(57)【要約】【課題】本願発明は、無細胞タンパク質合成系に共存させる細胞性膜組成物、特に小胞体を断片化したミクロソーム画分およびその調製方法の改良を課題とする。【解決手段】無細胞タンパク質合成法により合成された膜に標的化されるタンパク質を、膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分であって、以下の（ａ）および／または（ｂ）の構成からなる緩衝溶液中に調製された、細胞性膜組成物。（ａ）緩衝溶液中に含まれるトリエタノールアミン濃度が４０ミリモル／リットル以下、（ｂ）同様にスクロース濃度が０．２モル／リットル以下。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成法により合成された膜に標的化されるタンパク質を、膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分であって、以下の（ａ）および／または（ｂ）の構成からなる緩衝溶液中に調製された、細胞性膜組成物。
（ａ）緩衝溶液中に含まれるトリエタノールアミン濃度が４０ミリモル／リットル以下、
（ｂ）同様にスクロース濃度が０．２モル／リットル以下。
【請求項２】
以下の（ｃ）および／または（ｄ）を含有する緩衝溶液中に調製された、請求項１に記載の細胞性膜組成物。
（ｃ）両性イオン緩衝液成分、
（ｄ）糖アルコール類、トレハロースの少なくとも一つよりなる群より選択される物質。
【請求項３】
細胞性膜組成物が、動物の臓器由来のミクロソーム画分またはペルオキシソーム画分を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞性膜組成物。
【請求項４】
動物の臓器がイヌの膵臓由来であることを特徴とする、請求項３に記載の細胞性膜組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞性膜組成物を含む試薬類またはキット。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞性膜組成物を用いる、無細胞タンパク質合成方法。
【請求項７】
タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質または、小胞体、ゴルジ体、リソソーム等の細胞内小器官に局在するタンパク質のうちの少なくとも一つであることを特徴とする、請求項６に記載の細胞性膜組成物を存在させた無細胞タンパク質合成方法。
【請求項８】
タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、シグナル配列またはこれに類似の配列を持つことを特徴とする、請求項６に記載の細胞性膜組成物を存在させた無細胞タンパク質合成方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の細胞性膜組成物を使用して合成されたタンパク質。
【請求項１０】
タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質または、小胞体、ゴルジ体、リソソーム等の細胞内小器官に局在するタンパク質のうちの少なくとも一つであることを特徴とする、請求項９に記載の合成されたタンパク質。
【請求項１１】
タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、シグナル配列またはこれに類似の配列を持つことを特徴とする、請求項９に記載の合成されたタンパク質。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の細胞性膜組成物を使用し、および／または、請求項４〜６のいずれかに記載の方法によって合成されたタンパク質の活性を測定する方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の細胞性膜組成物を使用し、および／または、請求項６〜８のいずれかに記載の方法によって合成されたタンパク質を利用する、薬物またはその候補物質の評価方法またはスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の、薬物の評価方法またはスクリーニング方法によって評価あるいはスクリーニングされた、薬物またはその候補となる物質。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の方法による細胞性膜組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成により合成されたタンパク質を膜に移行させるための細胞性膜組成物に関する。また、この細胞性膜組成物を利用して実施する無細胞タンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学や分子生物学等の分野の進歩並びに各種ゲノム配列の解読の成果により、所望する遺伝子の産物であるタンパク質を発現させ、その生化学的ならびに構造生物学的な性質を解析することが比較的容易となってきた。特にその遺伝子配列が判明しているタンパク質においては、そのＤＮＡ配列を適当な発現ベクター上にクローン化し、例えば大腸菌のような発現・生産系を利用することによって、必要なタンパク質を得ることが可能である。このほか、大腸菌や他の生物による合成に加えて、近年の細胞工学的アプローチにより、種々の培養細胞を用いてもタンパク質合成が可能になってきている。
【０００３】
ただし、このような生細胞を用いたタンパク質合成系においては、比較的生産されにくいタンパク質が存在する。例えば、それ自身が合成されることでその細胞に対して成育を阻害するような物質、特に毒性を示すようなタンパク質については、発現させてそれを回収することはきわめて困難である。この他、毒性は示さずともＤＮＡ複製や組換えに関わるタンパク質のような細胞が分裂する際に重要な役割を果たすタンパク質等についても同様に発現が容易でない傾向がみられる。
【０００４】
このような問題点を克服するために考案されたのが、無細胞タンパク質合成システムである。これは生細胞の代わりに、種々の細胞系の破砕物を準備し、基質やエネルギー物質等を必要に応じて添加することで、細胞の成育とは無関係にタンパク質を合成・発現させる技術である。そのため技術的にほぼあらゆる種類のタンパク質を合成することが可能で、その応用範囲はきわめて広い。現在無細胞タンパク合成系として知られているものは、大腸菌の細胞破砕物、哺乳類の網状赤血球の抽出物それに、植物種子のエキストラクト等である。これらを用いることで、無細胞系においてタンパク質合成が可能である。
