(57)【要約】【課題】  色素上皮由来因子の新規な医療上用途を提供する。【解決手段】  活性成分として色素上皮由来因子またはその変異体を含有する、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物は血管障害をはじめとした種々の疾患の治療および予防に有用であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 色素上皮由来因子； 
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および
c) 該因子(a)または該変異体(b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群から選択される活性成分を含有する、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
NADPHオキシダーゼ仲介活性酸素種の生成を抑制する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、NF-κB活性化、IL-6発現、TNF-α活性、アンジオテンシンII活性、および／または終末糖化産物情報伝達を阻害する、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
NADPHオキシダーゼに起因する疾患を予防または治療するための、請求項１から３までのいずれか記載の医薬組成物。
【請求項５】
NADPHオキシダーゼに起因する疾患が、血管障害、NF-κB活性化−関連疾患、IL-6発現−関連疾患、TNF-α活性−関連疾患、アンジオテンシンII活性−関連疾患、および終末糖化産物情報伝達−関連疾患より成る群から選択される、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
血管障害が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
NF-κB活性化−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
IL-6発現−関連疾患が、冠動脈イベント、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫より成る群から選択される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項９】
TNF-α活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項１０】
アンジオテンシンII活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項１１】
NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症を治療するための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
終末糖化産物情報伝達−関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項１３】
a) 色素上皮由来因子；または
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体
をコードする核酸を含む、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するためのベクター。
【請求項１４】
NADPHオキシダーゼ仲介活性酸素種生成を抑制する、請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、NF-κB活性化、IL-6発現、TNF-α活性アンジオテンシンII活性および／または終末糖化産物情報伝達を阻害する、請求項１２または１４記載のベクター。
【請求項１６】
血管障害、NF-κB活性化−関連疾患、IL-6発現−関連疾患、TNF-α活性−関連疾患、アンジオテンシンII活性−関連疾患、および終末糖化産物情報伝達−関連疾患を予防または治療するための、請求項１３から１５までのいずれか記載のベクター。
【請求項１７】
NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症を治療するための請求項１３記載のベクター。
【請求項１８】
終末糖化産物情報伝達−関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症である請求項１６記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管障害を予防または治療するための医薬組成物またはベクターに関し、特に、色素上皮由来因子(PEDF)またはその変異体を活性成分として含有する医薬組成物およびPEDFまたはその変異体をコードする核酸を含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
色素上皮由来因子(PEDF)はセリンプロテアーゼインヒビターのスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、当初、ヒト網膜芽細胞腫細胞において強力な神経分化活性を有する因子としてヒト網膜色素上皮細胞の培養上清から精製された(非特許文献1)。最近、PEDFが細胞培養および動物モデルにおいて血管形成を非常に効果的に阻害することが示されている。PEDFは、網膜上皮細胞の成長および移動を阻害し、虚血誘発網膜新血管形成を抑制した(非特許文献2, 3)。
【０００３】
網膜は眼球に栄養や酸素を供給するための細小血管がネットワークを構成しているが、糖尿病などで高血糖状態が長く続くとこれらの血管が障害され、透過性の亢進を生じる。この病態がさらに進行し虚血領域が拡大していくと、新生血管を伴う増殖性糖尿病網膜症に至る。PEDFは硝子体に存在しており、そのレベルは眼血管形成疾患において減少していることから、眼に存在するPEDFは増殖性糖尿病網膜症の発症において機能的に重要であることが示唆される(非特許文献4)。しかしながら、PEDFがどのように上皮細胞(EC)の成長および機能を調節するのかは完全には理解されていない。
アテローム性動脈硬化症も同様にECに関連する炎症性繊維増殖疾患であり(非特許文献5)、その病因は、ECにおいて血栓性および炎症性反応を誘導するTNF-αおよびIL-1のような古典的炎症誘発性サイトカインであると考えられる(非特許文献6, 7)。ECはこれらサイトカインに暴露されると、IL-6産生、接着分子の発現および凝血促進活性の誘導を含む、決定的な機能的変化を起こす(非特許文献8-10)。これらサイトカインのシグナル伝達および遺伝子発現は、ECにおける活性酸素種(ROS)の生成に大きく依存している(非特許文献11, 12)。ROSは、網膜症およびアテローム性動脈硬化症において主要な役割を果たす酸化的ストレスを引き起こす。
血管細胞におけるROSは主として、NADPHオキシダーゼにより産生され(非特許文献31)、NADPHオキシダーゼは、細胞の成長、接着分子やサイトカインの遺伝子発現を含む、細胞の病態生理学的応答において不可欠であることが知られている(非特許文献31)。実際、NADPHオキシダーゼは終末糖化産物（AGE）（糖尿病において形成が加速される老齢巨大タンパク質誘導体）によって活性化され、それにより酸化的ストレスとECにおける遺伝子発現の変化とが関連付けられ、糖尿病性ミクロおよびマクロ血管障害が発症すると考えられている(非特許文献32)。
【０００４】
【非特許文献１】Tombran-Tink J, Chader CG, Johnson LV. PEDF: Pigment epithelium-derived factor with potent neuronal differentiative activity. Exp Eye Res 1991;53:411-414.
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【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは最近、PEDFがROS生成を抑制することによってAGE誘発周皮細胞アポトーシスおよび微小血管上皮細胞傷害を有意に阻害することを示した(非特許文献15, 33)。
そこで、本発明者らは、PEDFが、NADPHオキシダーゼ仲介細胞内シグナル経路を遮断することによって、糖尿病性血管合併症を含む様々なタイプの血管障害の進行を予防し得ると考えた。本発明者らのPEDFについての研究により、PEDFは実際にはNADPHオキシダーゼ活性を抑制すること、特に、ヒト臍帯静脈内皮細胞(以下、HUVECと表記する)においてPEDFがRac活性化を抑制することによりTNF-α誘発性NADPHオキシダーゼ活性を阻害し、その結果NF-κB活性化、IL-6発現、アンジオテンシンII活性および／または終末糖化産物(AGE)情報伝達を阻害することが明らかとなり、それによって本発明を完成させた。
【０００６】
即ち本発明は、以下の発明を提供する：
（１）  a) 色素上皮由来因子； 
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および
