(57)【要約】【課題】液体状の試料に液体状の反応試薬を添加するだけで、感度良く糖鎖の解析を行うことを可能とし、液体−液体の反応で有るため検出システムの微小化を可能とする。また、特異性の高い糖転移酵素を用いてため、試料を予め標識したり精製したりする必要はなく、非常に簡便に糖鎖の解析を行うことを可能とする。【解決手段】糖転移酵素の反応性に基づく糖鎖の検出方法であって、糖切断酵素を作用させる前と糖切断酵素を作用させた後の糖転移酵素の反応性の変化に基づく糖鎖の解析方法、又は、前記解析方法を用いた糖鎖解析装置、糖鎖センサー、糖鎖センサーチップ、診断薬、健康診断装置、健康診断センサー。健康診断センサーチップ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖転移酵素の反応性に基づく糖鎖の検出方法。
【請求項２】
糖切断酵素を作用させる前と糖切断酵素を作用させた後の糖転移酵素の反応性の変化に基づく糖鎖の解析方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法及び／又は請求項２に記載の方法を数個組み合わせることによる糖鎖の解析方法。
【請求項４】
糖転移酵素反応によって生じるヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸を検出することによって糖転移酵素の反応性を検出することによる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
糖転移酵素が、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
糖切断酵素が、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ（或いはノイラミニダーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、マンノシダーゼ、グルコシダーゼ、キシロシダーゼ、グルクロニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
検出されるヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸がＵＤＰ、ＧＤＰ、ＣＭＰからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
糖転移酵素反応によって生じたヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸の量を、少なくとも一つ以上の酵素反応により、検出が容易な物質の量に変換し、変換された物質の量を測定することによって、糖転移酵素反応によって生じたヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸の量を測定することによる、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、変換された物質の量を測定する方法が、吸光度変化測定、発光測定、電気信号測定からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＵＤＰ又はＧＤＰの検出方法が、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む請求項９に記載の方法。
（Ａ）ピルビン酸キナーゼ存在下、糖転移酵素反応によって生じたＵＤＰ又はＧＤＰとホスホエノールピルビン酸を反応させ、ＵＴＰ又はＧＴＰとピルビン酸を生成する工程。
（Ｂ）乳酸脱水素酵素存在下、上記（Ａ）の工程によって生じたピルビン酸とＮＡＤＨを反応させ、乳酸とＮＡＤを生成する工程。
（Ｃ）上記（Ｂ）の工程によって減少したＮＡＤＨの量を測定する工程。
【請求項１１】
ＣＭＰの検出方法が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む請求項９に記載の方法。
（Ａ）  ミオキナーゼ存在下、糖転移酵素反応によって生じたＣＭＰとＡＴＰを反応させ、ＣＤＰとＡＤＰを生成する工程。
（Ｂ）ピルビン酸キナーゼ存在下、上記（Ａ）の工程によって生じたＣＤＰ及びＡＤＰとホスホエノールピルビン酸を反応させ、ＣＴＰ及びＡＴＰとピルビン酸を生成する工程。
（Ｃ）乳酸脱水素酵素存在下、上記（Ｂ）の工程によって生じたピルビン酸とＮＡＤＨを反応させ、乳酸とＮＡＤを生成する工程。
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程によって減少したＮＡＤＨの量を測定する工程。
【請求項１２】
ＵＤＰ又はＧＤＰの検出方法が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む請求項９に記載の方法。
（Ａ）ピルビン酸キナーゼ存在下、糖転移酵素反応によって生じたＵＤＰ又はＧＤＰとホスホエノールピルビン酸を反応させ、ＵＴＰ又はＧＴＰとピルビン酸を生成する工程。
（Ｂ）上記（Ａ）の工程の後、ピルビン酸キナーゼの酵素活性を失活させる工程。
（Ｃ）ヌクレオシド二リン酸キナーゼ存在下、上記（Ａ）の工程により生じたＵＴＰ又はＧＴＰとＡＤＰを反応させ、ＵＤＰ又はＧＤＰ及びＡＴＰを生成する工程。
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程により生じたＡＴＰ量をルシフェラーゼにより測定する工程。
【請求項１３】
ＣＭＰの検出方法が、以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を含む請求項９に記載の方法。
（Ａ）  ミオキナーゼ存在下、糖転移酵素反応によって生じたＣＭＰとＡＴＰを反応させ、ＣＤＰとＡＤＰを生成する工程。
（Ｂ）ピルビン酸キナーゼ存在下、上記（Ａ）の工程によって生じたＣＤＰ及びＡＤＰとホスホエノールピルビン酸を反応させ、ＣＴＰ及びＡＴＰとピルビン酸を生成する工程。
（Ｃ）上記工程（Ｂ）の後、ミオキナーゼ及びピルビン酸キナーゼの酵素活性を失活させる方法。
（Ｄ）ヌクレオシド二リン酸キナーゼ存在下、上記（Ｂ）の工程により生じたＣＴＰ又はＡＴＰとＡＤＰを反応させ、ＣＤＰ又はＡＤＰ及びＡＴＰを生成する工程。
（Ｅ）上記（Ｄ）の工程により生じたＡＴＰ量をルシフェラーゼにより測定する工程。
【請求項１４】
請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた糖鎖解析装置。
【請求項１５】
請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた糖鎖センサー。
【請求項１６】
請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた糖鎖センサーチップ。
【請求項１７】
請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた診断薬。
【請求項１８】
請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた健康診断装置。
【請求項１９】
請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた健康診断センサー。
【請求項２０】
請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた健康診断センサーチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、迅速且つ簡便な検出方法及び解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖鎖は種々の単糖がグリコシド結合により連結した物質であり、近年の研究により、発生・分化、神経系、免疫系、癌の転移等の様々な生物現象に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。それ故、医薬品をはじめとする種々の分野への応用が期待されており、この糖鎖に関する関心が益々高まっている。
糖鎖の種々の分野での実用化のためには、分子生物学的解析方法、糖鎖合成技術の開発に加え、糖鎖の構造解析技術が重要となる。しかし、糖鎖は発色や、蛍光、或いはＵＶ吸収を殆ど示さないためから検出が困難であり、さらに、分岐構造を有することや構成単糖間の結合様式が多様で有ることから、糖鎖の解析はペプチド解析や核酸解析と比較してより困難なものであると言える。
【０００３】
現在知られている糖鎖解析方法は、糖鎖を標識した後分析する方法と、標識せずに分析する方法の２種類に分類される。標識による分析方法の一つである二次元マップ法は、蛍光物質２−アミノピリジンにより蛍光標識された糖鎖をモードの異なる２種類のＨＰＬＣカラムにより分析し、各カラムでの分析値を既知の分析マップに参照してサンプルの糖鎖構造を推測する方法である（例えば、非特許文献１〜５参照）。また、標識による分析方法の別の方法であるＦＡＣＥ法（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、電荷を有する蛍光物質で蛍光標識した糖鎖を電気泳動により分析し、同様に構造の推測を行う方法である。これら蛍光標識による方法は（例えば、非特許文献６〜８参照）、感度が良いため微量のサンプルを分析できるという点でよく用いられている方法であるが、生体試料からの糖蛋白質或いは糖脂質の精製、精製されたサンプルからの糖鎖の切り出し、糖鎖の標識反応・標識後の粗精製などの前処理が必要であるため、操作が煩雑で時間を要するという問題点があった。また、これらの方法は基本的にはＨＰＬＣ分析や電気泳動分析であるため、他種類の糖鎖や蛍光物質の混在する未精製生体試料を直接分析することは困難であり、簡便な方法といえるものではなかった。
【０００４】
未標識糖鎖の分析方法は主に分析機器によるものと、抗体などの生体機能分子を利用するものが知られている。分析機器による分析方法の一つであるＨＰＡＥ−ＰＡＤ法（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｐｕｌｓｅｄ  Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）は、糖鎖がアルカリ性溶液中で陰イオン性を示す性質を利用したもので、糖鎖を強アルカリを移動相とした陰イオン交換クロマトにより分析し、パルスドアンペロメトリ検出器により糖鎖を検出する方法である（例えば、非特許文献９参照）。本方法は糖鎖を標識せずに分析できるという点で優れた方法であるが、特殊な装置が必要である、感度的には蛍光標識法に劣る、未標識標準物質の調製が困難である、普及率が低いため情報が少ない等の問題点があった。また、蛍光標識法と同様、未精製生体試料の直接分析は困難であり、簡便な方法といえるものではなかった。その他の機器分析方法としては、ＮＭＲによる方法（例えば、非特許文献１０参照）、質量分析による方法（例えば、非特許文献１１〜１３参照）の開発が進んでいるが、今のところ糖鎖解析装置として完成しているものはなく、やはり、未精製生体試料の直接分析は困難であるという欠点を持っている。
【０００５】
上記の様な機器分析による方法とは異なり、生体機能分子を利用する方法では、生体の高い特異性・分子認識能力を利用するため、未精製生体試料の直接分析が可能であると考えられる。これら生体機能分子として、糖鎖を特異的に認識して結合・架橋形成するタンパク質であるレクチンや、抗糖鎖抗体がしばしば糖鎖の検出・解析に用いられる。しかしながら、これらの抗体やレクチンは糖鎖を特異的に認識して結合はするものの、結合するのみであり、結合したことを検出し得る何らかのシグナルを発することはないため、試料溶液にこれら生体機能分子溶液を添加・反応させても結合したかどうかを溶液中で検出することは不可能であった。そのため、結合を検出するためには、目的の生体試料又は抗体やレクチン等の生体分子を固定化したものを用いて反応を行わなければならず、さらに、生体分子を予め標識しておくか生体分子が糖鎖に結合した後、二次抗体などの別の手法により結合した生体分子を検出しなければならないため、非常に煩雑なものであった。
【０００６】
