(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の全体像を高分解能、高精度に観察し、得られた画像から細胞の活性度を判定する。【解決手段】試薬と蛍光標識された細胞とをプレートの複数のウェルに注入するディスペンサと、前記ウェルに励起光を照射して細胞から発生する蛍光を受け細胞の蛍光画像を得るセンサ部と、この蛍光画像を基に細胞の活性度を判定する判定部を備えた細胞の動態などを観測する創薬スクリーニング装置であって、前記センサ部は、ニポウ方式の共焦点スキャナと、対物レンズと、この対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させる焦点位置可変手段と、前記共焦点スキャナの出力画像を撮像するカメラを含み、前記焦点位置可変手段により対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させつつ、共焦点スキャナから対物レンズを介して前記細胞に励起光を照射し、細胞のスライス画像を得る機能を有する。【選択図】図１
2005095012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬と蛍光標識された細胞とをプレートの複数のウェルに注入するディスペンサと、前記ウェルに励起光を照射して細胞から発生する蛍光を受け細胞の蛍光画像を得るセンサ部と、このセンサ部からの蛍光画像信号に適宜の処理を施す画像処理部と、この画像処理部の出力画像を基に細胞の活性度を判定する判定部と、この判定部の結果を表示する表示部と、前記プレートおよびセンサ部を移動制御する機構制御部と、前記条件の設定や各部の制御を行う制御部を備えた細胞の動態などを観測する創薬スクリーニング装置であって、
前記センサ部は、ニポウ方式の共焦点スキャナと、対物レンズと、この対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させる焦点位置可変手段と、前記共焦点スキャナの出力画像を撮像するカメラを含み、前記焦点位置可変手段により対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させつつ、共焦点スキャナから対物レンズを介して前記細胞に励起光を照射し、細胞のスライス画像を得るように構成され、
前記制御部は、あらかじめ設定された条件に基づいて前記ディスペンサを駆動して細胞と試薬を複数のウェルにそれぞれ注入する機能を有した
ことを特徴とする創薬スクリーニング装置。
【請求項２】
前記画像処理部は、３次元データ処理によって前記複数のスライス画像または長焦点画像に基づいて細胞の画像を求める機能を備えたことを特徴とする請求項１に記載の創薬スクリーニング装置。
【請求項３】
前記判定部は、時間差分画像から演算されるオプティカルフローをもとに細胞内の循環活動とブラウン運動を区別する推論部を持ち、細胞の活性度を決定する機能を有したことを特徴とする請求項１または２に記載の創薬スクリーニング装置。
【請求項４】
前記プレートに有色塗料を付着させるディスペンサを備え、
前記判定部の判定結果に基づいて着目ウェルに対してのみ前記ディスペンサでマーキングするように構成したことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の創薬スクリーニング装置。
【請求項５】
前記センサ部の焦点位置可変手段は、対物レンズまたはセンサ部全体を光軸方向に移動するように構成されたことを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の創薬スクリーニング装置。
【請求項６】
前記センサ部の焦点位置可変手段は、光軸方向への移動にピエゾアクチュエータを用いたことを特徴とする請求項５に記載の創薬スクリーニング装置。
【請求項７】
前記センサ部は、互いに焦点位置の異なるマルチヘッドを使用して、マルチヘッドを切り換えることにより焦点位置を切り換えるようにしたことを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の創薬スクリーニング装置。
【請求項８】
