(57)【要約】【課題】  動脈硬化病変の検出及び診断に用いる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー及び動脈硬化診断用遺伝子マーカー、該動脈硬化診断用ポリペプチドに特異的に結合する抗体、該動脈硬化診断用遺伝子の発現を検出するプローブ、及び動脈硬化病動脈硬化病変の検出及び診断方法を提供すること。【解決手段】  スロンボスポンディン  タイプ１のモチーフ７を有するディスインテグリン−様及びメタロプロテアーゼであるＡＤＡＭＴＳ７、その遺伝子、及び本発明において検出した３４クローンの遺伝子を動脈硬化病変を特異的に検出することが可能な動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー及び動脈硬化診断用遺伝子マーカーとして用いる。本発明は、該動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーを検出するための抗体、血清中の抗体を検出するための抗原タンパク質、及び、該動脈硬化診断用遺伝子マーカーを検出するためのＤＮＡプローブ等を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＡＭＴＳ７ポリペプチド、ＡＤＡＭＴＳ７ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はＡＤＡＭＴＳ７ポリペプチドのアミノ酸配列の部分ポリペプチドからなる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー。
【請求項２】
ＡＤＡＭＴＳ７ポリペプチドが、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー。
【請求項３】
ＡＤＡＭＴＳ７塩基配列、又はＡＤＡＭＴＳ７塩基配列を含む塩基配列、又はＡＤＡＭＴＳ７塩基配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
【請求項４】
ＡＤＡＭＴＳ７塩基配列が、配列表の配列番号２に示されるＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項３記載の動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
【請求項５】
クローンＳ８Ａ（配列表の配列番号３）、クローンＳ１Ａ１（配列表の配列番号４）、クローンＮ４Ｊ３（配列表の配列番号５）、クローンＮ１１Ｄ１（配列表の配列番号６）、クローンＳ３Ｔ３（配列表の配列番号７）、クローンＳ３Ｍ１（配列表の配列番号８）、クローンＳ１０４（配列表の配列番号９）、又はクローン４７Ｂ２（配列表の配列番号１０）の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
【請求項６】
クローンＳ８Ｋ２（配列表の配列番号１１）、クローンＳ２５Ｑ２（配列表の配列番号１２）、クローンＳ１Ａ２（配列表の配列番号１３）、クローンＳ１Ｂ１（配列表の配列番号１４）、クローンＳ１Ｉ２（配列表の配列番号１５）、クローンＳ１Ｌ２（配列表の配列番号１６）、クローンＳ１Ｔ（配列表の配列番号１７）、クローンＳ３Ｂ（配列表の配列番号１８）、又はクローンＳ３Ｃ２（配列表の配列番号１９）の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
【請求項７】
クローンＳ３Ｑ４（配列表の配列番号２０）、クローンＳ８Ｎ（配列表の配列番号２１）、クローンＳ１１Ｆ（配列表の配列番号２２）、クローンＳ１１Ｈ（配列表の配列番号２３）、クローンＳ１１Ｎ３（配列表の配列番号２４）、クローンＳ１３Ｃ（配列表の配列番号２５）、クローンＳ１３Ｈ２（配列表の配列番号２６）、又はクローンＳ２５Ｊ２（配列表の配列番号２７）の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
【請求項８】
クローンＳ２５Ｐ１（配列表の配列番号２８）、クローンＳ２５Ｓ２（配列表の配列番号２９）、クローン７２３Ｊ（配列表の配列番号３０）、クローン１３４１Ｆ１（配列表の配列番号３１）、クローンＮ４７Ｋ（配列表の配列番号３２）、クローンＮ４７Ｍ（配列表の配列番号３３）、クローンＮ４７Ｏ２（配列表の配列番号３４）、クローンＮ４７Ｔ１（配列表の配列番号３５）、又はクローンＳ１Ｊ３（配列表の配列番号３６）の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか記載の遺伝子が発現するポリペプチド、又は該ポリペプチドの部分ポリペプチドからなる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー。
【請求項１０】
請求項１或いは２、又は請求項９記載のポリペプチドにより誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１１】
抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１０記載の抗体。
【請求項１３】
請求項３〜８のいずれか記載の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項１４】
請求項４〜８のいずれか記載の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項１３記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項１５】
請求項１３又は１４記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする動脈硬化マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【請求項１６】
請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いて、被検試料における動脈硬化診断用マーカーポリペプチドの発現を検出することを特徴とする動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項１７】
請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いる動脈硬化診断用マーカーポリペプチドの発現の検出を、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、プロテインアレイ法、放射線免疫検定法、蛍光抗体法、又はＳＥＲＥＸ法を用いて行うことを特徴とする請求項１６記載の動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項１８】
請求項１或いは２、又は請求項９記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーのポリペプチドの発現をＴＯＦ−ＭＡＳＳ法又はプロテインチップ法を用いて検出することを特徴とする動脈硬化診断法。
【請求項１９】
請求項１或いは２、又は請求項９記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーを用いて、被験体血中における抗体の発現を検出することを特徴とする動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項２０】
請求項１３又は１４記載の診断用プローブを用いて、被検細胞における動脈硬化マーカー遺伝子の発現を検出することを特徴とする動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項２１】
動脈硬化マーカー遺伝子の発現の検出を、ノーザンブロッティング法を用いて行うことを特徴とする請求項２０記載の動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項２２】
動脈硬化マーカー遺伝子の発現の検出を、請求項１５記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行うことを特徴とする請求項２０記載の動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか記載の動脈硬化マーカー遺伝子の発現の検出が、定量的又は半定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とする動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項２４】
