(57)【要約】【課題】      本発明は、Ｔ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤および抑制剤、腸管免疫増強剤、またはそれらのスクリーニング方法、並びに腸組織へのホーミング能が増強されたＴ細胞の製造方法の提供を目的とする。【解決手段】  本発明者らは、ナイーブＴ細胞がＴ細胞抗原受容体を介した抗原刺激を受ける際にレチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質が存在することにより、該Ｔ細胞は腸組織へのホーミング能を獲得することを見出した。そこで、レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する成分を有効成分として含有するＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質を有効成分として含有するＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤。
【請求項２】
レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質の存在下で培養したナイーブＴ細胞を有効成分とするＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤。
【請求項３】
レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質が、レチノイン酸、又はレチノイン酸受容体アゴニストである請求項１または２に記載のＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤。
【請求項４】
レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質を有効成分として含有する腸管免疫増強剤。
【請求項５】
レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質が、レチノイン酸、又はレチノイン酸受容体アゴニストである請求項４に記載の腸管免疫増強剤。
【請求項６】
レチノイン酸受容体アンタゴニスト又はレチノイン酸受容体アンタゴニストの存在下で培養したナイーブＴ細胞を有効成分として含有するＴ細胞の腸組織へのホーミング抑制剤。
【請求項７】
生体内から分離したナイーブＴ細胞をレチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質の存在下で培養することを特徴とする腸組織特異的ホーミング能が増強されたＴ細胞の製造方法。
【請求項８】
ビタミンＡを低減してなるＴ細胞の腸組織へのホーミング抑制用機能性食品。
【請求項９】
ナイーブＴ細胞を被検物質の存在下で培養し、少なくとも該細胞の腸組織へのホーミングに必要な成分の発現量を指標として被検物質を選択することを特徴とするＴ細胞の腸組織へのホーミング制御剤および腸管免疫増強剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質を有効成分として含有するＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤および腸管免疫増強剤、並びにナイーブＴ細胞を用いたＴ細胞の腸組織へのホーミング制御剤あるいは腸管免疫増強剤のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原刺激を受けていないナイーブＴ細胞は２次リンパ様器官に移入することができるが、通常の組織には移入することが出来ない。これに対し、２次リンパ様器官で抗原と出会って、活性化Ｔ細胞およびメモリーＴ細胞となると２次リンパ様器官ばかりでなく、通常の組織にも移入（ホーミング）することが可能で、そこで機能を発揮できる。しかし、そのホーミング先は初めに抗原により活性化された場である２次リンパ様器官が所属する組織が主となることが知られている（非特許文献１〜３等を参照）。
【０００３】
ナイーブＴ細胞が２次リンパ様器官に移入するための第一段階は、２次リンパ様器官の高内皮性小動脈（ｈｉｇｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｖｅｎｕｌｅ（以下、これを「ＨＥＶ」と称すことがある）に発現する糖質やインテグリンとの結合である。ナイーブＴ細胞の場合、その表面のＬ−セレクチン（以下、これを「ＣＤ６２Ｌ」と称することがある）が、ＨＥＶにあるＧｌｃＮＡｃ−６−ｓｕｌｆａｔｅを含む糖質に結合することで接着が促進される（非特許文献４等を参照）。
【０００４】
エフェクター／メモリーＴ細胞の場合、組織ごとに特有の接着分子およびケモカインを発現し、移入するＴ細胞のポピュレーションも組織ごとに異なっている。例えば、α４β７インテグリンを発現するケースでは、これに結合するＭＡｄＣＡＭ−１が腸組織の血管内皮細胞上に存在し、細胞接着が促進される。さらに、小腸上皮細胞または内皮細胞（腸組織）はケモカインＴＥＣＫ（ＣＣＬ２５）を産生し、その受容体ＣＣＲ９を持つＴ細胞の移入を促進することがわかっている（非特許文献５および６等を参照）。
【０００５】
しかし、これまで腸組織へのＴ細胞のホーミングに必要な接着分子やケモカインに対する受容体がどのような機構で発現するのかについては解明されていなかった。
【非特許文献１】Ｇｕｙ−Ｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８：１６６１（１９７８）
【非特許文献２】Ｋａｎｔｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５１７３（１９９９）
【非特許文献３】Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９５：１３５（２００２）
【非特許文献４】Ｂｕｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７２：２０９（１９９９）
【非特許文献５】Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：７６１（２０００）
【非特許文献６】Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１１１３（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｔ細胞の腸組織へのホーミングに必要な接着分子やケモカインに対する受容体をＴ細胞に発現させる機構を見出し、Ｔ細胞の腸組織へのホーミング制御剤や腸間免疫増強剤などを提供することなどを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ナイーブＴ細胞を抗原刺激する際に、ビタミンＡ（レチノール）代謝物質である低濃度のレチノイン酸の存在下で培養したところ、Ｔ細胞の腸組織へのホーミングに必要な接着分子やケモカインに対する受容体を発現することを見出した。また、これらの発現は、レチノイン酸がレチノイン酸受容体（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＡＲ）を活性化することにより誘導されていることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、
（１）レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質を有効成分として含有するＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤、
（２）レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質の存在下で培養したナイーブＴ細胞を有効成分とするＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤、
