(57)【要約】【課題】      温和な条件下で生理活性物質を分離精製する方法として膜の拡散現象を利用し、工業的に適用可能なプロセスを提供すること。【解決方法】            平均孔径が５ｎｍ以上で１００ｎｍ以下で、空孔率が３０％以上で９０％以下    の膜において、膜中の孔内部の拡散現象を利用した定常拡散法を適用し、得られた拡散液を平行濾過により膜で濃縮する。また被拡散液の残液に対し、複数の定常孔拡散法を適用することにより、生理活性物質を工業的規模で分離・精製することが可能となる 【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均孔径が５ｎｍ以上で１００ｎｍ以下で、空孔率が３０％以上で９０％以下の多孔性膜を用い、定常孔拡散法で分子量１００上の物質を分離精製する工程において、拡散液を平行濾過することによって目的物質を濃縮し、かつ被拡散液の残液を複数回にわたり定常孔拡散法の分離精製工程を経ることにより目的物質を分離精製する方法。
【請求項２】
請求項１において多孔性膜が多層構造膜であり、平行濾過に利用される膜が人工腎臓用膜モジュールであることを特徴とする物質分離精製方法。
【請求項３】
請求項１,２において定常孔拡散法での膜表面における被拡散液のひずみ速度が１／秒以上であり、平行濾過における膜表面における拡散液のひずみ速度は３．０／秒以上であり、かつ３００／秒以下であることを特徴とする物質分離精製方法
【請求項４】
請求項１,２,３において多孔性膜の平均孔経が１０ｎｍ以上で７５ｎｍ以下で空孔率が５０％以上８０％以下であり、該膜の素材が親水性高分子であり、かつ平行濾過用の濾過用膜の素材が親水性高分子であることを特徴とする物質分離精製方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は温和な条件下で生理活性物質等を製造するのに際し分離精製工程で用いる物質分離方法に関する。より詳しくは多孔性膜中の孔を介した物質の拡散現象を利用した物質分離精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパクや糖タンパク等の生理活性物質あるいは熱や化学薬品に対して不安定で変性しやすい物質を分離精製する方法として、超遠心分離,各種クロマトグラフィ,吸着,透析,エタノールや硫酸アンモニアを用いた沈降分離が採用されている。固液分離には精密濾過膜や限外濾過膜が利用されている。沈降分離以外の方法では大量処理が難しく、またすべてバッチ処理であり連続的なプロセスとして製造ラインを組み込むのが難しい。各種クロマトグラフィは分離精製方法としてはその性能の高さから多く採用されている。しかし適用される液体は清浄でその液体中に限られた物質種のみが混在した場合であり、一種類のクロマトグラフィ用担体としての汎用性は小さい
【０００３】
一方、膜濾過法は固液分離に向いているが、膜は目詰まりをおこし、安定した濾過性能を維持するのは難しく製造コストへの圧迫が大きいため、限られた溶液にのみ適用されている。（特許文献２,特許文献３）分離すべき分子の大きさが小さくなると適用される限外濾過膜の平均孔径は小さくなりそれに伴って膜の有効濾過面積当りの濾過量が小さくなる。また膜を介した拡散現象を利用した液中の物質分離精製法としては透析のみであり、大量に連続的な透析工程はほとんど実用化されていない。膜の拡散を利用した膜分離が利用されていない最大の理由は、分離速度が濾過の場合１０００分の１以下という極端に小さな物質の移動速度にある。気体の膜分離においては孔中に特殊な担体を埋め込む方法において気体分子の選択透過性を増加させる方法が知られている。（特許文献１）
【０００４】
本発明中で多孔性膜とは、フィールドエミッション型走査型電子顕微鏡によって膜中に孔の存在が認められる膜で平均孔径５ｎｍ以上の膜で空孔率が３０％以上の膜を意味する。拡散とは濃度勾配を騒動力とした物質移動を意味し、孔拡散とは多孔膜中の孔を介した拡散が主である拡散を意味する。従来の膜中での物質の拡散は膜を構成する素材の基質物を介した拡散で溶解拡散と定義されている拡散である。孔拡散と溶解拡散との区別は拡散の見掛けの活性化エネルギーを測定すれば良い。前者の拡散の場合該エネルギーは０〜４ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ後者は８〜５０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅの値を示す。定常孔拡散法とは膜中の孔を介した拡散において膜表面と膜裏面との物質の濃度の差が時間的にほぼ一定に保たれそのため拡散速度が一定に保たれる拡散を意味する。従来より透析等で利用される拡散ではこの濃度差の時間変化が起こり拡散速度は経時的に減少し定常状態は達成できない。