定量的又は半定量的ＰＣＲの使用が、ＲＴ−ＰＣＲ法、又はリアルタイムＰＣＲ法であることを特徴とする請求項２３記載の動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項２５】
被検細胞における遺伝子を、所定のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を請求項１３又は１４記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出することを特徴とする請求項２０記載の動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項２６】
請求項１３又は１４記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定した請求項１５記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体の少なくとも一つ以上を装備してなる動脈硬化の検出及び診断用キット。
【請求項２７】
請求項１或いは２、又は請求項９記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーの少なくとも一つ以上を搭載した動脈硬化マーカー抗体検出用診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化病変の検出及び診断に関し、特に、動脈硬化病変を特異的に検出及び診断するのに用いる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー及び動脈硬化診断用遺伝子マーカー、更には該マーカーを用いた動脈硬化の検出及び診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症は、大動脈、冠状動脈、脳動脈或いは頚動脈に多く発生し、心筋梗塞や脳梗塞などの主因となっている疾患である。現在、死亡原因の最上位を占める虚血性心疾患や脳血管障害などの虚血性臓器疾患発症の基礎には、粥状動脈硬化（アテローム性動脈硬化）の存在が重要であるといわれている。動脈硬化病変の病理形態学的特徴は、内皮下にコレステロールエステルを蓄積した細胞（泡沫化細胞）が集積した脂肪線状、更に進行した状態である平滑筋細胞、マクロファージ、Ｔ細胞などの浸潤と細胞壊死と脂肪蓄積が認められる繊維性硬班（fibrous  plaque）にある。脂肪蓄積した部位は構造的脆弱性を示し、血行力学的な力が引き金となり硬班が破綻し、組織因子と血液凝固系因子との反応により急激に血栓が形成される。冠動脈で硬班が破綻し血栓性閉塞が起きることが急性心筋梗塞、不安定狭心症、心臓性突然死などのいわゆる急性冠症候群の発症に密接に関係することが明らかにされて来ている（N. Eng. J. Med.,326,242-250,1992）。
【０００３】
動脈硬化は、自覚症状がないまま徐々に進行し、突如として心筋梗塞、脳梗塞、狭心症などに襲われるため早期発見が必要である。動脈硬化の病変の診断は、従来から、超音波検査、血管撮影、ＭＲＩ等の画像検査、心電図、脳波測定などが広く行われて来ているが、動脈硬化の病変の診断を早期発見に繋げるためには、生化学的検査による方法が望まれている。
【０００４】
生化学的検査による動脈硬化の病変の診断には、従来の方法としては血清中或いは血漿中のＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、リポ蛋白（α）、レムナントリポ蛋白、酸化ＬＤＬなどの血管壁脂質蓄積と関連する動脈硬化症惹起性のリポ蛋白の測定が用いられてきた。特に、近年血液中の動脈硬化関連物質の測定が注目され、炎症性物質：ＣＲＰの測定、クラミジア抗体価の測定が有用であるとの報告がある。
【０００５】
最近、これらの動脈硬化症惹起性のリポ蛋白を測定する動脈硬化の病変の多くの診断方法が開示されている。例えば、ＬＤＬの測定に関するものとしては、血清若しくは血漿中に存在する酸化ＬＤＬと複合体を形成するクラトフェリン、ミエロペルオキシダーゼ、又は顆粒球エラストラーゼなどの血清若しくは血漿中の好中球、単球／マクロファージなどの炎症細胞由来成分を免疫学的方法で測定するもの（特開２００２−４８７９０号公報）、酸化ＬＤＬ受容体の細胞外領域と免疫グロブリンの重鎖の定常領域の一部からなる融合ポリペプチドを用いた免疫学的アッセイ法を用いるもの（特開２００２−１７３５３号公報）、酸化ＬＤＬとα１アンチトリプシン複合体を特異的に認識する抗ヒトアルデヒド修飾−α１アンチトリプシンモノクローナル抗体を用いるもの（特開２０００−１８４８８５号公報、特開平１０−１４２２２６号公報）、血漿中のＬＤＬの酸化変性度をＶ−７０等のアゾ化合物からなる酸化剤により測定することよりなるもの（特開平９−２０３７３６号公報）等が開示されている。
【０００６】
更にリポ蛋白を測定する動脈硬化の病変の診断に関するものとしては、変性血液中のレムナントリポ蛋白（ＩＰＬ）を測定するもの（特開２００２−１８１８２０号公報）、ヒト軟骨ＧＰ３９−Ｌポリペプチドの遺伝子の発現を検出して、リュウマチや動脈硬化の病変の診断を行うもの（特開２００２−１４２７８１号公報）、血液中のアポＢ１００リポ蛋白を測定して動脈硬化の病変の診断を行うもの（特開２００２−５５１０６号公報）、ヒトリン脂質転送タンパク質（ＰＬＴＰ）に対するモノクローナル抗体を用いてＰＬＴＰを測定することによるもの（特開平１１−３４６７８２号公報）、及びアポリポ蛋白Ａ−Ｉ抗体を動脈硬化診断用マーカーとして用いるもの（特開平８−１６００４２号公報）等が開示されている。
【０００７】
また、動脈硬化の病変の診断に関するその他のものとしては、ナトリウム依存性胆汁酸トランスポータータンパク質の抗体を用いて、高脂血症や動脈硬化の病変の診断を行うもの（特開２００３−３１０２８１号公報）、第ＶＩＩ凝固因子−活性プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）をアテローム性動脈硬化症の危険因子として測定して診断するもの（特開２００３−３０４８７３号公報）、血管内皮細胞・平滑筋細胞由来ニューロピリン様分子（ＥＳＤＮ）、やその遺伝子の発現を検出して動脈硬化の検査を行うもの（特開２００３−１８９８７２号公報）、抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体を用いるもの（特開２００２−３０８９００号公報）、血漿試料中のセロトニン濃度をマーカーとして動脈硬化の病変の診断を行うもの（特開２００２−２７７４６１号公報、特開２００２−１３１３１３号公報））、等が開示されている。
【０００８】
更に、動脈硬化の病変の診断に関するその他のものとして、サイトカイン／増殖因子のＴＧＦ−βフアミリーのメンバーであるＤＰＰのシグナル伝達に必要とされるＭＡＤのイソ型ｓＭＡＤ３ポリペプチドを標的として、慢性腎不全、アテローム性動脈硬化の診断を行うもの（（特開２００２−２３８５８９号公報）、血液中のＬｐ（α）とα２−マクログロブリン／インターロイキン６との複合体を測定対象とし、その抗体を用いて免疫学的方法により測定するもの（特開２００１−２４９１２８号公報）、パラオキソナ−ゼに対するモノクローナル抗体を用いるもの（特開２０００−３３３６７４号公報）、飽和極長脂肪酸を測定して動脈硬化の検定を行うもの（特開２０００−２０６１１３号公報）、ＲＣ−９タンパク質、及びその抗体を用いてアテローム性動脈硬化症の診断を行うもの（特表２０００−５０３７６４号公報）等が開示されている。このように、動脈硬化の病変の診断に関する生化学的検査については、近年多くの方法が開示されているが、それらの検出マーカーはリスクマーカーがほとんどで、動脈硬化の病変の特異的診断のためには、該病変を特異的に検出できるマーカーの更なる開発が要望されている。
【０００９】
