(57)【要約】【課題】マクロライド系抗生物質に結合するのペプチドの提供。【解決手段】  マクロライド系抗生物質に結合するアミノ酸配列からなるペプチド、又は該アミノ酸配列と相同性のある配列を含むペプチド若しくはタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロライド系抗生物質に結合する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は該アミノ酸配列と相同性のある配列を含むペプチド若しくはタンパク質。
【請求項２】
マクロライド系抗生物質がクラリスロマイシンである請求項１記載のペプチド又はタンパク質。
【請求項３】
マクロライド系抗生物質に結合する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相同性のある配列を含む遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロライド系抗生物質に結合するペプチドとこれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラリスロマイシン（ＣＡＭ：６−Ｏ−メチルエリスロマイシンの同義語、（非特許文献１参照））は、アボット社（Abbott）の市販薬として１９９０年に送り出されたマクロライド系抗生物質の１つであり、ヒトの細菌感染を防御するために今日まで世界的に使用されてきた。エリスロマイシン（ＥＭ）およびその構造的同族体によって代表されるマクロライド系抗生物質は、特に細菌の５０Ｓリボソームサブユニットに結合し、タンパク質合成を抑制する（非特許文献２参照）。ＣＡＭはまた、胃のヘリコバクター＝ピロリ菌（Helicobacter pylori）を死滅させるために一般的に用いられる（前記菌は胃潰瘍および胃癌の両方の原因菌であると強く疑われている（非特許文献３参照））。ＣＡＭ、ＥＭおよびアジスロマイシン（ＡＭ）（非特許文献４参照）を含むマクロライド系抗生物質の新規な医薬的用途を開発するために例えば以下のような多くの研究が報告されている。
ヒト白血球のＩＬ８分泌の増加（非特許文献５〜７参照）；ヒト肺癌細胞におけるヘパラナーゼｍＲＮＡの増殖因子誘発発現のin vitro調節（非特許文献８参照）；血管形成および腫瘍増殖のin vivo抑制（非特許文献９参照）などである。ヒト細胞または癌さえもマクロライド系抗生物質に反応するという非常に多くの証拠が存在する（非特許文献１０参照）。
しかし、ヒトのタンパク質と結合するマクロライド系抗生物質の存在は明瞭ではない。
【０００３】
現在のところ、タンパク質と小分子との相互作用を特定することは非常に重要なことである。それは哺乳類の生化学的プロセスの解明に役立ち、さらに、おそらく新規な医薬および農薬の標的の立証を容易にするであろう。また、検査薬としてタンパク質又はペプチドを用い、これと結合する物質を調査することにより、薬効の有無、新たな効能、用途を持つ医薬の開発に役立つことが期待される。
【０００４】
タンパク質と結合する小分子を同定するためのもっとも新しい方法の１つは、スミス（Smith）が報告したいわゆる“ファージディスプレー”である。これにより、Ｍ１３バクテリオファージが提示するペプチドで構成されるランダムライブラリーの親和性選別を実施して、パクリタキセル（タキソール（Taxol））結合抗アポトーシスヒトタンパク質Ｂｃｌ−２が特定された。前記はチューブリンの配列と顕著な配列相同性をもたない。別の興味深い例によって、アントラサイクリン系抗生物質のドキソルビシン（アドリアマイシンの同義語）（固形腫瘍に広く用いられている抗癌剤の１つ）は核のリンタンパク質ｈＮｏｐｐｌ４０（ヒト肝ｃＤＮＡを発現しているＴ７ファージライブラリーから選別された）と結合することが示された。
しかしながら、マクロライド系抗生物質、特にクラリスロマイシンに結合するペプチドについては、研究されておらず、知られていなかった。
【非特許文献１】モリモトら（Morimoto,S.; Takahashi,Y.、Watanabe,Y.,Omura,S.(1984).J.Antibiotic.37,187.）
【非特許文献２】シュンゼンら（Schunzen,F., Zarivach,R., Harms,J., Bachan,A., Tocilj,A., Albrecht,R., Yonath,A., Francescbi,F.(2001).Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase centre in eubacteria. Nature,413,814-821,and references therein.）
【非特許文献３】プリスマスタディー（ Helicobacter pylori and gastric cancer:current status of the Austrain Czech German gastric cancer prevention trial (PRISMA Study).）
【非特許文献４】ミエルケら（ Miehlke S., Kirsch C., Dragosics B., Gschwantler M., Oberhuber G,. Antos D., Dite P., Lauter J., Labenz J., Leodolter A., Malfertheiner P., Neubauer A., Ehninger G., Stolte M., Bayerdorffer E. (2001). World J. Gastroenterol,7,243-247.）
【非特許文献５】5. Jacks S. S., Giguere S., Nguyen A. (2003). In vitro susceptibilities of Rhodococcus equi and other common equine pathogens to azithromycin, clarithromycin, and 20 other antimicrobials. Antimicrob Agents Chemother.47, 1742-1745.
