(57)【要約】      （修正有）【課題】アミノ酸配列を任意に改変した変異タンパク質を無細胞的に製造する方法を提供すること。【解決手段】以下の工程を含む、変異タンパク質の製造方法。(a) タンパク質をコードする遺伝子を鋳型とし、リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーＡ、および変異配列を含むプライマーＳとリンカー配列を含むリバースプライマーを組み合わせてPCRを行い、リンカー配列と変異配列を各末端に導入する工程(b) 転写開始領域を含む二本鎖DNA断片、転写終結領域を含む二本鎖DNA断片を相互に鋳型とし、該転写開始領域を含む二本鎖DNA断片の5’末端領域にアニールするセンスプライマーと該転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の3’末端領域にアニールするアンチセンスプライマーを用いてPCRを行い、各二本鎖DNA断片を連結させる工程(c) 得られた二本鎖DNAを用いて無細胞タンパク質合成系において変異タンパク質を調製する工程。【選択図】図１
2005095083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、無細胞タンパク質合成系による変異タンパク質の製造方法。
(a) タンパク質をコードする遺伝子を鋳型とし、リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーＡ、および変異配列を含むプライマーＳとリンカー配列を含むリバースプライマーの組み合わせでそれぞれ１段階目のPCRを行い、リンカー配列と変異配列を各末端部位に導入した２つの二本鎖DNA断片を増幅する工程
(b) 増幅された２つの二本鎖DNA断片、転写開始領域を含む二本鎖DNA断片、転写終結領域を含む二本鎖DNA断片を相互に鋳型とし、該転写開始領域を含む二本鎖DNA断片の5'末端領域にアニールするセンスプライマーと該転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーを用いて２段階目のPCRを行い、各二本鎖DNA断片を連結させ、直鎖状二本鎖DNAを増幅する工程
(c) 増幅された直鎖状二本鎖DNAを鋳型DNAとして無細胞タンパク質合成系において変異タンパク質を調製する工程
【請求項２】
前記プライマーＡとプライマーＳが、変異導入部位に対して逆行し、かつオーバーラップ配列を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、無細胞タンパク質合成系による変異タンパク質の製造方法。
(a) タンパク質をコードする遺伝子を鋳型とし、
リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーA1との組み合わせ；
変異配列を含むプライマーSiと変異配列を含むプライマーAi+1（１≦i≦p-1の整数：pはタンパク質をコードする遺伝子における変異導入部位の数を表す。）との関係を満たす全ての組み合わせ；
変異配列を含むプライマーSpとリンカー配列を含むリバースプライマーとの組み合わせ；
でそれぞれ１段階目のPCRを行い、p+1個の二本鎖DNA断片を増幅する工程
(b) 増幅されたp+1個の二本鎖DNA断片、転写開始領域を含む二本鎖DNA断片、転写終結領域を含む二本鎖DNA断片を相互に鋳型とし、該転写開始領域を含む二本鎖DNA断片の5'末端領域にアニールするセンスプライマーと該転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーを用いて２段階目のPCRを行い、各二本鎖DNA断片を連結させ、直鎖状二本鎖DNAを増幅する工程
(c) 増幅された直鎖状二本鎖DNAを鋳型DNAとして無細胞タンパク質合成系において変異タンパク質を調製する工程
【請求項４】
前記変異配列を含むプライマーSiと変異配列を含むプライマーAi+1（１≦i≦p-1の整数：pはタンパク質をコードする遺伝子における変異導入部位の数を表す。）が、変異導入部位に対して逆行し、かつオーバーラップ配列を有するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変異タンパク質が、変異導入前のタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記転写開始領域を含む二本鎖DNA断片及び/又は転写終結領域を含む二本鎖DNA断片が、タグペプチドをコードする配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸配列を任意に改変した変異タンパク質を、無細胞タンパク合成系において製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとする生物種の多型（polymorphism）は、疾患感受性（特定の疾患へのかかりやすさ）や薬物に対する反応性の個人差に影響する。従って、多型情報を利用した薬剤の開発、治療方法の選択など、いわゆるテーラーメード医療が今後益々重要になりつつある（Pfost, D.R. et al. Trends Biotechnol. (2000) 18, 334-338；Botstein, D. & Risch, N. Nat. Genet. (2003) 33, 228-237等）。タンパク質をコードする遺伝子上の多型が原因で生じた変異タンパク質は、野生型のタンパク質と比べて機能が低下・喪失・亢進・変異していることが予想されることから、その解析を行うことはタンパク質の構造や機能の解明、疾病の原因遺伝子の究明、薬剤標的遺伝子の同定などに役立つ。このような変異タンパク質の解析を行うに際して、多型を含む（患者等からの）遺伝子DNAが入手できなくても、野生型の（健常個体等からの）遺伝子DNAから必要とする変異タンパク質を製造することができれば便利である。
【０００３】
