(57)【要約】【課題】  ラマン散乱光や蛍光などの散乱光と、試料の光学像（共焦点光学顕微鏡像）とを同時に測定することができ、これらの位置関係を明確にすることができる共焦点顕微分光装置を提供する。【解決手段】  試料Ｓからの反射光と散乱光とをノッチフィルタ２７により分離させ、反射光の光量を光検出器４により測定するとともに、ラマン散乱光または蛍光スペクトルを光電子増倍管３またはＣＣＤ４６により同時に測定する。試料Ｓにおける被測定箇所を順次移動させながら反射光量、ラマン散乱光及び蛍光スペクトルの測定データを蓄積し、この測定データに基づく２次元または３次元分布像を表示する。【選択図】  図１
2005121479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続発振またはパルス発振する少なくとも２以上の励起用レーザ光源と、
所定の波長光を透過または反射し他の波長光を反射または透過する複数の光学フィルタ及び光路を遮断する複数のシャッタを有し、これら光学フィルタ及びシャッタを切換えることにより上記各励起レーザ光源からの励起レーザ光のうちから一の励起レーザ光を選択する励起レーザ光選択手段と、
上記励起レーザ光選択手段により選択された励起レーザ光の試料に対する照射を行う照射手段及びこの試料からの反射光または散乱光の集光手段となる共焦点光学顕微鏡と、
上記試料から発生した散乱光を分光して試料の被測定個所の分光スペクトルを測定する分光手段と、
上記試料の位置を３次元的に移動させながら、予め設定したスペクトル窓内のスペクトル強度のデータを蓄積し、蓄積したスペクトル強度のデータに基づいてスペクトル分布像を３次元的に表示するスペクトル分布像形成手段と
を備え、
上記分光手段は、上記励起レーザ光が上記共焦点光学顕微鏡により上記試料上の被測定箇所に集光されて照射されることにより該被測定箇所から発生する該励起レーザ光の反射光と散乱光とを、波長弁別を行う第１の光学フィルタにより分離させ、分離された反射光の強度を光検出器によって検出するとともに、分離された散乱光について、上記励起レーザ光選択手段による励起レーザ光の選択に同期して選択される該励起レーザ光よりも長波長の光を反射または透過する特性を有する第２の光学フィルタを介して、上記試料上の同一被測定個所について励起波長が異なるラマン散乱光及び蛍光スペクトルを分光装置により波長分散させて同時に測定し、
上記スペクトル分布像形成手段は、上記試料における被測定箇所を順次移動させながら、上記分光手段において測定された測定データの蓄積を所定回数繰返した後、蓄積された測定データに基づき、励起レーザ光の反射光測定に対応した共焦点光学顕微鏡像と、スペクトル測定に対応した２次元または３次元分布像とを表示する
ことを特徴とする共焦点顕微分光装置。
【請求項２】
入射される励起レーザ光のビーム径を予め設定されたビーム径に拡大または縮小し、ビーム形状を整形する機能を有するビームエクスパンダを備え、
上記ビームエクスパンダを経た励起レーザ光を上記共焦点光学顕微鏡に入射させることにより、該励起レーザ光の光束径を、該共焦点光学顕微鏡の対物レンズの瞳径に一致させることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微分光装置。
【請求項３】
上記励起レーザ光の一部を半透過鏡を介して取出して光強度を測定することにより、該励起レーザ光の光強度を算定し、
上記分光装置により波長分散されて測定されたラマン散乱光及び蛍光スペクトルの強度を、上記励起レーザ光の光強度によって除することにより、該励起レーザ光の光強度の変動により生ずるラマン散乱光及び蛍光スペクトルの強度の変動を補正することを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微分光装置。
【請求項４】
上記共焦点光学顕微鏡が備えているピンホールは、開口幅が連続可変可能な第１のスリットと、開口幅が連続可変可能となされ前記第１のスリットに対して開口幅方向を略々垂直となされて配置された第２のスリットとが重ねられることにより構成されていることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微分光装置。
