(57)【要約】      （修正有）【課題】マルチパラメーター自動血液用機器で血液サンプルにおける複数のパラメーターを測定するために使用される血液学的コントロール組成物およびシステムを提供する。【解決手段】（ａ）自動試験機器及び（ｂ）試験機器で使用するためのコントロールを含み、該コントロールが、１．白血球のサブポピュレーションから得られた適所に位置する５か所のスキャッタグラムを補償するための剤を含む等張懸濁媒体、２．網状赤血球成分、白血球成分、赤血球成分、有核赤血球成分、血小板成分、網状血小板成分及びそれらの混合物からなる群から選択される成分、及び３．網状赤血球成分からなる血液成分測定用システムからなる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）自動試験機器及び
（ｂ）試験機器で使用するためのコントロールを含み、
該コントロールが、
１．白血球のサブポピュレーションから得られた適所に位置する５か所のスキャッタグラムを補償するための剤を含む等張懸濁媒体
２．網状赤血球成分、白血球成分、赤血球成分、有核赤血球成分、血小板成分、網状血小板成分及びそれらの混合物からなる群から選択される成分、及び
３．網状赤血球成分からなる血液成分測定用システム。
【請求項２】
さらに、システムを用いた試験結果を視覚的に表示する装置を含む請求項１のシステム。
【請求項３】
さらに、バーコードスキャナーを含む請求項１のシステム。
【請求項４】
機器がコールター原理を用いて細胞を検出する請求項１のシステム。
【請求項５】
機器がＳＴＫＳ機器である請求項１のシステム。
【請求項６】
機器がGen-S機器である請求項１のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ここに明確に引用として組み込まれ、1999年8月20日に提出された継続中の米国特許出願第09/378,608号の共通の出願人による一部継続である。これによって出願人は、全ての目的のため及び35U.S.C.§120によって許容される範囲でこのような出願及び2000年2月26日に提出された米国特許出願第09/504,816号の提出日の利益を請求する。
【０００２】
この発明は、概して、血液学的コントロール組成物及びシステムに関し、特にマルチパラメーター自動血液用機器で血液サンプルにおける複数のパラメーターを測定するために使用される血液学的コントロール組成物及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
例えば、赤血球及び白血球数ならびに血小板数を測定する種々の自動機器のための血液学的コントロールが当該分野で知られており、以下の米国特許第3,558,522号、3,873,467号、4,179,398号、4,219,440号、4,299,726号、4,324,687号、4,358,394号及び4,436,821号（ここに参考文献として組み込まれる）に記載されている。現在、血液分析は、血液の種々の成分を分析するために、１以上のいくつかの異なる機器、その次に異なる血液サンプル及び血液サンプル標本の使用が必要である。しかし、いくつかの血液用機器は、現在、試験される各パラメーターに対して別々のサンプル標本を必要とすることなく、血液の種々のパラメーターを測定する性能を有する。そのような機器は、Beckman Coulter STKS又はGen-S System、Abbott Cell-Dyn 4000 Hematology System、Bayer ADVIA 120及びSysmex XE2100 Systemを含む。これらの改良された自動機器は、１以上の１）網状赤血球、２）赤血球、３）有核赤血球、４）血小板、５）網状血小板、６）リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球を含む白血球、７）全表現型の白血球を測定することができる。従って、これらの機器と共にコントロールとして使用されるであろう血液学的コントロール組成物を提供することが望ましいであろう。
【０００４】
好ましい実施形態において、マルチパラメーター自動血液用機器とともに使用するための血液学的コントロール組成物は、全血のような測定可能な性質を有する微粒子の懸濁液を含む。コントロール組成物は、１以上の血液細胞（即ち、全血中で見られるような成分を擬似するために取り扱われ又は処理された細胞）又はそれらの類似体（総称して血液細胞成分と呼ばれる）を含み、それらは、最終的な懸濁の前に、固定化、安定化又は他の処理による調製をされてもよいし、されなくてもよい。異なる実施形態において、血液細胞成分は、ヒト、動物又は他の全血の大きさ、形状又は他の測定可能な性質を示すソースから誘導されるかもしれない。例として、ここに参考文献として組み込まれる米国特許第4,198,206号、4,436,821号、5,008,021号、5,262,327号、5,270,208号、5,432,089号、5,460,797号、5,627,474号、5,677,145号、5,731,205号、5,811,099号及び5,981,282号は、それぞれ、血液細胞成分のこれらの型の例を含む。コントロールは、マルチパラメーター自動血液用機器で測定される場合、全血中の対応成分に類似する１以上の血液成分を有する。そのように測定された場合、コントロール組成物は、マルチパラメーター自動血液用機器のために良質で確実なデータの較正、演算、累積を補助する。
【０００５】