一方、タンパク質のX線結晶構造解析を多波長異常分散（multiple anomalous diffraction; MAD）法によって行う際、タンパク質内部のメチオニン(methionine)残基をセレン(selene; Se)元素で標識することが行われている（Uson, I, & Sheldrick, G.M. Curr. Opin. Struct. Biol. (1999) 9, 643-648)。しかしながら、メチオニンはコドン（codon）を１種類しか持たないため、タンパク質を構成する20種類のアミノ酸のなかで最も含まれにくいアミノ酸である。従って、メチオニン含有量の極めて少ないタンパク質又はその部分ドメインの３次構造をMAD法を用いて解明するためには、そのタンパク質内部のいくつかのアミノ酸残基をメチオニンに置換する必要がある。
【０００４】
遺伝子工学的手法によるタンパク質の合成方法としては、遺伝子DNAから細胞を用いてタンパク質を製造する方法（非特許文献１）、あるいは遺伝子DNAから無細胞的にタンパク質を製造する方法（非特許文献２、非特許文献３）が知られている。後者は無細胞タンパク質合成系と呼ばれるもので、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。無細胞タンパク質合成系はDNA断片をそのまま発現の鋳型として利用できるため、従来の大腸菌、酵母、培養細胞などの生細胞を用いる発現系に必要とされた、目的タンパク質遺伝子のベクターへのライゲーション、トランスフォーメーション、培養、集菌、溶菌といった時間と手間のかかる工程が一切不要となり、短時間で容易にタンパク質を発現することができる。近年、ゲノムにコードされたタンパク質の構造や機能を網羅的に解明しようとする、いわゆる構造・機能ゲノム科学研究が急速に発展し始め、解析対象とすべきタンパク質の数は飛躍的に多くなった。このために、多数のタンパク質試料を迅速に調製できる、ハイスループットなタンパク質発現系が必要となってきており、その意味でも無細胞タンパク質合成系に対する注目が集まっている。
【０００５】
一方、遺伝子の変異導入方法としては、１本鎖DNAと変異プライマーを混合し、細胞導入することでDNAに変異導入する方法（非特許文献４）、変異プライマーを用いたPCRによりDNAに変異導入する方法（site-directed mutagenesis by PCR：非特許文献５、非特許文献６）などが知られている。しかしながら、これまで無細胞系タンパク質合成系において変異タンパク質を製造するのに適した鋳型DNAの調製には至っていなかった。
【非特許文献１】Studier, F.W. et al., Methods Enzymol. (1990) 185, 60-89
【非特許文献２】Spirin, A.S. et al., Science (1988) 242, 1162-1164
【非特許文献３】Kigawa, T. et al., FEBS Lett. (1999) 442, 15-19
【非特許文献４】Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492
【非特許文献５】Ling, M.M. & Robinson, B.H., Anal. Biochem. (1997) 254, 157-178
【非特許文献６】Ho, S.N. et al., Gene (1989) 77, 51-59
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、アミノ酸配列を任意に改変した変異タンパク質を無細胞系タンパク質合成系において製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、所望する変異導入部位に対して逆行し、かつオーバーラップ配列を有する変異プライマーと、フォーワードプライマーまたはリバースプライマーとを組み合わせて１段階目のPCRを行い、続いて増幅された二本鎖DNA断片と制御（転写開始、転写終結）配列を含むDNAを用いて２段階目のPCRを行うことによって、所望の変異を導入した直鎖状二本鎖DNAを調製できることを見出した。また、この直鎖状二本鎖DNAを鋳型として用いて無細胞タンパク合成系にてタンパク合成を行ったところ、アミノ酸配列を任意に改変した変異タンパク質を製造することに成功した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の工程を含む、無細胞タンパク質合成系による変異タンパク質の製造方法。
(a) タンパク質をコードする遺伝子を鋳型とし、リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーＡ、および変異配列を含むプライマーＳとリンカー配列を含むリバースプライマーの組み合わせでそれぞれ１段階目のPCRを行い、リンカー配列と変異配列を各末端部位に導入した２つの二本鎖DNA断片を増幅する工程
(b) 増幅された２つの二本鎖DNA断片、転写開始領域を含む二本鎖DNA断片、転写終結領域を含む二本鎖DNA断片を相互に鋳型とし、該転写開始領域を含む二本鎖DNA断片の5'末端領域にアニールするセンスプライマーと該転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーを用いて２段階目のPCRを行い、各二本鎖DNA断片を連結させ、直鎖状二本鎖DNAを増幅する工程
(c) 増幅された直鎖状二本鎖DNAを鋳型DNAとして無細胞タンパク質合成系において変異タンパク質を調製する工程
(2) 前記プライマーＡとプライマーＳが、変異導入部位に対して逆行し、かつオーバーラップ配列を有するものである、請求項１に記載の方法。
(3) 以下の工程を含む、無細胞タンパク質合成系による変異タンパク質の製造方法。
(a) タンパク質をコードする遺伝子を鋳型とし、
リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーA1との組み合わせ；
変異配列を含むプライマーSiと変異配列を含むプライマーAi+1（１≦i≦p-1の整数：pはタンパク質をコードする遺伝子における変異導入部位の数を表す。）との関係を満たす全ての組み合わせ；
変異配列を含むプライマーSpとリンカー配列を含むリバースプライマーとの組み合わせ；
