(57)【要約】【課題】標準的な訓練を受けた技術者によって実行可能である遺伝子の発現の定量的な測定装置を提供すること。【解決手段】興味のある標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定し、かつ遺伝子発現のパターンを分析する装置であって、所望の遺伝子セットが全ての特定のｃＤＮＡ試料に対して分析できるように自動的にマスター混合物と拮抗鋳型混合物を混合するようにプログラムされており、毛細管に接続された貯蔵槽のストックからＰＣＲ反応を準備する手段を備え、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分子の表現型を決定する手段と、特定のｃＤＮＡから特定の遺伝子の増幅に必要な各成分の適切な一定量を組み合わせて混合物を形成する手段と、毛細管を介して空気熱サイクラーへ混合物を移動させる手段と、ＰＣＲ後に直接アガロース・ゲルのウェルに混合物を移す手段と、ゲルをデジタル的に撮像する手段と、デジタル画像を分析して遺伝子発現を定量する手段とを備える。【選択図】図６
2005095179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
興味のある標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定し、かつ遺伝子発現のパターンを分析する装置であって、所望の遺伝子セットが全ての特定のｃＤＮＡ試料に対して分析できるように自動的にマスター混合物と拮抗鋳型混合物を混合するようにプログラムされており、
毛細管に接続された貯蔵槽のストックからＰＣＲ反応を準備する手段を備え、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分子の表現型を決定する手段と、
特定のｃＤＮＡから特定の遺伝子の増幅に必要な各成分の適切な一定量を組み合わせて混合物を形成する手段と、
毛細管を介して空気熱サイクラーへ混合物を移動させる手段と、
ＰＣＲ後に直接アガロース・ゲルのウェルに混合物を移す手段と、
ゲルをデジタル的に撮像する手段と、
デジタル画像を分析して遺伝子発現を定量する手段とを備える装置。
【請求項２】
ｉ）ガラスバイアルＡ中の溶液ＡがｄＮＴＰｓ、緩衝液、および電気泳動染料を含有し、β−アクチンまたはＧＡＰＤＨのプライマーを含むまたは含まないストック溶液であり、毛細管が前記ガラスバイアルＡの蓋のＯリング、オン／オフ・バルブを通過し、第１Ｙバルブへ入り、前記第１Ｙバルブへ入るもう１つの毛細管が第１マルチチャンネル・コネクタから通じ、
複数の毛細管が前記第１マルチチャンネル・コネクタに入り、前記第１マルチチャンネル・コネクタに入る各毛細管がオン／オフ・バルブから到来し、オン／オフ・バルブに入る毛細管が蓋のＯリングを通過した後バイアル中の分離拮抗鋳型（ＣＴ）混合物（溶液Ｂ）から到来し、さらに４種類のＣＴ混合物があり、その各グループは５種類の異なるモル濃度（１０Ｅ−１２〜１０Ｅ−１６Ｍ）の１００種類のＣＴ、およびＣＴ混合物のグループを異なるグループへ変化させる手段を有し、前記第１Ｙバルブから来る毛細管が第２Ｙバルブへ入り、前記第２Ｙバルブに入る他の毛細管が第２マルチチャンネル・コネクタから到来し、前記第２Ｙバルブから出た毛細管が第４Ｙバルブに入り、第４Ｙバルブに入る他の管が第３マルチチャンネル・コネクタから到来し、前記第４Ｙバルブから出た毛細管が第５Ｙバルブへ入る、前記第１、第２、第４Ｙバルブおよび前記第１マルチチャンネル・コネクタと、
ｉｉ）複数の毛細管が前記第２マルチチャンネル・コネクタに入り、それぞれが前記第３Ｙバルブの１つから到来し、前記各第３Ｙバルブに入る毛細管が特定の遺伝子に対するプライマー溶液をそれぞれ含有するガラスバイアルの１つから到来し、前記第３Ｙバルブと前記第２マルチチャンネル・コネクタの間にオン／オフ・バルブがあって前記第３Ｙバルブから出た他の毛細管が第７Ｙバルブに入る、前記第３Ｙバルブおよび前記第２マルチチャンネル・コネクタと、
ｉｉｉ）前記各第３Ｙバルブから出た他の毛細管がオン／オフ・バルブを通過し、その後第７Ｙバルブに結合し、前記第７Ｙバルブに入る他の管がオン／オフ・バルブを通過した後に第４マルチチャンネル・コネクタから到来し、前記第４マルチチャンネル・コネクタに入る毛細管が前記第５Ｙバルブから到来し、前記第７Ｙバルブから出た管の１／４が第８Ｙバルブに入り、前記第８Ｙバルブに入る他の管がオン／オフ・バルブを通過した後に第６Ｙバルブから到来し、第７Ｙバルブの残りの３／４の管、および第８Ｙバルブから出た管がそれぞれ前記空気熱サイクラー内の別々のガラス毛細管に入る、前記第５、第６、第７、第８Ｙバルブ、および前記第４マルチチャンネル・コネクタと
を含む回路を備える請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ガラスバイアルＡ中の溶液Ａが、緩衝液、電気泳動染料、グリセロール、およびｄＮＴＰｓを含有し、アクチンまたはＧＡＰＤＨプライマーを含むまたは含まない０℃で保管された各反応ごとに６μｌずつのＰＣＲ反応成分を含む請求項２に記載の装置。
【請求項４】
ガラスバイアル中の溶液Ｂが１０倍濃度の拮抗鋳型（ＣＴ）混合物を各反応ごとに１μｌずつ含み、さらに５種類の異なる濃度５０ＣＴの４種類の異なる混合物、すなわち総計２０種類のＣＴ混合物を貯蔵するための貯蔵槽を含む請求項２に記載の装置。
【請求項５】
ガラスバイアル中の溶液Ｃがプライマーを各反応ごとに１μｌずつ含み、さらにプライマー溶液の５０種類の分離貯蔵槽を含み、各溶液が１０倍濃度で一対のプライマーを含有している請求項２に記載の装置。
【請求項６】
ガラスバイアル中のＴａｑポリメラーゼ溶液を各反応ごとに１μｌずつ使用し、０℃で保管される請求項２に記載の装置。
【請求項７】
各実験ごとに変化するｃＤＮＡのバイアル中の溶液を各反応ごとに１μｌずつ使用し、各ｃＤＮＡ溶液がβ−アクチンおよび／または逆転写効率用のＧＡＰＤＨ内部標準を含有し、逆転写の前にβ−アクチンまたはＧＡＰＤＨ配列とコリニアなポリＡテイルを含有する既知量のＲＮＡの配列が各ＲＮＡ試料に含まれ、前記配列が天然配列を増幅するために用いられるプライマーと共に増幅する短縮化されたβ−アクチンまたはＧＡＰＤＨ配列である請求項２に記載の装置。
【請求項８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲの後にＰＣＲ生成物を測定するためにバイアル中の高密度オリゴヌクレオチド・アレイをさらに含む請求項２に記載の装置。
【請求項９】
増幅される各ｃＤＮＡのセンス鎖にハイブリッド化するオリゴヌクレオチドが蛍光でラベルされる請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
ＰＣＲ反応中のｄＮＴＰの１つまたは複数が蛍光染料でラベルされる請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
高密度オリゴヌクレオチド・アレイが、
各遺伝子ごとに２種類のオリゴヌクレオチド・アレイが調製され、
ｉ）１つのアレイは同一のオリゴヌクレオチドに付着し、ＰＣＲ増幅された遺伝子に対する天然鋳型に独特の配列に結合することにより、
ｉｉ）もう１つのアレイは同一のオリゴヌクレオチドに付着し、拮抗鋳型の５’末端と短縮され位置ずれした拮抗鋳型の３’末端との接合部にまたがる配列に結合することになるという特徴を持つ請求項８に記載の装置。
【請求項１２】
ＰＣＲ生成物が高密度オリゴヌクレオチド・アレイに適用される請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
標的遺伝子の発現が、遺伝子発現を定量するためのデジタル画像を分析する手段を使用して、ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子に対する天然およびＣＴのアレイの蛍光強度を比較することによって定量される請求項１２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重拮抗逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用して遺伝子発現を定量的に測定するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は１９９３年４月６日に出願の米国特許出願第０８／０４３３９０号の一部継続出願、および１９９４年１月２８日に出願した米国特許出願第０８／１１８４３４号の一部継続出願である。
【０００３】
本発明は米国国立衛生研究所からの研究助成ＥＳ０２６７９号、およびＥＳ０１２４７号、リサーチソース部門からの助成ＲＲ０００４４号、衛生研究所契約９１−２号、国際鉛亜鉛機関契約ＣＨ６１１のもとで行われた。これらの機関は本発明に対して確定した権利を持つことがある。本発明は一般に、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅後のＲＮＡの細胞レベルでの定量を実施する装置に関する。
【０００４】
ＰＣＲ技術は一般的に米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号、および第４９６５１８８号に記載されている。ＰＣＲ技術は一般的に、核酸分子内にある核酸配列内に含有されるある所望の特定の核酸配列を増幅するプロセスを含む。ＰＣＲプロセスには過剰な２個のオリゴヌクレオチド・プライマーによる核酸の分離した相補鎖の処理を含む。プライマーは伸長し、所望の核酸配列を合成するための鋳型として作用する相補的プライマー伸長生成物を形成する。ＰＣＲプロセスは同時に段階的に実施され、所望の核酸配列の増幅量までの増加を達成するために、所望の回数反復されることができる。ＰＣＲプロセスによれば、各ＤＮＡ鎖上のプライマー間のＤＮＡ配列が、ＤＮＡの残りの部分および選択された試料の上で選択的に増幅される。ＰＣＲプロセスによって、ＤＮＡの所望の領域の特異的増幅が提供される。
【０００５】
ＰＣＲによる生成物の収率は、ある不定数のサイクルで指数関数的に増加する。
ある時点で、理由は不明確であるが反応は制限され、ＰＣＲ生成物は未知の速度で増加する。その結果、同一のサンプルを同時に増幅した場合でも、増幅生成物の収量が６倍も異なることが報告されている（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ、Ｇ．、ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２７２５−２７２９、１９９０）。
【０００６】
これらの刊行物を初めとする参考文献は、本発明の背景、そして場合によっては、本発明の実施方法を更に詳しく説明するために引用したものであり、本発明は、これらをすべて参考文献として包含するものである。したがって、ＰＣＲサイクルをある回数繰り返した後は、標的ＤＮＡの初期濃度を、外挿によって正確に決定することはできない。
【０００７】
ＰＣＲを定量的に進行させる目的で、さまざまな研究者が、指数的増幅が進行することが分かっているサイクル数だけ増幅したサンプルの分析を行ってきた（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｔ．、ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５２：１０８−１１６（１９９２）；Ｎｏｏｎａｎ、Ｋ．Ｅ．、らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７；７１６０−７１６４（１９９０）；Ｍｕｒｐｈｙ、Ｌ．Ｄ．、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：１０３５１−１０３５６（１９９０）：Ｃａｒｒｅ、Ｐ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：１８０２−１８１０（１９９１）；Ｃｈｅｌｌｙ、Ｊ．、らＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１８７：６９１−６９８（１９９０）；Ａｂｂｓ、Ｓ．、ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２９：１９１−１９６（１９９２）；Ｆｅｌｄｍａｎ、Ａ．Ｍ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８３：１８６６−１８７２（１９９１）。
【０００８】
こうした分析は一般に、ＰＣＲの早いステップ、即ち、ＰＣＲ生成物の測定を、臭化エチディウムで染色したゲルを分光光度計やデンシトメーターで分析することによってではなく、放射標識したプローブ、並びに、オートラジオグラフィーを使用することによって行うことができるステップで行われたものである。
放射活性を使用することは不便、高価であり、安全上の懸念がある。また、指数フェーズを各実験条件ごとに画定する必要があるので、更に時間や材料が必要となる。
【０００９】
もう１つの開発としては、拮抗的ＰＣＲがある。これは単一塩基突然変異拮抗鋳型の存在下で、ＰＣＲが行われる。（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ、前出；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：９４３７−９４４６（１９８９））。既知量の拮抗鋳型を、未知量の標的配列と共に増幅する。拮抗鋳型は、標的配列と同一である配列で（単一塩基突然変異、あるいは、配列の一部の欠失の場合を除く）、増幅に当たって標的ｃＤＮＡと同じプライマーを使用し、標的ｃＤＮＡと同じ効率で増幅する。スタート時の標的／標準の比は、全増幅プロセスを通じて保持され、指数フェーズが終了した後についても、この比が保たれる。
【００１０】
拮抗ＰＣＲは一般的に、Ｓｉｅｂｅｒｔ、Ｐ．Ｄ．、ら、Ｎａｔｕｒｅ３５９：５５７−５５８（１９９２）；Ｓｉｅｂｅｒｔ、Ｐ．Ｄ．、ら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１４：２４４−２４９（１９９３）、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ
Ｂｒｏｃｈｕｒｅ、１９９３、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）で論じられている。
【００１１】
しかし、拮抗ＰＣＲ単独では、スタート時の鋳型の量のばらつきを適切に制御することができない。試料の劣化やピペット時の誤差によって、こうしたばらつきは生じる。ノーザン分析を使用して遺伝子の発現を測定する場合には、同一ブロットを、標的遺伝子と組織サンプル間でばらつきがあったり、刺激に応答して変化したりすることがないとされる「ハウスキーピング」遺伝子の両方についてプローブすることによって、こうした問題を解決することができる。
