(57)【要約】【課題】  遺伝子操作を行うことなく、適用魚種もハタ科魚類に限ることなく、注射法以外にも浸漬法あるいは経口法による投与が可能なベータノダウイルス感染症に対する不活化ワクチンを提供する。【解決手段】  ベータノダウイルスをホルマリンで不活化して得られる不活化ベータノダウイルスを含有することを特徴とする魚類のベータノダウイルス感染またはベータノダウイルス感染による発病の予防のためのワクチン。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータノダウイルスをホルマリンで不活化したことを特徴とする不活化ベータノダウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載した不活化ベータノダウイルスを含有することを特徴とする魚類のベータノダウイルス感染またはベータノダウイルス感染による発病の予防のためのワクチン。
【請求項３】
前記ベータノダウイルスの感染による発病がウイルス性神経壊死症（Viral nervous necrosis）またはウイルス性脳網膜症（Viral encephalopathy and retinopathy）であることを特徴とする請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
請求項２に記載したワクチンを魚に投与することを特徴とする魚類のベータノダウイルス感染またはベータノダウイルスの感染による発病の予防方法。
【請求項５】
前記ベータノダウイルスの感染による発病がウイルス性神経壊死症（Viral nervous necrosis）またはウイルス性脳網膜症（Viral encephalopathy and retinopathy）であることを特徴とする請求項４に記載の予防方法。
【請求項６】
前記予防方法において、不活化ウイルスの投与が、注射、経口または浸漬により行われることを特徴とする請求項４または５に記載の予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不活化ベータノダウイルス、ワクチンおよび予防方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ベータノダウイルスを原因とするウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症は１９９０年頃より世界各地（東・東南アジア、オーストラリア、地中海諸国、英国、ノルウェー、米国）の海産種苗および養殖魚に発生しており、極めて致死性が高いことから、海産魚の種苗生産および養殖業にとって大きな脅威となっている。本ウイルスの宿主域は広く、現在３０魚種以上での発生が知られている（非特許文献１）。特にマハタなどのハタ科の養殖では本病の発生により養殖業そのものの存続が危ぶまれているのが現状である（非特許文献２，３）。
【０００３】
魚類のウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症の対策としてこれまでに”親魚のウイルス検査”と”卵および飼育水の消毒”が実施されてきたが（非特許文献４，５）、これらは自然感染の危険に晒されている海面での飼育には意味をなさず、またウイルス検査および消毒には高度な技術・設備と膨大な費用がかかり、公的機関以外には実施は困難であった。
【０００４】
ベータノダウイルスを原因とするウイルス性神経壊死症やウイルス性脳網膜症の防除法として遺伝子組換え外被タンパク質ワクチンの有効性が知られている（非特許文献６；特許文献１）。しかしながら、これは遺伝子組換えによるものである点ならびにハタ科魚類に限定された注射ワクチンという制限があるため、ワクチンとしての認可の道のりが決して平坦ではなくかつ限られた魚種と限られたサイズの魚にしか適用できないという欠点を有する。
【特許文献１】特開平１１−３２２７９１号公報
【非特許文献１】Munday et al.: Journal of Fish Diseases 25, 127-142, 2002
【非特許文献２】田中真二：養殖 10, 21-22, 2001
【非特許文献３】土橋ら：水産増殖 50, 355-361, 2002
【非特許文献４】Mori et al.: Fish Pathology 33, 443-444
【非特許文献５】Mushiake et al.: Fish Pathology 29, 177-182
【非特許文献６】Tanaka et al.: Journal of Fish Diseases 24, 15-22, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、上記の従来の遺伝子組換え外被タンパク質ワクチンの問題点を解決すべく、遺伝子操作を行うことなく、適用魚種もハタ科魚類に限ることなく、注射法以外にも浸漬法あるいは経口法による投与が可能なベータノダウイルス感染症に対する不活化ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、ホルマリンによりベータノダウイルスを不活化することにより、ベータノダウイルスの感染症を予防できる不活化ワクチンを得られることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
すなわち、本発明は下記を要点とするものである。
（１）  ベータノダウイルスをホルマリンで不活化したことを特徴とする不活化ベータノダウイルス。
