(57)【要約】【課題】  老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動及び老人性記憶障害モデル非哺乳類動物を提供すること、更には、該老人性記憶障害モデル動物を用いた老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  ショウジョウバエのようなハエにおいて、ａｍｎ遺伝子を変異させて、ａｍｎ遺伝子機能を欠損させることにより、ヒト老人性記憶障害（ＡＭＩ）と同様の非哺乳類モデル動物を作製する。また、ハエ類のａｍｎ遺伝子に高い相同性を有する、脊椎動物の脳下垂体アデニリルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）及び成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）等の遺伝子を標的として変異させて、変異マウス等の非ヒトモデル動物を調製することにより老人性記憶障害モデルの非ヒト哺乳動物を作製する。本発明は、これらのモデル動物を用いた、老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｍｎ遺伝子又はａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の機能が染色体上で欠損されていることを特徴とする老人性記憶障害モデル非ヒト動物。
【請求項２】
ａｍｎ遺伝子機能が染色体上で欠損されていることを特徴とする老人性記憶障害モデル非哺乳類動物。
【請求項３】
非哺乳類動物が、ハエ類であることを特徴とする請求項２記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物。
【請求項４】
ハエ類が、ショウジョウバエであることを特徴とする請求項３記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物。
【請求項５】
ａｍｎ遺伝子機能の欠損が、ａｍｎ遺伝子が変異していることによるものであることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物。
【請求項６】
ａｍｎ遺伝子機能の欠損が、遺伝子操作によりａｍｎ遺伝子の一部を変異させたものであることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物。
【請求項７】
ａｍｎ遺伝子機能の欠損が、ａｍｎ遺伝子の一部を欠失、置換、或いは付加により変異させたものであることを特徴とする請求項６記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物。
【請求項８】
ａｍｎ遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号１に示されるａｍｎ遺伝子の変異による機能の欠損であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物。
【請求項９】
ａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子機能の欠損が、ＰＡＣＡＰ遺伝子又はＧＨＲＨ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項９記載の老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
マウス遺伝子ライブラリーから得られた請求項１又は９記載のａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、マーカー遺伝子で置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後、胚幹細胞に導入し、ａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることを特徴とする老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項１２】
配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するａｍｎ遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、マーカー遺伝子で置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを非哺乳類動物に導入することを特徴とする老人性記憶障害モデル非哺乳類動物の作製方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物又は請求項１、９又は１０記載の老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物に、被検物質を投与し、該非哺乳類動物の記憶障害を測定・評価することを特徴とする老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１４】
非哺乳類動物又は非ヒト哺乳動物の記憶障害の測定・評価が、中期記憶の障害であることを特徴とする請求項１３記載の老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物に、被検物質を投与した場合、又は、請求項１、９又は１０記載の老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物に、被検物質を投与し場合と、ａｍｎ遺伝子非変異型非哺乳類動物の場合又はａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子非変異型非ヒト哺乳動物の場合とを、比較・評価することを特徴とする請求項１３又は１４記載の老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１６】
非哺乳類動物又は非ヒト哺乳動物が、ショウジョウバエであるか、又は、非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか記載の老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる老人性記憶障害予防及び／又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物及び非哺乳動物、特に、マウスのような老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動、及び、ハエ類のような非哺乳類動物、更には、該老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動及び非哺乳類動物を用いた老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
記憶は、記銘，保持、追想（再認）という一連の精神的作用によって維持されており、この過程のどこかに障害が起これば記憶は障害される。記銘力障害とは、脳への新たな情報のインプットが困難な状態で、１）意識障害、２）慢性器質脳障害、３）コルサコフ症状群（Korsakof's  syndrome）などに際して起こる。保持障害は、すでに獲得され、保持されている記憶材の消失であり、病的なものは脳器質疾患に際して見られる。追想障害には、量的障害と質的障害があり、追想の量的障害（亢進）である記憶亢進の例として、限られた範囲に関しては驚くほどの正確な機械的記憶を示すイディオ・サヴァン（idiot  savant：天才白痴）、発熱時、夢、催眠状態、ある種のてんかん発作（精神発作）などをあげることができる。追想の質的障害として、本来の体験と追想された内容が明らかに質的に異なるものを記憶錯誤と呼ぶ。空想性記憶錯誤、てんかんの複雑部分発作に見られる既視体験、未視体験がこれに当たる。
【０００３】
記憶障害には、老人性痴呆症として知られている加齢に伴う学習・記憶能力の低下、すなわち、老人性記憶障害が知られている。老人性記憶障害（age-related memory impairment）（ＡＭＩ）は、多くの種において観察されている。しかし、ＡＭＩの原因が、記憶過程における特異的減衰又は非特異的減衰のいずれによって生じるのか、明らかになっていない。例えば、ショウジョウバエ（Drosophila）において、１回の匂い条件付けパラダイム（a single olfactory conditioning paradigm）の後に獲得された記憶は、３つの異なる段階（phase）を有する：短期記憶（short-term memory）（ＳＴＭ）、中期記憶（middle-term memory）（ＭＴＭ）及び長く保持される麻酔耐性記憶（longer-lasting anesthesia-resistant memory）（ＡＲＭ）である。
【０００４】
老人性記憶障害（ＡＭＩ）における解剖学的変化及び生理学的変化については、十分に文献（Brain Research Brain Resarch Review 30, 236-249,1999；Neurobiol Aging 20, 125-136,1999）に記載されているが、ＡＭＩの根底にある分子機構についてはほとんど分かっていない。ＡＭＩの行動遺伝学的解析を実施する際の主な障害となるのが、動物モデルの長い寿命であった。例えば、マウスの視床下部及び皮質の両方における神経細胞機能に関与する多くの遺伝子は、加齢に伴い発現が変化した（Proc Natl Acad Sci U S A 98, 1930-1934,2001））。しかしながら、これらの遺伝子における変異がＡＭＩに影響を与えるか否かについて調べることは難しい。なぜなら、マウスの寿命は、６００日を超えるからである。
