(57)【要約】【課題】  環境中などに存在する多環芳香族化合物を、簡易な操作で迅速かつ経済的に測定する方法を提供すること。【解決手段】  マウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子が染色体内に発現可能に導入されている形質転換酵母を、被験物とともに培養し、培養した形質転換酵母の細胞内で、ＡｈレセプターとＡｒｎｔと多環芳香族化合物との複合体を形成せしめ、該複合体を検出することを特徴とする、多環芳香族化合物の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子が染色体内に発現可能に導入されている形質転換酵母を、被験物とともに培養し、
培養した形質転換酵母の細胞内で、ＡｈレセプターとＡｒｎｔと多環芳香族化合物との複合体を形成せしめ、
該複合体を検出することを特徴とする、多環芳香族化合物の測定方法。
【請求項２】
下記の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質；
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｈレセプター；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質；
をコードするＤＮＡと、
下記の（ｃ）または（ｄ）に示す蛋白質；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｒｎｔ；
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質；
をコードするＤＮＡと、が染色体内に発現可能に導入されている形質転換酵母を、被験物とともに培養し、
形質転換酵母の細胞内で、前記ＡｈレセプターもしくはＡｈレセプターとして機能する蛋白質と、前記ＡｒｎｔもしくはＡｒｎｔとして機能する蛋白質と、多環芳香族化合物と、の複合体を形成せしめ、
該複合体を検出することを特徴とする、多環芳香族化合物の測定方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２において、前記複合体の検出を、該複合体と結合する性質を有するＤＮＡを使用して行うことを特徴とする、多環芳香族化合物の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換酵母を用いた多環芳香族化合物の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類をはじめとする多環芳香族化合物の検出や分析には、高価で大掛りな分析装置が必要であり、操作も煩雑である。また、機器分析では、被験物中に含まれる多種の多環芳香族化合物を分離して検出することは可能であるが、測定結果から環境中の総合的な毒性を判断することは難しい。
【０００３】
ところで、動物にダイオキシン類などの多環芳香族化合物を投与した場合に薬物代謝酵素の誘導を仲介する因子としてＡｈレセプター（アリルハイドロカーボンレセプター；aryl hydrocarbon receptor）の存在が知られている。また、Ａｈレセプターの補助因子としてＡｒｎｔ（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator）と呼ばれる核内移動因子も同定されている。ＡｈレセプターおよびＡｒｎｔは、多環芳香族化合物と複合体を形成してリガンド応答性の遺伝子発現に関与し、他の構造遺伝子の転写調節因子として機能するものである。
【０００４】
そして、ラットやハムスター由来のＡｈレセプター遺伝子を、レポーター遺伝子とともに細胞に導入し、得られた形質転換細胞を利用して化学物質などのレポーターアッセイを行う方法や、形質転換細胞を培養して得られるＡｈレセプターを利用してレセプターバインディングアッセイを行う方法が提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。しかし、上記公報の形質転換細胞は、宿主細胞として昆虫やヒト由来の培養細胞を用いる方法であるため、培養方法が煩雑で培養時間も長いことから、多環芳香族化合物の測定結果が出るまでに時間がかかるという問題がある。
【０００５】
一方、Ａｈレセプター遺伝子を導入して形質転換した微生物として、ヒト由来のＡｈレセプター遺伝子を導入したサッカロマイセス・シェレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）を用い、数種の多環芳香族化合物に対するリガンド応答性を調査した報告がなされている（例えば、非特許文献１）。しかし、この報告で使用されているヒト由来のＡｈレセプター遺伝子はリガンド応答性が低く、多環芳香族化合物の検出感度が低い。また、本発明者が行った試験結果によれば、ヒト由来のＡｈレセプター遺伝子を導入した形質転換酵母を用いる方法では、バックグラウンド値が高くなる傾向があるため、環境中に微量に含まれる多環芳香族化合物の測定に適したものとは言えない。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−３５４４９４号公報
【特許文献２】特開２００１−７８７８２号公報