（２）１項に記載した不活化ベータノダウイルスを含有することを特徴とする魚類のベータノダウイルス感染またはベータノダウイルス感染による発病の予防のためのワクチン。
（３）  前記ベータノダウイルスの感染による発病がウイルス性神経壊死症（Viral nervous necrosis）またはウイルス性脳網膜症（Viral encephalopathy and retinopathy）であることを特徴とする２項に記載のワクチン。
（４）  ２項に記載したワクチンを魚に投与することを特徴とする魚類のベータノダウイルス感染またはベータノダウイルスの感染による発病の予防方法。
（５）  前記ベータノダウイルスの感染による発病がウイルス性神経壊死症（Viral nervous necrosis）またはウイルス性脳網膜症（Viral encephalopathy and retinopathy）であることを特徴とする４項に記載の予防方法。
（６）  前記予防方法において、不活化ウイルスの投与が、注射、経口または浸漬により行われることを特徴とする４項または５項に記載の予防方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、下記のような優れた効果を有するものである。
１）非遺伝子組換え製剤であるため安全である。
２）ベータノダウイルスは簡単に培養でき、容易に安価に高濃度（109-10 TCID50/ml）のワクチン液を作製できる。
３）不活化法が単純であり、保存性に優れている。
４）微粒子（ウイルス粒子：約25nm）懸濁状態であるので沈殿物が生じない。
５）注射、浸漬、経口法のいずれでも投与が可能である。
６）注射法の場合、１回の投与で長期間の効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明におけるベータノダウイルスとは、ノダウイルス科ベータノダウイルス属に属する直径約25nmのエンベロープを持たない球形ウイルスで、２分節のプラスセンス１本鎖RNA（RNA1, RNA2）をゲノムとして持つ。RNA1はポリメラーゼ遺伝子で、RNA2は外被タンパク質遺伝子である。本ウイルスは種々の海産魚に病原性を示す。本科のもう一つの属であるアルファノダウイルス属のウイルスは昆虫に病原性を示し、両属のウイルスはその遺伝子の塩基配列から明瞭に区別される。
【００１０】
本発明において、不活化ベータノダウイルスを調製するには、E-11細胞等の魚類由来株化細胞を用いて調製した103〜1010TCID50/ml、好ましくは109〜1010TCID50/ml程度のウイルス液にホルマリン液（ホルムアルデヒド約37%含有）を0.01%-1.0%、好ましくは0.5%-1.0%となるように添加し、4℃から37℃で5-90日間静置する。なお、ウイルス液が103TCID50/ml未満では、ベータノダウイルス感染またはベータノダウイルスの感染による発病に対して高い予防効果が期待できないという点で好ましくなく、また1011TCID50/mlを超えるウイルス液の調製は、実施する上で非現実的である。
【００１１】
一方、ホルマリン液の添加により抗原の安定性や投与が想定される対象動物の安全性に問題が生ずる場合には、不活化条件を緩和する措置をとる。例えば、ホルマリン液の減量、pH緩衝剤の添加、不活化温度の低下等により達成できる。また、必要であるならば不活化において残存する遊離ホルムアルデヒドは、亜硫酸ナトリウムを添加して中和するか、透析により除去できる。その後、不活化の有無は、E-11細胞等の魚類由来株化細胞を用いた培養法により確かめることができる。
【００１２】
本発明の不活化ワクチンの調製に際しては、例えば104〜109TCID50/mlとなるように、不活化ベータノダウイルスのウイルス原液を塩類溶液や培地等で希釈し、中和抗体価等の評価によってウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症の予防に足るウイルス量となるように調整する。その際、ウイルス抗原の安定性を高める安定剤の添加ならびに免疫原性の増強や感染防御効果の持続性を高めるアジュバントを添加することができる。作製されたワクチン液は、適当な容積、例えば約2-500ml溶のバイアルに分注し、密栓、密封する。なお場合により、ワクチン液は凍結乾燥を行って乾燥製剤として使用に供することができる。ワクチンは凍結しない冷温下、例えば約4-8℃の冷暗所で保存する。
【００１３】
本発明の不活化ワクチンの投与によって、魚類のベータノダウイルスの感染によるウイルス性神経壊死症（Viral nervous necrosis）またはウイルス性脳網膜症（Viral encephalopathy and retinopathy）を予防することができる。ウイルス性神経壊死症またはウイルス性脳網膜症とは、ベータノダウイルスの感染によって引き起こされる病気で、魚の中枢神経組織（脳および脊髄）および眼の網膜組織における神経細胞の壊死・融解による空胞形成を特徴とする。中枢神経系が冒されるため魚は異常遊泳し、特に仔魚、稚魚では極めて高い死亡率となる。成魚においてもハタ科魚などでは死亡率は50％を越える事例が多い。感染経路としては親魚からの垂直感染と発病保菌（＝ウイルス）魚からの水平感染がある。
【００１４】
本発明の不活化ワクチンを魚に投与するには、注射法、浸漬法または経口法のいずれでもよい。それぞれの投与方法について、以下に記載する。
【００１５】
