(57)【要約】【課題】    酵素反応を利用して被検物質を測定するために用いられる液体クロマトグラフィー装置であって、再現性良く被検物質を定量することができる装置及びそれに用いることができる反応コイルを提供すること。【解決手段】  酵素反応用反応コイルは、過酸化水素を生じる段階を含む酵素反応を行なうための反応コイルであって、少なくともその内表面が樹脂から成る。また、液体クロマトグラフィー装置は、液体クロマトグラフィーカラムと、その下流に接続された上記本発明の反応コイルとを具備する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化水素を生じる段階を含む酵素反応を行なうための反応コイルであって、少なくともその内表面が樹脂から成る、酵素反応用反応コイル。
【請求項２】
前記樹脂がフッ素樹脂である請求項１記載の反応コイル。
【請求項３】
前記フッ素樹脂が、ポリテトラフルオロエチレンである請求項２記載の反応コイル。
【請求項４】
前記反応コイルが、液体クロマトグラフィーカラムの下流に接続されるものである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の反応コイル。
【請求項５】
前記酵素反応が、コレステロールオキシダーゼを酵素とし、コレステロールを基質とする酵素反応である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の反応コイル。
【請求項６】
前記反応コイルが、液体クロマトグラフィーカラムの下流に接続されるものであり、前記酵素反応が、検体中のリポタンパク質コレステロールを分別定量するためのものである請求項５記載の反応コイル。
【請求項７】
検体中の低密度リポタンパク質コレステロールを定量するためのものである請求項６記載の反応コイル。
【請求項８】
液体クロマトグラフィーカラムと、その下流に接続された請求項１ないし７のいずれか１項記載の反応コイルとを具備する液体クロマトグラフィー装置。
【請求項９】
請求項８記載の液体クロマトグラフィー装置により、検体中のリポタンパク質コレステロールを分別定量する方法。
【請求項１０】
検体中の低密度リポタンパク質コレステロールを定量する請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応用反応コイル及びそれを用いた液体クロマトグラフィー装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
低密度リポタンパク質（以下、「LDL」ということがある）コレステロールは、動脈硬化の危険因子であり、血中LDLコレステロールは臨床検査において広く定量されている。血液中には、LDLの他に高密度リポタンパク質（以下、「HDL」ということがある）及び超低密度リポタンパク質（以下、「VLDL」ということがある）も含まれているので、LDLコレステロールのみを定量するためには、これらのLDL以外のリポタンパク質中のコレステロールと分別してLDLコレステロールを定量する必要がある。これを達成するための１つの手法として、液体クロマトグラフィーを用いる方法が知られている。この方法では、液体クロマトグラフィーで検体中のリポタンパク質をLDL、HDL及びVLDL（溶離条件により、さらにLDLを電荷の異なるLDL1、LDL2及びLDL3に分離できる）に分離し、分離された各分画をそのまま反応コイルに導き、反応コイル内において、コレステロールを基質とし、コレステロールオキシダーゼを酵素とした酵素反応を行なわせ、発生する過酸化水素を利用して蛍光色素を生じさせ、生じた蛍光色素を定量することにより、各リポタンパク質内のコレステロールの溶出を表すクロマトグラムを描き、このクロマトグラムに基づいて、各リポタンパク質コレステロールを分別定量する。
【０００３】
LDLを定量するための公知の液体クロマトグラフィー装置では、酵素反応を十分に行なわせるために、長い距離がとれるコイル状の流路（すなわち反応コイル）の中で反応が行なわれる。コイルは、巻回し易く、十分な強度を有し、酵素反応の反応物質と反応しにくい材料として、ステンレス鋼が採用されており、特に、ステンレス鋼から成る繊維で編んだ管が用いられている。
【０００４】
【非特許文献１】FEBS Letters 512 (2002) 218-222
