(57)【要約】      （修正有）【課題】アンジオスタチン組成物の提供。【解決手段】内皮形成インヒビターであるアンジオスタチンは、血液または尿から単離され、高速液体クロマトグラフィ−のＣ４逆相から単一のピークとして溶出されるタンパク質である。前記内皮形成インヒビターは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した測定でおよそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、マウスのプラスミーゲン分子のアミノ酸番号９８から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと非常に似たアミノ酸配列を有するタンパク質を含む分子である。アンジオスタチンを含む組成物による血管形成の介在する疾患およびプロセスの治療方法、および体液または組織中におけるアンジオスタチンの検出、または診断のキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、プラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８から始まるプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有し、抗血管形成活性を有するタンパク質を含む単離されたアンジオスタチンタンパク質。
【請求項２】
プラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８から始まるおよそクリングル１〜４領域のアミノ酸配列を有し、抗血管形成活性を有するタンパク質を含む単離されたアンジオスタチンタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質がヒトのプラスミノーゲン、マウスのプラスミノーゲン、ウシのプラスミノーゲン、アカゲザルのプラスミノーゲンまたはブタのプラスミノーゲンに由来する請求の範囲第１項または２項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項４】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列で始まるアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項または２項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項５】
前記プラスミノーゲンフラグメントはウシ内皮細胞検定においてインビトロでの内皮細胞増殖阻害活性を有する請求の範囲第１項または２項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が癌の成長を阻害することができる請求の範囲第１項または２項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項７】
癌が前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌からなるグループから選択される請求の範囲第６項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項８】
抗血管形成活性を有し、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、プラスミノーゲン分子のおよそアミノ酸番号９８から始まるプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有するアンジオスタチンタンパク質をコードする配列を有する単離されたヌクレオチド分子を含む組成物。
【請求項９】
抗血管形成活性を有するアンジオスタチンタンパク質をコードする配列を有する単離されたヌクレオチド分子を含み、前記アンジオスタチンタンパク質はプラスミノーゲン分子のおよそクリングル１〜４領域を含む組成物。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列で始まるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする請求の範囲第８項または９項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アンジオスタチンタンパク質がウシ内皮細胞検定においてインビトロでの内皮細胞増殖を阻害する活性を有する請求の範囲第８項または９項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アンジオスタチンタンパク質が癌の成長を阻害することができる請求の範囲第８項または９項に記載の組成物。
【請求項１３】
癌が前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌からなるグループから選択される請求の範囲第１２項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アンジオスタチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列はベクターに挿入されており、前記ベクターは細胞中に存在するときにアンジオスタチンタンパク質を発現することができる請求の範囲第８項または９項に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞中にベクターをトランスフェクトさせる工程を含むアンジオスタチンタンパク質を発現させる方法であって、前記ベクターは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、プラスミノーゲン分子のおよそアミノ酸番号９８から始まるプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有するアンジオスタチンタンパク質をコードする配列を有する単離されたヌクレオチド分子を含み、前記ベクターは細胞中に存在する時にアンジオスタチンタンパク質を発現することができることを特徴とするアンジ
オスタチンタンパク質を発現させる方法。
【請求項１６】
細胞中にベクターをトランスフェクトさせる工程を含むアンジオスタチンタンパク質を発現させる方法であって、前記ベクターは、抗血管形成活性を有し、プラスミノーゲン分子のおよそクリングル領域１〜４領域を含むアンジオスタチンタンパク質をコードする配列を有するヌクレオチド分子を含み、前記細胞はアンジオスタチンタンパク質を発現させることができることを特徴とするアンジオスタチンタンパク質を発現させる方法。
【請求項１７】
前記発現がインビトロで行われる請求の範囲第１５項または１６項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列で始まるアミノ酸配列をコードする請求の範囲第１５項または１６項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列が癌の成長を阻害することができるアンジオスタチンタンパク質をコードする請求の範囲第１５項または１６項に記載の方法。
【請求項２０】
癌が乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、線維芽細胞癌および細網癌からなるグループから選択される請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２１】
還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、プラスミノーゲン分子のおよそアミノ酸番号９８から始まるプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有するアンジオスタチンタンパク質の濃度を測定する工程を含む、サンプル中のアンジオスタチンタンパク質の濃度を決定する方法。
【請求項２２】
プラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８から始まるおよそクリングル領域１〜４領域を含み且つ抗血管形成活性を有する、サンプル中のアンジオスタチンタンパク質の濃度を測定する工程を含む、サンプル中のアンジオスタチンタンパク質の濃度を決定する方法。
【請求項２３】
サンプル中の前記アンジオスタチンタンパク質が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列で始まるアミノ酸配列を有する請求の範囲第２１項または２２項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アンジオスタチンタンパク質がウシ内皮細胞検定において内皮細胞増殖阻害活性を有する請求の範囲第２１項または２２項に記載の方法。
【請求項２５】
サンプルが哺乳動物の体液から得られることを特徴とする請求の範囲第２１項または２２項に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物が血管形成が介在する疾患または症状を有することを特徴とする請求の範囲第２５項に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物が癌を有することを特徴とする請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物において血管形成を阻害するアンジオスタチンタンパク質を含む医薬組成物であって、前記アンジオスタチンタンパク質はプラスミノーゲン分子のおよそクリングル領域１〜４領域を含み、抗血管形成活性を有することを特徴とする血管形成阻害を必要とする患者を治療するための医薬組成物。
【請求項２９】
哺乳動物において血管形成を阻害するアンジオスタチンタンパク質を含む医薬組成物であって、前記アンジオスタチンタンパク質は抗血管形成活性を有し、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値でおよそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、プラスミノーゲン分子のおよそアミノ酸番号９８から始まるプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を有することを特徴とする血管形成阻害を必要とする患者を治療するための医薬組成物。
【請求項３０】
前記アンジオスタチンタンパク質が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列で始まるアミノ酸配列を有する請求の範囲第２８項または２９項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記アンジオスタチンタンパク質がウシ内皮細胞検定において内皮細
胞増殖阻害活性を有する請求の範囲第２８項または２９項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
哺乳動物が血管形成により介在される疾患または症状を有する請求の範囲第２８項または２９項に記載の組成物。
【請求項３３】
哺乳動物が癌を有することを特徴とする請求の範囲第３２項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の表示】
【０００１】
本出願は、１９９４年４月２６日に出願された米国出願の部分継続出願である、１９９４年１０月２０日に出願された米国出願第０８／３２６，７８５号の部分継続出願である。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、アンジオスタチン(angiostatin)と称され、可逆的に内皮細胞の増殖を阻害する内皮形成インヒビターに関する。さらに詳細には、本発明は、血液や尿などの体液から単離できる、または、組換えを使用する方法、酵素を使用する方法もしくは化学的方法により合成できるアンジオスタチンタンパク質に関する。アンジオスタチンは、血管形成関連性疾患を抑制でき、また血管形成プロセスを調節できる。さらに本発明は、アンジオスタチン測定のための診断アッセイおよびキット、アンジオスタチンの位置特定(localization)のための組織化学検査キット、アンジオスタチンおよびアンジオスタチンの生合成をモニターする分子プローブをコードするＤＮＡ配列、アンジオスタチンに特異的な抗体、アンジオスタチンレセプターに対するペプチドアゴニストおよびアンタゴニストの開発、抗アンジオスタチンレセプター特異的抗体アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにアンジオスタチンペプチドに結合した細胞毒性物質に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書で使用する、血管形成という用語は、組織や器官内で新しい血管が発生することを意味する。通常の生理学的条件下では、ヒトおよび動物は、非常に限定された状況においてのみ血管形成を行う。たとえば、通常、傷の治癒、胎児または胚の発達、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成時において観察される。内皮(endothelium) とは、漿液腔(serous cavity)、リンパ管および血管の内側にある扁平な上皮細胞の薄い層のことである。
【０００４】
制御下および非制御下における血管形成は、どちらも同じように進行すると考えられる。基底膜に囲まれた内皮細胞と周辺細胞(pericyte)が毛細血管を形成する。血管形成では先ず、内皮細胞および白血球の放出する酵素によって基底膜が浸食される。次いで、血管の内膜を覆う内皮細胞が基底膜を貫いて突き出る。血管形成刺激因子の誘導により、浸食された基底膜を通って内皮細胞が遊動する。遊動した細胞が、親血管から肉芽(sprout)を形成し、ここで内皮細胞が細胞分裂と増殖を行う。内皮肉芽が互いに融合して毛細血管蹄(capillary loop)を形成し、新しい血管をつくる。
【０００５】
さまざまな疾病、腫瘍転移や内皮細胞の異常な増殖においては、持続的で非制御下の血管形成が起きており、これらの状態において見られる病理学的傷害の原因となっている。非制御下の血管形成を起こすさまざまな疾病の病理学的状態は、血管形成依存型か血管形成関連型の疾病に分類されている。
【０００６】
腫瘍の成長は血管形成依存性であるという仮説が始めて提唱されたのは、１９７１年である(非特許文献１)。この論文は、非常にシンプルな表現で次のように述べている。「いったん腫瘍が出現すると、腫瘍細胞集団が増殖するに先立ち、必ず腫瘍上に収束する新しい毛細血管が増大する。」ガンの出現は、現時点では、腫瘍の成長における前血管形成(prevascular)段階、すなわち大きさが数立方ミリメーターで且つ数百万個までの細胞集団が、既存の宿主の微小血管によって生存できる段階にあたると理解されている。この段階を越えて腫瘍が大きくなるには、新たな毛細血管の誘導が必要である。たとえば、マウスの早期前血管形成段階の肺微小転移は、組織切片を高性能の顕微鏡で観察しなければ検出
できない。
【０００７】
この考え方を支持する間接的な証拠の例には、以下のものがある。
（１）マウスの皮下の透明間腔(transparent chamber)に移植された腫瘍の成長速度は、血管形成前は緩慢で直線的な増加を示し、血管形成後は急速で指数的な増加を示す(非特許文献２)。
【０００８】
（２）単離された灌流臓器中の、血管が増殖しない腫瘍は、１〜２ｍｍ3までにしか成長できないが、これがマウスに移植されて血管形成すると、この大きさの１，０００倍超にまで急速に大きくなる(非特許文献３)。
【０００９】
（３）血管のない角膜における腫瘍の進行は、緩慢で直線的な成長を示すが、血管形成後は指数的な成長に転じる(非特許文献４)。
【００１０】
（４）ウサギの前眼房の水性液に懸濁された腫瘍は、１ｍｍ3未満の大きさの無血管性腫瘍のまま生存する。これはいったん虹彩血管床に移植されると、血管形成して急速に成長し、２週間以内に元の大きさの１６，０００倍にまで達する(非特許文献５)。
【００１１】
（５）腫瘍は、ニワトリの胚の漿尿膜上に移植されると、７２時間までの無血管性段階の間は緩慢に成長し、平均直径は０．９３＋０．２９ｍｍを越えない。血管形成開始後は、２４時間以内に急速な腫瘍の増大が起こり、７日目までにこれらの血管形成した腫瘍の平均直径は８．０＋２．５ｍｍに達する(非特許文献６)。
【００１２】
（６）ウサギの肝臓における転移巣の血管検査(vascular cast of metastases)は、転移腫瘍の大きさは不均一であるが、血管形成が起こる大きさの限界点は比較的均一であることを示した。腫瘍は、一般に直径１ｍｍまでは無血管性で、これを越えると血管が形成される(非特許文献７)。
【００１３】
（７）膵島のベータ細胞に腫瘍を発生する形質転換マウスにおいて、前血管形成の肥大した島は、大きさが１ｍｍまでである。６〜７週の週齢で、４〜１０パーセントの島で血管形成が起こり、これらの島は前血管形成段階の島の大きさの１０００倍以上の大きな血管形成腫瘍となる(非特許文献８)。
【００１４】
（８）ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子：vascular endothelial growth factor) に対して特異的な抗体は、微小血管密度を低下させ、ＶＥＧＦを血管形成の唯一のメディエーターとしている３種類のヒトの腫瘍の成長を「非常に強く」阻害する（ヌードマウスにおいて）。この抗体は、インビトロにおける腫瘍細胞の成長は阻害しない(非特許文献９)。
【００１５】
（９）抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体は、血管形成の唯一のメディエーターとしてｂＦＧＦの分泌に依存するマウスの腫瘍の成長を、７０％阻害する。この抗体は、インビトロにおける腫瘍細胞の成長は阻害しない（非特許文献１０)。
【００１６】
（１０）ｂＦＧＦの腹腔内投与は、腫瘍内の毛細管内皮細胞の成長を刺激することにより、一次腫瘍の成長と転移を促進する。腫瘍細胞それ自体はｂＦＧＦのレセプターを有さず、ｂＦＧＦはインビトロにおいて腫瘍細胞の分裂促進因子ではない(非特許文献１１) 。
【００１７】
（１１）特定の血管形成インヒビター（ＡＧＭ−１４７０）は、インビボにおいて腫瘍の成長と転移を阻害するが、インビトロでは腫瘍細胞の増殖を阻害する活性がずっと低い。このインヒビターは、腫瘍細胞の増殖を阻害する場合より４桁低い濃度で、血管内皮細胞の最大増殖の半分を阻害する(非特許文献１２)。さらに、腫瘍の成長が血管形成依存性で
あるという間接的な臨床所見が報告されている。
【００１８】
（１２）ガラス体に転移するヒトの網膜芽細胞腫瘍は、（摘出した目から取り出してインビトロで分析する場合は）生存して3Ｈ−チミジンを取り込むにもかかわらず、１ｍｍ3未満の大きさに限られた無血管性の球体に進行する。
【００１９】
（１３）卵巣癌は、小さな無血管性の白いシードとして腹膜に転移する（１〜３ｍｍ3）。これらは、そのうちのひとつまたは複数が血管形成するまではまれにしか大きくならない。
【００２０】
（１４）乳癌(非特許文献１３および１４) および前立腺癌(非特許文献１５) における血管形成の強度は、将来の転移のリスクの大きさと強く相関する。
【００２１】
（１５）ヒト皮膚メラノーマからの転移は、血管形成以前に起こることはまれである。血管形成が開始すると、病巣の厚みの増大および転移リスクが増大する(非特許文献１６)。
【００２２】
（１６）膀胱癌においては、疾患の状態および程度を表す指標としては、細胞学的指標よりも血管形成ペプチドであるｂＦＧＦの尿中濃度のほうが感度が高い（非特許文献１７)。
【００２３】
このように、腫瘍の転移において血管形成が主要な役割を果たしていることは明らかである。この血管形成作用を抑制または消失させることができれば、腫瘍は、存在したとしても大きくはならないことになる。疾患において、血管形成を防止することで、新しい微小管系の侵襲による傷害を防止できる可能性がある。血管形成プロセスの制御を目的とする療法は、これらの疾患を治癒または緩和できる可能性がある。
【００２４】
従って、好ましくない血管の増殖、特に腫瘍内への増殖を防止できる組成物および方法が必要とされる。また、前記組成物を検出、測定、位置特定する方法も必要とされる。前記組成物は、転移前の腫瘍中における内因性の成長因子の作用に打ち勝ち、腫瘍内における毛細血管の形成を防止し、これによって腫瘍の成長を抑制できるものであるべきである。前記組成物、組成物のフラグメント、および組成物に特異的な抗体は、また、傷の治癒や生殖などの他の血管形成プロセスに起こる毛細血管の形成も調節できるべきである。前記組成物および血管形成を防止する方法は、好ましくは毒性がなく副作用が少ないものであるべきである。また前記組成物の生合成の部位および前記組成物の結合部位を検出、測定、位置特定する方法も必要とされる。前記組成物および前記組成物のフラグメントは、放射活性および放射活性以外のいずれもの標識のための他の分子と結合させることができるべきである。
【非特許文献１】Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications., N. Engl. Jour. Med. 285:1182-1186, 1971
【非特許文献２】Algire GH, et al. Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6:73-85, 1945
【非特許文献３】Folkman J, et al., Tumor behavior in isoloated perfused organs: In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segment. Annals of Surgery 164:491-502, 1966
【非特許文献４】Gimbrone, M.A., Jr. et al., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Institute 52:41-427, 1974
