(57)【要約】【課題】L-シスタチオニンの経済的に有利な製造法を提供することを課題とする。【解決手段】発酵培地に微生物を培養するに際して、培養液にL-システイン（またはその生合成原料）およびまたはL-ホモセリン（またはその生合成原料）を添加して培養することによって、発酵物および発酵液中に著量のL-シスタチオニンを蓄積させ、これを採取する発酵法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源、窒素源、硫黄源その他微生物の生育に必要な栄養素を含む発酵培地にL-シスタチオニン生産能を有する微生物を培養して、培養物及びまたは培養液中にL-シスタチオニンを蓄積せしめ、培養物及びまたは培養液からL-シスタチオニンを採取する発酵法によるL-シスタチオニンの製造法において、発酵培地にL-システイン（またはその生合成原料）及びまたはL-ホモセリン（またはその生合成原料）を添加することを特徴とする発酵法によるL-シスタチオニンの製造法。
【請求項２】
L-システインの生合成原料としてL-シスチンを用いることを特徴とする請求項1記載の製造法。
【請求項３】
L-システインの生合成原料としてチオ硫酸もしくはその塩類を用いることを特徴とする請求項1記載の製造法。
【請求項４】
L-システインの生合成原料として硫化水素もしくはその塩類を用いることを特徴  とする請求項1記載の製造法。
【請求項５】
L-ホモセリンの生合成原料として、L-アスパラギン酸もしくはその塩類を用いる  ことを特徴とする請求項1記載の製造法。
【請求項６】
L-ホモセリンの生合成原料として、フマル酸もしくはその塩類を用いることを特  徴とする請求項1記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法によるL-シスタチオニンの製造法に関する。L-シスタチオニンは医薬、健康保健薬およびそれらの原料として用途の期待される物質である。
【背景技術】
【０００２】
従来発酵法によるL-シスタチオニンの製造法としては、本発明者の発明による大腸菌のメチオニン要求性変異株を用いる方法（特願2003-010654）が知られていたが、その蓄積量は低かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来知られていたL-シスタチオニンの製造法では、L-シスタチオニンの蓄積量は高々1g/lと低く、そのためL-シスタチオニンの回収率も低くなり、結果としてL-シスタチオニンの安価な製造を困難にしており、その蓄積量の向上が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明では、安価な炭素源、窒素源、硫黄源、その他の微量の栄養源を含む通常の発酵培地にL-シスタチオニン生産能を有する微生物を好気的に常法により培養するに際して、発酵液中にL-システインまたはその生合成原料とL-ホモセリンもしくはその生合成原料の組み合わせ、またはそのどちらか一方を添加することにより、L-シスタチオニン蓄積量が著しく向上することを見出し本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の発酵法によって、L-シスタチオニンを経済的に有利に生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の方法によれば安価な糖源、窒素源、硫黄源、その他微量の栄養源をほどよく含む発酵培地に微生物を好気的に培養するに際して、L-システインもしくはその生合成原料とL-ホモセリンもしくはその生合成原料の組み合わせ、もしくはそのどちらか一方を発酵の最初から、もしくは発酵の途中で添加する。
【０００７】
本発明で使用するL-システインの生合成原料としては、使用微生物が発酵中にL-システインに変換するものであればいずれでもよく、例えばL-シスチン、チオ硫酸もしくはその塩類、あるいは硫化水素もしくはその塩類があげられる。
【０００８】
本発明で使用するL-ホモセリンの生合成原料としては、使用微生物が発酵中にL-ホモセリンに変換するものであればいずれでもよく、例えばL-アスパラギン酸やフマル酸あるいはそれらの塩類あるいはホモセリンラクトンがあげられる。
【０００９】
本発明で使用する微生物としては、上記の条件でL-シスタチオニンを著量生成・蓄積するものであれば細菌類、始原菌類、真菌類のいずれの微生物も利用できる。また、それらは野生株、変異株のいずれでも良く、代表例として大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、バチルス属細菌、サッカロミセス・セレビシエー、アスペルギルス属菌類等に属する微生物があげられる。
【００１０】
使用微生物としては例えば大腸菌の変異株が好適である。変異株としては、例えば生育に少なくもL-メチオニンを要求する変異株が好適である。このL-メチオニン要求性はDL-メチオニン、D-メチオニンによっても満たされことがある。また、これらのメチオニン類の他に、L-ホモシステイン、DL-ホモシステイン、ホモシステインチオラクトンのどれかによっても満たされることがある。また、その要求性が上記のメチオニン類では満たされるがホモシステイン類では満たされないこともある。また、この要求性は漏出型（リーキー型）であってもよい。
