(57)【要約】【課題】  トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子、ならびに該遺伝子を利用した形質転換体の製造方法の提供を課題とする。【解決手段】  カイコのゲノムDNAを抽出し、TIR特異的プライマーによるＰＣＲおよびシーケンシングを行い、カイコ由来のMITE様トランスポゾンOrgandyの転移酵素をコードする遺伝子を見出した。該遺伝子は、新規なトランスポゾン転移酵素をコードすることが判明した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
【請求項２】
請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のDNAを含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のDNAまたは請求項３に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項５】
請求項２に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAを含む細胞に、請求項１に記載のDNAまたは請求項３に記載のベクターを導入し、該細胞における該DNAの転移を誘導することを含む、遺伝子の突然変異を誘発させる方法。
【請求項６】
請求項２に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAを含む細胞に、請求項１に記載のDNAまたは請求項３に記載のベクターを導入し、該細胞における該DNAの転移を誘導することを含む、突然変異が誘発された形質転換体の製造方法。
【請求項７】
下記（ａ）および（ｂ）のDNAもしくはベクターを細胞に導入し、（ａ）のDNAもしくはベクターから発現したタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により、（ｂ）のDNAもしくはベクターにおける外来DNAを該細胞のゲノムに挿入することを含む、外来DNAを細胞のゲノムへ導入する方法。
（ａ）請求項１に記載のDNA、または請求項３に記載のベクター
（ｂ）外来DNAを含む、請求項２に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA、または該DNAを含むベクター
【請求項８】
下記（ａ）および（ｂ）のDNAもしくはベクターを細胞に導入し、（ａ）のDNAもしくはベクターから発現したタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により、（ｂ）のDNAもしくはベクターにおける任意のタンパク質をコードするDNAを該細胞のゲノムに挿入することを含む、任意のタンパク質を発現する形質転換体の製造方法。
（ａ）請求項１に記載のDNA、または請求項３に記載のベクター
（ｂ）プロモーターの支配下に任意のタンパク質をコードするDNAが配置された構造のDNAを含む、請求項２に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA、または該DNAを含むベクター
【請求項９】
請求項２に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAが、配列番号：５から１０のいずれかに記載の末端逆位配列を含むDNAである、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項２に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAをゲノムに保持する、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項１１】
下記（ａ）および（ｂ）のDNAもしくはベクターを保持する形質転換体。
（ａ）任意のタンパク質をコードするDNAを含む、請求項２に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA、または該DNAを有するベクター
（ｂ）請求項１に記載のDNA、または請求項３に記載のベクター
【請求項１２】
請求項２に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAが、配列番号：５から１０のいずれかに記載の末端逆位配列を含むDNAである、請求項１０または１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
昆虫またはその卵である、請求項４、１０〜１２のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１４】
昆虫がカイコである、請求項１３に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子、ならびに該遺伝子を利用した形質転換体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鱗翅目昆虫カイコ(Bombyx mori)は自然環境下では自立できないほど家畜化された昆虫である。古来より絹をつくり出す昆虫として知られているが、今日、日本での蚕糸業の衰退は覆いようもない。しかし、昆虫の中でもっとも遺伝学、生理学、生化学的情報が集積しているもののひとつであるカイコでは有用タンパク質産生の『工場』として期待が高まっている。また、地球上でもっとも多様化した動物群とみなされる昆虫を今世紀に残された未利用資源と位置付けた時、カイコの研究を発展させることは昆虫の全般的理解を深め、その資源化を促すものと期待される。これを踏まえて、カイコのゲノムプロジェクトが開始された。
【０００３】
カイコ(Bombyx mori)のゲノムプロジェクトの進行は、他の生物の事例が示すように膨大な塩基配列データをもたらす。次に期待される課題としてこのデータをもとにバイオインフォマティクスを駆使して遺伝子の機能解析することも挙げられるが、実験的に遺伝子の機能を損うことから生じた表現型の変化（突然変異）より本来の機能を特定することも必要不可欠である。さらに遺伝子機能を改変したカイコ、あるいは新たな機能を付与されたカイコの作出法（遺伝子導入または形質転換法）の開発が遺伝子の機能解明を進める上で重要である。突然変異の誘発は遺伝子の機能を解析するために有効な手段である。トランスポゾンは、突然変異の誘発手段として有効であるばかりでなく、それと同時に遺伝子導入（形質転換）の手法としてカイコの遺伝子機能を改変あるいは新たな機能の付与にも必要不可欠な材料である。
【０００４】
