(57)【要約】      （修正有）【課題】乳ガン関連蛋白質、それをコーディングする遺伝子、及び該蛋白質または該遺伝子を利用した乳ガンの診断方法を提供する。【解決手段】開示されたアミノ酸配列を有し、アポトーシスを誘導する活性を有する単離された蛋白質、及びそれをコーディングする遺伝子、該遺伝子またはその断片が固定化されている基板を有するマイクロアレイ、並びに該蛋白質に特異的に結合する抗体を利用して乳ガンを診断する方法または細胞内で該遺伝子の発現レベルを決定して乳ガンを診断する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列を有し、乳ガンに特異的に発現する単離された蛋白質。
【請求項２】
アポトーシスに関与することを特徴とする請求項１に記載の単離された蛋白質。
【請求項３】
前記蛋白質は、細胞内にてｐ５３及びｐ２１からなる群から選択される一つ以上の蛋白質の発現を促進させることを特徴とする請求項１または２に記載の単離された蛋白質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質に特異的に結合する抗−ＢＣＲＰ抗体をヒト乳房組織由来のポリペプチド試料と反応させる段階を含む、乳ガンの存在を検出する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質をコーディングすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号３のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド由来の１０個以上の連続したヌクレオチドを含む、乳ガンの診断用または治療用のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチド。
【請求項８】
長さが１０ないし１００ヌクレオチドであることを特徴とする請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
プライマーまたはプローブであることを特徴とする請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドが固定化されている基板を有することを特徴とする乳ガン診断用マイクロアレイ。
【請求項１１】
請求項８または９に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む乳ガン診断用キット。
【請求項１２】
検体から乳房組織試料を得る段階と、
前記乳房組織試料における請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質の発現レベルを決定し、その結果から乳ガンの存在を判断する段階と、
を含む、乳ガンの診断方法。
【請求項１３】
前記蛋白質の発現レベルは、ノーザンブロッティング、または電気泳動を介して決定されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛋白質の発現レベルが、正常な乳房組織での発現レベルより高い場合に、乳ガンであると判断することを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；プログラム細胞死）を誘導する活性を有するＢＣＲＰ（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）蛋白質、それをコーディングする遺伝子、及びＢＣＲＰ遺伝子の断片が固定化されたマイクロアレイに係り、かつＢＣＲＰ蛋白質を特異的に認識する抗体を利用して乳ガンを診断する方法、及びＢＣＲＰ遺伝子が発現しているか否かを決定して乳ガンを診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳ガンは、世界で最も頻繁に診断される女性のガンである。乳ガンは、ガン関連死亡者数において、肺ガンに次いで多い。乳ガンの発生率は、去る５０年間着実に高まってきており、特に韓国では、急速な上昇の趨勢を示している。多数の確立された因子が女性の乳ガン罹患の危険性を高めうるが、それらの因子としては、老化、過去の乳ガン病歴、相当な放射線曝露、家族の中にガン罹患者がいること、社会経済的な階層、未出産、初経、閉経または３０歳を過ぎてからの初妊娠などが挙げられる。
【０００３】
乳ガンは不均質疾患であり、女性ホルモンによってさまざまな乳房腫瘍が誘導されることが知られているが、それ以外にも他の認知された因子及び未知の因子が多数存在する。確認されているガン遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）での変化としては、ＨＥＲ−２及び上皮成長因子受容体遺伝子の増幅及びサイクリンＤ１の過剰発現が挙げられる。これらのガン遺伝子の過剰発現は、かなり悪い予後と関連している。同様に、ｐ５３遺伝子のような腫瘍抑制遺伝子の遺伝的な変化または喪失は、乳ガンでかなり立証されており、さらに悪い予後とも関連している。研究者らは、閉経前の家族性乳ガンの予測材料であるＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２と呼ばれる２つの遺伝子を見つけた。現在では、化学予防試験についての候補者の動静を強化させることができる遺伝的危険評価が可能である。乳ガンの早期診断は、最良の治療結果を保証するのに必須であるが、発展したヘルスケアシステムを有する多くの国が乳ガンのスクリーニングプログラムを施行している。治療選択及び予後と関連した情報、例えばエストロゲン及びプロゲストロン受容体の状態測定もこのプログラムに含まれている。
