(57)【要約】      （修正有）【課題】イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）に結合する物質の解明、ＩＰ３Ｒが関与している各種の異常や疾患などの治療方法や診断方法の提供。また、ＩＰ３Ｒに結合してＩＰ３Ｒの機能を調節することにより細胞の機能を調節するための組成物及びそれを用いた調節方法に関する。【解決手段】細胞骨格タンパク質４．１Ｎからなる、レセプターＩＰ３Ｒの細胞内の局在化を調節する調節剤、および、細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチドからなる、ＩＰ３Ｒの細胞内移行阻害剤。さらに、少なくとも細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチド、及び検出・同定のための担体を含有してなる、ＩＰ３Ｒを検出・同定するための組成物に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞骨格タンパク質４．１Ｎからなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の細胞内局在の調節剤。
【請求項２】
イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）が、サブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）である請求項１に記載の細胞内局在の調節剤。
【請求項３】
細胞骨格タンパク質４．１Ｎが、少なくともそのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するものである請求項１又は２に記載の細胞内局在の調節剤。
【請求項４】
細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチドからなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の細胞内移行阻害剤。
【請求項５】
ＩＰ３Ｒが、サブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）である請求項４に記載の細胞内移行阻害剤。
【請求項６】
少なくとも細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチド、及び検出・同定のための担体を含有してなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）を検出・同定するための組成物。
【請求項７】
ＩＰ３Ｒが、サブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチドが、４．１ＮのＣＴＤである請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチドが、標識化されたペプチドである請求項６〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
組成物が、細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を認識する抗体を含有するものである請求項６〜９のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞骨格タンパク質４．１Ｎ、より詳細には、そのＣ末端領域（ＣＴＤ）が、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）、より詳細にはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）のＣ末端部（ＣＴＴ）に結合することを見出し、当該結合によりＩＰ３Ｒが細胞の基底膜領域に移行することを、及び当該細胞にＣＴＤを添加することにより当該移行を阻害できることを見出したものである。
即ち、本発明は、細胞骨格タンパク質４．１Ｎからなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）、より詳細にはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）の細胞内の局在化を調節する調節剤に関する。また、本発明は、細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチドからなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の細胞内移行阻害剤に関する。さらに、本発明は、少なくとも細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチド、及び検出・同定のための担体を含有してなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）を検出・同定するための組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内シグナル伝達系において脂質が重要な役割を果たしていることが明らかにされてきた。特にホスファチジルイノシトールのリン酸化物によるシグナル伝達についての研究が活発に行われている。
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、ジアシルグリセロールの残りの水酸基にイノシトールがリン酸エステルとして結合したものである。ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、リン脂質の１種であり、細胞の膜上にも存在しているが、その量は全リン脂質の１０％未満である。ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、大きく分けて２つの役割をになっており、そのひとつは膜に存在したままでリン酸化酵素などの各種のリン酸化反応の足場となることであり、他のひとつはリン酸化イノシトール部分が加水分解されて、セカンドメッセンジャーとしてのリン酸化イノシトールを放出する作用である。
ＰＩのイノシトール部分の水酸基はさらにリン酸化され、イノシトールの３位、４位、若しくは５位、又はこれらの２箇所以上がリン酸化されたイノシトールリン脂質が知られている。とりわけ、４位及び５位がリン酸化された４，５−ジホスホノホスファチジルイノシトール（ＰＩ（４，５）Ｐ２）は、小胞輸送や核への情報伝達の役割をになう３，４，５−トリホスホノホスファチジルイノシトール（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）の中間体となるばかりでなく、それ自身でも極めて重要な役割をになっている。
ＰＩ（４，５）Ｐ２は種々のアクチン結合タンパク質と結合することができ、細胞内のアクチンを再編成させることにより細胞の形態を保持し、また、変化させる役割をになっている。ＰＩ（４，５）Ｐ２の他の重要な役割は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）により、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に加水分解され、これらの分子をセカンドメッセンジャーとして放出することである。放出されたイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）は、細胞の小胞体の表面に存在するＩＰ３レセプター（ＩＰ３Ｒ）に結合し、小胞体内に貯蔵されているＣａ２＋を細胞質に放出させ、Ｃａ２＋依存性の各種の酵素を活性化させる。また、ＤＡＧはＣキナーゼを活性化させる。
【０００３】
細胞の受容体にホルモン、サイトカイン、神経伝達物質などの物質が結合することにより、細胞内にイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）の産生が誘発され、当該ＩＰ３が細胞の小胞体の表面に存在するイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）に結合する。当該ＩＰ３Ｒは、ＩＰ３によるシグナル伝達をＣａ２＋によるシグナル伝達系に変換することにより、さまざまな細胞機能において、例えば胚の発生、細胞の分化、増殖、貪食、顆粒分泌、運動、神経系における作用などのきわめて重要な役割を果たしており、細胞内でＩＰ３Ｒが正常に機能することが細胞の恒常性を維持する上で極めて重要なこととなっている。このように、ＩＰ３Ｒは細胞のシグナル伝達の関与する重要なタンパク質であるばかりでなく、細胞の多彩な機能を調整する重要なタンパク質でもある。したがって、ＩＰ３Ｒの機能を調節することにより細胞の各種の作用を調整することも可能となる。
細胞内におけるＩＰ３やＩＰ３Ｒの重要性が明らかにされてくるにつれて、これらについての研究も活発になってきており、ＩＰ３Ｒに対するモノクローナル抗体についての特許出願（特許文献１参照）、ＩＰ３を拮抗する方法についての特許出願（特許文献２参照）、さらにＩＰ３Ｒに高親和性で結合するポリペプチドについての特許出願（特許文献３参照）などの特許出願もなされてきている。これまでの分子クローニングの研究により、ＩＰ３Ｒファミリーには哺乳動物において少なくとも３つのサブタイプが存在することが知られている（非特許文献１〜３参照）。これらのＩＰ３Ｒは、構造的、機能的には、リガンド結合ドメイン、調節ドメイン、およびチャネルドメインの３つのドメインから構成されていることが明らかになっている（非特許文献４参照）。
結合ドメインは、ＩＰ３との結合に係わっており、ＩＰ３ＲのＮ末端部位の約６００個のアミノ酸からなるドメインである。突然変異解析により、この部位の３アミノ酸残基、例えばマウスＩＰ３Ｒタイプ１のＡｒｇ−２６５、Ｌｙｓ−５０８、及びＡｒｇ−５１１が、ＩＰ３との結合にとってきわめて重要であることが分かっている。また、Ａｒｇ−６５８が種々のイノシトールリン酸との特異的な結合を決定することも知られている。
チャネルドメインは、ＩＰ３ＲのＣ末端付近に存在し、６個の膜貫通領域を有し、Ｃａ２＋チャネルに対応している。膜貫通領域の１〜４番目は、ＩＰ３Ｒファミリーにおいて高度な相同性が保持されている。
調節ドメインは、Ｎ末端側の結合ドメインと、Ｃ末端側のチャネルドメインの間に存在し、このドメインは、Ｃａ２＋、Ｃａ２＋−カルモデュリン、ＦＫ５０６結合性蛋白１２Ｋ、ＡＴＰなどのさまざまな調節因子の結合部位、およびｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼＣによるリン酸化の部位が含まれている。そして、この調節ドメインが、ＩＰ３の結合によりチャネルを開く作用に大きく関与していると考えられる。ＩＰ３に誘導されるＣａ２＋の放出は、この調節ドメインによるさまざまな修飾によって精密に制御されていると考えられる。この調節ドメインは、ＩＰ３Ｒファミリー間における相同性はその他の部位に比べて低く、その結果、各々のサブタイプのＩＰ３Ｒ／Ｃａ２＋チャネル機能がそれぞれ異なって調節され、各々のサブタイプに特有なチャネル特性が生じていると考えられる。
【０００４】
このようにＩＰ３Ｒの調節ドメインに結合する物質により、ＩＰ３Ｒの機能が微妙に調整されていることから、ＩＰ３Ｒの調節ドメインに結合する物質を解明してゆくことはＩＰ３Ｒの機能を解明し、それが原因となっている各種の疾患に治療や診断に極めて有用なことになる。
一方、タンパク質４．１は、赤血球から同定されたタンパク質であり、赤血球細胞骨格タンパク質４．１と命名され、このタンパク質は、赤血球の細胞膜における形態と物理的安定性において、きわめて重要な役割を果すものである（非特許文献５参照）。タンパク質４．１の中で最初に同定されたタンパク質４．１Ｒでは、構造的・機能的な３領域が同定されている。Ｎ末端側の膜結合領域（ＭＢＤ、３０−ｋＤａドメイン又はＦＥＲＭ様ドメインとも呼ばれる）、Ｃ末端側のＣ末端領域（ＣＴＤ、２２−２４−ｋＤａドメインとも呼ばれる）、及び内部側の内部領域（ＳＡＢ、１０−ｋＤａドメインとも呼ばれる）の３領域である。
Ｎ末端側の膜結合領域（ＭＢＤ）は、バンド３、グリコホリンＣ、及びＣＤ４４などの内在性膜タンパク質の細胞質内の尾部への結合部位を有している。内部領域（ＳＡＢ）は、膜の安定性に必要なスペクトリン−アクチン結合活性を有している。Ｃ末端領域（ＣＴＤ）は、密着結合タンパク質ＺＯ−１とＺＯ−２、イムノフィリンＦＫＢＰ１３、及び真核細胞の紡錘形成を調節すると考えられる核の有糸分裂機構（ＮｕＭＡ）に関与するタンパク質に結合することが最近報告されている（非特許文献６参照）。また、タンパク質４．１Ｒは、上皮細胞などの細胞間接着装置の１種である密着結合に局在していることも報告されている（非特許文献７参照）。
タンパク質４．１Ｒの３つのホモローグがクローニングされている。広範囲に発現しているホモローグ４．１Ｇ、神経性のホモローグ４．１Ｎ、および脳でのホモローグ４．１Ｂである。これらはいずれも、構造的・機能的な３領域において、プロトタイプの４．１Ｒと高度な相同性を有しているが、保存領域であるＭＢＤ、ＳＡＢ、ＣＴＤ領域の間にある３つの非保存領域（Ｕ１、Ｕ２、及びＵ３）によってこれらの各ホモローグの構造が特徴付けられている。
【０００５】
【特許文献１】特開平８−１３４０９９号
【特許文献２】特表平８−５０２０６８号
【特許文献３】特開２０００−１３５０９５号
【非特許文献１】Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｔ．，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９），  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２，  ３２−３８