【非特許文献１】ミラー（Miller）,「トキシコロジー・アンド・アプライド・ファーマコロジー［Toxicology and Applied Pharmacology］」160, 297-303(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、環境中などに存在する多環芳香族化合物を、簡易な操作で迅速かつ経済的に測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明の第１の態様は、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子が染色体内に発現可能に導入されている形質転換酵母を、被験物とともに培養し、培養した形質転換酵母の細胞内で、ＡｈレセプターとＡｒｎｔと多環芳香族化合物との複合体を形成せしめ、該複合体を検出することを特徴とする、多環芳香族化合物の測定方法に関する。
【０００９】
本発明の多環芳香族化合物の測定方法では、形質転換酵母を使用し、その細胞内でＡｈレセプターとＡｒｎｔと多環芳香族化合物との複合体（以下、「複合体」と記すことがある）を形成せしめ、これを物理的、化学的または生化学的測定方法を用いて検出する。形質転換酵母には、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子が導入されているため、ダイオキシン類をはじめとする多環芳香族化合物の測定において、高い検出感度が得られる。また、この形質転換体の宿主細胞は酵母であるため、培養細胞に比べて取り扱いが容易であり、増殖も速く測定に長時間を要しない。さらに、使用する機器も簡易なもので済み、安価に多環芳香族化合物の分析が可能になる。
【００１０】
また、本発明の第２の態様は、下記の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質；（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｈレセプター；（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質；をコードするＤＮＡと、下記の（ｃ）または（ｄ）に示す蛋白質；（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｒｎｔ；（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質；をコードするＤＮＡと、が染色体内に発現可能に導入されている形質転換酵母を、被験物とともに培養し、形質転換酵母の細胞内で、前記ＡｈレセプターもしくはＡｈレセプターとして機能する蛋白質と、前記ＡｒｎｔもしくはＡｒｎｔとして機能する蛋白質と、多環芳香族化合物と、の複合体を形成せしめ、該複合体を検出することを特徴とする、多環芳香族化合物の測定方法である。この第２の態様においても、第１の態様と同様の作用効果が得られる。
【００１１】
また、本発明の第３の態様は、第１または第２の態様において、前記複合体の検出を、該複合体と結合する性質を有するＤＮＡを使用して行うことを特徴とする、多環芳香族化合物の測定方法である。この第３の態様では、複合体と結合する性質を有するＤＮＡ（例えば、生体内において複合体の認識配列として機能するＤＮＡ）を利用することにより、感度良く多環芳香族化合物を測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明方法によれば、ダイオキシン類をはじめとする多環芳香族化合物を、迅速かつ安価に、しかも高い検出感度を以って測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に係る形質転換酵母は、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子とマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子とが染色体内に発現可能に導入されたものである。ここでマウス由来のＡｈレセプター遺伝子やマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子の塩基配列は公知であり、一般的に利用可能なデータベースからも入手できる［例えば、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子ＮＭ ０１３４４（ＮＣＢＩ）；例えば、マウス由来のＡｒｎｔ遺伝子 Ｕ１０３２５（ＮＣＢＩ）など］。
【００１４】
マウス由来のＡｈレセプター遺伝子の具体的な例としては、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡのほか、この配列番号３で表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００１５】
また、マウス由来のＡｒｎｔ遺伝子の具体的な例としては、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡのほか、配列番号４で表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡも用いることができる。
【００１６】
上記「配列番号３で表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡ」や、上記「配列番号４で表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡ」は、配列番号３マウス由来のＡｈレセプター遺伝子や配列番号４のマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子を元に、例えば部位特異的変位導入法などの方法で作成できる。
【００１７】