【０００４】
乳ガン治療での主要課題は、早期発見率を改善すること、疾患進行を追跡して再発を確認するのに使用できる新しい非侵害性マーカを開発すること、そして特に５年という生存率が相変らず非常に低い、さらに進行した疾患に対する改善された治療法を開発することである。免疫療法及び標的化された毒素のような有望な新しい方法で腫瘍細胞を攻撃できるように、ガン細胞にさらに特異的な標的、理想的には腫瘍細胞の表面で発現する標的を探し出すことが必要である。
【０００５】
本発明者らは、乳ガンに特異的なＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を研究しているうちに、乳ガンに特異的に発現する蛋白質を発見して本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、乳ガン細胞で特異的に発現する単離された蛋白質を提供することである。
【０００７】
また、本発明は、前記蛋白質をコーディングする核酸配列及び前記蛋白質をコーディングする核酸配列またはその断片が固定化されているマイクロアレイを提供することである。
【０００８】
また、本発明は、前記蛋白質に特異的に結合する抗体を利用して乳ガンを診断する方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、前記蛋白質をコーディングする遺伝子が乳房組織で発現しているか否かを決定して乳ガンを診断する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一形態は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、乳ガンに特異的に発現する単離された蛋白質を提供する。
【００１１】
本発明の他の一形態は、本発明の蛋白質に特異的に結合する抗−ＢＣＲＰ抗体をヒト乳房組織由来のポリペプチド試料と反応させる段階を含む、乳ガンの存在を検出する方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらに他の形態は、本発明の蛋白質をコーディングすることを特徴とするポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
本発明のさらに他の形態は、本発明のポリヌクレオチド由来の１０個以上の連続したヌクレオチドを含む、乳ガン診断用または治療用のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチド、それが固定化されているマイクロアレイ及びそれを含むキットを提供する。
【００１４】
本発明のさらに他の一形態は、検体から乳房組織試料を得る段階と、前記乳房組織試料における本発明の蛋白質の発現レベルを決定し、その結果から乳ガンの存在を決定する段階と、を含む、乳ガンの診断方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による単離された蛋白質及びそれをコーディングする核酸は、乳ガンの診断と前記蛋白質を標的とする薬剤の開発とに有用に利用されうる。
【００１６】
本発明のＢＣＲＰ蛋白質に特異的に結合する抗体を利用した乳ガンの診断方法によれば、乳ガンを効果的に診断できる。
【００１７】
また、細胞内のＢＣＲＰ遺伝子の発現レベルを測定して乳ガンを診断する本発明の方法によれば、乳ガンを効果的に診断できる。
【００１８】
本発明のマイクロアレイは、乳ガンの存在を検出する分析のようなさまざまな分析方法に有用に使われうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下に記載する形態のみに制限されることはない。
【００２０】
本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、乳ガンに特異的に発現するアポトーシスを誘導する活性を有する単離された蛋白質を提供する。本発明の蛋白質（以下、ＢＣＲＰ蛋白質と称する）は膜蛋白質であり、正常組織では、心臓組織で特異的に発現するという特性を有する。また、本発明の蛋白質は、さまざまなガン組織のうち、乳ガン組織で特異的に発現する特性がある。従って、本発明の蛋白質の発現に基づいて乳ガンの存在を検出できる。
【００２１】
本発明において、前記ＢＣＲＰ蛋白質は、細胞内にて過剰発現すると、ｐ５３及びｐ２１からなる群から選択される一つ以上の蛋白質の発現を促進させる。
【００２２】
本発明は、また、配列番号４のアミノ酸配列を有する、前記蛋白質に特異的に結合する抗−ＢＣＲＰ抗体をヒト乳房組織由来のポリペプチド試料と反応させる段階を含む、乳ガンの存在を検出する方法を提供する。望ましくは、前記蛋白質の発現レベルが正常組織での発現レベルより高い場合に、より望ましくは３％、５％、１０％または１５％以上高い場合に、乳ガンが存在すると判断する。特定の蛋白質抗原に対する抗体を生産する方法は、当業者に公知であり、本発明でも、このような従来の抗体製造方法によって抗−ＢＣＲＰ抗体を生産できる。
