(57)【要約】【課題】高い遺伝子導入効率と注入の容易さを兼ね備えた新規のカイコ形質転換法を提供する。【解決手段】本発明により、カイコの染色体に導入することを目的とする遺伝子を持つ組み換えAcNPVと、導入しようとする目的遺伝子をカイコの染色体に効率良く導入するためにトランスポゾン由来の転移酵素を持つ組み換えAcNPVをタングステン針の先端に塗布し、この針で突くことによってカイコ卵に導入することにより、形質転換カイコを作製する方法が与えられた。本発明により目的遺伝子をカイコ染色体に効率良く挿入することが可能となり、形質転換カイコの作製がより容易となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）のゲノム内にトランスポゾンpiggyBacの転移酵素であるトランスポゼースからなるDNA断片が組み込まれている組み換えAcNPVと、トランスポゾンpiggyBacの逆向き末端反復配列とそれらに挟まれた外来遺伝子DNA断片がAcNPVのゲノム内に組み込まれている組み換えAcNPVを、タングステン針の先端に塗布し、上記2種類のウイルスが塗布された該タングステン針でカイコ卵を突くことよりなる、形質転換カイコの作製方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法によって作製され、そのゲノム中に外来遺伝子を保有するために当該外来遺伝子の遺伝子産物を生産する能力を有する形質転換カイコ。
【請求項３】
Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）のゲノム内にトランスポゾンpiggyBacの転位酵素であるトランスポゼースからなるDNA断片が組み込まれている組み換えAcNPVと、トランスポゾンpiggyBacの逆向き末端反復配列とそれらに挟まれた外来遺伝子DNA断片がAcNPVのゲノム内に組み込まれている組み換えAcNPVを、タングステン針の先端に塗布し、上記2種類のウイルスが塗布された該タングステン針でカイコ卵を突くことよりなる、カイコ卵に組み換えウイルスを接種する方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法によってウイルス接種された卵を孵化させることにより得られ、そのゲノム中に外来遺伝子を保有するために当該外来遺伝子の遺伝子産物を生産する能力を有する形質転換カイコ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換カイコを作製用の組換えAcNPVを用いた新しい形質転換カイコ作製法に関するものである。さらに詳しくは、カイコの染色体に導入することを目的とする遺伝子を持つ組み換えAcNPVと、導入しようとする目的遺伝子をカイコの染色体に効率良く導入するためにトランスポゾン由来の転移酵素を持つ組み換えAcNPVをカイコ卵に導入することにより、形質転換カイコを作製する方法に関するものである。本発明は、カイコ遺伝子の機能解析やカイコの品種改良、またカイコによる有用タンパク質の大量生産に使用可能な組換えAcNPVを、従来の技術よりもより簡易な方法によってカイコに導入し、カイコの形質転換を行うことを可能とするものである。
【背景技術】
【０００２】
カイコは絹糸を生産するための家畜昆虫であることに加え、生理・生化学、遺伝学などの基礎研究分野で実験動物として使用されている。さらに、優れたタンパク質合成能力を有することから有用タンパク質を生産するための宿主動物としても大きく期待されている。それ故にカイコに外来遺伝子を導入し形質転換カイコを作製する技術の開発は国内外で競って行われてきた。
【０００３】
森らはAutographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）をカイコ幼虫に感染させることにより、カイコを致死させることなく遺伝子を導入し、メスに感染させた場合には生殖細胞を通じて次世代まで外来遺伝子を伝達することが可能な方法を開発した（Bio/Technology 13, 1005-1007, 1995：非特許文献１）。この方法を発展させ、山尾らはフィブロインL鎖遺伝子配列の一部を組み込んだAcNPVを構築し、これをカイコ幼虫に感染させ、遺伝子ターゲッティングにより外来遺伝子をカイコゲノムのフィブロインL鎖遺伝子に挿入した形質転換カイコを作製することに成功した（Genes Dev. 13, 511-516, 1999：非特許文献２）。
【０００４】
一方、田村ら（Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000）は、鱗翅目昆虫Trichoplusia niに由来するトランスポゾンであるpiggyBacを組み込んだプラスミドベクターをカイコ卵に微量注射することにより、外来遺伝子を挿入した形質転換カイコを作製することに成功している。
【０００５】
