(57)【要約】【課題】複数の候補DNAから、１回の阻害検証実験で阻害作用を有する可能性の高いDNAを抽出し得る方法を提供すること。【解決手段】下記（１）〜（４）を含む、タンパク質分解酵素に阻害作用を有するDNAの探査方法。（１）タンパク質分解酵素と、このタンパク質分解酵素にアフィニティを有するDNAとこのタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体とを混合して、前記タンパク質分解酵素と前記複合体とを結合させ、得られたタンパク質分解酵素と複合体との結合体を、前記タンパク質分（２）解酵素と前記基質とが反応し得る状態にし、（３）前記結合体を解離する状態にし、かつ（４）前記基質が未分解である複合体を、前記基質が分解した複合体から単離する【選択図】図２
2005168411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分解酵素に阻害作用を有するDNAの探査方法であって、
（１）タンパク質分解酵素と、このタンパク質分解酵素にアフィニティを有するDNAとこのタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体とを混合して、前記タンパク質分解酵素と前記複合体とを結合させ、
得られたタンパク質分解酵素と複合体との結合体を、前記タンパク質分
（２）解酵素と前記基質とが反応し得る状態にし、
（３）前記結合体を解離する状態にし、かつ
（４）前記基質が未分解である複合体を、前記基質が分解した複合体から単離する
ことを含む前記方法。
【請求項２】
前記複合体は、塩基配列が異なる複数のDNAと基質とを連結した複合体の集合体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記DNAは、予め前記タンパク質分解酵素とアフィニティを有することを確認されたものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記DNAは、塩基数が１０〜１０００の範囲である請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記分解酵素と前記基質とが反応し得る状態にした後に結合体が、回収され、回収された結合体を解離する状態にする請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質分解酵素に予めゲルビーズが固定化されており、このゲルビーズを利用して結合体を回収する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複合体には、予めビオチンが固定化されており、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンの相互作用を利用して未分解である複合体を単離する請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、カテプシン、トロンビン、プラスミン、カスパーゼまたはマトリクスメタロプロテナーゼ(MMP)である請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記基質がペプチドまたはタンパク質である請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体は、DNAとタンパク質分解酵素の基質とが、リンカーを介して連結したものである請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体のリンカーは、DNAとタンパク質分解酵素の基質の連結に使用した二価試薬によって生じたものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離した基質が未分解である複合体に含まれるDNAをシーケンスすることをさらに含む請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記DNAのシーケンスが、前記複合体に含まれるDNAの増幅及び／又はクローニングを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質分解酵素にアフィニティを有するDNAとこのタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体のＤＮＡを、前記単離した基質が未分解である複合体に含まれるDNAの塩基配列と同一の塩基配列を有するＤＮＡとした複合体を用いて、請求項１に記載の（１）〜（４）を繰り返す、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質分解酵素に阻害作用を有するDNAの探査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分解酵素に阻害作用を有する阻害剤であるDNAは、従来、（１）タンパク質分解酵素とアフィニティを有するDNAを探査し、探査したDNAの中からタンパク質分解酵素に阻害作用を有するDNAを特定し、（３）特定したDNAをクローン化し、（４）クローン化したDNAをシーケンスし、（５）得られたシーケンスデータに基づいてDNAを作製し、（６）得られたDNAを用いて阻害検証実験を行って、確かに阻害作用を有することを検証することで行われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記方法では、DNAをクローン化した数だけ阻害検証実験をする必要が有り、阻害剤の探索のネックとなっていた。