【００２３】
本発明は、また、配列番号４のアミノ酸配列を有し、アポトーシスを誘導する活性を有する単離された蛋白質をコーディングすることを特徴とするポリヌクレオチドを提供する。望ましくは、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を有する。このような本発明のポリヌクレオチドは、前記蛋白質を発現させるのに使われるだけではなく、前記蛋白質の発現を決定して乳ガンの存在を決定するためにも使われうる。
【００２４】
従って、本発明は、また、配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド由来の１０個以上の連続したヌクレオチドを含む、乳ガン診断用または治療用のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを提供する。望ましくは、前記ポリヌクレオチドは、長さが１０ないし１００ヌクレオチド、さらに望ましくは１０ないし５０ヌクレオチドであることを特徴とするポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして使われうる。
【００２５】
本発明は、また、配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド由来の１０個以上の連続したヌクレオチドを含む、乳ガン診断用または治療用のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドが固定化されている基板を有することを特徴とする乳ガン診断用マイクロアレイを提供する。望ましくは、前記ポリヌクレオチドは、長さが１０ないし１００ヌクレオチド、さらに望ましくは１０ないし５０ヌクレオチドであることを特徴とするが、その限りではない。
【００２６】
本発明は、また、配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド由来の１０個以上の連続したヌクレオチドを含む、乳ガン診断用または治療用のキットを提供する。当該キットは、前記ヌクレオチドに加えて、当該ヌクレオチドを含む容器、及び当該キットを乳ガンの診断または治療に使用するための手順を説明するための説明書を含みうる。
【００２７】
さらに、本発明は、検体から乳房組織由来の核酸試料（乳房組織試料）を得る段階と、前記乳房組織試料における配列番号４のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現レベルを決定し、その結果から乳ガンの存在を決定する段階とを含む、乳ガンの診断方法を提供する。
【００２８】
本発明の前記方法において、前記蛋白質の発現レベルは、当業者に公知の多様な方法を利用して測定できる。本発明の方法において、ＢＣＲＰ遺伝子の発現レベルは、例えば、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）レベルでＢＣＲＰ遺伝子に特異的なプローブを利用してノーザンブロッティングを行うことにより決定できる。また、ＢＣＲＰ遺伝子の発現レベルは、全てのＲＮＡを抽出した後、ＢＣＲＰ遺伝子に特異的なプライマーを利用してＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ））を行い、得られる産物を確認することによって決定することもできる。しかし、発現レベルを決定する方法がこれらの例に限定されるものではない。乳房組織由来の核酸試料は、必ずしも純粋に精製された核酸試料だけを意味するのではなく、分析方法によって分析に使われうる核酸が存在しさえすればよい場合もある。例えば、ＰＣＲを利用してＢＣＲＰ遺伝子の発現レベルを確認しようとする場合には、核酸を分離せずに細胞を破砕した試料をそのまま使用することもできる。
【００２９】
本発明の前記方法においては、例えば、前記蛋白質の発現レベルが、正常な乳房組織での発現レベルより高い場合に、乳ガンと決定できる。
【００３０】
本発明者らは、商業的に利用可能な核酸または蛋白質データベースから選択されたさまざまな核酸配列について、乳ガン細胞で特異的に発現する核酸または蛋白質をサーチした。その結果、乳ガン細胞で特異的に発現すると確認された１つの核酸またはそれから推定される蛋白質、ＢＣＲＰ核酸または蛋白質を選択した。次に、ｃＤＮＡライブラリーから前記ＢＣＲＰ全長遺伝子をサーチして配列分析し、ノーザン分析を介してこの遺伝子が乳ガン細胞株及び患者の乳ガン細胞（図１１及び１２）で特異的に発現することを確認した。反復測定により、乳ガン細胞では、正常細胞よりも２倍ほど高く発現すると確認した（図１２）。また、前記ＢＣＲＰ遺伝子によってコーディングされる蛋白質が細胞内で発現する位置を免疫細胞化学法（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ）を利用して確認した。１つの方法として、前記蛋白質の遺伝子をｐＦＬＡＧベクター中に組換え、そこから得られる組換えベクターを動物細胞株にトランスフェクトした。