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明者らは、公知の液体クロマトグラフィー装置を用いて検体中のLDLを定量すると、クロマトグラムのベースライン（すなわちバックグランド）が安定しづらく（すなわち、同じ検体について同じ条件でクロマトグラフィーを行なってもクロマトグラムのベースラインの形状が不規則に変動する）、定量の再現性が満足できないという問題点を見出した。
【０００６】
本発明の目的は、酵素反応を利用して被検物質を測定するために用いられる液体クロマトグラフィー装置であって、再現性良く被検物質を定量することができる装置及びそれに用いることができる反応コイルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、従来の液体クロマトグラフィー装置によるリポタンパク質コレステロールの分別定量において、液体クロマトグラフィーカラムの下流に接続されるステンレス鋼製の反応コイルの材質を樹脂に変更することにより、再現性良くリポタンパク質コレステロールを分別定量できることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、過酸化水素を生じる段階を含む酵素反応を行なうための反応コイルであって、少なくともその内表面が樹脂から成る、酵素反応用反応コイルを提供する。また、本発明は、液体クロマトグラフィーカラムと、その下流に接続された上記本発明の反応コイルとを具備する液体クロマトグラフィー装置を提供する。さらに本発明は、上記本発明の液体クロマトグラフィー装置により、検体中のリポタンパク質コレステロールを分別定量する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、酵素反応を利用して被検物質を測定するために用いられる液体クロマトグラフィー装置であって、再現性良く被検物質を定量することができる装置及びそれに用いることができる反応コイルが提供された。本発明の反応コイルを用いた液体クロマトグラフィー装置により検体中のリポタンパク質コレステロールを分別定量すると、クロマトグラムのベースラインが変動することがほとんどなくなり、再現性が向上する。また、ベースラインが低くなるので、各ピークの面積が増大し、すなわち、各被検物質の測定精度が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
反応コイルは、管をコイル状に巻回したもので、その管の中で反応を行なうものである。上記の通り、本発明の反応コイルは、少なくともその内表面が樹脂から成る。コイル全体が樹脂から成っていてもよいし、金属等のコイルの内表面に樹脂をコーティングしてもよい。コイル全体を樹脂で形成するのが、簡便、安価で好ましい。樹脂としては、フッ素樹脂が好ましく、特にポリテトラフルオロエチレン樹脂が好ましい。ポリテトラフルオロエチレン樹脂は、「テフロン」（登録商標）の商品名で、米国デュポン社から市販されており、特に、テフロン（登録商標）樹脂から成る管状成形物も市販されているので、このような市販品を好ましく用いることができる。
【００１１】
反応コイルの内径は、特に限定されないが、通常0.25〜1.0mm程度、好ましくは約0.5mm程度である。また、反応コイルの長さは、特に限定されず、酵素反応の種類等により適宜選択されるが、リポタンパク質コレステロールを定量するための、液体クロマトグラフィーカラムの下流に接続されるものであれば通常、10〜20m、好ましくは約15m程度である。
【００１２】
本発明の反応コイルは、過酸化水素を生じる段階を含む酵素反応を行なうためのものである。下記実施例において実験的に示されるように、反応コイルの材質をステンレス鋼からポリテトラフルオロエチレンに変更することにより、コレステロールを基質としてコレステロールオキシダーゼを反応させて過酸化水素を生じさせる段階を含む酵素反応後のクロマトグラムのベースラインが安定し、再現性良く高精度に定量できるようになった。これは、過酸化水素とステンレス鋼の間で、結合、吸着、離脱等の何らかの相互作用が起きるためであると推測される。
【００１３】
