(57)【要約】      （修正有）【課題】ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体の提供。【解決手段】ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体であって、前記酵素を（ｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の特定のアミノ酸配列と、（ｉｉ）第１番目のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）残基を含まない、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の特定のアミノ酸配列とからなるグループから選択され、実質的にマイトジェン活性がなく、前記酵素をコードするＤＮＡを含む、発現ベクターを用いて形質転換された細菌宿主細胞細菌宿主細胞を培養する工程と、培養された前記細菌宿主細胞を使用してＤＮアーゼＢ酵素を発現させる工程と、前記培養された細菌宿主細胞から前記酵素を精製する工程とを含む、製造方法によって製造される、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体であって、
前記酵素は、
（ａ）細菌宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）培養された前記細菌宿主細胞を使用してＤＮアーゼＢ酵素を発現させる工程と、
（ｃ）前記培養された細菌宿主細胞から前記酵素を精製する工程とを含む、製造方法によって製造される、実質的に精製された酵素であり、
前記細菌宿主細胞は、発現ベクターの中に組み込まれたＤＮＡによってコード化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢを検出可能な量で発現することを可能にする方法で、前記発現ベクターを用いて形質転換され、
前記発現ベクターは、適当な細菌宿主細胞に適合する制御配列の少なくとも１つと操作的に連結された前記ＤＮＡを含み、
前記ＤＮＡは、
（ｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列と、
（ｉｉ）第１番目のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）残基を含まない、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列とからなるグループから選択される、アミノ酸配列をコード化するＤＮＡを含み、
該ＤＮＡがコードする酵素は実質的にマイトジェン活性がない、
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体であって、
前記酵素は、
（ａ）細菌宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）培養された前記細菌宿主細胞を使用してＤＮアーゼＢ酵素を発現させる工程と、
（ｃ）前記培養された細菌宿主細胞から前記酵素を精製する工程とを含む、製造方法によって製造される、実質的に精製された酵素であり、
前記細菌宿主細胞は、発現ベクターの中に組み込まれたＤＮＡによってコード化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢを検出可能な量で発現することを可能にする方法で、前記発現ベクターを用いて形質転換され、
前記発現ベクターは、適当な細菌宿主細胞に適合する制御配列の少なくとも１つと操作的に連結された前記ＤＮＡを含み、
前記ＤＮＡは、（ｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号７のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号７のヌクレオチド配列のうち、アルギニン（Ｒ）残基をコードする最初の３個のヌクレオチド配列を含まないヌクレオチド配列とからなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含み、該ＤＮＡがコードする酵素は実質的にマイトジェン活性がない、
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体。
【請求項３】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体であって、
前記酵素は、
（１）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素、および／または
（２）リーダーペプチドとアミノ末端で融合したストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素を含み、
前記（１）および（２）のＤＮアーゼＢ酵素以外のタンパク質を実質的に含まない、実質的に精製された酵素であって、
（ａ）実質的にマイトジェン活性がなく、
（ｂ）ｐＨ７．５でＤＮアーゼ活性を示し、
（ｃ）等電点がｐＨ８．１３とｐＨ８．５５との間にあり、
（ｄ）見かけ分子量が２５，０００ダルトンで、
（ｉ）ジエチルアミノエチル  セルロースへの吸着および溶離により第１溶出物を得る工程と、（ｉｉ）第１溶出物のフェニル  アガロース上でのクロマトグラフィーにより第２溶出物を得る工程と、（ｉｉｉ）第２溶出物のヘパリン  アガロース上でのクロマトグラフィーにより第３溶出物を得る工程と、（ｉｖ）第３溶出物のクロマトフォーカシングにより、画分Ｉおよび／またはＩＩを含む、実質的に精製されたＤＮアーゼＢ酵素を得る工程とを含む方法によって製造される、
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合する抗体。
【請求項４】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
前記酵素は、
（ａ）細菌宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）培養された前記細菌宿主細胞を使用してＤＮアーゼＢ酵素を発現させる工程と、
（ｃ）前記培養された細菌宿主細胞から前記酵素を精製する工程とを含む、製造方法によって製造される、実質的に精製された酵素であり、
前記細菌宿主細胞は、発現ベクターの中に組み込まれたＤＮＡによってコード化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢを検出可能な量で発現することを可能にする方法で、前記発現ベクターを用いて形質転換され、
前記発現ベクターは、適当な細菌宿主細胞に適合する制御配列の少なくとも１つと操作的に連結された前記ＤＮＡを含み、
前記ＤＮＡは、（ｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列と、
（ｉｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列のうち、第１番目のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）残基を含まないアミノ酸配列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列をコード化するＤＮＡを含み、該ＤＮＡがコードする酵素は実質的にマイトジェン活性がない、
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項５】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
前記酵素は、
（ａ）細菌宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）培養された前記細菌宿主細胞を使用してＤＮアーゼＢ酵素を発現させる工程と、
（ｃ）前記培養された細菌宿主細胞から前記酵素を精製する工程とを含む、製造方法によって製造される、実質的に精製された酵素であり、
前記細菌宿主細胞は、発現ベクターの中に組み込まれたＤＮＡによってコード化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢを検出可能な量で発現することを可能にする方法で、前記発現ベクターを用いて形質転換され、
前記発現ベクターは、適当な細菌宿主細胞に適合する制御配列の少なくとも１つと操作的に連結された前記ＤＮＡを含み、
前記ＤＮＡは、（ｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号７のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号７のヌクレオチド配列のうち、アルギニン（Ｒ）残基をコードする最初の３個のヌクレオチド配列を含まないヌクレオチド配列とからなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含み、該ＤＮＡがコードする酵素は実質的にマイトジェン活性がない、
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項６】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
前記酵素は、
（１）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素、および／または
（２）リーダーペプチドとアミノ末端で融合したストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素を含み、
前記（１）および（２）のＤＮアーゼＢ酵素以外のタンパク質を実質的に含まない、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素であって、
（ａ）実質的にマイトジェン活性がなく、
（ｂ）ｐＨ７．５でＤＮアーゼ活性を示し、
（ｃ）等電点がｐＨ８．１３とｐＨ８．５５との間にあり、
（ｄ）見かけ分子量が２５，０００ダルトンで、
（ｉ）ジエチルアミノエチル  セルロースへの吸着および溶離により第１溶出物を得る工程と、（ｉｉ）第１溶出物のフェニル  アガロース上でのクロマトグラフィーにより第２溶出物を得る工程と、（ｉｉｉ）第２溶出物のヘパリン  アガロース上でのクロマトグラフィーにより第３溶出物を得る工程と、（ｉｖ）第３溶出物のクロマトフォーカシングにより、画分Ｉおよび／またはＩＩを含む、実質的に精製されたＤＮアーゼＢ酵素を得る工程とを含む方法によって製造される、
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項７】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーターを使用して前記ＤＮアーゼＢ以外のタンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）配列番号１０のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子のプロモーター配列に、前記ＤＮアーゼＢ遺伝子以外のストレプトコッカス・ピオゲネスのタンパク質の構造遺伝子を操作的に連結させる工程と、
（ｂ）前記構造遺伝子にコード化されたタンパク質を発現させる工程とを含む、ＤＮアーゼＢ以外のタンパク質を発現させる方法。
【請求項８】
前記タンパク質はストレプトコッカス・ピオゲネス中で発現される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質はストレプトコッカス・ピオゲネス以外の原核生物中で発現される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１０の配列を有する、実質的に精製されたＤＮアーゼＢ遺伝子のプロモーター配列。
【請求項１１】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素と会合するリーダーペプチドを使用して原核生物中でタンパク質を発現させる方法であって、
（１）アミノ酸配列（配列番号１）Ｍ−Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｓ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｎ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｒを有するリーダーペプチドをコード化するＤＮＡに前記タンパク質をコード化するＤＮＡを融合させて、融合したＤＮＡが、前記タンパク質のアミノ末端に前記リーダーペプチドがある単一の読み取り枠を有する組換えタンパク質をコード化するようになる工程と、
（２）前記融合したＤＮＡを原核生物中に導入する工程と、
（３）前記融合したＤＮＡを前記原核生物中で発現させて、前記組換えタンパク質が回収し得る量で製造される工程とを含む、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素と会合するリーダーペプチドを使用して原核生物中でタンパク質を発現させる方法。
【請求項１２】
前記原核生物は大腸菌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記原核生物は、スタフィロコッカス種、ストレプトコッカス種及びストレプトマイセス種から選択されるグラム陽性菌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えタンパク質は前記原核生物の培地中に分泌される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ストレプトコッカス・ピオゲネスから誘導された組換えＤＮアーゼＢ発明の背景  本発明は病原菌ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿連鎖球菌：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から誘導される組換えＤＮアーゼＢ、その製造方法及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染症の予防と治療の進歩にもかかわらず、多数の細菌性病原体は依然として診療（ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）において深刻な問題であり、重い病気、さらには命にかかわる病気を引き起こし続けている。これらの病原体のうちの一つは、ストレプトコッカス・ピオゲネスである。ストレプトコッカス・ピオゲネスによって引き起こされる病気の中には、連鎖球菌咽頭炎（“連鎖球菌咽喉炎”）、猩紅熱及びこれらの化膿性台併症、例えば頸部腺炎、中耳炎、乳様突起炎、扁桃周囲膿瘍、髄膜炎、間質性肺炎、肺炎、産褥期敗血症、皮膚の蜂巣炎、膿痂疹、リンパ管炎、丹毒、急性糸球体腎炎及びリウマチ熱がある。
【０００３】
かかる感染症はしばしば病院で発生（院内感染）し、特に正常な免疫系の機能が抑制されている患者において生じる。後者のカテゴリーにはＡＩＤＳの患者、癌用に又は移植拒絶を防ぐために免疫抑制剤の投与を受けている患者、及び血行が悪い患者、例えば糖尿病の患者が含まれる。
【０００４】
これらの病気は、化膿性の病巣を根絶するために及び生き残っている化膿性の病巣に対する免疫反応によって引き起こされる続発症を予防するために迅速かつ有効な治療を必要とするので、ストレプトコッカス・ピオゲネスの存在について迅速に診断することがかかる感染症が疑われる患者には欠くことができない。ストレプトコッカス・ピオゲネスを迅速に診断することができないと、治療が極めて困難になり得るし又は治療が不可能になる場合さえあり得る。
【０００５】
現在、ストレプトコッカス・ピオゲネスの複数の検出方法が利用できるが、これらの方法は特に臨床用途において欠点を有する。
【０００６】
ストレプトコッカス・ピオゲネスの検出方法の中には、ＤＮアーゼＢすなわちストレプトコッカス・ピオゲネスによって産生されるＤＮＡ−分解酵素に対する抗体の存在の検出がある。この酵素は、感染中にストレプトコッカス・ピオゲネスから分泌される酵素であり、急性リウマチ熱及び急性糸球体腎炎に罹り始めている患者において実質的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）な力価（タイター）の抗体の発現（ｄｅｖｅｌｏｐ−ｍｅｎｔ）を始める。
【０００７】
これらのリウマチ熱及び糸球体腎炎については、ストレプトリシンＯ及びヒアルロニダーゼに対する抗体の検出法を含めて、血清に基づいた別の診断試験法が利用し得るが、Ａ群ベータ溶血性連鎖球菌のほとんど全ての菌株の間にＤＮアーゼＢが認められること並びに皮膚及び咽頭の感染症をもつ患者において高いＤＮアーゼＢ力価が認められることから、抗ＤＮアーゼＢ抗体の検定法はある利点を提供する。
【０００８】
抗ＤＮアーゼＢ抗体の検定については商業的に入手し得る多数の試験法があるが、これらの試験法は欠点をもっている。前記のように、改良された試験法が大いに必要とされる。
【０００９】
