(57)【要約】【課題】  患者の苦痛を伴うことなく、日常的に簡便に採取が可能な糞便検体を利用し、非侵襲的検査法によりヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性を判定する検査方法を提供する。【解決手段】  ヘリコバクター・ピロリ菌抗原陽性の糞便からヘリコバクター・ピロリ菌のＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡと配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマーとの混合液を調製し、調製した混合液を加温し、加温した混合液中でヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、増幅した遺伝子断片中に位置するヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の変異を測定し、測定した変異の有無の決定によってクラリスロマイシン耐性を検査することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法であって、ヘリコバクター・ピロリ菌抗原陽性の糞便からヘリコバクター・ピロリ菌のＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡと配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマーとの混合液を調製し、調製した混合液を加温し、加温した混合液中でヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、増幅した遺伝子断片中に位置するヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の変異を測定し、測定した変異の有無の決定によってクラリスロマイシン耐性を検査することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法。
【請求項２】
調製した混合液を加温する工程が、９５℃６０秒を１サイクル、９５℃３０秒、６５℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を１０サイクル、９５℃３０秒、５９℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を３８サイクル、６８℃１０分を１サイクルの連続的な加熱サイクルからなることを特徴とする請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法。
【請求項３】
ヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の変異を測定する工程が電気泳動法又は遺伝子配列決定法からなることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ抗原陽性の糞便検体を利用したヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性を判定するための簡便で高感度な検査方法に関する。
【０００２】
さらに詳しくは、本発明は、一般的なヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性の検査方法の検体に用いられる内視鏡検査による胃生検組織とは異なり、患者の苦痛を伴うことなく、日常的に簡便に採取が可能な糞便検体を利用すること、すなわち非侵襲的検査法によるヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori：本発明においては単にピロリと記載することがある。）菌感染は、胃炎や消化性潰瘍などの各種消化器疾患に深く関与している。日本ヘリコバクター学会の最新のガイドライン（例えば、非特許文献１を参照）では、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫を、除菌治療が勧められる疾患［Ａランク］とし、早期胃癌に対する内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）後胃、萎縮性胃炎、胃過形成性ポリープを、除菌治療が望ましい疾患［Ｂランク］としている。
【０００４】
ピロリ菌の除菌治療の第一選択は、プロトンポンプ阻害薬と抗菌薬２剤（アモキシシリンおよびクラリスロマイシン）を一週間投与する３剤併用療法が知られている。この３剤併用療法の除菌成績は８０〜９０％程度と高い治療効果が得られているが、その中でも除菌不成功となる場合、その主要な原因はクラリスロマイシン耐性菌の存在が考えられている。クラリスロマイシンは、副作用が少なく幅広い抗菌作用があるために、上気道感染、呼吸器感染等を中心に多用されている。本邦におけるピロリ菌のクラリスロマイシン耐性菌の頻度は１０〜１５％であり、近年その頻度が増加していることが問題となっている。従って、ピロリ菌の除菌治療において、クラリスロマイシン薬剤耐性菌の感染の有無が除菌成績に影響を及ぼす重要な要因と考えられている。
【０００５】
ピロリ菌の感染診断と除菌判定には、内視鏡による生検を必要とする検査法として、迅速ウレアーゼ試験、鏡検法、培養法があった（例えば、特許文献１を参照）。内視鏡検査は、病変の診断のために必要な場合には、その一環として実施できる利点があるが、患者の苦痛を伴う、いわゆる侵襲的検査法である。一方、内視鏡による生検組織を必要としない非侵襲的検査法としては、尿素呼気試験、血清、全血、尿、唾液を利用した抗ピロリ菌抗体測定、便中ピロリ菌抗原測定がある。ピロリ菌の除菌治療において、薬剤耐性菌の感染の有無が、その除菌成績に影響を及ぼす重要な要因と考えられるが、ピロリ菌の薬剤感受性試験には、内視鏡検査時に採取した生検組織から培養法でピロリ菌を分離し、その分離株の薬剤感受性を検査する必要があることから、患者の苦痛を伴う侵襲的検査法でのみ実施が可能であることに加え、結果判定までに長期間を要することも問題となっていた。このような状況から、ピロリ菌のクラリスロマイシン薬剤耐性の判定に関する非侵襲的検査法の開発が望まれていた。
