(57)【要約】【課題】ヒト生体内で発現し、平滑筋弛緩活性を有する生理活性たんぱく質、ペプチド、およびこれらをコードする遺伝子を提供する。【解決手段】本発明の物質はヒト生体内、とくに胎盤、脱落膜、羊膜等の組織で発現し、平滑筋弛緩活性を有することが明らかになった。本発明の物質、およびそれらの発現の調節機構は、いまだ未解明な点の多い妊娠維持、分娩発来機構、またはそれらの破綻の現われとしての、流早産、妊娠中毒症、子宮内胎児仮死をはじめとするさまざまな病態生理の解明に有用である。更に、生体成分であることより、従来より用いられている医薬品に比べ、より安全性が高く、特異的作用を兼ね備えた医薬品の開発が可能となる。また、従来に無いアプローチによる診断薬、スクリーニング系の開発とあいまって、さまざまな疾患を早期に予防し治療することがはじめて可能となり、特に周産期管理の質の向上、母児のｗｅｌｆａｒｅに貢献するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規な平滑筋弛緩物質をコードする、配列表の配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号１の塩基配列を有する遺伝子によりコードされる配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするたんぱく質。
【請求項３】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するたんぱく質よりシグナルペプチドが切断されて生ずる配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とするたんぱく質。
【請求項４】
配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するたんぱく質が生体内で翻訳後修飾を受けた結果生ずるたんぱく質およびペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列の一部を部分構造に含んだ合成たんぱく質または合成ペプチド。
【請求項６】
配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項７】
配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するたんぱく質を発現する組換え体。
【請求項８】
配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有する組換え蛋白質。
【請求項９】
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の部分構造をもつ組換え蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒト生体内で発現する新規な平滑筋弛緩物質、およびその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
妊娠子宮は，種で定められた一定の妊娠期間中，胎児の発育とともに特徴的な一連の変化を遂げる。すなわち、胎児の発育にあせて子宮腔内の容積を増大させ，この間，胎児の排出，すなわち妊娠の早期終結に結びつく子宮収縮が抑制される。妊娠期間中，胎児の発育・子宮内容積の急速な増大とともに、子宮平滑筋は弛緩状態を維持するが、一方で、胎児を保護するために、一定のｔｏｎｕｓを保たなければならない。更に分娩開始とともに子宮平滑筋は規則的な収縮により、妊娠期間に比しきわめて短期間のうちに、胎児を含めた子宮内容物を排出する。子宮筋の収縮には子宮筋層内の母体血流の減少による胎児・胎盤血流の減少のｒｉｓｋを伴う。胎児を娩出するために、子宮筋の収縮は十分に強力でなくてはならない反面、胎児・胎盤血流の減少、胎児仮死を含めたさまざまな周産期合併症に結びつく、過度の子宮収縮が抑制されることが必要となる。分娩時の子宮筋は胎児の状態と密接に関連して、収縮状態と弛緩状態が巧妙に制御されなくてはならない。
【０００３】
このように妊娠−分娩にわたり，子宮平滑筋は弛緩状態と収縮状態が精緻にコントロールされており，この制御機構の破綻が臨床的には流早産，胎児仮死等のさまざまな周産期合併症と結びついている。
なかでも、子宮筋の弛緩は，種の存続のための第一条件のひとつである，一定の妊娠期間の維持、すなわち子宮内での胎児の一定の発育、発達の確保のためには必要不可欠である。
他方，子宮収縮は，胎盤血流の減少に伴う胎児血流、特に胎児脳血流の減少による胎児脳細胞の不可逆的なｄａｍａｇｅの一因となる可能性があり，分娩時にもっともそのｒｉｓｋが高い。子宮収縮は分娩時に見られる効率的な子宮内容物の排出、その他、妊娠期間中の子宮筋の一定のｔｏｎｕｓの保持に欠くことのできないものであるが、胎児発育および胎児のｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇの確保のためには、子宮筋の弛緩と相互に密接に影響しあって、表裏一体の如くｃｏｎｔｒｏｌされていることが推察される。
【０００４】
然るに，妊娠分娩期間の子宮平滑筋弛緩のメカニズムはいまだ未解明な点が多く残されている。子宮平滑筋弛緩物質として，・２  ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ａｇｏｎｉｓｔ，ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ（ＮＯ），ｃａｒｂｏｎｍｏｎｏｏｘｉｄｅ（ＣＯ），ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＮＰ），ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＧＲＰ）等があげられるが，いずれも単独あるいは組み合わせて作用させて妊娠時の子宮平滑筋の弛緩をｉｎ  ｖｉｖｏ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現することはできない。
