(57)【要約】【課題】  メラトニン測定用のＨＰＬＣシステムを提供する。【解決手段】  本発明は、メラトニンを含む生体試料を導入する試料導入手段；少なくとも複数のカラムを有し、前記生体試料を、濃縮し且つ分離して、前記メラトニンを含む画分を採取する処理手段；及び単一の質量分析器を用いた選択イオン検出により、前記画分を用いて、前記メラトニンに由来する成分を検出する検出手段；を有することを特徴とする。煩雑な前処理を行うことなく、選択的にメラトニンを定量することが可能となる。【選択図】  図１
2005300358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラトニンを含む生体試料を導入する試料導入手段；
少なくとも複数のカラムを有し、前記生体試料を、濃縮し且つ分離して、前記メラトニンを含む画分を採取する処理手段；及び
単一の質量分析器を用いた選択イオン検出又は選択反応検出により、前記画分を用いて前記メラトニンに由来する成分を検出する検出手段；
を有する高速液体クロマトグラフィー装置。
【請求項２】
前記の少なくとも複数のカラムのそれぞれは、Ｃ８又はフェニル基結合型基材を有する第１カラム、炭素数８乃至３０の側鎖を有するシリカベース若しくはポリマーベースの基材からなる第２カラム及び炭素数８乃至３０の側鎖を有するシリカベース若しくはポリマーベースの基材からなる第３カラムであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記試料導入手段は、オートインジェクターであることを特徴とする請求項１又は２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カラムスイッチング−セミミクロカラム液体クロマトグラフィー／質量分析法に関し、特に、ヒト唾液中内因性ＭＬＴの直接かつ高感度分析に用いるカラムスイッチング−セミミクロカラム液体クロマトグラフィー／質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラトニン（ＭＬＴ）は、松果体から分泌される内因性ホルモンの一つであり、サーカディアンリズムなど、内因性制御活動の有用な指標として知られている。
【０００３】
生体液中のメラトニン（ＭＬＴ）濃度をモニタリングする方法としては、免疫学的手法ガスクロマトグラフィー／負イオン化学イオン化質量分析法（ＧＣ／ＮＩＣＩ−ＭＳ）
電気化学検出器（非特許文献６乃至８）又は蛍光検出器（非特許文献９乃至１１）と組合わせた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）などによる方法が報告されている。
【非特許文献１】ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ＩＭ、Ｎｏｒｍａｎ  ＴＲ、Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＧＤ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＳＭ、Ｊ．Ｐｉｎｅａｌ．Ｒｅｓ．１９８７；４：１７７〜１８３．
【非特許文献２】Ｎｏｗａｋ  ＲＭｃＭｉｌｌｅｎ  ＩＣ、Ｒｅｄｍａｎ  Ｊ、Ｓｈｏｒｔ  ＲＶ、Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９８７；２７：４４５〜４５２．
【非特許文献３】Ｌａａｋｓｏ  Ｍ−Ｌ、Ｐｏｒｋｋａ−Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ  Ｔ、Ａｌｉｌａ  Ａ、Ｓｔｅｎｂｅｒｇ  Ｄ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｇ、Ｊ．Ｐｉｎｅａｌ．Ｒｅｓ．、１９９０；９；３９〜５０．
【非特許文献４】Ｖｏｕｌｔｓｉｏｓ  Ａ、Ｋｅｎｎａｗａｙ  ＤＪ、Ｄａｗｓｏｎ  Ｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｈｙｔｈ．、１９９７；１２：４５７〜４６６．
【非特許文献５】Ｎａｇｔｅｇａａｌ  Ｅ、Ｐｅｅｔｅｒｓ  Ｔ、Ｓｗａｒｔ  Ｗ、Ｓｍｉｔｓ  Ｍ、Ｋｅｒｋｈｏｆ  Ｇ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  Ｇ、Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ．、１９９８；２０：１８１〜１８３．
【非特許文献６】Ｖｉｅｉｒａ  Ｒ、Ｍｉｇｕｅｚ  Ｊ、Ｌｅｍａ  Ｍ、Ａｌｄｅｇｕｎｄｅ  Ｍ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２；２０５：３００〜３０５．
【非特許文献７】Ｈａｒｕｍｉ  Ｔ、Ａｋｕｔｓｕ  Ｈ、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  Ｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ、１９９６；６７５：１５２〜１５６．
【非特許文献８】Ｃｈａｎｕｔ  Ｅ、Ｎｇｕｙｅｎ−Ｌｅｇｒｏｓ  Ｊ、Ｖｅｒｓａｕｘ−Ｂｏｔｔｅｒｉ  Ｃ、Ｔｒｏｕｖｉｎ  Ｊ−Ｈ、Ｌａｕｎａｙ  Ｊ−Ｍ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ、１９９８；７０９：１１〜１８．
