(57)【要約】【課題】  プローブおよびクランプのバイナリー組成物は、標的ハイブリダイゼーション検出のための方法を実行する。【解決手段】プローブがエキソヌクレアーゼ切断のための基質である場合、組成物は、リアルタイム測定および終点測定によって、ＰＣＲ産物の定量化および検出を提供する。プローブが増幅プライマーである場合、組成物はＰＣＲ産物の標識および検出のための改良された方法を提供する。プローブおよびクランプは、蛍光色素、消光剤、ハイブリダイゼーション安定化部分、化学発光色素、およびアフィニティーリガンドを用いて標識され得る。クランプは、２−アミノエチルグリシンＰＮＡのような核酸アナログであり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするためのバイナリー組成物であって、該バイナリー組成物は、以下：
標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含むプローブであって、ここで、該標的特異的部分が、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プローブ；および
プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含むクランプであって、ここで、該プローブ特異的部分が、該プローブの該クランプ特異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして該クランプは、該標的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能である、クランプ、
を含み、
ここで、該標識の検出の間、該プローブの該クランプ特異的部分は、該クランプの該プローブ特異的部分に結合したままである、
バイナリー組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して核酸ハイブリダイゼーションの分野に関し、より詳細には核酸増幅の組成物および方法に関する。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【化２】
2005160489.tif 000002
【０００４】
【化３】
2005160489.tif 000003
【０００５】
【化４】
2005160489.tif 000004
【０００６】
【化５】
2005160489.tif 000005
【０００７】
【化６】
2005160489.tif 000006
【背景技術】
【０００８】
（背景）
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、遺伝疾患の診断、ヒトの同定、微生物の同定、起源試験、ウイルス学、およびＤＮＡ配列決定における多様な適用を有する、現代生物学における重要なクラスの技術を含む。プライマー伸長反応は、多くの核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよび増幅方法の重要な成分である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅方法は、クローニング、遺伝子発現の分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝子マッピング、薬物発見などにおける進歩を可能にしてきた（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，１９９０；Ｂｅｖａｎ，１９９２；Ｇｒｅｅｎ，１９９１；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９９５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋおよび非Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対によってハイブリダイズする２以上の鎖の核酸および核酸アナログ分子の特異性およびアフィニティーは、効率的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイの重要なパラメーターである。ハイブリダイゼーションを改善するかまたは安定化する共有結合された標識または部分が所望される。
【００１０】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの別の重要な局面は、ハイブリダイゼーション事象の検出を容易にするために使用される方法である。蛍光法は、放射性同位体に対して多くの利点を有し、ここで標的ポリヌクレオチドまたはプローブまたはプライマーのいずれかが蛍光色素によって容易にかつ安全に標識され得る。標識されたプローブおよびプライマー、またはそれらの官能性等価物のコストを低くする方法が、非常に所望される。核酸ハイブリダイゼーションアッセイの特異性、親和性、および検出におけるさらなる改善のための必要性が存在したままである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用であるプローブおよびクランプの新規なバイナリー組成物、ならびにこのような組成物を使用する方法に関する。
【００１２】
第１の局面において、本発明は、プローブおよびクランプのバイナリー組成物を含み、このプローブは、標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含む。この標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に対して配列特異的に結合し得る。クランプは、プローブ特異的部分および標識を含む。プローブのクランプ特異的部分およびクランプのプローブ特異的部分は、プローブおよびクランプのバイナリー組成物において二本鎖構造を形成する。あるいは、プローブのクランプ特異的部分およびクランプの２つのプローブ特異的部分は、三重鎖構造を形成する。
【００１３】
【化７】
2005160489.tif 000007
【００１４】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの間、標的ポリヌクレオチド配列が検出され得、バイナリー組成物上の標識の検出によってサンプル中で定量され得る。プローブのクランプ特異的部分は、アッセイの検出段階の間、クランプのプローブ特異的部分に結合される。
【００１５】
クランプは、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログであり得る。核酸アナログは、ヌクレオチド間結合、糖、または核酸塩基部分の改変体から構成され得る。好ましいクランプは、以下：
【００１６】
【化８】
2005160489.tif 000008
の構造を有する、２−アミノエチルグリシン、ＰＮＡ、（Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９１）であり、ここでＢは核酸塩基または核酸塩基アナログである。
【００１７】
プローブは、核酸塩基アナログを含むオリゴヌクレオチドまたは核酸アナログ、糖アナログ、および／またはヌクレオチド間アナログであり得る。
【００１８】
第２の局面において、バイナリー組成物中のプローブまたはクランプは、１つ以上の標識を有する。このプローブ標識は、５’末端、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、または糖を含むがこれらに限定されない部位で結合され得る。このクランプ標識は、末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖、アミノ基、スルフィド基、およびカルボキシル基を含む部位において結合され得る。この標識として、ハイブリダイゼーション安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、化学発光色素、アミノ酸、およびアフィニティーリガンドが挙げられ得る。
【００１９】
第３の局面において、プローブおよびクランプのバイナリー組成物で標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法が提供される。この方法において、プローブの標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そして標識されたクランプはプローブにハイブリダイズする。（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列でプローブの標的特異的部分をハイブリダイズする工程；（ｉｉ）プローブのクランプ特異的部分でクランプのプローブ特異的部分をハイブリダイズする工程；および（ｉｉｉ）バイナリープローブを検出する工程、が標的ポリヌクレオチドを検出するために実施される。
【００２０】
第４の局面において、プローブおよびクランプのバイナリー組成物でポリメラーゼ連鎖反応産物を検出するための方法が提供される。この方法において、プローブは蛍光色素または消光剤を含み、そしてクランプは蛍光色素または消光剤を含み、その結果、バイナリー組成物は１つの蛍光色素および１つの消光剤を含む。プローブがクランプにハイブリダイズされる場合、バイナリー組成物はほとんど自己消光する。この方法は、（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列でプローブの標的特異的部分をハイブリダイズする工程；（ｉｉ）プローブのクランプ特異的部分でクランプのプローブ特異的部分をハイブリダイズする工程；（ｉｉｉ）５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｌａｗｙｅｒ，１９８９）、ＰＣＲプライマー、およびヌクレオシド５’トリホスフェートで標的を増幅する工程、（ｉｖ）ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってプローブを切断する工程、および（ｖ）蛍光色素を検出する工程、を介して実施される。本発明の１つの目的は、リアルタイムでまたは標的の増幅の終了点で発光した蛍光をモニターすることによって標識を検出することである。
【００２１】
第５の局面において、プライマーおよび標識されたクランプのバイナリー組成物でポリメラーゼ連鎖反応産物を標識するための方法が提供される。この方法において、プライマーは、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合し得る標的特異的部分、ならびにクランプ特異的部分を有する。このクランプは、標識、およびプライマーのクランプ特異的部分に配列特異的に結合し得るプライマー特異的部分を含む。標識は検出可能な蛍光色素であり得る。プライマーのクランプ特異的部分およびクランプのプライマー特異的部分は、プライマーおよびクランプのバイナリー組成物中の二本鎖構造を形成する。あるいは、プライマーのクランプ特異的部分およびクランプの２つのプライマー特異的塩基対部分は、プライマーおよびクランプのバイナリー組成物中の三重鎖構造を形成する。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびクランプの１つ以上のバイナリー組成物、１つ以上の対向鎖プライマー、およびヌクレオシド５’トリホスフェートで増幅され、ここで１つ以上の標識されたポリメラーゼ連鎖反応産物が生じる。
【００２２】
