(57)【要約】      （修正有）【課題】悪性黒色腫、骨肉腫等のがんに対する新しい治療様式、およびがんの予防（再発防止を含む）および治療のための医薬組成物の提供。【解決手段】色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）またはその変異体またはそれをコードする核酸分子を含むベクターを含み、アポトーシスを誘導する医薬組成物の使用。【効果】がんの予防および/または治療のための有望な新規治療薬となる可能性がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシスを誘導する医薬組成物であって、
（ａ）色素上皮由来因子、
（ｂ）前記（ａ）の色素上皮由来因子に対して機能的に同等な特性を持つ、前記（ａ）の因子の変異体、および、
（ｃ）前記（ａ）の因子または前記（ｂ）の変異体をコードする核酸分子を含むベクター、
からなる群から選択される活性成分を含む医薬組成物。
【請求項２】
がん細胞におけるアポトーシスを誘導する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
がん細胞が固形がん由来である、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
がんの予防または治療のための医薬組成物であって、
（ａ）色素上皮由来因子、
（ｂ）前記（ａ）の色素上皮由来因子に対して機能的に同等な特性を持つ、前記（ａ）の因子の変異体、および、
（ｃ）前記（ａ）の因子または前記（ｂ）の変異体をコードする核酸分子を含むベクター、
からなる群から選択される活性成分を含み、がんの予防または治療が、がん細胞においてアポトーシスを誘導する上記成分の活性に由来する医薬組成物。
【請求項５】
がんが固形がんである、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
がんが悪性黒色腫である、請求項１から５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項７】
がんが骨肉腫である、請求項１から５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項８】
がんが、肺がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、結腸腺がんまたは神経膠腫である、請求項１から５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項９】
アポトーシスを誘導するベクターであって、
（ａ）色素上皮由来因子、または、
（ｂ）前記（ａ）の色素上皮由来因子に対して機能的に同等な特性を持つ、前記（ａ）の因子の変異体、
をコードする核酸を含むベクター。
【請求項１０】
がんを予防または治療するためのベクターであって、
（ａ）色素上皮由来因子、または、
（ｂ）前記（ａ）の色素上皮由来因子に対して機能的に同等な特性を持つ、前記（ａ）の因子の変異体、
をコードする核酸を含み、がんの予防または治療が、がん細胞においてアポトーシスを誘導する前記（ａ）の因子または前記（ｂ）の変異体の活性に由来するベクター。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の属する技術分野］
本発明は、活性成分として色素上皮由来因子またはその変異体を含む、がんの予防または治療のための医薬組成物に関する。
【０００２】
［発明の背景］
腫瘍の成長および拡大における主な事象は、血管新生促進因子および血管新生抑制因子のバランスの変化である「血管新生スイッチ」である（１）。多くの腫瘍は、ヒト血管内皮成長因子（VEGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF)およびインターロイキン−８など多数の血管新生因子を過剰発現するのみならず、トロンボスポンジン−１のような血管新生阻害因子を発現低下し、こうして血管新生に傾く（１１、１２）。
【０００３】
血管新生は、既存の毛細血管から新たな血管ネットワークが形成される過程であり、腫瘍の成長、侵入および転移に必要とされる（１、２）。細胞は生存のために１０〜２００μｍ以内に血管がなければならないため、腫瘍は、血管供給の確立なしには容量１〜２ｍｍ３以上の成長は不可能である（１、２）。腫瘍血管は、遺伝的に安定であり、すばやく薬剤耐性を生じさせる変異を蓄積しにくい（３）。それ故、がん細胞ではなく、腫瘍の成長を促進する血管系を薬物治療における標的にすることは、がん治療のもっとも有望な方法の１つであると考えられる。
【０００４】
色素上皮由来因子（PEDF)は、セリンプロテアーゼ阻害物質のスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、強力なヒト網膜芽細胞腫神経分化活性を有する因子としてヒト網膜色素上皮細胞のならし培地から初めて精製された（４）。近年、PEDFは、細胞培養および動物モデルの両方において血管新生の強力な阻害物質であることが示唆された。現に、PEDFは、網膜内皮細胞の増殖、移動を阻害し、虚血誘発性網膜新血管形成を抑制することが報告されている（５、６）。さらに、PEDFの喪失は、増殖性糖尿病性網膜症における血管形成活性に関連している（７）。PEDFは、虚血および加齢による黄斑変性に起因するそれぞれ網膜および脈絡膜新血管形成を効果的に抑制することも知られている（６、１４）。ごく最近、PEDF欠損マウスはすい臓がんに罹りやすいことが、ドールらによって報告された（１５）。いずれにせよ、腫瘍の成長および血管新生におけるPEDFの機能的役割は、依然として不明である。
【０００５】
さらに、PEDFは内皮細胞においてFasリガンドを上方調節し、それによって腫瘍血管特異的にアポトーシス感受性にすることが開示されている（１６）。