【請求項５】
上記ピンホールは、必要とされる空間分解能及び光のスループット量に応じて、口径が調整されることを特徴とする請求項４記載の共焦点顕微分光装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点光学顕微鏡により試料に励起レーザ光を照射したときに生ずる反射光及び散乱光を測定する共焦点顕微分光装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料に励起レーザ光を照射したときに生ずるラマン散乱光や蛍光などを共焦点光学顕微鏡を介して検出する装置が提案されている。この共焦点光学顕微鏡として、特許文献１に記載されているものは、図８に示すように、レーザ光源１０１より発せられ平行光束となされた励起レーザ光をビームスプリッタ１０２を介して第１の集光レンズ１０３に入射させ、この第１の集光レンズ１０３により励起レーザ光を集光させ、この第１の集光レンズ１０３による集光点上にピンホールマスク（空間フィルタ）１０４のピンホール１０５を位置させ、さらに、このピンホール１０５内を通過して拡散する励起レーザ光を第２の集光レンズ（対物レンズ）１０６に導き、この第２の集光レンズ１０６により試料Ｓ上に励起レーザ光を集光させるように構成されたものが提案されている。
【０００３】
この共焦点光学顕微鏡においては、試料Ｓ上に集光された励起レーザ光が照射されることにより、この試料Ｓより励起レーザ光の反射光及び散乱光が生じる。この反射光及び散乱光は、第２の集光レンズ１０６を経て収束しつつピンホール１０５に戻り、このピンホール１０５及び第１の集光レンズ１０３を経て、ビームスプリッタ１０２に戻る。ビームスプリッタ１０２に戻った光束は、このビームスプリッタ１０２により、レーザ光源１０１側に戻る光路より分岐され、検出手段である光電子増倍管（ＰＭＴ：photomultiplier tube）１０８の側に導かれる。この光電子増倍管１０８においては、試料Ｓから反射または散乱された光束のうち、試料Ｓにおいて生じたラマン散乱光や蛍光など、レーザ光源１０１より発せられた励起レーザ光とは異なる波長の光が検出される。
【特許文献１】特開２０００−３２１２００公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上述のように共焦点光学顕微鏡を用いてラマン散乱光や蛍光などを検出する装置においては、これらラマン散乱光や蛍光などの散乱光と、試料の光学像（共焦点光学顕微鏡像）との位置関係が不明確であった。
【０００５】
すなわち、試料上のある被測定個所において、ラマン散乱光や蛍光などについて特異的なデータが得られた場合に、その被測定個所が、共焦点光学顕微鏡像（光学像）においてどのような箇所であるのかを特定することが困難であった。
【０００６】
ラマン散乱光や蛍光などに基づいて分析される被測定個所の化学状態と、当該被測定個所の凹凸などの光学像（３次元情報）とを同時に測定することができれば、被測定個所の状態をより的確に測定することができるのであるが、従来の装置においては、ラマン散乱光や蛍光などを測定する状態と、光学像を測定する状態とで、光学系の切換えや、試料の位置の変更などを行わなければならず、これらを同時に測定することはできなかった。
【０００７】
そこで、本発明は、上述の実情に鑑みて提案されるものであって、ラマン散乱光や蛍光などの散乱光と、試料の光学像（共焦点光学顕微鏡像）とを同時に測定することができ、これらの位置関係を明確にすることができる共焦点顕微分光装置を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の課題を解決するため、本発明に係る共焦点顕微分光装置は、連続発振またはパルス発振する少なくとも２以上の励起用レーザ光源と、所定の波長光を透過または反射し他の波長光を反射または透過する複数の光学フィルタ及び光路を遮断する複数のシャッタを有しこれら光学フィルタ及びシャッタを切換えることにより各励起レーザ光源からの励起レーザ光のうちから