(57)【要約】【課題】  医療及び分析機器産業など微量なヒスタミンを測定する分野において、ヒスタミンを高感度にしかも簡便に測定できる定量法ならびにその定量用試薬を提供する。【解決手段】  ヒスタミン含有試料（尿や血漿などの生体内物質や生体組織など）に、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４−イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアを化学発光法で測定することにより、ヒスタミンをより簡易に且つ極めて高感度に精度よく定量する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を化学発光法にて測定することを特徴とするヒスタミンの定量法。
【請求項２】
ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４−イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアを化学発光法にて測定することを特徴とするヒスタミンの定量法。
【請求項３】
ヒスタミン含有試料に、電子キャリアーの存在下、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わせ、生成する過酸化水素を化学発光法にて測定することを特徴とするヒスタミンの定量法。
【請求項４】
電子キャリアーがテトラゾリウム系の試薬である請求項３記載のヒスタミンの定量法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品産業、水産業、食品衛生、医療及び分析機器産業などの広い分野でヒスタミンの酵素的定量法に有効に利用される。また本発明は、分析試料中の微量ヒスタミンを簡便かつ感度よく検出できるヒスタミンの酵素的定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒスタミンは体内で起こるアレルギー反応の化学伝達物質であるため、ヒスタミンを多量蓄積した食品を摂取するとアレルギー様中毒が起こる。その症状は食後数分から数時間で顔面などに発赤が生じ、続いてかゆみ、じん麻疹や湿疹が出、ひどい場合はじん麻疹が全身に広がり気管支炎や血圧降下を起こす危険性を有する。これに対応して食品加工工場や食品衛生監視機関、臨床検査室などにおいてヒスタミン量を簡易且つ迅速に測定することができるヒスタミンの定量法が強く求められていた。
【０００３】
ヒスタミンの定量法としては、蛍光分析法、薄相クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、抗原抗体反応法、酵素法等が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
蛍光分析法は、Official Methods of Analysis of AOAC Internationalに掲載されている公定法であり、一般的に使用されている方法の一つである（例えば、非特許文献２参照。）。その原理は、ヒスタミンと蛍光試薬のo−フタルアルデヒドとヒスタミンとの縮合作用により蛍光色素をつくり、その蛍光の強さを蛍光分光光度計で測定するものである。しかし、この方法は、縮合作用前に作用妨害成分を除去してサンプルをきれいにする必要があり、陽イオンあるいは陰イオン交換樹脂カラム処理などを行うための手段と時間を避けることができない手間のかかるものであった。また、一般に魚肉が腐敗する際、ヒスタミンとほぼ同時に、カダベリンやプトレッシンといった生体アミンも生成するため、ヒスタミンの定量に際しては、ヒスタミン以外の生体アミンは分離除去しなければならない不便さを有する。
【０００５】
クロマトグラフィーによるヒスタミン定量法の研究はこれまで多数検討されている。薄相クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィーは、比較的安価な測定装置で多数の試料を同時に測定できるものの定量性が十分でなく、またガスクロマトグラフィーでは、ヒスタミンのような不揮発性アミンの直接定量は不可能であり、ヘプタフロロブチリル誘導体などに変換してから定量しなければならない不便さが指摘されている。
【０００６】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量は日本でも衛生試験法注解に掲載されており、最もよい方法として食品分析の学術雑誌や本などで紹介されている（例えば、非特許文献３参照。）。しかし、この方法は煩雑な前処理操作が必要であったり、測定に高度な装置・技術能力を必要とし、さらにクロマトグラフィーの操作に３０〜６０分程度かかるため多数分析には不向きである。
【０００７】
抗原抗体反応法は、市販キットとして普及している測定法の一つであるが、操作手順が多く、また反応時間が厳密である必要性があり測定のスピーディーさが要求される。
【０００８】
酵素法では、モノアミンオキシダーゼ固定化膜を被服した酵素電極法がある（例えば、非特許文献４参照。）。しかし、この方法は、検液の局部的な溶存酸素濃度（ＤＯ）を測定する方法であるため、精度が高くない（相対誤差約８％）欠点を有する。
【０００９】
他の酵素法では微生物由来のヒスタミンオキシダーゼ活性を有する酵素を用いた溶存酸素電極法がある（例えば、非特許文献５参照。）。この方法は、従来の蛍光分析法やＨＰＬＣ法に比較して、面倒な妨害物質除去操作や、ヒスタミン標準液を用いる校正操作が要らず、レスポンスタイムが１分半であることから、簡易で迅速な方法として、また高い精度（相対誤差が０．９８％）を有する優れた方法として既にＦＤＡからも良い内部評価を得ている（例えば、非特許文献６参照。）。しかしながら、この方法も、酸素電極の出力電流および飽和溶存酸素濃度が、温度の影響を受けやすいこと（温度依存型）への配慮により、実施に当り、検液の空気飽和操作を含め全工程を一定温度（３７℃）の下に行わなければならない。そのため、作用セルの温度を一定に保持するためのサーモスタット付き温水ジャケットを備えた反応装置が必要で、装置が嵩張り、移動の困難性や消費電力に対応する電源確保の困難性などで問題を有していた。またＤＯ電極の装着された作用セルは、そこに少しでも気泡（空気）が混入すると正確なＤＯの測定が困難となるため、定量操作の際は、必ず液密的に保持しなければならず、また作用セルは繰返して使用し、その都度洗浄しなければならない（すなわち使い捨て作用セルは使用できない）不便さを有していた。
