(57)【要約】【課題】  不死化により半永久的に継代培養が可能で、しかも正常形質を有する子宮内膜腺上皮細胞株を提供する。【解決手段】  外因性の不死化遺伝子が導入され不死化された不死化子宮内膜腺上皮細胞株である。非癌細胞としての形質及び典型的な子宮内膜腺上皮細胞としての形質が保持されている。外因性の不死化遺伝子としては、テロメレース活性を誘導する遺伝子、及び細胞周期調節因子を不活化する遺伝子を重複導入する。テロメレース活性を誘導する遺伝子は、ヒトテロメレース触媒サブユニットであり、細胞周期調節因子を不活化する遺伝子は、ヒトパピローマウイルス１６型Ｅ７遺伝子及びヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６遺伝子である。ヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６遺伝子の代わりにヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６Δ１５１変異遺伝子を導入してもよい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性の不死化遺伝子が導入されるとともに、非癌細胞としての形質及び典型的な子宮内膜腺上皮細胞としての形質が保持されていることを特徴とする不死化子宮内膜腺上皮細胞株。
【請求項２】
上記外因性の不死化遺伝子は、テロメレース活性を誘導する遺伝子、及び細胞周期調節因子を不活化する遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株。
【請求項３】
上記テロメレース活性を誘導する遺伝子は、配列番号１記載のヒトテロメレース触媒サブユニットであることを特徴とする請求項１記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株。
【請求項４】
上記細胞周期調節因子を不活化する遺伝子は、配列番号２記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ７遺伝子、及び配列番号３記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６遺伝子であることを特徴とする請求項２又は３記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株。
【請求項５】
上記細胞周期調節因子を不活化する遺伝子は、配列番号２記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ７遺伝子、及び配列番号４記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６Δ１５１変異遺伝子であることを特徴とする請求項２又は３記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株。
【請求項６】
ヒト子宮内膜組織由来であることを特徴とする請求項１記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株。
【請求項７】
上記非癌細胞としての形質は、
培養時に足場依存性を有すること、
ヌードマウスに腫瘍を形成しないこと、
及び染色体異常が見られないこと、
であることを特徴とする請求項１記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株。
【請求項８】
上記典型的な子宮内膜腺上皮細胞としての形質は、
細胞形状がほぼ円形で、細胞間結合の強い上皮細胞形態を有すること、
腺状構造を構築する能力を有すること、
サイトケラチン陽性及びビメンチン陽性であること、
エストロゲンレセプター及びプロゲステロンレセプターを発現すること、
及びステロイドホルモン応答性を有すること、
であることを特徴とする請求項１記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株。
【請求項９】
ヒト子宮内膜組織より子宮内膜腺上皮細胞を分離回収し、初代培養を行った後に、培養細胞に外因性の不死化遺伝子を導入することを特徴とする不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法。
【請求項１０】
上記外因性の不死化遺伝子として、テロメレース活性を誘導する遺伝子、及び細胞周期調節因子を不活化する遺伝子を重複導入することを特徴とする請求項９記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法。
【請求項１１】
上記テロメレース活性を誘導する遺伝子は、配列番号１記載のヒトテロメレース触媒サブユニットであることを特徴とする請求項１０記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法。
【請求項１２】
上記細胞周期調節因子を不活化する遺伝子は、配列番号２記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ７遺伝子、及び配列番号３記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６遺伝子であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法。
【請求項１３】
上記細胞周期調節因子を不活化する遺伝子は、配列番号２記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ７遺伝子、及び配列番号４記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６Δ１５１変異遺伝子であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法。
【請求項１４】
上記内膜腺上皮細胞は、ヒト子宮内膜組織を細切した後、ＤＮＡ分解酵素タイプ１及びコラーゲン分解酵素タイプ３による処理を行い、顕微鏡下に内膜腺細胞塊を回収することにより分離回収することを特徴とする請求項９記載の不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常形質を保持しつつも不死化形質を獲得し半永久的に継代培養が可能な子宮内膜腺上皮細胞株に関し、さらには、その作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮内膜はヒトの生殖に深く関与する組織であり、性成熟期を通じ、月経周期ごとに増殖、分泌、剥離（月経）を周期的に繰り返す。この周期的な変化は性ステロイドであるエストロゲンやプロゲステロンの働きにより引き起こされている。また、子宮内膜は妊娠時に受精卵の着床が起こる場所であり、胎盤形成を通じて胎児の発育及び成熟に関わる臓器でもある。