（３）レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質が、レチノイン酸、又はレチノイン酸受容体アゴニストである上記（１）または（２）に記載のＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤、
（４）レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質を有効成分として含有する腸管免疫増強剤、
（５）レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質が、レチノイン酸、又はレチノイン酸受容体アゴニストである上記（４）に記載の腸管免疫増強剤、
（６）レチノイン酸受容体アンタゴニスト又はレチノイン酸受容体アンタゴニストの存在下で培養したナイーブＴ細胞を有効成分として含有するＴ細胞の腸組織へのホーミング抑制剤、
（７）生体内から分離したナイーブＴ細胞をレチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質の存在下で培養することを特徴とする腸組織特異的ホーミング能が増強されたＴ細胞の製造方法、
（８）ビタミンＡを低減してなるＴ細胞の腸組織へのホーミング抑制用機能性食品、
（９）ナイーブＴ細胞を被検物質の存在下で培養し、少なくとも該細胞の腸組織へのホーミングに必要な成分の発現量を指標として被検物質を選択することを特徴とするＴ細胞の腸組織へのホーミング制御剤および腸管免疫増強剤のスクリーニング方法、
が、提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、Ｔ細胞の腸組織へのホーミングを制御するための医薬が提供される。本発明の医薬を、腸組織へのＴ細胞のホーミングが欠如または低減している個体に投与することによれば、該個体の腸組織における免疫活性を高めることができる。また、逆に腸組織へのＴ細胞のホーミングが過剰な個体に、本発明のホーミング抑制剤を投与することによれば、過剰なＴ細胞のホーミングを抑制することができ、これが原因となっている疾患の病状を緩和することができる。さらに、本発明は、Ｔ細胞の腸組織へのホーミングを制御する機能を有する物質の簡単なスクリーニング方法が提供される。本スクリーニング方法は、生体を介さずにスクリーニングが行えるため、より有効な医薬を取得するための強力なツールとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、レチノイン酸受容体を活性化する物質を有効成分として含有するＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤、および腸管免疫増強剤、レチノイン酸受容体アンタゴニストを有効成分として含有するＴ細胞の腸組織へのホーミング抑制剤、腸組織特異的ホーミング能が増強されたＴ細胞の製造方法、Ｔ細胞の腸組織へのホーミング抑制用機能性食品、並びにＴ細胞の腸組織へのホーミング制御剤および腸管免疫増強剤のスクリーニング方法に関する。これらを以下に詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、これらの内容には特定されない。
【００１１】
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原刺激を与えたＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導方法
本発明のＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤は、以下の実験によりその効果を確認したものである。詳細は実施例１〜３を参照のこと。
マウスＣＤ４あるいはＣＤ８陽性のナイーブＴ細胞を、マウス脾臓およびリンパ節からＣＤ４、あるいはＣＤ８、およびＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の発現を指標として分離した。分離したナイーブＴ細胞を、抗マウスＣＤ３抗体および抗マウスＣＤ２８抗体をコートしたプレートで培養する際、各濃度のレチノイン酸を添加してみたところ、腸組織へのホーミングに必須のα４β７インテグリンの発現が上昇し、ナイーブＴ細胞に特異的に発現するＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の発現が低下した。レチノイン酸の濃度は、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸の場合０．１ｎＭ以上で、また９−ｃｉｓ−レチノイン酸の場合１ｎＭ以上で上記の傾向が有意に生じた。すなわち、腸組織へホーミングするＴ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体を介して抗原により刺激を受ける際に、適当な濃度のレチノイン酸の存在下で培養することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製できることが見出された。
【００１２】
また、レチノイン酸存在下でＴ細胞抗原受容体を介して抗原刺激を与えたＴ細胞のＣＣＲ９遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定したところ、上昇していることがわかった。ＣＣＲ９は、小腸上皮細胞または内皮細胞が産生するケモカインＴＥＣＫの受容体であり、該組織へ移入する（ホーミングする）のに必須である。さらに、該細胞のケモカインＴＥＣＫへの遊走性を検定したところ、促進されていることが確認された。
【００１３】
さらに、レチノイン酸存在下でＴ細胞抗原受容体を介して抗原刺激を与えたＴ細胞をマウスに静脈注射により移入して、１晩経過後、小腸の粘膜固有層に存在するリンパ球をＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）に記載の方法で採取し、そこに存在するＴ細胞を調べたところ、注入した細胞が含まれていた。
【００１４】
また、レチノイン酸存在下で抗原刺激を与えることによる上記反応は、レチノイン酸受容体アゴニストである合成化合物Ａｍ８０（和光純薬工業社製）の添加によっても同様に見られることもわかった。このことから、ナイーブＴ細胞にレチノイン酸の存在下で抗原刺激を与えることによる腸組織へホーミング誘導は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）を介する反応であり、レチノイン酸受容体アンタゴニストにより阻害されることがわかった。
【００１５】
（２）Ｔ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤
本発明の一つは、Ｔ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤（以下、これを「ホーミング誘導剤」と称することがある）であるが、この有効成分には、レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質、およびレチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質の存在下で抗原刺激を受けたＴ細胞の何れかが用いられる。
【００１６】
（１）に記載した機構のとおり、個体に、本発明のホーミング誘導剤を投与することにより、該個体内においてＴ細胞が抗原刺激を受ける際、投与されたレチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質がレチノイン酸受容体を活性化し、この働きによって該Ｔ細胞に腸組織へのホーミングに必須の成分が発現され、該Ｔ細胞の腸組織へのホーミングが誘導される。
また、レチノイン酸受容体を活性化する物質の存在下で抗原により刺激を受けたＴ細胞は、腸組織へのホーミング能を有するので本発明のＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤として用いることができる。
【００１７】
