(57)【要約】【課題】  新規作用機序を有する血糖調節障害の予防・治療剤の提供。【解決手段】  ＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性調節剤を含む血糖調節障害の予防・治療用組成物；被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性を調節するか否かを評価することを特徴とする、血糖調節障害を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法、及び当該方法により得られる血糖調節障害の予防・治療剤；並びに遺伝性血糖調節障害の原因遺伝子及びＣＤＫ阻害因子遺伝子を欠損する非ヒト哺乳動物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性調節剤を含む、血糖調節障害の予防・治療用組成物。
【請求項２】
血糖調節障害が糖尿病である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
糖尿病がＩＩ型糖尿病である請求項２記載の組成物。
【請求項４】
血糖調節障害が低血糖症である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記発現及び／又は活性調節剤が、ＣＤＫ阻害因子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、ｓｉＲＮＡ、あるいは単鎖抗体、ドミナントネガティブ変異体、又は単鎖抗体、ドミナントネガティブ変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターである、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
前記発現及び／又は活性調節剤が、ＣＤＫ阻害因子、又はＣＤＫ阻害因子をコードする核酸を含む発現ベクターである、請求項１又は４記載の組成物。
【請求項７】
ＣＤＫ阻害因子がＣｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子である、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子がｐ２７Ｋｉｐ１である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性を調節するか否かを評価することを特徴とする、血糖調節障害を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
血糖調節障害が糖尿病である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
糖尿病がＩＩ型糖尿病である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
血糖調節障害が低血糖症である請求項９記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤＫ阻害因子がＣｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子である、請求項９〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子がｐ２７Ｋｉｐ１である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
スクリーニング系が非ヒト哺乳動物を用いるものである、請求項９〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
スクリーニング系が細胞を用いるものである、請求項９〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
スクリーニング系がタンパク質を用いるものである、請求項９〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
請求項９〜１７のいずれか１項記載の方法により得られうる血糖調節障害の予防・治療剤。
【請求項１９】
遺伝性血糖調節障害の原因遺伝子及びＣＤＫ阻害因子遺伝子を欠損する非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖調節障害の予防用・治療用の新規医薬組成物、血糖調節障害を予防・治療し得る物質の新規スクリーニング方法、新規非ヒト哺乳動物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン産生は、正常な生体機能の維持に不可欠である。インスリン産生を制御する一様式は、膵β細胞の増殖である。膵β細胞は、他の終末分化細胞とは異なり、増殖能を有することが知られており、実際、この能力を欠損するサイクリン依存性キナーゼ−４（cdk4）のノックアウトマウスは、β細胞数の減少によりインスリン欠乏をきたし、糖尿病を発症することが知られている（非特許文献１）。また、インスリン産生を亢進させる別の様式として、膵管に存在する前駆細胞による膵β細胞の新生がある。膵β細胞の新生では、膵β細胞数の増加に伴いインスリン産生が亢進し、血糖値が調節される。
【０００３】
近年、β細胞の機能を維持するために、インスリン、あるいはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ１）情報伝達系が重要な役割を担っていることが明らかとなりつつある。例えば、インスリン又はインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１：insulin like growth factor 1）受容体のノックアウトマウスでは、インスリン分泌障害が生じ、インスリン受容体基質２ (ＩＲＳ２: insulin receptor substrate 2) のノックアウトマウスではβ細胞の増殖が抑制されることが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、この情報伝達系の下流のエフェクター因子は未だ同定されていない。
【非特許文献１】Rane et al., Nature Genetics 22(1): 44-52 (1999)
【非特許文献２】Withers et al., Nature 391: 900-904 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
血糖調節に関与するタンパク質の同定は、血糖調節障害、例えば糖尿病や低血糖症に対する新たな作用機序を有する医薬品の開発につながる。本発明は、血糖調節障害に対する新規作用機序を有する予防・治療剤、新規作用機序を有する血糖調節障害を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ＣＤＫ阻害因子 (CDK inhibitor：ＣＤＫＩ) であるｐ２７Ｋｉｐ１について鋭意研究する中で、糖尿病患者、糖尿病モデル動物の膵島ではｐ２７Ｋｉｐ１の発現が亢進していることを発見した。また、本発明者らは、糖尿病モデル動物においてｐ２７Ｋｉｐ１を欠損させると、β細胞増殖の促進に伴いインスリン分泌能が改善し、血糖値が低下することを見出した。
これらの知見より、本発明者らは、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性と血糖調節能の異常、即ち血糖調節障害とが密接に関与していることを見出した。例えば、糖尿病では、膵島におけるＣＤＫ抑制因子の発現亢進や活性増強が生じていると考えられる。一方、低血糖症では、膵島におけるＣＤＫ抑制因子の発現抑制や活性低下が生じていると考えられる。
以上より、本発明者らは、ＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性を調節する物質が血糖調節障害を予防・治療し得る物質であること、並びに血糖調節障害を予防・治療し得る物質を開発するためには、ＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性を調節する物質をスクリーニングすればよいことなどを着想し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記の通りである：
（１）ＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性調節剤を含む、血糖調節障害の予防・治療用組成物；
（２）血糖調節障害が糖尿病である上記（１）の組成物；
（３）糖尿病がＩＩ型糖尿病である上記（２）の組成物；
（４）血糖調節障害が低血糖症である上記（１）の組成物；
（５）前記発現及び／又は活性調節剤が、ＣＤＫ阻害因子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、ｓｉＲＮＡ、あるいは単鎖抗体、ドミナントネガティブ変異体、又は単鎖抗体、ドミナントネガティブ変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターである、上記（１）〜（３）のいずれか記載の組成物；
（６）前記発現及び／又は活性調節剤が、ＣＤＫ阻害因子、又はＣＤＫ阻害因子をコードする核酸を含む発現ベクターである、上記（１）又は（４）記載の組成物；
（７）ＣＤＫ阻害因子がＣｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子である、上記（１）〜（６）のいずれかの組成物；