また、ここに参考文献として組み込まれる米国特許第5,888,790号及び"Improved Isolation of Normal Human Reticulocytes via Exploitation of Chloride-Dependent Potassium Transport"、Sorette ら、Blood、Vol.80、No.1（６月１日）、1992：249〜254頁は興味を秘めているかもしれない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
マルチパラメーター血液測定用の血液学的コントロール及びシステムが提供される。血液学的コントロールは、マルチパラメーター血液用機器が測定可能である種々の血液の構成成分についての値を与える。血液学的コントロールは、全血の構成成分である網状赤血球、白血球、赤血球、有核赤血球、血小板又は網状血小板を擬似するための成分を含む。
本発明の血液学的コントロール組成物の製造及び使用方法もここに提供される。
また、本発明のシステムは、血液用機器、コントロールを含み、さらに、出力又は読出し装置を含んでいてもよい。一実施形態では、システムは、他の周辺装置、例えばバーコードスキャナーシステムのようなサンプルを探し出し、それらを特定のデータと関連付けるための装置を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の血液学的コントロール組成物は、以下の全血の構成成分、即ち網状赤血球、白血球、赤血球、有核赤血球、血小板又は網状血小板の１以上を擬似するための成分を含む。一実施形態では、成分を、好ましくはリポ蛋白を含む等張媒体で懸濁する。本発明の血液学的コントロールは、マルチパラメーター血液用機器のような血液用機器が測定することができる種々の血液構成成分についての値を与える。マルチパラメーター血液用機器の例は、Backman Coulter STKS又はGen-S Systems、Abbott Cell-Dyn 4000 Hematology System、Bayer ADVIA 120 System、Sysmex XE2100 System等という名称で、限定されることなく、市販されているものを含む。
【０００８】
ここでの説明は、本発明のコントロールを製造するための複数の手段を含み、より好ましい一実施形態は、Backman Coulter GEN-S 機器で、赤血球、５種の白血球、網状赤血球及び血小板の読出し値を得るために、全血の特性を擬似する成分を有するコントロールを意図することが認識される。従って、全血の対応成分として、作動中に機器によって検出される同様の光散乱、伝導度、インビーダンス、光学的（蛍光を含む）、測光的又は他の特性応答を示す複数の粒子を含む懸濁液が提供される。
【０００９】
ここで使用される用語「コントロール組成物」は、組み合わせられ又は単独で使用された場合、機器が試験する全血の適切な特性を十分に擬似する１以上の血液成分（即ち、血液の構成成分及びその類似体）を意味すると理解される。以下は、種々の構成成分の製造について述べる。本発明のコントロールは、２以上の血液成分の混合物、好ましくは網状赤血球成分及び少なくとも３種の擬似成分、好ましくは白血球の５種のサブポピュレーションを意図する。特に言及しない限り、百分率は容量％である。
【００１０】
網状赤血球成分
コントロール組成物の網状赤血球成分は、本発明の血液用機器を用いて網状赤血球を検出するための適当な特性を示す成分を含む。従って、コントロールは、安定化された網状赤血球（即ち、いくらかのリボ核酸を含む未熟な無核赤血球）又はその類似体を適当に含有していてもよい。例えば、可能な実施形態のなかでは、網状赤血球成分が、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）の赤血球のカプセル化又は全血からの単離によって調製される純種の哺乳類の網状赤血球を含有していてもよい。網状赤血球成分は、適切ないずれかの方法によって調製される。例えば、参考文献として組み込まれる米国特許第5,432,089号参照。あるいは、貧血の動物（例えば、ブタ、ヤギ、ウサギ等）から血液を得ることによって適切な網状赤血球を得ることができる。
【００１１】
特に好ましい一実施形態では、網状赤血球成分は、非網状赤血球、例えば、ヒト又は他のソースからの赤血球を用いてカプセル化法によって調製される。赤血球は、カプセル化され、安定化される。一実施形態では、実例として、比較的高いMCV（例えば、約85〜95fL、より好ましくは約88〜92fL）を有する赤血球が提供される。
【００１２】
細胞を１以上の洗浄工程において適切な希釈液（例えば、約0.15MのNaCl）で洗浄する。次いで、細胞を所望のヘマトクリット値、例えば、約50％以上、より好ましくは約70％以上に濃縮する。
【００１３】
次いで、細胞はRNAとともにカプセル化される。例として、RNAは、適切な溶解工程、例えば低張性溶解によって、赤血球にカプセル化される。これは、赤血球と適切なｐＨ及び浸透圧を有するRNA溶液との混合を含む、多くの方法で行うことができる。例えば、溶液は少量のRNA（より好ましくは約1％）を含んでいてもよいし、約7〜8（より好ましくは約7.6）のｐＨを有する。溶液は約40mOsmの浸透圧を得るために（例えば、NaClで）調節される。
【００１４】
赤血球を、適宜変更することができる適当な割合でRNA溶液と混合する。本発明の好ましい実施形態では、濃縮された赤血球とRNA溶液との容量比は、約0.8〜約1.2：約1〜約2、より好ましくは約1：1.4である。溶解前又は溶解の初期段階で、例えば、室温（例えば、約37℃）以上に加熱することによって赤血球及びRNA溶液を予めインキュベートする。細胞は混合物中で溶解され、その後、赤血球は再度封じられる。例として、赤血球を塩溶液に入れ、次いで室温以上に加熱する（例えば、約0.15容量の約12％NaCl溶液を添加し、次いで細胞を約37℃に約１時間加熱又はアニールする）ことによって、再度封じられる。
