+R170P；Y167Q+R170P；Y167S+R170P；Y167T+R170P；Y167V+R170P；
Y167A+R170Q；Y167C+R170Q；Y167F+R170Q；Y167G+R170Q；Y167H+R170Q；
Y167I+R170Q；Y167L+R170Q；Y167M+R170Q；Y167N+R170Q；Y167P+R170Q；
Y167Q+R170Q；Y167S+R170Q；Y167T+R170Q；Y167V+R170Q；Y167A+R170S；
Y167C+R170S；Y167F+R170S；Y167G+R170S；Y167H+R170S；Y167I+R170S；
Y167L+R170S；Y167M+R170S；Y167N+R170S；Y167P+R170S；Y167Q+R170S；
Y167S+R170S；Y167T+R170S；Y167V+R170S；Y167A+R170T；Y167C+R170T；
Y167F+R170T；Y167G+R170T；Y167H+R170T；Y167I+R170T；Y167L+R170T；
Y167M+R170T；Y167N+R170T；Y167P+R170T；Y167Q+R170T；Y167S+R170T；
Y167T+R170T；Y167V+R170T；Y167A+R170V；Y167C+R170V；Y167F+R170V；
Y167G+R170V；Y167H+R170V；Y167I+R170V；Y167L+R170V；Y167M+R170V；
Y167N+R170V；Y167P+R170V；Y167Q+R170V：Y167S+R170V；Y167T+R170V；
Y167V+R170V；Y167A+R170Y；Y167C+R170Y；Y167F+R170Y；Y167G+R170Y；
Y167H+R170Y；Y167I+R170Y；Y167L+R170Y；Y167M+R170Y；Y167N+R170Y；
Y167P+R170Y；Y167Q+R170Y；Y167S+R170Y；Y167T+R170Y；Y167V+R170Y；
含んで成る変異体の群から選択される請求項１〜12のいづれか１項記載の変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤組成物を配合することにおいて、及び高められた自己タンパク質分解安定性を示すことにおいて有用な新規変異体プロテアーゼ酵素又は酵素変異体；前記酵素を含む洗浄及び洗剤組成物；適切な宿主細胞又は生物中に挿入される場合、前記酵素の発現をコードする突然変異誘発された遺伝子；及びそれにより形質転換され、そして前記酵素変異体を発現することができる宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
洗剤産業においては、酵素は、30年以上もの間、洗浄配合物に付与されて来た。そのような配合物に使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、及び他の酵素、又はそれらの混合物を包含する。商業的に最とも重要な酵素は、プロテアーゼである。
【０００３】
プロテアーゼは、30年以上もの間、洗剤産業において使用されて来たが、それらの酵素が、たとえば洗剤組成物に存在する基質及び／又は他の物質といかにして相互作用するかについての詳細はほとんど未知のままである。プロテアーゼの特定の残基に関係し、そしてプロテアーゼの一定の性質、たとえば酸化及び熱安定性に影響を与えるいくつかの因子が解明されて来たが、しかし見出されるべき多くの因子が残存する。また、物理的又は化学的特徴が、特定の洗剤組成物におけるプロテアーゼの良好な洗浄性能又は安定性を担当するかは、まだ正確には知られていない。
【０００４】
現在使用されているプロテアーゼは、多くの場合、天然からプロテアーゼを単離し、そして洗剤配合物においてそれらを試験することによって見出されて来た。
現在、少なくとも次のプロテアーゼが商業的に利用できることが知られており、そしてそれらの多くは、世界の多くの国々において多量に市販されている：
ズブチリシンBPN'又はNovo（たとえばSIGMA, St. Louis, USA から入手できる）、及びズブチリシン Carlsberg, ALCALASEＲ（NOVO RORDISK A/S) 及びMAXATASEＲ（Genencor) ;
バシラス  レンタス（Bacillus lentus)ズブチリシン、すなわちSAVINASEＲとしてNOVO NORDISK A/Sにより市販されるズブチリシン309 ; この酵素のタンパク質操作された変異体は DURAZYMＲとして市販される；
【０００５】
SAVINASEＲに密接に類似する酵素、たとえばズブチリシンPB92，Genencor Inc. により市販される MAXACALＲ（この酵素のタンパク質操作された変異体は MAXAPEMＲとして市販される）、SOLVAY etCie により市販される OPTICLEANＲ、及びGENENCOR Internationalにより市販されるPURAFECTＲ；
バシラス  レンタス  ズブチリシン、すなわちESPERASEＲとしてNOVO NORDISK A/Sにより市販されるズブチリシン147 ;
多くの商業的に使用されるプロテアーゼ、たとえば天然に存在するプロテアーゼのタンパク質操作された変異体、たとえば DURAZYMＲ（Novo Nordisk A/S）、RELASEＲ（Novo Nordisk A/S）、 MAXAPEMＲ（Gist-Brocades N.V.) 、PURAFECTＲ（Genencor International, Inc.) 。
【発明の開示】
【０００６】
従って、本発明の目的は、特に洗剤産業への使用のための改良されたタンパク質操作されたプロテアーゼ変異体を供給することである。
プロテアーゼ
タンパク質基質におけるアミド架橋を切断する酵素は、プロテアーゼ又は（交換可能的には）ペプチダーゼとして分類される（Walsh, 1979, Enzymotic Reactson Mechanisms. W.H. Freeman and Comyany, San Francisco, Chapter 3を参照のこと）。バシラス属の種の細菌は、２種の細胞外タイプのプロテアーゼ、すなわち中性プロテアーゼ（又はメタロプロテアーゼ）、及びアルカリプロテアーゼを分泌し、それらの中で、最とも重要なものは、セリン・エンドペプチダーゼであり、そして通常、ズブチリシンとしても言及される。
【０００７】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そして活性部位で必須セリン残基が存在する酵素である（White, Handler and Smith, 1973“Principles of Biochemistry”，Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, PP. 271-272) 。
細菌セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ドルトンの分子量を有する。それらは、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純な末端エステルを加水分解し、そして真核キモトリプシン、又はセリンプロテアーゼに対し、活性において類似している。サブグループを包含するより狭い用語、アルカリプロテアーゼは、 pH9.0〜11.0のいくつかのセリンプロテアーゼの高いpH最適性を反映している（総説として、Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 : 711-753 を参照のこと）。
【０００８】
ズブチラーゼ
セリンプロテアーゼのサブグループ、すなわち仮りに命名されたズブチラーゼは、Siezenなど., Protein Engng. 4 (1991) 719-737により提案されている。それらは、ズブチリシン様プロテアーゼとして前に言及されたセリンプロテアーゼの40個以上のアミノ酸配列の相同性分析により定義される。ズブチリシンは、グラム−陽性細菌又は真菌類により生成されるセリンプロテアーゼとしてこれまで定義されており、そしてSiezenなどによれば、現在、ズブチラーゼのサブグループである。広範囲の種類のズブチラーゼが同定されており、そして多くのズブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。
【０００９】
それらは、バシラス株からの次のような６個以上のズブチリシンを包含する：ズブチリシン168 、ズブチリシンBPN'、ズブチリシンCarlsberg 、ズブチリシンＹ、ズブチリシン  アミロサッカリチカス、及びメセンテリコペプチダーゼ（Kuriharaなど. (1972) J. Biol. Chem. 247 : 5629-5631 ; Wells など. (1983) Nucleic Acids Res. 11 : 7911-7925 ; Stahl and Ferrari (1984) J. Bucteriol. 159 : 811-819, Jacobs など. (1985) Nucl. Acid Res. 13 : 8913-8926 ; Nedkovなど. (1985) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 :421-430 ; Svendsenなど. (1986) FEBS Lett. 196 : 228-232)、アクチノミセタレス(Actinomycetales) からの１つのズブチリシン、サーモアクチノミセス・バルガリス（Thermoactionomyces vulgaris)からのサーミターゼ（Melounなど. (1985) FEBS Lett. 198 : 195-200)、及び１つの真菌類ズブチリシン、すなわちトリチラキウム・アルブム（Tritirachium album) からのプロテアーゼＫ（Jony and Mayer (1985) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 : 584-492) ; さらなる参照のためには、Siezenなど. からの表Ｉが下記に再現されている。
【００１０】
ズブチリシンは、物理的及び化学的に十分に特徴づけられている。それらの酵素の一次構造（アミノ酸配列）の知識の他に、基質の結合、遷移状態、生成物、少なくとも３種の異なったプロテアーゼインヒビターを明確にし、そして自然の変動に関する構造関係を定義する、ズブチリシンの50以上の高い分解Ｘ−線構造が決定されている（Kraut (1977) Ann. Rev. Biochem. 46 : 331-358) 。
ズブチラーゼの１つのサブグループ、I-S1は、“従来の”ズブチリシン、たとえばズブチリシン168 、ズブチリシンBPN'、ズブチリシン Carlsberg (ALCALASEＲ，NOVO NORDISK A/S) 、及びズブチリシンDYを包含する。
【００１１】
ズブチラーゼＩ-S2の追加のサブグループは、Siezenなど.(前記）により認識されている。サブグループＩ-S2プロテアーゼは、より高いアルカリズブチリシンとして記載されており、そして酵素、たとえばズブチリシン PB92 (MAXACALＲ，Gist-Brocades NV)、ズブチリシン 309 (SAVINASEＲ，NOVO NORDISK A/S）、ズブチリシン 147 (ESPERASEＲ，NOVO NORDISK A/S）、及びアルカリエラスターゼYaB を包含する。
ズブチラーゼ遺伝子のランダム及び部位特定突然変異誘発は、酵素の物理的及び化学的性質の知識から発生し、そしてズブチラーゼの触媒活性、基質特異性、三次構造、等に関する情報に寄与して来た（Wells など. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 1219-1223 ; Wells など. (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 317 : 415-423 ; Hwang and Warshel (1987) Biochem. 26 : 2669-2673 ; Rao など., (1987) Nature 328 : 551-554) 。
【００１２】
この分解を包含するより最近の出版物は、基質における特定の標的配列を切断する（位置24及び64）変異体の企画を言及する、Carterなど. (1989) Proteins 6 : 240-248 ; 多くの前に公開された結果を議論する、Graycar など. (1992) Annals of the New York Academy of Sciences 672 : 71-79 ; 及び前の結果をまた再考する、Takagi (1993) Int. J. Biochem. 25 : 307-312 である。
特に、ズブチリシン遺伝子の部位特定突然変異誘発がより注意を引きつけ、そして種々の突然変異が下記の特許出願及び特許記載されている。
【００１３】
すでに特徴づけられたプロテアーゼ変異体
多くの参考資料がプロテアーゼ変異体の構成を記載する。全体の従来技術状態の概観の獲得をより容易にするために、それらの参考資料が２種のセクションに整理される。
セクション１は、本発明に開示される変異体に関連されるとは現在思われないプロテアーゼ変異体の技術的背景及び同定を記載する参考資料を扱う。それらの参考資料は主に、異なった目的のためのプロテアーゼ変異体の構成における当業界の状態を要約するために包含される。
セクション２は、本発明の変異体にいくらか関連していると思われるプロテアーゼ変異体の同定を記載する参考資料を扱う。
【００１４】
技術的状態を要約する参考資料（セクション１）：
“カルボニル  ヒドロラーゼ”における部位特異的又はランダムに生成された突然変異、及び種々の性質、たとえばKcat／Ka比、pH−活性プロフィール、及び酸化安定性についての突然変異誘発された酵素の続くスクリーニングに関するヨーロッパ特許第130756号 (GENENTECH)（アメリカ再発行特許第34,606号（GENENCOR) に対応する）。この出版物は、変更された性質を示す酵素を供給するために、一定の特定された位置、すなわち-1 Tyr,  32 Asp, 155 Asn, 104 Tyr, 222 Met, 166 Gly, 64 His, 169 Gly, 189 Phe, 33 Ser, 221 Ser, 217 Tyr, 156 Glu又は152 PlaにおけるズブチリシンBPN'の部位特異的突然変異を開示する。位置−１を除くすべてのそれらの位置は、前記出願の出願の前、酵素の機能に関連されていることが知られているので、この出願は、特定の所望する性質を有する酵素を得るために突然変異を導入する位置を決定する問題を解決することに寄与しない。
ズブチリシンCarlsberg 及びその２つの変異体のクローニング及び発現に関するヨーロッパ特許第214435号（HENKEL) 。この出願においては、158 Aspの158 Serへの及び161 Serの161 Aspへの突然変異のための理由が提供されていない。
【００１５】
WO87/04461 (AMGEN)において、改良されたpH及び熱安定性を示す突然変異誘発された酵素を得るために親酵素に存在するAsn-Gly 配列の数を減じることが提案されており、この出願においては、ズブチリシンBPN'における109 Asp及び218 Asn残基の除去、突然変異誘発又は修飾が強調されている。実施例には、いづれの欠失又は Gly−残基の修飾も提供されていない。
WO87/05050号(GENEX) は、ランダム突然変異、及び改良された性質についてズブチリシンBPN'の多くの変異体の続くスクリーニングを開示する。この出願においては、突然変異は、位置218 Asn, 131 Gly, 254 Thr, 166 Gly, 116 Ala, 188 Ser, 126 Leu、及び53 Ser に記載されている。
【００１６】
ヨーロッパ特許第260105号（GENENCOR) は、触媒トリアド(triad) を含む酵素のある性質を、前記触媒トリアドから約15Å内のアミノ酸残基を選択し、そしてその選択されたアミノ酸残基を他の残基により置換することによって修飾することを記載する。この明細書に記載されるズブチラーゼタイプの酵素は、触媒三元体を含む酵素の種類に属するものとして特別に言及されている。ズブチリシンにおいては、位置222 及び217 が置換のための好ましい位置として示されている。
また、ズブチリシンBPN'における99 Asp の99 Ser への変換が酵素のpH依存性を変更することが、Thomas, Russell, and Fersht (1985) Nature 318 : 375-376 により示されている。
続く文献（1987) J. Mol. Biol. 193 : 803-813 においては、同じ著者がまた、156 Glnに代わる156 Serの置換も論じている。
【００１７】
それらの両突然変異は、活性64 His から約15Åの距離内に存在する。
Nature 328 : 496-500 (1987) において、Russel and Fersht は、それらの実験の結果、及び表面の電荷の変化を得るために酵素を突然変異誘発することによってpH−活性プロフィールを変更するための規則を論じている。
WO88/08028 (Genex)及びWO88/08033 (Amgen)の両者は、ズブチリシンBPN'のカルシウム結合部位におけるアミノ酸残基の修飾に関する。前記酵素は、より陰性に荷電された残基を元の残基と置換することによって安定化されると言われる。
【００１８】
WO95/27049 (SOLVAY S.A.)は、次の突然変異を有するズブチリシン 390タイプ  プロテアーゼを記載する：N43R＋N116R ＋N117R (BPN' 番号付け）。データは、その対応する変異体が、野生型に比較して、改良された安定性を有することを示す。
WO95/30011, WO95/30010及びWO95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY) は、表面結合されたよごれへの酵素の吸着を変える（すなわち、低める）よう企画される、ズブチリシンBPN'及びズブチリシン309 の両者における６個の領域、特に位置 199−200 (BPN' 番号付け）を記載する。基質への酵素による、低められた吸着はより良好な洗剤洗浄性剤をもたらすことが提案されている。いづれの変異体に対するデータ又は特定の洗剤洗浄性能のデータも提供されていない。
【００１９】
本発明に関連するこれまでに特徴づけられたプロテアーゼ変異体（セクション２）：
ヨーロッパ特許第251446号（GENENCOR) において、それは、一次及び三次構造レベルでの相同体考慮が、保存されているか又は否かにかかわらず、同等のアミノ酸残基を同定するためにいかにして適用され得るかを記載する。ズブチリシンBPN'の三次構造の発明者の知識と共にこの情報が、変更された性質を有する変異体の獲得の期待を供って、突然変異に対して敏感な多くの位置の選択を発明者に導びくことが主張されている。そのような同定される位置は次のものである：124 Met, 222 Met, 104 Tyr, 152 Aln, 156 Glu, 166 Gly, 169 Gly, 189 Phe, 217 Tyrさらに、155 Asn, 21 Tyr, 22 Thr, 24 Ser, 32 Asp, 33 Ser, 36 Asp, 46 Gly, 48 Ala, 49 Ser, 50 Met, 77 Asn, 87 Ser, 94 Lys,  ９５Val, 96 Leu, 107 Ile, 110 Gly, 170 Lys, 171 Tyr, 172 Pro, 197 Asp, 199 Met, 204 Ser, 213 Lys 及び221 Serの位置が、酵素の種々の性質に影響を及ぼすことが予測されるものとして同定されている。
【００２０】
また、多くの突然変異がそれらの提案を支持するために例示されている。それらの位置における単一の突然変異の他に、発明者はまた、多くの複数突然変異を実施した。さらに、発明者は、215 Gly, 67 His, 126 Leu, 135 Leu 、及び興味あるものとして、セグメント97−103, 126−129, 213−215 及び 152−172 内のアミノ酸残基を同定しているが、しかしそれらの位置のいづれかにおける突然変異は例示されていない。
【００２１】
本発明の目的のために特に興味あるものとして、ヨーロッパ特許第251446号の発明者は、170 Lys（ズブチリシンBPN'における、タイプＩ-S1）を置換することを示唆しており、特に彼らは、Glu 又はArg を元のLys に導入することを提案している。Glu 変異体が生成されたことは明らかであり、そして自己分解性分解に対してひじょうに敏感であることが見出された（ページ48, 121, 123（表ＸＸＩは明白な誤りを包含するが、しかし86分から13分への自己分解半減期の低下を示す）及び図32を参照のこと）WO89/06279 (NOVO NORDISK A/S）においては、位置170 が興味あるものとして示されており、そして存在する残基をTyr により置換することが提案されている。
【００２２】
しかしながら、そのような変異体に関するデータは与えられていない。WO91/00345 (NOVO NORDISK A/S）においては、同じ提案が存在し、そしてズブチリシン309(タイプＩ−Ｓ２）における位置170 のTyr 変異体が約８のpHで、洗剤における改良された洗浄性能を示すことが見出されている（表III ，IV，Ｖ，VI，VIII，Ｘにおける変異体S003) 。他の位置における他の置換と組合せての同じ置換がまた、前記出願の遺伝子概念に従って、改良された洗浄性能を示す（同じ表及び表VII におけるS004, S011−S014, S022−S024，S019, S020, S203, S225, S227) 。
【００２３】
ヨーロッパ特許第525610A1号（SOLVAY) においては、その一定の表面領域における疎水性を低めることによって、イオン性テンジド(tenside) に対しての酵素（ズブチリシンPB92に密接に関連するタイプＩ-S2ズブチラーゼ）の安定性を改良することが提案されている。位置164 (BPN' 番号付けを用いる場合、170)におけるArg をGln と置換することが提案されている。この置換を包含する変異体はこの出願には開示されていない。
【００２４】
WO94/02618 (GIST-BROCADES N.V.) においては、Ｉ-S2タイプのズブチリシンPB92の多くの位置164 (BPN' 番号付けを用いる場合、170)変異体が記載されている。元のArg をMet, Val, Tyr 及びIle により置換を示す例が提供されている。変異体の粉末洗剤における洗浄性能試験は、わずかな改良点を示す。特に、カカオに対するIle 変異体洗浄性能試験に関しては、約20〜30％の改良点が示される。安定性データは提供されていない。
PCT/DK96/00207（まだ公開されていない）においては、改良された洗浄性能及び／又は貯蔵安定性を有する多くのプロテアーゼ変異体が記載されている。
【００２５】
改良された洗浄性能を有するズブチラーゼ変異体が、元の残基よりもより疎水性のアミノ酸残基により親ズブチラーゼの疎水性ドメインに位置するか又は隣接する１又は複数のアミノ酸残基を置換することによって得られることが見出され、ここで前記疎水性ドメインはBLS309の残基I165, Y167, Y171 (BASBPN番号付け）に対応する残基を含んで成り、そして前記隣接する残基はBLS309の残基E136,G159, S164, R170, A194及びG195（BASBPN番号付けによる）に対応する残基を含んで成る（PCT/DK96/00207) 。
アメリカ特許第 5,543,302号は、異なる野生型プロテアーゼ（MILEZYMEＲ，SAVINASEＲ及びESPERASEＲにおける重要な自己タンパク質加水分解切断部位の同定を記載する。
【００２６】
本発明は、本発明者の係属中の特許出願PCT/DK96/00207に記載されるグループのプロテアーゼ変異体における自己タンパク質加水分解切断部位の位置に影響を及ぼす特定のプロテアーゼ変異体に集中している。本発明の変異体は、アメリカ特許第 5,543,302号における対応する野生型プロテアーゼについて記載される自己タンパク質加水分解パターンに比較して、変更された自己タンパク質加水分解パターンを示すことが見出された。
【００２７】
発明の要約
BLS309の残基P129, P131, E136, G159, S164, I165, Y167, R170, Y171 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体が、その対応する野生型に比較して、変更された自己タンパク質加水分解パターンを有することが、今や驚くべきことには、見出された。その主要変更は、残基 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）間に位置するらしい自己分解性切断部位である。