【非特許文献９】Ｒｉｚｚｏ  Ｖ、Ｐｏｒｔａ  Ｃ、Ｍｏｒｏｎｉ  Ｍ、Ｓｃｏｇｌｉｏ  Ｅ、  Ｍｏｒａｔｔｉ  Ｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ、２００２；７７４：１７〜２４．
【非特許文献１０】Ｒｏｍｓｉｎｇ  Ｓ、Ｕｌｆｂｅｒｇ  Ｊ、Ｂｅｒｇｑｖｉｓｔ  Ｙ、Ｓｃａｎｄ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００３；６３：８１〜８８．
【非特許文献１１】Ｐｅｎｉｓｔｏｎ−Ｂｉｒｄ  ＪＦ、Ｄｉ  Ｗ−Ｌ、Ｓｔｒｅｅｔ  ＣＡ、Ｋａｄｖａ  Ａ、Ｓｔａｌｔｅｒｉ  ＭＡ、Ｓｉｌｍａｎ  ＲＥ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９３；３９：２２４２〜２２４７．
【非特許文献１２】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｋ、Ｏｓｔｉｎ  Ａ、Ｌｅｖｉｎ  Ｊ−Ｏ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ、２００３；７９４：１１５〜１２３．
【非特許文献１３】Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ、ＦＤＡ、ＣＤＥＲ、  ａｎｄ  ＣＶＭ、Ｍａｙ  ２００１．
【非特許文献１４】Ｓｉｍｏｎｉｎ  Ｇ、Ｂｒｕ  Ｌ、Ｌｅｌｉｅｖｒｅ  Ｅ、Ｊｅａｎｎｉｏｔ  Ｊ−Ｐ、Ｂｒｏｍｅｔ  Ｎ、Ｗａｌｔｈｅｒ  Ｂ、Ｂｏｕｒｓｉｅｒ−Ｎｅｙｒｅｔ  Ｃ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．、１９９９；２１：５９１〜６０１．
【非特許文献１５】Ｓａｎｄｅｒｓ  ＤＣ、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ＡＫ、Ｈｏｒｄｉｎｓｋｙ  ＪＲ、Ｊ．Ａｎａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、１９９９；２３：１５９〜１６７．
【非特許文献１６】Ｍｉｌｅｓ  Ａ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、１９８９；４４：３７５〜３８５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、先行技術では、煩雑な試料の前処理が必要であり、測定値の信頼性を有しつつ、サーカディアンプロファイル測定に十分な感度で、ヒト唾液中の内因性ＭＬＴを直接定量可能なクロマトグラフ手法は報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、以下の構成を有するＨＰＬＣにより解決する。
【０００６】
つまり、請求項１に記載の発明によると、本発明の高速液体クロマトグラフィー装置は、
メラトニンを含む生体試料を導入する試料導入手段；
少なくとも複数のカラムを有し、前記生体試料を、濃縮し且つ分離して、前記メラトニンを含む画分を採取する処理手段；及び
単一の質量分析器を用いた選択イオン検出又は選択反応検出により、前記画分を用いて前記メラトニンに由来する成分を検出する検出手段；
を有することを特徴とする。
【０００７】
これにより、必要最小限の試料の前処理のみで、選択的にメラトニンを定量分析することが可能となる。
【０００８】
また、請求項２に記載の発明によると、請求項１に記載の発明において、上記の少なくとも複数のカラムのそれぞれは、Ｃ８又はフェニル基結合型を有する第１カラム、炭素数８乃至３０の側鎖を有するシリカベース若しくはポリマーベースの基材からなる第２カラム及び炭素数８乃至３０の側鎖を有するシリカベース若しくはポリマーベースの基材からなる第３カラムであることを特徴としている。これにより、効率的に、生体試料中に含まれるメラトニンを濃縮し、その化学的特性に応じて分離することにより、煩雑な前処理を行うことなく、生体試料を直接導入することによりメラトニンを高感度に測定することが可能となる。
【０００９】
さらに、請求項３に記載の発明によると、請求項１又は２に記載の発明において、前記試料導入手段は、オートインジェクターであることを特徴としている。これにより、上述のシステムにより実行される分析工程を、試料の導入から検出まで自動的に行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００１０】
最小限の試料前処理と比較的短い分析時間により、ハイスループットでの分析を可能にする、選択性に優れたＭＬＴの定量が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
メラトニン（ＭＬＴ）は、松果体から分泌される内因性ホルモンの一つである。哺乳類におけるＭＬＴの最も知られた機能は、睡眠−覚醒サイクルの制御である。ヒトにおけるその他の機能は、性成熟、鬱、抗酸化など多岐にわたる。ＭＬＴは、ヒトのサーカディアンバイオリズムの調節に中心的役割を果たす神経性内分泌物質であり、そのサーカディアンリズムのプロファイリングは内因性制御活動の有用な指標として認識されている。