【０００５】
このように、生細胞を使用する方法よりも応用範囲の広い無細胞タンパク質合成系であるが、ある種のタンパク質の合成については十分な合成量を示さないか、あるいは得られたタンパク質が本来の活性を保持していないケースがある。そのうちの一つに、生体膜上または生体膜内に標的化される、いわゆる膜系タンパク質がある。この膜に標的化されるタンパク質とは、細胞膜のような膜構造体上または膜構造体中に本来位置するタンパク質、または膜構造体を透過してその内側に存在するものを示し、そのタンパク質がリボソーム上で合成される際には膜構造体上またはその付近でタンパク質合成が進行し、合成完了後は最終的に膜上または膜中の所定の位置へと移行しおよび膜内へと透過するものである。
【０００６】
従来の生細胞を利用したタンパク質合成方法では、このような膜系タンパク質はその細胞中にほとんど発現しないか、または発現しても極微量で、しかも凝集等により不溶性の沈澱となるケースが大部分である。これに対し無細胞合成系においては、膜系タンパク質においてもそのアミノ酸配列を少なくとも一次構造的には合成できるものが存在する。ただし、多くのものが、その二次構造あるいはそれ以上の高次構造を正確に形成できず、その結果活性を持った形での発現は困難となっている。これを克服するためには、ジスルフィド結合や糖鎖の付加による修飾などを含む、正確な高次構造の形成に寄与できるような「足場」が必要となると考えられている。この足場となるものとしては、人為的に合成した脂質二重膜や生体からとった臓器由来の膜成分等が使用可能と考えられている。ただしこの場合でも、通常これらの成分を無細胞系に単に加えるだけではその合成機構を阻害するケースも多く、容易に実施できないという問題があった。すなわち添加する膜構造体と無細胞合成系との共役が必要で、再現性よく高い効率で合成・発現させることは容易ではなかった。
【０００７】
これを解決するために考えられたのが、細胞内器官である小胞体を断片化しその画分を無細胞タンパク質合成系に添加する方法である。細胞内成分である小胞体を断片化したものは通常ミクロソーム画分と呼ばれ、一般的には動物由来のミクロソームの調製法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。このミクロソーム画分は、動物の膵臓や肝臓および卵管といった臓器や、酵母の細胞からも得ることができる。調製されたミクロソーム画分は、ウサギ網状赤血球由来の無細胞タンパク質合成系ならびに、コムギ胚芽由来の無細胞タンパク質合成系と共役させることが可能である。ただし従来行われていた調製法では無細胞タンパク質合成系とのカップリングが十分でなく、一層高効率に機能するミクロソームの調製方法が待望されていた。
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，ｐ８４−９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は従来技術の課題を背景になされたもので、無細胞タンパク質合成系に共存させる細胞性膜組成物、特に小胞体を断片化したミクロソーム画分およびその調製方法の改良を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、これらの課題を解決するべく鋭意研究を進めた結果、ついに本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のようなものである。
【００１０】
項１．無細胞タンパク質合成法により合成された膜に標的化されるタンパク質を、膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分であって、以下の（ａ）および／または（ｂ）の構成からなる緩衝溶液中に調製された、細胞性膜組成物。
（ａ）緩衝溶液中に含まれるトリエタノールアミン濃度が４０ミリモル／リットル以下、
（ｂ）同様にスクロース濃度が０．２モル／リットル以下。
【００１１】
項２．以下の（ｃ）および／または（ｄ）を含有する緩衝溶液中に調製された、請求項１に記載の細胞性膜組成物。
（ｃ）両性イオン緩衝液成分、
（ｄ）糖アルコール類、トレハロースの少なくとも一つよりなる群より選択される物質。
【００１２】
（１）上記項２に記載の細胞性膜組成物において、両性イオン緩衝液成分がグッドの緩衝液を用いた緩衝溶液中に調製されることが好ましい。さらには、グッドの緩衝液としては、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が好ましい。さらには、ＨＥＰＥＳ緩衝液の最終濃度としては５ないし５００ミリモル／リットルの濃度範囲が、あるいは、最終ｐＨが６．８ないし８．２の範囲が、それぞれ好ましい。
（２）あるいは、上記項２に記載の細胞性膜組成物において、少なくとも０．２モル／リットル以上の濃度の糖アルコール類、トレハロースの少なくとも一つからなる群より選択される物質を含む緩衝溶液中で調製されることが好ましい。さらには、糖アルコール類として、ソルビトール、イノシトール、キシリトールの少なくとも一つよりなる群より選択される物質を使用することが好ましい。さらに、糖アルコール類としてソルビトールを用いた緩衝溶液において、最終濃度として０．２ないし４モル／リットルの濃度範囲のソルビトール溶液を含む緩衝溶液中で調製されることが好ましい。
【００１３】
項３．細胞性膜組成物が、動物の臓器由来のミクロソーム画分またはペルオキシソーム画分を含むことを特徴とする、項１または２に記載の細胞性膜組成物。
【００１４】
項４．動物の臓器がイヌの膵臓由来であることを特徴とする、項３に記載の細胞性膜組成物。
【００１５】
（１）上記項３に記載の細胞性膜組成物において、動物の臓器が、膵臓、肝臓、卵管から選択される少なくとも１種に由来することが好ましい。さらには、膵臓、肝臓、卵管から選択された臓器において、細胞性膜組成物が、ミクロソーム、ペルオキシソームまたはグリオキシソームから選択されることが好ましい。
（２）あるいは、上記項３に記載の細胞性膜組成物において、細胞性膜組成物が、植物または酵母由来であることが好ましい。
【００１６】
項５．項１〜４のいずれかに記載の細胞性膜組成物を含む試薬類またはキット。
【００１７】