以上のように、糖鎖を高感度に簡便且つ迅速に解析でき、さらに未精製生体試料の糖鎖を直接解析する技術は開発されていないことが実状であった。
【０００７】
【非特許文献１】
「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，８５巻，ｐ２５７，１９７８年
【０００８】
【非特許文献２】
「アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１６３巻，ｐ４８９，１９８７年
【０００９】
【非特許文献３】
「アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１７１巻，ｐ７３，１９８８年
【００１０】
【非特許文献４】
「アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２２６巻，ｐ１３０，１９９５年
【００１１】
【非特許文献５】
「生化学実験法２３  糖蛋白質糖鎖研究法」，株式会社学会出版センタ，１９８９年
【００１２】
【非特許文献６】
「ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」，６４６巻，ｐ２２７，１９９３年
【００１３】
【非特許文献７】
「ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」，７０５巻，ｐ８９，１９９５年
【００１４】
【非特許文献８】
「ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」，７２０巻，ｐ２９５，１９９６年
【００１５】
【非特許文献９】
「メソッド  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」，１７９巻，ｐ６５，１９８９年
【００１６】
【非特許文献１０】
「アドバンスィーズ  イン  カルボハイドレイト  ケミストリー  アンドバイオケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ    ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，４１巻，ｐ２０９，１９８３年
【００１７】
【非特許文献１１】
「アドバンスィーズ  イン  カルボハイドレイト  ケミストリー  アンドバイオケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ    ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，４５巻，ｐ１９，１９８７年
【００１８】
【非特許文献１２】
「ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー  ビー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ）」，７３４巻，ｐ１６９，１９９９年
【００１９】
【非特許文献１３】
「アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２０７巻，ｐ２０３，１９９２年
【００２０】
【非特許文献１４】
「電学論Ｅ」，１１９巻，ｐ４７６，１９９９年
【００２１】
【非特許文献１５】
「プロシィーディングス  オブ  ザ  マイクロ−ＴＡＳ  ’９８ワークショップ  バンフ  カナダ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏ−ＴＡＳ  ’９８  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，  Ｂａｎｆｆ，  Ｃａｎａｄａ）」，ｐ１，１９９８年
【００２２】
【非特許文献１６】
「アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），７１巻，ｐ５６６，１９９９年
【００２３】
【非特許文献１７】
「アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），７０巻，ｐ６８４，１９９８年
【００２４】
【非特許文献１８】
「アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），７０巻，ｐ５１７２，１９９８年
【００２５】
【非特許文献１９】
「アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），７０巻，ｐ３７９０，１９９８年
【００２６】
【非特許文献２０】
「アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），７１巻，ｐ４６６９，１９９９年
【００２７】
【非特許文献２１】
「ハンドブック  オブ  グリコシルトランスフェラーゼ  アンド  リレイティッド  ジーンズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ）」，スプリンガー，２００１年
【００２８】
【非特許文献２２】
「アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，３６巻，ｐ４３，１９７０年
【００２９】
【非特許文献２３】
「カレント  オピニオン  イン  ドラッグ  ディスカバリー  アンド  ディヴェロップメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」，３巻，ｐ７５６，２０００年
【００３０】
【非特許文献２４】
「蛋白質  核酸  酵素  １９９８年１２月号増刊  糖鎖生物学  糖鎖情報発信から受信のメカニズムまで」，共立出版株式会社，ｐ１３０，１９９８年
【００３１】
【課題を解決するための手段】
未精製生体試料の分析が可能であるという点及び標識化等の予備処理が不要な点で、生体機能分子を用いた糖鎖解析が有用であるということは明らかである。糖鎖の検出に使用され得る生体機能分子、すなわち糖鎖に作用する生体機能分子は、先述のレクチン、抗糖鎖抗体、の他に糖鎖消化酵素（グリコシダーゼ）、糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）、硫酸基転移酵素などが挙げられる。本発明者らは、これら生体機能分子の内、糖転移酵素が糖鎖を特異的に認識し、かつ糖鎖との反応（或いは結合）により検出可能なシグナルを発する生体機能分子であることに着目した。
【００３２】
糖転移酵素は糖ヌクレオチドを糖供与体とし、糖受容体となる糖鎖の特定に位置に特定の形式で糖を連結する酵素であり、糖転移酵素反応により新生糖鎖の他にヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸（以下、ＮＤＰ／ＮＭＰと省略する場合もある）を生成する。このＮＤＰ／ＮＭＰは種々の方法により容易に検出が可能であるので、糖転移反応が生じたかどうかはＮＤＰ／ＮＭＰの生成の有無を検出することにより検出することが可能となる。すなわち、ある特定の糖鎖構造を基質とする糖転移酵素と該糖転移酵素の糖供与体となる糖ヌクレオチドを含んでなる反応液中に測定対象である生体試料を添加し、該糖転移酵素が反応し得る条件下において反応を行った後、或いは該糖転移酵素反応中に、ＮＤＰ／ＮＭＰの測定を行い、ＮＤＰ／ＮＭＰが検出されれば、該生体試料中に該糖転移酵素の基質となる糖鎖構造が含まれる事が判る。しかも、糖転移酵素反応により生じるＮＤＰ／ＮＭＰの量は、該生体試料中の該糖鎖構造の濃度に比例するため、糖鎖構造の検出と同時に該糖鎖構造の定量も可能となる。
【００３３】
例えば、糖転移酵素の一種であるβ１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、β１−４ＧａｌＴと省略する場合もある）は、αラクトアルブミン非存在下ではＵＤＰ−ガラクトース（以下、ＵＤＰ−Ｇａｌと省略する場合もある）を糖供与体として、糖受容体基質ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｒ：糖、糖鎖を示す）のＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃと省略する場合もある）にβ１−４結合でガラクトース（以下、Ｇａｌと省略する場合もある）を転移する酵素であり、該糖転移酵素反応によりＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｇａｌ：ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｒ：糖、糖鎖を示す）とウリジン  ５’−二リン酸（以下、ＵＤＰと省略する場合もある）が生成する。そこで、該β１−４ＧａｌＴとＵＤＰ−Ｇａｌを含む反応液中に生体試料を添加し、適温にて一定時間反応を行った後、或いは反応中にＵＤＰの測定を行った結果、ＵＤＰの生成が検出された場合、該生体試料中にＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒは糖、糖鎖を示す）存在することが判る。また、ＵＤＰの生成量を測定するによりＧｌｃＮＡｃ−Ｒの定量も可能になる。
【００３４】
また、糖鎖の構成単糖を特異的に切断する酵素であるグリコシダーゼにより処理した生体試料と、処理しない生体試料の糖転移酵素反応性を比較することにより更に多くの糖鎖構造情報が得られる。例えば、生体試料中にＧｌｃＮＡｃ−ＲとＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲとＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒが混在している場合、β１−４ＧａｌＴを用いて該生体試料を測定すると、ＧｌｃＮＡｃ−Ｒのみが検出・定量される。次に、該生体試料をβ１−４ガラクトースを特異的に切断するβ１−４ガラクトシダーゼにより消化した後、β１−４ＧａｌＴを用いて該生体試料を測定すると、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの分だけβ１−４ＧａｌＴの反応量（ＵＤＰ生成量）が増加することから、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを検出、定量することが可能となる。同様に、β１−３ガラクトースを特異的に切断するβ１−３ガラクトシダーゼにより消化を行うことで、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ構造を検出、定量することが可能となる。また、フコース（以下、Ｆｕｃと省略する場合もある）を特異的に切断するフコシダーゼで処理した後で、β１−４ＧａｌＴの反応量（ＵＤＰ生成量）が増加しないことからフコシル化されたＧｌｃＮＡｃ−Ｒが存在しないことが確認される。このように、グリコシダーゼ消化と糖転移酵素の組み合わせにより、より多くの糖鎖構造情報を得ることが可能である。
【００３５】
このような、糖転移酵素とグリコシダーゼのセットをいくつか組み合わせることによりより高度な糖鎖構造解析が可能と考えられる。
【００３６】
以上の様に、糖転移酵素を糖鎖センサー素子として、ＮＤＰ／ＮＭＰを反応シグナルとして利用することにより簡便且つ迅速な糖鎖の構造解析及び定量が可能であることを見出した。
【００３７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００３８】
項１．糖転移酵素の反応性に基づく糖鎖の検出方法。
項２．糖切断酵素を作用させる前と糖切断酵素を作用させた後の糖転移酵素の反応性の変化に基づく糖鎖の解析方法。
項３．項１に記載の方法及び／又は請求項２に記載の方法を数個組み合わせることによる糖鎖の解析方法。