【非特許文献２】Ｂｌｏｎｄｅｌ，Ｏ．，  Ｔａｋｅｄａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８，  １１３５６−１１３６３
【非特許文献３】Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｈｉｎｏ，Ｍ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，  ２，  ９−２２
【非特許文献４】Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｔ．，  Ｋｏｈｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  ４，  ２９４−３０３
【非特許文献５】Ｃｏｎｂｏｙ，Ｊ．Ｇ．，  （１９９３），  Ｓｅｍｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  ３０，  ５８−７３
【非特許文献６】Ｍａｔｔａｇａｊａｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｎ．，  Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １４５，  ２９−４３
【非特許文献７】Ｍａｔｔａｇａｊａｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｎ．，  Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ３０５７３−３０５８５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）のドメインの構成を解明すると共に、ＩＰ３Ｒに結合する物質を解明し、ＩＰ３Ｒが関与している各種の異常や疾患などの治療方法や診断方法を提供することを目的としている。また、本発明は、ＩＰ３Ｒに結合してＩＰ３Ｒの機能を調節することにより細胞の機能を調節するための組成物及びそれを用いた調節方法に関する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、多種多様の機能を有するＩＰ３Ｒの機能を更に詳細に検討するためにＩＰ３Ｒの構造を更に詳細に検討した。ＩＰ３Ｒの３種のサブタイプの中でもっとも特徴的なタイプ１のＩＰ３Ｒ（ＩＰ３Ｒ１）は、２７４９個のアミノ酸からなるタンパク質であり、他のＩＰ３Ｒと同様に機能的な３つのドメインを有している。Ｎ末端側にはリガンド結合ドメイン（残基１−５７８）があり、中間部分には調節ドメイン（残基５７９−２２７５）があり、Ｃ末端の近くにはチャネルドメイン（残基２２７６−２５８９）がある（図１参照）。これらの各ドメインの機能については種々の角度から検討されてきたが、Ｃ末端部のアミノ酸残基で２５９０−２７４９の領域の機能については、未だ十分には明確化されておらず、当該部分がどのような機能を果たしているのかということは全く知られていなかった。
本発明者らは、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部の細胞質尾部の機能を研究するため、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて、Ｃ末端部に結合する分子を探究したところ、タンパク質４．１ＮとＩＰ３Ｒ１が、サブコンフルエントおよびコンフルエントにおいて結合することを、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞（イヌ腎臓上皮由来の培養細胞）において見出した。ＭＤＣＫ細胞は、よく研究された密着結合を有する上皮細胞株である。ＭＤＣＫ細胞がサブコンフルエントな状態からコンフルエントな状態に達すると、双方とも基底膜領域への移行が顕著であった一方、４．１Ｎのプロトタイプ的なホモローグ４．１Ｒは、密着結合に局在し、その他の小胞体（ＥＲ）マーカータンパク質は、コンフルエントなＭＤＣＫ細胞の細胞質に依然として存在していた。基底膜領域へのＩＰ３Ｒ１の局在化は、その４．１Ｎタンパク質の結合部位によって決まり、ＩＰ３Ｒ１の移行は４．１Ｎタンパク質の断片と結合することによって阻害され、４．１ＮがＩＰ３Ｒ１の細胞内の局在化を調節する重要な役割を果たしていることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、細胞骨格タンパク質４．１Ｎからなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）、より詳細にはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）の細胞内局在の調節剤に関する。
また、本発明は、細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を含有するペプチドからなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）、より詳細にはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）の細胞内の移行阻害剤に関する。
さらに、本発明は、少なくとも細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチド、及び検出・同定のための担体を含有してなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）、より詳細にはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）を検出・同定するための組成物、及びそれを用いたＩＰ３Ｒ、より詳細にはそのＩＰ３Ｒ１を検出・同定する方法に関する。
【０００９】
本発明者らは、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部（アミノ酸残基で２５９０−２７４９；このアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。）の機能を解明するため、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法によりスクリーニングをすることにより、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部へ結合する分子種を探索した。そのために、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部とＧＡＬ４−ＤＮＡ結合領域との融合タンパク質（ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ、図１Ａ参照）をベイト（ｂａｉｔ）として使用し、約４．０×１０６の酵母の形質転換体を、ＧＡＬ４−活性領域に融合した胚性および成人ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーの混合物にてスクリーニングした。栄養選択アッセイにより、１９のポジティブクローンを得たので、そのｃＤＮＡインサートの塩基配列を解析した。このうちの７クローンが、４．１ＮのＣ末端部分のさまざまな長さのアミノ酸配列に対応するシーケンスをコードしていた。最も短い断片は、マウス４．１ＮのＣ末端領域（アミノ酸残基７６７−８７９）（図１Ｂ参照、以下この断片を４．１Ｎ／ＣＴＤという）に対応していた。４．１ＮとＩＰ３Ｒ１の相互作用は、βガラクトシダーゼの活性に対するコロニーリフト濾過アッセイによって確認した。
【００１０】
図１は、マウスＩＰ３Ｒ１（図１Ａ）とタンパク質４．１Ｎの構造の概略を示す図である。図１Ａ及び図１Ｂの下段の数字は各タンパク質のアミノ酸の番号を示し、図１Ａの左側の斜線部はマウスＩＰ３Ｒ１（ｍＩＰ３Ｒ１）のリガンド結合ドメイン（残基１−５７８）を示し、その右の白抜き部分は調節ドメイン（残基５７９−２２７５）を示し、その右の黒四角が連続した部分はチャネルドメイン（残基２２７６−２５８９）を示す。右側の末端の斜線部はＣ末端部（ＣＴＴ：残基２５９０−２７４９；配列番号１参照）を示す。図１Ａの下の部分は、酵母のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）アッセイでベイトとして使用したマウスＩＰ３Ｒ１のＣ末端部（ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ）を示す。図１Ｂはタンパク質４．１Ｎの構造を示し、その左側から、白抜きで表されている第１の非保存領域（Ｕ１）、黒抜きで表されている膜結合領域（ＭＢＤ）、白抜きで表されている第２の非保存領域（Ｕ２）、黒抜きで表されているスペクトリン−アクチン結合領域（ＳＡＢ）、白抜きで表されている第３の非保存領域（Ｕ３）、チェック模様で表されているＣ末端領域（ＣＴＤ）をそれぞれ示している。図１Ｂの下は、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法のスクリーニングで得られたタンパク質４．１Ｎの最短のアミノ酸配列部分を示している。タンパク質４．１Ｎの８７９個のアミノ酸配列を配列表に配列番号２に示しておく。
【００１１】
タンパク質４．１ＮとＩＰ３Ｒ１の相互作用をさらに確認するため、ＧＳＴと４．１Ｎ／ＣＴＤの融合蛋白（ＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤ）を用いて免疫沈降アッセイを行った。グルタチオンセファロースビーズに担持させたＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤを、ＩＰ３Ｒ１の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ付きＣ末端部（ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ）、またはＧＦＰ単独を一過性に発現しているＣＯＳ−７細胞のライセートでインキュベーションし、よく洗浄した後、ＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤに結合しているタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＧＦＰ抗体でブロットした。結果を図２に、図面に代わる写真で示す。図２の上段は沈降したタンパク質を示し、中段と下段のパネルは、加えたタンパク質を示している。上段と中段は抗ＧＦＰ抗体でウエスタンブロット（ＷＢ）した場合を示し、下段はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した場合を示す。図２の左側はマーカー（ｋＤａ）を示す。
図２に示されるように、ＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤはＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴに結合するが、ＧＦＰには結合しない。ＧＳＴ単独では、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴに結合しなかった。これらの結果は、４．１Ｎ／ＣＴＤが、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部に生体外で結合することを示している。
【００１２】
４．１Ｎが生体内でＩＰ３Ｒ１に結合するか否かを確認するため、マウスの脳全部のライセートについて、３種類のラット抗ＩＰ３Ｒモノクローナル抗体、またはウサギ抗４．１Ｎポリクローナル抗体を用いて免疫共沈降法を行った。共沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗４．１Ｎ抗体又は抗ＩＰ３Ｒ１抗体でブロットした。ラットの抗体を用いた結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の上段は抗４．１Ｎ抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示し、下段は抗ＩＰ３Ｒ１抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示す。図３の左側はマーカー（ｋＤａ）を示す。その右側からインプットサンプル、ラットＩｇＧ、ラット４Ｃ１１抗体、ラット１８Ａ１０抗体、最も右側がラット１０Ａ６抗体を用いた場合をそれぞれ示している。
この結果、４．１Ｎは、３種のラット抗ＩＰ３Ｒ１抗体、４Ｃ１１抗体、１８Ａ１０抗体、及び１０Ａ６抗体によって免疫共沈降したが、正常ラットＩｇＧによっては沈降しなかった。図３に示すとおり、１３５ｋＤａおよび１００ｋＤａにおいて移動している２つのバンドが、インプットサンプルの抗４．１Ｎ抗体、および抗ＩＰ３Ｒ１抗体において免疫沈降したペレットとして検出された。これらのシグナルは、一次抗体を抗原蛋白にてプレインキュベーションすると消失した。１３５ｋＤａ蛋白は、４．１Ｎのプロトタイプ的な遺伝子産物である。１００ｋＤａ蛋白は、ワレンスキーらが報告した（Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．，  Ｂｌａｃｋｓｈａｗ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９，  ６４５７−６４６７）周辺組織に豊富なアイソフォームである。