【００１２】
ヒトのＭＬＴモニタリングを行う際の理想的な試料として、唾液が血液に代わる有用かつ非侵襲な代用品として注目を集めてきた。唾液中のＭＬＴ濃度は血液中のものとよく相関することが知られているので、よい指標となりうる。一方、このアプローチにおける難しさは、分析方法に必要とされる感度にある。唾液中ＭＬＴ濃度は、血中のフリーな（アルブミン非結合の）濃度に相当するため、血中レベルの約３０％となる。ＭＬＴの正常な生理学的血漿レベルは、昼間で＜１０ｐｇ／ｍＬ、夜間で６０ｐｇ／ｍＬと報告されている。したがって、生体由来のタンパク成分等、夾雑物質中に存在するｐｇレベルのＭＬＴを検出することになり、アッセイ法は必然的に高感度で選択的である必要がある。
【００１３】
（カラムスイッチングシステムの構築）
ヒト唾液中の内因性ＭＬＴ濃度は、昼間で数ｐｇ／ｍＬ、夜間で２０〜３０ｐｇ／ｍＬと報告されている（非特許文献１及び３）。一方、用いた質量分析器における概算の検出限界は、調整したＳＩＭ条件下でＭＬＴ１ｐｇであった。試料の直接注入で必要感度を満足させるため、多めの試料注入とオンライン試料濃縮が可能なカラムスイッチングシステムを構築した。
【００１４】
本発明におけるＨＰＬＣシステムの一例は、３本のカラムと２つの六方バルブで構築した（図１）。図２には、タイムプログラムと操作の詳細なまとめを、目的成分の流れイメージとともに示した。シリカベースの混成機能Ｃ８又はフェニル基材を充填したプレカラムがオンライン試料クリーンアップを担うことで、唾液の直接注入分析が可能となった。プレカラムからの目的成分フラクションは、ハートカット（バルブ切り替えにより分画する操作）され、オンライン濃縮のために中間トラップカラムへと導いた。保持された目的成分は、引き続いて強い溶媒強度の移動相でバックフラッシュ（トラップカラムの終端から移動相を逆に流す操作）され、最後の分析カラムへの導入される。ＭＬＴは分析カラム先端で再度濃縮され、直ちに残存するマトリックス由来の妨害成分と分離される。第２のバルブ（図１のＶ２）は、不要な溶離液部分を排除するために用いた。
【００１５】
試料の大量注入は、２〜６ｍｍ内径のプレカラムの採用により実現した。最終分離を担う分析カラムには、効果的な試料の濃縮と低流速化による高いＥＳＩシグナルを達成するため、セミミクロ内径（１〜３ｍｍ）のものを用いた。中間のトラップカラムは、異なる流速（２００〜２５００μＬ／分及び５０〜５００μＬ／分）に対する緩衝効果を得るべく機能する。このトラップカラムのサイズ（２〜６ｍｍＩＤ×１０ｍｍ）は、トラップ及びバックフラッシュの両方向で目的成分の迅速な移動が可能になるように設定した。
【００１６】
カラムスイッチング法は、次の３ステップにより構築した：３段階のクロマトグラフ過程個別の最適化、それらの組合わせとその状態でのチューニング。各ステップの詳細を以下の小節にて述べる。
【００１７】
（ａ）  移動相
移動相に用いる有機溶媒の選択は、高感度なＬＣ／ＭＳ分析法の開発に重要な因子である。本システムには、ＭＬＴのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）において、アセトニトリルより高い応答と優れたＳ／Ｎ比を与えたメタノールを選択した。緩衝剤には、揮発性に優れた酢酸アンモニウムを用いた。酢酸アンモニウムの添加は、ナトリウム付加イオンの抑制の面でも有用であった。
【００１８】
（ｂ）  プレカラムにおけるクロマトグラフ条件の最適化
プレカラムは、数種のシリカベースの混成機能型充填剤から選定した。プレカラムの選定基準は、（ｉ）タンパク質の凝固を防ぐ低い有機溶媒濃度（１０ｖ／ｖ％）の移動相でＭＬＴが適度に保持されること、（ｉｉ）唾液由来の妨害成分の効果的な除去、且つ（ｉｉｉ）大量注入時にもＭＬＴピーク形状が劣化しないこと、とした。
【００１９】
検証したプレカラム基材のうち、Ｃ８結合形基材（ＭＦ−Ｃ８）又はフェニル結合型基材（ＭＦ−Ｐｈ）が、唾液からのＭＬＴの抽出における保持、分離及びピーク幅に最良のバランスを示した。図３は、ＭＦ−Ｃ８プレカラムにおける、ＭＬＴ／ｄ７−ＭＬＴ混液（Ａ）及びヒト唾液（Ｂ）の典型的な溶離プロファイルを示す（検出：ＵＶ２２３ｎｍ）。移動相は、２０ｍＭの酢酸アンモニウムを含む水−メタノール混液（９０：１０、ｖ／ｖ）とした。図示した通り、ＭＬＴは大部分のマトリックス由来妨害成分（ピーク面積で９９％）と短時間のうちに分離された。注入量は、オートインジェクターの最大注入量である４００μＬとした。試料注入量がＭＬＴの保持時間及びピーク形状へ与える影響は、この注入量まで顕著ではないことを確認した。注目すべきは、内因性のＭＬＴレベルはここでの注入量の約１０、０００分の１に過ぎないことであり、本プロセスに続く検出方法の選択性がいかに重要であるかがわかる。
【００２０】
最適化されたカラムスイッチング条件において、目的成分の分画幅（ハートカット容積）は１．１分に決定した。すなわち、“ＭＬＴのピークトップから＋０．５分、−０．６分”に相当するプレカラムからの溶離液を、六方バルブ（図１及び２のＶ１）のバルブ位置を変えることで、次のトラップカラムに導入した。マイナスのオフセット（０．１分）は、唾液成分がプレカラムに蓄積するにつれ生じるわずかだが逐次的なＭＬＴ保持時間の減少に対応するためである。その程度については、耐久性に関する章にて後述する。
