(57)【要約】【課題】核酸を含有する生物学的サンプルを調製し、そして調製物由来の核酸を固相に吸着させる代替方法を提供する。吸着工程の間のアルコールの必要を克服すること。【解決手段】〔１〕（ａ）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；（ｂ）該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程；（ｃ）工程（ｂ）の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mより多くだけ増加する工程；（ｄ）工程（ｃ）の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程を含む、生物学的サンプル由来の核酸を固相に吸着するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；
（ｂ）該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mより多くだけ増加する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程
を含む、生物学的サンプル由来の核酸を固相に吸着するための方法。
【請求項２】
カオトロピック剤が塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の溶解緩衝液がタンパク質分解活性を有する酵素を含有することを特徴とする、請求項１および２いずれか記載の方法。
【請求項４】
タンパク質分解活性を有する酵素がカスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ（エスペラーゼ）、およびサブチリシンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）の溶解緩衝液が洗剤を含有することを特徴とする、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
固相がシリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群より選択される多孔性または非多孔性無機質基材を含有することを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
固相が磁性ガラス粒子を含有することを特徴とする、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
（ａ）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；
（ｂ）該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mより多くだけ増加する工程；
（ｄ）固相を提供し、工程（ｃ）の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程；
（ｅ）液相から該固相を分離する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の固相を洗浄緩衝液で任意に洗浄する工程；
（ｇ）該固相から核酸を溶出し、それにより核酸を単離する工程；
（ｈ）工程（ｇ）の核酸を溶出液から任意に沈殿させ、沈殿した核酸を単離する工程
を含む、生物学的サンプル由来の核酸を単離するための方法。
【請求項９】
カオトロピック剤が塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群より選択されることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）の溶解緩衝液がタンパク質分解活性を有する酵素および洗剤を含有することを特徴とする、請求項８および９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質分解活性を有する酵素がカスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ（エスペラーゼ）、およびサブチリシンからなる群より選択され、
洗剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸、ラウロイルザルコシンナトリウム、Triton-X100、Tween 20、オクチルβ-D-グルコシド、NonidetP40、CHAPSおよびSulphobetaine 14からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
固相がシリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群より選択される多孔性または非多孔性無機質基材を含有することを特徴とする、請求項８〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
固相が磁性ガラス粒子を含有することを特徴とする、請求項８〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１４】
生物学的サンプルが細菌細胞、真核生物細胞、ウイルスまたはその混合物を含有することを特徴とする、請求項８〜１３いずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相に核酸を吸着させる、すなわち、非共有結合させる方法に関する。さらに、本発明は、生物学的サンプルから核酸を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物学的物質、特に核酸は、それらの天然の環境からそれらを単離させる点で特別の難題をもたらす。一方では、それらの物質は、しばしば、非常に低い濃度で存在し、そして他方では、それらの物質は、しばしば、例えば細胞の溶解の後、多くの他の固形および溶解物質の存在下で見出される。これは、特に、特定の核酸の検出または核酸の特定の特性の検出を可能にする生物特異的アッセイにおいて、それらを単離または測定することを困難にする。このような生物特異的アッセイは、研究および開発における診断および生物分析学の分野で主要な役割を果たす。生物特異的アッセイの例は、ハイブリダイゼーションアッセイ、免疫アッセイおよびレセプター−リガンドアッセイである。ハイブリダイゼーションアッセイは、核酸被検体、例えばRNAおよびDNAの分子検出のために特異的塩基対合を使用する。従って、18から20ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、ヒトゲノム中での選択された相補配列の特異的認識を可能にしうる。2つのオリゴヌクレオチドプライマーの選択結合を伴う別のアッセイは、特許文献１に記載のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。この方法は、数サイクルで、デスオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で熱安定性ポリメラーゼにより、検出可能なレベルまで特異的核酸領域の選択的増幅を可能にする。
【０００３】
上述のように、核酸が、上述のアッセイの内の1つで分析されるか、または他の処理に使用されうる前に、それらは、例えば、タンパク質性および非タンパク質性成分として、様々な成分の複合混合物を含む生物学的サンプルから単離または精製されなければならない。しばしば、第一段階として、目的の成分、すなわち核酸の富化を可能にする処理が使用される。頻繁に、これらは、細菌細胞、真菌細胞、ウイルス粒子、またはヒト血球または植物細胞のような、より複雑な生物の細胞に含まれる。目的の成分としての核酸は、「標的成分」とも呼ばれうる。
【０００４】
上記細胞または粒子の内容物を放出するために、それらは、酵素で、または化合物で処理されて、このような生物の細胞壁および細胞膜を溶解、分解または変性させうる。この処理は、一般に、溶解と称される。このような溶解物質を含む得られた溶液は、溶解物と称される。溶解の間にしばしば遭遇する問題は、標的成分を分解する他の酵素（例えば、核酸を分解するデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ）が、溶解の間に標的成分と接触するようになることである。これらの分解酵素も、細胞の外側に存在しうるか、または、溶解の前に異なる細胞区画中で空間的に分離されてきた可能性があり、そして今、標的成分と接触するようになる。この処理の間に放出される他の成分は、例えば、リポ多糖のファミリーに属する内毒素であり得、これらの内毒素は、細胞に対して毒性があり、ヒトまたは動物治療で使用されることが意図される生成物に対して問題を引き起こしうる。
【０００５】
溶解段階に続くサンプル調製の次の段階で、核酸はさらに富化される。核酸は、それらが、プローブベースのアッセイで使用される前に、複雑な溶解混合物から通常抽出される。核酸の抽出のためのいくつかの方法がある。配列依存性または生物特異的方法としては、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは固定化プローブへのハイブリダイゼーションが挙げられる。配列依存性または物理化学的方法としては、例えば、フェノール−クロロホルムを用いた液体−液体抽出、純粋エタノールまたはイソプロパノールを用いた沈殿、ろ紙を用いた抽出、セチル−トリメチル−アンモニウム−ブロミドのようなミセル形成剤を用いた抽出、アクリジン誘導体のような固定化されたインターカレート染料への結合、シリカゲルまたは珪藻土のような基材への吸着、カオトロピック条件下での磁気的に誘導性のガラス粒子（MGP）または有機シラン粒子への吸着が挙げられる。他の理由のなかでも、核酸が修飾される必要がなく、天然の核酸でさえ結合されうるので、シリカ表面を有する材料のような基材への核酸の直接結合が好ましい。
【０００６】
抽出目的のために特に興味深いのは、他の表面は可能であるが、ガラス表面への核酸の吸着である。
【０００７】
細胞溶解および／またはミトコンドリア、色素体、核または他の核酸含有小器官のような細胞小器官の溶解などにより遊離される核酸は、無機質基材のような固相に結合し、核酸が結合した上記無機質基材を洗浄し、そして上記核酸を上記無機質基材から放出させることにより精製されうる。
【０００８】