【００１５】
その結果得られた混合物を分液漏斗に注ぎ入れ、室温で、適当な時間、例えば、少なくとも18時間インキュベートする。その後、漏斗の底部から（例えば、底部の約70％以下から）細胞を回収する。細胞を表２又は５の希釈液のような適当な希釈液で洗浄する。任意に、約0.5〜約5.0％、より好ましくは約0.75％のStreck
Laboratories 製品番号 233301、またSAT-CELL（Streck Laboratories（Omaha、Nebraska）から入手可能）を添加する。本発明の例示的な実施形態では、細胞を検出染色（例えば、メチレンブルー）されるように処理する。
【００１６】
別の実施形態において、網状赤血球成分を、乳糖又は他の適当な希釈剤で、（例えば、アルデヒド又は他の適当な固定剤で）固定する。また、固定剤を含まない希釈液のようなものを洗浄に使用してもよい。
【００１７】
白血球成分
本発明の実施形態において、全血中の白血球の特性を擬似するコントロール成分を、生体物質から調製する。より詳しくは、物質は細胞性生体物質であり、好ましくはヒト（いずれの適切な動物の血液細胞を使用してもよいが）の白血球を含む物質である。本発明の好ましい実施形態では、白血球成分は、５種の白血球型、即ち、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球のそれぞれのいくつか又は全てについて適切に測定可能な特性を再現するための物質を含み、その結果、それらもまた当該分野で開示されるレベルで提供される（例えば、表７を参照）。
【００１８】
血液学的コントロール組成物の白血球成分は、種々の細胞型の白血球、全表現型の白血球及びそれらの混合物からなる群から選択される血液細胞（例えば、白血球）又はそれらの類似体を含む。ここに参考文献として組み込まれる米国特許第5,270,208号及び5,262,327号は適切な白血球成分の例を与える（また、ここに参考文献として組み込まれる米国特許第5,529,933号も参照）。当然、当業者は、対象発明が白血球のみから調製される白血球成分に限定されないと理解するであろう。種々の他のソースのいずれかから調製される類似体が可能であり、鳥類、爬虫類、哺乳類等の赤血球に限定されずに、含まれる。
【００１９】
細胞はパック（１つのボトルにつき２〜３のパック）で提供される。細胞は、提供された物質中に存在する望ましくないいずれかの血液細胞を選択的に溶解し、細胞を洗浄し、及び細胞を固定化又はそうでなければ安定化する一連の工程によって処理される。
【００２０】
選択的な溶解は、例えば、望ましくない血液細胞を溶解剤に接触させるいずれかの適切な方法において行うことができる。どのような適当な溶解剤を使用してもよい。望ましくない細胞が赤血球を含んでいる場合、塩化アンモニウム及びトリズマベース（Trizma Based）のような緩衝ハライド（例えば、1リットルにつき約7.5gの塩化アンモニウム及び2gのトリス）が、溶解剤の１つの適したクラスを示す。溶解は、溶解剤での連続した一連の洗浄工程で行われる。溶解前、任意に細胞を、適切な固定剤と接触させるか、加熱させるか又は双方を行うような予備の固定化工程に付す。例えば、細胞を適量の固定剤（例えば、約0.11％のホルムアルデヒド）を含む緩衝抗菌性食塩水（任意に表５に記載された希釈液を含む）と接触させる。
【００２１】
溶解は１工程又は複数の工程（例えば、約１時間、次いで約25分）で行ってもよく、各工程後、溶解剤を除去し、新しい剤を加える。溶解後、細胞を洗浄し、溶解剤を除去する。いかなる適切な洗浄用組成物及び技術を使用してもよい。例えば、上述の緩衝抗菌性食塩水（固定剤なし）を使用してもよい。この溶液を用いて、細胞を少なくとも１工程、好ましくは２工程で洗浄し、細胞を適切な速度（例えば、約990rpmで約10分間）で遠心分離する（例えば、約200xg）。
【００２２】
固定化する前に、さらに表２のような希釈液中に約2％のBSAのようなアルブミン含有希釈液中で、細胞を予め処理することが好ましいかもしれない。希釈液は、ｐＨ約８及び約175〜300の浸透圧（例えば、約215）を有することが好ましい。約6℃で維持する場合、どのような適切な予備処理時間（例えば約１時間）を用いてもよい。
【００２３】
細胞を、細胞表面で蛋白を十分に変性させるいずれかの適切な方法で固定する。細胞を加熱してもよいし、固定剤と接触させてもよいし、その双方を行ってもよい。好ましい固定剤はアルデヒドであるが、例えば、アルデヒド、アルコール、複素環式尿素（例えば、ジアゾリジニル尿素（DUとして公知）、イミダゾリジニル尿素（IDUとして公知）又はそれらの混合物）あるいはそれらの混合物を含むものを含む、どのような適当な剤（好ましくは低張溶液）を用いてもよいことが当業者に認められるであろう。適切な固定剤の中でも、特に有効なアルコール含有剤の１つは、50容量％の［1-メチル-2-（5-メチル-3-オキサゾリジニル）-エトキシ］メトキシ］メタノール（例えば、HULS America, Inc.のNUOSEPT 145）又はその混合物である。１つの好ましい実施形態では、アルデヒドはホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【００２４】
実例として、固定化された混合物は、約10部の細胞、約20部の蒸留水、細胞膜のすべてにわたる浸透圧向上のためか、スキャッタグラム個体数読出しにおける集団形成の促進のためか、あるいはその双方のための剤（例えば、ソルビトールのような蔗糖約5g/l）、単球の読出しの安定化を助けるための剤（例えば、約4％のDU）及び、例えば、約４部のホルムアルデヒド及び約0.1部のグルタールアルデヒドのような固定剤を含むように調製される。固定化は、適当な時間、適当な温度で行われる。この固定剤を用いて、固定化が、例えば約22℃で、約2〜3日間で行われる（例えば、固定化前かつ冷蔵後に温める）。
