(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、塩基配列の検査、とりわけＳＮＰ及びプロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査を簡便にしかも精度よく、多数検体を効率よく検査できる方法を提供することである。【解決手段】  被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマー（以下、本プライマーを検出用プライマーと定義する。）を被検核酸試料にハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を行い、特定の塩基配列に対応してプライマー伸長反応が起こるか否かを検出するに当たり、プライマー伸長反応の生成物を該生成物に特異的に結合しうる結合対と結合させる方法を導入して検出することで簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる塩基配列又は変異の検査方法を提供する。【選択図】  【図２】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中に含まれる塩基配列又は変異を検査する方法であって、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマー（以下、本プライマーを検出用プライマーと定義する。）を被検核酸試料にハイブリダイズさせる工程並びに基質とポリメラーゼによりプライマー伸長させる工程、及びプライマー伸長反応の生成物を該生成物に特異的に結合しうる結合対と結合させる工程を導入することにより特定の塩基配列に対応してプライマー伸長反応または増幅反応が起こるか否かを検出する工程を組み合わせることを特徴とする塩基配列又は変異の検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の検査方法において、検出用プライマーが標識されているプライマーを用い、その３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させる工程を導入する検査方法。
【請求項３】
請求項１に記載の検査方法において、検出用プライマーの３´末端側に特定の塩基の５´側に隣接する塩基に相補的な標識連鎖終止ヌクレオチドが取り込まれるか否かを、検出用プライマー伸長反応物と特異的に結合しうる結合対と結合させて検出する検査方法。
【請求項４】
請求項１に記載の検査方法において、２本鎖核酸を試料とし、標識されている検出用プライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記検出用プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズする前記検出用プライマーとは異なる非標識のプライマーを組み合わせて用い、該検出用プライマーの３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させて検出する検査方法。
【請求項５】
請求項１に記載の検査方法において、２本鎖核酸を試料とし、検出用プライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズする前記プライマーとは異なる標識したプライマーを組み合わせて用い、該標識プライマーの３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させて検出する検査方法。
【請求項６】
請求項１に記載の検査方法において、プライマーの３´末端側にプライマー伸張した核酸断片とその塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを結合させることにより２本鎖核酸を形成させ、その形成の有無をインターカレーションにより検出する検査方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の検査方法において、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー伸長反応前のプライマーと特異的に結合しうる結合対のいずれか一方を固定化した多孔性担体及び他の一方を固定化した信号検出しうる物質又は担体を組み合わせて用いることにより、プライマー伸長した核酸断片を多孔性担体及び信号検出しうる物質又は担体に結合させ、多孔性担体上の信号を検出する検査方法。
【請求項８】
正常型又は変異型をそれぞれ又はそれらを組み合わせて検査する請求項１〜７に記載の検査方法。
【請求項９】
請求項７及び８に記載の方法を用いて正常型及び変異型を組み合わせて検査する方法であって、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを信号検出しうる物質又は担体に固定化し、検出用プライマーを正常型及び変異型で異なる物質で標識した検出用プライマーを用い、該プライマーのそれぞれの標識物質と特異的に結合しうる物質を多孔性担体上に、お互いが平行或いは交差上になるように配置して固定化した装置を用いる検査方法。
【請求項１０】
