(57)【要約】【課題】  本発明は、タンパク質の種類によらず、タンパク質の機能解析を高密度且つハイスループットに固相上で実施することを目的とする。【解決手段】  本発明は、目的タンパク質の構造及び機能を維持した状態で支持体に固定化し、タンパク質の相互作用解析を行うことを特徴とする。例えば、遺伝子工学的手法により、その片方の末端にタグとなるペプチドあるいはポリペプチドを融合させた状態で目的タンパク質を調製する。そして、支持体上に形成した抗タグ抗体からなる層を介して目的タンパク質を結合し、固相上で遊離した状態を保ちながら目的タンパク質をアレイ化し、その相互作用解析を行う。本発明により、目的タンパク質の不安定な構造及び機能に支障を与えずにその相互作用解析を行うことができる。例えば、タンパク質の相互作用解析、スクリーニング、定量、発現プロファイリング等のプラットフォームとして適用できる。【選択図】  図１
2005326165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗タグ抗体からなる層を支持体上に形成した抗タグ抗体チップ。
【請求項２】
抗タグ抗体チップ用支持体を洗浄・乾燥する工程と、洗浄済み支持体をアミノシラン化合物で処理する工程と、アミノシラン化支持体をタンパク質固定化試薬で処理する工程と、タンパク質固定化試薬コート済み支持体を抗タグ抗体で処理する工程とを含む抗タグ抗体チップの製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の抗タグ抗体チップの製造方法において、前記アミノシラン化合物が３−アミノプロピルトリエトキシシランであり、前記タンパク質固定化試薬がカリックスアレーンである。
【請求項４】
請求項２に記載の抗タグ抗体チップの製造方法において、前記タンパク質固定化試薬コート済み支持体を抗タグ抗体で処理する工程の後、支持体表面の抗タグ抗体が固定されていない部分をブロッキング剤でブロッキングする工程を有する。
【請求項５】
タグ融合目的タンパク質を抗タグ抗体からなる層を介して支持体上に固定化したタグ融合目的タンパク質アレイ。
【請求項６】
請求項５に記載のタグ融合目的タンパク質アレイにおいて、前記タグ融合目的タンパク質は、そのＮ末端あるいはＣ末端のいずれか一方の末端、あるいは必要に応じて目的タンパク質のアミノ酸配列内に、ペプチドあるいはポリペプチドを遺伝子工学的手法によりタグとして付加したものである。
【請求項７】
抗タグ抗体チップを製造する工程と、タグ融合目的タンパク質を抗タグ抗体からなる層を介して抗タグ抗体チップに固定化する工程とを含むタグ融合目的タンパク質アレイの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載のタグ融合目的タンパク質アレイの製造方法において、前記タグ融合目的タンパク質は、そのＮ末端あるいはＣ末端のいずれか一方の末端、あるいは必要に応じて目的タンパク質のアミノ酸配列内に、ペプチドあるいはポリペプチドを遺伝子工学的手法によりタグとして付加したものである。
【請求項９】
タグ融合目的タンパク質を抗タグ抗体からなる層を介して支持体上にアレイ化したタグ融合目的タンパク質アレイに、相互作用物質を含む溶液を反応させることを特徴とするタンパク質相互作用解析方法。
【請求項１０】
請求項９に記載のタンパク質相互作用解析方法において、前記タグ融合目的タンパク質は、そのＮ末端あるいはＣ末端のいずれか一方の末端、あるいは必要に応じて目的タンパク質のアミノ酸配列内に、ペプチドあるいはポリペプチドを遺伝子工学的手法によりタグとして付加したものである。
【請求項１１】
抗タグ抗体チップ上にタグ融合目的タンパク質をアレイ化したタンパク質相互作用解析用プラットフォーム。
【請求項１２】
遺伝子工学的に発現させた精製前の産物を直接抗タグ抗体チップに供試する工程と、タグ融合目的タンパク質のみを抗タグ抗体に結合させた状態で残渣を洗浄・除去する工程とを有するタグ融合目的タンパク質の精製方法。
【請求項１３】
