(57)【要約】      （修正有）【課題】導波層の表面で最小量の発光材料を検出することが可能である誘電体光センサー載台を提供する。【解決手段】励起光の入力結合のための回折格子が具備されており、前記基材（ａ）の屈折率が導波層（ｂ）の屈折率よりも低い、薄く透明な導波層（ｂ）が施された透明な基材（ａ）からなる平面の誘電体光センサー載台を用い、液体試料を該層（ｂ）と接触させ、試料中の発光特性を有する物質によるか又は該層（ｂ）上に固定された発光特性を有する物質により生成された発光を、電気光学的に測定する。【選択図】図１
2005326426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薄く透明な無機材料の導波層（ｂ）が施された透明な基材（ａ）を含む平面の誘電体光センサー載台であって、
励起光の入力結合のためのレリーフ回折格子が具備され、かつ、前記基材（ａ）の屈折率が導波層（ｂ）の屈折率よりも低く、
（Ａ）該回折格子は３〜６０nmの深さ変調を有し、
（Ｂ）該層（ｂ）の厚みが４０〜１６０nmであり、そして
（Ｃ）該層（ｂ）の厚みに対する該深さ変調の比が０．５より小さい、
ことを特徴とする平面の誘電体光センサー載台。
【請求項２】
該基材が、水晶、無機ガラス又はプラスチック材料で構成されている、請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項３】
ＳｉＯ２又は熱可塑性、熱硬化性若しくは構造的に架橋されたプラスチックからなる中間層が、基材（ａ）と導波層（ｂ）の間にさらに具備され、この中間層が基材（ａ）のものより小さいか又は等しい屈折率を有する、請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項４】
該平面の透明な導波層が、２より大きい屈折率を有する材料からなる、請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項５】
該平面の透明な導波層（ｂ）が、８０nm〜１６０nmの厚みを有する、請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項６】
該回折格子が、２００〜１，０００nmの回折格子周期を有する、請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項７】
該回折格子が、５〜３０nmの深さ変調を有する、請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項８】
該回折格子が、０．５〜２の線対空間の比を有する、請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項９】
接着促進層が、導波層の表面に存在する、請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項１０】
分析対象物を検出するために用いられる発光しうる物質が、導波層（ｂ）の表面上に直接固定されている、請求項１項記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項１１】
分析対象物内の結合パートナーの１つのためか又は分析対象物自体のための、化学的又は生化学的検出物質としての特定の結合パートナーが、センサー載台の表面上に固定された、請求項１に記載の平面の誘電体光センサー載台。
【請求項１２】
請求項１記載の載台と、レーザ光源と、漸減励起発光を測定するための測定ユニットと、を含む、発光を測定するための装置。
【請求項１３】
請求項１記載の平面の誘電体光センサー載台を用い、液体試料を該層（ｂ）と接触させ、試料中の発光特性を有する物質によるか又は該層（ｂ）上に固定された発光特性を有する物質により生成された発光を、電気光学的に測定することにより検出するための方法であって、
レーザからの該励起光が平面型導波路の中に該格子を介して結合し、かつ導波層を横断し、それにより発光特性を有する物質が導波層の漸減場中で励起して発光し、
等方的に放出された漸減励起発光を測定するか、又は該センサー載台中で戻り結合された漸減励起発光を該センサー載台の端部で測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導波路に基づく平面の誘電体光センサー載台を用いて、漸減的に励起された発光を測定するための方法に関する。本発明は、同様に、定性的親和性検出のためのこの方法の使用、及び光学的に濁った溶液中の発光成分の選択的定量測定のためのその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
光学的により薄い媒質によってとり囲まれている平面型導波路内に光波が結合すると、この光波は、全反射率により導波層の界面に導かれる。平面型導波路は最も簡単な場合には３層システム：基板、波伝導層、及び上層（例えば、検定用試料）からなり、波伝導層は最も高い屈折率を有している。付加的な中間層が、平面型導波路の活性を更に一層増強させることができる。
【０００３】
光エネルギーの一部分は光学的により薄い媒質に進入する。この部分は、漸減（減衰）場（evanescent(=fading)field）と呼ばれている。漸減場の強度は、導波層自体の厚み、及び導波層の屈折率ととり囲む媒質の屈折率の比により非常に大きく左右される。薄い導波路、すなわち導くべき波長よりも小さな層厚の場合、伝導される光の離散的モードを識別することが可能である。漸減場を用いると、例えば光学的により薄い媒質の中で被伝搬光波に直接隣接してのみ、発光を励起することができる。この原理は、漸減発光励起と呼ばれている。
【０００４】
漸減発光励起は、励起が導波層の直接的環境に制限されているので、分析の分野において非常に興味があるものである。
【０００５】
発光染料で標識付けされた抗体又は抗原の漸減励起発光を検出するための方法及び装置は、知られており、とりわけＵＳ−Ａ−４５８２８０９号に記載されている。この出願明細書中に請求されている集成装置は、漸減発光励起のための光ファイバーが使用されている。このような光ファイバーは、典型的には１ミリメートルまでの直径を有し、レーザー光がそれに結合されたとき多数のモードを処理する。漸減励起発光は、ファイバーの中を通り抜けて戻った部分（traction tunnelled back)によってのみ簡単な方法で測定することができる。装置の寸法がきわめて大きいこと及び比較的大きい試料体積が必要とされることが更なる欠点である。この装置は大きさを実質的に縮小すること、又は集積型光センサーにまで小型化することができない。通常、感度の増強には、装置寸法の増大が伴う。
