(57)【要約】【課題】ホヤの発生段階において発現する新規遺伝子群、及びその利用方法を提供する。【解決手段】本発明に係る新規遺伝子群は、カタユウレイボヤから単離された遺伝子群であって、ホヤの発生段階において発現する新規遺伝子群である。これらホヤ由来の新規遺伝子群は、脊索動物及び脊椎動物の発生機構の解明に有用である。さらに、上記発生機構についての研究を通じて、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、そのような疾患の診断法及び治療法の開発に、本発明は有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、ホヤの発生段階において発現する遺伝子。
【請求項２】
１以上９０４５以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列中のオープンリーディングフレーム領域を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号９０４７から９２０４のいずれかに示される塩基配列を有し、ホヤの発生段階において発現する遺伝子。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列又はその相補配列を、プローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項５】
２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において発現するタンパク質。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項８】
請求項５に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホヤの発生段階において発現する新規遺伝子群、及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、生物の発生についての研究が急速に進んでおり、種々の生物材料がその研究に使用されている。また、分子生物学の発展にともない、生物の発生についての研究は、現在、主として遺伝子を解析することにより行われる。そのような遺伝子の解析のうち、とりわけ、ヒトなどの脊椎動物とホヤなどの尾索動物とを含む脊索動物の発生段階において発現する遺伝子を解析することは、単に発生のメカニズムの解明のみならず、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムの解明にも資するものである。上記のような解析により得られた知見は、医学上及び産業上への応用も期待されている。具体的には、発生段階の異常に起因する遺伝子疾患の発症メカニズムの解明や、その診断法及び治療法の開発などに貢献することが期待されている。さらに、上記遺伝子のうち、発生段階において特異的に発現する遺伝子は、例えば発生段階における分化・誘導に影響を与えるなどのように、発生段階において重要な役割を担う遺伝子であると考えられる。
【０００３】
ところで、生物の発生についての研究対象となっている生物の１つにホヤが挙げられる。ホヤは、世界中の海に広く分布しており、岩やブイに付着して生活する生物である。ホヤの成体は、入水口及び出水口という２つの開口部を有している。この開口部を通過する海水から、ホヤは栄養物を濾過摂食する。ホヤは、すべて雌雄同体であり、ホヤの受精卵は、比較的短時間に胞胚、嚢胚、神経胚、尾芽胚を経て、オタマジャクシ型幼生へと変態する。ホヤの幼生は、しばらく遊泳したのち変態して成体となる。ホヤの形態形成パターンは、予定神経細胞が巻きあがって神経管を形成するなど、脊椎動物の発生様式とよく似ている。
【０００４】
ホヤは、尾索動物群に属する動物であって、ナメクジウオを含む頭索動物、カエルやヒトを含む脊椎動物とともに、脊索動物門を構成する。尾索動物は、尾に脊索を持つ。頭索動物は、脊索が頭部の先端まで延びている。脊椎動物は、発生にともなって、脊索が椎骨に置き換わる。これらの３つの動物群には、脊索、その背側の中空の神経管、咽頭の裂け目である鰓裂など、いくつかの共通した形質がある。脊索動物は、今から約５億年以上昔に、上述した脊索動物に特有の性質を獲得することによって、新口動物の共通の祖先から進化してきたものと考えられている。新口動物とは、脊索動物、半索動物、及び棘皮動物を含む動物群である。半索動物の例としてはギボシムシが、棘皮動物の例としては、ウニ、ヒトデなどが挙げられる。
【０００５】
ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制（ボディプラン）は、両生類のオタマジャクシ型幼生のミニチュア版とも言うべきものであり、脊椎動物を含む脊索動物の体制の最も単純な型（原型）を表している。つまり、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制（ボディプラン）は、脊椎動物の体制の最も単純な型（原型）に近いものと考えられているため、脊椎動物の体制を研究する上で、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制を調べることは、極めて重要な意味をもつ。また、ホヤの受精卵がどのように分裂して、胚を構成する各割球がどのような位置を占めて、最終的に何個のどのような細胞を生みだすのかというホヤの細胞系譜は、ほぼ完全に調べられている。
【０００６】
ここで、ホヤの細胞などについて、簡単に説明する。ホヤのオタマジャクシ型幼生を構成する細胞の数は少なく、２６５０個に満たない。しかし、これらの細胞は、表皮、中枢神経系、内胚葉（消化器系）、間充織、筋肉、脊索などの組織又は器官を構成しており、このホヤのオタマジャクシ型幼生の体制は、我々ヒトの体における初期の発生段階の基本的な体制と同一である。
【０００７】
また、上記のように、ホヤのオタマジャクシ型幼生の細胞数は少ないけれども、ホヤのオタマジャクシ型幼生には、頭部と尾部とが存在する。そして、頭部の背側には中枢神経系が存在する。その中枢神経系は、耳に相当する平衡器と、眼に相当する眼点とを含んでいる。この中枢神経系を構成する細胞数は約３５０個であり、そのうち神経細胞は約８０個と見積もられている。また、幼生の体全体には末梢神経細胞が散在する。そして、頭部の腹側には、消化器系をつくりだす内胚葉（細胞数約５００）が存在する。さらに、首の部分には、間充織（細胞数約９００）が存在する。間充織は、主として成体の中胚葉を形成する。
【０００８】
一方、上記幼生の尾部では、尾部の中央に４０個の細胞からなる脊索が、その両側には単核で横紋をもった筋肉が、また背側にはグリア細胞からなる神経索が、腹側には内胚葉索が存在する。また、幼生全体を１層の表皮が覆っている。
【０００９】
脊索は、脊索動物の個体発生において重要な役割を果たしており、内胚葉の誘導作用を受けて形成される。そして、形成された脊索は、その背側の外胚葉に働きかけて神経系形成を誘導するばかりでなく、脊索の両側における筋肉のパターン形成、及び消化器系の形成にも重要な働きをする。
【００１０】
また、本発明者は、以前、カタユウレイボヤの尾芽胚における遺伝子発現プロファイルを報告している（Development 128,2893-2904(2001)）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、脊索動物、脊椎動物などにおいて、発生段階に発現する遺伝子（発生遺伝子）の解析は、急速に進められている。しかし、脊椎動物における発生遺伝子の機能解析には、次の問題点がある。
【００１２】
脊椎動物は、進化にともなって、ゲノムレベルで２回の遺伝子重複が起こったと考えられている。そして、脊椎動物の遺伝子には、遺伝子重複による遺伝子機能のリダンダンシー（冗長性）が存在している。そのリダンダンシーの存在により、脊椎動物における遺伝子機能の解析は難しいという問題点がある。最近の研究では、脊索動物の共通の祖先から脊椎動物への進化のルートをたどった動物は、その進化の間に、遺伝子の全体的な重複が２回おこったことが明らかになっている。上記のように、進化の間に遺伝子の全体的な重複が２回起こり、無脊椎動物の遺伝子数を約１万５千と仮定する。そのとき、ヒトを含む脊椎動物の遺伝子数は、６万程度存在することになる。
【００１３】
一般的に、Ａという親遺伝子が重複してＡ＋Ａ'になった場合、Ａはもともとの機能を保持し、Ａ'にはＡと異なった新しい機能が付加されると考えられている。しかし、脊椎動物の進化時におこった発生遺伝子の重複は、その一般的なものとは違う側面がある。つまり、脊椎動物においては、ＡがＡ＋Ａ'＋Ａ''＋Ａ'''となっても、４つの遺伝子の機能は基本的に同じであるけれども、微妙にその空間的・時間的発現パターンを変えている。このことによって、脊椎動物は、原型的な脊索動物には認められないような量的にも質的にも異なった器官及び組織をつくり出し、巧妙な遺伝子の相互作用によって機能を増し、現存する非常に複雑な体制を得たと考えられている。このように、遺伝子重複による遺伝子機能のリダンダンシー（冗長性）が存在しているため、脊椎動物における遺伝子機能の解析は難しいという問題点がある。
【００１４】
一方、最近の研究では、ハエ、線虫、カエル、哺乳類などの様々な動物の体づくりは、基本的には同じ遺伝子や分子を使ってなされているということが明らかになっている。このような体づくりに関与している遺伝子としては、例えば、体の前後軸の確立にたずさわるホメオボックス遺伝子群、心臓の発生に関与するtinman遺伝子、動物の目の発生に関与しているPax6遺伝子などが挙げられる。
【００１５】
脊索動物であるホヤの遺伝子は、前述のような脊椎動物における遺伝子の重複がなく、遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っている。また、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制は、脊索動物の体制の最も単純な型（原型）を表している。したがって、脊索動物であるホヤは、ヒトを含む脊椎動物全般の発生メカニズムの解明に最適のモデル動物である。また、ホヤの発生段階において発現する遺伝子は、生物の発生の研究を進める上で重要であるばかりでなく、遺伝子治療及び再生医療などの医療分野、さらには環境分野、食品分野など、種々の分野に応用できると期待されている。
【００１６】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ホヤの発生段階において発現する新規遺伝子群、及びその利用方法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前述のように、ホヤの遺伝子には脊椎動物における遺伝子の重複がないこと、ホヤの発生遺伝子は遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っていること、及び、ホヤの発生遺伝子は脊索動物のボディプランの最も単純な型（原型）の形成に関与していることに着目した。さらに、本発明者は、ホヤの発生遺伝子における時間的・空間的発現機構の解析は、脊椎動物の複雑な発生遺伝子の時間的・空間的発現パターンの解明、及びその制御機構の解明に重要な貢献をもたらすと考えた。
【００１８】
