(57)【要約】      （修正有）【課題】二本鎖核酸選択性が高く、二本鎖核酸と安定な複合体を形成するインターカレータとして有用な新規化合物を提供する。【解決手段】下記式（１）で表される新規なフェロセン化多環式炭化水素誘導体またはその塩若しくはその水和物。2005343888.tif 000047（式中、Ａは多環式炭化水素を示し；Ｘはアルキレン基、−（ＣＨ２）ｘ−Ｂ−（ＣＨ２）ｙ−等を示し；Ｒ１は水素、アルキル基等を示し；Ｒ２〜Ｒ３は水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基を示す。）【選択図】図１５
2005343888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2005343888.tif 000042
（式中、Ａは多環式炭化水素若しくはその誘導体を示し；Ｘは置換基を有していてもよ
い炭素数１〜６のアルキレン基、−（ＣＨ2）x−Ｂ−（ＣＨ2）y−［ここでＢは窒素原子を１若しくは２個含む５員若しくは６員脂肪族複素環を示し；ｘおよびｙはそれぞれ独立に０〜３の整数を示す］、または−（ＣＨ2）a−（ＮＲ5）−（ＣＨ2）b−(ＮＲ6)−(ＣＨ2)c−［ここでａ、ｂおよびｃはそれぞれ独立に０〜３の整数を示し、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に水素またはメチル基を示す］のいずれかを示し；Ｒ1は水素、炭素数１〜３のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基、炭素数７〜９のアリールアルキル基若しくはアリールアルケニル基、または炭素数２若しくは３のアルキルカルボニル基を示し；Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基を示し；ｍおよびｎはそれぞれ独立に０〜２の整数を示す。１分子中の二つの同一表示基は互いに同一でも異なっていてもよい。）で表される化合物またはその塩若しくはその水和物。
【請求項２】
Ｘが下記式（２）
【化２】
2005343888.tif 000043
である、請求項１に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物。
【請求項３】
Ｘが、−Ｃ3Ｈ6Ｎ（ＣＨ3）Ｃ3Ｈ6−である、請求項１に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物。
【請求項４】
下記式（３）
【化３】
2005343888.tif 000044
（式中、Ａは多環式炭化水素若しくはその誘導体を示し；Ｙは窒素原子を１または２個含む５員または６員脂肪族複素環であって、カルボニル基に結合する基が窒素原子である環を示し；Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し；Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基を示し；ｍおよびｎはそれぞれ独立に０〜２の整数を示す。１分子中の二つの同一表示基は互いに同一でも異なっていてもよい。）で表される化合物またはその塩若しくはその水和物。
【請求項５】
Ｙがピペリジル基またはピペラジル基である請求項４に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物。
【請求項６】
Ｒ4がメチレン基であり、Ｙがピペリジル基であってその窒素原子がカルボニル基の炭素原子に結合している、請求項４に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物。
【請求項７】
Ａがナフタレンジイミド基である請求項１から６のいずれか１項に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物。
【請求項８】
ｍ＝ｎ＝０である請求項７に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物。
【請求項９】
Ａがナフタレンジイミド基である請求項１に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物を製造する方法であって、下記反応式（Ｉ）に示すように、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物と式（４）で表される化合物とを反応させて、式（５）で表される化合物を得る第一工程と、下記反応式（ＩＩ）に示すように、式（５）で表される化合物とフェロセンカルボン酸スクシンイミドエステルとを反応させて、目的物を得る第二工程と、を含む製造方法。
【化４】
2005343888.tif 000045
【請求項１０】
Ａがナフタレンジイミド基である請求項３に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物を製造する方法であって、下記反応式（ＩＩＩ）に示すように、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物と式（６）で表される化合物とを反応させて、式（７）で表される化合物を得る第一工程と、下記反応式（ＩＶ）に示すように、式（７）で表される化合物とフェロセンカルボン酸スクシンイミドエステルとを反応させて、目的物を得る第二工程と、を含む製造方法。
【化５】
2005343888.tif 000046
【請求項１１】
標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブ核酸と、被検試料とをハイブリダイゼーションが起こる条件下で接触させる工程と、
請求項１から８のいずれか１項に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物を添加する工程と、
二本鎖核酸に結合した前記化合物の電気化学応答を測定する工程と、
を含む、被検試料中の標的核酸を検出する方法。
【請求項１２】
標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が固定された電極と、請求項１から８のいずれか１項に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物とを含む、標的核酸検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖核酸に対するインターカレータとして有用な新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的または医学的研究や、臨床の場において、特定の塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を検出するために、その塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸をプローブとする方法が用いられている。かかる方法は、２つの核酸が互いに相補的な塩基配列を有している場合にのみ水素結合によって二本鎖を形成するという特異性に基づく。このような方法を用いる場合、標的となる核酸の検出には、標的核酸とプローブ核酸とがハイブリダイゼーションしたかどうかを確認する手段が必要となる。
【０００３】