【非特許文献６】クルドウスカら（ Kurdowska, A., Noble, J. M., Griffith D.E.(2001). The effect of azithromycin and clarithromycin on ex vivo interleukin-8 (IL-8) release from whole blood and IL-8 production by human alveolar macrophages. J. Antimicrob. Chemother.47,867-870.）
【非特許文献７】キクチら（ Kikuchi T., Hagiwara K., Honda Y., Gomi K., Kobayashi T., Takahashi H., Tokue Y., Watanabe A., Nukiwa T. (2002). Clarithromycin suppresses lipopolysaccharide-induced interleukin-8 production by human monocytes through AP- 1 and NF-kappa B transcription factors. J. Antimicrob. Chemother.49,745-755.）
【非特許文献８】サカキら（ Sasaki M., Ito T., Kashima M., Fukui S., Izumiyama N., Watanabe A., Sano M., Fujiwara Y, Miura M. (2001). Erythromycin and clarithromycin modulation of growth factor-induced expression of heparanase mRNA on human lung cancer cells in vitro. Mediators Inflamm.10,259-267.）
【非特許文献９】ヤツナミら（Yatsunami J., Hayashi S. (2001). Fourteen-membered ring macrolides as anti-angiogenic compounds. Anticancer Res.21,4253-4258.
【非特許文献１０】モリスら（Morris T. C., Ranaghan L., Morrison, J. (2001). Phase II trial of claritnromycin and pamidronate therapy in myeloma. Med. Oncol.,18,79-84.）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、マクロライド系抗生物質に結合するペプチドを得、さらにこれをコードする遺伝子を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
斯かる実状に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、マクロライド系抗生物質に結合するペプチドを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次のものを提供するものである。
【０００７】
＜１＞  マクロライド系抗生物質に結合する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は該アミノ酸配列と相同性のある配列を含むペプチド若しくはタンパク質。
【０００８】
＜２＞  マクロライド系抗生物質がクラリスロマイシンである＜１＞記載のペプチド又はタンパク質。
【０００９】
＜３＞  マクロライド系抗生物質に結合する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相同性のある配列を含む遺伝子。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のペプチドは、マクロライド抗生物質に結合する性質を持ち、この配列を含むタンパク質は、マクロライド抗生物質と結合する。それらのタンパク質には、膵臓癌及び慢性膵臓炎に強く発現するヒトｐ８タンパク質が含まれており、それらの治療にマクロライド抗生物質が適用されることが期待される。すなわち、本発明のペプチドを用いることにより、新たな薬効の発見が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
クラリスロマイシン（ＣＡＭ）に結合するペプチド（又はタンパク質）の特定
ＣＡＭ結合タンパク質を特定するために、我々は、表面キャプシドタンパク質上にランダムペプチドを表示する、ヒト白血球およびショウジョウバエ（Drosophilae）のｃＤＮＡフラグメントを含む２つのＴ７ファージライブラリーを用いた。ＣＡＭのビオチン化誘導体による生物選別（biopanning）後にペプチドを発現するファージクローンを選択的に増幅させた。本実験によって、ファージディスプレーペプチドライブラリーを用い、クラリスロマイシン結合ヒトｐ８タンパク質の存在が示された。さらにまた、発現ヒトｐ８タンパク質と二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）との結合は、ゲル移動性シフトアッセイでＣＡＭ１（１）、ＥＭ（２）およびＡＭ（３）によって妨害された。
【００１２】
以下に詳細に述べる
ビオチン化クラリスロマイシンの合成：
結合タンパク質のスクリーニングのために、炭水化物環のＣ２’でビオチン化したＣＡＭの誘導体をＣＡＭから製造した（化１）。
【００１３】
【化１】
