(57)【要約】【課題】  ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を提供する。【解決手段】  側鎖に残基を有するユニットをポリマー分子中に少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であって、前記ポリヒドロキシアルカノエートを生産する能力を有する微生物を、培地中で、総括酸素移動容量係数（ＫＬａ）が２００〜６００ｈｒ−１である酸素供給条件下で培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（１）〜（４）に示すユニットからなる群から選ばれた少なくとも１種類のユニットをポリマー分子中に少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であって、前記ポリヒドロキシアルカノエートを生産する能力を有する微生物を、培地中で、総括酸素移動容量係数（ＫＬａ）が２００〜６００ｈｒ−１である酸素供給条件下で培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
ここで、化学式（１）は、
【化１】
2005095069.tif 000025
（ａは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である；Ｒ１はフェニル構造或いはチエニル構造のいずれかの構造を有する残基を含んでいる；複数のユニットが存在する場合ａ及びＲ１はユニット毎に独立して上記の意味を表す）で示され、
化学式（２）は、
【化２】
2005095069.tif 000026
（式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｒ２はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＯＯＲ’、ＳＯ２Ｒ”（Ｒ’：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ３、およびＣ２Ｈ５のいずれかを表し、Ｒ”：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ３、およびＯＣ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基であり、ｂは化学式中に示した範囲から選ばれた整数であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）で示され、
化学式（３）は、
【化３】
2005095069.tif 000027
（式中、Ｒ３はシクロヘキシル基への置換基を示し、Ｒ３はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ハロゲン原子、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、ｃは化学式中に示した範囲から選ばれた整数であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）で示され、
化学式（４）は、
【化４】
2005095069.tif 000028
（ｄは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）で示される。
【請求項２】
下記化学式（５）〜（８）で示す化合物からなる群から選ばれた少なくとも１種を原料として、前記化学式（１）〜（４）に示すユニットからなる群から選ばれた少なくとも１種類のユニットをポリマー分子中に少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートを生産する能力を有する微生物を、下記化学式（５）〜（８）で示す化合物からなる群から選ばれた少なくとも１種を含んでなる培地中で、総括酸素移動容量係数（ＫＬａ）が２００〜６００ｈｒ−１である酸素供給条件下で培養することを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
ここで、化学式（５）は、
【化５】
2005095069.tif 000029
（ｅは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である；Ｒ１はフェニル構造、或いはチエニル構造のいずれかの構造を有する残基を含んでいる）で示され、
化学式（６）は、
【化６】
2005095069.tif 000030
（式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｒ２はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＯＯＲ’、ＳＯ２Ｒ”（Ｒ’：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ３、およびＣ２Ｈ５のいずれかを表し、Ｒ”：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ３、およびＯＣ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基であり、ｆは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である）で示され、
化学式（７）は、
【化７】
2005095069.tif 000031
（式中、Ｒ３はシクロヘキシル基への置換基を示し、Ｒ３はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ハロゲン原子、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、ｇは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である）で示され、
化学式（８）は、
【化８】
2005095069.tif 000032
（ｈは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である）で示される。
【請求項３】