SAVINASEＲは、広い基質特異性を有することが知られており、そして強力なインキュベーションに基づいて、多くの部位で、それ自体、自己切断するであろう。しかしながら、初期の１〜５の切断部位（一次部位）は、ズブチラーゼプロテアーゼの産業的用途のために最高に適切なものである。
【００２８】
残基 132−133 間に位置する前記自己分解性切断部位は、新規の一次自己タンパク質加水分解切断部位であると現在、思われる。これは、現在、この自己タンパク質加水分解切断部位がズブチラーゼプロテアーゼ酵素において、一次自己タンパク質加水分解切断部位として同定されている最初であると思われる。さらなる詳細に関しては、本明細書における実施例（下記参照のこと）に言及される。
【００２９】
従って、第１の観点において、本発明は、残基132 と133 (BASBPN 番号付けによる）との間に自己タンパク質加水分解切断部位を有する前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることによって特徴づけられ、そしてBLS309の残基129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する残基での又は１又は複数の残基における置換、挿入又は欠失によりさらに修飾されているズブチラーゼ酵素変異体に関し；それにより前記変異体は前記前駆体ズブチラーゼ酵素に対して高められた自己タンパク質加水分解安定性を示す。
【００３０】
第２の観点において、本発明は、BLS309の残基G159, S164, I165, Y167, R170, Y171 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基における修飾を有する前駆体ズブチラーゼ酵素変異体から誘導されることにより特徴づけられ；そしてさらに、残基129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する残基での又は１又は複数の残基における置換、挿入又は欠失により修飾されているズブチラーゼ酵素変異体に関し；それにより、前記変異体は前記位置 129〜136 のいづれかで修飾されていない前記前駆体ズブチラーゼ変異体に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示す。
【００３１】
アメリカ特許第 5,543,302号は、SAVINASEＲが、残基 192〜193間に位置する自己タンパク質加水分解切断部位を有することを教示し、そして高められた自己タンパク質加水分解安定性を有する変異体を得るためにこの部位の囲りの広い領域（残基 180〜210 間）において修飾を行なうことを提案している。
本発明者は、BLS309の残基P129, P131, E136, G159, S164, I165, Y167, R170, Y171 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基において修飾を有するSAVINASEＲ変異体及びSAVINASEＲの両者において、残基 192〜193 (BASBPN 番号付けによる）間にこの自己タンパク質加水分解部位を確かめた。本発明者は、残基 192〜193 (BASBPN 番号付けによる）間の自己タンパク質加水分解部位付近に特定の修飾（突然変異）、たとえばS190P 及びG193A (BASBPN 番号付けによる）を示唆する。
【００３２】
そのような特定の突然変異はアメリカ特許第 5,543,302号において論じられても又は示唆されてもおらず、ここでは、かなり広い領域（残基 180〜210 間）が単に記載されており、そして高められた自己タンパク質加水分解安定性をもたらす特異的突然変異はアメリカ特許第 5,543,302号には開示されていない。
さらなる詳細に関しては、本明細書における実施例（下記参照のこと）に言及されている。
【００３３】
従って、第３の観点においては、本発明は、残基192 と192 (BASBPN 番号付けによる）との間に自己タンパク質加水分解切断部位を有する前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることにより特徴づけられ、そしてさらに、残基189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する残基での又は１又は複数の残基における置換、挿入又は欠失により修飾されているズブチラーゼ酵素変異体に関し；それにより、前記変異体は前記前駆体ズブチラーゼ酵素に対して高められた自己タンパク質加水分解安定性を示す。
【００３４】
第４の観点において、本発明は、BLS309の残基P129, P131, E136, G159, S164, I165, Y167, R170, Y171 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基において修飾を有する前駆体ズブチラーゼ酵素変異体から誘導されることによって特徴づけられ、そしてさらに、BLS309の残基189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 (BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する残基での又は１又は複数の残基における置換、挿入又は欠失により修飾されているズブチラーゼ酵素変異体に関し；それにより、前記変異体は、前記位置 189〜196 のいづれかで修飾されていない前駆体ズブチラーゼ変異体に対して高められた自己タンパク質加水分解安定性を示す。
【００３５】
さらなる観点において、本発明は、縮主細胞中に適切な態様で挿入され、続いて第１の観点のズブチリシン酵素を発現するようにされる、本発明の酵素を発現することができるDNA 構造体に関する。
さらなる観点において、本発明は、第２の観点のDNA 構造体を適切な宿主中に挿入し、所望のズブチラーゼ酵素を発現するよう前記宿主を培養し、そして前記酵素生成物を回収することによって、本発明のズブチリシン酵素を製造することに関する。
本発明は、上記に示されるように、ズブチラーゼサブグループＩ-S2酵素及びその対応する酵素変異体を発現する遺伝子の変異体に一部関するが、但しそれらだけには制限されない。
【００３６】
本発明により包含される他のズブチラーゼ遺伝子変異体は、たとえばズブチラーゼ  サブグループＩ−Ｓ１、たとえばズブチリシンBPN'の変異体、及びズブチリシンCarlsberg 遺伝子及び続く変異体ズブチリシンBPN'、プロテアーゼＫ及びズブチリシンCarlsberg 酵素（濃液体洗剤において改良された安定性を示す）である。
本発明により包含されるさらに追加のズブチラーゼ遺伝子変異体は、たとえばプロテアーゼＫ及び他の遺伝子及び続く変異体プロテアーゼＫ、及び他のズブチラーゼ酵素（濃液体洗剤において改良された安定性を示す）である。
本発明に従って修飾され得る親ズブチラーゼ酵素の他の例は、表Ｉに列挙される。
さらに、本発明は、洗浄組成物への変異体酵素の使用、変異体酵素を含んで成る洗浄組成物、特に変異体ズブチリシン酵素を含んで成る洗剤組成物に関する。
本発明によれば、そのような洗剤組成物はさらに、１又は複数の他の酵素、たとえばリパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、等を含むことができる。
【００３７】
略  語
アミノ酸
Ａ    ＝    Ala     ＝    アラニン
Ｖ    ＝    Val     ＝    バリン
Ｌ    ＝    Leu     ＝    ロイシン
Ｉ    ＝    Ile     ＝    イソロイシン
Ｐ    ＝    Pro     ＝    プロリン
Ｆ    ＝    Phe     ＝    フェニルアラニン
Ｗ    ＝    Trp     ＝    トリプトファン
Ｍ    ＝    Met     ＝    メチオニン
Ｇ    ＝    Gly     ＝    グリシン
Ｓ    ＝    Ser     ＝    セリン
Ｔ    ＝    Thr     ＝    トレオニン
Ｃ    ＝    Cys     ＝    システイン
Ｙ    ＝    Tyr     ＝    チロシン
Ｎ    ＝    Asn     ＝    アスパラギン
Ｑ    ＝    Gln     ＝    グルタミン
Ｄ    ＝    Asp     ＝    アスパラギン酸
Ｅ    ＝    Glu     ＝    グルタミン酸
Ｋ    ＝    Lys     ＝    リジン
Ｒ    ＝    Arg     ＝    アルギニン
Ｈ    ＝    His     ＝    ヒスチジン
Ｘ    ＝    Xaa     ＝    いづれかのアミノ酸
【００３８】
核酸塩基
Ａ    ＝    アデニン
Ｇ    ＝    グアニン
Ｃ    ＝    シトシン
Ｔ    ＝    チミン（DNA においてのみ）
Ｕ    ＝    ウラシル（RNA においてのみ）
【００３９】
変異体
本発明に従って製造され、又は設計される種々の酵素変異体を説明する場合、次の命名法が参照の容易さのために適応されて来た：
元のアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸。
これによれば、位置195 におけるグルタミン酸によるグリシンの置換は次のように示されて：
Gly1 95 Glu 又はG195E ;
同じ位置でのグリシンの欠失は次の通りであり：
Gly195＊  又はG195＊  ; そして
追加のアミノ酸残基、たとえばリジンの挿入は次の通りである：
Gly195GlyLys又はG195GK。
【００４０】
番号付けのために使用される配列との比較における欠失が示される場合、位置36におけるアスパラギン酸の挿入に関して、そのような位置における挿入は次のように示される：
* 36 Asp  又は  * 36 D。
複数の突然変異は、次のように＋により分離され：
Arg170Tyr ＋Gly195Glu 又はR170Y ＋G195E 、
ここでそれらは、それぞれアルギニン及びグリシンをチロシン及びグルタミン酸により置換する、位置170 及び195 における突然変異を示す。
【００４１】
位置
本出願及び付随する請求の範囲において変異体を説明する場合、Siezenなど.,前記におけるように種々のズブチラーゼの整列（alignment)が使用される。ズブチラーゼに関連する他の出版物においては、特定酵素の他の整列（alignment)又は番号付けが使用されて来た。本明細書に使用される番号付けにより特定残基の位置を確立することは、当業者にとって日常のことである。多数のズブチラーゼと共に本発明の対応する残基の整列（alignment)を示す図１を参照のこと。多くのズブチラーゼと共に本発明の対応する残基の整列（alignment)を示すWO91/00345の表Ｉも参照のこと。
【００４２】
表Ｉ
現在確立されたズブチラーゼ（Siezenなど.,前記から）
生  物 cDNA 酵  素 頭字語
原核生物
細菌：グラム−陽性
バシラス・サブチリス              aprA  ズブチリシンＩ168, apr    ABSS168
（Bacillus subtilis) 168
Ｂ．アミロリケファシエンス        apr   ズブチリシンBPN'(NOVO)    BASBPN
（B. amyloliquefaciens)
Ｂ．サブチリス                    −    ズブチリシンDY            BSSDY
（B. subtilis) DY
Ｂ．リケニホルミス                ＋    ズブチリシンCarlsberg     BLSCAR
（B. licheniformis)
Ｂ．レンタス                      ＋    ズブチリシン147           BLS147
（B. lentus)
Ｂ．アムカロフィラス              ＋    ズブチリシンPB92          BAPB92
（B. alcalophilus) PB92
【００４３】
B. sp. DSM4828                    −    アルカリプロテアーゼ      BDSM48
B. YaB                            ale   アルカリエラスターゼYaB   BYSYAB
Ｂ．サブチリス 168                epr   最少細胞外プロテアーゼ    BSEPR
Ｂ．サブチリス                    bpf   バシロペプチダーゼＦ      BSBPF
Ｂ．サブチリス IFO3013            ispl  細胞内セリンプロテアーゼ１  BSISP1
Ｂ．サブチリス A50                −    細胞内セリンプロテアーゼ  BSIA50
Ｂ．サリンギエンシス              −    細胞外セリンプロテアーゼ  BTFINI
（B. thuringiensis)
バシラス・セレウス                −    細胞外セリンプロテアーゼ  BCESPR
（Bacillus cereus)
ノカルジオプシス・ダソンビレイ    −    アルカリセリンプロテアーゼ  NDAPII
（Nocardiopsis dassonvillei)
【００４４】
サーモアクチノミセス・バルガリス  −    サーミターゼ              TVTHER
（Thenmoactinomyces vulgaris)
エンテロコカス  ファエカリス      cylA  細胞溶解素成分Ａ          EFCYLA
（Enterococcus faecalis)
スタフィロコーカスエピターミジス  epiP  エピデルミンリーダー      SEEPIP
（Staphylococcus epidermidis)           プロテアーゼ
ストレプトコーカス  ピロケネス    scpA  C5a ペプチダーゼ          SPSCPA
（Streptococcus pyrogenes)
ラクトコーカス  ラクチス          prtP  SKII細胞壁プロテアーゼ    LLSKII
（Lactococcus lactis) SKII
【００４５】
細菌：グラム−陰性
ディケロバクター  ノドサス        ＋    塩基性プロテアーゼ        DNEBPR
（Dichelobacter nodosus)
キサントモナス  カムペストリス    ＋    細胞外プロテアーゼ        XCEXPR
（Xanthomonas campestris)
セラチア  マルセスセンス          ＋    細胞外セリンプロテアーゼ  SMEXSP
（Serratia marcescans)
サーマス  アクアチカス            pstI  アクアリシンＩ            TAAQUA
（Thermus aquaticas) YT-1
サーマス rT41A                    ＋    T41Aプロテアーゼ          TRT41A
ビブリオ  アルギノリチカス        proA  プロテアーゼＡ            VAPROA
（Vibrio alginolyticus)
ストラプトミセスルトゲルセンシス  −    プロテイナーゼＤ          SRESPD
（Straptomyces rutgersensis)
【００４６】
古細菌
好塩株172P1                       −    好塩細胞外プロテアーゼ    ARB172
シアノバクテリア
アナバエナ  バリアビリス          prcA  Ca−依存性プロテアーゼ    AVPRCA
（Anabaena variabilis)
【００４７】
下等真核生物
真菌類
トリチラキウムアルブム・リムバー  ＋    プロテイナーゼＫ          TAPROK
（Tritirachium album Limber)
Ｔ．アルブム                      ＋    プロテイナーゼＲ          TAPROR
Ｔ．アルブム                      proT  プロテイナーゼＴ          TAPROR
アスペルギラス・オリザエ          ＋    アルカリプロテアーゼ      AOALPR
（Aspergillus oryzae)
マルブランキア・プルケラ          −    サーモミコリン            MPTHMY
（Malbranchea Pulchella)
アクレモニウム・クリソゲウム      alp   アルカリプロテアーゼ      ACALPR
（Acremonium Chrysogenum)
【００４８】
酵  母
クルイベロミセス・ラクチス        hex1  Kex1セリンプロテイナーゼ  KLKEX1
（Kluyveromyces lactis)
サッカロミセス・セレビシアエ      hex2  Kex2セリンプロテイナーゼ  SCKEX2
（Saccharomyces cerevisiae)
Ｓ．セレビシアエ                  prb1  プロテアーゼＢ            SCPRB1
ヤロウィア・リポリチカ            xpr2  アルカリ細胞外プロテアーゼ  LXPR2
（Yarrowia lipolytica)
【００４９】
高等真核生物
蠕  虫
カエノルハビジチス・エレガンス    bli4  クチクラプロテアーゼ      CEBLI4
（Caenorhabditis elegans)
昆  虫
ショウジョウバエ                  fur1  フリン１                  DMFUR1
ショウジョウバエ                  fur2  フリン２                  DMFUR2
植  物
キュカミス  メロ                  −    ククミシン                CMCUCU
（Cucumis melo) （メロン）
【００５０】
哺乳類
ヒト（又は、ラット、マウス）      fur   フリン                    HSFUR1
ヒト（又はマウス）                ＋    インシュリノーマPC2       HSIPC2
プロテアーゼ
マウス                            ＋    下垂体PC3 プロテアーゼ    MMPPC3
ヒト                              ＋    トリペプチジル            HSTPP
ペプチダーゼII
【００５１】
表Ｉのために使用される文献：
アミノ酸配列に関する文献(GenBankＲ／EMBL Data Bank受託番号が括弧で示される）：
ARB172  Kamekura and Seno, (1990) Biochem. Cell Biol. 68 : 352-359 (成熟プロテアーゼ残基１〜35のアミノ酸配列決定；残基14は決定されなかった）。
BSS168  Stahl. and Ferrari. (1984) J. Bacteriol. 158 : 411-418 (KO1988）。Yoshimoto, Oyamaなど. (I488) J. Biochem. 103 : 1060-1065 (Ｂ．サブチリス var. アミロサカリチカスからの成熟サブチリシンは、T130S 及びT162S を有することにおいて異なる）。Svendsen, など. (1986) FEBS Lett. 196 : 228-232 (PIR A23624 ; アミノ酸配列決定；Ｂ．メセンテリカスからの成熟アルカリメセンテリコペプチダーゼはS85A, A88S, S89A, S183A 及びN259S を有することにおいて異なる）。
【００５２】
BASBPN  Wells,など. (1983) Nucl. Acids Res. 11 7911-7925 (XOO165) 。Vasanthaなど., (1984) J. Bacteriol. 159 : 811-814 (KO2496)。
BSSDY   Nedkov et al. (1983) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364 : 1537-1540 (PIR AOO969 ; アミノ酸配列決定）。
BLSCAR  Jacobs et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13 8913-8926 (XO3341) 。Smith et al. (1968) J. Biol. Chem. 243 : 2184-2191 (PIRAOO968 : アミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼ配列は、T103S, P129A, S158N, N161S及びS212N を有することにおいて異なる）。
【００５３】
BLS147  Hastrup など. (1989) PCT Patent Appl. WO 8906279, Pub. July 13 1989, (EsperaseＲ from B. lentus)。Takamiなど. (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol., 33 : 519-523 （バシラスsp. no. AH-101からの成熟アルカリプロテアーゼ残基１〜20のアミノ酸配列決定；この配列はN15Sを有することにおいてBLS147とは異なる）。
BABP92  van der Laanなど. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 : 901-909 。(MaxacalＲ）。Hastrup など. (1989) PCT特許出願WO8906279, Pub. 13. Jaly 1989 。（Ｂ．レンタスからのズブチリシン309 、すなわちSavinaseＲは、N87Sを有することにおいてのみ異なる）。Godette など. (1991) Abstracts 5th Protein Society Symposium, June 6,Baltimore : abstract M8 （Ｂ．レンタスからの高アルカリプロテアーゼは、N87S, S99D, S101R, S103A, V104I 及びG159S を有することにおいて異なる）。
【００５４】
BPSM48  Rettenmsier など. (1990) PCT Patent Appl. wo 90/04022 。Publ. April 19, 1990。
BYSYAB  Kanakoなど. (1989) J. Bacteriol. 171 : 5232-5236 (M28537) 。
BSEPR   Sloma など. (1988) J. Bacteriol. 170 : 5557-5563 (M22407) 。Bruckner (1990) Mol. Gen. Genet. 221 : 486-490 (X53307) 。
BSBPF   Sloma など. (1990) J. Bacteriol. 172 : 1470-1477 (M29035；証正された）。Wuなど. (1990) J. Biol. Chem. 265 : 6845-6850 (JO5400 : この配列は、フレームシフトのために、A169V 及び586 以下のＣ−末端残基を有することにおいて異なる）。
BSISP1  Koide など. (1986) J. Bacteriol. 167 : 110-116 (M13760) 。
【００５５】
BSAIA50 Stronginなど. (1978) J. Bacteriol. 133 : 1401-1411（成熟プロテアーゼ残基１〜54のアミノ酸配列決定；残基３，39，40, 45, 46, 49及び50は決定されなかった）。
BTFIN1  Chestukhina など. (1985) Biokhimiya 50 : 1724-1730（Ｂ．スリンギエンシスの変種のイスラエリエンシスからの成熟プロテアーゼ残基１〜14、及び変種フィニチマスからの残基１〜16及び 223〜243 のアミノ酸配列決定）。Kunitakeなど. (1989) Agric. Biol. Chem. 53 : 3251-3256（変種クルスタキ。BTKUKSからの成熟プロテアーゼ残基６〜20のアミノ酸配列決定）。
BCESPR  Chestukhina など. (1985) Biokhimiya 50 : 1724-1730（成熟残基１〜16及び 223〜243 のアミノ酸配列決定）。
【００５６】
NDAPII  Tsujibo など. (1980) Agric. Biol. Clem. 54 : 2177-2179 (成熟残基１〜26のアミノ酸配列決定）。