一方、メタロプロテアーゼのＡＤＡＭ（A Disintegrin And Metalloprotease）の特徴を示し、そして更にスロンボスポンジン（thrombospondin）ドメイン（ＴＳ）を含むタンパク質としてＡＤＡＭＴＳタンパク質が知られている。プロトタイプのＡＤＡＭＴＳは、マウスにおいて同定され、心臓及び腎臓内で発現され、そして炎症誘発性の刺激によりアップレギュレートされることが判明している（Journal of Biological Chemistry,272,556,January 1997）。ＡＤＡＭＴＳはこれまで９つのメンバーが認められており、このフアミリーのメンバーは、軟骨に重要な機械特性を提供し、そして関節炎の進行の間に失われる高分子量のプロテオグリカンであるアグレカン(aggrecan)を分解する能力を持つことが知られている。
【００１０】
例えば、マウスＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は、マトリックスメタロプロテアーゼドメイン及びディスインテグリンドメインを有し、また、スロンボスポンジンドメインを有するが、マトリックスメタロプロテアーゼドメイン及びディスインテグリンドメインを有するＡＤＡＭフアミリーには、骨や筋肉代謝、癌増殖抑制、又は受精に関与する各種タンパク質が含まれ、また、スロンボスポンジンには血管新生阻害作用、及び癌抑制作用があることが知られており、近年、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を医薬として利用することのいくつかの開示がなされている（特開２００３−１８０３８４号公報；特開２００２−３３０７６２号公報；特開２００２−３３０７６１号公報；特開２００１−３２７２９７号公報；特開２００１−３０９７９４号公報；特開平１１−４６７８１号公報）。ヒトＡＤＡＭＴＳ５〜７については、J. Biol. Chem. 274(36),25555-25563,1999,に報告されている。
【００１１】
【特許文献１】特開２００３−３１０２８１号公報。
【特許文献２】特開２００３−３０４８７３号公報。
【特許文献３】特開２００３−１８９８７２号公報。
【特許文献４】特開２００３−１８０３８４号公報。
【特許文献５】特開２００２−３３０７６２号公報。
【特許文献６】特開２００２−３３０７６１号公報。
【特許文献７】特開２００２−３０８９００公報。
【特許文献８】特開２００２−２７７４６１号公報。
【特許文献９】特開２００２−２３８５８９号公報。
【特許文献１０】特開２００２−１８１８２０号公報。
【特許文献１１】特開２００２−１４２７８１号公報。
【特許文献１２】特開２００２−１３１３１３号公報。
【特許文献１３】特開２００２−５５１０６号公報。
【特許文献１４】特開２００２−４８７９０号公報。
【特許文献１５】特開２００２−１７３５３号公報。
【特許文献１６】特開２００１−３２７２９７号公報。
【特許文献１７】特開２００１−３０９７９４号公報。
【特許文献１８】特開２００１−２４９１２８号公報。
【特許文献１９】特開２０００−３３３６７４号公報。
【特許文献２０】特開２０００−２０６１１３号公報。
【特許文献２１】特開２０００−１８４８８５号公報。
【特許文献２２】特開平１１−３４６７８２号公報。
【特許文献２３】特開平１１−４６７８１号公報。
【特許文献２４】特開平１０−１４２２２６号公報。
【特許文献２５】特開平９−２０３７３６号公報。
【特許文献２６】特開平８−１６００４２号公報。
【特許文献２７】特表２０００−５０３７６４号公報。
【非特許文献１】N. Eng. J. Med.,326,242-250,1992。
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry,272,556,January 1997。
【非特許文献３】J. Biol. Chem. 274(36),25555-25563,1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、動脈硬化病変の検出及び診断に用いる、動脈硬化病変を特異的に検出可能な動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー及び動脈硬化診断用遺伝子マーカー、該動脈硬化診断用ポリペプチドに特異的に結合する抗体、該動脈硬化診断用遺伝子の発現を検出するプローブ、更には該マーカーを用いた動脈硬化病変の検出及び診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、動脈硬化病変を特異的に検出することが可能な動脈硬化診断用マーカーを見い出すべく、動脈硬化性病変羅患患者の血清中に発現するタンパク質について、探索を行った結果、スロンボスポンディン  タイプ１のモチーフ７を有するディスインテグリン−様及びメタロプロテアーゼであるＡＤＡＭＴＳ７が、動脈硬化病変を特異的に検出することが可能な動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーとなることを見い出し、本発明を完成するに至った。本発明は、本発明の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー、該ポリペプチドマーカーを検出するための、該ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を含むものである。本発明の動脈硬化診断用ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される。
【００１４】
本発明は、上記本発明の動脈硬化診断用ポリペプチドをコードする塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカーを含むものであり、該塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する動脈硬化診断用マーカー遺伝子検出用プローブを含むものである。該動脈硬化診断用マーカー遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号２に示される。
更に、本発明者は、動脈硬化病変を特異的に検出することが可能な動脈硬化診断用マーカーを見い出すべく探索を行った結果、更に３４クローンの遺伝子を動脈硬化診断用遺伝子マーカーとして検出し、該遺伝子の塩基配列について同定を行った。該遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号３〜３６に示される。本発明は、該塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する動脈硬化診断用マーカー遺伝子検出用プローブをもまた含むものである。
【００１５】
更に、本発明は、上記本発明の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー及び動脈硬化診断用遺伝子マーカーを利用した動脈硬化の検出及び診断方法、及び該検出及び診断方法に用いるキット等を含むものである。
【００１６】
本発明において、発明を完成するに至った経緯について説明すると、本発明者は、動脈硬化病変を特異的に検出することが可能な動脈硬化診断用マーカーを見い出すべく、病院、及び協力施設に入院した動脈硬化性病変罹患患者の血清を本人、または家族の了解を得てスクリーニングを行った。得られたｃＤＮＡクローンはプラスミドpBlueScriptIIに組み込み塩基配列を決定した。その後プラスミドpGEXに組み替え大腸菌に導入し、ＩＰＴＧを加えてタンパク質を大量発現させタンパク質抽出液を調製した。それを用いて多数の患者血清との反応をウェスタン法により調べた。その結果、本発明のマーカーである３５クローンが動脈硬化病変罹患患者血清と陽性反応を示し動脈硬化性病変の存在、もしくは不安定性プラークの特異的マーカーとして有用であることを見い出した。そして、これらのクローンの抗原性や遺伝子のプローブを利用し、動脈硬化の検出及び診断方法を開発し、更には該検出及び診断方法に用いる遺伝子及びプロテインアレイでの診断キットの作製を可能とした。
【００１７】