抗タグ抗体チップを載置しこれを移動させる抗タグ抗体チップ載置機構と、抗タグ抗体チップにタグ融合目的タンパク質を含むサンプルを分注する分注機構と、チップ上の同一スポットに繰り返し分注できる位置認識機構と、反応済みの抗タグ抗体チップの標識サンプルの読取機構を有するタンパク質相互作用解析装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載のタンパク質相互作用解析装置であって、前記標識サンプルが蛍光標識サンプルであり、前記読取機構が蛍光スキャナー又は２光子励起スキャナーである。
【請求項１５】
請求項１３に記載のタンパク質相互作用解析装置であって、前記標識サンプルが非蛍光標識サンプルであり、前記読取機構が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置又は光導波路検出装置である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の機能解析を高密度且つハイスループットに固相上で一括で実施するための抗タグ抗体チップ、及びその関連技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な生物種についてゲノム解析が進展し、膨大な量の塩基配列情報の蓄積が世界的規模でなされている。生体内ではこれら塩基配列情報に基づいて転写及び翻訳の過程を経てタンパク質が合成され、その機能により生体としての様々な活動が維持されている。ゲノム情報の充実にともなって、近年では生体内の機能分子の主役であるタンパク質の構造及び機能解析がプロテオミクスあるいはプロテオーム解析と称して盛んになりつつある。
【０００３】
液相中で実施するタンパク質機能解析の事例として、酵素活性測定実験と阻害剤実験が挙げられる。前者は試験管内で酵素と基質を溶液中で反応させて酵素活性を測定する際の至適条件を検討する実験であり、後者はその反応液中に物質を添加することにより酵素反応を阻害する物質を探索する実験である。
【０００４】
一例を示すと、メラニン合成に関与するチロシナーゼ（ＥＣ 1.14.18.1）は、モノハイドロキシフェノール類（チロシン等）⇒ジハイドロキシフェノール類（ドーパ等）⇒キノン（ドーパキノン等）の反応を触媒する。したがって、チロシナーゼ溶液とチロシン溶液を反応させることにより、経時的にドーパ及びドーパキノンの生成を各々280nm及び475nmの吸光度で分光光学的に測定することができる。そのときの反応温度、反応組成、反応時間、ｐＨ等の諸条件を至適化することで実験系を確立する。この反応溶液に物質を添加することで反応を阻害する物質を探索する。例えば、チロシナーゼ活性阻害剤であるコウジ酸等を添加すると、ドーパ及びドーパキノンの生成を抑制する結果が得られる。
【０００５】
上記のような液相中で実施するタンパク質機能解析に対して、固相上におけるプロテオミクスの事例としてマススペクトロメトリー法等によるタンパク質の構造解析技術が考えられる。そのための支持体へのタンパク質固定化技術が提案されているが、構造解析の場合はタンパク質の機能を維持する必要性がないという特徴がある。また、表面プラズモン共鳴法や水晶発振子マイクロバランス法によるタンパク質間相互作用解析も試みられているが、いずれもある程度のサンプル数を一括して相互作用解析を行うまでには至っていない。
【０００６】
特にタンパク質の機能解析を高密度且つハイスループットに固相上で実施するためには、不安定なタンパク質の構造及び機能を維持した状態に保ちながら支持体に固定化する工夫が必要である。支持体へのタンパク質の固定は、物理的吸着や各種化合物の官能基を介した結合、ポリマー層に包埋する方法等が挙げられる。また、例えばカリックスアレーンのようなホスト／ゲスト分子を用いてタンパク質を捕捉する方法もある。いずれもタンパク質を支持体上に固定化することは可能であるが、タンパク質の構造及び機能の維持を考慮してはいない。
【０００７】
