(57)【要約】【課題】アガリクス茸菌糸体液体培養物を用いてイソフラボン−β−を製造する方法及びその方法によって製造された抗癌及び免疫機能を有する物質を提供する。【解決手段】本発明の製造方法においてアガリクス茸菌糸体自体の自家分解酵素を用いて中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを製造し、製造された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンは抗癌効果だけではなく免疫増進効果を同時に有する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソフラボンを含有する培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養して高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階と、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物から前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離する段階と、別個のアガリクス茸菌糸体液体培養物から自家分解酵素を分離する段階と、前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンに前記自家分解酵素を反応させ中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階と、前記中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離精製する段階とを含むアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項２】
前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離する段階は、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の熱水抽出液の濃縮溶液にエタノールを処理する段階と、前記濃縮溶液にエタノールを処理した溶液を沈澱させた後遠心分離して沈澱物を分離する段階を含むことを特徴とする請求項１に記載のアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項３】
前記エタノールは８０％の濃度で処理することを特徴とする請求項２に記載のアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項４】
前記中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階は、前記自家分解酵素をｐＨ４.５〜ｐＨ５.５で反応させることを特徴とする請求項１に記載のアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生産されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項５】
前記自家分解酵素を分離する段階は、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物を減圧ろ過する段階と、該減圧ろ過したアガリクス茸菌糸体液体培養物にＴＣＡを混合し遠心分離する段階と、前記遠心分離してできた沈澱物を分離する段階とを含むことを特徴とするアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生産された請求項１に記載のイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項６】
イソフラボンを含有する培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養して高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階と、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の自家分解酵素を活性化させ中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階、及び前記中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離・精製する段階とを含むアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生産されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のうちいずれか１項の製造方法によって製造されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカン。
【請求項８】
請求項７のイソフラボン−β−Ｄ−グルカンを抗癌剤として使用する方法。
【請求項９】
請求項７のイソフラボン−β−Ｄ−グルカンを免疫増進剤として使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アガリクス茸菌糸体液体培養法によって生成されたβ−Ｄ−グルカン（β−D−glucan）に係り、特にイソフラボンと結合されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカン（isoflavone−β−D−glucan）に関する。
【０００２】
また、本発明は、前記イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法に係り、特に高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンをアガリクス茸菌糸体培養物の自家分解酵素を用いて中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを製造する方法に関する。
【０００３】
さらに本発明は、前記イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの用途に関するもので、特に抗癌效果と免疫増進効果に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌は死亡原因第１位であって、昨年韓国の癌患者は２５万名に達しているところ、抗癌は際限ない関心事である。既存の抗癌剤は癌細胞に対する選択性がないことからその毒性が極めて強くて正常細胞にまで影響を及ぼす結果、脱毛、免疫力低下、肝機能低下など色々の副作用を引き起こす問題点があった。
【０００５】
これに副作用が少ない各種食品から天然抗癌性成分を得ようとする研究が多様に進められてきており、その結果、茸菌糸体から得られる多糖類であるβ−Ｄ−グルカンと、大豆などに含有されているイソフラボンが、それぞれ抗癌効果があるという事実が明らかになった。
【０００６】
特に、β−Ｄ−グルカンは茸の主要生理活性物質であって、茸の抗癌効果はβ−Ｄ−グルカンが免疫細胞を活性化させ癌の進行を遅らせ転移を防ぐ機能を行うことから起因したことだと判明したし、このことからβ−Ｄ−グルカンを抗癌治療と並用すればその薬効が優秀であることが明らかになっている。
【０００７】
従って、先進各国では茸菌糸体培養物の抽出物であるβ−Ｄ−グルカンを商品化している。その例として、最近日本から輸入され販売中のＡＨＣＣは椎茸などを含む７種の茸菌糸体培養物の抽出物を混合して商品化したもので、癌患者を対象に病院営業網を通して流通しており、日本だけではなくアメリカ市場ではアラビノキシラン（arabinoxylan）が流通しているが、これも椎茸菌糸体培養物からの抽出物である。国内では桑黄茸の菌糸体抽出物がメシマ−ＥＸ（Mesima−EX、韓国新薬）という商品名として開発され、今のところ臨床試験中である。
【０００８】
しかし、今まで商品化された茸菌糸体培養物の抽出物はその抽出過程に費用が高くつくという問題のため一般人に広く普及していない現状である。
【０００９】
これは、茸菌糸体培養物の抽出物である多糖類の抽出量がまさに茸培養期間と菌糸成長速度に左右されるが、椎茸菌糸体、桑黄茸菌糸体、霊芝茸菌糸体などは培養期間が長く菌糸生長が遅いため抽出できる量も少ないからである。
【００１０】
また、抽出された高分子多糖類が体内で吸収しやすくなるためには分子量が小さいことが求められるため、これを中低分子多糖類に加水分解する段階を必要とするが、この加水分解酵素の購入が容易でなくて生産に費用が嵩むことが避けられず、加水分解後に生成された中低分子多糖類を分離・精製できる抽出技術が足りず、収率が極めて低いというのが実情である。
【００１１】