【０００５】
これに対し、ショウジョウバエであるDrosophila melanogasterは、寿命が短く、老齢個体の行動遺伝学的解析に最適である（Exp Gerontol 37, 1347-1357,2002；Q J Exp Psychol B 46, 399-412,1993；Learn Mem 3, 49-59,1996；Neural Transm 107, 581-601,2000；Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova 85, 167-183,1999）。ショウジョウバエは、その遺伝的特徴から、古くから分子遺伝的解析に利用されてきた。最近、ショウジョウバエについて、その寿命に関連する遺伝子を特定する方法の開発（特開２００３−１７４８８７号公法）や、ショウジョウバエの生態を利用して、成体発症型神経変性遺伝子ｍｙｂのような遺伝子を導入し、該神経変性症の治療薬のスクリーニングに利用するトランスジェエニックハエの作製（特表２００２−５３８８０５号公報）などの技術が開示されている。
【０００６】
近年、ショウジョウバエにおける記憶形成の分子遺伝的研究は、進展し、多くの報告がなされている。このショウジョウバエにおける記憶形成の分子遺伝的研究により、記憶の区別可能な時間的段階（temporal phase）で機能する遺伝子が同定されている。これらの記憶段階は、個々の遺伝的変異により分離することができるため、少なくとも部分的に異なる機構を介して形成することが明らかにされている。単一遺伝子変異体（single-gene mutants）に匂い条件付け（olfactory conditioning）を行った後の記憶保持曲線（memory retention curves）は、特定の記憶段階における特徴的な破壊を示す。例えば、推定受容体チロシンキナーゼを欠損していると考えられている変異体（FEBS Lett 370, 250-254,1995；Neuroreport 13, 2309-2312,2002）であるlinotte（ｌｉｏ）（J. Neurogenet 9, 1-14,1993）、細胞接着分子ＦａｓIIを欠損した変異体（Cell 105, 757-768,2001）であるfasciclinII（ｆａｓII）、Drosophila１４−３−３タンパク質を欠損した変異体（Neuron 17, 931-944,1996）であるleonardo（ｌｅｏ）、及び複製開始点、認識複合体のサブユニットを欠損した変異体（Genetics 131,655-672,1992；Neuron 23, 45-54,1999）であるlatheo（ｌａｔ）は、トレーニング直後の記憶（０時間記憶）において減少を示すが、その後、野生型対照ハエの記憶とおおよそ平行して記憶の減衰が生じる。
【０００７】
Ｃａ2+／ＣａＭ依存アデニリルシクラーゼをコードするrutabaga（ｒｕｔ）（Cell 68, 479-489,1992）、ｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼをコードするdunce（ｄｎｃ）（Proc Natl Acad Sci U S A 83, 9313-9317,1986）、及び細胞接着分子インテグリンのサブユニットをコードするvolado（ｖｏｌ）（Nature 391, 455-460,1998）における変異は、短期記憶（ＳＴＭ）に障害を起こし、野生型対照と比較して、トレーニングの最初の１時間以内の方が、それ以降の記憶よりも大きな減少が見られる。これに対し、脊椎動物の脳下垂体アデニリルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）及び成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）（Neurosci 19, 8740-8746,1999；Science 268, 869-873,1995）に対する相同性を有する遺伝子をコードするamnesiac（ａｍｎ）における変異体は、０時間記憶及び７時間記憶においては最小の欠損を示し、これらの時点（timepoint）の間である中期記憶（ＭＴＭ）（Learn Mem 2, 320-333,1996；J Comp Physiol [A] 157, 263-277,1985）の記憶保持は、野生型対照よりも著しく低い。
【０００８】
最後に、ホスホリパーゼＡ２を欠損したradish（ｒｓｈ）の変異体は、７時間記憶の方がそれよりも早い時点より大きな欠損を示した。ｒｓｈは、ＭＴＭの後に一時的に形成される安定化した（consolidated）形態の記憶である、麻酔耐性記憶（ＡＲＭ）を欠損していることを示している。単一サイクルトレーニング（single-cycle training）の後（実験手順を参照のこと）、１回の条件づけのみでは記憶は、トレーニングの転写因子であるＣＲＥＢ（Cell 79, 35-47,1994；Cell 79, 49-58,1994）を必要とする、タンパク質合成依存性の長期間記憶（long-term memory）（ＬＴＭ）に固定されない。
【０００９】
ａｍｎ遺伝子産物は、記憶過程以外に、ｃＡＭＰシグナル伝達経路を介してエタノール感受性を制御することが分かっている（Cell 93, 997-1007,1998）。ハエの脳において、ａｍｎ遺伝子産物は、嗅覚学習及び嗅覚記憶の神経の中心（Science 274, 2104-2107,1996；Science 263, 692-695,1994）である、キノコ体（ＭＢ）（Cell 103, 805-813,2000）の葉を神経支配するＤＰＭ細胞中で優位的に発現する。おそらく、ａｍｎ遺伝子産物は、嗅覚記憶形成の際にＭＢにおけるｃＡＭＰシグナル伝達を調節する。
【特許文献１】特表２００２−５３８８０５号公報。
【特許文献２】特開２００３−１７４８８７号公報公法。
【非特許文献１】Brain Research Brain Resarch Review 30, 236-249,1999。
【非特許文献２】Neurobiol Aging 20, 125-136,1999。
【非特許文献３】Proc Natl Acad Sci U S A 98, 1930-1934,2001。
【非特許文献４】Exp Gerontol 37, 1347-1357,2002。
【非特許文献５】Q J Exp Psychol B 46, 399-412,1993。
【非特許文献６】FEBS Lett 370, 250-254,1995。
【非特許文献７】Learn Mem 3, 49-59,1996。
【非特許文献８】Neural Transm 107, 581-601,2000。
【非特許文献９】Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova 85, 167-183,1999。
【非特許文献１０】Neuroreport 13, 2309-2312,2002。
【非特許文献１１】J. Neurogenet 9, 1-14,1993。
【非特許文献１２】Cell 105, 757-768,2001。
【非特許文献１３】Neuron 17, 931-944,1996。
【非特許文献１４】Genetics 131,655-672,1992。
【非特許文献１５】Neuron 23, 45-54,1999。
【非特許文献１６】Proc Natl Acad Sci U S A 83, 9313-9317,1986。
【非特許文献１７】Cell 68, 479-489,1992。
【非特許文献１８】Nature 391, 455-460,1998。
【非特許文献１９】Neurosci 19, 8740-8746,1999。
【非特許文献２０】Science 268, 869-873,1995．
【非特許文献２１】Learn Mem 2, 320-333,1996。
【非特許文献２２】J Comp Physiol [A] 157, 263-277,1985。
【非特許文献２３】Cell 79, 35-47,1994。
【非特許文献２４】Cell 79, 49-58,1994。
【非特許文献２５】Cell 93, 997-1007,1998。
【非特許文献２６】Science 274, 2104-2107,1996。
【非特許文献２７】Science 263, 692-695,1994。
【非特許文献２８】Cell 103, 805-813,2000。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
老人性痴症として知られる老人性記憶障害の対処は、高齢化社会におけるQuality  of  Life（ＱＯＬ）の達成のために必要不可欠な事項であり、その療法の開発のためには、老人性記憶障害の分子メカニズムの解明とその予防／治療薬の開発が最重要事項となり、そのためにはヒトの老人性記憶障害と同一の記憶障害を示すモデル動物の開発が必要となる。
【００１１】