双翅目の昆虫であるキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogster)では、すでに前世紀にP因子を用いた遺伝子導入法が確立されていた。このことが、この昆虫種をモデル生物として位置付けさせる原動力となった。しかし、P因子が有効に働く範囲は一部の双翅目に限定されている。近年、鱗翅目由来のトランスポゾンPiggy Bacを用いた遺伝子導入技法が開発されたが、その利用は限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的はトランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子、ならびに該遺伝子を利用した形質転換体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。まず本発明者らは、カイコのogt、C108、w1の３系統をゲノムDNAの抽出に供し、TIR特異的プライマーによるPCR実験とシーケンシングを行い、カイコ由来のMITE(Miniature Inverted repeat Transposable Element)様トランスポゾンOrgandyの転移を支配する酵素（転移酵素：トランスポゼイス）をコードする遺伝子を持つコピーを確認した。即ち、本発明者らは、Organdyの転移を支配する新規なトランスポゾン転移酵素を見出すことに成功した。
【０００７】
上記のごとく本発明者らは、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子、ならびに該遺伝子を利用した形質転換体の製造方法を完成させた。即ち本発明は、
〔１〕  トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
〔２〕  〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質、
〔３〕  〔１〕に記載のDNAを含むベクター、
〔４〕  〔１〕に記載のDNAまたは〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換体、
〔５〕  〔２〕に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAを含む細胞に、〔１〕に記載のDNAまたは〔３〕に記載のベクターを導入し、該細胞における該DNAの転移を誘導することを含む、遺伝子の突然変異を誘発させる方法、
〔６〕  〔２〕に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAを含む細胞に、〔１〕に記載のDNAまたは〔３〕に記載のベクターを導入し、該細胞における該DNAの転移を誘導することを含む、突然変異が誘発された形質転換体の製造方法、
〔７〕  下記（ａ）および（ｂ）のDNAもしくはベクターを細胞に導入し、（ａ）のDNAもしくはベクターから発現したタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により、（ｂ）のDNAもしくはベクターにおける外来DNAを該細胞のゲノムに挿入することを含む、外来DNAを細胞のゲノムへ導入する方法、
（ａ）〔１〕に記載のDNA、または〔３〕に記載のベクター
（ｂ）外来DNAを含む、〔２〕に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA、または該DNAを含むベクター
〔８〕  下記（ａ）および（ｂ）のDNAもしくはベクターを細胞に導入し、（ａ）のDNAもしくはベクターから発現したタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により、（ｂ）のDNAもしくはベクターにおける任意のタンパク質をコードするDNAを該細胞のゲノムに挿入することを含む、任意のタンパク質を発現する形質転換体の製造方法、
（ａ）〔１〕に記載のDNA、または〔３〕に記載のベクター
（ｂ）プロモーターの支配下に任意のタンパク質をコードするDNAが配置された構造のDNAを含む、〔２〕に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA、または該DNAを含むベクター
〔９〕  〔２〕に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAが、配列番号：５から１０のいずれかに記載の末端逆位配列を含むDNAである、〔５〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕  〔２〕に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAをゲノムに保持する、〔４〕に記載の形質転換体、
〔１１〕  下記（ａ）および（ｂ）のDNAもしくはベクターを保持する形質転換体、
（ａ）任意のタンパク質をコードするDNAを含む、〔２〕に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA、または該DNAを有するベクター
（ｂ）〔１〕に記載のDNA、または〔３〕に記載のベクター
〔１２〕  〔２〕に記載のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAが、配列番号：５から１０のいずれかに記載の末端逆位配列を含むDNAである、〔１０〕または〔１１〕に記載の形質転換体、
〔１３〕  昆虫またはその卵である、〔４〕、〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の形質転換体、
〔１４〕  昆虫がカイコである、〔１３〕に記載の形質転換体、を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、ならびに該遺伝子を利用した形質転換体の製造方法が提供された。本発明で見出されたトランスポゾンと転移酵素の組み合わせにより、新たな形質転換系の確立がカイコおよび他種昆虫で可能となるとともに、突然変異の誘発手法の確立が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明者らによって、新規なトランスポゾン転移酵素が見出された。トランスポゾンとは、転移性遺伝因子(transposable genetic element)、または可動性遺伝因子(mobile genetic element)とも呼ばれ、DNA上のある部位から他の部位へ転移するDNA単位（断片）を言う。通常、両端に10〜50bp程度の逆位反復配列(IR)を持ち、内部に自らの転移に必要な酵素（トランスポゾン転移酵素; トランスポゼイス）をコードしている。トランスポゾン転移酵素は、あるDNA分子から他のDNA分子へと移動するトランスポゾンが転移する際の、DNA組換え反応を触媒（誘導）する酵素である。
【００１０】
上記IRはトランスポゾン転移酵素によって認識され、通常、トランスポゾンはランダムな位置に転移し、転移の標的部位の数塩基対の配列をトランスポゾンの両端に重複させる。一般的に、ゲノム上へのトランスポゾンの単純挿入により遺伝子不活性化や活性化を引き起こし、突然変異の誘発あるいは遺伝子の改変が生じる。
【００１１】
