(57)【要約】【課題】ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の転写調節機構およびＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子に関与する疾患の検出し得る方法を提供する【解決手段】ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の既知のプロモータ領域以外にさらに上流に新規なプロモータＤＮＡを提供する。このプロモータＤＮＡは単独で使用することも下流側のプロモータと供にデュアルプロモータとして使用することもできる。このデュアルプロモータの上流側プロモータからの転写はペルオキシソーム増殖薬活性化受容体活性化因子により発現誘導され得る。さらに、ＣＤ３６欠損症患者のゲノムＤＮＡの解析から上記上流側プロモータ領域内およびＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の第１２エキソンに変異が存在していた。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
さらに配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有する第二のプロモータ領域を連結した、請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを担持したベクター。
【請求項４】
前記請求項１又は２に記載のＤＮＡ下に転写可能に連結された遺伝子の発現がＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体）活性化因子により調節され得る、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３または４に記載のベクターを保持した細胞。
【請求項６】
請求項１又は２のＤＮＡ下に転写可能に連結された遺伝子の発現量をＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体）活性化因子を用いて調節する方法。
【請求項７】
配列番号１に記載の塩基配列と、被験者由来の核酸試料におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子デュアルプロモータの上流側プロモータ配列との比較に基づいて、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患の素因判定を行う方法。
【請求項８】
被験者由来の核酸試料におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のデュアルプロモータの上流側プロモータ領域内における塩基配列に基づいてＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関与疾患の素因判定を行うためのキットであって、対照ＤＮＡとして請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ又は請求項３に記載のベクターを含む、キット。
【請求項９】
被験者由来の核酸試料におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の第１２番エキソンにおける変異に基づいて、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子に関与する疾患の素因判定を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の既知のプロモータの上流に存在する新規なプロモータおよび該新規プロモータ領域内およびヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子第１２番エキソンにおける変異に基づきＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、注目されている生活習慣病に深い関わりを持つものに脂質代謝異常が挙げられる。この脂質代謝酵素遺伝子群の転写調節を行う中心的な核内受容体として、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；  ＰＰＡＲ）が知られている（Ｉｓｓｅｍａｎｎ  Ｉ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２０８：８５６−８５９（１９９０））。
【０００３】
このＰＰＡＲは、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、甲状腺ホルモン、脂溶性ビタミンなどをリガンドとする核内レセプターなどと同じファミリーに属し、これらレセプターと類似の機構により転写因子として機能する。ＰＰＡＲは３つのアイソフォームから構成されている。これらアイソフォームはリガンド依存的に活性化されて、９シスレチノイン酸をリガンドとするレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）とヘテロ二量体を形成する（Ｒａｎｊａｎ  ＭらによるＮａｔｕｒｅ  ３８６：４０７−４１０（１９９７）およびＨ．  ＰｏｉｒｉｅｒらによるＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１２：４８０−４８４（１９９７））。そして、このヘテロ二量体が脂質代謝関連遺伝子の転写調節領域におけるＤＲ−１（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔ  １）配列に結合し転写を調節している。
【０００４】
このようなＰＰＡＲを介する脂質代謝関連遺伝子の転写調節は、ミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸化、細胞質における脂肪酸合成、リポタンパク質の代謝、脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしている。さらに、これら脂質代謝だけでなく、酸化脂質の取り込みと動脈硬化発症（１１）、炎症応答（Ｄｅｖｃｈａｎｄ  ＰＲら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：３９−４３（１９９６）、Ｇｅｌｍａｎ  Ｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５５：  ９３２−９４３（１９９９））、大腸癌がん（Ｐａｓｈａ  Ｓａｒｒａｆら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（９）：１０４６−１０５２（１９９８），Ａｎｎｅ−Ｍａｉｅ  Ｌｅｆｆｂｖｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（９）：  １０５３−１０５７（１９９８））、乳がん（Ｅｎｒｉｑｕｅ  Ｓａｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（９）：  １０５８−１０６１（１９９８），Ｍｕｌｌｅｒ  Ｅら，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  ３：  ４６５−４７０  （１９９８））の発症にもＰＰＡＲが関与するとの報告がある。そのため、今後更に増大するであろうと考えられる糖尿病や動脈硬化などの生活習慣病へのＰＰＡＲの関与が注目されている。
【０００５】
一方、このＰＰＡＲにより転写調節を受け、生活習慣病、特に動脈硬化と関わりがあると考えられている遺伝子に、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子がある。このＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子は、ヒトでは第７番染色体に位置し（Ｋｉｒｋ  Ｔら，  Ｇｅｎｅ  １３３：  ２０５−２１２（１９９３）、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｕｉｚ  Ｅ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １７：７５９−７６１（１９９３））１２のコーディングエキソンから構成されていることが知られている（前掲Ｋｉｒｋ  Ｔ．ら、Ｔａｎｇ  Ｙ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：  ６０１１−６０１５（１９９３）、Ａｎｇｅｌ  Ｌ．ら，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９（２９）：  １８９８５−１８９９１  （１９９４））。