（ｃ）  中間トラップカラムの選択
ＭＬＴはｌｏｇＰ値約１．６と中程度の疎水性を有する。このことから、中間トラップカラムは、異なる特性をもつシリカベースのＣ１８ショートカラムから選定したが、これに限定されるものではなく、炭素数８乃至３０の側鎖を有するシリカベースの基材又は炭素数８乃至３０の側鎖を有するポリマーベースの基材からなるカラムであれば、本発明の目的を良好に達成することができる。各カラムのＭＬＴトラップ能は、プレカラム用移動相（バッファー含有１０％メタノール）を１，０００μＬ／分で流した時のＭＬＴの保持をＵＶでモニターすることで評価した。評価したカラムのうち、最も水素結合性の低いシリカベースのＣ１８相を充填したものを、ｋ’が１００以上（１２分以上）と強くかつ十分なＭＬＴの保持を示したため採用した。カラムのサイズとしては、２〜６−ｍｍＩＤ×１０−ｍｍが十分なトラップ容量とバックフラッシュにおける迅速な目的成分の移送の両立に最適であることがわかった。
【００２１】
（ｄ）  分析カラムにおけるクロマトグラフ条件
主分析カラムは以下の基準で選定した：（ｉ）中〜高レベルの有機溶媒を含む移動相（≧４０ｖ／ｖ％）で適度なＭＬＴの保持があること、（ｉｉ）ＭＬＴと唾液由来の起こりうる妨害成分との良い分離、そして（ｉｉｉ）低い背圧（≦１０ＭＰａ）。基準（ｉ）は、トラップカラムからの目的成分の迅速な溶離と、主カラムにおけるシャープな試料バンドの実現に不可欠である。基準（ｉｉ）もまた、イオン源の洗浄頻度を減らし、イオン化過程でのサプレッションをできる限り避けるのに重要である。本発明において、上記の基準を満たすカラムとしては、炭素数８乃至３０の側鎖を有するシリカベースの基材又は炭素数８乃至３０の側鎖を有するポリマーベースの基材からなるカラムが挙げることができる。
【００２２】
複数のカラム及び移動相を調べた結果、次の組合わせが上記基準を最大限満たした：比較的親水性の充填剤からなるセミミクロ内径のシリカベースのＣ１８カラム（Ｃ１８  ＡＱ、１〜３−ｍｍＩＤ×１５０−ｍｍ長＋ガードカラム）及び５ｍＭの酢酸アンモニウムを含む水−メタノール混液（５０：５０、ｖ／ｖ）。この組合わせにおけるＭＬＴの保持時間は、４．２分（ｋ’＝２）であった。除去されずに残った唾液由来の妨害成分とＭＬＴとの間の良好な分離は、カラムスイッチング構成にＵＶ検出を組合わせた系で確認した。なお、このカラムは、比較的低い背圧で使用できた（２ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ長、２００μＬ／分、４０℃において〜７ＭＰａ）。
（ｅ）  ＳＩＭ条件
主カラムに用いた移動相下において、ＭＬＴに対する最も高感度な応答を得るには、ＥＳＩの正イオンモードで行うことが好ましい。図４は、最適化したイオン源条件における、ＭＬＴ（Ａ）及び７−ＭＬＴ（Ｂ）のマススペクトルを示す。ＭＬＴのモニターでは、ソースフラグメンテーションを起こし、バックグラウンドを減らすことで良いＳ／Ｎ比を得るため、付加的な電圧をイオン源に付加した。その結果ｍ／ｚ１７４．１における顕著なフラグメントをＭＬＴのモニターイオンとした。このフラグメントは、おそらく側鎖からのアセタミド中性フラグメント（ＣＨ３ＣＯＮＨ２、５９ａｍｕ）の脱離により生成した成分であると考えられるが、ＭＴＬの定量に適した成分であれば、上記フラグメント以外の成分をモニターイオンとしてもよい。ソース電圧（製造者の用語ではＡＱＡｍａｘ）は、上記フラグメント種に安定で高い効率を与える最適値である４０Ｖとした。Ｄ７−ＭＬＴは、ソースフラグメンテーション電圧をかけることなく、ｍ／ｚ２４０．１のプロトン化分子（［Ｍ＋Ｈ］＋）としてモニターした。この条件下で、１０、０００ｐｇのｄ７−ＭＬＴを注入しても、ＭＬＴモニターへのＩＳのクロストークは観測されなかった。試料へ添加するＩＳ量は、この１／２５とした（１，０００ｐｇ／ｍＬ唾液）。
【００２３】
本発明では、ヒト唾液中内因性ＭＬＴの直接かつ高感度分析用に開発した、カラムスイッチング−セミミクロカラム液体クロマトグラフィー／質量分析法の構築、バリデーション及び応用について開示する。本発明は、内部標準物質として重水素ラベルしたＭＬＴを加えボルテックス攪拌するだけの前処理で、唾液の直接注入分析を可能にする。質量分析装置による選択イオン検出（ＳＩＭ）との組合わせにより、Ｓ／Ｎ比５以上で検出限界２．５ｐｇ／ｍＬが得られた。本発明の妥当性は、ＭＬＴ添加唾液試料の分析を通じ、選択性、感度、直線性、真度及び精度について評価した。健常被験者のサーカディアンリズムモニタリングへの応用例も示す。
【実施例】
【００２４】
（唾液試料の採取・調製・保存）
（ａ）  分析法評価用のコントロール唾液
分析法評価に用いたコントロールヒト唾液は、健常な志願者から採取した：３７歳男性１名と、３歳及び３７歳の女性２名。唾液は、昼間（１２：００〜１５：００）に唾液採取器具サリベッテ（ｃｏｔｔｏｎ  ｓｗａｂ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ、  Ｓａｒｓｔｅｄｔ、  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ及びＣｏ．Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）を用いて採取した。唾液提供者には、採取３０分前から飲食を禁止し、採取直前に口腔内を清浄な水で洗浄するよう指示した。唾液は、採取器具製造者の指示どおり、器具内の綿栓を噛むことで採取した。採取時間は１〜２分とし、１バイアルあたり約１〜１．５ｍＬの唾液を採取した。採取した唾液は直ちに凍結され、使用するまで−２０℃で保存した。唾液は、使用前に容器ごと約１５℃の流水中で１５分間さらして融解させ、５℃、３７５０回転で１５分間遠心した。