項４．糖転移酵素反応によって生じるヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸を検出することによって糖転移酵素の反応性を検出することによる、項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．糖転移酵素が、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも一つである、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．糖切断酵素が、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ（或いはノイラミニダーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、マンノシダーゼ、グルコシダーゼ、キシロシダーゼ、グルクロニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つである、項２〜５のいずれかに記載の方法。
項７．検出されるヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸がＵＤＰ、ＧＤＰ、ＣＭＰからなる群より選択される少なくとも一つである、項４〜６のいずれかに記載の方法。
項８．糖転移酵素反応によって生じたヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸の量を、少なくとも一つ以上の酵素反応により、検出が容易な物質の量に変換し、変換された物質の量を測定することによって、糖転移酵素反応によって生じたヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸の量を測定することによる、項４〜７のいずれかに記載の方法。
項９．請求項８に記載の方法において、変換された物質の量を測定する方法が、吸光度変化測定、発光測定、電気信号測定からなる群より選択される少なくとも一つである、項８に記載の方法。
項１０．ＵＤＰ又はＧＤＰの検出方法が、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含む項９に記載の方法。
（Ａ）ピルビン酸キナーゼ存在下、糖転移酵素反応によって生じたＵＤＰ又はＧＤＰとホスホエノールピルビン酸を反応させ、ＵＴＰ又はＧＴＰとピルビン酸を生成する工程。
（Ｂ）乳酸脱水素酵素存在下、上記（Ａ）の工程によって生じたピルビン酸とＮＡＤＨを反応させ、乳酸とＮＡＤを生成する工程。
（Ｃ）上記（Ｂ）の工程によって減少したＮＡＤＨの量を測定する工程。
項１１．ＣＭＰの検出方法が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む項９に記載の方法。
（Ａ）  ミオキナーゼ存在下、糖転移酵素反応によって生じたＣＭＰとＡＴＰを反応させ、ＣＤＰとＡＤＰを生成する工程。
（Ｂ）ピルビン酸キナーゼ存在下、上記（Ａ）の工程によって生じたＣＤＰ及びＡＤＰとホスホエノールピルビン酸を反応させ、ＣＴＰ及びＡＴＰとピルビン酸を生成する工程。
（Ｃ）乳酸脱水素酵素存在下、上記（Ｂ）の工程によって生じたピルビン酸とＮＡＤＨを反応させ、乳酸とＮＡＤを生成する工程。
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程によって減少したＮＡＤＨの量を測定する工程。
項１２．ＵＤＰ又はＧＤＰの検出方法が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む項９に記載の方法。
（Ａ）ピルビン酸キナーゼ存在下、糖転移酵素反応によって生じたＵＤＰ又はＧＤＰとホスホエノールピルビン酸を反応させ、ＵＴＰ又はＧＴＰとピルビン酸を生成する工程。
（Ｂ）上記（Ａ）の工程の後、ピルビン酸キナーゼの酵素活性を失活させる工程。
（Ｃ）ヌクレオシド二リン酸キナーゼ存在下、上記（Ａ）の工程により生じたＵＴＰ又はＧＴＰとＡＤＰを反応させ、ＵＤＰ又はＧＤＰ及びＡＴＰを生成する工程。
（Ｄ）上記（Ｃ）の工程により生じたＡＴＰ量をルシフェラーゼにより測定する工程。
項１３．ＣＭＰの検出方法が、以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を含む項９に記載の方法。
（Ａ）  ミオキナーゼ存在下、糖転移酵素反応によって生じたＣＭＰとＡＴＰを反応させ、ＣＤＰとＡＤＰを生成する工程。
（Ｂ）ピルビン酸キナーゼ存在下、上記（Ａ）の工程によって生じたＣＤＰ及びＡＤＰとホスホエノールピルビン酸を反応させ、ＣＴＰ及びＡＴＰとピルビン酸を生成する工程。
（Ｃ）上記工程（Ｂ）の後、ミオキナーゼ及びピルビン酸キナーゼの酵素活性を失活させる方法。
（Ｄ）ヌクレオシド二リン酸キナーゼ存在下、上記（Ｂ）の工程により生じたＣＴＰ又はＡＴＰとＡＤＰを反応させ、ＣＤＰ又はＡＤＰ及びＡＴＰを生成する工程。
（Ｅ）上記（Ｄ）の工程により生じたＡＴＰ量をルシフェラーゼにより測定する工程。
項１４．項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた糖鎖解析装置。
項１５．項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた糖鎖センサー。
項１６．請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた糖鎖センサーチップ。
項１７．請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた診断薬。
項１８．請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた健康診断装置。
項１９．請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた健康診断センサー。
項２０．請求項１〜１３に記載のいずれかの方法を用いた健康診断センサーチップ。
【００３９】
【発明の実施の形態】
本発明は、糖転移酵素の高い基質特性及び反応によりヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸（以下、ＮＤＰ／ＮＭＰと省略する場合もある）を生じるという性質を利用した糖鎖解析方法であり、未知試料に対する糖転移酵素の反応性を反応により生じるＮＤＰ／ＮＭＰを測定することを特徴とする糖鎖解析方法である。さらに、本発明は、種々のグリコシダーゼ消化を行う前と行った後の種々の糖転移酵素の反応性の差を解析することを特徴とする糖鎖解析方法である。
【００４０】
本発明の糖転移酵素反応
本発明において、糖転移酵素とは糖ヌクレオチドを糖供与体として糖受容体となる糖鎖に糖を連結し、新生糖鎖とヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸（以下、ＮＤＰ／ＮＭＰと省略する場合もある）を生じるものであって、該性質を有する限りいかなる形態であっても良い。糖転移酵素は天然より抽出されたものであっても、遺伝子組み換えにより生産されたものであってもよく、いかなる生物種由来のものであっても良い。また、夾雑する糖転移酵素或いは交雑するグリコシダーゼが糖転移反応に影響するほど存在するものでなければ、必ずしも単一精製標品で無くてもよい。また、糖転移酵素反応に影響しない範囲で糖転移酵素に別のタンパク質或いはペプチドが融合した融合型糖転移酵素を用いることも可能である。さらに、種々の支持体に糖転移酵素が結合した形態の固定化糖転移酵素を用いることも可能である。また、例えば本発明の糖鎖検出系を微小化して、マイクロトータル分析システム（以下μＴＡＳと省略する場合もある）（例えば、非特許文献１４〜２０参照）等のバイオチップとして分析する場合は、糖転移酵素反応室に糖転移酵素溶液を供給する形のチップであっても、糖転移酵素室の糖転移酵素が固定化されている形のチップであっても良い。本発明に用いる糖転移酵素は、基質特異性がよく知られているものが好ましいが、基質特異性が不明確な糖転移酵素であっても、予備実験によりその基質特異性を確認することで本発明に用いることは可能である。
【００４１】
本発明に用いる糖転移酵素は例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、ＧａｌＴと省略する場合もある）、フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦｕｃＴと省略する場合もある）、シアリルトランスフェラーゼ（以下、ＳｉａＴと省略する場合もある）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（以下、ＧｌｃＮＡｃＴと省略する場合もある）、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（以下、ＧａｌＮＡｃＴと省略する場合もある）、マンノシルトランスフェラーゼ（以下、ＭａｎＴと省略する場合もある）、グルコシルトランスフェラーゼ（以下、ＧｌｃＴと省略する場合もある）、キシロシルトランスフェラーゼ（以下、ＸｙｌＴと省略する場合もある）等が使用可能であるが（例えば、非特許文献２１参照）、糖転移反応によりヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸を生じるもので有ればいかなる種類のものでも使用できる。
【００４２】
例えば、ＧａｌＴとしては、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＩＩ、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＩＩＩβ１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＩＶ、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖ、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＶＩβ１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＶＩＩ、β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ、β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＩＩ、β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＩＩＩ、β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＩＶ、β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖ、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ等が例示されるが（例えば、非特許文献２１参照）、ＵＤＰ−ガラクトース（以下、ＵＤＰ−Ｇａｌと省略する場合もある）を糖供与体としてガラクトースを転移し反応産物としてウリジン  ５’−二リン酸（以下、ＵＤＰと省略する場合もある）を生じるものであればいかなるものでも用いることが可能である。
【００４３】
また、例えば、ＦｕｃＴとしては、α１−２フコシルトランスフェラーゼ−Ｉ、α１−２フコシルトランスフェラーゼ−ＩＩ、α１−３／４フコシルトランスフェラーゼ、α１−３フコシルトランスフェラーゼ−ＩＶ、α１−３フコシルトランスフェラーゼ−Ｖ、α１−３フコシルトランスフェラーゼ−ＶＩ、α１−３フコシルトランスフェラーゼ−ＶＩＩ、α１−３フコシルトランスフェラーゼ−ＩＸ、α１−６フコシルトランスフェラーゼ等が例示されるが（例えば、非特許文献２１参照）、ＧＤＰ−フコース（以下、ＧＤＰ−Ｆｕｃと省略する場合もある）を糖供与体としてフコースを転移し、反応産物としてグアノシン  ５’−二リン酸（以下、ＧＤＰと省略する場合もある）を生じるものであればいかなるものでも用いることが可能である。
【００４４】