（８）Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子がｐ２７Ｋｉｐ１である、上記（７）の組成物；
（９）被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性を調節するか否かを評価することを特徴とする、血糖調節障害を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法；
（１０）血糖調節障害が糖尿病である上記（９）の方法；
（１１）糖尿病がＩＩ型糖尿病である上記（１０）の方法；
（１２）血糖調節障害が低血糖症である上記（９）の方法；
（１３）ＣＤＫ阻害因子がＣｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子である、上記（９）〜（１２）のいずれかの方法；
（１４）Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子がｐ２７Ｋｉｐ１である、上記（１３）の方法；
（１５）スクリーニング系が非ヒト哺乳動物を用いるものである、上記（９）〜（１４）のいずれかの方法；
（１６）スクリーニング系が細胞を用いるものである、上記（９）〜（１４）のいずれかの方法；
（１７）スクリーニング系がタンパク質を用いるものである、上記（９）〜（１４）のいずれかの方法；
（１８）上記（９）〜（１７）のいずれかの方法により得られうる血糖調節障害の予防・治療剤；
（１９）遺伝性血糖調節障害の原因遺伝子及びＣＤＫ阻害因子遺伝子を欠損する非ヒト哺乳動物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の予防・治療用組成物及び方法は、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性の調節という新規作用機序により血糖調節障害（例えば、糖尿病、低血糖症）を予防・治療し得るため有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性を調節し得る血糖調節障害の予防・治療剤の開発を可能にするため有用である。本発明の非ヒト哺乳動物は、血糖調節障害とＣＤＫ阻害因子との関連性の解析、及び血糖調節障害の予防・治療剤の開発を可能にするため有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
初めに、本発明を特定するために用いられる各用語について説明し、次いで、本発明の種々の局面について詳述する。
【０００９】
哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、ヒト、サル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００１０】
ＣＤＫ阻害因子とは、サイクリン−サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ：cyclin dependent kinase）複合体に結合することにより、又はサイクリン−ＣＤＫ複合体の形成を妨害することにより、ＣＤＫ活性を阻害するタンパク質をいう。ＣＤＫ阻害因子としては、Ｉｎｋ４ファミリーに属する因子（例えば、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ１９Ｉｎｋ４ｄ）、Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子（例えば、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ５７Ｋｉｐ２）が挙げられる。本発明では、ＣＤＫ阻害因子は、サイクリン−ＣＤＫ複合体に結合し、又はサイクリン−ＣＤＫ複合体の形成を妨害し、ＣＤＫ活性を阻害するタンパク質である限り特に限定されないが、好ましくはＣｉｐ／Ｋｉｐファミリーに属する因子であり、より好ましくはｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ５７Ｋｉｐ２であり、最も好ましくはｐ２７Ｋｉｐ１である。
【００１１】
血糖調節障害は、インスリン分泌能の変動による血糖調節異常に起因する疾患であれば限定されないが、好ましくは、膵β細胞増殖の異常に伴う血糖調節異常に起因する疾患であり得る。このような血糖調節障害としては、例えば、糖尿病、低血糖症が挙げられる。
【００１２】
糖尿病については、１９９９年に日本糖尿病学会から新たな判定基準が報告されている。この報告によれば、糖尿病型とは、随時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ以上、７５ｇ経口糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上のいずれかを示す状態である。また、上記糖尿病型に該当せず、かつ、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１１０ｍｇ／ｄｌ未満および７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ未満の両方を満たす状態（正常型）でない状態を、境界型と呼ぶ。本発明において糖尿病とは、広義であり上記糖尿病型及び境界型の両方を意味するが、好ましくは糖尿病型を意味する。
【００１３】
また、糖尿病としては、膵β細胞の破壊によるインスリンの絶対的欠乏を特徴とするＩ型糖尿病、インスリン分泌低下を主体とするものと、インスリン抵抗性を主体としインスリンの相対的不足を伴うものに大きく分類されるＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病などが挙げられるが、本発明では、ＩＩ型糖尿病が好ましい。
【００１４】
低血糖症は、血糖値が低い症状を呈するものである限り特に限定されず、高インスリン血症、食原性低血糖症、小児低血糖症、ケトン性低血糖症等が例示されるが、ＣＤＫ阻害因子の発現の亢進及び／又は活性の増強によりインスリン分泌能の低下が引き起こされると考えられることから、低血糖症としては高インスリン血症が好ましい。また、ＣＤＫ阻害因子の発現の亢進及び／又は活性の増強によりインスリン分泌能の低下のみならず腫瘍の増殖をも抑制できると考えられるため、高インスリン血症のなかでもインスリノーマが好ましい。
以下、本発明の種々の局面について説明する。
【００１５】
１．血糖調節障害の予防・治療用組成物及び方法
本発明は、ＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性調節剤を含む、血糖調節障害の予防・治療用組成物に関する。本発明はまた、哺乳動物においてＣＤＫ阻害因子の発現又は活性を調節することを特徴とする、糖尿病の予防・治療方法に関する。本方法は、例えば、上記組成物の投与により行なわれる。
【００１６】
血糖調節障害は、当該障害の種類に応じて、ＣＤＫ阻害因子の発現を抑制又は亢進することで、あるいはその活性を阻害又は増強することで予防・治療することができる。
【００１７】
例えば、血糖調節障害が糖尿病である場合には、ＣＤＫ抑制因子の発現を抑制及び／又は活性を阻害することで糖尿病を予防・治療でき、一方、血糖調節障害が低血糖症である場合には、ＣＤＫ抑制因子の発現を亢進及び／又は活性を増強することで低血糖症を予防・治療できる。
【００１８】
従って、血糖調節障害として糖尿病を予防・治療するためには、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性調節剤として、ＣＤＫ阻害因子の発現を抑制する物質、ＣＤＫ阻害因子の活性を阻害する物質を用いることができる。一方、血糖調節障害として低血糖症を予防・治療するためには、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性調節剤として、ＣＤＫ阻害因子の発現を亢進する物質、ＣＤＫ阻害因子の活性を増強する物質を用いることができる。
【００１９】
ＣＤＫ阻害因子の発現を抑制する物質としては、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＲＮＡ分解酵素、蛋白質合成阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性剤等が例示されるが、他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。ＣＤＫ阻害因子の発現を特異的に抑制する物質としては、アンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、ｓｉＲＮＡ、転写抑制因子、後述するスクリーニング方法で得られうるもの等が例示される。
【００２０】
アンチセンス核酸は、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸であり得る。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明では、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’-Ｏ-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いてアンチセンス核酸を合成することもできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
【００２１】