TVTHER  Meloumなど. (1985) FEBS Lett. 183 : 195-200 (PIR AOO973 : 成熟プロテアーゼ残基１〜274 のアミノ酸配列決定）。
EFCYLA  Segarra など. (1991) Infect. Immun. 59 : 1239-1246。
SEEPIP  Schnell など. (1991) personal communication (Siezenなど.(前記））。
SPSCPA  Chenなど. (1990) J. Biol. Chem. 265 : 3161-3167 (JO5224)。
DNEBPR  Kortt など. (1991) Abstracts 5th Protein Society Symposium, June 22-26, Baltimore 。abstract 576。
【００５７】
LLSK11  Vos など. (1989) J. Biol. Chem. 264 : 13579-13585 (JO4962)。Kok など. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 231-238 (M24767 ; Wg2 株からの配列は44の位置、たとえばプロテアーゼドメインにおける18の差異及び残基1617〜1676の欠失において異なる）。Kiwakiなど. (1989) Mol. Microbiol., 3 : 359-369 (X14130 ; NCD0763 株からの配列は、46の位置、たとえばプロテアーゼドメインにおける22の差異及び残基1617〜1676の欠失において異なる）。
XCEXPR  Liu など. (1990) Mol. Gen. Genet. 220 : 433-440 。
SMEXSP  Yanagidaなど. (1986) J. Bacteriol. 166 : 937-994 (M13469) 。
TAAQUA  Teradaなど. (1990) J. Biol. Chem. 265 : 6576-6581 (JO54I4)。
TRAT41A McHaleなど. (1990) Abstracts 5th Eur. Congr. Biotechn. Christiansen, Munck and Villadsen (eds), Munksgaard Int. Publishers, Copenhagen。
【００５８】
VAPROA  Deane など. (1989) Gene 76 : 281-288 (M25499) 。
SRESPD  Lavrenova など. (1984) Biochemistry USSR. 49 : 447-454（残基１〜23のアミノ酸配列；残基13，18及び19は決定されなかった）。
AVPRCA  Makdenerなど. (1991) Mol. Gen. Genet. 225 : 113-120(公開された配列は、フレーフシフト読取り誤差のために位置 200〜210 近くで28個の未知の残基を有する）。
TAPROK  Gunkel and Gassen (1989) Eur. J. Biochem. 179 : 185-194 (XI4688/XI4689) 。Janyなど. (1986) J. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367 : 87 (PIR A24541 ; アミノ酸配列；成熟プロテアーゼはS745G, SILST204-280DSL及びVNLL264-267FNLを有することにおいて異なる）。
TAPROR  Samal など. (1990) Mol. Microbiol. 4 : 1789-1792 (X56116) 。
TAPROT  Samal など. (1989) Gene 85 : 329-333。
【００５９】
AOALPR  Tatsumi など. (1989) Mol. Gen. Genet. 219 : 33-38 。Cheevadhanarahなど. (1991) EMBL Data Library (X54726) 。
MPTHMY  Gaucher and Stevenson (1976) Nethods Enzymol. 45 : 4I5-433（残基１〜28、及び活性部位セリンを有するヘキサペプチドLSGTSMのアミノ酸配列決定）。
ACALPR  Isogaiなど. (1991) Agric. Biol. Chem. 55 : 47I-477。Stepanovなど. (1986) Int. J. Biochem. 18 : 369-375（残基１〜27のアミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼはH131]Q, R13[2]N及びS13[6]A を有することにおいて異なる）。
KLKEX1  Tanguy-Rougeau, Wesolowski-Louvel and Fukuhara (1988) FEBS lett. 234 : 464-470 (XO7038) 。
SCKEX2  Mizunoなど. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 156 : 246-254 (M24201)。
【００６０】
SCPRB1  Moehleなど. (1987) Mol. Cell. Biol. 7 : 4390-4399 (MI8097)。
YLXYPR2 Davidow など. (1987) J. Bacteriol. 169 : 4621-4629 (M17741) 。Matobaなど. (1988) Mol. Cell Biol. 8 : 4904-4916 (M23353) 。
CEBL14  Peters and Rose (1991) The Worm Breeder's Gazette 11 : 28 。
DMFUR1  Roebroekなど. (1991) FEBS Lett. 289 : 133-137 (X59384)。
DMFUR2  Roebroekなど. (1992) 267 : 17208-17215。
CMCUCU  Kanedaなど. (1984) J. Biochem. 95 : 825-829(活性部位セリンを有するオクタペプチドNIISGTSMのアミノ酸配列決定）。
HSFURI  van den Ouwelandなど. (1990) Nucl. Acids Res. 18 : 664 (XO4329) （マウスフリンの配列は、51の位置、たとえば触媒ドメインにおける５の位置、すなわちA15E, Y21F,F223F, A232V及びN258 [21D]において異なる。Misumiなど. (1990) Nucl. Acids Res. 18 : 6719 (X55660 ; ラットフリンの配列は、49の位置、たとえば触媒ドメインにおける３つの位置、すなわちA15E, Y21F, H24Rにおいて異なる）。
【００６１】
HSIPC2  Smoekens and Steiner (1990) J. Biol. Chem. 265 : 2997-3000 (JO5252) 。Seidahなど. (1990) DNA Cell Biol.9 : 415-424(マウス下垂体PC2 プロテアーゼの配列は、23の位置、たとえばプロテアーゼドメインにおける７つの位置、すなわち14F, 342[2]Y, E45D, N76S, D133E, V134L及びＧ２３９[1]D において異なる）。
MMPPC3  Swoekensなど. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 340-344 (M58507) 。Seidahなど. (1990) DNA Cell Biol. 9 : 415-424 (M55668/M55669；部分的配列）。
HSTPP   Tomkinson and Jonsson (1991) Biochemistry 30 : 168-174 (JO5299) 。
【００６２】
定義：
本発明を詳細に論じる前、次の用語がまず定義されるであろう。
“変更された自己分解安定性”
この用語“変更された自己分解安定性”又は“変更する自己分解安定性”とは、元のプロテアーゼの活性に比較して、自己分解安定性を高めること又は低めることを意味する。
【００６３】
“変更された自己タンパク質加水分解切断部位”
用語“変更された自己タンパク質加水分解切断部位”とは、元のプロテアーゼの部位に対しての変更された自己タンパク質加水分解切断部位を意見する。変更は、元のプロテアーゼにおける完全に新たな部位の形成又は前記プロテアーゼにおける部位の除去であり得る。用語“変更された自己タンパク質加水分解切断部位”はまた、切断パターンの変更の後、元のプロテアーゼにおける一次又は二次切断部位でない自己タンパク質加水分解部位が一次又は二次自己タンパク質加水分解部位になることが判明している変更を意味する。
【００６４】
“自己タンパク質加水分解切断部位”
用語“自己タンパク質加水分解切断部位”は、プロテアーゼの自己タンパク質加水分解が起こると思われるプロテアーゼの部位を示すために用いられる。この部位は、アミノ酸残基ＸとＹとの間に位置するよう定義され得る。
切断部位は、プロテアーゼの水溶液を調製し；自己分解により生成されるペプチドフラグメントの進行性切断を妨げるために前記プロテアーゼを急速に不活性化し；前記プロテアーゼの再活性化を妨げる条件下で前記ペプチドフラグメントを分離し；そして前記分離されたフラグメントのＮ−末端アミノ酸を同定することによって同定され得る。さらなる詳細のためには、本明細書における実施例（下記参照のこと）を参照のこと。
用語“自己タンパク質加水分解切断部位”は、他方では、“自己タンパク質加水分解分裂部位”とも呼ばれる。
【００６５】
“一次自己タンパク質加水分解切断部位”
用語“一次自己タンパク質加水分解切断部位”とは、プロテアーゼ自体が自己切断する初めの１〜５の初期切断部位を意味する。
【００６６】
“ズブチラーゼ変異体の修飾”
本明細書に記載されるようなズブチラーゼ変異体の修飾に関して使用される用語“修飾”とは、自己分解速度を遅くするための化学的修飾及び遺伝子操作を包含するよう定義される。前記修飾は、注目のアミノ酸における又はそのようなアミノ酸での置換、欠失及び／又は挿入による。
【００６７】
用語“修飾”が自己分解開裂部位近くで又はその付近における置換、欠失及び／又は挿入に関して使用される場合、それは自己分解の速度を遅くするための修飾を包含するよう定義される。修飾は、それらのアミノ酸の感受性（susceptive）ポリペプチド結合を含んで成るアミノ酸近くで又はその近くにおいて生じるべきである。用語“〜の近くにおいて”とは、感受性結合を形成するアミノ酸から３個上流又は下流の範囲内のアミノ酸を意味することが本明細書において定義される。
【００６８】
“ランダム突然変異誘発”
用語“ランダム突然変異誘発”とは、従来の態様で理解されること、すなわち親酵素のランダム位置での１又は複数の突然変異の導入、又は親酵素の選択された位置又は領域におけるランダムアミノ酸残基の導入を示すことを意味する。ランダム突然変異誘発は通常、親酵素と比較して、改良された性質を有する突然変異誘発された酵素の選択を可能にするスクリーニングにより達成される。ランダム突然変異を導入するための及び改良された性質をスクリーニングするための適切な技法は、本明細書においてさらに詳細に論じられる。
【００６９】
“洗浄性能”
たとえば洗浄の間、清浄されるべき目的物上に存在する種々の天然に存在する基質の分解を触媒する酵素の能力がしばしば、その洗浄能力、洗浄力又は洗浄性能として言及される。この明細書を通して、用語、洗浄性能とは、この性質を包含するために使用されるであろう。
“SAVINASEＲ”
SAVINASEＲは、NOVO NORDISK A/Sにより市販されている。それは、B. Lentus からのズブチリシン309 であり、そしてN87Sを有することにおいてのみ、BABP92と異なる。
【００７０】
“前駆体ズブチラーゼ”
用語“前駆体ズブチラーゼ”は、Siezenなど. (Protein Engineering 4 : 719-737 (1991））により定義されるズブチラーゼである。さらなる詳細のためには、本明細書に記載される“ズブチラーゼ”の項を参照のこと。前駆体ズブチラーゼはまた、天然源から単離され、これに続きズブチラーゼの特徴を保持しながら修飾されているズブチラーゼでもあり得る。
【００７１】
“基質”
プロテアーゼのための基質に関連して使用される用語“基質”とは、ズブチリシン  プロテアーゼによる加水分解を受けやすい少なくとも１つのペプチド結合を含む化合物を含んで成るものとして、その広範な形で解釈されるべきである。
“生成物”
プロテアーゼ酵素反応に由来する生成物に関して使用される用語“生成物”は、ズブチリシン  プロテアーゼを包含する加水分解反応の生成物を包含することが、本発明において解釈されるべきである。生成物は、続く加水分解反応において基質であり得る。
【００７２】
“ズブチラーゼ変異体”
本発明の情況において、用語ズブチラーゼ変異体又は突然変異誘発されたズブチラーゼとは、元の遺伝子又は親遺伝子を有しそして対応する親酵素を生産していた親微生物に由来する変異体遺伝子を発現する生物により生成されたズブチラーゼを意味し、ここで前記親遺伝子は、前記突然変異誘発されたズブチラーゼ  プロテアーゼが適切な宿主において発現される場合に使用される前記変異体遺伝子を生成するために突然変異誘発されている。
【００７３】
発明の特定の記載
変更された自己タンパク質加水分解パターンを有するズブチラーゼ変異体：
本発明によれば、残基 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）に、又はその近くに位置する一次自己タンパク質加水分解部位を有するいづれかの前駆体ズブチラーゼが、残基 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）間に位置する前記自己分解切断部位での又はその近く（残基 129〜136 間）での置換により修飾されることによって、高められた自己分解安定性を示すであろう。
【００７４】
本発明によれば、残基 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）間に位置するそのような一次自己分解切断部位を有する前駆体ズブチラーゼは、ズブチラーゼ変異体又は野生型ズブチラーゼであり得る。野生型ズブチラーゼは、上記切断部位を有する、表Ｉに示されるそれらのいづれかであり得る。ズブチラーゼ変異体は、表IIで論ぜられる変異体であり得るが、但しそれらだけには制限されない。表IIで論ぜられる変異体以外の他のズブチラーゼ変異体もまた、残基132 と133 (BASBPN 番号付けによる）との間に位置する一次自己分解開裂部位を有すると現在思われる。
【００７５】
本発明によれば、下記１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体（表IIを参照のこと）は、変更された自己タンパク質加水分解部位、好ましくは残基 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）に位置するか又はそれに隣接する変更された自己分解部位、好ましくは新たな一次自己タンパク質加水分解部位をもたらす。
本発明によれば、表IIに示されるアミノ酸残基のいづれかに１又は複数の修飾を有するズブチラーゼ変異体は、残基 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）間に位置する前記自己分解切断部位における又はその近く（残基 129〜136 間）における置換により修飾されることによって、高められた自己分解安定性を示すであろう。
【００７６】
表IIに示されるアミノ酸酸基のいづれかにおける１又は複数の修飾を有するズブチラーゼ変異体は、残基 192〜193 (BASBPN 番号付けによる）間に位置する自己分解切断部位における又はその近く（残基 190〜196 間）における置換により修飾されることによって、高められた自己分解安定性も示すであろうし、そして本発明によれば、相互利益が、 132〜133 及び 192〜193 間の両自己タンパク質加水分解部位のまわりの近くに修飾を組合すことによって得られる。
【００７７】
【表１】
2005160490.tif 000002
【００７８】
表IIは、図１に示される一列配列を用いて構成された。他のズブチラーゼをカバーする類似するか又はより大きな表は、当業者により容易に生成され得ることが明らかである。
さらに、表III は、残基 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）間に位置する言及された自己分解切断部位の近くに特定のアミノ酸を示す。他のズブチラーゼをカバーする類似するか又はより大きな表は、当業者により容易に生成され得ることが明らかである。
【００７９】
【表２】
2005160490.tif 000003
【００８０】
表III は、図１に示される一列配列を用いて構成された。残基 192〜193 間に位置する自己タンパク質加水分解部位の近くにおける残基を示す類似する表は、当業者により容易に作られ得る。
【００８１】
従って、本発明は、アミノ酸配列が、位置 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）間に位置する自己タンパク質加水分解部位の近く（すなわち位置129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136) の１又は複数のアミノ酸残基でさらに修飾されている、表IIに示される１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体；又は位置 192〜193 (BASBPN 番号付けによる）間に位置する自己タンパク質加水分解部位の近く（すなわち、位置190, 191, 192, 193,194, 195, 196)でさらに修飾されている、表IIに示される１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体；又はすぐ上で言及された２つの自己タンパク質加水分解部位の両者の近くでさらに修飾されている、表IIに示される１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体に関する。
【００８２】
本発明によれば、位置 132〜133 及び 192〜193 (BASBPN 番号付けによる）間に位置する自己タンパク質加水分解部位の両者、又は前記部位の個々の近くでの多くの特定の修飾が、ズブチラーゼの高められた自己タンパク質加水分解安定性を提供するであろう。
原則として、修飾は、得られる変異体の高められた自己タンパク質加水分解安定性をもたらす他の19個の可能なアミノ酸残基のいづれかによる、切断部位の近くに位置するアミノ酸残基の置換であり得る。修飾は、得られる変異体の高められた自己タンパク質加水分解安定性をもたらす切断部位の近くの20個の可能なアミノ酸残基の１又は複数のいづれかの残基の挿入であり得る。さらに、修飾は、得られる変異体の高められた自己タンパク質加水分解安定性をもたらす切断部位近くに位置するアミノ酸のいづれかの欠失であり得る。
【００８３】
高められた自己タンパク質加水分解安定性を生ぜしめる特定の修飾を同定するための方法は、前記部位の１方及び／又は前記部位の両者の近くの全領域における局在化されたランダム突然変異誘発（たとえば 129〜136 及び／又は 189〜196 間のすべての残基における局在化されたランダム突然変異誘発）、高められた安定性を生ぜしめる特定の修飾を同定するための続くスクリーニングアッセイを行なうことである。この方法の例示のためには、本明細書における実施例（下記参照のこと）を参照のこと。
高められた自己タンパク質加水分解安定性を生ぜしめる多くの特定の突然変異が本明細書に示される（下記セクション“Ｂ”及び“Ｃ”を参照のこと）。
たとえば表II又はIII を調べ、そして本発明の原理を適用することによって、高められた自己タンパク質加水分解安定性を有するズブチラーゼ変異体のための多くの候補体が明らかになる。
【００８４】
残基 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）間の自己タンパク質加水分解分裂部位を有する、BASBPN及びBLSCARの両前駆体ズブチラーゼ変異体のためには、高められた自己タンパク質加水分解安定性を有する変異体を製造するために、この自己タンパク質加水分解部位の近くの位置のいづれかで置換を行なうことが高く評価される。
本発明においては、ズブチラーゼは、Siezenなど.(前記）に従って定義される。本発明の多くの態様に適用できるより狭い態様においては、興味あるズブチラーゼは、サブグループＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２に属するものである。より特定の態様においては、本発明の多くの態様は、上記表Ｉに列挙されるズブチラーゼと、それらの一次構造において実質的に明確な相同性にされ得るグラム−陽性細菌のセリンプロテアーゼに関する。
【００８５】
本発明はまた、親酵素のアミノ酸配列に対するいづれか他の置換、欠失又は付加と組合して、上記位置におけるいづれか１又は複数の置換を含んで成る。特に、酵素に改良された性質を提供することが知られている他の置換との組合せが認識される。
そのような組合せは、位置：222(酸化安定性を改良する）、218(熱安定性を改良する）、酵素を安定化するCa−結合部位、たとえば位置76における置換、及び従来の技術から明らかな多くの他のものを含んで成る。
さらに、ヨーロッパ特許第405901号に言及される変異体との組合せがまた、特に企画される。
【００８６】
変異体
Ａ：位置 132〜133 (BASBPN 番号付けによる）間に変更された自己タンパク質加水分解切断部位を有する単一変異体
単一変異体は、下記に示される１又は複数の突然変異を含んで成る：
ズブチリシンBPN'、ズブチリシンCarlsberg 、ズブチリシン168、及びズブチリシンDY変異体：
A129V, A129I, A129L, A129M, A129F, G131V, G131I, G131L, G131M, G131F
K136V, K136I, K136L, K136M, K136F, S159V, S159I, S159L, S159M, S159F,
T164V, T164I, T164L, T164M, T164F, Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F
K170V, K170I, K170L, K170M, K170F, Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F
【００８７】
サーミターゼ変異体：
A129V, A129I, A129L, A129M, A129F, G131V, G131I, G131L, G131M, G131F,
Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F, T159V, T159I, T159L, T159M, T159F,
A164V, A164I, A164L, A164M, A164F, Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F
Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F, Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F
【００８８】
ズブチリシン309 、ズブチリシン147 及びバシラスPB92プロテアーゼ変異体：
T129V, T129I, T129L, T129M, T129F, G131V, G131I, G131L, G131M, G131F
E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G159I, G159L, G159M, G159F,
G164V, G164I, G164L, G164M, G164F, (BLS147)
S164V, S164I, S164L, S164M, S164F, (BLS309及びBAPB92)
Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C, Y167W, Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G,
Y167V, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F, R170W, R170A, R170H, R170N, R170P,
R170Q, R170S, R170T, R170Y (BLS309 のためには否認された）,
R170V (BAPB92 のためには否認された）,