【０００５】
子宮筋の収縮，弛緩作用の制御機構の破綻によりヒトでは早産，流産，子宮内胎児仮死等さまざまな周産期合併症が引き起こされる。
なかでも、早産は産婦人科臨床上最も携わることも多い疾患のひとつであり，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＩＶＦ）等のＡｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＲＴ）の飛躍的な進歩とあいまって、発育障害，発達障害等の早産児の重篤な合併症を含む、児の高いｍｏｒｔａｌｉｔｙ，ｍｏｒｂｉｄｉｔｙは周産期管理の上でもっとも深刻な課題の一つである。
【０００６】
然るに，子宮平滑筋の収縮，抑制機構の破綻として捉えられる早産の病態生理が明らかになっていない現在，その予防，治療を含めた周産期管理は病態に即した特異的なものとはいえない。現在，臨床の場でひろく早産の治療に用いられている薬剤は、塩酸リトドリン、硫酸マグネシウム、インドメサシンの３剤であり，いずれも平滑筋弛緩作用を有するが、早産治療の有効性は不十分な点が多く、同時に高頻度に出現する副作用が間題となる。なかでも、塩酸リトドリンはβ２アドレナリン受容体刺激作用による平滑筋弛緩薬で、３剤のなかで最も多く使用されているが、同時に併せもつ、β１アドレナリン受容体刺激作用による心悸充進、頻脈などはほぼ必発である。また、肺水腫により母体死亡にいたる重篤な副作用の出現が問題となっている。さらにそのうえ、欧米の複数のｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓによると、早産抑制効果についても、４８時間以上の妊娠延長効果を認めないと結論されている。インドメサシンは胎児、新生児への重篤な副作用のため、日本では現在使用禁忌となっている。
【０００７】
また、妊娠、分娩時の子宮収縮、あるいは胎児胎盤血管系の収縮、スパスムなどをふくめた、さまざまな要因に伴う胎児、胎盤血流の減少により、胎児仮死、脳性まひ、胎児死亡等の重篤な胎児合併症が引き起こされるが、現状の周産期管理は決して満足できるものでない。
【０００８】
さらに、血管平滑筋の収縮、スパスムを病態生理のひとつとする妊娠中毒症は胎盤早期剥離、子癇、さらには母体死亡にも結びつききわめて重篤な疾患である。また子宮内胎児発育遅延、子宮内胎児仮死、子宮内胎児死亡等、児にも重篤な帰結をもたらす周産期合併症である。現在、妊娠中毒症の病態の多くは未解明であり、治療手段も限られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、生体内より新規の平滑筋弛緩物質を同定することにより，いまだ未解明な点の多いヒトの妊娠維持および分娩発来機構を解明することが可能となる。あわせて、流産，早産，妊娠中毒症、子宮内胎児仮死等のさまざまな周産期合併症の病態生理が詳らかになることが期待される。病態に即した適切な周産期管理により，母体死亡、胎児・新生児死亡、胎児・新生児の発育・発達・機能障害にいたるさまざまな周産期合併症を早期に予知し、回避することができる。
係るに，本発明者らは鋭意努力を重ねた結、標的臓器である子宮筋に空間的にも機能的にも密接する胎、脱落膜、羊膜中より、新規平滑筋弛緩物質を単離、同定することにより本発明を完成させた。すなわち，本発明は平滑筋弛緩物質をヒト生体組織より単離し、たんぱく質のアミノ酸配列を提供すること，そのたんぱく質をコードする遺伝子の塩基配列を提供すること、その遺伝子の塩基配列を含有する発現ベクターを提供すること，そのたんぱく質を発現する組換え体を提供すること，および平滑筋弛緩活性を有する、その組換えたんぱく質およびそのペプチドフラグメントを提供することを目的とする。
【０００１０】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明の要旨は、平滑筋弛緩活性を有するたんぱく質、ペプチドをコードする配列表の配列番号１の配列を有する遺伝子であり、また配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するたんぱく質である。また、それらのたんぱく質が生体内で翻訳後修飾を受けた結果生ずる、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するたんぱく質を含むたんぱく質、生理活性ペプチドである。または、それらのたんぱく質、ペプチドのアミノ酸配列の一部を部分構造に含んだ合成化合物である。
▲１▼  新規な平滑筋弛緩物質をコードする、配列表の配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
▲２▼  配列表の配列番号１の塩基配列を有する遺伝子によりコードされる配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするたんぱく質。
▲３▼  配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するたんぱく質よりシグナルペプチドが切断されて生ずる配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とするたんぱく質。