本発明のＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤が投与されるべき個体とは、Ｔ細胞の腸組織へのホーミングを必要とするものであれば如何なるものでもよいが、例えば、腸管免疫が低下した個体や、他の場所にＴ細胞が過剰に移入してしまっている個体などが挙げられる。他の場所にＴ細胞が過剰に移入してしまっている個体とは、例えば、皮膚組織にＴ細胞が過剰に移入している個体等が挙げられる。このような個体では、本発明の腸組織へのホーミング誘導剤によりＴ細胞は皮膚組織へ移入するための物質の発現が抑制されるため、皮膚組織へのホーミングが抑制される。つまり、本発明のホーミング増強剤は皮膚炎症部分へのホーミング抑制剤として用いることもできる。また、同様に移植組織などの免疫寛容剤としても用いることができる。又、本発明の増強剤を投与する個体の種類は、特に制限はないが、哺乳類が好ましく挙げられる。
【００１８】
レチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質とは、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）のうち、好ましくはαおよびβを活性化する機能を有する物質をいい、具体的には、レチノイン酸および、レチノイン酸受容体（αおよびβ）アゴニスト、例えば、Ａｍ８０（和光純薬社製）、ＴＴＮＰＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｔｐ８０（Ｅｂｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．，４９：５０１（２００１））などが挙げられるが、これ以外にも（４）に記載の方法によりスクリーニングすることができる。レチノイン酸は、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸、９−ｃｉｓ−レチノイン酸のいずれでもよい。また、その他のレチノイン酸異性体および誘導体も、（４）に記載の方法によりスクリーニングすることにより、本発明の医薬の有効成分として用いることができる。
【００１９】
本発明により提供される医薬は、Ｔ細胞の腸組織へのホーミング誘導あるいは腸管免疫増強のための医薬として用いることができる。有効成分として上記のレチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質を用いる場合には、それ自体を医薬としてこれを要求する個体に投与してもよいが、一般には、これらの有効成分の１種又は２種以上を含む医薬組成物を製造して該個体に投与することが好適である。投与の方法は、経口、非経口のいずれでもよい。非経口による局所投与の場合には、例えば、２次リンパ様器官などに投与すると有効である。この２次リンパ様器官は小腸パイエル板や腸間リンパ節以外のものでもよい。また、ワクチン剤とともに本発明の医薬を投与することによれば、共に投与されたワクチンにより刺激を受けたＴ細胞が腸組織への移入を誘導されるため、腸組織において炎症を引き起こす抗原に有効である。
【００２０】
このような医薬組成物として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下剤、又は液剤などの経口投与の製剤、あるいは注射剤、座剤、軟膏、貼付剤などの非経口投与用の製剤を例示することができる。
経口投与用の錠剤又はカプセル剤は、通常は単位投与物として提供され、結合剤、充填剤、希釈剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤及び湿潤剤のような通常の製剤用担体を添加して製造することができる。錠剤は、この当業界で周知の方法に従って、例えば、腸溶性コーティング剤等を用いてコーティングすることができ、例えばセルロース、マンニトール、又はラクトース等の充填剤、澱粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤を用いて製造してもよい。
【００２１】
経口投与用の液剤は、例えば、水性又は油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤又はエリキシル剤等の他、使用前に水又は適当な媒体により再溶解され得る乾燥製剤として提供される。このような液剤には、通常の添加剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は水素化食用脂肪のような沈殿防止剤、レシチン、ソルビタンモノオレート、アラビアゴムのような乳化剤、アーモンド油、精製ココナッツ油、油状エステル（例えばグリセリンエステル）、プロピレングリコール、エチルアルコールのような（食用油も包含しうる）非水性媒体、p-ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、エチルエステル、もしくはプロピルエステル、又はソルビン酸のような保存剤及び必要に応じて通常の香味剤又は着色剤を配合することができる。経口投与剤の製剤は、混合、充填、又は打錠などの当業界で周知の方法により製造することができる。また、反復配合操作を用いて多量の充填剤等を使用した製剤中に有効成分を分布させてもよい。
【００２２】
非経口投与用の製剤は、一般には有効成分である化合物または細胞と滅菌媒体とを含有する液体担体投与量製剤として提供される。非経口投与用の溶剤は、通常、化合物を媒体に溶解させて滅菌濾過し、次に適当なバイアル又はアンプルに充填して密封することにより製造される。安定性を高めるために組成物を凍結させた後にバイアル中に充填し、水を真空下で除去してもよい。非経口懸濁液は実質的に非経口溶液の場合と同じ方法で製造されるが、有効成分を媒体に懸濁させてエチレンオキシド等により滅菌することにより好適に製造できる。また、有効成分が均一分布となるように必要に応じて界面活性剤、湿潤剤等を添加してもよい。
【００２３】
有効成分である物質の投与量は、物質の活性の強度、治療や予防の目的、個体の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定すればよい。また、１日あたり１〜数回に分けて投与するのが望ましい。
また、本発明の有効成分として、レチノイン酸受容体を活性化する物質の存在下で抗原刺激を受けたＴ細胞を用いる場合については、以下の方法により該医薬を調製することができる。
【００２４】
本発明のＴ細胞を調製するために用いるＴ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体を介した抗原による刺激を受けていないもの（以下、これを「ナイーブＴ細胞」と称することがある）が好ましいが、特定のホーミング能が形成されていないメモリーＴ細胞のようなＴ細胞も用いることができる。ナイーブＴ細胞は、これを投与する個体と免疫学的に適合する個体から取得する。ナイーブＴ細胞を取得する個体には本発明のホーミング誘導剤の投与を受ける個体も含まれる。個体からのナイーブＴ細胞の取得方法は、該Ｔ細胞が取得できる方法であれば特に制限はないが、例えば、該個体の組織、骨髄、胎児組織または末梢血を採取し、適切な培地または希釈液を用いて細胞の懸濁液を調製し、該懸濁液から、ナイーブＴ細胞に特異的に発現する表層マーカー（以下、これを「マーカー」と称することがある）を用いて単離する方法などが挙げられる。ナイーブＴ細胞のマーカーとしては、(i)ＣＤ４またはＣＤ８とＬ−セレクチン（以下、これを「ＣＤ６２Ｌ」と称することがある）が共に陽性であること、（ii）ＣＤ４またはＣＤ８とＣＤ４５ＲＢが陽性で、ＣＤ４４陰性または弱陽性細胞であることなどが挙げられる。さらに、上記マーカーにおいて、Ｔ細胞抗原受容体あるいはＣＤ３が陽性であることを確認しながら分離するとさらに好ましい。
【００２５】
マーカーを用いたナイーブＴ細胞の分離には、それ自体公知の常法を用いることができるが、例えば、マーカーの抗体を結合したマグネティックビーズを上記細胞懸濁液に添加し、マーカーを発現しているＴ細胞をマグネティックビーズを磁石で集めることにより分離する方法や、蛍光標識したマーカーの抗体を上記細胞懸濁液に添加し、蛍光物質が結合した細胞をセルソーターで分離する方法、マーカーの抗体をコーティングしたプレートで上記細胞懸濁液を培養したのち、プレートに結合した細胞のみを取得する方法、あるいはこれらの方法を組み合わせる等の方法が挙げられる。上記方法で用いられるマーカーの抗体は、ナイーブＴ細胞に発現しているマーカーが反応するものであれば何れのものでもよいが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。