【０００６】
平面型光学導波路を用いた漸減励起条件下でのバイオセンサーの発光を検出するための測光計器も、同様に知られており、とりわけＷＯ９０／０６５０３に開示されている。そこで使用されている導波層は、１６０〜１，０００nmの厚みを有し、励起波への光の結合（coupling of light)は、結合格子なしで行われる。
【０００７】
漸減励起発光の感度を増強するためと集積型光センサーを製造するためのさまざまな試みが行われてきた。かくして、例えば、Biosensors & Bioelectronics 6(1991), 595-607は、励起波への光の結合がプリズムを用いて行われ、２工程式イオン交換プロセスで製造される平面型単モード又は低モード導波路について報告している。使用される親和性系は、ヒト免疫グロブリンＧ／フルオレセインで標識付けされたプロテインＡであり、ここで抗体は導波路上に固定され、リン酸緩衝液中で検出されるべききフルオレセインで標識付けされたプロテインＡは、導波路の測定領域を覆うポリビニルアルコールのフィルムに添加される。この方法のかなりな欠点は、導波層と基板層の間の屈折率のわずかな差しか達成できず、その結果、感度は比較的低いものとなる、ということである。
【０００８】
プロテインＡに結合されたイソチオシアン酸フルオレセインにおいて、感度は２０nmであると言われている。これは、微細な痕跡を検出できるにはまだ不充分であり、感度の更なる増強が必要である。更に、プリズムによる励起波への光の結合の再現可能性及び実行可能性は、プリズムと導波路の間の接触領域の品質及び大きさに結合効率が著しく依存していることからみて、むずかしいように思われる。
【０００９】
もう１つの原理は、ＵＳ−Ａ−５０８１０１２号で提案されている。平面の導波層は２００nm〜１，０００nmの厚みを有し、２つの格子構造を含み、そのうちの１方の格子構造は反射格子として設計され、そのために、導波路に結合された光波は少なくとも２回格子構造の間のセンサー領域を横断しなければならない。この方法により、感度の増強が達成されると言われている。１つの欠点は、反射された放射線が、バックグラウンド放射線強度の望ましくない増大を導くことができるという点にある。
【００１０】
平面型導波路の製造法は、基材の平面構造、導波層の一定の厚み及び均質性並びに使用される材料の屈折率が非常に重要である方法である。これについては、とりわけＥＰ−Ａ−０５３３０７４号に記載されており、そこではプラスチック基材に対して無機導波路を適用することが提案されている。この方法は、例えば、プラスチック材料内に、構造をエッチングすることによって結合用回折格子の経済的に有用な構造化が実施できるという利点を有する。しかしながら、他方では、プラスチック基材の光学的品質に対する要求度が高くなる。
【００１１】
平面型導波路は、光ファイバーに基づく導波路に比べ、大規模生産において著しい利点を提供する。特に、通常、ファイバーの切断された端部に最終研磨をほどこして完全な光学的品質を得ることが必要である。しかしながら、平面型導波路は、大きな寸法で製造し、その後で望ましい大きさに押し抜いたり、破断又は切断することができる。端部に最終的研磨を施す作業はほとんどの場合、不要とすることができ、それにより大規模生産はより経済的なものとなる。
【００１２】
結合回折格子を伴う平面型導波路が有する更なる利点は、測定装置又は測定用装備における簡単な較正と、例えば分析対象物を固定するための簡単な被覆を施す、といった点にある。この目的のためには、再現可能な一定の層厚を調製することのできる被覆技術の標準的方法を使用することが可能である。このような方法の典型的な例としては、噴霧、ナイフ被覆、スピン被覆又は浸漬塗装である。品質制御も同様に、既知の非常に正確な方法により実施することができる。適当な方法は、顕微鏡又はインターフェロメトリー法、楕円偏光法又は接触角測定法である。光ファイバーに基づく導波路内に発生する湾曲した表面については、これらの方法は適用できないか、又は適用が困難である。
【００１３】
実際の導波層の他に、導波層への光波の結合の性質が主な問題点を構成している。集積型光センサーのためのテーパー付き導波路への光の結合のために回折格子に課せられる必要条件は、とりわけ、Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors V, Proc. SPIE, Vol 2068, 1-13, 1994 で議論されている。導波路の層厚及び回折格子の深さ変調は、この参考文献において重要な要点として記載されている。その中で提案されているシステムは、典型的には、集積型光学光ポインタとして使用できるが、検出すべき発光については全く言及されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発光測定のために集積型結合回折格子と共にこのような平面型導波路を使用することが望ましい場合には、それらの有用性及び高感度の達成のため不可欠な要点は、充分に大きな入力結合効率、できるかぎり強い漸減場、及び被伝搬波の低い減衰である。これらの要点は、導波層の屈折率及び基材材料の組み合わせ、並びに存在する全ての中間層、導波路の層厚、結合回折格子の構造、深さ変調及び回折格子周期によって決定的に左右される。更に、表面及びそれらの平面構造又は粗密度が必須の光学的品質として存在している。
【００１５】
現在、簡単な方法、かつ付加的な反射回折格子なしで、屈折率、層厚及び深さ変調といった上述の重要な要点を組合せることによって高感度で発光の漸減励起と検出のための方法を実施することが可能であることがわかっている。典型的には、被伝搬光波の減衰は、このとき３dB/cm未満であり、それにより結果として、被伝搬ビームの長い距離と、とり囲む媒質内への被伝搬波の低い散乱をもたらす。特に、これらの条件下では、ＴＥＯ及びＴＭＯモードを導くことが好ましい。発光を測定することに加えて、吸収性試料の存在下で励起光の吸収を高い精度で測定することができるためには、この伝搬距離で充分である。
【００１６】
１つのモードのみか又は少数のモードが導かれるこれらの平面型導波路は、特に高い感度及び小型化された構成によって特徴づけられている。通常、この感度は、平面構成又は繊維質構成の多モード導波路によっては達成できず、また達成されたとしても、はるかに大きな幾何的寸法を伴ってのみ可能である。
【００１７】