そこで、本発明の課題は、ヒトの老人性記憶障害と同一の記憶障害を示す、老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物及び非哺乳動物を提供すること、特に、マウスのような老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動、及び、ハエ類のような非哺乳類動物からなる老人性記憶障害モデル動物、更には、該老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動及び非哺乳類動物を用いた老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ショウジョウバエと哺乳類とは、学習記憶過程に多くの共通した分子メカニズムを持つことが示されている。本発明者のショウジョバエによる行動遺伝学的解析から、老人性記憶障害（老人性痴呆症）の原因が記憶過程の非特異的な障害ではなく、ａｍｎ（amnesiac）遺伝子が関与する記憶過程（ＭＴＭ：中期記憶）の極めて特異的な低下にあることが見い出された。すなわち、老人性記憶障害（ＡＭＩ）が、ａｍｎ遺伝子の変異体の中期記憶（ＭＴＭ）に見られると同様の記憶障害によることが見い出された。既にａｍｎ遺伝子シグナリングが低下しているａｍｎ遺伝子変異体は、野生型老齢体と同一の学習記憶障害を持つ。そして、ａｍｎ遺伝子が変異したａｍｎ遺伝子変異体のハエではＡＭＩが生じないのに対して、ａｍｎ遺伝子が変異していないハエではＡＭＩが生じることを見い出した。
【００１３】
これらの事実から、ショウジョウバエのようなハエにおいて、ａｍｎ遺伝子を変異させて、ａｍｎ遺伝子機能を欠損させることにより、ヒト老人性記憶障害（ＡＭＩ）と同様の非哺乳類モデル動物ができることを見い出し、本発明を完成するに至った。ショウジョウバエのようなハエ類においては、その寿命期間が短いことから、短期における老齢個体の行動遺伝学的解析が可能であり、更に、幼若時で既に老人性記憶障害を示すａｍｎ遺伝子変異体を用いることにより、老人性記憶障害のメカニズムの解明、或いは、老人性記憶障害予防及び／又は治療薬の開発に、有効に用いることができる老人性記憶障害モデル動物の作製が可能となる。
【００１４】
一方で、哺乳類には、ショウジョウバエのようなハエ類におけるａｍｎ遺伝子に高い相同性を有する、脊椎動物の脳下垂体アデニリルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）及び成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）等が存在し、これらの遺伝子は、ａｍｎ遺伝子と同様にｃＡＭＰ（サイクリックアデノシン３‘、５’−リン酸）のシグナリングに関与する。このことから、これらのホモローグ遺伝子が哺乳類における老人性記憶障害の発症に関与し、これらの遺伝子を標的として変異マウス等の非ヒトモデル動物を作製することにより老人性記憶障害モデルの非ヒト哺乳動物を作製することができる。
【００１５】
本発明は、上記のように、ショウジョウバエのようなハエにおいて、ａｍｎ遺伝子を変異させて、ａｍｎ遺伝子機能を欠損させたことによる老人性記憶障害（ＡＭＩ）モデル非哺乳類動物や、マウスのような哺乳類において、該ａｍｎ遺伝子に相同性を有するＰＡＣＡＰ或いはＧＨＲＨのような遺伝子の機能を欠損させたことによる老人性記憶障害モデル非ヒト動物を用いて、老人性記憶障害の予防及び／又は治療薬のスクリーニングを行なう方法を包含する。
【００１６】
すなわち本発明は、ａｍｎ遺伝子又はａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の機能が染色体上で欠損されていることを特徴とする老人性記憶障害モデル非ヒト動物（請求項１）や、ａｍｎ遺伝子機能が染色体上で欠損されていることを特徴とする老人性記憶障害モデル非哺乳類動物（請求項２）や、非哺乳類動物が、ハエ類であることを特徴とする請求項２記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物（請求項３）や、ハエ類が、ショウジョウバエであることを特徴とする請求項３記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物（請求項４）や、ａｍｎ遺伝子機能の欠損が、ａｍｎ遺伝子が変異していることによるものであることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物（請求項５）や、ａｍｎ遺伝子機能の欠損が、遺伝子操作によりａｍｎ遺伝子の一部を変異させたものであることを特徴とする請求項２〜４のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物（請求項６）や、ａｍｎ遺伝子機能の欠損が、ａｍｎ遺伝子の一部を欠失、置換、或いは付加により変異させたものであることを特徴とする請求項６記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物（請求項７）や、ａｍｎ遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号１に示されるａｍｎ遺伝子の変異による機能の欠損であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物（請求項８）や、ａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子機能の欠損が、ＰＡＣＡＰ遺伝子又はＧＨＲＨ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物（請求項９）や、非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項９記載の老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物（請求項１０）からなる。
【００１７】
また本発明は、マウス遺伝子ライブラリーから得られた請求項１又は９記載のａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、マーカー遺伝子で置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後、胚幹細胞に導入し、ａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることを特徴とする老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物の作製方法（請求項１１）や、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するａｍｎ遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、マーカー遺伝子で置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを非哺乳類動物に導入することを特徴とする老人性記憶障害モデル非哺乳類動物の作製方法（請求項１２）からなる。
【００１８】
さらに本発明は、請求項１〜９のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物又は請求項１、９又は１０記載の老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物に、被検物質を投与し、該非哺乳類動物の記憶障害を測定・評価することを特徴とする老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法（請求項１３）や、非哺乳類動物又は非ヒト哺乳動物の記憶障害の測定・評価が、中期記憶の障害であることを特徴とする請求項１３記載の老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法（請求項１４）や、請求項１〜９のいずれか記載の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物に、被検物質を投与した場合、又は、請求項１、９又は１０記載の老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物に、被検物質を投与し場合と、ａｍｎ遺伝子非変異型非哺乳類動物の場合又はａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子非変異型非ヒト哺乳動物の場合とを、比較・評価することを特徴とする請求項１３又は１４記載の老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法（請求項１５）や、非哺乳類動物又は非ヒト哺乳動物が、ショウジョウバエであるか、又は、非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか記載の老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法（請求項１６）や、請求項１３〜１６のいずれか記載のスクリーニング方法により得られる老人性記憶障害予防及び／又は治療薬（請求項１７）からなる。
【発明の効果】
【００１９】