【００１２】
「ハウスキーピング遺伝子」は、標的遺伝子の相対的な発現を測定する際の分母として作用する。この概念を適用することを試みて、他の研究者は、ＰＣＲによる増幅を別々の試験管内で行った。しかし、２個の遺伝子を別々の試験管内中で増幅する場合、試験管ごとの増幅条件のばらつきや、ピペット操作上の誤差は避けられない。
【００１３】
標的遺伝子と「ハウスキーピング」遺伝子を同一の試験管内で増幅する非拮抗多重ＰＣＲもＮｏｏｎａｎ前出、に記載されているが、増幅核種の指数範囲を決定するための標準曲線を作成する必要があるために、この方法は不便である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、上記欠点を持たず、かつ標準的な訓練を受けた技術者によって実行可能である遺伝子の発現の定量的な測定装置が必要とされている。本発明は、任意のＰＣＲ法と共に使用することができ、単純且つ簡単に実施することのできる技術を提供することによって、当業界のこうした要求に答えるものであって、本発明は、ＤＮＡ分析やＰＣＲ技法に対するこれまでに記載されているアプローチを劇的に改善するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の装置は、ＰＣＲによる増幅方法を改善したもので、「標的遺伝子」、「ハウスキーピング遺伝子」、およびこれらの各遺伝子と拮抗する鋳型を同時に増幅させるものであり、興味のある標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定し、かつ遺伝子発現のパターンを分析する装置であって、所望の遺伝子セットが全ての特定のｃＤＮＡ試料に対して分析できるように自動的にマスター混合物と拮抗鋳型混合物を混合するようにプログラムされており、毛細管に接続された貯蔵槽のストックからＰＣＲ反応を準備する手段を備え、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分子の表現型を決定する手段と、特定のｃＤＮＡから特定の遺伝子の増幅に必要な各成分の適切な一定量を組み合わせて混合物を形成する手段と、毛細管を介して空気熱サイクラーへ混合物を移動させる手段と、ＰＣＲ後に直接アガロース・ゲルのウェルに混合物を移す手段と、ゲルをデジタル的に撮像する手段と、デジタル画像を分析して遺伝子発現を定量する手段とを備える。
【００１６】
本発明における「標的ＤＮＡ配列」および「標的遺伝子」という用語は、その遺伝子あるいはＤＮＡ配列を選択的に増幅することを意図されている目標遺伝子のことを総称するものである。「ハウスキーピング遺伝子」という用語は、ＰＣＲ反応１回あたりのＲＮＡ量に対する内部基準として適切な遺伝子を意味する。
【００１７】
一般的かつ総合的意味において、本発明の鍵となるものは、標的遺伝子に対するプライマー、ハウスキーピング遺伝子に対するプライマー、そして標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の突然変異生成物を含む２種の内部標準拮抗鋳型プライマーを同時に使用することである。これらの突然変異は、点突然変異、挿入、欠失等であってもよい。
【００１８】
広い意味において、本発明は、ｃＤＮＡ分子の異種混合物中に存在する所定のｃＤＮＡ分子の特定の領域内の標的ＤＮＡ配列の量を定量する装置に関する。２個以上の標的遺伝子および／またはハウスキーピング遺伝子が利用され、２種以上の標的遺伝子および／または２種以上のハウスキーピング遺伝子を使用することもできるが、こうした追加の標的遺伝子および／またはハウスキーピング遺伝子を定量する場合には、この追加分の標的遺伝子および／またはハウスキーピング遺伝子の突然変異生成物を含む内部標準拮抗鋳型を更に含むことが必要になると理解すべきである。突然変異拮抗鋳型は、標的配列に対応するヌクレオチドに対して突然変異を生じたヌクレオチドを少なくとも１個含むものであると理解すべきである。
【００１９】
本発明の実施を成功させるために要求されることは、ハウスキーピング遺伝子の配列の対応するヌクレオチドと相補的なヌクレオチド１個のみが突然変異を生じていることである。しかし、もっと長い欠失、挿入、あるいは変異も本発明において有用であると考えられる。
【００２０】
標的遺伝子のプライマー（標的遺伝子の天然型鋳型と拮抗鋳型の両方に対するプライマーの役目を果たす）、ハウスキーピング遺伝子のプライマー（ハウスキーピング遺伝子の天然型鋳型と拮抗鋳型の両方に対するプライマーの役目を果たす）、標的遺伝子の拮抗鋳型、並びにハウスキーピング遺伝子の拮抗鋳型を、標的遺伝子並びにハウスキーピング遺伝子の双方のＤＮＡを含む天然ｃＤＮＡと共に、ＰＣＲプロセスにかける。
【００２１】
このＰＣＲプロセスでは、１）標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の天然型ｃＤＮＡ、および、２）標的遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の突然変異型拮抗鋳型のｃＤＮＡ生成物が得られる。このｃＤＮＡ生成物を、ｃＤＮＡ生成物の単離に適した方法を使用することによって単離する。標的遺伝子をコードする天然型ｃＤＮＡの量、および標的遺伝子の拮抗鋳型をコードする突然変異型ｃＤＮＡの量を、ハウスキーピング遺伝子をコードする天然型ｃＤＮＡの量、およびハウスキーピング遺伝子の拮抗鋳型をコードする突然変異型ｃＤＮＡの量と比較して測定することによって、天然型ｃＤＮＡ生成物と突然変異型ｃＤＮＡ生成物の相対的な存在量が検出される。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は標的ＤＮＡ配列の量を決定する際にＰＣＲ法で使用する新規な核酸プライマー分子に関する。
【００２３】
本発明によれば、「試料」という用語は、植物、個体、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養の成分から単離した組織、または液体の試料のことを一般に示す。プライマー、核酸、およびオリゴヌクレオチドという用語は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドのことを示し、これらの用語のいずれを使用するかによって配列の長さを区別する意図はないと理解すべきである。むしろ、これらの用語は、分子の一次構造を説明するものであると理解すべきである。これらの用語には、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ、および二本鎖及び一本鎖ＤＮＡが含まれる。
【００２４】
これらのオリゴヌクレオチドは、任意の現存の、即ち、天然の配列から誘導することができ、任意の方法で生成することができる。さらに、オリゴヌクレオチドは化学合成、逆転写、ＤＮＡ複製、およびこれらの生成法の組み合わせによって生成することもできると理解すべきである。
【００２５】
「プライマー」という用語は、一般的に、条件がプライマー伸長生成物の合成に適している場合に、相補的な鎖に沿った合成の開始地点として作用し得るオリゴヌクレオチドのことを示す。合成条件には４種の各デオキシリボヌクレオチド３燐酸、および少なくとも１種の重合誘導剤、例えば逆転写酵素、あるいは、ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。これらは、適切な緩衝液中に存在させ、この緩衝液は、補因子である成分、あるいは、種々の適当な温度下でのｐＨ等の条件に影響を及ぼす成分を含むこともできる。プライマーは一本鎖の配列として増幅効率を最適化するのが好ましいが、本発明においては、その他の二本鎖配列によっても実施可能であると理解すべきである。
【００２６】
「標的遺伝子」、「配列」、「標的核酸配列」という用語は、増幅および／または検出すべきオリゴヌクレオチド領域を意味する。標的配列が、増幅プロセスで使用されるプライマー配列の間に存在すると理解すべきである。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、遺伝子の定量的な発現を、ａ）少なくとも１種の目標標的遺伝子、および少なくとも１種のハウスキーピング遺伝子からのｃＤＮＡ、およびｂ）目標標的遺伝子及び「ハウスキーピング」遺伝子のｃＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ認識部位の欠失、あるいは、創出を生じるような塩基突然変異を含む内部標準突然変異拮抗鋳型を多重拮抗ＰＣＲで増幅することによって測定する。
【００２８】
別の実施形態によれば、本方法はａ）少なくとも１種の目標標的遺伝子、および少なくとも１種の「ハウスキーピング」遺伝子からのｃＤＮＡ、および、ｂ）人為的に短縮された目標標的遺伝子、および、「ハウスキーピング」遺伝子の配列を含む拮抗鋳型をＰＣＲで増幅することを含む。これらの短縮された配列は、ＰＣＲによる増幅で使用された標的遺伝子、および「ハウスキーピング」遺伝子のプライマーの両方と相同な配列を保持している。
【００２９】
試料細胞または組織から抽出したＲＮＡを逆転写する。ｃＤＮＡの連続希釈液を、標的遺伝子、及び、「ハウスキーピング」遺伝子と相同なオリゴヌクレオチドおよび定量済みの内部標準突然変異拮抗鋳型の存在下、ＰＣＲによって増幅する。増幅したＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼで消化し、エチジウムブロマイドで染色したアガロース・ゲル上で電気泳動を行い、天然型生成物を突然変異型生成物から分離する。
【００３０】
各バンドを定量するためにデンシトメトリーを行った。標的遺伝子の「ハウスキーピング」遺伝子に対する相対的な発現を測定するこの技術は、同一の内部標準のマスター混合物、および希釈液を用いて行った研究に関しては正確で再現性がある。相対的な遺伝子発現の比の平均値からの変異は２５％以内である。この技術は、遺伝子の発現の変化を測定するのに有用である。この方法は、調べる試料の量が限られていたり、遺伝子の発現レベルが低かったりする場合に特に有用である。
【００３１】
本発明の別の実施形態によれば、遺伝子発現量は、各突然変異拮抗鋳型の同時ポリメラーゼ連鎖反応による増幅に先立って、以下のステップ、すなわち外側のプライマーおよび内側の単一塩基ミスマッチ突然変異内部標準拮抗鋳型プライマーとを用いて、２種の初期ポリメラーゼ連鎖反応を行って、２つの重複したＤＮＡ断片を生成し、初期ポリメラーゼ連鎖反応の重複ＤＮＡ断片を単離、および精製し、外側のプライマーのみを用いて、２種の重複ＤＮＡ断片のそれぞれを、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、最初のポリメラーゼ連鎖反応による増幅を、プライマーを用いずに行ってヘテロ二量体を形成させ、そして、前ステップのポリメラーゼ連鎖反応の生成物を精製、増幅し、その後希釈して、拮抗鋳型として使用することを行うことによって測定される。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、多くの異なる遺伝子の拮抗鋳型は、ハウスキーピング遺伝子および単一標的遺伝子だけに対する拮抗鋳型より、むしろ同一の拮抗鋳型混合物中に含まれている。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲはここに記載する方法に従って、同一試験管内でハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子を増幅することなく成功することができるかもしれない。
【００３３】
本発明は特に、自動化された分子表現型装置に関する。
したがって、本発明の一目的は、遺伝子の発現を定量的に測定する改良された装置を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、商業的プロセス適した、ＰＣＲに基づく遺伝子の発現の定量的な測定装置を提供することにある。
本発明の上記その他の目的、および特徴やそれに付随する利点は、以下の詳細な記載を添付図面と関連づけて読むことによって一層よく理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明につき添付図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明に係る装置の説明をする前に、本発明に係る装置によって実施される定量的測定方法について説明する。
図１は標的遺伝子の相対的な発現量をＰＣＲで定量する際の作業手順の概略図である。
【００３５】
図２は各単一塩基突然変異内部標準の一定量と共に増幅し（各１０アットモル）ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロース・ゲルで電気泳動を行った、ＢＥＰ２Ｄヒト乳頭腫ウィルス永久ヒト気管支上皮細胞株ｃＤＮＡ（ＲＮＡ合計量は０．２５μｇから０．０５μｇを示す）の連続希釈液を示す写真である。その後、このゲルのネガ写真はバンドを定量するためにデンシトメトリーにかけられた。
【００３６】
図３は天然生成物（□ＧＳＨ−Ｐｘ（グルタチオンペルオキシダーゼ）および■ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ））対ＲＮＡ合計量を示すグラフである。ただし、開始ＲＮＡの少量によって（両ＧＳＨ−Ｐｘに対する最初の３個の四角）およびＧＡＰＤＨ）、反応はＲＮＡ量の増加に伴って指数関数的に進行し、反応は増幅のある点で非指数的となり、その結果非制限反応において予想されるより少ない生成物を形成する。直線は増幅プロセス全体にわたって指数的増幅を維持した場合に形成されるであろう理論的なＰＣＲ生成物（ＧＳＨ−ＰｘまたはＧＡＰＤＨのいずれか）の量を示す。
【００３７】
図４は天然増幅生成物／突然変異増幅生成物（□ＧＳＨ−Ｐｘおよび■ＧＡＰＤＨ）対ＲＮＡ合計量を示すグラフである。検討した合計ＲＮＡの範囲全体にわたってこの関係は、ＧＳＨ−Ｐｘ（ｒ２＝０．９８２）およびＧＡＰＤＨ（ｒ２＝０．９７３）の両方について直線性を維持する。これはＧｉｌｌｉｌａｎｄら．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：２７２５−２７２９、１９９０の所見と一致する。この関係は多重拮抗ＰＣＲの定量的性質を証明する。
【００３８】
図５は、ａ）対照として０．１％ＤＭＳＯで処理したＢＥＰ２Ｄ細胞、または、チトクロームｐ４５０ＩＡＩ（ＣＹＰＩＡＩ）を誘導しようとしてβ−ナフトフラボンで処理したＢＥＰ２Ｄ細胞から得たＲＮＡのノーザン分析（図５Ａ）、および、ｂ）ａと同一細胞からのｃＤＮＡの連続希釈物からＰＣＲ増幅したＤＮＡを示す写真である（図５Ｂ）。このｃＤＮＡはＧＡＰＤＨおよびＣＹＰＩＡＩのための拮抗鋳型内部標準、およびこれら遺伝子のオリゴヌクレオチド・プライマーの存在下で共に増幅された。