【００２５】
（ｂ）  サーカディアンプロファイリング用唾液
コントロール唾液提供者と同じ３７歳男性及び同女性が、サーカディアンプロファイルモニターの試験に参加した。唾液の採取方法は、Ｎｏｗａｋら（非特許文献２）による手順にほぼ沿って行った。唾液は１時間ごとに２５時間採取した（女性被験者は２０時開始、男性被験者は２１時開始）。唾液採取期間を通じ、被験者は空調された部屋内にとどまった。照明は２２時から７時まで照度の低い状態に落とし（暗期）、被験者は採取の時間を除き就寝した。唾液採取及び試料の扱いに関する他の手順は、上記のコントロール唾液と同様とした。
【００２６】
（標準溶液及び添加試料の調製）
ＭＬＴ母液は、精密に量った１００ｍｇのメラトニン（ＭＬＴ、構造式は図４（Ａ）挿入図に図示、シグマ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ））を１００ｍＬのメタノールに溶解させて調製した。ＭＬＴのストック溶液（１μｇ／ｍＬメタノール溶液）はＭＬＴ母液をメタノール（関東化学（東京、日本）、ＨＰＬＣグレード）で希釈して調製した。ＭＬＴストック溶液をさらに水で希釈して、終濃度５〜２５００ｐｇ／ｍＬ（１０濃度：５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、１５００及び２５００ｐｇ／ｍＬ）のＭＬＴ作業溶液を調製した。ＭＬＴ母液は、褐色ガラスビンにいれ、−７８°Ｃで保存した。ＭＬＴストック溶液及びＭＬＴ作業溶液は、使用まで褐色ガラスビンにいれ−２０°Ｃで保存した。内部標準（ＩＳ）溶液は、メラトニンの重水素ラベル体（ｄ７−ＭＬＴ、構造式は、図４（Ｂ）挿入図に図示、Ｎ−［２−（５−ｍｅｔｈｏｘｙ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）ｔｅｔｒａｄｅｕｔｅｒｏｅｔｈｙｌ］ｔｒｉｄｅｕｔｅｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）、１００μｇ／ｍＬのメタノール溶液）（１００μｇ／ｍＬ）のメタノール溶液を、水（ミリＱ超純水、ミリポア社製水ろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、東京、日本）から採取）で４０ｎｇ／ｍＬになるよう希釈して調製した。
【００２７】
標準溶液及び品質保証試料（ＱＣ試料）は、各測定ごとに、９５０μＬのコントロール唾液の入った１．５ｍＬのガラスバイアルに、２５μＬずつの作業溶液及びＩＳ溶液を加えて調製した。ＱＣ試料中のＭＬＴ濃度は、１０、２５、１００及び１０００ｐｇ／ｍＬとした。分析法バリデーション用のＭＬＴ添加唾液の調製も同じ手順で行った。
【００２８】
（装置）
分離系にはナノスペースＳＩ−２セミミクロＨＰＬＣシステム（資生堂社製、東京、日本）を用いた。ＨＰＬＣシステムの構成は、ポンプ２台（ｍｏｄｅｌ３００１）、脱気ユニット（ｍｏｄｅｌ３０１０）、オートインジェクター（ｍｏｄｅｌ３０２３）、カラムオーブン（ｍｏｄｅｌ３００４）、紫外可視吸光度検出器（ｍｏｄｅｌ３００２）、及び二連六方スイッチングバルブユニット（ｍｏｄｅｌ３０１２）とした。オートインジェクターのサンプルループは、標準の２５０μＬ容量のものから、４００μＬ容量のものに変更した。
【００２９】
質量分析法による検出は、エレクトロスプレーイオン源を備えたＦｉｎｎｉｇａｎ  ＡＱＡ単四重極型質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｑｕｅｓｔ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により行った。エレクトロスプレーイオン化に用いる窒素ガスは、２０Ｅ／１２Ｅ型窒素ガス発生装置（ＳＩＣ、  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、横浜、日本）で供給した。
【００３０】
プレカラムには、シリカベースの混成機能Ｃ８相を充てんしたカートリッジタイプの短いカラムを用いた（図１の１３０に相当、Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  ＭＦ−Ｃ８  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒ  （ｄｐ）５μｍ、４．０ｍｍ（ＩＤ）×２０ｍｍ、資生堂、東京、日本）。プレカラムの前には、０．