(57)【要約】【課題】  ナノスケールの空孔底部に一本鎖核酸プローブを固定し、プローブと標的核酸がハイブリダイズして二重螺旋構造を作った場合にのみ、インターカレーターが蛍光を発する標的核酸検出用素子、その製造方法、それを用いた標的核酸の検出方法及び標的核酸検出装置。【解決手段】  柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内に標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで得られる、標的核酸検出用素子であって、  該多孔体は、第一の成分を含み構成される柱状物質が第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体から、該柱状物質を除去して形成されていることを特徴とする標的核酸検出用素子、その製造方法、それを用いた標的核酸の検出方法及び標的核酸検出装置。【選択図】  図１
2005061996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内に標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで得られる、標的核酸検出用素子であって、
該多孔体は、第一の成分を含み構成される柱状物質が第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体から、該柱状物質を除去して形成されていることを特徴とする標的核酸検出用素子。
【請求項２】
前記多孔体が薄膜状である請求項１に記載の標的核酸検出用素子。
【請求項３】
前記多孔体の主成分がシリコン、ゲルマニウム、シリコンゲルマニウム混合物のいずれかである請求項１又は２に記載の標的核酸検出用素子。
【請求項４】
前記柱状の空孔の直径が２ｎｍ以上１５ｎｍ未満である請求項１〜３のいずれかに記載の標的核酸検出用素子。
【請求項５】
前記多孔体の底面にチオール基と結合する金属が形成されている請求項１〜４のいずれかに記載の標的核酸検出用素子。
【請求項６】
前記プローブ核酸がチオール基を有している一本鎖核酸である請求項１〜５のいずれかに記載の標的核酸検出用素子。
【請求項７】
（ａ）基板を用意する工程、
（ｂ）該基板上に、第一の成分を含み構成される柱状物質が、第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体を用意する工程、
（ｃ）該柱状物質を除去する工程、
（ｄ）該除去工程により得られる柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内にプローブ核酸を導入する工程、
を有していることを特徴とする標的核酸検出用素子の作製方法。
【請求項８】
前記（ａ）工程が導電性素材の基板又は基板表面に導電性素材の薄膜を設置した基板を用意する工程で、かつ前記（ｄ）工程の前に前記空孔底部に金、白金、銀、銅のいずれかを設置する工程を設ける工程を施す請求項７に記載の標的核酸検出用素子の作製方法。
【請求項９】
前記（ｄ）工程の前に、前記多孔体に化学的処理を施す工程を有している請求項７又は８に記載の標的核酸検出用素子の作製方法。
【請求項１０】
（ａ）柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内に標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで得られる、標的核酸検出用素子であって、
該多孔体は、第一の成分を含み構成される柱状物質が第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体から、該柱状物質を除去して形成されていることを特徴とする標的核酸検出用素子を、二重螺旋構造を形成した核酸にインターカレートすることで蛍光を発する蛍光試薬及び標的核酸を含む溶液に浸す工程、
（ｂ）該標的核酸がディネーチャーして一本鎖核酸になる温度まで前記溶液を上昇させる工程、
（ｃ）核酸が二重螺旋構造を形成する温度に該標的核酸検出用素子を低下させる工程、
（ｄ）該標的核酸検出用素子の表面に付着した核酸を除去する工程、
（ｅ）該標的核酸検出用素子に表面の多孔体面に励起光を当てる工程、
（ｆ）該標的核酸検出用素子の表面の多孔体面が発する蛍光を測定する工程、
を有していることを特徴とする標的核酸検出用素子を用いた検出方法。
【請求項１１】
（ａ）柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内に標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで得られる、標的核酸検出用素子であって、
該多孔体は、第一の成分を含み構成される柱状物質が第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体から、該柱状物質を除去して形成されていることを特徴とする標的核酸検出用素子、
（ｂ）該標的核酸検出用素子及び標的核酸を含む溶液を入れる容器、
（ｃ）該標的核酸検出用素子及び該容器を加温冷却する手段及び温度制御手段、
（ｄ）該標的核酸検出用素子の表面の多孔体面に励起光を照射する手段、
（ｅ）該標的核酸検出用素子の表面の多孔体面が発する蛍光を検出する手段、
を具備していることを特徴とする標的核酸検出用素子を用いた標的核酸検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで得られる、標的核酸検出用素子に関するものであって、特に柱状の空孔を有している多孔体の前記空孔内に前記核酸を導入することで、長鎖の核酸であっても誤検出の無い標的核酸検出用素子、その製造方法、それを用いた標的核酸の検出方法及び標的核酸検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の塩基配列を有する核酸が存在するかどうかを検出する技術は、遺伝子工学の発展とともに必要不可欠な技術として、医療分野のみならず、環境や食料品等への幅広い応用が期待されている。
【０００３】
一般的に、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出方法としては、これまで様々な技術が提案されてきており、一部実用化されているものもある。最も代表的な技術として、ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）が挙げられる。この方法は、例えばヒトの全遺伝子を制限酵素によって切断して得られるＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で展開し、サザンブロット法を用いてフィルター上に固定した後、蛍光色素等により標識したＤＮＡ（又はＲＮＡ）からなるプローブとハイブリッドさせ、目的ＤＮＡと検体ＤＮＡの切断パターンの相違から、目的とする遺伝子の有無を検出するものである。その他、プローブ核酸が標的核酸の一本鎖とハイブリッドを形成した際に、蛍光物質を標識したプローブの蛍光の偏向特性が変化することを利用した蛍光偏向解消法、同様に、スピンラベルしたＥＳＲ（電子スピン共鳴）特性が変化することを利用するスピン解消法等が挙げられる。
【０００４】
また、近年では二重螺旋構造を形成した二本鎖核酸に作用することで蛍光を発するインターカレーターと呼ばれる蛍光色素が多用されるようになってきた。代表的なインターカレーターとしては、エチジウムブロマイド（以下、ＥＢ）やＹＯＹＯ１をはじめとするいくつかの色素が販売されている。更に、２−メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩もインターカレーターである。
【０００５】
また、特定遺伝子検出のための特定塩基配列を有する標的核酸、もしくは、標的核酸の塩基配列の特定の部位に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を固相に固定し、それぞれに対応するプローブ核酸、もしくは、標的核酸とのハイブリッド体を形成させ、該ハイブリッド体を検出する、いわゆる固相ハイブリダイゼーション法は広く知られている。また、検出方法に関してもさまざまな手法が開発されている。
【０００６】
最も代表的な手法はサザンハイブリダイゼーション法で、これは、ゲル電気泳動で鎖長に応じて展開した核酸をナイロンフィルター等に移し取り、一本鎖にディネーチャーした後、例えば、ラジオアイソトープ標識したプローブ核酸を作用させ、形成したハイブリッド体をオートラジオグラフィーで検出するというものである。
【０００７】
上記方法の、ラジオアイソトープを使用する問題点を解決するために、化学的な発色を検出手段とする改良法も実用化されている。
【０００８】
近年では、更に簡便に特定の遺伝子を検出する手段として、マイクロプレート表面にプローブ核酸を固定し、ここに一本鎖の標的核酸を作用させ、ハイブリッドして形成された二重螺旋構造体をインターカレーターの蛍光によって検出するという手法が特許文献１に開示されている。
【０００９】
更に、このプローブ核酸をインクジェット法を用いて基板上にアレイ状に並べて一度に多数の核酸を検出する方法が特許文献２に開示されている。
【特許文献１】特開平７−５０６４８２号公報
【特許文献２】特開２００２−１５３２８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように特定の配列の核酸を検出する需要は増大し、そのために様々な方法が提案されつつある。
【００１１】
ただ、これらの方法は酵素で切断した核酸やプローブとなる一本鎖核酸が数十ｍｅｒ〜数百ｍｅｒほどの長さの核酸であることが多い。これは、核酸をゲル電気泳動した場合にこの範囲の長さの核酸が最も分解能が高く分離検出できることや、プローブを作製する際のＤＮＡ自動合成機の能力がせいぜい５０ｍｅｒ、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）の割合が高い場合でも１００ｍｅｒ程度のものしか合成できないからである。
【００１２】
