(57)【要約】      （修正有）【課題】ＬＡＭＰ法に用いることができるリステリア・モノサイトゲネスに特異的なプライマーを得ること、及びこれを用いて食肉製品などにリステリア・モノサイトゲネスを検出すること。【解決手段】特定の塩基配列FIP、BIP、F3またはB3からなる４種のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子に由来する特定遺伝子領域にアニーリングし、さらに環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)によって増幅可能なリステリア・モノサイトゲネス検出用ＬＡＭＰプライマーとする。または、検査対象物から菌を採取、増菌および培養し、DNAを分離し、このDNAに対して上記プライマーにアニーリングさせ、さらに環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)によって前記特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を反応液の濁度を目視判定するなどの光学的検査により確認するリステリア・モノサイトゲネスの検出方法とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1〜4に示される塩基配列FIP、BIP、F3およびB3からなる４種のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhly遺伝子に由来する特定遺伝子領域にアニーリングし、環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)によって増幅可能なリステリア・モノサイトゲネス検出用ＬＡＭＰプライマー。
【請求項２】
検査対象物から菌を採取、増菌および培養し、形成されたコロニーからDNAを分離し、このDNAに対して配列番号1〜4で示される塩基配列FIP、BIP、F3およびB3からなる４種のプライマー全種をリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhly遺伝子に由来する特定領域の遺伝子にアニーリングさせ、さらに環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)によって前記特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるリステリア・モノサイトゲネスの検出方法。
【請求項３】
光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である請求項２に記載のリステリア・モノサイトゲネスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、食中毒菌として知られているリステリア・モノサイトゲネスを、環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)によって特異的に検出することができるリステリア・モノサイトゲネス検出用ＬＡＭＰプライマーおよびリステリア・モノサイトゲネスの検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)は、古くから知られている人畜共通感染症の原因菌であり、リステリア属の中でも特に病原性を示すとされているものである。
【０００３】
本菌は哺乳類、鳥類などの動物の糞便を介して自然界に広く分布しており、それらを介して汚染された種々の食品により感染が起こると考えられている。特に家畜の健康保菌に関連して動物性食品の汚染が高いとされており、外国では牛乳、チーズ、食肉を介した集団食中毒も発生している。
【０００４】
従来、リステリア・モノサイトゲネスを生化学的性状によって判定する場合は、グラム染色、運動性、カタラーゼ試験、VP反応によってリステリア属と判定した後、更に溶血性試験、糖分解性試験を行うことで判定していた。
【０００５】
また、食品中に存在するリステリア・モノサイトゲネスの検出法についても市販の培地を用いて、増菌・分離培養を行い、疑陽性の菌に関して溶血性試験、糖分解性試験を行うが、この方法では、判定までに長時間を要し、また、糖の分解試験など色の判定を行う部分があって、判定には熟練を要する。
そこで、生化学的性状から判断するものではなく、遺伝子レベルでの判別方法が着目されている。
【０００６】
現在報告されている遺伝子レベルでの判定方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)が主流である。
ＰＣＲ法は、リステリア・モノサイトゲネス遺伝子配列の特定領域を増幅し、増幅の有無を確認する手法であり、そのためのＰＣＲプライマーが報告されている。このＰＣＲを用いた菌の判定方法はリステリア属に限らず様々な菌を特定する際に非常に信頼性が高く、広く用いられている方法である（例えば特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、このＰＣＲを用いた細菌の検出法は反応を行うために特別な大型機器を必要とし、最終判定方法には電気泳動法と呼ばれる特殊な手法や、紫外線を照射する装置などが必要となる。また、このＰＣＲによる検査は、開始から判定まで通常4〜5時間を要する。そのため、食品工場などの現場で用いるためには更に簡便かつ迅速に結果が得られる手法が求められていた。
【０００９】