商業的に入手し得る試験法は、次の３つのカテゴリー：すなわち（１）前記抗体の、酵素活性を阻害することができる能力を使用するＤＮアーゼＢ阻害に基づいた検定法；（２）種々のストレプトコッカス・ピオゲネス抗原に対する抗体のラテックス凝集検定法；及び（３）比濁（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ）阻害検定法に分けられる。また、ＥＬＩＳＡ検定法も研究室で使用されているが、以下に詳述するように、この検定法は日常の臨床応用に適しているということがまだ判明していない。
【００１０】
前記のＤＮアーゼＢ阻害検定法は非常に遅く、しかも典型的には実行するのに約４〜８時間要する。従って、治療をできるだけ早く開始できるように抗ＤＮアーゼＢ抗体の確認が迅速に必要とされる状況においては、ストレプトコッカス・ピオゲネスの存在が確認されるべきであり、前記の酵素阻害検定法は特に役立つという訳ではない。
【００１１】
前記のラテックス凝集検定法は５種類のストレプトコッカス・ピオゲネス抗原に対する抗体を検出することを目的とする。しかしながら、試験結果はラテックス凝集検定法と特異的抗ＤＮアーゼＢ試験法との間の一致が不十分であることを示している。一つの研究、すなわちＧ．Ｃ．ＫｌｅｉｎとＷ．Ｌ．Ｊｏｎｅｓの論文、“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｙｍｅ  Ｔｅｓｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  ０，Ａｎｔｉｄｅｏｘｙｒｉｂｏ−ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｂ，ａｎｄ  Ａｎｔｉｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  Ｔｅｓｔｓ，”Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２１，２５７−２５９（１９７１）においては、ラテックス凝集検定で陰性と検査された患者８０人中１２人は、実際には、抗ＤＮアーゼＢ抗体について陽性であった。この高い水準の誤った反対の結果は、この試験法が臨床用途に望ましくないことを意味している。
【非特許文献１】“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｙｍｅ  Ｔｅｓｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  ０，Ａｎｔｉｄｅｏｘｙｒｉｂｏ−ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｂ，ａｎｄ  Ａｎｔｉｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  Ｔｅｓｔｓ，”Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２１，２５７−２５９（１９７１）
【００１２】
前記の比濁阻害検定法は、抗ＤＮアーゼＢ抗体で被覆されたラテックス粒子の凝集を、該ラテックス粒子上の抗体と競争する抗ＤＮアーゼＢ抗体を含んでいる血清の存在下で、限られた量のＤＮアーゼＢの粗製調剤（ｃｒｕｄｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）で阻害することに依存する。この検定法は米国特許第５，０５５，３９５号明細書（本明細書において参照される）に記載されており、比較的感度が悪い。従って、この検定法はストレプトコッカス・ピオゲネスの感染の初期の段階で使用するのには適していない。抗ＤＮアーゼＢ抗体を正確に検定することが最も大切であるのはまさにこの段階である。その上、比濁阻害検定法に使用される試薬は製造することが困難である。
【特許文献１】米国特許第５，０５５，３９５号明細書
【００１３】
抗ＤＮアーゼＢ抗体のＥＬＩＳＡに基づいた検定法は、Ｍ．Ａ．Ｇｅｒｂｅｒらの論文，“Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒａ  ｔｏ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ＤＮａｓｅ  Ｂ”，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，９５，２５８−２６５（１９８０）に報告されている。この検定法は研究手段として有効であることが判明しているが、その商業用途、特に臨床診断におけるスケールアップは実行不可能である。これはかかるスケールアップが前記に詳述したような容易ならない病原体であるストレプ卜コッカス・ピオゲネスのＤＮアーゼＢ酵素の製造と精製とを必要とするからである。ＥＬＩＳＡ検定法の商業化に十分な酵素を製造するのに必要とされる量でこの病原菌を増殖させるには、極めて費用のかかる封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）法を必要とするばかりではなく、またストレプトコッカス・ピオゲネスの増殖に必要とされる培地も非常に複雑でありしかも高価である。これらの問題が抗ＤＮアーゼＢ抗体のＥＬＩＳＡ検定法の商業用の変形の開発を著しく妨げている。
【非特許文献２】Ｍ．Ａ．Ｇｅｒｂｅｒらの論文，“Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒａ  ｔｏ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ＤＮａｓｅ  Ｂ”，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，９５，２５８−２６５（１９８０）
【００１４】
従って、抗ＤＮアーゼＢ抗体の改良された迅速かつ特異的な検定法に対する要求が存在する。かかる検定法は、内科医が自分の診療室で使用できるものであり、しかも最小限度の装置しか必要としないものであるのが好ましい。これは、連鎖球菌咽喉炎又は猩紅熱のような病気をもつ患者が入院に先立ってその患者の家庭医に会うからであり、しかもその時点でのストレプトコッカス・ピオゲネスの感染についての正確な診断はその患者が入院している場合にのみ行われる爾後の診断よりも好ましいものであるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
かかる改良された検定法の開発は、多量のＤＮアーゼＢ酵素自体の入手可能性に左右される。従って、複雑で、扱いにくくしかも費用のかかる封じ込め手段（ｍｅａｓｕｒｅｓ）を必要とせずに、スケールアップして商業的な量の酵素を製造できる方法を使用するストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の製造方法に対する要求がある。
【００１６】
本発明者らは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中でストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢの遺伝子をクローン化し、発現させてストレプトコッカス・ピオゲネスの増殖を必要とせずに前記ＤＮアーゼＢ酵素の便利かつ効率的な製造を可能にした。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
このクローニング方法は、下記のアミノ酸配列：すなわち（ｉ）以下の図４に示されるストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素〔該酵素はそのアミノ末端にリーダーペプチドから誘導されるアルギニン（Ｒ）残基であって天然のＤＮアーゼＢ酵素には存在しないアルギニン（Ｒ）残基を含んでいる〕のアミノ酸配列；及び（ｉｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の機能的均等物をコード化する配列のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化する実質的に精製されたＤＮＡであって、場合によってはリーダーペプチドの残基を少なくとも１つ含んでいてもよいＤＮＡをもたらす。該ＤＮＡは図４のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ配列をコード化するＤＮＡ、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の機能的均等物をコード化するＤＮＡ及びリーダーペプチドをコード化するＤＮＡ以外のＤＮＡを実質的に含んでいない。
【００１８】
前記ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素のアミノ末端に融合されたリーダーペプチドをコード化するＤＮＡ配列をさらに含有するものであることが好ましい。
【００１９】
クローン化された前記ＤＮＡは、図３に示される配列をもつＤＮＡ、例えばストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の全アミノ酸配列とリーダーペプチドとをコード化するＤＮＡであるのが最も好ましい。
【００２０】
本発明の別の要旨は、適当な細菌宿主細胞に適合した制御配列の少なくとも１つに操作して連結された前記ＤＮＡ配列を含有するストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素用の発現ベクターにある。該発現ベクターはプラスミドベクターであるのが好ましい。典型的には、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素をコード化する前記ＤＮＡは、バクテリオファージλ由来の配列の少なくとも１つに連結される。
【００２１】
本発明の別の要旨は、本発明の発現ベクターを用いて形質転換、移入又は感染させた細菌宿主細胞であって、該形質転換細菌宿主細胞が、発現ベクターの中に組み込まれたＤＮＡによってコード化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢを検出可能な量で発現することを可能にする方法で形質転換、移入又は感染された細菌宿主細胞である。前記の発現されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢは前記酵素を産生する完全な（ｗｈｏｌｅ）細胞により分泌されるか又は分泌されないかいずれかであり得、しかも可溶性又は不溶性の形であり得る。
【００２２】
本発明の別の要旨は、図４のアミノ酸配列をもつタンパク質を含有する実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素にある。
【００２３】
本発明のさらに別の要旨は、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の製造方法であって、
（１）本発明の発現ベクターを用いて形質転換させた細菌宿主細胞を培養し；
（２）培養した細菌宿主細胞を使用して前記ＤＮアーゼＢ酵素を発現させ；そして
（３）培養した細菌宿主細胞から前記酵素を精製することを含んでなる実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の製造方法である。
【００２４】
本発明の別の要旨は、アミノ末端においてリーダーペプチドと融合されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素であって、該リーダーペプチドが次の配列：Ｍ−Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｓ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｎ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｒ（配列番号１）を有するものである、リーダーペプチドと融合されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素にある。
【００２５】
本発明のさらに別の要旨は、図４に示されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列において複数のアミノ酸のうちの少なくとも１つが別の天然産のＬ−アミノ酸によって置換されているタンパク質の変異体にある。得られる変異体は、低下又は増大したＤＮアーゼ活性を有するか又は別の改変された性質を有する。一つの好ましい態様においては、該変異体は天然のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の抗原反応性を実質的に保持している。
【００２６】
本発明のさらに別の要旨は、別の遺伝子又はタンパク質に対するストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子又はタンパク質の全体又は部分の翻訳又は転写融合体であって、得られる遺伝子組み立て体がいくつかの改変された性質を有するものである前記翻訳又は転写融合体にある。これらの性質としては、（１）高い水準のＲＮＡ発現；（２）高い水準のタンパク質発現；（３）該融合における第２の機能性酵素、レセプター又は他の活性タンパク質；（４）親和性リガンドに対するＤＮアーゼＢの融合；（５）高分子量タンパク質の産生；及び（６）高められた免疫活性を挙げ得る。
【００２７】
本発明のさらにまた別の要旨は、ストレプトコッカスＤＮアーゼＢ酵素及びアミノ末端においてリーダーペプチドと融合されているストレプトコッカスＤＮアーゼＢ酵素以外のタンパク質を実質的に含有していない実質的に精製された天然のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素にある。該実質的に精製されたタンパク質は、実質的にマイトジェン活性を有していない。前記の実質的に精製された酵素はさらに、等電点（ｐｌ）に応じて２つの画分、すなわち画分Ｉと画分ＩＩに精製される。それぞれの画分は実質的に他方の画分を含有していない調剤に精製し得る。
【００２８】
実質的に精製された天然ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の本発明の製造方法は、
（１）ジエチルアミノエチルセルロースに吸着させかつそれから溶出させて第１の溶出物を生成させること；
（２）得られた第１の溶出物をフェニルアガロース上でクロマトグラフィー分離して第２の溶出物を生成させること；
（３）得られた第２の溶出物をヘパリンアガロース上でクロマトグラフィー分離して第３の溶出物を生成させること；及び
（４）得られた第３の溶出物をクロマトフォーカシング（ｃｈｒｏ−ｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ：等電点クロマトグラフィー分離）して実質的に精製されたＤＮアーゼＢ酵素を生成させることを含んでなる。該方法はさらに、前記の実質的に精製されたＤＮアーゼＢを逆相高圧液体クロマトグラフィーにより精製することを含んでなるのが好ましい。画分Ｉと画分ＩＩの分離は、この２つの画分の酵素の異なるｐＩの結果としてクロマトフォーカシング工程で生じる。
【００２９】
本発明のさらにまた別の要旨は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素のアミノ末端のアミノ酸２４個をコード化するＤＮＡ配列であってそのリーダー配列の部分を含んでおらず、約３０％以下の誤対台を有するＤＮＡ配列のヌクレオチド少なくとも約１７個とハイブリッド形成する一本鎖核酸プローブにある。
【００３０】
本発明の別の要旨は増幅反応例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＲＣＲ又は他のＤＮＡ増幅反応にプライマー部位として機能するのに十分な大きさと特異性とをもつＤＮＡ配列の部分を包含する。また、ストレプトコッカス・ピオゲネスＢのＤＮＡ配列の同じ諸部分は、ＤＮＡ増幅反応なしで相同な配列の検出用の特異的プローブとしても機能する。
【００３１】
実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢは当該技術において周知の技法により、該ＤＮアーゼＢを特異的に結合する抗体を産生させるのに使用し得る。該抗体はポリクロナール抗体又はモノクロナール抗体のいずれかであり得る。
【００３２】
本発明の別の要旨は、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法にある。該方法は、次の工程：
（１）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料を調製する（ｐｒｏｖｉｄｅ）工程；
（２）前記試験試料に本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の一定量を加える工程であり、該−定量は試験試料中の抗ＤＮアーゼＢ抗体による酵素活性の阻害がない場台には検出可能な水準の酵素活性を産生するのに十分な量である；及び
（３）酵素検定を行うことにより試験試料中のＤＮアーゼＢ酵素の活性の水準を測定して試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する工程を含んでなる。
【００３３】
抗ＤＮアーゼＢ抗体を検出する別の方法は、次の工程：
（１）本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素を固体支持体例えばラテックス粒子に結台させる工程；
