(57)【要約】【課題】プロテインキナーゼに属する新たな蛋白質、スプライス変異体をコードする遺伝子を提供すること。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ：  （ａ）特定のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列から成る蛋白質、（ｂ）上記特定のアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換または付加された  アミノ酸配列から成り、該プロテインプロテインキナーゼと実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質、  および上記ＤＮＡにコードされる組換え蛋白質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）の何れかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表２で示されるアミノ酸配列において、第１番から第１８９番の新規な領域を含む蛋白質をコードするＤＮＡまたは配列表４の新規な蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列表１で示される第１番から第６６８番の新規なエクソン領域を含むＤＮＡまたは配列表３で示される、コード領域を含む新規なＤＮＡ。
（ｃ）配列表２または配列表４における新規な領域のアミノ酸配列中１もしくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列表２または配列表４と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列表１または配列表３における新規な領域を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列表２または配列表４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載の、配列表２または配列表４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質またはペプチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＤＮＡが挿入されたベクター
【請求項５】
請求項１または２に記載のＤＮＡ、または請求項４に記載のベクターを保有する宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、
請求項３に記載の蛋白質またはそのペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項３に記載の蛋白質に結合する抗体。
【請求項８】
請求項１に記載の、配列表１または配列表３に記載の新規な領域からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも
１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３に記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、  （ｂ）該蛋白質またはその部分ペプチドと披検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なプロテインキナーゼおよびプロテインキナーゼスプライス変異体をコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞が恒常性を維持し、かつ必要に応じて正常に分化・増殖し、更に組織レベルでの機能を発揮していくためには、細胞が持つ様々な生理機能が正しく調和して制御されなければならない。その様な制御機能の多くにおいて、蛋白質リン酸化酵素による蛋白質のリン酸化が中心的な役割を果たしている事がよく知られている。
【０００３】
真核細胞のリン酸化反応は、プロテインキナーゼによりＡＴＰのγ位の高エネルギーリン酸基が特定の蛋白質の特定の残基に蛋白質リン酸化酵素（以下プロテインキナーゼという）により転移することにより行われているが、現在までに多数のプロテインキナーゼ遺伝子が同定されており、それらは構造的によく保存された非常に大きい蛋白質ファミリーを構成している事が明らかとなっている。
【０００４】
【非特許文献１】
ハンクス（Ｈａｎｋｓ）
ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９９５  Ｍａｙ；  ９：  ５７６−９６
【０００５】
【非特許文献２】
マンニング（Ｍａｎｎｉｎｇ  ）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３  Ｄｅｃ；  ２９８：  １９１２−３４リン酸化反応は、分子の立体構造を変化させ、その性質を瞬時に変化させることから、生体内反応の制御において非常に重要な反応である。蛋白質のリン酸化は、ホルモン、神経伝達物質、増殖や分化の因子などの細胞外からのシグナルや、細胞周期のチェックポイント、環境や栄養ストレスにより起こる。リン酸化されることにより、活性化する蛋白質としては、代謝酵素や、制御蛋白質、受容体、細胞骨格蛋白質、イオンチャンネルまたはイオンポンプ、転写因子があげられる。
このように、プロテインキナーゼは、蛋白質にリン酸基を転移することにより、いろいろな細胞の増殖、分化、シグナル伝達を制御している。
【０００６】
【非特許文献３】
フンター  （Ｈｕｎｔｅｒ）Ｔ．，Ｃｅｌｌ  １９８７  Ｓｅｐ  １１；５０（６）：８２３−９
このシグナル伝達の異常により、炎症、癌、動脈硬化、乾癬症などの病気が引き起こされることも判っている。
【０００７】
【非特許文献４】
フンター（Ｈｕｎｔｅｒ）  Ｔ．，Ｈａｒｖｅｙ  Ｌｅｃｔ  １９９８−９９；９４：８１−１１９。
【０００８】
以上のような種々の生理反応が細胞中に多数存在するプロテインキナーゼにより細かく制御されており、従ってプロテインキナーゼに作用する薬剤はレセプターアゴニストやレセプターアンタゴニストなどに代表される既存の薬剤よりも、より緻密に生理機能を抑制し得る可能性を持つものと考えられる。プロテインキナーゼ作用薬は、望ましくない副作用を主作用からより解離させる事が可能な、有益性の高い医薬品となり得る事が期待される。
【０００９】
現在までに既に多数のプロテインキナーゼが単離され、研究されているもののいまだ同定されていないものも多数存在するものと予想される。また、遺伝子が単離されているものについても、それぞれのプロテインキナーゼが関わる細胞内生理機能についての知識はいまだ非常に乏しく、そのほとんどのは解明されていない状態であると言える。新たプロテインキナーゼを同定し、その生理機能を解明する事により、新たな医薬品の開発や治療法の開発に重要な進展がもたらされる事が期待される。
【００１０】
また、プロテインキナーゼの中には、その転写後の成熟過程でエクソンの領域および組合せ、あるいはそのどちらかを変化させることにより、一定領域で異なるアミノ酸配列を持つペプチドを作製するものが多数ある（以下スプライス変異体と称する）。プロテインキナーゼにはスプライス変異体毎に基質特異性などを変化させ、細胞内でのシグナル伝達経路において異なる役割を果たすと考えられているものが多数知られている［例えば、ＭＫＫ３（Ｅｎｓｌｅｎ  ｅｔ．ａｌ．  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０００  Ｍａｒ；  １９（６）：  １３０１−１１）、ＩＲＡＫ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２００１；  ２７６  （３１）：  ２９０３７−４４）、ｐ３８α（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２００２；  ２９１：  ８３８−４３）、ＤＣＬＫ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００２；  ２７７（２０）：  １７６９６−７０５）、  ＰＤＫ−１β（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．）、  ＣＫ１α（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００２；  ８６（４）：８０５ー１４）、ＪＮＫ（  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ２００３；  ３７０：１５９−６６）、ＳＴＥ２０（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ２００３  Ｍａｒ；  ２３（６）：  ２０６８−８２）］。これら多数の例に示される様に、細胞の機能や恒常性の維持においてプロテインキナーゼは遺伝子毎のみならず、それらの変異体毎に極めて精密に制御されており、新しい変異体の発見や生理機能の解析は病態の理解、新たな医薬品の開発や治療法の開発に重要な進展をもたらす事が期待される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、上述した如く多大な有用性を有するプロテインキナーゼに属する新たな蛋白質の探索を種々行った。その結果、ヒト小脳および
ヒト精巣由来のｃＤＮＡライブラリーから新規なプロテインキナーゼ遺伝子、および新規プロテインキナーゼスプライス変異体を同定することに成功し、
本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、新規なプロテインキナーゼ蛋白質、新規なプロテインキナーゼスプライス変異体ならびに該蛋白質をコードする遺伝子、
加えてそれらの製造方法および用途の提供を課題とする。
【００１３】
【発明の開示】
本発明は、ヘリックス研究所によって単離され、
構造が決定されたクローン（以下ヘリックスクローンという；特願平１１ー２４８０３６、特願２０００ー１１８７７６、
特願２０００ー１８３７６７）からプロテインキナーゼ様構造を持つクローンを選択する事によって達せられる。このヘリックスクローンは、
［１］オリゴキャップ法による全長率の高いｃＤＮＡライブラリーの作製および
［２］５’末端側の配列からの全長性の評価システム（ＥＳＴに対して非全長でないものを除いた後、クラスター化して代表配列を選択）
との組み合わせによって取得された、全長である確率の高いクローンである。
また、ｃＤＮＡは哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込まれているため、直ちに細胞における発現実験を行う事が可能であるなどの  利点を有する。
【００１４】
従って、本発明者等は、ほん既知のプロテインキナーゼ触媒ドメインの隠れマルコフモデル検索をヘリックスクローンの全てに対して行い、
更に配列の新規性に関する検討から、２個のクローン「Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３」、  「Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７」を選択した。これらには、ヒト新規蛋白質および既知プロテインキナーゼの  新規スプライス変異体をコードするｃＤＮＡが含まれている。
既知のプロテインキナーゼは、その多数が細胞内の様々なシグナル伝達経路に関わっている事が知られており、今回見出したプロテインキナーゼ様構造を持つ  クローンも同様に、何らかのシグナル伝達経路に関わっている可能性が考えられる。
これらは、更にレポーター遺伝子を用いたアッセイ系、あるいはＲＮＡｉなどを用いた実験において  評価していく事により、その生理機能を類推し、創薬標的分子としてのポテンシャルを探る事が可能であると考えられる。