【０００６】
ＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質は、４７２アミノ酸からなる糖タンパク質であり、糖鎖修飾により分子量は血小板で８８Ｋ、乳腺上皮細胞では５８Ｋ、赤血球では７８Ｋである。また、このアミノ酸構造により膜２回貫通型構造をとることが考えられている（Ｎｅｎｇｂｉｎｇ  Ｔａｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：  ２２３１５−２２３２０）。また、ＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質は、細胞接着に関わる分子であり、今までにトロンボスポンジン受容体（Ａｓｃｈ  ＡＳ．ら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７９（４）：  １０５４−１０６１（１９８７））、コラーゲン受容体（Ｔａｎｄｏｎ  ＮＮ．ら，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：  ７５７６−７５８３（１９８９））、マラリア感染赤血球の結合タンパク質（Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ  ＣＦ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３（４８９７）：  １４６９−１４７１  （１９８９））、長鎖脂肪酸の輸送担体（Ａｂｕｍｒａｄ  ＮＡ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：  １７６６５−１７６６８（１９９３））などとして機能することが報告されている。さらに、近年では、ＣＤ３６／ＦＡＴが酸化ＬＤＬの受容体として機能していることも報告され（Ｅｎｄｅｍａｎｎ  Ｇら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：  １１８１１−１１８１６  （１９９３））、動脈硬化の発症・進展に関与すると考えられている。
【０００７】
こうした多機能性タンパク質であるＣＤ３６／ＦＡＴの欠損症としては、血小板の障害である血小板ＣＤ３６欠損症が注目されている。この血小板ＣＤ３６欠損症の罹患率は、日本では約３％（Ｙ  Ｔｏｍｉｙａｍａら，  Ｂｌｏｏｄ  ７５：  ６８４−６８７  （１９９０））、アメリカでは約０．３％である。この血小板ＣＤ３６欠損症は、血小板と単球におけるＣＤ３６／ＦＡＴの発現量により二つのタイプ（タイプＩ、ＩＩ）に分類されている。具体的には、タイプＩでは血小板及び単球の双方におけるＣＤ３６発現が欠損し、タイプＩＩでは血小板のみでＣＤ３６発現が欠損している。
【０００８】
ＣＤ３６／ＦＡＴは心筋において主たるエネルギー源である長鎖脂肪酸の取込みを担い、心筋代謝でも重要である。そのため、一部のＣＤ３６欠損症例では心筋症を合併するケースが観られ、心筋障害の新しい危険因子として作用し得ると考えられている。
【０００９】
こうしたＣＤ３６／ＦＡＴ欠損症患者のゲノムＤＮＡの解析から、ＣＤ３６／ＦＡＴコーディング領域内における変異により、細胞膜表面にＣＤ３６が発現されていないことが報告されている（Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｋａｓｈｉｗａｇｉら，  Ｂｌｏｏｄ  ８３：  ３５４５−３５５２（１９９４）、Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｋａｓｈｉｗａｇｉら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ６９：  ４８１−４８４  （１９９３）、Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｋａｓｈｉｗａｇｉら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：  １０４０−１０４６  （１９９５）、Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｋａｓｈｉｗａｇｉら，  ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  １６：  １０２６−１０３２  （１９９６）、Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｋａｓｈｉｗａｇｉら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７４（２）：  ７５８−７６３  （１９９５））。また、上記血小板ＣＤ３６欠損症タイプＩでは、コーディング領域内の変異をホモで持ち、血小板および単球でのＣＤ３６の発現がゼロであることが報告されている（Ｔａｋａｏ  Ｔａｎａｋａら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２９：  １２１−１２７  （１９９７）、Ｆｕｍｉｏ  Ｏｋａｍｏｔｏら，  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６２：  ４９９−５０４  （１９９８）、Ｋｅｎｉｃｈｉ  Ｗａｔａｎａｂｅら，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２（５）：  ２６１−２６６（１９９８））。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記タイプＩＩの血小板ＣＤ３６欠損症では血小板のみで発現が観られないという表現形を示すが、この表現形は今まで報告されているコーディング領域内の変異によっては説明することはできない。
【００１１】
他方、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子はＰＰＡＲγ活性化薬により発現が誘導されることが報告されている（Ｌａｓｌｏ  Ｎａｇｙら，  Ｃｅｌｌ  ９３：  ２２９−２４０（１９９８）、  Ｐｅｔｅｒ  Ｔｏｎｔｏｎｚら，  Ｃｅｌｌ  ９３：  ２４１−２５２（１９９８））。しかし、その機序、さらにはＰＰＡＲγ活性化薬がＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子に直接または間接に作用する否かも分かっていない。
【００１２】
また、本願発明者らはマウスＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子は２つのプロモータにより転写が制御されるデュアルプロモータ構造をとることを明らかにしている。
【００１３】
そこで、本願発明者は、血小板特異的な転写制御が存在するとの予測の下、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の転写調節機構およびＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子に関与する疾患の原因を解明するために鋭意研究を行った結果、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の新たなプロモータ領域およびその領域内における変異を見出し、本発明に至った。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子には既知のプロモータ領域以外にさらに上流に新規なプロモータ活性を有する領域が存在し、デュアルプロモータ構造を有していることを見出した。このデュアルプロモータの上流側プロモータからの転写がＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体）活性化因子により調節されることを見出した。さらに、ＣＤ３６欠損症患者のゲノムＤＮＡの解析から上記上流側のプロモータ領域内およびＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の第１２エキソンに変異が存在していることを見出した。