【０００４】
そこで本発明の目的は、複数の候補DNAから、１回の阻害検証実験で阻害作用を有する可能性の高いDNAを抽出し得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
［請求項１］タンパク質分解酵素に阻害作用を有するDNAの探査方法であって、
（１）タンパク質分解酵素と、このタンパク質分解酵素にアフィニティを有するDNAとこのタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体とを混合して、前記タンパク質分解酵素と前記複合体とを結合させ、
得られたタンパク質分解酵素と複合体との結合体を、前記タンパク質分
（２）解酵素と前記基質とが反応し得る状態にし、
（３）前記結合体を解離する状態にし、かつ
（４）前記基質が未分解である複合体を、前記基質が分解した複合体から単離する
ことを含む前記方法。
［請求項２］前記複合体は、塩基配列が異なる複数のDNAと基質とを連結した複合体の集合体である請求項１に記載の方法。
［請求項３］前記DNAは、予め前記タンパク質分解酵素とアフィニティを有することを確認されたものである請求項１または２に記載の方法。
［請求項４］前記DNAは、塩基数が１０〜１０００の範囲である請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
［請求項５］前記分解酵素と前記基質とが反応し得る状態にした後に結合体が、回収され、回収された結合体を解離する状態にする請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
［請求項６］前記タンパク質分解酵素に予めゲルビーズが固定化されており、このゲルビーズを利用して結合体を回収する請求項５に記載の方法。
［請求項７］前記複合体には、予めビオチンが固定化されており、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンの相互作用を利用して未分解である複合体を単離する請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
［請求項８］前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、カテプシン、トロンビン、プラスミン、カスパーゼまたはマトリクスメタロプロテナーゼ(MMP)である請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
［請求項９］前記基質がペプチドまたはタンパク質である請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
［請求項１０］前記複合体は、DNAとタンパク質分解酵素の基質とが、リンカーを介して連結したものである請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
［請求項１１］前記複合体のリンカーは、DNAとタンパク質分解酵素の基質の連結に使用した二価試薬によって生じたものである請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］前記単離した基質が未分解である複合体に含まれるDNAをシーケンスすることをさらに含む請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
［請求項１３］前記DNAのシーケンスが、前記複合体に含まれるDNAの増幅及び／又はクローニングを含む請求項１２に記載の方法。
［請求項１４］前記タンパク質分解酵素にアフィニティを有するDNAとこのタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体のＤＮＡを、前記単離した基質が未分解である複合体に含まれるDNAの塩基配列と同一の塩基配列を有するＤＮＡとした複合体を用いて、請求項１に記載の（１）〜（４）を繰り返す、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、タンパク質分解酵素にアフィニティを有するＤＮＡライブラリ中の各ＤＮＡ鎖の末端に、適当な長さと性状を兼ね備えたリンカーを介して、当該タンパク質分解酵素のペプチド基質を連結した複合体を調製し、これを当該タンパク質分解酵素に結合および反応させる。反応物から未分解の複合体を回収し、例えば、そのＤＮＡ部分をＰＣＲで増幅することで、より阻害活性の高いＤＮＡライブラリを得ることができる。このサイクルを繰り返すことで、さらに高い阻害活性を有するＤＮＡライブラリを淘汰していくことができる。