一の励起レーザ光を選択する励起レーザ光選択手段と、この励起レーザ光選択手段により選択された励起レーザ光の試料に対する照射を行う照射手段及びこの試料からの反射光または散乱光の集光手段となる共焦点光学顕微鏡と、試料から発生した散乱光を分光して試料の被測定個所の分光スペクトルを測定する分光手段と、試料の位置を３次元的に移動させながら予め設定したスペクトル窓内のスペクトル強度のデータを蓄積し蓄積したスペクトル強度のデータに基づいてスペクトル分布像を３次元的に表示するスペクトル分布像形成手段とを備え、分光手段は、励起レーザ光が共焦点光学顕微鏡により試料上の被測定箇所に集光されて照射されることにより該被測定箇所から発生する該励起レーザ光の反射光と散乱光とを波長弁別を行う第１の光学フィルタにより分離させ分離された反射光の強度を光検出器によって検出するとともに分離された散乱光について励起レーザ光選択手段による励起レーザ光の選択に同期して選択される該励起レーザ光よりも長波長の光を反射または透過する特性を有する第２の光学フィルタを介して試料上の同一被測定個所について励起波長が異なるラマン散乱光及び蛍光スペクトルを分光装置により波長分散させて同時に測定し、スペクトル分布像形成手段は、試料における被測定箇所を順次移動させながら分光手段において測定された測定データの蓄積を所定回数繰返した後蓄積された測定データに基づき励起レーザ光の反射光測定に対応した共焦点光学顕微鏡像とスペクトル測定に対応した２次元または３次元分布像とを表示することを特徴とするものである。
【０００９】
また、本発明は、上述の共焦点顕微分光装置において、入射される励起レーザ光のビーム径を予め設定されたビーム径に拡大または縮小しビーム形状を整形する機能を有するビームエクスパンダを備え、このビームエクスパンダを経た励起レーザ光を共焦点光学顕微鏡に入射させることにより、該励起レーザ光の光束径を、該共焦点光学顕微鏡の対物レンズの瞳径に一致させることを特徴とするものである。
【００１０】
さらに、本発明は、上述の共焦点顕微分光装置において、励起レーザ光の一部を半透過鏡を介して取出して光強度を測定することにより該励起レーザ光の光強度を算定し、分光装置により波長分散されて測定されたラマン散乱光及び蛍光スペクトルの強度を励起レーザ光の光強度によって除することにより、該励起レーザ光の光強度の変動により生ずるラマン散乱光及び蛍光スペクトルの強度の変動を補正することを特徴とするものである。
【００１１】
そして、本発明は、上述の共焦点顕微分光装置において、共焦点光学顕微鏡が備えているピンホールは、開口幅が連続可変可能な第１のスリットと、開口幅が連続可変可能となされ第１のスリットに対して開口幅方向を略々垂直となされて配置された第２のスリットとが重ねられることにより構成されていることを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明は、上述の共焦点顕微分光装置において、ピンホールは、必要とされる空間分解能及び光のスループット量に応じて、口径が調整されることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る共焦点顕微分光装置においては、分光手段が、試料上の同一被測定個所について反射光の強度と、励起波長が異なるラマン散乱光及び蛍光スペクトルとを同時に測定し、また、スペクトル分布像形成手段が、励起レーザ光の反射光測定に対応した共焦点光学顕微鏡像とスペクトル測定に対応した２次元または３次元分布像とを表示するので、試料上の同一被測定個所についての共焦点光学顕微鏡像と、ラマン散乱光及び蛍光スペクトルとの位置関係が明確化される。
【００１４】
すなわち、本発明は、ラマン散乱光や蛍光などの散乱光と、試料の光学像（共焦点光学顕微鏡像）とを同時に測定することができ、これらの位置関係を明確にすることができる共焦点顕微分光装置を提供することができるものである。
【００１５】