前記イソフラボンは大豆に主に含有されている物質であって、アグリコン型（aglycon）のダイゼイン（daidzein）、ゲネステイン（genestein）、グリシテイン（glycitein）と、配糖体型のダイジン（daidzin）、ゲニスチン（genistin）、グリシチン（glycitin）とそのアセチル配糖体（acetylglucose）とマロニル配糖体（malonylglucose）が、それぞれ３種ずつ殆んど配糖体として存在する。イソフラボンは抗突然変異性、抗癌性を有する物質として知られているが、この抗癌作用はほとんどアグリコン型のゲネステインによるものであり、他の物質と結合された配糖体型に存在する場合は抗癌効果が明らかになっていない。
【００１２】
前述したように、抗癌性物質でありながらも正常細胞には影響を与えないと同時に、免疫細胞活性化機能を兼ねる物質が求められ、またそのような物質が低費用かつ多量抽出できる方策が求められている現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は前述した問題点を解決するために案出されたもので、その目的は抗癌効果を有する天然成分であるイソフラボンと免疫増進効果を有する天然成分であるβ−Ｄ−グルカンの配糖体を製造して抗癌効果と免疫効果を同時に有する物質を提供するところにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前述した従来の茸菌糸体培養物から高分子β−Ｄ−グルカンを抽出した後、茸菌糸体自体が分泌する自家分解酵素を用いて效率的に中低分子β−Ｄ−グルカンに分解する方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前述した目的を達成するための本発明のアガリクス茸菌糸体の液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法は、イソフラボンを含有する培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養して高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階と、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物から前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離する段階と、別個のアガリクス茸菌糸体液体培養物から自家分解酵素を分離する段階と、前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンに前記自家分解酵素を反応させ中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階、及び前記中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離精製する段階とを含む。
【００１６】
ここで、前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離する段階は、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の熱水抽出液の濃縮溶液にエタノールを処理する段階と、前記濃縮溶液にエタノールを処理した溶液を沈澱させた後遠心分離して沈澱物を分離する段階とを含む。特に、前記エタノールは８０％の濃度で処理することを含む。
【００１７】
前記自家分解酵素を分離する段階は、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物を減圧濾過する段階と、該減圧濾過したアガリクス茸菌糸体液体培養物にトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid、以下'ＴＣＡ'と称する）を混合し遠心分離する段階と、前記遠心分離してできた沈澱物を分離する段階とを含む。
【００１８】
前記中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階は前記自家分解酵素をｐＨ４.５〜ｐＨ５.５で反応させることを含む。
【００１９】
前述した目的を達成するための本発明のアガリクス茸菌糸体の液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンのもう一つの製造方法は、イソフラボンを含有する培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養して高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階と、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の自家分解酵素を活性化させ中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階、及び前記中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離精製する段階とを含む。
【００２０】
前述した目的を達成するための本発明のアガリクス茸菌糸体の液体培養物を用いて生成された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンは、前記製造方法によって製造される。
【００２１】
前述した目的を達成するための本発明のアガリクス茸菌糸体の液体培養物を用いて生成された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンは抗癌及び免疫増進を用途とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明はアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン配糖体を製造する方法及びその方法によって製造された抗癌及び免疫機能を有する物質であって、本発明に係る中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法において、アガリクス茸菌糸体自体の自家分解酵素を用いて自家分解酵素の最適活性条件下で高分子β−Ｄ−グルカンを中低分子β−Ｄ−グルカンで製造することによって従来の中低分子β−Ｄ−グルカンの製造にかかる費用及び時間を節減させ、単位時間当り生産量において優れた効果を奏し、本発明である中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンは単純に混合されている形態ではなく、結合されている物質であって、イソフラボン、β−Ｄ−グルカンそれぞれが有する抗癌機能または免疫機能を同時に有するようになって、抗癌効果をアップする効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明のアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法をさらに具体的に説明する。
【００２４】
図１は本発明であるアガリクス茸菌糸体培養物を用いて生成された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法の過程を全体的に示した図である。
図１に示した通り、本発明は高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階（１）を含む。
【００２５】
前記イソフラボンを含有する培地に液体培養する茸菌糸体はアガリクス茸菌糸体を使用することを特徴とする。これは、アガリクス、平茸、椎茸、桑黄茸、霊芝茸菌株などを液体培養して一定条件下に粘度（viscosity）変化を測定して、粘度が最低の菌株を自家分解酵素活性の指標にした時、次のような実験結果、自家分解酵素活性が最高の菌株としてアガリクスが選択された。
【００２６】
［実験例１］：自家分解酵素生成茸菌株の選択
表１はアガリクス、平茸（夏）、ササクレヒトヨタケ、椎茸、霊芝茸菌株などを３日間液体培養した後（培養条件:２５℃、１ｖ／ｖ／ｍ airation）、その培養液（１０ｍｌ）とアガリクス茸菌糸体液体培養物、平茸菌糸体培養物から抽出された高分子多糖体を８０％エタノールで処理したもの（以下、'８０ＥＰ'と称する）を三角フラスコ（５０ｍｌ）に入れ、予備実験で選抜された温度である５３℃と６３℃の培養器（インキュベータ）で５時間反応させた後粘度変化を測定した結果である。
【００２７】
自家分解酵素生成が活発な菌株を選抜した結果、アガリクスの粘度変化（Δ粘度/時間）が３，４７０ｍｌ／ｓｅｃで最高であり、平茸が１２０ｍｌ／ｓｅｃ、ササクレヒトヨタケが１０４ｍｌ／ｓｅｃの順に他の茸菌によってアガリクス茸菌糸体が一番優秀な自家分解能を示した。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
次の過程で、アガリクス茸菌糸体を、イソフラボンを含有する培地に液体培養する。
【００３０】
茸のような担子菌類から抗癌性多糖類を得る方法としては、子実体、固体培養された菌糸体、液体培養された菌糸体から抽出する方法がある。