【非特許文献５】Gimbrone MA Jr., et al., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularizaion. J. Exp. Med. 136:261-276
【非特許文献６】Kninghton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cancer, 35:347-356, 1977
【非特許文献７】Lien W., et al., The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970
【非特許文献８】Folkman J. et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339:58-61, 1989
【非特許文献９】Kim K J, et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362:841-844, 1993
【非特許文献１０】Hori A et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51:6180-6184, 1991
【非特許文献１１】Gross JL, et al. Modulation of solid tumor growth by bFGF. Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31:79, 1990
【非特許文献１２】Ingber D, et al., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48:555-557, 1990
【非特許文献１３】Weidner N, et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324:1-8, 1991
【非特許文献１４】Weidner N, et al., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma, J Natl. Cancer Inst. 84:1875-1887, 1992
【非特許文献１５】Weidner N, Carroll PR, Flax J, Blumenfeld W, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143(2):401-409, 1993
【非特許文献１６】Srivastava A, et al., The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0.76-4.0 mm thick skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133:419-423, 1988
【非特許文献１７】Nguyen M, et al., Elevated levels of an angiogenic peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. cancer Inst. 85:241-242, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
このように、本発明の目的のひとつはアンジオスタチンを含む組成物を提供することに
ある。
【００２６】
本発明の他の目的は、血管形成の介在する疾患およびプロセスを治療する方法を提供することである。
【００２７】
本発明のさらに別の目的は、体液または組織中におけるアンジオスタチンの有無および濃度を検出する診断または予知のための方法およびキットを提供することである。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、これに限定されないが、血管腫、固形腫瘍、血液由来腫瘍、白血病、転移、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管形成、クローン病、プラーク血管形成、冠動脈側副枝、大脳側副枝、動静脈異常形成、虚血性四肢血管形成、角膜疾患、皮膚潮紅、血管形成緑内障、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖、関節炎、糖尿病性血管形成、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、ヘリコバクター関連性疾患、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、排卵、月経、胎盤形成、およびネコ引っ掻き熱などを含む血管形成が介在する疾患およびプロセスの治療のための方法と組成物を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、癌の治療またはその成長を抑制する組成物を提供することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、インビボまたはインビトロにおいてアンジオスタチンを産生する酵素の産生または活性を調節または模擬する組成物を提供することである。
【００３１】
本発明のさらに別の目的は、このようなアンジオスタチンまたは抗アンジオスタチン抗体を必要としているヒトまたは動物に、アンジオスタチンＤＮＡを直接注入することにより、アンジオスタチンまたは抗アンジオスタチン抗体を提供することである。
【００３２】
本発明のひとつの目的は、体液中のアンジオスタチンに対して特異的な抗体の有無および量を検出する方法を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに別の目的は、プラスミノーゲンは認識せず、アンジオスタチン分子内の特定の領域に選択的なアンジオスタチンに対する抗体からなる組成物を提供することである。
【００３４】
本発明の別の目的は、癌の検出または予後診断の方法を提供することである。
【００３５】
本発明の別の目的は、インビボおよびインビトロにおいてアンジオスタチン結合部位の可視化および定量に使用する組成物を提供することである。
【００３６】
本発明のさらに別の目的は、アンジオスタチン生合成の検出および定量に使用する組成物を提供することである。
【００３７】
本発明のさらに別の目的は、副作用が最小限である癌の治療法を提供することである。
【００３８】
本発明のさらに別の目的は、癌の治療または癌の成長を抑制する細胞毒性物質を結合したアンジオスタチンまたはアンジオスタチンペプチドを含む組成物を提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、アンジオスタチン関連組成物を特定の部位にターゲッティド送達するための方法を提供することである。
【００４０】
本発明のさらに別の目的は、血管形成プロセスの調節のための遺伝子治療に有用な組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
本発明は、アンジオスタチンと称され、インビトロにおいてｂＦＧＦなどの内因性の成長因子の血管形成作用を克服する能力と、プラスミノーゲンのアミノ酸番号９８付近から始まるプラスミノーゲン内の一部分とのアミノ酸配列および構造的類似性を特徴とするタンパク質を含む。アンジオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した測定でおよそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、マウスの完全なプラスミーゲン分子のアミノ酸番号９８から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと非常に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質からなる（配列番号２）。
【００４２】
アンジオスタチンのアミノ酸配列は、種間でわずかに異なる。たとえば、ヒトのアンジオスタチンにおいて、アミノ酸配列は、上記のマウスのプラスミノーゲンフラグメントの配列とほとんど同一であるが、活性なヒトのアンジオスタチン配列は、完全なヒトプラスミノーゲンのアミノ酸番号９７または９９のいずれかのアミノ酸から始まっている。さらに、ヒトのプラスミノーゲンのフラグメントは、マウスの腫瘍モデルにおいて示されるものと類似の抗血管形成活性を有する。なお、活性なアンジオスタチン分子のアミノ酸の数は変化する場合があり、内皮抑制活性を有する全てのアミノ酸配列が本発明に含まれる。
【００４３】
本発明は、血管形成を抑制するに十分な用量の、実質的に精製されたアンジオスタチンまたはアンジオスタチン誘導体を含む組成物をヒトまたは動物に投与することにより、望まれないおよび制御されない血管形成が介在する疾患およびプロセスを治療する方法および組成物を提供するものである。本発明は、特に、腫瘍の治療、または腫瘍の成長の抑制に有用である。前血管形成転移性腫瘍を有するヒトまたは動物にアンジオスタチンを投与することにより、これらの腫瘍の成長または増大が防止される。
【００４４】
また、本発明は、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、およびアンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を含有する一以上の発現ベクターを含有する細胞をも包含する。さらに、本発明は、インビボでのアンジオスタチン濃度を改善する目的でアンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を患者に導入する遺伝子治療法も包含する。
【００４５】
また、本発明は、生物学的液体および組織中におけるアンジオスタチン検出および測定、組織および細胞内におけるアンジオスタチンの位置特定のための診断方法およびキットも含む。前記診断方法およびキットは、当業者に広く知られているいかなる構成のものでもよい。また、本発明は、アンジオスタチン分子およびその分子の一部分に特異的な抗体、およびアンジオスタチンに特異的な抗体の結合を阻害する抗体をも含む。これらの抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。腫瘍や他の血管形成が介在する疾患の発病または再発の診断および予知を目的とする、アンジオスタチンの有無や量を検出する診断キットにおいて、アンジオスタチンに特異的な抗体を使用することができる。アンジオスタチンに特異的な抗体はまた、ヒトまたは動物に投与して、ヒトまたは動物にアンジオスタチンに対する受動免疫を与え、これにより血管形成の阻害を小さくすることもできる。
【００４６】
また、本発明は、体液中のアンジオスタチンと結合する抗体の有無およびその量を検出するための方法およびキットをも含む。この診断方法およびキットは、当業者に広く知られているいかなる構成のものでもよい。
【００４７】
また、本発明は、アンジオスタチンレセプターに結合して、細胞に適切なシグナルを伝達し、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗アンジオスタチンレセプター特異的抗体をも含む。
【００４８】
また、本発明は、ポジトロンエミッショントモグラフィ、オートラジオグラフィー、フローサイトメトリー、ラジオレセプター結合アッセイおよび免疫組織化学検査を含むが、これらに限定されない手法による、アンジオスタチン結合部位の検出および可視化のための、アイソトープ標識または他の分子もしくはタンパク質で標識できるアンジオスタチンペプチドフラグメントおよびアナログを含む。
【００４９】
また、これらのアンジオスタチンペプチドおよびアナログは、アンジオスタチンレセプターにおいて、アゴニストおよびアンタゴニストとして作用し、アンジオスタチンの生物学的活性を増強または妨害する。このようなペプチドは、アンジオスタチンレセプターの単離に使用される。
【００５０】
また、本発明は、治療および研究目的で細胞毒性薬剤と結合させた、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン抗血清、またはアンジオスタチンレセプターアゴニストおよびアンジオスタチンレセプターアンタゴニストを含む。さらにまた、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン抗血清、またはアンジオスタチンレセプターアゴニストおよびアンジオスタチンレセプターアンタゴニストは、薬学的に許容される賦形剤、および任意に生分解性ポリマーなどの徐放性化合物または組成物と組合わされて治療用組成物を形成する。
【００５１】
本発明は、アンジオスタチンの転写および翻訳に関与するリボ核酸およびデオキシリボ核酸を検出する分子プローブを含む。これらの分子プローブは、組織および細胞内でのアンジオスタチン生合成を検出および測定する手段を提供する。
【００５２】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および効果は、下記の開示された実施態様の詳細な説明および添付の請求の範囲により理解されよう。
【発明の効果】
【００５３】
本発明は、血管形成を調節し、および望まれない血管形成、特に腫瘍の成長に関連する血管形成を抑制するに有効な組成物および方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明は、血管形成が介在するまたは血管形成を伴う疾患およびプロセスの検出および治療のための組成物および方法を包含する。前記組成物は、アンジオスタチンであり、アンジオスタチンは、血清、尿および腹水を含むがこれらに限定されない体液から単離し、または化学的または生物学的方法（たとえば、細胞培養、組換え遺伝子発現、ペプチド合成、および活性なアンジオスタチンを生じるプラスミノーゲンまたはプラスミンのインビトロ酵素分解) によって合成することができる。組換え法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ源からの遺伝子増幅、および逆転写酵素／ＰＣＲを使用するＲＮＡ源からの遺伝子増幅が含まれる。アンジオスタチンは、未血管形成または血管形成腫瘍などの組織内への血管成長を抑制する。
【００５５】
また、本発明は、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を保有するベクターを含み、前記ベクターは細胞内に存在するときにアンジオスタチンを発現できるものである組成物、ベクターを有する細胞を含み、前記ベクターはアンジオスタチンまたはそのフラグメントもしくはアナログをコードするＤＮＡ配列を有するものであり、前記ベクターは細胞内に存在するときにアンジオスタチンを発現できるものである組成物、および、ベクター
を有する細胞をヒトまたは非ヒト動物に移植することを含み、前記ベクターはアンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を有するものであり、前記ベクターは細胞内に存在するときにアンジオスタチンを発現できるものである方法を包含する。
【００５６】
さらにまた、本発明は、治療用の組成物を製造するために薬学的に許容される賦形剤、および必要に応じ生分解性ポリマーなどの徐放性物質または組成物と組み合わせた、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン抗血清、アンジオスタチンレセプターアゴニスト、またはアンジオスタチンレセプターアンタゴニストを包含する。特に本発明は、アンジオスタチンと特異的に結合する抗体を含み、前記抗体はプラスミノーゲンと結合しない組成物を包含する。
【００５７】
さらに詳細には、本発明は、アンジオスタチンと称される、およそ３８〜４５キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有し、インビトロにおいてｂＦＧＦなどの内因性成長因子の血管形成活性を打ち消すことのできるタンパク質を含む。アンジオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した測定でおよそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、マウスの完全なプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８から始まるマウスプラスミノーゲンフラグメントと実質的に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質である。「実質的に類似した」という表現は、アンジオスタチンアミノ酸配列に関して使用される場合、抗血管形成活性を有し、およそ３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有するアミノ酸配列で、またマウスのプラスミノーゲンのアミノ酸番号９８付近のアミノ酸から始まる、３８ｋＤ〜４５ｋＤの分子量のマウスのプラスミノーゲンのペプチドフラグメントとの配列と高い相同性を有するアミノ酸配列であるということである。非常に高い相同性とは、少なくともおよそ６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくともおよそ７０％のアミノ酸同一性、さらに好ましくは少なくともおよそ８０％のアミノ酸同一性を指す。ここで使用される「内皮抑制活性」とは、たとえば線維芽細胞成長因子存在下において培養中のウシの毛細管内皮細胞の成長を抑制するなどの一般的な血管形成を抑制する分子の能力を指す。
【００５８】
完全なマウスのプラスミノーゲン分子のアミノ酸配列を図１および配列番号１に示す。アンジオスタチンの配列は、およそ９８番目のアミノ酸から始まる。活性なヒトのアンジオスタチンも、完全なヒトプラスミノーゲン分子の９７または９９番目のアミノ酸から始まっていると考えられる。マウスから得たアンジオスタチンの始めの３３９個のアミノ酸のアミノ酸配列は図２（配列番号２）に示され、ヒト（配列番号３）、アカゲザル（配列番号４）、ブタ（配列番号５）、ウシ（配列番号６）のプラスミノーゲン由来の相当するプラスミノーゲンペプチドフラグメントの配列と比較されている。これらの配列が、それらのアミノ酸の５０％より多くが同一であることを考えると、アンジオスタチンのアミノ酸配列は種間で実質的には同一であると理解される。アンジオスタチンのアミノ酸の総数は、正確には分かっていないが、活性分子の分子量によって決められる。本発明のアンジオスタチンのアミノ酸配列は、プラスミノーゲン分子が由来する種により異なるかもしれない。このように、ヒトプラスミノーゲン由来の本発明のアンジオスタチンは、マウス由来のアンジオスタチンと配列が少し異なるが、マウスの腫瘍モデルにおいて示されるように抗血管形成活性を有する。
【００５９】
アンジオスタチンは、インビトロにおいて内皮細胞の成長を抑制する能力があることが判明している。アンジオスタチンは、他の細胞タイプに由来する細胞系の成長は抑制しない。特に、アンジオスタチンは、ルイス肺癌(Lewis lung carcinoma)細胞系、ミンク肺上皮細胞、３Ｔ３線維芽細胞、ウシ大動脈平滑筋細胞、ウシ網膜色素上皮、ＭＤＣｋ細胞（イヌ腎臓上皮）、ＷＩ３８細胞（ヒト胎児肺線維芽細胞）、ＦＥＮ細胞（マウス胎児線維芽細胞）およびＬＭ細胞（マウス結合組織）に対しては作用しない。腫瘍を有するマウス内の内因性アンジオスタチンは、およそ１０ｍｇアンジオスタチン／ｋｇ体重の全身濃度
において、転移腫瘍を抑制する作用がある。
【００６０】
アンジオスタチンは、プラスミノーゲン分子のクリングル領域により決定される特異的な三次元コンフォメーションを有する(Robbins, K.C., "The plasminogen-plasmin enzyme system" Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice, 2nd Edition,
ed. by Colman, R.W. et al. J.B. Lippincott Company, pp. 340-357, 1987) 。こういったクリングル領域はプラスミノーゲン分子のＮＨ2 末端部分に５つあり、これらはコンフォメーション的に関係したモチーフで、実質的な配列相同性がある。アンジオスタチンの三次元コンフォメーションは、プラスミノーゲンクリングル領域１〜３および４の一部を包含すると考えられる。プラスミノーゲン分子の各クリングル領域は、約８０アミノ酸からなり、３つのジフルフィド結合が含まれる。このシステインモチーフは、他の生物学的活性を有するタンパク質にも存在することが知られている。これらのタンパク質には、これらに限定されないが、プロトロンビン、肝細胞成長因子、拡散因子(scatter factor)、およびマクロファージ刺激タンパク質が含まれる(Yoshimura, T, et al., "Cloning, sequencing, and expression of human macrophage stimulating protein (MSP, MST1) confirms MSP as a member of the family of kringle proteins and locates the MSP gene on Chromosome 3" J. Biol. Chem., Vol.268, No.21, pp.15461-15468, 1933) 。三次元クリングル様コンフォメーションまたはシステインモチーフを有する、インビボにおいて抗血管形成活性を有する単離タンパク質またはペプチドはすべて、本発明の範囲であると考えられる。
【００６１】
