(57)【要約】      （修正有）【課題】  微量の試料で、短時間に、アロステリックタンパク質について、アロステリックリガンドおよび基質との結合による構造変化を解析するための手法を提供すること。【解決手段】  アロステリックタンパク質における基質若しくはそのアナログ及び／又はアロステリックリガンドの結合部位又はその近傍を同定する方法であって、以下の工程：(i)アロステリックタンパク質の重水素化、(ii) 重水素化されたタンパク質の質量測定、(iii) 重水素化されたタンパク質を断片化して、ペプチド混合物を得る、(iv)該ペプチド混合物中のペプチドの質量測定、(v) 断片化して得られた各ペプチドの重水素化率の算出、(vi) 断片化して得られた各ペプチドの相対重水素化率の算出、及び(vii) ペプチドの相対重水素化率から、アロステリックリガンド結合部位を含むペプチド及び／又は基質若しくはそのアナログ結合部位又はその近傍を含むペプチドを同定する、各工程を含む、前記の方法。【選択図】  図１
2005328767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロステリックタンパク質における基質若しくはそのアナログ及び／又はアロステリックリガンドの結合部位又はその近傍を同定する方法であって、以下の工程：
(i)アロステリックタンパク質を (1)単独、(2) 基質又はそのアナログ存在下、(3) アロステリックリガンド存在下及び(4) アロステリックリガンドと基質又はそのアナログの存在下の４つの異なる状態下におき、重水素化する工程、
(ii) (i) の工程で重水素化された４つの状態のタンパク質のそれぞれについて、質量を測定する工程、
(iii) (i) の工程で重水素化された４つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して、ペプチド混合物を得る工程、
(iv) (iii) の工程で得られたペプチド混合物中のペプチドの質量を測定する工程、
(v) (1)〜(4)の４つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を算出する工程、
(vi) (1)の状態のタンパク質を消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率で、(2)、(3)及び(4)の３つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を除することにより、各ペプチドの相対重水素化率を算出する工程、及び
(vii) ペプチドの相対重水素化率を(1)〜(4)の４つの異なる状態下においたタンパク質間で比較することにより、アロステリックリガンド結合部位を含むペプチド及び／又は基質若しくはそのアナログ結合部位又はその近傍を含むペプチドを同定する工程
を含む、前記の方法。
【請求項２】
少なくとも２個のリガンドが結合できるアロステリックタンパク質における少なくとも２個のリガンドが結合する順番を決定する方法であって、以下の工程：
(i’) アロステリックタンパク質を (1’)単独、(2’) 第１のリガンド存在下、(3’) 第２のリガンド存在下及び(4’) 第１のリガンド及び第２のリガンドの存在下の４つの異なる状態下におき、重水素化する工程、
(ii’) (i’) の工程で重水素化された４つの状態のタンパク質のそれぞれについて、質量を測定する工程、
(iii’) (i’) の工程で重水素化された４つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して、ペプチド混合物を得る工程、
(iv’) (iii’) の工程で得られたペプチド混合物中のペプチドの質量を測定する工程、
(v’) (1’)〜(4’)の４つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を算出する工程、
(vi’) (1’)の状態のタンパク質を消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率で、(2’)、(3’)及び(4’)の３つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を除することにより、各ペプチドの相対重水素化率を算出する工程、及び
(vii’)ペプチドの相対重水素化率を(1')〜(4')の４つの異なる状態下においたタンパク質間で比較することにより、第１のリガンド及び第２のリガンドがアロステリックタンパク質に結合する順番を決定する工程
を含む、前記の方法。
【請求項３】
アロステリックリガンドを検出する方法であって、以下の工程：
(i”)アロステリックタンパク質を (1”) 単独、(2”)被験物質存在下及び(3”)被験物質と基質又はそのアナログの存在下の３つの異なる状態下におき、重水素化する工程、
(ii”)(i”)の工程で重水素化された３つの状態のタンパク質のそれぞれについて、質量を測定する工程、
(iii”) (i”) の工程で重水素化された３つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して、ペプチド混合物を得る工程、
(iv”)(iii”) の工程で得られたペプチド混合物中のペプチドの質量を測定する工程、
(v”) (1”)〜(3”)の３つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を算出する工程、
(vi”) (1”)の状態のタンパク質を消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率で、(2”)及び(3”)の２つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を除することにより、各ペプチドの相対重水素化率を算出する工程、及び
(vii”) ペプチドの相対重水素化率を(1”)〜(3”)の３つの異なる状態下においたタンパク質間で比較することにより、被験物質がアロステリックリガンドであるか否かを判定する工程
を含む、前記の方法。
【請求項４】
(i”)の工程において、アロステリックタンパク質を (1”) 単独、 (2”)被験物質存在下及び(3”)被験物質と基質又はそのアナログの存在下の３つの異なる状態の他に、(4”)基質又はそのアナログの存在下におき、重水素化したものを用意し、この４つの状態のタンパク質について、(ii”)〜(vii”)の工程を行う、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アロステリックタンパク質における基質若しくはそのアナログ及び／又はアロステリックリガンドの結合部位又はその近傍を同定する方法、アロステリックタンパク質にリガンドが結合する順番を決定する方法、並びにアロステリックリガンドを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素に基質が結合する場合に代表されるように、タンパク質に低分子リガンドが結合することにより様々な生体反応が営まれる。その中には、アロステリックリガンド（activator）が分子表面に結合することによりタンパク質の構造が可逆的に変化して、始めて基質と結合することができるようになり、タンパク質の機能が発揮されるもの（アロステリックタンパク質）がある。このようなアロステリックタンパク質の機能を裏付ける構造変化に関する情報を得るためには、従来から X 線結晶構造解析や NMR が用いられている。しかしながら、X 線結晶構造解析では、タンパク質-リガンド-基質の三者複合体として、解析に適する単結晶が得られることが必要条件であり、結晶化に成功しない場合には構造情報が全く得られない。NMR では高磁場装置の開発に伴い測定対象となりうるタンパク質の分子量の上限がかなり大きくなったとはいえ、13C および 15N ラベルした試料が必要とされる上に溶解度、長時間測定に耐えられるタンパクの安定性などの見地から、実際には 30kDa を超えるタンパク質の低分子化合物との複合体の構造解析は容易ではない。また、両手法とも必要とする試料量はマイクロモルレベルと多い。これに対し、質量分析は、方法を工夫することにより、ナノモル以下の試料で、様々な構造情報を得ることができる。
