(57)【要約】  【課題】ビクニン遺伝子のノックアウトマウスを用いて、ＳＨＡＰ―ヒアルロナン複合体生成の有無が同マウスに及ぼす影響についての知見を見いだし、かかる知見を基に、産業上有用な技術を提供すること。  【解決手段】ビクニン遺伝子のノックアウトマウスに対して被験物質を投与し、炎症の惹起の度合いを指標として、被験物質の炎症惹起作用をスクリーニングする、炎症惹起物質のスクリーニング方法を提供し、さらに、遺伝子レベルで、ビクニン遺伝子の発現を抑制することで、生体内でのＳＨＡＰ―ＨＡ複合体の形成を抑制して抗炎症効果を発揮する、少なくとも配列番号１の塩基番号６１４５〜６２５０番目の塩基配列、を含むビクニンターゲッティング用ＤＮＡを有効成分とする抗炎症剤を提供することにより、上記の課題を解決した。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビクニン遺伝子のノックアウトマウスに対して被験物質を投与し、当該ノックアウトマウスにおける炎症の惹起の度合いを指標として、被験物質の炎症惹起作用をスクリーニングする、炎症惹起物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
同一の被験物質を下記ａ及びｂのマウスに投与して、これらのマウスａ及びｂにおいて惹起される炎症が同種及び/又は同程度である場合に、当該被験物質をビクニン非依存性の炎症惹起物質として評価する、請求項１記載の炎症惹起物質のスクリーニング方法。
ａ.被験物質を投与した、ビクニン遺伝子をノックアウトしていないマウス
ｂ.被験物質を投与した、ビクニン遺伝子のノックアウトマウス
【請求項３】
同一の被験物質を下記１及び２のマウスに投与して、１）これらのマウス１及び２において惹起される炎症が同種の炎症であり、かつ、マウス１において惹起される炎症の程度が下記２のマウスよりも強い場合、あるいは、２）マウス１及び２において惹起される炎症が質的に異なる場合には、当該被験物質をビクニン依存性の炎症惹起物質として評価する、請求項１記載の炎症惹起物質のスクリーニング方法。
１.被験物質を投与した、ビクニン遺伝子をノックアウトしていないマウス
２.被験物質を投与した、ビクニン遺伝子のノックアウトマウス
【請求項４】
ビクニン遺伝子のノックアウトマウスが、ゲノム中のＡＭＢＰ遺伝子のエキソン７のビクニン遺伝子に相当する部分をノックアウトしたノックアウトマウスである、請求項１〜３のいずれかに記載の炎症惹起物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ビクニン遺伝子のノックアウトマウスが、マウスゲノム中に、配列番号１の塩基番号６１４５〜６２５０で表される塩基配列を存在させることにより、当該ゲノム中のＡＭＢＰ遺伝子のエキソン７のビクニン遺伝子に相当する部分がノックアウトされたノックアウトマウスである、請求項１〜４のいずれかに記載の炎症惹起物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
ビクニン遺伝子のノックアウトマウスが、相同染色体の両方に配列番号１の塩基番号６１４５〜６２５０で表される塩基配列を含んでいるノックアウトマウスである、請求項５記載の炎症惹起物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
ビクニン遺伝子のノックアウトマウスが、α―１―ミクログロブリン遺伝子が正常に保持されているノックアウトマウスである、請求項１〜６のいずれかに記載の炎症惹起物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の炎症惹起物質のスクリーニング方法を行うための、スクリーニング用ノックアウトマウス。
【請求項９】
少なくとも配列番号１の塩基番号６１４５〜６２５０番目の塩基配列を含むビクニンターゲッティング用ＤＮＡを有効成分とする、抗炎症剤。
【請求項１０】
抗炎症剤が、ＳＨＡＰ―ヒアルロナン複合体の形成抑制剤である、請求項９記載の抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤のスクリーニング方法、具体的には、ノックアウトマウスを用いた炎症惹起物質のスクリーニング方法及び抗炎症剤に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ビクニン(bikunin)は、インター-α-トリプシンインヒビター（以下、ＩＴＩともいう）およびＩＴＩファミリー[プレ-α-トリプシンインヒビター（ＰαＩ）、インター-α-トリプシン様インヒビター（ＩＴＬＩ）]のコアとして存在する、コアタンパク質の１０番目のセリン残基に、Ｏ−グリコシド結合した、ヒアルロナン（ヒアルロン酸と同義。以下、「ＨＡ」ともいう）繰り返し２糖が約１５個あるコンドロイチン４―硫酸鎖を含む糖蛋白質である。
