(57)【要約】【課題】  蛍光相関分光法におけるシグナルを増強することができ、高感度に解析する。【解決手段】  相互作用する２成分のうち少なくとも一方を蛍光物質により標識し、当該２成分を含む溶液を調製する工程と、上記工程で調製した溶液にホルムアルデヒドを加える工程と、蛍光相関分光法により上記蛍光物質を検出することによって上記２成分の相互作用を分析する工程とを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互作用する２成分のうち少なくとも一方を蛍光物質により標識し、当該２成分を含む溶液を調製する工程と、
上記工程で調製した溶液にホルムアルデヒドを加える工程と、
蛍光相関分光法により上記蛍光物質を検出することによって、上記２成分の相互作用を分析する工程と、
を含む２成分作用分析方法。
【請求項２】
上記ホルムアルデヒドを加える工程では、上記溶液に含まれる２成分が平衡状態となった後に当該ホルムアルデヒドを加えることを特徴とする請求項１記載の２成分相互作用分析方法。
【請求項３】
上記溶液中の上記ホルムアルデヒドの濃度を0.005〜0.5％の範囲とすることを特徴とする請求項１記載の２成分相互作用分析方法。
【請求項４】
上記２成分は核酸と核酸の組み合わせ、核酸とタンパク質との組み合わせ、タンパク質とタンパク質との組み合わせのいずれかであることを特徴とする請求項１記載の２成分相互作用分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、タンパク質と核酸との相互作用を解析することができる２成分相互作用分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光相関分光法は、蛍光強度のゆらぎを解析し、その蛍光ゆらぎに関わる物理量を得ようとする方法である（非特許文献１参照）。一般に、蛍光相関分析法で得られる情報の範囲は広く、微小領域の中でのブラウン運動に起因する情報以外に、例えば分子の構造的なゆらぎや化学反応の情報などと広範に及ぶ。
【０００３】
蛍光相関分光法においては、例えば共焦点顕微鏡の持つ光学系と同等の光学系を用いる事によって、試料の極めて小さな直径約400nm、軸長2μm程度以下の領域（サブフェムトリットル）に励起光を集光し、そこから蛍光を検出することができる。ここで、例えば10nM程度の蛍光分子溶液を考えると、この領域には平均数個の分子が存在し、その数は分子がブラウン運動することによって平均値の辺りに増減する。
【０００４】
このため、この領域からの蛍光を測定すると、その蛍光強度は領域内の分子数の増減を反映したランダムなゆらぎとして観測される。このゆらぎは、蛍光分子の数が増加することにより平均化され、小さくなり、また分子の拡散速度が速くなれば速くなる。したがって、これを解析することによって、分子の数に関する情報とその拡散速度に関する情報を得ることができる。
【０００５】
また、上述したような蛍光相関分光法を適用することによって、核酸分子とタンパク質との相互作用といった２成分相互作用を解析することも可能となる。例えば、核酸分子及びタンパク質のいずれか一方に蛍光物質を結合させて標識し、その後、溶液中で核酸分子とタンパク質とを相互作用させる。そして、溶液中の微小領域を測定領域として、当該領域における蛍光を測定する。核酸分子とタンパク質とが相互作用している場合と、相互作用していない場合とで、検出される蛍光強度のゆらぎが異なることとなり、蛍光強度のゆらぎに基づいて核酸分子とタンパク質との相互作用の有無を検出することができる。
【非特許文献１】「蛋白質  核酸  酵素」、vol. 44、no. 9（1999）、p1431-1438
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、蛍光相関分光法を適用して、上述したような２成分相互作用解析を行う場合、十分な蛍光強度を得ることができず、検出精度が低いといった問題があった。
【０００７】
そこで、本発明は、蛍光相関分析法においてシグナルを増強することができ、高感度に解析することができる２成分相互作用解析方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するため本発明者が鋭意検討した結果、２成分を含む溶液中にホルムアルデヒドを存在させることによって、蛍光相関分光法におけるシグナルを増強できるといった知見を得ることができ、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
(1)  相互作用する２成分のうち少なくとも一方を蛍光物質により標識し、当該２成分を含む溶液を調製する工程と、
上記工程で調製した溶液にホルムアルデヒドを加える工程と、
蛍光相関分光法により上記蛍光物質を検出することによって、上記２成分の相互作用を分析する工程と、
を含む２成分作用分析方法。
【００１０】
(2)  上記ホルムアルデヒドを加える工程では、上記溶液に含まれる２成分が平衡状態となった後に当該ホルムアルデヒドを加えることを特徴とする（1）記載の２成分相互作用分析方法。
【００１１】
(3)  上記溶液中の上記ホルムアルデヒドの濃度を0.005〜0.5％の範囲とすることを特徴とする（1）記載の２成分相互作用分析方法。