一方、森らは上記のAcNPVとpiggyBacの両者が持つ利点に着目し、AcNPVとpiggyBacを併用して、piggyBacの転移活性を利用して外来遺伝子をカイコのゲノムに導入する方法を提案していたが、この方法による形質転換カイコの作製効率は必ずしも満足のいくものではなく、極めて多くのカイコにウイルス接種をする必要があった。さらに次世代において、その大量の子孫のカイコ組織からゲノムを採取し、個体毎にPCRなどの手法を用いて目的遺伝子を持つカイコを選抜する必要があった（特願２００２−３０６１６７号公報：特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】特願２００２−３０６１６７号公報
【非特許文献１】Bio/Technology 13, 1005-1007, 1995
【非特許文献２】Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記のとおり、世代を通じて外来遺伝子を伝達することができる形質転換カイコを作製する方法として、AcNPVをベクターとして外来遺伝子を導入する方法と、piggyBacを組み込んだプラスミドベクターをカイコ卵に微量注入することにより外来遺伝子を導入する方法の２つが開発されている。
【０００８】
AcNPVを用いる方法は、ウイルスをカイコ幼虫に接種するためベクターの注入方法が容易であるという利点がある。しかし、ゲノムへの遺伝子組込みの効率が低く、形質転換カイコを得るまでに労力と時間を要する。
【０００９】
またpiggyBacを組み込んだプラスミドベクターを用いる方法は、piggyBacの遺伝子転移作用を利用するため遺伝子導入効率が高いという利点がある一方で、カイコ卵にプラスミドを微量注入することが技術的に容易ではないという欠点を有する。それ故、日常的な方法として定着していない。
【００１０】
よって本出願の発明は、以上の事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、AcNPVを用いて、高い遺伝子導入効率と注入の容易さを兼ね備えた新規のカイコ形質転換法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、前記の課題を解決するため、以下の(1)から(4)の発明を提供する。(1)Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）のゲノム内にトランスポゾンpiggyBacの転移酵素であるトランスポゼースからなるDNA断片が組み込まれている組み換えAcNPVと、トランスポゾンpiggyBacの逆向き末端反復配列とそれらに挟まれた外来遺伝子DNA断片がAcNPVのゲノム内に組み込まれている組み換えAcNPVを、タングステン針の先端に塗布し、上記2種類のウイルスが塗布された該タングステン針でカイコ卵を突くことよりなる、形質転換カイコの作製方法。
【００１２】
(2)上記(1)の方法によって作製され、そのゲノム中に外来遺伝子を保有するために当該外来遺伝子の遺伝子産物を生産する能力を有する形質転換カイコ。
【００１３】
(3)Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）のゲノム内にトランスポゾンpiggyBacの転位酵素であるトランスポゼースからなるDNA断片が組み込まれている組み換えAcNPVと、トランスポゾンpiggyBacの逆向き末端反復配列とそれらに挟まれた外来遺伝子DNA断片がAcNPVのゲノム内に組み込まれている組み換えAcNPVを、タングステン針の先端に塗布し、上記2種類のウイルスが塗布された該タングステン針でカイコ卵を突くことよりなる、カイコ卵に組み換えウイルスを接種する方法。
【００１４】
(4)上記(3)の方法によってウイルス接種された卵を孵化させることにより得られ、そのゲノム中に外来遺伝子を保有するために前記外来遺伝子の遺伝子産物を生産する能力を有する形質転換カイコ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、カイコの染色体に導入することを目的とする遺伝子を持つ組み換えAcNPVと、導入しようとする目的遺伝子をカイコの染色体に効率良く導入するためにトランスポゾン由来の転移酵素を持つ組み換えAcNPVをタングステン針の先端に塗布し、この針で突くことによってカイコ卵に導入することにより、形質転換カイコを作製する方法が与えられた。本発明により目的遺伝子をカイコ染色体に効率良く挿入することが可能となり、形質転換カイコの作製がより容易となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、形質転換カイコを作製するための組換えバキュロウイルスを用いた新しい形質転換カイコ作製法を提供するものである。本発明において、カイコにとっては弱毒ウイルスであるAutographa californica核多角体病ウイルスの組み換えウイルスを２種類使用する。その２種類の組み換えウイルスとは、一つはカイコの染色体に導入することを目的とする遺伝子を持つ組み換えウイルスであり、他のウイルスはこの目的遺伝子をカイコの染色体に効率良く導入するためにトランスポゾン由来の転移酵素を持つ組み換えウイルスである。