項６．項１〜４のいずれかに記載の細胞性膜組成物を用いる、無細胞タンパク質合成方法。
【００１８】
（１）上記項６に記載の無細胞タンパク質合成法において、使用する抽出液は、植物由来、動物由来または細菌由来であることが好ましい。さらには、植物種子抽出液、大腸菌抽出液、哺乳類網状赤血球抽出液、動物細胞抽出液、昆虫細胞抽出液から選択されることが好ましい。さらには、コムギ胚芽由来抽出液を使用することが好ましい。
【００１９】
項７．タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質または、小胞体、ゴルジ体、リソソーム等の細胞内小器官に局在するタンパク質のうちの少なくとも一つであることを特徴とする、項６に記載の細胞性膜組成物を存在させた無細胞タンパク質合成方法。
【００２０】
項８．タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、シグナル配列またはこれに類似の配列を持つことを特徴とする、項６に記載の細胞性膜組成物を存在させた無細胞タンパク質合成方法。
【００２１】
（１）上記項６〜８のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成法において、無細胞タンパク質合成に用いる抽出液が、タンパク質合成阻害因子の混入が少ない方法で調製されたものであることが好ましい。
（２）あるいは、上記項６〜８のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成法において、無細胞タンパク質合成方法が、バッチ法、（拡散）重層法または透析法のいずれかから選択されることが好ましい。
【００２２】
項９．項１または２に記載の細胞性膜組成物を使用して合成されたタンパク質。
【００２３】
項１０．タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質または、小胞体、ゴルジ体、リソソーム等の細胞内小器官に局在するタンパク質のうちの少なくとも一つであることを特徴とする、項９に記載の合成されたタンパク質。
【００２４】
項１１．タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、シグナル配列またはこれに類似の配列を持つことを特徴とする、項９に記載の合成されたタンパク質。
【００２５】
項１２．項１または２に記載の細胞性膜組成物を使用し、および／または、請求項４〜６のいずれかに記載の方法によって合成されたタンパク質の活性を測定する方法。
【００２６】
項１３．項１または２に記載の細胞性膜組成物を使用し、および／または、請求項６〜８のいずれかに記載の方法によって合成されたタンパク質を利用する、薬物またはその候補物質の評価方法またはスクリーニング方法。
【００２７】
（１）上記項１３のいずれかに記載の薬物またはその候補物質の評価方法またはスクリーニング方法において、細胞性膜組成物の存在時と非存在時とでの、合成されたタンパク質の挙動を比較することが好ましい。
【００２８】
項１４．項１３に記載の、薬物の評価方法またはスクリーニング方法によって評価あるいはスクリーニングされた、薬物またはその候補となる物質。
【００２９】
項１５．項１または２に記載の方法による細胞性膜組成物の調製方法。
【００３０】
本発明の、無細胞タンパク質合成法により合成された膜に標的化されるタンパク質を、膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜組成物は、タンパク質合成の阻害および／または合成されたタンパク質が膜へ移行することの阻害を低減させるような組成を持った緩衝溶液中に調製されることが有効である。好ましくは、この緩衝溶液の組成が、緩衝液成分としてトリエタノールアミンを４０ミリモル／リットル以下しか含まないことおよび／または、スクロースを０．２モル／リットル以下しか含まないことが有効である。
【００３１】
スクロースについては、従来このような細胞性膜組成物の調製の際、約２５０ｍＭ程度使用されていた。スクロースがタンパク質合成反応中に存在すると、合成効率が減少するという結果が得られている（後述）ことより、できるだけその含有量が少ない方が好ましい。実際には、最終濃度が反応液中に１．２％（スクロース濃度として３５ｍＭ）含むと影響があることから、それ以下とするのが良い。本細胞性膜組成物はタンパク質合成系中に通常１５％程度の容量を添加することが多いことから、計算上は２３３ｍＭ以下とする必要がある。実際にはより低いほうが良いので、２００ｍＭ以下すなわち、０．２Ｍ以下しか含まないことが良い。この考え方をさらに進めて、タンパク質合成反応中に細胞性膜組成物は最大で３０％程度添加可能と見られることから、スクロースの含有量が０．１Ｍ以下であることはさらに好ましい。言うまでもなく、その含量は、低ければ低いほど良いことが予測される。
【００３２】
トリエタノールアミンについては、このような反応系への阻害的影響は確認されていないが、タンパク質合成反応は比較的鋭敏かつセンシティブな反応系であるため、その組成が結果的に変化してしまうことは反応の進行上好ましくない。タンパク質合成用試薬系中に含まれる緩衝材がＨＥＰＥＳのようなグッドの緩衝液であることが多いので、それ以外の緩衝材料が多く含まれることが好ましくない結果をもたらすと予想することは容易である。トリエタノールアミンは、このような細胞性膜組成物の調整の際一般的に約５０ｍＭの濃度で使用されてきたが、上記スクロースと同様に考えると、４０ｍＭ以下しか含まないことが必要と推測できる。さらに、その含有量が２０ｍＭ以下の方が好ましく、さらに言うと、その含量は低ければ低いほど良い可能性が予測される。
【００３３】
このような影響が考えられない物質については、その濃度が高いことによる問題点はあまり考える必要はない。従って、グッドの緩衝液であるＨＥＰＥＳについては、通常の使用範囲である５〜５００ｍＭ、各種糖類や糖アルコール類については、０．２〜４Ｍの間の濃度範囲で使用可能である。ここで、糖類および糖アルコール類については、濃度が低すぎると、浸透圧が変化し好ましくない。また凍結に対する耐性が低下し、保存することが困難になる。また高すぎると、調製後に析出するなどの問題が生じる。よって０．２〜４Ｍの範囲が好ましい。
【００３４】
