(57)【要約】      （修正有）【課題】  新規なマンナナーゼ、その形質転換体及びその使用方法。【解決手段】  特定のアミノ酸配列を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにクローン化されたマンナナーゼ遺伝子、その形質転換体、及びマンナーゼの製造法。マンナーゼおよびセルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素、キシログルカナーゼ等を含む酵素調整物、洗浄組成物、及び繊維、古紙、コーヒー抽出物処理、歯、コンタクトレンズ及び身辺洗浄用途への使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ１）E.コリDSM12180に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ１）配列番号６の位置32〜344に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ１）上記（ａ１）もしくは（ｂ１）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は（ａ１），（ｂ１）もしくは（ｃ１）のフラグメント；
（ａ２）E.コリDSM12433に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ２）配列番号10の位置32〜362に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ２）上記（ａ２）もしくは（ｂ２）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ２），（ｂ２）もしくは（ｃ２）のフラグメント；
（ａ３）E.コリDSM12441に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ３）配列番号１２の位置33〜331に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ３）上記（ａ３）又は（ｂ３）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ３），（ｂ３）もしくは（ｃ３）のフラグメント；
（ａ４）E.コリDSM9984に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ４）配列番号１４の位置166〜488に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ４）上記（ａ４）もしくは（ｂ４）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ４），（ｂ４）もしくは（ｃ４）のフラグメント；
（ａ５）E.コリDSM12432に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ５）配列番号１６の位置68〜369に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ５）上記（ａ５）もしくは（ｂ５）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は（ａ５），上記（ｂ５）もしくは（ｃ５）のフラグメント；
（ａ６）E.コリDSM12849に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ６）配列番号２２の位置29〜320に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ６）上記（ａ６）もしくは（ｂ６）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ６），（ｂ６）もしくは（ｃ６）のフラグメント；
（ａ７）E.コリDSM12180に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ７）配列番号２６の位置301〜625に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ７）上記（ａ７）又は（ｂ７）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ７），（ｂ７）もしくは（ｃ７）のフラグメント；
（ａ８）E.コリDSM12851に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ８）配列番号２８の位置166〜496に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ８）上記（ａ８）もしくは（ｂ８）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ８），（ｂ８）もしくは（ｃ８）のフラグメント；
（ａ９）E.コリDSM12852に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ９）配列番号３０の位置26〜361に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ９）上記（ａ９）もしくは（ｂ９）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は（ａ９），（ｂ９）もしくは（ｃ９）のフラグメント；
（ａ１０）E.コリDSM12436に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
（ｂ１０）配列番号３２の位置593〜903に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
（ｃ１０）上記（ａ１０）もしくは（ｂ１０）に定義されるポリペプチドと少なくとも85％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ１０），（ｂ１０）もしくは（ｃ１０）のフラグメント、である単離されたマンナナーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のマンナナーゼをコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、請求項１に記載のマンナナーゼの製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載のマンナナーゼを含んで成る酵素調製物。
【請求項７】
プロテアーゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ）、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はそれらの混合物から成る群から選択された１又は複数の酵素をさらに含んで成る請求項６記載の調製物。
【請求項８】
（i）同種不純物を有さず、そして（ii）請求項５記載の方法により生成される、マンナナーゼ活性を有する単離された酵素。
【請求項９】
有効量の請求項６記載の調製物又は有効量の請求項１に記載の酵素により処理される、セルロース、又は合成ファイバー、糸、織布又は不織布の性質を改良するための方法。
【請求項１０】
前記酵素調製物又は酵素が糊抜工程段階に使用される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
植物材料の変性又は修飾のための方法であって、前記植物材料を有効量の請求項６記載の調製物又は有効量の請求項１に記載の酵素により処理する方法。
【請求項１２】
前記植物材料が、リサイクル故紙；機械的、化学的、半化学的クラフト又は他のクラフト紙製造用パルプ；浸水工程にゆだねられたファイバー；又はグアーガムもしくはイナゴマメガム含有材料である請求項11記載の方法。
【請求項１３】
液体コーヒー抽出物を処理するための方法であって、前記コーヒー抽出物を有効量の請求項６記載の調製物又は有効量の請求項１に記載の酵素により処理する方法。
【請求項１４】
請求項６記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素を含んで成る洗浄用組成物。
【請求項１５】
セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼ；並びに従来の洗剤成分から選択された酵素をさらに含んで成る請求14記載の洗浄組成物。
【請求項１６】
前記酵素又は酵素調製物が、組成物合計の0.0001〜２重量％、好ましくは0.0005〜0.5重量％、より好ましくは0.001〜0.1重量％（純粋な酵素）のレベルで存在する請求項14記載の洗浄組成物。
【請求項１７】
前記酵素又は酵素調製物が、組成物合計の0.0001〜２重量％、好ましくは0.0005〜0.5重量％、より好ましくは0.001〜0.1重量％（純粋な酵素）のレベルで存在する請求項15記載の洗浄組成物。
【請求項１８】
前記酵素がアミラーゼである請求項15記載の洗浄組成物。
【請求項１９】
セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択されたさらにもう１つの酵素をさらに含んで成る請求項18記載の洗浄組成物。
【請求項２０】
アニオン性、非イオン性、カチオン性界面活性剤、及び/又はそれらの混合物から選択された界面活性剤を含んで成る請求項14記載の洗浄組成物。
【請求項２１】
漂白剤を含んで成る請求項14記載の洗浄組成物。
【請求項２２】
ビルダーを含んで成る請求項14記載の洗浄組成物。
【請求項２３】
２つの長い鎖を含んで成るカチオン性界面活性剤を含んで成る請求項２１記載の繊維製品軟化組成物。
【請求項２４】
布の機械処理のための方法であって、請求項６記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素を含む洗浄溶液により、機械洗浄工程の洗浄サイクルの間、繊維製品を処理することを含んで成る方法。
【請求項２５】
セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項６記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素の、繊維製品清浄及び/又は繊維製品しみぬきのためのクリーニング組成物への使用。
【請求項２６】
セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項６記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素の、硬質表面、例えば床、壁、浴室のタイル及び同様のものを清浄するためのクリーニング組成物への使用。
【請求項２７】
セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項６記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素の、手による及び機械皿洗いのためのクリーニング組成物への使用。
【請求項２８】
セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及び/又はキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項６記載の酵素調製物又は請求項１に記載の酵素の、経口、歯、コンタクトレンズ及び身辺清浄用途のための洗浄組成物への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物マンナナーゼ、より具体的には、中性及びアルカリpH範囲でそれらの主要酵素活用そしてマンナナーゼ活性を示す微生物酵素；そのような酵素を生成する方法；及びパルプ、布、油田掘削、清浄、洗濯、洗剤及びセルロース繊維加工産業へのそのような酵素の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンナン含有多糖類は、木材におけるヘミセルロース画分、及び多くのマメ科種子及び非マメ科植物のいくつかの成熟種子における内胚乳の主要成分である。実質的に置換されていない線状β−１、４−マンナンは、いくつかの非マメ科植物に見出される。例えば、ゾウゲヤシに存在する置換されていないβ−１、４−マンナンは、個々の多糖鎖の配座においてセルロースに似ており、そして水不溶性である。マメ科種子において、水溶性ガラクトマンナンは、合計乾量の20％までを構成する主要貯蔵炭水化物である。
【０００３】
ガラクトマンナンは、単一のα−１，１，６−ガラクトースにより置換された、任意にはアセチル基により置換された線状β−１，４−マンナン主鎖を有する。マンナンはまた、いくつかの単子葉植物にも見出され、そしてヤシ種子粉における細胞壁材料において最も豊富な多糖である。グルコマンナンは、多かれ少なかれ、規則的な態様で交互にβ−１，４−結合のマンノース及びグルコースの主鎖を有する線状多糖類であり、前記主鎖は任意には、ガラクトース及び/又はアセチル基により置換されている。マンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン及びガラクトグルコマンナン（すなわち、枝分かれガラクトースを有するグルコマンナン主鎖）は、軟木ヘミセロースの50％以上に寄与する。
【０００４】
さらに、多くの赤藻類のセルロースは、有意な量のマンノースを含む。マンナナーゼは、いくつかのバチルス生物に同定されている。例えば、Talbotなど., Appl. Environ. Microbiol., Vol.56, N.11, pp.3505-3510 (1990) は、162kDaの分量及び5.5〜7.5の最適pHを有するダイマー形での、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）に由来するβ−マンナナーゼを記載する。Mendozaなど., World J. Microbiol. Biotech., Vol. 10, No.5, pp.551-555 (1994) は、38kDaの分子量、pH5.0及び55℃での最適pH及び4.8のpIを有する、バチルス・サブチリスに由来するβマンナナーゼを記載する。
【０００５】
日本特許出願第03047076号は、ゲル濾過により測定される37±3kDaの分子量、３〜８の最適pH及び5.3〜5.4のpIを有する、バチルスsp. に由来するβマンナナーゼを開示する。日本特許出願第63056289号は、例えばマンナンのβ−１，４−D−マンノピラノシド結合を加水分解し、そしてマンノ−オリゴ糖を生成するアルカリ性熱安定βマンナナーゼの生成を記載する。日本特許出願第63036775号は、アルカリ性pHでβ−マンナナーゼ及びβ−マンノシダーゼを生成するバチルス微生物FERM  P−8856を言及する。日本特許出願第08051975号は、43±kDa及び57±3kDaの分子量及び８〜10の最適pHを有する、好アルカリバチルスsp. AM-001に由来するアルカリβ−マンナナーゼを開示する。
【０００６】
パルプ及び紙の漂白において有用なバチルス・アミロリクエファシエンスからの精製されたマンナナーゼ、及びその生成方法が、WO97/11164に開示される。WO91/18974号は、極端なpH及び温度で活性的なヘミセルラーゼ、例えばグルカナーゼ、キシラナーゼ又はマンナナーゼを記載する。WO94/25576号は、植物又は藻類細胞壁材料の分解又は変性のために有用であるマンナナーゼ活性を示す、アスペルギラス・アキュレアタス（Aspergillus aculeatus）CBS101.43からの酵素を開示する。WO93/24622号は、リグノセルロース性パルプの漂白のために有用なトリコダーマ・レセイ（Trichoderma reseei）から単離されたマンナナーゼを開示する。
【０００７】
WO95/35362号は、植物起源のしみの除去のためのペクチナーゼ及び/又はヘミセルラーゼ及び任意にはセルラーゼ活性を有する植物細胞壁酵素を含む清浄組成物を開示し、そしてさらに、C11SB.G17株からのアルカリマンナナーゼを開示する。
例えば、清浄組成物又は異なった産業工程に適用される場合、またはアルカリ性pH範囲においてマンナナーゼ活性を示す新規且つ効果的な酵素を提供することが、本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００８】
本発明者は、実質的なマンナナーゼ活性を有する新規酵素、すなわちバチルス属の細胞株から得られる、マンナナーゼ活性を示す酵素を現在見出しており、そしてそのような酵素ををコードするDNA配列の同定に成功した。前記DNA配列は、配列番号1, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29及び31として列挙する配列に列挙され；そして推定されるアミノ酸配列は、配列番号2, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30及び32として列挙する配列に列挙される。前記新規酵素は酵素分類EC3.2.1.78における酵素命名法に従って分類されると思われる。
【０００９】
第１の観点においては、本発明は，i) バチルスsp.I633により生成されるポリペプチド、ii)配列番号２の位置31〜330に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又はiii)上記 i) もしくはii) に定義されるポリペプチドと少なくとも65％相同であり、１又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ポリペプチドから誘導され、又は精製された形での前記ポリペプチドに対して生ぜしめられたポリクローナル抗体と免疫学的に反応する前記定義されたポリペプチドの類似体であるマンナナーゼに関する。
【００１０】
１つの観点においては、本発明は、（ａ）マンナナーゼ活性を有し、そしてヌクレオチド91〜ヌクレオチド990の配列番号１に示されるようなヌクレオチドの配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；（ｂ）上記（ａ）の種相同体；（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基330のアミノ酸配列に対して少なくとも65％同一であるマンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポイヌクレオチド分子；上記（ｄ）（ａ），（ｂ）もしくは（ｃ）に対して相補的な分子；及び（ｅ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）の変性ヌクレオチド配列から成る群から選択された，単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１１】
本発明のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチド分子（DNA配列）を含んで成るプラスミドpBXM3を用いて、寄託番号DSM12197として1998年5月29日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany でのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure にブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換した。
【００１２】
本発明のもう1つの観点においては、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；（ａ）ヌクレオチド91〜ヌクレオチド990の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成る、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、（ｂ）（ａ）の種相同体；（ｃ）アミノ酸残基31〜アミノ酸残基330の配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも65％同一である、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の変性ヌクレオチド配列から成る群から選択されたDNAセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターが提供される。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの観点においては、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている培養された細胞が提供され、ここで前記細胞はDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。
本発明のさらなる観点は、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸残基31〜アミノ酸残基330のアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチド分子；（ｂ）上記（ａ）の種相同体；及び（ｃ）マンナナーゼ活性を示す第１ポリペプチド部分及びセルロース結合機能を示す第２ポリペプチド部分を含んで成るマンナナーゼ活性を有する融合タンパク質（前記第２ポリペプチドは好ましくは、セルロース結合ドメイン（CBD），例えば配列番号４により示される結合タンパク質である）から成る群から選択されたマンナナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明のもう１つの観点においては、他のポリペプチドと組合して、本発明の精製されたポリペプチドを含んで成る組成物が提供される。
本発明のもう１つの観点においては、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている細胞を培養し、（それにより、前記細胞が前記DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する）、そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法が提供される。
【００１５】
本発明の新規酵素は、セルロース材料、特にセルロース含有ファイバー、糸、織布又は不織布の処理、機械紙−製造パルプ、クラフト紙又は再循環された故紙の処理、及び繊維の浸水のために有用である。前記処理は、紙、又は被服又は布の製造の準備のための材料へのセルロース材料の加工の間（後者は、例えば糊抜き又は精練段階において存在する）；又はそのような布又は被服の産業用又は家庭用洗浄の間に実施され得る。
従って、さらなる観点においては、本発明は、本発明の酵素を含んで成る清浄又は洗剤組成物；及びセルロース含有ファイバー、糸、織布又は不織布、及び合成又は一部合成布の処理、例えば清浄のためへの本発明の酵素の使用に関する。
【００１６】
本発明の酵素は、続く染色操作における正しい応答のためのセルロース材料の調製における酵素精練工程及び/又は糊抜き（マンナン糊剤の除去）において有用である。前記酵素又は、マンナン含有プリント用ペーストの除去のためにも有用である。さらに、新規酵素を含んで成る洗剤組成物は、洗濯物上に存在する土壌又はしみ、特にマンナン含有食品、植物及び同様のものに起因する土壌及びスポトを除去し又は漂白することができる。さらに、新規酵素を含んで成る清浄又は洗剤組成物による処理は、白色度を改良し、そしてセルロース材料への土壌の結合を妨げる。
【００１７】
従って、本発明はまた、本発明のマンナナーゼを含んで成る清浄組成物、例えば洗濯、皿洗い、硬質表面クリーナー、身辺用クレンジング及び経口/歯用組成物にも関する。さらに、本発明は、マンナナーゼ、及びセルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素を含んで成るそのような清浄組成物にも関し、そのような組成物は、卓越した清浄性能、すなわち卓越したしみの除去、ディンギー清浄又は白色性維持を付与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
定義：
本発明を、さらに詳細に論じる前、次の用語をまず定義するであろう。
用語“オルト体（ortholog）”（又は“種相同体”）とは、異なった種からの類似するポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する１つの種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
用語“パラ体（paralog）”とは、同じ種からの異なったポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する所定の種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
【００１９】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結された対象ポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、線状又は環状DNA分子を示す。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を包含することができ、そして任意には、１又は複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを含むことができる。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAに起因し、又は両要素を含むことができる。
【００２０】
本発明の発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられるいずれかの発現ベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である、染色体外実存体として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。
【００２１】
用語“組換え発現される”又は“組換え的に発現される”とは、ポリペプチド又はタンパク質の発現に関して本明細書において使用される場合、当業界における標準の定義に従って定義される。タンパク質の組換え的発現は一般的に、上記に記載されるような発現ベクターを用いることによって行われる。
【００２２】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチド分子に適用される場合、そのポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から除去されており、そして従って他の外来の又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成系内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノムクローンを含むそれらの分子である。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常関連する他の遺伝子を有さないが、しかし天然に存在する5'及び3'側の未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターは含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、Dynan and Tijan, Nature 319: 774-78, 1985を参照のこと）。用語“単離されたポリヌクレオチド”とは他方では、“クローン化されたポリヌクレオチド”とも称することができる。
【００２３】
タンパク質/ポリペプチドに適用される場合、用語“単離された”とは、タンパク質がその天然の環境以外の条件において見出されることを示す。好ましい形においては、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（すなわち“相同不純物”（下記参照のこと））を実質的に有さない。40％よりも高い純粋な形、より好ましくは60％よりも高い純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
さらにより好ましくは、SDS−PAGEにより決定される場合、高く精製された形、すなわち80％以上、より好ましくは95％以上、及びさらにより好ましくは99％以上の純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
【００２４】
用語“単離されたタンパク質/ポリペプチド”とは、他方では、“精製されたタンパク質/ポリペプチド”とも呼ばれ得る。
用語“相同不純物”（homologous impurity）とは、本発明のポリペプチドが最初に得られる相同細胞に起因するいずれかの不純物（例えば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプチド）を意味する。
用語“〜から得られた”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドが特定源（相同発現）により、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞（非相同発現）により生成されることを意味する。
【００２５】
用語“作用可能に連結される”とは、DNAセグメントに言及する場合、そのセグメントが、それらの意図された目的に関して機能するよう、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを意味する。
用語“ポリヌクレオチド”とは、5'から3'末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを示す。ポリヌクレオチドはRNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。
【００２６】
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、対照配列に比較して、相補的な塩基配列及び逆の配向を有するポリヌクレオチドを示す。例えば、配列5' ATGCACGGG 3'は、5' CCCGTGCAC 3'に対して相補的である。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較して）。縮重コドンは、異なったヌクレオチドトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれ、Aspをコードする）。
【００２７】
用語“プロモーター”とは、RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の5'非コード領域に検出されるが、しかし必ずしもそうではない。
用語“分泌シグナル配列”とは、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通してそのより大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。大きなペプチドは、通常、分泌経路を通して、遷移の間、分泌ペプチドを除去するために分解される。
用語“酵素コア”とは、修飾又は変更されているか又はされていないが、しかしその元の活性を保持している単一ドメイン酵素を示し；当業界において知られているような触媒ドメインは損なわれていないまま及び機能的のまま存続した。
【００２８】
用語“リンカー”又は“スペーサー”とは、複数ドメインタンパク質、例えば酵素コアを含んで成る酵素のドメインと結合ドメイン、例えばセルロース結合ドメイン（CBD）又はいずれか他の酵素ハイブリッドとの間に、又は融合ポリペプチド、例えば２種のコア酵素を含んで成る融合タンパク質として発現される２種のタンパク質又はポリペプチド間に存在することができる少なくとも２種のアミノ酸を含んで成るポリペプチドを意味する。例えば、CBDと酵素コアとの融合タンパク質は、酵素コアをコードするDNA配列、リンカーをコードするDNA配列及びCBDをコードするDNA配列を、１つの読み取り枠中に連続的に融合し、そしてこの構造体を発現することによって供給される。
【００２９】
用語“マンナナーゼ”又は“ガラクトマンナナーゼ”とは、マンナン  エンド−１，４−β−マンノシダーゼと公的に命名され、そして他の名称β−マンナナーゼ及びエンド−１，４−マンナナーゼを有し、そしてマンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン及びガラクトグルコマンナンにおける１，４−β−D−マンノシドの結合の加水分解を触媒するものとして当業界において定義されているマンナナーゼ酵素を示し、この酵素はEC3.2.1.78としての酵素命名法（http://www.ch/enzyme）に従って分類される。
【００３０】
発明の特定の記載：
他の関連する配列を得るためへの本発明の配列の使用法：本発明のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチド配列に関連する本発明に開示される配列情報が他の相同マンナナーゼを同定するための手段として使用され得る。例えば、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）が、種々の微生物源、特に異なったバチルス種からの他の相同マンナナーゼをコードする配列を増幅するために使用され得る。
【００３１】
活性試験についてのアッセイ：
マンナナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、当業界において知られている標準の試験方法に従って、例えば0.2％のAZCLガラクトマンナン（carob）、すなわちMegazymeの会社（Megazymeのインターネットアドレス：http://www.megazyme.com/Purchase/Index.html）からカタログNo.I-AZGMAとして入手できるエンド−１，４−D−マンナナーゼのアッセイのための基質を含む寒天プレートに押しぬかれた4mmの直径の穴に試験されるべき溶液を適用することによって試験され得る。
【００３２】
ポリヌクレオチド：
本発明の好ましい態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも中位の緊縮条件下で、配列番号1の類似する大きさの領域にハイブリダイズするであろう。
【００３３】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示される十分な配列又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号1の位置91〜990に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号1の位置91〜990に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろう。
【００３４】
ヌクレオチドプローブと相同DNA又はRNA配列の間の、中位又は高い緊縮下でのハイブリダイゼーションを決定するための適切な実験条件は、５×SSC（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム、Sambrook など., 1989）において、ハイブリダイズするDNAフラグメント又はRNAを含むフィルターの10分間のプレソーキング、及び５×SSC、５×Denhardtの溶液（Sambrookなど., 1989）、0.5％SDS及び100μg/mlの変性され、音波処理されたサケ精子DNA（Sambrookなど., 1989）の溶液におけるフィルターのプレハイブリダイゼーション、続いて、10ng/mlの濃度のランダム−プライムされた（Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13）、32P−dCTP−ラベルされた（１×109cpm/μgよりも高い比活性）プローブを含む同じ溶液における約45℃で12時間のハイブリダイゼーションを包含する。
【００３５】
次に、フィルターは、２×SSC, 0.5％SDSにより、少なくとも60℃（中位の緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（中位/た化位緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも70℃（高い緊縮性）、及びさらにより好ましくは少なくとも75℃（非常に高い緊縮性）で、30分間、2度洗浄される。
オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X−線フィルムを用いて検出される。
他の有用な単離されたポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29もしくは31の類似するサイズの領域、又はそれらに対して相補的な配列に、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズするであろうそれらのポリヌクレオチドである。
【００３６】
特に有用なポリヌクレオチドは次のものである：
配列番号１に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号1の位置91〜990に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号1の位置91〜990に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００３７】
配列番号５に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号５の位置94〜1032に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号５の位置94〜1032に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００３８】
配列番号９に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号９の位置94〜1086に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号９の位置94〜1086に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００３９】
配列番号11に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号11の位置97〜993に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号11の位置97〜993に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４０】
配列番号13に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号13の位置498〜1464に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号13の位置498〜1464に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４１】
配列番号15に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号15の位置204〜1107に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号15の位置204〜1107に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４２】
配列番号17に示される配列を含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する配列番号17の副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４３】
配列番号19に示される配列を含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する配列番号19の副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４４】