【０００５】
被拡散液とは定常孔拡散法を適用する前の液で、拡散液とは該拡散法によって得られた膜を介して拡散した後の溶液でいわゆる膜透過した物質を含む溶液で、この溶液中の物質濃度は被拡散液中の物質濃度より低い。（非特許文献１）被拡散液の残液とは被拡散液を定常孔拡散法を適用した後、被拡散液側の膜表面での出口の溶液を意味する。平行濾過とは膜表面に沿って溶液を流しながら濾過する方式の濾過で、クロスクロー濾過あるいはタンジェンシャル濾過ともいわれる。
【０００６】
平均孔径は（粘度・膜厚・濾過速度／膜間差圧・空孔率）で与えられる。ここで濾過速度は一平方メートル当りの純水の濾過速度でｍｌ／分の単位で測定され、膜厚はミクロン単位,粘度はセンチポイズ,膜間差圧はｍｍＨｇ単位で、空孔率は無次元単位である。この際の平均孔径はｎｍ単位となる。空孔率は次式で与えられる。
空孔率＝（１−膜の密度／素材高分子の密度）
膜の密度は（膜の重量／膜の面積＊膜の厚さ）で算出される。素材高分子の密度は空孔率０％の時の膜の密度でこれは既に文献で与えられている。多層構造膜とは膜の断面方向から電子顕微鏡で観察すると１０〜１０００ｎｍの厚さの層が認められ、膜の表面からの観察では網目状または粒子間の隙間が孔としてまた粒子相互は融着した様子が観察される膜である。
【０００７】
【特許文献１】特開平０６−０９１１３０「選択分離用高圧促進膜及びその使用法」        多孔膜中の孔に溶媒中に溶解した担体を含む促進剤液体を埋め込むことにより気体中の特定成分を促進輸送する。
【特許文献２】特開平０６−０４４９５４「電池及びこの電池に使用される選択性透過膜」        多孔性の透過膜により水蒸気の透過が阻止され酸素のみを効率良く透過させることにより優れた電池を与える。
【特許文献３】特開平１１−１９５４１０「リチウム二次電池」        ポリオレフィン微多孔膜を電池セパレータとして用いることにより電極群間の電解液の枯渇を防止する。
【非特許文献１】藤岡留美子,吉田雅子,吉村知珠,山村知子,真鍋征一著「粒子間の液中拡散係数差を利用した新しい膜分離装置の試作と分離特性」福岡女子大学人間環境学部紀要,29巻,１３項〜２０項,１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明では膜拡散現象を産業的に利用できるようにする。その際この膜拡散が持つ特徴、すなわち（１）膜の目詰りが起こりにくい（２）拡散速度の差にもとずいた分離精製が可能（３）膜濾過機構で中心となるふるい機構がほぼそのまま起こるという特徴を保持つつ、膜拡散のもつ欠点すなわち物質移動速度が遅い及び拡散液中の物質濃度が低い欠点を解消する方法を提案することを目的としている。
【０００９】
本発明の最大の特徴は、物質分離の方法として定常孔拡散法を利用する点にある。従来より利用されている膜の拡散は、膜の素材である高分子基質内に物質が溶解し、溶解後膜中を拡散するいわゆる溶解拡散機構での移動である。この機構での拡散係数は約１０の−１０乗平方センチメータ／秒である。そのため産業的には利用しにくいほど遅い速度である。これに対して孔拡散では拡散係数は約１０の−６乗平方センチメータ／秒であり、ほぼ濾過速度の約１／１０であり、産業的に利用可能な値となる。拡散であるため孔中への目詰り現象は無視できる程度しか起こらない。定常拡散により連続プロセスの一部に拡散機構が取り入れることが可能となる。定常拡散を実現するには膜を介した濃度勾配を一定にし、目詰りが起らなければ良い。従来において定常孔拡散が利用されなかった理由として（１）液体を流すのに必要な圧力によって濾過が起こる（２）孔拡散による物質分離データが皆無のため拡散係数の差が分離にどのように寄与するのか不明（３）孔拡散用に利用される孔の特性が不明のためこの目的に沿う多孔膜が入手出来ないことがあげられる。
【００１０】