2005095014.tif 000002
【００１４】
化学物質総収量が１４％のビオチン化誘導体を得るため以下の３つの合成工程によった。
工程１：ＣＡＭとＮ−ベンジル−β−アラニンとの縮合反応によるリンカー部分のビオチンのＣ２’への導入、
工程２：還元的水素添加によるベンジル保護基の除去、および
工程３：６−（ビオチンアミドカプロイルアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いるビオチン化によるビオチン化ＣＡＭ（５）の生成。
【００１５】
前記縮合反応（工程１）では、クロマトグラフィーによって分離される３つの生成物が得られた。前記の各々の構造は、ＮＭＲ実験によってカルディノース上のＣ２’およびデソサミン上のＣ２”で二置換された生成物、およびＣ２’またはＣ２”で一置換された２つの生成物であることが判明した。前記一置換生成物のＮＭＲデータでは、ＣＡＭのＣ２’の1Ｈ化学シフト（内部標準としてのＴＭＳから２Ｈ，δ３．２ｐｐｍ）は４．７９（２Ｈ）にシフトし、一方、Ｃ２”のそれは顕著にはシフトしなかった（各プロトンシグナルについて１．６１および２．３６）。ＨＭＢＣ実験では、Ｃ２’の１Ｈシグナル（４．７９）はエステルの炭素シグナルと１７０．４でクロスピークを有し、Ｎ−ベンジル−β−アラニンのＣ２’エステルの存在を示唆した。Ｃ２”誘導体は複雑な混合物を生じる水素添加反応に耐えられないので、Ｃ２’で一置換された生成物を次の工程で用いた。
【００１６】
生物選別による高親和性ファージの選別：
生物選別によるスクリーニングのために、Ｔ７ファージライブラリーは、キャプシドタンパク質のマルチクローニング部位内に提示されるべきペプチドの種々のｃＤＮＡ配列をもつ必要がある。このために、２つのＴ７ファージライブラリーをヒト白血球およびショウジョウバエ（ドロソフィラ＝メラノガスター、Drosophila melanogaster）のｃＤＮＡライブラリーから調製した。ＣＡＭのビオチン化誘導体をストレプトアビジン被覆ウェルに固定し、それを、それぞれヒト白血球およびショウジョウバエのｃＤＮＡフラグメントの挿入物を含む２つのＴ７ファージライブラリーとともにインキュベートした。生物選別によって選別し、数回緩衝液で洗浄して基質にランダムに結合した非特異物質を除去し、さらに溶出させて回収した各ファージは、ビオチン化ＣＡＭと親和性を示す可能性があるものの混合物であった。４回の生物選別を実施し、各回で洗浄し溶出させた溶液の各々についてファージの力価をチェックした。リガンドによって選別し回収したファージは、４回の選別後に白血球ファージライブラリーについては０．７８％およびショウジョウバエファージライブラリーについては０．２３％に増加し、一方、コントロールの回収ファージでは両方のケースで無視できる値であった。
【００１７】
リガンド選別ファージの配列分析およびペプチド配列の相同性検索：
回収したファージのｃＤＮＡ挿入物をアガロースゲル電気泳動分析のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。４回目の選別後（図１、Ｂ）、回収されたｃＤＮＡ挿入物は３回選別生成物（図１、Ａ）よりもはるかに均質であった。ショウジョウバエファージライブラリーの場合では、４回選別後の８３個の配列決定クローンの８９％が５７ヌクレオチド配列と同定され、前記はまたヒト白血球ライブラリーからも主要配列として得られた（配列決定クローンの６０％）。前記選別されたヌクレオチドの同族物の１９アミノ酸配列を、配列番号１（ＮＳＰＡＧＩＳＲＥＬＶＤＫＬＡＡＡＬＥ）に示す。
【００１８】
この配列をＦＡＳＡプログラムを用いてスイスプロットタンパク質データベース検索で調べた。相同性検索の結果、前記調査配列の１３アミノ酸は、核タンパク質として知られておりｄｓＤＮＡと結合するヒトｐ８タンパク質（８２アミノ酸）の５８−７０の領域で６６％の相同性インデックスを有していた。前記はプロアポトーシス刺激に対する反応に参画し、さらに組織が種々の損傷を相殺するために役立つような態様で細胞増殖を促進することができた。前記はまた、転移性表現型に寄与することができるが、その役割および機能ままだ明確ではない。
【００１９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析：
ヒトｐ８タンパク質とリガンドとしてのビオチン化ＣＡＭの結合を確認するために、ＢＩＡコアにリガンドを固定したセンサーチップを用いて解離定数を決定した。３種の異なるタンパク質濃度（２、４および６μＭ）を結合分析に用いた。リガンドはストレプトアビジンセンサーチップに固定し、続いてタンパク質溶液を前記リガンドに添加した。前記リガンドは注入によるヒトｐ８タンパク質と結合した。リガンドとタンパク質との結合の解離定数（ＫD）は５×１０-5Ｍであった（図２）。この結果は、ビオチン化ＣＡＭは、ファージペプチドライブラリーから生物選別によって選別したヒトｐ８タンパク質と直接相互作用することを示唆した。
【００２０】
ヒトｐ８タンパク質とマクロライド系抗生物質との間の結合の分析：
ヒトｐ８タンパク質のＤＮＡ結合活性を分析した。図３、Ａはｐ８タンパク質のｄｓＤＮＡ（２３７塩基対）のゲル移動度シフトアッセイを示している。前記結合アッセイでは、１０ｎＭｏｌ（ヌクレオチド）のｄｓＤＮＡを０−９．６μＭｏｌのｐ８タンパク質に添加した（図３、Ａ、レーン３−８）。ｄｓＤＮＡに結合したｐ８タンパク質はゲル内の位置が変化したが（レーン４−８）、一方、ＣＡＭまたは１．５％ＤＭＳＯ（溶媒として）を含むｄｓＤＮＡは変化しなかった（それぞれレーン２および３）。ビオチン化ＣＡＭ（エントリー１）、ＣＡＭ（エントリー２）、ＥＭ（エントリー３）およびＡＭ（エントリー４）は、ｐ８タンパク質（２．４μＭ）およびｄｓＤＮＡ（１０ｎＭｏｌ）との間の複合体形成を妨害した（図３Ｂ）。ビオチン化ＣＡＭ、ＣＡＭ、ＥＭおよびＡＭによるｐ８タンパク質のＤＮＡ結合活性の抑制は、それぞれ２．４、１．２、２．４および０．６ｍＭで観察された。