前記センサ部は、励起光として赤外光を使用し、２光子吸収を誘起して前記細胞から蛍光を発生させるようにしたことを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の創薬スクリーニング装置。
【請求項９】
前記ウェルに注入された細胞があらかじめ量子ドットを用いて染色されており、
前記センサ部は、前記細胞に短波長のレーザ光を照射し、識別機能を持つ分光特性を持つフィルターを介して、共焦点スキャナの出力画像をカメラで撮像するように構成したことを特徴とする請求項１ないし８のいずれかに記載の創薬スクリーニング装置。
【請求項１０】
前記センサ部は、前記共焦点スキャナの出力画像をラインセンサを用いて検出するように構成したことを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載の創薬スクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の発見あるいは新しい種類の医薬品を開発する創薬などにおいて用いられる創薬スクリーニング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬のスクリーニング装置としては、例えば蛍光試薬などで処理された細胞のスクリーニングを行う装置がよく知られている（例えば、特許文献１）。
図３は特許文献１に記載のスクリーニング装置の構成図である。この装置は、カメラに対して１−１００倍の倍率を持つ標準的な対物レンズと、電源２を持つ光源（例えば、１００Ｗ水銀−アーク灯または７５Ｗキセノンンランプ）を使用するＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立型蛍光顕微鏡のような倒立型蛍光顕微鏡１が使用される。顕微鏡対物レンズ上にはＸＹ方向にプレート４を移動させるためのＸＹステージ３がある。
【０００３】
プレート４は標準的な９６ウェルのプレートである。各ウェルには細胞が注入され、そして試薬が添加される。プレート４は顕微鏡アセンブリ１に載置された後、ＸＹステージ３によりＸＹ方向に移動され、各ウェルの細胞から発せられる蛍光像はカメラ７で受像される。カメラの出力信号は中央処理装置１０に入力され、処理されてディスプレイ１２上に蛍光像に対応した表示形式で表示される。また、ブリンタ１３にはハードコピーの記録を印刷することができる。
このようにして、試薬の細胞に対する作用効果を検出することができる。
【０００４】
なお、Ｚ軸焦点駆動機構５は、観測に先立って行う対物レンズ焦点調節のためのＺ軸方向移動機構である。また、ジョイスティック６は、ステージをＸＹＺ方向に手動で移動させるものである。その他、カメラ用の電源８、自動コントローラ９が備えられている。
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２５６０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このようなスクリーニング装置では次のような問題がある。
（１）光学的な蛍光顕微鏡では、同時に細胞の上から下までのすべての部分にピントの合った画像は得られず、焦点ボケしたぼやけた画像しか得られない。したがって、細胞全体にわたる形態や動態がよく把握できる高分解能、高精度な画像は得られない。
（２）光源の熱エネルギーが強く、細胞に悪影響を与える。
（３）観測に先立って、その都度対物レンズの焦点位置調整を行う必要がある。
（４）従来の装置では、細胞の活性度（ADMETOX：absorption,  distribution,  metabolism,  excretion  and  toxicity：吸収・分布・代謝・排泄・毒性）を画像処理で判定する際、生きている細胞の原形質流動と、死んだ細胞内のオルガネラのブラウン運動の違いが区別できず、大きな課題となっていた。このため、十分時間が経過し、死ぬか生きるかに区別された状態で、食性をみるのが現実的な方法となっていた。
【０００７】
本発明の目的は、このような課題を解決するもので、ニポウ方式の共焦点スキャナを用いると共に対物レンズの焦点位置を光軸方向に変化させつつ細胞の画像を観測することにより、細胞の全体像を高分解能、高精度に観測し、得られた画像から細胞の活性度