▲４▼  配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するたんぱく質が生体内で翻訳後修飾を受けた結果生ずるたんぱく質およびペプチド。
▲５▼  配列表の配列番号２のアミノ酸配列の一部を部分構造に含んだ合成たんぱく質または合成ペプチド。
▲６▼  配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子を含有する発現ベクター。
▲７▼  配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するたんぱく質を発現する組換え体。
▲８▼  配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有する組換え蛋白質。
▲９▼  配列表の配列番号３のアミノ酸配列の部分構造をもつ組換え蛋白質
【０００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の物質はヒトの生体内に存在し、新規な平滑筋弛緩作用を有する生理活性物質、およびそれをコードする遺伝子であり、生体組織から精製・単離することができる。原料となる生体組織としては、本発明の物質を含有する組織であれば特に限定されないが、特に胎盤、脱落膜、羊膜中に多く存在することから、それらの組織が好適に使用される。原料となる生体組織は、変性、分解などを防止する目的で冷凍状態で保存するのが好ましい。
【０００１２】
好ましい分離・精製操作の一例を示すと、原料となるヒト胎盤、脱落膜、羊膜組織は娩出後直ちに液体窒素で凍結したものを使用するのが好ましく、特願２０００−４０５０７６で示した如く、本発明の物質を得ることができる。
【００１３】
上記の原料からの本発明の物質をコードする遺伝子の構造決定は、分子生物学で一般的に用いられる各種方法と、ヒトゲノムのＤｒａｆｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅにコンピュータープログラムを用いてさまざまな解析を行った結果を組み合わせるという、新しい手法により行うことができる。
【００１４】
これらにより、本発明者等は、ヒト胎盤中に新規な平滑筋弛緩活性を有する生理活性物質を特定し、それをコードする遺伝子の構造を決定することに成功した。そして、本発明による遺伝子の発現、およびその遺伝子のコードするたんぱく質およびそのたんぱく質が生体内で翻訳後修飾を受けた結果生ずるたんぱく質およびペプチドにより、平滑筋の弛緩作用を含んだ複雑な生体機能が調節されていることが明らかになった。
なお，本発明の物質は，前記各請求項で特徴付けられる限り，その由来および製法は限定されるものではなく，いかなる由来および製法（化学的方法，遺伝子工学的方法を含め）により得られたものでも本願発明に包含される。
【００１５】
したがって、具体的には、本発明の物質により、いまだ未解明な点の多い、ヒトの妊娠維持および分娩発来機構、また不育症、不妊症を含めて広い意味で捉えた流産、または早産等の病態生理を解明することが可能となる。さらに血管平滑筋の収縮、スパスムが病態生理のひとつである妊娠中毒症、子癇、さらには胎盤早期剥離、また、子宮内胎児発育遅延、子宮内胎児仮死、子宮内胎児死亡、その他、遷延分娩、過強陣痛、弛緩出血等を含めて、母児に重篤な帰結をもたらす多くの周産期合併症の病態が明らかになる。また、本発明の物質は、妊娠、分娩、産褥期の多くの病態における医薬品として開発することが可能である。
なお、本発明のペプチドは、前記、各請求項で特徴付けられる限り、その由来及び製法は限定されるものではなく、如何なる由来及び製法（化学的方法、遺伝子工学的方法を含め）により得られたものでも本発明に包含される。
【００１６】
発明の物質はヒト子宮筋を含めた平滑筋弛緩作用を有するため、現在広く臨床の場で用いられている塩酸リトドリンなどに比べて、特異的にヒト子宮筋を弛緩させる、より安全かつ生理的な流早産防止薬として開発することが可能である。すなわち、特異的な子宮収縮抑制作用により、長期間にわたる流早産抑止が期待される。同時に、より強力な子宮収縮抑制作用により、従来よりさらに流早産の進行した状態での陣痛抑制が可能となり、早産、未熟児のさまざまな合併症の予防につながる。同時に、肺水腫等につながる母体への重篤な副作用は回避される。また、本発明の物質の化学構造を修飾することにより獲得される物質も同様に、より安全で生理的かつ特異的な作用を備えた流早産防止薬の開発を可能とするものである。また一方で、微弱陣痛による遷延分娩、過強陣痛、弛緩出血のような子宮筋の収縮異常を病態のひとつとする異常分娩の治療薬としての開発を可能とするものである。
【００１７】
また、妊娠、分娩時の子宮収縮、あるいは胎児胎盤血管系の収縮、スパスムなどをふくめた、さまざまな要因に伴う胎児、胎盤血流の減少により、胎児仮死、脳性まひ、胎児死亡等の重篤な胎児合併症が引き起こされるが、本発明の物質は平滑筋弛緩作用を有するため、それらを回避する有効な治療手段として開発することが可能となる。
【００１８】
妊娠中毒症は胎盤早期剥離、子癇、さらには母体死亡、また子宮内胎児発育遅延、子宮内胎児仮死、子宮内胎児死亡等、母児に重篤な帰結をもたらす周産期合併症である。妊娠中毒症は血管平滑筋の収縮、スパスムを病態生理のひとつとしており、本発明の物質によりその詳細が解明されることが期待される。さらに、本発明の物質により、特異的な妊娠中毒症の治療薬を開発することが可能となる。
【００１９】
診断薬、スクリーニング系としての可能性としては、以下の如くである。