【００２６】
かくして分離されたナイーブＴ細胞は、これをレチノイン酸受容体を活性化する機能を有する物質の存在下で、適当な抗原によりＴ細胞抗原受容体を介して刺激しながら培養する。適当な抗原とは、ナイーブＴ細胞を該抗原によりＴ細胞レセプターを介して刺激した場合に、エフェクターＴ細胞あるいはメモリーＴ細胞になるようなものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、あるいは抗Ｔ細胞レセプター抗体、あるいはこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、抗原として特定の病原体の一部や不活化した病原体の全体等特定のポリペプチドを含む物質を用いる場合には、これを抗原提示細胞と共にＴ細胞の培養液に添加する必要がある。抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞を得た個体もしくは該個体と免疫学的に適合する個体の末梢血から取得することができる。具体的な分離の方法は、例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌ,  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，２７９５−（１９９１）に記載の方法が挙げられる。
【００２７】
本発明においてナイーブＴ細胞の培養は、レチノイン酸またはレチノイン酸受容体のアゴニストの存在下で行われる。レチノイン酸を用いる場合には、培養液中のレチノイン酸濃度は１０−１１〜１０−４Ｍが好ましく、さらには１０−７〜１０−９Ｍが好ましく、１〜９×１０−８Ｍが最も好ましい。レチノイン酸受容体アゴニストとしては、例えば、Ａｍ８０（和光純薬社製）、ＴＴＮＰＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｔｐ８０（Ｅｂｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．，４９：５０１（２００１））などが挙げられる。これらの培養液中の濃度は、レチノイン酸受容体を活性化するに十分な濃度であれば特に制限はないが、例えば、Ａｍ８０の場合は、１０−１０〜１０−４Ｍが好ましく、さらには１０−６〜１０−８Ｍが好ましく、１〜９×１０−７Ｍが最も好ましい。
【００２８】
レチノイン酸、あるいはレチノイン酸受容体のアゴニストをナイーブＴ細胞培養液へ添加する時期は、培養初期からでもよいし、培養後１〜２日後でもよい。また、レチノイン酸の場合、培養液中で分解される可能性もあるので、適当時間経過後に添加してもよい。
培養容器および培養条件は、当業者がそれぞれのＴ細胞に適したものを選択して用いることができる。具体的には、例えば、ウシ胎児血清（以下、これを「ＦＣＳ」と称することがある）を添加した適当な培地を用いて、大過剰のフィ−ダー細胞および、抗原として抗ＣＤ３モノクローナル抗体と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、さらにエフェクターＴ細胞を誘導するための適当な物質を添加して培養する方法等が挙げられる。エフェクターＴ細胞を誘導するための適当な物質とは、例えば、Ｉｗａｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５，１０１７（２００３）に記載のものが挙げられ、この培養方法によれば、該Ｔ細胞をヘルパーＴ細胞１型（以下、これを「Ｔｈ１」と称することがある）あるいはヘルパーＴ細胞２型（以下、これを「Ｔｈ２」と称することがある）のいずれかに特異的に誘導することができる（具体例は、実施例１を参照のこと）。ここで、用いられる抗体およびサイトカインは、全て用いるＴ細胞に適したものを用いることが必要である。
【００２９】
培養に用いるナイーブＴ細胞は、１０３〜５×１０６個／ｍｌ、好ましくは１０４〜５×１０６個／ｍｌ、さらに好ましくは１０５個／ｍｌの濃度が好ましい。また、培養容器は、プラスチックプレート（例えば、住友ベークライト社製など）等を用いることができ、これを１０％ＣＯ２、３７℃の環境で約４８時間培養することが好ましい。この後、さらに３倍量の上記培地に懸濁して同様の条件でさらに培養するとより好ましい。
【００３０】
また、ナイーブＴ細胞は、上記培養前後に限界希釈法（例えば、Ｒｉｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２８，１８９−２０１（１９９０））などを用いてクローン化してから上記培養に用いてもよい。
かくして得られるＴ細胞は、本発明の腸組織へのＴ細胞のホーミング誘導剤あるいは腸管免疫増強剤として用いることができる。投与される細胞量は、通常、病原体に対する免疫性を有する正常な個体に存在する範囲内である。具体的には、例えば、１０６〜１０１０細胞／ｍ２、好ましくは１０７〜１０９細胞／ｍ２の範囲の細胞が注入される。これらのＴ細胞は、１回の注入か、またはある期間内に複数回注入してもよい。但し、注入するＴ細胞数あるいは注入回数は、注入される個体に適したものを担当医などによって決定され、かつ日常的な検査によって決定され得る。
【００３１】
（３）Ｔ細胞の腸組織へのホーミング抑制剤
本発明の一つは、Ｔ細胞の腸組織へのホーミング抑制剤（以下、これを「ホーミング抑制剤」と称することがある）であるが、この有効成分には、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、およびレチノイン酸受容体アンタゴニストの存在下で抗原刺激を受けたＴ細胞の何れかが用いられる。
【００３２】
（１）に記載した機構のとおり、個体に、本発明のホーミング抑制剤を投与することにより、該個体内においてＴ細胞が抗原刺激を受ける際、投与されたレチノイン酸受容体アンタゴニストによりレチノイン酸受容体の活性化が抑制され、この働きによって該Ｔ細胞には腸組織へのホーミングに必須の成分が発現されず、該Ｔ細胞の腸組織へのホーミングが抑制される。
また、レチノイン受容体アンタゴニストの存在下でＴ細胞抗原受容体を介した抗原刺激を受けたＴ細胞は、腸組織へのホーミング能を持たないので本発明のＴ細胞の腸組織へのホーミング抑制剤として用いることができる。
【００３３】
本発明のＴ細胞の腸組織へのホーミング抑制剤が投与されるべき個体とは、Ｔ細胞の腸組織へのホーミングが抑制されるべき個体であれば何れのものでもよいが、例えば、Ｔ細胞の腸組織へのホーミングが過剰な個体、あるいは他組織へのＴ細胞の移入を必要とする個体などが挙げられる。具体的には、Ｉ型糖尿病では、腸組織へのホーミングに必要なα４β７を発現する自己反応性Ｔ細胞が、そのリガンドＭＡｄＣＡＭ−１を介して膵臓に侵入してランゲルハンス島細胞を攻撃し、インスリン産生を阻害すると考えられているので、本発明のホーミング抑制剤によりこれらの細胞の働きを阻害することができる。また、Ｃｒｏｈｎ病等の炎症性腸疾患では、腸への炎症誘導性活性化Ｔ細胞のホーミングが起こっており、本発明のホーミング誘導剤によれば、特に小腸の炎症に関しては、これらの炎症性Ｔ細胞のホーミングが抑制される。また、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）では、この原因となるＴ細胞が腸パイエル板で活性化されることが重要であると考えられており、本発明のホーミング抑制剤によれば病態の緩和が期待できる。
【００３４】