【０００７】
本発明は、タンパク質分解酵素に阻害作用を有するDNAの探査方法である。本発明において、対象となるタンパク質分解酵素は、特に限定されないが、例えば、トリプシン、カテプシン、トロンビン、プラスミン、カスパーゼまたはマトリクスメタロプロテナーゼ(MMP) 等を挙げることができる。
【０００８】
ステップ（１）
本発明の方法では、まず、タンパク質分解酵素と、このタンパク質分解酵素にアフィニティを有するDNAとこのタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体とを混合して、前記タンパク質分解酵素と前記複合体とを結合させる。
【０００９】
上記タンパク質分解酵素と結合させる複合体は、タンパク質分解酵素にアフィニティを有するDNAを含む。このDNAは、予めタンパク質分解酵素とアフィニティを有することが確認されたものである。
【００１０】
さらに、上記複合体は、塩基配列が異なる複数のDNAと基質とを連結した複合体の集合体（ライブラリ）であることが好ましい。即ち、上記複合体は、タンパク質分解酵素とアフィニティを有することが確認された、塩基配列が異なる複数のDNAと基質とを連結した複合体の集合体であることが好ましい。塩基配列が異なるDNAの種類は、タンパク質分解酵素とのアフィニティ試験の結果、抽出されたDNAの数に応じて適宜設定できる。より具体的には、上記複合体は、例えば、タンパク質分解酵素とアフィニティを有することが確認された、塩基配列が異なる２〜１０００の範囲のDNAと基質とを連結した複合体の集合体であることが好ましい。但し、この範囲に限定される意図ではない。
【００１１】
前記複合体を構成するDNAは、塩基数は制限されないが、例えば、
実質的にタンパク質との結合に必要とされる長さ、実質的に有効な一本鎖領域の長さ、一本鎖化に必要なアビジンビーズへの結合効率という観点からは、１０〜１０００の範囲であることが適当である。但し、この範囲未満又はこの範囲を超えることを妨げるものではない。
【００１２】
前記複合体を構成するDNAは、例えば、特開平２００２−３１５５７７号に記載の核酸ライブラリの作製方法を利用して作製することができる。
【００１３】
タンパク質分解酵素とアフィニティを有することが確認されたDNAは、例えば、公知の以下のような方法で得ることができる。
【００１４】
（ライブラリの調製）
一端に不変配列領域、3'末端に可変配列領域を含むＤＮＡからなるＤＮＡ群(A群)および一端にA群の不変領域と相補的配列を有し、5'末端に可変配列を含むＤＮＡ群(B群)をハイブリダイズし、互いの可変配列領域をT4RNAリガーゼで連結する。連結したＤＮＡをＰＣＲで増幅後、これを材料として、連結された可変領域と互いに相補的配列を含む不変配列領域を有する２つの一本鎖ＤＮＡ群を調製する。これらの操作を基本サイクルとするＤＮＡブロックシャフリング法により、ＤＮＡライブラリを調製する。
【００１５】
使用したＤＮＡ配列の例を以下に示す。
(A群不変配列)5'GGCTCGCGAATACTGCGAAGACCACCATG (配列番号1)
(B群不変配列)5'GATCTCACTCCTTCGCAGTATTCGCGAGCC (配列番号2)
(可変配列)5'GGC, 5'ATT, 5'GAC, 5'AAA, 5'TCC, 5'TGCまたは5'CCA
【００１６】
基本サイクルを４サイクル回すことで可変配列領域の長さは４８塩基長のＤＮＡライブラリが得られる。
ここに示した方法は、以下の文献に記載の方法である。
Koichiro Kitamura et al., 843-853, Protein Engineering, Vol.15, No.10
【００１７】
（アフィニティによる淘汰）
前記ＤＮＡライブラリを一方がビオチン標識したプライマーで増幅し、ビオチン標識されていない側の不変配列領域を制限酵素で切断後、ビオチン・アビジン相互作用を利用してビオチン標識を含まない一本鎖ＤＮＡを回収する。このＤＮＡに、不変配列領域と相補的な配列を含むビオチン標識ＤＮＡオリゴマーをハイブリダイズし、可変領域のみを一本鎖ＤＮＡとした後、ゲルビーズに固定化した酵素に作用させる。この結合物を洗浄液(例えば、50mMトリス-HCl(pH7.2),0.5M NaCl)で洗浄後、溶出液(例えば、50mMトリス-HCl(pH7.2),１M NaCl, 10mM MgCl2)で溶出する。溶出物はビオチン・アビジン相互作用を利用してハイブリダイズしたビオチン標識ＤＮＡオリゴマーを除去後、回収された一本鎖ＤＮＡライブラリに別のＤＮＡオリゴマーをT4RNAリガーゼにより連結し、これを手がかりにＰＣＲで可変配列領域を増幅する。この基本サイクルを洗浄液および溶出液のストリンジェンシーを上げながら反復し、酵素にアフィニティを有するＤＮＡをセレクションする。
【００１８】
さらに、この複合体は、DNAとタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体である。タンパク質分解酵素の基質は、対象となるタンパク質分解酵素に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチドまたはタンパク質であることができる。