【０００３】
例えば、Smithらは、タンパク質主鎖のアミド水素の重水素交換反応と質量分析を組み合わせた構造解析法により、タンパク質において、機能に関連して構造変化がおきる部位を特定したり、高次構造に関する情報を得るための方法を報告している（非特許文献１及び２並びに特許文献１）。
【０００４】
また、Wangらは、2つの低分子リガンドと酵素の三者複合体に関して、重水素交換反応と質量分析を組み合わせた構造解析法により、２つのリガンドのそれぞれの結合部位を解析している（非特許文献３及び４）。
【特許文献１】国際公開第WO 00/39326号パンフレット
【非特許文献１】David L. Smith et al., JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY (1997), VOL. 32, 135-146
【非特許文献２】Zhongqi Zhang et al., Protein Science (1993), 2, 522-531
【非特許文献３】Fang Wang et al., Biochemistry (1997), Vol. 36, No. 13, 3755-3759
【非特許文献４】Fang Wang et al., Protein Science (1998), 7:293-299
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、微量の試料で、短時間に、アロステリックタンパク質について、アロステリックリガンドおよび基質との結合による構造変化を解析するための手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、タンパク質主鎖のアミド水素の重水素交換反応と質量分析を組み合わせた構造解析法において、相対重水素化率を指標とすることにより、アロステリックタンパク質におけるアロステリックリガンドおよび基質との結合による構造変化を解析することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  アロステリックタンパク質における基質若しくはそのアナログ及び／又はアロステリックリガンドの結合部位又はその近傍を同定する方法であって、以下の工程：
(i)アロステリックタンパク質を (1)単独、(2) 基質又はそのアナログ存在下、(3) アロステリックリガンド存在下及び(4) アロステリックリガンドと基質又はそのアナログの存在下の４つの異なる状態下におき、重水素化する工程、
(ii) (i) の工程で重水素化された４つの状態のタンパク質のそれぞれについて、質量を測定する工程、
(iii) (i) の工程で重水素化された４つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して、ペプチド混合物を得る工程、
(iv) (iii) の工程で得られたペプチド混合物中のペプチドの質量を測定する工程、
(v) (1)〜(4)の４つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を算出する工程、
(vi) (1)の状態のタンパク質を消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率で、(2)、(3)及び(4)の３つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を除することにより、各ペプチドの相対重水素化率を算出する工程、及び
(vii) ペプチドの相対重水素化率を(1)〜(4)の４つの異なる状態下においたタンパク質間で比較することにより、アロステリックリガンド結合部位を含むペプチド及び／又は基質若しくはそのアナログ結合部位又はその近傍を含むペプチドを同定する工程
を含む、前記の方法。
（２）  少なくとも２個のリガンドが結合できるアロステリックタンパク質における少なくとも２個のリガンドが結合する順番を決定する方法であって、以下の工程：
(i’) アロステリックタンパク質を (1’)単独、(2’) 第１のリガンド存在下、(3’) 第２のリガンド存在下及び(4’) 第１のリガンド及び第２のリガンドの存在下の４つの異なる状態下におき、重水素化する工程、
(ii’) (i’) の工程で重水素化された４つの状態のタンパク質のそれぞれについて、質量を測定する工程、
(iii’) (i’) の工程で重水素化された４つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して、ペプチド混合物を得る工程、
(iv’) (iii’) の工程で得られたペプチド混合物中のペプチドの質量を測定する工程、
(v’) (1’)〜(4’)の４つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を算出する工程、
(vi’) (1’)の状態のタンパク質を消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率で、(2’)、(3’)及び(4’)の３つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を除することにより、各ペプチドの相対重水素化率を算出する工程、及び
(vii’)ペプチドの相対重水素化率を(1')〜(4')の４つの異なる状態下においたタンパク質間で比較することにより、第１のリガンド及び第２のリガンドがアロステリックタンパク質に結合する順番を決定する工程
を含む、前記の方法。
（３）  アロステリックリガンドを検出する方法であって、以下の工程：
(i”)アロステリックタンパク質を (1”) 単独、(2”)被験物質存在下及び(3”)被験物質と基質又はそのアナログの存在下の３つの異なる状態下におき、重水素化する工程、
(ii”)(i”)の工程で重水素化された３つの状態のタンパク質のそれぞれについて、質量を測定する工程、
(iii”) (i”) の工程で重水素化された３つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して、ペプチド混合物を得る工程、
(iv”)(iii”) の工程で得られたペプチド混合物中のペプチドの質量を測定する工程、
(v”) (1”)〜(3”)の３つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を算出する工程、