カオトロピック塩の存在下でのガラス粒子またはシリカ粒子への核酸の吸着は、当該分野で公知であり（非特許文献１）、核酸についてのクロマトグラフィー精製および分離処理についての基礎を提供する。さらに当該分野で公知であるのは、高濃度のカオトロピック塩（例えば、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムおよびチオシアン酸グアニジンなど）を使用して、溶解物からRNAおよびDNAを単離および精製する方法である（非特許文献２；非特許文献３）。過塩素酸ナトリウムの存在下で、ガラス粉末上の細菌からのプラスミドDNAの精製は、非特許文献４に記載される。特許文献２では、酢酸を使用したファージ粒子の沈殿および過塩素酸塩を用いたファージ粒子の溶解によるガラス繊維フィルター上の一本鎖M13ファージDNAの単離が記載される。ガラス繊維フィルターに結合した核酸を洗浄し、次いで、メタノール含有Tris／EDTA緩衝液を用いて溶出させる。λファージからDNAを精製する類似の手順は、非特許文献５に記載される。その手順は、カオトロピック塩溶液中でのガラス表面への核酸の選択的結合、およびアガロース、タンパク質または細胞残渣のような混入物から核酸を分離することを伴う。混入物からガラス粒子を分離するために、粒子を遠心分離するか、または流動体を、ガラス繊維フィルターを通して流すかのいずれかでありうる。しかし、これは、その手順が、多量のサンプルを処理するために使用されるのを妨げる制限段階である。
【０００９】
塩およびエタノールを添加することによって沈殿後に核酸を固定するための磁性粒子の使用は、さらに有利であり、そして例えば、非特許文献６および特許文献３に記載される。この手順では、核酸は、磁性粒子と一緒に凝集される。磁場をかけ、そして洗浄工程を行うことによって、当初の溶媒から凝集物を分離する。1回の洗浄工程の後、核酸を、Tris緩衝液に溶解させる。しかし、この手順は、沈殿が、核酸に選択的でないという欠点を有する。むしろ、多様な固形および溶解物質を同様に凝集する。結果として、この手順は、存在する可能性のある有意な量の特異的酵素反応のあらゆるインヒビターを除去するために使用できない。多孔性、特にガラスマトリックス中に磁性粒子を含み、そしてストレプトアビジンを含む層で覆われた磁性多孔性ガラスも、市場で利用可能である。この製品は、それらがビオチンに共有結合するように複雑な調製段階で修飾される場合に、生物学的材料、例えばタンパク質または核酸を単離するために使用されうる。自動サンプル調製に非常に有効かつ適切な磁性化可能な特定の吸着剤が、提供される。フェリ磁性体および強磁性体、並びに超常磁性色素は、この目的のために使用される。最も好ましいMGPは、特許文献４に記載されるものである。
【００１０】
高濃度の塩の存在下で、無機質基材のような基材に同じものを吸着させることによる核酸の精製も、他の複合混合物に適用される。それらについての例は、分子生物学の当業者に公知であり、そして例えば、PCR、制限酵素消化、ライゲーション反応などのような核酸のインビトロ合成後の反応混合物が挙げられる。非特許文献１では、例えば、ヨウ化ナトリウムの存在下のアガロースゲルから、すりフリントガラスに核酸を結合する手順が提案される。高濃度の塩の存在下で、無機質基材のような基材に同じものを吸着させることによる核酸の精製のための別の適用は、その核酸と同時精製し得た発熱性混入物の除去である。
【００１１】
核酸がカオトロピック剤の存在下で無機質基材に結合する機構は、完全には明らかになっていない。核酸と溶媒との間の相互作用は、核酸が無機質支持体に吸着し、そして変性するように作用することが仮定される。高濃度のカオトロピック剤の存在下において、反応はほとんど定量的である。吸着核酸は、低イオン強度の無機質支持体緩衝液にアプライすることによって溶出されうる。
【００１２】
特許文献５には、所定の生物学的サンプルから約50塩基より長い核酸を単離する方法が開示されている。約2Mより高い濃度でカオトロピックイオンを含む水性溶解物を生成し、そして核酸を、溶解物からシリカ材料に吸着させる（「結合」とも呼ばれる）。シリカ材料およびカオトロピック塩を含むスラリーまたは樹脂を、生物学的材料に添加し、その結果、１段階溶解および結合手順を生じる。明細書中に開示される生物学的サンプルを溶解する方法は、アルカリ性水酸化物およびSDSを使用した細菌の溶解、2.8Mグアニジニウムの存在下でファージをインキュベートすることによるM13またはλファージの溶解、および2.8Mグアニジニウムの存在下で組織をインキュベートすることによる新鮮または凍結組織の溶解を包含する。さらに、N-ラウリル-ザルコシンを、溶解を助けるために使用する。
【００１３】
特許文献６および特許文献７は、液相中で、核酸を含む材料を、カオトロピック物質および核酸結合固相と混合することにより核酸を精製する方法を開示する。従って、その明細書中で開示される手順は、１段階溶解および結合手順をも示す。溶解および結合に続いて、結合した核酸を有する固相を、液相から分離する。洗浄工程に続いて、核酸を、固相から溶出させる。その明細書は、約10Mチオシアン酸グアニジニウム、約2％Triton-X100、約0.1M Tris塩、および約50μM EDTAを含む溶解緩衝液を開示する。別の溶解緩衝液は、さらに、40重量／体積％硫酸デキストランを含む。別の溶解緩衝液は、約10Mチオシアン酸グアニジニウムおよび約50μM EDTAを含有する。カオトロピック物質として、約3Mの濃度でヨウ化カリウムもしくはヨウ化ナトリウムを、または、1Mまたは8M尿素と組み合わせてヨウ化カリウムもしくはナトリウムを含む他の溶解緩衝液が明細書中に開示されている。生物学的サンプルを、溶解緩衝液とインキュベートし、ここで50体積部の生物学的サンプルを、900体積部の溶解緩衝液および40体積部の粗製シリカと混合することにより、生物学的サンプルの溶解は、達成される。粗製シリカを使用する代替として、シリカフィルター材料を使用する他の手順が記載される。
【００１４】
特許文献８は、クロマトグラフィー精製により核酸のクロマトグラフィー精製の方法を記載している。特に、第一の溶解段階および第二の結合段階を包含する２段階手順が、記載されている。第一の段階（溶解）では、生物学的サンプルを、カオトロピック剤と混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、約2Mおよび約4Mの間にある。都合により、混合物は、さらに、フェノール、クロロホルムまたはエーテルを含有する。都合により、混合物は、さらに、洗剤を含有する。プロテアーゼを添加し、そしてその混合物を、インキュベートする。第二段階（結合）では、アルコールを添加し、そして生じた混合物を、核酸結合固相と接触させる。
【特許文献１】米国特許第4,683,195号明細書
【特許文献２】独国特許第3724442号明細書
【特許文献３】国際公開第91／00212号パンフレット
【特許文献４】国際公開第01／37291号パンフレット
【特許文献５】米国特許第5,808,041号明細書
【特許文献６】欧州特許第0389063号明細書
【特許文献７】欧州特許第0819696号明細書
【特許文献８】欧州特許第0658164号明細書
【非特許文献１】Vogelstein，B.およびGillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76（1979）615−619
【非特許文献２】Boom, R.ら, J. Clin. Microbiol. 28（1990）495−503
【非特許文献３】Yamada, O.ら, J. Virol. Methods 27（1990）203−209
【非特許文献４】Marko, M.A.ら, Anal. Biochem. 121（1982）382−387
【非特許文献５】Jakobi, R.ら, Anal. Biochem. 175（1988）196-201
【非特許文献６】Alderton, R.P.ら, Anal. Biochem. 201（1992）166−169
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
当該分野の現状の方法は、所定の欠点を示す。従って、核酸を含有する生物学的サンプルを調製し、そして調製物由来の核酸を固相に吸着させる代替方法を提供することが、本発明の目的であった。アルコールが可燃性物質であり、従ってそれの使用を制限することが望ましいので、吸着工程の間のアルコールの必要を克服することが、本発明の別の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
すなわち、本発明は、
〔１〕（ａ）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；
（ｂ）該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mより多くだけ増加する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程
を含む、生物学的サンプル由来の核酸を固相に吸着するための方法；
〔２〕カオトロピック剤が塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群より選択されることを特徴とする、上記〔１〕記載の方法；
〔３〕工程（ａ）の溶解緩衝液がタンパク質分解活性を有する酵素を含有することを特徴とする、上記〔１〕および〔２〕いずれか記載の方法；
〔４〕タンパク質分解活性を有する酵素がカスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ（エスペラーゼ）、およびサブチリシンからなる群より選択されることを特徴とする、上記〔３〕記載の方法；
〔５〕工程（ａ）の溶解緩衝液が洗剤を含有することを特徴とする、上記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の方法；
〔６〕工程（ａ）の溶解緩衝液中の洗剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸、ラウロイルザルコシンナトリウム、Triton-X100、Tween 20、オクチルβ-D-グルコシド、Nonidet P40、CHAPSまたはSulphobetaine 14からなる群より選択されることを特徴とする、上記〔５〕記載の方法；
〔７〕固相がシリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群より選択される多孔性または非多孔性無機質基材を含有することを特徴とする、上記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の方法；
〔８〕固相が磁性ガラス粒子を含有することを特徴とする、上記〔１〕〜〔７〕いずれか記載の方法；
〔９〕（ａ）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；