式中、Ｒ１、即ち、フェニル構造、チエニル構造を有する残基が、化学式（９）〜（１６）のいずれかで示される残基の少なくとも１種であって、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す、請求項１または２に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【化９】
2005095069.tif 000033
（式中、Ｒ１１は芳香環への置換基を示し、ＲｃはＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＨ＝ＣＨ２基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）
【化１０】
2005095069.tif 000034
（式中、Ｒ１２は芳香環への置換基を示し、Ｒ２はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＳＣＨ３基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）
【化１１】
2005095069.tif 000035
（式中、Ｒ１３は芳香環への置換基を示し、Ｒ３はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）
【化１２】
2005095069.tif 000036
（式中、Ｒ１４は芳香環への置換基を示し、Ｒ５はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＯＯＲ’、ＳＯ２Ｒ”（Ｒ’：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ３、およびＣ２Ｈ５のいずれかを表し、Ｒ”：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ３、およびＯＣ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）
【化１３】
2005095069.tif 000037
【化１４】
2005095069.tif 000038
【化１５】
2005095069.tif 000039
【化１６】
2005095069.tif 000040
【請求項４】
前記培地が、少なくともカリウム塩及びナトリウム塩を、カリウムイオン：ナトリウムイオン＝０：１００〜１５：８５のモル比となるよう含んでなる請求項１乃至３のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項５】
前記カリウム塩及びナトリウム塩が、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）またはその水和物、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）またはその水和物、塩化カリウム（ＫＣｌ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）またはその水和物、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）またはその水和物、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）からなる群から選ばれた少なくとも１種類である請求項４に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項６】
前記リン酸二水素カリウムまたはその水和物を０〜２０ｍＭ含み、かつ、前記リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）またはその水和物を４５〜７０ｍＭ含む請求項５に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項７】
前記培地をｐＨ６．８〜８．０の範囲に制御して培養する請求項１乃至６のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項８】
前記微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物である請求項１乃至７のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多くの微生物がポリ−３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸（以下、ＰＨＢと略す場合もある）あるいはその他のポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略す場合がある）を生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた（非特許文献１参照）。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することが出来る。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことが少ない。
【０００３】
ＰＨＢは側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「ｕｓｕａｌ−ＰＨＡ」の一種である。一方、ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ、即ち、「ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡ」が極めて有用であると期待される。置換基の例としては、芳香環を含むもの（フェニル基、フェノキシ基など）や不飽和炭化水素などが挙げられ、非特許文献２には、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎ）が、５−フェニル吉草酸を基質として、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【特許文献１】特開平５−６４５９１号公報
【特許文献２】特開２００１−２８８２５６号公報
【特許文献３】特開２００２−８０５７１号公報