ハイブリダイゼーションの有無を確認する手段として、標的核酸を蛍光物質等で標識しておく方法が良く知られている。例えば、ある細胞における遺伝子発現解析をするために、その細胞に含まれるＲＮＡを蛍光標識し、固相担体に固定されたプローブｃＤＮＡと適当な条件下でハイブリダイゼーションさせた後、固相担体上の蛍光を検出する方法が広く用いられている。蛍光物質を用いる方法では、予め標的核酸に蛍光物質を化学的に結合させておく必要がある。またハイブリダイゼーションの有無は検出できるものの、二本鎖の形成を定量的に測定することができない。
【０００４】
このような問題を解決するものとして、二本鎖核酸に選択的に結合するインターカレータを用いる方法が提案されている。インターカレータとは、核酸の塩基間に縫い込まれるように挿入結合（インターカレーション）する性質を持つ分子をいい、例えばエチジウムブロマイドなどの色素が挙げられる。インターカレータは二本鎖核酸に規則的に縫い込まれるので、二本鎖が形成された量と結合するインターカレータの量に相関関係が得られ、ハイブリダイゼーションを定量的に測定することができる。またインターカレータはハイブリダイゼーション後に添加すればよく、予め標的核酸に結合させておく必要がない。
【０００５】
インターカレータを導電性のあるフェロセン等で修飾し、二本鎖核酸に結合したインターカレータを電気化学的に検出する方法も提案されている（例えば特許文献１および２参照）。電気化学的方法によれば、蛍光色素のように退色することもなく、リアルタイムでより正確な定量的測定を簡易に行うことが可能となる。このようなインターカレータとしては、下記式（８）
【化６】
2005343888.tif 000003
や、下記式（９）
【化７】
2005343888.tif 000004
で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体等が利用されている。
【特許文献１】特開平９−２８８０８０号公報
【特許文献２】ＷＯ０２／０５３５７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでにインターカレータとして利用されてきた上記式（８）で表されるピペラジン環含有フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、合成反応後の分離操作および精製操作等が煩雑であり、収率も１０％前後と低い。また、二本鎖選択性が不十分であり、静電的相互作用による一本鎖核酸への結合量との間に十分な差が得られにくい傾向がある。さらに、二本鎖核酸−インターカレータ複合体も不安定で、解離反応が進むのも速いという問題があった。
【０００７】
また、上記式（９）で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、収率は比較的高いが、さらに安定性および二本鎖核酸選択性に優れたインターカレータが求められている。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、合成反応後の分離操作および精製操作等が容易で高収率に得られ、二本鎖核酸選択性も高く、二本鎖核酸と安定な複合体を形成するインターカレータとして有用な化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み、優れたインターカレータを求めて鋭意研究を行った結果、下記式（１）
【化８】
2005343888.tif 000005
（式中、Ａは多環式炭化水素若しくはその誘導体を示し；Ｘは置換基を有していてもよ
い炭素数１〜６のアルキレン基、−（ＣＨ2）x−Ｂ−（ＣＨ2）y−［ここでＢは窒素原子を１若しくは２個含む５員若しくは６員脂肪族複素環を示し；ｘおよびｙはそれぞれ独立に０〜３の整数を示す］、または−（ＣＨ2）a−（ＮＲ5）−（ＣＨ2）b−（ＮＲ6）−（ＣＨ2）c−［ここでａ、ｂおよびｃはそれぞれ独立に０〜３の整数を示し、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に水素またはメチル基を示す］のいずれかを示し；Ｒ1は水素、炭素数１〜３のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基、炭素数７〜９のアリールアルキル基若しくはアリールアルケニル基、または炭素数２若しくは３のアルキルカルボニル基を示し；Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基を示し；ｍおよびｎはそれぞれ独立に０〜２の整数を示す。１分子中の二つの同一表示基は互いに同一でも異なっていてもよい。）、および下記式（３）
【化９】
2005343888.tif 000006
（式中、Ａは多環式炭化水素若しくはその誘導体を示し；Ｙは窒素原子を１または２個含む５員または６員脂肪族複素環であって、カルボニル基に結合する基が窒素原子である環を示し；Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し；Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基を示し；ｍおよびｎはそれぞれ独立に０〜２の整数を示す。１分子中の二つの同一表示基は互いに同一でも異なっていてもよい。）で表される化合物またはその塩若しくはその水和物、中でも特に、Ａがナフタレンジイミド基である化合物は、二本鎖に対する結合定数および選択性が高く、電流応答の再現性も良く、合成時に高収率で得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、
［１］下記式（１）
【化１０】
2005343888.tif 000007
（式中、Ａは多環式炭化水素若しくはその誘導体を示し；Ｘは置換基を有していてもよ
い炭素数１〜６のアルキレン基、または窒素原子を１または２個含む５員または６員脂肪族複素環を間に挟む２つの炭素数１〜３のアルキレン基を示し；Ｒ1は水素、炭素数１〜３のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基、炭素数７〜９のアリールアルキル基若しくはアリールアルケニル基、または炭素数２若しくは３のアルキルカルボニル基を示し；Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基を示し；ｍおよびｎはそれぞれ独立に０〜２の整数を示す。１分子中の二つの同一表示基は互いに同一でも異なっていてもよい。）で表される化合物またはその塩若しくはその水和物；
［２］Ｘが下記式（２）
【化１１】
2005343888.tif 000008
である、前記［１］に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物；
［３］Ｘが、−Ｃ3Ｈ6Ｎ（ＣＨ3）Ｃ3Ｈ6−である、前記［１］に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物；
［４］下記式（３）
【化１２】
2005343888.tif 000009
（式中、Ａは多環式炭化水素若しくはその誘導体を示し；Ｙは窒素原子を１または２個含む５員または６員脂肪族複素環であって、カルボニル基に結合する基が窒素原子である環を示し；Ｒ4は炭素数１〜６のアルキレン基を示し；Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立に水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基を示し；ｍおよびｎはそれぞれ独立に０〜２の整数を示す。１分子中の二つの同一表示基は互いに同一でも異なっていてもよい。）で表される化合物またはその塩若しくはその水和物；