（ｂ）該溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度は1Mと4Mとの間であり、該混合物をインキュベートする工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解するか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより該混合物中のカオトロピック剤の濃度を0.5Mより多くだけ増加する工程；
（ｄ）固相を提供し、工程（ｃ）の混合物を固相と接触させ、それにより該混合物由来の核酸を該固相に吸着する工程；
（ｅ）液相から該固相を分離する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の固相を洗浄緩衝液で任意に洗浄する工程；
（ｇ）該固相から核酸を溶出し、それにより核酸を単離する工程；
（ｈ）工程（ｇ）の核酸を溶出液から任意に沈殿させ、沈殿した核酸を単離する工程
を含む、生物学的サンプル由来の核酸を単離するための方法；
〔１０〕カオトロピック剤が塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群より選択されることを特徴とする、上記〔９〕記載の方法；
〔１１〕工程（ａ）の溶解緩衝液がタンパク質分解活性を有する酵素および洗剤を含有することを特徴とする、上記〔９〕および〔１０〕いずれか記載の方法；
〔１２〕タンパク質分解活性を有する酵素がカスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ（エスペラーゼ）、およびサブチリシンからなる群より選択され、
洗剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸、ラウロイルザルコシンナトリウム、Triton-X100、Tween 20、オクチルβ-D-グルコシド、Nonidet P40、CHAPSおよびSulphobetaine 14からなる群より選択されることを特徴とする、上記〔１１〕記載の方法；
〔１３〕工程（ｂ）の混合物が、生物学的サンプル、約2Mの濃度のチオシアン酸グアニジニウム、約25mMの濃度のTris塩、約10体積％の濃度のTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性が約3U/mlであり、混合物のpHが約6であることを特徴とする、上記〔１２〕記載の方法；
〔１４〕工程（ｂ）の混合物が、生物学的サンプル、約2.7Mの濃度の塩酸グアニジニウム、約5mMの濃度の尿素、約5mMの濃度のTris塩、約9体積％の濃度のTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性が約3U/mlであり、混合物のpHが4.4と6.5との間であることを特徴とする、上記〔１２〕記載の方法；
〔１５〕工程（ｂ）の混合物が、生物学的サンプル、約2.4Mの濃度の塩酸グアニジニウム、約1.6mMの濃度の尿素、約85mMの濃度のTris塩、約88mMの濃度のEDTA、約8mMの濃度のNaCl、約9体積％の濃度のTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性が約3U/mlであり、混合物のpHが4.4と6.5との間であることを特徴とする、上記〔１２〕記載の方法；
〔１６〕工程（ｂ）の混合物が約20℃と約75℃の間の温度で10分〜30分間インキュベートされ、ここで混合物がかき混ぜられることを特徴とする、上記〔１３〕記載の方法；
〔１７〕固相がシリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群より選択される多孔性または非多孔性無機質基材を含有することを特徴とする、上記〔９〕〜〔１６〕いずれか記載の方法；
〔１８〕固相が磁性ガラス粒子を含有することを特徴とする、上記〔９〕〜〔１６〕いずれか記載の方法；ならびに
〔１９〕生物学的サンプルが細菌細胞、真核生物細胞、ウイルスまたはその混合物を含有することを特徴とする、上記〔９〕〜〔１８〕いずれか記載の方法
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、核酸を含有する生物学的サンプルを調製し、そして調製物由来の核酸を固相に吸着させる代替方法を提供すること、および吸着工程の間のアルコールの必要を克服することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書で、用語「核酸」は、少なくとも1種の核酸を示すことが理解される。さらに、用語「核酸」は、核酸の混合物も示しうる。用語「固相」および「基材」は、水溶液中で実質的に不溶性であり、そして高イオン強度の水溶液中の核酸が、その物質が添加されるときに吸着しうる物質を示す。従って、例は、シリカ、ガラス、石英、ゼオライトまたはそれらの混合物のような多孔性または非多孔性無機質粒子である。さらに、用語「基材」は、シリカ、ガラス、石英、またはゼオライトで被覆された磁気的に誘導性の粒子を包含する。さらに、「粉末」または「粉末状」材料の形態での基材は、液体有機化合物のような液相または水溶液中に分散させたときに、懸濁液を生じる、微細に分割された材料に該当することが分かる。用語「粉末」または「粉末状」材料は、粉末状材料が凝集されたが、しかし、水溶液のような液相と組合わせた場合に、なお懸濁液を生じる錠剤を含むことを意図する。さらに、用語「高イオン強度」および「高濃度」は、約1Mに等しいか、またはそれより大きい濃度で溶解した塩から生じる水溶液中でのイオン強度または濃度を意味することが理解される。好ましいのは、1から10Mまでの濃度でのカオトロピック塩である。
【００１９】
発明者らは、驚くべきことに、２工程溶解および結合手順を行うことは有利であり、ここで、第一工程では、生物学的サンプルを、カオトロピック剤を含む水性溶解緩衝液と混合し、そして混合物をインキュベートすることによって、溶解を達成し、第二工程では、混合物中のカオトロピック剤の濃度を増大させ、そして混合物を、核酸を結合する能力のある固相と接触させ、ここで液相中の核酸を、固相に吸着させることを知見した。
【００２０】
従って、本発明の第一の態様は、（a）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；（b）溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度が1Mと4Mの間にあり、混合物をインキュベートする工程；（c）工程（b）の混合物に、追加量のカオトロピック剤を溶解させるか、または追加量のカオトロピック剤を含む水溶液を添加する工程であって、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度を、0.5Mより多くまで増大させる、工程；（d）工程（c）の混合物を、固相と接触させ、それにより、混合物由来の核酸を固相に吸着させる工程を包含する、生物学的サンプル由来の核酸を固相に吸着させる方法である。
【００２１】
本発明の第二の態様は、（a）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；（b）溶解緩衝液を、生物学的サンプルと混合させ、それにより、混合物中のカオトロピック剤の濃度が、1Mと4Mの間にあり、そしてその混合物をインキュベートする工程；（c）工程（b）の混合物に、追加量のカオトロピック剤を溶解させるか、または追加量のカオトロピック剤を含む水溶液を添加し、それにより、混合物中のカオトロピック剤の濃度を、0.5Mより多くまで増大させる工程；（d）固相を提供し、そして工程（c）の混合物を、固相と接触させ、それにより、混合物から得られる核酸を、固相に吸着させる工程；（e）液相から固相を分離し；（f）都合により、工程の固相を、洗浄緩衝液で洗浄する工程；（g）固相から核酸を溶出させ、それにより、核酸を単離する工程；（h）都合により、溶出液から工程（g）の核酸を沈殿させ、そして沈殿核酸を単離する工程を包含する、生物学的サンプルから核酸を単離する方法である。
【００２２】
核酸を、それらの天然の環境から単離する多くの手順が、ガラス表面のような基材に対するそれらの結合作用の使用により、近年提案されている。例えば、高い塩条件下で、チオシアン酸グアニジンのようなカオトロピック剤を使用することが一般的である。高濃度のカオトロピック剤は、水の原料特性を変化させる（Cacace， M．G．ら, Quarterly Review of Biophysics （1997）30：241−277頁）。
【００２３】
水中での特定のイオンは、疎水性相互作用を増大させる傾向にある一方で、他のイオンは、疎水性相互作用を減少させる。どのイオンが、その効果がホフマイスター系列と呼ばれるものにより記載される傾向を示すのか。そのシリーズは、以下のとおりである：
【００２４】
陽イオン：
NH4＋＞Rb＋＞K＋＞Na＋＞Cs＋＞Li＋＞Mg2＋＞Ca2＋＞Ba2＋＞グアニジニウム
陰イオン：
PO43−＞SO42−＞HPO42−＞酢酸イオン＞クエン酸イオン＞酒石酸イオン＞Cl−＞Br−＞NO3−＞ClO3−＞ClO4−＞I−＞SCN−
【００２５】
左にあるイオンは、「コスモトロピック」であり、そして疎水性相互作用の強度を増大させ、従って、高濃度でタンパク質を沈殿または「塩析」するとされる。右にあるイオンは、「カオトロピック」であり、そして疎水性相互作用を弱める傾向にある。ホフマイスター系列は、なぜグアニジニウムがタンパク質変性剤であるかを説明する。それは、タンパク質を変性させる疎水性相互作用を弱める。対照的に、（NH4）2SO4は、NH4＋とSO42−イオンに解離する。これらのイオンの両方は、コスモトロピックであり、そして各々の効果は、独立で、そして付加的である。これは、（NH4）2SO4を、タンパク質精製手順で広く使用される用途の広い沈殿剤にする。NaClは、そのシリーズの中ごろにあり、そしてそれは、コスモトリピックでも、カオトロピックでもない。
【００２６】
核酸を含有する生物学的サンプルを調製し、そして調製物由来の核酸を、固相に吸着させるために、有利に、２工程溶解および結合方法が使用されることが、発明者らにより知見された。第一工程（溶解）では、カオトロピック剤の濃度は、第二工程（結合）でより低い。溶解工程の間、それは、生物学的サンプルと溶解緩衝液の混合物中で、カオトロピック剤の好ましい濃度は、1Mと4Mの間にあるとされる。従って、本発明の第一の好ましい態様は、（a）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；（b）溶解緩衝液を、生物学的サンプルと混合し、それにより、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、1Mと4Mの間であり、そしてその混合物をインキュベートする工程；（c）工程（b）の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解させるか、またはさらなるカオトロピック剤を含む水溶液を添加し、それにより、混合物中のカオトロピック剤の濃度を、0.5Mより多くだけ増大させる工程；（d）工程（c）の混合物を、固相と接触させ、それにより、混合物由来の核酸を固相に吸着させる工程を包含する、生物学的サンプル由来の核酸を固相に吸着させる方法である。