その後、前記遺伝子の発現をｐＦＬＡＧ蛍光システムを利用して確認した（図３ないし図５）。また、ＢＣＲＰ蛋白質の機能を確認するために、これを細胞内に過剰発現させ、前記ＢＣＲＰ蛋白質が細胞に及ぼす影響を調べた。この目的のために、前記ＢＣＲＰ蛋白質をコーディングする遺伝子を動物細胞株にトランスフェクトし、そこから全てのＲＮＡを抽出し、それを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った。前記ＲＴ−ＰＣＲによって、前記ＢＣＲＰ遺伝子、及び他のｐ５３及びｐ２１のようなアポトーシスに関連する遺伝子の発現レベルをモニタリングした（図６）。本発明者らは、また、前記ＢＣＲＰ遺伝子のプロモーターの構造を確認した。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲が以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：ＳＮＰデータに基づいたＢＣＲＰ遺伝子のサーチ
１．ＢＣＲＰ遺伝子のサーチ
別途の研究を介して乳ガンと関連性があると明らかになったＳＮＰについて、データベース（ＮＣＢＩ：米国・国立医学図書館提供のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のサーチ及び分析により、ＳＮＰが存在する部位の塩基配列を検索し、遺伝子を増幅するためのプライマーを作ることができる情報を入手した。
【００３３】
２．ＢＣＲＰ遺伝子断片の増幅
入手された塩基配列情報を利用し、サーチされたＳＮＰ周囲のＤＮＡを増幅するためのプライマーをデザインした（配列番号１及び２）。
【００３４】
次に、ゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットをプライマーとしてＰＣＲを行い、２３９ｂｐのＢＣＲＰ遺伝子断片を増幅した。このとき、使われたＰＣＲ条件は、フォワード及びリバースプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌずつ使用し、ゲノムＤＮＡ鋳型を２００ｐｇ〜１μｇ使用し、９５℃で４０秒、５７℃で４０秒、７２℃で１分間の反応をそれぞれ３５回反復した。その結果を１％アガロースゲル電気泳動を介して確認し、２３９ｂｐの予想ＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。これを全長ＢＣＲＰ遺伝子サーチのためのプローブとして使用した。
【００３５】
３．ｃＤＮＡライブラリーを介した全長ＢＣＲＰ遺伝子のサーチ
使われたｃＤＮＡライブラリーは、ヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリー（λｔｒｉｐｌｒＥｘライブラリー）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）であり、サーチ過程は、製造業者の実験指針（ＰＴ３００３−１）によった。サーチ過程を簡単に説明すれば次の通りである。
【００３６】
ｍＲＮＡを得るために、ＰＣＲを行うと同時に、先に得たＰＣＲ産物をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーサーチを実施した。サーチ用の細胞としては、一般的に多用されるＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ ｂｌｕｅ細胞を使用した。
【００３７】
まず、ライブラリーの力価を確認した結果、２セットいずれも２．０×１０９ｐｆｕ／ｍｌであった。次に、前記ｃＤＮＡライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ ｂｌｕｅのプレートに塗布した。一般的に、２ないし５×１０４ｐｆｕ／１５０ｍｍで塗布した。次に、λファージを（＋）電荷を帯びるナイロン膜に転移した。放射能同位元素で標識されたｄＣＴＰ（［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ，３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を利用してランダム開始（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ）ＤＮＡ標識法によって標識されたプローブを使用し、フィルタハイブリダイゼーション（ｆｉｌｔｅｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応を行って検出した。その結果、陽性クローンを得た。
【００３８】
４．全長ＢＣＲＰ遺伝子の塩基配列分析及び蛋白質配列予測
得られたクローンから得たＢＣＲＰ遺伝子配列を配列自動分析器（ＡＢＩ ３７００）を利用して分析し、全長ＢＣＲＰ遺伝子の塩基配列を確認した。また、ＮＣＢＩおよびプログラム（ｎｅｗ ＧＥＮＳＣＡＮＷ ｗｅｂ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して遺伝子の推定蛋白質配列を確認した。ＢＣＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３と同じであり、それによってコーディングされる蛋白質のアミノ酸配列は配列番号４と同じである。ＢＣＲＰのサーチに使われたＳＮＰは、プロモーター領域に位置し、ＢＣＲＰゲノム遺伝子は、１６０３２ないし９６５５４６に位置しており、３個のイントロンおよび４個のエクソンより構成されていることが分かった。