そこで、本発明者は、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）の受精卵・卵割期胚・尾芽胚・幼生・幼若体で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３'側７６,９２０及び５'側７６,２５０のＥＳＴ（expressed sequence tag：発現配列タグ）解析を行い、約５,０００の遺伝子を選んだ。そして、それら遺伝子の中から、４,６８１の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定して、本発明を完成させるに至った。
【００１９】
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）のタンパク質をコードし、ホヤの発生段階において発現する遺伝子である。
（ａ）２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００２０】
なお、ここで言う「ホヤの発生段階」とは、ホヤの受精卵、卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体を含むものとする。また、ここでいう「発現する遺伝子」とは、ｍＲＮＡとして転写される遺伝子のことをいう。さらに、「２以上９０４６以下の偶数の配列番号」とは、具体的に言うと、下記の表１〜表８７において「配列番号(アミノ酸)」の項目に示す番号のことである。
【００２１】
本発明の「遺伝子」には、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えば、クローニング、化学合成技術、又はそれらの組み合わせによって得られるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡなどが含まれる。なお、ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよい。また、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。
【００２２】
なお、本発明の「遺伝子」がＲＮＡを意味するときは、塩基配列中の「Ｔ（チミン）」を「Ｕ（ウラシル）」と読み替えて解釈するものとする。また、本発明の「遺伝子」は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２３】
本発明の遺伝子は、ホヤ由来の遺伝子である。ここでホヤとは、ホヤ類に属する動物を指す。ホヤ類に属する動物としては、例えば、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）、ユウレイボヤ(Ciona savignyi)、マボヤ(Halocynthia roretzi)などが挙げられる。
【００２４】
なお、本発明の「遺伝子」は、以下の（ｂ）のタンパク質をコードし、ホヤの発生段階において発現する遺伝子であってもよい。
（ｂ）２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００２５】
本発明の遺伝子は、１以上９０４５以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列中のオープンリーディングフレーム領域を有する。ここで言う「１以上９０４５以下の奇数の配列番号」とは、具体的に言うと、下記の表１〜表８７において「配列番号(塩基)」の項目に示す番号のことである。
【００２６】
そして、本発明の遺伝子は、配列番号９０４７から９２０４のいずれかに示される塩基配列を有し、ホヤの発生段階において発現する遺伝子である。なお、ここにいう「配列番号９０４７から９２０４」は、具体的に言えば、表８８〜表９１の「配列番号(塩基)」の項目に記載されている。
【００２７】
なお、本発明の遺伝子は、１以上９０４５以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列と、配列番号９０４７から９２０４のいずれかに示される塩基配列とにおいて、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するものであってもよい。ここで、「１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列」とは、公知のＤＮＡ組換え技術、変異導入方法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数の塩基が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列のことである。
【００２８】
本発明の遺伝子検出器具は、上記に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列又はその相補配列を、プローブとして用いている。上記遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明の遺伝子の発現パターンを検出・測定するなどに利用できる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子の少なくとも一部を、基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップなどが挙げられる。
【００２９】
本発明のタンパク質は、次の（ａ）というタンパク質である。
（ａ）２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において発現するタンパク質。
【００３０】
なお、ここで言う「発現するタンパク質」とは、遺伝子によって合成されるタンパク質という意味である。
【００３１】
本発明のタンパク質は、細胞などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明のタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドを含むタンパク質としては、例えば、HA、Myc、flagなどのエピトープで標識されたタンパク質などが挙げられる。
【００３２】
なお、本発明のタンパク質は、２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において発現する上記（ｂ）のタンパク質であってもよい。
【００３３】
ここで、「１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法などの公知の変異タンパク質作製法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００３４】
このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質である。ここにいう「変異タンパク質」とは、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異タンパク質を意味する。しかし、ここにいう「変異タンパク質」は、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したタンパク質であってもよい。
【００３５】
上記変異タンパク質の性質は、特に限定されるものではない。例えば、上記変異タンパク質は、もとの野生型のタンパク質と同様の機能を有するものであっても、野生型のタンパク質の機能を担う領域に変異を生じさせることによって、もとの野生型のタンパク質が有していた機能を増強したものであっても、その機能が弱まったものであっても、その機能が失われたものであってもよい。
【００３６】
本発明の組換え発現ベクターは、上記に記載の遺伝子を含んでいる。このベクターを用いると、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、形質転換体を得ることができる。さらに、そのベクターに含まれる遺伝子がコードする遺伝子を対象細胞（宿主細胞）内で発現させることによって、目的とするタンパク質を生産することができる。
【００３７】
本発明の形質転換体は、上記に記載の遺伝子が導入されたものである。すなわち、本発明の形質転換体は、次の（あ）若しくは（い）に示す遺伝子、又はそれら遺伝子の相補配列からなる遺伝子、及び当該遺伝子の少なくとも１つを含有する組換えベクターを含んでいる。
（あ）１以上９０４５以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される遺伝子。
（い）配列番号９０４７から９２０４のいずれかに示される塩基配列を有し、ホヤの発生段階において発現する遺伝子。
【００３８】
なお、ここでいう「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（ホヤ、海洋生物、魚類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。現在、ホヤは、実験動物・モデル動物として広く用いられている。そのため、上記形質転換体の例のうち、特にホヤの形質転換体は、本発明に係る遺伝子やタンパク質を用いた発生や再生等の研究に利用できるだけでなく、本発明に係る遺伝子やタンパク質のヒトホモログの関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などにも有用である。
【００３９】
本発明の抗体は、上記（ａ）のタンパク質に対する抗体である。具体的に言えば、上記（ａ）のタンパク質又はそのタンパク質の部分ペプチドを抗原として、公知の方法により得られる抗体（ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）である。
【００４０】
なお、本発明の抗体は、上記（ｂ）のタンパク質に対する抗体であってもよい。さらに、本発明の抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、その改変タンパク質、若しくはそれらタンパク質の部分ペプチドを抗原として、公知の方法により得られる抗体とすることも可能である。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、この実施の形態に限定されるものではない。
【００４２】
（１）ホヤについて
本実施の形態においては、ホヤの１種であるカタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）を用いた。カタユウレイボヤは、ホヤの中でも世界で広く研究されている種である。また、カタユウレイボヤのゲノムサイズは約１６０Ｍｂ（Ｍｂ＝１００万塩基）であり、カタユウレイボヤの遺伝子数は約１５,５００と見積もられている。これは、ショウジョウバエのゲノムサイズ及び遺伝子数にほぼ匹敵する。さらに、カタユウレイボヤの発生遺伝子の時間的・空間的発現を調節する配列（基本的プロモーター及びエンハンサー）のほとんどは、転写開始点の上流約１ｋｂ以内、場合によっては約２００塩基対以内におさまっている。したがって、カタユウレイボヤのゲノムは、多くの遺伝子が比較的コンパクトにつまった型のゲノムであることが予想される。
【００４３】
（２）遺伝子及びタンパク質について
