(57)【要約】【課題】  ヒト脂肪酸β酸化酵素複合体（ＴＦＰ）に対する各種基質の反応性の評価、および新規基質の設計を可能とする。さらにはヒトＴＦＰの機能を直接制御しうる活性化剤および阻害剤の検索、評価を可能にする。【解決手段】  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ由来の脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）の結晶を作製し、Ｘ線結晶構造解析を行い、複合体の立体構造を明らかにし、ホモロジーモデリングによりヒト脂肪酸β酸化酵素複合体（ＴＦＰ）の立体構造を明らかにすることにより本発明の課題は解決できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ由来の脂肪酸のβ酸化酵素複合体の斜方晶系の結晶であって単位格子定数がａ＝９４〜９６Å、ｂ＝１１７〜１５５Å、ｃ＝１９１〜２０１Å、α＝β＝γ＝９０°である結晶。
【請求項２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ由来の脂肪酸のβ酸化酵素複合体の単斜晶系の結晶であって単位格子定数がａ＝１８１Å、ｂ＝９５Å、ｃ＝１６１Å、β＝１１２°である結晶。
【請求項３】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ由来の脂肪酸のβ酸化酵素複合体の単斜晶系の結晶であって単位格子定数がａ＝１８０Å、ｂ＝９４Å、ｃ＝１４９Å、β＝１１２°である結晶。
【請求項４】
ハンギングドロップ蒸気拡散法による脂肪酸のβ酸化酵素複合体の結晶化において、β酸化酵素複合体を予め一般式：
Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ
（式中、Ｒは炭素数４〜２０のアルキル基を表わし、ｎは２〜１０の整数である）
で示される化合物の溶液に対して透析して結晶化に用いることを特徴とする脂肪酸のβ酸化酵素複合体の結晶化方法。
【請求項５】
亜鉛塩を結晶化の内液に添加することを特徴とする請求項４に記載の脂肪酸β酸化酵素複合体の結晶化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ（以下、Ｐ．ｆｒａｇｉと略す）由来の脂肪酸β酸化酵素複合体のαおよびβサブユニットのポリペプチドの結晶に関し、また、この結晶を用いてＸ線回折による結晶構造解析によりえられた脂肪酸β酸化酵素複合体の立体構造に関する。本発明では、さらに、これらの立体構造を用いて得られたヒトの脂肪酸β酸化酵素複合体とその基質との複合体の立体構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質は、糖質、蛋白質と並んで生命活動に必要なエネルギーの供給源となる物質である。中でも脂質は、効率良くエネルギーを貯えることができる化学組成をもつために、エネルギー貯蔵物質として利用されるという特徴がある。実際、動植物体は脂肪組織を持っており、脂肪のエネルギーを中性脂肪（トリアシルグリセロール）の形で貯えている。すなわち、過剰に摂取したエネルギーを蓄積しておくことで、将来にエネルギーが不足した時のための準備をすることが可能となる。この脂質を利用した生体エネルギーの蓄積は、長い進化の課程で生命が獲得した必要不可欠なメカニズムではあるものの、急速に変化した人間の生活環境にとっては諸刃の剣となってしまった。過剰なカロリー摂取による過度な脂肪の蓄積である肥満は、糖尿病などの生活習慣病の原因となることが知られており、特に先進諸国において解決していかなければならない大きな課題である。生活習慣病は、消費エネルギーに対して過剰なカロリー摂取によって誰にでも起こりうる問題であるために、一般の人々にも広く認知されているほど関心が高い。従って、脂肪代謝の改善は、現代社会に大きなインパクトを与えることは間違いなく、ゆえに産業的価値も非常に大きい。
【０００３】
脂肪の代謝は、ヒトを含む脊椎動物ではミトコンドリアとペルオキシゾームで行われている。このうち、エネルギー生産のための代謝はミトコンドリアが担っている。エネルギー貯蔵型であるトリアシルグリセロールは、まずリパーゼによる加水分解によって脂肪酸がグリセロール骨格から遊離する。この脂肪酸は、血中を介して細胞膜に局在する脂肪酸トランスポーターによって細胞内に取り込まれる。さらに、ミトコンドリア外膜にあるアシル化補酵素Ａ合成酵素によって脂肪酸が補酵素Ａにチオエステル結合を介して結合し、アシル補酵素Ａとなる。このアシル基はカルニチン回路を介してミトコンドリア内膜の内側へ移動する。この長鎖アシル基を持った補酵素Ａが、４種類の化学反応から構成される脂肪酸β酸化反応サイクルによって分解される（図１）。
【０００４】