【００２５】
固定化細胞を適当な洗浄剤（例えば、希釈液中の細胞安定剤）で洗浄し、固定化剤を除去する。実例として、希釈液（例えば、表３に一覧されるような組成を有する希釈液）中の金属ハライド（例えば、約5％のNaF）細胞安定剤を含む溶液中、約900rpmで、約10分間の遠心分離中（例えば、約200xg）に２回洗浄する。
【００２６】
別の例示的な実施形態では、本発明のコントロール組成物用の白血球成分を調製する場合、細胞は、全血又は所望の細胞集団を含む予め分画された全血の一部から一般的な分離により得られる。細胞を、例えば、ポリエチレングリコール20,000（PEG）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）及び2％のウシ血清アルブミンを有するグルコン酸マグネシウムを含有するリン酸緩衝液中で再懸濁する。この溶液の浸透圧は固定化前に白血球を膨潤させるのに十分であることが好ましい（例えば、約215mosm）。次いで、細胞をこの溶液中に、例えば、約6℃で１時間保持してもよい。
【００２７】
細胞は、好ましくは表面を変性させるか、細胞形態の保持を果たすために適当な媒質で固定化する。例示として、一実施形態では、5g/lのソルビトール、7.4％のホルムアルデヒド及び0.125％のグルタールアルデヒドを含む蒸留水溶液である。もちろん、他の適当な固定剤を適当な量で使用してもよい。より好ましい実施形態では、白血球及び固定化溶液を、適切な白血球の位置を与えるのに十分な温度で維持する（例えば、約4〜12℃）。固定剤を適切な割合で細胞に添加する。一実施形態では、例えば、10mlの細胞懸濁液と24mlの固定化溶液との割合が用いられる。固定化溶液中の蒸留水は白血球をさらに膨潤させ、一方固定剤は細胞膜を安定化する。従って、細胞を室温で２日間固定剤中に放置する。
【００２８】
固定化後、細胞を洗浄することが好ましい。１つの観点では、それらをリン酸緩衝液で洗浄する。そのような溶液の１つはポリエチレングリコール（PEG）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、グルコン酸マグネシウム及びウシ血清アルブミンを含む。白血球がコントロール組成物の他の成分へ添加されるために待機している間、スキャッタグラムの位置の安定性を高めるため、使用前にリポ蛋白の濃縮物を150mg/dl HDLで添加し、細胞を貯蔵する。
【００２９】
フローサイトメトリーについて米国特許第5,459,073号（ここに参考文献として組み込まれる）に記載のように調製された白血球を表現型化のために使用してもよいと認められるであろう。表現型化のため調製される細胞は、通常、ヒストグラム/スキャッタグラム上で他の白血球の位置を妨げるべきではないため、２種類の白血球、即ち種々の細胞型及び表現型の白血球を混合することによって、双方の必要条件を満たすことができる。
【００３０】
特定の機器用のコントロールでは、白血球を希釈又は濃縮する必要があるかもしれない。例えば、Cell-Dyn 機器にとって総数10,000となる希釈が好ましい。
【００３１】
赤血球の成分
この実施形態では、全血中の赤血球の特性を擬似するコントロールの成分は、生体適合物質から調製される。より詳しくは、物質は細胞性生体物質であり、（いずれかの適切な動物からの類似血液細胞を使用してもよいが）ヒトの赤血球を含む物質が好ましい。
【００３２】
提供された細胞を、限定されないが、遠心分離、濾過等を含むいずれかの適当な分離技術で供給される液状媒体又は上清から分離する。細胞を１以上（例えば、３）の一連の連続的な洗浄工程で洗浄し、それに応じて過剰の上清を除去する。細胞は、好ましくは表３の希釈液のような希釈液及び任意に、細胞安定剤、アルブミン、酸素存在下で細胞が溶血する可能性を減少させる剤及びそれらの混合物からなる群から選択される１以上の添加成分で洗浄する。より好ましい観点では、添加成分は、金属ハライド細胞安定剤、ウシ血清アルブミン（BSA）、酸化防止剤及びそれらの混合物からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、希釈液は、表５のようなものであり、約0.003〜約0.010（より好ましくは約0.005％）のNaF、約2％のBSA、約0.005〜約0.020（より好ましくは約0.010％）のスルファサリジンを含有する。表２の希釈液を同様に適宜使用してもよい。
【００３３】
任意に、最終用途及び商業上の理由によって、劣化の割合を軽減するため１以上の剤を、適当な量、例えば、製品番号233301又はSTA CELL（この物質も、他の１以上の成分に対し適切に添加されてもよい）と称呼されているStreck Laboratories (Omaha、Nebraska)から入手可能な物質を約0.25〜約2.0％、より好ましくは約0.75％で使用してもよい。さらに、任意に、細胞を実質的にブドウ糖を含まない環境で調製するのが好ましい。別の任意の実施形態では、細胞を洗浄した後固定し（例えば、グルタールアルデヒド固定液のような適当な蛋白変性工程で）、次いでさらに洗浄する。
【００３４】
細胞は、いくらかの適当な時間洗浄してもよいし、いくらかの適当な回数、（例えば、より高濃度を有する同じ又は異なる洗浄液中で）再懸濁してもよい。
当業者は、赤血球を、グルコン酸マグネシウム希釈液を用いることにより、他の全ての細胞性物質を含まないように洗浄してもよいと理解するであろう。
【００３５】