【００１５】
上記の如く、本発明者等は、新規なプロテインキナーゼ蛋白質、新規スプライス変異体ならびに該蛋白質をコードする遺伝子、
加えてそれらの製造および用途に関し、より具体的には
（Ａ）下記（ａ）から（ｄ）の何れかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表２で示されるアミノ酸配列において、第１番から第１８９番の新規な領域を含む蛋白質をコードするＤＮＡまたは配列表４の新規な蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１６】
（ｂ）配列表１で示される第１番から第６６８番の新規なエクソン領域を含むＤＮＡまたは配列表３で示される、コード領域を含む新規なＤＮＡ。
（ｃ）配列表２または配列表４における新規な領域のアミノ酸配列中１もしくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列表２または配列表４と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
（ｄ）配列表１または配列表３における新規な領域を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、配列表２または配列表４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
（Ｂ）Ａに記載の、配列表２または配列表４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）ＡまたはＢに記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質またはペプチド。
（Ｄ）ＡまたはＢに記載のＤＮＡが挿入されたベクター
（Ｅ）ＡまたはＢに記載のＤＮＡ、またはＤに記載のベクターを保有する宿主細胞。
（Ｆ）Ｅに記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、
Ｃに記載の蛋白質またはそのペプチドの製造方法。
（Ｇ）Ｃに記載の蛋白質に結合する抗体。
（Ｈ）Ａに記載の、配列表１または配列表３に記載の新規な領域からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも  １５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（Ｉ）Ｃに記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、  （ｂ）該蛋白質またはその部分ペプチドと披検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法。
を提供するものである。
【００１９】
本発明は、新規なプロテインキナーゼスプライス変異体をコードするヒト由来遺伝子「Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３」および新規プロテインキナーゼをコードするヒト由来遺伝子「Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７」を提供する。ヒト由来遺伝子「Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３」ｃＤＮＡの塩基配列を配列表１に、該ｃＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列表２に示す。ヒト由来遺伝子「Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７」ｃＤＮＡの塩基配列を配列表３に、該ｃＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列表４に示す。配列表１に示す「Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３」は４５７アミノ酸よりなる蛋白質をコードするＯＲＦを有し、また配列表３に示す「Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７」は４８３アミノ酸からなる蛋白質をコードするＯＲＦを有する。
【００２０】
本発明はまた本発明蛋白質（配列表２または配列表４）と機能的に同等な蛋白質を包含する。このような蛋白質には、例えば本発明蛋白質の置換変異体ホモローグなどが含まれる。本願明細書では、置換変異体とは１以上５０アミノ酸以内、特に１０アミノ酸以下の変異、挿入および欠失を含む変異体を含む。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質が本発明蛋白質と同様に、蛋白質をリン酸化する機能を有する事を指す。目的の蛋白質が、蛋白質をリン酸化するか否かは以下の手法により判定する事が出来る。
【００２１】
プロテインキナーゼ蛋白質と基質蛋白質を適当な反応液中で混合し、ＡＴＰ存在下で反応を行った後、基質蛋白質のリン酸化状態を測定することにより、リン酸化活性を判定することができる。プロテインキナーゼ蛋白質は適当な細胞株や、組織の抽出物から一般的な生化学的な方法により精製したものを使用することができる。また、哺乳動物細胞（ＣＯＳ７、ＣＶ−１、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３など）や、昆虫細胞（Ｓｆ９など）、エシェリヒア属菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母などにプロテインキナーゼ蛋白質を発現する遺伝子を導入し、大量発現させたプロテインキナーゼ蛋白質を用いることもできる。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰなどの、放射性同位元素で標識されたＡＴＰを用いることにより、基質蛋白のリン酸化状態を、液体シンチレーションカウンターや、オートラジオグラフィーなどにより測定することができる。
【００２２】
また、リン酸化蛋白特異的抗体などを用い、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）や、ウエスタンブロット法などにより基質蛋白のリン酸化状態を測定することができる。基質蛋白としては、特定のプロテインキナーゼに特異的な蛋白質を用いることもできるし、一般にプロテインキナーゼの基質として利用されるカゼインや、ヒストン、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）といった蛋白質を用いることもできる。あるいは、リン酸化される配列を持つ合成ペプチドなども用いることができる。
【００２３】
更に、プロテインキナーゼ蛋白質自身のリン酸化（自己リン酸化）を測定することによってもリン酸化活性を判定することもできる。より具体的には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｈａｒｄｉｅ  ＤＧ．等  著、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．、１９９３）などの成書に記載の一般的な方法に従って行うことができる。
【００２４】
ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための方法として、蛋白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、本発明蛋白質（配列表２または配列表４）のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明蛋白質（配列表２または配列表４）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内）であると考えられる。
【００２５】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。
例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、  親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、  脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、  水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、  硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、  カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、  塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、  芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）  を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。
【００２６】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００２７】
本発明蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、本発明蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質は、本発明蛋白質と他のペプチドまたは蛋白質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合蛋白質を作製する方法は、公知の方法により本発明蛋白質（配列表２または配列表４）をコードするＤＮＡと他のペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡを適宜フレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチドまたは蛋白質としては、特に限定されない。
【００２８】
本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、（６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる）６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃの断片などの公知のペプチドを使用することができる。  また、本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合蛋白質）などが挙げられる。市販されているこれらペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡを本発明の蛋白質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合蛋白質を調製することができる。
【００２９】
また、ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製する他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、本発明蛋白質をコードするＤＮＡ配列（配列表１または配列表３）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから本発明蛋白質と機能的に同等な蛋白質を単離することも通常行いうることである。本発明には、本発明蛋白質をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードし、本発明蛋白質と機能的に同等な蛋白質が含まれる。このような蛋白質としては、例えば、ヒトおよび他の哺乳動物のホモログ（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシなどがコードする蛋白質）が挙げられる。
