(57)【要約】【課題】  膜タンパク質レセプター全体の発現・精製の過程、更には、脂質膜への再構成の過程が不要で、リガンド分子にラベルを設けることも不要となり、結果として、測定のために多くの操作工程を省略でき、少量の試料での測定が可能なバイオセンサー、バイオセンサーによる測定方法及びバイオセンサー装置を提供する。【解決手段】  表面に膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメインを組み込んだ膜脂質を圧電素子又は表面プラズモン共鳴センサーの表面に固定したことを特徴とする。【選択図】  図２
2005098733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメインを組み込んだ膜脂質を圧電素子又は表面プラズモン共鳴センサーの表面に固定したことを特徴とするバイオセンサー。
【請求項２】
前記脂質膜を、脂質二重層とすることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のバイオセンサーを使用して生体分子間の相互作用を測定することを特徴とする測定方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のバイオセンサーを備えることを特徴とするバイオセンサー装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、膜タンパク質とそれに結合する分子との生体分子間相互作用を測定するためのバイオセンサー、バイオセンサーによる測定方法及びバイオセンサー装置に関するものである。更に、詳細には、圧電素子や表面プラズモン共鳴(SPR)等の液中センサー及びプレートリーダー等のようなセンサー上への脂質膜の固定化が必要とされる測定系において、レセプター(受容体)が膜タンパク質で、それに対するリガンド分子の相互作用を測定するためのバイオセンサー、バイオセンサーによる測定方法及びバイオセンサー装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、膜タンパク質のレセプターとそのリガンドとの結合の測定は、リポソーム化した膜タンパク質に放射性ラベルや蛍光ラベルを施したリガンドを結合させ、それらからの信号を測定するという方法がとられてきた。
しかしながら、これらの方法では多量のサンプルが必要であるため、その大量発現系を構築しなければならず、リガンドに放射性ラベルや蛍光ラベルも必要となる。
また、膜タンパク質レセプターを脂質膜に再構成するには、通常、膜分画で得られた膜タンパク質の可溶化を行い、それを溶液中でリポソーム化するという過程が必要であり非常に手間の掛かるものであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明は、膜タンパク質レセプター全体の発現・精製の過程、リガンド分子にラベルを設ける過程及び脂質膜のリポソーム化過程を不要とすることにより、測定のために多くの操作工程を省略でき、少量の試料での測定が可能なバイオセンサー、バイオセンサーによる測定方法及びバイオセンサー装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決すべく本発明者等は鋭意検討の結果、膜タンパク質のレセプターの細胞外活性ドメインを脂質膜の表面に組み込んでリガンドとの生体分子間の相互作用が測定できるという知見に基づき、以下の通り解決手段を見出した。
即ち、本発明のバイオセンサーは、請求項１に記載の通り、表面に膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメインを組み込んだ膜脂質を圧電素子又は表面プラズモン共鳴センサーの表面に固定したことを特徴とする。
また、請求項２に記載のバイオセンサーは、請求項１に記載のバイオセンサーにおいて、前記脂質膜を、脂質二重層とすることを特徴とする。
また、本発明のバイオセンサーによる測定方法は、請求項３に記載の通り、請求項１又は２に記載のバイオセンサーを使用して生体分子間の相互作用を測定することを特徴とする。
また、本発明のバイオセンサー装置は、請求項４に記載の通り、請求項１又は２に記載のバイオセンサーを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、大量発現系を有しない膜タンパク質リセプターであっても、細胞外活性ドメインを脂質膜に組み込むだけで、そのリガンドとの生体分子間の相互作用が測定可能となる。従って、膜タンパク質レセプター全体の発現・精製過程が不要となる。また、リガンド分子にラベル等の処理を必要としないので、膜タンパク質レセプターとそのリガンドとの生体分子間の相互作用の測定時間を短くすることが可能となる。また、更に、細胞外活性ドメインのみを用いることにより、リポソーム懸濁液への細胞外活性ドメインの添加のみによって、膜タンパク質を脂質膜に再構成することができるので、脂質膜への再構成過程を大幅に縮小できる。
また、更に、脂質二重層によって脂質膜を構成することにより、細胞外活性ドメインをより高密度で脂質膜に固定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明において使用される圧電素子とは、例えば、水晶振動子(Quartz Crystal Microbalance sensor)、APM(Acoustic Plate Mode Sensor)、FPW(Flexural Plate- Wave Sensor)、SAW(Surface Acoustic-Wave Sensor)などが挙げられる。
本発明では、上記圧電素子の電極表面又は表面プラズモン共鳴センサー（SPR）の表面を化学的又は物理的に親水性又は疎水性に改質し、その表面に膜タンパク質のレセプターの細胞外活性ドメイン（リガンド結合部位）を組み込んだ脂質膜を圧電素子又は表面プラズモン共鳴センサーの表面に固定化するものである。これにより、大量発現系が確立されていないレセプターについても、脂質膜に、このレセプターのリガンド結合部位だけを組み込んで測定することが可能となる。