【０００６】
ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性機構は、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の点突然変異によるとされ、その中でも最も頻度が高い点突然変異は、２１４３番目のアデニンがグアニンに置換された変異であり、その次に頻度が高いのは２１４２番目のアデニンがグアニンに置換された変異であることが報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。また、発生頻度が比較的低い点突然変異として２１４２番目のアデニンがシトシンに置換された変異（例えば、非特許文献２を参照）、その他にも、２１１５番目と２１４１番目のアデニンがともにグアニンに置換された変異や、２７１７番目のチミンがシトシンに置換された変異なども知られている。
【０００７】
このような特定の遺伝子領域における点突然変異を効果的に検出する方法としては、核酸増幅法（例えば、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法等）で増幅した遺伝子断片について、制限酵素による切断の違いで判定する方法や塩基配列決定法が汎用されている。最近、ＰＣＲによるヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅及び遺伝子突然変異の検出について、リアルタイムＰＣＲによって実施している例が報告されている（例えば、非特許文献３を参照）が、リアルタイムＰＣＲは非常に高価な分析機器であるため、通常の医療機関で簡便に実施することは困難であった。また、この方法では、クラリスロマイシン感受性及びクラリスロマイシン耐性の両者のヘリコバクター・ピロリ菌が混在した糞便検体では、容易にクラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリ菌を検出することはできないという問題点があった。
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−２８６０９９号公報
【０００９】
【非特許文献１】H. pylori感染の診断と治療のガイドライン２００３年改訂版、日本ヘリコバクター学会誌、第４巻、２００３年、Supplement、第２〜１８頁
【非特許文献２】アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemotherapy）、第４５巻、２００１年、第１５００〜１５０４頁
【非特許文献３】ヘリコバクター（Helicobacter）、第８巻、２００３年、第４８０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ピロリ菌のクラリスロマイシン薬剤耐性の検査法に関し、患者に苦痛を与えず、簡便で高感度な検査法について鋭意研究を重ねた結果、検査に供する検体として糞便を利用し、ヘリコバクター・ピロリ菌抗原陽性の糞便から抽出したＤＮＡについて、核酸増幅法により特定の温度条件にてピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、増幅した遺伝子断片中の配列の変異を決定することによって、高感度にピロリ菌のクラリスロマイシン薬剤耐性を判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明の目的は、患者の苦痛を伴うことなく、日常的に簡便に採取が可能な糞便検体を利用し、非侵襲的検査法によりヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性を判定する検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決する本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法であって、ヘリコバクター・ピロリ菌抗原陽性の糞便からヘリコバクター・ピロリ菌のＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡと配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマーとの混合液を調製し、調製した混合液を加温し、加温した混合液中でヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、増幅した遺伝子断片中に位置するヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の変異を測定し、測定した変異の有無の決定によってクラリスロマイシン耐性を検査することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法であって、以下の（１）又は（２）を望ましい態様としている。
【００１３】
（１）調製した混合液を加温する工程が、９５℃６０秒を１サイクル、９５℃３０秒、６５℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を１０サイクル、９５℃３０秒、５９℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を３８サイクル、６８℃１０分を１サイクルの連続的な加熱サイクルからなること。