しかし、約２０ｍｅｒ長さのプローブの配列を適切に設計することによって、短い時間と低いコストで標的核酸が存在するかどうかを正確に検出することが可能である。
【００１３】
一方で、例えばあるタンパク質の突然変異の有無を調べたい場合等、一つのタンパク質（又はそのサブユニット）の一部の遺伝子配列のみが違っている場合、その部分を含む長鎖のプローブを作製して検出する必要が生じる。長鎖の一本鎖核酸を作製しそれをプローブとすることは不可能ではないが、長鎖の一本鎖故の問題が生じる。
【００１４】
第一は、核酸が長いためにわずかの塩基配列の違いがあってもハイブリダイズして二重螺旋構造をとってしまうことがある、という点である。この場合、配列が違う部分は二重螺旋構造をとらないため、ナノスケールで見れば図６（ａ）や（ａ’）の模式図のように一部二重螺旋構造が崩れて膨らんだような形状になるが、その他の部分は二重螺旋構造を形成しているため、インターカレーターを導入すると蛍光を発し、プローブ核酸と同じ配列の核酸である、と誤検出してしまう。
【００１５】
第二は、一本鎖核酸は一般に一定温度を下回ると水素結合によって二重螺旋構造になろうとするが、相補対がない場合には自分自身の配列の中でセルフハイブリダイズを起こし二次元構造をとることがある、という問題である。一般に、タンパク質の合成をコードするＲＮＡの終結シグナルの部分は図６（ｂ）のような二次元構造をとり、この形状でタンパク質合成酵素の動きを止めるといわれている。図６（ｂ）で＝のマークはＲＮＡ分子内の水素結合である。このＲＮＡの元になるＤＮＡもＵ（ウラシル）がＴ（チミン）になっている以外は全く同じ配列の配列を持つため、ディネーチャー後の温度降下時に同様の二次構造をとる可能性が高い。プローブと標的核酸がハイブリダイズする時に一方又は両方がこのような形状になってしまい、図６（ｃ）の模式図のように残りの部分がたまたま相補対の関係になっている場合は、一部に突起が生じたような二重螺旋構造ができてしまい、インターカレーターが蛍光を発して誤検出してしまう。
【００１６】
このように、長鎖の一本鎖プロープを用いて長鎖の核酸を検出する場合、上述の理由により、核酸の一部の突然変異の有無を検出することができない可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
このような技術的背景により、本発明者らは上記課題に対して種々の検討を加えた結果、数ｎｍの空孔構造を自己組織的に形成する多孔体を用い、この空孔底部に一本鎖プローブ核酸を固定することで、プローブと標的核酸の配列が相補的である場合にのみハイブリダイズしておよそ直径２ｎｍ強の正しい二重螺旋構造を形成させ、配列が一部違う場合は二重螺旋構造の形成を妨げることで、長鎖の核酸を正確に検出する方法を見出し、本発明に至った。
【００１８】
本発明は、ナノスケールの空孔底部に一本鎖核酸プローブを固定し、プローブと標的核酸がハイブリダイズして二重螺旋構造を作った場合にのみ、インターカレーターが蛍光を発する標的核酸検出素子を提供することである。
【００１９】
また、本発明は上記のような検出素子の製造方法を提供することである。
【００２０】
また、本発明は上記のような検出素子による標的核酸の検出方法を提供することである。
【００２１】
また、本発明は上記のような検出素子による標的核酸の検出装置を提供することである。
【００２２】
本発明の第一の発明は、
柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内に標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで得られる、標的核酸検出用素子であって、
該多孔体は、第一の成分を含み構成される柱状物質が第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体から、該柱状物質を除去して形成されていることを特徴とする標的核酸検出用素子である。
【００２３】
また本発明においては、前記多孔体が薄膜状であることが好ましい。
【００２４】
また本発明においては、前記多孔体の主成分がシリコン、ゲルマニウム、シリコンゲルマニウム混合物のいずれかであることが好ましい。
【００２５】
また本発明においては、前記柱状の空孔の直径が２ｎｍ以上１５ｎｍ未満であることが好ましい。
【００２６】
また本発明においては、前記多孔体の底面にチオール基と結合する金属が形成されていることが好ましい。
【００２７】
また本発明においては、前記プローブ核酸がチオール基を有している一本鎖核酸であることが好ましい。
【００２８】
本発明の第二の発明は、
（ａ）基板を用意する工程
（ｂ）該基板上に、第一の成分を含み構成される柱状物質が、第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体を用意する工程、
（ｃ）該柱状物質を除去する工程、
（ｄ）該除去工程により得られる柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内にプローブ核酸を導入する工程、
を有していることを特徴とする標的核酸検出用素子の作製方法である。
【００２９】
また本発明においては、前記（ａ）工程が、導電性素材の基板又は基板表面に導電性素材の薄膜を設置した基板を用意する工程で、かつ前記（ｄ）行程の前に前記空孔底部に金、白金、銀、銅のいずれかを設置する工程を設けることが好ましい。
【００３０】
また本発明においては、前記（ｄ）工程の前に、前記多孔体に化学的処理を施す工程を含んでもよい。
【００３１】
本発明の第三の発明は、
（ａ）柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内に標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで得られる、標的核酸検出用素子であって、
該多孔体は、第一の成分を含み構成される柱状物質が第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体から、該柱状物質を除去して形成されていることを特徴とする標的核酸検出用素子を、二重螺旋構造を形成した核酸にインターカレートすることで蛍光を発する蛍光試薬及び標的核酸を含む溶液に浸す工程、
（ｂ）該標的核酸がディネーチャーして一本鎖核酸になる温度まで前記溶液を上昇させる工程、
（ｃ）核酸が二重螺旋構造を形成する温度に該標的核酸検出用素子を低下させる工程、
（ｄ）該標的核酸検出用素子の表面に付着した核酸を除去する工程、
（ｅ）該標的核酸検出用素子に表面の多孔体面に励起光を当てる工程、
（ｆ）該標的核酸検出用素子の表面の多孔体面が発する蛍光を測定する工程、
を有していることを特徴とする標的核酸検出用素子を用いた検出方法である。
【００３２】
本発明の第四の発明は、
（ａ）柱状の空孔を有している多孔体の該空孔内に標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで得られる、標的核酸検出用素子であって、
該多孔体は、第一の成分を含み構成される柱状物質が第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体から、該柱状物質を除去して形成されていることを特徴とする標的核酸検出用素子、
（ｂ）該標的核酸検出用素子及び標的核酸を含む溶液を入れる容器、
（ｃ）該標的核酸検出用素子及び前記容器を加温冷却する手段及び温度制御手段、
（ｄ）該標的核酸検出用素子の表面の多孔体面に励起光を照射する手段、
（ｅ）該標的核酸検出用素子の表面の多孔体面が発する蛍光を検出する手段、
を具備していることを特徴とする標的核酸検出用素子を用いた標的核酸検出装置である。
【発明の効果】
【００３３】
上記したように、本発明によれば、互いに共晶関係にある複数の成分からなるナノ構造体の一方の成分を除去して得られる多孔体薄膜の空孔内に、標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸を導入することで、長鎖の核酸であっても誤検出の少ない新規な新規な標的核酸検出素子を簡便な方法で作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３５】
図１は、本発明の標的核酸検出用素子の一例を示す概略図である。図１（ａ）は検出素子の模式図、また図１（ｂ）は素子の一部分をナノサイズで描いた模式図である。
【００３６】
図１において１０１は一本鎖プローブ核酸である。一般に二重螺旋構造をとっている場合と違って一本鎖の核酸は直鎖であるため空孔１０５から先端が出ている。この方が標的核酸とハイブリダイズし易く、かつハイブリダイズして二重螺旋構造をとった時にちょうど空孔１０５に収まり、その他の不純物を付着する可能性が低くなり都合がよい。１０２は基板、１０３は基板上部に作製した導電性素材の薄膜、又は金、白金、銀、銅のうちのいずれか一種類の薄膜、１０４は１０３の一部を表面に露出させた電極、１０５は空孔を有している多孔質薄膜、である。
【００３７】
本発明の空孔の形状は図１（ｂ）のように、ほぼ円柱のものでもよいし、また楕円柱等任意の形状が適応可能である。また、柱状の空孔の直径（平均径を示す）２ｒは２ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。これは、二重螺旋構造をとった核酸の直径がおよそ２ｎｍであることに起因する。また、あまり直径が大き過ぎると、プローブを空孔底部に設置した意味が無くなる。空孔の間隔（平均間隔を示す）２Ｒは５ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。また、深さＬは数μｍ以下、好ましくは２０００ｎｍ以下である。これ以上深いと、確実に底部に一本鎖プローブを接着できなくなることがある。ここで平均径とは、例えば、実際のＳＥＭ写真（約１００ｎｍ×７０ｎｍの範囲）で観察される空孔部分をコンピュータで画像処理して、導出される値である。
【００３８】
なお、柱状の空孔とは上記サイズを満足するものであれば、任意のアスペクト比（深さＬ／孔径２ｒ）を有している形状を含むものである。なお、好ましいアスペクト比（深さＬ／孔径２ｒ）は０．５〜１０００の範囲である。