【００３０】
本発明蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件として、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、これら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ハイブリダイゼーションの条件に関するさらなる指針は、例えばサムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）、およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）により容易に入手可能である。
【００３１】
また、ハイブリダイゼーションにかえて、本発明蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表１または配列表３）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して単離することも可能である。
【００３２】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、本発明蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、通常、本発明蛋白質（配列表２または配列表４）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の蛋白質には、本発明蛋白質と機能的に同等であり、かつ配列表２または配列表４に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有する蛋白質も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも６５％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、更に好ましくは８５％以上の同一性、最も好ましくは９５％以上の同一性を指す。蛋白質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
【００３３】
本発明の蛋白質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた蛋白質が、本発明の蛋白質と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の蛋白質を原核細胞、例えばエシェリヒア属菌で発現させた場合、本来の蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明の蛋白質にはこのような蛋白質も包含される。
【００３４】
本発明の蛋白質は、公知の方法により、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質であれば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば配列表１または配列表３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の蛋白質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または更にこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
【００３５】
また、本発明の蛋白質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として宿主細胞（例えば、動物細胞やエシェリヒア属菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
【００３６】
天然の蛋白質であれば、例えば、本発明の蛋白質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明の蛋白質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００３７】
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、更に好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明の蛋白質に対する抗体の作製、本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明の蛋白質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。また、本発明の蛋白質のアンタゴニストや競合阻害剤になり得る。本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
【００３８】
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、上述したような本発明の蛋白質のｉｎｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明の蛋白質により治療可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明の蛋白質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明の蛋白質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
【００３９】
本発明のＤＮＡは、公知の方法により調製することができる。例えば、本発明の蛋白質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列表１または配列表３）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明の蛋白質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列表１または配列表３）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
【００４０】
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明の蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
【００４１】
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明の蛋白質を発現する細胞、組織、臓器から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）などにより全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などを使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
【００４２】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）などを用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマーなどを用いて、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
【００４３】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。更に、これより組換えベクターを作製し、エシェリヒア属菌などに導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
【００４４】
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）および／または終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入などが挙げられる。
【００４５】
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列表１の塩基配列において１０２位の塩基Ａから１４７２位の塩基ＧからなるＤＮＡを包含する。また、配列表３の塩基配列において３６位の塩基Ａから１４５１位の  ＧからなるＤＮＡを包含する。
【００４６】
本発明のＤＮＡはまた、配列表１の新規性のある領域または配列表３に示す塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ上記本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを含む。ハイブリダイゼーションにおける条件は適宜選択することができるが、具体的には上記した条件を用いることができる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡを得ることができる。上記のハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくは天然由来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡである。
【００４７】
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。
本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明の蛋白質を発現させるために有用である。
【００４８】
ベクターとしては、例えば、エシェリヒア属菌を宿主とする場合には、ベクターをエシェリヒア属菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、エシェリヒア属菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、更に形質転換されたエシェリヒア属菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。
【００４９】
本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、エシェリヒア属菌での発現を目的とした場合は、ベクターがエシェリヒア属菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどのエシェリヒア属菌とした場合においては、エシェリヒア属菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
【００５０】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、エシェリヒア属菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００５１】
エシェリヒア属菌以外にも、例えば、本発明の蛋白質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（インビトロゲン社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