本発明はまず、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを提供する。本発明に含まれる、本発明者らによって同定されたトランスポゾン転移酵素をコードする塩基配列を配列番号：１に、該塩基配列によってコードされるトランスポゾン転移酵素のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１２】
また本発明のDNAとして、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが挙げられる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質（トランスポゾン転移酵素）と同等の生物学的機能、生化学的機能（生化学的活性）を有することを指す。これらの機能としては、例えば、本発明のトランスポゾン転移酵素の活性、即ち、上記のトランスポゾンが転移する際のDNA組換え反応を触媒する活性等を挙げることができる。該活性の有無は、当業者においては、一般的な方法によって適宜評価することが可能である。例えば、被験タンパク質について、Organdyトランスポゾン（例えば、Organdy3.0もしくは0.5）の転移を触媒可能か否かについて検討することにより、被験タンパク質がトランスポゾン転移活性を有するか否かを評価することができる。Organdyトランスポゾンが転移したか否かは、例えば、該トランスポゾンDNAの一部の領域をプローブとするサザンハイブリダイゼーション法によって容易に解析することが可能である。
【００１３】
具体的にはトランスポゾン転移酵素活性は、対象となるトランスポゾンの挿入によって生じた突然変異体について、突然変異体から野生型への復帰個体の生じる頻度を推定することで評価することができる。すなわち、上記突然変異体が劣性ホモ接合体であれば、転移酵素を与えることにより、トランスポゾンが２つ突然変異遺伝子のいずれかで切り出されると、遺伝子の野生型への復帰が生じ、表現型も復帰する。転移酵素の活性または量が多いほど復帰突然変異率が高くなる。
【００１４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAには、例えば配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等をコードするDNA、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等であって、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA等が含まれる。
【００１５】
本発明は、本発明のDNAによりコードされるタンパク質（ポリペプチド）を提供する。本発明のタンパク質の一例としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質も本発明に含まれる。
【００１６】
上記の機能的に同等なタンパク質を調製するための方法の1つの態様としては、タンパク質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法が挙げられる。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、およびPCR法等の当業者に周知の方法を用いて、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。また、タンパク質中のアミノ酸の変異は、自然界において生じることもある。本発明には、このように人工的か自然に生じたものかを問わず、本発明のタンパク質（例えば、配列番号：２）において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などにより変異したタンパク質であって、本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。
【００１７】
一般的に、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するためには、当該タンパク質を構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が考えられる。また、機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００１８】
トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質としては、これらタンパク質と他のタンパク質とが融合したものが挙げられ、これらの融合タンパク質も本発明に含まれる。融合タンパク質を作製するには、例えば、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAと他のタンパク質をコードするDNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質は、特に限定されない。
【００１９】
本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6ＸHis、10ＸHis、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag 、SV40T 抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらタンパク質をコードするDNAを本発明のタンパク質をコードするDNAと融合させ、これにより調製された融合DNAを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
【００２０】
本発明のタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内であると考えられる。
【００２１】
本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための方法としては他に、ハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wily & Sons Section 6.3-6.4)を利用して本発明のタンパク質をコードするDNA配列（例えば、配列番号：１）、またはその一部をもとに同種または異種生物由来のDNA試料から、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAから本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質を得ることは、通常行いうることである。
【００２２】