［５］Ｙがピペリジル基またはピペラジル基である前記［４］に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物；
［６］Ｒ4がメチレン基であり、Ｙがピペリジル基であってその窒素原子がカルボニル基の炭素原子に結合している、前記［４］に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物；
［７］Ａがナフタレンジイミド基である前記［１］から［６］のいずれか１項に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物；
［８］ｍ＝ｎ＝０である前記［７］に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物；
［９］Ａがナフタレンジイミド基である請求項１に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物を製造する方法であって、下記反応式（Ｉ）に示すように、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物と式（４）で表される化合物とを反応させて、式（５）で表される化合物を得る第一工程と、下記反応式（ＩＩ）に示すように、式（５）で表される化合物とフェロセンカルボン酸スクシンイミドエステルとを反応させて、目的物を得る第二工程と、を含む製造方法；
【化１３】
2005343888.tif 000010
［１０］Ａがナフタレンジイミド基である前記［３］に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物を製造する方法であって、下記反応式（ＩＩＩ）に示すように、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物と式（６）で表される化合物とを反応させて、式（７）で表される化合物を得る第一工程と、下記反応式（ＩＶ）に示すように、式（７）で表される化合物とフェロセンカルボン酸スクシンイミドエステルとを反応させて、目的物を得る第二工程と、を含む製造方法；
【化１４】
2005343888.tif 000011
［１１］標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブ核酸と、被検試料とをハイブリダイゼーションが起こる条件下で接触させる工程と、
前記［１］から［８］のいずれか１項に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物を添加する工程と、
二本鎖核酸に結合した前記化合物の電気化学応答を測定する工程と、
を含む、被検試料中の標的核酸を検出する方法；
［１２］標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が固定された電極と、前記［１］から［８］のいずれか１項に記載の化合物またはその塩若しくはその水和物とを含む、標的核酸検出用キット、に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、合成反応後の分離操作および精製操作等が容易で高収率に得られ、二本鎖核酸に対する選択性の高いインターカレータとして有用な、新規なフェロセン化多環式炭化水素誘導体および新規なフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体が提供される。本発明に係るフェロセン化多環式炭化水素誘導体およびフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、二本鎖核酸に挿入結合（インターカレーション）した後、二本鎖核酸と安定な複合体を形成するので、検出もしやすい。
【００１２】
本発明に係る新規化合物を用いれば、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸を、リアルタイムで高感度かつハイスループットに検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明に係る化合物を、その好ましい実施形態に基づいて詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何等限定するものではない。
【００１４】
本発明に係る化合物は、その一実施形態として、下記式（１’）
【化１５】
2005343888.tif 000012
で表される新規なフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（化合物（１’））を提供する。かかるフェロセン化ナフタレンジイミドは、特に、二本鎖核酸に選択的に結合するインターカレータとして有用なものである。
【００１５】
本発明における化合物（１’）の「塩」としては、無機塩基との塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられ、特に限定されないが、最も好ましくは塩酸塩である。
【００１６】
また本発明に係る化合物（１’）は水和物であっても非水和物であってもよい。
【００１７】
本発明の化合物は、前記式（１’）に示されるように、ナフタレンジイミド部と、フェロセン部と、両部を繋ぐリンカー部分である「−Ｘ−ＮＲ1−ＣＯ−Ｃ2Ｈ4−」と
から構成されている。そして、上記ナフタレンジイミド部は、ＤＮＡ等の二本鎖等の隣り合った塩基対の間に平行に挿入される芳香族板状分子構造の縫い込み型インターカレータ部分として機能する。一方、上記フェロセン部は、酸化還元活性を有するので、その存在を電気化学的に検出することができる。これにより、化合物１’は、電気化学活性縫い込み型インターカレータとして機能することができる。本発明の化合物は、上記リンカー部分を前記式（１’）に示す構造としたことにより、合成反応後の分離操作および精製操作等が容易で、収率も高く、特に二本鎖選択性の高いインターカレータとなっている。
【００１８】
式（１’）中、Ｘがピペラジル基を含む下記式（２）
【化１６】
2005343888.tif 000013
であるもの、およびＸが−Ｃ3Ｈ6Ｎ（ＣＨ3）Ｃ3Ｈ6−であるものは、インターカレータとして用いた場合に、二本鎖核酸への会合反応が速く進む一方で解離反応が抑制され、安定した二本鎖核酸−インターカレータ複合体を形成することができる。
【００１９】
また、式（１’）中、ｍおよびｎが１または２である場合（０でない場合）において、Ｒ2およびＲ3で示される水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基としては、メチル基、メトキシ基、メトキシカルボニル基、ニトロ基、カルボキシル基、ジメチルアミノメチル基およびジメチルアミノエチルアミノカルボニル基等が挙げられる。例えば、ジメチルアミノメチル基の場合には、水溶液中でプロトン化して電子求引基であるジメチルアンモニウムメチル基として機能する。特に、本発明の化合物をインターカレータとして水溶液中で使用する場合には、無置換のフェロセニル基を含む化合物も好ましいが、Ｒ2およびＲ3として上記の水溶液中で電子供与基または電子求引基となる基を含む化合物は、水溶液中での電子供与基または電子求引基によって電流量の測定時の電位が変化し、その利用価値も高いため好ましい。
【００２０】