本研究においては、本発明者らはヒトPEDFを過剰発現するよう安定にトランスフェクトしたヒト悪性黒色腫細胞株G361のインビトロおよびインビボ増殖特性ならびにヒトPEDFで処理したヒトＭＧ６３骨肉腫細胞のインビトロ増殖特性を検討した。
【０００６】
［発明の概要］
色素上皮由来因子（PEDF)は、近年、哺乳動物の眼における血管新生に対する最も強力な阻害物質であり、増殖性糖尿病性網膜症のような血管性眼疾患においてPEDFレベルが低下していることが示されている。本発明者らはヒトPEDFを過剰発現するよう安定にトランスフェクトしたヒト悪性黒色腫細胞株G361のインビトロおよびインビボ増殖特性を検討した。黒色腫細胞株G361およびA375におけるPEDFタンパク質の発現レベルは、ヒトの培養メラノサイトのそれと同じであるが、２つの腫瘍細胞株における血管内皮成長因子（VEGF）の発現レベルは、正常メラノサイトのそれより非常に強かった。PEDFの過剰発現は、G361を移植したヌードマウスにおける腫瘍の成長および血管形成を有意に抑制することが見いだされた。さらに、インビトロにおけるG361細胞の増殖率は、PEDFをトランスフェクトした細胞において減少した。PEDFタンパク質は、何もトランスフェクトしていないG361細胞において濃度依存的に増殖遅延およびアポトーシス性の細胞死を引き起こし、それはFasリガンドに対する抗体による処理によって完全に阻害されることが示された。本発明は、がんの成長および拡大におけるPEDF処理の２つの有益な効果を提供する；１つは、腫瘍血管形成の抑制であり、もう１つは、腫瘍血管でない腫瘍細胞におけるFasリガンド依存的なアポトーシスの誘導である。それゆえ、PEDFは、がんに罹患する患者の予防および／または治療のための有望な新規治療薬となる可能性がある。
【０００７】
［発明の詳しい説明］
本発明は、
（１）アポトーシスを誘導する医薬組成物であって、
（ａ）色素上皮由来因子、
（ｂ）前記（ａ）の色素上皮由来因子に対して機能的に同等な特性を持つ、前記（ａ）の因子の変異体、および、
（ｃ）前記（ａ）の因子または前記（ｂ）の変異体をコードする核酸分子を含むベクター、
からなる群から選択される活性成分を含む医薬組成物；
【０００８】
（２）がん細胞においてアポトーシスを阻害する、前記（１）に記載の医薬組成物；
【０００９】
（３）がん細胞が、固形がん由来、例えば肺がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、骨肉腫、結腸腺がんまたは神経膠腫由来であり、なかでも悪性黒色腫由来または骨肉腫由来である、前記（２）に記載の医薬組成物；
【００１０】
（４）がんの予防または治療のための医薬組成物であって、
（ａ）色素上皮由来因子、
（ｂ）前記（ａ）の色素上皮由来因子に対して機能的に同等な特性を持つ、前記（ａ）の因子の変異体、および、
（ｃ）前記（ａ）の因子または前記（ｂ）の変異体をコードする核酸分子を含むベクター、
からなる群から選択される活性成分を含み、がんの予防または治療が、がん細胞においてアポトーシスを誘導する、上記成分の活性に由来する特徴とする医薬組成物；
【００１１】
（５）がんが、固形がん、例えば肺がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、骨肉腫、結腸腺がんまたは神経膠腫であり、なかでも悪性黒色腫または骨肉腫である、前記（４）に記載の医薬組成物；
【００１２】
（６）アポトーシスを誘導するベクターであって、
（ａ）色素上皮由来因子、または、
（ｂ）前記（ａ）の色素上皮由来因子に対して機能的に同等な特性を持つ、前記（ａ）の因子の変異体、
をコードする核酸を含むベクター；および、
【００１３】
（７）がんを予防または治療するためのベクターであって、
（ａ）色素上皮由来因子、
（ｂ）前記（ａ）の色素上皮由来因子に対して機能的に同等な特性を持つ、前記（ａ）の因子の変異体、
をコードする核酸を含み、がんの予防または治療が、がん細胞においてアポトーシスを誘導する前記（ａ）の因子または前記（ｂ）の変異体の活性に由来するベクター；に関する。
【００１４】
本発明者らは、黒色腫細胞においてPEDFによって誘導される増殖遅延およびFasリガンドに依存するアポトーシス性細胞死の誘発を初めて見い出した。本発明は、PEDFが黒色腫細胞におけるFasリガンド誘導によって当該腫瘍細胞に直接アポトーシスを引き起こすことができるという発見に基づいている。近年、顆粒球がFasリガンド関連アポトーシス誘導によって黒色腫肺転移を阻害することが明らかにされ（１７）、このことは我々の発見を支持している。
【００１５】
アポトーシスとは、高度に定型化された様式の自殺という外部刺激に対する細胞応答である、プログラムされた細胞死の過程を意味する。アポトーシスの事象には、細胞の縮小、細胞クロマチンの分解、そのゲノムの破壊などが含まれる。アポトーシスは、細胞挙動の３つの一般的なタイプの１つであり（他の２つは複製と分化である）、発生、組織ホメオスタシスおよび損傷への応答に必須の役割を果たしている。アポトーシスは、ネクローシスとは異なる、細胞のプログラムされた死である。
【００１６】
PEDF、その変異体または関連するベクターを含む医薬組成物は、アポトーシスを誘導する。本発明の医薬組成物は、アポトーシスの誘導が疾患の予防（再発防止を含む）および治療に有効である、そのような疾患に対処するために使用できる。対象となる疾患の例は、がんまたは肉腫などを含む。本発明において、予防には再発防止が含まれる。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、がんの予防（再発防止を含む）および治療に特に有用である。がんは、例えば、肺がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、悪性黒色腫、骨肉腫、結腸腺がんおよび神経膠腫などの固形がんを含み、悪性黒色腫、骨肉腫、結腸腺がんおよび神経膠腫が特に例示され、なかでも悪性黒色腫、骨肉腫の予防（再発防止を含む）または治療に有効である。