R170I (BAPB92 については除かれる) ,
R170L, R170M (BAPB92については除かれる），
R170F, R170G, R170C, Y171A, Y171H, Y171N, Y171P, Y171C, Y171W, Y171Q,
Y171S, Y171T, Y171G, Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F
【００８９】
Ｂ：位置 132〜133 間に位置する自己タンパク質加水分解切断部位の近くで修飾された変異体
次の突然変異の１又は複数のいづれかを、さらに含んで成る上記セクション“Ａ”のもとに言及される単一変異体のいづれか：
P129D, P129E, P129A (BLS309)
S130D, S130E, S130A (BLS309)
P131G, P131D, P131A (BLS309)
S132C, S132A, S132P (BLS309)
A133P (BLS309)
T134C, T134P, T134A (BLS309)
L135P, L135A (BLS309)
E136A, E136P, L136K (BLS309)
V104C+S132C (BLS309)
V104C+T134C (BLS309)
A108C+T134C (BLS309)
【００９０】
Ｃ：位置 192〜193 間に位置する自己タンパク質加水分解切断部位の近くで修飾された変異体
次の突然変異の１又は複数のいづれかをさらに含んで成る上記セクション“Ａ”のもとに言及される単一変異体のいづれか：
F189A, F189G, F189D, F189R, F189Y, F189E, F189N (BLS309)
S190P, S190D, S190T (BLS309)
Q191S, Q191T, Q191N, Q191A, Q191L, Q191D, Q191W (BLS309)
Y192A, Y192P, Y192D, Y192E, Y192V (BLS309)
G193A, G193N, G193P (BLS309)
A194P, A194D (BLS309)
G195E (BLS309)
L196A (BLS309)
【００９１】
Ｄ：位置 132〜133 及び 192〜193 間に位置する両自己タンパク質加水分解部位の近くで修飾された変異体
セクション“Ｂ”下に言及される１又は複数の突然変異のいづれか及び／又は上記セクション“Ｃ”のもとに言及される１又は複数の突然変異のいづれかの組合せをさらに含んで成る、上記セクション“Ａ”のもとに言及される単一変異体のいづれか。
Ｅ：さらなる組合せ変異体：
セクション“Ｂ”，“Ｃ”、及び／又は“Ｄ”のもとに言及される上記変異体のいづれかは、次の位置のいづれかにおいて他の突然変異と組合される場合、好都合であることが予期される：27, 36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235 、及び274 。
【００９２】
特に、次のBLS309及びBAPB92変異体における突然変異が、組合せのために適切であると思われる：K27R,   ＊36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L及びT274A 。
また、上記に言及された１又は複数の他の置換、欠失及び／又は挿入のいづれかと組合してのいづれか１又は２つの置換X167V, X167M, X167F, X167L, X167I, X170V, X170M, X170F, X170L 、及び／又はX170I を含んで成るそのような変異体は、セクション“Ａ”，“Ｂ”、及び／又は“Ｃ”のもとに言及された突然変異のいづれかと組合すことが好都合であると思われる。
【００９３】
さらに、“Ａ”，“Ｂ”、及び／又は“Ｃ”として上記に言及される１又は複数の置換、欠失及び／又は挿入のいづれかと組合して、突然変異V104N-S101G, K27R+V104Y+N123S+T274A 又はN76D+V104A又はそれらの突然変異の他の組合せ（V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) のいづれかを含んで成る変異体は、改良された性質を示すと思われる。
【００９４】
言及されるべき特定の組合せは、次の通りである：
Ａ：Y167I+R170L+A133P
Ｂ：Y167I+R170L+T134P
Ｃ：Y167I+R170L+A133P+T134P
Ｄ：Y167I+R170L+V104C+S132C
Ｅ：Y167I+R170L+A108C+T134C
Ｆ：Y167A+R170S+F189A
Ｇ：Y167A+R170S+Y192A
Ｈ：Y167A+R170S+Y192P
Ｉ：Y167A+R170S+Y192A+A194P
Ｊ：Y167A+R170S+Y192P+A194P
Ｋ：Y167A+R170S+F189G
Ｌ：Y167A+R170S+F189E
Ｍ：Y167A+R170S+F189R
Ｎ：Y167I+R170L
Ｍ：Y167I+R170L+A194P
Ｏ：Y167A+R170S+A194P
Ｐ：Y167A+R170L+A194P
Ｑ：Y167A+R170N+A194P
【００９５】
Ｒ：V104C+S132C+Y167I+R170L
Ｓ：A108C+T134C+Y167I+R170L
Ｔ：V104C+S132C+Y167A+R170S
Ｕ：V104C+S132C+Y167A+R170L
Ｖ：V104C+S132C+Y167A+R170N
Ｘ：A133D+Y167I+R170L
Ｙ：P129K+Y167I+R170L
Ｚ：A133P+Y167A+R170S+A194P
AA：T134P+Y167A+R170S+A194P
BB：A133P+Y134P+Y167A+R170S+A194P
CC：A133P+Y167A+R170N+A194P
DD：T134P+Y167A+R170N+A194P
EE：A133P+T134P+Y167A+R170N+A194P
FF：A133P+Y167A+R170L
GG：P129K+P131H+Y167I+R170L
HH：A133P+Y167A+R170S
II：A133P+Y167A+R170N
JJ：Y167A+R170S+F189K
KK：V104C+T134C+Y167A+R170S
【００９６】
ズブチラーゼ遺伝子における突然変異の生成方法
遺伝子中に突然変異を導入するための多くの方法は、当業界において良く知られている。ズブチラーゼ遺伝子のクローニングの手短な議論の後、ズブチラーゼ遺伝子内のランダム部位及び特定の部位に突然変異を生成するための方法が論じられるであろう。
【００９７】
ズブチラーゼ遺伝子のクローニング
ズブチラーゼをコードする遺伝子は、表Ｉに示される生物のいづれか、特にグラム−陽性細菌又は真菌類から、当業界において良く知られている種々の方法によりクローン化され得る。第１に、DNAのゲノム及び／又はcDNAライブラリーが、研究されるべきズブチラーゼを生産する生物からの染色体DNA 又はメッセンジャーRNA を用いて構成されるべきである。次に、そのズブチラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、相同のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、そして細菌DNA のゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーからのズブチリシン−コードクローンを同定するために使用され得る。他方では、細菌又は生物の他の株からのズブチラーゼに対して相同の配列を含むラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、低い緊縮性のハイブリダイゼーション又は洗浄条件を用いて、ズブチラーゼ−コードクローンを同定するために使用され得た。
【００９８】
ズブチラーゼ−生成クローンを同定するためのさらにもう１つの方法は、発現ベクター、たとえばプラスミド中にゲノムDNA のフラグメントを挿入し、得られるゲノムDNA ライブラリーによりプロテアーゼ陰性細菌を形質転換し、そして次に、ズブチラーゼのための基質、たとえば脱脂乳を含む寒天上に前記形質転換された細菌をプレートすることを含む。ズブチラーゼ−生成プラスミドを含むそれらの細菌は、分泌されたズブチラーゼによる脱脂乳の消化のために、透明な寒天の輪により取り囲まれるコロニーを生成するであろう。
【００９９】
ズブチラーゼ遺伝子におけるランダム突然変異の生成
ズブチラーゼ遺伝子が適切なベクター、たとえばプラスミド中にクローン化されると、いくつかの方法がその遺伝子中にランダム突然変異を導入するために使用され得る。
たとえば、ランダム突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA 配列をPCR 生成された突然変異誘発にゆだねることにより実施され得る。さらに、ランダム突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいづれかの組合せの使用により実施され得る。
【０１００】
突然変異誘発剤は、たとえばトランジション、トランスバーション、逆位、スクランブリング、欠失及び／又は挿入を誘発する剤であり得る。
本発明のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（MNNG) 、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート(EMS) 、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。
そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は、典型的には、突然変異誘発が起こる適切な条件下で、選択の突然変異誘発剤の存在下で突然変異誘発されるべき親酵素をコードするDNA 配列をインキュベートし、そして所望の性質を有する突然変異誘発されたDNAを選択することによって実施される。
【０１０１】
突然変異誘発がオリゴヌクレオチドの使用により実施される場合、オリゴヌクレオチドは、変更されることが所望される位置でのオリゴヌクレオチドの合成の間、３個の非親ヌクレオチドによりドーピング又はスパイキングされ得る。ドーピング又はスパイキングは、不所望のアミノ酸についてのコドンが回避されるよう実施され得る。ドーピング又はスパイキングされたオリゴヌクレオチドは、たとえばPCR, LCR又はいづれかのDNA ポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、いづれかの公開された技法によりプロテアーゼ酵素をコードするDNA 中に導入され得る。
PCR 生成される突然変異誘発が使用される場合、親プロテアーゼ酵素をコードする化学的に処理された又は処理されていない遺伝子が、ヌクレオチドの誤った組込みを高める条件下でPCR にゆだねられる（Deshler 1992, Leung など. 1989) 。
【０１０２】
Ｅ．コリ（Fowlerなど. 1974) 。Ｓ．セレビシアエ又は他のいづれかの微生物のミューテーター株は、親酵素を含むプラスミドを用いて前記ミューテーター株を形質転換し、前記プラスミドを含むミューテーター株を増殖せしめ、そして前記ミューテーター株から突然変異誘発されたプラスミドを単離することによって、プロテアーゼ酵素をコードするDNA のランダム突然変異誘発のために使用され得る。続いて突然変異誘発されたプラスミドを用いて、発現生物を形質転換することができる。
【０１０３】
突然変異誘発されるDNA 配列は便利には、親プロテアーゼ酵素を発現する生物から調製されたゲノム又はcDNAライブラリーに存在することができる。あるいは、そのDNA 配列は、突然変異誘発剤と共にそれ自体インキュベートされ得、又は他の方法として、適切なベクター、たとえばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在させ、これらのベクターを暴露することができる。突然変異誘発されるDNA はまた、前記細胞のゲノムに組込まれることによって、又は細胞に含まれるベクター上に存在することによって、宿主細胞に存在させることができる。最終的に、突然変異誘発されるDNA は、単離された形で存在することができる。ランダム突然変異にゆだねられるDNA 配列は好ましくは、cDNA又はゲノムDNA 配列である。
【０１０４】
ランダム突然誘発は好都合には、問題の親プロテアーゼの一部に位置することができる。これは、たとえば酵素の一定の領域が酵素の所与の性質のために特に重要なものであることが同定されている場合、好都合であり、そしてこれは、修飾される場合、改良された性質を有する変異体をもたらすことが予測される。そのような領域は通常、親酵素の三次構造が解明されそして酵素の機能と関連付けられる場合に同定され得る。
【０１０５】
局在化されたランダム突然変異誘発は、便利には、上記のようなPCR 生成突然変異誘発技法又は当業界において知られているいづれか他の適切な技法の使用により実施される。
他方では、修飾されるべきDNA 配列の一部をコードするDNA 配列は、たとえば適切なベクター中に挿入されることによって単離され得、そして前記一部は続いて、上記突然変異誘発方法のいづれかの使用により突然変異誘発にゆだねられ得る。
局在化されたランダム突然変異誘発は、１又は複数のそれらの領域において実施され得、そして好ましくは、少なくとも２つの前記領域において実施される。
【０１０６】
ズブチラーゼ遺伝子における特定部位の突然変異誘発の生成
ズブチラーゼ遺伝子がクローン化され、そして同定される突然変異のための所望する部位及び元の残基を置換するための残基が決定されると、それらの突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。それらのオリゴヌクレオチドは所望する突然変異部位を端に有するヌクレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成の間、挿入される。好ましい態様においては、部位特定突然変異誘発は、Dengなど. (Anal. Biochem. 200 : 81-88 (1992)) 及びMarkvardsen など. (BioTechniques 18 (3) : 371-372 (1995)) によりそれぞれ記載される“ユニーク部位排除(USE) ”又は“ウラシル−USE ”により実施される。
【０１０７】
組換え発現ベクター
本発明の酵素をコードするDNA 構造体を含んで成る組換えベクターは、組換えDNA 方法に便利にゆだねられ得るいづれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自主的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製と独立している、染色体外存在物として存在するベクター、たとえばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞中に一部又は完全に組込まれ、そしてそれが導入される染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【０１０８】
ベクターは好ましくは、本発明の酵素をコードするDNA 配列がそのDNA の転写のために必要とされる追加のセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは、プラスミド又はウィルスDNA に由来し、又は両要素を含むことができる。用語“作用可能に連結される”とは、セグメントが、それらの意図された目的と協調して機能し、たとえば転写がプロモーターにより開始され、そして酵素をコードするDNA 配列を通して進行するよう配置されることを示す。
プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいづれかのDNA 配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種であるかいづれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。
【０１０９】
細菌宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、バシラス・ステアロサーモフィラス・マルトース生成（maltogenic) アミラーゼ遺伝子、バシラス・リケニホルミス  α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリケファシエンス  α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・スブチリス  アルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバシラス・プミラス  キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージλPR 又はPL プロモーター又はＥ．コリlac, trp又はtac プロモーターを包含する。
本発明の酵素をコードするDNA 配列はまた、必要なら、適切なプロモーターに作用可能に連結され得る。
【０１１０】
本発明の組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞においてそのベクターの複製を可能にするDNA 配列を含むことができる。
ベクターはまた、選択マーカー、たとえば宿主細胞における欠陥を補足する生成物の遺伝子、又はたとえば抗生物質、たとえばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン又は同様のものに対する耐性、又は重金属又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含むことができる。
【０１１１】
本発明の酵素を宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、組換えベクターに供給され得る。分泌シグナル配列は、酵素をコードするDNA 配列に、正しい読取り枠を整合して連結される。分泌シグナル配列は通常、酵素をコードするDNA 配列の５’側に位置する。分泌シグナル配列は、酵素と通常関連する配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものでもあり得る。
本発明の酵素をコードするDNA 配列、プロモーター及び任意には、ターミネーター及び／又は分泌シグナル配列とそれぞれ連結するために、又は適切なPCR 増幅スキムによりそれらの配列をアセンブルするために、及びそれらを、複製又は組込みのために必要な情報を含む適切なベクター中に挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrookなど.,前記を参照のこと）。
【０１１２】
宿主細胞
宿主細胞中に導入される本発明の酵素をコードするDNA 配列は、問題の宿主に対して同種性（homologous）か又は異種性（heterologous）のいづれかであり得る。宿主細胞に対して同種性である場合、すなわち宿主細胞により天然に生産される場合、それは典型的には、もう１つのプロモーター配列に、又は適用できるなら、その天然の環境におけるよりも他の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に作用可能に連結されるであろう。用語“同種性”とは、問題の宿主生物に対して生来の酵素をコードするDNA 配列を含めることを意図する。用語“異種性”とは、天然において宿主細胞により発現されないDNA 配列を含めることを意図する。従って、前記DNA 配列は、他の生物からであり得、又はそれは合成配列であり得る。
【０１１３】
本発明のDNA 構造体又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の酵素を生成することができるいづれかの細胞であり、そして細菌、酵母、菌類及び高等真核細胞を包含する。
【０１１４】
培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる細菌宿主細胞の例は、グラム−陽性細菌、たとえばバシルスの株、たとえば、Ｂ．スブチリス、Ｂ．リケニルホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケニファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ラウタス、Ｂ．メガセリウム又はＢ．スリンギエンシス又はストレプトミセス（Streptomyces) 属の株、たとえばＳ．リビダンス（S. lividans)又はＳ．ムリナス（S. murinus) 、又はグラム−陰性細菌、たとえばＥ．コリ（E. coli)である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体知られている態様でコンピテント細胞を用いることによりもたらされ得る（Sambrookなど.,前記を参照のこと）。
細菌、たとえばＥ．コリにおいて酵素を発現する場合、酵素は細胞質に、典型的には不溶性顆粒（封入体としても知られている）として保持され得、又は細菌分泌配列によりペリプラズム空間に向けられ得る。前者の場合、細胞が溶解され、そして顆粒が回収され、そして変性され、その後、酵素が変性剤を希釈することによって再生される。後者の場合、ペリプラズム空間の内容物を放出するために、たとえば音波処理又は浸透ショックにより細胞を破壊し、そして酵素を回収することによって、酵素がペリプラズム空間から回収され得る。
【０１１５】
グラム陽性細菌、たとえばバシルス又はストレプミセス株において酵素を発現する場合、酵素は細胞質に保持され得、又は細菌分泌配列により細胞外培地に向けられ得る。後者の場合、酵素は下記のようにして培地から回収され得る。
【０１１６】
ズブチラーゼの製造方法
本発明は、本発明に従って、単離された酵素を製造するための方法を提供し、ここで酵素をコードするDNA 配列により形質転換された適切な宿主細胞が酵素の生成を可能にする条件下で培養され、そしてその得られる酵素が培養物から回収される。
本明細書において定義される場合、単離されたポリペプチド（たとえば酵素）は、 SDS−PAGEにより決定される場合、他の非ズブチラーゼポリペプチドを実質的に有さない、たとえば少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは約60％の純度さらにより好ましくは約80％の純度、最とも好ましくは約90％の純度及びさらに最とも好ましくは約95％の純度のポリペプチドである。用語“単離されたポリペプチド”とは、代わりに、“精製されたポリペプチド”とも称する。
【０１１７】
酵素をコードするDNA 配列を含んで成る発現ベクターが異種宿主細胞を形質転換する場合、本発明の酵素の異種組換え体生成を可能にすることができる。
それにより、同種性不純物を有さないことを特徴とする高度に精製されたズブチラーゼ組成物を製造することが可能である。
この場合、同種性不純物とは、本発明の酵素が始め得られる同種性細胞に起因するいづれかの不純物（たとえば、本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。
【０１１８】
形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖するために適切ないづれかの従来の培地であり得る。発現されたズブチラーゼは便利には、培養培地中に分泌され得、そしてそれから、培養培地から細胞を遠心分離又は濾過により分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質成分を沈殿せしめ、続いて、クロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様の方法を用いることを包含する良く知られた方法により回収され得る。
【０１１９】
変異体酵素を含んで成る洗剤組成物
本発明はまた、洗浄及び洗剤組成物及び変異体ズブチリシン酵素を含んで成るそのような組成物への本発明の変異体酵素の使用を包含する。そのような洗浄及び洗剤組成物は、下記にさらに詳細に記載される。
【０１２０】
洗剤の開示及び例：
界面活性剤系
本発明の洗剤組成物は、界面活性剤系を含んで成り、ここで前記界面活性剤は、非イオン性及び／又はアニオン性、及び／又はカチオン性、及び／又は両性、及び／又は両性イオン性、及び／又は半極性界面活性剤から選択され得る。
界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。
界面活性剤は好ましくは、組成物に存在する酵素成分と適合できるように配合される。液体又はゲル組成物においては、界面活性剤は、最とも好ましくは、それがそれらの組成物におけるいづれかの酵素の安定性を促進し、又は少なくとも低下せしめないような手段で配合される。
【０１２１】