を判定し、判定結果を認識容易な表示形式で表示することのできる創薬スクリーニング装置を提供することにある。
本発明の他の目的は、細胞および試薬をあらかじめ設定した条件に従ってウェルへ自動注入できる創薬スクリーニング装置を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、時間差分画像からオプティカルフローを演算により求め、これに基づいて細胞内の循環活動とブラウン運動を区別する推論を行って細胞の活性度を決定できるようにした創薬スクリーニング装置を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、測定後のプレートから最適ウェルや最悪ウェルなどを見出すのを容易にするために、着目ウェルにマーキングを簡単に施すことのできる創薬スクリーニング装置を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、照射光量を少なくし細胞に対して励起光の悪影響が出ないようにした創薬スクリーニング装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１に記載の発明では、
試薬と蛍光標識された細胞とをプレートの複数のウェルに注入するディスペンサと、前記ウェルに励起光を照射して細胞から発生する蛍光を受け細胞の蛍光画像を得るセンサ部と、このセンサ部からの蛍光画像信号に適宜の処理を施す画像処理部と、この画像処理部の出力画像を基に細胞の活性度を判定する判定部と、この判定部の結果を表示する表示部と、前記プレートおよびセンサ部を移動制御する機構制御部と、前記条件の設定や各部の制御を行う制御部を備えた細胞の動態などを観測する創薬スクリーニング装置であって、
前記センサ部は、ニポウ方式の共焦点スキャナと、対物レンズと、この対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させる焦点位置可変手段と、前記共焦点スキャナの出力画像を撮像するカメラを含み、前記焦点位置可変手段により対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動させつつ、共焦点スキャナから対物レンズを介して前記細胞に励起光を照射し、細胞のスライス画像を得るように構成され、
前記制御部は、あらかじめ設定された条件に基づいて前記ディスペンサを駆動して細胞と試薬を複数のウェルにそれぞれ注入する機能を有した
ことを特徴とする。
【０００９】
このような構成によれば、ニポウ方式の共焦点スキャナにより細胞を高速に、綺麗でＳＮの良い正確な画像を得て、この画像に基づいて細胞の活性度を自動判定し、その判定結果を認識容易な形式で表示することができる。
【発明の効果】
【００１０】
以上説明したように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）共焦点スキャナを用いると共に、対物レンズの焦点位置を光軸方向に変化させてサンプルの画像を観察するため、どの細胞も全体にわたって高分解能、高精度に観察できる。
（２）従来に比べて励起光の熱エネルギーが弱く、細胞に悪影響を与えないで観測できる。
（３）細胞の活性度が自動判定できると共に、その結果が色分け表示されるなどにより、細胞の状態や薬効を簡単に把握することができる。
（４）プレート上の最適ウェルや最悪ウェルなどの着目ウェルにマーキングしておくことができるため、観測後にプレート上で着目ウェルを容易に見出すことができる。
（５）細胞の動態のトレンドも容易に把握できる。
（６）ウェルへの細胞および試薬の注入条件を様々に設定し、その条件に従って容易に自動注入することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る創薬スクリーニング装置の一実施例を示す構成図である。図１において、１００はセンサ部、２００は機構制御部、３００は画像処理部、４００はプレート（図３のプレート４に相当）、５００は判定部、６００は制御部、７００は表示部、８００はディスペンサである。
【００１２】
センサ部１００は、レーザ光源１１０、ニポウ方式の共焦点スキャナ１２０、対物レンズ１３０、焦点位置可変手段１４０、カメラ１５０から構成されている。
