(57)【要約】【課題】  マイクロプレートの変形に起因する分注操作の支障を起こさず、正確な分注が可能となるマイクロプレート用温度制御装置を提供する。【解決手段】  温度制御機能を備えたウェルブロックと遮温蓋を有し、マイクロプレート内の試料温度を制御する温度制御装置であって、マイクロプレートの穴部以外をウェルブロックに密着させるプレート押え手段を設けてなるマイクロプレート用温度制御装置。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度制御機能を備えたウェルブロックと遮温蓋を有し、マイクロプレート内の試料温度を制御する温度制御装置であって、マイクロプレートの穴部以外をウェルブロックに密着させるプレート押え手段を設けてなるマイクロプレート用温度制御装置。
【請求項２】
プレート押え手段が独自の駆動源を持たず、遮温蓋に連動して閉じるものである請求項１記載の装置。
【請求項３】
プレート押え手段が遮温蓋に押されて閉じる際に当該遮温蓋と押え手段が適切に接触する為のガイド部材を設けてなるものである請求項２記載の装置。
【請求項４】
遮温蓋が閉まる際にプレート押え手段が確実にマイクロプレートを押えるような弾性体を設けてなるものである請求項１〜３のいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
遮温蓋が開いた際に、プレート押え手段がマイクロプレートの押えを継続するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
遮温蓋の回動支点の全部又は一部を回動方向にねじれる弾性体で構成した請求項１〜５のいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
弾性体が所定位置までねじれた状態で遮温蓋が開閉し、蓋を閉じる場合では閉じた後、さらにねじれて蓋の押付け力を高めることを特徴とする請求項６記載の装置。
【請求項８】
遮温蓋の全部又は一部が透明なガラス或いは樹脂で構成されたものである請求項１〜７のいずれか１項記載の装置。
【請求項９】
遮温用の蓋の透明なガラス或いは樹脂部にマイクロプレート穴部を避けてヒーターを配置してなるものである請求項８記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のハイブリダイゼーションやその後のＢ／Ｆ分離において、マイクロプレート内の試料温度を制御して反応を促進させるマイクロプレート用の温度制御装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸のハイブリダイゼーションを行う場合、図１に示すようなハイブリダイゼーション装置が使用される。斯かるハイブリダイゼーション装置においては、デネーチャー（９５℃前後）やアニーリング（４０〜７０℃）を行うため、ヒーターとチラーを備えたウェルブロックを用いて、マイクロプレート内の試料温度を制御することが行われている（例えば、特許文献１参照）。
また、通常、斯かる装置の反応部ｂの上部には遮温蓋が設けられ、昇温時における試料の蒸発防止が図られている。そして、ハイブリダイゼーション後の洗浄時にはこの蓋を開けて分注ヘッドａを用いて反応部から上清を吸って廃液部ｃへ捨てたり、洗浄液部ｄから反応部へ洗浄液を分注する分注ヘッドによる分注作業が行われる。
【０００３】
しかしながら、斯かる従来の装置では、熱によってマイクロプレートが変型し、反ることがしばしばあり、これによって各ウェルの高さに差が生じ、試料の吸引吐出操作において、ウェル底までヘッド先端のチップが届かない場合や、逆に一部だけのチップ先端がウェル底を突っついてしまい、正確な吸引，吐出が出来ない場合があった。
【０００４】
また、既知のＰＣＲ装置では、遮温蓋にヒーターやヒーター上のシール部材をマイクロプレート上部に圧接するものがあるが、この場合では分注作業の為に蓋を開くとマイクロプレートの押えを継続することが出来ずに上記のような分注時の不具合を解消できない。
【特許文献１】特開２００３−１６４２７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、マイクロプレートの変形に起因する分注操作の支障を起こさず、正確な分注が可能となるマイクロプレート用温度制御装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、温度制御機能を備えたウェルブロックと遮温蓋を有し、マイクロプレート内の試料温度を制御する温度制御装置であって、マイクロプレートの穴部以外をウェルブロックに密着させるプレート押え手段を設けてなるマイクロプレート用温度制御装置を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明装置によれば、１）マイクロプレートを押えた状態で分注作業が可能であり、精度の良い、正確な分注が出来る。