第６の局面において、ポリメラーゼ連鎖反応産物を検出するための方法が提供され、ここで標的ポリヌクレオチドは、３’末端において標的特異的部分を含み、５’末端においてホモピリミジン配列部分を含むプライマーで増幅される。標的の５’末端と同じホモピリミジン配列および１つ以上の標識を含むクランプがＰＣＲ混合物中に存在する。このプライマーのホモピリミジン配列は、増幅され、ＰＣＲ産物の末端部分を形成する。クランプは、ＰＣＲ産物によるハイブリダイゼーションによって二重鎖または三重鎖構造を形成し、標識が検出される。この標識は蛍光色素であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施形態への参照が詳細になされ、これらの例は、添付の図面に例示される。本発明を好ましい実施形態に関して記載するが、それらは、本発明をこれらの実施形態に制限する意図ではないことが理解される。反対に、本発明は、代替物、改変物および等価物を含むことを意図し、これらは、添付の請求項によって規定されるように、本発明内に含まれ得る。
【００２４】
（Ｉ．定義）
他であることが記載されていなければ、本明細書で用いられるとき、以下の用語および語句は、以下の意味を有することが意図される：
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、２本鎖および１本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのαアノマー形態などを含む、ヌクレオチドモノマーまたはそのアナログのポリマーを意味する。通常、これらのモノマーは、ホスホジエステル結合で連結されており、ここで用語「ホスホジエステル結合」は、結合する対イオン、例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、Ｎａ+を含む、ホスホジエステル結合またはそのリン酸アナログを含む結合をいう。代表的には、ポリヌクレオチドは、数モノマーユニット、例えば、５−４０から、数千モノマーユニットまでのサイズの範囲にある。ポリヌクレオチドが、例えば「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字の配列によって表されるときは常に、これらのヌクレオチドは、左から右に５’から３’への順であること、そして他であることが記載されていなければ、「Ａ」はデオキシアデノシン、「Ｃ」はデオキシシチジン、「Ｇ」はデオキシグアノシン、および「Ｔ」はデオキシチミジンを示すことが理解される。
【００２５】
「ヌクレオシド」は、１’位でペントースに結合した、プリン、デアザプリン、またはピリミジン核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）、例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなどからなる化合物をいう。このヌクレオシド塩基がプリンまたは７−デアザプリンであるとき、ペントースは、プリンまたはデアザプリンの９位で核酸塩基に結合し、そしてこの核酸塩基がピリミジンであるとき、ペントースは、ピリミジンの１位で核酸塩基に結合する。
【００２６】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、３リン酸エステルをいい、ここで、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位置に結合したヒドロキシル基である。ヌクレオチドは、３つの部分：糖、リン酸、および核酸塩基から構成される（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６）。２重らせんの一部分であるとき、ヌクレオチドはまた「塩基」または「塩基対」と呼ばれる。最も一般的に天然に存在する核酸塩基、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）は、ワトソン／クリック塩基対合を行う水素結合官能基をもつ。
【００２７】
用語「ワトソン／クリック塩基対合」は、配列特異的水素結合（例えば、ＡはＴおよびＵと対合し、そしてＧはＣと対合する）によって一緒に結合する、ヌクレオチドおよびそのアナログの特異的な対のパターンをいう。
【００２８】
用語「核酸アナログ」は、モノマーヌクレオチドアナログ単位から作られる核酸のアナログをいい、そして核酸に関連するいくつかの特性および性質を持っている。核酸アナログは、改変された（ｉ）核酸塩基部分、例えば、Ｃ−５−プロピンピリミジン、プソイドイソシチジンおよびイソグアノシン、（ｉｉ）糖部分、例えば、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、および／または（ｉｉｉ）ヌクレオチド間部分、例えば、３’−Ｎ−ホスホルアミデートを有し得る（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ、１９９１）。糖部分およびヌクレオチド間部分が、２−アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーで置換されたアナログのクラスは、ペプチド核酸ＰＮＡである（Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９１）。
【００２９】
「標的」は、プライマーまたはプローブによるハイブリダイゼーションのための配列を含むポリヌクレオチドをいう。
【００３０】
「付着部位」は、リンカーが付着するプローブまたはクランプ上の部位をいう。  「リンカー」は、プローブまたはクランプを標識に結合する鎖を含む１つ以上の原子をいう。
【００３１】
本明細書で用いるとき「キメラ」は、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上のヌクレオチドアナログユニットを含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００３２】
「低級アルキル」、「低級アルキレン」および「低級置換アルキレン」は、１−１２の炭素原子からなる、直鎖基、分岐基、または環状基をいう。
【００３３】
「標識」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログに共有結合した成分をいう。１つの好ましいクラスの標識は、蛍光、化学的発光、および電気化学的発光のような手段によって、分子の検出のための信号を提供する（Ｋｒｉｃｋａ、１１９９２）。別の好ましいクラスの標識は、二重らせんのハイブリダイゼーションを増大し、安定化し、またはそれに影響するために供される、ハイブリダイゼーション安定化成分（例えば、インターカレーター、マイナーグルーブ結合剤、および架橋官能基）である。なお別の好ましいクラスの標識が、特異的または非特異的捕獲手段によって分子の分離または固定化を行うために供される（Ａｎｄｒｕｓ、１９９５）。
【００３４】
「検出」は、共有結合した検出標識の性質を基に分子を検出、観察または測定することをいう。検出標識は、制限されずに、フルオレセインおよびローダミン誘導体のような蛍光色素、シアニン色素（Ｋｕｂｉｓｔａ、１９９７）およびエネルギー移動色素（Ｃｌｅｇｇ、１９９２；Ｃａｒｄｕｌｌｏ、１９８８）を含む。
【００３５】
「プローブ」は、標的特異的部分およびクランプ特異的部分を有し得るオリゴヌクレオチドまたは核酸アナログをいう。
【００３６】
「クランプ」は、プローブ特異的部分を有するオリゴヌクレオチドまたは核酸アナログをいう。クランプは、標識、例えば、蛍光色素または消光剤を保有し得、そして蛍光色素または消光剤部分を保有するプローブにハイブリダイズするとき、蛍光エネルギー移動を行う。このクランプはまた、マイナーグルーブ結合剤またはインターカレーターのような、標的ポリヌクレオチドとのバイナリープローブ組成物の結合を安定化するための他の標識を保有し得る。
【００３７】
「プライマー」は、特定の標的核酸に選択的にアニーリングし、そしてその後、プライマーが５’から３’方向に伸長するプライマー伸長反応の開始点として供され得るプローブをいう。
【００３８】
用語「プライマー伸長反応」は、標的／プライマー２重らせんと、付加されたヌクレオチドが、標的の対応するヌクレオチドに相補的であるようにプライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加を生じるヌクレオチドとの間の反応をいう。
【００３９】
用語「５’→３’ヌクレアーゼ活性」は、ホスホジエステル結合で核酸を切断する酵素活性をいう。この活性は、エンド（内部のホスホジエステル結合で切断する）またはエキソ（核酸鎖の５’末端に最も近いホスホジエステル結合で切断する）のいずれかであり得る。
【００４０】
用語「自己消光」は、分子間のエネルギー移動効果をいい、例えば、蛍光色素および消光剤は、蛍光発色団から消光剤へのエネルギー移動を可能にし、蛍光色素による蛍光の減少を生じる形態でプローブ上に結合されることをいう。
【００４１】
用語「終点分析」は、データ収集を反応が終了するときのみに行う方法をいう。エキソヌクレアーゼアッセイの終点分析は、ＰＣＲが終了するとき蛍光色素信号測定を行う。結果は、ＰＣＲ熱サイクリングの開始から終了までの蛍光色素信号の蛍光変化（好ましくは、任意の内部コントロール信号を減じる）を報告する。  用語「リアルタイム分析」は、ＰＣＲの間の周期的モニタリングをいう。エキソヌクレアーゼアッセイのリアルタイム分析は、サイクルからサイクルへの蛍光色素信号変化（好ましくは、任意の内部コントロール信号を減じる）を測定する。  （ＩＩ．バイナリー組成物の設計および合成）
（Ａ．プローブおよびプライマー）
プローブまたはプライマーは、標的に対して配列特異的にハイブリダイズし得る任意の構造であり得る。好ましくは、プローブおよびプライマーは、オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログである。一般に、本発明のバイナリー組成物の設計および合成は従来の教示に従う。好ましくは、オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログは、ホスホルアミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ、１９９２；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９９３）を用いる、自動化された、固相ＤＮＡ合成機上で合成される。このオリゴヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法は、その効率的かつ迅速なカップリング、および開始ヌクレオチドモノマーの安定性のために好ましい方法である。代表的には、合成は、固体支持体に結合した生長するポリヌクレオチド鎖を用いて実施され、その結果、液相中の過剰の試薬は、濾過により容易に除去され、それによってサイクル間の精製工程の必要性を排除し得る。
【００４２】
ＤＮＡホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手され得、そして２’−ＯＭｅ  ＲＮＡモノマーは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）から得られ得る。核酸塩基保護基は、ＤＮＡおよび２’−ＯＭｅ  ＲＮＡヌクレオシドの両方に対して、ベンゾイル（ＡbzおよびＣbz）およびジメチルホルムアミジン（Ｇdmf）であり得る。非ヌクレオシドのＰＥＯリンカーは、以下の構造を持つホスホルアミダイトシンソン（ｓｙｎｔｈｏｎ）として取り込まれ得る。
【００４３】
【化９】
2005160489.tif 000009
【００４４】
