(57)【要約】【課題】  プリオン病の研究・診断のために、通常の施設でも簡便な手段により、高感度のプリオン蛋白測定に供しうるプリオン蛋白の分離、濃縮、または試料調製の方法を提供する。【解決手段】  プリオン蛋白を含む試料に蛋白凝集作用物質を作用させる行程と、凝集した蛋白を可溶化する行程とにより蛋白（プリオン蛋白等、およびウイルス等）の分離、濃縮、試料調製を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリオン蛋白を含む試料に蛋白凝集作用物質を作用させる工程と、回収した沈殿物質を可溶化する工程とからなることを特徴とするプリオン蛋白の分離、濃縮、または試料調製の方法。
【請求項２】
蛋白凝集作用物質を溶液で加える請求項１記載の方法。
【請求項３】
蛋白凝集物質は多価金属陽イオン物質である請求項１または２の方法。
【請求項４】
多価金属イオン物質を除去もしくは封鎖して可溶化する請求項１から３のいずれかの方法。
【請求項５】
金属キレート化剤を用いる請求項４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、試料中に存在する蛋白（たとえばプリオン蛋白等）を蛋白凝集作用物質で分離・濃縮し、試料を調製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン投与や硬膜移植によりヒトからヒトへ感染する医原性プリオン病が、大きな社会問題となっているが、歴史的にみて、ヒトと動物のプリオン病の間に直接関連はないとされていた。しかし、１９９６年に、牛海綿状脳症いわゆる狂牛病が人に感染し、ヤコブ病を引きおこしたことが、突然発表された。これによりプリオン病が新たに主要食物からヒトに感染することが示された。そのため食の安全性に関する危機管理も浮き彫りにされ、プリオン病に対する不安が広がっている。ウシ由来副産物は食料以外にも医薬品、化粧品など数多く使用されていたために、厳しい規制による新たな問題点も起こっている。ウシの個体管理や検査システムにより安全性は確保できたと考えられているが、現在の診断方法では死後の検体検査しかできない。殺さずに生きたままで確定診断ができる診断技術の開発がのぞまれている。プリオン病の病原因子は核酸をもたない蛋白質性感染性粒子であり、正常細胞に発現している正常型プリオン蛋白が異常型プリオンに変化することにより生理的な代謝経路から外れて、神経系への蓄積と神経細胞死を起すと考えられている。国内外において牛海綿状脳症発症、汚染硬膜移植による医原性プリオン病の多発などプリオン病を取り巻く状況は医療・食に関し近年さらに激しさを増している。これに伴い、発症早期あるいは発症前診断の開発が急がれている。
【０００３】
最も一般的なプリオン病の診断方法は、臨床検査と異常プリオン蛋白の検出である。臨床検査では神経細胞の破壊に伴う蛋白質の測定、脳波、脳の画像診断、プリオン蛋白質遺伝子変異の検索が行われている。検査法としてはWestern blot法やＥＬＩＳＡ法、免疫組織染色法などが用いられている。ウシ等のプリオン病の検査・診断法としては、死後の中枢神経組織や髄液・リンパ節等からWestern blot法やＥＬＩＳＡ法によって異常プリオン蛋白を検出するものである。この方法では、発症の早期や発症前に確定診断を行う手段はヒトやウシに関して残念ながら未だ確立していない。生検材料を免疫学的測定するには、材料の調達・調製が難しくまた、分離回収には特別な施設・設備・技術を要し、一般的に簡便に利用でき得る方法はない。
【０００４】
近年、プリオン蛋白質の検出技術はいろいろと開発され、測定感度も向上している。しかし、測定感度の向上にも限界があり、試料中の蛋白を検出限界以上に濃縮する必要性がある。また、近年尿中プロテアーゼ抵抗性プリオン蛋白が注目され始めている。尿は検体採取が容易であり研究・生前診断に大きな期待が寄せられている（特許文献１）（非特許文献１）。しかし、この方法は、微量な蛋白を測定するために尿を透析し、超遠心を行い、蛋白を沈殿させる方法であり、特別な施設・設備・機器を必要としており一般的ではなく、生前診断のための材料調達・調製・検出方法は確立していない。
【０００５】
現在ウシのプリオン病診断には死後の中枢神経組織を可溶化し、これを免疫学的測定方法の材料としており、この可溶化の方法では材料が稀釈され、微量のプリオン蛋白を検出することが難しい。また死後の組織を用いた免疫学的診断も長時間を要し、かつ同時に多数の検体を処理することは困難であり簡便な方法ではない。そこで微量な蛋白の濃縮・調製と短時間かつ簡便な方法が重要な課題である。