【００２７】
カオトロピック剤は、カオトロピック塩であることが好ましい。カオトロピック剤は、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群から選択されることがさらに好ましい。好ましくは、ヨウ化アルカリは、KIまたはNaIである。好ましくは、過塩素酸アルカリは、NaClO4またはKClO4である。これらの化合物の混合物、並びにこれらの化合物と尿素の混合物も可能である。
【００２８】
使用されるカオトロピック剤によって、工程（b）の混合物中でのそれの最適濃度は、変化しうる。例えば、塩酸グアニジニウムまたはチオシアン酸グアニジニウムを使用して匹敵するカオトロピック効果を得るために、1Mと4Mの間の所定範囲にある様々な濃度が選択されるべきである。この差の根底にある概念は、水中に溶解される場合にチオシアン酸グアニジニウム塩は解離して、2つのカオトロピックイオンを生じるのに対して、解離した塩酸グアニジニウムは、ただ1つのカオトロピックイオンを生じることである。従って、工程（b）の混合物で、カオトロピック剤の濃度は、1Mと2Mの間にあることが好ましい。工程（b）の混合物で、カオトロピック剤の濃度は、1.5Mと2Mの間にあることがさらに好ましい。工程（b）の混合物で、カオトロピック剤の濃度は、約2Mであることが、さらにいっそう好ましい。使用されるカオトロピック剤によって、工程（b）の混合物で、カオトロピック剤の濃度は、2Mと4Mの間にあることも好ましい。工程（b）の混合物で、カオトロピック剤の濃度は、2.5Mと3Mの間にあることがさらに好ましい。工程（b）の混合物で、カオトロピック剤の濃度は、約3Mであることがさらにいっそう好ましい。
【００２９】
この点で、数的定量値と組合わせた語句「約」は、この値が、変分（vartiation）に供され、それにより、値によって示されるか、または定義される所望の技術的効果は、変わらないままでありうることを意味することは、当業者の一般的理解である。一般に、「約」は、5％の変動を包含することが分かる。例えば、約100の値は、95と105の間の値を包含する。
【００３０】
グアニジニウムおよびチオシアン酸イオンは、ホフマイスター系列で、それぞれ、例えばカリウムまたはナトリウム陽イオン、またはヨウ化物または塩化物陰イオンより増強されたカオトロピック特性を示すと分類される。従って、工程（b）の混合物中で、カオトロピック剤の濃度は、2Mと4Mの間にあることも好ましい。
【００３１】
第二工程（結合）では、さらなるカオトロピック剤を、工程（b）の混合物に添加することにより、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、増大される。工程（c）について示されるとおり、所望の増加を達成するいくつかの方法がある。工程（b）の混合物に、固形物としてカオトロピック剤を添加し、そしてカオトロピック剤を溶解させることが可能である。代わりに、カオトロピック剤の水溶液を調製し、そして工程（b）の混合物に添加する。好ましくは、水溶液は、緩衝液塩、洗剤または両方のような別の成分を含む。このような水溶液についての例は、実施例２、3および4に記載される結合緩衝液である。
【００３２】
工程（c）の混合物中のカオトロピック剤の濃度は、0.5Mより多くだけ増大される。従って、工程（c）は、工程（b）の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解させるか、またはさらなるカオトロピック剤を含む水溶液を添加することが、好ましく、ここでは、混合物中のカオトロピック剤の濃度を、1.5Mと10Mの間にある値に増大させる。混合物中での飽和が達成されるまで、さらなるカオトロピック剤を、工程（b）の混合物に、固形物として添加できることが、言及される。従って、工程（c）は、工程（b）の混合物中にさらなる量のカオトロピック剤を溶解させ、それにより、その混合物を、カオトロピック剤で飽和させることを包含することが、さらに好ましい。工程（c）で、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、0.5Mと6Mの間だけ増大されることが、好ましい。工程（c）で、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、0.5Mと4Mの間まで増大されることが、さらに好ましい。工程（c）で、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、0.5Mと3Mの間まで増大されることがさらにいっそう好ましい。工程（c）で、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、0.5Mと2Mの間まで増大されることが、さらにいっそう好ましい。工程（c）で、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、0.5Mと1.5Mの間まで増大されることが、さらにいっそう好ましい。工程（c）で、混合物中のカオトロピック剤の濃度は、0.5Mと1Mの間まで増大されることが、さらにいっそう好ましい。
【００３３】
詳細には、（少なくとも1種の）核酸（標的核酸としても称される）を、シリカ粒子、シリカ繊維、ガラスフィルターまたはガラス粒子のような基材と結合させる手順は、以下のとおりに記載されうる。本発明により、1.5Mと10Mの間、そして好ましくは2Mと6Mの間の濃度を示すカオトロピック塩の存在下で行われる。
【００３４】
DNAまたはRNAは、これらの条件下で、すなわち、所定の濃度のカオトロピック剤の存在下で、ガラス表面を有する材料に結合する。基材、すなわち、核酸に親和性を示す材料と溶解物を接触させるために、溶解物を、基材と混合し、そして結合が生じるのに十分な期間インキュベートする。基材が、ガラス、シリカまたは石英繊維を包含するフィルターである場合、重力によるか、圧力をかけることによるか、または吸引を行うことによって、溶解物（すなわち、工程（c）の混合物）に、フィルターを通過させることができる。フィルターを通過させながら、液相中の核酸が、固相と接触するようになり、そしてそこに吸着される。専門家らは、通常、液相および固相のインキュベーションの持続期間に精通する。様々な時点で、表面上に固定された生物学的材料の量を測定することによって、インキュベーションを最適化させうる。10秒と30分の間のインキュベーション時間は、核酸に適切となりうる。
【００３５】
核酸を遊離させるために、生物学的サンプルを溶解させるときに、核酸を固相に結合させるか、または核酸を生物学的サンプルから単離する手順で、タンパク質分解活性を示す酵素を使用することが、さらに好ましい。用語「タンパク質分解活性を示す酵素」は、生物学的サンプル中で、核酸分解酵素または他の所望でないタンパク質を迅速に分解するプロテアーゼまたはプロテアーゼの混合物を包含すると理解される。本文脈において、用語「プロテアーゼ」は、あらゆるヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、またはEC3.4〜3.11に包含されるとおりのタンパク質分解活性を有する酵素（すなわち、ペプチド結合に作用するヒドロラーゼ）およびその修飾（酵素の活性を保持した修飾）を意味することが意図される。タンパク質分解活性を有する酵素は、動物組織、植物組織、微生物から単離されうるか、または組換え手順によって得ることができる。
【００３６】
従って、工程（a）の溶解緩衝液は、タンパク質分解活性を有する酵素を含有することが、好ましい。タンパク質分解活性を有する酵素は、EC3.4〜3.11に包含されるとおりのプロテアーゼから選択されることが、さらに好ましい。タンパク質分解活性を有する酵素は、アクロモペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、アンクロッド、アンギオテンシン変換酵素、ブロメライン、カルパイン、カルパインI、カルパインII、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼG、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼW、カルボキシペプチダーゼY、カスパーゼ、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、カスパーゼ13、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンG、カテプシンH、カテプシンL、キモパパイン、キマーゼ、アルファ−キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、補体C1r、補体C1s、補体因子D、補体因子I、ククミシン、ジペプチジルペプチダーゼIV、白血球エラスターゼ、脾臓エラスターゼ、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、エンテロキナーゼ、Xa因子、フィシン、フリン、グランザイムA、グランザイムB、HIVプロテアーゼ、IGase、カリクレイン組織、ロイシンアミノペプチダーゼ、細胞質ゾルロイシンアミノペプチダーゼ、ミクロソーム性ロイシンアミノペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロリダーゼ、プロナーゼE、前立腺特異的抗原、Streptomyces griseus由来の好アルカリ性プロテアーゼ、Aspergillus由来のプロテアーゼ、Aspergillus saitoi由来のプロテアーゼ、Aspergillus sojae由来のプロテアーゼ、B. licheniformis由来のアルカリ性プロテアーゼ、B. licheniformis由来のアルカラーゼ、Bacillus polymyxa由来のプロテアーゼ、Bacillus sp由来のプロテアーゼ、Bacillus sp由来のプロテアーゼ（エスペラーゼ）、Rhizopus sp.由来のプロテアーゼ、プロテアーゼS、プロテアソーム、Aspergillus oryzae由来のプロテイナーゼ、プロテイナーゼ3、プロテイナーゼA、プロテイナーゼK、プロテインC、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ、レニン、レンニン、ストレプトキナーゼ、サブチリシン、サーモリシン、トロンビン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トリプシン、トリプターゼ、およびウロキナーゼからなる群より選択されるのが、さらにいっそう好ましい。タンパク質分解活性を有する酵素は、カスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ（エスペラーゼ）、およびサブチリシンからなる群より選択されることが、さらにいっそう好ましい。EC3.4〜3.11に包含されるような少なくとも2種の異なるプロテアーゼの混合物も好ましい。プロテアーゼの選択に関して、専門家らは、通常、溶解緩衝液の最適化に精通している。実施例1に記載されるとおり、当業者は、様々の濃度で、カオトロピック剤を含有する緩衝液中の選択プロテアーゼのタンパク質分解活性について試験する。好ましくは、工程（b）による混合物のカオトロピック条件下でのプロテアーゼ活性が選択される。プロテアーゼを用���たインキュベーションの持続期間の最適化、並びにインキュベーション温度の最適化は、専門家によって行われうる。パラメーターとして、当業者は、生物学的サンプルから液相に遊離され、そして基材に結合される能力のある核酸の量を決定する。