【０００３】
一方、子宮内膜は癌の発生母地でもある。子宮内膜は腺上皮細胞と間質細胞からなるが、いわゆる内膜の腺分泌機能に重要なのは腺上皮細胞であり、また内膜癌の大部分は腺上皮から発生する腺癌である。子宮内膜癌の発生機構は明らかになっていないが、エストロゲンの長期持続刺激によりＰＴＥＮ等のいくつかの遺伝子変異の集積により起こることがわかっている。
【０００４】
子宮内膜の生殖に関わる多彩な機能や子宮内膜癌化過程における遺伝子異常を研究するには、先ず内膜腺上皮細胞を培養、継代する必要がある。ところが、子宮内膜腺上皮細胞は、通常の培養を試みてもわずか１〜２週間で増殖を停止し、継代が不可能となる。このため、培養系での実験は不可能で、内膜の機能や癌化のメカニズムを明らかにする実験が著しく立ち遅れていた。したがって、これらの実験を進めるためには、子宮内膜腺上皮細胞を不死化する技術が必要不可欠である。
【０００５】
正常体細胞を半永久的に培養継代可能にする（不死化）ために従来より広く用いられてきたのは、ＳＶ４０−ＬＴ（Simian virus 40 large T-antigen）遺伝子である。このＳＶ４０−ＬＴ遺伝子を用いて正常体細胞の不死化を行う手法が、種々の細胞において提案されている（例えば、特許文献１や特許文献２等を参照）。特許文献１には、ＳＶ４０−ＬＴ遺伝子を用いてヒト水晶体細胞を不死化する手法が、また、特許文献２には、ヒト肝臓細胞を不死化する手法が開示されている。
【特許文献１】特開平１０−５２２７２号公報
【特許文献２】特開２０００−１４３９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、子宮内膜腺上皮細胞の場合、ＳＶ４０−ＬＴ遺伝子を用いて不死化を行うと、高度の染色体異常を伴う現象が多く観察され、その結果、本来の細胞の形質を失ってしまうという大きな問題がある。
【０００７】
さらに、子宮内膜腺上皮細胞の場合、これを単離することが難しく、純化した子宮内膜腺上皮細胞に対して不死化技術を適用するに至らないという問題もある。子宮内膜組織には、間質細胞が豊富に存在し、腺上皮細胞を回収したとしても間質細胞の混入が避けられず、培養後は間質細胞が優位に増殖し、培養後２〜３週間でほとんど全てが間質細胞により占められてしまう。このような状態で遺伝子導入を行っても間質細胞優位に遺伝子が導入されるため、内膜腺上皮細胞の不死化細胞の回収は困難である。子宮内膜腺上皮細胞の不死化を成功させるには、遺伝子導入前に内膜腺上皮細胞を高度に純化することが肝要となる。
【０００８】
このような状況から、これまで子宮内膜腺上皮細胞の不死化に成功した例がないばかりでなく、これまで前記子宮内膜腺上皮細胞の単離の困難性から本細胞の不死化を試みた報告もほとんどなく、実際に正常形質を有する不死化成功例は皆無である。このことは、子宮内膜の機能解析、生殖機構や正常細胞の癌化機構の解明、さらには子宮内膜再生の研究等を進める上で、非常に大きな障害となっている。
【０００９】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものである。すなわち、本発明は、正常形質を保持しつつも不死化形質を獲得し半永久的に継代培養が可能な不死化子宮内膜腺上皮細胞株を提供することを目的とし、さらにはその作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、子宮内膜腺上皮細胞の不死化について、種々の研究を重ねてきた。その結果、
（１）テロメアを伸長させるテロメレースを活性化すれば細胞分裂ごとにテロメアを喪失することなく、テロメア依存性の細胞老化を免れること、
（２）テロメア依存性の細胞老化とは別個にテロメア非依存性の早期細胞老化の機構が存在すること、
（３）子宮内膜腺上皮細胞の場合、早期細胞老化を回避するには、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ７遺伝子及びＥ６遺伝子による細胞周期調節因子の不活化が最適であり、ＳＶ４０−ＬＴ遺伝子を用いた場合のように染色体異常を伴うこともなく、本来の細胞の形質が維持されること、
等を知見するに至った。本発明者は、これら知見に加えて、子宮内膜組織から子宮内膜腺上皮細胞を単離する技術を確立し、不死化した子宮内膜腺上皮細胞株を初めて樹立するに至った。
【００１１】
本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株は、これら技術の積み重ね、及び長期に亘る鋭意研究の末に完成されたものである。すなわち、本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株は、外因性の不死化遺伝子が導入されるとともに、非癌細胞としての形質及び典型的な子宮内膜腺上皮細胞としての形質が保持されていることを特徴とする。
【００１２】
本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株は、外因性の不死化遺伝子の導入により、半永久的に培養継代可能とされている。ここで重要なのは、外因性の不死化遺伝子の導入により、テロメア依存性の細胞老化とテロメア非依存性の早期細胞老化を免れることであり、そのために、本発明では、外因性の不死化遺伝子として、テロメレース活性を誘導する遺伝子（例えばヒトテロメレース触媒サブユニット）、及び細胞周期調節因子を不活化する遺伝子（例えば、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ７遺伝子及びＥ６遺伝子）が重複導入されている。特に、細胞周期調節因子を不活化する遺伝子としてのヒトパピローマウイルス１６型のＥ７遺伝子及びＥ６遺伝子は、ＳＶ４０−ＬＴ遺伝子のように作用が強すぎず、その導入によって染色体異常を伴うこともなく、不死化された子宮内膜腺上皮細胞において本来の細胞の形質が維持される。
【００１３】
本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株は、上記外因性の不死化遺伝子の導入により不死化されているが、それとともに、非癌細胞としての形質及び典型的な子宮内膜腺上皮細胞としての形質が保持されている。ここで、非癌細胞の形質とは、培養時に足場依存性を保持し、ヌードマウス皮下で腫瘍塊を形成せず、染色体異常が見られないこと等である。また、典型的な子宮内膜腺上皮細胞の形質とは、細胞がほぼ円形で、細胞間結合の強い上皮細胞形態を有し、腺状構造を構築する能力を有し、サイトケラチン陽性及びビメンチン陽性であり、エストロゲンレセプター及びプロゲステロンレセプターを発現し、且つステロイドホルモン応答性を有していること等である。これら非癌細胞としての形質及び典型的な子宮内膜腺上皮細胞としての形質が保持されていることで、子宮内膜の機能解析、生殖機構又は正常細胞の癌化機構の解明、及び子宮内膜再生等の研究を進める上で、極めて有用な実験材料となり得る。