老人性痴呆症のような老人性記憶障害は、高齢化社会における高齢者の社会参加を妨げる大きな原因となることが予想されているが、未だ有効なモデル動物が確立されていないことから、分子レベルでの発現に至る経緯の解明や予防・治療薬の開発が大きく遅れている。本発明において、ショウジョウバエのようなハエ類の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物を作製することにより、短期間の、有効な老人性記憶障害の遺伝子解析が可能なモデル動物を提供することが可能となり、また、該モデル非哺乳類動物を用いることにより短期間に、有効な老人性記憶障害の予防及び／又は治療薬のスクリーニングを行なうことが可能となった。更に、ａｍｎ遺伝子に相同性を有するＰＡＣＡＰ或いはＧＨＲＨのような遺伝子の機能を欠損させた老人性記憶障害モデル動物を作製することにより、マウスのような哺乳類において、老人性記憶障害モデル動物を提供することが可能となり、該老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物を用いて、老人性記憶障害の予防及び／又は治療薬のスクリーニングを行なうことが可能となる。したがって、本発明は、老人性記憶障害の遺伝的機能の解明や、予防・治療薬の開発に大きく貢献することが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の、老人性記憶障害を発症するモデル非ヒト動物は、ａｍｎ遺伝子又はａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の機能が染色体上で欠損することにより、老人性記憶障害を発症するモデル非ヒト動物よりなる。本発明における非ヒト動物としては、ａｍｎ遺伝子を染色体上に有するショウジョウバエのようなハエ類の非哺乳類動物、或いは、ａｍｎ遺伝子に相同性を有するＰＡＣＡＰ或いはＧＨＲＨのような遺伝子を染色体上に有するマウスのような非ヒト哺乳動物を挙げることができる。
【００２１】
本発明において、ショウジョウバエのようなハエ類の非哺乳類動物において、老人性記憶障害を発症するモデル非ヒト動物を作製するために、その遺伝子の機能を染色体上で欠損させるａｍｎ遺伝子は、公知の遺伝子であり（Cell 93, 997-1007,1998）、その遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１に示される。該配列は、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいてアクセッションナンバーでアプローチすることができる。また、本発明において、マウスのような非ヒト哺乳動物において、老人性記憶障害を発症するモデル非ヒト動物を作製するために、その遺伝子の機能を染色体上で欠損させる、ａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子、すなわち、脊椎動物の脳下垂体アデニリルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）及び成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）も、公知の遺伝子である（Neurosci 19, 8740-8746,1999；Science 268, 869-873,1995）。
【００２２】
本発明において、ショウジョウバエのようなハエ類の非哺乳類動物において、老人性記憶障害モデル非ヒト動物を作製するためには、公知の遺伝子操作手段を用いて、染色体上のａｍｎ遺伝子を変異することにより行なうことができる。例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するａｍｎ遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、マーカー遺伝子で置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを非哺乳類動物に導入することにより作製される。ａｍｎ遺伝子変異は、遺伝子操作によりａｍｎ遺伝子の一部を欠失、置換、或いは付加により変異させて行なうことができる。
【００２３】
ハエ等へのベクターの導入は、公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、構築されたターゲッティングベクターをハエの単数又は複数の細胞、例えばハエの胚に導入することにより達成することができる。導入方法としては、電気穿孔法、マイクロインジェクション等公知の導入方法を用いることができる。
【００２４】
また、マウスのような非ヒト哺乳動物において、老人性記憶障害を発症するモデル非ヒト動物を作製するためには、その遺伝子の機能を染色体上で欠損させることにより作製することができる。例えば、マウス遺伝子ライブラリーから得られたＰＡＣＡＰ又はＧＨＲＨのような、ａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、マーカー遺伝子で置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後、胚幹細胞に導入し、ａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子の遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることにより作製される。
【００２５】
更に、具体的に示せば、ＰＡＣＡＰ又はＧＨＲＨのようなａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちホモ接合体変異マウス（−／−）は、例えば、マウス膵臓から構築したマウス遺伝子ライブラリー或いはＭＩＮ６細胞からＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、該遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた遺伝子の一部又は全部を、例えばｌａｃ−Ｚ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、必要に応じて、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲッティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｘ−ｇａｌによる染色あるいはＧ４１８やガンシクロビル（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００２６】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体変異マウス（＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体変異マウスをインタークロスさせることによって、ホモ接合体変異マウス（−／−）を得ることができる。そして、かかるホモ接合体変異マウスにＰＡＣＡＰ又はＧＨＲＨのような遺伝子が欠損しているかどうかを確認する方法としては、例えば、このマウスのＰＡＣＡＰ又はＧＨＲＨのような遺伝子の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００２７】
本発明における、老人性記憶障害の予防・治療薬のスクリーニングには、例えばショウジョウバエのような本発明の老人性記憶障害モデル非哺乳類動物、或いはマウスのような老人性記憶障害モデル非ヒト哺乳動物に、被検物質を投与し、該非哺乳類動物の記憶障害を測定・評価することにより老人性記憶障害の予防及び／又は治療薬のスクリーニングを行なうことができる。老人性記憶障害の予防・治療効果の測定には、例えば、ショウジョウバエのような場合には、被検物質を投与したハエを、臭い付け連合学習課題による学習記憶行動の変化等の解析を用いて測定・評価することができる。
【００２８】
本発明において、非哺乳類動物又は非ヒト哺乳動物の記憶障害の測定・評価は、中期記憶の障害としての測定・評価される。本発明において、本発明の老人性記憶障害モデル非ヒト動物を用いて老人性記憶障害予防及び／又は治療薬のスクリーニングを行なうに際して、老人性記憶障害モデル非哺乳類動物或いは非ヒト哺乳動物に、被検物質を投与し、評価する場合に、被検物質を投与し場合と、ａｍｎ遺伝子非変異型非哺乳類動物の場合又はａｍｎ遺伝子に相同性を有する遺伝子非変異型非ヒト哺乳動物の場合とを、比較・評価することが特に好ましい。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
［ハエを用いた記憶保持試験］
１．老齢ハエにおける記憶保持試験
後記する実験手順に従い老齢ハエにおける記憶保持について試験した。本発明者が行なう実験条件において、野生型ハエの平均寿命は、孵化後４８日間である。死亡率が１０％以下の死亡前プラトー段階（premortality plateau phase）には、最初の２２日間が含まれ、死亡率が９０％のときに測定した寿命の最高値は７４日間である（図１Ａ）。老齢ハエの嗅覚記憶保持について調べるため、まず、本発明者らは、生後１、１０、２０（死亡前プラトー段階の最後に近い方）、３０及び５０（平均寿命のあたり）日目のハエで１回の条件付けの後、０、１及び７時間記憶を調べた。本発明者は、生後１０日目のハエに最初に生じた、統計的に顕著であるが微かな０時間記憶の障害を認めた（図２Ａ）。しかしながら、この障害は、加齢の最中にそれ以上進行しなかった。本発明者は、すべての年齢のハエにおいて、７時間記憶の著しい変化を認めなかった（図２Ｃ、Ｆ［４、３９］＝２。３６、一元分散分析（一元分散分析によりＰ＞０．０５）。これに対し、生後２０日目のハエにおける１時間記憶は激しく障害され、さらなる加齢によりこの障害は悪化した（図２B）。