【００１９】
DNAと基質との連結は、公知の方法を用いて適宜行うことができる。
公知の方法は、例えば、以下の文献に記載の方法である。
(1) N. D. Shinha et al., 2659-2669, Nucleic Acids Research, 1988, Vol.16, No.6, 
(2) Jerzy Olejnik et al., 4626-4631, Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No.23,
(3) Joseph G. Harrison et al., 3136-3145, Nucleic Acids Research, 1998, Vol.26, No.13,
(4) Nicholas J Ede et al., 373-378, Bioconjugate Chem. 1994, Vol.5
【００２０】
前記複合体は、DNAとタンパク質分解酵素の基質とが、リンカーを介して連結したものであることができる。リンカーとして使用しうる二価試薬としては、例えば、以下に挙げるものを例示できる。
ジスクシンイミジル  スベラート（Disuccinimidyl suberate(DSS)）
N-[ε-マレイミドカプロイロキシ] スクシンイミドエステル（N-[ε-Maleimidocaproyloxy]succinimide ester(EMCS)）
N-[ε-マレイミドカプロイロキシ] スルフォスクシンイミドエステル（N-[ε-Maleimidocaproyloxy]sulfosuccinimide ester(Sulfo-EMCS)）
N-[γ-マレイミドブチリルオキシ] スクシンイミドエステル（N-[γ-Maleimidobutyryloxy]succinimide ester(GMBS)）
N-[γ-マレイミドブチリルオキシ] スルフォスクシンイミドエステル（N-[γ-Maleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester(Sulfo-GMBS)）
N-[κ-マレイミドウンデカノイルオキシ] スルフォスクシンイミドエステル（N-[κ-Maleimidoundecanoyloxy]-sulfosuccinimide ester(Sulfo-KMUS) ）
【００２１】
図１に、DNAとタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体の概念図を示す。図中、ＤＮＡは、両末端のＰＣＲプライマーの配列に相当する不変配列領域に隣接して中央にライブラリに相当する可変配列領域を含む構造の一本鎖ＤＮＡを示している。このDNAとタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体は、例えば5'末端にチオール基等の官能基を標識したＰＣＲプライマーに由来するＤＮＡの官能基と、基質ペプチドの末端官能基、または、例えばリシン等のアミノ酸側鎖の官能基を、例えば、該当する官能基選択的二価試薬を介して結合させることにより合成することができる。ペプチド基質は、基質切断部位に対してＤＮＡ結合部位と異なる側にセレクション用のビオチン標識を含んでいることを示している。
【００２２】
ステップ（２）
次いで、得られたタンパク質分解酵素と複合体との結合体を、前記タンパク質分解酵素と前記基質とが反応し得る状態にする。より具体的には、例えば、以下の通りである。
複合体とゲルビーズ固定化カテプシンEを（2:1）のモル比で混合した後、反応用バッファー中、４０℃で10分間インキュベーションする。（反応用バッファー組成： 50mM 酢酸ナトリウム、5mM MgCl2、0.1M  NaCl）10分後、5％トリクロロ酢酸を投入して反応を止める。
【００２３】
上記タンパク質分解酵素と基質とが反応し得る状態にして得られた結合体を分離することが、好ましい。この分離は、タンパク質分解酵素に、予め、例えば、ゲルビーズを固定化しておき、このゲルビーズを利用して、タンパク質分解酵素を回収することで、結合体を分離することができる。
【００２４】
ステップ（３）
前記反応し得る状態にし、回収した結合体を、次いで解離する状態にする。結合体が解離する状態とは、例えば、反応後の溶液に等量のストレプトアビジン磁気ビーズを投入し、攪拌しながら室温で１時間インキュベーションする操作がある。ストレプトアビジン磁気ビーズ懸濁液の組成は、２M NaClと高イオン強度であることから結合体は解離しやすい条件となるが、場合によっては加熱操作で補足することができる。
【００２５】
上記解離の操作により、複合体の基質部分が未分解であるタンパク質分解酵素と複合体との結合体、及び複合体の基質部分が分解されたタンパク質分解酵素と複合体との結合体は、ともに解離して、タンパク質分解酵素、未分解の複合体及び分解された複合体（DNA及び基質の一部と基質の他方の一部）とに分かれる。
【００２６】
ステップ（４）