第一段目の反応（図１の反応（２））を行うアシル化補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＡＣＤ）は、アシル化補酵素Ａの２位と３位の炭素に結合する水素を引き抜いて２−エノイル化補酵素Ａを生成する。
二段目の反応（図１の反応（３））は、前段階で脱水素された位置に水を付加して３−ヒドロキシアシル化補酵素Ａとなる反応で、２−エノイル化補酵素Ａヒドラターゼ（２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ；ＥＣＨ）が触媒する。
三段目の反応（図１の反応（４））は、３−ヒドロキシアシル化補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（３−ｈｙｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＨＡＣＤ）によって付加された水酸基から水素が引き抜かれ３−ケトアシル化補酵素Ａとなる。
最終段階（図１の反応（５））を触媒する３−ケトアシル化補酵素Ａチオラーゼ（３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ；ＫＡＣＴ）で、３−ケトアシル補酵素Ａが炭素数の２つ少ないアシル化補酵素Ａとアセチル化補酵素Ａへと開裂する。短くなったアシル化補酵素Ａは再び一段階目のＡＣＤの基質となり、最終的にアセチル補酵素Ａになるまでサイクルが回転する。
脂肪酸β酸化反応サイクルでは、基質となるアシル基の長さに応じてそれぞれ異なる酵素が触媒する。ミトコンドリアに取り込まれた直後の長いアシル基を分解するのは、膜に結合した２つの酵素が４段階の脂肪酸β酸化反応を行う。
最初の反応を触媒するのは極長鎖に特異的なＡＣＤ（ｖｅｒｙ−ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＣＤ；ｖｌＡＣＤ）で、残りの３つの反応は、三頭酵素（ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＴＦＰ）と呼ばれる長鎖アシル基に特異的なＥＣＨ、ＨＡＣＤおよびＫＡＣＴから構成される酵素複合体が担っている（W.-H. Kunau et al., Prog. Lipid Res., vol. 34, 267 (1995)）。サイクルが進行してアシル基の長さが短くなってくると、膜に結合した２つの酵素のシステムから、ミトコンドリアマトリックス中に可溶化している単機能酵素群へと基質が引き渡されると考えられている。
【０００５】
ヒトのＴＦＰは遺伝子がクローニングされており、構成成分は分子量７９ｋＤａのαサブユニット（ＴＦＰａ）（配列番号４）と分子量４９ｋＤａのβサブユニット（ＴＦＰｂ）（配列番号５）である。溶液中でのオリゴマー構造はα４β４とする説とα２β２とする説があり、確定していない（Y. Uchida et al., J. Biol. Chem., vol. 267,1034 (1992), K. Carpenter et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 183, 443 (1992)）。単機能酵素とのアミノ酸配列上の類似性から、ＴＦＰａのＮ末端部分がＥＣＨ、Ｃ末端部分がＨＡＣＤ、ＴＦＰｂはＫＡＣＴに相当すると予想されている（W.-H. Kunau et al., Prog. Lipid Res., vol. 34, 267 (1995)）。
【０００６】
ＴＦＰに類似した複合酵素は原核生物にも存在する。Ｐ．ｆｒａｇｉ由来の脂肪酸β酸化酵素複合体（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  β−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＦＯＭ）は、ＥＣＨおよびＨＡＣＤ触媒機能を有する７７ｋＤａのαサブユニット（ＦＯＭａ）（配列番号２）とＫＡＣＴ触媒機能を有する４１ｋＤａのβサブユニット（ＦＯＭｂ）（配列番号３）の構成成分からなっており、溶液中ではα２β２のヘテロ４量体を形成する（S. Sato et al., J. Biochem., vol. 111, 8 (1992)）。アミノ酸配列上ＦＯＭａおよびＦＯＭｂはそれぞれＴＦＰａとＴＦＰｂと相同性が高く（図２および３）、両者の構造は基本的に共通していると推定される。同様の複合体は大腸菌にも存在する（W.-H. Kunau et al., Prog. Lipid Res., vol. 34, 267 (1995)）。
【０００７】