現在、プロテインチップと称して市販されている製品がいくつか存在する。例えば、HydroGel（PerkinElmer社）やPower Matrix Slide（Full Moon BioSystems社）はガラス基板上にポリマーゲルを重層することによりタンパク質分子を３次元的に捕捉する仕組みであるのに対して、FAST Slide（Schleicher & Schuell社）はニトロセルロースメンブレンをガラス基板上に貼付した製品である。また、その他各社からアルデヒド基、エポキシ基、アミノ基等でガラス基板表面を修飾したチップもタンパク質の固定にも適用可能という形で市販されている。
【０００８】
アプリケーションとしては、例えばHydroGelやFAST Slideについてチップベースのイムノアッセイ法が提示されている。これは、チップ上に抗体を固定してそれに特異的に結合する抗原量を測定する手法である。しかしながら、抗原（目的タンパク質）の構造及び機能を保持する工夫を施しながらチップ上で相互作用を解析するものではない。
【０００９】
プロテインチップは、プロテオミクス解析のなかでも機能解析用の１つの手段として期待されているが、タンパク質をスライドガラス等の支持体に直接あるいはタンパク質固定化試薬等を用いて固定させた場合は、タンパク質の構造及び機能を維持できないことが多い。
【００１０】
一方、現在ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現プロファイリングが盛んに行われている。発現プロファイリングは、その生体内で発現している遺伝子を網羅的に解析することにより、そのパターンからその生体の特徴付けを行うものである。例えば、ある疾病の患者と非患者の遺伝子発現パターンを比較することによって、その疾病に関与している遺伝子を特定するとともに、その遺伝子発現の正常化や翻訳産物の機能阻害等を行うような薬剤の開発及び評価に応用できる技術である。しかしながら、生体内において遺伝子は情報分子としての役割が主であり、遺伝子そのものが例えば疾病を引き起こすわけではない。生体内において機能分子としての役割を示すのは遺伝子の翻訳産物であるタンパク質である。また、必ずしも遺伝子の発現量と疾病との間に相関性があるとは限らないことが多いため、遺伝子の発現プロファイリングを行うよりもタンパク質の発現プロファイリングを行う方がより正確に生体内における機能変化を評価できると期待される。
【００１１】
【非特許文献１】Yoshimura, T. et al., The Journal of Biological Chemistry, 278(52), 53105-53111 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、タンパク質の種類によらず、タンパク質の機能解析を高密度且つハイスループットに固相上で実施することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、目的タンパク質の構造及び機能を維持した状態で支持体に固定化し、タンパク質の相互作用解析を行うことを特徴とする。
【００１４】
例えば、遺伝子工学的手法により、その片方の末端にタグとなるペプチドあるいはポリペプチドを融合させた状態で目的タンパク質を調製する。そして、支持体上に形成した抗タグ抗体からなる層を介して目的タンパク質を結合し、固相上で遊離した状態を保ちながら目的タンパク質をアレイ化し、その相互作用解析を行う。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、目的タンパク質の不安定な構造及び機能に支障を与えずにその相互作用解析を行うことができる。例えば、タンパク質の相互作用解析、スクリーニング、定量、発現プロファイリング等のプラットフォームとして適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と利益を、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００１７】
図１は、本実施例の抗タグ抗体チップの構造の概略図であり、チップ１、チップ１の部分拡大図、及びチップ１とタグ融合目的タンパク質５が抗タグ抗体６を介して結合している状態の模式図からなる。
【００１８】