次いで、前記基質部分が未分解である複合体を、分解した複合体から単離する。
【００２７】
複合体を構成するDNAは、前述のようにタンパク質分解酵素とアフィニティがあることを予め確認されたものである。しかし、タンパク質分解酵素のどの部位とアフィニティを有するかはその時点では不明である。タンパク質分解酵素とアフィニティがあるDNAの内、タンパク質分解酵素の反応サイトまたはその近傍にアフィニティを有し、その結果、タンパク質分解酵素の酵素反応を阻害する物質では、複合体を構成する基質はタンパク質分解酵素によって分解されない可能性が高い。それに対して、タンパク質分解酵素の反応サイトまたはその近傍以外の部位にアフィニティを有するDNAを構成成分として有する複合体の場合、DNAによってはタンパク質分解酵素の酵素反応は阻害されず、複合体を構成する基質はタンパク質分解酵素によって分解される可能性が高い。
【００２８】
そこで、複合体が未分解である場合、複合体を構成するDNAは、タンパク質分解酵素の反応サイトまたはその近傍にアフィニティを有する可能性が高いと考えられ、本発明では、基質部分が未分解である複合体を単離する。
【００２９】
尚、前述の複合体を構成するリンカーの長さは、例えば、タンパク質分解酵素の反応サイトまたはその近傍以外の部位にアフィニティを有するDNAを構成成分として有する複合体の場合、複合体を構成する基質が、タンパク質分解酵素によって分解される可能性が高くなるように、決定することが好ましい。そうすることで、複合体が未分解である場合に、複合体を構成するDNAが、タンパク質分解酵素の反応サイトまたはその近傍にアフィニティを有する可能性が高くなる。
【００３０】
より具体的な単離方法としては、例えば、複合体に、予め、例えば、ビオチンを固定化しておく。特に、ビオチンは複合体の基質の末端（DNAと反対側の）に固定化しておく。そうすることで、未分解である複合体とタンパク質分解酵素との結合体は、ビオチンを有するので、アビジンまたはストレプトアビジンと結合するものとして単離ですることができる。一方、タンパク質分解酵素で基質が分解された結合体は、ビオチンは、基質の一部とともに複合体から分離しているので、これらとの結合性は有さない。
【００３１】
このようにして、基質部分が未分解である複合体を単離する。
単離された複合体は、DNA部分をシーケンスすることで、タンパク質分解酵素の反応サイトまたはその近傍にアフィニティを有し、かつタンパク質分解酵素の酵素反応を阻害する可能性の高い物質（DNA）を特定することができる。より具体的には、複合体に含まれるDNAを増幅し、ついでDNAの塩基配列を決定する。DNAの増幅及びDNAの塩基配列の決定は、常法により行うことができる。
【００３２】
本発明の方法では、タンパク質分解酵素にアフィニティを有するDNAとこのタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体のＤＮＡを、前記のようにして単離した基質が未分解である複合体に含まれるDNAの塩基配列と同一の塩基配列を有するＤＮＡとした複合体を用いて、再度、上記ステップ（１）〜（４）を繰り返すことができる。
このように、上記（１）〜（４）のサイクルを繰り返すことにより、アフィニティによる淘汰が進み、さらなる阻害活性の向上が期待される。
【００３３】
図２の説明図により、本発明の方法の一態様についてより具体的に説明する。
（１）5'末端チオール標識一本鎖ＤＮＡライブラリは、5'チオール標識プライマーおよび5'ビオチン標識プライマーを用いたＰＣＲ産物からビオチン・アビジン相互作用を利用して調製する。
（２）5'末端チオール標識一本鎖ＤＮＡライブラリを、例えばEMCS等の二価試薬と反応する。
（３）EMCS付加ＤＮＡライブラリを精製後、C末端にリシン、および、N末端にビオチンを有し、かつ、中央部分にタンパク質分解酵素の基質配列を有するペプチドと反応することにより、ＤＮＡ-ペプチド基質複合体を生成する。
（４）ＤＮＡ-ペプチド基質複合体がゲルビーズ上に固定化したタンパク質分解酵素と結合し、ペプチド基質が分解される条件でインキュベートする。
（５）ビーズを洗浄して、未結合のＤＮＡ-ペプチド基質複合体を除去後、結合したＤＮＡ-ペプチド基質複合体を回収する(切断を受けたものと未反応のものを含む)。
（６）回収したＤＮＡ-ペプチド基質複合体からビオチン・アビジンの相互作用を利用して、未切断のＤＮＡ-ペプチド基質複合体を回収する。
（７）回収した未切断のＤＮＡ-ペプチド基質複合体をテンプレートとし、5'チオール標識プライマーおよび5'ビオチン標識プライマーを用いたＰＣＲを行う。
（８）ステップ１から７までの操作を反復することにより、タンパク質分解酵素の阻害活性を有するＤＮＡ群を淘汰する。選択されたＤＮＡ群については、常法に従いクローニング後、活性検定および配列決定を行う。
【実施例】
【００３４】
カテプシンEにアフィニティを有するＤＮＡライブラリのスクリーニング
カテプシンEにアフィニティを有するＤＮＡライブラリのスクリーニングを以下のプロトコルに従って実施した。
【００３５】
1)PCR 増幅
未淘汰のＤＮＡライブラリをテンプレートとして以下に示す方法でＰＣＲ増幅する。
