(57)【要約】  【解決手段】  配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、ならびにそれを含む医薬組成物。  【効果】  本発明のタンパク質またはその塩、ならびにそれを含む医薬組成物はアミロイドβタンパク質前駆体（ＡＰＰ）が代謝を受けアミロイドβタンパク質（Ａβ）が産生するのを効果的に抑制することができ、従って、アルツハイマー病等の、Ａβがその発症原因の一つといわれている種々の疾患の新しい予防法や治療法を提供することができる。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
【請求項２】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
【請求項３】
配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と特異的に結合する、請求項１記載のタンパク質またはその塩。
【請求項４】
配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と特異的に結合する、請求項１記載のタンパク質またはその塩。
【請求項５】
アミロイドβタンパク質産生抑制作用を有する、請求項１記載のタンパク質またはその塩。
【請求項６】
アミロイドβタンパク質の産生抑制が、アミロイド前駆体タンパク質代謝を制御することによるものである、請求項５記載のタンパク質またはその塩。
【請求項７】
請求項１記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項８】
請求項１記載のタンパク質または請求項７記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号１で表わされる塩基配列を有する請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項８または９記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の組換えベクターを保持する形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のタンパク質または請求項７記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩の製造方法。
【請求項１３】
請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１４】
請求項８記載のＤＮＡを含有してなる医薬。
【請求項１５】
アミロイド前駆体タンパク質の代謝を制御し、アミロイドβタンパク質の産生を抑制し得る請求項１３または１４記載の医薬。
【請求項１６】
請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項１７】
請求項１６記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩の定量方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩が関与する疾患の診断方法。
【請求項１９】
請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２０】
さらに配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
さらに配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする請求項１９または２０記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２３】
さらに配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子を用いることを特徴とする請求項２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
さらに配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子を用いることを特徴とする請求項２２または２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
（ｉ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｉ）配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、および（ｉｉｉ）アミロイド前駆体タンパク質を共発現し得る細胞を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２６】
アミロイドβタンパク質の産生量を指標とする請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質と配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質との解離を阻害する化合物もしくは結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法である請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質と配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質との解離を阻害する化合物もしくは結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法である請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
アミロイドβタンパク質が関連する疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法である請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項３０】
アミロイドβタンパク質が関連する疾患が、アルツハイマー病である、請求項２９記載のスクリーニング方法。
【請求項３１】
（ｉ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｉ）配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、および（ｉｉｉ）アミロイド前駆体タンパク質を共発現し得る細胞を含有することを特徴とするアミロイドβタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項３２】
請求項１のタンパク質の発現量を増加させる化合物からなるアミロイドβタンパク質が関連する疾患の予防・治療剤。
【請求項３３】
アミロイドβタンパク質が関連する疾患が、アルツハイマー病である、請求項３２記載の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカデインに特異的に結合し、且つアミロイドβタンパク質の産生を阻害する活性を有するタンパク質とそのＤＮＡ、ならびにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病患者脳の病理学的特徴として、神経細胞の脱落に加えて、老人斑、神経原線維変化の蓄積が知られている。これらのうち、アルツハイマー病における最初期の病理変化は老人斑の形成であり、その主要構成成分がアミロイドβタンパク質（Ａβ）であることから、Ａβの産生あるいは分解の異常がアルツハイマー病の発症・進展に深くかかわっていると考えられている。Ａβはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からβ−セクリターゼによる１回目の切断の後、γ−セクリターゼ（プレセニリン複合体）による２回目の膜内切断を受けて産生される。
【０００３】
プレセニリンあるいはプレセニリン複合体（以下単にＰＳと略す）によって代謝を受ける膜タンパク質はＡＰＰだけでなく、細胞分化に必要なＮｏｔｃｈやガン細胞転移に機能するＣＤ４４等多数報告されている。このようにＰＳによってＡＰＰやＮｏｔｃｈ、ＣＤ４４から生成したフラグメントは転写調節因子等と結合し新たな遺伝子発現を誘起あるいは抑制する。このような現象はＲＩＰ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）による細胞内情報伝達系として最近注目を集めている。 
【０００４】
ＡＰＰの細胞質ドメインに結合する分子の一つであるＸ１１Ｌは、一回膜貫通型の膜タンパク質であり、アミノ末端側の細胞外ドメインには、２つのカドヘリン様モチーフと１つのＣａ２＋結合サイトを有するタンパク質（アルカデインあるいはＸＢ３１またはｃａｌｓｙｎｔｅｎｉｎとも称される）と三者複合体を形成し、ＡＰＰを安定化し代謝を制御しＡβの産生を抑制している（特許文献１および非特許文献１参照）。また、アルカデインにはα、βおよびγの３つのアイソフォームがあることも知られている。
【０００５】
しかしながらアルカデインを介したＡＰＰの代謝制御機構やアルカデイン自身の生理機能には解明されていない点も多く、依然さらなる解析が必要とされていた。
【特許文献１】特開２００３−１６４２９８号公報
【非特許文献１】「ザ  ジャーナル  オヴ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），２００３年，第２７８巻，第４９号，ｐ．４９４４８−４９４５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はアルカデインを介したＡＰＰの代謝制御機構やアルカデイン自身の生理機能を解明する一貫として、アルカデインに特異的に結合し、且つＡＰＰの代謝を制御しＡβの産生を抑制するような作用を有する新規なタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、該タンパク質をコードするＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質またはＤＮＡを含有する医薬、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質またはその部分ペプチドもしくはそれらをコードする遺伝子を用いることを特徴とする、Ａβの産生を抑制する化合物のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、アルカデインを介したＡＰＰの代謝制御機構とアルカデイン自身の生理機能の解明を目的として、酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法によりアルカデインに結合する新規分子アルカデイン結合タンパク質（以下ＡｌｃＢＰともいう）を同定した。ＡｌｃＢＰは４回膜貫通型の分子であり、ＡＰＰ同様に多くの組織で発現している。本発明者らはＡｌｃＢＰがアルカデインのみだけでなくＡＰＰとも結合すること、ＡｌｃＢＰとＡＰＰを共発現させた細胞ではＡβ４０、Ａβ４２両方の産生が著しく抑制されることを見いだした。さらにＡｌｃＢＰがγ−セクリターゼ（ＰＳ複合体）によるＡＰＰの２回目の膜内切断を阻害し得ることを確認した。これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は下記の通りである。
（１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
（２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
（３）配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と特異的に結合する、上記（１）記載のタンパク質またはその塩。
（４）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と特異的に結合する、上記（１）記載のタンパク質またはその塩。
（５）アミロイドβタンパク質産生抑制作用を有する、上記（１）記載のタンパク質またはその塩。
（６）アミロイドβタンパク質の産生抑制が、アミロイド前駆体タンパク質代謝を制御することによるものである、上記（５）記載のタンパク質またはその塩。
（７）上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
（８）上記（１）記載のタンパク質または上記（７）記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
（９）配列番号１で表わされる塩基配列を有する上記（８）記載のＤＮＡ。
（１０）上記（８）または（９）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【０００９】
（１１）上記（１０）記載の組換えベクターを保持する形質転換体。
（１２）上記（１１）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記（７）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造方法。
（１３）上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
（１４）上記（８）記載のＤＮＡを含有してなる医薬。
（１５）アミロイド前駆体タンパク質の代謝を制御し、アミロイドβタンパク質の産生を抑制し得る上記（１３）または（１４）記載の医薬。
（１６）上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
（１７）上記（１６）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩の定量方法。
（１８）上記（１７）記載の定量方法を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩が関与する疾患の診断方法。
（１９）上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２０）さらに配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする上記（１９）記載のスクリーニング方法。
【００１０】
（２１）さらに配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする上記（１９）または（２０）記載のスクリーニング方法。