【００１０】
これらの諸問題を解決した酵素によるヒスタミン測定法として、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この方法は、ヒスタミン含有試料に、フェナジンメトサルフェートやメルドラブルーなどのテトラゾリウム系の電子キャリアーおよびＭＴＴ、Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ、ＷＳＴ−８などのテトラゾリウム系の還元系発色試薬の存在下、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わせ、生成する色素を測定する比色定量法であり、試料中よりヒスタミンの分画操作や面倒な妨害物質（不純物）を除去する前処理操作の要らない、定量に要する時間が短時間である、簡便な装置を用いて測定することができる、作用セルは液密的条件下で操作する必要がない（すなわち開放系で操作することが可能である）、などの特徴を有するものである。
【００１１】
ところで、ヒスタミンは多くの生物系中から見いだされ、生体内の免疫応答や胃酸分泌、そして神経系の機能に関与する物質であり、アレルギー性および炎症性疾病の症状発生において重要視される生体内成分である。よって、ヒスタミンを定量することは上記した食品衛生面ばかりでなく、臨床面でも必要不可欠なものとなってきている（例えば、非特許文献７参照。）。
【００１２】
しかし、臨床面においては、より微量なヒスタミンの検出が必要とされるため、１０−６Ｍ程度が測定限界である比色定量法では、検出感度の点で満足いくものではない（例えば、特許文献１および非特許文献７参照。）。また、比色定量法以外の測定方法では、検出感度の点では満足のいくものもあるが、それぞれ上記したような問題点がある。そのため、ヒスタミンを極めて高感度にしかも簡便に定量する方法が求められていた。
【００１３】
【特許文献１】特開２００１−１５７５９７号公報
【非特許文献１】斉藤、外１名，「食品中のアミン類の分析」，月刊フードケミカル，１９９４年７月，第１０巻，第７号，ｐ．１１５−１２２
【非特許文献２】エイオーエイシー  オフィシャル  メソッド（ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）  ９７７．１３，“エイオーエイシー  オフィシャル  メソッド  オブ  アナリシス”（“ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ ”），米国，１９９５年，ｐ．１６−１８
【非特許文献３】“日本薬学会編  衛生試験法・注解”，金原出版，１９９０年，ｐ．２８８
【非特許文献４】Ｋａｒｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｌ．  １９８０年，第２巻，ｐ．１１７−１２０
【非特許文献５】野村、外４名，「酸素センサーによる魚肉ヒスタミン定量法の改良」，食品衛生学雑誌，１９９６年２月，第３７巻，第２号，ｐ．１０９―１１３
【非特許文献６】フード  ケミカル  ニュース（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｗｓ），（米国食品医薬品局）ＦＤＡ発行，米国，１９９４年９月２６日，ｐ．１９
【非特許文献７】岩崎、外７名，「グラスファイバー法を用いた好塩基球ヒスタミン遊離試験の食物アレルギー診断における臨床評価」，アレルギー，１９９４年５月，第４３巻，第５号，ｐ６０９−６１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、極めて高感度で簡便に試料中のヒスタミンを定量することができるヒスタミンの定量法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ヒスタミン含有試料に、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を化学発光法により測定することにより、高感度にしかも簡便にヒスタミンを定量し得ることを知り、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【００１６】
すなわち本発明は、以下の定量法に関する。
１．ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を化学発光法にて測定することを特徴とするヒスタミンの定量法。
２．ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４−イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアを化学発光法にて測定することを特徴とするヒスタミンの定量法。
３．ヒスタミン含有試料に、電子キャリアーの存在下、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わせ、生成する過酸化水素を化学発光法にて測定することを特徴とするヒスタミンの定量法。
４．電子キャリアーがテトラゾリウム系の試薬である上記３記載のヒスタミンの定量法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、測定試料中のヒスタミンを、極めて高感度で、かつ簡便に定量することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成物を化学発光法で測定することにより、ヒスタミンを精度よく定量する。
【００１９】
本発明の測定対象となるヒスタミン含有試料としては、ヒスタミンを含有するものであれば如何なるものでもよく、例えば液状および固形状の食品、尿や血漿などの生体内物質や生体組織などが挙げられる。特に本発明はヒスタミンが微量に含まれている生体組織などには最適に適用できる。
【００２０】
