(57)【要約】【課題】  胚性幹細胞や、骨芽細胞、軟骨細胞などアルカリホスファターゼ活性を有する細胞を、当該酵素活性を測定することにより、その量を相対的に比較測定する方法を提供する。【解決手段】  リン酸を含まず、pHが7.5から8.5に調整された緩衝液に、4-メチルウンベリフェリルホスフェート等の蛍光基質および／またはパラニトロフェニルホスフェート等の吸光基質を添加した基質溶液を、胚性幹細胞や、骨芽細胞、軟骨細胞などアルカリホスファターゼ活性を有する細胞培養体に加え、1分から60分の範囲で反応させた後、反応生成物の蛍光および／または吸光を測定して当該培養体の量を相対的に測定することによる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整されており、アルカリホスファターゼ用の蛍光基質および／または吸光基質を含む緩衝液を用いて、細胞培養体のアルカリホスファターゼ活性を比較測定することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項２】
アルカリホスファターゼ用の蛍光基質が4-メチルウンベリフェリルホスフェート、吸光基質がパラニトロフェニルホスフェートである、請求項１に記載のアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項３】
緩衝液が少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む、請求項１に記載のアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項４】
リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、蛍光基質として4-メチルウンベリフェリルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む緩衝液を用いて、細胞培養体のアルカリホスファターゼ活性を比較測定することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項５】
リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、吸光基質としてパラニトロフェニルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む緩衝液を用いて、細胞培養体のアルカリホスファターゼ活性を比較測定することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項６】
リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、アルカリホスファターゼ用の蛍光基質および／または吸光基質を含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止後生成物を測定しアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項７】
アルカリホスファターゼ用の蛍光基質が4-メチルウンベリフェリルホスフェート、吸光基質がパラニトロフェニルホスフェートである、請求項６に記載のアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項８】
緩衝液が少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む、請求項６に記載のアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項９】
リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、蛍光基質として4-メチルウンベリフェリルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止後生成物の蛍光値を測定しアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項１０】
リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、吸光基質としてパラニトロフェニルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止後生成物の吸光値を測定してアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項１１】
無菌的に作成した、リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、蛍光基質として4-メチルウンベリフェリルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸と塩基または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸と塩基のいずれかを含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、当該反応液を無菌的に分離後少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止させ、生成物の蛍光値を測定してアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とするアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項１２】