【００１８】
１．タンパク質
本発明において、単に「色素上皮由来因子」または「PEDF」と呼称する場合は、色素上皮由来因子タンパク質を意味する。色素上皮由来因子（PEDF)のアミノ酸配列およびその核酸配列は、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 90(4), 1526-1530(1993)に記載されており、GenbankのNo. M76979に登録されている。参考のため、ヒトPEDFのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。本発明によれば、PEDFには、ヒト、イヌ、ネコ、ウシおよびウマなどの哺乳類由来のすべての種類のPEDFが含まれ、ヒトPEDFが好ましい。
【００１９】
タンパク質をコードするDNAの発現によるPEDFの調製は、“Molecular Cloning”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)などの多数の出版物および参考文献をもとに行うことができる。具体的には、適切な発現ベクター（例えば、pBK-CMV）に本発明のDNAを挿入することにより発現プラスミドを構築する。次いで、発現プラスミドを適切な宿主細胞に導入し、形質転換体を得る。宿主細胞の例としては、大腸菌のような原核生物、酵母のような単細胞真核生物および昆虫または動物のような多細胞真核生物を含む。
発現プラスミドの宿主細胞への導入は、カルシウムリン酸法、電気的パルス法、リポフェクション法などの通常の方法によって行うことができる。所望のタンパク質は、常法によって適切な培地にて形質転換体を培養することによって調製される。こうして得られるタンパク質は、標準的な生化学的手順によって分離および精製できる。
【００２０】
本明細書に使用する、「PEDFと機能的に同等の特性を持つPEDFの変異体」とは、ヒトPEDFと機能的に同等の特性を持つ限り、PEDF変異体のすべてを含む。例えば、PEDFの変異体は、US6319687、WO03059248、WO9324529などに記載されている。
【００２１】
PEDF変異体の望ましい例は、ヒトPEDFのアミノ酸配列中に１つまたはそれ以上、あるいは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加といった変異を含み、かつヒトPEDFと機能的に同等な特性を持っているPEDF変異体を含む。
【００２２】
ヒトPEDFと機能的に同等な特性とは、腫瘍の血管新生の抑制および／または腫瘍細胞におけるFasリガンド依存的なアポトーシスの誘導であって、ヒトPEDFのそれと同等であるものを意味する。
【００２３】
本発明の変異体は、また前述したような組換え技術によって作製することができる。
【００２４】
上述のようにして作製される変異体が、機能的に同等な特性を持つか否かは、以下に示す実施例に従って証明することができる。
【００２５】
本発明のPEDFまたはその変異体を含む医薬組成物は、必要であれば通常の担体をも含むことができる。
【００２６】
本発明のPEDFまたはその変異体を含む医薬組成物は、例えば、皮内、皮下、あるいは静脈注射によって投与できる。好適には、上記のようなPEDFまたはその変異体は、がん塊が存在する部位への直接注入、あるいは特定のがんに対する抗体を利用することによって投与される。がんの標的化のため、従来のあらゆる方法を用いることができる。このような製剤中のタンパク質の量は、予防または治療される疾患、患者の年齢および体重などによって適度に変わり得るが、典型的には、0.0001mg〜1000mg、好適には0.001mg〜100mg、より好適には0.01mg〜10mgのPEDFまたはその変異体を、毎日（日に1回から数回に分けて投与することができる）、あるいは数日毎ないし数ヶ月毎に投与する。
【００２７】
２．核酸およびベクター
本発明はさらに、がんを予防または治療する医薬組成物であって、色素上皮由来因子、または色素上皮由来因子のアミノ酸配列中に1つまたは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加といった変異を含みかつ色素上皮由来因子と機能的に同等な特性を持つ色素上皮由来因子の変異体をコードする核酸を含むベクターを活性成分として含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
本明細書中に使用する「核酸」は、一本鎖または二本鎖であり得るDNAおよびRNAを含む。核酸は、典型的なDNA合成または遺伝子工学的方法、たとえば、“Molecular Cloning”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)のような標準テキストに記載の方法によって容易に調製される。
【００２９】
ベクターに組み込まれた核酸をがん患者に投与することによって、PEDFあるいはその変異体は、がん細胞中で高度に発現する。
【００３０】
そのようなベクターは、従来から使用されている遺伝子治療に有用なベクターを使用できる。ベクターには、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルスあるいはシンドビスウイルスのようなDNAまたはRNAウイルスに上述したような核酸が組み込まれたウイルスベクターがあり、それらを細胞に導入する。これらの方法の中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスあるいはヘルペスウイルスを使用するものは、特に好適である。ベクターの具体的な例としては、pAd/CMV/V5-DEST Gateway ベクター(Invitrogen)が挙げられる。
【００３１】