【００１７】
これら２種類の組み換えウイルスを針先に塗布し、これをカイコの卵に突き刺すことによって卵をウイルスに感染させる。ウイルスの増殖によって、転移酵素が発現し、目的遺伝子がカイコの染色体に効率良く挿入され、形質転換カイコが得られる。
【００１８】
トランスポゾンpiggyBacは、上述したように鱗翅目昆虫Trichoplusia niに由来する培養細胞であるTN-368から単離されたClass IIに属するトランスポゾンである。中央部にあるトランスポゼース遺伝子と、その両端に存在する13bpの逆向き反復配列から構成されており、長さは約2.5kbである。トランスポゼース遺伝子からはトランスポゼース蛋白質が合成され、この酵素の作用により、逆向き配列に挟まれた領域（piggyBac自体）を標的配列であるTTAAに転移させる。本発明の方法においては、AcNPVを利用して外来遺伝子をカイコに導入すると共に、piggyBacの転移活性を利用して外来遺伝子をカイコのゲノムDNAに安定かつ高効率で組み換えることができる。
【００１９】
なおトランスポゼース遺伝子および／または外来遺伝子の発現を促進するためにプロモーター／エンハンサーを使用することができる。そのようなプロモーター／エンハンサーはそれぞれの遺伝子の内在性プロモーター／エンハンサーをそのまま使用しても良いし、あるいは内在性プロモーターを外来性のプロモーターと置換したり、内在性プロモーターの上流に外来性エンハンサーを組み込んでも良い。置換するプロモーターとしては、例えばカイコアクチンプロモーターやショウジョウバエHSP70プロモーター等を挙げることができる。
【００２０】
前述の２種類の組み換えウイルスを接種されたカイコにおいては、一対の逆向き反復配列に挟まれた外来遺伝子DNAは、トランスポゼース蛋白質の作用によってカイコゲノムの標的配列TTAAに転移される。これによって、トランスポゼース遺伝子を外来遺伝子と共にカイコゲノム内に転移させることによる外来遺伝子のゲノム内での不安定化が防止され、外来蛋白質がカイコゲノム内で安定に発現する。
【００２１】
田村らはトランスポゾンであるpiggyBacを組み込んだプラスミドベクターをカイコ卵に微量注射することにより、外来遺伝子を挿入した形質転換カイコを作製することに成功している。この方法は実体顕微鏡下でタングステン針を用いカイコ卵の卵殻に穴を開けてからガラスキャピラリーでプラスミドベクターを注入するというものである。この方法は前述したようにpiggyBacの遺伝子転移作用を利用するため遺伝子導入効率が高いという利点があるが、一方で、カイコ卵にプラスミドを微量注入することが技術的に容易ではない。また、微量注入にマイクロインジェクター、マイクロマニュピュレーターといった特殊かつ高価な器具を必要とする。
【００２２】
本発明は、特殊な器具を用いずに組換えAcNPVを実体顕微鏡下でタングステン針を用いてカイコ卵に導入し、外来遺伝子をカイコのゲノムDNAに安定かつ高効率で組み込む方法を提供するものである。
【００２３】
導入する外来遺伝子DNAには特段の制限はなく、種々の有用な外来遺伝子DNAを使用することができる。よって本発明においてカイコの品種改良、あるいはカイコでの産生を目的とするタンパク質の遺伝子cDNAのノックイン、カイコ遺伝子のノックダウン、ジーンタゲティング法によるカイコ遺伝子のノックアウトを行うための遺伝子構造物等を使用することができる。
【００２４】
以上のカイコの遺伝子組換え用AcNPVを用いて、以下のように形質転換カイコを作製する。
(1)外来遺伝子が挿入された組換えAcNPVをタングステン針の先端に塗布し、この針で突くことによってカイコ非休眠卵に導入する。孵化した幼虫の中から外来遺伝子を発現する個体を選抜する。
(2)外来遺伝子を発現する個体を交配し、次世代を採種する。次世代において外来遺伝子がカイコゲノムDNAに転移し、外来遺伝子を発現するカイコ幼虫を選抜する。
【００２５】
(1)と(2)のスクリーニングは、幼虫体液からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型としてPCRにより外来遺伝子を検出する方法により行うことができる。また、外来遺伝子とともにマーカー遺伝子を同時にウイルス内に組み込むこともでき、この場合にはマーカー遺伝子の表現型を指標としてスクリーニングすることが可能である。例えば、GFPを含む蛍光タンパク質遺伝子をマーカー遺伝子として組み込んだ場合には、卵や幼虫に励起光をあててその蛍光を観察する方法によって容易にスクリーニングすることができる。