（２２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２３）さらに配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子を用いることを特徴とする上記（２２）記載のスクリーニング方法。
（２４）さらに配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子を用いることを特徴とする上記（２２）または（２３）記載のスクリーニング方法。
（２５）（ｉ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｉ）配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、および（ｉｉｉ）アミロイド前駆体タンパク質を共発現し得る細胞を用いることを特徴とするアミロイドβタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２６）アミロイドβタンパク質の産生量を指標とする上記（１９）記載のスクリーニング方法。
（２７）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質と配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質との解離を阻害する化合物もしくは結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法である上記（１９）記載のスクリーニング方法。
（２８）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質と配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質との解離を阻害する化合物もしくは結合を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法である上記（１９）記載のスクリーニング方法。
（２９）アミロイドβタンパク質が関連する疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法である上記（１９）記載のスクリーニング方法。
（３０）アミロイドβタンパク質が関連する疾患が、アルツハイマー病である、上記（２９）記載のスクリーニング方法。
【００１１】
（３１）（ｉ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｉ）配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、および（ｉｉｉ）アミロイド前駆体タンパク質を共発現し得る細胞を含有することを特徴とするアミロイドβタンパク質の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（３２）上記（１）のタンパク質の発現量を増加させる化合物からなるアミロイドβタンパク質が関連する疾患の予防・治療剤。
（３３）アミロイドβタンパク質が関連する疾患が、アルツハイマー病である、上記（３２）記載の予防・治療剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＡＰＰが代謝を受けＡβが産生されるのを効果的に抑制することができ、従って、アルツハイマー病等の、Ａβがその発症原因の一つといわれている種々の疾患の新しい予防法や治療法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質である。当該タンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、Ａｌｃαともいう）、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、Ａｌｃβともいう）、もしくは配列番号８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、Ａｌｃγともいう）と特異的に結合し、また、配列番号１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（アミロイド前駆タンパク質；以下、ＡＰＰともいう）と特異的に結合する。従って、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をアルカデイン結合タンパク質（ＡｌｃＢＰ）と称する。
【００１４】
本発明のタンパク質、ならびに本発明で用いられる各タンパク質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８あるいは配列番号１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、各配列番号で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。相同性（同一性）（％）は、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、相同性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、相同性％は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０  ｍａｔｒｉｘ、並びにｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４、及びｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５若しくは６のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １２、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ４を用いることができる。
【００１６】
各配列番号で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、例えば、各配列番号で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、各配列番号で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
【００１７】
実質的に同質の活性としては、ＡｌｃＢＰ（配列番号２）の場合にはＡｌｃα（配列番号４）、Ａｌｃβ（配列番号６）もしくはＡｌｃγ（配列番号８）との結合活性やＡＰＰ（配列番号１０）との結合活性などが、Ａｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγの場合には、それぞれＡｌｃＢＰとの結合活性やＸ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性などが、ＡＰＰの場合には、ＡｌｃＢＰとの結合活性やＸ１１ＬのＰＤドメインとの結合活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、上記の活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１８】
また、本発明のタンパク質あるいは本発明で用いられる各タンパク質には、例えば、（ｉ）各配列番号で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）各配列番号で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）各配列番号で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）各配列番号で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失、付加または置換されている場合、その挿入、欠失、付加または置換の位置としては、活性が消失しない限り、特に限定されない。
【００１９】
本発明のタンパク質あるいは本発明で用いられる各タンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃＢＰをはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００２０】
本発明のタンパク質あるいは本発明で用いられる各タンパク質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２１】
本発明のタンパク質あるいは本発明で用いられる各タンパク質またはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、それらタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞のホモジナイズ上清を、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００２２】
本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ（フェニルアセトアミドメチル）樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００２３】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００２４】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２５】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００２６】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２７】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２８】
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したペプチドとを製造し、これらのペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
【００２９】
本発明のタンパク質もしくは本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタンパク質あるいは本発明で用いられるタンパク質を構成し得る部分ペプチドまたはアミノ酸残基と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  および  Ｍ．Ａ．  Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス  （Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮｅｗＹｏｒｋ  （１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座  １、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
【００３０】
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられるタンパク質を精製単離することができる。上記方法で得られるタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００３１】
本発明において、配列番号２（ＡｌｃＢＰ）、配列番号４（Ａｌｃα）、配列番号６（Ａｌｃβ）、配列番号８（Ａｌｃγ）もしくは配列番号１０（ＡＰＰ）のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、各タンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該遺伝子としては、各タンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。各タンパク質をコードする遺伝子としては、前述した各タンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。本発明のＡｌｃＢＰをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃＢＰと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。本発明で用いられるＡｌｃαをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号３で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃαと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。本発明で用いられるＡｌｃβをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号５で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号６で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃβと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。本発明で用いられるＡｌｃγをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号７で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃγと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。本発明で用いられるＡＰＰを��ードする遺伝子としては、例えば、配列番号９で表される塩基配列を含有する遺伝子、または配列番号９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するＡＰＰと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何れのものでもよい。
【００３２】
各配列番号で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、各配列番号で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００３３】
