(57)【要約】      （修正有）【課題】I 分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有する融合タンパク質を可溶性タンパク質として生産すること、また、融合タンパク質から上記酵素そのものも容易に得ることを可能とする。【解決手段】糖結合性タンパク質とI 分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとの組換え融合タンパク質、及び、以下の工程（１）〜（３）を含む組換え融合タンパク質の製造方法。（１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性タンパク質をコードするＤＮＡと上記酵素をコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、（２）得られた形質転換体を培養して、糖結合性タンパク質と上記酵素との融合タンパク質を生成させ、（３）得られた培養物から、該融合タンパク質を分離する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖結合性タンパク質とＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとの組換え融合タンパク質。
【請求項２】
Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼがヒト由来である請求項１〜４のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、（ａ）または（ｂ）に記載されるタンパク質である請求項１又は２に記載の組換え融合タンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４００で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、該タンパク質の膜貫通領域の全部又は一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列を含む請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
糖結合性タンパク質とＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとの間にプロテアーゼ認識配列を含む請求項１〜５のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
糖結合性タンパク質がマルトース結合性タンパク質である請求項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである請求項６記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質の製造方法。
（１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性タンパク質をコードするＤＮＡとＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（２）得られた形質転換体を培養して、糖結合性タンパク質とＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとの融合タンパク質を生成させ、
（３）得られた培養物から、該融合タンパク質を分離する
【請求項１３】
Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼがヒト由来である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４００で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
マルトース結合性タンパク質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ  ｐ２、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ、ｐＭＡＬ  ｃ２、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｇからなる群から選択されるベクターにに由来する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法により得られる融合タンパク質から、糖結合タンパク質部分を除去してＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを採取する工程を含む、Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項２０】
糖結合タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のＣ末端側にプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテアーゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去する事を特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖タンパク質プロセッシング酵素の一種である、Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを、安価に効率よく生産する方法に関する。詳細には、マルトース結合タンパク質とＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質及び該タンパク質を大腸菌体内で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、細胞において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖タンパク質などとして存在している。これら糖鎖の構造は生物種や組織特異的に異なっているが、同一生物種や同一組織内でも発生時期や疾病等によっても異なることから、従来考えられていたタンパク質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等のタンパク質に対する物理的性質の付与といった機能の他に、発生・分化、神経系、免疫系、癌の転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用という点から近年非常に注目されるようになった。
【０００３】
これら糖鎖は、生体内においては糖転移酵素によって合成されている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であり、また、その糖受容体の糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、通用、１つのグリコシド結合は１つの糖転移酵素によって形成されるといわれている。これら糖転移酵素は糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な酵素である。しかしながら、天然に存在する糖転移酵素の量は、極僅かであり大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【０００４】