【００５２】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば更に好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
【００５３】
更に、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）などの由来のものを用いることもできる。更に、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンプロテインキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、エシェリヒア属菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子などを含むことができる。
【００５４】
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明の遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えば、ｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
【００５５】
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、エシェリヒア属菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の蛋白質の製造や発現のための産生系として使用することができる。蛋白質製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００５６】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
【００５７】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
【００５８】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、エシェリヒア属菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１などが挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
【００５９】
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより蛋白質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）などの血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であることが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
【００６０】
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に、目的とするＤＮＡを導入し、動物または植物の体内で蛋白質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
【００６１】
動物を使用する場合、哺乳類動物を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
【００６２】
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
【００６３】
また、上記において昆虫を使用することもできる。例えば、カイコを用いる場合、目的の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、
このカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）  ３１５，５９２−５９４）。
【００６４】
更に、植物を使用する場合、例えば、タバコを用いることができる。
タバコを用いる場合、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えば、ｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、
このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のような  バクテリアに導入する。
このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、
本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
【００６５】
これにより得られた本発明の蛋白質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な蛋白質として  精製することができる。  蛋白質の分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、免疫沈降、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶などを適宜選択、組み合わせれば蛋白質を分離、  精製することができる。
【００６６】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが挙げられる。
これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーを用いて  行うことができる。
本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された蛋白質も包含する。
【００６７】
なお、蛋白質を精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的に  ペプチドを除去することもできる。  蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインプロテインキナーゼ、  グルコシダーゼなどが用いられる。
【００６８】
本発明は、また、本発明の蛋白質と結合する抗体を提供する。
本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。
また、ウサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体および  モノクローナル抗体、更にヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
【００６９】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明の蛋白質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、
例えばヒト、マウス又はラット由来の蛋白質が好ましく、特にヒト由来の蛋白質が好ましい。
ヒト由来の蛋白質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
【００７０】
本発明において、感作抗原として使用される蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、また、
蛋白質の部分ペプチドであってもよい。  蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、蛋白質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。
本願明細書で述べる「抗体」とは蛋白質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
【００７１】
本発明の蛋白質またはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターによって  本願明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的の蛋白質またはその断片を公知の方法で得て、  これらを感作抗原として用いればよい。  また、蛋白質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明の蛋白質を感作抗原として使用してもよい。
短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリア蛋白質と  適宜結合させて抗原とすることが好ましい。
【００７２】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して  選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
【００７３】
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどが使用される。
ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。  霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。
サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジーなどが使用される。
【００７４】
感作抗原を哺乳動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。
一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射する。
具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩液などで適当量に希釈、
懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。更に、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。
また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
【００７５】
ここで、本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、
抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。  この血液から公知の方法により血清を分離する。
ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む  画分を更に単離して、これを使用してもよい。
例えば、本発明の蛋白質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、更にこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを  調製することができる。
【００７６】
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、
哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。  この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による  融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
【００７７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，  Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）などに準じて  行うことができる。
【００７８】