次に、本実施の形態の遺伝子及びタンパク質について説明する。本実施の形態の遺伝子は、ホヤから単離され、ホヤの発生段階において発現する遺伝子である。本実施の形態の遺伝子は、２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、より具体的に言えば、１以上９０４５以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列を有する遺伝子（全長ｃＤＮＡ配列）である。さらに、本実施の形態の遺伝子は、塩基配列中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を有している。
【００４４】
なお、上記「塩基配列中のＯＲＦ領域」は、配列表の数字見出し<222>の項目と、下記の表９２〜表１８２の「翻訳領域」の項目とに示されている。例えば、配列ＩＤ１（配列番号１）に示される塩基配列では、総塩基数は２０２９であって、そのうち６６〜１９７０番目の塩基配列をＯＲＦ領域として有している。この配列ＩＤ１の例において、配列表の数字見出し<222>の項目では、ＯＲＦ領域を「<222> (66)..(1970)」と示している。また、下記の表９２〜表１８２の「翻訳領域」の項目においては、配列ＩＤ１のＯＲＦ領域を「66〜1970」と示している。
【００４５】
さらに、本実施の形態の遺伝子は、配列番号９０４７から９２０４のいずれかに示される塩基配列を有し、ホヤの発生段階において発現する遺伝子である。
【００４６】
本発明者は、次のようにして、本実施の形態における遺伝子を得た。まず、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）の受精卵・卵割期胚・尾芽胚・幼生・幼若体で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３'側７６,９２０及び５'側７６,２５０のＥＳＴ（expressed sequence tag：発現配列タグ）解析を行った。次に、上記ＥＳＴ解析により得られた配列情報の中から、約５,０００の遺伝子を選び、この中から４,６８１の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定した。また、一部の遺伝子については、in situ ハイブリダイゼーションにより、それら遺伝子の発現を調査した。
【００４７】
また、上記ホヤの発生段階において発現する遺伝子がコードするタンパク質（アミノ酸配列）は、２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される。以下、表１〜表３２９に基づいて、本実施の形態の遺伝子及びタンパク質について説明する。
【００４８】
【表１】
2005160301.tif 000002
【００４９】
【表２】
2005160301.tif 000003
【００５０】
【表３】
2005160301.tif 000004
【００５１】
【表４】
2005160301.tif 000005
【００５２】
【表５】
2005160301.tif 000006
【００５３】
【表６】
2005160301.tif 000007
【００５４】
【表７】
2005160301.tif 000008
【００５５】
【表８】
2005160301.tif 000009
【００５６】
【表９】
2005160301.tif 000010
【００５７】
【表１０】
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【００５８】
【表１１】
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【００５９】
【表１２】
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【００６０】
【表１３】
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【００６１】
【表１４】
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【００６２】
【表１５】
2005160301.tif 000016
【００６３】
【表１６】
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【００６４】
【表１７】
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【００６５】
【表１８】
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【００６６】
【表１９】
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【００６７】
【表２０】
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【００６８】
【表２１】
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【００６９】
【表２２】
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【００７０】
【表２３】
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【００７１】
【表２４】
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【００７２】
【表２５】
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【００７３】
【表２６】
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【００７４】
【表２７】
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【００７５】
【表２８】
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【００７６】
【表２９】
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【００７７】
【表３０】
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【００７８】
【表３１】
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【００７９】
【表３２】
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【００８０】
【表３３】
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【００８１】
【表３４】
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【００８２】
【表３５】
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【００８３】
【表３６】
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【００８４】
【表３７】
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【００８５】
【表３８】
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【００８６】
【表３９】
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【００８７】
【表４０】
2005160301.tif 000041
【００８８】
【表４１】
2005160301.tif 000042
【００８９】
【表４２】
2005160301.tif 000043
【００９０】
【表４３】
2005160301.tif 000044
【００９１】
【表４４】
2005160301.tif 000045
【００９２】
【表４５】
2005160301.tif 000046
【００９３】
【表４６】
2005160301.tif 000047
【００９４】
【表４７】
2005160301.tif 000048
【００９５】
【表４８】
2005160301.tif 000049
【００９６】
【表４９】
2005160301.tif 000050
【００９７】
【表５０】
2005160301.tif 000051
【００９８】
【表５１】
2005160301.tif 000052
【００９９】
【表５２】
2005160301.tif 000053
【０１００】
【表５３】
2005160301.tif 000054
【０１０１】
【表５４】
2005160301.tif 000055
【０１０２】
【表５５】
2005160301.tif 000056
【０１０３】
【表５６】
2005160301.tif 000057
【０１０４】
【表５７】
2005160301.tif 000058
【０１０５】
【表５８】
2005160301.tif 000059
【０１０６】
【表５９】
2005160301.tif 000060
【０１０７】
【表６０】
2005160301.tif 000061
【０１０８】
【表６１】
2005160301.tif 000062
【０１０９】
【表６２】
2005160301.tif 000063
【０１１０】
【表６３】
2005160301.tif 000064
【０１１１】
【表６４】
2005160301.tif 000065
【０１１２】
【表６５】
2005160301.tif 000066
【０１１３】
【表６６】
2005160301.tif 000067
【０１１４】
【表６７】
2005160301.tif 000068
【０１１５】
【表６８】
2005160301.tif 000069
【０１１６】
【表６９】
2005160301.tif 000070
【０１１７】
【表７０】
2005160301.tif 000071
【０１１８】
【表７１】
2005160301.tif 000072
【０１１９】
【表７２】
2005160301.tif 000073
【０１２０】
【表７３】
2005160301.tif 000074
【０１２１】
【表７４】
2005160301.tif 000075
【０１２２】
【表７５】
2005160301.tif 000076
【０１２３】
【表７６】
2005160301.tif 000077
【０１２４】
【表７７】
2005160301.tif 000078
【０１２５】
【表７８】
2005160301.tif 000079
【０１２６】
【表７９】
2005160301.tif 000080
【０１２７】
【表８０】
2005160301.tif 000081
【０１２８】
【表８１】
2005160301.tif 000082
【０１２９】
【表８２】
2005160301.tif 000083
【０１３０】
【表８３】
2005160301.tif 000084
【０１３１】
【表８４】
2005160301.tif 000085
【０１３２】
【表８５】
2005160301.tif 000086
【０１３３】
【表８６】
2005160301.tif 000087
【０１３４】
【表８７】
2005160301.tif 000088
【０１３５】
【表８８】
2005160301.tif 000089
【０１３６】
【表８９】
2005160301.tif 000090
【０１３７】