(vi”) (1”)の状態のタンパク質を消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率で、(2”)及び(3”)の２つの状態のタンパク質のそれぞれを消化及び／又は断片化して得られた各ペプチドの重水素化率を除することにより、各ペプチドの相対重水素化率を算出する工程、及び
(vii”) ペプチドの相対重水素化率を(1”)〜(3”)の３つの異なる状態下においたタンパク質間で比較することにより、被験物質がアロステリックリガンドであるか否かを判定する工程
を含む、前記の方法。
（４）  (i”)の工程において、アロステリックタンパク質を (1”) 単独、 (2”)被験物質存在下及び(3”)被験物質と基質又はそのアナログの存在下の３つの異なる状態の他に、(4”)基質又はそのアナログの存在下におき、重水素化したものを用意し、この４つの状態のタンパク質について、(ii”)〜(vii”)の工程を行う、（３）記載の方法。
【０００８】
本明細書において、「アロステリックタンパク質」とは、アロステリックリガンドが基質結合部位以外の分子表面に結合することによりタンパク質の構造が可逆的に変化して、初めて基質と結合することができるようになり、タンパク質の機能が発揮されるものをいう。
【０００９】
「アロステリックリガンド」とは、アロステリックタンパク質に特異的に結合する低分子化合物で、結合により他の部位での基質との結合に影響を及ぼすような化合物をいう。
【００１０】
「基質」とは、酵素などの機能を有するタンパク質の作用を受ける特定の化合物をいう。
【００１１】
「基質のアナログ」とは、基質と類似する化合物で、基質の結合部位に結合しうる化合物をいい、これには、阻害剤などが含まれる。
【００１２】
「重水素化」とは、重水溶液などに溶解することで交換可能な水素原子（H）を重水素原子（D）に置き換えることで、ここではタンパク質の主鎖のアミド水素を重水素に置き換えることをいう。
【００１３】
「消化」とは、ペプチド結合を加水分解する酵素（プロテアーゼ）により、タンパク質をペプチドに分解することをいう。
【００１４】
「断片化」とは、タンパク質をより小さな断片に切断することをいう。
【００１５】
「相対重水素化率」とは、単独の状態下においたアロステリックタンパク質の消化により得られたペプチドの重水素化率（１とする）に対する、他の状態下においたアロステリックタンパク質の消化により得られたペプチドの重水素化率の比をいい、ここで、「重水素化率」とは、タンパク質主鎖のアミド窒素に結合した水素原子（H）が重水素原子（D）に置き換わることによる質量変化を、すべてのアミド水素が重水素に置き換わることによる質量変化の理論値を基準（1.0）として求めた重水素化率をいう。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、アロステリックタンパク質のアミノ酸数残基レベルでの構造変化を、NMR法やＸ線結晶構造解析の手法に比べると短時間でかつ少ない試料量で得られる。本発明により、これまで構造情報を得ることができなかったタンパク質、すなわち結晶化させることができないタンパク質や高分子量のタンパク質でもアロステリックリガンドの結合による構造変化について解析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態をより詳細に説明する。
【００１８】
図１に本発明の方法の概略を示す。
【００１９】
まず、アロステリックタンパク質における基質及び／又はアロステリックリガンドの結合部位又はその近傍を同定する方法について説明する。アロステリックタンパク質を (1) 単独、(2) 基質又はそのアナログ存在下、(3) アロステリックリガンド存在下及び(4)アロステリックリガンドと基質の存在下の４つの異なる状態下におき、例えば、pD 7.2、４℃で重水素ラベルする。適当な時間経過後（例えば、2時間後）、重水素化ギ酸（重水素化ギ酸の代わりに、重水素化トリフルオロ酢酸などを用いてもよい。）で溶液の重水素イオン濃度を 例えば、pD 2.5 まで下げて重水素化反応をクエンチした後、重水素化された４つの状態のタンパク質それぞれについて、例えば、ESIMS （Electrospray ionization mass spectrometry）で質量を正確に測定する。また、重水素化された４つの状態のタンパク質の重水素化率を算出しておくとよい。重水素化率の算出は、V. Katta & B.T.Chait (1991) Rapid Commun. Mass Spectrom. 5, 214-217、S.Akashi, Y.Naito, and K.Takio (1999) Anal. Chem. 71, 4974-4980、A.N.Hoofnagle, K.A.Resing, and N.G.Ahn (2003) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 などに記載の方法に従えばよい。重水素化された４つの状態のタンパク質は、例えば、樹脂に固定化したペプシンで4℃で7分間消化するが、消化の方法はこれに限定されるわけではない。また、消化しないで、質量分析装置の中で断片化してもよいし、消化とともに断片化してもよい。断片化は、タンパク質を ESI 法でイオン化し、生成される分子量関連イオンを質量分析装置内で衝突活性化することにより行うことができる。消化及び／又は断片化により得られたペプチド混合物については、固定化ペプシンをろ過などの方法で除去後、ESIMS で質量を正確に測定する。ESIMS でペプチドの質量を測定する際に、重水素化していないペプチドについてMS/MS de novo sequecingを行うとペプチドの帰属が容易になる。また、重水素化された各ペプチドの質量から重水素化率を算出しておくとよい。さらに、(1)単独の状態下においたアロステリックタンパク質の消化により得られたペプチドの重水素化率を１とした時の相対重水素化率も算出しておくとよい。ペプチドの相対重水素化率を(1)〜(4)の４つの異なる状態下においたタンパク質間で比較・解析することにより、アロステリックリガンド及び／又は基質結合により構造変化が生じた部位を含むペプチドを同定する。例えば、(1)〜(4)の４つの異なる状態下においたタンパク質の消化により得られたペプチド間で比較したとき、相対重水素化率の相違が見られるペプチドを、アロステリックリガンド及び／又は基質結合により構造変化が生じた部位を含むペプチドと同定することができる。例えば、(3) アロステリックリガンド存在下の状態下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が(1) 単独及び(2) 基質又はそのアナログ存在下の２つの状態下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率より明らかに小さい〔例えば、アロステリックタンパク質がカテコール-O-メチルトランスフェラーゼ（catechol-O-methyltransferase、以下、「COMT」と記すこともある）であり、基質のアナログがトルカポン(Tolcapone)であり、アロステリックリガンドがS-(5’-アデノシル)-L-メチオニン(S-(5’-adenosyl)-L-methionine、以下、「SAM」と記すこともある)である場合を例にとると���図７のフラグメント1-24、 9-24、 25-28、 40-53、91-99、及び 100-106〕場合には、そのペプチドはアロステリックリガンドの結合部位を含むもしくはそれら結合部位形成ペプチドと隣接していると判定することができる。