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、
アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。
当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、  通常、数日〜数週間継続して行う。
次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
【００７９】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染した
ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質、蛋白質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有する
ミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを  得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
【００８０】
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、
例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明の蛋白質を  カップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。
本発明の抗体は、本発明の蛋白質の精製、検出に用いられる他、本発明の蛋白質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。
また、この抗体を本発明の蛋白質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。
得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
【００８１】
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となる蛋白質、蛋白質発現細胞またはその  溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて蛋白質に対する  ヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、  ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
【００８２】
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球などの免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により  不死化させた細胞を用いてもよい。
【００８３】
このようにして得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる  （例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。
組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマまたは抗体を産生する感作リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、
適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。
本発明は、この組換え型抗体を包含する。
【００８４】
更に、本発明の抗体は、本発明の蛋白質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってもよい。
例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた  シングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  （１９８８）８５，５８７９−５８８３参照）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする  遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，  Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （１９９１）９，１３２−１３７参照）。
【００８５】
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。  このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。
これらの方法はこの分野において既に確立されている。
【００８６】
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなる  キメラ抗体または非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）および  定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
【００８７】
前記のようにして得られた抗体は、均一にまで精製することができる。
本発明で使用される抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などを適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる  （Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）が、これらに限定されるものではない。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定またはＥＬＩＳＡなどにより行うことができる。
【００８８】
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。
例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．  （ファルマシア社製）などが挙げられる。
【００８９】
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが挙げられる  （Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６参照）。
これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００９０】
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、
ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。
ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明の蛋白質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、
例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。
酵素、例えば、アルカリフォスファターゼなどで標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、
次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
【００９１】
蛋白質として蛋白質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片を使用してもよい。
本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（ファルマシア社製）を使用することができる。
【００９２】
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の蛋白質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、
該抗体と該蛋白質との免疫複合体を検出または測定することからなる、本発明の蛋白質の検出または測定方法を実施することができる。
本発明の蛋白質の検出または測定方法は、蛋白質を特異的に検出または測定することができるため、蛋白質を用いた種々の実験などに有用である。
【００９３】
本発明は、また、本発明蛋白質をコードするＤＮＡ（配列表１の新規性のある領域または配列表３）またはその相補鎖に相補的な少なくとも  １５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【００９４】
ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。
また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも  ７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、更に好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。
相同性を決定するためのアルゴリズムは本願明細書に記載したものを使用すればよい。
【００９５】
このような核酸には、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該ＤＮＡの発現を  検出するためのプローブやプライマー、本発明の蛋白質の発現を制御するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体  （例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡなど）が含まれる。
また、このような核酸は、ＤＮＡチップの作製に利用することもできる。
【００９６】
プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的とし、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００９７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列表１の新規性のある領域または配列表３の塩基配列中のいずれかの箇所に  ハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表１の新規性のある領域または配列表３の塩基配列中の連続する少なくとも  １５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。  更に好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。
修飾体として、例えばメチルホスホネート型またはエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、
ホスホロチオエート修飾体またはホスホロアミデート修飾体などが挙げられる。
【００９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て  相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列表１の新規性のある領域または配列表３に示される  塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１または複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
