(57)【要約】【課題】      パスパラムの効率的な育成方法及び形質転換体の提供。【解決手段】  パスパラムのランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織を培養することにより得られたカルスを培養し、不定胚を得、該不定胚より植物体を再生させることを特徴とするパスパラムの育成方法。本発明の育成法を利用すると任意の外来遺伝子を導入したアグロバクテリウムとパスパラムのカルスを共培養することで、形質転換体を得ることができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パスパラムのランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織を培養することにより得られたカルスを培養し、不定胚を得、該不定胚より植物体を再生させることを特徴とするパスパラムの育成方法。
【請求項２】
請求項１記載の育成方法によって得られたパスパラムの再分化植物体。
【請求項３】
請求項１記載の育成方法によって得られたカルスを、外来遺伝子を導入したアグロバクテリウムと共培養することにより形質転換することを特徴とする、パスパラムの形質転換植物の育成方法。
【請求項４】
請求項３の方法によって得られた植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基本的に他殖性で遺伝的背景が個体ごとに異なり、かつ高い再分化率の遺伝子型の種子あるいは植物を見いだすことが困難なパスパラムにおいて、効率的に再分化可能なカルスを誘導し、さらにこのカルスにアグロバクテリウムを感染させて任意の遺伝子を導入した植物体を効率よく得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネ科スズメノヒエ属植物であるパスパラムは、色合いが鮮やかなほか、成長が早く、塩害や冬枯れに強いシーショアパスパラム(Seashore paspalum、Paspalum vaginatum：以下、パスパラム)であって、近年ゴルフ場、海岸の砂浜や空港用地等で導入・試作が始まり、シバに代わる植物として注目されている。
パスパラムは不稔性であり、基本的に他殖性で遺伝的背景が個体ごとに異なるため、均質で効率のよい育種方法が求められていた。パスパラムは、ノシバやコウライシバ等のシバ属植物で開発された増殖法に準じた育種法を適用しても高い再分化率の遺伝子型の種子あるいは植物を見出すことが困難であった。
単子葉植物であるシバ属植物において組織培養を行う場合、一般に以下のような方法が採られている。滅菌した完熟種子を発芽させ、次いで発芽、胚軸、子葉または根をオーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモンを含むMS培地やガンボルグB5培地等に移植し、培養することで再分化可能なカルスを得る（例えば、非特許文献１参照。）。
適切な条件を選べば、種子以外にも根やランナーなどからカルスを誘導することができるが、それらのカルスは必ずしも再分化能を持っているとは限らず、器官による特異性やカルスを維持する培養条件及び培養期間によっても再生能力に違いが見られる事が知られている（例えば、非特許文献２参照。）。
一方、シバ、特にノシバ（Zoysia japonica）やコウライシバ（Zoysia matrella）の種子は、堅い外えいに覆われていること、種子中のアブシジン酸濃度が高いこと等の理由で発芽率が低い事が知られている上、遺伝的背景が個体ごとに異なり、再分化効率の高い遺伝子型の種子あるいは植物を見出すことが困難であることが知られている（例えば、非特許文献３参照。）。従って、効率的に再分化可能なカルスを得るためには、種子以外の組織、器官から再分化可能なカルスを誘導する方法を開発する必要があった。しかしながら、上記記載のように種子以外の組織、器官から誘導したカルスは必ずしも再分化能を持っていない。一方、パスパラムについて上述の様な検討はなされていない。