【００１５】
すなわち、本発明は、（１）配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有するＤＮＡ、（２）前記（１）のＤＮＡにさらに配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有する第二のプロモータ領域を連結したＤＮＡ、（３）前記（１）または（２）に記載のＤＮＡを担持したベクター、（４）前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ下に転写可能に連結された遺伝子の発現がＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体）活性化因子により調節され得る前記（３）に記載のベクター、（５）前記（３）または（４）に記載のベクターを保持した細胞、（６）前記（１）又は（２）のＤＮＡ下に転写可能に連結された遺伝子の発現量をＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体）活性化因子を用いて調節する方法、（７）配列番号１に記載の塩基配列と、被験者由来の核酸試料におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子デュアルプロモータの上流側プロモータ配列との比較に基づいて、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患の素因判定を行う方法、（８）被験者由来の核酸試料におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のデュアルプロモータの上流側プロモータ領域内における塩基配列に基づいてＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関与疾患の素因判定を行うためのキットであって、対照ＤＮＡとして請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ又は請求項３に記載のベクターを含むキット、（９）被験者由来の核酸試料におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の第１２番エキソンにおける変異に基づいてＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子に関与する疾患の素因判定を行う方法、である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータに関する。より具体的には、ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータは既知のプロモータ（以下、「下流側プロモータ」という）よりも上流にさらに別のプロモータ（以下、「上流側プロモータ」という）が備えられたデュアルプロモータ構造を有する。特に、本発明はこの新たに見出した上流側プロモータに関する。この上流側プロモータは既知の下流側プロモータと同じヒト第７番染色体上の上流１３〜１４ｋｂｐに位置し、下流側プロモータから転写される転写開始点よりも１３〜１４ｋｂｐ上流の別の転写開始点からの転写を制御する。
【００１８】
この上流側プロモータは、下流側プロモータとは別に単独で利用することも、また第二のプロモータとして下流側プロモータと共に利用することもできる。また、上流側プロモータは配列番号１に記載された配列から構成されるが、必ずしもこの全長を用いる必要はなく、プロモータ活性を有する一部配列として用いることもできる。また、下流側プロモータと共に用いる場合、下流側プロモータは配列番号２に記載された配列から構成され、この全長を用いても、またこのうちプロモータ活性を有する一部配列を用いてもよい。なお、プロモータとして機能する最小配列の決定は、先ず、上記配列番号１、２のＤＮＡを段階的に欠失させたデリーションシリーズを作成し、その下流にリポータ遺伝子などを接続し、該リポータ遺伝子の発現量に基づいて、プロモータ活性を有する範囲を同定することにより実施することができる。
【００１９】
上流側プロモータは、ヒトゲノミックライブラリー、例えばヒトＢＡＣライブラリーより配列番号１に記載の塩基配列又はその一部を用いて、スクリーニングより得ることができる。また、配列番号８および９に記載のプライマー（ｈＣＤｐ−Ｌ１、ｈＣＤｅ１−Ｒ）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡよりＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により調製することもできる。また、上流側プロモータに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータは、配列番号１および２に記載の塩基配列又はそれらの一部配列を用いて、ヒトゲノミックライブラリー等またはその他生物由来のゲノミックライブラリーより類似のプロモータをスクリーニングすることもできる。
【００２０】
また、当業者であれば、プロモータ活性を保持あるいは向上させ得るように、配列番号１又は２に記載の配列の一部を置換、欠失させることも、または、他の配列を付加することも可能である。
【００２１】
上流側プロモータ又はさらに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータは、例えば、その生体内における変異に由来するＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質の欠損あるいは発現異常症、例えば血小板ＣＤ３６欠損症、脂質代謝異常症などの治療や予防に利用することが可能である。すなわち、このプロモータを有するＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子を適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）に挿入し、または生理学的もしくは物理的な方法（リポフェクチン法、エレクトロポーレーション法など）で生体内に導入し、正常な制御下でＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子を発現させ、これによりＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の欠損あるいは発現異常などの改善を図ることができる。
【００２２】
また、上流側プロモータ又はさらに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータをベクターに組み込んで、発現ベクターとして使用することもできる。特に、上流側プロモータはＰＰＡＲ活性化薬に応答して該プロモータの下流に連結された遺伝子の発現が誘導されるため、本プロモータを備えた発現ベクターは、誘導的な発現を実行させたい場合に好適に使用し得る。例えば、前記上流側プロモータの下流に殺細胞遺伝子を連結させた発現ベクターを死滅させたい癌などの病巣組織に導入し、ＰＰＡＲ活性化薬により発現を誘導することにより、病巣組織を破壊するなどの応用に用いることもできる。
【００２３】
また、ＰＰＡＲ活性化薬存在下の場合に発現が見られる細胞、例えば、ヒト単球／マクロファージ由来のＴＨＰ−１細胞株を用いることにより、種々の遺伝子の細胞内における機能解析に利用することもできる。すなわち、上流側プロモータに機能を調べたい遺伝子を連結させ、この遺伝子をＴＨＰ−１などの細胞株に導入し、ＰＰＡＲ活性化薬存在下、非存在下での発現を調節し、それぞれの作用を解析することにより当該遺伝子の機能を解析することもできる。
【００２４】
上流側プロモータからの誘導的な発現を実行させるためのＰＰＡＲ活性化薬は、α、γ活性化薬のいずれを用いてもよいが、緩やかに発現を誘導させる場合にはα活性化薬を用いることが好ましく、強く発現を誘導させる場合にはγ活性化薬を用いることが好ましい。また、ＰＰＡＲα活性化薬は、例えば、Ｂｎｅｚａｆｉｂｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）やＷｙ１４６４３  （４−ｃｈｌｏｒｏ−６−（２，３−ｘｙｌｉｄｉｎｏ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ−ｔｈｉｏ）  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、  東京化成）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、ＰＰＡＲγ活性化薬は、例えば、ＰｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅやＴｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