レーザ光源１１０から発生した励起光としてのレーザ光は、ニポウ方式の共焦点スキャナ１２０を通り、対物レンズ１３０によりプレート４００のサンプル４０１上に集束する。レーザ光により励起され発光したサンプルからの蛍光は対物レンズ１３０を経由して共焦点スキャナ１２０に戻って来て、カメラ１５０に入力される。カメラ１５０ではサンプル４０１のＸＹ平面の蛍光像が得られる。
【００１３】
ニポウ方式の共焦点スキャナ１２０は、例えば図２に示すような構成である。ただし、図２では、図１とは上下が逆の関係で示してあり、また、対物レンズ１３０およびカメラ１５０の受光素子１５１を併せて示してある。
図２において、励起光であるレーザ１２１は、マイクロレンズディスク１２２に配置された各マイクロレンズ１２３により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１２４を透過後、ピンホールディスク（ニポウディスクともいう）１２５に設けられた個々のピンホール１２６を通過し、対物レンズ１３０によりサンプル４０１に集光される。
【００１４】
サンプル４０１から発生した蛍光は再び対物レンズ１３０を通り、ピンホールディスク１２５の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホール１２６を通過した蛍光はダイクロイックミラー１２４で反射され、リレーレンズ１２９により、カメラの受光素子１５１上に蛍光画像を結像する。
ここで使用されるダイクロイックミラー１２４は、励起光１２１を透過し、サンプル４０１からの蛍光を反射するように設計されている。
【００１５】
マイクロレンズディスク１２２とピンホールディスク１２５は部材１２７で機械的に連結され、回転軸１２８の周りを一体で回転する。個々のマイクロレンズ１２３とピンホール１２６は、ピンホールディスク１２５上に形成された個々のピンホール１２６からの励起光がサンプル４０１の観察平面を走査するように配置されている。また、ピンホール１２６が並んでいる平面と、サンプル４０１の観察平面と、カメラの受光素子１５１とが互いに光学的に共役な関係に配置されているため、受光素子１５１上にはサンプル４０１の光学的断面像、すなわち共焦点画像が結像される。
【００１６】
図１に戻って、焦点位置可変手段１４０は、対物レンズ１３０の焦点位置をＺ軸方向（光軸方向）に連続的または不連続的に移動（以下走査ともいう）させるものである。焦点位置可変手段としては、例えばピエゾアクチュエータ（単にアクチュエータという）を用いることができる。以後アクチュエータを例にとって説明する。
【００１７】
機構制御部２００は、プレート４００を載置した基板ステージ（図示せず）をセンサ部１００に対して所定位置に載置すると共に各ウェルを順次観測するために基板ステージを移動するためにＸＹＺ軸方向へ適宜移動するためのＸＹＺ方向駆動と、センサ部のＸＹ軸方向位置調整のためのＸＹ方向駆動を行うものである。
【００１８】
画像処理部３００は、カメラ１５０からの画像信号を受けて、細胞の動態などを表すための適宜の画像処理やデータ処理を行う。なお、処理には、例えば、細胞の蛍光強度やカイネティクス、さらにヒストグラムや相関図などの統計的解析を行うための処理も含まれる。
処理した画像は制御部５００により表示部６００に表示される。
制御部６００は、例えばマイクロコンピュータが使用され、機構制御部２００、アクチュエータ１４０、画像処理部３００、判定部５００、ディスペンサ８００を適宜制御する。
【００１９】
ディスペンサ８００は、プレート４００の各ウェルに細胞（あらかじめ蛍光標識された生きた細胞）と試薬を例えば電磁ポンプ（図示せず）などを用いてそれぞれ注入すると共に、測定後のプレート上にマーキングするための機構を備えている。試薬としては、１種類とは限らず、複数種類の試薬、また同じ種類であっても濃度の異なる試薬などと、多種のものが適宜適用される。ディスペンサ８０１は細胞注入用、ディスペンサ８０２は試薬Ａ注入用、ディスペンサ８０３は試薬Ｂ注入用、ディスペンサ８０４はマーキング用の有色塗料塗布用である。なお、試薬や塗料用のディスペンサの個数は、実施例に限定されるものではない。
【００２０】