また、シバにおいて任意の遺伝子を導入するためには、細胞壁を酵素消化したプロトプラストに対し電気的に穴を開けて遺伝子を取り込ませる電気穿孔法や、カルスに遺伝子をまぶした金属球を打ち込むパーティクルボンバートメント法を用いる必要があったが、高価な機器が必要であること、プロトプラストから植物体を再生させるまでには煩雑な操作が必要なうえ長い培養期間が必要であるためにアルビノなどのいわゆる培養変異を起こす確率が高いこと、電気穿孔法やパーティクルボンバートメント法では一細胞あたり複数の遺伝子が導入されてしまうこと等の欠点が指摘されていた（例えば、非特許文献４参照。）。
アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法は、実験操作が簡便である、培養変異が少ない、遺伝子が１コピーのみ導入されることが多い等の優れた特徴を持つが、アグロバクテリウムは本来イネ科の植物に対する感染能力が低いため、従来はパスパラムに対して適用できなかった（例えば、非特許文献５参照。）。
近年、ノシバにおいてアグロバクテリウム法を用いて外来遺伝子を導入した事例が報告された（例えば、非特許文献６参照。）。しかしながら上記方法は、種子からカルス誘導を行っているために新たに再分化率の高い遺伝子型をスクリーニングするのに多大な労力と時間を必要とする上、同じ遺伝子型の植物体は得られないので、再現性がない、不稔の個体には適用できない、操作法そのものはイネなどで用いられているものとほぼ同じであるためパスパラムに適用すると効率が低い、等の問題がある。
【０００３】
【非特許文献１】Krans et al.、Crop Sci. 22:1193-1197(1982)
【非特許文献２】Zhong et al.、 Plant Cell Rep. 10:453-456(1991)
【非特許文献３】Asano、Plant Science 72:267-273(1990)
【非特許文献４】Xiao et al.、Plant Cell Rep. 16:874-878(1997)
【非特許文献５】Hiei et al.、Plant J. 6:271-282(1994)
【非特許文献６】遠山ら，「Agrobacterium tumefaciensを利用したノシバ（Zoysia japonica steud.）の効率的な形質転換」，育種学研究，第３巻，別冊２号，２００１年，p８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記のような実状に鑑み、高い再分化率の遺伝子型を再度スクリーニングする必要がない、不稔性のパスパラムにおいて効率的に再分化可能なカルスを得ることを可能とし、さらに任意の外来遺伝子を導入することを可能にする技術を提供し、有用な形質を持つパスパラムを取得、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、パスパラムのランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織を培養することにより得られたカルスが高い再分可能を有していること、ならびにかかるカルスに対してはアグロバクテリウムが高い効率で感染することを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、パスパラムのランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織を培養することにより得られたカルスを培養し、不定胚を得、該不定胚より植物体を再生させることを特徴とするパスパラムの育成方法である。また、本発明はアグロバクテリウムをランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織から誘導したカルスと共培養することを特徴とする、パスパラムの形質転換法に関し、さらにはパスパラムのランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織から誘導したカルスあるいは該カルスのアグロバクテリウムを用いて得た形質転換体からそれぞれ再生される植物体に関する。