（２）ヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の変異を測定する工程が電気泳動法又は遺伝子配列決定法からなること。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、糞便検体を利用したピロリ菌のクラリスロマイシン薬剤耐性に対する非侵襲的検査法に関するものであり、本発明により奏される効果は以下のとおりである。
【００１５】
（１）内視鏡等を利用した生検検体を必要としないことから、検査を必要とする患者に苦痛を与えず、小児等への応用が簡易である。
（２）培養法等による検査や、薬剤感受性試験を行う必要がなく、短時間で高感度な検査結果が得られ、除菌成績との相関性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１７】
本発明において、非侵襲的検査法とは、患者の苦痛を伴う内視鏡検査による胃生検組織採取を必要とせず、日常的に簡便に採取が可能な検体を利用することにより実施可能な検査法を示し、具体的には、尿素呼気試験や、血清、全血、尿、唾液を利用した抗ピロリ抗体測定、便中ピロリ抗原測定等を例示することができる。尚、本発明のピロリ菌のクラリスロマイシン薬剤耐性の判定に用いる非侵襲的検査法としては、検体に糞便を用い、検体から抽出したＤＮＡを用いてピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、増幅した遺伝子断片中に位置するピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の変異を決定することによって行われる。
【００１８】
本発明に使用される糞便検体は、便中ピロリ菌抗原測定の結果が陽性の糞便であることが好ましい。これによって、糞便中にピロリ菌の菌体成分の有無を直接把握することができる。尚、ピロリ菌抗原測定は、例えば、２種類の動物をヘリコバクター・ピロリの菌体成分で免疫し、血清を採取して抗体を精製し、それらの抗体を利用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法で実施することが出来る。さらに簡便には、市販の便中ピロリ菌抗原測定キットを使用することができる。
【００１９】
本発明において、ヘリコバクター・ピロリ菌抗原陽性の糞便からＤＮＡを抽出する方法は、糞便中に含有される核酸増幅（ＰＣＲ）阻害物質の除去が可能な抽出法であれば特に限定されるものではなく、市販の糞便検体からのＤＮＡ抽出キットを使用することができる。
【００２０】
本発明のＰＣＲに使用するヘリコバクター・ピロリ菌検出プライマーには、ヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子のクラリスロマイシン耐性に関与する領域を含む１００〜２００塩基対の長さの遺伝子断片を増幅できれば特に限定されるものではないが、具体的には、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマーの組合せであることを例示することができる。従来報告されている、ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性の判定に用いられる増幅遺伝子断片の塩基対は、本発明より長い６００〜９００（範囲はおおよそで記載した）であった（ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー［Journal of Clinical Microbiology］、第４１巻、２００３年、第３６３６〜３６４０頁）。そのため、検体から抽出されるサンプルに含まれる遺伝子含有量が少ないものについて、６００〜９００塩基対の遺伝子断片（増幅産物）を増幅した場合、目的の遺伝子領域が効率的に増幅されず、突然変異の検出率（検出感度）が上がらないという問題点が残されていた。ここで、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマーを組合せ、本発明の温度条件でＰＣＲを行った場合に増幅される遺伝子断片は１３５塩基対であった。また、本発明では糞便検体を利用するため、糞便に存在する他の細菌の遺伝子は検出しないように設計する必要があり、本発明による特定の短い遺伝子領域について増幅することによって、他の細菌の検出感度を低くすることができるという効果も兼ね備えている。
【００２１】
本発明において、配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマーを組合せてＰＣＲ反応を行う上での温度条件は、９５℃６０秒を１サイクル、９５℃３０秒、６５℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を１０サイクル、９５℃３０秒、５９℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を３８サイクル、６８℃１０分を１サイクルの連続的な加熱サイクルであることが好ましい。尚、ヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡを合成する上で、使用するプライマーが、必要に応じて配列番号１又は配列番号２に記載の配列に特定の配列を延長したり、配列番号１又は配列番号２に記載の配列の5'末端又は3'末端を任意の長さだけ欠損させた場合等においては、ＰＣＲ産物の増幅を効率よく行うために、前記温度条件について適宜変更することが可能である。
【００２２】