【００３９】
図６は遺伝子発現を定量的に測定するための本発明に係る装置の概略図である。
【００４０】
長年にわたって、遺伝子の発現は、ＲＮＡをノーザン法、あるいは、ドットブロット検定で定量することによって測定されてきた。こうした技術では、各測定に対して１０５個以上の細胞から得られるＲＮＡ量が必要とされる。しばしば生検では、組織学的診断に必要な数の細胞しか得られないことがあり、こうした場合、細胞の数は１０５個にはるかに満たない。最近開発されたＰＣＲ法では、細胞１００個程度のレベルのＲＮＡでも測定が可能である。しかし、今日までに発表されている技術では、定性的な測定しか行うことができず、定量的な測定は行うことができなかった。
【００４１】
本発明は、多重拮抗逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応による増幅を使用して、遺伝子発現の定量的な測定を簡素化し、改善する方法を実施するための装置に関するものであって、試料から抽出したＤＮＡを逆転写し、次に、「ハウスキーピング遺伝子」と目的標的遺伝子の両方のプライマーの存在下でＰＣＲによって増幅する。遺伝子の発現は、一種以上の標的遺伝子の量を、「ハウスキーピング」遺伝子の量と比較することによって測定する。
【００４２】
本発明で使用することのできるハウスキーピング遺伝子として適切なものは種々のものがあり、例えば、遺伝子発現のノーザン分析で内部標準として使用されてきたハウスキーピング遺伝子、例えばＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ
ＲＮＡ、および、１８Ｓ ＲＮＡ、およびリボ核タンパク質を含む。（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７（１９８４）；Ｂａｒｂｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７１１５（１９８９））。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、ハウスキーピング遺伝子中に存在する、既知の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する任意の配列、または既知の制限エンドヌクレアーゼ部位に対して１ないし２塩基対のミスマッチを含む任意の配列と相同な合成オリゴヌクレオチドを使用することができる。こうした制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いるのは、天然に生じている部位を非認識部位に突然変異させるか、またはミスマッチ部位をマッチ部位に突然変異させるかすることである。いずれの場合も、内部標準突然変異鋳型に適した突然変異配列を生成させるためである。
【００４４】
特定の別の遺伝子を分析するのに使用するハウスキーピング遺伝子中の特定の部位は、この別の遺伝子中に存在するマッチ部位並びにミスマッチ部位に応じて決まる。一つの決定要因は、ハウスキーピング遺伝子及び標的遺伝子から生成するＤＮＡ断片のサイズである。これらの断片は、ゲル電気泳動の際に十分に分離することが望ましい。
【００４５】
さらに、本発明では、ハウスキーピング遺伝子としての遺伝子中の配列に対して相同な配列を含有する全てのオリゴヌクレオチドを使用することができる。この種の相同な配列を使用し、Ｃｅｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１０４７（１９９３）に記載された方法に従って発生させたハウスキーピング遺伝子に対する人為的に短縮した拮抗鋳型を生成することができる。
【００４６】
全ての既知の認識部位に対する１塩基対ないし２塩基対のミスマッチを有する配列を同定してマッチさせるためには、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐのソフトウェアパッケージ内のマッププログラムを使用することができる（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、前出、１９８４）。各遺伝子についてのｃＤＮＡ配列が得られ、そして各遺伝子が全ての既知の制限エンドヌクレアーゼに対する１から２塩基のミスマッチを有する配列とのマッチの存在について評価される。本発明によれば、こうした認識配列のいずれか、またはこれら配列内の１ないし２塩基対のミスマッチを含有する全ての遺伝子を使用することが可能である。
【００４７】
多重拮抗ＰＣＲ（突然変異標準の任意の所定のマスター混合物並びに希釈液に対して）についての本発明では、再現性のある標的遺伝子／ハウスキーピング遺伝子の比が得られる。ＲＮＡの量の増加に従って、天然型生成物の量対出発ＲＮＡの合計量の関係が線形を維持できなくなるので（図３）、増幅が反応全体にわたって指数的ではないことは明らかである。
【００４８】
しかし、各遺伝子に対する拮抗鋳型を使用すると、標的遺伝子／ハウスキーピング遺伝子の比は一定値に保たれる。この量的な結果については、各遺伝子の天然型／突然変異型鋳型の比対出発ＲＮＡの合計量が線形の関係を有することによって示される（図４）。このことから拮抗鋳型内部対照の有用性が示され、相対的な遺伝子発現量を定量するために増幅の指数フェーズ内のみで定量する必要がなくなる。同一実験内の各サンプル間で比に再現性があるので、使用する希釈チューブの数は少なくてよい。遺伝子の発現を測定するに当たっては、チューブ１本のみ必要で、このチューブ内ですべてのバンドを定量することができる。このことによって手順が簡素化され、一回に多くの異なったサンプルを評価することが可能となる。
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、突然変異型生成物を天然型生成物から分離するために使用される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択することができる。さらに、制限エンドヌクレアーゼで消化した後に生じるＰＣＲ生成物の最終的な長さも、考慮すべき要素である。
【００５０】
特定の実施形態では、ポリアクリルアミドゲルよりはアガロース・ゲルを使用する方が好ましい。しかし、適切な分離を行うために、ＤＮＡ断片のサイズの差が大きいこと（約５０〜１００塩基対の差）が要求される。
【００５１】
本発明の方法は、標的遺伝子とハウスキーピング遺伝子の両方に対して同一の認識部位を使用することによって、いっそう簡素化が可能である。ＥｃｏＲＩ部位が適当であることが多い。本発明の特定の実施形態では、ＥｃｏＲＩ、またはＢａｍＨＩでの消化に基づいて、天然ＧＡＰＤＨから分離するＧＡＰＤＨ拮抗鋳型を調製した。しかし、もっと多くの遺伝子で用いることのできるＥｃｏＲＩ、または他の制限エンドヌクレアーゼでの消化に基づいた分離もあり得ると理解すべきである。
【００５２】
突然変異標準の相異なるマスター混合物、および希釈液を使用して、ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡについて行った研究では、標的／ハウスキーピング（ＧＳＨ−Ｐｘ／ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現の比に大きなばらつき（２００倍以下）が見られた。別々に逆転写を行ったサンプルでも同様の結果が得られたので、このステップに導入されたばらつきは小さいものである。いずれの反応条件の差異も、天然鋳型の増幅同様に拮抗鋳型の増幅に影響を及ぼし、したがって、この両者の比は一定のまま保たれる。したがって、このばらつきは、反応中の内部標準突然変異拮抗鋳型の量の差によって生じたものである可能性が高い。拮抗鋳型の濃度は極めて低く（フェンプトモル範囲）、反応中に存在する分子の数に何らかの変化があれば大きな誤差が生じてしまう。
【００５３】
本発明の方法は、突然変異内部標準拮抗鋳型と共に、同一のマスター混合物を使用した各試料間で再現性があることによって示されるように、いずれの所定の研究でも正確である。したがって、好ましい実施形態によれば、比較試料は、突然変異内部標準拮抗鋳型の同一の希釈液と同じマスター混合物を使用して同時に調べるのが望ましい。
【００５４】
好ましい実施形態によれば、反応混合物は以下のものを含有する。ａ）ハウスキーピング遺伝子の拮抗鋳型、ｂ）目標標的遺伝子の拮抗鋳型、ｃ）ハウスキーピング遺伝子をＰＣＲで増幅するためのオリゴヌクレオチド・プライマー、ｄ）目標標的遺伝子をＰＣＲで増幅するためのオリゴヌクレオチド・プライマー、ｅ）反応緩衝液、およびｆ）試験試料由来のｃＤＮＡ。
【００５５】
ＰＣＲ条件は例えば、１倍のＰＣＲ緩衝液、（例えば、５０ｍＭＫＣＬ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣ１２）、標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子をコードするプライマー（各２５ピコモル）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）、および反応混合物１００μＬあたり一定量の各拮抗鋳型を含むマスター混合物を使用することによって各実験について標準化されることも好ましい。増幅を行う前に、各反応液１００μｌに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を加える。ＰＣＲによる増幅は、９４℃で１分、６０℃で１分、そして７２℃で１分、３５〜３８サイクルにわたって実施するか、または増幅する特定の領域に最適な条件で行う。なるべく多くのヘテロ二量体が形成されるように、増幅の後、ＰＣＲ生成物を１０分加熱してから徐々に冷却することが好ましい。
【００５６】
Ｈｉｇｕｃｈｉに従って突然変異を導入した拮抗鋳型を使用した反応において、各ＰＣＲチューブからの試料（４０μＬ）を、制限エンドヌクレアーゼで１２〜１６時間消化する。これら生成物をエチジウムブロマイドで染色した、３％Ｎｕｓｉｅｖｅ、１％ＬＥアガロースのゲル上で、６０Ｖにて２〜３時間電気泳動にかける。Ｐｏｌａｒｏｉｄ６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影する。
【００５７】
このネガ写真を、例えば、Ｚｅｉｎｅｈ １Ｄ Ａｕｔｏｓｔｅｐｏｖｅｒ Ｖｉｄｅｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｍｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州フラートン）を用いたＺｅｉｎｅｈ
Ｓｏｆｔ レーザー走査デンシトメーターモデルＳＬＲ２Ｄ／ＩＤを使用してデンシトメトリーにかける。あるいは、染色ゲルを、デジタルカメラを使用して直接デンシトメトリーで評価するか、自動配列決定用ゲル（例えばＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．より提供）で評価する。各曲線の下側の面積を計算し、定量に使用する。バンドの相対的な大きさ、およびヘテロ二量体の形成に関して補正を行う。結果を標的遺伝子対ハウスキーピング遺伝子の相対的な比として表す。
【００５８】
多重拮抗ＰＣＲによって遺伝子の発現の定量を改良し、簡便化できる。極めて少量の組織あるいは細胞の試料であっても、放射標識を用いることなく遺伝子の発現を定量することができる。その結果、多重逆転写ＰＣＲは費用が安くてすみ、放射標識より安全に使用することができる。結果は、突然変異内部標準拮抗鋳型の同一のマスター混合物、および希釈液を使用した場合については再現性がある。
【００５９】
本発明の方法によれば、既知あるいは潜在的なハウスキーピング遺伝子（ヒト、マウス、およびラットのＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、１８ＳＲＮＡ、およびすべてのリボ核タンパク質遺伝子を含むが、これらに制限されない）の各ｃＤＮＡの核鎖と相同で、制限エンドヌクレアーゼ認識部位配列を含有するか、または制限エンドヌクレアーゼ認識配列に対して１ないし２塩基対のミスマッチを有する全てのオリゴヌクレオチドが、本発明を実施する上で有用であると理解すべきである。このオリゴヌクレオチドは、定量的ＰＣＲで使用するハウスキーピング遺伝子の拮抗鋳型を調製するために使用される。
【００６０】
さらに、本発明の方法によれば、既知または潜在的なハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ、およびすべてのリボ核タンパク質遺伝子を含むが、これらに限定されない）中の配列と相同な配列を含む全てのオリゴヌクレオチドが、人為的に短縮された拮抗鋳型を生成する上で有用であると理解すべきである。このオリゴヌクレオチドは、本発明で使用するハウスキーピング遺伝子の拮抗鋳型を調製するのに使用される。
【００６１】
本発明の技術の用途としては、ａ）内視鏡による生検（ブラシあるいはピンセット）、針吸引、および骨髄生検によって得られた組織からの遺伝子の発現の評価、ｂ）遷移トランスフェクション分析におけるリポーター遺伝子の発現の定量、および、ｃ）遺伝子治療後のトランスフェクトされた遺伝子の定量が考えられる。
【００６２】
Ｍｏｒａｌｅｓ、Ｍ．Ｊ．およびＧｏｔｔｌｉｅｄ、Ｄ．Ｉ．（遷移トランスフェクション分析におけるレポーター遺伝子の発現をポリメラーゼ連鎖反応に基づいて検出、定量する方法、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１０、１８８−１９４（１９９３））、に記載された方法でもレポーター遺伝子からの転写を測定することができるが、この方法では、分析で生じるＲＮＡの量の差に起因するばらつきを制御することはできない。本発明の方法は、トランスフェクトされた細胞由来のＧＡＰＤＨ
ＲＮＡ等、外在性のレポーター遺伝子と内在性のハウスキーピング遺伝子の両方を同時に評価するのに更に有用である。
【００６３】
嚢胞性繊維症貫膜伝導調節遺伝子（ＣＦＴＲ）中の数多くの相異なる突然変異が疾患に関連していることが報告されているが、突然変異に関連した最も一般的な疾患は、５０８の位置での３つの塩基の欠失である。最近述べられた方法（Ｃｈａ、Ｒ．Ｓ．、Ｚａｒｂｌ、Ｈ．、ＫｅｏｈａｖｏｎｇＰ．、Ｔｈｉｌｌｙ、Ｗ．Ｇ、マッチ増幅突然変異分析（ＭＡＭＡ）：ｃ−Ｈａｒａｓ遺伝子に対する適用、ＰＣＲの方法と応用、２：１４−２０（１９９２））を使用すると、異常な５０８欠失遺伝子のみ、あるいは、正常なＣＦＴＲ遺伝子のみの増幅を生じるオリゴヌクレオチド・プライマーを調製することができる。
【００６４】
本発明の方法を使用すると、細胞１個当たりの外在性ＣＦＴＲ遺伝子の相対的な量を測定することができると考えられる。異常ＣＦＴＲの量を何等かの内部標準と比較することなしには、トランスフェクションの効率を定量することはできないはずである。ＲＮＡをノーザン分析によって測定するには試料はあまりに少量である。
