(57)【要約】【課題】  本発明は、ヌクレオチド、特にＡＴＰをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを酵素反応によって製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】  ヌクレオチド、特にＡＴＰの存在下で、セリンに、セリンホスホトランスフェラーゼを作用させて、Ｏ−ホスホセリンを生成させることを特徴とする、Ｏ−ホスホセリンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチドの存在下でセリンに、セリンホスホトランスフェラーゼを作用させて、Ｏ−ホスホセリンを生成させることを特徴とする、Ｏ−ホスホセリンの製造方法。
【請求項２】
ヌクレオチドがＡＴＰである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該セリンホスホトランスフェラーゼとして、該セリンホスホトランスフェラーゼを産生する微生物の菌体処理物、粗酵素、又は精製酵素を作用させる、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
該微生物が、アエロパイラム属に属する微生物である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
該微生物が、アエロパイラム・ペルニックスである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
ヌクレオチドをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する、セリンホスホトランスフェラーゼ。
【請求項７】
ヌクレオチドがＡＴＰである、請求項６に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。
【請求項８】
アエロパイラム属に属する微生物に由来する、請求項６又は７に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。
【請求項９】
アエロパイラム・ペルニックスに由来する、請求項６又は７に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−ホスホセリンの製造方法に関する。より詳細には、ＡＴＰをリン酸供与体として使用して、セリンからＯ−ホスホセリンを製造する方法に関する。更に本発明は、ヌクレオチド、特にＡＴＰをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する新規なセリンホスホトランスフェラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｏ−ホスホセリンは、しみ・そばかすなどの色素沈着改善作用があるシステインや去痰作用があるカルボシステイン（システイン誘導体）の原料化合物として知られている。
【０００３】
従来、Ｏ−ホスホセリンの酵素的な合成としては、Propionibacterium shermanii由来
の酵素を、ピロリン酸をリン酸供与体としてセリンに作用させる方法が知られている（下反応式参照）。しかしながら、当該酵素を使用する反応において、リン酸供与体としてピロリン酸の代わりにヌクレオチド（例えばＡＴＰ）を使用すると、Ｏ−ホスホセリンは生成しない。
【数１】
2005160371.tif 000002
【０００４】
また、タンパク質中のセリン残基をＡＴＰ存在下でリン酸化する酵素が知られているが、この酵素では遊離しているセリンに対しては反応性を示さないことが分かっている。
【０００５】
一方、ＡＴＰをリン酸供与体としてホモセリンからＯ−ホスホホモセリンを合成する酵素として、ホモセリンキナーゼが知られているが、当該酵素は基質としてセリンを使用することができない。
【０００６】
このように、ヌクレオチドをリン酸供与体として、セリンからＯ−ホスホセリンを酵素反応により合成することは、これまでに知られていない。
【特許文献１】特公平７−１１４７００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明の目的は、従来にない新たな方法でＯ−ホスホセリンを製造する方法を提供することである。より詳細には、本発明は、ヌクレオチド、特にＡＴＰをリン酸供与体として、セリンからＯ−ホスホセリンを酵素反応によって製造する方法を提供することを目的とする。更に本発明は、ヌクレオチド、特にＡＴＰをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、ヌクレオチド、特にＡＴＰ
をリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する酵素（以下、これをセリンホスホトランスフェラーゼという）を新たに見出し、該酵素を用いることにより、従来にない新たな方法でＯ−ホスホセリンを製造できることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて、更に検討を重ねて完成されたものである。
【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げるＯ−ホスホセリンの製造方法を提供する。
項１．  ヌクレオチドの存在下でセリンに、セリンホスホトランスフェラーゼを作用させて、Ｏ−ホスホセリンを生成させることを特徴とする、Ｏ−ホスホセリンの製造方法。
項２．  ヌクレオチドがＡＴＰである、項１に記載の製造方法。