【非特許文献１】「生分解性プラスチックハンドブック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・ティー・エス，Ｐ１７８−１９７（１９９５）
【非特許文献２】Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９１，１９５７−１９６５（１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
微生物を用いたＰＨＡの製造方法において、ＰＨＡを効率良く生産するためには、ＰＨＡの生産に至適な酸素供給条件下で微生物を培養することが重要である。従来のＰＨＡの生産においては、培養系の酸素供給能力を表す指標である「総括酸素移動容量係数（以下、ＫＬａと略す場合がある）」が２００ｈｒ−１より小さい酸素供給条件下で培養することが好ましいとされていた。
【０００５】
ｕｓｕａｌ−ＰＨＡについては、特許文献１に、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属微生物を、ＫＬａ＝１０〜２５０ｈｒ−１で培養して増殖させた後、窒素制限下でＫＬａ＝３０〜３００ｈｒ−１で培養し、３−ヒドロキシ酪酸と４−ヒドロキシ酪酸とからなるＰＨＡを製造させる方法が開示されている。ここでは、前段の培養は１５〜１７０ｈｒ−１、後段の培養は４０〜１５０ｈｒ−１とするのが最も好ましいとされており、ＫＬａが大き過ぎると副反応や菌体の損傷等によりにＰＨＡの生成速度が減少すると記載されている。
【０００６】
一方、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡについては、前記特許文献１に示される、３−ヒドロキシ酪酸ユニットを含むＰＨＡとは生合成の経路が異なるため、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生産に最適な酸素供給条件を実現するためには、従来例とは全く別個な技術の開発が必要と考えられた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、従来例よりも大きいＫＬａで示される酸素供給条件に設定して微生物を培養することにより、より効果的にｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを生産出来ることを初めて明らかにした。さらに、培地中のナトリウム塩及びカリウム塩の比率や、ｐＨを最適化することによって、その効果がより大きくなることも明らかにした。
【０００８】
即ち本発明は、機能性ポリマーとしても有用なｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの製造方法に関するものである。
【０００９】
具体的には、化学式（１）〜（４）に示すユニットからなる群から選ばれた少なくとも１種類のユニットをポリマー分子中に少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法であって、前記ポリヒドロキシアルカノエートを生産する能力を有する微生物を、培地中で、ＫＬａが２００〜６００ｈｒ−１である酸素供給条件下で培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。ここで、化学式（１）は、
【００１０】
【化１】
2005095069.tif 000002
【００１１】
（ａは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である；Ｒ１はフェニル構造或いはチエニル構造のいずれかの構造を有する残基を含んでいる；複数のユニットが存在する場合ａ及びＲ１はユニット毎に独立して上記の意味を表す）で示され、化学式（２）は、
【００１２】
【化２】
2005095069.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｒ２はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＯＯＲ’、ＳＯ２Ｒ”（Ｒ’：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ３、およびＣ２Ｈ５のいずれかを表し、Ｒ”：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ３、およびＯＣ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基であり、ｂは化学式中に示した範囲から選ばれた整数であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）で示され、化学式（３）は、
【００１４】
【化３】
2005095069.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ３はシクロヘキシル基への置換基を示し、Ｒ３はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ハロゲン原子、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、ｃは化学式中に示した範囲から選ばれた整数であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）で示され、化学式（４）は、
【００１６】
【化４】
2005095069.tif 000005
（４）
（ｄは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）で示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜ＰＨＡ＞
本発明で製造するｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡは、生分解性樹脂としての基本骨格を有しており、それゆえ、従来のプラスチックと同様、溶融加工等により各種製品の生産に利用することが出来ると共に、石油由来の合成高分子とは異なり、生物により分解され、自然界の物質循環に取り込まれるという際立った特性を有している。そのため、燃焼処理を行なう必要もなく、大気汚染や地球温暖化を防止するという観点でも有効な材料であり、環境保全を可能とするプラスチックとして利用することが出来る。さらに、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの各種官能基に起因する機能・物性を利用して、各種の機能性材料、例えば、医療用軟質部材等としての利用も期待出来る。