また上記発現ベクターは、ＰＰＡＲ活性化薬以外のＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子にプロモータからの発現を制御し得る物質のスクリーニングに用いることもできる。また、上流側プロモータと下流側プロモータとは、細胞や発生段階で利用され方が異なるため、上記発現ベクターは種々の細胞あるいは発生段階における上流側プロモータまたは下流側プロモータの機能を解析する手段としても用いることができる。このような目的で発現ベクターを用いる場合には、上記プロモータの下流に、例えば、ルシフェラーゼなどのレポータ遺伝子などを接続することが好ましい。
【００２６】
また、本発明の他の態様は、前記ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ配列に基づき、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患の素因判定を行う方法に関する。具体的には、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域の塩基配列（例えば配列番号１または／および配列番号２に記載の配列）と被験者由来ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域の塩基配列とを比較し、被験者由来のプロモータ領域に変異を有する場合に、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患の素因を有すると判定される。
【００２７】
この変異としては、単一の塩基配列の多型（ＳＮＰ）であっても、ある程度の塩基長の欠失、置換、付加などであってもよい。ＳＮＰの一例としては、上流側（エキソン１ａ）の転写開始点から−５９３位の「Ａ」のホモ又はヘテロ変異が挙げられる。また、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患としては、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の発現異常により生じる疾患、例えば、血小板ＣＤ３６欠損症や、ＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質が関与する脂質代謝異常症などが挙げられる。また変異の検出の手法は、塩基配列を直接決定することにより変異を検出することもでき、また、制限酵素断片の多型（ＲＦＬＰ）に基づき変異を検出することもできる。
【００２８】
上記ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患の素因判定を簡便に行うために、キット化することもできる。この場合には対照ＤＮＡとして、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータＤＮＡ（例えば、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡや配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）またはプロモータＤＮＡを保持するベクターをキットに含めることができる。
【００２９】
さらに、本発明の他の態様は、被験者由来の核酸試料におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の第１２番エキソンにおける変異に基づいてＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子に関与する疾患の素因判定を行う方法に関する。この第１２エキソンの変異としては、ＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質の機能異常を導く変異、例えば、第１２エキソン配列内のヌクレオチドの欠失、置換、付加など、さらには、第１２エキソンと隣接するイントロン内のスプライシングのシグナル配列に変異による第１２エキソンの欠落などが挙げられる。この第１２エキソンの変異は被験者のｍＲＮＡを対象として検出してもよく、また、ゲノムＤＮＡを対象として検出してもよい。例えば、ｍＲＮＡ上の第１２エキソンは第１２エキソンよりも上流のエキソン内に位置するプライマー（例えば、配列番号１２（ＣＭＰ９プライマー））と第１２エキソンよりも下流のエキソン内に位置するプライマー（例えば、配列番号：１３（ＭＰ１２プライマー））とを用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅することができる。また、ゲノムＤＮＡ上の第１２エキソンは、上流のゲノムＤＮＡ上に位置にするプライマー（例えば、エキソン１１内に位置するプライマー（例えば、配列番号：１４（ＣＤ３６−１１Ｕ）など）と、第１２エキソンよりも下流に位置するプライマー（例えば配列番号：１５（ＣＤ３６−１３Ｌ）など）を用いてＰＣＲにより増幅することができる。これら増幅されたＤＮＡの長さ又はその詳細な塩基配列を解析し、変異が検出されることにより被験者がＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患の素因を判定することができる。
【００３０】
以下に上記プロモータ領域の変異およびエキソン１２内の変異の検出に関してさらに詳細に説明する。
【００３１】
本発明の上記判定方法において、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域やエキソン１２に生じた変異の検出は、例えば、被検者のＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモーター領域やエキソン１２の塩基配列を直接決定することによって行うことができる。
【００３２】
この方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。次いで、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、上述したようにＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことも可能である。最終的に、単離したＤＮＡの塩基配列を決定し、対照と比較する。この単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。また「対照」は、配列番号１および２に記載の配列もしくは正常な（野生型）ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域または正常なエキソン１２を含むＤＮＡの配列を言う。一般に健常人のＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２を含むＤＮＡの配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２を含むＤＮＡの配列と比較することを意味するが、ＧｅｎＢａｎｋ等に野生型として登録されているＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のエキソン１２を含むＤＮＡの配列や配列番号１または配列番号２における転写開始点上流配列と比較してもよい。このような比較の結果、被検者のＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２を含むＤＮＡの配列が対照と異なっていた場合には、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子に関与する疾患の遺伝的素因を有すると判定することができる。
【００３３】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００３４】