【表９０】
2005160301.tif 000091
【０１３８】
【表９１】
2005160301.tif 000092
まず、表１〜表９１の各項目について説明する。「配列ＩＤ」の項目には、本発明者によって見出されたホヤの発生段階において発現する各遺伝子（４６８１個）に付された番号を記している。後述の表９２〜表３２７における「配列ＩＤ」の項目も同様である。
【０１３９】
「配列番号（塩基）」の項目には、本実施の形態における遺伝子の配列番号を記している。なお、表１〜表８７における「配列番号（塩基）」の項目には、本実施の形態における遺伝子（全長ｃＤＮＡ配列）と、該ｃＤＮＡ配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列とが併記された配列の配列番号を記している。表８８〜表９１における「配列番号（塩基）」の項目には、本実施の形態における遺伝子（ｃＤＮＡ配列）のみが記載された配列の配列番号を記している。
【０１４０】
「配列番号（アミノ酸）」の項目には、本実施の形態におけるタンパク質のアミノ酸配列の配列番号を記している。なお、「配列番号（アミノ酸）」の項目の配列番号で示されるアミノ酸配列は、表１〜表８７の「配列番号（塩基）」の項目に記した配列番号のアミノ酸配列（塩基配列に併記されているアミノ酸配列）を、単独で表した配列である。
【０１４１】
表１〜表９１の「ｃＤＮＡの長さ」の項目には、本実施の形態における遺伝子（全長ｃＤＮＡ）の総塩基数を記載している。「アミノ酸残基の数」の項目には、本実施の形態におけるタンパク質のアミノ酸残基数を記載している。
【０１４２】
【表９２】
2005160301.tif 000093
【０１４３】
【表９３】
2005160301.tif 000094
【０１４４】
【表９４】
2005160301.tif 000095
【０１４５】
【表９５】
2005160301.tif 000096
【０１４６】
【表９６】
2005160301.tif 000097
【０１４７】
【表９７】
2005160301.tif 000098
【０１４８】
【表９８】
2005160301.tif 000099
【０１４９】
【表９９】
2005160301.tif 000100
【０１５０】
【表１００】
2005160301.tif 000101
【０１５１】
【表１０１】
2005160301.tif 000102
【０１５２】
【表１０２】
2005160301.tif 000103
【０１５３】
【表１０３】
2005160301.tif 000104
【０１５４】
【表１０４】
2005160301.tif 000105
【０１５５】
【表１０５】
2005160301.tif 000106
【０１５６】
【表１０６】
2005160301.tif 000107
【０１５７】
【表１０７】
2005160301.tif 000108
【０１５８】
【表１０８】
2005160301.tif 000109
【０１５９】
【表１０９】
2005160301.tif 000110
【０１６０】
【表１１０】
2005160301.tif 000111
【０１６１】
【表１１１】
2005160301.tif 000112
【０１６２】
【表１１２】
2005160301.tif 000113
【０１６３】
【表１１３】
2005160301.tif 000114
【０１６４】
【表１１４】
2005160301.tif 000115
【０１６５】
【表１１５】
2005160301.tif 000116
【０１６６】
【表１１６】
2005160301.tif 000117
【０１６７】
【表１１７】
2005160301.tif 000118
【０１６８】
【表１１８】
2005160301.tif 000119
【０１６９】
【表１１９】
2005160301.tif 000120
【０１７０】
【表１２０】
2005160301.tif 000121
【０１７１】
【表１２１】
2005160301.tif 000122
【０１７２】
【表１２２】
2005160301.tif 000123
【０１７３】
【表１２３】
2005160301.tif 000124
【０１７４】
【表１２４】
2005160301.tif 000125
【０１７５】
【表１２５】
2005160301.tif 000126
【０１７６】
【表１２６】
2005160301.tif 000127
【０１７７】
【表１２７】
2005160301.tif 000128
【０１７８】
【表１２８】
2005160301.tif 000129
【０１７９】
【表１２９】
2005160301.tif 000130
【０１８０】
【表１３０】
2005160301.tif 000131
【０１８１】
【表１３１】
2005160301.tif 000132
【０１８２】
【表１３２】
2005160301.tif 000133
【０１８３】
【表１３３】
2005160301.tif 000134
【０１８４】
【表１３４】
2005160301.tif 000135
【０１８５】
【表１３５】
2005160301.tif 000136
【０１８６】
【表１３６】
2005160301.tif 000137
【０１８７】
【表１３７】
2005160301.tif 000138
【０１８８】
【表１３８】
2005160301.tif 000139
【０１８９】
【表１３９】
2005160301.tif 000140
【０１９０】
【表１４０】
2005160301.tif 000141
【０１９１】
【表１４１】
2005160301.tif 000142
【０１９２】
【表１４２】
2005160301.tif 000143
【０１９３】
【表１４３】
2005160301.tif 000144
【０１９４】
【表１４４】
2005160301.tif 000145
【０１９５】
【表１４５】
2005160301.tif 000146
【０１９６】
【表１４６】
2005160301.tif 000147
【０１９７】
【表１４７】
2005160301.tif 000148
【０１９８】
【表１４８】
2005160301.tif 000149
【０１９９】
【表１４９】
2005160301.tif 000150
【０２００】
【表１５０】
2005160301.tif 000151
【０２０１】
【表１５１】
2005160301.tif 000152
【０２０２】
【表１５２】
2005160301.tif 000153
【０２０３】
【表１５３】
2005160301.tif 000154
【０２０４】
【表１５４】
2005160301.tif 000155
【０２０５】
【表１５５】
2005160301.tif 000156
【０２０６】
【表１５６】
2005160301.tif 000157
【０２０７】
【表１５７】
2005160301.tif 000158
【０２０８】
【表１５８】
2005160301.tif 000159
【０２０９】
【表１５９】
2005160301.tif 000160
【０２１０】
【表１６０】
2005160301.tif 000161
【０２１１】
【表１６１】
2005160301.tif 000162
【０２１２】
【表１６２】
2005160301.tif 000163
【０２１３】
【表１６３】
2005160301.tif 000164
【０２１４】
【表１６４】
2005160301.tif 000165
【０２１５】
【表１６５】
2005160301.tif 000166
【０２１６】
【表１６６】
2005160301.tif 000167
【０２１７】
【表１６７】
2005160301.tif 000168
【０２１８】
【表１６８】
2005160301.tif 000169
【０２１９】
【表１６９】
2005160301.tif 000170
【０２２０】
【表１７０】
2005160301.tif 000171
【０２２１】
【表１７１】
2005160301.tif 000172
【０２２２】
【表１７２】
2005160301.tif 000173
【０２２３】
【表１７３】
2005160301.tif 000174
【０２２４】
【表１７４】
2005160301.tif 000175
【０２２５】
【表１７５】
2005160301.tif 000176
【０２２６】
【表１７６】
2005160301.tif 000177
【０２２７】
【表１７７】
2005160301.tif 000178
【０２２８】
【表１７８】
2005160301.tif 000179
【０２２９】
【表１７９】
2005160301.tif 000180
【０２３０】
【表１８０】
2005160301.tif 000181
【０２３１】
【表１８１】
2005160301.tif 000182
【０２３２】
【表１８２】
2005160301.tif 000183
次に、表９２〜表１８２について説明する。「翻訳領域」の項目では、左側の列にはアミノ酸翻訳開始位置を示しており、右側の列にはアミノ酸翻訳停止位置を示している。すなわち、「翻訳領域」の項目は、本実施の形態における遺伝子（全長ｃＤＮＡ）配列中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を示している。
【０２３３】
なお、本実施の形態のアミノ酸配列及びＯＲＦ領域は、以下のアルゴリズムに基づいて決定した。まず、決定した塩基配列を、読み枠ごとにアミノ酸に変換する。その変換後、途中に終止コドンが入らないアミノ酸配列を探索する。そして、探索されたアミノ酸配列のうち、最長のアミノ酸配列を有する部分を、候補ＯＲＦとする。次に、その候補ＯＲＦ中において、５’末端側からメチオニン（開始コドン）を探す。そして、候補ＯＲＦ中にメチオニンがあるときは、そのメチオニンからＯＲＦの末端（３’末端側）までの部分を、ＯＲＦ領域であると決定した。さらに、そのＯＲＦ領域の決定に合わせて、アミノ酸配列を決定した。
【０２３４】
なお、上記アルゴリズムにより、候補ＯＲＦ中にメチオニン（開始コドン）がない遺伝子、及び、アミノ酸残基の数が１０未満となる遺伝子については、アミノ酸配列を併記していない。
【０２３５】
表９２〜表１８２の「３’末端」の項目は、上記アルゴリズムにより判定したＯＲＦの３’末端側が終止コドンであるか否かを示している。つまり、「３’末端」の項目において、ＯＲＦの３'末端側が終止コドンで終わっているものはcloseと、終わっていないものはopenと記載している。
【０２３６】
表９２〜表１８２の「orf/cDNA」の項目においては、次の条件１と条件２との両方を満たしているものについて「＊」を付している。ここにいう条件１とは、ＯＲＦ領域の塩基数／ｃＤＮＡの塩基数が０．１（１０％）未満であるという条件である。そして、条件２とは、相同性検索の結果が出力されていないという条件である。なお、条件１の「ＯＲＦ領域の塩基数」とは、上記アルゴリズムにより決定された塩基数である。そして、条件２における「相同性検索の結果が出力されていない」ものは、ＢＬＡＳＴ検索の結果、あらかじめ設定した基準以上の相同性を示す配列が得られなかったことを示している。
【０２３７】
上記項目により、本実施の形態の遺伝子については、次のことが言える。上記「３’末端」の項目においてcloseと記載されており、かつ、「orf/cDNA」の項目において「＊」が付されていない遺伝子は、全長ｃＤＮＡと考えられる。