【０００３】
ビクニンは、例えば、生体内で、ヒアルロナン（ヒアルロン酸と同義。以下、ＨＡともいう）が、ＩＴＩファミリーとの相互作用により、ＩＴＩファミリーの重鎖（ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３）と結合して、ＳＨＡＰ（血清由来ヒアルロナン結合蛋白質）―ヒアルロナン複合体（本明細書においてはＳＨＡＰ−ＨＡ複合体ともいう）を生成する際に生成され、尿中に排出される代謝産物としても知られている。
【０００４】
ＳＨＡＰ―ＨＡ複合体は、ヒアルロナンが豊富に存在するゲル状の組織中や体液成分、例えば、リウマチ患者の関節液、慢性肝炎・肝硬変患者の血清、排卵された卵細胞の表面や子宮内膜などに多く存在していることが知られている。
【０００５】
このように、ヒアルロナンリッチマトリックスの機能に重要と考えられるSHAP-HA複合体の生理的役割を追求するために、ITIファミリー分子の共通な構成成分であるビクニンの遺伝子を遺伝的にノックアウトすることで、ITIファミリー分子の産生を抑制したノックアウトマウスが、本発明者らにより作出された（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００２―６５２８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決すべき課題は、上述の状況において作出された、ビクニン遺伝子のノックアウトマウスを用いて、ＳＨＡＰ―ＨＡ複合体生成の有無が同マウスに及ぼす影響についての知見を見いだし、かかる知見を基に、産業上有用な技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、この課題の解決に向けて、上記のビクニン遺伝子のノックアウトマウスに対して、人工的に炎症反応を惹起し、当該炎症反応に対する感受性を検討した。その結果、当該ノックアウトマウスでは、驚くべきことにビクニン遺伝子がノックアウトされることにより、通常のマウスでは認められない炎症反応に対する抵抗性が付与されていることが確認された。
【０００８】
本発明者は、このような知見に基づき、ビクニン遺伝子のノックアウトマウスを用いることで、炎症惹起物質のスクリーニングを行うことが可能であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ビクニン遺伝子のノックアウトマウスに対して被験物質を投与し、当該ノックアウトマウスにおける炎症の惹起の度合いを指標として、被験物質の炎症惹起作用をスクリーニングする、炎症惹起物質のスクリーニング方法（以下、本スクリーニング方法ともいう）を提供する発明である。
【００１０】
また、本発明は、本スクリーニング方法に用いることができる、ビクニン遺伝子のノックアウトマウス（以下、本スクリーニング用マウスともいう）を提供する発明である。
また、他方、遺伝子レベルで、ビクニン遺伝子の発現を抑制することで、生体内でのＳＨＡＰ―ＨＡ複合体の形成を抑制して抗炎症効果を発揮する、少なくとも配列番号１の塩基番号６１４５〜６２５０番目の塩基配列、を含むビクニンターゲッティング用ＤＮＡを有効成分とする抗炎症剤（以下、本抗炎症剤ともいう）を提供する発明である。
【００１１】
[ノックアウトマウス]
本スクリーニング用マウスは、上記の特許文献１に記載されている要領で、通常のノックアウトマウスの作出手法により作出することができる。一般的には、ビクニン遺伝子をノックアウトすることが可能なビクニンターゲッティング用ＤＮＡを、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に導入し、このビクニンターゲッティング用ＤＮＡが組み込まれた細胞を選択し、これをマウスの胚に組み込み、キメラマウスを作出する手法が採用される。
【００１２】
１-１）ノックアウトマウスを作出するためのビクニンターゲッティング用ＤＮＡ
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ビクニン遺伝子のターゲッティングに用いることが可能であり、これを用いて、ビクニン遺伝子をノックアウトすることができる。