無菌的に作成した、リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、吸光基質としてパラニトロフェニルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸と塩基または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸と塩基のいずれかを含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、当該反応液を無菌的に分離後少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止させ、生成物の吸光度を測定してアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一に記載の測定方法に使用するための、無菌的に作成した、リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、吸光基質としてパラニトロフェニルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸と塩基若しくは2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸と塩基のいずれかを含む緩衝液、または該緩衝液を含む試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞や、骨芽細胞、軟骨細胞などアルカリホスファターゼ活性を有する細胞を、当該酵素活性を測定することにより、細胞量を相対的に比較測定する方法又はそれに使用する試薬を提供するもので、近年注目されている再生医療などにおいて移植用細胞の分化状態や細胞量の管理に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
従来細胞量の測定は細胞をトリプシンなどの解離剤を用いて回収し、血球計算盤やコールターカウンター等でその数を直接計数する（非特許文献１）か、DNA定量や、MTT（非特許文献２）やXTT、Alamarblueといった呼吸系の酵素によって還元される色素の変色量を吸光および／または蛍光によって測定する方法が主流であった。しかしながら、近年発達した培養細胞を利用した再生医療研究で注目されるようになった、胚性幹細胞や、間葉性幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞は、未分化細胞を維持するために異種の細胞と共培養したり、未分化集団の一部が分化したりするため、単純に細胞数を計数したり、呼吸系酵素による色素の変色量を測定するだけでは未分化細胞の量や、分化した細胞の量を把握することが困難であった。
【０００３】
アルカリホスファターゼは胚や胎盤のほか、骨や肝臓、小腸に特異的なアイソザイムがあり、骨芽細胞や軟骨細胞、肝細胞の場合はしばしば分化マーカーとして、また胚性幹細胞や始原生殖細胞等の場合では未分化のマーカーとして利用される。しかし、一般的なアルカリホスファターゼの活性測定はpH 9以上の緩衝液中で行われることが多く（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）、生存したままの細胞を測定することは困難であり、測定に供した細胞の利用は考えられなかった。
【０００４】
一方、未分化の始原幹細胞の増殖を定量するための方法として、無血清DMEM培地中に、約0.2mmol/Lの濃度の4-メチルウンベリフェリルホスフェートを、細胞培養体に添加し、37℃下、約1時間〜約2時間の間、その細胞をインキュベートした後、蛍光プレートリーダーを、励起波長360nmおよび発光波長448nmで使用して、蛍光産物の量を測定する方法が報告されている（特許文献５および特許文献６）。しかし、無血清DMEM培地は通常pHが7.0から7.2の間で利用され、このpH領域ではアルカリホスファターゼの活性が低く抑えられる。また、一般に無血清DMEM培地にはリン酸塩が1mmol/L近く含まれているが、アルカリホスファターゼはリン酸が存在すると阻害される。従って無血清DMEM培地を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定した場合、感度が低く、測定に2時間近くの長時間を要するという問題点があった。
【０００５】
【非特許文献１】日本組織培養学会編  組織培養の技術［基礎編］  １９９６年  ｐ３８−３９
【非特許文献２】日本生化学会編  新生化学実験講座１８「細胞培養技術」  １９９０年  ｐ８５
【特許文献１】特開平６−２３７７９６号公報
【特許文献２】特開平９−３２２７９９号公報
【特許文献３】特開２００２−１８１８２５号公報
【特許文献４】特許第３１４６７７８号公報
【特許文献５】特開２００１−１７１６３号公報