すなわち具体的には本発明は、（１）ＡＤＡＭＴＳ７ポリペプチド、ＡＤＡＭＴＳ７ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はＡＤＡＭＴＳ７ポリペプチドのアミノ酸配列の部分ポリペプチドからなる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーや、（２）ＡＤＡＭＴＳ７ポリペプチドが、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする前記（１）記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーや、（３）ＡＤＡＭＴＳ７塩基配列、又はＡＤＡＭＴＳ７塩基配列を含む塩基配列、又はＡＤＡＭＴＳ７塩基配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカーや、（４）ＡＤＡＭＴＳ７塩基配列が、配列表の配列番号２に示されるＤＮＡ配列を有することを特徴とする前記（３）記載の動脈硬化診断用遺伝子マーカーや、（５）クローンＳ８Ａ（配列表の配列番号３）、クローンＳ１Ａ１（配列表の配列番号４）、クローンＮ４Ｊ３（配列表の配列番号５）、クローンＮ１１Ｄ１（配列表の配列番号６）、クローンＳ３Ｔ３（配列表の配列番号７）、クローンＳ３Ｍ１（配列表の配列番号８）、クローンＳ１０４（配列表の配列番号９）、又はクローン４７Ｂ２（配列表の配列番号１０）の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカーや、（６）クローンＳ８Ｋ２（配列表の配列番号１１）、クローンＳ２５Ｑ２（配列表の配列番号１２）、クローンＳ１Ａ２（配列表の配列番号１３）、クローンＳ１Ｂ１（配列表の配列番号１４）、クローンＳ１Ｉ２（配列表の配列番号１５）、クローンＳ１Ｌ２（配列表の配列番号１６）、クローンＳ１Ｔ（配列表の配列番号１７）、クローンＳ３Ｂ（配列表の配列番号１８）、又はクローンＳ３Ｃ２（配列表の配列番号１９）の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカーや、（７）クローンＳ３Ｑ４（配列表の配列番号２０）、クローンＳ８Ｎ（配列表の配列番号２１）、クローンＳ１１Ｆ（配列表の配列番号２２）、クローンＳ１１Ｈ（配列表の配列番号２３）、クローンＳ１１Ｎ３（配列表の配列番号２４）、クローンＳ１３Ｃ（配列表の配列番号２５）、クローンＳ１３Ｈ２（配列表の配列番号２６）、又はクローンＳ２５Ｊ２（配列表の配列番号２７）の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカーや、（８）クローンＳ２５Ｐ１（配列表の配列番号２８）、クローンＳ２５Ｓ２（配列表の配列番号２９）、クローン７２３Ｊ（配列表の配列番号３０）、クローン１３４１Ｆ１（配列表の配列番号３１）、クローンＮ４７Ｋ（配列表の配列番号３２）、クローンＮ４７Ｍ（配列表の配列番号３３）、クローンＮ４７Ｏ２（配列表の配列番号３４）、クローンＮ４７Ｔ１（配列表の配列番号３５）、又はクローンＳ１Ｊ３（配列表の配列番号３６）の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカーや、（９）前記（５）〜（８）のいずれか記載の遺伝子が発現するポリペプチド、又は該ポリペプチドの部分ポリペプチドからなる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーからなる。
【００１８】
また本発明は、（１０）前記（１）或いは（２）、又は（９）記載のポリペプチドにより誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体や、（１１）抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１０）記載の抗体や、（１２）抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする前記（１０）記載の抗体や、（１３）前記（３）〜（８）のいずれか記載の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブや、（１４）前記（４）〜（８）のいずれか記載の遺伝子の塩基配列；又は該遺伝子の塩基配列を含む塩基配列；又は該遺伝子配列の部分塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる前記（１３）記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブや、（１５）前記（１３）又は（１４）記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする動脈硬化マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップからなる。
【００１９】
更に本発明は、（１６）前記（１０）〜（１２）のいずれか記載の抗体を用いて、被検試料における動脈硬化診断用マーカーポリペプチドの発現を検出することを特徴とする動脈硬化の検出及び診断方法や、（１７）前記（１０）〜（１２）のいずれか記載の抗体を用いる動脈硬化診断用マーカーポリペプチドの発現の検出を、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、プロテインアレイ法、放射線免疫検定法、蛍光抗体法、又はＳＥＲＥＸ法を用いて行うことを特徴とする前記（１６）記載の動脈硬化の検出及び診断方法や、（１８）前記（１）或いは（２）、又は（９）記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーのポリペプチドの発現をＴＯＦ−ＭＡＳＳ法又はプロテインチップ法を用いて検出することを特徴とする動脈硬化診断法や、（１９）前記（１）或いは（２）、又は（９）記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーを用いて、被験体血中における抗体の発現を検出することを特徴とする動脈硬化の検出及び診断方法や、（２０）前記（１３）又は（１４）記載の診断用プローブを用いて、被検細胞における動脈硬化マーカー遺伝子の発現を検出することを特徴とする動脈硬化の検出及び診断方法や、（２１）動脈硬化マーカー遺伝子の発現の検出を、ノーザンブロッティング法を用いて行うことを特徴とする前記（２０）記載の動脈硬化の検出及び診断方法や、（２２）動脈硬化マーカー遺伝子の発現の検出を、前記（１５）記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行うことを特徴とする前記（２０）記載の動脈硬化の検出及び診断方法や、（２３）前記（２０）〜（２２）のいずれか記載の動脈硬化マーカー遺伝子の発現の検出が、定量的又は半定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とする動脈硬化の検出及び診断方法や、（２４）定量的又は半定量的ＰＣＲの使用が、ＲＴ−ＰＣＲ法、又はリアルタイムＰＣＲ法であることを特徴とする前記（２３）記載の動脈硬化の検出及び診断方法や、（２５）  被検細胞における遺伝子を、所定のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を前記（１３）又は（１４）記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出することを特徴とする前記（２０）記載の動脈硬化の検出及び診断方法や、（２６）  前記（１３）又は（１４）記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定した前記（１５）記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び前記（１０）〜（１２）のいずれか記載の抗体の少なくとも一つ以上を装備してなる動脈硬化の検出及び診断用キットや、（２７）前記（１）或いは（２）、又は（９）記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーの少なくとも一つ以上を搭載した動脈硬化マーカー抗体検出用診断キットからなる。
【発明の効果】
【００２０】