本発明に用いるヒスタミンデヒドロゲナーゼとしては、ヒスタミンに特異的に作用すれば良く、例えば、特開２００１−１５７５７９「ヒスタミンデヒドロゲナーゼおよびその製造法」記載のヒスタミンデヒドロゲナーゼなどが使用できる。ヒスタミンデヒドロゲナーゼの使用濃度に関しては特に制限がないが、終濃度０．０２〜２．００Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。
【００２１】
本発明に用いる化学発光方法についての制限はない。ヒスタミン含有試料にヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子キャリアー、４−イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニアを化学発光法で測定できればよい。望ましくは還元型電子キャリアーを酸素と反応させ、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ2-）と過酸化水素に変換させる。このＯ2-と過酸化水素とが化学発光試薬と反応して化学発光する方法が望ましい。
【００２２】
本発明に用いる電子キャリアーとしては、チトクローム類、キノン類、フラビン類およびＦｅ−ｓ類などが挙げられるが、本発明における電子伝達がうまくなされるものであればどのような物質でも構わない。特に本発明で用いる電子キャリアーとしては、フェナジンメトサルフェートやメルドラブルーなどのテトラゾリウム系の電子キャリアーが使用できる。使用濃度に関しては特に制限がないが、終濃度０．２〜２０．０μＭの電子キャリアー（例えば１−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ）の系の組合せが望ましい。
【００２３】
本発明に用いる化学発光試薬としては、ルミノール誘導体、ジオキセタン類、ロフィン、アクリジン誘導体、テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン、シッフ塩基およびシュウ酸誘導体など挙げられるが、望ましくはルミノール（ルミノールの場合発光触媒としてパーオキシダーゼを共存させる）やアクリジン誘導体のルシゲニンなどの化学発光試薬を使用する。使用濃度については何の制限もないが、望ましくは終濃度５〜５００μＭの化学発光試薬（例えばルミノールやルシゲニン）を用いる。
【００２４】
本発明に用いる緩衝剤の種類、ｐＨについても、本発明の目的を損なわない範囲であれば特に制限はない。用いる緩衝剤としては、例えばリン酸カリウムなどのリン酸塩、トリス−塩酸塩、酢酸塩などが挙げられる。緩衝剤の濃度やｐＨについては１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８．０〜１０．０の系の組合せが望ましい。
【００２５】
本発明に用いる化学発光を検出する方法についても制限はないが、通常微弱な発光を捉え、増幅し検出することができる発光検出器（ルミノメーター）を利用する方法が望ましい。
【００２６】
以下、実施例により本発明の特徴について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００２７】
（ヒスタミン定量用試薬の調製）
精製水に以下の３の成分をそれぞれ以下の濃度又は単位で溶解調整した。
（１）２１４ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）    ０．７ｍｌ
（２）０．０６ｍＭ  １−Ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ（電子キャリアー、同仁化学研究所社製）    ０．２ｍｌ
（３）３ｍＭ  ルシゲニン（発光試薬、ＳＩＧＭＡ社製）    ０．０５ｍｌ
上記（１）および（２）の試薬と０．５Ｕ／ｍｌ  ヒスタミンデヒドロゲナーゼ（キッコーマン社製）  ０．２ｍｌを測定直前に混合することにより、ヒスタミン測定用試薬（反応試薬液）を調製した。
【００２８】
（ヒスタミン標準溶液の調製）
ヒスタミン２塩酸塩（ＳＩＧＭＡ社製）を精製水で溶解し、５ｍＭ  ヒスタミン溶液（ｐＨ７．０）を調整した。これを精製水でさらに１０００倍にし５μＭのヒスタミン標準液を作製した。このヒスタミン標準液をさらに１倍、１０倍、２０倍、１００倍（５、０．５、０．２５、０．００５μＭ）となるように精製水で希釈し試験に供した。
【００２９】
（ヒスタミンの定量）
先ず反応試薬液１．１ｍｌと各ヒスタミン標準溶液をそれぞれ３７℃、５分間予備加温させる。次に予備加温させた反応試薬液に各ヒスタミン標準溶液を０．１ｍｌ添加し、続けて（３）を加え、この反応液中の発光量をルミノメーター（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１、ＢＥＲＴＨＯＩＤ社製）で経時的に測定した。
【００３０】
本発明法によるヒスタミン濃度と発光量の経時変化を図１に示した。発光量は２２秒後に最大を示し、時間の経過とともに徐々に減少した。図１の斜線縦棒部分は、待ち時間３０秒からその後６秒間の発光量の範囲を示し、この範囲の総発光量とヒスタミン濃度との相関関係において測定精度、再現性ともに良好な結果が得られた。
【００３１】
上記発光量の測定条件における発光量とヒスタミン標準液の濃度をそれぞれ常用対数で示した結果を図２に示す。この結果から、発光量とヒスタミン濃度間に、高い相関性があることが認められた。特に、ヒスタミン濃度１０−８〜１０−６Ｍの範囲で、発光量とヒスタミン濃度間に高い直線性が認められた。一方、ホルマザンなどの発色試薬を用いた比色定量法では１０−６Ｍ程度が測定限界であり、本発明を利用することにより、比色定量法と比較して極めて高感度にヒスタミンを定量することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、食品産業、水産業、食品衛生、医療及び分析機器産業などの広い分野で有効に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒスタミン濃度と発光量の経時変化を示す図
【図２】発光測定条件における発光量とヒスタミン濃度の常用対数での相関を示す図
【図１】
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【図２】
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