本発明は、パスパラムのランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織を摘出し、この組織をカルス誘導を行うため一般に使用される培地、好ましくはオーキシンとサイトカイニンを添加したMS培地を基本とする培地などで培養してカルスを誘導増殖させることを特徴の一つとする。かかるカルスが種子、葉、葉鞘、茎を用いた時に比べ、高い分化能を有していることは新たな知見である。
さらに、かかるカルスは任意の遺伝子を含むアグロバクテリウムと混合して振とう培養することで、イネ科植物としては意外な高効率でアグロバクテリウムを感染させることができることも明らかになった。またこの感染後のカルスは依然として高い再分可能を有しており、カルスを選抜薬剤を含む再分化培地に移植し、無菌条件下で静置培養することによって植物体を再生させることができる。
本発明により、任意の外来遺伝子を導入したパスパラムを高効率で得ることが可能となる。すなわち、パスパラムの個体ごとに異なる遺伝子型に左右されず、一定した再生植物や形質転換植物を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のパスパラムの育成方法は、（１）カルス誘導工程、（２）不定胚増殖工程、（３）幼植物体育成工程からなる。
【０００７】
（１）カルス誘導工程
本工程は、パスパラムのランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織を無菌的に培養することによりカルスを得る。パスパラムは、あらかじめ滅菌処理し、発根培地にて明所で２０〜３０℃、１〜２ヶ月間培養した無菌植物体を用いる。ここでいう滅菌処理は本植物の生育に害を与えずかつ雑菌の浸入を防ぐものであれば何でも良く、エタノール、メタノール等のアルコール類、次亜塩素酸ナトリウム、Tween20、80、100等の界面活性剤、塩素化イソシアヌル酸ナトリウム及びその塩類、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗菌剤を用いることができる。なかでも、アルコール類、次亜塩素酸ナトリウムを用いるのがよく、使用濃度は本植物の生育に害を与えない濃度であればよい。例えばエタノール、メタノール等のアルコール類であれば30〜100％の濃度で、次亜塩素酸ナトリウムであれば有効塩素濃度0.5〜10％を用いるのがよい。発根培地はランナーから植物体が得られうるものであれば何でも良く、例えばMurashige&Skoog（ＭＳ）培地、Linsmaier&Skoog（ＬＳ）培地、N6培地等の培地を用いることが出来る。これら培地に上述の滅菌剤をパスパラムの生育に影響を与えない濃度に加えて使用しても良い。
【０００８】
無菌植物体から得たランナー又はランナーから派生した直立茎より得られた生長点を含む組織をカルス誘導培地（エンブリオジェニックカルス誘導培地）に置床し、暗所で２０〜３０℃、１〜２ヶ月間培養し、パスパラムのカルスを得る。ここで用いるカルス誘導培地は、植物からカルス或いはエンブリオジェニックカルス（Enbriogenic Cullus; ＥＣ）を誘導し得るものであればどのようなものでも良く、例えばＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ６培地等の培地を用いることができる。好ましくは、ＬＳ培地を用いることができる。この時各培地には、糖類、植物ホルモンを加える事が好ましい。加える糖類はスクロース、マルトース等が良く、添加濃度は１〜９％が好ましい。植物ホルモンとしては、１−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等のオーキシンやカイネチン、ベンジルアデニン、ジベレリン等のサイトカイニンを用いるが、特にオーキシンとサイトカイニンの組み合わせが好ましい。具体的には、２，４−Ｄ０〜５ｍｇ／Ｌ、カイネチン０．０５〜１ｍｇ／Ｌの組み合わせ等が好ましい。
【０００９】
（２）不定胚増殖工程