複数の遺伝子又は核酸の塩基配列又は変異を検査する請求項１〜９に記載の検査方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の検査方法に用いる検査試薬、検査装置、又は検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸試料中に含まれる特定の塩基配列の検査方法および試薬に関するものであり、とりわけ１塩基置換（ＳＮＰ）及びプロモーター領域に見られる特定塩基の繰り返し配列の検査方法及び検査試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子変異には、数塩基の繰り返し配列の反復数の増減によるマイクロサテライトの変異、数塩基の挿入や欠失による変異、ＳＮＰ等があることはよく知られている。ＳＮＰは遺伝子のうち、特に蛋白質翻訳領域に高頻度に見つかるため疾患との関連など臨床的意義が大きい。未知のＳＮＰを探索するには、直接塩基配列をシーケンスする方法が主に行われている。一方既知のＳＮＰを検査する方法は、種々の方法が提唱されている（例えば、非特許文献1等）。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法(特許文献1及び２)は遺伝子増幅法を利用した変異の検出方法としてよく知られている。この方法では、プライマーの末端塩基がＳＮＰの塩基になるように設計された正常型プライマーと変異型プライマーを用意し、検体と２つのプライマーをそれぞれ別々にＰＣＲし、どちらが増幅するかにより判定する。しかし、この方法では非特異が多く出現するなどの問題があった。
【０００４】
ＰＣＲ増幅産物に制限酵素を作用させ、ＳＮＰのタイプにより、増幅産物が切断さ
れるか否かを電気泳動によって確認、判定する方法では、検体の増幅後、増幅反応に
使用したＤＮＡポリメラーゼ(酵素)や未反応のプライマーは制限酵素との正常な反応を妨げる虞があるため、これらを除去する必要があり、さらに制限酵素は、既存の酵素から調べたい遺伝子配列の認識に最適なものを選択するが、現在の技術では全ての遺伝子配列と整合する酵素を設計することは困難で、例えばいずれの制限酵素でも検体が切断されない等の問題がかなりの確率で発生することが知られている。
【０００５】
検体をＰＣＲで増幅しながら、正常型と変異型の２種類のＳＮＰを含むプライマーと別々にプローブ反応させ、どちらのタイプのプローブが反応するかで判定するタックマン法や、ＰＣＲ反応を用いずにＳＮＰを検出する方法で、検体に対しミスマッチ部分(フラップ配列)とＳＮＰ配列を含むシグナルプローブとＳＮＰ部分がオーバーラ
ップするインベーダーオリゴを結合させた後、クリーベイスと呼ばれる特別な酵素を作用させ、シグナルプローブのＳＮＰ塩基が検体配列と同じ時だけ、この酵素でフラップ配列が切断され、切断されたフラップ配列は、シグナルを生成するＦＲＥＴプローブにインベーダーオリゴとなって作用し、発生する蛍光シグナルを検出するインベーダー法等も知られている。
【０００６】
特許文献３には変異部位に相補的な標識連鎖終止ヌクレオチドを取り込ませること
により、その標識連鎖終止ヌクレオチドの有無を検出する技術が開示されている。こ
の方法は、検体をＰＣＲ等で増幅後、検出する塩基の一つ手前の塩基に結合するように設計されたプライマーを用い、ポリメラーゼによる伸長反応により検出部位に標識連鎖終止ヌクレオチドが取り込まれるか否かを検出する方法である。この方法は汎用されている装置で測定できるといった利点はあるが、１塩基のみの変異を識別することから前述のＰＣＲ法と同様に特異性に劣るといった欠点があった。さらに、伸長反応の前処理として、検体のＰＣＲで用いた基質を完全にアルカリホスファターゼ等により除去しなければならないといった問題もあった。
【０００７】
特許文献４には、化学発光によりプライマー伸長反応の有無を検出することによる
遺伝子変異検査の技術が開示されている。この方法は、変異検出用プライマーの３´末端近傍に人工ミスマッチを入れることにより特異性を高めており、しかもホモジニアスな検出方法であるが、検体をＰＣＲにより増幅させると同時にプライマーの伸長反応を化学発光により検出することは、ルシフェラーゼやルシフェリンが熱に不安定であるため困難である。ＰＣＲ増幅後、ポリメラーゼ反応により生成するピロリン酸
を発光により測定するには、ＰＣＲ増幅で生成した内因性のピロリン酸を予めアルカリホスファターゼで分解しておく必要があるなどの前処理や、複数の酵素が必要となる。さらに発光測定の専用装置が必要である。
【０００８】
特許文献５によれば、プライマーの３´末端から２番目のヌクレオチドを検査部位
に対応させ、さらにその１塩基上流部位に人エミスマッチを挿入したプライマーを用
いるプライマー伸長法が開示されている。この方法は特別な酵素や機器を必要とせず、
汎用性があり優れた方法であるが、プライマーの３´末端が被検核酸と相補的であるため、検出部位に変異がある場合でも、用いるポリメラーゼの種類によってはプライマー仲長反応が起きる虞があった。さらに、この方法ではゲノム遺伝子のプロモーター領域のＴＡリピートのような特定塩基配列の繰り返し配列における欠失や挿入を検査しようとした場合に、プライマーの３´末端が必ずしも被検核酸の塩基と相補ならない場合が起こり、この発明の本質である３´ヌクレアーゼ活性に対する耐性効果が得られないといった問題があり、この方法はＳＮＰの検査に限られる。
【非特許文献１】検査と技術、増刊号、（２００２）、３０，９９１−９９５
【特許文献１】特公平４−６７９６０号
【特許文献２】特公平４−６７９５７号
【特許文献３】特開平１１−１０３８９４号
【特許文献４】特開２００２−１０１８９９号
【特許文献５】ＷＯ０１／４２４９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、塩基配列の検査、とりわけＳＮＰ及びプロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査を簡便にしかも精度よく、多数検体を効率よく検査できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＳＮＰの検査を簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる方法を鋭意研究した。被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマー（以下、本プライマーを検出用プライマーと定義する。）を被検核酸試料にハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を行い、特定の塩基配列に対応してプライマー伸長反応が起こるか否かを検出するに当たり、プライマー伸長反応の生成物を該生成物に特異的に結合しうる結合対と結合させる方法を導入して検出することで簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる塩基配列又は変異の検査方法を提供することが可能なった。