固体培養の場合は培養期間が長く抗癌性多糖類の抽出工程が複雑であり、子実体から抗癌性多糖体を抽出する場合、抽出される多糖体の含量が少なく、収率が低い問題点があって大量生産が困難な実情である。
【００３１】
一方、液体培養法は培養期間が短く、常に一定した条件下で培養が可能なので多糖体の含量が均一な菌糸体を大量に得られ、よって固体培養より低費用で生産できるため、本発明は液体培養法を用い、特にイソフラボンを含有する培地に液体培養する。
【００３２】
前記イソフラボンを含有する培地は大豆、大豆粕を含む天然植物性素材になれ、これより分離されたイソフラボンまたは合成イソフラボンを含有する培地を全て使用できる。
【００３３】
前記イソフラボンを含有する培地は炭素源として黄砂糖と無機塩を添加し高圧滅菌して液体培地を製造する。
【００３４】
アガリクス茸菌糸体を、前記イソフラボンを含有する液体培地に接種した後、振盪または曝気して１〜７日間培養すれば液体培養物内に高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成させうる。ここで、前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンは分子量３万以上を有する。
【００３５】
本発明に係るアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法は、図１に示した通り、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物から前記アガリクス茸菌糸体液体培養物から前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルコンを分離する段階（２）を含む。
【００３６】
まず、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物を熱水抽出する。前記熱水抽出法は菌糸体培養物を１００℃で１０時間加熱抽出した後、１２１℃で１時間高圧滅菌する方法で行なう。
【００３７】
前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の熱水抽出液をエタノール（ＥｔＯＨ）濃度を１０〜８０％別に濃度別に分画して処理した後溶液を沈澱させる。遠心分離して上澄液を除去し沈澱物を分離すれば、イソフラボンが結合された分子量１０万以上の高分子β−Ｄ−グルカンを含有する沈澱物を分離することができる。
【００３８】
前記エタノール処理は８０％エタノールで処理することを特徴とするが、８０％エタノール処理の場合にその含量が最高だったからである。後述する自家分解酵素の処理は＜アガリクス茸菌糸体液体培養物に８０％エタノールで処理して生成された高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン＞（以下、'８０ＥＰ'と称する）で処理するようにする。
【００３９】
［実験例２］：含量が最高の分画の採択:８０ＥＰ
（１）実験過程
前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の熱水抽出液をエタノール濃度別に分画して沈澱物を分離し、各分離された沈澱物をバイオセップＳ−２０００カラム（Ｂｉｏｓｅｐ  Ｓ−２０００ｃｏｌｕｍｎ）を使って分離した。
【００４０】
（２）実験結果
図２は、横軸に時間（ｍｉｎ）、縦軸に長さ（ｍＡＵ）をとり、上段から順番に４０，５０，６０，７０，８０％でエタノールを処理した沈澱物をバイオセップＳ−２０００で分離したことをそれぞれ示した図である。最下段右側はアガリクス茸菌糸体液体培養物原液の場合を示した図である。
【００４１】
図２に示した通り、７０ＥＰ（７０％エタノールで処理して生成された高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン、以下'７０ＥＰ'と称する）と８０ＥＰで殆んど類似したクロマトグラムパターン（ＲＴ２.２と３）を示したが、８０ＥＰでＲＴ（Retention time）３ピークがＲＴ２.２ピークより大きかったが、７０ＥＰでは二つのピークが殆んど類似であった。他の濃度の場合はアガリクス茸菌糸体液体培養物原液に含有されているものと類似であった（ＲＴ２.２，３，３.６ピーク）。
【００４２】
従って、８０ＥＰには抽出量の含量が異なるＥＰ（エタノールで処理して生成された高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン（ethanol precipitate）、以下'ＥＰ'と称する）に比べて多いのみならず、不要なピーク（ＲＴ３.６、他のＥＰには発見される）を無視できて８０ＥＰを対象にするとき、究極的に本発明のイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの収得率が高められる。
【００４３】
本発明に係るアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法は、図１に示した通り、本発明はアガリクス茸菌糸体液体培養物から自家分解酵素を分離する段階（３）を含む。
【００４４】
本発明は、アガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて抽出される高分子β−Ｄ−グルカンの体内吸収を容易にするため、中低分子β−Ｄ−グルカンで製造することが目的であるが、中低分子β−Ｄ−グルカンに分解する加水分解酵素をアガリクス茸菌糸体自体が分泌する自家分解酵素にし、特に本自家分解酵素の最適活性条件下で反応させることを特徴とするもので、従来の加水分解酵素の適切な選択の難しさを解決したものである。多様な茸菌株のうちアガリクス茸菌糸体を採択したことは、前述したようにアガリクス自家分解酵素活性が最大の茸菌株であるからである。
【００４５】
前記自家分解酵素の分離は、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物を減圧濾過して濾液に最終濃度が１０％になるようＴＣＡを混合して、４℃で２４時間放置した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）して沈澱物を分離して行なうことができる。
【００４６】
［実験例３］：自家分解酵素のＵＶスペクトル測定
図３はアガリクス茸菌糸体液体培養物を１０％ＴＣＡ溶液で沈澱させ、その沈澱物をジエチルアミノエチル（diethylaminoethyl、以下‘ＤＥＡＥ'と称する）カラムクロマトグラフィで分画した後のＵＶ（２８０ｎｍ）スペクトルである。
【００４７】
図３の横軸は各分画物の番号、縦軸はそれぞれの分画物について２８０ｎｍにおける吸光度を示した図である。
【００４８】
分画物のモニタリングをＵＶ（２８０ｎｍ）で行なった結果８個のピークを得た。二番目のピークである８番分画物がＵＶ２８０ｎｍで最高の吸光度を示したところが、前記２８０ｎｍで最高吸光を示す分画物（以下、‘チューブ＃８'と称する）を図１の（２）段階で分離した８０ＥＰに処理して後述する中低分子イソフラボンβ−Ｄ−グルカンを生成するのに使用される。
【００４９】
図４は前記チューブ＃８のＵＶスペクトル（２２５〜４４５ｎｍ）を示した図である。横軸は波長、縦軸は吸光度を示したものであり、左側には波長対吸光度を具体的な数値で示したものである。図４に示した通り、最高吸光度は２７０ｎｍであった。
【００５０】
［実験例４］：自家分解酵素活性確認
自家分解酵素の活性を確認するため、自家分解酵素が含有されていると推定されるＤＥＡＥカラムクロマトグラフィ分画物を８０ＥＰに処理した後、ＴＳＫカラム（移動相:H２O）、Ｃ１８カラム（移動相:メタノール（ＭｅＯＨ）:１ｍＭアンモニウムアセテート（ammoniumacetate ６:４））を使って高分子β−Ｄ−グルカンが中低分子β−Ｄ−グルカンに変ったことを確かめた。このとき、流速は全て１ｍｌ／ｍｉｎであり、ピークの検出はイソフラボンを確かめるためにＵＶ２５７ｍｍ，２６７ｍｍを使用したし、β−Ｄ−グルカンを確かめるためにＲＩ検出器（detector）を使用した。
【００５１】
［実験例５］ ：自家分解酵素の分子量測定
（１）実験内容
前記チューブ＃８が自家分解活性試験で最高の活性を示したところ、以下これに含まれたプロチン（protein）の分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide gel electrophoresis、以下‘ＳＤＳ−ＰＡＧＥ'と称する）で測定した。
【００５２】
（２）実験過程
自家分解酵素が含まれているＤＥＡＥカラムクロマトグラフィ分画物（チューブ＃８）から溶媒を除去した後少量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファで溶かした後、Ｌａｅｍｍｌｉ法によって１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。