アンチセンス核酸の長さは、ＣＤＫ阻害因子のｍＲＮＡもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はないが、例えば、少なくとも約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ（初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、好ましくは約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００２２】
また、本発明のアンチセンス核酸は、ＣＤＫ阻害因子のｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＣＤＫ阻害因子の遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００２３】
リボザイムとは核酸を切断する酵素活性を有する核酸分子（主にＲＮＡ）をいい、本発明では、ＣＤＫ阻害因子のｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るものを意図する。最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、リボザイムは、配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。
【００２４】
デコイ核酸とは、ＣＤＫ阻害因子に対する転写調節因子が結合する領域を模倣する核酸分子をいい、ＣＤＫ阻害因子の発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、ＣＤＫ阻害因子に対する転写活性化因子が結合する領域を模倣する核酸分子であり得る。本発明では、デコイ核酸としては、ＣＤＫ阻害因子、例えば、ｐ２７ｋｉｐ１に対する転写活性化因子であるＦｏｘｏ−１［Medema et al., Nature 404: 782-787 (2000)］、Ａｈ受容体［Kolluri et al., Genes Dev. 13(13): 1742-53 (1999)］、並びにｐ２１Ｃｉｐ１に対する転写活性化因子であるｐ５３が結合する領域を模倣するものを用いることができる。また、ＣＤＫ阻害因子に対する転写活性化因子としては、その他にも、ＭｙｏＤ、ＳＴＡＴ１、ＩＲＦ１、Ｃ−ＥＢＰβ、ビタミンＤ受容体が報告されているので、これら転写活性化因子が結合する領域を模倣するものを用いてもよい。デコイ核酸は転写活性化因子が結合する領域と完全に一致していてもよいが、ＣＤＫ阻害因子に対する転写活性化因子が結合し得る程度の同一性を保持していればよい。デコイ核酸の長さは転写活性化因子が結合する限り特に制限されない。また、デコイ核酸は、同一領域を反復して含んでいてもよい。
【００２５】
ｓｉＲＮＡとは、ＣＤＫ阻害因子のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相当する二本鎖オリゴＲＮＡである。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として注目されている。
【００２６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、例えば、ＣＤＫ阻害因子のｃＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。デコイ核酸及びｓｉＲＮＡは、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
【００２７】
また、ＣＤＫ阻害因子の活性を阻害する物質としては、ＣＤＫ阻害因子の活性を阻害する限り特に限定されないが、他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。ＣＤＫ阻害因子の活性を特異的に阻害する物質としては、ＣＤＫ阻害因子に対する単鎖抗体、ドミナントネガティブ変異体、後述するスクリーニング方法で得られうるもの等が例示される。
【００２８】
ＣＤＫ阻害因子に対する単鎖抗体とは、ＣＤＫ阻害因子に対するモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を連結させたものをいう。ＣＤＫ阻害因子は、細胞周期のステージに応じて核内、細胞質内を行き来していることが知られている。従って、ＣＤＫ阻害因子に対する単鎖抗体を細胞内に導入すれば、当該単鎖抗体はＣＤＫ阻害因子に結合し、その作用を阻害すると考えられる。
【００２９】
ＣＤＫ阻害因子に対する単鎖抗体は、下記の通り作製することができる。先ず、適切な哺乳動物にＣＤＫ阻害因子を投与して免疫し、この免疫感作動物から得た抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマ（融合細胞）を調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いたＣＤＫ阻害因子に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する。次いで、当該クローンからｃＤＮＡライブラリーを作製し、保存性の高い免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常領域や可変領域のＮ末端配列等をコードするｃＤＮＡをプローブに用いて、当該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてＣＤＫ阻害因子モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの単離を行う。最後に、これら軽鎖及び重鎖可変領域のコーディング領域をリンカーを介して読み枠を合わせて連結し、これを発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞中で発現させることで、ＣＤＫ阻害因子に対する単鎖抗体を得ることができる。
【００３０】
ＣＤＫ阻害因子のドミナントネガティブ変異体とは、ＣＤＫ阻害因子に対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。ＣＤＫ阻害因子のドミナントネガティブ変異体は、天然のＣＤＫ阻害因子と競合することで間接的にその活性を阻害することができる。ＣＤＫ阻害因子のドミナントネガティブ変異体としては、サイクリン−ＣＤＫ複合体に結合するが、当該複合体の活性を阻害しないもの又はその阻害の程度が低減したものなどが挙げられる。このようなドミナントネガティブ変異体は、ＣＤＫ阻害因子の触媒ドメイン等に変異を導入することによって作製することができる。
【００３１】
変異の導入方法としては、当該分野で周知の方法が挙げられ、例えば、その蛋白質をコードする塩基配列を変換する方法を用いることができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット等を用いて、ODA-LAPCR法やGupped duplex法やKunkel法等の方法に従って行なうことができる。
【００３２】
ＣＤＫ阻害因子の発現を亢進する物質としては、ＣＤＫ阻害因子の発現を増加させる限り特に限定されないが、他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。ＣＤＫ阻害因子の発現を特異的に亢進する物質としては、ＣＤＫ阻害因子、転写活性化因子、後述するスクリーニング方法で得られうるもの等が例示される。
【００３３】
ＣＤＫ阻害因子の転写活性化因子は、ＣＤＫ阻害因子に特異的な転写活性化因子である限り特に限定されず、例えば、ｐ２７Ｋｉｐ１に特異的な転写活性化因子であるＦｏｘｏ１［Medema et al., Nature 404: 782-787 (2000)］、Ａｈ受容体［Kolluri et al., Genes Dev. 13(13): 1742-53 (1999)］、及びｐ２１Ｃｉｐ１に対する転写活性化因子であるｐ５３、並びにＭｙｏＤ、ＳＴＡＴ１、ＩＲＦ１、Ｃ−ＥＢＰβ、ビタミンＤ受容体が挙げられる。
【００３４】
ＣＤＫ阻害因子の活性を増強する物質としては、ＣＤＫ阻害因子の活性を向上させる限り特に限定されないが、他の遺伝子・蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。ＣＤＫ阻害因子の活性を特異的に増強する物質としては、後述するスクリーニング方法で得られうるもの等が例示される。
【００３５】
ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性調節剤として核酸分子を用いる場合は、該核酸分子を単独で、又はプラスミド若しくはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター）等の適切なベクターに挿入した後、当該分野で周知の方法に従って投与することができる。また、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性調節剤としてタンパク質分子を用いる場合は、剤形を工夫することによって当該分野で周知のＤＤＳ技術により当該タンパク質自体を投与することができ、また、当該タンパク質をコードする核酸分子を単独で、又は適切なベクターに挿入した後、当該分野で周知の方法に従って投与することもできる。
【００３６】
ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性調節剤は、所定の組織、例えば膵島特異的に作用させても、非特異的に作用させてもよい。膵島とは、膵臓内に存在する、ランゲルハンス島とも呼ばれるインスリンを分泌する内分泌組織をいう。インスリン分泌の調節という観点から、標的としては、膵島の中でも膵β細胞が好ましい。また、例えば、血糖調節障害が糖尿病の場合には、膵島以外の組織におけるＣＤＫ阻害因子の発現の抑制又は活性の阻害によりインスリン抵抗性を改善し得るので、本発明では、標的組織として膵島のみならず膵島以外の組織（例えば、肝臓、筋肉等）も意図される。