０．２μモルスケールにおける合成の各カップリングサイクルには、アセトニトリル中の０．１Ｍホスホルアミダイトヌクレオシドの４０μｌ（約３．５ｍｇ）を、アセトニトリル中の０．５Ｍ  ５−Ｈテトラゾールの１２０μｌと同時に加える。カップリング時間は、ＤＮＡホスホルアミダイトについては２５秒、そして２’−ＯＭｅ  ＲＮＡホスホルアミダイトおよびＰＥＯホスホルアミダイトについては４分である。
【００４５】
合成の完了後、オリゴヌクレオチドは、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ2：Ｈ2Ｏ（１：１：２）の混合物を用いる処理（Ｗｏｏ、１９９３）、またはＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機のＵｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌに記載のように濃水酸化アンモニウムを室温にて１時間用いる処理により、支持体から切断され得る。塩基保護基は、８５℃で１時間または６５℃で３時間、この混合物を加熱することにより除去され得る。オリゴヌクレオチドは、逆相ＨＰＬＣ、アニオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリーゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびその他の従来技法（Ａｎｄｒｕｓ、１９９５）により分析および精製され得る。
【００４６】
プローブおよびクランプのバイナリー組成物を設計することでは、好ましくは、以下の一般的ガイドラインに従う：（ｉ）プローブは長さが６−１００ヌクレオチドである、（ｉｉ）標的核酸配列がＰＣＲアンプリコン内に位置する場合、プローブ配列は、プローブがＰＣＲプライマー間の配列上の位置でハイブリダイズするようであるべきである；および（ｉｉｉ）プローブ／クランプの親和性（Ｔｍ、融解温度）は、プローブ／標的と同じまたはそれより高くあるべきである（Ｃｌｅｇｇ、１９９２；Ｃａｒｄｕｌｌｏ、１９８８；Ｌｉｖａｋ、１９９５）。
【００４７】
プローブが、蛍光色素および／または消光剤を含む標識を含む場合、好ましくは、この色素および／または消光剤は、プローブおよびクランプのバイナリー組成物中で十分緊密であり、その結果、この蛍光色素からの蛍光は、消光剤によって実質的に消光される（図１）。この蛍光色素および／または消光剤は：（ｉ）プローブおよびクランプの内部部位、（ｉｉ）内部部位、そして他方はプローブまたはクランプの末端、または（ｉｉｉ）プローブまたはクランプの末端に付着され得る。
【００４８】
（Ｂ．クランプ）
クランプは：（ｉ）バイナリー組成物のプローブのクランプ特異的部分に配列特異的なハイブリダイゼーションを行い、そして（ｉｉ）１つ以上の標識を保持し得る、任意の構造であり得る。好ましくは、クランプは：（ｉ）高親和性、（ｉｉ）高特異性、（ｉｉｉ）高溶解性、（ｉｖ）非伸長性、（ｖ）化学的安定性、および（ｖｉ）増幅の非妨害性を有する。好ましくは、クランプは、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログ、例えばＰＮＡを含む。このプローブおよびクランプは、ワトソン／クリックおよびその他の塩基対合相互作用（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、１９９７；Ｒｕｍｎｅｙ、１９９５）により結合して、２重らせんまたは３重らせん構造のいずれかを形成し得る（図２）。このクランプは、１つ以上の共有結合された標識を有する。このバイナリー組成物のクランプとプローブとの間の親和性は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ条件に耐えるに十分強い。
【００４９】
好ましい実施形態では、クランプは、ポリメラーゼによっては伸長しない。クランプ中の非伸長性の糖修飾の例は、３’リン酸、３’アセチル、２’−３’ジデオキシ、および３’アミノ、２’−３’デヒドロを含む。このクランプは、エチレンオキシまたはポリエチレンオキシのような、非塩基対合、非ヌクレオシドリンカーを含み得る。好ましくは、バイナリー組成物中のクランプは、６−５０ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなる。
【００５０】
特に好ましいクランプは、天然のホスホジエステル−デオキシリボース骨格がペプチド様単位であるＮ−（２−アミノエチル）−グリシンによって置換された核酸アナログである、ペプチド−核酸オリゴマー（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９１）を含む。本発明のＰＮＡクランプは、ワトソン／クリック塩基対合によって、プローブのクランプ特異的部分中の相補的配列と塩基対合し得る。ＰＮＡのプローブへの結合は、ＰＮＡの平行または逆平行配向（逆平行２重らせんがかなりより安定（Ｅｇｈｏｌｍ、１９９３）であるが）のいずれかで生じ得る。ＰＮＡクランプが、２つのプローブ特異的配列、またはプライマー特異的配列と３重らせん構造を形成するように設計されたバイナリー組成物では、ヒンジ領域は、プローブの３’末端にあるか、またはプローブの５’末端側であるかのいずれかであり得る（図１３）。
【００５１】
クランプのプローブ特異的部分中の反復配列、およびプローブのクランプ特異的部分中のそれらの相補物は、それらの：（ｉ）高親和性、（ｉｉ）高特異性、および（ｉｉｉ）高溶解性のために好適である。２重らせん形成性クランプのプローブ特異的部分中の特に好ましい反復配列は（ＣＡＧ）nであり、ここで３塩基配列が１〜１０回繰り返される（Ｂｏｆｆａ、１９９５；Ｗｉｔｔｕｎｇ、１９９７）。３重らせん形成性クランプのプローブ特異的部分中の好ましい反復配列は、このプローブ配列（ＣＡＧ）nに結合する（ＴＣＣ）nおよびアナログである。
【００５２】
ＰＮＡクランプは、市販の試薬を用いて市販の自動化合成機上で従来法を用いて合成され得る（Ｄｕｅｈｏｌｍ、１９９４；Ｖｉｎａｙａｋ、１９９７；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ、１９９７）。
【００５３】
（Ｃ．プローブおよびクランプのバイナリー組成物中の核酸アナログ）
プローブおよびクランプは、核酸塩基、糖、および／またはヌクレオチド内部分への改変を保持する種々の核酸アナログを含み得る。
【００５４】
好ましい核酸塩基アナログ改変は、Ｃ−５−アルキルピリミジン類、２−チオピリミジン、２，６−ジアミノプリン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、７−デアザプリン、イソシチジン、プソイドイソシチジン、イソグアノシン、４（３Ｈ）−ピリミドン、ヒポキサンチン、８−オキソプリン類およびユニバーサル塩基（Ｍｅｙｅｒ、１９９４）を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
１つ以上のヌクレオシド中の好ましい糖アナログ改変は、２’−改変または３’−改変を含むがこれらに限定されず、ここで２’−または３’−位置は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリロキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモであり得る。
【００５６】
その他の好ましい糖アナログ改変は、４’−α−アノマーヌクレオチド類、１’−α−アノマーヌクレオチド類、２’−分岐基−リボヌクレオチド類、および２’−Ｏ−分岐基−リボヌクレオチド類を含む。以下の構造は、いくつかの好ましい２’−糖改変を例示する。
【００５７】
【化１０】
2005160489.tif 000010
【００５８】
１つ以上のヌクレオチドの間の好ましいヌクレオチド間アナログは、以下を含むが、これらに限定されない：（ｉ）ヌクレオチド間結合における酸素の、硫黄、炭素、または窒素による置換、および（ｉｉ）サルフェート、カルボキシレート、アミドのヌクレオチド間リン酸ジエステル結合。他の好ましいヌクレオチド間アナログは、以下を含む；２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）、２’−５’−結合、逆方向３’−３’結合、逆方向５’−５’結合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホルアミデート、アルキル化ホスホトリエステルの分枝構造、および３’−Ｎ−ホスホルアミデート。
【００５９】
（Ｄ．標識プローブおよびクランプ）
バイナリー組成物のプローブおよびクランプ上での標識は、検出の簡易化、親和性の増大、およびハイブリダイゼーションの安定化を含む種々の機能に貢献する。オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログに標識を連結するための方法は、周知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６）。標識は、オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログの場合では；（ｉ）末端、例えば、プローブの５’および３’末端、（ｉｉ）ヌクレオチド間結合、（ｉｉｉ）糖類、および（ｉｖ）核酸塩基基を含む種々の連結部位で連結され得る。
【００６０】
標識、例えば蛍光色素は、標識および／またはモノマー（例えば、ホスホルアミダイトヌクレオシド）の適切な機能付与によって、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログに結合され得る。核酸およびアナログへの、標識の結合方法の詳細な記載は、文献において多数見出され得る（Ｔｈｅｉｓｅｎ、１９９２；Ａｎｄｒｕｓ、１９９５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６；Ｊｕ、１９９５）。蛍光色素および／または消光剤を、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに共有結合的に結合する１つの方法は、蛍光色素と、消光剤ホスホラミダイトモノマーの結合によるものである（Ｔｈｅｉｓｅｎ、１９９２）。これらのモノマーは、自動合成機上のアセトニトリル溶液中に導入され、そして最後に、モノマーが支持体に結合したオリゴヌクレオチドにカップリングされる。あるいは、オリゴヌクレオチドの核酸塩基部分は、支持体から切断され、そして脱保護された後に、内部的に標識され得る。第３の方法は、核酸塩基上の求核性反応性基（例えば、アミノまたはチオール）が、活性エステルまたは標識上の他の活性基にカップリングし得ることである。例として、シチジンまたはチミンの５−位に結合したアミノリンカーは、カルボキシ−ＦＡＭ色素のＮＨＳ−エステルにカップリングし、オリゴヌクレオチド内の任意の所定のヌクレオチドの位置でのオリゴヌクレオチドの標識において、アミド結合を形成し得る（Ｒｕｔｈ、１９９０；Ｍｅｙｅｒ、１９９４）。オリゴヌクレオチドの５’末端もまた、このような様式において標識され得る（Ａｎｄｒｕｓ、１９９５）。ホスフェートおよびホスフェートアナログもまた、同様の方法によって標識され得る（Ａｇｒａｗａｌ、１９９０）。固相合成支持体は、３’標識されたオリゴヌクレオチドを与えるために、標識（例えば、蛍光色素）を備える（Ｗｏｏ、１９９６；Ｍｕｌｌａｈ、１９９７；Ｍｕｌｌａｈ、１９９８）。プローブの３’末端ヌクレオチドは、さらにブロックされ得、そして核酸ポリマーによって伸展不可能にされ得る。このような３’ブロッキングは、ホスフェート基の化学的結合によって都合よく行われる（Ｈｏｒｎ、１９８６；ＰｈｏｓｐｈａＬｉｎｋとして市販、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００６１】
