(57)【要約】【課題】  １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの製造時において、該化合物の変異を抑制し、且つ微生物の増殖を抑制するための至適条件を提供すること。【解決手段】  基質である澱粉あるいは澱粉分解物の溶液を、ｐＨを２．５〜４．０で、好ましくは、さらに基質濃度２０〜４０％で、酵素α−１，４−グルカンリアーゼで処理して１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを製造する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉あるいは澱粉分解物の溶液を、ｐＨ２．５〜４．０において、酵素α−１，４−グルカンリアーゼで処理して１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを生成せしめることを特徴とする、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの製造法。
【請求項２】
ｐＨが３．０〜３．５である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
α−１，４−グルカンリアーゼがイオン交換樹脂に固定化された形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
溶液中における澱粉あるいは澱粉分解物の濃度が２０〜４０重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを水溶液中ｐＨ２．０〜４．５で保存することを特徴とする、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの保存方法。
【請求項６】
ｐＨが２．５〜３．５である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
保存時の温度が２０℃以下である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
１，５−Ｄアンヒドロフルクトースが請求項１に記載の製造法で製造されたものである、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの製造法および保存法に関する。さらに詳しくは、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを高い製造効率で製造する方法および製造された該化合物が分解あるいは他化合物へ変換することのないように安定的に保存する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下、１，５−ＡＦ）は分子内に二重結合を有しており、他の単糖類と比較して反応性に富む物質である。１，５−ＡＦは還元力、抗菌活性が高いため、食品に安全に添加される抗酸化剤（［特許文献１］参照）、枯草菌および乳酸菌に特に有効な抗菌剤（［特許文献２］参照）や、さらには澱粉の老化防止剤（［特許文献３］参照）、タンパク質等のアミノ化合物への糖供与体（［特許文献４］参照）としても利用可能であり、さらに食品の着色剤（［特許文献５］参照）等として幅広い応用が検討されている単糖である。また、この単糖は抗生物質ピロンミクロテシンの前駆体でもある（［特許文献６］参照）。
【０００３】
Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒは、この有用性の高い１，５−ＡＦを化学的に合成する方法を開示している（［非特許文献１］参照）。しかし、この化学的合成には多くの工程が含まれており、また収率も低いため、得られる製品が高価になるという問題がある。
【０００４】
上記特許文献１は、Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ  ｃｏｓｔａｔａまたはＭｏｒｃｈｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ等の菌類やＧｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ  ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ等の藻類からα−１，４−グルカンリアーゼ（以下、リアーゼ）を単離する方法、および、澱粉または澱粉分解物の溶液を単離したリアーゼで処理することにより１，５−ＡＦを容易かつ安価に、そして大量に製造する方法を開示している。この特許文献１に記載された製造法では、反応条件が基質濃度２５％以下、基質と酵素の反応時のｐＨおよび温度は酵素リアーゼの供給源によって多少異なるが、ｐＨ約３．８〜７．６、温度約３５〜５０℃が好ましいとされている。
【０００５】