【００１１】
本発明は以下の構成からなる。
１、核酸試料中に含まれる塩基配列又は変異を検査する方法であって、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマー（以下、本プライマーを検出用プライマーと定義する。）を被検核酸試料にハイブリダイズさせる工程並びに基質とポリメラーゼによりプライマー伸長させる工程、及びプライマー伸長反応の生成物を該生成物に特異的に結合しうる結合対と結合させる工程を導入することにより特定の塩基配列に対応してプライマー伸長反応または増幅反応が起こるか否かを検出する工程を組み合わせることを特徴とする塩基配列又は変異の検査方法。
２、前記１に記載の検査方法において、検出用プライマーが標識されているプライマーを用い、その３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させる工程を導入する検査方法。
３、前記１に記載の検査方法において、検出用プライマーの３´末端側に特定の塩基の５´側に隣接する塩基に相補的な標識連鎖終止ヌクレオチドが取り込まれるか否かを、検出用プライマー伸長反応物と特異的に結合しうる結合対と結合させて検出する検査方法。
４、前記１に記載の検査方法において、２本鎖核酸を試料とし、標識されている検出用プライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記検出用プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズする前記検出用プライマーとは異なる非標識のプライマーを組み合わせて用い、該検出用プライマーの３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させて検出する検査方法。
５、前記１に記載の検査方法において、２本鎖核酸を試料とし、検出用プライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズする前記プライマーとは異なる標識したプライマーを組み合わせて用い、該標識プライマーの３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させて検出する検査方法。
６、前記１に記載の検査方法において、プライマーの３´末端側にプライマー伸張した核酸断片とその塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを結合させることにより２本鎖核酸を形成させ、その形成の有無をインターカレーションにより検出する検査方法。
７、前記１〜６に記載の検査方法において、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー伸長反応前のプライマーと特異的に結合しうる結合対のいずれか一方を固定化した多孔性担体及び他の一方を固定化した信号検出しうる物質又は担体を組み合わせて用いることにより、プライマー伸長した核酸断片を多孔性担体及び信号検出しうる物質又は担体に結合させ、多孔性担体上の信号を検出する検査方法。
８、正常型又は変異型をそれぞれ又はそれらを組み合わせて検査する前記１〜７に記載の検査方法。
９、前記７及び８に記載の方法を用いて正常型及び変異型を組み合わせて検査する方法であって、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを信号検出しうる物質又は担体に固定化し、検出用プライマーを正常型及び変異型で異なる物質で標識した検出用プライマーを用い、該プライマーのそれぞれの標識物質と特異的に結合しうる物質を多孔性担体上に、お互いが平行或いは交差上になるように配置して固定化した装置を用いる検査方法。
１０、複数の遺伝子又は核酸の塩基配列又は変異を検査する前記１〜９に記載の検査方法。
１１、前記１〜１０に記載の検査方法に用いる検査試薬、検査装置、又は検査キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、塩基配列の検査、とりわけＳＮＰ及びプロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査をできる方法を提供し、測定に際して特殊な機器、設備を必要とせずに安価で簡便に、しかも精度よく多数検体を効率よく検査できるといった、格段の効果を有する検査方法、検査試薬及びキットを提供することを可能にした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において用いられている用語の定義は以下のとおりである。
１、核酸とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）の両方又はどちらか一方を表し、ＤＮＡにおいては特に限定しない限り、１本鎖又は２本鎖のいずれも含まれる。また、ある特定の領域の全長を核酸とし、その一部を核酸断片という。
２、オリゴヌクレオチドとはとりわけ、数塩基〜数十塩基からなる核酸断片をいう。
３、プライマーとは１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし、ポリメラーゼによる塩基伸長反応を誘導し得るオリゴヌクレオチドである。