動脈硬化は、自覚症状がないまま徐々に進行し、突如として心筋梗塞、脳梗塞、狭心症などに襲われるため早期発見が必要である。動脈硬化の病変の診断は、従来から、超音波検査、血管撮影、ＭＲＩ等の画像検査、心電図、脳波測定などが広く行われて来ているが、動脈硬化の病変の診断を早期発見に繋げるためには、生化学的検査による方法が重要である。本発明のポリペプチドマーカーや遺伝子マーカーを利用することにより、動脈硬化の病変の特異的な検出診断が可能となり、動脈硬化の病変の早期発見に繋げることが可能となる。また、本発明のポリペプチドマーカーや遺伝子マーカーの検出のために、本発明のマーカーポリペプチドに結合する抗体や本発明のマーカー遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡプローブ等をチップやアレイの形で用意することにより、簡便な操作で動脈硬化の病変の検出及び診断を行うことが可能となり、動脈硬化の早期発見に大きく貢献することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、動脈硬化の病変で特異的に発現する、動脈硬化診断用マーカーポリペプチド又は動脈硬化診断用マーカー遺伝子の発現を検出して、動脈硬化の病変の検出及び診断を行うことよりなる。本発明において、動脈硬化診断用のポリペプチドマーカーとなるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、本発明において動脈硬化診断用遺伝子マーカーとなる遺伝子は、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子である。
【００２２】
配列表の配列番号１に示されるポリペプチドは、スロンボスポンディン  タイプ１のモチーフ７を有するディスインテグリン−様及びメタロプロテアーゼ（a disintegrin-like and metalloprotease(reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif,7）であるＡＤＡＭＴＳ７のポリペプチドであり、配列表の配列番号２に示される遺伝子は、該ポリペプチドをコードするＡＤＡＭＴＳ７の遺伝子である（J. Biol. Chem. 274(36),25555-25563,1999）。該ポリペプチドは、細胞外マトリックス分解酵素のひとつであり、自然免疫や炎症反応において重要な役割を担っている。本発明の動脈硬化診断用マーカーポリペプチド及びマーカー遺伝子のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列情報は、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、アクセッションナンバー：ＮＭ＿０１４２７２によりアプローチすることができる。
【００２３】
更に、本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子は、以下に列挙するクローンの遺伝子であり、その塩基配列は以下に記載するそれぞれの配列表の配列番号に示され、該遺伝子のＤＮＡ配列（塩基配列）情報は、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、以下に記載するそれぞれのアクセッションナンバーによりアプローチすることができる。
【００２４】
すなわち、本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子は、［クローン名：Ｓ８Ａ；配列表の配列番号３；Accession No.：NM_001402；遺伝子名： eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1；遺伝子の説明：アミノアシルｔＲＮＡの輸送に関与する。］、［クローン名：Ｓ１Ａ１；配列表の配列番号４；Accession No.：NM_003938；遺伝子名：Adaptor-related protein complex 3, delta 1 subunit 遺伝子の説明：細胞内小胞輸送に関与する。］、［クローン名：Ｎ４Ｊ３；配列表の配列番号５；Accession No.：NM_003118；遺伝子名： Secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin)；遺伝子の説明：細胞外マトリックスの構築に関与する分泌タンパク質。］、［クローン名：Ｎ１１Ｄ１；配列表の配列番号６；Accession No.：NM_002337；遺伝子名： Low density lipoprotein-related protein-associated protein 1：遺伝子の説明：LDLレセプター構成タンパク質のひとつ。］、［クローン名：Ｓ３Ｔ３；配列表の配列番号７；Accession No.：NM_002946；遺伝子名： replication protein A2；遺伝子の説明：DNA修復に関与。］、［クローン名：Ｓ３Ｍ１；配列表の配列番号８；Accession No.：NM_139281；遺伝子名： T-cell activation WD repeat protein；遺伝子の説明：不詳。］、［クローン名：Ｓ１０４；配列表の配列番号９；Accession No.：NM_145117；遺伝子名： Neuron navigator 2；遺伝子の説明：ビタミンＡを介する神経成長に関与。］、及び、［クローン名：４７Ｂ２；配列表の配列番号１０；Accession No.：NM_003246；遺伝子名：thrombospondin 1；遺伝子の説明：内皮細胞の血栓形成等の調節。］からなる。
【００２５】
また、本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子は、［クローン名：Ｓ８Ｋ２；配列表の配列番号１１；Accession No.：NM_006597；遺伝子名： heat shock 70kDa protein 8；遺伝子の説明：シャペロン。］、［クローン名：Ｓ２５Ｑ２；配列表の配列番号１２；遺伝子： heat shock 27kDa protein 1と相同性が高い；遺伝子の説明：シャペロン。］、［クローン名：Ｓ１Ａ２；配列表の配列番号１３；Accession No.：NM_004926；遺伝子名： Zinc finger protein 36, C3H type-like 1；遺伝子の説明：転写因子と想定される。］、［クローン名：Ｓ１Ｂ１；配列表の配列番号１４；Accession No.：AF483215；遺伝子名：Histocompatibility (minor) 13；遺伝子の説明：免疫に関与する膜タンパク質。］、［クローン名：Ｓ１Ｉ２；配列表の配列番号１５；Accession No.：NM_014684；遺伝子名： KIAA0373 gene product；遺伝子の説明：機能不詳。］、［クローン名：Ｓ１Ｌ２；配列表の配列番号１６；Accession No.：NM_000967；遺伝子名： Ribosomal protein L3t；遺伝子の説明：60Ｓリボゾームタンパク質の構成要素。］、［クローン名：Ｓ１Ｔ；配列表の配列番号１７；Accession No.：NM_133494；遺伝子名：NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 7；遺伝子の説明：アスペルギルスの分裂関連タンパク質に相同性あり。］、［クローン名：Ｓ３Ｂ；配列表の配列番号１８；Accession No.：NM_002945；遺伝子名：replication protein A1；遺伝子の説明：DNA複製、修復なに関係するＤＮＡ結合タンパク質。］、及び［クローン名：Ｓ３Ｃ２；配列表の配列番号１９；Accession No.：NM_005054；遺伝子名：RAN binding protein 2-like 1；遺伝子の説明：ＲＮＡ結合タンパク質。］からなる。
【００２６】
更に、本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子は、［クローン名：Ｓ３Ｑ４；配列表の配列番号２０；Accession No.：NM_144582；遺伝子名：testis expressed sequence 11；遺伝子の説明：マウス精巣に発現する遺伝子に相似。］、［クローン名：Ｓ８Ｎ；配列表の配列番号２１；Accession No.：NM_015089；遺伝子名：Homo sapiens p53-associated parkin-like cytoplasmic protein；遺伝子の説明：p53の細胞質内局在を行う。］、［クローン名：Ｓ１１Ｆ；配列表の配列番号２２；Accession No.：XM_168590；遺伝子名：zuotin related factor 1；遺伝子の説明：Ｍ期タンパク質。］、［クローン名：Ｓ１１Ｈ；配列表の配列番号２３；Accession No.：AY026527；遺伝子名：TBC1 domain family, member 2；遺伝子の説明：ＳＥＲＥＸ法で同定された前立腺抗原。］、［クローン名：Ｓ１１Ｎ３；配列表の配列番号２４；Accession No.：NM_005324；遺伝子名：H3 histone, family 3B (H3.3B)；遺伝子の説明：ヒストンファミリー。］、［クローン名：Ｓ１３Ｃ；配列表の配列番号２５；Accession No.：NM_015548；遺伝子名：dystonin；遺伝子の説明：S細胞骨格、細胞接着に関与。］、［クローン名：Ｓ１３Ｈ２；配列表の配列番号２６；Accession No.：NM_004566；遺伝子名：6-phosphofructo-2-kinase/fructose -2,6-biphosphatase 3；遺伝子の説明：糖代謝に関与。］、及び、［クローン名：Ｓ２５Ｊ２；配列表の配列番号２７；Accession No.：NM_032121；遺伝子名：implantation-associated protein；遺伝子の説明：機能不詳］からなる。