【００１８】
本発明で製造するｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの一例として、化学式（１）〜（４）に示すユニットからなる群から選ばれた少なくとも１種類を含むＰＨＡを挙げることが出来る。さらに、化学式（１）で示すユニットの一例として、式中Ｒ１が、化学式（９）〜（１６）で示す残基であるユニットを挙げることが出来る。
【００１９】
【化５】
2005095069.tif 000006
【００２０】
（式中、Ｒ１１は芳香環への置換基を示し、ＲｃはＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＨ＝ＣＨ２基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）
【００２１】
【化６】
2005095069.tif 000007
【００２２】
（式中、Ｒ１２は芳香環への置換基を示し、Ｒ２はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＳＣＨ３基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）
【００２３】
【化７】
2005095069.tif 000008
【００２４】
（式中、Ｒ１３は芳香環への置換基を示し、Ｒ３はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）
【００２５】
【化８】
2005095069.tif 000009
【００２６】
（式中、Ｒ１４は芳香環への置換基を示し、Ｒ５はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＯＯＲ’、ＳＯ２Ｒ”（Ｒ’：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ３、およびＣ２Ｈ５のいずれかを表し、Ｒ”：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ３、およびＯＣ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合ユニット毎に独立して上記の意味を表す）
【００２７】
【化９】
2005095069.tif 000010
【００２８】
【化１０】
2005095069.tif 000011
【００２９】
【化１１】
2005095069.tif 000012
【００３０】
【化１２】
2005095069.tif 000013
【００３１】
＜ＰＨＡ生産菌＞
本発明で用いる微生物は、化学式（１）〜（４）に示すユニットからなる群から選ばれた少なくとも１種類を含むＰＨＡを生産し得る微生物であれば、いかなる微生物であっても良い。利用可能なＰＨＡ産生能を有する微生物の好適な一例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を挙げることが出来る。
【００３２】
より具体的には、シュードモナス・チコリアイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｓｅ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・アルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス  ジェッセニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｅｓｓｅｎｉｉ）を用いることが出来る。
【００３３】
更には、より好適な菌株として、例えば、シュードモナス・チコリアイ  ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  ＹＮ２；ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・チコリアイ  Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  Ｈ４５；ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・ジェッセニイ  Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｅｓｓｅｎｉｉ  Ｐ１６１；ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７６）、シュードモナス・プチダ  Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｐ９１；ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７３）を挙げることができる。これら４種の菌株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、特許文献２及び特許文献３に記載されている微生物である。
【００３４】
また、これらシュードモナス属微生物の他に、例えば、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．），コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐ．）に属し、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを生産することが知られている菌株の多くも本発明の方法に利用可能である。
【００３５】
前記の微生物を、化学式（１）〜（４）に示すユニットの導入のための基質となる炭素源を少なくとも含んだ培地で培養することで、目的とするＰＨＡを生産することが出来る。このようなＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成される、アイソタクチックなポリマーである。