【００５３】
分子量標準タンパク質としてはβ−ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）（１７５ＫＤａ）、パラミオシン（Paramyosin）（８３ＫＤａ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Glutamicdehydrogenase）（６２ＫＤａ）、アルドラーゼ（Aldolase）（４８ＫＤａ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（Triosephosphate isomerase）（３３ＫＤａ）、β−ラクトグロブリンＡ（β−Lactoglobulin A）（２５ＫＤａ）、リソザイム（Lysozyme）（１７ＫＤａ）、アプロチニン（Aprotinin）（７ＫＤａ）を用いた。
【００５４】
（３）実験結果
図５は前記チューブ＃８と＃１４のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示した図である。横軸のＳＭ（サイズ標識、ｓｉｚｅ  ｍａｒｋｅｒ、以下'ＳＭ'と称する）は前記分子量標準タンパク質の分子量サイズの基準標識であり、縦軸は分子量サイズを示す。
【００５５】
図５に示した通り、チューブ＃８の分子量は縦軸下段の７ＫＤａで濃い色を示すところ、自家分解酵素の分子量は約７ＫＤａであることが分かる。
【００５６】
本発明に係るアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法は、図１に示したように、アガリクス茸菌糸体液体培養物から分離した自家分解酵素を前記高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンに反応させ、中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階（４）を含む。
【００５７】
前記８０％エタノールで処理した高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン（８０ＥＰ）をｐＨ５.５に調整した後、前記ＤＥＡＥカラムから分離された自家分解酵素を１０ｍｌ加えて５３℃で１時間反応させ加水分解させることによって中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する。ここで、前記中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンは分子量３万未満の分子量を有する。
【００５８】
後述する自家分解酵素の最適活性条件はｐＨ４.５または５.５、５３℃、３時間反応に現れ、粘度の変化は３時間反応が最適であったが、高分子中低分子生成に与える効果は１時間と３時間反応にさほど差がないため、１時間反応でも殆んど同一な結果が得られる。
【００５９】
［実験例６］：自家分解酵素の活性化最適条件
（１）実験過程
アガリクス茸菌糸体培養物自体の自家分解酵素活性化（activation）の最適条件を求めるためにアガリクス茸菌糸体培養物と前記８０ＥＰを１，３，５，１５，２４時間の反応時間別に反応温度５３℃、６３℃の反応温度で反応ｐＨ４.５，５.５，６.５，７.５の条件下で培養し粘度の変化を測定した。
【００６０】
（２）実験結果
表２はアガリクス茸菌糸体培養物の粘度変化結果である。
実験の結果、アガリクス茸菌糸体培養物の自家分解酵素活性は培養物のｐＨ４.５〜５.５、５３℃で３時間反応したときが最適であった。
【００６１】
表２に示した通り、同一条件下で、アガリクス茸菌糸体培養物は３時間反応（ｐＨ４.５、５３℃）で粘度を１８，７５０から１，５００に１２.５倍減少させた。
【００６２】
実験結果を通して自家分解酵素はｐＨ４.５〜５.５、５３℃で３時間反応するとき、もっとも活性化されることが分かる。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
前述したような実験を通して自家分解酵素の最適活性条件を究明した。その究明された条件に基づき前述した分離された自家分解酵素（チューブ＃８）を高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン（８０ＥＰ）に反応させ、中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成させることができる。
【００６５】
以下、前記中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンが生成されたかを、次のような実験を通して確認した。
【００６６】
［実験例７］：中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン生成確認
［１］薄層クロマトグラフィ（thin−layer chromatography、以下'ＴＬＣ'と称する）分離による確認
図６は自家分解酵素を８０ＥＰに反応させたものに対するＴＬＣパターンを示した図である。
【００６７】
横軸のＤＰ７はマルトヘプタオース（maltoheptaose）、ＤＰ４はマルトテトラオース（maltotetraose）、ＤＰ３はマルトトリオース（maltotriose）、ＤＴ５，０００はデキストラン５，０００（dextran  5000）、ＤＴ１２，０００はデキストラン１２，０００（dextran 12000）、ＤＴ２５，０００はデキストラン２５，０００（dextran  25000）、Ｐ＋８０％エタノールは８０ＥＰに自家分解酵素処理したもの、８０％エタノールは自家分解酵素処理しない８０ＥＰを示す。縦軸はＲｆであってクロマトグラムで物質の分離を示す単位である。
【００６８】
遊離糖または高分子糖は、ＵＶ吸光度を有しない物質である。従って、ＴＬＣで分離された区域が、ＵＶ吸光度だけを有する物質であるか、糖化合物なのか、それともＵＶ吸光度を有する糖化合物（糖とＵＶを吸収できる物質の複合物）であるかを調べるため、ＴＬＣで分離されたバンドをＵＶランプでも確認し、ジフェニルアミンアリジンホスフェート（diphenylamine aridine phosphate、以下'ＤＡＰ'と称する）で発色（糖確認発色物）して確かめた。
【００６９】
図６に示した通り、使われたＴＬＣシステムでは低分子多糖体（ＤＰ７以下）は移動したが、中分子多糖体（ＭＷが５，０００）以上の多糖体は移動しなかった。しかし、自家分解酵素で処理された高分子多糖体には、ＤＡＰで発色される低分子糖（ＤＰ３以下）とＤＡＰに発色されながらＵＶ吸光度を有する物質が混合されていた。
【００７０】
特に、全く移動しない中分子以上の多糖体もＵＶ吸光度を有しており、ＤＰ７程度の糖化合物もＵＶ吸光度を有していた。また、これにはＵＶ吸光度だけを有する物質も含有されていた。
【００７１】
このような結果は、自家分解によって高分子多糖体が中低分子に転換されることが分かり、これら分子には、糖以外にＵＶ吸光度を有する物質が結合されていることを意味する。
【００７２】
［２］高性能液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography 、以下'ＨＰＬＣ'と称する）による分離
図７ａ及び図７ｂは、８０ＥＰにＨＰＬＣ（ＴＳＫ  ｃｏｌｕｍｎ）から分離した分画（自家分解酵素）を反応させ反応物に含有されている分解物をＨＰＬＣで分析したものを示した図である。
【００７３】
横軸は時間（ｍｉｎ）、縦軸は長さ（ｍＡＵ）を示し、左側は分画物＃２、＃８、＃１４、＃２５、＃３５、＃６５、＃８３に８０ＥＰを反応させた後のＨＰＬＣクロマトグラムであり、右側は各分画物自体のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００７４】
最上段の８０ＥＰのクロマトグラムをみれば、４個のピークを含有していることが分かる。しかし、自家分解酵素をＤＥＡＥクロマトグラフィ（図３）で分離した各分画物をＨＰＬＣで確認した後８０ＥＰと反応させた時、チューブ＃８分画によっては元々の８０ＥＰの４個のピークが全く異なる様相に現われることから、新たな物質が生成されたことと見られる。一方、他の分画によっては自家分解酵素を反応させない８０ＥＰ自体のピークの様相がほとんどそのまま維持されたことから、分解されないことが分かる。
【００７５】
すなわち、８０ＥＰにチューブ＃８分画を反応させた時、８０ＥＰに含有された高分子多糖体が中低分子多糖体（分子量約３０，０００〜９，０００）に分解されたことが確認できる。
【００７６】
８０ＥＰに自家分解酵素（チューブ＃８）を処理した分解物をＨＰＬＣで分離しつつ、ＵＶとＲＩ検出器で同時にモニタリングした。
【００７７】
図８ａはＲＩ検出結果、図８ｂはＵＶ検出結果（２６７ｎｍ）を示した図である。
【００７８】
図８ａおよび図８ｂに示した通り、ＲＴ８.８ピークだけＵＶとＲＩ検出の両側に全て反応があったし、他のピークはＵＶ吸光度を有したりＲＩ検出にだけ反応を有することが分かる。