【００２７】
また、本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子は、［クローン名：Ｓ２５Ｐ１；配列表の配列番号２８；Accession No.：NM_001071；遺伝子名：thymidylate synthetase；遺伝子の説明：DNA修復、複製に関与。］、［クローン名：Ｓ２５Ｓ２；配列表の配列番号２９；Accession No.：BC007942；遺伝子名：synaptonemal complex protein SC65；遺伝子の説明：肝質性膀胱炎の自己抗原。］、［クローン名：７２３Ｊ；配列表の配列番号３０；Accession No.：NM_032025；遺伝子名：eukaryotic translation initiation factor (eIF) 2A；遺伝子の説明：翻訳に関連。］、［クローン名：１３４１Ｆ１；配列表の配列番号３１；Accession No.：AB011175；遺伝子名：TBC1 domain family, member 4；遺伝子の説明：ＴＢＣドメインを有するタンパク質。］、［クローン名：Ｎ４７Ｋ；配列表の配列番号３２；Accession No.：NM_002778；遺伝子名：prosaposin；遺伝子の説明：saposinの前駆タンパク質。］、［クローン名：Ｎ４７Ｍ；配列表の配列番号３３；Accession No.：NM_003400；遺伝子名：exportin 1；遺伝子の説明：シグナル伝達に関連。］、［クローン名：Ｎ４７Ｏ２；配列表の配列番号３４；Accession No.：NM_016441；遺伝子名：cysteine-rich motor neuron 1；遺伝子の説明：運動神経の成長に関連］、［クローン名：Ｎ４７Ｔ１；配列表の配列番号３５；Accession No.：NM_001404；遺伝子名：eukaryotic translation elongation factor 1 gamma；遺伝子の説明：タンパク質翻訳に関連。］、［クローン名：Ｓ１Ｊ３；配列表の配列番号３６；Accession No.：NM_006129］；遺伝子名：Bone morphogenetic protein 1；遺伝子の説明：プロテアーゼ。］からなる。
【００２８】
本発明において、本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子の発現を検出するには公知の遺伝子の発現の検出方法を用いることができる。例えば、本発明のＡＤＡＭＴＳ７遺伝子の発現を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、本発明の遺伝子マーカーにより、動脈硬化の病変を検出、識別するために、本発明の動脈硬化診断用遺伝子マーカーのＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するプローブを用いることができる。該プローブを用いて動脈硬化の病変を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、配列表に示した遺伝子マーカーのＤＮＡ配列から適宜の長さのＤＮＡプローブを作製し、適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを被検体とハイブリダイズすることにより、動脈硬化のマーカー遺伝子の発現の検出を行う。該ＤＮＡプローブとしては、配列表に示した本発明の遺伝子マーカーの塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる動脈硬化診断用マーカー遺伝子検出用プローブを用いることができる。また、該プローブを、少なくとも１つ以上を固定化させたマーカー遺伝子検出用のマイクロアレイ又はＤＮＡチップの形で用いることもできる。
【００２９】
なお、上記ＤＮＡプローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「動脈硬化診断用マーカー遺伝子のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３０】
本発明において、本発明の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーの検出を行うには、該ポリペプチドによって誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて行うことができる。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を挙げることができる。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドマーカーを抗原として、常法により作製することができる。本発明の抗体を用いて、被検試料における動脈硬化診断用マーカーポリペプチドの発現を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的測定法を用いて実施することができる。該免疫学的測定法としては、例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、放射線免疫検定法、蛍光抗体法を挙げることができる。また、組換え発現クローニングによる血清学的抗原同定法であるＳＥＲＥＸ（Serological identification of antigens by recombinant cDNA expression cloning）法を用いることもできる。
【００３１】
本発明においては、本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子検出用プローブ及び／又は本発明の動脈硬化診断用マーカーポリペプチド検出用抗体を用いて、被検試料における動脈硬化診断用マーカー遺伝子及び／又は動脈硬化診断用マーカーポリペプチドの発現を検出し、動脈硬化の病変を診断することができる。被検細胞における動脈硬化診断用マーカー遺伝子の検出に際しては、被検試料における遺伝子を増幅するために、定量的又は半定量的ＰＣＲを用いることができる。該ＰＣＲとしてはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）又はリアルタイムＰＣＲ法を用いることができる。該ＰＣＲを行うに際しては、本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子を増幅するためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーからなるプライマーを用いる。該プライマーの構築は、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３〜３６に示される塩基配列に基づいて適宜行うことができる。
【００３２】
本発明において、動脈硬化の病変の検出及び診断を行うには、被検試料の細胞における遺伝子を、上記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を本発明の動脈硬化診断用マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出する。
【００３３】