また本発明は、癌などの疾患の診断または予後観察の目的での体液および組織中のアンジオスタチンの検出も含む。また本発明は、細胞および組織中のアンジオスタチン結合部位およびレセプターの検出を含む。また本発明は、これに限定されるものではないが関節炎や腫瘍などを含む血管形成性疾患およびプロセスを、アンジオスタチンの産生を刺激すること、および／または、高度に精製されたアンジオスタチンまたはアンジオスタチンアゴニストもしくはアンタゴニストおよび／またはアンジオスタチン抗血清またはアンジオスタチン抗血清に対する抗血清を患者に投与することによって、治療または予防する方法を含む。さらなる治療方法には、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチンアナログ、アンジオスタチン抗血清、または細胞毒性剤を結合させたアンジオスタチンレセプターアゴニストおよびアンタゴニストの投与を含む。なお、アンジオスタチンは、動物由来でも人間由来のものでもよいと理解されるものである。アンジオスタチンは、化学反応または発現システムと連係した組換え法により合成されてもよい。アンジオスタチンは、単離されたプラスミノーゲンまたはプラスミンを酵素で切断して血管形成活性を有するペプチドを形成することにより製造することもできる。アンジオスタチンは、また、プラスミノーゲンを切断してアンジオスタチンにする内因性酵素の作用を模倣する物質によって作成することもできる。アンジオスタチン産生は、また、プラスミノーゲン切断酵素の活性に作用する物質により調節できる。
【００６２】
アンジオスタチンと特異的に結合する抗体を使用した受動的抗体療法は、生殖、発達、および傷の治癒と組織の修復などの血管形成依存性プロセスの調節に使用することができる。さらに、アンジオスタチン抗体のＦａｂ領域に対する抗血清を投与して、アンジオスタチンと結合する内因性のアンジオスタチン抗血清の作用をブロックすることができる。
【００６３】
また本発明は、患者の体内でアンジオスタチンをコードする遺伝子をコントロールするという遺伝子療法も包含する。遺伝子産生タンパク質の発現のために細胞にＤＮＡを移入または送達する様々な方法、または遺伝子治療と呼ばれる方法が、Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356 (1992) に開示されている。この内容は、引用により本明細書に含める。遺伝子治療には、エクスビボまたはインビボ治療のいずれかで使用するための、体細胞または生殖系細胞内に
ＤＮＡ配列を組み込むことが含まれる。遺伝子治療は、遺伝子を交換、正常または異常な遺伝子機能を増幅し、感染症や他の病気に対抗する作用をする。
【００６４】
これらの医学的問題を遺伝子治療で治療するという手法には、欠陥のある遺伝子を識別した後に機能を有する遺伝子を付与して欠陥遺伝子の機能を代替するか、機能が少しある遺伝子を増幅するといった治療手法、症状を治療するまたは組織や器官の治療に対する感受性をより高めるような産生タンパク質をコードする遺伝子を付与するといった予防的手法が含まれる。予防的手法の例としては、アンジオスタチンなどの遺伝子を患者の体内に導入し血管形成の発生を予防する、または腫瘍細胞の放射線に対する感受性を高める遺伝子を導入してから腫瘍に放射線照射をすれば殺傷される腫瘍細胞数が増加するなどがある。
【００６５】
本発明において、アンジオスタチンＤＮＡまたはアンジオスタチン調節配列を導入する多くのプロトコールが想定されている。特にアンジオスタチンに関連して通常見られるものとは異なるプロモーター配列、またはアンジオスタチンタンパク質の産生を増幅させる他の配列のトランスフェクションも、遺伝子治療の方法として想定されている。この技術の例は、Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Massachusettsにみられるが、これは相同組換えを使用して細胞内のエリスロポエチン遺伝子を活性化する「遺伝子スイッチ」を挿入するものである。Genetic Engineering News, April 15, 1994を参照のこと。通常の状態でアンジオスタチン（またはアンジオスタチンレセプター) を発現しない細胞内においてアンジオスタチン（またはアンジオスタチンレセプター) を活性化するのに、このような「遺伝子スイッチ」を使用できる可能性がある。
【００６６】
遺伝子治療における遺伝子導入方法は、広く三つのカテゴリーに分類される。すなわち、物理的方法（エレクトロポーレーション、遺伝子直接導入および粒子砲撃(particle bonbardment)等）、化学的方法（脂質ベースのキャリア、または他の非ウイルス性ベクター) 、および生物学的方法（ウイルス由来ベクターおよびレセプター取り込み)である。たとえば、ＤＮＡでコートしたリポゾームを含む非ウイルス性ベクターを使用することもできる。このようなリポゾーム／ＤＮＡ複合体は、患者に直接に経静脈投与することができる。このリポゾーム／ＤＮＡ複合体は肝臓に濃縮され、肝臓でＤＮＡはマクロファージやクッペル(Kupffer)細胞に送達されると考えられている。これらの細胞は寿命が長く、したがって長期間にわたって送達されたＤＮＡの発現が得られる。さらに、治療用ＤＮＡのターゲッティド送達として、ベクターや遺伝子のネイクト(naked)ＤＮＡを、所望の器官、組織または腫瘍に直接注入することもできる。
【００６７】
遺伝子治療の方法論は、送達場所に関して説明することもできる。基本的な遺伝子の送達方法には、エクスビボ(ex vivo)遺伝子導入、インビボ(in vivo)遺伝子導入、およびインビトロ(in vitro)遺伝子導入が含まれる。エクスビボ遺伝子導入においては、細胞を患者から採取し細胞培養で増殖させる。この細胞にＤＮＡを導入し、ＤＮＡが導入された細胞の数を増やし、患者に再移植する。インビトロ遺伝子導入においては、形質転換細胞は、組織培養細胞等の細胞培養で成長させた細胞で、特定の患者から採取された特定の細胞ではない。これらの「実験室細胞」にＤＮＡが導入され、それぞれ患者への移植や他の用途において、導入細胞を選択し、増加させる。
【００６８】
インビボ遺伝子導入では、細胞が患者の体内にある状態で患者の細胞内にＤＮＡが導入される。この方法には、患者への遺伝子送達に非感染性ウイルスを使用したウイルス媒介遺伝子導入を使用すること、または患者内の治療部位にネイクトＤＮＡを注入し、遺伝子産生タンパク質が発現される細胞の一部にＤＮＡを取り込ませることを含む。さらに、たとえば「遺伝子銃」の使用などの、ここに記載する他の方法も、アンジオスタチンＤＮＡまたはアンジオスタチン調節配列のインビトロ挿入に使用することができる。
【００６９】
遺伝子治療の化学的方法には、細胞膜を通過してＤＮＡを運ぶ脂質ベースの化合物（必ずしもリポゾームでなくてもよい）も含まれ得る。負に帯電するＤＮＡに結合する正に帯電する脂肪をベースにするイオンであるリポフェクチン(lipofectin)またはサイトフェクチン(cytofectin)は、細胞膜を通過して細胞内部にＤＮＡを供給できる複合体を形成する。他の化学的方法では、レセプターに基づく飲食作用を使用するが、これには、特定のリガンドと細胞表面のレセプターの結合およびこれを包み込んで細胞膜を通って移動させる段階が含まれる。リガンドがＤＮＡと結合し、複合体全体が細胞内に移送される。リガンド遺伝子複合体は血中に注入され、レセプターを有する標的細胞が特異的にリガンドと結合してリガンド−ＤＮＡ複合体が細胞内に移送される。
【００７０】
多くの遺伝子治療方法では、細胞内に遺伝子を入れるのにウイルスベクターを使用している。たとえば、改変したレトロウイルスベクターは、エクスビボ法において、遺伝子を、末梢および腫瘍浸潤リンパ球、肝臓細胞、表皮細胞、筋細胞、または他の体細胞中に遺伝子を導入するために使用されている。これらの改変細胞は、次いで患者に導入され、挿入ＤＮＡによる遺伝子産物を供給する。
【００７１】
ウイルスベクターは、また、インビボプロトコールにおいて細胞に遺伝子を入れるために使用されている。外来遺伝子の組織特異的な発現を得るために、組織特異的であることが判明しているシス作用性調節要素またはプロモータを使用することができる。あるいは、これは、インビボの特異的な解剖組織学的部位へのＤＮＡまたはウイルスベクターのインシチュ(in situ)送達により達成できる。たとえば、インビボにおける血管への遺伝子導入は、インビトロで遺伝子導入した内皮細胞を動脈壁の選択された部位に移植することで達成された。周囲の細胞もウイルスに感染し、遺伝子産物を発現した。たとえばカテーテルなどでウイルスベクターをインビボ部位に直接送達し、一定の部分のみウイルスに感染させて長期的で部位特異的な遺伝子発現を得ることができる。レトロウイルスベクターを使用したインビボ遺伝子導入もまた、その器官に通じる血管中に改変したウイルスを注入することで、乳房組織および肝臓組織において実証されている。
【００７２】
遺伝子治療プロトコールに使用されているウイルスベクターには、レトロウイルス、ポリオウイルスやシンドビスウイルスなどの他のＲＮＡウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアおよび他のＤＮＡウイルスなどが含まれるがこれらに限定されるものではない。複製欠損マウスレトロウイルスベクターが、もっとも広範に使用される遺伝子導入ベクターである。マウス白血病レトロウイルスは、タンパク質コア（ｇａｇ）の中に納まり、宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）で周囲を被覆された、ＲＮＡと核コアタンパク質とポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素の複合体である。レトロウイルスの遺伝子構造は、５’および３’のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）の間に位置するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ウイルスの構造タンパク質がイントランス(in trans)にパッケージング細胞株に供給されれば、５’および３’ＬＴＲおよびパッケージングシグナルを保有する最低限のベクターで、ベクターパッケージング、感染、標的細胞への取り込みが十分に可能になるということをレトロウイルスのベクターシステムでは利用している。遺伝子導入におけるレトロウイルスの基本的な利点は、大半のタイプの細胞が有効に感染して遺伝子を発現すること、標的細胞の染色体ＤＮＡ中に正確に単一コピーベクターを挿入できること、およびレトロウイルスゲノムの取扱いが簡易であることが含まれる。
【００７３】
アデノウイルスは、キャプシドタンパク質で周囲を取り囲まれた、コアタンパク質と複合体を形成した直鎖状の二本鎖ＤＮＡからなる。分子ウイルス学における進展により、これらの生物の生理を利用してインビボにおいて標的細胞内に新しい遺伝子配列を導入できるベクターを作成することができるようになった。アデノウイルスに基づくベクターは、
遺伝子産物ペプチドを高濃度に発現する。アデノウイルスベクターは、ウイルスの力価が低くても感染効率が高い。さらに、ウイルスは、無細胞状態のビリオンとしても完全な感染力を有するので、産生細胞系の注入が不要である。その他のアデノウイルスベクターに考えられる利点は、インビボにおいて長期間にわたり異種遺伝子の発現を得られることである。
【００７４】
ＤＮＡ送達の物理的方法には、リポゾームや他の膜融合のための小胞などの融合性脂質小胞、リポフェクチンのようなＤＮＡを取り込むカチオン脂質の脂質粒、ＤＮＡのポリリジン媒介移送、胚や体細胞内へのＤＮＡのマイクロインジェクションなどのＤＮＡの直接注入、「遺伝子銃」で使用される金粒子などのような空気圧により送達されるＤＮＡ被覆粒子、およびリン酸カルシウムＤＮＡ導入などのような無機化学的方法が含まれる。別の方法であるリガンド媒介遺伝子治療では、特定の細胞や組織にＤＮＡを向かわせるために、ＤＮＡを特定のリガンドと複合させてリガンドＤＮＡ複合体を形成させる。
【００７５】
プラスミドＤＮＡを筋肉細胞に注射すると、ＤＮＡ導入され、マーカー遺伝子を持続的に発現する細胞を高い割合で得られることが判明している。プラスミドのＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれる場合もあれば組み込まれない場合もある。導入ＤＮＡが取り込まれない場合は、最終的に分化した非増殖性の組織において、長期間、細胞またはミトコンドリアゲノム中における突然変異による挿入、欠失、改変の恐れもなく、遺伝子産物タンパク質のトランスフェクションおよび発現をさせることができる。永久である必要はないが、長期間にわたる特定の細胞への治療遺伝子の導入は、遺伝性疾患または予防的使用における治療を可能とする。レシピエント細胞のゲノムに突然変異が起こることなく、遺伝子産物レベルを一定に維持するためにＤＮＡを定期的に再注射することができる。外来ＤＮＡが取り込まれないことは、全てのＤＮＡ構築物が様々な遺伝子産物の発現を行う状態で、ひとつの細胞内に数種類の異なる外因性ＤＮＡ構築物の存在を可能とし得る。
【００７６】
粒子媒介遺伝子導入方法は、始め植物組織の形質転換に使用されていた。ＤＮＡをコートした高密度粒子（金またはタングステンなど）を、標的器官、組織または細胞を貫通できるだけの高速に加速させるための原動力を得るのに、粒子砲撃装置、または「遺伝子銃」を使用する。粒子砲撃は、インビトロシステムで、またはエクスビボまたはインビボ手法と組みあわせて、細胞、組織または器官にＤＮＡを導入するために使用できる。
【００７７】
遺伝子導入のためのエレクトロポーレーションでは、細胞または組織がエレクトロポーレーション媒介遺伝子導入を受けやすくするために、電流を使用する。ＤＮＡ分子が細胞内へと通過できるように膜の透過性を高くするために、所定の電場を伴う短い電気インパルスを使用する。この技術は、インビトロシステムで、またはエクスビボもしくはインビボ手法と組みあわせて、細胞、組織または器官にＤＮＡを導入するために使用できる。
【００７８】
外来ＤＮＡを細胞に導入するのに、インビボにおけるキャリア媒介による遺伝子導入を使用できる。キャリア−ＤＮＡ複合体は、簡便に体液または血流中に導入され、次いで部位特異的に体内の標的器官または組織に向かう。リポゾームと、ポリリジン、リポフェクチンまたはサイトフェクチンなどのポリカチオンとの双方とも使用できる。細胞特異的または器官特異的なリポゾームを作成でき、このようにリポゾームによって運ばれる外来ＤＮＡは、標的細胞中に取り込まれる。特定の細胞上の特定のレセプターを標的とする免疫リポゾームの注入は、レセプターを保有する細胞へＤＮＡを導入する簡便な方法として使用できる。これまで使用されてきた別のキャリアシステムは、インビボ遺伝子導入のために、ＤＮＡを肝臓細胞に運ぶためのアシアロ糖タンパク質／ポリリジン複合体システムを使用するものである。
【００７９】
また、ＤＮＡがレシピエント細胞に運ばれた後に細胞質内または核質内に留まるように
、導入ＤＮＡを他の種類のキャリアと複合化させることもできる。特別に作成した小胞複合体中の核タンパク質キャリアと結合させ、直接核に運搬されるようにすることもできる。
【００８０】
アンジオスタチンの遺伝子調節は、アンジオスタチン遺伝子、またはアンジオスタチン遺伝子に関連する制御領域、または相当するＲＮＡ転写物と結合する化合物を投与して、転写または翻訳の速度を調節することで行える。さらに、インビボでアンジオスタチンを供給する源を提供するために、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を導入した細胞を患者に投与することもできる。たとえば、アンジオスタチンをコードする核酸配列を含むベクターを細胞を導入することもできる。
【００８１】
ここにおいて使用される「ベクター」という用語は、特定の核酸配列を含有またはこれに関連し、その特定の核酸配列を細胞内に移送する機能を果たすキャリアのことである。ベクターの例には、プラスミド、およびウイルスなどの感染性微生物、またはリガンド−ＤＮＡ複合体、リポゾーム、脂質−ＤＮＡ複合体などの非ウイルス性ベクターがある。アンジオスタチンＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子は、アンジオスタチンを発現できる発現ベクターを形成するために発現制御配列と作用可能に結合されていることが望ましい。感染細胞は患者の正常組織由来の細胞でも、患者の疾患組織の細胞でもよく、または患者の細胞でなくともよい。
【００８２】
たとえば、患者から切除した腫瘍細胞を、本発明のアンジオスタチンタンパク質を発現するベクターで形質転換し、患者に再度導入することもできる。形質転換した腫瘍細胞は、患者の体内において腫瘍の生育を抑制できる濃度のアンジオスタチンを産生する。患者はヒトでもヒト以外の動物でもよい。細胞は、非ベクターのもの、またはエレクトロポーレーション、イオンポーレーション、または「遺伝子ガン」の使用など、当業で既知の物理的または化学的方法で形質転換させてもよい。さらに、アンジオスタチンＤＮＡを、キャリアの助けなしに、直接患者に注入してもよい。特に、アンジオスタチンＤＮＡは、皮膚、筋肉または血液に注入することができる。
【００８３】
患者にアンジオスタチンを導入するための遺伝子治療プロトコールは、細胞のまたはミニクロモゾームのゲノムにアンジオスタチンＤＮＡを組み込むことによるものでも、細胞の細胞質または核質内で別個に複製する、または複製しないＤＮＡ構築物によって行うものでもよい。アンジオスタチンの発現は、長期間継続するものでも、細胞、組織もしくは器官内のアンジオスタチンタンパク質濃度または血中濃度を所望の値に維持するために定期的に注入を繰り返してもよい。
【００８４】
アンジオスタチンは、ＨＰＬＣ Ｃ４カラム（表３を参照）で単離することができる。アンジオスタチンタンパク質は、アクリロニトリルグラジエントの３０％〜３５％において溶出される。還元条件でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、活性を有するタンパク質バンドは、約３８キロダルトンの位置に単一のピークとして溶出される。
【００８５】
本発明者らは、転移腫瘍内の血管形成を抑制し、これにより転移腫瘍そのものの成長を抑制するアンジオスタチンを含む、内皮細胞増殖に対して特異的なインヒビターが、一次腫瘍の成長中には血液流へ放出されていることをすでに証明している。一次腫瘍に伴って放出されるアンジオスタチンの発生源は、知られていない。この物質は、特殊なプロテアーゼによるプラスミノーゲンの分解により産生されるが、アンジオスタチンを、アンジオスタチンをコードする特定の遺伝子の発現によって産生させることができた。
【００８６】
一次腫瘍が血管を形成する表現型となるのは、血管形成ペプチドの産生が正常細胞の産
生する内皮細胞インヒビターに優る場合であるが、この内皮細胞インヒビターは悪性転換中は産生低下調節(down-regulated)を受けると考えられている。個々の腫瘍細胞におけるアンジオスタチンの産生が、親細胞での産生に比較して減少する調節を受けていても、腫瘍全体が産生するインヒビターの総量は、循環系に流入して離れた部位の微小転移腫瘍の内皮成長を抑制するのに十分である可能性がある。アンジオスタチンは、一次腫瘍の放出する血管形成ペプチドよりもずっと長期間にわたり循環系に残存する。このように血管形成ペプチドは局所的に作用するが、アンジオスタチンは全身的に作用し、幾分長い半減期で血中を循環する。アンジオスタチン半減期は、およそ１２時間から５日である。
【００８７】
以下の仮説に拘束されることを望むものではないが、ある腫瘍が血管形成状態になると、１種類または複数の血管形成ペプチドを放出するが（例、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦなど）、これは局所的に作用し、近隣の一次腫瘍内の内皮を血管外の方向から攻撃するが、循環しない（または短い半減期で循環する）と考えられる。一次腫瘍がその集団を拡大し続けるためには、これらの血管形成ペプチドは、内皮細胞インヒビター（血管形成のインヒビター）の作用に打ち勝つに十分な量を産生される必要がある。いったん、こういった一次腫瘍が順調に成長を始めると、腫瘍は内皮細胞インヒビターを血管中に放出し続ける。この仮説によれば、これらのインヒビターは一次腫瘍から離れた場所で作用し、血管内の方向から転移腫瘍の毛細血管内皮に作用し、循環を続ける。このように、離れた場所にある転移腫瘍がちょうど血管形成を開始しようという時、その近隣の毛細血管内皮は流入するアンジオスタチンにより抑制を受けていることとなる。
【００８８】
一次腫瘍が、循環系に継続的にアンジオスタチンを放出するような大きさにいったん到達すると、二つ目の腫瘍移植片（または微小転移腫瘍）がその血管形成を開始または増大させることは難しい。一つ目の腫瘍の移植の直後に二つ目の腫瘍移植片（たとえば、皮下スペース内、または角膜内、または経静脈的に肺内への移植）を移植した場合は、一つ目の腫瘍は二番目の腫瘍を十分に抑制できない（二番目の腫瘍の血管形成が、十分に開始してしまうため）。二つの腫瘍を同時に移植した場合は（例、両わきなど）インヒビターは互いに同等の抑制効果を有する。
【００８９】
本発明のアンジオスタチンは、
（ｉ）腫瘍を有するヒトおよび動物に抗血管形成療法として投与され、
（ｉｉ）予後観察のマーカーとして、ヒトおよび動物の血清、尿、または組織においてモニターされ、
（ｉｉｉ）同じような血管形成抑制(angiostatic)分子について、癌患者の血清および尿を分析する基準として使用される。
【００９０】
本発明の一部として、アンジオスタチンは血液または尿などの患者の体液から単離することができ、またはアンジオスタチンは、当業者に周知の組換えＤＮＡ法または合成ペプチド化学法により製造することができると考えられる。タンパク質精製法は、本技術分野で広く知られており、アンジオスタチンの精製およびインヒビター活性のアッセイの方法の具体的な例を下記の実施例に記載する。ヒト内因性アンジオスタチンの単離は、同様の手法を使用して行われる。
【００９１】
組換えＤＮＡ法を使用してアンジオスタチンを製造する方法の一例は、次のステップを含む。すなわち、（１）上記の通りおよびさらに詳細には下記の通り、アンジオスタチンを同定および精製し、（２）精製したインヒビターのＮ末端アミノ酸配列を決定し、（３）前記アンジオスタチン配列の５’および３’ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、（４）ポリメラーゼを使用してアンジオスタチン遺伝子配列を増幅し、（５）発現ベクターのような、適切なベクターへ増幅配列を挿入し、（６）微生物やインヒビター遺
伝子を発現できる他の表現系へ遺伝子を有するベクターを導入し、（７）組換え技術で産生したインヒビターを単離するステップである。適切なベクターには、ウイルス、バクテリアおよび真核生物の（酵母など）発現ベクターが含まれる。上記の手法は、"Molecular
Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989などの実験マニュアルに、詳細にわたり記載されている。ヒトのプラスミノーゲンのＤＮＡ配列は、既に公表されており（Browne, M.J., et al., "Expression of recombinant human plasminogen and aglycoplasminogen in Hela cells" Fibrinolysis Vol.5 (4). 257-260, 1991)、本明細書に引用により含める。
【００９２】
アンジオスタチンの遺伝子は、高濃度でアンジオスタチンを発現する細胞または組織（腫瘍細胞など）から、次のように単離することもできる。すなわち、（１）組織からメッセンジャーＲＮＡを単離し、（２）逆転写酵素を使用して、これに相当するＤＮＡ配列を合成し、（３）適当なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、活性なアンジオスタチンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を増幅する方法で単離する。
【００９３】
アンジオスタチンまたは生物学的に活性なアンジオスタチンフラグメントを生産するさらに別の方法は、ペプチド合成による方法である。下記にさらに詳細に説明されるアッセイシステムを使用して、生物学的に活性なアンジオスタチンフラグメントをいったん見つければ、これを、たとえば、自動ペプチド配列決定法などにより配列決定することができる。あるいは、たとえば、上記の方法などによって、アンジオスタチンをコードする遺伝子またはＤＮＡ配列がいったん分離されれば、当技術分野で広く知られたマニュアルまたは自動式配列決定方法により、ＤＮＡ配列を決定することができる。この場合は、核酸配列からアミノ酸配列に関する情報が得られる。このように、トリプシン消化などの特別な方法で生物学的に活性なフラグメントが作成できれば、またはそのフラグメントのＮ末端の配列が決まれば、残るアミノ酸配列は、これに相当するＤＮＡ配列から決定することができる。
【００９４】
ペプチドのアミノ酸配列が判明すれば、"Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton and R.C. Sheppard, IRL Press, Oxford, Englandに例示されているなどの当技術分野において広く知られた技術により、フラグメントを合成することができる。同様に、後にそれぞれが結合して、より大きなフラグメントを形成する複数のフラグメントを合成することもできる。これらの合成ペプチドフラグメントは、インビトロおよびインビボでのアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を試すために、特定の位置にアミノ酸置換を行って作成することもできる。組織に対する親和力が強いペプチドフラグメントは、アフィニティーカラムにおいて、アンジオスタチンレセプターを分離するのに使用することができる。アンジオスタチンレセプターの分離および精製は、アンジオスタチンの作用機序の解明に向けて基本的なステップである。アンジオスタチンレセプターの単離およびアンジオスタチンアゴニストおよびアンタゴニストの同定は、生物学的活性の最終経路である、アンジオスタチンレセプターの活性を調節する薬剤の開発の助けとなる。レセプターが単離できれば、インシチュおよび溶液ハイブリダイゼーション技術を使用して、レセプターの位置と合成をモニターする核酸プローブを作成することができる。さらに、アンジオスタチンレセプターの遺伝子を単離し、発現ベクター中に組み込んで患者腫瘍細胞などの細胞に導入し、その細胞タイプ、組織または腫瘍細胞のアンジオスタチンと結合する能力を増大して局所における血管形成を抑制することができる。
【００９５】
アンジオスタチンは、血管形成の介在する、または血管形成を含む疾患またはプロセスの治療に有効である。本発明は、有効量のアンジオスタチンもしくは生物学的に活性なアンジオスタチンのフラグメントまたは集合して抗血管形成活性を有するアンジオスタチンフラグメント混合物、またはアンジオスタチンアゴニストまたはアンタゴニストにより血
管形成介在性疾患を治療する方法を含む。血管形成介在性疾患には、固形腫瘍; 白血病のような血液由来の腫瘍; 腫瘍転移巣; たとえば血管腫、聴神経腫、神経繊維芽腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫などの良性腫瘍; リューマチ様関節炎; 乾癬; 糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管形成緑内障、水晶体後繊維増殖、皮膚紅潮などの眼球血管形成疾患; オースラー−ウエ−バ−症候群; 心筋血管形成;プラーク血管形成; 末梢血管拡張; 血友病関節; 血管繊維細胞腫; および創傷肉芽などが含まれるが、これらに限定されるものではない。アンジオスタチンは、内皮細胞の過剰または異常な刺激による疾患の治療に有効である。これらの疾患には、腸癒着、クローン病、アテローム硬化、強皮症、たとえばケロイドのような過形成瘢痕などがあるが、これらに限定されるものではない。アンジオスタチンは、胚の着床に必要な血管形成を防止することにより、バースコントロール薬として使用できる。アンジオスタチンは、ネコ引っ掻き病(Rochele minalia quintosa)および潰瘍(Helicobacter pylori) などのような病理学的帰結として血管形成を起こす疾患の治療に有用である。
【００９６】
アンジオスタチンの合成ペプチドフラグメントには、さまざまな用途がある。高い特異性および結合活性でアンジオスタチンレセプターに結合するペプチドを放射活性標識して、オートラジオグラフィーおよびメンブラン結合技術を用いて、結合部位の可視化または定量に使用することができる。この応用は、重要な診断および研究の手段を与えるものである。アンジオスタチンレセプターの結合特性についての知見は、レセプターに関連する形質導入メカニズムの研究の助けとなる。
【００９７】
さらに、アンジオスタチンペプチドを半減期の短い放射性同位元素で標識することにより、ポジトロンエミッショントモグラフィーや他の最新のラジオグラフィー技術を利用してインビボにおいてレセプター結合部位を可視化することが可能となり、アンジオスタチン結合部位を有する腫瘍の位置特定ができる。
【００９８】
これらの合成ペプチド中にシステマティックにアミノ酸置換を行うことで、レセプターに対するアンジオスタチンの結合を促進または消滅させる親和性の高いアンジオスタチンレセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストを得ることができる。このようなアゴニストは、微小転移腫瘍の成長を抑制し、これにより腫瘍の伝搬を制限するのに使用される。アンジオスタチンのアンタゴニストは、血管形成が不十分でない場合においてアンジオスタチンの阻害作用を遮断し、血管形成を促進する。たとえば、この治療は、糖尿病における創傷修復を促進する治療効果がある。
【００９９】
アンジオスタチンペプチドは、腫瘍細胞の培養細胞からアンジオスタチンレセプターを単離するためのアフィニティーカラムの作成に使用される。アンジオスタチンレセプターの単離、精製に次いで、アミノ酸配列決定をおこなう。この情報をもとに、アンジオスタチンレセプターの遺伝子または遺伝子配列を同定、単離することができる。次に、クローン化した核酸配列を、レセプターを発現する能力のあるベクターに挿入するために作成する。これらの技術は、当業者には広く知られている。アンジオスタチンレセプターをコードする核酸配列の腫瘍細胞へのトランスフェクション、およびＤＮＡ導入された腫瘍細胞によるレセプターの発現は、これらの細胞の内因性または外因性アンジオスタチンに対する反応性を増大し、これにより転移腫瘍の成長速度を低下させる。
【０１００】
リシンなどの細胞毒性物質はアンジオスタチンおよび強い親和性を持つアンジオスタチンペプチドフラグメントを結合させ、アンジオスタチンと結合する細胞を破壊する手段を得ることができる。これらの細胞は、微小転移腫瘍および一次腫瘍などを含むがこれらに限定されず、多くの部位において見いだされる。細胞毒性物質を結合させたペプチドは、所望の部位への送達を最大限に行えるような方法で注入される。たとえば、リシンの結合した高親和性アンジオスタチンペプチドフラグメントを、標的部位に血液を供給している
血管中または標的に直接カニューレで送達する。このような薬剤はまた、インフュージョンカニューレにつなげた浸透圧ポンプを使用してコントロールしながら送達される。アンジオスタチンアンタゴニストを血管形成刺激物質と同時に投与して、組織の血管形成を増大させることもできる。この治療方法は、転移腫瘍を破壊するのに有効な手法である。
【０１０１】
アンジオスタチンは、病気の治療を目的とする他の成分や手法と組み合わせて使用されることもある。たとえば、腫瘍を手術、放射線照射または化学療法といった従来の治療法とアンジオスタチンとで治療し、その後、微小転移腫瘍の休止(dormancy)状態を継続させ、残存するすべての一次腫瘍の成長を安定および抑制するために、患者に引き続きアンジオスタチンを投与することもできる。更に、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン抗血清、アンジオスタチンレセプターアゴニスト、アンジオスタチンレセプターアンタゴニスト、またはこれらの組み合わせは、薬学的に許容される賦形剤、および任意に生分解性ポリマーなどの徐放性基質と組み合わされて治療用組成物が形成される。
【０１０２】
本明細書において、徐放性基質とは、酵素、または酸／塩基加水分解反応、または溶解により分解する材料で、通常はポリマーでできている。いったん体内に入いると、この基質は酵素または体液により作用を受ける。徐放性基質は、好ましくは、リポゾーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド  コグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）、ポリアンヒドライド、ポリ（オルソ）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、ポリサッカライド、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコーンなどの生体適合材料から選択される。好ましい生分解性基質は、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチド  コグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー) のいずれかの基質である。
【０１０３】
本発明の血管形成を調節する治療用組成物は、固体、液体またはエアゾールでもよく、および既知のいずれかの投与経路で投与される。固体の治療組成物の例には、錠剤、クリーム、植え込み型剤形がある。錠剤は経口投与、治療用クリームは局所投与される。植え込み型投与投与ユニットは、たとえば腫瘍の部位などに局所的に投与してもよく、または治療用血管形成調節成分を全身に放出するために、たとえば皮下に植え込んでもよい。液体組成物の例には、皮下、静脈、動脈注射用の剤形ならびに局所および眼内投与用剤形が含まれる。エアゾール剤形の例には、肺への投与のための吸入用剤形が含まれる。
【０１０４】
また、本発明アンジオスタチンは、インヒビターおよびそのレセプターに特異的な抗体を作成するのに使用できる。前記抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体のいずれでもよい。アンジオスタチンまたはアンジオスタチンレセプターに特異的に結合するこれらの抗体は、体液または組織のアンジオスタチンまたはアンジオスタチンレセプターの検出または定量を目的とする、当業者に広く知られている診断方法およびキットにおいて使用することができる。これらの検査の結果は、腫瘍および他の血管形成介在性疾患の発生または再発を、診断または予想するのに使用できる。
【０１０５】
アンジオスタチンはまた、アンジオスタチンに結合する能力を有する抗体を、検出および定量する診断方法およびキットに使用することができる。これらのキットは、インシチュにおいて一次腫瘍が分泌するアンジオスタチンの存在下における微小転移腫瘍の拡散を示す、血中のアンジオスタチン抗体の検出を可能とするであろう。こういったアンジオスタチン抗体が血中にある患者では、多発性腫瘍および癌を発症する可能性が高く、治療後または寛解期間の後に癌が再発する可能性が高い。これらの抗アンジオスタチン抗体のＦａｂフラグメントは、抗アンジオスタチン抗体を中和するのに使用することができる抗ア
ンジオスタチンFabフラグメント抗血清を作成するにあたり、抗原として使用することができる。このような方法は、抗アンジオスタチン抗体による血中アンジオスタチンの排除を低下させ、血中アンジオスタチン濃度を有効に上昇させる。
【０１０６】
本発明の他の構成は、過剰の内因性アンジオスタチンの作用を遮断する方法である。これは、システム中の好ましくないアンジオスタチンに対して特異的な抗体でヒトまたは動物に受動的に免疫を与えることで行える。この治療は、異常な排卵、月経、胎盤形成および血管形成の治療において重要である。これは、転移プロセスにおけるアンジオスタチン排除の効果を調べるにあたり、有用な手段を提供するものである。アンジオスタチン抗体のＦａｂフラグメントには、アンジオスタチンとの結合部位が含まれる。このフラグメントは、当業者において既知の技術を使用してアンジオスタチン抗体から単離される。アンジオスタチン抗血清のＦａｂフラグメントは、抗Ｆａｂフラグメント血清の産生を開始させるための抗原として使用される。アンジオスタチンのＦａｂフラグメントの抗血清を注入すれば、アンジオスタチンのアンジオスタチン抗体との結合を防止できる。治療効果は、アンジオスタチンと抗アンジオスタチンのＦａｂフラグメントの結合を遮断することで内因性抗アンジオスタチン抗体を中和することにより得られる。この治療の総効果は、内因性血中アンジオスタチンが標的細胞に到達することを助け、これにより転移の広がりを減少させるものである。
【０１０７】
なお、本発明は、内皮形成抑制活性を有するアンジオスタチンのすべての誘導体を含有すると理解されよう。本発明は、完全なアンジオスタチンタンパク質、アンジオスタチンタンパク質の誘導体、および生物学的活性なアンジオスタチンタンパク質のフラグメントを含む。これらには、アミノ酸置換、またはアミノ酸基に糖または他の分子が結合した、アンジオスタチン活性を有するタンパク質が含まれる。また、本発明は、アンジオスタチンおよびアンジオスタチンレセプターをコードする遺伝子、およびこれらの遺伝子により発現されるタンパク質を含む。
【０１０８】
上記のアンジオスタチン活性を有するタンパク質およびタンパク質フラグメントは、当業者に既知の製剤方法を使用して、薬学的に許容される剤形で、単離および実質的に精製されたタンパク質およびタンパク質フラグメントとして提供することができる。これらの剤形は、標準的な経路で投与することができる。一般に、この組み合わせ物は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳室内、大脳内、膣内、子宮内、経口、直腸、または非経口（たとえば、静脈内、髄腔内、皮下または筋肉内) 経路で投与することができる。さらに、アンジオスタチンは、これを徐放させるような生分解性ポリマー中に含有させることもでき、前記ポリマーを、薬剤送達が必要とされる場所、たとえば腫瘍の部位の周辺に、またはアンジオスタチンが全身的に徐々に放出されるように植え込むこともできる。直接に転移腫瘍成長部位中にまたはその腫瘍への供給血管中への送達など、目的の部位にカニューレを使用して、高濃度のアンジオスタチンを制御下に送達するために浸透圧ミニポンプもまた使用される。生分解性ポリマーおよびその用途は、たとえば、本明細書中に引用により含める、Brem et al., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991)に詳細に記載されている。
【０１０９】
本発明のアンジオスタチンの用量は、疾患の状態、または治療する症状、ならびに体重およびヒトまたは動物の状態、および薬剤の投与経路などの他の臨床的要因によって決められる。ヒトまたは動物の治療においては、およそ０．５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇのアンジオスタチンが投与できる。その特定の動物またはヒト内におけるアンジオスタチンの半減期により、アンジオスタチンは１日数回から１週間に１回までの割合で投与される。なお、本発明は、ヒトおよび動物における使用の双方への適用があることが理解されよう。本発明の方法は、単独および複数投与、同時または長時間にわたるものを想定している。
【０１１０】
アンジオスタチン剤形には、口、直腸、眼（ガラス体内または眼房内を含む）、鼻、局所（バッカルおよび舌下を含む）、子宮内、膣、非経口（皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内および硬膜外を含む）における投与に適切なものを含む。アンジオスタチン剤形は、便利なように、用量単位の剤形にすることができ、また、従来の薬学上技術を使用して調製できる。このような技術には、活性成分と薬学的キャリアまたは賦形剤とを混合する段階を含む。一般に、製剤は、均一かつ丁寧に、活性成分と液体キャリア、または細かくした固体キャリアまたはその双方とを混合し、それから、必要があれば製剤を成形して調製される。
【０１１１】
非経口投与に適当な剤形には、水溶性または非水溶性滅菌注射液で、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を投与対象者の血液と等張とするための溶質を含んでもよい注射液、ならびに水溶性または非水溶性滅菌懸濁液で、懸濁剤と粘ちょう化剤を含んでもよい懸濁液が含まれる。製剤は、１回用量または複数用量が入る容器、たとえば、密封アンプルおよびバイアルなどに入れて提供されてもよく、および使用の直前に滅菌液体キャリア、たとえば注射用水などを加えるだけでよい、凍結乾燥状態で保存することもできる。即席の注射溶液および懸濁液は、先に記載したようなものの滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製できる。
【０１１２】
好ましい１回用量剤形は、投与成分の１日分の用量または単位、１日分のサブドース(sub-dose)、またはこれの適当な分割物を含むものである。なお、投与成分に加えて、特に上記のように、本発明の剤形には、該当する剤形の種類によって当技術分野で従来より使用される他の薬剤を含み得る。患者に二元的な治療を提供するために、必要に応じて、細胞毒性物質を、アンジオスタチンタンパク質または生物学的に機能を有するこれのペプチドフラグメントに混合または結合することもできる。
【０１１３】
本発明の血管形成抑制ペプチドは、標準的なマイクロケミカル設備で合成することができ、純度はＨＰＬＣおよびマススペクトロフォトメトリーで確認できる。ペプチド合成、ＨＰＬＣ精製およびマススペクトロフォトメトリーの方法は、一般に当技術分野で知られているものである。また、アンジオスタチンペプチドおよびアンジオスタチンレセプターペプチドは、組換え大腸菌または酵母菌表現系において産生され、カラムクロマトグラフィーで精製される。
【０１１４】
これに限定されないが、以下を含むいくつかの応用用途のために、完全なアンジオスタチン分子から各種のペプチドフラグメントを合成することができる。すなわち、特定の抗血清の作成のための抗原として、アンジオスタチン結合部位において活性なアゴニストおよびアンタゴニストとして、アンジオスタチンと結合する細胞を狙って殺傷するための細胞毒性物質と結合させてまたはこれと組み合わせて使用するペプチドとしての用途である。これらのペプチドを含むアミノ酸配列は、アンジオスタチン分子の外側領域のその位置を基に選択され、抗血清との結合に関与し得るものである。アンジオスタチンのアミノおよびカルボキシ末端、および分子の中央部分は、合成されるフラグメントのなかにそれぞれ別に存在してよい。
【０１１５】
これらのペプチド配列は、ゲンバンク(GenBank)、ブルックヘブンプロテイン(Brookhaven protein)、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＰＩＲなどのタンパク質配列データベースを使用して、配列相同性の存在を検討するために、既知の配列と比較される。この情報により、他の分子との配列相同性が高い配列を排除することができ、特異性の高いアンジオスタチンの抗血清、アゴニスト、アンタゴニストを開発できる可能性が高くなる。
【０１１６】
アンジオスタチンおよびアンジオスタチン由来ペプチドは、標準的な方法を使用して他の分子と結合させることができる。アンジオスタチンのアミノおよびカルボキシ末端の双
方ともに、チロシンとリジン残基を有し、たとえば、従来技術を使用した放射活性標識などの多くの技術でアイソトープまたはアイソトープ以外の標識が付与される（チロシン残基−クロラミンＴ、ヨードゲン、ラクトパーオキシダーゼ；リジン残基−ボルトン−ハンター試薬）。これらのカップリング技術は、当業者には広く知られているものである。また、これらの残基を持たないフラグメントにチロシンまたはリジンを付加して、ペプチド上の反応性のアミノおよびヒドロキシ基の標識付与を行いやすくできる。カップリング手法は、スルフヒドリル、カルボキシ、アミド、フェノール、およびイミダゾールを含むがこれに限定されないアミノ酸で利用できる官能基によって選択される。これらのカップリングを行うには、様々な試薬が使用されるが、その中には、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミドおよびｐ-ベンゾキノンが含まれる。
【０１１７】
アンジオスタチンペプチドは、アイソトープ、酵素、キャリアタンパク質、細胞毒性物質、蛍光分子、ケミルミネッセンス、バイオルミネッセンスおよびその他の様々な用途のための化合物と化学的にカップリングされる。カップリング反応の効率は、その特定の反応に適切なそれぞれの手法によって決まる。たとえば、アンジオスタチンペプチドを125I