上記のような本発明のベクターを含む医薬組成物は、必要であれば通常の担体を含む。
【００３２】
本発明ベクターを含む医薬組成物は、例えば、皮内、皮下、あるいは静脈注射によって投与できる。好適には、上記のようなPEDFまたはその変異体は、がん塊が存在する部位への直接注入、あるいは特定のがんに対する抗体の利用によって投与される。がんの標的化のため、従来のあらゆる方法を用いることができる。このような製剤中のベクターの投与量は、予防または治療される疾患、患者の年齢および体重などによって適度に変わり得るが、典型的には、0.0001mg〜100mg、好適には0.001mg〜10mgの核酸を、毎日（日に1回から数回に分けて投与することができる）、あるいは数日毎ないし数ヶ月毎に投与する。
【００３３】
［実施例］
以下に示す実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例はいかなる意味においても本発明を制限するものではない。示されるすべての値は、± S. E. M. (標準誤差)を意味する。統計的な有意差は、一対比較のためのスチューデントのｔ検定を使用して評価した。p <0.05において有意差あり、と判断した。
【００３４】
参考例１
黒色腫細胞および正常なメラノサイトからのPEDFおよびVEGFの発現
１．１  細胞
２つのヒト悪性黒色腫細胞株G361およびA375 (ATCC Nos. CRL-142およびCRL-1619, American Type Culture Collection, Manassas, VA)を、10%ウシ胎児血清(FCS)と100単位/mlペニシリン／ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地中で培養した。正常ヒト新生児メラノサイトは、クラボウ(大阪)から購入し、製造元の取り扱い説明書に従って培養した。
【００３５】
１．２  ヒトPEDFに対するポリクローナル抗体(Ab)の調製
44残基のPEDFポリペプチド(VLLSPLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSFDIHGT: 配列番号３)に対するポリクローナル抗体を既報（８）のようにして調製した。得られたポリクローナル抗体（抗PEDF抗体）が実際、精製されたPEDFタンパク質に結合することを確認した(データ掲載せず）。
【００３６】
１．３  免疫蛍光顕微鏡法
カバーグラス上にて培養したG361、A375または正常メラノサイトに対して免疫蛍光染色を行った。各々の細胞型を、上記１．２に記載のようにして調製した抗PEDF抗体とともに、4℃で一晩インキュベートし、次に、これらの一次抗体をフルオレセインイソチアネート (FITC)−標識化ヤギ抗ウサギIgG(Vector Laboratories, Burlingame, CA)で検出した。蛍光染色は、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡(Laser Scanning Confocal Imaging System MRC 1024; Bio-Rad, Richmond, CA)を用いて検出した。結果を、図1Aに示す。
【００３７】
１．４  ウエスタンブロット解析
G361、A375および正常メラノサイトを、100-mmディッシュにて全面成長するまで培養し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗い、そして既報（９）のようにして細胞溶解した。タンパク質を、還元条件下のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、次いで、ニトロセルロース・フィルタ上にブロットした。フィルタを脱脂粉乳でブロックし、続いてヒトPEDF、ヒト血管内皮成長因子(VEGF) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)またはα-チューブリン(Santa Cruz Biotechnology) に対する一次抗体とともにインキュベートした。インキュベート後、フィルタをホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG (Amersham Pharmacia Biotech, New Jersey)で処理し、得られた免疫複合体を、既報（８）の強力化学発光検知システム(ECL) (Amersham)を用いて視覚化した。結果を、図1Bに示す。
【００３８】
１．５  結果
ヒト悪性黒色腫細胞株G361およびA375を、PEDFおよびVEGFの内性発現によって選択した。図1Aおよび1Bに示すように、G361およびA375細胞は大量のPEDFを発現しており、これら腫瘍細胞におけるPEDFの発現レベルは、正常なヒト培養メラノサイトのそれと同程度であった。対照的に、これらの細胞におけるVEGFの発現レベルはまったく異なり、G361およびA375細胞はVEGFの強力な発現によって特徴づけられるが、正常メラノサイト由来の細胞溶解液からはVEGFタンパク質はほとんど検出されなかった（図1B）。
【００３９】
１．６  考察
本研究において、２つのヒト悪性黒色腫細胞株G361およびA375がPEDFタンパク質を発現し、細胞溶解液中のPEDFの発現レベルは正常の(非悪性の）ヒトメラノサイトのそれと同程度であるという観察事項が初めて証明された。これは、内生PEDF生産の減少または損失のみが悪性黒色腫の発達に寄与するものでないことを示している。皮膚中の正常メラノサイトに由来するPEDFの生理的役割を解明することは、本研究の本来の目的を超える。本研究において本発明者らは、正常メラノサイトは最小量のVEGFしか産生しないが、2つの黒色腫細胞株はVEGFタンパク質を高発現することを明らかにした。メラノサイトは、VEGFの生産の増大に関係するプロセスである、細胞分裂活性化プロテインキナーゼによる構成的なシグナル活性化によって悪性黒色腫細胞へと形質転換され、黒色腫形質転換におけるVEGFの機能的な役割についての仮説が立証されている(１３)。