一般の人々の関心と比例して、脂肪の代謝を改善する方法と称されるものは数多く存在する。しかし、脂肪分解の分子メカニズムに科学的に裏付けられた効果を証明できる方法は皆無である。この理由の一つとして、各酵素の立体構造に基づいた脂肪分解メカニズムへの理解が不十分であることが挙げられる。実際に脂肪酸が分解される課程であるβ酸化反応サイクルに焦点を絞ると、単機能酵素ではそれぞれの酵素でいくつかの立体構造が決定されており、反応メカニズムの理解はかなり進んでいる。しかし、ミトコンドリア内膜に結合したｖｌＡＣＤとＴＦＰの立体構造情報は得られていない。特に、ＴＦＰについては３種類の酵素が集合した構造は、単機能酵素の構造情報だけでは予測不能で、集合する意義を含めて構造的見地からの分子メカニズムの理解が必須である。また、単機能酵素のＥＣＨにおいて、基質のアシル基が長くなるほど反応効率が低下することが知られている。この事実は、より長鎖のアシル基を効率良く分解するためにはＴＦＰのような複合体が必要とされていることと関連している可能性がある。一般に食物として摂取される脂質は、内膜上の酵素でしか分解できない長いアシル基から構成されている。したがって、β酸化反応サイクルの点から脂質代謝の改善を試みようとした場合、内膜上の酵素システムをターゲットとすることがより重要である。そのためにも、内膜に結合した２つの酵素、特にＴＦＰの原子レベルの立体構造が必要とされていた。
【０００８】
また、ＴＦＰの欠損は三頭酵素欠損症および長鎖ヒドロキシアシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症として知られており（C. R. Roe et al., The metabolic & molecular bases of inherited disease, vol. 2, chap. 101 (2001)）、生体エネルギー供給に大きな支障を引き起こす。具体的には、感染、長期間の飢餓、過労、激しい運動などに伴うブドウ糖からのエネルギー供給が不足した時に脂肪酸の代謝不全に陥り、β酸化の活発な心筋、肝臓および骨格筋などの働きが障害されやすい。また、β酸化障害によって生じる長鎖アシルカルニチンは不整脈の誘発に関係があると推定されており、突然死につながる可能性もある（C. R. Roe et al.,  The metabolic & molecular bases of inherited disease, vol. 2, chap. 101 (2001)）。遺伝子中でもっとも頻繁に見い出される変異はＧ１５２８Ｃで、蛋白質としてはＨＡＣＤの活性残基と予想されている（５１０（ＦＯＭ：Ｇｌｕ４６３）番）のグルタミン酸残基がグルタミンに置換される変異である。他にも、Ｔ８４５Ａ、Ｃ８７１Ｔ、Ｔ９１４Ａ、Ｃ１６７８Ｔなども報告されている。いずれの場合も、ＴＦＰによる長鎖脂肪酸分解活性が著しく低下したことが原因とされている（内山温他、日本臨床６０卷  増刊号４、７４７（２００２）、S. Eaton et al., Biochem. Soc. Trans., vol. 28, 177 (2000)）。ＴＦＰの欠損症を含む脂肪酸代謝異常の一般的な治療方針は、（１）長期間の空腹・飢餓を避ける、（２）低脂肪高炭水化物食とする、（３）急性期には早期にブドウ糖輸液を行って血糖維持することによって脂肪酸分解を最小限にすることなどである。特にＴＦＰの欠損症では、長鎖脂肪酸の代謝を必要としない中鎖脂肪酸で作られたミルクやオイルなどが利用される。一般には７５〜９０％の致命率であるといわれているが、食事療法を受けた患者では６７％が生存しており、その有用性が証明されている。従って、迅速かつ的確な初期診断とその後の適切な対応によって、患者の予後の改善が十分期待できる。しかしながら、遺伝子診断からＴＦＰに新種の変異が見つかった場合、予想される欠損症の重篤度を予測することは立体構造の知見がない場合には困難である。よって、本疾患における的確な初期診断のためにもＴＦＰの立体構造の解明が望まれている。
【非特許文献１】S. Sato et al., J. Biochem., vol. 111, 8 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＴＦＰの原子レベル立体構造の解明には、Ｘ線結晶構造解析法の適用が必須である。このためには、ＴＦＰの原子レベルの高分解能回折像を与える結晶の作成、さらにはＴＦＰ結晶化のためのＴＦＰ大量調製が必要である。現時点において、ヒトのＴＦＰ蛋白質試料を安定かつ大量に調製する方法が確立していないために、ヒトのＴＦＰを結晶化することは不可能に近い。
【００１０】
そこで、本発明者らは、ヒトミトコンドリアの脂肪酸β酸化酵素複合体：三頭酵素（ＴＦＰ）とアミノ酸配列の相同性が高く、脂肪酸β酸化酵素複合体として類似性の高い、Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のＦＯＭをターゲットとして三次元立体構造を決定し、その構造を基にヒトのＴＦＰの立体構造を推定する方法を選択した。本発明者らは、Ｐ．ｆｒａｇｉ由来ＦＯＭを結晶化し、その三次元立体構造を脂肪酸β酸化複合体として初めて原子レベルで決定することに成功した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のβ酸化酵素複合体の斜方晶系結晶であって、単位格子定数がａ＝９４〜９６Å、ｂ＝１１７〜１５５Å、ｃ＝１９１〜２０１Å、α＝β＝γ＝９０°である結晶を要旨とする。