【００１３】
マウスビクニン遺伝子は、同じく血清蛋白質であるα-1-ミクログロブリン（以下、α-1-Mともいう）遺伝子と隣接しており、共通のmRNAからα-1-ミクログロブリンとビクニンが結合した前駆体蛋白質として翻訳される。前駆体蛋白質は翻訳後に特異的プロテアーゼにより切断を受け、α-1-ミクログロブリンとビクニンに分かれる。染色体上には、α-1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体遺伝子（AMBP gene）として存在し、１０個のエキソンからなり、前半エキソン１から７がα-1-ミクログロブリンをコードし、後半エキソン７から１０がビクニンをコードしている。
【００１４】
これらの後半のエキソンのうち、エキソン７は、成熟α-1-ミクログロブリンのＣ末端のアミノ酸残基、コンドロイチン硫酸鎖が結合する１０番目のセリン残基を含むビクニンのＮ末端部分および切断サイトから構成されている。ビクニン遺伝子のノックアウトマウスを作出するには、このエキソン７の位置をターゲティングサイトにするのが最も好ましい。また、α-1-ミクログロブリンの産生や前駆体切断酵素への影響を少なくするため、エキソン７の5'側のα-1-ミクログロブリン-ビクニン前駆体の切断部位はそのまま保存することが好ましい。また、同時にビクニン分子の発現を阻止し、しかもコンドロイチン硫酸鎖が結合する10位セリン残基付近の部分ペプチドをも翻訳させないために、ビクニンN-末端をコードする塩基配列を変異させることが好ましい。特にその塩基の数を変化させることは翻訳コードのフレームをずらすことで、たとえペプチドが作られてもビクニン様のコンドロイチン硫酸結合性のペプチドは産生されないため特に有効である。
【００１５】
また、ノックアウトマウスの作出に使用するＤＮＡには、陽性選別を行うための陽性マーカー遺伝子を含有させることが好ましい。陽性マーカー遺伝子は、目的のＤＮＡが細胞に導入された場合に発現して、これにより選別を行うことができるものである。陽性マーカー遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子を用いることが好ましい。
【００１６】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡはこのような思想に基づいて設計されたものであり、例えば、後述する具体的な方法で製造することができる。
【００１７】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡをノックアウトマウス作出に用いる場合には、当該ＤＮＡを適当なベクターに組み込んで使用することが好ましく、これにより、ビクニンターゲッティング用ＤＮＡが提供される。用いるベクターは当業者が適宜選択することができるが、陰性選別を行うための陰性マーカー遺伝子を含んでいるベクターであることが好ましい。
【００１８】
陰性マーカー遺伝子は、目的の相同組換えが起こらなかった場合に発現して選別を行うことができるものである。陰性マーカー遺伝子としては、染色体ＤＮＡに導入されたときに宿主細胞において発現するものであれば特に限定されず、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子などが挙げられるが、チミジンキナーゼ遺伝子が好適である。
【００１９】
このようにしてノックアウトマウスを作出するためのビクニンターゲッティング用ＤＮＡが提供される。
【００２０】
１-２）ビクニンターゲッティング用ＤＮＡの生体内の発現ベクター
ビクニンターゲッティング用ＤＮＡは、遺伝子治療用の態様として、これを有効成分とした抗炎症剤として生体に投与し、生体内におけるビクニン遺伝子の発現を抑制することにより、ＳＨＡＰ―ＨＡ複合体の形成をも抑制して、当該複合体の形成による炎症を予防または治療することが可能である。
【００２１】
ビクニンターゲッティング用ＤＮＡの遺伝子治療用の態様とは、ビクニンターゲッティング用ＤＮＡを生体内で発現可能なベクターに組み込んだ態様である。この生体内で発現可能なベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらのウイルス遺伝子を組み込んだベクターに、さらに、ビクニンターゲッティング用ＤＮＡ（例えば、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ）を発現可能な遺伝子を組み込んで、このベクターと、制限酵素処理を行った親ウイルスＤＮＡ―ＴＰ(terminal protain)を、２９３細胞等にトランスフェクションして、相同組換えを起こすことにより、ビクニンターゲッティング用ＤＮＡの生体内の発現ベクターを得ることができる。