【００１２】
(4)  上記２成分は核酸と核酸の組み合わせ、核酸とタンパク質との組み合わせ、タンパク質とタンパク質との組み合わせのいずれかであることを特徴とする（1）記載の２成分相互作用分析方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、蛍光相関分光法による検出シグナルを増強することができ、その結果、２成分の相互作用を高感度に解析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明を適用した２成分相互作用解析方法は、蛍光相関分光法を利用して２成分間の相互作用を解析するものである。本方法において「２成分」とは、相互作用する一対の成分を意味しており、一方又は両方の成分自体が単一の分子でなくても良い。すなわち、２成分における一方又は両方の成分は、複数の構成要素からなる複合体であっても良い。したがって、本方法において、「２成分の相互作用」と表現する場合には、３以上の構成要素からなる相互作用を含む意味である。
【００１５】
ここで、相互作用に寄与する構成要素としては、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）及び核酸類似体を含む核酸分子、タンパク質、低分子化合物、核酸分子及びタンパク質を除く他の高分子化合物を例示することができる。したがって、本方法において、２成分の相互作用としては、これらの構成要素が寄与するものであれば、特に限定されないが、例えば、核酸と核酸の相互作用、核酸とタンパク質の相互作用、タンパク質とタンパク質の相互作用を挙げることができる。
【００１６】
本方法においては、先ず、少なくとも一方が蛍光物質で標識した２成分を含む溶液を調製する。ここで、使用可能な蛍光物質としては、特に限定されないが、蛋白質として存在し、レーザ照射または自身のエネルギーによって、蛍光、発光を始めとする光シグナルを発する物質等を挙げることができる。例えば、オワンクラゲから抽出された緑色蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰと称する；Green Fluorescent Protein）、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）およびＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）等を挙げることができる。更に、ウミシイタケ由来の同様の蛍光タンパク質であってもよい。
【００１７】
また、使用可能な蛍光物質としては、核酸分子の５’末端及び/又は３’末端に結合して当該核酸分子を標識することができる、例えば、TAMRA、Alexa488、Alexa633、Cy3、Cy5、FITC、Rhodamine、Texas Red等を挙げることができる。
【００１８】
例えば、解析対象の２成分のうち一方がタンパク質であって、当該タンパク質に蛍光物質を結合させる際には、解析対象のタンパク質と上述した蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする組換え遺伝子を有する発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを用いて上記タンパク質に標識物質を結合させることができる。
【００１９】
一方、解析対象の２成分のうち一方が核酸分子であって、当該核酸分子に蛍光物質を結合させる際には、例えば、http://www.techno-qanda.net/dsweb/Get/Document-3499/DNAsynthe2.pdfの「２．特殊残基の結合」の「１」蛍光標識プライマーの合成」に記載の方法、Applied Biosystem User Bulletin, 78 (1994)に準じて合成することができる。
【００２０】
次に、本方法では、２成分を含む溶液にホルムアルデヒドを加える。ホルムアルデヒドは、２成分を含む溶液を調製した後、37℃程度で20〜30分インキュベートした後に添加することが好ましい。また、ホルムアルデヒドは、溶液中に0.005〜0.5％の濃度となるように添加することが好ましく、より好ましくは0.007〜0.2％の濃度となるように添加する。溶液中のホルムアルデヒドの濃度が0.5％より高い場合には、溶液に含まれる２成分の凝集現象が生ずるおそれがあり好ましくない。また、溶液中のホルムアルデヒドの濃度が0.005％未満の場合には、溶液に含まれる２成分間の相互作用に対する影響が不十分となり、蛍光シグナルを増強できないおそれがある。
【００２１】
次に、本方法では、蛍光相関分光法によって、上記溶液の微小領域における蛍光を測定する。ここで、蛍光相関分光法（即ち、ＦＣＳ）は、蛍光で標識した標的分子の媒質中におけるゆらぎ運動を測定し、自己相関関数(Autocorrelation function)を用いることにより、個々の標的分子の微小運動を正確に測定する技術である（参照文献：D.Magde and E.Elson, “Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization”, Biopolymers 1974 13(1) 29-61）。本方法においてＦＣＳは、溶液中の蛍光分子のブラウン運動をレーザ共焦点顕微鏡により微小領域で捉えることによって、蛍光強度のゆらぎから拡散時間を解析し、物理量（分子の数、大きさ）を測定することにより実行される。