１，５−ＡＦを製品として市場に流通させる場合、１，５−ＡＦの含有量あるいは色調等の変化が少ないことが要求される。さらに量産に対応すべく安定的な方法での製造が不可欠となる。しかし、１，５−ＡＦは反応性が高く、製造中や保存中に、変化し易いという難点がある。また、特に上述の特許に記載の製造条件では、反応器内は勿論のこと、最終的に得られた製品に存在する微生物も極めて増殖しやすい状態にある。
【０００６】
従って、反応器内における微生物の増殖を抑えながら安定的に連続的に製造を行なうことができ、さらに製造した１，５−ＡＦの安定性を長期に維持できる条件が望まれるが、それについては今まで特に検討されていなかった。
【特許文献１】特表平９−５０５９８８号
【特許文献２】特開２００１−８９３７７号
【特許文献３】特開２００１−３３３７１２号
【特許文献４】特開２００１−２１３８９１号
【特許文献５】特開２００２−２７９４５号
【特許文献６】仏国特許出願公開第２６１７５０２号
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２１巻、１４２９〜１４３２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、１，５−ＡＦをより安定的に且つ微生物の増殖を抑制して製造することを可能とした、１，５−ＡＦの製造法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、１，５−ＡＦを安定的に保存する保存法を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、１，５−ＡＦの安定的な且つ連続的な生産を可能とするための製造条件について鋭意検討を行った結果、基質と酵素の反応時のｐＨ、さらには基質濃度を調整することにより、１，５−ＡＦが分解および／または他化合物へ変換することなく、且つ、微生物の増殖を抑制しながら品質的に安定な該化合物を製造できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明の上記目的および利点は、第１に、澱粉または澱粉分解物等の溶液を、ｐＨ２．５〜４．０において、酵素α−１，４−グルカンリアーゼで処理して１，５−ＡＦを生成せしめることを特徴とする１，５−ＡＦの製造方法によって達成される。
【００１２】
本発明の上記目的および利点は、第２に、１，５−ＡＦを水溶液中ｐＨ２．０〜４．５で保存することを特徴とする、１，５−ＡＦの保存方法によって達成される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明法によれば、澱粉または澱粉分解物等の溶液をα−１，４−グルカンリアーゼで処理して１，５−ＡＦを製造する際に、基質と酵素の処理反応時のｐＨおよび好ましくはさらに基質濃度を調整することで、１，５−ＡＦを従来の方法よりも非常に安定的に且つ微生物の繁殖を抑制しながら製造できるため、製造を停止することなく、連続的に生産することが可能となる。また、１，５−ＡＦを本発明の方法で保存することにより、より長期に安定的に保存可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の製造方法で使用されるα−１，４−グルカンリアーゼ（以下、リアーゼということがある）は、紅藻オゴノリに水を加え破砕した後、固液分離して得られた抽出液に澱粉を投入し澱粉吸着させた後、澱粉を回収し、さらにその澱粉にデキストリン水溶液を加えて酵素を溶出することによって得ることができる。
【００１５】
基質との反応で使用された酵素を繰り返し連続的に使用することを可能とするために、得られたα−１，４−グルカンリアーゼを担体に固定化して使用することが好ましい。一般的な酵素の固定化の方法として、例えば、官能基を有するポリアクリルアミドゲルを担体とした共有結合法あるいはイオン交換樹脂へのイオン結合法、シリカゲルやアルミナ等の担体への物理的吸着法、架橋性樹脂等を使用した包括法等が挙げられる。
【００１６】
本発明の１，５−ＡＦの製造法では、澱粉あるいは澱粉分解物の溶液と酵素リアーゼの反応時のｐＨがｐＨ２．５〜４．０の条件下で行われる。このｐＨは３．０〜３．５の範囲がより好ましい。さらに、溶液中の澱粉あるいは澱粉分解物の濃度を２０〜４０重量％に調整したものを使用することで、生成した１，５−ＡＦが分解および／または他化合物へ変換することなく、１，５−ＡＦを安定的に且つ微生物の繁殖を抑制しながら製造することが可能である。
【００１７】
さらに、１，５−ＡＦは、水溶液中で、ｐＨを２．０〜４．５、好ましくは２．５〜３．５に調整して、さらに２０℃以下の温度で保存することで該化合物の変異あるいは変色、微生物汚染といった品質上の劣化を抑制でき、安定的な保存が可能となる。特に本発明の上記製造法により製造した１，５−ＡＦをこの方法で保存することにより、さらに安定的に１，５−ＡＦを長期に亘り保存することが可能となる。本発明の保存法において、保存対象となる１，５−ＡＦの他に成分が共存していてもよい。他の成分としては、例えば、フルクトース、グルコース、マルトオリゴ糖やマルトデキストリンなどの糖類が挙げられる。