ＰＮＡクランプは、オリゴヌクレオチドに関する上記と同様の活性化エステル法（ＮＨＳ−）、および他の簡便な方法によって、カルボキシルおよびアミノ末端で、ならびに核酸塩基で標識され得る。
【００６２】
ハイブリダイゼーション安定化部分には、以下が挙げられるがこれらに限定されない：マイナーグルーブ結合剤、インターカレーター、ポリ−リジンおよびスペルミンのようなポリカチオン、ならびに架橋官能基。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対の安定性またはハイブリダイゼーションの速度（すなわち、親和性）を増大し得る。ハイブリダイゼーション安定化部分は、完全に相補的なプローブ（Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の１つ以上のミスマッチを含む）と標的配列との間の熱的溶解温度、Ｔmにおける大きな差によって体現化される塩基対形成の特異性の増加に役立つ。好ましいマイナーグルーブ結合剤には、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＣＤＰＩ1-3、ＭＧＢ１、ネトロプシンおよびジスタマイシンが挙げられる（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６）。マイナーグルーブ結合剤の例は、以下の構造；
【００６３】
【化１１】
2005160489.tif 000011
（ここで、Ｌは、プローブおよびクランプの標識のためのリンカーまたは結合部位である）を有するＣＤＰＩ3（Ｋｕｔｙａｖｉｎ、１９９６；Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ、１９９５）である。
【００６４】
マイナーグルーブ結合剤（例えば、ＣＤＰＩ1-3、ＭＧＢ１（図１１））のカルボキシル基は、アミノ基とカップリングするためのＮＨＳエステルとして活性化され得るか、または自動合成によって直接標識するためのホスホルアミダイトとして活性化され得る。プローブおよびクランプのバイナリー組成物において、プローブまたはクランプに標識される場合、マイナーグルーブ結合剤は、いくつかまたは実質的に大部分の標的配列への、ハイブリダイゼーションの親和性および特異性を増加し得る（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６、ｐ．３３７−４６）（図６）。
【００６５】
プローブおよびクランプの標識に有用な蛍光色素には、以下が挙げられる；ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ジクロロ−フルオレセイン、ジクロロ−ローダミン、およびシアニン（Ｂｅｒｇｏｔ、１９９４、Ｍｅｎｃｈｅｎ、１９９３）。消光剤には、以下が挙げられる；ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、マラカイトグリーン、およびシアニン。シアニンは、以下の構造を有し得る；
【００６６】
【化１２】
2005160489.tif 000012
（ここで、Ｒ1またはＲ2は、Ｈ、低級アルキル、低級アルキレン、置換された低級アルキレン、フェニル、またはアリールであり；Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、またはＮ−Ｒであり；Ｒ3は、ニトロ、ハロ、スルホネート、ヒドロキシ、アミノ、低級アルキル、またはトリハロメチルであり、そしてｎ＝１〜２である）（Ｋｕｂｉｓｔａ、１９９７）。プローブまたはクランプの標識のための結合部位は、Ｒ1、Ｒ2、またはＲ3であり得る。
【００６７】
別の好ましい標識のクラスは、化学発光化合物を含む。以下の構造を有する化学発光色素が、特に好ましい；
【００６８】
【化１３】
2005160489.tif 000013
（ここで、Ｒ1は、水素またはハロゲンであり；Ｒ2は、ホスフェート、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、または水素であり；Ｒ3は、メチル、エチル、および低級アルキルであり、そしてＬは、バイナリー組成物へのリンカーである）（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ、１９９４；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ、１９９０）。親和性リガンドには、以下が挙げられる：ビオチン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ、およびペプチド。
【００６９】
蛍光色素には、以下が挙げられる：６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）（図９）。５−カルボキシ異性体もまた、有用である。蛍光色素部分の他の実施形態は、シアニン色素、ダンシル誘導体などである。
【００７０】
別の好ましい標識のクラスは、消光剤部分を含む。以下を含むがこれらに限定されない消光剤が、特に好ましい：（ｉ）以下からなる群より選択されるローダミン色素：テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、および（ｉｉ）ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ、ニトロチアゾールブルー（ＮＴＢ）を含むシアニン色素、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾール化合物など（図１０）。
【００７１】
本発明のフルオレセイン（左）およびローダミン（右）誘導体は、以下の一般式および番号系を有し得（ここで、Ｌはリンカーである）、そして番号の位置の１つ以上で置換され得る。
【００７２】
【化１４】
2005160489.tif 000014
【００７３】
（ＩＩＩ．プローブおよびクランプのバイナリー組成物を使用する方法）
本発明のプローブおよびクランプのバイナリー組成物は、このプローブが相補的標的にハイブリダイズする任意のハイブリダイゼーションアッセイで使用され得る（図２）。
【００７４】
増幅なしのハイブリダイゼーションは、非標識プローブおよび蛍光標識クランプのバイナリー組成物からの蛍光によって、検出および測定され得る（図４）。この方法は、以下を包含する：ｉ）プローブおよびクランプのバイナリー組成物を標的にハイブリダイズする工程、ｉｉ）結合していない組成物を洗浄または除去する工程、およびｉｉｉ）結合した組成物／標的二重鎖から蛍光を検出および測定する工程。
【００７５】
特定の好ましい実施形態において、このプローブおよびクランプのバイナリー組成物は標識され得、その結果、単一クランプ配列は、経済性、便利性、および簡易化された販売および取扱いのための多くの異なるプローブ配列にハイブリダイズするために、選択され得る。単一クランプ特異的部分は、標的特異的な異なる部分を含む多くのプローブに取り込まれ得る。次いで、単一の相補的なクランプ配列は、多くの核酸ハイブリダイゼーションアッセイに貢献し得る。例えば、２μモルの規模で調製された標識クランプは、１００，０００より多くのアッセイ（アッセイあたり、約１０ｐモルが必要である）を提供し得る。標識クランプと共に組成物中で使用される場合、非標識プローブは、費用および単純性の利点を有する。標識プローブは、高価かつ骨が折れるため、プローブおよびクランプのバイナリー組成物のこの汎用性のある有用性は、非常に望ましい特徴である。さらに、単一反応容器中の標的サンプルの複数の遺伝子座は、各々の配列が、異なるかつスペクトル的に分解できる蛍光色素で標識されている複数の組成物でプローブすることでアッセイされ得る。反応容器内の蛍光色素部分からのそれぞれの発光スペクトルは、別個の発光の寄与が分解され得るように、十分に重ならないようにしなくてはならない。別個のピークは、定量化され得、標的配列（すなわち、増幅産物）の相対量と関連する。
【００７６】
特に好ましい実施形態において、本発明のプローブおよびクランプは、ＰＣＲの間の増殖産物のリアルタイムの測定を提供する定量法および薬剤において使用され得る（Ｈｏｌｌａｎｄ、１９９１；Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９９２；Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９９３；Ｇｅｌｆａｎｄ、１９９３；Ｌｉｖａｋ、１９９６）。蛍光色素−消光剤プローブ（Ｌｉｖａｋ、１９９５）を使用するエキソヌクレアーゼアッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））は、ＰＣＲを実施するために必要であるサンプルプロセシングなしで、閉管系におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の直接検出を与える。Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて、プライマーの伸張を実行し、そしてポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼもまた、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によって、標的へアニールされたプローブを変位（ｄｉｓｐｌａｃｅ）および切断する。Ｔａｑｍａｎ型のアッセイにおいて、このプローブは自己消光し、蛍光色素および消光部位を含む。スペクトルの重なりは、プローブがインタクトな場合、効率的なエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能とする（Ｃｌｅｇｇ、１９９２）。標的にハイブリダイズされる場合、このプローブはＰＣＲの間に切断され、存在する標的プローブハイブリッドの量に比例した蛍光シグナルを放出する（Ｌｉｖａｋ、１９９６；Ｌｉｖａｋ、１９９８）。
【００７７】
Ｔａｑｍａｎ型のアッセイにおいて、適切なエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、増幅の間にバイナリー組成物のプローブを実質的に切断し、消光色素から蛍光色素を分離する。本発明の自己消光するプローブおよびクランプのバイナリー組成物において、このプローブがクランプにハイブリダイズされる場合、蛍光色素の消光剤への接近は、蛍光色素の蛍光の消光を引き起こす（図３）。プローブがクランプにハイブリダイズされない場合、蛍光色素の蛍光は、消光されない（図１）。このプローブのクランプ特異的部分は、切断後も、クランプのプローブ特異的部分への結合を維持する（図８）。
【００７８】
特定のプローブおよびクランプのバイナリー組成物についての蛍光色素−消光剤の対は、蛍光色素の発光スペクトルが消光剤の吸収に重なるように選択される。このプローブは、蛍光色素または消光剤のいずれかで標識され、次いで、このクランプがもう片方で標識され得る。この消光剤は、この蛍光色素からのシグナルがもはや消光されないように、切断時に、蛍光色素に対して近位から放出される。蛍光の増加は、ＰＣＲ産物のコピー数の増加に伴って、直接および比例的に関連して起きる（図８）。リアルタイムアッセイまたは終点アッセイの使用によって、ＰＣＲ産物の検出および定量化は、切断され自己消光した蛍光プローブの蛍光の増加を測定することで、得られ得る。プローブおよび異なる色素からなる２つ以上の自己消光バイナリー組成物は、標的ポリヌクレオチドの異なる部位に、同時的または経時的にハイブリダイズされ得る。