【００３７】
膵島特異的な作用を達成するための方法としては、当該分野で公知の任意の方法を用いることができる。例えば、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性調節剤を発現ベクターの形態で用いる場合には、核酸分子を膵島（例えば、膵β細胞）特異的なプロモーターに連結したベクターを利用することで、膵島特異的に作用させることができる。このようなプロモーターとしては、当該分野で公知のものを用いることができ、例えば、膵β細胞特異的なプロモーターとしては、インスリンプロモーターが挙げられる。
【００３８】
本発明の組成物は、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性調節剤と薬学的に許容され得る担体とを含む。
【００３９】
薬学的に許容され得る担体とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、粘稠剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、注射剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。
【００４０】
投与量は、対象の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性調節剤など）の種類などにより異なるが、通常成人（体重６０ｋｇとして）一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇの範囲で投与することができる。なお、他の哺乳動物の場合も、当該哺乳動物の体重で換算した量を投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
【００４１】
また、非経口投与としては注射が好ましく、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。注射剤は、必要に応じて、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００４２】
本発明の予防・治療用組成物及び方法は、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性の調節という新規作用機序により血糖調節障害（例えば、糖尿病、低血糖症）を予防・治療し得るため有用である。また、特定の血糖調節障害治療薬は、ある患者には優れた薬効を奏するのに対し、別の患者では薬効をほとんど奏さないといったことが知られている。この原因の一つとしては、血糖調節障害の発症原因や個人の遺伝的素因等の差異が考えられる。また、近年、個々の遺伝子型を考慮した上で特定の疾患についてより適切な治療を選択するいわゆるテラーメード治療が所望されている。本発明の予防・治療用組成物及び方法は、血糖調節障害においてテラーメード治療を実現する一手段であり得、また、血糖調節障害の予防・治療の幅を広げうるものであるため有用である。
【００４３】
２．血糖調節障害を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法及びキット
本発明は、被検物質が哺乳動物のＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性を調節するか否かを評価することを特徴とする、血糖調節障害を予防・治療し得る物質のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性の測定用要素を含む、血糖調節障害を予防・治療し得る物質のスクリーニング用キットに関する。
【００４４】
本スクリーニング方法では、血糖調節障害の種類に応じて、当該障害を予防・治療し得る物質が同定される。例えば、血糖調節障害が糖尿病である場合には、ＣＤＫ抑制因子について発現の抑制及び／又は活性の阻害を指標として糖尿病を予防・治療し得る物質をスクリーニングでき、一方、血糖調節障害が低血糖症である場合には、ＣＤＫ抑制因子について発現の亢進及び／又は活性の増強を指標として低血糖症を予防・治療し得る物質をスクリーニングできる。
【００４５】
本発明のスクリーニング方法に用いられる被検物質としては、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、有機低分子化合物、蛋白質、脂質、糖質、核酸の他、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００４６】
本スクリーニング方法で用いられるスクリーニング系としては、スクリーニングが可能である限り特に限定されないが、非ヒト哺乳動物、細胞、タンパク質を用いる系が例示される。以下、スクリーニング系として非ヒト哺乳動物、細胞、タンパク質のそれぞれを用いた場合の方法論を詳述する。
【００４７】
２．１．非ヒト哺乳動物によるスクリーニング方法
スクリーニング系が非ヒト哺乳動物である場合、本方法で用いられる非ヒト哺乳動物は特に限定されず、例えば、正常な非ヒト哺乳動物、血糖調節障害（例えば、遺伝性血糖調節障害）を有する非ヒト哺乳動物が用いられる。また、血糖調節障害として糖尿病を意図する場合には糖尿病を有する非ヒト哺乳動物が、血糖調節障害として低血糖症を意図する場合には低血糖症を有する非ヒト哺乳動物を用いることができる。本スクリーニング方法で用いられる糖尿病を有する非ヒト哺乳動物としては、遺伝子操作により糖尿病の症状を呈する遺伝子改変哺乳動物、並びに食餌の過剰摂取、自然発症等の遺伝子操作以外の手段により糖尿病の症状を呈する哺乳動物が挙げられる。一方、低血糖症モデル哺乳動物についても糖尿病モデル動物と同様であり、遺伝子操作により低血糖症の症状を呈する遺伝子改変哺乳動物、並びに遺伝子操作以外の手段により低血糖症の症状を呈する哺乳動物であり得る。
【００４８】
本スクリーニング方法は、非ヒト哺乳動物を用いる限り特に限定されないが、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、（ｉｉ）該非ヒト哺乳動物におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性を測定する工程、（ｉｉｉ）被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現を抑制又は活性を阻害しているか否かを評価する工程を含む。
【００４９】
工程（ｉ）において、被検物質は、被検物質の種類に応じて、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈注射、腹腔内投与）される。被検物質の投与量、投与期間などは、投与される物質の種類に応じて適宜決定することができる。また、被検物質は、上述した本発明の組成物に準じて投与することもできる。
【００５０】
工程（ｉｉ）において、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性は、当該分野で周知の方法により測定することができる。具体的には、非ヒト哺乳動物におけるＣＤＫ阻害因子の発現量は、蛋白質又はｍＲＮＡの測定に基づき決定される。蛋白質の発現量は、非ヒト哺乳動物より所望の組織を摘出し、その組織切片を調製後又は抽出液（例えば、細胞抽出液、核抽出液）を調製後、ＣＤＫ阻害因子に対する抗体を用いる免疫学的手法により決定することができる。また、ＣＤＫ阻害因子に対する抗体は自ら作製したものや市販のものを用いることができる。ｍＲＮＡの発現量は、非ヒト哺乳動物より所望の組織を摘出し、Total ＲＮＡを調製後、ノザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法等によって決定することができる。また、核／細胞質におけるＣＤＫ阻害因子の局在を、免疫染色により測定してもよい。
【００５１】
工程（ｉｉｉ）において、被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現又は活性を調節しているか否かは、対照の非ヒト哺乳動物におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性と比較することによって決定することができる。具体的には、血糖調節障害が糖尿病である場合には、被験物質を投与した非ヒト哺乳動物におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性が、被検物質を投与しない非ヒト哺乳動物におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性よりも有意に低下していれば被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現を抑制又は活性を阻害したと評価される。一方、血糖調節障害が低血糖症である場合には、被験物質を投与した非ヒト哺乳動物におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性が、被検物質を投与しない非ヒト哺乳動物におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性よりも有意に上昇していれば被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現を亢進又は活性を増強したと評価される。本スクリーニング方法により同定された、ＣＤＫ抑制因子の発現を抑制又は活性を阻害する物質は、糖尿病を予防・治療することができ、ＣＤＫ抑制因子の発現を亢進又は活性を増強する物質は、低血糖症を予防・治療することができる。