本発明のDNAには、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、本発明のトランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが含まれる。このようなDNAとしては、例えば、動物、植物、微生物に由来する本発明のタンパク質をコードするDNAのホモログ等が挙げられる。好適には、動物由来であり、より好ましくは昆虫由来であり、さらに好ましくはカイコ由来であるが、特にその由来は制限されない。
【００２３】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指すが、特にこれらの条件に限定されるものではない。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%以上）の配列の同一性を指す。
【００２４】
また、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA（配列番号：１）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を利用して、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離することも可能である。
【００２５】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術によって単離されるDNAによってコードされる、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のタンパク質には、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質と機能的に同等であり、かつ該タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有するタンパク質も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を指す。
【００２６】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００２７】
また、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明に含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。変異するアミノ酸数は、特に制限されるものではないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは、1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個のアミノ酸である。
【００２８】
あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。
【００２９】
本発明のDNAは、本発明のタンパク質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。
【００３０】
本発明のDNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本明細書において配列番号：２で示された本発明のトランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAは、配列番号：１で示される塩基配列を元に設計したDNA断片をプライマーとして用いるPCR法により調製することができる。または、その塩基配列を元に、当業者に公知の核酸化学合成法などにより、本発明のトランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを得ることもできるが、これらに限定されない。
【００３１】
また、本発明のDNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 ）。また、本発明のDNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）および／または終止コドン（TAA、TGA、またはTAG）の挿入等が挙げられる。
【００３２】
また本発明のタンパク質は、該タンパク質を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なることがあり得る。しかしながら、得られたタンパク質が、本発明のタンパク質と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明のタンパク質を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のタンパク質のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明のタンパク質はこのようなタンパク質も包含する。
【００３３】
本発明のタンパク質は「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。本発明のポリペプチドには、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などが含まれていてもよい。
【００３４】
本発明は、また、本発明のタンパク質の断片であって、本発明の上記タンパク質と機能的に同等なポリペプチドを提供する。こうした断片は全体的に前記本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３５】
好適な断片としては、必ずしも限定されるものではないが、例えば、アミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含む一連の残基とカルボキシル末端を含む一連の残基の二連の残基の欠失したアミノ酸配列を有するトランケーション(truncation)ポリペプチドが含まれる。また、αヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な（本発明のタンパク質の活性を有する）断片である。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減少した断片を含めて、本発明のタンパク質の活性を媒介するものである。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。これらのポリペプチド断片は、抗原活性を含めた本発明のタンパク質の生物学的活性を保持することが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。典型的なこうした置換は、通常、Ala, Val, LeuとIleの間、SerとThrの間、酸性残基 AspとGluの間、AsnとGlnの間、塩基性残基 LysとArgの間、または芳香族残基 PheとTyrの間で起こる。
【００３６】