【特許文献６】特表２００１−５２００３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、胚性幹細胞や、骨芽細胞、軟骨細胞などアルカリホスファターゼ活性を有する細胞を、当該酵素活性を測定することにより、その量を相対的に比較測定する方法を確立することを課題とし、従来の技術では困難であった多種類の性質を有する細胞集団の中で目的とする細胞の量だけを相対的に比較測定する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前述の課題を解決すべく研究を進めた結果、リン酸イオンを含まずpHが7.5から8.5に調整されアルカリホスファターゼ用の蛍光基質および／または吸光基質を含む緩衝液を用いて、胚性幹細胞や、骨芽細胞、軟骨細胞などアルカリホスファターゼ活性を有する細胞培養体のアルカリホスファターゼ活性を比較測定することにより、細胞量を比較的高感度に測定する方法を確立した。
【０００８】
つまり本発明は以下よりなる。
１．リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整されており、アルカリホスファターゼ用の蛍光基質および／または吸光基質を含む緩衝液を用いて、細胞培養体のアルカリホスファターゼ活性を比較測定することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
２．アルカリホスファターゼ用の蛍光基質が4-メチルウンベリフェリルホスフェート、吸光基質がパラニトロフェニルホスフェートである、前項１に記載のアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
３．緩衝液が少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む、前項１に記載のアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
４．リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、蛍光基質として4-メチルウンベリフェリルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む緩衝液を用いて、細胞培養体のアルカリホスファターゼ活性を比較測定することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
５．リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、吸光基質としてパラニトロフェニルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む緩衝液を用いて、細胞培養体のアルカリホスファターゼ活性を比較測定することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
６．リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、アルカリホスファターゼ用の蛍光基質および／または吸光基質を含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止後生成物を測定しアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
７．アルカリホスファターゼ用の蛍光基質が4-メチルウンベリフェリルホスフェート、吸光基質がパラニトロフェニルホスフェートである、前項６に記載のアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
８．緩衝液が少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む、前項６に記載のアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
９．リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、蛍光基質として4-メチルウンベリフェリルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止後生成物の蛍光値を測定しアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
１０．リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、吸光基質としてパラニトロフェニルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸のいずれかを含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止後生成物の吸光値を測定してアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
１１．無菌的に作成した、リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、蛍光基質として4-メチルウンベリフェリルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸と塩基または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸と塩基のいずれかを含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、当該反応液を無菌的に分離後少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止させ、生成物の蛍光値を測定してアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とするアルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