カルス誘導工程で得られたパスパラムの組織由来のＥＣを液体培地中に加え、２０〜３０℃、暗条件下で、１〜２００ｒｐｍで７〜２１日間振盪培養し、ＥＣを増殖させる。ここでいうＥＣとは、パスパラムから誘導されたカルス塊上に形成される表面に光沢があり、白く、固めのカルス塊を示す。ＥＣを培養する液体培地はＥＣが増殖し得る培地であれば何でも良く、例えばＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ６培地等の培地を用いることが出来る。この時各培地に加える糖類は、スクロース、マルトース等が良く、添加濃度は１〜９％が好ましい。又、２，４−Ｄ、カイネチン、ＮＡＡ等の各種植物ホルモンの濃度も不定胚の増殖に適した濃度であれば良く、又これらホルモンを併用して添加しても良い。
【００１０】
（３）幼植物体育成工程
不定胚増殖工程で得られた不定胚を細かく砕いた後、再分化培地に置床し、明条件で２０〜３０℃、２週間から２ヶ月間培養することにより幼植物体が得られる。ここで用いる液体培養は固体培養よりも比較的短い期間で大量の不定胚を増殖させることが出来、又砕かれた不定胚は、多芽体になりにくく、発根状況も良好である。
本工程で使用する再分化培地は不定胚の再分化に適した培地であれば何でも良く、例えばＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ６培地等の培地を用いることが出来る。この時各培地に加える糖類にはスクロース、マルトース等が良く、添加濃度は１〜９％が好ましい。又各培地に加える２，４−Ｄ、カイネチン、ＮＡＡ等の各種植物ホルモンの濃度も不定胚の再分化に適した濃度であれば良く、又これらホルモンを併用して添加しても良い。
前述までのパスパラムを用いた（１）カルス誘導工程、（２）不定胚増殖工程、（３）幼植物体育成工程の各工程を実施する事により、今まで報告のなかったパスパラムの再分化系を完成するに至った。
【００１１】
形質転換植物体
再分化能を持つカルスを適当な大きさに分割したもの、又はそのまま、好ましくは５ｍｍ程度に分割したものを、以下に述べるアグロバクテリウムによる形質転換に使用することができる。
【００１２】
形質転換に用いるアグロバクテリウムの調製も、通常採用される方法により行うことができる。また、該アグロバクテリウムの遺伝子への外来遺伝子の導入もまた、通常の操作方法に従って任意の遺伝子を保持させればよい。
【００１３】
例えば、Agrobacterium  tumefaciensのLBA４４０４株、EHA１０１株、EHA１０５株、C５８C１株、あるいはAgrobacterium  rhizogenesのＤ６株、１７２４株、Ａ５株、Ａ１３株等のアグロバクテリウムを用いることができる。任意の遺伝子を導入したアグロバクテリウムを１日〜３日間、２８℃で適当な培地を用いて振とう培養する。その後。新しい培地に交換することでアグロバクテリウムを洗浄し、ＯＤ６００における濁度が０．２になるように新しい培地に懸濁する。懸濁する際の培地には、一般にアグロバクテリウムの培養に用いられる培地であればどのような培地を用いても良いが、好ましくはＡＢ培地、ＡＡＭ培地等の無機培地、さらに好ましくはＡＡＭ培地等が挙げられる。
【００１４】
このようにして培養したアグロバクテリウムを含む懸濁液の適当量に前述のカルスを浸して共培養を行う。使用するアグロバクテリウム懸濁液の量は、１０〜４０ｍＬ、好ましくは２０ｍＬ程度で有ればよく、カルスは、５ｍｍ程度に分割したものを使用するのが好ましい。
【００１５】
また、培養温度は２０〜３０℃、好ましくは２５℃、照射条件は０〜３０００ルクスで１５〜２０時間日長、好ましくは暗条件下で、震蕩条件は０〜１００ｒｐｍ、好ましくは５０ｒｐｍ、培養時間は３〜１４日、好ましくは３〜７日、さらに好ましくは５日間振とう培養する。
【００１６】
さらに１０ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴンを含むカルス誘導培地にカルスとアグロバクテリウムを移してカルスにアグロバクテリウムを感染させる。培養温度は、２０〜３０℃、好ましくは２８℃で、照射条件は０〜３０００ルクスで１５〜２０時間日長、好ましくは暗条件で、培養時間は３〜１４日、好ましくは５〜９日、さらに好ましくは７日間静置培養し、カルスにアグロバクテリウムを感染させる。