【００２２】
このようにして得られたビクニンターゲッティング用ＤＮＡの生体内発現ベクターを単離・精製して、これを生体に投与することにより、生体内のビクニン遺伝子に対してビクニンターゲッティング用ＤＮＡが相同組換えを起こし、生体内のビクニン産生の抑制によりＳＨＡＰ―ＨＡ複合体の形成が抑制されて、これにより、炎症の予防・治療が可能となる。
【００２３】
本抗炎症剤の形態は、注射剤形態であることが一般的であり、静脈内、筋肉内、骨内、関節内、皮下、皮内、腹腔内、気管内、気管支内投与等により投与され得る。本抗炎症剤の投与量は、剤の投与方法、投与形態、患者の症状等に応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるものではないが、一般には有効成分であるビクニンターゲッティング用ＤＮＡの生体内発現ベクターを、生体内で発現できるように適度に調製して、この製剤を、適量、一日一回または数回に分けて投与するのが好適である。
【００２４】
本抗炎症剤が適応とされる炎症としては、関節炎、皮膚炎、肺炎、肝炎、腸炎、気管炎、気管支炎等の、ＳＨＡＰ―ＨＡ複合体の形成が関連していると考えられるあらゆる炎症が例示可能である。
【００２５】
２）ノックアウトマウスの作出
本スクリーニング用マウスとして用い得る、ビクニン遺伝子のノックアウトマウスは、好適には、ゲノム中のＡＭＢＰ遺伝子のエキソン７のビクニン遺伝子に相当する部分をノックアウトした、ビクニン遺伝子のノックアウトマウスである。当該ノックアウトマウスは、ゲノム中に、配列番号１の塩基番号６１４５〜６２５０で表される塩基配列を含んでいることを特徴とする、ビクニン遺伝子のノックアウトマウスであることが好ましい。このマウスは、ビクニン遺伝子の発現を完全に欠いているか（ビクニン欠損ホモタイプ(-/-)；以下単に「(-/-)」と略記する）、または当該遺伝子の発現量が低下しており(ビクニン欠損ヘテロタイプ(+/-)；以下単に「(+/-)」と略記する)、かつ配列番号１の塩基番号６１４５〜６２５０で表される塩基配列を含んでいる点が特徴である。
【００２６】
また当該ノックアウトマウスはさらに、ビクニン遺伝子に隣接するα―１―ミクログロブリン遺伝子が正常に保持されているものが好ましく、このようなビクニン遺伝子のノックアウトマウスを用いることにより、後述するように、炎症惹起物質のスクリーニングを行うことができる。
【００２７】
本スクリーニング用マウスは、さらに、相同染色体の両方に配列番号１の塩基番号６１４５〜６２５０で表される塩基配列を含んでいるもの（(-/-)）が好ましく、これによりビクニン遺伝子の発現を完全に欠いたマウスとすることができる。
【００２８】
[本スクリーニング方法]
上述したように、本スクリーニング方法は、本スクリーニング用マウスに対して被験物質を投与し、当該マウスにおける炎症の惹起の度合いを指標として、被験物質の炎症惹起作用をスクリーニングする方法として提供される。
【００２９】
本スクリーニング方法によるスクリーニングを行う対象となり得る被験物質は、有機化合物、無機化合物、ペプチド、蛋白質、酵素、抗体等、特に限定されず、天然物または合成品のいずれであってもよい。
【００３０】
また、被験物質や対照物質の投与方法も、スクリーニングすべき物質が惹起する炎症の種類や、被験物質の性質等に応じて自由に選択することが可能であり、例えば、静脈内、筋肉内、骨内、関節内、皮下、皮内、腹腔内、気管内、気管支内投与、さらには皮膚上への塗布等を選択可能である。
【００３１】
ここで、本スクリーニング方法によりスクリーニングすべき物質が惹起する炎症は、特に限定されず、例えば、関節炎、皮膚炎、肺炎、肝炎、腸炎、気管炎、気管支炎等を例示することができる。ただし、本スクリーニング方法は、１）ビクニン非依存性の炎症を惹起する物質をスクリーニングする態様（第１の態様）と、２）ビクニン依存性の炎症を惹起する物質をスクリーニングする態様（第２の態様）、に大別される。
【００３２】
１）ビクニン非依存性の炎症を惹起する物質をスクリーニングする態様