c) 該因子(a)または該変異体(b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群から選択される活性成分を含有する、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物；  NADPHオキシダーゼ仲介活性酸素種の生成を抑制する該医薬組成物；  NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、NF-κB活性化、IL-6発現、TNF-α活性、アンジオテンシンII活性、および／または終末糖化産物情報伝達を阻害する、該医薬組成物；
具体的には、
NADPHオキシダーゼに起因する疾患を予防または治療するための、本発明の医薬組成物；より具体的には、NADPHオキシダーゼに起因する疾患が、血管障害、NF-κB活性化−関連疾患、IL-6発現−関連疾患、TNF-α活性−関連疾患、アンジオテンシンII活性−関連疾患、および終末糖化産物情報伝達−関連疾患より成る群から選択される、該医薬組成物；
さらに具体的には、
血管障害が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物；  NF-κB活性化−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物；  IL-6発現−関連疾患が、冠動脈イベント、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫より成る群から選択される、本発明の医薬組成物；  TNF-α活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物；  アンジオテンシンII活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物；  NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症を治療するための本発明の医薬組成物；  終末糖化産物情報伝達−関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症である、本発明の医薬組成物；
（２）  a) 色素上皮由来因子；または
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体
をコードする核酸を含む、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するためのベクター；  NADPHオキシダーゼ仲介活性酸素種生成を抑制するベクター；  NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、NF-κB活性化、IL-6発現、TNF-α活性アンジオテンシンII活性および／または終末糖化産物情報伝達を阻害するベクター；
具体的には、
NADPHオキシダーゼに起因する疾患を予防または治療するための、本発明のベクター；より具体的には、NADPHオキシダーゼに起因する疾患が、血管障害、NF-κB活性化−関連疾患、IL-6発現−関連疾患、TNF-α活性−関連疾患、アンジオテンシンII活性−関連疾患、および終末糖化産物情報伝達−関連疾患より成る群から選択される、該ベクター；
さらに具体的には、
血管障害が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター；  NF-κB活性化−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター；  IL-6発現−関連疾患が、冠動脈イベント、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫より成る群から選択される、本発明のベクター；  TNF-α活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター；  アンジオテンシンII活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター；  NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症を治療するための本発明のベクター；  終末糖化産物情報伝達−関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症である、本発明のベクター；に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
(1) NADPHオキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物
本発明者らは、後述する実施例に示す２つの異なる方法（図２）によって、PEDFがTNF-α誘発NADPHオキシダーゼ活性を抑制することを示した。正確な分子機構は明らかでないが、本発明者らの本研究は、PEDFがHUVECにおいてRac活性化を抑制することによりTNF-α誘発NADPHオキシダーゼ活性を阻害している可能性があることが示唆する。
【０００８】
本発明の医薬組成物は、NADPHオキシダーゼ障害を予防または治療するために使用することができる。本発明において、予防には再発防止も含む。NADPHオキシダーゼは活性酸素種(ROS)の生成を仲介する。ROSは、過酸化水素のような分子、次亜塩素酸イオンまたはスーパーオキサイドアニオンのようなイオン、ヒドロキシルラジカルのようなラジカルなどであり、殺菌に関与する。しかしながら、ROSは網膜症およびアテローム性動脈硬化症において主要な役割を果たす酸化的ストレスを引き起こす場合がある。
従って本発明者らは、TNF-α暴露HUVECにおける活性酸素種(ROS)生成、NF-κB活性化およびIL-6発現に対するPEDFの効果について検討した。TNF-αは細胞内ROS生成を有意に上昇させ、それはPEDFまたはNADPHオキシダーゼ阻害物質であるジフェニレン・ヨードニウム(以下、DPIと表記する)により完全に抑制された。さらに、PEDFはTNF-αが誘発するNADPHオキシダーゼ活性の上昇を完全に阻害した。PEDFまたは抗酸化剤であるN-アセチルシステインは、TNF-α誘発NF-κB活性化を有意に阻害した。PEDFは、TNF-α誘発IL-6発現をmRNAおよびタンパク質レベルの両者において阻害した。さらに、TNF-αはPEDF mRNAレベルを減少させた。リガンドブロット解析により、HUVECがPEDFに対して結合親和性を有する膜タンパク質を有することが明らかとなった。これらの結果は、PEDFがHUVECにおいてNADPHオキシダーゼ仲介ROS生成を抑制することにより、TNF-α誘発NF-κB活性化およびその後のIL-6過剰発現を阻害することを示している。
【０００９】
さらに、アンジオテンシンII（AngII）がHUVECにおいて、酸化還元に感受性を有する転写因子であるNF-κBの活性化、ついでMCP-1（Monocyte Chemoattractant protein-1）の発現を顕著に誘発し、これらが抗酸化剤であるＮ-アセチルシステイン(以下、NACと表記する)同様、PEDFによって完全に阻害されること、およびHUVECにおいてAngIIにて誘発されたROSの発生をNADPHオキシダーゼ阻害剤であるDPIと同様に阻害することを見出した。
また、終末糖化産物（AGE）は、微小血管内皮細胞での分子内活性酸素種の活性を顕著に刺激するが、これらがPEDFによって完全に抑制されること、また、PEDFは、NADPHオキシダーゼ活性における増加と同様に終末糖化産物（AGE）にて誘発されたNADPHオキシダーゼを阻害すること、さらにPEDFは、血液透析糖尿病患者(DM-HD)血清からのAGE分画で処理した細胞に対し、有意な抗酸化活性を示すことを明らかにした。さらに、AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対し、有効性を示した。以上の一連の事象を本明細書においては「終末糖化産物（AGE）情報伝達」という。
以上の知見より、本発明はまた、NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、NF-κB活性化、IL-6発現、TNF-α活性、アンジオテンシンII活性および／または終末糖化産物（AGE）情報伝達を阻害する医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明が目的とする対象疾患はNADPHオキシダーゼに起因する疾患であり、これには例えば血管障害、NF-κB活性化−関連疾患、IL-6発現−関連疾患、TNF-α活性−関連疾患、アンジオテンシンII活性−関連疾患、および終末糖化産物（AGE）情報伝達−関連疾患が包含される。
血管障害には、脈管炎、アテローム性動脈硬化症、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞などが含まれる。
【００１１】
NF-κB活性化−関連疾患の例には、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞が含まれる。
