(57)【要約】【課題】ニポウ方式の共焦点スキャナを用いると共に対物レンズの焦点位置を光軸方向に変化させつつ細胞の画像を観測することにより、細胞の全体像を、高速に、しかも綺麗かつ正確（ＳＮ比が良い）な画像で得ることのできるスクリーニング方法および装置を提供することにある。【解決手段】ウェル中に試薬と蛍光標識された細胞とを注入しておき、ニポウ方式の共焦点スキャナを用いて、光軸方向に焦点位置を変化させ、各焦点位置において前記ウェルに励起光を照射し、細胞から発生する蛍光を受け、細胞のスライス画像に基づいて細胞の活性度などを測定する。【選択図】                    図１
2005098722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェル中に試薬と蛍光標識された細胞とを注入しておき、
ニポウ方式の共焦点スキャナを用いて、光軸方向に焦点位置を変化させ、各焦点位置において前記ウェルに励起光を照射し、細胞から発生する蛍光を受け、細胞のスライス画像に基づいて細胞の活性度などを測定するようにしたスクリーニング方法。
【請求項２】
複数のスライス画像または長焦点画像に基づいて細胞の活性度などを測定するようにしたことを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
試薬と蛍光標識された細胞とが複数のウェルに注入されてなるプレートを用意しておき、このウェルに励起光を照射して細胞から発生する蛍光を受け細胞の蛍光画像を得るセンサ部と、このセンサ部からの蛍光画像信号に適宜の処理を施す画像処理部と、この画像処理部の出力を表示する表示部を備え、細胞の動態などを観測するスクリーニング装置であって、
前記センサ部は、ニポウ方式の共焦点スキャナと、対物レンズと、この対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させる焦点位置可変手段と、前記共焦点スキャナの出力画像を撮像するカメラを含み、前記焦点位置可変手段により対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させ各焦点位置において、共焦点スキャナから対物レンズを介して前記細胞に励起光を照射し、細胞の光軸方向に異なる複数のスライス画像を得るように構成されたことを特徴とするスクリーニング装置。
【請求項４】
前記画像処理部は、前記複数のスライス画像または長焦点画像に基づいて細胞の画像を求める機能を備えたことを特徴とする請求項３に記載のスクリーニング装置。
【請求項５】
前記センサ部の焦点位置可変手段は、対物レンズまたはセンサ部全体を光軸方向に移動することを特徴とする請求項３または４に記載のスクリーニング装置。
【請求項６】
前記センサ部の焦点位置可変手段は、ピエゾアクチュエータを用いたことを特徴とする請求項５に記載のスクリーニング装置。
【請求項７】
前記センサ部は、互いに焦点位置の異なるマルチヘッドを使用して、マルチヘッドを切り換えることにより焦点位置を移動させるようにしたことを特徴とする請求項３または４に記載のスクリーニング装置。
【請求項８】
前記センサ部は、励起光として赤外光を使用し、２光子吸収を誘起して前記細胞から蛍光を発生させるようにしたことを特徴とする請求項３ないし７のいずれかに記載のスクリーニング装置。
【請求項９】
前記ウェルに注入された細胞があらかじめ量子ドットを用いて染色されており、
前記センサ部は、前記細胞に短波長のレーザ光を照射し、識別機能を持つ分光特性を持つフィルターを介して、共焦点スキャナの出力画像をカメラで撮像するように構成したことを特徴とする請求項３ないし８のいずれかに記載のスクリーニング装置。
【請求項１０】
前記センサ部は、前記共焦点スキャナの出力画像をラインセンサを用いて検出するように構成したことを特徴とする請求項３ないし９のいずれかに記載のスクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の発見あるいは新しい種類の医薬品を開発する創薬などにおいて用いられるスクリーニング方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
この種のスクリーニング装置としては、例えば蛍光試薬などで処理された細胞のスクリーニングを行う装置がよく知られている（例えば、特許文献１）。
