(57)【要約】【課題】  肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子又はそれら部分領域は、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の機能が直接的又は間接的に関与する病的症状・疾患との関連性解明、そしてそれら病的症状・疾患の予防又は治療のための医薬品開発に極めて有用であって、新規な肝臓Ｘ受容体アイソフォーム（例えば、新規な肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームである肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質）の取得、その遺伝子及びそれらの利用等が望まれていた。【解決手段】  本発明は、肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームであって、少なくともエクソン５の一部領域が欠失し、エクソン３中のＤＮＡ結合ドメインのジンクフィンガーモチーフを構成する８個のシステイン残基を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質等に関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームであって、少なくともエクソン５の一部領域が欠失し、エクソン３中のＤＮＡ結合ドメインのジンクフィンガーモチーフを構成する８個のシステイン残基を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質。
【請求項２】
エクソン５以外のエクソンは正常型肝臓Ｘ受容体βと実質的に同一であることを特徴とする請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質。
【請求項３】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
【請求項４】
請求項３記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２で示される塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の部分ポリペプチドであって、請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のうち、少なくともエクソン５の一部領域が欠失することにより新たに連結された２つのアミノ酸残基を含む領域からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項７記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号４で示される塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチド又は請求項１０記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチドを、宿主細胞中で自立複製可能なベクターに導入する工程を有することを特徴とするベクターの製造方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の形質転換体を培養して、肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生させる工程を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチドを発現する能力を欠損させてなることを特徴とする遺伝子欠損動物。
【請求項１５】
請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項８乃至９記載のいずれかのポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１６】
請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、請求項８乃至９記載のいずれかのポリヌクレオチド又は請求項１５記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１７】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触させる工程及び当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の変化を測定する工程を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被験物質を接触させる工程、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程及び前記産生量に基づき被験物質の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質タンパク質に対する作用性を評価する工程を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のリガンドを接触させ、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第一工程、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のリガンド及び被験物質の両者を接触させ、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程及び前記第一工程と前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に基づき被験物質の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１７乃至１９記載のいずれかのスクリーニング方法により選択された肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質。
【請求項２１】
請求項２０記載の物質がアゴニスト活性を有することを特徴とする物質。
【請求項２２】
請求項２０記載の物質がアンタゴニスト活性を有することを特徴とする物質。
【請求項２３】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を特異的に認識することを特徴とする抗体又は抗体の一部。
【請求項２４】
請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチドに基づき設計されてなることを特徴とするプライマー。
【請求項２５】
遺伝子治療法のための、請求項８乃至９記載のいずれかのポリヌクレオチドが有する塩基配列に対する特異的ポリヌクレオチドプローブの使用。
【請求項２６】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、生体試料中のメッセンジャ−RNA（mRNA）から相補的DNA（cDNA）を合成する第一工程、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項８記載のポリヌクレオチド、に対応する前記相補的DNA（cDNA）の部分領域を増幅する第二工程及び増幅された部分領域を検出する第三工程を有することを特徴とする方法。
【請求項２７】
第二工程において、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから選択される1つ又は複数をプライマーとして用いるPCR法により増幅することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項８記載のポリヌクレオチドが、配列番号４で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２６又は２７記載の方法。
【請求項２９】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基づき前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドを特異的に検出することができる第一抗体をマイクロタイターウェルに結合させる第一工程、生体試料中の請求項１乃至５記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質が、マイクロタイターウェル上の前記第一抗体に結合させる第二工程、第二工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある生体試料を除去する第三工程、前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質における、第一抗体とは異なるエピトープに結合することができる標識された第二抗体を、第一抗体に結合された肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に結合させる第四工程、第四工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある第二抗体を除去する第五工程、第五工程後、第二抗体の存在有無を当該第二抗体が有する標識を指標にして検出する第六工程を有することを特徴とする方法。
【請求項３１】
粥状動脈硬化病変を調べるためのマーカーとしての、請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の使用。
【請求項３２】
粥状動脈硬化病変を調べるためのマーカーとしての、請求項２又は３記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の使用。
【請求項３３】
粥状動脈硬化病変を調べるためのマーカーとしての、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの使用。
【請求項３４】
粥状動脈硬化病変を調べるためのマーカーとしての、請求項４乃至５のいずれかのポリヌクレオチド又は請求項９記載のポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームである肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核内レセプターにより発現制御を受ける標的遺伝子を同定することは、それぞれの臓器や細胞の機能を解明するのみならず、疾患の原因を解明することにつながる可能性があることから、精力的になされている。さらに、核内レセプターによる標的遺伝子の制御は、その核内レセプター特異的な低分子物質（リガンド）に依存しており、これらのリガンド（アゴニスト）又はリガンド依存的な核内レセプターの機能を阻害するアンタゴニストを治療薬とした開発も行われている（非特許文献１）。
核内レセプターはリガンド結合ドメインとDNA結合ドメインの二つのドメインで構成される。受容体の後半部分がコードするリガンド結合ドメインはそれぞれのレセプターに特異的なリガンドが結合し、構造変化を引き起こすことにより、リガンド依存的な転写活性化反応が誘導される。受容体の前半部分がコードするDNA結合ドメインはジンクフィンガーモチーフを２つ有し、これを介して標的遺伝子の転写制御領域に結合する。各々のジンクフィンガーモチーフは４個のシステイン残基の側鎖に亜鉛イオンを配位しており、合計８個のシステイン残基は核内レセプターでよく保存されている（非特許文献２）。
核内レセプターの一種である肝臓Ｘ受容体には、これまでに２種類のサブタイプ（肝臓Ｘ受容体α、肝臓Ｘ受容体β）が存在することが報告されている（非特許文献３）。肝臓Ｘ受容体α及び肝臓Ｘ受容体βは、核内レセプターの1つであるレチノイドX受容体（RXR）とヘテロダイマーとを形成し、標的遺伝子の転写制御領域に結合することにより、標的遺伝子の転写を制御することが知られている。これら核内レセプターのヘテロダイマーは、「AGGTCA」（又は関連の６ヌクレオチドからなるモチーフ）が同方向又は逆方向に並んだ構造を有するコアモチーフを含む転写調節領域の特定配列（シス配列）に結合する。２つのシス配列において、コアモチーフ間のスペーサーはヘテロダイマーの組み合わせにより異なっており、このスペーサーの長さの違いにより、核内レセプターのヘテロダイマーの標的遺伝子に対する結合の特異性が決定される（非特許文献４）。肝臓Ｘ受容体とレチノイド受容体とのヘテロダイマーの場合には4 bp（DR4）である（非特許文献５）。