次に、ウサギ抗４．１Ｎ抗体を用いて相互免疫沈降を行った結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の左側はマーカー（ｋＤａ）を示す。その右側からインプットサンプル、ウサギＩｇＧ、ウサギ抗４．１Ｎ抗体を用いた場合をそれぞれ示す。図４の上段は抗ＩＰ３Ｒ１抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示し、下段は抗４．１Ｎ抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示す。この結果、ＩＰ３Ｒ１は免疫共沈降した。ネガティブコントロールによる実験では、正常ラットＩｇＧも、正常ウサギＩｇＧも、４．１ＮおよびＩＰ３Ｒ１と免疫沈降しなかった。これらの結果を総合すると、４．１ＮがＩＰ３Ｒ１と生体内で相互に作用していることを示している。
【００１３】
次に、４．１Ｎに結合するためのＩＰ３Ｒ１のＣ末端部の最小シーケンスを確認するため、ｐＧＢＴ９を用いてＩＰ３Ｒ１のＣ末端部を順次欠失させた断片を（図５におけるΔ１−Δ５）を作製し、４．１Ｎ／ＣＴＤとの結合性を、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて調べた。結果を図５に示す。図５のＦＬはＣ末端部の全長（残基２５９０−２７４９）を用いた場合を示し、Δ１−Δ５はＣ末端部分が順次欠失したものを示す。各断片を、ｐＧＢＴ９にサブクローニングし、ｐＡＣＴ２−４．１Ｎ／ＣＴＤと共に酵母に共形質転換した。図５の各断片の右側は、β−ガラクトシダーゼ活性および栄養選択アッセイの各々の結果を示す。＋は陽性であったことを示し、−は陰性であったことを示す。
この結果、完全長のＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴは４．１Ｎ／ＣＴＤと相互作用するが、欠失した変異体（Δ１−Δ５）はいずれも相互作用しないことが明らかになった。これらの結果は、ＩＰ３Ｒ１の最後のアミノ酸１４個が、４．１Ｎへの結合には必須であることを示している。
【００１４】
次に沈降アッセイを行い、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法による結果を確認した。ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ（ＧＦＰタグ付きＣ末端部が完全長のＩＰ３Ｒ１）、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０（Ｃ末端部の最後のアミノ酸１４個の欠失したＧＦＰタグ付きＩＰ３Ｒ１）、またはＧＦＰ−１８Ａ１０（ＧＦＰタグ付きのＩＰ３Ｒ１のＣ末端部の最後のアミノ酸１４個）を一過性に発現しているＣＯＳ−７細胞のライセート中で、グルタチオンセファロースに担持したＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤ融合蛋白又はＧＳＴをインキュベーションした。加えたタンパク質と沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色するか、または１８Ａ１０抗体および／または抗ＧＦＰ抗体でブロットした。結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６の最下段は加えたＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤまたはＧＳＴを示している。真中の４つの段は、加えたＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０、およびＧＦＰ−１８Ａ１０を示している（Ｉｎｐｕｔ）。上側の２つの段は、沈降したタンパク質を示している（Ｐｅｌｌｅｔ）。図６の左側はマーカー（ｋＤａ）であり、それから右側は順にＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０、ＧＦＰ−１８Ａ１０（以上がＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤに対する場合である。）、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、及びＧＦＰ−１８Ａ１０（以上がＧＳＴに対する場合である。）の場合をそれぞれ示す。図６の上側の４段は抗ＧＦＰ抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）した場合であり、その下の２段は抗１８Ａ１０抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）した場合であり、最下段はＣＢＢで染色した場合を示す。
この結果、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０、ＧＦＰ−１８Ａ１０の発現が、抗ＧＦＰ抗体および１８Ａ１０抗体の双方を用いたウェスタンブロット（ＷＢ）により確認された。図６に示すとおり、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−ＮおよびＧＦＰ−１８Ａ１０は、ＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤによって沈降したが、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０は沈降しなかった。ＧＳＴでは、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−ＮもＧＦＰ−１８Ａ１０も沈降しなかった。これらを総合すると、これらの結果は、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端側の最後のアミノ酸１４個が、４．１Ｎとの結合にとって必要かつ十分であることを示すものである。
さらに、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端の最後のアミノ酸１４個は、ＩＰ３Ｒ１の１８Ａ１０抗体の特異的な認知部位であり（Ｎａｋａｄｅ，Ｓ．，  Ｍａｅｄａ，Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２７７．  （Ｐｔ  １），  １２５−１３１）、ＩＰ３Ｒ２およびＩＰ３Ｒ３との相同性が無いので、これらのデータは、４．１Ｎ／ＣＴＤがＩＰ３Ｒ２またはＩＰ３Ｒ３のいずれのＣ末端部とも結合しないという酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）アッセイの結果を裏付けると同時に、４．１Ｎが特異的にＩＰ３Ｒ１に結合することを示すものである。
【００１５】
次に、４．１ＮのＣＴＤ領域と、ＩＰ３Ｒ１との結合について検討した。図７に４．１Ｎのアミノ酸配列の１−７６６のもの、７６７−８７９（ＣＴＤ）、７７７−８７９、７８３−８７９、７８４−８７９、及び７８９−８７９の各断片とＧＡＬ４との融合タンパク質の概略を示す。これらの４．１Ｎの各断片を含む遺伝子をｐＧＡＤ４２４にサブクローニングし、ｐＧＢＴ９−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴと共に酵母に共形質転換した。β−ガラクトシダーゼ活性および栄養選択アッセイを行った。結果を図７の各断片の右側にそれぞれ示す。＋は陽性を示し、−は陰性を示す。
この結果、４．１Ｎのアミノ酸配列（ａａ）の７６７から、または７７７から、または７８３から８７９までで構成される４．１ＮのＣ末端領域のデレーションは、ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴと相互作用し、４．１Ｎ／ΔＣＴＤ（ａａ．１−７６６）の断片およびａａ．７８４から、または７８９から８７９までで構成される４．１ＮのＣ末端領域の一部欠失体は相互作用しないことが明らかにされた。
次に沈降アッセイを行い、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法での結果を確認した。ＨＡタグ付き４．１Ｎ融合蛋白：ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ４．１Ｎ／ＦＬ（ＨＡタグ付き完全長４．１Ｎ）、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ４．１Ｎ／ΔＣＴＤ（ａａ．１−７６６のＣＴＤが欠失したＨＡタグ付き４．１Ｎ）、またはｐｃＤＮＡ３−ＨＡ４．１Ｎ／ＣＴＤ（ＨＡタグ付き４．１ＮのＣＴＤ、ａａ．７６７−８７９）をコードするプラスミドを用いて、一過性に移行したＣＯＳ−７細胞のライセートで、グルタチオンセファロースに担持したＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ融合蛋白又はＧＳＴをインキュベーションした。沈降したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色するか、又は抗ＨＡ抗体でブロットした。結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８の最下段は、加えたＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴまたはＧＳＴを示し、真中の２段は、加えたＨＡ４．１Ｎ／ＦＬ、ＨＡ４．１Ｎ／ΔＣＴＤ、およびＨＡ４．１Ｎ／ＣＴＤを示し、上部の２段は、沈降したタンパク質を示している。ＨＡ４．１Ｎ／ＦＬとＨＡ４．１Ｎ／ＣＴＤはいずれもＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴによって沈降したが、ＨＡ４．１Ｎ／ΔＣＴＤは沈降しなかった。ＨＡ４．１Ｎ／ＦＬもＨＡ４．１Ｎ／ＣＴＤも、ＧＳＴ単独によっては沈降しなかった。
これらの結果は、４．１ＮのＣＴＤ（ａａ．７６７−８７９）が、ＩＰ３Ｒ１との結合に必要かつ十分であることを示すものである。
【００１６】
次に、サブコンフルエントおよびコンフルエント双方のＭＤＣＫ細胞における４．１ＮとＩＰ３Ｒ１の結合を観察した。ブッシュら（Ｂｕｓｈ，Ｋ．Ｔ．，  Ｓｔｕａｒｔ，Ｒ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９，  ２３６９４−２３６９９）は、ＩＰ３Ｒが基底膜領域のみならずコンフルエントになったＭＤＣＫ細胞の細胞質においても局在すると報告したが、この局在化の根底にある分子機序は解明されていなかった。そこで、４．１Ｎのプロトタイプ的ホモローグである４．１Ｒが、赤血球膜の骨格タンパク質であることを考慮し、ＭＤＣＫ細胞における４．１Ｎの細胞内の局在と、ＩＰ３Ｒ１の局在との関係を調べた。
サブコンフルエントおよびコンフルエントのＭＤＣＫ細胞を固定し、細胞膜を透過性にして、抗ＩＰ３Ｒ１抗体および抗４．１Ｎ抗体またはアレクサ（Ａｌｅｘａ）５９４ファロイジンにより免疫染色し、共焦点顕微鏡で解析した。結果を図面に代わるカラー写真で図９に示す。図９のＡ段及びＢ段はサブコンフルエントの状態のものであり、Ｃ段及びＤ段はコンフルエントの状態のものである。図９中の「Ｆ−ａｃｔｉｎ」はファロイジンで染色したものであり、ＩＰ３Ｒ１は抗ＩＰ３Ｒ１抗体を用いて染色したものであり、４．１Ｎは抗４．１Ｎ抗体を用いて染色したものである。各段の右端は、各段の左側と中側とをマージしてそれぞれ示したものである。図９中のスケールバーは、２０μｍを示す。
この結果、サブコンフルエントのＭＤＣＫ細胞では、細胞質にＩＰ３Ｒ１が存在した（図９Ａ参照）。４．１Ｎは、細胞質と核に分布し、細胞質において一部ＩＰ３Ｒ１と共局在した（図９Ｂ参照）。ファロイジンにより免疫染色した細胞膜の領域には、ＩＰ３Ｒ１も４．１Ｎも存在しなかった（図９Ａ参照）。一方、コンフルエントになったＭＤＣＫ細胞では、細胞質においてＩＰ３Ｒ１と４．１Ｎの双方に免疫蛍光によるわずかな染色が認められたことを別にすると、４．１ＮおよびＩＰ３Ｒ１は、細胞と細胞の接着領域で斑点状の共局在化が顕著に認められた（図９Ｃ及びＤ参照）。これらの結果は、ＭＤＣＫ細胞がサブコンフルエントからコンフルエントな状態に達すると、４．１ＮとＩＰ３Ｒ１の双方が、細胞質（および核）から細胞と細胞の接着領域に移行することを示すものである。
【００１７】
さらに、４．１ＮがＭＤＣＫ細胞においてＩＰ３Ｒ１に結合するか否かを確認するため、サブコンフルエントおよびコンフルエントのＭＤＣＫ細胞のライセートについて、２種のラットのポリクローナル抗ＩＰ３Ｒ１抗体、４Ｃ１１抗体及び１８Ａ１０抗体を用いて免疫沈降を行った。共沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗４．１Ｎ抗体および抗ＩＰ３Ｒ１抗体によりブロットした。結果を図１０に図面に代わる写真で示す。図１０のＡはサブコンフルエントの場合を示し、Ｂはコンフルエントの場合を示す。図１０のＡ及びＢのそれぞれの上段は抗ＩＰ３Ｒ１抗体によりウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示し、下段は抗４．１Ｎ抗体によりウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示す。図１０のＡ及びＢのそれぞれの左側はマーカー（ｋＤａ）を示し、その右が順に、インプットサンプル、正常ラットＩｇＧ、４Ｃ１１抗体、及び最も右側は１８Ａ１０抗体の場合をそれぞれ示す。