各ウェルに注入する細胞および試薬は、事前に制御部６００で設定・記憶されていて、その設定に従ってディスペンサ８０１，８０２,８０３の電磁ポンプが駆動され、プレート４００の各ウェルに自動注入される。このときプレート４００は、制御部６００によって制御される機構制御部２００により、注入ディスペンサに対応した位置へ自動的に移動される。
【００２１】
判定部５００は、画像処理部３００にて得られた画像処理後のデータを用いて細胞の活性度を決定する機能を有する。活性度を決定する機能の一例を次に記載する。
時間（t ）の画像と、ある時間経過後(t＋Δt）の画像との間の差分画像から、微粒子の動きベクトルを抽出する。このΔt 刻みのベクトルの流れの総体はオプティカルフローと呼ばれる。このオプティカルフローは、原形質流動の場合、一方向となり、ブラウン運動の場合、フロー方向はランダムで、積算しても長距離に行くことはない。
【００２２】
判定部５００は、時間差分画像から演算されるオプティカルフローをもとに細胞内の循環活動と、ブラウン運動を区別するプログラムを組み込んだ推論部（ＡＩ推論エンジン）を持ち、誤判定なく、細胞の活性度の判定を可能にしている。特に、原形質流動の速度は、活性度と良い関係にあり、スクリーニング開始初期において素早い判定を可能にする。
また、判定部５００は、活性度に応じて、ウェルごとに取捨選択ないし活性度に対応して色分けされたマークを付加するなどして、表示部で識別容易な表示形式として出力することもできる。
【００２３】
このような構成における動作を次に説明する。あらかじめ制御部６００に設定した情報に従って細胞および試薬のディスペンサからプレート４００の各ウェルに注入が行われる。この場合、ディスペンサ８００とプレートは制御部６００の指示に従って機構制御部２００により駆動され、相対的に移動する。
ウェルへの注入後、機構制御部２００の駆動により、プレート４００がセンサ部１００上の所定位置に設置される。
【００２４】
センサ部１００からのレーザ光（励起光）によりウェルのサンプルが照射され、細胞から蛍光が発生する。この蛍光は対物レンズ１３０、アクチュエータ１４０を通って、共焦点スキャナ１２０上に結像する。その像（細胞画像）はカメラ１５０で読取られる。
【００２５】
このとき、対物レンズ１３０はアクチュエータ１４０によりＺ軸方向に連続的または不連続的に走査される。これにより、Ｚ軸方向の上から下まで、異なる各断面位置での細胞のスライス画像がカメラ１５０でとらえられる。共焦点スキャナにより得た各スライス画像は綺麗でＳＮ比の良い正確な画像である。本発明では共焦点スキャナとしてニポウ方式の共焦点スキャナを用いているため、綺麗でＳＮ比の良い正確な画像をより高速に得ることができる。
このようにして各ウェルとも同様して画像測定する。この画像測定は所定の時間間隔で行われる。
【００２６】
画像処理部３００では、カメラ１５０で得られた複数のスライス画像をもとに細胞の深さ方向の画像がはっきりと正確に映し出された超深度の画像を得る。この画像は、ウェル中での各細胞のＺ軸方向のバラツキに関係なく、従来の蛍光顕微鏡によるボケた画像よりもより正確に細胞全体の動態をとらえた蛍光画像である。この画像データは図示しない記憶手段に適宜格納しておくことができる。
なお、画像処理にハフ変換を用いてもよい。また、アクチュエータ１４０をＺ軸方向に連続走査し、超深度の蛍光画像がカメラ１５０上で撮影されるようにしてもよい。
【００２７】
画像処理部３００により処理された画像データは、判定部５００に渡される。判定部５００では、ＡＩ推論エンジンにより、時間（t ）の画像と、ある時間経過後(t＋Δt）の画像との差分画像からオプティカルフローを演算し、細胞の活性度の判定を行う。そして、ウェルごとに活性度に応じた色分けマークを付加するなどして識別容易な表示形式のデータを出力する。また、最適ウェルや最悪ウェルがどのウェルであるかの情報も出力する。
この判定部５００での判定結果は、表示部７００上に表示される。なお、判定結果は必要に応じて記憶手段（図示せず）に記憶しておくことができる。
【００２８】
制御部６００は、ウェルの注入条件、例えば各ウェルに注入した細胞や試薬の種類や濃度などの情報を、上記判定結果と併せて表示部７００上に表示することができる。