また、本発明の形質転換酵母は、下記の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡと、および下記の（ｃ）または（ｄ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡとが染色体内に発現可能に導入されたもの、としても特定され得る。  
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｈレセプター。  
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質。  
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｒｎｔ。  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質。
【００１８】
ここで、上記（ｂ）の「配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質」や上記（ｄ）の「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質」についても、前記と同様にマウス由来のＡｈレセプター遺伝子やマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子を元に、例えば、部位特異的変位導入法などの方法で作成できる。
【００１９】
本発明で形質転換に使用する酵母は、一般的に遺伝子組換え技術が適用できるものであれば特に制限なく利用できるが、もっとも技術の確立しているものとして、サッカロマイセス・シェレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）を用いることが好ましい。この他、分裂酵母（Schizoaccharomyces）や糸状酵母（Candida）等も遺伝子組換え技術が適用できるものであれば制限なく利用できる。
【００２０】
形質転換酵母の調製は、例えば以下のような手順で行うことができる。  
マウスのＤＮＡ中のＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子の作成は、上記配列番号３および配列番号４の塩基配列や、一般に利用可能なデータベース（前掲）の情報を元に、適切なプライマーを選定してＰＣＲ法を利用したり、化学合成などにより行うことができる。
【００２１】
ＰＣＲ法では、テンプレートとなるマウスのＤＮＡを元に、公知のＡｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子の部分的な塩基配列（例えば、配列番号３、配列番号４の塩基配列の一部など）をプライマーとしてＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子を合成することができる。ここでテンプレートとなるマウスのＤＮＡは、マウスの組織から、公知の遺伝子工学的手法により入手できる。例えば、マウスの肝臓などの組織由来のＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖のｃＤＮＡを合成し、得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えばプラスミドやファージなどのベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。このｃＤＮＡライブラリーから、公知のＡｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子の部分的な塩基配列（例えば、配列番号３、配列番号４の塩基配列の一部など）をプローブとして利用するハイブリダイゼーション法等によってテンプレートとなるＤＮＡを入手することができる。また、公知のＡｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子の部分的な塩基配列を元にプライマーを作成し、上記ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によって直接Ａｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子を合成することもできる。
【００２２】
また、化学合成の場合は、公知のＡｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号３、配列番号４の塩基配列）から、ホスホアミダイト法など既知の方法に従って合成すればよい。
【００２３】
次に、得られた遺伝子を適切な制限酵素（例えば、Ｓal I、Hpa I等）により処理し、同様に切断した酵母用シャトルベクター［例えば、pAUR101、pAUR224等（以上、タカラ酒造製）、pl-RED1（東洋紡製）等］と修飾酵素［例えば、Ligation High（東洋紡製）、T4 DNA Ligase（タカラ酒造製）、T4 DNA Ligase、DNA Ligase（以上、NEB製）等］を用いてライゲーションする。ライゲーションの終わったＤＮＡを例えばエレクトロポーレーション法や、リン酸カルシウム法などにより化学的処理をした大腸菌の細胞等に形質転換し、適量まで増殖させた後、例えば溶菌、吸着抽出などにより目的のプラスミドを取り出す。
【００２４】
上記のような処理をしたシャトルベクターを、例えばエレクトロポーレーション法や酢酸リチウム法などの化学的処理により、酵母に対し形質転換し、適切な選択培地等を用いて形質転換体を選抜する。形質転換酵母は、Ａｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子が染色体内に導入されているため、リガンド（多環芳香族化合物）応答性の遺伝子発現に関与する転写調節因子としてのマウスＡｈレセプターやマウスＡｒｎｔを産生する。