４、プローブとは１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の特徴は、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマー（検出用プライマー）を用いること及び、該検出用プライマーの３´末端が被検核酸の特定の塩基配列に相補的であるか否かによって、プライマー伸長反応やポリメラーゼ連鎖反応等の増幅反応が起こるか否かを検出する工程において、プライマー伸長反応の生成物を該生成物に特異的に結合しうる結合対と結合させる工程を導入して検出することを組み合わせたことである。
【００１５】
本発明を実施するために設計される、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換した検出用プライマーの設計は図１に示したごとくである。例えば、検査しようとする核酸の塩基配列が正常型で「５´・・・ＴＡＣ―――３´」であり、変異型で「５´・・・ＧＡＣ―――３´」であれば、正常型用プライマーは「５´―――Ｃ*ＴＡ３´」とし、変異型用プライマーは「５´Ｃ*ＴＣ３´」となるように設計する。すなわち検査しようとする配列中の下線部分（−）が正常型でＴ、変異型でＧとなっているのであるから、検出用プライマーはその部位で、それぞれ相補になるＡとＣが３´末端に来るようにする。そしてその１塩基上流は相補塩基であるＴとし、下線（  *）で表した２塩基上流部は被検核酸の塩基はＣであるので、本来はその相補塩基Ｇのところを、人工ミスマッチとなるようにＣを入れる。その後の上流部分は相補配列を用いる。この人工ミスマッチ導入の塩基種の選択は一例であり、相補でない組み合わせであれば特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明を実施するために設計される、上記検出用プライマーの３´末端が被検核酸の特定の塩基配列に相補的であるか否かによって、プライマー伸長反応やＰＣＲ等の増幅反応が起こるか否かを検出する工程において、プライマー伸長反応により生じた部位に特異的に結合しうる結合対について、それぞれの実施形態に応じて説明する。
【００１７】
本発明の第１の実施の形態は、予め増幅された被検核酸に前記検出用プライマーをハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を起こさせる。ここで用いる検出用プライマーは、その５´末端をビオチン、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ジゴキシゲニン等の公知の標識物質で標識しておく。プライマー伸長反応により生成した部位を特異的に結合しうる結合対は、プライマー伸長反応により生成した塩基配列に相補的な配列を有する捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて結合させる。すなわちプライマー伸長反応が起これば標識検出用プライマーを含む核酸断片が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブと結合する。一方変異のためにプライマー伸長反応が起こらなければ、標識検出用プライマーを含む核酸断片が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブと結合しないので、標識物質が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブに結合しない。捕獲用オリゴヌクレオチドプローブ上に結合した標識物質を検出することにより、プライマー伸長の有無が検出でき、ひいては遺伝子の配列、変異が検査できる（図２）。ここで用いる捕獲用オリゴヌクレオチドプローブは適当な固相担体に結合させて用いることが好適である。固相担体への結合はアミノ化オリゴヌクレオチドを、サクシニイミド基を介して結合させるなどの公知の方法が適用される。固相担体は、磁性粒子、マイクロタイタープレートウエル、チューブ、ガラスビーズ、プラスチックビーズ等が用いられる。
【００１８】
本発明の第２の実施の形態は、予め増幅された被検核酸に前記検出用プライマーをハイブリダイズさせ、連鎖終止基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を起こさせ、１塩基伸長させる。ここで用いる連鎖終止基質のダイデオキシヌクレオチドは、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の公知の標識物質で標識しておく。プライマー伸長反応が起これば、これらの標識ダイデオキシヌクレオチドがプライマーに取り込まれることになる。この場合の、一つの実施の形態として、これらの標識物質に特異的に結合しうる結合対を結合させることにより信号の検出工程へ導くことが可能になる（図３）。プライマーの５´末端を連鎖終止基質とは異なる標識物質で標識しておき、固相上に結合させた特異的結合対と伸長反応物を反応させることにより、固相上にプライマー伸長反応物を捕獲した後、プライマーの５´末端の標識物質を検出することで本発明を実施できる。もう一方の実施の形態としては、逆にプライマーの５´末端の標識物質、あるいはプライマーの塩基配列と相補は配列を持つオリゴヌクレオチドを介して、固相上にプライマー伸長反応物を捕獲して、伸長反応により結合した標識物質をその結合対を用いて検出する方法も本発明に含まれる。さらにこのばあいには、標識連鎖終止ヌクレオチドの標識物質が蛍光物質のごとく、それ自体で検出可能なものであれば、固相上に捕獲したプライマー伸長反応物を直接検出することも可能である。
【００１９】