２）遮温蓋に押え手段をガイドする部材及び板ばねを付けることにより、押え手段を事前に閉めなくとも遮温蓋を閉じる動作で押え手段を閉じることができる。３）遮温蓋が開いた際にも、プレート押え手段がマイクロプレートの押えを継続させることにより、遮温蓋を開けてもマイクロプレートが反る事が無く、確実に分注作業が行われる。４）遮温蓋が完全に閉じた後に、更にばねでモーメントを発生させるようにすることにより、遮温蓋とベース面が密着し、外気との遮断が確実に行なえる。さらに、遮温蓋の位置は密着状態で確実に確保される為、ヒーター上のシールが均一にマイクロプレートの上部を押えることができ、ウェルからの蒸発を抑えられる。
また、遮温蓋の一部を透明なガラス或いは樹脂とした本発明装置を用いれば、容器中の溶液の光強度等を測定する際、遮温蓋を開ける必要がなく、遮温蓋を開ける時間を短縮でき、また遮温蓋を開けた際に溶液が蒸発してしまうことがないため、データ誤差の少ない計測が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明装置の実施の形態を、図２〜図９を用いて説明する。尚、図２〜９中、同一の符号を付した部分は同一物を表わす。
図２及び図３は装置全体の斜視図であり、図２はプレート押えが開いた状態を示し、図３はプレート押えが閉じた状態を示す。図４は左側面図であり、遮温蓋が閉じた状態と開いた状態を示す。図５は遮温蓋支点軸付近の上面図、図６は遮温蓋支点軸と遮温蓋駆動軸の連結部の左側面模式図を示す。
【０００９】
ベース面１上には、ウェルブロック２が設置されている。ウェルブロック２には、この上に乗せられるマイクロプレート３内試料の温度制御を行なうためのペルチェ素子等の温度制御装置（図示せず）が備えられている。また、ベース面１上にはブラケット４に支持された回動自在のプレート押え支点軸５があり、軸上にはプレート押え手段であるプレート押え６が固定されている。プレート押え手段は、マイクロプレートの穴部以外をウェルブロックに密着固定するものであり、マイクロプレートの穴部を塞がず、マイクロプレートをウェルブロックに押さえることができるものであれば、その材質及び形状は特に制限されない。例えば、マイクロプレートの穴部に相当する部分を全てくり貫き、プレートの周囲のみを押さえるようにしたフレーム形状の板（プレート押え６）や、プレートの一個一個の穴部を個別に開けた多数の穴を持つ板等が挙げられる。
このプレート押え６が閉じた状態ではラッチ部材７とプレート押え６の先端が係合し、マイクロプレート３はウェルブロック２上にロックされる。すなわち、プレート押え６は当該ラッチによりロックされ、遮温蓋１０が開いた際にも、マイクロプレートの押えは継続され、マイクロプレートが反ることはない。
【００１０】
一方、ベース面１上には別のブラケット８に支持された遮温蓋支点軸９があり、締結された遮温蓋１０と共に回動可能となっている。遮温蓋１０上にはガイド部材１１で板厚方向に移動可能なヒーター１２等の温度制御装置が取り付けられており、圧縮ばね１３にてマイクロプレート３を押さえつける方向に負勢されている。温度制御装置としては、例えばヒーター板が挙げられ、必要に応じて、その上にシール材を貼り付けることにより、遮温蓋が閉じた場合にウェルからの試料の蒸発をより完全に防ぐことが可能となる。ヒーター１２の横には、プレート押え６が遮温蓋１０に押されて閉じる際に、遮温蓋とプレート押えが適切に接触するためのガイド板１４が設置されている。遮温蓋１０、プレート押え６が共に開いた状態ではプレート押え６の先端はガイド板１４に接している。ガイド板１４の遮温蓋回動支点から遠い側の左右には板ばね１５が設けられ、遮温蓋１０が閉じた状態ではプレート押え６の先端を下方へ押し付ける。すなわち、プレート押え６は、独自の駆動源を持たず、遮温蓋に連動して閉じることができる。
【００１１】
遮温蓋１０の外周にはベース面１に当接される面に遮温シール１６が付けられ、また遮温蓋１０の先端にはベース面１に当接する凸部１７が設けられている。
遮温蓋支点軸９の端面にはすり割りが設けられており、そこにはダンパばね１８のような回動方向にねじれる弾性体の一端が差し込まれている。また、ダンパばね１８の外周は遮温蓋支点軸９に一体で取り付けられる軸方向に凸部２０を設けたカラー１９に覆われている。ダンパばね１８のもう一端はすり割りを有した遮温蓋駆動軸２１に係合されている。遮温蓋駆動軸２１は別のブラケット２３で回動自在に、また遮温蓋支点軸９と同軸を保った位置で支持されており、軸に一体に取り付けられたプーリー２４、タイミングベルト２５、及び図示しないモーターにて駆動される。
【００１２】