最近では、ＰＣＲ法に代わる遺伝子増幅法として環状型等温増幅反応(Loop-Mediated Isotherma  Amplification；ＬＡＭＰ)による手法が栄研化学株式会社より開発された。この手法は必要とする試薬に特定の遺伝子領域を増幅するためのプライマーを混合し、６５℃付近の一定温度にて1時間程度反応させ、その判定は反応液の濁度により確認可能な方法である。
また、この手法は、ＰＣＲ法で見られるような特殊な大型機器を用いる必要はなく、また反応時間も短いため簡便であり、迅速な結果を得られると考えられる。
【００１０】
しかしながら、この手法は、検査対象の細菌に対して特異的に反応するプライマーを独自に開発する必要があるが、食中毒に関与するリステリア・モノサイトゲネスについても特異的なプライマーは未だ発見されていない。
【００１１】
そこで、本願の発明者らは、食中毒に関与するリステリア・モノサイトゲネスに特異的なプライマーを、他のリステリア属菌の遺伝子配列と比較検討することによって設計し、得られたプライマーに所期した性能があることについて試験により確認し、この発明を完成させたのである。
【００１２】
すなわち、この発明の課題は、ＬＡＭＰ法に用いることができるリステリア・モノサイトゲネスに特異的なプライマーを得ること、およびこれを用いて食肉製品などに付着したリステリア・モノサイトゲネスを簡便かつ確実に判別できる検出方法とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した新規なプライマーを得るという課題を解決するために、この発明では、配列番号1〜4に示される塩基配列FIP、BIP、F3およびB3からなる４種のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhly遺伝子に由来する特定遺伝子領域にアニーリングし、さらに環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)によって増幅可能なリステリア・モノサイトゲネス検出用ＬＡＭＰプライマーとしたのである。
【００１４】
上記したリステリア・モノサイトゲネス検出用ＬＡＭＰプライマーは、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子上の約２３０baseに関して他の細菌とは異なる塩基配列が存在していることを利用し、これをターゲットとしたプライマー４種類(ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３)を全て用いるプライマーセットである。
【００１５】
上記のプライマーセットを用いると、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子上の約２３０baseに4種類のプライマーが特異的にアニーリングする。
【００１６】
これら4種類のプライマーは、６５℃付近においてアニーリングと同時にDNA鎖の合成も起こすものである。それぞれのプライマーから始まるDNA鎖の合成は、他のプライマーから合成したDNA鎖を剥がしながら進行するため、等温反応にて遺伝子の増幅が起こる。
このようにアニーリング反応およびＤＮＡ増幅反応によると、６０℃〜６５℃付近(６３℃付近が特に好ましい。)で1時間程度反応を行うことにより１０9〜１０10倍にDNAを増幅させることが可能である。
【００１７】
このようにしてリステリア・モノサイトゲネスの特定のDNA領域が増幅されると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、増幅の有無が目視により判定できる。また、電気泳動法などを利用して所定の荷電性のDNA断片の有無を確認し、検出することもできる。
【００１８】
また、食肉製品などに付着したリステリア・モノサイトゲネスを簡便且つ確実に判別できる検出方法にするという課題を解決するため、この発明は、検査対象物から菌を採取、増菌および培養し、形成されたコロニーからDNAを分離し、このDNAに対して配列番号1〜4で示される塩基配列FIP、BIP、F3およびB3からなる４種のプライマー全種をリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhly遺伝子に由来する特定領域の遺伝子にアニーリングさせ、さらに環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)によって前記特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるリステリア・モノサイトゲネスの検出方法としたのである。
【００１９】
上記した検出方法により、食品に付着していると考えられるリステリア・モノサイトゲネスを後述する適当な培地で培養し、寒天培地上に形成されたコロニーからDNAを分離し、このDNAに対して、上記した新規のプライマーを用いたＬＡＭＰ法を上記同様にして行い、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅する。
【００２０】
このDNA増幅反応の有無は周知の方法で確認できる。増幅反応により副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響により反応液は白濁し、反応液の濁度の目視判定する確認または透過光量測定機器などを用いた光学的検査により、増幅反応の有無が簡単に確認できる。
【００２１】
また、電気泳動法によって所定の荷電性のある分画の有無をもってDNA増幅反応を確認でき、更にこの分画を分取して紫外線透過量を測定し、それを予め増幅されているDNAの紫外線透過量と比較することにより、リステリア・モノサイトゲネスの存在を確認することもできる。