で放射標識するには、クロラミンＴと比活性の高いＮａ125Ｉを使用して行う。反応は、ナトリウムメタバイスルファイトで停止させ、反応混合物は使い捨てカラムで脱塩する。標識されたペプチドをカラムから溶出し画分を回収する。各画分から一部を採取し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。このようにして、未反応のＮａ125Ｉを、標識済アンジオスタチンペプチドから分離する。最も高い比放射活性を示したペプチド画分を、アンジオスタチン抗血清に対する結合能力の分析などの後の使用のために保管する。
【０１１８】
ペプチド複合体の他の応用は、ポリクローナル抗血清の製造である。たとえば、リジン残基を有するアンジオスタチンペプチドを、グルタルアルデヒドを使用して精製ウシ血清アルブミンに結合する。反応の効率は、放射標識ペプチドの取り込みを測定して判断する。未反応のグルタルアルデヒドおよびペプチドは、透析で分離する。複合体は後の使用のために保管する。
【０１１９】
アンジオスタチン、アンジオスタチンアナログ、アンジオスタチンのペプチドフラグメントおよびアンジオスタチンレセプターに対する抗血清を作成することができる。ペプチドの合成および精製後、当業者に既知の確立された手法で、モノクローナルおよびポリクローナル抗血清を作成する。たとえば、ポリクローナル抗血清は、ウサギ、ヒツジ、ヤギまたは他の動物において作成される。ウシ血清アルブミンなどのキャリア分子と複合したアンジオスタチンペプチド、またはアンジオスタチン自体を、アジュバンド混合液と混合してエマルジョンを作成し、背中、首、わき腹、および場合によっては足の裏の複数の部位に皮下注射する。ブースター注射は、２〜４週間毎など、一定の期間毎におこなう。採血は、たとえば、怒張後の耳末梢静脈を使用した静脈穿刺により、各回の注射から約７から１０日後におこなう。血液サンプルは、４℃で一晩凝固させた後、４℃、３０分間、約２，４００×ｇで遠心分離する。血清を回収し、小分けにし、直ちに使用する場合は４℃で、後の分析用には−２０〜−９０℃にて保存する。
【０１２０】
ポリクローナル抗血清の形成の血清サンプルおよびモノクローナル抗血清の培養培地細胞の全てで、抗体価を測定する。抗体価は、いくつかの方法、たとえばドットブロットおよび密度分析を使用したもの、およびプロテインＡ、二次抗血清、冷エタノールまたは活性炭−デキストランを使用した放射活性ペプチド−抗体複合体の沈降と引き続くガンマカウンタ−による活性測定など、によって測定される。また、最も抗体価の高い抗血清は、市販のアフィニティーカラムで精製する。アンジオスタチンペプチドは、アフィニティーカラム内のゲルにカップリングされる。抗血清サンプルをカラムに通すと、抗アンジオスタチン抗体はカラムに結合して残る。これらの抗体を次いで溶出して回収し、力価測定と特異性について評価する。
【０１２１】
最も抗体価の高い抗血清は、以下について評価する。すなわち、ａ）抗原の特異的結合が最大で非特異的結合が最小となる最適な抗血清希釈倍率、ｂ）標準置換曲線における斬増するアンジオスタチンペプチドとの結合能力、ｃ）プラスミノーゲンおよび関連する種のアンジオスタチンを含む関連ペプチドおよびタンパク質との交差反応の可能性、ｄ）血漿、尿、組織および培養細胞培地の抽出物中のアンジオスタチンペプチドに対する検出能力についてである。
【０１２２】
アンジオスタチンおよびアンジオスタチンレセプターの測定用キットもまた、本発明の一部である。最大の抗体価および特異性を有し、血漿、尿、組織および培養細胞培地の抽出物中のアンジオスタチンペプチドを検出できる抗血清は、アンジオスタチンの迅速、高信頼性、高感度、および特異的な測定および位置特定をおこなう、使用が簡便なキットを作成するためにさらに検討される。これらのアッセイキットは、以下の技術を含むがこれに限定されるものではない。すなわち、競合および非競合的アッセイ、ラジオイムノアッセイ、バイオルミネッセンスおよびケミルミネッセンスアッセイ、フルオロメトリックアッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡなどの酵素結合アッセイ、マイクロタイタープレート、尿または血液の迅速なモニタリング用の抗体でコーティングしたストリップまたはディップスティック、ならびにイムノサイトケミストリーである。各キットついて、アッセイの範囲、感度、精度、信頼性、特異性および再現性を確立する。置換または活性の標準曲線の２０％、５０％および８０％地点において、アッセイ内およびアッセイ間の変動を確かめる。
【０１２３】
研究および臨床で一般に使用されるアッセイキットの一例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キットである。アンジオスタチンＲＩＡを、以下に説明する。アンジオスタチンまたはアンジオスタチンペプチドへの放射性ヨウ素化および精製を行った後、最大の抗体価を有する抗血清を数種類の希釈倍率にして、適当なバッファシステム中に比較的一定量の放射活性（１０，０００ｃｐｍなど）を含む試験管中に添加する。他の試験管にバッファまたは免疫前の血清を入れて、非特異的な結合を測定する。４℃で２４時間インキュベーションした後、プロテインＡを添加し、試験管を振とうし、室温で９０分間インキュベートし、４℃、約２，０００〜２，５００×ｇで遠心分離し、標識抗原に結合した抗体の複合体を沈殿させる。上清を吸引して除去し、沈殿物中の放射活性をガンマカウンターで測定する。非特異的結合を差し引いた後、標識ペプチドの約１０〜４０％と結合した希釈倍率の抗血清についてさらに検討を行う。
【０１２４】
次に、抗血清の作成に使用したある希釈範囲（約０．１ｐｇ〜１０ｎｇ）のアミノ酸ペプチドを、既知の量のこのペプチドを、放射活性ペプチドおよび抗血清を入れた試験管に添加して評価する。さらに、たとえば２４〜４８時間インキュベートした後、プロテインＡを添加し、試験管を遠心分離にかけ、上清を除去し、沈殿物の放射活性を測定する。放射標識をしないアンジオスタチンペプチド（標準品）による放射標識アンジオスタチンペプチド結合の置換から、標準曲線が得られる。数種類の濃度の他のアンジオスタチンペプチドフラグメント、プラスミノーゲン、異なる種のアンジオスタチン、および相同ペプチドをアッセイ試験管に添加して、アンジオスタチン抗血清の特異性を確認する。
【０１２５】
一次および二次腫瘍、ルイス肺癌、アンジオスタチン産生細胞培養物、胎盤、子宮、ならびに、脳、肝臓および小腸などの他の組織を含むがこれに限定されない、様々な組織の抽出物を、アンジオスタチンを抽出する為に用いられている抽出手法を使用して調製する。組織抽出物を凍結乾燥またはスピードバック(Speed Vac)処理した後、アッセイバッファを添加して、種々の量をＲＩＡ試験管に入れる。既知のアンジオスタチン産生細胞の抽出物は、標準曲線と並行する置換曲線を描いたが、一方、アンジオスタチンを産生しない組織の抽出物は、アンジオスタチン抗血清由来の放射標識されたアンジオスタチンと置換
しなかった。さらに、ルイス肺癌を有する動物から得た尿、血漿および脳脊髄液を、斬増量でアッセイ試験管に添加した。並行の置換曲線は、組織および体液中のアンジオスタチンを測定するアンジオスタチンアッセイの有用性を示す。
【０１２６】
アンジオスタチンを含有する組織抽出物は、さらに、その一部を逆相ＨＰＬＣにかけて確認をした。溶出画分を回収し、スピードバックで乾燥させ、ＲＩＡバッファで還元し、アンジオスタチンＲＩＡで分析した。最大のアンジオスタチン免疫活性は、アンジオスタチンの溶出ポジションに相当する画分中に存在した。
【０１２７】
アッセイキットは、手引き書、抗血清、アンジオスタチンまたはアンジオスタチンペプチドおよび場合によっては、放射標識アンジオスタチンおよび／または結合アンジオスタチンアンジオスタチン抗体複合体の沈殿用の試薬を提供するものである。キットは、腫瘍を有する、または有さない動物およびヒトの生物学的液体および組織抽出物中のアンジオスタチンの測定に有用である。
【０１２８】
他のキットは、組織および細胞中のアンジオスタチンの位置特定に使用される。このアンジオスタチン免疫組織化学キットでは、手引き書、アンジオスタチン抗血清、および場合によっては、フルオロセインイソチオアネートなどの蛍光分子または一次抗血清を可視化するのに使用される他の試薬と結合された二次抗血清を提供する。免疫組織化学技術は、当業者においては広く知られている。このアンジオスタチン免疫組織化学キットでは、光学および電子顕微鏡の双方を使用して、組織切片および培養細胞中のアンジオスタチンの位置を特定できる。これは、研究および臨床用のどちらにも使用できる。たとえば、腫瘍を生検または採取し、アンジオスタチン産生部位を検査するために組織切片をミクロトームで切り出す。このような情報は、腫瘍の発見と治療において、診断および場合によっては治療において有用である。アンジオスタチンの生合成部位を可視化する他の方法には、アンジオスタチンメッセンジャーＲＮＡをプローブで探すインシチュハイブリダイゼーションにおいて、核酸を放射標識する方法がある。同様に、免疫組織化学技術を使用して、アンジオスタチンレセプターの位置を特定し、可視化、定量することができる。
【０１２９】
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、これらの実施例はどのような場合でも本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。なお、反対に、本明細書の説明を読めば、本発明の精神および／または添付の請求の範囲から外れる事なく、当業者に連想される他の態様、変更、およびこれらの均等物によることもできることが明らかである。
【実施例１】
【０１３０】
転移腫瘍の成長が一次腫瘍に抑制され一次腫瘍の切除で促進される、動物における腫瘍システムの選択
【０１３１】
その腫瘍自体の転移を抑制する能力のある様々なマウスの腫瘍をスクリーニングして、一次腫瘍が最も有効に肺転移を抑制するルイス肺癌を選択した。同系Ｃ５７ＢＩ６／Ｊの６週齢オスのマウスに１×１０6 の腫瘍細胞を注射（背部皮下）した。肉眼で確認できる腫瘍が始めて出現したのは、３〜４日後であった。腫瘍の大きさが約１，５００ｍｍ3に達した時、マウスを２つのグループに無作為に分けた。第１のグループでは腫瘍を完全に切除し、第２のグループでは疑手術をおこなって腫瘍は無傷(intact)で残した。転移腫瘍の成長を抑制するのは、大きさ５００〜３，０００ｍｍ3の腫瘍であるが、高い生存率で局所再発を起こさずに安全に切除できる一次腫瘍の大きさは、最大で１，５００ｍｍ3である。
【０１３２】
２１日後、全てのマウスを屠殺し、剖検をおこなった。一次腫瘍を無傷で残したマウス
では、４個の肉眼で確認できる＋２の転移腫瘍があったのに対して、腫瘍を切除したマウスでは５０個の＋５の転移腫瘍があった（ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、以前に証明されているように、腫瘍の大きさと密接に相関する肺重量によっても確認された。腫瘍を無傷で残したマウスに比較して、腫瘍を切除したマウスの肺の湿重量は、４００％大きかった（ｐ＜０．０００１）。
【０１３３】
この実験モデルは、再現性のあるデータを与え、記載の実験は再現性があった。この腫瘍は、「ルイス肺癌−低転移性」（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）と名付けられた。この腫瘍はまた、ＢおよびＴリンパ球を欠損するＳＣＩＤマウスにおけるのとほとんど同一のパターンで転移を抑制した。
【実施例２】
【０１３４】
一次腫瘍除去の有無に関係なく、高い転移性を有するルイス肺癌の変異種の単離
【０１３５】
実施例１のひとつのグループのマウスのＬＬＣ−Ｌｏｗ細胞系から、ルイス肺癌の転移性の高い変異種が自然発生的に生じた。これを実施例１に記載の方法にしたがって単離し、再度移植した。この腫瘍（ＬＬＣ−Ｈｉｇｈ）は、一次腫瘍の有無に関係なく３０箇所以上の肉眼で確認できる肺転移腫瘍を形成した。
【実施例３】
【０１３６】
転移腫瘍の大きさおよびその中の腫瘍細胞の増殖速度。転移を抑制する一次腫瘍の作用（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）
【０１３７】
全ての実験において、Ｃ５７ＢＩ６／Ｊ６マウスを使用した。マウスの皮下に、ＬＬＣ−Ｌｏｗ細胞を接種し、１４日後に半数のマウスの一次腫瘍を切除した。腫瘍切除から５、１０、１５日後にマウスを屠殺した。肺転移腫瘍の組織学的切片を得た。一次腫瘍を無傷で残したマウスには、肺に血管形成のない微小転移腫瘍があった。これらの転移腫瘍は、直径が１２〜１５細胞層以内で、腫瘍切除から１５日後でさえも有意なサイズの増大はなかった。これに対して、一次腫瘍を切除したマウスでは、手術後５日ですでに血管形成のある大きな転移腫瘍が出現していた。これらの転移腫瘍は、腫瘍除去後１５日目には、（肺重量および組織学的検査に反映されるように）さらに４倍に大きくなった。一次腫瘍を切除したマウスのうちおよそ５０％が、実験が終了する前に肺腫瘍転移で死亡した。一次腫瘍を無傷のままにしたマウスはすべて、実験の終了まで生存していた。
【０１３８】
転移腫瘍内の腫瘍細胞の複製速度は、事前にマウスに注射したＢｒｄＵで染色された核を数えることて測定した。一次腫瘍を切除しないマウスにおいて、ＢｒｄＵを取り込んだ腫瘍細胞の割合が高かったのは小型の無血管性転移腫瘍であったが、一次腫瘍を切除したマウスでは、血管形成中の大きな転移腫瘍で同程度のＢｒｄＵの取り込みが観察された（図３）。この知見は、一次腫瘍の存在は、転移内の腫瘍細胞の複製速度に直接の影響を与えないことを示唆する。
【０１３９】
図３において、左のパネルは、一次腫瘍の有無における肺の腫瘍細胞のＢｒｄＵラベリングインデックスを示す。免疫組織化学的染色に先立ち、切片は０．２Ｍ ＨＣｌで１０分間、透過化(permeablilized)し、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2中、１μｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ（ベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）で３７℃で１５分間消化した。ラベリングインデックスは、２５０の倍率で、陽性核の割合をカウントして判断した。図３の右のパネルは、一次腫瘍を切除しない、または手術後５、１０、１５日に一次腫瘍を切除した場合の動物の肺総重量の分析を示す。マウスは、ＢｒｄＵ（０．７５ｍｇ／マウス) の腹腔内注入から６時間後に屠殺された。
【実施例４】
【０１４０】
無傷の一次腫瘍の存在下における肺転移腫瘍中の血管形成の抑制
【０１４１】
肺転移腫瘍における血管形成の程度を測定するために、フォン・ヴィレブランド(ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ)因子（内皮に特異的なマーカー、ダコ社カーペンテリア、カリフォルニアから入手可能）に対する抗体で組織を染色した。無傷の一次腫瘍を有する動物の転移腫瘍は、既存の肺血管の周囲に薄カフス様（８〜１２の腫瘍細胞層）に形成されていた。血管の内側を覆う内皮細胞を除いて、フォン・ヴィレブランド因子に対して陽性な細胞はほんのわずかか、または存在しなかった。これと反対に、一次腫瘍切除後５日目の動物における肺転移腫瘍は、大きいばかりでなく、フォン・ヴィレブランド因子で強く染色された内皮細胞を含む毛管肉芽で浸潤されていた。
【０１４２】
肺転移腫瘍における内皮細胞の存在に関する免疫組織化学的分析においては、接種後１９日の無傷の一次腫瘍を伴う肺転移腫瘍では、既存の微小血管の周囲を腫瘍細胞がカフス様に取り囲んでいた。転移腫瘍は、最大で８〜１２の細胞層であった。微小血管の周囲に血管形成の証拠はなく、新しい微小血管は観察されなかった。これは、血管形成前の段階の最大の大きさの無血管性の転移腫瘍の典型であった。
【０１４３】
一次腫瘍を切除してから５日後（一次腫瘍の接種後１９日）に採取された組織の免疫組織化学的分析では、肺において既存の血管の周囲を転移腫瘍が取り囲んでいた。一方、一次腫瘍を切除しなかったサンプルでは、腫瘍は血管形成していた。このように無傷の一次腫瘍は、転移腫瘍における新たな毛細血管の形成を抑制するが、転移腫瘍内の腫瘍細胞の増殖は一次腫瘍による影響を受けない。
【実施例５】
【０１４４】
一次腫瘍は、マウス角膜に移植された二次腫瘍の血管形成を抑制する。この二次腫瘍の成長は抑制される。
【０１４５】
０．２５から０．５ｍｍ2のルイス肺癌（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）を、第０日にマウスの角膜に移植した(Muthukkaruppan Vr., et al., Angiogenesis in the mouse cornea. Science
205:1416-1418, 1979) 。一次腫瘍は、角膜への移植の４または７日前；角膜への移植の日；角膜への移植の４または７日後のいずれかに、１ｘ１０6 個のＬＬＣ−Ｌｏｗ細胞を背部の皮下に接種して形成させた。対照マウスは、角膜への移植を行ったが、皮下腫瘍ではない細胞を移植した。他の対照マウスは、角膜への移植と角膜への移植の４日前に背部にＬＬＣ−Ｈｉｇｈ腫瘍細胞の接種をおこなった。角膜は、角膜腫瘍の成長（接眼マイクロメーターで測定した）および角膜縁の端からの新しい毛細血管の成長について、スリットランプ立体顕微鏡で毎日検査した。
【０１４６】
一次皮下腫瘍を有さない対照マウスでは、大半の角膜（６／８）で、角膜への移植後６〜７日目から血管形成が始まり１０日目まで続いていた。１０日目までに、血管形成した角膜腫瘍は、全眼の容積の約四分の一にまで到達していた。一次皮下ＬＬＣ−Ｌｏｗ腫瘍がある場合は、角膜への移植の最低４日前までに一次腫瘍を形成させていたときは、角膜への移植片は血管形成していなかった（表１）。血管形成がない場合は、角膜腫瘍は、角膜内で薄い白色の無血管性円板として緩慢に成長した。
【０１４７】
しかし、角膜への移植から４日経過する前に一次腫瘍を移植しなかった場合は、角膜で血管形成があり、３／３の角膜腫瘍は、腫瘍を有さない対照と同じ速度で成長した。ＬＬＣ−Ｈｉｇｈの皮下一次腫瘍がある場合は、大半の角膜（２／３）で、角膜への移植後７日目に血管形成が始まり１０日目まで続いていた。ここでもまた、１０日目までに、血管形成した角膜腫瘍は、全眼の容積の約四分の一にまで到達していた。
【０１４８】
【表１】
2005046148.tif 000002
【０１４９】
眼への腫瘍移植の７日前に一次ＬＬＣ−Ｌｏｗ皮下腫瘍が移植された場合（すなわち−７）は、０／１０の角膜において血管形成があると予想されたが、腫瘍のうち２つは（２／１０）は、大きすぎたために（３ｃｍ3超）壊死性となった。
【実施例６】
【０１５０】
無傷の一次腫瘍は、二次皮下移植片すなわち塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）により誘導される血管形成を抑制する。
【０１５１】
実施例５および６に記載の実験は、一次腫瘍が、二次転移腫瘍中における血管形成を抑制することを示しているが、これらの研究は、一次腫瘍が、（ｉ）直接、内皮増殖（または血管形成）を抑制している、または（ii）転移腫瘍細胞の血管形成活性を低下調節することにより間接的にそれを抑制している、のいずれであるのかを明らかにしていない。これらの二つの可能性の違いを明確にするために、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有するマトリゲル(matrigel)の移植により、皮下血管形成の病巣を誘導した(Passaniti A, et al., A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and anti-angiogenic agent using reconstituted basement membrane, heparin and fibroblast grwoth factor. Lab.Invest. 67:519,1992)。
【０１５２】
ヘパリン存在下、２５または５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するマトリゲル （基底膜タンパク質の抽出物）を、正常なマウスおよび腫瘍を有するマウス（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）の腹面に皮下注射した。４日後にマウスを屠殺し、ゲル中のヘモグロビン濃度を測定して血管形成を定量した。マトリゲルに入った新しい血管数がヘモグロビン濃度に相関することは、以前に証明されている(Folkman J., Angiogenesis and its inhibitiors in "Important Advances in Oncology 1985", VT DeVita, S. Hellman and S. Rosenberg, editors, J.B. Lippincott, Philadelphia 1985)。 組織学的検査のためにも、いくつかのゲルを調製した。正常マウスでは、５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するマトリゲルペレットは、完全な赤色である。これには、新たな毛細血管が濃密に広がり、２．４ｇ／ｄｌのヘモグロビンが含まれていた。ｂＦＧＦを含まないマトリゲルは、透明の灰色で、ヘモグロビン含有量はわずか０．４ｇ／ｄｌである（６倍の差）。これに対して、一次腫瘍を有するマウスから得たマトリゲルには、０．５ｇ／ｄｌのヘモグロビンしか含まれなかった（図４）。
【０１５３】
この実験におけるほぼ完全な血管形成の抑制は、ルイス肺癌の一次腫瘍の存在が、ｂＦＧＦの誘導する血管形成を直接抑制することを示唆する。
【実施例７】
【０１５４】
一次腫瘍を除去した動物への、腫瘍を有する動物から得た血清の導入は、転移を抑制する。
【０１５５】
マウスにルイス肺癌を上記のように移植した。１５日後、腫瘍の大きさが約１，５００ｍｍ3の時、マウスを無作為に４つのグループに分けた。３つのグループでは、一次腫瘍を外科的に完全に切除し、一つのグループでは（偽手術手順を行った後）腫瘍を無傷で残した。３つの切除グループのマウスは、その後、毎日、生理食塩水、正常で腫瘍を有さないマウスから得た血清、または１，５００ｍｍ3のルイス肺癌を有するマウスから得た血清の腹腔内注射を受けた。腫瘍を無傷で残したマウスのグループは、生理食塩水の腹腔内注射を受けた。全てのマウスは、２１日間処置後、安楽死させ、肺転移腫瘍を計数した（表２）。