また、本発明は、上述の共焦点顕微分光装置において、励起レーザ光をこの励起レーザ光のビーム径を予め設定されたビーム径に拡大または縮小しビーム形状を整形する機能を有するビームエクスパンダを介して共焦点光学顕微鏡に入射させることにより、該励起レーザ光の光束径を、該共焦点光学顕微鏡の対物レンズの瞳径に一致させるので、励起用レーザ光源の発光エネルギを高効率で励起レーザ光として使用することができる。
【００１６】
さらに、本発明は、上述の共焦点顕微分光装置において、分光装置により波長分散されて測定されたラマン散乱光及び蛍光スペクトルの強度を励起レーザ光の光強度によって除することにより、該励起レーザ光の光強度の変動により生ずるラマン散乱光及び蛍光スペクトルの強度の変動を補正するので、励起用レーザ光源における励起レーザ光の発光強度が変動しても、この変動に影響されずに、安定してラマン散乱光及び蛍光スペクトルを測定することができる。
【００１７】
そして、本発明は、上述の共焦点顕微分光装置において、共焦点光学顕微鏡が備えているピンホールを、開口幅が連続可変可能な第１のスリットと、開口幅が連続可変可能となされ第１のスリットに対して開口幅方向を略々垂直となされて配置された第２のスリットとを重ねることにより構成しているので、ピンホールの径を、例えば、共焦点光学顕微鏡において必要とされる空間分解能及び光のスループット量に応じて、自在に設定することができる。
【００１８】
また、本発明は、上述の共焦点顕微分光装置において、ピンホールは、必要とされる空間分解能及び光のスループット量に応じて、口径が調整されるようにしているので、共焦点光学顕微鏡において必要な空間分解能及び光のスループット量が迅速に実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
【００２０】
本発明に係る共焦点顕微分光装置は、図１に示すように、対物レンズブロック部１内に設置される試料Ｓに対し、励起用レーザ光源２より発せられたレーザ光束を照射し、この照射により試料Ｓから生ずるラマン散乱や蛍光などの成分を共焦点光学顕微鏡及び分光装置を介して光電子増倍管（ＰＭＴ：photomultiplier tube）３により検出するとともに、試料Ｓからの反射光の強度を光検出器４によって検出する装置である。
【００２１】
図１において、（Ａ）は正面図であり、（Ｂ）は側面図である。
【００２２】
なお、対物レンズブロック部１内において、試料Ｓは、図示しない３次元ステージ（Ｘ−Ｙ−Ｚステージ）により支持されており、任意の３次元方向に移動操作可能となされている。
【００２３】
この共焦点顕微分光装置においては、励起用レーザ光源２として、図２に示すように、連続発振またはパルス発振する少なくとも２以上の互いに発振波長の異なる励起用レーザ光源２ａ，２ｂ，２ｃ・・・が設けられている。これら各励起用レーザ光源２ａ，２ｂ，２ｃ・・・から発せられた各レーザ光は、励起レーザ光選択手段によって一のレーザ光のみが選択されて、励起レーザ光として試料Ｓに導かれることとなる。励起レーザ光選択手段は、図２に示すように、所定の波長光を透過または反射し他の波長光を反射または透過する光学フィルタである複数のエッジフィルタと、光路を遮断する複数のシャッタとを有して構成されている。各エッジフィルタは、いずれか一が光路上に位置するように切換え可能となされ、各シャッタは、いずれか一が開放状態となるように切換え可能となされている。
【００２４】
すなわち、この励起レーザ光選択手段においては、第１の励起用レーザ光源２ａから発せられたレーザ光は、開放された第１のシャッタ５を介して、第１のビームコンバイナ（合成器）６を経て、第１乃至第３の遅相板７，８，９のうち第１の励起用レーザ光源２ａに適応する遅相板を経て、さらに、第１乃至第３のエッジフィルタ１０，１１，１２のうち第１の励起用レーザ光源２ａに適応するエッジフィルタを経て出射される。
【００２５】
また、第２の励起用レーザ光源２ｂから発せられたレーザ光は、開放された第２のシャッタ１３を介して、第２のビームコンバイナ（合成器）１４及び第１のビームコンバイナ６を経て、第１乃至第３の遅相板７，８，９のうち第２の励起用レーザ光源２ｂに適応する遅相板を経て、さらに、第１乃至第３のエッジフィルタ１０，１１，１２のうち第２の励起用レーザ光源２ｂに適応するエッジフィルタを経て出射される。