本発明の抗体を用いて蛍光抗体法を用いて、被検試料細胞における動脈硬化診断用マーカーポリペプチドの発現を検出し、可視的に動脈硬化の病変の検出を行うことができる。蛍光抗体法により動脈硬化診断用ポリペプチドを発現している細胞を標識化するには、本発明の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を蛍光標識し、これを抗原を発現している試料細胞に結合させて、動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーを発現する細胞を標識化する（直接蛍光抗体法）か、或いは、抗原を発現している細胞に、未標識の本発明の特異抗体を結合させた後に、標識化した二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）を結合させて動脈硬化診断用ポリペプチドを標識化し（間接蛍光抗体法）、該標識化した動脈硬化診断用ポリペプチドを発現する細胞を検出し、診断を行う。
【００３４】
本発明の動脈硬化病変の検出及び診断に用いる動脈硬化診断用マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定した動脈硬化診断用マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び本発明の動脈硬化診断用マーカーポリペプチド検出用の抗体は、それらを装備した動脈硬化病変の検出及び診断用キットとして製品化しておくことができる。
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
［実験手順−ＳＥＲＥＸ法、ウェスタン法、ＥＬＩＳＡ法］
（試料の調製）
（１）病院および研究協力施設を受診した頚動脈狭窄症患者を対象とし、外来受診者の中から性別・年齢（±5歳）を一致させた，正常被験者をコントロールとして選択した。外来受診時又は脳神経外科入院時に，１）研究目的や研究協力の任意性などを家族に説明しインフォームド・コンセントを得た上で，２）家族歴・既往歴・飲酒や喫煙難などのライフスタイル，作業態様に関する問診を行い，３）採血を行って血清と血球成分を分離凍結保存する。さらに，４）医師の診療録を基に，臨床的重症度，治療経過，血液検査所見などを記載する。解析対象の患者血液は血清分離後マイナス８０度にて研究開始まで凍結保存する。抗体および診療録は暗号匿名化した後、使用する。
（２）血清によるスクリーニング対象はヒト臍帯静脈内皮(ＨＵＶＥＣ)由来ｃＤＮＡライブラリーを組み込んだ市販λＺＡＰ  IIファージベクター(STRATAGENE)を用いる。
【００３７】
（ＳＥＲＥＸ法実験手順）
（３）ＳＥＲＥＸ法によるスクリーニングはSahinらの方法に準じて実施する。
１）上記（２）のファージベクターを大腸菌（XL1-Blue）に感染させ、１５ｃｍＮＺＹagar培地上で培養する。
２）プラークが出現したのを確認後、ＩＰＴＧ（isopropyl thiogalactoside）処理したニトロセルロース膜を培地上にのせ膜にファージ由来タンパク質を発現、転写させる。
３）０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍希釈した患者血清と膜と一夜インキュベートし発現タンパク質と血清中抗体を反応させる。
４）洗浄後２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を膜と反応させる。
５）発色試薬としてＮＢＴ、ＢＣＩＰを使い血清ＩｇＧ認識クローンを同定する。
６）陽性クローンは２、３次スクリーニング（１０ｃｍ dish）を行い、偽陽性クローンを排除する。
７）選択されたファージをExAssist helper phage system(Stratagene, La Jolla, CA)によりpBlueScriptに変換する。
８）Rapid plasmid miniprep system(Marigen)を用いプラスミドを精製する。
９）塩基配列決定は外部委託もしくはDNA Sequencing kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems)を使用しＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００ DNA Analyzer (Applied Biosystems)により実施する。得られた塩基配列を公開されているデータベース上の塩基配列と照合し得られえたクローンの相同性検索を行う。この時点で読み枠の違ったクローンを除外し残ったものを抗原タンパク質候補としタンパク質精製の過程へと進める。
【００３８】
（ＥＬＩＳＡ法実験手順）
（４）２次スクリーニングとしてのＥＬＩＳＡ法の準備
１）抗原タンパク質候補のインサートを含むpBlueScriptをタンパク質発現、精製用ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham bioscience）への組み換えを行う。得られた塩基配列情報よりpBlueScriptよりｐＧＥＸへの組み換えに適した制限酵素、ｐＧＥＸプラスミド（4T1-3）を選択し制限酵素処理を行う。
２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動後目的のバンドを精製キットGeneElute Minus EtBr Spin Columns(ＳＩＧＭＡ)を用い切り出し，制限酵素処理されたインサートおよびｐＧＥＸを回収する。
３）Ligation kit ver.2（Takara）を用いインサートとｐＧＥＸをライゲーションしインサートを含むプラスミドを作製する。
４）クローンにより適当な制限酵素が存在しない場合にはＰＣＲ法によりインサートを作製する。あらかじめ制限酵素認識部位を持つプライマーを外注により作製し動脈瘤組織より抽出したＲＮＡを鋳型に逆転写ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを作製、さらにＰＣＲを行い全長のインサートを得る。以下は同様に制限酵素、ライゲーションキットを用いたライゲーションを行う
５）真核細胞タンパク質発現用に改良された大腸菌コンピテントセルＢＬ２１(DE3) RIL codon plus(STRATAGENE)に得られたｐＧＥＸを形質転換する
６）アンピシリン入りＬＢ培地で培養、ＩＰＴＧでインサートＤＮＡ由来タンパク質の発現を誘導する。
７）大腸菌を遠心分離回収し超音波破砕、可溶画分と不溶画分に分離する
８）目的タンパク質が不溶画分に入る場合は尿素を用い可溶化を行う
９）得られた可溶タンパク質を、GSTrapFF（Amersham Bioscience）を用いＧＳＴ融合タンパク質のみを精製する
１０）カラムよりのタンパク質の抽出はトロンビン切断により行う。
【００３９】
（ウェスタン法実験手順）
（５）ウェスタン法による２次スクリーニング
１）上記で得られた形質転換されたＢＬ２１(DE3) RIL codon plusをＬＢアンピシリン２ｍｌで１夜培養する。
２）ＬＢアンピシリン２０ｍｌに移し変え１時間培養後ＩＰＴＧ終濃度１ｍＭとなるように加えたものとコントロールをさらに３時間培養する。
３）培養液を遠心後、大腸菌を回収しサンプルバッファーにて溶解、ウェスタン法のサンプルとする。
４）１２％ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを電気泳動後、転写装置でニトロセルロース膜にタンパク質を転写する。
５）１％スキムミルクでｂｌｏｃｋｉｎｇ後、５０００倍患者血清を1次抗体として加え、１夜インキュベートする。
６）ＴＢＳＴで洗浄後、１万倍希釈ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加え２０分間反応させる
７）ＴＢＳＴで洗浄後、発色試薬Immunostar (WAKO)を使い発色させる。
８）フィルムに感光させる。
９）コントロールに無くＩＰＴＧ誘導に存在するバンドを陽性バンドとする。
【００４０】
（ＥＬＩＳＡ法実験手順）
（６）ELISA法による２次スクリーニング
１）ＳＥＲＥＸ法にて得られた精製タンパク質をＥＬＩＳＡ法の固相とする。９６穴ＥＬＩＳＡプレートに５０μｇ/ｍｌの濃度の精製タンパク質を入れ一晩４℃で保存、固相化させる。
２）前述のタンパク質精製によりクローンあたり５ｍｇの精製タンパク質の採取を目標とする。
３）ＰＢＳ洗浄、１％スキムミルクでブロッキング後患者血清、および対照血清を２０００倍希釈し固相化したタンパク質と反応させる。
４）ＰＢＳ洗浄後ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加える
５）基質を加え発色させプレートリーダーにてＯＤ４９０ｎｍの吸収を測定する