Taq ポリメラーゼ (Greiner, Tokyo, Japan)                             1U
10 × バッファ                                                       5μl
[670ｍM Tris-HCl, 166ｍM (NH4)2SO4, 4.5% TritonX100, 2mg/m  l gelatin]
MgCl2 (25ｍM)                                                        5μl
ｄNTP (2.5ｍM)                                                       4μl
テンプレート                  ＤＮＡライブラリ (1fmole以上)
プライマー                b-3' stem primer (100pmol/μl)             0.5μl
5' part primer (100pmol/μl)               0.5μl
H2O                                                             up to 50μl
*必要に応じてスケールアップすることができる。
プログラム
90℃ 2min
90℃ 30sec
45℃ 1min
72℃ 30sec
90℃ 30sec、45℃ 1min及び72℃ 30secを30サイクル行い、得られた増幅物は電気泳動法で確認し、エタノール沈殿で精製する。
【００３６】
2)制限酵素処理 (Mbo II)
反応混合物:
Mbo II (Takara)                                                      8U
10 × L Buffer                                                       5μl
[100mM Tris-HCl (pH7.5), 100mM MgCl2, 10mM ジチオスレイトール]
DNA                                                                  ~50pmol
H2O                                                             up to 50μl
37℃ で 1時間インキュベートする。
【００３７】
3)一本鎖DNA の調製
a. ＤＮＡのストレプトアビジン磁気ビーズへの結合
制限酵素消化物                                                       50μl
ストレプトアビジン磁気ビーズ                                         50μl
[Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal, Oslo, Norway)]
懸濁物を30分間振とうする。
磁石でビーズをチューブ底に固定し、上清を捨てる。
b. 0.01% BSA水溶液による洗浄
100μlの0.01% BSAを添加し、良く混合する。
磁石でビーズをチューブ底に固定し、上清を捨てる。
この操作を２回繰り返す。
c. 二本鎖DNAの変性および非ビオチン標識一本鎖ＤＮＡの回収
室温で２分間50μlの25% (w/v) アンモニア水で処理し、磁石でビーズをチューブ底に固定した後、上清を回収する。(非ビオチン標識一本鎖ＤＮＡは上清中に存在する)
この操作を２回繰り返す。
回収液を乾燥する。
【００３８】
4)プライマーb-3' stemのハイブリダイゼーション
回収した ssDNAを 95μl のセレクションバッファ(以下参照)に溶解する。 5μl のb-3' stem プライマー溶液 (10pmol/μl)を添加する。
94℃ (5 分) および 60℃ (15分)の加熱処理でＤＮＡをハイブリダイズする。
【００３９】
5)  DNA アプタマーの試験管内スクリーニング
材料:
1.セレクションバッファ: 
50 mM 酢酸ナトリウム (pH 4.5)
100 mM NaCl
5 mM MgCl2
2.洗浄バッファ 1: 
50 mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)
0.5 M NaCl
3.洗浄バッファ2:
50 mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)
1 M NaCl
4.溶出バッファ1:
50 mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)
1 M NaCl
10 mM MgCl2
5.溶出バッファ2:
50 mM酢酸ナトリウム(pH 4.5)
2 M NaCl
10 mM MgCl2 
【００４０】
操作:
ステップ 1. セレクションバッファ中のDNAを固定化酵素と20-30分間反応させる。