また式（１’）中、Ｒ1で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基およびプロピル基等が挙げられ、アルケニル基としては、２−プロぺニル基等が挙げられ、アルキニル基としては、エチニル基および２−プロピニル基等が挙げられ、アリールアルキル基としては、ベンジル基およびメチルベンジル基等が挙げられ、アリールアルケニル基としては、３−フェニル−２−プロペニル基等が挙げられ、アルキルカルボニル基としては、アセチル基等が挙げられる。特に、本発明の化合物をインターカレータとして使用する場合には、Ｒ1は、核酸に対する結合時の障害を回避できる点で、立体的に嵩高くない基、例えば、水素、メチル基等であることが好ましい。
【００２１】
特に本発明の化合物のうち、Ｘが上記式（２）を示し、Ｒ1が水素であり、かつｍ＝ｎ＝０（Ｒ2およびＲ3の置換基を有さず無置換；即ち、Ｒ2およびＲ3が水素原子）である化合物、即ち下記式（１０）
【化１７】
2005343888.tif 000014
および、下記式（１０’）
【化１８】
2005343888.tif 000015
で表される化合物は、高収率で得られ、二本鎖核酸選択性が高く、核酸と安定な複合体を形成するインターカレータであり、特に好適である。
【００２２】
本発明に係る化合物（１’）の製造方法は特に限定されないが、以下の製造方法、即ち、下記反応式（Ｉ）に示すように、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物と式（４）で表される化合物とを反応させて、式（５）で表される化合物を得る第一工程と、下記反応式（ＩＩ）に示すように、式（５）で表される化合物とフェロセンカルボン酸スクシンイミドエステルとを反応させて、目的物を得る第二工程とを含む製造方法が収率の面等で好ましい。
【化１９】
2005343888.tif 000016
ここで、上記反応式（Ｉ）に係る反応においては、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の溶媒中で反応物を加熱還流し、その後、生成物を再結晶等により分離・精製する等通常の合成法で行われる操作を必要に応じて行う。
【００２３】
上記反応式（ＩＩ）に係る反応においては、例えばまず化合物（５）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等の溶媒中で撹拌し、ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護されたアミノ基の脱保護を行い、続いて、クロロホルム、トリエチルアミン等の溶媒中で反応物を撹拌し、減圧での溶媒除去や再結晶等により分離・精製する等の通常の合成法で行われる操作を必要に応じて行う。
【００２４】
また、本発明に係る化合物は、その一実施形態として、下記式（３’）
【化２０】
2005343888.tif 000017
で表される新規なフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（化合物（３’））を提供する。かかるフェロセン化ナフタレンジイミドは、特に、二本鎖核酸に選択的に結合するインターカレータとして有用なものである。
【００２５】
本発明における化合物（３’）の「塩」としては、無機塩基との塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられ、特に限定されないが、最も好ましくは塩酸塩である。また、本発明に係る化合物（３’）は水和物であっても非水和物であってもよい。
【００２６】
本発明の化合物は、前記式（３’）に示されるように、ナフタレンジイミド部と、フェロセン部と、両部を繋ぐリンカー部分である「−Ｒ4−Ｙ−ＣＯ−Ｃ2Ｈ4−」とから構成されている。そして、上記ナフタレンジイミド部は、ＤＮＡ等の二本鎖等の隣り合った塩基対の間に平行に挿入される芳香族板状分子構造の縫い込み型インターカレータ部分として機能する。一方、上記フェロセン部は、酸化還元活性を有するので、その存在を電気化学的に検出することができる。これにより、化合物（３’）は、電気化学活性縫い込み型インターカレータとして機能することができる。本発明の化合物は、上記リンカー部分を前記式（３’）に示す構造としたことにより、合成反応後の分離操作および精製操作等が容易で、収率も高く、二本鎖選択性の高いインターカレータとなっている。
【００２７】
式（３’）中、Ｙが窒素原子を１または２個含む５員または６員脂肪族複素環であるものは、インターカレータとして用いた場合に、二本鎖核酸への会合反応が速く進む一方で解離反応が抑制され、安定した二本鎖核酸−インターカレータ複合体を形成することができ、この点でＹは特にピペリジル基またはピペラジル基であることが好ましい。
【００２８】
また式（３’）中、Ｒ４がメチレン基であり、Ｙがピペリジル基であってその窒素原子がカルボニル基の炭素原子に結合しているものは、分離精製操作が容易な点や、二本鎖核酸と安定した複合体を形成する点で特に優れている。
【００２９】
式（３’）において、ｍ、ｎ、Ｒ2およびＲ3の定義については、上記化合物（１’）と同様である。
【００３０】
化合物（３’）の製造方法は特に限定されないが、以下の製造方法、即ち、下記反応式（ＩＩＩ）に示すように、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物と式（６）で表される化合物とを反応させて、式（７）で表される化合物を得る第一工程と、下記反応式（ＩＶ）に示すように、式（７）で表される化合物とフェロセンカルボン酸スクシンイミドエステルとを反応させて、目的物を得る第二工程とを含む製造方法が収率の面等で好ましい。
【化２１】
2005343888.tif 000018
ここで、上記反応式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に示される反応は、上記反応式（Ｉ）および（ＩＩ）にそれぞれ準じた操作によって行なうことができる。
【００３１】
本発明に係る化合物（１’）および（３’）は、従来公知のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体に比べて、中でも従来からインターカレータとして用いられている前記ピペラジン環含有フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体に比べて、合成反応後の分離操作および精製操作が容易で、しかも、高い収率で得ることが可能なものである。
【００３２】
本発明の化合物の用途は特に制限されず、種々の用途に応用できるが、前述の通り、二本鎖核酸に対して規則的に挿入結合するインターカレータとして優れている。
【００３３】
本発明に係る化合物の二本鎖核酸に対するインターカレータとしての機能は、例えば、本発明の化合物と二本鎖核酸との混合物において、二本鎖核酸の濃度変化にともなう紫外可視吸収スペクトルの変化を測定することによって評価できる。一般にインターカレータが二本鎖核酸に挿入結合すると、紫外可視吸収スペクトルにおいて、小さな長波長シフトと極大吸収の淡色効果が観察される。スペクトルの変化から算出した結合率に基づいて、スキャッチャードプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  Ｐｌｏｔ）により結合定数および座位数を算出することにより、結合能の強さを数値化して評価することができる。
【００３４】
ここで、二本鎖核酸とは、相補的な塩基配列を有する２つの一本鎖核酸が、塩基間の水素結合によって比較的安定な二本鎖を形成した状態をいう。核酸としては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されず、また細胞から抽出されたものでも、人工的に合成されたものであってもよい。