でそれぞれ１段階目のPCRを行い、p+1個の二本鎖DNA断片を増幅する工程
(b) 増幅されたp+1個の二本鎖DNA断片、転写開始領域を含む二本鎖DNA断片、転写終結領域を含む二本鎖DNA断片を相互に鋳型とし、該転写開始領域を含む二本鎖DNA断片の5'末端領域にアニールするセンスプライマーと該転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーを用いて２段階目のPCRを行い、各二本鎖DNA断片を連結させ、直鎖状二本鎖DNAを増幅する工程
(c) 増幅された直鎖状二本鎖DNAを鋳型DNAとして無細胞タンパク質合成系において変異タンパク質を調製する工程
(4) 前記変異配列を含むプライマーSiと変異配列を含むプライマーAi+1（１≦i≦p-1の整数：pはタンパク質をコードする遺伝子における変異導入部位の数を表す。）が、変異導入部位に対して逆行し、かつオーバーラップ配列を有するものである、(3)に記載の方法。
(5) 前記変異タンパク質が、変異導入前のタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものである、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記転写開始領域を含む二本鎖DNA断片及び/又は転写終結領域を含む二本鎖DNA断片が、タグペプチドをコードする配列を含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、アミノ酸配列を任意に改変した変異タンパク質を無細胞タンパク質合成系において短時間で製造することができる。また、本発明は変異タンパク質を無細胞的に合成するため、該タンパク質をコードする遺伝子の細胞への形質導入やプラスミドへのクローニングの必要がなく操作が簡便である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、無細胞タンパク質合成系による変異タンパク質の製造方法であって、以下の工程を含む。
(a) タンパク質をコードする遺伝子を鋳型とし、リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーＡ、および変異配列を含むプライマーＳとリンカー配列を含むリバースプライマーの組み合わせでそれぞれ１段階目のPCRを行い、リンカー配列と変異配列を各末端部位に導入した２つの二本鎖DNA断片を増幅する工程
(b) 増幅された２つの二本鎖DNA断片、転写開始領域を含む二本鎖DNA断片、転写終結領域を含む二本鎖DNA断片を相互に鋳型とし、該転写開始領域を含む二本鎖DNA断片の5'末端領域にアニールするセンスプライマーと該転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーを用いて２段階目のPCRを行い、各二本鎖DNA断片を連結させ、直鎖状二本鎖DNAを増幅する工程
(c）増幅された直鎖状二本鎖DNAを鋳型DNAとして無細胞タンパク質合成系において変異タンパク質を調製する工程
【００１１】
以下、各工程について添付図面に沿って詳述する。図１は、タンパク質をコードする遺伝子断片に１段階目のPCR法により変異を導入した後、それらの変異導入断片を２段階目のPCR法（オーバラップエクステンションPCR法）により連結することによって、無細胞タンパク質合成系の鋳型DNAに用いることができる直鎖状二本鎖DNAを調製する方法を示したフローチャートである。
【００１２】
工程(a)
まず工程(a)において、タンパク質をコードする遺伝子を鋳型とし、リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーＡ、および変異配列を含むプライマーＳとリンカー配列を含むリバースプライマーの組み合わせでそれぞれ１段階目のPCRを行う。
鋳型となる「タンパク質をコードする遺伝子」は、例えばcDNAライブラリーからクローン化したものだけでなく、ゲノムDNAクローンや合成DNAを用いることもできる。
図１に示すように、リンカー配列を含むフォーワードプライマー（FW)と変異配列を含むプライマーＡの組み合わせによるPCRでは、N末端から変異導入部位（M)の近傍までのアミノ酸配列をコードする断片（以下、N末側コード断片という）が増幅され、変異配列を含むプライマーＳとリンカー配列を含むリバースプライマー(RV)の組み合わせによるPCRでは、変異導入部位（M)の近傍からC末端までのアミノ配列をコードする断片（以下、C末側コード断片という）が増幅される。
【００１３】
「フォーワードプライマー」、「リバースプライマー」のリンカー配列は、1段階目のPCRで増幅されるN末側コード断片の5’末端部位、C末側コード断片の3’末端部位にそれぞれ付与される。
一方、「プライマーＡ」、「プライマーＳ」の変異配列は、1段階目のPCRで増幅されるN末側コード断片の3’末端部位、C末側コード断片の5’末端部位にそれぞれ導入される。「プライマーＡ」、「プライマーＳ」の変異配列は、それぞれのプライマーに1箇所存在してもよく、複数箇所存在してもよい。
「プライマーＡ」、「プライマーＳ」は、対象となるタンパク質をコードする遺伝子の変異導入部位に対して逆行し、かつオーバーラップ配列を有する。
ここで、「オーバーラップ配列」とは、2段階目のPCRでハイブリダイズして、1段階目のPCRで増幅された変異導入断片同士を連結するための配列をいい、その長さは導入すべき変異の種類や数により異なるが、１８〜３６塩基であることが好ましい。
また、本発明において、「変異導入部位」とは、タンパク質をコードする遺伝子上において逆行する２つのプライマーによりアミノ酸変異が導入される箇所の数をいう。「変異導入部位」は、通常、７から１０のアミノ酸配列からなり、ひとつの変異導入部位に、変異アミノ酸（１アミノ酸の変異）が複数個存在してもよい。
【００１４】
変異配列を含むプライマーの配列は、下記の基準を満たすように設計すればよい。
(i)  Tm= 2x(A+T) + 4x(G+C)で計算されるTm値が78以上であること。