【００３９】
まず、一本鎖プローブの元となる二本鎖核酸の作製方法について説明する。
【００４０】
一本鎖プローブは、後述する空孔底部の金、白金、銀、銅のいずれかと結合するようにどちらかの末端にチオール基を有しておれば、作製方法は特に限定されない。
【００４１】
一例を紹介する。まず、市販のＤＮＡ合成機を用いて３’端末側にチオール基を有した１０ｍｅｒ程度の一本鎖オリゴマーを作製する。次に、この一本鎖オリゴマーを二本鎖にするのだが、その方法としては相補対の配列をＤＮＡ合成機で合成して混合しハイブリダイズさせる方法、ポリメラーゼ（ＤＮＡ合成酵素）とＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各モノマーを溶解した適切な溶液に３’端末側にチオール基を有した一本鎖オリゴマーを溶解して適切な温度で適切な時間静置して二本鎖にする方法、等が考えられる。
【００４２】
プローブ本体を構成する核酸の入手方法は特に限定されない。市販されているものならばそれを購入すればよいし、目的生物のジェノミックＤＮＡの必要な部位をＰＣＲで増幅してもよいし、何らかのプラスミドに接合してホストに入れクローニングした後、回収精製してもよい。ただ、クローニングした場合は何らかの制限酵素で目的のＤＮＡを切り出し、一本鎖にする必要がある。また、塩基数は１００００ｍｅｒ以下、好ましくは６０００ｍｅｒ以下がよい。一般に核酸は二重螺旋構造をとると１０塩基あたり３．４ｎｍといわれているので、６０００ｍｅｒで約２０００ｎｍである。これ以上長くなると、以下で記述する空孔内にプローブを設置することが極端に困難になるからである。
【００４３】
このようにして作製した３’端末側にチオール基を有した一本鎖オリゴマーにプローブ本体となる直鎖の二本鎖核酸をライゲートすればよい。ライゲートの方法は、市販のライゲーションキットの用法に従って行えばよい。
【００４４】
ただこの時、プローブ本体のＤＮＡの向きを限定したい場合や、ライゲーションの効率を高めたい場合は、以下のような操作をするとよい。
【００４５】
予めＤＮＡ合成機を用いて３’端末側にチオール基を有した１０ｍｅｒ程度の一本鎖オリゴマーを作製する際、二本鎖になったものが何か特定の制限酵素で認識切断されるように配列を設計する。制限酵素はプローブ本体のＤＮＡを消化しないものであれば何でもよいが、ＥｃｏＲＩやＰｓｔＩ等の６塩基対を認識して消化切断し、端を４塩基の一本鎖にするものが適している。上記方法で二本鎖にした３’端末側にチオール基を有した１０ｍｅｒ程度のオリゴマーを適切な溶液に再溶解し制限酵素を添加して適切な温度にし、５’末端側に消化済みにする。
【００４６】
次にプローブ本体となる直鎖核酸の３’末端側にも、３’端末側にチオール基を有した１０ｍｅｒ程度の二本鎖オリゴマーと同じ消化酵素の認識消化サイトを作製し消化する。具体的な方法としては、ＰＣＲでプローブ本体を作製する場合は予めプライマーにそのような配列を作り込んでおけばよい。また、プラスミドでクローニングする場合はマルチクローニングサイト（以下、ＭＣＳ）の認識部分をうまく利用すればよい。
【００４７】
このようにして両者の５’及び３’末端側を同じ制限酵素で消化済みにした上でライゲートすれば上記目的は達せられる。
【００４８】
上記方法にて、３’端末側にチオール基を有した二本鎖核酸が作製される。これを一本鎖にするには、温度を高めてディネーチャーすればいいわけだが、ディネーチャー及び空孔底部への接合は、後述する素子作製方法の中で記述する。
【００４９】
この時、チオール基が無い側に上記と同様に、ＤＮＡ合成機を用いて３’端末側にチオール基を有した一本鎖オリゴマーを二本鎖にしたものをライゲートしてもよい。このようにすればプローブの元になる二本鎖核酸の作製工程は長くなるが、二本鎖のどちらの３’端末側にもチオール基を有した二本鎖核酸が得られるので、後述するプローブ導入工程（ｄ）で無駄になる一本鎖核酸が無くすことができ、使用する核酸量を半分にできる上、作製時間を短くすることができる。
【００５０】
次に図２を用いて、素子作製方法の各工程について更に詳しく説明する。
【００５１】
（ａ）基板準備
ここで基板１０２の材質は、目的の空孔を作製するプロセスに耐えうるものであれば、どのようなものでも良好に用いることができる。例えば、金属、シリコンウエハ又はガラス等が好ましく用いられる。また、基板の形状としては平滑な板状のものに限らず、曲面を有するもの、表面にある程度の凹凸や段差を有するもの等が挙げられるが、上部に作製される空孔に不都合がなければ、特に限定されるものではない。
【００５２】
次に、基板が導電性素材でない場合は、基板表面に導電性素材薄膜を作製する。導電性素材は特に限定されないが後述する空孔作製時のエッチングや酸化処理に耐える素材であればよく、金、白金、銀、銅やタングステン等が好適に用いられる。最後に、素子の電極となる部分にマスクをする。
【００５３】
（ｂ）第一の成分と第二の成分の混合薄膜領域作製
次に、金、白金、銀、銅のいずれか又は表面に金、白金、銀、銅のいずれか薄膜を作製した基板上に第一の成分と第二の成分の混合薄膜を形成する。ここでいう混合薄膜とは第一の成分が微細な柱状の形態となって第二の成分のマトリクス中に分散されている材料を示す。このような構造体は、互いに共晶系にある物質において形成されることが本発明者らの研究で明らかになっている。
【００５４】
共晶関係にある複数の成分は特に限定されないが、複数の成分のうち第一の成分をアルミニウム、第二の成分をシリコン、ゲルマニウム又はシリコンゲルマニウム混合物にした場合、本発明に好ましく用いることのできる混合薄膜領域が形成されることがわかっている。
【００５５】
上記第一の成分と第二の成分から目的にあった混合薄膜を形成するには、両者を非平衡状態にすればよい。これは、このような非平衡状態で物質を形成する成膜法で作製された共晶関係の二成分の混合薄膜１０７は、両者が準安定状態の共晶型組織となり、第一の成分が数ｎｍレベル程度の径を持った第一の成分の柱状物質１０９を形成しその周りを第二の成分の成分領域１０８が取り囲むように自己組織的に分離するからである。
【００５６】
両者を非平衡状態にする代表的な方法としてスパッタリング法がある。原料としての第一、第二の成分は、例えば、スパッタ装置の第一の成分のターゲット上に第二の成分のチップを配することで達成される。第二の成分のチップは、複数に分けて配置しても一つでもよい。但し、均一な第一の成分を含む空孔を第二の成分領域内に均一に分散させるには、基板に対称（例えば同心円上）に配置しておくのがよい。また、所定量の第一の成分と第二の成分との粉末を焼成して作製した混合焼成物を構造体作製のターゲット材として用いることもできる。また、第一の成分と第二の成分のターゲットを別々に用意し、同時に両方のターゲットをスパッタリングする方法を用いてもよい。
【００５７】
形成される膜中の第二の成分の量は、例えば第一の成分がアルミニウムで第二の成分がシリコン又はゲルマニウムの場合、第一、第二両者の全量に対して２０〜７０ａｔｏｍｉｃ％が好ましく、より好ましくは２５〜６５ａｔｏｍｉｃ％、更に好ましくは３０〜６０ａｔｏｍｉｃ％である。シリコン又はゲルマニウム量がかかる範囲内であれば、シリコン又はゲルマニウム領域内にアルミニウムの空孔が分散したアルミニウムシリコン又はアルミニウムゲルマニウム混合薄膜領域が得られる。
【００５８】
本発明において、アルミニウムの割合等を示すａｔｏｍｉｃ％とは、例えば、シリコンとアルミニウム等の単原子の原子の数の割合を示し、ａｔｏｍ％あるいはａｔ％とも記載され、例えば誘導結合型プラズマ発光分析法でアルミニウムシリコン混合膜中のシリコンとアルミニウムの量を定量分析した時の値である。
【００５９】
また、基板温度としては、２００℃以下が好ましく、室温〜１５０℃の範囲が特に好ましい。
【００６０】
第一の成分をアルミニウム、第二の成分をシリコン、ゲルマニウム又はシリコンゲルマニウム混合物とした場合、このような方法で第一、第二の成分の混合薄膜領域を形成すると、アルミニウムとシリコン又はゲルマニウムが準安定状態の共晶型組織となり、アルミニウムがシリコン又はゲルマニウムマトリックス中に数ｎｍのスケールで分離した構造となる。その時のアルミニウムはほぼ円柱状形状であり、その直径は０．５〜１５ｎｍであり、間隔は３〜１５ｎｍである。ただ前述したように、二重螺旋構造をとった核酸の直径がおよそ２ｎｍであるため、作製されるアルミニウムの柱状構造の直径も２ｎｍ以上になるようにする必要がある。
【００６１】
アルミニウムシリコン、アルミニウムゲルマニウム又はアルミニウムシリコンゲルマニウム混合薄膜領域のシリコン、ゲルマニウム又はシリコンゲルマニウムの量は、例えばアルミニウムターゲット上に置くシリコン、ゲルマニウムチップの量を変えることで制御できる。非平衡状態で成膜を行う場合、特にスパッタリング法の場合は、アルゴンガスを流した時の反応装置内の圧力は、０．２〜１Ｐａ程度が好ましく、プラズマを形成するための出力は４インチターゲットの場合は１５０〜１０００Ｗ程度が好ましい。これらの条件は、形成する材料の構造に対して最適になるように設定される。
【００６２】
非平衡状態で物質を形成する成膜法は、スパッタリング法が好ましいが抵抗加熱蒸着、電子ビーム蒸着（ＥＢ蒸着）をはじめとする任意の非平衡状態で物質を形成する成膜法が適用可能である。
【００６３】
上記の様にして成膜された第一の成分と第二の成分の混合薄膜１０７は、第一の成分を主成分とする柱状物質１０９と、その周囲の第二の成分を主成分とする領域１０８を備える。
【００６４】
柱状物質１０９の組成は、第一の成分を主成分とするが、柱状の微細構造体が得られていれば、酸素、アルゴン、窒素等の他の元素を含有していてもよい。なお、主成分とは、空孔部の成分構成比において第一の成分の割合が８０ａｔｏｍｉｃ％以上、好ましくは９０ａｔｏｍｉｃ％以上をいう。
【００６５】
また、第一の成分の柱状構造の周囲を取り囲んでいる第二の成分の領域１０８の組成は、柱状の微細構造体が得られていれば、酸素、アルゴン、窒素、水素等の各種の元素を含有してもよい。なお、主成分とは、第二の成分の領域の成分構成比においてシリコンの割合が８０ａｔｏｍｉｃ％以上、好ましくは９０ａｔｏｍｉｃ％以上をいう。