本発明の物質及びその化学構造を修飾することにより獲得される物質が、周産期における様々な病態の診断薬、あるいはスクリーニング系として開発されることが可能である。まず第一に、本発明の物質及びその化学構造を修飾することにより得られる物質は、流早産予知、予後判定に関する診断薬、あるいはスクリーニング系として用いられる可能性をもつ。一方、分娩開始予知、あるいは分娩の進行状態の予測に関する診断薬、スクリーニング系として応用されることが可能である。さらには、微弱陣痛による遷延分娩、過強陣痛、弛緩出血のような子宮筋の収縮異常を病態のひとつとする異常分娩の予知のための診断薬あるいはスクリーニング系としての開発の可能性を持つ。
また、妊娠、分娩時の子宮収縮、あるいは胎児胎盤血管系の収縮、スパスムなどをふくめた、さまざまな要因に伴う胎児、胎盤血流の減少により引き起こされる、胎児仮死、脳性まひ、胎児死亡等の重篤な胎児合併症を未然に予防するための診断薬、あるいはスクリーニング系としての開発の可能性を持つ。
また、妊娠中毒症をはじめとした多岐にわたる血管病変の診断薬あるいはスクリーニング系としての開発の可能性を持つ。
現時点で、このような診断薬、あるいはスクリーニング系に有効なものは無い。
【００２０】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
ＲＮＡの抽出は以下の方法により行った。正常分娩後自然娩出された胎盤より、絨毛組織、脱落膜組織、羊膜を採取し、直ちに液体窒素にて凍結した。ＲＮＡの抽出はＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．等の方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９，１９８７）によった。凍結組織をＴｒｉｚｏｌ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中にてＰｏｌｙｔｒｏｎでｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅし、上清画分より全ＲＮＡをえた。
【００２１】
全ＲＮＡより逆転写反応によるＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成はＬｉｆｅ  Ｔｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）により行った。キットの使用説明書に従い、約３μｇｒｍの全ＲＮＡよりＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを得た。
【００２２】
３’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）に用いたＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の３’ＲＡＣＥキットにより行った。使用説明書に従い，上記の全ＲＮＡより３’ＲＡＣＥ反応のＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを得た。
【００２３】
得られたＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として以下に示すそれぞれのプライマーによりＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、遺伝子の構造を決定した。プライマーの塩基配列を決定するため、特願２０００−４０５０７６において特定されるペプチドをコードする遺伝子の構造の予測をコンピュータープログラムを用いて行った。
【００２４】
インターネットを用いたＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）プログラムによって、特願２０００−４０５０７６において示されたアミノ酸配列をコードする塩基配列とその存在部位がヒト１２番染色体上に特定された。
【００２５】
上記で特定される塩基配列を含んだヒト１２番染色体の約７０００ｂｐにわたる遺伝子領域において、コンピューターによる遺伝子予測プログラムによる遺伝子の予測を行った。遺伝子予測プログラムとして、インターネットによりＢＣＭ（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＦＧＥＮＥＳを用いたところ、特願２０００−４０５０７６において特定されるペプチドをコード領域に含む、５Ｅｘｏｎより構成される３３３ｂｐの遺伝子が予測された。
【００２６】
予測された遺伝子の第１Ｅｘｏｎと第５Ｅｘｏｎの配列よりそれぞれ配列表の配列番号５および配列番号６で示したＳｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ，Ａｎｔｉ−ｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒを設定し、絨毛組織、脱落膜組織、羊膜より得られたＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＥｘＴａｑを用い、反応液の組成は使用説明書に従った。ＰＣＲはＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用い、９４℃３０秒，５５℃３０秒７２℃６０秒を１サイクルとし３０サイクル行った。２％アガロースによりＰＣＲ産物の一部を電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で目的産物の確認をしたが、ゲル上で明らかなバンドが確認できなかったため、初回ＰＣＲ産物の１／１００量を再度、９４℃３０秒，５７℃３０秒，７２℃６０秒を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応にて、同一のプライマー対を用いて増幅した。