【００１４】
一方、本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法は、ヒト子宮内膜組織より子宮内膜腺上皮細胞を分離回収し、初代培養を行った後に、培養細胞に外因性の不死化遺伝子を導入することを特徴とするものである。
【００１５】
本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法は、子宮内膜腺上皮細胞の分離回収と、不死化のための遺伝子導入とを基本とするものである。これら技術の組み合わせにより、半永久的に継代培養が可能な不死化子宮内膜腺上皮細胞株が樹立される。
【００１６】
ここで重要なのは、子宮内膜組織から子宮内膜腺上皮細胞を単離する技術の確立である。本発明者は、試行錯誤を繰り返し、その結果、間質細胞が混入することなく子宮内膜腺上皮細胞を効率的に単離し得る方法を確立するに至った。すなわち、上記不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法において、子宮内膜腺上皮細胞は、ヒト子宮内膜組織を細切した後、ＤＮＡ分解酵素タイプ１及びコラーゲン分解酵素タイプ３による処理を行い、顕微鏡下に内膜腺細胞塊を回収することにより分離回収する。この単離技術により、純化した子宮内膜腺上皮細胞への不死化技術の適用が可能になり、効率的に不死化子宮内膜腺上皮細胞株が作製される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、半永久的に継代培養が可能な不死化子宮内膜腺上皮細胞株を樹立することが可能である。また、本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株は、正常体細胞の形質及び子宮内膜腺上皮細胞の形質を保持していることから、様々な分野において利用価値があり、特に、子宮内膜の機能や癌化のメカニズムを明らかにする実験を進める上で極めて有用な実験材料を提供することが可能である。
【００１８】
また、本発明の作製方法によれば、子宮内膜腺上皮細胞を単離して不死化遺伝子を導入することができるので、不死化子宮内膜腺上皮細胞株を非常に効率的に樹立することができる。特に、内膜腺上皮細胞を高度に純化するために、内膜組織を細切し酵素処理した後、顕微鏡下に内膜腺１個１個を回収する方法は、本発明者らが開発したものであり、極めて高い純度の内膜腺細胞塊の回収が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を適用した不死化子宮内膜腺上皮細胞株及びその作製方法について、モデル図等を参照しながら詳細に説明する。
【００２０】
一般に、正常体細胞は、試験管内での培養でも無限に増殖、分裂できるわけではなく、一定の分裂回数の後、増殖を停止する。これは染色体末端の構造であるテロメアとよばれる繰り返し配列が、細胞分裂ごとに徐々に短縮し、限界まで短縮するとＤＮＡダメージシグナルが働いて細胞が増殖を停止するためと考えられている。図１は、このテロメアの短縮による細胞増殖停止の機構を示すモデル図である。染色体末端には、テロメアと称される１本鎖領域があり、正常体細胞では、染色体はループ構造（図中、左方に示す構造）をとっている。テロメアは、前述の通り細胞分裂ごとに徐々に短縮し、限界まで短縮すると染色体は図中右方に示すようにループ構造をとれなくなる。すると、ＤＮＡダメージシグナルが出され、細胞増殖が停止する。テロメアの長さは細胞の寿命を決定する分裂時計と考えられ、正常細胞では分裂ごとに徐々に短縮してゆくために、最終的には必ず増殖停止を迎える。これをテロメア依存性の細胞老化と呼ぶ。
【００２１】
一方、多くの癌細胞は細胞老化を迎えることなく、永久的に増殖を続ける。また、ほとんどすべての癌細胞ではテロメアを伸長させるテロメレースが活性化されている。したがって細胞分裂ごとにテロメアを喪失することなく、テロメア依存性の細胞老化を免れている。テロメレースを構成する構成成分が相次いでクローニングされ、なかでもヒトテロメレース触媒サブユニット（以下、ｈＴＥＲＴと称する。）が酵素活性を担う最重要分子であることがわかっている。
【００２２】
テロメレース活性を持たない正常細胞にｈＴＥＲＴを遺伝子導入するとテロメレース活性が誘導され、ある種の正常細胞を不死化できる。当初はｈＴＥＲＴ導入によりほとんどの正常細胞は不死化できるのではないかと考えられていたが、これは細胞種に依存し、上皮系の細胞ではむしろこの方法で不死化できる細胞は稀で、テロメレースの活性化だけでは不死化を誘導できないことがわかってきた。上皮系の細胞の老化過程を観察すると、テロメアが短縮する以前に早期に細胞増殖が停止する。この際、細胞周期を負に調節するｐ１６やＲｂ蛋白等の細胞周期調節因子の活性化が起こり、増殖が停止することが明らかになった。すなわち、テロメア依存性の細胞老化とは別個にテロメア非依存性の早期細胞老化の機構が存在する。
【００２３】
図２は、細胞周期調節因子の活性化による細胞増殖停止のモデル図である。細胞増殖においては、Ｒｂ蛋白と結合したＥ２Ｆを遊離する必要があり、ＣＤＫによるＲｂ蛋白のリン酸化によりＥ２Ｆの遊離が行われる。これに対し、ＤＮＡが傷ついたと認識され、ＤＮＡダメージシグナルが出されると、ｐ２１やｐ１６等が増加し、ＣＤＫをブロックしてＥ２Ｆの遊離を阻害し、細胞周期が停止する。
【００２４】
上皮細胞はこのように２段階の老化機構を有すると考えられる。このため、上皮細胞を不死化させるためには、先ず、ｐ１６やＲｂの機能を停止させる必要がある。ｐ１６の作用経路はＲｂ経路の上流にあり、その作用は最終的にはＲｂを介するものであるので、上皮細胞の早期の細胞老化の防止にはＲｂを不活化することが肝要であると考えられる。Ｒｂの機能を不活化する方法として有望なのは、ヒトパピローマウイルス（以下、ＨＰＶと称する。）の癌遺伝子の導入である。子宮頚癌を誘発する悪性型のＨＰＶは、癌遺伝子Ｅ６及びＥ７をゲノムに含んでいる。図３に示すように、Ｅ７蛋白はＲｂ蛋白と結合し、この機能を不活化する。またＥ６蛋白は、癌抑制遺伝子産物ｐ５３と結合しこれを不活化する。Ｅ６蛋白にはこれ以外にも造腫瘍性などに関わる様々な機能があり、総体的にはＥ７蛋白の機能を補足し、協調的に働く。
【００２５】
したがってＨＰＶＥ６およびＥ７の遺伝子導入によりＲｂ蛋白を不活化すれば、培養早期の増殖停止を乗り越えられる可能性がある。さらにこれを乗り越えることが出来た場合にも、その後にテロメア短縮による細胞老化が訪れる可能性が高い。これをｈＴＥＲＴ遺伝子導入により乗り越えられるのではないかという仮説を立てた。すなわち、図４に示すように、第１のシネッセンス（老化）をＲｂ蛋白とＨＰＶ１６Ｅ７との結合、及び癌抑制遺伝子産物ｐ５３とＨＰＶ１６Ｅ６の結合によって乗り越え、第２のシネッセンスをｈＴＥＲＴ遺伝子の導入によって乗り越えるというものである。