配列番号21に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号21の位置88〜960に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号21の位置88〜960に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４５】
配列番号23に示される十分な配列を含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する配列番号23の副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４６】
配列番号25に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号25の位置904〜1874に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号25の位置904〜1874に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４７】
配列番号27に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号27の位置498〜1488に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号27の位置498〜1488に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４８】
配列番号29に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号29の位置79〜1083に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号29の位置79〜1083に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４９】
及び配列番号31に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号31の位置1779〜2709に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号31の位置1799〜2709に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド。
【００５０】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。DNA及びRNAを単離するための方法は、当業界において良く知られている。興味ある遺伝子をコードするDNA及びRNAは、当業界において知られている方法により、Gene Banks 及びDNAライブラリーにおいてクローン化され得る。
次に、本発明のマンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同定され、そして、例えばハイブリダイゼーション又はPCRにより単離される。
【００５１】
本発明はさらに、異なった細菌株からの相対ポリペプチド及びポリヌクレオチド（オルト体又はパラ体）を提供する。バチルス sp. ,バチルス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）、バチルス・ハロジェランス（Bacillus halodurans）、バチルス・グラウジ（Bacillus clausii）及びバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）を包含するグラム−陽性好アルカリ菌株からのマンナナーゼポリペプチド；及び、カルジセルロジルプトルの種を包含する熱嫌気性細菌グループからのマンナナーゼポリペプチドが特に興味あるものである。また、菌類ヒューミコラ又はスキタリジウム（Scytalidium）、特にヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）又はスキタリジウム・サーモフィラム（Scytalidium thermophilum）種からのマンナナーゼポリペプチドが興味あるものである。
【００５２】
本発明のマンナナーゼ活性を有するポリペプチドの種相同体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明より提供される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、本発明のDNA配列は、タンパク質を発現する細胞型から得られる染色体DNAを用いて、クローン化され得る。適切なDNA源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン又はサザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次にライブラリーが、陽性細胞系の染色体DNAから調製される。
【００５３】
次に、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のDNA配列が、種々の方法により、例えば本明細書に開示される配列から企画されたプローブにより、又は開示される配列に基づいて1又は複数組みの変性プローブによりプローブすることによって単離され得る。本発明のDNAはまた、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）（Mullis, アメリカ特許第4,683,202号）を用いて、又は本明細書に開示される配列からの企画されたプライマーを用いてクローン化され得る。
【００５４】
さらなる方法においては、DNAライブラリーは、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され得、そして興味あるDNAの発現が、材料及び方法、及び例１に記載のようにして、バチルス・sp.からクローン化され、発現され、そして精製された、マンナナーゼに対して生ぜしめられた抗体（モノクローナル又はポリクローナル）により、又はマンナナーゼ活性を有するポリペプチドに関連する活性試験により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノムクローンの単離に適用され得る。
E.コリDSM12197に存在するプラスミドpBXM3中にクローン化されるDNA配列（配列番号１）及び本発明の類似するDNA配列のマンナナーゼコード部分は、細菌種バチルスsp.I633の株、又は本明細書に記載されるようなもう1つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５５】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号５のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12180として1998年5月18日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号５のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）の株、例えばDSM8721株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５６】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号９のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12433として1998年10月７日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号９のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・sp. AAI12の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５７】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号11のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12441として1998年10月９日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号11のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・ハロヂュランス（Bacillus halodurans）の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５８】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号13のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM9984として1995年５月11日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号13のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、菌類種ヒューミコラ・インソレンスの株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５９】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号15のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12432として1998年10月５日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号15のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・sp.AA349の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６０】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号17のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12847として1999年６月４日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号17のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・sp.の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６１】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号19のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12848として1999年６月４日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号19のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・sp.の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６２】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号21のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12849として1999年６月４日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号21のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・sp.の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６３】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号23のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12850として1999年６月４日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号23のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・sp.の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６４】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号25のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12846として1999年６月４日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号２５のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・sp.の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６５】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号２７のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12851として1999年６月４日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号27のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・sp.の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６６】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号29のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12852として1999年６月４日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号29のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌バチルス・リケニホルミスの株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６７】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号31のDNA配列）を用いて、寄託番号DSM12436として1998年10月５日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of GermanyのInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたE.コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号31のDNA配列）及び/又はその類似するDNA配列は、細菌カルジセルロシルプトルsp.の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６８】
他方では、類似する配列は、E.コリDSM12197に存在するプラスミド（結合された配列番号１に同一であると思われる）、E.コリDSM12180に存在するプラスミド（結合された配列番号５に同一であると思われる）、E.コリDSM12433に存在するプラスミド（結合された配列番号９に同一であると思われる）、E.コリDSM12441に存在するプラスミド（結合された配列番号11に同一であると思われる）、E.コリDSM9984に存在するプラスミド（結合された配列番号13に同一であると思われる）、
【００６９】
E.コリDSM12432に存在するプラスミド（結合された配列番号15に同一であると思われる）、E.コリDSM12847に存在するプラスミド（結合された配列番号17に同一であると思われる）、E.コリDSM12848に存在するプラスミド（結合された配列番号19に同一であると思われる）、E.コリDSM12849に存在するプラスミド（結合された配列番号21に同一であると思われる）、E.コリDSM12850に存在するプラスミド（結合された配列番号23に同一であると思われる）、E.コリDSM12846に存在するプラスミド（結合された配列番号25に同一であると思われる）、
【００７０】
E.コリDSM12851に存在するプラスミド（結合された配列番号27に同一であると思われる）、E.コリDSM12852に存在するプラスミド（結合された配列番号29に同一であると思われる）又はE.コリDSM12436に存在するプラスミド（結合された配列番号31に同一であると思われる）から得られるDNA配列、例えばその副配列に基づいて、前記DNA配列によりコードされるマンナナーゼのもう1つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列（すなわち、本発明のマンナン分解酵素の変異体）を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導入により構成され得る。
【００７１】
ポリペプチド：
配列番号２の位置31〜490におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号２のアミノ酸番号１〜30の配列は、シグナルペプチドである。配列番号２の位置31〜330におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置331〜342においてリンカー及び位置434〜490において未知の機能の少なくとも1つのC−末端ドメインを含んで成ると思われる。
【００７２】
本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号２のアミノ酸番号31〜330の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、N−末端で又はC−末端で作用可能に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。配列番号２のアミノ酸番号343〜490の副配列を有するドメインは、未知の機能のマンナナーゼ酵素のドメインであり、このドメインは既知のマンナナーゼにおける類似するドメインと非常に相同性である。
【００７３】
配列番号６の位置32〜494におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号６のアミノ酸番号１〜31の配列は、シグナルペプチドである。配列番号６の位置32〜344におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置435〜494において未知の機能の少なくとも1つのC−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号６のアミノ酸番号32〜344の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７４】
配列番号10の位置32〜586におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号10のアミノ酸番号１〜31の配列は、シグナルペプチドである。配列番号10の位置32〜362におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置463〜586において未知の機能の少なくとも1つのC−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号10のアミノ酸番号32〜362の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７５】
配列番号12の位置33〜331におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号12のアミノ酸番号１〜32の配列は、シグナルペプチドである。配列番号12の位置33〜331におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインでると思われる。配列番号12のアミノ酸番号33〜331の配列、すなわち触媒ドメインを含んで成るこのマンナナーゼ酵素コアは、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメイン、すなわち融合タンパク質の一部に、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合されても又はされなくても良い。
【００７６】
配列番号14の位置22〜488におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号14のアミノ酸番号１〜21の配列は、シグナルペプチドである。配列番号14の位置166〜488におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置22〜164において未知の機能の少なくとも1つのC−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号14のアミノ酸番号166〜488の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７７】
配列番号16の位置26〜369におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号16のアミノ酸番号１〜25の配列は、シグナルペプチドである。配列番号16の位置68〜369におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置26〜67において未知の機能の少なくとも1つのN−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号16のアミノ酸番号68〜369の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７８】
配列番号18のアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列の部分的配列形成部分である。本発明は、配列番号18のアミノ酸番号１〜305の配列を含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
配列番号20のアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列の部分的配列形成部分である。本発明は、配列番号20のアミノ酸番号１〜132の配列を含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７９】
配列番号22の位置29〜320におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号22のアミノ酸番号１〜28の配列は、シグナルペプチドである。配列番号22の位置29〜320におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであると思われる。配列番号22のアミノ酸番号29〜320の配列、すなわち触媒ドメインを含んで成るこのマンナナーゼ酵素コアは、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメイン、すなわち融合タンパク質の一部に、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合されても又はされなくても良い。
【００８０】
配列番号24のアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列の部分的配列形成部分である。本発明は、配列番号24のアミノ酸番号29〜188の配列を含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
配列番号26の位置30〜815におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号26のアミノ酸番号１〜29の配列は、シグナルペプチドである。配列番号26の位置301〜625におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置44〜166及び195〜300において未知の機能の少なくとも２つのN−末端ドメイン、及び位置626〜815において未知の機能のC−末端ドメインを含んで成ると思われる。
【００８１】
本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号26のアミノ酸番号301〜625の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００８２】
配列番号28の位置38〜496におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号28のアミノ酸番号１〜37の配列は、シグナルペプチドである。配列番号28の位置166〜496におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置38〜165において未知の機能の少なくとも1つのC−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号28のアミノ酸番号166〜496の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００８３】
配列番号30の位置26〜361におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号30のアミノ酸番号１〜25の配列は、シグナルペプチドである。配列番号30の位置26〜361におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであると思われる。配列番号30のアミノ酸番号26〜361の配列、すなわち触媒ドメインを含んで成るこのマンナナーゼ酵素コアは、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメイン、すなわち融合タンパク質の一部に、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合されても又はされなくても良い。
【００８４】
配列番号32の位置23〜903におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号32のアミノ酸番号１〜22の配列は、シグナルペプチドである。配列番号32の位置593〜903におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、それぞれ位置23〜214、224〜424及び434〜592において未知の機能の少なくとも3個のN−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号32のアミノ酸番号593〜903の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、N−末端で又はC−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００８５】
本発明はまた、それぞれ、配列番号2，6，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30及び32のポリペプチドに対して実質的に相同であるマンナナーゼポリペプチド、及びそれらの種相同体（パラ体又はオルト体）も提供する。用語“実質的に相同である”とは、
配列番号２のアミノ酸番号33〜340もしくは33〜490に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号６のアミノ酸番号32〜344もしくは32〜494に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号10のアミノ酸番号32〜362もしくは32〜586に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号12のアミノ酸番号33〜331に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
【００８６】
配列番号14のアミノ酸番号166〜488もしくは22〜488に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号16のアミノ酸番号68〜369もしくは32〜369に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号18のアミノ酸番号１〜305に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号20のアミノ酸番号１〜132に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号22のアミノ酸番号29〜320に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号24のアミノ酸番号29〜188に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
【００８７】
配列番号26のアミノ酸番号301〜625もしくは30〜625に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号28のアミノ酸番号166〜496もしくは38〜496に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号30のアミノ酸番号26〜361に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；又は
配列番号32のアミノ酸番号593〜903もしくは23〜903に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
に対して65％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、及びさらにより好ましくは少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために、本明細書において使用される。
【００８８】
そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号２のアミノ酸番号31〜330もしくは31〜490に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号６のアミノ酸番号32〜344もしくは32〜494に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；配列番号10のアミノ酸番号32〜362もしくは32〜586に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号12のアミノ酸番号33〜331に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；配列番号14のアミノ酸番号166〜488もしくは22〜488に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号16のアミノ酸番号68〜369もしくは32〜369に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
【００８９】
配列番号18のアミノ酸番号１〜305に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号20のアミノ酸番号１〜132に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号22のアミノ酸番号29〜320に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号24のアミノ酸番号29〜188に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
【００９０】
配列番号26のアミノ酸番号301〜625もしくは30〜625に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号28のアミノ酸番号166〜496もしくは38〜496に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号30のアミノ酸番号26〜361に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；又は
配列番号32のアミノ酸番号593〜903もしくは23〜903に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
に対して少なくとも95％、及び最も好ましくは98％又はそれ以上同一であろう。
【００９１】
％配列同一性は、従来の方法、すなわち当業者において知られているコンピュタープログラムパッケージプログラム、例えば引用により本明細書に組込まれる、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453において開示されるようなGCGプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）に提供されるGAPにより決定される。GAPは、ポリペプチド配列比較のために次の設定を用いて使用される：3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延長ペナルティー。
【００９２】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、DNA配列比較に関して次の設定でのGAPを用いて類似する方法により決定される：5.0のGAP創造ペナルティー及び0.3のGAP延長ペナルティー。
本発明の酵素調製物は好ましくは、微生物、好ましくは細菌、原生生物、又は菌類、特に細菌、例えばバチルス、好ましくは、バチルスsp.種、及びすべての種が好ましくは、整列された16S rDNA配列に基づいて、バチルスsp.I633, バチルス・ハロジランス又はバチルスsp.AAIに対して少なくとも95％、さらにより好ましくは少なくとも98％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択され得るバチルス株に属する細菌に由来する。
【００９３】
それらの種は、RDP (Ribosomal Database Project) (Bonne L. Maidak, Neils Larson, Michael J. McCaughey, Ross Overbeek, Gary J. Olsen, Karl Fogel, James Blandy, and Carl R. Woese, Nucleic Acids Reseach, 1994, Vol. 22, No17, p.3485-3487, The Ribosomal Database Project) からの整列された16S rDNA 配列から同定される系統発生学的関係に基づいて請求されている。
【００９４】
表IIに由来する情報は、バチルスsp.I633 に対して93％以上相同であるすべての種が請求されている高い関連性のバチルス種からのすべての５種のファミリーのマンナナーゼについての請求に基づかれている。それは次のものを包含する：バチルス・スポロサーモジュランス（Bacillus sporothermodurans）、バチルス・アカロフィラス（Bacillus acalophilus）、バチルス・プソイドアルカロフィラス（Bacillus pseudoalcalophilus）及びバチルス・クラウジ（Bacillus clausii）を包含する。図１：バチルスsp.I633に最も密接に関連するARPプログラムから生成される系統発生学的系図を参照のこと。16S RNAは配列番号33に示す。
【００９５】
【表１】
2005160476.tif 000002
【００９６】
他の有用なファミリーの5種のマンナナーゼは、すべての種が整列された16S配列に基づいてバチルス・ハロジュランスに対して93％以上の相同性を示す高い関連性のバチルス種に由来するそれらのものである。それらのバチルス種は次のものを包含する：スポロラクトバチルス・ラエビス（Sporolactobacillus laevis）、バチルス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）及びマリノコーカス・ハロフィラス（Marinococcus halophilus）。図２：バチルス・ハロジュランス に最も密接に関連するARPプログラムから生成される系統発生学的系図を参照のこと。
【００９７】
【表２】
2005160476.tif 000003
【００９８】
他の有用なファミリーの５種のマンナナーゼは、バチルス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）種、及びすべての種が好ましくは、整列された16S rDNAに基づいて、バチルス・アガラドハエレンスDSM8721に対して少なくとも95％、さらにより好ましくは少なくとも98％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択された株に由来するそれらのものである。
【００９９】
有用なファミリーの26種のマンナナーゼは、例えば、バチルス、sp.AAI12に対して93％以上相同であるすべての種が請求されている高い関連性のバチルス種に由来するそれらのものである。それらは次のものを包含する：バチルス・スポロサーモジュランス（Bacillus sporothermodurans）、バチルス・アカロフィラス（Bacillus acalophilus）、バチルス・プソイドアルカロフィラス（Bacillus pseudoalcalophilus）及びバチルス・グラウジ（Bacillus clausii）。図３：バチルスsp.AAI12に最も密接に関連するARPプログラムから生成される系統発生学的系図を参照のこと。16S RNAは、配列番号34に示されている。
【０１００】
【表３】
2005160476.tif 000004
【０１０１】
他の有用なファミリーの26種のマンナナーゼは、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）種、及びすべての種が好ましくは、整列された16S rDNA配列に基づいて、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に対して少なくとも95％、さらにより好ましくは少なくとも98％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択された株に由来するそれらのものである。
【０１０２】
実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は好ましくは、保存性アミノ酸置換（表２を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に対して実質的に影響を与えない他の置換であるマイナーな性質のもの；典型的には、１〜約30個の少数のアミノ酸の欠失；及び短いアミノ−又はカルボキシル−末端延長、例えば、アミノ酸−末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、例えばポリ−ヒスチジン路、プロテインAの延長である（Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991）。