【００３９】
実施例２：ＢＣＲＰ遺伝子の細胞及び組織内発現の確認
１．ノーザンブロッティングを介したＢＣＲＰ遺伝子の細胞内発現の確認
実施例１で得たＰＣＲ産物をプローブとして、複数個のヒト正常組織および腫瘍組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃｏｒｐ．）についてノーザンブロッティング分析を行った。その結果を図１及び図２に示す。図１及び図２に示すように、正常組織では、心臓組織のみでＢＣＲＰ遺伝子が特異的に発現することが確認され、腫瘍組織では、乳ガン組織のみで特異的に発現することが確認された。このような結果から、本発明のＢＣＲＰ遺伝子の発現を調べることにより、乳ガンの存在が検出されうるということが分かる。図１において、ノーザンブロッティングに使われた組織は脳芯（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ）、心臓、骨格筋、結腸（ｃｏｌｏｎ）、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、及び末梢血白血球細胞であり、図２において、ノーザンブロッティングに使われたガン組織は、乳ガン、卵巣ガン、子宮ガン、肺ガン、腎臓ガン、胃ガン、結腸ガン及び直腸ガンの組織（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社で製作されたｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔを使用）であった。図１及び図２に示す１．２ｋｂという数値は、サイズマーカーを表し、ブロッティング結果は１．３７ｋｂで現れた。
【００４０】
前記ノーザンブロッティングの具体的な過程は次の通り行った。
【００４１】
（１）放射能標識されたプローブの製作
ランダム開始ＤＮＡ標識法（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｒｐ．Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ，＃１００４７６０）を使用してプローブを製作した。ＢＣＲＰ ＰＣＲ産物を精製して約２５ｎｇを使用し、同位元素［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ，２５０ μＣｉ（ＢＭＳ Ｃｏｒｐ．）を利用した。
【００４２】
（２）ハイブリダイゼーションボトルを利用したプレハイブリダイゼーション（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
７ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（＃８０１５−１，ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）を６８℃であらかじめ温めてナイロン膜を６８℃で３０分間プレハイブリダイゼーションした。
【００４３】
（３）放射性標識されたプローブの変性
放射性標識されたプローブを９５ないし１００℃で、８ないし１０分間煮沸し、その後速やかに氷中に入れた。
【００４４】
（４）ハイブリダイゼーション
１０ｍｌの新鮮なＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液に上記の放射性プローブを混合した。そしてナイロン膜が入っているハイブリダイゼーションボトルからプレハイブリダイゼーション溶液を除去し、前記放射線プローブが混合された新鮮なＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を入れた。その後、１時間ほど６８℃で振盪しながら培養した。
【００４５】
（５）洗浄
洗浄溶液１（２×ＳＳＣ、０．５５％ＳＤＳ）を利用し、室温で３０ないし４０分間洗浄した。次に、洗浄溶液２（０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を利用し、５０℃で４０分間さらに洗浄した。次に、ナイロン膜をボトルから取り出し、完全には乾かないほどに水気を除去した後、プラスチックラップで包んだ。
【００４６】
（６）前記ナイロンフィルムをＸ線フィルムに入れ、−７０℃で露光させた後、１〜２日後に取り出してバンドを確認した。
【００４７】
２．ＢＣＲＰ遺伝子の組織内発現の確認
乳ガン患者の病巣部分（ｌｅｓｉｏｎａｌ ｐａｒｔ）及び非病巣部分（ｎｏｎｌｅｓｉｏｎａｌ ｐａｒｔ）でのＢＣＲＰ遺伝子の発現を確認した。
【００４８】