転写因子であるNF-κBは、炎症誘発性サイトカインおよび成長因子の遺伝子発現を調節し、血管機能障害およびアテローム性動脈硬化症の発症において中心的役割を果たす(非特許文献34)。本発明者らは本発明において、TNF-αがIL-6発現をNF-κBの活性化を介してmRNAおよびタンパク質レベルで有意に誘導することを発見した。PEDFまたは抗酸化物質NACは、TNF-α誘発NF-κB活性化およびそれに続くIL-6 mRNA発現上昇を有意に阻害するので、PEDFはその抗酸化特性を介してIL-6発現を減少させた可能性があり、本明細書で述べるように本発明者らはそれに関して多くの証拠を示した。
【００１２】
IL-6発現−関連疾患の例には、冠動脈イベント、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫が含まれる。アテローム性動脈硬化症における全身性炎症反応のほとんどが、IL-6の作用によって説明できる。IL-6はC-反応性タンパク質(CRP)の肝合成の主要な誘導因子であり、また、不安定狭心症の患者におけるIL-6およびCRPの血清レベルの上昇は予後不良と関連がある(非特許文献35, 36)。さらに、最近幾つかの研究により、CRPが一見健康な中年男性における心血管疾患の独立した予測危険因子であり得ることが示された(非特許文献37)。それ故PEDFは、IL-6およびCRP産生を弱めることによって、アテローム性動脈硬化症の進行に対して有利な効果を示し得るであろう。以上のことから、PEDFは、アテローム性動脈硬化症の発達および進行において重要な役割を果たしている可能性がある。
【００１３】
TNF-α活性−関連疾患の例には、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞が含まれる。TNF-αは、ROSの生成を介して複数の細胞機能に対し多面的作用を発揮する(非特許文献8, 13, 14)。事実、以下に示す実施例は、TNF-αがROS生成、NF-κB活性化およびIL-6発現を誘発することを示す。それに対して、以下に示す実施例はまた、TNF-αによって誘発されるこれら機能が実際にPEDFによって抑制または阻害されたことを示す。即ちPEDFは、TNF-α活性、特にNADPHオキシダーゼ活性に基づくTNF-α活性−関連疾患を予防または治療するのに使用できると考えられる。
【００１４】
アンジオテンシンII活性−関連疾患には、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞が含まれる。アンジオテンシンII（AngII）は、レニン-アンジオテンシン系の支配的なエフェクターであり、血管壁細胞での数多くの炎症性増殖性応答を調整し、そのことにより動脈硬化症を惹起しうることが知られている。本発明者らは、以下の実施例試験結果以外の試験結果も合わせて、PEDFが、AngIIが誘発された血管内皮細胞の活性化を試験管内で阻害し、その機序がNADPHオキシダーゼにより媒介されたROSの発生を抑制することによるものであることを見出した。このことにより、PEDFは動脈硬化症の発症および悪化に重要な予防、治療効果を示すことが判明した。この知見により、本発明は、さらに、PEDFのNADPHオキシダーゼ活性阻害作用によるアンジオテンシンＩＩ活性を抑制し、このことからアンジオテンシンＩＩ由来の疾患、たとえば、血管障害、特に動脈硬化症等の循環器系疾患の予防または治療剤を提供することができる。
【００１５】
本発明は、さらにNADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより終末糖化産物（AGE）生成に伴う糖尿病性血管合併症、即ち終末糖化産物（AGE）情報伝達−関連疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
終末糖化産物（AGE）情報伝達−関連疾患には、糖尿病性血管合併症、例えば増殖性糖尿病網膜症等が含まれる。
【００１６】
また、本発明者らは本研究において、PEDF単独ではTNF-α暴露HUVECにおけるNADPHオキシダーゼ活性、NF-κBプロモーター活性またはIL-6 mRNAレベルに影響しないことを発見した。つまり、PEDFは基本状態ではECに対して有害な作用を示さないようである。従って本発明の組成物およびベクターは、本明細書記載の数多くの疾患を、より安全に、より都合良く、そして副作用の問題を懸念することなく、予防または治療するのに使用可能である。
この知見により、本発明は、NADPHオキシダーゼに起因する疾患から予防または治療させる医薬組成物および／またはそのためのベクターを提供する。この態様において、本発明は、NADPHオキシダーゼに起因する疾患から予防または治療させるのみであり、過剰の作用を示さない。
【００１７】
(2) 本発明の医薬組成物に含まれる活性成分
活性成分は、以下より成る群から選択することができる：
a) 色素上皮由来因子；
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および
c) 該因子(a)または該変異体(b)をコードする核酸分子を含むベクター。
(2)-1. 色素上皮由来因子
色素上皮由来因子(PEDF)のアミノ酸配列および核酸配列は、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1526-1530 (1993)に記載されており、ジーンバンクアクセション番号 M76979で登録されている。参考のため、ヒトPEDFのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ配列番号：１および２において示す。本発明によれば、PEDFには、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマのような哺乳類由来の全種類のPEDFが含まれるが、ヒト由来のPEDFが好ましい。
PEDFは、Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)のような多くの出版物および参考文献に従って、該タンパク質をコードするDNAを発現させることにより産生することができる。特に、発現プラスミドは、本発明のDNAを適切な発現ベクター(例えばpBK-CMV)に挿入することによって構築する。そして、その発現プラスミドを適切な宿主細胞に導入し形質転換細胞を得る。宿主細胞の例には、大腸菌のような原核生物、酵母のような単細胞性真核生物、および昆虫並びに動物のような多細胞性真核生物の細胞が含まれる。発現プラスミドは、リン酸カルシウム法、電気穿孔法、リポフェクチン法等のような常套的方法により宿主細胞へ導入することができる。所望のタンパク質は、該形質転換体を通常の方法に従い適切な培地中で培養することにより産生される。このようにして得られたタンパク質は、標準的生化学的手法に従って単離精製することができる。
【００１８】
本明細書で用いる場合、「PEDFと機能的に同等の性質を有するPEDFの変異体」には、ヒトPEDFと機能的に同等の性質を有するすべての種類のPEDF変異体が含まれる。例えばPEDFの変異体は、US6319687、WO03059248、WO9324529等に記載されている。
PEDF変異体の好ましい例には、ヒトPEDFのアミノ酸配列に対して置換、欠失および／または付加である１つもしくはそれ以上、または幾つかのアミノ酸残基の変化を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトPEDFと機能的に同等の性質を有するPEDFの変異体が含まれる。
ヒトPEDFと機能的に同等の性質とは、ヒトPEDFと同等のNADPHオキシダーゼ活性の抑制を意味する。
本発明の変異体もまた、前述の組換え技術によって調製することができる。
前述のように調製した変異体が機能的に同等の性質を有するか否かは、本明細書で後述する実施例に従って証明することができる。
【００１９】
PEDFまたはその変異体を含有する本発明の医薬組成物はまた、要すれば、常套的な担体を含むことができる。
PEDFまたはその変異体を含有する本発明の医薬組成物は、例えば、皮内、皮下または静脈内注射によって投与することができる。好ましくは、このようなPEDFまたはその変異体は、注射によって病変が存在する部位に直接投与する。そのような製剤中のタンパク質の量は、治療する疾患、患者の年齢および体重等に依存して適宜変化するであろうが、典型的には、毎日(1回または数回に分けて投与することができる)、数日から数ヶ月ごとにPEDFまたはその変異体を0.0001mg-1000 mg、好ましくは0.001mg-100 mg、より好ましくは0.01mg-10mg投与する。
【００２０】
(2)-2. 核酸およびベクター
本発明の医薬組成物が含有する活性成分は、色素上皮由来因子、または色素上皮由来因子のアミノ酸配列に対して置換、欠失および／または付加である１つまたは幾つかのアミノ酸残基の変化を含み、かつ色素上皮由来因子と機能的に同等の性質を有するその変異体をコードする核酸を含むベクターであってよい。
【００２１】