また、例えば、(4) アロステリックリガンドと基質の存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が(1) 単独、 (2) 基質又はそのアナログ存在下及び(3) アロステリックリガンド存在下の３つの状態下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率よりも明らかに小さい（例えば、図７のフラグメント1-24、40-53、 91-99、 100-106、 142-154、 172-181及び211-223）場合には、そのペプチドは基質の結合部位を含むペプチド（図７のフラグメント40-53、 91-99、142-154、 172-181）もしくはそれら結合部位形成ペプチドと隣接しているペプチド（図７のフラグメント1-24，100-106、 211-223）であると判定することができる。
なお、図７において、フラグメント1-24、40-53、91-99, 100-106及び142-154は、(4) アロステリックリガンドと基質又はそのアナログの存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が (3) アロステリックリガンド存在下においたタンパク質の消化により得られたそれよりも明らかに小さく、かつその相対重水素化率の傾向が、(3) アロステリックリガンド存在下においたタンパク質と(4) アロステリックリガンドと基質又はそのアナログの存在下においたタンパク質間で一致しているが、このことはこれらのペプチドがアロステリックリガンドの結合と基質又はそのアナログの結合の両方に関わっている、もしくは影響を受けていることを示している。また、フラグメント9-24の相対重水素化率が、(3) アロステリックリガンド存在下においたタンパク質と(4) アロステリックリガンドと基質又はそのアナログの存在下においたタンパク質間で差がないが、このことはこのフラグメントがアロステリックリガンドの結合時にのみ影響を受け、基質又はそのアナログの結合時には直接影響を受けないことを示している。このことはフラグメント9-24がアロステリックリガンド結合部位を形成しているか、もしくはそれに隣接しているが、基質又はそのアナログの結合部位から遠く離れていることを示している。フラグメント172-181の相対重水素化率は、(4) アロステリックリガンドと基質又はそのアナログの存在下においたタンパク質では小さく、 (3) アロステリックリガンド存在下においたタンパク質では小さくないが、このことは、これらのフラグメントが基質又はそのアナログの結合部位を含み、かつ、アロステリックリガンドの結合部位からは遠く離れていることを示唆している。このような解析により、アロステリックタンパク質における基質又はそのアナログ及びアロステリックリガンドの結合部位をアミノ酸数残基からなるペプチドレベルで同定することができる。１個のアロステリックタンパク質に結合するアロステリックリガンドの数は１個に限定されるわけではなく、２個以上であってもよい。また、１個のアロステリックタンパク質に結合する基質又はそのアナログの数は１個に限定されるわけではなく、２個以上であってもよい。
【００２０】
上記の方法において、アロステリックリガンドを第１のリガンド、基質又はそのアナログを第２のリガンドと見なせば（あるいは、逆でもよい）、アロステリックタンパク質における少なくとも２個のリガンドの結合する順番を決定することができる。例えば、以下の１の条件を満たすペプチドと２の条件を満たすペプチドの両方が存在する場合には、第１のリガンドがアロステリックタンパク質に結合する順番が１位で、第２のリガンドがアロステリックタンパク質に結合する順番が２位である、すなわち、第１のリガンド（例えば、アロステリックリガンド）がアロステリックタンパク質に結合することによって、アロステリックタンパク質の構造が変化して、第２のリガンド（例えば、基質又はそのアナログ）がアロステリックタンパク質に結合することができるようになったと結論することができる。
１．(2’) 第１のリガンド存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチド及び(4’) 第１のリガンド及び第２のリガンドの存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が同程度で、それらが(3’) 第２のリガンド存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率よりも明らかに小さい（例えば、図７のフラグメント9-24）。
２．(2’) 第１のリガンド存在下及び(3’) 第２のリガンド存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が(1’) 単独の状態下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率とほぼ同程度で、それらよりも(4’) 第１のリガンド及び第２のリガンドの両者の存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が明らかに小さい（例えば、図７のフラグメント172-181）。
【００２１】
上記の１の条件を満たすペプチドは、アロステリックタンパク質とアロステリックリガンドが結合することによって形成された複合体から生じたアロステリックリガンド結合フラグメントであり、かつ基質との結合に関与しないフラグメントであると考えられる。また、上記の２の条件を満たすペプチドは、アロステリックリガンドがアロステリックタンパク質に結合することによって、アロステリックタンパク質の構造が変化した後、基質又はそのアナログがアロステリックタンパク質に結合することによって形成された複合体から生じた基質又はそのアナログ結合フラグメントであると考えられる。
【００２２】
１個のアロステリックタンパク質に結合するリガンドの数は２個に限定されるわけではなく、３個以上であってもよい。
【００２３】
次に、アロステリックリガンドを検出する方法について説明する。例えば、アロステリックタンパク質を (1”) 単独、 (2”) 被験物質存在下及び(3”)被験物質と基質又はそのアナログの存在下の３つの異なる状態下におき、例えば、pD 7.2、４℃で重水素ラベルする。適当な時間経過後（例えば、2時間後）、重水素化ギ酸（重水素化ギ酸の代わりに、重水素化トリフルオロ酢酸などを用いてもよい。）で溶液の水素イオン濃度を 例えば、pD 2.5 まで下げて重水素化反応をクエンチした後、重水素化された３つの状態のタンパク質それぞれについて、例えば、ESIMSで質量を正確に測定する。また、重水素化された３つの状態のタンパク質の重水素化率を算出しておくとよい。「重水素化率」の定義及び算出方法は上記の通りである。重水素化された３つの状態のタンパク質は、例えば、樹脂に固定化したペプシンで4℃で7分間消化するが、消化の方法はこれに限定されるわけではない。また、消化しないで、質量分析装置の中で断片化してもよいし、消化とともに断片化してもよい。断片化は、タンパク質を ESI 法でイオン化し、生成される分子量関連イオンを質量分析装置内で衝突活性化することにより行うことができる。消化及び／又は断片化により得られたペプチド混合物については、固定化ペプシンをろ過などの方法で除去後、ESIMS で質量を正確に測定する。ESIMS でペプチドの質量を測定する際に、重水素化していないペプチドについてMS/MS de novo sequecingを行うとペプチドの帰属が容易になる。また、重水素化された各ペプチドの質量から重水素化率を算出しておくとよい。さらに、(1”)の状態下においたアロステリックタンパク質の消化により得られたペプチドの重水素化率を１とした時の相対重水素化率も算出しておくとよい。ペプチドの相対重水素化率を(1”)〜(3”)の３つの異なる状態下においたタンパク質間で比較・解析することにより、被験物質がアロステリックリガンドであるか否かを判定する。例えば、以下の１の条件を満たすペプチドと２の条件を満たすペプチドの両方が存在する場合は被験物質がアロステリックリガンドであると判定することができ、それ以外の場合には、被験物質がアロステリックリガンドではないと判定することができる。