【０２３８】
また、「orf/cDNA」の項目において「＊」が付されている遺伝子、及び、アミノ酸を併記していない遺伝子（配列ＩＤ４５２４〜４６８１の遺伝子）は、上記アルゴリズムによれば、non-codingＲＮＡから得られたｃＤＮＡであるという可能性がある。しかし、ここにいう可能性は、上記アルゴリズムによる判断に基づくものである。
【０２３９】
表９２〜表１８２の「確率」の項目には、相同性検索（ＢＬＡＳＴ検索）の結果挙げられた各既知クローンとの相同性の程度を示す確率（probability）が記されている。相同性検索の結果などについては、下記に説明する。
【０２４０】
【表１８３】
2005160301.tif 000184
【０２４１】
【表１８４】
2005160301.tif 000185
【０２４２】
【表１８５】
2005160301.tif 000186
【０２４３】
【表１８６】
2005160301.tif 000187
【０２４４】
【表１８７】
2005160301.tif 000188
【０２４５】
【表１８８】
2005160301.tif 000189
【０２４６】
【表１８９】
2005160301.tif 000190
【０２４７】
【表１９０】
2005160301.tif 000191
【０２４８】
【表１９１】
2005160301.tif 000192
【０２４９】
【表１９２】
2005160301.tif 000193
【０２５０】
【表１９３】
2005160301.tif 000194
【０２５１】
【表１９４】
2005160301.tif 000195
【０２５２】
【表１９５】
2005160301.tif 000196
【０２５３】
【表１９６】
2005160301.tif 000197
【０２５４】
【表１９７】
2005160301.tif 000198
【０２５５】
【表１９８】
2005160301.tif 000199
【０２５６】
【表１９９】
2005160301.tif 000200
【０２５７】
【表２００】
2005160301.tif 000201
【０２５８】
【表２０１】
2005160301.tif 000202
【０２５９】
【表２０２】
2005160301.tif 000203
【０２６０】
【表２０３】
2005160301.tif 000204
【０２６１】
【表２０４】
2005160301.tif 000205
【０２６２】
【表２０５】
2005160301.tif 000206
【０２６３】
【表２０６】
2005160301.tif 000207
【０２６４】
【表２０７】
2005160301.tif 000208
【０２６５】
【表２０８】
2005160301.tif 000209
【０２６６】
【表２０９】
2005160301.tif 000210
【０２６７】
【表２１０】
2005160301.tif 000211
【０２６８】
【表２１１】
2005160301.tif 000212
【０２６９】
【表２１２】
2005160301.tif 000213
【０２７０】
【表２１３】
2005160301.tif 000214
【０２７１】
【表２１４】
2005160301.tif 000215
【０２７２】
【表２１５】
2005160301.tif 000216
【０２７３】
【表２１６】
2005160301.tif 000217
【０２７４】
【表２１７】
2005160301.tif 000218
【０２７５】
【表２１８】
2005160301.tif 000219
【０２７６】
【表２１９】
2005160301.tif 000220
【０２７７】
【表２２０】
2005160301.tif 000221
【０２７８】
【表２２１】
2005160301.tif 000222
【０２７９】
【表２２２】
2005160301.tif 000223
【０２８０】
【表２２３】
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【０２８１】
【表２２４】
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【０２８２】
【表２２５】
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【０２８３】
【表２２６】
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【０２８４】
【表２２７】
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【０２８５】
【表２２８】
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【０２８６】
【表２２９】
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【０２８７】
【表２３０】
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【０２８８】
【表２３１】
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【０２８９】
【表２３２】
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【０２９０】
【表２３３】
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【０２９１】
【表２３４】
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【０２９２】
【表２３５】
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【０２９３】
【表２３６】
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【０２９４】
【表２３７】
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【０２９５】
【表２３８】
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【０２９６】
【表２３９】
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【０２９７】
【表２４０】
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【０２９８】
【表２４１】
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【０２９９】
【表２４２】
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【０３００】
【表２４３】
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【０３０１】
【表２４４】
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【０３０２】
【表２４５】
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【０３０３】
【表２４６】
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【０３０４】
【表２４７】
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【０３０５】
【表２４８】
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【０３０６】
【表２４９】
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【０３０７】
【表２５０】
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【０３０８】
【表２５１】
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【０３０９】
【表２５２】
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【０３１０】
【表２５３】
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【０３１１】
【表２５４】
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【０３１２】
【表２５５】
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【０３１３】
【表２５６】
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【０３１４】
【表２５７】
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【０３１５】
【表２５８】
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【０３１６】
【表２５９】
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【０３１７】
【表２６０】
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【０３１８】
【表２６１】
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【０３１９】
【表２６２】
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【０３２０】
【表２６３】
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【０３２１】
【表２６４】
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【０３２２】
【表２６５】
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【０３２３】
【表２６６】
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【０３２４】
【表２６７】
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【０３２５】
【表２６８】
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【０３２６】
【表２６９】
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【０３２７】
【表２７０】
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【０３２８】
【表２７１】
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【０３２９】
【表２７２】
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【０３３０】