例えば、本発明における多型の検出は、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等によっても行うことができる。この場合には、被検者からＤＮＡ試料を調製し、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて電気泳動などにより分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。なお、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では調べたいＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２含むＤＮＡを増幅し、この増幅したＤＮＡを制限酵素による切断および電気泳動に供する。このような方法では、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンド移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２のＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。
【００３５】
さらに別の方法としてＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９９１  Ａｕｇ  １；  ６（８）：  １３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．  、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  １９９５  Ａｐｒ  １；  ４（５）：  ２７５−２８２．）を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したＤＮＡ試料から、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２を含むＤＮＡを増幅する。ここで増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させた後、非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。この原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。この方法は、操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。
【００３６】
さらに別の方法として変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  ＤＧＧＥ法）等を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したＤＮＡ試料から、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２を含むＤＮＡを増幅する。増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離し、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００３７】
このようなＤＧＧＥ法は、変性剤存在下でのＤＮＡ断片の不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法であるため、ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために部分的に１本鎖へと解離される。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
【００３８】
さらに別の方法として、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５）を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２を含むＤＮＡ、および該ＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を作成し、該ＤＮＡと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたＤＮＡを検出することにより、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域またはエキソン１２の配列の変異を検出する。
【００３９】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。
【００４０】
また、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のエキソン１２の変異はリボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法によって検出することも可能である。具体的には、被験試料であるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のエキソン１２を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだ野生型ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のエキソン１２ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。被験試料に変異が存在する場合には、その変異部分においてハイブリッドが一本鎖構造となるため、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断して、これをオートラジオグラフィー等で検出する。
【００４１】
また、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域内における変異の検出方法としては、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の発現量を指標とすることによって検査を行う方法である。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳が含まれる。従って、「発現産物」には、ｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。例えば、ｍＲＮＡの発現量の測定は、直接被検者から該ＲＮＡ試料を調製し、その量をノーザンブロッティング法で対照と比較することの他に、当業者において公知のその他の方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの量に基づきｍＲＮＡを測定する方法や、ＤＮＡアレイ法（新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅、羊土社、ｐ２８０−２８４）によるハイブリダイズの強度に基づいて測定する等によって実施することもできる。
【００４２】
また、ＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質の発現量の測定は、被験者からタンパク質試料を調製し、該タンパク質試料に含まれるＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質の量をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びにＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質に結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または免疫蛍光法などにより測定することもできる。
【００４３】
上記の方法において、対照と比較して、ＣＤ３６／ＦＡＴ  遺伝子の発現量、またはＣＤ３６／ＦＡＴタンパク質の発現量が有意に減少していた場合には、ＣＤ３６／ＦＡＴに関連した疾患の遺伝的素因として、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のプロモータ領域内における変異を有すると判定することができる。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００４５】