図１１及び１２は、相異なる乳ガン患者の乳ガン組織由来の細胞からＲＮＡを分離し、配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図である。図１１及び図１２において、「Ｎ」及び「Ｂ．Ｎ」は非病巣部分（正常組織）のレーンであり、「Ｔ」及び「Ｂ．Ｔ」は病巣部分（乳ガン組織）のレーンである。図１１及び図１２に示すように、病巣部分（乳ガン組織）では非病巣部分（正常組織）に比べてＢＣＲＰ遺伝子の発現が増加し、比較遺伝子として選定された、ガンと関連があることがすでに明らかにされているｐ５３の発現が顕著に増加した。なお、ＲＴ−ＰＣＲにおけるｐ５３の増幅は、配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて行った。
【００４９】
図１３は、乳房の正常組織及び腫瘍組織のＲＮＡに対するノーザンブロッティング分析を行った結果を示す図である。図１３に示すように、ＢＣＲＰ遺伝子（約１．８ｋｂ）の発現が増加していることが分かる。図１３において、レーン１ないし３は、他の腫瘍供与者についての結果であり、レーン４は対照群としての正常乳房組織の結果である。レーン１ないし３の発現量の平均値を計算し、正常組織での発現量と比較した結果、乳ガン細胞では正常細胞に比べてＢＣＲＰ遺伝子が２．０５倍ほど高く発現していた。
【００５０】
実施例３：ＢＣＲＰ蛋白質の細胞内発現位置の確認
本実施例では、免疫細胞化学法を介してＢＣＲＰ遺伝子が細胞内で発現する位置を確認した。この目的のために、まず、ＢＣＲＰ遺伝子をｐＦＬＡＧベクター（Ｓｉｇｍａ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＮＹ）にクローニングした。クローニング過程は次の通りである。配列番号３のＢＣＲＰ遺伝子をＮｏｔ Ｉ酵素とＳａｌ Ｉ酵素とで消化し、ｐＦＬＡＧベクターもまた同じ酵素で消化して、ライゲーションした。クローニングされたＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡを複数の細胞株にＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ ２０００を利用してトランスフェクトした。ＢＣＲＰ遺伝子が発現されうるようにトランスフェクトされた細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した後、３．５％パラホルムアルデヒドを使用してプレート上に固定した。次に、細胞内部が染色されうるように、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で細胞を透過性にした。１％ＢＳＡブロッキング溶液を利用して余白をブロックした。Ｆｌａｇ特異的抗体を前記細胞が固定されているプレートに反応させ、Ｆｌａｇ特異的抗体（抗−ＦＬＡＧ Ｍ２）をＢＣＲＰ蛋白質−Ｆｌａｇに特異的に結合させた。最後に、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ＩｓｏＴｈｉｏＣｙａｎａｔｅ）が共役した二次抗体（抗−マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ）を前記ＢＣＲＰ蛋白質−Ｆｌａｇ−一次抗体複合体に反応させた。蛍光顕微鏡を利用し、ＦＩＴＣから発生する蛍光を介してＢＣＲＰ蛋白質が発現する位置を確認した。比較のために何もトランスフェクトさせていない細胞株にＦｌａｇ特異的抗体を利用して上記と同様の方法で共に実験した。
【００５１】
以上の結果を図３ないし図５に示す。図３ないし図５は、それぞれＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡでトランスフェクトされた結腸ガン細胞株Ｃｌｏｎｅ Ａ（ＣＡ）、一次培養された正常腎臓細胞、及びＨＥＫ ２９３細胞株についてＦＩＴＣ蛍光を観察した結果を示すものである。図３ないし図５に示すように、３つの細胞株において、ＢＣＲＰはいずれも細胞膜で観察された。
【００５２】
このような実験結果から、本発明のＢＣＲＰ蛋白質は、細胞膜で特異的に発現すると見られる。
【００５３】
実施例４：ＢＣＲＰ遺伝子の発現が細胞株内の遺伝子発現に及ぼす影響
本実施例では、ＢＣＲＰ遺伝子発現が細胞株の遺伝子発現に及ぼす影響を確認した。この目的のために、まず、ノーザンブロッティング分析を介してＢＣＲＰ遺伝子のｍＲＮＡの存在を確認した。次に、実際細胞株でＢＣＲＰ遺伝子の発現が細胞内の既に知られたガン及びアポトーシスと関連した遺伝子の発現に及ぼす影響を調べた。まず、ＣＡ（Ｃｌｏｎｅ Ａ）細胞株に前記で製作されたＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ ２０００を利用してトランスフェクトし、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した後、全てのＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲを実施した。β−アクチンを対照群として使用した。プライマーとして、ＢＣＲＰ遺伝子、β−アクチン、ｐ５３、ｐ２１、ＣｙｔＣ、カスパーゼ５、カスパーゼ３及びＡｐａｆ １遺伝子を増幅させることができるプライマーセットをそれぞれ使用した（表１）。ＲＴ−ＰＣＲの結果より得られるＰＣＲ産物の量をモニタリングすることにより、各遺伝子の発現レベルを確認することができた。
【００５４】
【表１】
2005230011.tif 000002