このようにして、従来の蛍光顕微鏡を用いた装置では得られない綺麗でＳＮ比の良い正確な画像を得て、各ウェルごとに細胞の活性度を自動判定しその判定結果を認識しやすい表示形式で表示することができる。
【００２９】
他方、１つのプレートに配置されるウェルの数は、９６個から４００個、さらに８０００個へと増大傾向にあり、測定後のプレートから最適ウェルや最悪ウェルを見出すのは簡単ではなく、間違いやすいこともある。そこで、制御部６００では、判定部５００の判定結果に基づき、マーキング用のディスペンサ８０４と制御機構部２００を駆動して測定後のプレート４００の着目ウェルにのみマーキングを行う。例えば、ディスペンサ８０４より有色塗料をプレート表面の着目ウェル近傍に付着させる。
【００３０】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
例えば、実施例では３次元対物レンズ１３０をピエゾアクチュエータ１４０でＺ軸方向に走査するようにしたが、遠・中・近などのマルチヘッドを用いて３次元処理するようにしてもよい。
あるいはまた、対物レンズ１３０をピエゾアクチュエータで駆動するのではなく、対物レンズ１３０と共焦点スキャナ１２０の間に電圧制御型の可変焦点レンズを挿入して電圧制御により対物レンズのサンプルへの焦点位置を可変するようにしてもよい。
【００３１】
また、実施例ではレーザ光により励起するようにしたが、２光子吸収を利用し、励起光として赤外光を照射し、２光子吸収を誘起してサンプルから蛍光を発生させるようにしてもよい。これによれば、細胞には光エネルギーの少ない赤外光の照射で済み、細胞に対する光の影響をほぼなくすことができる。
【００３２】
また、量子ドットを用いて細胞を染色し、短波長のレーザ光で励起し、カメラのフィルターに識別機能を持つ分光特性を持たせて、サンプルの画像をカメラで撮像するようにしてもよい。これにより、感度と識別能力を容易に向上させることができる。
また、ニポウ方式の共焦点スキャナにおいて、その出力画像をラインセンサを用いて検出するようにしてもよい。これによれば、同時性と更なる高分解能性を同時に達成することができる。この場合、ラインセンサとして、マルチカラーラインセンサを用いてもよい。
【００３３】
また、ディスペンサは電磁ポンプを使用したものではなく、ピエゾアクチュエータを用いて高速化したものでもよい。
また、プレート４００は１個とは限らず、それぞれ条件の異なる複数個のプレートについて、注入条件設定、観測、判定を連続的に行うことができる。
また、画像処理部３００や判定部５００は、図では独立の構成要素として示してあるが、制御部６００に含めた構成としてもよい。
【００３４】
また、生きた細胞を共焦点スキャナ下で長時間にわたって間歇的に観測し、細胞の活性状態をトレンド表示することもできる。
【００３５】
なお、画像処理部３００で利用する画像としては、対物レンズを光軸方向に必要深さだけ走査して得られるサンプル（細胞）の断面の画像情報をカメラの同じフレーム期間内に露光させて得た画像（走査した厚さ分の長い焦点深度の画像。これを長焦点画像と呼ぶ）を用いるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明に係る創薬スクリーニング装置の一実施例を示す構成図である。
【図２】共焦点スキャナの一実施例図である。
【図３】従来のスクリーニング装置の一例を示す構成図である。
【符号の説明】
【００３７】
１００  センサ部
１１０  レーザ光源
１２０  共焦点スキャナ
１２１  レーザ
１２２  マイクロレンズディスク
１２３  マイクロレンズ
１２４  ダイクロイックミラー
１２５  ピンホールディスク
１２６  ピンホール
１２７  部材
１２８  回転軸
１２９  リレーレンズ
１３０  対物レンズ
１４０  アクチュエータ
１５０  カメラ
１５１  受光素子
２００  機構制御部
３００  画像処理部
４００  プレート
４０１  サンプル
５００  判定部
６００  制御部
７００  表示部
８００  ディスペンサ
【図１】
2005095012.tif 000003
【図２】
2005095012.tif 000004
【図３】
2005095012.tif 000005