【表２７３】
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【０３３１】
【表２７４】
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【０３３２】
【表２７５】
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【０３３３】
【表２７６】
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【０３３４】
【表２７７】
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【０３３５】
【表２７８】
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【０３３６】
【表２７９】
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【０３３７】
【表２８０】
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【０３３８】
【表２８１】
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【０３３９】
【表２８２】
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【０３４０】
【表２８３】
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【０３４１】
【表２８４】
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【０３４２】
【表２８５】
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【０３４３】
【表２８６】
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【０３４４】
【表２８７】
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【０３４５】
【表２８８】
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【０３４６】
【表２８９】
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【０３４７】
【表２９０】
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【０３４８】
【表２９１】
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【０３４９】
【表２９２】
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【０３５０】
【表２９３】
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【０３５１】
【表２９４】
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【０３５２】
【表２９５】
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【０３５３】
【表２９６】
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【０３５４】
【表２９７】
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【０３５５】
【表２９８】
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【０３５６】
【表２９９】
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【０３５７】
【表３００】
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【０３５８】
【表３０１】
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【０３５９】
【表３０２】
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【０３６０】
【表３０３】
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【０３６１】
【表３０４】
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【０３６２】
【表３０５】
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【０３６３】
【表３０６】
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【０３６４】
【表３０７】
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【０３６５】
【表３０８】
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【０３６６】
【表３０９】
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【０３６７】
【表３１０】
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【０３６８】
【表３１１】
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【０３６９】
【表３１２】
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【０３７０】
【表３１３】
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【０３７１】
【表３１４】
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【０３７２】
【表３１５】
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【０３７３】
【表３１６】
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【０３７４】
【表３１７】
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【０３７５】
【表３１８】
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【０３７６】
【表３１９】
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【０３７７】
【表３２０】
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【０３７８】
【表３２１】
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【０３７９】
【表３２２】
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【０３８０】
【表３２３】
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【０３８１】
【表３２４】
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【０３８２】
【表３２５】
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【０３８３】
【表３２６】
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【０３８４】
【表３２７】
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次に、表１８３〜表３２７について説明する。「相同性検索結果」の項目には、ＢＬＡＳＴ（ブラスト）による相同性検索の結果を示している。なお、「相同性検索結果」の項目において空白となっているものは、ＢＬＡＳＴ検索の結果、あらかじめ設定した基準以上の相同性を示す配列が得られなかったことを示している（表３２９のＤIIにあたる）。本実施の形態における遺伝子において、ＢＬＡＳＴ検索により結果が得られているものは、その検索結果である既知遺伝子と同様の機能を有する可能性が高い。
【０３８５】
【表３２８】
2005160301.tif 000329
次に、表３２８の各項目について説明する。表３２８には、「配列ＩＤ」、「機能的分類」、「尾芽胚」、「幼生」、及び「幼若体」の項目がある。
【０３８６】
「機能的分類」の項目には、各遺伝子がコードするタンパク質の機能に関する情報を示している。機能的分類の最初の文字がＡのもの（ＡI〜ＡIX）は、多種の細胞で一般的に使われている機能にかかわることを示している。最初の文字がＢのもの（ＢI〜ＢIII）は、細胞間コミュニケーションにかかわることを示している。最初の文字がＣのもの（ＣI〜ＣIII）は、転写因子及び遺伝子発現の制御にかかわることを示している。最初の文字がＤのもの（ＤI〜ＤII）は、十分な類似性検索情報がないことを示している。さらに、「機能的分類」に記した各記号の意味は、表３２９に示す。
【０３８７】
【表３２９】
2005160301.tif 000330
なお、上記「機能的分類」は、基本的に、文献(Lee, Y.-H. et al., Development, 126, 3857-3867(1999))に記載の分類法に従ったものである。
【０３８８】
次に、表３２８における「尾芽胚」、「幼生」、「幼若体」の項目について説明する。これら「尾芽胚」、「幼生」、及び「幼若体」の項目は、ホヤの尾芽胚、幼生、又は幼若体の各発生段階において、配列ＩＤ（ＩＤ４６７０〜４６８１）で示される各遺伝子が、特異的に発現する組織若しくは器官を示している。例えば、配列ＩＤ４６７０に示される遺伝子は、幼若体の鰓裂において特異的に発現する。また、配列ＩＤ４６７４に示される遺伝子は、尾芽胚の表皮、及び幼生の表皮において特異的に発現する。この「尾芽胚」、「幼生」、及び「幼若体」の項目に記載の組織及び器官は、ホールマウントin situハイブリダイゼーションの結果から判断したものである。
【０３８９】
ここで、上記「尾芽胚」・「幼生」・「幼若体」という発生段階について、簡単に説明する。尾芽胚という発生段階は、ホヤ幼生を構成する組織や器官の分化が始まるときであり、この段階においては、それぞれの組織形成に関与する遺伝子が働いていると考えられる。幼生という発生段階にあるホヤは、ある意味では、完全に分化し、独特な機能をもった細胞の集まりからなるといえる。特に、この幼生という段階においては、神経系などの機能に関与する遺伝子の発現が期待される。幼若体という発生段階においては、既に多くの成体器官の形成が進んでおり、幼生とは異なった遺伝子の発現が期待される。
【０３９０】