【００３７】
工程（a）の溶解緩衝液は、プロテイナーゼKを含有することが、非常に好ましい。好ましくは、工程（b）の混合物中でのプロテイナーゼKの活性が、0.1U/mlと10U/mlの間にある。工程（b）の混合物中でのプロテイナーゼKの活性が、1U/mlと6U/mlの間にあることが、さらに好ましい。工程（b）の混合物中でのプロテイナーゼKの活性が、2U/mlと4U/mlの間にあることが、さらにいっそう好ましい。工程（b）の混合物中でのプロテイナーゼKの活性が、約3U/mlであることが、さらにいっそう好ましい。この点で、プロテイナーゼKの列挙された活性値は、実施例1に記載されるとおりに測定された活性値を表すことが分かる。
【００３８】
核酸を遊離させるために生物学的サンプルを溶解するときに、または核酸を固相に結合させるときに、その手順に洗剤、すなわち、陰イオン、陽イオン、両極性イオン、または非イオン性洗剤を使用することが、さらに好ましい。このような洗剤は、当業者に周知である。一般に、「洗剤」は、表面活性剤であり、そして界面活性剤としても知られる。洗剤は、それが溶解される媒体の表面張力、および／または他の相との界面張力を低下させる能力があり、従って、液体／蒸気で、および／または他の界面で、確実に吸着される。従って、洗剤は、極性（水溶性）および非極性（疎水性）ドメインを有する両極性分子である。それらは、疎水性分子または水溶性を付与する分子ドメインに結合する能力がある。そのイオン特徴によって、洗剤は、イオン性洗剤、非イオン性洗剤、および双極性イオン洗剤として分類されうる。イオン性洗剤は、さらに、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、LiDS（ドデシル硫酸リチウム）、またはセチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）のような陽イオン性洗剤、およびデオキシコール酸、またはナトリウムラウロイルザルコシンのような陰イオン性洗剤のいずれかに分類されうる。従って、これらは、通常、強いタンパク質変性剤である。このような非イオン性洗剤は、タンパク質変性が少ない。これは、CHAPSまたはスルホベタイン14のような双極性イオン洗剤にも当てはまる。双極性イオン、内部塩または二極性イオンとしても知られる双極性イオン化合物は、反対符号の式単位の電荷を有する中性化合物である。
【００３９】
従って、工程（a）の溶解緩衝液は、洗剤を含有することが好ましい。工程（a）の溶解緩衝液は、陰イオン、陽イオン、双極性イオンまたは非イオン性洗剤を含有することが、さらに好ましい。工程（a）の溶解緩衝液中の洗剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸、ラウロイルザルコシンナトリウム、Triton-X100、ツイーン20、オクチルベータ−D−グルコシド、ノニデットP40、CHAPSまたはスルホベタイン14からなる群から選択される。しかし、他の洗剤が可能である。一般に、生物学的サンプルを溶解するためにカオトロピック剤、洗剤およびプロテアーゼの組合わせを使用した場合、当業者は、タンパク質分解活性が防止されることに基づいて、洗剤および工程（b）の混合物中でのその濃度を選択する。
【００４０】
好ましくは、固相は、シリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群から選択される多孔性または非多孔性無機質基材を包含する。さらに、好ましいのは、固相は、金属酸化物、および／または金属混成酸化物、アルミナ、チタニア、ジルコニア、およびガラスから主に構成される材料からなる群から選択される多孔性または非多孔性無機質基材を包含する。固相は、0.1μmから1,000μmまでの粒子サイズを示す無機質基材を包含することも好ましい。固相は、2から1,000nmまでの孔サイズを示す多孔性無機質支持体材料を包含することも、好ましい。さらに好ましくは、多孔性または非多孔性支持体材料、特にゼオライトは、目のあらい充填物の形態にある。さらにいっそう好ましくは、固相は、ガラス、石英またはセラミックフィルターシートの形態にあるフィルターシート、および／またはシリカゲルおよび／または無機質支持体の粒子または繊維を含む膜、および石英またはガラスウールの織物から構成される。固相は、磁性誘引性粒子を包含することも、好ましい。さらに好ましくは、磁性誘引性粒子を、シリカゲル、ガラス、石英およびゼオライトからなる群から選択される無機質基材で被覆する。さらにいっそう好ましくは、基材は、磁性ガラス粒子を包含する。
【００４１】
本発明の別の態様は、（a）カオトロピック剤を含有する水性溶解緩衝液を提供する工程；（b）その溶解緩衝液を生物学的サンプルと混合し、ここで、混合物中のカオトロピック剤の濃度が1Mと4Mの間にあり、そして混合物をインキュベートする工程；（c）工程（b）の混合物に、さらなる量のカオトロピック剤を溶解させるか、またはさらなるカオトロピック剤を含有する水溶液を添加し、それにより混合物中のカオトロピック剤の濃度を、0.5Mより多くまで増大させる工程；（d）固相を提供し、そして工程（c）の混合物を、固相と接触させ、それにより、混合物由来の核酸を固相に吸着させる工程；（e）液相から固相を分離する工程；（f）都合により、工程の固相を、洗浄緩衝液で洗浄する工程；（g）固相から核酸を溶出させ、それにより核酸を単離する工程；（h）都合により、溶出液から工程（g）の核酸を沈殿させ、そして沈殿核酸を単離する工程を包含する、生物学的サンプルから核酸を単離する方法である。
【００４２】
固相は、シリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、およびゼオライトからなる群から選択される多孔性または非多孔性無機質基材を包含することが、好ましい。固相は、磁性ガラス粒子を包含することも、好ましい。
【００４３】
カオトロピック剤がカオトロピック塩であることが、非常に好ましい。カオトロピック剤が、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化アルカリ、および過塩素酸アルカリからなる群から選択されることが、さらに好ましい。
【００４４】
工程（a）の溶解緩衝液は、タンパク質分解活性を有する酵素および洗剤を含有することも、好ましい。工程（a）の溶解緩衝液は、タンパク質分解活性を有する酵素を含有することが、非常に好ましい。タンパク質分解活性を有する酵素は、EC3.4〜3.11で包含されるとおりのプロテアーゼから選択されることが、さらに好ましい。タンパク質分解活性を有する酵素は、カスパーゼ、プロテイナーゼK、プロナーゼE、Bacillus sp由来のプロテアーゼ（エスペラーゼ）、およびサブチリシンからなる群から選択されることがさらにより好ましい。EC3.4〜3.11で包含されるような少なくとも2種の異なるプロテアーゼの混合物も好ましい。工程（a）の溶解緩衝液は、陰イオン、陽イオン、双極性イオンまたは非イオン性洗剤を含有することも、非常に好ましい。工程（a）の溶解緩衝液中の洗剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、デオキシコール酸、ラウロイルザルコシンナトリウム、Triton-X100、ツイーン20、オクチルベータ−D−グルコシド、ノニデットP40、CHAPSまたはスルホベタイン14からなる群から選択されることは、さらにいっそう好ましい。
【００４５】
工程（b）の混合物のpH値は8.5と4の間にあることが好ましい。工程（b）の混合物のpH値は7.5と5の間にあることがさらに好ましい。工程（b）の混合物のpH値は7と6の間にあることがさらにいっそう好ましい。工程（b）の混合物のpH値は約6であることが、さらにいっそう好ましい。
【００４６】
工程（b）の混合物は、生物学的サンプル、1.5Mと3Mの間の濃度でチオシアン酸グアニジニウム、20mMと40mMの間の濃度でTris塩、5体積％と20体積％の間の濃度でTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性は1U/mlと5U/mlの間にあり、そして、ここで、混合物のpHは、8.5と6.0の間にあることが、非常に好ましい。この点で、プロテイナーゼKの活性は、実施例1で記載されるとおりに測定されることが分かる。
【００４７】
工程（b）の混合物は、生物学的サンプル、1.5Mと2.5Mの間の濃度でチオシアン酸グアニジニウム、20mMと30mMの間の濃度でTris塩、5体積％と15体積％の間の濃度でTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性は、2U/mlと4U/mlの間にあり、そして、ここで、混合物のpHは、8.5と6.0の間にあることが、非常に好ましい。
【００４８】
工程（b）の混合物は、生物学的サンプル、約2Mの濃度でチオシアン酸グアニジニウム、約25mMの濃度でTris塩、約10体積％の濃度でTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性は、約3U/mlであり、そして、ここで、混合物のpHは、約6であることが、非常に好ましい。さらにいっそう好ましくは、6のpHである。それについての例は、実施例２の実験４で使用される溶解混合物（すなわち、工程（b）による混合物）である。