DNA:        100 μl (セレクションバッファ)
酵素: 5 μl (固定化操作および活性検定により調製したもの)
DNA : 酵素モル比 = 4 : 1
【００４１】
ステップ2. セレクションバッファによる洗浄
上記反応液に 200 μlのセレクションバッファを添加し、チューブを数回穏やかにタッピングする。卓上遠心機で３０秒間遠心した後、上清を静かにピペットで吸い出し捨てる。
以下の表１に記したようにこの操作を繰り返す。
【００４２】
ステップ3. 洗浄バッファ1による洗浄
ステップ２の洗浄および遠心第５ラウンドの後、200 μlの洗浄バッファ1を添加し、チューブを数回穏やかにタッピングする。卓上遠心機で３０秒間遠心した後、上清を静かにピペットで吸い出し捨てる。
以下の表１に記したようにこの操作を繰り返す。
【００４３】
ステップ4. 洗浄バッファ２による洗浄
このステップには二種類の操作が含まれる: 
A) 200 μlの洗浄バッファ 2 を添加し、チューブを数回穏やかにタッピングする。時々タッピングしながら室温で５分間反応させる。卓上遠心機で３０秒間遠心した後、上清を静かにピペットで吸い出し捨てる。
以下の表１に記したようにこの操作を繰り返す。
B) 200 μl の洗浄バッファ 2 を添加し、チューブを数回穏やかにタッピングする。15000rpmで1分間遠心した後、上清を静かにピペットで吸い出し捨てる。
以下の表１に記したようにこの操作を繰り返す。
【００４４】
ステップ5. 溶出バッファ 1による溶出
最初に 37℃の恒温槽を準備する。100 μl の溶出バッファ 1を添加して、チューブを数回穏やかにタッピングする。チューブを恒温槽に１０分間浸す。2-5分間間隔で穏やかにタッピングし、再び恒温槽に戻す。卓上遠心機で３０秒間遠心した後、上清を静かにピペットで吸い出し、きれいなチューブに回収する。
この操作を２回繰り返す。
【００４５】
ステップ 6. 溶出バッファ２による溶出
最初に ９５℃の恒温槽を準備する。100 μl の溶出バッファ２を添加して、チューブを数回穏やかにタッピングする。チューブを恒温槽に５分間浸す。2分間間隔で穏やかにタッピングし、再び恒温槽に戻す。卓上遠心機で３０秒間遠心した後、上清を静かにピペットで吸い出し、きれいなチューブに回収する。
この操作を２回繰り返す。
回収した上清からエタノール沈殿でＤＮＡを精製する。
注意:塩濃度が高い場合は、70%エタノールで２、３回ペレットを洗浄する。
【００４６】
6)一本鎖DNA の調製 ( (3)と同様)
a. ＤＮＡのストレプトアビジン磁気ビーズへの結合
回収ＤＮＡに対し、以下のものを添加する。
水                                                                   10μl
ストレプトアビジン磁気ビーズ                                         10μl
[Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal, Oslo, Norway)]
懸濁物を30分間振とうする。
磁石でビーズをチューブ底に固定し、上清を捨てる。
b. 0.01% BSA水溶液による洗浄
100μl の 0.01% BSAを添加し、良く混合する。
磁石でビーズをチューブ底に固定し、上清を捨てる。
この操作を２回繰り返す。
c. 二本鎖DNAの変性および非ビオチン標識一本鎖ＤＮＡの回収
室温で２分間50 μlの25% (w/v) アンモニア水で処理し、磁石でビーズをチューブ底に固定した後、上清を回収する。(非ビオチン標識一本鎖ＤＮＡは上清中に存在する)
この操作を２回繰り返す。
回収液を乾燥する。
【００４７】
7)ハイブリダイゼーション
回収した 一本鎖DNAを ２μl の水に溶解する。 1μl のプライマーb-5'stem溶液 (1pmol/μl)および5μl の 2×TRL バッファ[100mM Tris-HCl (pH 8.0), 20mM MgCl2, 20mg/l BSA, 2mM ヘキサアミンコバルトクロライド (III) 、 50% ポリエチレングリコール 6000]を添加する。
94℃ (5 分) および 60℃ (15分)の加熱処理でＤＮＡをハイブリダイゼーションする。
【００４８】
8)Y-ライゲーション反応
1μl の1mM ATP および 2μl (50U)の T4 RNAリガーゼ (Takara)を添加し、25℃で一晩 (12時間)反応する。
ステップ１から８までの操作を反復する。
【００４９】
【表１】
2005168411.tif 000003
【００５０】
ペプチド・DNA複合体の調製
以下のプロトコルに従って、ペプチド・DNA複合体を調製した。
(1) 上記で作製したDNAライブラリを5'ビオチン標識プライマー(b-3h-Stem  : GGCTCGCGAATACTGCGAAGGAGTGAGATC)(配列番号3)と5'チオール標識プライマー(SH-5sPartT7 : CTGCGAAGACCACCATG) (配列番号4)を用いてPCR法にて増幅する(各50pmole, 50μLのPCR2本)。