チップ１には縦横にｍ×ｎ個のスポット２が設けられている。チップ１は、支持体３とその表面に処理されたタンパク質固定化試薬４の層からなり、このタンパク質固定化試薬４の層には抗タグ抗体６を介してタグ融合目的タンパク質５が結合している。タグ融合目的タンパク質５は、目的タンパク質８とタグ７とからなり、タグ７部分で抗タグ抗体６と結合している。目的タンパク質８は種々の物質と反応又は非反応し、その内、相互作用物質９と結合することによって、相互作用の有無が検出される。
【００１９】
本実施例のタンパク質相互作用解析装置は、上記抗タグ抗体チップと、抗タグ抗体チップにタグ融合目的タンパク質を含むサンプルを分注する分注機構と、反応済みの抗タグ抗体チップの標識サンプルの読取機構を有する。
【００２０】
図２は、抗タグ抗体チップの読取機構の概略図である。チップ１５はホルダー１６に保持され、ステージ１７でＸ−Ｙ方向に移動できる。光源１２から出た検出光はスプリッター１３で反射し、レンズ１４で集光されてチップ１５に照射される。チップ１５からの反射光は、レンズ１４及びスプリッター１３を通過し、ミラー１８で反射され、フィルター１９を通過し、レンズ２０で集光され、ピンホール２１を通過した後、検出器２２で検出される。光源１２、ステージ１７、検出器２２等は、検出装置本体１０外の制御・解析端末１１で制御される。
【００２１】
図３は、抗タグ抗体チップのサンプル分注機構の概略図である。ノズル３５は、レール３２上を位置捕捉装置３３に従って移動するヘッド３４に固定されている。ノズル３５により、サンプル３８からチップ３９へ分注される。ノズル３５は、操作中、適宜、ノズル洗浄装置３６で洗浄され、ノズル乾燥装置３７で乾燥される。分注機構全体３１内には温度・湿度センサー４２が設けられ、位置捕捉装置３３、ポンプ４０、４１等とともに制御装置３０で制御される。
【００２２】
目的タンパク質は遺伝子工学的手法により、タグとなるペプチドあるいはポリペプチドを融合した状態で調製し、タグと抗タグ抗体との抗原抗体反応により目的タンパク質を固相上にアレイ化する。
【００２３】
本実施例は、従来の方法とは異なり、目的タンパク質の構造及び機能を固相上で維持した状態を保つために抗タグ抗体からなる層をチップ上に形成し、それに対してタグ融合目的タンパク質のアレイ化を行う。抗タグ抗体は抗原となるタグを特異的に認識して結合するが、目的タンパク質と直接結合することはない。これにより、目的タンパク質の構造及び機能に支障を与えない状態で間接的に固定化することによりアレイ化できる。
【００２４】
また、タグ融合目的タンパク質の固相への固定化は、支持体上に層を形成する抗タグ抗体とタグとの抗原抗体反応によるため、両者を混合するだけで結合反応が起こる。その場合、通常タンパク質を溶解するときに用いる緩衝液（例えばリン酸バッファー等）をそのまま用いるだけで、特殊な条件に置換する必要はない。
【００２５】
目的タンパク質に関する相互作用解析を抗タグ抗体チップ上で実施する。抗タグ抗体チップ上で目的タンパク質自身は遊離した状態を維持し、その末端に付加したタグを介してのみ抗タグ抗体と結合するため、目的タンパク質はその構造及び機能を維持した状態でチップ上にアレイ化されることになる。したがって、本実施例によりチップ上で一般的に不安定なタンパク質をインタクトな状態に維持しながら相互作用解析を行うことが可能となる。目的タンパク質に相互作用させる物質の種類（例えばタンパク質、核酸、糖、化合物、ウィルス、細胞等およびその混合物）は問わない。また、目的タンパク質に物質を相互作用させた後、さらに別の物質を重ねて作用させることも可能である。
【００２６】
支持体は固相として成立するものであれば材質の種類は問わない。例えば、ガラス、樹脂、ウェハー等が挙げられ、形状も例えば平板、球状、溝状、筒状等種類を問わない。サイズも使用する装置に適用できる範囲であれば構わない。
【００２７】
図４に、抗タグ抗体チップの作製フローの一例を示す。
【００２８】