さらなる実例として、別の実施形態では、濃縮された赤血球が提供され、一緒にされた上清から分離され、ヒトの濃縮された赤血球のパックを溶液（例えば、PEG（MW=20,000）を含むリン酸緩衝液）中で懸濁し、一晩沈殿させる。次いで上清を除去し、PEGを有する0.5％のNaClをパックされた赤血球に等しい量で添加し、室温で4〜5時間放置する。上清を再度除去し、細胞をNaCl溶液中で再懸濁し、6℃で一晩貯蔵する。パックはさらに過剰な溶血について検査され、在庫から除去される。残余パックは、MCVに基づいてバッチに貯留し、12〜14のパックを合わせて１つのバッチを製造する。バッチをNaCl溶液中室温で約４〜５時間再懸濁する。もちろん、他の時間及び温度を用いてもよい。
【００３６】
各バッチをPEG、EDTA及びグルコン酸マグネシウムを含むリン酸緩衝液中に再懸濁する。細胞を沈殿させ、上清を除去し、細胞を６℃で90日まで貯蔵するため、より低いPEG濃度の上記の溶液中で再懸濁する。
【００３７】
Coulter STKSで赤血球の安定化において効率的な希釈液の１つは、PEG、Na2EDTA、グルコン酸マグネシウム及び酸化防止剤（例えば、スルファサラジン又はα-トコフェロール）を含有するリン酸緩衝液を含み、リポ蛋白を本発明のコントロール組成物に添加するとき、酸化防止剤を、溶血を防ぐために添加する。また、最終的な希釈液は、白血球の位置を改善させるために約2％のウシ血清アルブミンを含む。細胞をこの希釈液中で洗浄した後、Streck Laboratories（Omaha、Nebraska）のSTA-CELLを赤血球の総容量に対して0.75％で添加すると、MCVに対してさらなる安定性が得られる。
【００３８】
任意に、ある適用では、例えばゆっくり遠心分離することによって余分な赤血球を除去した後、赤血球を固定することが望ましいかもしれない。例として、そのような実施形態について、表２の希釈液を使用する。細胞を洗浄し、希釈液中で適切な濃度（例えば、約4×106/mm3）に再懸濁する。ｐＨは約７で、懸濁液中にブドウ糖が存在しないのが好ましい。約１対1の割合で細胞を希釈液及び適量の固定剤（例えば、グルタールアルデヒド約0.007％から約0.01％（総量に対して））と適温で適当な期間（例えば、22℃で約１又は２日間）混合する。次いで、得られた細胞を希釈液のようなもの（好ましくはｐＨ７〜８）で複数回（例えば、１〜５回）洗浄する。細胞を約1500rpmで約15分間遠心分離する。必要に応じて、デカントし、超音波処理を行う。さらに、細胞を適宜、Streck Laboratories,Inc.（Omaha 、Nebraska）の適量のSTA-CELL（例えば、約0.75％）を添加することによってさらに処理してもよい。
【００３９】
有核赤血球成分
本発明のコントロール組成物の有核赤血球成分は、使用する場合、有核赤血球又は、例えば、シチメンチョウ又はニワトリの赤血球のようなその類似体を含む。例えば、シチメンチョウの赤血球をリン酸緩衝液中で洗浄し、約1×106/mm3数に設定する。細胞をリン酸溶液（細胞容量と等しい容量）+0.4％v/vのグルタールアルデヒドで、室温にて１日間固定し、次いでリン酸緩衝液で洗浄する。
【００４０】
固定されたシチメンチョウの赤血球を本発明のコントロール組成物に添加し、Coulter STKSでNRBCフラグ又はAbbott Laboratoriesによって製造されたCell-Dyne 4000を製造するために少なくとも10％の白血球数と等しい細胞数を与える。本発明の実施例ではシチメンチョウの細胞の使用を意図するが、他の細胞ソースからの細胞を当業者が理解するように用いてもよい。
【００４１】
血小板成分
本発明の好ましい実施形態では、血液学的コントロール組成物はさらに血小板成分、好ましくは血小板の擬似成分を提供する。他の可能な型のなかでも、血小板成分は安定化されたヒトの血小板又はヤギ、ウシ又はブタの血液細胞を擬似した血小板を含有していてもよい。一実施形態では、それらは赤血球から調製される。ここに参考文献として組み込まれ、適切な血小板の参照用のコントロール及び製造方法の例を開示する米国特許第4,160,644号及び4,198,206号を参照のこと。当業者は、擬似血小板を調製するための他の多くの技術を理解するであろう。
【００４２】
通常、どのように血小板を調製するかは、細胞のソースによるかもしれない（即ち、それらが、血小板に似せるために収縮、膨潤、あるいはそうでなければ大きさを整えるか、形作られる動物の血液細胞であるか、また血液の血小板であるか）。通常、細胞を洗浄し、任意に予備固定し、大きさを整えて形作り、次いで固定化又は大きさ及び形状について安定化し、中和する。
【００４３】
例として、血小板成分を、ヤギの赤血球のような動物の血液細胞から調製する。細胞を緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）のような適当な緩衝溶液で１回以上（例えば、約３回）洗浄する。溶液はまた、適量のキレート剤（例えば、約1％のエチレンジアミン四酢酸（EDTA））を含む。
【００４４】
細胞は、任意に、大きさを整えて形作る工程を補助するのに適した方法で予め固定される。実例として、細胞を適当な予備固定化溶液と接触させる（（例えば、１対１の固定剤（例えば、約0.0085％のグルタールアルデヒド）を有する最初の洗浄溶液中で）。そのような固定剤の量は、確かに、サイジングの比率（例えば、収縮率）を制御するため必要に応じて適切に調節することができる。予備固定溶液を高い温度（例えば、約30℃）に温め、そのような温度で十分な時間（例えば、約90分間）予備固定を行うことが好ましい。予備固定の工程後、例えば遠心分離、吸引法又はその双方によって上清を除去する。
【００４５】