本明細書で用いる場合、「核酸」にはDNAおよびRNAが含まれ、それらは一本鎖または二本鎖であってよい。核酸は、典型的DNA合成または遺伝子工学的方法に従い、例えば”Molecular Cloning”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)のような標準的テキストの記載に従い容易に調製することができる。
【００２２】
ベクターに組み込まれた核酸を癌患者に投与することにより、PEDFまたはその変異体は癌細胞において高発現する。つまり、これらベクターは、常套的に用いられるように遺伝子治療に有用である。ベクターの例には、前述の核酸をDNAまたはRNAウィルス、例えばレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワクチニアウィルス、ポックスウィルス、ポリオウィルス、またはシンドビスウィルスに組み込んで細胞に導入するウイルスベクターが含まれる。これら方法のうち、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルスまたはワクチニアウィルスを用いるものが特に好ましい。該ベクターの具体例には、pAd/CMV/V5-DEST Gateway Vector (Invitrogen)が含まれる。
【００２３】
本発明のベクターを含有する医薬組成物はまた、要すれば、常套的な担体を含んでも良い。
このようなベクターを含む医薬組成物は、例えば、皮内投与、皮下投与または静脈注射により投与することができる。好ましくは、このようなPEDFまたはその変異体は、病変の存在する部位に直接投与する。そのような製剤中のベクターの量は、予防または治療する疾患、患者の年齢および体重等に依存して変化するであろうが、典型的には、毎日(1回または数回に分けて投与することができる)、数日から数ヶ月ごとに核酸を0.0001mg-100 mg、好ましくは0.001mg-10 mg投与する。
本発明はまた、前述のベクター自身を包含する。
【００２４】
(3) 結合タンパク質
本発明者らはさらに、HUVECがPEDFに対する結合親和性を有する膜タンパク質を有するかについて研究した。
前述のように、PEDFがTNF-α誘発性ROS生成を阻害することは、TNF-α暴露HUVECにおけるPEDFの抗酸化機能を示唆する。しかしながら、PEDFがTNF-αの受容体との相互作用を介してその効果を発揮していないかについて調べなければならない。本発明者らは培養HUVECの細胞膜にPEDF特異的結合タンパク質が存在することを初めて明らかにしたので（図６Ａ）、その可能性はなさそうである。該結合データのスキャッチャード解析により、シングルクラスの高親和性受容体であることがわかった（図６Ｂ）。PEDFの受容体結合領域のペプチドに対する抗体(非特許文献15)は、PEDFの抗酸化特性を完全に中和した（図１Ｂ）。さらに、図６Ｃに示すように、PEDFはTNF-αとその受容体との結合を妨げなかった。これらを総合すると、本発明者らの結果は、HUVECにおいてTNF-α誘発性ROS生成の阻害に関与するPEDF特異的結合タンパク質が存在することを示唆する。なお、非特許文献30によると、網膜芽細胞腫上にKd 値 1.7-3.6 nM、80-85 kDaの異なるタイプのPEDF結合タンパク質が存在することを報告されていて、細胞タイプ特異的なPEDF受容体が存在している可能性があることを示唆している。
【実施例】
【００２５】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、いかなる意味おいてもこれら実施例に限定されるものではない。全ての値を平均 ± SEMで示した。特に示さない限り、統計学的比較のため、one-way ANOVA に続いて Scheffe F testを行った。
本参考例および実施例において用いたTNF-α、DPI、ルシゲニン、NADH、NADPH、NACおよびピロリジンジチオカルバメート(PDTC)は、Sigma (St. Louis、MO)より購入した。CDP-Star 化学発光システムおよび125I-TNF-α は、Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, United Kingdom)より購入した。IL-6 ELISA システムは、Biosource (Camarillo, CA)より得た。
【００２６】
以下の実施例において本発明者らは、TNF-αによって誘発されるROS(活性酸素種)産生について調べるためHUVECを使用した。TNF-αは、多くの細胞機能に対してROSの生成を介して多面的作用を発揮する(非特許文献8, 13, 14)。そこで本発明者らは初めにTNF-αを用いて、HUVECにおいてPEDFがTNF-α誘発細胞内ROS生成を阻害できるか、およびどのように阻害するかについて調べた。次に本発明者らは、TNF-α暴露HUVECにおけるNF-κB活性化およびそれに続くIL-6発現に対するPEDFの効果について検討した。
【００２７】
参考例１  PEDFタンパク質の精製
PEDFタンパク質は既報のようにして精製した(非特許文献15)。精製PEDFタンパク質のSDS-PAGE解析により分子量約50kDaの一本のバンドが示され、それは抗ヒトPEDFモノクローナル抗体と陽性反応を示した(非特許文献15)。ヒトPEDFに対するポリクローナル抗体もまた、既報のように調製した(非特許文献15)。
【００２８】
PEDF-発現ベクターおよびPEDF精製のための発現ベクターの調製について簡単に説明する。
PEDF cDNAは、初めにヒト胎盤cDNAライブラリー(Clontech, Palo Alto, CA)より単離し、既報のように哺乳類発現ベクターであるpBK-CMV(Stratagene, La Jolla, CA)に挿入した(非特許文献35)。
簡単に説明すると、該cDNAライブラリーからPEDFをコードする遺伝子を以下の条件のPCRにより単離した：
PCR プライマー
Fw : 5’-CTCAGTGTGCAGGCTTAGAG-3’ (配列番号：3)
Rev : 5’-CCTTCGTGTCCTGTGGAATC-3’ (配列番号：4)
x 10 pfu バッファー                     4 μl
dNTP (各2mM)                            4 μl
プライマー (Fw) (10 μM)                4 μl
プライマー (Rev) (10 μM)               4 μl 
鋳型 (200 mg)
pfuポリメラーゼ(STRATAGENE)           0.5 μl 
蒸留水                            /合計40 μl 
PCR条件(Parkin Elmer 2400)
(ステップ 1 x 1)
95℃       5min
(ステップ 2 x 30)
95℃       0.5min
60℃       0.5min
72℃       1.5min
(ステップ 3 x 1)
72℃       10min
4℃        ∞min
増幅確認後、PCR産物をpBluescript II KSのSma Iサイトにライゲートした。制限酵素消化およびシークエンスによって構造を確認し、また、5’側にXba Iサイトを含むことも確認した。
Xba IおよびHind III(ブラント)で切断したPEDF PCR産物を、pBK-CMV (STRATAGENE)のNhe I(ブラント)およびXba Iサイトの間に挿入し、PEDF-発現ベクターであるプラスミドpBK-CMV-PEDFを得た。
【００２９】
次に、PEDF精製のための発現ベクターを以下の手順に従い構築した。
His-Tag用オリゴDNA、
5’-AATTCCATCATCATCATCATCATTAAT-3’ (配列番号：5)および
5’-CTAGATTAATGATGATGATGATGATGG -3’ (配列番号：6)を合成し、互いにアニールさせた。PEDFのストップコドンを取り除き3’末端にEco RI サイトを挿入するため、5’-CGGAATTCGGGGCCCCTGGGGTCC -3’ (配列番号：7)並びに前述のFw プライマー (配列番号：4)、および鋳型としてpBK-CMV-PEDFを用いてPCRによりオリゴDNAを合成した。増幅産物をBgl IIおよびEco RIで切断し、切断産物を前述のアニール済His Tag用オリゴDNAにライゲートした。ライゲート産物をBgl IIおよびXba Iで切断した精製pBK-CMV-PEDFに挿入した。構造を制限酵素消化およびシークエンスによって確認した
翻訳エンハンサーを挿入するため、pcDNA4-HisMax (Invitrogen)からSac IおよびXba Iを用いて単離したエンハンサー部分をpBluescript II KSの同じ制限酵素サイトにライゲートした。クローンの単離後、該ベクターをNco Iサイト (ブラント)およびBam HIサイトで切断し、ベクターバックボーンを得た。
【００３０】
PEDFの5’末端を修飾するため、5’-GCATGCAGGCCCTGGTGCTACTCC -3’ (配列番号：8) (PEDF 5'末端にSph I サイトを挿入)並びに5’-TTAGGTACCATGGATGTCTGGGCT -3’ (配列番号：9)、および鋳型としてpBK-CMV-PEDFを用いてオリゴDNAを合成し、合成産物をpGEM-T easy (Promega)に挿入した。クローンを単離し、そしてSph Iサイト(ブラント)およびBam HIサイトで切断した。その結果生じた断片を前述のベクターバックボーンに挿入した。
