(57)【要約】  【課題】  感度の高い融解曲線解析法を提供する。  【解決手段】  核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを含む溶液の温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析することを含む融解曲線解析法において、ハイブリッドのシグナルの測定の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させる工程を行う。【選択図】  図１
2005058107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを含む溶液の温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析することを含む融解曲線解析法であって、
ハイブリッドのシグナルの測定の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させる工程を行うことを特徴とする解析法。
【請求項２】
シグナルが蛍光である請求項１記載の解析法。
【請求項３】
核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを含む溶液の温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析することを含む融解曲線解析法を行うための、温度の制御が可能な恒温装置の温度を制御する温度制御手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムであって、
温度制御手段は、ハイブリッドのシグナルの測定のための温度の制御の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させるための温度の制御を行う、プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の融解曲線解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
融解曲線解析は、核酸プローブをターゲット核酸にハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析する方法として知られている。融解曲線の解析により得られる融解温度は、核酸プローブとターゲット核酸との相同性を反映するため、この融解温度の決定により、ターゲット核酸の同一性が判別できる。また、核酸プローブを一塩基多型の部分に設定した場合、融解温度の決定により多型の型を判別できる（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】クリニカル・ケミストリー(Clinical Chemistry)、２０００年、第４６巻、第５号、ｐ．６３１−６３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、感度の高い融解曲線解析法およびその方法を実施するためのプログラムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、融解曲線の測定を繰り返すことにより、ハイブリッドの融解によるシグナルの変化量が大きくなることを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【０００５】
本発明は、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを含む溶液の温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析することを含む融解曲線解析法であって、
ハイブリッドのシグナルの測定の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させる工程を行うことを特徴とする解析法を提供する。
【０００６】
本発明の方法においては、シグナルは蛍光であることが好ましい。
【０００７】
また、本発明は、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを含む溶液の温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析することを含む融解曲線解析法を行うための、温度の制御が可能な恒温装置の温度を制御する温度制御手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムであって、
温度制御手段は、ハイブリッドのシグナルの測定のための温度の制御の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させるための温度の制御を行う、プログラムを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、高感度な融解曲線解析(Tm解析)が可能になる。特に、一回のTm解析ではシグナルの変化量が十分でなく、融解温度の決定ができなかったり、その精度が低かったりするような場合であっても、正確なTm解析が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法は、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを含む溶液の温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定する測定工程、および、シグナルの変化により核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析する解析工程を含む融解曲線解析法であり、ハイブリッドのシグナルの測定工程の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させる工程を行うことを特徴とする。
【００１０】
本発明の方法は、シグナルの測定の前に、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを含む溶液の温度を特定の条件で上昇させてハイブリッドを解離させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させることの他は、通常のTm解析の方法に従って行うことができる。
【００１１】
核酸プローブは、ターゲット核酸、シグナルの測定方法および解析の目的に応じて適宜設定される。核酸プローブは、通常にはDNAである。
【００１２】
本発明において、ハイブリッドの融解により変化するシグナルとは、ハイブリッドの融解により生じるまたは大きくなるシグナル、および、ハイブリッドの融解により消失するまたは小さくなるシグナルの両方を包含する。ハイブリッドの融解とは、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが変性して核酸プローブとターゲット核酸に分離することを意味する。シグナルは蛍光であることが好ましい。
【００１３】
シグナルの測定方法の例としては、蛍光標識した核酸プローブを用いる方法、二本鎖DNAに特異的に結合し、結合したときに蛍光が変化する蛍光試薬を用いる方法等が挙げられる。
【００１４】
蛍光標識した核酸プローブの例としては、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（例えば、特開２００２−１１９２９１号公報参照）等が挙げられる。核酸プローブは一つでなくてもよく、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)効果を生じる２種の蛍光色素でそれぞれ標識され、ターゲット核酸に結合したときにFRET効果が生じるように設定された二つの核酸プローブを用いてもよい。
【００１５】
二本鎖DNAに特異的に結合し、結合したときに蛍光が変化する蛍光試薬の例としては、SYBR(商標) Green I色素が挙げられる。
【００１６】
蛍光の測定は、蛍光色素に応じた波長の励起光を用い発光波長の光を測定することに行うことができる。
【００１７】
ターゲット核酸は、通常にはDNAであり、通常の核酸増幅の方法により得られたものであってもよい。核酸増幅の方法としては、PCRポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、PCR、ICAN、LAMP等が挙げられる。PCRポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いる核酸プローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。
【００１８】