(2)100μLのストレプトアビジン磁気ビーズ懸濁液(2×B&W)を添加し、1時間振とうする。
(3)ビーズを25μLのアンモニア水(2分間)で2回抽出してチオール基標識鎖を回収後、乾燥する。
(4)二価試薬EMCS(N-[ε-マレイミドカプロイルオキシ]スクシンイミドエステル、1mg/mL-アセトニトリル)溶液を10μl添加し、37℃で1時間攪拌する。
(5)アセトニトリルをエバポレートした後、20μLの0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、ゲル濾過脱塩カラム(NAP5、Pharmacia)で脱塩する。
(6)回収した1mLの修飾DNA水溶液を乾燥後、1μLの1M重炭酸ナトリウム溶液、2μLの水及び6μLのペプチド水溶液(2mg/mL)(N末端ビオチン標識Pro Pro Thr Ile Phe Phe Arg Leu Lys)を添加し、37℃で一晩放置する。
(7)反応溶液をNAP5カラムで脱塩して、回収液を乾燥する。
(8)100μLの0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、100μLのストレプトアビジン磁気ビーズ懸濁液(2×B&W)を添加し、1時間振とうする。
(9)ビーズを25μLのアンモニア水(2分間)で2回洗浄後、25μLのアンモニア水(65℃、15分間)で2回抽出して、ペプチド結合DNAを回収する。
【００５１】
淘汰試験方法
以下の方法に従って、淘汰試験を行った。
(1)ペプチド基質・ＤＮＡ複合体とゲルビーズ固定化カテプシンEを（2:1）のモル比で混合した後、反応用バッファー中、４０℃で10分間インキュベーションする。（反応用バッファー組成： 50mM 酢酸ナトリウム(pH4.5)、5mM MgCl2、0.1M  NaCl）
(2)10分後、5％トリクロロ酢酸を投入して反応を止める。
(3)反応後の溶液に等量のストレプトアビジン磁気ビーズ懸濁液を投入し、攪拌しながら室温で１時間インキュベーションする。
(4)磁気ビーズを磁石で固定し、上清を廃棄する。残った磁気ビーズを0.01%BSA 200μlで２回洗浄する。
(5)磁気ビーズに25％アンモニア水25μlを投入し、60℃で15分インキュベーションする。その後、上清を回収する。この操作を２回行う。
(6)凍結乾燥機でアンモニア水を蒸発させた後、10μlの水で溶解したものをテンプレートとしてPCRを行う（94℃  30秒、50℃  1分及び72℃  30秒を３０サイクル行う）。
PCR条件
94℃  2分
94℃  30秒
50℃  1分
72℃  30秒
72℃  5分
(7)PCR産物を元に次サイクル用のSFリンクを作製し、淘汰サイクルを回していく。
【００５２】
カテプシンE阻害活性検定法
（１）セレクションバッファー（50mM酢酸ナトリウム(pH4.5), 5mM MgCl2, 0.1M NaCl）86μlとカテプシンE溶液（3.36mM）3μlを混ぜたものを室温で5分間インキュベーション。
（２）この溶液にライブラリのPCR産物を一本鎖化したもの（非ビオチン鎖側、10pmol/μl）を1μl加え、室温で15分間インキュベーション。（ブランクとして水１μlを加えたものも同時に作製）
（３）この溶液にカテプシンE基質（(株)ペプチド研 Code:3200-V）10μlを加え、40℃で10分間反応。
（４）10分後、すぐに氷中に移し、5％トリクロロ酢酸 1mlを加え反応を止める。
（５）この溶液を分光蛍光光度計で測定する（328nm Excitation, 396nm Emission）。カテプシンEの活性が高いもの程396nmのピークが高くなるので、ブランクとの値を比較することによってライブラリの阻害活性が求まる。
【００５３】
上記の方法に従い、カテプシンEに対するアフィニティで淘汰したＤＮＡライブラリおよび、本方法を用いてカテプシンEに対する阻害活性で淘汰したＤＮＡライブラリについて、カテプシンE阻害活性を検定した結果を図３に示す。
Af-Round3 : アフィニティによる淘汰後のＤＮＡライブラリ
SF-Round1: 本方法での阻害活性による淘汰後のＤＮＡライブラリ
その結果、アフィニティで淘汰したＤＮＡライブラリに対し、本方法を１サイクル施して得られたＤＮＡライブラリに阻害活性の向上が認められた。さらに、同様のサイクルを繰り返すことにより、さらなる阻害活性の向上が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】DNAとタンパク質分解酵素の基質とを連結した複合体の概念図。
【図２】本発明の一態様の説明図。
【図３】カテプシンE阻害活性の検定結果。図中、Af-Round3 は、アフィニティによる淘汰後のＤＮＡライブラリであり、SF-Round1は、本発明の方法での阻害活性による淘汰後のＤＮＡライブラリ
【図１】
2005168411.tif 000004
【図２】
2005168411.tif 000005
【図３】
2005168411.tif 000006
【配列表】
2005168411000001.app