（２）前記固体支持体に結合されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素に、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料を反応させて該抗体を前記酵素すなわち前記固体支持体に結台させる工程；及び
（３）前記固体支持体に結合された前記抗体を検出して試験試料中の前記抗体を検出及び／又は測定する工程を含んでなる。
【００３４】
このアプローチは、定量について比濁法、混濁法、凝集法又はＥＬＩＳＡ法に使用し得る。
【００３５】
抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を検出する別の方法は、（１）ＤＮアーゼＢの緩衝溶液を調製し；（２）前記ＤＮアーゼＢの緩衝溶液を、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料と反応させ；そして（３）前記溶液中の光の吸収及び／又は光の散乱の変化を観察及び／又は測定することによってＤＮアーゼＢと抗ＤＮアーゼＢ抗体との間の反応を検出することを含んでなる。
【００３６】
抗ＤＮアーゼＢ抗体を検出する別の方法は毛管電気泳動である。
【００３７】
前記のクローン化された配列はストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子と会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）プロモーターを含んでいるので、本発明のさらに別の要旨は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーターを使用してＤＮアーゼＢ以外のタンパク質を発現させる方法にある。この方法は、
（１）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーターをストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子から分離し；
（２）前記プロモーターをＤＮアーゼＢの遺伝子以外のストレプトコッカス・ピオゲネスタンパク質の構造遺伝子と操作的に連結させ；
そして
（３）前記構造遺伝子によってコード化された前記タンパク質を発現させることを含んでなる。
【００３８】
前記タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス中で又はストレプトコッカス・ピオゲネス以外の原核生物中で発現させ得る。
【００３９】
本発明の別の要旨は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーター配列であってその中に転写開始部位と、細菌プロモーターの共通−１０及び−３５部位に相同性の部位とを含んでいるプロモーター配列から誘導される実質的に精製されたプロモーター配列にある。
【００４０】
本発明のさらに別の要旨は、原核生物中でタンパク質を発現させるためのＤＮアーゼＢのリーダーペプチドと、次の配列：Ｍ−Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｓ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｎ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｒ（配列番号：１）との使用にある。この要旨はリーダーペプチドを含んでいる完全なクローン化ＤＮアーゼＢセグメントが大腸菌の中で発現されると、タンパク質が培地中に分泌されるという知見によるものである。リーダーペプチドを使用して原核生物中でタンパク質を発現させる方法は、
（１）リーダーペプチドをコード化するＤＮＡに、タンパク質をコード化するＤＮＡを融合させ、それによって得られた融合ＤＮＡにタンパク質のアミノ末端にあるリーダーペプチドをもつ単一の読み取り枠をもつ組換えタンパク質をコード化させ；
（２）前記の融台ＤＮＡを原核生物中に導入し；そして
（３）前記の融合ＤＮＡを原核生物中で発現させて組換えタンパク質を回収し得る量で産生させることを含んでなる。
【００４１】
前記の原核生物は大腸菌、またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ−ｃｏｃｃｕｓ）種、ストレプトコッカス種もしくはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種などのグラム陽性菌であり得る。
【００４２】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の商業的に使用可能な供給源に対する要求を満たす目的で、本発明者らはストレプトコッカス・ピオゲネスゲノムＤＮＡ由来のＤＮアーゼＢ用の遺伝子を大腸菌の中にクローン化した。ストレプトコッカス・ピオゲネスと大腸菌の間には、これら２種類の菌の１８ＳリボソームＲＮＡの配列における相当なダイバージェンス（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）によって示されるような進化論的違い、並びに形態的特徴及び他の分類学的特徴（大腸菌はグラム陰性菌であり、一方ストレプトコッカス・ピオゲネスはグラム陽性菌である）の違いがあるにもかかわらず、本発明者らはクローン化遺伝子の大腸菌中での発現と、発現されたタンパク質の活性に応じて酵素検定によって選別を行い得る発現タンパク質の活性とについてかかる高い水準を達成した。
【００４３】
Ｉ．大腸菌中でのストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子のクローニング及び発現
大腸菌中でのストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子のクローニング及び発現は、下記の工程（該工程は、活性な酵素が遺伝子から発現される形態で完全な遺伝子のクローニングを達成するために注意深く最適化される）：すなわち
（１）ゲノムＤＮＡを単離する工程；
（２）ＤＮＡクローニング用のゲノムＤＮＡ断片を調製する工程；
（３）ＤＮＡ断片をクローニングベクター中に組み込む工程；
（４）細菌を感染させ、選別する工程；及び
（５）得られたクローン及びＤＮＡを特定する工程を必要とする。
【００４４】
Ａ．ゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡはストレプトコッカス・ピオゲネスから、内因性ヌクレアーゼの活性及びＤＮＡを分解又は変性できる他の因子の活性を最小にする条件下で単離するのが好ましい。これは細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ）と、タンパク質の分解とを必要とする。好ましい細胞の溶解方法は、６５℃でタンパク質分解酵素アクロモペプチダーゼを用いて培養し、次いでカオトロピック界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて培養する方法である。この方法はキレート剤例えばＥＤＴＡの存在下で行うのが最も好ましい。別法として、別のプロナアーゼ例えばプロテアーゼ及びプロテイナーゼＫが細胞を溶解するのに使用できる。他の溶解方法は当該技術において公知である（Ｓ．Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉらの論文、“Ａ  Ｎｅｗ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  Ｌｙｔｉｃｕｓ“，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４１，２４８７−２４８９（１９７７））。
【００４５】
次いで、ＤＮＡをフェノール又はフェノールークロロホルムで抽出し、抽出したＤＮＡをエタノールで沈殿させるのが好ましい。適当な抽出順序は、当容量のフェノールを用いて２回抽出し、次いでフェノール／クロロホルムの１：１の混台物を用いて１回抽出することである（例１）。得られた抽出緩衝液は、ヌクレアーゼ活性を最小限にするためにキレート剤例えばＥＤＴＡを含有するのが好ましい。かかる方法は周知であり、例えばＤ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅの論文，“Ｌａｒｇｅｒ−ａｎｄ  Ｓｍａｌｌ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ“，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２，３３−４０（１９８７）及びＤ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅの論文，“Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ“，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２，４１−４８（１９８７）に記載されている。
【００４６】
ＤＮＡの適当な供給源は、Ｃ２０３Ｓすなわち菌株Ｃ２０３の非Ｍ含有変異株としても知られているストレプトコッカス・ピオゲネスの菌株ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４２８９である。しかしながら、同様の方法は、ＤＮアーゼＢの遺伝子を含有するストレプトコッカス・ピオゲネスの別の菌株を使用し得る。
【００４７】
単離したＤＮＡは抽出及びエタノール沈殿の後にＲＮアーゼＡを用いて処理し、次いでさらに塩化セシウム勾配で精製するのが好ましい。
【００４８】
Ｂ．クローニング用のＤＮＡ断片の調製
単離したゲノムＤＮＡはクローニングする前に断片化することが好ましい。断片化はＤＮＡを注射針、最も好ましくは２５ゲージ（ｇａｕｇｅ）の注射針の中を約３０回通すことによって行うのが最も好ましい。これは、約６〜８ｋｂの平均サイズをもつ切断されたＤＮＡをもたらす。
【００４９】
あまり好ましくない別の方法では、制限エンドヌクレアーゼ例えばＳａｕ  ３Ａ又はＭｂｏ  Ｉを用いる部分消化が使用できる。これは例えばＡ．−Ｍ．Ｆｒｉｓｃｈａｕｆの論文、“Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ：Ｓｉｚｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ“、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２，１８３−１８９（１９８７）に記載されている。この文献は本明細書において参照される。
【００５０】
Ｃ．クローニングベクターへのＤＮＡ断片の組み込み
次の工程はクローニングベクター中へのＤＮＡ断片の組み込みである。かかるクローニングベクターは、典型的には適当な細菌宿主細胞に適合した制御配列の少なくとも１つに操作して連結されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢをコード化するＤＮＡ配列を含有する。かかる制御配列はオペレーターとプロモーターを含む。適当なプロモーターとしては、バクテリオファージλＰＬプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター及びバクテリオファージＴ７プロモーターが挙げられる。また、クローニングベクターは、発現に適したリボソーム結台部位も含有する。好ましいクローニングベクターはλｇｔ１１（Ｒ．Ａ．ＹｏｕｎｇとＲ．Ｗ．Ｄｖｉｓの論文，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８０，１１９４（１９８３））であり、これは該ベクターに組み込まれ、かつクローン化ＤＮＡに操作して連結されたｌａｃプロモーターによって制御された発現を可能にする。他の適当なクローニングベクターが当該技術において周知であり、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの著作，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ“（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ発行，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年），第３巻、第１７章、標題”Ｅｘ−ｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ“に記載されており、この文献は本明細書において参照される。ファージλｇｔ１１に関しては、ＤＮＡはＥｃｏ  ＲＩ切断部位に挿入される。かかるクローニングに関しては、切断されたＤＮＡは大腸菌リガーゼ次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用し、次いでＥｃｏ  ＲＩリンカーを加えることにより修復されるのが好ましい。これらのＥｃｏ  ＲＩ−末端化断片は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した後にλｇｔ１１アームに連結され得る。メチラーゼによる認識部位のアデニン残基においてメチル化されたＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼにより消化されないことから、この消化操作の間は、内部のＥｃｏ  ＲＩ部位はＥｃｏ  ＲＩメチラーゼを用いて保護される。
【００５１】
連結反応の完了後に、得られたＤＮＡはファージ粒子の構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に必要とされる遺伝子においてバクテリオファージλ変異体を用いて感染させた細菌から調製された抽出物の混合物を使用して、試験管内で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）バクテリオファージλの頭部に詰め込まれる。詰め込み方法は当該技術において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの著作、前記の著作、第１巻、ｐｐ．２．９５−２．１０８に記載されている。
【００５２】
Ｄ．細菌の感染と選別
試験管内詰め込みによって構築されたファージ粒子を使用して感受性の大腸菌を感染させた。特に好ましい細菌宿主細胞はＹ１０９０（−ｐＭＣ９）、すなわちｐＭＣ９プラスミドを欠いている細胞である。適当な方法は色指示薬としてトルイジンブルーＯ０．０１％を含有するＤＮアーゼテスト寒天〔Ｄｉｆｃｏ社（ミシガン州デトロイト所在）製〕の上部寒天の上層（ｏｖｅｒｌａｙ）とプラークとを重ねる方法である。これはＤＮアーゼＢ遺伝子を発現するプラークの検出を可能にする。
【００５３】
この系におけるＤＮアーゼＢ遺伝子の予想外に高い水準の発現は、免疫スクリーニング（これは一般にクローン化遺伝子産生物の検出に必要とされる）を必要とせずに、得られる酵素活性を直接検出することによる陽性クローンの直接検出を可能にした。
【００５４】
感染させた宿主細胞を使用する実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢの製造方法は、
（ａ）バクテリオファージλ誘導体であり得る適当な発現ベクターを用いて形質転換させた細菌宿主細胞を培養し；
（ｂ）培養した形質転換細菌宿主細胞を培養してＤＮアーゼＢ酵素を発現させ；そして
（ｃ）培養した形質転換細菌宿主細胞から前記酵素を精製することを含んでなり得る。
【００５５】
Ｅ．クローンの特定とＤＮＡの配列決定
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子（２−６と命名する）を含有するλｇｔ１１ファージを単離し、該ファージからＤＮＡを調製した。このクローンを制限分析により分析し、得られた結果を図１に示す。ヌクレアーゼ活性の存在に関するＥｃｏ  ＲＩ及びＥｃｏ  ＲＩ／Ｓａｃ  Ｉサブクローンの分析は、図２に示されるように、ＤＮアーゼＢ遺伝子の一部が内部のＳａｃ  Ｉ〜Ｅｃｏ  ＲＩ領域の中に配置されていることを示す。
【００５６】
クローン化されたＤＮＡの配列決定は標準的な方法、例えばＳａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーター法を使用して行い得る。配列決定分析は、λｇｔ１１ファージ内をＤＮアーゼ活性があると思われる領域にわたってプライマー合成法（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）により開始し得る。かかる配列決定の結果を図３に示す。
【００５７】
図３に示される配列をもつクローン化ＤＮＡは、長い読み取り枠すなわち転写解読枠（ＯＲＦ）を組み込んでいる。このＯＲＦの翻訳によって誘導されるアミノ酸配列を図３及び図４に示す。アミノ酸４４（Ｇｌｎ）において始まるこのＯＲＦの５’−末端部分のアミノ酸配列は、精製された天然産のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢの配列決定によって得られたアミノ酸配列（セクションＩＶ）と一致する。
【００５８】