細胞を収縮させ、擬似血小板構造を形成するために大きさを整えて形作りをする場合の例としては、細胞を適切な方法で溶解する（例えば、塩化アンモニウムトリス（ammonium chloride tris）のような溶解剤を用いて）ことが好ましい。溶解中、細胞の大きさ及び形状をBayer CorporationのH3（レーザーの光学検出装置を有する血液用分析装置）のような適切な機器を用いてモニターしてもよい。次いで、細胞を適当な希釈液（例えば、表４の希釈液）で１回以上洗浄する。
【００４６】
上述したような血液細胞を用いて、擬似血小板を適当ないずれかの方法、好ましくは細胞表面で蛋白を変性させる方法で固定する。特に好ましい実施形態では、細胞を表４のような希釈液及び約0.1％のホルムアルデヒドの１対１の溶液で固定する。固定化溶液の温度を適当な期間（例えば、約３日間）で上昇させるのが好ましい（例えば、約37℃）。
【００４７】
次いで、細胞を適当な洗浄液で洗浄して固定剤を除去し、また細胞の表面に結合していない未反応のいくらかの固定剤を中和するための方法を採ることが好ましい。固定剤は、好ましくはアルデヒドであることを示すために、適量のグリシン溶液を洗浄液に使用する。適宜、１以上のさらなる洗浄液を用いて、１以上の付加的な洗浄工程を行ってもよい。例えば、連続的な洗浄工程を、表４、５の洗浄用組成物又はそれらの混合物を用いて行ってもよい。
【００４８】
血小板成分は、いずれかの適当な工程を用いてヒトの血液から製造することができることは理解されるであろう。例として、限定されることなく、ヒトの血液が提供される（好ましくは固定剤を有する希釈液中に（例えば、約0.10％のホルムアルデヒドを含有する表５のような希釈液）。任意に、赤血球を除去し、その結果得られた細胞を固定化細胞と混合する。例えば、赤血球を１つの容器につき約400mlの量で約900rpmにて約10分間遠心分離する。
【００４９】
提供されたような細胞を固定剤（例えば、約１対１の割合の表４のような希釈液と適量の固定剤（例えば、約0.075％のグルタールアルデヒド））に入れる。固定化を、約22℃で約2日間行う。固定化後、遠心分離を（400mlの容器に対して）約1800rpmで約20分間行う。２つの別々の細胞回収物を合わせ、洗浄し（例えば、表２のような1×希釈液中で）、次いで遠心分離（例えば、約1800rpmで約20分間）する。任意に、血小板を残余赤血球からデカントする。血小板の凝集に対処するため適宜、超音波処理を使用してもよい。また、デカンテーションを、デブリスを確かめるために用いてもよく、赤血球は除去される。
【００５０】
次いで、その結果生じた物質を希釈液中で再懸濁する。適切な希釈液の例は、ブドウ糖を含有せず、ｐＨが約７である表２の希釈液であろう。
【００５１】
網状血小板成分
本発明の別の実施形態では、コントロール組成物は、網状血小板成分を含む。限定されることなく、例示として、カプセル化された核酸を有するヤギの赤血球が、本発明に有用な網状血小板成分の一例を構成するであろう。他の類似体を同様に使用してもよい。
【００５２】
別の実施形態では、さらなる実例として、本発明のコントロール組成物用の網状血小板は、RNAの細胞中への侵入、ヘモグロビンの残留又はその双方を行うために多孔性の血液細胞膜を誘発することによって調製される。次いで、細胞の大きさを調整し又は形作って安定化させる。例示として、ヤギの赤血球を約0.9％のNaCl溶液に入れ、70〜80％のヘマトクリット（HCT）に濃縮する。濃縮赤血球と適当な塩（例えば、KCl）で300mosmに調節された4％のRNA溶液との等量（各20ml）を一緒に混合し、グリセロールを含有するもののような低張溶液（osm＝90〜100）500mlに対して、90分間６℃で透析する。透析は、細胞を損傷することなく浸透圧をゆっくりと変化させることが必要である。赤血球の溶液で得られた浸透圧の変化は約300〜約150mosmである。この工程は、細胞膜に孔を生成し、赤血球溶液中のRNAを赤血球に入れることを可能にする。
【００５３】
浸透圧は、等張液に対してRNAを含有する赤血球を透析することによって等張に戻す。この透析を室温で30分間行うと、細胞の最終浸透圧は約260mosmである。この工程は、低張性透析によって生成された孔を再度封じ、よって細胞内にRNAを閉じ込める。
【００５４】
0.1％のNuosept101を含有する再シール希釈液80ミリリットルをカプセル化された赤血球に添加し、混合物を37℃で３時間加熱する。この加熱工程は、カプセル化工程により弱った細胞を溶解するのを補助し、カプセル化された赤血球の膜をアニールする。
【００５５】
例示のため、ヤギの赤血球をヤギの全血の他の成分から分離する。例えば、細胞をPBS中で３回洗浄し、血漿と白血球とを除去する。濃度を8×106/mm3に調節し、0.224〜0.320％のグルタールアルデヒドを含有する細胞に等しいPBSの容量で固定すると、収縮工程中に適切な溶解を行うのに必要な量の保護をもたらす。細胞を30℃で1時間インキュベートし、1200RPMで15分間遠心分離する。上清を除去し、細胞容量を固定容量の４分の１に調節する。
【００５６】
塩化アンモニウム溶液を固定細胞のもとの容量と等しくなるよう細胞に添加する。理論に拘束されることなく、塩化アンモニウム溶液は、ヘモグロビンが細胞に抜け出せるように膜に孔を生成し、一方グルタールアルデヒドは全溶解から保護する。細胞を、Bayer H-1での（MPV）減少に基づくヘモグロビンの損失についてモニターする。MPVがBayer H-1で10flである場合、細胞をリン酸緩衝液で希釈し、1800RPMで20分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を洗浄し、遊離ヘモグロビンを除去してヘモグロビン周囲の膜を収縮させ、Beckman Coulterにより製造されたS＋IVのようなインビーダンス機器で約10flのMPVを生じさせる。