本発明は、Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のβ酸化酵素複合体の単斜晶系結晶であって単位格子定数がａ＝１８１Å、ｂ＝９５Å、ｃ＝１６１Å、β＝１１２°である結晶をも要旨とする。
本発明は、Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のβ酸化酵素複合体の単斜晶系結晶であって単位格子定数がａ＝１８０Å、ｂ＝９４Å、ｃ＝１４９Å、β＝１１２°である結晶をも要旨とする。
【００１２】
本発明は、ハンギングドロップ蒸気拡散法による脂肪酸のβ酸化酵素複合体の結晶化において、β酸化酵素複合体を予め一般式：
Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ
（式中、Ｒは炭素数４〜２０のアルキル基を表わし、ｎは２〜１０の整数である）
で示される化合物に対して透析して結晶化に用いることを特徴とする脂肪酸のβ酸化酵素複合体結晶化方法にも関する。
本発明は、上記結晶化方法において亜鉛塩を結晶化溶液の内液に添加することを特徴とする脂肪酸のβ酸化酵素複合体の結晶化方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（１）ＦＯＭタンパク質の製造
ＦＯＭタンパク質のアミノ酸配列は公知である。このオペロン遺伝子（ｆａｏＡＢ）を大量発現系に構築し、タンパク質を調製する（M. Ishikawa et al., Biochem. J., vol. 328, 815 (1997)参照）。
【００１４】
（２）ＦＯＭタンパク質の結晶の製造
本発明者はハンギングドロップ蒸気拡散法でＦＯＭタンパク質の結晶化を試みた。蒸気拡散法は結晶化容器を用い閉鎖系空間を作り出す。容器内閉鎖系は、タンパク質を含む内液と外液から構成される。外液の塩濃度と沈殿剤の濃度を内液のこれらの濃度以上とすることによって、内液の各成分濃度は蒸気平衡を通じて外液との平行状態に達するまでゆっくりと上昇する。この結果外液の設定濃度次第で内液の過飽和状態を作り出すことが可能となる。そこから結晶の析出可能な過飽和状態を探し出す。ＦＯＭタンパク質の性質と機能から予測されるように、結晶の不安定さと多形転移現象により結晶構造解析に用い得る結晶を得ることができなかった。
【００１５】
しかし我々はこの問題を、ＦＯＭタンパク質を、予め、一般式：
Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ
（式中、Ｒは炭素数４〜２０のアルキル基を表わし、ｎは２〜１０の整数である）
で示される非イオン性界面活性剤溶液に対して透析してから内液に加えることにより解決し、良好な結晶を得ることに成功した。しかし、この非イオン性界面活性剤を内液に直接加えるだけでも結晶は得られない。
例えば、ＦＯＭタンパク質を５〜５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）緩衝液に溶解して（ｐＨ６〜７．５）、この溶液を濃度０．１〜１．０％で同じ緩衝液に上記化合物を溶解した溶液に対して一晩室温で透析した後、結晶化に適当な濃度まで濃縮する。
【００１６】
本発明のハンギングドロップ蒸気拡散法による結晶化の条件は例えば以下のようである。
内液組成：
ＦＯＭタンパク質                                  ３〜５０ｍｇ／ｍｌ
ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）          ５０〜２５０ｍＭ（ｐＨ５〜７）
ポリエチレングリコール                            ２〜５％
外液組成：
ＭＥＳ                          １００〜５００ｍＭ（ｐＨ５〜７）
ポリエチレングリコール          ４〜１０％
なお内液には必要に応じ、ＮＡＤ等の基質、基質類似体を加えてもよい。結晶化は２０℃で行い、数日後良好な結晶がえられる。
上記非イオン性界面活性剤の１つであるｎ−オクチルペンタオキシエチレン溶液に対して透析したＦＯＭタンパク質を用いて数十回結晶化を同条件で行った。この方法で得られる結晶は次に述べるＸ線構造解析の結果によれば斜方晶系に属するものであるが、極めて興味深いことに単位格子の大きさ、特にｂの大きさが１１７〜１５５Åの範囲で大きく変動することがわかった（図４）。