図３は特許文献１に記載のスクリーニング装置の構成図である。この装置は、カメラに対して１−１００倍の倍率を持つ標準的な対物レンズと、電源２を持つ光源（例えば、１００Ｗ水銀−アーク灯または７５Ｗキセノンンランプ）を使用するＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立型蛍光顕微鏡のような倒立型蛍光顕微鏡１が使用される。顕微鏡対物レンズ上にはＸＹ方向にプレート４を移動させるためのＸＹステージ３がある。
【０００３】
プレート４は標準的な９６ウェルのプレートである。各ウェルには細胞が注入され、そして試薬が添加される。プレート４は顕微鏡アセンブリ１に載置された後、ＸＹステージ３によりＸＹ方向に移動され、各ウェルの細胞から発せられる蛍光像はカメラ７で受像される。カメラの出力信号は中央処理装置１０に入力され、処理されてディスプレイ１２上に蛍光像に対応した表示形式で表示される。また、ブリンタ１３にはハードコピーの記録を印刷することができる。
このようにして、試薬の細胞に対する作用効果を検出することができる。
【０００４】
なお、Ｚ軸焦点駆動機構５は、対物レンズ焦点調節のためのＺ軸方向移動機構である。また、ジョイスティック６は、ステージをＸＹＺ方向に手動で移動させるものである。その他、カメラ用の電源８、自動コントローラ９が備えられている。
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２５６０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このようなスクリーニング装置では次のような問題がある。
（１）光学的な蛍光顕微鏡では、同時に細胞の上から下までのすべての部分にピントの合った画像は得られず、焦点ボケしたぼやけた画像しか得られない。したがって、細胞全体にわたる形態や活性度（ADMETOX：absorption,  distribution,  metabolism,  excretion  and  toxicity：吸収・分布・代謝・排泄・毒性）などが把握できる綺麗でかつＳＮ比の良い正確な画像は得られない。
（２）光源の熱エネルギーが強く、細胞に悪影響を与える。
（３）観測に先立って、対物レンズの焦点位置調整を行う必要がある。
【０００７】
本発明の目的は、このような課題を解決するもので、ニポウ方式の共焦点スキャナを用いると共に対物レンズの焦点位置を光軸方向に変化させつつ細胞の画像を観測することにより、細胞の全体像を、高速に、しかも綺麗かつ正確（ＳＮ比が良い）な画像で得ることのできるスクリーニング方法および装置を提供することにある。
本発明の他の目的は、励起光の照射光量を少なくし細胞に対して励起光の悪影響が出ないようにしたスクリーニング装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１に記載の発明では、
ウェル中に試薬と蛍光標識された細胞とを注入しておき、
ニポウ方式の共焦点スキャナを用いて、光軸方向に焦点位置を変化させつつ前記ウェルに励起光を照射し、細胞から発生する蛍光を受け、細胞のスライス画像に基づいて細胞の活性度などを測定するようにしたことを特徴とする。
【０００９】
また、請求項３に記載の発明では、
試薬と蛍光標識された細胞とが複数のウェルに注入されてなるプレートを用意しておき、このウェルに励起光を照射して細胞から発生する蛍光を受け細胞の蛍光画像を得るセンサ部と、このセンサ部からの蛍光画像信号に適宜の処理を施す画像処理部と、この画像処理部の出力を表示する表示部を備え、細胞の動態などを観察測定するスクリーニング装置であって、
前記センサ部は、ニポウ方式の共焦点スキャナと、対物レンズと、この対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させる焦点位置可変手段と、前記共焦点スキャナの出力画像を撮像するカメラを含み、前記焦点位置可変手段により対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させつつ、共焦点スキャナから対物レンズを介して前記細胞に励起光を照射し、細胞の光軸方向に異なる複数のスライス画像を得るように構成されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
以上説明したように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）ニポウ方式の共焦点スキャナを用いると共に、対物レンズの焦点位置を光軸方向に変化させてサンプルの画像を観察するため、高速に、綺麗で正確（ＳＮ比の良い）な画像を得ることができる。