これらの核内レセプターは機能上及び構造上、類似性をもっており、現在までに肝臓Ｘ受容体では2種類のサブタイプが見出されており、またRAR、RXR及びPPAＲでは３種類のサブタイプ並びにこれらによりコードされるタンパク質が変化した形のアイソフォームが見い出されている（非特許文献６）。RAR及びPPAＲのアイソフォームは選択的スプライシング及び／又は異なるプロモーターの制御により生じると考えられており、発現の組織特異性や役割が異なることが知られている（非特許文献７）。従って、核内レセプターのサブタイプ及びアイソフォームは、それぞれ異なる機能を有していると考えられる。
肝臓Ｘ受容体のアゴニストは粥状動脈硬化を防止する薬効を有する（非特許文献８）。肝臓Ｘ受容体は酸化LDLにより活性化を受け、コレステロールトランスポータータンパク質ABCA1の転写を促進し、粥状動脈硬化の進行過程で重要な現象であるマクロファージ細胞の泡沫化を阻止している。人工的に作製した肝臓Ｘ受容体βのリガンド結合ドメイン欠失変異体は正常型肝臓Ｘ受容体の機能を阻害しABCA1の転写を抑制する（非特許文献９）。よって、肝臓Ｘ受容体のアイソフォームは、粥状動脈硬化の進行と関係がありこれらを制御することは有用であるので、薬剤探索の標的として極めて重要である。しかしながら、天然に生体内で発現している肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームとして２種が報告されているが（非特許文献１０及び特許文献１）、これらのアイソフォームはDNA結合ドメイン中のジンクフィンガーモチーフを構成する８個のシステイン残基の一部又は全てを欠失しており、また、転写機能及び正常型肝臓Ｘ受容体との関係についてはいずれも明らかではない。
【０００３】
【非特許文献１】Wilson et al.、 J. Med. Chem.、43:527-550、2000
【０００４】
【非特許文献２】Evans、Science、240：889-895、1988
【０００５】
【非特許文献３】Peet et al.、 Curr. Opin. Genet. Dev. 8:571-575、1998
【０００６】
【非特許文献４】Umesono et al.、 Cell 65:1255-1266、1991
【０００７】
【非特許文献５】Lehman et al.、 J. Biol. Chem.、272:3137-3140、1997
【０００８】
【非特許文献６】Mangelsdorf and Evans、Cell、83:841-850、1995
【０００９】
【非特許文献７】Takeyama et al.、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:395-400、1996
【００１０】
【非特許文献８】Joseph et al..、Proc Natl Acad Sci U S A、99:7604-7609、2002
【００１１】
【非特許文献９】Venkateswaran et al.、Proc Natl Acad Sci U S A、97:12097-12102, 2000
【００１２】
【非特許文献１０】Saito et al.、Oncogene、14:617-621、1997
【００１３】
【特許文献１】Isogai et al.、EP1308459
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このように肝臓Ｘ受容体は粥状動脈硬化の進行に深く関与しており、そのアイソフォームは新しい薬剤探索の標的候補となる。
以上、既に述べたように、肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子又はそれら部分領域は、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の機能が直接的又は間接的に関与する病的症状・疾患との関連性解明、そしてそれら病的症状・疾患の予防又は治療のための医薬品開発に極めて有用であって、新規な肝臓Ｘ受容体アイソフォームの取得、さらにはその機能解析等が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、このような状況下において鋭意検討した結果、正常型肝臓Ｘ受容体の機能を阻害する新規な肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームである肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質タンパク質を見い出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームであって、少なくともエクソン５の一部領域が欠失し、エクソン３中のＤＮＡ結合ドメインのジンクフィンガーモチーフを構成する８個のシステイン残基を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質（以下、本発明スプライシング変異体タンパク質と記すこともある。）；
２．エクソン５以外のエクソンは正常型肝臓Ｘ受容体βと実質的に同一であることを特徴とする請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質；
３．下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
４．請求項３記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
５．配列番号２で示される塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
６．請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の部分ポリペプチドであって、請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のうち、少なくともエクソン５の一部領域が欠失することにより新たに連結された２つのアミノ酸残基を含む領域からなることを特徴とするポリペプチド（以下、本発明ポリペプチドと記すこともある。）；
７．配列番号３で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６記載のポリペプチド；
８．請求項７記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
９．配列番号４で示される塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド；
１０．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
１１．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチド又は請求項１０記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
１２．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子と記すこともある。）又は請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチドを、宿主細胞中で自立複製可能なベクターに導入する工程を有することを特徴とするベクターの製造方法（以下、本発明ベクターの製造方法）；
１３．請求項１１記載の形質転換体を培養して、肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生させる工程を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の製造方法；
１４．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチドを発現する能力を欠損させてなることを特徴とする遺伝子欠損動物；
１５．請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、本発明ポリペプチド遺伝子と記すこともある。）又は請求項８乃至９記載のいずれかのポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター；
１６．請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、請求項８乃至９記載のいずれかのポリヌクレオチド又は請求項１５記載の組換えベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
１７．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触させる工程及び当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の変化を測定する工程を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法（以下、本発明の第一のスクリーニング方法と記すこともある。）；
１８．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被験物質を接触させる工程、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程及び前記産生量に基づき被験物質の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質タンパク質に対する作用性を評価する工程を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法（以下、本発明の第二のスクリーニング方法と記すこともある。）；
１９．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のリガンドを接触させ、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第一工程、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のリガンド及び被験物質の両者を接触させ、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程及び前記第一工程と前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に基づき被験物質の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有することを特徴とする肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法（以下、本発明の第三のスクリーニング方法と記すこともある。）；
２０．請求項１７乃至１９記載のいずれかのスクリーニング方法により選択された肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質；
２１．請求項２０記載の物質がアゴニスト活性を有することを特徴とする物質。
２２．請求項２０記載の物質がアンタゴニスト活性を有することを特徴とする物質；
２３．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を特異的に認識することを特徴とする抗体又は抗体の一部；
２４．請求項４乃至５記載のいずれかのポリヌクレオチドに基づき設計されてなることを特徴とするプライマー；
２５．遺伝子治療法のための、請求項８乃至９記載のいずれかのポリヌクレオチドが有する塩基配列に対する特異的ポリヌクレオチドプローブの使用。
２６．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、生体試料中のメッセンジャ−RNA（mRNA）から相補的DNA（cDNA）を合成する第一工程、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項８記載のポリヌクレオチド、に対応する前記相補的DNA（cDNA）の部分領域を増幅する第二工程及び増幅された部分領域を検出する第三工程を有することを特徴とする方法；
２７．第二工程において、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから選択される1つ又は複数をプライマーとして用いるPCR法により増幅することを特徴とする請求項２６記載の方法；
２８．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項８記載のポリヌクレオチドが、配列番号４で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２６又は２７記載の方法；