【００３１】
時間的な記憶保持の詳細について分析するため、本発明者は、生後１、１０、２０、３０及び５０日目のハエの記憶保持曲線（memory retention curves）を作製した。図２Dに示すように、生後２０日目のハエの記憶保持曲線は、生後１日目のａｍｎ変異体の曲線と類似しており、１時間記憶の減少が著しいが、０時間及び７時間記憶に対してはそれほどの減少を示さなかった。この類似性は、例えば生後５０日目のハエのように、より老齢なハエにおいて顕著になる。
【００３２】
ハエが、嗅覚の鋭さやショック反応などのタスク関連スキルを欠損している場合でも、学習及び記憶の明確な欠陥は、この匂い条件付け（olfactory conditioning）手順を用いることによって観察することができる。しかし、表１に示すように、生後１０日目のハエは、トレーニング及びテストに用いた匂い濃度（１０0）において正常な嗅覚回避を示し、また、１／１０倍の濃度（１０-1）においても同様であった。
【００３３】
【表１】
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同じように、かかる生後１０日目のハエは、匂い条件付けに用いた電位（６０V）において正常なショック反応を示し、より低い電位（２０V）においても同様であった。これらの結果は、生後１０日目のハエの０時間記憶におけるパフォーマンスの欠損が、提示された刺激の認知又は刺激に対する反応の減少によって説明できないことを明らかにしている。これに対して、生後２０日目のハエの場合は、正常なショック反応を示したにも関わらず、生後１日目のハエと比較して嗅覚回避の減少を示した。この観察は、嗅覚回避に対する年齢の影響に関する以前の研究（Exp. Gerontol 37,1347-1357,2002）の報告と一致している。しかしながら、生後２０日目のハエは、生後１０日目のハエと同一の０時間記憶スコアを有するため（パフォーマンス指標［ＰＩ］±ＳＥＭ＝生後１０目は７５±５、これに対し、生後２０日目は７３±６；各群につきＮ＝６）、生後２０日目のハエは匂いを正常に感知及び区別するが、それらに対する嫌悪反応が低いと考えられる。
【００３４】
同様に、生後３０日目及び生後５０日のハエが比較できる０時間記憶を有することから、これらのハエが正常に２つの異なる匂いを感知及び区別するが、加齢に伴い匂いの嫌悪性が変化することを示す。これらのことから、０時間記憶の結果やこれらの感覚運動解析から、生後２０日目以降のハエは、生後１０日目のハエと同様に、匂いの認知及びショックの関連を学習するための匂いの認知及びショック反応の能力を十分に有することが示唆される。したがって、これらのハエにおける１時間記憶の著しい減少は、記憶過程の加齢に関連した障害によるものであることが示される。
２．生後１０日目のハエの記憶獲得における微かな障害についての検証
後記実験手順により、生後１０日目のハエの記憶獲得における微かな障害について検証した。
【００３５】
図２Dに示すように、生後１０日目のハエは、０時間及び０．５時間記憶においては微かではあるが有意な減少を示すが、その後の記憶減衰は正常のようである。このことは、以前にｆａｓII変異体（Cell 105 ,757-768, 2001）について示されたように、生後１０日目のハエは、獲得においては微かな障害を有するが、その後の記憶過程は正常である。生後１０日目のハエにおける獲得についてより詳しく調べるために、本発明者は、トレーニングセッション内のＣＳ−ＵＳトライアルの数を変化させた（J. Neurosci. 20,  2944-2953,2000；Cell 105 ,757-768, 2001；J. Comp. Physiol. [A] 157,263-277,  1985）。生後１日目及び生後１０日目のハエの両方において、０時間記憶はトレーニングトライアルの数の関数として徐々に増大し、生後１０日目のハエの０時間記憶は生後１日目のハエ同数のトライアルで少し低い値をとる（図３Ａ）。
【００３６】
したがって、生後１０日目のハエの０時間記憶のスコアーは、トレーニングトライアルの数を増加させることにより、生後１日目のハエと同じに設定することができる。生後１日目のハエに６回のトライアル、生後１０日目のハエに８回のトライアル行ってトレーニングすることにより、本発明者らは、両方の群より同じスコアーの０時間記憶を得ることができた。これらの条件下では、生後１日目及び生後１０日目のハエの記憶保持曲線は区別不可能であった（図３Ｂ）。生後１日目のハエ及び生後１０日目のハエにそれぞれ４回及び６回のトライアルを行ってトレーニングし、０時間記憶を正常にしたときについても同一の結果が得られた（データに図示せず）。したがって、ｆａｓII変異体について報告されているように、これらの結果は、生後１０日目のハエでは獲得が微かに障害されるが、その後の記憶過程は正常であることを確認した。
３．老齢ハエとａｍｎ変異体との記憶統合差異
後記実験手順により、老齢ハエとａｍｎ変異体との記憶統合の差異について検証した。
【００３７】
最初に生後２０日目で生じる１時間記憶の著しい低下は、更なる加齢に伴い進行する（生後２０日目対生後５０日目におけるＰＩのｔ−検定によりＰ＜０．０１）。この結果により、この障害がＡＭＩにとって重大である疑いがあったことから、本発明者は、更なる特徴づけを行なうことにした。また、老齢ハエとａｍｎ変異体との間の時間的な記憶保持における特徴的な類似性から、本発明者は、それらの類似性をさらに検証したいと考えた。
【００３８】
１時間記憶は、２つの成分に分けることができる。すなわち、ＳＴＭ及びＭＴＭからなる麻酔感受性記憶成分（ＡＳＭ）及び麻酔耐性（ＡＲＭ）である。その他の生物と同様に、ハエは、新たに形成した記憶が最初は不安定であり、amnesia記憶障害誘導処理、例えば寒冷ショックによる麻酔などにより破壊させることができる。この最初の不安定なＡＳＭは、最終的にはより安定した、寒冷ショック耐性のＡＲＭに統合される。野生型ハエにおいては、ＡＲＭは、トレーニング後の最初の２時間で徐々に形成され最高値に到達する。このとき、同時にＡＳＭの減少が生じる。トレーニング後１時間と２時間との間に存在するＡＳＭの主要構成成分であるＭＴＭは、ａｍｎ変異体において欠損していると以前に報告されている（Cold Spring Harb Symp . Quant.Bio. 55,203-211,1990）。したがって、本発明者は、老齢ハエに存在する１時間記憶の欠損が、麻酔感受性ＭＴＭか又はＡＲＭの欠損からなるのかを決定しようと考えた。
【００３９】
ＡＲＭは、「逆行性健忘実験（retrograde amnesia experiments）」により直接測定することが可能である。かかる実験では、１回の条件付け後、ハエに異なる時間で１０分間の寒冷ショックを与え条件付け３時間後の記憶を定量化する（Proc. Natl. Acad.ＦｏｌｋｅｒｓSci.USA 90,8123-8127,1993 ;Nature 262 ,576-577,1976;Cell 79,35-47,1994; Cold Spring Harb Symp . Quant.Bio. 55,203-211,1990）。寒冷ショックをトレーニング直後の時点で与えると、記憶は重度に障害される。なぜなら、この時点の記憶のほとんどがＡＳＭだからである。その結果として、３時間記憶は低い。しかしながら、条件付けと寒冷ショックとの間の時間間隔が増大すると、ＡＳＭからＡＲＭへの時間依存的統合を反映して、記憶はより寒冷ショックに対して耐性を示すようになる。したがって、時間がより経過してから寒冷ショックが投与されるに従って３時間記憶は増加し、トレーニング後の２時間以内に漸近の最大値に到達する（図４Ｂ参照のこと）。「逆行性健忘実験」において、本発明者らは、若齢（生後１日目）及び老齢（生後２０日目）の野生型ハエ並びに若齢（生後１日目）ａｍｎ変異体のＡＲＭ形成について比較した。
【００４０】
図４Ａに示されるように、若齢野生型ハエにおいて、寒冷ショックを与えていない３時間記憶のスコアー（ＰＩ）は、約４５である。トレーニングから２時間後に寒冷ショックを与えると、ＡＲＭは、正常な３時間記憶の６０％であるＰＩ２７の漸近のスコアーに達した。ａｍｎ28A変異体においては、ＡＲＭの最高値は、若齢野生型ハエのＡＲＭの最高値と同じであった。しかしながら、寒冷ショックを与えない場合の記憶は、寒冷ショックを与えた場合の３時間記憶と同じままであった。このことは、トレーニング３時間後に存在するＡＳＭの主な記憶成分がａｍｎ依存性のＭＴＭからなることを示す。生後２０日目の野生型ハエは、ＡＲＭの最高値が若齢野生型ハエと同じままであって麻酔感受性のａｍｎ依存ＭＴＭが欠如している（寒冷ショックを与えた３時間記憶と寒冷ショックを与えない３時間記憶の間に差がない）という点で、ａｍｎ28A変異体と同じである。
【００４１】