［実施例１］  ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ活性化薬によるヒト細胞株におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の発現誘導
ヒトＣＤ３６／ＦＡＴがＰＰＡＲγ活性化薬による発現誘導がみられるという報告がすでにあるが（前掲Ｔｏｎｏｔｏｎｚら）、その作用機序はわかっていない。そこで、本実施例１ではヒト由来単球／マクロファージ細胞株であるＨＬ６０とＴＨＰ−１を用いて、ＰＰＡＲ活性化薬によるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の発現誘導実験を行った。
【００４６】
ＴＨＰ−１、ＨＬ６０をＰＰＡＲα活性化薬（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ、２００μＭ）、ＰＰＡＲγ活性化薬（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ、１μＭ）で２４時間又は４８時間処理した後、トータルＲＮＡをＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｏｋｉ  Ｓａｃｃｈｉ  （１９８７）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｈｅｍ．  １６２：  １５６−１５９）により調製した。ＣＤ３６／ＦＡＴｍＲＮＡ量の変化をＣＤ３６／ＦＡＴコーディング領域のｃＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションにより定量した（図１）。
【００４７】
図１に示すようにＴＨＰ−１ではＰＰＡＲγ活性化薬だけでなくα活性化薬にも応答して発現誘導がみられた。一方、ＨＬ６０ではＰＰＡＲα、γ両活性化薬による刺激の有無にかかわらず発現は全く見られなかった。
【００４８】
ＴＨＰ−１およびＨＬ６０は共にヒト由来単球／マクロファージであるが、ＰＰＡＲ活性化薬への応答は異なっていた。このような応答の違いは、おそらく細胞の分化状態の違いによることが考えられる。
【００４９】
［実施例２］  ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の転写開始領域の解析
ヒトＣＤ３６／ＦＡＴの発現が、ＰＰＡＲα、γ両活性化薬により誘導する機構を解析するために、ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の転写調節領域を解析した。
【００５０】
具体的には、変法５’ＲＡＣＥ法（Ｍｏｔｏｊｉｍａ，  Ｐａｓｓｉｌｌｙら（１９９８）  ＪＢＣ  ２７３：  １６７１０−１６７１４）によりヒトＣＤ３６／ＦＡＴｍＲＮＡの５’末端の構造を調べた。ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞のｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡの３’末端にオリゴｄＣテールを伸長付加し、図２（Ｂ）に模式的に示す各プライマー（１、２、３）とオリゴｄＧプライマーとを用いてＰＣＲを行った。
【００５１】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分画し、そのサイズを確認した（図２（Ａ））。平滑末端化しｐＵＣ１８ベクターのＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングした。
【００５２】
クローニングされた２０個のｃＤＮＡの塩基配列決定を行った結果、従来の報告とは異なる５’非翻訳領域をもつＣＤ３６／ＦＡＴｃＤＮＡが１クローン同定された（図２（Ａ）において矢印で示す）。このことより、従来報告されている転写開始点とは別にさらに上流の転写開始点が存在することが示唆された。
【００５３】
［実施例３］  ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子プロモータ領域のクローニング
ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子における既知の下流側プロモータ領域については転写開始点から上流２８９ｂｐまで報告されている（Ａｎｇｌｅ  Ｌら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９（２９）：  １８９８５−１８９９１（１９９４））。この既に報告されている領域よりも上流の配列を決定するために、上記において新たに同定されたエキソン配列からプライマーを設計し、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、上流領域のクローニングを行った。ここで得られた約５００ｂｐクローニング断片の塩基配列を解析し、上流側プロモータの一部を含む領域、エキソン１ａの５７塩基と転写開始点から上流４２９塩基までを決定した。
【００５４】
さらに上流の配列を得るために、上記においてクローニングされた約５００ｂｐ断片を基にプローブを調整し、ヒト染色体ＢＡＣライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）のスクリーニングを行った。このスクリーニングにおいてハイブリダイズしたＢＡＣクローンを入手し、これら各クローンＤＮＡを種々の制限酵素を用いて消化した後、上記と同様の５００ｂｐ断片をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行った。このサザン解析において、適切な長さをもつ上流側および下流側プロモータ領域を含む断片をそれぞれ同定し（図３にＡ，Ｂとして示す）、同定された断片をプラスミドベクターにサブクローニングした。
【００５５】
［実施例４］  ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子プロモータ領域の塩基配列
上流側プロモータ
実施例３におけるＢＡＣクローンからプロモータ領域を含む断片を得、ＧＰＳＴＭ−１  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢｉｏＬａｂｓ）を用いてトランスポゾンの挿入を利用した方法により更に上流の塩基配列を決定した。これらにより約２ｋｂｐのプロモータ領域の配列とエキソン１ａから下流約２．５ｋｂｐ（図３中「Ａ」として示す領域の配列）の塩基配列が得られた。なお、塩基配列の決定は、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍＥｘｃｅｌ  ＩＩ  Ｌｏｎｇ−ＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｉｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＡＬＦＴＭ  （ＥＰＩＤＣＥＮＴＲＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用い、添付のプロトコールに従って行った。配列番号１には上流側プロモータ領域における転写開始点から上流２ｋｂｐとエキソン１ａの一部配列を示す。また、ＴＦＳＥＡＲＣＨを用いて主要な転写因子が結合することが予測される配列について解析し、その結果を配列番号１の配列の特徴として示す。
【００５６】
得られた配列から予想されるシス因子には、典型的なＰＰＡＲ応答配列（ＰＰＲＥ）は存在していなかった。一方、脂質代謝に関与するＰＰＡＲγと相互作用し転写を調節すると言われているＣ／ＥＢＰα、βが結合する配列が存在していた。また、この上流プロモータ領域には転写開始点から−１２０ｂｐ付近まではマウスのプロモータ領域と高い相同性（７９％）を持っていた。この領域は転写制御に生物種を越えて重要であることが考えられる。
【００５７】
下流プロモータ
ＢＡＣクローンからプロモータ領域を含む断片を得て、上記と同様にトランスポゾンの挿入により更に上流まで塩基配列を決定し、約４ｋｂｐのプロモータ領域の配列とエキソン１ｂから下流に約１．２ｋｂｐの配列を得た（図３中、「Ｂ」として示す領域の配列）。プロモータ領域の配列およびエキソン１ｂから下流の一部配列を配列番号２に示す。また、ＴＦＳＥＡＲＣＨを用いて主要な転写因子が結合することが予測される配列を配列番号２の配列の特徴として示す。