【０１５６】
【表２】
2005046148.tif 000003
【０１５７】
これらの結果は、肺重量でも確認された。ふたつのグループ間の差はｐ＝＜０．０００１［（５５と５０）対（７と３）］。同様の結果が、腫瘍を有する動物の尿中のアンジオスタチンを使用して得られている。
【実施例８】
【０１５８】
ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ
【０１５９】
ＢＣＥ細胞は、９継代から14継代の間のもののみ使用される。０日目に、ＢＣＥ細胞を、ゼラチン処理（ＰＢＳ中１．５％ゼラチン、３７℃、１０％ＣＯ２で２４時間、その後０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄）２４ウェルプレートに、１２，５００細胞／ウェルの濃度で撒く。細胞数の計数には、ヘモサイトメーターを使用する。細胞は、１０％の加熱不活性化（５６℃、２０分間）子ウシ血清と１％グルタミン−ペン−ストレップ（ＧＰＳ）を含有する５００μｌのＤＭＥＭ中で培養される。
【０１６０】
ＢＣＥ細胞に、以下のチャレンジを行う。すなわち、培養液を除去し、２５０μｌのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％ＧＰＳに置き換える。次にテストするサンプルをウェルに加え
る（量は、テストするサンプルによって異なる）。プレートを３７℃／１０％ＣＯ２に約１０分置く。２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む２５０μｌのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％ＧＰＳを各ウェルに添加する。最終的な培養液は、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む５００μｌのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％ＧＰＳとなる。プレートを３７℃／１０％ＣＯ２インキュベータに戻し、７２時間置く。
【０１６１】
４日目に、培養液を除去して細胞を計数し、その後すべてのウェルを２〜３分間トリプシン消化する（０．５ｍｌ、トリプシン／ＥＤＴＡ）。懸濁した細胞を９．５ｍｌのヘミトール(Hemetall)を入れたシンチレーションバイアルに移し、コールターカウンターを使用して計数する。１活性単位とは、内皮細胞をｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌ中で７２時間インキュベートした場合に、毛細血管内皮増殖の最大値の半分の抑制の効果を与える、アンジオスタチンを含有する血清量である。
【実施例９】
【０１６２】
低転移性のルイス肺癌（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）を有するマウスから得た血清は、インビトロにおける毛細血管内皮細胞増殖を抑制する。
【０１６３】
７２時間増殖アッセイにおいて、ウシ毛細血管内皮細胞は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌ）により刺激を受けた。これらの培養物に添加した、腫瘍を有するマウスから得た血清は、用量依存的および可逆的に内皮細胞の成長を抑制した。正常血清は抑制性がなかった（図５）。内皮細胞の増殖は、腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスおよびＳＣＩＤマウスから得られた血清によっても同様に（対照と比較して）阻害された。一次腫瘍を除去すると、３〜５日目までにアンジオスタチン活性は血清から消失した。
【０１６４】
腫瘍を有する動物の血清はまた、ウシ動脈内皮細胞および自然発生性マウス血管内皮腫由来の内皮細胞を抑制した（Obeso, et al., "Methods in Laboratory Investigation, A
Hemangioendothelioma-derived cell line; Its use as a Molel for the Study of Endothelial Cell Biology," Lab. Invest., 63(2), pgs 259-269, 1990)が、ルイス肺癌細胞、３Ｔ３線維芽細胞、動脈平滑筋細胞、ミンク肺上皮、またはＷ１３８ヒト胎児肺線維芽細胞を抑制しなかった。
【実施例１０】
【０１６５】
転移腫瘍を抑制しないルイス肺癌（ＬＬＣ−Ｈｉｇｈ）を有するマウスの血清は、インビトロにおける毛細血管内皮細胞の増殖を抑制しない。
【０１６６】
ＬＬＣ−Ｈｉｇｈの一次腫瘍を有するマウスの血清は、対照に比較して、ｂＦＧＦの刺激するウシ毛細血管内皮細胞の増殖を有意に抑制しなかった。また、この血清は、精製の始めの二段階（ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーおよびゲル濾過）終了後には、どの画分にもアンジオスタチン活性が見られなくなる。
【実施例１１】
【０１６７】
ルイス肺癌（低転移性）から得た腹水もアンジオスタチン血清を産生する。
【０１６８】
ＬＬＣ−ＬｏｗまたはＬＬＣ−Ｈｉｇｈ腫瘍細胞（１０6 ）のいずれかをマウスの腹腔内に注入すると、１週間後、1０〜２０匹のマウスのそれぞれより、１〜２ｍｌの血液の混ざった腹水が得られた。小さい腸間腫瘍が見られた。次いでマウスを安楽死させた。心臓穿刺により血清を得た。対照として、正常の、腫瘍を有さないマウスから血清を得た。血清と腹水から遠心分離により細胞を除去し、上清をｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）により刺激されたウシ毛細血管内皮細胞においてアッセイした（実施例９を参照）。双方のタイプの腫瘍から得た腹水は、７２時間後において、対照に比較して、毛細血管内皮細胞の増殖
を有意に刺激した（たとえば、１００％増殖）（図６）。反対に、低転移性マウスから得た血清は、内皮細胞増殖を抑制した（対照の７９％抑制）。高転移の細胞系から得た血清は、２００％の刺激をした。
【０１６９】
これらのデータは、低転移の細胞系の腹水には、アンジオスタチンを凌駕する優勢な内皮成長刺激因子が含まれること示す。この条件は、固形一次腫瘍に類似している。さらに、刺激活性に打ち消されているが、血清中にアンジオスタチン活性が現れている。このパターンは、固形一次腫瘍（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）と同様である。高転移性の腫瘍（ＬＬＣ−Ｈｉｇｈ）から得た腹水は、また、優勢な内皮座刺激因子を含むが、血清中にアンジオスタチンは確認されない。
【実施例１２】
【０１７０】
カラムクロマトグラフィーによる血清からのアンジオスタチンの分画と成長抑制画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
【０１７１】
アンジオスタチンを精製するために、腫瘍を有するマウスの血清をプールした。上記のインビトロ抑制因子活性アッセイによりアッセイされた抑制活性を、ヘパリン−セファロース、バイオゲルＡ０．５ｍｍアガロースゲル、および数サイクルのＣ４逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、逐次、クロマトグラフィーを行った。内皮抑制活性を有するＨＰＬＣ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、見かけの還元分子量で３８，０００ダルトンの明確なバンドを示し、これは約２Ｘ１０7の比活性にまで、およそ１００万倍（表３参照）精製された。精製の各段階で、プールされた画分を、既知の内皮インヒビター存在について特異的な抗体を使用して検査した。部分精製または精製画分中に、血小板因子４、トロンボスポジンまたはトランスフォーミング成長因子βは検出されなかった。
【０１７２】
【表３】
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【０１７３】
活性の１単位とは、内皮細胞をｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌ中で７２時間インキュベートした場合に、毛細血管内皮増殖を最大値の半分に抑制する効果を与える、アンジオスタチンを含有する血清の量である。
【実施例１３】
【０１７４】
カラムクロマトグラフィーによる尿からのアンジオスタチンの分画と成長抑制画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
【０１７５】
血清からの内皮細胞インヒビターの精製は、各マウスから得られる血清が少量なこと、
および、血清中のタンパク質が多量なことにより、妨害される。
【０１７６】
腫瘍を有するマウスから得た尿が分析され、これに、腫瘍を有さないマウスおよびＬＬＣ−Ｈｉｇｈ腫瘍を有するマウスの尿中には存在しない内皮細胞増殖のインヒビターが含有されることが見い出された。この内皮細胞抑制活性物の精製は、血清の精製に使用されたと同じ方法で行われた（上記参照）（図７）。
【０１７７】
図７は、腫瘍を有する動物の部分精製血清または尿のＣ４逆相クロマトグラフィーを示す。全ての画分は、実施例９に記載された、ｂＦＧＦを添加したウシ毛細血管内皮細胞における７２時間増殖アッセイで検定された。いずれの場合も、明確な抑制ピークが、３０〜３５％アクリロニトリルで画分２３に溶出するのが観察された。腫瘍を有する動物の血清の、３サイクル目のＣ４逆相クロマトグラフィーから得た抑制活性を有する画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、およそ３８，０００ダルトンの位置に一本のバンドを示した。
【実施例１４】
【０１７８】
血中のアンジオスタチンの分析
【０１７９】
実施例９に記載の方法に従って内皮抑制作用がアッセイされた。アンジオスタチンは、シンクロパック(Synchropak)ＨＰＬＣ  Ｃ４カラムで単離された（シンクロコム社、ラフィエット、インディアナ州）。インヒビターは、３０〜３５％のアクリロニトリルグラジエントにおいて溶出された。ドデシル硫酸ナトリウムポリアルリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の還元条件のゲル（β−メルカプトエタノール（５％ ｖ／ｖ））において、活性を有するタンパク質バンドは３８キロダルトンの位置に溶出された。非還元条件においては、活性を有するタンパク質バンドは２８キロダルトンの位置に溶出された。最初のサンプルが尿または血清から単離されたもののどちらであっても、活性は同じポイントに検出された。他のバンドには活性は検出されなかった。
【０１８０】
このバンドに含まれる活性は、加熱（１００℃、１０分間）または、トリプシン処理で消失した。活性を有するバンドを、水／クロロホルム混合液（１：１）で抽出した場合、水相のみに活性が検出された
【実施例１５】
【０１８１】
ヒトプラスミノーゲン由来の抑制作用のあるフラグメントの精製
【０１８２】
プラスミノーゲンリジン結合サイトＩは、シグマケミカル社より入手した。この調製物は、エラスターゼで消化したヒトプラスミノーゲンの精製物である。この方法で得たリジン結合サイトI は、プラスミンＡ鎖（クリングル１＋２＋３）中の少なくとも始めの３つのループ構造（番号１〜３）を凝集体の状態で含有するペプチドの集まりである（Sotrrup-Jensen,L., et al., in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol.3, 191, Davidson,J.F., et al., eds. Raven Press, New York 1978およびWiman, B., et al., Biochemica et Biophysica Acta, 579, 142 (1979)) 。プラスミノーゲンリジン結合サイトＩ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー州）は、水に再懸濁し、ＨＰＬＣグレードの水／０．１％ＴＦＡで予め平衡化したＣ４逆相カラムにアプライされた。カラムを水／０．１％ＴＦＡからアセトニトリル／０．１％ＴＦＡまでのグラジエントで溶出し、画分をポリプロピレン製試験管に回収した。各画分の一部をスピードパック(speed vac)で蒸発させ、水に再懸濁し、増殖アッセイにおいてＢＣＥに添加した。抑制活性のある画分について、同様の溶出グラジエントを用いて、この手順を２回繰り返した。抑制活性は、最終のＣ４カラム精製において３０〜３５％アセトニトリルにおいて溶出された。抑制活性のある画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、見かけの還元分子量が４０、４２．５
、４５キロダルトンの３つの明瞭なバンドが示された。非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、３０、３２．５、３５キロダルトンの分子量のバンドがそれぞれ示された。
【実施例１６】
【０１８３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの抑制活性物の抽出
【０１８４】
ヒトプラスミノーゲン由来の精製物から得た活性を有する精製画分を、非変性条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。隣のレーンでは同じサンプルを泳動させて銀染色を施しておき、そのバンドに相当する部分のゲルを切り出し、ポリプロピレン製試験管に入れて、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中、４℃、１２時間インキュベートした。上清を除去し、生理食塩水中で６時間の透析を２回（ＭＷＣＯ＝６−８０００）、蒸留水中で６時間の透析を２回行った。透析物は、真空遠心分離にて乾燥させた。生成物は生理食塩水中に再懸濁し、１ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽成長因子の刺激を与えたウシ毛細血管内皮細胞に添加して７２時間アッセイをおこなった。３つのバンドのそれぞれから抽出されたタンパク質は、毛細血管内皮細胞を抑制した。
【実施例１７】
【０１８５】
プラスミノーゲンフラグメント治療の研究
【０１８６】
マウスにルイス肺癌を移植し、腫瘍が１，５００〜２，０００ｍｍ3になった時に切除する。手術の日に、マウスを６匹づつ、６つのグループに無作為に割り振った。マウスには、ヒトプラスミノーゲンの精製された抑制活性のある３種のフラグメント、完全なヒトプラスミノーゲン、腫瘍を有する動物の尿、正常マウスの尿、または生理食塩水のいずれかを毎日腹腔内投与した。偽手術のみを行った腫瘍を有するマウスの１グループには、生理食塩水の注射をおこなった。一次腫瘍の切除直後、ロ−ディング(loading)投与として、２４μｇ（１．２ｍｇ／ｋｇ／日／マウス) の抑制活性を有するフラグメントをマウスに腹腔内投与した。その後、実験期間を通して、毎日１２μｇ（０．６ｍｇ／ｋｇ／日／マウス) の抑制活性を有するプラスミノーゲンフラグメントをマウスに腹腔内投与した。対照マウスには、腫瘍の切除後、同じ用量の完全なプラスミノーゲン分子を投与した。尿処置については、正常なまたは腫瘍を有するマウスの尿を濾過、十分に透析、凍結乾燥し、そして滅菌水に再懸濁して２５０倍の濃縮液を作成した。一次腫瘍の切除の日にローディング投与として、腫瘍を有するマウスまたは正常マウスから得た透析尿濃縮液０．８ｍｌを２回の腹腔内注射としてマウスに投与した。その後、実験の期間中、透析濃縮尿０．４ｍｌを毎日マウスに腹腔内投与した。処置は１３日間おこない、１３日目に全てのマウスを屠殺して剖検した。
【０１８７】
実験の結果は、図８と９に示す。図８は、１３日間の処置後の表面肺転移腫瘍を示す。表面肺転移腫瘍とは、剖検時においてマウスの肺に観察された転移腫瘍を指す。立体顕微鏡を使用して転移腫瘍を計数した。図８は、実際に計数された表面肺転移腫瘍の数の平均値と標準誤差を示す。図示されるように、一次腫瘍を有するマウスのグループでは転移は見られなかった。一次腫瘍を切除し、生理食塩水による処置を受けたマウスでは、広範な転移が見られた。ヒト由来のプラスミノーゲンフラグメントによる処置を行ったマウスでは、転移は見られなかった。完全なプラスミノーゲン分子による処置を行ったマウスでは、広範な転移が見られ、完全なプラスミノーゲン分子には内皮抑制活性がないことを示した。腫瘍を有するマウスから得た透析および濃縮した尿による処置をおこなったマウスでは、転移はなかった。正常マウスの尿の濃縮液で処置したマウスでは、広範な転移が見られた。肺重量の測定でも同様の結果が得られた（図９）。
【実施例１８】
【０１８８】
マウスおよびヒトのアンジオスタチンのアミノ酸配列
【０１８９】
マウス尿から単離されたアンジオスタチンおよびヒトのリジン結合サイトＩフラグメント調製物のアミノ酸配列を、アプライドバイオシステムモデル４７７Ａタンパク質シークエンサーを使用して決定した。フェニルチオヒダントインアミノ酸画分を、オンラインのＡＢＩモデル１２０Ａ  ＨＰＬＣによって同定した。マウスおよび人間のアンジオスタチンのＮ末端配列およびトリプシン消化物から決定したアミノ酸配列から、アンジオスタチンのアミノ酸配列は、マウスのプラスミノーゲンのアミノ酸番号９８から始まる配列に類似していることが示唆される。従って、アンジオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して約３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有するタンパク質から成り、マウスの完全なプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８のアミノ酸から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと実質的に同様のアミノ酸配列を有する分子である。マウスアンジオスタチンのアミノ酸配列の始めを、図１に示す（配列番号２）。アミノ酸配列の長さは、図１に示されるものよりも少し長いまたは短い可能性もある。
【０１９０】
ヒトのリジン結合サイトＩの活性画分のＮ末端アミノ酸分析およびトリプシン消化（実施例１５参照）の結果は、この画分の配列が、ヒトのプラスミノーゲンの、アミノ酸番号９７または９９付近から開始していること、およびヒトのアンジオスタチンとマウスのアンジオスタチンに相同性があることを示している。ヒトのアンジオスタチンのアミノ酸配列の始め（アミノ酸番号９８から開始）を図２に示す（配列番号３）。図２において、マウスとヒトのアンジオスタチンのアミノ酸配列を、ブタ、ウシ、アカゲザルといった他の種のプラスミノーゲン内のアミノ酸配列の相当する部分と比較しているが、これはこれらの種においてアンジオスタチンが存在することを示すものである。
【実施例１９】
【０１９１】
大腸菌におけるヒトのアンジオスタチンの発現
【０１９２】
大腸菌における真核生物の遺伝子の翻訳の効率を高めるために、ｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（インビトロゲン社製）（図１０）を使用して、ｔｒｃプロモーターからの高いレベルの転写を得た。金属との親和性を有する樹脂を使用した一段階の精製のためにＮ末端にニッケル結合性ポリヒスチジンテイルを融合した状態で、アンジオスタチンを発現させた。発現後、融合ぺプチド中のエンテロキナーゼ分解認識サイトを利用して、精製した組換えタンパク質からＮ末端ヒスチジン融合ペプチドを除去できる。組換えヒトアンジオスタチンタンパク質は、リジンと結合することが判明しており、クリングル領域１、２および３に対して特異的なモノクローナル抗体と交差反応性があり、インビトロにおいてｂＦＧＦの誘導する内皮細胞増殖を抑制する。
【０１９３】
インサートを作成するために、ヒトの肝臓ｍＲＮＡから、これを逆転写し、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）および特異的なプライマーを使用して増幅し、ヒトのアンジオスタチンをコードする遺伝子フラグメントを得た。１１３１の塩基対からなる産生物は、ヒトのプラスミノーゲンの９３番目から４７０番目のアミノ酸をコードするものである。増幅したフラグメントは、ｐＴｒｃＨｉｓＡのＸｈｏＩ／ＫｐｎＩサイト中にクローン化し、この構築物をＸＬ−１Ｂ（ストラタジーン社から入手可能）大腸菌宿主細胞中に導入した。プラスミドベクターｐＴｒｃＨｉｓＡのみを保有する対照クローンも同様にＸＬ−１Ｂ大腸菌宿主細胞に導入した。このクローンを、ベクター対照クローンと呼ぶ。どちらのクローンも、以下の記載の通り、同様に精製した。
【０１９４】
発現コロニーは、以下のように選択した。アンジオスタチンをコードする遺伝子で形質転換した大腸菌のコロニーリフト(lift)を、ＩＰＴＧをしみ込ませかつＬＢ寒天プレート上に重ねたニトロセルロースフィルター上で生育させた。ＩＰＴＧで発現を誘導した後、コロニーをニトロセルロースフィルター上で溶菌させる。ニトロセルロースリフトをブロ
ックし、濯いだ後、アンジオスタチンの特異的なコンフォメーションを認識する２種類の異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ ＤｃｄおよびＶａｐ;ノ−トルダム大学のS.G. McCance および F.J. Castellinoより贈与）をプローブとして検索した。ｍＡｂｓが認識する発現の旺盛なコロニーを選択した。
【０１９５】
最大の発現を得られる最適時間を確認するために、ＩＰＴＧ誘導の前後の様々な時間に細胞を集め、繰り返し凍結−融解サイクルを行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、ｍＡｂｓ ＤｃｄおよびＶａｐプローブ検索により分析した。
【０１９６】