【００６６】
（ｃ）空孔形成
上記の混合薄膜領域薄膜から第一の成分の柱状物質１０９のみを選択的にエッチングにより除去する。その結果、空孔１０５を有している第二の成分領域のみが残り、第二の成分の多孔質薄膜１０８が形成される。
【００６７】
ウエットエッチングに用いる溶液は、例えば、第一の成分がアルミニウム、第二の成分がシリコンの場合、アルミニウムを溶かしシリコンをほとんど溶解しない、リン酸、硫酸、塩酸及びクロム酸溶液等の酸が挙げられるが、エッチングによる空孔形成に不都合がなければ水酸化ナトリウム等のアルカリを用いることができ、特に酸の種類やアルカリの種類には限定されるものではない。また、数種類の酸溶液やあるいは数種類のアルカリ溶液を混合したものを用いてもよい。またエッチング条件は、例えば、溶液温度、濃度、時間等は、作製するシリコン混合薄膜領域に応じて、適宜設定することができる。
【００６８】
最後に、マスクを剥離して導電性素材を露出さる。この部分は（ｃ’−２）工程及び（ｄ）工程で電極として用いられる。
【００６９】
次に記載する（ｃ’−１）工程は必須ではなく、第二の成分及び要求される検出素子の性能に応じて行う工程である。
【００７０】
（ｃ’−１）第二の成分混合薄膜領域の化学処理
多孔質薄膜を透明にして蛍光を観察し易くするために、工程（ｃ）で作製した多孔質薄膜に対して化学処理を施し、多孔体の性質を変化させる工程を行ってもよい。この場合の化学処理とは、具体的には酸化処理等を示す。
【００７１】
この工程により第二の成分多孔質膜１０８は、第二の成分の酸化物の多孔質膜１０６となる。
【００７２】
工程（ｃ）で作製された第二の成分の多孔質膜の酸化方法としては、例えば第二の成分がシリコン又はゲルマニウムの場合、含酸素雰囲気中で加熱する方法の他、含水蒸気雰囲気中での加熱、陽極酸化、酸素プラズマに晒す等の任意の酸化方法が適用可能である。ここで、シリコン酸化物領域の組成は、シリコン酸化物を主成分とするが、アルゴンや窒素等の他の各種の元素や元素の酸化物を含有してもよい。例えば第一の成分がアルミニウム、第二の成分がシリコンである場合、シリコン酸化物領域におけるシリコンの含有量は酸素を除く全ての元素に対して８０ａｔｏｍｉｃ％以上、好ましくは８５ａｔｏｍｉｃ％以上である。
【００７３】
なお、（ｃ）工程で使用する溶液が同時に第二の成分の多孔質膜を酸化する場合、一つの溶液で一度に（ｃ）工程と（ｃ’−１）工程を行ってもよい。
【００７４】
また、必要に応じて空孔形成材料表面に親水処理を施すとよい。例えば空孔形成材料がシリコンなら表面にシラノール基を導入すればよい。
【００７５】
次に記載する（ｃ’−２）工程は（ａ）工程の導電性材料が金、白金又は銀以外の場合に必須の工程である。
【００７６】
（ｃ’−２）空孔底部に金、白金、銀、銅のいずれかを設置する工程
工程（ｃ）で作製された空孔の底部は工程（ａ）の導電性素材が露出している。ここにチオール基と結合する金属の薄膜を作製する。金属薄膜作製方法は特に限定されないが、例えば電着が好適に用いられる。ここで用いられる金属は、後述するようにチオール基を有する一本鎖プローブを空孔底部に接続させるため用いられるもので、チオール基と結合するものでかつ検出用素子を核酸溶液に浸した際に腐食しないものであれば特に限定されないが、金、白金又は銀等が好適に用いられる。
【００７７】
（ｄ）一本鎖プローブ導入工程
上記の表面に空孔を有している多孔質薄膜を作製した基板を、前述した３’端末側にチオール基を有した二本鎖核酸を溶解した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に浸し、水温を上昇させてディネーチャーされ一本鎖になった核酸のチオール基が空孔底部の金、白金、銀、銅のいずれかと結合して導入は完了する。ただ、単純に浸けただけでは導入に時間がかかる上に、チオール基を持つ一本鎖が反対向きに空孔内に入る場合やチオール基を持たない相補鎖の一本鎖核酸が空孔に入る可能性もあるので、基板表面につけた導電性素材と多孔質薄膜を挟むように液中に設置した電極に正極、陰極を逆にしながら電圧を数回かければ、より確実である。
【００７８】
図３を使って詳しく説明する。まず、（ａ）は表面に空孔を有している多孔質薄膜を作製した基板を３’端末側にチオール基を有した二本鎖核酸を溶解した状態である。この図で、実線はプローブ、点線はその相補対核酸である。次に、（ｂ）のように水溶液を好ましくは８５〜９５℃、より好ましくは８８〜９２℃に加熱して、核酸をディネーチャーさせ一本鎖にする。次に、（ｃ）のように基板表面の金、白金又は銀を陽極、基板と反対側に設置した電極を隠極として数十ボルトの電圧をかけると、一本鎖核酸が基板側に移動し、一部は都合良くチオール基を頭にして空孔内に入り底部の金、白金、銀、銅のいずれかと接合するが、向きが逆のものや、相補鎖が入ってしまうもの、ちょうど多孔質薄膜に水平に張り付いて空孔に入れない物等もある。次に、（ｄ）のように電極の陽極・陰極の向きを逆にする。すると、ＤＮＡは逆に引き寄せられるため、チオール基で空孔底部の金と接合したプローブ以外は空孔内部から外に出る。その後、（ｅ）のように再び、基板の金、白金又は銀電極側を陽極にすると、核酸は再び空孔内に泳動され都合良くチオール基を頭にして空孔内に入ったものは空孔底部の金、白金又は銀に結合する。この（ｄ）と（ｅ）の操作を何度か繰り返すことで、ほぼ全ての空孔にプローブがチオール基を介して結合した状態（ｆ）になる。
【００７９】
液中の３’端末側にチオール基を有した二本鎖核酸の量だが、多孔質薄膜の作製条件及びＦＥ−ＳＥＭによる観察によって、およその空孔の数はわかるので、それと同数になるように調整するとよい。あまり少な過ぎると、導入プローブの絶対数が少なく、標的核酸がハイブリダイズして蛍光を発しても観察できない可能性がある。またあまり多過ぎると、一つの空孔に複数のプローブが入ってしまい、標的核酸が入る余地が無くなり、標的核酸が存在するにもかかわらず検出できない可能性がある。
【００８０】
（ｆ）のような状態になった後、基板を液から取り出し、基板表面に付着した可能性のある相補鎖を洗い流したのち、乾燥させればよい。
【００８１】
以上の工程を経て、表面の多孔体のナノスケールの空孔底部に一本鎖核酸のプローブを固定した標的核酸検出素子が完成する。
【００８２】
なお、図１（ａ）では、電極の部分を除いて基板全面が多孔質膜である例を図示したが、図４（ａ）、（ｂ）のように、多孔質上に流路を作製し核酸を含む水溶液がその上を通るような構造にしてもよい。このような構造にすると、温度コントロールをしながらサンプルを流路に流すだけで標的核酸の有無を検出することも可能となる。
【００８３】
また図示しないが、予め一本鎖にした複数種類のプローブをインクジェット法等で多孔質薄膜上にドットマトリクス状に打ち込むことで、一度の多数の標的核酸の有無を調べることが可能なプローブアレイを検出素子上に作製することも可能である。この場合、全ての空孔に確実にプローブが入るわけではないので、事前にどの程度の割合でプローブが入るかを確認しておくとよい。
【００８４】
次に、上記工程を経て作製した標的核酸検出素子を用いた、標的核酸の検出方法及び検出装置を説明する。
【００８５】
まず、図５の側面図ように標的核酸検出素子２００を容積約４ｍＬの検出装置の容器２０１に設置し、測定する核酸を溶解した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液で容器を満たした。この容器は、インターカレーターを励起する励起光及び発する蛍光が可視光の場合は普通のガラス又はその他透明な素材でよいが、励起光又は蛍光のどちらかがＵＶの場合には、標的核酸検出素子２００と反対の面のみＵＶを透過する石英ガラス又は紫外線不透過剤を添加していない透明アクリル等で作製する必要がある。
【００８６】
次に容器の蓋を閉め内部を密封し、温度センサの付きの加温手段２０２で溶液温度を好ましくは８５〜９５℃、より好ましくは８８〜９２℃に加熱して二本鎖の標的核酸をディネーチャーして一本鎖状態にした。この後、温度センサの付きの冷却手段２０３で標的核酸検出素子２００の温度を好ましくは６０℃以下、より好ましくは５５℃以下にし、約１０分間静置する。この時の温度は高いほどハイブリダイズし難くなるので、予め標的核酸や標的核酸と似た配列の核酸をいくつか測定して決めればよい。温度センサの付きの加温手段２０２及び温度センサの付きの冷却手段２０３は、温度制御装置２０４にて連動して制御されている。
【００８７】
この一連の操作で、サンプルの核酸が標的核酸ならば、一本鎖になった核酸のうち、プローブと相補鎖のものが空孔内でプローブと結合して二重螺旋構造を形成する。
【００８８】
この後、容器２０１内の溶液を洗い流して液中及び標的核酸検出素子２００の表面に付着した核酸を除去した後、インターカレーターが溶解した水溶液に検出素子を浸して数分間静置し、インターカレーター固有の励起光を当てて表面を観察する。サンプルの核酸が標的核酸である場合は、空孔内でプローブと標的核酸が二重螺旋構造を形成しているので、蛍光が観察される。
【００８９】
ここで用いられるインターカレーターは特に限定されない。ＥＢ、２−メチル−４、６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩又はＹＯＹＯ１等が広く用いられている。
【００９０】
この蛍光を容器の透明な面に密着させた蛍光検出手段２０６で検出する。蛍光検出手段としては、励起光を透過しないフィルタを取り付けたフォトダイオードアレイ等の二次元受光装置等がよい。この蛍光検出手段２０６の信号を、ＡＤコンバーターを内蔵したパソコン２０７に入力する。このパソコンは、全ての検出素子の出力電圧が一定以上なら、測定した核酸は標的核酸であると判断させるプログラムが走っており、標的核酸かどうかを判定させる。
【００９１】
以上、本発明の要旨を再度述べると、