【０１０３】
一般的には、Fordなど., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991 (引用により本明細書に組込まれる)を参照のこと。親和性標識をコードするDNAは、商業的供給者（例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。
しかしながら、上記変更が好ましくは，マイナーな性質のものであったとしても、そのような変更はまた、大きな性質のもの、例えば、本発明のマンナナーゼポリペプチドへの、300個までのアミノ酸の大きなポリペプチドの融合、又は両アミノ−又はカルボキシル−末端延長としての融合でもあり得る。
【０１０４】
【表４】
2005160476.tif 000005
【０１０５】
20個の標準的アミノ酸の他に、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−N−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）は、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基により置換され得る。制限された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、アミノ酸残基により置換され得る。“不自然なアミノ酸”は、タンパク質合成の後、修飾され、そして/又は標準のアミノ酸の側鎖とは異なるそれらの側鎖に化学的構造を有する。不自然なアミノ酸は、化学的に合成され得、又は好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３,３−ジメチルプロリンを包含する。
【０１０６】
本発明のマンナナーゼポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあらゆる残基に導入され、そして得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、マンナナーゼ活性）について試験される。また、Hilton など., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996を参照のこと。
【０１０７】
酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Vos など., Science 255: 306-312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの相同性の分析からも推定され得る。
【０１０８】
複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え及び/又はシャフリング、続く適切なスクリーニング方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989), WO95/17413号又はWO95/22625号により開示される既知の方法を用いて、生成され、そして試験され得る。
【０１０９】
手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数位置の同時ランダム化、又は組換え/異なった突然変異のシャフリング（WO95/17413号、WO95/22625号）、続いての機能的ポリペプチドについての選択、及び次に、個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドの配列決定のための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号；Huse, WIPO Publication WO92/06204号）及び特定領域の突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46: 145, 1986; Ner など., DNA 7: 127, 1988）を包含する。
【０１１０】
上記に開示されるような突然変異誘発/シャフリング方法は、宿主細胞においてクローン化され、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高い処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、そして近代装置を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける重要な個々のアミノ酸残基の急速な決定を可能にし、そして未知の構造体のポリペプチドに適用され得る。
【０１１１】
上記で論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号２の残基33〜340又は33〜490；配列番号６の残基32〜344又は32〜494；配列番号10の残基32〜362又は32〜586；配列番号12の残基33〜331；配列番号14の残基166〜488又は22〜488；配列番号16の残基68〜369又は32〜369；配列番号18の残基１〜305；配列番号20の残基１〜132；配列番号22の残基29〜320；配列番号24の残基29〜188；配列番号26の残基301〜625又は30〜625；配列番号28の残基166〜496又は38〜496；配列番号30の残基26〜361；配列番号32の残基593〜903又は23〜903に対して実質的に相同であり、そして野生型タンパク質のペクチン分解活性を保持する種々のポリペプチドを同定し、そして/又は調製することができる。
【０１１２】
本発明のマンナナーゼ酵素は、触媒的活性ドメインを含んで成る酵素コアの他に、また、セルロース結合ドメイン（CBD）を含んで成り、前記酵素のセルロース結合ドメイン及び酵素コア（触媒的活性ドメイン）は操作可能的に連結される。そのセルロース結合ドメイン（CBD）はコードされた酵素の内部部分として存在することができ、又は他の起源からのCBDはマンナン分解酵素中に導入され、従って酵素ハイブリッドを創造する。この場合、用語“セルロース−結合ドメイン”とは、Peter Tommeなど.,“Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties” in “Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates”, John N, Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No.618, 1996により定義されるとおりであるものとして理解されるべきである。
【０１１３】
この定義は、120よりも多くのセルロース−結合ドメインを10種のファミリー（I−X）に分類し、そしてCBDが種々の酵素、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及びキチナーゼに見出されることを示す。DBDはまた、藻類、例えば赤藻類ポルフィラ・パーピュレア（Porphyra purpurea）において、非加水分解性多糖−結合タンパク質として見出されている（Tommeなど.,前記を参照のこと）。しかしながら、CBDのほとんどは、セルラーゼ及びキシラナーゼであり、CBDはタンパク質のN及びC末端で見出され、又は内部に存在する。
【０１１４】
酵素ハイブリッドは当業界において知られており（例えば、WO90/00609号及びWO95/16782号を参照のこと）、そしてマンナン分解酵素をコードするDNA配列に、リンカーを伴って又は伴わないで、連結されるセルロース−結合ドメインをコードするDNAのフラグメントを少なくとも含んで成るDNA構造体を用いて、宿主細胞を形質転換し、そして融合された遺伝子を発現するために宿主細胞を増殖することによって調製され得る。
【０１１５】
酵素ハイブリッドは、次の式：
CBD−MR−X
により記載され、ここで前記CBDは少なくともセルロース−結合ドメインに対応するアミノ酸配列のN−末端又はC−末端領域であり；MRは中間領域（リンカー）であり、そして結合、又は好ましくは、約２〜約100個の炭素原子、より好ましくは２〜40個の炭素原子の短い結合基であり得；又は好ましくは約２〜約100個のアミノ酸、より好ましくは２〜40個のアミノ酸であり得；そしてXは本発明のマンナナーゼ分解酵素のN−末端又はC−末端の領域である。配列番号４は、マンナナーゼ酵素コア及びCBDの酵素ハイブリッドのアミノ酸配列を開示する。
【０１１６】
好ましくは、本発明のマンナナーゼ酵素は、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも8.5、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも9.5、より好ましくは少なくとも10、さらにより好ましくは少なくとも10.5、特に少なくとも11のpHでその最大の触媒活性を有し；そして好ましくは、酵素の最大活性は、少なくとも40℃、より好ましくは少なくとも50℃、さらにより好ましくは少なくとも55℃の温度で得られる。
好ましくは、本発明の清浄組成物は、例えば、機械洗浄工程の洗浄サイクルの間、布を処理するために使用される場合、典型的には、約８〜約10.5のpHを有する洗浄溶液を提供する。典型的には、そのような洗浄溶液は、約20℃〜約95℃、好ましくは約20℃〜約60℃、好ましくは約20℃〜約50℃の温度で使用される。
【０１１７】
タンパク質生成：
十分な長さのタンパク質、そのフラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のタンパク質及びポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換され、又はトランスフェクトされ、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。
【０１１８】
細菌細胞、特に、グラム−陽性生物の培養された細胞が好ましい。バチルス属からの次のグラム−陽性細胞が特に好ましい：バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・レンタス（Bacillus lenntus）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・リケニホルミス、又はバチルス sp.特に、バチルス sp.AAI12。
【０１１９】
もう1つの好ましい態様においては、宿主細胞は菌類細胞である。“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiomycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びヅイゴミコタ（Zygomycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）、及びオーミコタ（Oomycota）（Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Hawksworh など., 1995, 前記）を包含する。
【０１２０】
アスコミコタの代表的なグループは、例えばニュウロスポラ（Neurospora）、ユウペニシリウム（Eupenicillium）（＝ペニシリウム（penicillium））、エメリセラ（Emericella）(＝アスペルギラス（Aspergillus）)、ユウロチウム（Eurotium）（＝アスペルギラス（Aspergillus）)、及び上記に列挙される真の酵母を包含する。バシジオミコタの例は、マッシュルーム、サビ菌及び黒穂病菌を包含する。
【０１２１】
キトリジオミコタの代表的なグループは、例えばアロマイセス（Allomyces）、ブラストクラジエラ（Blastocladiella）、コエロモマイセス（Coelomomyces）及び水性菌類を包含する。オーミコタの代表的なグループは、例えばサプロェグニオマイセトウス（Saprolegniomycetous）水性菌類(水カビ)、例えばアキヤ(Achlya)を包含する。栄養胞子菌の例は、アスペルギラス、ペニシリウム、カンジダ及びアルテルナリア（Alternaria）を包含する。ヅイゴミコタの代表的なグループは、例えばリゾパス(Rhizopus)及びムコル（Mucor）を包含する。
【０１２２】
さらにもう1つの好ましい態様においては、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”とは、ユーミコタ（Eumycota）及びオーミコタ（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど., 1995, 前記により定義されるような）。より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicilium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）又はトリコダーマ（Trichoderma）の種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。
【０１２３】
特に、前記細胞は、PCT/US/95107743に記載されるように、トリコダーマの種、好ましくはトリコダーマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）又はトリコダーマ・レセイ（Trichoderma reesei）、又はアスペルギラスの種、最も好ましくはアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギラス・ニガー（Aspergillusniger）、又はフサリウムの種、最も好ましくはフサリウムATCC20334の特徴を有するフサリウム sp. に属する。
【０１２４】
菌類細胞は、それ自体既知の態様でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、EP238023号及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA81: 1470-1474に記載される。フサリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardier など., 1989, Gene 78: 147-156又は米国特許同時継続出願08/269,449号により記載される。
【０１２５】
酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito など., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及びHinnenなど., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA75: 1920に記載される方法を用いて形質転換され得る。哺乳類細胞は、Graham and Van der Eb (1978, Virology 52: 546) のリン酸カルシウム沈殿法を用いて、直接的な摂取により形質転換され得る。
【０１２６】
クローン化された分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は、次の文献に開示されている：Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel など. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; 及びBacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim など., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C. (それらは引用により本明細書中に組込まれる)。
【０１２７】
一般的に、本発明のマンナナーゼをコードするDNA配列は、一般的に発現プロモーター内に転写プロモーター及びターミネーターを含む、その発現のために必要とされる他の遺伝子要素に作用可能に連結される。前記ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製起点を含むが、但し当業者は、一定のシステム内において、選択マーカーが別々のベクター上に供給され得、そして外因性DNAの複製が宿主ゲノムへの組み込みにより提供され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベル内の通常のことである。多くのそのような要素は、文献に記載されており、そして商業的供給者から入手できる。
【０１２８】
宿主細胞の分泌経路中にポリペプチドを向けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列はポリペプチドの配列であり得、又は他の分泌されたタンパク質に起因し、又は新たに合成され得る。多くの適切な分泌シグナル配列が当業界において知られており、そして特に、バチルス宿主細胞における分泌のための適切な分泌シグナル配列のさらなる記載については、次の文献を参照のこと：Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim など., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.;及びCutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley and Sons, 1990。
【０１２９】
分泌シグナル配列は、DNA配列に正しく読み取り枠を整合して連結される。分泌シグナル配列は、通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の５'側に位置し、但しあるシグナル配列は興味のDNA配列の他の場所に位置することができる（例えば、Welch など., アメリカ特許第5,037,743号；Holland など., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。
【０１３０】
本発明の発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられるいずれかの発現ベクターであり、そしてベクターの選択はしばしば、そのベクターが導入される宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体外存在物（その複製は染色体複製に無関係である）として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【０１３１】
糸状菌宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、例えばADH3プロモーター（McKnightなど., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099）又はtpiAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（gluA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するそれらのものである。
【０１３２】
形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養物、及び選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。定義された培地及び複合培地を包含する種々の適切な培地が、当業界において知られており、そして一般には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要な場合、成長因子のような成分を含むことができる。薬物選択、又は発現ベクター上に担持され、又は宿主細胞中に同時にトランスフェクトされる選択マーカーにより補充される必須栄養物における栄養不足により、増殖培地は、外因的に付加されたDNAを含む細胞を選択するであろう。
【０１３３】
タンパク質単離：
発現された組換えポリペプチドが分泌される場合、そのポリペプチドは増殖培地から精製され得る。好ましくは、発現宿主細胞は、ポリペプチドの精製の前、培地から除かれる（例えば、遠心分離による）。
発現された組換えポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、宿主細胞は好ましくは、破壊され、そしてポリペプチドは、そのような精製技法の第１段階である水性“抽出物”中に開放される。好ましくは、発現宿主細胞は、細胞破壊の前、培地から除去される（例えば遠心分離による）。
【０１３４】
細胞破壊は、従来の技法、例えばリゾチーム消化により、又は細胞に高圧力を付与することにより行われ得る。そのような細胞破壊技法のさらなる説明のためには、Robert K. Scobes, Protein Purification, Second edition, Springer-Verlagを参照のこと。
発現された組換えポリペプチド（又はキメラポリペプチド）が分泌されても又はされなくても、それは、分別及び/又は従来の精製方法を用いて、精製され得る。
【０１３５】
硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロープ抽出が、サンプルの分別のために使用され得る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なアニオン交換媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ及び同様のものを含む。PEI, DEAE, QAE及びQ誘導体が好ましく、そしてDEA Fast-Flow セファロース（Pharmacia, Piscataway, NJ）が特に好ましい。
【０１３６】
典型的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル、ブチル、又はオクチル基により誘導体化されたそれらの媒体、例えばフェニル−セファロース  FF（Pharmacia）、Toyopearlブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−セファロース（Pharmacia）及び同様のもの；又はポリアクリル酸樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso Haas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材のビーズ樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂、及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。
【０１３７】
それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び/又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基により変性され得。カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、及びカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体が、良く知られており、そして当業界において広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。
【０１３８】
特定方法の選択は、日常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。
本発明のポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学合成を通して調製され得る。本発明のポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり；グリコシル化され又は非グリコシル化され得；ペギル化され（pegylated）又は非ペギル化され得；そして最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。
【０１３９】
本明細書に開示される配列情報に基づけば、本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号１に示されるDNA配列、少なくとも位置94〜位置990のDNA配列、又は他方では、位置94〜位置1470のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列がクローン化され得る。
【０１４０】
同様に、本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号５に示されるDNA配列、少なくとも位置94〜位置1032のDNA配列、又は他方では、位置94〜位置1482のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号９に示されるDNA配列、少なくとも位置94〜位置1086のDNA配列、又は他方では、位置94〜位置1761のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号11に示されるDNA配列、少なくとも位置97〜位置993のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；
【０１４１】
本発明のマンナナーゼをコードし、そして本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号13に示されるDNA配列、少なくとも位置498〜位置1464のDNA配列、又は他方では、位置64〜位置1464のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号15に示されるDNA配列、少なくとも位置204〜位置1107のDNA配列、又は他方では、位置76〜位置1107のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；
本発明のマンナナーゼを部分的にコードし、そして配列番号17に示されるDNA配列を含んで成るDNA配列；本発明のマンナナーゼを部分的にコードし、そして配列番号19に示されるDNA配列を含んで成るDNA配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号21において少なくとも位置88〜位置960に示されるDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；
【０１４２】
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号23に示されるDNA配列を含んで成るDNA配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号25に示されるDNA配列中の少なくとも位置904〜位置1875のDNA配列、又は他方では、位置88〜位置2445のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号27に示されるDNA配列中の少なくとも位置498〜位置1488のDNA配列、又は他方では、位置112〜位置1488のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；
【０１４３】
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号29に示されるDNA配列中の少なくとも位置79〜位置1083のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列；及び
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号31に示されるDNA配列中の少なくとも位置1779〜位置2709のDNA配列、又は他方では、位置67〜位置2709のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列がクローン化され得る。
【０１４４】
クローニングは、当業界において知られている標準の方法により、例えば、
−バチルス株、特にB.sp.I633, B.sp.AAI12, B.sp.AA349, バチルス・アガラドハエレンス、バチルス・ハロジュランス、バチルス・クラウジ及びバチルス・リケニホルミスから選択された株、又は菌株、特にヒューミコラ・インソレンス株からゲノムライブラリーを調製し；
【０１４５】
−そのようなライブラリーを、適切な基質プレート上にプレートし；
−配列番号1, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29又は31のいずれかに基づいてのプローブを用いて、標準のハイブリダイゼーション技法により、本発明のポリヌクレオチド配列を含んで成るクローンを同定し；又は
−配列番号1, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29又は31からの配列情報に基づいてのプライマーを用いて、逆PCR法により、前記ゲノムライブラリーからクローンを同定することによって行われる。逆PCRに関する追加の詳細は、M.J. MCPherson など：（“PCR A Practical Appraach" Information Press, Ltd, Oxford England) に言及される。
【０１４６】
本明細書に開示される配列情報（配列番号1, 2, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32）に基づいて、本発明の相同マンナナーゼをコードする相同ポリヌクレオチド配列を、関連する微生物、特にバチルス属、例えばバチルスsp.の好アルカリ種の他の株、又は菌類株、例えばヒューミコラの種からのゲノムライブラリーを用いて、類似する方法により単離することは、当業者のための日常の作業である。
【０１４７】
他方では、本発明のマンナン又はガラクトマンナン−分解性酵素をコードするDNAは、良く知られている方法によれば、便利には、適切な源、例えば上記生物のいずれかから、E.コリDSM12197, DSM12180, DSM12433, DSM12441, DSM9984, DSM12432, DSM12436, DSM12846, DSM12847, DSM12848, DSM12849, DSM12850, DSM12851及びDSM12852のいずれかに存在するプラスミドから得ることができるDNA配列に基づいて調製された合成オリゴヌクレオチドプローブの使用によりクローン化され得る。
【０１４８】
従って、本発明のポリヌクレオチド分子は、E.コリDSM12197, DSM12180, DSM12433, DSM12441, DSM9984, DSM12432, DSM12436, DSM12846, DSM12847, DSM12848, DSM12849, DSM12850, DSM12851及びDSM12852のいずれかから単離され、ここで上記のようにしてクローニングすることによって得られるプラスミドは寄託される。また、本発明は、E.コリDSM12197, DSM12180, DSM12433, DSM12441, DSM9984, DSM12432, DSM12436, DSM12846, DSM12847, DSM12848, DSM12849, DSM12850, DSM12851及びDSM12852のいずれかの単離された、実質的に純粋な生物学的培養物にも関する。
【０１４９】
本明細書において、用語“酵素調製物”とは、微生物の単一種から、たぶん単離され、そして精製された従来の酵素発酵生成物（そのような調製物は通常、多くの異なった酵素活性を含んで成る）；又は単一成分酵素、好ましくは細菌又は菌類種から従来の組換え技法を用いることによって誘導された酵素の混合物（前記酵素は、発酵され、そしてたぶん単離され、そして別々に精製されており、そして異なった種、好ましくは菌類又は細菌種に起因する）；又は組換えマンナナーゼ酵素の発現のための宿主細胞として作用するが、しかし他の酵素、例えばペクチン分解酵素、プロテアーゼ又はセルラーゼを同時に生成する微生物の発酵生成物（微生物の天然に存在する発酵生成物、すなわちその対応する天然に存在する微生物により従来通りに生成される酵素複合体である）のいずれかを意味する。
【０１５０】
本発明のマンナナーゼ調製物はさらに、下記から成る群から選択された１又は複数の酵素を含んで成る：プロテアーゼ、セルラーゼ（エンド−β−１,４−グルカナーゼ）、β−グルカナーゼ（エンド−β−１,３（４）−グルカナーゼ）、リパーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシログルナナ−ゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はそれらの混合物。
【０１５１】
好ましい態様においては、調製物中の1又は複数の、又はすべての酵素は、組換え技法を用いて生成され、すなわち酵素は所望する酵素ブレンドにより酵素調製物を形成するために、他の酵素と共に混合される単一成分酵素である。
【０１５２】
さらなる観点においては、本発明はまた、本発明の酵素調製物を生成するための方法にも関し、ここで前記方法は、マンナナーゼを生成することができる微生物，例えば野生型株を前記酵素の生成を可能にする条件下で培養し、そして培養物から酵素を回収することを含んで成る。培養は、従来の発酵技法、例えばマンナナーゼ酵素の生成を誘発する増殖培地を十分に確保するために撹拌しながら、振盪フラスコ又は発酵器においての培養を用いて実施され得る。
【０１５３】
増殖培地は、従来のN−源、例えばペプトン、酵母抽出物又はカザミノ酸、低められた量の従来のC−源、例えばデキストロース又はスクロース、及びインデューサー、例えばグアーガム又はイナゴマメガムを含むことができる。回収は、従来の技法、例えばバイオマス及び上清液の遠心分離又は濾過による分離、上清液の回収、又は興味ある酵素が細胞内に存在する場合、細胞の破壊、たぶん続いて、ヨーロッパ特許第0406314号に記載されるようなさらなる精製、又はWO97/15660号に記載のような結晶化により実施され得る。
【０１５４】
本発明の酵素又は酵素調製物を生成する有用な細菌の例は、好ましくはバチルス/ラクトバチルスサブディビジョン（subdivision）からのグラム−陽性細菌、好ましくはバチルス属からの株、より好ましくはバチルス sp.の株である。
さらにもう1つの観点においては、本発明は、上記に記載される性質を有し、そして相同不純物を有さず、そして従来の組換え技法を用いて生成される、単離されたマンナナーゼに関する。
【０１５５】
免疫学的交差反応性：
免疫学的交差反応性の決定に使用されるべきポリクローナル抗体は、精製されたマンナナーゼ酵素の使用により調製され得る。より特定には、本発明のマンナナーゼに対する抗血清が、N. Axelsen など., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, 又はA. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (より詳しくは、p.27-31) に記載される方法に従って、ウサギ（又は他のゲッ歯動物）を免疫化することによって生ぜしめられ得る。
【０１５６】
精製された免疫グロブリンは、例えば塩沈殿（(NH4)2 SO4）、続いて透析、及びDEAE−Sephadex上でのイオン交換クロマトグラフィーにより、抗血清から得られる。タンパク質の免疫化学特徴化が、Outcherlony 二重拡散分析（O. Ouchterlony, Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publication, 1967, pp.655-706）、架橋された免疫電気泳動（N. Axelsen など., 前記, Chapters 3and 4)、又はロケット免疫電気泳動（N. Axelsen など., Chapter 2）のいずれかにより行われ得る。
【０１５７】
洗剤産業への使用：
さらなる観点においては、本発明は、本発明のマンナナーゼ又はマンナナーゼ調製物を含んで成る洗剤組成物、本発明のマンナナーゼ又はマンナナーゼ調製物を含む洗浄溶液により、機械洗浄の洗浄サイクルの間、布を処理することを含んで成る、布の機械処理のための方法、及び卓越した清浄性能、すなわち卓越したしみの除去性能、黒ずんだ物の清浄及び白色度の維持を提供する、本発明のマンナナーゼ及び任意には、セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択されたもう１つの酵素を含んで成る清浄組成物、例えば洗濯、皿洗い、硬質表面クリーナー、個人用洗浄及び経口/歯用組成物に関する。
【０１５８】
論理的ではないが、本発明のマンナナ−ゼは、ガラクトマンナンを含む土壌又はしみを効果的に分解し、又は加水分解することができ、そして従って、そのような土壌又はしみを含んで成る洗濯物を清浄することができると思われる。
本発明の清浄組成物は、少なくとも１つの追加の洗剤成分を含むべきである。それらの追加の成分の正確な性質、及びその導入のレベルは、組成物の物理形、及びそれが使用される洗浄操作の性質に依存するであろう。
【０１５９】
本発明の清浄組成物は好ましくは、選択された界面活性剤、他の酵素ビルダー及び/又は漂白系から選択された洗浄成分をさらに含んで成る。
本発明の清浄組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状、錠剤、スプレー、発泡体、粉末又は粒質物であり得る。粒状組成物はまた、“圧縮”形でも存在することができ、そして液体組成物はまた、“濃縮された”形でも存在することができる。
【０１６０】
本発明の組成物は、手動及び機械皿洗い組成物、手動及び機械洗濯洗剤組成物、例えば洗濯用添加剤組成物、及び染色された布のソーキング及び/又は前処理への使用のために適切な組成物、添加されるすすぎ用布軟化剤組成物、及び一般的な家庭用硬質表面洗浄操作への使用のための組成物として配合され得る。そのようなカルボヒドラーゼを含む組成物はまた、衛生用製品、コンタクトレンズ清浄剤、及び健康及び美容ケアー製品、例えば経口/歯用ケアー及び身辺用洗浄組成物としても配合され得る。
【０１６１】
手動皿洗い方法のための組成物として配合される場合、本発明の組成物は、好ましくは、界面活性剤、及び好ましくは、有機ポリマー化合物、石鹸水増強剤、第II族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ及び追加の酵素から選択された他の洗剤化合物を含む。
【０１６２】
洗濯機洗浄方法への使用のために適切な組成物として配合される場合、本発明の組成物は好ましくは、界面活性剤及びビルダー化合物の両者、及びさらに、好ましくは、有機ポリマー化合物、漂白剤、追加の酵素、石鹸水の泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、土壌懸濁及び抗−再沈殿剤、及び腐食防止剤から選択された１又は複数の洗剤成分を含む。洗濯組成物はまた、追加の洗剤成分として軟化剤も含むことができる。カルボヒドラーゼを含むそのような組成物は、洗濯洗剤組成物として配合される場合、布の清浄、しみの除去、白色度の維持、軟化、発色、染料移行の阻害、及び消毒を提供することができる。
【０１６３】
本発明の組成物はまた、固体又は液体形で、洗剤添加剤製品としても使用され得る。そのような添加剤製品は、従来の洗剤組成物の性能を補充し、又は高めることが意図され、そして清浄工程のいずれの段階ででも添加され得る。
必要とされる場合、洗濯洗剤組成物の密度は、20℃で測定される組成物１Ｌ当たり400〜1200g、好ましくは500〜950gの範囲である。
【０１６４】
本明細書における組成物の“圧縮”形は、密度により、及び組成物に関しては、無機充填剤塩の量により最良に影響され；無機充填剤塩は、粉末形での洗剤組成物の従来の成分であり；従来の洗剤組成物においては、充填剤塩は、実質的な量で、典型的には、合計組成物の17〜35重量％で存在する。圧縮組成物においては、充填剤塩は、合計組成物の15重量％を越えない量で、好ましくは10重量％を越えない量で、最も好ましくは５重量％を越えない量で存在する。無機充填剤塩は、本発明の組成物に存在する場合、アルカリ及びアルカリ土類金属の硫酸塩及び塩化物塩から選択される。好ましい充填剤塩は、硫酸ナトリウムである。