１． (2”) 被験物質存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が(1”) 単独の状態下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率よりも明らかに小さい（例えば、図７のフラグメント1-24、 9-24、 25-28、 40-53、 91-99及び100-106）。
２． (3”) 被験物質と基質又はそのアナログの存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が(2”) 被験物質存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率よりも明らかに小さい（例えば、図７のフラグメント1-24、40-53、 91-99、 100-106、 142-154、 172-181及び211-223）。
【００２４】
上記の１の条件を満たすペプチドはアロステリックリガンドの結合に直接関与するか又は結合部位の近傍に存在し、上記の２の条件を満たすペプチドは基質の結合部位を含むか又は近傍に存在すると考えられる。
【００２５】
本発明のアロステリックリガンド検出方法においては、さらに、アロステリックタンパク質を(1”)〜(3”)の３つの状態の他に(4”)基質又はそのアナログの存在下におき、上記の操作を行ってもよい。(4”) 基質又はそのアナログの存在下においたタンパク質を用意することによって、被験物質がアロステリックリガンドであるか否かの判定をより確かなものとすることができる。例えば、(2”) 被験物質存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が(1”) 単独及び(4”) 基質又はそのアナログ存在下の２つの状態下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率より小さい（例えば、図７のフラグメント1-24、 9-24、 25-28、 40-53、91-99）場合には、そのペプチドは被験物質（アロステリックリガンド）の結合に直接関与するか又は結合部位の近傍に存在するとより確かに判定することができ、被験物質がアロステリックリガンドであるという判定はより確かなものとなる。また、例えば、(3”) 被験物質と基質又はそのアナログの存在下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率が(1”) 単独、 (4”) 基質又はそのアナログ存在下及び(2”) 被験物質存在下の３つの状態下においたタンパク質の消化により得られたペプチドの相対重水素化率よりも明らかに小さい（例えば、図７のフラグメント1-24、 40-53、 91-99、 100-106、 142-154、 172-181及び211-223）場合には、その被験物質はアロステリックリガンド結合部位形成ペプチドもしくはその近傍に結合したことをより確かに判定することができ、被験物質がアロステリックリガンドであるという判定はより確かなものとなる。
【００２６】
本発明の方法は、NMR法やX線結晶構造解析の手法と組み合わせて用いてもよい。本発明の方法をNMR法やX線結晶構造解析の手法と組み合わせることによって、より詳細な構造変化の解析が可能となる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
［実施例１：リコンビナントヒトCOMTの調製］
リコンビナントヒトCOMTはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパクとして大腸菌で発現させられ、次いでグルタチオンレジンにて吸着させられた後、トロンビン処理で遊離させられた。得られた粗タンパクをクロマトグラフィーにて精製し、逆相クロマトグラフィーにて純度を確認した。リコンビナントヒトCOMTは760 ug/mLの濃度で60 mM 塩化ナトリウム、50 mM Bis Tris、 2.5 mM 塩化マグネシウム、0.5 mM ジチオスレイトール、10%グリセリン (pH 7.0)溶液として得られた。調製したリコンビナントヒトCOMTのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００２９】
［実施例２：ペプチドマスマッピング］
5 mM酢酸アンモニウム水溶液にギ酸を加えてpH 2.5とし消化用緩衝液を調製した。実施例１で得られたリコンビナントヒトCOMT(50 uL)の緩衝液は消化用緩衝液及びチタンフィルターにより平衡化、作成されたP-4ファインゲルスピンカラム（バイオラド社）によるゲルろ過にて交換された。消化用緩衝液で平衡化した固定化ペプシン（2倍モル）は上記リコンビナントヒトCOMTに加えられた。反応混合物は４℃にて７分間振とうされ、次いでチタンフィルターによりろ過された。それぞれのペプシン断片は液体クロマトグラフィーによる分離を行うこと無しにQ-Tof2装置のMS/MS法により同定された。この結果は図３に示された。
【００３０】
［実施例３：リガンド非存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化(Apo-HCOMT)］
重水中において(Cambridge Isotope Laboratories社)酢酸-d4(Cambridge Isotope Laboratories社)及び水酸化アンモニウム-d５(Cambridge Isotope Laboratories社)より100 mM 酢酸-d3アンモニウム-d4 (pD7.2)を調製した。これに1% メタノール-d4(Aldrich社)を加え、重水素化用緩衝液とした。実施例１で得られたリコンビナントヒトCOMT(50 uL)の緩衝液は重水素化用緩衝液により平衡化されたP-4ファインゲルスピンカラム（バイオラド社）によるゲルろ過にて交換された。重水素化反応は４℃、２時間実施された。その後、5 mM 酢酸-d3アンモニウム-d4 にギ酸-d2（Merck社）を加えてpD 2.5とした重水素化反応停止液で平衡化されたP-4ファインゲルスピンカラムを用いて重水素化反応を停止させた。被検物は液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。この実験は２回繰り返された。
