(57)【要約】【課題】  新規なアマドリ化合物の測定方法を提供する。【解決手段】  アブラナ科ダイコン属植物の発芽種子由来のフルクトシルアミノ酸キナーゼ、その製造方法、および該キナーゼを用いるアマドリ化合物の分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アブラナ科ダイコン属植物の発芽種子由来のフルクトシルアミノ酸キナーゼ。
【請求項２】
前記アブラナ科植物がダイコン属ラデイッシュである請求項１記載のフルクトシルアミノ酸キナーゼ。
【請求項３】
アブラナ科の植物の種子をその発芽に適した条件下で育成し、得られた発芽種子からフルクトシルアミノ酸キナーゼを精製することを特徴とする、フルクトシルアミノ酸キナーゼの製造方法。
【請求項４】
被検試料を、ＡＴＰの存在下、請求項１または２に記載のフルクトシルアミノ酸キナーゼと接触させ、ＮＡＤＨの生産量を測定することを特徴とする、試料中に含まれるアマドリ化合物の測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アブラナ科植物由来の新規なフルクトシルアミノ酸キナーゼに関し、さらに詳しくはアブラナ科植物の発芽種子由来のフルクトシルアミノ酸キナーゼおよび該フルクトシルアミノ酸キナーゼを用いてアマドリ化合物を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸のようなアミノ基を有するアミノ化合物と、グルコース、果糖等の還元性の糖とが共存する場合に起こる非酵素的な糖付加（グリケーション）はメイラード反応として広く知られている。メイラード反応では、まず還元糖のアルデヒド基と、アミノ化合物のアミノ基が反応してシッフ塩基を形成し、アマドリ転位によりアマドリ化合物が生成する（前期反応生成物）。次いで、アマドリ化合物は酸化、脱水、縮合などの複雑な反応を経由していわゆるＡＧＥ（後期反応生成物）が生成される。メイラード反応はあらゆる生物界で見られる反応であり、例えば、食品中のタンパク成分の場合は、糖化による褐変化等として表れ、品質変化の原因となる。また、生体内ではヘモグロビン、アルブミン、イムノグロブリンなどが糖化され、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンは、糖尿病の診断における指標として用いられている。
【０００３】
メイラード反応におけるアマドリ化合物の生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数で表される。従って、その生成量から、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができることから、アマドリ化合物の分析は、医療分野、食品分野等で有用である。特に医療分野で注目されるのは、糖尿病の診断および管理の指標としての糖化タンパクである。糖尿病は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害を初め様々な全身症状（合併症）を引き起こす疾患であり、失明や透析導入の最も主要な原因となっている。これらの合併症は、患者の生活や社会活動を制限するばかりか医療費の増加にも係っており、深刻な社会問題である。従って、糖尿病の早期発見と発見後の適切な血糖コントロールの重要性が指摘されている。糖尿病における血糖コントロールの指標として、通常、過去約１〜２ヶ月の平均血糖値を反映する糖化ヘモグロビン、過去約２週間の平均血糖値を反映する糖化アルブミン、あるいは血清中の還元能を有する糖化タンパク質を意味するフルクトサミン等が測定される。
【０００４】
フルクトサミンは、血清中のアルブミン等のタンパク質のアミノ基にグルコースが非酵素的に結合した糖化タンパクで、その糖鎖がフルクトース構造をとることからフルクトサミンと呼ばれている。血中タンパクの半減期(アルブミンは17.5日)がほぼ2週間であることから、フルクトサミンは過去2〜3週前の血糖値の平均値をよく反映すると言われている。通常、フルクトサミンの半減期は16.5日と言われており、ＨｂＡ1ｃ(半減期28.7日)が過去1カ月の血糖値を反映するのに対し、より近い過去の血糖値を調べるのに適しており、ＨbＡ１ｃと共に、血糖のコントロール状態の指標として重要である。
【０００５】
アマドリ化合物の測定に広く用いられている手法として、アマドリ化合物がアルカリ性条件下で有する還元性を利用して色素発色により測定する化学的方法（非特許文献１)がある。また、アマドリ化合物を酸化還元酵素で処理して生成する過酸化水素の量または消費される酸素の量に基づく酵素法も知られており、例えば、フルクトシルアミンデグリカーゼを用いる方法（特許文献１）およびフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いる方法（特許文献２〜７）等が知られている。
【０００６】