【特許文献１】特表２００１−５２０７５５号公報
【非特許文献１】The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, No.34, pp31479-31482,2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この出願の発明は、上記の免疫学的検出法の問題点を解決し、簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便に処理することができ、また生前診断等のためにプリオン蛋白の分離、濃縮回収、あるいは試料調整の方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、次の方法を提供する。
〔１〕プリオン蛋白を含む試料に蛋白凝集作用物質を作用させる工程と、回収した沈殿物質を可溶化する工程とからなることを特徴とするプリオン蛋白の分離、濃縮、または試料調製の方法。
〔２〕蛋白凝集作用物質を溶液で加える上記の方法。
〔３〕蛋白凝集物質は多価金属陽イオン物質である上記の方法。
〔４〕多価金属イオン物質を除去もしくは封鎖して可溶化する上記の方法。
〔５〕金属キレート剤ＥＤＴＡを用いる方法。
【０００８】
以上のとおりのこの出願の発明は、発明者による検討から得られた全く新しい知見に基づいて完成されたものである。すなわち、発明者は、血漿・血清及び尿中の蛋白（ウイルスを含む）の表面荷電を利用した蛋白凝集・濃縮法を見出した。それは蛋白表面陰性荷電に対しては陽性荷電を持つ多価金属陽イオンが有効であり、不溶性の単体粒子に結合させた陽性荷電物質であってもよい。さらに表面荷電を利用できるものであればこれに該当する。このことから発明者は、プリオン蛋白を分離・濃縮回収する目的のために、多価金属イオンを利用することができると着眼し、発現正常プリオンを用い、尿中でのプリオン蛋白の濃縮を検討した。その結果、尿中に加えた発現正常プリオン蛋白を沈殿させる方法を完成させることができた。
【０００９】
以上のように、発明者が解明することができた事実のひとつは、多価金属陽イオンを用い、尿中の発現正常プリオン蛋白を簡便な遠心分離法で沈殿させることができることであった。正常プリオン及び異常プリオン（感染性プリオン）とはアミノ酸の一次構造上相同であり、両者にアミノ酸一次構造上の差異は認められないが、蛋白質分離酵素に対する部分抵抗性、界面活性剤への不溶性および感染性の有無により両者を区別している。またプリオンは糖鎖修飾をうけており、現在のプリオン抗体も両者に反応することから、今回の濃縮法は異常プリオンの濃縮に問題はない。
【００１０】
そして、この出願の発明においては、このようにして分離、濃縮した蛋白質の沈殿を可溶化して各種分析、測定のための試料調製を可能としていることも極めて有用な新しい知見として、発明の基礎にしている。このことも注目されることである。
【発明の効果】
【００１１】
この出願の発明によれば、特別の設備を要することなく検査機関、研究機関、医療施設でプリオン蛋白を含む試料中の蛋白を濃縮・調整でき、簡便かつ多数検査を測定でき、これによってプリオン病の研究ならびに検査診断を通じてプリオン病の早期診断、治療、予防に貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この出願の発明の方法では、免疫学的方法を阻害しないで濃縮された物質を分離・濃縮回収し、分離・濃縮回収した蛋白を各種の測定法に使用可能な状態にすること、即ち沈殿により分離回収・濃縮した蛋白を可溶化する。より具体的には、プリオン蛋白を含む試料に対して蛋白凝集作用物質を作用させて沈殿を生成させる。この際の蛋白凝集作用物質としては、好適には、たとえば多価金属陽イオン物質であって、溶液状態で加えることが好適である。そして、沈殿物から金属イオンを取り除くこと、もしくは封鎖すること、すなわち、多価の金属イオンの沈殿物を可溶化し、その後の測定に利用可能な試料とすることができる。たとえば金属イオンを除去または封鎖する方法としては、たとえば代表的には、ＥＤＴＡやＥＧＴＡのような金属イオンキレート化剤、あるいはクエン酸塩のようなものが有用である。
【００１３】