得られたベクターをSac Iサイト(ブラント)およびBam HIサイトで切断して翻訳エンハンサー−PEDF5’部分を取り出した。翻訳エンハンサー−PEDF5’部分を含む断片を、Nhe Iサイト(ブラント)およびBam HIサイトで切断した3’His-Tag含有pBK-CMV-PEDFにライゲートし、PEDF精製のための発現ベクターを得た。得られたベクターを制限酵素消化および配列決定によって確認した。
【００３１】
参考例２  HUVECストックの調製
HUVEC(Clonetics, CC-2517)を、2 % ウシ胎児血清、0.4 % ウシ脳抽出物、10 ng/ml ヒト上皮細胞増殖因子および1 μg/ml ヒドロコルチゾンを添加したEBM培地中で培養した。実施例において、TNF-α処理は上皮細胞増殖因子およびヒドロコルチゾンを含まない培地中で行った。
【００３２】
実施例１  HUVECにおけるROS生成に対するPEDFの効果（１）
本発明者らは初めに、PEDFがTNF-αに暴露されたHUVECにおいてROS（活性酸素種）生成を阻害できるかについて検討した。
HUVECを10 ng/ml TNF-αで示した時間処理し、その後細胞内のROS生成を蛍光プローブ CM-H2DCFDA (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) を用いて既報のようにして検出した(非特許文献18, 19)。図１Ａに示すように、ROS生成は4時間で上昇し始め、24時間で最大に達した；10 ng/ml TNF-αで24時間インキュベートすると、細胞内ROS生成が約1.4倍増加した。10 ng/mlより高い濃度のTNF-αはHUVECに対して毒性を示す。
【００３３】
1 または 10 nMのPEDF、50 nM DPI、または5 μg/ml 抗PEDF抗体（Abs）の存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間処理し、その後細胞内ROS生成を前述のように検出した。ROS生成の比率は無添加の対照の値に対するものであり、縦軸に示している。結果は図１Ｂに示す。PEDFまたはDPIは、TNF-αが誘発するROS生成の上昇を完全に阻害することがわかった。
PEDFに対するポリクローナル抗体をPEDFと組み合わせて添加すると、TNF-α暴露HUVECにおけるPEDFの抗酸化効果は完全に消失した。10 nM PEDFは、無細胞系におけるキサンチン/キサンチンオキシダーゼ反応によるスーパーオキサイド生成を阻害しない。これらの結果は、PEDF自身がフリーラジカル除去作用を有するのではないことを示唆する。
【００３４】
実施例２  HUVECにおけるROS生成に対するPEDFの効果（２）
実施例１において、PEDFはDPIと同様に、TNF-αが誘発するROS生成の上昇を完全に阻害することが示された。しかし、DPIのような薬理学的阻害物質はある標的細胞に対して完全に特異的ではないので、ここでは、PEDFのROS生成阻害の機序について調べた。本発明者らは、TNF-α暴露HUVECにおけるROS生成がNADPHオキシダーゼによるものであることをさらに検討するため、DN-RacT17N(ドミナント−ネガティブ・ヒトRac-1変異体)過剰発現技術を用いて実験を行った。DN-RacT17は、NADPHオキシダーゼに不可欠な構成要素であるGTPase Rac-1(非特許文献28)の作用が完全に遮断されている。
既報のように(非特許文献17)、DN-RacT17N 発現ベクター（堀口博士から供与）(非特許文献16) または空のベクターを、HUVECに一過性にトランスフェクトした。DN-RacT17N-トランスフェクトおよび模擬トランスフェクトHUVECを、10 ng/ml TNF-αで24時間処理し、ROSを定量的に解析した。ROS生成の比率は、TNF-αなしでの模擬トランスフェクト対照細胞の値に対するものである。図１Ｃに示すように、DN-RacT17Nの過剰発現により、TNF-α誘発性のROS生成上昇は完全に阻害された。
【００３５】
本発明者らは次に、TNF-αがHUVECにおいてRac-1発現および活性化を介してROS生成を誘導し得るかについて検討した。
10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを4時間で処理し、その後逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により解析した。下のパネルは、Rac-1 遺伝子誘導を定量的に表したものを示す。データはβ-アクチンmRNA由来シグナルの強度によってノーマライズし、対照と対比している。図１Ｄに示すように、TNF-αは、中程度に、しかし有意にRac-1 mRNAレベルを上昇させ、それは10 nM PEDFによって完全に抑制された。その後、Rac Activation Assay Kit (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY)を用いてRac活性を測定した。10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間で処理した。図１Ｅに示すように、Rac-GTP プルダウンアッセイにより、TNF-αは有意にRacを活性化し、それはまた、PEDF処理によって完全に阻害されることがわかった。
【００３６】
これらの知見は、NADPHオキシダーゼの重要な構成要素の１つであるRac-1がTNF-α誘発性ROS生成に直接関与し、またPEDFの分子標的であることを示唆する。一方、一酸化窒素合成酵素阻害物質である N-ω-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル、キサンチンオキシダーゼ阻害物質であるオキシプリノール、またはミトコンドリアNADPHデヒドロゲナーゼ阻害物質であるロテノンは、HUVECにおけるTNF-α誘発性ROS生成に影響しない。本発明者らはまた、PEDFはTNF-α暴露HUVECにおけるアポトーシス性細胞死を増加させないことを見出している。これらの結果は、TNF-α暴露HUVECに対するPEDFの抗酸化効果が、単純にそのアポトーシス促進性に起因するものではないことを示唆している。
【００３７】
実施例３  HUVECにおけるNADPHオキシダーゼ活性に対するPEDFの効果
本発明者らは次に、PEDFが実際にNADPHオキシダーゼ活性を抑制できるかについて検討した。
10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間で処理し、その後、1 mM EGTA、150 mM スクロース、電子受容体として5 μM ルシゲニン、および基質として100 μM NADPHを含有するリン酸緩衝液（50 mM, pH 7.0）における発光アッセイにより、NADPHオキシダーゼ活性を測定した (非特許文献20)。図２Ａに示すように、TNF-αはNADPHオキシダーゼ活性を有意に上昇させ、それは10 nM PEDFによって完全に抑制された。TNF-αによって誘発されるNADPHオキシダーゼ活性の上昇度は、ROS生成の上昇度と近似していた。TNF-αはNADPHオキシダーゼ活性を約1.3倍に上昇させた。PEDF単独ではHUVECにおけるNADPHオキシダーゼ活性には影響しない。
【００３８】
10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間で処理した。その後、2 μM ジヒドロエチジウムを含有するフェノールレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地で細胞をインキュベートした。30分後、共焦点レーザー顕微鏡によって細胞を画像化した。図２Ｂに示すように、ジヒドロエチジウムによる細胞染色によっても、PEDFがHUVECにおいてTNF-α誘発NADPHオキシダーゼ活性を阻害することが明らかとなった。TNF-αは、HUVECにおけるNADPHオキシダーゼの重要な構成要素の１つであるp22phoxまたはgp91phoxのmRNAレベルを上昇させなかった。
【００３９】
実施例４  HUVECにおけるNF-κBプロモーター活性に対するPEDFの効果
ROS (活性酸素種)は、転写因子NF-κBの活性化を介して数多くの遺伝子発現を調節する(非特許文献29)。それ故本発明者らは、PEDFがHUVECにおいてTNF-αが誘発するNF-κB転写活性を減弱することができるかについて調べた。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に連結されたNF-κBプロモーターを含むプラスミドは、Dr. Fujita T（Department of Tumor Cell Biology, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science）より提供していただいた(非特許文献21)。1 または 10 nMのPEDFまたは抗酸化物質である1 mM NAC の存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを4時間処理し、その後既報のようにNF-κBルシフェラーゼ活性を測定した(非特許文献17)。ルシフェラーゼ活性の比率は対照の値に対するものである。図３Ａに示すように、TNF-αはNF-κBプロモーター活性を有意に上昇させた。PEDFおよび抗酸化物質NACは、部分的ではあるものの有意にTNF-α誘発性のNF-κBプロモーター活性上昇を抑制することがわかった。