本発明は、互いに共晶関係にある複数の成分からなる微細な構造を有する混合薄膜から一方の成分を除去して得られる多孔体薄膜の空孔内に一本鎖核酸をプローブとして導入し、容易に長鎖の標的核酸の検出素子を作製し得たものである。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例により本発明を詳述するが、これらは本発明をなんら限定するものではない。
【００９３】
まず本実験で用いる標的核酸として、クローニング用ベクターとして一般的に用いられる約３０００ｂｐの長さの環状のプラスミドｐＵＣ１８（東洋紡社製）のＭＣＳから７塩基を切除した直鎖核酸を用いることにした。
【００９４】
それに従い、全実施例に共通に用いる５’末端側にチオール基を導入した長鎖の一本鎖核酸プローブＡ、前記プローブで検出されるべき標的核酸Ｂ、標的核酸Ｂと一部配列の違う偽標的核酸Ｃ及びＤの作製方法を記述する。
【００９５】
（一本鎖プローブＡの元になる二本鎖核酸Ａ’の作製）
ＤＮＡ自動合成機（ＡＢＩ社製、３８１Ａ）を用いて配列番号１の一本鎖核酸を合成した。なお配列番号１の一本鎖核酸末端には核酸自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ：Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いることによってチオール基を導入した。続いて通常の脱保護を行い核酸を回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の操作に用いた。
・配列番号１：５’ＨＳ−（ＣＨ2）6−Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−ＡＣＴＧＣＡＧＧＴＣ３’
【００９６】
また、ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号２の一本鎖核酸も合成した。こちらは特に末端に修飾基を導入せず作製し、通常の脱保護を行い核酸を回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の操作に用いた。
・配列番号２：５’ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴ３’
【００９７】
配列番号１の核酸部分と配列番号２の核酸は祖補対の関係で、両者を等モルづつ１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）水溶液（ｐＨ８．３）に添加して室温にてゆっくり撹拌してハイブリダイズさせた後、この水溶液をエタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、一端にチオール基を持つ二重螺旋構造の乾燥した核酸Ａ１を作製した。なお、この二本鎖核酸は消化酵素ＰｓｔＩによる認識消化サイトを有する。
【００９８】
次に、核酸Ａ１を消化酵素添付のＨ−Ｂｕｆｆｅｒに添加し、消化酵素ＰｓｔＩを添加し、水溶液を３７℃に加温して約１時間静置した後、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、更にエタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、５’末端側にチオール基を持ち、３’末端側にＰｓｔＩ消化済みサイトを持つ乾燥した核酸Ａ２を作製した。
【００９９】
次に、ｐＵＣ１８を消化酵素添付のＨ−Ｂｕｆｆｅｒに添加し、消化酵素ＳｐｈＩとＰｓｔＩを添加し、水溶液を３７℃に加温して約１時間静置した後、アガロースゲルに電気泳動して約３０００塩基対の長さのＤＮＡのみを回収し、エタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、ＳｐｈＩ消化済みサイトとＰｓｔＩ消化済みサイトを持つ直鎖のｐＵＣ１８’を作製した。
【０１００】
最後に、核酸Ａ２粉末及びｐＵＣ１８’粉末を等モルづつライゲーションハイ（東洋紡社製：Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ及び反応バッファーを主体としたライゲーションキット）の溶液に溶解し、１６℃で１時間静置し、両者のＰｓｔＩサイトを接合した。これをフェノール処理して酵素を失活させた後、エタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、５’末端側にチオール基が付き、３’末端側がＳｐｈＩ消化済みサイトになっている二本鎖核酸Ａ’を得た。
【０１０１】
一本鎖プローブＡは、各実施例で述べるように、二本鎖核酸Ａ’を９０℃の水温中でディネーチャーして得る。
【０１０２】
（標的核酸Ｂの作製）
上記ｐＵＣ１８’の作製方法と同様の作業を行い、標的核酸Ｂを得た。
【０１０３】
（偽標的核酸Ｃの作製）
ＤＮＡ自動合成機用いて配列番号３の一本鎖核酸及び配列番号３の核酸と相補対の配列の核酸（配列番号４、配列は示さず）を合成した。通常の脱保護を行い核酸を回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の操作に用いた。
・配列番号３：５’ＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ３’
【０１０４】
配列番号３の核酸と配列番号４の核酸を等モルづつ１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液（ｐＨ８．３）に添加して室温にてゆっくり撹拌してハイブリダイズさせた後、この水溶液をエタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、乾燥した核酸Ｃ１を作製した。なお、この二本鎖核酸の３’末端側は消化酵素ＢａｍＨＩによる認識消化サイト、５’末端側は消化酵素ＥｃｏＲＩによる認識消化サイトである。
【０１０５】
次に、核酸Ｃ１を消化酵素添付のＨ−Ｂｕｆｆｅｒに添加し、消化酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩを添加し、水溶液を３７℃に加温して約１時間静置した後、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、更にエタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、３’末端側に消化酵素ＢａｍＨＩによる認識消化サイト、５’末端側に消化酵素ＥｃｏＲＩによる認識消化サイトを持つ乾燥した核酸Ｃ２を作製した。
【０１０６】
次に、ｐＵＣ１８を消化酵素添付のＨ−Ｂｕｆｆｅｒに添加し、消化酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩを添加し、水溶液を３７℃に加温して約１時間静置した後、アガロースゲルに電気泳動して約３０００塩基対の長さのＤＮＡのみを回収し、エタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、ＢａｍＨＩによる認識消化サイト、５’末端側消化酵素ＥｃｏＲＩによる認識消化サイトを持つ直鎖のｐＵＣ１８’’を作製した。
【０１０７】
最後に、核酸Ｃ２粉末及びｐＵＣ１８’’粉末を等モルづつライゲーションハイの溶液に溶解し、１６℃で１時間静置し、両者のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを接合した。これをフェノール処理して酵素を失活させた後、エタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、一本鎖になった場合に二次元構造をとってプローブＡにハイブリダイズし易い偽標的核酸Ｃを得た。
【０１０８】
この配列番号３の１２塩基目〜１４塩基目までは、本来のＭＣＳにＡＡＡの３塩基を挿入しており、プローブ核酸とハイブリダイズして図５（ａ）又は（ａ’）の模式図のような二重螺旋構造をとる可能性が高い。
【０１０９】
（偽標的核酸Ｄの作製）
ＤＮＡ自動合成機用いて配列番号５の一本鎖核酸及び配列番号４の核酸と相補対の配列の核酸（配列番号６、配列は示さず）を合成した。通常の脱保護を行い核酸を回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の操作に用いた。
・配列番号５：５’ＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ３’
【０１１０】
配列番号５の核酸と配列番号６の核酸を等モルづつ１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液（ｐＨ８．３）に添加して室温にてゆっくり撹拌してハイブリダイズさせた後、この水溶液をエタノール沈殿処理して、遠心沈殿して上澄み水を除去し乾燥させて、乾燥した核酸Ｄ１を作製した。なお、この二本鎖核酸の３’末端側は消化酵素ＢａｍＨＩによる認識消化サイト、５’末端側消化酵素ＥｃｏＲＩによる認識消化サイトである。
【０１１１】
次に、偽標的核酸Ｃと同様の方法で、Ｄ１をｐＵＣ１８’’にライゲートして一本鎖になった場合に二次元構造をとってプローブＡにハイブリダイズし易い偽標的核酸Ｄを得た。
【０１１２】
この配列番号５の１２塩基目〜３２塩基目までは、タンパク質をコードする情報の終結シグナルの部分で生物のＤＮＡの中には非常に良く見られる配列に近いものである。この終結シグナルの部分のＲＮＡは図５（ｂ）のような二次元構造をとり、タンパク質合成酵素の動きを止めるといわれている。このＲＮＡとＵ（ウラシル）がＴ（チミン）が違う以外は全く分子内水素結合をする部分が同じ配列の配列番号３の核酸も、室温付近で一本鎖状態の時は同様の二次構造をとり、図５（ｃ）のようにプローブとハイブリダイズする可能性が高い。
【０１１３】
なお、二重螺旋構造を形成した長さはおよそ３．４ｎｍ／１０塩基といわれており、本実施例で用いるプローブＡと標的核酸Ｂがハイブリダイズして二重螺旋構造を形成した場合は、約１０００ｎｍである、と考えられる。
【０１１４】
＜実施例１＞
本実施例は、基板上に多孔質シリコン酸化物薄膜を作製し、その空孔中にプローブＤＮＡを導入して作製した図１（ａ）に示した模式図のような標的核酸検出用素子を用い、インターカレーターとしてＥＢを用い、図５に示した側面図のような標的核酸検出装置を用いて標的核酸を検出した例である。