β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは糖蛋白質或いは糖脂質の糖鎖の形成に関与する重要な酵素であり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として、糖受容体である糖蛋白質或いは糖脂質の糖鎖にβ１−６結合で、Ｎ−アセチルグルコサミンを転移する酵素である。現在、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（以下、ＧｎＴＶと省略する場合もある）、ｃｏｒｅ２形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（以下、Ｃ２ＧｎＴＩと省略する場合もある）、ｃｏｒｅ２形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（以下、Ｃ２ＧｎＴＩＩと省略する場合もある）、ｃｏｒｅ２形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（以下、Ｃ２ＧｎＴＩＩＩと省略する場合もある）、Ｉ分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（以下、Ｉ−ＧｎＴと省略する場合がある）の５種類のβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが知られている（非特許文献１参照）。
【０００５】
ＧｎＴＶは糖蛋白質のＮ結合型糖鎖のα１−６マンノースにβ１−６結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移し、［ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｍａｎα１−６］（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを合成する酵素である。Ｃ２ＧｎＴＩ及びＣ２ＧｎＴＩＩＩは糖蛋白質のＯ結合型糖鎖（ムチン型糖鎖）のコア１構造のＮ−アセチルがラクトサミンにβ１−６結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移し、Ｇａｌβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃ−Ｒ（コア２構造）を合成する酵素である。
【０００６】
本発明のＩ−ＧｎＴは、ポリＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎ構造のガラクトースにβ１−６結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移し、Ｉ−抗原分岐を形成させる酵素である。ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒを基質とした場合、ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒを合成し、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒを基質とした場合、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒを合成する。さらに、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒを基質とした場合、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒ（主反応物）及びＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒを合成し、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒを基質とした場合、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒ（主反応産物）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ−Ｒを合成するという基質特異性を有する。Ｉ−ＧｎＴにより合成された分岐に、さらにβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが作用し、Ｉ−抗原すなわち、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌ−Ｒ構造が合成される。このＩ抗原のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ糖鎖にα２，３−シアリルトランスフェラーゼやα１，３−フコシルトランスフェラーゼが作用し、ＬｅＸ、ｓＬｅＸ等のルイス構造が形成される。
【０００７】
最後の、Ｃ２ＧｎＴＩＩはコア２合成活性、コア４合成活性、すなわち、ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃ−Ｒ合成活性、及びＩ−分岐合成活性を有するユニークな酵素である。
以上のように、Ｉ−ＧｎＴはルイス構造形成のための基本骨格を合成するという点で、重要な酵素の一つであると考えられている。ルイス構造は癌の転移や、免疫系に深く関与していると考えられている糖鎖構造で、これらを合成し用いることで医薬品など種々の用途への応用が期待されている。また、Ｉ抗原構造は多価のルイス構造を形成することが可能であり、より強力な効果が期待されている。
Ｉ−ＧｎＴはこの多価ルイス構造糖鎖の合成のために必須な酵素であり、その安定した供給が望まれていた。
【０００８】
この、Ｉ−ＧｎＴは、各種動物の臓器に存在することが知られているが、大量且つ安定した臓器の入手は困難であり、かつ、単一のタンパク質にまで精製しようとすると非常に手間のかかることから、遺伝子組換えによる生産が期待されている。
【０００９】
該酵素をコードするｃＤＮＡは、ヒト由来（例えば、非特許文献２参照）、マウス由来（例えば、非特許文献３参照）のものが既に単離されている。
【００１０】
組換えタンパク質の大量生産には、コスト的な点を考慮すれば、細菌や酵母などの微生物で該タンパク質を発現させる方法が有利である。しかしながら、微生物の発現系では、発現したタンパク質の多くが不溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）として存在することがあり、精製に先立って可溶化・再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）の工程を必要とするので、効率的とは言えなかった。さらに、一部可溶性タンパク質として発現した酵素についても、それを高純度で得るためには、各種クロマトグラフィー処理を含む多くの精製工程が必要であり、多大な時間及びコストがかかるため、商業生産用の発現としては十分ではなかった。
【００１１】
一方、目的とする遺伝子を大量に発現させ、かつ、発現産物の精製を容易にする方法として、目的タンパク質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やプロテインＡなどとの融合タンパク質として発現させる方法がある。該方法では、ＧＳＴとの融合タンパク質は。グルタチオンをリガンドとするアフィニティカラムムロマトグラフィーにより、また、プロテインＡとの融合タンパク質はＩｇＧをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィーにより、それぞれ容易に精製することができる。しかしながら、この方法を用いた場合、前期と同様に封入体を生成する可能性が高い。このような理由から、Ｉ−ＧｎＴを大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【００１２】
【非特許文献１】
「ハンドブック  オブ  グリコシルトランスフェラーゼ  アンド  リレイティッド  ジーンズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ）」，スプリンガー
【００１３】
【非特許文献２】
「ジーンズ  アンド  ディベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」，７巻，ｐ４６８，１９９３年
【００１４】
【非特許文献３】
「グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，７巻，ｐ２８５，１９９７年
【００１５】
【非特許文献４】
「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２５９巻，ｐ１０６０６，１９８４年
【００１６】
【非特許文献５】
「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブザ  ユナイティッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，６９巻，ｐ２１１０，１９７２年
【００１７】
【非特許文献６】
「モレキュラー  ジェネティクス  アンド  ゲノミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」，１６８巻，ｐ１１１，１９７９年
【００１８】
【非特許文献７】
「ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，５６巻，ｐ２０９，１９７１年
【００１９】
【非特許文献８】
「細胞工学別冊  実験プロトコールシリーズ  グライコバイオロジー実験プロトコール  糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン」，秀潤社，１９９６年
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、遺伝子操作によりＩ−ＧｎＴを、マルトース結合タンパク質（以下、ＭＢＰと省略する場合もある）等の糖結合性タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させると、Ｉ−ＧｎＴを可溶性タンパク質として得ることができ、また、該タンパク質は糖結合性タンパク質の特異的親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィーによって容易に精製でき、得られた融合タンパク質がＩ−ＧｎＴ活性を有する事を見いだした。
【００２１】
さらに、本発明者らは、糖結合タンパク質とＩ−ＧｎＴとの融合部位の配列を特異的に切断するプロテアーゼにより、該融合タンパク質からＩ−ＧｎＴも取得できることを見いだした。
【００２２】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００２３】
項１．糖結合性タンパク質とＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとの組換え融合タンパク質。
項２．Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼがヒト由来である項１〜４のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
項３．Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、（ａ）または（ｂ）に記載されるタンパク質である項１又は２に記載の組換え融合タンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
項４．Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４００で示されるアミノ酸配列を含む、項３に記載のタンパク質。
項５．Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、該タンパク質の膜貫通領域の全部又は一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列を含む項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
項６．糖結合性タンパク質とＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとの間にプロテアーゼ認識配列を含む項１〜５のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
項７．糖結合性タンパク質がマルトース結合性タンパク質である項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
項８．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである項６記載の組換え融合タンパク質。
項９．項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
項１０．項９記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
項１１．項１０記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
項１２．以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質の製造方法。
（１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性タンパク質をコードするＤＮＡとＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（２）得られた形質転換体を培養して、糖結合性タンパク質とＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとの融合タンパク質を生成させ、
（３）得られた培養物から、該融合タンパク質を分離する
項１３．Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼがヒト由来である項１２記載の方法。
項１４．Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４００で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項１３記載の方法。
項１５．Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
項１６．Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
項１７．糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
項１８．マルトース結合性タンパク質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ  ｐ２、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ、ｐＭＡＬ  ｃ２、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｇからなる群から選択されるベクターにに由来する項１７に記載の方法。
項１９．項１２〜１８のいずれかに記載の方法により得られる融合タンパク質から、糖結合タンパク質部分を除去してＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを採取する工程を含む、Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
項２０．糖結合タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のＣ末端側にプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテアーゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去する事を特徴とする請求項１９記載の方法。