【００２６】
さらに、第３の励起用レーザ光源２ｃから発せられたレーザ光は、開放された第３のシャッタ１５を介して、第２のビームコンバイナ（合成器）１４及び第１のビームコンバイナ６を経て、第１乃至第３の遅相板７，８，９のうち第３の励起用レーザ光源２ｃに適応する遅相板を経て、さらに、第１乃至第３のエッジフィルタ１０，１１，１２のうち第３の励起用レーザ光源２ｃに適応するエッジフィルタを経て出射される。
【００２７】
この励起レーザ光選択手段においては、選択される励起用レーザ光源に対応したいずれか一のシャッタが開放され、他のシャッタは閉塞される。また、この励起レーザ光選択手段においては、選択される励起用レーザ光源に対応して、第１乃至第３の遅相板７，８，９のうちのいずれか一及び第１乃至第３のエッジフィルタ１０，１１，１２のうちのいずれか一が選択されて、光路上に配置される。
【００２８】
この励起レーザ光選択手段から出射された励起レーザ光は、図１に示すように、第１のミラー１６及び第２のミラー１７に反射されて光路を変えられて、プラズマライン１８を透過し、ボラライザ（偏光子）となる偏光ビームスプリッタ１９に入射される。第２のミラー１７は半透過鏡であり、この第２のミラー１７においては、励起レーザ光のうちの一定比率の光量が透過する。この第２のミラー１７を透過したレーザ光は、第１のＮＤ（Neutral Density）フィルタ２０を透過して、励起レーザ光の光量較正用の光電子増倍管（ＰＭＴ）２１に入射される。
【００２９】
偏光ビームスプリッタ１９に入射された励起レーザ光は、第２のＮＤフィルタ２２を透過して、ビームエキスパンダ２３に入射される。なお、第１及び第２のＮＤフィルタ２０，２２は、それぞれターレット式に複数の濃度の異なるフィルタを備えており、選択された励起用レーザ光源に応じて、ステッピングモータ駆動により対応するフィルタが選択されるようになっている。
【００３０】
ビームエキスパンダ２３は、図３に示すように、第１乃至第３の凸レンズＬ１，Ｌ２，Ｌ３から構成されており、第１及び第２の凸レンズＬ１，Ｌ２間の距離Ｘ１と第２及び第３の凸レンズＬ２，Ｌ３間の距離Ｘ２とをそれぞれ可変することにより、入射される励起レーザ光の光束径（ビーム径）を予め設定されたビーム径に拡大または縮小し、ビーム形状を整形する機能を有している。
【００３１】
図３において、（Ａ）に示す状態よりも、（Ｂ）に示す状態においては、第１及び第２の凸レンズＬ１，Ｌ２間の距離Ｘ１が小さくなされ、第２及び第３の凸レンズＬ２，Ｌ３間の距離Ｘ２が大きくなされることにより、出射光の光束径が大きくなっている。
【００３２】
この励起レーザ光のビーム径は、後述する共焦点光学顕微鏡の対物レンズの瞳径に一致するように調整される。この共焦点顕微分光装置においては、励起レーザ光のビーム径が対物レンズの瞳径に一致することにより、励起用レーザ光源２の発光エネルギを高効率で励起レーザ光として使用することができる。
【００３３】
ビームエキスパンダ２３における各凸レンズＬ１，Ｌ２，Ｌ３の移動は、ステッピングモータ駆動によって行われる。また、このビームエキスパンダ２３を経た励起レーザ光の光束径は、選択される励起用レーザ光源及び使用する対物レンズに応じて予め設定された値に調整される。
【００３４】
ビームエキスパンダ２３からの出射光は、図１に示すように、第３のミラー２４及び第４のミラー２５に反射されて光路を変えられて、二分の一波長板２６を透過して、第１の光学フィルタとなるノッチフィルタ（Notch-filter）（または、エッジフィルタ）２７に入射される。このノッチフィルタ２７は、特定の狭い波長域の光束のみを反射する特性を持ったフィルタであり、ここでは、励起用レーザ光源２より発せられる光束の中心波長帯域を反射する特性を有している。このノッチフィルタ２７に反射された励起レーザ光は、対物レンズブロック部１に入射され、第５のミラー２８に反射され、共焦点光学顕微鏡を構成する対物レンズ２９に入射される。この共焦点光学顕微鏡は、励起レーザ光選択手段において選択された励起レーザ光を試料Ｓに対して照射する照射手段となるとともに、この試料Ｓからの反射光及び散乱光を集光する集光手段となるものである。すなわち、対物レンズ２９に入射された励起レーザ光は、試料Ｓ上の被測定箇所に集光して照射される。