【００３６】
＜培養＞
培養方法は、液体培養法を用いることが出来、さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコ中で、振とうしつつ酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる通気攪拌方式の酸素供給方法がある。
【００３７】
一般に微生物の培養においては、用いる培養系・培養装置の酸素供給能力が微生物の能力等に影響する場合が多く、従って、目的に沿った最適な酸素供給条件下で微生物を培養することは極めて重要である。
【００３８】
例えば、培養系で、気相（空気）中の酸素の液相（培地）への移動は次式によって表される。 
ｄＣ／ｄｔ＝ＫＬａ（Ｃｓ−Ｃｌ）    ・・・（数１）
ここで、ｄＣ／ｄｔは酸素移動速度（ｍｍｏｌ／ｌ・ｈｒ）、ＫＬは液境膜の酸素移動速度係数（ｃｍ／ｈｒ）、ａは単位体積当たりの気液界面積（ｃｍ２／ｃｍ３）、Ｃｓは設定条件での液相への飽和溶存酸素濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）、Ｃｌは液相中の溶存酸素濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）である。ＫＬとａを掛け合わせたＫＬａ（通常ｈｒ−１）を「総括酸素移動容量係数」と呼んで用いている。ＫＬａは培養系の酸素供給能力を表す指標となり、同じ条件ではＫＬａが大きい方が酸素の供給能力が大きい。
【００３９】
ＫＬａの測定方法には、亜硫酸酸化法、排気ガス分析法、Ｇａｓｓｉｎｇ−ｏｕｔ法などの方法を用いることが出来る。後に述べる実施例においてはＧａｓｓｉｎｇ−ｏｕｔ法を用いて、以下のようにＫＬａを測定した。フラスコあるいはジャーファーメンターに液相として一定量の水を入れ、この液相中の酸素を、窒素ガスにより置換して、該液相の酸素濃度を低下させる。次いで、温度、圧力、通気速度、振とう数（通常ｒｐｍ；１分間当たりの回転数またはストローク／分）あるいは攪拌数（通常ｒｐｍ）を設定して、該条件下で一定時間培養する。液相の溶存酸素濃度を、溶存酸素濃度電極を用いて測定し、前記式よりＫＬａを算出する。
【００４０】
本発明におけるＰＨＡの生産に好適な酸素供給条件は、ＫＬａとして２００〜６００ｈｒ−１である。該ＫＬａで示される酸素供給条件は、例えば、フラスコ培養であれば振とう数、培地液量、フラスコの形状等を適宜設定することにより実現でき、また、ジャーファーメンターや培養タンクを用いた培養であれば、通気量や通気方法、攪拌数、培地液量、圧力、培養槽や攪拌羽の形状等を適宜設定することにより実現出来る。さらに、後述する、培地中のナトリウム塩及びカリウム塩の比率や、ｐＨの制御によって、その効果がさらに大きくなり得る。
【００４１】
本発明の方法に利用可能な培地としては、リン源（例えば、リン酸塩等）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等）など、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものも用いることが出来るが、本発明の方法の効果をより大きくするためには、カリウム塩とナトリウム塩をカリウムイオン：ナトリウムイオン＝０：１００〜１５：８５のモル比となるよう含んでいることが望ましい。前記の組成は、例えば、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）またはその水和物、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）またはその水和物、塩化カリウム（ＫＣｌ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）またはその水和物、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）またはその水和物、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）といった、微生物の培養に一般に用いられる無機塩類を培地中に添加することで達成出来る。
【００４２】
前記無機塩類の濃度は、例えば、リン酸二水素カリウムまたはその水和物であれば０〜２０ｍＭ、リン酸水素二ナトリウムまたはその水和物であれば４５〜７０ｍＭとするのが好適である。例えば、モル比をカリウムイオン：ナトリウムイオン＝２：９８とする場合、リン酸二水素カリウム０．４５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム８．８６ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加すればよい。
【００４３】
更には、良好な菌体の増殖、それに伴うＰＨＡの生産性の向上を図るためには、前記の培地に必須微量元素を適量添加することができ、例えば、以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加することが極めて有効である。かかる微量成分溶液の添加は、微生物の増殖に際して使用される微量金属元素などを供給するものである。
【００４４】
（微量成分溶液の組成）
ニトリロ三酢酸：１．５；ＭｇＳＯ４：３．０；ＭｎＳＯ４：０．５；ＮａＣｌ：１．０；ＦｅＳＯ４：０．１；ＣａＣｌ２：０．１；ＣｏＣｌ２：０．１；ＺｎＳＯ４：０．１；ＣｕＳＯ４：０．１；ＡｌＫ（ＳＯ４）２：０．１；Ｈ３ＢＯ３：０．１；Ｎａ２ＭｏＯ４：０．１；ＮｉＣｌ２：０．１（ｇ／Ｌ）
また、前記の培地に、微生物の増殖を促す基質として、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーといった栄養素をさらに添加することも可能である。
【００４５】
また、前記の培地に、微生物の増殖により消費されるエネルギー源、炭素源として、糖類、例えば、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等をさらに添加することも可能である。
【００４６】