項２１．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである項２０記載の方法。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｉ−ＧｎＴ活性を有するタンパク質を、Ｉ−ＧｎＴと糖結合タンパク質との融合タンパク質としたこと、該融合タンパク質は可溶性タンパク質であることを特徴とするものである。
【００２５】
さらに、本発明は、Ｉ−ＧｎＴを糖結合タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させることにより、Ｉ−ＧｎＴを可溶性融合タンパク質として生成させるのを可能にしたこと、並びに糖結合タンパク質の有する特異的親和性を利用して融合タンパク質及びＩ−ＧｎＴを容易且つ大量に精製するのを可能にしたことを特徴とする。
【００２６】
本発明の融合タンパク質
本発明において、ＭＢＰなどの糖結合タンパク質とＩ−ＧｎＴとの融合タンパク質（以下、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質の場合には、「ＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴ」と省略する場合もある）は、糖結合タンパク質の有する特異的親和性、すなわちＭＢＰの場合にはマルトース並びにマルトース残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持し、且つＩ−ＧｎＴが有する酵素活性を保持する限り、いかなる形態のものであってもよい。さらに、図１に示すごとく、少なくとも糖結合タンパク質部分を除去した後に得られるＩ−ＧｎＴが本来の酵素活性を保持するものがよい。
【００２７】
好ましくは、該融合タンパク質は、糖結合タンパク質のＣ末端側にＩ−ＧｎＴが連結されたものであり、特に好ましくは糖結合タンパク質とＩ−ＧｎＴが融合部位において、酵素学的または化学的手段により容易に切断され得る構造を有するものである。
【００２８】
糖結合タンパク質とは、糖並びに糖残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持するタンパク質であって、例えば、各種レクチン、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質などが例示できる。好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質などであり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質（以下、ＭＢＰと省略することがある。）である。
【００２９】
糖結合タンパク質は、いかなる生物種由来のものであっても良いが、このましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
【００３０】
また、該ＭＢＰは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する限り、必ずしも全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであっても良い。公知のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有するタンパク質が例示できる。
【００３１】
本発明においては、ＭＢＰをコードする遺伝子としてｐＭＡＬ  ｐ２或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ或いはｐＭＡＬ  ｃ２或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｇ（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に由来するものを使用することができる。
【００３２】
本発明の糖結合タンパク質は、該タンパク質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩ、トロンビン、レニンなどが挙げられるが、好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）又はＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）、エンテロキナーゼ認識配列、すなわち、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号５）、ゲネナーゼＩ認識配列、すなわち、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号６）又はＴｙｒ−Ｈｉｓ（配列番号７）であり、より好ましくは第Ｘａ因子認識配列又はエンテロキナーゼ認識配列である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴの精製後に該プロテアーゼを作用させて、ＭＢＰ部分を容易に除去することができる。
【００３３】
また、より好ましい態様においては、糖結合タンパク質は、糖結合タンパク質部位とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合タンパク質はＩ−ＧｎＴから遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩ融合タンパク質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。本発明の場合には、配列番号９（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ）のスペーサー配列を含むｐＭＡＬ  ｐ２或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ或いはｐＭＡＬ  ｃ２或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｇ（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用することができる。
【００３４】
Ｉ−ＧｎＴも、いかなる生物種由来のものであってよいが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。さらに、本発明において、Ｉ−ＧｎＴは、Ｉ−ＧｎＴ活性を保持する限りＩ−ＧｎＴ全長配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであっても良い。例えば、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質や（ｂ）上記（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってよい。
【００３５】
特に、Ｉ−ＧｎＴはゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、ＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴを可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメイン領域の全部又は一部を除いたＩ−ＧｎＴの一部を使用することも、本発明の好ましい実施態様の１つである。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも２９〜４００で示されるアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。
【００３６】
また、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも２９〜４００で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、Ｉ−ＧｎＴ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３７】