本発明のタンパク質は任意の適当な方法で製造することができる。このようなタンパク質には、単離された天然に存在するタンパク質、組換え的に生産されたタンパク質（組換えタンパク質）、合成的に製造されたタンパク質、またはこれらの方法の組み合わせにより製造されたタンパク質が含まれる。任意のタンパク質（ポリペプチド）を製造するための方法（手法）は、当業者においては一般的によく知られている。組換えタンパク質は、例えば、本発明のDNAを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現したタンパク質を精製することにより調製することが可能である。一方、天然由来のタンパク質は、例えば、後述する本発明のタンパク質に対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 16.1-16.19)。ここで「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントが含まれる。
【００３７】
本発明のタンパク質（ポリペプチド）またはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細胞は、本発明のタンパク質に結合する抗体を産生するための免疫原としても使用することができる。抗体は、好ましくは、本発明のタンパク質に免疫特異的である。「免疫特異的」とは、その抗体が他のタンパク質に対するその親和性よりも本発明のタンパク質に対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
【００３８】
本発明のタンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。本発明のタンパク質あるいはそのGSTとの融合タンパク質をウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、本発明のタンパク質をマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。上記抗体は、本発明のタンパク質やこれを発現する細胞の単離、同定、および精製に利用することができる。
【００３９】
また本発明には、本発明のDNAを増幅するためのオリゴヌクレオチド（プライマー）、および本発明のDNAを検出・単離するためのオリゴヌクレオチド（プローブ）が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい態様においては、本発明者らにより同定されたDNA（配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖）に相補的な、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合には、通常、15〜100ヌクレオチド、好ましくは15〜35ヌクレオチドの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のDNAの少なくとも一部もしくは全部の配列を含む少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30ヌクレオチドの鎖長のヌクレオチドが用いられる。このようなヌクレオチドは、好ましくは本発明のタンパク質をコードするDNAに特異的にハイブリダイズするものである。「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、本発明のDNA（例えば、配列番号：１に記載のDNA）とハイブリダイズし、他のポリペプチドをコードするDNAとはハイブリダイズしないことを意味する。
【００４０】
また本発明は、本発明のDNAもしくは本発明のタンパク質をコードするDNAを含むベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持する、あるいは本発明のタンパク質を発現させるために有用である。
【００４１】
本発明のベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましい。本発明のタンパク質（ポリペプチド）を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
【００４２】
本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：カイコ）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
【００４３】
宿主細胞において発現したタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のタンパク質に組み込むことができる。これらのシグナルは目的のタンパク質に対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
【００４４】
本発明のタンパク質の回収は、本発明のタンパク質が培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のタンパク質が細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にタンパク質を回収する。
【００４５】
組換え細胞培養物から本発明のタンパク質を回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
【００４６】
また、本発明のトランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質は、例えば、生物のゲノム遺伝子に対して突然変異を導入（誘発）する方法、あるいは、所望の遺伝子(DNA)を生物のゲノム上へ導入（挿入）する方法等に利用することが可能である。本発明のタンパク質を利用したこれらの方法もまた、本発明に含まれる。
【００４７】
IRを有するトランスポゾンは、本発明のタンパク質によって該IRが認識され、通常、ランダムな位置へのトランスポゾンの挿入（転移）が起こる。このトランスポゾンの挿入により、挿入部位の遺伝子の不活性化や活性化が引き起こされ、ゲノム上の遺伝子の突然変異が誘発される。より具体的には、上記トランスポゾンとは、本発明のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAを指す。
【００４８】
本発明の好ましい態様においては、上記突然変異誘導方法は、本発明のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAを含む細胞に、本発明のDNAもしくはベクターを導入し、該細胞における該DNAの転移を誘導することを含む方法である。即ち、上記方法においては、本発明のDNAもしくはベクターから発現するトランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質の働きにより、上記DNAが細胞のゲノム上のランダムな位置へ挿入される。その結果、該DNAの挿入部位において遺伝子の突然変異が生じる。
【００４９】