【００４０】
実施例１
PEDF発現ベクターおよびPEDF精製のための発現ベクターの調製
PEDFのcDNAを既報（８）のようにしてヒト胎盤cDNAライブラリー(Clontech, Palo Alto, CA)からクローニングし、哺乳類発現ベクターpBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA)に挿入した。
【００４１】
簡単に説明すると、PEDFをコードする遺伝子は、下記の条件によるPCRによってcDNAライブラリーから単離した：
PCRプライマー
Fw : 5’-CTCAGTGTGCAGGCTTAGAG-3’  (配列番号 4)
Rev : 5’-CCTTCGTGTCCTGTGGAATC-3’ (配列番号 5)
x 10 pfu buffer                         4 μl
dNTP (2mM each)                         4 μl
プライマー(Fw) (10 μＭ)                4 μl
プライマー(Rev) (10 μＭ)               4 μl
テンプレート(200 mg)
pfu ポリメラーゼ (STRATAGENE)         0.5 μl
蒸留水                          /total 40 μl
PCRの条件 (Parkin Elmer 2400)
(工程1 x 1)
95℃             5分
(工程2 x 30)
95℃           0.5分
60℃           0.5分
72℃           1.5分
(工程3 x 1)
72℃            10分
4℃             ∞分
【００４２】
増幅を確認した後、PCR産物をpBluescript II KSのSmaI部位に連結した。得られた構築物を、制限酵素による消化および配列決定によって確認し、さらに5’側にXba I部位を含むことを確認した。
【００４３】
Xba IおよびHind III (平滑末端化)で切断しておいたPEDFのPCR産物を、pBK-CMV(STRATAGENE)のNhe I (平滑末端化)およびXba I部位間にクローニングし、PEDF発現ベクターであるpBK-CMV-PEDFプラスミドを作製した。
【００４４】
次いで、PEDF精製のための発現ベクターを、下記の手法により構築した。
His-TagのオリゴDNAである、5’-AATTCCATCATCATCATCATCATTAAT-3’ (配列番号6)と、5’-CTAGATTAATGATGATGATGATGATGG -3’ (配列番号7) を合成し、互いにアニーリングさせた。PEDFの停止コドンを除去し、3’末端のEco RI部位を挿入するため、5’-CGGAATTCGGGGCCCCTGGGGTCC-3’(配列番号8)および上述したFwプライマー(配列番号4)を用い、pBK-CMV-PEDFをテンプレートとして使用し、PCRによってオリゴDNAを合成した。増幅産物を、Bgl IIおよびEco RIで切断し、切断した産物を上述したHis Tag用のアニールしたオリゴDNAに連結した。連結産物を、Bgl IIおよびXba Iで切断し、精製したpBK-CMV-PEDFに挿入した。その構築物を、制限酵素による消化と配列決定によって確認した。
【００４５】
翻訳エンハンサーを挿入するために、Sac IおよびXba Iを用いてpcDNA4-HisMax(Invitrogen)から単離したエンハンサーセグメントを、pBluescript II KSの同じ制限酵素部位へ連結した。クローンの単離後、ベクターをNco I 部位(平滑末端化)およびBam HI部位で切断し、ベクター骨格を得た。
【００４６】
PEDFの5’末端を修飾するために、5’-GCATGCAGGCCCTGGTGCTACTCC-3’(配列番号9)(Sph I部位はPEDF５’末端に挿入した)および5’-TTAGGTACCATGGATGTCTGGGCT-3’(配列番号10)を用い、テンプレートとしてpBK-CMV-PEDFを使用しオリゴDNAを合成し、合成した産物を、pGEM-T easy (Promega)に挿入した。クローンを単離し、次いでSph I部位(平滑末端化)およびBam HI部位で切断した。得られた断片を上述のベクター骨格に挿入した。
【００４７】
得られたベクターをそのSac I部位(平滑末端化)およびBam HI部位で切断することによって該ベクターから翻訳エンハンサー−PEDF5’部位を取り出した。翻訳エンハンサー−PEDF5’部分を含む断片を、Nhe I部位(平滑末端化)およびBam HI部位で切断した3’にHis-Tagを持つpBK-CMV-PEDFに連結し、PEDFの精製のための発現ベクターを得た。得られたベクターを、制限酵素による消化と配列決定によって確認した。
【００４８】
実施例２
PEDF過剰発現転換体の調製
FuGENE 6トランスフェクション試薬を用い、実施例1にて調製したPEDF発現ベクターまたは発現ベクターpBK-CMVのみを、サブ全面成長のG361またはA375培養物に安定にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を1:3に分け、400μg/ml Zeocin(Invitrogen)を含む完全増殖培地へ移し、形質転換体を選択した。安定にトランスフェクトされたクローンを拡大し、PEDF生産のために特性化した。
【００４９】