本発明者は孔拡散が支配的になる拡散装置と運転条件と孔特性を検討した結果（１）被拡散液を膜表面へ流入するための液送用ポンプと被拡散液の残液を膜表面より系外へ流出させるための液送用ポンプとの両者を連動させる（２）連動の際両ポンプの送液速度を事実上一致させる（３）平均孔径を３ｎｍ以上２００ｎｍ以下で空孔率が１０％以上９０%以下の高分子多孔膜では孔拡散が支配的な拡散が実現できる（４）孔拡散係数を異にする物質を複数種類混合した水溶液での孔拡散での拡散係数は単独の場合の値に近いかあるいはわずかに低下することが多い。すなわち拡散係数に差がある物質相互は分離可能であることを明らかにすることができた。（１）〜（４）の実験結果を得ることによって初めて本特許に到達した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の最大の特徴は特定の孔特性を持つ多孔膜を用い、孔拡散現象を利用して液中物質の分離精製方法を提供する点にある。すなわち平均孔径が５ｎｍ以上で１００ｎｍ以下で、空孔率が３０％以上で９０％以下の多孔性膜の素材としては膜の再生の容易さと吸着による孔の目詰りを防止する意味で親水性高分子であることが望ましい。具体的には再生セルロース膜、ポリスルホン膜、ポリアクリロニトリル膜、セルロース誘導体膜である．平均孔径が５ｎｍ未満であれば溶解・拡散機構による寄与が大きく、拡散係数が小さくなりすぎる。ウイルス等の感染性粒子の膜透過を防止する観点からは平均孔径は７５ｎｍ以下であり、拡散速度の大きさからは平均孔径は１０ｎｍ以上で空孔率は５０％以上が望ましい。空孔率の上限は９０％以下である。９０％を超えると膜の力学的性質の低下が著しく、ピンホールの発生確率も高くなる。膜の強度、取り扱いやすさ及びピンホールの発生を防止する観点からは空孔率は８０％以下が望ましい。
【００１２】
多孔性膜の製法として湿式または乾式法での製膜方法が採用できる。この方法では製膜過程でミクロ相分離が通常発生する。ミクロ相分離を膜厚方向に遂次発生させることにより多層構造膜を作製できる。多層構造膜では微粒子の除去性が優れかつ拡散速度も同一の平均孔径と空孔率を持つ他の構造膜に比較して大きい。
【００１３】
本発明の特徴は定常孔拡散法を採用している点にある。膜を介した液体の濃度差を一定に保つ（定常状態に保つための必要条件）ために膜の表面に沿って被拡散液を一定速度で流し、かつ拡散液を膜の裏面に沿って一定速度で
流す。この際流す方向は両者同一方向に設定するのが、濾過による物質移動が起こりにくいために望ましい。被拡散液の膜表面におけるひずみ速度は１／秒以上であれば膜表面における物質の堆積を防止できる。ひずみ速度の極端な増加は被拡散液中の生理活性物質の不活化をもたらすのでひずみ速度は被拡散液の組織に依存した最適値が存在する。
【００１４】
拡散液中の目的物質の濃度は被拡散液中の濃度の約  １／１０になっている。拡散液中の物質濃度を高めるために拡散液を平行濾過により濃縮する工程を本発明では採用している。平行濾過による膜濃縮工程では濾過条件は温和であり相変化を伴わないので拡散液中の生理活性物質の変成はほとんど起こらない。平行濾過に用いる膜素材としては現在人工腎臓用に利用されている親水性膜モジュールが最適である。すなわち平均孔径約３ｎｍの再生セルロース製人工腎臓、平均孔径４ｎｍのポリスルホン製人工腎臓などがある。拡散液は一般に清浄であるため、拡散液のひずみ速度は３／秒以上でかつ３００／秒以下であることにより濃縮用人工腎臓の目詰りが防止できる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明方法を採用することにより、生理活性物質等を分離精製することが可能となる。熱的、力学的、化学的に不安的な物質の分離精製には膜分離が最適であると考えられていたが工業的には膜分離には前述のように多くの障害がある。膜分離の特徴が最も反映する膜拡散法ではほとんど工業的な展開が出来なかった。本発明では膜拡散の持つ最大の欠点であった分離速度の小さい点を大幅に改善することに成功し、膜拡散を工業的に利用可能なレベルまで改良した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
分子量約５万のアルブミン水溶液（濃度５重量％）中にＣ型肝炎ウイルスが混入している可能性がある溶液（被拡散液）よりアルブミンを濃縮分離する場合を例に、本発明を実施するための最良の形態を示す。平均孔径３５ｎｍの再生セルロース多孔膜で約１５０層の多層造膜を用いる。空孔率は６０%であり、水中での空孔率は８０％である。膜形態は中空糸膜で内径３３０ミクロン膜厚３０ミクロンで有効拡散面積は１００平方センチメートルである。中空糸膜の長さは８センチである。有効拡散面積を大きくするには中空糸膜の本数を増加させる方法をとり、中空糸膜の長さは内径の大きさを大きくすれば長くしても良い。中空糸膜を円筒状モジュールに成型する。