図１０Ａ及びＢに示すとおり、サブコンフルエントおよびコンフルエント双方のＭＤＣＫ細胞において、４．１Ｎはラット抗ＩＰ３Ｒ１抗体の２種によりＩＰ３Ｒ１と共に共沈降したが、正常ラットＩｇＧでは沈降しなかった。これらの結果は、４．１Ｎが、サブコンフルエントおよびコンフルエント双方のＭＤＣＫ細胞においてＩＰ３Ｒ１に結合することを示すものである。
【００１８】
次に、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域における４．１ＮおよびＩＰ３Ｒ１の双方の局在化についてさらに検討した。
４．１ＮおよびＩＰ３Ｒ１は、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の細胞と細胞の接着領域において局在していた（図１０Ｄ参照）。しかし、前記したブッシュらの報告では、ＩＰ３Ｒ１は基底膜領域に局在すると報告されている。また、４．１Ｎのプロトタイプ的なホモローグである４．１Ｒは、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の密着結合に局在すると報告されている（Ｍａｔｔａｇａｊａｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｎ．，  Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ３０５７３−３０５８５）。４．１ＮおよびＩＰ３Ｒ１の局在化を正確に確定するため、４．１ＮおよびＩＰ３Ｒ１の局在化を、ＭＤＣＫ細胞の密着結合を構成するマーカータンパク質としてＺＯ−１、およびＭＤＣＫ細胞の基底膜領域のマーカータンパク質としてＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅを用いて、これらの局在と比較した。コンフルエントのＭＤＣＫ細胞を固定し細胞膜を透過性にして、抗４．１Ｎ抗体または抗ＩＰ３Ｒ１抗体、および抗ＺＯ−１抗体または抗Ｎａ，Ｋ  ＡＴＰａｓｅα１抗体で免疫染色し、連続した厚さ０．２μｍの部分を共焦点顕微鏡で解析した。結果を図１１に図面に代わるカラー写真で示す。図１１の上段（Ａ）は抗４．１Ｎ抗体を用いて染色（緑色）したものであり、下段（Ｂ）は抗ＩＰ３Ｒ１抗体を用いて染色（緑色）したものである。Ａ１及びＢ１は抗ＺＯ−１抗体を用いて染色（赤色）したものであり、Ａ２及びＢ２は抗Ｎａ，Ｋ  ＡＴＰａｓｅα１抗体を用いて染色（赤色）したものである。それぞれの写真における下の段、Ａ’１、Ａ’２、Ｂ’１、及びＢ’２は、それぞれの断面での写真を示す。図１１におけるスケールバーは、２０μｍを示す。
４．１Ｎ（緑色）（Ａ１、Ａ’１、Ａ２、Ａ’２）とＩＰ３Ｒ１（緑色）（Ｂ１、Ｂ’１、Ｂ２、Ｂ’２）のいずれも、抗ＺＯ−１抗体（赤色）によって免疫標識された密着結合には局在していないが、抗Ｎａ，Ｋ  ＡＴＰａｓｅα１抗体（赤色）によって免疫標識された基底膜領域には局在している。図１１の三次元図に示すとおり、これらの結果は、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の密着結合においては４．１Ｒが局在するが、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域では、４．１ＮがＩＰ３Ｒ１と共局在することが示された。
【００１９】
図９及び図１０に示される結果により、サブコンフルエントおよびコンフルエントの双方のＭＤＣＫ細胞において、４．１ＮはＩＰ３Ｒ１と結合することが示され、図１１に示される結果により基底膜領域での共局在が示されたが、このＩＰ３Ｒ１の基底膜領域への移行に果たす４．１ＮとＩＰ３Ｒ１の相互作用の役割を調べるため、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０、ＧＦＰ−１８Ａ１０、またはＧＦＰ単独を一過性に発現しているＭＤＣＫ細胞をコンフルエントな状態にした後、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図１２に図面に代わるカラー写真で示す。図１２の上段（Ａ）はＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎの場合を示し、中段（Ｂ）はＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０の場合を示し、下段（Ｃ）はＧＦＰ−１８Ａ１０の場合を示す。図１２の各段の左側はそれぞれのＧＦＰの蛍光（緑色）を示し、中側は抗４．１抗体による染色（赤色）を示す。右側は左側と中側のマージしたものである。図１２のスケールバーは、２０μｍを示す。
図１２に示されるとおり、内在性の４．１Ｎが基底膜領域に動員されると、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ（図１２Ａ参照）、およびＧＦＰ−１８Ａ１０（図１２Ｃ参照）も基底膜領域に動員される。しかし、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０（図１２Ｂ参照）もＧＦＰ単独（データなし）も、基底膜領域に動員されなかった。したがって、これらの結果は、ＩＰ３Ｒ１の４．１Ｎ結合部位が、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域におけるＩＰ３Ｒ１の局在化に、必要かつ十分であることを示すものである。
【００２０】
次に４．１Ｎ／ＣＴＤ断片が、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域におけるＩＰ３Ｒ１局在化をブロッキングするか否かを検討した。
コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域における４．１Ｎの局在化に、４．１Ｎのどの部位が係わっているのかを確認するため、ベーナス（Ｖｅｎｕｓ（黄色蛍光蛋白の変異体（Ｎａｇａｉ，Ｔ．，  Ｉｂａｔａ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０，  ８７−９０））タグ付き４．１Ｎ融合蛋白またはベーナス（Ｖｅｎｕｓ）単独をコードするプラスミドでＭＤＣＫ細胞を形質転換した。Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ（４．１Ｎの完全長）、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ΔＣＴＤ（ＣＴＤ欠失の４．１Ｎ）、およびＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤ（４．１ＮのＣＴＤ）を一過性に発現するＭＤＣＫ細胞をコンフルエントな状態にして免疫染色し、共焦点顕微鏡にて解析した。結果を図１３のＡ〜Ｃに図面に代わるカラー写真で示す。また、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤ、またはＶｅｎｕｓ単独およびＩＰ３Ｒ１を、一過性に共発現するＭＤＣＫ細胞をコンフルエントな状態にし、抗ＩＰ３Ｒ１抗体で免疫染色して共焦点顕微鏡にて解析した。結果を図１３のＤ〜Ｆに図面に代わるカラー写真で示す。図１３のＡ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬを発現する場合を示し、Ｂ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ΔＣＴＤを発現する場合を示し、Ｃ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤを発現する場合を示し、Ｄ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ及びＩＰ３Ｒ１を発現する場合を示し、Ｅ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤ及びＩＰ３Ｒ１を発現する場合を示し、Ｆ段はＶｅｎｕｓ単独及びＩＰ３Ｒ１を発現する場合を示す。図１２のそれぞれの段における左側はＶｅｎｕｓによる蛍光（緑色）を示し、中側は図１２のそれぞれに示される抗体により染色（赤色）されたものを示し、右側はこれらをマージしたものを示す。図１３のスケールバーは、２０μｍを示す。
この結果、サブコンフルエントのＭＤＣＫ細胞では、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬおよびＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤが細胞質と核に分布し、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ΔＣＴＤは細胞質に分布した（データなし）。コンフルエントのＭＤＣＫ細胞では、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ（図１３Ａ参照）およびＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ΔＣＴＤ（図１３Ｂ参照）が完全に基底膜領域に動員され、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤ（図１３Ｃ参照）およびＶｅｎｕｓ単独（データなし）は、細胞質と核に分布した。これらの結果は、Ｃ末端領域ではなくＮ末端部位が、基底膜領域における４．１Ｎの局在化に係わっていることを示すものである。
４．１ＮのＣＴＤは、ＩＰ３Ｒ１に結合するために必要かつ十分であり（図７及び８参照）、４．１Ｎ／ＣＴＤ断片は、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域には局在しなかった（図１３Ｃ参照）。４．１Ｎ／ＣＴＤ断片が、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域へのＩＰ３Ｒ１の移行をブロッキングするのか否かを確認するため、ＭＤＣＫ細胞に、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤまたはＶｅｎｕｓをコードするプラスミドを、ＩＰ３Ｒ１と共にトランスフェクトした。図１３のＤ−Ｆに示すとおり、ＩＰ３Ｒ１がＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬと共発現した場合、どちらもコンフルエントのＭＤＣＫ細胞の細胞と細胞の接着部分の周辺に動員された。しかし、ＩＰ３Ｒ１がＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤと共発現した場合、どちらもコンフルエントのＭＤＣＫ細胞の細胞質と核に留まった。Ｖｅｎｕｓとのこの共発現は、ＩＰ３Ｒ１の分布に影響しなかった。総合するとこれらの結果は、ＩＰ３Ｒ１と４．１Ｎ間の相互作用がＩＰ３Ｒ１の移行に係わっており、４．１ＮのＮ末端部位と４．１ＮのＣＴＤの両方が、コンフルエントなＭＤＣＫ細胞の基底膜領域へのＩＰ３Ｒ１の移行にとって必要であることを示している。
【００２１】
ＩＰ３Ｒ１は、小胞体（ＥＲ）での局在化が顕著であることで知られている。
確かにサブコンフルエントのＭＤＣＫ細胞では、細胞質におけるＩＰ３Ｒ１の局在化が認められたが（図９参照）、一方、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の場合、基底膜領域におけるＩＰ３Ｒ１の局在化が認められた（図９Ｃ及びＤ、並びに図１１のＢ２及びＢ’２参照）。コンフルエントのＭＤＣＫ細胞におけるＥＲの局在化を検出するため、その他の内在性のＥＲタンパク質をマーカータンパク質としてその免疫染色を行った。コンフルエントのＭＤＣＫ細胞を固定し細胞膜を透過性にして、抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα１抗体および抗カルネキシン抗体で染色し、共焦点顕微鏡で解析した。結果を図１４Ａに図面に代わるカラー写真で示す。また、ＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａ、又はＤｓＲｅｄ−ＫＤＥＬが一過性に発現するＭＤＣＫ細胞をコンフルエントな状態にし、抗ＩＰ３Ｒ１抗体で免疫染色して、共焦点顕微鏡で解析した。結果を図１４Ｂ及びＣにそれぞれ図面に代わるカラー写真で示す。図１４Ａの左側は抗カルネキシン抗体で染色（緑色）した場合を示し、中側は抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα１抗体で染色（赤色）した場合を示し、右側はそれらをマージしたものを示す。図１４Ｂの左側はＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａの蛍光（緑色）を示し、中側は抗ＩＰ３Ｒ１抗体で染色（赤色）した場合を示し、右側はそれらをマージしたものを示す。図１４Ｃの左側はＤｓＲｅｄ−ＫＤＥＬの蛍光（赤色）を示し、中側は抗ＩＰ３Ｒ１抗体で染色（緑色）した場合を示し、右側はそれらをマージしたものを示す。図１４のスケールバーは、２０μｍを示す。
図１４Ａに示されるとおり、カルネキシンは細胞質に局在したが、基底膜領域には局在しなかった。とりわけ、抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα１抗体によって免疫標識された細胞と細胞の接着部位では、カルネキシンの免疫蛍光がまったく認められなかった。さらに、その他の３種のＥＲタンパク質、カルレティキュリン、カルセクエンストリン（ｃａｌｓｅｑｕｅｎｓｔｒｉｎ）、及び筋小胞体カルシウム−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）も、細胞質における局在が認められた（データなし）。これらの結果は、ＩＰ３Ｒ１がコンフルエントのＭＤＣＫ細胞で基底膜領域に移行しても、その他のＥＲマーカータンパク質は依然として細胞質に局在することを示している。