２９．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基づき前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有することを特徴とする方法；
３０．請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項６乃至７記載のいずれかのポリペプチドを特異的に検出することができる第一抗体をマイクロタイターウェルに結合させる第一工程、生体試料中の請求項１乃至５記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質が、マイクロタイターウェル上の前記第一抗体に結合させる第二工程、第二工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある生体試料を除去する第三工程、前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質における、第一抗体とは異なるエピトープに結合することができる標識された第二抗体を、第一抗体に結合された肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に結合させる第四工程、第四工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある第二抗体を除去する第五工程、第五工程後、第二抗体の存在有無を当該第二抗体が有する標識を指標にして検出する第六工程を有することを特徴とする方法；
３１．粥状動脈硬化病変を調べるためのマーカーとしての、請求項１記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の使用；
３２．粥状動脈硬化病変を調べるためのマーカーとしての、請求項２又は３記載の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の使用；
３３．粥状動脈硬化病変を調べるためのマーカーとしての、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの使用；
３４．粥状動脈硬化病変を調べるためのマーカーとしての、請求項４乃至５のいずれかのポリヌクレオチド又は請求項９記載のポリヌクレオチドの使用；
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、正常型肝臓Ｘ受容体タンパク質による粥状動脈硬化の防止に関与する新規な肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームである肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用が提供可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームである肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用に関する。
【００１８】
本発明スプライシング変異体タンパク質は、肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームであって、少なくともエクソン５の一部領域が欠失し、エクソン３中のＤＮＡ結合ドメインのジンクフィンガーモチーフを構成する８個のシステイン残基を有するペプチド配列を有する。
代表的なものとしては、エクソン５以外のエクソンは正常型肝臓Ｘ受容体βと実質的に同一である肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を挙げることができる。例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質として、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、又は（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するものがあげられる。
このような肝臓Ｘ受容体β遺伝子は、例えば、エクソン５の５´末端132塩基が欠失してなる肝臓Ｘ受容体βのアイソフォーム遺伝子等である。
【００１９】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」に関して、一般に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列が多少変更された場合には、例えば、当該アミノ酸配列中の1又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されるような変更があった場合でも、当該タンパク質の生理活性が維持される場合があることはよく知られた事実であり、従って、本発明でいう「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、特定のアミノ酸配列（即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列）と実質的に同等の生物活性が保持される限り、当該アミノ酸配列中の1又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたヒト肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質も本発明の範囲に含まれることを意味する。前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個（ここで「数個」とは、２〜約１０個程度である。）である。かかる改変の数は、当該タンパク質の生理活性が維持される範囲であればよい。より具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の1個以上20個以下、好ましくは１個以上10個以下、さらに好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたヒト肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質である。このような変異は、例えば、蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、器官、組織間の差異等により天然に生じる変異であってもよいし、人為的なアミノ酸の変異（例えば、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって、天然の蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入し発現させることにより作出された蛋白質が有するアミノ酸配列中に存在するアミノ酸の変異）であってもよい。
【００２０】
このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異体タンパク質は、保存的に置換されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。これは特定のアミノ酸残基が物理化学的類似性（例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質）を有する残基によって置換されていてもよいことを意味している。このような保存的置換の非限定的な例には、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換のような、脂肪族鎖含有アミノ酸残基の間の置換や極性基の間の置換等が挙げられる。
【００２１】
アミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異体タンパク質は、例えば、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子に公知技術である部位特異的変異導入（例えば、Nelson and McClelland、 Methods Enzymol、 216; 279、 1992等、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.、12、9441-9456、1984）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法）を行うことにより得ることができる。
【００２２】
部位特異的変異導入は、導入したい変異を含む合成プライマーを用いて行うことができる。即ち、プライマーとして前記合成オリゴヌクレオチド及びその塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、正常型肝臓Ｘ受容体βの遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、増幅反応を行う。次に、メチル化感受性制限酵素であるDpn Iで処理することにより、新たに形成された変異を有するDNAのみが残る。この反応液を用いて大腸菌XLI-Blue株を形質転換し、アンピシリン含有LB寒天培地に捲く。37 ℃で一晩培養し、増殖したコロニーからプラスミドを単離する。これにより、変異されたDNAを含むプラスミドを得ることができる。上記方法に基づくキットとしては、例えば、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）等が販売されており、これらを利用してもよい。目的の変異が導入されたことは、その塩基配列を決定することにより確認できる。
【００２３】
さらにまた、アミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を行う方法としては、前記の部位特異的変異導入の他にも、遺伝子を変異原で処理する方法又は遺伝子を制限酵素で開裂し、選択した遺伝子断片を除去、付加若しくは置換し、次いで連結する方法等も挙げることができる。
【００２４】
尚ここで「正常型肝臓Ｘ受容体β」とは、同一種の生物由来の当該受容体タンパク質のアミノ酸配列において、天然に最も高頻度に出現するアミノ酸配列からなる肝臓Ｘ受容体βを意味する。例えば、ヒト由来正常型肝臓Ｘ受容体βとしては、公共データベースに登録されているアミノ酸配列（GenBank Accession No. NM_007121）からなる肝臓Ｘ受容体βを挙げることができる。
【００２５】
本発明において「アミノ酸同一性」、「塩基同一性」とは、２つの蛋白質又は２つのＤＮＡ間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の蛋白質又はＤＮＡは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.、22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、当該同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
【００２６】
本発明における「アミノ酸同一性」はアミノ酸配列基準であって、例えば、約95％以上であることが好ましい。これに対して「塩基同一性」は塩基配列基準であって、前記アミノ酸同一性に対応して、例えば、約95％以上であることが好ましい。
【００２７】
本発明スプライシング変異体タンパク質は、ハイブリダイゼーション法やPCR法等により取得することができる。
例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳類等の動物組織又はそれらの動物由来培養細胞から、Sambrook and Russell；モレキュラー クローニング第3版、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（2001年）等に記載される遺伝子工学的方法に準じてRNAを抽出し、一本鎖cDNAを合成する。具体的には、例えば、肝臓等の組織をチオシアン酸グアニジン等のタンパク質変性剤を含む溶液中で破砕し、さらに当該破砕物にクロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分からフェノール、クロロホルム等を用いて全RNAを抽出する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、ISOGEN（ニッポンジーン社製）、TRIZOL試薬（インビトロジェン社製）がある。