レチノイン酸受容体アンタゴニストとは、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）に結合し、この活性化を阻害する機能を有する物質であれば如何なるものであってもよいが、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）のうち、αおよびβのアゴニストが好ましい。具体的には、例えば、ＬＥ１３５（Ｕｍｅｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４０：４２２２（１９９７））、ＬＥ５４０（Ｕｍｅｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４０：４２２２（１９９７））、ＢＭＳ４９３  （Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ社製）等が挙げられるが、これら以外にも（４）に記載の方法によりスクリーニングすることができる。
【００３５】
本発明により提供される医薬は、Ｔ細胞の腸組織へのホーミング抑制のための医薬として用いることができる。有効成分としてレチノイン酸アンタゴニストを用いる場合には、（２）に記載の方法で製剤化し、個体に投与することができる。具体的な投薬量としては、ＬＥ１３５の場合、０．１〜５００  ｍｇ／ｋｇ程度を１日１回または複数回に分けて投与することが好ましい。また、有効成分としてレチノイン酸アンタゴニストの存在下でＴ細胞抗原受容体を介した抗原刺激を行ったＴ細胞を用いる場合には、（２）に記載の方法で調製するが、アンタゴニストの添加量としては、例えばＬＥ１３５を用いる場合、１０−９〜１０−３Ｍが好ましく、さらには１０−５〜１０−７Ｍが好ましく、１０−６Ｍの範囲が挙げられる。得られたＴ細胞の製剤化方法及び個体への投与または注入方法は（２）に記載の方法を用いることができる。
【００３６】
また、本発明のレチノイン酸受容体アンタゴニストと同様の機能を有するものとして、ビタミンＡを低減してなる機能性食品も本発明の範囲に含まれる。
レチノイン酸は、食物中のビタミンＡ類（主にレチノールエステルとβ-カロテン）からの代謝産物として、いくつかの特定の細胞によって産生される。一般に、ビタミンＡは主に肝臓でレチノールエステルの形で蓄えられ、必要に応じて血中に放出される。血中ではほとんどがレチノールの形で結合タンパク質（ＲＢＰ）と結合して、ほぼ一定の濃度（１〜３×１０−６Ｍ）に保たれている。レチノールが標的細胞に入ると、細胞内でレチナール、レチノイン酸へと代謝される。レチノールからレチナールへの変換は可逆過程で、これにはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）が関与し、この酵素にはいくつかのアイソフォームがある。レチナールからレチノイン酸への変換にはレチナールデヒドロゲナーゼ（ＲＡＬＤＨ）が関与し、これにもいくつかのアイソフォームが存在する。即ち、ビタミンＡを低減してなる機能性食品は、これを摂取した個体内でレチノイン酸の産生量を低減させるため、該個体内の２次リンパ様器官におけるレチノイン酸受容体の活性化が抑制され、Ｔ細胞の腸組織へのホーミング抑制機能が誘導される。本発明の機能性食品は、ビタミンＡを多く含む食品からビタミンＡのみを低減してなるものが好ましい。ここでいう食品とは、固体でも飲料あるいは調味料などの液体でもよく、また動物用の資料もこれに含まれる。
【００３７】
（４）Ｔ細胞の腸組織へのホーミング制御剤のスクリーニング方法
本発明はＴ細胞の腸組織へのホーミングを誘導または抑制する機能を有する物質のスクリーニング方法も提供する。本発明のスクリーニング方法では、ナイーブＴ細胞を被検物質の存在下で培養し、少なくとも該細胞の腸組織へのホーミングに必要な成分の発現量を指標として被検物質を選択するものである。Ｔ細胞の腸組織へのホーミングに必須の成分とは、α４β７インテグリン、ケモカインＴＥＣＫ受容体（ＣＣＲ９）などが挙げられる。
【００３８】
ナイーブＴ細胞の取得および培養方法は、（２）に記載した方法を用いることができる。また、特定のホーミング能が形成されていないメモリーＴ細胞のようなＴ細胞も用いることができる。Ｔ細胞抗原受容体を介した抗原刺激には、抗Ｔ細胞抗原受容体抗体、抗ＣＤ３抗体、あるいは抗ＣＤ２８抗体、あるいはその組み合わせが好ましく用いられる。用いる被検物質としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられ、これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被検物質存在下でのナイーブＴ細胞の培養方法も、（２）に記載の方法におけるレチノイン酸などを被検物質に置き換えた方法などが用いられる。
【００３９】
このような培養を行った後、培養液からＴ細胞を回収し、該細胞に発現しているα４β７インテグリン、ケモカインＴＥＣＫ受容体（ＣＣＲ９）の発現量を測定する。この発現量を好ましくは、上記培養前の該物質の発現量と比較して、有意に増加した場合には、該被検物質はＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導活性を有していると判断でき、逆に低減または変化しなかった場合には該被検物質はＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導活性を有していないと判断することができる。
【００４０】
さらに、上記培養後のＴ細胞について、腸以外の組織へのホーミングに必須な成分の発現量を測定し、これがα４β７インテグリン、ケモカインＴＥＣＫ受容体（ＣＣＲ９）の発現量より多ければ、該被検物質は、他組織へのホーミング誘導能を有する、即ち腸組織へのＴ細胞のホーミング抑制活性を有すると判断することができる。腸以外の組織へのホーミングに必須な成分とは、例えば、皮膚組織への移入に必要なＥ−セレクチンリガンドおよびＰ−セレクチンリガンド、あるいはケモカインＴＡＲＣ受容体（ＣＣＲ４）などが挙げられる。
【００４１】
これらの指標となる物質の測定方法は、それ自体公知の定法を用いることができる。例えば、蛍光物質を結合させた指標となる物質の抗体を該Ｔ細胞と接触させ、細胞に結合した蛍光物質の量を測定する方法や、Ｔ細胞内のＲＮＡなどを定法に従って分離精製し、指標となるタンパク質をコードする遺伝子の発現量として定量的ＰＣＲ法又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲなどを用いて測定する方法などが挙げられる。
【００４２】
また、ケモカインＴＥＣＫ受容体（ＣＣＲ９）の発現量が増加したことを確認する方法としては、実際に該Ｔ細胞のケモカインＴＥＣＫへの遊走性を定法に従って測定する方法も挙げられる。
かくして選択されたＴ細胞の腸組織へのホーミング制御活性を有する物質は、上記（２）および（３）のＴ細胞の腸組織へのホーミング誘導剤、あるいは抑制剤として用いることができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ マウスＴ細胞の腸組織へのホーミング受容体発現を制御する物質の探索・同定
（１）ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の取得
ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取するマウスＤＯ１１．１０は、ＲＡＧ−２遺伝子欠損マウスと、Ｔ細胞抗原受容体（以下、これを「ＴＣＲ」と称することがある）を遺伝子導入したマウスの、交配により作製されたものである。ＲＡＧ−２遺伝子欠損マウスは、常法（ジーンターゲッティング、メディカルサイエンスインターナショナル（１９９５））に従って作製されたものである（Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８，８５５（１９９２））。また、ＴＣＲ遺伝子導入マウスは、Ｍｕｒｐｈｙらにより卵白アルブミン（ＯＶＡ）に特異的なＴＣＲ遺伝子を導入、作製されたものである（Ｍｕｒｐｈｙ，ＫＭ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，１７２０（１９９０））。
【００４４】
両マウスを交配することにより、ＲＡＧ−２を欠損した遺伝的背景に、単一のＴＣＲを発現する、つまり内因性のＴＣＲ発現がなく、導入されたＴＣＲのみを発現するマウスが作製された。このマウスでは主要組織適合抗原（ＭＨＣ）拘束性を利用することにより、胸腺においてＴ細胞の分化をＣＤ４陽性細胞系列に誘導することができ、末梢の大部分のＴ細胞がＣＤ４陽性細胞となる特徴がある。しかも、ＯＶＡを投与しない限り、大部分の末梢Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。