結合回折格子の入力結合（input-coupling）効率は高く、そのために導波路に結合される光波の強度は同様に高くなり、その結果低い減衰と合わさって優れた感度がもたらされることになる。
【００１８】
この感度は、漸減場が驚くほど強いこと、かつかくして生成された高い電磁場が感度の更なる増強に寄与することによって、一層高められる。それにより、導波層の表面で最少量の発光材料さえも検出する可能性が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明は、その１つの形態において、励起光の入力結合のための回折格子が具備されており、かつ基材（ａ）の屈折率が導波層（ｂ）の屈折率よりも低い、薄く透明な導波層（ｂ）が施された透明な基材（ａ）からなる平面の誘電体光センサー載台を用い、液体試料を該層（ｂ）と接触させ、試料中の発光特性を有する物質によるか又は該層（ｂ）上に固定された発光特性を有する物質により生成された発光を、電気光学的に測定することにより検出するための方法であって、
（Ａ）該励起光が平面型導波路の中に結合（coupled)し、かつ導波層を横断し、それにより発光特性を有する物質が導波層の漸減場で発光まで励起され、
（Ｂ）該回折格子は３〜６０nmの深さ変調を有し、
（Ｃ）該層（ｂ）の厚みが４０〜１６０nmであり、そして
（Ｄ）該層（ｂ）厚みに対する該深さ変調の比が０．５より小さい、
ことを特徴とする方法に関する。
【００２０】
本発明の範囲内では、平面の誘電体光センサー載台というのは、この載台が、裸眼で見て平面に見えることを条件として、細片、平板、円板又はその他のあらゆる幾何形状をしているということを意味する。選ばれた幾何形状は、本質的に重要ではなく、センサー載台が組み込まれる装置全体の構成によって左右され得る。しかしながら、これは、励起光源及び電気光学的検出システムから空間的に分離された、独立した素子として使用することもできる。好ましい配置は、実質的な小型化を可能にするような配置である。
【００２１】
適切な基材は、典型的には、あらゆる種類のガラス又は石英である。できるかぎり低い光学屈折率及びできるかぎり低い固有発光を有し、しかも、例えばエッチング、カッティング及び研磨といったようなできるかぎり簡単な方法で光学的に処理することのできるガラスを使用することが好ましい。基材は、少なくとも励起及び発光波長において透明でなくてはならない。
【００２２】
基材は、また、例えばＥＰ−Ａ−０５３３０７４号に記載されているようにプラスチック材料であってもよい。
【００２３】
基材は、また、基材のそれより低いか又は同一の屈折率を有し、かつ１０μm未満の厚みを有する薄い層が具備されていてもよい。この層は基材の表面粗密度を低減するのに役立つことができ、熱可塑性、熱硬化性又は構造的に架橋されたプラスチック、又はＳｉＯ2といったような無機材料で構成されていてもよい。
【００２４】
発光励起のためには、実質的に平行な光のみが適している。本発明の範囲内では、「実質的に平行な」という表現は、５°未満の相違を意味するものとして理解される。このことはすなわち光が弱い発散性又は収斂性を有していてよいということを意味する。
発光励起のためにはコヒーレント光、より特定的に言うと、波長３００〜１，１００nm、更に特定的には４５０〜８５０nm、最も好ましくは４８０〜７００nmのレーザー光を使用することが好ましい。
【００２５】
適切に使用できるレーザーは、色素レーザー、ガスレーザー、固体レーザー及び半導体レーザーである。必要な場合には、発光波長は、非線形光学的結晶により２倍化させることもできる。ビームは、更に光学素子により集束させたり、偏光させたり、又はグレーフィルターによって減衰させたりすることもできる。特に適切なレーザーは、それぞれ４５７nm〜５１４nm及び５４３nm〜６３３nmの波長で発光する、アルゴン、イオンレーザー及びヘリウム−ネオンレーザーである。特に優れて適切なレーザーは、６３０nm〜１，１００nmの基本波長で発光する半導体材料のダイオードレーザー又は周波数２倍化ダイオードレーザーである。これは、これらのレーザーが、寸法が小さく電力消費量が低いことからセンサーシステム全体の実質的な小形化を可能にするからである。
【００２６】
本発明の範囲内では、「試料」という語は、測定されるべき物質、すなわち分析対象物を含有する可能性のある、検定されるべき溶液全体を意味するものとしてとられるものとする。測定は単一工程又は多工程方式の検定の中で行うことができ、その間、センサー載台の表面は１つ又は２つ以上の溶液と接触させられている。利用される溶液のうち少なくとも１つは、本発明の実施において検出され得る発光特性を有する物質を含有することができる。
【００２７】
発光特性を有する物質がすでに導波層（ｂ）上に吸着されている場合には、試料は、発光成分を含まなくてもよい。この試料は、更なる成分、すなわち典型的にはpH緩衝液、塩、酸、塩基、表面活性物質、粘度に影響を及ぼす改質剤又は染料を含むことができる。特に、溶媒として生理食塩水を使用することができる。発光成分自体が液体である場合、溶媒を添加せずにすませることができる。この場合、試料は、発光特性を有する成分を１００％まで含むことができる。
【００２８】
試料は、更に生物学的媒質、例えば卵黄、体液又はその構成成分、特に血液、血清、血漿又は尿を含有してもよい。更に、試料は、地表水、土壌又は植物の一部分といったような天然の又は合成の媒質の抽出物溶液、生物加工ブロス又は合成ブロスで構成されていてもよい。
【００２９】
試料は、未希釈であっても、付加的に溶媒と共に用いられてもよい。
【００３０】
適切な溶媒は、水、水性緩衝液及びタンパク質溶液並びに有機溶剤である。適切な有機溶剤は、アルコール、ケトン、エステル、及び脂肪族炭化水素である。水、水性緩衝液、又は水と水混和性有機溶剤を使用することが好ましい。
【００３１】
しかしながら、試料には、例えば顔料粒子、分散剤、天然又は合成のオリゴマー又は重合体といった、溶媒中に不溶な構成成分を含むことができる。
【００３２】
適切な発光化合物は、典型的にはローダミン、フルオレセイン誘導体、クマリン誘導体、ジスチリルビフェニル、スチルベン誘導体、フタロシアニン、ナフタロシアニン、ポリピリジル−ルテニウム錯体、例えばトリス（２，２′−ビピリジル）−ルテニウム塩化物、トリス（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム塩化物、トリス（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウム塩化物及びポリピリジル−フェアジン−ルテニウム錯体、白金−ポルフィリン錯体例えばオクタエチル−白金−ポルフィリン、長寿命ユーロピウム及びテルピウム錯体又はシアニン染料をも含む、３３０nm〜１，０００nmの波長範囲の発光を有する発光染料である。血液又は血清中での分析のために特に適しているのは、６００〜９００nmの範囲の吸収及び発光波長を有する染料である。