【０１６５】
本発明の液体洗剤組成物は、“濃縮された形”でも存在することができ、そのような場合、本発明の液体組成物は、従来の液体洗剤に比較して、低量の水を含むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤中の水含有率は、洗剤組成物中、40重量％以下、より好ましくは30重量％以下、最も好ましくは20重量％以下である。
【０１６６】
クリーニング組成物：
界面活性剤系：
本発明の洗浄又は洗剤組成物は界面活性剤系を含んで成り、ここで前記界面活性剤は、非イオン性、及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性、及び/又は両性及び/又は両性イオン性、及び/又は半極性界面活性剤から選択され得る。
【０１６７】
界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。界面活性剤は好ましくは、組成物に存在する酵素ハイブリッド及び酵素成分と適合できるよう配合される。液体又はゲル組成物においては、界面活性剤は最も好ましくは、それが、それらの組成物における酵素ハイブリッド又は酵素の安定性を促進するか又は少なくとも分解しないような態様で配合される。
本発明への使用のための適切な界面活性剤系は、本明細書に記載される１又は複数の非イオン性及び/又はアニオン性界面活性剤を界面活性剤として含んで成る。
【０１６８】
アルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレンオキシド縮合物が、本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤としての使用のために適切であり、そしてポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。それらの化合物は、直鎖又は枝分かれ鎖形状において、約６〜約14個の炭素原子、好ましくは約８〜約14個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルキルフェノールと酸化アルキレンとの縮合生成物を包含する。
【０１６９】
好ましい態様においては、酸化エチレンは、アルキルフェノール１モル当たり、約２〜約25モル、より好ましくは約３〜約15モルに等しい量で存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤は、GAF Corporationにより市販されているIgepal（商標）CO-630 ; 及びRohm & Haas Companyにより市販されているTriton（商標）X-45, X-114, X-100, 及びX-102を包含する。それらの界面活性剤は、通常、アルキルフェノールアルコキシレート（例えば、アルキルフェノールエトキシレート）として言及される。
【０１７０】
約１〜約25モルの酸化エチレンと第一および第二脂肪族アルコールとの結合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は枝分かれ鎖の第一又は第二アルコールであり、そして一般的には、約８〜約22個の炭素原子を含む。アルコール１モル当たり約２〜約10モルの酸化エチレンと、約８〜約20個の炭素原子、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールとの縮合生成物が好ましい。アルコール１モル当たり、約２〜約７モルの酸化エチレン及び最も好ましくは、２〜５モルの酸化エチレンが、前記縮合生成物に存在する。
【０１７１】
このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する：Tergitol（商標）15-S-9 (９モルの酸化エチレンとC11-C15線状アルコールとの縮合生成物)、Tergitol（商標）24-L-6NMW (狭い分子量分布を有する、６モルの酸化エチレンとC12-C14第一アルコールとの縮合生成物) (両者ともUnion Carbide Corporationにより市販されている)；Neodol（商標）45-9 (９モルの酸化エチレンとC14-C15線状アルコールとの縮合生成物)、Neodol（商標）23-3 (3.0モルの酸化エチレンとC12-C13線状アルコールとの縮合生成物)、Neodol（商標）45-7 (７モルの酸化エチレンとC14-C15線状アルコールとの縮合生成物)、Neodol（商標）45-5 (５モルの酸化エチレンとC14-C15線状アルコールとの縮合生成物) (Shell Chemical Company により市販されている)；Kyro（商標）EOB (９モルの酸化エチレンとC13-C15アルコールとの縮合生成物) (The Procter & Gamble Company により市販されている)；及びGenapol LA050（５モルの酸化エチレンとC12-C14アルコールとの縮合生成物）（Hoechstにより市販されている）。それらの生成物におけるHLBの好ましい範囲は８〜11、及び最も好ましくは８〜10である。
【０１７２】
また、約６〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を含む疎水性基を有する、アメリカ特許第4,565,647号に開示されるアルキル多糖類、及び約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最も好ましくは約1.3〜約2.7のサッカリド単位を含む親水性基を有する多糖、例えばポリグリコシドが、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤として有用である。
【０１７３】
５〜６個の炭素原子を含むいずれかの還元サッカリドが使用され得、例えばグルコース、ガラクトース、及びガラクトシル成分がグルコシル成分により置換され得る（任意には、疎水性基が２−,３−,４−,等の位置で結合され、従って、グルコシド又はガラクトシドとは対照的に、グルコース又はガラクトースが得られる）。サッカリド間結合は、例えば、追加のサッカリド単位の１つの位置と先に存在するサッカリド単位上の２−,３−,４−及び/又は６−位置との間で存在することができる。
【０１７４】
好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式：
R2O (CnH2nO)t (グリコシル)x
［式中、R2は、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物（ここで、アルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含む）から成る群から選択され；ｎは、２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜約10、好ましくは０であり；そしてxは約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最も好ましくは約1.3〜約2.7である］を有する。
【０１７５】
グリコシルは好ましくは、グルコースに由来する。それらの化合物を調製するためには、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、そして次に、グルコース、又はグルコース源と反応せしめられ、グルコースが形成される（1−位置での結合）。次に、追加のグリコシル単位が、それらの１−位置と、先に存在するグルコシル単位２−,３−,４−,及び/又は６−位置、好ましくは、優力的には２−位置との間に結合され得る。
【０１７６】
酸化プロピレンとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性基と酸化エチレンとの縮合生成物がまた、本発明の追加の非イオン性界面活性剤系としての使用のために適切である。それらの化合物の疎水性部分は、好ましくは、約1500〜約1800の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は、全体として分子の水溶性を高める傾向があり、そして生成物の液体特性は、ポリオキシエチレン含有率が縮合生成物の合計重量の約50％であり、約40モルまでの酸化エチレンとの縮合に対応する点まで維持される。このタイプの化合物の例は、BASFにより市販されている一定のPluronic（商標）界面活性剤を包含する。
【０１７７】
酸化プロピレン及びエチレンジアミンの反応に起因する生成物と酸化エチレンとの縮合生成物はまた、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のためにも適切である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレンジアミン及び過剰の酸化プロピレンの反応生成物から成り、そして一般的には、約2500〜約3000の分子量を有する。この疎水性成分は、縮合生成物が約40〜約80重量％のポリオキシエチレンを含み、そして約5,000〜約11,000の分子量を有する程度まで、酸化エチレンにより縮合される。このタイプの非イオン性界面活性剤の例は、BASFから市販されているTetronic（商標）化合物を包含する。
【０１７８】
アルキルフェノールのポリ酸化エチレン縮合物、すなわち約１〜約25モルの酸化エチレン、アルキル多糖類及びそれらの混合物と第一及び第二脂肪族アルコールとの縮合生成物は、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために好ましい。３〜15個のエトキシ基を有するG9-C14アルキルフェノールエトキシレート、及び２〜10個のエトキシ基を有するC8-C18アルコールエトキシレート（好ましくは、C10平均）、及びそれらの混合物が最も好ましい。
【０１７９】
下記式：
【化１】
2005160476.tif 000006
【０１８０】
［式中、R1はHであり、又はR1はC1-4ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合であり、R2はC5-31ヒドロカルビルであり、そしてZは線状ヒドロカルビル鎖に直接的に結合される少なくとも３個のヒドロキシルを有するそのヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビルである］
で表されるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤、又はそのアルコキシル化された誘導体が、非常に好ましい非イオン性界面活性剤である。好ましくは、R1はメチルであり、R2は直鎖のC11-15又はC16-18アルキル、又はアルケニル鎖、例えばヤシアルキル又はそれらの混合物であり、そしてZは還元糖、例えばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから還元アミノ化反応において誘導される。
【０１８１】
非常に好ましいアニオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル化されたスルフェート界面活性剤を包含する。その例は、式RO(A)mSO3M [式、Rは置換されていないC10-C20アルキル又はC10-C24アルキル成分を有するヒドロキシアルキル基、好ましくはC12-C20アルキル又はハロ−キシアルキル、より好ましくはC12-C18アルキル又はヒドロキシアルキルであり、Aはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍはゼロよりも大きく、典型的に約0.5〜約６、より好ましくは約0.5〜約３であり、そしてMはH, 又は例えば、金属カチオンであり得るカチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、等）、アンモニウム、又は置換されたアンモニウムカチオンである。
【０１８２】
アルキルエトキシル化されたスルフェート及びアルキルプロポキシル化されたスルフェートが本明細書において企画される。置換されたアンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペルジニウムカチオン、及びアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物から誘導されたそれらのもの、及び同様のものを包含する。
【０１８３】
典型的な界面活性剤は、C12-C18アルキルポリエトキシレート（1.0）スルフェート（C12-C18E(1.0), C12-C18アルキルポリエトキシレート（2.25）スルフェート（C12-C18(2.25)M）及びC12-C18アルキルポリエトキシレート（3.0）スルフェート（C12-C18E(3.0)M）、C12-C18アルキルポリエトキシレート（4.0）スルフェート（C12-C18E(4.0)M）(ここで、Mは便利には、ナトリウム及びカリウムから選択される)である。
【０１８４】
使用される適切なアニオン性界面活性剤は、“The Journal of the American Oil Chemists Society”52(1973), pp.323-329に従って、気体SO3によりスルホン化されたC8-C20カルボン酸（すなわち、脂肪酸）の線状エステルを含むアルキルエステルスルホネート界面活性剤である。適切な出発材料は、牛脂、ヤシ油、等から誘導されるような天然の脂肪物質を包含する。
【０１８５】
特に、洗濯用途のための好ましくはアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、下記式：
【化２】
2005160476.tif 000007
【０１８６】
［式中、R3はC8-C20ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組み合わせであり、R4はC1-C6ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組み合わせであり、そしてMはアルキルエステルスルホネートと共に水溶性塩を形成するカチオンである］で表される構造を有するアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含んで成る。適切な塩形成カチオンは、金属、例えばナトリウム、カリウム及びリチウム、及び置換された又は置換されていないアンモニウムカチオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを包含する。好ましくは、R3はC10-C16アルキルであり、そしてR4はメチル、エチル又はイソプロピルである。R3がC10-C16アルキルであるメチルエステルスルホネートが特に好ましい。
【０１８７】
他の適切なアニオン性界面活性剤は、式ROSO3M［式中、Rは好ましくは、C20-C24ヒドロカルビル、好ましくはC10-C20アルキル成分を有するアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはC12-C18アルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてMは、H、又はカチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウム、又は置換されたアンモニウム（例えば、メチル−、ジメチル−及びトリメチルアンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウム、及びアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン及びそれらの混合物から誘導された第四アンモニウムカチオン、及び同様のもの）である］で表される水溶性塩又は酸であるアルキルスルフェート界面活性剤を包含する。典型的には、C12-C16のアルキル鎖は、低い洗浄温度（例えば、約50度以上）のために好ましい。
【０１８８】
洗浄目的のために有用な他のアニオン性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物にも含まれ得る。それらは、次のものを包含する：石鹸の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウム塩、例えばモノ−、ジ−及びトリエタノール塩）、C8-C22第一又は第二アルカンスルホネート、C8-C24オレフィンスルホネート、イギリス特許第1,082,179号明細書に記載されるような、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解された生成物のスルホン化により調製されたスルホン化さえたポリカルボン酸、C8-C24アルキルポリグリコールエーテルスルホネート（10モルまでの酸化エチレンを含む）、
【０１８９】
アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルホネート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート、パラフィンスルホネート、アルキルホスホネート、イセチオネート、例えばアシルイセチオネート、N−アシルタウレート、アルキルスクシナメート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に、飽和及び不飽和C12-C18モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に、飽和及び不飽和C6-C12ジエステル）、
【０１９０】
アシルサルコシネート、アルキル多糖類のスルフェート、例えばアルキルポリグルコシドのスルフェート（非イオン性の硫酸化されていない化合物は下記に記載される）、枝分かれ鎖の第一アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、例えば式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+［式中、RはC8-C22アルキルであり、ｋは１〜10の整数であり、そしてMは可溶性塩形成カチオンである］で表されるそれらのもの。樹脂酸及び水素化された樹脂酸、例えばロジン、水素化されたロジン、及びタル油に存在するか又はその油から誘導された樹脂酸及び水素化された樹脂酸がまた適切である。
【０１９１】
アルキルベンゼンスルホネートが非常に好ましい。線状（直鎖）アルキルベンゼンスルホネート（LAS）（ここで、アルキル基は好ましくは、10〜18個の炭素原子を含む）が特に好ましい。
さらなる例は、“Surface Active Agents and Detergents”（Vol. I and II by Schwartz, Perry and Berch）に記載される。種々のそのような界面活性剤はまた、一般的に、アメリカ特許第3,929,678号（第23頁左欄、第58行〜第29頁左欄、第23行；引用により本明細書に組み込まれる）にも開示される。
本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約１〜約40重量％、好ましくは約３〜約20重量％のそのようなアニオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１９２】
本発明は清浄又は洗濯洗剤組成物はまた、カチオン性、両性、両性イオン及び半極性界面活性剤、並びに本明細書においてすでに記載されたもの以外の非イオン性及び/又はアニオン界面活性剤を含むことができる。
本発明の洗濯洗剤組成物への使用のために適切なカチオン性洗剤海面活性剤は、１つの長鎖ヒドロカルビル基を有すそれらのものである。そのようなカチオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する：アンモニウム海面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲン化物、及び下記式：
【０１９３】
［R2(OR3)y］ [R4(OR3)y]2R5N+X-
［式中、R2は、アルキル又はアルキル鎖に約８〜約18個の炭素原子を有するアルキルベンジル基であり；個々のR3は、-CH2CH2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2CH2(CH2OH)-, -CH2CH2CH2-及びそれらの混合物から成る群から選択され；個々のR4は、C1-C4アルキル、C1-C4ヒドロキシアルキル、２つのR4基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、
【０１９４】
及び-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH（ここで、R6は、約1000以下の分子量を有するいずれかのヘキソース又はヘキソースポリマー、及びｙが０でない場合、水素である）から成る群から選択され；R5は、R4と同じであるか、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の合計数、又はR2＋R5が約18よりも大きくなく；個々のｙは０〜約10であり、そしてｙ値の合計０〜約15であり；そしてXがいずれかの適合できるアニオンである］を有するそれらの海面活性剤。
【０１９５】
非常に好ましいカチオン性界面活性剤は、下記式：
R1R2R3R4N+X-（ｉ）
［式、C6-C16アルキルであり、個々のR2, R3, 及びR4は独立して、C1-C4アルキル、C1-C4ヒドロキシアルキル、ベンジル及び-(C2H40)XH（ここで、Xは２〜５の値である）であり、Xはアニオンである］で表される本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くとも１つのR2, R3又はR4がベンジルであるべきである。
【０１９６】
R1のための好ましいアルキル鎖長は、特に、アルキル基がヤシ脂肪に由来する鎖長の混合物、又はオレフィン増成又はOXOアルコール合成により合成的に誘導される場合、C12-C15である。
R2R3及びR4のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンXは、ハロゲン化合物、メトスルフェ−ト、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。
【０１９７】
本明細書において使用するための式（ｉ）の適切な第四アンモニウム化合物の例は、次のものである：ココナッツ・トリメチルアンモニウム塩化合物又は臭化物；ココナッツ・メチルジヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；デシルトリエチルアンモニウム塩化物；デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；C12-C15ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；ココナッツ・ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；ミリスチルトリメチルスルフェート；ラウリルジメチルベンジルアンモニウム塩化物又は臭化物；ラウリルジメチル (エテノキシ)4アンモニウム塩化物又は臭化物；コリンエステル［式（ｉ）（式中、R1は
【０１９８】
【化３】
2005160476.tif 000008
であり、そしてR2R3R4はメチルである）で表される化合物］；ジアルキルイミダゾリン［式（ｉ）の化合物］。
【０１９９】
本明細書において有用な他のカチオン性界面活性剤は、アメリカ特許第4,228,044号及びヨーロッパ特許第000224号に記載される。
本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約25重量％、好ましくは１〜約８重量％のそのようなカチオン性界面活性剤を含んで成る。
【０２００】
両性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又は複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体として広く記載され得、ここで前記脂肪族基は直鎖又は枝分かれ鎖であり得る。脂肪族置換基の１つは少なくとも約８個の炭素原子、典型的には、約８〜約18個の炭素原子を含み、そして少なくとも1つは、アニオン性水溶性基、例えばカルボキシ、スルホネート又はスルフェートを含む。例えば、両性界面活性剤については、アメリカ特許第3,929,678号（第19頁左欄、第18〜35行）を参照のこと。
本明細書において包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性界面活性剤を含んで成る。
【０２０１】
両性イオン性界面活性剤はまた、洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第三スルホニウム化合物の誘導体として広く記載され得る。例えば、両性イオン性界面活性剤については、アメリカ特許第3,929,678号（第19頁左欄、第38行〜第22頁右欄、第48行）を参照のこと。
本明細書において包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０２０２】
半−極性非イオン性界面活性剤は、約10〜約18個の炭素原子の1つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された2つの成分を含む水溶性アミン酸化物；約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭酸原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分を含む水溶性ホスフィン酸化物；及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭酸原子のアルキル及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された１つの成分を含む水溶性スルホキシドを含む、特定カテゴリーの非イオン性界面活性剤である。
【０２０３】
半−極性非イオン性洗剤界面活性剤は、下記式：
【化４】
2005160476.tif 000009
【０２０４】
［式中、R3は、約８〜約22個の炭素原子を含む、アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；R4は、約２〜約３個の炭素原子を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；Xは０〜約３であり；そして個々のR5は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又はヒドロキシアルキル基、又は約１〜約３個の酸化エチレン基を含むポリ酸化エチレンである］で表される酸化アミン界面活性剤を含む。R5基は、環構造を形成するために、例えば酸素又は窒素原子を通して、お互い結合され得る。
【０２０５】
それらのアミンの界面活性剤は特に、C10-C18アルキルジメチルアミン酸化物及びC8-C12アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミン酸化合物を含む。
本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような半−極性非イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０２０６】
ビルダー系：
本発明の組成物はさらに、ビルダー系を含むことができる。次のいずれかの従来のビルダー系が、本発明への使用のために適切である：アルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、材料、例えばエチレンジアミンテトラアセテート、金属イオン封鎖剤、例えばアミノポリホスホネ−ト、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸。明らかな環境の理由のためにほとんど好ましくはないけれども、ホスフェートビルダーもまた、本発明において使用され得る。
【０２０７】
適切なビルダーは、無機イオン交換材料、通常、無機水和化されたアルミノシリケート材料、より特定には、水和化された合成ゼオライト、例えば水和化されたゼオライトA，X, B, HS又はMAPであり得る。
もう１つの適切な無機ビルダー材料は、積層されたシリケート、例えばSKS-6(Hoechst)である。SKS−６は、珪酸ナトリウムから成る積層された結晶性シリケート（Na2Si2O5）である。
【０２０８】
1つのカルボキシ基を含む適切なポリカルボキシレートは、ベルギー特許第831， 368号、第821、368号及び第821、370号に開示されるように、乳酸、グリコール酸及びそれらのエーテル誘導体を包含する。2つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、琥珀酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）ニ酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルト酸及びフマル酸の水溶性塩、及びドイツ特許第2,446,686号及び第2,446,487号、及びアメリカ特許第3,935,257号に記載されるエーテルカルボキシレート、及びベルギー特許第840,623号に記載されルスルフィニルカルボキシレートを包含する。
【０２０９】
3個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、特に水溶性シトレート、アコニトレート及びトラコネート、及びスクシネート誘導体、例えばイギリス特許第1,379,241号に記載さえるカルボキシメチルオキシスクシネート、オランダ特許出願第7205873号に記載されるラクトオキシスクシネート、及びイギリス特許第1,387,447号に記載されるオキシポリカルボキシレート材料、例えば２−オキサ−１，１，３−プロパントリカルボキシレートを包含する。
【０２１０】
４個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,261,829号に開示されるオキシジスクシネート、スルホ置換基を含む１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレート、例えばイギリス特許第1,398,421号及び第1,398,422号及びアメリカ特許第3,936,448号に開示されるスルホスクシネート誘導体、及びイギリス特許第1,082,179号に記載されるスルホン化され、熱分解されたシトレートを包含し、そしてホスホン置換基を含むポリカルボキシレートはイギリス特許第1,439,000号に開示される。
【０２１１】
脂環式及び複素環式ポリカルボキシレートは、次のものを包含する：シクロペンタン−シス、シス、シス−テトラカルボキシレート、シクロペンタジエニドペンタカルボキシレート、２，３，４，５−テトラヒドロ−フラン−シス、シス、シス−テトラカルボキシレート、２，５−テトラヒドロ−フラン−シス−ジスカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート、１，２，３，４，５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート、及び多価アルコール、例えばソルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体。芳香族ポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,425,343号に開示される、メリット酸、ピロメリット酸及びフタル酸誘導体を包含する。
【０２１２】
上記のうち、好ましいポリカルボキシレートは、分子当たり３個までのカルボキシ基を含むヒドロキシカルボキシレート、より特定には、シトレートである。
本発明の組成物への使用のための好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトA，又は積層されたシリケート（SKS-6），及び水溶性カルボキシレートキレート剤、例えばクエン酸の混合物を包含する。
【０２１３】
本発明の洗剤組成物への包含のための適切なキレ−ト化剤は、エチレンジアミン−N，N'−ニ琥珀酸（EDDS），そのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は置換されたアンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好ましいEDDS化合物は、遊離酸形及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。EDDSのそのような好ましいナトリウム塩の例は、Na2EDDS及びNa4EDDSを包含する。EDDSのそのような好ましいマグネシウム塩の例は、MgEDDS及びMg2EDDSを包含する。マグネシウム塩は、本発明の組成物への包含のために最も好ましいものである。
【０２１４】
好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばビオライトA，及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、例えばクエン酸の混合物を包含する。
粒質組成物への使用のためのビルダー系の一部を形成することができる他のビルダー材料は、無機材料、例えばアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、及び有機材料、例えば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート及びアミノポリカルボキシレートを包含する。
【０２１５】
他の適切な水溶性有機塩は、ホモー又はコ−ポリマー酸又はそれらの塩であり、ここで前記ポリカルボン酸は２個よりも多くない炭素原子によりお互い分離された少なくとも２つのカルボキシ基を含んで成る。
このタイプのポリマーは、GB-A-1,596,756号に開示される。そのような塩の例は、MW2000〜5000のポリアクレレート、及び無水マレイン酸とのそれらのコポリマーであり、そのようなコポリマーは、20,000〜70,000、特に約40,000の分子量を有する。
【０２１６】
洗浄ビルダー塩は通常、組成物の５〜80重量％の量で含まれる。液体洗剤のためのビルダーの好ましいレベルは、５〜30％である。
酸素：
マンナナ−ゼは、本発明の洗浄又は洗剤組成物中に、好ましくは、0.0001〜２重量％、より好ましくは0.0005〜0.5重量％、最も好ましくは0.001〜0.1重量％のレベルで、純粋な酵素形で導入され得る。
【０２１７】
本発明の清浄組成物はさらに、セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから成る群から選択されたカルボヒドラーゼを必須要素として含むことができる。好ましくは、本発明の清浄組成物は、マンナナーゼ、アミラーゼ、及びセルラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから成る群から選択されたもう１つの生物精練型酵素を含むであろう。
【０２１８】
本発明において使用できるセルラーゼは、細菌又は菌類セルラーゼを含む。好ましくは、それらは、５〜12のpH最適値及び50CEVU/mg（セルラーゼ粘度単位）以上の比活性を有するであろう。適切なセルラーゼは、アメリカ特許第4,435,307号、J61078384号及びWO96/02653号に開示されており、それらの特許はそれぞれ、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコダーマ（Trichoderma）、チエラビア（Thielavia）及びスポロトリカム（Sporotrichum）から生成される菌類セルラーゼを開示する。EP739982号は、新規バチルス種から単離されたセルラーゼを記載する。適切なセルラーゼはまた、GB−A−2075028号；GB−A−2095275号；DE−OS−2247832号及びWO95/26398号にも開示される。
【０２１９】
そのようなセルラーゼの例は、ヒューミコラ・インソレンスの株（Humicola grisea var. thermgidea）、特に株ヒューミコラ・インソレンスDSM1800により生成されるセルラーゼである。他の適切なセルラーゼは、約50kDの分子量、5.5の等電点を有し、そして415個のアミノ酸を含むヒューミコラ・インソレンス起源のセルラーゼ；及びヒューミコラ・インソレンス、DSM1800に由来する約43kDのエンド−β−１,４−グルカナーゼであり；好ましいセルラーゼはPCT特許出願WO91/17243号に開示されるアミノ酸配列を有する。
【０２２０】
また、適切なセルラーゼは、WO94/21801号に記載されるトリコダーマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）からのBGIIIセルラーゼである。特に適切なセルラーゼは、色彩保護利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、WO96/29397号、EP−A−0495257号、WO91/17243号、WO91/17244号及びWO91/21801号に記載されるセルラーゼである。布の保護及び/又は洗浄性質についての他の適切なセルラーゼは、WO96/34092号、WO96/17994号及びWO95/24471号に記載される。
【０２２１】
前記セルラーゼは通常、洗剤組成物の0.0001〜２重量％の純粋な酵素のレベルで洗剤組成物に導入される。
本発明のための好ましいセルラーゼは、アルカリセルラーゼ、すなわち７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも25％、より好ましくは少なくとも40％の活性を有する酵素である。より好ましいセルラーゼは、７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性を有する酵素である。好ましいアルカリセルラーゼは、商標Carezyme（商標）としてNovo Nordisk A/Sから市販されるセルラーゼである。
【０２２２】
アミラーゼ（α及び/又はβ）は、炭水化物基材のしみの除去のために含まれ得る。1994年２月３日に公開されたWO94/02597号、Novo Nordisk A/Dは、変異体アミラーゼを組込む清浄組成物を記載する。また、1995年４月20日に公開されたWO95/10630号、Novo Nordisk A/Sも参照のこと。清浄組成物への使用のための既知の他のアミラーゼは、α−及びβ−アミラーゼの両者を包含する。α−アミラーゼは当業界において知られており、そして次の特許に開示されるものを包含する：アメリカ特許第5,003,257号；EP252,666号；WO91/00353号；FR2,676,456号；EP285,123号；EP525,610号；EP368,341号；及びイギリス特許出願第1,296,839号（Novo）。
【０２２３】
他の適切なアミラーゼは、1994年８月１８日に公開されたWO94/18314号及び1994年２月22日に公開されたWO96/05295（Genencor）に記載される安定性−増強されたアミラーゼ、及び1995年４月に公開されたWO95/10603号に公開される、Novo Nordisk A/Sから入手できる特許における、追加の修飾を有するアミラーゼ変異体である。また適切なアミラーゼは、EP277216号及びWO96/23873号（すべては、Novo Nordisk による）に記載される。
【０２２４】