【００２７】
２％アガロースによりＰＣＲ産物の一部を電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で目的産物の確認をしたところ、ゲル上で約３００ｂｐに相当する部分にバンドが確認できたため、塩基配列の決定を行うためＰＣＲ産物のサブクローニングを行った。
【００２８】
ＰＣＲ産物のサブクローニングは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔを用いた。ＰＣＲ産物より未反応のプライマーを除去し、キットの使用説明書に従いｐＧＥＭ−Ｔ  ＶｅｃｔｏｒにＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇを行った。Ｔ４−ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅによるｏｖｅｒｎｉｇｈｔのｌｉｇａｔｉｏｎ反応の後、ＪＭ  １０９  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌへｔｒａｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。ＬＢ寒天培地上で一晩培養し，倍地上のコロニーよりｃｏｌｏｎｙＰＣＲによりｉｎｓｅｒｔの確認を行った。
【００２９】
Ｉｎｓｅｒｔの確認されたコロニーを一晩液体培養し、Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ法にてプラスミドを抽出し後、塩基配列を決定した。塩基配列の解析にはＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。
【００３０】
塩基配列を解析することにより、遺伝子予測プログラムのＦＧＥＮＥＳにより予測された遺伝子が非腫瘍のヒト正常組織中に存在することが初めて実験的に示された。
【００３１】
５’非翻訳領域の塩基配列の決定は以下の方法によった。
ヒトゲノムのＤｒａｆｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅにおいて、遺伝子予測プログラムのＦＧＥＮＥＳにより予測された遺伝子の開始コドンの上流の塩基配列が一義的に特定されるが，その中で開始コドンとコドンの読み枠の一致するｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎを特定し、その更に５’側上流に配列表の配列番号７で示されるＳｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを設定した。配列表の配列番号６と配列表の配列番号８で表されるＡｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを遺伝子のアミノ酸コード領域内に設定した。
【００３２】
配列表の配列番号７で示されるＳｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒと配列表の配列番号６で表されるＡｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用い，ヒト胎盤組織由来のＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として、９４℃３０秒，５５℃３０秒７２℃６０秒を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。２％アガロースによりＰＣＲ産物の一部を電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で目的産物の確認をしたが、ゲル上で明らかなバンドが確認できなかったため、初回ＰＣＲ産物の１／１００量を、配列表の配列番号８で表されるＡｎｔｉ−ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒと、初回ＰＣＲのＳｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとの間でＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲは初回ＰＣＲと同一条件とした。
【００３３】
ＰＣＲ産物の一部を２％アガロースにより電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で目的産物の確認をしたところ、ゲル上で単一バンドの増幅が確認できたため、既述の方法に従い、塩基配列の決定を行った。
【００３４】
得られた塩基配列より、開始コドンとｉｎ  ｆｒａｍｅで読み枠の一致するｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎを２ヶ所含む５’非翻訳領域の塩基配列が特定された。
【００３５】