【００４９】
工程（b）の混合物は、生物学的サンプル、約2.7Mの濃度で塩酸グアニジニウム、約5mMの濃度で尿素、約5mMの濃度でTris塩、約9体積％の濃度でTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性は、約3U/mlであり、そして、ここで、混合物のpHは、約4.4と6.5の間にあることも、非常に好ましい。
【００５０】
工程（b）の混合物は、生物学的サンプル、約2.4Mの濃度で塩酸グアニジニウム、約1.6mMの濃度で尿素、約85mMの濃度でTris塩、約88mMの濃度でEDTA、約8mMの濃度でNaCl、約9体積％の濃度でTriton-X100、およびプロテイナーゼKを含有し、ここで、混合物中のプロテイナーゼKのタンパク質分解活性は、約3U/mlであり、そして、ここで、混合物のpHは、約4.4と6.5の間にあることも、非常に好ましい。
【００５１】
プロテアーゼを含む工程（b）の混合物を、タンパク質分解活性を可能にする所定量の時間および周囲条件でインキュベートすることは、さらに好ましい。工程（b）の混合物を、10分から30分までの間、20℃と75℃の間の温度でインキュベートし、ここで、混合物をかき混ぜすることは、好ましい。好ましいかき混ぜ手順は、ローラー混合機または熱混合機である。用語「かき混ぜ（agitation）」および「かき混ぜすること（to agitate）」は、試験管を1秒に1回反転するように工程（b）の混合物を含有する試験管を動かすと解される。その用語は、工程（b）の混合物中で乱流を引き起こすことに関して等価の効果を示す動きをも包含する。かき混ぜの程度は、単離されるべき核酸のサイズにも影響されうる。多すぎるかき混ぜは、せん断力を導き、そして混合物中の核酸分子のサイズ限定を生じうる。従って、遅いかき混ぜが、専門家によって選択されうる。
【００５２】
工程（b）の混合物は、30分間、室温でインキュベートされ、ここで、その混合物がローラー混合機を用いてかき混ぜられることがさらに好ましい。工程（b）の混合物は、約10から20分間、50℃と75℃の間の温度でインキュベートされ、ここで、その混合物が熱混合機を用いてかき混ぜられることが、さらにいっそう好ましい。工程（b）の混合物を、10分から20分間、約56℃でインキュベートし、ここで、その混合物を、ローラー混合機または熱混合機を用いてかき混ぜることが、さらにいっそう好ましい。工程（b）の混合物を、15分間、56℃でインキュベートし、ここで、その混合物を、ローラー混合機または熱混合機を用いてかき混ぜることが、さらにいっそう好ましい。工程（b）の混合物を、10分から20分間、約72℃でインキュベートし、ここで、その混合物を、ローラー混合機または熱混合機を用いてかき混ぜることも、非常に好ましい。工程（b）の混合物を、10分間、72℃でインキュベートし、ここで、その混合物を、ローラー混合機または熱混合機を用いてかき混ぜることが、さらにいっそう好ましい。
【００５３】
工程（c）の混合物由来の核酸を固相に吸着させた後、結合核酸を、液相から分離する。これは、一般に、重力により、または磁性ガラス粒子に結合した核酸の都合のよい場合には、磁性粒子に結合した材料を、磁場を使用することによって分離することにより達成されうる。例えば、磁性粒子は、インキュベーションが行われた容器の壁に引き付けられうる。その後、磁性粒子に結合されなかったサンプル内容物を含有する液体を、除去できる。使用される除去手順は、インキュベーションが行われた容器の型による。適切な工程は、ピペット採取または吸引を介して液体を除去する工程を包含する。
【００５４】
固相がフィルター（例えば石英またはガラス繊維を含有するフィルター）である場合には、工程（c）の混合物は、好ましくは、フィルターを通過させる。その後、固相からの液相の分離は、引力によるか、圧力の使用によるか、または吸引の使用によるかによって達成される。
【００５５】
その後、結合したDNAまたはRNAを有する固相を洗浄しうる。この工程は、生物学的サンプル中の所望でない材料の特性および量、並びに単離核酸の所望の純度に依存して任意である。洗浄工程が望まれる場合には、固相を、少なくとも1回、例えばイソプロピルアルコールまたはエタノールのようなアルコール1〜90体積％の混合液で洗浄することが好ましい。洗浄溶液の例は、実施例２（Ａ）に記載される「インヒビター除去緩衝液」および「洗浄緩衝液」である。一般に、核酸が固相の表面から放出されないが、しかしできるだけ十分に、所望でない混入物を洗い流す洗浄溶液を使用する。この洗浄工程は、好ましくは、結合した核酸を有する材料を、洗浄溶液とインキュベートすることによって行われる。固相は、好ましくは、この工程の間に再懸濁される。固相がフィルターである場合、洗浄溶液を、フィルターに通すことが好ましい。混入した洗浄溶液は、好ましくは、核酸を結合するための上記工程とちょうど同様に除去される。2つの連続した洗浄工程を行い、ここで、第一の洗浄工程は、インヒビター除去緩衝液を使用して行われ、そして第二の洗浄工程は、洗浄緩衝液を使用して行われることがさらにいっそう好ましい。インヒビター除去緩衝液は、それがカオトロピック剤を含有する点で特徴づけられる。インヒビター除去緩衝液を用いた洗浄は、例えば制限酵素またはポリメラーゼによって行われる反応のような酵素的反応に干渉する可能性のある毒性物質またはインヒビターを除去する。洗浄緩衝液を用いた洗浄は、結合した核酸から残りのカオトロピック剤を除去する。最後の洗浄工程の後、材料を、真空で簡単に乾燥させることができるか、または流動体を、エバポレートさせうる。アセトンを用いた予備処理工程も、行われうる。
【００５６】
その後、その条件を反転しうる、例えば塩濃度を減少させて、材料に結合したDNAまたはRNAを溶出させる。溶出緩衝液は、ドイツ国特許第3724442号およびJakobi, R.ら, Anal. Biochem. 175（1988）196−201から公知である。低塩含有率を示す溶出緩衝液は、特に、0.2Mより少ない含有率を示す緩衝液である。好ましくは、溶出緩衝液は、緩衝目的のための物質Trisを含有する。溶出緩衝液は、Tris塩を含有する水溶液であり、ここで、Tris塩の濃度は50mMであることが、非常に好ましい。さらに好ましいのは、Tris塩を含有する水溶液であり、ここで、Tris塩の濃度は50mMであり、そしてpHは6.5と8.5の間にある。さらにいっそう好ましいのは、7.5のpHである。さらに好ましくは、溶出緩衝液は脱イオン水である。精製DNAまたはRNAを含有する溶液を、他の反応のために現在使用しうる。都合により、例えばエタノールまたはイソプロパノールを使用して溶液から核酸を沈殿させうる。沈殿物は、さらに洗浄工程に供することもできる。この種類の方法は当業者に周知であり、そしてSambrook, FritschおよびManiatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に詳細に記載される。
【００５７】
標的核酸を検出および測定しうる。上述の精製方法、続いて測定または検出工程または精製方法、続いて増幅および測定または検出工程が、好ましい。標的核酸または目的の核酸は、非標的核酸のマトリックス中に含まれ得、そして特定の核酸の上記混合物中の主要成分でさえありうる。適切なDNA検出方法は当業者に公知であり、そしてSambrook, FritschおよびManiatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001；ならびにAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY, 1987のような標準教科書に記載される。
【００５８】
DNA検出工程が例えば沈殿工程として行われる前に、さらなる精製工程もありうる。検出方法は、限定されないが、二本鎖DNAに挿入し、そして以降、それの蛍光を変えさせるエチジウムブロミドのような特定の染料の結合または挿入が挙げられ得る。精製DNAは、都合により制限消化の後に、電気泳動法によっても分離され、そして以後可視化されうる。特異的配列に対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびその後のハイブリッドの検出を利用するブローブベースのアッセイもある。当業者に公知のさらなる工程の後に、DNAを配列決定することも可能である。他の方法は、特異的プローブが結合されるシリコンチップに対するDNA配列の多様性を使用し、そして相補的配列が結合するときにシグナルを生じる。
【００５９】
本発明は、非タンパク質性成分、および核酸を含み、ここで核酸がDNAまたはRNAまたは両方を包含するタンパク質性成分の混合物も包含する。
【００６０】
本発明は、ウイルスまたは細菌細胞、並びに例えば白血球のようなヒトおよび動物細胞などの多細胞生物から単離された細胞、およびハプテン、抗原、抗体および核酸、血漿、脳液、痰、便、生検標本、骨髄、口腔洗浄液、血清、組織、尿またはそれらの混合物のような免疫学的に活性な低および高分子化合物を包含する、核酸が精製される生物学的サンプルも包含する。本発明は、ヒトまたは動物の体由来の流動体のような生物学的サンプルも包含する；好ましくは、生物学的サンプルは、全血、血漿、血清または尿である。全血サンプルは、好ましくは、EDTA血、ヘパリンまたはクエン酸血である。血漿は、好ましくは、EDTA、ヘパリンまたはクエン酸血漿である。本発明の態様では、生物学的サンプルは、細菌細胞、真核生物細胞、ウイルスまたはそれらの混合物を包含する。
【００６１】
核酸およびタンパク質性材料の混合物は、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）またはその両方を含み、好ましくはDNAまたはRNAまたはその両方が、ウイルスまたは（少なくとも1種の）微生物由来であることも好ましい。ウイルスは、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）またはパルボウイルスB19でありうる。
【００６２】