ところで、本実施の形態におけるタンパク質は、２以上９０４６以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において発現するタンパク質であってもよい。
【０３９１】
また、本実施の形態における遺伝子は、１以上９０４５以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
【０３９２】
（３）遺伝子の取得方法
次に、本実施の形態における遺伝子の取得方法について説明する。本実施の形態における遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、例えば、前述の開示された配列情報などに基づいて、上記各遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離して、クローニングする方法が挙げられる。さらに具体的に言えば、上記各ｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ホヤのゲノムＤＮＡライブラリやｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【０３９３】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明の遺伝子配列を含むＤＮＡ断片の取得ができたか否かを、容易に確認することができる。
【０３９４】
また、機能上重要と考えられる領域や進化上よく保存されている領域の中から上記プローブの配列を選択して、ホヤやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリをスクリーニングすれば、上記各遺伝子と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を、単離及びクローニングできる可能性が高い。
【０３９５】
本発明の遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法としては、上記スクリーニングによる方法以外にも、例えば、ＰＣＲなどの増幅手段を用いる方法が挙げられる。具体的に言うと、まず、上記各ｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中から、それぞれプライマーを調製する。次に、これらプライマーを用いて、ホヤのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）などを鋳型にしてＰＣＲなどを行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を、大量に取得することができる。
【０３９６】
（４）タンパク質の取得方法
本発明のタンパク質の取得方法についても、特に限定されるものではない。例えば、まず、上記各遺伝子（ｃＤＮＡ配列）を導入した組換え発現ベクターを作製する。次に、大腸菌・酵母などの微生物又は動物細胞などに上記ベクターを組み入れた形質転換体を、周知の方法により取得する。そして、ベクターに導入されているｃＤＮＡを発現させることにより、ｃＤＮＡがコードするタンパク質を生産すれば、本発明のタンパク質を容易に取得することができる。
【０３９７】
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター、及び、宿主には様々なものがある。そのため、それら発現ベクター及び宿主は、目的に応じて選択すればよい。また、生産したタンパク質は、用いた宿主と、タンパク質の性質とに応じて、適切な条件下で精製及び取得すればよい。
【０３９８】
上記タンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法などを利用して塩基配列に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法が挙げられる。その他の方法としては、例えば、トランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法により、上記各ｃＤＮＡの塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えて、変異タンパク質を作製するという方法が挙げられる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【０３９９】
（５）遺伝子検出器具
次に、本実施の形態における遺伝子検出器具について説明する。本実施の形態の遺伝子検出器具は、本発明の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列、又はその相補配列を、プローブとして用いたものである。上記遺伝子検出器具としては、例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化して作るＤＮＡチップが挙げられる。なお、ここで言う「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
【０４００】
上記基盤上に固定化するオリゴヌクレオチドは、次の（i）及び（ii）の中から選ばれたＤＮＡ配列であって、そのＤＮＡ配列にあるコード領域内の７ヌクレオチド以上の連続したＤＮＡ配列、又はその連続したＤＮＡ配列の相補配列からなることがより好ましい。
(i)１以上９０４５以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるＤＮＡ配列
（ii）配列番号９０４７から９２０４のいずれかに示されるＤＮＡ配列
上記遺伝子検出器具のプローブとして用いる配列は、調製したｃＤＮＡのそれぞれについて、個々を識別することが可能な特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって、決定することができる。例えば、ＳＡＧＥ：Serial Analysis of Gene Expression法（Science 276:1268, 1997; Cell 88:243, 1997; Science 270:484, 1995; Nature 389:300, 1997; 米国特許第5,695,937 号）により、プローブとして用いる配列を決定することができる。
【０４０１】
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
【０４０２】
もちろん、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して、遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
【０４０３】
（６）組換え発現ベクター及び形質転換体
次に、本実施の形態の組換え発現ベクター及び形質転換体について説明する。本実施の形態の組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は、特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主（ホスト）細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるためにプロモーター配列を選択して、これと本発明に係る遺伝子とを各種プラスミドなどに組み込んだものを、発現ベクターとして用いればよい。
【０４０４】
なお、本発明の遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミドなどを、発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによって、マーカー遺伝子の発現から、本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
【０４０５】
なお、上記宿主（ホスト）細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、ホヤ由来の細胞をはじめとして、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeや分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫Caenorhabditis elegans、アフリカツメガエル（Xenopas laevis）の卵母細胞、各種哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができる。
【０４０６】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も、特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【０４０７】
本実施の形態の形質転換体は、本発明の遺伝子が導入された形質転換体であり、例えば、本発明の遺伝子の少なくとも１つを含有する組換え発現ベクターを含むものが挙げられる。すなわち、本発明の遺伝子を発現する形質転換体は、上記と同様の、従来公知の手法により生産することができる。もちろん、対象細胞（宿主細胞）の種類に応じ、従来公知の手法の中から最適な手法を選択することによって、本実施の形態の形質転換体を生産することが好ましい。
【０４０８】
（７）抗体
次に、本実施の形態の抗体について説明する。本実施の形態の抗体は、本発明のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。ここに言う公知の方法としては、例えば、文献（Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))」、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」）に記載の方法などが挙げられる。本実施の形態の抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
【０４０９】
（８）有用性
上記のように、本発明に係る遺伝子は、本発明者によって初めて明らかにされた、ホヤの発生段階において発現する新規遺伝子である。したがって、本発明に係る遺伝子、タンパク質などは、以下の有用性を有する。
【０４１０】
前述のように、ハエ、線虫、カエル、哺乳類など、様々な動物の体づくりは、基本的には同じ遺伝子及び分子を使ってなされていることが明らかになっている。また、脊索動物であるホヤの遺伝子は、前述のように、脊椎動物における遺伝子の重複がなく、遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っている。
【０４１１】
したがって、ホヤの発生段階に発現する遺伝子の解析により得られた知見は、単にホヤにおける発生のメカニズムの解明のみならず、ヒトを含む脊椎動物や脊索動物における発生のメカニズムの解明にも資するものである。
【０４１２】
そして、上記解明により得られた知見は、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムの解明にも資するものであり、さらに、医学上及び産業上へ有効利用できる。具体的には、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、そのような疾患の診断法及び治療法の開発などに有効利用できるものである。
【０４１３】