【００４０】
NF-κB p65活性を測定するために、核タンパク質を抽出し、それらのNF-κB p65コンセンサス配列に対する結合活性をTansFactorキットを用いて測定した。10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを4時間処理した。TransFactor 抽出キット(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)を用いて細胞から核タンパク質を抽出し、TransFactor NF-κB p65 キット(BD Biosciences Clontech)を用いてNF-κB p65コンセンサス配列に対するそれらの結合活性を測定した。図３Ｂに示すように、TNF-αはNF-κB p65活性を上昇させ、それはPEDFによって有意に阻害された。
【００４１】
実施例５  HUVECにおけるIL-6 mRNAおよびタンパク質レベルに対するPEDFの効果
本発明者らは次にPEDFがHUVECにおいてIL-6の発現に影響し得るかについて検討した。
10 nM PEDF、1 mM NAC 、またはNF-κB の阻害物質である10 μM PDTC (ピロリジンジチオカルバメート)の存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きで4時間処理したHUVECよりポリ(A)+RNAを単離し、既報のようにして半定量的RT-PCRによって解析した(非特許文献26)。増幅のためのポリ(A)+RNA鋳型量(30 ng)およびサイクル数（Rac-1遺伝子につき28サイクル；IL-6およびPEDF遺伝子につき35サイクル；β-アクチン遺伝子につき22サイクル）は、反応が直線的に進行する定量的範囲（シグナル強度を鋳型量およびサイクル数の関数としてプロットすることによって決定）において選択した(非特許文献27)。半定量的RT-PCRにおいて用いたプライマー 配列は、ヒトRac-1につき5’-ACCCCTTCTGACTGAGCAATATGCC-3’(配列番号：10)および5’-CAATAGGCAAAGCGACTACAGGAGG-3’(配列番号：11)(非特許文献22)、ヒトIL-6 mRNAにつき5’-CCTTCTCCACAAGCGCCTTC-3’(配列番号：12)および5’-GGCAAGTCTCCTCATTGAATC-3’(配列番号：13)(非特許文献23)およびヒトPEDF mRNAにつき5’-TCACAGGCAAACCCATCAAGCTGAC-3’(配列番号：14)および5’-GCCTTCGTGTCCTGTGGAATCTGCT-3’(配列番号：15)(非特許文献24)であった。ヒトIL-6およびPEDF cDNAを検出するための内部オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブは、それぞれ5’-TCAATTCGTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGT-3’(配列番号：16)および5’-CGCCCCATCCTCGTTCCACTCAAAGCC-3’(配列番号：17)であった。ヒトβ-actin mRNAを検出するために半定量的RT-PCRで使用した上流および下流プライマーの配列は、既報のものを同じである(非特許文献25)。
【００４２】
図４Ａに示すように、TNF-αはIL-6 mRNAレベルを有意に上昇させ、それは、PEDF、NAC、またはNF-κBの阻害物質であるPDTC(ピロリジンジチオカルバメート)によって、部分的ではあるものの有意に阻害された。PEDF、NACまたはPDTC(ピロリジンジチオカルバメート)単独ではIL-6 mRNAレベルには影響しなかった。
【００４３】
その後、1または10 nMのPEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間処理した。培地中に放出されたIL-6タンパク質は、ELISAキットを用いて製造元の説明に従い測定した。PEDFは、TNF-α暴露HUVECからのIL-6タンパク質の分泌を有意に阻害することも明らかとなった（図４Ｂ）。
【００４４】
実施例６  HUVECにおけるPEDF結合タンパク質
本発明者らは次に、HUVECがPEDFに対して結合親和性を示す細胞表面タンパク質を有するかについて検討した。
HUVEC由来の界面活性剤溶解性細胞膜タンパク質を15 %ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリデンジフルオライドメンブランに転写した。既報のように(非特許文献15)、メンブランと30 nM フルオレセン標識PEDFを、分子20倍過剰量の非標識PEDFタンパク質の非存在(レーン 1)または存在(レーン 2)下インキュベートした。その結果生じた免疫複合体をCDP-Star 化学発光システムにより視覚化した。図６Ａに示すように、分子量約60 kDaのHUVEC膜タンパク質が、フルオレセン標識PEDFタンパク質と結合した。結合シグナルは、分子20倍過剰量の非標識PEDFタンパク質の存在下ではほとんど検出できず、これにより培養HUVECの膜抽出物に対するフルオレセン標識PEDFの結合の特異性が確認された。さらに、10 ng/ml TNF-αを処理すると、HUVECにおける膜に対するPEDF結合が約1.3倍上昇する。
【００４５】
本発明者らは次に、PEDF結合プロファイルを解析し、その物理化学的パラメーターを測定した。放射性標識PEDFは、既報のようにして(非特許文献15)精製PEDFタンパク質と125Iから調製した。HUVECを示した濃度の125I-PEDFタンパク質と、分子20倍過剰量の分子非標識PEDFタンパク質の非存在(黒丸)または存在(非特異的結合、白丸)下インキュベートした。特異的PEDF結合は既報のように測定した(非特許文献15)。全結合から非特異的結合を差し引くことにより特異的結合(黒四角)を計算した。全ての実験ポイントを4例の平均で示した。図６Ｂに示すように、結合データのスキャッチャード解析により、解離定数(Kd) 84.7 nMのシングルクラス結合部位 (HUVEC 1 細胞につきBmax = 51,000 部位)であることがわかった。
【００４６】
本発明者らは次に、PEDFがHUVECにおいてTNF-αの受容体結合を阻害するかについて検討した (125I-TNF-α結合アッセイ)。10 nM PEDFの存在または非存在下、HUVECを10 ng/ml 125I-TNF-αと4 ℃で90分間インキュベートし、その後細胞を1 M NaOHで溶解し、細胞溶解物の放射活性を既報のように測定した(非特許文献15)。Unpaired t test を行った； p<0.05 を有意と判断した。図６Ｃに示すように、PEDFはTNF-αの受容体に対する結合に影響しなかった。
【００４７】
実施例７  PEDFの抗動脈硬化症作用
（1）HUVECにおけるAngII誘発性NF-κBプロモーター活性に対するPEDFの効果
HUVECを10 nMのPEDFの存在下または非存在下に、100 nMのアンジオテンシンII（AngII）にて4時間処理し、NF-κBルシフェラーゼ活性を測定した。AngII未処理も試験した。
すなわち、HUVECを、2％牛胎児血清（FBS）、0.4％牛脳抽出物、10ｎg/mLヒト上皮成長因子および1μg/mLヒドロコルチゾンを追加したＥＢＭ培地にて培養した。AngII処理は、前記培地から上皮成長因子およびヒドロコルチゾンを除いた培地で行った。また、ルシフェラーゼアッセイの測定は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にNF-κBプロモーターを接続させたプラスミドを用いて、Yamagishi SらによるJ. Cardiovasc. Pharmacol. 2004; 43: 724-730に記載の方法によった。
結果を図７に示す。図７から明らかなように、AngIIはNF-κBプロモーター活性を顕著に増加させるが、PEDFはその作用を完全に抑制した。
【００４８】
（2）HUVECにおけるAngII誘発性MCP-1 mRNAおよびタンパク質レベル上昇に対するPEDFの効果
MCP-1はNF-κB標的遺伝子の一つであり、in vitroおよびin vivoにて単球に対する走化性を誘発する。そこで、PEDFが、HUVECにてMCP-1の発現にどのような影響を与えるか実験した。MCP-1 mRNAに対する効果の試験は、HUVECから単離されたPoly(A)＋ＲＮＡを10 nMのPEDFの存在下または非存在下に、100 nMのAngIIにて4時間処理し、ＲＴ-ＰＣＲにて測定した。AngII未処理も試験した。ＲＴ-ＰＣＲ法は、Yamagishi SらによるDiabetologia.1998; 41: 1435-1441に記載された方法にて行った。MCP-1タンパク質に対する効果の試験は、HUVECを10 nMのPEDFの存在下または非存在下に、100 nMのAngIIにて24時間処理し、培地中に生じたMCP-1タンパク質をＥＬＩＺＡ法にて測定した。AngII未処理も試験した。