これらの結果、ｐＴｒｃＨｉｓＡ／ＨＡｓＨ４クローンが選択された。ＩＰＴＧ誘導を４時間行った後、細胞ペレットを回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ8.0 、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロ−ルおよび２００ｍｇ／ｍｌリソゾ−ム中に懸濁して３０分間、４℃において攪拌した。このスラリーを１４，０００ｒｐｍ、２５分間遠心分離し、ペレットを５０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロールおよび０．１％ＤＯＣ中に再懸濁した。この懸濁液を１時間、４℃で攪拌し、１４，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。この段階での上清画分には、発現されたアンジオスタチンが含まれる。大腸菌の発現するヒトアンジオスタチンは、元のアンジオスタチンの物理特性、すなわちリジンに結合するという特性を有することが判明した。したがって、リジン−セファロースカラム（ファルマシア社またはシグマ社製）を使用して、一段階で、大腸菌の発現したアンジオスタチンが精製された。アンジオスタチンのカラムからの溶出は、０．２Ｍε−アミノ-n- カプロン酸、ｐＨ７．５で行った。
【０１９７】
これらの実験に続いて、スケールアップして１０リットルのｐＴｒｃＨｉｓＡ／ＨＡｓＨ４クローンのバッチ発酵を行った。このスケールアップの誘導で得られた細胞を沈殿させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５に懸濁させ、各破砕の間１０℃に冷却しながら１０，０００ｐｓｉで３回破砕した。得られたライゼートを、１０，０００ｒｐｍで、３０分間、４℃において遠心分離して清澄化し、リジンーセファロ−スカラムで発現されたアンジオスタチンを単離した（図１１）。
【０１９８】
大腸菌が発現したヒトアンジオスタチンの精製物を、水に対してよく透析し、凍結乾燥した。発現されたヒトアンジオスタチンは、培養液中（ＤＭＥＭ、５％ＢＣＳ、１％ゲンタマイシン／ペニシリン／ストレプトマイシン）に３μｇ／ｍｌの推定濃度で再懸濁し、実施例８、３９ページに記載されるように、インビトロにおけるウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイに使用した。同様に、ベクターのみを含有する対照クローンも、ｐＴｒｃＨｉｓＡ／ＨＡｓＨ４クローンと同じ方法で処理した。全く同様にＩＰＴＧで誘導し、細菌ライゼートを使用してリジンに結合させ、０．２Ｍアミノカプロン酸で溶出し、十分に透析して凍結乾燥した。この対照の調製物も、３μｇ／ｍｌの同じ推定濃度で培地中に再懸濁した。組換えアンジオスタチンサンプルと対照は、それぞれ異なる誘導および発酵バッチ、別個の精製過程で得たもので、すべてメリーランドのエントラメド社(EntreMed)において符号を付した。ＢＣＥアッセイは、これらの符号をつけたサンプルを使用して、盲検法で、ボストンのチルドレンズ・ホスピタル(Childre's Hospital)において実施された。
【０１９９】
組換えヒトアンジオスタチンのＢＣＥアッセイの結果は、大腸菌で発現したヒトアンジオスタチンが、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌの濃度で使用）によるＢＣＥ細胞の増殖を抑制することを示した（図１２）。培養液中に懸濁した（約３μｇ／ｍｌの濃度）組換えアンジオスタチンストックは、１：５、１：１０、１：２０に希釈して使用した。抑制パーセントは、以下にしたがって計算した。
【０２００】
【数１】
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【０２０１】
ＢＣＥ細胞増殖の抑制パーセントは、同じ濃度のプラスミノーゲン由来のアンジオスタチンによる値と同等かそれ以上であった。再度実施したＢＣＥアッセイの結果を図１３に示したが、ここでは１：５に希釈したストックを使用し、組換えアンジオスタチンは、プラスミノーゲン由来のアンジオスタチンと同程度の抑制パーセントを示した。図１３は、ヒト組換えアンジオスタチンタンパク質は、細胞培養において、ＢＣＥの増殖を６０％以上、さらには７５％以上にも抑制するという驚嘆すべき結果を示す。
【実施例２０】
【０２０２】
アンジオスタチンは、アポトーシス速度を増大させることにより、微小転移腫瘍を休止状態に維持する。
【０２０３】
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにルイス肺癌細胞（１ｘ１０6 ）を皮下接種後、大きさ約１．５ｃｍ3の一次腫瘍が出現した。一次腫瘍の外科的切除または偽手術をマウスに施した。手術後５、１０および１５日目にマウスを屠殺し、肺の組織学的検査を行った。一次腫瘍を切除したマウスでは、偽手術をおこなった対照と比較して、かなり大きな転移腫瘍の増殖が見られた（図１４）。転移腫瘍の増大とともに肺重量が有意に増大していた。
【０２０４】
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みにより測定される、腫瘍細胞増殖の分析では、５、９および１３日目において、一次腫瘍を無傷のままにしたマウスと切除したマウス間に差はなく、腫瘍塊の増大は増殖の促進により説明できないことを示した（図１５）。したがって、これらのマウスにおいて細胞の死滅について検討した。遺伝子発現における変化に依存し、発生および小腸などの組織における迅速な増殖における細胞の消滅に関わる細胞の死滅の過程であるアポトーシスを、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）技術により免疫組織化学的に標識したＤＮＡフラグメントを使用して調べた。アポトーシスインデックスは、各屠殺時に測定した。一次腫瘍の切除は、調べた全ての時点において、統計的に有意にアポトーシスインデックスを増大（約３から４倍）させる要因となった（図１５）。
【０２０５】
一次腫瘍を切除したマウスに外因性のアンジオスタチンサプレッサーを投与することで、これを裏付ける証拠が得られた。この物質ＴＮＰ−１４７０（以前にＡＧＭ−１４７０と呼ばれたＯ−クロロアセチルカルバモイルフマギロール）は、抗血管形成活性が報告されているフマギリンのアナログである。ＴＮＰ−１４７０の皮下注射（３０ｍｇ／ｋｇ、二日毎) により、上記の一次腫瘍を無傷で残したラットで得たのと非常に類似した結果を得た。これらの動物では、生理食塩水を注射した対照ラットと比較して、肺重量が小さく、増殖インデックスは同等であり、アポトーシスインデックスは増大していた(図１６）。
【０２０６】
これらのデータは、腫瘍細胞の増殖と細胞の死滅の速度が均衡状態にある間は、転移腫瘍は休止状態にあることを示している。おそらく、腫瘍細胞におけるアポトーシスを促進させることにより転移腫瘍の成長をコントロールしている血管形成インヒビター（アンジオスタチン）が除かれることが原因で、一次腫瘍を切除すると転移腫瘍の成長が急速に増大する。これらの作用は、一次腫瘍の切除と外因性の血管形成インヒビターの投与後に観
察されるものと類似している。総合して考えると、これらのデータは、一次腫瘍が微小転移腫瘍を休止させるアンジオスタチンを放出していることを示唆するものである。
【実施例２１】
【０２０７】
インビボにおけるアンジオスタチンによる一次腫瘍の治療
【０２０８】
アンジオスタチンは、上記の実施例１５に記載されるように、ヒトのプラスミノーゲンを制限的にエラスターゼ消化して精製した。アンジオスタチンをリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁して、６週齢オスＣ５７ＢＩ６／Ｊマウスに投与した。ルイス肺癌またはＴ２４１線維肉腫の細胞のいずれか１ｘ１０6 個をマウスの皮下に移植した。４日後、腫瘍の大きさが８０〜１６０ｍｍ3になった時にアンジオスタチンによる治療を開始した。アンジオスタチンの４０ｍｇ／ｋｇの単回投与、または８０ｍｇ／ｋｇの２回投与を、腹腔内（ｉｐ）または皮下（ｓｃ）注射でおこなった。治療を１９日間継続し、マウスは各時点で屠殺された。
【０２０９】
１日用量で４０ｍｇ／ｋｇをｉｐ投与した場合のアンジオスタチンは、Ｔ２４１細胞の成長を非常に強く抑制した（図１７）。この成長抑制作用は、２日以内に肉眼で確認できる程度になり、実験の期間中、度合いが強くなっていった。１８日目には、アンジオスタチン投与マウスの腫瘍の容積は、生理食塩水を注射した対照マウスの腫瘍のおよそ３８％となった。この差は、統計的に有意である。（ｐ＜０．００１、スチュデントのｔ検定）。
【０２１０】
アンジオスタチン投与（総用量８０ｍｇ／ｋｇ、すなわち、４０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与または皮下投与で１日２回投与）も、ＬＬＣ−ＬＭ一次腫瘍の成長速度を有意に低下させた（図１７）。この抑制作用は、４日目に確認され、以後、調べた時点全てにおいて程度が増大していった。実験の最終日（１９日）では、アンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、生理食塩水を投与した対照のわずか２０％であり、有意な差があった（ｐ＜０．００１、スチュデントのｔ検定）。
【０２１１】
別の実験では、Ｔ２４１線維肉腫、ルイス肺癌（ＬＭ）、または細網肉腫を移植したマウスにアンジオスタチン（５０ｍｇ／ｋｇ ｑ１２ｈ）を投与した。各タイプの腫瘍細胞において、アンジオスタチンが投与されたマウスでは、腫瘍がかなり小さくなった。図１９は、Ｔ２４１線維肉腫について、２４日目のアンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、非投与マウスのわずか１５％であったことを示す。図２０は、ルイス肺癌（ＬＭ）について、２４日目のアンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、非投与マウスのわずか１３％であったことを示す。図２１は、細網肉腫について、２４日目のアンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、非投与マウスのわずか１９％であったことを示す。示したのデータは、各時点における４匹のマウスの平均値である。
【０２１２】
これらの結果は、アンジオスタチンが、インビボにおいて異なる３種類の異なる一次腫瘍の成長の非常に強力なインヒビターであることを示す。
【実施例２２】
【０２１３】
インビボにおけるマウスのヒト細胞由来一次腫瘍のアンジオスタチンによる治療
【０２１４】
２種類のヒト腫瘍細胞系、すなわち、ヒト前立腺癌ＰＣ−３とヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢに対するアンジオスタチンの作用を調べた。免疫不全ＳＣＩＤマウスにヒトの腫瘍細胞を移植し、実施例２１に記載のように、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのアンジオスタチンを基本的に１２時間毎に投与した。その結果、本発明のアンジオスタチンタンパク質が、ヒトの腫瘍細胞の成長の強力なインヒビターであることが示された。図２２は、ヒトの前立腺癌Ｐ
Ｃ−３に関し、２４日目において、アンジオスタチンを投与したマウスの平均腫瘍容積は、投与をおこなわない対照マウスのわずか２％であることを示している。図２３は、ヒトの乳癌ＭＤＡ−ＭＢに関するもので、２４日目において、アンジオスタチンを投与したマウスの平均腫瘍容積は、投与をおこなわない対照マウスのわずか８％であることを示している。
【実施例２３】
【０２１５】
遺伝子治療−アンジオスタチン遺伝子トランスフェクションの腫瘍の容積に対する効果
【０２１６】
マウスのプラスミノーゲンのアミノ酸番号１〜４６０をコードする、マウスのプラスミノーゲンｃＤＮＡ（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手）に由来する、アンジオスタチンをコードする１３８０塩基対のＤＮＡ配列を、ＰＣＲを使用して作成し、発現ベクターに挿入した。この発現ベクターをＴ２４１線維肉腫細胞に導入し、ＤＮＡ導入細胞をマウスに移植した。対照マウスには、非ＤＮＡ導入Ｔ２４１、または、ベクターのみを導入したＴ２４１（すなわち、アンジオスタチンを発現しない導入細胞）を移植した。３種類のアンジオスタチン発現ＤＮＡ導入細胞のクローンを、実験で使用した。平均腫瘍容積を、経時的に測定した。その結果、非ＤＮＡ導入および非発現の対照細胞に比較して、アンジオスタチン発現細胞クローンのマウスにおいて平均腫瘍容積の驚くべきかつ劇的な低下が示された。
【０２１７】
マウスアンジオスタチンタンパク質をコードするマウスＤＮＡ配列は、マウスのプラスミノーゲンｃＤＮＡに由来する。マウスのアンジオスタチンには、マウスのプラスミノーゲンクリングル領域１〜４が含まれる。このクローンの構築の概略図を図２４に示す。
【０２１８】
マウスのアンジオスタチンタンパク質クローンを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMトランスフェクションシステム（ライフテクノロジーズ社、ゲティスバーグ、ＭＤから入手可能）を使用して、Ｔ２４１線維肉腫細胞に導入した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM試薬は、メンブラン濾過水中の、カチオン脂質 N-[1-(2,3-ジオレイロキシ）プロピル]-n,n,n-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)およびジオレコイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE) の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤である。
【０２１９】
細胞の一過性のトランスフェクションのための手順は以下の通りである：
１．Ｔ２４１細胞を６０ｃｍ2の組織培養皿で成長させる（血清を添加した適当な成長培地２ｍｌ中に約１〜２ｘ１０5 細胞を接種）。
２．37℃で、ＣＯ2 インキュベーター中で、細胞が４０〜７０％コンフルエント(confluent)になるまで細胞をインキュベートする。通常１８〜２４時間かかるが、所要時間は細胞のタイプによって違う。Ｔ２４１腫瘍細胞のコンフルエンシィは約７０％である。
３．以下の溶液を１２ｘ７５ｍｍの滅菌試験管に準備する。
溶液Ａ：各トランスフェクション処理用に、５μｇのＤＮＡを１００μｌの血清を含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉリデュースドセーラムメディウム(Reduced Serum Medium:ライフテクノロジーズ社より入手可能）中に希釈する（組織培養等級の脱イオン水も使用できる）。
溶液Ｂ：各トランスフェクション処理用に、３０μｇのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMを１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で希釈する。
４．２種類の溶液を混合し、穏やかに攪拌し、室温で１０〜１５分間インキュベートする。
５．血清を含まない培地で２回細胞を洗浄する。
６．各トランスフェクション処理用に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM試薬−ＤＮＡ複合体を含有する各試験管に、０．８ｍｌの血清を含まない培地を添加する。穏やかに攪拌し、その複合体を細胞に接触させる。
７．ＣＯ2インキュベーター中、約１２時間、３７℃にて細胞をインキュベートする。
８．ＤＮＡを含有する培地を、１ｍｇ／ｍｌ選択血清含有培地で置き換え、細胞をＣＯ2 インキュベーター中、３７℃にて、合計４８〜７２時間インキュベートする。
９．トランスフェクションから４８〜７２時間後、細胞抽出物の遺伝子活性を検定する。
【０２２０】
ＤＮＡ導入した細胞は、アンジオスタチン特異的抗体を使用して、アンジオスタチンタンパク質の発現についてアッセイすることができる。または、およそ１０〜１４日後、ＣＭＶ−アンジオスタチンを導入したＴ２４１細胞中に、Ｇ４１８抵抗性コロニーが出現する。また、ベクターのみを導入したクローンの中にも、多くのクローンが見られたが、導入をしなかったクローンでは見られなかった。免疫蛍光法を使用して、Ｇ４１８抵抗性クローンを、アンジオスタチン発現クローンとして選択した。
【０２２１】
興味深いことに、図２５および２６に示す通り、アンジオスタチンを導入したＴ２４１細胞とルイス肺癌のインビトロにおける成長は抑制されないか、他の点で悪影響を受けた。
【０２２２】
図２７は、トランスフェクション実験の結果を示す。マウスにおいて、アンジオスタチン発現Ｔ２４１導入クローンは、３種類とも、平均腫瘍容積が対照マウスよりもずっと少なかった。クローン３７を移植したマウスの平均腫瘍容積は、対照マウスのわずか１３％で、クローン３１およびクローン２５では、それぞれ対照マウスの腫瘍容積のわずか２１％と３４％であった。これらの結果は、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列は、細胞中に導入できること、導入されたＤＮＡ配列は、移植先の細胞によってアンジオスタチンタンパク質を発現する能力を有すること、発現されたアンジオスタチンはインビボで作用し、腫瘍の成長を低下させることを証明した。
【実施例２４】
【０２２３】
インビボにおけるアンジオスタチン発現部位の位置特定
【０２２４】
インビボにおけるアンジオスタチンタンパク質の発現部位の位置特定をするために、ルイス肺癌(マウス) 、Ｔ２４１線維肉腫（マウス）およびブルキット(Burkitt)のリンパ腫細胞（ヒト）の種々の細胞型に由来する全ＲＮＡを、腫瘍細胞から直接採取したものおよび数継代後の細胞培養によるものについて分析してアンジオスタチン転写物の存在を確認した。サンプルをノーザン分析した結果、マウスのプラスミノーゲンに相当する約２．４ｋｂの単一シグナルが示された正常マウスの肝臓ＲＮＡ以外のすべてのサンプルでは、ｔｈｎ配列とのシグナルハイブリダイゼーションがないことが判明した。ヒトのサンプルのノーザン分析の結果、ヒトのプラスミノーゲンに相当する約２．４ｋｂの単一シグナルが示された正常ヒト肝臓ＲＮＡ以外では、ヒトのアンジオスタチン配列とのシグナルハイブリダイゼーションがないことが判明した。
【０２２５】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析の結果、正常マウス肝臓以外では、サンプル中にマウスアンジオスタチン配列でプローブ検索される成生物がないことが判明した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析の結果、正常ヒト肝臓サンプル以外では、全てのヒトから得たサンプル中に、ヒトアンジオスタチン配列でプローブ検索される成生物がないことが判明した（マウスでの予想サイズは１，０５０ｂｐ、ヒトでは１，１３４ｂｐ）。
【０２２６】
このように、上記の全てのマウスのサンプル中では、マウスアンジオスタチン転写物（マウスのプラスミノーゲンのアミノ酸９７〜４５０と同一と考えられる)が産生されず、上記ヒトのサンプル中ではヒトアンジオスタチン転写物( ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９３〜４７０と同一と考えられる)が産生されないと考えられる。正常なマウス／ヒ
トの肝臓で得られた陽性シグナルは、プラスミノーゲンとのハイブリダイゼーションのものである。
【実施例２５】
【０２２７】
酵母におけるアンジオスタチンの発現
【０２２８】
ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９３〜４７０をコードする遺伝子フラグメントを、酵母(Pichia pastoris)中のＰＨＯ１分泌シグナルを利用してタンパク質の分泌発現を可能とする、ｐＨＩＬ−ＳＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩサイト中にクローン化した。同様に、ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９３〜４７０をコードする遺伝子フラグメントを、酵母菌(Pichia pastoris)中のα因子分泌シグナルを利用してタンパク質の分泌発現を可能とする、ｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩサイト中にクローン化した。これらのシステムで発現されたヒトアンジオスタチンタンパク質には、タンパク質プロセッシング、タンパク質ホールディング、およびグリコシル化などの翻訳後の修飾など、大腸菌での発現システムにはない多くの利点がある。
【０２２９】
Pichia pastorisでの遺伝子の発現は、Sreekrishna, K. et al.,(1988) High level expression of heterologous proteins in methylotropic yeast Pichia pastoris. J. Basic Microbiol. 29 (4): 265-278、および Clare, J.J. et at. (1991) Produciton of epidermal growth factor in yeast: High-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies, Gene 105:205-212に記載されている。どちらも本明細書に、引用により含める。
【実施例２６】
【０２３０】
トランスジェニック動物および植物におけるアンジオスタチンタンパク質の発現
【０２３１】
アンジオスタチン遺伝子転写物を発現するウシまたはブタ科などのトランスジェニック動物を作成する。トランスジェニック動物は、たとえば、これらの動物の乳中にアンジオスタチンタンパク質を発現する。さらに、アンジオスタチン遺伝子転写物を発現する食用のトランスジェニック植物を作成する。
【０２３２】
外来ＤＮＡを発現するトランスジェニック動物の作成は、本明細書に引用により含めるSmith H. Phytochrome transgenics: functional, ecological and biotechnical applications, Semin. Cell. Biol. 1994 5(5):315-325に記載されている。