本発明の第３の実施の形態は、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマーでしかもその５´末端を標識したプライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズする非標識のプライマー、所謂リバースプライマーとを組み合わせて、ゲノム核酸或いは予め増幅された被検核酸にプライマー対をハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応および増幅反応を起こさせる（図４）。後の操作は段落番号００１６で述べた本発明の第１の実施の形態と同様に行い、プライマー伸長反応により伸長した部分を特異的に固相に捕獲することにより実施することが可能である。ここで用いる捕獲用のオリゴヌクレオチドは、標識プライマーが新たに伸長する部分の相補配列を有するものであればよいが、リバースプライマーの配列を含まないことが好適である。この実施の形態では、予め増幅させた核酸試料に限定されることなく、直接ゲノム核酸を増幅しながら変異も検出できる。
【００２０】
本発明の第４の実施の形態は、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換した非標識プライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズするプライマーの５´末端を標識した、所謂標識リバースプライマーとを組み合わせて、ゲノム核酸或いは予め増幅された被検核酸にプライマー対をハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応および増幅反応を起こさせる（図５）。後の操作は、標識リバースプライマーの３´側に伸張した塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて特異的に伸長反応物を捕獲することにより、段落番号００１６で述べた本発明の第１の実施の形態と同様に実施することが可能である。ここで用いる捕獲用のオリゴヌクレオチドは、標識リバースプライマーが新たに伸長する部分の相補配列を有するものであればよいが、非標識の検出用プライマーの配列を含まないことが好適である。すなわち、検査しようとする特定の塩基よりも３´側下流部分で、標識リバースプライマーの３´末端がハイブリダイズする部位までの間の配列から選択することが好ましい。この実施の形態においても、予め増幅させた核酸試料に限定されることなく、直接ゲノム核酸を増幅しながら変異も検出できる。
【００２１】
本発明の第５の実施の形態は、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換した非標識プライマーを用い、プライマー伸長反応させる。リバースプライマーを用いて、増幅と同時にすることも可能である。次いでプライマー伸長した部位に特異的に結合する捕獲用オリゴヌクレオチドを用いて２本鎖を形成させる。このときアクリジニウムエステルやエチジウムブロミドのように２本鎖構造と１本鎖構造で安定性や信号強度の変化が起こる物質を作用させる、所謂インターカレーション効果を利用することにより、プライマー伸長が起きたか否かを検出することにより本発明を実施することが可能である（図６）。
本実施の形態では、必ずしも捕獲用オリゴヌクレオチドプローブは固相化する必要はなく、所謂ホモジニアスな系で検査が可能である。
【００２２】
本発明を実施するに当たり、信号の検出方法は、前述のごとく、固相に捕獲された標識物質を検出する方法が好適に用いられる。さらにインターカレーション効果を利用することにより、ホモジニアス系でも検出が可能であることは既に述べた。前述のこれらの方法に加えて、免疫測定法で用いられている、ラテラルフロー型やフロースルー型の分析方法も本発明に適用される。金属コロイド粒子、着色ラテックス或いは蛍光ラテックス等の信号を与えることが可能な粒子に捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化しておき、プライマー伸長反応物を結合させる。プライマーの伸長部分とは異なる部位と特異的に結合しうるもうひとつの結合物質を予めろ紙、メンブラン等の多孔性担体に固定化しておき、そこに粒子−プライマー伸長物複合体を導き反応させる。プライマー伸長が起きていれば粒子は多孔性担体に捕獲されることになる（図７）。プライマーの伸長部分とは異なる部位と特異的に結合しうる結合対の組み合わせの例として、５´末端をビオチン標識したプライマーであれば、アビジン又はストレプトアビジンを固相化しておくことができる。フルオレセインやジゴキシゲニン標識であればそれぞれに対する抗体を固相化しておく。非標識プライマーであればプライマーの塩基配列と相補的配列をもつオリゴヌクレオチドプローブを固相化しておくことが可能である。本実施の形態では金属コロイド粒子、着色ラテックス或いは蛍光ラテックス等の信号を与えることが可能な粒子に結合させる捕獲用オリゴヌクレオチドと、多孔性担体に固定化する結合対を逆にすることも可能である。
【００２３】
上記のラテラルフロー型やフロースルー型の分析方法においては、試験の実施が適切に行われたか否かを判定するコントロールが必要となる場合がある。本発明の実施に際しても、コントロールを入れることができる。例えば、オリゴデオキシチミジン（ＯｄＴ）を着色粒子等に固定化したものを検査用の着色粒子等と混ぜておき、一方多孔性担体のコントロール検出部位にオリゴデオキシアデニン（ＯｄＡ）を固定化しておくことにより、試験が正常に実施されたか否かを検証するためのコントロール機能を付加できる。
【００２４】
