(57)【要約】【課題】FGF-5が原因で生じる疾患の治療を目的とする薬剤、特に育毛剤を提供するための強力でしかも特異性の高いFGF-5阻害剤の提供。【解決手段】アミノ酸配列中にLeu-Tyr-Ala-Argからなる配列を少なくとも有するポリペプチド又はその塩を上記FGF-5阻害剤とする。 【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列中に Leu-Tyr-Ala-Argなる配列を有し、かつ繊維芽細胞成長因子５（ＦＧＦ−５）阻害活性を有することを特徴とするポリペプチド又はその塩。
【請求項２】
下記（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のいずれかに記載のアミノ酸配列で示される請求項１に記載のポリペプチド又はその塩。
（I）    Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（II）   Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
（III）  Leu-Tyr-Ala-Arg
（IV）  Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（V）   Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
（VI）  Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（VII）
Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを含有することを特徴とする、繊維芽細胞成長因子５(FGF-5)阻害剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、FGF-5が原因で生じる疾患に対する予防又は治療薬剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、育毛剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はFGF-5阻害剤に関し、さらに詳しくは脱毛の予防およびまたは治療に有用な医薬品又は頭髪用化粧料に利用できることが期待されているFGF-5阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
繊維芽細胞増殖因子の中で、FGF-5は毛成長に関与していることが報告されている（非特許文献１参照）。また、FGF-5アンタゴニストは、FGF-5による毛成長抑制効果を阻害することが知られ、育毛剤として期待されており（非特許文献２参照）、FGF-5の一部からなるポリペプチドで、毛の生育に対するFGF-5の抑制作用を阻害する１０個のアミノ酸からなるポリペプチドがFGF-5アンタゴニストとして報告されている（特許文献１、非特許文献３参照）。すなわち、FGF-5の一部からなるポリペプチドVal-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln-Ile-Tyr（No11ペプチド；アミノ酸配列VIII）にFGF-5阻害活性が検出され、抜毛後のFGF-5のマウス皮内投与によって引き起こされる毛成長阻害作用を有意に抑制した。  しかしながら、上記従来技術（特許文献１、非特許文献３参照）で用いられた、ペプチドの毛成長阻害作用の抑制効果発現には10mg/100mlの高濃度の皮内投与が必要である。ペプチドは高価であるため、該ペプチドのFGF-5に対する阻害活性は育毛剤として使用するための充分な活性があるとは言えない。さらに、上記アミノ酸配列（VIII）のペプチドは実際臨床で用いられている投与形態で外用剤として適用する場合には、より高濃度のペプチドが必要になる。
このため、FGF-5アンタゴニストの育毛剤への実用化に向けて、より強いアンタゴニスト活性をもつペプチドが要望されている。
【０００３】
【非特許文献１】Hebert, JM.,Rosenquist, T., Gotz, J. and Martin, GR.,1994. FGF-5 as a regulator of the hairgrowth cycle: Evidence from targeted and spontaneous mutations. Cell78:1017-1025.
【非特許文献２】Suzuki, S., OtaY., Ozawa K. and Imamura T. 2000. Dual-mode regulation of hair growth cycle bytwo Fgf-5 gene products. J. Invest. Dearmatol. 114:456-463.
【非特許文献３】Ito, C.,Saitoh, Y., Fujita, Y., Yamazaki, Y., Imamura, T., Oka, S. and Suzuki, S. 2003.Decapeptide with fibroblast growth factor (FGF)-5 partialsequence inhibits hair growth suppressing activity of FGF-5. J. Cell. Physiol.197:272-283.