１２．無菌的に作成した、リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、吸光基質としてパラニトロフェニルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸と塩基または2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸と塩基のいずれかを含む緩衝液を細胞培養体に加えて1分以上60分以下の時間反応させ、当該反応液を無菌的に分離後少なくとも0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩を含む反応停止液を添加して反応停止させ、生成物の吸光度を測定してアルカリホスファターゼ活性を比較することを特徴とする、アルカリホスファターゼ活性を有する細胞の相対測定方法。
１３．前項１〜１２のいずれか一に記載の測定方法に使用するための、無菌的に作成した、リン酸イオンを含まず、pHが7.5から8.5に調整され、吸光基質としてパラニトロフェニルホスフェートを含み、少なくとも2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸と塩基若しくは2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸と塩基のいずれかを含む緩衝液、または該緩衝液を含む試薬キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、胚性幹細胞や、骨芽細胞、軟骨細胞などの細胞のアルカリホスファターゼ活性を短時間に正確に測定することが可能になり、当該酵素活性を測定することにより、細胞量を相対的に比較測定する方法が確立された。さらに、従来の技術では困難であった分化状態の違う多種類の性質を有する細胞集団の中で目的とする細胞の量だけを相対的に比較測定することが可能になったばかりでなく、それらの細胞を生きたままの状態で経時的にモニターすることが可能となり、細胞の量と分化状態を把握することが容易になった。また、反応生成物となる4-メチルウンベリフェロン等を標準として用い検量線を書かせて測定値などを比較することにより、各測定時の単位時間当たりの反応量として活性を表すことも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
具体的には、リン酸塩を使用しない緩衝液系によりpHを7.5から8.5に調整し、この溶液にアルカリホスファターゼ用の蛍光基質および／または吸光基質を添加して反応に供する。このときの緩衝液系としては2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}エタンスルホン酸（以下Hepesと略す）や、N-トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタン（以下Trisと略す）、N-トリス(ハイドロキシメチル)メチルグリシン（以下Tricineと略す）、2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸（以下EPPSと略す）等が利用でき、細胞に与える毒性の面からHepesまたはEPPSの緩衝液が最も好ましい。
このときのHepesまたはEPPSの濃度は細胞毒性と緩衝効果の面から、10から30mmol/Lが好ましい。また、この溶液にはリン酸塩以外の塩を加えることが可能であり、細胞を生きたままで測定するためには、浸透圧を調整するため8から9g/LのNaClを加えてもかまわない。
【００１１】
アルカリホスファターゼ活性を測定するための基質としては、蛍光基質と吸光基質のいずれを用いてもかまわないが、蛍光基質としては4-メチルウンベリフェリルホスフェート、吸光基質としてはパラニトロフェニルホスフェートが一般的に利用される。感度の面からは蛍光基質を利用することが好ましく、4-メチルウンベリフェリルホスフェートを用いることがより好ましい。
【００１２】
前述の基質溶液はそのままでも利用できるが、細胞を生きたまま経時的に測定するためには溶液を滅菌することが好ましく、溶液の化学的組成が安定なまま滅菌できることから、0.45μm以下のポアサイズのフィルターによるろ過滅菌にて滅菌することが好ましい。
【００１３】
本方法におけるアルカリホスファターゼ活性は、前述の基質溶液を細胞培養体に添加し1分から60分反応させた後、基質溶液を分離し蛍光および／または吸光リーダーで測定することができる。ただし、遊離した細胞やアルカリホスファターゼが混入していると反応が進んでしまい、多検体を一度に測定する場合には正確な反応が困難になる場合があり、そのような場合には反応停止液を添加することが好ましい。反応停止液の組成としては0.1mol/Lから5mol/Lのリン酸塩溶液が好ましく、反応停止の効果の面から0.5mol/Lから1mol/Lのリン酸塩溶液がより好ましい。また反応停止後の溶液のpHを安定させるためには適当な緩衝系を添加することが好ましく、反応生成物の測定値と定量性の観点からpH 7.5から8.5に調整した50から200mmol/Lの緩衝系を使用することが好ましい。