【００１７】
内液にさらに、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、硝酸亜鉛等の亜鉛塩を更に添加することで単斜晶系に属する２種類の結晶が得られる。亜鉛塩の濃度は０．５〜５ｍＭが好ましい。結晶に金属を添加する例はあるが、多くはタンパク質の機能に必須の金属である。本発明の場合、機能、酵素活性と無関係な金属を加えることによって安定性の高い結晶がえられることがわかった。他の２価金属イオン、マンガン、バリウム、ストロンチウムでは亜鉛のように安定性の高い結晶は得られない。これらの結晶化条件はすべての脂肪酸β酵素複合体の構造を決定する上で重要となると考えられる。
【００１８】
（２）ＦＯＭ結晶のＸ線構造解析の方法
Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のβ酸化酵素複合体の結晶構造は、Ｘ線構造解析法によって決定される。単結晶のＸ線回折強度データは、回転対陰極を装備したＸ線発生装置または放射光を利用したＸ線を利用して取得する。初期位相の決定には、重原子多重同型置換法、多波長異常分散法、分子置換法が利用できる（Jan Drenth, [Principles of Protein X-ray Crystallography], Springer-verlag Inc. (1994))。我々は重原子多重同型置換法により初期位相の決定を行い、立体構造の決定を行った。本発明により立体構造が決定されたことから、今後は我々が実施した重原子多重同型置換法による重原子誘導体結晶の調製などの実施を行う必要性がなくなり、これらの立体構造を利用した分子置換法での簡便な解析が可能となる。例えば、斜方晶系結晶では他にも格子定数が異なる結晶が得られているが、我々の実施例にも示したように分子置換法で結晶構造を決定することがより効率的となる。得られた初期位相から初期的な立体構造モデルをグラフィックスワークステーション上で作成する。このモデルは、立体化学的制約を課した構造精密化により最適化され、最終的な立体構造モデルとなる。
【００１９】
（３）ＦＯＭ結晶の構造解析結果得られた知見
Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のβ酸化酵素複合体の立体構造（単位格子定数がａ＝１８１Å、ｂ＝９５Å、ｃ＝１６１Å、β＝１１２°の単斜晶系結晶）を図６Ａに示す。この構造は、７１５アミノ酸残基（１〜７１５番）からなるαサブユニットが、Ｎ末端から２８３番までがＥＣＨ、３１４番からＣ末端までのＨＡＣＤと、それらをつなぐリンカー（２８４番から３１３番まで）の３つの部分から構成されることがわかった。一方、３９０アミノ酸残基（２〜３９１番）からなるβサブユニットは全体でＫＡＣＴを構成していた。また、単位格子定数がａ＝９６Å、ｂ＝１１８Å、ｃ＝１９１Å、α＝β＝γ＝９０°の斜方晶系結晶の構造も明らかになり（図６Ｂ）、単斜晶系結晶の構造とくらべるとＨＡＣＤ部分が残りのＥＣＨとＫＡＣＴに対して相対的に大きく変化していた。
ＦＯＭを構成する３つの酵素は、それぞれ対応する単機能酵素の立体構造が明らかにされている。これらをそれぞれＦＯＭ複合体の立体構造と比較すると、活性部位周辺の構造は基本的に同じであった（図７）。従って、活性部位周辺における基質の結合および触媒反応のメカニズムは複合体酵素と単機能酵素で本質的に変わらないことが示唆される。また、それぞれの活性部位周辺には、結晶化の際、添加した補酵素と基質類似体の結合が観測された。そこで、得られた立体構造と単機能酵素との類似性を基に、ＦＯＭ複合体に含まれる３酵素の基質結合を明らかにした（図８）。
多機能酵素複合体では、各構成酵素が連係することにより触媒する連鎖反応を全体的に「効率化」すると考えられている。しかし、「効率化」を示す間接的な実験結果はあるものの、そのメカニズムについてはいずれの複合酵素でも未だ解明されていない。その結果、「効率化」の有無そのものが未だに議論の対象であり、ＦＯＭ複合体でもこの状況は同じである。そこで、我々は、ＦＯＭに含まれる３つの酵素が連係して連鎖反応を効率化する分子メカニズムを立体構造から考察した。その結果、図６Ａの構造と図６Ｂの構造の間でＦＯＭ複合体がコンフォメーション変化するのに伴って、基質がＦＯＭに結合した状態で３つの活性部位間を渡り歩くことができることがわかった。すなわち、ＦＯＭの複合体形成による連鎖反応の効率化とは、基質が溶液中に自由拡散することを妨げることによって酵素周辺の基質の実効濃度を高めることにあると推測された。このメカニズムは、これまでの多くの実験結果と一致する（L. Agius and H. S. A. Sherratt, Eds., Channelling in Intermediary Metabolism (Portland Press Ltd, London, 1997）。