【００３５】
本発明に係る化合物をインターカレータとして用いれば、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出をすることができる。かかる検出は、例えば、標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブ核酸と、被検試料とをハイブリダイゼーションが起こる条件下で接触させる工程と、本発明に係る化合物を添加する工程と、二本鎖核酸に結合した前記化合物の電気化学応答を測定する工程と、を含む方法により行うことができる。また、標的核酸に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を電極に固定しておくことにより、二本鎖核酸に挿入結合した本発明にかかる化合物の量をサイクリックボルタンメトリーやディファレンシャルパルスボルタンメトリーによって電気化学的に測定することができる。かかる測定方法により、二本鎖の形成を定量的に測定することが可能となり、これを利用して被検試料における標的核酸の定量的測定を、リアルタイムで高感度かつハイスループットに行うことができる。
【００３６】
本発明は、標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が固定された電極と、本発明に係る化合物とを含む標的核酸検出用キットも提供する。電極を、ボルタンメトリーでそのまま測定できるチップ状に形成しておくことにより、標的核酸の検出をより簡便に、ハイスループットに行うことができる。
【００３７】
本発明の化合物を用いた標的核酸の検出方法は、遺伝子の発現解析、特定の遺伝子がゲノムに存在するかどうかの検出、変異や多型の検出、ウィルスや細菌の検出に応用して用いることができ、生物学、医学、法医学等の分野において広く利用される。
【００３８】
以上、本発明の好ましい実施形態について詳述したが、本発明はかかる実施形態に限定されず、種々の変更形態を採用することができる。具体的には、前記式（１’）におけるＮ，Ｎ’−ジ置換ナフタレンジイミド〔前記式（１）におけるＡに相当〕を、その他の種々の多環式炭化水素若しくはその誘導体、例えば、芳香属炭化水素、脂肪属複素環、芳香属複素環、脂環式炭化水素等の環を複数有する化合物またはその誘導体、具体的には、１，５−、２，６−、９，１０−ジ置換アントラセン、１，５−、２，６−ジ置換アントラキノン、１，５−、２，６−、４，９−ジ置換アクリジン誘導体等に変更することが可能である。
【００３９】
式（１）におけるＡを９，１０−ジ置換アントラセンとした新規なフェロセン化アントラセン誘導体も同様に好ましく、このような化合物として、例えば、Ｘが−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ3Ｈ6−Ｎ（ＣＨ3）−Ｃ3Ｈ6−である、下記式（１１）が挙げられる。
【化２２】
2005343888.tif 000019
このフェロセン化アントラセン誘導体は、例えば、下記に示す合成例のように、フェロセンプロピオン酸スクシンイミドエステルを用いて得ることができる。
【化２３】
2005343888.tif 000020
前記フェロセン化アントラセン誘導体も、前述した前記式（１’）および式（３’）で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体と同様に、合成反応後の分離操作および精製操作等が容易で、しかも単離・精製収率が３０％と高く、特にインターカレータとして有用な化合物として提供できる。尚、このフェロセン化アントラセン誘導体に関して特に詳述しない点については、前述のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体と同様である。従って、該フェロセン化アントラセン誘導体における各置換基の例や、用途等については、前述のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体について説明した事項が適宜適用される。
【００４０】
以下に、本発明に係る化合物の有利な効果を示すため、実施例、試験例を示すが、これらは例示的なものであって、本発明は如何なる場合も以下の具体例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
ＮＦｃｐｒｏの合成
（ｉ）リンカー部の片Ｂｏｃ保護
本発明に係る化合物の例として、上記式（１０）で表される新規フェロセン化ナフタレンジイミド（以下「ＮＦｃｐｒｏ」と称することもある）を合成するために、まずリンカー部となる１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンの片Ｂｏｃ保護を、下記スキームにしたがって行った。
【化２４】
2005343888.tif 000021
１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン５１．６ｍｌ（０．２５ｍｏｌ）を１，４−ジオキサン約２０ｍｌに溶解させ、これにS-tert-butyloxycarbonyl-4,6-dimethyl-2-mercaptopyrimidine１２．０ｇ（０．０５ｍｏｌ）を１，４−ジオキサン約８０ｍｌに溶解させた溶液を室温で約５時間かけて滴下した。滴下後しばらく撹拌していると溶液の粘性が高くなったのでさらに１，４−ジオキサンを約２００ｍｌ加え、その後一晩撹拌を続けた。
生成した白色沈殿を吸引ろ過で取り除き、ろ液を減圧留去した。減圧留去後純水約１５０ｍｌを加え、それにＮａＣｌを加えて塩析を行った後、酢酸エチルで抽出を行った(１００ｍｌ×４)。有機層を炭酸カリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して黄色油状物質を得た。
得られた化合物の1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータを表１に示す。
【表１】
2005343888.tif 000022
以上の結果より、得られた黄色油状物質は、下記式で表される化合物（１２）であると同定された。収量は１２．３ｇ、収率は８２％であった。
【化２５】
2005343888.tif 000023
上記構造式中のａ〜ｆは、表１中のケミカルシフト（δ値）に対応する水素（プロトン）それぞれの位置を示す。
なお、1Ｈ−ＮＭＲ測定結果に酢酸エチルのピークが認められたため、真空ポンプでよく乾燥させた後、次の反応に進んだ。
【００４２】
（ｉｉ）ナフタレンテトラカルボン酸二無水物への化合物（１２）の結合
続いて、上記反応式（Ｉ）に示される反応として、下記スキームに従い、ナフタレンテトラカルボン酸二無水物にリンカー部となる化合物（１２）を結合させた。
【化２６】
2005343888.tif 000024
１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物４．６４ｇ（０．０１７ｍｏｌ）と化合物（１２）１２．０ｇ（０．０４０ ｍｏｌ）をＴＨＦ１５０ｍｌ中で加熱還流した。約２３時間後、溶媒を減圧留去した。得られた茶褐色固体をクロロホルムに溶解させ、不溶成分を吸引ろ過によって取り除き、ろ液を減圧留去して茶褐色固体を得た。これをメタノール約２００ｍｌに溶解させ、不溶成分(肌色固体)を吸引ろ過でろ別し、ろ液を水１０００ｍｌで再沈殿した。一晩静置したのち結晶を取り出してデシケーターで乾燥させて黄土色固体を得た。