（２）従来に比べて励起光の熱エネルギーが弱く、細胞に悪影響を与えないで観測できる。
（３）従来のように観測に先立って対物レンズの焦点位置調整を行う必要はない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係るスクリーニング装置の一実施例を示す構成図である。図１において、１００はセンサ部、２００は機構制御部、３００は画像処理部、４００はプレート（図３のプレート４に相当）、５００は中央処理装置、６００は表示部である。
【００１２】
センサ部１００は、レーザ光源１１０、ニポウ方式の共焦点スキャナ１２０、対物レンズ１３０、焦点位置可変手段１４０、カメラ１５０から構成されている。
レーザ光源１１０から発生した励起光としてのレーザ光は、ニポウ方式の共焦点スキャナ１２０を通り、対物レンズ１３０によりプレート４００のサンプル４０１上に集束する。レーザ光により励起され発光したサンプルからの蛍光は対物レンズ１３０を経由して共焦点スキャナ１２０に戻って来て、カメラ１５０に入力される。カメラ１５０ではサンプル４０１のＸＹ平面の蛍光像が得られる。この場合、ニポウ方式の共焦点スキャナを使用しているため、高速で、しかも綺麗で正確な（ＳＮの良い）画像が得られる。
【００１３】
ニポウ方式の共焦点スキャナ１２０は、例えば図２に示すような構成である。ただし、図２では、図１とは上下が逆の関係で示してあり、また、対物レンズ１３０およびカメラ１５０の受光素子１５１を併せて示してある。
図２において、励起光であるレーザ１２１は、マイクロレンズディスク１２２に配置された各マイクロレンズ１２３により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１２４を透過後、ピンホールディスク（ニポウディスクともいう）１２５に設けられた個々のピンホール１２６を通過し、対物レンズ１３０によりサンプル４０１に集光される。
【００１４】
サンプル４０１から発生した蛍光は再び対物レンズ１３０を通り、ピンホールディスク１２５の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホール１２６を通過した蛍光はダイクロイックミラー１２４で反射され、リレーレンズ１２９により、カメラの受光素子１５１上に蛍光画像を結像する。
ここで使用されるダイクロイックミラー１２４は、励起光１２１を透過し、サンプル４０１からの蛍光を反射するように設計されている。
【００１５】
マイクロレンズディスク１２２とピンホールディスク１２５は部材１２７で機械的に連結され、回転軸１２８の周りを一体で回転する。個々のマイクロレンズ１２３とピンホール１２６は、ピンホールディスク１２５上に形成された個々のピンホール１２６からの励起光がサンプル４０１の観察平面を走査するように配置されている。また、ピンホール１２６が並んでいる平面と、サンプル４０１の観察平面と、カメラの受光素子１５１とが互いに光学的に共役な関係に配置されているため、受光素子１５１上にはサンプル４０１の光学的断面像、すなわち共焦点画像が結像される。
【００１６】
図１に戻って、焦点位置可変手段１４０は、対物レンズ１３０またはセンサ部１００全体を駆動して、対物レンズ１３０による焦点位置をＺ軸方向（光軸方向）に連続的または不連続的に移動（以下走査ともいう）させるものである。焦点位置可変手段としては、例えばピエゾアクチュエータ（単にアクチュエータという）が使用される。以後アクチュエータを例にとって説明する。
【００１７】
機構制御部２００は、プレート４００を載置した基板ステージ（図示せず）をセンサ部１００に対して所定位置に載置すると共に各ウェルを順次観測するために基板ステージをＸＹＺ方向へ適宜移動するＸＹＺ方向駆動と、センサ部のＸＹ方向位置調整のためのＸＹ方向駆動を行うものである。
【００１８】
画像処理部３００は、カメラ１５０からの画像信号を受けて、細胞の活性度などを表すための適宜の画像処理やデータ処理を行う。なお、処理には、例えば、細胞の蛍光強度やカイネティクス、さらにヒストグラムや相関図などの統計的解析を行うための処理も含まれる。
そして本装置では従来の装置とは異なり高速で、綺麗な正確なＳＮ比の良い画像が得られることから、容易に細胞ごとの動態などを正確に得ることができる。
処理した画像は中央処理装置５００により表示部６００に表示される。
中央処理装置５００は、また、機構制御部２００、アクチュエータ１４０、画像処理部３００を適宜制御する。
【００１９】