【０１００】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明の蛋白質の産生細胞に作用して、該蛋白質をコードするＤＮＡまたは  ｍＲＮＡに結合することにより、その転写または翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明の蛋白質の発現を  抑制することにより、結果的に本発明の蛋白質の作用を抑制する効果を有する。
【０１０１】
本発明の蛋白質は、これに結合する化合物のスクリーニングに有用である。  すなわち、本発明の蛋白質と、該蛋白質に結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、そして本発明の  蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する、ことからなる本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方法において  使用される。
【０１０２】
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。
また部分ペプチドであってもよい。  また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。
被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、
精製もしくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。
被検試料を接触させる本発明の蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、
他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。
【０１０３】
本発明の蛋白質を用いて、例えば該蛋白質に結合する蛋白質をスクリーニングする方法としては、公知の多くの方法を  用いることが可能である。  このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。  具体的には、以下のように行うことができる。
本発明の蛋白質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ  Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに  挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。  発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１  （１９８２）），ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ  ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），  ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），  ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，ｐ．６８４−７０４  （１９８７），ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６  （１９８８）），ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒなどの一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
【０１０４】
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７）参照）、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７）参照）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５）参照）、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，２３０−２３４（１９９３）参照）などの方法があるが、いずれの方法によってもよい。
【０１０５】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明の蛋白質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合蛋白質として本発明の蛋白質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学  １３，８５−９０（１９９５）参照）。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などとの融合蛋白質を発現することができるベクターが市販されている。
【０１０６】
融合蛋白質にすることにより本発明の蛋白質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合蛋白質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０蛋白質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明の蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学  １３，８５−９０（１９９５）参照）。
【０１０７】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明の蛋白質、それと結合能を有する蛋白質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明の蛋白質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明の蛋白質に対する抗体は、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を適当なエシェリヒア属菌発現ベクターに導入してエシェリヒア属菌内で発現させ、発現させた蛋白質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
【０１０８】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明の蛋白質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合蛋白質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明の蛋白質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
【０１０９】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）参照）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
【０１１０】
免疫沈降された蛋白質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることで蛋白質の分子量により結合していた蛋白質を解析することができる。また、この際、一般的には本発明の蛋白質に結合した蛋白質は、クマシー染色や銀染色といった蛋白質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内の蛋白質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。蛋白質の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的の蛋白質を精製し、その配列を決定することもできる。
【０１１１】
また、本発明の蛋白質を用いて、該蛋白質に結合する蛋白質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０参照）を用いて行うことができる。すなわち、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、肝臓や腎臓）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させた蛋白質を固定し、精製して標識した本発明の蛋白質と上記フィルターとを反応させ、本発明の蛋白質と結合した蛋白質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明の蛋白質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明の蛋白質または本発明の蛋白質に融合したペプチドまたはポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法または蛍光を利用する方法などが挙げられる。
【０１１２】
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ  （１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製）参照）を用いて行う方法が挙げられる。２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明の蛋白質と結合する蛋白質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡをエシェリヒア属菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードする蛋白質を得ることができる。これにより本発明の蛋白質に結合する蛋白質またはその遺伝子を調製することが可能である。２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）遺伝子などが挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
【０１１３】
本発明の蛋白質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明の蛋白質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物などが挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明の蛋白質に結合した蛋白質を調製することができる。
【０１１４】
得られた蛋白質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０１１５】
本発明において、結合した化合物を検出または測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明の蛋白質と被検化合物との間の相互作用を微量の蛋白質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明の蛋白質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
【０１１６】
また、蛋白質に限らず、本発明の蛋白質に結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明の蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９参照）が知られている。