【００６５】
本発明の方法は、外在性の正常ジストロフィン遺伝子を、内在性の突然変異遺伝子の存在下で選択的に増幅するＰＣＲシステムを開発する上で有用である。ジストロフィンの場合、疾患は比較的大きな欠失の結果である。数種の異なった欠失が記載されている。本発明の方法を用いると、トランスフェクトされた正常遺伝子を選択的に増幅する各種のＰＣＲシステムを開発することができ、またこれらの場合それぞれについての重要な異常遺伝子についても同様である。これは欠失領域にまたがるプライマーを選択することによって行われる。
【００６６】
さらに、本発明の方法では、２種以上の遺伝子の評価を同時に行うこともできると理解すべきである。
【００６７】
（方法）
ファルマシア（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー）から入手した精製デオキシリボヌクレオチドを希釈して、１０ｍＭの原液とした。組換えＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）、トリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素、およびリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ）は、プロメガ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン）から入手した。ＥＣＯＲＩ酵素は、ＵＳＢ（クリーブランド、オハイオ州）から入手した。プライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３９１ ＰＣＲ−Ｍａｔｅ ＥＰ ＴＭ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで調製した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎｓ、Ｅｌｍｅｒ、Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０で行った。使用した他の緩衝液および溶液は、種々のソースから入手し、分子生物学用の等級のものを使用した。
実験はヒト乳頭腫ウィルス永久ヒト気管支上皮細胞株（ＢＥＰ２Ｄ）（Ｗｉｌｌｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：５３７０−５３７７、１９９０）を用いて行った。
【００６８】
ＲＮＡの単離は以下のようにして実施した。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、およびＳａｃｃｈｉによって記載された方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６２、１５６−１５９、１９８７）に基づいてＲＮＡは単離された。ＢＥＰ２Ｄ細胞株を含有するフラスコから、培養培地を取り出した。直ちに、ＧＩＴ（４．０Ｍチオシアン酸グアニジニウム、０．１ＭトリスＣ１（ｐＨ７．５）、１％β−メルカプトエタノール）緩衝液を細胞上に注いだ（約５００μＬ／ＢＥＰ２Ｄ細胞５００〜１０００万個）。
【００６９】
次に、溶解した細胞を含有する各５００μｌのＧＩＴ緩衝液を、１．５ｍＬの微量遠心分離管に移した。各微量遠心分離管に５０μＬの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、５００μＬの水で飽和させたフェノール、および１００ｍＬのクロロホルム−イソアミルアルコール混合物（４９：１）を順次加えた。微量遠心分離管を十分に振とうし、氷上に１５分間置き、４℃で２０分間、１４，０００ＲＰＭにて微量遠心分離を行った。各遠心分離管の水性層を、新たな微量遠心分離管に移し、上記抽出を繰り返した。再び、各遠心分離管の水性層を、新たな微量遠心分離管にイソプロパノール（５００μＬ）と共に移し、−７０℃に１５分間置いた。
【００７０】
次に、この微量遠心分離管を、４℃で２０分間、１４，０００ＲＰＭにて微量遠心分離した。ＲＮＡを７０％エタノールで２回洗浄し、真空乾燥した。ＲＮＡを０．１％のジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理したＨ２Ｏに混合し、分光光度計（Ｇｉｌｆｏｒｄ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ２６０）で定量した。
【００７１】
逆転写は、以下のようにして実施した。抽出したＲＮＡを、滅菌した微量遠心分離管に入れた。１μｇのＲＮＡのそれぞれに、０．２ｍｇのオリゴｄＴを加えた。これを６５℃で５分間加熱し、氷の上に１分間置いた。これに２μＬの１−ｍＭｄＮＴＰ、２μＬの逆転写酵素（ＲＴ）緩衝液（５０．０ｍＭトリス、４０．０ｍＭＫＣ１、および８０ｍＭ
ＭｇＣ１２）、０．５μＬのＲＮａｓｉｎ、および１μＬのＡＭＶ逆転写酵素（９．５００単位／ｍＬ）を加えた。これを４２℃で１時間インキュベートし、反応を停止するために８０℃まで１０分間加熱した。結果として得られたｃＤＮＡを、−２０℃で保存した。
【００７２】
プライマーおよび突然変異内部標準拮抗鋳型の調製は、以下のように行った。
Ｏｌｉｇｏ−ＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハメル、ミネソタ）を用いて理想配列を同定した。プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ３９１ ＰＣＲ−Ｍａｔｅ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて生成した。
【００７３】
プライマーの配列は以下の通りである。
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）（Ｃｈａｄａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６：２６８−２７１、１９９０）天然鋳型並びに突然変異鋳型の双方を増幅するために使用した「外側」のプライマーからは、結果として長さが３５４塩基対の生成物が生じる。「外側」のプライマーは配列番号１）（Ｃｈａｄａら．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
６：２６８−２７１、１９９０）Ｐｏｓ．２４１ ５’−ＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＴ−３’（コードセンス）であり、クローニングされた配列の２４１−２６１の塩基に対応する、および配列番号２）（Ｃｈａｄａら．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
６：２６８−２７１、１９９０）Ｐｏｓ．５７４ ５’−ＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣ−３’（アンチコードセンス）であり、５７４−５９４の塩基とアニーリングする。
【００７４】
突然変異内部標準を合成するのに使用する「内側」のプライマーは、天然のｃＤＮＡ塩基対（下線を施したもの）を変化させることによって、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を除去する。この「内側」のプライマーは、配列番号３）（Ｃｈａｄａら．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
６：２６８−２７１、１９９０）Ｐｏｓ．３０９ ５’−ＡＴＴＣＴ ＧＡＴＴＴＣ ＣＣＴＣＡＡＧＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＣＴ−３’（コードセンス）、および配列番号４）（Ｃｈａｄａら．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
６：２６８−２７１、１９９０）Ｐｏｓ．３０９ ３’−ＴＡＡＧＡ ＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＧＧＡ−５’（アンチコードセンス）である。
【００７５】
両方のプライマーとも、クローニングされた配列の３０９−３３８の塩基に対応する。突然変異は、センス鎖の３１６の位置にある天然のＡがＴによって置換されることの結果である。天然ＧＳＨ−Ｐｘを制限エンドヌクレアーゼで消化すると、２８０および７４塩基対の生成物を生じる。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）天然鋳型並びに突然変異鋳型の双方を増幅するために使用した「外側」のプライマーからは、結果として長さが７８８または７９０塩基対の生成物が生じる。
【００７６】
この「外側」のプライマーは、配列番号５）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）Ｐｏｓ．４６ ５’−ＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧ−３’（コードセンス）（クローニングされた配列の９−３２の塩基に対応する）、および配列番号６）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）Ｐｏｓ．８１２ ５’−ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣ−３’（アンチコードセンス）であり、７７７−７９８の塩基とアニーリングする。
【００７７】
突然変異鋳型を合成するために使用する「内側」のプライマーは、天然のｃＤＮＡ塩基対１つ（下線を施したもの）を変化させることによって、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を創出する。この「内側」のプライマーは、配列番号７）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）Ｐｏｓ．２３４ ５’−ＴＧＡＴＣＡＡＴＧ ＧＡＡＴＴＣ ＣＣＡＴＣＡＣＣＡ−３’（コードセンス）、および配列番号８）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）Ｐｏｓ．２３４ ３’−ＡＣＴＡＧＴＴＡＣ ＣＴＴＡＡＧ ＧＧＴＡＧＴＧＧＴ−５’（アンチコードセンス）である。
【００７８】
両方のプライマーとも、クローニングされた配列の１９９−２２２の塩基に対応する。突然変異は、センス鎖の２１１の位置にある天然のＡがＴによって置換されることの結果である。天然ＧＳＨ−Ｐｘを制限エンドヌクレアーゼで消化すると、５８８および２００塩基対の生成物を生じる。
【００７９】
別の突然変異ＧＡＰＤＨ鋳型を使用して、いくつかの実験を行った。この鋳型には、新規のＢａｍＨＩ制限部位が導入されている。
天然鋳型並びに突然変異鋳型の双方を増幅するために使用した「外側」のプライマーからは、結果として長さが６３４塩基対の生成物が生じる。この「外側」のプライマーは、配列番号９）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）Ｐｏｓ．２００ ５’−ＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３’（コードセンス）であり、クローニングされた配列の１６５−１８８の塩基に対応し、および配列番号１０）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）Ｐｏｓ．８１３ ５’−ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣ−３’（アンチコードセンス）であり、７７７−７９８の塩基とアニーリングする。
【００８０】
突然変異鋳型を合成するために使用する「内側」のプライマーは、天然のｃＤＮＡ塩基対１つ（下線を施したもの）を変化させることによって、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＧＧＡＴＴＣ）を創出する。この「内側」のプライマーは、配列番号１１）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）Ｐｏｓ．３６８ ５’−ＣＡＧＧＧＧ ＧＧＡＴＣＣ ＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴ−３’（コードセンス）、および配列番号１２）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２、１９８５）Ｐｏｓ．３６８ ３’−ＧＴＣＣＣＣ ＣＣＴＡＧＧ ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＧＴＡ−５’（アンチコードセンス）である。
【００８１】
両方のプライマーとも、クローニングされた配列の３３３−３５８の塩基に対応する。突然変異は、七ンス鎖の３４２の位置にある天然のＧがＴによって置換されることの結果である。この突然変異ＧＡＰＤＨを制限エンドヌクレアーゼで消化すると、４６０塩基対および１７４塩基対の生成物が生じる。
【００８２】
突然変異内部標準拮抗鋳型は、Ｈｉｇｕｃｈｉ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７３５１−７３６７、１９８８に記載されたように部位特異的突然変異誘発によって調製した。こうした単一塩基が突然変異の結果、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が創出（ＧＡＰＤＨ）または欠失（ＧＳＨ−Ｐｘ）が生じた。（ＢａｍＨＩ部位を導入した突然変異ＧＡＰＤＨを使用した実験も行った）。
【００８３】
各突然変異生成物について、「外側」のプライマーおよび「内側」の単一塩基ミスマッチプライマーを使用した２種の初期ポリメラーゼ連鎖反応によって、２種の重複したＤＮＡ断片が生じる。（ＧＳＨ−Ｐｘについてはプライマー１と４、および２と３、そしてＧＡＰＤＨについてはプライマー５と８、および、６と７）。
【００８４】
この重複ＤＮＡ断片を、エチジウムブロマイドで染色した３％Ｎｕｓｉｅｖｅ、１％ＬＥアガロース・ゲルで電気泳動にかけた。バンドを切り出し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ
０．４５μＭフィルター（日本ミリポア工業株式会社、米沢、日本）を使用して精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、洗浄し、真空乾燥し、１００μＬの滅菌ｄＨ２Ｏに混合した。２種の各重複ＤＮＡ断片１μＬを、外側のプライマーのみを使用してＰＣＲで増幅した。最初のＰＣＲサイクルはプライマーを用いずに行い、ヘテロ二量体を形成させた。全突然変異生成物はこのように形成され、増幅された。