【００２２】
本発明に従って実行されるＦＣＳによる検出の原理を更に詳しく説明する。ＦＣＳでは、試料中の微小視野領域から発生する蛍光信号を顕微鏡で検出定量する。この時、媒質中の蛍光標識した標的分子は常に運動している（即ち、ブラウン運動）。従って、標的分子がこの微小視野領域内に進入する頻度および前記領域内に留まる時間に応じて、検出される蛍光強度が変化する。例えば、２量体化が生じて見かけの分子量が増大すれば、標的分子の運動は遅くなり、見かけの分子数は減少する。その結果、微小視野領域内に入ってくる頻度は低下し、観察される蛍光強度が変化する。このような蛍光強度の変化をモニターすることにより、標的分子の見かけの分子量変化を追跡できる。
【００２３】
本工程は例えば、蛍光相関分析装置によって実施することができる。以下、本方法において使用され得る蛍光相関分析装置の例を、図１を参照して説明する。図１に示すように、蛍光相関分光装置は、レーザ光源１と、前記レーザ光源１からの光ビームの強度を減弱する光強度調節手段（ここでは、ＮＤフィルタ）２と、適切な光強度調節手段２を設定する光減弱選択装置（ここでは、ＮＤフィルタチェンジャー）３と前記レーザ光源１からの光ビームを前記試料に集光し、共焦点領域を形成する光学系４、５と、蛍光分子を含有する試料を載せたステージ６と、前記試料からの蛍光を集光する光学系７〜１１と、集光した蛍光を検出する光検出器１２と、蛍光強度の変化を記録する蛍光強度記録手段とからなる。このように、蛍光相関分析装置は、共焦点レーザ顕微鏡系を応用したものである。図１において、光源のレーザ（１）は、アルゴンレーザー、ヘリウム−ネオンレーザー、クリプトン、ヘリウム−カドミウムなど、何れであってもよい。
【００２４】
図１において、レーザ光源からの光ビームを前記試料に集光し、共焦点領域を形成する光学系４、５は、具体的にはダイクロイックミラー４、および対物レンズ５を意味する。レーザ光源１からの光ビームは、図１中の矢印で示すような経路で、先ず、蛍光強度調節手段（ここでは、ＮＤフィルタ）２の減弱度に従ってその強度が減弱され、次いでダイクロイックミラー４により入射光に対して９０度のステージ方向に屈折し、対物レンズ５を通ってステージ６上の試料に照射される。このようにして光ビームは、微小な１点で前記試料に集光され共焦点領域が形成される。
【００２５】
本発明においてステージ６の試料は、上述したように、解析対象の２成分及びホルムアルデヒドを含む溶液である。図１において、共焦点領域内の蛍光分子から放射された蛍光を集光する光学系７〜１１は、具体的には、フィルタ７、チューブレンズ８を経て、反射鏡９により屈折し、ピンホール１０に結像した後、レンズ１１を通過して光検出器１２に集光される。
【００２６】
集光された蛍光を検出する光検出器（ここでは、アバランシャルフォトダイオード）１２は、受容した光信号を電気信号に変換し、蛍光強度記録手段（ここでは、コンピュータ）１３に送信する。
【００２７】
蛍光強度の変化を記録する蛍光強度記録手段１３は、伝達された蛍光強度データの記録・解析を行う。具体的には、この蛍光強度データの解析により自己相関関数を設定する。蛍光分子の動きによる分子量の増大および分子数の減少、あるいは蛍光分子のＤＮＡ特定領域への結合による分子数の減少などは、自己相関関数の変化により検出することができる。
【００２８】
本方法においては、解析対象の２成分及びホルムアルデヒドを含む溶液を試料とするため、ホルムアルデヒドを含まない溶液を試料とする場合と比較して、より強い蛍光強度を生ずることとなる。したがって、蛍光強度のゆらぎから解析した拡散時間がより高い値を示すこととなり、溶液に含まれる２成分の相互作用をより高感度に解析することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
本例では、先ず、２成分の一方として、５’末端をTAMRAで標識した二本鎖オリゴDNAを準備した。なお、二本鎖オリゴDNAとしては、T7プロモータ領域を含む配列（配列番号１）のものと、AP1結合領域を含む配列（配列番号２）のものと２種類準備した。また、２成分の他方としては、T7 RNAポリメラーゼ（配列番号３）とAP1タンパク質（配列番号４）とを準備した。なお、T7 RNAポリメラーゼはタカラバイオ社から購入し、AP1タンパク質はプロメガ社から購入した。さらに、250mMのTris(pH7.5)、1mg/mlのBSA、1%のglycerol、5Mの2-Mercaptoethanol、35mMのKCl及び5MのEDTAからなる５×結合緩衝液を調製した。
【００３１】
なお、本例においては、上記二本鎖オリゴDNAを0.032μMの溶液とした。なお、本例では、後述するように、FCSで最初に測定したときに、測定領域内の蛍光分子数（n）が３〜６になるように濃度を設定した。しがって、上記二本鎖オリゴDNAの濃度は実験の度に変わることに留意する。
【００３２】