【００１４】
以下に本発明を詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
36回継代培養したカニクイザルの胚性幹細胞を、末盛らの論文〔2001 Dev. Dyn. Oct;222(2):273-9〕に記載された方法により3日間培養し、直径60mmシャーレ14枚分をえた。各シャーレの培地を吸引後、CaCl2 0.1mg/LとMgSO4(7H2O) 0.1mg/Lを含む30mmol/LのHepes緩衝液1mLで洗浄し、pHを7.08、7.33、7.53、7.81、8.02、8.33、8.53にしたHepes緩衝液で0.2mmol/Lに希釈した4-メチルウンベリフェリルホスフェート溶液1mLを各2枚ずつのシャーレに加え、37℃のCO2インキュベーター内で1時間反応後、反応液の0.8mLを24穴のマイクロプレートに移しEx355nm/Em460nmの蛍光値を測定した。その結果アルカリホスファターゼ測定値はpHが7.33を超えると上昇し8.33から8.53では測定機器の上限感度にほぼ到達した（図１）。このことから基質溶液のpHは7.5から8.5が好適であることが示された。また、この反応終了後いずれの細胞もよく接着しており、継続して培養が可能な状態であった。
【実施例２】
【００１６】
32回継代培養を続けたカニクイザルの胚性幹細胞を、1枚当たり2.8×106cells含む直径60mmシャーレ32枚分を末盛らの論文〔2001 Dev. Dyn. Oct;222(2):273-9〕に記載された方法に従って処理し細胞沈殿物を得た。DMSO 20%(V/V)（22%(W/V)）及び血清代替物としてアルブミンとインスリンおよびトランスフェリンを含有する血清代替物（Knockout Serum Replacement:Invitorogen社）〔以下血清代替物(A)という〕20%(V/V)、グルコースを3g/L、CaCl2を0.5g/L、MgSO4を0.15g/Lの割合で追加したDMEM:HamF12=1:1培地〔以下培地(A)という〕60%(V/V)を含有する凍結保存液2mLに、2.2×107cells分の細胞を懸濁し、各濃度2本づつのセラムチューブに移した後、ミスターフロスティー（Nalgen社）を用いて約1℃/minの比率で-80℃まで冷却した後、液体窒素容器中で1日間保存した。一方DMSOを10%(V/V)（11%(W/V)）の濃度で添加し、血清代替物(A)20%(V/V)、培地(A)70%(V/V)を含有する凍結保存液2mLに、同様に各濃度毎2.2×107cells分の細胞を懸濁し、各濃度2本のセラムチューブに移した後、ミスターフロスティー（Nalgen社）を用いて約1℃/minの比率で-80℃まで冷却した後、液体窒素容器中で1日間保存した。その後それらを解凍し各セラムチューブ毎に直径60mmシャーレ2枚ずつに播種し、その後末盛らの論文〔2001 Dev. Dyn. Oct;222(2):273-9〕に記載された培地を用いて培養した。
【００１７】
胚性幹細胞の増殖を調べる目的で、2日目、4日目、6日目に各シャーレの培地を吸引後CaCl2の0.1mg/LとMgSO4(7H2O)の0.1mg/Lを含む30mmol/LのHepes緩衝液(pH 8.3) 1mLで洗浄後、同様の緩衝液で0.2mmol/Lに希釈した4-メチルウンベリフェリルホスフェート溶液1mLを加え37℃のインキュベーター内で1時間反応後、反応液の0.8mlを24穴のマイクロプレートに移しEx355nm/Em460nmの蛍光を測定し、1mL当たりの蛍光値に換算してプロットした。この時コントロールとして胚性幹細胞を継代培養する時に用いたのと同じフィーダー細胞のアルカリホスファターゼ活性を調べた。さらに6日目の各シャーレをトリプシン処理して細胞を解離し、各シャーレの細胞数を測定した。その結果保存条件の違う胚性幹細胞の増殖に応じてアルカリホスファターゼの活性が経時的に測定できることが証明された（図２）。また、6日目の各シャーレの細胞数の測定では、アルカリホスファターゼ活性の結果と相関していた（図３）。
【実施例３】
【００１８】
57回継代培養したカニクイザルの胚性幹細胞を、末盛らの論文〔2001 Dev. Dyn. Oct;222(2):273-9〕に記載された方法により5日間培養し、直径60mmシャーレ10枚分をえた。各シャーレの培地を吸引後、CaCl2 0.1mg/LとMgSO4(7H2O) 0.1mg/Lを含む30mmol/LのHepes緩衝液1mLで洗浄後、pHを8.2に調整したHepes緩衝液同様の組成の緩衝液で0.2mmol/Lに希釈した4-メチルウンベリフェリルホスフェート溶液1mLを各2枚ずつのシャーレに加え37℃のCO2インキュベーター内で1時間反応後、予め停止液として100mmol/L Hepesに0.5mol/L Na2HPO4を加えpHを8.2に調整したもの、100mmol/L Hepesに0.5mol/L Na2HPO4を加えpHを7.7に調整したもの、100mmol/L Hepesに1mol/L Na2HPO4を加えpHを8.2に調整したもの、100mmol/L Hepesに2mol/L Na2HPO4を加えpHを8.2に調整したものをそれぞれ0.5mLずつ2穴毎に加えたものに、反応液の0.5mLを各穴に添加し、Ex355nm/Em460nmの蛍光値を測定した。また、比較例として停止液の代わりに30mmol/L HepesでpHを8.2に調整したもの0.5mLを用いた。なお、この時バックグランドとして胚性幹細胞を継代培養する時に用いたのと同じフィーダー細胞のアルカリホスファターゼ活性を調べ、各値から差し引いて蛍光値の変化をプロットした（図４）。停止液を加えたものはいずれも比較例に対し蛍光値の変化を有意に抑えており、蛍光値を長時間安定に保つことが証明された。