【００４５】
上記マウスをＳＰＦ条件下にて飼育し、この脾臓およびリンパ節を無菌的に取り出し、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）に記載の方法により、１０％非働化ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社製）で１〜５ｘ１０７細胞／ｍｌ濃度の細胞懸濁液を調整した。この細胞懸濁液から、Ｉｗａｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１０１７（２００３）に記載の方法によって、ＣＤ４陽性ＣＤ６２Ｌ強陽性のＴ細胞を精製し、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞として用いた。
【００４６】
具体的には、この細胞懸濁液１ｍｌあたり５０mｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４（Ｄｙｎａｌ社製）を添加し、４℃で２０分緩やかに撹拌した。Ｄｎｙａｂｅａｄｓに接着した細胞をＤｙｎａｌ  ＭＰＣ−１  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｄｙｎａｌ社製）を用いて集め、非接着細胞を除去した。接着した細胞を、新たな培地に再懸濁して同様な方法で再び集め、この操作をさらに２度繰り返して洗浄した。  
【００４７】
洗浄した接着細胞は１０％濃度のＤｅｔａｃｈａＢｅａｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４（Ｄｙｎａｌ社製）に懸濁して室温で４０分緩やかに撹拌してビーズから剥がし、ビーズのみをＤｙｎａｌ  ＭＰＣ−１  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒで除去してＣＤ４陽性Ｔ細胞を得た。この細胞画分を１ｘ１０８細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、ＭＡＣＳ  ＣＤ６２Ｌ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を添加して４℃で２０分培養した。
【００４８】
これらの細胞を新たな培地に懸濁し、Ｍｉｎｉ  ＭＡＣＳ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）に設置したＭＳカラムに添加し、カラムをさらに２ｍｌの培地で洗浄してＣＤ６２Ｌ陰性または弱陽性細胞を除去した。その後、カラムを装置から外してさらに１ｍｌの培地を添加し、カラム内に留まったＣＤ４陽性でＣＤ６２Ｌ強陽性の細胞を回収した。
【００４９】
（２）ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化に伴う各種ホーミング受容体の発現変化とその制御
上記（１）で取得したナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を７．５ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度で１０％ ウシ胎児血清を含む培地に懸濁した。この細胞懸濁液を、Ｉｗａｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Int．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１０１７（２００３）に記載の方法によって、抗マウスＣＤ３抗体と抗マウスＣＤ２８抗体をコートした懸濁培養用プラスチックプレート（住友ベークライト社製）内で、１０％ＣＯ２、３７℃の環境で４８時間刺激を加えて培養した。
【００５０】
培養後、細胞を２０〜５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌリコンビナント・マウス・インターロイキン−２（ＩＬ−２：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を含む３倍量の新しい培養液に懸濁し、抗体をコートしていない培養プレート中でさらに４８〜９６時間培養した。この２段階の培養の際、通常は他のサイトカインは添加しないが、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）を特異的に誘導するためには１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナント・マウスＩＬ−１２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、および２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウスＩＬ−４抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製：クローン１１Ｂ１１）を添加した。また、ヘルパーＴ細胞２型（Ｔｈ２）を特異的に誘導するためには４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリコンビナント・マウス・インターロイキン−４（ＩＬ−４：Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウス・インターフェロン−γ抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製、クローン：ＸＭＧ１．２）、および２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗マウス・インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、クローン：Ｃ１７．８）を添加した。ホーミング受容体発現への影響を検定する物質としてａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ＲＡ）又は９−ｃｉｓ−レチノイン酸をこの２段階の培養の全期間に０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭの濃度で添加した。
【００５１】
これらの培養で得た細胞を洗浄後、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識したモノクローナル抗マウスＬＰＡＭ−１（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  α４β７  ｃｏｍｐｌｅｘ）抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製、クローン：ＤＡＴＫ３２）またはモノクローナル抗マウスＣＤ６２Ｌ（Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）  抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製、クローン：ＭＥＬ−１４）、およびＦｃ受容体をブロックするためのモノクローナル抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製、クローン：２．４Ｇ２）と４℃で３０分培養した。細胞をマウスＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎとヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分の融合タンパク質（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ社製）またはマウスＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎとヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分の融合タンパク質（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）と４℃で３０分培養した場合には洗浄後、さらにＰＥ標識した抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体と４℃で３０分培養した。細胞は洗浄後に蛍光標識の強度をセルソーター（ＦＡＣＳｃａｎ：日本ベクトン・ディッキンソン社製）によって解析した。