本発明の融合タンパク質の製造方法
本発明において、糖結合タンパク質―Ｉ−ＧｎＴは、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡとＩ−ＧｎＴをコードするＤＮＡを、結果的に上記性質を有する融合タンパク質として転写・翻訳されるように−すなわちインフレームに（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）−連結したキメラＤＮＡを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより取得される。
【００３８】
本発明において、Ｉ−ＧｎＴをコードするＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであっても良いが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。さらに、本発明において、Ｉ−ＧｎＴをコードするＤＮＡは、その転写翻訳産物がＩ−ＧｎＴ活性を保持する限りＩ−ＧｎＴ遺伝子の全コード量ＩＩを含む必要はなく、該コード領域に一部を含むものであっても良い。特に、Ｉ−ＧｎＴはゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、糖結合タンパク質―Ｉ−ＧｎＴを可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメインをコードする領域を除いたＩ−ＧｎＴコード配列を使用することも、本発明の好ましい実施態様の１つである。
【００３９】
Ｉ−ＧｎＴをコードするＤＮＡは、公知のＩ−ＧｎＴ遺伝子配列（例えば、非特許文献２或いは３参照）の配列等に基づいて、自体公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のＩ−ＧｎＴ遺伝子配列を基に、Ｉ−ＧｎＴのコード領域の全部または一部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、Ｉ−ＧｎＴを発現する細胞又は組織から抽出した全ＲＮＡもしくはポリＡ（＋）ＲＮＡ或いは染色体ＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行うことによりクローニングすることができる。このとき、その後ろのベクターへのクローニングを容易にするために、用いるオリゴプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加することもできる。
【００４０】
あるいは、公知のＩ−ＧｎＴ遺伝子配列を基に適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてＩ−ＧｎＴを発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーをプラーク（またはコローニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００４１】
さらに、Ｉ−ＧｎＴをコードするＤＮＡは、部分または完全精製されたＩ−ＧｎＴの全部又は一部を抗原として常法により抗体を作成し、これを用いてＩ−ＧｎＴを発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００４２】
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のＩ−ＧｎＴ遺伝子配列を基にＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲ法によってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
【００４３】
本発明の好ましい態様においては、ヒト由来Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（以下、ｈＩ−ＧｎＴと省略する場合もある）をコードするＤＮＡの全部または一部を含むものである。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４００で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは配列番号１に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号８５〜１２００で示される塩基配列を含むＤＮＡである。或いは、ｈＩ−ＧｎＴをコードするＤＮＡは、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含むＤＮＡである。ｈＩ−ＧｎＴの膜貫通ドメインは、疎水性プロット分析の結果から、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号７〜２５で示される部分であると推定されている。したがって、該ドメインをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号１に示される塩基配列中、塩基番号１９〜７５で示される塩基配列である。
【００４４】
もちろん、ｈＩ−ＧｎＴをコードするＤＮＡは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全部をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、好ましくは配列番号１に示される塩基配列の全部を含むＤＮＡであってもよい。
【００４５】
本発明において、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡは、上述の各種タンパク質をコードするＤＮＡが例示され、好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロール結合タンパク質またはキチン結合タンパク質をコードするＤＮＡであり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００４６】
また、該ＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
【００４７】
また、該ＭＢＰをコードするＤＮＡは、マルトースマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。
【００４８】
大腸菌由来のＭＢＰは、ペリプラズムに存在する分泌タンパク質であり、初期翻訳産物はそのＮ末端にシグナルペプチドを含む。本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、宿主大腸菌で機能し得るシグナルペプチドをコードする塩基配列（シグナル配列）を含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有するグラム陰性菌であるから、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナル配列を含む場合であっても、発現したＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴが培地中にまで分泌される可能性は低い。しかしながら、ＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴがペリプラズム空間に蓄積すれば、菌体を完全に破砕せずにスフェロプラスト化することにより該融合タンパク質を回収することができるので、その後の精製をより容易に行うことができる。但し、この場合には、特にＩ−ＧｎＴの膜貫通ドメインを削除しておくことが好ましい。該ドメインが存在すると、ＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴはペリプラズム空間に到達せずに内膜にとどまる可能性があり、該融合タンパク質の回収が煩雑になるからである。