本発明に従って使用されるべき好ましいシステムは、本明細書に記載される１又は複数の非イオン性及び／又はアニオン性界面活性剤を界面活性剤として含んで成る。
アルキルフェノールの酸化ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレン縮合物は、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切であり、そしてポリエチレンオキサイド縮合物が好ましい。それらの化合物は、直鎖又は枝分れ鎖形状に約６〜約14個の炭素原子、好ましくは約８〜約14個の炭素原子を有するアルキルフェノールとアルキレンオキサイドとの縮合生成物を包含する。
【０１２２】
好ましい態様においては、エチレンオキサイドは、アルキルフェノール１モル当たり約２〜約25モル、より好ましくは約３〜約15モルのエチレンオキサイドに等しい量で存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤は、GAF Corporation により市販されるIgepalＴＭ CO-630 ; 及びRohm & Haas Company により市販されるTriton TM X-45, X-114, X-100 及びX-102 を包含する。それらの界面活性剤は、アルキルフェノールアルコキシレート（たとえばアルキルフェノールエトキシレート）として通常言及される。
【０１２３】
約１〜約25モルのエチレンオキサイドと第一及び第二脂肪族アルコールとの縮合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は枝分れ鎖、第１又は第２のいづれかであり得、そして一般的には、約８〜約22個の炭素原子を含む。アルコール１モル当たり約２〜約10モルのエチレンオキサイドと、約８〜約20個の炭素原子、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールとの縮合生成物が好ましい。アルコール１モル当たり、約２〜約７モルのエチレンオキサイド及び最とも好ましくは２〜５モルのエチレンオキサイドが前記縮合生成物に存在する。
【０１２４】
このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例は、Tergitol TM 15-S-9（C11−C15の直鎖状アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Tergitol TM 24-L-6NMW(C12−C14第一アルコールと狭い分子量分布を有する６モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）（両者ともUnion Carbide Corporation により市販されている）；Neodol TM 45−9（C14−C15直鎖状アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、NeodolTM 23-3（C12−C13直鎖状アルコールと 3.0モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Neodol TM 45-7（C14−C15直鎖状アルコールと７モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Neodol TM 45-5（C14−C15直鎖状アルコールと５モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物（Shell Chemical Companyにより市販されている）；Kyro TM EDB (C13−C15アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物（Procter & Gamble Companyにより市販されている）；及びGenapol LAO50(C12−C14アルコールと５モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）(Hoechstにより市販されている）を包含する。それらの生成物におけるHLB の好ましい範囲は、８〜11及び最とも好ましくは８〜10である。
【０１２５】
約６〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を含む疎水性基を有する、アメリカ特許第 4,565,647号に開示されるアルキルポリサッカリド、及び約 1.3〜約10、好ましくは約 1.3〜約３、最とも好ましくは約 1.3〜約2.7 のサッカリド単位を含む親水性基を有するポリサッカリド、たとえばポリグリコシドは、本発明の界面活性剤系中の非イオン性界面活性剤としても有用である。５又は６個の炭素原子を含むいづれかの還元サッカリド、たとえばグルコース、ガラクトースが使用され得、そしてガラクトシル成分はグルコシル成分と置換され得る（任意には、疎水性基は、２−，３−，４−、等の位置で結合され、従って、グルコシド又はガラクトシドに対立するものとして、グルコース又はガラクトースを付与する）。追加のサッカリド単位の１つの位置と、前のサッカリド単位上の２−，３−，４−、及び／又は６−位置との間にサッカリド間結合が存在することができる。
【０１２６】
好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式：
R2O (CnH2nO)t（グリコシル)x
〔式中、R2 はアルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物から成る群から選択され、ここで前記アルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含み；ｎは２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜約10、好ましくは０であり；そしてｘは約 1.3〜約10、好ましくは約 1.3〜約10、最とも好ましくは約 1.3〜約2.7 である〕を有する。それらの化合物を調製するためには、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、そして次に、グルコース、又はグルコース源と反応せしめられ、グルコシド（１−位置での結合）が形成される。次に、追加のグリコシル単位が、それらの１−位置と前のグリコシル単位の２−，３−，４−、及び／又は６−位置、好ましくは、有力的には２−位置との間に結合され得る。
【０１２７】
プロピレンオキサイドとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性塩基とエチレンオキサイドとの縮合生成物はまた、本発明の追加の非イオン性界面活性剤系として使用するためにも適切である。それらの化合物の疎水性部分は、好ましくは約1500〜約1800の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は、全体として分子の水溶解性を高める傾向があり、そして生成物の液体性質が、ポリオキシエチレン含有率が、約40モルまでのエチレンオキサイドとの縮合に対応する、縮合生成物の合計重量の約50％である点まで保持される。このタイプの化合物の例は、BASFにより市販されるPluronicＴＭ界面活性剤を包含する。
【０１２８】
プロピレンオキサイド及びエチレンジアミンの反応に起因する生成物とエチレンオキサイドとの縮合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤系中の非イオン性界面活性剤として使用のためにも適切である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレンジアミン及び過剰のプロピレンオキサイドの反応生成物から成り、そして一般的には、約2500〜約3000の分子量を有する。この疎水性成分は、縮合生成物が約40〜約80重量％のポリオキシエチレンを含み、そして約 5,000〜約11,000の分子量を有する程度までエチレンオキサイドにより縮合される。このタイプの非イオン性界面活性剤の例は、BASFにより市販されているTetronicＴＭ化合物を包含する。
【０１２９】
アルキルフェノールの酸化ポリエチレン縮合物、第一及び第二脂肪族アルコールと約１〜約25モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物、アルキルポリサッカリド、及びそれらの混合物は、本発明の界面活性剤系中の非イオン性界面活性剤として使用するために好ましい。３〜15個のエトキシ基を有するC8−C18アルキルフェノールエトキシレート、及び２〜10個のエトキシ基を有するC8−C18アルコールエトキシレート（好ましくは平均C10）、及びそれらの混合物が、最とも好ましい。
【０１３０】
ひじょうに好ましい非イオン性界面活性剤は、下記式：
【化１】
2005160490.tif 000004
【０１３１】
〔式中、R1 はＨであり、又はR1 はC1-4 ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であり、R2 はC5-31ヒドロカルビルであり、そしてＺは線状ヒドロカルビル鎖に直接的に結合される少なくとも３個のヒドロキシルを有する前記ヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビル、又はそのアルコキシル化された誘導体である〕
で表わされるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤である。好ましくは、R1 はメチルであり、R2 は直鎖C11-15 アルキル又はC16-18アルキル、又はアルケニル鎖、たとえばココナッツアルキル、又はそれらの混合物であり、そしてＺは、還元性アミノ化反応において、還元糖、たとえばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから誘導される。
【０１３２】
ひじょうに好ましいアニオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル化スルフェート界面活性剤を包含する。その例は、式 RO(A)mSO3M（ここでＲは、C10−C24アルキル成分を有する置換されていないC10−C24アルキル又はヒドロキシアルキル基、好ましくはC12−C20アルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはC12−C18アルキル又はヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍはゼロよりも大きく、典型的には約 0.5〜約６、より好ましくは約 0.5〜約３であり、そしてＭはＨ、又はカチオン、たとえば金属カチオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、等）、アンモニウム又は置換されたアンモニウムカチオンである）で表わされる水溶性塩又は酸である。アルキルエトキシル化スルフェート及びアルキルプロポキシル化スルフェートは、本発明において企画される。
【０１３３】
置換されたアンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン及び第四アンモニウムカチオン、たとえばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウムカチオン、及びアルキルアミン、たとえばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物及び同様のものに由来するそれらのカチオンを包含する。典型的な界面活性剤は、C12−C18アルキルポリエトキシレート(1.0) スルフェート（C12−C18E(1.0）M）、C12−C18アルキルポリエトキシレート（2.25）スルフェート（C12−C18E（2.25）M）、及びC12−C18アルキルポリエトキシレート(3.0) スルフェート（C12−C18E(3.0) M）、並びにC12−C18アルキルポリエトキシレート(4.0) スルフェート（C12−C18E(4.0) Ｍ）（ここでＭは便利には、ナトリウム及びカリウムから選択される）である。
【０１３４】
使用される適切なアニオン性界面活性剤は、アルキルエステルスルホネート界面活性剤、たとえば“The Journal of the AmericanOil Chemists Society”，52 (1975), pp. 323-329に従って気体SO3 によりスルホネート化されるC8−C20カルボン酸（すなわち、脂肪酸）の線状エステルである。適切な出発材料は、牛脂、ヤシ油、等から遊導されるような天然の脂肪界面活性剤を包含する。
【０１３５】
特に、洗濯用途のための好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、下記構造式：
【化２】
2005160490.tif 000005
【０１３６】
〔式中、R3 はC8−C20ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組合せであり、Ｒ４  はＣ１  −Ｃ６  ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組合せであり、そしてＭはアルキルエステルスルホネートと水溶性塩を形成するカチオンである〕
で表わされるアルキルエステルスルホネート界面活性剤を包含する。適切な塩−形成カチオンは、金属、たとえばナトリウム、カリウム及びリチウム、及び置換された又は置換されていないアンモニウムカチオン、たとえばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを包含する。好ましくは、R3 はC10−C16アルキルであり、そしてR4 はメチル、エチル又はイソプロピルである。R3 がC10−C16アルキルであるメチルエステルスルホネートが特に好ましい。
【０１３７】
他の適切なアニオン性界面活性剤は、式ROSO3M〔式中、Rは好ましくはC10−C24ヒドロカルビル、好ましくはC10−C20アルキル成分、より好ましくはC12−C18アルキル又はヒドロキシアルキルを有するアルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてＭはＨ又はカチオン、たとえばアルキル金属カチオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウム又は置換されたアンモニウム（たとえばメチル−、ジメチル−、及びトリメチル−アンモニウムカチオン及び第四アンモニウムカチオン、たとえばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペルジニウムカチオン、及びアルキルアミン、たとえばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、及びそれらの混合物、及び同様のものに由来する第四アンモニウムカチオン）である〕で表わされる、水溶性塩又は酸であるアルキルスルフェート界面活性剤を包含する。典型的には、C12−C16のアルキル鎖は、低い洗浄温度（たとえば約50℃以下）のために好ましく、そしてC8−C20アルキル鎖は、高い洗浄温度（たとえば約50℃以上）のために好ましい。
【０１３８】
洗浄目的のために有用な他のアニオン性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物に含まれ得る。それらは、石鹸の塩（たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウム塩、たとえばモノ−、ジ−及びトリエタノールアミン塩）、C8−C22一次又は二次アルカンスルホネート、C8−C24オレフィンスルホネート、イギリス特許第 1,082,179号明細書に記載されるような、アルカリ土類金属シトレートの熱分解された生成物のスルホン化により調製されたスルホン化されたポリカルボン酸、C8−C24アルキルポリグリコールエーテルスルフェート（10モルまでのエチレンオキサイドを含む)；
【０１３９】
アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、イソチオネート、たとえばアシルイソチオネート、Ｎ−アシルタルトレート、アルキルスクシネート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に、飽和及び不飽和C12−C18モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に、飽和及び不飽和C6−C12ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキルポリサッカリドのスルフェート、たとえばアルキルポリグリコシドのスルフェート（下記に記載される非イオン性のスルフェート化されていない化合物）、枝分れされた一次アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、たとえば式 RO(CH2CH2O)k−CH2COO-M+〔式中、RはC9−Ｃ22アルキルであり、ｋは１〜10の整数であり、そしてＭは可溶性塩形成カチオンである〕で表わされるカルボキシレートを包含する。樹脂酸及び水素添加された樹脂酸、たとえばロジン、水素添加されたロジン、及びタル油に存在するか又はタル油に由来する樹脂酸及び水素添加された樹脂酸がまた適切である。
【０１４０】
アルキルベンゼンスルホネートが、ひじょうに好ましい。線状（直鎖）アルキルベンゼンスルホネート（LAS)（ここで、アルキル基は好ましくは、10〜18個の炭素原子を含む）が特に好ましい。
さらなる例は、“Surface Active Agents and Defergents”（Schwarts, Perry and Berch によるVol.Ｉ及びII）に記載される。種々のそのような界面活性剤がまた、アメリカ特許第 3,929,678号（第23欄、第58行〜第29欄、第23行；引用により本明細書に組込まれる）に開示される。
【０１４１】
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約１〜約40重量％、好ましくは約３〜約20重量％のそのようなアニオン性界面活性剤を含んで成る。
本発明の洗濯洗剤組成物は、また本明細書にすでに記載された界面活性剤以外のカチオン性、両性、両性イオン性、及び単一極性界  面活性剤も含むことができる。
本発明の洗濯洗剤組成物への使用のために適切なカチオン性洗浄剤界面活性剤は、１つの長鎖のヒドロカルビル基を有するものである。そのようなカチオン性界面活性剤の例は、アンモニウム界面活性剤、たとえばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲニド、及び下記式：
【０１４２】
〔 R2(OR3)y〕〔R4(OR3)y〕2R5Ｎ+Ｘ-
〔式中、R2 は、アルキル鎖に約８〜約18個の炭素原子を有するアルキル又はアルキルベンジル基であり、個々のR3 は−CH2CH2−，−CH2CH(CH3)−，−CH2CH(CH2OH)−，−CH2CH2CH2−及びそれらの混合物から成る群から選択され；個々のR4 はC1−C4 アルキル、C1−C4 ヒドロキシアルキル、２つのR4 基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、−CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH（ここでR6 は約1000以下の分子量を有するヘキソース又はヘキソースポリマーである）、及び水素（ｙがゼロでない場合）から成る群から選択され；R5 はR4 と同じであり、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の合計数又はR2 ＋R5 は約12よりも多くなく；個々のｙは０〜約10であり；そしてｙ値の合計は０〜約15であり；そしてＸはいづれかの適合できるアニオンである〕を有するそれらの界面活性剤を包含する。
【０１４３】
ひじょうに好ましいカチオン性界面活性剤は、下記式：
R1R2R3R4N+X-    （ｉ）
〔式中、R1 はC8−C16アルキルであり、R2 ，R3 及びR4 の個々は独立して、C1−C4 アルキル、C1−C4 ヒドロキシアルキル、ベンジル、及び（C2H40)x H （ここでｘは２〜５の値を有する）であり、そしてＸはアニオンである〕を有する本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くても１つのR2 ，R3 又はR4 はベンジルであるべきである。
【０１４４】
R1 のための好ましいアルキル鎖長は、特に、アルキル基がココナッツ又はヤシ種の脂肪に由来する鎖長の混合物であるか、又はオレフィン構築又はOXO アルコール合成により合成的に誘導される場合、C12−C15である。
R2， R3 及びR4 のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンＸはハロゲン化物、メトスルフェート、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。
本発明における使用のための式（ｉ）の適切な第四アンモニウム化合物の例は次のものである：
【０１４５】
ココナッツトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ココナッツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
デシルトリエチルアンモニウムクロリド；
デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
C12−C15ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ココナッツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート；
ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ラウリルジメチル（エテノキシ)4 アンモニウムクロリド又はブロミド；
コリンエステル（式（ｉ）の化合物、ここでR1 は、CH2-CH2-O-C(=O)-C12-C14アルキルであり、そしてR2， R3及び OR4 はメチルである）；
ジ−アルキルイミダゾリン〔式（ｉ）の化合物〕。
【０１４６】
本発明において有用な他のカチオン性界面活性剤はまた、アメリカ特許第 4,228,044号及びヨーロッパ特許000224号にも記載されている。
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、 0.2〜約25重量％、好ましくは約１〜約８重量％のそのようなカチオン性界面活性剤を含んで成る。
両性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又は脂肪族基が直鎖又は枝分れ鎖であり得る、複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体として広く記載され得る。脂肪族置換基の１つは、少なくとも約８個の炭素原子、典型的には約８〜約18個の炭素原子を含み、そして少なくとも１つはアニオン性水−溶解基、たとえばカルボキシ、スルホネート、スルフェートを含む。両性界面活性剤の例のためには、アメリカ特許第 3,929,678号（第19欄、第18〜35行）を参照のこと。
【０１４７】
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約 0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性界面活性剤を含んで成る。
両性イオン界面活性剤はまた、洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第三スルホニウム化合物の誘導体として広く記載され得る。両性イオン界面活性剤の例のためには、アメリカ特許第 3,929,678号（第19欄、第38行〜第22欄、第48行）を参照のこと。
【０１４８】
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的には、 0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性イオン性界面活性剤を含んで成る。