【０１１５】
なお、図１の（ｂ）は素子の一部をナノサイズで描いた模式図である。
【０１１６】
（基板の準備）
まず、一辺の長さが２ｃｍ厚さが１ｍｍのシリコン基板を用意し、マグネトロンスパッタリング法によって銀を２０ｎｍ積層した。
【０１１７】
（多孔質シリコン酸化物薄膜の作製）
次に、このシリコン基板上の一辺に幅１ｍｍのマスクをした上で、マグネトロンスパッタリング法を用いて、１０００ｎｍの膜厚のアルミニウムとシリコンの混合膜を作製した。ターゲットには、直径が４インチ（１０１．６ｍｍ）の円形のアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のシリコンチップを６枚おいたものを用いた。スパッタ条件は、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：３００Ｗとした。また、基板温度は室温（２５℃）とした。
【０１１８】
ＦＥ−ＳＥＭ（電界放出走査型電子顕微鏡）にて、アルミニウムシリコン混合膜の上部及び断面を観察したところ、シリコン領域に囲まれた円形のアルミニウム柱状構造体が二次元的に配列していた。また、アルミニウム柱状構造体の孔径は６ｎｍであり、その平均中心間間隔は８ｎｍであった。また、長さは１０００ｎｍであり、それぞれのアルミニウム柱状構造体部分はシリコン領域により互いに分離されていた。
【０１１９】
また、誘導結合型プラズマ発光分析法（ＩＣＰ法）により、本実施例で作製したアルミニウムシリコン混合膜中の元素組成の分析を行った。なお、この分析用に用いたのはカーボン基板上に作製した膜である。その結果、シリコンのアルミニウムとシリコンの全量に対する分量は３７ａｔｏｍｉｃ％と求められた。以上のようにして、微細な柱状のアルミニウムを６３ａｔｏｍｉｃ％含むアルミニウムシリコン混合膜の形成が確認された。この混合膜をＸ線回折分析で評価した。その結果、シリコンの回折ピークは認められず、シリコンは非晶質であることがわかった。一方、アルミニウムに関しては複数の回折線が見られ、アルミニウムは結晶性であることが示された。
【０１２０】
このようなシリコンをアルミニウムとシリコンの全量に対して３７ａｔｏｍｉｃ％含んだアルミニウムシリコン混合膜をリン酸５質量％中に２４時間浸し、アルミニウム柱状構造体部分のみを選択的にエッチングして空孔を形成した、同時にシリコンをシリコン酸化物にした。この結果、ナノスケールの空孔が膜面に垂直に形成された多孔質シリコン酸化物の膜が形成された。広域電子エネルギー損失構造解析（ＥＥＬＳ）により、シリコン酸化物が形成されたことが確認された。
【０１２１】
ＦＥ−ＳＥＭにて、酸化後の膜を観察した。基板真上方向から見た表面の形状はシリコン酸化物に囲まれた空孔が二次元的に配列していた。空孔部の孔径は５ｎｍであり、その平均間隔は約８ｎｍであった。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察したところ、深さ１０００ｎｍであり、それぞれの空孔部分はシリコン酸化物領域により隔たれており互いに独立していた。
【０１２２】
また、シリコン酸化物領域中のシリコンの含有量は、ＩＣＰ法によって酸素を除く全ての原子に対して約９０ａｔｏｍｉｃ％と求められた。
【０１２３】
最後に、マスクを剥離した。この結果、基板上に幅１ｍｍの銀電極を持ち、２０ｍｍ幅１９ｍｍの領域に約６×１０12（２．５＊１０6×２．４＊１０6）個の空孔が存在する多孔質シリコン酸化物薄膜が作製された。
【０１２４】
（一本鎖プローブＡの導入）
表面に多孔質シリコン薄膜を作製した基板を、内径が高さ２０ｍｍ、幅２０ｍｍ奥行き２ｍｍで２０ｍｍ四方の白金電極が付き、内部温度を２０〜９５℃の範囲で調整できる反応容器に、この多孔質シリコン酸化物薄膜を作り込んだ基板を多孔質シリコン酸化物薄膜と反対側の白金電極の間に約１ｍｍの隙間ができるように設置した。この時、基板の銀電極が上になるように入れた。
【０１２５】
予め作製しておいた５’末端側にチオール基が付いた二本鎖核酸Ａ’を総量が１×１０-11ｍｏｌになるように溶解した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液約０．４ｍＬを容器に入れ基板を浸した。この時、基板上部の銀電極が水溶液につからないようにした。
【０１２６】
次に基板上の銀電極と容器の白金電極に電線を接続して容器の蓋を閉め内部を密封し、内部温度を９０℃にして二本鎖ＤＮＡをディネーチャーして一本鎖状態にした。この後、基板上の金電極を正極、容器の白金電極を陰極として約２０Ｖの電圧を１分間、一本鎖のプローブＡを空孔内に泳動した。その後１分間休止後、電極の正負を逆にして更に１分間電圧をかけその後１分間休止した。この操作を１０回繰り返した。この操作により、５’末端側にチオール基が付いた一本鎖プローブＡが多孔質シリコン酸化物薄膜底部の銀に結合させた。
【０１２７】
最後に、この基板を容器内溶液温度が９０℃のまま取り出し、やはり９０℃の１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸し、多孔膜表面の核酸を完全に洗い落とした。核酸が溶解していない別の９０℃リン酸緩衝液に基板を移し、自然に室温まで温度を下げた後、エタノールで洗浄し、窒素雰囲気で乾燥させた。
【０１２８】
この一連の方法で、表面に銀を蒸着した基板上に多孔質シリコン酸化物薄膜を作製し、その空孔底部の銀に一本鎖プローブＡが結合した、標的核酸検出素子を完成させた。
【０１２９】
（標的核酸Ｂを検出できることを確認）
次に上記方法で作製した標的核酸検出素子を用い、予め作製しておいた標的核酸Ｂの検出を試みた。
【０１３０】
図５のように標的核酸検出素子２００を容積約４ｍＬの検出装置の容器２０１に設置し、標的核酸Ｂを総量が１×１０-11ｍｏｌ、になるように溶解した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液で容器を満たした。この容器は、標的核酸検出素子２００と反対の面のみＵＶを透過する石英ガラスでできている。
【０１３１】
次に容器の蓋を閉め内部を密封し、温度センサの付きの加温手段２０２で溶液温度を９０℃にして二本鎖の標的核酸をディネーチャーして一本鎖状態にした。この後、温度センサの付きの冷却手段２０３で標的核酸検出素子２００の温度を５５℃に下げて、約１０分間静置した。温度センサ付きの加温手段２０２及び温度センサ付きの冷却手段２０３は、温度制御装置２０４にて連動して制御されている。
【０１３２】
最後に容器内溶液を取り除き、再度１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で多孔膜表面の核酸を完全に洗い落とした。その後、１μＭになるようにＥＢ（シグマアルドリッチ社製）を溶解した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に１０分間浸した。
【０１３３】
この基板を水溶液に浸したまま、石英ガラスを通してＵＶランプを当てたところ、素子全体がオレンジ色の蛍光を発した。この蛍光を４００ｎｍ以下の光を通さないローパスフィルタ付きのフォトダイオードアレイを用いた蛍光検出装置２０６で検出し、その出力をＡＤコンバーターを内蔵したパソコン２０７に入力した。このパソコン２０７には全ての検出素子の出力電圧が一定以上だと、測定した核酸が標的核酸であると判定するプログラムが走っている。パソコン２０７は測定した核酸が標的核酸であると判定した。
【０１３４】
また念のため、この基板を水溶液から取り出し、蒸留水で洗浄後、窒素雰囲気で乾燥させ、落射型蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＭＴ２、対物レンズは１０倍、接眼レンズは５倍）にＧ励起フィルタをセットして観察したところ、やはり全体が一様に蛍光を発していることが確認された。
【０１３５】
これらの結果から、多孔質シリコン酸化物薄膜の空孔内にほぼ均一に一本鎖プローブＡが入り、Ａと相補対の関係にある標的核酸Ｂの一本鎖になったものが空孔内でＡとハイブリダイズし、二重螺旋構造を形成し蛍光を発していることが確かめられた。
【０１３６】
（偽標的核酸Ｃを誤検出しないことを確認）
核酸をＢからＣに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１３７】
この基板にＵＶランプを当てたところ、素子はほとんど蛍光を発さず、パソコン２０７は測定した核酸が標的核酸ではないと判定した。また、顕微鏡で観察しても蛍光は観察されなかった。
【０１３８】
これらの結果から、空孔内の一本鎖プローブＡが一本鎖のままであり、偽標的核酸Ｃは検出されないことが確かめられた。
【０１３９】
（偽標的核酸Ｂを誤検出しないことを確認）
核酸をＢからＤに変得た以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１４０】
この基板にＵＶランプを当てたところ、素子はほとんど蛍光を発さず、パソコン２０７は測定した核酸が標的核酸ではないと判定した。また、顕微鏡で観察しても蛍光は観察されなかった。
【０１４１】
これらの結果から、空孔内の一本鎖プローブＡが一本鎖のままであり、偽標的核酸Ｄは検出されないことが確かめられた。
【０１４２】
以上の結果より、銀薄膜の上に作製した多孔質シリコン酸化物薄膜を用い、空孔底部にチオール基を付けた一本鎖プローブを付けて作製し標的核酸検出素子は、プローブと同じ配列を持つ核酸のみを検出し、一部が異なる核酸や一本鎖になった場合に一部が二次元構造を作りプローブにハイブリダイズし易い核酸を誤検出しないことが確認できた。
【０１４３】
＜比較例１＞
実施例１と異なりシリコン基板表面に多孔質シリコン酸化物薄膜を作製せず、ただ金をスパッタリングしただけの基板を用意し、実施例１と同様に銀の表面に一本鎖プローブＡを導入した標的核酸検出素子を作製した。
【０１４４】
（標的核酸Ｂを測定）
この標的核酸検出素子を実施例１と同様に図５の検出装置に設置し標的核酸Ｂを溶解した液の入った容器に入れ、実施例１と同様の操作を行った。