また本発明の上記方法は、細胞へ本発明のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAと、本発明のDNAもしくはベクターを同時に導入（コトランスフェクション）することによっても実施することができる。
【００５０】
本発明の上記方法における「本発明のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA（「転移DNA」とも記載）」としては、例えば、Organdy3.0またはOrgandy0.5を挙げることができる。Organdy3.0の全長塩基配列を配列番号：３に、Organdy0.5の全長塩基配列を配列番号：４に示す。本発明の上記転移DNAは、必ずしも配列番号：３または５で示されるDNAに限定されず、通常、末端にIR配列を有するDNAであればよい。該IR配列としては、好適には、Organdy3.0の末端IR配列、またはOrgandy0.5の末端IR配列を挙げることができる。通常、上記IR配列は、転移DNAの両末端のそれぞれのIR配列（5'末端IR、3'末端IR）のいずれの配列であってもよい。
【００５１】
上記IR配列としては、より具体的には、配列番号：５〜１０のいずれかに記載の塩基配列を例示することができる。ここで、配列番号：５はOrgandy3.0の末端IR配列(5'側)、配列番号：６はOrgandy0.5の末端IR配列(5'側)、配列番号：７はOrgandy(AB091367)の末端IR配列(3'側)、配列番号：８はOrgandy3.0の末端IR配列(3'側)、配列番号：９はOrgandy0.5の末端IR配列(3'側)、配列番号：１０はOrgandyの末端IR配列(5'側)を示す。なお、上記Organdyをコードする遺伝子の塩基配列についての情報は、当業者においては、GenBank等の公共の遺伝子データベースを利用して、容易に取得することができる。例えば、Organdyの塩基配列は、GenBankアクセッション番号AB091367によって取得することが可能である。
【００５２】
また、本発明の転移DNAは、以下のような末端IR配列の組み合わせを有するDNAであることが好ましい。
（ａ）配列番号：５に記載のDNAと配列番号：８に記載のDNAをそれぞれ両末端とするDNA
（ｂ）配列番号：６に記載のDNAと配列番号：９に記載のDNAをそれぞれ両末端とするDNA
（ｃ）配列番号：７に記載のDNAと配列番号：１０に記載のDNAをそれぞれ両末端とするDNA
【００５３】
本発明における上記IR配列は、配列番号：５〜１０のいずれかに記載の配列に、必ずしも限定されない。例えば、配列番号：５〜１０のいずれかで示される塩基配列の一部を改変した配列であっても、本発明のタンパク質によって認識され得る配列であれば、本発明におけるIR配列として利用することが可能である。当業者においては、任意のDNAについて、本発明のタンパク質によって認識され、かつ転移が誘導されるか否かを評価することができる。評価した結果、本発明のタンパク質によって認識され、かつ転移が誘導されるものと判定されるDNA（断片）は、本発明の「転移DNA」として利用することが可能である。
【００５４】
また本発明の「転移DNA」に、本発明のトランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれていてもよい。即ち、転移酵素をシスに供給することにより、本発明の方法を実施することが可能である。また、好ましい態様においては、本発明の上記方法は、本発明のタンパク質をトランスに供給することにより実施することができる。即ち、本発明の転移DNAには、本発明のタンパク質をコードするDNAを含まなくともよい。
【００５５】
本発明の方法によって変異の誘導が可能な細胞は、特に制限されず、任意の細胞を本発明の方法に供することができる。本発明の変異誘導方法に供することが可能な細胞としては、通常、動物細胞、植物細胞等を挙げることができるが、好ましくは、カイコ細胞である。
【００５６】
本発明において上記細胞は、本発明の転移DNAを含む（保持する）細胞であり、通常、細胞のゲノム上へ該転移DNAを有する細胞が好適に用いられるが、特にこの形態に限定されず、例えば、本発明の転移DNAを担持するベクター（プラスミド）を含むような細胞も、利用することが可能である。該ベクターは、当業者においては、使用する細胞の種類等を考慮して、適宜、適切なベクターを選択することができる。例えば、上述の各種ベクターを好適に利用することができる。また、本発明の転移DNAを担持するベクターも、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術を用いて適宜作製することが可能である。該ベクターの細胞への導入も、例えば、上述の種々の方法によって行うことができる。
【００５７】
また本発明は、上記突然変異導入方法を利用した、突然変異が誘発された形質転換体（突然変異体）の製造方法を提供する。上記製造方法の好ましい態様においては、本発明のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNAを保持する細胞に、本発明のDNAもしくはベクターを導入し、該細胞における該DNAの転移を誘導することを含む、製造方法である。
【００５８】
本発明の上記突然変異誘導方法、もしくは突然変異体の製造方法は、所謂「トランスポゾン・タッギング(transposon tagging)」と呼ばれる遺伝子クローニング方法に応用することが可能であり、非常に有用である。トランスポゾン・タッギングは、例えば、以下のような方法によって行うことができる。遺伝子のクローニングを行う細胞について、本発明の上記方法により、ゲノム遺伝子の突然変異を誘導させ、突然変異体を多数作出する。目的の遺伝子の機能（活性）を失った（低下した）突然変異体を選抜し、その染色体から本発明の転移DNA（もしくは該DNAの一部）をプローブとして、該DNAが挿入されたゲノム断片をクローニングする。このゲノム断片の中には、本発明の転移DNAが挿入されたために機能（活性）が失われた（低下した）目的の遺伝子が存在することが期待される。
【００５９】
本発明の突然変異誘導方法の一例として、以下のような方法を示すことができるが、特にこの方法に限定されない。
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を、供与体（トランスポゾン転移酵素）として用いる。
（２）これを直接、Organdy3.0は欠くがOrgandyを有する系統の卵に導入し、それから生じる胚の生殖細胞中でのこのMITE(Miniature Inverted repeat Transposable Element)の転移を誘発する。
（３）転移の結果生じた新たな挿入による遺伝子機能の欠損（挿入突然変異）を表現型の変化として確認し、遺伝子の機能解析に供する。
【００６０】
さらに本発明は、本発明のタンパク質もしくはDNAを利用した、任意の外来DNAを細胞へ導入する方法に関する。本発明において外来DNAの細胞への導入とは、通常、該細胞のゲノムへの外来DNAの導入を指す。