半−極性非イオン性界面活性剤は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分を含む水溶性アミンオキシド；約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分、及び約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分を含む水溶性ホスフィンオキシド；及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分、及び約１〜約３個の炭素原子のアルキル及びヒドロキシアルキル成分から成る群から選択された成分を含む水溶性スルホキシドを含む非イオン性界面活性剤の特別なカテゴリーである。
【０１４９】
半一極性非イオン性洗剤界面活性剤は、下記式：
【化３】
2005160490.tif 000006
【０１５０】
〔式中、R3 は約８〜約22個の炭素原子を含む、アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；R4 は約２〜約３個の炭素原子を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；ｘは０〜約３であり；そして個々のR5 は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又はヒドロキシアルキル基、又は約１〜約３個のエチレンオキサイド基を含むポリエチレンオキシドである〕
を有する酸化アミン界面活性剤を含む。R5 基は、環構造を形成するために、たとえば酸素又は窒素原子を通してお互いに対して結合され得る。
それらのアミンオキシド界面活性剤は特に、Ｃ１８アルキルジメチルアミンオキシド及びC8−C12アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドを包含する。
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような半一極性非イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１５１】
ビルダー系
本発明の組成物は、さらにビルダー系を含むことができる。いづれかの従来のビルダー系、たとえばアルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、材料、たとえばエチレンジアミンテトラアセテート、金属イオン封鎖剤、たとえばアミノポリホスホネート、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸が、本発明への使用のために適切である。明確な環境理由のためにはほとんど好ましくはないが、ホスフェートビルダーはまた、本発明においても使用され得る。
【０１５２】
適切なビルダーは、無機イオン交換材料、通常、水和化された無機アルミノシリケート材料、より特別には、水和化された合成ゼオライト、たとえば水和化されたゼオライトＡ，Ｘ，Ｂ，HS又はMAPであり得る。
他の適切な無機ビルダー材料は、積層されたシリケート、たとえば SKS−６(Hoechst) である。 SKS-6は、硅酸ナトリウム（Na２Si２O５) から成る積層された結晶性シリケートである。
【０１５３】
カルボキシ基を含む適切なポリカルボキシレートは、ベルギー特許第 831,368号、第 821,369号及び第 821,370号に開示されるような乳酸及びグリコール酸の塩、並びにそれらのエーテル誘導体を包含する。２つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、琥珀酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）二酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルトロン酸及びフマル酸の水溶性塩、並びにドイツ特許第 2,446,686号及び第 2,446,487号、アメリカ特許第 3,935,257号に記載されるエーテルカルボキシレート、及びベルギー特許第 840,623号に記載されるスルフィニルカルボキシレートを包含する。
【０１５４】
３個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは特に、水溶性シトレート、アコニトレート及びシトラコネート、並びにスクシネート誘導体、たとえばベルギー特許第 1,379,241号に記載されるカルボキシメチルオキシスクシネート、及びオキシポリカルボキシレート材料、たとえばイギリス特許第 1,387,447号に記載される２−オキサー１，１，３−プロパントリカルボキシレートを包含する。
【０１５５】
４個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、イギリス特許第 1,261,829号に開示されるオキシジスクシネート、１，１，２，２−エタンテトラカルボキシレート、スルホ置換基を含む１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレート、たとえばイギリス特許第 1,398,421号及び第 1,398,422号、及びアメリカ特許第 3,936,448号に開示されるスルホスクシネート、及びイギリス特許第 1,082,179号に記載されるスルホネート化された、熱分解されたシトレートを包含し、そしてホスホン置換基を含むポリカルボキシレートがイギリス特許第 1,439,000号に開示されている。
【０１５６】
脂環式及び複素環式ポリカルボキシレートは、シクロペンタン−シス；シス−シス−テトラカルボキシレート；シクロペンタジエニド；ペンタカルボキシレート；２，３，４，５−テトラヒドロフラン−シス、シス、シス−テトラカルボキシレート；２，５−テトラヒドロフラン−シス；ジスカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート；１，２，３，４，５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート；及び多価アルコール、たとえばソルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体を包含する。芳香族ポリカルボキシレートは、イギリス特許第 1,425,343号に開示される、メリット酸、ピロメリット酸、及びフタル酸誘導体を包含する。
【０１５７】
上記のうち、好ましいポリカルボキシレートは、分子当たり３個までのカルボキシ基を含むヒドロキシカルボキシレート、より特定には、シトレートである。
本発明の組成物への使用のための好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、たとえばゼオライトＡ、又は積層されたシリケート(SKS-6）、及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、たとえばクエン酸の混合物を含む。
【０１５８】
本発明の洗剤組成物への包含のための適切なキレート化剤は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二琥珀酸（EDDS）、又はそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、又は置換されたアンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好ましいEDDS化合物は、遊離酸形及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。EDDSのそのような好ましいナトリウム塩の例は、Na２EDDS 及びNa４EDDS を包含する。EDDSのそのような好ましいマグネシウム塩の例は、MgEDDS及びMg２EDDS を包含する。マグネシウム塩は、本発明の組成物への包含のために最とも好ましいものである。
【０１５９】
好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、たとえばゼオライトＡ及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、たとえばクエン酸の混合物を包含する。
顆粒組成物への使用のためのビルダー系の一部を形成することができる他のビルダー材料は、無機材料、たとえばアルカリ金属の炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、及び有機材料、たとえば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート、及びアミノポリカルボキシレートを包含する。
他の適切な水溶性有機塩は、ホモ又はコポリマー酸又はそれらの塩であり、ここでポリカルボン酸は２つよりも多くない炭素原子によりお互いから分離される少なくとも２つのカルボキシル基を含んで成る。
【０１６０】
このタイプのポリマーは、GB−Ａ− 1,596,756に開示される。そのような塩の例は、 MW 2000〜5000のポリアクリレート、及び無水マレイン酸とのそれらのコポリマーであり、そのようなコポリマーは20,000〜70,000、特に約40,000の分子量を有する。
洗剤ビルダー塩は通常、組成物中に５〜80重量％の量で含まれる。液体洗剤のためのビルダーの好ましいレベルは、３％〜30％である。
【０１６１】
酵  素
本発明の酵素調製物の他に、好ましい洗剤組成物は、清浄性能及び／又は布保護の利点を付与する他の酵素を含んで成る。
そのような酵素は、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（たとえばラッカーゼ）を包含する。
【０１６２】
プロテアーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれか他のプロテアーゼが使用され得る。適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に又は遺伝子的に修飾された突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ、又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、ズブチリシン、特にバシルスに由来するもの、たとえばズブチリシンNovo、ズブチリシンCarlsberg 、ズブチリシン309 、ズブチリシン147 及びズブチリシン168 である（WO89/06279号に記載される）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（たとえばブタ又はウシ起源の）及びWO89/06270号に記載されるフサリウム（Fusarium) プロテアーゼである。
【０１６３】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Novo Nordisk A/S（デンマーク）により商標Alcalase, Savinase, Primase, Durazym、及びEsperaseとして市販されるもの、Genencor Internationalにより商標Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect 及びPurafect OXPとして市販されるもの、及びSolvay Enzymesにより商標Opticlean 及びOptimaseとして市販されるものを包含する。プロテアーゼ酵素は、本発明の組成物中に、組成物中の酵素タンパク質の 0.00001〜２重量％のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％のレベルで、より好ましくは 0.001〜0.5 重量％のレベルで、さらにより好ましくは、0.01〜0.2 重量％のレベルで導入され得る。
【０１６４】
リパーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのリパーゼが使用され得る。適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。
有用なリパーゼの例は、ヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載のようなヒューミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa) リパーゼ、ヨーロッパ特許第238023号に記載のようなリゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei) リパーゼ、ヨーロッパ特許第214761号に記載のようなカンジダ(Candida) リパーゼ、たとえばＣ．アンタルクチカ(C. antarctica) リパーゼ、たとえばＣ．アンタルクチカリパーゼＡ又はＢ、ヨーロッパ特許第218272号に記載のようなプスードモナス(Pseudomonas) リパーゼ、たとえばＰ．アルカリゲネス P. alcaligenes 及びＰ．プスードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes) リパーゼ、ヨーロッパ特許第311376号に記載のようなＰ．セパシア（P. cepacia) リパーゼ、イギリス特許第 1,372,034号に開示されるようなＰ．スツツゼリ（P. stutzeri)リパーゼ、Ｐ．フルオレスセンス（P. fluorescens) リパーゼ、バシルスリパーゼ、たとえばＢ．スブチリスリパーゼ（Dartois など., (1993), Biocliemica et Biophysica acta 1131, 253-260)、Ｂ．ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus)リパーゼ（JP64/744992号）及びＢ．プミラス（B. pamilus) リパーゼ（WO91/16422号）を包含する。
【０１６５】
さらに、次のような多くのクローン化されたリパーゼが有用である：Yamaguchi など., (1991), Gene 103, 61-67により記載されるペニシリウム・カメムベルチ(Penicillium camembertii) リパーゼ、ゲオトリカム・カンジダム (Geotricum candidum) リパーゼ（Schimada, Y.など., (1989), J. Biochem., 106, 383-388) 、及び種々のリゾパス (Rhizopus) リパーゼ、たとえばＲ．デレマル（R. delemar) リパーゼ（Hass, M.J.など., (1991), Gene 109, 117-113),Ｒ．ニベウス(R. niveus) リパーゼ（Kugimiyaなど., (1992), Biosci. Biotech. Biochem., 56, 716-719)、及びＲ．オリザエ(R.oryzae) リパーゼ。
他のタイプの脂肪分解酵素、たとえばグチナーゼ、たとえばWO88/09367号に記載のようなプスードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina) に由来するクチナーゼ、又はフサリウム・ソラニ pisi (Fusarium solani pisi)に由来するクチナーゼ（たとえばWO90/09446号に記載される）もまた有用である。
【０１６６】
特に適切なリパーゼは、リパーゼ、たとえばＭ１  LipaseＴＭ， Luma fastＴＭ及び LipomaxＴＭ（Genencor),  LipolaseＴＭ及びLipolase UltraＴＭ（Novo Nordisk A/S）及びLipase P“Amano ”(Amano Pharmaceutical Co. Ltd.) である。
リパーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の 0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは 0.001〜0.5 重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2 重量％のレベルで導入される。
【０１６７】
アミラーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのアミラーゼ（α及び／又はβ）は、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された突然変異体が包含される。たとえば、アミラーゼは、イギリス特許第 1,296,839号により詳細に記載されるＢ．リケニホルミスの特定株から得られるα−アミラーゼを包含する。市販のアミラーゼは、 DuramylＴＭ，TermamylＴＭ，FungamylＴＭ及び BANＴＭ（Novo Nordisk A/Sから入手できる）、及びRapidaseＴＭ及び Maxamyl PＴＭ（Genencorから入手できる）である。
【０１６８】
アミラーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の 0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは 0.001〜0.5 重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2 重量％のレベルで組込まれる。
【０１６９】
セルラーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのセルラーゼが使用され得る。適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンス(Humicola insolens) から生成される菌類セルラーゼを開示するアメリカ特許第 4,435,307号に開示される。特に適切なセルラーゼは、色彩保護の利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許出願第 0495257号に記載されるセルラーゼである。
【０１７０】
市販のセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンスの株により生成される CelluzymeＴＭ（Novo Nordisk A/S）及び KAC-500 (B)ＴＭ（Kao Corporation)を包含する。
セルラーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の 0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは 0.001〜0.5 重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2 重量％のレベルで導入される。
【０１７１】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：ペルオキシダーゼ酵素は、過酸化水素又はその源（たとえば過炭酸塩、過硼酸塩又は過硫酸塩）と組合して使用される。オキシダーゼ酵素は、酸素と組合して使用される。両タイプの酵素は、“溶液漂白”するために、すなわち染色された布から他の布への、前記布が洗浄液体において一緒に、好ましくは、たとえばWO94/12621号及びWO95/01426号に記載されるような増強剤と一緒に洗浄される場合、織物染料の移行を妨げるために使用される。適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。
【０１７２】
ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素は、通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の 0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは 0.001〜0.5 重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2 重量％のレベルで導入される。
上記言及された酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及び／又はセルラーゼの混合物が、本明細書に包含される。
洗剤組成物に導入される、本発明の酵素又はいづれか他の酵素は通常、洗剤組成物に、前記組成物中の酵素タンパク質の 0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは 0.001〜0.5 重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2 重量％のレベルで導入される。
【０１７３】
漂白剤：本発明の洗剤組成物に含まれ得るさらなる任意の洗剤成分は、漂白剤、たとえば 400〜800 ミクロンの粒度を有するPB１，PB４及び過炭酸塩を包含する。それらの漂白剤成分は、１又は複数の漂白剤、及び選択される漂白剤に依存して、１又は複数の漂白活性化剤と包含することができる。存在する場合、酸素漂白化合物は典型的には、約１％〜約25％のレベルで存在するであろう。一般的に、漂白化合物は、非液体配合物、たとえば粒状洗剤における任意の添加される成分である。
本発明に使用するための漂白剤成分は、酸素漂白剤及び当業界において知られている他のものを含む洗剤組成物のために有用な漂白剤のいづれかであり得る。
本発明のために適切な漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤であり得る。
【０１７４】
使用され得る１つのカテゴリーの酸素漂白剤は、過カルボン酸漂白剤及びその塩を包含する。この種類の剤の適切な例は、マグネシウムモノペルオキシフタレート六水和物、メタ−クロロ過安息香酸のマグネシウム塩、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオン酸を包含する。そのような漂白剤は、アメリカ特許第 4,483,781号、アメリカ特許第 740,446号、ヨーロッパ特許第 0133354号及びアメリカ特許第 4,412,934号に開示される。ひじょうに好ましい漂白剤は、また、アメリカ特許第 4,634,551号に記載されるような６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸を包含する。
【０１７５】
使用され得るもう１つのカテゴリーの漂白剤は、ハロゲン漂白剤を包含する。次亜ハロゲン化物の例は、トリクロロイソシアヌル酸及びナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレート、及びＮ−クロロ及びＮ−ブロモアルカンスルホンアミドを包含する。そのような材料は通常、最終製品の 0.5〜10重量％、好ましくは１〜５重量％で添加される。
【０１７６】
過酸化水素開放剤は、漂白活性化剤、たとえばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS；アメリカ特許第 4,412,934号に記載される）、３，５−トリメチルヘキサノールオキシベンゼンスルホネート（ISONOBS ; ヨーロッパ特許第120591号に記載される）、又はペンタアセチルグルコース (PAG) (それらは、活性漂白種として過酸を形成するために過加水分解され、改良された漂白効果を導びく）と組合して使用され得る。さらに、漂白活性化剤C8（6−オクタンアミド−カプロイル）オキシベンゼン−スルホネート、C9（6−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンカルホネート、及びC10（6−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート、又はそれらの混合物は、ひじょうに適切である。また適切な活性化剤は、たとえばヨーロッパ特許出願第91870207.7号に開示されるようなアシル化されたシトレートエステルである。
【０１７７】
有用な漂白剤、たとえばペルオキシ酸、及び本発明の洗浄組成物への使用のための漂白活性化剤及び過酸素漂白化合物を含んで成る漂白システムがUSSN 08/136,626 に記載されている。過酸化水素はまた、洗浄及び／又はすすぎ工程の開始で又はその間、過酸化水素を発生することができる酵素システム（すなわち、酵素及びそのための基質）を添加することによっても存在することができる。そのような酵素システムは、ヨーロッパ特許出願第 0537381号に開示される。
【０１７８】
酸素漂白剤以外の漂白剤はまた当業界において知られており、そして本発明に使用され得る。特に興味ある１つのタイプの非酸素漂白剤は、光活性化された漂白剤、たとえばスルホン化された亜鉛及び／又はアルミニウムフタロシアニンを包含する。それらの材料は洗浄工程の間、支持体上に沈着され得る。酸素の存在下で、たとえば布を乾かすために日光につるすことによる日光による照射に基づいて、スルホン化された亜鉛フタロシアニンが活性化され、そして結果的に、支持体が漂白される。好ましい亜鉛フタロシアニン及び光活性化された漂白工程は、アメリカ特許第 4,033,718号に記載されている。典型的には、洗剤組成物は、約 0.025〜約1.25重量％のスルホン化された亜鉛フタロシアニンを含むであろう。