【特許文献１】特開第2002-293720号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、特許文献１で報告されているような従来のFGF-5アンタゴニスト活性より、より強いアンタゴニスト活性をもったペプチドを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、特許文献１と非特許文献３で報告されている上記アミノ酸配列(VIII)で示されるペプチド、あるいはFGF-5のアミノ酸配列等を参考にして、様々なペプチド、あるいはポリペプチドを合成し、これらペプチドのFGF-5アンタゴニスト活性を詳細に検討した。そして、これらペプチド中に有効なFGF-5アンタゴニスト活性を有するものを見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。すなわち本発明は以下に示すとおりである。
【０００６】
（１）  アミノ酸配列中にLeu-Tyr-Ala-Argなる配列を有し、かつ繊維芽細胞成長因子５（ＦＧＦ−５）阻害活性を有することを特徴とするポリペプチド又はその塩。
（２）下記（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記（１）に記載のポリペプチド又はその塩。
（I）    Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（II）   Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
（III）  Leu-Tyr-Ala-Arg
（IV）  Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（V）   Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
（VI）  Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（VII）
Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
（３）上記（１）又は（２）に記載のポリペプチド又はその塩を含有することを特徴とする、繊維芽細胞成長因子５(FGF-5)阻害剤。
（４）上記（１）又は（２）に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、FGF-5が原因で生じる疾患に対する治療薬剤。
（５）上記（１）又は（２）に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、育毛剤
【発明の効果】
【０００７】
本発明のポリペプチドは、Leu-Tyr-Ala-Argの４個のアミノ酸からなる共通配列を有し、最低限の配列を有する上記アミノ酸配列（III）のペプチドは、上記従来のアミノ酸配列（VIII）のペプチドと比較して、FGF-5による細胞増殖活性阻害活性において 約1/2.6のIC50値を示すとともに、分子量が1/2.2と小さく、アミノ酸配列(VIII）)のペプチドに比して安価で経皮吸収のすぐれた薬剤を提供する。また、上記配列(IV)のペプチドは、FGF-5による細胞増殖活性阻害活性においてアミノ酸配列(VIII)のペプチドの約1/40のIC50値という驚くべき阻害活性を示す。さらに、本発明のその他のペプチドも、アミノ酸配列(VIII)のペプチドより低濃度でFGF-5による細胞増殖活性阻害活性を示す。これに加えて、本発明のポリペプチドは、いずれもFGF-5に対する高い特異性を有する。
以上のことから本発明によれば、より低濃度で活性を示し、かつ特異性の高いFGF-5阻害剤を提供することが可能となり、FGF-5が原因で生じる疾患の予防乃至治療剤、特に育毛剤等の開発に大いに貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のポリペプチドは少なくともLeu-Tyr-Ala-Argのアミノ酸配列を有し、FGF-5による細胞増殖活性を阻害する活性を有する限り、本発明に包含される。アミノ酸配列の長さは特に限定はないが、アミノ酸数２０個以下のポリペプチドが、合成のし易さ、薬剤の吸収性の点で望ましい。  本発明における、ポリペプチドを具体的に挙げると、例えば、以下のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
（I）    Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（II）   Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
（III）  Leu-Tyr-Ala-Arg
（IV）  Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（V）   Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
（VI）  Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
（VII）
Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
【０００９】
本発明のこれらペプチドは、上記Leu-Tyr-Ala-Argからなる特定のアミノ酸配列を有する限度において、上記各ポリペプチドのＣ末端又はＮ末端のいずれか少なくとも一方に１または数個のアミノ酸を有していてもよく、また、１または数個のアミノ酸を置換、欠失していてもよい。
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成することができる。また、通常の遺伝子発現操作等の生物学的手法に従って、上記ポリペプチドをコードするDNA配列を含む組み換えベクターを製造した後、該ベクターにより形質転換された細胞、例えば微生物を調製し、該形質転換対を培養した培養物から所望のポリペプチドを分離精製することもできる。