【００６１】
上記方法の好ましい態様においては、本発明の転移DNAへ外来DNAが挿入された構造、もしくは転移DNAの一部の配列と外来DNAとが置換された構造のDNA（これらのDNAを「外来DNA担持転移DNA」と記載する場合あり）、および本発明のタンパク質を発現するDNAを細胞へ導入し、本発明のタンパク質が有するトランスポゾン転移活性により、外来DNA担持転移DNAを細胞のゲノムへ挿入させることを特徴とする方法である。
【００６２】
本発明の上記方法の好ましい態様においては、下記（ａ）および（ｂ）のDNAもしくはベクターを細胞に導入し、（ａ）のDNAもしくはベクターから発現したタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により、（ｂ）のDNAもしくはベクターにおける外来DNAを該細胞のゲノムに挿入することを含む、外来DNAを細胞のゲノムへ導入する方法である。
（ａ）本発明のDNAもしくはベクター
（ｂ）外来DNAを含む、本発明のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA、または該DNAを含むベクター
【００６３】
上記方法において、転移DNAへ外来DNAを挿入することは、当業者においては、通常の遺伝子工学技術を用いて用意に行うことができる。また、本発明の転移DNAの一部の塩基配列を外来DNAに置換することも、当業者においては、通常行い得ることである。
【００６４】
また、上記の外来DNA導入方法に使用される細胞は、本発明の転移DNAもしくは該DNAの部分領域をゲノム中に含まないような細胞であることが好ましい。
【００６５】
また上記方法を利用して、任意のタンパク質を細胞において発現させることが可能である。即ち、任意のタンパク質をコードするDNAが発現可能なように機能的にプロモーターと連結させた構造のDNAを、上記の外来DNAとして、本発明の上記方法により、細胞のゲノムへ挿入させればよい。
【００６６】
従って本発明は、本発明のタンパク質を用いた、任意のタンパク質を細胞において発現させる方法を提供する。該方法により、任意のタンパク質を発現している形質転換体の製造が可能である。
【００６７】
本発明の上記方法の好ましい態様においては、下記（ａ）および（ｂ）のDNAもしくはベクターを細胞に導入し、（ａ）のDNAもしくはベクターから発現したタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により、（ｂ）のDNAもしくはベクターにおける任意のタンパク質をコードするDNAを該細胞のゲノムに挿入することを含む、任意のタンパク質を発現する形質転換体の製造方法である。
（ａ）本発明のDNAもしくはベクター
（ｂ）プロモーターの支配下に任意のタンパク質をコードするDNAが配置された構造のDNAを含む、本発明のタンパク質のトランスポゾン転移酵素活性により転移が誘導されるDNA、または該DNAを含むベクター
【００６８】
また、本発明の方法の一例として、より具体的に以下のような方法を示すことができるが、特にこの方法に限定されない。
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を、供与体（トランスポゾン転移酵素）として用いる。
（２）Organdy0.5もしくはOrgandy3.0の内部を任意の遺伝子に入れ替える形の遺伝子組換え（形質転換）用ベクターを作製する。
（３）Organdy3.0を欠くカイコもしくは他種昆虫の卵に（１）の供与体と、（２）の遺伝子組換え用ベクターを同時に導入し、Organdy3.0にコードされているトランスポゾン転移酵素活性により胚の生殖細胞の核ゲノムへの組換えを誘発させ、形質転換を起こさせる。
（４）成長した導入個体を交配し、導入した遺伝子の特徴を基に遺伝子組換え体をスクリーニングし、回収する。
【００６９】
さらに本発明は、本発明のDNAまたはベクターを保持する形質転換体、並びに、本発明の転移DNAを保持する形質転換体を提供する。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。ここでDNAの「保持」とは、通常、ゲノムに該DNAが挿入されている状態を指すが、プラスミド等のように、ゲノムへ挿入されずに存在する状態であってもよい。なお、本発明において「形質転換体」とは、通常、外来DNAが導入され、その結果、該外来DNAの形質を示すようになった細胞（細胞体）を指すが、必ずしも、形質が該細胞の表現型として表れた場合に限定されない。導入されたDNAの形質が表現されない、もしくは検出されない場合であっても、外来DNAが導入された細胞（細胞体）であれば、本発明における「形質転換体」に含まれる。
【００７０】
本発明の形質転換体は、その種類等は特に制限されないが、好ましくは昆虫もしくはその卵、またはこれら由来の細胞である。該昆虫とは、好ましくはカイコである。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００７２】
Organdyは両端に40bpの末端逆位反復をもつDNA型のトランスポゾンである。その大きさと挿入部位の重複（Target Site Duplication: TSD）の特性からMITE (Miniature Inverted repeat Transposable Element)とみなされ、特に、TSDがTAAないしTTAという特性よりトウモロコシのtouristとの関連が推測されていた。本実施例ではTIR特異的プライマーによるPCR実験とシーケンシングを行った。
【００７３】
〔実施例１〕  TIR特異的プライマーによるPCRおよびシーケンシング
カイコのogt、C108、w1の３系統をゲノムDNAの抽出に供した。５齢幼虫の後部絹糸腺または成虫全体を液体窒素で凍結後粉砕し、これをプロテネイスK含有の緩衝液に懸濁し、５０℃で３時間処理した。これをフェノール／クロロフォルムで抽出後、ゲノムDNAの粗抽出物をエタノール沈澱させ回収した。さらにRNAエイス処理によりRNAを消化・除去した後、クロロフォルム抽出を経てゲノムDNAを精製した。
【００７４】
Organdyを増幅するために、公開されているOrgandyの548bpの塩基配列(GenBank Accession Number:AB091367)の両端に位置する末端逆位反復（Terminal Inverted Repeat: TIR）にもとづき２種のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し用いた（図１）。一方は両TIRに対応する22塩基よりなる縮合オリゴヌクレオチドプライマーである（プライマー１tgc ygg aac cac act gcg yta t／配列番号：１１）。もう一方は、このOrgandyの３'側のTIR特異的な20塩基のオリゴヌクレオチドプライマーである（プライマー２／配列番号：１２）。
【００７５】