より具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃＢＰをコードする遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃαをコードする遺伝子としては、配列番号３で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。配列番号６で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃβをコードする遺伝子としては、配列番号５で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するＡｌｃγをコードする遺伝子としては、配列番号７で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するＡＰＰをコードする遺伝子としては、配列番号９で表される塩基配列を含有する遺伝子などが用いられる。
【００３４】
本発明において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述の配列番号２（ＡｌｃＢＰ）で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子におけるＤＮＡと同義であり、同様なものが例示される。本発明において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するものであればいかなるものであってもよい。
【００３５】
本発明のタンパク質あるいは本発明のＤＮＡにコードされたポリペプチド（ＡｌｃＢＰ）のＡｌｃへのあるいはＡＰＰへの結合能は、例えば、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、エピトープタグを用いた共免疫沈降（例えば、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法）、共鳴プラズモン相互作用解析などにより評価することができる。
【００３６】
具体的には、下記方法などが挙げられる。
結合能評価方法１（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法）
（１）ＡｌｃＢＰ  ｃＤＮＡを、ｐｒｅｙベクターに組込み、ｐｒｅｙプラスミドを得るステップ；
（２）得られたｐｒｅｙプラスミドを酵母（ＥＧＹ４８［ｐ８ｏｐ  ｌａｃＺ］）に導入して、ｐｒｅｙプラスミド保持クローンを得るステップ；
（３）ヒトＡＰＰ遺伝子（全長や細胞内ドメインなど）あるいはヒトＡｌｃ遺伝子を、ｂａｉｔベクターに組込み、ｂａｉｔプラスミドを得るステップ；
（４）得られたｂａｉｔプラスミドを、前記ステップ（２）で得られたｐｒｅｙプラスミド保持クローンに導入し、クローンを得るステップ；並びに
（５）前記（４）で得られたクローンを、ロイシン欠失プレート上で３日間培養し、酵母細胞内におけるＡＰＰあるいはＡｌｃとＡｌｃＢＰとの相互作用能をロイシン欠失プレート上でのコロニー形成能により評価するステップ；を含む方法。
かかる評価方法１においては、ロイシン欠失プレート上でコロニーが形成されることを、ＡｌｃＢＰとＡＰＰあるいはＡｌｃとが結合することの指標とする。
【００３７】
結合能評価方法２（共免疫沈降法）
１．ＡｌｃＢＰとＡＰＰ（あるいはＡｌｃ）との結合能評価（２者複合体）
（１）シグナル配列の下流にＦＬＡＧ配列を有するＡｌｃＢＰを発現するＦＬＡＧ−ＡｌｃＢＰ発現プラスミドを得るステップ；
（２）細胞に、前記ステップ（１）で得られたＦＬＡＧ−ＡｌｃＢＰ発現プラスミドとＡＰＰ発現プラスミドとを、一過的にコトランスフェクトして、トランスフェクタントを得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られたコトランスフェクタントを培養して、培養細胞を得るステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた培養細胞から、細胞抽出液を得るステップ；
（５）前記ステップ（４）で得られた細胞抽出液に抗ＦＬＡＧ抗体を加えて共免疫沈降を行うステップ；並びに
（６）共免疫沈降を、ウエスタンブロット解析により検出するステップ；を含む方法。
かかる方法２−１．においては、抗ＦＬＡＧ抗体を用いる場合において、ＡＰＰ−ＡｌｃＢＰあるいはＡｌｃ−ＡｌｃＢＰの複合体の沈降がみられることを、ＡｌｃＢＰとＡＰＰ（もしくはＡｌｃ）とが結合することの指標とする。
【００３８】
２．ＡｌｃＢＰとＡＰＰおよびＡｌｃとの結合能評価（３者複合体）
（１）シグナル配列の下流にＦＬＡＧ配列を有するＡＰＰを発現するＦＬＡＧ−ＡＰＰ発現プラスミドを得、一方でＮ末側にＭｙｃ配列を有するＡｌｃＢＰを発現しうるＭｙｃ−ＡｌｃＢＰ発現プラスミドを得るステップ；
（２）細胞に、前記ステップ（１）で得られたＦＬＡＧ−ＡＰＰ発現プラスミドとＭｙｃ−ＡｌｃＢＰ発現プラスミドとＡｌｃ発現プラスミドとを、一過的にコトランスフェクトして、トランスフェクタントを得るステップ；
（３）前記ステップ（２）で得られたコトランスフェクタントを培養して、培養細胞を得るステップ；
（４）前記ステップ（３）で得られた培養細胞から、細胞抽出液を得るステップ；
（５）前記ステップ（４）で得られた細胞抽出液に抗ＦＬＡＧ抗体を加えて共免疫沈降を行うステップ；並びに
（６）共免疫沈降を、ウエスタンブロット解析により検出するステップ；を含む方法。
かかる方法２−２．においては、抗ＦＬＡＧ抗体を用いる場合において、ＡＰＰ−ＡｌｃＢＰ−Ａｌｃの複合体の沈降がみられることを、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとＡｌｃとが結合することの指標とする。
【００３９】
結合能評価方法３（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法）
（１）ＧＳＴとＡｌｃＢＰとからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ＡｌｃＢＰ）と、ＡＰＰまたはＡｌｃとを接触させるステップ；
（２）グルタチオンビーズでタンパク質を、回収するステップ；並びに
（３）抗ＡＰＰ抗体（または抗Ａｌｃ抗体）を用いたウエスタンブロット解析を行い、ＧＳＴ−ＡｌｃＢＰと、ＡＰＰとの複合体を検出するステップ；を含む方法。
かかる方法３においては、ＧＳＴ−ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの複合体の存在を、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとが結合することの指標とする。
【００４０】
結合能評価方法４（共鳴プラズモン相互作用解析）
（１）ＡＰＰ（もしくはＡｌｃ）又はＡｌｃＢＰ（いずれも全長又は結合に関与する部分タンパク質）を固定化したチップに、対応して、ＡｌｃＢＰ又はＡＰＰ（もしくはＡｌｃ）を一定の流速で、送液するステップ；及び
（２）適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度など）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳなど）〕により相互作用を検出するステップ；を含む方法。
かかる方法４においては、Ａｌｃ−ＢＰとＡＰＰ（もしくはＡｌｃ）とからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、ＡｌｃＢＰとＡＰＰ（もしくはＡｌｃ）とが結合することの指標とする。
【００４１】
また、ＡｌｃＢＰの発現によるＡＰＰの代謝制御作用は、例えば、パルスチェイス法、免疫測定法などにより評価することができる。
【００４２】
具体的には、例えば、下記方法が挙げられる。
代謝分解抑制能評価方法１（パルスチェイス法）
（１）ＦＬＡＧ−ＡｌｃＢＰ発現プラスミドとＡＰＰ発現プラスミドとを一過的にコトランスフェクトした細胞を得るステップ；
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞を、３５Ｓ−標識メチオニン含有培地で一定時間培養し、ついで、過剰量のメチオニンを添加するステップ；
（３）培養液と細胞抽出液とを調製し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降により、タンパク質を回収するステップ；及び
（４）回収されたタンパク質をゲル上で電気泳動して分離し、シグナルの解析を行い、それにより量的変動を調べるステップ；を含む方法。
【００４３】
代謝分解抑制能評価方法２（免疫測定法）
（１）ＡＰＰ発現プラスミドとＡｌｃＢＰ発現プラスミドとを一過的にコトランスフェクトした細胞を得るステップ；及び
（２）前記ステップ（１）により得られた培養上清を回収し、サンドウィッチＥＬＩＳＡ法によりＡβ濃度を測定するステップ；を含む方法。
【００４４】
本発明のタンパク質もしくは本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子のクローニングの手段としては、各タンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを各タンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。遺伝子の塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたタンパク質をコードする遺伝子は目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該遺伝子はその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。本発明の組換えベクター、特に本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードする遺伝子から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該遺伝子断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００４５】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００４６】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明で用いられるタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００４７】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン（Ｇｅｎｅ），２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００４８】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ  細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，  Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３巻，  ２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００４９】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６巻，  ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
【００５０】
このようにして、タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００５１】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，  Ｋ．Ｌ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｇ．Ａ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００５２】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，  Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の牛胎児血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔ザ・ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明で用いられるタンパク質を生成せしめることができる。
【００５３】
上記培養物から本発明のタンパク質あるいは本発明で用いられるタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。本発明で用いられるタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００５４】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明で用いられるタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【００５５】
〔モノクローナル抗体の作成〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なうことができる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２５６巻，４９５  （１９７５）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００５６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが用いられる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００５７】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００５８】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
ポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物からポリクローナル抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で結合させる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００５９】