標的核酸成分および他の核酸を、基本的に上に記載されるとおりに精製することも、好ましい。その後、標的核酸成分がさらに操作および検出される、すなわち、それは、標的配列を検出可能な量まで特異的に増幅するポリメラーゼ連鎖反応で増幅される。他の可能な増幅反応は、リガーゼ連鎖反応（LCR, Wu, D.Y.およびWallace,R.B., Genomics 4（1989）560−569、およびBarany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（1991）189−193）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Barany, F., PCR Methods and Applic. 1（1991）5−16）；Gap-LCR(国際公開第90／01069号)；修復連鎖反応（欧州特許第0439182号）、3SR（Kwoh, D.Y.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）1173−1177；Guatelli, J.C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87（1990）1874−1878；国際公開第92／08800号）、およびNASBA(米国特許第5,130,238号)である。さらに、鎖置換増幅（SDA）、転写媒介性増幅（TMA）、およびQ-ベータ−増幅（例えば、Whelen, A.C.およびPersing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50（1996）349−373；Abramson, R.D.およびMyers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4（1993）41−47）がある。
【００６３】
特に好ましいのは、国際公開第92／02638号および対応の米国特許第5,210,015号；米国特許第5,804,375号；米国特許第5,487,972号に開示されるTaqMan（登録商標）検出方法である。この方法は、シグナルを発生するポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用する。詳細には、標的核酸成分の領域に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチド、および同じ標的核酸成分配列鎖の第二領域に相補的な配列を含有するが、しかし第一のオリゴヌクレオチドで定義された核酸配列を含まない標識オリゴヌクレオチドと、サンプルを接触させて、ハイブリダイゼーション条件の間に二重鎖の混合物を作製する工程であって、ここで、二重鎖は、第一のオリゴヌクレオチドの3'末端が標識オリゴヌクレオチドの5'末端に隣接するように、第一のオリゴヌクレオチドおよび標識オリゴヌクレオチドにアニールした標的核酸を含む、工程を包含する方法により、標的核酸成分を検出する。その後、ポリメラーゼの5'から3'へのヌクレアーゼ活性が、アニールされた標識オリゴヌクレオチドを切断し、そして標識フラグメントを放出することを可能にするのに十分な条件下で、5'から3'へのヌクレアーゼ活性を示すテンプレート依存性核酸ポリメラーゼで、この混合物を処理する。標識オリゴヌクレオチドの加水分解によって発生されるシグナルを検出および／または測定する。TaqMan（登録商標）技術は、形成されるべき反応複合体に結合し、そして検出可能にする固相についての必要を排除する。さらに一般的な見地から見ると、増幅および／または検出反応が、均一な溶液相である、標的核酸成分の精製、続いて検出工程についての手順が開示される。
【００６４】
以下の実施例、文献および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、それの真の範囲は、添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の概念から逸脱することなく説明される手順で修飾が行われうることが理解される。
【実施例】
【００６５】
実施例１
（Ａ）カオトロピック剤の存在下でのプロテイナーゼKのインキュベーション
10μlの20mg/mlのプロテイナーゼKの保存溶液（Roche Diagnostics GmbH、Mannheimm、カタログ番号745723；4.5ml水中に溶解された90mg）を、50mM Tris-HCl（pH6.0）、1％DTT、20％Triton-X100およびxMチオシアン酸グアニジニウム（x＝0、1、2、3、4、5、6）を含有するカオトロピック緩衝液と混合した。混合した直後、下に記載されるアッセイ（0分活性値）を使用して、混合物の第一のアリコート（10μl）の中でプロテイナーゼK活性を測定した。混合した15分後、下に記載されるアッセイ（15分活性値）を使用して、混合物の第二のアリコート（10μl）の中でプロテイナーゼK活性を測定した。
【００６６】
（Ｂ）プロテイナーゼK活性を測定するアッセイ
カオトロピック緩衝液（上（Ａ）を参照）中10μlのプロテイナーゼKを、アッセイ緩衝液、すなわち、980μl 0.2Mトリエタノールアミン、0.05％（重量／体積）PEG6000、0.1M塩化カルシウム、および10μlの200mM基質溶液と混合した。基質は、Suc-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリドであった。アッセイ緩衝液を、キュベットに提供した。混合直後に、キュベットを、光度計に入れた。測定（吸収）を25℃で、15分かけて行った。アッセイ緩衝液中のプロテイナーゼKの活性を、405nmでの吸収における変化によって示されるとおり速度論から計算した。
【００６７】
表１は、（Ａ）で与えた様々の濃度でのチオシアン酸グアニジニウムの存在下でのプロテイナーゼKの0分値の活性を列挙する。表２は、（Ａ）で与えた様々の濃度でのチオシアン酸グアニジニウムの存在下でのプロテイナーゼKの15分値の活性、並びに対照値（カオトロピック剤の存在なし）を列挙する。その値は、カオトロピック剤なしの対照緩衝液中でのプロテイナーゼKの0分活性値（（Ａ）を参照）に関連して表現され、0.5U/mlに対応し；この値を100％と設定した。表１および表２のデータを図１および図２においてグラフで示す。
【００６８】
【表１】
2005230012.tif 000002
【００６９】
【表２】
2005230012.tif 000003
【００７０】
実施例２
（Ａ）試薬
a）プロテイナーゼK保存溶液：組換え体プロテイナーゼK、PCR級、50U/ml
b）溶解緩衝液：4Mチオシアン酸グアニジニウム、50mM Tris-HCl、20％Triton-X100、pH6.0
c）結合緩衝液：4Mチオシアン酸グアニジニウム、50mM Tris-HCl、20％Triton-X100、pH6.0
d）インヒビター除去緩衝液：5M塩酸グアニジニウム、20mM Tris-HCl、38％エタノール、pH6.6
e）洗浄緩衝液：20mM NaCl、2mM Tris-HCl、80％エタノール、pH7.5
f）溶出緩衝液：50mM Tris-HCl、pH8.2
g）エタノール（100％）
【００７１】
さらなる必要性：シリカゲル膜を含有する市販のスピンカラム、例えば、Machery＆Nagelにより配布されるNucleoSpin Blood L。
【００７２】
（Ｂ）実験１：プロテイナーゼK処理なしの１工程手順
1．15mlファルコンチューブに1,000μlのEDTA血液をピペット採取する
2．1,000μlの溶解緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
3．ローラー混合機で、室温で、15分間インキュベートし、かき混ぜる
4．スピンカラムを、新たなファルコンチューブに入れる
5．工程1．〜2．の混合物（約2,000μl）を、スピンカラムに移動する
6．1,900×gで、3分間、遠心分離する
7．1,000μlのインヒビター除去緩衝液を添加する
8．4,500×gで、2分間、遠心分離する
9．2,000μlの洗浄緩衝液を添加する
10．4,500×gで、10分間、遠心分離する
11．フロースルーを捨て、そして新たなファルコンチューブにフィルターカラムを入れる
12．300μlの予備加熱（70℃）した溶出緩衝液で溶出する
13．室温で、5分間、インキュベートする
14．4,500×gで、2分間、遠心分離する
15．260、280および320nmでの溶出液のOD測定
【００７３】
（Ｃ）実験２：プロテイナーゼK処理を含む１工程手順
1．15mlファルコンチューブに125μlのプロテイナーゼKをピペット採取する
2．1,000μlのEDTA血液を添加し、ゆっくりボルテックスする
3．1,000μlの溶解緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
4．15分間、56℃で（例えば、熱混合機を使用することによって）インキュベートおよび振蘯し、かき混ぜる
5．スピンカラムを、新たなファルコンチューブに入れる
6．工程1.〜3．の混合物（約2,125μl）を、スピンカラムに移動する
7．1,900×gで、3分間、遠心分離する
8．1,000μlのインヒビター除去緩衝液を添加する
9．4,500×gで、2分間、遠心分離する
10．2,000μlの洗浄緩衝液を添加する
11．4,500×gで、10分間、遠心分離する
12．フロースルーを捨て、そして新たなファルコンチューブにフィルターカラムを入れる
13．300μlの予備加熱（70℃）した溶出緩衝液で溶出する
14．室温で、5分間、インキュベートする
15．4,500×gで、2分間、遠心分離する
16．260、280および320nmでの溶出液のOD測定
【００７４】
（Ｄ）実験３：エタノールを含む２工程手順
1．15mlファルコンチューブに125μlのプロテイナーゼKをピペット採取する
2．1,000μlのEDTA血液を添加し、ゆっくりボルテックスする
3．1,000μlの溶解緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
4．15分間、56℃で（例えば、熱混合機を使用することによって）インキュベートおよび振蘯し、かき混ぜる
5．1,000μlのエタノールを添加し、ゆっくりボルテックスする
6．スピンカラムを、新たなファルコンチューブに入れる
7．工程1.〜5．の混合物（約3,125μl）を、スピンカラムに移動する
8．1,900×gで、3分間、遠心分離する
9．1,000μlのインヒビター除去緩衝液を添加する
10．4,500×gで、2分間、遠心分離する
11．2,000μlの洗浄緩衝液を添加する
12．4,500×gで、10分間、遠心分離する
13．フロースルーを捨て、そして新たなファルコンチューブにフィルターカラムを入れる
14．300μlの予備加熱（70℃）した溶出緩衝液で溶出する
15．室温で、5分間、インキュベートする
16．4,500×gで、2分間、遠心分離する
17．260、280および320nmでの溶出液のOD測定
【００７５】
（Ｅ）実験４：結合緩衝液を含む２工程手順
1．15mlファルコンチューブに125μlのプロテイナーゼKをピペット採取する