市販のα−アミラーゼ生成物の例は、GenencorからのPurafect OX AM（商標）, 及びTermamyl（商標）, Ban（商標）, Fuugamyl（商標）, 及びDuramyl（商標）（すべては、Novo Nordisk A/S Denmark から入手できる）である。WO95/26397号は、他の適切なアミラーゼ、すなわちPhadebas（商標） α−アミラーゼ活性アッセイにより測定される場合、25℃〜55℃の温度範囲、及び８〜10の範囲のpH値で、Termamyl（商標）の比活性よりも少なくとも25％高い比活性を有することによって特徴づけられるα−アミラーゼを記載する。WO96/23873号（Novo Nordisk）に記載される上記酵素の変異体が適切である。活性レベルに関して、改良された性質、及び熱安定性及びより高い活性レベルの組み合わせを有するほかのデンプン分解酵素が、WO95/35382号に記載される。
【０２２５】
本発明のための好ましいアミラーゼは、商標Termamyl, Duramyl 及びMaxamyl として市販さえているアミラーゼ、及び/又はWO96/23873号において配列番号２として開示される、高められた熱安定性を示すα−アミラーゼ変異体である。
特定の用途のための好ましいアミラーゼは、アルカリアミラーゼ、すなわち７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも40％の酵素活性を有する酸素である。より好ましいアミラーゼは、７〜12に範囲のpHでそれらの最大活性を有する酵素である。
デンプン分解酵素は、組成物の0.0001〜２重量％好ましくは0.00018〜0.06重量％、より好ましくは0.00024〜0.048重量％の純粋の酵素レベルで、本発明の洗剤組成物に組込まれる。
【０２２６】
用語“ペクチン分解酵素”とは、次のものを包含することが意図される：アラビナナーゼ（EC 3.2.1.99）、ガラクタナーゼ（EC 3.2.1.89）、ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）、エキソ−ポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67）、エキソ−ポリ−α−ガラクツロニダーゼ（EC 3.2.1.82）、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチンエステラーゼ（EC 3.2.1.11）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、エキソ−ポリガラクツロナーゼリアーゼ（EC 4.2.2.9）及びヘミセルラーゼ、例えばエンド−１,３−β−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.32）、キシラン−１，４−β−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）及びα−L−アラビノフラノシダーゼ（EC 3.2.1.55）。
【０２２７】
ペクチン分解酵素は、上記酵素活性の天然の混合物である。従って、ペクチン酵素は、ペクチンエチルエステル結合を加水分解するペクチンメチルエステラーゼ、ガラクツロン酸分子間グリコシド結合を分解するポリガラクツロナーゼ、及びガラクツロン酸の不飽和誘導体を形成するためにα−１→４グリコシド結合の非加水分解性切断をもたらすようペクチン酸に対して作用するペクチントランスエリミナーゼ又はリアーゼを包含する。
ペクチン分解酵素は、好ましくは合計組合物の0.0001〜２重量％、より好ましくは0.0005〜0.5重量％、最も好ましくは0.001〜0.1重量％（純粋な酵素）のレベルで、本発明に従って組成物中に導入される。
【０２２８】
特定の用途のための好ましいペクチン分解酵素は、アルカリペクチン分解酵素、すなわち７〜12のpHで、それらの最大活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも40％の酵素活性を有する酵素である。より好ましいペクチン分解酵素は、７〜12のpHでそれらの最大活性を有する酵素である。アルカリペクチン分解酵素は、好アルカリ微生物、例えば細菌、菌類及び酵素、例えばバチルス種により生成される。好ましい微生物は、日本特許第56131376号及び第56068393号に記載されるように、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である。
【０２２９】
アルカリペクチン分解酵素は、ガラクツラン−１，４−α−ガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.6.7）、ポリ−ガラクツロナーゼ活性（EC 3.2.1.15）、ペクチンエステラーゼ（EC 3.1.1.11）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）及びそれらのイソ酵素を包含し、そしてそれらはエルウィニア（Erwinia）種により生成され得る。日本特許第59066588号、日本特許第63042988号、及びWorld J. Microbiol. Microbiotechnol. (8, 2, 115-120) 1992に記載されるように、E.クリサンテミ（E. chrysanthemi）、E.カロトボラ（E. carotovora）、E.アミロボラ（E. amylovora）、E.ヘルビコラ（E. herbicola）、E.ジソルベンス（E. dissolvens）が好ましい。前記アルカリペクチン酵素はまた、日本特許第73006557号及びAgr. Biol. Chem. (1972), 36 (2) 285-93に開示されるように、バチルス種によって生成され得る。
【０２３０】
用語キシログルカナーゼは、Vincken and Voragen at Wageningen University [vincken など. (1994) Plant Physiol., 104, 99-107] により記載される酵素ファミリーを包含し、そしてHayashiなど. (1989) Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 139-168に記載されようなキシログルカンを分解できる。Vincken などは、トリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）から精製されたキシログルカナーゼ（エンド−IV−グルカナーゼ）による、単離されたリンゴ細胞壁のセルラーゼからのキシログルカン被膜の除去を示した。この酵素は、細胞壁−埋封されたセルロースの酵素分解を増強し、そしてペクチン酵素と共同して作用する。Gist−BrcadesからのRapidase LIQ＋は、キシログルカナーゼ活性を含む。
【０２３１】
このキシログルカナーゼは、好ましくは、組成物の0.0001〜２重量％.,より好ましくは0.0005〜0.5重量％、最も好ましくは0.001〜0.1重量％の純粋な酵素レベルで、本発明の清浄組成物中に導入される。
特定用途のための好ましいキシログルカナーゼは、アルカリキシログルカナーゼ、すなわち７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは40％の酵素活性を有する酵素である。より好ましいキシログルカナーゼは、７〜12の範囲のpHで、それらの最大活性を有する酵素である。
【０２３２】
上記酵素は、いずれか適切な起源のもの、例えば植物、動物、細菌、菌類及び酵母起源のものであり得る。起源はさらに、中温性又は高温性（extremphilic）（好冷性、向冷性、好熱性、好圧性、好アルカリ、好酸性、好ハロゲン性、等）であり得る。それらの酵素の精製された又は精製されない形が使用され得る。現在、本発明の清浄組成物において野生型酵素の性能効率を最適化するためにタンパク質又は遺伝子工学技法を通してそれらの酵素を修飾することは、通常の実施である。例えば、変異体は、そのような組成物中の通常遭遇する成分に対する酵素の適合性が高められるように企画され得る。他方では、変異体は、酵素変異体の最適pH、漂白剤又はキレート剤安定性、触媒活性及び同様のものが特定の清浄用途に適合するよう調整され得る。
【０２３３】
特に、漂白剤安定性の場合、酸化に対して敏感なアミノ酸に対して、及び表面適合性のための表面の電荷に対して注意が払われるべきである。そのような酵素の等電点はいくつかの荷電されたアミノ酸の置換により修飾され、例えば等電点の上昇はアニオン性界面活性剤との適合性の改良を助けることができる。酵素の安定性は、キレート剤安定性を高めるために、例えば追加の塩架橋及び強い金属結合部位の創造によりさらに高められ得る。
【０２３４】
漂白剤：
本発明の洗剤組成物に含まれ得る追加の任意の洗剤成分は、漂白剤、例えばPB1，PB4, 及び400〜800μの粒子サイズを有するペルカルボネートを包含する。それらの漂白剤成分は、１又は複数の酸素漂白剤、及び選択される漂白剤に依存して、１又は複数の漂白活性化剤を含むことができる。存在する場合、酸素漂白化合物は典型的には、約１％〜約25％のレベルで存在するであろう。一般的に、漂白化合物は、非液体配合物、例えば粒状洗剤において任意の添加される成分である。
【０２３５】
本発明に使用するための漂白剤成分は、洗剤組成物のために有用な漂白剤、例えば酸素漂白剤、及び当業界において知られている他のもののいずれかであり得る。
本発明のための適切な漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤であり得る。
【０２３６】
使用され得る酸素漂白剤の１つのカテゴリーは、過カルボン酸漂白剤及びその塩を包含する。この種類の剤の適切な例は、マグネシウムモノペルオキシフタレート・６水和物、すなわちメタ−クロロ過安息香酸、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオール酸を包含する。そのような漂白剤は、アメリカ特許第4,483,781号、アメリカ特許第740,446号、ヨーロッパ特許第0133354号及びアメリカ特許第4,412,934号に開示される。非常に好ましい漂白剤はまた、アメリカ特許第4,634,551号に記載されるように、６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸も包含する。
【０２３７】
使用され得るもう１つのカテゴリーの漂白剤は、ハロゲン漂白剤を包含する。次亜ハロゲン化合物漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸、及びナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレ−ト、及びN−クロロ及びN−ブロモアルカンスルホンアミドを包含する。そのような材料は通常、最終生成物の0.5〜10重量％、好ましくは１〜５重量％で添加される。
【０２３８】
次の過酸化水素離型剤が、漂白活性化剤と一緒に使用され得る：テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS;アメリカ特許第4,412,934号に記載される）、３，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート（ISONOBS；ヨーロッパ特許第120591号に記載される）又はペンタアセチルグルコース（PAG）、ここでそれらは、活性漂白種として過酸を形成するために過加水分解され、改良された漂白効果がもたらされる。
【０２３９】
さらに、次の漂白活性剤が非常に適切である：C8（6−オクタアミド−カプロイル）オキシベンゼン−スルホネート、C9（6−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート及びC10（６−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート又はそれらの混合物。または適切な活性化因子は、アシル化されたシトレートエステル、例えばヨーロッパ特許出願第91870207.7号に開示されるようなものである。
【０２４０】
本発明の清浄組成物への使用のための漂白活性化剤及び過酸漂白化合物を含んで成る漂白系及び過オキシ酸を含む有用な漂白剤が、USSN出願08/136,626号に記載される。
過酸化水素はまた、洗浄及び/又はすすぎ工程の開始又はその間、過酸化水素を発生できる酵素系（すなわち、酵素及びそのための基質）を添加することによって存在することができる。そのような酵素系は、ヨーロッパ特許出願0537381号に開示される。
【０２４１】
酸素漂白剤以外の漂白剤もまた、当業界において知られており、そして本発明において使用され得る。特に興味ある１つのタイプの非酸素漂白剤は、光活性化された漂白剤、例えばスルホン化された亜鉛及び/又はアルミニウムフタロシアニンを包含する。それらの材料は、洗浄工程の間、支持体上に沈着され得る。日中の光下で乾燥するために布を吊り下げることによって、酸素の存在下で光による照射に基づいて、スルホン化された亜鉛フタロシアニンが活性化され、そして従って、支持体が漂白される。
【０２４２】
好ましい亜鉛フタロシアニン及び光活性化された漂白工程は、アメリカ特許第4,033,718号に記載されている。典型的には、洗剤組成物は、約0.025〜約1.25重量％のスルホン化された亜鉛フタロシアニンを含むであろう。
漂白剤はまた、マンガン触媒を含むことができる。このマンガン触媒は、“Efficient mangamese catalysts for low-Temperature bleaching”、Nature 369 1994, pp.637-639に記載される化合物の１つであり得る。
【０２４３】
石鹸の泡抑制剤：
もう１つの任意の成分は、シリコーン及びシリカ−シリコーン混合物により例示される石鹸の泡抑制剤である。シリコーンは一般的に、アルキル化されたポリシロキサン材料により表され得るが、ところがシリカは通常、細かく分割された形で使用され、シリカエーロゲル及びキセロゲル、及び種々のタイプの疎水性シリカにより例示される。それらの材料は粒質物として導入され得、ここで石鹸の泡抑制剤は好都合には、水溶性又は水分散性、実質的には非界面活性剤不透明過性キャリヤーに開放できるように導入される。他方では、石鹸の泡抑制剤は、液体キャリヤーに溶解され又は分散され、そして１又は複数の他の成分上に噴霧することによって適用され得る。
【０２４４】
好ましいシリコーン石鹸の泡抑制剤はアメリカ特許第3,933,672号に開示される。他の特に有用な石鹸の泡抑制剤は、ドイツ特許出願（DTOS）第2,646,126号に記載される自己乳化性シリコーン石鹸の泡抑制剤である。そのような化合物の例は、シロキサン−グリコールポリマーである、DOW Corningから市販されているDC−544である。特に好ましい石鹸の泡抑制剤は、シリコーン油及び２−アルキル−アルケノールの混合物を含んで成る石鹸の泡抑制剤系である。適切な２−アルキル−アルカノールは、商標名Isofol 12Rとして市販されている２−ブチル−オクタノールである。
【０２４５】
そのような石鹸の泡抑制剤系は、ヨーロッパ特許出願第0593841号に記載されている。
特に好ましいシリコーン石鹸の泡抑制剤は、ヨーロッパ特許出願第92201649.8号に記載されている。前記組成物は、ヒュームド非孔性シリカ、例えばAerosilRと組合して、シリコーン/シリカ混合物を含んで成る。
上記石鹸の泡抑制剤は通常、組成物の0.001〜２重量％、好ましくは0.01〜１重量％のレベルで使用される。
【０２４６】
他の成分：
洗剤組成物に使用される他の成分、例えば土壌−沈殿防止剤、土壌−開放剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り抑制剤、着色剤、及び/又は封入された又は封入されていない香料が使用され得る。
特に適切な封入材料は、イギリス特許第1,464,616号に記載されるような、多糖及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
【０２４７】
他の適切な水溶性封入材料は、アメリカ特許第3,455,838号に記載されるような、置換ジカルボン酸のゲル化されていないスターチ酸エステルに由来するデキストリンを含んで成る。それらの酸−エステルデキストリンは、好ましくは、モチ状トウモロコシ、モチ状モロコシ、サゴ、タピオカ及びジャガイモのようなスターチから調製される。前記封入材料の適切な例は、National Starchにより製造されるN−Lokを包含する。N-Lok封入材料は、変性されたトウモロコシスターチ及びグルコースから成る。スターチは、一官能価置換された基、例えばオクテニル無水琥珀酸を添加することによって変性される。
【０２４８】
本発明において適切な再付着防止剤及び土壌沈殿防止剤は、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース、及びホモ−又はコ−ポリマーポリカルボン酸又はそれらの塩を包含する。このタイプのポリマーは、ビルダーとして前に言及された、ポリアクリレート及び無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、及びエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸と無水マレイン酸とのコポリマー（前記無水マレイン酸は、コポリマーの少なくとも20％モル％を構成する）を包含する。それらの材料は通常、組成物の0.5〜10重量％より好ましくは0.75〜８重量％、最も好ましくは１〜６重量％のレベルで使用される。
【０２４９】
好ましい蛍光増白剤は、特徴的にはアニオン性であり、それらの例としては、次のものを列挙することができる：二ナトリウム４，４'−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２'−ジスルホネート；ニナトリウム４，４'−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ−スチルベン−２：２'−ジスルホネート；二ナトリウム４，４'−ビス−（２，４−ジアニリノ−s−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２'−ジスルホネート；一ナトリウム４'，４"−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート；
【０２５０】
二ナトリウム４，４'−ビス−（２−アニリノ−４−（N−メチル−N−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２,２'−ジスルホネ−ト；二ナトリウム４，４'−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２'−ジスルホネ−ト；二ナトリウム４，４'−ビス−（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２'−ジスルホネート；ナトリウム−２−（スチルビル−４"−（ナフト−１', ２'：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２"−スルホネート；４，４'−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニル。
【０２５１】
他の有用なポリマー材料は、ポリエチレングリコール、特に1,000〜10,000の分子量、より特定には2,000〜8,000の分子量及び最も特定には、約4,000の分子量のものである。それらは、0.20〜５重量％、より好ましくは0.25〜2.5重量％のレベルで使用される。それらのポリマー及び前記のホモ−又はコ−ポリマー性ポリカルボキシレート塩は、白色度の維持、布への灰の付着、及び遷移金属不純物の存在下での、粘土、タンパク質性及び酸化性土壌に対して清浄性能を改良するために価値あるものである。
【０２５２】
本発明の組成物において有用な土壌開放剤は従来、種々の割合でのエチレングリコール及び/又はプロピレングリコール単位とテレフタル酸とのコポリマー又はターポリマーである。そのようなポリマーの例は、アメリカ特許第4,116,885号及び第4,711,730号、及びヨーロッパ特許第0272033号に開示される。ヨーロッパ特許第0272033号による特に好ましいポリマーは、下記式：
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75
［式中、PEGは-(OC2H4)O-であり、POは（OC3H6O）であり、そしてTは（pOOC6H4CO）である］を有する。
【０２５３】
ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリコーとしての変性されたポリエステルがまた、非常に有用であり、ここで末端基は、第１に、スルホルベンゾエート及び第２に、エチレングリコール及び/又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成る。目的は、“主に”、スルホベンゾエート基により両端でキャップされたポリマーを得ることであり、本明細書においては、本明細書における前記コポリマーのほとんどは、スルホベンゾエート基によりキャップされるであろう。
【０２５４】
しかしながら、いくつかのコポリマーは十分にはキャップされず、そして従って、それらの末端基はエチレングリコール及び/又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成り、従って、第２に、そのような種から成ることができる。
本明細書における選択されたポリエステルは、約46重量％のジメチルテレフタル酸、約16重量％の１，２−プロパンジオール、約10重量％のエチレングリコール、約13重量％のジメチルスルホ安息香酸及び約15重量％のスルホイソフタル酸を含み、そして約3,000の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は、ヨーロッパ特許第311342号に記載されている。
【０２５５】
軟化剤：
布軟化剤もまた、本発明に従って、洗濯洗剤組成物中に導入され得る。それらの剤は、無機又は有機型のものであり得る。無機軟化剤は、GB-A-１ 400898号及びアメリカ特許第5,019,292号に開示されるスメクタイトクレー（smectite clays）により例示される。有機布軟化剤は、GB-A1 514276号及びヨーロッパ特許第0011340号に開示されるように水不溶性第三アミンを含み、そしてモノC12-C14第四アンモニウム塩とのそれらの組み合わせがEP-B-0026528号に開示されており、そして前記剤は、ヨーロッパ特許第0242919号に開示されるように２つの長鎖アミドを含む。布軟化システムの他の有用な有機成分は、ヨーロッパ特許第0299575号及び第0313146号に開示されるように高分子量ポリ酸化エチレン材料を含む。
【０２５６】
スメクタイトクレーのレベルは通常、５〜15重量％、より好ましくは８〜12重量％の範囲であり、そして前記材料は配合物の残りに混合された乾燥成分として添加される。有機布軟化剤、例えば水不溶性第三アミン又は２つの長鎖アミド材料は、0.5〜５重量％、通常１〜３重量％のレベルで導入され、そして高分子量ポリ酸化エチレン材料及び水溶性カチオン性材料は、0.1〜２重量％、通常0.15〜1.5重量％のレベルで添加される。それらの材料は通常、組成物の噴霧乾燥された部分に添加されるが、但し多くの場合、それは乾燥混合された粒質物としてそれらを添加し、又は組成物の他の固体成分上に溶融された液体としてそれらを噴霧することがより便利であり得る。
【０２５７】
ポリマー性色素移動阻害物質：
本発明の界面活性剤組成物は、0.001重量％〜10重量％、好ましくは0.01重量％〜２重量％、さらに好ましくは0.05重量％〜１重量％のポリマー性色素移動阻害物質を含む。該ポリマー性色素移動阻害物質は通常、界面活性剤組成物に取り込まれて、着色布地から、該界面活性剤組成物で洗浄される布地へ色素が移動するのを阻害する。これらのポリマーは、色素が洗濯物中の他の物質に結合する機会を有する前に、着色布地から離れていく色素と複合体を生成するかまたはこれを吸着する能力を有する。
【０２５８】
特に好適なポリマー性色素移動阻害物質は、ポリアミンＮ−オキソドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとの共重合体、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドンとポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物である。
このようなポリマーはまた、本発明の酵素の性能を増強する。
【０２５９】
製紙パルプ産業における使用
さらに、本発明のマンナナーゼは、製紙パルプ（化学パルプ、半パルプ、機械パルプまたはクラフトパルプ）の塩素を含まない漂白プロセスにおいて、これらの輝きを上昇させ、こうして漂白プロセスにおける過酸化水素のニーズを低減または排除するのに有用である。
【０２６０】
繊維産業およびセルロース繊維加工産業における使用
本発明のマンナナーゼは、繊維の製造または界面活性剤と組合せた繊維のクリーニングのために、他の炭水化物分解酵素（例えば、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、種々のペクチナーゼ）と組合せて使用することができる。
本発明において「セルロース性材料」という用語は、綿、混紡綿、または天然もしくは人工セルロース物質（例えば、木材パルプのようなキシラン含有セルロース繊維由来）またはこれらの混紡から作られた、繊維、織布や不織布（ニット、織物、デニム、ヤーン、およびタオル地を含む）を意味する。
【０２６１】
混紡の例には、綿またはレーヨン／ビスコースと、羊毛、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリビニルクロリド繊維、ポリビニリドンクロリド繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）およびセルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、アサ、アマ／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）のような１つまたはそれ以上のコンパニオン材料との混紡がある。
【０２６２】
例えば綿繊維を衣類の製造に使用可能な材料にするような、繊維産業のセルロース材料の加工には、以下のいくつかの工程がある：繊維を紡糸してヤーンにする：ヤーンから織布またはニットの作成および以後の製品化、染色、仕上げ操作。織布品は、一連の縦糸の間に横糸を織ることにより作成され、これらの糸のタイプは異なっていてもよい。
【０２６３】
糊抜き：整経速度を上昇させるために、織る前に高分子糊（例えば、マンナン、デンプン、CMCまたはPVA）が加えられる。この材料は、さらに加工する前に除去しなければならない。本発明の酵素は、マンナン含有糊の除去に有用である。
元糊の分解
グアールガムやローカストビーンガムのようなガラクトマンナンは、Ｔシャツへの捺染のような繊維の捺染、例えば食品や捺染糊のような増粘剤として広く使用されている。本発明の酵素または酵素調製物は、加工装置の残存食物の粘度を低下させ、従って加工後のクリーニングを促進するのに使用することができる。さらに、この酵素または酵素調製物は、捺染糊の粘度を低下させ、従って繊維の捺染後の過剰の捺染糊の洗浄を促進するのに有用であると考えられる。
【０２６４】
植物物質の分解または修飾
本発明の酵素または酵素調製物は好ましくは、植物由来の物質を含有するマンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナンまたはガラクトグルコマンナンの分解または修飾ための物質として有用である。このような物質の例としては、グアールガムやローカストビーンガムがある。
本発明のマンナナーゼは、植物由来の物質の物理化学的性質（例えば、粘度）を修飾するのに使用できる。例えばマンナナーゼは、マンナンを含有する飼料や食物の粘度を低下させ、粘性のあるマンナン含有物質の加工を促進するのに有用である。
【０２６５】
コーヒー抽出
本発明の酵素または酵素調製物はまた、液体コーヒー抽出物中に存在するガラクトマンナンの加水分解に、好ましくは（インスタント）コーヒーの凍結乾燥中のゲル形成を阻害するために使用される。好ましくは本発明のマンナナーゼは、酵素消費を低減させ、コーヒーの汚染を避けるために、固定化される。この使用はさらに、EP-A-676145で説明されている。
【０２６６】
地下部の破砕における使用（石油掘穿）
さらに、本発明の酵素は、ビージェイサービシーズ社（BJ Services Company） （米国テキサス州ヒューストン）の米国特許第5,806,597号，5,562,160号、5,201,370号、および5,067,566号に開示されたように、酵素破壊剤として有用であると考えられる。
【０２６７】
従って本発明のマンナナーゼは、井戸掘穿において地下部の破壊法として有用であり、ここでは、水性液体、水和可能ポリマー、水和可能ポリマーを架橋するための適当な架橋剤を混合して、ポリマーゲルと酵素破壊物質（すなわち、本発明の酵素）を形成する。架橋ポリマーゲルは、地下部を破壊するのに充分な圧力下で、井戸穴中にポンプで入れられる。酵素破壊物は、時間とともに架橋ポリマーを分解して液体の粘度を低下させるため、液体を地下部から井戸の表面にポンプで送ることができる。
【０２６８】
酵素破壊物は、分解性液体または分解剤−架橋剤−ポリマー複合体（これはさらに、水和可能ポリマーと架橋剤を含む）の成分でもよい。分解性液体または複合体は、ゲルまたはゲル化可能なものである。複合体は、周りの地下部を分解するのに充分な圧力下で、井戸穴内の液体を所望の位置にポンプで送ることにより、井戸穴の周りの地下部を分解するのに、分解性液体中の複合体の使用方法に有用である。液体が井戸穴中に入れられ、所望の分解が完了する時まで、ｐＨと温度の具体的な条件を維持することにより、複合体は実質的に非反応性状態で維持される。いったん分解が完了すれば、複合体が不活性である特定の条件は、もう維持されない。条件が充分に変化すると複合体が活性になり、分解物はポリマー分解の触媒を始め、分解性液体が、地下部から井戸の表面に液体を充分に送られるようにする。
【０２６９】
材料と方法
活性試験ための測定法
マンナナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の標準的試験方法により試験され、例えば、被験溶液を、0.2%AZCLガラクトマンナン(carob)（メガザイム（Megazyme）社のカタログ番号I-AZGMZとして入手できるエンド−１，４−ベータ−Ｄ−マンナナーゼの測定ための基質）（メガザイム（Megazyme）社のインターネットアドレス：http://www.megazyme.com/Purchase/index.html））を含有する寒天プレート中に開けた直径４mmの穴に適用する。
【０２７０】
マンナナーゼ比色法の触媒活性（ManU）の測定
基質：0.1Mグリシン緩衝液(pH10.0)中のcarob由来の0.2%AZCLガラクトマンナン（メガザイム（Megazyme）、オーストラリア）。
この測定法は、サーモミキサー上のエッペンドルフマイクロチューブ１．５ml中で攪拌しながら温度を40℃に制御して行われる。0.750mlの基質を0.05mlの酵素と20分間インキュベートし、15000rpmで４分遠心分離して反応を停止させる。基質の色を、１cmのキュベット中で600nmで測定する。
１ManU（マンナナーゼ単位）は、１cmで0.24の吸光度を与える。
【０２７１】
株とドナー生物
前述のバチルス・スペーシスI633は、配列番号１に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12197は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号１）。
前述のバチルス・アガラダエレンス（Bacillus agaradhaerens)NCIMB40482は、配列番号５に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12180は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む（配列番号５）。
【０２７２】
前述のバチルス・スペーシスAAI12は、配列番号９に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12433は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む（配列番号９）。
前述のバチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）は、配列番号11に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12441は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む（配列番号１１）。
前述のフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）は、配列番号13に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
【０２７３】
大腸菌DSM9984は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む（配列番号13）。
前述のバチルス・スペーシスAA349は、配列番号15に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12432は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号15）。
大腸菌DSM12847は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号17）。
大腸菌DSM12848は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号19）。
【０２７４】
前述のバチルス・クラウジイー（Bacillus clausii）は、配列番号21に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12849は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む（配列番号21）。
大腸菌DSM12850は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号23）。
バチルス・スペーシスは、配列番号25に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12846は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む（配列番号25）。
【０２７５】
バチルス・スペーシスは、配列番号27に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12851は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む（配列番号２７）。
前述のバチルス・リケニホルミス（licheniformis）は、配列番号２９に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12852は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号29）。
バチルス・スペーシスは、配列番号31に示すDNA配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12436は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む（配列番号31）。
【０２７６】
大腸菌株：大腸菌SJ2の細胞（ヂデリクセン（Diderichsen, B.）, ウェドステッド（Wedsted, U.）, ヘデガード（Hedegaard, L.）, ジェンセン（Jensen, B. R.）, スジョホルム（Sjoholm, C.）、(1990)、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）のエクソ酵素であるアルファ−アセトラクテートデカルボキシラーゼをコードするaldBのクローニング、J. Bacteriol., 172, 4315-4321）を調製し、バイオラッド（Bio-Rad）のジーンパルサー（Gene Pulser）（登録商標）を使用して、電気穿孔法により、製造業者の説明書に従って形質転換した。
【０２７７】
枯草菌（B. subtilis）PL2306。この株は、既知の枯草菌（Bacillus subtilis）セルラーゼ遺伝子の転写単位中で破壊されたａｐｒ遺伝子とｎｐｒ遺伝子（ヂデリクセン（Diderichsen, B.）, ウェドステッド（Wedsted, U.）, ヘデガード（Hedegaard, L.）, ジェンセン（Jensen, B. R.）, スジョホルム（Sjoholm, C.）、 (1990)、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）のエクソ酵素であるアルファ−アセトラクテートデカルボキシラーゼをコードするａｌｄＢのクローニング、J. Bacteriol., 172, 4315-4321）を有するため、セルラーゼ陰性細胞となっている枯草菌（B. subtilis）DN1885である。この破壊は基本的に既に記載されているように行われた（ソネンシェイン（A.L. Sonenshein）, ホッホ（J.A. Hoch）とリチャードロシック（Richard Losick）(1993)、 枯草菌（Bacillus subtilis）と他のグラム陽性細菌、アメリカ微生物学会（American Society for
microbiology）、p. 618）。
【０２７８】
ヤスビン（Yasbin, R. E.）, ウィルソン（Wilson, G.A.）およびヤング（Young, F. E.）(1975)、枯草菌（Bacillus subtilis）の溶原性株中の形質転換とトランスフェクション：コンピタント細胞中のプロファージの選択的誘導の証拠、J. Bacteriol. 121: 296-304に記載したように、コンピタント細胞を調製し形質転換した。
【０２７９】
一般的分子生物学的方法：
特に明記しないバチルスIIは、DNA操作と形質転換は、分子生物学の標準的方法を使用して行った（サムブルーク（Sambrook）ら、モレキュラークローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク：アウスベル（Ausubel, F.M.）ら（編）、「分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、1995：ハーウッド（Harwod, C.R.）とカッティング（Cutting, S.M.）（編）「バチルス（Bacillus）ための分子生物学的方法（Molecular Biological Methods for Bacillus）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、1990）。
【０２８０】
ＤＮＡ操作の酵素は、製造業者の説明書に従って使用される（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼなどは、ニューイングランドバイオラボズ社（New England Biolabs, Inc.）から入手できる）。
【０２８１】
プラスミド
pSJ1678:(WO94/19454として発行された国際特許出願を参照されたい）。
pBK-CMV（ストラタジーン社（Stratagene inc）、ラホヤ、カリホルニア州）
pMOL944。このプラスミドは、プラスミドを枯草菌（Bacillus subtilis）中で繁殖できるようにする成分と、カナマイシン耐性遺伝子を実質的に含有し、バチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）ATCC14580由来の強いプロモーターとシグナルペプチドを有する、pUB110誘導体である。シグナルペプチドは、SacII部位を含有し、シグナルペプチドと融合したタンパク質の成熟部分をコードするDNAをクローン化するのに便利である。このため、細胞の外側に対するプレ−プロテインが発現される。
このプラスミドは、通常の遺伝子操作法により作製され、以下に簡単に説明する。
【０２８２】
pMOL944の作製：