【発明の効果】
【００２２】
この発明は、配列番号1〜4に示される塩基配列からなるリステリア・モノサイトゲネス検出用ＬＡＭＰプライマーとしたので、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子に由来する特定領域を、環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)によって増幅させてリステリア・モノサイトゲネスを検出できる新規なリステリア・モノサイトゲネス検出用ＬＡＭＰプライマーであるという利点がある。
【００２３】
また、本願のリステリア・モノサイトゲネスの検出方法に係る発明は、食品などの検査対象物に付着したリステリア属細菌を培養してDNAを分離し、このDNAに対して配列番号1〜4に示される塩基配列からなるプライマーを全て用いて環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)を行ない、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子に由来する特定領域の増幅の有無を確認することからなるリステリア・モノサイトゲネスの検出方法としたので、食肉製品などのリステリア・モノサイトゲネス汚染の有無を簡便且つ確実に判別できるリステリア・モノサイトゲネス検出方法であるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
[リステリア・モノサイトゲネスに特異的なＬＡＭＰプライマーの設計]
まず、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のhly遺伝子と、下記に示すリステリア属の塩基配列を比較し、リステリア・モノサイトゲネスに特異的なＬＡＭＰプライマーを設計した。なお、hly遺伝子の塩基配列はDDBJ(DNA Data Bank of Japan)から取得した。
【００２５】
(2) リステリア・イバノビ(Listeria ivanovii)
(3) リステリア・イノキュア(Listeria innocua)
(4) リステリア・シリゲリ(Listeria seeligeri)
(5) リステリア・ウェルシュメリ(Listeria welshimeri)
(6) リステリア・グレイ(Listeria grayi)
【００２６】
配列番号1〜4に示されているように、設計したＬＡＭＰプライマーは、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子に存在する約230baseの部分をターゲットとしたプライマー4種類(ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３)である。
実際に(1)リステリア・モノサイトゲネス(AZ97035)及び下記に示すリステリア属の他細菌を用いてＬＡＭＰ反応を行った結果、リステリア・モノサイトゲネスのみ増幅反応が進行し、その他の細菌では増幅反応が見られなかった。
【００２７】
(2) リステリア・イバノビ(Listeria ivanovii)                      AZ99073
(3) リステリア・イノキュア(Listeria innocua)                     AZ99091
(4) リステリア・シリゲリ(Listeria seeligeri)                     ATCC35967
(5) リステリア・ウェルシュメリ(Listeria welshimeri)              ATCC35897
(6) リステリア・グレイ(Listeria grayi)                           ATCC19120
【００２８】
これらのことから、今回設計したプライマーはリステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出するプライマーとして有効であると判断された。
【００２９】
[リステリア・モノサイトゲネスの検出方法]
まず、食品からリステリア属を採取し、DNAを分離する。
【００３０】
この発明でいう食品はリステリア・モノサイトゲネスが存在していると考えられる食品である限り、特に限定するものではない。例えば、食肉、食肉加工品、乳製品などが代表例として挙げられる。
【００３１】
このような食品からリステリア属を採取する場合、まず、リステリア属を検出するために最適であるとされる液体培地を用いて増菌培養を行い、引き続きリステリア属のみが生育可能な選択性を有する寒天培地に画線塗抹して培養を行う。
【００３２】
このようにして得られたリステリア属のコロニーからDNAを分離する。DNAを分離するには、白金耳を用いてコロニーを掻き採り、数十μlの蒸留水に懸濁する。それを９５℃で１０分間加熱する熱処理を行えばＤＮＡ溶出液が得られる。
【００３３】
次に、DNAに対して前記した1〜4のプライマーを全て用いて環状型等温増幅反応(ＬＡＭＰ)を行ない、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅させる。
【００３４】
ＬＡＭＰ法は、DNAに所定のプライマーをアニーリングさせた状態で市販のDNAポリメラーゼを1時間程度60℃〜65℃付近で反応させると、リステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子の特定領域が増幅するという反応である。
【００３５】
増幅の有無、すなわちリステリア・モノサイトゲネスの検出は、反応液の白濁具合により目視で確認することが可能である。