【０１４５】
この基板にＵＶランプを当てたところ、素子全体がオレンジ色の蛍光を発した。パソコンは標的核酸であるとの判定をした。また顕微鏡観察でも銀薄膜表面にほぼ均一に一本鎖プローブＡが付着し、Ａと相補対の関係にある標的核酸Ｂの一本鎖になったものがＡとハイブリダイズし、二重螺旋構造を形成していることが確かめられた。
【０１４６】
（偽標的核酸Ｃを測定）
核酸をＢからＣに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１４７】
この基板にＵＶランプを当てたところ、素子全体がオレンジ色の蛍光を発した。パソコンは標的核酸であるとの判定をした。また顕微鏡観察でも銀薄膜表面にほぼ均一に一本鎖プローブＡが付着し、Ａと相補対の関係にある標的核酸Ｂの一本鎖になったものがＡとハイブリダイズし、二重螺旋構造を形成していることが確かめられた。
【０１４８】
（偽標的核酸Ｂを測定）
核酸をＢからＤに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１４９】
この基板にＵＶランプを当てたところ、素子全体がオレンジ色の蛍光を発した。パソコンは標的核酸であるとの判定をした。また顕微鏡観察でも銀薄膜表面にほぼ均一に一本鎖プローブＡが付着し、Ａと相補対の関係にある標的核酸Ｂの一本鎖になったものがＡとハイブリダイズし、二重螺旋構造を形成していることが確かめられた。
【０１５０】
以上の結果より、銀薄膜の上にプローブを付けて作製した標的核酸検出素子は、プローブと同じ配列を持つ核酸以外にも、一部が異なる核酸や一本鎖になった場合に一部が二次元構造を作りプローブにハイブリダイズし易い核酸を誤検出することが確認できた。
【０１５１】
＜実施例２＞
本実施例は、基板上に多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜を作製し、その空孔中にプローブＤＮＡを導入して作製した図１に示した模式図のような標的核酸検出用素子を用い、インターカレーターとしてＰ２を用い、標的核酸を検出した例である。
【０１５２】
（基板の準備）
まず、一辺の長さが２ｃｍ厚さが１ｍｍのシリコン基板を用意し、マグネトロンスパッタリング法によってタングステンを２０ｎｍ積層した。
【０１５３】
（多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜の作製）
次に、このゲルマニウム基板上の一辺に幅１ｍｍのマスクをした上で、マグネトロンスパッタリング法を用いて、１０００ｎｍの膜厚のアルミニウムとゲルマニウムの混合膜を作製した。ターゲットには、直径が４インチ（１０１．６ｍｍ）の円形のアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のゲルマニウムチップを４枚おいたものを用いた。スパッタ条件は、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：３００Ｗとした。また、基板温度は室温（２５℃）とした。
【０１５４】
ＦＥ−ＳＥＭ（電界放出走査型電子顕微鏡）にて、アルミニウムゲルマニウム混合膜の上部及び断面を観察したところ、ゲルマニウム領域に囲まれた円形のアルミニウム柱状構造体が二次元的に配列していた。また、アルミニウム柱状構造体の孔径は６ｎｍであり、その平均中心間間隔は８ｎｍであった。また、長さは１０００ｎｍであり、それぞれのアルミニウム柱状構造体部分はゲルマニウム領域により互いに分離されていた。
【０１５５】
また、誘導結合型プラズマ発光分析法（ＩＣＰ法）により、本実施例で作製したアルミニウムゲルマニウム混合膜中の元素組成の分析を行った。その結果、ゲルマニウムのアルミニウムとゲルマニウムの全量に対する分量は３７ａｔｏｍｉｃ％と求められた。以上のようにして、微細な柱状のアルミニウムを６３ａｔｏｍｉｃ％含むアルミニウムゲルマニウム混合膜の形成が確認された。この混合膜をＸ線回折分析で評価した。その結果、ゲルマニウムの回折ピークは認められず、ゲルマニウムは非晶質であることがわかった。一方、アルミニウムに関しては複数の回折線が見られ、アルミニウムは結晶性であることが示された。
【０１５６】
このようなゲルマニウムをアルミニウムとゲルマニウムの全量に対して３７ａｔｏｍｉｃ％含んだアルミニウムゲルマニウム混合膜をリン酸５質量％中に２４時間浸し、アルミニウム柱状構造体部分のみを選択的にエッチングして空孔を形成し、同時にゲルマニウムをゲルマニウム酸化物にした。この結果、ナノスケールの空孔が膜面に垂直に形成された多孔質ゲルマニウム酸化物の膜が形成された。ゲルマニウム酸化物の形成は、広域電子エネルギー損失構造解析（ＥＥＬＳ）により確認された。
【０１５７】
ＦＥ−ＳＥＭにて、酸化後の膜を観察した。基板真上方向から見た表面の形状はゲルマニウム酸化物に囲まれた空孔が二次元的に配列していた。空孔部の孔径は６ｎｍであり、その平均間隔は約８ｎｍであった。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察したところ、空孔の深さは１０００ｎｍであり、それぞれの空孔部分はゲルマニウム酸化物領域により隔たれており互いに独立していた。
【０１５８】
また、ゲルマニウム酸化物領域中のゲルマニウムの含有量は、ＩＣＰ法によって酸素を除く全ての原子に対して約９０ａｔｏｍｉｃ％と求められた。
【０１５９】
最後に、マスクを剥離した。この結果、基板上に幅１ｍｍのタングステン電極を持ち、２０ｍｍ幅１９ｍｍの領域に約６×１０12（２．５＊１０6×２．４＊１０6）個の空孔が存在する多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜が作製された。
【０１６０】
（空孔底部への金の電着）
このように作製された多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜の空孔の底部に下地のタングステンを電極として電着を行い金粒子を付けた。電着は、市販の電気メッキ液（高純度化学研究所製金用電気メッキ液、商品コードＫ−２４Ｅ）を用い、４０℃に保持した酸性浴（ｐＨ＝４．５）中において、０．５Ａ／ｄｍ2の電流密度で行った。
【０１６１】
（一本鎖プローブＡの導入）
この、表面に多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜を作製し空孔底部に金粒子を電着した基板に、実施例１と同様の方法で一本鎖プローブＡを導入し、標的核酸検出素子を作製した。
【０１６２】
（標的核酸Ｂを検出できることを確認）
この標的核酸検出素子を標的核酸Ｂを溶解した液の入った図５の装置の容器２０１に入れ実施例１と同様の操作を行った。最後にＥＢの代わりに代表的な２−メチル−４、６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩の一種であるＰ２（本発明者らが合成）を最終濃度が１μＭになるように溶解した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に１０分間間浸した。
【０１６３】
この基板を水溶液から取り出し、蒸留水で洗浄後、窒素雰囲気で乾燥させ、落射型蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＭＴ２、対物レンズは１０倍、接眼レンズは５倍）に特注のフィルタ（朝日分光社製、励起波長５８０ｎｍ、蛍光波長５４０ｎｍ）をセットして観察したところ、やはり全体が一様に蛍光を発していることが確認された。このことから、多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜の空孔内にほぼ均一に一本鎖プローブＡが入り、Ａと相補対の関係にある標的核酸Ｂの一本鎖になったものが空孔内でＡとハイブリッドし、二重螺旋構造を形成していることが確かめられた。
【０１６４】
（偽標的核酸Ｃを誤検出しないことを確認）
核酸をＢからＣに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１６５】
この基板を蛍光顕微鏡で観察したが蛍光を発している部分は確認されず、一本鎖プローブＡと偽標的核酸Ｃとはハイブリダイズしていないことが確かめられた。
【０１６６】
（偽標的核酸Ｄを誤検出しないことを確認）
核酸をＢからＤに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１６７】
この基板を蛍光顕微鏡で観察したが蛍光を発している部分は確認されず、一本鎖プローブＡと偽標的核酸Ｄとはハイブリダイズしていないことが確かめられた。
【０１６８】
以上の結果より、多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜を用い、金をメッキした空孔底部にチオール基を付けた一本鎖プローブを付けて作製し標的核酸検出素子は、プローブと同じ配列を持つ核酸のみを検出し、一部が異なる核酸や一本鎖になった場合に一部が二次元構造を作りプローブにハイブリダイズし易い核酸を誤検出しないことが確認できた。
【０１６９】
＜実施例３＞
本実施例は、基板上に多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜を作製し、その空孔中に金の代わりに銅の薄膜を作製した以外は実施例２と同様の例である。
【０１７０】
実施例２と同様にシリコン基板上にタングステン薄膜を設け多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜を作製した基板を電着にて銅薄膜を付けた。電着には、市販の電気メッキ液（高純度化学研究所製銅用電気メッキ液、商品コードＣ−１００ＥＰ）を用い、５５℃に保持したピロリン酸銅浴（ｐＨ＝４．５）中において、２．０Ａ／ｄｍ2の電流密度で行った。この後、実施例１と同様に空孔底部に一本鎖プローブＡを導入し、標的核酸検出素子を作製した。
【０１７１】
（標的核酸Ｂを検出できることを確認）
この標的核酸検出素子を標的核酸Ｂを溶解した液の入った図５の装置の容器２０１に入れ実施例１と同様の操作を行い、最後にＥＢを添加した。