本発明において、ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性の判定、すなわち、突然変異を検出（２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２番目又は第２１４３番目において、アデニンがグアニンに変異した突然変異の有無）する方法としては、変異が起きているか否かを調べることができるいずれの方法によっても行なうことができる。例えば、遺伝子断片の塩基配列を決定することによって行うことができる。また、遺伝子断片を所定の制限酵素で消化し、消化産物を電気泳動にかけてバンドを検出することによっても突然変異の有無を判定することが可能である。この場合、使用する制限酵素は、突然変異の有無によって切断が起きたり起きなかったりするものを選択して使用する。このような制限酵素としては、第２１４２番目の突然変異を検出するための制限酵素としてMboII又はBceAI を挙げることができ、第２１４３番目の突然変異を検出するための制限酵素としてBsaIを挙げることができる。これらの制限酵素を使用して増幅させた遺伝子断片を消化した場合、具体的には以下に示す電気泳動パターンが確認される。すなわち、クラリスロマイシン感受性（正常）ならば、いずれの制限酵素によっても切断が起きず、電気泳動で観察されるバンドはいずれの場合も１本である。一方、クラリスロマイシン耐性である、増幅遺伝子中の第２１４２番目のアデニンがグアニンに変異している場合には、MboII によって切断が起き、バンドは２本観察されるが、BsaI又はBceAIで消化しても切断は起きず、観察されるバンドは１本のままである。また、クラリスロマイシン耐性である増幅遺伝子中の第２１４２番目のアデニンがシトシンに変異している場合には、BceAIによって切断が起き、バンドは２本観察されるがMboII又はBsaIで消化しても切断は起きず、観察されるバンドは１本のままである。さらに、第２１４３番目のアデニンがグアニンに変異している場合には、BsaIによって切断が起き、バンドは２本観察されるが、MboII又はBceAI で消化しても切断は起きず、観察されるバンドは１本のままである。従って、増幅させた遺伝子断片をMboII 、或いはBsaI又はBceAIでそれぞれ消化し、その電気泳動パターンを調べることにより、クラリスロマイシン感受性（正常）、クラリスロマイシン耐性第２１４２番目変異型、又はクラリスロマイシン耐性第２１４３番目変異型を識別することが可能である。
【００２３】
［試験例１］
この試験は、糞便中ピロリ菌抗原陽性の糞便検体から抽出したＤＮＡを鋳型として、ヘリコバクター・ピロリ２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲによって特異的に増幅するために必要な温度条件を調べるために行った。
【００２４】
（１）試料
試料として、小児２名から糞便検体の提供を受け、これらを検体Ａおよび検体Ｂとした。
【００２５】
（２）試験方法
検体Ａおよび検体Ｂの糞便中ピロリ菌抗原を、HpSA ELISA（メリディアン社製）で測定したところ２検体とも陽性であった。次に、各検体から約２００ｍｇずつ計りとり、QiAamp DNA Stool Mini Kit（キアゲン社製）でＤＮＡを抽出し、それぞれＤＮＡ抽出液２００μＬを得た。ＰＣＲチューブにこれらＤＮＡ抽出液５μＬを取り、配列番号１及び配列番号２に記載のプライマー溶液それぞれ０．４μＭずつを加え、さらにｄＮＴＰ０．２ｍＭ、５０倍濃耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック社製）１μＬ、１０倍濃ＰＣＲ緩衝液５μＬをそれぞれ添加し、精製水で全量を５０μＬに調整した。  
【００２６】
次いで、以下の二つの異なる温度条件でＰＣＲを行った。温度条件１は、Ｍａｅｄａらの方法〔ガット（Ｇｕｔ）、第４３巻、１９９８年、ｐ．３１７〜３２１〕に従い、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃６０秒をからなる工程を３０サイクルの連続的な加熱サイクルで行った。また、温度条件２は、９５℃６０秒を１サイクル、９５℃３０秒、６５℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を１０サイクル、９５℃３０秒、５９℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を３８サイクル、６８℃１０分を１サイクルの連続的な加熱サイクルで行った。ＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を含む溶液について各５μＬを３％アガロース電気泳動に供し、分子量マーカー（インビトロジェン社製）との比較から、ＰＣＲ産物に含まれるＤＮＡの大きさを検討した。尚、前記配列番号１及び配列番号２を用いたＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ（ＰＣＲ産物）の長さは、ピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列から１３５塩基対であることが明らかとなっている。
【００２７】
（３）試験結果
本試験の結果は、図１に示すとおりである。図の左から、レーン１は分子量マーカー、レーン２は温度条件１における検体ＡのＰＣＲ産物、レーン２は温度条件１における検体ＢのＰＣＲ産物、レーン３は温度条件２における検体ＡのＰＣＲ産物、レーン４は温度条件２における検体ＢのＰＣＲ産物である。
【００２８】
温度条件１において、ピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に対応する１３５塩基対のバンドは、検体Ａでは検出されなかった。また、検体Ｂでは１３５塩基対のバンドは観察されたものの、主に１３５塩基対よりも大きなバンドが検出された。したがって、温度条件１では、ピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子は効果的に増幅されず、糞便中に含有される他の遺伝子が非特異的に増幅されたと考えられる。一方、温度条件２では、検体Ａ及び検体Ｂの両方から得られたＰＣＲ産物中に、ピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に対応する１３５塩基対のバンドが一本検出された。したがって、温度条件２では、糞便検体からピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子が特異的に増幅されたと考えられる。