化学的な測定方法の最大の問題点は反応の特異性が低いことである。また、生体試料に混在する干渉物質の影響を受けやすいこと、色素により反応セルが汚染されることなども課題である。
一方、酵素法（フルクトシルアミンデグリカーゼ法、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ法）に用いられている酵素は、糖化アミノ酸やごく一部の糖化ペプチドにのみ作用し、糖化タンパクには作用せず、また糖化ペプチドに対する反応性が低いことから、糖化タンパク等の高分子物質を測定する際には予め化学的な方法やプロテアーゼによる断片化処理が必要であるという問題点がある。また、オキシダーゼ反応には酸素が必須であるため測定環境の酸素分圧により測定値が左右される恐れもある。従って、断片化処理等が不要であり、簡便で正確な糖化タンパク測定法の開発が強く望まれていた。
【０００７】
フルクトサミン−３−キナーゼおよびフルクトシルリジン−６−キナーゼは、タンパク質のアマドリ化合物にも作用することが知られている。糖尿病患者におけるタンパクの非酵素的糖化が細胞に及ぼす悪影響を防止する等の観点から、哺乳動物由来のフルクトサミン−３−キナーゼについて論じた報告がある（非特許文献２）。該文献には、この酵素が糖化タンパクをリン酸化しフルクトシルリジン３リン酸を生成させる反応を触媒することが記載されている。また大腸菌においても、フルクトシルリジン−６−キナーゼがフルクトシルリジンのリン酸化に関与していることが報告されている（非特許文献３）。しかし、これら非特許文献２、３のいずれにも、糖尿病患者における糖化タンパクの分析法はもとより、糖尿病の診断に関する記載はない。
【０００８】
【特許文献１】特開平第6-46846号公報
【特許文献２】特公平第6-65300号公報
【特許文献３】特開平第3-155780号公報
【特許文献４】特開平第7-289253号公報
【特許文献５】特開平第8-154672号公報
【特許文献６】特開平第11‐243950号公報
【特許文献７】特開平第5‐192193号公報
【非特許文献１】Clin. Chem. Acta., vol. 127, p.87 (1983)
【非特許文献２】Diabetes, vol. 50, p.2139-2147(2001）
【非特許文献３】Bio.Chem.,vol. 277, p.42523-42529(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、簡便であり、かつ環境中の酸素分圧などに影響されないアマドリ化合物の測定方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ね、新規なフルクトシルアミノ酸キナーゼをアブラナ科植物から得ることに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、アブラナ科ダイコン属植物の発芽種子由来のフルクトシルアミノ酸キナーゼを提供するものである。
【００１１】
本明細書中、「フルクトシルアミノ酸キナーゼ」とはタンパク質、ペプチドおよびアミノ酸のようなアミノ基を有するアミノ化合物と、グルコース、果糖等の還元性の糖との非酵素的な糖付加反応の生成物（メイラード反応の前期反応生成物）を基質としてリン酸化し、これを分解する酵素を指す。好ましくはフルクトシルバリンの３位リン酸化作用を有するフルクトシルアミノ酸キナーゼである。
なお、本明細書中、以下の説明では、フルクトシルアミノ酸キナーゼを「ＦＡＫ」と記載する。
【００１２】
本発明のＦＡＫは、被子植物、裸子植物を含む任意の植物の種子から得ることができる。しかし、被子植物が好ましく、アブラナ科植物がより好ましい。特に好ましいのはダイコン属の植物である。任意の植物部位から得ることができるが、好ましくはその種子、より好ましくは発芽種子から得ることができる。種子または発芽種子からＦＡＫを得るには、種子から酵素等を抽出し、精製するために用いられる当該技術分野で既知の方法や装置を利用することができる。種子は発芽能力を維持していることを条件として、植物から採取した生の種子、乾燥した種子など、任意の状態であってよい。しかし、入手、保管等の取り扱いが容易であり、一定の収率を上げることができるという点から、乾燥状態のものを用いるのが好都合である。
【００１３】
種子の「発芽」とは、植物学的には、熟した種子中に存在する形態的に高度に分化した胚の各器官の生長を意味する。発芽の際には、種子形成の段階では合成的であった胚乳や子葉のような貯蔵器官が完全に分解的になる一方、生長を始めた胚の各器官は専ら合成的になる。発芽は、種子の吸水に始まり、温度の上昇と時間の経過によって胚生長のための呼吸活性が発現し、内圧などにより種皮が破壊されて胚が外部へ伸長する過程である。通常、まず幼根が現れ、次いで幼芽が現れる。目視観察で認められるのは、種皮の破壊とそれに続く幼根、幼芽の出現である。