本スクリーニング方法の第１の態様は、同一の被験物質を下記ａ及びｂのマウスに投与して、これらのマウスａ及びｂにおいて惹起される炎症が同種及び/又は同程度の炎症である場合に、当該被験物質をビクニン非依存性の炎症惹起物質として評価する態様の本スクリーニング方法である。
ａ.被験物質を投与した、ビクニン遺伝子をノックアウトしていないマウス
ｂ.被験物質を投与した、ビクニン遺伝子のノックアウトマウス
【００３３】
すなわち、被験物質の投与により、上記の「マウスａ」（正常マウス）と、ビクニン遺伝子がノックアウトされて、生体内においてビクニンが存在しない[主に、(-/-)マウスの場合]か、若しくは、少ない[主に、(+/-)マウスの場合]「マウスｂ」（本スクリーニング用マウス）、において惹起される炎症の種類と程度が同等である場合には、当該被験物質により惹起される炎症は、ビクニンやＳＨＡＰ―ＨＡ複合体が関連して惹起される炎症とは無関係の炎症であることが明らかになる。その結果、当該被験物質は、生体内におけるビクニンの存在・非存在や存在量にかかわらず、当該生体内において炎症を惹起する、ビクニン非依存性の炎症惹起物質として評価されることとなる。
【００３４】
２）ビクニン依存性の炎症を惹起する物質をスクリーニングする態様
本スクリーニング方法の第２の態様は、同一の被験物質を下記１及び２のマウスに投与して、１）これらのマウス１及び２において惹起される炎症が同種の炎症であり、かつ、マウス１において惹起される炎症の程度が下記２のマウスよりも強い場合、あるいは、２）マウス１と２において惹起される炎症が質的に異なる場合には、当該被験物質をビクニン依存性の炎症惹起物質として評価する態様の本スクリーニング方法である。
１.被験物質を投与した、ビクニン遺伝子をノックアウトしていないマウス
２.被験物質を投与した、ビクニン遺伝子のノックアウトマウス
【００３５】
すなわち、1)被験物質の投与により、上記の「マウス１」（正常マウス）と、ビクニン遺伝子がノックアウトされて、生体内においてビクニンが存在しない[主に、(-/-)マウスの場合]か、若しくは、少ない[主に、(+/-)マウスの場合]「マウス２」（本スクリーニング用マウス）、において惹起される炎症の種類が同種の炎症である場合には、当該被験物質により惹起される炎症の程度が、マウス２よりもマウス１の方が強い場合（マウス１のみに炎症が認められる場合を含む）には、当該被験物質が、生体内に存在するビクニンやＳＨＡＰ―ＨＡ複合体と関連して炎症を惹起する物質であることが明らかとなる。また、２）炎症の程度にかかわらず、被験物質により惹起される炎症の種類がマウス１と２の間で異なる場合には、当該被験物質が、生体内のビクニンやＳＨＡＰ―ＨＡ複合体と関連する特定の炎症を惹起する物質であることが明らかとなる。
【００３６】
つまり、これらの場合には、被験物質が、生体内のビクニンにより何らかの影響を受けて炎症を惹起する、ビクニン依存性の炎症惹起物質として評価されることになる。
【００３７】
本スクリーニング方法により選別された炎症惹起物質は、これに対する抗炎症剤を開発する手がかりとなるものであり、産業上の利用可能性を有する発明である。
【発明の効果】
【００３８】
本発明により、炎症惹起物質を選別可能なスクリーニング方法と、これを行うためのノックアウトマウスが提供される。また、炎症に対する遺伝子治療を行うためのターゲッティングベクターが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本スクリーニング用マウスの作出
本スクリーニング用マウスは、下記の通り、特開２００２−６５２８１号公報の実施例に記載の方法に従い、作出した。
【００４０】
１）ターゲッティングベクターの構築
マウスゲノムDNAライブラリーからクローニングされ、エキソン５、エキソン６およびエキソン７を含むプラスミドベクターから、エキソン７にあるビクニンの７位セリン残基をコードするヌクレオチド ２塩基(AG)を ３塩基(CGC)に置換したミュータントを、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社)を用いて作製し、同時にその部分に制限酵素（Eco47III）切断サイトを創製した。そしてその切断サイトをEco47IIIで処理し、HpaIで切断した終止コドンを含むSV40 poly Aシグナルを持ち、さらにその下流に陽性マーカーである抗生物質耐性能を示すネオマイシン耐性遺伝子（neo）を含んだDNAカセットを結合させた。なお、ターゲッティングベクター構築のための基本ベクターには、ブルースクリプトIIＳＫ＋プラスミドベクター（pBluescript II SK+：ストラタジーン社製）を用いた。