本発明は、単一の遺伝子の検査のみならず、複数の遺伝子の検査を同時に行うことも可能である。一つの酵素等をコードする遺伝子の複数の箇所の変異を同時に検査することも、また、異なる複数の酵素等をコードする遺伝子を同時に検査することも可能である。具体的には、検出用プライマーとリバースプライマーの組み合わせ及び捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを検査しようとする特定の塩基に対応して設計し、同時に被検核酸試料にプライマー対をハイブリダイズ後、プライマー伸長させて、伸長部位を特異的に捕獲することにより実施できる。それぞれの捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを、例えばマイクロタイタープレートの特定のウエルに配置して固定化しておけば、一つの装置で同時に複数の変異検査を実施することも可能である。またフロースルー型の分析装置を使えば、複数の捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを多孔性担体上に固定化しておくことにより、一つの装置で同時に複数の変異検査を実施することも可能である（図８）。これと同様の方法で、核酸チップ（核酸アレイ）上に複数の捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化しておくことにより、一つの装置で同時に複数の変異検査を実施することも可能である。
【００２５】
多孔性担体を用いた分析法の本発明の応用例として、図９に示したように、一つの変異について、正常型と変異型をそれぞれ異なる標識物質で標識した標識検査用プライマーを設計し、一つの着色粒子等に固定化した共通の捕獲用オリゴヌクレオチドプローブでプライマー伸長物を捕獲する。そして多孔性担体上に標識物質に対する特異的結合対を十字型に固定化した装置を構築し、そこに着色粒子−プライマー伸長物複合体を反応させることにより、一つの装置で同時に複数の変異検査を実施することも可能である。
【００２６】
本発明の方法を実施するための検査試薬及びキットも本発明に含まれる。正常型検出用プライマー、変異検出用プライマー、ポリメラーゼ、基質、及び捕獲用オリゴヌクレオチドプローブが必須の構成試薬となる。増幅工程を組み込む場合にはリバースプライマーを、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固相化する場合には、マイクロタイタープレート或いは磁性粒子等の適当な固相にプローブを固定化した固相を、
標識物質がビオチンであれば、それを検出するための酵素標識アビジン或いは酵素標識ストレプトアビジンと酵素活性測定のための基質類を構成試薬にする。さらに、検体からの核酸抽出用試薬、核酸処理用のアルカリ液等の処理液類、緩衝液類及び洗浄液等も組み込むことができる。
【実施例１】
【００２７】
グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）のアミノ酸配列４８６番目のチロシンのアスパラギン酸への変異（Ｙ４８６Ｄ）が知られている。このアミノ酸をコードする遺伝子の変異を本発明の方法により調べた。まず本酵素をコードする遺伝子のエキソン５領域の変異部分を含む領域を配列番号１に示したフォワードプライマーと配列番号２に示したリバースプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。ＵＧＴ遺伝子のエキソン５領域のＹ４８６Ｄの変異を検出するために、得られたＰＣＲ産物に配列番号３及び４に示した変異部位の２塩基上流部位に人工的にミスマッチをいれ５'末端をビオチンで標識した検出用プライマーと通常の基質（４種類のデオキシヌクレオシド３リン酸）を加えてプライマー伸長反応を行った。反応終了後、反応液に２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μＬを加え、２本鎖核酸を1本鎖にし、それを配列番号５で示した捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調製して室温で３０分間ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温２０分間反応させ、未反応の標識アビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分問反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表1に示した。変異型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便に変異が検出できることがわかった。
【００２８】
【表１】
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【実施例２】
【００２９】
配列番号３及び４に示した変異部位の２塩基上流部位に人工的にミスマッチをいれ５'末端をビオチンで標識した検出用プライマーと配列番号２で示したリバースプライマーを用いて、白血球より抽出したゲノム核酸をＰＣＲで増幅させた。その後、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μLを加え、２本鎖核酸を1本鎖にし、それを配列番号５で示した捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調製して室温で３０分問反応ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温で２０分間反応させ、未反応の標識ストレプトアビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分間反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μL加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍの吸光皮を測定した。その結果を表２に示した。変果型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便に変異が検出できることがわかった。またこの方法では、予め被検核酸を増幅しておかなくとも、変異検出が可能であることもわかった。
【００３０】
【表２】
2005160430.tif 000004
【実施例３】
【００３１】