【００７９】
従って、ＲＴ８.８ピークの反応様相からみて、多糖体が他の物質（ＵＶ吸光度を有する物質）と結合しているという事実が確認でき、この物質はＵＶ吸光度を有する物質であるイソフラボンを意味する。
【００８０】
［実験例８］：中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの生成が加水分解酵素によることの確認
［１］８０ＥＰの差異
中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンが、アガリクス茸菌糸体を培養する途中に、自家分解酵素の作用を受けて生成されたものであることを立証するための実験である。
【００８１】
培地の一部構成分である大豆粕（以下、'ＳＰ'と称する）をエタノール濃度（１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０％）別に分画して沈澱物を分離した。
【００８２】
その結果、ＳＰ分解物は１０〜６０％エタノールによって形成される沈澱物はほとんどなく、７０ＥＰで最多の沈澱物が形成されたし、８０ＥＰは少量であった。
【００８３】
従って、アガリクス茸菌糸体液体培養物から由来した沈澱物は８０ＥＰで最多であったため、この沈澱物に含有された物質はＳＰに含有されていた物質ではなく、アガリクス茸菌糸体を培養する過程において生成された生物学的元素転換（bioconversion）された物質であることが推測できる。
【００８４】
［２］ＴＬＣによる確認
図９は培地原料として使用されたＳＰとその酸加水分解物（以下、'ＳＰＨ'と称する）をＴＬＣに分離した後そのパターンを示した図である。
【００８５】
横軸のＡＰはアガリクス茸菌糸体液体培養物から得た８０ＥＰを再び８０％エタノールで処理した沈澱物、ＡＰＨはＡＰを酸加水分解したもの、ＡＳは前記８０ＥＰの上澄液、ＡＳＨはＡＳを加水分解したもの、ＳＰは中間構成成分、ＳＰＨはＳＰを加水分解したものを示し、Ｇ、Ｄ及びＧＴを標識として使った。ここで、Ｇはゲネステイン、Ｄはダイドザイン、ＧＴはゲニスタイン標準フォームであり、縦軸はこれらそれぞれに対するＲｆを示す。
【００８６】
ＳＰから得た全ての試料にはＵＶだけ吸光度を有する物質（Ｒｆ０.９９９，０.５４２，０.３０６）だけ確認され（特にＧ及びＤなど）、ＵＶランプとＤＡＰで同時に反応する物質は分離されなかった。
【００８７】
従って、ＳＰではＵＶ吸光度だけ有する物質が培養液に供給されることが分かった。しかし、ＡＰから得た分画物ではＵＶとＤＡＰで同時に反応する物質（Ｒｆ０.５４２，０.０１４）があった。
【００８８】
従って、これら物質は原料に含有された物質ではなく、培養過程中で原料の成分が酵素によって生物学的元素転換された事実が分かる。
【００８９】
図１０はこれら分離された物質に対するＵＶスペクトル結果を示した図であり、図１１ａ，図１１ｂ，図１１ｃはＩＲスペクトル結果を示した図である。
【００９０】
これらスペクトルは全てＧやＤのスペクトルと非常に類似であった。
従って、これらの物質は全てＧやＤのグリコサイド（glycoside）であることが分かった。
よってこれらは培養のうち酵素によって生物学的元素転換がなされたことが分かった。
【００９１】
前記実験例７，８によって、高分子β−Ｄ−グルカンが中低分子β−Ｄ−グルカンに分解され、その分解が自家分解酵素によるものであり、また中低分子β−Ｄ−グルカンだけで構成されることではなく、多糖体でない他のいずれの物質（この物質は後述する実験で確認）が結合されている形態に生成されたことを確認した。
【００９２】
本発明に係るアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法は、図１に示したように、本発明は前記生成された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを分離・精製する段階（５）を含む。
【００９３】
生成されたイソフラボンを含有した中低分子β−Ｄ−グルカンをＤＥＡＥカラムクロマトグラフィに分離し、前記ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィで分離された分画物を真空濃縮器で濃縮させた後、再びシリカゲル（silicagel）カラムクロマトグラフィを使って分離する。
【００９４】
［実験例９］：中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの存在の確認
前記分画物中に中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの存在はＴＬＣとＨＰＬＣを使って確認した。
【００９５】
［１］ＴＬＣによる確認
シリカゲルカラムクロマトグラフィによって分離された分画物を再びＴＬＣ（Silica ６０Ｆ−２５４プレート、５×１０ｃｍ）を使用して分離した。このとき、ブタノール（Butanol）:エタール（Ethanol）:水（Ｈ2Ｏ）を５:３:３（ｖ/ｖ/ｖ）を展開溶媒として使った。
【００９６】
分離されたバンドが糖化合物であることを確認するためＤＡＰで発色させ、ＵＶ吸光物質の存在を確認するためにＵＶランプ（短波）で照射した。
【００９７】
［２］ＨＰＬＣ
バイオセップＳ−２０００カラム（移動相；２０ｍＭ リン酸ナトリウム）、ＴＳＫカラム（移動相；Ｈ２Ｏ）、Ｃ１８カラム（移動相；メタノール（ＭｅＯＨ）:１ｍＭアンモニウムアセテート（ammonium acetate）６:４）を使用した。流速は全て１ｍｌ／ｍｉｎであった。このとき、ピークの検出はＵＶ２５７ｎｍ，２６７ｎｍ，２８０ｎｍとＲＩ検出器を使用した。
【００９８】
［実験例１０］：最終物質にイソフラボンが含有されているのかの確認
表３は、最終的に分離・精製された本発明のイソフラボン−β−Ｄ−グルカン（Ａ）とイソフラボン−β−Ｄ−グルカンを自家分解酵素で加水分解したもの（Ｂ）のそれぞれの場合に、遊離ゲネステインとダイドザインの含量を比較したものである。
【００９９】
【表３】
2005105247.tif 000005
【０１００】
イソフラボン−β−Ｄ−グルカン（Ａ）とイソフラボン−β−Ｄ−グルカンを酵素（β−グルコシダーゼ（β−glucosidase）:メガザイムキット（Megazyme kit）で加水分解させたもの（Ｂ）それぞれについてＨＰＬＣで分析した（Ｃ１８カラム、移動相メタノール:１ｍＭアンモニウムアセテート=６:４、流速:１ｍｌ／ｍｉｎ）。
【０１０１】
その結果、Ａでは遊離ゲネステインとダイドザインが測定されず、Ｂではゲネステインは１５０ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔ、ダイドザインは２８.２ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔの含量を示した。
【０１０２】
これは本発明の最終産物のＡではイソフラボンのアグリコン型であるゲネステインとダイドザインが検出されなかったが、加水分解させた後（Ｂ）にだけ検出されたもので、第１に最終産物にイソフラボンが含有されていることを示し、第２に、本発明の最終産物であるＡのイソフラボンとβ−Ｄ−グルカンは単純に混合されたことではなく、配糖体として存在する新物質であることが分かる。
【０１０３】
本発明のアガリクス茸菌糸体の液体培養物を用いて生成された抗癌性イソフラボン−β−Ｄ−グルカンのもう一つの製造方法は次の通りである。
【０１０４】
図１２に示された（６）段階は図１の（１）段階、図１２の（８）段階は図１の（５）段階と同様な過程によってなされる。
【０１０５】
図１２の（７）段階は自家分解酵素を分離して８０ＥＰ（アガリクス茸菌糸体液体培養物から抽出液に８０％エタノールで処理した高分子イソフラボンを含有したβ−Ｄ−グルカン）に処理することではなく、前述した自家分解酵素の活性最適条件であるｐＨ５.５〜６.５で１〜３時間反応させた後高圧加熱して抽出する方法よりなる。前記高圧加熱して抽出する方法は前述した図１の（２）段階で行われる方法と同様である。
【０１０６】
本発明の前記製造方法によって製造された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの分子量と構造は次の通りである。
【０１０７】
［実験例１１］：中低分子 イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの分子量測定
ＴＳＫカラムが装着されたＨＰＬＣ（Dionex社ＰＤＡ−１００ＵＶ探知機とＲＩ探知機、Ｐ−６８０ポンプ（pump）、ＡＳＩ−１００フラクションコレクタ（fraction collector））を使って分子量を測定した。このときの移動相は３次蒸溜水を使用し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。
【０１０８】