このような構成における動作を次に説明する。あらかじめプレート４００の各ウェルにはサンプルすなわち蛍光標識された生きた細胞および試薬がそれぞれ注入されている。このプレート４００が、機構制御部２００により駆動され、センサ部１００上の所定位置に設置される。
センサ部１００からのレーザ光（励起光）によりサンプルが照射され、細胞から蛍光が発生する。この蛍光は対物レンズ１３０、アクチュエータ１４０を通って、共焦点スキャナ１２０上に結像する。その像（細胞画像）はカメラ１５０で読取られる。
【００２０】
このとき、対物レンズ１３０はアクチュエータ１４０によりＺ軸方向に連続的または不連続的に走査される。ニポウ方式の共焦点スキャナによれば高速に細胞のスライス像が得られ、カメラ１５０ではＺ軸方向の上から下まで異なる各断面位置での細胞のスライス画像をとらえることができる。
【００２１】
画像処理部３００では、カメラ１５０で得た複数のスライス画像を基に所定の画像処理を施し細胞全体にわたる活性度などの画像を得る。
なお、画像処理では、例えば、３次元データ処理によりカメラ１５０で得られた複数のスライス画像から１枚の２次元画像（重ね合わせ画像）としたり、蛍光の発現量の違いに応じて画像を色分けするなどの処理も行う。また、画像処理に、ハフ変換処理も含めることもできる。
【００２２】
画像処理部３００により処理された画像は、必要に応じて記憶手段（図示せず）に記憶されると共に、中央処理装置５００により表示部６００に表示される。
このようにして、従来の蛍光顕微鏡を用いた装置では得られない綺麗でＳＮ比の良い性格な画像を観測することができる。
【００２３】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
例えば、実施例では３次元対物レンズ１３０をピエゾアクチュエータ１４０でＺ軸方向に走査するようにしたが、遠・中・近などのマルチヘッドを用いて３次元処理するようにしてもよい。
あるいはまた、対物レンズ１３０をピエゾアクチュエータで駆動するのではなく、対物レンズ１３０と共焦点スキャナ１２０の間に電圧制御型の可変焦点レンズを挿入して電圧制御により対物レンズのサンプルへの焦点位置を移動させるようにしてもよい。
【００２４】
また、実施例ではレーザ光により励起するようにしたが、２光子吸収を利用し、励起光として赤外光を照射し、２光子吸収を誘起してサンプルから蛍光を発生させるようにしてもよい。これによれば、細胞には光エネルギーの少ない赤外光の照射で済み、細胞に対する光の影響をほぼなくすことができる。
【００２５】
また、量子ドットを用いて細胞を染色し、短波長のレーザ光で励起し、カメラのフィルターに識別機能を持つ分光特性を持たせて、サンプルの画像をカメラで撮像するようにしてもよい。これにより、感度と識別能力を容易に向上させることができる。
また、ニポウ方式の共焦点スキャナにおいて、その出力画像をラインセンサを用いて検出するようにしてもよい。これによれば、同時性と更なる高分解能性を同時に達成することができる。この場合、ラインセンサとして、マルチカラーラインセンサを用いてもよい。
【００２６】
なお、画像処理部３００で利用する画像としては、対物レンズを光軸方向に必要深さだけ走査して得られるサンプル（細胞）の断面の画像情報をカメラの同じフレーム期間内に露光させて得た画像（走査した厚さ分の長い焦点深度の画像。これを長焦点画像と呼ぶ）を用いるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係るスクリーニング装置の一実施例を示す構成図である。
【図２】共焦点スキャナの一実施例図である。
【図３】従来のスクリーニング装置の一例を示す構成図である。
【符号の説明】
【００２８】
１００  センサ部
１１０  レーザ光源
１２０  共焦点スキャナ
１２１  レーザ
１２２  マイクロレンズディスク
１２３  マイクロレンズ
１２４  ダイクロイックミラー
１２５  ピンホールディスク
１２６  ピンホール
１２７  部材
１２８  回転軸
１２９  リレーレンズ
１３０  対物レンズ
１４０  アクチュエータ
１５０  カメラ
１５１  受光素子
２００  機構制御部
３００  画像処理部
４００  プレート
４０１  サンプル
５００  中央処理装置
６００  表示部
【図１】
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【図２】
2005098722.tif 000004
【図３】
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