【００２０】
（４）ヒト由来ＴＦＰのホモロジーモデリング
Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のＦＯＭは、ヒトのミトコンドリアに存在するＴＦＰとアミノ酸配列上の相同性があり、ＦＯＭの立体構造からＴＦＰのホモロジーモデルを作成することが可能である。両者のアミノ酸配列を比較して、ＦＯＭの構造中に対応するＴＦＰのアミノ酸残基に置き換えることでＴＦＰの三次元モデルを作成する。得られたモデルは、立体化学的に適切な構造をとるようにするために、エネルギー最小化を行う。
【実施例１】
【００２１】
ＦＯＭタンパク質の製造
Ｐ．ｆｒａｇｉのオペロン遺伝子ｆａｏＡＢ（配列番号１）をｐＴ７７大量発現ベクター（Tabor, S. Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel, F. M. et al.eds. (Wiley and Sons, New York,1990)pp. 16.2.1-16.2.11）に挿入し，発現ベクターを宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入した。発現ベクターを取り込んだ大腸菌を選択し、大量（１リットル）培養し、１ｍＭ  イソプロピル  b−Ｄ−チオガラクトシドの培地への添加によりＦＯＭタンパク質の発現を誘導し、３時間後培養を止め、遠心操作により大腸菌を回収した。
【００２２】
大腸菌を超音波破砕し遠心操作すると、可溶性画分にＦＯＭタンパク質が抽出された。この粗細胞抽出液を透析チューブに移し、ＤＴＴ３ｍＭ、グリセロール２０％、リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ６．５）の外液に対し透析を行った。透析の後、タンパク質溶液を、チューブから取り出し、ＤＴＴ３ｍＭ、グリセロール２０％、リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ６．５）で平衡化したホスホセルロースカラムに吸着させる。カラムを同緩衝液で洗浄した後、吸着タンパク質を、リン酸カリウム濃度を５００ｍＭに上げた上記緩衝液（ｐＨ６．５）により、濃度勾配法によって溶出させた。溶出したタンパク質分画を集め、セントリプレップ濃縮器（アミコン製）を使って濃縮した。濃縮したタンパク質を、ＤＴＴ３ｍＭ、グリセロール１０％、リン酸カリウム緩衝液２００ｍＭ（ｐＨ６．５）で平衡化したスーパーデックス２００（アマシャム製）を使って、ゲルろ過を行った。溶出タンパク質画分を集め透析チューブに入れ、ＤＴＴ３ｍＭ、グリセロール５０％、ＰＩＰＥＳ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ６．５）に対して透析を行った。透析による緩衝液の交換後、タンパク質溶液は、結晶化を行うまで、不凍液として−２０℃で保存した。  
【実施例２】
【００２３】
ＦＯＭの結晶の製造（斜方晶系結晶の場合）
実施例１で製造したＦＯＭタンパク質を、０．６％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチルペンタオキシエチレンを含む１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）に対して、限界分子量１２０００の透析膜を用いて一晩透析した後、ＦＯＭタンパク質を約１５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＦＯＭタンパク質の最終濃度を３−１０ｍｇ／ｍｌ、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５−６．５）８０−８２ｍＭ、ＮＡＤ  １ｍＭ、アセトアセチル−ＣｏＡ  ０．１ｍＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４Ｋ）３．５％になるように内液を調製し、外液組成はＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５−６．５）２００ｍＭ、ＰＥＧ４Ｋ７％、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）３ｍＭとした。これらの溶液を含む結晶化容器をインキュベター中に静置する事により蒸気拡散法で結晶を製造した。結晶は約３日後に生成した。この実験を数十回繰り返し行い、それぞれ結晶を得、Ｘ線結晶分析に付した。
【実施例３】
【００２４】
実施例２においてｎ−オクチルペンタオキシエチレンに変えてｎ−オクチルテトラオキシエチレンを用いた外は実施例２と同様にしてＦＯＭの結晶を得た。
【実施例４】
【００２５】