前記糖類に代えて、有機酸またはその塩、より具体的には、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸、並びに、ＴＣＡサイクルから１段階や２段階の少ない生化学的反応により誘導される有機酸、またはそれらの水溶性の塩を利用することも出来る。有機酸またはその塩として、例えば、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などのヒドロキシカルボン酸やオキソカルボン酸類またはその水溶性の塩を用いることが可能である。あるいは、アミノ酸またはその塩、例えば、アスパラギン酸やグルタミン酸等のアミノ酸またはその塩を用いることが可能である。有機酸またはその塩を添加する際には、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、並びにその塩からなる群から、一種または複数種を選択し、培地に添加し、溶解させることがより好ましい。あるいは、アミノ酸またはその塩を添加する際には、アスパラギン酸、グルタミン酸ならびにそれらの塩からなる群から、一種または複数種を選択し、培地に添加し、溶解させることがより好ましい。
【００４７】
微生物増殖のための炭素源、並びに、ＰＨＡ生産のためのエネルギー供給源として培地に添加される上記の共存基質の濃度は、通常、培地あたり０．０５％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲、より好ましくは、０．２％〜２％（ｗ／ｖ）の範囲に選択することが望ましい。
【００４８】
また、前記の培地に、必要に応じて、目的とするＰＨＡを生産するための基質を添加することも出来る。目的とするＰＨＡを生産するための基質としては、使用する微生物により該モノマーユニットに変換され得るものであれば、いずれの炭素源を用いても良いが、例えば、化学式（５）〜（８）で示すアルカン酸を用いることが出来る。ここで、化学式（５）は、
【００４９】
【化１３】
2005095069.tif 000014
【００５０】
（ｅは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である；Ｒ１はフェニル構造、或いはチエニル構造のいずれかの構造を有する残基を含んでいる）で示され、化学式（６）は、
【００５１】
【化１４】
2005095069.tif 000015
【００５２】
（式中、Ｒ２は芳香環への置換基を示し、Ｒ２はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＯＯＲ’、ＳＯ２Ｒ”（Ｒ’：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ３、およびＣ２Ｈ５のいずれかを表し、Ｒ”：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ３、およびＯＣ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基であり、ｆは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である）で示され、化学式（７）は、
【００５３】
【化１５】
2005095069.tif 000016
【００５４】
（式中、Ｒ３はシクロヘキシル基への置換基を示し、Ｒ３はＨ原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ハロゲン原子、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基であり、ｇは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である）で示され、化学式（８）は、
【００５５】
【化１６】
2005095069.tif 000017
【００５６】
（ｈは化学式中に示した範囲内から選ばれた整数である）で示される。さらに、化学式（５）で示すアルカン酸のとして、式中Ｒ１が、化学式（９）〜（１６）で示す残基であるアルカン酸を例示することが出来る。これら基質の含有比率は、培地あたり０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲に選択することが望ましい。
【００５７】
培養温度は、利用する微生物菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、通常、１５℃〜３７℃の範囲、より好ましくは、２０℃〜３０℃の範囲程度に選択することが適当である。
【００５８】
培養ｐＨは、使用する微生物の生育や目的とするＰＨＡの生産にとり良好な範囲であれば良いが、本発明の方法の効果をより大きくするためには、ｐＨ６．８〜８．０の範囲に制御して培養することが望ましい。ｐＨの制御方法は、培地に予めｐＨ緩衝能を持たせて制御する方法や、培養中の培地ｐＨの変化に応じて酸、アルカリを適宜添加して制御する方法など、微生物の培養に一般に用いられる方法を採用することが可能であるが、例えば、前記のカリウム塩及びナトリウム塩を適宜組み合わせて培地に添加することにより、該培地にｐＨ緩衝能を持たせる方法を用いることが可能である。
【００５９】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積せしめる手法としては、上述する、所定の濃度で基質を添加した、リン酸塩、並びにアンモニウム塩または硝酸塩等の窒素源を含む培地において微生物を培養する一段階培養法の他に、培養を二段階に分けて行なう二段階培養法を採用することも出来る。この二段階培養法では、一次培養として、所定の濃度で基質を添加した、リン酸塩、並びにアンモニウム塩または硝酸塩等の窒素源を含む培地において、微生物を一旦十分に増殖させた後、二次培養として、培地に含まれる塩化アンモニウムのような窒素源を制限した上で、所定の濃度で基質を添加した培地に、一次培養で得られた菌体を移し、更に培養して、微生物にＰＨＡを生産・蓄積せしめる。この二段階培養法を採用すると、ＰＨＡの生産性が向上する場合がある。
【００６０】
生産されるＰＨＡは微生物の菌体内に蓄積されるので、培養により増殖させ、ＰＨＡを生産・蓄積している菌体を集菌することで、培地との分離が容易になされる。集菌した菌体を、洗浄・乾燥した後、ＰＨＡを回収することが出来る。
【００６１】