【００８５】
突然変異ＰＣＲ生成物を、上記のようにしてゲルで精製し、バルク生成物を形成するために再度増幅した。バルク生成物をゲルで精製して、分光光度計で測定した。拮抗鋳型として使用するように、突然変異生成物をアットモル範囲まで希釈した。１μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（Ｌｏｆｔｓｔｒａｎｄ、ベセスダ、メリーランド）を担体として使用した。各突然変異鋳型のサンプルについて、コンタミネーションを確実に防止するために制限エンドヌクレアーゼで消化した。
【００８６】
ＰＣＲの条件は以下の通りであった。ＰＣＲの条件は、反応混合物１００μｌ当たり、１×ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣ１（ｐＨ９．０）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２）、２５ピコモルのＧＳＨ−Ｐｘ、およびＧＡＰＤＨをコードするプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）、および一定量の両方の内部標準を含有するマスター混合物を使用することによって各実験について標準化した。増幅の前に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を１００μＬの各反応物に加えた。ＢＥＰ２Ｄ細胞系から得たｃＤＮＡを連続希釈し、試料ＰＣＲの試験管に入れた。全ての実験において、コンタミネーションまたは酵素の消化が完了しているかどうかチェックするために、鋳型を含有せず、天然のｃＤＮＡのみ、または突然変異型の標準のみを含有する対照用の試験管を増幅した。
【００８７】
ＰＣＲによる増幅は、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間、３５サイクルにわたって行った。増幅の後、ヘテロ二量体の形成が最大となるようにＰＣＲ生成物を１０分間加熱した。
【００８８】
生成物の定量は以下のように行った。各ＰＣＲチューブからの試料（４０μＬ）を、制限エンドヌクレアーゼで１２〜１６時間消化する。（新規ＢａｍＨＩ制限部位を有する突然変異ＧＡＰＤＨを使用して行った実験も、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで４〜５時間に亘って消化した）。これら生成物をエチジウムブロマイドで染色した、３％Ｎｕｓｉｅｖｅ、１％ＬＥアガロースのゲル上で、６０Ｖにて２〜３時間電気泳動にかける。
【００８９】
Ｐｏｌａｒｏｉｄ６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影する。このネガ写真をデンシトメトリーにかける（Ｚｅｉｎｅｈ １Ｄ Ａｕｔｏｓｔｅｐｏｖｅｒ
Ｖｉｄｅｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｂｉｏｍｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州フラートンを用いたＺｅｉｎｅｈ Ｓｏｆｔ レーザー走査デンシトメーターモデルＳＬＲ２Ｄ／１Ｄ）。各曲線の下側の面積を計算し、定量に使用する。バンドの相対的な大きさ、およびヘテロ二量体の形成に関して補正を行う。結果をＧＳＨ−Ｐｘ対ＧＡＰＤＨの相対的な比として表す。
【００９０】
２つめの一連の実験では、β−ナフトフラボンに暴露したＢＥＰ２Ｄ細胞中のチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）ＩＡＩ遺伝子を評価するために、Ｃｅｌｉの方法によって拮抗鋳型を用いた多重拮抗逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＣ
ＲＴ−ＰＣＲ）を調製した。ＣＹＰＩＡＩ遺伝子の発現の誘導はＣｅｌｉの拮抗鋳型を用いたＭＣＲＴ−ＰＣＲとノーザン分析の両方を使用して評価した。ＣＹＰＩＡＩ遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子の両方に対して拮抗鋳型を調製した。
【００９１】
ＧＡＰＤＨに対する拮抗鋳型を調製するために使用したプライマーは、配列番号１３）（Ｔｏｋｕｎａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５６１６−５６１９、１９９０）Ｐｏｓ．７５
５’−ＧＧＴ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＡＡ ＣＧＧ ＡＴＴＴＧＧ ＴＣＧ−３’Ｐｏｓ．９４、および、配列番号１４）（Ｔｏｋｕｎａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５６１６−５６１９、１９９０）Ｐｏｓ．８４２
５’−ＣＣＴ ＣＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＣＣ ＣＡＴＣＡＣ ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＣＣ Ｃ−３’Ｐｏｓ．６１６であった。
【００９２】
拮抗鋳型と天然鋳型の両方を増幅するために、配列番号１３と共に使用した低位の外側プライマーは、配列番号１５）（Ｔｏｋｕｎａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５６１６−５６１９、１９９０）Ｐｏｓ．８４２
５’−ＣＣＴ ＣＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡＣＣ−３’Ｐｏｓ．８２２であった。
【００９３】
ＣＹＰＩＡＩに対する拮抗鋳型を調製するのに使用したプライマーは、配列番号１６）（Ｊａｉｓｗａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：８０−８３、１９８９）Ｐｏｓ．１２４１
５’−ＣＡＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＡＣＡＡＧ−３’Ｐｏｓ．１２６２、および、配列番号１７）（Ｊａｉｓｗａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：８０−８３、１９８９）Ｐｏｓ．１５５５＼／Ｐｏｓ．１４２８Ｐｏｓ．１５７５
５’−ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＡＴＧＧＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＣＧＡ ＴＡＣ ＡＣＴ ＴＣＣ Ｇ−３’Ｐｏｓ．１４４８拮抗鋳型と天然鋳型の両方を増幅するために、配列番号１８と共に使用した低位の外側プライマーは、配列番号１８）（Ｊａｉｓｗａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２８：８０−８３、１９８９）Ｐｏｓ．１５７５ ５’−ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＡＴＧＧ−３’Ｐｏｓ．１５５５であった。
【００９４】
ＰＣＲによる増幅に際しての条件は、アニーリング温度を５５℃とし、増幅を３８サイクルにわたって行った以外は、Ｈｉｇｕｃｈｉ法によってＧＡＰＤＨ及びＧＳＨ−Ｐｘに対して調製した拮抗鋳型を使用した実験について記載したものと同一とした。
前もって制限エンドヌクレアーゼで消化しておかなくても、天然鋳型と拮抗鋳型が分離するので、試料はＰＣＲ反応管から直接取り出して、エチジウムブロマイドで染色した３％Ｎｕｓｉｅｖｅ、１％ＬＥアガロース・ゲルに適用した。
【００９５】
その後、ポラロイド６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影し、このネガ写真をデンシトメーターで解析することによって、生成物を定量することができた。
【００９６】
β−ナフトフラボン（１０μＭ）と共に各種の時間にわたってインキュベートしたＢＥＰ２Ｄ細胞由来のＲＮＡは、上述のように、１％ＬＥホルムアルデヒド変性用ゲルで電気泳動を行ってノーザン分析を行うか、ＭＣ
ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。ノーザン分析については、ＲＮＡをＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎに移した後、フィルターを３２ＰでラベルしたＣＹＰＩＡＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズした。
【００９７】
（結果）
ＰＣＲによる定量に使用した手順を図１に図示する。ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡの連続希釈液（ＲＮＡ合計量で０．２５μｇから０．０５μｇを示す）を、一定量の各単一塩基突然変異内部標準（各１０アットモル）と共に増幅し、その後上述したように分析した。図２に示すように、各バンドを定量するためにゲルのネガ写真をデンシトメトリーで分析した。
【００９８】
各曲線の下側の面積を用いて、天然型生成物／突然変異型生成物の相対的な比を得た。相対的なバンドのサイズに関して補正を行った（即ち、突然変異型ＧＡＰＤＨは、天然型ＧＡＰＤＨと比較する際には７８８／５８８を乗じ、天然型ＧＳＨ−Ｐｘは、突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘと比較する際には３５４／２８０を乗じた）。ＰＣＲの後、生成物を１００℃に１０分間加熱してから徐々に冷却することによってヘテロ二量体の形成が最大となるようにした。ヘテロ二量体の最大化の後、ヘテロ二量体の形成はこうした条件下では二項分布に従うので、デンシトメトリーのデータを二次方程式を使って解析することによって、各生成物の量を決定した（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ８７：２７２５−２７２９（１９９０）、Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：９４３７−９４４６、１９８９）。
【００９９】
最終的な値は、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対するオッズ比として表した。図３で示したように、天然型生成物の量(任意のデンシトメトリーの単位)を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフはＧＳＨ−Ｐｘ、およびＧＡＰＤＨのいずれについても線形を維持しなかった。しかし、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの比を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフ、および天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフは、いずれの遺伝子についても線形であった。
【０１００】
各試料管から得られた比（２．１８：１、１．１４：１，２．００：１、１．７６：１、２．４６：１、２．７１：１、及び、１．９２：１）を平均することによって、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比の平均値として２．１７：１を、標準偏差として０．３３を得た。値は平均から２５％を超えて変動しなかった。
【０１０１】
この技術のばらつきを評価するために、突然変異標準とマスター混合物の各種の希釈液を使用して、上記の実験を繰り返し行った。各試料管から得られた比（１：９．０９、１：８．１３、１：９．４３、１・８．１３、１：６．６２、１：８．７７、１：７．６９、１：１０．００、１：７．５８及び１：７．０４）を平均することによって、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比の平均値として１：８．２５が、標準偏差として１．０７が得られた。値は平均から２２％を超えて変動しなかった。このことより、この技術の精度が確認され、また、突然変異標準の新規希釈液を含有する新規マスター混合物によってもたらされる変動も明らかになる。
【０１０２】
同一のマスター混合物および突然変異標準の希釈液を使用した試料間のばらつきを評価するために、ＢＥＰ２ＤのＲＮＡを３つの別々のフラスコから独立に抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡの粗希釈（５倍）のみを行った。各試験に対して４本のＰＣＲ管を調べた。得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比は１５．０１：、１７．６９：１、および２１．７６：１（平均＝１８．１５、標準偏差＝３．４０）であった。３つの値はいずれも平均値からの変動が２０％以内であった。
【０１０３】
この結果によって、独立に逆転写されるが、同一のマスター混合物並びに内部標準希釈液を用いて増幅されるサンプルを比較する場合におけるこの技術の精度が確認される。
ＢＥＰ２ＤのＲＮＡをノーザン法で分析したところ、ｍＲＮＡのＧＳＨＰｘ／ＧＡＰＤＨ比は約１：８であった。
【０１０４】
（実施例）
ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡの連続希釈液を、一定量の単一塩基突然変異内部標準拮抗鋳型（各１０アットモル）と共に増幅して評価した。ゲルのネガ写真（図２に示す）をデンシトメトリーで分析して各バンドを定量した。
バンドのデンシトメトリー測定により得られた各曲線下領域から着手し、天然型生成物／突然変異型生成物の比率を次のようにして計算した。データは１回に１遺伝子から評価した。相対的なバンドのサイズに関して補正を行った。（突然変異型ＧＡＰＤＨを天然型ＧＡＰＤＨと比較する場合には７８８／５８８を乗じ、天然型ＧＳＨ−Ｐｘを突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘと比較する場合には３５４／２８０を乗じた）。
【０１０５】