得られた全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーをmRNAのポリA配列に結合させ、逆転写酵素、例えば、RNaseH- Superscript II Reverse Transcriptase (インビトロジェン社製)及び添付されたバッファーとオリゴdTプライマーとを用いて、42 ℃で1時間反応させ、次いで99 ℃で5分間加熱することにより、逆転写酵素を失活させる。次いで、RNaseHにより、mRNA鎖にニックを入れ、該１本鎖cDNAを鋳型にして大腸菌DNAポリメラーゼIにより2本鎖cDNAを合成する。得られた2本鎖cDNAの末端をT4 DNA ポリメラーゼにより平滑化する。平滑化された2本鎖cDNAをpBluescript II vectorやバクテリオファージ、例えば、λgt11、EMBL3等のベクターにT4リガーゼにより挿入し、cDNAライブラリーを作成する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、cDNA合成システムプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）やTimeSaver cDNA合成キット（アマシャムバイオサイエンス社製）等が挙げられる。このようにして作製されたcDNAライブラリーから、例えば、配列番号４で示される塩基配列の部分塩基配列を有するDNAをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの条件としては、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするようなものをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J.、 Frisch E. F.、 Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができ、また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology、 John Wiley & Sons、 N. Y. (1989)、 6.3.1-6.3.6）や、50%ホルムアミド、6 ×SSC、5 X デンハルト溶液、0.5%(w/v) SDS及び熱変性したサケ精子DNA（100 μg/ml）を含む溶液中に、ランダムプライミング法により[α-32P]dCTPで標識された前記プローブ（10 X 106 cpm/ml）を用いて、42 ℃にて一晩保温してハイブリッドを形成させた後、0.1%(w/v) SDSを含む2×SSC中、室温で10分間洗浄し、さらに0.1%(w/v) SDSを含む0.2×SSC中、55 ℃で10分間２回洗浄するような条件等を挙げることができる。尚、洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで約５０℃程度の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで約５０℃程度までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度との両方を変えることもできる。
次いでX線フィルム（例えば、Hyperfilm-MP；アマシャムバイオサイエンス社製）又はバイオイメージングシステム（BAS-2000；富士フイルム社製）によりシグナルを検出し、プローブと結合する塩基配列を有するベクターを含む組換え体を得ることができる。
【００２８】
PCR法のプライマーを設計する場合には、例えば、配列番号２又は４で示される塩基配列から、例えば、以下の条件を満たすように２つを選定すればよい。
１）プライマーの長さが15塩基から40塩基、好ましくは、20塩基から30塩基。
２）プライマーの中のグアニンとシトシンとの割合が、40%〜60％、好ましくは45％〜55％、より好ましくは50％〜55％。
３）プライマー配列において、アデニン、チミン、グアニン、シトシンの分布が部分的に偏らないこと。例えば、グアニン、シトシンが繰り返すような領域は適切ではない。
４）選定されるプライマーに対応する遺伝子の塩基配列上の距離が、好ましくは100塩基乃至3000塩基、さらに好ましくは、100塩基乃至500塩基。
５）各プライマー自身又は2つのプライマー間に相補的な配列が存在しないこと。
プライマーの塩基配列が選定されれば、市販のＤＮＡ合成機により化学合成すればよい。
例えば、センスプライマーとして配列番号５で示される塩基配列と、アンチセンスプライマーとして配列番号６で示される塩基配列とを使う組み合わせが挙げられる。PCRの条件としては、例えば、反応液中に、プライマーをそれぞれ200 nMになるように添加し、前記で合成した1本鎖cDNAを鋳型にして、例えば、LA Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）及び当該酵素に添付された反応緩衝液を用いてPCRを行う。かかるPCRとしては、例えば、95 ℃、3分間の熱変性後、94 ℃、 30秒間、55 ℃、 30秒間、72 ℃、1分間を１サイクルとして35サイクル程度行う。ここで、前記のようにして合成されたcDNAの代わりに、クロンテック社製クイッククローンcDNA等の市販の各種動物由来のcDNAを用いてもよい。得られた反応液の一部を、アガロースゲル電気泳動により解析し、目的のバンドを、直接又はゲルから切り出した後、TAクローニングシステムによりpGEM-T Easyベクター（プロメガ社製）にクローニングする。挿入されたDNA断片の塩基配列は、ダイターミネーター法により決定し、確認することができる。
【００２９】
因みに、本発明者は、正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質をコードするDNA断片を増幅するために、配列番号５及び６記載のプライマーを設計し、これを合成した。当該プライマーを用いかつヒト白血球由来のcDNAを鋳型に用いてPCRを行い、増幅DNA断片を得た。得られた増幅DNA断片を解析した結果、選択的スプライシングにより生じた肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームである肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を得ることができた。
塩基配列及びアミノ酸配列に基づく正常型肝臓Ｘ受容体βの遺伝子構造との比較から、単離された肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質は、エクソン５の一部領域が欠失したものであって、エクソン５以外のエクソンは正常型肝臓Ｘ受容体βと実質的に同一である肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質）であったが、これは公共データベースに既に登録されているエキソン５の５’末端132塩基及びエキソン３の３’末端127塩基を欠失した配列（GenBank Accession No. AK091535）とは異なり、エキソン５の５’末端132塩基のみが欠失した変異体タンパク質（即ち、正常型肝臓Ｘ受容体βのエクソン５の前記塩基が欠失した以外は、正常型と全く同一の塩基配列を有していた。
以下、肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5と記すこともある。）であった。AK091535によりコードされるタンパク質は、エキソン３の欠失塩基数が３の倍数ではないためエキソン４内でフレームシフトによる新たな終止コドンが現れ、177アミノ酸で構成されるが、これに対して上記の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質は正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質と同じ終止コドンが使用され417アミノ酸で構成される。
【００３０】
肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5が有する、肝臓Ｘ受容体βのリガンドの１つであるT0901317（Repa et al., Science, 289;1524-1529, 2000等記載による転写活性化能は、正常型肝臓Ｘ受容体βが有する当該転写活性化能と比較して極めて弱いレベル又は認められないレベルであった。さらに、正常型肝臓Ｘ受容体α又は正常型肝臓Ｘ受容体βと肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5とを共発現させたところ、正常型肝臓Ｘ受容体α又は正常型肝臓Ｘ受容体βのみのときに見られるリガンド依存的な転写活性化は著しく抑制された。以上の新たに得られた知見から、肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5は、生体内においてドミナントネガティブ的に、正常型肝臓Ｘ受容体による粥状動脈硬化の防止機能に関与するが確認された。
【００３１】
次いで、前述のようにして取得される本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子）を形質転換させる宿主細胞において利用可能なベクターに導入することができる。例えば、宿主細胞中で自立複製可能なベクターであって、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクターに、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことにより、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を有するベクターを構築することができる。本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を有するベクターとしては、具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpUC19（宝酒造社製）、pBluescript II（Stratagene社）等を挙げることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpACT2（クロンテック社製）、pYES2 (インビトロジェン社製)等を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合にはpRc/RSV、pRc/CMV (インビトロジェン社)等のプラスミド等を挙げることができる。
【００３２】
本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のようなベクターに組み込むことにより、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を宿主細胞で発現させることが可能なベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子が導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子が発現されるように、当該プロモーターと本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子とを結合させることを意味する。使用されるプロモーターは、形質転換する宿主細胞内でプロモーター活性を示すものであって、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。宿主細胞が動物細胞である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)プロモーター等を挙げることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、アルコール脱水素酵素 (ADH)1遺伝子プロモーター、ガラクトース代謝酵素(GAL)1遺伝子プロモーター等を挙げることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子とが機能可能な形で結合するように、当該プロモーターの下流に本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRc/RSV、pRc/CMV等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、当該クローニング部位に本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を挿入し動物細胞へ導入すれば、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を発現させることができる。また前述の出芽酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、当該プラスミド又はその誘導体のADH1プロモーターの下流に本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を挿入すれば、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を、例えば、CG1945株(クロンテック社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能な本発明ベクターが構築できる。