【実施例】
【００２１】
実施例１
実験方法
材料：エリスロマイシンはシグマ（Sigma, USA）から購入した。他のマクロライド系抗生物質、ＣＡＭおよびＡＭは錠剤からＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、各サンプルはシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。全てのマクロライドの構造および合成生成物はＮＭＲ（AVANCE DRX-400および600, Bruker BioSpin, Germany）およびＥＳＩ−ＭＳ（Esquire 3000 plus, Bruker Daltonics, Germany）の両方でチェックした。ＮＭＲデータの化学的シフトいずれも、ＸＷＩＮ−ＮＭＲおよびデータアナリシス（DataAnalysis）でそれぞれ処理した。発現されたタンパク質のＭＳは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Reflex IV, Bruker Daltonics, Germany）で決定した。ＳＰＲデータはバイオセンサーＢＩＡｃｏｒｅ３０００（Sweden）で収集し、ストレプトアビジン研究用等級のセンサーチップはＢＩＡｃｏｒｅ（Sweden）から購入した。ＤＮＡ配列は、ＡＢＩＰＲＩＳＭR３１００ジネティックアナライザー（Applied Bioscience, USA）を用いて分析した。他の試薬はいずれも分析用等級で、本文で特に述べないかぎりジュンセイ社（Japan）から購入した。
【００２２】
ビオチン化ＣＡＭの合成：
Ｎ−カルボベンキシルオキシ−β−Ｌ−アラニン（９０ｍｇ、０．４ｍＭｏｌ）、１−（３−ジメチルアモノロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ、１００ｍｇ、０．５２ｍＭｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６ｍｇ、０．０５ｍＭｏｌ）を、乾燥ピリジン中のＣＡＭ（１）の溶液（２００ｍｇ、０．６２ｍＭｏｌ）に添加し、続いて前記混合物を５０℃で５日間攪拌した。前記反応混合物に水を注ぎいれ、続いて酢酸エチルで抽出した。硫酸マグネシウム無水物上で乾燥させた後、ろ液を真空中で蒸発させシロップを得た。前記シロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーでクロマトグラフィーに付して生成物（４）（５５．３ｍｇ、０．０５８ｍＭｏｌ、２２．３％）を得た。生成物（４）の陽性ＥＳＩ−ＭＳは、Ｃ49Ｈ81Ｎ2Ｏ16のＭ＋Ｈイオンとしてｍ／ｚ９５３．５を示した。
【００２３】
【化２】
2005095014.tif 000003
【００２４】
化２は、クラリスロマイシン（ＣＡＭ、（１））、エリスロマイシン（ＥＭ、（２））およびアジスロマイシン（ＡＭ、（３））の構造、並びにビオチン化クラリスロマイシン（５）の合成経路を示す。（５）を精製するためには以下の３つの合成工程が存在する。工程１：ＣＡＭ（１）とＮ−ベンジル−β−アラニンとの縮合反応によりモノエステル（４）を生じる、工程２：還元的水素添加、工程３：６−（ビオチンアミドカプロイルアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによるビオチン化。
Ｂは、ＨＭＢＣおよびＣＯＳＹの部分的同定を示す。Ｎ−カルボベンキシルオキシ−β−Ｌ−アラニニルクラリスロマイシンのＣＯＳＹおよびＨＭＢＣにおける1Ｈ−1Ｈ相関関係がそれぞれ太線および矢印で表されている。
【００２５】
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）；マクロライド部分、１Ｈ：δ５．０５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝２．３２、１１．１２Ｈｚ，Ｈ−１３），３．７４（１Ｈ，Ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，Ｈ−３），３．７２（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１０），３．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５６Ｈｚ，Ｈ−５），３．０２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２２），２．９７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），２．８３（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝７．２８，９．１２Ｈｚ，Ｈ−２），２．５８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），１．９６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１４ｂ），１．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４），１．６８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７ｂ），１．