従って、本発明は、次のアミノ酸配列：すなわち（ｉ）図４に示されるストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素のアミノ酸配列；及び（ｉｉ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の機能的均等物をコード化する配列のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化するＤＮＡを含有してなる実質的に精製されたＤＮＡを包含する。該ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素のアミノ末端に融合したリーダーペプチド以外は、図４のアミノ酸配列又はストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の機能的均等物をコード化していないＤＮＡを実質的に含んでいない。以下に述べるように、読み取り枠から生成された翻訳産物はリーダーペプチドを含んでいる。
【００５９】
本明細書において、“機能的均等物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）”という用語は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢについて一般的に使用される検定法において検出し得るＤＮアーゼ活性をもつタンパク質であってかつ実質的に生成されたＤＮアーゼＢに対する抗体と少なくとも検出可能な程度まで交差反応するタンパク質をいう。この“機能的均等物”という用語は、１つ又はそれ以上の同類アミノ酸置換によって図４の配列と異なる配列をもつタンパク質を包含するものであるが、それに限定されるものではない。かかる同類アミノ酸置換としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｂ）及びロイシン（Ｌ）のいずれかをこれらのアミノ酸のうちの他のいずれかに置換すること；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に及びその逆にグルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換すること；グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）に及びその逆にアスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）に置換すること；並びにセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に及びその逆にスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に置換することを包含するが、これらに限定されるものではない。前記の置換は“同類（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）”とみなし得るアミノ酸置換ばかりではない。別の置換もまた具体的なアミノ酸の環境に応じて同類とみなし得る。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）は、アラニンとバリン（Ｖ）であり得るように、頻繁に交換可能であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしばロイシン及びイソロイシンと置換され得、またバリンと置換される場台もある。リシン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）は、しばしばその位置で（そこではアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷である）交換可能であり、しかもこれら２つのアミノ酸残基の異なるｐＨは重要ではない。さらに別の変化は具体的環境において“同類”とみなし得る。
【００６０】
また、図３の配列の一部を含有するＤＮＡ配列であって、特異的な塩基ハイブリッド形成を必要とする反応において反応剤として働く十分な大きさと特異性とをもつＤＮＡ配列は本発明の範囲内にある。かかるＤＮＡ配列は、増幅反応例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）又は別の増幅反応のプライマーであり得る。また、該ＤＮＡ配列はハイブリッド形成プローブであり得る。該ＤＮＡ配列は少なくとも塩基１０個の長さであるのが好ましく、少なくとも塩基５０個の長さであるのがさらに好ましい。
【００６１】
Ｆ．バクテリオファージλｐＬプロモーターの調節下でＤＮアーゼＢを産生する大腸菌発現プラスミド△３３中へのストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢのクローン化遺伝子の挿入
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢのクローン化遺伝子を大腸菌発現プラスミド△３３に伝達させ得る。該プラスミドはバクテリオファージλプロモーターｐＬの制御下でクローン化遺伝子を発現する。ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子は、前記λ２−６クローン由来のＤＮアーゼＢ遺伝子に修飾末端を取り付けるために、ＰＣＲを使用することにより発現べクターの中に挿入されるのが好ましい。好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼを用いる標準的ＰＣＲ法に従うＰＣＲ反応用のプライマーとして下記のヌクレオチドが使用できる。
【００６２】
Ａ：５’−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−３’（配列番号：２）
Ｂ：３’−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−５’（配列番号：３）
【００６３】
これらのプライマーは増幅用の鋳型としてλｇｔ１１  ＤＮアーゼＢクローン２−６ＤＮＡと共に使用できる。得られる増幅生成物は、前記△３３発現ベクターに挿入するのに先立ち、エンドヌクレアーゼＢａｍ  ＨＩとＳａｌ  Ｉを用いて消化し得る。これはｐＬプロモーターによって調節された転写融合体を作る。大腸菌の適当な菌株（Ｃ６Ｏ０Ｃ１＋、ｇａｌ  Ｋ−）は挿入されたＤＮＡによって形質転換され、血漿を含んでいる細菌はアンピシリンを用いる選別により選別できる。ＤＮＡはこれらのクローンから、標準的微小台成法、例えばＦ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌらの著作，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ発行，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７年）§１．６に記載の方法により、次いで単離したプラスミドを適当な制限エンドヌクレアーゼ（Ｂａｍ  ＨＩとＳａｌ  Ｉ）を用いて切断してプラスミドが所望の組換え断片を含有するかどうかを調べることにより調製し得る。所望の組み立てをもつプラスミドは大腸菌宿主細胞の中に導入でき、その大腸菌宿主細胞は、Ｊ．Ｅ．Ｍｏｔｔらの論文、“Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｇ  ｔｈｅ  λｐＬ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒρ”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，８８−９２（１９８５）に記載されているようなナリジキシン酸プロトコールによる誘導に供される。該文献は本明細書において参照される。ナリジキシン酸がＤＮＡを損傷し、ｒｅｃＡタンパク質、すなわち大腸菌の回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）タンパク質を誘導することは当該技術においては公知である。ｒｅｃＡタンパク質はプロテアーゼ活性をもち、λＣＩ＋プレッサーの不活性化を招く。この不活性化はｐＬプロモーターによる過剰発現を招く。ｐＬプロモーターから転写を活性化する他の方法もまた使用できる。ナリジキシン酸誘導を使用する場台には、相当な量のＤＮアーゼＢが細胞の外に分泌される。
【００６４】
ＩＩ．組換えによって産生された酵素の性質λ２−６ファージから組換えにより産生された酵素は、ＤＮアーゼＢのアミノ末端に融合されたリーダーペプチドを含んでいる。このリーダーペプチドは次の配列：Ｍ−Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｓ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｎ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｒ（配列番号：１）を有する。
【００６５】
免疫阻害検定（例７）は、基質としてＤＮＡ−色素複台体を使用することができるＤＮアーゼの能力に基づいて、非組換えＤＮアーゼＢ酵素と同じ方法で組換えストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢがヒト血清中で抗ＤＮアーゼ酵素により阻害されることを例証する。
【００６６】
ＩＩＩ．組換えによって産生されたＤＮアーゼ酵素の変異体
本発明の別の要旨は、ＤＮアーゼＢ活性が改変されているストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子の変異体又は変異型にある。これらの変異体ＤＮアーゼＢ酵素は、より高いか又はより低い水準のヌクレオアーゼ活性を有し得る。これらの変異体はヌクレオアーゼ活性を全て取り除く単一のアミノ酸置換（ｃｈａｎｇｅ）を含有するが、重要な免疫エピトープを全て維持するので、これらの変異体が天然のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の抗原反応性を実質的に保持しているのが好ましい。従って、大腸菌中での高い水準の発現は、改変されたＤＮアーゼＢを用いてヒト抗体反応性を変えることなく達成し得る。かかる変異体又は変異型は、当該技術において周知の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの著作、前記の著作、第１５章、標題“Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｎｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  ＤＮＡ”に記載の方法に従って調製し得る。かかる技法としては、リンカー挿入突然変異誘発、リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いたオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発及び高突然変異菌株中での増殖が挙げられる。
【００６７】
ＩＶ．ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素用のリーダーペプチドの使用
Ｍ−Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｓ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｎ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｒ（配列番号：１）のアミノ酸配列をもつＤＮアーゼＢ用リーダーペプチドは、細菌中で組換えタンパク質の発現及び産生に使用し得る。リーダーペプチドの適当な使用方法は、
（１）Ｍ−Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｓ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｔ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｎ−Ｔ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｒ（配列番号：１）のアミノ酸配列をもつリーダーペプチドをコード化するＤＮＡに、タンパク質をコード化するＤＮＡを融合させ、それによって得られた融合ＤＮＡにタンパク質のアミノ末端に存在するリーダーペプチドをもつ単一の読み取り枠をもつ組換えタンパク質を形成させ；
（２）該融台ＤＮＡを原核生物中に導入し；そして
（３）該融合ＤＮＡを原核生物中で発現させて組換えタンパク質を回収可能な量で産生させることを含んでなる。
【００６８】
前記の細菌は大腸菌であるか又はグラム陽性菌、例えばスタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びストレプトマイセスであり得る。
【００６９】
組換えタンパク質は、培地から回収し得るように原核生物によって培地中に分泌される。
【００７０】
産生されるべきタンパク質用の遺伝子に対してリーダーペプチドをコード化するＤＮＡセグメントを融合する方法は、当該技術においては周知であり、平滑末端連結が挙げられる。平滑末端連結は典型的にはＴ４リガーゼ〔Ｖ．Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ  ＆  Ｈ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａの論文，“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＣＸＩＩ．Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ａｎ  Ａｌａｎｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ．Ｅｎｚｙｍｉｃ  Ｊｏｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  Ｆｏｒｍ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １  ｔｏ  ２０”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７２，４２７（１９７２）；Ｖ．Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ＆  Ｓ．Ｄ．Ｅｈｒｌｉｃｈの論文，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｓｅ  ｉｎｔｈｅ  Ｊｏｉｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｆｌｕｓｈ−Ｅｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｓｔ−ｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｌ．，８６，５３１（１９７８）〕を用いて行われ、しかも縮台剤例えばポリエチレングリコール又は塩化ヘキサアンミンコバルトの存在下で行われるのが好ましい。
【００７１】
別法として、付着末端を生成する適当な制限エンドヌクレーゼが存在し、リンカーのカルボキシル末端に対応するリンカーをコード化するＤＮＡのタンパク質と、該タンパク質のアミノ末端に対応するタンパク質をコード化する遺伝子の部分との両方を切断できる。該制限エンドヌクレーゼを使用して連結用の付着末端を生成できる。
【００７２】
Ｖ．ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の精製
Ａ．天然ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢの精製
本発明の別の要旨は、天然のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の改良された精製方法にある。この方法は、市販の検定試薬中に存在するＤＮアーゼＢのポリアクリルアミドゲル分析を使用しかつ組換え酵素のゲル電気泳動における挙動と比較することによって開発された。該精製方法は、酵素の粗抽出物又は別の供給源を用いて出発して、次の工程：（１）ジエチルアミノエチルセルロースに吸着させかつそれから溶出させて第１の溶出物を生成させる工程；（２）得られた第１の溶出物をフェニルアガロース上でクロマトグラフィ一分離して第２の溶出物を生成させる工程；（３）得られた第２の溶出物をヘパリンアガロース上でクロマトグラフィー分離して第３の溶出物を生成させる工程；及び（４）得られた第３の溶出物をクロマトフォーカシングして実質的に精製されたＤＮアーゼＢ酵素を産生させる工程を用いる。前記クロマトフォーカシングはモノ−Ｐカラムを用いて行うのが好ましい。精製されたＤＮアーゼは、クロマトフォーカシング中に使用した両性電解質を除去するために、逆相高圧液体クロマトグラフィーを使用して０．１％トリクロロ酢酸水溶液と０．０８％トリクロロ酢酸アセトニトリル溶液との勾配を用いてＣ４上でさらに分画されるのが好ましい。
【００７３】