(ii) 配列中の(G+C)の割合が33.3%以上であること。
(iii) 逆行するプライマーはそれぞれ任意の変異を含んでいてもよいが、互いのプライマーが形成する相補的な塩基対の長さが完全に一致し、かつ18塩基対以上であること。
(iv) 増幅すべき遺伝子断片の塩基配列と18塩基以上アニールできること。
(v) プライマーの3’末端のヌクレオチドはC又はGが好ましい（ただし、A又はTであってもよい）。
(vi) プライマーの5’末端の直前のヌクレオチドはA又はTであることが好ましい(ただし、G又はCであってもよい）。
上記操作によって、リンカー配列と変異配列をその各末端部位に導入した２つの二本鎖DNA断片が増幅される。
【００１５】
本発明方法の他の態様として、タンパク質をコードする遺伝子への変異導入部位が複数である場合、上記(a)の工程の１段階目のPCRを以下のプライマーの組み合わせにて行えばよい。
リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーA1との組み合わせ；
変異配列を含むプライマーSiと変異配列を含むプライマーAi+1（１≦i≦p−１の整数：pはタンパク質をコードする遺伝子における変異導入部位の数を表す。）との関係を満たす全ての組み合わせ；
変異配列を含むプライマーSpとリンカー配列を含むリバースプライマーとの組み合わせ。
このPCRによって、リンカー配列と変異配列をその各末端部位に導入した２つの二本鎖DNA断片、変異配列を両末端部位に導入したp＋1個の二本鎖DNA断片が増幅される。
【００１６】
例えば、タンパク質をコードする遺伝子の４箇所の部位に変異を導入する場合、
リンカー配列を含むフォーワードプライマーと変異配列を含むプライマーＡ１；
変異配列を含むプライマーＳ１と変異配列を含むプライマーＡ２;
変異配列を含むプライマーＳ２と変異配列を含むプライマーＡ３;
変異配列を含むプライマーＳ３と変異配列を含むプライマーＡ４;
変異配列を含むプライマーＳ４とリンカー配列を含むリバースプライマー；
の組み合わせのプライマーが使用され、全部で５つの二本鎖DNA断片が増幅される。
【００１７】
PCRの反応条件等（温度、時間、サイクル数、反応液組成）は、通常使用されるものであればよく、当業者において適宜設定することができる。
【００１８】
本発明において、変異タンパク質とは、変異導入前のタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個、例えば１〜10個程度のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を有するタンパク質をいう。また、該変異タンパク質には、内部置換体、内部欠失体のみならず、N末欠失体、C末欠失体も含まれる。
【００１９】
１段階目のPCRによって増幅された二本鎖DNA断片は、下記の２段階目のPCRの鋳型として用いるため、PCR反応液から従来公知の方法で精製することもできるが、PCR反応液をそのまま用いることもできる。
【００２０】
工程(b)
次に、工程(b)では、工程(a）で増幅された二本鎖DNA断片、転写開始領域を含む二本鎖DNA断片、及び転写終結領域を含む二本鎖DNA断片を鋳型とし、該転写開始領域を含む二本鎖DNA断片の5'末端領域にアニールするセンスプライマーと該転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーを用いて２段階目のPCRを行う。例えば、上記のN末側コード断片、C末側コード断片が工程(a)で増幅された場合、転写開始領域を含む二本鎖DNA断片の3’末端にあるリンカー配列は、N末側コード断片の5’末端にあるリンカー配列と結合し、これら２つのDNA断片が相互にプライマー及び鋳型となって伸長反応が起こる。一方、転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の5’末端にあるリンカー配列は、C末側コード断片の3’末端にあるリンカー配列と結合し、これら２つのDNA断片が相互にプライマー及び鋳型となって伸長反応が起こる。また、増幅された複数（上記の例では２つ）の二本鎖DNA断片同士は、前記オーバーラップ配列を介して連結し、DNA断片同士が相互にプライマー及び鋳型となって伸長反応が起こる。これらの一連の反応によって各二本鎖DNA断片が連結し、直鎖状二本鎖DNAを得ることができる。
【００２１】
ここで、「転写開始領域を含む二本鎖DNA断片」とは、その3'末端に上記の増幅された二本鎖DNAのひとつと連結するためのリンカー配列を有し、その上流にRNAポリメラーゼが転写を開始するために認識し、特異的に結合するためのプロモーター配列を含む二本鎖DNA断片をいう。「転写開始領域を含む二本鎖DNA断片」の塩基数は、５０〜１５００塩基、好ましくは１００〜３００塩基とすればよく、リンカー配列の塩基数は、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜２５塩基とすればよい。プロモーター配列としては、大腸菌のファージに由来するT7プロモーター配列、T3プロモーター配列、SP6プロモーター等を用いることができる。さらに、この「転写開始領域を含む二本鎖DNA断片」の5'末端領域には２段階目のPCRにおいてセンスプライマーがアニールする配列を含む。
【００２２】
また、「転写終結領域を含む二本鎖DNA断片」とは、その5'末端に上記の増幅された二本鎖DNAのひとつと連結するためのリンカー配列を有し、その下流にRNAポリメラーゼの脱離を促し、転写を終結するためのターミネーター配列を含む二本鎖DNA断片をいう。
転写終結領域を含む二本鎖DNA断片の塩基数は、５０〜１５００塩基、好ましくは１００〜３００塩基とすればよく、リンカー配列の塩基数は、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜２５塩基とすればよい。ターミネーター配列は、一般にGCに富んだ対称性を示す配列と、それに続くTの連続する特徴的な構造を有している。ターミネーター配列としては、例えば、大腸菌のファージに由来するT7ターミネーター配列、T3ターミネーター配列、SP6ターミネーター配列等を用いることができる。さらに、この「転写終結領域を含む二本鎖DNA断片」の3'末端領域には２段階目のPCRにおいてアンチセンスプライマーがアニールする配列を含む。