遮温蓋駆動軸のダンパばね１８付近には円周方向に凸部２２を持った鍔部が形成されており、遮温蓋１０が開いた状態でダンパばね１８が十分なモーメントを貯えた位置にて遮温蓋駆動軸凸部２２と前記カラー凸部２０が当接するような関係に組まれている。このモーメントは遮温蓋駆動軸を固定して見た場合に遮温蓋支点軸が閉じる方向に負勢される。
従って、遮温蓋１０が開いた状態から遮温蓋の凸部１７がベース面１に当接するまでは遮温蓋駆動軸２１と遮温蓋支点軸９は一体となって回動する。すなわち、遮温蓋が閉じる場合、閉じた後さらにねじれて蓋の押付け力が高められ、遮温蓋とベース面が密着し、外気との遮断が確実に行なえる。
【００１３】
遮温蓋駆動軸２１のもう一端にはセンサ検知板２６が取り付けられ、駆動軸の適正位置をブラケット２３に付けられたセンサ２７にて知ることができる。また、遮温蓋支点軸９のもう一端にもセンサ検知板２８が取り付けられ、ブラケット８に付けられたセンサ２９にて遮温蓋の適正位置を知ることができる。
【００１４】
図７は試料の蛍光強度等を検出する場合の本発明装置の斜視図、図８は同正面から見た断面図、図９はガラス板上に貼られたヒーターの一例を示す。
試料の蛍光強度等を検出する場合には、遮温蓋１０は、その一部又は全部が透明なガラス或いは樹脂とする。遮温蓋１０に開いた穴３１の下にはマイクロプレート３の一列のウェルが位置し、遮温蓋１０の穴３１とマイクロプレート３の間にはヒーター３３の貼られたガラス板３２が挟まれている。尚、ヒーターは、マイクロプレート穴部を避けて配置される。蛍光検出ユニット３０は図示しないＸＹ方向駆動装置によって或いはＺ方向駆動装置によって目的のウェル上に移動し、蓋の上からウェル内試料の蛍光強度等が測定される。
【００１５】
次に、本発明の装置を用いて、核酸ハイブリダイゼーションを行う場合の例を述べる。
核酸ハイブリダイゼーションは、例えば、核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプル核酸が注入・混合された反応容器を反応部に設置し、加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のディネーチャー温度に設定し、当該温度を所定時間保持してサンプル核酸の一本鎖化が行われるが（例えば、特開２００３−１６４２７９号公報）、当該反応は、本発明装置を用いれば、以下のように行うことができる。
すなわち、マイクロプレート３（上記反応容器）を本発明のウェルブロック２に乗せた後、遮温蓋１０をプーリー２４、タイミングベルト２５を介して図示しないモーターにて自動で閉じる。この際、プレート押え６は遮温蓋１０のガイド板１４で滑るように押されてプレート押え支点軸５を中心に閉じる方向に回転する。従って、遮温蓋１０に取り付けられたヒーター１２や或いはマイクロプレートからの試料の蒸発を防ぐシール材に接することなく（故にヒーターやシール材を傷付ける事無く）マイクロプレート上に位置するまで押されて行く。更に遮温蓋１０が閉じると今度は遮温蓋１０の板ばね１５に押され、プレート押え６の先端はラッチ部材７にてロックされる。さらにモーターを回すと遮温蓋１０の先端凸部１７はベース面１に当たり、遮温シール１６がベース面１に密着して遮温蓋１０の内部は密閉される。この状態から更にモーターを回すと遮温蓋駆動軸凸部２２と前記カラー凸部２０が離れ、遮温蓋駆動軸と遮温蓋支点軸間のダンパばねが締め付け方向に回されて遮温蓋の位置を変えないまま、ベース面にさらに強く押し付ける状態となり、ヒーター板１２の圧縮ばね１３とプレート押え６をロックする為の板ばね１５の反力に打ち勝つ適切なモーメントが遮温蓋１０に与えられる位置で遮温蓋駆動軸２１のセンサ検知板２６をセンサ２７が検知してモーターの回転を止める。この状態で例えば７０℃にてサンプル核酸の一本鎖化が行われる。
そして、これに続く吸引・吐出等の分注操作に際しては、上記の段階で閉じた遮温蓋１０がプーリー２４、ベルト２５を介した図示しないモーターにて開けられる。この初期には遮温蓋駆動軸２１と遮温蓋支点軸９間のダンパばね１８の締め付けが緩むだけであり遮温蓋駆動軸２１を回転させても遮温蓋支点軸９はまだ回転しない。遮温蓋駆動軸２１がそのまま回り続けると遮温蓋駆動軸凸部２２と前記カラー凸部２０とが接し、今度は遮温蓋駆動軸２１の回転がそのまま遮温蓋支点軸９へ伝わり遮温蓋１０は開き始める。遮温蓋１０が規定位置まで開くとセンサ検知板２８をセンサ２９が検知してモーターの回転を停止する。
このように、本発明装置は、マイクロプレートを用いた核酸ハイブリダイゼーションにおける温度制御装置として使用できる。
【実施例】
【００１６】
実施例１
図９に示す本発明装置を用いて、アルデヒド脱水素酵素の酵素活性有無を決定するＡＬＤＨ２遺伝子（第１２染色体）のエクソン１２に存在する一塩基多型（ＳＮＰｓ）の遺伝子型判別を行なった。