【００４９】
本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、該タンパク質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩ、トロンビン、レニンなどが挙げられるが、好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）又はＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）、エンテロキナーゼ認識配列、すなわち、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号５）、ゲネナーゼＩ認識配列、すなわち、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号６）又はＴｙｒ−Ｈｉｓ（配列番号７）であり、より好ましくは第Ｘａ因子認識配列又はエンテロキナーゼ認識配列である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴの精製後に該プロテアーゼを作用させて、ＭＢＰ部分を容易に除去することができる。
【００５０】
より好ましい態様においては、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡは、糖結合タンパク質コード領域とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合タンパク質はＩ−ＧｎＴから遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩ融合タンパク質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。
【００５１】
ＭＢＰをコードするＤＮＡは、公知のＭＢＰ遺伝子配列［例えば、大腸菌由来ＭＢＰ（非特許文献４）を基に、Ｉ−ＧｎＴをコードするＤＮＡについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることができ、また、常法によりＭＢＰのＣ末端側に上記のプロテアーゼ認識配列およびスペーサー配列を導入することができる。本発明の場合には、配列番号８のスペーサー配列を含む。
【００５２】
また、大腸菌由来ＭＢＰをコードするＤＮＡは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製のｐＭＡＬ  ｐ２（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬ  ｃ２（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｇ（シグナル配列を欠失する）のような市販のベクターから得ることができる。
【００５３】
糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。Ｉ−ＧｎＴをコードするＤＮＡをベクター中にクローニングする際に、Ｉ−ＧｎＴのＮ末端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡにも同じ制限酵素認識部位（もしくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。
【００５４】
本発明の発現ベクターは、上記の糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴをコードするキメラＤＮＡが、大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモータ領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域および−１０領域が含まれる。所望の組換えタンパク質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより望ましい。このようなプロモーター領域としてｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサータンパク質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサータンパク質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴをコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネーターを用いることができる。本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自立複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、Ｍ１３  ｏｒｉなどが挙げられる。
【００５５】
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００５６】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより調製することができる。宿主の菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
【００５７】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）（非特許文献５参照）、プロトプラスト法（非特許文献６参照）、コンピテント法（非特許文献７参照）、エレクトロポレーション法等が挙げ有られる。
【００５８】
糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴは、上記の糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴをコードするキメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物から糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴを回収することにより得ることができる。
【００５９】
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、多の栄養源［例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など］を培地中に添加しても良い。
【００６０】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
【００６１】
培養を大型タンク内で行う場合は、目的タンパク質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた種培養液を大型タンク中に接種するのが好ましい。
【００６２】
糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴの発現が、誘導タンパク質遺伝子のプロモーター系によって制御される場合、誘導物質は誘導開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．６になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧと省略する場合もある）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加速度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類によって適宜変更することができる。
【００６３】