ハイブリッドを含む溶液の組成は、シグナルの測定および融解曲線の解析を妨げない範囲で適宜選択される。すなわち、シグナルの測定、および、核酸プローブとその塩基配列に相補的な配列を有するターゲット核酸とのハイブリダイゼーションが可能であれば特に制限されないが、通常には、一価の陽イオン濃度が1.5〜5 mM、pHが７〜９である。PCR等のDNAポリメラーゼを用いる増幅方法の反応液は、通常、この条件を満たすので、増幅後の反応液をそのままTm解析に用いることができる。
【００１９】
測定工程における昇温速度は、通常には、0.1〜1℃／秒である。
【００２０】
本発明において、融解曲線の解析とは、融解温度の決定だけでなく、融解曲線に基づくターゲット核酸の同一性の判別や多型の型の判別も包含する。解析工程は、一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する工程であってもよい。変異を検出する場合には、Tm解析の結果に基づく変異の検出は通常の方法に従って行うことができる。本発明における検出とは、変異の有無の検出の他、変異型DNAの定量、野生型DNAと変異型DNAの割合の測定も包含する。
【００２１】
本発明の方法では、ハイブリッドのシグナルの測定工程の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させる工程が行われる。
【００２２】
温度を連続的に上昇させる工程における昇温速度は、通常には、１〜１００℃／分、好ましくは、６〜６０℃／分である。昇温速度は、測定工程における昇温速度と同じであっても、異なっていてもよい。
【００２３】
溶液の温度は、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する（すなわち、ハイブリッドが融解する）まで上昇させればよい。通常には、室温〜７０℃から９０〜９８℃に上昇させる。
【００２４】
溶液の温度を上昇させるときに、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定してもよい。すなわち、シグナルの測定工程と同一の工程を行ってもよい。
【００２５】
ハイブリッドを形成させる方法は、核酸プローブとターゲット核酸とがアニーリングする限り、特に限定されないが、通常には、４０〜７０℃まで溶液の温度を低下させればよい。
【００２６】
溶液の温度を連続的に上昇させ、次いでハイブリッドを形成させる工程は、繰り返しても良い。シグナルの測定工程の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させる工程を行うことにより、シグナルの変化量が大きくなり、従って、高感度なTm解析が可能になる。溶液の温度を連続的に上昇させ、次いでハイブリッドを形成させる工程として、シグナルの測定工程と同一の工程を行う場合には、必要とする感度が得られるまで、この工程を繰り返すようにしてもよい。
【００２７】
上記の工程を行うことによりシグナルの変化量が大きくなる理由は、温度を連続的に上昇させてハイブリッドを融解させ、次いでハイブリッドを形成させることにより、ハイブリッドの融解と形成が、DNAポリメラーゼ反応などのハイブリッド形成に影響を与えるよ
うな反応がその途中に生じない条件で行われることになるため、プローブ核酸がターゲット核酸にハイブリダイズしやすくなるためと推定される。
【００２８】
本発明のプログラムは、本発明の方法を実施するためのものであり、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを含む溶液の温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析することを含む融解曲線解析法を行うための、温度の制御が可能な恒温装置の温度を制御する温度制御手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムであって、温度制御手段が、ハイブリッドのシグナルの測定のための温度の制御の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させるための温度の制御を行うことを特徴とする。
【００２９】
温度の制御が可能な恒温装置は、従来の融解曲線解析を行うための装置として知られているものと同様でよく、ハイブリッドの融解によるシグナルを測定できる手段を備えていれば特に限定されない。例えば、ハイブリッドを含む溶液の蛍光を測定できる分光蛍光光度計を備えた恒温装置が挙げられる。
【００３０】
ハイブリッドのシグナルの測定工程における温度条件、および、溶液の温度を上昇させ、ハイブリッドを形成させる工程における温度条件は、本発明の方法について説明したのと同様である。
【００３１】
温度制御手段は、溶液の温度を連続的に上昇させ、次いでハイブリッドを形成させる工程における、昇温速度、到達温度などの温度条件の入力を受ける手段を有していてもよく、その場合には、入力された温度条件に基づいて恒温装置の温度が制御される。
【００３２】
本発明のプログラムは、コンピューターが、ハイブリッドのシグナルの測定のための温度の制御の前に、溶液の温度を、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドが形成される温度から、核酸プローブとターゲット核酸が解離する温度まで連続的に上昇させ、次いで、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドを形成させるための温度の制御を行う手段として機能するようにする他は、温度の制御が可能な恒温装置の温度の制御のためのプログラムと同様に作成することができる。
【００３３】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例】
【００３４】
膵ラ氏島アミロイドタンパク質（Islet Amyloid Polypeptide（IAPP））のアミノ酸配列の20位のセリンがグリシンに置換するミスセンス変異（S20G変異）をもたらす塩基の変異（以下、「IAPP S20G変異」ともいう）を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、S20G変異を含む部分を増幅できるように表２に示すプライマーを設計した。表１中、位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００３５】
【表１】
2005058107.tif 000003
【００３６】
次に、表２に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表２中、位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。また、塩基配列中の大文字は、IAPP S20G変異の部位を示し、3'末端の(P)は、リン酸化されていることを示す。BODIPY(商標) FL及びTAMRA(商標)による標識は、常法に従って行った。
【００３７】
【表２】
2005058107.tif 000004
【００３８】
精製ヒトゲノム（２コピー／μｌ）をサンプルとして、Smart Cycler System（Cephied)を用い、以下の条件でPCR及びTm解析を行った。Tm解析における励起波長及び検出波長は、それぞれ450〜495nm及び505〜537 nm(BODIPY FL)、527〜555 nm及び565〜605 nm(TAMRA)であった。
【００３９】
【表３】
2005058107.tif 000005
【００４０】
【表４】
2005058107.tif 000006
【００４１】
Tm解析は、PCR増幅後の反応液を95℃に加熱し、増幅産物を一本鎖に変性させた後、50℃まで温度を下げてプローブをターゲット核酸（ターゲット)にハイブリダイズさせ、次
に、温度を95℃まで1℃/secの昇温速度で上昇させ、この昇温中の蛍光を測定して行った。さらに、測定後の反応液の温度を50℃まで低下させ、プローブをターゲットにハイブリダイズさせた後、温度を95℃まで1℃/secの昇温速度で上昇させ、この昇温中の蛍光を測定するTm解析の工程を繰り返した。
【００４２】
結果を、図１に示す。図１から明らかなようにTm解析の工程を繰り返すことにより、シグナルが強くなること、すなわち、Tm解析の感度が向上することが明らかになった。
【００４３】
なお、図１において縦軸は、蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（-dF/dt）、横軸は温度（℃）である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Tm解析の工程を繰り返したときの検出感度の変化を示す。
【図１】
2005058107.tif 000007
【配列表】
2005058107000001.app