より好ましくは、緩衝溶液中に、両性イオン緩衝液成分および／または、糖アルコール類、トレハロースのうちの少なくとも一つからなる群より選択される物質を含有することが有効である。さらに好ましくは、その両性イオン緩衝液成分として、グッドの緩衝液を緩衝材として含むことがさらに有効である。一層好ましくは、ここで使用するグッドの緩衝液が、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）溶液を使用するのが良い。またこの時の濃度は、特に規定するものではないが、最終濃度として５〜５００ミリモル／リットル程度が好ましい。同様にそのｐＨについても６．８〜８．２付近が好ましい。
【００３５】
また本発明の細胞性膜組成物を調製するために使用する緩衝溶液は、少なくとも０．２モル／リットル以上の濃度の、糖アルコール類、トレハロースのうちの少なくとも一つよりなる群より選択される物質を含有していることが好ましい。さらに好ましくは、糖アルコール類が少なくとも０．２モル／リットル以上の濃度のソルビトール、イノシトール、キシリトールのうちの少なくとも一つよりなる群より選択される物質を含むことが有効である。この時の濃度は、特に規定するものではないが、最終濃度として０．２ないし４モル／リットルの濃度範囲が好ましい。
【００３６】
本発明において、膜構造体上へ標的化されるとは、膜に埋まり込む、または膜表面に存在するということを意味している。タンパク質の種類としては、膜系タンパク質を挙げることができる。膜系タンパク質の多くは、Ｎ末端にシグナル配列と呼ばれる疎水性に富んだ配列を有しており、細胞質中でＳＲＰ（シグナル認識粒子）により認識され、小胞体へ運ばれる。運ばれたタンパク質は、Ｎ末端から小胞体中へ陥入し、最終的に小胞体の膜上に存在するようになる。膜系タンパク質の種類によっては、一回以上膜を貫通するものが存在する。細胞膜へ局在化する膜系タンパク質は、小胞体からゴルジ体を経て、細胞膜へ移動する経路が知られている。シグナル配列は、最終的にシグナルペプチダーゼの作用により切除されるものが多い。
【００３７】
また、膜構造体内へ標的化されるとは、たとえば小胞体やミクロソーム内へ存在するようになるということである。これらのタンパク質もＮ末端にシグナル配列を有しているものが多く、細胞質中でＳＲＰ（シグナル認識粒子）により認識され、小胞体へ運ばれる。それらのタンパク質はジスルフィド結合や、糖鎖修飾などを受けた後、ゴルジ体へ運ばれ、最終的に細胞外へ分泌されるものや、リソソームなどの細胞内小器官へ輸送されるものが多い。
【００３８】
ゴルジ体はゴルジ装置とも呼ばれ、動物および植物のいずれの細胞内にも見られる小器官である。電子顕微鏡による観察では、扁平な円板状の小嚢が数層重積した層板構造物として確認できる。粗面小胞体でつくられたタンパク質は、ゴルジ体を通る過程で各種修飾を受けることが知られ、この後各種の部位へ輸送される際に、各物質の振り分け場として機能していると考えられている。
【００３９】
リソソームは、細胞内外物質の加水分解・消化に関わる細胞内小器官で、その小胞内には四十種類以上の酸性領域で機能する加水分解酵素が局在している。細胞内で不要になった、あるいは過剰に生産された物質はリソソームのもつ作用により分解を受ける。また、一部の生理活性物質においては、その前駆体がリソソーム内の酵素によって活性化され、細胞外に放出されるものもある。
【００４０】
本発明において、タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質は、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質または、小胞体、ゴルジ体、リソソーム等の細胞内小器官に局在するタンパク質のうちの少なくとも一つであることが好ましい。これらのうちから選択されるタンパク質については、本発明の細胞性膜成分を存在させた無細胞タンパク質合成法により合成されることが可能と考えられる。
【００４１】
また同じように、タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分によって膜に標的化されるタンパク質が、シグナル配列またはこれに類似の配列を持つことが好ましい。シグナル配列またはその類似の配列を持ったタンパク質については、本発明の細胞性膜組成物を存在させた無細胞タンパク質合成法により合成されることが可能であると考えられる。
【００４２】
本発明の、タンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜組成物は動物の臓器由来の成分であることが好ましい。好ましくは、動物の膵臓、肝臓、卵管等から選択される臓器由来のものを使用することができる。この他、植物または酵母の細胞由来のものを用いることも可能である。
【００４３】
本発明の細胞性膜組成物は、ミクロソーム画分またはペルオキシソーム画分から選択される成分を含むことが好ましい。ここでミクロソームとは、組織のホモジネートから遠心および超遠心分離することで沈殿として回収できる画分で、小胞体が細胞の破砕によってちぎれてできたものが主成分である。ミクロソームは動物の臓器由来のものが好ましいが、この他酵母由来のミクロソーム画分を、本発明の細胞性膜組成物として用いることも可能である。これに加えて、細胞中の小器官であるミクロボディー画分を使用することもできる。細胞由来のミクロボディー画分である、ペルオキシソームやグリオキシソーム等の器官を、同様の目的に使用することが可能であると考えられる。
【００４４】
本発明の方法で得られる細胞内膜組成物を共存させて所望のタンパク質を合成する方法において、該所望のタンパク質を無細胞タンパク質合成系によって合成することができる。無細胞タンパク質合成系には、通常バッチ法と呼ばれる各構成要素を一液として混合し適当な温度でインキュベートする方法、合成用の溶液とエネルギーを供給するための溶液との少なくとも二種類の溶液から構成される、拡散重層法（以下重層法）と言われる方法（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２００２，  Ｖｏｌ．５１４，  １０２−１０５）、並びに合成用の溶液とエネルギーを供給するための溶液の間に、エネルギー物質は透過させるが、それ以外の構成要素は透過させないような半透膜構造をもった膜を存在させることからなる透析法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８８，  Ｖｏｌ．２４２，  １１６２−１１６４）等の、各種合成方法を利用することができる。