【００２３】
センスプライマー、アンチセンスプライマーは、上記で得られた直鎖状二本鎖DNAとアニールして伸長反応を起こし、該直鎖状二本鎖DNAが増幅できるものであればよい。
例えば、センスプライマーの塩基配列は該直鎖状二本鎖DNAの5'末端領域とハイブリダイズしてプライマーとして働くものであればよく、アンチセンスプライマーの塩基配列は該直鎖状二本鎖DNAの3'末端領域とハイブリダイズしてプライマーとして働くものであればよい。5'末端領域、3’末端領域の塩基配列が相補的である場合には、１種類のプライマー（ユニバーサルプライマー）で増幅反応が可能である。センスプライマー、アンチセンスプライマーは、通常、5〜50塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、好ましくは15〜25塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。２種類のプライマーを用いるよりも１種類のユニバーサルプライマーを用いる方がPCRによる副産物が少ない点で有利である。ユニバーサルプライマーとしては、例えば、U2プライマー、M13プライマー等を用いることができる。
【００２４】
また、上記「転写開始領域を含む二本鎖DNA断片」、「転写終結領域を含む二本鎖DNA断片」のいずれか一方又は両方に、タグペプチドをコードする配列を含むことが好ましい。タグペプチドとは、発現させるタンパク質のN末端及び／又はC末端に付加されたアミノ酸配列であって、該タンパク質の特定物質との結合能を利用してアフィニティー精製を行ったり、ウェスタンブロッティング検出をする場合の手がかりとして利用できる。タグペプチドとしては、例えば、ヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン(TrxA)、セルロース結合ドメイン(CBD)、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、StreptagTM）が挙げられるが、ヒスチジンタグ（配列番号27）が好ましい。
【００２５】
これらのタグ配列の下流には、トロンビン、Factor Xa、エンテロキナーゼ等のプロテアーゼ切断部位ができるような塩基配列を含んでいてもよく、目的タンパク質を上記タグ配列から切り離して精製することもできる。また、上記タグ配列は目的タンパク質のC末端側に配し、N末端側のリーダー配列の機能を残したまま、精製を容易に行えるようにすることもできる。
【００２６】
工程(c)
最後に、工程（c)では、工程（b)で増幅された直鎖状二本鎖DNAを鋳型DNAとして用いて、無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を合成する。
本発明における「無細胞タンパク質合成系」とは、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系とmRNAの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系の両者を包含する。
本発明の無細胞タンパク質合成系による変異タンパク質製造は従来から知られる無細胞タンパク質合成のための材料、すなわち無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、目的タンパク質をコードする鋳型となる核酸、エネルギー源（ATP、GTP、クレアチンホスフェート等の高エネルギーリン酸結合含有物）等を用いて行うことができる。
【００２７】
「無細胞タンパク質合成用細胞抽出液」とは、リボソーム、tRNAなどのタンパク質インビボ合成に関与する翻訳系又は転写系／翻訳系に必要な成分を含む植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞からの抽出液をいう。具体的には、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスL−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、Hela細胞、CHO細胞、出芽酵母等の抽出液が挙げられる。細胞抽出液の調製は、例えばPratt, J.M.ら、Transcription and trasnlation-a practical approach(1984）、pp.179−209に記載の方法に従い、上記細胞をフレンチプレスやグラスビーズにて破砕し、タンパク質成分やリボソームを可溶化するための数種類の塩を含有する緩衝液を加えてホモジナイズし、遠心分離にて不溶成分を沈殿させることによって行うことができる。
【００２８】
好ましい細胞抽出液としては大腸菌S30細胞抽出液を例示することができる。
当該S30細胞抽出液は、大腸菌A19株（rna，met）、BL21 star、BL21 codon plusから既知の方法（Zubayら（1973)Ann.Rev.Genet.7:267-287)により調製することができ、また市販品（Promega社やNovagen社からも入手可能）を用いてもよい。
上記無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の量は、特に限定されないが、例えば、反応液全体の10〜40重量％の範囲が好ましい。
【００２９】
鋳型DNAの無細胞タンパク質合成用反応液（以下、反応液ともいう）への添加濃度は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成するタンパク質の種類等によって適宜設定することができるが、例えば、通常0.1〜10nM程度とされる。
【００３０】