【００３１】
［実施例４：アロステリックリガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化(S-HCOMT)］
実施例１で得られたリコンビナントヒトCOMT(50 uL)に1% メタノール、2 mM S-(5’-アデノシル)-L-メチオニン（SIGMA社、図２参照）となるようにリガンドを添加した。その後、この緩衝液は1%メタノール-d4、2mM S-(5’-アデノシル)-L-メチオニンを含有した重水素化用緩衝液(pD 7.2)により平衡化されたP-4ファインゲルスピンカラム（バイオラド社）によるゲルろ過にて交換された。重水素化反応は４℃、２時間実施された。その後、5 mM 酢酸-d3アンモニウム-d4 にギ酸-d2を加えてpD 2.5とした重水素化反応停止液で平衡化されたP-4ファインゲルスピンカラムを用いて重水素化反応を停止させた。被検物は液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。この実験は２回繰り返された。
【００３２】
［実施例５：リガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化(T-HCOMT)］
実施例１で得られたリコンビナントヒトCOMT(50 uL)に1% メタノール、1 mMトルカポン（Bruhin, Jurg. EP0855379 A1に記載の方法に従い、調製した。図２参照）となるようにリガンドを添加した。その後、この緩衝液は1%メタノール-d4、1 mM トルカポンを含有した重水素化用緩衝液(pD 7.2)により平衡化されたP-4ファインゲルスピンカラム（バイオラド社）によるゲルろ過にて交換された。重水素化反応は４℃、２時間実施された。その後、5 mM 酢酸-d3アンモニウム-d4 にギ酸-d2を加えてpD 2.5とした重水素化反応停止液で平衡化されたP-4ファインゲルスピンカラムを用いて重水素化反応を停止させた。被検物は液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。この実験は２回繰り返された。
【００３３】
［実施例６：アロステリックリガンドおよびリガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化(ST-HCOMT)］
実施例１で得られたリコンビナントヒトCOMT(50 uL)に1% メタノール、2 mM S-(5’-アデノシル)-L-メチオニン、1 mMトルカポンとなるようにリガンドを添加した。その後、この緩衝液は1%メタノール-d4、2 mM S-(5’-アデノシル)-L-メチオニン、1 mM トルカポンを含有した重水素化用緩衝液(pD 7.2)により平衡化されたP-4ファインゲルスピンカラム（バイオラド社）によるゲルろ過にて交換された。重水素化反応は４℃、２時間実施された。その後、5 mM 酢酸-d3アンモニウム-d4 にギ酸-d2を加えてpD 2.5とした重水素化反応停止液で平衡化されたP-4ファインゲルスピンカラムを用いて重水素化反応を停止させた。被検物は液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。この実験は２回繰り返された。
【００３４】
［実施例７：重水素化リコンビナントヒトCOMT重水素化率測定］
実施例３にて得られた被検物は30秒以内に融解され、氷冷したマイクロシリンジを用いてフローインジェクション法によるエレクトロスプレー四重極型質量分析器（Waters社、ZQ4000）による分析に供された。重水素化率はリコンビナントヒトCOMT上の交換性水素の数から計算された完全重水素化理論質量を基に算出された。得られたデータから平均値を算出した。実施例４、実施例５および実施例６で得られた被検物も同様にして分析され、重水素化率が求められた。この結果は図４に示された。
【００３５】
［実施例８：リガンド非存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化それに続くペプシン消化］
実施例３によって得られたリガンド非存在下における重水素化リコンビナントヒトCOMTに実施例３で調製された重水素化反応停止液で平衡化した固定化ペプシンを加え（２倍モル量）、４℃において7分間振盪した。その後、反応混合物をろ過し、ろ液を液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。この実験は３回繰り返された。
【００３６】
［実施例９：アロステリックリガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化それに続くペプシン消化］
実施例４によって得られたアロステリックリガンド存在下における重水素化リコンビナントヒトCOMTに実施例３で調製された重水素化反応停止液で平衡化した固定化ペプシンを加え（２倍モル量）、４℃において7分間振盪した。その後、反応混合物をろ過し、ろ液を液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。この実験は３回繰り返された。
【００３７】
［実施例１０：リガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化それに続くペプシン消化］
実施例５によって得られたリガンド存在下における重水素化リコンビナントヒトCOMTに実施例３で調製された重水素化反応停止液で平衡化した固定化ペプシンを加え（２倍モル量）、４℃において7分間振盪した。その後、反応混合物をろ過し、ろ液を液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。この実験は３回繰り返された。
【００３８】
［実施例１１：アロステリックリガンドおよびリガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化それに続くペプシン消化］
実施例６によって得られたアロステリックリガンドおよびリガンド存在下における重水素化リコンビナントヒトCOMTに実施例３で調製された重水素化反応停止液で平衡化した固定化ペプシンを加え（２倍モル量）、４℃において7分間振盪した。その後、反応混合物をろ過し、ろ液を液体窒素で凍結させ、使用直前まで-80℃で保存した。この実験は３回繰り返された。
【００３９】
［実施例１２：重水素化リコンビナントヒトCOMTペプシン消化フラグメントの重水素化率測定］
実施例８にて得られた被検物は30秒以内に融解され、氷冷したマイクロシリンジを用いてフローインジェクション法によるエレクトロスプレー四重極型質量分析器による分析に供された。ペプシン消化フラグメントの重水素化率は実施例２において同定されたペプチド上の交換性水素の数から計算された完全重水素化理論質量を基に算出された。得られたデータから平均値および標準偏差を算出した。実施例９、実施例１０および実施例１１で得られた被検物も同様にして分析され、完全重水素化理論質量=1とした場合の重水素化率が求められた。完全重水素化理論質量=1とした場合の結果は図５及び表１に示された。質量分析器による重水素化フラグメントの測定例が図６に示された。2価荷電のフラグメント40-53は重水素化しない条件では781.2に観測されるが、重水素化反応を行うと高質量側に移動する。重水素化反応におけるリガンドの添加の有無により重水素化量が異なることが観測された。