【００５７】
MPVがH-1で10flである場合、細胞をリン酸緩衝液で希釈し、1800  RPMで20分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を洗浄し、遊離ヘモグロビンを除去し、ヘモグロビン周囲の膜を収縮させてBeckman Coulterにより製造されたS＋IVのようなインビーダンス機器で約10flのMPVを生じさせる。
【００５８】
より好ましい実施形態では、ヘモグロビンのさらなる損失と膜の収縮を防ぐために、細胞を、例えば、1×106/mm3数で細胞容量に等しいリン酸緩衝液の容量中0.04％のグルタールアルデヒドで１回以上固定する。細胞を室温で一晩放置し、次いで洗浄する。この実施例ではヤギの細胞の使用を意図するが、当業者が理解しているように他の細胞ソースからの細胞（例えば、安定化されたヒトの血小板）を使用してもよい。
【００５９】
懸濁用媒体
本発明は、等張懸濁媒体に、網状赤血球成分、白血球成分、赤血球成分、有核赤血球成分、血小板成分及び網状血小板成分の１種以上を混合する工程からなるマルチパラメーターシステムで使用するための血液学的コントロール組成物の製造方法に関する。
【００６０】
コントロール成分を、自動機器でコントロールを処理できるようにする適当な濃度の適当な懸濁媒体で懸濁することが好ましい。従って、懸濁媒体はｐＨが約6.5〜約8.5で、等張である。例として、本発明の可能な実施形態の中で、等張懸濁媒体は緩衝剤、酸化防止剤、蛋白又はそれらの混合物、例えば、グルコン酸マグネシウム/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）/有核赤血球を有するリン酸緩衝液；添加剤HDLを含む同じ緩衝剤、スルファサラジン及びアルファトコフェロール；又は3％のアルブミンを含む同じ緩衝剤を含有していてもよい。
【００６１】
リポ蛋白
いずれかの希釈液中に存在するBSAはスキャッタグラム上で白血球の位置を向上させる一方、リポ蛋白はまた、５つの白血球のサブポピュレーションの適切な位置決定を含む全血を表すスキャッタグラムを有効に与える量で使用されるのが好ましい。参考文献として組み込まれる米国特許第5,270,208号及び5,262,327号を参照。リポ蛋白のソース、好ましくは、高密度リポ蛋白（即ち、HDL）から実質的になるものを、コントロールの約0.5〜約8.0容量％で、より好ましくは約100〜175mg/dlでコントロール組成物に添加し、α-トコフェロールをリポ蛋白の酸化により生じる過酸化物を減少させるために、さらにリポ蛋白ソースに添加する。適当な市販のリポ蛋白の形態の例はSUPERTRATE（Bayerから入手可能）である。
【００６２】
混合成分
構成成分の貯蔵容量は以下の概算濃度で調製される；
RBC： 6.0×106/mm3
WBC: 150,000/mm3
血小板： 10×106/mm3
網状赤血球: 5.5×10/mm3の赤血球数の50％
NRBC： 0.5×106/mm3
例えば、５リットル容量で、最終的なコントロール組成物を調製するために、構成成分の貯蔵容量を以下のように組み合わせる；
【表１】
2005121661.tif 000002
組み合わせた構成成分は、適切な最終希釈液を添加することによって最終総容量5リットルに至る（例えば、ここに参考文献として組み込む米国特許第5,262,327号に従って調製される（好ましくは、SUPERTRATE又はそのような物質を含む））。当業者は、これ及び本発明の他の実施形態を調製するための他の手段及び方法があることを理解するであろう。さらに濃度は、試験したときに所定の異常読出し値を有するコントロールをもたらすよう変動させることができる。
【００６３】
コントロールの使用
以下は、マルチパラメーター自動血液用機器における操作の正確さ及び再現性を測定するためにコントロール組成物を用いる方法の例について述べる。例として、Beckman Coulter STKS又はGen-S Systems、Abbott Cell-Dyn 4000 Hematology System、Bayer ADVIA 120及びSysmex XE2100 Systemのようなマルチパラメーター自動血液用機器が、任意にスライドプレパレーションモジュールが搭載されて提供される。例として、例えば、それぞれ1.0％、2.5％及び9.0％の適切な範囲での高いコントロール値を有する、処理され、安定化されたヒトの赤血球成分及び網状赤血球成分を含む、クレームされたコントロール組成物を入手又は調製する。使用前にそれを冷却する。試験開始時に、コントロール組成物を約15分間、室温で温め、手動で混合し、内容物の再懸濁について調べる。
【００６４】
コントロール組成物を、試験用バイアルを受け入れるための開口を有する適切なカセットを用いてバッチ量で試験することができる、試験サンプルと同じ標準方法で調製し、分析する。調製後、コントロール組成物及び試験サンプルを、データを視覚表示するマルチパラメーター自動血液用機器で各対象成分型の個体数を数えることによって分析する。
【００６５】
Coulter Systemについて、自動試験機器は、VCS Technology（Beckman Coulterで販売されているような）として一般的に知られている技術を採用することができる。VCSは、一般に、同時に体積伝導度と散乱測定値とから細胞のサンプルを分析する。通常、原料サンプルは、溶解及びフローサイトメトリーで細胞を測定するために適当な試薬（キットの成分を含んでいてもよい）と物理的な攪拌とを組み合わせて用いられる。
従って、サンプルを、等張懸濁液中の細胞容量を測定するためにCoulter Principle of (DC) Impedanceによって試験することができる。