【００２６】
本発明者は、このような仮説に基づいて実際に子宮内膜腺上皮細胞への遺伝子導入を行った。その結果、前記増殖停止を乗り越え、半永久的に継代培養が可能な不死化子宮内膜腺上皮細胞株を得ることに成功した。
【００２７】
本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株は、外因性の不死化遺伝子が導入されるとともに、非癌細胞としての形質及び典型的な子宮内膜腺上皮細胞としての形質が保持されていることを特徴とするものである。ここで、外因性の不死化遺伝子は、先の第２のシネッセンスを回避するためテロメレース活性を誘導する遺伝子、及び第１のシネッセンスを回避するための細胞周期調節因子を不活化する遺伝子である。
【００２８】
具体的には、例えば、上記テロメレース活性を誘導する遺伝子としては、配列番号１記載のヒトテロメレース触媒サブユニットである。また、上記細胞周期調節因子を不活化する遺伝子としては、配列番号２記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ７遺伝子、及び配列番号３記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６遺伝子である。なお、ヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６遺伝子には多彩な機能があるが、正常型Ｅ６遺伝子に代わり、ｐ５３結合能のみを保持し、その他の機能を廃絶させた配列番号４記載のヒトパピローマウイルス１６型Ｅ６Δ１５１変異遺伝子を導入することも可能である。
【００２９】
次に、上述の不死化子宮内膜腺上皮細胞株の作製方法について説明する。本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株は、ヒト子宮内膜組織由来の細胞株である。したがって、同細胞株は、例えば、以下のように樹立することが出来る。例えば、子宮内膜に異常のない良性疾患（例えば、子宮筋腫）により摘出した子宮より患者の同意を得て子宮内膜組織を採取後、これを細切し、腺上皮細胞と間質細胞とを分離するための酵素処理を行う。ここで、分離のために用いる酵素としては、ＤＮＡ分解酵素タイプ１（DNase I）およびコラーゲン分解酵素タイプ３（collagenase type 3）を組み合わせて用いることが望ましい。この処理により内膜腺上皮細胞は内膜間質細胞と分離する。
【００３０】
内膜腺上皮細胞は、上記の処理後に、図５に示すように、ブドウの房状の腺細胞塊として腺構造を保持しているのに対して、間質細胞は細胞間の結合が弱く単一細胞となっているため、顕微鏡下に一個一個の内膜腺塊を容易に回収できる。約５００〜１０００個程度の内膜腺を回収し、血清を含む培養液中において培養を行う。望ましい実施の形態においては、上記培養液は１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培養液である。通常この培養状態で約２週間は培養可能である。また、本明細書中においては、この培養状態を初代培養と呼称する。
【００３１】
前記初代培養状態の内膜上皮細胞への、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ６遺伝子、同Ｅ７遺伝子及びヒトテロメレース触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の導入は常法に従って行うことができ、具体的にはエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、レトロウイルスベクターの使用等が挙げられる。また、この際、不死化のための最初のステップとして、まずテロメア非依存性の細胞老化を乗り越える必要があるため、先ずＥ６およびＥ７遺伝子を導入し、その後にｈＴＥＲＴ遺伝子を導入することが望ましい。
【００３２】
次いで、ゲノムＤＮＡへの遺伝子導入が行われ同遺伝子を保持発現することにより細胞老化を乗り越えた細胞を選択し回収する。また、ここで行う選択をより確実にするため、例えば、導入した発現ベクター内に存在する選択マーカーを利用した、薬剤に対する感受性の差による薬剤セレクション等の手段を併せ行うことができる。
【００３３】
また、前述した回収細胞におけるＥ６，Ｅ７又はｈＴＥＲＴ遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認することができる。さらに、ｈＴＥＲＴ遺伝子を導入し同遺伝子が発現することに基づくテロメレース活性はＴＲＡＰ法により測定し確認することができる。
【００３４】
これらの回収した細胞は、免疫組織学的染色の手法及びＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析方法を用いて子宮内膜腺上皮細胞由来であることを確認することができる。先ず、上記免疫組織学的染色のマーカーとしては、例えば、腺上皮に特異的に発現するサイトケラチン、間質細胞と上皮細胞の双方で発現するビメンチン、及び血管内皮細胞において発現するＣＤ３４等の分子を挙げることができ、これらの染色結果を組み合わせて確認することができる。一般的には、内膜腺上皮細胞であればサイトケラチン陽性、ビメンチン陽性、ＣＤ３４陰性を呈する可能性が高い。さらに、これらの細胞は、子宮内膜腺上皮細胞の特徴であるエストロゲンレセプター（ＥＲα）、及びプロゲステロンレセプター（ＰＲ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認することができる。
【００３５】
また、これらの回収した細胞は、形態的及び機能的にも子宮内膜腺上皮細胞の形質を保持していることを確認する。子宮内膜腺上皮細胞の形態的形質の確認として、具体的には、例えばマトリゲル（Becton Dickinson社製）等を用いた三次元培養を行うことにより腺構造を形成しつつ増殖することを確認する。また、機能的形質の確認としては、例えば、通常の培養時におけるステロイドホルモンに対する応答性を確認する。
【００３６】
さらに、これらの回収した細胞は、癌化形質を獲得していないことについて確認を行う。具体的には、まず足場依存性を保持していることを証明する目的で軟寒天培地を用いたコロニー形成試験を行った場合にコロニー形成が認められないこと、及びヌードマウス皮下に細胞を移植しても腫瘍塊を形成しないことの確認を行う。また、染色体異常についても確認を行う。
【００３７】