ＰＣＲの間、プライマーにより制限される条件下では、配列相同性のある異種の一本鎖同士はアニーリングしてヘテロ二量体を形成することができる（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｇ．，Ｐｅｒｒｉｎ，Ｓ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｋ．およびＢｕｎｎ，Ｈ．Ｆ．（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２７２５−２７２９）。異種の鎖が一塩基対のみ異なる場合、本発明のように、異種の鎖は下記のＰｕｎｎｅｔｔ升目に示すようにランダムに再アニーリングする（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、上掲；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｉ．，およびＹｕｎｉｓ，Ｊ．Ｊ．（１９９２年）Ｂｌｏｏｄ７９：１６２９−１６３５）。
2005095179.tif 000003
【０１０６】
ここで、Ｎ＝再アニーリング前の一本鎖天然型生成物の割合、Ｍ＝再アニーリング前の一本鎖突然変異型生成物の割合、ＮＮ（またはＮ２）＝再アニーリング後の二本鎖天然型生成物の割合、２ＮＭ＝再アニーリング後に生成されたヘテロ二量体の割合、およびＭＭ（Ｍ２）＝再アニーリング後の二本鎖突然変異型生成物の割合である。
【０１０７】
ヘテロ二量体は制限酵素により切断されず、電気泳動で未消化のホモ二量体と同一の移動度を示したため間接的に解明した。したがって、デンシトメトリーではヘテロ二量体を未消化のホモ二量体と同時に読み取った。Ｐｕｎｎｅｔｔ升目での分布に基づいて生成物を定量するため、ヘテロ二量体がＰＣＲ後に確実にランダムで形成されるようにした。これは（上掲のＧｉｌｌｉｌａｎｄらおよびＴｈｏｍｐｓｏｎらにより記載された方法に従い）１００℃で１０分間加熱してから徐々に冷却して実施した。
【０１０８】
ＧＡＰＤＨについては、天然型生成物（ＮＮ）もヘテロ二量体（ＮＭ）もＥｃｏＲＩにより切断されなかった。したがって、大型のバンドでは天然型ＧＡＰＤＨホモ二量体（ＮＮ）およびＮＭヘテロ二量体の両方が示された。このバンドはＰｕｎｎｅｔｔ升目に従い、計算上はＮ２＋２ＮＭで表されるが、一方ＥｃｏＲＩ切断の結果得られたバンドの割合はＭ２の値で表された。したがって、ＰＣＲの前に天然型（Ｎ）鋳型と突然変異型（Ｍ）鋳型の量が等しい（１：１）場合、ヘテロ二量体がランダムに形成された後、明らかに比は３：１［Ｎ２＋２ＮＭ：Ｍ２］となるであろう。
【０１０９】
このことを更に説明するため、第１サンプルレーン（図２に示す）から得られたデンシトメトリーの生データを表１に示すが、数学的な処理を行い下記に示す最終的な比率を得た。
【０１１０】
Ｍ２の値は分かっており（２，２１４）、Ｎ２＋２ＮＭの値も分かっている（１０，０９５）。この情報からＭを計算し（４７．０５）、二次方程式（ａＸ２＋ｂＸ＋ｃ＝０）でＮを求めた：
Ｎ２＋２Ｎ（４７．０５）−１０，０９５＝０
二次方程式の解の公式（Ｎ＝−ｂ±√（ｂ２−４ａｃ）／２ａ）を使用してＮを求めた。この場合、ａ＝１、ｂ＝９４．１、ｃ＝１０，０９５であり、したがってＮ＝６３．８９である。目的とする情報はＮ／Ｍの比率であり、すなわち６３．８９／４７．１０つまり１．３６／１である（ＰＣＲ後に存在していた一本鎖ＤＮＡの割合を求めたが、これらはＰＣＲ前に存在していたこれに対応する二本鎖ＤＮＡの割合と同一である）。
【０１１１】
デンシトメトリーの値は相対的なものであるため、二次方程式の解の公式を使用する上での不都合は、バンドの比例するデンシトメトリー値を加算した値が＝１すなわち（Ｎ２＋２ＮＭ）＋Ｍ２＝１となるように割り当てることで回避することができる。そしてこの方程式は（Ｎ２＋２ＮＭ）＋Ｍ２＝（Ｎ＋Ｍ）２＝１したがってＮ＋Ｍ＝１と解くことができる、この場合、各バンドに割り当てて１とする各相当部分は、各デンシトメトリー値により決定される（表１）。
【０１１２】
双方のバンドのデンシトメトリー値を合計すると１２，３０９（１０，０９５＋２，２１４）であるため、大きい方のバンド（Ｎ２＋２ＮＭ）の相対的な割合は０．８２（１０，０９５／１２，３０９）となり、小さい方のバンド（Ｍ２）の相対的な割合は０．１８（２，２１４／１２，３０９）となる。したがって、突然変異型ＧＡＰＤＨホモ二量体（Ｍ２）の割合は０．１８となり、一本鎖突然変異型ＧＡＰＤＨ（Ｍ）の割合は０．４２４となる。Ｎ＋Ｍ＝１であるため、一本鎖天然型ＧＡＰＤＨ（Ｎ）の割合は１−０．４２４すなわち０．５７６となり、天然型生成物の突然変異型生成物に対する比率は０．５７６／０．４２４すなわち先に計算したように、１．３６／１となる。
【０１１３】
2005095179.tif 000004
【０１１４】
次に、上記ＧＡＰＤＨと同一レーンの天然および突然変異ＧＳＨ−Ｐｘのデンシトメトリー値を使用して同様な計算を実施した：
Ｎ２＝０．５５８，Ｎ＝０．７４７およびＭ＝１−０．７４７＝０．２５３
天然型／突然変異型の比率は次のように得られる：
天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ＝０．７４７／０．２５３＝２．９５／１
天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨ＝０．５７６／０．４２４＝１．３６／１
そして最終的な見込み率が得られる：
天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型
ＧＡＰＤＨ＝２．９５／１．３６＝２．１７／１
【０１１５】
上述したように、最終的な値は天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ対天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの見込み率で表された。天然型生成物の量（デンシトメトリーの単位は任意）と出発ＲＮＡの合計量との間の関係は、ＧＳＨ−ＰｘについてもＧＡＰＤＨについても全域を通しては直線性が維持されなかった（図３参照）が、出発ＲＮＡの合計量に対する天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの比率および天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比率の関係は、両遺伝子とも直線性を示した（図４参照）。各サンプルチューブから得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ対天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比率（２．１７：１、２．１４：１、２．０0：１、１．７６：１、２．４６：１、２．７１：１、１．９２：１）を平均し、平均値２．１７：１、標準偏差０．３３が得られた。平均値から２５％以上乖離する値はなかった。
【０１１６】
本技法の変動を評価するため、異なった希釈率の突然変異標準とマスターの混合物を使用して実験を繰り返し実施した。各サンプルチューブから得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ対天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比率（１：９．０９、１：８．１３、１：９．４３、１：８．１３、１：６．６２、１：８．７７、１：７．６９、１：１０．００、１：７．５８、１：７．０４）を平均し、平均値１：８．２５、標準偏差１．０７が得られた。平均値から２２％以上乖離する値はなかった。
【０１１７】
同一のマスター混合物および突然変異標準の希釈液を使用したサンプル間の変動を評価するため（新規なＢａｍＨＩ制限部位を有する突然変異型ＧＡＰＤＨを使用）、ＢＥＰ２ＤのＲＮＡを３つの別々のフラスコから別々に抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを５倍希釈した。各試験についてＰＣＲチューブ４本で実施した。天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ対天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比率は１５．０１：１，１７．６９：１および２１．７６：１（平均＝１８．１５、標準偏差＝３．４０）だった。３つの値はすべて平均値から２０％以内だった。
【０１１８】
図５に示すように、ＣＹＰＩＡＩ遺伝子の発現は、ノーザン分析およびＭＣ ＲＴ−ＰＣＲの両方でほぼ同程度観察された。天然ｃＤＮＡおよび拮抗鋳型ｃＤＮＡを表すＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の各バンドを比較すると、対照細胞由来のサンプル１μｌのレーンと、β−ナフトフラボンに暴露した細胞由来のサンプル３μｌのレーン上に、ほぼ同一量のｃＤＮＡが位置していることが明らかである。どのレーン上に同一量のｃＤＮＡが位置しているかという測定により、天然型のＣＹＰＩＡＩ遺伝子を示すバンドでは、対照細胞由来のｃＤＮＡを含むレーンに比べて、β−ナフトフラボンに暴露した細胞由来のｃＤＮＡを含むレーンできわめて強く表れていることが明白である。
【０１１９】
（実施例）
４０種類の拮抗鋳型を１つの混合物に混ぜ合わせ、所与のどのサンプルにおいても４０遺伝子が迅速に定量化できる（混合物には生体異物代謝酵素、分化特異タンパク質、転写因子、ＤＮＡ修復酵素、アポトーシスタンパク遺伝子などをコード化した遺伝子が含まれる）。実施形態によっては、８０遺伝子を超える拮抗鋳型が含まれる。好ましい実施形態によっては、本発明の実施者は必ずしもこれらの遺伝子をすべて評価することを望むものではなく、むしろおよそ５０遺伝子の混合物を調製することを望む可能性がある。
【０１２０】
データの誤りまたは欠失の最も大きい発生源であり時間を消費するのは、電気泳動の穿孔に添加するＰＣＲ反応液の調製である。
【０１２１】
本発明では、毛細導管付きの機器を作成することで、ＲＴ−ＰＣＲ定量化における分子の表現型化過程を自動化する方法および装置を提供する。本発明装置はオリゴＤＮＡ合成装置より優れた改良品である。
【０１２２】
図６は本発明に係る装置の概略図である。回路には第１Ｙバルブ１，第２Ｙバルブ２および第４Ｙバルブ４、第１マルチチャンネルコネクター（１）を含むことができる。装置は次のように機能する。
ガラスバイアル（ガラス瓶）Ａ中の溶液ＡはＰＣＲ反応混合物のストック溶液であり、ｄＮＴＰ、緩衝剤、電気泳動用色素を含み、β−アクチンまたはＧＡＰＤＨは、含む場合と含まない場合とがある。毛細管はガラスバイアルＡの蓋のＯリングを経由してオン／オフ・バルブを通り、第１Ｙバルブ１に入る。第１Ｙバルブ１に入っているその他の毛細管は第１マルチチャンネル・コネクタ（１）から通っている。図示した実施形態では、２０本の毛細管が第１マルチチャンネル・コネクタ（１）に通っている。第１マルチチャンネル・コネクタ（１）に通っている２０本の毛細管は、それぞれがオン／オフ・バルブ（黒点で示す）から達している。オン／オフ・バルブに入り込む毛細管は、ガラスバイアル中の個別の拮抗鋳型（ＣＴ）混合物（溶液Ｂ）からその蓋のＯリングを通って達している。
【０１２３】
ＣＴ混合物は４グループある（各グループは１００種類の異なったＣＴを異なった５モル濃度（１０Ｅ−１２〜１０Ｅ−１６Ｍ）で含む）。ＣＴ混合物のグループは、必要に応じて異なったグループに変更可能である。第１Ｙバルブ１から出た毛細管は第２Ｙバルブ２に入る。第２Ｙバルブ２に入る他の毛細管は第２マルチチャンネル・コネクタ（２）から出ている。この第２Ｙバルブ２から出ている毛細管は第４Ｙバルブ４に入る。第４Ｙバルブ４に入る他のバルブは第３マルチチャンネル・コネクタ（３）から出ている。第４Ｙバルブ４から出ている毛細管は第５Ｙバルブ５に入る。
【０１２４】
装置には更に第３Ｙバルブ３および第２マルチチャンネル・コネクタ（２）が含まれる。図示した実施形態では、４０本の毛細管が第２マルチチャンネル・コネクタ（２）に集まり、それぞれが４０ある第３Ｙバルブ３の１つずつから出ている。各第３Ｙバルブ３に入る毛細管は、特定の遺伝子に対するプライマー溶液（溶液Ｃ）をそれぞれが含んでいるガラスバイアルから出ている。第３Ｙバルブ３と第２マルチチャンネル・コネクタ（２）との間にはオン／オフ・バルブがある。第３Ｙバルブ３から出ている他の毛細管は第７Ｙバルブ７に入る。
【０１２５】
装置には更に、第５Ｙバルブ５、第６Ｙバルブ６、第７Ｙバルブ７および第８Ｙバルブ８と第４マルチチャンネル・コネクタ（４）が含まれる。図示した実施形態では、それぞれの第３Ｙバルブ３から出たその他の毛細管はオン／オフ・バルブを通って第７Ｙバルブ７に接続する。第７Ｙバルブ７に入る他のチューブは、オン／オフ・バルブを通った後で第４マルチチャンネル・コネクタ（４）から入る。第４マルチチャンネル・コネクタ（４）に入る毛細管は第５Ｙバルブ５から出ている。第７Ｙバルブ７から出ているチューブの内１０本が第８Ｙバルブ８に入る。第８Ｙバルブ８に入る他のチューブは、オン／オフ・バルブを通った後で第６Ｙバルブ６から出ている。第７Ｙバルブ７の残り３０から出ているチューブと第８Ｙバルブ８の残り１０から出ているチューブは、空気熱サイクラー内にある１本の別のガラス毛細管に入る。
【０１２６】
所望の溶液には次の材料を含むことができる。
ＰＣＲ反応成分は緩衝剤、電気泳動用色素、グリセロールおよびｄＮＴＰを含み、アクチンまたはＧＡＰＤＨプライマーを含むことも含まないこともあるが、０℃で保存した（反応ごとに６μｌ）。
【０１２７】
拮抗鋳型（ＣＴ）は１０倍濃度で混合する（反応ごとに１μｌ）。容器としては、５０種類のＣＴで異なった４種類の組み合わせを異なった５濃度で混合した合計で２０個のＣＴ混合容器がある。
【０１２８】
プライマー（反応ごと１μｌ）。プライマー溶液のセパレータ容器が５０個ある。各溶液にはプライマーの対が１０倍濃度で含まれる。溶液は実験で計画するＣＴ溶液により変えることが可能な５０のブロックとなる。
Ｔａｑポリメラーゼ溶液（反応ごと１μｌ）、０℃で保存。
【０１２９】
ｃＤＮＡ溶液（反応ごとに使用される１μｌ）。これらは実験毎に変えることができる。各ｃＤＮＡ溶液には逆転写を効果的にするためβ−アクチンおよびまたはＧＡＰＤＨ内部標準を含めることができる。逆転写前に、β−アクチンまたはＧＡＰＤＨ配列と同一直線上のポリＡテールを含む既知量のＲＮＡ配列が各ＲＮＡサンプルに含まれる。配列は短くされたβアクチンまたはＧＡＰＤＨの配列であり、これは天然型配列を増幅するために使用されるプライマーで増幅される。
【０１３０】
本発明によれば、ＰＣＲ反応はストックから毛細管に接続した容器で用意される。特定ＤＮＡの特定遺伝子を増幅するために必要な各成分の適当量を混合または組み合わせた後、混合物をキャプラリーチューブを通して空気熱サイクラーに移動する。そしてＰＣＲ後、混合物を直接アガロース・ゲルの穿孔に移す。適切な電気泳動を行った後、ゲルはデジタルで自動的に画像化され、画像は自動的に分析され遺伝子発現を定量する。人手にて行なう作業は、所望の遺伝子を増幅するために装置のプログラム設定をすること、および適当量試験するために分析するｃＤＮＡサンプルを装置に添加することだけである。