項３．  該セリンホスホトランスフェラーゼとして、該セリンホスホトランスフェラーゼを産生する微生物の菌体処理物、粗酵素、又は精製酵素を作用させる、項１又は２に記載の製造方法。
項４．  該微生物が、アエロパイラム属に属する微生物である、項３に記載の製造方法。項５．  該微生物が、アエロパイラム・ペルニックスである、項４に記載の製造方法。
【００１０】
更に、本発明は、下記に掲げるセリンホスホトランスフェラーゼを提供する。
項６．  ヌクレオチドをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する、セリンホスホトランスフェラーゼ。
項７．  ヌクレオチドがＡＴＰである、項６に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。項８．  アエロパイラム属に属する微生物に由来する、項６又は７に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。
項９．  アエロパイラム・ペルニックスに由来する、項６又は７に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。
【００１１】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のセリンホスホトランスフェラーゼは、ヌクレオチドをリン酸供与体として利用してセリンをリン酸化して、Ｏ−ホスホセリンを合成する酵素である（下反応式参照；該式には、ヌクレオチドとしてＡＴＰを用いた場合の反応式を示す）。
【数２】
2005160371.tif 000003
【００１３】
当該セリンホスホトランスフェラーゼとしては、アエロパイラム（Aeropyrum）属に属
する微生物が産生する酵素が挙げられる。当該酵素として、より具体的には、アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（JCM 9820）が産生する酵素を例示できる。
【００１４】
当該セリンホスホトランスフェラーゼは、上記微生物を通常の方法で培養することによって得ることができる。培養は液体培養であっても、或いは固体培養であってもよい。培養に使用する培地としては、当該微生物が良好に生育して該セリンホスホトランスフェラーゼを産生する適当な培地であれば特に制限されず、適当な炭素源、窒素源、無機塩、その他栄養源を含有する合成培地或いは天然培地を使用することができる。例えば、培地の炭素源としては、グルコース、スクロース、フラクトース、マルトース、グリセリン、デキストリン、オリゴ糖、デンプン、糖蜜、コーンスティープリカー、麦芽エキス、有機酸
等が挙げられる。また、窒素源としては、コーンスティープリカー、酵母エキス、各種ペプトン、大豆粉、肉エキス、フスマエキス、カゼイン、アミノ酸及び尿素等の有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩等の無機窒素源等が挙げられる。無機塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩及びその他の金属塩等が挙げられる。更に、その他の栄養源としては、ビタミン類、アミノ酸類、核酸類等が挙げられる。培養は、静置培養または通気撹拌培養などで行われる。培養温度は使用する微生物の種類によって異なるが、通常６０〜１００℃、好ましくは８０〜１００℃を例示できる。培養中、培地のｐＨが５〜９、好ましくは６〜８の範囲となるように、ｐＨ調整することが望ましい。培養時間は、通常１〜７日、好ましくは２〜５日である。
【００１５】
本発明では、上記セリンホスホトランスフェラーゼとして、前記のようにして得られる培養物から回収した上記微生物の菌体処理物をそのまま使用してもよいし、該微生物から単離した粗酵素又は精製酵素を使用してもよい。該菌体処理物としては、具体的には、超音波破砕物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、菌体のタンパク質画分等が挙げられる。該菌体処理物の一態様として、超音波破砕物の水溶性画分を硫安沈殿した後、透析することによって得られる菌体処理物を挙げることができる。また、該粗酵素又は精製酵素は、上記菌体処理物を通常酵素精製に用いられる方法、例えば塩析、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過または凍結乾燥等の方法により得ることができる。
【００１６】
また、上記セリンホスホトランスフェラーゼとして、上記菌体処理物、粗酵素又は精製酵素を適当な担体に固定化した固定化酵素を使用してもよい。
【００１７】
なお、上記セリンホスホトランスフェラーゼは、遺伝子組み換え技術を利用して調製した酵素であってもよい。
【００１８】
なお、アエロパイラム・ペルニックスは、ＤＮＡの全配列が明らかにされている。従って、アエロパイラム・ペルニックスが産生する該セリンホスホトランスフェラーゼのＮ末端側及びＣ末端側の一部のアミノ酸配列を同定し、そのデータをアエロパイラム・ペルニックスのＤＮＡの全配列に照合させることにより、該酵素をコードするＤＮＡ配列及びそのアミノ酸全配列を同定できる。これによって該酵素及びこれをコードするＤＮＡを取得することが可能である。
【００１９】
本発明で使用するセリンは、Ｄ体、Ｌ体の別を問うものではないが、好ましくはＬ−セリンである。
【００２０】
上記セリンホスホトランスフェラーゼのリン酸供与体は、ヌクレオチドをリン酸供与体として利用する。当該ヌクレオチドとしては、特に制限されないが、一例として、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＤＰ、ＧＤＰ等を挙げることができる。これらの中で好ましくはＡＴＰである。