【００３３】
特に適した発光性化合物は、例えばイソチオシアン酸フルオレセインといった、共有結合することができる官能基を含有するフルオレセイン誘導体などの染料である。
【００３４】
同様に非常に適しているのは、とりわけClinical Chemistry 40（9）: 1819-1822, 1944 に同様に記載されている単−及び二官能性Ｃｙ５．５TM 染料といったBiological Detection Systems Inc.,から入手可能な機能性蛍光染料である。
【００３５】
好ましい発光は、蛍光である。
【００３６】
使用に好適な発光染料は、同様に、例えば抗体又は抗体フラグメント、抗原、タンパク質、ペプチド、レセプター又はそのリガンド、ホルモン又はホルモンレセプター、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体、プロテインＡ及びＧ、アビジン又はビオチンのような結合タンパク質、酵素、酵素補助因子又は阻害物質、レクチン又は炭水化物のような生化学親和性系の中の結合パートナーの１つ又は重合体に対して化学的に結合されていてもよい。最後に言及した電子対共有発光標識付けは、可逆的又は不可逆的（生）化学親和性検定に好ましく利用されるものである。また、発光標識付けされたステロイド、脂質及びキレータを使用することもできる。特に、さまざまなルーテニウム錯体のように、挿入において発光の増強を示す場合には、ＤＮＡ鎖又はオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーション検定のために、挿入発光染料もまた特に興味がある。これらの発光標識付けされた化合物をセンサー載台の表面上に固定されたその親和性パートナーと接触させた場合、測定された発光強度から定量的に結合を測定することができる。例えば、酵素での発光消光又はタンパク質の立体配座修飾による発光の増強の形で、試料が発光団と相互作用した時点で発光の変化を測定することによっても分析対象物の定量的測定が可能である。
【００３７】
導波層の屈折率は、用いられる基材及びあらゆる中間層の屈折率よりも大きくなくてはならない。好ましくは、平面の透明な導波層は、２より大きい屈折率を有する材料で構成されている。
【００３８】
適切な材料は、典型的には無機材料、好ましくは、ＴｉＯ2、ＺｎＯ、Ｎｂ5Ｏ5、Ｔａ2Ｏ5、ＨｆＯ2又はＺｒＯ2といった無機金属酸化物である。
【００３９】
Ｔａ2Ｏ5及びＴｉＯ2が好ましい。
【００４０】
透明な導波層の厚みは、好ましくは８０〜１６０nmである。
【００４１】
励起光を導波層に結合するための回折格子の深さ変調は、好ましくは５〜３０nmである。
【００４２】
回折格子は好ましくは、０．５−２の線対空間の比を有する。線対空間の比というのは、典型的には、矩形回折格子において線幅対空間幅の比率である。
【００４３】
励起光を結合するための回折格子は、光学回折回折格子、好ましくはレリーフ回折格子の形態を有する。レリーフ構造は、異なる形のものであってよい。例えば、正弦、矩形又はのこぎり歯構造が適切である。このような回折格子の製造方法は知られている。これらを製造するためには、主として、例えばChemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors V. Proc. SPIE Vol 2068, 1-13, 1944で記載されている方法のような写真製版又はホログラフィ方法及びエッチング技術が使用される。
【００４４】
回折格子構造は、基材上で製造し、その後導波層に移送することができ、この導波層の中で回折格子構造はその後結像されるか、又は回折格子は導波層自体の中で製造することができる。
【００４５】
回折格子周期は２００〜１，０００nmであることができ、回折格子は、好都合にはただ１つの周期性しか示さない、すなわち単回折である。
【００４６】
本発明の方法において、試料は、固定状態で導波層と接触させ、かつその上に連続的に導くことができ、サイクルは、まばら又は密のいずれであってもよい。
【００４７】
この方法の１つの特定の実施形態は、導波層（ｂ）の表面で直接分析対象物を検出するために用いられる発光特性を有する物質を固定することからなる。発光特性を有する物質は、例えば、タンパク質に結合され、それにより導波層の表面でこの方法で発光まで励起されることができる発光団であることができる。このタンパク質に対する親和性を有するパートナーがこの固定層上に導かれる場合、発光は改変することができ、該パートナーの量はこの方法で測定することができる。特に、親和性錯体の両方のパートナーは、例えば発光消光の形でのこの２つの間のエネルギー移動から濃度の測定を行うことができるように、発光団で標識付けすることもできる。
【００４８】
化学的又は生化学的親和性検定を実施するための方法のもう１つの好ましい形態は、分析対象物自体のための又は結合パートナーの１つのための化学的又は生化学的検出物質として、特定の結合パートナーをセンサー載台の表面上に固定することからなる。検定は単工程方式又は多工程方式検定であることができ、その連続する工程において、センサー載台の表面上に固定された検出物質のための結合パートナーを含有する１つ又は２つ以上の溶液が導かれ、分析対象物は、部分的工程のうちの１つにおいて結合状態となる。分析対象物の検出は、親和性検定での発光標識付けされた関与物質を結合させることによって行われる。使用される発光標識付けされた物質は、親和性検定の１つ又は２つ以上の結合パートナー、又は発光団を有する分析対象物の類似体で構成されていてもよい。ただ一つの判定基準は、分析対象物の存在が、選択的に発光信号を導くか又は選択的に発光信号の変更を導くかである。
【００４９】
検出物質の固定は、典型的には、導波層上の直接的な疎水性吸収又は共有結合によってか、又は、表面の化学的改質の後に例えばシラン化又は重合体層を施すことによって実施される。更に、導波路上での直接的な検出物質の固定を容易にするため、導波層に対して直接接着促進層として例えばＳｉＯ2からなる薄い中間層を施すことができる。この中間層の厚みは、５０nm好ましくは２０nmを超えるべきではない。
【００５０】