結果を図８に示す。図８ＡおよびＢに示すように、AngIIはmRNAおよびタンパク質レベルにてMCP-1の発現を顕著に増加させたが、これはPEDFによって完全に阻害された。
【００４９】
（3）HUVECにおけるAngII誘発性分子内ROS発生に対するPEDFの効果
ROSはNF-κBの転写活性化を通して動脈硬化を誘発する遺伝子の発現を調整することが知られている（たとえば、Griendling KKらによるCir. Res. 1994; 74: 1141-1148参照）。一方、抗酸化剤であるNACがAngIIに暴露されたHUVECでのNF-κBの活性化およびMCP-1発現に作用することを見出している。これらから、AngIIにより発生するROSがPEDFの分子標的となる可能性がある。そこで、HUVECにおける分子内ROS発生に対するPEDFの効果を調べた。まず、AngIIのROS発生への効果を調べた。実験は、HUVECを図９Ａに示された時間をかけて100 nMのAngIIで処理し、生成したROSを蛍光プローブであるCM-H2DCFDA（米国Molecular Probe Inc.）を用いて定量分析した（検出手法は、たとえば、Yamagishi S.らによるJ. Biol. Chem. 2001; 276: 25096-25100等に記載されている）。図９Ａに示すように、ROSはAngIIにより4時間後から発生し始め、24時間で最大となる。100 nMのAngIIでの24時間培養では、1.4倍のROS発生が観測された。そこで、そのROS発生に対するPEDFの効果を調べた。HUVECを1 nMまたは10 nMのPEDF、10 nMのPEDFに50μg/mLの抗PEDF抗体を共存させたもの、および50 nMのDPIの存在下または非存在下に100 nMのAngIIにて24時間処理し、上記と同様にROSを定量した。その結果、図９Ｂに示したように、PEDFは濃度依存的にAngIIにより誘発されたROSの増加を抑制し、10 nMのPEDFにて完全に抑制された。これに抗PEDF抗体（たとえば、Yamagishi S.らによるJ. Mol. Cell. Cardiol. 2004; 37: 497-506参照）を共存させた系では、抑制作用が中和されたことから、HUVECに対し、PEDFが特異的に作用することが分かる。また、NADPHオキシダーゼ阻害剤として知られているDPIが、ROS発生を抑制したことから、PEDFの分子作用機序はNADPHオキシダーゼの抑制であると考えられる。
【００５０】
（4）HUVECにおけるAngII誘発性NADPHオキシダーゼ活性に対するPEDFの効果
上記実施例等により、PEDFがNADPHオキシダーゼ活性を阻害して、AngIIに作用していることが示唆されたが、それを本実験により確認した。
HUVECを1 nMまたは10 nMのPEDF、10 nMのPEDFと5μg/mLの抗PEDF抗体との共存系の存在下または非存在下に100 nMのAngIIにて24時間処理し、細胞を均質液調製用緩衝液（20 mMのHepes、pH7.0、100 mMの塩化カリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する1 mMのEDTA）に懸濁し、基質としてのNADPH（100μM）を含有する50 mMのリン酸緩衝液（pH7.0、さらに1 mMのEDTA、150 nMのショ糖および電子受容体としての5μMのルシゲニンを含有する）中にてリン光分析にてNADPHを測定した（たとえば、Griendling KKによるCir. Res. 1994; 74: 1141-1148参照）。
結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、PEDFは濃度依存的にAngIIにより誘発されたNADPHオキシダーゼ活性を抑制し、一方、抗PEDF抗体を共存させると、その抑制効果が中和されることが示された。
【００５１】
実施例８  NADPHオキシダーゼ活性を抑制することによる終末糖化産物（AGE）生成に伴う糖尿病性血管合併症への適用
(1)  微小血管内皮細胞での細胞内活性酸素種の生成およびNADPHオキシダーゼ活性に対する作用
(a) ヒト成人皮膚微小血管内皮細胞(以下、血管内皮細胞という)を、1Mまたは10MのPEDF、50MのDPIまたは終末糖化産物（AGE）の受容体(RAGE)mRNAに対するアンチセンスDNA(10μM)の存在下または非存在下に所定濃度のAGE処理牛血清アルブミン(AGE-BSA)または非糖化牛血清アルブミンにて24時間処理し、その後、活性酸素種（ROS）を定量的に解析した。ここで、AGE-BSAは非特許文献15に記載された方法により調製した。すなわち、牛血清アルブミン(50mg/ml)を0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中にて0.1MD-グリセルアルデヒドとともに無菌下に7日間培養することにより調製した。未反応還元糖は、リン酸緩衝化生理食塩水で透析することにより除去した。対照となる非糖化牛血清アルブミンは還元糖を存在させないことを除いて同一の条件にてインキュベーションし作製した。得られた調製物にエンドトキシンが含まれていないことを確認した（使用機器：Endospecy ES-20S, 生化学工業(株)）。RAGE mRNAに対するアンチセンスDNAは、Yamagishi, S.らによるFEBS Lett. 1996, 384:103-106に記載された方法に準拠して調製した。活性酸素種の細胞内生成は、Yamagishi, S.らによるKidney Int., 2003, 63:464-473に記載された方法に準拠して蛍光プローブ(CM-H2DCFDA, Molecular Probes Inc.)を用いて測定した。その結果を図11(a)に示す。図中、*は100μg/mlのAGE-BSAにて処理した値に対してP<0.01にて有意であることを示す。BSAは非糖化牛血清アルブミンによる処理の結果を、AGEsはAGE処理牛血清アルブミンによる処理の結果を示す。本図から明らかなように、PEDFはAGEにより修飾された血清アルブミンからのROS生成に対し、DPIよりも優れた抑制作用を示した。
【００５２】
(b) 血管内皮細胞を10nMのPEDFの存在下または非存在下に100μg/ml のAGE-BSAまたは非糖化牛血清アルブミンにて24時間処理し、NADPHオキシダーゼ活性をルミネッセンス法により測定した。すなわち、細胞を緩衝液(20mM Hepes、pH7.0、100mM塩化カリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する1mM EDTA)に懸濁し、細胞ホモジネートを非特許文献20に記載した方法により、1mMEDTA、150mMショ糖、電子アクセプターとして5μMルシジェニンおよび基質として100μM NADPHを含有する50mMリン酸緩衝液(pH7.0)中にてルミネッセンス法により測定した。結果を図11(b)に示す。本図から明らかなように、PEDFはAGEにより修飾された血清アルブミン処理細胞において、優れたNADPHオキシダーゼ抑制作用を示した。
本実験(a),(b)に用いた血管内皮細胞であるヒト成人皮膚微小血管内皮細胞(Clonetics Corp.)は、5%牛胎児血清、0.4%牛脳抽出物、10ng/mlヒト上皮成長因子および1μg/mlヒドロコルチゾンを追加したエオシン・メチレン・ブルー培地にて培養した。AGE処理は、ヒト上皮成長因子およびヒドロコルチゾンを除いた培地中にて行った。
【００５３】
(2) 微小血管内皮細胞における血清AGE分画に対する効果
インフォームドコンセントを得た血液透析糖尿病患者(DM-HD)血清または健康人(Normal)血清から常法によりAGE分画を得、その分画を用いて微小血管内皮細胞を10nMPEDFの存在下または非存在下に24時間処理した。活性酸素種であるスーパーオキサイドの産生を定量的に分析した結果を図12に示す。ここで、スーパーオキサイド生成は、上記のように処理して得た細胞を3μMジヒドロエチジウムを含むフェノールレッドフリーのダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)にて培養し、30分後に蛍光強度を測定し、細胞をレーザースキャニング共焦点顕微鏡にて画像化し、定量化した。本図から明らかなように、PEDFは血液透析糖尿病患者(DM-HD)血清からのAGE分画で処理した細胞からの活性酸素種産生を有意に抑制した。
【００５４】
(3) AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対する静脈投与での効果