【００１０】
本発明の上記ポリペプチドは、育毛剤、例えば育毛促進、発毛促進、および脱毛予防などとして用いる医薬品、医薬部外品の有効成分として用いることが想定されるが、その場合、上記ポリペプチドまたは生理学的に許容されるその塩から選ばれる１または2種以上のポリペプチドをそのまま用いる、または製剤学的に許容される１または2種以上の製剤添加物を用いて上記ポリペプチドの１または2種以上を有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが望ましい。そして、上記ポリペプチドは例えばクリーム剤、噴霧剤、塗布剤、または貼付剤等の外用剤として用いることができるが、例えば注射剤として患部に直接投与してもよい。さらに上記ポリペプチドは、シャンプーやリンスに配合してもいいし、例えばリポソーム等に封入して製剤を調整してもよい。
【００１１】
また、後述するように、本発明のペプチドはFGF-5による細胞増殖を顕著に阻害する活性を有し、例えばFGFレセプターの１つであるFGF-1(III)cを遺伝子発現操作により細胞表面に強制的に発現させたマウスIL-3依存性proB細胞であるBa/F3細胞株(R1c/Ba/F3細胞)を用いた場合、実施例2で詳述する条件においてFGF-5による細胞増殖阻害活性のIC50値は、アミノ酸配列(I)が64.7 μM、(II)が265 μM、(III)が184 μM、(IV)が146 μM、(V)が346 μM、(VI)が11.9 μM、(VII)が55.6 μMで、いずれのペプチドも特許文献１で記載されている構造式（VIII）ペプチドのIC50値470 μMに比し、高いFGF-5阻害活性を示した。また、いずれのペプチドも該細胞のInterleukin(IL)-3による細胞増殖をまったく阻害せず、本発明のペプチドは、FGF-5に対して高い特異性を有する阻害剤となりうるものである。
【００１２】
また、本発明のペプチド、アミノ酸配列(I)-(VII)のFGFレセプター結合活性は、例えば実施例3に詳述する条件においてリガンドであるFGF-5のレセプター結合に対する阻害活性として測定すると、FGF-5に対するIC50値は、アミノ酸配列(I)が224 μM、(II)が300 μM、(III)が667 μM、(IV)が195 μM、 (V)が99 μM、(VI)が141 μM、(VII)が123 μMで、いずれも特許文献１で記載されている構造式(VIII)ペプチドのIC50値759 μMに比し、高いFGFレセプター結合活性を有する。
【００１３】
以上、本発明のポリペプチドは、FGF-5に対する特異性の高い優れた阻害剤であり、FGF-5が原因で生じる疾患治療薬剤、特に育毛剤として有用な薬剤を提供するものである。
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１４】
以下の実施例１は、本発明のポリペプチドのFGF-5の細胞増殖阻害活性を測定するために使用した、FGFレセプター（FGF-1(III)c）を細胞表面に有するR1c/Ba/F3細胞の調製例を示すものである。
同実施例２は、FGF-5によるR1c/Ba/F3細胞の細胞増殖に対する本発明のポリペプチドの阻害活性をアミノ酸配列(VIII)のペプチドと比較して示すとともに、R1c/Ba/F3細胞のIL-3による細胞増殖活性に対しては、本発明のポリペプチドは阻害活性をもたないことを示すものである。
また、実施例３は、特許文献２に記載されている、マイクロタイタープレートを用いたFGFR-1(III)cの細胞外ドメインをイムノグロブリンFc部位と結合したリコンビナントキメラ蛋白と、該レセプターリガンドであるFGF-5を用い、本発明ポリペプチドのレセプター結合活性をFGF-5のレセプター結合に対する阻害活性として測定し、構造式(VIII)のペプチドと比較して示すものである。
【００１５】
〔実施例１〕
R1c/Ba/F3細胞は以下の参考文献１に記載されているそれ自体公知の方法に従い作成した。すなわちヒトFGFR-1(III)cプラスミド（参考文献２）を電気せん孔法によりBa/F3細胞に挿入した。10% FBS、500 μg/mlの抗Antibiotic G-418 Sulfate（プロメガ社）、10 ng/mlのFGF-1と10 μg/mlのheparinを含むRPMI培地で継代培養して形質転換させた安定なR1c/Ba/F3細胞を得た。
参考文献１；Yoneda, A.,
Asada, M., Oda, Y., Suzuki, M. and Imamura, T., 2000. Engineering of an
FGF-proteoglycan fusion protein with 
heparin-independent, mitogenic activity. Nat. Biotec. 18(6):641-644. 
参考文献２；Ornitz, DM., Xu,
J., Colvin, JS., McEwen, DG., MacArthur, CA., Coulier, F., Gao, G. and
Goldfarb, M., 1996. Receptor specificity of the fibroblast growth factor
family. J. Biol. Chem. 271(25):15292-15297.
【００１６】
〔実施例2〕
（１）  R1c/Ba/F3細胞を10% FBS、500 μg/mlの抗Antibiotic G-418 Sulfateを含むRPMI培地に懸濁した後、96穴の細胞培養用プレートにウエルあたり5 x 104個加えた。
次いで、本発明のアミノ酸配列（I）~（VII）のペプチドと従来の上記アミノ酸配列VIIIのペプチドをそれぞれ濃度を変えて、1.54 x 10-9MのFGF-5、及び5μg/mlのheparin / 10% FBS / 500 μg/mlのAntibiotic
G-418 Sulfate / RPMI培地とともに１ウエルあたり100