【００５２】
その結果を図１に示す。図１Ａの実線はａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ａｌ−ｔｒａｎｓ−ＲＡ）を１０ｎＭ添加した場合の細胞表面への各マーカー（図上に表示）発現レベル（横軸）を示し、点線はレチノイン酸無添加の場合のマーカー発現レベルを示す。発現レベルは、平均発現レベル（平均蛍光強度からバックグラウンドレベルを差し引いた値）である。また、図左には、ナイーブＴ細胞の培養条件を示した。図から明らかなように、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ＲＡ）の存在下で培養した細胞では、ＩＬ−４やＩＬ−１２を添加しない条件（ｕｎｓｋｅｗｅｄ  条件）下、Ｔｈ１誘導条件下、およびＴｈ２誘導条件下のいずれにおいても、α４β７インテグリンの発現が上昇し、ＣＤ６２Ｌの発現は抑制される傾向があった。また、皮膚へのホーミングに関与する分子Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎリガンド（Ｅ−ｌｉｇ）およびＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎリガンド（Ｐ−ｌｉｇ）の発現は、ｕｎｓｋｅｗｅｄ条件およびＴｈ１誘導条件において抑制される傾向があった。また、図１Ｂには、上記のｕｎｓｋｅｗｅｄ条件のＴ細胞にａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸あるいは９−ｃｉｓ−レチノイン酸（９ｃＲＡ）が、それぞれ０〜１０００ｎＭ添加した培養条件で、細胞表面へのα４β７インテグリン（図中黒丸で示す）とＥ−ｌｉｇ（図中白丸で示す）の発現レベル（縦軸）を示した。図から明らかなように、レチノン酸添加の効果は、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸の場合、０．１ｎＭ以上の添加で有意に認められ、９−ｃｉｓ−レチノイン酸（９ｃＲＡ）の場合、１ｎＭ以上の添加で有意に認められた。
【００５３】
さらに、上記培養で得た細胞からＡｄａｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１４７０８（２０００）に記載の方法にて全ＲＮＡを調製し、種々のサイトカイン受容体ｍＲＮＡに対する半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲの鋳型ｃＤＮＡは、上記の方法で調製したＲＮＡ５μｇ／２０μｌから１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを調製して用いた。ＤＮＡ量は、反応液を５倍希釈してから、そのうち１μｌを用いてコントロールであるＧＡＰＤＨをＰＣＲ法で増幅し、増幅されたＧＡＰＤＨが各サンプル間で等量となるように調整して用いた。用いたセンス・プライマーおよびアンチセンス・プライマーの配列は、それぞれ、ＣＣＲ９には配列番号１および２、ＣＣＲ７には配列番号３および４、ＣＣＲ４には配列番号５および６、ＦｕｃＴ−ＶＩＩには配列番号７および８、およびコントロールのＧＡＰＤＨには配列番号９および１０に記載のものを用いた。これらの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を図２に示す。図中、「Ｎｏｎｅ」はレチノイン酸を添加していない培養系の結果を示し、ＲＡはレチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸）を１０-８Ｍ添加した培養系、また「Ａｍ８０」はレチノイン酸受容体アゴニストであるＡｍ８０を１０-７Ｍ添加した培養系を示す。又、各３レーンは、鋳型ＤＮＡ量を１倍、１／３倍、１／９倍として用いた結果を示す。図から明らかなように、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸はＣＣＲ９遺伝子の発現を誘導促進する効果を示した。一方、皮膚へのホーミングに関与するＣＣＲ４遺伝子の発現はａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸の添加により抑制された。また、Ｅ−ｌｉｇおよびＰ−ｌｉｇの発現に必要なｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＦｕｃＴ−ＶＩＩの発現も抑制された。しかし、ＣＣＲ７の発現にはほとんど影響を与えなかった。
【００５４】
（３）レチノイン酸受容体アゴニストのナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化に伴う各種ホーミング受容体の発現変化への影響
９ｃＲＡはレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）とレチノイドＸ受容体ＲＸＲの両者に結合するが、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸はレチノイン酸受容体にのみ結合するので、これらの作用はレチノイン酸受容体を介して発揮されると考えられる。但し、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸から９ｃＲＡへの変換が細胞内で起こる可能性がある。そこでレチノイン酸受容体のアゴニストである合成化合物Ａｍ８０（和光純薬工業製）の効果を調べたところ、その１０ｎＭ添加によっても同様な効果が認められたので、レチノイン酸受容体を介した作用によることが確認された。また、レチノールやレチナールの活性はａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸の１／１００以下だった。
【００５５】
（４）レチノイン酸受容体アンタゴニストのナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化に伴う各種ホーミング受容体の発現変化への影響
上記（２）と同様にしてナイーブＴ細胞をｕｎｓｋｅｗｅｄ条件で培養する際、１ｎＭ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸とレチノイン酸受容体のアンタゴニストである合成化合物ＬＥ１３５（Ｕｍｅｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４０：４２２２（１９９７））を１μＭ、培養開始後２４時間目に添加して、得られるＴ細胞のα４β７インテグリンの発現量を測定した。又、コントロールとして、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸を添加しない系、及びＬＥ１３５を添加しない系についても同様に得られるＴ細胞のα４β７インテグリンの発現量を測定した。その結果を図３に示す。図中、「ＬＥ１３５」はＬＥ１３５を添加した系の結果を示し、「Ｎｏｎｅ」は添加していない系の結果を示す。又、斜線で塗ったグラフはａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノン酸を添加した系の結果を示し、黒く塗ったグラフは添加しない系の結果を示す。図から明らかなように、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノン酸の存在下で培養されることによるα４β７インテグリンの発現は、ＬＥ１３５の添加によって抑えられることがわかった。
【００５６】