【００２２】
これらの観察をさらに確認するため、ＭＤＣＫ細胞にＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａとＥＧＦＰの融合タンパク質）、およびＤｓＲｅｄ−ＫＤＥＬ（カルレティキュリンのＥＲ標的・移行シグナルペプチドとＤｓＲｅｄ２の融合タンパク質）を一過性にトランスフェクトし、コンフルエントな状態にし、抗ＩＰ３Ｒ１抗体、及び抗４．１Ｎ抗体でそれぞれブロットした。結果を図１５に図面に代わる写真で示す。図１５のＡは抗ＩＰ３Ｒ１抗体を用いてウエスタンブロッティング（ＷＢ）した場合を示し、図１５のＢは抗４．１Ｎ抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）した場合を示す。図１５のそれぞれの左側はマーカー（ｋＤａ）を示し、その右側はマウスの脳のライセートの場合を示し、その右側はＭＤＣＫ細胞のライセートを示す。
この結果、内在性のＩＰ３Ｒ１は、基底膜領域における集中が顕著であったが、外来的に発現したＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａおよびＤｓＲｅｄ２−ＫＤＥＬは、依然として細胞質に分布した（図１４Ｂと１４Ｃ）。総合するとこれらの結果は、ＩＰ３Ｒ１はコンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域に局在するが、ＥＲはそうではないことが示された。
【００２３】
前記したブッシュらの報告では、ラット小脳から純化したＩＰ３Ｒに対する抗体を用いて、ＩＰ３ＲがＭＤＣＫ細胞の基底膜領域のみならず、コンフルエントの細胞質にも局在するとされていたが、この局在化を明らかにする分子機序は、解明されていなかった。本発明は、生体外及び生体内試験により、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部と、４．１ＮのＣＴＤの間の相互作用を実証した。ＩＰ３Ｒ１および４．１Ｎに特異的な抗体を使用することにより、ＩＰ３Ｒ１と４．１Ｎが、サブコンフルエントおよびコンフルエントの双方のＭＤＣＫ細胞で結合し、ＭＤＣＫ細胞がサブコンフルエントからコンフルエントな状態に達すると、細胞質（および核）から基底膜領域に移行することを明らかにしてきた。そして、基底膜領域へのＩＰ３Ｒ１の局在化は、その４．１Ｎ結合部位によって決まり、４．１Ｎ／ＣＴＤ断片によってブロッキングされることが示された。４．１Ｎ／ＣＴＤ断片は、４．１ＮがＩＰ３Ｒ１に結合するために必要かつ十分であるが、ＣＴＤ断片のみでは基底膜領域には移行しなかった。さらに本発明者らは、コンフルエントにおいてＩＰ３Ｒ１は基底膜領域に局在するが、その他の数種の内在性の、または外来性のＥＲマーカータンパク質は、依然として細胞質に留まることも見出した。これらのデータは、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域におけるＩＰ３Ｒ１の局在化が、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部と４．１ＮのＣＴＤの間で制御されていることを示している。
【００２４】
タンパク質が構造的および機能的に明確な膜領域に結合することは、極性をもった上皮細胞の基本的特質である。４．１ＮとＩＰ３Ｒ１が、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域に移行するための詳細な機序は、十分に解明された訳ではないが、基底膜領域への４．１ＮおよびＩＰ３Ｒ１が移行するプロセスの特徴のいくつかを本発明で確認することができた。第１に、４．１Ｒと４．１Ｎは高度な相同性を共有するが、細胞内の局在においては相違している。第２に、基底膜領域への４．１Ｎの移行には、４．１ＮのＮ末端部位（ａａ．１−７６６）が関与している。第３に、基底膜領域へのＩＰ３Ｒ１の移行には、４．１ＮとＩＰ３Ｒ１間の相互作用が必要である。４．１Ｒの２つのアイソフォーム、１３５ｋＤａと１５０ｋＤａは、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の密着結合において、ＺＯ−１、ＺＯ−２、およびオクルディンと共局在することが報告されている。これと対照的に、４．１Ｎは密着結合には局在しないが（図１１Ａ１及びＡ’１参照）、コンフルエントなＭＤＣＫ細胞の基底膜領域に局在する（図１１Ａ２及びＡ’２参照）。４．１Ｒ／ＣＴＤ断片は、生体外でＺＯ−１およびＺＯ−２に結合するが、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の密着結合へ動員することはできなかったことが報告されている。４．１Ｎ／ＣＴＤも、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜に動員することはできなかった（図１３Ｃ参照）。基底膜に完全に動員できる４．１ＮのＮ末端部位（図１３Ｂ参照）には、各ホモローグに特有な３個のドメインと、高度に保存性を維持しているＭＢＤドメイン（図１Ｂ参照）がある。４．１Ｒと４．１Ｎの細胞内における局在の相違は、このホモローグに特有なドメインによって決まってくる可能性がある。４．１ＲのＭＢＤは、バンド３、グリコホリンＣおよびＣＤ４４などの内在性の膜タンパク質と相互作用をすることが知られている。４．１Ｎとこれらタンパク質との相互作用は、まだ明らかにされていないが、４．１Ｎと４．１Ｒ間の配列全体に高度な相同性があることから、４．１ＮのＮ末端部位（ａａ．１−７６６）にも、複数の内在性の膜タンパク質と相互作用する能力があるのではないかと推測できる。コンフルエントな状態のＭＤＣＫ細胞からのシグナル、および４．１Ｎのユニークなドメインによって誘導されると考えられるこれらの相互作用によって、基底膜領域への４．１Ｎ−ＩＰ３Ｒ１複合体の移行が可能になっていると考えられる。
【００２５】
ＩＰ３Ｒ１は、小胞体における局在が顕著なことで知られている。サブコンフルエントのＭＤＣＫ細胞の場合、確かにＩＰ３Ｒ１も細胞質に認められた（図９Ｂ参照）。しかしコンフルエントのＭＤＣＫ細胞の場合、ＩＰ３Ｒ１の示した細胞内の局在は、その他のＥＲマーカータンパク質とは相違していた。即ち、ＩＰ３Ｒ１は、基底膜領域における集中が顕著であり（図９Ｃ及びＤ、並びに図１１Ｂ２及びＢ’２参照）、その他のＥＲマーカータンパク質は細胞質に留まり、基底膜領域の細胞と細胞の接着部分には明らかに認められなかった（図１４Ａ参照）。さらに、外来性で発現したＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａおよびＤｓＲｅｄ２−ＫＤＥＬが、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域に移行しなかったことが見出された（図１５参照）。
ＩＰ３Ｒ全体の約１０−２０％は、細胞膜非透過性のコンフルエントのＭＤＣＫ細胞の主として基底側から、外部添加によりビオチン化できることを考慮すると、血管壁側膜、血管壁側膜サブドメイン、あるいは関連する膜組織の周辺にＩＰ３Ｒ１の一部が局在し、膜貫通型タンパク質としてＩＰ３Ｒ１の一部が存在している可能性がある。コンフルエントのＭＤＣＫ細胞におけるＩＰ３Ｒ１の生理学的機能を解明するためには、基底膜領域でのＩＰ３Ｒ１の存在状態をさらに詳細に調べる必要がある。
【００２６】
ＩＰ３Ｒが原形質膜に局在する、あるいは存在することを示唆する証拠は顕著になりつつある。いくつかの細胞株について免疫標識法で観察した結果、ＩＰ３Ｒの細胞内プールの一部が原形質膜に局在するのが認められたことが報告されている。細胞内を分取した研究では、ＩＰ３Ｒが高頻度で原形質膜断片に認められたことも報告されている。タニムラら（Ｔａｎｉｍｕｒａ，Ａ．，  Ｔｏｊｙｏ，Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ２７４８８−２７４９３４９）は、ＩＰ３Ｒの３つのアイソフォームのすべてを、いくつかの細胞株において外部からビオチン化したことを報告している。
一方、４．１ＮのＣＴＤは、ＡＭＰＡ受容体サブユニットであるＧｌｕＲ１、及びドーパミン受容体Ｄ２とＤ３に結合することが報告されており、この相互作用がこれら受容体の細胞表面での発現を制御していると考えられる。細胞の骨格タンパク質や膜タンパク質である４．１Ｎは、神経組織のみならず非神経組織にも発現することも報告されており、ＭＤＣＫ細胞において認められた、ＩＰ３Ｒ１の細胞内局在を制御する役割を果たす４．１Ｎの作用は、その他の全ての細胞株においても重要である可能性がある。
【００２７】
基底膜領域におけるＩＰ３Ｒ１の役割の詳細は、現在のところ十分に解明できていない。ＩＰ３Ｒ１が血管壁側の近くに局在することによって、ＩＰ３Ｒ１はＩＰ３シグナルを効率的に受けることができ、それによって局在するＣａ２＋増加を急速に誘導できるため、Ｃａ２＋の作用を受けやすいアクチン結合性タンパク質を通じて近くのアクチン細胞骨格を調節し、細胞接着と細胞の極性維持において重大な役割を果たしている可能性が考えられる。もし、ＩＰ３Ｒ１が、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞の基底膜領域において、膜貫通型タンパク質として存在しているとすれば、ＩＰ３結合領域、および４．１Ｎと結合するＣ末端部が細胞質に向き合い、ＩＰ３Ｒ１は原形質膜のＣａ２＋チャネルとして機能していると考えられる。さらに、原形質膜にあるＩＰ３Ｒは、容量性Ｃａ２＋流入（ＣＣＥ）チャネルとしての機能も果たすことができるとの仮説を裏付けるデータも報告されている。
【００２８】
ウーら（Ｗｕ，Ｓ．，  Ｓａｎｇｅｒｍａｎ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １５４，  １２２５−１２３３５４）は、スペクトリン蛋白４．１の相互作用が乱れた結果として、細胞質の基質全体のサプシガルピン刺激性Ｃａ２＋反応が低下し、内皮細胞が選択的に損傷されると報告している。その他の報告では、Ｃａ２＋ストアの枯渇と原形質膜へのＣａ２＋流入との間の結合プロセスを調整する、細胞骨格アクチンの動的作用が明らかになってきている。４．１Ｎが膜結合性タンパク質、スペクトリン／アクチン結合性タンパク質であり、細胞骨格の構成要素である事実を考慮すると、４．１ＮとＩＰ３Ｒ１間の相互作用による機能的寄与、およびＣａ２＋ストアの枯渇に刺激された原形質膜へのＣａ２＋流入のプロセスにおける、この相互作用に基づいたＩＰ３Ｒ１の細胞内移行は重要である。
【００２９】
以上のように、本発明は細胞骨格タンパク質４．１Ｎが、ＩＰ３Ｒ、より詳細にはＩＰ３Ｒ１に結合するタンパク質であることを初めて見出したものである。
したがって、本発明は、細胞骨格タンパク質４．１Ｎからなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の細胞内局在の調節剤を提供するものである。本発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）としては、そのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）が好ましく、より詳細には本発明は、ＩＰ３Ｒ１の細胞内での局在化の調節剤を提供するものである。本発明の調節剤は、ＩＰ３Ｒ１の細胞内での局在化を調整し、ＩＰ３Ｒ１の各種の機能の解明のみならず、細胞の分化、分裂などの機構の解明や、ＩＰ３Ｒ１の細胞の局在化の異常に伴う各種の疾患の治療や診断に有用である。
本発明の細胞骨格タンパク質４．１Ｎとしては、少なくともそのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するものであればよく、より詳細には４．１Ｎの７８３〜８７９までのアミノ酸配列を有するもので有ればよい。より好ましくは、さらに４．１ＮのＮ末端側の領域を有するペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の細胞内局在の調節剤は、ＩＰ３Ｒの細胞内における移行を阻害するものであってもよいし、また移行を促進させるものであってもよい。また、細胞内でのＩＰ３Ｒの局在化を正常な形態に戻すように調節するためのものであってもよいし、他の特定の状態に変化させるための調節であってもよい。
【００３０】
本発明の細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチドからなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の細胞内移行阻害剤は、前記した細胞内の局在化の調節におけるＩＰ３Ｒ、好ましくはＩＰ３Ｒ１の移行の阻害のためのものである。このような阻害剤としては、細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列、より詳細には少なくとも４．１Ｎの７８３〜８７９までのアミノ酸配列を有するペプチドである。このようなペプチドはＩＰ３Ｒ、好ましくはＩＰ３Ｒ１の移行を阻害するためのドメインだけでなく、他の機能を有するドメイン、例えばＧＦＰなどの標識となり得るドメインや、他のタンパク質や化学物質に結合できるドメインを有していても良い。
【００３１】