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの塩基配列またはその一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、該タンパク質または部分ペプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの全塩基配列または部分塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡの全塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００６０】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、例えば、Ａｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγ、ならびにＡＰＰとの結合活性を有し、Ａβの産生を抑制するなどの作用を有している。したがって、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩はさまざまな用途に用いることができる。以下に、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質に対する抗体（本発明の抗体と略記する場合がある）およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００６１】
（１）各種疾病の治療・予防剤などの医薬
本発明のタンパク質は、Ａｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとＡＰＰと複合体を形成することにより、ＡＰＰの代謝を制御しＡβの産生を抑制することができるのでＡβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療剤などの医薬として有用である。
【００６２】
本発明のタンパク質を上記の医薬として使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質を用いる場合には生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００６３】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤手法に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベートＴＭ８０、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００６４】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。該タンパク質またはＤＮＡの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に通常成人のアルツハイマー病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき有効成分を約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは約１．０〜２００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象組織、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人のアルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき有効成分を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６５】
本発明のタンパク質は、上記したようにＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγならびにＡＰＰと結合し、ＡＰＰの代謝を制御し、Ａβの産生を抑制し得ることから、本発明のタンパク質をコードする遺伝子（以下、単に本発明の遺伝子ともいう；詳細は上述；好ましくはＤＮＡ）もまた、Ａβ関連疾患（例えばアルツハイマー病）の予防・治療剤などの医薬として有用である。
【００６６】
本発明の遺伝子によれば、細胞、特に、脳組織における神経細胞への導入により、コードされたポリペプチドを発現させ、ＡＰＰの代謝を制御し、Ａβの産生を抑制することが期待される。
【００６７】
本発明の遺伝子は、細胞への導入及び細胞における発現に適した配列からなる遺伝子と連結して、組換えＤＮＡとして使用することもできる。かかる組換えＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
【００６８】
前記細胞としては、神経細胞が挙げられる。
【００６９】
前記細胞における発現に適した配列としては、例えば、転写を制御するプロモーター配列などの制御遺伝子、神経細胞特異的に発現する遺伝子の転写領域の配列（例えば、ＰＤＧＦのプロモーター配列；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ５９４２３）などが挙げられる。
【００７０】
また、本発明の遺伝子又は組換えＤＮＡを、適切な担体に含有させて用いることにより、より一層、細胞への導入が容易になり、かつ該遺伝子によりコードされたポリペプチドを発現させ、ＡＰＰの代謝分解を阻害すること、ひいてはＡβの産生が抑制されることが期待される。したがって、本発明の遺伝子又は組換えＤＮＡを含有した担体からなる細胞導入用担体も本発明の範囲に含まれる。
【００７１】
担体としては、細胞への導入に適したベクター、リポソーム、金属粒子、正電荷ポリマー、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランなどが挙げられる。また、前記担体は、リポソーム、金属粒子、正電荷ポリマー、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥデキストランのいずれかに、本発明の遺伝子又は組換えＤＮＡを含有した細胞への導入に適したベクターを保持せしめたものであってもよい。
【００７２】
細胞への導入に適したベクターのうち、非ウイルス性ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ  ［ジーン（Ｇｅｎｅ），  １０８巻，  １９３−２００  （１９９１）］やｐＢＫ−ＣＭＶ  、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ  （インビトロゲン社製、ストラタジーン社製）  などの発現ベクターが挙げられる。また、ウイルス性ベクターとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、無毒化したレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルス、またはＲＮＡウイルスなどのウイルス性ベクターが挙げられる。このうち、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びヘルペスウイルスベクターが好ましい。
【００７３】
また、リポソーム、金属粒子、正電荷ポリマーなどの担体のうち、最も好ましいものとしては、リポソームが挙げられる。かかるリポソームとしては、カチオニックリポソーム、ＨＶＪ（センダイウイルス）−リポソーム、改良型ＨＶＪ−リポソーム（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム）、正電荷リポソームなどが挙げられる。
さらに、本発明の遺伝子によれば、該遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現により、ＡＰＰの代謝分解を阻害することができるため、ＡＰＰの分解阻害剤をも提供することができる。かかるＡＰＰの分解阻害剤も本発明の範囲に含まれる。
【００７４】
本発明の遺伝子をＡβ関連疾患の予防・治療剤として使用する場合、有効成分の含有量及びその投与回数は、投与目的、個体の年齢、体重、状態等に応じて、ＡＰＰの代謝を制御し、かつＡβの産生を抑制する効果を十分に発揮させうる範囲で適宜設定され得る。例えば、本発明の遺伝子の含有量として、０．０００１〜１００ｍｇ程度であることが望ましい。
【００７５】
投与手段は、特に神経細胞における導入を達成し得、ＡＰＰの代謝分解を阻害し、かつＡＰＰの代謝を制御し、かつＡβの産生を抑制する効果を十分に発揮させうるものであれば、特に限定されるものではない。
【００７６】
例えば、本発明の遺伝子を含有する医薬を細胞、組織又は個体に導入する方法としては、リン酸−カルシウム共沈法；微小ガラス管を用いた核酸の直接注入法；内包型リポソームによる遺伝子導入法；静電気型リポソームによる遺伝子導入法；ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）；受容体介在性遺伝子導入法；パーティクル銃で担体（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法；ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法；正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。
【００７７】
患者への投与方法としては、例えば、以下の手法が挙げられる。すなわち、線維芽細胞やアストロサイトなどの細胞に対して体外で本発明の遺伝子を導入し、遺伝子導入が成功した細胞を選択したうえで、脳内に移植するｅｘ  ｖｉｖｏの方法や、ウイルスベクターやリポソームを用いて直接脳内の特定の部位に局所注入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の遺伝子の導入を行なうアプローチが考えられる。さらに、徐放性の製剤を調製し、患部近くに埋め込む手法や、オスモチックポンプを用いて、脳内に連続的に徐々に投与する方法も挙げられる。
【００７８】
また、本発明の遺伝子を含有する医薬は、通常の薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤などを含有してもよい。
【００７９】
本発明の遺伝子を含有する医薬によれば、アルツハイマー病において顕著に見られる老人斑の主要構成成分であるＡβの生成を阻害するため、アルツハイマー病の治療効果が認められる。したがって、本発明の遺伝子を含有する医薬を有効成分として含有したアルツハイマー病の治療剤も本発明の範囲に含まれる。
【００８０】
本発明の治療剤における有効成分量は、疾患、患者の年齢及び体重等に応じて適宜設定することができるが、例えば、本発明の遺伝子の含有量として、０．０００１〜１００ｍｇであることが望ましい。
【００８１】
かかる治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法又は動物、例えば、ヒト等の哺乳動物からある種の細胞を取り出して体外で治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法により、投与することができる。かかる手法については、例えば、日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁；月刊薬事，３６（１），２３−４８，１９９４；実験医学増刊，１２（１５），１９９４；日本遺伝子治療学会編  遺伝子治療開発研究ハンドブック，エヌ・ティー・エス，１９９９等を参照することができる。
【００８２】
患者への投与方法としては、例えば、以下の手法が挙げられる。すなわち、線維芽細胞やアストロサイトなどの細胞に対して体外で本発明の遺伝子を含有する治療剤を導入し、遺伝子導入が成功した細胞を選択したうえで、脳内に移植するｅｘ  ｖｉｖｏ  の方法や、ウイルスベクターやリポソームを用いて直接脳内の特定の部位に局所注入し、ｉｎ  ｖｉｖｏ  で本発明の遺伝子の導入を行なうアプローチが考えられる。さらに、徐放性の製剤を調製し、患部近くに埋め込む手法や、オスモチックポンプを用いて、脳内に連続的に徐々に投与する方法も挙げられる。
【００８３】
（２）遺伝子診断剤
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードする遺伝子は、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子の異常（遺伝子異常）を検出することができる。したがって、本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードする遺伝子は、本発明のタンパク質が関与する各種疾病の遺伝子診断剤として有用である。例えば、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子（ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）が損傷し、欠損し、あるいはタンパク質の発現が減少していることが検出された場合は、例えば、ＡＰＰ代謝異常に関連する疾患、Ａβに関連する疾患（例えばアルツハイマー病など）、あるいはＰＳの活性異常（活性化）によって引き起こされる疾患などの疾病である可能性ありと診断することができる。一方、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子（ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）が異常に増加し、あるいはタンパク質の発現が異常に増加していることが検出された場合は、例えば、ＡＰＰ代謝異常に関連する疾患、Ａβに関連する疾患、ＰＳの活性が弱いために引き起こされる病気などの疾病である可能性ありと診断することができる。
【００８４】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＵＳＡ），８６巻，２７６６−２７７０（１９８９））などにより実施することができる。
【００８５】
（３）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
【００８６】