多価金属陽イオンとは、血液や体液等の検体中の蛋白を凝集不溶化した後、沈殿濃縮させるための試薬であり、分離・濃縮された蛋白は検査・診断に用いられる。この出願の発明方法によるプリオン濃縮の対象となる検体としては、血漿、血清、細胞破壊液、尿や唾液等の各種体液、培養細胞破壊液等、生体由来副産物などが挙げられる。
【００１４】
蛋白凝集・沈殿物質としては、上記のように、好適には、亜鉛、コバルト、マンガン、銅等の多価金属陽イオンが例示されるが、好ましくは２価イオン、特に亜鉛が示される。このような亜鉛等の２価イオンは、たとえば好適には酢酸亜鉛のような有機酸塩の形態で使用することができる。もちろん、他の適宜な形態であってもよい。不溶性単体粒子（磁性粒子）の表面荷電が陽であれば他の多価イオン物質でも使用できる。
【００１５】
この出願の発明によれば特別な機器や熟練した技術を用いることなく、短時間で簡便に実行できる。これにより従来測定できなかった生前診断、治療、予防に貢献することができる。また多数検体測定も可能となる。
【００１６】
以下、実施例を説明するが、もとより発明の範囲がこれら実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００１７】
＜実施例１＞  酢酸亜鉛を用いた尿中のプリオンの分離回収・濃縮、濃縮蛋白の可溶化
（１）発現正常プリオンを含む尿中からのプリオン蛋白の分離回収・濃縮
発現正常プリオン蛋白を加えたヒト尿５ｍＬに１Ｍ酢酸亜鉛５０μＬを加え、混合後、室温で５分間反応させた。反応終了後３０００ｒｐｍで５分間、冷却遠心機にて分離し、上清の尿を捨て沈殿を得た。
（２）分離回収・濃縮プリオン蛋白の可溶化
上記作業にて得た沈殿に金属キレート化剤の０．４Ｍ  ＥＤＴＡ５０μＬを加え沈殿を可溶化した。最終用量は約１００〜２００μＬであった。
（３）抗体固相化プレートの作製
抗プリオン抗体固相化プレートの作製には市販の山羊抗プリオン抗体を通常のポリスチレン製９６穴型タイププレートに固相化した。即ち、２８０ｎｍ吸光度が０．０１になるように０．２Ｍ carbonate緩衝液で稀釈した抗体液をプレート穴に５０μＬづつ加え、４℃で一中夜、物理的に吸着させ、その後２％のTween ８０含有のＴＢＳ緩衝液で洗浄した。洗浄した穴に４％のスキムミルク（ＴＢＳ緩衝液）を加え１時間室温で反応させブロッキングする。反応終了後先述の洗浄液にて十分洗浄し抗体固相化プレートを作製した。
（４）尿中から酢酸亜鉛を用いて分離回収・濃縮したプリオン蛋白の測定
固相化プレートの穴に４％スキムミルクを加え実施例１の方法で分離回収・濃縮可溶化した測定検体を１時間反応させた。反応終了後先述の洗浄液にて十分に洗浄した後、抗プリオンモノクロ抗体を１時間反応させた。反応終了後、洗浄液で十分洗浄後、山羊西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体を作用させ室温で１時間反応させた。反応後、前記の洗浄液で洗浄し、反応基質を加えて発色させ、停止液添加後二波長で測定を行った。対照としてヒトの尿の測定をおこなった。
（５）分離回収率の確認
発現プリオン蛋白をヒト尿で稀釈系列各５ｍＬを作製し、一部を非濃縮用サンプルとして濃縮率の対照とした。次に尿で稀釈されたサンプル５ｍＬを濃縮し、分離回収した分画をＥＬＩＳＡ法で測定した（表１）。測定には検体２０μＬを使用した。非濃縮においては０．０２μｇ／ｍＬ以上０．２μｇ／ｍＬ未満が検出限界であるが、濃縮することにより検出限界が０．０１μｇ／ｍＬ未満であることが判明した。上記の結果より、当該実施例におけるプリオン蛋白の回収率はほぼ１００％に近い値であることがわかった。対照として健康人の尿を濃縮して測定した。（表２）
【００１８】
【表１】
2005300431.tif 000002
【００１９】
【表２】
2005300431.tif 000003
＜実施例２＞  酢酸亜鉛濃度による尿中の異常プリオンの分離回収・濃縮、濃縮蛋白の可溶化
発現正常プリオン蛋白を加えたヒト尿５ｍＬに１Ｍ酢酸亜鉛５０μＬ、１００μＬを加え、混合後、室温で５分間反応させた。反応終了後３０００ｒｐｍで５分間、冷却遠心機にて分離し、上清の尿を捨て濃縮試料をＥＬＩＳＡ法で測定した（表３）。ヒト尿中に加えられたプリオン発現蛋白は酢酸亜鉛量８０μＬ（最終亜鉛濃度３．６ｍＭ）で回収されることが判明した。
【００２０】
【表３】
2005300431.tif 000004