上記無細胞タンパク質合成系におけるエネルギー源は、生体内でエネルギー源として利用される物質であれば特に限定はされないが、好ましくはATP，GTP，クレアチンリン酸等の高エネルギーリン酸結合を有する物質が挙げられる。また、当該エネルギー源の反応液への添加濃度は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成するタンパク質の種類等によって適宜設定することができる。
【００３１】
上記反応液には、必要に応じて、ATP再生に関与する酵素（例えば、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ又はクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組み合わせ）、各種のRNAポリメラーゼ（T7、T3、及びSP6 RNA polymerase等）、タンパク質の三次元構造を形成する働きを持つシャペロンタンパク質類（例えば、DnaJ、DnaK、GroE、GroEL、GroES及びHSP70等）を添加してもよい。
【００３２】
また、上記反応液には、必要に応じて、非タンパク質性成分を補強することができる。非タンパク質性成分とは、もともと無細胞タンパク質合成用細胞抽出液中に含まれている成分であるが、別途添加することでタンパク質合成能を向上させることができる成分であり、例えばtRNAが挙げられる。
【００３３】
さらに、上記反応液は、必要に応じて、タンパク質やRNAの保護及び／又は安定化のための各種の添加剤を含有させてもよい。当該添加剤としては、例えば、リボヌクレアーゼ（RNアーゼ）阻害剤（胎盤RNaseインヒビター等）；還元剤（ジチオトレイトール等）；RNA安定化剤（スペルミジン等）；プロテアーゼ阻害剤（フェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）等）などが挙げられる。これらの反応液への添加濃度は、使用する無細胞タンパク質合成用細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成する目的タンパク質の種類等に応じて適宜設定すればよい。
【００３４】
無細胞タンパク質合成には、従来から知られているバッチ法、透析法のいずれの方法を用いてもよい。
例えば、バッチ法を用いる場合、反応液には鋳型DNA、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、目的タンパク質の構成材料となるアミノ酸混合物、LM mixture (ATP、GTP、CTP、UTP）、緩衝液、塩類、RNアーゼ阻害剤、抗菌剤のほか、必要によりT7 RNAポリメラーゼなどのRNAポリメラーゼ（DNAを鋳型として用いる場合）、tRNAなどを含むことができる。その他、ATP再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ又はクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組み合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃8000)、3’，5’−cAMP、葉酸類、還元剤（例えばジチオトレイトール）などを含むことができる。
【００３５】
ここで、緩衝液としては、例えばHepes-KOH、Tris-OAcのような緩衝剤が使用できる。塩類としては、例えば酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、塩化カルシウムなどを用いることができ、抗菌剤としては、例えばアジ化ナトリウム、アンピシリンなどを用いることができる。
【００３６】
反応条件は、使用する無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、合成する目的タンパク質等によって適宜設定すればよいが、温度は通常20〜40℃、好ましくは23〜37℃であり、時間は通常1〜24時間、好ましくは3〜4時間である。
【００３７】
また、透析法を用いて連続的に目的タンパク質を製造する場合、上記バッチ式の反応液を透析内液とし、反応液の5〜10倍容量の透析外液に対して透析を行い、生成した目的タンパク質を透析内液又は透析外液から回収する。透析外液は、透析内液組成から無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、RNアーゼ阻害剤、鋳型DNA、RNAポリメラーゼを除いたものが使用できる。従って、透析外液は、例えば、緩衝液、LM mixture (ATP、GTP、CTP、UTP）、塩類、目的タンパク質の構成材料となるアミノ酸混合物、ATP再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼ、抗菌剤などを含んでいればよい。
【００３８】
透析内液と透析外液を隔てる透析膜の分画分子量は、3,500〜100,000、好ましくは10,000〜50,000である。透析は、通常20〜40℃、好ましくは23〜37℃にて攪拌しつつ行い、定期的（通常24時間毎）に新しい外液と交換する。また、新たな核酸（好ましくはmRNA）を定期的（通常24時間毎）に反応液に補給してもよい。透析外液は反応速度が低下した時点で新鮮なものと交換することが望ましい。
【００３９】
透析は、透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とう若しくは攪拌（回転攪拌など）可能な透析装置を用いて行うことができる。小スケール反応用装置としては、例えばDispoDialyzer（登録商標）（Spectrum社製）やSlidealyzer（登録商標）（Pierce社製）等を用いることができる。また、大スケール反応用装置としては、Spectra/Por（登録商標）透析用チューブ（Spectrum社製）等を用いることができる。また、振とう速度若しくは攪拌速度は低速、例えば100〜200rpmとし、反応時間は目的タンパク質の生成を監視しながら適当に選択することができる。
【００４０】