５５μｍのポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製フリットを組み込んだ低デッドボリュームのプレカラムマイクロフィルター（図１のＦに相当、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  Ｏａｋ  ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ、ＵＳＡ）及びガードカラム（図１のＧに相当、Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  ＭＦ−Ｃ８又はＭＦ−Ｐｈ１  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、ｄｐ５μｍ、２〜６ｍｍ  ＩＤ×１０ｍｍ、資生堂、東京、日本）を接続した。中間トラップカラムには、ポリマー被覆型シリカＣ１８カートリッジ（図１の１５０に相当、Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＵＧ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、ｄｐ５μｍ、２〜６ｍｍＩＤ×１０ｍｍ、資生堂、東京、日本）を用いた。主分析カラムは、セミミクロ内径のシリカベースのＣ１８カラム（ＯＤＳカラム）（図１の１６０に相当、Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＡＱ、ｄｐ５μｍ、１〜３ｍｍ  ＩＤ×１５０ｍｍ、資生堂、東京、日本）とした。分析カラムの前には、同じ充てん剤からなるガードカラム（図１のＧに相当、１〜３ｍｍＩＤ×１０ｍｍ）を接続した。プレカラム及び分析カラムは、４０°Ｃに保ったカラムオーブン中に入れて操作した。トラップカラムは、室温下で使用した（２５±５°Ｃ）。
【００３１】
水平ローター（モデルＧＨ−３．８）を備えた温調式遠心器、ベックマンコールターモデルＧＳ−６ＫＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｋ．Ｋ．、東京、日本）は、３７５０ｒｐｍ、５°Ｃで操作した。
【００３２】
（クロマトグラフ条件）
カラムスイッチングシステムの構成を図１に示し、図２には詳細なカラムスイッチング操作プログラムを目的成分の流れと共に示した。試料の通るすべての配管は、０．１３ｍｍ内径のＰＥＥＫチューブとした。プレカラム用の移動相（ポンプ１、図１の１１０）は、２０ｍＭの酢酸アンモニウムを含む水−メタノール（９０：１０、ｖ／ｖ）、分析カラムの移動相（ポンプ２、図１の１１２）は、５ｍＭの酢酸アンモニウムを含む水−メタノール（５０：５０、ｖ／ｖ）とした。すべてのカラムスイッチング分析は、試料注入量４００μＬで行った。インジェクションポートは、毎回注入ごとに２０μＬの水−メタノール（５０：５０、ｖ／ｖ）で洗浄した。オートインジェクター（図１の１２０）のサンプルラック温度は、分析期間を通じ１５℃とした。
【００３３】
プレカラムと中間カラムは、カラム単体にＵＶ２２３ｎｍ検出を組み合わせたシンプルな構成で最適化した。最適化には、ＭＬＴ、ｄ７−ＭＬＴ混液（各０．１２５μｇ／ｍＬの水溶液）を用いた（４００μＬ注入）。ＭＬＴ／ｄ７−ＭＬＴ混合ピークの保持時間をモニターする日常ＱＣにもこの溶液を用いた。主分析カラムのクロマトグラフ条件の最適化は、２μＬのＭＬＴ／ｄ７−ＭＬＴ混液（各５ｎｇ／ｍＬの水溶液）をカラムに注入し選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）することで実施した。カラムスイッチングシステムの評価（システム回収率、ピーク形状及び感度）は、４００μＬのＭＬＴ／ｄ７−ＭＬＴ混液（ＭＬＴ：２５ｐｇ／ｍＬ、ｄ７−ＭＬＴ：１０００ｐｇ／ｍＬ水溶液）をシステムに注入し、ＭＬＴ及びｄ７−ＭＬＴのＳＩＭ応答を確認することで行った。
【００３４】
（質量分析条件）
エレクトロスプレーイオン源は、正イオンモードで操作した。窒素シースガスは、ガスレギュレーターを通し０．７Ｍｐａで供給した。プローブ電圧は＋３．００ｋＶとし、プローブ温度は２５０°Ｃに設定した。ソース電圧（メーカー用語ＡＱＡｍａｘ）は、ＭＬＴモニターには４０Ｖ、ｄ７−ＭＬＴモニターには２２Ｖとした。その他のイオン源パラメーターは、分析カラムのみを用いたＭＬＴのＬＣ／ＭＳ分析において、ＭＬＴのプロトン化分子イオンが最も強くかつ安定に得られる条件に最適化した。最適化の評価は、１μＬのＭＬＴ溶液（１０μｇ／ｍＬメタノール）をカラムスイッチングと同様の条件で操作した分析カラムに注入して行った。
【００３５】
ＭＬＴの定量は、イオン源ブロック内で生成する主フラグメントイオン（ｍ／ｚ＝１７４．０６）のＳＩＭにより行った。内部標準（ＩＳ）としたｄ７−ＭＬＴは、プロトン化分子イオン（ｍ／ｚ＝２４０．０６）のＳＩＭにより検出した。ソース電圧は、それらターゲットイオンのシグナルが最も高くなる値に最適化した。両イオンとも、マススパン（測定質量幅）は０．１０ａｍｕ、ドゥエルタイムは０．１６７ｍｓとした。その他の質量分析部のパラメーターは、イオンエネルギー１．０ｅＶ；ＲＦレンズ電圧０．３Ｖ；低質量側分解能、１２．５；高質量側分解能、１２．５；検出器電圧、６５０Ｖとした。
【００３６】
定量計算は、ＭＬＴ及びＩＳそれぞれのマスクロマトグラムにおけるＭＬＴ、ＩＳのピーク面積を元に行った。データ取得、ピーク面積計算及び直線性とシステム適合性評価を含めた定量計算は、装置付属のソフトウェアＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｘｃａｌｉｂｕｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２）  及びＱｕａｎ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２）を用いて行った。