【００７９】
この様式において、ハイブリダイゼーション現象は、蛍光によって検出および測定され得る。このハイブリダイゼーション現象は、可逆的であり、代表的には塩基対化を融解または分裂する条件（例えば、変性剤または加熱）によって影響され得る。特定の標的配列の存在または非存在は、サンプル中で検出され得る。
【００８０】
自己消光バイナリー組成物は、例えば、マイナーグルーブ結合剤のようなハイブリダイゼーション安定化部分でさらに標識され得る（図５）。マイナーグルーブ結合剤は、標的とプローブとの間の結合の、特異性および親和性を増加し得る。
【００８１】
明らかに、これらの方法は、多数の独立して検出可能な標識（例えば、スペクトル分解可能な（例えば、単一反応におけるいくつかの標的核酸の同時の検出および増幅をモニターするため）発光スペクトルを有する蛍光色素）を含むように一般化され得、その結果、多数の検出シグナルがモニターされる。このような複数標識系は、単一容器内で起こる複数プローブ実験および複数増幅の分析を必要とする適用において有利である。このような系において、標識が蛍光色素である場合、各々の色素は、スペクトル分解によって同定され得、従って複数標的同定を可能にする（Ｌｉｖａｋ、１９９６；Ｍｅｎｃｈｅｎ、１９９３；Ｂｅｒｇｏｔ、１９９４）。
【００８２】
自己消光蛍光色素−消光剤部分を有するプローブおよびクランプのバイナリー組成物は、種々の核酸増幅法と組み合わせて使用され得る。本発明の系で使用され得る例示的な増幅模式図は、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ、１９９１）のようなリガーゼに基づく増幅スキーム、Ｑ−βレプリカーゼ、および鎖置換増幅スキーム（Ｗａｌｋｅｒ、１９９２）を含む。
【００８３】
プライマーおよび標識クランプのバイナリー組成物は、ＰＣＲによって標的配列を増幅し、標識ＰＣＲ産物を産生するために使用され得る（図６および７）。得られたＰＣＲ産物の標識は、ハイブリダイゼーションによって、プライマーのクランプ特異的部分に結合され得る。これらの方法に従って、非標識プライマーが使用され得、このプライマーは、５’蛍光色素標識プライマーのような標識プライマーよりも、調製のために有意に費用が低く、そして労働集約的でない。非標識プライマーの各々は、プライマー特異的配列ＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴを含み、保存性配列クランプに結合するための、５’末端にＡＡＡＧＧＡＧＧＡ−３’のような保存性のクランプ特異的配列およびそのアナログを有し得る。あるいは、この非標識
プライマーは、増幅時にＰＣＲ産物の部分となる保存性ホモピリミジン配列を５’末端に有し得る。標識クランプは、同様のホモピリミジン配列を有し、ＰＣＲ産物の３’末端にホモプリン相補配列を有する、検出可能な二重鎖または三重鎖構造を特異的に形成する（図７）。従って、標識クランプの単一合成は、多くの標識ＰＣＲ実験に十分であり得る。
【００８４】
（ＩＶ．実施例）
本発明はさらに、以下の実施例の考慮によって、明白にされる。この実施例は、本発明の純粋な例示であると意図され、いかなる様式においてもその範囲を限定するように意図されない。
【００８５】
（実施例１．標識プローブの合成）
Ａ．  ５’蛍光色素−プローブ
【００８６】
【化１５】
2005160489.tif 000015
ＢＡＫ−ヒト血小板膜糖タンパク質ＩＩｂについての遺伝子中のＢａｋ多型性（Ｌｙｍａｎ，１９９０）。
ＧＴＴ１−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、θクラスについてのヒト遺伝子（Ｐｅｍｂｌｅ，１９９４）
Ｂ．  ３’消光剤−プローブ
【００８７】
【化１６】
2005160489.tif 000016
Ｃ．  ５’消光剤−２’−Ｏ−メチルＲＮＡ／ＤＮＡキメラプローブ
【００８８】
【化１７】
2005160489.tif 000017
Ｄ．  ３’蛍光色素、５−プロピニル含有プローブ
【００８９】
【化１８】
2005160489.tif 000018
Ｅ．  ２，６−ジアミノプリン（ＤＡＰ）含有プローブ
【００９０】
【化１９】
2005160489.tif 000019
Ｆ．  ２−チオピリミジン含有プローブ
【００９１】
【化２０】
2005160489.tif 000020
【００９２】
【化２１】
2005160489.tif 000021
【００９３】
プローブを、Ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機において０．２μｍｏｌのスケールで合成した。５’蛍光色素を、延長された１２０秒のカップリング時間で、蛍光色素ホスホルミダイト（アセトニトリル中で、０．１Ｍ）として付着させた。５’蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを、濃水酸化アンモニウム中で、６５℃で２時間脱保護した。３’消光剤プローブを、以下の構造、および他の構造的改変体を有する消光剤支持体を用いて、合成した（Ｍｕｌｌａｈ，１９９７；Ｍｕｌｌａｓｈ，１９９８）。この標識を、固体支持体Ｓについての付着部位およびオリゴヌクレオチド合成の開始のためのＤＭＴ保護ヒドロキシ部位を有するリンカーに付着させた。この固体支持体は、コントロールドポアガラスまたはポリスチレンであり得る。合成が完了した後、エステル結合を切断し、以下の構造を有する固体支持体から３’標識オリゴヌクレオチドを分離する。
【００９４】
【化２２】
2005160489.tif 000022
【００９５】
（実施例２．  ＰＮＡクランプの合成）
ＰＮＡの自動合成を、ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機または４３３Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）を用いて、合成機製造業者の使用説明書およびＥｄｈｏｌｍ，１９９３に記載の一般的手順に従って行った。
【００９６】
ＰＮＡクランプを、以前に報告された（Ｄｕｅｈｏｌｍ，１９９４）ように、基本的に２〜５μｍｏｌのスケールで合成した。ＰＮＡのカルボキシ末端リジンを、ｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いてプレロードしたＭＢＨＡ固体支持体上で、調製した。カルボキシ末端アミドを有するＰＮＡを、ＭＢＨＡ支持体上に直接的にか、またはｔ−Ｂｏｃ  Ｔ  ＰＮＡモノマーを用いてプレロードしたＭＢＨＡ支持体上のいずれかで合成した。すべての樹脂を、０．１〜０．２５ｍｍｏｌｅ／ｇまでロードした。内部リジン残基（Ｋ）を、内部標識を必要とせず、かつｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いて調製される配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏｓ．）２３のクランプの調製を除いて、ｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（ｃｌｂｚ）として結合した。ピペリジン洗浄を、代表的にキャッピング工程の後に行ったが、ｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）をＰＮＡアセンブリに組み込んだ場合には、この洗浄を排除した。チミンＴ、シチジンＣ、およびプソイドイソシチジンＪ核酸塩基を有する代表的なＰＮＡ構造の一部を示す（図１２）。スペーサーＯ、２−［２−（２−アミノエトキシ）］酢酸を、Ｆｍｏｃ−アミノ保護シントンとして結合する。１以上のスペーサーＯ単位は、三重らせんを形成するクランプにおける可撓性の、非塩基対合のヒンジ領域として作用する（図１３）。ＰＮＡの合成を、ＭＢＨＡ（メチルベンズヒドリラミン）リンカー、高荷重型ポリスチレン支持体上で、工程の循環によって、２〜５０μｍｏｌのスケールで実施し得る。このサイクルを、Ｂｏｃ−ＰＮＡモノマー付加の各々について実施し（Ｋｏｃｈ，１９９７；Ｄｕｅｈｏｌｍ，１９９４）、そして以下の表に要約する。
【００９７】
【表１】
2005160489.tif 000023
ＤＩＥＡ    ジイソプロピルエチルアミン
ＴＦＡ      トリフルオロ酢酸
ＨＡＴＵ    １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール−テトラメチルウラニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェートＤＣＭ      ジクロロメタン
ＤＭＡ      ジメチルホルムアミド
（表．Ｍｏｄｅｌ４３３Ａ合成機におけるＰＮＡ合成サイクル）
ＰＮＡの合成を、標準合成技術ならびに核酸塩基（Ａbz、Ｃbz、Ｇibu、Ｔ）および一級アミノ（ＭＭＴ、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ）保護基を用いて行った。３ｍｌの反応容器を４４０μｌの総反応容積を有する５μｍｏｌｅスケールで使用する。合成の終りで、このＰＮＡをＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）を用いて室温で１時間切断させ、続いて、粗ＰＮＡのエーテル沈殿をする。
【００９８】
（実施例３．  ＰＮＡ／ＤＮＡキメラクランプの合成）
ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの自動合成を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機または４３３Ａペプチド合成機を用いて、使用説明書およびＵｈｌｍａｎｎ、１９９６；Ｖａｎ  ｄｅｒ  ｌａａｎ、１９９７；Ｖｉｎａｙａｋ、１９９７に記載される一般的手順に従って行った。
【００９９】
ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ合成のために使用した支持体は、ヒドロキシメチル安息香酸リンカーを有する非膨潤性の高架橋型ポリスチレンビーズである（Ｖｉｎａｙａｋ、１９９７）。キメラ合成のためのＰＮＡモノマーは、一級アミノ保護ためにモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）基を使用する。第１工程において、このモノマー、ＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡ（各々を、ＤＭＦ／アセトニトリル（１／１）中に溶解する）を、反応カートリッジに同時に送達する。１６分後、キャッピング試薬を送達する。ＰＮＡの一級アミノ酸官能基が転位および環化する傾向を最小にするために、アミノ末端を最後のＭＭＴ基の除去の後アセチル化する。ＤＮＡ部位およびＰＮＡ部位を連結するため、およびキメラ合成、切断、脱保護、および精製のための他の手順のための試薬は、記載される（Ｖａｎ  ｄｅｒ  ｌａａｎ、１９９７）。このアプローチにおいて、このキメラを、単一のカートリッジ中でかつ単一の合成機において、連続して作製し得る。
【０１００】
（実施例４．クランプの標識）
Ａ．  消光剤−ＰＮＡクランプ
【０１０１】
【化２３】
2005160489.tif 000024
Ｂ．  蛍光色素−ＰＮＡクランプ
【０１０２】
【化２４】
2005160489.tif 000025
Ｃ．  ＭＧＢ、標識−ＰＮＡクランプ
【０１０３】
【化２５】
2005160489.tif 000026