前記精製方法は、ストレプトコッカスＤＮアーゼＢ酵素及びそのアミノ末端においてリーダーペプチドに融合されたストレプトコッカスＤＮアーゼＢ酵素以外のタンパク質を実質的に含んでいない実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素をもたらす。この実質的に精製されたタンパク質は実質的にマイトジェン活性を有していない（下記の例６参照）。
【００７４】
精製は電荷の異なる２つの実質的に精製されたＤＮアーゼＢ画分をもたらす。この画分のそれぞれは、他の画分及び他のタンパク質を実質的に含んでいない。これらの画分を画分Ｉ（これはｐＨ８．５５〜８．４でクロマトフォーカシングカラムから溶出する）及び画分ＩＩ（これはｐＨ８．２２〜８．１３でクロマトフォーカシングカラムから溶出する）と命名する。質量分光分析により得られた分子量データ（例３）は、精製された天然ＤＮアーゼＢの画分Ｉと画分ＩＩの間の分子量の違いが別の方法による（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ）同じアミノ酸配列の僅かな（ｍｉｎｏｒ）変性（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と一致していることを示す。可能な変性は脱アミノ化であり、これは適当なｐＩシフトを生じる。
【００７５】
精製したタンパク質は配列決定し得る。画分Ｉと画分ＩＩの両方の最初のアミノ酸２３個は次の読取り可能な配列：QTQVSNDVVLNDGASXYLNEALA（配列番号：４）（但し、配列中のＸはトリプトファン又はリシンを表わす）を生じた。
【００７６】
以下に詳しく述べるように、この配列は遺伝子のアミノ末端アミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列の１つとハイブリッド形成するのに適したプローブを設計する手段を表わす。
【００７７】
Ｂ．組換えによって生成させたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の精製
組換えストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢは、キメラ細胞中で高濃度で存在し、同様の方法で精製し得る。例えば、組換えＤＮアーゼＢは、λＤＮアーゼＢ２−６ファージを用いて感染させて大腸菌から採取したファージ溶解液から、Ｑ−セファロース（トリメチルアミノエチルアガロース）上でのクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ヘパリンセファロース上でのクロマトグラフィー及びＱ−セファロース上でのクロマトグラフィーにより精製し得る。ｐＬプロモーターからストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢを発現する組換えプラスミド△３３を用いて感染させた大腸菌中で生成させた組換えＤＮアーゼＢは、ヘパリンセファロースを用いたクロマトグラフィー、Ｑ−セファロース上でのクロマトグラフィー及び逆相高圧液体クロマトグラフィーにより精製し得る。他の精製方法が公知であり、当業者によって使用され得る。
【００７８】
ＶＩ．クローン化ＤＮＡにハイブリッド形成し得るＤＮＡプローブの精製
本発明の別の要旨は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素のアミノ末端アミノ酸２４個をコード化するＤＮＡ配列であって、約３０％以下の誤対合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を有するＤＮＡ配列とハイブリッド形成する一本鎖核酸プローブの製造にある。上記の核酸プローブはＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。該プローブがＤＮＡである場台には、標準的な緊縮条件、すなわちＦ．Ａｕｓｕｂｅｌらの著作，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９０年）に記載の条件下では、好ましくは下誤対合の程度は約１０％以下である。
かかるプローブの適当な配列は、表１の関連アミノ酸について示した腸内細菌遺伝子についてのコドン使用表を使用することによって誘導し得る。
【００７９】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼのアミノ末端領域のアミノ酸に使用されるコドン
【００８０】
【表１−１】
2005046151.tif 000002
【００８１】
【表１−２】
2005046151.tif 000003
【００８２】
かかるプローブの一例を下記に示す。
【００８３】
プローブ１：Ｃ−Ａ−Ｕ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−Ａ−Ｒ−Ｔ−Ｎ−Ｗ−Ｓ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｙ−Ｇ−Ｔ（配列番号：５）
【００８４】
この配列において、Ｒはプリンを表わし（すなわち、Ａ又はＧ）、Ｙはピリミジンを表わし（すなわち、Ｔ又はＣ）、ＳはＧ又はＣを表わし、ＷはＡ又はＴを表わしかつＮは４種類の共通デオキシリボヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）を表わす。
【００８５】
このプローブ及び他のプローブは当該技術において周知の方法、例えば“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｇ．Ｍ．Ｂｌａｃｋ−ｂｕｒｎ  ＆  Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  発行，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９０年）、第３章第１０６〜１２３頁に記載されているようなホスホトリエステル法又はホスファイトトリエステル法による固相ＤＮＡ合成により台成し得る。
【００８６】
ＶＩ．ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢと会合した上流プロモーターの使用
本発明の別の要旨は、ＤＮアーゼＢ以外のタンパク質を発現するための、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子と元来会台された上流プロモーターの単離と使用にある。このプロモーター配列の検出は以下の例１１に記載する。
【００８７】
前記プロモーター配列はλ２−６クローン中に保持される。この配列は、転写用の開始部位と、細菌プロモーターの共通−１０及び−３５部位と実質的に相同性の部位とを含む（例１１）。この実質的に精製されたプロモーター配列は本発明の範囲内にある。
【００８８】
このプロモーター配列を使用してＤＮアーゼＢ以外のタンパク質を発現させる方法は、
（１）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーターをストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子から分離し；
（２）前記プロモーターを、ＤＮアーゼＢ用の遺伝子以外のストレプトコッカス・ピオゲネスタンパク質用の構造遺伝子と操作的に連結させ；そして
（３）前記構造遺伝子によってコード化された前記タンパク質を発現させることを含んでなる。
【００８９】
前記タンパク質はストレプトコッカス・ピオゲネス中で又はストレプトコッカス・ピオゲネス以外の原核生物、例えば大腸菌で発現させ得る。前記プロモーターはベクター又はプラスミドのプロモーターに操作して連結された遺伝子を発現するためのベクター又はプラスミドに組み込み得る。
【００９０】
ＶＩＩ．実質的に精製されたＤＮアーゼＢの使用
本発明はまた、天然の供給源から精製されるか又は組換えＤＮＡ技術によって産生されるかにかかわらず、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の幾つかの使用を包含する。
【００９１】
Ａ．抗体の調製における酵素の使用
本発明の方法によって製造された酵素の使用の中には、抗体の調製がある。抗体はポクロナール抗体又はモノクロナール抗体のいずれかであり得る。ポクロナール抗体及びモノクロナール抗体の両方の製造は、Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎｅの著作，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８年）第５３〜３１８頁に記載されている。得られる抗体はストレプトコッカス・ピオゲネス酵素の検出、すなわち存在が疑われる培地において使用し得る。
【００９２】
Ｂ．抗ＤＮアーゼＢ抗体の検出における酵素の使用
本発明の実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の重要な用途は、血清中におけるような抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体の検出にある。かかる抗体の存在は、活性なストレプトコッカス・ピオゲネス感染を示すものであり、しかも重い化膿性続発症が生じるかもしれないという警告信号である。
【００９３】
ＤＮアーゼＢ抗体の一つの検出方法は、該抗体が酵素の活性を阻害し得るということを用いる。かかる方法は、次の工程：すなわち
（１）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を含有していると疑われる試験試料を調製する工程；
（２）前記試験試料に本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素の一定量を加える工程であり、該一定量は試験試料中の抗ＤＮアーゼＢ抗体による酵素活性の阻害がない場合には検出可能な水準の酵素活性を産生するのに十分な量である；及び
（３）酵素検定を行うことにより試験試料中のＤＮアーゼＢ酵素の活性の水準を測定して試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する工程を含んでなり得る。
【００９４】
前記の酵素検定は、標準的方法例えばＷａｍｐｏｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）のＤＮＡ−色素複台体分解検定法により行い得る。この検定法は、基質としてＤＮＡ−色素複台体を使用することができるＤＮアーゼの能力に基づいている。この複合体は６４２ｎｍの最大吸収波長を示す。しかしながら、該ＤＮＡ−色素複合体はＤＮアーゼによって分解されるので、最大吸収波長のシフトと、６４２ｎｍにおける吸収低下とがある。他の酵素検定法、例えば粘度検定法が利用できる。該粘度検定法は長いＤＮＡ分子を分解できる、すなわちＤＮＡを含有する溶液の粘度を著しく低下させることができる酵素の能力を測定する。別法として、検定法は基質として放射性ＤＮＡを使用し、培養後に放射能の放出を定量することによって行い得る。デオキシリボヌクレアーゼの別の検定方法は当該技術において周知である。
【００９５】
血清中の抗ＤＮアーゼＢ抗体の別の検定法は、ＥＬＩＳＡ検定法である。この検定法は、
（１）本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素を固体支持体に結合させる工程；
（２）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料を前記ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素と反応させて、該抗体を該酵素にすなわち前記固体支持体に結合させる工程；及び
（３）前記固体支持体に結合された前記抗体を検出して試験試料中の前記抗体を検出及び／又は測定する工程を含んでなる。
【００９６】
ＥＬＩＳＡ法は当該技術において周知であり、例えばＰ．Ｔｉｊｓｓｅｎの著作、“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ発行，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５年）に記載されている。使用される固体支持体は、典型的にはプラスチック、例えばポリスチレンであるが、他の固体支持体例えばニトロセルロースも使用できる。結合抗体の検出は、典型的には第１の抗体に特異的な第２の抗体を加えることによって行われる。該第２の抗体はストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素を結合しない。かかる抗体は、例えば酵素標識抗ヒト免疫グロブリンＧであり得る。酵素標識は典型的には、アルカリホスファターゼ、λ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼである。かかる酵素類は可視スペクトラムにおいて光学吸収を有し、肉眼で又は分光光度計を用いて検出し得る。
【００９７】
また、血清中の抗ＤＮアーゼＢ抗体の検定には、抗原−抗体・複合体の形成を検出及び／又は測定する別の技法も使用し得る。これらの技法は、凝集した抗原−抗体・複合体、ここでは酵素−抗体・複合体を光の吸収又は散乱の変化により検出する。一般に、かかる検定法は、
（１）本発明のＤＮアーゼＢの緩衝溶液を調製し；
（２）前記ＤＮアーゼＢの緩衝溶液を、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料と反応させ；そして
（３）前記溶液中の光吸収及び／又は光散乱の変化を観察及び／又は測定することによってＤＮアーゼＢと抗ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ抗体との間の反応を検出することを含んでなる。
【００９８】
前記のＤＮアーゼＢと抗ＤＮアーゼＢ抗体の間の反応は、比濁分析（ｎｅｐｈｅｒｏｍｅｔｒｙ）又は混濁分析（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ）により検出し得る。抗ＤＮアーゼＢ抗体の別の検出方法は毛管電気泳動である。
【００９９】
Ｃ．他の用途
組換えタンパク質は感受性の個体においてストレプトコッカス・ピオゲネスに対して免疫化するためのワクチン開発に使用し得、また病気例えば粘度が高濃度のＤＮＡを含有する滲出液によるものである場合の嚢胞性繊維症における肺粘度症（ｌｕｎｇ  ｖｉｓｃｏｓｉｓｔｙ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ）の治療におけるエアゾールとしても使用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１００】
例
以下の例は、説明を目的としたものであり、本発明を限定する意図のものではない。
【実施例１】
【０１０１】
例１ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子のクローニング  ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子を、組換え体λバクテリオファージから生じたヌクレアーゼ活性の活性に基づく比色検出により同定した。ファージは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｌａｎｓｆｉｅｌｄ  Ｇｒｏｕｐ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４２８９）ゲノムＤＮＡから精製した剪断ＤＮＡを含むλライブラリーの生成物であった。
【０１０２】
ストレプトコッカス・ピオゲネスからの染色体ＤＮＡの調製
ストレプトコッカス・ピオゲネス株ＡＴＣＣ１４２８９を、Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ寒天平板で画線培養して、３７℃で２日間温置した。単一のコロニーを用いて１リットルのＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ培養液を１０％仔ウシ血清と共に温置した。培養物は、約３６時間振とうしながら３７゜Ｃで成長させて高密度にした。
【０１０３】
細胞は、３５００ｒｐｍで４℃で４５分間のＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ遠心機による遠心分離により集めた。細胞ペレットは、２５ｍｌの４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ中に再び懸濁させた。１ｍｌの緩衝液に含むようにしたタンパク質分解酵素アクロモペプチダーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（６０ｍｇ）（Ｗａｍｐｏｌｅ）を加え、得られる混合物を６５℃で１時間温置した。溶菌は、見られなかった。次に、全量で２０ｍｌの１０％ＳＤＳを加え、温置を１時間継続させた。溶菌は、非常に明白であった。次に、５０ｍｌの緩衝液を加え、ＳＤＳの濃度を２．５％に下げた。
【０１０４】
この混合物を、同じ量のフェノールで２回抽出してから、フェノール／クロロホルム（１：１）で１回抽出した。水相中のＤＮＡをエタノールにより沈殿させた。ＤＮＡは、遠心分離により回収した。ペレットを、４ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥ）中に再び懸濁させた。ＲＮアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌで５０μｌ）を加え、この混合物を３時間３７゜Ｃで温置した。