【００３７】
（分析法バリデーションの方法）
開発した分析法の妥当性は、適切な試料を用い、（ａ）選択性、（ｂ）直線性、（ｃ）検出下限（ＬＬＯＤ）、定量限界（ＬＬＯＱ）、（ｄ）真度及び精度についての分析により検証した。日内及び日間再現性の評価には、検量線（１セット）及び４濃度水準のＱＣ試料（Ｎ＝６）を３日間に分けて分析した。マトリックス効果の検証は、２種の異なる起源の唾液から調製したＱＣ試料の日間再現性により行った。評価基準は、生体試料分析法のバリデーションにおけるＦＤＡガイドライン（非特許文献１３）沿ったものとした。
【００３８】
（ａ）選択性
分析法の選択性は、３人の健常な志願者から採取した昼間唾液の分析により評価した。評価基準は、ＭＬＴ及びＩＳの保持時間付近に検出可能なピークを認めない、とした。
【００３９】
（ｂ）直線性
ＭＬＴの定量は内部標準法により行った。高低の２濃度範囲とした検量線は、１０濃度レベルのＭＬＴ標準溶液を使って作成した。５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、１５００及び２５００ｐｇ／ｍＬのＭＬＴ及び１０００ｐｇ／ｍＬのｄ７−ＭＬＴ（ＩＳ）を含むＭＬＴ標準溶液をそれぞれ分析し、ＳＩＭクロマトグラムにおけるＭＬＴ及びＩＳのピーク面積比をそれらの既知濃度比に対してプロットした。低濃度領域用の検量線作成には、５、１０、２５、５０、１００及び２５０ｐｇ／ｍＬのＭＬＴ標準溶液を用いた。高濃度領域用には、１００、２５０、５００、１０００、１５００及び２５００ｐｇ／ｍＬのＭＬＴ標準溶液を用いた。直線回帰計算は、重み付け及び原点強制なしで行った。すべての定量実験は、以上の計算方法を元に実施した。評価基準は、（１）決定係数（Ｒ２）は最低５濃度レベルで＞０．９９であり、（２）各標準溶液の真度（期待値からのずれ）は、定量下限（ＬＬＯＱ）では±２０％以内、その他のポイントでは±１５％以内である、とした。
【００４０】
（ｃ）検出下限（ＬＬＯＤ）
検出下限（ＬＬＯＤ）は、推定ＬＬＯＤ付近のＭＬＴ添加唾液の分析により確認し、Ｓ／Ｎ比５が得られる濃度とした。
【００４１】
（ｄ）精度と真度
精度と真度は、４濃度水準のＱＣ試料（Ｎ＝６）の３日間の分析結果から評価した。ＱＣ試料の濃度は、１０（ＬＬＯＱ）、２５（Ｌｏｗ）、１００（Ｍｅｄｉｕｍ）及び１０００（Ｈｉｇｈ）ｐｇ／ｍＬとした。評価基準は、（１）日内及び日間精度が±１５％以内であり、（２）日内及び日間真度が１００±１５％以内である、とした。
【００４２】
（ｅ）  試料溶液の安定性
唾液中ＭＬＴ及びｄ７−ＭＬＴの安定性についてはＳｉｍｏｎｉｎら（非特許文献１４）によりまとめられている（＋２０℃  ７日、  ＋４℃  ７日、且つ、−２０℃  ６ヶ月の３温度条件）ので、本発明では省略した。
【００４３】
（ｆ）  カラムスイッチングシステムとしての性能
最適化されたカラムスイッチング条件及び操作プログラム（図２）において各クロマトグラム過程の性能の維持と目的成分の完全な送達が達成されていることを示すため、カラムスイッチング過程あり・なしの条件で得たクロマトグラムを比較することでシステムリカバリーを評価した。その結果、カラムスイッチング構成のシステムに４００μＬの試料注入したときのクロマトグラムは、１０ｐｇオンカラムとして同一量のＭＬＴを含む試料２μＬを単一カラム構成に注入した時とほとんど同一のクロマトグラムを与えた。
【００４４】
図５は、本システムにより得たヒト夜間唾液の典型的なクロマトグラムを示す。図示のように、推定濃度２５ｐｇ／ｍＬの内因性ＭＬＴが良好なＳ／Ｎ比（〜５０）にてモニターされた。一回の分析は１０分以内に終了し、分析後のカラムのフラッシュや洗浄操作は必要としなかった。この点については、以下で述べる分析法バリデーションにて確認した。
【００４５】
（分析法バリデーションの結果）
（ａ）  選択性
分析法の選択性は、健常な志願者３名から得たヒト昼間唾液の分析により評価した。ＭＬＴ及びｄ７−ＭＬＴのそれぞれのＳＩＭクロマトグラムにおける各成分の溶出位置に、妨害ピークは認められなかった。
【００４６】
（ｂ）  直線性
標準溶液の濃度範囲は、内因性サーカディアン測定（５〜２５０ｐｇ／ｍＬで６濃度水準（“ｌｏｗ  ｒａｎｇｅ”））と外因性ＭＬＴの臨床応用（非特許文献１５）（１００〜２５００ｐｇ／ｍＬで６濃度水準（“ｈｉｇｈ  ｒａｎｇｅ”））の両方をカバーすべく設定した。２ヶ月間を通して得た検量線は、評価した濃度範囲において、決定係数（Ｒ２）０．９９８以上と良好な直線性を示した（５〜２５０ｐｇ／ｍＬ（ｎ＝９）及び１００〜２５００ｐｇ／ｍＬ（ｎ＝６））。直線回帰計算により得た検量線は、平均値±標準偏差として、ｙ＝（０．００１４７±
０．０００１４７）ｘ＋（０．００２９６±
０．００６０３）（ｌｏｗ  ｒａｎｇｅ）及びｙ＝（０．００１４２±
０．００００９８７）ｘ＋（０．０３７５±
０．０２０１）（ｈｉｇｈ  ｒａｎｇｅ）であった。
【００４７】
（ｃ）  検出下限  （ＬＬＯＤ）
ＭＬＴの検出下限は、Ｓ／Ｎ比５以上として２．５ｐｇ／ｍＬであった。
【００４８】
（ｄ）  精度及び真度