（５）Ｔ細胞の化学遊走活性へのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸の影響
ＣＣＲ９遺伝子の発現がａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸により増強されることで、実際にＴ細胞のＣＣＲ９のリガンドであるケモカインＴＥＣＫ（ＣＣＬ２５）へのケモタクシス（化学遊走）が促進されるか否かを検定した。Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．＆Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１３５（２００２）の方法に基づいて、上記培養細胞の一部を用いて化学遊走が検定した。その結果を図４に示す。図中、「Ｎｏｎｅ」で示したグラフはレチノイン酸を添加しないで培養したＴ細胞の結果を示し、「ＲＡ」で示したグラフはａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸を１０ｎＭ添加した培養系のＴ細胞の結果を示す。また、「ＴＥＣＫ」はケモカインＴＥＣＫへの遊走性を解析した結果を示し、「ＴＡＲＫ」「ＣＴＡＣＫ」「ＩＰ−１０」はそれぞれケモカインの種類を示す。ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸の存在下で活性化されたＴ細胞は、ＴＥＣＫへの化学遊走能を著しく促進されることが判明した。しかし、他のケモカインＴＡＲＣ、ＣＴＡＣＫ、およびＩＰ−１０などへの反応にはあまり大きな影響はなかった。
【００５７】
実施例２ Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸存在下に活性化されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでのホーミング・パターンの変化
実施例１に示した２段階の培養により得られた活性化Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるホーミング・パターンを解析した。ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸を添加して培養した細胞は緑色の蛍光色素５−（ａｎｄ−６）−ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）で標識し、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸を加えずに培養した細胞は赤色の蛍光色素ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ）で標識した後、両細胞を１：１に混合して、１．５％  ＦＣＳを含む培地０．２５  ｍｌにそれぞれの細胞を１０７個ずつ含むように懸濁し、これらの細胞と同系の非Ｔｇマウスに静脈注射により移入した。
【００５８】
一晩経過した後、種々の２次リンパ様器官および小腸の粘膜固有層に存在するリンパ球をＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）に記載の方法で採取し、そこに存在する蛍光色素標識細胞をＦＡＣＳｃａｎで解析した。この結果を図５に示す。図中、Ｉｎｐｕｔは投与する前の細胞の蛍光（緑色および赤色）とその割合（緑色細胞：赤色細胞）を示し、ＰＬＮ、ＳＰＬ、ＭＬＮ、ＰＰは、投与後１６時間目のマウスの２次リンパ様器官における両細胞（それぞれＲ１とＲ２の区画の中の細胞）の割合を示す。同様に、ＰＬＮ（末梢リンパ節）、ＳＰＬ（脾臓）、ＭＬＮ（腸間膜リンパ節）、ＰＰ（パイエル板）における両細胞（それぞれＲ１とＲ２の区画の中の細胞）の蛍光強度を示した。横軸は緑色の蛍光強度、横軸は赤色の蛍光強度を示す。それぞれの組織におけるＲ１：Ｒ２の比をｈｏｍｉｎｇ  ｉｎｄｅｘとして右上の棒グラフで示した。
【００５９】
図から明らかなように、緑色細胞：赤色細胞の比が、脾臓（ＳＰＬ）ではほぼ１：１だったが、腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）では１．６、小腸パイエル板（ＰＰ）では２．８、皮膚などを担当する末梢リンパ節（ＰＬＮ；鼠径部リンパ節と腋下リンパ節を用いた）では逆に０．３だった。また、小腸粘膜固有層では、少数の緑色細胞が存在したが赤色細胞はほとんど検出できなかった。従って、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸と培養されたＴ細胞は実際にｉｎ  ｖｉｖｏで腸へのホーミング能が上昇し、逆に末梢リンパ節へのホーミング能は低下することが判明した。
【００６０】
実施例３ ビタミンＡ欠乏マウスにおけるＴ細胞の腸へのホーミング能への影響
Ｔ細胞の腸組織へのホーミング能に生体内のビタミンＡレベルが影響を与えるか否かを解析するために、ビタミンＡ欠乏マウスを作製した。妊娠２週目からビタミンＡを欠損させた餌を与えた群と、同じ餌にビタミンＡだけを通常の餌と同レベル加えたものを与えた対照群の妊娠マウスから、それぞれ生まれた仔マウスをさらに同じ餌で８〜１２週間飼育し、血中のレチノールレベルが著しく低下したことをＣｈａｔｅｌｌａｒｄ−Ｇｒｕａｚ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３９：１４２１（１９９８）に記載の方法に基づいて確認した。その小腸粘膜固有層に存在するＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を解析した。その結果、対照群のマウスでは通常通りのＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞が回収できたのに対し、ビタミンＡ欠乏マウスではほとんどＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞が得られなかった。このことは、食物抗原等によって生ずる筈の活性化Ｔ細胞やメモリーＴ細胞が小腸組織にホーミングしにくくなっていることを示しており、生理的にもビタミンＡ代謝物質のレチノイン酸がＴ細胞の腸へのホーミングに関与していることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】レチノイン酸存在下でナイーブＴ細胞を活性化した場合の、a4b7インテグリン、ＣＤ６２Ｌ、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎリガンド（Ｅ−ｌｉｇ）およびＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｎリガンド（Ｐ−ｌｉｇ）の細胞表面における発現量を蛍光標識抗体とｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて解析した結果を示す図である。
【図２】レチノイン酸存在下でナイーブＴ細胞を活性化した場合の、ＣＣＲ９、ＣＣＲ７、ＣＣＲ４、ＦｕｃＴ−ＶＩＩ、およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲによる半定量的検定により測定した電気泳動の結果を示す図である。
【図３】レチノン酸存在下でナイーブＴ細胞を活性化する際、レチノイン酸アンタゴニストを添加して、得られたＴ細胞のα４β７インテグリン発現量を解析した結果を示すグラフである。
【図４】レチノイン酸の存在下でナイーブＴ細胞を活性化した場合の、種々のケモカインに対する遊走性を解析した結果を示すグラフである。
【図５】レチノイン酸の存在下、ナイーブＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化した後、ｉｎ  ｖｉｖｏに投与してホーミング特異性をＦＡＣＳｃａｎを用いて解析した結果を示す図である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【配列表】
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