【００３５】
試料Ｓ上に集光された励起レーザ光は、この試料Ｓにより散乱光などを含んで反射され、ノッチフィルタ２７に戻る。このノッチフィルタ２７において、試料Ｓ上の被測定箇所から発生する励起レーザ光の反射光と散乱光とは、このノッチフィルタ２７の反射光と透過光とに分離される。すなわち、ノッチフィルタ２７は、励起レーザ光を反射させ、他の波長光を透過されることにより波長弁別を行う。
【００３６】
ここでノッチフィルタ２７により反射された励起レーザ光は、試料Ｓからの反射光であり、二分の一波長板２６、第４のミラー２５を経て、第３のミラー２４に戻る。この試料Ｓからの反射光は、第３のミラー２４において一部が透過し、第６のミラー３０により反射され、集光レンズ３１により集光される。この集光レンズ３１による集光点上には、ピンホールマスク（空間フィルタ）のピンホール３２が位置されている。このピンホール３２内を通過して拡散する光束は、第３のＮＤフィルタ３３を透過して、光検出器４に入射される。この光検出器４は、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、反射光の光量を測定する。
【００３７】
一方、ノッチフィルタ２７を透過した他の波長光は、試料Ｓにおける散乱光であり、この散乱光を散乱光を分光して試料の被測定個所の分光スペクトルを測定する分光手段に入射される。この分光手段において、散乱光は、アイリス３４及びボラライザ（偏光子）となる偏光ビームスプリッタ３５を経て、さらに、第２の光学フィルタとなるバンドパスフィルタ３６及びアイリス３７を経て、集光レンズ３８に入射される。バンドパスフィルタ３６は、励起レーザ光よりも長波長の光を透過させる特性を有している。このバンドパスフィルタ３６は、励起レーザ光選択手段における励起用レーザ光源の選択に同期して選択される。
【００３８】
集光レンズ３８に入射された散乱光は、集光されつつ、第７のミラー３９により反射される。この集光レンズ３８による集光点上には、ピンホールマスク（空間フィルタ）のピンホール４０が位置されている。このピンホール４０内を通過して拡散する光束は、分光ブロック４１に入射される。
【００３９】
この共焦点顕微分光装置において、対物レンズ２９より各ピンホール３２，４０に至る共焦点光学顕微鏡においては、各ピンホール３２，４０は、図４に示すように、開口幅が連続可変可能な第１のスリット５０と、開口幅が連続可変可能となされ第１のスリット５０に対して開口幅方向を略々垂直となされて配置された第２のスリット５１とが重ねられることにより構成されている。すなわち、ピンホール３２，４０の開口面積は、第１のスリット５０の開口幅と第２のスリット５１の開口幅との積によって示される。
【００４０】
これらスリット５０，５１の開口幅は、ステッピングモータ駆動により、可変調整される。ピンホール３２，４０の口径は、例えば、共焦点光学顕微鏡において必要とされる空間分解能及び光のスループット量に応じて、自在に設定することができる。すなわち、ピンホール３２，４０の口径を小さくすると共焦点光学顕微鏡における空間分解能が向上するが、スループット量は減少し、ピンホール３２，４０の口径を大きくすると共焦点光学顕微鏡における空間分解能が低下するが、スループット量は増大する。
【００４１】
このように、この共焦点顕微分光装置においては、ピンホール３２，４０の口径を調整することにより、共焦点光学顕微鏡において必要な空間分解能及び光のスループット量を迅速に設定することができる。
【００４２】
分光ブロック４１に入射された試料Ｓからの散乱光は、図１に示すように、ミラー４２に反射され、分光装置となる反射型回折格子４３を経て、さらに、ミラー４４に反射されて、ミラー４５を経て、光電子増倍管３により検出される。または、ミラーの位置を切り替えることにより入射された散乱光は、電荷結合素子（ＣＣＤ：charge-coupled device）４６に入射される。
【００４３】