PCRは次の条件で行った：0.2mMの各dNTP、400nMのプライマー1ないし２（末端逆位反復を利用しているため、１種類で増幅反応が可能）、2.5μlの10xExTaq緩衝液、そして1.25単位のExTaq polymeraseを含む反応液に10ngのカイコゲノムDNAを鋳型として加え、総量を25μlにして反応に供した。PCR反応はTaKaRa PCR Thermal cycler MPを用いて行った。反応条件は、96℃３分間の加温後、次の温度処理（96℃ 20秒、50℃ 20秒、72℃ 5分）を30回くり返した。さらに、68℃で５分間の加温後、4℃まで冷却して反応を終了した。
【００７６】
増幅産物はアガロース電気泳動で分離し、ゲルを臭化エチジューム染色後、紫外線照射下で確認した。その後、増幅産物はQIAPrep PCR purification kit (QIAGEN)を用いて精製し、pGem-T easy vector (Promega)にクローニングし、シーケンシング反応に供した。
【００７７】
ABI提供のプロトコールにしたがい、BigDye Terminatorシーケンシングキットver 1ないしver 3（ABI）によるシーケンシング反応をpGem-T easy vector特異的プライマーで最初に行い、クローンの両端の塩基配列を決定した。この配列に基づき、次のプライマーを合成してプライマーウォーキングとして残りの塩基配列を順次解読した。シーケンシング反応はTaKaRa PCR Thermal cycler MPを用いて行った。シーケンシング反応物の電気泳動・シグナル検出にはABI Sequencer 3100を用いた。
【００７８】
プライマーウォーキングにより決定したそれぞれの塩基配列はSequence Assembler (ABI)を用いて結合した。ORFの探索、アミノ酸配列への翻訳等はGenetyx-Mac ver 11（日本ゼネティクス）を用いて行った。その結果、次のことが判明した。
【００７９】
１）両端のTIRのコンセンサス塩基配列に基づくプライマー１を用いたPCRでは、上記の約550bpの配列（Organdy0.5：図３）に対応する断片が過剰に増幅されたことにより、これよりも大きなDNA断片の確認は困難であった。
【００８０】
２）３'側のTIRの塩基配列に基づくプライマー２を用いたPCRでは、Organdy0.5の他により長い断片が増幅されるようになった。w1系統ではOrgandy0.5以外に1.4kbと3.0kbの断片の増幅が確認された。しかし、ogtとC108系統では3.0kbの断片の増幅は見られなかった。1.4kbと3.0kbの増幅断片を以後Organdy1.4および3.0（図２）と称する。
【００８１】
３）上記PCRで増幅されたOrgandy0.5、1.4および3.0をクローニングし塩基配列を決定したところ、Organdy0.5、1.4、3.0の5'側のTIRにはAB091367の配列と比較して７bpの欠失がみられた。これはOrgandyの転移に最小限必要な末端逆位反復の長さが23bpである可能性を示唆する。
【００８２】
４）Organdy1.4はOrgandy0.5にカイコ特異的レトロポゾンであるBm1と未知のDNA断片が異なる部位に挿入した構造であることが確認された。すなわち、Organdy1.4はカイコゲノム中に頻繁に観察されるトランスポゾン中にさらにトランスポゾンが挿入したネステッド構造をとるものである。
【００８３】
５）Oragndy3.0は Organdy0.5全域と相同な両端（5'末、3'末とも250bp程度）を持つが、その内側はOrgandy1.4とは著しく異なる塩基配列である。Oragndy3.0では登録されているOrgandy (AB091367)の塩基配列の相補鎖にタンパク質をコード可能な領域（Open Reading Frame: ORF）を２ヶ所確認した。２番目のORF (ORF2)には、イネのMITE様トランスポゾンであるping/pong（Jiang N, Bao Z, Zhang X, Hirochika H, Eddy SR, McCouch SR, and Wessler SR. 2003.  An active DNA transposon family in rice.  Nature 421:163-167.、Kikuchi K, Terauchi K, Wada M, and Hirano HY. 2003.  The plant MITE mPing is mobilized in anther culture.  Nature 421:167-170.、Nakazaki T, Okumoto Y, Horibata A, Yamahira S, Teraishi M, Nishida H, Inoue H, and Tanisaka T. 2003.  Mobilization of a transposon in the rice genome. Nature. 421:170-172.）の第２ORFにコードされているとされるトランスポゼイスと有意な相同性、すなわち、198アミノ酸残基を比較して23.3%の一致がみられるタンパク質がコードされていた (配列番号：２)。また、ORF数およびトランスポゼイス様配列をコードするORFが２番目にあることもping/pongと共通していた。
【００８４】
以上の結果より、Organdy3.0にはOrgandyの転移を支配するトランスポゼイスがコードされていると結論した。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】TIRにおける配列の変異を表す図である。＃はPCRプライマーとアニールする領域を示す。Organdy3.0は、このプライマーを用いて増幅したため、この領域の配列はプライマーと完全一致する。5'側、3'側同士のTIRで塩基が一致する場合は、＊を付して表した。従ってOrgandy3.0の5'側TIRでは登録されているOrgandyに比べて７塩基対の欠失が観察された。
【図２】Organdy3.0の全体塩基配列を示す図である。GenBank Accession Number:AB091367として登録されている配列の相補鎖側に当たる。末端逆位配列（TIR）は太字で表し、下線を施した。PCRプライマーとアニールする領域には＃を付した。TIRの内側に位置する順方向不完全配列は波下線を施して表した。トランスポゼイスをコードすると考えられる配列部分は□で囲って表した（翻訳されたアミノ酸配列は、配列番号：２を参照）。
【図３】Organdy0.5の全体塩基配列を示す図である。GenBank Accession Number:AB091367として登録されている配列の相補鎖を表す。末端逆位配列（TIR）は太字で表し、下線を施した。PCRプライマーとアニールする領域には＃を付した。TIRの内側に位置する順方向不完全配列は波下線を施して表した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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