【０１０５】
ＤＮＡを、塩化セシウム勾配中でさらに精製した。ＤＮＡの最終濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０６】
λｇｔ１１でのストレプトコッカス・ピオゲネスライブラリーの組立て
単離した染色体ＤＮＡ（３００ｐｍｌ）をＴＥ緩衝液２００μｌに加えた。この混合物を、２５ゲージ針を有する１ｍｌの注射器（ｓｙｒｉｎｇｅ）に約３００回通過させてＤＮＡを剪断して平均の大きさ６ｋｂとした。
【０１０７】
剪断ＤＮＡ（１５０μｌ）を、大腸菌リガーゼで処理して、後続の操作によりギャップとなり得るであろうＤＮＡ中の存在するニックを修復した。ＤＮＡ１５０μｌに、２０μｌの１０ｘ大腸菌リガーゼ緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）および５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を加え、２０μｌのＮＡＤ＋（３６ｍＭ）および７μｌの大腸菌リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．，４単位／μｌ）を、ＤＮＡに加え、次に、この混合物を室温で４−５時間放置した。リガーゼを、６５℃で１５分間熱して死なせた。ＤＮＡは、エタノールにより沈殿させた。
【０１０８】
リガーゼ処理ＤＮＡ中のＥｃｏ  ＲＩ部位は、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のプロトコールに準じてＥｃｏメチラーゼによりメチル化した。これは、その切断が、クローニング手順を妨げるであろう内部Ｅｃｏ  ＲＩ部位を封鎖（ｂｌｏｃｋ）するためにした。
【０１０９】
ＤＮＡの剪断末端は、メチル化の後、ＤＮＡ混合物へ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（３０００Ｕ／ｍｌ）２μｌ、２．５ｍＭの４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートのそれぞれ２０μｌおよび０．１ＭのＭｇＣｌ２３０μｌを加えることによりＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより修復した。反応は、室温で１５分間行った。混合物は、フェノール／クロロホルムにより１回、次にエーテルにより１回抽出した。水性分画中のＤＮＡは、次に、エタノールにより沈殿させた。
【０１１０】
Ｅｃｏ  ＲＩリンカーは、ＤＮＡに結合させた。使用したリンカーは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの八量体であった。リンカー結合の後、ＤＮＡは、過剰量のＥｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素により消化された。所望の大きさの範囲、すなわち６−８ｋｂのＤＮＡを、電気泳動の後、アガロースゲルから精製した。ＤＮＡは、エタノール沈殿により濃縮し、次に、λｇｔ１１への結合のために準備した。
【０１１１】
約２μｇの剪断ＤＮＡを、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼで予め消化した１μのλｇｔ１１と結合させ、この際、末端りん酸塩残基は、アルカリ性ホスファターゼにより処理して除去しておいた。連結は、全量５μｌのバクテリオファージＴ４リガーゼにより行った。連結反応は、４℃で夜通し行った。
【０１１２】
全結合混合物は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）パッケージング抽出物を用いて試験管内でパッケージングした。１μｌのパッケージングしたファージを、イソプロピルチオ−β−Ｄガラクトシド（ＩＰＧ）の存在下でＹ１０９０大腸菌の菌叢に塗布し、色素形成基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄガラクトシド）（Ｘｇａｌ）約５％のプラークが青色であった。パッケージング効率は、ＤＮＡ１μｇ当たり約１０６プラークであった。
【０１１３】
ヌクレアーゼ活性を持ったλ組換え体クローンに対するスクリーニング
増幅されていないライブラリー（１０μｌ）に、ＬＥ３９２のオーバーナイト（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養物０．１ｍｌを塗布した（ｐｌａｔｅｄ）。５時間後、プレートに、０．５ｘＢＢＬ  ＤＮアーゼテスト寒天および０．０１％トルイジンブルーおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を塗布した。全部で１０のプレートをスクリーニングした。４４のピンクのプラーク（潜在的にヌクレアーゼ陽性）を再スクリーニングした。４４のピンクのプラークのうち９つはヌクレアーゼ活性について陽性であると一貫して再スクリーニングされた。
【０１１４】
ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼの生産が、ホスト大腸菌バクテリアに有害であるため、これらのヌクレアーゼ陽性クローンのプラークの大きさは、ヌクレアーゼ陰性クローンに対するよりもより小さい。したがって、ヌクレアーゼ活性を下げるであろう突然変異を蓄積する選択圧があり、これが、安定なヌクレアーゼ陽性クローンの単離の仕事を複雑にする。
【０１１５】
本発明の選択およびスクリーニング手順の改良の１つは、安定なヌクレアーゼ陽性クローンを可能とする選択圧を下げることである。これをするために、プラズミドｐＭＣ９なしの大腸菌株Ｙ１０９０をヌクレアーゼ担持ファージに対するホストとして用いた。プレートライゼートを用いてクローンをプラーク精製する系統を発生させた。この手順で、ホストおよびファージは、温置５時間の後に塗布する代わりに、０．５ｘＢＢＬ  ＤＮアーゼテスト寒天および０．０１％トルイジンブルーおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２に直接塗布した。
【０１１６】
９つの組換え体クローンのライゼートを、ＤＮＡ含有のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析した。すべての９つのクローンのヌクレアーゼは、ＳＤＳ変性の後その活性を保持した、またすべてが、同じ約２５ｋｄの見かけ分子量を有する。
【０１１７】
これらの９つのライゼートを、等電点分離法用のＩＥＦ３−９ゲルを有するＰｈａｓｔＧｅ１システムで分析した。電気泳動の後、ゲルに、ＴＡＥ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中の１％アガロースに含むようにした３．５ｍｌのＤＮアーゼ基質（ストレプトナーゼＢキット）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を塗布した。ゲルの基端の縁のすべて９つのライゼートについての活性バンドは、クローン化されたヌクレアーゼについての非常に高いｐＩを示唆する。このことは、また、すべて９つのクローンが、同じ遺伝子を含むことを示唆した。
【０１１８】
特に、２−６と呼ばれるＤＮアーゼ活性を示す１つのファージをさらに分析した。λＤＮアーゼＢ２−６クローンを、制限エンドヌクレアーゼ分析により分析してＤＮＡフラグメントを特徴づけた。２−６クローン中のλベクター中のストレプトコッカス・ピオゲネスゲノム挿入断片（ｉｎｓｅｒｔ）は、約５．２ｋｂであった。ヌクレアーゼ遺伝子の位置は、ＤＮアーゼ２−６クローンのより小さな領域をλｇｔ１１にサブクローニングし、ヌクレアーゼ活性についてサブクローンをテストすることにより測定した。図２は、さまざまなサブクローンとそれらのヌクレアーゼ活性の位置を示している。サブクローン１および４は、ヌクレアーゼ活性を生じたが、非常に不安定であった。サブクローン２および３は、ヌクレアーゼ活性に欠けるが、安定であった。このサブクローニングの結果は、ＤＮアーゼＢ遺伝子の少なくとも一部が、内部Ｓａｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩフラグメントに存在することを示した。ＤＮアーゼＢタンパク質からのアミノ末端配列が遺伝子暗号と共に用いられ、サブクローンのいくつかおよびＤＮアーゼ２−６挿入断片にハイブリット化するために用いられた一組の同義性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを発生させた。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮアーゼＢ２−６中の３．５ｋｂＥｃｏ  ＲＩフラグメントおよびサブクローン３中のＳａｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩにハイブリッド化した。このデータは、サブクローン化データと共に、ヌクレアーゼ遺伝子の転写が、図解したように左から右に非常になり得ることを示唆し、Ｓａｃ  Ｉ部位がＤＮアーゼＢ遺伝子内にあることを示唆する。
【０１１９】
５．２ｋｂ挿入断片に隣接するストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮＡのマッピングが、ゲノムＤＮＡブロットハイブリッド形成によりなされる。λＮＤアーゼ２−６ＤＢＡの３．５ｋｂおよび１．５ｋｂ  Ｅｃｏ  ＲＩフラグメントをゲル精製し、ランダムプライミングにより３２Ｐで標識した。同じゲノムブロットを、２つのプローブと連続的にハイブリッド化させた。ストレプトコッカス・ピオゲネス染色体中の挿入断片およびその隣接領域の部分的制限エンドヌクレアーゼマップを図１に示す。
【実施例２】
【０１２０】
例２ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢを含むクローン２−６の配列決定
ヌクレオチド配列分析を、上記のＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．のジデオキシヌクレオチド読み終わり法（ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によりクローン２−６に行った。配列分析は、クローン２−６のλｇｔ１１ファージ内からＤＮアーゼ活性の疑問領域を横断してプライミング合成により開始された。配列決定の結果は、図３および４に示してある。ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢは、配列の初めの全部の読み取り枠内にある。
【実施例３】
【０１２１】
例３未変性（ｎａｔｉｖｅ）ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢの精製
未変性ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢを、正しいヌクレアーゼのマーカーとして商業的ＤＮアーゼＢ分析試薬を用いて精製した。言い換えるなら、商業的キットのＤＮアーゼＢで得られるポリアクリルアミドゲル電気泳動結果が、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４２８９から得られる抽出物中のゲル電気泳動からの結果と比較された。精製手順は、以下を含んだ：ＤＥ−２３ジエチルアミノエチルセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）へのバッチ吸着；（２）フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上でのクロマトグラフィー；（３）ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのクロマトグラフィー；および（４）Ｍｏｎｏ−Ｐ等電点分離法。
【０１２２】
細菌培養物
Ａから誘導したストレプトコッカス・ピオゲネスＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４２８９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）。Ｂｅｒｎｈｅｉｍｅｒ  Ｃ２０３Ｓ（Ｃ２０３の変異型を含むｎｏｎ−Ｍ）を、ＤＮアーゼＢ含有培地のコレクションに対して細菌源として用いた（酵素は、バクテリアにより培地に分泌された）。０．０１％洗浄済ヤギ赤血球で補足した脳心臓注入媒質（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）（１リットル）（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）の各容量を新たなオーバーナイト培養物１ｍｌで接種した。これらの培養物を２リットルの三角フラスコ中で３７℃で温和に攪拌しながら（３００ｒｐｍ）２０時間成長させた。精製に先立ち、培地は、Ｐｅｌｌｉｃｏｎフィルター（０．２２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＧＶＬＰ膜）を用いてろ過し、さらに０．４５μｍ使い捨てろ過装置（Ｎａｌｇｅｎｅ，Ｎａｌｇｅ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によりろ過して、透明にし滅菌した。この手順により約１０５リットルの培地を処理した。
【０１２３】
ジエチルアミノエチルセルロースへのバッチ吸収
透明にした媒質は、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ装置と、フィルター面積約０．４６ｍ２、流量１２０ｍｌ／分、圧力２０ｌｂ／平方インチ（１．４ｋｇ／ｃｍ２）で１０Ｋ膜（ＰＬＧＣ、再生セルロース）を用いて濃縮した。媒質の最初の容量１０５リットルを、タンパク質濃度２．３ｍｇ／ｍｌとして４リットルに最終的に濃縮した。
【０１２４】
ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）（ＤＥ２３，Ｗｈａｔｍａｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）が、１５容量の０．５ＭのＨＣｌによる洗浄と、これに続く１５容量の０．５ＭのＮａＯＨによる２回目の洗浄により再生された。水酸化ナトリウムによる洗浄の繰り返しの後、ＤＥＡＥ−セルロースを中性になるまで水洗した。最後に、セルロースをＴＭＣ緩衝液（１ｍＭ  ＴｒｉＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）中で夜通し平衡化させた。
【０１２５】
平衡化させたウエットセルロース（１００ｇ）を、５００ｍｌの濃縮ストレプトコッカス・ピオゲネス媒質上澄みに加えた。この混合物を４℃で２０分間３００ｒｐｍで振とうしてから、４５分間３５００ｒｐｍで遠心分離させた。セルロースは、ＴＭＣ緩衝液４５０ｍｌで洗浄し、２つの上澄み液を一緒にした。
【０１２６】
フェニルセファロースのクロマトグラフィー
ジエチルアミノエチルセルロースバッチ吸収からの上澄み液を０．４５μｍ膜を通して濾過することにより透明にした。硫酸アンモニウムを０．８Ｍに加えてから、０．８Ｍの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのりん酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセフアロースＣＬ４５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に通した。
【０１２７】
８０ｍｌのフェニルセファロースカラムに、２５８μｇ／ｍｌの濃度てサンプル１１００ｍｌを１．８５ｍｌ／分で充填した。ＤＮアーゼ活性を、フロースルーで収集してから、１０ｋｄ膜（Ｄｉａｆｌｏ  ＹＭ１０，Ａｍｉｃｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．）を用いて限外濾過により濃縮した。最終タンパク質濃度は、０．２４５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１２８】
ヘパリンセファロースのクロマトグラフィー
フェニルセフアロースカラムからの濃縮流出液を、ヘパリン緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２ｍＭ  ジチオスレイトール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ＮａＣｌ、１０％グリセロール）に対して透析した。ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（８０ｍｌ）を、ヘパリン緩衝液Ａと平衡化させてから、流量１．０ｍｌ／分で充填した。カラムを３容量のヘパリン緩衝液Ａで洗浄してから、０％と１００％緩衝液Ｂの間の勾配を、２．２ｍｌ／分の流量で流した。緩衝液Ｂは、塩化ナトリウムの濃度が１．０モル／リットルであることを別として緩衝液Ａと同じであった。ＤＮアーゼ活性は、約２５０ｍｌの容量で３５０ｍＭのＮａＣｌで溶離した。ＤＮアーゼ活性は、限外濾過により濃縮した。
【０１２９】
Ｍｏｎｏ−Ｐ等電点分離法