本明細書中、「発芽」または「発芽種子」というとき、この種皮が破壊された時点を指す。
種子の発芽及び生育に影響する主な環境要因は水分、温度、酸素及び光であるが、至適条件は植物により異なる。本発明のＦＡＫの単離精製に適した発芽種子は上記定義の「発芽」後、24時間未満の種子である。
本発明のＦＡＫはアブラナ科の任意の植物が得ることができる。以下に代表的な植物と属名を示す。
【００１４】
アブラナ科の植物
【表１】
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【００１５】
【表２】
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【００１６】
【表３】
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【００１７】
【表４】
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【００１８】
【表５】
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【００１９】
【表６】
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【００２０】
【表７】
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【００２１】
【表８】
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【００２２】
【表９】
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【００２３】
【表１０】
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【００２４】
【表１１】
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【００２５】
アブラナ科ダイコン属の植物
【表１２】
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【００２６】
本発明のＦＡＫの調製にはアブラナ科ダイコン属の植物の種子が好ましく、ラデイッシュの種子がより好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（１）ＦＡＫの調製
本発明のＦＡＫは、アブラナ科の種子を適当な発芽条件下で成育させ、発芽後２４時間未満の間に単離・精製することにより効率よく得ることができる。
発芽に適した条件は品種や種子の状態（乾燥程度）にもより異なるが、本発明方法に用いる発芽種子を得るには、通常、予め湿らせておいた脱脂綿等の苗床に種子を播種し、室温〜４０℃、好ましくは約２５℃で約２４間放置して発芽させる。次いで、発芽種子を、水または２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ8.5、２ｍＭ ＤＴＴ＋０.１ｍＭ ＰＭＳＦ緩衝液中で破砕する。これを遠心分離することにより、無細胞抽出液（粗酵素液）を得る。破砕は、乳鉢、ホモジナイザー等を用いて機械的に磨り潰す方法など任意の方法で行うことができる。機械的な破砕の場合には、海砂等の破砕補助剤を用いてもよい。
【００２８】
次いで、無細胞抽出液から酵素を分離精製するには、常法に従い、硫安による塩析、エタノール等の有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィやゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィなどを、適宜組み合わせて行う。例えば、無細胞抽出液を硫安分画し、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせて処理することにより、精製ＦＡＫを得ることができる。
【００２９】
（２）ＦＡＫ酵素活性の測定
ＦＡＫ酵素活性の測定は以下の方法で行う。
FAKを含む反応液の組成：
2005058157.tif 000014
方法：
まず、フルクトシルバリン以外のものを混合して30℃で2分保温し、その後、
フルクトシルバリンを添加して反応を開始して、340nｍの吸光度変化を測定する。
活性は1分間に1μmolのNADHを酸化する酵素量を1ｕと定義した。
【００３０】
（３）ｐＨおよび温度の条件
前記活性測定法方法に準じ、ｐＨ４から１０.０の範囲の各ｐＨ条件により酵素反応を行った。ただし、使用したバッファーはｐＨ４から６.０の範囲では１００ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ６.０から８.０の範囲では１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７.０から９.０の範囲では１００ｍＭトリス−塩酸バッファー、ｐＨ９．０から１０.０の範囲では１００ｍＭ グリシン−ＮａＯＨバッファーである。下記の表１３及び図１に示すとおり、本発明のＦＡＫの至適反応ｐＨは、３０℃において約８であることが明らかになった。