【００１８】
本発明の製造方法あるいは保存方法で使用されるｐＨ調整剤としては、例えば、乳酸、酒石酸、クエン酸、酢酸、リン酸、塩酸、硫酸およびそれらの塩類等が挙げられ、これらの中の少なくとも１種含むｐＨ調整剤が好ましい。さらに、これらの調整剤は、例えば乳酸／乳酸ナトリウム緩衝液、酒石酸／酒石酸ナトリウム緩衝液、クエン酸／クエン酸ナトリウム等の緩衝液として使用するのが好ましい。なかでも、臭気および保存安定性の両面より、乳酸緩衝液が好ましい。
【００１９】
前述の方法で調製した固定化酵素リアーゼと澱粉または澱粉分解物の溶液を反応させることで１，５−ＡＦの製造を行った。１，５−ＡＦの生成量は、高速液体クロマトグラフを用いて表１に記載の条件で測定することで算出した。
【００２０】
【表１】
2005168454.tif 000002
【００２１】
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
実施例１（反応時ｐＨによる１，５−ＡＦ生成率への影響）
三級アミンを官能基とするスチレン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂（オルガノ社製、ＩＲＡ−９６−ＳＢ）１ｇに対してリアーゼ濃度０．１ｍｇ／ｍｌの水溶液（ｐＨ５．０）４０ｍｌを加え４℃で２４時間振とうし、樹脂に酵素リアーゼを吸着させた。
【００２３】
上記の如く調製したリアーゼ固定化樹脂１００ｇを容量２００ｍｌのガラスカラムに詰めた。その後、乳酸緩衝液を用いてｐＨを２．０から０．５毎に４．５まで調整した固形分３０重量％のデキストリン溶液を予め加熱殺菌した後、上記カラムにそれぞれ１２時間通液した。高速液体クロマトグラフを用いて１，５−ＡＦの生成率を測定した。図１に示すとおり、ｐＨが３．０〜４．５においてはほぼ一定であった。一般的に大部分の細菌が属する好中性菌の増殖可能ｐＨは４．０〜９．０であるので、微生物汚染を回避する観点から、基質ｐＨを４．０以下もしくは９．０以上にするべきであるが、９．０以上に上げると酵素活性の低下や、生成した１，５−ＡＦの変性が現れる。このようなことから、基質と酵素の反応時のｐＨは、２．５〜４．０、特に３．０〜３．５に特定される。
【００２４】
実施例２（ｐＨ調整による１，５−ＡＦの保存安定化の検討）
保存するための至適ｐＨを検討するために、５０℃での加速保存試験を行った。
【００２５】
１，５−ＡＦ含量３５％、固形分７０重量％の糖液を、乳酸緩衝液を用いてｐＨ３．０から５．５まで０．５毎に調整した後に、５０℃で保存し、高速液体クロマトグラフを用いて、組成の経時変化を調べた。その結果、図２に示すとおり、ｐＨ３．０、３．５では経時的組成変化に殆ど違いは認められなかった。また、ｐＨ５．０以上では明らかに１，５−ＡＦ含有量の低下が確認された。
【００２６】
実施例３（１，５−ＡＦ保存温度の検討）
ｐＨを３．５に調整した１，５−ＡＦ含量３６％、固形分７０％の糖液を、４℃、１５℃、３０℃、４０℃、５０℃でそれぞれ保存し、高速液体クロマトグラフを用いて、１，５−ＡＦ含有量の経時変化をそれぞれ測定した。その結果を図３に示す。温度が高くなるにつれて、顕著に１，５−ＡＦ含量が低下する傾向が見られた。この結果から、１，５−ＡＦを低温下で保存することが好ましいことが判った。
【００２７】
実施例４（好適な基質濃度の検討）
基質として、濃度を２０〜５０重量％に調整したデキストリン溶液を使用し、酵素と反応させて１，５−ＡＦを合成した。その結果、図４に示すように濃度が高いほど１，５−ＡＦの生産性が低下することが認められた。糖濃度が高いほど、その糖液中の微生物が増殖し難くなることは周知のことであり、本製造に関しても微生物汚染の観点からすると基質濃度を高めるべきであるが、必要以上に基質濃度を上げると、酵素の反応効率が低下し生産性が悪くなる。従って、微生物抑制と生産性の観点から最適な濃度を設定する必要がある。図４の基質および酵素反応で得られた反応液の菌数を測定したところ、濃度を３０重量％以上に設定すれば菌の繁殖を抑えることが可能であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】反応時のｐＨと１，５−ＡＦ生成率の関係。
【図２】５０℃で保存時の１，５−ＡＦ含有量の経時変化のｐＨ依存性。
【図３】保存時の１，５−ＡＦ含有量の経時変化の温度依存性。
【図４】１，５−ＡＦ含有量の経時変化の基質温度依存性。
【符号の説明】
【００２９】
イ  保存開始時
ロ  保存１週間後
ハ  保存１２週間後
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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