血清なしの培養培地中で48時間培養された安定にトランスフェクトされたG361細胞から、ならし培地を入手し、次に、Microcon 10 MWCO フィルタ(Amicon, Beverly, MA)を用い20倍に濃縮した。タンパク質を、還元条件下のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、つづいてニトロセルロース・フィルタにブロットした。フィルタを、脱脂粉乳でブロックし、続いてヒトPEDFに対する一次抗体とともにインキュベートした。インキュベート後、フィルタを、ホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG (Amersham Pharmacia Biotech, New Jersey)で処理し、得られた免疫複合体を、既報（８）に記載の強力化学発光検知システム(ECL) (Amersham)を用いて視覚化した。その結果を図２に示す。図中、レーン１は、精製したPEDFタンパク質をポジティブコントロールとして用いた結果、レーン２は、ヒトPEDF発現ベクターを安定にトランスフェクトしたG361細胞の結果、およびレーン３は、発現ベクターpBK-CMVのみをG361細胞にトランスフェクトした結果を示す。
【００５０】
ポジティブコントロールとして用いた精製PEDFタンパク質は、以下のようにして調製した。FuGENE 6 トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を製造元の取り扱い説明書に従って用い、293T細胞(ATCC No. CRL-11268, ATCC, Rockville, MD)に実施例１におけるPEDF精製用発現ベクターをトランスフェクトした。その後、細胞調製液からNi-NTA spin kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)を製造元の取り扱い説明書に従って用い、ならし培地からPEDFタンパク質を精製した。精製したPEDFタンパク質のSDS-PAGE解析では、約50kDaの分子量を持った単一のバンドが示され、そのバンドは、参考例１．２にて調製したヒトPEDFに対する抗PEDF抗体との反応性を示した。
【００５１】
図２に示すように、PEDFをトランスフェクトされたG361細胞は、増大した量のPEDFを分泌するが、対照ベクターをトランスフェクトされた細胞は、ほとんどまたは全く上清PEDFタンパク質を発現しなかった。PEDFをトランスフェクトされたA375細胞も、同様の結果を示した(データ掲載せず）。
【００５２】
実施例３
インビボにおける腫瘍細胞の成長に対するPEDF過剰発現の効果
PEDF過剰発現がインビボでG361腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ネズミへG361異種移植片を移植した。
【００５３】
BALB/c-nu/nuマウスを日本クレア（東京）から購入し、特定病原体未感染条件下において飼育した。すべての飼育手法は、北海道大学の動物の世話および使用に関する制度委員会によって提供されるガイドラインに沿って許可されたプロトコールで行なった。
【００５４】
実施例1で調製したヒトPEDF発現ベクターまたは発現ベクターpBK-CMVのみを安定にトランスフェクトされた全面成長G361細胞をトリプシン処理し、1 x 10７細胞/mlの密度にPBS中に再縣濁した。100万個の腫瘍細胞を、6週齢のメスの胸腺欠損ヌードマウス(n=5)それぞれの脇腹に皮内注入した。1組のデジタル測径器を使用し5日間おきに腫瘍の最小および最大直径を測定し、腫瘍容積を、以下の式を用いて計算した：
容積(mm３) = [(最小直径)２ x (最大直径)]/２ (１０)。
【００５５】
結果を図３に示す。対照ベクターをトランスフェクトされた細胞では、30日後に300-400 mm３に達する迅速に成長する腫瘍を形成した。対照的に、PEDF過剰発現細胞は、30日の観察期間にわたりG361細胞のインビボ腫瘍成長をほとんど完全に阻害した。
【００５６】
実施例４
腫瘍塊中の血管形成に対するPEDF過剰発現の効果
PEDF−トランスフェクトおよび対照ベクター−トランスフェクト腫瘍での腫瘍誘導血管新生の程度を検証するために、凍結切片を移植の30日後に腫瘍異種移植片から調製した。各腫瘍異種移植片の5つの異なる凍結切片を、FITC-結合ウサギ抗マウスCD31(PharMingen, San Diego, CA)を用いて染色した。核はプロピディウムヨーダイドで染色した。共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて、60倍の倍率で3つの異なる領域を各々検討した。各切片からの3つの異なる領域での蛍光陽性領域の割合を測定した。
【００５７】
その結果を、図４に示す。図４に示されるように、形態計測解析により、PEDFを過剰発現させたG361細胞由来の30日経過後の腫瘍における腫瘍血管は、対照ベクターをトランスフェクトした腫瘍細胞と比較して減少していることが明らかになった。
【００５８】
実施例５
PEDF過剰発現によって引き起こされる腫瘍細胞のアポトーシス
PEDF過剰発現がインビトロで腫瘍細胞増殖に影響を及ぼすかどうかを検証するため、ヒトPEDF発現ベクターまたは発現ベクターpBK-CMVのみを安定にトランスフェクトされた培養G361細胞の増殖率を測定した。
【００５９】
実施例１にて調製したヒトPEDF発現ベクターまたは発現ベクターpBK-CMVのみを安定にトランスフェクトしたG361細胞を、２４時間血清飢餓状態に置き、色素排除試験を用いて、２、４、６日後の細胞数を測定した。その結果を図５Aに示す。図５Aは、PEDFトランスフェクト体の増殖率が対照ベクタートランスフェクト細胞のそれよりも有意に低いことを示している。
【００６０】