実施例２においてｎ−オクチルペンタオキシエチレンに変えてｎ−オクチルトリオキシエチレンを用いた外は実施例２と同様にしてＦＯＭの結晶を得た。
【実施例５】
【００２６】
ＦＯＭの結晶の製造（単斜晶系結晶の場合）
内液に塩化亜鉛１ｍＭを加えた外は実施例２と同一の条件で結晶化を行い、２種類の結晶を得た。
【実施例６】
【００２７】
ＦＯＭ結晶のＸ線結晶解析
Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のβ酸化酵素複合体の立体構造は、まず、実施例５で製造した結晶の１つである単位格子定数がａ＝１８１Å、ｂ＝９５Å、ｃ＝１６１Å、β＝１１２°の単斜晶系結晶を用いて行った。初期位相の決定は、２つの水銀誘導体と１つのセレン誘導体を用いた重原子多重同型置換法で行った。初期位相の計算はプログラムＳＨＡＲＰ（E. de La Fortelle et al., Methods Enzymol., vol. 276, 472 (1997））を利用した。立体構造モデルの構築はプログラムＯ（T.A. Jones et al., Acta Cryst., vol. A47， 110 (1991)）およびＱＵＡＮＴＡ（Accerlys Inc.）上で行った。構造精密化はプログラムＣＮＳ(Brunger et al., Acta Crst., Vol. D54. 905-921(1998))を使い、分解能２．５Åの立体構造モデルを得た。さらに、得られた結晶形１の立体構造を利用して、実施例５で製造したもう一つの結晶である単位格子定数がａ＝１８０Å、ｂ＝９４Å、ｃ＝１４９Å、β＝１１２°の単斜晶系結晶、実施例２で製造した単位格子定数がａ＝９６Å、ｂ＝１１８Å、ｃ＝１９１Å、α＝β＝γ＝９０°の斜方晶系結晶、実施例２で製造した単位格子定数がａ＝９６Å、ｂ＝１５４Å、ｃ＝１９１Å、α＝β＝γ＝９０°の斜方晶系結晶の立体構造をプログラムＡＭｏＲｅ（J. Navaza et al., Acta Crystallogr., vol. A50,157(1994)）を利用した分子置換法により決定した。モデルの構築および精密化を同様に行い、それぞれ分解能３．３Å、３．５Å、３．９Åの立体構造モデルを得た。
【実施例７】
【００２８】
ヒト由来ＴＦＰの立体構造ホモロジーモデル
ホモロジーモデリングは、プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（J.D. Thompson et al, Nucleic Acids Research, vol. 22, 4673 (1994)）から出力されたＰ  ｆｒａｇｉ由来ＦＯＭとヒト由来ＴＦＰとのアミノ酸配列比較（図２と図３）を参考にしながら結晶形１のＦＯＭ立体構造上にヒト由来ＴＦＰのアミノ酸配列を構築した。このために、三次元立体構造表示グラフィックスプログラムｉｎｓｉｇｈｔＩＩ（Accerlys Inc.）を利用した。構築したモデルは、ＣＶＦＦ（Accerlys Inc.）等の分子力場を利用してプログラムＤＩＳＣＯＶＥＲ（Accerlys Inc.）により立体構造最適化を行った。得られたホモロジーモデルを図９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によって、長鎖アシル基をもつ脂肪酸β酸化反応のうち、複合酵素に含まれる酵素（ＥＣＨ、ＨＡＣＤ、ＫＡＣＴ）の基質認識機構、および、脂肪酸β酸化反応サイクルの連鎖反応メカニズムを明らかにした。これらの結果によって、ヒトのＴＦＰに対する各種基質の反応性の評価、および新規基質の設計が可能となった。さらにはヒトＴＦＰの機能を直接制御しうる活性化剤および阻害剤の検索、評価、および設計をも可能となった。よって、ヒトの脂肪酸β酸化酵素に関係する疾患に対する治療、医薬品の開発を行うために重要な基礎的構造情報が得られることとなる。ＴＦＰの欠損症治療の面においても、ＴＦＰの遺伝子診断により新規の変異が明らかになった場合でも予想される欠損症の重篤度予測が可能となり、その結果として初期診断の迅速化がもたらされることは遺伝子上の欠損を持つ患者にとって大きな利益となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】脂肪酸β酸化回路を示す。
【図２ａ】ヒトミトコンドリア脂肪酸β酸化酵素複合体（ＴＦＰ）αとＰ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）αのアミノ酸配列の相同性を示す。＊印は同一アミノ酸、・印は類似アミノ酸
【図２ｂ】ヒトミトコンドリア脂肪酸β酸化酵素複合体（ＴＦＰ）αとＰ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）αのアミノ酸配列の相同性を示す。図２ａの続きである。