過酸化水素を生じる段階を含む酵素反応としては、検体中のリポタンパク質コレステロールの定量に広く用いられている、コレステロールオキシダーゼを酵素とし、コレステロールを基質とする酵素反応を好ましい例として挙げることができる。リポタンパク質中には、コレステロールが含まれ、また、コレステロールがエステル化したコレステロールエステルも含まれている。リポタンパク質中のコレステロールの定量方法では、先ず、コレステロールエステルを、コレステロールエステラーゼ（コレステリルエステルヒドロラーゼ、CEH)により加水分解してコレステロールを生成させる。次いで、生成したコレステロール及び初めから含まれているコレステロールにコレステロールオキシダーゼ(CO)を作用させてコレステロールを酸化し、コレステノンと過酸化水素を生成させる。次いで、この過酸化水素を定量することにより、リポタンパク質中に含まれるコレステロール（コレステロールエステルの形態で含まれているものも包含する）が定量される。生じた過酸化水素の定量は、例えば、ペルオキシダーゼ(POD)の存在下で、過酸化水素と反応して色素を形成する化合物と反応させ、生じた色素の量を蛍光測定や吸光度測定等により測定することにより行なうことができる。色素は、例えば、ペルオキシダーゼの作用により、過酸化水素と４−アミノアンチピリンとＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン）を反応させることにより形成される。これにより形成される色素は、青色に着色しているので、吸光度測定により色素を定量することができ、ひいてはコレステロールを定量することができる。このような酵素反応自体は周知であり、そのための試薬キットも市販されているので、市販の試薬キットを用いて容易に実施することができる。また、これらの酵素反応は、室温で行うことができる。
【００１４】
リポタンパク質中のコレステロールを定量する他の方法として、上記CEH、CO及びPOD並びにホモバニリン酸(HVA)とリポタンパク質とを反応させる方法もある。この方法の原理は、次の通りである。上記、方法とほぼ同様であり、先ず、コレステロールエステルを、コレステロールエステラーゼ（コレステリルエステルヒドロラーゼ、CEH)により加水分解してコレステロールを生成させる。次いで、生成したコレステロール及び初めから含まれているコレステロールにコレステロールオキシダーゼ(CO)を作用させてコレステロールを酸化し、コレステノンと過酸化水素を生成させる。次いで、この過酸化水素を定量することにより、リポタンパク質中に含まれるコレステロール（コレステロールエステルの形態で含まれているものも包含する）が定量される。生じた過酸化水素を定量するために、ペルオキシダーゼ(POD)の存在下で、過酸化水素と反応して色素を形成するHVAと反応させる。この反応物は、アルカリ化で蛍光を発するため、水酸化ナトリウムと反応させ、蛍光を測定することにより、色素を測定することができる。ひいてはコレステロールを定量することができる。
【００１５】
また、ホモバニリン酸を用いる上記方法は、上記非特許文献１に記載されているように公知であるが、本発明の反応コイルを用いる場合には、反応コイルに適用する、酵素反応用試薬組成物中の各成分の濃度は、好ましくは、CO（22.4 U/mg）が0.5〜10 μg/ml、さらに好ましくは 1.0〜5.0μg/ml、CEH（118 U/mg）が0.3〜5.0μg/ml、さらに好ましくは0.5〜2.0μg/ml、PO（129 U/mg）が5.0〜50μg/ml、さらに好ましくは10〜20μg/ml、HVAが20〜250 μg/ml、さらに好ましくは50〜100 μg/mlである。これらの成分の濃度が上記範囲にあると、測定の再現性及び精度がさらに向上する。また、酵素反応用試薬組成物中には、リポタンパク質からのコレステロール及びコレステロールエステルの露出を促進するための界面活性剤が通常含まれる。このような界面活性剤としては、特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、特に、膜可溶化能に優れ、タンパク質の失活が少ないTriton X-100（商品名）等が好ましい。また、この酵素反応の温度は、特に限定されないが、40〜50℃程度で行なうことが好ましい。
【００１６】
本発明の反応コイルは、液体クロマトグラフィーカラムの下流に接続されるものであることが好ましい。すなわち、検体中に含まれる複数の被検物質を分別定量する場合に、被検物質の分離を液体クロマトグラフィーにより行い、液体クロマトグラフィーカラムから出てきた各分画をそのまま反応コイルに導いて酵素反応を行い、酵素反応により生成した物質を連続的に定量することにより、上記複数の被検物質を分別して定量することができるが、本発明の反応コイルは、このような用途に用いられる反応コイルであることが好ましい。