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７ａ），１．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１４ａ），１．４１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８），１．２１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１２Ｈｚ，Ｈ−１６），１．１３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２４Ｈｚ，Ｈ−１９），１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８８Ｈｚ，Ｈ−２０），１．１０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２１），０．８４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−１５），０．８４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−１７），13Ｃ：δ２２１．１（Ｃ−９），１７５．１（Ｃ−１），８０．８（Ｃ−５），７８．２（Ｃ−６およびＣ−３），７４．６（Ｃ−１３），７４．２（Ｃ−１２），６９．１（Ｃ−１１），５０．５（Ｃ−２２），４５．２（Ｃ−８），４５．０（Ｃ−２），３８．７（Ｃ−７），３８．０（Ｃ−４），１９．８（Ｃ−１８），２１．０（Ｃ−１４），１０．６（Ｃ−１５），１５．９（Ｃ−１６），１７．９（Ｃ−１９），１６．１（Ｃ−２１），１２．３（Ｃ−２０），８．９（Ｃ−１７）；
【００２６】
カルディノース部分、1Ｈ：δ４．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．４４，１０．６８Ｈｚ，Ｈ−２’），４．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ，Ｈ−１’），３．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），２．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３’），２．１５（６Ｈ，ｓ，Ｈ−７’およびＨ−８’），１．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’ａ），１．２４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０４Ｈｚ，Ｈ−６’），１．２３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’ｂ），13Ｃ：δ１００．３（Ｃ−１’），７１．５（Ｃ−２’），６８．３（Ｃ−５’），６３．８（Ｃ−３’），３９．７（Ｃ−７’および８’），２８．２２（Ｃ−４’），２１．５（Ｃ−６’）；
【００２７】
デソサミン部分、1Ｈ：δ４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４８Ｈｚ，Ｈ−１”），３．９５（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝６．３２，６．２４Ｈｚ，Ｈ−５”），３．３２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−８”），３．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８８，８．８８Ｈｚ，Ｈ−４”），２．３６（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２”ａ），１．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５２，２．２８Ｈｚ，Ｈ−２”），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２４Ｈｚ，Ｈ−６”），１．２５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−７”），13Ｃ：δ９５．９（Ｃ−１”），７７．８（Ｃ−４”），７２．９（Ｃ−３”），６５．９（Ｃ−５”），４９．４（Ｃ−８”），２１．５（Ｃ−７”），１８．６（Ｃ−６”）。
【００２８】
エタノール（２０ｍＬ）中の生成物（４）の溶液（４６ｍｇ、０．０４８ｍＭｏｌ）を１０％のＰｄ／Ｃ（１０ｍｇ）の存在下で水素雰囲気下で１２時間室温で攪拌した。前記反応混合物をろ過し、ろ液を真空中で蒸発させた。残留油（３９ｍｇ）および６−（ビオチンアミドカプロイルアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３０ｍｇ、０．０５ｍＭｏｌ）を乾燥ピリジン（１０ｍＬ）中で溶解し、続いて２時間室温で攪拌した。前記反応混合物を真空中で蒸発させ，残留物をシリカゲルカラムでクロマトグラフィーに付し、生成物（５）を得た（４１．５ｍｇ、０．０３３ｍＭｏｌ、６９％）。生成物（５）の陽性ＥＳＩ−ＭＳは、Ｃ63Ｈ111Ｎ6Ｏ18ＳのＭ＋Ｈイオンとしてｍ／ｚ１２７１．７を示した。
【００２９】
ショウジョウバエ（D. melanogaster）のＴ７ファージライブラリーの構築：