【００４５】
またこれらの無細胞タンパク質合成法においては、植物種子由来の抽出物を使用することが好ましい。または、無細胞合成法において、哺乳類の網状赤血球由来の抽出物を使用することもできる。あるいは、無細胞合成法において、大腸菌由来の抽出物を使用することも可能である。この他、無細胞合成法において、酵母由来の抽出物をタンパク質合成に使用することも可能である。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の、膜に標的化されるタンパク質を膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分であって、以下の（ａ）および／または（ｂ）の構成からなる緩衝溶液中に調製された細胞性膜組成物を、無細胞タンパク質合成系に加えることで、タンパク質合成量並びに合成効率を高めることを可能にした。
（ａ）緩衝溶液中に含まれるトリエタノールアミン濃度が４０ミリモル／リットル以下、
（ｂ）同様にスクロース濃度が０．２モル／リットル以下。
特に、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質または、小胞体、ゴルジ体、リソソーム等の細胞内小器官に局在するタンパク質や、その内部にシグナル配列またはこれに類似の配列を持ったタンパク質について高い効果が期待できる。またその配列中に糖鎖付加のような修飾部位を持ったタンパク質等においては、飛躍的な効果が見られるという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
次に本発明において使用する言葉を定義し、その内容について説明する。
【００４８】
本発明は、無細胞タンパク質合成系により合成された膜に標的化されるタンパク質を、膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分であって、以下の（ａ）および／または（ｂ）の構成からなる緩衝溶液中に調製された細胞性膜組成物である。
（ａ）緩衝溶液中に含まれるトリエタノールアミン濃度が４０ミリモル／リットル以下、
（ｂ）同様にスクロース濃度が０．２モル／リットル以下。
そしてその緩衝液中に、両性イオン緩衝液成分および／または、糖アルコール類、トレハロースのうちの少なくとも一つからなる群より選択される物質を含有する緩衝溶液中に調製された、細胞性膜組成物である。また、その溶液中に両性イオン緩衝液として、グッドの緩衝液を緩衝材として含む。
【００４９】
本願明細書中に記載されている種々の物質について、その測定方法を以下に示す。
【００５０】
トリエタノールアミンの測定方法：トリエタノールアミン（別名：２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール）を含むと考えられる資料の赤外吸収スペクトルを、ＪＩＳ−Ｋ０１１７（赤外分光分析方法）によって測定すると、波数３３７０ｃｍ−１、２９５０  ｃｍ−１、１４５０  ｃｍ−１、１３６０  ｃｍ−１、１２８０  ｃｍ−１、１１５０  ｃｍ−１、１０３０  ｃｍ−１および８８０  ｃｍ−１付近に主な吸収を認める。この方法により、トリエタノールアミンを測定することができる。また、ＧＣ／ＭＳ法によっても、トリエタノールアミンを定量することができる（月岡忠，小沢秀明、ＧＣ／ＭＳによる環境試料中のトリエタノールアミンの定量、環境化学、Ｖｏｌ．１、５４９ページ、１９９１）
【００５１】
スクロースの測定方法：旋光度法による定量か、あるいは加水分解して転化糖として定量できる（日本薬学会編、「衛生試験法」１８）。または、アンスロン試薬を用いるアンスロン法や、セリワノフ試薬を使用するレゾルシン法（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３版、Ｖｏｌ．ＩＩＩ、２１５−２１６）等によっても測定することができる。
【００５２】
ＨＥＰＥＳの測定方法：ＨＥＰＥＳを含むと考えられる資料の赤外吸収スペクトルを、ＪＩＳ−Ｋ８００８（赤外分光光度法による試験法）によって測定すると、波数３４４０ｃｍ−１、２９４０  ｃｍ−１、１４７０  ｃｍ−１、１３６０  ｃｍ−１、９５０  ｃｍ−１、７７０  ｃｍ−１、および５９０  ｃｍ−１付近に主な吸収を認める。この方法により、ＨＥＰＥＳを測定することができる。この他、高速液体クロマトグラフ法によっても測定することができる（ＪＩＳ−Ｋ９８０４）。
【００５３】
ソルビトールの測定方法：比色法で測定することができる。過ヨウ素酸でホルムアルデヒドとギ酸に酸化し、過剰の過ヨウ素酸を除き、ホルムアルデヒドをクロモトロープ酸と反応呈色させ比色（５７０ｎｍ）する（出典は、上記スクロース測定法の２番目の文献）。このほか、隣接水酸基の定量によっても測定することができる。
【００５４】
イノシトールの測定方法：イノシトールを含むと考えられる試料に、濃硝酸を加えて蒸発乾固させた後これを水に溶かし、酢酸ストロンチウム溶液を加える。イノシトールが存在すれば紅紫色となり、測定できる（ＪＩＳ−Ｋ８０９４）。この他、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用したバイオアッセイ法（出典は、上記スクロース測定法の２番目の文献、６７ページ）によっても定量することができる。
【００５５】
キシリトールの測定方法：キシリトールとＮＡＤを混合し脱水素酵素を反応させると、キシルロースとＮＡＤＨが生じる。ここに、塩化ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）を加えてジアフォラーゼを反応させると、フォルマザンを生成する。この生成したフォルマザンの吸光度（４９２ｎｍ）を測定することで、キシリトールの定量的な測定を行うことができる。またこの際、生じたＮＡＤＨの吸光度（３４０ｎｍ）を直接測ることで、測定することもできる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  第３版、Ｖｏｌ．６、４８４−４９０、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｌｏｎｄｏｎ）。このほか、キシリトールを含むと考えられる試料をアセチル化し、これをガスクロマトグラフィーにかけることによって定量することもできる。また、高速液体クロマトグラフ法によっても、キシリトールを定量することができる。
【００５６】