また、例えば、ＳｉａＴとしては、α２−３シアリルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ）、α２−３シアリルトランスフェラーゼ−ＩＩ（ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩ）、α２−３シアリルトランスフェラーゼ−ＩＩＩ（ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩ）、α２−３シアリルトランスフェラーゼ−ＩＶ（ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＶ）、α２−３シアリルトランスフェラーゼ−Ｖ（ＳＴ３Ｇａｌ−Ｖ）、ガラクトースα２−６シアリルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）、Ｎ−アセチルガラクトサミンα２−６シアリルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ）、Ｎ−アセチルガラクトサミンα２−６シアリルトランスフェラーゼ−ＩＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩ）、Ｎ−アセチルガラクトサミンα２−６シアリルトランスフェラーゼ−ＩＩＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩＩ）、Ｎ−アセチルガラクトサミンα２−６シアリルトランスフェラーゼ−ＩＶ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＶ）、α２−８シアリルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＳＴ８Ｓｉａ−Ｉ）、α２−８シアリルトランスフェラーゼ−ＩＩ（ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ）、α２−８シアリルトランスフェラーゼ−ＩＩＩ（ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩ）、α２−８シアリルトランスフェラーゼ−ＩＶ（ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶ）、α２−８シアリルトランスフェラーゼ−Ｖ（ＳＴ８Ｓｉａ−Ｖ）等が例示されるが（例えば、非特許文献２１参照）、ＣＭＰ−シアル酸（以下、ＣＭＰ−Ｓｉａと省略する場合もある）を糖供与体としてシアル酸を転移し、反応産物として５’−シチジル酸（以下、ＣＭＰと省略する場合もある）を生じるものであればいかなるものでも用いることが可能である。
【００４５】
また、例えば、ＧｌｃＮＡｃＴとしては、β１−２  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＧｎＴ−Ｉ）、β１−２  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩ）、β１−３  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｉ−ＧｎＴ）、フコースβ１−３    Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｆｒｉｎｇｅ）、β１−４  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）、β１−４  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＶ（ＧｎＴ−ＩＶ）、β１−４  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＶＩ（ＧｎＴ−ＶＩ）、β１−６  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ（ＧｎＴ−Ｖ）、Ｉ抗原形成β１−６  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｉ−ＧｎＴ）、コア２形成β１−６  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ、コア２形成β１−６  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩ、コア２形成β１−６  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩＩ、α１−４  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ等が例示されるが（例えば、非特許文献２１参照）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと省略する場合もある）を糖供与体としてＮ−アセチルグルコサミンを転移し、反応産物としてＵＤＰを生じるものであれば、いかなるものでも使用できる。
【００４６】
また、例えば、ＧａｌＮＡｃＴとしては、β１−４  Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、α１−３  Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（血液型Ａ型抗原合成酵素）、α１−３  Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（フォルスマン抗原構成酵素）等が例示されるが（例えば、非特許文献２１参照）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと省略する場合もある）を糖供与体としてＮ−アセチルガラクトサミンを転移し、反応産物としてＵＤＰを生じるもので有ればいかなるものでも使用できる。
【００４７】
また、ＭａｎＴはＧＤＰ−マンノース（以下、ＧＤＰ−Ｍａｎと省略する場合もある）を糖供与体としてマンノースを転移し、反応産物としてＧＤＰを生じるもので有ればいかなるものであっても使用できる。
【００４８】
また、ＧｌｃＴはＵＤＰ−グルコース（以下、ＵＤＰ−Ｇｌｃと省略する場合もある）を糖供与体としてグルコースを転移し、反応産物としてＵＤＰを生じるもので有ればいかなるものであっても使用できる。
【００４９】
また、ＸｙｌＴはＵＤＰ−キシロース（以下、ＵＤＰ−Ｘｙｌと省略する場合もある）を糖供与体としてキシロースを転移し、反応産物としてＵＤＰを生じるもので有ればいかなるものであっても使用できる。
【００５０】
糖転移酵素反応は糖転移反応を行う反応条件で有ればいかなる条件でも良いが、用いる糖転移酵素の至適反応条件に近い条件を用いることが好ましい。また、対をなして使用するグリコシダーゼの作用しうる反応条件で有れば、より好ましい。例えば、反応温度は、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５℃〜４２℃、さらにより好ましくは３０℃〜４０℃の範囲であり、一般的に３７℃付近の反応温度がよく用いられる。しかしながら、糖転移酵素に種類により至適反応温度は異なるため、一概には一般的な温度を設定することはできず、使用する糖転移酵素に応じて、或いは対をなして使用するグリコシダーゼの諸性質に応じて適宜設定することが望ましい。また、例えば、反応ｐＨは好ましくは、ｐＨ４．０〜９．０、より好ましくは至適反応ｐＨ５．０〜８．５、さらにより好ましくは至適反応ｐＨ５．５〜８．０が使用されるが、至適反応温度と同様に、糖転移酵素の種類、対をなして使用するグリコシダーゼの諸性質に応じて適宜設定することが望ましい。
【００５１】
また、生体試料中に糖転移酵素反応を阻害する物質が存在する場合、予め簡単な処理によってこれら阻害物質を除去してから糖転移酵素反応を行ってもよい。例えば、阻害物質が酵素類である場合、加熱処理や溶媒処理、小さなクロマト担体などを用いて処理することが可能である。例えば、本発明の糖鎖検出系を微小化してμＴＡＳ等のバイオチップ（例えば、非特許文献１４〜２０参照）として分析する場合は、サンプルが糖転移酵素反応室に行くまでの流路に加熱室を設けても良いし、サンプルが糖転移酵素反応室に行くまでの流路に分子ふるい、イオン交換、疎水分離、その他種々のなどの原理を利用した分離流路を設けることも可能である。また、阻害物質が低分子のものである場合、脱塩カラムなどにより前処理することも可能であり、μＴＡＳとして用いる場合は、サンプルが糖転移酵素反応室に行くまでの流路に分子ふるい、イオン交換、疎水分離、その他種々のなどの原理を利用した分離流路を設けることも可能である。
【００５２】
本発明の糖ヌクレオチド
本発明における、糖ヌクレオチドは使用する糖転移酵素に特異的なものを用いることが好ましい。例えば、ＧａｌＴの場合ＵＤＰ−Ｇａｌが、ＦｕｃＴの場合ＧＤＰ−Ｆｕｃが、ＳｉａＴの場合ＣＭＰ−Ｓｉａが、ＧｌｃＮＡｃＴの場合ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが、ＧａｌＮＡｃＴの場合ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが、ＭａｎＴの場合ＧＤＰ−Ｍａｎが、ＧｌｃＴの場合ＵＤＰ−Ｇｌｃが、ＸｙｌＴの場合ＵＤＰ−Ｘｙｌがそれぞれ好ましく用いられる。糖ヌクレオチドの濃度は、糖転移酵素反応によりヌクレオシド二リン酸或いはヌクレオシド一リン酸を生じるもので有ればいかなる条件でもよいが、好ましくは使用する糖転移酵素の糖ヌクレオチドに対するＫｍ値の１／２倍以上、より好ましくはＫｍ値の２倍以上、さらにより好ましくはＫｍ値の５倍以上、最も好ましくはＫｍ値の１０倍以上である。
【００５３】
本発明に用いるグリコシダーゼ
本発明における、グリコシダーゼは糖鎖のグリコシド結合を加水分解する酵素であればいかなるものでも使用できる。グリコシダーゼは天然より抽出されたものであっても、遺伝子組み換えにより生産されたものであってもよく、いかなる生物種由来のものであっても良い。また、目的の反応以外の反応を生じさせる夾雑酵素がグリコシダーゼ反応或いは糖転移酵素反応に著しく影響するほど存在するものでなければ、必ずしも単一精製標品で無くてもよい。また、グリコシダーゼ反応に影響しない範囲でグリコシダーゼに別のタンパク質或いはペプチドが融合した融合型グリコシダーゼを用いることも可能である。さらに、種々の支持体にグリコシダーゼが結合した形態の固定化グリコシダーゼを用いることも可能である。また、例えば、本発明の糖鎖検出系を微小化してμＴＡＳ等のバイオチップとして分析する場合は（例えば、非特許文献１４〜２１参照）、グリコシダーゼ反応室にグリコシダーゼ溶液を供給する形のチップであっても、グリコシダーゼ反応室のグリコシダーゼが固定化されている形のチップであっても良い。
【００５４】
グリコシダーゼとしては、例えば、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、マンノシダーゼ、グルコシダーゼ、キシロシダーゼ等が用いられるが、基質特異性の高いものが好ましい。例えば、β１−３，４，６ガラクトシルトランスフェラーゼを用いるより、β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ又はβ１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ又はβ１−６ガラクトシルトランスフェラーゼを別々に用いる方が、好ましい。また、エキソグリコシダーゼだけでなく、エンドグリコシダーゼを用いることも有効な手段となりうる。また、グリコシダーゼとしての基質特異性がよく知られているものが好ましいが、基質特異性が不明確なグリコシダーゼであっても、予備実験によりその基質特異性を確認することで本発明に用いることは可能である。また、使用するグリコシダーゼは対をなして使用する糖転移酵素の反応条件において作用しうるものが好ましい。例えば、至適反応ｐＨ４．０〜９．０、好ましくは至適反応ｐＨ５．０〜８．５、より好ましくは至適反応ｐＨ５．５〜８．０の酵素学的性質を有するグリコシダーゼを用いることが望ましい。
【００５５】