また、画期的な治療法として注目されている再生医療、遺伝子治療の実現にも、本発明の遺伝子、タンパク質などを利用できる可能性がある。例えば、上記のような発生機構を調べる基礎研究を通じて、再生医療、遺伝子治療に直接役立つ知見が得られる可能性がある。さらに、その得られた知見は、種々の応用面・臨床面での利用、例えば、形態形成異常などの各種遺伝子疾患に対する、新たな再生技術の開発、新たな遺伝子治療法の開発、各種遺伝子疾患の病態機序の研究、その治療薬の開発などの利用が期待できる。そして、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムを研究解析するための研究材料として、さらに、こうした研究を通じて、幹細胞の分化の誘導、及び分化した細胞の増殖を促すなどの新たな技術の開発にも、本発明に係る遺伝子、タンパク質などは有用である。
【０４１４】
上述のように、本発明の遺伝子は、発生段階において発現する。そのため、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患において、その疾患の原因となる遺伝子の発現を調節するなどの治療法及び治療薬の開発に、本発明の遺伝子を利用することができる。例えば、発生段階において、ある遺伝子の発現が微量なために起こる疾患では、その疾患の原因となる遺伝子の発現を促すなどの治療法及び治療薬の開発に、本発明に係る遺伝子を利用することができる。
【０４１５】
発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患においては、その疾患の原因となる遺伝子に変異が生じている。そのため、上記のような発生段階において発現する遺伝子の変異が関与している遺伝子疾患の診断に、本発明に係る遺伝子検出器具及び抗体を利用することができる。ここで言う遺伝子検出器具及び抗体の利用としては、例えば、上記遺伝子疾患の診断薬としての利用が挙げられる。
【０４１６】
さらに、本発明に係る遺伝子は、再生医療・遺伝子疾患といった医学薬学分野での利用だけでなく、海水などの水質調査といった環境測定にも利用することができる。例えば、測定したい環境でホヤを飼育して、そのホヤの遺伝子の発現量を、本発明に係る遺伝子検出器具（ＤＮＡチップ）などで測定する。この場合、測定したい環境の海水を採取して、その採取した海水中でホヤを飼育してもよい。
【０４１７】
上記のような環境測定により、種々の環境因子に対してそれぞれ感受性を示す遺伝子を特定することができる。例えば、ある地域の海水を用いて飼育したホヤのみが特別な遺伝子発現パターンを示したとすると、その海水を詳しく調査・分析することにより、その遺伝子発現の原因となる環境因子を特定することができる。このような環境測定は、例えば環境浄化や養殖など、産業上広く利用できるものである。
【０４１８】
さらに、本発明の遺伝子は、ホヤの形質転換体の作製に利用できる。例えば、食用のホヤの改良に、本発明の遺伝子を利用できる。食用としてのホヤには、例えば、マボヤ(Halocynthia roretzi)が挙げられる。
【０４１９】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０４２０】
本発明の各遺伝子の配列（ｃＤＮＡ配列）と、各遺伝子がコードするタンパク質とを、次の方法により決定した。
【０４２１】
（１）使用したホヤ
ホヤは、京都大学の舞鶴Fisheries Research Station及び東北大学のEducation and Research Center of Marine Bio-Resourcesで培養したカタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）を使用した。このホヤの成体を一定の光のもとで保持することにより、卵母細胞(oocyte)の成熟を促した。
【０４２２】
ホヤの卵子及び精子（精巣）は、生殖輸管から外科的に採取した。必要に応じて、受精後、１．３％チオグリコール酸ナトリウム（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）と、０．０６５％アクチナーゼＥ（Kaken Pharmaceutical Company, Tokyo, Japan）とを含んだ海水に卵子を浸すことによって、受精卵からコリオンを除いた。洗浄後、寒天で覆われたシャーレ内で、５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを含んでいるミリポア−フィルタでろ過された海水（MFSW：Millipore-filtered seawater）とともに、室温（１８℃〜２０℃）下に受精卵を保持した。そのような環境に受精卵を保つことによって、ホヤの卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体を得た。
【０４２３】
（２）ｃＤＮＡライブラリの作製
まず、上記カタユウレイボヤを用いて、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、ホヤの受精卵（受精直後）、卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体から抽出した。また、酸グアニジウムチオシアネイト−フェノール−クロロホルム法（ＡＧＰＣ法）(Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159(1987))により、上記ＲＮＡを抽出した。
【０４２４】
次に、上記ＡＧＰＣ法で抽出したＲＮＡを精製して、ｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）+ＲＮＡ）を得た。なお、オリゴテクスビーズ（Roche社製）を用いた２回の精製により、ポリ（Ａ）+ＲＮＡを得た。
【０４２５】
次に、上記精製されたポリ（Ａ）+ＲＮＡを、EcoRI部位を５'末端に有し、XhoI部位を３'末端に有する２本鎖のｃＤＮＡに変換した。その変換には、ｃＤＮＡ合成キット（Stratagene社製）を用いた。
【０４２６】
次に、EcoRI及びXhoIで処理されたベクター（pBSII-SK(-)）に、上記ｃＤＮＡを結合させた。上記ｃＤＮＡが結合したベクターを、エレクトロポレーションにより、XL-1 Blue MRF'菌（Stratagene社製）に導入して、ｃＤＮＡライブラリを得た。
【０４２７】
上記ライブラリは、Genetix Q-Pixロボットを使って３８４ウェルプレートに整列した。なお、上記ライブラリは、得られたＲＮＡの由来（受精卵、卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体の由来）が分かるように作製されている。
【０４２８】
（３）塩基配列のシークエンス
塩基配列のシークエンスは、下記の方法で行った。まず、３８４ウェルプレートからクローンを取り出し、ｃＤＮＡ挿入断片をＰＣＲにより増幅した。その増幅は、アガロース電気泳動法を用いて、良好な増幅であることを確認した。
【０４２９】
上記ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を精製した後、オートシークエンサーを用いて、そのＰＣＲ産物の塩基配列を従来の手法で決定した。なお、オートシークエンサーは、Academia DNA Sequencing Center, National Institute of Genetics, Japanのオートシークエンサー（ＡＢＩ３７００）を用いた。塩基配列の決定には、上記のオートシークエンサーとともに、ビッグダイターミネータ(the big-dye terminators)も用いた。なお、シークエンスにおいて、３'配列用のプライマーに固着オリゴｄＴプライマー(5'-(T)17-V-3')を、５'配列用のプライマーにＢＳ７４０(5'-CCGCTCTAGAACTAGTG-3')を用いた。
【０４３０】
（４）クラスタリング及び相同性検索
３’末端配列タグを用いてクローンの重複を調べ、クローンをクラスタに分類した。上記クラスタの分類には、ＦＡＳＴＡプログラムを用いた。それぞれのクラスタは、同一の遺伝子をエンコードするｃＤＮＡクローンを含んでいる。
【０４３１】
次に、３’側７６,９２０のＥＳＴ及び５'側７６,２５０のＥＳＴの塩基配列について、相同性検索を行った。相同性検索には、データベースとして、遺伝子データベース（ＤＤＢＪ ＤＮＡデータベース）と、タンパク質データベース（ＤＡＤ）とを用いた。相同性検索には、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ）を用いた。
【０４３２】
上記相同性検索により、遺伝子がコードするタンパク質の情報を得て、そのタンパク質の情報を分類した。その結果を、上記表３２８及び表３２９の「機能的分類」に示す。なお、タンパク質の情報を分類するにあたり、基本的には、文献(Lee, Y.-H. et al., Development, 126, 3857-3867(1999))に記載の分類法に従った。
【０４３３】
（５）ｃＤＮＡ塩基配列の決定
次に、上記相同性検索の結果（ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸの結果）を考慮して、約５,０００の遺伝子を選び出した。そして、それらの遺伝子の中から、４,６８１の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定した。
【０４３４】
なお、決定したｃＤＮＡの塩基配列は、本発明に係る上記タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域のほか、５'末端側と３'末端側とにそれぞれ非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むものが多いけれども、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含まないものもある。
【０４３５】
なお、配列ＩＤ４６７０〜４６８１（配列番号９１９３〜９２０４）の遺伝子については、文献（Kusakabe et al., Develop. Biol. ,242, 188-203(2002)）に記載の方法に基づいて、ホールマウントin situ ハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）によって、発現を調べた。そのin situ ハイブリダイゼーションの結果は、表３２８に示している。
【０４３６】
【発明の効果】
以上のように、本発明の遺伝子は、ホヤの発生段階において発現する遺伝子であり、ホヤの発生のみならず、脊索動物及び脊椎動物の発生において、重要な役割を担っている可能性が高い遺伝子である。それゆえ、本発明は、脊索動物及び脊椎動物の発生機構の解明に有用である。さらに、本発明は、このような発生機構に関する研究を通じて、医学上及び産業上への応用も期待されており、具体的には、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、さらに、そのような疾患の診断法及び治療法の開発に有用であるという効果を奏する。
【０４３７】
【配列表】
【配列表】
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2005160301000002.app
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