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲの過程は、次の通りである。ＢＣＲＰ遺伝子が過剰発現した細胞株から抽出した全てのＲＮＡをＳｕｐｅｒｅｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を利用して逆転写させてｃＤＮＡを得る。得られたｃＤＮＡ ２００ｐｇ〜１μｇを鋳型にＴａｑポリメラーゼを利用し、それぞれ１０ｐｍｏｌのフォワード及びリバースプライマー（表１参照）でＰＣＲを行った。鋳型に使われたゲノムＤＮＡは、ＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡであり、トランスフェクトされたＣＡ細胞株と対照群細胞とから抽出された全てのＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型に使用してＰＣＲを行った。このとき使われたＰＣＲ条件は、９５℃で４０秒、増幅対象遺伝子によってそれぞれ異なるアニーリング温度で４０秒、７２℃で１分間の反応をそれぞれ３０回反復した。前記アニーリング温度は、β−アクチン、カスパーゼ５及びＢＣＲＰの場合に５８℃；ｐ５３、ｐ２１、ＣｙｔＣ、カスパーゼ３及びＡｐａｆ １の場合に５２℃であった。増幅産物を１％アガロースゲル電気泳動を介して確認し、その結果を図６に示す。図６において、「Ｃ」はコントロールとしてのトランスフェクトされていないＣＡ細胞株を示し、「ＣＡ」はトランスフェクトされたＣＡ細胞株を示す。図６に示すように、ｐ５３の発現が増加し、ｐ５３−依存性成長停止（ａｒｒｅｓｔ）の一時的な調節因子として知られているｐ２１の発現が増加した。しかし、それ以外の他の遺伝子については発現の差は見られなかった。
【００５６】
実施例５：ＢＣＲＰ遺伝子の過剰発現が細胞株の増殖とアポトーシスとに及ぼす影響
１．ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析
ＭＴＴ分析を介して細胞内でのＢＣＲＰ遺伝子の過剰発現が細胞株の増殖とアポトーシスとに及ぼす影響を確認した。ＭＴＴ分析は、生きている細胞内のミトコンドリア脱水素酵素がＭＴＴを還元させた結果生成されるホルマザンの吸光度を測定する方法であり、測定された吸光度は、生きていて代謝的に旺盛な細胞の濃度を反映する。分析に使われた細胞株は、Ｃｌｏｎｅ Ａ（ＣＡ）およびＣＸ−１（結腸ガン細胞株）、並びに正常腎臓細胞株であるＨＥＫ ２９３である。実施例４のように、ｐＦＬＡＧ−ＢＣＲＰベクターＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ ２０００を利用してトランスフェクトし、対照群としてはｐＦＬＡＧのみをトランスフェクトしたベクター対照群、何もトランスフェクトしていないが、同じストレスを受けたナッシング対照群（ｎｏｔｈｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）、そして細胞がないブランク対照群を使用した。
【００５７】
実験結果は、二回の反復実験から得たものである。ＣＡ及びＣＸ−１細胞株では対照群に比べて細胞増殖が少なかった。すなわち、細胞成長が対照群に比べて抑制された。また、ＨＥＫ ２９３細胞株の場合にも、結腸ガン細胞株（ＣＡ及びＣＸ−１）と同じように、２つの他の対照群に比べて細胞増殖が相対的に少なかった。以上の結果を図７に示す。図７は、ＨＥＫ ２９３、ＣＡ及びＣＸ−１（それぞれ、Ａ，Ｂ及びＣ）細胞株でのＢＣＲＰの過剰発現が細胞株の増殖に及ぼす影響を評価した結果である。
【００５８】
２．アポトーシス分析
この分析実験では、ＨＥＫ ２９３、ＣＡ及びＣＸ−１細胞株を使用し、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を利用してＢＣＲＰ遺伝子の発現がアポトーシスに及ぼす影響を調べた。対照群としては、ｐＦＬＡＧベクターのみをトランスフェクトしたベクター対照群を使用した。
【００５９】
二回の反復分析を行った結果、ＣＡ及びＣＸ−１では、二回とも対照群細胞に比べてアポトーシスが弱く現れたが、ＨＥＫ ２９３ではほとんど変化が起きていないか、または弱いアポトーシスの傾向を示した。分析結果を図８ないし図１０に示す。図８ないし図１０は、それぞれＨＥＫ ２９３、ＣＡ及びＣＸ−１についての蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による分析結果を示す。
【００６０】
実施例６：ヒト乳ガン細胞でのアポトーシスがＢＣＲＰ遺伝子の発現に及ぼす影響
従来、ヒト乳ガン細胞に抗ガン剤であるタキソール（ｔａｘｏｌ）を処理すると、アポトーシスが誘導されることが知られている。本実施例では、アポトーシスが起こる場合のＢＣＲＰ遺伝子の発現レベルを調べるために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株をタキソール処理してアポトーシスを誘導し、ＢＣＲＰ遺伝子の発現レベルを上記の方法に従ってＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。
【００６１】