なお、この共焦点光学顕微鏡の光学系を簡略化して示すと、図５に示すように、試料Ｓからの反射光及び散乱光が対物レンズ２９により集光され、この集光点にピンホールマスクのピンホール４０が配置され、このピンホール４０を経た光束を光電子増倍管３により検出するという光学系となっている。
【００４４】
試料Ｓからの散乱光のうち、励起波長が異なるラマン散乱光及び蛍光スペクトルは、反射型回折格子４３により波長分散されて、ミラー４５を切り替えることにより光電子増倍管３または電荷結合素子４６に入射される。光電子増倍管３は、主として波長幅の広い蛍光スペクトルの検出に使用する。また、電荷結合素子４６は、主として多数の微細構造を示すラマン散乱光の検出に使用する。
【００４５】
そして、この共焦点顕微分光装置は、この装置内の各部分の動作を制御し、また、測定されたデータを信号処理するためのスペクトル分布像形成手段となる電子回路部を備えている。
【００４６】
この電子回路部は、試料Ｓを支持する３次元ステージを制御し、試料Ｓの位置を３次元的に移動させながら、予め設定したスペクトル窓内のスペクトル強度のデータを蓄積し、蓄積したスペクトル強度のデータに基づいて、図示しない表示装置を介して、スペクトル分布像を３次元的に表示する。また、この電子回路部は、試料Ｓの位置を３次元的に移動させながら試料Ｓからの反射光の光量のデータを蓄積し、蓄積された測定データに基づき、図示しない表示装置を介して、励起レーザ光の反射光測定に対応した共焦点光学顕微鏡像を表示する。
【００４７】
すなわち、この電子回路部は、試料Ｓにおける被測定箇所を順次移動させながら、分光手段において測定された測定データの蓄積を所定回数繰返した後、蓄積された測定データに基づいて、スペクトル分布像及び共焦点光学顕微鏡像を表示することができる。
【００４８】
したがって、この共焦点顕微分光装置においては、上述のように、分光手段が、試料Ｓ上の同一被測定個所について反射光の強度と、励起波長が異なるラマン散乱光及び蛍光スペクトルとを同時に測定し、また、スペクトル分布像形成手段が、励起レーザ光の反射光測定に対応した共焦点光学顕微鏡像とスペクトル測定に対応した２次元または３次元分布像とを表示するので、試料Ｓ上の同一被測定個所についての共焦点光学顕微鏡像と、ラマン散乱光または蛍光スペクトルとの位置関係が明確化される。
【００４９】
さらに、この電子回路部は、励起レーザ光の一部を半透過鏡である第２のミラー１７を介して励起レーザ光の光量較正用の光電子増倍管（ＰＭＴ）２１によって取出し、光強度を測定することにより、励起レーザ光の光強度を算定する。このように、励起レーザ光の一部を取り出す光学系を簡略化して示すと、図６に示すように、共焦点光学顕微鏡に入射される前の励起レーザ光の一部を第２のミラー１７によって光電子増倍管２１に入射される光学系となる。
【００５０】
そして、この電子回路部は、分光装置により波長分散されて測定されたラマン散乱光または蛍光スペクトルの強度を、励起レーザ光の光強度によって除して較正することにより、励起レーザ光の光強度の変動により生ずるラマン散乱光または蛍光スペクトルの強度の変動を補正する。
【００５１】
したがって、この共焦点顕微分光装置においては、励起用レーザ光源２における励起レーザ光の発光強度が変動しても、この変動に影響されずに、安定してラマン散乱光及び蛍光スペクトルを測定することができる。
【００５２】
なお、本発明に係る共焦点顕微分光装置は、図７に示すように、本体部を倒立させて使用することができるようになされている。
【００５３】
図７において、（Ａ）は側面図であり、（Ｂ）は正面図である。
【００５４】
この場合には、試料Ｓが対物レンズ２９の下方に設置され、対物レンズ２９は、この試料Ｓに対して、上方より、励起レーザ光を照射することとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明に係る共焦点顕微分光装置の構成を示す正面図（Ａ）及び側面図（Ｂ）である。
【図２】上記共焦点顕微分光装置を構成する励起レーザ光選択手段を示す側面図である。
【図３】上記共焦点顕微分光装置を構成するコリメータを示す側面図である。
【図４】上記共焦点顕微分光装置を構成するピンホールマスクを示す正面図である。