ポリ（Ａ）+ＲＮＡ、ランダムプライマー、５’−メチル化ｄＣＴＰ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリンカー、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ７セレクト１０−３ｂベクターおよびＴ７パッケージングエキストラクトはノバゲン（Novagen, USA）から購入した。全ＲＮＡの部分標本８０μｇは、ショウジョウバエ（D. melanogaster）のＫｃ細胞から抽出した。オリゴテックス−ｄｔ３０（スーパー）（Takara, Japan）を２回目の単離に用いて材料の損失を最小限にし、ランダムプライミングによるｃＤＮＡ合成に適したポリ（Ａ）+ＲＮＡを生成した。ｃＤＮＡ合成は、ランダムプライマーを有する４μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡでプライミングを実施し、続いて５’−メチル化ｄＣＴＰを両方の鎖に取り込ませ、１回目と２回目の鎖の合成の間には抽出も沈澱も実施しなかった。続いてｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、末端を平滑にし方向性を有するＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリンカーで連結した。リンカーとの連結の後、ｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで連続的に消化し、続いてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化Ｔ７セレクト１０−３ｂベクターアームに挿入した。得られたｃＤＮＡをＴ７ファージ１０−３ｂベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ファージへの充填を実施した。このライブラリーの力価は１．６×１０10ｐｆｕ／ｍＬであった。
【００３０】
ヒト白血球のＴ７ファージライブラリーの構築：
ＨｉｎｄＩＩＩランダムプライマー（ｄＴＴＮＮＮＮ）、ＭＭＬＶ−ＲＴ、メチル化ｄＮＴＰ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡｐｏｌＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリンカーはノバゲンNovagen, USA）から購入した。ペプチド配列を交互に入れ換えるＴ７ファージライブラリーは以下のように作製した。ＲＮイージーマクシ（Rneasy Maxi, Quiagen, USA）で抽出したヒト白血球由来全ＲＮＡの４００μｇをオリゴテックス−ｄＴ３０樹脂（oligotex-dT30, Takara, Japan）に適用してポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを精製した。４μｇのポリ（Ａ）+ｍＲＮＡからＨｉｎｄＩＩＩランダムプライマー（ｄＴＴＮＮＮＮ）を用いてＤＮＡ合成を開始し、第一鎖ｃＤＮＡは基質としてメチル化ｄＮＴＰを用いＭＭＬＶ−ＲＴで合成した。第二鎖ｃＤＮＡは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成し、得られた二本鎖ｃＤＮＡの末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした。平滑末端を有する二本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにつなぎ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られたｃＤＮＡをＴ７ファージ１０−３ｂベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ファージに充填した。一次リコンビナントの力価は４×１０6ｐｆｕ／ｍＬであった。
【００３１】
生物選別および配列分析：
４回の選別後、約４０個のプラークを任意にＬＢプレートから単離し、各々をファージ抽出緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＭｇＳＯ4）に溶解させた。ファージを破壊するために、前記抽出物を６５℃で１０分加熱した。続いて以下のプライマーを用いてファージＤＮＡをＰＣＲで増幅した：前進方向プライマー（配列番号２）５’−ＧＡＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＣ−３’および逆方向プライマー（配列番号３）５’−ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡ−３’。増幅後、ＰＣＲフラグメントをＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Amersham Biosciences）でクリーンアップし、１００％エタノールを添加して精製しＰＣＲ生成物を沈澱させた。続いて精製ＰＣＲフラグメントの配列を決定した。配列の結果をもとにして、Ｔ７ファージキャプシドに提示されているアミノ酸配列を決定した。候補クローンを増幅し、ビオチン化ＣＡＭ誘導体に対する親和性をチェックした。
【００３２】
ｐ８の発現と精製：
ＴＧ緩衝液は以下の試薬を含む；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、０．０１％ノニデット−Ｐ４５０、プロテアーゼインヒビター（１ｍｇ／ｍＬのロイペプチンおよびペプスタチン）および１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）。