適当な検出物質は、典型的には、抗原に対する抗体、免疫グロブリンに対するプロテインＡ及びＧといった結合タンパク質、リガンドに対するレセプター、その相補鎖に対するＲＮＡ及びＤＮＡの１本鎖及びオリゴヌクレオチド、ビオチンに対するアビジン、酵素基質に対する酵素、酵素補助因子又は阻害物質、炭水化物に対するレクチンである。それぞれの親和性パートナーのいずれがセンサー載台の表面上に固定されているかは、検定の構成によって左右されることになる。
【００５１】
検定自体は、単一工程の複合化方法（complexing process）、例えば競合検定、又は多工程方法、例えばサンドイッチ検定であることができる。
【００５２】
競合検定の最も簡単な場合においては、未知濃度の分析対象物と発光標識付け以外は類似している既知量の化合物を含有する試料を、センサー載台の表面と接触させ、ここで発光標識付けされた分子と標識付けされていない分子は、それらの固定された検出物質の結合部位について競合する。この検定形態においては、試料が全く分析対象物を含有しない場合に、最大の発光信号が達成される。検出すべき物質の濃度が増大するにつれて、観察中の発光信号は低くなる。
【００５３】
競合免疫検定においては、固定されるのは必ずしも抗体である必要はない。抗原もまた検出物質としてセンサー載台の表面上に固定することができる。通常、化学的又は生化学的親和性検定において、パートナーのいずれが固定されるかは重要でない。これは、導波層の漸減場内の吸着された質量の変化に基づいている、表面プラズマ共鳴又はインターフェロメトリーといった方法に比べて、発光に基づく検定が有する基本的な利点である。
【００５４】
更に、競合検定の場合、競合は、センサー載台の表面の結合部位に制限される必要はない。例えば、既知量の抗原をセンサー載台の表面上で固定し、次に発光標識付けされた抗体及び分析対象物としての同じ抗原の検出すべき未知量のみを含有している試料と接触させる。この場合、表面上に固定されている抗原と溶液状態で存在する抗原間の競合が、抗体の結合に関して起こる。
【００５５】
多工程方式検定の最も簡単な場合は、一次抗体がセンサー載台の表面上に固定されているサンドイッチ免疫検定である。検出すべき抗原の結合及び抗原の第２のエピトープに対する検出を実施するために用いられる発光標識付けされた二次抗体の結合は、抗原を含有する溶液及び発光標識付けされた抗体を含有する第２の溶液との連続的接触によるか、又は上述のこれら２つの溶液の組合せにより実施することができ、これにより最終的に抗原及び発光標識付けされた抗体からなる部分複合体が結合されることになる。
【００５６】
親和性検定は、同様に、更なる付加的な結合工程を含むこともできる。例えば、サンドイッチ免疫検定法の場合、いわゆるＦｃ部分において前述のとおり実施される連続サンドイッチ検定において、一次抗体として作用することになる免疫グロブリンを特異的に結合させるプロテインＡは、第１工程においてセンサー載台の表面上に固定することができる。
【００５７】
典型的には既知のアビジン−ビオチン親和性系を用いた更なるタイプの親和性検定が数多く存在する。
【００５８】
親和性検定タイプの例は、J.H. Rittenburg, Fundamentals of Immunoassay; in Dvelopment and Application of Immunoassay for Food Analysis, J.H. Rittenburg(Ed.), Elsevier, Essex 1990, 又はin P.Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, R.H. Burdon, P.H. Van Knippenberg(Eds), Elsevier, Amsterdam 1985に見い出すことができるだろう。
【００５９】
更に、ただ一回の使用だけでなく再生してセンサー載台の表面を使用することが可能である。適当な条件下、例えば低いｐＨ、高い温度の下で、有機溶剤又はいわゆるカオトロピック試薬（塩）（chaotropic reagents(salts)）を用いて、固定された検出物質の結合能力を実質的に損なうことなく選択的に親和性複合体を解離させることが可能である。厳密な条件は、特定の親和性系により強く左右される。
【００６０】
この方法のもう１つの基本的実施形態は、一方では、戻り結合（back-coupling)の場合に信号測定にまた適用されるが、導波路の漸減場に対する信号の生成を制限し、他方では、平衡プロセスとしての親和性複合体形成の可逆性からなる。連続流系内で適切な流量を用いることによって、漸減場内の結合された発光標識付けされた親和性パートナーの、結合又は脱着又は解離を実時間で監視することが可能である。したがって、この方法は、異なる会合定数又は解離定数を測定するための動力学研究又は変位検定のためにも適している。
【００６１】
漸減励起発光の検出は、既知の方法で行うことができる。フォトダイオード、フォトセル、光電子増倍管、ＣＣＤカメラ及び検出器セット、例えばＣＣＤセルなどを適切に用いてもよい。発光は、その上のミラー、プリズム、レンズ、フレネルレンズ及び屈折率変化形レンズなどといった光学素子で結像することができる。発光波長を選択するためには、フィルター、プリズム、単色フィルター、二色フィルター及び回折回折格子といった既知の素子を用いることが可能である。
【００６２】
本発明の方法の１つの実施形態は、等方的に発光された漸減励起発光を測定することからなる。
【００６３】
本発明の方法のもう１つの実施形態には、センサー載台の端部において、このセンサー載台で戻り結合された（coupled back）漸減励起発光を検出することが含まれる。この戻り結合された蛍光の強度は驚くほど高く、そのためこの方法を用いて同様に非常に優れた感度も達成できる。
【００６４】
本発明の方法のもう１つの実施態様は、等方的に放出された漸減励起発光並びに導波路に戻り結合された発光を、互いに独立して、ただし同時に測定することからなる。導波層からの発光団の距離によって左右される２つの発光検出方法の異なる選択性のため、この実施形態では、発光団の空間的分布についての付加的な情報を得ることができる。したがって、これは、発光団の光化学減衰と発光団を有する親和性複合体の解離を識別する可能性を提供する。
【００６５】
本発明の方法の１つの利点は、発光の検出の他に、照射された励起光の吸収も同様に測定できるという点にある。光ファイバー又は平面構成の多モード導管路と比べて、この場合、かなり優れた信号対雑音比が達成される。発光及び吸収の同時測定により、高感度で発光抑制効果を測定することが可能となる。