得られた化合物の1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータを表２に示す。
【表２】
2005343888.tif 000025
以上の結果より、得られた黄土色固体は、下記式で表される化合物（１３）であると同定された。収量は２．４ｇ、収率は１７％であった。
【化２７】
2005343888.tif 000026
上記構造式中のａ〜ｋは、表２中のケミカルシフト（δ値）に対応する水素（プロトン）それぞれの位置を示す。
なお、1Ｈ−ＮＭＲ測定結果で、ｈの積分比があっていないのは、メタノールのヒドロキシル基のピークと水のピークが重なっているためであると考えられる。
【００４３】
（ｉｉｉ）ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護されたアミノ基の脱保護
次に、下記スキームに従い、化合物（１４）を得るために、化合物（１３）の脱Ｂｏｃ反応を行った。
【化２８】
2005343888.tif 000027
化合物（１３）２．４１ｇ（２．８９ｍｍｏｌ）にＴＦＡ７ｍｌを加え、室温で約７時間撹拌した。撹拌停止後溶媒を減圧留去し、赤色固体を得た。これをメタノールに溶解させた後、クロロホルムで再沈殿を行い薄紫色固体を得た。
得られた固体の1Ｈ−ＮＭＲ測定および元素分析を行った。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータを表３に、元素分析の結果を表４に示す。
【表３】
2005343888.tif 000028
【表４】
2005343888.tif 000029
元素分析の結果より、得られた化合物は６ヶ所がＴＦＡの塩になっていることが確認された。1Ｈ−ＮＭＲの結果とあわせて、上記薄紫色固体は、下記式で表される化合物（１４）であると認められた。収量は３．２ｇ、収率は８３％であった。
【化２９】
2005343888.tif 000030
上記構造式中のａ〜ｊは、表３中のケミカルシフト（δ値）に対応する水素（プロトン）それぞれの位置を示す。
【００４４】
（ｉｖ）ＮＦｃｐｒｏの合成
最後に、下記スキームに従い、目的化合物であるＮＦｃｐｒｏを得るために、化合物（１４）とフェロセンプロピオン酸スクシンイミドエステル（化合物（１５））を反応させた。
【化３０】
2005343888.tif 000031
１００ｍｌナス型フラスコに化合物（１４）０．５３ｇ（０．４ｍｍｏｌ）、クロロホルム２０ｍｌ、トリエチルアミン０．３５ｍｌ（２．４ｍｍｏｌ）を加え完全に溶解させた後、フェロセンプロピオン酸スクシンイミドエステル ０．２９ｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加え室温で撹拌した。シリカゲルＴＬＣで反応追跡を行い、１８時間後反応を終了し溶媒を減圧留去し、茶色の油状物質を得た。これをクロロホルム１００ｍｌに溶かし、純水１００ｍｌで洗浄、抽出し、クロロホルム相を減圧留去した。得られた固体物を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて(展開溶媒 クロロホルム：メタノール：ジエチルアミン=９５：５：０．５)Ｒｆ値０．１５の成分を分取し、溶媒を減圧留去した。さらに１２時間減圧乾固して、融点が３００℃以上である橙色粉末を得た。
得られた化合物を1Ｈ−ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳを用いて同定し、およびＨＰＬＣにより純度チェックを行った。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータを表５に示す。
【表５】
2005343888.tif 000032
以上の結果より、得られた橙色粉末は、下記式で表される化合物（１０）であると認められた。
【化３１】
2005343888.tif 000033
上記構造式中のａ〜ｎは、表５中のケミカルシフト（δ値）に対応する水素（プロトン）それぞれの位置を示す。
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳによる測定結果を図１に示す。マトリックスとしてα-cyano-ＩＶ-hydroxycinnamic acid（ＣＨＣＡ）を用い、レーザ強度は１２５０
とした。最も大きなピークのｍ／ｚ＝１１１５．８から、得られた化合物が上記化合物（１０）であることがさらに確認された。なお、ｍ／ｚ＝１０４９．７、ｍ／ｚ＝９８２．２のピークは、それぞれフェロセン部位のシクロペンタジエンが一つずつ外れたものである。
ＨＰＬＣの純度測定結果を図２に示す。検出波長は３８５ｎｍとし、カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３を用い、試料注入溶媒はメタノール、溶離液Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液、溶離液Ｂは０．１％ＴＦＡメタノール溶液とした。溶離液のグラジエント条件を表６に示す。
【表６】
2005343888.tif 000034
また、リテンションタイムが２０分の時のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを図３に示す。
上記に示したＨＰＬＣによる純度チェックにおいても、目的物由来のピークのみが観測された。この結果から、シリカゲルクロマトグラフィーにより、２つのリンカーの両方にフェロセンが導入された化合物（目的物であるＮＦｃｐｒｏ）が、２つのリンカーのうち１つだけにフェロセンが導入された化合物から効率よく分離され、純度の高いＮＦｃｐｒｏを高収率で得られたことが確認された。
【実施例２】
【００４５】
ＦＮＤ２の合成
次に、本発明に係る化合物の例として、上記式（１０’）で表される新規フェロセン化ナフタレンジイミド（以下「ＦＮＤ２」と称することもある）を、以下のスキームにしたがって合成した。
【化３２】
2005343888.tif 000035
化合物（Ａ）０．２９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）とフェロセンプロピオン酸スクシンイミドエステル０．３１ｇ（０．９ｍｍｏｌ）をＣＨＣｌ3  １５ｍｌ／ＴＥＡ０．２６ｍｌ（１．８ｍｍｏｌ）混合溶液に溶解させ、室温で撹拌した。４２時間後反応を終了させ、反応溶媒を減圧留去した。溶液にクロロホルム１００ｍｌを加え、飽和食塩水２００ｍｌ（５０ｍｌ×４回）で洗浄した。クロロホルムを減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ジエチルアミン＝１０：０．２：０．５）にて、Ｒｆ値０．２の茶褐色成分を分取した。溶媒を減圧留去した後、ＭｅＯＨを加えて吸引ろ過したところ、橙黄色粉末が得られた。
得られた固体を1Ｈ−ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳを用いて同定し、およびＨＰＬＣにより純度チェックを行った。1Ｈ−ＮＭＲの結果を表７に示す。
【表７】
2005343888.tif 000036
1Ｈ−ＮＭＲの結果から、上記橙黄色固体は、下記式に示す化合物（１０’）であると認められた。収量は０．２１ｇ、収率は７０％であった。
【化３３】
2005343888.tif 000037
上記構造式中のａ〜ｎは、表７中のケミカルシフト（δ値）に対応する水素（プロトン）それぞれの位置を示す。