Ｈｉｓタグ結合緩衝液は以下の試薬を含む：２０ｍＭＮａＨ2ＰＯ4、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．５。
Ｈｉｓタグ溶出緩衝液は以下の試薬を含む：２０ｍＭＮａＨ2ＰＯ4、０．５ＭＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．５。
【００３３】
リコンビナントＰ８タンパク質のｃＤＮＡクローニング、発現および精製：
Ｐ８フラグメントはヒトの完全長ＥＳＴクローン（クローンＩＤ：ＣＳ０ＤＩ０１５ＹＰ０５（Invitrogen））から得た。完全なＰ８コード配列を含むベクターｐＥＴ２８ａ（Novagen）をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。プライマーは以下を用いた。（配列番号４）５’−ＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣ−３’および（配列番号５）５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣ−３’。
【００３４】
Ｐ８の開放読み枠（GenBank Accession No. AL545570）は８２個のアミノ酸残基のポリペプチドをコードし、質量は８．９ｋＤａであった。リコンビナントタンパク質の発現およびＰ８タンパク質の精製のために、前記得られた構築物で大腸菌ＢＬ２１（DE3 pLys S）をヒートショックにより形質転換し、１つのコロニーを用いてＬＢ培地（１％グルコースおよび１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン含有）に３０℃で接種した。前記培養を一晩増殖させ、この１００ｍＬを２リットルのＳＢ培地中の１％グルコースに３０℃で接種した。１時間増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。２時間３０℃で増殖させた後、前記培養を１５０００ｇで１０分４℃で遠心沈澱させた。ペレットをＴＧ緩衝液に懸濁し、３０秒で１０回超音波処理し、３００００ｇで２０分４℃で遠心沈澱させた。続いてチャージおよび洗浄を実施した５ｍＬのＨｉｓ結合樹脂（Novagen）と上清を混合した。カラムを１００ｍＬのＴＧ緩衝液で洗浄し、１％グリセロールと１００ｍＭのグルタチオン（還元型）を含むトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させた。ＴＧ緩衝液で透析後の溶出リコンビナントｐ８タンパク質を種々のアッセイに用いた。
【００３５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：
ヒトｐ８タンパク質とビオチン化ＣＡＭの結合分析は、バイオセンサーＢＩＡコア３０００装置（ストレプトアビジン研究用等級センサーチップ付き）を用いて実施した。全ての緩衝液は使用前にろ過した。カップリング緩衝液（８％ＤＭＳＯ含有１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中のビオチン化ＣＡＭ（０．０１Ｍ、ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ，０．００５％Ｐ２０，３ｍＭＥＤＴＡ）を含むカップリング緩衝液（１０％ＤＭＳＯ、ｐＨ５．０）２０μＬを流速２０μＬ／分で注入してストレプトアビジンセンサーチップ上にリガンドとして固定した。非結合リガンドを１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて洗浄した。ヒトｐ８タンパク質の結合分析は、前記タンパク質を含む泳動緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中で流速２０μＬ／分で２５℃で実施した。動態パラメーターはＢＩＡ評価ソフト３．１を用いて決定した。ヒトＰ８タンパク質とクラリスロマイシンの結合分析は、バイオセンサーＢＩＡコア装置、ＢＩＡＣＯＲＥＸ（BIAcore, Sweden）を用いて実施した。全ての緩衝液は使用前にろ過した。動態パラメーターはＢＩＡ評価ソフト３．１を用いて決定した。
【００３６】
ゲル移動度シフトアッセイ：
ゲル移動度シフトアッセイは、文献（Casas-Finet et al.）の記載にしたがって実施した。結合混合物（最終容積２０μＬ）は以下を含む：２０ｍＭＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ，０．０５％Ｐ４０，１０％グリセロール、１０ｎＭ２５４ｂｐＤＮＡ，及び０〜２．４μＭのｐ８タンパク質。種々の濃度の化合物を前記結合混合物に添加し、続いて２５℃で３０分インキュベートした。サンプルを１．０％アガロース（０．１Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５ｍＭＥＤＴＡ含有）中で２時間４℃で５０ボルトで泳動させた。
【００３７】
図３ＡおよびＢの実験方法：
結合混合物（最終容積２０μＬ）は以下を含む：２５ｍＭＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭＤＴＴ、０．０５％Ｐ−４０、１０％グリセロール、１０ｎＭ２５４ｂｐＤＮＡ，及び、０又は２．４μＭのｐ８タンパク質。
【００３８】
種々の濃度のＣＡＭ、ＥＭおよびＡＭを前記混合物に添加し、続いて２５℃で１０分インキュベートした。サンプルは１％アガロースゲル（０．１Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５ｍＭＥＤＴＡ含有）で５０ボルトで２時間泳動させた。