2．1,000μlのEDTA血液を添加し、ゆっくりボルテックスする
3．1,000μlの溶解緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
4．15分間、56℃で（例えば、熱混合機を使用することによって）インキュベートおよび振蘯し、かき混ぜる
5．1,000μlの結合緩衝液を添加し、ゆっくりボルテックスする
6．スピンカラムを、新たなファルコンチューブに入れる
7．工程1.〜5．の混合物（約3,125μl）を、スピンカラムに移動する
8．1,900×gで、3分間、遠心分離する
9．1,000μlのインヒビター除去緩衝液を添加する
10．4,500×gで、2分間、遠心分離する
11．2,000μlの洗浄緩衝液を添加する
12．4,500×gで、10分間、遠心分離する
13．フロースルーを捨て、そして新たなファルコンチューブにフィルターカラムを入れる
14．300μlの予備加熱（70℃）した溶出緩衝液で溶出する
15．室温で、5分間、インキュベートする
16．4,500×gで、2分間、遠心分離する
17．260、280および320nmでの溶出液のOD測定
【００７６】
【表３】
2005230012.tif 000004
【００７７】
【表４】
2005230012.tif 000005
【００７８】
DNAの純度に関して、1.8±0.1の260nm／280nm比（320補正を含めた）は、許容しうると見なされる。そのデータは、本発明による方法、すなわち実験４の方法は、実験３の方法と比較して等しい純度（高純度のDNAでない場合）を生じることを示す。
【００７９】
実施例３
（Ａ）試薬
a）溶解緩衝液／結合緩衝液：カオトロピック（7M［溶解緩衝液］／4M［結合緩衝液］チオシアン酸グアニジニウム、50mM Tris-HCl、20％Triton-X100、pH6.0）
b）インヒビター除去緩衝液（5MグアニジニウムHCl、20mM Tris-HCl、38％エタノール、pH6.6）
c）洗浄緩衝液（20mM NaCl、2mM Tris-HCl、80％エタノール、pH7.5）
d）溶出緩衝液（50mM Tris、pH8.1）
e）エタノール（無水）
【００８０】
さらなる必要性：ガラス繊維フィルターカラム（シリカゲル膜を有する、例えばNucleoSpin Blood L、Machery−Nagelから市販）
【００８１】
（Ｂ）実験５：１工程手順：溶解緩衝液：7M、結合緩衝液なし
1,000μlのEDTA血液を、15mlファルコンチューブにピペット採取し、1,000μlの溶解緩衝液（7M）を添加し、そしてチューブをボルテックスした。混合物を、15分間、56℃で、熱混合機でインキュベートした。ガラス繊維フィルターカラムを有する新たなファルコンチューブを提供し、そして全サンプル調製物（約2,000μl；カオトロープ濃度3.5M）を、フィルターカラムに移動させた。1,900×gで、3分間の遠心分離の後、1,000μlのインヒビター除去緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、2分間、別の遠心分離工程を行った。その後、2,000μlの洗浄緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、10分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、そしてフィルターカラムを、新たなファルコンチューブに入れた。結合した核酸を、500μlの予備加熱（70℃）した溶出緩衝液を使用して溶出させた。溶出緩衝液を、カラムに移動させ、そして室温で5分間インキュベートした。4,200×gで、2分間、遠心分離の後、230、260、280および320nmでの光学密度測定により、フロースルーを分析した。
【００８２】
（Ｃ）実験６、２工程手順：溶解緩衝液：7M、結合緩衝液：4M
1,000μlのEDTA血液を、15mlファルコンチューブにピペット採取し、1,000μlの溶解緩衝液（7M）を添加し、そしてチューブをボルテックスした。混合物を、15分間、56℃で、熱混合機でインキュベートした。500μlの結合緩衝液（4M）を添加し、ボルテックスにより混合した。ガラス繊維フィルターカラムを有する新たなファルコンチューブを提供し、そして全サンプル調製物（約2,500μl；カオトロープ濃度4.5M）を、フィルターカラムに移動させた。1,900×gで、3分間の遠心分離の後、1,000μlのインヒビター除去緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、2分間、別の遠心分離工程を行った。その後、2,000μlの洗浄緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、10分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、そしてフィルターカラムを、新たなファルコンチューブに入れた。結合した核酸を、500μlの予備加熱（70℃）した溶出緩衝液を使用して溶出させた。溶出緩衝液を、カラムに移動させ、そして室温で5分間インキュベートした。4,200×gで、2分間、遠心分離の後、230、260、280および320nmでの光学密度測定により、フロースルーを分析した。
【００８３】
【表５】
2005230012.tif 000006
【００８４】
【表６】
2005230012.tif 000007
【００８５】
実施例４
（Ａ）試薬
a）溶解緩衝液／結合緩衝液：カオトロピック（7M［溶解緩衝液］／5M［溶解緩衝液］／4M［結合緩衝液］チオシアン酸グアニジニウム、50mM Tris-HCl、20％Triton-X100、pH6.0）
b）インヒビター除去緩衝液（5MグアニジニウムHCl、20mM Tris-HCl、38％エタノール、pH6.6）
c）洗浄緩衝液（20mM NaCl、2mM Tris-HCl、80％エタノール、pH7.5）
d）溶出緩衝液（50mM Tris、pH8.1）
e）エタノール（無水）
【００８６】
さらなる必要性：ガラス繊維フィルターカラム（シリカゲル膜を有する、例えばNucleoSpin Blood L、Machery-Nagelから市販）
【００８７】
（Ｂ）実験7：１工程手順：溶解緩衝液：7M、結合緩衝液なし
1,000μlのEDTA血液を、15mlファルコンチューブにピペット採取し、1,000μlの溶解緩衝液（7M）を添加し、そしてチューブをボルテックスした。混合物を、15分間、56℃で、熱混合機でインキュベートした。ガラス繊維フィルターカラムを有する新たなファルコンチューブを提供し、そして全サンプル調製物（約2,000μl；カオトロープ濃度3.5M）を、フィルターカラムに移動させた。1,900×gで、3分間の遠心分離の後、1,000μlのインヒビター除去緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、2分間、別の遠心分離工程を行った。その後、2,000μlの洗浄緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、10分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、そしてフィルターカラムを、新たなファルコンチューブに入れた。結合した核酸を、500μlの予備加熱（70℃）した溶出緩衝液を使用して溶出させた。溶出緩衝液を、カラムに移動させ、そして室温で5分間インキュベートした。4,200×gで、2分間、遠心分離の後、230、260、280および320nmでの光学密度測定により、フロースルーを分析した。
【００８８】
（Ｃ）実験８、２工程手順：溶解緩衝液：5M、結合緩衝液：4M
1,000μlのEDTA血液を、15mlファルコンチューブにピペット採取し、1,000μlの溶解緩衝液（5M）を添加し、そしてチューブをボルテックスした。混合物を、15分間、56℃で、熱混合機でインキュベートした。500μlの結合緩衝液（4M）を添加し、ボルテックスにより混合した。ガラス繊維フィルターカラムを有する新たなファルコンチューブを提供し、そして全サンプル調製物（約2,500μl；カオトロープ濃度3.5M）を、フィルターカラムに移動させた。1,900×gで、3分間の遠心分離の後、1,000μlのインヒビター除去緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、2分間、別の遠心分離工程を行った。その後、2,000μlの洗浄緩衝液を、カラムに移動させ、続いて4,200×gで、10分間、遠心分離した。フロースルーを捨て、そしてフィルターカラムを、新たなファルコンチューブに入れた。結合した核酸を、500μlの予備加熱（70℃）した溶出緩衝液を使用して溶出させた。溶出緩衝液を、カラムに移動させ、そして室温で5分間インキュベートした。4,200×gで、2分間、遠心分離の後、230、260、280および320nmでの光学密度測定により、フロースルーを分析した。
【００８９】
【表７】
2005230012.tif 000008
【００９０】
【表８】
2005230012.tif 000009
【００９１】
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【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】チオシアン酸グアニジニウムの濃度変化に関連したt＝0分でのプロテイナーゼKの活性（0分値）。x軸は、チオシアン酸グアニジニウムのモル濃度を示し、y軸は、プロテイナーゼKの活性[％]を示す。
【図２】チオシアン酸グアニジニウムの濃度変化に関連したt＝15分でのプロテイナーゼKの活性（15分値）。x軸は、チオシアン酸グアニジニウムのモル濃度を示し、y軸は、プロテイナーゼKの活性[％]を示す。
【図３】実施例２および表３による1ml血液当たりのμgでのDNAの収量。x軸は各々の実験を示し、y軸は1ml血液当たりのμgでのDNA収量を示す。さらに標準偏差も示す。
【図４】実施例３および表５による1ml血液当たりのμgでのDNAの収量。x軸は各々の実験を示し、y軸は1ml血液当たりのμgでのDNA収量を示す。さらに標準偏差も示す。
【図５】実施例４および表７による1ml血液当たりのμgでのDNAの収量。x軸は各々の実験を示し、y軸は1ml血液当たりのμgでのDNA収量を示す。さらに標準偏差も示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
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