【００２１】
本発明のＯ−ホスホセリンの製造では、ヌクレオチドの存在下で、セリンに上記セリンホスホトランスフェラーゼを作用させて、Ｏ−ホスホセリンを生成させる。Ｏ−ホスホセリンを生成させる反応は水性溶媒中で行われる。反応時の水性溶媒のｐＨとしては、使用する酵素の特性に応じて適宜設定すればよいが、例えば、６．５〜９、好ましくは７〜８．２、更に好ましくは７．５程度となる範囲を挙げることができる。
【００２２】
本発明のＯ−ホスホセリンの製造において、セリンは、水性溶媒中の初期濃度が、通常５〜１００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、更に好ましくは１０ｍＭ程度となるように、水性溶媒に添加すればよい。
【００２３】
また、リン酸供与体として使用するヌクレオチドは、該ヌクレオチドの種類によっても異なるが、種類水性溶媒中の初期濃度が、通常５〜１００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、更に好ましくは１０ｍＭ程度となるように、水性溶媒に添加すればよい。
【００２４】
上記セリンホスホトランスフェラーゼは、水性溶媒中に、例えば０．００５〜０．２Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは０．０１〜０．０２Ｕ／ｍｌとなるように添加して用いられる。なお、セリンホスホトランスフェラーゼの活性は、０．３ｍｌのHepes緩衝液（ｐＨ 7.5）を溶媒として、１０ｍＭセリン及び１０ｍＭ ＡＴＰ存在下で、８０℃で１分間反応を行った場合に、１μmolのホスホセリンを生成する
酵素活性を１Ｕとして表示する。
【００２５】
本発明のＯ−ホスホセリンの製造において、水性溶媒には、必要に応じて各種キレート剤、界面活性剤及び有機溶媒等を添加してもよい。
【００２６】
上記セリンホスホトランスフェラーゼを作用させる際の反応温度は、該酵素の特性に応じて、適宜設定することができるが、通常６０〜９５℃、好ましくは７０〜９５℃、更に好ましくは８０〜９０℃を挙げることができる。
【００２７】
反応時間としては、例えば１〜２４時間、好ましくは２〜５時間、更に好ましくは２〜３時間を挙げることができる。
【００２８】
上記の如く上記セリンホスホトランスフェラーゼをセリン及びヌクレオチドに作用させることにより、Ｏ−ホスホセリンを水性溶媒中に蓄積をさせることができる。
【００２９】
本発明のＯ−ホスホセリンの製造では、ヌクレオチドの存在下で、セリンに上記セリンホスホトランスフェラーゼを作用させて酵素反応を行うことにより、Ｏ−ホスホセリンを反応液中に蓄積をさせることができる。
【００３０】
得られたＯ−ホスホセリンの分離、精製は、イオン交換樹脂による処理、膜処理、有機溶媒による沈澱濃縮等の公知の方法により行うことができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のＯ−ホスホセリンの製造方法によれば、リン酸供与体としてヌクレオチド、好適にはＡＴＰを利用して、セリンからＯ−ホスホセリンを製造することができる。本発明は、従来にない新たな手法で、Ｏ−ホスホセリンを製造する方法を提供するものである。
【００３２】
本発明の方法は、リン酸供与体としてヌクレオチドを利用するため、菌体破砕後の核酸の分解物を原料として用いることができるといった点で利点がある。また、リン酸供与体として、ＡＴＰを使用する系では、菌体内においてＡＴＰ再生系酵素と共役して、ＡＴＰを再合成することができるという点でも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１
（１）アエロパイラム・ペルニックス菌体処理物の調製
アエロパイラム・ペルニックス（JCM 9820）を１Ｌ当たり37.4gのMarine broth2216と
１gのチオ硫酸塩を含有する液体培地に植菌し、９０℃で５０時間、通気攪拌培養を行っ
た。得られた培養液から、遠心分離により菌体を回収し、該菌体１ｇ（湿潤重量）を８０
ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭ Hepes-NaOH、０．２ｍＭピリドキサールリン酸、ｐＨ７
．５）に懸濁した。これを超音波破砕した後、遠心分離により、固形分を除去し、得られた上清に８０％となるように硫安を添加し、沈殿を生成させた。生じた沈殿を遠心分離により回収し、４ｍｌのバッファーＡに溶解してバッファーＡに対して透析を行い、得られた溶液をアエロパイラム・ペルニックス菌体処理物とした。得られた菌体処理物（液体状）は、０．００４４Ｕ／ｍｇのセリンホスホトランスフェラーゼ酵素活性を有していた。
【００３４】
（２）Ｏ−ホスホセリンの製造
０．３ｍｌの水性溶媒（０．１Ｍ Hepes-NaOH、０．２ｍＭピリドキサールリン酸、ｐ
Ｈ７．５）に、Ｌ−セリンを１０ｍＭ、ＡＴＰを１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2を２ｍＭ、及びア
エロパイラム・ペルニックス菌体処理物を４ｍｇ／ｍｌとなるように添加して、８０℃で２時間反応を行った。得られた反応液中のＯ−ホスホ−Ｌ−セリンをアミノ酸分析計によって分析した結果、反応液中にＯ−ホスホ−Ｌ−セリンが２．１ｍＭの濃度で蓄積していることが明らかとなった。
【００３５】
この結果から、ＡＴＰをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを酵素反応により製造できることが確認された。