トレハロースの測定方法：トレハロースを含むと考えられる試料を、高速液体クロマトグラフィーにより、ＵＬＴＯＲＯＮ  ＰＳ  ８０Ｃカラムを用いて、温度８５℃、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎで分析することにより、定量することができる（化学工学論文集、１７−３、６０１ページ、１９９１）
【００５７】
両性イオン緩衝液とは、水溶液中で酸性と塩基性の両方の性質を示す両性電解質の緩衝作用を利用した緩衝液で、各種のバッファー類等の他、アミノ酸の水溶液等も広義には含まれる。従来のミクロソーム画分の調製方法は、調製溶液中に緩衝液としてトリエタノールアミン溶液を使用していた（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ８４−９３）が、本発明においてはより汎用されているグッドの緩衝液を用いてその調製を行った。グッドの緩衝液はＮ．Ｅ．Ｇｏｏｄらが開発した一群の両性イオン緩衝液の総称で、多くの緩衝液用の試薬が開発され、市販されている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８０，  Ｖｏｌ．１０４，  ３００−３１０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９７２，  Ｖｏｌ．２４，  ５３−６８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９６６，  Ｖｏｌ．５，  ４６７−４７７）。
本発明においては、いずれのグッドの緩衝液も使用可能と考えられるが、特に２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を用いることが良い結果を導く。このＨＥＰＥＳは最終濃度が５〜５００ｍＭの範囲で用いられ、また最終ｐＨは２０℃付近で６．８〜８．２の範囲で使用することが好ましい。ｐＨの調節には水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等が使用できる。
【００５８】
グッドの緩衝液はその多くが、水溶液として溶けやすく、生体膜を通過しにくく、またイオン強度が低いこと等緩衝液としてやや穏やかな性質を持っている。これに加えて現行のコムギ胚芽由来無細胞合成用抽出液もこのＨＥＰＥＳを利用した反応液組成を持っており、調製された細胞性膜組成物が反応系中に加えられてもその組成の変化が極めて少ないことが予想される。そのため、この組成物が反応系中に存在しても無細胞タンパク質合成システムが本来の能力を発揮することができ、また本細胞性膜組成物の持つ合成されたタンパク質の膜への移行活性についても阻害される恐れが極めて小さくなるとみることができる。
【００５９】
本発明の細胞性膜組成物を調製するための緩衝溶液には、少なくとも最終濃度０．２モル／リットル以上の濃度の、糖アルコール類、トレハロースのうちの少なくとも一つからなる群より選択される物質を含むことが好ましい。ここで糖アルコール類の種類としては、ソルビトール、イノシトール、キシリトールの少なくとも一つからなる群から選択されるものを使用することができる。従来は、これらの糖類および糖アルコール類ではなく、スクロースが使用されていた（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ８４−９３）。その理由としては、糖類をある程度の濃度で含有させることで浸透圧の影響を避け、また凍結保存の際の安定性向上にも寄与できると考えられる。ただしこのスクロースの存在は、無細胞タンパク質合成反応に影響を及ぼし、その合成量を低下させるという結果が得られている（図１）。図１に見られるように、無細胞タンパク質合成系に糖類を添加しない系に比べて、スクロースを添加するとその合成量が減少している。これに対し、トレハロースおよび糖アルコール類であるソルビトール、イノシトール、キシリトールのような物質を使用した場合には、このような合成阻害は見られない。使用する際の濃度としては、０．２〜４モル／リットルの範囲でこれらの糖アルコール類を含む溶液を調製し、使用することが好ましい。
【００６０】
本発明において調製される細胞性膜組成物が含む成分とは、小胞体を中心とした画分を示す。小胞体は真核細胞の細胞質内に網目状に広がる膜状構造を持った小器官で、扁平な袋状構造が重層して連続した構造をもつ。特にその表面にリボソームが多数結合した粗面小胞体は、タンパク質合成の主役となる器官である。またミクロソームとは、組織のホモジネートから、遠心および超遠心分離することで沈殿として回収できる画分で、小胞体が細胞の破砕によってちぎれてできたものが主成分である。
【００６１】
本発明において調製される細胞性膜組成物は、その成分としてミクロソーム画分を含むことが好ましい。このミクロソーム画分は動物の臓器等から回収することが可能で、特に動物の膵臓（蛋白質核酸酵素，  １９９２，  Ｖｏｌ．３７，  １５１−１５６）、肝臓（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９８８，  Ｖｏｌ．１５６，  ９６４−９６９）、卵管（Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９９，  Ｖｏｌ．２７４，  ２５６７５−２５６８１）等から抽出し、用いることができる。
【００６２】
特に従来から使用されてきて実績があるのが、イヌの膵臓から調製した細胞性膜組成物である（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ８４−９３、生物化学実験法３７、「蛋白質の分泌と細胞内輸送」  ６３−６５）。健康状態の良いイヌの膵臓を摘出し、これらに記載の方法により、細胞性膜組成物を調製することができる。この時使用するイヌの種類としては、特に限定するものではないが、好ましくは系統が純系化されているものが良く、さらに好ましくは、実験用等に広く使用されているビーグル犬が良い。
【００６３】
また酵母の細胞からも抽出して利用することが可能である（Ｙｅａｓｔ，  １９８６，  Ｖｏｌ．２，  ３５−５２、蛋白質核酸酵素，  １９９１，  Ｖｏｌ．３６，  ２５４８−２５５４）。
【００６４】