【０１１７】
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、本発明の蛋白質の活性を調節するための薬剤の候補となり、本発明の蛋白質の発現異常や機能異常などに起因する疾患や本発明の蛋白質の活性を制御することにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。本発明のスクリーニング方法を用いて単離しうる化合物の構造の一部を、付加、欠失および／または置換により変換される物質も、本発明の蛋白質に結合する化合物に含まれる。
【０１１８】
本発明の蛋白質、または本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物をヒトや動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、蛋白質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【０１１９】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料に更に油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【０１２０】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩液、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【０１２１】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【０１２２】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に適宜投与することができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、症状に応じて適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、適当な投与量を適宜選択して使用可能である。
【０１２３】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト組織より全ＲＮＡとして抽出されたｍＲＮＡを購入した。以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来、購入先」の順に示した。
【０１２４】
ＢＲＡＣＥ：小脳（Ｂｒａｉｎ，ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ），  クローンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＃６４０３５−１）
ＴＥＳＴＩ：精巣（Ｔｅｓｔｉｓ）、クローンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＃６４０２７−１）それぞれのＲＮＡよりオリゴキャプ法［Ｍ．  Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｓｕｇａｎｏ，  Ｇｅｎｅ，  １３８：  １７１−１７４  （１９９４）］を改良した方法（国際特許公報ＷＯ  ０１／０４２８６）によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。オリゴキャップ  リンカー（Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒ、配列番号：５）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ、配列番号：６）を用いて、同公報に記載したようにＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次いで、５’（配列番号：７）と３’（配列番号：８）のＰＣＲプライマーを用いＰＣＲ  （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩで切断した。次いで、通常は２ｋｂ以上に分画したｃＤＮＡ断片をＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（図１参照）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
（２）オリゴキャップ法で作製したｃＤＮＡライブラリーからのクローンの５’−末端の全長性の評価
これらより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬〔ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  バイオシステム社（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製〕を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００，バイオシステム社製）でＤＮＡ塩基配列を解析し、得られたデータをデータベース化した。
【０１２５】
オリゴキャップ法を改良した方法で作製したヒトｃＤＮＡライブラリーの５’−末端の全長率を次の方法で求めた。公共データベース中のヒト既知ｍＲＮＡと５’−末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知ｍＲＮＡ配列より長く５’−末端が伸びている場合、または５’−末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。これをもとに５’−末端の全長率
［全長クローン数／（全長クローン数＋非全長クローン数）］
を計算した。この結果、５’−末端の全長率は、どちらのｃＤＮＡライブラリーも約９０％であった。この結果より、オリゴキャップ法で取得したヒトｃＤＮＡライブラリーからのクローンの５’−端配列の全長率が非常に高いことが分かった。
実施例２
ｃＤＮＡクローン末端配列解析と全長塩基配列解析クローンの選択
各ｃＤＮＡライブラリーより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’末端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｄ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，バイオシステム社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００，バイオシステム社製）で解析した。得られたデータについてはデータベース化を行った。
【０１２６】
解析されたｃＤＮＡクローンの５’末端配列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅのｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓの表記があるデータを対象にしたＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、ヒトのｍＲＮＡ配列に同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、相同性９０％以上かつコンセンサス配列が５０塩基対以上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させた。グループ内の、より５’−側に長いクローンを選択し、選択されたクローンについては必要に応じ３’末端配列を５’末端配列と同様の方法で解析取得した。取得された末端配列のデータを解析し、５’末端と３’末端の配列でコンティグを作るクローンは除いた。更に再度前記と同様にＢＬＡＳＴによる相同性検索によりヒトのｍＲＮＡ配列に同一なものは除いた。こうして選択したクローンより全長塩基配列解析を行うクローンを得た。
実施例３
全長塩基配列解析
全長塩基配列解析に選抜されたクローンについて各々全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は、主にカスタム合成ＤＮＡプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成ＤＮＡプライマーを用い、バイオシステム社製のＤＮＡシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてＤＮＡ塩基配列を解析した。場合によっては、リコール（Ｌｉｃｏｒ）社製ＤＮＡシーケンサーも利用した。次に、決定された全長塩基配列から、蛋白質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。ＢＲＡＣＥのｃＤＮＡライブラリーよりＢＲＡＣＥ２０４７５７３を、ＴＥＳＴＩのｃＤＮＡライブラリーよりＴＥＳＴＩ２０５３６６７を選択した。
実施例４
キナーゼ様の配列を有するクローンの選択
ヘリックスクローンの核酸配列を先ず標準遺伝子コード（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）を用いてペプチド配列に変換し、その中から連続して２００アミノ酸以上よりなるペプチド配列のみから成るデータベースを作成した。該データベースに対し、キナーゼ触媒ドメインを表す隠れマルコフモデルＰＦ０００６９（ＰＦＡＭデータベース）をクエリーとし、Ｗｉｓｅ２．０（ｅｓｔｗｉｓｅｄｂ）により全ヘリックスクローンに対するホモロジー検索を試みた。期待値（Ｅｘｐｅｃｔ）が０．０１以下を示すクローンのみを選択した。その結果１９６個のクローンにキナーゼ触媒活性ドメインが検出された。
得られたクローンに関してＮＣＢＩ
ＢＬＡＳＴを用いて蛋白データベース〔ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ）、ｒｅｆｓｅｑ（ＮＣＢＩ）、Ａａｇｅｎｅｓｅｑ（ダウエント社）〕に対する相同性検索を実施した。その結果、２クローン「Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３」および「Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７」の２クローンを、キナーゼ様構造を持ち、かつ配列に新規性を持つクローンとして選択した。
本件クローンと既知の遺伝子との相同性検索の結果のトップヒット遺伝子とのアラインメントを図２および図３に示す。
【０１２７】
「Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３」は、その配列にヒト新規蛋白質をコードしており、プロテインキナーゼとして機能していることが推察された。
【０１２８】
「Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７」は、その配列にヒト新規蛋白質をコードしており、プロテインキナーゼとして機能していることが推察された。
【０１２９】
また、これらの遺伝子が以下の様にヒトゲノム配列上にマッピングすることによりヒト遺伝子である事を確認し、さらに第一エクソン上流の構造に転写開始シグナルの同定を試みた。
ヒトゲノム配列は２００３年４月１４日に公開されたヒトゲノム配列（ｃｈｒ１．ｆａ〜ｃｈｒ２２．ｆａ、ｃｈｒＸ．ｆａ、ｃｈｒＹ．ｆａおよびｕｎｐｌａｃｅｄ＃ｃｏｎｔｉｇｓ．ｆａ；ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＃ｓａｐｉｅｎｓ／Ａｐｒｉｌ＃１４＃２００３／）を用いた。「Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０３７５７３」および「Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７」のＤＮＡ配列をそれぞれＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行いマッピングを試みた。マッピングの結果をそれぞれ表１および表２に示す。