【００２５】
すなわち、形質転換酵母が多環芳香族化合物に接触すると、ＡｈレセプターとＡｒｎｔとが、多環芳香族化合物と複合体を形成する。この複合体は、ＤＮＡ上のＸＲＥ（Xenobiotic Response Element）とよばれるエンハンサー領域などの複合体認識配列に結合し、その下流の構造遺伝子の発現を誘導する。したがって、上記性質を利用し、複合体を直接公知の方法により測定することにより、多環芳香族化合物を検出することができる。
【００２６】
上記のようにして得られた形質転換酵母は、通常の培養条件で継代培養できるほか、凍結乾燥して保存することも可能である。
【００２７】
本発明方法による多環芳香族化合物の測定は、上記形質転換酵母を被験物に接触させることにより行われる。ここで多環芳香族化合物としては、例えば、ダイオキシン類、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、β−ナフトフラボン、３−メチルコラントレン、ベンゾピレンおよびその誘導体、ベンゾイミダゾール、ジベンゾアンスラセン、ペンタクロロフェノール、ジコホール、オクタクロロスチレンなどを挙げることができる。
【００２８】
被験物としては、特に制限はないが、例えばダイオキシン類による汚染が懸念される水、土壌、焼却灰などを挙げることができる。また、形質転換酵母を被験物に接触させる方法としては、例えば形質転換酵母、または形質転換酵母を含む培養液を試験物と混合することや、その混合状態を酵母の培養条件下で所定時間維持して多環芳香族化合物を形質転換酵母菌体に十分作用させることによって実施される。
【００２９】
形質転換酵母が多環芳香族化合物に接触すると、前記したようにＡｈレセプターとＡｒｎｔとが、多環芳香族化合物と複合体（ヘテロダイマー）を形成する。この複合体を測定することにより、多環芳香族化合物を検出することができる。複合体を測定する場合は、形質転換酵母菌体を例えば溶菌や破砕などの方法で処理し、複合体を抽出する。得られた複合体を例えば電気泳動、ＥＬＩＳＡ、バイオチップ（ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく検出方法）、質量分析器などを用いて測定する。ここで、生化学的方法により測定を行う場合は、前記複合体との結合能を有する複合体認識配列として公知のＸＲＥなどの塩基配列［上掲の非特許文献１を参照］を化学合成等の手法で作成したものを利用することができる。例えば、ＸＲＥ配列を含むＤＮＡに蛍光標識を付し、これと複合体を結合させた後、ポリアクリルアミド電気泳動により分離して蛍光標識のバンドを検出するゲルシフトアッセイなどが可能である。なお、本発明では、マウス由来のＡｈレセプターおよびＡｒｎｔを用いるため、前記ＸＲＥなどの複合体認識配列もマウス由来のものを用いることが好ましい。
【００３０】
本発明測定方法の一般的な実施方法の例を挙げれば、以下のとおりである。まず、測定においては、形質転換酵母を前培養して菌の増殖を図り、十分な菌体量を確保することが好ましい。  
前培養は、形質転換酵母として表１に示すようなアミノ酸、無機塩、ビタミン類、糖類等からなる培地で継続的に培養された状態のものを利用する場合には、培養液５０μｌを分取し、表１に示す培地５０００μｌ中に加え、例えば３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって行う。形質転換酵母が凍結乾燥菌体である場合には、例えばYPD培地などの栄養培地を加え、３０℃で２４時間培養した培養液を５０μｌ分取し、前記と同様に表１に示す培地５０００μｌに加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって前培養を行う。
【００３１】
［培地組成］
ドロップアウトパウダー＊１                  １．３ｇ
無機塩類＊２                                １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                            ５ｇ
炭素源（グルコースまたはガラクトース）      ２０ｇ
＊１；ドロップアウトパウダーの組成
アデニン                ２．５ｇ
Ｌ−アルギニン          １．２ｇ
Ｌ−アスパラギン酸      ６ｇ
Ｌ−グルタミン酸        ６ｇ
Ｌ−ヒスチジン          １．２ｇ
Ｌ−ロイシン            ３．６ｇ
Ｌ−リジン              １．８ｇ
Ｌ−メチオニン          １．２ｇ
Ｌ−フェニルアラニン    ３ｇ
Ｌ−セリン            ２２．５ｇ
Ｌ−スレオニン        １２ｇ
Ｌ−チロシン            １．８ｇ
Ｌ−バリン              ９ｇ
ウラシル                １．２ｇ
＊２；Yeast nitrogen W/O Amino Acid & Ammonium Sulfate（Difco社製）
前培養により菌が十分に増殖したら、被験物と前培養液を適当な割合で混合し、２８〜３０℃程度の温度条件で所定時間（例えば１８時間程度）培養して多環芳香族化合物を菌体に対し十分作用させる。被験物が固体の場合には、例えばジメチルスルホキシド（DMSO）等の菌体に対して毒性を示さない溶媒を用い、被験物を溶解し、あるいは被験物中の多環芳香族化合物を抽出してから混合することが好ましい。培養環境中に多環芳香族化合物が存在すれば、形質転換酵母内では、培養初期段階からＡｈレセプターやＡｒｎｔが産生され、複合体を形成する。従って本発明方法では、培養時間が短時間でも検出が可能である点で従来法に比べて優れている。