この他、細胞内器官である、ミクロボディー画分を使用することもできる。ペルオキシソームやグリオキシソームのようなミクロボディー画分を、膜構造上に存在するタンパク質の合成等に用いることができ（蛋白質核酸酵素、１９９２、Ｖｏｌ．３７、７５９−７６３）、ミクロソームと同様の効果を持つことが予測される。
【００６５】
無細胞タンパク質合成法は、一般的に合成しようとするタンパク質の遺伝子の配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡと、タンパク質合成のためのコンポーネントである細胞由来の抽出物、それに各種アミノ酸やＡＴＰおよびＧＴＰ等のエネルギー物質を加えて実施される。細胞由来の抽出物としては、植物種子由来の抽出物を使用することができ、好ましくは、この抽出物は新鮮なコムギ胚芽を用いて調製することが可能である（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ３８−５０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ＵＳＡ，  ２０００，  Ｖｏｌ．９７，  ５５９−５６４）。または哺乳類の網状赤血球由来の抽出物を使用することもできる。この抽出物は哺乳類の血液、好ましくはウサギの血液を採取し、これを用いて調製することが可能である（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９７６，  Ｖｏｌ．６７，  ２４７−２５６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ５０−７４）。あるいは、無細胞合成系において、大腸菌由来の抽出物を使用することも可能である。この抽出物は、大腸菌Ｋ００２株より調製することができる（蛋白質核酸酵素，  １９９２，  Ｖｏｌ．３７，  ６８−７４）。この他、無細胞合成系において、酵母由来の抽出物を使用することもできる。この抽出物は、酵母を培養した溶液を用いて調製することが可能である（Ｙｅａｓｔ，  １９８６，  Ｖｏｌ．２，  ３５−５２、蛋白質核酸酵素，  １９９１，  Ｖｏｌ．３６，  ２５４８−２５５４）。
【００６６】
このような無細胞タンパク質合成法においては、使用する無細胞合成用抽出液の良否によって合成されるタンパク質の量および／またはその質が大きく左右される。特に抽出液中に存在するタンパク質合成阻害因子が充分除かれていることが望ましい。タンパク質合成を阻害する因子としては、リボソーム不活化タンパク質等が知られており、こういった物質を徹底的に除去することによって非常に効率よく高レベルでの無細胞タンパク質合成が可能になった（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ＵＳＡ，  ２０００，  Ｖｏｌ．９７，  ５５９−５６４、Ｂｉｏｉｎｄｕｓｔｒｙ，  ２０００，  Ｖｏｌ．１７，  ２０−２７）。
【００６７】
これらの抽出物を用いて無細胞タンパク質合成を実施する際に、一般的には合成用抽出物に加えて各種アミノ酸、ＡＴＰやＧＴＰといったエネルギー物質等の構成要素を一度に混合し、反応を開始させる。このような方法を通常バッチ法と呼び、一般的には数時間反応させて実施する。この反応は系にもよるが進行するにつれてエネルギー物質等が不足していき、数時間後にはタンパク質合成反応がプラトーに達し、そこで合成はほぼ停止する。
【００６８】
バッチ法におけるエネルギー物質等の不足を避けるため、反応を進めるのに必要なコンポーネントとエネルギーを含む溶液とをあらかじめ二層に分けた形で反応させ、その界面付近から徐々に反応を進める、前記した「（拡散）重層法」が考案された。この方法を用いることで、エネルギー物質の枯渇により数時間程度でプラトーに達していた反応が十数時間以上継続可能になり、大幅な収量の増加が達成された。反応の中核を成す無細胞タンパク質合成用抽出物を同じ量使用した場合に、数倍以上高い回収量を達成することができる。
【００６９】
また別の方法として、前記したようにタンパク質合成用の反応系とエネルギー源を含む溶液とを半透膜のような仕切りで隔絶し、合成に伴ってエネルギー源等を供給していく「透析法」を利用することもできる。この方法は、半透膜を装着したキュベットのようなインスツルメントが必要となるものの、スケールアップについても容易に可能で、非常に高い収量が期待される。この方法によっても、タンパク質の性質にもよるが高い回収量の実現が期待できる。
【００７０】
本発明の方法によって得られた細胞性膜組成物は、これらのいずれの方法に対しても使用できる。
【００７１】
これまでに述べたような方法で調製した細胞性膜組成物は、各種の無細胞タンパク質合成系と組み合わせることにより、あらゆる種類のタンパク質を合成できる可能性を持つ。特に通常のタンパク質合成系では発現が困難な、生体膜上または生体膜内に標的化されるタンパク質、特に細胞膜を貫通すると予測されるアミノ酸配列を含んだ、いわゆる膜系タンパク質の活性型での発現に効果を発揮する。
【００７２】
一般的に無細胞合成系で単に膜系タンパク質を合成すると、アミノ酸配列通りの一次構造を合成することは可能であるが、活性を発現するために必要な二次構造等の複雑な構造を形成することは極めて困難である。しかし、本発明の細胞性膜組成物を共存させることにより、二次構造の形成を可能にし、活性のある形での合成を実現できる。
【００７３】
その一例としては、単に無細胞タンパク質合成系で発現させても、糖鎖のような修飾部位を持つタンパク質の場合はその糖鎖が付加されないケースが大部分であるが、ミクロソームのような細胞性膜成分を含む組成物を加えることで、タンパク質合成の際に効率よく糖鎖を付加することができ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２００１，  Ｖｏｌ．５０７，  ３４１−３４５）、より生体内で機能しているタンパク質と近い構造で発現させることが可能である。この糖鎖が付加されるという性質は、合成されたタンパク質の分子量を増大させ、これによってタンパク質が活性型で合成されたか否かの判断をアシストすることができる。特に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのような電気泳動的な検出法により、それは達成できる。
【００７４】
この他、通常無細胞合成系では困難なジスルフィド結合の形成についても、ミクロソーム画分のもつ折り畳み構造の形成能によって、その構造形成が可能になるタンパク質も存在する。加えて、合成された後細胞外へ輸送されるいわゆる分泌型タンパク質においても、小胞体膜中に入った後そのミクロソーム画分の持つシグナルペプチドの切断等の作用により、成熟型のタンパク質へと変換され、その機能を発現し得ることが容易に想像できる。