また、生体試料中に糖グリコシダーゼ反応を阻害する物質が存在する場合、予め簡単な処理によって阻害物質を除去してからグリコシダーゼ反応を行ってもよい。例えば、阻害物質が酵素類である場合、加熱処理や溶媒処理、小さなクロマト担体などを用いて処理することが可能である。例えば、本発明の糖鎖検出系を微小化してμＴＡＳ等のバイオチップとして用いる場合は（例えば、非特許文献１４〜２０参照）、サンプルがグリコシダーゼ反応室に行くまでの流路に加熱室を設けても良いし、サンプルがグリコシダーゼ反応室に行くまでの流路に分子ふるい、イオン交換、疎水分離、その他種々のなどの原理を利用した分離流路を設けることも可能である。また、阻害物質が低分子のものである場合、脱塩カラムなどにより前処理することも可能であり、μＴＡＳとして利用する場合は、サンプルがグリコシダーゼ反応室に行くまでの流路に分子ふるい、イオン交換、疎水分離、その他種々のなどの原理を利用した分離流路を設けることも可能である。
【００５６】
本発明におけるヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド一リン酸の検出
本発明におけるＮＤＰ／ＮＭＰの検出方法は、自体公知のいかなる方法を用いて行ってもよい。また、ＧａｌＴ、ＧｌｃＴ、ＧｌｃＮＡｃＴ、ＧａｌＮＡｃＴ、ＸｙｌＴはＵＤＰ−糖を糖供与体とするので、これらの糖転移酵素反応により生じるヌクレオシド二リン酸（以下、ＮＤＰと省略する場合もある）はＵＤＰであり、ＦｕｃＴ、ＭａｎＴはＧＤＰ−糖ヌクレオシドを糖供与体とするので、これらの糖転移に反応により生じるＮＤＰはＧＤＰであり、さらに、ＳｉａＴはＣＭＰ−Ｓｉａを糖供与体とするので、ＳｉａＴ反応により生じるヌクレオシド一リン酸（以下、ＮＭＰと省略する倍もある）はＣＭＰである。すなわち、ＵＤＰ又はＧＤＰ又はＣＭＰを検出することによりほぼ全ての糖転移酵素反応の検出が可能になる。
【００５７】
例えば、ＵＤＰ又はＧＤＰ等のＮＤＰの検出は、糖転移酵素反応により生じたＮＤＰをホスホエノールビルビン酸（以下、ＰＥＰと省略する場合もある）存在下、ピルビン酸キナーゼ（以下、ＰＫと省略する場合もある）の作用によりピルビン酸とヌクレオシド三リン酸（以下、ＮＴＰと省略する場合もある）に変換後、生じたピルビン酸をＮＡＤＨの存在下、乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨと省略する場合もある）の作用によりＮＡＤと乳酸に変換を行う反応を行うことにより、ＮＤＰ量を紫外線吸収（Ａ３４０）測定で検出が容易なＮＡＤＨの減少量として測定することが可能である（図−１及び非特許文献２２参照）。また、例えば、ＣＭＰの検出は、ＳｉａＴ反応により生じたＣＭＰをＡＴＰ存在下ミオキナーゼ（以下、ＭＫと省略する場合もある）の作用によりＡＤＰとＣＤＰに変換後、生じたＣＤＰをＰＥＰ存在下ＰＫ作用によりピルビン酸とＣＴＰに変換後、生じたピルビン酸をＮＡＤＨの存在下、ＬＤＨの作用によりＮＡＤと乳酸に変換を行う反応を行うことにより、ＣＭＰ量を紫外線吸収（Ａ３４０）測定で検出が容易なＮＡＤＨの減少量として測定することが可能である（図−２及び非特許文献２２〜２３参照）。この反応系の場合、ＭＫ反応により生じたＡＤＰが同時に該反応液中に存在するＰＥＰ／ＰＫ系とＮＡＤＨ／ＬＤＨ系により変換され、同様にＮＡＤＨの減少が生じるため、感度は２倍になると考えられる。このような方法で有れば、一般的な分析機器である分光高度計を用いることにより非常に簡便に測定することが可能となる。
【００５８】
また、例えば、ＵＤＰ又はＧＤＰ等のＮＤＰの検出は、糖転移酵素反応により生じたＮＤＰをＰＥＰ存在下、ＰＫの作用によりピルビン酸とＮＴＰに変換後、加熱など種々の方法によりＰＫを失活させた後、ＰＫ反応により生じたＮＴＰをＡＤＰ存在下ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（以下、ＮＤＫと省略する場合もある）の作用によりＮＤＰ（ＵＤＰ又はＧＤＰ）とＡＴＰに変換、生じたＡＴＰをルシフェラーゼ検出系により発光として検出するという反応により、糖転移酵素反応により生じたＮＤＰ量を発光量として検出することができる（図−３参照）。ＣＭＰの検出もＭＫ反応系を加えることで、同様に発光量として検出することができる。このような発光法で有れば、さらに高感度で検出することが可能となる。
【００５９】
以上の様な酵素変換法に用いる酵素類は、目的の酵素反応を行う限り、天然より抽出されたものであっても、遺伝子組み換えにより生産されたものであってもよく、いかなる生物種由来のものであっても良い。また、目的の反応以外の反応を生じさせる夾雑酵素がＮＤＰ／ＮＭＰの変換反応に著しく影響するほど存在するものでなければ、必ずしも単一精製標品で無くてもよい。また、ＮＤＰ／ＮＭＰの変換反応に影響しない範囲でこれら酵素類に別のタンパク質或いはペプチドが融合した融合型酵素を用いることも可能である。さらに、種々の支持体に酵素類がが結合した形態の固定化酵素を用いることも可能である。また、例えば、本発明の糖鎖検出系を微小化してμＴＡＳ等のバイオチップとして用いる場合は（例えば、非特許文献１４〜２０参照）、ＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応室に酵素類を供給する形のチップであっても、ＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応室の酵素類が反応室に固定化されている形のチップであっても良い。
【００６０】
以上の様な方法の他に、生じたＮＤＰ／ＮＭＰをそのまま、或いは酵素法などによる何らかの変換を行った後、ＮＤＰ／ＮＭＰ量（すなわち、糖転移酵素反応量、すなわち、糖鎖存在量）を電気信号として検出する方法やＳＰＲ、レーザー光線をはじめとするその他の光信号として検出する方法を用いることも可能である。
【００６１】
ＮＤＰ／ＮＭＰの測定は糖転移酵素反応と同時に行っても良いし、糖転移反応後に行っても良い。糖転移酵素反応とＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応を同時に行うことはその簡便性から、より好ましく、例えば、本発明の糖鎖検出系を微小化してμＴＡＳ等のバイオチップとして用いる場合は（例えば、非特許文献１４〜２１参照）、糖転移反応室とＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応室が同一の反応室により行われるものであってもよく、糖転移酵素或いは変換酵素類が固定化されている反応室を用いても良い。また、糖転移酵素反応室、ＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応室の他にシグナル検出室（流路）を設けてもよい。
【００６２】
また、例えば、生体試料中にＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応の阻害物質が存在する場合、糖転移酵素反応後、反応液を予め簡単な処理により阻害物質を除去した後、ＮＤＰ／ＮＭＰ検出を行うことも可能である。例えば、阻害物質が酵素類である場合、加熱処理や溶媒処理、小さなクロマト担体などを用いて処理することが可能である。また例えば、本発明の糖鎖検出系を微小化してμＴＡＳ等のバイオチップとして用いる場合は（例えば、非特許文献１４〜２１参照）、サンプルがＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応室に行くまでの流路に加熱室を設けても良いし、サンプルがＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応室に行くまでの流路に分子ふるい、イオン交換、疎水分離、その他種々のなどの原理を利用した分離流路を設けることも可能である。また、阻害物質が低分子のものである場合、脱塩カラムなどにより前処理することも可能であり、例えば、μＴＡＳとして利用する場合は（例えば、非特許文献１４〜２１参照）、サンプルがＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応室に行くまでの流路に分子ふるい、イオン交換、疎水分離、その他種々のなどの原理を利用した分離流路を設けることも可能である。
【００６３】
本発明の糖鎖検出系の利用形態
本発明の利用形態はいかなるものであってもよい。例えば、グリコシダーゼ処理した又は未処理の試料を糖転移酵素反応試薬とＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応試薬の入った試験管に添加、反応後、反応液をキュベットに移してＮＤＰ／ＮＭＰの測定を行うことによっても実施できる。また、該反応をキュベット中で行い、反応と同時に、ＮＤＰ／ＮＭＰの測定を行うことによっても実施できる。また、該試料を糖転移酵素反応試薬の入った試験管中にて反応後、何らかの処理を施し、或いは未処理のまま、ＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応試薬の入った試験管に添加、反応後、反応液をキュベットに移してＮＤＰ／ＮＭＰの測定を行うことによっても実施できるし、ＮＤＰ／ＮＭＰ検出反応をキュベット中で行うことにより、反応と同時にＮＤＰ／ＮＭＰの測定を行うことによっても実施できる。これらの方法は、自体公知の種々の自動分析装置により連続的に分析を行うことによっても実施できる。
【００６４】
また、試料は微量であるほど好ましいことから、反応或いは検出をさらに微量化することが好ましく、例えば、９６穴のタイタープレート中で反応或いは、タイタープレートに測定サンプルを添加して例えば、プレートリーダーにより測定することによっても実施できる。また、このような方法であれば、試料の微量化だけでなく、多検体を同時に測定することが可能であるので、種々の糖転移酵素−グリコシダーゼの反応セットを一度に調べることができ、操作がより簡便になる。
【００６５】
さらに、μＴＡＳなどの微量チップとして本発明の糖鎖検出系を用いることにより、さらに、試料の微量化が可能になる（例えば、非特許文献１４〜２１参照）。また、μＴＡＳの場合、試料の精製流路を導入することもでき、種々のサンプルに対応することができる。さらに、大量の糖転移酵素−グリコシダーゼ反応セットを一枚のチップに組み込むことで、網羅的な解析が可能となっるため、糖鎖シーケンサーとしての利用も可能となる。また、チップ化により微小化されるため、携帯性が増加し、携帯型の健康診断装置としての利用も可能となるし、糖鎖センサーチップとしての利用も可能となる。
【００６６】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
【００６７】
実施例１  β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素反応系によるＵＤＰ検出法を用いた糖鎖の検出及び定量
５０ｍＭ  グリシン／グリシン緩衝液  ｐＨ８．６    １４０μＭ  ＮＡＤＨ（シグマ社製）  −  １．２８ｍＭ  ホスホエノールビルビン酸（シグマ社製）−  ５ｍＭ  塩化マンガン−  ５０ｍＭ  ＫＣｌ  −  ３７０μＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ（シグマ社製）−  ０．２％  αラクトアルブミン（シグマ社製）−  ７Ｕ／ｍｌ  ピルビン酸キナーゼ（シグマ社製）−  １０Ｕ／ｍｌ  乳酸脱水素酵素（シグマ社製）−  １２ｍＵ／ｍｌ  β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ（東洋紡社製）の組成からなる反応液に１０〜１５０μＭのグルコース溶液１８０μｌを添加、総量８００μｌとした反応液を３０℃にて反応を行い、反応２時間におけるＡ３４０の減少を測定した（非特許文献２２参照）。その結果、添加したグルコースの濃度に応じて直線的にＡ３４０の減少がみられた（図−４）。本結果から、本反応系によりグルコースの検出及び定量が可能であることが確認された。
【００６８】
次に、同反応条件により５００μＭのガラクトース溶液、フコース溶液、シアル酸溶液、Ｎ−アセチルガラクトサミン溶液の測定を行った。その結果、いずれのガラクトース濃度においてもＡ３４０の減少は全く見られなかった（表１）。さらに、同反応条件により１００μＭのガラクトース、フコース、シアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含む１０〜１５０μＭのグルコース溶液の測定を行った結果、グルコース濃度に応じて直線的にＡ３４０の減少が見られた（図−５）。本結果から、糖混合溶液でも、β１−４ＧａｌＴの特性に応じてグルコースのみを検出、定量することができることが確認された。