図１３はデキストラン（Dextran）標準フォームと比較してログスケール（log scale）で概略の分子量を計算したもので、中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの分子量は約２５，０００の結果が出た。
【０１０９】
［実験例１２］：中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの構造
製造用ＨＰＬＣ（ＴＳＫカラム、移動相；Ｈ2Ｏ）を使って中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを再び分離し、その中から抗癌効果が最大のピークを収集（collection）して構成糖とイソフラボン（ゲネステイン、ダイドザイン）、ＩＲ、Ｈ−ＮＭＲ、ＵＶスペクトルを分析した。
【０１１０】
図１４は前記実験結果現れたＩＲスペクトルを示した図である。
ＩＲ分析で特徴的なスペクトルは４９５−６５６ｃｍ-1（強、広い）、１０１４ｃｍ-1（強、狭い）、１１０９ｃｍ-1（弱、狭い）、１４０２.０、１４５０．８、１４７２.７ｃｍ-1（弱、広い）、１６４２.６ｃｍ-1（強、狭い）、２０９７．０−２１１２．０ｃｍ-1（中弱、広い）、２３９０ｃｍ-1（極弱、広い）、２８４３ｃｍ-1（中、ＯＨ吸収付近で狭い〜３０００ｃｍ-1）、３１７３.０−３６４８ｃｍ-1（ＯＨ吸収広い〜３０００ｃｍ-1）であった。
これは、標準フォームＧやＤのＩＲスペクトルと比較したとき、標準フォームが示す特徴的な作用時のＩＲ吸光を示した。
【０１１１】
図１５は前記実験の結果、現われたＨ−ＮＭＲを示した図である。
図１６は前記実験の結果、現われたＵＶスペクトルを示した図である。
ＵＶは２６７ｎｍで最大吸光度を示したが、これもＧの最大吸光度と同一であった。
これより、ＲＴ８.８ピークはイソフラボンのうちＧを主に含有するβ−Ｄ−グルカンであることが分かる。
【０１１２】
［実験例１３］：構成糖の調べ
試料にリン酸ナトリウムバッファ（buffer）（２０ｍＭ、ｐＨ６.５）５ｍｌを入れ、メガザイムキット（β−glucosidase）（０.２Ｕ、０.１ｍｌ）とリケナーゼ（licnenase）（１０Ｕ、０.２ｍｌ）に分解した後、ＨＰＬＣでカラム（RezoRCM−Monosaccharide column）、２００×１０ｍｍ）で糖を分析した。
【０１１３】
図１７は前記実験結果、ＲＴ８.８の単糖類の構成を示した図である。
ＲＴ８.８の構成糖を調べたところ、β−Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース（D−fructose）リボース（ribose）で構成糖とするβ−Ｄ−グルカンであることが分かる。
【０１１４】
本発明の前述した製造方法によって製造された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンは抗癌剤及び免疫増進剤として使われる。
【０１１５】
本発明の製造方法によって製造され分離されたイソフラボン−中低分子β−Ｄ−グルカンは癌細胞について強い殺害効果を示す一方、一般細胞にはほとんど毒性がないことが特徴である。本発明はイソフラボン含有培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養したものを用いるもので、イソフラボンのアグリコン型で抗癌効果があることが判明された事実であるが、本発明のように、イソフラボン−β−Ｄ−グルカン配糖体が、抗癌効果があるということは報告されたことがない。
【０１１６】
以下、本発明の製造方法によって製造された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの抗癌効果と免疫効果を、実験例を通して裏付ける。
［中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを含有する自家分解物または分離精製された中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの抗癌効果］
【０１１７】
［実験例１４］：Ｓ−１８０細胞に対する毒性実験
（１）実験
１０ｍｇ／ｍｌダブル蒸溜水（double distilled water、以下‘ＤＤＷ'と称する）で調製した試料を再びダルベッコＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagle's medium、以下‘ＤＭＥＭ'と称する）で再び１０倍稀釈して処理はＤＤＷ（１００μｌ）＋ＤＭＥＭ（９００μｌ）、試料処理は試料稀釈液（１００μｌ）＋ＤＭＥＭ（９００μｌ）濃度になるよう構成した。予め培養されたＳ−１８０細胞を１．５×１０5細胞/ｍｌになるよう稀釈して、表５のように３ｍｌ体積で処理した後（５×１０4cell/ml  ＤＭＥＭで稀釈）、処理されたウェルプレート（well plate）を５％ＣＯ2培養器（incubator）（３７℃）で４８時間培養してからトリフェインブルー（tryphane blue）で細胞を染色してヘマサイトメーター（haemacytometor）で生細胞数を調べてＥＤ５０値を求めた。
【０１１８】
（２）結果
表４は８０ＥＰを自家分解酵素（チューブ＃８）で処理した試料のＳ−１８０腹水癌細胞に対する細胞毒性を調べた結果を示したものである。
【０１１９】
４８時間培養後対照群の細胞は、２３.７×１０４cell/mlに成長した。自家分解した試料（自家分解されたＡＢ）は添加濃度別（１０，２０，３０μｇ/ｍｌ）にそれぞれ７.５，６.０，５.５×１０4cell/mlに成長してＥＤ５０（μｇ/ｍｌ）値は０.９であり、自家分解しない試料（ＡＢ）は添加濃度別（１０，２０，３０μｇ/ｍｌ）にそれぞれ１１.０，９.５，８.０×１０4細胞/ｍｌに成長してＥＤ５０（μｇ/ｍｌ）値は２.１であった。
【０１２０】
従って、自家分解酵素を処理した試料の細胞毒性が増加した。
これは自家分解酵素によって８０ＥＰから癌細胞に毒性を示す物質が生成されたことを意味する。
【０１２１】
【表４】
2005105247.tif 000006
【０１２２】
［実験例１５］：マウスに対する抗腹水癌性
（１）動物及び材料
癌研究所（Institute for Cancer Research、以下‘ＩＣＲ'と称する）雌マウス（mouse）（６〜７週齢）は‘生命科学'（Life Science）（大邱）で、Ｓ−１８０は'遺伝子銀行'（ソウル）で購入して継代しつつ使用した。Ｓ−１８０培養に必要な培地はＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社で、その他使用された一般試薬は特急ないし１級以上を使った。
【０１２３】
（２）マウス抗腹水癌実験
雌マウス（６〜７週齢）をケージ（cage）当り１０匹ずつ入れた（このとき、ケージ当り平均重さが同じくなるよう任意的に入れる）。温度と湿度が調節される施設に水と食べ物を自由に食べさせて１週間飼育した。ＩＣＲ雌マウス腹腔で継代培養されたＳ−１８０細胞（１×１０7cell/ｍｌ  ＰＢＳ）を各マウスに０.１ｍｌずつ腹腔に注射して腹水癌を誘発した。
【０１２４】
腹水癌誘発後２日毎に試料０.１ｍｌをマウスの腹腔に注射した。Ｓ−１８０細胞腹腔投与後３日間隔にマウスの重さと飼料摂取量を調べ、４０日間生存したマウスの匹数と生存日数を記録した。
【０１２５】
（３）結果
表５は、Ｓ−１８０腹水癌細胞をＩＣＲ雌マウスの腹腔に投与した１日後に試料（自家分解酵素を処理した８０ＥＰ）を処理した後、４０日間生存したマウスの数と生存日数を調べたことを示している。
【０１２６】
対照群マウスの平均寿命は１９.２日であった。しかし、自家分解された８０ＥＰ処理群（ＡＢ自家分解）の寿命は２６.９日に延びて４０％の寿命延長効果を示したし、４０日まで３匹が生存した。自家分解されない８０ＥＰ処理群（ＡＢ）の寿命延長効果はコントロール区よりは強かったが、ＡＢ自家分解処理群よりは弱かった。
【０１２７】
【表５】
2005105247.tif 000007
【０１２８】
［実験例１６］：ヒト癌細胞株（Human cancer cell lines）に対する細胞毒性
（１）用意１−培地調製  
ＤＭＥＭ培地１袋を９００ｍｌの３次蒸溜水に入れ完全に溶かしてペニシリン−ストラプトマイシン（phenicillin-straptomicin）１ｍｌを添加した。これに、重炭酸ナトリウム（sodium bicarbonate）（２ｇ）を添加しウシ胎児血清（fetal bovine serum、以下'ＦＢＳ'と称する）１００ｍｌを添加した後濾過紙（０.２２μｍ）でろ過させ４℃に保管した。
【０１２９】
（２）用意２−前培養
実験開始２４時間前にヒト癌細胞株 （ＭＣＦ−７、乳ガンとヘラ細胞（breastcencer and Hela）、子宮頸部癌細胞（uterine cervix cencer cell））をＤＭＥＭ培養液（５％ＣＯ2培養器、３７℃、２４時間）に継代培養した。
【０１３０】