表１は、日内及び日間バリデーション評価結果をまとめたものである。内因性サーカディアンモニタリング（ＬＬＯＱ〜ＭｅｄｉｕｍのＱＣ、１０〜１００ｐｇ／ｍＬ）及び外因性ＭＬＴのほとんどの臨床モニタリング（Ｍｅｄｉｕｍ〜ＨｉｇｈのＱＣ、１００〜１０００ｐｇ／ｍＬ）をカバーするため、４濃度のＱＣ試料を用いた。精度は評価した全濃度でＲＳＤ≦１３％と、分析法バリデーションを通して満足いくものであった。真度もまた、９７−１０８％と常に良好であった。
【００４９】
【表１】
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（ｅ）  耐久性
本システムは、少なくとも、７０個の試料注入からなる一回の分析ラン（唾液総量として２８ｍＬを注入）の間、耐久性を示していた。ＱＣ試料はほぼ一定の値を示し、ＭＳ応答の絶対値も分析ランを通じて一定であった。唯一検出された変化は、プレカラムの前に配置したミクロフィルターの圧上昇であった。圧力は、７０試料の分析ランで最大〜７．５ＭＰａに到達したが、定量結果への影響は皆無であった。フィルターの交換は、試料注入の合間に、分析法の信頼性へ影響を与えずに交換することも可能である。
【００５０】
プレカラムマイクロフィルターとは対照的に、次のＭＦ−Ｃ８プレカラムは繰り返し唾液注入後もほんのわずかな圧力増加と保持時間の減少しか示さなかったことから、フィルターが試料中の異物や不溶性成分の効果的な第一関門として働いたことが示唆された。総量１６ｍＬの唾液を注入した分析ラン３回の平均において、プレカラムの圧力上昇は対初期値約１０２％であった。保持時間の減少は０．０７分より少なく、ピーク形状の劣化は認められなかった。これらの状態においても、プレカラムの前に配置した安価なガードカラムを交換することで、初期のカラム性能を容易に回復することができる。トラップカラム及び分析カラムにおいては、プレカラムのようなわずかな圧力上昇以外に、バリデーション操作を通じて顕著なダメージは観測されなかった。
【００５１】
本システムでは、プレカラムにおけるＭＬＴ保持時間の減少がシステム性能の重要な指標であった。したがって、システム適合性確認のためのＱＣサンプルとして、プレカラムにおけるＭＬＴ保持のモニターを各分析ランに含めた。プレカラム出口に接続されたＵＶ検出器（図１、１９０に相当）はこの目的のために配置した。本分析法の変数は、プレカラムにおけるＭＬＴの保持時間から一義的に決まるバルブスイッチングタイミングだけなので、分析条件の微調整は容易であった。
【００５２】
（健常な被験者のサーカディアンモニターへの応用）
図６は、本発明のＨＰＬＣシステムを用いて、健常な被験者２名から得た唾液中ＭＬＴのサーカディアンプロファイリングを示す。被験者のＭＬＴ濃度は２時にピークとなり、夜明け（６時３０分）に向けて徐々に減少した。これらの唾液ＭＬＴの分泌プロファイルは、既報（非特許文献２乃至４及び１６）の結果と類似していた。この結果から、本法はヒト唾液中の内因性ＭＬＴのサーカディアンモニタリングに有用であることが示された。本法は、ＭＬＴ濃度１０００ｐｇ／ｍＬまで検証されているので、ＭＬＴの臨床応用へも適用できるであろう。
【００５３】
（結論）
開発したカラムスイッチングセミミクロＬＣ／ＭＳ法は、ヒト唾液中の内因性ＭＬＴの直接定量を可能にした最初のクロマトグラフ手法である。本法は選択性に優れ、最小限の試料前処理と比較的短い分析時間により、高いスループットでの分析を可能にする。本法はまた、既に報告されている免疫学的またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法より劣るものの同等の感度を有することが示された。濃度範囲１０〜１０００ｐｇ／ｍＬで評価したバリデーションの結果、及び健常被験者の内因性ＭＬＴプロファイリングへの応用成功例から、本法はほとんどのヒト被験者に対するＭＬＴ研究に有用であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明によるＨＰＬＣシステムの概略図である。
【図２】本発明に従ったシステムにより、カラムスイッチング操作プログラムの一例を示した図である。
【図３】本発明におけるプレカラムを用いたＭＬＴ／ｄ７−ＭＬＴ混液（Ａ）及びヒト唾液（Ｂ）の典型的な溶離プロファイルである。
【図４】最適化したイオン源条件におけるＭＬＴ（Ａ）及びｄ７−ＭＬＴ（Ｂ）のマススペクトルである。
【図５】本発明に従ったシステムにより分析して得た夜間における唾液の典型的なクロマトグラムである。
【図６】本発明によるシステムを用いて得た、被検者（ｓｕｂｊｅｃｔ）由来の唾液中ＭＬＴのサーカディアンプロファイリングである。
【符号の説明】
【００５５】
１１０    ポンプ１
１１２    ポンプ２
１２０    オートインジェクター
１３０    プレカラム
１４０    六方バルブ
１５０    中間トラップカラム
１６０    分析カラム
１７０    六方バルブ
１８０    質量分析器
１９０    ＵＶ検出器
【図１】
2005300358.tif 000004
【図２】
2005300358.tif 000005
【図３】
2005300358.tif 000006
【図４】
2005300358.tif 000007
【図５】
2005300358.tif 000008
【図６】
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