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳによる測定結果を図４に示す。マトリックスとしてα-cyano-ＩＶ-hydroxycinnamic acid（ＣＨＣＡ）を用い、レーザ強度は２．２×
１０4とした。最も大きなピークのｍ／ｚ＝１００５．０２から、得られた化合物が上記ＦＮＤ２（１０’）であることがさらに確認された。
ＨＰＬＣの純度測定結果を図５に示す。検出波長は３８４ｎｍとし、カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３を用い、試料注入溶媒は０．１％ＴＦＡ水溶液、溶離液Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液、溶離液Ｂは７０％アセトニトリル／３０％−０．１％ＴＦＡ溶液とした。溶離液のグラジエント条件を表８に示す。
【表８】
2005343888.tif 000038
また、リテンションタイムが１７．２分の時のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを図６に示す。
上記に示したＨＰＬＣによる純度チェックにおいても、目的物由来のピークのみが観測された。この結果から、純度の高いＦＮＤ２を高収率で得られたことが確認された。
【実施例３】
【００４６】
ＮＦｃｐｒｏのインターカレータとしての性能評価
実施例１で合成されたＮＦｃｐｒｏ（上記式（１０））の縫い込み型インターカレータとしての性能を評価するために、Ｃａｌｆ  ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡ（ＣＴ−ＤＮＡ）の添加に伴うＮＦｃｐｒｏの紫外可視吸収スペクトルの変化の測定、およびＳｃａｔｃｈａｒｄ解析を行った。一般に、化合物がインターカレータとして二本鎖核酸に結合すると、その化合物の紫外可視吸収スペクトルは、小さな長波長シフトと、大きな淡色効果（Hypochromic effect）を示す。また、インターカレータの濃度を一定に保って、ＤＮＡを種々変化させたとき、インターカレータの紫外可視吸収スペクトルが等吸収点を通る二つの状態間で変化すれば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析により結合定数や、結合部位の数を求めることができる。
下記の条件で、ＮＦｃｐｒｏを含む溶液中に、ＤＮＡ溶液を少量（３μＬ程度）ずつ滴下し、その都度ＮＦｃｐｒｏの紫外可視吸収を測定した。ＤＮＡ溶液は全部で３００μＬ滴下し、全測定に６分間要した。滴下終了後４分間撹拌し、さらに１分間放置した。なお、測定温度は２５℃とし、ＮＦｃｐｒｏは、塩酸塩として水に溶解して使用した。
・buffer; ２−モルホリノ・エタン・スルホン酸（MES）  10mM、EDTA (pH 6.25)  1mM、NaCl  0.1M
・stock solution; [NFcpro]=1.2mM、[Calf thymus DNA]=3mM (bp)
・セル中の濃度; [NFcpro]=2.4μM
・使用セル; 10cmセル
結果を図７に示す。極大吸収の淡色効果が見られ、ＣＴ−ＤＮＡに対してインターカレーションしていることが示唆された。
また、紫外可視吸収スペクトルの変化から結合率を算出し、この結合率に基づいて、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  Ｐｌｏｔしたものを図８に示す。下記式（α）により、図８に基づく実験データと理論データを最適化（ｆｉｔｔｉｎｇ）させることによって、結合定数Ｋ、座位数ｎを算出した。波長は３８２ｎｍとした。
ｒ／Ｌ＝Ｋ（１−ｎｒ）〔（１−ｎｒ）／｛１−（ｎ−１）ｒ｝〕n-1…（α）
結合定数Ｋ＝５７×１０5[Ｍ-1]、座位数ｎ＝１．４と算出された。後述する比較例からもわかるように、ＮＦｃｐｒｏは、従来用いられているインターカレータと比較して１０〜５０倍強い結合定数を有することがわかった。
【００４７】
比較例として、従来からインターカレータとして使用されている、下記式（８）で表されるＮＦｃｃａおよび式（１５）で表されるＮＦｃａｃについても紫外可視吸収スペクトルの測定およびＳｃａｔｃｈａｒｄ  Ｐｌｏｔを行った。
【化３４】
2005343888.tif 000039
【化３５】
2005343888.tif 000040
ＮＦｃｃａおよびＮＦｃａｃも塩酸塩として水に溶かして用い、bufferおよびstock solutionはＮＦｃｐｒｏと同様の条件で、セル中濃度は[ＮＦｃｃａ]＝[ＮＦｃａｃ]＝２２μＭ、使用セルは１ｃｍセルとした。
ＮＦｃａｃの紫外可視吸収スペクトル変化を図９に、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  Ｐｌｏｔを図１０に示す。図９においては、極大吸収の淡色効果が見られ、ＣＴ−ＤＮＡに対してインターカレーションしていることが示唆された。
結合定数Ｋ＝６．８×１０5[Ｍ-1]、座位数ｎ＝２．１と算出された。座位数２．１という数字から、ＤＮＡ塩基対一つおきにインターカレータが挿入結合していることが示唆された。
【００４８】
本発明に係る化合物であるＮＦｃｐｒｏ、比較例であるＮＦｃａｃおよびＮＦｃｃａについて、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  Ｐｌｏｔにより求めた結合定数および座位数を表９に示す。
【００４９】
【表９】
2005343888.tif 000041
ＮＦｃｐｒｏは、ＮＦｃｃａと比較して約５０倍、ＮＦｃａｃに対しても１０倍近い結合定数を有することがわかった。ＮＦｃｐｒｏは、長いリンカー部が有するため、ＤＮＡからの解離反応が抑制され、より安定なＤＮＡ−インターカレータ複合体を形成したものと考えられる。
【実施例４】
【００５０】
ディファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）を用いたＮＦｃｐｒｏの二本鎖選択性の評価
表面に一本鎖ＤＮＡを固定した電極を用いて、この一本鎖に静電的相互作用によって結合するインターカレータの量、およびこの一本鎖に相補的な配列を有する標的ＤＮＡがハイブリダイゼーションした際に生じた二本鎖にインターカレーションするインターカレータの量を、それぞれ電気化学的に測定した。
インターカレータとしては、本発明に係るＮＦｃｐｒｏ、比較例としてＮＦｃｃａおよびＮＦｃａｃを合成し、塩酸塩として用いた。
【００５１】
（ｉ）プローブＤＮＡの電極への固定
１０ｐｍｏｌ／μｌのＤＮＡ溶液１μＬを金電極表面に滴下し、乾燥しないようにキャップをして、２５℃で２時間放置した。その後、１ｍＭの２−メルカプトエタノール１μＬを金電極表面に滴下して、２５℃で２時間放置し、一本鎖固定化電極を得た。一本鎖ＤＮＡは、硫黄原子を介して金電極に固定される。
本実施例では、配列番号：１に記載されるＷｉｌｄｔｙｐｅ  Ｇ７１Ｒの部分配列（２４ｍｅｒ）を標的ＤＮＡとし、これに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブＤＮＡとした。プローブＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に示す。これらのオリゴヌクレオチドの調製は、北海道システム・サイエンス株式会社に委託した。Ｇ７１Ｒ配列は、抗癌剤イリノテカンの副作用を引き起こすとされている危険因子の一つである。
【００５２】
（ｉｉ）プローブＤＮＡに対するインターカレータの結合量の測定