【００５８】
得られた配列から予測されるシス因子には、−２６００塩基にＰＰＲＥ様の配列であるＣＯＵＰ−Ｔが存在していた。また、転写開始点から−３０ｂｐ付近にＴＡＴＡボックスが存在し、−２７０ｂｐ付近にＤＲ−１配列が存在していた。また、マウスＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の下流プロモータと相同性は上流プロモータにおける相同性よりも、より広範囲に存在していた。
【００５９】
両プロモータ間の距離
それぞれのプロモータをサブクローニングすることはできたが、そのプロモータが一つの染色体上に存在していることを示すために、両プロモータ領域を含む単一のＢＡＣクローンを得ることを試みた。
【００６０】
上流側プロモータが含まれるＢＡＣ  ＤＮＡ断片Ａ中のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと、下流側プロモータが含まれるＢＡＣ  ＤＮＡ断片Ｂ中のＸｂａＩ−ＮｃｏＩフラグメントとをプローブとして用い、サザンブロットにより両プローブに反応するＢＡＣクローンをスクリーニングした。
【００６１】
ここで得られたＢＡＣクローンの制限酵素地図を解析し、図３に示す制限酵素地図と比較した。その結果、新たに発見された上流側の転写開始点は、既知の下流側に位置する転写開始点より上流１３ｋｂに位置していた。
【００６２】
この転写開始点間の距離をさらに確認するために、プライマー（ｈＣＤｍｔ−Ｌ（配列番号３）、ｈＣＤｐ−ｖＲ１（配列番号４））を用いてＰＣＲを行った（図４）。ｈＣＤｍｔ−Ｌプライマーは上流側の転写開始点から転写されるエキソン１ａの５’端側に位置し、ｈＣＤｐ−ｖＲ１プライマーは下流側の転写開始点から転写されるエキソン１ｂの３’端側に位置する。
【００６３】
エキソン１ａ、１ｂをそれぞれ含むプローブで、得られたＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションを行った。その結果、両プローブに反応する１３ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。この結果は、上記制限酵素を用いて距離の算定結果と一致することから、転写開始点間の距離は１３ｋｂｐであることが確認された。以上より、新たに発見された転写開始点は、既知の転写開始点と同一の染色体上の上流１３ｋｂｐに位置していた。
【００６４】
ＣＤ３６／ＦＡＴの染色体位置
上記において新たに発見された転写開始点は、既知の転写開始点と同一の染色体上の上流１３ｋｂｐに位置していることが確認されたが、さらにＤＮＡデータベースを用いて確認を行った。
【００６５】
ＤＮＡデータベースとしてＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔを用いて、上記（１）、（２）で塩基配列が決定された上流側の４．５ｋｂｐと下流側の５．３ｋｂｐの塩基配列を、公表されているヒト染色体配列と比較した。これら決定された配列は７番染色体の塩基配列と高いホモロジーを示し、これら転写開始点間の距離もデータベース上では１４ｋｂｐと、算定された距離（１３ｋｂｐ）とほぼ一致していた。従って、ＣＤ３６／ＦＡＴの両転写開始点が包含されているＢＡＣ  ＤＮＡは７番染色体由来であると考えられた。
【００６６】
［実施例５］  上流エキソンの発現
ヒト肝癌由来細胞株であるＨｅｐＧ２、ヒト由来単球／ヒトマクロファージであるＴＨＰ−１を用いてＲＴ‐ＰＣＲ法により両プロモータからの発現とＰＰＡＲ活性化薬への応答を解析した。
【００６７】
具体的には、ＰＰＡＲα活性化薬（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ、２００μＭ）又はＰＰＡＲγ活性化薬（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ、１μＭ）の存在下または非存在下で４８時間培養し、その後、これら各細胞株からｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出は上述したＡＧＰＣ法に従った。
【００６８】
抽出したｍＲＮＡを図５および図６（Ａ）に示すプライマー（ｅ２：ｈＣＤ３００−Ｒ（配列番号５）と、ｖ：ｈＣＤｖｇ−Ｌ（配列番号６）またはｍ：ｈＣＤｍｔ−Ｌ（配列番号７））を用いて、ＲＴ‐ＰＣＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ３ｒｄ  ｅｄ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ２００１）を行った。ＰＣＲ産物を電気泳動により分画した（図６）。
【００６９】
プライマーｍとプライマー２または３の組合わせによるＰＣＲ産物はＨｅｐＧｓ細胞（図６（Ｂ））およびＴＨＰ−１細胞（図６（Ｄ））で検出された。すなわちＨｅｐＧｓ細胞、ＴＨＰ−１細胞において、新たに見出した１ａエキソンは発現されていることが確認された。
【００７０】
また、ＨｅｐＧ２細胞では新たに見出した上流側プロモータのみから転写が行われることが確認された。しかし、ＰＰＡＲ活性化薬の添加の有無に拘わらず発現に変化は見られず、ＰＰＡＲ活性化薬への応答は見られなかった。
【００７１】
ＴＨＰ−１細胞では下流側のプロモータでは、ＰＰＡＲ活性化薬の有無を問わず同様の強い転写活性が確認された。一方、新たに見出した上流側プロモータでは、ＰＰＡＲ活性化薬非存在下では転写活性は見られないが、ＰＰＡＲ活性化薬により発現が誘導された。特に、ＰＰＡＲγ活性化薬により強い発現誘導が確認された。
【００７２】
［実施例６］  細胞株への遺伝子導入法を用いたヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子プロモータ領域の機能解析
上記でクローニングされたプロモータ領域に染色体内の遺伝子の応答と同じ機能があるか否かを、レポーターアッセイによって解析を行った。
【００７３】
ＴＨＰ−１、ＨｅｐＧ２を用い、遺伝子導入を行った。導入した遺伝子は、それぞれ転写開始点を含むそれぞれプロモータ領域（１．５ｋｂｐ）をＰＣＲにより増幅した。ここで用いたＰＣＲプライマーの位置を図９に示す。エキソン１ａの転写開始点を含むプロモータ領域をｈＣＤｐ−Ｌ１（配列番号８）及びｈＣＤｅ１−Ｒ（配列番号９）プライマーにより、また、エキソン１ａの転写開始点を含むプロモータ領域をｈＣＤｐ−ｖＬ１（配列番号１０）及びｈＣＤｐ−ｖＲ１（配列番号１１）により増幅した。また、これらプライマーは、一方（ｈＣＤｐ−Ｌ１またはｈＣＤｐ−ｖＬ１）にＳａｃＩ認識配列を、他方（ｈＣＤｅ１−ＲまたはｈＣＤｐ−ｖＲ１）にＮｈｅＩ認識配列を含むように設計された。
【００７４】
ここで得られたＰＣＲ産物をＳａｃＩ及びＮｈｅＩで消化し、ホタルルシフェラーゼを含むｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（ＰｒｏＭｅｇａ）のマルチクローニングサイトに挿入した（図８）。
【００７５】
ここで調製されたベクターをＨｅｐＧ２にＳｕｐｅｒＦａｃｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いリポフェクチン法により導入した。一方、遺伝子導入の困難なＴＨＰ−１（７〜８×１０６細胞／ｍｌ、５００μｌ）はエレクトロポーション法（ＥＬＥＣＴＲＯ  ＳＱＵＡＲＥ  ＰＯＲＥＴＯＲ（ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、４８０Ｖ、９０μｓｅｃ、パルス回数３回）を用いて各ベクターを導入した。また、同様に陰性対照としてプロモータ領域を含まないｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒベクターを導入した細胞株を準備した。
【００７６】
またルシフェラーゼアッセイはＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて行った。このシステムでは調べたい転写調節領域を組込んだホタルルシフェラーゼをレポータとするベクターの他に、ウミシイタケルシフェラーゼをレポータとするベクターを上記ベクター導入の際に供にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を測定する際には、このコントロールベクターから得られた値を内部標準値として、調べたい転写調節領域を組込んだレポータの発現値を補正した。