３’非翻訳領域の塩基配列を決定するため、３’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を行った。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓを用い、キットの使用説明書に従い、ヒト胎盤組織より得られた全ＲＮＡからＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡの合成を行った。配列表の配列番号５で示されるＳｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒをアミノ酸コード領域内に設定し、９４℃３０秒，５５℃３０秒７２℃６０秒を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲにて３’非翻訳領域を増幅した。更に配列表９で示されるＳｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒをアミノ酸コード領域内に設定しＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにて３’非翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で目的産物の確認をしたところ、ゲル上で増幅産物のバンドが確認できたため、既述の方法に従い、塩基配列の決定をおこなった。得られた塩基配列よりｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎに続く３’非翻訳領域の塩基配列を決定した。
【００３６】
発現ベクター、組換え体の作成はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＬＩＣ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用い、以下の方法によった。
【００３７】
前述した３’非翻訳領域の塩基配列を決定するために作成したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡより、配列表の配列番号７で示される５’非翻訳領域内のＳｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒと，キットに付属する３’ＲＡＣＥ用のＡｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用い、９４℃３０秒５５℃３０秒７２℃６０秒を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行った。２％Ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌによりＰＣＲ産物の一部を電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で目的産物の確認をしたが、ゲル上で明らかなバンドが確認できなかったため、６００ｂｐより７００ｂｐに相当する部分のゲルを切り出しＤＮＡを抽出して、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにて、３’，５’非翻訳領域を含む６２１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは初回ＰＣＲと同一条件とした。ＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で目的産物の確認をしたところ、予想される６２１ｂｐに相当する増幅産物のバンドが確認できた。
【００３８】
キットの使用説明書により、５’端にベクター特異的な配列を付加した配列表の配列番号１０で示されるＳｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒを設定し、同様に３’端にもベクター特異的な配列を付加した配列表の配列番号１１で示されるＡｎｔｉ−ｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒを設定した。
これらのプライマー対を用いて、前述のＰＣＲ産物の１／１００量を用いて、配列表の配番号１の塩基配列のアミノ酸をコードする領域の全長を増幅した。ＰＣＲは初回ＰＣＲと同一条件とした。ＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で目的産物の確認をしたところ、ゲル上で予想される３５９ｂｐに相当する増幅産物のバンドが確認できた。
【００３９】
さらに、５’端にベクター特異的な配列を付加した配列表の配列番号１２で示されるＳｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒを設定し、配列番号１１で示されるＡｎｔｉ−ｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒとともに上記のＰＣＲ産物の一部を用いて、配表の配列番号４で示されるＤＮＡの領域を増幅した。
【００４０】
増幅された、３’、５’両端にベクター特異的な配列を持つＰＣＲ産物の一部を、キットの使用説明書に従い、酵素処理によりｐＣＡＬ−ｎ−ＦＬＡＧ  ｖｅｃｔｏｒのクローイングサイトに挿入し、発現ベクターを得た。サブクローニングして、挿入された塩基配列に変異、フレームシフトがないことをＤＮＡシークエンサーにより確認した。
【００４１】
キットの使用説明書により、発現ベクターをＢＬ２１発現細胞にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎすることにより、配列表の配列番号３で示されるたんぱく質を発現する組換え体を得た。
【００４２】