pUB110プラスミド（マッケンジー（McKenzie, T.）ら、1986, Plasmid 15:93-103）を、ユニークな制限酵素ＮｃｉＩで消化した。プラスミドpDN1981（ジョルゲンセン（P.L. Jorgensen）ら、1990, Gene, 96, p37-41）にコードされたａｍｙＬプロモーターから増幅したPCR断片を、NciIで消化し、NciI消化したpUB110中に挿入して、プラスミドｐＳＪ２６２４を得た。
使用した２つのPCRプライマーは以下の配列を有する：
# LWN5494 5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'
# lwn5495 5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3'
【０２８３】
プライマー＃LWN5494は、プラスミド中にNotI部位を挿入する。
次にプラスミドpSJ2624をSacIとNotIで消化し、pDN1981上にコードされたamyLプロモーターで増幅したPCR断片を、SacI-NotI消化pSJ2624中に挿入して、プラスミドpSJ2670を得た。
このクローニングは、同じプロモーターで、しかし反対方向で最初のamyLプロモーターを置換している。PCR増幅に使用された２つのプライマーは以下の配列を有する：
#LWN5938 5'-GTCGGCGGCCGTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3'
#LWN5939 5'-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'
【０２８４】
プラスミドpSJ2670を、制限酵素PstIとBclIで消化し、アルカリ性アミラーゼSP722（特許＃WO9526397-A1）をコードするクローン化したDNA配列から増幅したPCR断片を、PstIとBclIで消化し、挿入して、プラスミドpMOL944を得た。PCR増幅に使用された２つのプライマーは以下の配列を有する：
#LWN7864 5'-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3'
#LWN7901       5' -AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3'
プライマー＃LWN7901は、プラスミド中にSacII部位を挿入する。
【０２８５】
ドナー株の培養とゲノムDNAの単離
バチルスの関連する株（例えば、バチルス（Bacillus）種I633）を、500mlのTY当たり50mlの1Mナトリウム−セスキカルボナートを添加して、pHを約9.7に調整したTY中で増殖させた。30℃、300rpmで24時間インキュベート後、細胞を採取し、ピッチャー（Pitcher）らが記載した方法によりゲノムDNAを単離した［ピッチャー（Pitcher, D. G.）, サンダース（Saunders, N.A.）, オーウェン（Owen, R. J）;チオシアン酸グアニジウムによる細菌性ゲノムDNAの迅速抽出；Lett Appl Microbil 1989 8 151-156］。
【０２８６】
培地
TY（アウスベル（Ausubel, F.M.）ら（編）、「分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、1995に記載）。
LB寒天（アウスベル（Ausubel, F.M.）ら（編）、「分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、1995に記載）。
LBPGは、0.5％グルコースと0.05Mリン酸カリウム（pH7.0）を補足したLB寒天。
【０２８７】
AZCL−ガラクトマンナンを、LBPG−寒天に0.5%になるように加える。AZCL−ガラクトマンナンは、メガザイム（Megazyme）（オーストラリア）から得られる。
BPX培地は、EP0506780(WO91/09129)に記載されている。
NZY寒天（１リットル当たり）  5gのNaCl、2gのMgSO4、5gの酵母エキス、10gのNZアミン（カゼイン加水分解物）、15gの寒天；脱イオン水を加えて１リットルにし、NaOHでpHを7.5に調整し、オートクレーブする。
【０２８８】
NZYブロス（１リットル当たり）  5gのNaCl、2gのMgSO4、5gの酵母エキス、10gのNZアミン（カゼイン加水分解物）；脱イオン水を加えて１リットルにし、NaOHでpHを7.5に調整し、オートクレーブする。
NZY上層寒天（１リットル当たり）  5gのNaCl、2gのMgSO4、5gの酵母エキス、10gのNZアミン（カゼイン加水分解物）、0.7%(w/v）アガロース；脱イオン水を加えて１リットルにし、NaOHでpHを7.5に調整し、オートクレーブする。
以下の非限定例により本発明を説明する。
【０２８９】
実施例１．バチルス（Bacillus）種（I633）由来のマンナナーゼ
ラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）ベクター中のバチルス（Bacillus）Ｉ６３３由来のゲノムライブラリーの作製
バチルス（Bacillus）I633のゲノムDNAを、制限酵素Sau3Aで部分的に消化し、0.7%アガロースゲル（シーケム（SeaKem）アガロース、FMC、米国）で電気泳動によりサイズ分画した。1.5〜10kbの大きさの断片を単離し、DNA断片を1.5%アガロースゲルに逆に流して１つのDNAバンドに濃縮し、次にキアクイック（Qiaquick）ゲル抽出キットを製造業者（キアゲン社（Quiagen Inc.）、米国）の説明書に従って使用して、アガロースゲルスライスから断片を抽出した。
【０２９０】
ゲノムライブラリーを作製するために、上記から精製し分画した約100ngのDNAを、1μgのBamHI切断し脱リン酸化したラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）ベクターアーム（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリホルニア州、米国）に、製造業者の説明書に従って、＋４℃で２４時間連結した。製造業者（ストラタジーン（Stratagene）、米国）の説明書に従って、ギガパックIIIゴールドパッケージングエキストラクト（GigaPackIII Gold packaging extract）（ストラタジーン（Stratagene））を使用して、連結混合物の３μｌのアリコートを直接パッケージングした。ストラタジーン（Stratagene）（米国）の大腸菌XL1-Blue MRF−株を使用して、ゲノムラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）ファージライブラリーを力価測定した。増幅しなかったゲノムライブラリーは、１％未満のベクターバックグランドを有する3×107 プラーク形成単位（pfu）からなる。
【０２９１】
ラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）中の機能性発現によるベータ−マンナナーゼクローンのスクリーニング
ゲノムライブラリーからの約5000プラーク形成単位（pfu）を、大腸菌XL1-Blue MRF'（ストラタジーン（Stratagene）、米国）を宿主として使用して、次にプレートを37℃で24時間インキュベートして、0.1%AZCL−ガラクトマンナン（メガザイム（MegaZyme）、オーストラリア、カタログ番号I-AZGMA）を含有するNZY−寒天プレート上に広げた。マンナナーゼ陽性ラムダクローンを、陽性ファージクローンの周りに青い加水分解輪を形成させて同定した。
【０２９２】
これらを、目的のプラークを含有するTOP寒天スライスの芯を抜いて、500μlのSM緩衝液と20μlのクロロホルム中に入れることにより、スクリーニングプレートから回収した。上記の0.1%AZCL−ガラクトマンナンを含有するNZYプレートに、芯を抜いたファージストックのアリコートを広げることにより、マンナナーゼ陽性ラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）クローンをプラーク精製した。単一のマンナナーゼ陽性ラムダクローンを、芯を抜いて、500μlのSM緩衝液と20μlのクロロホルム中に入れ、上記したようにもう一回広げて、精製した。
【０２９３】
マンナナーゼ陽性ラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）クローンからのファージミドの単一クローンインビボ切断
大腸菌XL1-Blue細胞（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリホルニア州）を調製し、ストラタジーン（Stratagene）が推奨するように１０mM  MgSO4中に再懸濁した。マンナナーゼ陽性クローンからの純粋なファージストックの２５０μｌのアリコートを、ファルコン2059試験管中で、200μlのXL1-Blue MRF'細胞（OD600=1.0）と＞106 pfu/mlのエクサシスト（ExAssist）M13ヘルパーファージ（ストラタジーン（Stratagene））と一緒にし、混合物を37℃で15分間インキュベートした。３mlのMNYブロスを各試験管に加え、試験管を37℃で2.5時間インキュベートした。
【０２９４】
試験管を20分間65℃で加熱して、大腸菌細胞とバクテリオファージラムダを死滅させた。ファージミドは加熱に対して耐性である。試験管を3000rpmで15分間遠心分離して、細胞破片を除去し、上清をきれいなファルコン2059試験管中にデカントした。切断した１本鎖ファージミドを含有する上清のアリコートを使用して、200μlの大腸菌XLOLR細胞（ストラタジーン（Stratagene）、10mMのMgSO4中でOE600=1.0）を、37℃で15分間インキュベートすることにより感染させた。細胞に350μlのNZYブロスを加え、試験管を37℃で45分間インキュベートした。
【０２９５】
細胞のアリコートを、LBカナマイシン寒天プレートに広げ、37℃で24時間インキュベートした。５つの切断した単一のコロニーを、0.1%AZCL−ガラクトマンナン（メガザイム（Megazyme）、オーストラリア）を含有するLBカナマイシン寒天プレートに再度画線培養した。マンナナーゼ陽性ファージミドクローンを、陽性コロニーの周りの青い加水分解輪の形成により解析した、これらは、単離したファージミドDNA（キアスピン（QiaSpin）キット、キアゲン（Quiagen）、米国）のEcoRI、PstI、EcoRI-PstI、およびHindIIIによる制限酵素分解物、次にアガロースゲル電気泳動によりさらに解析した。
【０２９６】
ヌクレオチド配列の解析
ゲノムベータ−１，４−マンナナーゼクローンpBXM3のヌクレオチド配列を、両方の鎖からジデオキシ鎖停止法（サンガー（Sanger, F）., ニックレン（Nicklen, S.）、およびクールソン（Coulson, A. R.） (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467）により、500μgのキアゲン（Quiagen）精製した鋳型（キアゲン（Quiagen）、米国）、Taqデオキシ末端サイクル配列決定キット（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、米国）、蛍光標識ターミネーター、および５pmolのpBK-CMVポリリンカープライマー（ストラタジーン（Stratagene）、米国）または合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、決定した。配列データの解析は、デベロー（Devereux）ら、1984（デベロー（Devereux, J.）、ヘベルリ（Haeberli, P.）、およびスミシーズ（Smithies, O.）、 (1984) Nucleic Acids Res. 387-395）に従って行った。
【０２９７】
配列の整列（Sequence Alignment）
本発明のバチルス（Bacillus）種I633（すなわち、配列番号２）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）（ジーンバンク（GenBank）/EMBL 受け入れ番号O66185）、ビブリオ種（受け入れ番号O69347）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）（受け入れ番号P51529）、およびカルジセルロシルプトー・サッカロリチカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus（受け入れ番号Ｐ２２５３３)のグリコヒドロラーゼファミリー５ベータ−１，４−マンナナーゼの複数の配列の整列。複数の配列整列は、GCGウィスコンシン（Wisconsin）ソフトウェアパッケージ、バージョン8.1のPileUpプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ３．００とギャップ伸長ペナルティ0.10を用いて、作成した。
【０２９８】
配列の類似性
バチルス（Bacillus）種I633からクローン化した本発明のファミリー５ベータ−１，４−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）（ジーンバンク（GenBank）/EMBL 受け入れ番号O66185）のベータ−１，４−マンナナーゼと75%の類似性と60.1%の同一性を示し、ビブリオ種（受け入れ番号O69347）のベータ−１，４−マンナナーゼと64.4%の類似性と44.6%の同一性を示し、
【０２９９】
ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）（受け入れ番号P51529）のベータ−１，４−マンナナーゼと63%の類似性と43.2%の同一性を示し、カルジセルロシルプトー・サッカロリチカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus（受け入れ番号P2253)のベータ−１，４−マンナナーゼと52.5%の類似性と34.4%の同一性を示す。配列は、GCGウィスコンシン（Wisconsin）ソフトウェアパッケージ、バージョン8.1のGAPプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ3.00とギャップ伸長ペナルティ0.10を用いて、整列させた。
【０３００】
バチルス（Bacillus）種（I633）マンナナーゼ遺伝子のクローニング
枯草菌（B．subtilis）中の触媒コアマンナナーゼ酵素のサブクローニングと発現
本発明のDNA配列をコードするマンナナーゼを、以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを使用して増幅した：
BXM2.upper.SacII
5'-GTT GAG AAA GCG GCC GCC TTT TTT CTA TTC TAC AAT CAC ATT ATC-3'
BXM2.core.lower.NotI
5'-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCT CAC TAC GGA GAA GTT CCT CCA TCA G-3'
制限部位SacIIとNotIに下線を引いてある。
【０３０１】
上記のようにバチルス（Bacillus）種I633から単離した染色体ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Amplitaq）DNAポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を使用して、PCR反応中の鋳型として使用した。PCR反応は、200μMの各dNTP、2.5単位のアンプリタク（Amplitaq）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、シータス（Cetus）、米国）および100pmolの各プライマーを含有するPCR緩衝液（10mMトリス−塩酸（pH8.3）、50mM  KCl、1.5mM MgCl2、0.01％(w/v)ゼラチン）中で作成した。
【０３０２】
PCR反応は、DNAサーマルサイクラー（ランドグラフ（landgraf）、ドイツ）を使用して行った。94℃で１分間のインキュベートを1回行った後、94℃で30秒の変性、60℃で１分のアニーリング、72℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、PCRを30サイクル行った。増幅産物の5μlのアリコートを、0.7%アガロースゲル（ヌシーブ（NuSieve）、FMC）で電気泳動して解析した。1.0kbの大きさのDNA断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３０３】
PCR断片のサブクローニング：
上記のように作成したPCR産物の45μlのアリコートを、キアクイック（QIAquick）PCR精製キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸（pH8.5）中で溶出した。5μgのpMOL944と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNotIで消化し、0.8%低温ゲル化アガロース（シープラーク（SeqPlaque）GTG、FMC）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（QIAquick Gel）抽出キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
【０３０４】
次に、単離したPCR DNA断片を、SacII-NotI消化し精製したpMOL944に連結した。連結は、0.5μgの各DNA断片、1UのT4 DNAリガーゼおよびT4リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）、ドイツ）を使用して、16℃で一晩行った。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（B. subtilis）PL2306を形質転換した。形質転換した細胞を、LBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に広げた。37℃で18時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドDNAを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３０５】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをMB748と呼んだ。クローンMB748をTY-10μg/mlカナマイシン中で37℃で一晩増殖させ、翌日１mlの細胞を使用して、枯草菌（B. subtilis）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Qiaprep Spin Plasmid Miniprep）キット＃27106を使用して、細胞からプラスミドを単離した。このDNAを配列決定し、配列番号１中の塩基対1201〜1203位に対応するアミノ酸残基No331を置換する停止コドンが導入されたマンナナーゼの成熟部分に対応するDNA配列が明らかになった（配列番号１の追加DNA配列中の91〜990位と、配列番号２中の追加タンパク質配列中の31〜330位に対応する）。
【０３０６】
Ｂ．枯草菌（B. subtilis）中の成熟完全長マンナナーゼのサブクローニングと
発現
本発明のDNA配列をコードするマンナナーゼを、以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを使用してPCR増幅した：
BXM2.upper.SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AAT TCC GGA TTT TAT GTA AGC GG-3'
BXM2.lower.NotI
5'-GTT GAG AAA GCG GCC GCC TTT TTT CTA TTC TAC AAT CAC ATT ATC-3'
制限部位SacIIとNotIに下線を引いてある。
【０３０７】
上記のようにバチルス（Bacillus）種I633から単離した染色体DNAを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Amplitaq）DNAポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を使用して、PCR反応中の鋳型として使用した。PCR反応は、200μMの各dNTP、2.5単位のアンプリタク（Amplitaq）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、シータス（Cetus）、米国）および100pmolの各プライマーを含有するPCR緩衝液（１０mMトリス−塩酸（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01%(w/v)ゼラチン）中で作成した。
【０３０８】
PCR反応は、DNAサーマルサイクラー（ランドグラフ（landgraf）、ドイツ）を使用して行った。94℃で１分間のインキュベートを1回行った後、94℃で30秒の変性、60℃で１分のアニーリング、７２℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、PCRを30サイクル行った。増幅産物の5μlのアリコートを、0.7%アガロースゲル（ヌシーブ（NuSieve）、FMC)で電気泳動して解析した。1.0kbの大きさのDNA断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３０９】
PCR断片のサブクローニング：
上記のように作成したPCR産物の45μlアリコートを、キアクイック（QIAquick）PCR精製キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸（pH8.5）中で溶出した。5μgのpMOL944と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNotIで消化し、0.8%低温ゲル化アガロース（シープラーク（SeqPlaque）GTG、FMC）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（QIAquick Gel）抽出キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。次に、単離したPCR DNA断片を、SacII-NotI消化し精製したpMOL944に連結した。連結は、0.5μgの各DNA断片、1UのT4 DNAリガーゼおよびT4リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）、ドイツ）を使用して、16℃で一晩行った。
【０３１０】
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（B. subtilis）PL2306を形質転換した。形質転換した細胞を、LBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に広げた。37℃で18時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドDNAを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３１１】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをMB643と呼んだ。クローンMB643をTY-10μg/mlカナマイシン中で37℃で一晩増殖させ、翌日１mlの細胞を使用して、枯草菌（B. subtilis）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Qiaprep Spin Plasmid Miniprep）キット＃27106を使用して、細胞からプラスミドを単離した。このDNAを配列決定し、配列番号１中のマンナナーゼ317〜1693と配列番号２中の33〜490の成熟部分に対応するDNA配列が明らかになった。
クローンMB643を、２枚の邪魔板の付いた500mlの振盪フラスコ中で10μg/mlのカナマイシンとともに25×200mlのBPX培地中で、37℃、300rpmで５日間増殖させた。
【０３１２】
アミノ酸残基第341番からアミノ酸残基第490番までの未知の機能を有するＣ末端ドメインをコードするDNA配列は、既知のマンナナーゼからのX18と呼ぶドメインと高い相同性を有する。このX18は、ヨシダ（Yoshida S.）, サコ（Sako Y.）, ウチダ（Uchida A.）:Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:514-420 (1998)中の「グアールガムを分解するバチルス・シルクランス（Bacillus circulans）K-1の酵素をコードする遺伝子の大腸菌中のクローニング、配列解析、および発現」から、EMBLエントリーAB007123中に見いだされる。この遺伝子は、シグナルペプチド（aa1〜34）、ファミリー５マンナナーゼの触媒性コア（aa35〜335）、リンカー（aa336〜362）および最後に未知の機能を有するX18ドメイン（aa363〜516）をコードする。
【０３１３】
このX18ドメインはまた、枯草菌（Bacillus subtilis）ベータ−マンナナーゼスイスプロテインデータベースエントリーP55278中に見いだされ、これは、シグナルペプチド（aa1〜26）、ファミリー26マンナナーゼの触媒性コア（aa27〜360）、およびこの未知の機能のＸ１８タンパク質ドメイン（aa361〜513）を開示する（枯草菌（Bacillus subtilis）ＮＭ−３９からのベータ−マンナナーゼ遺伝子のクローニングと配列決定、メンドーザ（Mendoza NS）; アライ（Arai M）;スギモト（Sugimoto K）;ウエダ（Ueda M）;カワグチ（Kawaguchi T）;ジョソン（Joson LM）, フィリピン、IN Biochimica Et Biophysica Acta Vol. 1243, No. 3 pp. 552-554 (1995)）。
【０３１４】
実施例２．バチルス（Bacillus）種I633からのマンナナーゼの発現、精製および性状解析
実施例１で材料と方法に記載されたように得られたクローンＭＢ７４８を、２枚の邪魔板の付いた500mlの振盪フラスコ中で10μg/mlのカナマイシンとともに25×200mlのBPX培地中で、37℃、300rpmで５日間増殖させた。
クローンMB748の振盪フラスコ培養液4500mlを採取し、pHを5.6に調整した。陽イオン性物質（10% C521)100mlと陰イオン性物質(A130)180mlを、凝集のために攪拌中に加えた。ソ−バル（Sorval）RC 3B遠心分離機を使用して6℃、9000rpmで20分遠心分離して、凝集した物質を分離した。上清を、ワットマンガラスフィルターGF/DとＣを使用して清澄化し、最後にフィルトロンでカットオフ１０kDaで濃縮した。
【０３１５】
この濃縮液700mlを、水酸化ナトリウムを使用してpH7.5に調整した。清澄な溶液を、50mlのトリス（pH7.5）で平衡化した1000mlのＱ−セファロースカラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したマンナナーゼ活性を、塩化ナトリウム勾配を使用して、1100ml中に溶出した。これを、フィルトロン膜を使用して440mlに濃縮した。高純度のマンナナーゼを得るために、この濃縮物を、0.1M酢酸ナトリウム（pH6.0）で平衡化したスーパーデックス（Superdex）200カラムに通した。
純粋な酵素は、SDS-PAGEで分子量34kDaの単一のバンドを与えた。
【０３１６】
ローカストビーンガムを使用する定常状態速度論：
異なる量の基質ローカストビーンガムを使用して、0.1Mグリシン緩衝液中でpH10で40℃で20分インキュベートし、次に還元糖の生成を測定することにより測定を行った。定常状態中の還元糖のマイクロモルの生成の計算のために、グルコースを標準物質として使用した。
【０３１７】
以下のデータは、本発明の高度に精製したマンナナーゼについて得られた：
KCatは467／秒で標準偏差が13；
kMは0.7で標準偏差は0.07。
エリタクスソフトウェア・ユーケー（Erithacus Software U.K.）のレザーバロー（Leatherbarrow）によるコンピュータープログラムグラフィット（grafit）を、計算のために使用した。還元糖は、PHBAH法（レバー（Lever, M.）(1972), 炭水化物の比色法定量ための新しい反応、Anal. Biochem. 47, 273-279）を使用して測定した。
【０３１８】
精製したタンパク質の以下のＮ末端配列を決定した：ANSGFYVSGTTLYDANG。
安定性：マンナナーゼは、室温で２日間インキュベート後、pH6.0〜11で充分安定であった。
pH活性プロフィールは、酵素がpH7.5〜pH10の間で60%以上の活性を有することを示す。
最適温度は、pH10で50であった。
DSC示差走査熱量測定は、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH6.0で融点として66℃を与え、このマンナナーゼ酵素は熱安定性であることを示していた。
免疫学的性質：デンマークの会社DAKOの通常の技術を使用して、高度に精製したクローン化マンナナーゼに対して、ウサギポリクローナル単一特異性血清を作成した。血清は、本発明の粗の精製していないマンナナーゼとともにアガロースゲル中で好ましい単一の沈殿物を生成した。
【０３１９】
実施例３．界面活性剤中の実施例２の酵素の使用
緩衝液の代わりに市販の界面活性剤を使用して、前記したようにｃａｒｏｂ度から0.2%AZCL−ガラクトマンナン（メガザイム（Megazyme）、オーストラリア）で40℃で20分インキュベートし、次に青色を測定することにより、実施例２に記載したように得られた酵素は、グリシン緩衝液中で、ヨーロッパ粉末界面活性剤Ariel Future中で60%の相対活性を有し、ヨーロッパ液体界面活性剤Ariel Future中で80%の相対活性を有し、US Tide粉末中で45%の相対活性を有し、US Tide液体界面活性剤中で37%の相対活性を有していた。これらの試験において界面活性剤濃度は、市販の界面活性剤のパッケージで推奨されたものであり、洗浄水は、ヨーロッパ（Ariel Future）条件で１８度の硬度を有し、US条件（US Tide）で９度の硬度を有した。
【０３２０】
実施例４．バチルス（Bacillus）種I633（実施例１と２）とセルロース結合ドメイン（CBD）との融合タンパク質の作製と発現
クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）ＹＳ株（プール（Poole D M）;モラグ（Morag E）;ラメド（Lamed R）;バイアー（Bayer EA）;ヘーズルウッド（Hazlewood GP）;ギルバート（Gilbert HJ）(1992)、 クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）ＹＳからのセルロソームサブユニットＳ１のセルロース結合ドメインの同定、Fems Microbiology Letters Vol. 78, No. 2-3 pp. 181-186）からのCipB遺伝子のDNA配列をコードするCBDは、すでにベクターｐＭＯＬ１５７８中に導入されていた。
【０３２１】
CBDをコードする染色体DNAは、プール（Poole D M）;モラグ（Morag E）;ラメド（Lamed R）;バイアー（Bayer EA）;ヘーズルウッド（Hazlewood GP）;ギルバート（Gilbert HJ）(1992)、 クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）YSからのセルロソームサブユニットS1のセルロース結合ドメインの同定、Fems Microbiology Letters Vol. 78, No. 2-3 pp. 181-186に記載されたように得られる。CBDをコードするDNA試料を、PCRの鋳型として使用し、CBDを、pMOL944ベクターに基づく適当なプラスミドpMB993中でクローン化した。
【０３２２】
ｐＭＢ９９３ベクターは、CipB CBDを含有し、ペプチドリンカーがCBDに先行する。このリンカーは、以下の配列ASPEPTPEPTからなり、直後にCipB CBDが続く。ASアミノ酸は、制限エンドヌクレアーゼ部位NheIを構成するDNA配列から得られ、これは以下で、本発明のマンナナーゼをクローン化するために使用される。
マンナナーゼ．Upper.SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AAT TCC GGA TTT TAT GTA AGC GG-3'
マンナナーゼ．Lower.NheI
5'-CAT CAT GCT AGC TGT AAA AAC GGT GCT TAA TCT CG-3'
制限部位NheIとNotIに下線を引いてある。
【０３２３】
上記のようにバチルス（Bacillus）種I633から単離した染色体DNAを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Amplitaq）DNAポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を使用して、PCR反応中の鋳型として使用した。PCR反応は、200μMの各dNTP、2.5単位のアンプリタク（Amplitaq）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、シータス（Cetus）、米国）および100pmolの各プライマーを含有するPCR緩衝液（10mMトリス−塩酸（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01%(w/v)ゼラチン）中で作成した。
【０３２４】
PCR反応は、DNAサーマルサイクラー（ランドグラフ（landgraf）、ドイツ）を使用して行った。94℃で１分間のインキュベートを1回行った後、94℃で30秒の変性、60℃で１分のアニーリング、72℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、PCRを30サイクル行った。増幅産物の５μｌのアリコートを、0.7%アガロースゲル（ヌシーブ（NuSieve）、FMC）で電気泳動して解析した。0.9kbの大きさのDNA断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３２５】
PCR断片のサブクローニング：
上記のように作成したPCR産物の45μlのアリコートを、キアクイック（QIAquick）PCR精製キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸（pH8.5）中で溶出した。5μgのpMOL993と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNheIで消化し、0.7％低温ゲル化アガロース（シープラーク（SeqPlaque）GTG、FMC）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（QIAquick Gel）抽出キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
【０３２６】
次に、単離したPCR DNA断片を、SacII-NheI消化し精製したpMB993に連結した。連結は、0.5μgの各DNA断片、1UのT4 DNAリガーゼおよびT4リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）、ドイツ）を使用して、16℃で一晩行った。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（B. subtilis）PL2306を形質転換した。形質転換した細胞を、LBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に広げた。37℃で18時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドDNAを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３２７】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをMB1014と呼んだ。クローンMB1014をTY-10μg/mlカナマイシン中で３７℃で一晩増殖させ、翌日１mlの細胞を使用して、枯草菌（B. subtilis）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Qiaprep Spin Plasmid Miniprep）キット#27106を使用して、細胞からプラスミドを単離した。このDNAを配列決定し、配列番号３に示すマンナナーゼ−リンカー−cbdと配列番号４に示す追加タンパク質配列の成熟部分に対応するDNA配列が明らかになった。
すなわち最終濃度は、以下の発現関連成分を含有する：（amyL−プロモーター）−（amyL−シグナルペプチド）−マンナナーゼ−リンカー−CBDを含有する。
【０３２８】
マンナナーゼ−CBD融合タンパク質の発現と検出
MB1014をTY-培地中で37℃、250rpmで20時間インキュベートした。1mlの無細胞上清を、ミリポアH20中の200μlの10%Avicel（メルク、ダームスタット（Darmstadt）、ドイツ）と混合した。この混合物を0℃で0.5時間インキュベートした。AvicelへのこのBXM2−リンカー−CBD融合タンパク質の結合後、結合タンパク質を5000gで５分遠心分離した。ペレットを100μlのSDS-PAGE緩衝液中に再懸濁し、95℃で５分間沸騰させ、5000gで５分遠心分離し、25μlを4〜20％リームリ（Laemmli）トリス−グリシン、SDS-PAGE NOVEXゲル（Novex、米国）にのせた。
【０３２９】
試料をエクセル（Xcell）（登録商標）ミニセル（Mini-Cell）（ノベックス（Novex）、米国）中で、製造業者が推奨するように電気泳動し、ゲルの以後のすべての操作（クマシーによる染色、脱染色と乾燥）は、製造業者が記載するように行った。
約５３kDaのタンパク質バンドの出現は、プラスミドpMB1014上にコードされた完全長マンナナーゼ−リンカー−CGD融合体の枯草菌（B. subtilis）での発現を証明していた。
【０３３０】
実施例５．バチルス・アガラダエレンス（Bacillus agaradhaerens）由来のマンナナーゼ
バチルス・アガラダエレンス（Bacillus agaradhaerens）からのマンナナーゼ遺伝子のクローニング
ゲノムＤＮＡ調製
バチルス・アガラダエレンス（Bacillus agaradhaerens）NCIMB40482を、WO94/01532に記載されているように、液体培地中で繁殖させた。30℃、300rpmで16時間インキュベート後、細胞を採取し、ピッチャー（Pitcher）らの方法によりゲノムDNAを単離した（ピッチャー（Pitcher, D. G.）, サンダース（Saunders, N.A.）, オーウェン（Owen, R. J）(1989), チオシアン酸グアニジウムを用いる細菌性ゲノムDNAの迅速抽出、Lett. Appl. Microbiol,, 8, 151-156）。
【０３３１】
ゲノムライブラリー作製
ゲノムDNAを制限酵素Sau3Aで部分的に消化し、0.7%アガロースゲル上で電気泳動によりサイズ分画した。2〜7kbの大きさの断片を、電気泳動によりDEAE−セルロースペーパー（ドレッツェン（Dretzen, G.）, ベラード（Bellard, M.）, サッソン−コルシ（Sassone-Corsi, P.）,チャンボン（Chambon, P.）(1981)、 アガロースとアクリルアミドゲルからのDNA断片の回収ための信頼できる方法, Anal. Biochem., 112, 295-298）上に単離した。