上述の一本鎖固定化電極を、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）、０．１ＭのＫＣｌ水溶液および５０μＭのインターカレータ溶液からなる溶液（以下「電解溶液」という）に３分間浸し、ＤＰＶ測定を行った。ＤＰＶ測定には、ＡＬＳ  Ｍｏｄｅｌ  ６１０を用い、掃引速度１００ｍＶ／ｓｅｃとして、指示書に従って通常の測定方法により測定した。ＤＰＶ測定では、ＤＮＡに結合したインターカレータ量を、その末端に導入したフェロセンをシグナルとして検出することにより測定する。
【００５３】
ＮＦｃｐｒｏ、ＮＦｃａｃ、ＮＦｃｃａについての測定結果を、それぞれ図１１、１２、１３中に「ｓｓＤＮＡ」で示す。
【００５４】
一本鎖ＤＮＡに対するインターカレータの結合は、静電的相互作用によるものであると考えられる。
【００５５】
（ｉｉｉ）プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション
（ｉ）で得られた一本鎖固定化電極表面に、Ｗｉｌｄｔｙｐｅ  Ｇ７１Ｒ溶液（１０
ｐｍｏｌ／μｌ）溶液１μＬを滴下した。乾燥しないようにキャップをし、２５℃で３０分間放置して、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを生じさせた。
【００５６】
（ｉｖ）二本鎖ＤＮＡに対するインターカレータの結合量の測定
この電極を電解溶液に３分間浸し、ＤＰＶ測定を行った。
ＮＦｃｐｒｏ、ＮＦｃａｃ、ＮＦｃｃａについての測定結果は、それぞれ図１１、１２、１３中に「ｄｓＤＮＡ」で示す。
いずれのインターカレータについても、二本鎖ＤＮＡへの結合量は、一本鎖ＤＮＡへの結合量を上回った。それぞれのピーク電位は、サイクリックボルタンメトリーにより得られた酸化電位に相当するものであった。
二本鎖ＤＮＡから得られるＤＰＶ測定の結果には、二本鎖に対して挿入結合（インターカレーション）したインターカレータからのシグナルと、静電的相互作用により結合しているインターカレータからのシグナルが含まれると考えられる。そこで、上記（ｉｉ
）で得られた一本鎖状態でのピーク応答電流値をｉ0、（ｉｖ）で得られた二本鎖形成後
のピーク応答電流値をｉとして、下記式に従って応答電流のピーク電流増加率Δｉを求め、この値で二本鎖ＤＮＡへの結合能の評価を行った。
Δｉ＝[（ｉ−ｉ0）／ｉ0]×１００（％）
それぞれのピーク電流値および、Δｉの値を図１４に示す。Δｉ値は、ＮＦｃｐｒｏが最も大きく１８２％であり、ＮＦｃｃａは１２３％、ＮＦｃａｃは８８％であった。このことから、二本鎖に対する選択性は、ＮＦｃｐｒｏが最も高いことがわかる。ＮＦｃｐｒｏは、ピーク電流値のばらつきも小さく、ベースラインも安定している。
なお、本実施例において二本鎖ＤＮＡへの結合能を示すΔｉ値と、実施例２においてＳｃａｔｃｈａｒｄ解析により得られた値とが異なるのは、溶液中と固相担体上での二本鎖ＤＮＡへの結合能の違いや、ＤＮＡ一分子当たりのインターカレータの濃度の違いなどが原因とされる。
【実施例５】
【００５７】
競合インターカレーションによる結合能の評価
電解溶液中に２種類のインターカレータを共存させ、競合してインターカレーションさせることにより、両インターカレータの結合能を比較した。
実施例３と同様の方法で、配列番号：２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、一本鎖固定化電極を作成した。電極表面に、配列番号：１に記載の塩基配列を有するＷｉｌｄｔｙｐｅ  Ｇ７１Ｒ（標的ＤＮＡ）を含む電解溶液を滴下し、ハイブリダイゼーションさせた。
この電極を、ＮＦｃｐｒｏおよびＮＦｃｃａを含む電解溶液に３分間浸し、ＤＰＶ測定を行った。測定結果を図１５に示す。それぞれのインターカレータに相当するピーク電流値が観測され、二本鎖ＤＮＡへのインターカレーションによるピーク電流値の増加も見られる。競合的にインターカレーションが起こったため、それぞれのピーク電流値の増加率に差が現れた。
図１６に、ピーク電流値の比較と、実施例３と同様の方法で求めたΔｉの値を示す。ＮＦｃｐｒｏのΔｉは９８％であり、ＮＦｃｃａ（Δｉ＝２５％）に比較して、約４倍の増加率を示した。これは、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析による結合能の評価の結果とも一致し、ＮＦｃｐｒｏの結合能の高さが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明に係る新規化合物ＮＦｃｐｒｏのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳによる測定結果を示す。
【図２】ＮＦｃｐｒｏ合成時のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】図２に示すクロマトグラムにおいてリテンションタイム２０分のフラクションのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図４】本発明に係る新規化合物ＦＮＤ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳによる測定結果を示す。
【図５】ＦＮＤ２合成時のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】図５に示すクロマトグラムにおいてリテンションタイム１７．２分のフラクションのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図７】ＤＮＡ添加に伴う、ＮＦｃｐｒｏの紫外可視吸収スペクトルの変化を示す。
【図８】ＮＦｃｐｒｏについてのスキャッチャードプロットを示す。
【図９】ＤＮＡ添加に伴う、ＮＦｃａｃの紫外可視吸収スペクトルの変化を示す。
【図１０】ＮＦｃａｃについてのスキャッチャードプロットを示す。
【図１１】ＮＦｃｐｒｏをインターカレータとして用いた時のＤＰＶボルタモグラムを示す。
【図１２】ＮＦｃａｃをインターカレータとして用いた時のＤＰＶボルタモグラムを示す。
【図１３】ＮＦｃｃａをインターカレータとして用いた時のＤＰＶボルタモグラムを示す。
【図１４】ＮＦｃｐｒｏ、ＮＦｃａｃ、ＮＦｃｃａのピーク電流値を示す。
【図１５】ＮＦｃｐｒｏおよびＮＦｃｃａを用いた競合インターカレーションにおけるＤＰＶボルタモグラムを示す。
【図１６】図１５に示す競合インターカレーションにおける、ピーク電流値を示す。
【図１】
2005343888.tif 000048
【図２】
2005343888.tif 000049
【図３】
2005343888.tif 000050
【図４】
2005343888.tif 000051
【図５】
2005343888.tif 000052
【図６】
2005343888.tif 000053
【図７】
2005343888.tif 000054
【図８】
2005343888.tif 000055
【図９】
2005343888.tif 000056
【図１０】
2005343888.tif 000057
【図１１】
2005343888.tif 000058
【図１２】
2005343888.tif 000059
【図１３】
2005343888.tif 000060
【図１４】
2005343888.tif 000061
【図１５】
2005343888.tif 000062
【図１６】
2005343888.tif 000063
【配列表】
2005343888000001.app