尚、本発明において膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメインを膜脂質に組み込むとは、膜タンパク質レセプターの結合活性ドメインのみを再構成することをいう。この場合の膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメインは、有機合成等の化学的手法並びに大腸菌発現、酵母菌発現、昆虫細胞発現等の生物学的手法により合成されるものである。また、組み込む為の具体的な方法としては、脂質単ラメラ小胞(unilamellar vesicle)の懸濁液に粉末状の膜外活性ドメインを加えること等が挙げられる。
【０００７】
また、本発明に使用される脂質膜は、生体膜又は脂質、界面活性剤及び両親媒性分子によって構成される人工生体膜（生体膜モデル）を使用することができ、膜タンパク質のレセプターの細胞外活性ドメインを高密度で前記脂質膜表面に形成するためには、脂質二重層とすることが好ましい。
尚、前記脂質二重層として、圧電素子の電極表面又は表面プラズモン共鳴センサー（SPR）の表面に固定するためには、圧電素子の電極表面又は表面プラズモン共鳴センサー（SPR）の表面を親水性となるように処理しておくことが好ましい。
【０００８】
前記バイオセンサーによるリガンドと、膜タンパク質のレセプターの細胞外活性ドメインの相互作用の測定方法の具体的な例としては、試料溶液をバイオセンサーに接触させた状態で、バイオセンサーを所定の周波数で発振させ、試料溶液中のリガンドが細胞外活性ドメインに結合することによりバイオセンサーに生じる周波数変化や位相変化に基づいて、重量及び／又は膜厚変化等を測定する方法が挙げられる。
尚、前記リガンドとしては、具体的には、生体物質（タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖）やその他の化学物質等を使用することができる。
【０００９】
また、本発明によるバイオセンサー装置は、前記したような試料溶液中のリガンドと、膜タンパク質のレセプターの細胞外活性化ドメインとの相互作用を測定できるものであれば特に制限されるものではないが、一般的に、バイオセンサー、バイオセンサーを所定の周波数で発振させる発振装置及びバイオセンサーの周波数変化を測定するインピーダンスアナライザ等から構成される。
【実施例１】
【００１０】
以下、本発明のバイオセンサーの一実施例について図面を参照して説明する。
まず、リン脂質を適度に有機溶媒に溶解し、十分に凍結乾燥してフィルム状にする。これを純水により100mMになるように水和させると多重ラメラ小胞(maltilamellar vesicle)懸濁液となる。これに超音波処理を施して脂質単ラメラ小胞(unilamellar vesicle)懸濁液とする。
次に、前記100mMの脂質単ラメラ小胞(unilamellar vesicle)懸濁液数ｍｌに対して、κレセプター（７本膜貫通へリックスのＧタンパク質共役型受容体の一種）のリガンド結合部位とされるExtra Cellular Loop II(ECL-II)をモル比で１／１００程度、細胞外活性ドメインとして加えて懸濁して、図１に示されるようにリン脂質単ラメラ小胞１の表面に膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメイン２を組み込んだ。
一方で、図２に示されるように、水晶振動子(Quartz Crystal Microbalance sensor)３の金属電極３ａ表面に、1-Octanethiol（又は1-Octadecanethiolでもよい。）を自己組織化膜(SAM:Self-assembly Monolayer)４として修飾することにより、電極表面３ａを疎水性に改質しておいて、この電極表面３ａに膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメイン２を組み込まれた脂質単ラメラ小胞１を滴下し、１時間程度放置することにより、電極表面３ａ上に膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメイン２が組み込まれた単層膜１'が形成され、本実施例のバイオセンサー６が得られることになる。
【実施例２】
【００１１】
次に、本発明の他の実施例について図面を参照して説明する。尚、脂質、膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメイン及び水晶振動子は、実施例１と同じものを使用した。
図３に示されるように、水晶振動子３の電極３ａ表面にＳｉＯ2皮膜７を100nmの厚さで蒸着して電極３ａ表面を親水性へと改質し、この電極３ａに膜タンパク質レセプターの細胞外活性ドメイン２を組み込まれた脂質単ラメラ小胞懸濁液を滴下し、１時間程度放置することにより、電極３ａ上に膜タンパク質レセプター細胞外活性ドメイン２が組み込まれた脂質二重膜１''が形成され、本実施例のバイオセンサー９が得られることになる。
【００１２】
上記実施例１及び２で説明したバイオセンサーを発振させた状態で、リガンド分子を添加すると、脂質膜５、８上の膜タンパク質のレセプターの細胞外活性ドメイン２とリガンドが結合し、水晶振動子３の周波数が減少する。この結果、レセプターである膜タンパク質のレセプター２とそのリガンド分子との結合(解離)定数を計測することで、その活性を測定することができた。
このように、実施例１、２では、大量発現系が確立されていないκレセプターであっても、そのリガンド分子との相互作用を容易に測定することができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１に使用される脂質単ラメラ小胞の説明図
【図２】実施例１の説明図
【図３】実施例２の説明図
【符号の説明】
【００１４】
１    脂質単ラメラ小胞
１'    単層膜（脂質膜）
１''    脂質二重層（脂質膜）
２    膜タンパク質のレセプターの膜外活性ドメイン
３    水晶振動子
３ａ  電極
３ｂ  石英板
４    自己組織化膜
６    実施例１のバイオセンサー
７    ＳｉＯ2皮膜
９    実施例２のバイオセンサー
【図１】
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【図２】
2005098733.tif 000004
【図３】
2005098733.tif 000005