【００３３】
本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ベクター等を宿主細胞に導入することにより、本発明形質転換体を取得することができる。本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ベクター等を宿主細胞へ導入する方法としては、形質転換される宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。
例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合には、モレキュラー・クローニング第3版（Sambrook and Russell、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、2001年）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類細胞を宿主細胞とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に導入することができる。また、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を、酵母を宿主細胞として発現させてもよい。この場合、好ましくは、出芽酵母（例えば、サッカロミセスセレビシエ）を用いるが、ピキア (Pichia) 等の酵母を用いてもよい。酵母を形質転換する方法としては、例えば、 Itoらの方法（J. Bacteriol. 153; 163-168、 1983）等に記載されている。バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を組み込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いることができる。このようなトランスファーベクターの具体的例としては、pVL1392、pVL1393（インビトロジェン社製）等のプラスミドを挙げることができる。本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を前記のようなトランスファーベクターに挿入し、当該トランスファーベクターとウイルスゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子がゲノム上に組み込まれた組換えウイルスを得ることができる。ウイルスゲノムとしては、バキュロウイルス、アデノウイルス等のゲノムを用いることができる。尚、ウイルスをベクターに用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスDNAを宿主細胞に導入できるほか、組み換えウイルスを直接、宿主細胞へ感染させることによってもウイルスDNAを宿主細胞に導入することができる。
【００３４】
本発明スプライシング変異体タンパク質は、天然に存在する生物体から抽出、精製等の操作により、天然タンパク質として調製することができるし、又は、遺伝子工学的手法を用いて組換えタンパク質として調製することもできる。例えば、ヒトの細胞、組織から粗抽出液を調製し、種々のカラムを使うことにより、精製タンパク質を調製することができる。ここでの細胞としては、本発明スプライシング変異体タンパク質を産生・発現しているものであれば特に限定されず、例えば、肝臓由来細胞、腎臓由来細胞等を用いることができる。また、本発明スプライシング変異体タンパク質の中でヒト以外の生物において産生・発現されているものについては、当該生物から調製することができる。
【００３５】
本発明スプライシング変異体タンパク質を製造するには、上記ようにして本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ベクター等を適当な宿主細胞に形質転換し、当該形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を培養して、肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生させればよい。産生された肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を通常の方法に従って回収する。回収された本発明スプライシング変異体タンパク質は、目的に応じて適当な方法により精製される。例えば、本発明形質転換体が微生物である場合には、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機塩、無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養される。培養は一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等）等が可能である。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約15℃〜約40 ℃の培養温度、pHが約6.0〜約8.0の培地において培養するのが一般的である。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常、約1時間〜約24時間である。誘導型のプロモーターを用いている場合は、誘導時間は1日以内が望ましく、通常数時間である。
また、上記形質転換体が哺乳類、昆虫類等の動物細胞である場合には、当該形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。動物細胞の場合には、例えば、終濃度が約5%(v/v)〜約10%(v/v)となるよう牛胎児血清（Fetal Bovine Serum; FBS）を添加した液体培地（インビトロジェン社製等）を用いて37 ℃、5% CO2存在下等の条件で培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば、0.25%(v/v)程度のトリプシン/PBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類細胞の場合も同様に、例えば、10%(v/v) FBSを含むGrace培地等或いはSF-900（インビトロジェン社製）等の無血清培地を用いて培養温度約25 ℃〜約30 ℃で培養すればよい。また、バキュロウイルス等の組換えウイルスベクターを用いる場合、感染後、72時間以内に細胞を回収するのが望ましい。
本発明形質転換体により産生された本発明スプライシング変異体タンパク質の回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えばよく、例えば、培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた該細胞を通常のバッファー、例えば、適当なプロテアーゼ阻害剤を含むPBSに懸濁した後、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕し、破砕液を20、000 X gで数十分間から1時間程度遠心分離し、上清画分を回収することにより、目的である本発明スプライシング変異体タンパク質を含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分から通常のタンパク精製技術により各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製された目的である本発明スプライシング変異体タンパク質を回収することもできる。尚、本発明スプライシング変異体タンパク質の代わりに本発明ポリペプチドを、前述と同様な方法により回収することもできる。
【００３６】
次に、本発明スプライシング変異体タンパク質等の利用について説明する。
本発明スプライシング変異体タンパク質は、例えば、被験物質と本発明スプライシング変異体タンパク質又はその断片との結合能や結合量等を評価するためのリガンド・レセプターバインディングアッセイ等に用いることができる。
当該方法を利用して、本発明スプライシング変異体タンパク質が直接的又は間接的に関与する病的症状・疾患との関連性を、まずリガンド（アゴニスト）を特定し、次いでリガンドと本発明スプライシング変異体タンパク質とにより転写制御される遺伝子群を特定することによって解明することができる。リガンド（アゴニスト）の特定は、本発明スプライシング変異体タンパク質又は本発明ポリペプチドに被験物質を接触させることにより、本発明スプライシング変異体タンパク質又は本発明ポリペプチドにより転写制御される遺伝子群の発現レベルの変化を検出することによって行うことができる。
【００３７】
また、本発明スプライシング変異体タンパク質は、当該スプライシング変異体タンパク質と、当該スプライシング変異体タンパク質が結合する標的遺伝子との発現系を構築し、リガンド添加による標的遺伝子産物であるタンパク質の増加を検出する方法等にも用いることができる。
例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、β−ガラクトシダーゼ等のようなレポータータンパク質を標的遺伝子のプロモーターの制御下で発現するようなレポーター遺伝子を用いることにより、宿主細胞中での標的遺伝子の発現の有無を容易に検出することができる。さらに、本発明スプライシング変異体タンパク質の全長の代わりに、当該タンパク質のリガンド結合領域とDNA結合性タンパク質とのキメラ遺伝子を発現させ、レポーター遺伝子として、DNA結合性タンパク質が結合する塩基配列の下流に最小活性プロモーター及び前述のレポータータンパク質をコードする遺伝子を連結したプラスミドを用いることができる。DNA結合性タンパク質としては、例えば、GAL4、LeXA等を用いることができる。本発明スプライシング変異体タンパク質と当該スプライシング変異体タンパク質が結合する標的遺伝子との発現系及び当該スプライシング変異体タンパク質のリガンド結合領域とDNA結合性タンパク質とのキメラ遺伝子を発現させるプラスミドは、通常の遺伝子組換技術により調製することができる。
【００３８】
また、本発明スプライシング変異体タンパク質は、細胞中で発現されたmRNAから標識化されたDNAを転写させ、得られた標識DNAをDNAライブラリーチップにハイブリダイズさせることにより、本発明スプライシング変異体タンパク質により発現制御された遺伝子を特定する際にも利用することができる。
【００３９】
さらにまた、本発明スプライシング変異体タンパク質が直接的又は間接的に関与する病的症状・疾患との関連性は、本発明スプライシング変異体タンパク質を発現する細胞に、本発明スプライシング変異体タンパク質に作用する物質（具体的には、アンタゴニスト又はアゴニスト）を接触させた時の標的遺伝子の発現量と、被験物質を接触させていない前記スプライシング変異体タンパク質発現細胞における標的遺伝子の発現量とを比較することにより、活性化される遺伝子を特定することにより機能の解明が可能である。
【００４０】
本発明スプライシング変異体タンパク質に作用する物質の第一のスクリーニング方法として、例えば、まず本発明スプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触させる工程及び当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の変化を測定する工程を有する方法（即ち、本発明の第一のスクリーニング方法）をあげることができる。
【００４１】
上記方法において、本発明スプライシング変異体タンパク質と接触させる被験物質の濃度は、通常、約０．１μＭ〜約１０μＭであればよく、１μＭ〜１０μＭが好ましい。本発明スプライシング変異体タンパク質と被験物質とを接触させる時間は、通常、１８時間以上６０時間以下程度であり、好ましくは２４時間以上４０時間以下程度が挙げられる。
【００４２】
上記方法において、本発明スプライシング変異体タンパク質の変化を測定するには、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質に対する化学物質の結合能の測定や結合量の定量のほか、結合特異性、結合力の分析等が可能な試験方法を用いたリガンド・レセプターバインディングアッセイを利用すればよい。
【００４３】