【００２６】
以下に実施例を示して、この出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１：組換えAcNPVの作製
piggyBac遺伝子を含んだプラスミドp3E1.2を鋳型として、piggyBacの転移酵素遺伝子をプライマー１（5’-AAAAAAGCTTATGGGATGTTCTTTAGACGA-3’：配列番号１）およびプライマー２（5’-AAAAAAGCTTATACTAATAATAAATTCAAC-3’：配列番号２）のオリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅を行った。増幅されたDNA断片を制限酵素HindIIIで消化した後、バキュロウイルストランスファーベクターpBlueBacHisC（Invitrogen）のHindIIIサイトに挿入した。
【００２８】
次にショウジョウバエのヒートショックタンパク質プロモーターをこのトランスファーベクターのHindIIIとBamHIサイトに挿入し、組換えトランスファーベクターpHSPpigTransを構築した。得られた組換えトランスファーベクターを線状バキュロウィルスDNA（Pharmingen）とともにリポフェクチン（Gibco）を用いて、ヨトウガ由来培養細胞（Sf21）にトランスフェクションした。
【００２９】
次に培養上精中に生成された組換えウイルスをプラーク法で純化し、さらにこのウイルスをSf21細胞に感染させることにより、高力価のウイルス溶液を調製した。作製されたウイルスはpiggyBacの転移酵素をショウジョウバエのヒートショックタンパク質プロモーターの制御下で発現する組換えウイルス（AcpigTrans）である。
【００３０】
次にAcNPVのゲノムDNA内に、piggyBacの一対の逆向き反復配列とそれらに挟まれた外来遺伝子DNAとからなる融合DNA断片が組み込まれている組換えAcNPVの作製を行った。まず、上記のp3E1.2をSacI, PstIで消化し末端を平滑化した後、合成したマルチクローニングサイト（XbaI-Bam HI-SmaI-KpnI-EcoRI-SacI-XhoI）を挿入した。
【００３１】
このベクターからSalIとEcoRVでITRに挟まれた領域を切り出し、pBacPAK9（Clontech）のEcoRVとXhoIサイトに挿入し、pAcpigMCSを構築した。pAcpigMCSのSmaIサイトにカイコアクチンプロモーター、EGFP遺伝子、SV40ポリA付加シグナルからなる断片を挿入し、組換えトランスファーベクターpAcpigEGFPを構築した。そして、AcpigTransの作製と同様の方法で組換えウイルスAcpigEGFPを作製した。
【００３２】
図１はカイコ染色体へEGFP遺伝子を導入するために作製した２種類の組換えウイルスベクターを示す図である。一つはpiggyBacの両末端に存在する逆方向反復配列（Inverted terminal repeat, ITR）の間にEGFP遺伝子を挿入したウイルスAcpigEGFPである。この組換えウイルスは形質転換カイコの選抜マーカーとしてカイコアクチンプロモーターの制御下でEGFP遺伝子発現する。もう一方の組換えウイルスAcpigTransは、ショウジョウバエのヒートショックタンパク質プロモーターの制御下でpiggyBacの転移酵素遺伝子を発現する。これら２種類の組み換えウイルスを接種すると、EGFP遺伝子は染色体上のTTAAという配列を認識してランダムに導入されると考えられる。
【００３３】
実施例２：タングステン針を用いたカイコ卵への組換えウイルスの導入
１頭のカイコ蛾が生んだ非休眠卵（300〜400粒）に実施例１で作製したAcpigTransとAcpigEGFPを非休眠卵に以下の方法で注射した。
【００３４】
タングステン針の先端を紙やすりで磨ぎ、この先端にAcpigTransとAcpigEGFPの混合液を塗布し、実体顕微鏡下でカイコ非休眠卵を針で突くことによってウイルスをカイコ卵に導入した。タングステン針を用いてカイコ卵へ組み換えウイルスを導入する様子を図２に示す。カイコ蛾の非休眠卵（300〜400粒）にAcpigTransとAcpigEGFPを非休眠卵に以下の手法で注射した。タングステン針の先端を紙やすりで磨ぎ、この先端にAcpigTransとAcpigEGFPの混合液を塗布し、実体顕微鏡下でカイコ非休眠卵を針で突くことによってウイルスをカイコ卵に導入した。ウイルス接種を行うカイコ非休眠卵は産卵後2時間以内のものを使用した。ウイルス接種を行った非休眠卵は、水で湿らせた脱脂綿とともにシャーレに入れ、25℃で催青させた。
【００３５】