【００７７】
その結果、ＴＨＰ−１にプロモータ領域を含まない陰性対照ベクターを導入した場合に比べ、両プロモータ（上流側、下流側）供にルシフェラーゼ活性値が約２倍高い値が示された（図示せず）。構築したルシフェラーゼ発現ベクターにはプロモータ活性があることが確認された。
【００７８】
次に、ＰＰＡＲ活性化薬（α活性化薬（Ｗｙ１４６４３）、γ活性化薬（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））で４８時間処理した細胞株と、処理を行わなかった細胞株との比較を行った（図９、１０）。
【００７９】
ＴＨＰ−１細胞株において、上流側のプロモータ（Ｐｍ）約１．５ｋｂｐでは、薬物処理なしにおけるルシフェラーゼ活性値を基準として、ＰＰＡＲα活性化薬（Ｗｙ）処理細胞株で１．６４倍ルシフェラーゼ活性が上昇していた。また、ＰＰＡＲγ活性化薬（Ｔｒｏ）処理細胞株で４．７６倍と著しい活性の上昇が確認された（図９）。
【００８０】
一方、下流側プロモータ（Ｐｖ）では、ＰＰＡＲ両活性化薬処理細胞株と、非処理の細胞株との間でルシフェラーゼ活性の値に有意な差は見なかった（図１０）。
【００８１】
また、ＨｅｐＧ２細胞株においては、上流側プロモータ（Ｐｍ）でも、ＰＰＡＲ活性化薬処理の有無にかかわらずルシフェラーゼ活性に差は見られなかった（図９）。
【００８２】
これらの結果は、実施例５に示したｉｎ  ｖｉｖｏの発現結果を反映していた。すなわち、ＨｅｐＧ２細胞では上流側プロモータのみから転写が行われるが、ＰＰＡＲ活性化薬への応答は見られなかったことや、ＴＨＰ−１細胞では下流側プロモータでは、ＰＰＡＲ活性化薬への応答はみられず、一方、上流側プロモータでは、ＰＰＡＲ活性化薬、特に、ＰＰＡＲγ活性化薬により強い発現誘導が見られたことを反映していた。
【００８３】
［実施例７］  ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の多型解析
本願によりヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子がデュアルプロモータ構造をとることが明らかとなったが、このプロモータ構造とＣＤ３６／ＦＡＴ欠損症との関係を解析した。
【００８４】
今までのＣＤ３６／ＦＡＴ欠損症患者における遺伝子解析から報告されている変異部位はすべてコーディング領域内である。そこで、本実施例では、新たに見出したプロモータ領域内の遺伝子解析を行った。
【００８５】
この解析は、ＣＤ３６／ＦＡＴ欠損症タイプＩ（血小板および単球の双方でＣＤ３６／ＦＡＴの発現が見られない）患者由来が３サンプル、タイプＩＩ（血小板のみでＣＤ３６／ＦＡＴの発現が見られない）患者由来が９サンプル、健常人由来が３サンプルで総計１５サンプルを用いて実施した。
【００８６】
遺伝子解析の結果、デュアルプロモータの上流側プロモータ約１ｋｂｐの間に５個のＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出した（図１１）。ここで検出されたＳＮＰのうち、−５９３領域のＳＮＰは健常人では見られないが、欠損症タイプＩ、ＩＩではタイプＩＩの１サンプル（＃８）を除き全てＧがホモ又はヘテロで存在していた。
【００８７】
また、−１４領域のＳＮＰは、健常人、欠損症タイプＩではみられず、タイプＩＩの一人を除き、全てがホモで存在していた。
【００８８】
［実施例８］  ＣＤ３６／ＦＡＴコーディング領域内での新たなＳＮＰ
ＣＤ３６／ＦＡＴコーディング領域内のＳＮＰの解析も行った。ＣＤ３６／ＦＡＴｍＲＮＡ対象としてＣＭＰ９プライマー（配列番号１２）とＣＭＰ１２プライマー（配列番号１３）とを用い、ＲＴ−ＰＣＲ  により１１７５から１７１５の領域を増幅した。
【００８９】
これら両プライマーによるＰＣＲ産物を解析した結果、ＣＤ３６／ＦＡＴ欠損症患者のサンプルにおいて、エキソン１２が欠落している変異を検出した。
【００９０】
さらに、このサンプルのゲノムＤＮＡを解析した。すなわち、エキソン１１内の配列と相補するＣＤ３６−１１Ｕプライマー（配列番号１４）とエキソン１３内の配列と相補するＣＤ３６−１３Ｌプライマー（配列番号１５）を用いて、エキソン１２を含む領域を増幅し、その塩基配列を決定した。
【００９１】
ゲノムＤＮＡ配列の解析結果、イントロン１１とエキソン１２との境界領域に７塩基（ＴＴＴＡＧ／ＡＴ：「／」はイントロンとエキソンの境界線を示す）の欠損が検出された（図１２）。この欠損配列内には、スプライシングのアクセプター配列が含まれていた。その結果、イントロン１１の適切なスプライシングが行われず、エキソン１２の欠落がもたらされたことが説明できる。
【００９２】
【配列表】
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【００９３】
【発明の効果】
本発明により、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子における既知のプロモータとは別に上流に新たなプロモータが存在し、デュアルプロモータ構造をとっていること、また、この新たな上流プロモータはＰＰＡＲ活性化薬により発現誘導が可能であることを明らかにした。さらに、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子に関与する疾患の患者において、有意に高い割合で、この新たなプロモータ領域内に変異が検出された。さらに、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子のエキソン１２においても、エキソン１２が欠損する変異を検出した。従って、これらプロモータ領域内における変異や、エキソン１２内における変異を検出することにより、ＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子関連疾患の遺伝的素因を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＰＡＲα、γ活性化薬によるヒト細胞株ＨＬ６０、ＴＨＰ−１におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の発現誘導結果を示す電気泳動図である。
【図２】５’−ＲＡＣＥ法によるヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の５’非翻訳領域の解析に用いたプライマーの位置および得られたｃＤＮＡの電気泳動結果を示す図である。
【図３】ヒトＣＤ／ＦＡＴ遺伝子のデュアルプロモータ構造を示す図である。
【図４】実施例４における転写開始点間の距離を解析するために用いたプライマー位置を示す図である。
【図５】実施例５におけるＲＴ−ＰＣＲで用いたプライマーの位置を示す図である。
【図６】ヒト細胞株ＨｅｐＧ２、ＴＨＰ−１における上流側プロモータからのエキソン１ａの発現をＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した結果を示す電気泳動図である。
【図７】実施例６におけるレポータ解析に使用するためのプロモータ領域をＰＣＲにより調製するためのプライマー配列とそのＰＣＲ産物を模式的に示す図である。
【図８】実施例６におけるレポータ解析に使用するベクターの構成を示す図である。
【図９】ＴＨＰ−１およびＨｅｐＧ２細胞株におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の上流側プロモータにおけるＰＰＡＲ活性化薬への応答をルシフェラーゼレポータ解析により解析した結果を示すグラフである。
【図１０】ＴＨＰ−１細胞株におけるＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の上流側プロモータにおけるＰＰＡＲ活性化薬への応答をレポータ解析により解析した結果を示すグラフである。
【図１１】ヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の上流側プロモータ領域内の多型解析を行った結果を示す図である。
【図１２】ＣＤ３６／ＦＡＴ欠損症患者で検出されたヒトＣＤ３６／ＦＡＴ遺伝子の第１１イントロン−第１２エキソンの変異を模式的に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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