微生物細胞からＰＨＡを回収する方法としては、通常行なわれている方法を適用することが出来る。例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトンなどの有機溶媒による抽出が最も簡便である。前記の溶媒以外に、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルが用いられる場合もある。また、有機溶媒の使用が望ましくない作業環境中では、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、次亜塩素酸塩、アンモニア、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理、超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法のいずれかの方法を用いて、微生物細胞を物理的に破砕した後、ＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を採用することも出来る。
【００６２】
微生物を用いてＰＨＡを生産する場合、複数のモノマーユニットを含有せしむことが可能であり、必要とするポリマーの機能性、物性などを考慮の上、設計すると良い。即ち、目的とするＰＨＡを生産するための基質、例えば、化学式（５）〜（８）で示されるアルカン酸の複数種を培地中に共存させることにより、複数種のユニットを含むＰＨＡを生産することが可能である。この場合のアルカン酸の含有比率は、培地あたりそれぞれ０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲に選択することが望ましい。
【００６３】
（実施例）
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。なお、これら実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例の形態によって限定されるものではない。また、「％」は特に標記した以外は質量基準である。
【実施例１】
【００６４】
予め、５００ｍｌ振とうフラスコに一定量の水を入れ、後述する培養条件におけるＫＬａをＧａｓｓｉｎｇ−ｏｕｔ法により測定した。
【００６５】
リン酸水素二ナトリウム８．８６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．４５ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、微量成分溶液３ｍｌ／Ｌを含んでなる無機培地（カリウムイオン（Ｋ＋）とナトリウムイオン（Ｎａ＋）のモル比は、Ｋ＋：Ｎａ＋＝２：９８）に、ポリペプトン（日本製薬（株））０．５ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース０．５ｇ／Ｌ、５−フェニル吉草酸１２ｍＭ、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸１．５ｍＭを添加し、前記の振とうフラスコに一定量入れて高温高圧殺菌して室温まで冷却して培地を調製した。培地ｐＨは７．２であった。
【００６６】
シュードモナス・チコリアイＹＮ２株を前記培地に接種し、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４０時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して真空乾燥した。
【００６７】
この乾燥菌体ペレットを酢酸エチル１０ｍｌに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収し真空乾燥し、得られたＰＨＡを秤量した。
【００６８】
得られたＰＨＡの構造決定を、１Ｈ−ＮＭＲ（ＦＴ−ＮＭＲ：ＢｒｕｋｅｒＤＰＸ４００；共鳴周波数：４００ＭＨｚ；測定核種：１Ｈ；使用溶媒：ＣＤＣｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ３；測定温度：室温）によって行った。
【００６９】
培地液量及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表１に示した。培地液量が２００〜３００ｍｌのときと比較して、１００ｍｌ以下のときに、培地液量当たりのＰＨＡ収量は高い値を示した。
【００７０】
【表１】
2005095069.tif 000018
【実施例２】
【００７１】
培地中のリン酸水素二ナトリウムを７．４７ｇ／Ｌとし、リン酸二水素カリウムを１．７８ｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして培地を調製した（無機培地中のカリウムイオン（Ｋ＋）とナトリウムイオン（Ｎａ＋）のモル比は、Ｋ＋：Ｎａ＋＝１０：９０）。培地ｐＨは７．０であった。これを用いて、実施例１と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。培地液量及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表２に示した。培地液量が２００ｍｌのときと比較して、７５ｍｌ以下のときに、培地液量当たりのＰＨＡ収量は高い値を示した。
【００７２】
【表２】
2005095069.tif 000019
【実施例３】
【００７３】
培地中のリン酸水素二ナトリウムを６．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを３．０ｇ／Ｌとした以外は、実施例１と同様にして培地を調製した（無機培地中のカリウムイオン（Ｋ＋）とナトリウムイオン（Ｎａ＋）のモル比は、Ｋ＋：Ｎａ＋＝１９：８１）。培地ｐＨは６．７であった。これを用いて、実施例１と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。培地液量及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表３に示した。培地液量が２００ｍｌのときと比較して、１００ｍｌ以下のときに、培地液量当たりのＰＨＡ収量は高い値を示した。
【００７４】
【表３】
2005095069.tif 000020
【実施例４】
【００７５】