その後形質転換カイコを作出するためのスクリーニングを行った(図３)。組換えウイルスを接種した卵から孵化したG0幼虫のスクリーニングは、EGFPの緑色蛍光を観察することによって行った(図４)。孵化直後の1齢幼虫を蛍光顕微鏡で観察したところ、全身から緑色蛍光が観察された。孵化直後の１齢幼虫を蛍光顕微鏡で観察したところ、全身から緑色蛍光が観察された。緑色蛍光を発したカイコの出現率は2.2％であった（表１）。なお表１において、ウイルスをカイコ卵にインジェクトした時の形質転換カイコの出現率を示す。
【００３６】
【表１】
2005168460.tif 000002
【００３７】
緑色蛍光が観察されたG0幼虫を飼育し、G1世代を採種した。このG0蛾からゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、EGFP遺伝子の増幅を試みた。このPCRに用いたプライマーは、EGFP遺伝子の配列を増幅するためのものとして配列番号３および４のオリゴヌクレオチドを使用した。このプライマーによって600bpの増幅産物が得られる。反応終了後、1.5%アガロースで電気泳動を行ったところ、２個体に600bpの増幅産物が得られた（表１）。
【００３８】
実施例３：緑色蛍光を示したG1世代の個体から抽出したゲノムのサザンブロット解析
採種した２蛾区のG1世代を飼育し、蛍光顕微鏡で観察を行った。１蛾区では284頭のG1幼虫のうち30頭、もう１蛾区では141頭のG1幼虫のうち22頭が緑色蛍光を発した（表１、図５）。G1世代でのスクリーニングを図５に示す。G1幼虫のスクリーニングは、EGFPの緑色蛍光を観察する方法によって行った。図５において(A)は明視野、(B)は蛍光下で撮影した写真である。
【００３９】
緑色蛍光が観察されたG1幼虫を飼育し、G2世代の卵を採種した。G2世代の卵を採種後、G1世代の蛾からゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAを制限酵素BamHIとEcoRI（レーン1,2）、EcoRIとPstI（レーン3,4）で消化した後、蛍光標識したEGFP遺伝子をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。図６（A）において、図の右にDNAマーカーのサイズ（kbp）を記した。なお、レーン1と3、レーン2と4はそれぞれ別のG1蛾から抽出したゲノムDNAである。レーン1と2では1265bp、レーン3と4ではそれぞれ5459bpと4794bpに対応するシグナルが検出された。レーン1と2で検出された1265bpのシグナルは、AcpigEGFPのコンストラクトから予想される断片のサイズと一致する。
【００４０】
なお図６（B）はAcpigEGFPのコンストラクトの概略図である。ゲノムDNAの消化に用いられた制限酵素とその予想されるフラグメントのサイズ（kbp）を記した。黒線はプローブとして用いた断片を示す。また、コンストラクト内にはPstIサイトが存在しないことが判っている。これらの結果から緑色蛍光を発したG1幼虫では、EGFP遺伝子がカイコゲノムDNAに組み込まれていることが明らかとなった。
【００４１】
以上詳しく説明したとおり、本発明は、高い遺伝子導入効率と注入の容易さを兼ね備え、従来の方法とは全く違った、新規のカイコ形質転換法を提供するものである。この発明により、形質転換によるカイコの品種改良や、有用タンパク質を大量に生産する形質転換カイコの作製がより容易に行えるようになり、幅広い分野でのカイコの有効利用が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
カイコはタンパク質の生産能力が非常に高いために、カイコ核多角体病ウイルスなどをベクターに用いて、インターフェロンなどの有用タンパク質をカイコ体内で生産することが既に行われている。このようなカイコを用いた有用タンパク質生産による医薬品開発などの産業に、本発明を利用することができると考えられる。更に本発明によりカイコが作り出すシルクの性状を遺伝子レベルで改変することも可能であり、繊維業においても利用されるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１はAcNPVとpiggyBacを併用したカイコゲノムへの外来遺伝子の導入のためのウイルスベクターの図である。
【図２】図２はタングステン針を用いたカイコ卵への組換えウイルスの導入の様子を示す写真である。
【図３】図３は形質転換カイコを作出するためのスクリーニング方法の概略を示す図である。
【図４】図４はG0世代でのスクリーニングの様子を示す写真である。
【図５】図５はG1世代でのスクリーニングの様子を示す写真である。(A)は明視野であり、(B)は蛍光下で撮影した。
【図６】図６は緑色蛍光を示したG1世代の個体からとったゲノムのサザンブロット解析の写真と、AcpigEGFPのコンストラクトの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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