本発明の方法では、糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴの精製は、該融合タンパク質の存在する画分を、その糖結合タンパク質と特異的に結合する各種糖残基を含むリガンドを結合した不溶性担体をを用いたアフィニティクロマトグラフィーに付することにより、一段階で達成することができる。
【００６４】
例えば、糖結合タンパク質がＭＢＰの場合、ＭＢＰをコードするＤＮＡが、シグナル配列を欠失している場合、ＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴは菌体の可溶性画分に局在するので、その場合、培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理および界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をアフィニティクロマトグラフィーに用いる。
【００６５】
一方、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナル配列を有する場合、発現したＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴは分泌されたペリプラズム空間に蓄積している可能性が高い。したがって、その場合、リゾチーム処理等によって菌体をスフェロプラスト化してＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴを溶液中に遊離させ、濾過もしくは遠心分離して菌体を除去した後、得られる上清をアフィニティクロマトグラフィーに用いる。
【００６６】
アフィニティクロマトグラフィーの吸着体としては、例えば、ＭＢＰの場合には、アミロースをアガロースビーズに固定化したアミロース樹脂（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製のＡｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ等）を使用することができるが、他のＭＢＰに対するリガンド及び他の不溶性マトリックス基（例えばセルロース、デキストラン、合成ポリーマー等）を使用してもよい。
【００６７】
糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴは、上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間撹拌した後濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度の糖結合タンパク質と吸着体の結合を阻害する糖（例えば、ＭＢＰの場合にはマルトース）を含む溶離液を加えて適当な時間撹拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填して糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴ含有画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度の上記溶離液をアプライしてカラムに吸着した糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴを溶出することによって得ることもできる。
【００６８】
このようにして得られた本発明のＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴは、Ｉ−ＧｎＴ活性を有するので、このまま、酵素として使用することができる。
【００６９】
Ｉ−ＧｎＴの調製
上述のように、本発明の好ましい態様においては、糖結合タンパク質―Ｉ−ＧｎＴはその融合部位に配列特異的なプロテアーゼによって認識切断されるアミノ酸配列を含むので、上記のようにして精製された糖結合タンパク質−Ｉ−ＧｎＴに該プロテアーゼを作用させることにより糖結合タンパク質部分が除去されて、所望のＩ−ＧｎＴが生成する。好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子である。本発明においては配列番号３の第Ｘａ因子認識配列を含むｐＭＡＬ  ｐ２、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｃ２、或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用することができる。糖結合タンパク質―Ｉ−ＧｎＴにプロテアーゼを作用させる際の反応温度、溶液のｐＨ、反応時間等は、使用するプロテアーゼの種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、第Ｘａ因子の場合、中性緩衝液中、４〜４０℃で１〜２５時間反応させることにより、糖結合タンパク質とＩ−ＧｎＴとを開裂させることができる。反応終了後、反応液に上記の吸着体を加えて適当な時間撹拌することにより、遊離した糖結合タンパク質のみが吸着体に吸着するので、該吸着体を濾過することによりＩ−ＧｎＴのみを精製することができる。あるいは、該吸着体を充填したカラムに反応液をアプライして素通り画分を回収することによってもＩ−ＧｎＴを精製することができる。
【００７０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
【００７１】
実施例１  ＰＣＲによるｈＩ−ＧｎＴ  ｃＤＮＡ断片の取得及び発現ベクターの構築
（１）ＰＣＲプライマーの設計
配列番号１記載のヒトＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｉ−ＧｎＴ）ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号１０及び１１に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号８５〜１０４で示される塩基配列であり、後者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１１８３〜１２０３で示される塩基配列である。
【００７２】
（２）ヒトテトラカルシノーマ細胞ＰＡ−１株由来ＲＮＡからの逆転写反応
ヒトテトラカルシノーマ細胞ＰＡ−１株からＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ：ＱＩＡＧＥＮ社製品）により抽出した５μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーを用いたＲＴ  ＰＣＲ  ｈｉｇｈ（ＲＴ  ＰＣＲ  ｈｉｇｈ：東洋紡社製）による逆転写反応を行った。得られた反応液をＰＡ−１  １ｓｓｃＤＮＡ溶液とした。
【００７３】
（３）ＰＣＲ反応
上記ＰＡ−１  １ｓｓｃＤＮＡ及び上記合成オリゴヌクレオチドを用いて、以下の条件によりＰＣＲ反応を行った。
［ＰＡ−１  １ｓｓｃＤＮＡ  ２．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡社製）２．５μｌ、Ｘ１０ＫＯＤ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｎｏ．１（東洋紡社製）２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（東洋紡社製）１．０μｌ、１０ｐｍｏｌｅ／μｌの配列番号１０に記載のオリゴヌクレオチド１．０μｌ、１０ｐｍｏｌｅ／μｌの配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチド１．０μｌ、０．３Ｕ／μｌ  ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）０．５μｌ、反応液容量２５μｌ、９８℃（３０秒間）−６１℃（３０秒間）−７４℃（３０秒間）を４サイクル後、  ９８℃（３０秒間）−６４℃（３０秒間）−７４℃（３０秒間）を３１サイクル］。