【００６６】
この方法は、連続波（ＣＷ）モードで照射することによって実施することができ、すなわち励起は、経時的に一定である光強度で行うことができる。
【００６７】
しかしながら、この方法は、例えば１ピコ秒から１００秒までのパルス長を有する調時パルスの形での励起光の照射によるか、及び発光の時間分解された検出（短いパルス長の場合）によるか又は秒〜分単位の間隔で実施することもできる。この方法は、例えば分析的に結合形成の速度を監視するか又は短い露出時間を用いた光化学減衰による発光信号の減少を防ぐことが望ましい場合にはつねに特に有利である。適当な短いパルス長及び検出の適切な時間分解を用いることにより、更に、短寿命放射線が減衰した後にのみ分析対象物の発光を検出することによって、この場合好ましくは長寿命である標識付け用分子の発光から、センサー材料及び試料の望ましくないあらゆる発光構成成分の拡散光、ラマン及び短寿命発光を区別することが可能である。更に、時間分解された発光検出は、パルス励起（変調された励起及び検出とちょうど同じように）の後、分子発光の減衰に対する分析対象物の結合の影響を研究することを可能にする。固定された検出物質による分析対象物の特異的認識及び導波路の漸減場への信号生成の空間的制限に加えて、分子発光減衰時間を、選択性の更なる判定基準として利用することができる。
【００６８】
この方法は、同様に、変調された強度を有する１つ又は２つ以上の周波数での励起光を入力結合し、結果として得られる試料発光の移相及び変調を検出することによっても実施することができる。
【００６９】
本発明は、更に、発光する能力のある標識付けされた結合パートナーの発光を検出することによるか又は分析対象物との相互作用により固定された発光標識付けされた親和性パートナーの発光特性の変化を測定することにより、既知の親和性パートナー及び検定構成を伴う化学的又は生化学的親和性検定において、分析対象物を定量的に測定するために本発明の方法を使用することにも関する。
【００７０】
信号生成及び検出は導波路上の化学的又は生化学的検出表面に制限されており、媒質からの干渉信号は弁別されていることから、固定された検出素子に対する物質の結合は、実時間で監視できる。したがって、適当な流量を有する連続流系内の会合及び解離率を直接検出することにより、親和性スクリーニング、又は変位検定のため、又は特に薬品の開発のために本発明の方法を使用することも可能である。
【００７１】
本発明は、そのもう１つの形態において、抗体又は抗原の定量的測定を目的とする本発明の方法の使用に関する。
【００７２】
本発明の方法の更にもう１つの有用性は、レセプター又はリガンド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖、ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体、酵素、酵素基質、酵素補助因子又は阻害物質、レクチン及び炭水化物の定量的測定にある。
【００７３】
更なる１形態においては、本発明は、光学的に濁った流体内の発光構成成分の選択的な定量的測定を目的とする、本発明の方法の使用に関する。
【００７４】
光学的に濁った流体は、典型的には、地表水、溶解土壌抽出物及び溶解植物抽出物を含む環境分析からの試料を含み、卵黄などの生物学的流体、血液、血清又は血漿のような流体であってよい。適切な流体としては、化学薬品製造において得られる反応溶液、染料溶液又は蛍光白色化剤の製造に由来する反応溶液である。同様に適しているのは、１つ又は２つ以上の発光性成分を含有していることを条件として、典型的に織物産業において用いられる全てのタイプの分散剤及び配合物である。かくして、この方法は、品質保障のためにも使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７５】
本発明のこれらの実施形態は詳しくは、以下のとおりである：
励起光学部品及び導波路：
１  励起用レーザービーム
１ａ  被伝搬モード
２  結合角度
３  格子（深さ４〜５nm、周期７５０nm、矩形）
４  ４ａ及び４ｂからなる光センサー載台
４ａ  導波層（Ｔａ2Ｏ5、４８８nmでｎ＝２．３１７）
４ｂ  基材（Corning ガラス、４８８nmでｎ＝１．５３８）
等方的に放出された発光についての検出用光学部品：
５  適当な焦点距離の集束レンズ
６  例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター
７  適当な焦点距離の集束レンズ
８  検出器（フォトダイオード）
センサー、載台で戻り結合された発光についての検出用光学部品：
９  矩形断面を有するグラスファイバー束
１０  例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター
１１  フォトダイオード
透過光の検出：
１２  矩形断面を有するグラスファイバー束
１３  例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター
１４  フォトダイオード
試料セル（回転可能）：
１５  （センサー載台に対し押しつけられた状態で）これと共にフローセルを形成する上部部分
１６  密封用Ｏリング
１７  流体用入口ポート
１８  流体用出口ポート
１９  サーモスタット制御のための入口ポート
２０  サーモスタット制御のための出口ポート
配置のために使用されている個々の要素は既知のものであり、市販されている。
【００７６】
以下の例は、本発明を例示するものである。全ての例中の濃度M は、モル/lを表す。
例１
１．１  光学的構成
アルゴン−イオンレーザー（励起波長４８８nm）の励起光を、基材の背面から回転ミラーを用いて導波層の格子上へ導く。Ｏリングによって密封された自動温度調節制御のフローセルを、導波層の面に対し上から押しつける。このセルの体積は約０．０７mlである。漸減場内で励起された試料の発光及び励起光の透過を、空間的に差をつけて配置された３つの検出器によって同時に記録する。この配置は、図１に概略的に例示されている。検出器８はフォトダイオード（UDT UV-50, United Detector Technology, Hawthorne, CA. USA)からなり、その上に干渉フィルター及び集束レンズを通して等方的に発光した発光が集束されている。検出器１４は、フォトダイオード（SR 1133, Hamamatsu）からなり、これに対しては、導波層で背面結合され連続モードの伝播方向について９０°の下で観察された発光が、光学グラスファイバーを用いて導かれ、干渉フィルターの中に通されている。信号は、トランスインピーダンス増幅器を用いて増強される。透過光は、干渉フィルターを通過しながらフォトダイオード（UDT UV-50, United Detector Technology, Hawthorne, CA. USA)上へと、モードの伝播方向で検出器１１により類似の方法で導かれ、増強される。