具体的には例えば、上述のようにして本発明形質転換体から回収された本発明スプライシング変異体タンパク質に標識されたリガンドが結合している状態において、これに被験物質を共存させると、被験物質と標識リガンドとの競合から、両者の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質への親和性に応じて、標識リガンドが本発明スプライシング変異体タンパク質から遊離し、本発明スプライシング変異体タンパク質に結合した標識リガンドの量が減少し、よって本発明スプライシング変異体タンパク質に結合した標識量が減少する。従って、遊離型の標識リガンドの標識量又は結合型の標識リガンドの標識量をモニターすることにより、被験物質の本発明スプライシング変異体タンパク質への結合能が間接的に分かる。
標識リガンドとしては、例えば、トリチウム標識されたオキシコレステロール等を用いることができる。反応系は大きく3群に分けられる。1つの系は、本発明スプライシング変異体タンパク質に標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみが添加される群であり、被験物質の濃度がゼロの系に相当し、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明スプライシング変異体タンパク質に対する総結合量を示す。もう1つの系は、本発明スプライシング変異体タンパク質に標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標識されていないオキシコレステロールが、本発明スプライシング変異体タンパク質を十分飽和し標識リガンドが結合できなくなるだけの濃度（例えば10 μM）となるよう添加された系であり、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明スプライシング変異体タンパク質に対する非特異的結合量と判断される。従って、本発明スプライシング変異体タンパク質への標識リガンドの特異的結合量は、前者の総結合量から後者の非特異的結合量を引いた値となる。3番目の系は、本発明スプライシング変異体タンパク質に標識リガンドが結合しているところへ、被験物質が、例えば、最終濃度10μM（この濃度は目的により任意に変更する。）となるよう添加された系である。被験物質が本発明スプライシング変異体タンパク質への結合能を有する場合には、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして求めた被験物質の濃度がゼロの時の本発明スプライシング変異体タンパク質への標識リガンドの特異的結合量より小さくなる。このようにしてリガンド・レセプターバインディングアッセイを行うことにより、本発明スプライシング変異体タンパク質に対する被験物質の結合能を調べることができ、被験物質が複数の物質を含む場合にはその中に本発明スプライシング変異体タンパク質に親和性を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。
さらに、本発明スプライシング変異体タンパク質に対する被験物質の結合能をより詳細に評価するには、例えば、前記の3番目の系における被験物質の添加濃度を変えて同様にアッセイを行い結合型の標識リガンドの標識量を測定する。当該測定値に基づき、各アッセイにおける結合型と遊離型のリガンド量を算出して、被験物質と本発明スプライシング変異体タンパク質との結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価することができる。
尚、上記の被験物質が肝臓Ｘ受容体βの結合配列を含む転写制御領域の制御下にある遺伝子の転写を活性化するかどうかの評価は、例えば、肝臓Ｘ受容体βの結合配列を含む転写制御領域の下流に連結されてなるレポーター遺伝子を使用して、後述のレポーターアッセイ等の試験方法により評価することができる。
【００４４】
本発明スプライシング変異体タンパク質に作用する物質の第二のスクリーニング方法としては、本発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被験物質を接触させる工程、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程及び前記産生量に基づき被験物質の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質タンパク質に対する作用性を評価する工程を有する方法（第二のスクリーニング方法）であってもよい。
【００４５】
本発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞と接触させる被験物質の濃度は、通常、約０．１μＭ〜約１０μＭであればよく、１μＭ〜１０μＭが好ましい。発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、１８時間以上６０時間程度であり、好ましくは２４時間から４０時間程度が挙げられる。
【００４６】
本発明スプライシング変異体タンパク質に作用する物質の第三のスクリーニング方法としては、本発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のリガンドを接触させ、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第一工程、請求項１乃至３記載のいずれかの肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のリガンド及び被験物質の両者を接触させ、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程及び前記第一工程と前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に基づき被験物質の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有する方法（第三のスクリーニング方法）もあげることができる。
【００４７】
本発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞と接触させるリガンド又は被験物質の濃度は、通常、約０．１μＭ〜約１０μＭであればよく、１μＭ〜１０μＭが好ましい。本発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞とリガンド又は被験物質とを接触させる時間は、通常、１８時間以上６０時間程度であり、好ましくは２４時間から４０時間程度が挙げられる。
【００４８】
これらスクリーニング方法（即ち、３種のスクリーニング方法、以下、総じて本発明スクリーニング方法と記すこともある。）は、当該方法により選択された肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質（本発明では、肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に作用する物質とは、当該物質に対する拮抗物質を含めた広い意味を有するものであって、アゴニスト活性を有する物質、当該物質に対するアンタゴニスト活性を有する物質を含むものである。）を探索し、これら物質を医薬品の候補として提供可能とする。
【００４９】
本発明スクリーニング方法により選抜される物質を有効成分とする薬剤は、その有効量を経口的又は非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、当該薬剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、前記薬剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の前記薬剤本脂肪蓄積調節剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
【００５０】
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明スクリーニング方法により選抜される物質を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００５１】
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、前記薬剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回又は数回に分けて投与することができる。
【００５２】
本発明は、本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法も提供する。
本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法としては、生体試料中のメッセンジャ−RNA（mRNA）から相補的DNA（cDNA）を合成する第一工程、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ポリペプチド遺伝子等に対応する前記相補的DNA（cDNA）の部分領域を増幅する第二工程、及び増幅された部分領域を検出する第三工程を有する方法をあげることができる。
【００５３】
本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明ポリペプチド遺伝子等としては、具体的には、配列番号２又は４で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド等をあげることができる。
【００５４】
当該方法における第二工程において、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから選択される1つ又は複数をプライマーとして用いるPCR法により増幅するような工程を好ましくあげることもできる。
【００５５】
本発明は、本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド等を発現する能力を欠損させてなる遺伝子欠損動物も提供する。
本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド等を発現する能力を欠損させてなる遺伝子欠損動物等の実験動物及びその利用に関して、本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の機能を有する実験動物由来の内在性スプライシング変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を破壊（不活性化）することによりモデル動物を作成し、このモデル動物の物理学的、生物学的、病理学的及び遺伝子的特徴を分析することにより、本発明スプライシング変異体タンパク質の機能と疾病との関連性を解明することも可能となる。
【００５６】
また、前述した内在性肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を破壊（不活性化）されたモデル動物に、本発明のヒト由来遺伝子を導入することにより、本発明のヒト由来遺伝子のみを有するモデル動物を作成し、導入されたヒト由来遺伝子をターゲットとした薬剤（化合物等）を投与することにより、その薬剤の治療学的効果を評価することも可能である。
【００５７】
本発明は、さらに、遺伝子治療法のための、
（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（２）上記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド
（３）配列番号４で示される塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチドが有する塩基配列に対する特異的ポリヌクレオチドプローブ（特異的RNAプローブ又は特異的DNAプローブ）の使用も提供する。
このような本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列）を有する遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の全部又は一部よりなる、正常型肝臓Ｘ受容体による粥状動脈硬化の防止に関与する疾患の診断用プローブ及び当該プローブを含有してなる当該障害を伴う疾患の診断薬をも提供するものである。例えば、病理切片に対して本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子のIn situハイブリダイゼーションを行うことにより、当該障害を伴う疾患の有無や進行具合を検出することができる。