実施例２と同様に操作して、インフォームドコンセントの得られた48例の検体について、本発明の方法を用いてＵＧＴ−１遺伝子のＹ４８６Ｄの変異を調べ、ダイレクトシーケンス法の結果と比較した。その結果、表３に示したように全例ダイレクトシーケンス法と一致し、本発明の有用性が明らかになった。
【００３２】
【表３】
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【実施例４】
【００３３】
実施例２で用いた配列番号２に示したプライマーの５´末端側をビオチン標識しプ
ライマーと配列番号３及び４に示した、人エミスマッチを含む検出用プライマーを
用い、ＰＣＲ反応によりゲノム核酸を増幅した。その後、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μLを加え、２本鎖核酸を1本鎖にし、それを配列番号６で示したプローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調製して室温で３０分間反応ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温で２０分間反応させ、未反応の標識アビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分問反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μL加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表４に示した。変異型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便に変異が検出できることがわかった。
【００３４】
【表４】
2005160430.tif 000006
【実施例５】
【００３５】
グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）遺伝子のプロモーター領域のＴＡリピート数は正常型では６個であるが、挿入が起こり７個になっている変異が知られている。この変異を本発明の方法により調べた。まずプロモーター領域の遺伝子の変異部分を含む領域を配列番号７に示したビオチン標識した変異検出用フォワードプライマーと配列番号８に示したリバースプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。増幅反応後、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μLを加え、２本鎖核酸を１本鎖にし、それを配列番号９で示した捕獲用プローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調整して室温で３０分間反応ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温で２０分間反応させ、未反応の標識アビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分問反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μL加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表５に示した。変異型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便にＴＡリピートの挿入による変異が検出できることがわかった。
【００３６】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は特定の遺伝子配列、とりわけ遺伝子変異の簡便な検査方法を提供するものであり、遺伝子変異の検査試薬、検査装置及び検査キットとして、臨床検査の分野で用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明で用いる検出用プライマーの設計方法とプライマー伸長の原理を説明した図である。
【図２】本発明の第１の実施の形態の原理を説明した図である。
【図３】本発明の第２の実施の形態の原理を説明した図である。
【図４】本発明の第３の実施の形態の原理を説明した図である。
【図５】本発明の第４の実施の形態の原理を説明した図である。
【図６】本発明の第５の実施の形態の原理を説明した図である。
【図７】本発明の実施の形態のうち多孔性担体と標識粒子を用いたときの原理を説明した図である。
【図８】本発明の実施の形態のうち多孔性担体と標識粒子を用いたときに、複数の遺伝子検査を行えることを説明した図である。
【図９】本発明の実施の形態のうち多孔性担体と標識粒子を用いたときに正常型と変異型を同一装置で検査する方法を説明した図である
【符号の説明】
【００３９】
１、     被検核酸
２、     検査用プライマー
３、     特定の塩基（変異部位）
４、     プライマー用標識物質
５、     プライマー伸長反応部位
６、     プライマー伸長反応部位に相補配列の捕獲用オリゴヌクレオチドプローブ
７、     固相担体
８、     固相担体へ結合させるためのスペーサー
９、     プライマー伸長が起こらないことを表した記号
１０、プライマー伸長により結合した連鎖終止ヌクレオチド
１１、連鎖終止ヌクレオチドの標識物質に対する結合対
１２、２本鎖被検核酸試料
１３、リバースプライマー
１４、インターカレーション物質
１６、着色標識粒子
１７、多孔性担体
１８、検出用プライマーの標識物質に対する特異的結合対
１９、検出ライン
２０、変異型検出ライン
２１、正常型検出ライン
２２、コントロール検出部位
２３、試料注入口及び捕獲用オリゴヌクレオチドプローブ固定化標識粒子
２４、収納ケース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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