【００４１】
上記の方法で得たミュータントプラスミドベクターは、ターゲッティング位置（エキソン７）から上流がエキソン５および６を含む約4.4kb であったが、ターゲッティングベクターのロングアームとしては短いと考えられたため、別途マウスゲノムDNAからPCRによってエキソン３およびエキソン４領域を含むDNAフラグメントを作製し、ブルースクリプトIIクローニングベクターでサブクローニングした後、上記ミュータントベクターとXbaIサイトで結合させて、上流約6kbのロングアームを持つミュータントプラスミドベクターとした。
【００４２】
なお、PCRで得られたDNAフラグメントについては、シークエンシングによりエキソン３及びエキソン４の配列に変異がないことを確認した。
【００４３】
ショートアームとしては、マウスゲノムDNAクローンからサブクローニングしたプラスミドＤＮＡから、制限酵素EcoRIおよびPvuIIを使って、エキソン９および10を含む約1.8kbのDNAフラグメントを切り出し、ブルースクリプトIIクローニングベクターにサブクローニングした後、ベクターのSalIサイトで、上記ミュータントプラスミドベクターの neo遺伝子の下流に結合させた。最終的に制限酵素ClaIとSalIで切り出したもの（配列番号１）を、陰性マーカーとしてチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）を含んだDNAカセットを持つベクター（pBSII2SX neo/tk）のClaIおよびSalIサイトの間に挿入して、目的のビクニン特異的ターゲッティングベクター（コンストラクト）を構築した。
【００４４】
２）ＥＳ細胞の樹立
上記のコンストラクトを、ＥＳ細胞（E14）にBioRad Gene Pulser IIを用いてエレクトロポレーションした。すなわち、まず上記ターゲッティングベクターをPvuIで切断して線状化したDNAをフェノール／クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、遠心後、沈殿を70%エタノールで洗浄して乾燥させた。この乾燥物をＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0)/1 mM EDTA）を用いて 1μg/μlとなるように溶解し、プラスミド溶液とした。
【００４５】
また、前日に培養液を交換しておいたＥＳ細胞をトリプシン処理によって培養皿から剥離して、トリプシン処理とピペッティングにより細胞を単細胞として遊離させ、細胞数をカウント後、ＥＳ細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（PBS(-））で洗浄して、5×１０7個／ｍｌとなるようにPBS(-)に浮遊させた。
【００４６】
この細胞浮遊液 0.7 mlを、前記プラスミド溶液30μlと混合した後、エレクトロポレーション用ディスポーザブルキュベット内に移し、室温で５分間放置した。その後、細胞に電気パルス（250Ｖ、500μＦ）を加えた。室温で５分間放置後、３０ｍｌのＥＳ培地を添加して（1.2×１０6個／ｍｌ）、これを予めフィーダー細胞をまいてあり、９ｍｌのＥＳ培地が入った１００mm径の培養皿に３ｍｌ（３.5×１０6 個）の細胞をまいた。
【００４７】
２４時間後からGeneticin418(G418,ギブコ社製)（200μｇ／ｍｌ）を含む培地を用いて陽性選択を開始した。また３日後、さらにガンシクロビルを終濃度2μMとなるように加えて、陰性選択を開始した。９日目から顕微鏡下で培養中のＥＳ細胞を観察して、400個のコロニーを採取した。それらのコロニーから、後述するＰＣＲ法及びサザンハイブリダイゼーション法により、９個のクローンを相同組み換え体として選択した。
【００４８】
３)ノックアウトマウスの作出
上記で得られた相同組換えES細胞（#162）を、凝集法によってマウス（C57BL/6）の８細胞胚に組み込み、キメラマウスを作出した。得られたキメラマウス（雄４匹）を雌C57BL/6マウスと交配させ、産まれた仔マウス（F1）の尾先端から抽出したDNAを後述のPCR法およびサザンハイブリダイジェーション法により調査して、（+/-）のマウスを選択した。そのヘテロマウス同士を交配させて、（-/-）のマウスを作出した。
【００４９】