以上に記述した方法により作製し選択した細胞は、半永久的に継代培養を行うことが可能であり、且つ非癌性の子宮内膜腺上皮細胞の形質を維持しているため、様々な利用方法が考えられる。特に生殖研究の分野において幅広い応用が考えられる。受精卵が子宮内膜に着床する際、先ず卵と内膜上皮の間に接着が起こるが、これまで内膜上皮細胞の培養が不可能であったため、試験管内でこれらの現象を解析することが不可能であった。ここで、本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株を用いることにより、着床における受精卵の接着、さらには浸潤などの解析が可能になる。
【００３８】
また、再生医学の分野でも本発明の細胞株を利用した発展が期待される。これまで他臓器では幹細胞を用いた臓器再生の研究が進みつつあるが、生殖臓器では全く行われていない。この点において、子宮内膜に関しては本発明の細胞株が内膜の再生に応用できる可能性がある。特に内膜間質細胞は培養が容易で、長期にわたり増殖可能であるため、本発明の細胞株との共培養を行うことで内膜再生を実現できる可能性がある。
【００３９】
一方、子宮内膜上皮はステロイドホルモン感受性の高い組織である。これは子宮内膜の月経周期ごとのダイナミックな変化がステロイドホルモンの作用によって引き起こされていることを考えれば明らかである。本発明の細胞株はステロイドホルモン応答性が保持されている。したがって、ステロイドホルモンの作用、シグナル伝達の解析などにも有用な材料である。
【００４０】
また、本発明の細胞株は癌化形質を獲得していない。子宮内膜癌化過程においてテロメレースの活性化は重要なステップであるが、本発明者らの解析ではテロメレースの活性化は細胞の不死化には関与するものの、悪性形質の獲得には直接的には関与していないものと考えられる。また早期の細胞老化にかかわるＲｂの機能を不活化することも、直接癌化形質の獲得には賦与しなかった。これらのことより不死化の条件として上記の因子は重要であるが、癌化形質の獲得にはさらに別のステップが必要であることがわかる。したがって、これらの細胞は、今後、ＰＴＥＮなどの遺伝子不活化などの遺伝子操作を加えることで、癌化するか否かを確認する等、内膜の多段階癌化ステップの解析に有用である。内膜癌の癌化過程においては、これまで培養実験系自体が存在せず、試験管内の発癌実験が不可能であったので、本発明の細胞株は内膜癌化のメカニズムの解析に道を開く可能性がある。
【実施例】
【００４１】
次に、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
【００４２】
子宮内膜腺上皮細胞株は、具体的には以下に述べるような方法で作製することができる。
【００４３】
実験１  初代培養
子宮内膜組織を細切し３５０ unit/mlのDnase I（宝酒造社製）および１８０ unit/mlのcollagenase type 3（Washington Biochemical Corporation社製）にてＤＭＥＭ培養液（Invitorogen社製）中で３７℃において４０分間処理した。この酵素処理により内膜腺上皮細胞は内膜間質細胞と分離した。顕微鏡下において約５００〜１０００個の内膜腺を回収し、１０％ＦＢＳ（Sigma社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培養液［ただしＩＴＳ（BD Bioscience社製）を含む。］で培養した。この培養状態を初代培養と呼称する。図５に、ヒト子宮内膜組織より回収され、ブドウの房状の細胞塊を形成している内膜腺上皮細胞の顕微鏡写真を示す。
【００４４】
実験２  遺伝子導入
ＨＰＶ１６Ｅ６及びＨＰＶ１６Ｅ７遺伝子とｈＴＥＲＴ遺伝子はレトロウイルス発現ベクターにて各々単独、または互いの組み合わせにより前記初代培養状態の内膜上皮細胞に導入した。導入に用いるレトロウイルス発現ベクターの構築は以下の如く行った。すなわち、ＨＰＶ１６Ｅ６又はＨＰＶ１６Ｅ７遺伝子発現ベクターは、配列番号３記載のＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子配列又は配列番号２記載のＨＰＶ１６Ｅ７遺伝子配列をＬＲシステム（invitrogen社製）を用いてレトロウイルスベクターに組み込んだ。またＥ６には多彩な機能があるため、機能解析を容易にするために、Ｅ６のｐ５３結合能のみを保持しその他の機能を廃絶させた変異遺伝子Ｅ６Δ１５１（配列番号４）をも導入した。同Ｅ６Δ１５１はＥ６遺伝子よりKiyonoらの報告（Kiyono T et al, Proc Natl Acad Sci U S A.1997,  94:11612-11616）に従い欠失させて作成した。なおこれらの発現ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子が組み込んであり、Ｇ４１８にて選択が可能である。
【００４５】
ｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクターは、配列番号１記載のｈＴＥＲＴ遺伝子（ｃＤＮＡ）を前述した方法によりレトロウイルスベクターに組み込み、Kiyonoらの報告（Kiyono T et al, Nature 1998, 396: 84-88）に従い作成したものを用いた。なおこのベクターにはピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んであるため、遺伝子導入細胞はピューロマイシンにより選択可能である。
【００４６】
前述した方法により組み換えを行ったレトロウイルスベクターのパッケージング細胞への導入と産生及び内膜上皮細胞への感染（導入）はNaviauxらの報告（Naviaux RK et al, J Virol. 1996, 70:5701-5705）に従って行った。また、この際、まずＨＰＶ１６Ｅ６およびＨＰＶ１６Ｅ７遺伝子を導入し、その後にｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。
【００４７】
実験３  遺伝子導入細胞の選択及び回収