【０２３３】
なお、先に記載の事項は、本発明の好ましい実施態様にのみ関し、後記に添付される特許請求の範囲に記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの修飾や変更を加えることができるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１−１】図１−１は、配列番号１、すなわち、完全なマウスのプラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す。
【図１−２】図１−２は、図１−１の続きである。
【図２−１】図２−１は、マウスのアンジオスタチンの始めの部分の配列（配列番号２）を示し、そのマウスのプラスミノーゲンペプチドフラグメントの配列と、ヒト（配列番号３）、アカゲザル（配列番号４）、ブタ（配列番号５）、ウシ（配列番号６）の配列の相当部分との比較を示す。マウスの配列が１番目、次いで人間、アカゲザル、ブタ、ウシの順である。
【図２−２】図２−２は、図２−１の続きである。
【図２−３】図２−３は、図２−２の続きである。
【図３】図３は、一次腫瘍の存在または非存在下における、肺の腫瘍細胞のＢｒｄＵラベリングインデックスを示す。
【図４】図４は、インビボにおけるｂＦＧＦにより誘導された血管形成に対するルイス肺一次腫瘍の影響のマトリゲル(Matrigel)分析を示す。
【図５】図５は、ルイス肺癌（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）を有するマウスから得た血清と正常マウスから得た血清の用量反応曲線を示す。ウシ毛細血管内皮細胞を、ｂＦＧＦ誘導７２時間増殖アッセイを使用してアッセイした。
【図６】図６は、腹水中においては低および高転移性腫瘍のいずれもが内皮細胞分裂活性を有するが、血清中においては低転移性腫瘍系のみが内皮抑制活性を有することを示す。
【図７】図７は、腫瘍を有する動物から得た部分精製の血清と尿のＣ４逆相クロマトグラフィーのプロファイルを示す。
【図８】図８は、完全なプラスミノーゲン分子、ヒトプラスミノーゲンのリジン結合サイトＩ調製物から得た活性画分、腫瘍を有するマウスから得た濃縮尿、および正常マウスから得た濃縮尿で処置後１３日目のマウスの肺表面転移を示す。
【図９】図９は、ヒトのプラスミノーゲンの完全なプラスミノーゲン分子、リジン結合サイトＩ調製物から得た活性画分、腫瘍を有するマウスから得た濃縮尿、および正常マウスから得た濃縮尿で処置後１３日目のマウスの肺重量を示す。
【図１０】図１０は、ｐＴｒｃＨｉｓベクターの概略図である。
【図１１】図１１(写真)は、１０リットルの大量培養でヒトアンジオスタチンを発現する大腸菌の、ヒトプラスミノーゲンクリングル領域１〜３に対するモノクローナル抗体をプローブとした免疫ブロットである。矢印は、組換えヒトアンジオスタチンを示す。Ａ）は、０．２Ｍアミノカプロン酸で溶出された組換えアンジオスタチンを示す。Ｂ）は、リジンカラムの１×ＰＢＳでの最後の洗浄液を示す。Ｃ）は破砕した細胞からの清澄化したライゼートを示す。
【図１２】図１２は、ストックの希釈の関数としての、ウシ毛細血管内皮細胞の成長の抑制パーセントを示す。Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２およびＥはヒトアンジオスタチン抗血管形成活性を発現する組換えクローンである。Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１およびＤ２対照は、アンジオスタチンをコードするヒトのＤＮＡ配列を含まないベクターを含有するネガティブ対照クローンである。
【図１３】図１３は、インビトロにおけるウシ毛細血管内皮細胞に対する組換えヒトアンジオスタチンの増殖抑制作用を示す。
【図１４】図１４（写真）は、一次腫瘍の除去および生理食塩水または抗血管形成作用を有するフマギリンアナログを使用した処置後の、成長増殖インデックスおよびアポトーシスインデックスを示す。
【図１５】図１５は、インビボにおけるヒトアンジオスタチンの４０ｍｇ／ｋｇ／日の単回投与による治療によるマウスのＴ２４１一次腫瘍の成長の抑制を示す。
【図１６】図１６は、インビボにおけるヒトアンジオスタチンの４０ｍｇ／ｋｇ／投与 の二回投与（８０ｍｇ／ｋｇ／日)による治療によるマウスのＬＬＣ−ＬＭ一次腫瘍の成長の抑制を示す。
【図１７】図１７は、ルイス肺癌の一次腫瘍の切除の、該癌の肺転移腫瘍の成長に与える作用を示す。
【図１８】図１８は、腫瘍切除後の成長増殖およびアポトーシスインデックスを示す。
【図１９】図１９は、Ｔ２４１線維肉腫細胞を移植されたマウスにおける総腫瘍容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を時間の関数として示した。
【図２０】図２０は、ルイス肺癌（ＬＭ）細胞を移植されたマウスにおける総腫瘍容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を時間の関数として示した。
【図２１】図２１は、細網肉腫細胞を移植されたマウスにおける総腫瘍容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を時間の関数として示した。
【図２２】図２２は、ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を移植された免疫不全ＳＣＩＤマウスにおける総腫瘍容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を、２４日以上の期間にわたり、時間の関数として示した。
【図２３】図２３は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ細胞を移植された免疫不全ＳＣＩＤマウスにおける総腫瘍容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を、２４日以上の期間にわたり、時間の関数として示した。
【図２４】図２４は、マウスのプラスミノーゲンｃＤＮＡに由来するマウスアンジオスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列の概略図である。マウスアンジオスタチンは、マウスのプラスミノーゲンクリングル領域１〜４を含む。ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応の略であり、Ｐ１はＰＣＲのための５’末端オリゴヌクレオチドプライマーであり、Ｐ２はＰＣＲのための３’末端オリゴヌクレオチドプライマーであり、ＳＳはシグナル配列であり、ＡＴＧは翻訳開始コドンであり、ＴＡＡは翻訳停止コドンであり、ＨＡはヘマグルチニンエピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬ）であり、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４はそれぞれマウスのプラスミノーゲンクリングル領域１、２、３および４であり、ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターであり、Ｔ７はバクテリオファージプロモーターであり、ＰＡは未活性化ペプチドであり、ＳＰ６はＳｐ６プロモーターである。
【図２５】図２５は、非導入細胞（モック(mock)）、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を含まないベクター（ベクター５）のみを導入した細胞、および２つのアンジオスタチン発現クローン（ＡＳＴ３１およびＡＳＴ３７）の細胞数を日数の関数として示す。パネル（ａ）は、Ｔ２４１細胞のトランスフェクションの結果を示す。パネル（ｂ）は、ＬＬ２細胞の結果を示す。
【図２６】図２６は、アンジオスタチンクローンを含有する大腸菌細胞に由来する培地の、細胞数に対する結果を示す。非導入細胞（モック）、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を含まないベクターのみを導入した細胞（ベクター５）、および３つのアンジオスタチン発現クローン（ＡＳＴ２５、ＡＳＴ３１およびＡＳＴ３７）。パネル（ａ）は、対照（モック）および全てのアンジオスタチンクローン（発現および非発現）由来の培地のインキュベーションの、細胞数に対する結果を示す。パネル（ｂ）は、対照（モック）、ベクターのみ（ベクター６）、およびマウスのアンジオスタチンを発現するアンジオスタチンクローン由来の培地のインキュベーションの、細胞数に対する結果を示す。パネル（ｃ）は、対照（モック）およびマウスのアンジオスタチンを発現するアンジオスタチンクローン由来の精製培地のインキュベーションの、細胞数に対する結果を示す（培地はリジン−セファロースカラムで精製され、リジン結合成分を回収した。）。
【図２７】図２７は、線維肉腫細胞にアンジオスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を保有するベクターが導入され、該ベクターはアンジオスタチンタンパク質を発現することができる場合の、マウスにおける総腫瘍容積に対する作用を、Ｔ２４１線維肉腫細胞の移植時期の関数として示す。「非導入(non-transfected)」は、マウスに移植された非改変のＴ２４１線維肉腫細胞である。「ベクター６」は、マウスに移植された、アンジオスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含まないベクターのみを導入したＴ２４１線維肉腫細胞である。「クローン２５、クローン３１、クローン３７」は、マウスに移植された、アンジオスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを導入したＴ２４１線維肉腫細胞の３種のアンジオスタチン産生クローンである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月3日(2004.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値で３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有するタンパク質であって、同タンパク質に相当する配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９８のアミノ酸をアミノ末端とするプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列におけるアミノ酸と５０％より多くのアミノ酸が同一であるアミノ酸配列を含み、抗血管形成活性を有する単離されたアンジオスタチンタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９８のアミノ酸をアミノ末端とするクリングル１〜４領域のアミノ酸配列を含み、抗血管形成活性を有する単離されたアンジオスタチンタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質がヒトのプラスミノーゲン、マウスのプラスミノーゲン、ウシのプラスミノーゲン、アカゲザルのプラスミノーゲンまたはブタのプラスミノーゲンに由来する請求の範囲第１項または２項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項４】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列をアミノ末端アミノ酸配列として含む請求の範囲第１項または２項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項５】
前記アンジオスタチンタンパク質はウシ内皮細胞検定においてインビトロでの内皮細胞増殖阻害活性を有する請求の範囲第１項または２項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が癌の成長を阻害することができる請求の範囲第１項または２項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項７】
癌が前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌からなるグループから選択される請求の範囲第６項に記載のアンジオスタチンタンパク質。
【請求項８】
抗血管形成活性を有し、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値で３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有するタンパク質であって、同タンパク質に相当する配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９８のアミノ酸をアミノ末端とするプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列におけるアミノ酸と５０％より多くのアミノ酸が同一であるアミノ酸配列を含むアンジオスタチンタンパク質をコードする配列を含む単離されたヌクレオチド分子を含む、血管形成阻害を必要とする患者を治療するための医薬組成物。
【請求項９】
抗血管形成活性を有するアンジオスタチンタンパク質をコードする配列を含む単離されたヌクレオチド分子を含み、前記アンジオスタチンタンパク質はプラスミノーゲン分子のクリングル１〜４領域を含む、血管形成阻害を必要とする患者を治療する
ための医薬組成物。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド分子が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列をアミノ末端アミノ酸配列として含むタンパク質をコードする請求の範囲第８項または９項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アンジオスタチンタンパク質がウシ内皮細胞検定においてインビトロでの内皮細胞増殖を阻害する活性を有する請求の範囲第８項または９項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アンジオスタチンタンパク質が癌の成長を阻害することができる請求の範囲第８項または９項に記載の組成物。
【請求項１３】
癌が前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌からなるグループから選択される請求の範囲第１２項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アンジオスタチンタンパク質をコードするヌクレオチド配列はベクターに挿入されており、前記ベクターは細胞中に存在するときにアンジオスタチンタンパク質を発現することができる請求の範囲第８項または９項に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞中にベクターをトランスフェクトさせる工程を含むアンジオスタチンタンパク質を発現させる方法であって、前記ベクターは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値で３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有するタンパク質であって、同タンパク質に相当する配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９８のアミノ酸をアミノ末端とするプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列におけるアミノ酸と５０％より多くのアミノ酸が同一であるアミノ酸配列を含むアンジオスタチンタンパク質をコードする配列を含む単離されたヌクレオチド分子を含み、前記ベクターは細胞中に存在する時にアンジオスタチンタンパク質を発現することができることを特徴とするアンジオスタチンタンパク質を発現させる方法。
【請求項１６】
細胞中にベクターをトランスフェクトさせる工程を含むアンジオスタチンタンパク質を発現させる方法であって、前記ベクターは、抗血管形成活性を有し、プラスミノーゲン分子のクリングル領域１〜４領域を含むアンジオスタチンタンパク質をコードする配列を含むヌクレオチド分子を含み、前記細胞はアンジオスタチンタンパク質を発現させることができることを特徴とするアンジオスタチンタンパク質を発現させる方法。
【請求項１７】
前記発現がインビトロで行われる請求の範囲第１５項または１６項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド分子が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列をアミノ末端アミノ酸配列として含むアミノ酸配列をコードする請求の範囲第１５項または１６項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド分子が癌の成長を阻害することができるアンジオスタチンタンパク質をコードする請求の範囲第１５項または１６項に記載の方法。
【請求項２０】
癌が乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、線維芽細胞癌および細網癌からなるグループから選択される請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル中のアンジオスタチンタンパク質の濃度を決定する方法であって、
ａ）  アンジオスタチンタンパク質に結合する抗体をサンプルと混合し、
ｂ）  抗体とアンジオスタチンタンパク質の複合体の濃度を測定することを含み、
前記アンジオスタチンタンパク質は、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値で３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有するタンパク質であって、同タンパク質に相当する配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９８のアミノ酸をアミノ末端とするプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列におけるアミノ酸と５０％より多くのアミノ酸が同一であるアミノ酸配列を含み、抗血管形成活性を有する、方法。
【請求項２２】
サンプル中のアンジオスタチンタンパク質の濃度を決定する方法であ
って、
ａ）  アンジオスタチンタンパク質に結合する抗体をサンプルと混合し、
ｂ）  抗体とアンジオスタチンタンパク質の複合体の濃度を測定することを含み、
前記アンジオスタチンタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９８のアミノ酸をアミノ末端とするクリングル領域１〜４領域を含み且つ抗血管形成活性を有する、方法。
【請求項２３】
サンプル中の前記アンジオスタチンタンパク質が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列をアミノ末端アミノ酸配列として含む請求の範囲第２１項または２２項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アンジオスタチンタンパク質がウシ内皮細胞検定において内皮細胞増殖阻害活性を有する請求の範囲第２１項または２２項に記載の方法。
【請求項２５】
サンプルが哺乳動物の体液から得られることを特徴とする請求の範囲第２１項または２２項に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物が血管形成が介在する疾患または症状を有することを特徴とする請求の範囲第２５項に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物が癌を有することを特徴とする請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物において血管形成を阻害するアンジオスタチンタンパク質を含む医薬組成物であって、前記アンジオスタチンタンパク質はプラスミノーゲン分子のクリングル領域１〜４領域を含み、抗血管形成活性を有することを特徴とする血管形成阻害を必要とする患者を治療するための医薬組成物。
【請求項２９】
哺乳動物において血管形成を阻害するアンジオスタチンタンパク質を含む医薬組成物であって、前記アンジオスタチンタンパク質は抗血管形成活性を有し、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定値で３８キロダルトン〜４５キロダルトンの分子量を有し、前記アンジオスタチンタンパク質は同タンパク質に相当する配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９８のアミノ酸をアミノ末端とするプラスミノーゲンフラグメントのアミノ酸配列におけるアミノ酸と５０％より多くのアミノ酸が同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする血管形成阻害を必要とする患者を治療するための医薬組成物。
【請求項３０】
前記アンジオスタチンタンパク質が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるグループから選択されるアミノ酸配列をアミノ末端アミノ酸配列として含む請求の範囲第２８項または２９項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記アンジオスタチンタンパク質がウシ内皮細胞検定において内皮細胞増殖阻害活性を有する請求の範囲第２８項または２９項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
哺乳動物が血管形成により介在される疾患または症状を有する請求の範囲第２８項または２９項に記載の組成物。
【請求項３３】
哺乳動物が癌を有することを特徴とする請求の範囲第３２項に記載の組成物。