【００５２】
２．２．細胞によるスクリーニング方法
スクリーニング系が細胞を用いる系である場合、本スクリーニング方法で用いられる細胞は、ＣＤＫ阻害因子の発現／又は活性の評価に適切な細胞である限り特に限定されないが、例えば、膵島由来の細胞、肝由来の細胞等であり得る。また、膵島由来の細胞としては膵β細胞が好ましい。また、細胞は、所望の組織から直接的又は間接的に単離、入手されるもの、及び／又はその元の形質を保持していると考えられるものである限り特に限定されず、初代培養細胞、当該細胞から化学的処理、遺伝子操作等の手法により誘導された細胞株、細胞バンクより入手可能な細胞、市販の細胞が例示される。なお、初代培養細胞、細胞株は、当該分野で周知の方法により作製することができる。
【００５３】
また、血糖調節障害として糖尿病を意図する場合には、糖尿病を有する哺乳動物由来の細胞、増殖能が低下している細胞、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性が上昇している細胞などを用いることができる。一方、血糖調節障害として低血糖症を意図する場合には、低血糖症を有する哺乳動物由来の細胞、増殖能が上昇している細胞、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性が低下している細胞などを用いることができる。
【００５４】
本スクリーニング方法の一態様は、外来遺伝子を導入しない細胞（例えば、初代培養細胞、細胞株）を用いる系であり得る。
【００５５】
本スクリーニング方法の別の態様は、レポーター系である。従って、本スクリーニング方法は、レポーター遺伝子に対してＣＤＫ阻害因子の転写調節領域を作動可能に連結した構築物（例えば、プラスミド、ベクター）を導入した細胞を用いることもできる。ＣＤＫ阻害因子の転写調節領域は、レポーター解析が可能である限り特に限定されず、また、各ＣＤＫ阻害因子に応じてそれぞれ転写調節領域が知られているが、例えば、ＣＤＫ阻害因子の転写調節領域として、ｐ２７Ｋｉｐ１の転写調節領域［例えば、Medema et al., Nature 404: 782-787 (2000); Kolluri et al., Genes Dev. 13(13): 1742-53 (1999)］、ｐ２１Ｃｉｐ１の転写調節領域［例えば、Mol Cell. 8(1):57-69 (2001) 参照］を用いることができる。
【００５６】
レポーター遺伝子としては、検出可能なタンパク又は酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばGFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子、GUS(β−Glucuronidase)遺伝子、LUS(Lusiferase)遺伝子、CAT(Chloramphenicolacetyl transferase)遺伝子等が挙げられる。
【００５７】
さらに、本スクリーニング方法における他の方法論としては、ハイブリッドシステムや、その他の当該分野で公知の手法を用いることもできる。例えば、スリーハイブリッドシステムにおいて、被検物質の有無におけるサイクリン−ＣＤＫ複合体に対するＣＤＫ阻害因子の活性を測定することで、ＣＤＫ阻害因子の活性を増強又は阻害する被検物質を選択することができる。
【００５８】
本スクリーニング方法は、ＣＤＫ阻害因子の発現／又は活性の評価に適切な細胞を用いるものである限り特に限定されないが、例えば、（ｉ）培養培地において、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性の評価に適切な細胞に被検物質を接触させる工程、（ｉｉ）ＣＤＫ阻害因子を発現している細胞におけるＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性を測定する工程、（ｉｉｉ）被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性を調節しているか否かを評価する工程を含む。
【００５９】
工程（ｉ）において、被検物質は培養培地に予め添加されていてもよく、また、細胞を培養培地で一定時間培養した後に添加されてもよい。細胞と被検物質の接触時間としては、発現及び／又は活性の調節の評価が可能である限り特に限定されないが、例えば、約１５〜７２時間であり得る。また、培養は通常約３０℃〜４０℃で行なわれ、必要に応じて通気や撹拌が加えられる。培養培地としては、当該分野で周知の哺乳動物用培養培地を用いることができ、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地，ＤＭＥＭ培地，ＲＰＭＩ １６４０培地，１９９培地などが例示される。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。
【００６０】
工程（ｉｉ）において、ＣＤＫ阻害因子の発現及び／又は活性は、当該分野で周知の方法により測定することができる。例えば、細胞におけるＣＤＫ阻害因子の発現量は、蛋白質又はｍＲＮＡの測定に基づき決定される。蛋白質の発現量は、例えば、培養培地から細胞を回収し、細胞から測定用サンプル（例えば、細胞抽出液、核抽出液）を調製後、ＣＤＫ阻害因子に対する抗体を用いて決定することができる。ＣＤＫ阻害因子に対する抗体は自ら作製したものや市販のものを用いることができる。ｍＲＮＡの発現量は、培養培地から細胞を回収し、細胞からTotal ＲＮＡを調製後、ノザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法等によって決定することができる。また、レポーター系を用いた場合には、レポーター遺伝子の発現量が測定される。さらに、核／細胞質におけるＣＤＫ阻害因子の局在を、免疫染色により測定することもできる。
【００６１】
細胞におけるＣＤＫ阻害因子の活性は、当該分野で周知の方法により測定することができる。細胞を用いるＣＤＫ阻害因子の活性測定の詳細については、例えば、米国特許第6,635,450号、米国特許公開US 2003-0013638 A1、及びそれらの中で引用されている参考文献を参照のこと。
【００６２】
工程（ｉｉｉ）において、被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現又は活性を調節しているか否かは、対照細胞におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性と比較することによって決定することができる。具体的には、血糖調節障害が糖尿病である場合には、被験物質の存在下で培養した細胞におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性が、被検物質の非存在下で培養した細胞におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性よりも有意に低下していれば、被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現を抑制又は活性を阻害したと評価される。一方、血糖調節障害が低血糖症である場合には被験物質の存在下で培養した細胞におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性が、被検物質の非存在下で培養した細胞におけるＣＤＫ阻害因子の発現又は活性よりも有意に上昇していれば被検物質がＣＤＫ阻害因子の発現を亢進又は活性を増強したと評価される。本スクリーニング方法により同定された、ＣＤＫ抑制因子の発現を抑制又は活性を阻害する物質は、糖尿病を予防・治療することができ、ＣＤＫ抑制因子の発現を亢進又は活性を増強する物質は、低血糖症を予防・治療することができる。
【００６３】
２．３．タンパク質によるスクリーニング方法
スクリーニング系がタンパク質自体を用いるものである場合、本スクリーニング方法で用いられるタンパク質は、ＣＤＫ阻害因子単独、あるいはＣＤＫ阻害因子とサイクリン及び／又はサイクリン依存性キナーゼとの組合せであり得る。本スクリーニング方法では、ＣＤＫ阻害因子の活性として、サイクリン−ＣＤＫ複合体に結合することによる、又はサイクリン−ＣＤＫ複合体の形成を妨害することによる、ＣＤＫ活性の調節を評価することが好ましいので、タンパク質としては、ＣＤＫ阻害因子と、当該因子と相互作用し得るサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼとの組合せが好ましい。
【００６４】
本スクリーニング方法で用いられるサイクリンとしては、ＣＤＫ阻害因子の活性の測定に用い得るものである限り特に限定されないが、例えば、サイクリンＤ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）、サイクリンＥが挙げられる。具体的には、Ｉｎｋ４ファミリーに属する因子はサイクリンＤと、ｐ２１Ｃｉｐ１はサイクリンＤと、ｐ２７Ｋｉｐ１はサイクリンＤ及びサイクリンＥと結合することが知られている。従って、本スクリーニング方法では、サイクリンは、ＣＤＫ阻害因子の種類に応じて適宜用いられる。
【００６５】
本スクリーニング方法で用いられるＣＤＫとしては、ＣＤＫ阻害因子の活性の測定に用い得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６が挙げられる。具体的には、サイクリンＤはＣＤＫ４／６と、サイクリンＥはＣＤＫ２と結合することが知られている。従って、本スクリーニング方法では、ＣＤＫは、サイクリンの種類に応じて適宜用いられる。