【００４０】
【表１】
2005328767.tif 000003
表１には、HCOMTフラグメントの絶対重水素化率をまとめた。完全重水素化理論質量=1とする。網掛けは当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上低いフラグメントを、濃い灰色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上高いフラグメントを示す。薄い灰色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以下低いあるいは高いフラグメントを示す。
【００４１】
［実施例１３：重水素化リコンビナントヒトCOMTペプシン消化フラグメントの重水素化率評価］
実施例９、実施例１０、実施例１１で得られた各フラグメントの重水素化率を実施例８で得られた該当する各フラグメントの重水素化率で除した結果が図７及び表２に示された。
実施例９においてフラグメント1-24、9-24、 25-28、 40-53、 91-99および100-106は同実験における各フラグメントの平均重水素化率より3%以上低いことが判明した。このことから、これらのフラグメントがS-(5’-アデノシル)-L-メチオニン結合サイトを形成している、もしくはS-(5’-アデノシル)-L-メチオニン結合サイトの近傍に位置し、S-(5’-アデノシル)-L-メチオニンが結合する際に重水素化速度において影響があることが判明した。また、実施例１１においてフラグメント1-24、 9-24、 40-53、 91-99、 100-106、 142-154、 172-181および211-223は同実験における各フラグメントの平均重水素化率より3%以上低いことが判明した。このことから、これらのフラグメントがトルカポン結合サイトを形成している、もしくはトルカポン結合サイトの近傍に位置し、トルカポンが結合する際に重水素化速度が低下する影響があることが判明した。このうち、特にフラグメント9-24および172-181についてより詳細に説明する。フラグメント9-24は実施例９および実施例１１における相対重水素化率比がそれぞれ0.830と0.834であり両者間にほとんど変化が認められない。しかしながら実施例１０における相対重水素化率比は0.907であり、明らかに実施例９および実施例１１より高い。このことから実施例９および実施例１１におけるリガンドであるS-(5’-アデノシル)-L-メチオニンはトルカポンの非存在、存在の違いに関わらずフラグメント9-24の重水素化速度を低下させることが結論される。一方、フラグメント172-181は実施例９における相対重水素化率比は1.000であり、S-(5’-アデノシル)-L-メチオニンの非存在、存在による重水素化速度の変化は認められない。しかしながら、実施例１１におけるフラグメント172-181の相対重水素化率比は0.745であり、明らかに実施例９より低い。実施例１０におけるフラグメント172-181の相対重水素化率比は0.915であり若干実施例９より低い重水素化量ではあるが、実施例１１程低い値ではない。このことから、トルカポンはS-(5’-アデノシル)-L-メチオニンの非存在下ではリコンビナントヒトCOMTに対し結合せず、 S-(5’-アデノシル)-L-メチオニンの存在下においてのみ結合できることが結論された。以上の２点よりリコンビナントヒトCOMTに対するS-(5’-アデノシル)-L-メチオニンとトルカポンの結合順は最初にS-(5’-アデノシル)-L-メチオニン、次いでトルカポンである事が結論づけられた。
【００４２】
アロステリックタンパク質について、アロステリックリガンドおよび基質との結合による構造変化を解析する場合、重水素化率を指標にするよりも相対重水素化率を指標にすることが有効であることは以下の理由から明らかである。例えば、フラグメント100-106 は分子表面に存在せず、実施例８、９、１０、１１での重水素化率は表１に示したようにそれぞれ0.455、0.413、0.413、0.377 といずれも低く、各フラグメントの重水素化率を示した図５から、リガンドの有無による重水素化率の違いをはっきりと認識することは容易ではない。これに対し、リガンド非存在下における重水素化率を１として算出された相対重水素化率は表２に示したように0.909、0.908、0.828となり、相対重水素化率を示す図７を用いることにより、リガンド有無による重水素化反応の受け方の違いについて容易に解析することができる。すなわち、相対重水素化率を指標とすることにより、リガンドの有無によるアロステリックタンパク質の構造変化に関する解析が容易になることは明らかである。
【００４３】
【表２】
2005328767.tif 000004
表２には、HCOMTフラグメントの相対重水素化率をまとめた。Apo-HCOMTの重水素化率を１とする。網掛けは当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上低いフラグメントを、濃い灰色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上高いフラグメントを示す。薄い灰色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以下低いあるいは高いフラグメントを示す。
【００４４】
［実施例１４：アロステリックリガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化それに続くペプシン消化実験結果のラット COMT の構造に対するコンピュータによる解析］
実施例１３で得られた結論が妥当であるかどうかを検証するためにコンピュータによるドッキングスタディを実施した。
ヒトCOMTと80%の相同性を持っているラットCOMTとS-(5’-アデノシル)-L-メチオニンおよび3,5-ジニトロカテコールの3成分結晶(1vid.pdb)の原子座標はプロテインデータバンクから入手され、マグネシウムイオンに配位しているHOH400以外の水分子および3,5-ジニトロカテコールは削除された。このようにして得られたラットCOMT原子座標はソフトウェアViewerLite 4.2 (Accelrys社、サンジエゴ、カリフォルニア州、US)によって可視化された。得られたラットCOMTのリボン図及び分子表面図は表２における実施例９の各フラグメントの重水素化レベル別に着色され、図８及び図９に示された。図８及び図９において黄色は当該実験における各フラグメントの平均重水素化率より３％以上低いフラグメントを、赤色は当該実験における各フラグメントの平均重水素化率より３％以上高いフラグメントが示された。その結果、表２における実施例９において各フラグメントの平均重水素化率より３％以上低いフラグメントはS-(5’-アデノシル)-L-メチオニン結合サイトを形成している、もしくはその近傍にあることが確認された。
【００４５】
［実施例１５：アロステリックリガンドおよびリガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化それに続くペプシン消化実験結果のラット COMT の構造に対するコンピュータによる解析］
実施例１３で得られた結論が妥当であるかどうかを検証するためにコンピュータによるドッキングスタディを実施した。