１）注射法
注射可能な稚魚以上の魚では、103〜109TCID50/mlに調整したホルマリン不活化ウイルス液（ワクチン液）を魚体あたり0.1-0.5ml量、筋肉内もしくは腹腔内に接種する。
【００１６】
２）浸漬法
注射が不可能な稚魚では、103〜108TCID50/mlに調整したワクチン液に魚を1-24時間浸漬する。必要に応じて追加免疫をおこなう。
【００１７】
３）経口法
ワクチン液を混合した餌料（103-8TCID50/g）を自由摂餌させる。5-14日間の連続投与が望ましい。
【００１８】
本発明の、不活化ワクチンが有効な魚種としては、例えばハタ科魚があげられる。日本においては、マハタ、キジハタ、クエなどである。ハタ科魚は種類が多く特にアジアにおいては最重要養殖対象魚であるが、殆どすべての対象種でベータノダウイルス感染症が報告されており（非特許文献１）、仔稚魚のみならず成魚においても高死亡率となる。また、日本におけるヒラメやノルウェーのオヒョウ、あるいはオーストラリアや地中海諸国で重要なスズキ類が本ワクチン接種の対象となる。また魚種を問わず稚魚期の魚あるいは親魚の予防免疫に有効である。
【００１９】
以下に実施例をもって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
１）ウイルス培養条件
マハタ病魚由来ベータノダウイルス（SGEhi00株）とE-11細胞（Iwamoto et al.: Diseases of Aquatic Organisms 43, 81-89, 2000）を用いて検討した結果、25℃での5日間培養により109TCID50/mlのウイルス液が得られた。
２）ウイルス不活化条件
上記ウイルス液を用いてホルマリンによるウイルス不活化条件について検討した結果、ホルマリン濃度0.5%で10日間（4℃）の処理によりウイルスを完全に不活化できた。
３）ワクチン効果試験
上記不活化ウイルス液（ワクチン液）を人工生産されたマハタ０才魚（平均体重12.3g）の腹腔内に１尾あたり0.1ml接種した。ワクチン接種後14日、35日、および74日目に培養ウイルスによる攻撃試験を行った。ウイルス攻撃は１尾あたり104.5TCID50と103.5TCID50の２濃度とした。各２区ずつ（供試尾数：１区２５尾）試験を行った。
【００２１】
その結果、ワクチン接種後14日、35日および74日目のすべての攻撃試験においてワクチン区の死亡率は対照区のそれに比べて有意に低く、極めて高いワクチン有効率（RPS）、すなわちRPS=93%（14日目）, RPS=83%（35日目）および RPS=75%（74日目）が得られた。その結果を図１に示した。なお、RPS=60%以上が実用的ワクチンの基準である。
【実施例２】
【００２２】
実施例１と同様にしてワクチン接種したマハタ０才魚をワクチン非接種魚とともに海面筏に収容し、自然感染に対するワクチン効果をみた。その結果64日間の観察期間においてワクチン区の死亡率は対照区のそれに比べて有意に低く、極めて高いワクチン有効率（RPS=85%）が得られた。各２区ずつ（供試尾数：１区１５０尾）で試験を行った。その結果を図２に示す。
【００２３】
この自然感染試験において、ワクチン接種魚の血中ウイルス中和抗体価を調べたところ、ワクチン接種１０日後より抗体が検出され、その抗体価は６０日後に最高値に達した後徐々に低下したが、抗体産生は１６０日後でも認められた。その結果を図３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明のホルマリン不活化ワクチンは、その高い有効性・持続性に加えて、作製の簡便性、安全性、低価格、および適用魚種の広さの点で優れており、本ワクチンが市販されれば日本は言うに及ばず世界の海産養殖業の持続的発展に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】人為感染に対する不活化ワクチンの効果を示すグラフ。
【００２６】
マハタ０才魚にワクチン液（不活化ウイルス液）を腹腔内接種し（各２区設定）、ワクチン接種後14日目(Ａ，Ｂ)、35日目（Ｃ，Ｄ）、および74日目（Ｅ，Ｆ）に、ワクチン区および対照区の魚に培養ウイルスによる攻撃試験をおこなった。水温：20℃（免疫期間）、25℃（ウイルス攻撃期間）
○(白抜き丸）：対照区（攻撃ウイルス量104.5TCID50/尾）
□(白抜き四角）：対照区（攻撃ウイルス量103.5TCID50/尾）
●(中黒丸）：ワクチン区（攻撃ウイルス量104.5TCID50/尾）
■ （中黒四角）：ワクチン区（攻撃ウイルス量103.5TCID50/尾）
【図２】自然感染に対する不活化ワクチンの効果を示すグラフ。
【００２７】
マハタ０才魚にワクチン液（不活化ウイルス液）を腹腔内接種して対照区の魚とともに海面筏に収容し、自然感染による死亡をみた（各２区設定：Ｇ，Ｈ）。
○（白抜き丸）：対照区
●（中黒丸）：ワクチン区
▲（中黒三角）：水温
【図３】不活化ワクチン接種後のウイルス中和抗体価の推移を示すグラフ。
【００２８】
○（白抜き丸）：ワクチン区
●（中黒丸）：対照区
【図１】
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【図２】
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【図３】
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