次に、本発明者らは、生後１日目、生後２０日目及びａｍｎ28A変異体のＡＲＭ形成過程を比較した。これらすべてのハエの間でＡＲＭの最高値に差は認められなかったが、トレーニング後２０分、３０分及び１時間のＡＲＭにおいては、生後１日目の野生型ハエよりもａｍｎ変異体の方が著しく低かった（ｔ−検定によりＰ＜０．０５、図４Ｂ）。重要なことに、これらの時点におけるより、低いＡＲＭスコアは、生後２０日目の野生型ハエにも認められた。また、生後２０日目の野生型ハエ及びａｍｎ変異体におけるＡＲＭ形成をプロットする曲線は、区別不可能であった。したがって、ａｍｎ変異体又は加齢ハエのいずれもＡＲＭの最高値を変化させないが、それらは均しくＡＲＭ形成の速度を低下させ、ＡＭＩとａｍｎ依存記憶の低下との関連を示唆している。
【００４２】
ａｍｎ変異体及び老齢野生型ハエにおいても強いＡＲＭが形成されるという観察は、ＡＲＭが、遅い動態にもかかわらず、ＭＴＭが欠如していても生成されることを示唆している。さらに、ＭＴＭがＡＲＭ形成を促進する間に、ＡＲＭは、ＳＴＭなどの早い段階の記憶成分から生成される可能性を示唆している。
４．記憶変異体を用いたＡＭＩの行動遺伝学的解析
記憶変異体を用いてＡＭＩの行動遺伝学的解析を行なった。
【００４３】
老齢野生型ハエとａｍｎ変異体との間の記憶パフォーマンスが極度に類似していたため、本発明者は、加齢によりａｍｎ依存の記憶が特異的に阻害されると仮定した。この仮定が正しければ、ａｍｎ変異体は、加齢による記憶の障害をこれ以上示さないはずである。その一方で、他の、ａｍｎ非依存性の記憶成分がＡＭＩに寄与する場合、ａｍｎ変異体もＡＭＩ効果を示すはずである。したがって、本発明者は、各種記憶変異体の若齢及び老齢期における１時間記憶を比較した。
【００４４】
図５Ａに示すように、linotte（ｌｉｏ1）変異体は、加齢に伴いさらに１時間記憶の減少を示す。同様に、volado（ｖｏｌ2）及びlatheo（ｌａｔｐ1）も、１時間記憶の減少、すなわち正常なＡＭＩを示した。これらの変異体に見られるＡＭＩは、野生型対照ハエに見られるのと定量的に同様の記憶減少を示した（生後１日目のハエと生後２０日目のハエとのＰＩスコアの差は、約２５である）。
【００４５】
一方、老齢ａｍｎ変異体の１時間記憶（ａｍｎ28A、ａｍｎx8及びａｍｎ1）は、生後５０日目でも若齢ａｍｎ変異体との間で顕著な差は見られなかった。注目すべきことに、生後１日目のａｍｎとｌａｔ変異体は、同程度の１時間記憶を有しながら、生後２０日目のｌａｔは顕著なＡＭＩを示したが、ａｍｎ変異体は示さなかった。また、ａｍｎに加えて、本発明者らは、rutabaga（ｒｕｔ1）変異体の生後１日目及び生後２０日目の間でＰＩスコアに有意な差を認めることができなかった。しかしながら、生後１日目のｒｕｔ1における１時間記憶はＡＭＩの振幅よりも低いため、本発明者は、ｒｕｔ変異体にＡＭＩが欠如しているかどうかについての結論は得られなかった。
【００４６】
ａｍｎ変異体におけるＡＭＩの欠如をさらに特徴づけるため、本発明者は、生後１０日目、２０日目及び５０日目のａｍｎ変異体の記憶保持曲線を作製した。図５Ｂに示すように、これらの曲線は区別不可能であり、加齢により障害された記憶成分がａｍｎ変異体で欠損していることを示唆する。重要なことに、ａｍｎ28Aプロモーター制御下（ａｍｎ２８Ａ；ｕａｓ−ａｍｎ+）と同様に、ａｍｎ+導入遺伝子を主にＤＰＭ細胞中に発現させると（ａｍｎx8；ｃ３１６／ｕａｓ−ａｍｎ+、ａｍｎ1；ｃ３１６／ｕａｓ−ａｍｎ+）、ＡＭＩは、ａｍｎ変異体において回復した（図６）。ａｍｎ28A変異は、ａｍｎ遺伝子転写開始部位付近のＰ−ＧＡＬ４因子の挿入によるものであり（J. Neurosci.19,8740-8746,1999;Cell 93,997-1007,1998）、ａｍｎプロモーター制御下で転写因子ＧＡＬ４発現が生じる。したがって、ａｍｎ+導入遺伝子は、ａｍｎ遺伝子産物を正常に発現する領域で発現する。これらのことから、本発明者の得られた結果は、ＡＭＩが、ａｍｎ依存性の記憶成分が特異的に阻害されることによって起こるという強い証拠を提供した。
５．ＤＰＭ細胞の形態及び老齢ハエのａｍｎ発現
ＤＰＭ細胞の形態と老齢ハエのａｍｎ発現の関係について試験した。ａｍｎ変異体におけるＡＭＩの欠如により、本発明者は、ＤＰＭ細胞の加齢の最中の形態学的変化を調べようと考えた。なぜなら、ａｍｎ遺伝子産物は、主にこれらの細胞中で発現するからである（Cell 103,805-813,2000）。ＤＰＭ細胞が年齢関連性細胞死に対して異常に感受性が高い場合、それらは加齢の際に選択的に欠損する可能性があり、結果的にＡＭＩが生じる。しかしながら、ＤＰＭ細胞におけるｍＣＤ８−ＧＦＰの発現（ｃ３１６−Ｇａｌ４ドライバーラインを使用）は、ＤＰＭ細胞が加齢に伴い著しく増殖したことを示す（図７Ａ及び７Ｂ、それぞれＮ＝９及び１５）。これまでの報告（Cell 103,805-813,2000）と一致して、生後２日目（若齢）及び生後２０日目（老齢）のハエから得た脳の共焦点画像のスタックから与えられる容量（volume rendering from stacks of confocal images）は、ＤＰＭ細胞が、同側ＭＢのすべての葉を神経支配するが腎杯又は脚は神経支配しないことを示す。
【００４７】
老齢ハエにおいては、ＤＰＭ細胞は若齢ハエより顕著な分枝を有し、ＭＢ葉の大きさが増大した。ＭＢに投射するＤＰＭ細胞のシナプス前終末の特徴は、ＧＦＰに融合したシナプス前小胞タンパクシナプトブレビン、ｎ−ｓｙｂ−ＧＦＰをレポーターとして用いることによっても証明された（Learn Mem. 5,52-77,1998）。本発明者らは、若齢ハエ（図７Ｃ、Ｎ＝９）よりもむしろ老齢ハエ（図７Ｄ、Ｎ＝５）のＭＢ葉においてｎ−ｓｙｂ−ＧＦＰが高く発現することを見い出し、ＤＰＭ細胞とＭＢ細胞との間のシナプス結合（connection）が、ハエの加齢に従って増大することを示唆した。ＤＰＭ細胞は消失していないため、本発明者は次に、ａｍｎ遺伝子発現が加齢により減少するかどうかを調べた。この可能性について調べるため、本発明者らは、生後１日目のハエと生後２０日目のハエとの間のａｍｎ転写物の発現を比較し、ＤＰＭ細胞におけるａｍｎ導入遺伝子の過剰発現がＡＭＩを抑制するかどうかを調べた。
【００４８】
しかしながら、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果、若齢ハエと老齢ハエとの間でａｍｎ遺伝子の発現に顕著な差は認めれなかった（図７Ｅ）。また、ＤＰＭ細胞中でａｍｎ遺伝子が過剰発現したｃ３１６−Ｇａｌ４／ｕａｓ−ａｍｎ+トランスジェニックハエでは、正常なＡＭＩが起こった（図７Ｆ）。これらの結果は、ａｍｎ変異体で阻害された記憶経路がＡＭＩにとって重大であるが、おそらく、ＡＭＩを起こすのは、ａｍｎ遺伝子自体の発現における変化が原因とは考えられない。したがって、ａｍｎは、ＡＭＩに関与する記憶経路に必要ではあるが、それ自体の発現変化がＡＭＩを引き起こすのではない。
［実験的考察］
ショウジョウバエは、遺伝学研究のための最適なモデルとして知られているが、ＡＭＩのためには十分な研究が行なわれていない。以前の研究では、キヌレニン経路の変異体において、加齢により、求愛学習に重大な衰退が認められた。しかしながら、このような衰退は野生型ハエでは認められなかった（J. Neural.Transm. 107,581-601,2000;RossFiziol. Zh. I.M.Sechenova. 85,167-183,1999）。本試験において、本発明者は、パブロフ型嗅覚記憶においては、野生型ハエの有意なＡＭＩを観察した。最初に、生後１０日目のハエでは条件付け直後の記憶に微かな障害が生じる。しかしながら、この障害は微かなものであり、加齢によりそれ以上増加しないため、ＡＭＩに対して少ない寄与を示唆する（図２Ａ）。一方、生後２０日目以降のハエの１時間記憶の障害は、より重大である（図２Ｂ）。記憶保持の時間的動態及び規模において、このような障害は、ａｍｎ変異体で見られる障害と同様であり（図２Ｄ）、ＡＭＩとａｍｎ依存記憶成分との関連を示唆している。
【００４９】
生後１日目のａｍｎ変異体は既に老齢ハエと似ているため、ａｍｎ変異体が早老である可能性がある。しかしながら、本発明者は、ａｍｎ変異体で平均寿命の短縮を観察しておらず、むしろ寿命の延長を観察した。ａｍｎ変異体と老齢ハエとの間の記憶行動の類似及びａｍｎハエにおけるＡＭＩの欠如（図５）を考えると、ＡＭＩは、加齢に伴う記憶課程の全般的な障害でも非特異的な障害でもなく、むしろ極めて特異的なａｍｎ依存性の記憶成分の障害である。このａｍｎ依存記憶成分は、ＭＴＭとして分類されている（Trends Neurosci.18,212-218,1995;Annu. Rev. Neurosci. 21,407-444,1998;Learn Mem.2,320-333,1996）。
【００５０】
ＡＭＩの他の解釈として挙げられるのは、加齢により注意力や感覚認知が低下して、条件付けによる学習ができないという可能性がＡＭＩの他の解釈として挙げられる。
【００５１】
実際に、生後２０日目のハエは、以前に報告（Exp. Gerontol. 37,1347-1357,2002）されているように、匂いの回避の減少を示す。しかしながら、生後２０日目以降のハエは、正常な匂い回避及びショック反応を有する生後１０日目のハエと同程度の０時間記憶を示した（図２Ａ）。また、加齢は、運動活性にも影響を与える可能性がある（Exp.  Gerontol.37,1347-1357,2002）。しかしながら、生後５０日目までのハエのショック回避は正常であった。これらの観察は、生後２０日目以降のハエがこのパブロフ型条件付けを実行するための記銘力の状態、感覚認知及び運動活性を十分に維持していることを示唆する。