合成したタンパク質の精製は、生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の量及び種類が格段に少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法としては、例えば硫酸アンモニウム若しくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト、等電点クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング等が挙げられ、精製はこれらの方法を当該タンパク質の性質に応じて単独に又は適宜組み合わせて行うことができる。また、当該タンパク質に付加したタグを特異的に認識し吸着することを利用したアフィニティー精製法を用いることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（実施例１）  鋳型DNAの調製
野生型タンパク質としてメチオニン含有量の極めて少ない出芽酵母タンパク質YJL115Wの保存領域を用い、種々の変異タンパク質の製造を試みた。
配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子によってコードされる野生型タンパク質（YJL115W-WT)に対し、該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の第90位のValから第97位のLeuまでのアミノ酸配列を表１に示す変異型のアミノ酸配列に置換した変異タンパク質(YJL115W-MT1〜8)を製造した。
【００４２】
【表１】
2005095083.tif 000003
（１）変異アミノ酸を含む第90位Valから第97位Leuまでのアミノ酸配列部分のみを示す。下線は変異させた各アミノ酸の部位を示す。
【００４３】
まず、配列番号１の１位から507位の塩基配列を有する断片を鋳型とし、下記のプライマー（seq-S1〜seq-A8の塩基配列中、小文字部分は変異導入箇所を表す。）を表２に示す組み合わせで用いて１段階目のPCRを行った。PCR反応液組成を表３に、PCR条件を表４に示す。
【００４４】
（使用プライマー）
seq-FW  （配列番号３）：CCAGCGGCTCCTCGGGAATGTCAATTGTTTCACTG
seq-RV  （配列番号４）：GGGCGGGGATCAATCAATCATTATACGCCGGGCTGTTCAGG
seq-S1  （配列番号５）：GTTATTCTAatgAGTTGTTCTTATGACGGG
seq-A1  （配列番号６）：AGAACAACTcatTAGAATAACAGTCACACT
seq-S2  （配列番号７）：ACTGTTATTatgatgAGTTGTTCTTATGACGGG
seq-A2  （配列番号８）：AGAACAACTcatcatAATAACAGTCACACTAAC
seq-S3  （配列番号９）：GTGACTGTTatgCTAatgAGTTGTTCTTATGACGGG
seq-A3  （配列番号10）：AGAACAACTcatTAGcatAACAGTCACACTAACCAA
seq-S4  （配列番号11）：AGTGTGACTatgATTCTAatgAGTTGTTCTTATGACGGG
seq-A4  （配列番号12）：AGAACAACTcatTAGAATcatAGTCACACTAACCAATTC
seq-S5  （配列番号13）：TTGGTTAGTatgACTGTTATTCTAatgAGTTGTTCTTATGACGGG
seq-A5  （配列番号14）：AGAACAACTcatTAGAATAACAGTcatACTAACCAATTCACTCGC
seq-S6  （配列番号15）：TTGGTTAGTatgACTatgATTCTAatgAGTTGTTCTTATGACGGG
seq-A6  （配列番号16）：AGAACAACTcatTAGAATcatAGTcatACTAACCAATTCACTCGC
seq-S7  （配列番号17）：AGTGTGACTGTTATTCTAatgAGTTGTTCTTATGACGGG
seq-A7  （配列番号18）：TAGAATAACAGTCACACTcatCAATTCACTCGCAGGAAT
seq-S8  （配列番号19）：AGTatgACTatgATTCTAatgAGTTGTTCTTATGACGGG
seq-A8  （配列番号20）：TAGAATcatAGTcatACTcatCAATTCACTCGCAGGAAT
【００４５】
【表２】
2005095083.tif 000004
（１）プライマーの組み合わせは、それぞれ左側に示したものが5’側、右側に示したものが3’側に相当する。
【００４６】
【表３】
2005095083.tif 000005
【００４７】
【表４】
2005095083.tif 000006
【００４８】
１段階目のPCRより得られた各断片（5'側PCR反応産物、3'側PCR反応産物）の種類を表２に、また各断片のアガロースゲル電気泳動写真を図２に示す。
【００４９】
次に、１段階目のPCRで得られた各断片（5'側PCR反応産物、3'側PCR反応産物）の表５に示す組み合わせ、T7P-Nhis-NL1断片(配列番号21）、U2プライマー（配列番号22）、T7T-DT2断片（配列番号25）の混合物に対し、２段階目のPCRを行った。PCR反応液組成を表６に示す（PCR条件は１段階目のPCR反応と同じである）。なお、YJL115W-WTについてはYJL115W-0を5μl用いて２段階目のPCRを行った。
【００５０】
ここで用いたT7P-Nhis-NL1断片(配列番号21）は、U2プライマー（配列番号22）により増幅可能であり、NL1リンカー配列（配列番号23）を含むことから１段階目のPCRで合成したYJL115W-X-1（Xは1から8までの整数）の断片と相補的に水素結合し、２段階目のPCRによりこれらの配列と結合することができる。また、T7プロモーター配列（配列番号24）を持つので、得られたPCR産物をT7 RNAポリメラーゼと混合・保温することによりRNAの活発な転写が可能となる。
【００５１】