発現大腸菌細胞を５０ｍｌのＬＢ培養液中で３７℃、一晩振とう培養した後、５００ｍｌのＬＢ培養液中で本培養した。Ｏ．Ｄ．値が０．５から０．６になった時点で、発現たんぱく質を誘導するためにＩＰＴＧを添加し、３７℃，３時間浸透培養を続けた。その後、遠心にて大腸菌を集菌した後、３０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ，Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ，ＮａＣｌ；１０ｍＭ，β−ｍｅｒｃａｐｔｏ−−ｅｔｈａｎｏｌ；１．０ｍＭ，ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ；１．０ｍＭ，Ｉｍｉｄａｚｏｌ；２ｍＭ，ＣａＣｌ）に懸濁し、超音波ホモジナイザーにてホモジナイズした。遠心にて得られた上清を、キットの記載にしたがってｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎにより精製した。Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析したところ、ゲル上で予想される分子量のたんぱく質の単一のバンドが得られた。
【００４３】
発現した融合たんぱく質よりタグ配列を切断するため、バッファー交換した後、エンテロキナーゼと室温で２０時間反応させた。キットの記載どうりにＳＴＩ−ａｇａｒｏｓｅとｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎにより，エンテロキナーゼとｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎを除いて，配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有する組換え蛋白質を含有する最終精製品を得た。
【００４４】
得られた最終精製品より、以下に述べるマグヌス実験で平滑筋弛緩活性を確認した。
妊娠２１日目のＳＤ系ラットをエーテル吸入にて安楽死させ、子宮を摘出し、Ｋｒｅｂｓ液（ＮａＣｌ，１２０ｍＭ；ＫＣｌ，４．７ｍＭ；ＣａＣｌ２，２．５ｍＭ；ＭｇＣｌ２，１．２ｍＭ；ＮａＨＣＯ３，２５．０ｍＭ；ＫＨ２ＰＯ４，１．２ｍＭ；Ｇｌｕｋｏｓｅ，１４．０ｍＭ）中、４℃で保存した。摘出した子宮より、幅約５ミリメートルのリング状標本を作成した。
【００４５】
４．５ｍｌのクレブス液のはいった、３７℃に加温した浴槽にサンプルを入れ、２本の金属のフックでリング状の標本を固定した。クレブス液は５％ＣＯ２ガスで持続的に通気した。フックの一方は固定し、他方はトランスジューサー（Ｄｙｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｒａｎｄｕｃｅｒ  Ｔｙｐｅ  ＵＬ−２０ＧＲ，ミネベア株式会社）及び増幅器（ＤＳＡ−６０３型動ひずみ測定器、ミネベア株式会社）に接続してペンレコーダー（ＬＲ４２００，横河電気株式会社）により等尺性の収縮を記録した。
【００４６】
図１は，０．１５ｇｒｍの前負荷をかけて、自発収縮が収まった後、１．０７ｎＭのオキシトシンを添加した際の子宮収縮を示す。律動的な収縮が認められた。
浴槽よりクレブス液でオキシトシンを洗い流した後、約１０ｎＭの組換え蛋白質を含む最終精製品を加え、５．５分後に１．０７ｎＭのオキシトシンを加えた場合の収縮を図２で示す。オキシトシン単独投与に比べ、子宮収縮が著明に抑制されていることが示された。
浴槽をクレブス液で洗浄し組換え蛋白質とオキシトシンを洗い流した後、１．０７ｎＭのオキシトシンを単独に加えた際、図１と同様の律動的な収縮が認められ、組換え蛋白質による収縮抑制が可逆的であることが示された。
【００４７】
他の子宮筋標本で０．５ｇｒｍの前負荷をかけ、１．０７ｎＭのオキシトシンを添加した際の子宮では、同様に図３に示すような収縮を認めた。浴槽よりクレブス液でオキシトシンを洗い流して１．０７ｎＭのオキシトシンを加え、１分後に約５０ｎＭの組換え蛋白質を含有する最終精製品を加えた場合、明らかな子宮収縮抑制を認めた。（図４）。
なお、コントロールとして、組換え蛋白質を溶解したバッファーのみを浴槽に添加し場合、オキシトシンの子宮筋収縮に対する影響は認めなかった。
【００４８】
本発明の生理活性物質による平滑筋弛緩作用が明らかとなった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明は、ヒト生体内で発現する新規な平滑筋弛緩作用を有する生理活性物質、及びそれをコードする遺伝子に関し、いまだ未解明な点の多い妊娠維持、分娩発来機序をはじめとした生体機能の多岐にわたる維持調節機構、またその破綻として捉えられる、流早産、妊娠中毒症、胎児・新生児仮死等をはじめとしたさまざまな疾患の病態生理の解明に有用である。更に、生体成分であることより、従来より用いられている医薬品に比べ、より安全性が高く、特異的作用を備えた医薬品の開発が可能となる。また、従来に無いアプローチによる診断薬、スクリーニング系の開発とあいまって、さまざまな疾患を早期に予防し治療することがはじめて可能となり、特に周産期管理の質の向上、母児のｗｅｌｆａｒｅに貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  １．０７ｎＭのオキシトシン添加による妊娠ラット子宮筋の収縮。
【図２】  約１０ｎＭの組換え蛋白質を加え、５．５分後に１．０７ｎＭのオキシトシンを添加した場合の妊娠ラット子宮筋の収縮。
【図３】  他の妊娠ラット子宮筋標本で、１．０７ｎＭのオキシトシンを添加した場合の子宮筋収縮。
【図４】  １．０７ｎＭのオキシトシンを加え、１分後に５０ｎＭの組換え蛋白質を添加した際の妊娠ラット子宮筋の収縮。
【００５０】
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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