支持体にはタンパク質を固定するための試薬（例えばカリックスアレーン等）を塗布する。その場合、必要に応じて支持体表面とタンパク質固定化試薬との結合を仲介するための試薬（例えば３-アミノプロピルトリエトキシシラン等のようなシランカップリング剤）を塗布することもある。例えば、カリックスアレーンの場合は、支持体に３-アミノプロピルトリエトキシシランをコーティングした後、カリックスアレーン分子のアルデヒド基と3-アミノプロピルトリエトキシシラン分子のアミノ基とをアゾメチン結合により固定することによりチップ全体のコーティングを行う。
【００２９】
抗タグ抗体作成のための支持体は、上記以外の例えばガラス基板表面にニトロセルロースメンブレンやポリマーゲルを貼り付けたものや、ガラス基板表面を各種官能基で修飾したものも適用できる。
【００３０】
抗タグ抗体はタンパク質固定化試薬を介して支持体に固定化する。抗タグ抗体はスポット領域内で飽和状態になるように密に固定することにより、抗タグ抗体からなる層を支持体上に形成する。抗タグ抗体が結合できなかった部位は、一般的にブロッキングに用いる例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質でその部分を埋め、目的タンパク質が直接支持体あるいはタンパク質固定化試薬に接触しないようにする。目的タンパク質の末端には抗原となるタグが融合しているため、抗タグ抗体はタグのみを認識して結合するが、目的タンパク質とは結合しない。これにより、目的タンパク質自身は常に遊離した状態を保ちながらタグのみを介して抗タグ抗体に結合することによりチップ上にアレイ化されることになる。
【００３１】
図５に、抗タグ抗体チップの使用手順の一例を示す。
【００３２】
タグ融合目的タンパク質の調製は遺伝子工学的手法により行う。目的タンパク質をコードするＤＮＡ断片を発現ベクター（例えばｐＥＴベクター、ｐＧＥＸベクター等）に組み込む。発現ベクターは目的タンパク質の末端等にタグ融合可能なものとし、そのベクターに適した発現系によりタグ融合目的タンパク質として高発現させる。タグ融合目的タンパク質の精製は、そのタグと特異的に結合する物質（例えば抗タグ抗体や基質等）を用いて親和性を利用したアフィニティー精製法により回収する。
【００３３】
目的タンパク質の末端領域にタグを融合することに支障がある場合は、タンパク質の内部にタグを導入するように設計することも可能である。本実施例は、目的タンパク質へのタグの融合を遺伝子工学的に自由に行えることを活かし、目的タンパク質の特性に合わせてチップへのアレイ化をタグと抗タグ抗体との結合で実現する技術を提供する。
【００３４】
タグの種類はタグ融合目的タンパク質として遺伝子工学的に発現させることを想定しているため、ペプチドあるいはポリペプチド（タンパク質）であることが望ましい。ただし、例えばグルタチオン-Ｓ−トランスフェラーゼのようなタンパク質をタグとして目的タンパク質に付加する場合、例えばヘキサヒスチジンのようなペプチドをタグとして付加する場合に比べてタグの分子量が大きくなるため、目的タンパク質の特性によってはその影響を受けやすくなることも考えられる。したがって、本実施例のタグとしてはポリペプチドよりもペプチドの方が望ましい。
【００３５】
近年は各種生物種のゲノム解析が盛んであるため、タンパク質情報に比べて遺伝子情報の量が著しく増加している。したがって、遺伝子情報をもとにしてその翻訳産物であるタンパク質解析を行う方向が一般的になりつつある。その場合、発達した遺伝子工学的手法を用いて遺伝子からタンパク質を生合成する際、合成したタンパク質を効率良く精製するためにタンパク質の末端にタグと称するペプチドあるいはタンパク質を融合した状態で合成し、タグを特異的に認識する物質（例えば抗タグ抗体や基質等）を用いてタグ融合目的タンパク質をアフィニティー精製する。本実施例は、合成したタグ融合目的タンパク質をそのまま固相上における相互作用解析に用いる技術を提供する。
【００３６】
従来、遺伝子工学的技術により合成したタグ融合目的タンパク質は、タグとの親和性を利用したアフィニティー精製後に、例えばトロンビン等のような特定のタンパク質分解酵素を用いてタグと目的タンパク質とを切断してから再度アフィニティー精製法を利用して目的タンパク質画分からタグ断片及び消化されなかったタグ融合目的タンパク質を除去する操作を行い、目的タンパク質を回収して解析に用いる。本実施例は、タグと目的タンパク質との切り離しを必要とせず、タグをチップへの結合媒体として活用することを特徴とし、従来法に比べて作業工程を簡略化できる。