濃縮ＤＮアーゼ９画分を、２５ｍＭのジエタノールアミンｐＨ９．５に対して透析してから等電点分離した。充填緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（２５ｎＭ  エタノールアミン、ｐＨ９．５）中で平衡化したｍｏｎｏ  Ｐ  ５／２０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を５００μ１のサンプルと共に注入してから、９ｍｌの充填緩衝液で洗浄した。カラムは、１００％緩衝液Ｂ（１０％ポリバッファー９６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＨ６．０）で溶離した。溶離した全容量は、３４ｍｌであり；０．５ｍｌの画分が収集された。活性の２つのピークは、ｐＨ８．５５−８．４（画分２５−２９）で収集され、画分Ｉと名づけ、８．２２−８．１３（画分３４−３５）で収集されたものを画分ＩＩと名づけた。収集した画分は、等電点フォーカシング活性ゲル、銀染色法およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【０１３０】
逆相高圧液体クロマトダラフィー
クロマトフォーカシングからのピーク画分は、Ｃ４カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて逆相高圧液体クロマトグラフィーによるクロマトフォーカシングのために用いた両性電解質（ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）を除去するようにさらに精製した。サンプルを緩衝液Ａ（水に含むようにした０．１％トリフルオル酢酸）に充填し、０％−１００％緩衝液Ｂ（アセトニトリル中の０．８％トリフルオル酢酸）の勾配を用いて流量１ｍｌ／分でカラムを溶離した。これらのタンパク質は、約１ｍｌの容量の６５％緩衝液Ｂで溶離した。
【０１３１】
ＳＤＳおよび等電分析
すべてのサンプルのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析を、ＰＨＡＳＴシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）自動化装置の使用により行った。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＰｈａｓｔＧｅｌ  １０−１５％ゲルで行った。等電ゲルは、ＰｈａｓｔＧｅｌ  ＩＥＦ３−９ゲルを用いて流した。ＳＤＳおよび等電ゲルの両者の銀染色法は、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ自動化染色装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）を用いて行った。等電フォーカシングゲルへのＤＮアーゼサンプルの活性検定は、再構成したＤＮアーゼ基質染料（Ｗａｍｐｏｌｅ）１ｍｌとりん酸塩緩衝塩を含む１％溶解アガロース溶液５ｍｌとによる電気泳動の後、ゲルを上塗りすることにより行った。室温で基質オーバーレイと共にＩＥＦゲルを温置したところ、ヌクレアーゼ活性を中心としてピンク色に青色の基質染料を変えることにより活性の検出をもたらした。ＳＤＳ変性サンプルの活性検定は、５００μｇ／ｍｌへリングテステス（ｈｅｒｒｉｎｇ  ｔｅｓｔｅｓ）ＤＮＡの存在下で重合させたＳＤＳ−１４％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。電気泳動の後、ゲルを、水で洗浄してから、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２％のアジ化ナトリウムと３７℃で２時間平衡化させた。ヌクレアーゼによるＤＮＡの分解の結果として見えるようになるヌクレアーゼ活性を観察するため、エチジアムブロミド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を１μｇ／ｍｌまで加えた。
【０１３２】
タンパク質配列決定
精製ＤＮアーゼの画分ＩおよびＩＩのアミノ末端配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）４７７配列決定装置を用いて決定した。精製した酵素（画分ＩおよびＩＩ）のそれぞれのサンプルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）４７０  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒに充填した。画分ＩおよびＩＩの両方の初めの２３個のアミノ酸が次の読み取り可能な配列を生じた：Q−T−Q−V−S−N−D−V−V−L−N−D−G−A−S−X−Y−L−N−E−A−L−A（配列番号：４）（ここで、Ｘは、明確には確認できないアミノ酸を示すが、最もおそらくは、トリプトファンまたはリジンである）。
【０１３３】
質量分光学分析
イオンスプレー質量スペクトル分析を、組換え体ＤＮアーゼＢ（例１）と精製未変性ＤＮアーゼＢの画分ＩおよびＩＩに、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙイオン化システムを有するＦｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ＴＳＱ７００三段階四重極質量分析計を用いて行った。サンプルは、上記したようにＣ４カラムを用いて逆相分画により得た。ＤＮアーゼＢタンパク質が、６５％緩衝液Ｂで溶離し、保存のため凍結乾燥させた。流量１μｌ／分での注入に先立ち、サンプルは、アセトニトリル−水−酢酸（５０：５０：１）に溶解させた。
【０１３４】
質量分析により測定された分子量は、次のようであった：組換え体ＮＤアーゼＢ（例１）−−２５，５４９；精製した自然のＤＮアーゼの画分Ｉ−−２５，３９０；精製した自然のＤＮアーゼＢの画分ＩＩ−−２５，３９７。これらの結果は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列決定の結果と一致していて、組換え体ＤＮアーゼＢがアミノ末端に１つの追加のアミノ酸を有することを示している。精製した自然のＤＮアーゼＢの画分ＩとＩＩとの間の分子量の差は、さもないと同一のアミノ酸配列の小さな変更と一致する。可能な変更は、脱アミノ化であり、これは、適当なｐＩシフトを起こす。
【実施例４】
【０１３５】
例４バクテリオファージλ２−６クローンから生じた組換え体ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢの精製とアミノ末端配列分析
λＤＮアーゼＢ２−６ファージライゼート中の組換え体ＤＮアーゼＢタンパク質を、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析によりＳＤＳポリアクリルアミドゲルで確認した。商業的なＤＮアーゼＢに対するウサギ抗体を用いて、組換え体ＤＮアーゼＢの存在を検出した。ＳＢＳ−ポリアクリルアミドゲルのクーマーシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）は、組換え体ＤＮアーゼＢタンパク質が、ライゼート中の全タンパク質の約５％であったことを示唆する。わずか１個のヌクレアーゼが、ＳＤＳ−ＤＮＡ−ポリアクリルアミドゲルシステム中に検出された。ヌクレアーゼは、２５，０００ダルトンの見かけ分子量を有している。
【０１３６】
組換え体ＤＮアーゼＢタンパク質の精製が、商業的なＤＮアーゼＢ検定キット中の対照用に用いた基質を使用するヌクレアーセ活性検定とＳＢＳ−ポリアクリルアミドゲルとを用いて監視された。精製手順は、次の（１）−（４）を含んだ：（１）Ｑ−セファローズ（トリメチルアミノメチルアガロース）でのクロマトグラフィー；（２）硫酸アンモニウム沈殿；（３）ヘパリン−アガロースでのクロマトグラフィー；（４）Ｑ−セファロースでのクロマトグラフィー。２リットルのλＤＮアーゼＢ２．６ファージライゼートを、１０ｍＭのＭｇＣｌ２で補足したルリアブイヨン（Ｌｕｒｉａ  ｂｒｏｔｈ）上のオーバーナイト細胞組織として得た。上澄みを、４℃４５分間で３６３５ｘｇのＢｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）遠心機で細胞組織の遠心分離の後に集めて、細胞デブリ（上澄みの液の容量は１９００ｍｌであった）を除去した。
【０１３７】
ライゼートを、０．４５μｍ濾過ユニットを通して濾過して残りのバクテリアと細胞デブリを除去した。次にこの濾液を、Ｑ−セフアローゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（これは２０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡと平衡させておいた）の約２００ｍｌカラムを通してた。カラムのフロースルーを集めた。この画分に、硫酸アンモニウムをゆっくりと加えて室温で８０％の最終濃度としてライゼートを濃縮した。脱塩したタンパク質を、３０分間１５，０００ｘｇで還心分離した。
【０１３８】
透析したタンパク質にグリセロールを加えて最終濃度１０％とした。この標品（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を、０．４５μｍ濾過ユニットを通して濾過した。タンパク質標品の導電率を測定し、タンパク質標品を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈して、導電率を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール（緩衝液Ａ）の溶液とそれと同じとした。最終容量は１８００ｍｌであった。
【０１３９】
このサンプルを、流量１２０ｍｌ／時でＰｈａｒｍａｃｉａ  ＥＰＬＣシステムでヘパリン−セファロースカラム（約１００ｍｌ）に充填した。カラムを４００ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。ＤＮアーゼＢを、緩衝液Ａ中に含むようにした勾配２５ｍＭ−５００ｍＭのＮａＣｌの１リットルで溶離した。ＤＮアーゼ活性は、容量約１７５ｍｌ中の約１２５ｍＭのＮａＣｌで溶離した。
【０１４０】
ヘパリンアガロースカラムから溶離したＤＮアーゼ画分を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に対して透析し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化した約１７５ミリリットルＱ−セファロースカラムに充填した。Ｑ−セファロースカラムからのフロースルーを集め、等電フォーカシング活性ゲル、銀染色法およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。組換え体ＤＮアーゼＢタンパク質の標品は、９９％均質であった。最終的な溶出液（１１０ｍｌ）のタンパク質濃度は、約１００μｇ／ｍｌであった。これは、約５．５ｍｇ／培養物１リットルの収量に当たる。次に、例３に上記したように、最終生成物を逆相高圧液体クロマトグラフィーにかけた。
【０１４１】
精製組換え体ＤＮアーゼＢのアミノ末端配列は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２０２０／Ｇｏｌｄを用いて決定した。
アミノ酸配列は、アミノ末端がアルギニン（Ｒ）であることを別として、自然のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢのそれと同一であった。このアルギニンは、組換え体ＤＮアーゼＢをつくる方法から生じた。
【０１４２】
ＤＮアーゼＢの分光分析は、ＤＮアーゼが均質であることを示した。
【実施例５】
【０１４３】
例５ｐＬプロモーターの規制下での大腸菌プラズミド中のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素のクローニングと発現
バクテリオファージλプロモーターｐＬを組み入れたプラズミドベクターを用いてストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ遺伝子の規制された発現を証明するために追加の遺伝組立てを行った。この組立ては、λ２−６クローン中のＤＮアーゼＢ遺伝子に修飾末端を組み込むためポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を用いて行った。次のオリゴヌクレオチドを指名し、製造者の推奨に従いＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成装置で合成した：
【０１４４】
Ａ：５’−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−３’（配列番号：２）
Ｂ：３’−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−５’（配列番号：３）
【０１４５】
製造者の指示に従い、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いてＰＣＲ反応でこれらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ＭｇＣｌ２の最終濃度を４ｍＭに調節し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）を用いて２０サイクル反応（３７℃、２分間；７２℃、３分間；９５°Ｃ、２分間）を行った。λｇｔ１１クローン２−６（１００ｍｇ）のＤＮＡを、各プライマーの２００μＭと共に鋳型として用いた。得られる増幅された生成物は、Δ３３発現ベクターに組み込むのに先立って、さらに、ＢａｍＨＩおよびＳａｌ  Ｉにより消化された。これらの操作は、図５に示すような配列との翻訳融合体を生じさせた（これは、λｐＬプロモーターにより規制される）。
【０１４６】
Ｃ６００  Ｃｌ＋，ｇａｌＫバクテリアを結合混合物により形質転換させ、ＬＢ−Ａｍｐ皿に塗布した。その後、ＤＮＡのミニ標品をつくり（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７）（Ｓｅｃｔｉｏｎ１．６）、次に、プラズミドを酵素Ｂａｍ  ＨＩおよびＳａｌ  Ｉによりカットしプラズミドが組換え体ＤＮアーゼＢフラグメントからなるかどうかを決定した。所望の組立てのプラズミドをさらにＡＲ１２０ホスト株へと形質転換した。組換え体ＤＮアーゼＢを含んでなるプラズミドを有するこれらのホスト細胞をナリジキン酸プロトコール（上記Ｍｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）を介して誘導操作に付した。形質転換したＡＲ１２０を含んでなるコロニーを寒天平板から上げ、Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（塩基：１２ｇトリプトン、２４ｇ酵母エキス、５ｍｌグリセロール、９００ｍｌ蒸留水；塩／塩基１リットル：１．７ｇＫＨ２ＰＯ４、１５．８ｇＫ２ＨＰＯ４（無水）、１００ｍｌ蒸留水）および１００ｐｇ／ｍｌペニシリン中で接種し、３７℃で成長させて、６５０ｎｍでの培養物の光学密度を０．４とした。
【０１４７】
その後、ナリジキン酸を、最終濃度６０μｇ／ｍｌで接種混合物に加えた。培養物を、３７℃で約８時間または夜通し（約１６時間）温置した。すべての細胞画分を、培養物からの上澄み液、音波処理済細胞ペレットおよび音波処理済細胞ペレットからの上澄み液を含めてＤＮアーゼＢ活性について検定した。
【０１４８】
オーバーナイト誘導については、ＤＮアーゼＢが、大腸菌細胞の外に分泌された。８時間誘導は、細胞の外（約３０％が内部であった）に分泌したＤＮアーゼＢのほとんどを音波処理した上澄み液中で回収した。ＤＮアーゼＢの量は、十分大きく、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのクーマーシーブリリアントブルー染色で視覚化された。
【実施例６】
【０１４９】
例６ｐＬプロモーターの規制下での大腸菌中に生じた組換え体ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢの精製
組換え体ＤＮアーゼＢクローンのある量（６リットル）を、超ブイヨン（ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）中で成長させ、例５に記載したように夜通し誘導した。上澄み液を収穫し、１０Ｋ膜を用いてＰｅｌｌｉｃｏｎ濃縮装置により濃縮した：濃縮により容量６００ｍｌとなった。
【０１５０】