【００３２】
被験物と形質転換酵母との接触を行った後、公知の手法により形質転換酵母菌体を溶菌させる。溶菌は、例えば緩衝液中における超音波処理や、溶菌剤を添加した緩衝液で処理することによって実施できる。例えば以下に示すＺ緩衝液（溶菌剤として、界面活性剤のサルコシルを添加）などにより菌体を溶菌させる。
【００３３】
（Ｚ緩衝液）
Ｎａ２ＨＰＯ４                            ６０ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４                            ４０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                                  １ｍＭ
ＫＣｌ                                  １０ｍＭ
ジチオスレイトール（Dithiothreitole）    ２ｍＭ
サルコシル（Sarcosil）                  ０．２０％
次に、上記溶菌液を適量採取し、前記した測定方法により測定を実施し、ダイオキシン類などの多環芳香族化合物を検出する。
【００３４】
上記の本発明測定方法を簡単に実施するため、前記形質転換酵母を含む多環芳香族化合物の測定用キットを作成しておくこともできる。この測定用キットには、例えば、凍結乾燥形質転換酵母に加え、形質転換酵母の培養用組成物（液状または粉末状培地）、形質転換酵母を溶菌可能な成分を含む緩衝液、濃度既知の試料に基づき作成した検量線データなどの構成要素を含めることができる。キットに含める上記各構成要素は、それぞれ前記した内容に準じて調製することができる。なお、ポリスチレンに吸着しやすいメチルコラントレン等が被験物である場合は、試験操作にはガラス製の容器、器具を用いることが好ましい。  
【実施例】
【００３５】
以下、実施例および比較例等を挙げ本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって何ら制約を受けるものではない。
【００３６】
実施例１  
＜Ａｒｎｔ遺伝子の作成＞
Ａｒｎｔ遺伝子は、以下に述べるＲＴ−ＰＣＲ法により作成した。Ｃ５７ＢＬマウス肺細胞より、Absolutely ＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ MiniprepKit（東洋紡製）により全ＲＮＡ（Total−RNA）を抽出し、Poly（A) Quik mRNA（東洋紡製）を用いてｍ−ＲＮＡの精製を行った。これにより得られたｍ−ＲＮＡをRever TraAce−α（東洋紡製）により逆転写反応させることでｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことでＲＴ−ＰＣＲ法を行った。この時のＰＣＲ反応では、プライマーとして配列番号５の塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号６の塩基配列のリバースプライマーを用いた。
【００３７】
ＰＣＲ法に使用する反応液は以下の組成のものを用いた。  
反応液組成：５μｌＫＯＤ＋用緩衝液、５μｌ  ２ｍＭｄＮＴＰ、２μｌ  ２５ｍＭＭｇＣｌ２、１．５μｌ  プライマー、２μｌ  テンプレート、１μｌ  ＫＯＤ＋ポリメラーゼ（東洋紡製）
また、ＰＣＲ法における温度条件は、（１）９４℃で熱変性、（２）５３℃で３０秒のアニーリング、（３）６８℃で７分の伸長を１サイクルとし、（１）〜（３）を３０サイクル繰り返して反応を行った。
【００３８】
＜Ａｈレセプター遺伝子の作成＞
Ａｈレセプター遺伝子も、以下に述べるＲＴ−ＰＣＲ法により作成した。  
Ｃ５７ＢＬマウス肺細胞より、Absolutely ＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ MiniprepKit（東洋紡製）により全ＲＮＡ（Total−RNA）を抽出し、Poly（A) Quik mRNA（東洋紡製）を用いてｍ−ＲＮＡの精製を行った。これにより得られたｍ−ＲＮＡをRever TraAce−α（東洋紡製）により逆転写反応させることでｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことでＲＴ−ＰＣＲ法を行った。この時のＰＣＲ反応では、プライマーとして配列番号７の塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号８の塩基配列のリバースプライマーを用いた。
【００３９】
ＰＣＲ法に使用する反応液は以下の組成のものを用いた。  
反応液組成：５μｌＫＯＤ＋用緩衝液、５μｌ  ２ｍＭｄＮＴＰ、２μｌ  ２５ｍＭＭｇＣｌ２、１．５μｌ  プライマー、２μｌ  テンプレート、１μｌ  ＫＯＤ＋ポリメラーゼ（東洋紡製）
また、ＰＣＲ法における温度条件は、（１）９４℃で熱変性、（２）５３℃で３０秒のアニーリング、（３）６８℃で７分の伸長を１サイクルとし、（１）〜（３）を３０サイクル繰り返して反応を行った。
【００４０】
＜プロモーターとのライゲーション＞