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、  特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００８７】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラスなどが用いられる。サンドイッチ法においては不溶化したモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化したモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量等を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００８８】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にも、レーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００８９】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、公知の総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．  ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、  同書  Ｖｏｌ．  ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量することができる。
【００９０】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質が関与する各種疾病の診断を行なうことができる。例えば、本発明のタンパク質の濃度が減少している場合は、例えば、ＡＰＰ代謝異常に関連する疾患、Ａβ関連疾患（例えばアルツハイマー病など）などの疾病である可能性ありと診断することができる。一方、本発明のタンパク質の濃度が増加している場合は、例えば、ＡＰＰ代謝異常に関連する疾患、Ａβ関連疾患などの疾病である可能性ありと診断することができる。
【００９１】
さらに、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。さらに、本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。
【００９２】
（４）Ａβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、（Ａ）本発明のタンパク質（配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質；ＡｌｃＢＰ）もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（Ｂ）（ｉ）ＡｌｃＢＰもしくはその部分ペプチド、および（ｉｉ）配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（それぞれＡｌｃα、Ａｌｃβ、Ａｌｃγ）またはその部分ペプチド（好ましくは、Ａｌｃα、ＡｌｃβまたはＡｌｃγとＡｌｃＢＰとの複合体）を用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（Ｃ）（ｉ）ＡｌｃＢＰもしくはその部分ペプチド、および（ｉｉ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（ＡＰＰ）もしくはその部分ペプチド（好ましくは、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの複合体）を用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（Ｄ）（ｉ）ＡｌｃＢＰ、（ｉｉ）Ａｌｃα、ＡｌｃβまたはＡｌｃγもしくはそれらの部分ペプチド、および（ｉｉｉ）ＡＰＰもしくはその部分ペプチド（好ましくは、Ａｌｃα、ＡｌｃβまたはＡｌｃγ、ＡｌｃＢＰおよびＡＰＰとの複合体）を用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（Ｅ）本発明のタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子；ＡｌｃＢＰ遺伝子）を用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（Ｆ）配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子（それぞれＡｌｃα遺伝子、Ａｌｃβ遺伝子、Ａｌｃγ遺伝子）を用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（Ｇ）（ｉ）ＡｌｃＢＰ遺伝子、および（ｉｉ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子（ＡＰＰ遺伝子）を用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（Ｈ）（ｉ）ＡｌｃＢＰ遺伝子、（ｉｉ）Ａｌｃα遺伝子、Ａｌｃβ遺伝子またはＡｌｃγ遺伝子、および（ｉｉｉ）ＡＰＰ遺伝子を用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（Ｉ）ＡｌｃＢＰ、Ａｌｃα、ＡｌｃβまたはＡｌｃγ、およびＡＰＰを共発現し得る細胞を用いることを特徴とするＡβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法である。
【００９３】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、Ａβの産生量を指標とすることができる。Ａβとしては、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるＡβ４０、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるＡβ４２、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるＡβ４３などが挙げられる。より具体的には、上記のスクリーニング方法において、試験化合物の存在下または非存在下におけるＡβの産生量を測定し、比較する。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。Ａβの測定法には種々の方法が用いられるが、Ａβ特異的抗体を用いる免疫化学的方法を用いることが好ましい。これらの方法には、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法あるいはそれらの組み合わせ方法が用いられる。Ａβ特異的抗体としては、ポリクローナル抗体を用いても良いが、例えば、ＢＡＮ５０、ＢＮＴ７７、ＢＳ８５、ＢＡ２７、ＢＣ０５（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３４，  １０２７２−１０２７８，  １９９５）または６Ｅ１０、４Ｇ８などのモノクローナル抗体を用いても良い。とりわけ、ＢＡ２７およびＢＣ０５は、それぞれＡβ４０およびＡβ４２／４３に選択的な抗体であるため、これらの抗体、あるいは同様な選択性を有する抗体を用いれば、Ａβ４０の産生を阻害する化合物、Ａβ４２／４３の産生を阻害する化合物、あるいはＡβ４０およびＡβ４２／４３いずれの産生も阻害する化合物を選択することが可能となる。さらに、分泌型ＡＰＰ量はＡβの産生を間接的に反映すると考えられることから、分泌型ＡＰＰ量を免疫沈降法、ウエスタンブロッティング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法などの免疫化学的方法で検出しても良い。ＡｌｃＢＰ、Ａｌｃα、ＡｌｃβまたはＡｌｃγ、およびＡＰＰを共発現し得る細胞としては、これらの遺伝子を含有するベクターで形質転換した形質転換体を用いることができるが、他にＩＭＲ−３２、ＰＣ１２ｈ、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（Ｎ２ａ）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨなどの細胞株、またはＡＰＰとＰＳ−１／２を導入したＨＥＫ−２９３などの細胞株を用いることもできる。
【００９４】
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、試験化合物の存在下におけるＡβ産生量が、試験化合物の非存在下におけるＡβ産生量に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少している試験化合物をＡβの産生を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。また、コントロールとして、ＡｌｃＢＰ、Ａｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγ、および（または）ＡＰＰを発現していない細胞を用いて、試験化合物の存在下におけるＡβ産生量を測定することもできる。
【００９５】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるＡｌｃＢＰ、Ａｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγ、および（または）ＡＰＰ、またはそれらをコードする遺伝子、またはそれらを共発現し得る細胞を含有するものである。上記した本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物は、（１）ＡｌｃＢＰとＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとの解離を阻害するか、ＡｌｃＢＰとＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとの結合を促進することにより、（２）ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの解離を阻害するか、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの結合を促進することにより、Ａβの産生を阻害する化合物またはその塩である。
【００９６】
上記したスクリーニング方法で得られた化合物またはそれから誘導される化合物は、塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例えばアルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。上記した本発明のスクリーニング方法で得られた化合物は、Ａβの産生を効率良く阻害することができるので、Ａβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療剤として使用することができる。本発明のスクリーニング方法で得られた化合物を含有する医薬は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形で提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。また、例えば非経口投与に適する剤形としては、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与剤、経皮投与剤、軟膏剤など）、座剤（例、直腸剤、膣座剤など）、徐放剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）、ペレット、点滴剤などが用いられる。
【００９７】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは約１．０〜２００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９８】
（５）ＡｌｃＢＰの発現量を増加させる化合物からなるＡβ関連疾患の予防・治療剤
上記したように、本発明のタンパク質（ＡｌｃＢＰ）は、ＡＰＰの代謝を制御し、Ａβの産生を抑制することからＡｌｃＢＰの発現量を増加させる化合物はＡβ関連疾患（例えばアルツハイマー病など）の予防・治療剤として有用である。ＡｌｃＢＰの発現量を増加させる化合物としては、最終的にＡＰＰの代謝制御にかかわるＡｌｃＢＰの量を増加させるものであれば特に限定されず、ＡｌｃＢＰの発現そのものを増加させる場合もあればＡｌｃＢＰの分解を抑制し、結果的にＡｌｃＢＰ量を増加させるものであってもよい。
ＡｌｃＢＰの発現量の増加は、当分野で通常実施される手法を用いて確認することができる。具体的には、上記「（３）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量」で述べた手法を用いて実施することができる。また、遺伝子レベルでの確認は、ＡｌｃＢＰ遺伝子（例えば、配列番号１の塩基配列で表されるＤＮＡ）の遺伝子配列情報に基づいて適当なプローブを作成し、ノザンブロット法などの常套手段で行なうことができる。
【００９９】
当該化合物は、塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例えば、アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。上記したＡｌｃＢＰの発現量を増加させる化合物は、Ａβの産生を効率良く阻害することができるので、Ａβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療剤として使用することができる。本発明において用いられるＡｌｃＢＰの発現量を増加させる化合物を含有する医薬は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。また、例えば非経口投与に適する剤形としては、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与剤、経皮投与剤、軟膏剤など）、座剤（例、直腸剤、膣座剤など）、徐放剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）、ペレット、点滴剤などが用いられる。
【０１００】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは約１．０〜２００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１０１】
（６）治療方法