【００６６】
従って、本スクリーニング方法では、サイクリン及びＣＤＫは、ＣＤＫ阻害因子の種類に応じて適宜用いられ得る。例えば、ＣＤＫ阻害因子としてＩｎｋ４ファミリーに属する因子又はｐ２１Ｃｉｐ１を用いる場合は、サイクリン及びＣＤＫとしてサイクリンＤ及びＣＤＫ４／６を、ＣＤＫ阻害因子としてｐ２７Ｋｉｐ１を用いる場合は、サイクリン及びＣＤＫとしてサイクリンＤ−ＣＤＫ４／６複合体、サイクリンＥ−ＣＤＫ２を用い得る。
【００６７】
ＣＤＫ阻害因子、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼの各タンパク質は、当該分野で周知の方法により得ることができる。例えば、これらのタンパク質は、それぞれ、哺乳動物においてこれらを発現している任意の組織より、又はこれらを発現している哺乳動物由来の細胞株より得ることができる。また、これらのタンパク質は、当該タンパク質をコードする核酸分子を用いて細胞系・無細胞系にて合成することができる。また、市販されている場合には、市販のタンパク質を用いることもできる。なお、これらタンパク質は、必ずしも精製される必要はなく、ＣＤＫ活性の調節を測定することができる限り、他のタンパク質等の共雑物を含む混合物であってもよい。
【００６８】
本スクリーニング方法は、スクリーニング系がタンパク質自体を用いるものである限り特に限定されないが、例えば、被検物質とＣＤＫ阻害因子との相互作用、又は被検物質とサイクリン-ＣＤＫ複合体とＣＤＫ阻害因子との相互作用の有無及び程度を測定、評価する工程、あるいは被検物質の存在下においてＣＤＫ阻害因子によるＣＤＫ活性の調節能を測定、評価する工程を含むものであり得る。
【００６９】
相互作用の有無は、当該分野で公知の相互作用解析方法、例えば、免疫学的手法、表面プラズモン共鳴、バインディングアッセイ（binding assay）等によって評価することができる。例えば、ＣＤＫ阻害因子、サイクリン、ＣＤＫのいずれかをチップ上に固定し、ＣＤＫ阻害因子、サイクリン、ＣＤＫの内、チップに固定した以外の２種の蛋白質、被検物質を含有する溶液を該チップ上にロードし、ＣＤＫ阻害因子、サイクリン、ＣＤＫ、被検物質を接触させる。次いで、表面プラズモン共鳴法により、被検物質の存在下でサイクリン−ＣＤＫ複合体に対するＣＤＫ阻害因子の結合及び解離を測定し、上記２種の蛋白質を含有するが、被検物質を含有しない溶液をチップ上にロードした場合の結合及び解離と比較する。そして、結合及び解離の速度あるいは結合量についての比較結果に基づいて、サイクリン−ＣＤＫ複合体に対するＣＤＫ阻害因子の結合活性を調節する被検物質が選択される。
【００７０】
相互作用の評価により選択される被検物質としては、サイクリン−ＣＤＫ複合体に対するＣＤＫ阻害因子の結合を低下させるものが含まれると考えられる。このような被検物質は、血糖調節障害の中でも糖尿病を予防・治療し得る物質としてスクリーニングされ得る。一方、相互作用の評価により選択される被検物質としては、サイクリン−ＣＤＫ複合体に対するＣＤＫ阻害因子の結合能を上昇させるものが含まれると考えられる。このような被検物質は、血糖調節障害の中でも低血糖症を予防・治療し得る物質である可能性がある。
【００７１】
また、被検物質の存在下におけるＣＤＫ阻害因子によるＣＤＫ活性の調節能は、当該分野で周知の方法により測定することができる。例えば、ＣＤＫ阻害因子がｐ２７Ｋｉｐ１である場合には、サイクリンＥ−ＣＤＫ２複合体のＣＤＫ２部分の部位特異的リン酸化、又はヒストンキナーゼ活性についてアッセイすることにより活性を評価することができる［例えば、Koff et al., Science 260: 536-539 (1993); Matsushime et al., Cell 65: 701-713 (1991); 並びに米国特許第6,635,450号、米国特許公開US 2003-0013638 A1、及びそれらの中で引用されている参考文献を参照のこと］。本スクリーニング方法により同定された、ＣＤＫ抑制因子の活性を阻害する物質は、糖尿病を予防・治療することができ、また、ＣＤＫ抑制因子の活性を増強する物質は、低血糖症を予防・治療することができる。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法及びキットは、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性の調節という新規作用機序を示す血糖調節障害を予防・治療し得る物質の開発を可能にするため有用である。また、本発明のスクリーニング方法及びキットは、血糖調節障害においてテラーメード治療を実現する一手段であり得、また、血糖調節障害の予防・治療の幅を広げうる血糖調節障害を予防・治療し得る物質の開発を可能にするため有用である。
【００７３】
上記スクリーニング方法により選ばれた、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性を調節し得る物質は、任意の医薬上許容される担体を配合することにより血糖調節障害の予防・治療剤とすることができる。従って、本発明は、本発明のスクリーニング法により選ばれたＣＤＫ阻害因子の発現又は活性を調節し得る物質を有効成分とする血糖調節障害の予防・治療剤を提供する。
【００７４】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００７５】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００７６】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。投与方法が視床下部付近への局所注入の場合、有効成分である物質を人工脳髄液に溶解もしくは懸濁させた注射液剤が好ましい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。プルーロニックゲルは体温でゲル化し、それ以下の低温では液体であることから、リガンドをプルーロニックゲルとともに局所注入して標的組織周辺でゲル化させることにより、長期持続性とすることができる。当該リガンド製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、物質および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００７７】
本発明のリガンド製剤の投与量は、ＣＤＫ阻害因子の発現又は活性を調節し得る物質の活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり約０．０００８〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００８〜約０．０２５／ｋｇである。
【００７８】
３．遺伝性血糖調節障害の原因遺伝子及びＣＤＫ阻害因子遺伝子を欠損する非ヒト哺乳動物
本発明は、遺伝性血糖調節障害の原因遺伝子及びＣＤＫ阻害因子遺伝子を欠損する非ヒト哺乳動物に関する。本発明はまた、遺伝性血糖調節障害を有する非ヒト哺乳動物とＣＤＫ阻害因子遺伝子欠損非ヒト哺乳動物とを交配させる非ヒト哺乳動物の作製方法に関する。
【００７９】
遺伝性血糖調節障害は、上記「血糖調節障害」のうち子孫に遺伝する（即ち、生殖系列細胞のゲノム変異を伴う）ものである限り特に限定されない。また、遺伝性血糖調節障害を有する非ヒト哺乳動物は、ヘテロ接合体であってもホモ接合体であってもよい。遺伝性糖尿病を有する非ヒト哺乳動物としては、例えば、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ｆａ／ｆａラット、それらのヘテロ接合体が挙げられる。また、遺伝性糖尿病を有する非ヒト哺乳動物としては、例えば、インスリン受容体、インスリン様増殖因子−１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、インスリン受容体基質−２（ＩＲＳ２）、ｐ７０ｓ６ｋ、Ｃｒｅｂ等の既知のインスリン産生に関連するシグナル伝達因子（但し、ＣＤＫ阻害因子を除く）の遺伝子を欠損する哺乳動物が挙げられる。遺伝性血糖調節障害を有する非ヒト哺乳動物は、当該分野で周知の方法により作製してもよいが、市販されているものを購入することもでき、また、受託されているものを入手してもよい。
【００８０】
ＣＤＫ阻害因子遺伝子欠損非ヒト哺乳動物は、ＣＤＫ阻害因子ノックアウト哺乳動物であり、ヘテロ接合体、ホモ接合体のいずれであってもよい。
ＣＤＫ阻害因子遺伝子欠損非ヒト哺乳動物は、既報［Nakayama et al., Cell 85(5): 707-20 (1996)］に従い作製してもよいが、市販されているものを購入することもでき、また、受託されているものを入手してもよい。
【００８１】
遺伝性血糖調節障害を有する非ヒト哺乳動物とＣＤＫ阻害因子遺伝子欠損非ヒト哺乳動物との交配は、当該分野で周知の方法により行なうことができる。なお、交配は同種間で行なわれるが、系統は同じであっても異なっていてもよい。また、得られた非ヒト哺乳動物が遺伝性血糖調節障害の原因遺伝子及びＣＤＫ阻害因子遺伝子の両方を欠損しているか否かは、当該分野で周知の方法、例えば、ＰＣＲ等により確認することができる。
【００８２】