さらに、何も導入していないG361細胞の増殖およびアポトーシスに対するPEDFタンパク質の効果を検討するため、Fasリガンドに対するモノクローナル抗体(PharMingen)10μg/mlの存在または不存在下の培地において様々な濃度のPEDFタンパク質とともにまたはタンパク質なしに細胞を培養した。６日間インキュベート後の生存細胞数を測定した。アポトーシスは、16時間インキュベート後のDNA断片を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)にて検討し、操作は製造元(Cell Death Detection ELISA, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)の取り扱い説明書に従った。何もトランスフェクトしていない培養G361細胞におけるPEDFタンパク質濃度依存的な増殖遅延およびアポトーシス性細胞死の誘導は、Fasリガンドに対する中和抗体の処理によって完全にブロックされた(図5Bおよび5C)。これらの結果は、PEDFがFasリガンド依存的に、間接的にG361細胞のアポトーシスを誘発することを示唆している。
【００６１】
次いで、PEDF−トランスフェクトまたは対照ベクター−トランスフェクト腫瘍細胞におけるアポトーシスを顕微鏡写真を用いて検討した。 
【００６２】
アポトーシスの程度を測定するために、移植後30日の腫瘍異種移植片から凍結切片を調製した。TUNEL解析をインサイチュウ（in situ）アポトーシス検出キット (Boeringer Mannheim)を用いて行った。アポトーシスを起こした細胞数を、免疫蛍光顕微鏡を用いて、200倍の倍率で10の任意に選択された領域で測定した。結果を、図6に示す。図６は、PEDF過剰発現G361細胞由来の腫瘍において、対照ベクターをトランスフェクトしたがん細胞に比べアポトーシスを起こした細胞が有意に増加したことを示している。
【００６３】
実施例６
骨肉腫への作用
腫瘍細胞として、ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞（理研細胞バンクから入手）を用い、１０％牛胎児血清（米国ＩＣＮ・バイオメディカルズ社）および１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地にて培養した。この培地に１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ濃度のＰＥＤＦ（S. Yamagishi, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002, 296(4), 877-882に記載のようにして調製）を添加し、２日間培養後、生存細胞数を数えた。生存細胞数は、S. Yamagishi, et al., Journal of Biological Chemistry, 1997, 272 (13), 8723-8730に記載の手法により計数した。比較として、既知の抗がん剤であるメトトレキセートを添加した場合と対照としてＰＥＤＦを添加しない場合も同様に実験を行った。
【００６４】
図７Ａに示すように、ＰＥＤＦは濃度依存的に生存細胞数を減少させ、１００ｎＭでは、非添加群に比べ５０％以下に減少させ、これはメトトレキセート０．３ｎＭと同程度の効果であった。ＰＥＤＦのこの効果は、参考例１．２にて調製した抗ＰＥＤＦ抗体（図中、Ａｂ）を添加することにより消失した。これは、生存細胞数の減少がＰＥＤＦの作用による特異的なものであることを意味している。ＰＥＤＦが骨肉腫培養細胞の成長を抑制することはＤＮＡ合成レベルでも確認された（図７Ｂ）。
【００６５】
次に、ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞（理研細胞バンクから入手）を２日間、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ濃度のＰＥＤＦ（S. Yamagishi, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002, 296(4), 877-882に記載のようにして調製）にて処理し、細胞膜を溶解して、細胞溶解物のカスパーゼ−３／７活性を蛍光分析（Apo-One homologous caspase-3/7分析法、米国プロメガ社）にて測定した。また、上清をＤＮＡ断片に対するＥＬＩＺＡ法（セル  デス  ディテクション、ドイツ国ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社）にて分析した。カスパーゼ−３／７はＤＮＡを断片化させる酵素であり、細胞死の実行に重要な役割を果たしている（Cohen, G.M., 1997, Biochemical Journal, 326(Pt1), 1-16参照）。図８に示したように、ＰＥＤＦは濃度依存的にカスパーゼ−３／７の活性を上昇させ、その結果ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞に細胞死をもたらした。
【００６６】
参考実験例
腫瘍細胞の生体内での増殖、転移には、腫瘍細胞自身から分泌される血管新生誘導因子の産生が重要である。ＰＥＤＦはＭＧ６３骨肉腫細胞に作用し、腫瘍細胞における血管新生の誘導に最も重要な血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を抑制した。すなわち、ＰＥＤＦの所定濃度で４時間処理したＭＧ６３骨肉腫細胞からＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡｓを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトＶＥＧＦｍＲＮＡ量を解析した。ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡを検出するためのプライマーは、たとえば、Ｓ．  ＹａｍａｇｉｓｈｉらのＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，２７７（２３），２０３０９−２０３１５に記載されている．ＲＴ−ＰＣＲ法は、Ｍ．  ＮｏｍｕｒａらのＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，  ２７０（４７），２８３１６−２８３２４に記載されている。測定結果を図９にまとめたように、ＰＥＤＦ１００ｎＭ処理群では、非処理群に比し、ほぼ５０％減少させることが明らかとなった。