単離したDNA断片を、BamHI消化したpSJ1678プラスミドDNAに連結し、連結混合物を使用して、大腸菌SJ2を形質転換した。
【０３３２】
陽性クローンの同定
上記のように作製した大腸菌中のDNAライブラリーを、0.2%AZCL−ガラクトマンナン（メガザイム（Megazyme））と９μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB寒天プレート上でスクリーニングし、37℃で一晩インキュベートした。マンナナーゼ活性を示すクローンは、青い拡散輪とともに現れた。これらのクローンの１つからのプラスミドDNAを、1mlの一晩培養ブロス上でキアゲンプラスミドスピンプレップにより単離した（細胞は、37℃で9μg/mlのクロラムフェニコールとともにTY中で250rpmでインキュベートした）。
【０３３３】
このクローン（MB525）を、クローン化Sau3ADNA断片のDNA配列決定によりさらに解析した。DNA配列決定は、Ｔａｑデオキシ−末端サイクル配列決定キット（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、米国）を使用し、蛍光標識ターミネーターと適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー歩行により行った。
配列データの解析は、デベロー（Devereux）ら（1984）Nucleic Acids Res. 12, 387-395に従って行った。マンナナーゼをコードする配列を配列番号５に示す。得られたタンパク質配列を、配列番号６に示す。
【０３３４】
枯草菌（B. subtilis）中のバチルス・アガラダエレンス（B. agaradhaerens）のサブクローニングと発現
本発明のDNA配列をコードするマンナナーゼは、これらの２つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを使用してPCR増幅した。
マンナナーゼ．upper.SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCA AGT ACA GGC TTT TAT GTT GAT GG-3'
マンナナーゼ．lower.NotI
5'-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCG CTA TTT CCC TAA CAT GAT GAT ATT TTC G-3'
制限部位SacIIとNotIIに下線を引いてある。
【０３３５】
上記のようにバチルス・アガラダエレンス（Bacillus agaradhaerens）NCIMB40482から単離した染色体DNAを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Amplitaq）DNAポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を使用して、PCR反応中の鋳型として使用した。PCR反応は、200μMの各dNTP、２．５単位のアンプリタク（Amplitaq）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、シータス（Cetus）、米国）および100pmolの各プライマーを含有するPCR緩衝液（１０mMトリス−塩酸（pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01％(w/v)ゼラチン）中で作成した。
【０３３６】
PCR反応は、DNAサーマルサイクラー（ランドグラフ（landgraf）、ドイツ）を使用して行った。94℃で１分間のインキュベートを1回行った後、94℃で30秒の変性、60℃で１分のアニーリング、72℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、PCRを30サイクル行った。増幅産物の5μlのアリコートを、0.7％アガロースゲル（ヌシーブ（NuSieve）、FMC)で電気泳動して解析した。1.4kbの大きさのDNA断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３３７】
PCR断片のサブクローニング：
上記のように作成したPCR産物の45μlアリコートを、キアクイック（QIAquick）PCR精製キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸（pH8.5）中で溶出した。
【０３３８】
5μgのpMOL944と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNotIで消化し、0.8%低温ゲル化アガロース（シープラーク（SeqPlaque）GTG、FMC）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（QIAquick Gel）抽出キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。次に、単離したPCR DNA断片を、SacII-NotI消化し精製したpMOL944に連結した。連結は、0.5μgの各DNA断片、1UのT4 DNAリガーゼおよびT4リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）、ドイツ）を使用して、16℃で一晩行った。
【０３３９】
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（B. subtilis）PL2306を形質転換した。形質転換した細胞を、LBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に広げた。37℃で18時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドDNAを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３４０】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをMB594と呼んだ。クローンMB594をTY-10μg/mlカナマイシン中で37℃で一晩増殖させ、翌日１mlの細胞を使用して、枯草菌（B. subtilis）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Qiaprep Spin Plasmid Miniprep）キット＃27106を使用して、細胞からプラスミドを単離した。
【０３４１】
このDNAを配列決定し、配列番号７中のマンナナーゼ94〜1404と配列番号７中の94〜1404の成熟部分に対応するDNA配列が明らかになった。得られた成熟タンパク質を配列番号８に示す。配列番号５の配列によりコードされるマンナナーゼの３’末端は、PCRで使用した低プライマーの設計に従って、配列番号７に示すものに変換された。得られたアミノ酸配列を配列番号８に示し、配列番号６のＣ末端（SHHVREIGVQFSAADNSSGQTALYVDNVTLR）を、配列番号８のＣ末端（IIMLGK）に変換されることが明らかである。
【０３４２】
実施例６．バチルス・アガラダエレンス（Bacillus agaradhaerens）からのマンナナーゼの発現、精製および性状解析
実施例５のように得られたクローンMB594を、2枚の邪魔板の付いた500mlの振盪フラスコ中で10μg/mlのカナマイシンとともに25×200mlのBPX培地中で、37℃、300rpmで５日間増殖させた。
【０３４３】
クローン594（バッチ＃9813）の6500mlの振盪フラスコ培養液を採取し、pHを5.5に調整した。凝集のために攪拌しながら146mlの陽イオン物質（C521）と292mlの陰イオン性物質（A130)を加えた。ソ−バル（Sorval）RC 3B遠心分離機を使用して6℃、9000rpmで20分遠心分離して、凝集した物質を分離した。上清を、ワットマンガラスフィルターGF/DとＣを使用して清澄化し、最後にフィルトロンでカットオフ10kDaで濃縮した。
【０３４４】
この濃縮液750mlを、水酸化ナトリウムを使用してpH7.5に調整した。清澄な溶液を、50mlのトリス（pH7.5）で平衡化した900mlのQ-セファロースカラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したマンナナーゼ活性を、塩化ナトリウム勾配を使用して溶出した。
純粋な酵素は、SDS-PAGEで分子量38kDaの単一のバンドを与えた。
マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列（すなわち、翻訳されたDNA配列）を配列番号６に示す。
【０３４５】
速度論定数の測定：
基質：ローカストビーンガム（carob）と還元糖分析（PHBAH）。ローカストビーンガムはシグマ（Sigma）から（G-0753）。
異なる濃度のローカストビーンガムを使用し40℃、pH10で20分インキュベートして、速度論測定を行うと以下が得られた：
KCat:467/秒。
Km:0.08g/L
MW:38kDa
pI（等電点）:4.2
マンナナーゼの最適温度は60℃であった。
【０３４６】
pH活性プロフィールは、pH8〜10で最大活性を示した。
DSC示差走査熱量測定は、トリス緩衝液中でpH7.5で融点として77℃を与え、この酵素が熱安定性であることを示している。
carobからの0.2%AZCL−ガラクトマンナンを基質として使用して、上記したように40℃でインキュベートした洗剤適合性は、従来の液体洗剤と極めて良好な適合性を示し、従来の粉末洗剤と良好な適合性を示した。
【０３４７】
実施例７．洗剤中の本発明の酵素の使用
実施例６に記載したように得られた精製酵素（バッチ＃9813）は、従来の市販の液体洗剤を使用したミニ洗浄試験で１ppmのレベルで試験した時、改良したクリーニング性能を示した。試験は、従来の北アメリカ洗浄条件で行った。
【０３４８】
実施例８．バチルス（Bacillus）種AAI12から得られるマンナナーゼ
バチルス（Bacillus）種AAI12からのゲノムライブラリーの作製
バチルス（Bacillus）種のゲノムDNAを、制限酵素Sau3Aで部分的に消化し、0.7%アガロースゲル（シーケム（SeaKem）アガロース、FMC、USA)で電気泳動によりサイズ分画した。１．５〜１０kbの大きさの断片を単離し、DNA断片を1.5%アガロースゲルに逆に流して１つのDNAバンドに濃縮し、次にキアクイック（Qiaquick）ゲル抽出キットを製造業者（キアゲン社（Quiagen Inc.）、米国）の説明書に従って、アガロースゲルスライスから断片を抽出した。
【０３４９】
ゲノムライブラリーを作製するために、上記から精製し分画した約100ngのDNAを、1μgのBamHI切断し脱リン酸化したラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）ベクターアーム（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリホルニア州、米国）に、製造業者の説明書に従って、+4℃で24時間連結した。製造業者（ストラタジーン（Stratagene）、米国）の説明書に従って、ギガパックIIIゴールドパッケージングエキストラクト（GigaPackIII Gold packaging extract）（ストラタジーン（Stratagene））を使用して、連結混合物の３μｌのアリコートを直接パッケージングした。
【０３５０】
ストラタジーン（Stratagene）（米国）の大腸菌XL1-Blue MRF-株を使用して、ゲノムラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）ファージライブラリーを力価測定した。増幅しなかったゲノムライブラリーは、１％未満のベクターバックグランドを有する7.8×107 プラーク形成単位（pfu）からなる。
【０３５１】
ラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）中の機能性発現によるベータ−マンナナーゼクローンのスクリーニング
ゲノムライブラリーからの約5000プラーク形成単位（pfu）を、大腸菌XL1-Blue MRF'（ストラタジーン（Stratagene）、米国）を宿主として使用して、次にプレートを３７℃で２４時間インキュベートして、0.1%AZCL-ガラクトマンナン（メガザイム（MegaZyme）、オーストラリア、カタログ番号I-AZGMA）を含有するNZY-寒天プレート上に広げた。マンナナーゼ陽性ラムダクローンを、陽性ファージクローンの周りに青い加水分解輪を形成させて同定した。
【０３５２】
これらを、目的のプラークを含有するTOP寒天スライスの芯を抜いて、500μlのSM緩衝液と20μlのクロロホルム中に入れることにより、スクリーニングプレートから回収した。上記の0.1%AZCL−ガラクトマンナンを含有するNZYプレートに、芯を抜いたファージストックのアリコートを広げることにより、マンナナーゼ陽性ラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）クローンをプラーク精製した。単一のマンナナーゼ陽性ラムダクローンを、芯を抜いて、500μlのSM緩衝液と20μlのクロロホルム中に入れ、上記したようにもう一回広げて、精製した。
【０３５３】
マンナナーゼ陽性ラムダザペクスプレス（lamdaZAPExpress）クローンからのファージミドの単一クローンインビボ切断
大腸菌XL1-Blue細胞（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリホルニア州）を調製し、ストラタジーン（Stratagene）が推奨するように10mM  MgSO4 中に再懸濁した。マンナナーゼ陽性クローンからの純粋なファージストックの250μlのアリコートを、ファルコン2059試験管中で、200μlのXL1-Blue MRF'細胞（OD600=1.0)と>106 pfu/mlのエクサシスト（ExAssist）M13ヘルパーファージ（ストラタジーン（Stratagene））と一緒にし、混合物を37℃で15分間インキュベートした。
【０３５４】
３mlのMNYブロスを各試験管に加え、試験管を37℃で2.5時間インキュベートした。試験管を65℃で20分間加熱して、大腸菌細胞とバクテリオファージラムダを死滅させた。ファージミドは加熱に対して耐性である。試験管を3000rpmで１５分間遠心分離して、細胞破片を除去し、上清をきれいなファルコン２０５９試験管中にデカントした。切断した１本鎖ファージミドを含有する上清のアリコートを使用して、200μlの大腸菌XLOLR細胞（ストラタジーン（Stratagene）、10mMのMgSO4 中でOE600=1.0）を、37℃で15分間インキュベートすることにより感染させた。細胞に350μlのNZYブロスを加え、試験管を37℃で45分間インキュベートした。
【０３５５】
細胞のアリコートを、LBカナマイシン寒天プレートに広げ、37℃で24時間インキュベートした。５つの切断した単一のコロニーを、0.1%AZCL-ガラクトマンナン（メガザイム（Megazyme）、オーストラリア）を含有するLBカナマイシン寒天プレートに再度画線培養した。マンナナーゼ陽性ファージミドクローンを、陽性コロニーの周りの青い加水分解輪の形成により解析した、これらは、単離したファージミドDNA（キアスピン（QiaSpin）キット、キアゲン（Quiagen）、米国）のEcoRI、PstI、EcoRI-PstI、およびHindIIIによる制限酵素分解物、次にアガロースゲル電気泳動によりさらに解析した。
【０３５６】
ヌクレオチド配列の解析
ゲノムベータ−１，４−マンナナーゼクローンpBXM1のヌクレオチド配列を、両方の鎖からジデオキシ鎖停止法（サンガー（Sanger, F）., ニックレン（Nicklen, S.）、およびクールソン（Coulson, A. R.） (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467）により、500μgのキアゲン（Quiagen）精製した鋳型（キアゲン（Quiagen）、米国）、Taqデオキシ末端サイクル配列決定キット（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、米国）、蛍光標識ターミネーター、および５pmolのpBK-CMVポリリンカープライマー（ストラタジーン（Stratagene）、米国）または合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、決定した。配列データの解析は、デベロー（Devereux）ら、1984（デベロー（Devereux, J.）、ヘベルリ（Haeberli, P.）、およびスミシーズ（Smithies, O.）(1984)、Nucleic Acids Res. 387-395）に従って行った。
【０３５７】
配列の整列
本発明のバチルス（Bacillus）種AAI12（すなわち、配列番号10）、カルジセルロシルプトー・サッカロリチカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）（ジーンバンク（GenBank）/EMBL 受け入れ番号P77847）、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Dictyoglomus thermophilum）（受け入れ番号O30654）、ロードサーマス・マリヌス（受け入れ番号P49425)、ManAによりコードされるピロミセス（Piromyces）種（受け入れ番号P55296）、バチルス（Bacillus）種（受け入れ番号P91007）、枯草菌（Bacillus subtilis）（受け入れ番号O05512）、およびシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（受け入れ番号P49424）からのグリコヒドロラーゼファミリー26の複数の配列の整列を、GCGウィスコンシン（Wisconsin）ソフトウェアパッケージ、バージョン8.1（前記参照）のPileUpプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ3.00とギャップ伸長ペナルティ0.10を用いて、作成した。
【０３５８】
配列の類似性
バチルス（Bacillus）種AAI12からクローン化した本発明のファミリー26ベータ−１，４−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、カルジセルロシルプトー・サッカロリチカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）（ジーンバンク（GenBank）/EMBL 受け入れ番号P77847）のベータ−１，４−マンナナーゼと45%の類似性と19.8%の配列同一性を示し、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Dictyoglomus thermophilum）（受け入れ番号O30654）のベータ−１，４−マンナナーゼと49%の類似性と25.1%の同一性を示し、
【０３５９】
ロードサーマス・マリヌス（Rhodothermus marinus）（受け入れ番号P49425）のベータ−１，４−マンナナーゼと48.2%の類似性と26.8%の同一性を示し、ManAによりコードされるピロミセス（Piromyces）種（受け入れ番号P55296）のベータ−１，４−マンナナーゼと46%の類似性と19.5%の配列同一性を示し、バチルス（Bacillus）種（受け入れ番号P91007)のベータ−１，４−マンナナーゼと47.2%の類似性と22%の同一性を示し、枯草菌（Bacillus subtilis）（受け入れ番号O05512）のベータ−１，４−マンナナーゼと52.4%の類似性と27.5%の配列同一性を示し、
【０３６０】
およびシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（受け入れ番号P49424）のベータ−１，４−マンナナーゼと60.6%の類似性と37.4%の同一性を示す。配列は、GCGウィスコンシン（Wisconsin）ソフトウェアパッケージ、バージョン8.1のGAPプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ3.00とギャップ伸長ペナルティ0.10を用いて、整列させた。
【０３６１】
バチルス（Bacillus）種（AAI12）マンナナーゼ遺伝子のクローニング
枯草菌（B．subtilis）中のマンナナーゼのサブクローニングと発現
本発明のDNA配列をコードするマンナナーゼを、以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを使用して増幅した：
BXM1.upper.SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA TTT TCT GGA AGC GTT TCA GC-3'
BXM1.lower.NotI
5'-CAG CAG TAG CGG CCG CCA CTT CCT GCT GGT ACA TAT GC-3'
制限部位SacIIとNotIに下線を引いてある。
【０３６２】
上記のようにバチルス（Bacillus）種AAI12から単離した染色体DNAを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Amplitaq）DNAポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を使用して、PCR反応中の鋳型として使用した。PCR反応は、200μMの各dNTP、2.5単位のアンプリタク（Amplitaq）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、シータス（Cetus）、米国）および100pmolの各プライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（10mMトリス−塩酸（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.01％(w/v)ゼラチン）中で作成した。
【０３６３】
PCR反応は、DNAサーマルサイクラー（ランドグラフ（landgraf）、ドイツ）を使用して行った。94℃で１分間のインキュベートを1回行った後、94℃で30秒の変性、60℃で１分のアニーリング、72℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、PCRを30サイクル行った。増幅産物の５μｌのアリコートを、0.7%アガロースゲル（ヌシーブ（NuSieve）、FMC）で電気泳動して解析した。1.0kbの大きさのDNA断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３６４】
PCR断片のサブクローニング：
上記のように作成したPCR産物の45μlのアリコートを、キアクイック（QIAquick）PCR精製キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸（pH8.5）中で溶出した。5μgのpMOL944と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNotIで消化し、0.8%低温ゲル化アガロース（シープラーク（SeqPlaque）GTG、FMC）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（QIAquick Gel）抽出キット（キアゲン（Quiagen）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
【０３６５】
次に、単離したPCR DNA断片を、SacII-NotI消化し精製したpMOL944に連結した。連結は、0.5μgの各DNA断片、1UのT4 DNAリガーゼおよびT4リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）、ドイツ）を使用して、16℃で一晩行った。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（B. subtilis）PL2306を形質転換した。形質転換した細胞を、LBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に広げた。37℃で18時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドDNAを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３６６】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをMB747と呼んだ。クローンMB748をTY-10μg/mlカナマイシン中で37℃で一晩増殖させ、翌日１mlの細胞を使用して、枯草菌（B. subtilis）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Qiaprep Spin Plasmid Miniprep）キット＃27106を使用して、細胞からプラスミドを単離した。このDNAを配列決定し、配列番号９中のマンナナーゼの成熟部分に対応するDNA配列が明らかになった。
【０３６７】
バチルス（Bacillus）種AAI12からのマンナナーゼの発現、精製および性状解析
上記のように得られたクローンMB747を、２枚の邪魔板の付いた500mlの振盪フラスコ中で10μg/mlのカナマイシンとともに25×200mlのBPX培地中で、37℃、300rpmで５日間増殖させた。
クローンMB747の4100mlの振盪フラスコ培養液を採取し、pHを7.0に調整し、２mMになるようにEDTAを加えた。凝集のために攪拌しながら185mlの陽イオン物質（10% C521）と370mlの陰イオン性物質（A130）を加えた。ソ−バル（Sorval）RC 3B遠心分離機を使用して6℃、9000rpmで20分遠心分離して、凝集した物質を分離した。上清を、ワットマンガラスフィルターGF/DとCを使用して清澄化し、最後にフィルトロンでカットオフ10kDaで濃縮した。
【０３６８】
この濃縮液1500mlを、水酸化ナトリウムを使用してpH7.5に調整した。清澄な溶液を、25mlのトリス（pH7.5）で平衡化した1000mlのQ-セファロースカラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したマンナナーゼ活性を、塩化ナトリウム勾配を使用して1100mlで溶出した。これを、フィルトロン膜を使用して440mlに濃縮した。高純度のマンナナーゼを得るために、濃縮物を、0.1M酢酸ナトリウム（pH6.0）で平衡化したスーパーデックス（Superdex）カラムに通した。
純粋な酵素は、SDS-PAGEで分子量62kDaの単一のバンドを与えた。
マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列（すなわち、翻訳されたDNA配列）を配列番号10に示す。
【０３６９】
以下のＮ末端配列を決定した：FSGSVSASGQELKMTDQN。
pI（等電点）:4.5
DSC示差走査熱量計は、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH6.0で融点として64℃を与え、このマンナナーゼ酵素は熱安定性であることを示していた。
触媒活性はイオン強度とともに上昇したため、高イオン強度のリン酸緩衝液の塩を使用することにより、酵素の比活性が上昇するかも知れないことを示している。
本発明のポリペプチドのマンナナーゼ活性は、カルシウムイオンにより阻害される。
【０３７０】
免疫学的性質：デンマークの会社DAKOの通常の技術を使用して、本発明の高度に精製したマンナナーゼに対して、ウサギポリクローナル単一特異性血清を作成した。血清は、本発明の粗マンナナーゼとともにアガロースゲル中で好ましい単一の沈殿物を生成した。
【０３７１】
実施例９．洗剤における実施例８の酵素の使用
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の0.2%AZCL−ガラクトマンナン(Megazyme, Australia)とともに40℃にて20分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例８に記載のようにして得られた酵素は、グリシンバッファーで測定された活性に対して、欧州の粉末洗剤Ariel Futurでは比活性132%、米国のTide粉末洗剤では比活性108%、米国のTide液体洗剤では比活性86%で活性を示した。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件(Ariel Futur)下では18度、米国条件(米国Tide)下では9度である水道水であった。
【０３７２】
実施例１０．バチルス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)由来マンナナーゼ
pSJ1678ベクター内でのバチルス・ハロデュランス由来ゲノムライブラリーの構築
バチルス・ハロデュランスのゲノムDNAを制限酵素Sau3Aで部分消化し、0.7%アガロースゲル(SeaKemアガロース、FMC、USA)における電気泳動によりサイズ分画した。２ないし10kbの間のサイズのDNA断片をDEAE−セルロースペーパーにおける電気泳動により単離した(Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981)  アガロースおよびアクリルアミドゲルからDNA断片を回収する信頼性のある方法  Anal. Biochem., 112, 295-298)。単離されたDNA断片をBamHIで消化したpSJ1678プラスミドDNAと連結し、この連結混合物を用いて大腸菌(E. coli)ＳＪ２を形質転換した。
【０３７３】
大腸菌における機能的発現によるβ−マンナナーゼクローンのスクリーニング
宿主として大腸菌SJ2を用い、ゲノムライブラリーから約10,000コロニー形成単位（cfu）を9μg/mlクロラムフェニコールおよび0.1%AZCL-ガラクトマンナン(Megazyme, Australia, カタログ番号I-AZGMA)を含有するＬＢ寒天プレートに置き、次いでこのプレートを37℃で24時間インキュベートした。
【０３７４】
マンナナーゼ陽性大腸菌コロニーは陽性プラスミドコロニー周囲の青い加水分解ハローの形成によって確認した。pSJ1678のマンナナーゼ陽性コロニーを、単離コロニーを上記の9μg/mlクロラムフェニコールおよび0.1%AZCL−ガラクトマンナンLBプレート上で再び画線培養することによりコロニー純化した。単一のマンナナーゼ陽性プラスミドコロニーを、プラスミドDNAの精製のため、9μg/mlクロラムフェニコールを含有する5mlのLB培地に接種した。
【０３７５】
ヌクレオチド配列解析
ゲノムβ−１，４−マンナナーゼクローンpBXM5のヌクレオチド配列は、Qiagenにより精製された鋳型(Qiagen, USA)500ngおよびTaqデオキシ末端サイクルシーケンシングキット(Perkin-Elmer, USA)、蛍光標識ターミネーター、およびpBK-CMVポリリンカープライマー(Stratagene, USA)または合成オリゴヌクレオチドプライマーのいずれか5pmolを用い、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467)により両鎖から決定した。配列データの解析はDevereux et al., 1984 (Devereux, J., Haeberli, P., and Smithies, O. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395)に従って行った。
【０３７６】
配列のアライメント
本発明のバチルス・ハロデュランス（すなわち、配列番号12）、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)(GenBank/EMBL受託番号066185)、ビブリオ種（受託番号069347）、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)（受託番号P51529）およびカルジセルロシルプトル・サッカロリチカス(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)（受託番号P22533）由来のグリコヒドロラーゼファミリー５  β−１，４−マンナナーゼの多重配列アライメント。多重配列アライメントはGCGウィスコンシンソフトウェアパッケージ、バージョン8.1のPileUpプログラムを用い、ギャップ形成ペナルティー3.00およびギャップ伸長ペナルティー0.10で作製した。
【０３７７】
配列の類似性
バチルス・ハロデュランスからクローニングされた本発明のファミリー５  β−１，４−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、バチルス・シルクランス(GenBank/EMBL受託番号066185)のβ−１，４−マンナナーゼと７７％の類似性および６０％の配列同一性を、ビブリオ種（受託番号069347）由来のβ−１，４−マンナナーゼと64.2%の類似性および46%の配列同一性を、ストレプトミセス・リビダンス（受託番号P51529）由来のβ−１，４−マンナナーゼと63%の類似性および41.8%の配列同一性を、カルジセルロシルプトル・サッカロリチカス（受託番号P22533）由来のβ−１，４−マンナナーゼと60.3%の類似性および42%の配列同一性を示す。これらの配列はGCGウィスコンシンソフトウェアパッケージ、バージョン8.1のGAPプログラムを用い、ギャップ形成ペナルティー3.00およびギャップ伸長ペナルティー0.10で作製した。
【０３７８】
バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）マンナナーゼ遺伝子のクローニング
Ｂ．サブチリス(B. subtilis)における成熟型全長マンナナーゼのサブクローニングおよび発現
本発明のマンナナーゼをコードするDNA配列はこれら２つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを用いてPCR増幅した。
BXM5  上流  SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA CAT CAC AGT GGG TTC CAT G-3'
BXM5  下流  NotI
5'-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAT TGA AAC ACA CTG CTT CTT TTA G-3'
制限部位SacIIおよびNotIは下線で示されている。
【０３７９】
上記のようなバチルス・ハロデュランスから単離された染色体ＤＮＡを、製造業者の指示に従いAmpliTaqDNAポリメラーゼ(Parkin Elmer)を用いるPCR反応において鋳型として用いた。PCR反応は、各dNTP 200μM、AmpliTaqポリメラーゼ(Perkin Elmer, Cetus, USA）2.5単位、および各プライマー100pmolを含有するPCRバッファー（10mM Tris-HCl、pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01%（w/v）ゼラチン）中で設定した。
【０３８０】
PCR反応はDNAターミナルサイクラー(Landgraf, Germany)を用いて行った。一度94℃で１時間インキュベートした後、94℃で30秒間の変性、60℃で１分間のアニーリング、および72℃で２分間の伸長といったサイクルプロフィールを用いて30サイクルのPCRを行った。増幅産物のアリコート5μlを0.7%アガロースゲル(NuSieve, FMC)における電気泳動によって解析した。0.9kbのサイズのDNA断片が現れ、遺伝子セグメントが適切に増幅されていることを示した。
【０３８１】
PCR断片のサブクローニング
上記のようにして作製されたPCR産物のアリコート45μlを製造業者の指示に従いQIAクイックPCR増幅キット(Qiagen, USA)を用いて精製した。精製したDNAを10mM Tris-HCl、pH8.5 50μlに溶出した。
pMOL944 5μlおよび精製PCR断片25μlをSacIIおよびNotIで消化し、0.8%低固化温度アガロース(SeaPlaque GTG, FMC)ゲルで電気泳動に付し、適切な断片をゲルから切り取り、製造業者の指示に従いQIAクイックゲル抽出キット(Qiagen, USA)を用いて精製した。次いで、単離したPCR断片をSacII-NotIで消化して精製したpMOL944に連結した。連結は、各DNA断片0.5μl、T4 DNAリガーゼ１単位およびT4  リガーゼバッファー(Boehringer Mannheim, Germany)を用いて16℃で一晩行った。
【０３８２】
この連結混合物を用いてコンピテントＢ．サブチリス  PL2306を形質転換した。形質転換細胞をLBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に置いた。37℃で18時間インキュベートした後、プレート上にコロニーが認められた。いくつかのクローンを、一晩培養した培養液からプラスミドDNAを単離することにより解析した。
【０３８３】
かかる１つの陽性コロニーを数回、上記の寒天プレートで画線培養した。このクローンをMB878と称した。クローンMB878をTY-10μg/mlカナマイシンで37℃で一晩培養し、翌日、細胞1mlを用い、Ｂ．サブチリスプラスミド調製物に関する製造業者の推奨に従いQiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106を用いて細胞からプラスミドを単離した。このDNAをDNA配列決定したところ、配列番号11における97〜993番および配列番号12における33〜331番のマンナナーゼ成熟部分に相当するDNA配列が明らかになった。
【０３８４】
バチルス・ハロデュランス由来マンナナーゼの発現、精製および同定
上記のようにして得られたクローンMB878を、２個のバッフル付き500ml振盪フラスコにて、10μg/mlカナマイシンを含む25×200mlBPX培地中で、37℃、300rpmで５日間増殖させた。
【０３８５】
クローンMB878の振盪フラスコ培養液5000mlを回収し、pHを6.0に調整した。フロキュレーションのための振盪の間に、陽イオン物質（10% C521)125mlおよび陰イオン物質（A130)250mlを加えた。フロキュレートした材料を、Sorval RC 3B遠心分離機を用い、9000rpm、6℃にて20分間遠心分離することにより分離した。上清をNaOHでpH8.0に調整し、ワットマンガラスフィルターGF/DおよびＣで清澄化した。
【０３８６】
次いで、50gのDEAE A-50 Sephadexを0.1M酢酸ナトリウム、pH6.0で平衡化して濾液に加え、酵素を結合させ、室温で一晩放置した。結合した酵素は、酢酸バッファー中0.5M NaClで溶出した。次いで、水酸化ナトリウムでpHを8.0に調整した後、排除限界10kDaのFiltronで濃縮して450mlとし、20%グリセロール、20%MPGおよび2%Berolで安定化させた。この産物を増幅試験に用いた。
【０３８７】
この濃縮物2mlを水酸化ナトリウムでpH8.5に調整した。高純度マンナナーゼを得るため、濃縮物を0.1Mリン酸ナトリウム、pH8.5で平衡化したSuperdexカラムに通した。
この精製酵素はSDS-PAGEで、分子量34kDaの単一バンドを示した。
このマンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、すなわち翻訳されたDNA配列は配列番号12に示されている。
精製タンパク質の下記Ｎ末端配列が決定された：AHHSGFHVNGTTLYDA。
【０３８８】
ｐＨ活性プロフィール（ManUアッセイ（40℃にて20分間のインキュベーション）を使用）は、この酵素がpH7.5〜pH10の間で50%より高い比活性を持つことを示す。