図１４は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株をタキソール処理した場合の、細胞形態の変化を示す図である。図１４のＡはタキソール処理前の細胞形態を示し、図１４のＢはタキソール処理後の細胞形態を示す。図１４のＢに示すように、タキソール処理によってアポトーシスが起こることが分かる。
【００６２】
図１５は、タキソール処理がＢＣＲＰ遺伝子の発現に及ぼす影響をＲＴ−ＰＣＲ法を利用して確認した結果を示す図である。図１５に示すように、タキソール処理によってＢＣＲＰ遺伝子の発現が増加することが分かる。
【００６３】
以上のような結果から、本発明のＢＣＲＰ遺伝子によって細胞増殖が抑制され、アポトーシスが強く誘導されることはないが、対照群に比べて弱く誘導されることが分かった。これに付け加え、間接的な証拠であるタキソール処理した細胞株でのＢＣＲＰの発現などの結果を総合してみるならば、ＢＣＲＰがアポトーシスに関与することが推定される。また、実施例４で確認したように、ＢＣＲＰ遺伝子によって、ｐ５３及びｐ２１の発現が顕著に増加することが分かった。このような結果を総合してみれば、ＢＣＲＰ遺伝子の過剰発現によってｐ５３の発現量が増加し、ｐ５３の活性化によってｐ２１の発現量が増加すると見られる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の 乳ガン関連蛋白質、それをコーディングする遺伝子、及び該蛋白質及び該遺伝子を利用した乳ガンの診断方法は、乳ガン診断関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】さまざまな正常組織に対してＢＣＲＰ遺伝子特異的プローブを使用してノーザンブロッティングした結果を示す。
【図２】さまざまなガン組織に対してＢＣＲＰ遺伝子特異的プローブを使用してノーザンブロッティングした結果を示す。
【図３】ＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡでトランスフェクトされた結腸ガン細胞株ＣＡに対してＦＩＴＣ蛍光を観察して細胞内でＢＣＲＰが発現して存在する位置を調べた結果を示す。
【図４】ＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡでトランスフェクトされた、一次培養された正常腎臓細胞に対してＦＩＴＣ蛍光を観察して細胞内でＢＣＲＰが発現して存在する位置を調べた結果を示す。
【図５】ＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞株に対してＦＩＴＣ蛍光を観察して細胞内でＢＣＲＰが発現して存在する位置を調べた結果を示す。
【図６】ＢＣＲＰ遺伝子でトランスフェクトされたＣＡ細胞株でのＢＣＲＰの発現レベル、及び、ＢＣＲＰが過剰発現した場合のアポトーシス関連のさまざまな遺伝子の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果を示す。
【図７】細胞増殖分析（ＭＴＴ分析）を介して、ＨＥＫ ２９３、ＣＡ及びＣＸ−１（それぞれ、Ａ，Ｂ及びＣ）細胞株でＢＣＲＰの過剰発現が細胞株の増殖に及ぼす影響を評価した結果を示す。
【図８】ＢＲＣＰのトランスフェクトによる過剰発現が細胞株に及ぼす影響を見るために、ＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３に対してアポトーシス分析を行い、さらにＦＡＣＳ分析を行った結果を示す。
【図９】ＢＲＣＰのトランスフェクトによる過剰発現が細胞株に及ぼす影響を見るために、ＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡでトランスフェクトされたＣＡに対してアポトーシス分析を行い、さらにＦＡＣＳ分析を行った結果を示す。
【図１０】ＢＲＣＰのトランスフェクトによる過剰発現が細胞株に及ぼす影響を見るために、ＢＣＲＰ−ｐＦＬＡＧベクターＤＮＡでトランスフェクトされたＣＸ−１に対してアポトーシス分析を行い、さらにＦＡＣＳ分析を行った結果を示す。
【図１１】乳ガン患者の乳ガン組織及び正常組織からＲＮＡを分離し、配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＢＣＲＰの発現の差を調べた結果を表す。
【図１２】乳ガン患者の乳ガン組織及び正常組織からＲＮＡを分離し、配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＢＣＲＰの発現の差を調べた結果を表す。
【図１３】相異なる３名の乳ガン患者の乳房腫瘍組織のＲＮＡに対してノーザンブロッティング分析を行った結果を示す。
【図１４】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を抗ガン剤であるタキソールで処理してアポトーシスを誘導した場合の細胞形態の変化を示す。
【図１５】図１４に示す細胞から抽出されたＲＮＡを利用し、タキソール処理がＢＣＲＰ遺伝子の発現に及ぼす影響をＲＴ−ＰＣＲを利用して確認した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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