【００６９】
【表１】
2005046029.tif 000002
【００７０】
次に、同反応条件により、１０〜１５０μＭのラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）溶液の測定を行った結果、いずれのラクトース濃度においてもＡ３４０の減少は全く見られなかった（図−６）。さらに、βガラクトシダーゼ（東洋紡社製）により、処理したラクトースの測定を行った。その結果、ラクトース濃度に応じて直線的にＡ３４０の減少が見られた（図−６）。本結果から、グリコシダーゼ消化により糖転移酵素の反応性が変化すること、その変化から、糖鎖構造の推測が可能となることが確認された。
【００７１】
実施例２    ルイス構造糖鎖混合液の糖転移酵素による糖鎖解析シミュレーション
次に、表２に記載した各々未知量１７種類のルイス関連構造糖鎖からなる混合溶液の種々の糖転移酵素による糖鎖解析についてのシミュレーションを行った。
【００７２】
【表２】
2005046029.tif 000003
【００７３】
【表３】
2005046029.tif 000004
【００７４】
（１）α１−３フコシルトランスフェラーゼＶＩＩを用いた解析
α１−３フコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（以後、ＦＵＴ７と省略する場合もある）は、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒのみを基質として、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを形成する酵素である（非特許文献２４参照）。従って、表２記載のルイス関連構造糖鎖混合溶液中のＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒだけを検出することができる（表３参照）。さらに、該糖鎖混合溶液をα１−３フコース構造及びα１−４フコース構造を加水分解するα１−３／４フコシダーゼ（以下、α３／４Ｆａｓｅと省略する場合もある）により処理すると、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−ＲだけがＦＵＴ７によって検出可能なＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ構造に変換される（表３参照）。従って、予めＦＵＴ７のＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線を作成しておくことにより、これらの定量が可能となる。すなわち、未処理の該糖鎖混合溶液、及びα３／４Ｆａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液を各々ＦＵＴ７を用いて測定し、未処理該糖鎖混合溶液の測定値がＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量となり、α３／４Ｆａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値から未処理該糖鎖混合溶液の測定値を引いた値が、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量となる（表３参照）。
【００７５】
以上の様に、ＦＵＴ７とα３／４Ｆａｓｅを用いることにより該糖鎖混合溶液中のＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの検出及び定量が可能となる。
【００７６】
（２）β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼを用いた解析
β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、β１−４ＧａｌＴと省略する場合もある）はＧｌｃＮＡｃ−Ｒを基質として、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを形成する酵素である。表２に記載の糖鎖混合溶液中β１−４ＧａｌＴにより検出されるのは、ＧｌｃＮＡｃ−Ｒのみである（表４参照）。さらに、該糖鎖混合溶液をβ１−４ガラクトース構造のみを特異的に加水分解するβ１−４ガラクトシダーゼ（以下、β４Ｇａｓｅと省略する場合もある）により処理すると、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒだけがβ１−４ＧａｌＴによって検出可能なＧｌｃＮＡｃ−Ｒ構造に変換される（表４参照）。また、さらに、該糖鎖混合溶液をβ４Ｇａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅにより処理すると、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲとＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒのみが、β１−４ＧａｌＴによって検出可能なＧｌｃＮＡｃ−Ｒ構造に変換される（表−４参照）。さらに、該糖鎖混合溶液をβ１−３ガラクトース構造のみを特異的に加水分解するβ１−３ガラクトシダーゼ（以下、β３Ｇａｓｅと省略する場合もある）により処理すると、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒだけがβ１−４ＧａｌＴによって検出可能なＧｌｃＮＡｃ−Ｒ構造に変換される（表−４参照）。また、さらに、該糖鎖混合溶液をβ３Ｇａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅにより処理すると、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−ＲとＧａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒのみが、β１−４ＧａｌＴによって検出可能なＧｌｃＮＡｃ−Ｒ構造に変換される（表−４参照）。
【００７７】
【表４】
2005046029.tif 000005
【００７８】
従って、予めβ１−４ＧａｌＴのＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線を作成しておくことにより、これらの定量が可能となる。すなわち、未処理の該糖鎖混合溶液、β４Ｇａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液、β４Ｇａｓｅとα３／４Ｆａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液、β３Ｇａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液、β３Ｇａｓｅとα３／４Ｆａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液を各々β１−４ＧａｌＴを用いて測定すると、未処理該糖鎖混合溶液の測定値がＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量となり、β４Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値から未処理該糖鎖混合溶液の測定値を引いた値が、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量となる（表−４参照）。さらに、β４Ｇａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値からβ４Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値を引いた値が、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量となる（表−４参照）。また、β３Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値から未処理該糖鎖混合溶液の測定値を引いた値が、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量となり、β３Ｇａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値からβ３Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値を引いた値が、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量となる（表−４参照）
【００７９】
以上の様に、β１−４ＧａｌＴとβ４Ｇａｓｅ、β３Ｇａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅを用いることにより該糖鎖混合溶液中のＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの検出及び定量が可能となる。
【００８０】
（３）α１−３フコシルトランスフェラーゼＩＸを用いた解析
α１−３フコシルトランスフェラーゼＩＸ（以下、ＦＵＴ９と省略する場合もある）はＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ或いはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを基質として、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ或いはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを形成する酵素である（非特許文献２４参照）。
【００８１】
表−２に記載の糖鎖混合溶液中ＦＵＴ９によって検出されるのは、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒである（表−５参照）。さらに、該糖鎖混合溶液をβ４Ｇａｓｅにより処理すると、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲはＦＵＴ９で検出できないＧｌｃＮＡｃ−Ｒに変換されるため、ＦＵＴ９によって検出されるのはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒのみとなる（表−５参照）。また、該糖鎖混合溶液をβ４Ｇａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅにより処理すると、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−ＲがＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに変換され、糖鎖混合溶液中のＦＵＴ９により検出される糖鎖は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−ＲとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒとなる（表−５参照）。また、さらに、該糖鎖混合溶液をα１−３ガラクトースを特異的に加水分解するα１−３ガラクトシダーゼ（以下、α３Ｇａｓｅと省略する場合もある）により処理すると、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲがＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに変換され、糖鎖混合溶液中のＦＵＴ９により検出される糖鎖は、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒとなる（表−５参照）。また、さらに、該糖鎖混合溶液をα１−３Ｎ−アセチルガラクトサミンを特異的に加水分解するα１−３  Ｎ−アセチルがガラクトサミニダーゼ（以下、α３ＧＮａｓｅと省略する場合もある）により処理すると、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲがＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに変換され、糖鎖混合溶液中のＦＵＴ９により検出される糖鎖は、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒとなる（表−５参照）。