培地中のリン酸二水素カリウムをリン酸二水素ナトリウムとした以外は、実施例１と同様にして培地を調製した（無機培地中のカリウムイオン（Ｋ＋）とナトリウムイオン（Ｎａ＋）のモル比は、Ｋ＋：Ｎａ＋＝０：１００）。これを用いて、実施例１と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。培地液量及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表４に示した。培地液量当たりのＰＨＡ収量は、実施例１の培地液量７５ｍｌの場合と同等の高い値を示した。
【００７６】
【表４】
2005095069.tif 000021
【００７７】
一方、前記培地に塩酸または水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨをそれぞれ６．６及び８．４に調整した培地を用いて同様にＰＨＡの生産を試みたところ、培地液量当たりのＰＨＡ収量は上記の２／３以下であった。
【実施例５】
【００７８】
培地中に５‐（４−ビニルフェニル）吉草酸を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして培地を調製した。これを用いて、実施例１と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。培地液量及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表５に示した。培地液量が２００〜３００ｍｌのときと比較して、１００ｍｌ以下のときに、培地液量当たりのＰＨＡ収量は高い値を示した。
【００７９】
【表５】
2005095069.tif 000022
【実施例６】
【００８０】
培地中の５‐フェニル吉草酸１２ｍＭを５‐（フェニルスルファニル）吉草酸０．２％に変更し、５‐（４−ビニルフェニル）吉草酸を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして培地を調製した。これを用いて、実施例１と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。培地液量及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表６に示した。培地液量が２００〜３００ｍｌのときと比較して、１００ｍｌ以下のときに、培地液量当たりのＰＨＡ収量は高い値を示した。
【００８１】
【表６】
2005095069.tif 000023
【実施例７】
【００８２】
予め、５Ｌジャーファーメンターに２．５Ｌの水を入れ、後述する培養条件におけるＫＬａをＧａｓｓｉｎｇ−ｏｕｔ法により測定した。
【００８３】
リン酸水素二ナトリウム８．８６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．４５ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、微量成分溶液３ｍｌ／Ｌを含んでなる無機培地（カリウムイオン（Ｋ＋）とナトリウムイオン（Ｎａ＋）のモル比は、Ｋ＋：Ｎａ＋＝２：９８）に、ポリペプトン（日本製薬（株））０．５ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース０．５ｇ／Ｌ、５−フェニル吉草酸１２ｍＭ、５−（４−ビニルフェニル）吉草酸１．５ｍＭ、消泡剤ＰＥ−Ｍ（和光純薬工業（株））０．１ｍｌ／Ｌを添加し、前記のジャーファーメンターに２．５Ｌ入れて高温高圧殺菌して室温まで冷却して培地を調製した。培地ｐＨは７．２であった。
【００８４】
シュードモナス・チコリアイＹＮ２株を前記培地に接種し、３０℃、撹拌数６００ｒｐｍ、通気量３．７５Ｌ／分（１．５ｖｖｍ）で通気撹拌培養した。４０時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて一度洗浄して真空乾燥した。
【００８５】
この乾燥菌体ペレットを酢酸エチル１００ｍｌに懸濁し、３５℃で１６時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収し真空乾燥し、得られたＰＨＡを秤量した。
【００８６】
得られたＰＨＡの構造決定を、１Ｈ−ＮＭＲ（ＦＴ−ＮＭＲ：ＢｒｕｋｅｒＤＰＸ４００；共鳴周波数：４００ＭＨｚ；測定核種：１Ｈ；使用溶媒：ＣＤＣｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ３；測定温度：室温）によって行った。
【００８７】
撹拌数及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表７に示した。
【実施例８】
【００８８】
撹拌数を８００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。撹拌数及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表７に示した。
【実施例９】
【００８９】
撹拌数を１０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。撹拌数及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表７に示した。
【００９０】
（比較例２）
撹拌数を４００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。撹拌数及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表７に示した。
【００９１】
（比較例３）
撹拌数を１２００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様にしてＰＨＡを取得し構造決定した。撹拌数及びそのＫＬａ、乾燥菌体重量、ＰＨＡの収量及びモノマーユニット比を表７に示した。
【００９２】
【表７】
2005095069.tif 000024
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の方法により、生分解性材料、機能性材料などとして有用なＰＨＡを効率的に生産することが可能となる。