【０１３１】
選別した遺伝子すべてを増幅するのに要する時間は、混合に約１０分、ＰＣＲ増幅に３０分、電気泳動に９０分、そしてデジタル画像化およびデータ分析に１０分であり、合計２時間１５分である。実施形態によっては、装置には４０チャンネルの用具が含まれ、２時間少々での４０遺伝子分析を提供する。また本発明により想定される範囲内で、２００または１０００以上のチャンネルを有する装置が構築できる。
【０１３２】
本明細書に記載された方法による定量的ＲＴ−ＰＣＲの後に起こるＰＣＲ生成物の測定での高密度オリゴヌクレオチド配列の使用は次の変更を行える。増幅されている各ｃＤＮＡのヤンス鎖とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを蛍光標識する。ＰＣＲ反応で１つ以上のｄＮＴＰに蛍光色素を標識する。
【０１３３】
高密度オリゴヌクレオチド配列の調製は次の特性で行うことができる。各遺伝子に対して２つのオリゴヌクレオチド配列を調製する。１つの配列は、本明細書に記載された方法を使用してＰＣＲ増幅した遺伝子の天然鋳型特有の配列に対して相同であり結合するオリゴヌクレオチド（図２のａ）に付着した。他の配列は、拮抗鋳型の５’末端と、Ｃｅｌｉの方法により調製した拮抗鋳型の一端が切られ、整然としていない３’末端との間を連結する配列に対して相同であり結合するオリゴヌクレオチド（図２のｂ）に付着した。
【０１３４】
ＰＣＲ生成物を上述した方法により調製した高密度オリゴヌクレオチド配列に適用した。標的遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子の天然型とＣＴに対する配列の蛍光強度を比較することで定量化される。
【０１３５】
（配列表）
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ジェームズ・シー・ウィリー（Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊａｍｅｓ  Ｃ）
（ｉｉ）発明の名称：多重拮抗逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用して遺伝子発現を定量的に測定する方法
（ｉｉｉ）配列の数：１８
（ｉｖ）住所
（Ａ）宛先：Ｅｍｃｈ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｓｃｈａｕｂ，＆Ｐｏｒｃｅｌｌｏ  Ｃ
ｏ．，Ｌ．Ｐ．Ａ．
（Ｂ）通り：Ｏｎｅ  Ｓｅａｇａｔｅ、Ｓｕｉｔｅ  １９８０
（Ｃ）市：Ｔｏｌｅｄｏ
（Ｄ）州：Ｏｈｉｏ
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：４３６０４
（ｖ）コンピュータ読み取り可能形態：
（Ａ）媒体の種類：ＦＤ
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ互換
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  リリース１．０、バージョン１．２５
（ｖｉ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：０８／１８８，４３４
（Ｂ）出願日：１９９４年１月２８日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）以前の出願データ：
（Ａ）出願番号：０８／０４３，３９０
（Ｂ）出願日：１９９３年４月６日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人に関する情報：
（Ａ）氏名：キャサリン・ビー・マーティノー（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｃａｔｈｅｒ
ｉｎｅ  Ｂ．）
（Ｂ）登録番号：３１，８５４
（Ｃ）参照／名簿番号：９３２０６
（ｉｘ）遠距離通信に関する情報
（Ａ）電話番号：（４１９）２４３−１２９４
（Ｂ）ファックス番号：（４１９）２４３−８５０２
【０１３６】
（２）配列番号１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｈ）セルライン：ＨＬ−６０
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：エス・チャダ（Ｃｈａｄａ，Ｓ．）
エム・エム・ル＝ボー（Ｌｅ  Ｂｅａｕ，Ｍ．Ｍ．）
エル・ケイシー（Ｃａｓｅｙ，Ｌ．）
ピー・イー・ニューバーガー（Ｎｅｗｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｅ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
（Ｄ）巻数：第６巻
（Ｆ）ページ：２６８−２７１
（Ｇ）発行年月日：１９９０年９月
（ｘｉ）配列：配列番号１：
ＧＧＧＧＣＣＴＧＧＴ  ＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣ  Ｔ
【０１３７】
（２）配列番号２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｈ）セルライン：ＨＬ−６０
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：エス・チャダ（Ｃｈａｄａ，Ｓ．）
エム・エム・ル＝ボー（Ｌｅ  Ｂｅａｕ，Ｍ．Ｍ．）
エル・ケイシー（Ｃａｓｅｙ，Ｌ．）
ピー・イー・ニューバーガー（Ｎｅｗｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｅ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
（Ｄ）巻数：第６巻
（Ｆ）ページ：２６８−２７１
（Ｇ）発行年月日：１９９０年９月
（ｘｉ）配列：配列番号２：
ＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧ  ＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧ  Ｃ
【０１３８】
（２）配列番号３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｈ）セルライン：ＨＬ−６０
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：エス・チャダ（Ｃｈａｄａ，Ｓ．）
エム・エム・ル＝ボー（Ｌｅ  Ｂｅａｕ，Ｍ．Ｍ．）
エル・ケイシー（Ｃａｓｅｙ，Ｌ．）
ピー・イー・ニューバーガー（Ｎｅｗｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｅ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
（Ｄ）巻数：第６巻
（Ｆ）ページ：２６８−２７１
（Ｇ）発行年月日：１９９０年
（ｘｉ）配列：配列番号３：
ＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴ  ＣＣＣＴＣＡＡＧＴＡ  ＣＧＴＣＣＧＧＣＣＴ
【０１３９】
（２）配列番号４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｈ）セルライン：ＨＬ−６０
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：エス・チャダ（Ｃｈａｄａ，Ｓ．）
エム・エム・ル＝ボー（Ｌｅ  Ｂｅａｕ，Ｍ．Ｍ．）
エル・ケイシー（Ｃａｓｅｙ，Ｌ．）
ピー・イー・ニューバーガー（Ｎｅｗｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｅ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
（Ｄ）巻数：第６巻
（Ｆ）ページ：２６８−２７１
（Ｇ）発行年月日：１９９０年９月
（ｘｉ）配列：配列番号４：
ＴＡＡＧＡＣＴＡＡＡ  ＧＧＧＡＧＴＴＣＡＴ  ＧＣＡＧＧＣＣＧＧＡ
【０１４０】
（２）配列番号５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（Ｇ）細胞の種類：肝細胞
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ジェイ・ワイ・ツォー（Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．）
エックス・サン（Ｓｕｎ，Ｘ．）
ティー・カオ（Ｋａｏ，Ｔ．）
ケイ・エス・リース（Ｒｅｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．）
アール・ウー（Ｗｕ，Ｒ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（Ｄ）巻数：第１３巻
（Ｆ）ページ：２４８５−２５０２
（Ｇ）発行年月日：１９８５年
（ｘｉ）配列：配列番号５：
ＧＧＴＣＧＧＧＡＧＴ  ＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴ  ＧＧＴＣＧ
【０１４１】
（２）配列番号６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（Ｇ）細胞の種類：肝細胞
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ジェイ・ワイ・ツォー（Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．）
エックス・サン（Ｓｕｎ，Ｘ．）
ティー・カオ（Ｋａｏ，Ｔ．）
ケイ・エス・リース（Ｒｅｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．）
アール・ウー（Ｗｕ，Ｒ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（Ｄ）巻数：第１３巻
（Ｆ）ページ：２４８５−２５０２
（Ｇ）発行年月日：１９８５年
（ｘｉ）配列：配列番号６
ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣ  ＡＣ
【０１４２】
（２）配列番号７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（Ｇ）細胞の種類：肝細胞
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ジェイ・ワイ・ツォー（Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．）
エックス・サン（Ｓｕｎ，Ｘ．）
ティー・カオ（Ｋａｏ，Ｔ．）
ケイ・エス・リース（Ｒｅｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．）
アール・ウー（Ｗｕ，Ｒ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（Ｄ）巻数：第１３巻
（Ｆ）ページ：２４８５−２５０２
（Ｇ）発行年月日：１９８５年
（ｘｉ）配列：配列番号７：
ＴＧＡＴＣＡＡＴＧＧ  ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣ  ＡＣＣＡ
【０１４３】
（２）配列番号８に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（Ｇ）細胞の種類：肝細胞
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ジェイ・ワイ・ツォー（Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．）
エックス・サン（Ｓｕｎ，Ｘ．）
ティー・カオ（Ｋａｏ，Ｔ．）
ケイ・エス・リース（Ｒｅｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．）
アール・ウー（Ｗｕ，Ｒ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（Ｄ）巻数：第１３巻
（Ｆ）ページ：２４８５−２５０２
（Ｇ）発行年月日：１９８５年
（ｘｉ）配列：配列番号８：
ＡＣＴＡＧＴＴＡＣＣ  ＴＴＡＡＧＧＧＴＡＧ  ＴＧＧＴ
【０１４４】
（２）配列番号９に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（Ｇ）細胞の種類：肝細胞
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ジェイ・ワイ・ツォー（Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．）
エックス・サン（Ｓｕｎ，Ｘ．）
ティー・カオ（Ｋａｏ，Ｔ．）
ケイ・エス・リース（Ｒｅｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．）
アール・ウー（Ｗｕ，Ｒ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（Ｄ）巻数：第１３巻
（Ｆ）ページ：２４８５−２５０２
（Ｇ）発行年月日：１９８５年
（ｘｉ）配列：配列番号９：
ＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧ  ＴＣＡＡＧＧＣＡＡＣ
【０１４５】
（２）配列番号１０に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（Ｇ）細胞の種類：肝細胞
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ジェイ・ワイ・ツォー（Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．）
エックス・サン（Ｓｕｎ，Ｘ．）
ティー・カオ（Ｋａｏ，Ｔ．）
ケイ・エス・リース（Ｒｅｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．）
アール・ウー（Ｗｕ，Ｒ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（Ｄ）巻数：第１３巻
（Ｆ）ページ：２４８５−２５０２
（Ｇ）発行年月日：１９８５年
（ｘｉ）配列：配列番号１０：
ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣ  ＡＣ
【０１４６】