このことから、PEDFの作用として、腫瘍からのVEGFの産生をPEDFが抑え、その結果血管新生を阻害することでin vivoで腫瘍のアポトーシスを引き起しうると考えることができる。
【００６７】
［発明の効果］
発明者らの本研究は、黒色腫の成長および拡大に対するPEDFの２つの有益な効果を提供した；1つは、腫瘍血管形成の抑制であり、もう１つは、腫瘍細胞におけるFasリガンド依存的なアポトーシスの誘導である。また、骨肉腫細胞に対しても、効果的なアポトーシス誘導作用を発揮し、顕著な抗腫瘍効果を示す。よって、PEDFは、黒色腫、骨肉腫を含むあるタイプのがんに罹患した患者に対して有望な新規予防（再発防止も含む）または治療薬となりうる。
【００６８】
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】G361、A375および正常メラノサイトの免疫蛍光染色（A）とウエスタンブロット解析（B）を示す。図１Aにおいて、挿入図は、一次抗体なしのネガティブ染色を示す。スケールバーは、１０μｍである。
【図２】G361細胞のならし培地におけるウエスタンブロット解析の結果であり、ヒトPEDF発現ベクターを安定にトランスフェクトしたG361細胞（レーン２）または発現ベクターのみをトランスフェクトしたG361細胞（レーン３）を示す。精製したPEDFタンパク質（0.2μｇ）は、ポジティブコントロールとして用いた（レーン１）。
【図３】G361異種移植マウスにおける腫瘍細胞の増殖に対するPEDF過剰発現の効果を示すグラフである。＊印は、対照細胞と比較してP＜0.0001であることを示す。
【図４】G361異種移植片における腫瘍血管を示す。G361異種移植片におけるCD31（白抜き領域）および核（点線部）のプロピディウムヨーダイドによる免疫蛍光染色の顕微鏡写真である。図４Aは、ヒトPEDF発現ベクターを安定にトランスフェクトされたG361細胞の顕微鏡写真を示す。図４Bは、pBK-CMV発現ベクターのみを安定にトランスフェクトしたG361細胞の顕微鏡写真を示す。スケールバーは、５０μｍである。図４Cは、腫瘍における蛍光陽性領域（１０００μｍ２毎）の定量分析を示す。＊印は、対照細胞と比較してP＜0.0001であることを示す。
【図５】インビトロにおけるG361細胞の増殖およびアポトーシスを示すグラフである。図５Aは、インビトロにおいて、ヒトPEDF発現ベクターまたはpBK-CMV発現ベクターのみを安定にトランスフェクトしたG361細胞の増殖率を示す。図５Bおよび５Cは、それぞれ、何もトランスフェクトしていないG361細胞の増殖およびアポトーシスに対するPEDFタンパク質の効果を示す。＊印は、未処理と比較してP＜0.0001であることを示す。
【図６】G361異種移植片におけるアポトーシス細胞を示す。G361異種移植片においてTUNELアッセイを用いたアポトーシス細胞（白抜き領域）およびプロピディウムヨーダイドにより染色した核（点線部）の顕微鏡写真である。図６Aは、ヒトPEDF発現ベクターを安定にトランスフェクトしたG361細胞の顕微鏡写真である。図６Bは、pBK-CMV発現ベクターのみを安定にトランスフェクトしたG361細胞の顕微鏡写真である。スケールバーは、５０μｍである。図６Cは、腫瘍におけるアポトーシス細胞の割合を定量分析した結果を示す。＊印は、対照細胞と比較してP＜0.005であることを示す。
【図７】ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞の増殖に対するPEDFタンパク質の効果を示すグラフである。図７ＡはヒトＭＧ６３骨肉腫細胞の増殖に対するPEDFタンパク質の濃度依存的な効果を示すグラフである。図中、Ａｂは抗PEDF抗体である。＊印は、ＰＥＤＦを添加していない対照細胞と比較してP＜0.05であることを示す。図７ＢはＰＥＤＦ添加によりＤＮＡ合成が抑制されたことを示すグラフである。図中、＊＊印は、ＰＥＤＦを添加していない対照細胞と比較してP＜0.01であることを示す。
【図８】PEDFタンパク質によるヒトＭＧ６３骨肉腫細胞のアポトーシス細胞死を示すグラフである。図８ＡはＰＥＤＦが濃度依存的にカスパーゼ−３／７の活性を上昇させることを示し、図８ＢはＤＮＡ断片の分析に基づくアポトーシス細胞死の計数を示すグラフである。＊＊印は、ＰＥＤＦを添加していない対照細胞と比較してP＜0.01であることを示す。
【図９】PEDFタンパク質によるヒトＭＧ６３骨肉腫細胞における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現抑制を示すグラフである。＊印は、ＰＥＤＦを添加していない対照細胞と比較してP＜0.05であることを示す。
【図１】
2005298473.tif 000002
【図２】
2005298473.tif 000003
【図３】
2005298473.tif 000004
【図４】
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【図５Ａ】
2005298473.tif 000006
【図５Ｂ】
2005298473.tif 000007
【図５Ｃ】
2005298473.tif 000008
【図６】
2005298473.tif 000009
【図７】
2005298473.tif 000010
【図８】
2005298473.tif 000011
【図９】
2005298473.tif 000012
【配列表】
2005298473000001.app