本発明は、（Ａ）ＡｌｃＢＰとＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとの解離を阻害するか、ＡｌｃＢＰとＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとの結合を促進することを特徴とするＡβの産生阻害方法、（Ｂ）ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの解離を阻害するか、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの結合を促進することを特徴とするＡβの産生阻害方法を提供する。この方法は、Ａβ関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の予防・治療方法として有用である。ＡｌｃＢＰとＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとの解離を阻害するか、ＡｌｃＢＰとＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとの結合を促進する手段としては、前記したスクリーニング方法で得られる、ＡｌｃＢＰとＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとの解離を阻害するか、ＡｌｃＢＰとＡｌｃα、ＡｌｃβもしくはＡｌｃγとの結合を促進する化合物またはその塩を投与することなどが挙げられる。ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの解離を阻害するか、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの結合を促進する手段としては、前記したスクリーニング方法で得られる、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの解離を阻害するか、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの結合を促進する化合物またはその塩を投与することなどが挙げられる。
【０１０２】
さらに本発明はＡｌｃＢＰの発現量を増加させることを特徴とするＡβ産生阻害方法を提供する。この方法はＡβ関連疾患（例えばアルツハイマー病）の予防・治療方法として有用である。ＡｌｃＢＰの発現量を増加させる手段としては、前記したＡｌｃＢＰの発現量を増加させる化合物を投与することなどが挙げられる。
【０１０３】
（７）新規複合体
Ａｌｃα、ＡｌｃβまたはＡｌｃγとＡｌｃＢＰとの複合体、ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの複合体およびおよびＡｌｃα、ＡｌｃβまたはＡｌｃγ、ＡｌｃＢＰおよびＡＰＰとの複合体またはその塩は新規であり、上記した本発明のスクリーニングに有用である。複合体の塩としては、前記した本発明のスクリーニング方法に用いられるタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
【０１０４】
（８）アンチセンスＤＮＡ（もしくはＲＮＡｉ）
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡもしくはｍＲＮＡや本発明のタンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡ（もしくはＲＮＡｉ）は、生体内において上記の作用を発揮する本発明のタンパク質またはそれをコードするＤＮＡの機能を抑制することができる。すなわちＰＳの活性化を引き起こし得る。したがって、ＰＳの活性化（ＲＩＰの活性化）が有用な種々の用途に利用することができる。
【０１０５】
該アンチセンスＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合、前記した本発明のタンパク質またはＤＮＡを含有する各種疾病の治療・予防剤と同様にして実施することができる。さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【０１０６】
（９）ＤＮＡ転移動物の作製
さらに本発明は、アルカデイン結合活性を有する新規なタンパク質（ＡｌｃＢＰ）をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター、および（５）第（４）記載の組換えベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬などを提供するものである。
【０１０７】
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
【０１０８】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【０１０９】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来のものとしては、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられるが、好ましくは全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどを用いることができる。
【０１１０】
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。その他、目的ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ヒトなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明のＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明のＤＮＡを保持することを意味する。ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明のＤＮＡを有する。
【０１１１】
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明のＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のＤＮＡを過剰に有することを意味する。ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【０１１２】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。さらに、目的ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した異常な本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
【０１１３】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、（ａ）組織培養のための細胞源としての使用、（ｂ）本発明のＤＮＡ転移哺乳動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたタンパク質組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、（ｃ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、（ｄ）上記（ｃ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および（ｅ）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
【０１１４】
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、Ａβ関連疾患（例えばアルツハイマー病）との関連性を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【０１１５】
（１０）ノックアウト動物の作製
さらに、本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する細胞である第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）レポーター遺伝子が本発明のタンパク質のプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の動物、
（８）レポーター遺伝子が大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子である第（７）項記載の動物、
（９）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の動物、
（１０）ゲッ歯動物がマウスである第（９）項記載の動物、および
（１１）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のタンパク質のプロモーター活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
を提供する。
【０１１６】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【０１１７】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用い得る。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【０１１８】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭ  ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．  Ｊ．  Ｅｖａｎｓ及びＭ．  Ｈ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９２巻，１５４，１９８１；Ｇ．  Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ，  プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７８巻，７６３４，１９８１；Ｔ．  Ｃ．  Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー，（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ），８７巻，２７，１９８５〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０１１９】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【０１２０】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。また、本発明のタンパク質発現不全マウスは、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０１２１】
また、本発明のタンパク質の構造遺伝子をレポーター遺伝子で置換された本発明のタンパク質発現動物では、レポーター遺伝子が本発明のタンパク質のプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、本発明のタンパク質のプロモーターの活性を検出することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。このような本発明のタンパク質発現不全動物は、本発明のタンパク質のプロモーターを活性化または不活化する物質をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のタンパク質発現不全に起因する各種疾患の原因究明または治療薬の開発に大きく貢献することができる。
【０１２２】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ  ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ  ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ  ：アデニン
Ｔ  ：チミン
Ｇ  ：グアニン
Ｃ  ：シトシン
ＲＮＡ  ：リボ核酸
ｍＲＮＡ  ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ  ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ  ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ  ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ  ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ  ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ  ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ  ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ  ：グリシン
Ａｌａ  ：アラニン
Ｖａｌ  ：バリン
Ｌｅｕ  ：ロイシン
Ｉｌｅ  ：イソロイシン
Ｓｅｒ  ：セリン
Ｔｈｒ  ：スレオニン
Ｃｙｓ  ：システイン
Ｍｅｔ  ：メチオニン
Ｇｌｕ  ：グルタミン酸
Ａｓｐ  ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ  ：リジン
Ａｒｇ  ：アルギニン
Ｈｉｓ  ：ヒスチジン
Ｐｈｅ  ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ  ：チロシン
Ｔｒｐ  ：トリプトファン
Ｐｒｏ  ：プロリン
Ａｓｎ  ：アスパラギン
Ｇｌｎ  ：グルタミン
ｐＧｌｕ  ：ピログルタミン酸
Ｈｓｅ  ：ホモセリン
【０１２３】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ  ：ｐ−トルエンスルフォニル  
Ｂｏｃ  ：ｔ−ブトキシカルボニル
Ｂｚｌ  ：ベンジル
Ｚ  ：ベンジルオキシカルボニル
ＤＮＰ  ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ  ：トリチル
Ｂｕｍ  ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ  ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ  ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ  ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ  ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ  ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：ＡｌｃＢＰのスクリーニング
酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法により実施した。
酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニングはＭＡＴＣＨ  ＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）の標準プロトコールに基づいて行った。ＢａｉｔにはＧＡＬ４ＢＤを含むｐＧＢＴ９ベクターにＡｌｃαの細胞質ドメインであるＣ末端１０１アミノ酸のうちＮ末側２２アミノ酸を削ったＣ末端７９アミノ酸を組み込んだコンストラクトを使用し、ｐＧＡＤ４２４ベクターに組み込まれたＨｕｍａｎ  ａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）約９．８×１０６個のクローンに対してスクリーニングを行った。手順としては、Ｂａｉｔプラスミド１０ｎｇをＨｆ７Ｃ酵母株（ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ａｄｅ２−１０１，ｌｙｓ２−８０１，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ｇａｌ４−５４２，ｇａｌ８０−５３８，ＬＹＳ：：ＧＡＬ１−ＨＩＳ３，ＵＲＡ：：（ＧＡＬ４  １７ｍｅｒ）３−ＣＹＣ１−ＬａｃＺ）にトランスフォームし、ＳＤ（Ｔｒｐ−）プレートにまいた後、３０℃で２日間培養し、生えてきたコロニーにｐｒｅｙとなるｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ５０μｇをトランスフォームし、ＳＤ（Ｔｒｐ−／Ｌｅｕ−／Ｈｉｓ−）に１５ｍＭ  ３−Ａｍｉｎｏ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ（３−ＡＴ）を添加したプレートにまいた後、３０℃で５日間培養して、生えてきたＨｉｓ＋陽性のコロニーを単離した。
【０１２５】
単離したＨｉｓ＋陽性コロニーに対して、次にβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った。ＢＩＯＤＹＮＥ  ＮＹＬＯＮ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ（Ｐａｌｌ  Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ）をプレートに重ねてコロニーを移しとり、メンブレンを液体窒素に浸して一旦凍結させた後、ｚ−バッファー／Ｘ−Ｇａｌ溶液（組成：１ｍｇ／ｍｌ  ５−Ｂｒｏｍｏ−４Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ（−）−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−Ｇａｌ），６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／７Ｈ２Ｏ，４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｈ２Ｏ，１ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ）に浸してコロニーが青色に発色するかを調べた。β−ガラクトシダーゼアッセイにおいて陽性だったクローンについては、大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセルにトランスフォームし、ｐｒｅｙ側のプラスミドのみを単離した。単離したプラスミドのインサート中の塩基配列はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩ）を用いて決定した。その結果、約７０クローンの陽性クローンのうち５クローンがインサート内にＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ，ＤＨＨＣ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １２（ＺＤＨＨＣ１２）を有していた。塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１２６】
実施例２：各組織でのＡｌｃＢＰの発現状況の解析（ノザンブロット解析）
ノザンブロットはｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて行った。メンブレンをハイブリダゼーションバッファー（組成：５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド，６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，９０ｍＭ  ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ），０．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ６．５，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，０．０５％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン，０．２５ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ）に浸し、６５℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った後、バッファーを交換し、ヒトＡｌｃＢＰあるいはヒトβ−アクチンに特異的な３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを５．０×１０６ｃｐｍ／ｍｌとなるように加え、６５℃で２４時間ハイブリダイゼーションを行った。その後メンブレンを６８℃の２×ＳＳＣ（組成：３００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭ  ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）＋０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで１５分×２回洗浄し、バイオイメージアナライザー（Ｆｕｊｉ，ＢＡＳ  ２０００）により定量した。
結果を図１に示す。調べた全ての組織において予想されるサイズにバンドが観察された。この結果からＡｌｃＢＰは脳を含めた多くの組織に発現していることが示唆された。
【０１２７】
尚、ｃＤＮＡプローブはＰＣＲにより増幅した各遺伝子のプローブとする部分のｃＤＮＡ断片２５ｎｇとＳｔｒｉｐ−ＥＺＴＭ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて３７℃で３０分反応反応を行って［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰで標識する事で作成した。これをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を用いたスピンカラム法により精製し、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。
【０１２８】
実施例３：ＡｌｃＢＰとＡｌｃαとの結合活性（共免疫沈降）
３．５ｃｍ培養皿（６×１０５細胞相当）のＣｏｓ−７細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、各０．７５μｇのＣ末ＦＬＡＧｔａｇ−Ａｌｃα１とＮ末Ｍｙｃｔａｇ−ＡｌｃＢＰ  ｉｎ  ｐｃＤＮＡ３．１のコンストラクトのプラスミドをトランスフェクションした。総ＤＮＡ量は１．５μｇに統一するため、トランスフェクション（−）の場合には空ベクターｐｃＤＮＡ３．１を加えた。トランスフェクション２４時間後、ＰＢＳ（組成：１０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍｌで細胞を回収し、６，０００ｒｐｍ，５分，４℃で遠心し、プロテアーゼインヒビターミックス（組成：５μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，  Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）を含むＨＢＳ−Ｔ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（組成：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１５０μｌを沈殿に加えて、４℃で３〜７時間攪拌して可溶化した。可溶化した細胞は１２，０００ｒｐｍ，２分，４℃で遠心し、上清を免疫沈降（ＩＰ）に用いた。ＩＰは可溶化上清１００μｌに対して、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２を２μｌ（ＳＩＧＭＡ，９．８μｇ  ＩｇＧ）を加え、４℃で２時間攪拌した後、ＨＢＳ−Ｔ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化させた２５％（ｗ／ｖ）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅを２０μｌ加えて４℃で１時間攪拌した。樹脂を遠心により回収しＨＢＳ−Ｔ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。この樹脂に対し、５×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（４３％（ｖ／ｖ）グリセロール，１６％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，６４ｎｇ／ｍｌブロモフェノールブルー，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６，８）１５μｌ、８Ｍ尿素１５μｌを加え、攪拌後、５分間煮沸して、樹脂に結合した成分を可溶化した。遠心後、この上清成分を用いて７．５％，および１５％グリシンゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＲＯＴＲＡＮ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｒｏｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写し、ウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットには１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体  Ｍ２（ＳＩＧＭＡ，１／１００００）、抗Ｍｙｃ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１／５０００）を用いた。２次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２，抗Ｍｙｃ抗体には抗マウスＩｇＧ，ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｓｉｆｉｃ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）１：５０００を使用した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、メーカーの説明書に従い、操作を行った。
結果を図２に示す。
ＡｌｃαとＡｌｃＢＰをＣｏｓ−７細胞に強制発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した結果、Ａｌｃαが免疫沈降されるのに伴ってＡｌｃＢＰも共沈されてきた。この結果より細胞においてＡｌｃαとＡｌｃＢＰとが結合していることが示された。
【０１２９】
実施例４：ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの結合活性（共免疫沈降）
Ｃ末ＦＬＡＧｔａｇ−Ａｌｃα１とＮ末Ｍｙｃ−ＡｌｃＢＰのかわりにＣ末ＦＬＡＧｔａｇ−ＡｌｃＢＰとＡＰＰとを用いる以外は実施例３と同様にしてＡｌｃＢＰとＡＰＰとの結合活性を調べた。結果を図３に示す。
ＡＰＰとＡｌｃＢＰをＣｏｓ−７細胞に強制発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した結果、ＡＰＰが免疫沈降されるのに伴ってＡｌｃＢＰも共沈されてきた。この結果より細胞においてＡＰＰとＡｌｃＢＰとが結合していることが示された。
【０１３０】
実施例５：ＡｌｃＢＰの強制発現によるＡβ産生の抑制
実施例４からＡｌｃＢＰとＡＰＰの相互作用が明らかになったことから、ＡｌｃＢＰがＡＰＰと結合してＡＰＰの代謝を安定化させる作用を有するか否か検討した。ＡＰＰの代謝産物でありアルツハイマー病発症の主要原因と考えられるＡβの産生量がＡｌｃＢＰ存在下で変化するかを調べた。具体的には以下のようにして行った。
ＡＰＰとＡｌｃＢＰを強制発現させたＮ２ａマウス神経芽細胞腫細胞の培地を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて培地中に放出されたＡβ量を定量した（Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２２４３−２２５４  （１９９９））。
【０１３１】
また、ＡｌｃＢＰの発現量を変化させるために、Ｎ２ａマウス神経芽細胞腫細胞へのＡＰＰとＡｌｃＢＰのコトランスフェクションは以下のような組み合わせでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）、ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１／１０（割合＝１／１０）、ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１／５（割合＝１／５）、ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１（割合＝１／１）。
【０１３２】
ウェルをＡβ４０を特異的に認識するモノクローナル抗体（２Ｄ１）またはＡβ４２を特異的に認識するモノクローナル抗体（４Ｄ８）でコーティングした（０．３μｇ  ＩｇＧ、ＰＢＳ中）。０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳでウェルを洗浄した後、３％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳでブロッキングした。