（２）配列番号１１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ジェイ・ワイ・ツォー（Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．）
エックス・サン（Ｓｕｎ，Ｘ．）
ティー・カオ（Ｋａｏ，Ｔ．）
ケイ・エス・リース（Ｒｅｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．）
アール・ウー（Ｗｕ，Ｒ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（Ｄ）巻数：第１３巻
（Ｆ）ページ：２４８５−２５０２
（Ｇ）発行年月日：１９８５年
（ｘｉ）配列：配列番号１１：
ＣＡＧＧＧＧＧＧＡＴ  ＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴ  ＣＡＴＣＡＴ
【０１４７】
（２）配列番号１２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖ）フラグメント型：中間部
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ジェイ・ワイ・ツォー（Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．）
エックス・サン（Ｓｕｎ，Ｘ．）
ティー・カオ（Ｋａｏ，Ｔ．）
ケイ・エス・リース（Ｒｅｅｓｅ，Ｋ．Ｓ．）
アール・ウー（Ｗｕ，Ｒ．）
（Ｃ）刊行物名：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（Ｄ）巻数：第１３巻
（Ｆ）ページ：２４８５−２５０２
（Ｇ）発行年月日：１９８５年
（ｘｉ）配列：配列番号１２：
ＧＴＣＣＣＣＣＣＴＡ  ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡ  ＧＴＡＧＴＡ
【０１４８】
（２）配列番号１３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｆ）組織の種類：肝臓
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ケイ・トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｋ．）
ワイ・ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．）
ケイ・サカタ（Ｓａｋａｔａ，Ｋ．）
ケイ・フジモリ（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ｋ．）
エム・オオクボ（Ｏｈｋｕｂｏ，Ｍ．）
ケイ・サワダ（Ｓａｗａｄａ，Ｋ．）
エス・サキヤマ（Ｓａｋｉｙａｍａ，Ｓ）
（Ｂ）論文名：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ［ヒト肺癌におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の増大］
（Ｃ）刊行物名：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．
（Ｄ）巻数：第４７巻
（Ｆ）ページ：５６１６−５６１９
（Ｇ）発行年月日：１９９０年夏季
（Ｋ）配列番号１３における関連残基：１から２４まで
（ｘｉ）配列：配列番号１３：
ＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ  ＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧ  ＧＴＣＧ
【０１４９】
（２）配列番号１４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肺
（Ｇ）細胞の種類：気管支上皮細胞
（Ｈ）セルライン：肺癌
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ケイ・トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｋ．）
ワイ・ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．）
ケイ・サカタ（Ｓａｋａｔａ，Ｋ．）
ケイ・フジモリ（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ｋ．）
エム・オオクボ（Ｏｈｋｕｂｏ，Ｍ．）
ケイ・サワダ（Ｓａｗａｄａ，Ｋ．）
エス・サキヤマ（Ｓａｋｉｙａｍａ，Ｓ）
（Ｂ）論文名：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ［ヒト肺癌におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の増大］
（Ｃ）刊行物名：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．
（Ｄ）巻数：第４７巻
（Ｆ）ページ：５６１６−５６１９
（Ｇ）発行年月日：１９９０年夏季
（Ｋ）配列番号１４における関連残基：１から４０まで
（ｘｉ）配列：配列番号１４：
ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣ  ＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣ  ＡＣＡＧＴＴＴＣＣＣ
【０１５０】
（２）配列番号１５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：肺
（Ｇ）細胞の種類：気管支上皮細胞
（Ｈ）セルライン：肺癌
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：ケイ・トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｋ．）
ワイ・ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．）
ケイ・サカタ（Ｓａｋａｔａ，Ｋ．）
ケイ・フジモリ（Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ｋ．）
エム・オオクボ（Ｏｈｋｕｂｏ，Ｍ．）
ケイ・サワダ（Ｓａｗａｄａ，Ｋ．）
エス・サキヤマ（Ｓａｋｉｙａｍａ，Ｓ）
（Ｂ）論文名：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ［ヒト肺癌におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の増大］
（Ｃ）刊行物名：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．
（Ｄ）巻数：第４７巻
（Ｆ）ページ：５６１６−５６１９
（Ｇ）発行年月日：１９９０年夏季
（Ｋ）配列番号１５における関連残基：１から２０まで
（ｘｉ）配列：配列番号１５：
ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣ
【０１５１】
（２）配列番号１６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：乳房
（Ｇ）細胞の種類：乳房上皮細胞
（Ｈ）セルライン：ＭＣＦ−７
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：エイ・ケイ・ジャイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ，Ａ．Ｋ．）
エフ・ジェイ・ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．）
ディー・ダブリュー・ネバート（Ｎｅｂｅｒｔ，Ｄ．Ｗ．）
（Ｂ）論文名：Ｈｕｍａｎ  ｄｉｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏ
ｍｅ  Ｐ−１−４５０（ＴＣＤＤ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）  ｍＲＮＡ、  ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ．
［ヒトダイオキシン誘導性シトクロムＰ−１−４５０（ＴＣＤＤ−誘導性）ｍ
ＲＮＡ、コンプリートｃｄｓ．］
（Ｃ）刊行物名：Ｓｃｉｅｎｃｅ
（Ｄ）巻数：第２２８巻
（Ｆ）ページ：８０−８３
（Ｇ）発行年月日：１９８９年６月１５日
（Ｋ）配列番号１６における関連残基：１から２１まで
（ｘｉ）配列：配列番号１６：
ＣＡＴＣＣＣＣＣＡＣ  ＡＧＣＡＣＡＡＣＡＡ  Ｇ
【０１５２】
（２）配列番号１７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：乳房
（Ｇ）細胞の種類：乳房上皮細胞
（Ｈ）セルライン：ＭＣＦ−７
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：エイ・ケイ・ジャイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ，Ａ．Ｋ．）
エフ・ジェイ・ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．）
ディー・ダブリュー・ネバート（Ｎｅｂｅｒｔ，Ｄ．Ｗ．）
（Ｂ）論文名：Ｈｕｍａｎ  ｄｉｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏ
ｍｅ  Ｐ１−４５０：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ａｍｉ
ｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ［ヒトダイオキシン誘導性シトクロムＰ１
−４５０：相補的ＤＮＡおよびアミノ酸配列］
（Ｃ）刊行物名：Ｓｃｉｅｎｃｅ
（Ｄ）巻数：第２２８巻
（Ｆ）ページ：８０−８３
（Ｇ）発行年月日：１９８９年６月１５日
（Ｋ）配列番号１７における関連残基：１から４０まで
（ｘｉ）配列：配列番号１７：
ＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡ  ＴＧＣＴＴＣＡＴＧＧ  ＧＴＣＴＣＡＣＣＧＡ  ＴＡＣＡＣＴＴＣＣＧ
【０１５３】
（２）配列番号１８に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮想配列：否
（ｉｖ）アンチセンス：否
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト（ホモサピエンス）
（Ｄ）発達段階：成人
（Ｆ）組織の種類：乳房
（Ｇ）細胞の種類：乳房上皮細胞
（Ｈ）セルライン：ＭＣＦ−７
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：エイ・ケイ・ジャイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ，Ａ．Ｋ．）
エフ・ジェイ・ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．）
ディー・ダブリュー・ネバート（Ｎｅｂｅｒｔ，Ｄ．Ｗ．）
（Ｂ）論文名：Ｈｕｍａｎ  ｄｉｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏ
ｍｅ  Ｐ１−４５０：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ａｍｉ
ｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ［ヒトダイオキシン誘導性シトクロムＰ１
−４５０：相補的ＤＮＡおよびアミノ酸配列］
（Ｃ）刊行物名：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．
（Ｄ）巻数：第２２８巻
（Ｆ）ページ：８０−８３
（Ｇ）発行年月日：１９８９年６月１５日
（Ｋ）配列番号１８における関連残基：１から２０まで
（ｘｉ）配列：配列番号１８：
ＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡ  ＴＧＣＴＴＣＡＴＧＧ
【０１５４】
この発明をある程度詳細にその最も好ましい実施形態について説明してきたが、この発明の精神と範囲に反することなしに広範に異なる実施形態を構成することができることは明白なので、この発明は添付請求の範囲において限定した以外はその特定の実施形態に制約されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】標的遺伝子の相対的な発現量をＰＣＲで定量する際の作業手順の概略図である。
【図２】は各単一塩基突然変異内部標準の一定量と共に増幅し（各１０アットモル）ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロース・ゲルで電気泳動を行った、ＢＥＰ２Ｄヒト乳頭腫ウィルス永久ヒト気管支上皮細胞株ｃＤＮＡ（ＲＮＡ合計量は０．２５μｇから０．０５μｇを示す）の連続希釈液を示す写真である。
【図３】天然生成物（□ＧＳＨ−Ｐｘ（グルタチオンペルオキシダーゼ）および■ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ））対ＲＮＡ合計量を示すグラフである。
【図４】天然増幅生成物／突然変異増幅生成物（□ＧＳＨ−Ｐｘおよび■ＧＡＰＤＨ）対ＲＮＡ合計量を示すグラフである。
【図５】ａ）対照として０．１％ＤＭＳＯで処理したＢＥＰ２Ｄ細胞、または、チトクロームｐ４５０ＩＡＩ（ＣＹＰＩＡＩ）を誘導しようとしてβ−ナフトフラボンで処理したＢＥＰ２Ｄ細胞から得たＲＮＡのノーザン分析（図５Ａ）、および、ｂ）ａと同一細胞からのｃＤＮＡの連続希釈物からＰＣＲ増幅したＤＮＡを示す写真である（図５Ｂ）。
【図６】遺伝子発現を定量的に測定するための本発明に係る装置の概略図である。
【符号の説明】
【０１５６】
１    第１Ｙバルブ
２    第２Ｙバルブ
３    第３Ｙバルブ
４    第４Ｙバルブ
５    第５Ｙバルブ
６    第６Ｙバルブ
７    第７Ｙバルブ
８    第８Ｙバルブ
（１）  第１マルチチャンネル・コネクタ
（２）  第２マルチチャンネル・コネクタ
（３）  第３マルチチャンネル・コネクタ
（４）  第４マルチチャンネル・コネクタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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