また、本発明は、少なくとも細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチド、及び検出・同定のための担体を含有してなる、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）を検出・同定するための組成物、及びそれを用いたＩＰ３Ｒを検出・同定する方法を提供するものである。本発明の少なくとも細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列を有するペプチドとしては、細胞骨格タンパク質４．１ＮのＣ末端領域（ＣＴＤ）を構成するアミノ酸配列、より詳細には少なくとも４．１Ｎの７８３〜８７９までのアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。このようなペプチドはＩＰ３Ｒ、好ましくはＩＰ３Ｒ１の移行を阻害するためのドメインだけでなく、他の機能を有するドメイン、例えばＧＦＰなどの標識となり得るドメインや、他のタンパク質や化学物質に結合できるドメインを有していても良い。また、このようなペプチドは、検出や同定をより容易にするための標識化がなされていてもよい。このような標識化としては、蛍光マーカー、放射性の標識、金属原子への特異的な吸着性を有する原子（例えば、硫黄原子など）の導入などの各種の手法を採用することができる。さらに、このようなペプチドに格別の標識化を行うことなく、当該ペプチドに対する抗体を用いて検出や同定を行うこともできる。このような抗体としては、公知の４．１Ｎ抗体を使用することもできるが、当業者に周知の方法により製造され得る、本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体であってもよい。
本発明の検出・同定するための組成物における検出・同定のための担体としては、各種の溶媒や、緩衝液、また本発明のペプチドの安定化剤、溶解補助剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明は、前記してきた検出・同定をするための組成物を用いたＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）を検出・同定する方法を提供する。本発明の方法は、被検体に前記してきた組成物を適用してこれを通常の手法により検出・定量化することにより行うことができる。
本発明のこの方法は、被検体におけるＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）の存在を検出・同定するためだけでなく、それらの細胞内での局在化の状況や、細胞内におけるＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）の存在の異常や動向を検出し、同定し、定量化するために適用することができる。
【００３３】
以上で説明してきたように、本発明は細胞骨格タンパク質４．１Ｎ、特にそのＣ末端領域（ＣＴＤ）が、ＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）のＣ末端部（ＣＴＴ）に結合すること、そして４．１ＮがＮ末端側のアミノ酸を有している場合には、細胞がコンフルエントな状態になった場合にＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）を細胞の基底膜領域に移行させることを初めて見出したものであり、係る技術思想を利用するすべての範囲を本発明は包含するものであることは当業者には明白である。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３５】
実施例１  （プラスミド構築）
プラスミドはすべて、大腸菌株ＨＢ１０１を用いて増殖させた。ｃＤＮＡ断片のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるすべての産物は、プラチナルＲ（ＰｌａｔｉｎｕｍＲ）  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（インビトロジェン社）を用いたフレームで生成し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７自動シーケンサ（米国バイオシステムズ社製を使用）を使用してヌクレオチドのシーケンシングを行った。
ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部をコードするｃＤＮＡ（ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ、ａａ．２５９０−２７４９）を、マウスＩＰ３Ｒ１のｃＤＮＡからのＰＣＲによって作製し、ｐＧＢＴ９（クロンテック社）のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの部位にサブクローニングし、ｐＧＢＴ９−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴを作製した。
ｐＥＧＦＰ−Ｃ３（クロンテック社）のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの部位にサブクローニングしＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴを作製した。
ｐＧＥＸ−ＫＧ（Ｇｕａｎ，Ｋ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．  （１９９１），  Ａｎａｌ．  Ｂｌｏｃｈｅｍ．，  １９２，  ２６２−２６７）のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの部位にサブクローニングしＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴを作製した。
【００３６】
異なる長さのＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ（図５参照）に応じて、Ｃ末端が欠失したＤＮＡを、ｐＧＢＴ９のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの部位にサブクローニングした。
Ｎ末端でＥＧＦＰ  ｃＤＮＡと融合している、完全長のマウスＩＰ３Ｒ１を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ＋（インビトロジェン社）にサブクローニングしてＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎを作製した。
ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−ＮのＥｃｏＲＩからＸｈｏｌ部位（ａａ．２２１６−２７４９）で構成されている断片を、マウスＩＰ３Ｒ１のａａ．２２１６−２７３７で構成されているＰＣＲ産物と交換することにより、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０を作製した。
マウスＩＰ３Ｒ１のａａ．２７３８−２７４９で構成されている合成ＤＮＡ断片を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、ＧＦＰ−１８Ａ１０を作製した（ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０とＧＦＰ−１８Ａ１０の用語の意味するところは、ＩＰ３Ｒ１の最後の１４残基が、１８Ａ１０抗体による特異な認知部位を含むことにある。）。
ｐＢａｃｔ−ＳＴｎｅｏＢ−Ｃ１（ＩＰ３Ｒ１を発現させるために使用）とＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａは、文献に記載の方法に準じて製造した（Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．，  Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０），  Ｎｅｕｒｏｎ．，  ５，  １１−１８；  Ａｉｈａｒａ，Ｙ．，  Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．，  ６５，  ２３６−２４６）。
ＥＲマーカー、ＤｓＲｅｄ２−ＫＤＥＬを構築するため、文献記載の方法（Ｔｅｒａｓａｋｉ，Ｍ．，  Ｊａｆｆｅ，Ｌ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，，（１９９６），  ’Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．，  １７９，  ３２０−３２８；  Ｒｏｄｅｒｉｃｋ，Ｈ．Ｌ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４０５，  １８１−１８５）に準じて、２段階ＰＣＲ操作により、カルレティキュリンのＮ末端１７アミノ酸をＤｓＲｅｄ２（クロンテック社）のＮ末端に融合し、ＥＲ標的および移行シグナル配列、ＫＤＥＬをそのＣ末端に融合した。生成したＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ＋（インビトロジェン社）にサブクローニングした。
【００３７】
マウス小脳ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして使用し、マウス４．１Ｎ完全長シーケンス（取得番号：ＡＦ０６１２８３）に対応する
５’−ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴ−３’と、
５’−ＡＴＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴ−３’
（下線は、クローニングの各々ＥｃｏＲＩとＸｂａｌ部位を示す）のプライマーを使用し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ＋（インビトロジェン社）（ｐｃＤＮＡ３−４．１Ｎ）のＥｃｏＲＩとＸｂａｌ部位にサブクローニングし、ＰＣＲによってマウス４．１ＮのｃＤＮＡを入手した。
ｐｃＤＮＡ３−４．１Ｎにおいて４．１Ｎのａａ．１−２９８で構成されるＥｃｏＲＩからＥｃｏＲＶのｃＤＮＡ断片を、それに対応するシーケンスを含むＰＣＲ産物と交換してｐｃＤＮＡ３−ＨＡ４．１Ｎ／ＦＬを作製し、ＨＡ−タグシーケンスとＥｃｏＲＩ部位を含む５’−プライマー、およびＥｃｏＲＶ部位を含む３’−プライマーを使用して増幅した。ＶｅｎｕｓのｃＤＮＡ（Ｎａｇａｉ，Ｔ．，  Ｉｂａｔａ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０，  ８７−９０）をテンプレートとして使用し増幅したＰＣＲ産物を、ｐＣＤＮＡ３−４．１ＮのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの部位に挿入し、ｐｃＤＮＡ３−Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬを作製した。
ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ４．１Ｎ／ＦＬおよびｐｃＤＮＡ３−Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ（Ａｐａｌ−Ａｐａｌ）のａａ．６６３−８７９で構成されている４．１Ｎ断片を、４．１Ｎのａａ．６６３−７６６で構成されているＰＣＲ産物と交換することにより、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ４．１Ｎ／ΔＣＴＤ、およびｐｃＤＮＡ３−Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ΔＣＴＤ（ａａ．１−７６６）を作製した。
ＥｃｏＲＩ部位およびＨＡタグシーケンスを含む５’−プライマーと、Ｘｂａｌ部位およびストップコードを含む３’−プライマーを使用して増幅した４．１Ｎ／ＣＴＤのＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ＋のＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ部位にサブクローニングしてｐｃＤＮＡ３−ＨＡ４．１Ｎ／ＣＴＤ（ａａ．７６７−８７９）を作製した。Ｖｅｎｕｓ（ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片）と、４．１Ｎ／ＣＴＤ（ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片）のＰＣＲ産物の２つを、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ＋のＢａｍＨＩおよびＸｂａｌ部位にサブクローニングしてｐｃＤＮＡ３−Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤ（ａａ．７６７−８７９）を作製した。４．１Ｎ／ＣＴＤのＰＣＲ産物を、ｐＧＥＸ−ＫＧのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、ＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤを作製した。  異なる長さの４．１Ｎ（図７参照）に応じて一部を欠失させた構成体を、ｐＧＡＤ４２４（クロンテック社）のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。