【００７７】
１．２．  センサー材料及び結合結果の特徴づけ
１．２．１  光センサー載台
幾何形状：１６mm×４８mm×０．５mm。
導波層：Ｔａ2Ｏ5、４８８nmでｎ＝２．３１７、厚み１００±５mm。
基材：Corning ガラスＣ７０５９、４８８nmでｎ＝１．５３８。
格子：深さ変調４〜５nm、格子周期７５０nmの矩形格子。
１．２．２  ６３３nmでの励起での結合結果
結合角度：４〜５（第２の屈折率）
結合効率：格子部位で７％
減衰：２．５dB/cm
【００７８】
１．３．  固定されたプロテインＡ上のフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリンの測定
試料溶液：
１×１０−８M のフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリン（Sigma Chemicals, F-IgG）；０．０４１M のＮａ2ＨＰＯ4及び０．０２８M のＫＨ2ＰＯ4からなる０．５リットルのリン酸緩衝液；１mlのＰＯＥ−（２０）−モノラウリン酸ソルビトール（Tween ２０、ＩＣＩ）：２００mgのアジ化ナトリウム、５０mlのメタノール、１リットルになるまで精製水で増量されたもの。
プロテインＡの水溶液（Sigma Chemicals,１mg/ml)の中で１０時間、センサーをインキュベートする。なおも遊離した吸着部位を中和するため、センサーを蒸留水で洗浄し、その後１０g/リットルのウシ血清アルブミン（Sigma Chemicals)を含むリン酸緩衝液中で１時間再度インキュベートする。
試料溶液を、プロテインＡが吸着されているセンサー表面全体にわたり９分間連続的に流す。
等方的に放出された蛍光、漸減戻り結合の蛍光及び透過を、１．１に与えられた記述に従ってこれらの９分間にわたり測定する。Ｆ−ＩｇＧに基づいて約１×１０−１０M の感度が達成される。
以下の応用例全てにおいて、例１中に記述されたセンサー載台及びその中で記述された光学的装置が使用されている。
【００７９】
例２
固定されたプロテインＡ上でのフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリンの測定
使用された溶液：
１）緩衝溶液：０．５リットルのリン酸緩衝液（０．０４１M のＮａ2ＨＰＯ4＋０．０２８M のＫＨ2ＰＯ4）、０．１５１M のＮａＣｌ、２５０mg/lのアジ化ナトリウム、５０mlのメタノール、１g/リットルのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Sigma Chemicals）；０．５mlのＰＯＥ−（２０）−モノラウリン酸ソルビトール（Tween ２０、ＩＣＩ）からなり、１リットルになるまで蒸留水で増量されたもの。
２）プロテインＡ（Sigma Chemicals)を固定するための溶液：１mg/mlの蒸留水；
３）中和溶液：緩衝溶液１）＋１０mg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma Chemicals)；
４）洗浄溶液：緩衝溶液１）；
５）試料溶液：緩衝溶液１中のフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリン；
６）再生溶液：グリシン緩衝液、pH２。
方法；
プロテインＡを固定化するための溶液２）で光センサー載台を１０時間インキュベートする。なおも遊離した吸着部位を中和させるべく、センサー載台を蒸留水で洗浄し、次に、１０g/リットルのＢＳＡを含有する中和溶液中で１時間、再度インキュベートする。
この方法は、フローセル（流量１ml／分）内で実施される以下の個々の工程からなる：
・緩衝溶液１）で５分間の洗浄及びそれに続くバックグラウンド信号の記録；
・９分間にわたる試料溶液５）の添加；
・緩衝溶液１）での５分間の洗浄；
・再生溶液６）の５分間の添加；
・緩衝溶液１）での５分間の洗浄。
等方的に放出された蛍光及びセンサー載台で戻り結合の蛍光並びに透過を、例１に従って、この方法の工程全てにわたり測定する。
等方的に放出された蛍光の強い信号に加えて、戻り結合の蛍光からの強い信号、並びに、分析対象物の存在下での著しく減少した透過が測定される。蛍光信号は、蛍光分析対象物の添加中に増大し、吸着曲線の典型的な形状を示す。戻り結合の蛍光についての信号は、同じ増強において、等方的に放出された蛍光に比べてわずか２分の１だけ低いものである。透過信号は、事実上蛍光信号のミラー反転である形状を有する。最大蛍光に達するまでに、透過信号は２５％だけ減少する。透過信号は、再生工程の後、蛍光が減少する同じ量だけ再び増大する。
【００８０】
例３
固定されたプロテインＡ上でのフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリンの検出
使用された溶液：
１）緩衝溶液：１／３のリン酸緩衝液（０．０４１M のＮａ2ＨＰＯ4＋０．０２８M のＫＨ2ＰＯ4)、０．１５１M のＮａＣｌ、２００mg/lのアジ化ナトリウム、５０mlのメタノールからなり、１リットルになるまで蒸留水で増量されたもの；
２）プロテインＡ（Sigma Chemicals)を固定するための溶液：１mg/mlの緩衝溶液１）；
３）中和溶液：緩衝溶液１）＋１０mg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma Chemicals)；
４）洗浄溶液：これは、バックグラウンド信号を検出するためにも使用される、緩衝溶液１＋１mg/mlのＢＳＡ；
５）試料溶液：１mg/mlのＢＳＡを伴う、緩衝液１）中の異なる濃度（１０−８M、１０−９M、１０−１０M、１０−１１M）のフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリンＭ；
６）再生溶液：グリシン緩衝液pH２．５。
【００８１】
方法：