本スクリーニング用マウスの炎症に対する特性の検討
上述した要領で作出された本スクリーニング用マウス[（+/-）のマウスと（-/-）のマウス各グループ４匹ずつ]を、本試験例に用いた。なお、マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスをＤＢＡ１／Ｊ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ）系統と戻し交配をし、５代目のマウスを使用した。
【００５０】
１）感作実験
０．２％のウシ由来タイプＩＩ型コラーゲン（Ｋ４１）（コラーゲン技術研修会製）の０．１mol／lの酢酸溶液とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）を１対１で混ぜ、コラーゲンの終濃度が０．１％となる様に乳化状の溶液を作成し、感作用溶液とした。
【００５１】
（−／−）マウス群及び（＋／−）マウス群の各々のマウスに上記感作用溶液０．２ml（コラーゲン２００μｇ）をマウスの尻尾の付け根に皮下注射にて投与した。
【００５２】
２）引き続いて３週間後、０．１％のウシ由来タイプＩＩ型コラーゲン（Ｋ４１）の０．１mol／lの酢酸溶液を被験溶液とし、各々のマウスに被験溶液０．１ml（コラーゲン１００μｇ〉を同様にマウスの尻尾の付け根に皮下注射にて投与した。
【００５３】
投与後のマウスの状態を肉眼的観察に基づく関節炎スコアを用いて記録した。投与後、０、７、１３、１９、２６、３５、５５日に観察を行った（表１）。
表１におけるスコアは、各経過日における各群４匹ずつのマウス１匹当たりの関節炎スコア平均値である。
【００５４】
なお、使用した関節炎スコアの概略は、マウス手足の指が炎症を起こしていればスコアを１とし、炎症がなければ０とした。各マウスの全指（計２０本）を観察し、そのスコア合計を関節炎スコアとした。したがって、１匹当たりの関節炎スコアの総合計は２０である。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
表１の肉眼的観察による関節炎スコアにおいては、ビクニン遺伝子の発現を完全に欠いている（−／−）マウスは、炎症惹起の為のコラーゲン投与後１ヶ月経っても炎症の症状は確認されず、炎症の発症が顕著に遅延していた。一方、ビクニン蛋白質の産生が野生型に近い（＋／−）マウスは、投与後１週間は炎症の発症が観察されなかったが、２週間を待たず炎症が発症し、その後も明らかに炎症が悪化した。
【００５７】
これら結果は、ビクニン遺伝子の発現が炎症の発症に関与している事を示唆している。つまり、ビクニン遺伝子の発現を制御する事により、炎症耐性又は炎症抑制能の獲得が可能であることが明らかとなった。
【００５８】
前述したように、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体が炎症を起こしている関節液に多く存在することは知られていた。しかし、本試験例により、ＳＨＡＰ―ＨＡ複合体が炎症発症後に炎症部位に産生されるのでは無く、炎症の発症機序に深く関与していることが明確となった。言い換えれば、本試験例の結果は、ビクニン遺伝子の発現を抑制する、つまり、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の形成を抑制することにより、炎症の発症が抑制されることを示唆している。
【００５９】
これにより、ビクニン遺伝子のノックアウトに限らず、ビクニン遺伝子の発現抑制、や、ＳＨＡＰ−ＨＡ複合体の形成過程を抑制することにより、リウマチ様の炎症を伴う疾患の有用な治療剤や抗炎症剤の開発の可能性が考えられる。
【００６０】
上記のビクニン遺伝子のノックアウトマウス（本スクリーニング用マウス）を用いた本スクリーニング方法によって、このような治療剤や抗炎症剤の有効成分となり得る抗炎症物質を見いだす手がかりとなり得る炎症惹起物質を、in vivoでスクリーニングすることが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本スクリーニング方法により選別された炎症惹起物質は、これに対する抗炎症剤を開発する手がかりとなるものであり、また、ビクニンターゲッティング用ＤＮＡは、それ自体が抗炎症剤として利用することが可能であり、産業上の利用可能性を有する発明である。
【配列表】
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