前述した遺伝子導入後に、ベクター内に存在する選択マーカーを利用した薬剤セレクションにより、これらの遺伝子を保持発現しコロニーを形成している細胞を回収した。具体的には、まず、Ｅ６遺伝子又はＥ７遺伝子発現ベクターを単独あるいは同時に導入し、G418(Sigma社製)により薬剤選択を行う。これにより増殖してきた細胞にｈＴＥＲＴ遺伝子発現ベクターを導入し、ピューロマイシン（Sigma社製）により薬剤選択を行い、増えてきた細胞を回収した。上述したセレクションの結果、図６に示す如く、計５種類の細胞株を回収した。その内訳は、ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を保持する３種の細胞株（ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−２，及びＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−３）、Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子のみを保持する細胞（ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７）、及び変異遺伝子Ｅ６Δ１５１とＥ７遺伝子及びｈＴＥＲＴを保持する細胞（ＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ）であった。ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝子又はｈＴＥＲＴ遺伝子の単独導入を行った細胞は回収できなかった。
【００４８】
実験４  遺伝子導入細胞における発現遺伝子
前述したセレクションの結果回収された５種類の細胞におけるＥ６遺伝子、Ｅ７遺伝子、及びｈＴＥＲＴ遺伝子の発現はＲＴ−ＰＣＲ法にて確認した。ＲＴ−ＰＣＲ法を行うに先立ち、各遺伝子に特異的なプライマー対を作製した。すなわち、Ｅ６遺伝子に特異的なforwardプライマー (配列番号５)及びreverseプライマー (配列番号６)、Ｅ７遺伝子に特異的なforwardプライマー (配列番号７)及びreverseプライマー(配列番号８)、そして、hTERT遺伝子に特異的なforwardプライマー(配列番号９)及びreverseプライマー(配列番号１０)である。一方、上記回収された５種類の細胞株からIsogen（ニッポンジーン社製）を用いて精製したtotal RNAを材料として、oligo (dT) セルロースカラムを用いてpoly (A)+ RNAを精製した。cDNA作製はRNA PCR kit version 2 (宝酒造社製)により、ランダムプライマーを用いて行った。
【００４９】
引き続くＰＣＲ反応は、以下の如く行った。各細胞から調整したｃＤＮＡ２μｌに対して、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、２．５unitsのGene Taq（ニッポンジーン社製）、及び各０．２μＭ  のｆｏｒｗａｒｄ及びreverseプライマーを含む緩衝液５０μｌを加えた。各試料液に対して、変性反応９４℃、３０秒間、アニーリング反応５５oＣ（ＨＰＶ１６Ｅ６又はＥ７プライマーを用いた場合）又は６０oＣ（ｈＴＥＲＴプライマーを用いた場合）、３０  秒間、伸長７２℃、４５秒間を１サイクルとして２８サイクルの反応を行った。なお、遺伝子発現の陽性対照として、Nakayamaらの報告（Nakayama J. et al, Nat Genet.1998, 18: 65-68）に従い、ＧＡＰＤＨに特異的なプライマーを用いて同様にＰＣＲ反応を行った。図７にＰＣＲ産物の７％ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果を示す。ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７細胞ではｈＴＥＲＴ遺伝子の発現は認められていないが、ｈＴＥＲＴ遺伝子導入細胞ではその発現が確認できた。
【００５０】
実験５  遺伝子導入細胞における性状解析
各細胞におけるテロメレース活性をTelomeric Repeat Amplification Protocol (ＴＲＡＰ)法によりTRAPEZEテロメレース検出キット (Intergen社製)を用いて測定した。図８にその結果を示す。ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現がないＥＭ−Ｅ６／Ｅ７細胞ではテロメレース活性は認められないものの、ｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した細胞では明らかにテロメレース活性が認められた。またこれらの細胞の内膜上皮細胞由来を証明するために、免疫組織学的方法により、サイトケラチン、ビメンチン、ＣＤ３４を染色した。５種類の細胞全てにおいてサイトケラチン陽性、ビメンチン陽性、ＣＤ３４陰性を呈した。図９（ａ）にＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−３細胞におけるサイトケラチン染色結果（陽性）、図９（ｂ）にビメンチン染色結果（陽性）、図９（ｃ）にＣＤ３４染色結果（陰性）、及び図９（ｄ）に抗体を作成した動物の血清をコントロールとして反応させた結果（陰性コントロール）を示す。上皮細胞は一般にサイトケラチン陽性、ビメンチン陰性（まれに陽性）であるが、正常内膜組織を染色した過去の成績ではサイトケラチン陽性、ビメンチン陽性であることが確認されており、上述した結果はこれに合致する。ＣＤ３４は血管内皮マーカーであり、ＣＤ３４陰性であることは血管内皮由来を否定するものである。さらに、前述したＲＴ−ＰＣＲ法に従い、内膜上皮細胞の特徴であるエストロゲンレセプター（ＥＲα、使用したプライマーは配列番号１１で示されるforwardプライマー及び配列番号１２で示されるｒｅｖｅｒｓｅプライマー）及びプロゲステロンレセプター（ＰＲ、使用したプライマーは配列番号１３で示されるforwardプライマー及び配列番号１４で示されるreverseプライマー）の発現を解析したところ、両者の発現が確認された（図７）。なお、ここでのＰＣＲ反応は、変性反応９４℃、３０秒間、アニーリング反応６２oＣ、３０  秒間、伸長７２℃、４５秒間を１サイクルとして行った。以上の解析よりこれら５種類の細胞が内膜腺上皮細胞由来である可能性が強く示唆された。
【００５１】
実験６  細胞増殖パターンの解析
これら５種類の細胞は円形で、細胞間結合が強く、上皮細胞に典型的な形態を示す（図１０）。安定的に培養が可能であり、遺伝子導入後約４０回の分裂までは上記５種類の細胞はほぼ同様の増殖パターンを示した（図１１）。ところがｈＴＥＲＴを導入していないＥＭ−Ｅ６／Ｅ７は、約４０回の分裂後、増殖が停止し、細胞は扁平、巨大化し、細胞老化を思わせる形態を示した［図１２（ａ）及び（ｂ）］。実際、老化細胞に特有のβ−ｇａｌ染色陽性細胞が高率に出現してきた［図１３（ａ）］。一方、ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，２，３及びＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴでは増殖も停止することなく、また形態的にも扁平、巨大化することなく正常形態を保持し、β−ｇａｌ染色陽性細胞の出現も認めなかった［図１４及び図１３（ｂ）］。すなわち、ｈＴＥＲＴを導入されていないＥＭ−Ｅ６／Ｅ７では約４０回の分裂時点で細胞老化が誘導されるが、ｈＴＥＲＴ導入細胞はこの障害を乗り越えていることが示された。