【００１７】
このような液体クロマトグラフィー装置を用いて検体中のリポタンパク質コレステロールを分別定量する場合、各種リポタンパク質を分離するための液体クロマトグラフィーカラムとしては従来から用いられているカラムをそのまま用いることができ、陰イオン交換カラムが好ましく、特に、ジエチルアミノエチルセルロース(DEAE)基を有する多糖類から成る充填剤を充填した陰イオン交換カラムが好ましい。溶離液も従来と同じものを用いることができ、例えば、EDTA含有リン酸緩衝液と、EDTA含有塩化ナトリウム水溶液との勾配を用いることができる（下記実施例参照）。
【００１８】
上記液体クロマトグラフィー装置では、上記液体クロマトグラフィーカラムの下流に上記した本発明の反応コイルが接続されている。上記酵素反応用試薬組成物は、液体クロマトグラフィーカラムよりも下流で反応コイルよりも上流の部位からラインに添加され、反応コイルに供給される。
【００１９】
上記液体クロマトグラフィー装置により検体中のリポタンパク質コレステロールを分別定量する場合であって、酵素反応用試薬組成物として、上記したHVAを含む組成物を用いる場合には、反応コイル内での反応後の生成物をアルカリ性(pH10以上）にすることが、蛍光強度が安定し、より大きくなるので好ましい。したがって、好ましい態様では、上記反応コイルの下流にさらに第２の反応コイルを接続し、この第２の反応コイルの上流から、水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ水溶液をラインに供給することが好ましい。この場合、第２の反応コイルも、少なくともその内表面が樹脂から成ることが好ましい。
【００２０】
上記液体クロマトグラフィー装置を用いて検体中のリポタンパク質コレステロールを分別定量する場合には、各種リポタンパク質を含む検体、例えば血漿や血清等を上記液体クロマトグラフィーカラムにかけ、溶離液を流してクロマトグラフィーを行なう。そうすると、検体中のHDL、LDL、VLDLが分離され、LDLはさらに電荷に応じてLDL1、LDL2、LDL3に分離される。次いで、各分画をそのまま反応コイルに導くと共に、反応コイルの上流部位から上記酵素反応用試薬組成物を添加する。そうすると、各リポタンパク質中のコレステロール量に応じた量の蛍光物質又は色素が生成される。生成物をアルカリ性にする場合には、反応コイルからの生成物をそのまま第２の反応コイルに導き、第２の反応コイルの上流から水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ水溶液を添加する。第２の反応コイルの下流で蛍光又は吸光度を測定し、クロマトグラムを描く。クロマトグラムの各ピークの面積を算出し、既知濃度のリポタンパク質コレステロールを含む標準試料を用いて得られた検量線からの値と比較することにより、検体中の各リポタンパク質コレステロールを定量することができる。
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
実施例１
図１に示す液体クロマトグラフィー装置を用いて、血漿中のリポタンパク質コレステロールを分別定量した。図１中、１０は液体クロマトグラフィーカラム、１２は本発明の反応コイル、１４は第２の反応コイルを示す。本実施例では、液体クロマトグラフィーカラム１０としては、DEAE-グルコマンナンを充填した陰イオン交換カラムである栗田工業社製のDEAE-glucomannan gel column（商品名  ：  粒径５μｍ、カラムサイズ50mm x 内径4.6mm）を用いた。本発明の反応コイル１２として、長さ15m、内径5mmのテフロン（登録商標）樹脂から成る管を用いた。第２の反応コイル１４として、長さ5m、内径5mmのテフロン（登録商標）樹脂から成る管を用いた。
【００２３】
液体クロマトグラフィーカラム１０の上流には、ポンプＡ及びポンブＢが接続され、ポンプＡは溶離液Ａを供給し、ポンプＢは溶離液Ｂを供給する。液体クロマトグラフィーカラム１０と反応コイル１２の間の部位には、ポンプＣが接続されている。ポンプＣは酵素反応用試薬組成物を供給する。反応コイル１２と反応コイル１４の間の部位にはポンプＤが接続され、ポンプＤは0.1M水酸化ナトリウム水溶液を供給する。第２の反応コイル１４の下流には、蛍光検出器が接続され、励起波長352nm、測定波長420nmで生成物中の蛍光を測定した。