プロテインＡを固定化するための溶液を用いて光センサー載台を２時間インキュベートする。なおも遊離した部位を全て中和するため、センサーを蒸留水で洗浄し、次に１０g/リットルのＢＳＡを含有するリン酸緩衝溶液中で再び１時間インキュベートする。
【００８２】
この方法は、以下の個々の工程からなる：
−  洗浄溶液４）（０．１ml／分）で２分間の洗浄しバックグラウンド信
号を記録する工程；
−  自動試料採取器を介してループ内へ試料（１ml）の同時吸引する工
程；
−  次に、ループ（０．１ml／分、開始及び終了パルスの間）をはずす
ことによりセンサー載台全体にわたり約７分間試料を通過させる工程；
−  その後、溶液４）で洗浄する工程；
−  再生溶液の適用後、再び溶液４）で洗浄する工程。
等方的に発光された蛍光及び透過を、例１に従って、この方法の工程全てにわたり測定する。
１０-10Mの濃度のフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリンＡで、更に明確な蛍光信号が観察される。透過の変化を、最高１０-8Mの濃度で決定する。
データを平均した後（９点平均）、なおも１０-11Mという分析対象物濃度が見られる。
異なる濃度で、初期バックグラウンド信号（信号／雑音比１〜４mV）と比べて、試料添加の終了時点で以下の信号変化が記録される：
［Ｆ−ＩｇＧ］      蛍光信号（Ｖ）        透過信号の変化
１０-8M                １．０                −１０％
１０-9M                ０．２                決定されず
１０-10 M               ０．０３９            決定されず
１０-11 M               ０．００８            決定されず
（平均後）
検出限界は１０-11M未満で、これはフルオレセイン標識付けされたＩｇＧ１０-14 モルの分析対象物濃度に対応する。
【００８３】
例４
ハイブリダイゼーション検定における固定された相補鎖でのフルオレセインで標識付けされたオリゴヌクレオチドの測定
使用された溶液：
１）０．０６９M のリン酸緩衝液（０．０４１M のＮａＨ2 ＰＯ4 ＋０．０２８M のＮａＨ2 ＰＯ4)、０．１７６M のＫＣｌ、１mlのＰＯＥ−（２０）モノラウリン酸ソルビトール（Tween ２０、ＩＣＩ）、１ｇのポリアクリル酸ＰＡＡ５，１００、５００mg/ リットルのアジ化ナトリウムからなり、１リットルになるまで蒸留水で増量された、ハイブリダイゼーション緩衝液（pH７．７５）。
２）試料溶液：１６の塩基対からなりセンサー載台上に固定されたオリゴマに相補的なフルオレセインで標識付けされたオリゴマー（ハイブリダイゼーション緩衝液１中のフルオレセイン−５′−ＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧ−３′（１０−１２M/リットル))；
３）  再生溶液：水溶液中の尿素５０％（G/G)。
方法：
粒子上でオリゴヌクレオチド合成のために使用されるような標準的方法（例えばM.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, A practicalapproach, Oxford University Press, NY 1990）により３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシランでシラン化されたセンサー載台上で直接オリゴヌクレオチド合成装置（Applied Biosystems 394B）を用いて、３′ＣＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣ−５′捕獲プローブを合成する。ただし、標準的合成とは異なり、センサー表面からのその後の剥離を防ぐべく３′末端で表面上に定着させるための安定した連鎖基として、４−（４，４−ジメトキシトリチル）ヒドロキシブチル酸を使用する。水での洗浄後、センサー載台を、検出方法で固定検出鎖と共に使用する。
【００８４】
この方法は、以下の個々の工程からなる。
−  ハイブリダイゼーション緩衝液１）（０．５ml／分）で８分間洗浄し
バックグラウンド信号を記録する工程；
−  ２６分にわたり（５ml／分の５秒の流水の後）試料溶液２）
（０．０５ml／分）を添加する工程；
−  ハイブリダイゼーション緩衝液１）（０．５ml／分）で４分間洗浄す
る工程；
−  ４分間にわたり再生溶液３）を添加する工程（０．５ml／分）；
−  ハイブリダイゼーション緩衝液１）（０．５ml／分）で４分間洗浄す
る工程。
この方法の工程中、例１に従って、等方的に発光された蛍光及び透過を測定する。試料を１０分間にわたり添加した後、フルオレセイン標識付けされたトレーサーＤＮＡの５００アトモル（attomol）に対応して、約１mVの信号／雑音で２０mVの蛍光信号が観察される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の方法を実施するための装置の配置の断面図を概略的に示している。
【図２】光導波路の拡大断面図を概略的に示している。
【符号の説明】
【００８６】
１  励起用レーザービーム
１ａ  被伝搬モード
２  結合角度
３  格子（深さ４〜５nm、周期７５０nm、矩形）
４  ４ａ及び４ｂからなる光センサー載台
４ａ  導波層（Ｔａ2Ｏ5、４８８nmでｎ＝２．３１７）
４ｂ  基材（Corningガラス、４８８nmでｎ＝１．５３８）
５  適当な焦点距離の集束レンズ
６  例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター
７  適当な焦点距離の集束レンズ
８  検出器（フォトダイオード）
９  矩形断面を有するグラスファイバー束
１０  例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター
１１  フォトダイオード
１２  矩形断面を有するグラスファイバー束
１３  例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター
１４  フォトダイオード
１５  （センサー載台に対し押しつけられた状態で）これと共にフローセルを形成する上部部分
１６  密封用Ｏリング
１７  流体用入口ポート
１８  流体用出口ポート
１９  サーモスタット制御のための入口ポート
２０  サーモスタット制御のための出口ポート
【図１】
2005326426.tif 000003
【図２】
2005326426.tif 000004