濃縮した抽出物は、ヘパリン緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２ｍＭ  ジチオスレイトール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール）に対して透析した。ヘパリンカラムを例３に示すように充填し、流し、溶離させた。ヘパリンカラムからの溶出液を２０ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ８．５）中で透析した。少量の外来性のタンパク質が、ＤＮアーゼＢ標品からバッチ吸収によりＱ−セファロースに吸収された。ある量のＱ−セファロース（１００ｍｌ）を、２０ｎＭのエタノールアミン（ｐＨ８．５）と平衡化させてから、１００ｍｌのヘパリンＤＮアーゼＢ画分に加えた。Ｑ−セファロースは、４℃２０分でのバッチ手順で抽出物に結合させた。結合の後、Ｑ−セファロースを、０．４５μｍ濾過ユニットを通して濾過した。樹脂は、遠心分離による分離に先立って、５０ｍｌの２０ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ８．５）により２０分間最終的に洗浄した。この手順からの２つの溶出液を一緒にし、逆相クロマトグラフィー、アミノ酸配列決定および質量分光分析により分析した。逆相クロマトグラフィーについては、１ｍｌの精製ＤＡアーゼＢを、Ｃ４カラムに通し、容量１ｍｌの６５％緩衝液Ｂで溶離した。例３の未変性ＤＮアーゼＢの精製についてと同じ緩衝液を用いた。
【０１５１】
アミノ酸配列は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２０２０／Ｇｏｌｄを用いて決定した。アミノ酸配列は、Ｒ−Ｑ−Ｔ−Ｑ−Ｖ−Ｓ−Ｎ−Ｄ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｎ−Ｄ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｔ−Ｆ−Ｎ−Ｄ−Ｓ−Ｐ−Ｎ−Ｙ−Ｙ−Ｋ−Ｔ−Ｌ−Ｇ（配列番号：６）であった。
【０１５２】
質量分光分析も自然のＤＮアーゼＢについて記載したようにして行い、同等な結果を得た。
【実施例７】
【０１５３】
例７ＤＮアーゼＢ酵素のアミノ末端配列に対応するＤＮＡプローブの準備
ＶＡＸ  ＧＣＧプログラム（表１）への腸内細菌の高度に発現された遺伝子についてのコドン処理を用いることにより、次の同義性プローブが得られた：Ｃ−Ａ−Ｕ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−Ａ−Ｒ−Ｔ−Ｎ−Ｗ−Ｓ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｙ−Ｇ−Ｔ（（配列番号５）。この配列で、Ｒは、プリン（すなわちＡまたはＧ）であり、Ｙは、ピリミジン（ＴまたはＣ）であり、Ｓは、ＧまたはＣであ、Ｗは、ＡまたはＴであり、そしてＮは、４つの普通のデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。このプローブは、効率的に、λｇｔ１１クローン２．６にハイブリッド化され、未変性ＤＮアーゼＢタンパク質が、クローン化された遺伝子から誘導されとことが確認される。
【実施例８】
【０１５４】
例８抗ＤＮアーゼＢ抗体による組換え体ＤＮアーゼＢの抑制
組換え体ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢがその特性において自然のＤＮアーゼＢに相当することを示すため、免疫抑制を実施した。組換え体ＤＮアーゼＢを、抗ＤＮアーゼＢ抗体を含む対照の正の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ヒト血清を用いる抑制検定で商業的に入手し得る自然のＤＮアーゼＢと比較した。使用した検定は、基質としてＤＮＡ−染料複合体を使用するＤＮアーゼＢの能力に基づいた。この複合体は、最大光学吸収度を６４２ｎｍで示す。しかしながら、ＤＮＡ−染料複合体は、ＤＮアーゼにより分解されるので、吸収の最大波長にシフトがあり、酵素活性は、６４２ｎｍでの測定される吸収の減少により示される。図６に示されるように、組換え体酵素は、自然に存在するストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢに対する免疫反応の結果として抗ＤＮアーゼＢ酵素を含むヒト血清により自然のストレプトコッカス・ピオゲネスと同じようにして不活性化される。
【実施例９】
【０１５５】
例９ＤＮアーゼＢ遺伝子の転写がΛ２−６クローン中のストレプトコッカスプロモーターから生じることの測定
例４に示されるように、λ２−６クローンからのＤＮアーゼＢ遺伝子の発現の高いレベルがあった。この発現の原因である強い細菌プロモーターの開始部位を測定するため、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内ランオフ転写検定を行った。この検定は、転写ＲＮＡランオフの長さをサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ配列決定ラダーと比べることにより転写開始の正確な塩基を決定させることを可能とする。この検定は、大腸菌の転写の開始部位に強い証拠を与える。各種ストレプトコッカスの公知の転写開始部位との比較は、この部位が、連鎖球菌転写の原因領域であることを立証する（Ｊ．Ｆｒｒｅｔｔｉ  ＆  Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ，『連鎖球菌遺伝学（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）』（１９８７）第２９３頁、連鎖球菌の転写の開始と翻訳の前兆となるヌクレオチド配列の編集（Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｈａｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ））。
【０１５６】
ランオフ転写反応では、ＲＮＡポリメラーゼが、プロモーター領域を認識し、転写を開始させる。酵素が、鋳型の端から最終的に脱落するので、これはランオフー転写である。これは、転写開始部位を調べる標準的な方法である。
【０１５７】
ＤＮアーゼＢ遺伝子の上流領域を含むＰＣＲフラグメントが、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼとの試験管内ランオフ転写反応のための鋳型として用いられた。２つのオリゴヌクレオチド、位置２９８−２８０のオリゴヌクレオチド＃２４６およびオリゴヌクレオチド＃２６７（図３には示してない）を用いて、約２９０の塩基対のＰＣＲ  ＤＮＡ生成物が、つくられ、フラグメントが、ゲル電気泳動の後に精製された。ランオフ転写反応は、３０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１２０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの２−メルカプトテサノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｔｅｔｈａｎｏｌ）、４ｍＭのスペルミジン、０．４ｍＭのＡＴＰ、０．４ｍＭのＣＴＰ、０．４ｍＭのＧＴＰ、０．０８ｍＭのＵＴＰ、８０単位のＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１単位のＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および５μｌ［３２Ｐ］ＵＴＰ（全量で１００μｌ）中で行った。この混合物を３７℃で３０分間温置した。反応を停止させるため、１０μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを加えた。
【０１５８】
サンプルを希釈し、配列決定ゲルで電気泳動にかけた。転写産物の大きさを正確に決定するため、２−６ＤＮＡにオリゴヌクレオチド２４６を用いる配列決定反応を行った。反応は、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）サイクル配列決定キットを用いて行った。配列決定ラダーの開始点は、ランオフ転写産物のランオフ点と同じである。尿素ポリアクリルアミドゲル中の配列決定ラダーと一緒に転写産物を分析することにより、転写開始部位の位置が決定された。
【０１５９】
図７は、転写解読枠の上流のＤＮＡ配列および大腸菌プロモーターの共通配列（Ｄ．Ｋ．Ｈａｗｌｅｙ  ＆  Ｗ．Ｒ．ＭｃＣｌｕｒｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：２２３７−２２５５（１９８３））を示している。転写データは、ＲＮＡポリメラーゼについて２つの可能な開始部位（位置９６および９７）があることを示唆する。これらの部位は、図７で星印をつけてある。−３５および−１０領域は、下線がしてある。
【実施例１０】
【０１６０】
例１０ヒト血清サンプル中の抗ＤＮアーゼ体との反応での自然のＤＮアーゼＢとの精製された組換え体ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢの等価性（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）
ヒト血清サンプル中の抗ＤＮアーゼ抗体との反応で、組換え体ＤＮアーゼＢが、商業的なストレプトナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｎａｓｅ）Ｂの形で自然のＤＮアーゼＢと等価であることを示すため、精製したＤＮアーゼＢ酵素を、ストレプトナーゼＢ検定で商業的なストレプトナーゼＢの代わりに用いた。Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）からの患者サンプルを、ストレプトナーゼＢ診断キットにある指示にしたがってテストした。同じサンプルについて、再構成したストレプトナーゼＢと同様なヌクレアーゼ活性を与えるように希釈した精製組換え体ＤＮアーゼＢを用いてテストした。結果を表２に示し、図８に相関関係の形でグラフにした。
【０１６１】
【表２】
2005046151.tif 000004
【０１６２】
分かるように、商業的ストレプトナーゼＢと精製組換え体ＤＮアーゼを用いた結果の間の相関関係は極めて高い。このように、精製組換え体ＤＮアーゼＢは、商業的なストレプトナーゼＢのように血清中に見られる抗ＤＮアーゼ抗体と実質的に同じように反応する。
【実施例１１】
【０１６３】
例１１精製した自然のＤＮアーゼＢのマイトジェン活性の欠如
精製された自然のＤＮアーゼＢが、ヒトリンパ球マイトジェン検定でマイトジェン活性を有するかどうか測定するため、精製された自然のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢのさまざまな画分を、Ｔ．Ｙｕｔｓｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．の『ストレプトコッカス・ピオゲネスによりつくられたマイトジェン因子の新しい種類（Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｅｎｅｓ）』、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３０８：３０−３４（１９９２））により用いられた手順に従いマイトジェン検定でテストした。マイトジェン活性についてのＤＮアーゼＢのテストにたいして、製造者により記載されたようにして行ったＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１段階勾配手順を用いて、ヒトリンパ球を単離した。リンパ球を１０５細胞／ウエルの濃度でマイクロタイタープレート（９６個のウエル）に塗布した。湿度を持たせた雰囲気（３７℃、５％ＣＯ２、１μＣｉの三重水素化したチミジン）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）での３日間の成長の後、１ｍＣｉ／ｍｌで、各ウエルに加えた。さらに２４時間の成長の後、細胞は、１０％の胎児ウシ血清でＭＥＭ媒質に溶解させた１００ｍＭのＥＤＴＡ２０μｌを用いて、ガラス管に移した。ウエルを、１０％胎児ウシ血清と共に追加の２００μｌのＭＥＭで洗浄した後、加えた三重水素化したチミジンを沈殿させるため、５００μｌの１０％のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）を各ガラス管に加えた。ＴＣＡ／細胞混合物は、ガラスフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）での濾過に先立ち、２０分間氷上で温置させた。フィルターは、さらに、５％のＴＣＡおよび１００％のエタノールで洗浄してから、乾燥させ、次に、シンチレーションで計数した。マイトジェン活性についての正の対照として、コンカナバリンＡ（示すように１μｇ／ｍｌ−１００μｇ／ｍｌ）を用いた。
【０１６４】
大腸菌ＤＮアーゼＩ、例３のヘパリン−セファロース画分、例３の精製した画分、および例３のストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢについて結果を図９に示す。結果は、両方の精製した画分ＩおよびＩＩさらに組換え体ＤＮアーゼＢが実質的にマイトジェン活性を有さないことを示している。ヘパリン−セファロース画分が、検出可能なマイトジェンを有さなく、なぜなら、さらなる精製で除去されたからである。このことは、マイトジェン活性が、ＤＮアーゼＢタンパク質に存在しなく１種またはそれ以上の不純物に存在すること示している。
【０１６５】
発明の利点
本発明は、多量のストレプトコッカス・ピオゲネスを成長させる高価で危険な工程を必要とすることなく高度に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢ酵素を得る方法を提供する。該酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネスのほかのタンパク質からそれを精製することなく得られる；該酵素は、適当な発現ベクターにより移入された大腸菌からまたは組換え体ファージ感染大腸菌から精製され得る。発現ベクターは、発現を最適化させるように選択され得る。
【０１６６】
次に、ストレプトコッカス・ピオゲネスＤＮアーゼＢは、ＤＮアーゼＢに特異的な検定で血清中の抗ＤＮアーゼＢ抗体についての検定をするために用いられ得る。特に、精製されたＤＮアーゼＢの有用性は、固相に吸着された精製酵素を用いるＥＬＩＳＡ検定の利用を可能とし、これは、広範囲の利用に適当であり実施が容易で便利な検定である。この検定は、高い感度を有しまた特異的である。このような検定は、ストレプトコッカス・ピオゲネス感染を検出する臨床での用途に特に適当である。
【０１６７】
以上、本発明を本発明のある好ましい形についてかなり詳細に説明したが、他の形も可能である。したがって、添付の請求の範囲の精神と範囲は、ここに含まれる好ましい形の説明に限定されるものではない。
【０１６８】
本発明のこれらの特徴及び別の特徴、要旨（ａｓｐｅｃｔ）並びに利点は以下の記載、添付の請求の範囲及び添付の図面を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】クローン化されたＤＮアーゼＢを含んでいる領域について、該クローン中のキメラＤＮＡの領域と、ＤＮアーゼＢの遺伝子との位置を示す、部分的制限地図。
【図２】図１のクローン化されたＤＮＡのサブクローンの位置と、該サブクローンによって産生されたヌクレアーゼ活性の指標を表わす図。
【図３−１】図１に示される部分制限地図をもつクローンのＤＮＡ配列。
【図３−２】図１に示される部分制限地図をもつクローンのＤＮＡ配列。
【図４】図２のＤＮＡ配列から誘導される組換えＤＮアーゼＢタンパク質のアミノ酸配列であって、天然産の精製ＤＡアーゼＢの配列決定の結果として決定されたアミノ末端をもつ、アミノ酸配列。
【図５−１】ＤＮアーゼＢ配列をコード化するＤＮＡにバクテリオファージλプロモーターを融合するための組立て体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）のＤＮＡ配列と、該組立て体の形成におけるＰＣＲに使用されるプライマーのＤＮＡ配列。
【図５−２】ＤＮアーゼＢ配列をコード化するＤＮＡにバクテリオファージλプロモーターを融合するための組立て体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）のＤＮＡ配列と、該組立て体の形成におけるＰＣＲに使用されるプライマーのＤＮＡ配列。
【図６】ヒト抗ＤＮアーゼＢ血清による組換えＤＮアーゼＢの不活性化すなわち失活を表わすグラフ。
【図７】クローン化されたＤＮＡ中の読取り枠の上流のＤＮＡ配列と、大腸菌プロモーターのコンセンサス配列。
【図８】組換えＤＮアーゼＢ酵素を使用するヒト血清中の抗ＤＮアーゼＢ抗体の定量と、ストレプトコッカス・ピオゲネスから単離された市販のＤＮアーゼＢ酵素を使用するヒト血清中の抗ＤＮアーゼＢ抗体の定量との間の一致を示す補正曲線。
【図９】組換えＤＮアーゼＢと天然産ＤＡアーゼＢの精製調剤の両方からマイトジェン活性が本質的に欠乏していることを示すグラフ。
【配列表フリーテキスト】
【０１７０】
配列５：ｎ＝ａ、ｃ、ｔまたはｇ
【図１】
2005046151.tif 000005
【図２】
2005046151.tif 000006
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005046151.tif 000014
【図９】
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【配列表】
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