【００３７】
図５に示すように、本実施例は、遺伝子工学的手法により発現させたタグ融合目的タンパク質のアフィニティー精製とチップへの固定化を同時に行うことも可能である。従来の技術では、発現させたタグ融合タンパク質のアフィニティー精製、タンパク質分解酵素等によるタグと目的タンパク質との切断、タグと目的タンパク質の混合溶液からの目的タンパク質の回収、目的タンパク質の濃縮等の工程を経なければ目的タンパク質の相互作用解析に適用することはできなかった。本実施例は、抗タグ抗体からなる層を固相上に形成しているため、合成したタグ融合目的タンパク質の精製なしに、例えば大腸菌を用いた発現系で合成したタグ融合目的タンパク質の場合は、細胞破砕物を直接チップ上に供試することによって、タグ融合目的タンパク質のアフィニティー精製を兼ねるとともにチップへの固定化を同時に行うことも可能である。これにより、作業工程を著しく簡略化するとともに目的タンパク質の回収率低下を招かずに効率良く固相上で目的タンパク質の相互作用解析に用いることが可能となる。このことは、例えば発現量の低い目的タンパク質の精製及びアレイ化のシングルステップ法としても適用できる。
【００３８】
一般的に遺伝子工学的手法を用いて目的タンパク質を生合成する場合は、目的タンパク質の末端にタグを融合した状態で合成し、そのタグに対する親和性を利用してアフィニティー精製する。したがって、タグの種類を統一することで同じ精製法を適用することが可能となる。その場合、合成したタグ融合目的タンパク質をチップ上にアレイ化するときも、目的タンパク質の種類にかかわらず融合したタグに対する抗タグ抗体を共通して利用することが可能である。このことは、抗タグ抗体の種類に応じて作製した抗タグ抗体チップを製品として提供することができる。
【００３９】
本実施例は、タンパク質の種類に関係なくその構造及び機能を維持した状態で固相上にアレイ化して相互作用解析を行えることから、固相上におけるタンパク質の相互作用解析用プラットフォームとして適用できる。したがって、検出機構（図２）やサンプル分注機構（図３）等の解析に必要な周辺装置を組み合わせることによって、全自動あるいは半自動のタンパク質相互作用解析システムとして提供することができる。
【００４０】
相互作用の検出は、蛍光標識したサンプルを検出する場合、例えば蛍光スキャナーあるいは２光子励起スキャナー等が適用できる。一方、非蛍光標識サンプルの場合は、例えば表面プラズモン共鳴装置あるいは光導波路装置等が適用できる。
【００４１】
抗タグ抗体、タグ融合目的タンパク質及びそれに相互作用させる物質等の固相上への分注は、例えばマイクロピペッター等を用いた手作業だけでなく、接触型あるいは非接触型のサンプル分注機構等による全自動あるいは半自動の分注処理システムを構築できる。
【００４２】
チップ上の同一スポットへ繰り返しサンプルを分注する必要がある場合は、例えば予めチップ上に位置認識用の印を設定しておき、サンプル分注装置上の位置捕捉装置（例えばＣＣＤカメラ等）でチップ上の印を認識することによりスポット位置の記憶と割り出しを行う。
【００４３】
チップ表面のブロッキング、洗浄等の操作は、例えばトレイ等を用いた手作業だけでなく、ハイブリダイゼーション装置等による全自動あるいは半自動の処理システムを構築できる。
【００４４】
本実施例は、近年普及及び進展している遺伝子工学的手法を活かしながら、複雑なタンパク質相互作用をチップ上で網羅的かつ普遍的に実現できることを意味しており、タンパク質に関連した研究用途のみならず、医療、検査、診断や創薬分野のスクリーニング等に適用可能である。特に、タンパク質は遺伝子等の情報分子とは異なり、実際に生体内で各種作用を司る機能分子であるため、その相互作用をチップ上で網羅的かつ普遍的に実現できることは有効である。
【００４５】