【００５２】
実験７  テロメア長の解析
さらにこれら５種類の細胞のテロメア長をTRF length 法に従いTeloTTAGGG Telomere Length Assay Kit (Rosche社製)を用いて試験し、サザンブロット法により解析した結果を図１５に示す。ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，２，３及びＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴのｈＴＥＲＴ導入細胞は分裂回数の増加に伴うテロメアの短縮は認められず、約１０ｋｂを保持していた。むしろＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴのようにテロメア長が逆に延長している細胞もみられた。これに対し、ｈＴＥＲＴを導入されていないＥＭ−Ｅ６／Ｅ７はテロメアが著しく短縮し、遺伝子導入後約４０回の分裂時点では約５ｋｂにまで短縮していた。これらの結果から、テロメレース活性を持たないＥＭ−Ｅ６／Ｅ７細胞ではテロメア短縮により細胞老化を来すものの、その他の細胞はテロメレースによりテロメアが維持され、細胞老化を免れていると考えられた。
【００５３】
実験８  細胞の三次元培養による形態解析
以上に述べた解析において、不死化形質を獲得していることが確認された４種類の細胞株、すなわちＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，２，３及びＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴが正常内膜上皮細胞の形質をどの程度保持しているかを確認するために以下の実験を行った。先ず、マトリゲル（Becton Dickinson社製）を用いた三次元培養を行い、腺構造をとり得るかどうかを確認した。その結果、腺管状の立体構造を取ることが確認された［図１６及び図１７（ａ）〜（ｃ）］。この腺管様構造のパラフィン包埋切片を作成し、断面を観察すると、内腔を形成する環状に並んだ細胞が確認され、腺管としての形態に類似する構造が確認された［図１８（ａ）及び（ｂ）］。
【００５４】
実験９  細胞のステロイドホルモン応答性
さらにＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，２，３及びＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ細胞のステロイドホルモンに対する反応性を確認した。エストロゲンである１７β−estradiol（Ｅ２）を培養液中に加え、ＷＳＴ−１  assay（Boehringer Mannheim社製）を用いて増殖活性を測定したところ、１ｎＭ以上の濃度で４８時間をピークに増殖促進効果が確認された［図１９（ａ）及び（ｂ）］。さらにプロゲステロンの一種であるmedroxy-progesterone acetate （ＭＰＡ）を作用させたところ、一過性の増殖促進とそれに引き続いて起こる増殖抑制効果が確認された［図１９（ｃ）及び（ｄ）］。なお、図１９各図において、＃はｐ＜０．０１を示し、＊はｐ＜０．００１を示す。以上のことより、ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，２，３及びＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ細胞は形態的にも機能的にも子宮内膜腺上皮細胞の形質を保持していることが確認された。
【００５５】
実験１０  細胞の癌化性質の解析
また、ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，２，３及びＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ細胞の癌化形質についても解析した。これらの細胞を軟寒天培地上で培養しても全くコロニーを形成されなかった［図２０（ｂ）］。一方、コロニー形成の陽性対照として子宮内膜癌由来の癌細胞であるＨＥＣ−１細胞を用いた場合、高率にコロニー形成が認められた［図２０（ａ）］。またヌードマウスにＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，２，３又はＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ細胞を移植しても腫瘍を形成しなかった［図２１（ｂ）］。これに対して陽性対照として用いた子宮内膜癌由来の癌細胞であるＩｓｈｉｋａｗａ細胞では腫瘍形成が高率に認められた［図２１（ａ）］。これらの結果より、ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，２，３およびＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ細胞は癌化形質は獲得していないと思われた。また、染色体検査を行った結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
表１に示す如く、ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，３及びＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴにおいては染色体は正常であった。ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−２ではｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌな染色体転座を認めたものの軽微なものであった。なお、本実施例において樹立した不死化子宮内膜腺上皮細胞であるＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ−１，  ２，３及びＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ細胞はその後も安定的に分裂を繰り返し、現在までに１００回以上の分裂後も増殖を続け、また培養に伴う形態変化も認められていない。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株は、正常体細胞の形質及び子宮内膜腺上皮細胞の形質を保持していることから、様々な分野において利用価値がある。特に生殖研究の分野において、本発明の不死化子宮内膜腺上皮細胞株を用いることにより、着床における受精卵の接着、さらには浸潤などの解析が可能になる。また、再生医学の分野でも、本発明の細胞株を利用することにより、内膜再生を実現できる可能性がある。さらに、本発明の細胞株はステロイドホルモン応答性が保持されている。したがって、ステロイドホルモンの作用、シグナル伝達の解析などにも有用な材料である。また、本発明の細胞株は癌化形質を獲得していないため、例えば新たな遺伝子操作を加えることにより内膜の多段階癌化ステップの解析を行うモデルとして極めて有用である。内膜癌の癌化過程においてはこれまで培養実験系自体が存在せず、試験管内の発癌実験が不可能であったので、本発明の細胞株は内膜癌化のメカニズムの解析に新たな道を開く可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】テロメアの短縮による細胞増殖停止の機構を示すモデル図である。