漂白剤はまた、マンガン触媒を含むことができる。マンガン触媒は、“Efficient mangunese catalysts for low-temperature bleaching ”，Nature 369, 1994, pp. 637-639 に記載される化合物の１つであり得る。
【０１７９】
石鹸水の泡抑制剤：もう１つの任意の成分は、シリコーン、及びシリカ−シリコーン混合物により例示される石鹸水の泡抑制剤である。シリコーンは一般的に、アルキル化されたポリシロキサン材料により示され、そしてシリカは通常、シリカエーロゲル及びキセロゲル、及び種々のタイプの疎水性シリカにより例示される細かく分割された形で使用される。それらの材料は粒状物として導入され得、ここで石鹸水の泡抑制剤が水溶性又は水分散性の実質的に非界面活性の洗剤不浸透性のキャリヤーに、好都合には、開放できるように導入される。他方では、石鹸水の泡抑制剤は、液体キャリヤーに溶解され又は分散され、そして１又は複数の他の成分上に噴霧することによって適用される。
【０１８０】
好ましいシリコーン石鹸水の泡調節剤は、アメリカ特許第 3,933,672号に開示される。他の特に有用な石鹸水の泡抑制剤は、ドイツ特許出願DTOS第 2,646,126号に記載される、自己乳化性シリコーン石鹸水の泡抑制剤である。そのような化合物の例は、シロキサン−グリコールコポリマーである、Dow Corning から市販されているDC−544 である。特に好ましい石鹸水の泡抑制剤は、シリコーン油及び２−アルキル−アルカノールの混合物を含んで成る石鹸水の泡抑制剤システムである。適切な２−アルキル−アルカノールは、商標Isofol 12 R として市販されている２−ブチル−オクタノールである。
【０１８１】
そのような石鹸水の泡抑制剤は、ヨーロッパ特許出願第 0593841号に記載される。
特に好ましいシリコーン石鹸水の泡調節剤は、ヨーロッパ特許出願第92201649.8号に記載される。前記組成物は、非多孔性ヒュームドシリカ、たとえば AerosilＲ  と組合して、シリコーン／シリカ混合物を含むことができる。
上記石鹸水の泡抑制剤は通常、組成物の 0.001〜２重量％のレベル、好ましくは0.01〜１重量％のレベルで使用される。
他の成分：洗剤組成物に使用される他の成分、たとえば土壌−沈殿防止剤、土壌−開放剤、螢光増白剤、石磨剤、殺菌剤、曇り阻止剤、着色剤、及び／又は封入された又は封入されていない香料が使用され得る。
特に適切な封入材料は、イギリス特許第 1,464,616号に記載されるような、ポリサッカリド及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
【０１８２】
他の適切な水溶性封入材料は、アメリカ特許第 3,455,838号に記載されるような、置換されたジカルボン酸のゲル化されていないスターチ酸エステルに由来するデキストリンを含んで成る。それらの酸−エステルデキストリンは好ましくは、ロウ質のトウモロコシ、ロウ質のモロコシ、サブ、タピオカ及びジャガイモのようなスターチから調製される。前記封入材料の適切な例は、National Starchにより製造されるＮ−Lok を包含する。そのＮ−Lok 封入材料は、変性されたトウモロコシスターチ及びグルコースから成る。そのスターチは、一官能置換された基、たとえばオクテニル無水琥珀酸を添加することによって変性される。
【０１８３】
本発明において適切な再沈着防止剤及び土壌沈殿防止剤は、セルロース誘導体、たとえばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシエチルセルロース、及びホモ−又はコポリマー性ポリカルボン酸又はそれらの塩を包含する。このタイプのポリマーは、ポリアクリレート、及びビルダーとして前で言及された無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、並びに無水マレイン酸とエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸とのコポリマー（前記無水マレイン酸はコポリマーの少なくとも20モル％を構成する）を包含する。それらの材料は、通常、組成物の 0.5〜10重量％のレベル、より好ましくは0.75〜８重量％のレベル、最とも好ましくは１〜６重量％のレベルで使用される。
【０１８４】
好ましい螢光増白剤は、アニオン特性のものであり、その例は、二ナトリウム４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート、二ナトリウム４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ−スチルベン−２：２’−ジスルホネート、二ナトリウム４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート、一ナトリウム４’，４”−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート、二ナトリウム４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート、二ナトリウム４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、二ナトリウム−４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、ナトリウム−２−スチルビル−４”−（ナフト−１’，２’：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２”−スルホネート、及び４，４’−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニルである。
【０１８５】
他の有用なポリマー材料は、ポリエチレングリコール、特に1000〜10000 の分子量、より好ましくは2000〜8000の分子量及び最とも好ましくは約4000の分子量のものである。それらは、0.20〜５重量％のレベル、より好ましくは0.25〜2.5 重量％のレベルで使用される。それらのポリマー及び前に言及されたホモ−又はコポリマー性ポリカルボキシレート塩は、遷移金属不純物の存在下で粘土、タンパク質性及び酸化できる土壌に対する白色度維持、布への灰分沈着、及び洗浄性能を改良するために価値がある。
【０１８６】
本発明の組成物において有用な土壌開放剤は便利には、テレフタル酸と種々の組合せでのエチレングリコール及び／又はプロピレングリコール単位とのコポリマー又はターポリマーである。そのようなポリマーの例は、アメリカ特許第 4,116,885号及び第 4,711,730号、及びヨーロッパ特許第 0270033号に開示される。ヨーロッパ特許第 0272033号による特に好ましいポリマーは、下記式：
CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO]2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75
〔式中、PEG は−(OC2H4)O−であり、POは（OC3H6O) であり、そしてＴは(POOC6H4CO) である〕を有する。
【０１８７】
ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリマーのような変性されたポリエステルがまたひじょうに有用であり、ここで末端基は主に、スルホベンゾエート、及び第二に、エチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成る。目標は、“主に”スルホベンゾエートにより両末端でキャップされたポリマーを得ることであり、本発明においては、本明細書における前記コポリマーのほとんどが、スルホベンゾエート基により末端キャップされるであろう。しかしながら、いくつかのコポリマーは、十分にキャップされず、そして従って、それらの末端基は、エチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成り、その理由から、“第二に”そのような種から成ることができる。
【０１８８】
本明細書における選択されたポリエステルは、約46重量％のジメチルテレフタル酸、約16重量％の１，２−プロパンジオール、約10重量％のエチレングリコール、約13重量％のジメチルスルホ安息香酸及び約15重量％のスルホイソフタル酸を含み、そして約 3,000の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は、ヨーロッパ特許第311342号に詳細に記載されている。
【０１８９】
軟化剤：希釈化剤はまた、本発明に従って洗濯洗剤組成物中に導入され得る。それらの剤は無機又は有機タイプのものであり得る。無機軟化剤は、GB−Ａ−１ 400898 及びアメリカ特許第 5,019,292号に開示されるスメクタイト粘土により例示される。有機軟化剤は、GB−Ａ１ 514276 及びヨーロッパ特許第 0011340号に開示されるような水不溶性第三アミン、及びEP−Ｂ− 0026528号に開示されるようなモノＣ１２−Ｃ１４第四アンモニウム塩とのそれらの組合せ、並びにヨーロッパ特許第 0242919号に開示されるようなジ−長鎖アミドを包含する。布軟化システムの他の有用な有機成分は、ヨーロッパ特許第 0299575号及び第 0313146号に開示されるような高分子量ポリエチレンオキシド材料を包含する。
【０１９０】
スメクタイト粘土のレベルは通常、５〜15重量％、より好ましくは８〜12重量％の範囲で存在し、そしてその材料は、配合物の残りに乾燥混合された成分として添加される。布用有機軟化剤、たとえば水不溶性第三アミン又はジ−長鎖アミド材料は、 0.5〜５重量％、通常１〜３重量％のレベルで導入され、ところが高分子量ポリエチレンオキシド材料及び水溶性カチオン性材料は 0.1〜２重量％、通常0.15〜1.5 重量％のレベルで添加される。それらの材料は通常、組成物の噴霧乾燥された部分に添加されるが、但し、いくつかの場合、組成物の他の固体成分上に、それらを乾燥混合された粒状物として添加し、又はそれらを溶融された液体として噴霧することがより便利である。
【０１９１】
ポリマー染料−移行阻害剤：本発明の洗剤組成物はまた、 0.001〜10重量％、好ましくは0.01〜２重量％、より好ましくは0.05〜１重量％のポリマー染料−移行阻害剤を含むことができる。前記ポリマー染料−移行阻害剤は通常、洗剤組成物により洗浄される布上への着色された布からの染料の移行を阻害するために洗剤組成物中に導入される。それらのポリマーは、染料が洗浄において他の製品に付着するようになる機会を有する前、染色された布から洗浄される不堅牢染料を複合体化し、又は吸収する能力を有する。
特に適切なポリマー染料−移行阻害剤は、ポリマーＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はそれらの混合物である。
そのようなポリマーの添加はまた、本発明の酵素の性能を増強する。
【０１９２】
本発明の洗剤組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状又は顆粒形で存在し得る。
非ダスチング粒質物は、たとえばアメリカ特許第 4,106,991号及び第 4,661,452号（両者ともNovo Industri A/S による）に開示されるようにして生成され得る、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。ロウ質被覆材料の例は、1000〜2000の平均分子量を有するポリ（エチレンオキサイド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG)；16〜50個のエチレンオキサイド単位を有するエトキシル化されたノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含み、そして15〜80個のエチレンオキサイド単位が存在するエトキシル化された脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。流動層技法による適用のために適切なフィルム−形成被覆材料の例は、イギリス特許第 1483591号に与えられている。
【０１９３】
本発明の粒状組成物はまた、“圧縮形”でも存在でき、すなわちそれらは従来の顆粒状洗剤よりも比較的高い密度、すなわち 550〜 950ｇ／ｌの密度を有することができ；そのような場合、本発明の粒状洗剤組成物は、従来の粒状洗剤に比較して、低い量の“無機充填剤塩”を含むだろうし；典型的な充填剤塩はスルフェート及びクロリドのアルカリ土類金属塩、典型的には硫酸ナトリウムであり；“圧縮”洗剤は典型的には、10％よりも高くない充填剤塩を含んで成る。本発明の液体組成物はまた、“濃縮された形”でも存在することができ、そのような場合、本発明の液体洗剤組成物は、従来の液体洗剤に比較して、低い量の水を含むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤の水含有率は、洗剤組成物の30重量％以下、より好ましくは20重量％以下、最とも好ましくは10重量％以下である。
【０１９４】
たとえば、本発明の組成物は、手動及び機械用洗濯洗剤組成物、たとえば洗濯用添加組成物及び染色された布の前処理への使用のために適切な組成物、添加されるすすぎ用布軟化剤組成物、及び一般的な家庭用硬質表面洗浄操作及び皿洗操作への使用のための組成物として配合され得る。
次の例は、本発明のために組成物を例示するものであって、本発明の範囲を必ずしも制限し、又は定義するものではない。
【０１９５】
洗剤組成物においては、略された成分の識別は次の意味を有する：
LAS ：ナトリウム線状Ｃ１２アルキルベンゼンスルホネート
TAS ：ナトリウム牛脂アルキルスルホネート、
XYAS：ナトリウムCIX−CIYアルキルスルフェート
SS：式２−ブチルオクタン酸の二次石鹸界面活性剤
25EY：平均Ｙモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣ１２−Ｃ１５の主に線状の第一アルコール
45EY：平均Ｙモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣ１４−Ｃ１５の主に線状の第一アルコール
XYEZS ：１モル当たり平均Ｚモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣＩＸ−ＣＩＹナトリウムアルキルスルフェート
【０１９６】
非イオン性：BASF Gmbh により商標Plurafax LF404として市販されている、平均3.8 のエトキシル化の程度及び平均4.5のプロポキシル化の程度を有するC13−C15の混合されたエトキシル化／プロポキシル化脂肪アルコール
CFAA：C12−C14アルキルＮ−メチルグルカミド
TFAA：C16−C18アルキルＮ−メチルグルカミド
シリケート：非晶性珪酸ナトリウム（SiO2：Na2Oの比＝2.0)
NaSKS-6：式δ−Na2Si2O5の結晶性積層シリケート
カーボネート：無水炭酸ナトリウム
ホスフェート：ナトリウムトリポリホスフェート
MA／AA：約80,000の平均分子量を有する、マレイン酸／アクリル酸（1:4）コポリマー
【０１９７】
ポリアクリレート：BASF Gmbh により商標PA30として市販されている、8,000 の平均分子量を有するポリアクリレートホモポリマー
ゼオライトＡ：１〜10μｍの範囲での一次粒度を有する、式 Na12(AlO2 SiO2)12・27H2O の水和化されたナトリウムアルミノシリケート
シトレート：クエン酸三ナトリウム・2H2O
クエン酸（citric) ：クエン酸
過硼酸塩：実験式 NaBO2・H2O を有する非晶性過硼酸ナトリウム・１H2O 漂白剤
【０１９８】
PB４：非晶性過硼酸ナトリウム・4H2O
過炭酸塩：実験式2Na2CO3・3H2O2を有する非晶性過炭酸ナトリウム漂白剤
TAED：テトラアセチルエチレンジアミン
CMC ：ナトリウムカルボキシメチルセルロース
DETPMP：商標Dequest 2060としてMonsontoにより市販されているジエチレントリアミン五（メチレンホスホン酸）
PVP ：ポリビニルピロリドンポリマー
EDDS：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二琥珀酸、ナトリウム塩の形での〔S,S〕異性体
洗濯水の泡抑制剤：50℃のMpt の25％パラフィンワックス、17％疎水性シリカ、58％パラフィン油
【０１９９】
粒状洗濯水の泡抑制剤：粒状形での12％シリコーン／シリカ、18％ステアリルアルコール、70％スターチ
スルフェート：非晶性硫酸ナトリウム
HMWPEO：高分子量ポリエチレンオキシド
TAE25 ：牛脂アルコールエトキシレート（25）
【０２００】
洗剤例Ｉ
本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製することができる：
ナトリウム線状Ｃ１２アルキルベンゼンスルホネート     6.5
硫酸ナトリウム                                      15.0
ゼオライトＡ                                        26.0
ナトリウムニトリロトリアセテート                     5.0
本発明の酵素                                         0.1
PVP                                                  0.5
TAED                                                 3.0
硼酸                                                 4.0
過硼酸塩                                            18.0
フェノールスルホネート                               0.1
水／少量                                           100％まで
【０２０１】
洗剤例II
本発明の布用圧縮粒状洗浄組成物（密度 800ｇ／ｌ）を次のようにして調製することができる：
45AS                                                 8.0
25E3S                                                2.0
25E5                                                 3.0
25E3                                                 3.0
TFAA                                                 2.5
ゼオライトＡ                                        17.0
NaSKS−６                                           12.0
クエン酸                                             3.0
カーボネート                                         7.0
MA／AA                                               5.0
CMC                                                  0.4
本発明の酵素                                         0.1
TAED                                                 6.0
過炭酸塩                                            22.0
EDDS                                                 0.3
粒状石鹸水の泡抑制剤                                 3.5
水／少量                                           100％まで
【０２０２】
洗剤例III 
着色された布の洗濯において特に有用である本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製した：
LAS                                   10.7            −
TAS                                    2.4            −
TFAA                                    −           4.0
45AS                                   3.1          10.0
45E7                                   4.0            −
25E3S                                   −           3.0
68E11                                  1.8            −
25E5                                    −           8.0
シトレート                            15.0           7.0
カーボネート                            −          10
クエン酸                               2.5           3.0
ゼオライトＡ                          32.1          25.0
Na−SKS −６                            −           9.0
MA／AA                                 5.0           5.0
DETPMP                                 0.2           0.8
本発明の酵素                           0.10          0.05
シリケート                             2.5            −
スルフェート                           5.2           3.0
PVP                                    0.5            −
ポリ（４−ビニルピリジン）−Ｎ−オキシド／ビニルイミダゾール及びビニルピロリドンのコポリマー                           −           0.2
過炭酸塩                               1.0            −
フェノールスルホネート                 0.2            −
水／少量                             100％まで
【０２０３】
洗剤例IV
“洗浄を通しての軟化”能力を提供する本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製することができる：
45AS                                    −          10.0
LAS                                    7.6            −
68AS                                   1.3            −
45E7                                   4.0            −
25E3                                    −           5.0
ココ−アルキル−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド
1.4           1.0
シトレート                             5.0           3.0
Na−SKS −６                            −          11.0
ゼオライトＡ                          15.0          15.0