【０１７２】
この基板を実施例１と同様に図５の装置で評価したところ、パソコン２０７では標的核酸だとの判定が出、顕微鏡でも基板全体が蛍光を発していることが確かめられた。
【０１７３】
（偽標的核酸Ｃを誤検出しないことを確認）
核酸をＢからＣに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１７４】
この基板を実施例１と同様に図５の装置で評価したところ、パソコン２０７では標的核酸ではないとの判定が出、蛍光顕微鏡で観察したが蛍光を発している部分は確認されず、一本鎖プローブＡと偽標的核酸Ｃとはハイブリダイズしていないことが確かめられた。
【０１７５】
（偽標的核酸Ｄを誤検出しないことを確認）
核酸をＢからＣに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１７６】
この基板を実施例１と同様に図５の装置で評価したところ、パソコン２０７では標的核酸ではないとの判定が出、蛍光顕微鏡で観察したが蛍光を発している部分は確認されず、一本鎖プローブＡと偽標的核酸Ｃとはハイブリダイズしていないことが確かめられた。
【０１７７】
以上の結果より、多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜を用い、銅をメッキした空孔底部にチオール基を付けた一本鎖プローブを付けて作製し標的核酸検出素子は、プローブと同じ配列を持つ核酸のみを検出し、一部が異なる核酸や一本鎖になった場合に一部が二次元構造を作りプローブにハイブリダイズし易い核酸を誤検出しないことが確認できた。
【０１７８】
＜実施例４＞
本実施例は、基板上に多孔質シリコンゲルマニウム酸化物薄膜を作製し、その空孔中にプローブを導入して作製した図１に示した模式図のような標的核酸検出用素子を用い、インターカレーターとしてＹＯＹＯ１を用い、標的核酸を検出した例である。
【０１７９】
（基板の準備）
まず、一辺の長さが２ｃｍ厚さが１ｍｍのシリコン基板を用意し、マグネトロンスパッタリング法によって白金を２０ｎｍ積層した。
【０１８０】
（多孔質シリコンゲルマニウム酸化物薄膜の作製）
次に、このシリコン基板上の一辺に幅１ｍｍのマスクをした上で、マグネトロンスパッタリング法を用いて、１０００ｎｍの膜厚のアルミニウムとシリコン、ゲルマニウムの混合膜を作製した。ターゲットには、直径が４インチ（１０１．６ｍｍ）の円形のアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のシリコンとゲルマニウムチップを各々２枚枚おいたものを用いた。スパッタ条件は、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：３００Ｗとした。また、基板温度は室温（２５℃）とした。
【０１８１】
ＦＥ−ＳＥＭ（電界放出走査型電子顕微鏡）にて、シリコンゲルマニウム混合膜の上部及び断面を観察したところ、シリコンゲルマニウム領域に囲まれた円形のアルミニウム柱状構造体が二次元的に配列していた。また、アルミニウム柱状構造体の孔径は７ｎｍであり、その平均中心間間隔は１０ｎｍであった。また、長さは１０００ｎｍであり、それぞれのアルミニウム柱状構造体部分はシリコンゲルマニウム領域により互いに分離されていた。
【０１８２】
また、誘導結合型プラズマ発光分析法（ＩＣＰ法）により、本実施例で作製したアルミニウムシリコンゲルマニウム混合膜中の元素組成の分析を行った。なお、この分析用に用いたのはカーボン基板上に作製した膜である。その結果、シリコンのアルミニウムとシリコンの全量に対する分量は３３ａｔｏｍｉｃ％と求められた。以上のようにして、微細な柱状のアルミニウムを６７ａｔｏｍｉｃ％含むアルミニウムシリコンゲルマニウム混合膜の形成が確認された。この混合膜をＸ線回折分析で評価した。その結果、シリコン及びゲルマニウムの回折ピークは認められず、シリコン及びゲルマニウムは非晶質であることがわかった。一方、アルミニウムに関しては複数の回折線が見られ、アルミニウムは結晶性であることが示された。
【０１８３】
このようなシリコンとゲルマニウムの総量をアルミニウムとシリコンとゲルマニウムの全量に対して３３ａｔｏｍｉｃ％含んだアルミニウムシリコンゲルマニウム構造体を９８％濃硫酸溶液中にて２４時間浸し、アルミニウム柱状構造部分のみを選択的にエッチングして細孔を形成した。この結果、シリコンゲルマニウム多孔質体が作製された。
【０１８４】
次に、作製された多孔質シリコンゲルマニウム薄膜を酸素雰囲気中で加熱した。ここでは、大気圧で酸素を５０ｓｃｃｍ流しながら、８００℃で１時間加熱した。この結果、ナノスケールの空孔が膜面に垂直に形成された多孔質シリコンゲルマニウム酸化物の膜が形成された。広域電子エネルギー損失構造解析（ＥＥＬＳ）により、シリコン酸化物及びゲルマニウム酸化物が形成されたことが確認された。
【０１８５】
ＦＥ−ＳＥＭにて、酸化後の膜を観察した。基板真上方向から見た表面の形状はシリコンゲルマニウム酸化物に囲まれた空孔が二次元的に配列していた。空孔部の孔径は５ｎｍであり、その平均間隔は約１０ｎｍであった。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察したところ、空孔の深さは１０００ｎｍであり、それぞれの空孔部分はシリコンゲルマニウム酸化物領域により隔たれており互いに独立していた。
【０１８６】
また、ゲルマニウム酸化物領域中のゲルマニウムの含有量は、ＩＣＰ法によって酸素を除く全ての原子に対して約９０ａｔｏｍｉｃ％と求められた。
【０１８７】
最後に、マスクを剥離した。この結果、基板上に幅１ｍｍの白金電極を持ち、２０ｍｍ幅１９ｍｍの領域に約４×１０12（２．０＊１０6×１．９＊１０6）個の空孔が存在する多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜が作製された。
【０１８８】
（一本鎖プローブＡの導入）
この表面に多孔質ゲルマニウム酸化物薄膜を作製した基板に、実施例１と同様の方法で空孔底部の白金表面に一本鎖プローブＡを導入した標的核酸検出素子を作製した。
【０１８９】
（標的核酸Ｂを検出できることを確認）
この標的核酸検出素子を標的核酸Ｂを溶解した液の入った図５の装置の容器２０１に入れ実施例１と同様の操作を行った。最後にＥＢの代わりにＹＯＹＯ１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製、ＤＭＳＯ溶液に溶解）を最終濃度が１μＭになるように溶解した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液に１０分間間浸した。
【０１９０】
この基板を水溶液から取り出し、蒸留水で洗浄後、窒素雰囲気で乾燥させ、落射型蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＭＴ２、対物レンズは１０倍、接眼レンズは５倍）にＢ励起フィルタをセットして観察したところ、全体が一様に蛍光を発していることが確認された。このことから、多孔質シリコンゲルマニウム酸化物薄膜の空孔内にほぼ均一に一本鎖プローブＡが入り、Ａと相補対の関係にある標的核酸Ｂの一本鎖になったものが空孔内でＡとハイブリッドし、二重螺旋構造を形成していることが確かめられた。
【０１９１】
（偽標的核酸Ｃを誤検出しないことを確認）
核酸をＢからＣに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１９２】
この基板を蛍光顕微鏡で観察したが蛍光を発している部分は確認されず、一本鎖プローブＡと偽標的核酸Ｃとはハイブリダイズしていないことが確かめられた。
【０１９３】
（偽標的核酸Ｄを誤検出しないことを確認）
核酸をＢからＤに変えた以外は、上記Ｂの検出方法を同様の作業を行った。
【０１９４】
この基板を蛍光顕微鏡で観察したが蛍光を発している部分は確認されず、一本鎖プローブＡと偽標的核酸Ｄとはハイブリダイズしていないことが確かめられた。
【０１９５】
以上の結果より、白金薄膜の上に作製した多孔質シリコンゲルマニウム混合物酸化物薄膜を用い、空孔底部にチオール基を付けた一本鎖プローブを付けて作製し標的核酸検出素子は、プローブと同じ配列を持つ核酸のみを検出し、一部が異なる核酸や一本鎖になった場合に一部が二次元構造を作りプローブにハイブリダイズし易い核酸を誤検出しないことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】本発明のおいて標的核酸検出素子の例を示す概略図である。
【図２】本発明の標的核酸検出素子の製造方法の一例を示す説明図である。
【図３】本発明のおいて空孔内に一本鎖プローブを導入する方法の一例を示す説明図である。
【図４】本発明のおいて流路の一例を示す概略図である。
【図５】本発明のおいて標的核酸検出装置の例を示す側面図である。
【図６】ＤＮＡ及びＲＮＡの二次元構造を示す模式図である。
【符号の説明】
【０１９７】
１０１  一本鎖核酸プローブ
１０２  基板
１０３  導電性素材の薄膜、又は金、白金、銀、銅のうちのいずれか一種類の薄膜
１０４  １０３の一部を表面に露出させた電極
１０５  空孔
１０６  第二の成分の酸化物からなる多孔質薄膜
１０７  第一の成分と第二の成分の混合薄膜領域
１０８  第二の成分からなる多孔質薄膜
１０９  第一の成分からなる柱状成分
１１０  金、白金、銀、銅のうちのいずれか一種類の薄膜薄膜
１１１  流出入口
１１２  流路
２００  標的核酸検出素子
２０１  容器
２０２  温度センサ付き加温装置
２０３  温度センサ付き冷却装置
２０４  温度制御装置
２０５  励起光照射装置
２０６  蛍光検出装置
２０７  ＡＤコンバーター内蔵パソコン
【図１】
2005061996.tif 000003
【図２】
2005061996.tif 000004
【図３】
2005061996.tif 000005
【図４】
2005061996.tif 000006
【図５】
2005061996.tif 000007
【図６】
2005061996.tif 000008