【００２９】
以上の結果から、温度条件２の方法は従来の方法である温度条件１の方法に比して、糞便検体を用いたヘリコバクター・ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性検査方法を行う上で、好適であることが判明した。
【００３０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
［ヘリコバクター・ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の検出］
０〜１６歳の小児２７名から糞便検体の提供を受け、使用するまで冷凍保存した。これらの糞便検体の便中ピロリ菌抗原をHpSA ELISA（メリディアン社製）で測定したところ、陽性２３名、陰性４名であった。残りの糞便は、ＤＮＡ抽出まで再び冷凍保存した。次に、糞便検体から約２００ｍｇずつを秤取し、QiAamp DNA Stool Mini Kit（キアゲン社製）でＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ抽出液２００μｌを得た。次いで、前記ＤＮＡ抽出液５μｌ、配列番号１及び配列番号２に記載されたプライマーをそれぞれ０．４μＭ、さらにｄＮＴＰ０．２ｍＭ、５０×耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック社製）１μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌを添加し、精製水で全量を５０μｌに調整した。ＰＣＲの温度条件は、９５℃６０秒を１サイクル、９５℃３０秒、６５℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を１０サイクル、９５℃３０秒、５９℃３０秒、６８℃３０秒からなる工程を３８サイクル、６８℃１０分を１サイクルの連続的な加熱サイクルで行った。反応溶液５μｌを常法により５％アガロース電気泳動にかけ、分子量マーカー（インビトロジェン社製）との比較から、１３５塩基対のバンドの有無を調べた。その結果、糞便中ピロリ菌抗原陽性２３名のうち、ＰＣＲ産物中に１３５塩基対のバンドを有するＰＣＲ陽性は２１名であった。一方、糞便中ピロリ菌抗原陰性４名は全てＰＣＲ陰性であった。以上の結果より、ヘリコバクター・ピロリ菌感染患者の糞便検体から９１．３％の検出感度で、高感度にクラリスロマイシン耐性の原因となる２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の領域を増幅することが可能であった。
【００３２】
［クラリスロマイシン耐性ヘリコバクター・ピロリ菌の点突然変異の検出］
前記ピロリ菌抗原陽性のうち、ＰＣＲ陽性と判定された検体のＰＣＲ産物を含む溶液２５μＬを常法によりエタノール沈殿させ、回収したＤＮＡを精製水１０μＬに溶解した。このＤＮＡ溶液を２μＬずつ３本のチューブに分注し、５unitのMboII（ニューイングランド・バイオラボス社製）、５unitのBsaI（ニューイングランド・バイオラボス社製）、又は０．５unitのBceAI（ニューイングランド・バイオラボス社製）と、各制限酵素に適した緩衝液を添加し、精製水で全量を１５μＬに合わせ、一晩反応させた。この制限酵素処理液５μＬを常法により５％アガロース電気泳動にかけ、制限酵素による切断の有無を調べた。
【００３３】
その結果、ＰＣＲ陽性２１名の検体のうち、MboIIによる切断が１名の検体に確認され、それとは別にBsaIによる切断が４名の検体に確認された。また、BceAIによる切断は確認されなかった。なお、その他のＰＣＲ陽性１６名の検体にはいずれの酵素による切断も確認されなかった。すなわち、クラリスロマイシン耐性ヘリコバクター・ピロリ菌の点突然変異の検出率は、２３．８％であった。
【００３４】
前記ＰＣＲ陽性と判定された検体のＰＣＲ産物を含む溶液２０μＬを用いて、常法によりＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。その結果、ＰＣＲ陽性２１名のうち、２１４２番目のアデニンがグアニンに置換された点突然変異が１名、２１４３番目のアデニンがグアニンに置換された点突然変異が４名確認された。その他のＰＣＲ陽性１６名には、点突然変異は確認されなかった。
【００３５】
除菌成績の追跡調査では、本発明の方法によるＰＣＲ陽性２１名のうち、クラリスロマイシンを含む３剤併用療法による除菌治療が３名に行われた。この３名のうち、除菌不成功は２名であり、除菌成功は１名であった。除菌不成功２名には、いずれも本発明の方法でクラリスロマイシン耐性ヘリコバクター・ピロリ菌が検出された。一方、除菌成功１名には、本発明の方法でクラリスロマイシン耐性性ヘリコバクター・ピロリ菌は検出されなかった。したがって、本発明の方法による結果は、除菌成績との相関性が高いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、糞便検体を利用したピロリ菌のクラリスロマイシン薬剤耐性に対する非侵襲的検査法に関するものであり、内視鏡等を利用した生検検体を必要としないことから、検査を必要とする患者に苦痛を与えず、小児等のピロリ菌感染診断への応用が簡易である。また、培養法等による検査や、薬剤感受性試験を行う必要がなく、短時間で高感度な検査結果が得られ、除菌成績との相関性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ヘリコバクター・ピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子に対応するＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図１】
2005168474.tif 000002
【配列表】
2005168474000001.app