MA／AA                                 4.0           4.0
DETPMP                                 0.4           0.4
過硼酸塩                              15.0            −
過炭酸塩                                −          15.0
TAED                                   5.0           5.0
スメクタイト粘土                      10.0          10.0
HMWPEO                                  −           0.1
本発明の酵素                           0.10          0.05
シリケート                             3.0           5.0
カーボネート                          10.0          10.0
粒状石鹸水の泡抑制剤                   1.0           4.0
CMC                                    0.2           0.1
水／少量                             100％まで
【０２０４】
洗剤例Ｖ
本発明の重質液体布用洗浄組成物を次のようにして調製することができる：
Ｉ            II
LAS 酸形                                −          25.0
クエン酸                               5.0           2.0
75AS酸形                               8.0            −
25AE2S酸形                             3.0            −
25AE7                                  8.0            −
CFAA                                   5              −
DETPMP                                 1.0           1.0
脂肪酸                                 8              −
オレイン酸                              −           1.0
エタノール                             4.0           6.0
プロパンジオール                       2.0           6.0
本発明の酵素                           0.10          0.05
ココ−アルキル−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド
−           3.0
スメクタイト粘土                        −           5.0
PVP                                    2.0            −
水／少量                             100％まで
【０２０５】
材料及び方法
株：
Ｂ．レンタス309 及び147 は、NCIBに寄託され、そして受託番号NCIB 10309及び10147 を与えられた、バシラス  レンタスの特定株であり、そして引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第 3,723,250号に記載される。
Ｅ．コリMC1000（M.J. Casadaban and S.N. Cohen (1980) ; J.Mol. Biol. 138 : 179-207) を、従来の方法によりｒ-，ｍ+にし、そしてそれはまた、アメリカ特許出願号 039,298号にも記載される。
【０２０６】
プラスミド：
pJS3：ズブチラーゼ309 をコードする合成遺伝子を含む、Ｅ．コリ−Ｂ．スブチリスシャトルベクター．（Jacob Schiodt など., Proten and Peptide letters 3 : 39-44 (1996)により記載される）。
pSX222：Ｂ．スブチリス発現ベクター（WO96/34946号に記載される）。
【０２０７】
一般的分子生物学法：
特にことわらない限り、DNA 操作及び形質転換は、分子生物学の標準方法を用いて実施した（Sambrookなど. (1989) Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Horbor Lab., Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, F.M. など. (eds.)“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons, 1995 ; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus ”，John Wiley and Sons, 1990)。DNA 操作のための酵素は、供給者の規格に従って使用された。
【０２０８】
DNA 操作のための酵素：
特にことわらない限り、DNA 操作のためのすべての酵素、たとえば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、等は、New England Biolabs, Inc. から得られる。
ランダム突然変異誘発されたライブラリーの構成：
局在化されたランダム突然変異誘発の実施：
突然変異誘発されるべきアミノ酸コドンに対応するヌクレオチドを除いて、突然変異されるべきDNA 配列の一部に対応する突然変異誘発プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成する。
【０２０９】
続いて、その得られる突然変異誘発プライマーを、適切な対抗するプライマーとのPCR 反応に使用する。得られるPCR フラグメントを精製し、そしてシャトルベクター中にクローン化する。
他方では、及び必要なら、その得られるPCR フラグメントを、消化、及びシャトルベクター中への前記突然変異誘発されたプライマーのクローニングを可能にするために第２の適切な対抗するプライマーと共にプライマーとして第２のPCR 反応に使用する。そのPCR反応は、通常の条件下で実施される。
【０２１０】
タンパク質分解活性：
本発明において、タンパク質分解活性は、Kilo Novo プロテアーゼ単位（KNPU）で表わされる。その活性は、酵素標準(SAVINASEO)に対して相対的に決定され、その決定は、タンパク質分解酵素によりジメチルカゼイン(DMC) 溶液を次の標準条件下で消化することに基づかれている：50℃，pH8.3 ，９分、９分の反応時間、３分の測定時間。フォルダーAF 220／１が、Novo Nordisk A/S，Denmark の要求に基づいて利用でき、ここでそのフォルダーは引用により組込まれる。
【０２１１】
GUは、標準条件下で、40℃での15分間のインキュベーションの間、基質としてＮ−アセチルカゼインを用いて、１ｍモルのグリシンに等しい量の NH２−基を生成するタンパク質分解酵素活性として定義されるグリシン単位である。
酵素活性はまた、Journal of American Oil Chemists Socienty, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., and Smith, L.A., (1988) に記載される、可溶性基質、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラニトロフェノールとの反応に従って、PNA アッセイを用いても測定され得る。
【０２１２】
発酵：
ズブチラーゼ酵素の発酵は、 100mlのBPX 培地を含む 500mlのバッフル三角フラスコにおいて30℃で５日間、回転振盪テーブル（300r.p.m.)上で行なわれた。結果的に、たとえば２ｌのブイヨンを製造するためには、20個の三角フラスコが同時に発酵された。高められた自己タンパク質加水分解安定性を有するプロテアーゼについて試験するためのアッセイ：
プロテアーゼを含むサンプルを、マイクロタイタープレート又は振盪フラスコのいづれかにおいてプロテアーゼの発現を可能にする適切な培地において、対照株を包含する株を増殖することによって製造する。
【０２１３】
プロテアーゼを含む個々のサンプルから、アリコートを取り、これに、１／10体積の２Ｍのグリシン−NaOH緩衝液を添加し、pHを10.0にし、そしてそのアリコートを、それぞれ４℃及び55℃で３時間インキュベートする。
インキュベーションの後、プロテアーゼ活性を、次の緩衝液における 0.6ｇ／ｌでの基質スクシニル−アラニン−アラニン−パラ−ニトロフェノール（Suc-Ala-Ala-pNA)を用いて決定する：150mM のKCl, 50mM のNa２B４O７  (pH は9.0 に調節される）。
20μｌのサンプル及び 180μｌの基質を、96−ウェルマイクロタイタープレートのウェルにおいて混合する。
【０２１４】
色の進行を、マイクロプレートリーダーにおいて 405nmで追跡する。
活性を、標準としてSavinaseＲを用いて決定する。
サンプルの残留活性を、４℃でインキュベートされるアリコートのプロテアーゼ活性に対する55℃でインキュベートされるアリコートのプロテアーゼ活性として百分率で計算する。
高められた残留活性を示すプロテアーゼを同定する。
【０２１５】
培地：BPX ：組成（１ｌ当たり）：
ジャガイモ  スターチ         100ｇ
粉砕された大麦                50ｇ
ダイズ粉末                    20ｇ
Na2HPO4・12H2O                  9ｇ
プルロニック                   0.1ｇ
カゼイン酸ナトリウム          10ｇ
培地中のスターチが、α−アミラーゼにより液化され、そして培地が 120℃で45分間、加熱することによって殺菌される。殺菌の後、培地のpHが、NaHCO３を 0.1Ｍまで添加することによって、９に調節される。
【０２１６】
例
本発明の酵素変異体の生成のためには、次に記載されるのと同じ材料及び方法を参照のこと：WO89/06279 (Novo Nordisk A/S）、ヨーロッパ特許第 130,756号（Genentech)、ヨーロッパ特許第 479,870号（Novo Nordisk A/S）、ヨーロッパ特許第 214,435号（Henkel) 、WO87/04461（Amgen)、WO87/05050 (Genex)、ヨーロッパ特許出願第87303761号（Genentech)、ヨーロッパ特許第 260,105号（Genencor) 、WO88/06624（Gist-Brocades NV) 、WO88/07578（Genentech)、WO88/08028 (Genex)、WO88/08033 (Amgen)、WO88/08164 (Genex)、Thomasなど. (1985) Nature, 318 : 375-376 ; Thomas など.(1987) J. Mol. Biol., 193 : 803-813 ; Russel and Fersht (1987) Nature 328 : 496-500 。当業界において広く確立された他の方法がまた、使用され得る。
【０２１７】
例１．酵素変異体の構成及び発現：
ズブチラーゼ309 特定部位変異体を、それぞれDengなど. (Anal. Biochem. 200 : 21-88 (1992)) 及びMarkvardsen など. (BioTechniques 18 (3) : 371-372 (1995)) により記載される、“Unique site elimination (USE) ”又は“Uracil-USE”技法により製造した。
鋳型プラスミドは、pJS3、又はズブチラーゼ309 の変異体を含むその類似体であった。USE 突然変異を、構造体R170L 変異体に対して指図されたオリゴヌクレオチドと共にY167A 変異体をコードする遺伝子を含むpJS3類似体に対して実施し、最終Y167A+R170L ズブチラーゼ309 変異体をもたらした。
【０２１８】
次に、pJS3に構成されたズブチラーゼ309 変異体を、制限酵素 KpnＩ及び Mlu２を用いて、Ｂ．スブチリスpSX222発現プラスミド中にサブクローン化した。
この構造体を用いて、コンピテントＢ．スブチリス株を形質転換し、そしてプロテアーゼを精製するために、10μｇ／mlのクロラムフェニコール(CAM) を含む培地において上記のようにして発酵した。
【０２１９】
例２．酵素変異体の精製：
この方法は、ズブチリシン147 酵素、ズブチリシン309 酵素又はその変異体の２ｌ規模の発酵の精製に関する。
約 1.6ｌの発酵ブイヨンを、１ｌのビーカーにおいて35分間、5000rpm で遠心分離した。上清液を10％酢酸を用いて、pHを6.5 に調節し、そしてSeitz Supra S100フィルタープレート上で濾過した。
【０２２０】
濾液を、Amicon S1Y10 UF 遠心分離機を備え付けられたAmicon CH2A UFユニットを用いて、約 400mlに濃縮した。UF濃縮物を、遠心分離し、そして濾過し、その後、pH７でBacitracin親和性カラム上で室温で吸収した。プロテアーゼを、室温でBacitracinカラムから、pH７に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、 0.1Ｍの硼酸及び 0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝溶液中、25％の２−プロパノール及び１Ｍの塩化ナトリウムを用いて溶離した。
【０２２１】
Bacitracin精製段階からのプロテアーゼ活性を有する画分を組合し、そしてpH6.5 に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、 0.2Ｍの硼酸及び 0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された 750mlのSephadex G25カラム（５cmの直径）に適用した。
Sephadex G25カラムからのタンパク質分解活性を有する画分を組合し、そしてpH6.5 に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、 0.2Ｍの硼酸及び 0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された 150mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交換カラム（５cmの直径）に適用した。
【０２２２】
プロテアーゼを、２ｌの同じ緩衝液（ズブチリシン147 の場合、０〜0.2 Ｍの塩化ナトリウム）における０〜0.1 Ｍの塩化ナトリウムの線状グラジエントを用いて溶離した。
最終精製段階においては、CM Sepharoseカラムの、プロテアーゼ含有画分を組合し、そしてGR81PP膜（Danish Sugar Factories Inc. からの）を備えたAmicon限外濾過セルにおいて濃縮した。
前記構成及び上記単離方法について例１の技法を用いることによって、次のズブチリシン309 変異体を生成し、そして単離した：
【０２２３】
Ａ：Y167I+R170L+A133P
Ｂ：Y167I+R170L+T134P
Ｃ：Y167I+R170L+A133P+T134P
Ｄ：Y167I+R170L+V104C+S132C
Ｅ：Y167I+R170L+A108C+T134C
Ｆ：Y167A+R170S+F189A
Ｇ：Y167A+R170S+Y192A
Ｈ：Y167A+R170S+Y192P
Ｉ：Y167A+R170S+Y192A+A194P
Ｊ：Y167A+R170S+Y192P+A194P
Ｋ：Y167A+R170S+F189G
Ｌ：Y167A+R170S+F189E
Ｍ：Y167A+R170S+F189R
Ｎ：Y167I+R170L
Ｍ：Y167I+R170L+A194P
Ｏ：Y167A+R170S+A194P
Ｐ：Y167A+R170L+A194P
Ｑ：Y167A+R170N+A194P
Ｒ：V104C+S132C+Y167I+R170L
Ｓ：A108C+T134C+Y167I+R170L
【０２２４】
例３．自己分解切断部位の同定：
SavinaseＲ変異体Ｎ：167I+R170Lの画分（上記のような精製の後）は、 SDS−PAGE分析により、自己分解分解にたぶん起因する２つのバンドを含むことが見出された。前記バンドはそれぞれ、12KDa及び10KDa のMrを伴って移動した。それらの２つのバンドを構成するペプチドのＮ−末端アミノ酸配列を、 SDS−PAGE、及びPVDF膜上へのエレクトロブロットに従って決定した。
Mr12KDa を伴って移動するバンドのＮ−末端アミノ酸配列は、Ｎ：Y167I+R170L のＮ−末端アミノ酸配列に対して同一であるAla-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-であることが見出された。
【０２２５】
Mr10KDa を伴って移動するＮ−末端アミノ酸配列は、Ｎ：Y167I+R170L におけるアミノ酸残基 187〜195 (BPN' 番号付けによる残基 193〜201)のアミノ酸配列に対して同一であるGly-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile-Val-Ala-Pro-であることが見出された。これは、Ｎ：Y167I+R170L におけるアミノ酸残基186 及び187 (BPN' 番号付けによる残基192 及び193)間のペプチド結合を、自己分解切断部位として同定する。
前記画分のマトリックス助力レーザー脱着イオン化time-of-flight質量分光学（Matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry) は、２種の成分の質量がそれぞれ、12,997.5KDa ±BKDa及び8,397.8KDa±８KDa であることを示した。
【０２２６】
Ｎ：Y167I+R170L におけるアミノ酸残基 187〜269 (BPN' 番号付けによる残基 193〜275)から成る自己分解フラグメントの理論的質量は、8,397.3KDaであり、それにより、他の自己分解切断部位が残基186 側Ｃ−末端で生じなかったことを確かめた。
より大きなフラグメント（12,997.5KDa)の質量値を用いて、他の自己分解切断がＮ：Y167I+R170L におけるアミノ酸残基130 及び131 （BPN'番号付けによる残基132 及び133)間に生じることを推定することが可能である。Ｎ：Y167I+R170L におけるアミノ酸残基１〜300 (BPN' 番号付けによる残基１〜132)から成る自己分解フラグメントの理論的質量は、12,699.1KDa である。
【０２２７】
Ｎ：Y167I+R170L における自己分解切断部位のそれらの発見を実証するために、プロテアーゼを、 0.1Ｍのリン酸ナトリウム(pH7.5) において37℃で、２mg／mlの濃度でインキュベートした。０分〜６時間までの種々の時点で、インキュベーション混合物の20μｌアリコートを取り、そして１％  TFA 80μｌを添加し、Ｎ：Y167I+R170L のタンパク質加水分解活性の不可逆的阻害をもたらす。マトリックス助力レーザ脱着time-of-flight質量分光計による分析まで、サンプルをフリーザーに保持した。
質量分光計の結果は、それぞれ12,698.9KDa ±13KDa 及び8,396.1KDa±８KDa の質量を有するフラグメントの量の定常上昇、及び26,607.0KDa ±26KDa の質量を有する成分の定常減少を明確に示した。
【０２２８】
例４．ランダムプロテアーゼ変異体の構成
３個のランダムライブラリーを、自己タンパク質加水分解切断部位 132〜133 の近くで構成した。３個のライブラリーの個々において、BLS309変異体Y167I+R170L を鋳型として使用した。
アミノ酸（aa）１） 129〜131 ，２） 132〜133 ，３） 134〜135 の３個のライブラリーの構成を、上記材料及び方法セクションに記載のようにして調製した。
突然変異誘発されることが所望されるアミノ酸コドンで第１及び第２塩基における４個々の塩基の個々25％を有する１つのオリゴヌクレオチドを合成した。１又は２個のコドンを有するアミノ酸への変更のためのより大きな見込みを付与するために50％Ｇ／50％Ｃを有する、コドンにおける第３ヌクレオチド（wobble塩基）を合成した。
【０２２９】
突然変異誘発プライマーを、鋳型として、適切な対抗プライマー及びプラスミドpJS3：（Y167I+R170L)とのPCR 反応に使用した。得られるPCR フラグメントを精製し、そしてその得られるPCR フラグメントを、第２の適切な対抗プライマーと共にプライマーとして第２のPCR 反応に使用した。この段階は、突然変異誘発された領域を消化し、そしてpJS3シャトルベクター中にクローン化できるために好都合であった。
10,000〜80,000クローン／ライブラリーを含む、領域 129〜131, 132〜133, 134〜135 のライブラリーを調製した。
10個のランダムに選択されたクローンを配列決定し、企画された突然変異を確かめた。
【０２３０】
例５．高められた自己タンパク質加水分解活性を有するプロテアーゼ変異体の同定
例４に記載のようにして構成された個々のライブラリーにおけるクローンを、上記のようにして、自己タンパク質加水分解安定性について試験する。
個々のライブラリーのために、 500個の個々のクローンを、10μｇ／mlのクロラムフェニコール(CAM) を有するLB培地 200mlにおいて37℃で一晩、マイクロタイタープレートにおいてインキュベートする。
【０２３１】
対照株としてSAVINASEＲ変異体Ｎ：Y167I+R170L を用いて、相対的に高められた自己タンパク質加水分解安定性を有する変異体：Ｘ：A133D+Y167I+R170L ，Ｙ：P129K+Y167I+R170L 、及びGG：P129K+P131H+Y167I+R170L を同定した。
これは、 132〜133 間に位置する自己タンパク質加水分解切断部位の近くの置換（P129K, P131H, A133P)が高められた自己タンパク質加水分解安定性を提供することを示す。
【０２３２】
例６．高められたタンパク質加水分解安定性を有する変異体による比較的発酵実験
SavinaseＲ変異体“Ｍ：Y167I+R170L+A194P ”を、残基 192〜193 間に位置する自己タンパク質加水分解分裂部位の近くにA194P 置換を有さないその前駆体変異体“Ｎ：Y167I+R170L ”と、発酵実験において比較した。
両変異体を、pSX222発現ベクターバックグラウンドにおいてクローン化し、そして10μｇ／mlのCAM を含む 100mlのBPX 培地において、上記のようにして発酵した。
５日間の発酵の後、BPX 発酵培地15mlを遠心分離し、そして上清液を、上記のようにして、タンパク質加水分解活性（KPNU）を測定するために使用した。
【０２３３】
“Ｍ：Y167I+R170L+A194P ”を含む発酵培地は、“Ｎ：Y167I+R170L ”変異体を含む発酵培地に比較して、有意に高いレベルのタンパク質加水分解活性を有した。
両変異体が同じ比活性を有すると現在思われており、そして従って、“Ｍ：Y167I+R170L+A194P ”変異体を含む発酵培地における高いタンパク質加水分解活性は、A194P 置換を有さない“Ｎ：Y167I+R170L ”前駆体変異体に比較して、“Ｍ：Y167I+R170L+A194P ”における相対的に高められた自己タンパク質加水分解安定性のためであると現在思われる。
類似する結果が、A194P 突然変異を有さないそれらの対応する前駆体変異体と比較して、変異体Ｏ：Y167A+R170S+A194P ，Ｐ：Y167A+R170L+A194P 及びＱ：Y167A+R170N+A194P により得られた。
【０２３４】
さらに、類似する結果が、A133P 突然変異を有さないその対応する前駆体変異体と比較して、変異体HH：Ａ133P+Y167A+R170Sにより得られた。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、表Ｉに示される多くのズブチラーゼの一列配列を示す。
【図１】
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