【００２４】
用いた溶離液Ａ、溶離液Ｂ及び酵素反応用試薬組成物の組成は次の通りであった。
溶離液Ａ：  1x10-3M EDTA含有20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
溶離液Ｂ：  1x10-3M EDTA含有500mM塩化ナトリウム水溶液
酵素反応用試薬組成物：  CO: 0.022 U/ml; CEH: 0.059 U/ml; PO: 1.3 U/ml; HVA: 0.5 mg/ml; Triton X-100（商品名）0.2重量％を含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
溶離液Ａと溶離液Ｂは、図１に示すように混合してラインに供給した。混合比率を経時的に変化させることにより段階的な勾配を与えた。混合比率の変化は、横軸に時間（分）、縦軸に溶離液Ｂの％をとったグラフとして図１の右側に示されている。
【００２５】
測定は次のように行なった。ポンプＡ及びポンプＢを作動させ、溶離液ＡとＢの混合物を、図１に示す段階勾配を与えながら液体クロマトグラフィーカラム１０の上流に供給した。混合物の流速は1.0 ml/分であった。ポンプＣを作用させて酵素反応用試薬組成物を0.5ml/分の流速で反応コイル１２の上流に供給した。ポンプＤを作用させて0.1M水酸化ナトリウム水溶液を0.5ml/分の流速で第２の反応コイル１４の上流に供給した。液体クロマトグラフィーカラム１０の温度は２５℃、反応コイル１２の温度は４５℃、第２の反応コイル１４の温度は２５℃に維持した。この状態で検体（ヒト血漿をリン酸緩衝液で１０倍希釈したもの）を液体クロマトグラフィーカラムの上流に注入し、第２の反応コイルの下流に接続された蛍光検出器で、蛍光強度を経時的に測定した。得られたクロマトグラムをコンピューターで解析し（島津製作所製CLASS-LC10ソフトウェア  バージョン1.41)、各ピークの面積を算出した。測定は、異なるヒトから得た３種類の検体について行なった。また、同一検体について同日に５回測定を行い、日内再現性を調べた。また、異なる日（連続した３日間）に合計３回測定を行い、日差再現性を調べた。
【００２６】
得られたクロマトグラムの１例を図２に示す。図２の横軸は時間（分）、縦軸は、蛍光強度の相対値（具体的には蛍光強度を電気信号に変換して測定された電圧(mV)）である。図２に示すように、ベースラインはほぼ平坦であり、繰返し測定してもこのベースラインの形状は変化しなかった。また、上記のようにして測定した日内再現性及び日差再現性は、下記表１及び２に示す通りであった。
【００２７】
表１    日内再現性
2005121524.tif 000002
【００２８】
表２    日差再現性
2005121524.tif 000003
【００２９】
以上のように、変動係数は、同日測定の場合でも異なる日に測定した場合でも最大で５％未満であり、本発明の反応コイルを用いることにより、再現性良く測定を行うことができる。
【００３０】
比較例１
図１に示す反応コイル１２及び第２の反応コイル１４を、ステンレス鋼繊維を編んで形成した同じサイズの公知の反応コイルに換えたことを除き、実施例１と同じ操作を行なった。
【００３１】
得られたクロマトグラムの１例を図３に示す。図３に示されるように、このクロマトグラムのベースラインは図２に示すクロマトグラムのベースラインよりも高く、かつ、平坦性が悪くていびつな形状をしている。したがって、本発明のコイルを用いた場合（図２）の方が、精度良く測定できることが分る。さらに、図３のクロマトグラムのベースラインの形状は安定しておらず、測定ごとにかなり大きく変動した。したがって、本発明のコイルを用いた場合の方が再現性良く測定できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の実施例で用いた液体クロマトグラフィー装置を模式的に示す図である。
【図２】本発明の実施例１で得られたクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明の比較例１で得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１】
2005121524.tif 000004
【図２】
2005121524.tif 000005
【図３】
2005121524.tif 000006