【図３ａ】ヒトミトコンドリア脂肪酸β酸化酵素複合体（ＴＦＰ）βとＰ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）βのアミノ酸配列の相同性を示す。＊印は同一アミノ酸、・印は類似アミノ酸を示す。
【図３ｂ】ヒトミトコンドリア脂肪酸β酸化酵素複合体（ＴＦＰ）βとＰ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）βのアミノ酸配列の相同性を示す。図３ａの続きである。
【図４】Ｐ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）の斜方晶系結晶の多形性を示す。結晶格子を決定した４５個の単斜晶形結晶を単位格子の体積が小さい順番に並べ、その体積（パネルＡ）と格子定数（パネルＢ）をグラフで表した。パネルＢのグレーで示した領域が、それぞれの軸が変化した範囲を示している。単位格子の体積が大きく変化するのに伴い、特にｂ軸の格子定数が顕著に変化していることがわかる。
【図５】Ｐ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）の一次構造を示す。α鎖はＥＣＨとＨＡＣＤの酵素部分を含み、それらがリンカー部分でつながれている。β鎖はＫＡＣＴの酵素部分からなる。それぞれの一次構造の下に、対応する単機能酵素およびヒト由来の脂肪酸β酸化酵素複合体の一次構造を示す。下線はアミノ酸配列上類似性の高い部分を示している。特に、α鎖のＧｌｕ１２０、Ｇｌｕ１４０、Ｈｉｓ４５１、Ｇｌｕ４６３、β鎖のＣｙｓ９５、Ｈｉｓ３４７、Ｃｙｓ３７７はそれぞれが属する酵素の活性残基で、単機能酵素やヒト由来の脂肪酸β酸化酵素複合体でも厳密に保存されている。
【図６】Ｐ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）の立体構造を示す。パネルＡは結晶形１、パネルＢは結晶形２の構造である。結合していた補酵素（ＮＡＤ＋）および基質類似体（アセチルＣｏＡ、Ｃ８Ｅ５）はスティックモデルで示されている。真中の図の矢印は、分子内に見い出される２回軸を表している。一つの分子にα鎖、β鎖ともに２個ずつ含むために、それぞれα鎖間とβ鎖間に２回軸が存在する。それらの２回軸は、結晶形１ではほぼ一致しているものの、結晶形２では１０Åずれている。すなわち、ＦＯＭ複合体は、分子全体で２回対称を保持する結晶形１の構造から、非対称な結晶形２の構造に変化できることがわかる。
【図７】Ｐ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）と単機能酵素の立体構造との比較を示す。最上段の３つの構造は、Ｐ．ｆｒａｇｉ由来のＦＯＭを構成するＥＣＨ部分（パネルＡ）、ＨＡＣＤ部分（パネルＤ）およびＫＡＣＴ部分（パネルＧ）である。中段は対応する単機能酵素の立体構造を表している。それぞれ、ホモ６量体を形成するｒａｔ由来ＥＣＨ（パネルＢ）、ホモ２量体を形成するヒト由来ＨＡＣＤ（パネルＥ）、ホモ４量体を形成するＺｏｏｇｌｏｅａ．  ｒａｍｉｇｅｒａ由来ＡＡＣＴ（アセトアセチル補酵素Ａチオラーゼ）（パネルＨ）である。最下段は、それぞれＥＣＨ部分（パネルＣ）、ＨＡＣＤ部分（パネルＦ）、ＫＡＣＴ部分（パネルＩ）における構造の重ね合わせである。
【図８】Ｐ．ｆｒａｇｉ由来  脂肪酸β酸化酵素複合体（ＦＯＭ）のリガンド結合部位を示す。最上段は、Ｐ．ｆｒａｇｉ由来ＦＯＭ複合体の立体構造中に観測された補酵素および基質類似体の結合の様子を示す。それぞれパネルＡがＥＣＨ部分（Ｃ８Ｅ５が結合）、パネルＤがＨＡＣＤ部分（ＮＡＤ＋およびＣ８Ｅ５が結合）、パネルＧがＫＡＣＴ部分（アセチルＣｏＡが結合）を表している。中段は、対応する単機能酵素が基質又はその類似体を結合した立体構造。パネルＢはｒａｔ由来ＥＣＨとアセトアセチルＣｏＡの複合体、パネルＥはヒト由来ＨＡＣＤとヒドロキシブチルＣｏＡとの複合体、パネルＨがＺ．  ｒａｍｉｇｅｒａ由来ＡＡＣＴとＣｏＡとの複合体を表す。パネルＨでは活性残基であるＣｙｓ８９がアセチル化されている。最下段は、Ｐ．ｆｒａｇｉ由来ＦＯＭ複合体のリガンド結合モデルを表す。基質にはアシル基の炭素鎖長が１６であるヘキサデカノイルＣｏＡの誘導体を利用している。
【図９】ヒトミトコンドリア脂肪酸β酸化酵素複合体（ＴＦＰ）のホモロジーモデル示す。球はヒト由来ＴＦＰの機能が欠損した患者から得られた変異の箇所を表す。特に、枠内に示したＶａｌ２８２はα−βサブユニット間の疎水性インターフェースに位置し、これがアスパラギン酸に変化することによりサブユニット間相互作用が弱まることが予想される。矢印はＨＡＣＤの活性部位であるＧｌｕ５１０の変異を表している。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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