継代培養されたヒト癌細胞株 （MCF−７、 breast cencer and Hela、uterine cervix cencer cell）にTrypsin−EDTA（Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid）１ｍｌを処理して５％Ｃ０2培養器、３７℃に１０分ほど反応させ、セルが培地から取れるようにしてから、遠心分離（1，500rpm、２min）してセルを回収した後、回収されたセルを前記製造した培地１２ウェルプレートにそれぞれ１ｍｌずつ分柱し、５×１０4セルになるように調節した。
【０１３１】
（３）ヒト癌細胞株に対する細胞毒性
［１］ヘラ細胞（Hela cell）とＭＣＦ−７cell
表６は、８０ＥＰを自家分解酵素（チューブ＃８）で処理する前後のヒト癌細胞株［ヘラ細胞（Hela cell:子宮頸部癌細胞株（uterine cervis cancer cell line）］に対する細胞毒性を調べた結果を示したものである。
【０１３２】
ヘラ細胞は、４８時間培養後各２０.１x１０４cell/mlに成長した。ヘラ細胞で自家分解されたＡＢとＡＢのＥＤ５０値は、それぞれ０.９と５.６μｇ/ｍｌで自家分解されたＡＢが強い細胞毒性を示した。
【０１３３】
この癌細胞株について自家分解されたＡＢがＡＢより強い細胞毒性を示して、自家分解によって８０ＥＰから毒性が強い物質が生成されたことを意味する。
【０１３４】
【表６】
2005105247.tif 000008
【０１３５】
表７は、前記ヘラ細胞の場合と同じく、８０ＥＰを自家分解酵素（チューブ＃８）で処理する前後のヒト癌細胞株ＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞株）に対する細胞毒性を調べた結果を示したものである。
【０１３６】
ＭＣＦ−７細胞は４８時間培養後、２１.５x１０4cell/mlに成長した。ＭＣＦ−７について自家分解されたＡＢとＡＢのＥＤ５０値はそれぞれ１.２、５、８μｇ/ｍｌであって、ヘラ細胞に対する毒性と類似であった。
【０１３７】
【表７】
2005105247.tif 000009
【０１３８】
［２］Ｃａｃｏ−２（大腸癌細胞）
ヒト癌細胞株Ｃａｃｏ−２に対する自家分解酵素（チューブ＃８またはＨＰＬＣによって分画された自家分解酵素、図５）を処理した８０ＥＰをＤＥＡＥカラムクロマトグラフィで６分画（Ｔｕｂｅ  ４，１４，２５，３２，６８，８３）を得た。
【０１３９】
図１８は各分画についてＣａｃｏ−２に対する細胞毒性を調べたことを示した図である。グラフの横軸は‘対照群'，‘β−グルカン'，‘＃４'，‘＃１４'など各サンプルを表示したものであり、縦軸は自家分解酵素を処理した後の細胞数を対照群に対するパーセンテージで示したものである。
【０１４０】
図１８から分かるように、対照群に比べて自家分解酵素を処理しない８０ＥＰは８５.７％の生存率を示し、１４％の細胞毒性を示したが、８０ＥＰに自家分解酵素を処理して分離した分画チューブ＃４と＃１４はそれぞれ約３７％と３３％の細胞毒性を示した。他の分画でも細胞毒性はあったが、チューブ＃４や＃１４より弱かった。
この結果は前述した結果（自家分解酵素処理による細胞毒性物質の生成）を裏付けられる資料になる。
【０１４１】
図１９は、チューブ＃８を濃度別に処理した結果を示している。
横軸は‘対照群'と‘自家分解酵素を処理しない８０ＥＰ'（サンプルＡ）、‘自家分解酵素を処理した８０ＥＰ'（サンプルＢ）を示したものであり、縦軸は細胞数を対照群に対するパーセンテージで示したものである。白棒の濃度は１ｍｇ、点文様棒は５ｍｇ、黒棒は１０ｍｇである。
【０１４２】
自家分解酵素を処理しない８０ＥＰ（サンプルＡ）は、濃度が増加するほど大した効果がなかった。しかし、自家分解酵素を処理した８０ＥＰを１，５，１０ｍｇ処理した時のＣａｃｏ−２に対する細胞毒性は対照群に比べてそれぞれ約２，２３，４２％であった。
従って、この分解物は細胞毒性が強く、分解によって細胞毒性物質が生成されたことを意味する。
【０１４３】
本発明のイソフラボン−中低分子β−Ｄ−グルカンは前述した抗癌効果だけではなく、免疫効果を同時に有することを特徴とする。免疫機能は抗癌機能と並行するとき、抗癌効果を一層アップすることができる。以下、実験例を通して本発明のイソフラボン−中低分子β−Ｄ−グルカンが有する免疫効果を説明する。
【０１４４】
［実験例１７］：イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを含有する自家分解物または分離精製されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの免疫増進効果
（１）動物、材料及び実験条件
ＩＣＲ雌マウス（６〜７週齢、４匹/ケージ/群）で、マウス用ペレット（pellet）飼料で１週間予備飼育して、体重が２８±１ｇであるものを実験に使用した。水と飼料は自由に提供し、照明は１２時間間隔の明暗サイクル（light−and−dark cycle）を維持して自然照明に近くし、飼育室の温度は２２±１℃、湿度は５０％に調節して飼育した。
【０１４５】
（２）実験内容
試料をそれぞれ１，２，４ｍｇ／ｇ体重/０.２ｍｌ  Ｄ・Ｗ濃度で調剤して経口を通して強制に投与した。最後の試料処理の次の日に各マウスの重さを計って、リポポリサッカライド［（lipopolysaccharide、以下‘ＬＰＳ'と称する）１ｍｇ/ｋｇ無菌ヘペス（ＨＥＰＥＳ）］をマウスの腹腔に注射した。ＬＰＳ注射した直後迅速にマウスの体重を調べた。そして４，８，１２，２４，４８時間経過後それぞれマウスの体重を調べた。
【０１４６】
（３）実験結果
図２０は、ＬＰＳを処理することによってＩＣＲ雌マウスの体重を減量させることについて、自家分解酵素が処理された８０ＥＰの効果を示した図である。
横軸は時間、縦軸は体重減量を示したものである。
【０１４７】
図２０の（１）は対照群、（２），（３），（４）は自家分解されたＡＺ処理群をそれぞれ１，２，４ｍｇ処理したもの、（５），（６），（７）は自家分解処理しない８０ＥＰをそれぞれ１，２，４ｍｇ処理したことを示す。
【０１４８】
ＬＰＳは一般に共有結合によって結合された脂質と多糖の複合体であるが、主にグラム陰性菌の外膜成分として存在する内毒素の本体である。ＬＰＳは色々の生物活性を示すので、内毒素（エンドトキシン）とも呼ばれ、病源細菌のリポ多糖は宿主の免疫系によって感染の信号として認識される。従って、ＬＰＳを処理して体重が減少する程度を観察することによって免疫力を推定できる。
【０１４９】
本実験においてＬＰＳを処理したマウスは、全て体重が減少した。試料を処理しない対照群マウスはＬＰＳ処理後経時的に体重が急激に減少して、ＬＰＳ処理２４時間後にはＬＰＳ処理前より２.４ｇ減少した。
自家分解された８０ＥＰ処理群（自家分解されたＡＺ）も、ＬＰＳ処理後経時的に体重が減少したが、対照群よりはその体重減少の程度が少なかった。
【０１５０】
対照群の場合、体重の減少が著しかったＬＰＳ処理２４時間の体重減少程度は、自家分解されたＡＺ処理群の場合１ｍｇ，２ｍｇ，４ｍｇ処理についてそれぞれ−１.７７，−１.２２ｇ，−０.７５ｇであって体重変化があった。すなわち、自家分解されたＡＺ処理群はＬＰＳの効果を減少させることができた。
【０１５１】
自家分解を処理しない８０ＥＰ処理群（８０％ＥｔＯＨ）も、処理濃度（１，２，４ｍｇ）によって体重の減少を減らしたが、その効果は自家分解されたＡＺ処理群より低かった。
【０１５２】
これによって８０ＥＰを自家分解酵素で処理した場合、ＩＣＲ雌マウスでＬＰＳの効果を軽減させうる物質が生成されたことを意味し、すなわちイソフラボン−中低分子β−Ｄ−グルカンに免疫効果があることを示す。
【０１５３】
以下、本発明のアガリクス茸菌糸体を液体培養して生成されたイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造方法に対する実施例を通して、本発明をさらに詳述する。但し、これら実施例は本発明を例示するためのもので、本発明がこれらのみに限定されることではなく、それぞれ実施例は反復実施してその結果の再現性を確認した。
【０１５４】
［実施例］
１.イソフラボンを含有する培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養して高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン（分子量３万以上）の生成
【０１５５】
大豆（４０ｇ）または大豆粕（４０ｇ）を水にふやかしてミキサーで十分に磨砕させた後、プロテアーゼ（１０ｇ）及びセルラーゼ（１０ｇ）を添加して６０Ｃ、２００ｒｐｍで１−５時間処理して酵素分解させた。これをそのまま使用することもできるが、天然植物性素材から分離されたイソフラボン（イソフラボン含量１０−１０００ｍｇ）または合成イソフラボン（１０−１０００ｍｇ）を添加することができる。これに、炭素源として黄砂糖（２２０ｇ）、リボース（ribose）（３ｇ）と無機塩（ＭｇＳＯ4：１０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4:１０ｇ）を添加して水を加えて１リットルにした。これを高圧滅菌（１２１℃、１時間）して液体培地として使用した。アガリクス茸菌糸体を液体培地に接種した後、２５〜３５℃で振盪または曝気して１−７日間培養した。