【実施例４】
【００１９】
5継代目のヒト間葉性幹細胞（CCS-PT-2501:旭テクノグラス社）を6.53×104cells/シャーレでφ60シャーレ（旭テクノグラス社）64枚に播き込んだ。播き込んでから6時間後に、32枚を骨芽細胞分化用培地（CCM-PT-3002:旭テクノグラス社）に置き換え、残りの32枚を通常の間葉性幹細胞増殖培地（CCM-PT-3001:旭テクノグラス社）に置き換えた。その後、3〜4日毎にそれぞれの培地にて培地交換を行ないながら、培養1・2・5・6・9・13・15・20日目にサンプリングしてアルカリホスファターゼ活性測定及び、細胞数のカウントを行ない、さらに培養2・5・9・13・15・20日目のサンプルについて同様にサンプリングしてカルシウムデポジションアッセイ（Calcium Deposition Assay）を行なってそれぞれの測定値の変化を調べた。 
【００２０】
アルカリホスファターゼ活性の測定は、各シャーレの培地を吸引後、CaCl2 0.1mg/LとMgSO4(7H2O) 0.1mg/Lを含むpHを8.2に調整した30mmol/Lの2-{4-(2-ハイドロキシエチル)-1-ピペラジニル}プロパンスルホン酸（EPPS）緩衝液1mLで洗浄後、同様の組成の緩衝液で0.2mmol/Lに希釈した4-メチルウンベリフェリルホスフェート溶液2mLを各シャーレに加え37℃のCO2インキュベーター内で30分間反応後、予め停止液として1mol/L K2HPO4を含む100mmol/L EPPS緩衝液（pH 7.70）を0.5mLずつ加えた24穴マイクロプレートに、0.5mLの反応液を添加し、Ex355nm/Em460nmの蛍光値を測定した。この時、120、60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375μmol/Lに希釈した反応生成物である4-メチルウンベリフェリルホスフェート（4-MeU）のEx355nm/Em460nmの蛍光値を同様に測定して検量線を作成し、シャーレ当たりの4-MeU生成量としてアルカリホスファターゼ活性を表した。
【００２１】
細胞数の測定は、アルカリホスファターゼ活性測定後のシャーレからアスピレーターで培地を吸引後、0.5mmol/LのEDTAを加えたPBS 2mLで2回洗浄し、0.25%トリプシンで5〜7分間37℃・5%CO2でインキュベートした後、ピペッティングで細胞を剥がし、細胞懸濁液を15mL遠沈管に回収し、血球計算盤で細胞数を測定した。
【００２２】
カルシウムデポジションアッセイは、次の方法により実施した。各シャーレからアスピレーターで培地を吸引し、Ca・Mg(-)のPBS（インビトロジェン社）2mLで2回洗浄した後、0.5N HClを1mL/φ60シャーレ加えてセルスクレーパー（IWAKI #9000-220）を用いて、細胞をシャーレから剥がし、15mL遠沈管に回収した。さらに、0.5N HClを1mL/φ60シャーレ加えてシャーレを洗浄し15mL遠沈管に回収した。遠沈管を4℃で3〜24時間振盪しカルシウムを抽出し、500g、2分間の遠心分離を行ない上清を別の容器に移した。この遠心上清をオルトクレゾールフタレインコンプレキソン（OCPC）法によるカルシウム定量キット（カルシウムC-テストワコー:和光純薬工業）を用いて570nmの吸光測定により定量した。
【００２３】
測定の結果、細胞数の変化は骨芽細胞分化用培地と間葉性幹細胞成長培地との間で大きな差はなかったが（図５）、アルカリホスファターゼは、骨芽細胞分化用培地で培養した方で培養開始後5日前後から顕著に上昇し、15日前後でピークに達した（図６）。カルシウムデポジションアッセイの結果では、骨芽細胞分化用培地で培養した方にのみアルカリホスファターゼ活性の上昇に追随するようにCaの蓄積が観察され（図７）、骨芽細胞分化用培地で培養された間葉性幹細胞が骨芽細胞に分化して骨形成が行なわれたことが示唆された。以上のことから、本発明のアルカリホスファターゼ活性測定法により、細胞の分化度が異なる細胞の相対的比較が可能であることが示唆された。
【実施例５】
【００２４】
6継代目の骨芽細胞（CCS-2538:旭テクノグラス社）を1.0×105cells/シャーレの濃度で骨芽細胞増殖培地（CCM-3207:旭テクノグラス社）に懸濁し、φ60シャーレ（旭テクノグラス社）12枚に播き込んだ。翌日から4日間、そのシャーレのうち3枚を用いて、実施例４と同様の方法により、アルカリホスファターゼ活性を測定後、実施例４と同様の方法により、細胞数を測定し、細胞数とアルカリホスファターゼ活性との関係を調べた。その結果、骨芽細胞の細胞数とアルカリホスファターゼ活性は相関していることが示唆された（図８）。
【実施例６】
【００２５】