【０１３３】
洗浄後、培養液またはＡβペプチドの希釈液をウェルに添加した。洗浄後、ウェルにビオチン化した２Ｄ１抗体を１２．５μｇ／ｍＬの濃度で加えた。
尚、２Ｄ１抗体は、ヒトＡβに対するモノクローナル抗体２Ｄ１であり、αセクリターゼとβセクリターゼの切断部位の間にあるヒト特異的ＦＲＨ（６００−６０２）配列を抗原として認識する抗体である（Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ．ａｌ，上述）。
【０１３４】
洗浄後、ウェルに、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（１：２０００希釈，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を添加した。さらに、洗浄後、ウェルに、２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を添加して、室温でインキュベートして発色させ、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１３５】
結果を図４に示す。ＡｌｃＢＰの発現量依存的にＡβ４０およびＡβ４２の産生量に著しい減少が認められた。
【０１３６】
実施例６：ＡｌｃＢＰ共発現によるＡＰＰ代謝産物生成に対しての影響
（１）ＡｌｃＢＰの共発現によるＣＴＦ、ｓＡＰＰ産生への影響
実施例５より、ＡｌｃＢＰのＡβ産生抑制効果が確認されたことから、かかる効果がＡＰＰの代謝のどの段階で影響を受けているかを検討した。
ＡＰＰは、その代謝やＡβ産生の過程で２段階の切断を受けることが知られている（図５Ａ）。このうち１段階目の切断を受けて、細胞外にＮ末断片であるｓＡＰＰが放出され、細胞内にはＣ末断片であるＣＴＦが残り２段階目の切断を受ける。ＡＰＰとＡｌｃＢＰを強制発現させた細胞の培地中に分泌されたｓＡＰＰ量と細胞内ＣＴＦ量をウエスタンブロットにより定量することでＡｌｃＢＰがＡＰＰの１段階目の切断に与える影響を調べた。
【０１３７】
３．５ｃｍ  ｄｉｓｈ（８×１０５細胞相当）のＨＥＫ２９３細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、各０．７５μｇのＮ末ＦＬＡＧｔａｇ−ＡＰＰとＮ末Ｍｙｃｔａｇ−ＡｌｃＢＰ  ｉｎ  ｐｃＤＮＡ３．１のコンストラクトのプラスミドを以下のＤＮＡ用量の組み合わせでトランスフェクションを行った。
・ＡＰＰ（０．８μｇ）
・ＡＰＰ（０．８μｇ），  ＡｌｃＢＰ（０．０８μｇ）；（ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１／１０）
・ＡＰＰ（０．８μｇ），  ＡｌｃＢＰ（０．１６μｇ）；（ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１／５）
・ＡＰＰ（０．８μｇ），  ＡｌｃＢＰ（０．８μｇ）；（ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１）
【０１３８】
総ＤＮＡ量を１．６μｇに統一するため、トランスフェクション（−）の場合には空ベクターｐｃＤＮＡ３．１を加えた。トランスフェクション２４時間後、ＰＢＳ（組成：１０  ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍｌで細胞を回収し、６，０００ｒｐｍ，５分，４℃で遠心し、プロテアーゼインヒビターミックス（組成：５μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）を含むＨＢＳ−Ｔ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（組成：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１５０μｌを沈殿に加えて、４℃で３〜７時間攪拌して可溶化した。可溶化した細胞は１２，０００ｒｐｍ，２分，４℃で遠心し、上清成分のうち６μｌ（４％，ｉｎｐｕｔ）を用いて７．５％グリシンゲルおよび１５％トリシンゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。分離後、１次抗体として抗ＡＰＰ抗体ＡＰＰ−Ｃ（ＳＩＧＭＡ，１／５０００）、２次抗体として抗ウサギＩｇＧ，ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｓｉｆｉｃ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）１：５０００によるウエスタンブロットを行い細胞内のＣＴＦを検出した。
【０１３９】
また、ｓＡＰＰに関してはトランスフェクション２４時間後の培地を回収して抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降を行った後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットを行うことで検出した。免疫沈降の条件としては、まず培地１ｍｌに対して１５０μｌ  Ｍｉｘ［１］（７．７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，５０ｎｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）を加え、５分間煮沸し、タンパク成分を変性させた。その後３．７５ｍｌ  Ｍｉｘ［２］（６，７％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０，０．４Ｍ  ＮａＣｌ，２６ｍＭ  ＥＤＴＡ，２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）、１．７５ｍｌ  Ｍｉｘ［３］（１７．５ｎｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ  ｉｎ  ＤＤＷ）を順次加えた後、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２を４μｌ（ＳＩＧＭＡ，１９．６μｇ  ＩｇＧ）加え、４℃で２時間攪拌した。その後リンス液（０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）で平衡化させた２５％（ｗ／ｖ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅを２０μｌ加えて４℃で１時間攪拌させ、樹脂成分を２，０００ｒｐｍ，２分，４℃で遠心して回収した。回収した樹脂成分は洗浄液［１］（０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）、洗浄液［２］（０．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）、リンス液（組成は前述）で順次洗浄した。その後、この樹脂に対し、５×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（４３％（ｖ／ｖ）グリセロール，１６％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，６４ｎｇ／ｍｌブロモフェノールブルー），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６，８）１５μｌ、８Ｍ尿素１５μｌを加え、攪拌後、５分間煮沸して、樹脂に結合した成分を可溶化した。遠心後、この上清成分を用いて７．５％グリシンゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、メンブレンに転写し、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（ＳＩＧＭＡ，１／１００００）によるウエスタンブロットを行った。
【０１４０】
結果を図５Ｂに示す。ｓＡＰＰ、ＣＴＦαのいずれもＡｌｃＢＰ存在下でその産生量の減少が認められた。この結果からＡｌｃＢＰはＡＰＰの代謝過程において第１段階目の切断を抑制することが示された。
【０１４１】
（２）Ｃ９９を用いたＡβアッセイ
さらにＡｌｃＢＰがＡＰＰの２段階目の切断を制御するか否かを解明する目的で細胞にＣＴＦ−β（ＡＰＰ−Ｃ９９）を発現させた。ＡＰＰ−Ｃ９９はＡＰＰがβ部位での切断を受けたＣＴＦ−βに相当する（図６参照）。
１．８ｃｍ  ｄｉｓｈ（４×１０５細胞相当）Ｎ２ａ細胞に対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、以下のＤＮＡ用量と組み合わせでトランスフェクションを行った。
・ＡＰＰ−Ｃ９９（０．４μｇ）
・ＡＰＰ−Ｃ９９（０．４μｇ），ＡｌｃＢＰ（０．０４μｇ）；（ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１／１０）
・ＡＰＰ−Ｃ９９（０．４μｇ），ＡｌｃＢＰ（０．０８μｇ）；（ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１／５）
・ＡＰＰ−Ｃ９９（０．４μｇ），ＡｌｃＢＰ（０．４μｇ）；（ＡＰＰ：ＡｌｃＢＰ＝１：１）
総ＤＮＡ量は等しく０．８μｇとするために空のｐｃＤＮＡ３．１を加えた。トランスフェクション２４時間後、培地を回収した。培地は１２，０００ｒｐｍで２ｍｉｎ，４℃で遠心、上清にＰ．Ｉ．ｍｉｘ（組成：５μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）を加えたものをサンプルとしてＡβ濃度をｓＥＬＩＳＡ法で測定した。
【０１４２】
また、上記実施例６（１）と同様にしてＡＰＰとＡｌｃＢＰを共発現させた細胞についてもＣＴＦとｓＡＰＰの産生への影響を同時に調べた。
【０１４３】
結果を図７に示す。培地中に分泌されたＡβはＡβ４０、Ａβ４２とも生成量が減少していた。この結果よりＡｌｃＢＰは２段階目のγ部位における切断を制御していることが示された。また、この減少は１段階目の切断によって生じるＣＴＦとｓＡＰＰの量の減少の程度に比べてより顕著であった。
【０１４４】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］本発明のアルカデイン結合タンパク質をコードする遺伝子の塩基を示す。
［配列番号：２］本発明のアルカデイン結合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：３］アルカデインαをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：４］アルカデインαのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：５］アルカデインβをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：６］アルカデインβのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：７］アルカデインγをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：８］アルカデインγのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：９］アミロイド前駆体タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を示す。
［配列番号：１０］アミロイド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
ＡｌｃＢＰのＡβ産生制御の詳細なメカニズムやその生理機能を解明することにより、アルツハイマー病などのＡβ関連疾患の治療、治療薬の開発に繋がる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】成体ヒト各組織におけるＡｌｃＢＰのｍＲＮＡの発現をノザンブロット法により解析した図である。数値はｍＲＮＡの大きさ（ｋｂｐ）を示す。
【図２】ＡｌｃＢＰとＡｌｃαとの結合活性を共免疫沈降により解析した結果を示す図である。＋はＡｌｃα（ＦＬＡＧ−Ａｌｃα）またはＡｌｃＢＰ（Ｍｙｃ−ＡｌｃＢＰ）を発現させた場合、−は発現させていない場合を示す。ＡｌｃαはＡｌｃα１を示す。ａｎｔｉ  ＦＬＡＧは、抗ＦＬＡＧ抗体を示す。Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅはＣｏｓ細胞の可溶化物を示す。バンドはそれぞれＡｌｃα（ＦＬＡＧ−Ａｌｃα）およびＡｌｃＢＰ（Ｍｙｃ−ＡｌｃＢＰ）の存在を示す。
【図３】ＡｌｃＢＰとＡＰＰとの結合活性を共免疫沈降により解析した結果を示す図である。＋はＡＰＰまたはＡｌｃＢＰ（ＦＬＡＧ−ＡｌｃＢＰ）を発現させた場合、−は発現させていない場合を示す。ａｎｔｉ  ＦＬＡＧは、抗ＦＬＡＧ抗体を示す。Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅはＣｏｓ細胞の可溶化物を示す。バンドはそれぞれＡＰＰおよびＡｌｃＢＰ（ＦＬＡＧ−ＡｌｃＢＰ）の存在を示す。
【図４】ＡｌｃＢＰの強制発現による培養液中へのＡβ４０、Ａβ４２の分泌に及ぼす効果を示す図である。ＡｌｃＢＰを強制発現させていない、すなわち空ベクターのみをトランスフェクションした細胞での結果を１として相対的に評価した。ＡｌｃＢＰの発現量はトランスフェクションするＡｌｃＢＰ発現ベクターの量を適宜設定することによって種々変更した。
【図５】Ａは、２段階で行われるＡＰＰの代謝機構を模式的に示した図である。Ｂは、ＡｌｃＢＰを強制発現させた場合に培養液中に分泌されるＣＴＦおよびｓＡＰＰの量を測定した結果を示す図である。ＣはＢの結果をそれぞれグラフ化したものである。
【図６】β部位で切断を受けたＣＴＦ（ＣＴＦ−β；ＡＰＰ−Ｃ９９）がさらにγ部位での切断をうける様子を模式的に示した図である。
【図７】β部位で切断を受けたＣＴＦ（ＣＴＦ−β；ＡＰＰ−Ｃ９９）とＡｌｃＢＰを共発現させた場合に培養液中に分泌されるＡβ（Ａβ４０およびＡβ４２）の量ならびにＣＴＦとｓＡＰＰの量を測定した結果をそれぞれ示す図である。ＡｌｃＢＰを強制発現させていない、すなわち空ベクターのみをトランスフェクションした細胞での結果を１として相対的に評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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