Adamis, A.P.らの方法(Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2000, 44: 2155-2162)に準じて血液網膜関門(Blood retinal barrier, 以下、BRBという)損傷に対するPEDFの効果を実験した。すなわち、SD系ラットを麻酔処置後、FITC抱合デキストラン(4.4kDa, Sigma社)を静脈注射した。10〜15分後、血液サンプルをとり、各ラットをリン酸緩衝化生理食塩水にて灌流した。灌流後、網膜を採取し、重量を測定し、均質化してFITC抱合デキストランを抽出した。BRB損傷を[(a)/(b)]/[(c)x(d)]の式により計算した。ここで、(a)は網膜内FITC抱合デキストラン量(μg)を、(b)は、網膜重量(g)を、(c)は血漿中のFITC抱合デキストラン濃度(μg/mL)を、(d)は循環時間(h)を示す。図13に示したように、AGE-BSA処置群において、PEDF投与群は非投与群に比べ、有意な効果を発揮した。
【００５５】
実施例８は、PEDFが終末糖化産物（AGE）による微小血管内皮細胞での分子内活性酸素種を抑制し、終末糖化産物（AGE）にて誘発されたNADPHオキシダーゼ活性を阻害し、また、PEDFが血液透析糖尿病患者(DM-HD)血清からのAGE分画で処理した細胞に対し、有意な活性を示すことを明らかにした。さらに、AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対し、有効性を示した。
【００５６】
考察
本発明において本発明者らは、PEDFがHUVECにおいてTNF-α誘発NF-κB活性化およびIL-6発現を、NADPHオキシダーゼ仲介ROS(活性酸素種)生成から回復させることにより阻害することを、以下の証拠に基づき示した：[1] TNF-αはHUVECにおいて細胞内ROS(活性酸素種)生成を有意に刺激し、それは、PEDF、NADPHオキシダーゼ阻害物質であるDPI（実施例１参照）、またはDN-RacT17N (ドミナント−ネガテブ・ヒトRac-1 変異体)の過剰発現（実施例２参照）によって完全に抑制された；
[2] PEDFはTNF-αの誘発するNADPHオキシダーゼ活性上昇を完全に抑制した（実施例３参照）；および、
[3] PEDFまたは抗酸化剤NACは、TNF-α誘発NF-κB活性化およびIL-6発現を有意に阻害した（実施例４および５参照）。実施例7からは、PEDFが濃度依存的にAngIIにより誘発されたNADPHオキシダーゼ活性を有意に抑制することが示された。また、実施例8からは、PEDFがNADPHオキシダーゼ活性を抑制することによる終末糖化産物（AGE）生成に伴う糖尿病性血管合併症が予防または治療できる可能性が示された。
【００５７】
PEDFは10 nMでTNF-α誘発性ROS産生を対照レベル以下に減少させる一方で、TNF-αの非存在下ではROS生成に影響を及ぼさないことは興味深いことであった。本発明者らは正確なメカニズムを理解していないが、以下のように説明できるであろう。HUVECにおけるPEDF遺伝子発現に対するTNF-αの効果を検討するため、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きで4時間処理したHUVECよりポリ(A)+RNAを単離し、RT-PCRにより解析した。図５に示すように、TNF-αはHUVECにおいてPEDF mRNAレベルを減少させることがわかった。従って本発明者らは、PEDF mRNAの減少は、逆にその機能的結合タンパク質の上昇をもたらし、それによって外部から投与されたPEDFのROS生成に対する阻害効果を増強している可能性があると推測している。TNF-α処理によりHUVECにおける膜に対するPEDF結合は約1.3倍増加し、このことは本発明者らの推測を支持している。TNF-αが誘発するPEDF mRNA減少のメカニズムは本発明者らの研究からは明らかではない。本発明者らはごく最近、培養ECおよび周皮細胞の両者において、酸化的ストレス条件下PEDF mRNAレベルが抑制されることを発見したので、TNF-α誘発性ROS生成がPEDF mRNAレベルの抑制に関与しているのかもしれない。どのようなメカニズムにせよ、TNF-αによるPEDF発現の減少は、酸化的ストレス誘発細胞障害をさらに悪化させるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】HUVECにおける細胞内ROS生成に対するPEDFの効果を示す。図１Ａは、HUVECにおける細胞内ROS生成に対するTNF-αの効果を示すグラフである：*, P <0.01 （TNF-α抜きの値と比較）。図１Ｂは、HUVECにおける細胞内ROS生成に対するPEDF、DPI、または抗PEDF抗体（Abs）の効果を示すグラフである: *, P <0.01 （TNF-α単独の値と比較）。図１Ｃは、HUVECにおけるROS生成に対するDN-RacT17Nを示すグラフである: *, P <0.01 （TNF-αを処理した偽トランスフェクト細胞の値と比較）。図１Ｄは、TNF-α誘発Rac-1 mRNA レベルに対するPEDFの効果を示すグラフである。図１Ｅは、TNF-α誘発Rac活性に対するPEDFの効果を示すグラフである：*, P <0.01 （TNF-α単独の値と比較）。
【図２】HUVECにおけるNADPHオキシダーゼ活性に対するPEDFの効果を示すグラフである。図２Ａは、TNF-α-誘発NADPHオキシダーゼ活性に対するPEDFの効果を示すグラフである: *, P <0.01 （TNF-α単独の値と比較）。図２Ｂは、共焦点顕微鏡下での細胞の典型的顕微鏡写真を示す。
【図３】HUVECにおけるNF-κB活性に対するPEDFの効果を示すグラフである：*, P <0.05 （TNF-α単独の値と比較）。図３Ａは、PEDFおよびNACが、TNF-αの誘発するNF-κBプロモーター活性の上昇を抑制することを示すグラフである。図３Ｂは、TNF-αがNF-κB p65活性を上昇させ、それがPEDFによって有意に阻害されることを示すグラフである：*, P <0.05 （TNF-α単独の値と比較）。
【図４】HUVECにおけるIL-6 mRNAおよびタンパク質レベルに対するPEDFの効果を示す。図４Ａは、IL-6遺伝子の誘導を定量的に示すグラフである。データはβ-アクチンmRNA由来シグナルの強度によってノーマライズし、対照の値と対比させた：*, P <0.05; **, P <0.01 （TNF-α単独の値と比較）。図４Ｂは、IL-6タンパク質の誘導を定量的に示すグラフである： *, P <0.01（TNF-α単独の値と比較）。
【図５】HUVECにおけるPEDF遺伝子発現に対するTNF-αの効果を示す。下のパネルはPEDF遺伝子の誘導を定量的に示したものである。データはβ-アクチンmRNA由来シグナルの強度によってノーマライズし、対照の値と対比させた。Unpaired t testを行った； p<0.05 を有意であると判断した：*, P <0.01 （対照細胞の値と比較）。
【図６】HUVECに対する精製PEDFタンパク質（ＡおよびＢ）およびTNF-α（Ｃ）の結合を示す。図６Ａはフルオレセン標識PEDFによるリガンドブロットである。図６Ｂは、PEDF結合プロファイルを示すグラフである。図６Ｃは、HUVECにおけるTNF-α結合に対するPEDFの効果を示すグラフである。
【図７】HUVECにおけるアンジオテンシンII（AngII）誘発性NF-κB活性に対するPEDFの効果を示すグラフである：＊印は、AngII単独処理群に対して、P <0.05で有意であることを示す。
【図８】HUVECにおけるAngII誘発性MCP-1 mRNAおよびタンパク質レベル上昇に対するPEDFの効果を示すグラフである：＊印は、AngII単独処理群に対して、P <0.01で有意であることを示す。図８ＡはMCP-1 mRNAに対するPEDFの効果を、図８ＢはMCP-1タンパク質に対するPEDFの効果をそれぞれ示すグラフである。
【図９】HUVECにおけるAngII誘発性分子内ROS発生に対するPEDFの効果を示すグラフである。図９ＡはAngIIによりROSが発生することを示し（＊印はAngII無処理群に対して、Ｐ＜0.01にて有意であることを示す）、図９ＢはそのROS発生をPEDFが抑制することを示している（＊、＊＊印はAngIIでの値に比べて、それぞれP<0.05、P<0.01で有意であることを示す）。
【図１０】HUVECにおけるAngII誘発性NADPHオキシダーゼ活性に対するPEDFの効果を示すグラフである（＊、＊＊印はAngIIでの値に比べて、それぞれP <0.05、P <0.01で有意であることを示す）。
【図１１】微小血管内皮細胞での細胞内活性酸素種の生成およびNADPHオキシダーゼ活性に対するPEDFの作用を示すグラフである（*はAGE-BSA処置群(図ではAGEsと表記されている)に対してP<0.01にて有意であることを示す）。
【図１２】微小血管内皮細胞における血清AGE分画に対する効果を示すグラフである(*はDM-HD群に対してPEDF投与群がP<0.01にて有意であることを示す)。
【図１３】AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対する静脈投与での効果を示すグラフである(*はPEDF投与群は非投与群に比べ、P<0.01にて有意であることを示す)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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