【図５】上記共焦点顕微分光装置における共焦点光学顕微鏡の光学系を簡略化して示す側面図である。
【図６】上記共焦点顕微分光装置において励起レーザ光の光強度を測定する光学系を簡略化して示す側面図である。
【図７】上記共焦点顕微分光装置を倒立させて使用している状態を示す側面図（Ａ）及び正面図（Ｂ）である。
【図８】従来の共焦点光学顕微鏡の構成を示す側面図である。
【符号の説明】
【００５６】
２  レーザ光源、３  光電子倍増管、３１  第１の集光レンズ、３２  ピンホール、３８  第２の集光レンズ、４０  ピンホール
【図１】
2005121479.tif 000003
【図２】
2005121479.tif 000004
【図３】
2005121479.tif 000005
【図４】
2005121479.tif 000006
【図５】
2005121479.tif 000007
【図６】
2005121479.tif 000008
【図７】
2005121479.tif 000009
【図８】
2005121479.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月16日(2003.10.16)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
連続発振またはパルス発振する少なくとも２以上の励起用レーザ光源と、
所定の波長光を透過または反射し他の波長光を反射または透過する複数の光学フィルタ及び光路を遮断する複数のシャッタを有し、これら光学フィルタ及びシャッタを切換えることにより上記各励起用レーザ光源からの励起レーザ光のうちから一の励起レーザ光を選択する励起レーザ光選択手段と、
上記励起レーザ光選択手段により選択された励起レーザ光の試料に対する照射を行う照射手段及びこの試料からの反射光または散乱光の集光手段となる共焦点光学顕微鏡と、
上記試料から発生した散乱光を分光して試料の被測定箇所の分光スペクトルを測定する分光手段と、
上記試料の位置を３次元的に移動させながら、予め設定したスペクトル窓内のスペクトル強度のデータを蓄積し、蓄積したスペクトル強度のデータに基づいてスペクトル分布像を３次元的に表示するスペクトル分布像形成手段と
を備え、
上記分光手段は、上記励起レーザ光が上記共焦点光学顕微鏡により上記試料上の被測定箇所に集光されて照射されることにより該被測定箇所から発生する該励起レーザ光の反射光と散乱光とを、波長弁別を行う第１の光学フィルタにより分離させ、分離された反射光の強度を光検出器によって検出するとともに、分離された散乱光について、上記励起レーザ光選択手段による励起レーザ光の選択に同期して選択される該励起レーザ光よりも長波長の光を反射または透過する特性を有する第２の光学フィルタを介して、上記試料上の同一被測定箇所について励起波長が異なるラマン散乱光及び蛍光スペクトルを分光装置により波長分散させて同時に測定し、
上記スペクトル分布像形成手段は、上記試料における被測定箇所を順次移動させながら、上記分光手段において測定された測定データの蓄積を所定回数繰返した後、蓄積された測定データに基づき、励起レーザ光の反射光測定に対応した共焦点光学顕微鏡像と、スペクトル測定に対応した２次元または３次元分布像とを表示する
ことを特徴とする共焦点顕微分光装置。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、試料に励起レーザ光を照射したときに生ずる反射光及び散乱光を共焦点光学顕微鏡により測定する共焦点顕微分光装置に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明に係る共焦点顕微分光装置は、図１に示すように、対物レンズブロック部１内に設置される試料Ｓに対し、励起用レーザ光源２より発せられたレーザ光束を照射し、この照射により試料Ｓから生ずるラマン散乱光や蛍光などの成分を共焦点光学顕微鏡及び分光装置を介して光電子増倍管（ＰＭＴ：photomultiplier tube）３により検出するとともに、試料Ｓからの反射光の強度を光検出器４によって検出する装置である。