ＰＣＲ反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片の確認を行った。
【００７４】
（４）塩基配列の確認及び発現ベクターの構築
該ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて切断した後、予め同制限酵素にて切断しておいたｐＭＡＬ  ｃ２或いはｐＭＡＬ  ｐ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート培地で選抜した。
大腸菌より該ＤＮＡ断片を保持するプラスミドを調製、該ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法に従って決定した結果、配列番号１に記載の塩基配列中塩基番号８５〜１２０３で示される塩基配列と一致することが分かり、所望のｈＩ−ＧｎＴのｃＤＮＡ断片が得られたことが確認された。また、ｐＭＡＬ  ｃ２にＰＣＲ断片を連結して構築されたベクターをｐＭＬＩＧＮ−Ｃ１０１、ｐＭＡＬ  ｐ２にＰＣＲ断片を連結して構築されたベクターをｐＭＬＩＧＮ−Ｐ１０１と命名し、発現ベクターの構築も同時に完了した。
【００７５】
実施例２  Ｉ−ＧｎＴの発現確認
（１）組換え大腸菌を用いたＭＢＰ−ｈＩ−ＧｎＴ融合タンパク質の調製
実施例１で得られた発現ベクターｐＭＬＩＧＮ−Ｃ１０１或いはｐＭＬＩＧＮ−Ｐ１０１で形質転換された大腸菌  ＪＭ１０９株を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン、及び０．２％グルコースを含むＬＢ培地５ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３７℃にて一晩振とう培養を行った。得られた培養液５００μｌを、同培地５０ｍｌの入った５００ｍｌ培養フラスコに植菌した。３７℃にて振とう培養を行った後、ＯＤ６６０＝３．０〜４．０に達した時点で、培養温度を２５℃に低下させ、そのまま２５℃にて３０分間培養を行った後、最終濃度０．３ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに２５℃にて培養を１６時間続けた。培養後、菌体を遠心分離により集め、緩衝液１（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５    ０．２Ｍ  ＮａＣｌ    １ｍＭ  ＥＤＴＡ    １ｍＭ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ    １０ｍＭ  ２メルカプトエタノール）２０ｍｌに懸濁、超音波破砕装置にて菌体を破砕した後、遠心分離により得られた上清を粗酵素液とした。予め緩衝液１で平衡化しておいたアミロースレジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）カラム（５ｍｌ）に、該粗酵素液を通過することにより、ＭＢＰ−ｈＩ−ＧｎＴ融合タンパク質を吸着させた。緩衝液１でカラムを洗浄した後、１０ｍＭマルトースを含む緩衝液１で吸着したＭＢＰ−ｈＩ−ＧｎＴ融合タンパク質を溶出させた。溶出画分を集め、脱塩カラムＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にてマルトースを除去したものをＭＢＰ−ｈＩ−ＧｎＴ融合タンパク質溶液とした。
【００７６】
（２）Ｉ−ＧｎＴ基質の調製
ＬＮｎＴ糖鎖（Ｇｌｙｋｏ社製：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＯＨ）（化１）２．０ｍｇを常法に従い（非特許文献８参照）、２アミノピリジンにより蛍光標識・ゲル濾過精製し、ＬＮｎＴ−ＰＡ（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ）を６１６ｎｍｏｌｅを得た。
【００７７】
（３）Ｉ−ＧｎＴ活性測定
０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ８．０を４μｌ、１ｍＭ  ＬＮｎＴ−ＰＡ（上記（２）で得られたもの）を１μｌ、３０６ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ社製）を１μｌ、上記（１）で得られたＭＢＰ−ｈＩ−ＧｎＴ融合タンパク質溶液を５μｌからなる反応液２０μｌを３７℃にて１５分間反応後、１分間の煮沸により反応を停止した。該反応液にＭｉｌｌｉＱ水８０μｌを添加、混合後、遠心分離よって得られ上清２０μｌをＨＰＬＣにより分析し、反応産物のＧＭ１ａ−ＰＡの量を測定した。その結果、ｐＭＬＩＧＮ−Ｃ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９が高いＩ−ＧｎＴ活性を示した（図２）。しかし、ｐＭＬＩＧＮ−Ｐ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９ではＩ−ＧｎＴ活性は検出されなかった。Ｉ−ＧｎＴ活性を上記反応条件により、一分間当たりに１μｍｏｌｅのＮ−アセチルグルコサミンをＬＮｎＴ−ＰＡに転移する酵素量と定義した場合、ｐＭＬＩＧＮ−Ｃ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９のＩ−ＧｎＴの生産性は、１０ｍＵ／Ｌ−Ｂｒｏｔｈと算出された。
【００７８】
【発明の効果】
本発明の方法では、Ｉ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｉ−ＧｎＴ）活性を有する融合タンパク質を可溶性タンパク質として容易に効率よく大量に生産することができる。また、融合タンパク質からＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｉ−ＧｎＴ）そのものも容易に得ることができる。
【００７９】
本発明によって得られるＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｉ−ＧｎＴ）は、自体糖鎖工学研究用試薬として有用で有るだけでなく、得られたＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｉ−ＧｎＴ）を利用することにより、研究用途或いは医薬用途として有用な種々のルイス構造糖鎖、或いはルイス構造糖鎖類似体等の糖鎖合成が容易になる。さらに、種々の有用タンパク質や種々の糖鎖含有化学物質の糖鎖修飾にも利用が可能となる。また、研究用途或いは医薬用途として有用なＩ  分岐形成β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｉ−ＧｎＴ）抗体を容易に得ることが可能となる。
【００８０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、Ｉ−ＧｎＴ  が触媒する反応を示した図である。詳しくは、糖ヌクレオチドであるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）をＮ−アセチルグルコサミン供与体として、糖受容体であるＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒにフコースをα１−３結合で転移し、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成せしめる反応を示した図である。
【図２】本図は、大腸菌で発現させたＭＢＰ−Ｉ−ＧｎＴ融合タンパク質のＩ−ＧｎＴ活性測定の結果を示  した図である。
【図１】
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【図２】
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