ここで診断用プローブとしては、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものであれば特に制限されるものではない。当該プローブを診断薬の有効成分とするためには、プローブが分解されないような適当なバッファー類や滅菌水に溶解することが好ましい。また、In situハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、J. Neurobiol. 29、 1-17 (1996)に記載の手法が挙げられる。また、In situ  PCRの方法を利用することも可能である。
前記診断においては、プローブのみならず、本発明スプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体（後述参照）を使用することができ、この場合には、免疫染色法により粥状動脈硬化病変の有無や進行具合を検出することができる（Dev. Biol. 170、 207-222 (1995); J. Neurobiol. 29、 1-17 (1996)参照）。使用される抗体は、例えば、Antibodies; A Laboratory Manual、 Lane、 H、 D. ら編、Cold Spring Harber Lboratory Press 出版New York 1989等に記載の方法により容易に作製される。
【００５８】
本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子又は本発明へプチド遺伝子は、それ自体、本発明スプライシング変異体タンパク質の機能を遺伝子レベルで制御するアンチセンス医薬品として、遺伝子治療での使用において有用である。例えば、配列番号４に含まれる20塩基以上の塩基配列、好ましくは30塩基前後の塩基配列を用いることができる。
上述のアンチセンス医薬品には、DNAのみならずRNAも含まれる。また、塩基配列は、センス配列でもアンチセンス配列（即ち、センス配列に相補性を有する塩基配列）でも構わない。
【００５９】
ここで「本発明ペプチド」、「本発明ペプチド遺伝子」とは、前述の如く、本発明スプライシング変異体タンパク質の部分領域（部分ポリペプチド）又はこれに対応する本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子の部分領域（部分ポリヌクレオチド）であり、少なくともエクソン５の一部領域が欠失することにより新たに連結された２つのアミノ酸残基を含む領域からなるポリペプチド又はこれに対応するポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、少なくとも６個の連続するアミノ酸又は少なくとも１８個の連続する塩基を含むことがよい。
代表的なものとしては、例えば、肝臓Ｘ受容体β遺伝子のエクソン５の５´末端９０塩基が欠失してなる肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームのうち、正常型肝臓Ｘ受容体βには存在しない領域からなるポリペプチド又はこれに対応するポリヌクレオチド等をあげることができる。
さらに具体的には、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの又はこれに対応する塩基配列（例えば、配列番号４で示される塩基配列）を有するもの等があげられる。
尚、上記のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は上記のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターは、前述の本発明ベクターの調製方法に準じて調製すればよい。さらにまた、このようにして調製された組換えベクターを、前述の本発明形質転換体の調製方法に準じて宿主細胞に導入することにより形質転換体を調製することもできる。
【００６０】
本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のうち、配列番号４で示される塩基配列は、プローブ又はプライマーとして本発明スプライシング変異体タンパク質以外のさらなる肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の探索ツールとして利用することが可能である。
その長さは少なくとも15個の連続する塩基を含む塩基配列であることが望ましい。プローブは通常の方法により、例えば、放射性同位元素、ジゴキシゲニン、ビオチン、検出可能な酵素等により標識できる。例えば放射能ラベルされたリンを用いる場合、cDNA断片を用いる場合には、ランダムプライミングラベルにより標識し、また、合成プライマーを使用する場合にはリン酸化酵素により5'末端標識すると都合がよい。このように標識したプローブをcDNAライブラリーにハイブリダイゼーションしてクローニングを行う。ハイブリダイゼーションは、通常の方法、条件により行うことができる。例えば、1XSSC、0.5%(w/v) SDS、65 ℃での洗浄である。cDNAライブラリーは、哺乳類を含む動物由来のものであってもよいが、特にヒトの組織・細胞由来のものが望ましい。
【００６１】
本発明は、本発明スプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体又は抗体の一部を含む。当該抗体又は抗体の一部は、下記のような方法により作製することができる。
例えば、配列番号１又は３で示される本発明スプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体は、前述のような遺伝子工学的方法により得られた本発明スプライシング変異体タンパク質又はその部分領域（ポリペプチド）或いは配列番号３で示されるペプチド断片を用いて、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ又はヒツジ等の通常抗体作成に用いられる動物に免疫することにより得ることができる。また、免疫した哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合することによりモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００６２】
これらの抗体を利用した、本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法としては、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質若しくは本発明ポリペプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基づき本発明スプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有する方法をあげることができる。さらに具体的には、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質若しくは本発明ポリペプチドを特異的に検出することができる第一抗体をマイクロタイターウェルに結合させる第一工程、生体試料中の本発明スプライシング変異体タンパク質が、マイクロタイターウェル上の前記第一抗体に結合させる第二工程、第二工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある生体試料を除去する第三工程、本発明スプライシング変異体タンパク質における、第一抗体とは異なるエピトープに結合することができる標識された第二抗体を、第一抗体に結合された肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に結合させる第四工程、第四工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある第二抗体を除去する第五工程、第五工程後、第二抗体の存在有無を当該第二抗体が有する標識を指標にして検出する第六工程を有する本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法があげられる。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの特定の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
実施例１  （肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質遺伝子のクローニング）
肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質遺伝子の翻訳領域全体を増幅できるプライマーを設計した。センスプライマーとしてhLXRβ(ORF)−F／H(配列番号５)及びアンチセンスプライマーとしてhLXRβ(ORF)−R／B(配列番号６)を用いて、市販品として入手できるヒト白血球及び肝臓由来cDNAライブラリー（クロンテック社製cDNA Library）を鋳型として、PCR法によりＤＮＡ断片の増幅を行った。
PCR法の反応条件は、下記の通りであった。
2.5 unitのEX Taq DNA Polymerase  (宝酒造社製)、20 pmolのセンスプライマーとしてhLXRβ(ORF)−F／H(配列番号５)、20 pmolのアンチセンスプライマーとしてhLXRβ(ORF)−R／B(配列番号６)及び鋳型である一本鎖cDNA（クロンテック社製の白血球又は肝臓由来cDNA）を含む50 μｌの反応液（MgCl２、デオキシリボヌクレオチド混合液を含む）を準備した。この反応液を、96 ℃で30秒間、59 ℃で30秒間及び72 ℃で165秒間を1サイクルとして40サイクルの反応に供した。得られたPCR産物の一部を、臭化エチジウムを含む1%アガロースゲルにて電気泳動し、DNA断片の増幅を確認した。その結果を図１に示した。肝臓由来のcDNAを鋳型として用いた反応では正常型肝臓Ｘ受容体タンパク質をコーが異なる肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体ドする長さのDNA断片だけが増幅された。それに対して、白血球由来のcDNAを鋳型として用いた反応では、正常型肝臓Ｘ受容体に加えて正常型肝臓Ｘ受容体よりも短いDNA断片が増幅された。
反応生成物をpGEM-T Easy vector（プロメガ社製）にTAクローニングシステムを用いてライゲーションした。ライゲーションは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われ、まず大腸菌DH5α株のコンピテントセル（東洋紡績社製）がライゲーション反応液により形質転換され、次いで得られた菌体を、X-gal及びイソプロピルβ-D-ガラクトピラノシド（IPTG）を塗布したアンピシリンを含むLB寒天培地上にまき、これを37 ℃で一晩培養した。培養後、当該寒天培地上に形成されたアンピシリン耐性白色コロニーを上述のPCR産物がTAベクターにクローニングされたものとして得た。
次いで、得られた白色を呈する形質転換体を用いてコロニーPCRを行うことにより、正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質とエクソン-イントロン構造タンパク質翻訳領域全体を含むクローンの検出を行った。コロニーPCR法の反応条件は下記の通りであった。KOD-Plus- DNA Polymerase  (東洋紡績社製)、及び鋳型である一本鎖cDNAを含む50 μｌの反応液（MgSO4、デオキシリボヌクレオチド混合液を含む）を準備した。エクソン１から４までを増幅する反応液ではセンスプライマーとしてhLXRβ(ORF)−F／H(配列番号５)及びアンチセンスプライマーとしてhLXRβR5（配列番号７）を、エクソン４からエクソン８までを増幅する反応液ではセンスプライマーとしてhLXRβF5（配列番号８）及びアンチセンスプライマーとしてhLXRβ(ORF)−R／B(配列番号６)を、各々20pmol添加した。これに、プレートから滅菌した楊枝によりわずかな量採取された上記の白色を呈する形質転換体を懸濁した後、この反応液を94 ℃で2分間熱変性した後、94 ℃で15秒間、59 ℃で30秒間及び68 ℃で45秒間を1サイクルとして35サイクルの反応に供した。得られたPCR産物を臭化エチジウムを含むアガロースゲルにて電気泳動し、正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質とは異なる長さのDNA断片が増幅された形質転換体からプラスミドを抽出し、当該プラスミド中に挿入されたDNA断片の塩基配列を確認した。その結果、エクソン５の５’側132塩基が欠失した肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5を含む翻訳領域全体を含むクローンを得ることができた。図２は、ヒト正常組織由来の正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質と得られた肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質のエクソン-イントロン構造との比較を表している。