一方、T7T-DT2断片（配列番号25）は、U2プライマー（配列番号22）により、増幅可能であり、１段階目のPCRで合成したYJL115W-Y-2（Yは1から8までの整数）の断片と相補的に水素結合し、２段階目のPCRによりこれらの配列に結合することができる。また、T7ターミネーター配列（配列番号26）を持つので、PCR産物を鋳型とするRNAの転写反応がこの部分で終結することが可能となる。
【００５２】
【表５】
2005095083.tif 000007
（１）断片の組み合わせは、それぞれ左側に示したものが5’側、右側に示したものが3’側に相当する。
【００５３】
【表６】
2005095083.tif 000008
【００５４】
２段階目のPCR反応により得られた断片の種類（YJL115W-0〜8）を表５に、及び各断片のアガロースゲル電気泳動写真を図３に示す。
【００５５】
（実施例２）  無細胞タンパク合成系により変異タンパク質の合成
実施例１で得られたDNA断片を、Invitorgen社のTOPO TA cloning kit（cat.K4500-01）を用いてpCR2.1-TOPOに連結し、このプラスミドを大腸菌DH5α株に形質転換した。この形質転換体を培養した後、VIOGENE社のプラスミド抽出キットを用いてプラスミドを純化した。得られたプラスミドについてはdideoxy-sequencing法に従って塩基配列を決定し、YJL115W-0〜8として示す全てのコンストラクトが表１に示す変異アミノ酸を含んだアミノ酸配列をコードしていることを確認した。
【００５６】
これらのDNA断片を用いて、透析法による無細胞タンパク合成を行った。
タンパク質合成の反応液（透析内液）の組成を表７に、タンパク質合成基質溶液（透析外液）の組成を表９にそれぞれ示す。また、表７、９中のLMCPYの組成を表８に、表９中のS30バッファーの組成を表１０にそれぞれ示す。
【００５７】
【表７】
2005095083.tif 000009
【００５８】
【表８】
2005095083.tif 000010
【００５９】
【表９】
2005095083.tif 000011
【００６０】
【表１０】
2005095083.tif 000012
【００６１】
30μlの透析内液を入れたDispo/Dialyzer CE（分子量限界10000もしくは50000，Spectrum社製）を、1000〜1500μlの透析外液の入った24穴平底（またはU底）プレート内に固定し、透析膜が透析外液に常時接するようにする。試験管用振とう培養器で30℃、200〜500rpmで振とうすることによりタンパク質合成を行った。
【００６２】
合成したタンパク質溶液（透析内液の約30μl）は、60μlの滅菌蒸留水と混合し、そのうち15μlを分注した。残りのサンプルは、5300rpm x 10分の遠心分離操作を行い、その上清15μlを別に分注した。それぞれの溶液に30μlのアセトンを混合し、氷上で5分冷却した後、5300rpm x 30分の遠心分離操作で沈澱画分を取得した。この沈澱画分を60〜65℃で10分乾燥した後、下記表１１に示す組成のSDSサンプルバッファー（20〜30μl）で沈澱物を完全に溶解した。この溶液を100℃で3〜5分熱処理した後、5〜10μlを用いてSDS-PAGE法による電気泳動解析を行った。
【００６３】
【表１１】
2005095083.tif 000013
【００６４】
YJL115W-MT4、YJL115W-WT、YJL115W-MT1のSDS-PAGEによる解析結果を図４に示す。SDS-PAGEゲルはSYPRO orangeにより染色し、FUJI LAS-1000の蛍光強度観察により発現タンパク質を検出した。
【００６５】
鋳型DNAの濃度に依存的してYJL115W-MT4、YJL115W-WT、YJL115W-MT1の各タンパク質の発現が約25kDaの位置に確認できた。従って、本発明の方法で変異を導入したYJL115W-MT4、YJL115W-MT1はそれぞれ変異導入前のYJL115W-WTと同程度に発現しているといえる。また、TとSの画分の比較から合成されたタンパク質の大部分が可溶性であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、Ｘ線結晶構造解析（MAD法）に必要なメチオニン導入タンパク質の調製、疾患関連性や薬剤応答性などの研究に必要な遺伝子多型に起因する変異タンパク質の調製を簡便迅速に行えることができる。従って、タンパク質機能の網羅的・系統的解析に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、変異タンパク質作成の手順の模式図を示す（四角は２本鎖DNA、矢印は1本鎖DNAプライマー、Mは変異導入部位、斜線はリンカー配列を示す）。
【図２】図２は、１段階目のPCRより得られた各断片のアガロースゲル電気泳動写真を示す（レーン１：分子量マーカー、レーン２：野生型断片（YJL115W-0）、レーン3〜10：YJL115W-X-1（Xは1から8までの整数）、レーン11〜18：YJL115W-Y-2（Yは1から8までの整数）、写真の左側に記載した数値：各バンドの移動度を示す）。
【図３】図３は、２段階目のPCRより得られた各断片のアガロースゲル電気泳動写真を示す（レーン１：分子量マーカー、レーン２：野生型断片（YJL115W-0）、レーン3〜10：YJL115W-1〜8、写真の左側に記載した数値：各バンドの移動度を示す）。
【図４】YJL115W-MT4、YJL115W-WT、YJL115W-MT1について、それぞれのタンパク質の発現をSDS-PAGE法によって解析した結果を示す（T：無細胞タンパク質合成で得られた画分の1/20量、S：Tの画分を5300rpm x 10分の遠心分離操作によって上清となった画分の1/20量、鋳型DNAの最終濃度：各サンプルの左側からそれぞれ8.0, 4.0, 2.0, 1.0 ng/μl、写真の左側に記載した数値：分子量マーカーの移動度を示す）。
【図１】
2005095083.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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