Ｄ．  消光剤およびマイナーグルーブ結合剤標識２’−Ｏ−メチルＲＮＡクランプ
【０１０４】
【化２６】
2005160489.tif 000027
Ｅ．  ５−プロピニル含有ＰＮＡクランプ
【０１０５】
【化２７】
2005160489.tif 000028
ＰＮＡ配列は、左にアミノ末端、右にカルボキシ末端を書いた。
２’−Ｏ−メチルＲＮＡ配列は、左に５’、右に３’を書いた。
【０１０６】
クランプ配列（配列番号１９〜２１、２２、２３、２８、２９、３１〜３７））を、プローブの３’末端で配列：ＡＡＡＧＧＡＧＧＡ−３’をクランプするように設計した。クランプ配列番号２５、２７、３８、４０および２４、２６、３０、３９は、それぞれＡＡＧＧＡＧＧＡおよびＡＧＧＡＧＧＡのより短い配列に、結合する。クランプ配列番号２２〜２６、２８、２９、３５〜３９は、このプローブの５’末端に対して方向付けられたヒンジ領域およびこのプローブの３’末端に相補的な末端を含むが、クランプ配列番号１９〜２１、３１〜３４は、プローブの３’末端で方向付けられたヒンジ領域およびこのプローブの５’末端に対して相補的な末端を有する（図１３）。クランプ配列番号１９および２２は、ＰＮＡ対ＤＮＡの最も安定な配向の代表である。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、ＰＮＡのアミノ末端をＤＮＡの３’末端と対合し、かつＰＮＡのカルボキシ末端をＤＮＡの５’末端と対合にする場合、逆平行の配向にある。ＰＮＡクランプのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合部分のアミノ末端（（Ｃ）−ＴＴＴＣＣＴＣＣＴ−（Ｎ））は、このプローブの３’末端に対して逆平行の配向で存在する。ＰＮＡクランプのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合部分のカルボキシ末端（（Ｎ）−ＴＴＴＪＪＴＪＪＴＣ−（Ｃ））は、このプローブの３’末端に対して平行の配向にある。これらの配向は、（ＰＮＡ）2／ＤＮＡ三重鎖において、最も安定であることが示されている（Ｅｇｈｏｌｍ、１９９５，Ｅｇｈｏｌｍ、１９９３）。クランプ配列番号２７、３０、４０は、プローブと二重鎖構造を形成するが、クランプ配列番号１９〜２６、２８、２９、３１〜３９、４１、４２は、プローブと三重鎖構造を形成する。
【０１０７】
報告されようなクランプについてのすべての標識反応は、２μｍｏｌの合成的調製物に関する反応である。内部標識およびアミノ末端標識の前に、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ：ピペリジン（４：１）を用いる室温で３時間の支持体結合保護ＰＮＡの処理によって、リジン（Ｋ）側鎖から除去した。アミノ末端ｔ−Ｂｏｃ基を、ＴＦＡ：メタクレゾール（１９：１）を用いる支持体結合ＰＮＡの１０分間の処置によって除去した。この支持体を徹底的にＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、続いて、脱保護した。カルボキシ末端標識および内部標識を、リジン側鎖に付着させた。カルボキシ末端標識を、両方の末端の標識化を同時に行ったクランプ配列番号２１を除き、アミノ末端脱保護および標識の前に行った。ＰＮＡを、カルボキシ末端に、ＭＧＢ１およびＣＤＰＩ３を用いて標識し、そしてアミノ末端にはＮＴＢおよびＴＡＭＲＡを用いて標識した。
【０１０８】
（ＴＡＭＲＡおよびＮＴＢ標識）
標識を、１００μｌのＤＭＦまたはＮＭＰ中に溶解したＴＡＭＲＡまたはＮＴＢの５ｍｇのＮＨＳエステルおよび１０μｌのＤＩＥＡを支持体結合ＰＮＡに添加し、そして、２〜１８時間（代表的に終夜）反応させることにより、行った。この支持体をＤＭＦおよび引き続いてＤＣＭを用いる標識の後、切断の前に洗浄した。
【０１０９】
（ＭＧＢ１標識）
ＭＧＢ１のカルボン酸（Ｇｏｎｇ、１９９７）（５ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌｅ）を、１００μｌＤＭＦ中に溶解し（図１１）、そして０．９５当量のＨＡＴＵ（ＤＭＦ中０．２ｍ）および５μｌのＤＩＥＡの添加によって活性化した。この活性化ＭＧＢ１溶液を、支持体結合ＰＮＡに添加し、そして室温で１時間カップリングさせた。次いで、この樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭ中で洗浄し、続いて、切断した。
【０１１０】
（ＣＤＰＩ標識）
ＣＤＰＩ3（図１１）を、Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ、１９９５）の３つの継続的なカップリングによってＰＮＡに付着させ、ＣＤＰＩ3標識ＰＮＡを得た。Ｆｍｏｃ（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌｅ）で保護した、ＣＤＰＩモノマー単位、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートを、１００μｌのＮＭＰ中に溶解し、そして０．９５当量のＨＡＴＵ（ＤＭＦ中０．２Ｍ）および２当量のＤＩＥＡ（ＤＭＦ中０．４ｍ）によって活性化した。室温で１時間後、活性化Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩ溶液を、この支持体結合ＰＮＡに添加し、そして室温でもう１時間カップリングさせた。樹脂を、２０ｍｌのＤＭＦを用いるカップリングの後洗浄した。Ｆｍｏｃを、室温で、ピペリジン：ＤＭＦ（１：４）を用いる１０分間の樹脂支持体処置によって除去した。このカップリングサイクルおよび脱保護サイクルを、合計３回の手動のカップリングのすべてについて、さらに２回繰り返した。
【０１１１】
（実施例５．  プローブおよびクランプのハイブリダイゼーションの速度）
３つのクランプ（配列番号１９，２０，２１）のプローブ（配列番号１）へのハイブリダイゼーションの速度を、消光の関数として測定した。ハイブリダイゼーションおよびクランプ消光剤ＮＴＢによる消光の際のプローブのＦＡＭ色素からの蛍光強度［Ｆ］の減少を、６０℃でＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ７７００上で測定した。当量の、クランプ（１００ｎＭ）およびプローブ（１００ｎＭ）を、９５℃で１分間混合し、６０℃に冷却し、そして［Ｆ］を２９分間測定した（図１４）。プローブの消光の有意な加速を、４倍過剰のクランプ（４００ｎＭ）を用いて達成した（ここで、消光を、１５秒以内に３つのクランプの各々を用いて実質的に完了させた）（図１５）。
【０１１２】
（実施例６．  プローブおよびクランプのバイナリー組成物を用いるエキソヌクレアーゼ／増幅アッセイ）
以下の試薬を混合し、そして２５μｌをＰＣＲのために各々のサンプル容器に分配した：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グリセロール、１０ｍｍ  ＭｇＣｌ2、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ジアザｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、０．１ｕ／μｌのＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｍｐｅｒａｓｅ  ＵＮＧおよび受動的参照物を含む１２．５μｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｐ／Ｎ  ４３０４４３７）
９００ｎＭ（最終濃度）：ＧＴＴ１順方向標的プライマー：
５’ＧＣＡＡＡＴＡＴＡＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡ３’  （配列番号４４）
９００ｎＭ（最終濃度）：ＧＴＴ１逆方向標的プライマー：
５’ＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴ３’  （配列番号４５）
１００ｎＭ  プローブおよび４００  ｎＭ  クランプ組成物
１０μｌ（約２０ｎｇ）  ゲノム標的ＤＮＡ
標的サンプルを熱サイクリング条件（５０℃にて２分間で開始し、９５℃で１０分維持し、次いで９５℃で１５秒の変性ならびに６０℃での１分間のアニーリングならびに伸張の４０サイクルによって増幅させた。熱サイクリングおよびリアルタイム蛍光検出を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．）において行った。好ましい終点検出システムは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM７２００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍである。
【０１１３】
エキソヌクレアーゼアッセイの結果を、２つのパラメーター（Ｒｎ値およびＣt値）を用いて分析し得る。Ｒｎ値は、ＰＣＲの間の蛍光における増大、すなわちより正確には、蛍光色素の蛍光とＰＣＲ実験の終りでの受動的蛍光参照色素の蛍光との比（すなわち、Ｒｎ（標的）＝標的プローブの発光強度÷受動的参照の発光強度）である。Ｃt値すなわち闘サイクル数は、この蛍光比がバックグラウンドから区別可能であるＰＣＲサイクルの数である。所与の蛍光色素および標的の固定濃度に関して、ＲｎおよびＣｔ値の両方は、消光剤の効果を反映する。用語ΔＲｎとは、バックグラウンドまたは初期の蛍光の減算を伴うＰＣＲの間の蛍光の増大である。
【０１１４】
ＰＣＲの産物を、プローブおよびクランプのバイナリー組成物の切断のリアルタイムの検出を用いて測定した。ＢＡＫ標的を、プローブおよびクランプのバイナリー組成物（ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ７７００（図１６）において４００ｎＭのクランプ（配列番号１９、２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１））の存在下で引き続いて増幅させた。蛍光の変化（ΔＲｎ）を、増幅サイクルに対してプロットした。蛍光の変化がバックグラウンドから区別可能であるサイクル（Ｃt）は、標的配列の存在を示す。バックグラウンドの蛍光が減算されない場合、３つのクランプの消光効率の差異（Ｒｎ）が、著しい（図１７）。２つのＮＴＢ標識を有するクランプ（配列番号２１）は、クランプ（配列番号１９）より良好に消光する。３つのリジン標識を有するクランプ（配列番号２０）は、１つのリジンを有するクランプ（配列番号１９）より良好に消光する。
【０１１５】
ＧＴＴ１標的を、連続して、１）プローブおよびクランプのバイナリー組成物：１００ｎＭ  プローブ（配列番号２）および４００ｎＭ  クランプ（配列番号２０、２１）、および２）蛍光色素および消光剤を有するＴａｑｍａｎプローブ：
５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ３’  配列番号４３
の存在下で増幅した。リアルタイムのＰＣＲ検出をバックグラウンド蛍光の減算（ΔＲｎ）（図１８）を用いて、およびバックグラウンド蛍光の減算を使用せずに（Ｒｎ）（図１９）、ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ７７００において測定した。ＣTにおける有意な差異は、バイナリープローブ／クランプ組成物とＴａｑｍａｎプローブとを比較する場合、測定されなかった。
【０１１６】
すべての刊行物およびすべての特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が参考として援用されことを詳細にかつ個々に示されるかのように同程度まで、本明細書中で参考として援用される。