【０１３０】
【表１】
2005046024.tif 000002
【０１３１】
Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３のクロモゾーム上の位置を特定するため配列番号：１をクエリーとしてヒトゲノム配列データベース（Ａｐｒ．１４，２００３）に対してＢＬＡＳＴ検索を実施した。得られた結果を通常期待されるエクソン−イントロン境界（ＧＴ−ＡＧルール）に矛盾しないよう手動で再配置した。その結果配列番号：１の全ての領域で合理的な一致が得られた。
【０１３２】
【表２】
2005046024.tif 000003
【０１３３】
Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７のクロモゾーム上の位置を特定するため配列番号：１をクエリーとしてヒトゲノム配列データベース（Ａｐｒ．１４，２００３）に対してＢＬＡＳＴ検索を実施した。得られた結果を通常期待されるエクソン−イントロン境界（ＡＧ−ＧＴルール）に矛盾しないよう手動で再配置した。その結果配列番号：３の全ての領域で合理的な一致が得られた。
また、転写開始点周辺のＴＡＴＡシグナル、イニシエーター（ＩＮＲ）シグナルの位置を図４および図５に示す。
実施例１から４の結果より、本発明遺伝子はヒトの完全長蛋白質をコードしている事が示された。
実施例５
（１）「Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３」の発現頻度解析ははその塩基配列に含まれる新規性のある領域に特異的なプライマーセット５’（ｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔ  ｇｃｔｃｔｔｔｇｃｔ／配列番号：９）と３’（ｃｃｔｃｃｔｔａｇａ  ｃａｇａａｇｃｃｃｃ  ａｃａ／配列番号：１０）を用い、クローンテック社のＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  （ＭＴＣ（ＴＭ））  Ｐａｎｅｌｓ  Ｈｕｍａｎ  ＩおよびＨｕｍａｎ  ＩＩの合計１６組織由来ｃＤＮＡ（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸および末梢白血球）をＰＣＲ法により増幅する事により行った。ＤＮＡ合成酵素としてポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｒ００１Ａ；タカラバイオ株式会社）を用い、鋳型ｃＤＮＡ  ２．５ｎｇ、各プライマーを０．３μＭ、ｄＮＴＰを各０．１ｍＭを含む１倍希釈の酵素添付緩衝液となるよう調整した。各反応液は９２℃１分間の熱変性の後、９２℃１０秒、５８℃１０秒の温度サイクルを＜！−−標準化用遺伝子の、Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３およびＣ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７それぞれについて２５回、／／−−＞４３回＜！−−および３５回／／−−＞繰り返して増幅した。増幅産物は８％  アクリルアミドゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色後写真撮影することにより行った。
結果を図６に示す。
（２）「Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７」の発現頻度解析はその特異的プライマーセット５’（ｃａｔｔｔｇｃｔｇａ  ｇｃｃｃｔｃｔｃｔｔ  ｇｔ／配列番号：１１）と３’（ｇｃｔｇａｃｃｃｃａ  ｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇ  ｇｔ／配列番号：１２）を用い、クローンテック社のＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  （ＭＴＣ（ＴＭ））  Ｐａｎｅｌｓ  Ｈｕｍａｎ  ＩおよびＨｕｍａｎ  ＩＩの合計１６組織由来ｃＤＮＡを鋳型として上記と同様な方法で行った。但し、温度サイクルを３５回繰り返した。
結果を図６に示した。
（３）コントロール遺伝子としてＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を上記同様に各鋳型ｃＤＮＡから増幅した。増幅にはＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（４０２８６９；アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）に含まれるＧＡＰＤＨ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ＰｒｉｍｅｒとＧＡＰＤＨ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒを用い、上記と同様の条件で増幅した。但し、温度サイクルは２５回とした。
結果を図６に示した。
【０１３４】
【配列表】
2005046024.tif 000004
2005046024.tif 000005
2005046024.tif 000006
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2005046024.tif 000029
【０１３５】
【産業上の利用の可能性】
本発明により、新規なヒトプロテインキナーゼ蛋白質、および該蛋白質をコードする遺伝子が提供された。キナーゼによる蛋白質のリン酸化状態の調節は、細胞の正常な分化・増殖、および細胞レベルでの生理機能にとって中心的な役割を担っている。本発明の新規キナーゼ・フォスファターゼも細胞内生理機能に深く関わっているものと考えられることから、本発明の蛋白質は、医薬品開発の上で薬剤の標的分子として有用である。また、本発明の蛋白質に作用する薬剤は、従来のレセプターアゴニスト・アンタゴニストに代表される薬剤よりも、より緻密に細胞内生理機能を調節し得る有効な医薬品となることが期待される。
特に、Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３は胎盤において強い発現が見られ、従って発生期において、特に本クローンの由来から小脳の発生期において重要な役割を果たしている新規スプライス変異体である事が示唆された。これにより、特に発生期の異常の診断、治療にも特に有効な利用が期待される。
また、Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７に関しては、白血球、脾臓、胸腺の様に免疫系組織に特に強く見出され、精巣、胎盤のような発生関連組織、および膵臓、肺に若干の発現が見られた。従って、この遺伝子では発生期の異常の診断、治療および免疫疾患の診断、治療において特に有益な利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で作成したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３を示す。
【図２】ＣＬＵＳＴＡＬＷによるＣ−ＢＲＡＣＥ２０３７５７３とその相同性のトップヒット遺伝子とのアラインメントを示す。相同性のトップヒット遺伝子は、配列番号：２のペプチド配列をクエリーとして各データベース〔ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ）、ｒｅｆｓｅｑ（ＮＣＢＩ）及びＡａｇｅｎｅｓｅｑ（ダウエント社）〕に対するＢＬＡＳＴ検索を実施して得た。図中ｇｉ｜１０８６４６５０｜ｒｅｆはｒｅｆｓｅｑより得られたＰＫＣζ遺伝子の配列である。
【図３】ＣＬＵＳＴＡＬＷによるＣ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７とその相同性のトップヒット遺伝子とのアラインメントを示す。相同性のトップヒット遺伝子は、配列番号：２のペプチド配列をクエリーとして各データベース〔ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ）、ｒｅｆｓｅｑ（ＮＣＢＩ）及びＡａｇｅｎｅｓｅｑ（ダウエント社）〕に対するＢＬＡＳＴ検索を実施して得た。図中ｇｉ｜１０７２７２６４｜ｇｂはＧｅｎＰｅｐｔより得られた機能未知の遺伝子の配列である。
【図４】表３の結果の第一エキソンの上流にある転写開始シグナルを検討した。図５と共に、ゲノム中  ｕｎｐｌａｃｅｄ＃ｃｏｎｔｉｇｓ．ｆａ中ＮＴ＿０７７９８４．１の  ２７００１から２７８２０の領域を示す。図中配列の上部の数字は２７００１から数えた塩基の位置を示す。イニシエーター配列コンセンサス配列（Ｃ／Ｔ  Ｃ／Ｔ  Ａ  Ｎ  Ｔ／Ａ  Ｃ／Ｔ  Ｃ／Ｔ）および、その上流−４５から−２５の位置にあるＡＴリッチ領域の存在から予測された転写開始点は配列番号：１の５’末端と一致した。
【図５】表３の結果の第一エキソンの上流にある転写開始シグナルを検討した。図４と共に、ゲノム中  ｕｎｐｌａｃｅｄ＃ｃｏｎｔｉｇｓ．ｆａ中ＮＴ＿０７７９８４．１の  ２７００１から２７８２０の領域を示す。図中配列の上部の数字は２７００１から数えた塩基の位置を示す。イニシエーター配列コンセンサス配列（Ｃ／Ｔ  Ｃ／Ｔ  Ａ  Ｎ  Ｔ／Ａ  Ｃ／Ｔ  Ｃ／Ｔ）および、その上流−４５から−２５の位置にあるＡＴリッチ領域の存在から予測された転写開始点は配列番号：１の５’末端と一致した。
【図６】表３の結果の第一エキソンの上流にある転写開始シグナルを検討した。図７と共に、ゲノム中  ｃｈｒ１３．ｆａ中ＮＣ＿００００１３．５の  ２７７６０００１から２７７６０６８０の領域を示す。図中配列の上部の数字は２７７６０００１から数えた塩基の位置を示す。イニシエーター配列コンセンサス（Ｃ／Ｔ  Ｃ／Ｔ  Ａ  Ｎ  Ｔ／Ａ  Ｃ／Ｔ  Ｃ／Ｔ）およびその上流−３１の位置にあるＡＴリッチ領域の存在から予測された転写開始点は配列番号：１の５’末端と一致した。
【図７】表３の結果の第一エキソンの上流にある転写開始シグナルを検討した。図６と共に、ゲノム中  ｃｈｒ１３．ｆａ中ＮＣ＿００００１３．５の  ２７７６０００１から２７７６０６８０の領域を示す。図中配列の上部の数字は２７７６０００１から数えた塩基の位置を示す。イニシエーター配列コンセンサス（Ｃ／Ｔ  Ｃ／Ｔ  Ａ  Ｎ  Ｔ／Ａ  Ｃ／Ｔ  Ｃ／Ｔ）およびその上流−３１の位置にあるＡＴリッチ領域の存在から予測された転写開始点は配列番号：１の５’末端と一致した。
【図８】本発明遺伝子の発現頻度解析の結果をＰＣＲ増幅産物の泳動像として示す。Ｃ−ＢＲＡＣＥ２０４７５７３は胎盤において強い発現が見られた。また、Ｃ−ＴＥＳＴＩ２０５３６６７に関しては、白血球、脾臓、胸腺の様に免疫系組織に特に強く見出され、精巣、胎盤のような発生関連組織、および膵臓、肺に若干の発現が見られた。
【図１】
2005046024.tif 000030
【図２】
2005046024.tif 000031
【図３】
2005046024.tif 000032
【図４】
2005046024.tif 000033
【図５】
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【図６】
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【図７】
2005046024.tif 000036
【図８】
2005046024.tif 000037