至適温度（ManUアッセイ；グリシンバッファーを使用）はpH10では60℃〜70℃の間であることが分かった。
免疫学的特性：Danish社DAKOの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
【０３８９】
実施例１１．洗剤における実施例10のマンナナーゼ酵素の使用
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の0.2%AZCL-ガラクトマンナン(Megazyme, Australia)とともに40℃にて20分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例１０に記載のようにして得られたマンナナーゼ酵素は、欧州の液体洗剤Ariel Futur、米国のTide粉末および液体洗剤において、バッファーにおける活性に対して40%より高い活性で活性を示した。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件(Ariel Futur)下では18度、米国条件(米国Tide)下では9度である水道水であった。
【０３９０】
実施例１２．バチルス種AA349由来のマンナナーゼ
バチルス種（AA349）マンナナーゼ遺伝子のクローニング
Ｂ．サブチリスにおける触媒核マンナナーゼ酵素のサブクローニングおよび発現
本発明のマンナナーゼをコードするDNA配列は以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。
BXM7  上流  SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AGT GGA CAT GGG CAA ATG C-3'
BXM7  下流  NotI
5'-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAT TTT TTG TAT ACA CTA ACG ATT TC-3'
制限部位SacIIおよびNotIは下線で示されている。
【０３９１】
上記のようなバチルス種AA349から単離された染色体DNAを、製造業者の指示に従いAmpliTaqDNAポリメラーゼ(Parkin Elmer)を用いるPCR反応において鋳型として用いた。PCR反応は、各dNTP 200μM、AmpliTaqポリメラーゼ(Perkin Elmer, Cetus, USA）2.5単位、および各プライマー100pmolを含有するPCRバッファー(10mM Tris-HCl、pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01%(w/v)ゼラチン）中で設定した。
【０３９２】
PCR反応はDNAターミナルサイクラー(Landgraf, Germany)を用いて行った。一度94℃で１時間インキュベートした後、94℃で30秒間の変性、60℃で１分間のアニーリング、および72℃で２分間の伸長といったサイクルプロフィールを用いて30サイクルのPCRを行った。増幅産物のアリコート5μlを0.7%アガロースゲル(NuSieve, FMC)における電気泳動によって解析した。1.0kbのサイズのDNA断片が現れ、遺伝子セグメントが適切に増幅されていることを示した。
【０３９３】
PCR断片のサブクローニング
上記のようにして作製されたPCR産物のアリコート45μlを製造業者の指示に従いQIAクイックPCR増幅キット(Qiagen, USA)を用いて精製した。精製したDNAを10mM Tris-HCl、pH8.5 50μlに溶出した。pMOL944 5μlおよび精製PCR断片25μlをSacIIおよびNotIで消化し、0.8%低固化温度アガロース(SeaPlaque GTG, FMC)ゲルで電気泳動に付し、適切な断片をゲルから切り取り、製造業者の指示に従いQIAクイックゲル抽出キット(Qiagen, USA)を用いて精製した。次いで、単離したPCR断片をSacII-NotIで消化して精製したpMOL944に連結した。連結は、各DNA断片0.5μl、T4 DNAリガーゼ１単位およびT4  リガーゼバッファー(Boehringer Mannheim, ドイツ)を用いて16℃で一晩行った。
【０３９４】
この連結混合物を用いてコンピテントＢ．サブチリス  PL2306を形質転換した。形質転換細胞をLBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に置いた。37℃で18時間インキュベートした後、プレート上にコロニーが認められた。いくつかのクローンを、一晩培養した培養液からプラスミドＤＮＡを単離することにより解析した。
【０３９５】
かかる１つの陽性コロニーを数回、上記の寒天プレートで画線培養した。このクローンをMB879と称した。クローンMB879をTY-10μg/mlカナマイシンで37℃で一晩培養し、翌日、細胞1mlを用い、Ｂ．サブチリスプラスミド調製物に関する製造業者の推奨に従いQiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106を用いて細胞からプラスミドを単離した。このDNAをDNA配列決定したところ、マンナナーゼの成熟部分に相当するDNA配列が明らかになった（添付のDNA配列の配列番号15における204〜1107番および添付のタンパク質配列の配列番号16における26〜369番に相当）。
【０３９６】
バチルス・スペーシスAA349由来マンナナーゼの発現、精製および同定
上記のようにして得られたクローンMB879を、２個のバッフル付き500ml振盪フラスコにて、10μg/mlカナマイシンを含む25×200mlBPX培地中で、37℃、300rpmで５日間増殖させた。
クローンMB879の振盪フラスコ培養液400mlを回収し、pHを6.5に調整した。フロキュレーションのための振盪の間に、陽イオン物質（10% C521)19mlおよび陰イオン物質（A130)38mlを加えた。フロキュレートした材料を、Sorval RC 3B遠心分離機を用い、5000rpm、6℃にて２５分間遠心分離することにより分離した。
【０３９７】
次いでこれを濃縮し、水で洗浄し、排除限界10kDaのFiltronで伝導率を低くし、150mlとした。その後pHを4.0に調整し、その液体を50mM酢酸ナトリウムバッファーpH4.0にてS-Sepharoseカラムクロマトグラフィーに適用した。カラムはまず0.5MまでのNaOH勾配で溶出し、次ぎに0.1MグリシンバッファーpH10でマンナナーゼを溶出した。マンナナーゼ活性画分をプールしたところ、それらはSDS-PAGEにおいて分子量38kDaの単一バンドを示した。
このマンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、すなわち翻訳されたDNA配列は配列番号16に示されている。
【０３９８】
pH活性プロフィール（ManUアッセイ（40℃にて20分間のインキュベーション）を使用）は、この酵素がpH5〜pH10の間で30%より高い比活性を持つことを示す。
至適温度（ManUアッセイ；グリシンバッファーを使用）はpH10では60℃〜70℃の間であることが分かった。
免疫特性：Danish社DAKOの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
【０３９９】
実施例１３．洗剤における実施例13のマンナナーゼ酵素の使用
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の0.2%AZCL−ガラクトマンナン(Megazyme, Australia)とともに40℃にて20分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例12に記載のようにして得られたマンナナーゼ酵素は、欧州の液体洗剤Ariel Futur、および米国のTide液体洗剤において、バッファーにおける活性に対して６５％より高い活性で活性を示した。このマンナナーゼは欧州のAriel Futur製粉末洗剤および米国のTide粉末洗剤においては３５％より高い活性であった。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件(Ariel Futur)下では１８度、米国条件(米国Tide)下では9度である水道水であった。
【０４００】
実施例１４．真菌フミコーラ・インソレンス(Humisola insolens)ＤＳＭ１８００株由来のマンナナーゼ
フミコーラ・インソレンス由来ファミリー２６  β−１，４−マンナナーゼの発現クローニング
真菌株および培養条件
フミコーラ・インソレンスDMS1800株は、WO97/32014に記載のようにして発酵させ、26℃で５日間増殖させた後に菌糸を採取し、直ちに液体窒素中で凍結させ、-80℃で保存した。
【０４０１】
RNアーゼフリーガラス製品、チップおよび溶液の準備
RNAの単離に使用するすべてのガラス製品は２２０℃で少なくとも12時間燃焼処理した。エッペンドルフ管、ピペットチップおよびプラスチックカラムはEtOh中0.1%ジエチルピロカーボネート(DEPC)で12時間処理してオートクレーブにかけた。バッファー類および水はすべて（ただし、Ｔｒｉｓ含有バッファーは除く）0.1%DEPCで37℃にて12時間処理してオートクレーブにかけた。
【０４０２】
全ＲＮＡの抽出
全RNAは、クアニジウムチオシアネートで抽出した後、以下の改良を用いた5.7M CsClクッション(Chirgwin et al., 1979)で超遠心分離を行うことによって調製した。凍結菌糸を液体窒素中、乳鉢と乳房で粉砕して微粉末とした後、予め冷却したコーヒーミルで粉砕し、直ちに５容量のRNA抽出バッファー（4M GuSCN、0.5%Na−ラウリルサルコシン、25mM  クエン酸ナトリウム、pH7.0、0.1M β−メルカプトエタノール）に懸濁した。
【０４０３】
この混合物を室温で30分間攪拌し、遠心分離（室温、5000rpm、30分、Heraeus Megafuge 1.0 R）して細胞残渣をペレットとした。上清を回収し、5.7M CsClクッション（5.7M CsCl、0.1M EDTA、pH7.5、0.1%DEPC；使用前にオートクレーブ処理）上に、CsClクッション12.0mlにつき上清26.5mlを用い、注意深く積層して遠心分離し、全RNAを得た（Beckman, SW 28ローター、2500rmp、室温、24時間）。遠心分離後、上清を注意深く除去し、RNAペレットを含有するチューブの底を切り取り、70%EtOHですすいだ。全RNAペレットをエッペンドルフ管に移し、500mlTE、pH7.6に懸濁し（困難であれば、５分間６５℃で時折加熱する）、フェノール抽出を行い、-20℃で12時間エタノールで沈殿させた（2.5容量のEtOH、0.1容量の3M NaAc、pH5.2）。このRNAを遠心分離により回収し、７０％ＥｔＯＨ中で洗浄し、最小量のDEPC-DIに再懸濁した。RNA濃度はOD260/280を測定することにより求めた。
【０４０４】
ポリ(A)+RNAの単離
ポリ(A)+RNAはオリゴ(dT)セルロースアフィニティークロマトグラフィー(Aviv & Leder, 1972)により単離した。典型的には、0.2gのオリゴ（dT）セルロース(Boehringer Mannheim, 結合能の確認用)を10mlの1×カラム充填バッファー（20mM Tris-HCl、pH7.6、0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1％SDS)中で予め膨潤させ、DEPC処理したプラグプラスチックカラム(Poly Prepクロマトグラフィーカラム、Bio Rad)に充填し、20mlの１×充填バッファーで平衡化した。この全RNAを65℃で８分間加熱し、５分間氷上でクエンチし、１容量の２×カラム充填バッファーを添加した後、RNAサンプルをカラムに装填した。
【０４０５】
溶出液を回収し、毎装填前に上記のようにしてサンプルを加熱して氷上でクエンチすることにより、2、3回再装填した。このオリゴ(dT)カラムを10容量の１×充填バッファーで、次いで３容量の塩媒質バッファー（20mM Tris-Cl、 pH7.6、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1%SDS）で洗浄し、その後、ポリ(A)+RNAを65℃に予熱した３容量の溶出バッファー（10mM Tris-Cl、pH7.6、1mM EDTA、0.05% SDS)を溶出し、500mlの画分を回収した。回収した各画分についてOD260を読み取り、mRNA含有画分をプールし、-20℃で12時間エタノール沈殿を行った。ポリ(A)+RNAは遠心分離により回収し、DEPC-DIWに再懸濁し、-80℃で５ないし10mgアリコートとして保存した。
【０４０６】
ｃＤＮＡの合成
第一鎖の合成
F. S. Hagen (pers. comm.)により開発されたヘアピン改良法を用いたRNアーゼＨ法(Gubler & Hoffman 1983, Sambrook et al., 1989)により、5mgのフミコーラ・インソレンスポリ(A)+RNAから二本鎖cDNAを合成した。ポリ(A)+RNA(DEPC処理水5ml中5mg）を70℃で８分間加熱して氷上でクエンチし、各dNTP(Pharmacia)1mM、40単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤(RNasin, Promega)、10mgのオリゴ(dT)12-18プライマー(Pharmacia)および1000単位のSuperScript II RNアーゼ  H-逆転写酵素(Bethesda Research Laboratories)を含有する１ｍＭ逆転写酵素バッファー（50mM Tris-Cl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、Bethesda Research Laboratories）で最終量50mlとした。反応混合物を45℃で１時間インキュベートすることにより、第一鎖cDNAを合成した。
【０４０７】
第二鎖の合成
合成後、30mlの10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTAを加え、40mgのグリコーゲン担体(Boehringer Mannheim)、20容量の10M NH4Acおよび2.5容量の96%EtOHを添加することにより、mRNA:cDNAハイブリッドを-20℃で12時間、エタノール沈殿させた。このハイブリッドを遠心分離により回収し、70%EtOHで洗浄し、風乾し、各dNTP100m、44単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ(Amersham)、6.25単位のRNアーゼ  Ｈ(Bethesda Research Laboratories)および10.5単位の大腸菌DNAリガーゼ(New England Biolabs)を含有するM250mlの第二鎖バッファー（20mM Tris-Cl、pH7.4、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、16mM βNAD+)に再懸濁した。第二鎖cDNAの合成は、反応試験管を16℃で３時間インキュベートすることにより行い、EDTAを添加して最終濃度20mMとすることにより反応を停止した後、フェノール抽出した。
【０４０８】
マングマメ（Mung bean）ヌクレアーゼ処理
２容量の96%EtOH、0.1容量の3M NaAc、pH5.2を添加することにより、二本鎖(ds)cDNを-20℃で12時間エタノール沈殿させ、遠心分離により回収し、70%EtOHで洗浄し、乾燥させ(SpeedVac)、36単位のマングマメヌクレアーゼ(Bethesda Research Laboratories)を含有する30mlのマングマメヌクレアーゼバッファー（30mM NaAc、pH4.6、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2%グリセロール）に再懸濁した。反応物を30℃で30分間インキュベートした後、70mlの10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTAを添加し、フェノール抽出して、２容量の96%EtOhおよび0.1容量の3M NaAc、pH5.2で-12℃にて12時間エタノール沈殿させることで一本鎖ヘアピンDNAをクリッピングした。
【０４０９】
T4 DNAポリメラーゼによる平滑末端化
二本鎖cDNAを、各dNTP0.5mM、および7.5単位のT4 DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を含有する50mlのT4 DNAポリメラーゼバッファー（20mM Tris-酢酸、pH7.9、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT）中、37℃で15分間反応混合物をT4 DNAポリメラーゼとともにインキュベートすることにより平滑末端化した。EDTAを添加して最終濃度20mMとすることにより停止した後、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。
【０４１０】
アダプターの連結およびサイズ選択
充填反応の後、600pmolのBst Iアダプターおよび５単位のT4リガーゼ(Invitrogen)を含有する３０ｍｌの連結反応バッファー（50mM Tris-Cl、pH7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25mg/mlウシ血清アルブミン）中、反応混合物を16℃で12時間インキュベートすることにより、cDNAを非パリンドロームBstX Iアダプター（1mg/ml、Invitrogen）に連結した。70℃で５分間加熱することにより反応を停止させ、アダプターを付加したcDNAをアガロースゲル電気泳動（0.8%HSB−アガロース、FMC）でサイズ分画して連結していないアダプターと小cDNAを分離した。cDNAを排除限界0.7kbでサイズ選択し、10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTA中、100ボルトで１時間、cDNAをアガロースゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、上記のように-20℃で12時間エタノール沈殿させた。
【０４１１】
フミコーラ・インソレンスcDNAライブラリーの構築
アダプターを付加した二本鎖cDNAを遠心分離により回収し、70%EtOH中で洗浄し、25mlのDIWに再懸濁した。大スケールライブラリー連結に先立ち、各々、1mlの二本鎖cDNA(#1〜#3)、２単位のT4リガーゼ(Invitorgen)および50ng（試験管#1）、100ng（試験管#2）また200ng（試験管#3および#4）Bst XIで切断したpYES 2.0ベクター(Invitrogen)を含有する連結反応バッファー（上記と同様）10ml中で４種の試験連結反応を行った。
【０４１２】
連結反応は、16℃で12時間インキュベートすることにより行い、70℃で５分間加熱し、各連結反応物1mlを40mlのコンピテント大腸菌1061細胞（LB培養液１リットル中OD600=0.9、冷DIW中で２回、10%グリセロール20ml中で１回洗浄し、10%グリセロール2mlに再懸濁させる）にエレクトロポレーションした（200W、2.5kV、25mF）。各形質転換混合物に1mlのSOCを添加した後、細胞を37℃で１時間増殖させ、LB+アンピシリンプレート（100mg/ml）に50mlをプレーティングし、37℃で12時間増殖させた。
【０４１３】
至適条件を用い、９単位のT4リガーゼを含有する40mlの連結反応バッファーにて大スケール連結反応を設定し、反応物を16℃で12時間インキュベートした。70℃で５分間加熱することによって連結反応を停止し、-20℃で12時間エタノール沈殿させ、遠心分離により回収し、10mlのDIWに再懸濁した。上記と同じエレクトロポレーション条件を用いて1mlアリコートをエレクトロコンピテント大腸菌1061細胞に形質転換し、形質転換細胞を滴定し、そのライブラリーをＬＢ＋アンピシリンプレートに5000〜7000c.f.u.／プレートにプレーティングした。1×106組換えクローンを含むｃＤＮＡライブラリーは１）-80℃にて20%グリセロール中で個々のプール（5000〜7000c.f.u.／プールとして、2)-20℃にて同プールの細胞ペレットとして、また３）-20℃にて個々のプール由来のQiagen精製プラスミドDNA(Qiagen Tip 100, Diagen)として保存した。
【０４１４】
フミコーラ・インソレンス由来β−１，４−マンナナーゼcDNAのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycis cerevisiae)における発現クローニング
個々のプールからの精製プラスミドDNA(100ng/ml)のアリコート1mlをエレクトロコンピテントＳ．セレビシエW3124(MATa;ura 3-52;leu 2-3、112;his 3-D200;pep 4-1137;prcl::HIS3、prb1::LEU2;cir+）細胞40ml(500mlYPD中OD600=1.5、冷DIW中で２回、冷1Mソルビトール中で１回洗浄し、1Mソルビトール0.5mlに再懸濁した、Becker & Guarante, 1991）へエレクトロポレーションした。
【０４１５】
1M冷ソルビトール1mlを添加した後、80mlアリコートをSC+グルコース−ウラシル上にプレーティングしてプレート当たり250〜400コロニー形成単位を得、30℃で３〜５日間インキュベートした。これらのプレートを、寒天プレートに配合されたＡＺＣｌ−ガラクトマンナン(MegaZyme, Australia)を含有するSC+ガラクトース−ウラシルプレート上に再びプレーティングした。Ｈ．インソレンスライブラリー由来の総数約50,000個の酵母コロニーをマンナナーゼ陽性コロニーに関してスクリーニングした。
【０４１６】
陽性コロニーは、相当する酵母コロニー周囲の青い加水分解ハローの形成によって確認した。単一のコロニーとしてクローンを得、ビオチニル化pYES2.0ポリリンカープライマーを用いて酵母細胞溶解物から直接ｃＤＮＡ挿入部を増幅し、磁気ビーズ(Dynabead M-280, Dynal)系によって精製し、チェーンターミネーション法(Sanger et al., 1977)およびSequenase系(United States Biochemical)を用いて各cDNAクローンの５’末端を配列決定することにより個々に同定した。
【０４１７】
マンナナーゼ陽性酵母コロニーを50ml試験管内でYDP培養液20mlに接種した。試験管を30℃で２日間振盪し、3000rpmにて１０分間の遠心分離により細胞を回収した。WO94/14953に従い全酵母DNAを単離し、オートクレーブ処理した水50mlに溶解し、上記のようなエレクトロポレーションにより大腸菌へ形質転換した。pYES2.0cDNAクローンを含有する挿入部をLB+アンピシリン寒天プレートにプレーティングするこによりレスキューし、標準法を用いて大腸菌からプラスミドDNAを単離し、制限酵素で消化することにより解析した。
【０４１８】
ヌクレオチド配列解析
全長Ｈ．インソレンス  β−１，４−マンナナーゼcDNAクローンpC1M59のヌクレオチド配列は、500ngのQiagen精製鋳型(Qiagen, USA)、Taqデオキシターミナルサイクルシーケンシングキット(Perkin-Elmer, USA)、蛍光標識ターミネーターおよび5pmolのpYES2.0ポリリンカープライマー(Invitrogen, USA)を用い、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger et al. 1977)によって両鎖から決定した。配列データの解析はDevereue et al. (1984)に従って行った。
【０４１９】
アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)における異種発現
アスペルギルス・オリゼの形質転換
アスペルギルス・オリゼの形質転換は、Christensen et al., (1988), Biotechnology 6, 1419-1422によって記載されたように行った。
アスペルギルス発現のβ−１，４−マンナナーゼ発現カセットの構築
標準法を用いてマンナナーゼクローンpC1M59からプラスミドDNAを単離し、制限酵素解析により解析した。適当な制限酵素を用いてｃＤＮＡ挿入部を切り出し、プラスミドp77の誘導体であるアスペルギルス発現ベクターpHD414に連結した（EP238023に記載）。pHD414の構築はWO93/11249にさらに記載されている。
【０４２０】
アスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)の形質転換
一般法：100mlのYPD(Sherman et al., Methods in Yeast Gnetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981)にＡ．オリゼまたはＡ．ニゲルの胞子を接種し、37℃で約２日間振盪しながらインキュベートする。ミラクロスで濾過して菌糸を採取し、200mlの0.6M MgSO4で洗浄する。菌糸を15mlの1.2M MgSO4、10mMNaH2PO4、pH=5.8に懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、120mgのノボザイム（登録商標）234を含有するバッファー1mlを加える。
【０４２１】
５分後に1mlの12mg/ml BSAを加え、37℃で1.5〜2.5時間、顕微鏡下で観察したサンプルに多数のプロトプラストが見られるまで穏やかに浸透しながらインキュベートを続ける。この懸濁液をミラクロスで濾過し、濾液を滅菌試験管に移し、5mlの0.6Mソルビトール、100mM Tris-HCl、pH=7.0で覆った。100gで15分間遠心分離を行い、MgSO4クッションの上層からプロトプラストを回収する。このプロトプラスト懸濁液に２容量のSTCを加え、混合物を1000gで５分間遠心分離する。プロトプラストペレットを3mlのSTCに再懸濁し、再びペレットとする。これを繰り返す。
【０４２２】
最後に、プロトプラストを0.2〜1mlのSTCに再懸濁する。100μlのプロトプラスト懸濁液を、10μlのSTC中適当なDNA5〜25μgと混合した。プロトプラストをp3SR2(Ａ．ニデュランス(A. nidulans)ａｍｄＳ遺伝子含有プラスミド）と混合する。この混合物を室温で２５分間放置し、0.2mlの60%PEG4000、10mM CaCl2および10mM Tris-HCl、pH7.5を加え、注意深く混合し（２回）、最後に0.85mlの同溶液を加え、注意深く混合する。
【０４２３】
この混合物を室温で２５分間放置し、2500gで15分間遠心分離し、ペレットを2mlの1.2Mソルビトールに再懸濁する。さらに１回沈降を行った後、プロトプラストを適当なプレートに拡げる。プロトプラストを最小プレートに拡げてバックグラウンドの増殖を阻害する。37℃で4〜7日間インキュベートした後、胞子を選び取り、拡げて単一コロニーとする。この手順を繰り返し、２回目の再単離の後に単一コロニーの胞子を所定の形質転換体として保存する。
【０４２４】
アスペルギルス・オリゼ形質転換体の精製
Amds+-プレート（+0.01%Triton X-100)上の分生胞子によって精製し、YPM中、30℃で３日間増殖させた。
マンナナーゼ陽性アスペルギルス・オリゼ形質転換体の確認
アスペルギルス・オリゼ形質転換体からの上清を、基質として0.2%AZCl−ガラクトマンナン(MegaZyme, Australia)を含有する寒天プレート上でβ−１，４−マンナナーゼ活性に関して分析した。陽性形質転換体は、30℃で24時間インキュベートした後にプレートを青い加水分解ハローに関して分析することで確認した。
【０４２５】
SDS-PAGE解析
β−１，４−マンナナーゼを産生するアスペルギルス・オリゼ形質転換体からの上清のSDS-PAGE解析。形質転換体を５ｍｌのＹＰＭ中で３日間増殖させる。10μlの上清を12%SDS-ポリアクリルアミドゲルに適用し、その後これをクマシーブリリアントブルーで染色した。
【０４２６】
フミコーラ・インソレンスマンナナーゼの精製および同定
上記のように遺伝子をＡ．オリゼに形質転換し、形質転換株を、マルトースシロップ、スクロース、MgSO4、Ka2PO4、K2SO4、クエン酸酵母抽出物および微量の金属からなる標準培地を用い、発酵槽で増殖させた。インキュベーションは通気しながら34℃で６日間行った。
発酵液（5000ml）を回収し、濾過により液体から菌糸を分離した。この清澄な液体をフィルトロンで濃縮して275mlとした。
【０４２７】
マンナナーゼは陽イオンクロマトグラフィーを用いて精製した。S-Sepharoseカラムを25mMクエン酸pH4.0で平衡化し、カラムに結合したマンナナーゼを塩化ナトリウム勾配（0〜0.5M）を用いて溶出した。マンナナーゼ活性画分をプールし、pHを7.3に調整した。次いで、プールしたマンナナーゼ100mlを5mlまで濃縮し（ml当たり13mgのタンパク質を含む）、これを適用試験に用いた。さらなる精製のため、２ｍｌを、酢酸ナトリウムバッファーpH6.1を用いたSuperdex200におけるサイズクロマトグラフィーに適用した。マンナナーゼ活性画分はSDS-PAGEにおいて染色されたバンドと同じ分子量45kDaおよび38kDaであることを示し、このことはＮ末端非触媒ドメインのタンパク質分解的変性を示すものである。
【０４２８】
マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、すなわち翻訳されたDNA配列は配列番号14に示されている。
配列番号13のDNA配列は1〜21番にシグナルペプチドをコードしている。またその他のマンナナーゼに見られる機能が不明のドメインも、配列番号14のアミノ酸配列の22〜159番に示されており、触媒活性ドメインは配列番号14の160〜488番に見られる。
最も高い配列相同性は、DICTYOGLOMUS THERMOPHILUM（49%の同一性）；マンナナーゼ配列EMBL;1997年７月にREEVES R.A., GIBBS M.D., BERGQUIST P.L.により寄託されたAF013989に対して認められた。
【０４２９】
分子量：38kDa
DSC（酢酸ナトリウムバッファー  ｐＨ6.0中）は65°であった。
pH活性プロフィール（ManUアッセイを使用（40℃で20分間インキュベーション））は酵素がpH8で至適活性を有することを示している。
至適温度（ManUアッセイを使用；基質としてはMegaZyme AZCLローカストビーンガム）は、pH10では70℃であることが分かった。
免疫特性：Danish社DAKOの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
【０４３０】
実施例１５．フミコーラ・インソレンスファミリー２６マンナナーゼの洗浄評価
洗浄性能は、ローカストビーンガムで被覆した布帛を本発明のマンナナーゼを含む洗浄溶液中で洗浄することで評価した。洗浄後、布帛を酸化鉄で汚染することにより効果を視覚化した。
ローカストビーンガム布帛の準備：清浄な綿の布帛を2g/lのローカストビーンガムの溶液に浸し、室温で一晩乾燥させた。これらの布帛を水で予備洗浄し、再び乾燥させた。
【０４３１】
洗浄：15°dHの水中6、7g/lのAriel Futur液の入ったビーカーに小さな円形のローカストビーンガム布帛を置き、磁気攪拌しながら４０℃で３０分間インキュベートした。これらの布帛を水道水ですすぎ、乾燥させた。
汚染：これらの布帛を0.25g/lのFe2O3の入ったビーカーに入れ、３分間攪拌した。これらの布帛を水道水ですすぎ、乾燥させた。
評価：MacBath ColorEye 7000規約反射率分光光度計を用いて布帛の規約反射率を400nmで測定した。
【０４３２】
結果は
Δ規約反射率＝（Ｒ洗浄後−Ｒ洗浄前）酵素−（Ｒ洗浄後−Ｒ洗浄前）対照
（式中、Ｒは440nmでの規約反射率である）
として表した。
本発明のマンナナーゼは、バチルス種I633由来の対照マンナナーゼよりも若干良好な洗浄性能で、ローカストビーンガム布帛において明らかに有効である。
Δ規約反射率として示される、バチルス種I633由来のマンナナーゼ（実施例１〜３）と比較したフミコーラ・インソレンスファミリー26マンナナーゼの洗浄特性：
【０４３３】
【表５】
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【０４３４】
実施例１６〜４０．
以下の例は本発明の組成物を例示するものであり、本発明の範囲を必ずしも制限または規定するものではない。
洗剤組成物において、酵素レベルは全組成物に対する純酵素重で表し、特に断りのない限り洗剤成分は全組成物に対する重量で表す。そこで略記された成分は以下の意味を有する。
【０４３５】
【表６】
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【０４３６】
【表７】
2005160476.tif 000012
【０４３７】
【表８】
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【０４３８】
【表９】
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【０４３９】
【表１０】
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【０４４０】
【表１１】
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【０４４１】
【表１２】
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【０４４２】
【表１３】
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【０４４３】
【表１４】
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【０４４４】
【表１５】
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【０４４５】
【表１６】
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【０４４６】
【表１７】
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【０４４７】
【表１８】
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【０４４８】
【表１９】
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【０４４９】
【表２０】
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【０４５０】
【表２１】
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【０４５１】
【表２２】
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【０４５２】
【表２３】
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【０４５３】
【表２４】
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【０４５４】
【表２５】
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【０４５５】
【表２６】
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【０４５６】
【表２７】
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【０４５７】
【表２８】
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【０４５８】
【表２９】
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【０４５９】
【表３０】
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【０４６０】
【表３１】
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【０４６１】
【表３２】
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【０４６２】
【表３３】
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【０４６３】
【表３４】
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【０４６４】
【表３５】
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【０４６５】
【表３６】
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【０４６６】
【表３７】
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【０４６７】
【表３８】
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【０４６８】
【表３９】
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【０４６９】
【表４０】
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【０４７０】
【表４１】
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【０４７１】
【表４２】
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【０４７２】
【表４３】
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【０４７３】
【表４４】
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【０４７４】
【表４５】
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【０４７５】
【表４６】
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【０４７６】
【表４７】
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【０４７７】
【表４８】
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【０４７８】
【表４９】
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【０４７９】
【表５０】
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【０４８０】
【表５１】
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【０４８１】
【表５２】
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【０４８２】
【表５３】
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【０４８３】
【表５４】
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【０４８４】
【表５５】
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【配列表】
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