中空糸膜モジュールの外筒入口部に被拡散液部を連絡し、静水圧として３０センチメートル〜１００センチメートル水柱頭とし、モジュールの外筒出口部に流速制御用のスクリューコックをつける。中空糸膜内部の中空部入口と出口とに対応するモジュールの出入口へ連動ポンプを設置する。連動ポンプによる流れ速度を１．５ミリリットル／分に設定するとひずみ速度は１．２／秒となる。一方被拡散液部の流れの速度は拡散液側の流れ速度に近い値に設定する。拡散液中のアルブミンの濃度は０．５重量％となっており、この液中ではＣ型肝炎ウイルスは検出限界以下となる。この拡散液を平均孔径３ｎｍの再生セルロース製人工腎臓用中空糸内部にひずみ速度５／秒で平行濾過する．膜間差圧として２００ｍｍＨｇとするとアルブミン濃度１０重量％の水溶液が回収される。被拡散液の残液をさらに同一の回路を用いて次の被拡散液として再び定常孔拡散を行いアルブミンの回収率を高めることが出来る。この分離精製工程を連続化することによりアルブミンンの回収率を９０％以上にすることは可能である。
【実施例１】
【００１７】
分子量１４００万のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と酸性染料Ａｃｉｄ  ｏｒａｎｇｅ７（分子量３５０．３２）とを溶解した水溶液に平均孔径３５ｎｍ空孔率６０％の再生セルロース多孔性中空糸膜（内径３３０ミクロン膜厚３０ミクロン有効拡散面積１００平方センチメーター）を用いた定常孔拡散を２５℃で実施した。被拡散液の流れの速度は２ミリリットル／分で拡散液の流れの速度は２．２ミリリットル／分であった。拡散液を平均孔径３ｎｍの再生セルロース中空糸モジュールを用いてひずみ速度３／秒で膜間差圧１００ｍｍＨｇで平行濾過した。その結果、ＤＮＡおよびＡｃｉｄ  ｏｒａｎｇｅ７の単独の水溶液での拡散係数（２５℃）の常用対数ではそれぞれ−８．２１４平方センチメートル／s及び−６．８５０平方センチメートル／sであったが混合溶液には−９．３６４以下と−６．６１８平方センチメートル／sとなり、Ａｃｉｄ  ｏｒａｎｇｅ７のみが拡散液中に拡散し、両者は完全に分離でまた、この分離効率はそれぞれの成分の単独の場合の拡散係数からの予測を越えるレベルであった。またＡｃｉｄ  ｏｒａｎｇｅ７の最終の濃縮率は最初の混合液中での値の約３倍であった。Ａｃｉｄ  ｏｒａｎｇｅ７の拡散の見掛けの活性化エネルギーは０．４６８ｋｃａｌ／ｍｏｌｅであり、孔拡散によって膜中の拡散が起こっていることが確認できた。
【実施例２】
【００１８】
分子量５４４．６８のＡｃｉｄ  ｂｌｕｅ１とＡｃｉｄ  ｏｒａｎｇｅ７との等量混合水溶液を用いて実施例と同様に孔拡散を実施した。それぞれ単独の場合の拡散係数（２５℃）の対数は−７．１０４平方センチメートル／sおよび−６．８５０平方センチメートル／sであった混合水溶液ではそれぞれ−７．０５９と−６．８３３平方センチメートル／sであり、両成分が独立に孔拡散をしていることがわかる。ただし分離効率の程度を示す拡散係数の比は１、２５であり、拡散液をさらに孔拡散によって分離する必要がある。この拡散液を被拡散液として孔拡数すると拡散係数比は１．２８となった。従って２段の孔拡散により見掛けの拡散係数比は１．６となった。すなわち孔拡散を多段に行うことにより成分間の分離はより効果的となることがわかる。
【実施例３】
【００１９】
１種類の分散塗料Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｏｒａｎｇｅ３（分子量２４２．２４）と
１種類の蛍光増白剤クロモテール（分子量３００．２７）の飽和水溶液を実施例１と同様に孔拡散による分離を行った。単独成分の場合の拡散係数の対数はＤｉｓｐｅｒｓｅ  ｏｒａｎｇｅ３では−７．７７７平方センチメートル／s，クロモテールでは−６．４６３平方センチメートル／sであった。混合成分の溶液では前者が−６．５８３後者が−９．６７２以下となり、両者は完全に分離された。従って孔拡散が適用可能な系として混合成分間の相互作用により溶液中での分子の会合状態が変化し、孔拡散による分離が可能となる場合も存在する。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
温和な条件下で分離、精製が求められる産業（例，製薬産業，食品産業）、特にタンパク質やＤＮＡなどの生理活性をもつ物質の分離、精製に本発明は利用できる。またコロイド系を取り扱う工業においてコロイド粒子を含めて特定の微粒子を精製、分離する方法として工業的プロセスに組み込むことが出来る。