コラーゲンスポンジ（NMPコラーゲンスポンジ:日本ハム）を無菌的に24穴マイクロプレートに入れて、コラーゲンスポンジの真上から、骨芽細胞増殖培地（CCM-3207:旭テクノグラス社）を緩やかに添加し、37℃・5%CO2条件でスポンジがしっとりするまでインキュベートして膨潤させ、培地を吸引後、6継代目の骨芽細胞（CCS-2538:旭テクノグラス社）を1.0×105cells/250μLの濃度で骨芽細胞増殖培地に懸濁させた細胞懸濁液を播種し、1時間後、残りの培地750μLを加えた。翌日、滅菌済みピンセットでスポンジをφ35シャーレに移し、実施例４と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定し、さらに3日後と7日後にも同様の方法でアルカリホスファターゼ活性を測定した。その結果、骨芽細胞が播種されたコラーゲンスポンジのアルカリホスファターゼ活性の値が経時的に上昇していることが示され（図９）、細胞数を測定することが困難なコラーゲンスポンジ中の細胞でも増殖の過程を連続的にモニターすることが可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
以上詳述したように、本発明は、胚性幹細胞や、骨芽細胞、軟骨細胞などの細胞のアルカリホスファターゼ活性を短時間に正確に測定することを可能とし、これによりそれらの細胞量を相対的に比較測定することが可能となり有用である。さらに本発明は、従来の技術では困難であった分化状態の違う多種類の性質を有する細胞集団の中で目的とする細胞の量だけを相対的に比較測定することを可能とするばかりでなく、それらの細胞を生きたままの状態で経時的にモニターすることを可能とし、細胞の量と分化状態を把握することを容易にするため、例えば再生医療研究等における細胞培養時に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は実施例１の結果を示すものである。横軸は基質溶液のpHを示したものであり、縦軸は各アルカリホスファターゼ活性測定時の相対蛍光値を示したものである。なおグラフ中の黒の太実線は近似線であり、菱形が実測値を示す。
【図２】図２は実施例２における、保存条件が異なる胚性幹細胞の再培養時におけるアルカリホスファターゼ活性の推移の結果を示すものである。横軸は培養経過日数を示し、縦軸は各アルカリホスファターゼ活性測定時の相対蛍光値を示したものである。図中、黒丸はDMSO 10%(V/V)、白丸はDMSO 20%(V/V)の場合を示す。
【図３】図３は実施例２における、保存条件が異なる胚性幹細胞の再培養６日後の細胞数とアルカリホスファターゼ活性の関係の結果を示すものである。横軸は保存条件の種類を示し、左側の縦軸は細胞数を、右側の縦軸は各アルカリホスファターゼ活性測定時の相対蛍光値を示したものである。棒グラフは細胞数、線グラフは蛍光値を示す。
【図４】図４は実施例３の結果を示すものである。横軸は反応停止後の経過時間を示し、縦軸は各アルカリホスファターゼ活性測定時の相対蛍光値を示したものである。図中、白菱形は比較例30mmol/L Hepes(pH 8.2)の場合、四角は実施例の100mmol/L Hepes+0.5mol/L Na2HPO4(pH 8.2)の場合、三角は実施例の100mmol/L Hepes+0.5mol/L Na2HPO4(pH 7.7)の場合、×は実施例の100mmol/L Hepes+1mol/L Na2HPO4(pH 8.2)の場合、丸は実施例の100mmol/L Hepes+2mol/L Na2HPO4(pH 8.2)の場合を示す。
【図５】図５は実施例４における、骨芽細胞分化用培地と間葉性幹細胞増殖培地で培養した間葉性幹細胞の細胞数の推移を示したものである。横軸は培養日数を、縦軸はシャーレあたりの細胞数を示す。白菱形は間葉性幹細胞増殖培地で培養した場合を、四角は骨芽細胞分化用培地で培養した場合を示す。
【図６】図６は実施例４における、骨芽細胞分化用培地と間葉性幹細胞増殖培地で培養した間葉性幹細胞のアルカリホスファターゼ活性の推移を示したものである。横軸は培養日数を示し、縦軸はアルカリホスファターゼによって生成したシャーレあたりの4-MeUのmol数を示す。白菱形は間葉性幹細胞増殖培地で培養した場合を、四角は骨芽細胞分化用培地で培養した場合を示す。
【図７】図７は実施例４における、骨芽細胞分化用培地と間葉性幹細胞増殖培地で培養した間葉性幹細胞のカルシウムデポジションアッセイの結果を示したものである。横軸は培養日数を示し、縦軸はシャーレあたりのCa量を示す。白菱形は間葉性幹細胞増殖培地で培養した場合を、四角は骨芽細胞分化用培地で培養した場合を示す。
【図８】図８は実施例５における、骨芽細胞の細胞数と各アルカリホスファターゼ活性の関係を示すもので、横軸は細胞数を示し、縦軸はアルカリホスファターゼによって生成したシャーレあたりの4-MeUのmol数を示す。菱形は実測値を、直線は相関を示す。
【図９】図９は実施例６における、コラーゲンスポンジで培養した骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性の推移を示すもので、横軸は培養日数を示し、縦軸はアルカリホスファターゼによって生成したシャーレあたりの4-MeUのmol数を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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