【表１３】
2005058157.tif 000015
【００３１】
酵素の温度条件は、０.１Ｍ Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ８.０）中、３０〜６０℃の温度条件下でＦＡＫを加え、１０分間インキュベートした後、上記（２）に記載の方法で酵素活性を測定することにより判定した。測定結果を表１４及び図２に示す。これらの結果から、本発明のＦＡＫの反応性に好適な温度範囲は３０〜３５℃であることが明らかになった。
【表１４】
2005058157.tif 000016
【００３２】
（４）分子量の測定
後述の実施例に記載の方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルろ過法で分子量を測定した。その結果、本発明のＦＡＫの分子量はＳＤＳ電気泳動法により測定した場合、４５kＤa、ゲルろ過法で測定した場合、４８ｋＤａであることが明らかになった。
本発明のＦＡＫの特性は以下の通りである。
（a）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４５kＤaであって、ゲルろ過法による分子量が４８ｋＤａである。
（b）アマドリ化合物とＡＴＰの存在下、フルクトシルバリン３位リン酸化を行い、ＮＡＤＨを生成する反応を触媒する。
（ｃ）至適反応ｐＨは３０℃において約８、至適反応温度は３０〜３５である。
【００３３】
本発明のＦＡＫは、ＡＴＰの存在下、アマドリ化合物中の糖化アミノ酸、例えばフルクトシルバリン（ＦＶ）を特異的に３−リン酸化し、次いでフルクトシルアミノ酸３−リン酸(例、フルクトシルリジン３−リン酸）を形成するという２段階の反応を触媒する（非特許文献２等)。本発明のアマドリ化合物測定法では、１段階目のリン酸化反応を利用する。すなわち、フルクトシルアミノ酸のリン酸化に際して生成されるＮＡＤＨの量を指標として、試料中のアマドリ化合物の量を測定する。
本発明方法に適した反応系は当該技術分野で既知であり、例えば、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０中、被検試料と本発明のＦＡＫをＡＴＰの存在下、一定時間接触させ、ＮＡＤＨの生産量を測定することにより、行うことができる。
【００３４】
キナーゼ活性測定は、他の既知の方法によっても行うことができ、例えば、前記非特許文献２に記載のラジオアイソトープを用いた方法等が挙げられる。
ＦＡＫの使用量は、それぞれ、使用する測定法により適宜選択することができるが、通常、０.１ｍＵ／ｍｌ以上、好ましくは１ｍＵ／ｍｌである。緩衝液としては２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０等を用いる。
【００３５】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、該実施例は本発明を限定するものではない。
実施例１  ハツカダイコン（ラディッシュ）の種子由来のＦＡＫの精製
（１）無細胞抽出液の調製
ハツカダイコンの種は株式会社トーホクから購入した（商品名：赤丸二十日大根チェリーメイト）。
十分湿らせた脱脂綿の上に濾紙を一枚敷き、その上にハツカダイコンの種子２ｇを蒔いた。２５℃で一日放置し、発芽した種子のみを粗酵素液の調製に用いた。
乳鉢に１-２gの発芽種子と同量の海砂を入れ、10 mlの0.1 M Tris-HCl緩衝液（pH 8.5、2 mM DTTおよび0.1 mM PMSFを含む）を加えて乳棒で磨り潰した。破砕液を10,000 rpm、10分間遠心分離し、上清を無細胞抽出液（粗酵素液）として得た。
【００３６】
（２）ＦＡＫ活性の測定
上記（１）で得た無細胞抽出液15μｌを含有する885 μlの反応液（組成：25 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 8.0)、1 mM MgCl2、0.25 mMホスホエノールピルビン酸、0.15 mM NADH、1 mM ATP-Mg、10 μｇウサギ筋肉由来ピルビン酸キナーゼ、および５μｇウサギ筋肉由来乳酸脱水素酵素）を30℃で２分間保温し、15 μlの0.1 Mフルクトシルバリン（同仁化学社製）を添加することにより反応を開始し、340 nmの吸光度を測定した。活性は１分間に１μmolのNADHを酸化する酵素量を１Ｕと定義した。
【００３７】
（３）ＦＡＫの精製
上記（１）と同様にして得られる無細胞抽出液を以下の方法で精製した。
１）硫安分画