また、使用する固相のアレイ化面の範囲内であればタグ融合目的タンパク質のスポット数は適宜変更可能であるため、高密度化とそれにともなって小スケール化を実現することが可能である。また、目的タンパク質の種類も問わない。したがって、あらゆるタンパク質を本実施例の原理によってチップ上に固定化し、相互作用解析に用いることが可能である。目的タンパク質に関連したスクリーニング、定量、発現プロファイリング等の機能解析を行うことができるとともに、構造解析に適用することもできる。
【００４６】
本実施例は、固相上にタンパク質をその構造及び機能を維持した状態で高密度にアレイ化して相互作用解析できることから、タンパク質の発現プロファイリングにも適した技術といえる。ＤＮＡマイクロアレイのように生体内における遺伝子の転写産物の発現量を調べるよりも翻訳産物であるタンパク質の発現量を直接調べる方がより適確に生体内で機能を示す分子の状態を反映することになるため、プロテインチップによる相互作用解析や発現プロファイリングは今後普及することが期待される。本実施例はそのためのプラットフォームを提供することができるとともに、タンパク質相互作用解析に関する受託解析サービス化にも適している。
【００４７】
［検証実験］
［本実験の目的］
Ｅｃ ＤＯＳタンパク質とその一部を構成するＰＡＳドメインタンパク質は相互作用により結合することが知られている（上記非特許文献１）。そこで、図５に示したように、その各々を遺伝子工学的手法により調製した後、タグ融合Ｅｃ ＤＯＳタンパク質をチップ上にアレイ化し、ＰＡＳドメインタンパク質が濃度依存的に結合することを検討した。
【００４８】
[タグ融合Escherichia coli由来direct oxygen sensorタンパク質（Ｅｃ ＤＯＳ）及びそれを構成するヘム結合ＰＡＳドメインのタグ融合タンパク質の調製]
Ｅｃ ＤＯＳタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム領域をｐＥＴ２８ａ(+)発現ベクター（Novagen）のマルチクローニングサイトにフレーム枠を合わせてクローニングした。同様にＥｃ ＤＯＳタンパク質を構成するＰＡＳドメインについても別途クローニングした。ＢＬ２１コンピテントセル（Stratagene）内で各タンパク質を各々高発現させた後、細胞を破砕してその上清を回収した。硫安分画後、Sephadex Ｇ−２５カラム（Amersham Biosciences）を用いて脱塩処理して得られた溶出液をNi-NTA-agaroseカラム（Qiagen）に供試して各ヒスチジンタグ融合タンパク質をアフィニティー精製した。タグ融合ＰＡＳドメインタンパク質に関しては、ヒスチジンタグ領域をトロンビン消化で切り離し、その産物をニッケルキレーティング担体に供試して、タグを除去したＰＡＳドメインタンパク質を上清として回収した。得られたＰＡＳドメインタンパク質は、Ｃｙ３ラベリングキット（Amersham Biosciences）を用いて蛍光標識した。
【００４９】
［抗タグ抗体チップの作製］
抗タグ抗体チップは図４の手順にしたがって作製した。抗タグ抗体を固定するチップとして市販のプロテインチップ（ProteoChip A, 日立ハイテクノロジーズ）を用いた。ProteoChip Aは洗浄したスライドガラスをアミノシランカップリングした後にタンパク質固定化試薬であるカリックスアレーン分子をコーティングしたものである。本実施例では同チップにφ2.0mmのスポッティング用の穴を予め開けたスポットシール（意匠登録出願済み）を貼付し、そのスポット内にサンプルを分注して目的タンパク質の相互作用解析を行った。本実施例では抗タグ抗体として抗Ｈｉｓ−ｔａｇモノクローナル抗体（ＭＡＢ050, Ｒ&Ｄ Systems）を用いた。同抗体は、抗体用希釈溶液（30% グリセロールを含むｐＨ 7.4に調製したＰＢＳバッファー）で100μg/mlの濃度に調製し、各スポットに1.5μl分注した後、37℃で一晩インキュベートすることによって抗体をチップ上に固定した。チップを洗浄溶液Ａ（0.5% Tween-20を含むｐＨ 7.8に調製したＰＢＳバッファー）に浸漬して20min振盪しながら過剰の抗体を除去した後、脱イオン水でリンスした。次に、チップをＰＢＳバッファー（ｐＨ 7.4）で調製した3% ＢＳＡ溶液に浸漬し、室温で60min振盪しながらブロッキングを行った。ブロッキング後のチップは、洗浄溶液Ａに浸漬して20min振盪しながら洗浄した後、脱イオン水でリンスしたものを抗タグ抗体チップとした。