次に、上記二本鎖オリゴDNAを含む溶液15.5mlと、5×結合緩衝液4mlと、1mg/mlのタンパク質溶液5mlとを混合して、37℃で20〜30分間インキュベートした。次に、インキュベート後、溶液にホルムアルデヒドを最終濃度が0.07%となるように添加し、十分に攪拌した。なお、比較として、二本鎖オリゴDNAのみを含む溶液、二本鎖オリゴDNA及びタンパク質のみを含む溶液、二本鎖オリゴDNA、タンパク質及びグルタルアルデヒド（最終濃度0.5%）を含む溶液を調製した。
【００３３】
次に、各溶液を15000rpmで10秒間遠心分離することで、各溶液から泡沫を除去した。その後、各溶液を37℃で20〜30分間インキュベートしたのち、蛍光相関分析装置によって各溶液の微小領域における蛍光強度を測定した。
【００３４】
本例では蛍光相関分析装置として、一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス社製）を使用した。蛍光相関分析装置で測定した蛍光強度のゆらぎから解析した拡散時間を、各溶液についてまとめた結果を図２に示す。図２において、溶液１はT7プロモータ領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNAのみを含む溶液、溶液２はT7プロモータ領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNA及びT7 RNAポリメラーゼのみを含む溶液、溶液３はT7プロモータ領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNA、T7 RNAポリメラーゼ及び0.07%のホルムアルデヒドを含む溶液、溶液４はT7プロモータ領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNA、T7 RNAポリメラーゼ及び0.5%のグルタルアルデヒドを含む溶液である。また、図２において、溶液５はAP1結合領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNAのみを含む溶液、溶液６はAP1結合領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNA及びAP1タンパク質のみを含む溶液、溶液７はAP1結合領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNA、AP1タンパク質及び0.07%のホルムアルデヒドを含む溶液、溶液８はAP1結合領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNA、AP1タンパク質及び0.5%のグルタルアルデヒドを含む溶液である。
【００３５】
図２から分かるように、ホルムアルデヒドを溶液に加えた場合（溶液３及び７）には、拡散時間が高い値を示しており、高感度で測定できることが明らかとなった。これに対して、グルタルアルデヒドを用いた場合（溶液４及び８）には、このような効果を得ることができなかった。
【００３６】
次に、感度の向上とホルムアルデヒドの濃度との関係を調べた。具体的には、T7プロモータ領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNAとT7 RNAポリメラーゼを含む溶液におけるホルムアルデヒドの濃度を変化させて、上記と同様に蛍光強度を測定し、拡散時間を解析した。なお、本実験における対照としては、T7プロモータ領域を含む配列からなる二本鎖オリゴDNAに対して相互作用しないc-junタンパク質を、T7 RNAポリメラーゼの代わりに使用して、同様に拡散時間を解析した。
【００３７】
結果を図３に示す。図３に示すように、ホルムアルデヒドの濃度が0.0074％未満の場合には、対照と比較して、二本鎖オリゴDNAとタンパク質との特異的な相互作用を高感度に検出することができなかった。また、ホルムアルデヒドの濃度が0.15％を超える場合には、対照においても蛍光強度のゆらぎが検出され、対照と比較して二本鎖オリゴDNAとタンパク質との特異的な相互作用を高感度に検出することができなかった。この結果より、ホルムアルデヒドの濃度を0.005％以上、0.5％以下、より好ましくは0.007％以上、0.2％以下とすることによって、より確実に検出感度を向上できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明を適用した２成分相互作用解析方法を実施するための蛍光相関分析装置を概略的に示す構成図である。
【図２】実施例で調製した溶液１〜８を蛍光相関分析装置で測定し、各溶液について拡散時間を解析した結果を示す特性図である。
【図３】ホルムアルデヒドの濃度と拡散時間との関係を示す特性図である。
【符号の説明】
【００３９】
１…レーザ光源、２…光強度調節手段、３…光減弱選択装置、６…ステージ、１２…光検出器、１３…蛍光強度記録手段
【図１】
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【図２】
2005098876.tif 000003
【図３】
2005098876.tif 000004
【配列表】
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