常法に従い、無細胞抽出液を、硫酸アンモニウム濃度50%-60%飽和画分を緩衝液Ａ（50 mM Tris-HCl (pH 8.5) + 2 mM DTT + 0.1 mM PMSF）に溶解し、同溶液で一晩透析した。
【００３８】
２）クロマトグラフィ
以下の条件下、透析後の硫安画分のクロマトグラフィを行った。
イオン交換クロマトグラフィ
アマシャムバイオサイエンス社製HiPrep 16/10 DEAEを使用し、緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ + 0.5 M KCl）を用いたリニアグラディエントで溶出。流速：2ml/min。
疎水クロマトグラフィ
アマシャムバイオサイエンス社製HiTrap Phenyl FF (High sub)を使用し、緩衝液Ａと緩衝液Ｃ（緩衝液Ａ + 30%飽和 硫安）を用いたリニアグラディエントで溶出。流速：2ml/min。
イオン交換クロマトグラフィ
アマシャムバイオサイエンス社製Resource Q (1 ml)を使用し、上記のイオン交換クロマトグラフィと同じ条件で溶出。流速：１ml/min。
ゲル濾過クロマトグラフィ
アマシャムバイオサイエンス社製Superdex 200 HR10/30を用い、緩衝液Ｄ（緩衝液Ａ（但し0.1 mM PMSFは不含）＋0.1 M NaCl）で溶出。流速：0.25 ml/min。
【００３９】
（４）ＦＡＫの分子量測定
ＳＤＳ電気泳動法による測定
FastSystemを用い、常法に従ってＳＤＳ電気泳動法（ゲル濃度１０〜１５ｗ／ｖ％のグラジエントゲル使用）により分子量の測定を行った。分子量既知の標準タンパク質としてアマシャム  バイオシステムズ社製の分子量マーカー（ホスホリラーゼｂ（９７ｋＤa）、牛血清アルブミン（６８ｋＤa）、オボアルブミン（４５ｋＤa）、カルボニックアンヒドラーゼ（３２ｋＤa）、トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、α-ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ））を使用して測定したところ、ＦＡＫの分子量は４５ｋＤaであった。
【００４０】
ゲル濾過法による測定
常法に従ってゲル濾過法による分子量の測定を行った。アマシャムバイオサイエンス社製Superdex 200 HR10/30を用い、緩衝液Ｄ（緩衝液Ａ（但し0.1 mM PMSFは不含）＋0.1 M NaCl）で溶出した。分子量既知の標準タンパク質として、ロシュ・ダイアグノスティックス（株）社製の分子量マーカー（アルドラーゼ  １５０ｋＤa、牛血清アルブミン  ６８ｋＤa、オボアルブミン  ４５ｋＤa、キモトリプシノーゲンＡ  ２５ｋＤa、チトクロームＣ  １２．５ｋＤa）を使用して検量線を作成し、本発明酵素の分子量を算出した。本発明のＦＡＫのゲルろ過法により測定した分子量は約４８ｋＤaであることが判明した。
【００４１】
（５）基質特異性
上記（２）に記載の測定条件下、酵素0.1 ｍＵと、糖化ヒト血清アルブミン（ＦＨＳＡ）、糖化ウシ血清アルブミン（ＦＢＳＡ）（東洋紡社製）等を用い、下記の表に記載の条件下で基質特異性を検討した。
実施例で得たＦＡＫの精製過程における酵素活性、酵素特性を以下の表１５−１７にまとめて示す。
【００４２】
（１）ハツカダイコンのＦＡＫ活性
【表１５】
2005058157.tif 000017
（２）ハツカダイコンからのＦＡＫの精製
【００４３】
【表１６】
2005058157.tif 000018
（３）ハツカッダイコン由来のＦＡＫの酵素諸特性：
分子量：    ＳＤＳ−ＰＡＧＥ    45,000
ゲルろ過            48,000
至適ｐＨ：  ｐＨ８．５
基質特異性
【表１７】
2005058157.tif 000019
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のＦＡＫは過去2〜3週前の血糖値の平均値の指標となるため血糖のコントロール状態をよりきめ細かく管理することができる。また、ＦＡＫは糖化タンパクの糖化部位に直接作用するので、プロテアーゼ等による断片化のための前処理が不要となり、作業が簡便化され、日常的に糖尿病の症状管理を行うことも可能となる。さらに、キナーゼ反応の反応速度は比較的早いことから、上記前処理作業の省略と併せて、測定時間の短縮を図ることができる。また、キナーゼは酸素を必要としないので、測定環境によって測定値が変動する恐れも低い。このように、本発明のＦＡＫによれば、糖尿病患者の症状を管理することが極めて容易になると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明のFAKの至適反応ｐＨを示すグラフである。
【図２】本発明のFAKの至適反応温度を示すグラフである。
【図１】
2005058157.tif 000020
【図２】
2005058157.tif 000021