ヒトCOMTと80%の相同性を持っているラットCOMTとS-(5’-アデノシル)-L-メチオニンおよび3,5-ジニトロカテコールの3成分結晶(1vid.pdb)の原子座標はプロテインデータバンクから入手され、マグネシウムイオンに配位しているHOH400以外の水分子および3,5-ジニトロカテコールは削除された。このようにして得られたラットCOMT原子座標に対するトルカポンのドッキングスタディはソフトウェアADAM (株式会社医薬分子設計研究所、東京、日本国)を用いて実施され、ソフトウェアViewerLite 4.2 (Accelrys社、サンジエゴ、カリフォルニア州、US)によって可視化された。得られたラットCOMTのリボン図及び分子表面図は表２における実施例１１の各フラグメントの重水素化レベル別に着色され、図１０及び図１１に示された。図１０及び図１１において黄色は当該実験における各フラグメントの平均重水素化率より３％以上低いフラグメントを、赤色は当該実験における各フラグメントの平均重水素化率より３％以上高いフラグメントが示された。その結果、表２における実施例１１において各フラグメントの平均重水素化率より３％以上低いフラグメントはトルカポン結合サイトを形成している、もしくはその近傍にあることが確認された。トルカポンのヒトCOMTへの結合はフラグメント1-24、 91-99及び100-106に対して２次的影響があると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の方法により、アロステリックタンパク質のアミノ酸数残基レベルでの構造変化について、NMR法やX線結晶構造解析の手法に比べると、短時間でかつ少ない試料量で調べることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の方法の概略図。
【図２】実施例で用いた化合物の化学構造。
【図３】ペプシン消化後の組換えHCOMTのペプチドマップ。本明細書において、アミノ酸番号の記述はこの図を基にしている。
【図４】100 mM CD3COOND4 pD 7.2、1%メタノール-d4中で、４℃にて２時間、重水素化した時のヒトCOMTの重水素化率。 (1) ヒトCOMTのみ（Apo-HCOMT）；  (2) 1 mMのトルカポン（基質）存在下（T-HCOMT）；  (3) 2 mMのSAM（アロステリックリガンド）存在下（S-HCOMT）；  (4) 1 mMのトルカポン（基質）と2 mMのSAM（アロステリックリガンド）の存在下（ST-HCOMT）。
【図５】ヒトCOMTフラグメントの重水素化率。完全に重水素化された場合を１とする。左から1-24、9-24、25-28、29-33、40-53、54-64、65-69、76-78、79-88、91-99、100-106、105-116、113-116、123-138、142-154、162-168、172-181、182-190、191-196、211-223。ひし形（灰色）がApo-HCOMT、三角形（灰色）がT-HCOMT、小さな正方形（灰色）がS-HCOMT、大きな丸形（黒色）がST-HCOMTの重水素化率を示す。図中の点線は上からApo-HCOMT（灰色）、T-HCOMT（細破線）、S-HCOMT（中破線）、ST-HCOMT（太線）の場合のそれぞれの平均重水素化率の値を示す。
【図６】フラグメント40-53の典型的なチャート。ヒトCOMTを異なるバッファー中で４℃で２時間インキュベーションした後、固定化したペプシンで４℃で７分間消化したときに、フラグメント 40-53 の2価イオン781.23はより高いm/zに移動した。バッファーの成分は以下の通りである。最上部：100 mM CH3COONH4、 pH 7.2、 1% メタノール；２番目：100 mM CD3COOND4、 pD 7.2、 1% メタノール-d4 (Apo-HCOMT)；３番目：100 mM CD3COOND4、 pD 7.2、 1% メタノール-d4、 2 mM SAM (S-HCOMT)；４番目：100 mM CD3COOND4、 pD 7.2、 1% メタノール-d4、 1 mM トルカポン (T-HCOMT)；最下部：100 mM CD3COOND4、 pD 7.2、 1% メタノール-d4、 2 mM SAM、 1 mM トルカポン (ST-HCOMT)。このフラグメントを完全に重水素化したものの平均質量の理論値はm/z=796.0（2価）と算出された。
【図７】ヒトCOMTフラグメントの相対重水素化率。Apo-HCOMTの重水素化率を１とする。ひし形（灰色）がApo-HCOMT、三角形（灰色）がT-HCOMT、小さな正方形（灰色）がS-HCOMT、大きな丸形（黒色）がST-HCOMTの相対重水素化率を示す。図中の直線は上からApo-HCOMT（灰色）、T-HCOMT（細破線）、S-HCOMT（中破線）、ST-HCOMT（太線）の場合のそれぞれの平均相対重水素化率の値を示す。
【図８】アロステリックリガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化それに続くペプシン消化実験における各フラグメントを重水素化率別にラットCOMTの構造に重ね合わせた図。S-(5’-アデノシル)-L-メチオニンは緑色で示された。黄色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上低いフラグメントを、赤色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上高いフラグメントを示す。
【図９】図８の分子表面図。S-(5’-アデノシル)-L-メチオニンは緑色で示された。黄色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上低いフラグメントを、赤色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上高いフラグメントを示す。
【図１０】アロステリックリガンドおよびリガンド存在下におけるリコンビナントヒトCOMTの重水素化それに続くペプシン消化実験における各フラグメントを重水素化率別にラットCOMTの構造に重ね合わせ次いでトルカポンをコンピュータによりドッキングさせた図。S-(5’-アデノシル)-L-メチオニンは緑色で、トルカポンは紫色で示された。黄色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上低いフラグメントを、赤色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上高いフラグメントを示す。
【図１１】図１０の分子表面図。S-(5’-アデノシル)-L-メチオニンは緑色で、トルカポンは紫色で示された。黄色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上低いフラグメントを、赤色は当該実験における各フラグメントの平均相対重水素化率より３％以上高いフラグメントを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
＜配列番号１＞
配列番号１は、リコンビナントヒトCOMTのアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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