６）各タンパク質、血清とも３回の実験を行い、平均を血清抗体値とする。
【００４１】
［ウエスタンブロット法によるペプチドマーカーの検出］
病院、及び協力施設に入院した動脈硬化性病変罹患患者の血清を本人、または家族の了解を得てスクリーニングに用いた。得られたｃＤＮＡクローンはプラスミドpBlueScriptIIに組み込みシークエンス。その後プラスミドpGEXに組み替え大腸菌に導入し、ＩＰＴＧを加えてタンパクを大量発現させタンパク質抽出液を調製した。それを用いて多数の患者血清との反応をウエスタン法により調べた。
【００４２】
ウエスタン法による解析には、λＺＡＰIIをベクターとするヒト臍帯静脈内皮細胞由来ｃＤＮＡライブラリーを使用した。組み込まれたｃＤＮＡをＩＰＴＧ処理により発現させ、動脈硬化病変罹患患者に存在する抗体と反応するものを単離した。単離したｃＤＮＡクローンについてさらにpGEXプラスミドに組み替えタンパク質の大量発現を行った後、動脈硬化病変罹患患者の反応をウェスタン法により解析し、陽性反応を示すクローンを選択した。ウェスタン  ブロット法により検出したクローンのブロッティングの写真を図１に示す。
【００４３】
［ＳＥＲＥＸ法によるペプチドマーカー遺伝子の確認］
検出したクローンの遺伝子の配列決定をＳＥＲＥＸ法を用いて行った。得られたＤＮＡ配列を、公開されている遺伝子データーベース上の塩基配列と照合した結果、得られたクローンの遺伝子は、細胞外マトリクス分解酵素のひとつであるスロンボスポンディン  タイプ１のモチーフ７を有するディスインテグリン−様及びメタロプロテアーゼ（a disintegrin-like and metalloprotease(reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif,7）：ＡＤＡＭＴＳ７のポリペプチドのＤＮＡ配列と一致した。
【実施例２】
【００４４】
［実験手順−ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定］
上記実施例１の実験手順を用いて、検出した８つのクローンの遺伝子について、ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定を行い、動脈硬化患者における遺伝子の発現を確認した。その測定値を以下に示す：［クローンＳ８Ａ（配列表の配列番号３）：ELISA法による抗体価測定−動脈硬化患者：0.84±0.29；健常対象：0.71±0.13  （p<0.05）］、［クローンＳ１Ａ１（配列表の配列番号４）：ELISA法による抗体価測定−動脈硬化患者：2.56±1.93；健常対象：1.63±1.18  （p<0.05）］、［クローンＮ４Ｊ３（配列表の配列番号５）：ELISA法による抗体価測定−動脈硬化患者：0.83±0.69；健常対象：0.29±0.15  （p<0.05）］、［クローンＮ１１Ｄ１（配列表の配列番号６）：ELISA法による抗体価測定−動脈硬化患者：23.9±22.0；健常対象：9.96±15.6  （p<0.05）］、［クローンＳ３Ｔ３（配列表の配列番号７）：ELISA法による抗体価測定−動脈硬化患者：66.2±58.3；健常対象：37.2±22.5（p<0.05）］、［クローンＳ３Ｍ１（配列表の配列番号８）：ELISA法による抗体価測定−動脈硬化患者：73.9±101.9；健常対象：34.8±24.2  （p<0.05）］、［クローンＳ１０４（配列表の配列番号９）：ELISA法による抗体価測定−動脈硬化患者：1.88±1.04；健常対象：1.39±0.77  （p<0.05）］、「クローン４７Ｂ２（配列表の配列番号１０）：ELISA法による抗体価測定−動脈硬化患者：9.58±8.95 健常対象：2.63±13.4  （p<0.05）］。
【実施例３】
【００４５】
［実験手順−ＳＥＲＥＸ法による遺伝子発現の確認］
上記実施例１の実験手順を用いて、検出した９つのクローンの遺伝子について、ＳＥＲＥＸ法により、動脈硬化患者における遺伝子の発現を確認した。その検出結果（ＳＥＲＥＸ法による陽性プラーク）を以下の図２に示す：［クローンＳ８Ｋ２（配列表の配列番号１１）：図２−ａ］、［クローンＳ２５Ｑ２（配列表の配列番号１２）：図２−ｂ］、［クローンＳ１Ａ２（配列表の配列番号１３）：図２−ｃ］、［クローンＳ１Ｂ１（配列表の配列番号１４）：図２−ｄ］、［クローンＳ１Ｉ２（配列表の配列番号１５）：図２−ｅ］、［クローンＳ１Ｌ２（配列表の配列番号１６）：図２−ｆ］、［クローンＳ１Ｔ（配列表の配列番号１７）：図２−ｇ］、［クローンＳ３Ｂ（配列表の配列番号１８）：図２−ｈ］、［クローンＳ３Ｃ２（配列表の配列番号１９）：図２−ｉ］。
【実施例４】
【００４６】
［実験手順−ＳＥＲＥＸ法による遺伝子発現の確認］
上記実施例１の実験手順を用いて、検出した８つのクローンの遺伝子について、ＳＥＲＥＸ法により、動脈硬化患者における遺伝子の発現を確認した。その検出結果（ＳＥＲＥＸ法による陽性プラーク）を以下の図３に示す：［クローンＳ３Ｑ４（配列表の配列番号２０）：図３−ａ］、［クローンＳ８Ｎ（配列表の配列番号２１）：図３−ｂ］、［クローンＳ１１Ｆ（配列表の配列番号２２）：図３−ｃ］、［クローンＳ１１Ｈ（配列表の配列番号２３）：図３−ｄ］、［クローンＳ１１Ｎ３（配列表の配列番号２４）：図３−ｅ］、［クローンＳ１３Ｃ（配列表の配列番号２５）：図３−ｆ］、［クローンＳ１３Ｈ２（配列表の配列番号２６）：図３−ｇ］、［クローンＳ２５Ｊ２（配列表の配列番号２７）：図３−ｈ］。
【実施例５】
【００４７】
［実験手順−ＳＥＲＥＸ法による遺伝子発現の確認］
上記実施例１の実験手順を用いて、検出した９つのクローンの遺伝子について、ＳＥＲＥＸ法により、動脈硬化患者における遺伝子の発現を確認した。その検出結果（ＳＥＲＥＸ法による陽性プラーク）を以下の図４に示す：［クローンＳ２５Ｐ１（配列表の配列番号２８）：図４−ａ］、［クローンＳ２５Ｓ２（配列表の配列番号２９）：図４−ｂ］、［クローン７２３Ｊ（配列表の配列番号３０）：図４−ｃ］、［クローン１３４１Ｆ１（配列表の配列番号３１）：図４−ｄ］、［クローンＮ４７Ｋ（配列表の配列番号３２）：図４−ｅ］、［クローンＮ４７Ｍ（配列表の配列番号３３）：図４−ｆ］、［クローンＮ４７Ｏ２（配列表の配列番号３４）：図４−ｇ］、［クローンＮ４７Ｔ１（配列表の配列番号３５）：図４−ｈ］、［クローンＳ１Ｊ３（配列表の配列番号３６）：図４−ｉ］。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の実施例において、検出した動脈硬化診断用のポリペプチドを用いたウエスタン  ブロット法により血中抗体を検出したメンブレンの写真である。
【図２】本発明の実施例において、本発明において検出した９つのクローンの遺伝子産物について、ＳＥＲＥＸ法により、動脈硬化患者における血中抗体の存在を確認した結果（ＳＥＲＥＸ法による陽性プラーク）を示す図である。ａ〜ｉは、それぞれクローンＳ８Ｋ２、クローンＳ２５Ｑ２、クローンＳ１Ａ２、クローンＳ１Ｂ１、クローンＳ１Ｉ２、クローンＳ１Ｌ２、クローンＳ１Ｔ、クローンＳ３Ｂ、及びクローンＳ３Ｃ２の遺伝子のＳＥＲＥＸ法による陽性プラークの検出結果を示す写真である。
【図３】本発明の実施例において、本発明において検出した８つのクローンの遺伝子産物について、ＳＥＲＥＸ法により、動脈硬化患者における血中抗体の存在を確認した結果（ＳＥＲＥＸ法による陽性プラーク）を示す図である。ａ〜ｈは、それぞれクローンＳ３Ｑ４、クローンＳ８Ｎ、クローンＳ１１Ｆ、クローンＳ１１Ｈ、クローンＳ１１Ｎ３、クローンＳ１３Ｃ、クローンＳ１３Ｈ２、及びクローンＳ２５Ｊ２の遺伝子のＳＥＲＥＸ法による陽性プラークの検出結果を示す写真である。
【図４】本発明の実施例において、本発明において検出した８つのクローンの遺伝子産物について、ＳＥＲＥＸ法により、動脈硬化患者における血中抗体の存在を確認した結果（ＳＥＲＥＸ法による陽性プラーク）を示す図である。ａ〜ｉは、それぞれクローンＳ２５Ｐ１、クローンＳ２５Ｓ２、クローン７２３Ｊ、クローン１３４１Ｆ１、クローンＮ４７Ｋ、クローンＮ４７Ｍ、クローンＮ４７Ｏ２、クローンＮ４７Ｔ１、及びクローンＳ１Ｊ３の遺伝子のＳＥＲＥＸ法による陽性プラークの検出結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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