【０１１７】
少数の実施形態のみを、詳細に記載してきたが、分子生物学および化学の分野の当業者は、多くの改変が、好ましい実施形態においてその技術から逸脱することなく可能であることを明白に、理解する。すべてのこのような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１１８】
（発明の要旨）
本発明は以下を提供する。
（１）  標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするためのバイナリー組成物であって、上記バイナリー組成物は、以下：
標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含むプローブであって、ここで、上記標的特異的部分が、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プローブ；および
プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含むクランプであって、ここで、上記プローブ特異的部分が、上記プローブの上記クランプ特異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして上記クランプは、上記標的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能である、クランプ、
を含み、
ここで、上記標識の検出の間、上記プローブの上記クランプ特異的部分は、上記クランプの上記プローブ特異的部分に結合したままである、
バイナリー組成物。
（２）  項目１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記プローブの上記クランプ特異的部分および上記クランプの上記プローブ特異的な塩基対部分が二重鎖を形成する、バイナリー組成物。
（３）  項目１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記プローブの上記クランプ特異的部分および上記クランプの上記プローブ特異的な塩基対部分が三重鎖を形成する、バイナリー組成物。
（４）  上記プローブが６〜１００のヌクレオチドを含む、項目１に記載のバイナリー組成物。
（５）  上記プローブの上記クランプ特異的部分がプリンヌクレオチドを含む、項目１に記載のバイナリー組成物。
（６）  上記クランプの上記プローブ特異的部分がピリミジン核酸塩基アナログを含む、項目１に記載のバイナリー組成物。
（７）  上記クランプが６〜５０のヌクレオチドアナログを含む、項目１に記載のバイナリー組成物。
（８）  上記クランプ配列が（ＣＡＧ）n（ここで、ｎ＝１〜１０）を含む、項目１に記載のバイナリー組成物。
（９）  項目１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記クランプ配列が、（ＴＣＣ）nおよび上記プローブ配列（ＧＧＡ）n（ここで、ｎ＝１〜１０）に結合する核酸アナログを含む、バイナリー組成物。
（１０）  項目１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記プローブが、以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログからなる群から選択される核酸アナログを含む、バイナリー組成物。
（１１）  項目１０に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記核酸塩基アナログが、以下：Ｃ−５−アルキルピリミジン、２，６−ジアミノプリン、２−チオピリミジン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、７−デアザプリン、イソシチジン、プソイドイソシチジン、イソグアノシン、４（３Ｈ）−ピリミドン、ヒポキサンチン、８−オキソプリン、および万能塩基からなる群から選択される、バイナリー組成物。
（１２）  項目１０に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記糖アナログが、以下：２’−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド、２’−アリルリボヌクレオチド、２’−ハロ−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル−リボヌクレオチド、２’−分枝基−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−分枝基−リボヌクレオチド、４’−α−アノマーヌクレオチド、および１’−α−アノマーヌクレオチドからなる群から選択される、バイナリー組成物。
（１３）  項目１０に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記ヌクレオチド間アナログが、以下：２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）、２’−５’−結合、逆方向３’−３’結合、逆方向５’−５’結合、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホルアミデート、アルキル化ホスホトリエステル分枝構造、および３’−Ｎ−ホスホルアミデートからなる群から選択される、バイナリー組成物。
（１４）  上記クランプが、非塩基対の、非ヌクレオシドリンカーを含む、項目１に記載のバイナリー組成物。
（１５）  上記クランプが、１つ以上の２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）モノマー単位を含む、項目１に記載のバイナリー組成物。
（１６）  項目１に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記クランプが、以下：末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖、アミノ基、スルフィド基、およびカルボキシル基からなる部位に付着される１つ以上の標識を有する、バイナリー組成物。
（１７）  上記プローブが１つ以上の標識を含む、項目１に記載のバイナリー組成物。
（１８）  項目１７に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記標識が以下：５’末端、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、および糖からなる群から選択される部位に付着される、バイナリー組成物。
（１９）  項目１および１７に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記クランプ標識および上記プローブ標識が、以下：ハイブリダイゼーション安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、化学発光色素、アミノ酸、およびアフィニティーリガンドからなる群から選択される、バイナリー組成物。
（２０）  項目１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記ハイブリダイゼーション安定化部分が、以下：マイナーグルーブ結合剤、インターカレーター、および架橋官能基からなる群から選択される、バイナリー組成物。
（２１）  項目２０に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記マイナーグルーブ結合剤が、以下：Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＣＤＰＩ1-3、ＭＧＢ１、ネトロプシン、およびジスタマイシンからなる群から選択される、バイナリー組成物。
（２２）  項目１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記蛍光色素が、以下：ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、４，７−ジクロロ−フルオレセイン、４，７−ジクロロ−ローダミン、およびシアニンからなる群から選択される、バイナリー組成物。
（２３）  項目１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記蛍光消光剤が、以下：ＴＡＭＲＡ、ＮＴＢ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、マラカイトグリーン、およびシアニンからなる群から選択される、バイナリー組成物。
（２４）  項目１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記化学発光色素が、以下の構造を有する化学発光前駆体からなる群から選択され：
【０１１９】
【化１０１】
2005160489.tif 000029
ここで、Ｒ1は、水素またはハロゲンであり；Ｒ2は、ホスフェート、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、または水素であり；Ｒ3は、メチル、エチル、低級アルキルであり；そしてＬはリンカーである、バイナリー組成物。
（２５）  項目１９に記載のバイナリー組成物であって、ここで、上記リガンドが、以下：ビオチン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ、およびペプチドからなる群から選択される、バイナリー組成物。
（２６）  標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするためのバイナリー組成物であって、以下：
標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含むプローブであって、ここで、上記標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プローブ；および
２つのプローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含むクランプであって、ここで、上記２つのプローブ特異的部分は、上記プローブの上記クランプ特異的部分に配列特異的に結合し、三重鎖を形成し得る、クランプ、
を含む、バイナリー組成物。
（２７）  標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするためのバイナリー組成物であって、以下：
標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含むプローブであって、ここで、上記標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プローブ；および
プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含むクランプであって、ここで、上記プローブ特異的部分は、上記プローブの上記クランプ特異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして上記クランプは、上記標的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能である、クランプ、
を含み、
ここで上記標識の１つは、上記標的の上記プローブへの結合を安定化するハイブリダイゼーション安定化部分である、