【００５０】
［タグ融合Ｅｃ ＤＯＳタンパク質の固定による相互作用解析用チップの作製］
抗タグ抗体チップの各スポットにタンパク質用希釈溶液（10% ＢＳＡ及び30% グリセロールを含むｐＨ 7.4に調製したTrisバッファー）で100μg/mlに調製したタグ融合Ｅｃ ＤＯＳタンパク質を1.5μl分注した後、室温で3hrインキュベートした。チップを洗浄溶液Ｂ（0.5% Tween-20を含むｐＨ 7.4に調製したTrisバッファー）に浸漬して20min振盪しながら過剰のタグ融合目的タンパク質を除去した後、脱イオン水でリンスすることによってタグ融合Ｅｃ ＤＯＳタンパク質をアレイ化した相互作用解析用チップを作製した。
【００５１】
［Ｅｃ ＤＯＳタンパク質とＰＡＳドメインタンパク質との相互作用解析］
タグ融合Ｅｃ ＤＯＳタンパク質をアレイ化した相互作用解析用チップのスポットにタンパク質用希釈溶液で0 − 10μg/mlの範囲で5段階に希釈したＣｙ３標識ＰＡＳドメインタンパク質を1.5μl分注し、室温で3hrインキュベートした。次に、チップを洗浄溶液Ｂに浸漬して20min振盪しながら洗浄した後、脱イオン水でリンスすることによって結合しなかったＣｙ３標識ＰＡＳドメインタンパク質を除去した。窒素ガスの吹き付けによりチップ上の水滴を除去した後、蛍光スキャナー（ScanArray Express, Perkin Elmer）で蛍光検出を行った。その結果を図６に示す。
【００５２】
図６の結果より、Ｃｙ３標識ＰＡＳドメインタンパク質の濃度依存的に蛍光強度が変化することから、本実施例がＥｃ ＤＯＳタンパク質とＰＡＳドメインタンパク質との相互作用をチップ上で実現していることが認められた。このことは、目的タンパク質の構造及び機能を維持した状態でチップ上にアレイ化可能であるとともに、それに対して相互作用する物質を反応させることにより、両者の相互作用をモニタリングできることを示唆している。チップ化のメリットの一つである高集積化を活かすことにより、例えば創薬ターゲットタンパク質を高密度にアレイ化したチップを作製した後、数多くの創薬候補となる低分子化合物等を一括してチップ上のタンパク質スポットと各々反応させることにより、相互作用を示す低分子化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、タンパク質に関連した研究用途のみならず、医療、検査、診断や創薬分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】抗タグ抗体チップの構造の概略図。
【図２】抗タグ抗体チップの読取機構の概略図。
【図３】抗タグ抗体チップのサンプル分注機構の概略図。
【図４】抗タグ抗体チップの作製手順。
【図５】抗タグ抗体チップの使用手順。
【図６】蛍光検出結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【００５５】
１：チップ、２：スポット、３：支持体、４：タンパク質固定化試薬、５：タグ融合目的タンパク質、６：抗タグ抗体、７：タグ、８：目的タンパク質、９：相互作用物質。
１０：検出装置本体、１１：制御・解析端末、１２：光源、１３：スプリッター、１４：レンズ、１５：チップ、１６：ホルダー、１７：ステージ、１８：ミラー、１９：フィルター、２０：レンズ、２１：ピンホール、２２：検出器。
３０：制御装置、３１：分注機構全体、３２：レール、３３：位置捕捉装置、３４：ヘッド、３５：ノズル、３６：ノズル洗浄装置、３７：ノズル乾燥装置、３８：サンプル、３９：チップ、４０：ポンプ、４１：ポンプ、４２：温度・湿度センサー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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