【００５２】
ａｍｎ遺伝子産物は、ＤＰＭ細胞において有意に発現するため、ＤＰＭ細胞が加齢に伴い変性し、結果的にＡＭＩが生じる可能性もあった。しかしながら、図７に示すように、本発明者は、変性よりもむしろＤＰＭ終末の有意な増加を確認した。興味深いことに、加齢の際のＤＰＭ終末の増加にも関わらず、本発明者は、ａｍｎ発現の有意な増加を観察しなかった。ＤＰＭ終末の増加により各シナプスあたりのａｍｎ遺伝子産物の量が減少するのであれば、ａｍｎ導入遺伝子の過剰発現がＡＭＩを改善する可能性もある。しかしながら、本発明者は、野生型（データに図示せず）において、ＤＰＭ細胞（ｃ３１６−ＧＡＬ４により誘発される（driven by））又は全神経細胞（ｅｌａｖ−ＧＡＬ４により誘発される（driven by））でａｍｎ導入遺伝子を過剰発現させてもＡＭＩを逆戻りさせることはできなかった。したがって、ａｍｎそれ自体の発現の変化がＡＭＩの原因である可能性は低く、ＡＭＩに応答性であるのはむしろａｍｎ下流のｃＡＭＰシグナル伝達の変性と考えられる。
【００５３】
本発明者は、ＡＭＩがｒｕｔ−アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の変異体において欠如しているのかどうかを結論づけることはできなかったが、本研究の結果は、ＡＭＩにおけるｃＡＭＰシグナル伝達の重要性を示唆している。なぜなら、ａｍｎ遺伝子は、ＡＣを介して効果を発揮するＰＡＣＡＰと配列の相同性を有する推定上のペプチドをコードするからである（Nature 375,588-592,1995）。この可能性を裏付けるように、老齢げっ歯類では、ＡＭＩがｃＡＭＰシグナル伝達を促進する薬剤により改善する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,5280-5285
,1999; Proc. Natl. Acad. Sci. USA  95,15020-15025,1998）。ｒｕｔ−ＡＣの発現は、正常な嗅覚記憶のためにＭＢで特異的に必要とされており（Science 288,672-675,2000）、３時間までの嗅覚記憶を想起（retrieve）するためにはＭＢ（ＭＢ葉）からのシナプス出力（output）が必要である（Nature 411 ,476-480,2001;Science 293,1330-1333,2001;Neuron 35,951-960,2002）。
【００５４】
したがって、１つの説明として、ＤＰＭ細胞終末（cell terminals）から放出されるＰＡＣＡＰ様ペプチドが、嗅覚記憶を処理するため、ＭＢ葉におけるｒｕｔ−ＡＣ活性を延長する可能性が挙げられる。一方、ＤＰＭ細胞でａｍｎ+導入遺伝子を発現させることにより、野生型と定量的に同様のＡＭＩをａｍｎ変異体で回復させることができた。これらのことから、本発明者は、ｃＡＭＰを介したＤＰＭ細胞及びＭＢ葉の間のシグナル伝達がａｍｎ依存性のＭＴＭの形成に重要であり、このシグナル伝達が、生後２０日目で減衰し、ＡＭＩを導くこの仮説を立てた。
【００５５】
ショウジョウバエの状態と同様に、哺乳類ににおけるａｍｎ遺伝子産物の推定上の相同体であるＰＡＣＡＰは、げっ歯類における記憶保持にとって重要であることが確認されている。ＰＡＣＡＰ受容体を欠如したマウスは、１トライアルの恐怖条件付けに対して正常な学習（０時間記憶）を示したが、記憶の減衰は異常に急速であった（Brain Res. Mol. Brain Res 84,79-89,2000;Neurobiol. Learn Mem. 76,1-6,2001）。また、受動的回避タスクの獲得直後のＰＡＣＡＰ−３８の投与は、ラットの記憶保持を改善する（Neurobiol. Learn Mem. 76,1-6,2001）。げっ歯類モデルの場合、生後約１０〜１２ヶ月で激しい記憶減衰が生じる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA  96,5280-5285,1999;Neurobiol. Aging 16,149-160,1995）。げっ歯類の平均寿命を考えれば、生後１０〜１２ヶ月は、ハエにおける生後２０日目とおおよそ同じである。したがって、本発明者らが見い出したものは、哺乳類系においても保存されていることを示唆し、ＰＡＣＡＰ受容体を欠如したマウス変異体がＡＭＩの欠如を示すかどうかを調べることは大変興味のあるものである。
［実験手順］
この実施例における試験は、以下の実験手順に従った。
（ハエの系統及び飼育条件）
この試験において、シヨウジョウバエにおけるｖｏｌ1以外の各変異体がｗ1118の親系統由来であったため、Cantonized ｗ1118系統である、ｗ（ＣＳ１０）（J.Neurogenet 9,1-14,1993）を野生型対照として用いた。ｖｏｌ1は、ｒｙ506由来のものである。全てのハエ系統は２２±２℃及び６０±１０％の湿度で１２−１２時間の明暗サイクルで維持した。約５０匹のハエ（行動を分析するため）又は２０匹のハエ（寿命を測定するため）をフードバイアルで飼育し、２、３日おきに新鮮なフードバイアルに移した。全ての行動分析は、規定の環境の部屋で行い、赤色の照明の下で６０％の湿度、２５℃で匂い条件付けを行った。
（行動分析）
１．パブロフ型匂い条件づけ
文献（Tully and Quinn, 1985）記載の通りに、標準的な単一サイクルトレーニングに修正を加えて行った。約１００匹のハエに対して条件刺激（ＣＳ）として、順次２つの嫌悪的な匂い（３−オクタノール[ＯＣＴ]又は４−メチルシクロヘキサノール[ＭＣＨ]）を６０秒嗅がせ、各匂いを嗅がせた後に４５秒間のインターバルを与えた。最初のＣＳ＋匂い（ＯＣＴ又はＭＣＨのいずれか）への露出中、ハエに無条件刺激（UＳ）として、６０Ｖ、１．５秒間のＤＣ電気ショックパルスを３秒毎に与えた。記憶保持について調べるため、トレーニングしたハエをＴ型の迷路の中央に集め、そこでＣＳ＋（電気ショック有り）及びＣＳ−（電気ショック無し）に同時に露出した。以前に文献（Cell 79,35-47,1994）に記載されたように、ＣＳ＋とＣＳ−でハエが５０：５０（記憶なし）に分布するとＰＩ記憶スコアがゼロ、０：１００の分配でＣＳ＋を避けて分布すればＰＩが１００となる。
２．記憶獲得テスト
以前の研究（J.Neurosci. 20,2944-2953,2000;Cell 105, 757-768,2001）に従い、いくつかの修正を加えた短期プログラムのトレーニングを行なった。１つのトレーニングトライアルにおいて、ハエにＣＳ＋を５秒間と、ＣＳ+の発生から３．５秒間遅れて、１回の１．５秒間の電気ショックを与えた。３０秒間のインターバル後、かかるハエに電気ショックを与えないＣＳ−を嗅がせた。複数のトレーニングトライアルについては、トライアル間のインターバルは３０秒であった。
３．記憶統合テスト
寒冷ショックによる逆行性健忘実験を、文献（Cold Spring  Harb Symp.Quant. Bio. 55,203-211,1990;Cell 79,35-47,1994）記載の通りに行なった。単一サイクルトレーニング後の様々な時間で異なる群のハエを、ガラス製の試験管に移し、かかる試験管を氷水に浸すことにより、１０分間の寒冷ショック麻痺を与えた。寒冷ショック処理後、保持インターバルの間にかかるハエをフードバイアルに戻した。各群についてトレーニング後３時間の記憶を測定した。
４．ＤＰＭ神経細胞の形態学
Chiang ら（J. Comp. Neurol.440,1-11,2001）の方法に修正を少し加え、ハエ脳のwhole mount調製及び共焦点画像処理を行なった。簡潔に、切開した脳をＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで２時間固定し、真空槽中の０．２５％のトリトンＸ１００を含むＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで再び、さらに２時間固定した。固定した組織にFocus ClearTM（Pacgen社製）を１滴加えて透明にし、MountClearTM（Pacgen社製）で包埋した。４０Ｘ  Ｃ−アポクロマート水浸漬対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．２）を使用して、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡（Carl Zeiss社製）を用いてwhole mount脳を画像処理した。Amira 2.3（TGS社製）の「votex」モジュールを用いて容量rendering及び容量画像の回転を行った。
５．半定量ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡのうち５μｇを、２５ｐｍｏｌのランダムな６塩基ヌクレオチド鎖を用いてＲＴ反応を行った。テンプレート濃縮に対する線形状の反応を得るため、使用したＲＴ産物は１／３０００〜１／１２５に調整し、ＰＣＲのサイクル数は２５〜３３サイクルで調整した。両方向のａｍｎ（フォワード５’−ＡＴＧＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧ−３’及びリバース５’−ＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＧＣＧＧＴ−３’）及び対照のＧＡＰＤＨ１（フォワード５’−ＧＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＧ−３’及びリバース５’−ＣＣＣＴＴＧＣＧＧＡＴＴＡＴＧＣＡＡＣＡ−３’）のプライマーセットで、線形反応を、ＲＴ産物容量１／７５０及び３０サイクルで得た。したがって、ＲＴ産物の１／７５０容量及び３０サイクルを用いて、ａｍｎ又はＧＡＰＤＨ１プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行なった。