【００３９】
他の方法：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は標準的なレムリ（Laemli）法を用いて７．５％および１０％ゲルにより実施した。電気泳動後、ゲルをレイら（Wray et al.）の記載にしたがって銀染色した。タンパク質濃度は標準物質としてｇ−グロブリンを用いるタンパク質アッセイキット（Bio-Rad）によりブラッドフォード（Bradford）の方法にしたがって決定した。
【００４０】
以上を各図に示す。
図１は、生物選別で選別されたＴ７ファージに挿入されたショウジョウバエのｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。Ａ：３回選別後のＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ、Ｂ：４回選別後のＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ。４回選別後、選別ファージの８９％がアガロースゲル電気泳動分析で類似のバンドを示した。
【００４１】
図２は、ビオチン化クラリスロマイシンとヒトｐ８タンパク質との結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す。ビオチン化クラリスロマイシンとヒトｐ８タンパク質との結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）シグナル（BIAcore, 実験方法の項を参照）によって検出され、反応ユニットとして示されている。３種の異なる濃度のｐ８タンパク質（曲線１：６μＭｏｌ、曲線２：４μＭｏｌ、および曲線３：２μＭｏｌ）を、ストレプトアビジンセンサーチップ上の固定ビオチン化ＣＡＭ（３０μｇ／μＬ）に２０μＬ／分で３分間注入し、２０μＬ／分で９０秒間解離させた。泳動緩衝液単独の注入から生じるバックグラウンドは作図前にデータから差し引いた。陰性コントロールのためには、３種の異なる濃度のＢＳＡ（曲線４：６μＭｏｌ、曲線５：４μＭｏｌ、および曲線６：２μＭｏｌ）を、ストレプトアビジンセンサーチップ上の固定ビオチン化ＣＡＭ（５）に同じ態様で注入した。
【００４２】
図３は、ｐ８タンパク質とｄｓＤＮＡとの結合のゲル電気泳動移動度シフト分析を示す。最終容積２０μＬで各サンプルを１．０％アガロースゲル上で５０Ｖで２時間泳動させた。臭化エチジウム染色ゲルの写真が示されている。
Ａ：ヒトｐ８タンパク質とｄｓＤＮＡとの結合のゲルシフト分析。
合成ｄｓＤＮＡ（１０ｍＭｏｌ、５１２ｂｐ）およびヒトｐ８タンパク質を混合した。レーン１−３はタンパク質を含まない；レーン４−８はそれぞれ０．６、１．２、２．４、４．８および９．６μＭの濃度のタンパク質と混合された；レーン２−８は１．５％のＤＭＳＯを含み、レーン２はＣＡＭ（１ｍＭ）を含んでいた。
Ｂ：ヒトｐ８タンパク質、ｄｓＤＮＡおよびマクロライド類（エントリー１−４はそれぞれビオチン化ＣＡＭ、ＣＡＭ、ＥＭおよびＡＭ）との間の結合のゲルシフト分析。
合成ｄｓＤＮＡ（１０ｍＭｏｌ、５１２ｂｐ）、ヒトｐ８タンパク質（それぞれ０μＭ（レーン１）および２．４μＭ（レーン２−６））を混合した。レーン１−２はマクロライドを含まず、レーン３−６では各々以下の濃度のマクロライド類が混合された（それぞれ０．３、０．６、１．２および２．４ｍＭｏｌ）。
本実験によって、クラリスロマイシン結合ヒトｐ８タンパク質の存在が示された。さらにまた、発現ヒトｐ８タンパク質と二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）との結合は、ゲル移動性シフトアッセイでＣＡＭ１、ＥＭおよびＡＭによって妨害されることが判った。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
マクロライド抗生物質は、抗感染症薬として世界中で広く処方されている。マクロライド系抗生物質が抗腫瘍薬として利用できることは、すでにＷＯ９５／２８９３９に示されている。本発明によるマクロライド系抗生物質結合ペプチド、そのアミノ酸配列を含むタンパク質及びそれらをコードする遺伝子群は、癌化学療法を行う場合に鍵となる標的をしめしている。従って、臨床的には、このアミノ酸配列を含むタンパク質及びそれらをコードする遺伝子群の発現を基に、マクロライド系抗生物質の適用拡大が可能となる。特にこれまで有効な坑腫瘍薬が開発されていない癌治療に期待が持たれる。
かように、検査薬として本発明のタンパク質又はペプチドを用い、これと結合する物質を調査することにより、薬効の有無、新たな効能、用途を持つ医薬の開発に役立つことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】生物選別で選別されたＴ７ファージに挿入されたショウジョウバエのｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す図である。
【図２】ビオチン化クラリスロマイシンとヒトｐ８タンパク質との結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す図である
【図３】図３は、ｐ８タンパク質とｄｓＤＮＡとの結合のゲル電気泳動移動度シフト分析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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