【００１１】
さらに、本発明に使用する微生物変異株としては、各種の薬剤（例えばアミノ酸の構造類似体、アミノ酸生合成や核酸生合成の中間体の構造類似体、ビタミン類の構造類似体）に耐性または感受性の性質を持つものが使用される。そして、これらの薬剤耐性と薬剤感受性の性質と上記の栄養要求性の性質の両方を合わせてもつ変異株であっても良い。
【００１２】
さらに、本発明に使用する微生物変異株としては、セリン-O-アセチル転移酵素やO-アセチルセリンスルフヒドラーゼ等のシステイン生合成経路の酵素類がL-システインのフィードバック調節に対して耐性になった変異株あるいはホモセリンサクシニル転移酵素やシスタチオニン・ガンマ・シンターゼのようなメチオニン合成酵素類がL-メチオニンのフィードバック調節に対して耐性になった変異株、あるいはその両方の性質の変異株が使用できる。そして、これらのフィードバック調節に対する耐性の性質と、上述の栄養要求性、薬剤耐性あるいは薬剤感受性の性質とを合わせてもつ変異株であっても良い。
【００１３】
また、上記の酵素の性質が遺伝子導入法によって付与されたものであっても良い。
【００１４】
本発明に使用する微生物の代表例として大腸菌に属し、生育に少なくともL-メチオニンまたはL-ホモシステインを要求する変異株FERMP-18891をあげることができる。
【００１５】
本菌株は、次の実験例のように、L-メチオニン、DL-メチオニン、D-メチオニンまたはDL-ホモシステインまたはL-ホモシステインのうちのどれか一つを生育に必要とする変異株であり、独立行政法人産業技術総合研究所に保管されて公知である。
【００１６】
大腸菌変異株FERMP-18891と大腸菌野生株K-12を、ブイヨン寒天培地にそれぞれ接種し37℃で一夜培養した。生育した菌体の一部を採取して、殺菌水2mlに懸濁し、1mlあたり約10８個の細胞を含む細胞懸濁液をそれぞれ調製した。これらの細胞懸濁液0.1mlづつを、それぞれの菌株について４枚づつの最少寒天培地｛グルコース  1%、硫酸アンモニウム  0.2%、  KH2PO4  0.15%、  K2HPO4  0.05%、  MgSO4・7H2O  0.05%、  FeSO4・7H2O  0.01%、  MnSO4・4H2O  0.007%、  NaCl  0.01%、  無機塩類混液（１Ｌ中にCaCl2・H2O  5.3g、  CoCl2  40mg、  CuSO4・5H2O  40mg、  H3BO3  30mg、Na2MoO4  47ｍｇ、  ZnSO4・7H2O  200mgを含む）を1ml/Lおよび寒天2%を含む培地、pH7｝30mlを含む平板培地の片隅に、シリンダーカップを置き、それぞれのカップの中にL-メチオニン(2.5mg/ml）溶液、D-メチオニン(2.5mg/ml)溶液、ＤＬ−メチオニン(2.5mg/ml)溶液または殺菌水（対照）をそれぞれ0.02mlづつ注入して、30℃で48時間静置培養した。その結果は次の表1に示すように、野生株では４つのどの条件でも平板の表面全体に良好な生育が認められた。
【００１７】
一方変異株では、L-メチオニン、D-メチオニンまたはDL-ホモシステインを与えたシリンダーカップの周辺にのみ生育ゾーンが認められ、殺菌水（対照）を与えたカップの周辺またはカップから離れた領域ではまったく生育が認められなかった。    
【００１８】
【表１】
2005168422.tif 000002
【００１９】
本発明に使用する発酵培地としては、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類その他の栄養物を程良く含有しかつL-システイン（またはその生合成原料）およびまたはL-ホモセリン（またはその生合成原料）を程よく含む培地ならば合成培地、天然培地のいずれでも使用できる。
【００２０】
L-システイン（またはその生合成原料）およびまたはL-ホモセリン（またはその生合成原料）は発酵の途中で培養液中に添加してもよい。
【００２１】
炭素源としては、使用菌の利用可能なものであればいずれを用いてもよい。例えば、グルコース、フラクトース、しょ糖、乳糖、マンノース、マルトース、廃糖蜜、でんぷん加水分解物等の炭水化物、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、シスチン、システイン、アラニン、プロリン、グリシン、トリプトファン、セリン、ホモセリン、スレオニン等のアミノ酸類、乳酸、ピルビン酸、酢酸、リンゴ酸、ギ酸、コハク酸、フマール酸、クエン酸、各種脂肪酸等の有機酸類、エタノール、プロパノール、ブタノール、メタノール等のアルコール類を単独あるいは組み合わせて使用できる。
【００２２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、亜硫酸アンモニウム、硫化アンモニウム、チオ硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、各種の有機酸アンモニウム塩、各種の硝酸塩類、アンモニア水、尿素等が単独あるいは組み合わせて使用できる。
【００２３】
硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム等の硫酸塩、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩、硫化アンモニウム、硫化カリウム、硫化ナトリウム、硫化水素等の硫化物、チオ硫酸塩類、メルカプタン、シテイン（シスチン）等のメルカプト化合物、その他の有機無機硫黄化合物が使用できる。
【００２４】
要求物質であるメチオニンおよびホモシステインは、L-型、D-型、DL-型のいずれでも、使用菌の利用できるものであれば単独あるいは組み合わせて利用できる。またこれらを含む天然または合成物質や、容易にこれらに変化しうる物質たとえばメチオニンのヒダントイン、ホモシスチン、ホモシステインチオラクトン等も使用できる。これらの要求物質の使用量は、培地の組成やその他の培養条件によって異なるが、用いた培養条件下で、それらを充分量添加した場合の最大生育量に対して、50~90%程度の生育量が得られるように制限して供給することが望ましい。
以上の物質は、培養の初期、あるいは培養の途中で分割あるいは一括して添加する事が出来る。
【００２５】
培養は振とう培養や通気撹拌培養等の好気的条件下で行われる。培養中培養液のpHは5~9に維持されるのが好適である。中和剤としては、アンモニア水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、燐酸マグネシウム、水酸化カリウム、尿素等が用いられる。
【００２６】
培養期間は通常3~7日間で、主として培養液中に著量のL-シスタチオニンが蓄積する。
【００２７】
培養液からのL-シスタチオニンの単離は常法により溶媒抽出、各種クロマトグラフィーによって行われる。
【００２８】
以下にL-システイン（またはその生合成原料）とL-ホモセリン（またはその生合成原料）の濃度を変えて発酵液に添加して、L-シスタチオニンの蓄積量が増加した例を示す。
【実施例】
【００２９】
実施例1としてグルコース10g/l、ポリペプトン10g/l、酵母エキス5g/l、尿素3g/lの組成からなるpH７の種培地10mlを300ml容三角フラスコに入れて120℃で10分間オートクレーブ殺菌する。これに大腸菌変異株FERMP-18891を接種し、往復振とう培養機上で130rpmの振とう速度で30℃の温度下で24時間振とう培養する。得られた培養液を下記の基本組成の殺菌した発酵培地7mlを含む300ml容三角フラスコに0.7ml宛接種し、さらに別に殺菌したL-メチオニンの培地中の最終濃度が125μg/mlになるように添加し、種培養と同様に振とう培養した。発酵培地の基本組成（培地1Lあたり）は次のとおりであった。フラクトース  30g、(NH4)2SO4  10g、FeSO4・7H2O  0.01g、MnSO4・4H2O  0.007g、MgSO4・7H2O  0.5g、KH２PO4  1.5g、K2HPO4  0.5g、NaCl  0.1g、酵母エキス  1g、ウラシル  0.1g、CaCO3  20g。
ただし、(NH4)2SO4とCaCO3とは他の培地組成とは別に殺菌して加えた。また、培地のpHをアンモニア水で7に調整した後、120℃で10分間オートクレーブ殺菌した。
【００３０】
培養18時間目に殺菌した30%フラクトース溶液を0.7mlづつ各フラスコ添加し、同時に殺菌したL-システイン（25mg/ml溶液）とL-ホモセリン（25mg/ml溶液）とを各々0.7mlづつ添加して培養を続行して合計40時間培養した。
【００３１】
発酵液を集めて450mlとし、-20℃で凍結し、それを解凍後8,000rpm、4℃の条件で遠心分離して得た上澄液の中には、3.7g/lのL-シスタチオニンが含まれていた。この液を内径2.5cm、長さ30cmのH＋ タイプの陽イオン交換樹脂ダイアイオンSK#1Bのカラムに、1時間当たり153mlの速度で通塔して、L-シスタチオニンを吸着させた。
【００３２】
カラムに259mlの水を同様に通塔して水洗後、順次おのおの295mlづつの0.5Ｎ、1N、2N  NH4OHで同様に溶出し、77mlづつのフラクションを集めた。そそれぞれのフラクションを薄層クロマトグラフィーで試験した結果、0.5N  NH4OHで溶出した３番目と4番目のフラクションにL-シスタチオニンが含まれることが分かった。
【００３３】
それぞれのフラクションを集めて減圧下で濃縮し、デシケータの中で乾燥させ、-L-シスタチオニンの粗製品0.9gを得た。これを50％メタノールに溶解後5℃で放置した結果、0.6gのL-シスタチオニンの純製品を得た。そのNMR解析、LC-MS解析、HPLC解析の結果は標準のL-シスタチオニンのそれと一致した。
【００３４】
実施例2として、発酵液中にL-システインおよびその生合成原料としてL-シスチン、チオ硫酸ナトリウム、または硫化ナトリウムを用い、L-ホモセリンおよびその原料としてL-アスパラギン酸ナトリウムおよびフマル酸アンモニウムを用い、それぞれの添加濃度を変えた他は実施例1と同様に実施した結果は表2に示すとおり、これらの物質の添加によってL-シスタチオニンの蓄積量が著しく増加した。
【００３５】
【表２】
2005168422.tif 000003