【００６６】
例えば、伝導度を、周波数帯域の範囲で交流電圧を印加することによって用いてもよい。エネルギーは、細胞膜の双極性脂質層の短絡で細胞を貫通することができる。
細胞についての情報はまた、コヒーレント光源、例えばレーザービームに応じて細胞から検出された散乱特性からのような、光散乱技術で入手可能である。
当然、サンプル試験の形式は決して上記に限定されるものではない。上述のように他の原則を用いてもよい。
【００６７】
分析から得られた各個体数は、コントロール組成物中の各成分型に対する既知の参考値と比較するか、又は試験サンプルにおける各成分型の個体数とコントロール組成物中の成分の対応する値とを比較する。コントロール組成物及び試験サンプル中の成分の測定に関するデータは、例えば、適切なソフトウェアでプログラムされ、適切なデータファイル構造を含むコンピューターのような電子手段によって収集、モニター、蓄積、比較及び分析される。
【００６８】
【表２】
2005121661.tif 000003
【００６９】
【表３】
2005121661.tif 000004
【００７０】
【表４】
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【００７１】
【表５】
2005121661.tif 000006
【００７２】
多くの成分が特定の例として開示されているが、示唆された多くの代替成分又は異なる濃度のいずれかを、そのような成分のために適切に置換することができることを当業者は理解するであろう。以下の表６は、種々の代替物の例を示し、表２〜５の希釈液で用いた場合の通常使用される濃度範囲の簡単な解説も含む。成分は参考として特別な作用のために記載されているが、そのような説明は理論に拘束されることなく提示されていることを理解すべきである。いくつかの実例において、成分は異なる又は付加的な作用を示すであろう。さらに、この好ましい実施形態の文脈において、作用についての表６の参考事項が、さらなる代替物を選択させることができることを当業者は理解するであろう。従って、他のものをそのような成分に添加し又はその代用として有利に使用してもよいことが明らかである場合は、特定の例示的ないずれかの成分又は濃度の幅に結び付けようとしなくてもよい。
【００７３】
同様に、成分を適宜、希釈液から検出してもよい。従って、いくつかの成分の組み合わせを所望の結果を実現するために適当に使用してもよい。
【００７４】
希釈液は、界面活性剤、溶血阻害剤、赤血球沈降タンク、MCV安定剤、緩衝剤、代謝物質、浸透圧調節剤、抗菌剤、抗真菌剤、蛋白源、白血球のサプボプレーションのポジショナー、酸化防止剤、デブリス還元剤又はそれらの混合物として作用する１以上の剤を含むことが好ましい。
【００７５】
【表６】
2005121661.tif 000007
【００７６】
【表７】
2005121661.tif 000008
【００７７】
さらなる代替の例示的実施形態
赤血球成分について、グルコン酸Mg及びEDTA（例えば、約3.92g/lのグルコン酸Mg、7.04g/lのEDTA-二ナトリウム、2.68g/lのNa2HPO4、6g/lのブドウ糖及び抗菌物質（pH7.1及び約300のKClを用いて浸透圧））を含む希釈液は赤血球を安定化し、その結果赤血球のパラメーターは200日間安定する。
白血球成分を新鮮なヒトの白血球から調製する。赤血球及び血小板が含まれない細胞を上記の希釈液を用いて洗浄する。細胞を浸透圧280で、pH7.2のリン酸緩衝食塩水中で懸濁する。20％のNuosept 145 (Huls America)溶液を白血球と1：1で混合し、約10％（例えば、9.11％）の最終濃度を得る。混合物を、約37〜50℃の温度で６日間以上放置する。その後、細胞を適当な希釈液、例えば表２のような希釈液で１回以上（例えば、3回）洗浄し、遠心分離し（例えば、約900rpmで10分間）、表２のような希釈液（ブドウ糖を含有せず、ｐＨが約７である）中で再懸濁する。
【００７８】
血小板成分を低速の遠心分離（900RPMで10分間）で全血成分を含まないヒトの血小板を洗浄することによって調製する。次いで、血小板を低レベルのグルタールアルデヒドを添加することによって安定化する。血小板は.075％のグルタールアルデヒド（最終濃度.037％のグルタールアルデヒド）を含有するグルコン酸マグネシウム希釈液と1：1で混合することによって安定化する。22℃でのインキュベーションの後、細胞を希釈液中で再度洗浄して使用に備える。同じ処置をウシ又はブタに用いてもよい。
網状赤血球は、ここに参考文献として組み込まれる米国特許第5,432,089号に記載されるような酵母RNAのカプセル化によって調製される。
【００７９】
白血球成分を、例えば約22℃で約20日間、赤血球を維持することで他と異なる安定性を実現するために、赤血球で固定（set up）する。
最終的なコントロールは以下の細胞濃度（表８）を含み、適所に位置する５種の異なる白血球及び網状赤血球、実質的に全血に近いものを含むヒストグラム/スキャッタグラムのプロフィルを示し、200日間以上安定である。このコントロールは、Cell Dyn 系列、Bayer H-3及びSysmex SF機器に対してそのような結果を提供する。
【００８０】
【表８】
2005121661.tif 000009
従って、上記の説明は本発明の例示的実施形態のみを開示し、記載している。当業者は、そのような説明及び添付図面ならびに請求項から種々の交換、変更及び変化が以下の請求項で定義されるような本発明の趣旨かつ範囲から逸脱せずになされることが理解されるであろう。全ての特許及びここに列挙されている他の公報は、参考文献に特別に組み込まれている。