本発明の非ヒト哺乳動物は、血糖調節、例えば、糖尿病、低血糖症に対するＣＤＫ阻害因子の作用の解析に有用である。また、本発明の非ヒト哺乳動物に由来する卵子、精子、受精卵、胚性幹細胞、組織（例えば、膵臓、膵島、肝臓、骨格筋、脂肪）なども、本発明の非ヒト哺乳動物の作製、及び血糖調節に対するＣＤＫ阻害因子の作用の解析に有用である。さらに、本発明の非ヒト哺乳動物に由来する細胞は、血糖調節に対するＣＤＫ阻害因子の作用の解析に有用である。血糖調節に対するＣＤＫ阻害因子の作用の解析に好適な細胞としては、例えば、膵β細胞、膵β細胞の前駆細胞、肝細胞、筋芽細胞、脂肪細胞が挙げられ、また、当該細胞は、初代培養細胞、株化細胞のいずれであってもよい。これら細胞は、当該分野で周知の方法により調製することができる。
【００８３】
以下に参考例、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００８４】
方法
マウスは、温度を制御した施設にて、厳密な12時間の明暗サイクルで維持し、餌及び水を自由に摂取させた。マウスには、6.5% (w/w) 脂肪、47%炭水化物、23.5%蛋白質を含有する標準的なダイエット食を与えた。体重、fed blood glucoseは、毎週午前9：00−11：00に測定した。
【００８５】
糖負荷試験 (glucose tolerance test)、インスリン負荷試験 (insulin tolerance test)
糖負荷試験は、11-12週齢マウスを16時間絶食させた後、体重1 g当たり15 mgのD-グルコースを腹腔内投与した。t=0, 15, 30, 60, 120分に血液を尾静脈から回収し、グルコース、インスリンを測定した。インスリン負荷試験は、9-10週齢のマウスに、体重1 kg当たり1 Uのヒトインスリンを腹腔内投与し、t=0, 15, 30, 60分に血糖値を測定した。
【００８６】
免疫染色
取り出した器官を、10% bufferedホルマリン中に置き、パラフィンに包埋し、2-5 μmの切片を調製した。この切片を、p27 (Transduction Lab)に対する抗体で染色した。
【００８７】
参考例１：2型糖尿病患者の膵島におけるp27発現の解析
先ず、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 (CDKI) が糖尿病の発症に関与するか否かを調べるため、2型糖尿病患者の膵切片を、CDKIの一分子種であるp27に特異的な抗体を用いて免疫染色した。また、膵島におけるp27の発現を定量・比較するために、2型糖尿病患者 (DM (+))、及び非2型糖尿病被験体 (DM (-))において、腺房-核、膵島-核、膵島-細胞質の染色の相対強度をスコア付けし、解析した。
その結果、β細胞−核/腺房細胞−核におけるp27発現比は、糖尿病患者で上昇し、β細胞/α細胞比と負の相関を示した（図１Ａ）。また、β細胞−核/β細胞−細胞質におけるp27発現比は、糖尿病患者で上昇し、β細胞/α細胞比と負の相関を示した（図１Ｂ）。
【００８８】
参考例２：2型糖尿病モデル動物の膵島におけるp27発現の解析
p27の細胞内局在は、細胞増殖に対する「ブレーキ」としての機能に重要である。活性p27は核内に局在し、サイクリン依存性キナーゼ (CDK) に結合、阻害する。一方、不活性p27は細胞質内に局在し、ユビキチン−プロテオソーム経路を介して分解される。従って、参考例１で示された膵島-核/膵島-細胞質におけるp27発現比の増加は、2型糖尿病の発症においてp27がβ細胞増殖の「ブレーキ」として機能していることを示唆すると考えられた。
そこで、p27について2型糖尿病モデル動物でも2型糖尿病患者と同様の現象が確認されるか調べるため、2型糖尿病モデル動物であるIRS2 (insulin receptor substrate-2) -/-マウス（既報［Withers et al., Nature 391: 900-904 (1998)］に従い作製）、db/dbマウス（Clea Japanより入手）の膵切片を、p27に対する特異的な抗体を用いて免疫染色した。
その結果、8週齢の雄Irs2-/-マウスの膵島では、細胞質、核のいずれでもp27蛋白質の発現が亢進していた（データ示さず）。興味深いことに、この8週齢のマウスの血糖値はほぼ正常であり、Irs欠乏は、高血糖ではなくp27発現を亢進するようであった。これにより、p27の発現亢進は高血糖による二次的な変化ではなく、Irs2欠損による１次的な変化と考えられた。また、db/dbマウスでは、p27の発現が肥満・糖尿病の進行に伴い次第に亢進するとともに膵島の核に主に局在した（データ示さず）。
【００８９】
実施例１：Irs2、p27欠損マウスの作製
Irs2、p27を欠損させたマウスを、Irs2+/-マウスとp27+/-マウスとの交配により作製した。なお、Irs2+/-マウスは、既報［Withers et al., Nature 391: 900-904 (1998)］に従い作製し、mixed C57BL/6J×129Svバックグランドで維持した。p27+/-マウスは、既報［Nakayama et al., Cell 85(5): 707-20 (1996)］に従い作製し、mixed C57BL/6Jバックグランドで維持した。次いで、作製されたIrs2+/-、p27+/-マウスを交配させ、野生型 (wt）、p27+/-、p27-/-、Irs2-/-、Irs2-/--p27+/-、Irs2-/--p27-/-の各マウスを作製した。
【００９０】
参考例３：Irs2-/-マウスにおける随時血糖の測定
次いで、β細胞増殖の負の調節因子としてのp27の機能を検証するため、実施例１で作製されたマウスについて随時血糖の測定を行なった。
その結果、Irs2-/-マウスでは、生後7-8週でわずかに高血糖の症状を呈し、この症状はさらに2-3週間持続した（図２）。p27遺伝子の破壊は、この期間における高血糖に影響しなかった。一方、顕著な高血糖が生後およそ12週のIrs2-/-マウスで生じたものの、p27遺伝子の破壊はこの進行を阻害した（図２）。
【００９１】
参考例４：Irs2-/-マウスにおけるp27欠損の影響
参考例３で観察されたIrs2-/-マウスにおけるわずかな高血糖、顕著な高血糖は、それぞれ、インスリン抵抗性、β細胞不全に起因し得ると考えられた。そこで、この仮説を検証するため、インスリン負荷試験 (ITT)、腹腔内グルコース負荷試験 (IP-GTT) を行なった。
その結果、ITTでは、Irs2-/-、Irs2-/--p27+/-、Irs2-/--p27-/-マウスが同様のインスリン抵抗性を示した（図３）。しかしながら、IP-GTTでは、Irs2-/--p27+/-、Irs2-/--p27-/-マウスは、Irs2-/-マウスに比べ、インスリン分泌、耐糖能 (glucose tolerance) のいずれも改善した（図４Ａ，Ｂ）。
以上より、p27がIrs2-/-マウスにおけるインスリン抵抗性に実質的に影響を及ぼさないこと、Irs2-/-マウスにおける高血糖がp27の阻害により改善されることが明らかとなった。
【００９２】
実施例２：レプチン受容体、p27欠損マウスの作製
次いで、p27の効果を、レプチン受容体欠損db/dbマウスで試験することとした。db/dbマウスは、肥満により誘導される末梢インスリン抵抗性、肝臓グルコース過剰産生、膵インスリン分泌不全を生じる十分に確立された2型糖尿病の遺伝モデルである。
C57BL/6KsJバックグランドのdb/+マウスは、Clea Japanから入手した。このdb/+マウスを、実施例１で作製されたp27欠損マウスと交配させ、mixed C57BL/6J×C57BL/KsJバックグランドのdb/+-p27+/-マウスを得た。次いで、二重ヘテロ接合F1子孫を互いに交配させ、p27+/+、p27+/-、p27-/-のdb/dbマウスを作製した。db及び破壊されたp27遺伝子を有するマウスを、５世代にわたってC57BL/KsJバックグランドとさらに戻し交配した。
【００９３】
参考例５：db/dbマウスにおけるp27欠損の影響
次いで、実施例２で作製したマウスを用いて、db/dbマウスにおけるp27欠損の影響について試験した。
その結果、破壊されたp27遺伝子 (p27+/-又はp27-/-) を有するdb/dbマウスの高血糖は、db/db-p27+/+マウスに比べ改善されていた（図５）。また、IP-GTTでは、db/db-p27+/-、db/db-p27-/-マウスは、db/db-p27+/+マウスに比べ、インスリン分泌、耐糖能が改善された（図６Ａ，Ｂ）。しかしながら、Irs2-/-マウスとは異なり、18週齢のdb/db-p27-/-マウスの多くは血糖値が正常であり、数匹のマウスのみがわずかに高血糖であった。また、db/dbマウスの脂肪肝がp27遺伝子の欠失により改善された（データ示さず）。
以上より、db/dbマウスにおけるp27の欠損がインスリン抵抗性を改善することが示唆された。
【００９４】
参考例６：膵島過形成に対するp27作用の解析
糖尿病の膵島におけるp27の効果を検証するため、膵島質量を測定した。
その結果、非糖尿病マウスにおけるp27の軽度な発現と一致して、膵島質量の軽度な増加が、野生型マウスと比較してp27-/-マウスで観察された（図７）。Irs2-/-マウスでは既報の通り膵島過形成不全が観察され、膵島質量は18週齢で減少した。Irs2-/--p27+/-、Irs2-/--p27-/-マウスでは膵島質量は野生型レベルに戻ったが、肝インスリン抵抗性の存在下でさえも増加しなかった。このことは、Irs2の破壊により誘起される幾つかの異常がレスキューされないままであることを示唆する。対照的に、膵島質量の増加が、10週齢のdb/dbマウスで観察され (コントロールの300%)、p27遺伝子の欠失は、db/dbマウスの膵島質量をさらに増強した。
以上より、p27の阻害は膵島質量の増加を引き起こすことが明らかとなった。
【００９５】
参考例７：p27による膵島過形成調節機構の解析
次いで、p27が膵島過形成を調節する機構を解明するため、膵島密度、膵β細胞サイズ、平均膵島サイズを測定した。