【図２】細胞周期調節因子の活性化による細胞増殖停止のモデル図である。
【図３】Ｅ７及びＥ６による不活化を示すモデル図である。
【図４】２段階のシネッセンスの回避のモデル図である。
【図５】ヒト子宮内膜組織より回収され、ブドウの房状の細胞塊を形成している内膜腺上皮細胞の顕微鏡写真である。
【図６】初代培養状態の子宮内膜腺上皮細胞に対してＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、同Ｅ７遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を導入することにより長期培養が可能になり、回収された細胞のリストである。
【図７】ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、同Ｅ７遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した細胞内におけるエストロゲンリセプター（ＥＲα）、プロゲステロンリセプター（ＰＲ）、ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、同Ｅ７遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、及び遺伝子発現の陽性対象としてＧＡＰＤＨ遺伝子の各遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法及び電気泳動により解析した写真である。
【図８】ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、同Ｅ７遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した細胞内におけるテロメレース活性をＴＲＡＰ法及び電気泳動により解析した写真である。
【図９】（ａ）はEM-E6/E7/TERT-3細胞におけるサイトケラチン染色結果、（ｂ）は同細胞におけるビメンチン染色結果、（ｃ）は同細胞におけるＣＤ３４染色結果、（ｄ）は抗体を作成した動物の血清をコントロールとして反応させた結果（陰性コントロール）である。
【図１０】試験管内で培養中のＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−２細胞の顕微鏡写真である。
【図１１】ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−１、２細胞、及びＥＭ−Ｅ６／Ｅ７細胞の増殖曲線である。
【図１２】（ａ）及び（ｂ）はＥＭ−Ｅ６／Ｅ７細胞（分裂回数４０回）の試験管内培養状態の顕微鏡写真である。
【図１３】（ａ）はＥＭ−Ｅ６／Ｅ７細胞（分裂回数４０回）におけるβ−ｇａｌ染色結果であり、（ｂ）はＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−２細胞（分裂回数５１回）におけるβ−ｇａｌ染色結果である。
【図１４】ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−２細胞（分裂回数５１回）の試験管内培養状態の顕微鏡写真である。
【図１５】ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−１細胞（分裂回数１９回又は６９回）、ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−２細胞（分裂回数２２回又は５１回）、ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−３細胞（分裂回数２２回又は５７回）、ＥＭ−Ｅ６Δ１５１／Ｅ７／ｈＴＥＲＴ細胞（分裂回数１９回又は６９回）、及びＥＭ−Ｅ６／Ｅ７細胞（分裂回数２２回又は４０回）におけるテロメア長をＴＲＦｌｅｎｇｔｈ法及びサザンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図１６】ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−２細胞をMatrigel上で三次元培養した状態の顕微鏡写真である。
【図１７】（ａ）〜（ｃ）はＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−２細胞がMatrigel上で腺状構造を取っている状態の顕微鏡写真である。
【図１８】（ａ）及び（ｂ）はＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−２細胞の腺状構造をＨＥ染色した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１９】ＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−２細胞のステロイドホルモン応答性を解析した結果であり、（ａ）は培養液中にＥ２を１、１０又は１００ｎＭ添加し４８時間後の増殖活性を測定した結果、（ｂ）は培養液中にＥ２を１００ｎＭ添加し経時的に増殖活性を測定した結果、（ｃ）は培養液中にＭＰＡを１、１０又は１００ｎＭ添加し４８時間後の増殖活性を測定した結果、（ｄ）培養液中にＭＰＡを１００ｎＭ添加し経時的に増殖活性を測定した結果を示す。
【図２０】（ａ）はＨＥＣ−１細胞の軟寒天培地上でのコロニー形成試験結果を示し、（ｂ）はＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−１細胞の軟寒天培地上でのコロニー形成試験結果を示す。
【図２１】（ａ）はＩｓｈｉｋａｗａ  細胞のヌードマウス皮下での腫瘍塊形成試験結果であり、（ｂ）はＥＭ−Ｅ６／Ｅ７／ＴＥＲＴ−１細胞のヌードマウス皮下での腫瘍塊形成試験結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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