【００１７】
５００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンなど適当な抗生物質を加えた滅菌水でアグロバクテリウムが付着したカルスをすすぐことにより除菌した後、ハイグロマイシンなどの適当な選抜薬剤を加えたカルス誘導培地に置床し、２０〜３０℃（好ましくは２５℃）、０〜３０００ルクスで１５〜２０時間日長（好ましくは暗条件）の条件下で２１〜５６日、好ましくは２１〜３５日、さらに好ましくは２８日間静置培養する。遺伝子が導入されなかったカルスは、徐々に褐変化していく。変色せずに生き残ったカルスのみを適当な選抜薬剤を含み、かつオーキシンやサイトカイニンなどを含まないカルス誘導培地（以下再生培地）に置床し、２０〜３０℃（好ましくは２５℃）、０〜３０００ルクスで１５〜２０時間日長（好ましくは暗条件）の条件下で２１〜５６日、好ましくは２１〜３５日、さらに好ましくは２８日間静置培養する。変色せずに生き残ったカルスのみをさらに新しい再生培地に置床し、上記と同じ条件で静置培養することをさらに０〜５回、好ましくは２回繰り返す。早いものではこの段階で幼植物体が出始める。幼植物体が見られるカルスおよび変色せずに生き残ったカルスのみを新しい再生培地に置床し、２０〜３０℃（好ましくは２５℃）、０〜３０００ルクスで１５〜２０時間日長（好ましくは３０００ルクス）の条件下で２１〜５６日、好ましくは２１〜３５日、さらに好ましくは２８日間静置培養する。幼植物体が得られるまで、適宜繰り返す。
【実施例】
【００１８】
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
１．カルス誘導工程
シーショアパスパラム（ 学名：Paspalum vaginatum )のランナー又はランナーから派生した直立茎を洗浄し、余分な皮を除去したうえで、生長点を含む節の部分を約２ｃｍに切断した後、７０％エタノールで５分間、ついで次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素濃度１％）＋Ｔｗｅｅｎ２０（有効濃度０．１％）溶液に２０分間浸漬し殺菌する。その後無菌条件下において滅菌水で３回洗浄後、ＭＳ基本培地に３０ｇ／Ｌスクロース、０．３ｇ／Ｌゲルライトを添加し、ｐＨ５．８に調整後、１２０℃、１気圧、１５分間オートクレーブにて滅菌した上記ＭＳ固体培地２５ｍＬの入った直径９０ｍｍ×高さ２０ｍｍの滅菌シャーレに置床した。その後、２５℃暗条件下で１４日間培養し、無菌植物体を取得した。
取得した無菌植物体の生長点を切断して小切片とする。この小切片を、ＭＳ基本培地、Ｎ６基本培地又はＬＳ基本培地にスクロース（３０〜６０ｇ／Ｌ）、２，４−Ｄ（１ｍｇ／Ｌ）、カイネチン（０．１ｍｇ／Ｌ）及びゲルライト（０．３ｇ／Ｌ）をそれぞれ加え、ｐＨ５．８に調整した上記固体培地に置床し、カルスを誘導する。各培地で、いずれもカルスの形成が認められた。一方、根を用いた場合、約５５〜７０％の効率でカルスの形成が認められたが、には、カルス形成はほとんど認められなかった。これを２５℃、暗条件下で培養すると、不定胚が得られる。置床後４０日位に生成された不定胚を取り、以後の実験に用いた。
【００２０】
２．不定胚増殖工程
〔液体培地増殖による方法〕
１００ｍＬ様三角コルベンに増殖培地［ＬＳ培地にスクロース（６０ｇ／Ｌ）、２，４−Ｄ（１ｍｇ／Ｌ）、カイネチン（０．１ｍｇ／Ｌ）、ｐＨ５．８］を６０ｍＬ入れ、パスパラムの組織から得られた不定胚を０．２ｍＬ程添加した。また、２００ｍＬ様三角コルベンの場合も同様、同割合で添加し、２５℃、暗条件、１００ｒｐｍで１４日間振とう培養した。
以下に示した表は、固体培地、液体培地といった増殖方法によるＥＣの形成効率の違いを示したものである。
【００２１】
表1．増殖方法の効率化
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