【００３８】
実施例２  （酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）アッセイ）
酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイのために、ＧＡＬ４ベースのＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムＩＩ（クロンテック社）を使用した。プラスミドベクターｐＧＢＴ９、ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合領域（ＧＡＬ４−ＢＤ）をコードするｐＧＡＤ４２４、およびＧＡＬ４−活性領域（ＧＡＬ４−ＡＤ）を各々使用して、ハイブリッドタンパク質を発現させた。ＩＰ３Ｒ１（ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ）のＣ末端部と相互作用するタンパク質をスクリーニングするため、ＧＡＬ４−ＡＤベクターｐＡＣＴ２における胚性および成人ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（いずれもクロンテック社）の混合物を、ＧＡＬ４−ＢＤベクターｐＧＢＴ９（詳細は、実施例１のプラスミド構築の項を参照）にクローニングしたマウスＩＰ３Ｒ１タイプ１のＣ末端部をＰＪ６９−４Ａ酵母におけるベイトとして使用し、スクリーニングした。ｐＧＢＴ９−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴまたはｐＧＢＴ９単独による酵母への共形質転換により、相互作用をもつ形質転換体の特異性をさらに試験した。相互作用をもつ形質転換体からＤＮＡを単離し、ＧＡＬ４−ＡＤプラスミドを大腸菌株ＨＢ１０１で調製して、シーケンシングを行った。結合領域のマッピングについては、ＧＡＬ４−ＢＤまたはＧＡＬ４−ＡＤに融合した各々のインサートをもつプラスミドにて酵母を共形質転換し、ドロップアウト・ロイシン、トリプトファン、アデニン、ヒスチジンの栄養選択性について、またニトロセルロースフィルターに対するβガラクトシダーゼの活性について、クロンテック社のマニュアルに説明されているとおり、アッセイを行った。
【００３９】
実施例３  （抗体の製造）
抗４．１Ｎ抗体の産生については、４．１ファミリーの他のアイソホームと相同性のないマウス４．１Ｎのアミノ酸残基５８８−７９０に対応するヌクレオチド配列を、ｐＲＳＥＴ−Ｃ（インビトロジェン社）にサブクローニングし、このプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、Ｈｉｓ６タグ付き蛋白を発現させ、ニッケルカラムで精製した。ニホンシロウサギとウィスターラットを、この融合蛋白を用いて免疫した。標準プロトコルに従い、ウサギの抗血清を、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社）に結合したＧＳＴ−４．１Ｎ断片（ａａ．５８８−７９０）に対し親和性のカラムを用いて精製した。
抗ＩＰ３Ｒ１ラットモノクローナル抗体：１８Ａ１０、４Ｃ１１、１０Ａ６、および抗ＩＰ３Ｒ１マウスモノクローナル抗体ＫＭ１１１２については、文献に記載の方法に準じて製造した（Ｍａｅｄａ，Ｎ．，  Ｎｉｉｎｏｂｅ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  ５１，  １７２４−１７３０；  Ｍａｅｄａ，Ｎ．，  Ｎｉｉｎｏｂｅ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，１３３，  ６７−７６；  Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．，  Ｆｕｒｕｙａ，Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ３５４，  １４９−１５４）。
Ｈ１Ｌ３は、大腸菌で発現したマウスＩＰ３Ｒ１の残基２４６３−２５３６に対応する、純化融合蛋白を用いて調製した、ウサギ多クローン性抗ＩＰ３Ｒ１抗体である。
抗ＺＯ−１抗血清（Ｔ８７５４）は、京都大学の月田承一郎博士のご好意により提供していただいた。その他の抗体については、市販品を用いた。
【００４０】
実施例４  （細胞培養とトランスフェクション）
ＣＯＳ−７細胞とＭＤＣＫ細胞は、加熱処理した１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク）で培養した。サブコンフルエントおよびコンフルエントになったＭＤＣＫ細胞については、ＭＤＣＫ細胞を、各々０．６−１．０×１０５および２．２５×１０５細胞による平板培養法で、１８×１８ｍｍのポリ−Ｌ−リジンを被覆したカバーガラスに固着し、３５ｍｍ培養皿で各々１〜５日間培養した。トランスフェクションは、メーカーのプロトコルに従い、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（ライフテクノロジー社）を使用して実施した。
トランスフェクションの１日後に、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を回収した。トランスフェクトしたカバーグラス上のＭＤＣＫ細胞は、トランスフェクションの３日後に固定し、その後以下に記述する抗体で免疫蛍光染色処理した。
【００４１】
実施例５  （免疫共沈降、プルダウン結合アッセイ、免疫ブロット法）
サブコンフルエントおよびコンフルエントのＭＤＣＫ細胞のライセートと、形質転換した大腸菌、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞のライセート、および８週齢ＩＣＲ雄マウスの全脳（ＳＬＣ社、日本）を、ＨＥＫ２９３細胞のライセートの調製および脳組織からのＰ２断片の調製については、文献記載（Ｓｈｅｎ，Ｌ．，  Ｌｉａｎｇ，Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２０，  ７９３２−７９４０）の方法に準じて調製した。
ＭＤＣＫ細胞のライセート、およびマウス全脳のライセートの免疫共沈降は、文献記載の方法に準じて行った（Ｓｈｅｎ，Ｌ．，  Ｌｉａｎｇ，Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２０，  ７９３２−７９４０）。プルダウン結合アッセイは、免疫共沈降プロトコルを修飾して行った。要約すると、大腸菌、およびトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞のライセートを、１％デオキシコール酸ナトリウムにより３６℃で３０分間可溶化し、次に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ９．０、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の０．１容量を加え、この調製液を１００，０００×ｇで３０分遠心させた。この上清をインビトロ結合アッセイに使用した。
各反応について、大腸菌ライセートの１，０００μｇ蛋白を、グルタチオンセファロース  ４Ｂ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社）の１：１スラリー３０μｌにより４℃で２時間インキュベーションし、次に洗浄用緩衝液（４ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）にて３回洗浄した後、沈降したグルタチオンセファロース  ４Ｂと融合タンパク質の複合体を使用した。同時に、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞ライセートの５００μｇ蛋白を、グルタチオンセファロース  ４Ｂの１：１スラリー２５μｌにより４℃で１時間インキュベーションし、ライセートのビーズへの非特異的結合を除去した。このように除去したライセートの上清を、グルタチオンセファロース  ４Ｂ−タンパク質の複合体に加え、この混合物を４℃で２時間または一夜インキュベーションした。次にこの混合物を沈降させ、洗浄用緩衝液にて３回洗浄した。タンパク質を１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーにより３分間煮沸して溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。このタンパク質をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（マサチューセッツ州ベッドフォード、ミリポア社）に移し、この膜を、抗ＧＦＰ抗体、抗４．１Ｎ抗体、１８Ａ１０抗体、４Ｃ１１抗体または抗ＨＡ抗体でブロッティングした。
【００４２】
実施例６  （蛍光と共焦点レーザー顕微鏡）
カバーグラスの細胞を、新たに調製した１．７５％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞培養培地により室温で１５分間培養した。次にこの細胞を、ＰＢＳにて３回洗浄、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳにて室温で５分間かけて細胞膜を透過性にし、２％正常ヤギ血清を含むＰＢＳにて室温で１時間で固定化し、ＰＢＳにて３回洗浄した。次にこの細胞を一次抗体（（ＭＤＣＫ細胞の内在性のＩＰ３Ｒ１については）ウサギ抗４．１Ｎ抗体、Ｈ１Ｌ３抗体、（外来性で発現したＩＰ３Ｒ１については）ＫＭ１１１２抗体、および抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα１抗体、最終濃度：２μｇ／ｍｌ、抗ＺＯ−１抗血清、１：１、ラット抗４．１Ｎ抗血清（ＭＤＣＫ細胞の内在性の４．１ＮとＩＰ３Ｒ１の二重免疫染色についてのみＨ１Ｌ３抗体と共に使用）１：５０）にて室温で１時間インキュベーションし、上記のように３回洗浄した。次にこれを、適切なアレクサフルオロ４８８（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）、アレクサフルオロ５９４（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４）、二次抗体またはアレクサ５９４（Ａｌｅｘａ  ５９４）ファロイジン（モレキュラプローブス社）にて、室温で１時間インキュベーションし、再度３回洗浄した。
カバーガラスに載せる際には、ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｌｄ）封入剤（ヴェクター・ラボラトリー）を用いた。蛍光画像は、６０Ｘ対物レンズの倒立顕微鏡（日本国東京都オリンパス社ＩＸ７０）に付随している走査型共焦点顕微鏡（オリンパス社ＦＶ−３００）を使用して撮影した。
【００４３】
【発明の効果】
本発明は、細胞骨格タンパク質４．１Ｎ、特にそのＣ末端領域（ＣＴＤ）が、ＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）のＣ末端部（ＣＴＴ）に結合すること、そして４．１ＮがＮ末端側のアミノ酸を有している場合には、細胞がコンフルエントな状態になった場合にＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）を細胞の基底膜領域に移行させることを初めて見出したものであり、本発明によりＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）検出・同定が容易に行えるようになるだけでなく、ＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）の細胞内での局在化を調節することが可能となり、ＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）の機能の解析や、ＩＰ３Ｒ、好ましくはそのサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ１）が関与している各種の疾患や異常の予防、治療、診断への応用が可能となる。
【００４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウスＩＰ３Ｒ１とタンパク質４．１Ｎの構造の概略を示す図である。図１Ａ及び図１Ｂの下段の数字は各タンパク質のアミノ酸の番号を示す。
【図２】図２は、ＧＳＴと４．１Ｎ／ＣＴＤの融合蛋白（ＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤ）を用いて、ＩＰ３Ｒ１の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ付きＣ末端部（ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ）と免疫沈降アッセイを行った結果を示す図面に代わる写真である。図２の上段は沈降したタンパク質を示し、中段と下段のパネルは、加えたタンパク質を示している。上段と中段は抗ＧＦＰ抗体でウエスタンブロット（ＷＢ）した場合を示し、下段はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した場合を示す。図２の左側はマーカー（ｋＤａ）を示す。