【００８２】
【表５】
2005046029.tif 000006
【００８３】
従って、予めＦＵＴ９のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線を作成しておくことにより、これらの定量が可能となる。すなわち、未処理の該糖鎖混合溶液、β４Ｇａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液、β４Ｇａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液、α３Ｇａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液、及びαＧＮａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液をＦＵＴ９を用いて測定し、それぞれの測定値から各成分の定量が可能となる。例えば、β４Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値から未処理該糖鎖混合溶液の測定値を差し引いた値をＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線を用いて定量することにより、該糖鎖混合溶液中のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量が定量される（表−５参照）。また、β４Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値をＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線用いて定量することにより該糖鎖混合溶液中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量が定量される（表−５参照）。また、β４Ｇａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値からβ４Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値を差し引いた値をＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線用いて定量することにより該糖鎖混合溶液中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量が定量される（表−５参照）。また、α３Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値から未処理該糖鎖混合溶液の測定値を差し引いた値をＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線用いて定量することにより該糖鎖混合溶液中のＧａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量が定量される（表−５参照）。また、α３ＧＮａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値から未処該理糖鎖混合溶液の測定値を差し引いた値をＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線用いて定量することにより該糖鎖混合溶液中のＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量が定量される（表−５参照）。
【００８４】
以上の様に、ＦＵＴ９とβ４Ｇａｓｅ、α３Ｇａｓｅ、αＧＮａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅを用いることにより糖鎖混合溶液中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの検出及び定量が可能となる。
【００８５】
（４）α１−２フコシルトランスフェラーゼを及びその他の糖転移酵素系を用いた解析
α１−２フコシルトランスフェラーゼ（以下、α１−２ＦｕｃＴと省略する場合もある）はＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ或いはＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを基質として、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ或いはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを形成する酵素である（非特許文献２４参照）。
【００８６】
表−２に記載の糖鎖混合溶液中α１−２ＦｕｃＴによって検出されるのは、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ及びＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒである（表−６参照）。さらに、該糖鎖混合溶液をβ４Ｇａｓｅにより処理すると、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒはα１−２ＦｕｃＴで検出できないＧｌｃＮＡｃ−Ｒに変換されるため、α１−２ＦｕｃＴによって検出されるのはＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒのみとなる（表−６参照）。また、該糖鎖混合溶液をβ３Ｇａｓｅにより処理すると、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒはα１−２ＦｕｃＴで検出できないＧｌｃＮＡｃ−Ｒに変換されるため、α１−２ＦｕｃＴによって検出されるのはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒのみとなる（表−６参照）。従って、予めα１−２ＦｕｃＴのＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ及びＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線を作成しておくことにより、これらの定量が可能となる。すなわち、未処理の該糖鎖混合溶液、β４Ｇａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液、及びβ３Ｇａｓｅにより処理された該糖鎖混合溶液をα１−２ＦｕｃＴを用いて測定し、それぞれの測定値から各成分の定量が可能となる。例えば、未処理該糖鎖混合溶液の測定値からβ４Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値を差し引いた値をＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線を用いて定量することにより、該糖鎖混合溶液中のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量が定量される（表−６参照）。また、未処理該糖鎖混合溶液の測定値からβ３Ｇａｓｅ処理該糖鎖混合溶液の測定値を差し引いた値をＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線を用いて定量することにより、該糖鎖混合溶液中のＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量が定量される（表−６参照）。
【００８７】
【表６】
2005046029.tif 000007
【００８８】
また、該糖鎖混合溶液をα２−３シアル酸構造を特異的に加水分解するα２−３シアリダーゼ（以下、α３Ｓａｓｅと省略する場合もある）により処理すると、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−ＲがＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ  に、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ  Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲがＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒにそれぞれ変換され、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの構造に変化はなく、また、その他の成分もα１−２ＦｕｃＴに検出される構造に変換されないため、α３Ｓａｓｅにより処理した該糖鎖混合溶液をα１−２ＦｕｃＴを用いて測定して得られた測定値はＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの総和を示す（表−６参照）。また、該糖鎖混合溶液をα３Ｓａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅにより処理すると、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−ＲがＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに、また、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲがＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに変換され、さらに、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの構造に変化はなく、また、その他の成分もα１−２ＦｕｃＴに検出される構造に変換されないため、α３Ｓａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅにより処理した該糖鎖混合溶液をα１−２ＦｕｃＴを用いて測定して得られた測定値は、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの総和を示す（表−６参照）。そこで、α３Ｓａｓｅ及びα３／４Ｆａｓｅにより処理した該糖鎖混合溶液の測定値からα３Ｓａｓｅにより処理した該糖鎖混合溶液の測定値を差し引いた値は、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの総和を示すことになる（表−６参照）。該糖鎖混合溶液中のＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（１）の方法により定量が可能であり、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量は、上記実施例２−（２）の方法により測定が可能であるので、これらの方法によりＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１��４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量を差し引くことにより、該糖鎖混合溶液中のＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量を定量することが可能となる。
【００８９】