増殖方法    使用ＥＣ量                期間      増殖ＥＣ量    再分化能
固体増殖    0.2mL（シャーレ）        1.5ヶ月      0.6mL        ○
液体増殖    0.2mL（100 mLコルベン）  2週間        1.0mL        ○
0.3mL（200 mLコルベン）  2週間        1.8mL        ○
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
＊ＥＣ量はPCV（Packed Cell Volume）にて測定
【００２２】
液体による増殖  →  ２週間で５倍  →  期間の大幅短縮
培養した不定胚を細かく砕きながら、1mm以下の大きさにそろえた。このようにして得られた不定胚は多芽体になりにくく、発根状況も良好であり、かつ固体培養よりも比較的短い期間で大量の不定胚を増殖させる事が出来る（ 表1参照 ）ので、本方法は従来の技術に比べ改善された方法である。
【００２３】
４．幼植物体育成工程
増殖された不定胚をスクロース（30g/L）を含有するＭＳ培地で洗浄し、ＰＣＶにて約0.3ｍＬを、植物生長調整物質を含まない固体培地［ＬＳ培地にスクロース（30ｇ/Ｌ）、ソルビトール（30ｇ/Ｌ）、ナフタレン酢酸（1ｍｇ/Ｌ）、カイネチン（2.5ｍｇ/Ｌ）、カゼイン（0.2g/L）及びゲルライト（0.5g/L）、ｐＨ5.8）］を25ｍＬ入ったシャーレ(直径9ｃｍ）に置床した。これを25℃、明条件下で30日間程度培養する事により幼植物体が得られた。
【００２４】
実施例２
（１）遺伝子導入工程
AB培地中で培養したアグロバクテリウム（ LBA4404/pIG121Hm ）を3000 rpmで10分間遠心し、菌体を回収する。その後 AAM溶液で OD600=0.2になるように懸濁液を作製した。細かく砕いたＥＣを本懸濁液に5分間浸漬させ感染処理を行った。
（２）導入処理をしたＥＣの培養と抗生物質による選抜の工程
上記感染処理後、ＥＣを洗浄せずにカルス誘導培地に、アセトシリンゴンを加えた共存培地上に置床し、25℃、暗条件下で7日間培養させた。
その後、滅菌水にカルベニシリン（ 500mg/L ）を加えた洗浄液にて洗浄し、除菌した後、ＥＣを再分化培地［ＬＳ培地にスクロース（30ｇ/Ｌ）、ソルビトール（30ｇ/Ｌ）、ナフタレン酢酸（1ｍｇ/Ｌ）、カイネチン（2.5ｍｇ/Ｌ）、カゼイン（0.2g/L）、及びゲルライト（0.5g/L）を加え、ｐＨ5.8］に置床し、25℃、明条件下で培養しながら選抜を行った。
さらに、2〜7日後にGUS染色溶液［ 組成；X-gluc（20mg/L）、フェリシアン化カリウム溶液（ 12.5M ）、フェロシアン化カリウム（ 12.5M ）、トリトンX-100、メタノール、リン酸緩衝液 （ 150mM、pH7）］をＥＣの一部に滴下し、37℃、暗条件下で培養した。2〜10日後に顕微鏡によって青色の呈色反応の確認を行ったところ、いくつかのＥＣで青色の呈色が確認された。
よって，この結果からシーショアパスパラムに遺伝子が導入され、発現している事が明らかとなった。
【００２５】
上記遺伝子導入工程において植物体を得る為に、ＥＣを再分化培地［ＬＳ培地にスクロース（30ｇ/Ｌ）、ソルビトール（30ｇ/Ｌ）、ナフタレン酢酸（1ｍｇ/Ｌ）、カイネチン（2.5ｍｇ/Ｌ）、カゼイン（0.2g/L）、及びゲルライト（0.5g/L）を加え、ｐＨ5.8］ に置床した。
25℃、明条件下で培養しながら選抜を行いＥＣの生育を継続させると、約20日間程でいくつかのＥＣよりグリーンスポットが形成され、その後再分化が確認された。
生育促進培地［ MS培地にスクロース（ 30g/L ）、ゲルライト（ 0.3g/L ）を添加し、pH5.8に調整後、120℃、1気圧、15分間オートクレーブにて滅菌する。］100mLが入った縦100mm×横80mm×高さ100mmのカルチャーボトルに移植したところ、植物体まで出来る事が確認された。
再生した植物体の葉を用いてGUS染色溶液にて染色したところ、一部の再生体で青色の呈色が認められた。この事により、形質転換個体を得る事が確認出来た。