すなわち、血液から市販キットQIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)によって抽出されたゲノムDNAを鋳型として、プライマー２種（5’-biotin−GGAGT TGGGC GAGTA CGG−3’、および5’−GCAGG TCCAC AATCA CAG −3’）を用いて63bpのDNA断片をPCR増幅した。このPCR断片50μlと100 μgのストレプトアビジン固定化磁気微粒子をTENバッファ (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA and 1M NaCl, pH7.4) 50μl中で混合し、この容器を本発明のウェルブロック２にセットした。室温で15分間インキュベートした後、DNAと磁気微粒子の結合体をマイクロプレート３の底部へ図示しない磁石によって集め、図示しない分注ヘッドで上清を除去した（固相分離）。その後、50mMの水酸化ナトリウム溶液を分注し、磁気微粒子上のDNAを一本鎖に変性させ、再度固相分離によって上清を除去した。更に、200pmolの検出プローブ（Cy5標識ALDH2*1型検出プローブ：5’−Cy5−TTCAC TTCAG TGTAT−3’、および Cy3標識ALDH2*2型検出プローブ：5’−Cy3 −TTTCA CTTTA GTGTAT-3’）を導入し、90℃に温度制御された遮温蓋１０を閉め、72℃で3分間熱変性後、ゆっくりと25℃まで冷却し10分間インキュベートすることによって、磁気微粒子上の一本鎖DNAと二本鎖を形成させた。この後、遮温蓋１０を開け、洗浄バッファで3回固相分離・洗浄することで、未反応の検出プローブを除去した。更に遮温蓋１０を閉めた後、蛍光検出ユニット３０をマイクロプレート３の対象ウェル上面に移動させ、25℃における容器中の溶液の蛍光強度を2つの検出プローブについて測定した（Cy5：Ex645nm, Em675nm、Cy3：Ex540nm, Em570nm）。測定後、容器温度を2℃上昇させ、再び溶液の蛍光強度を測定した。同様にして2℃ずつ80℃まで容器温度を上昇させながら、その度の溶液蛍光強度を順次測定を行なった。全ての測定が終了後、各温度における2つの検出プローブの蛍光強度の差（ALDH2*1型プローブからALDH2*2型プローブを引く）を図にプロットし、このカーブがプラス側に膨らむか（ALDH2*1ホモ型）、マイナス側に膨らむか（ALDH2*2ホモ型）、ゼロ付近で平坦か（ヘテロ型）を観察することによって遺伝子型を判別した。
本発明装置によれば、遮温蓋を閉じたままで蛍光強度を測定できることから、遮温蓋を開ける時間を短縮でき、また遮温蓋を開けた際に溶液が蒸発してしまうことがなく、データ誤差の少ない計測が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】従来のハイブリダイゼーション装置の斜視図である。
【図２】図２は本発明装置全体の斜視図（プレート押えが開いた状態）である。
【図３】図３は本発明装置全体の斜視図（プレート押えが閉じた状態）である。
【図４】図４は本発明装置の左側面図である。
【図５】図５は遮温蓋支点軸付近の上面図である。
【図６】図６は遮温蓋支点軸と遮温蓋駆動軸の連結部の左側面模式図である。
【図７】図７は蛍光強度を検出する場合の本発明装置の斜視図である。
【図８】図８は蛍光強度を検出する場合の本発明装置の正面から見た断面図である。
【図９】図９はガラス板上に貼られたヒーターの配置を示した図である。
【符号の説明】
【００１８】
１．ベース面
２．ウェルブロック
３．マイクロプレート
４．ブラケット
５．プレート押え支点軸
６．プレート押え手段
７．ラッチ部材
８．ブラケット
９．遮温蓋支点軸
１０．遮温蓋
１１．ガイド部材
１２．ヒーター
１３．圧縮ばね
１４．ガイド板
１５．板ばね
１６．遮温シール
１７．凸部
１８．ダンパばね
１９．カラー
２０．凸部
２１．遮温蓋駆動軸
２２．凸部
２３．ブラケット
２４．プーリー
２５．タイミングベルト
２６．センサ検知板
２７．センサ
２８．センサ検知板
２９．センサ
３０．蛍光検出ユニット
３１．穴
３２．ガラス板
３３．ヒーター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005265627.tif 000008
【図７】
2005265627.tif 000009
【図８】
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【図９】
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