【図３】図３は、マウスの脳全部のライセートについて、３種類のラット抗ＩＰ３Ｒモノクローナル抗体を用いて免疫共沈降法を行い、共沈降したタンパク質を抗４．１Ｎ抗体又は抗ＩＰ３Ｒ１抗体でブロットした結果を示す図面に代わる写真である。図３の上段は抗４．１Ｎ抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示し、下段は抗ＩＰ３Ｒ１抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示す。図３の左側はマーカー（ｋＤａ）を示す。その右側からインプットサンプル、ラットＩｇＧ、ラット４Ｃ１１抗体、ラット１８Ａ１０抗体、最も右側がラット１０Ａ６抗体を用いた場合をそれぞれ示している。
【図４】図４は、マウスの脳全部のライセートについて、ウサギ抗４．１Ｎポリクローナル抗体を用いて免疫共沈降法を行い、共沈降したタンパク質を抗４．１Ｎ抗体又は抗ＩＰ３Ｒ１抗体でブロットした結果を示す図面に代わる写真である。図４の上段は抗ＩＰ３Ｒ１抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示し、下段は抗４．１Ｎ抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示す。
【図５】図５は、ＩＰ３Ｒ１のＣ末端部を順次欠失させた断片の概略、及び当該断片を用いて４．１Ｎ／ＣＴＤとの結合性を、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて調べた結果を示す。図５のＦＬはＣ末端部の全長（残基２５９０−２７４９）を用いた場合を示し、Δ１−Δ５はＣ末端部分が順次欠失したものを示す。図５の各断片の右側は、β−ガラクトシダーゼ活性および栄養選択アッセイの各々の結果を示す。＋は陽性であったことを示し、−は陰性であったことを示す。
【図６】図６は、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ（ＧＦＰタグ付きＣ末端部が完全長のＩＰ３Ｒ１）、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０（Ｃ末端部の最後のアミノ酸１４個の欠失したＧＦＰタグ付きＩＰ３Ｒ１）、またはＧＦＰ−１８Ａ１０（ＧＦＰタグ付きのＩＰ３Ｒ１のＣ末端部の最後のアミノ酸１４個）を一過性で発現しているＣＯＳ−７細胞のライセート中で、ＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤ融合蛋白又はＧＳＴをインキュベーションし、加えたタンパク質と沈降したタンパク質をアッセイした結果を示す図面に代わる写真である。図６の最下段は加えたＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤまたはＧＳＴを示している。真中の４つの段は、加えたＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０、およびＧＦＰ−１８Ａ１０を示している（Ｉｎｐｕｔ）。上側の２つの段は、沈降したタンパク質を示している（Ｐｅｌｌｅｔ）。図６の左側はマーカー（ｋＤａ）であり、それから右側は順にＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０、ＧＦＰ−１８Ａ１０（以上がＧＳＴ−４．１Ｎ／ＣＴＤに対する場合である。）、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、及びＧＦＰ−１８Ａ１０（以上がＧＳＴに対する場合である。）の場合をそれぞれ示す。図６の上側の４段は抗ＧＦＰ抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）した場合であり、その下の２段は抗１８Ａ１０抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）した場合であり、最下段はＣＢＢで染色した場合を示す。
【図７】図７は、４．１Ｎのアミノ酸配列の１−７６６のもの、７６７−８７９（ＣＴＤ）、７７７−８７９、７８３−８７９、７８４−８７９、及び７８９−８７９の各断片とＧＡＬ４との融合タンパク質の概略、及びこれらの４．１Ｎの各断片を含む遺伝子をｐＧＡＤ４２４にサブクローニングし、ｐＧＢＴ９−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴと共に酵母に共形質転換し、β−ガラクトシダーゼ活性および栄養選択アッセイを行った結果を各断片の右側にそれぞれ示すものである。図７中の＋は陽性を示し、−は陰性を示す。
【図８】図８は、ＨＡタグ付き４．１Ｎ融合蛋白である、ＨＡ４．１Ｎ／ＦＬ（ＨＡタグ付き完全長４．１Ｎ）、ＨＡ４．１Ｎ／ΔＣＴＤ（ａａ．１−７６６のＣＴＤが欠失したＨＡタグ付き４．１Ｎ）、またはＨＡ４．１Ｎ／ＣＴＤ（ＨＡタグ付き４．１ＮのＣＴＤ、ａａ．７６７−８７９）を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞のライセートで、ＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴ融合蛋白又はＧＳＴをインキュベーションし、沈降したタンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色するか、又は抗ＨＡ抗体でブロットした結果を示す図面に代わる写真である。図８の最下段は、加えたＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１／ＣＴＴまたはＧＳＴを示し、真中の２段は、加えたＨＡ４．１Ｎ／ＦＬ、ＨＡ４．１Ｎ／ΔＣＴＤ、およびＨＡ４．１Ｎ／ＣＴＤを示し、上部の２段は、沈降したタンパク質を示している。
【図９】図９は、サブコンフルエントおよびコンフルエントのＭＤＣＫ細胞を固定し、細胞膜を透過性にして、抗ＩＰ３Ｒ１抗体および抗４．１Ｎ抗体またはファロイジンにより免疫染色し、共焦点顕微鏡で解析した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図９のＡ段及びＢ段はサブコンフルエントの状態のものであり、Ｃ段及びＤ段はコンフルエントの状態のものである。図９中の「Ｆ−ａｃｔｉｎ」はファロイジンで染色したものであり、ＩＰ３Ｒ１は抗ＩＰ３Ｒ１抗体を用いて染色したものであり、４．１Ｎは抗４．１Ｎ抗体を用いて染色したものである。各段の右端は、各段の左側と中側とをマージしてそれぞれ示したものである。
【図１０】図１０は、サブコンフルエントおよびコンフルエントのＭＤＣＫ細胞のライセートについて、２種のラットのポリクローナル抗ＩＰ３Ｒ１抗体、４Ｃ１１抗体及び１８Ａ１０抗体を用いて免疫沈降を行い、共沈降したタンパク質を抗４．１Ｎ抗体および抗ＩＰ３Ｒ１抗体によりブロットした結果を示す図面に代わる写真である。図１０のＡはサブコンフルエントの場合を示し、Ｂはコンフルエントの場合を示す。図１０のＡ及びＢのそれぞれの上段は抗ＩＰ３Ｒ１抗体によりウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示し、下段は抗４．１Ｎ抗体によりウエスタンブロッティング（ＷＢ）したものを示す。図１０のＡ及びＢのそれぞれの左側はマーカー（ｋＤａ）を示し、その右が順に、インプットサンプル、正常ラットＩｇＧ、４Ｃ１１抗体、及び最も右側は１８Ａ１０抗体の場合をそれぞれ示す。
【図１１】図１１は、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞を固定し細胞膜を透過性にして、抗４．１Ｎ抗体または抗ＩＰ３Ｒ１抗体、および抗ＺＯ−１抗体または抗Ｎａ，ＫＡＴＰａｓｅα１抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡で解析した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１１の上段（Ａ）は抗４．１Ｎ抗体を用いて染色（緑色）したものであり、下段（Ｂ）は抗ＩＰ３Ｒ１抗体を用いて染色（緑色）したものである。Ａ１及びＢ１は抗ＺＯ−１抗体を用いて染色（赤色）したものであり、Ａ２及びＢ２は抗Ｎａ，Ｋ  ＡＴＰａｓｅα１抗体を用いて染色（赤色）したものである。それぞれの写真における下の段、Ａ’１、Ａ’２、Ｂ’１、及びＢ’２は、それぞれの断面での写真を示す。
【図１２】図１２は、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎ、ＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０、ＧＦＰ−１８Ａ１０、またはＧＦＰ単独を一過性に発現しているＭＤＣＫ細胞をコンフルエントな状態にした後、共焦点顕微鏡で観察した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１２の上段（Ａ）はＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１−Ｎの場合を示し、中段（Ｂ）はＧＦＰ−ＩＰ３Ｒ１／Δ１８Ａ１０の場合を示し、下段（Ｃ）はＧＦＰ−１８Ａ１０の場合を示す。図１２の各段の左側はそれぞれのＧＦＰの蛍光（緑色）を示し、中側は抗４．１抗体による染色（赤色）を示す。右側は左側と中側のマージしたものである。
【図１３】図１３は、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ（４．１Ｎの完全長）、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ΔＣＴＤ（ＣＴＤ欠失の４．１Ｎ）、およびＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤ（４．１ＮのＣＴＤ）を一過性に発現するＭＤＣＫ細胞をコンフルエントな状態にして免疫染色し、共焦点顕微鏡にて解析した結果を示す図面に代わるカラー写真であり（Ａ〜Ｃ）、また、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ、Ｖｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤ、またはＶｅｎｕｓ単独およびＩＰ３Ｒ１を、一過性に共発現するＭＤＣＫ細胞をコンフルエントな状態にし、抗ＩＰ３Ｒ１抗体で免疫染色して共焦点顕微鏡にて解析した結果を示す図面に代わるカラー写真である（Ｄ〜Ｆ）。図１３のＡ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬを発現する場合を示し、Ｂ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ΔＣＴＤを発現する場合を示し、Ｃ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤを発現する場合を示し、Ｄ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＦＬ及びＩＰ３Ｒ１を発現する場合を示し、Ｅ段はＶｅｎｕｓ−４．１Ｎ／ＣＴＤ及びＩＰ３Ｒ１を発現する場合を示し、Ｆ段はＶｅｎｕｓ単独及びＩＰ３Ｒ１を発現する場合を示す。図１２のそれぞれの段における左側はＶｅｎｕｓによる蛍光（緑色）を示し、中側は図１２のそれぞれに示される抗体により染色（赤色）されたものを示し、右側はこれらをマージしたものを示す。
【図１４】図１４は、コンフルエントのＭＤＣＫ細胞を固定し細胞膜を透過性にして、抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα１抗体および抗カルネキシン抗体で染色し、共焦点顕微鏡で解析した結果を示す図面に代わるカラー写真であり（図１４Ａ）、また、ＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａ、又はＤｓＲｅｄ−ＫＤＥＬが一過性に発現するＭＤＣＫ細胞をコンフルエントな状態にし、抗ＩＰ３Ｒ１抗体で免疫染色して、共焦点顕微鏡で解析した結果を示す図面に代わるカラー写真である（図１４Ｂ及びＣ）。図１４Ａの左側は抗カルネキシン抗体で染色（緑色）した場合を示し、中側は抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα１抗体で染色（赤色）した場合を示し、右側はそれらをマージしたものを示す。図１４Ｂの左側はＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａの蛍光（緑色）を示し、中側は抗ＩＰ３Ｒ１抗体で染色（赤色）した場合を示し、右側はそれらをマージしたものを示す。図１４Ｃの左側はＤｓＲｅｄ−ＫＤＥＬの蛍光（赤色）を示し、中側は抗ＩＰ３Ｒ１抗体で染色（緑色）した場合を示し、右側はそれらをマージしたものを示す。
【図１５】図１５は、ＭＤＣＫ細胞にＥＧＦＰ−ＳＥＲＣＡ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａとＥＧＦＰの融合タンパク質）、およびＤｓＲｅｄ−ＫＤＥＬ（カルレティキュリンのＥＲ標的・移行シグナルペプチドとＤｓＲｅｄ２の融合タンパク質）を一過性にトランスフェクトし、コンフルエントな状態にし、抗ＩＰ３Ｒ１抗体、及び抗４．１Ｎ抗体でそれぞれブロットした結果を示す図面に代わる写真である。図１５のＡは抗ＩＰ３Ｒ１抗体を用いてウエスタンブロッティング（ＷＢ）した場合を示し、図１５のＢは抗４．１Ｎ抗体でウエスタンブロッティング（ＷＢ）した場合を示す。図１５のそれぞれの左側はマーカー（ｋＤａ）を示し、その右側はマウスの脳のライセートの場合を示し、その右側はＭＤＣＫ細胞のライセートを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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