【００３６】
また、電気泳動法で所定の荷電性のある分画の有無を調べることでも行える。電気泳動は、サイズ排除クロマトグラフィーの充填剤として周知のアガロースゲルを用いたゲルクロマトグラフィーを採用することができる。電気泳動法で得られた分画を分取してDNAを染色し、その紫外線透過量を測定してリステリア・モノサイトゲネスのhly遺伝子由来の増幅DNA断片を確認すれば良い。
【実施例１】
【００３７】
〔実施例〕
下記に示すリステリア属細菌のいずれかを食品に添加した６種類のサンプルを調整し、このサンプル１〜６をUVM培地(メルク社製)を用いて３０℃、４８時間培養し、リステリア属細菌を増菌した。引き続きPALCAM寒天培地に培養後のUVM培地を画線塗抹し、３５℃、４８時間培養した。
【００３８】
(1)  リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)         AZ97035
(2)  リステリア・イバノビ(Listeria ivanovii)                      AZ99073
(3)  リステリア・イノキュア(Listeria innocua)                     AZ99091
(4)  リステリア・シリゲリ(Listeria seeligeri)                     ATCC35967
(5)  リステリア・ウェルシュメリ(Listeria welshimeri)              ATCC35897
(6)  リステリア・グレイ(Listeria grayi)                           ATCC19120
【００３９】
上記の培養により得たコロニーを一白金耳で掻き取り、１．５mlチューブに入れた２０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。その後、９５℃で１０分間熱処理を行った。熱処理後の反応液２μlを鋳型とした。
【００４０】
抽出した鋳型及び配列番号1〜4に示したプライマーを用いて下記の表1に示す組成のＬＡＭＰ反応液を調整し、プログラム可能な温度調整器(Programmable Thermal Controller、ＭＪリサーチ社製：ＰＴＣ−100)を用いてＬＡＭＰを行った。ＬＡＭＰ反応は栄研化学社製のLoopampDNA増幅試薬キットを用いた。
【００４１】
ＬＡＭＰ反応条件は、６０℃〜６５℃(６３℃が特に好ましい。)で１時間保持して反応させ、その後、８０℃で２分間の酵素変性処理を行った。
【００４２】
【表１】
2005095105.tif 000002
【００４３】
上記のようにしてＬＡＭＰ反応の終了したサンプルについて、反応液の白濁の有無を目視により判定した。なお、反応チューブをサンプル1〜6とし、1はリステリア・モノサイトゲネス、2はリステリア・イバノビ、3はリステリア・イノキュア、4はリステリア・シリゲリ、5はリステリア・ウェルシュメリ、6はリステリア・グレイとした。
【００４４】
目視観察の結果、1のチューブのみ反応液が白濁していることが確認でき、すなわち、リステリア・モノサイトゲネスのみにおいてDNA増幅反応が行われたことが分かり、この菌の存在を判定することができた。
【００４５】
また、目視判定を行ったサンプルについて以下の電気泳動を行なった。すなわち、２％もしくは３％のアガロースゲル(日本ジーン社製：アガロース２１に緩衝液A(1×TBE buffer)を添加したもの)を作成し、電気泳動装置(コスモ・バイオ社製)に設置し、ゲルが浸るように緩衝液Aを満たした。ＬＡＭＰ反応の終了したサンプルに１０分の1倍量の緩衝液B(１０×Loading buffer)を加え、作成したゲルに５μlを使用した。１００Vにおいて、約３０分間泳動を行なった。次いで電気泳動が終了したゲルを1×TBE bufferで10,000倍希釈したSYBER Green  Ｉ(コスモ・バイオ社製)の溶液に１０分以上浸し、DNAを染色した。染色したゲルを紫外線照射装置(プリントグラフ：アトー社製)を用いてDNAを確認し、その結果を図１に示した。
【００４６】
前記した緩衝液A(1×TBE buffer)は、トリスベース(Tris base)１０．８gにホウ酸５．５g及び０．５MのEDTA(pH8.0)４mlを脱イオン水で1リットルに調整したものである。また、前記した緩衝液B(10×Loading buffer)はSDS 1.00％、グリセロール 50.00％、ブロモフェノールブルー０．０５％の組成からなるものである。
【００４７】
電気泳動の結果である図１において、左端から右側へ1〜7とし、1は100bpラダーマーカー、2はリステリア・モノサイトゲネス、3はリステリア・イバノビ、4はリステリア・イノキュア、5はリステリア・シリゲリ、6はリステリア・ウェルシュメリ、7はリステリア・グレイである。この図１の結果からは、リステリア・モノサイトゲネスのみＬＡＭＰ反応特有の種々のサイズのDNA増幅断片が確認できる。
以上のようにして、2種類の方法でDNA増幅反応の有無を行った結果を表２に示した。
【００４８】
【表２】
2005095105.tif 000003
【００４９】
表２の結果からも明らかなように、配列番号1〜4に示すプライマーを用いてＬＡＭＰ反応を行うと、リステリア・モノサイトゲネスを検出できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】電気泳動の結果を示す図表
【図１】
2005095105.tif 000004
【配列表】
2005095105000001.app