Gal 1,10プロモーター領域を有するプラスミド（YEｐ181 Gal 1,10；ＧｅｎＢａｎｋ，ｐＢＭ２７２）をBamH IおよびSal Iで処理し、同じくBamH IおよびSal Iで処理したＡｒｎｔ遺伝子をLigation High（東洋紡製）を用い、１６℃でライゲーションした。得られた反応物をSma IおよびEcoR Iで処理した後、Sma IおよびMfe Iで処理したＡｈレセプター遺伝子をLigation High（東洋紡製）を用い、１６℃でライゲーションした。
【００４１】
＜シャトルベクターの作成＞
得られたプロモーターと上記遺伝子のライゲーション産物をSal IおよびHpa Iを用いて処理し、Sal IおよびSma Iで処理したシャトルベクターpAUR101（タカラ酒造製）にLigation High（東洋紡製）を用い、１６℃でライゲーションした。
【００４２】
＜形質転換＞
上記の作成されたシャトルベクターをサッカロマイセス・シェレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）W303株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＭＹＡ−１５１）に酢酸リチウム法によって形質転換した。この形質転換酵母は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９３２９として寄託済みである。
【００４３】
＜粗タンパク−多環芳香族複合体液の調製＞
多環芳香族の一種であるβ−ナフトフラボン（１０ｍＭジメチルスルホシキド溶液として）を最終濃度が１μＭになるように（×１０,０００）添加した培地に、前記形質転換酵母を接種し、２８℃で１８時間作用させた。形質転換酵母を遠沈した後、サンプルバッファーとともに超音波ホモジナイザーにより溶菌し、粗タンパク−多環芳香族複合体液を調製した。使用した培地組成およびサンプルバッファーの組成は以下のとおりである。
【００４４】
［培地組成］
ドロップアウトパウダー＊１    １．３ｇ
無機塩類＊２                  １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４              ５ｇ
＊１；ドロップアウトパウダーは、前記したものを用いた。  
＊２；Yeast nitrogen W/O Amino Acid & Ammonium Sulfate（Difco社製）
［サンプルバッファーの組成；  １０ｍｌ中］
０．５Ｍトリス−ＨＣｌ    １ｍｌ
グリセロール              １ｍｌ
蒸留水                    ８ｍｌ
１％ＢＰＢ                ３滴
【００４５】
＜検出のための蛍光標識ＤＮＡ溶液の調整＞
ＸＲＥ配列；ｔｔｇｃｇｔｇａｃａａｔｔｃ（配列番号９）を５つ反復するＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により増幅した後、常法に従いFluorescein（蛍光色素）で標識した。標識には、Fluorescein-12-dUTP［ベリンガー マンハイム（Boehringer Mannheim）社製, カタログ番号１０９３０７０］を使用した。
【００４６】
＜ゲルシフトアッセイ＞
上記粗タンパク−多環芳香族複合体液と蛍光標識ＤＮＡ溶液を反応させた後、ポリアクリルアミド電気泳動により分離した。電気泳動は、アクリル濃度１０％、ゲル厚３ｍｍのゲルを用い、１００Ｖ、８０ｍＡで３５分かけて実施した。泳動用緩衝液としては、１リットル中にトリス６０ｇ、グリシン２８．８ｇを含有し、ｐＨ８．３のものを使用した。
【００４７】
この電気泳動ゲルをメンブランにブロッティングしたものをゲルイメージャー（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長  ５２０ｎｍ）によりバンド検出した。メンブレンブロッティングは、ハイボンド−Ｎ［Hybond−N；アマシャム バイオサイエンス(Amersham Bioscience)社製：ＲＰＮ１２１０Ｎ］を用い、定法に従い室温で１０時間実施した。また、対照として、形質転換をしていないワイルドタイプの酵母菌体についても同様に処理し、ゲルシフトアッセイを実施した。
【００４８】
その結果、ワイルドタイプの酵母のレーンと比較し、形質転換酵母のレーンでは、蛍光標識ＤＮＡ溶液のＸＲＥ配列由来のバンド以外に溶出時間の遅れたバンドが検出された。これは、形質転換酵母内でＡｈレセプターとＡｒｎｔとβ−ナフトフラボンとの複合体が形成され、これがＸＲＥ配列に結合した結果、溶出時間の遅れとなって現れたものである。従って、形質転換酵母を使用することによって、被験物中のダイオキシン類などの多環芳香族化合物の存在を、迅速かつ経済的に確認することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の多環芳香族化合物の測定方法は、環境中などに存在するダイオキシン類などの多環芳香族化合物の簡易測定やモニタリングなどに利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。  
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。  
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。  
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。  
配列番号９
ＸＲＥ配列として合成されたオリゴヌクレオチド。  
【配列表】
2005058078000001.app