［表及び図面の説明］
（表１  老齢ハエにおける嫌悪的な嗅覚回避及びショック反応）
嗅覚の回避
各群につき、Ｎ＝８〜１２。全てのスコアは、平均値Ｐｌｓ±ＳＥＭで表した。**生後１日目のハエとは統計学的に異なる（ｔ−検定によりＰ＜０．０１）。匂い条件づけに用いた濃度は、＃１０0である。
（図１．  野生型ショウジョウバエの寿命）
生存率曲線（Ａ）及び死亡率の頻度ヒストグラム（Ｂ）は、Ｎ＝４８３匹のハエから得た。平均寿命は生後４８日間、死亡前プラトー段階（死亡率が１０％以下生じる）は生後２２日間、死亡率の最高値（死亡率が９０％以上生じる）は生後７４日間である。
（図２．  記憶保持における年齢関連性変化）
０時間（Ａ）、１時間（Ｂ）及び７時間（Ｃ）記憶の加齢による変化。生後１０日目のハエに生じた０時間記憶の微かな障害は、（Ａ）加齢によりそれ以上進行しなかった。（Ｂ）一方、生後２０日目のハエに認められた１時間記憶の障害は、加齢に伴ない増大した。生後５０日目のハエの１時間記憶のＰＩスコアは、生後２０日目のハエのスコアと比較して著しく低かった（ｔ-検定によりＰ＜０．０１）。（Ｃ）加齢による、７時間記憶の顕著な変化は認められなかった。（Ｄ）は、記憶保持曲線の加齢による変化を表す。生後２０日目及びそれ以降の野生型ハエの記憶保持曲線は、ａｍｎ変異体において観察された結果と同様のものであった。即ち０時間及び７時間記憶への影響は最小であったが、それらの時点の間の記憶は著しく障害されている。全ての群において、Ｎ＝６〜１４である。本論文における全ての図のエラーバーは、ＳＥＭを示す。**は、ｔ−検定を用いた生後１日目のハエと比較した場合のＰ＜０．００１を示す。
（図３．生後１０日目のハエの、記憶獲得障害）
（Ａ）生後１日目及び生後１０日目のハエを、「短期プログラムトレーニング」内のＣＳ−ＵＳトライアルのさまざまな数（１〜１２）でトレーニングし、最終トライアル直後にテスト（０時間記憶）を行った。生後１日目及び生後１０日目のハエにおいて０時間記憶は大幅に増大したが、生後１０日目のハエは、生後１日目のハエと比較して、「短期プログラムトレーニング」より低い０時間記憶を示した（全群において、Ｎ＝６〜１２）。（Ｂ）生後１０日目のハエ及び生後１日目のハエをそれぞれ８回及び６回のトライアルを行うことにより生後１０日目のハエの０時間記憶を生後１日目の記憶と同程度に設定したとき、生後１０日目のハエ及び生後１日目のハエの記憶保持曲線は区別不可能であった（全群において、Ｎ＝６〜１２）。
（図４．老齢ハエにおける記憶の固定と、ａｍｎ変異体の関係）
単一のサイクルトレーニング（黒色矢印）の後、ハエに寒冷ショック感覚消失を０、１０、２０、３０、６０又は１２０分後に(寒冷ショックの時間、薄い青色の矢印)施し、３時間記憶を測定した（白色の矢印）。３時間記憶は、寒冷ショックを後の時点で与えると増大し、トレーニング後２時間以内に漸近的な最高値に達する（Ｂを参照）。（Ａ）ＡＲＭの最高値（トレーニング後２時間で寒冷ショック）は、若齢（生後１日目）のハエと老齢（生後２０日目）のハエ並びにａｍｎ（生後１日目）変異体との間で変化はなかった（一元分散分析により、Ｆ[２、１５]＝３．１８、Ｐ＞０．０５）。若齢ハエにおいて、寒冷ショックを与えない３時間記憶は、寒冷ショックを与えた場合と比較して著しく高く、老齢及びａｍｎハエに欠如している感覚消失感受性ＭＴＭの存在を示唆する（ｔ−検定により、若齢ハエは、Ｐ＜０．０１、老齢及びａｍｎハエは、Ｐ＞０．０５）。（Ｂ）若齢（生後1日目）、老齢（生後２０日目）及びａｍｎ（生後１日目）のハエにおけるＡＲＭの形成過程。（全群において、Ｎ＝６〜８）。
（図５．ａｍｎ変異体におけるＡＭＩの欠如）
（Ａ）ｌｉｏ1、ｖｏｌ2、ｌａｔP1、ｒｕｔ1、ａｍｎ28A、ａｍｎX8及びａｍｎ1変異体における１時間記憶の加齢に伴う変化。他の記憶変異体と比較して、１時間記憶は、ａｍｎ変異体では生後５０日目でも加齢に伴なう変化はない。（Ｂ）生後１日目、生後２０日目及び生後５０日目のａｍｎ28A変異体の記憶保持曲線。これらの群の間では、記憶保持の顕著な変化はない。（全群において、Ｎ＝６〜１２、**Ｐ＜０．００２、***Ｐ＜０．００１）。
（図６．ａｍｎ変異体におけるＡＭＩの回復）
ａｍｎ+導入遺伝子を、ａｍｎ28Aプロモーターの制御下で導入すると、ａｍｎ28A変異体でＡＭＩは回復した（ａｍｎ28A；ｕａｓ−ａｍｎ+）。ａｍｎ28A変異は、ａｍｎ遺伝子転写開始部位付近のＰ｛ＧＡＬ４｝因子の挿入によるものである（J. Neurosci. 19,8740-8746,1999;Cell 93,997-1007,1998）。同様に、ｃ３１６−ＧＡＬ４ドライバーによりＤＰＭ細胞中でａｍｎ+導入遺伝子が発現しても、ＡＭＩは回復した（ａｍｎX8；ｃ３１６／ｕａｓ−ａｍｎ+及びａｍｎ1；ｃ３１６／ｕａｓ−ａｍｎ+）。ｕａｓ−ａｍｎ+導入遺伝子（ａｍｎX8；ｕａｓ−ａｍｎ+及びａｍｎ1；ｕａｓ−ａｍｎ+）又はｃ３１６−ＧＡＬ４ドライバー単独（ａｍｎX8；ｃ３１６及びａｍｎ1；ｃ３１６）では、ＡＭＩに影響を与えない。（全群において、Ｎ＝６〜８、**Ｐ＜０．０１）。
（図７．ＤＰＭ細胞の形態及び老齢ハエにおけるａｍｎ遺伝子の発現）
（Ａ〜Ｄ）加齢の際のＤＰＭ細胞における形態学的変化を示す共焦点画像。（Ａ及びＢ）若齢及び老齢野生型ハエにおけるＤＰＭ細胞の全体的な形態。ＤＰＭ細胞におけるｍＣＤ８−ＧＦＰレポーター発現の共焦点画像のスタックより得た容量rendering画像（ｃ３１６−ＧＡＬ４により誘発される（driven by））。矢頭は、ＤＰＭ細胞の細胞体を示す。老齢（生後２０日目、Ｂ）ハエは、若齢（生後２日目、Ａ）ハエよりもＭＢ葉へのより広範な分枝を示す。（Ｃ及びＤ）ＤＰＭ神経細胞における神経シナプトブレビン−ＧＦＰレポーター発現を示す、ＭＢ葉の単一の共焦点切片。スケールバー＝５０μｍ。（Ｅ）ａｍｎ遺伝子発現における年齢依存的変化。半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を行なった結果、加齢に伴なうａｍｎ遺伝子発現の顕著な変化は見られなかった。（Ｆ）ＤＰＭ神経細胞におけるａｍｎ＋導入遺伝子の過剰発現は、野生型バックグラウンドにおいては、ＡＭＩを抑制しなかった。ｃ３１６−Ｇａｌ４／ｕａｓ−ａｍｎ+トランスジェニックハエは、野生型の対照と比較した場合、１時間保持において同様の著しい減少を示した（ｔ−検定によりＰ＜０．０１、Ｎ＝６〜８）。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の実施例の試験において、野生型ショウジョウバエの寿命についての生存率曲線（Ａ）及び死亡率の頻度ヒストグラム（Ｂ）を示す図である。
【図２】本発明の実施例の試験において、記憶保持における年齢関連性変化について、（Ａ）〜（Ｃ）は所定時間記憶における年齢関連性変化を、（Ｄ）は記憶保持曲線における年齢関連性変化を示す図である。
【図３】本発明の実施例の試験において、（Ａ）は生後１日目及び生後１０日目のハエを、トレーニングセッション内のＣＳ−ＵＳトライアルのさまざまな数（１〜１２）でトレーニングし、最終トライアル直後にテスト（０時間記憶）を行った結果を、（Ｂ）は生後１０日目のハエ及び生後１日目のハエをそれぞれ８回及び６回のトライアルを行うことにより生後１０日目のハエの０時間記憶を生後１日目の記憶と同程度に設定した結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例の試験において、老齢ハエにおける記憶の統合と、ａｍｎ変異体の関係について、単一のサイクルトレーニングの後、ハエに寒冷ショック感覚消失を施し、３時間記憶について分析した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例の試験において、ａｍｎ変異体におけるＡＭＩの欠如について、ｌｉｏ1、ｖｏｌ2、ｌａｔP1、ｒｕｔ1、ａｍｎ28A、ａｍｎX8及びａｍｎ1変異体における１時間記憶の年齢関連性変化を示す図である。
【図６】本発明の実施例の試験において、ａｍｎ変異体におけるＡＭＩの回復について、ａｍｎ+導入遺伝子を、ａｍｎ28Aプロモーターの制御下で導入した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例の試験において、ＤＰＭ細胞の形態及び老齢ハエにおけるａｍｎ遺伝子の発現について、（Ａ〜Ｄ）は加齢の際のＤＰＭ細胞における形態学的変化を示す共焦点画像を、（Ｅ）はａｍｎ遺伝子発現における年齢依存的変化を、（Ｆ）はＤＰＭ神経細胞におけるａｍｎ＋導入遺伝子の過剰発現の状況を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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