μl加え、72時間培養した。  R1c/Ba/F3細胞の増殖活性は、各ウエルにWST-8（和光純薬工業株式会社）液  5μlを加え、さらに3時間培養し、WST-8ホルマザンの産生量に伴う450 nmの発色を測定して求めた。結果を図１に示す。
図1aによれば、上記各ペプチドの添加濃度依存的に発色量が低下し、上記本発明のアミノ酸配列I〜VIIのペプチド、及び従来のアミノ酸配列（VIII）のペプチドは、いずれも、ＦＧＦ−５による細胞増殖活性を濃度依存的に阻害することを示した。
一方、図１ｂは、上記（I）〜（VIII）のぺプチドについて、各濃度毎にコントロールに対する発色量を％で求めた結果を示すグラフであり、このグラフより求めた、FGF-5による細胞増殖活性の50%阻害を示すペプチド濃度（ＩＣ５０）は、それぞれ、アミノ酸配列（I）のペプチドで65 μM、アミノ酸配列（II）のペプチドで 265 μM、アミノ酸配列（III）のペプチドで184 μM、アミノ酸配列（IV）のペプチドで146 μM、アミノ酸配列（V）のペプチドで346 μM、アミノ酸配列（VI）のペプチドで12 μM、アミノ酸配列（VII）のペプチドで56 μMであるのに対して、従来のアミノ酸配列（VIII）のペプチドでは470 μMであり、本発明の上記ペプチドにおける、FGF-5による細胞増殖阻害活性は、従来のペプチドと比べ極めて高いことが明らかとなった。
【００１７】
（２）ペプチドの非特異的細胞増殖活性阻害活性を調べるために、FGF-5とheparin に代えて、50 pg/ml のマウスIL-3を含む培地を使用する他は、上記（１）と同様にしてR1c/Ba/F3細胞増殖活性に基づく発色を測定した。結果を図２に示す。
図2によれば、上記各ペプチドは、添加濃度を変化させてもIL-3によるR1c/Ba/F3細胞増殖に基づく発色変化が殆と起こらず、IL-3によるR1c/Ba/F3細胞の増殖をまったく阻害しなかった。
このことから、アミノ酸配列(I)-(VIII)のペプチドはいずれも特異性の高いFGF-5阻害物であることがわかる。
【００１８】
〔実施例3〕
5 mg/mlのProtein Aを含むDDWを96穴のマイクロタイタープレートにウエルあたり50 ml加え、一晩4℃で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄し100 ml
の1% BSA/PBSを加え二時間室温で放置後、50 mlの0.5 mg/mlのFGFR-1(III)c-Fc-キメラ体/1% BSA/PBSを加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、上記アミノ酸配列（I）〜（VIII）の各ペプチドをそれぞれ濃度を変えて、1.54 x 10-9MのFGF-5及び5 μg/mlのheparin / 10% FBS / RPMI培地とともに、１ウエルあたり50 μl加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、2 mg/mlのヒツジ由来抗ヒトFGF-５ポリクローナル抗体を１ウエルあたり50 ml加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、500倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウマ由来抗ヒツジイムノグロブリン抗体（フナコシ）を１ウエルあたり50 ml加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、3 mg/mlのペルオキシダーゼ基質（シグマ）と0.01% H2O2を含む0.1M クエン酸緩衝液(pH5.2)を１ウエルあたり50 ml加え、30分間室温で放置した後1M H2SO4を１ウエルあたり50 ml加え、492 nmの発色を測定した。マイクロタイタープレートに結合しているFGF-5結合量に伴うペルオキシダーゼ基質の発色を測定し、ペプチドを加えないときの発色量を100%コントロールとして加えたペプチド濃度毎のコントロールに対する発色量を％で求めた。
図３は、この測定結果に基づき上記（I）〜（VIII）のペプチドについての結果を示すグラフである。
図３によれば、FGF-5のレセプターへの結合量の50%阻害を示すペプチド濃度（ＩＣ５０）は、それぞれアミノ酸配列（I）のペプチドでは224 μM、アミノ酸配列（II）のペプチドでは 300 μM、アミノ酸配列（III）のペプチドでは667 μM、アミノ酸配列（IV）のペプチドでは195 μM、アミノ酸配列（V）のペプチドでは99 μM、アミノ酸配列（VI）のペプチドでは141 μM、アミノ酸配列（VII）のぺプチドでは123 μM、アミノ酸配列（VIII）では759 μMであった。したがって、本発明のペプチドはＦＧＦ−５のレセプターの結合に対する阻害活性も、従来のもの（アミノ酸配列（VIII））より顕著に高い。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のアミノ酸配列(I)-(VII)のペプチドについて、各濃度毎にFGF-5によるR1c/Ba/F3細胞増殖活性阻害を測定した結果を示すグラフ（ａ）、及び該測定結果に基づき、上記のぺプチドについて、各濃度毎にコントロールに対する発色量を％で求めた結果を示すグラフ（ｂ）である。
【図２】本発明のアミノ酸配列(I)-(VII)のペプチドについて、各濃度毎にR1c/Ba/F3細胞のIL-3による細胞増殖活性の阻害程度を測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のアミノ酸配列(I)-(VII)のペプチドについて、各濃度毎にFGF-5のレセプターへの結合の阻害を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2005298371.tif 000002
【図２】
2005298371.tif 000003
【図３】
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【配列表】
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