【０１５６】
２.高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの分離
前記培養液を高圧抽出（１２１℃、１時間）した後、硅藻土ろ過した濾液を真空濃縮（１０倍）した試料２００ｇに８０％エタノール溶液になるようエタノールを添加し、均一に振った後、４℃で２４時間放置して沈澱させた。
【０１５７】
沈澱物と上澄液を分離するために１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液を除去し、その後、分子量１０万以上のβ−Ｄ−グルカンを含有する沈澱物（８０ＥＰ:３.８ｇ）を分離した。
【０１５８】
３.アガリクス茸菌糸体液体培養物から自家分解酵素の分離／精製
（１）ＴＣＡ沈澱
アガリクス茸菌糸体培養物を減圧濾過して、濾液にＴＣＡを混合（最終濃度が１０％になるよう）して４℃で２４時間放置してから、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）して沈澱物を分離した。
【０１５９】
（２）ＤＥＡＥコラムクロマトグラフィ（column chromatography）
前記沈澱物を５０ｍＭソジウムアセテートバッファ（ｐＨ.５.０）に溶かしてＤＥＡＥカラム（２ｃｍ、１１０ｃｍ）で分離して１０ｍｌずつ収集した。
このとき使われた移動相は、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4と２０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．０）であった。
【０１６０】
４.中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンを生成する段階
前段階で製造された８０ＥＰをｐＨ５.５に調整した後、ＤＥＡＥカラムから分離された自家分解酵素１０ｍｌを添加して、振動培養器（shaking incubator）で反応（５３℃、１時間）させた。自家分解酵素によって中・低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン（分子量３万未満）が生成されたかを確認するため、ＴＬＣとＨＰＬＣを使って分離/確認した実験例は前述した通りである。
【０１６１】
５.中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの分離・精製
（１）ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィ
前記実施例３で製造された自家分解物３ｍｌを５ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７.７）が充填されたＤＥＡＥカラム（２ｃｍ，１１０ｃｍ）に充填した後、３１０ドロップ（１０ｍｌ）ずつ収集（collection）した。このとき、使われた移動相は、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（５Ｍｍ  ＮａＨ2ＰＯ4と５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．７）にした。
【０１６２】
（２）シリカゲル（Silicagel）カラムクロマトグラフィ
ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィによって分離された分画物を真空濃縮器で濃縮させた後、再びシリカゲルカラムクロマトグラフィを使って分離した。
このとき、ブタノール（Butanol）:エタノール（Ethanol）:水（Ｈ2Ｏ）を５:３:３（v/v/v）を溶離剤として使った。分劃物中に中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの存在はＴＬＣとＨＰＬＣと確認したことは実験例で述べた通りである。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明は、抗癌効果を有する天然成分であるイソフラボンと免疫増進効果を有する天然成分であるβ−Ｄ−グルカンの配糖体を製造する分野および医療分野において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】本発明である中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの製造工程を示した図である。
【図２】アガリクス茸菌糸体液体培養物にエタノール処理したものに対するＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図３】アガリクス茸菌糸体液体培養物の沈澱物をＤＥＡＥカラムクロマトグラフィで分画した後のＵＶスペクトルを示した図である。
【図４】チューブ＃８のＵＶスペクトルを示した図である。
【図５】チューブ＃８とチューブ＃１４のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示した図である。
【図６】自家分解酵素を８０ＥＰに反応させたものに対するＴＬＣパターンを示した図である。
【図７ａ】各分画物に８０ＥＰを反応させる前後のＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図７ｂ】各分画物に８０ＥＰを反応させる前後のＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図８ａ】８０ＥＰにチューブ＃８を処理したものに対するＲＩ検出結果を示した図である。
【図８ｂ】８０ＥＰにチューブ＃８を処理したものに対するＵＶ検出結果を示した図である。
【図９】大豆粕とその酸加水分解物をＴＬＣで分離した後そのパターンを示した図である。
【図１０】前記分離された物質に対するＵＶスペクトルを示した図である。
【図１１ａ】前記分離された物質に対するＩＲスペクトルを示した図である。
【図１１ｂ】前記分離された物質に対するＩＲスペクトルを示した図である。
【図１１ｃ】前記分離された物質に対するＩＲスペクトルを示した図である。
【図１２】本発明に係るイソフラボン−β−Ｄ−グルカンの他の製造方法の工程図である。
【図１３】中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの分子量をログスケールで示した図である。
【図１４】中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンのＩＲスペクトルを示した図である。
【図１５】中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンのＨ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図１６】中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンのＵＶスペクトルを示した図である。
【図１７】中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカンの単糖類の構成を示した図である。
【図１８】各分画についてＣａｃｏ−２に対する細胞毒性を示した図である。
【図１９】チューブ＃８を濃度別に処理した結果を示した図である。
【図２０】ＬＰＳの処理とＩＣＲ雌マウスの体重感量関係を自家分解酵素処理と関連して示した図である。
【符号の説明】
【０１６５】
１  高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン生成
２  高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン分離
３  自家分解酵素分離
４  中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン生成
５  中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン分離
６  高分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン生成
７  中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン生成
８  中低分子イソフラボン−β−Ｄ−グルカン分離
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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