ヒト正常組織由来の肝臓Ｘ受容体βと得られた肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質との相違点は、エクソン5の１３２塩基の欠失のみであり、その他の塩基配列には違いは認められなかった。エクソン５の一部領域が欠失しても、欠失した塩基数が132個(44アミノ酸)であることから、エクソン5以降の読み枠は正常型と全く同じであった。得られた肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に由来する新規アミノ酸配列は、417アミノ酸（1251塩基）からなるタンパク質となる。
【００６５】
実施例２  （肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質発現ベクターの構築）
正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質及び実施例１で得られた肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質が各々クローニングされたプラスミドを、キットにより推奨された方法に従って、制限酵素Hind III及びBamH Iで切断した。当該酵素による処理液をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルからインサートDNAに相当するＤＮＡ断片のバンドを回収した。回収されたＤＮＡ断片は、あらかじめHind III及びBamH Iで切断しておいたpFLAG-CMV2(シグマ)にクローニングした。Hind III及びBamIH Iで切断しておいたpFLAG-CMV2（約300 ng）と上記のインサートDNA（約500 ng）とを混合した後、これにT4リガーゼを添加し、当該混合物を16 ℃で２時間のライゲーションを行った。ライゲーションは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われ、まず大腸菌DH5α株のコンピテントセル（東洋紡績社製）がライゲーション反応液により形質転換され、次いで得られた菌体を、アンピシリンを含むLB寒天培地上にまき、これを37 ℃で一晩培養した。培養後、当該寒天培地上に形成されたアンピシリン耐性コロニーからプラスミドDNAを調製し、さらに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を、前述のダイレクトシークエンスで得られた塩基配列と比較して、翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることが確認されたプラスミドを選択し、各々のプラスミドをpCMV2-hLXRβWT、pCMV2-hLXRβD5と命名した。
【００６６】
実施例３  （肝臓Ｘ受容体βの結合配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドの作製）
肝臓Ｘ受容体βの結合配列（DR4）を含む塩基配列（配列番号９）からなるオリゴヌクレオチド及び当該塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０）を合成し、これらをアニーリングさせて2本鎖DNA（以下、DR4 DNAと記すこともある。）とした後、T4ポリヌクレオチドキナーゼを作用させてその両末端をリン酸化することにより、リン酸化DNA断片を得た。次に、pGL2 promoterベクター（プロメガ社製）を制限酵素Nhe Iで消化した後、大腸菌由来アルカリホスファターゼを加えて65 ℃で1時間保温した。当該保温液を低融点アガロースゲル電気泳動に供した後、検出されたバンド部分のゲルからDNA断片を回収した。回収された約100 ngのＤＮＡと、約１μｇの上記のリン酸化DNA断片とを混合した後、これにT4リガーゼを添加し、当該混合物を16℃で30分間のライゲーションを行った。ライゲーションは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われ、まず大腸菌DH5αコンピテントセル（宝酒造社製）がライゲーション反応液により形質転換され、次いで得られた菌体を、アンピシリンを含むLB寒天培地上にまき、これを37 ℃で一晩培養した。培養後、当該寒天培地上に形成されたアンピシリン耐性コロニーからプラスミドDNAを調製し、さらに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列から、pGL2 promoterのNhe I部位にDR4 DNAが逆タンデムに２つ結合されてなるDNA断片を有するプラスミドを選択し、これをプラスミドpGL2-DR4と命名した。
【００６７】
実施例４  （一過性発現系におけるレポーターアッセイによる肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5の機能評価）
ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞株（ATCC; CRL-1573）を、チャコールデキストランにより低分子物質を除去した牛胎児血清(FBS) 10%と抗生物質としてペニシリン（100 unit/ml）とストレプトマイシン（100 μg/ml）とを含み、フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において5％ CO2存在下37 ℃にて継代培養した。継代培養されたHEK293細胞株を10cm細胞培養用ディッシュに約2 X 106個になるように捲いた。これを37 ℃で1日間培養した後、当該細胞に、Lipofectamine（インビロトジェン社製）を用いて当該キットが推奨する方法に従って、各々１μgの実施例２で構築された正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質及びヒト肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質発現プラスミドと実施例３で作製されたレポータープラスミドpGL2-DR4とを導入した。これを37 ℃で24時間培養した後、当該細胞をピペッティングにより回収した。回収された細胞を均一懸濁した後、これを96穴プレートに播種した。さらに、当該プレートにエタノールで溶解しておいた各種の化合物が添加された。これを37 ℃でさらに約2日間培養した後、当該プレートに5倍に希釈された細胞溶解剤PGC50（ニッポンジーン社製）を50μl／wellずつ加えて、時々軽くゆすりながら室温で30分間放置することにより、細胞を溶解させた。このようにして調製された細胞溶解液を10μlずつ96穴白色サンプルプレート（ベルトールド社製）に採取し、ルミノメーターLB96p（ベルトールド社製）で50μl/wellずつ酵素基質液PGL100（ニッポンジーン社製）を添加し、直ちに発光量を1秒間測定した。正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質又は当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に対する肝臓Ｘ受容体リガンド(アゴニスト)の測定結果をそれぞれ図３に示した。また、正常型肝臓Ｘ受容体αタンパク質又は正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質と当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質とを共発現させた結果を図４に示した。これらの結果から、当該肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質がリガンド依存的な転写活性化能を欠き、正常型肝臓Ｘ受容体α又は正常型肝臓Ｘ受容体βの転写活性化能をドミナントネガティブ的に阻害することが明らかとなった。よって肝臓Ｘ受容体βが発現している白血球においては、当該肝臓Ｘ受容体スプライシング変異体タンパク質は正常型肝臓Ｘ受容体タンパク質の機能を阻害することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、正常型肝臓Ｘ受容体タンパク質による粥状動脈硬化の防止に関与する新規な肝臓Ｘ受容体βのアイソフォームである肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用が提供可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、正常型肝臓Ｘ受容体β及び肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質の肝臓（中央レーン）及び白血球（右レーン）における発現を調べた結果を示した図である。肝臓Ｘ受容体βの翻訳領域全体を増幅するプライマーとして配列番号５及び配列番号６で示されるプライマーを用いて行った35サイクルのPCRにより増幅されたPCR産物を示したものである。PCR反応により得られたPCR産物は、TAクローニング後、その塩基配列の決定を行った。「WT」で表したDNA断片は正常型肝臓Ｘ受容体βに由来するPCR産物（1403塩基）であった。これよりも短い肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質に由来するPCR産物が確認され、「D5」で表したDNA断片は本発明スプライシング変異体タンパク質（肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5）に相当するDNA断片であり、これより短いDNA断片は公知の肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質（GenBank Accession No. AR035537）に相当し「AR035537」で表したDNA断片であった。
【図２】図２は、正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質と本発明スプライシング変異体タンパク質（肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5）のドメイン構造を図式的に示した図である。翻訳領域は黒色で示した。
【図３】図３は、HEK293細胞における一過性発現系におけるレポーターアッセイによる本発明スプライシング変異体タンパク質（肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5）の機能評価の結果を示した図である。下記の２種の組み合わせ；（１）DR4-luciferaseベクター（pGL2- DR4）と肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5発現ベクターとの組み合わせ（「LXRβD5」で示された右側ゾーン）、（２）DR4-luciferaseベクター（pGL2- DR4）と正常型肝臓Ｘ受容体βタンパク質発現ベクターと組み合わせ（「LXRβWT」で示された左側ゾーン）、各々をHEK293細胞に導入し、肝臓Ｘ受容体βリガンドT0901317を培地に添加した時の転写活性化能を測定した結果を示している。全てのサンプルは1 μM の9-cis レチノイン酸を含む。各試験区におけるルシフェラーゼ活性の値を相対値として示した。「WT」は正常型肝臓Ｘ受容体βを意味している。誤差線は標準偏差を表す。
【図４】図４は、HEK293細胞において、DR4-luciferaseベクター（pGL2- DR4）、正常型肝臓Ｘ受容体α発現ベクター（pCMV2-hLXRαWT：「LXRαWT」で表した。）又は正常型肝臓Ｘ受容体β発現ベクター（pCMV2-hLXRβD5：「LXRβWT」で表した。）と本発明スプライシング変異体タンパク質（肝臓Ｘ受容体βスプライシング変異体タンパク質D5：「LXRβD５」で表した。）発現ベクターとを共存させた時の転写活性化能を測定した結果を示した図である。横軸は共存系における組み合わせを＋（共存）、−（非共存）で表している。全てのサンプルは5 μg/mlのT0901317及び 1 μMの 9-cis レチノイン酸を含む。ルシフェラーゼ活性の値を相対値として示した。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
2005160341.tif 000002
【図２】
2005160341.tif 000003
【図３】
2005160341.tif 000004
【図４】
2005160341.tif 000005
【配列表】
2005160341000001.app