その結果、膵島密度の低下又は増加が10週齢のIrs2-/-又はdb/dbマウスでそれぞれ観察され、p27遺伝子の破壊はこの値に影響を及ぼさなかった（図８Ａ）。しかしながら、対照的に、平均膵島塊面積は、p27の欠失により顕著に増加した（図９）。
以上より、p27が膵島新生ではなく膵島成長を調節することが示唆された。
【００９６】
参考例８：β細胞増殖に対するp27作用の解析
p27が膵島成長を調節する様式をさらに調べるため、アポトーシスについてのタネル法 (tunnel assay)、増殖についての増殖細胞核抗原 (PCNA：proliferating cell nucleus antigen) 免疫染色、β細胞のサイズの測定を行なった。
その結果、アポトーシス及びβ細胞のサイズは、p27欠失に影響されないようであったが、db/db-p27+/-又はdb/db-p27-/-マウスの膵島では、PCNAポジティブ細胞の増加が観察された。
以上より、p27の阻害はβ細胞の増殖を促進することが示唆された。
なお、実施例１−２、参考例１−８に開示される本研究に関する捕捉データを図１０、図１１に示す。
【００９７】
実施例３：db/dbマウスを用いたスクリーニング
適切な溶媒に溶解させた被検物質（例えば、10mg-500mg）を、db/dbマウスに1日3回3日間腹腔内投与する。コントロールとして、溶媒のみをdb/dbマウスに1日3回3日間腹腔内投与する。3日後、db/dｂマウスより膵臓を摘出し、10% bufferedホルマリン中に置き、パラフィンに包埋し、膵島について2-5 μmの切片を調製する。次いで、この切片を、p27に対する抗体 (Transduction Lab製) 及びAnti-mouse antibody FITC conjugated (Jackson Lab製)を用いて免疫染色する。切片における蛍光強度を測定し、コントロールと比較することで、被検物質によるp27発現調節能を評価する。
【００９８】
実施例４：細胞を用いたスクリーニング
初代培養の膵島細胞を、既報［Endocrinology 128: 3193-3198］に従い調製する。0.25 mlの6.3%フェノバルビタール溶液を雄のウイスターラットに腹腔内注射し、コラゲナーゼ処理により膵島細胞を単離する。単離した膵島細胞を、10% FBS、400 U/mlペニシリン、200 mgストレプトマイシンを含有するRPMI 1640培地に懸濁し、60mm組織培養ディッシュに蒔く。膵島細胞を5% CO2、37℃で2-4時間インキュベートした後、被検物質を添加し、さらに１日間インキュベートする。次いで、培養物を10% bufferedホルマリン中で固定した後、p27に対する抗体 (Transduction Lab製) 及びAnti-mouse antibody FITC conjugated (Jackson Lab製)を用いて免疫染色する。蛍光強度に基づきp27について核／細胞質局在を測定し、コントロールと比較することで、被検物質によるp27局在の変化を評価する。
【００９９】
実施例５：サイクリン-ＣＤＫ複合体に対するＣＤＫ阻害因子の相互作用を評価するスクリーニング
５．１．組換えp27蛋白質の調製
ヒトp27をコードするcDNAを、pET21a (Novagen製) にサブクローニングし、C末端にヘキサヒスチジン配列が付加されたp27をコードするコンストラクトを作製する。p27をBL21 (DE3) 細胞で発現させ、8 M尿素、50 mM Tris-HCL (pH 7.4)、20 mMイミダゾールを含有する溶液中で該細胞をソニケーションする。次いで、遠心分離により清澄化し、Ni2+-NTAアガロースに4℃で1時間結合させる。カラムを、0.5 M塩化ナトリウム、50mM Tris (pH 7.4)、20% グリセロール中、6 M - 0.75 M尿素の逆勾配により洗浄し、200 mM イミダゾール、20 mM HEPES (pH7.4)、1 M KCl、100 mM EDTAで溶出させる。溶出液をHBB緩衝液 (25 mM HEPES-KOH (pH 7.7), 25 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.05% NP-40, 1 mM DTT)に対して一晩透析することにより組換えｐ27蛋白質を精製し、使用時まで-80℃で保存する。
【０１００】
５．２．Biacore（登録商標）によるスクリーニング
既報[Anal Biochem. 1998; 265 (2):340-50.]に従う一般的な方法によりBIACOREaを用いる。既報に従い調製したサイクリンE（例えば1〜10μg）を10mMの酢酸バッファー（pH 4）に溶解し、BIACOREaのセンサーチップCM5の表面のマトリックスにカルボキシル基を介して固定化する。HBSバッファー（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社製）をセンサーチップに20μl/分の流速で流し、バックグラウンドの値を記録する。途中から10nM〜10μMの被検物質、実施例５．１．で調製したp27、既報に従い調製したCDK2を含有するHBSバッファーに切り替えて１分間流し、薬剤の結合に伴う値の変化を記録する。次いで、被検物質を含有しないがp27、CDK2を含有するHBSバッファーに切り替え、被検物質の不在下での値の変化を記録する。結合と解離の速度、あるいは最大結合量から、サイクリンE - CDK2複合体に対するp27の結合を調節する被検物質を選択する。
【０１０１】
実施例６：ＣＤＫ阻害因子によるＣＤＫ活性の調節能を評価するスクリーニング（
in vitro キナーゼアッセイ）
組換えp27蛋白質は、実施例５．１．と同様にして作製する。サイクリンE, ヘマルグチニンタグ化CDK2 (CDK2-HA) を発現するバキュロウイルスベクターは、既報［Desai et al., Mol. Biol. Cell., 3(5): 571-82 (1992)］に従い作製する。バキュロウイルス発現サイクリンE、CDK2-HAを含有するHigh 5 (H5) 昆虫細胞抽出物を、被検物質の存在及び非存在下、組換えp27蛋白質と共に37℃で30分間インキュベートし、抗ＨＡ抗体 (12CA5モノクローナル抗体, BABCO製)で沈降させ、複合体のヒストンH1キナーゼ活性を測定する［Koff et al., Science 260: 536-539 (1993)］。Rbキナーゼ反応を既報［Matsushime et al., Cell 65: 701-713 (1991)］に従い行なう。ヒストンH1バンド及びRbバンドのリン酸化をPhosphorimager (Molecular Dynamics製)で定量する。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の予防・治療用組成物及び方法は、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性の調節という新規作用機序により血糖調節障害（例えば、糖尿病、低血糖症）を予防・治療し得る。また、本発明のスクリーニング方法は、ＣＤＫ阻害因子の発現・活性を調節し得る血糖調節障害の予防・治療剤の開発を可能にする。さらに、本発明の非ヒト哺乳動物は、血糖調節障害とＣＤＫ阻害因子との関連性の解析、及び血糖調節障害の予防・治療剤の開発を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】p27の発現（Ａ）、局在（Ｂ）を示す図である。DM (+)は2型糖尿病患者を、DM (-)は非2型糖尿病被験体をそれぞれ示す。
【図２】Irs2+/-マウスとp27+/-マウスとの交配により作製された種々のマウスにおける随時血糖の測定の結果を示す図である。
【図３】Irs2+/-マウスとp27+/-マウスとの交配により作製された種々のマウスにおけるインスリン負荷試験の結果を示す図である。
【図４】Irs2+/-マウスとp27+/-マウスとの交配により作製された種々のマウスにおける腹腔内糖負荷試験（Ａ，Ｂ）の結果を示す図である。
【図５】db/+-p27+/-マウス間の交配により作製された種々のマウスにおける随時血糖の測定の結果を示す図である。
【図６】db/+-p27+/-マウス間の交配により作製された種々のマウスにおける腹腔内糖負荷試験（Ａ，Ｂ）の結果を示す図である。
【図７】Irs2+/-マウスとp27+/-マウスとの交配、及びdb/+-p27+/-マウス間の交配により作製された種々のマウスにおける膵島質量（mg）を示す図である。
【図８】Irs2+/-マウスとp27+/-マウスとの交配、及びdb/+-p27+/-マウス間の交配により作製された種々のマウスにおける膵島密度（/cm2）（Ａ）、膵β細胞サイズ（Ｂ）を示す図である。
【図９】Irs2+/-マウスとp27+/-マウスとの交配、及びdb/+-p27+/-マウス間の交配により作製された種々のマウスにおける平均膵島サイズを示す図である。
【図１０】db/+-p27+/-マウス間の交配により作製された種々のマウスにおける体重（Ａ）、脳重量（Ｂ）、副睾丸周囲脂肪重量（Ｃ）、大網脂肪重量（Ｄ）、腎臓周囲脂肪組織（Ｅ）を示す図である。
【図１１】Irs2+/-マウスとp27+/-マウスとの交配、及びdb/+-p27+/-マウス間の交配により作製された種々のマウスにおける摂食、エネルギーホメオスタシス、代謝に関する種々のパラメータを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【図５】
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