バイナリー組成物。
（２８）  標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法であって、以下の工程：
プローブおよびクランプのバイナリー組成物を提供する工程であって、上記プローブおよびクランプのバイナリー組成物が、以下：
標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含み、ここで、上記標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プローブ；および
プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含み、ここで、上記プローブ特異的部分は、上記プローブの上記クランプ特異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして上記クランプは、上記標的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能である、クランプ；
を含む、工程；
上記プローブの上記標的特異的部分を、上記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる工程；
上記クランプの上記プローブ特異的部分を上記プローブの上記クランプ特異的部分にハイブリダイズさせる工程；ならびに
上記バイナリープローブを検出する工程、
を包含する、方法。
（２９）  ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出するための方法であって、以下の工程：
プローブおよびクランプのバイナリー組成物を提供する工程であって、上記プローブおよびクランプのバイナリー組成物が、以下：
標的特異的部分、クランプ特異的部分および１つ以上の標識を含み、ここで上記標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プローブ；および
プローブ特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含み、ここで、上記プローブ特異的部分は、上記プローブの上記クランプ特異的部分に配列特異的に結合することが可能であり、そして上記クランプは、上記標的ポリヌクレオチドに配列特異的に結合することが不可能である、クランプ；
を含む、工程；
上記プローブの上記標的特異的部分を、上記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる工程；
上記クランプの上記プローブ特異的部分を上記プローブの上記クランプ特異的部分にハイブリダイズさせる工程；ならびに
エキソヌクレアーゼ活性、ＰＣＲプライマー、およびヌクレオシド５’トリホスフェートを有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記標的を増幅する工程、
上記ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブを切断する工程、ならびに
上記標識を検出する工程、
を包含する、方法。
（３０）  項目２９に記載の方法であって、ここで上記標識が、リアルタイムでか、または標的増幅の終点で、発せられる蛍光をモニターすることによって検出される、方法。
（３１）  ポリメラーゼ連鎖反応生成物を標識するための方法であって、以下の工程：
標的特異的部分およびクランプ特異的部分を含み、ここで上記標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、プライマー；および
プライマー特異的部分、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含み、ここで、上記プライマー特異的部分は、上記プライマーの上記クランプ特異的部分に配列特異的に結合し得る、クランプ；
を提供する工程；ならびに
ＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上のバイナリープライマーおよびクランプの組成物、１つ以上の対向鎖プライマー、およびヌクレオシド５’トリホスフェートを用いて、上記標的を増幅する工程であって、
ここで、１つ以上の標識ポリメラーゼ連鎖反応生成物が生じる、工程
を包含する、方法。
（３２）  上記標識が検出可能な蛍光色素である、項目３１に記載の方法。
（３３）  ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出するための方法であって、以下の工程：
３’末端に標的特異的部分および５’末端にホモピリミジン配列部分を含み、ここで上記標的特異的部分は、標的ポリヌクレオチド配列に配列特異的に結合することが可能である、１つ以上のプライマー；および上記ホモピリミジン配列、１つ以上の標識、ならびに以下：核酸塩基アナログ、糖アナログ、およびヌクレオチド間アナログから選択される少なくとも１つの核酸アナログを含むクランプ、を提供する工程；
ＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の対向鎖プライマー、およびヌクレオシド５’トリホスフェートを用いて、上記標的を増幅する工程；ならびに
上記標識を検出する工程であって、
ここで、上記クランプの上記ホモピリミジン配列が、上記ポリメラーゼ連鎖反応生成物の３’末端で、上記ホモピリミジン配列の相補体に結合する、工程
を包含する、方法。
（３４）  上記標識が検出可能な蛍光色素である、項目３３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、ハイブリダイズした蛍光色素（Ｆ）−プローブおよび消光剤（Ｑ）−クランプのバイナリー組成物ならびにハイブリダイズしていない蛍光色素（Ｆ）−プローブおよび消光剤（Ｑ）−クランプのバイナリー組成物を示す。
【図２】図２は、バイナリープローブおよび三重鎖組成物（上）ならびにバイナリープローブおよび二重鎖組成物（下）の、標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを示す。
【図３】図３は、蛍光色素−標識プローブおよび消光剤−クランプの組成物の、標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを示す。
【図４】図４は、プローブおよび蛍光色素−標識クランプの、標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを示す。
【図５】図５は、蛍光色素−標識プローブの、消光剤／マイナーグルーブ結合剤（ＭＧＢ）−標識クランプに対するハイブリダイゼーション、およびプローブの、標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション（標的に結合するプローブのＭＧＢによる安定化）を示す。
【図６】図６は、非標識プライマーおよび蛍光色素−標識クランプの、ＰＣＲ標的に対するハイブリダイゼーションを示す。
【図７】図７は、標的ポリヌクレオチドの、５’ホモプリン配列を用いた増幅、およびＰＣＲ産物の３’ホモプリン配列に結合する、三重鎖を形成する蛍光標識クランプを示す。
【図８】図８は、エキソヌクレアーゼアッセイを示し、このアッセイによって、三重らせんを形成する自己消光バイナリープローブ、ならびにクランプの組成物１（蛍光色素および消光剤を含む）、ならびに標的プライマー２ａおよび２ｂが、標的ポリヌクレオチド３にハイブリダイズされる。増幅の重合段階の間、プライマー２ａおよび２ｂは、ポリメラーゼ酵素を用いて伸長され、それによって伸長されたプライマー４ａおよび４ｂを形成する。プライマー伸長反応の間、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性は、蛍光色素−プローブフラグメント５およびクランプ特異的プローブフラグメント６を有する消光剤標識クランプを含む、プローブフラグメントを形成するように、プローブ１を切断するように作用する。
【図９】図９は、フルオレセイン蛍光色素の構造：ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＮＥＤを示し、ここで、Ｌはリンカーである。
【図１０】図１０は、消光剤の構造：ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＮＴＢを示す。
【図１１】図１１は、マイナーグルーブ結合剤の構造：ＭＧＢＩ、Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩ、ＣＤＰＩ3を示す。
【図１２】図１２は、モノマー単位：Ｔ、Ｃ、プソイドイソシトシンＪ、およびエチレンオキシスペーサーＯを含むＰＮＡクランプを示す。
【図１３】図１３は、プローブおよびクランプのバイナリー組成物を示す。三重鎖を形成するクランプ（配列番号１９、配列番号２２）を標識なしで示す。
【図１４】図１４は、時間に対する、プローブおよびクランプのバイナリー組成物のハイブリダイゼーションの速度、すなわち蛍光強度［Ｆ］を示す。１００ｎＭのクランプ（配列番号１９、２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）、６０℃；ＡＢＩモデル７７００。
【図１５】図１５は、プローブおよびクランプのバイナリー組成物のハイブリダイゼーションの速度、すなわち時間に対する蛍光強度［Ｆ］を示す。４００ｎＭのクランプ（配列番号１９、２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）、６０℃；ＡＢＩモデル７７００。
【図１６】図１６は、ＢＡＫ標的のリアルタイムＰＣＲ検出（サイクル数に対するΔＲｎ、ＣTの測定、バックグラウンド蛍光を引いた場合）を示す。プローブおよびクランプのバイナリー組成物：４００ｎＭのクランプ（配列番号１９、２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）。
【図１７】図１７は、ＢＡＫ標的のリアルタイムＰＣＲ検出（サイクル数に対するＲｎ、ＣTの測定、バックグラウンド蛍光を引かない場合）を示す。プローブおよびクランプのバイナリー組成物：４００ｎＭのクランプ（配列番号１９、２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号１）。
【図１８】図１８は、ＧＴＴ１標的のリアルタイムＰＣＲ検出（サイクル数に対するΔＲｎ、ＣTの測定、バックグラウンド蛍光を引いた場合）を示す。プローブおよびクランプのバイナリー組成物：４００ｎＭのクランプ（配列番号２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号２）。Ｔａｑｍａｎプローブ：５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ３’。
【図１９】図１９は、ＧＴＴ１標的のリアルタイムＰＣＲ検出（サイクル数に対するΔＲｎ、ＣTの測定、バックグラウンド蛍光を引かない場合）を示す。プローブおよびクランプのバイナリー組成物：４００ｎＭのクランプ（配列番号２０、２１）、１００ｎＭのプローブ（配列番号２）。Ｔａｑｍａｎプローブ：５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号４３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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