以上の様に、α１−２ＦｕｃＴとβ３Ｇａｓｅ、β４Ｇａｓｅ、α３Ｓａｓｅ、及びα３／４Ｆａｓｅを用いることにより該糖鎖混合溶液中のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの検出及び定量が可能となる。
【００９０】
（４）α１−３／４フコシルトランスフェラーゼを及びその他の糖転移酵素系用いた解析
α１−３／４フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ３と省略する場合もある）は、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲのＧｌｃＮＡｃにα１−３結合でフコースを転移して、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成するα１−３フコシルトランスフェラーゼ活性と、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−ＲのＧｌｃＮＡｃα１−４結合でフコースを転移して、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成するα１−４フコシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である（非特許文献２４参照）。従って、ＦＵＴ３のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対する検量線を作成しておくことにより、上記実施例２−（１）〜（３）と同様に種々のグリコシダーゼとの組み合わせにより糖鎖の解析が可能となる。
【００９１】
例えば、表−２記載のルイス関連構造糖鎖混合溶液をα１−２フコース構造を特異的に加水分解するα１−２フコシダーゼ（以下、α２Ｆａｓｅと省略する場合もある）により処理した後、加熱処理などにより一旦α２Ｆａｓｅを失活させた後、β３Ｇａｓｅで処理したものをＦＵＴ３を用いて測定した測定値は、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの総和となる（表−７参照）。ここで、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（１）の方法により定量可能であり、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量、及びＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（２）の方法により定量可能であり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（３）の方法により定量可能であることから、本測定値からＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量を差し引くことにより、該糖鎖混合溶液中のＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの定量が可能になる。
【００９２】
【表７】
2005046029.tif 000008
【００９３】
また例えば、該糖鎖混合溶液をα３Ｓａｓｅにより処理した後、加熱処理などにより一旦α３Ｓａｓｅを失活させた後、β３Ｇａｓｅで処理したものをＦＵＴ３を用いて測定した測定値は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの総和となる（表−７参照）。ここで、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（１）の方法により定量可能であり、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（２）の方法により定量可能であり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（３）の方法により定量可能であることから、本測定値からＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量を差し引くことにより、該糖鎖混合溶液中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの定量が可能になる。
【００９４】
また例えば、該糖鎖混合溶液をα３Ｇａｓｅにより処理したものをＦＵＴ３を用いて測定した測定値は、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの総和となる（表−７参照）。ここで、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量は本実施例で上述された方法により定量可能であり、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（１）の方法により定量可能であり、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（２）の方法により定量可能であり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（３）の方法により定量可能であることから、本測定値からＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量を差し引くことにより、該糖鎖庫運号溶液中のＧａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの定量が可能になる。
【００９５】
また例えば、該糖鎖混合溶液をα３ＧＮａｓｅにより処理したものをＦＵＴ３を用いて測定した測定値は、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの総和となる（表−７参照）。ここで、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量は本実施例で上述された方法により定量可能であり、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（１）の方法により定量可能であり、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（２）の方法により定量可能であり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（３）の方法により定量可能であることから、本測定値からＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量を差し引くことにより、該糖鎖混合溶液中のＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの定量が可能になる。
【００９６】
また例えば、該糖鎖混合溶液をα３／４Ｆａｓｅとβ３Ｇａｓｅにより処理したものをＦＵＴ３を用いて測定した測定値は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの総和となる（表−７参照）。
【００９７】
ここで、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量は本実施例で上述された方法により定量可能であり、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの量は上記実施例２−（１）の方法により定量可能であり、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−ＲＲ量は上記実施例２−（２）の方法により定量可能であり、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（３）の方法により定量可能であり、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量は上記実施例２−（４）の方法により定量可能であることから、本測定値からＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ、及びＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ量を差し引くことにより、該糖鎖混合溶液中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの定量が可能になる。
【００９８】
以上の様に、本実施例の（１）〜（４）の方法を組み合わせることにより、表−２記載のルイス関連構造糖鎖混合溶液の１７種類の糖鎖を全て検出、定量することが可能であることが確認された。このような結果を踏まえ、さらに、糖鎖の大きな構造を認識する糖転移酵素（例えば、α１−６フコシルトランスフェラーゼやβ１−４  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ、或いはβ１−６  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ等）を用いることで、更に詳細な情報を得ることができる。また、糖脂質に特異性の高い糖転移酵素と糖蛋白質に特異性の高い糖転移酵素を使い分けることによってもさらに詳細な解析が可能になる。また、さらに、エンド型グリコシダーゼを活用することによってもさらに詳細な解析が可能になると考えられる。
【００９９】
【発明の効果】
本発明の方法では、従来の方法とは異なり液体状の試料に液体状の反応試薬を添加するだけで、感度良く糖鎖の解析が可能となり、液体−液体の反応で有るため従来の方法とは異なり検出システムの微小化が可能となる。また、特異性の高い糖転移酵素を用いてため、試料を予め標識したり精製したりする必要はなく、非常に簡便に糖鎖の解析が可能となる。
【０１００】
解析システムの微小化が可能になるため、例えばμＴＡＳなどを用いることで他種類の糖転移酵素−グリコシダーゼのセットを一度に測定することができ、糖鎖の網羅的解析、すなわち、糖鎖シーケンサーの開発が可能になる。また、簡便に糖鎖変化を測定できるため種々の診断薬用途或いは健康診断装置としての利用も可能になる。また、微小化により、携帯性が向上することから携帯型健康診断装置或いは健康診断チップとして利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、ＧＤＰ−フコースやＵＤＰ−ガラクトースなどのＮＤＰ−糖を糖供与体とする糖転移酵素を糖鎖検出用素子として用いた場合の糖鎖検出方法の一例を示すものである。
【図２】本図は、ＣＭＰ−ＳｉａなどのＣＭＰ−糖を供与体とする糖転移酵素を糖鎖検出用素子として用いた場合の糖鎖検出方法の一例を示すものである。
【図３】本図は、ＧＤＰ−フコースやＵＤＰ−ガラクトースなどのＮＤＰ−糖を糖供与体とする糖転移酵素を糖鎖検出用素子として用いた場合の糖鎖検出方法の一例を示すものであり、その中でも発光法による方法を示すものである。
【図４】本図は、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼを糖鎖検出素子として用いてグルコースを測定した結果を示すものである。
【図５】本図は、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼを糖鎖検出素子として用いてグルコースを測定した場合に、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼの基質となり得ない糖質が存在してもグルコースの検出には影響が無いことを示した図である。
【図６】本図は、ガラクトシダーゼを組み合わせてβ１−４ガラクトシルトランスフェラーゼを糖鎖検出素子として用いてラクトースを測定した結果を示すものであり、グリコシダーゼ消化により糖転移酵素の反応性が変化すること、その変化から、糖鎖構造の推測が可能となることを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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