【００７５】
今一つの効果として、本発明の細胞性膜組成物を無細胞タンパク質合成系に共存させることにより、膜に標的化されるタンパク質がその本来とるべき構造でもって発現してくることが可能になると考えられる。近年医薬品の候補物質として生体膜上または生体膜中に存在するタンパク質がクローズアップされてきている。特に膜中に存在して各種イオン性物質や生理活性を持った物質等をキャッチしてその物質そのものまたはそれによりもたらされる情報を伝達する、いわゆる受容体型タンパク質は非常に脚光を浴びている。その中でも、七回膜貫通構造を持つＧタンパク質共役型受容体に代表されるようなタンパク質は、そのリガンドとの反応機序においてその注目度が急激に上昇している。ただしこの受容体型タンパク質は膜上または膜中で非常に複雑な構造を形成して存在しているものが多いため、従来のタンパク質合成方法によって合成することは困難であった。本発明の細胞性膜組成物を無細胞タンパク質合成時に使用することで、上記のようなタンパク質を活性型で発現させ、その活性を測定することが可能になると見られる。またこのようにして合成されたタンパク質が医薬品としての薬物並びにその候補物質として使用できるか評価およびスクリーニングすることも可能になる。特に活性型になるとそのタンパク質の内部に糖鎖等の修飾を受けるタンパク質については、活性型として発現したか否かが本発明の細胞性膜組成物の有無で判断できる系を構築することが可能と考えられ、例えば電気泳動法等によりその差を比較することで、薬物またはその候補物質としての評価またはスクリーニング法として使用できる。このように、膜貫通領域を含むタンパク質の効率よくかつ高レベルで合成可能な反応系が待望されている。
【００７６】
以上のことより、本発明における構成要素としては、以下のような細胞性膜組成物を調製できるような構成を有するものが好ましい。すなわち、無細胞タンパク質合成法により合成された膜に標的化されるタンパク質を、膜構造体上または膜構造体中に移行させるための細胞性膜成分であって、以下の（ａ）および／または（ｂ）の構成からなる緩衝溶液中に調製された、細胞性膜組成物である。
（ａ）緩衝溶液中に含まれるトリエタノールアミン濃度が４０ミリモル／リットル以下、
（ｂ）同様にスクロース濃度が０．２モル／リットル以下。
その具体的な構成としては、
（１）  この細胞性膜組成物を調製するために用いる緩衝溶液が、両性イオン緩衝液成分および／または、糖アルコール類、トレハロースのうちの少なくとも一つからなる群より選択される物質を含有する。
（２）両性イオン緩衝液がグッドの緩衝液、特にＨＥＰＥＳからなり、また糖アルコール類がソルビトールからなる。
（３）調製される細胞性膜組成物が、ミクロソーム画分やペルオキシソーム画分を中心とする膜成分であることを特徴とする。
（４）ミクロソーム画分が動物の臓器由来であることを特徴とする。特に、動物の膵臓、肝臓、卵管等に由来するものであればより好ましい。またはミクロソーム画分が酵母または植物の細胞由来であっても良い。
（５）さらに得られる細胞性膜組成物は、無細胞タンパク質合成系に用いることができる。そして該無細胞合成系は、植物種子、哺乳類の網状赤血球、大腸菌または酵母由来の抽出物を含む。
【００７７】
本発明の構成（１）では、細胞内成分の調製方法においてその調製溶液中に両性イオン緩衝液および／または糖アルコール類、トレハロースのうちの少なくとも一つからなる群より選択される物質を含むものである。
構成（２）では、その両性イオン緩衝液が、グッドの緩衝液であることが好ましく、さらにグッドの緩衝液が、ＨＥＰＥＳの水溶液であることが好ましい。そしてその濃度は、５〜５００ｍＭの範囲で用いることができるが、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲が良い。また最終ｐＨは、２０〜２５℃の温度範囲でｐＨ６．８〜８．２の範囲で使用可能で、ｐＨ７．０〜８．０の範囲がさらに好ましい。この時ｐＨを調節する際には水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の水溶液を使用することができる。またこの緩衝溶液は、少なくとも０．２モル／リットル以上の糖アルコール類を含む。この糖アルコール類としては、ソルビトール、イノシトール、キシリトールのうちの少なくとも一つからなる群より選択され、特に好ましくはソルビトールである。その濃度は０．２〜４モル／リットルの範囲であることが好ましい。
【００７８】
構成（３）においては、調製される細胞性膜組成物が小胞体を中心とする成分であり、動物や酵母の細胞から得ることができる。さらにこの組成物が、小胞体の断片化されたミクロソーム画分であることが好ましい。
そして構成（４）では、調製されるミクロソーム画分が、動物の細胞、特に臓器由来である。臓器の種類としては、膵臓、肝臓そして卵管等を使用することができるが、その限りではない。また植物または酵母の細胞由来でも使用可能である。
構成（５）については、このようにして得られたミクロソームのような細胞性膜成分からなる組成物を無細胞タンパク質合成に使用できる。調製された組成物を無細胞タンパク質合成反応液に加えることができ、その添加する量は任意であるが、好ましくは、反応系の容量の３〜３０％程度が好ましい。さらに好ましくは、５〜２０％程度添加するのが良い。添加量が少なすぎるとタンパク質合成を向上させる効果が見られず、また多すぎる場合には反応系の進行に影響を与える可能性が考えられる。
【００７９】
ここで実施するタンパク質合成反応においては、反応温度は反応が行われる限り特に制限はなく、無細胞タンパク合成を実行させる細胞由来の抽出物等に合わせた温度で行われるが、通常は５〜６０℃で行われることが好ましい。より好ましくは１０℃以上、５０℃の範囲であり、特に好ましくは２０℃以上、４０℃以下の範囲が良い。
またその反応時間は、２〜４０時間程度が好ましく、より好ましくは３時間以上、３５時間以下の範囲であり、特に好ましくは２４時間以下が良い。
【００８０】
さらに、本発明は無細胞タンパク質合成用の試薬類およびキットである。試薬類およびキットとしては、本発明の細胞性膜組成物と無細胞タンパク質合成を実行させる細胞由来の抽出物とを組み合わせることができ、さらには、ＡＴＰやＧＴＰ等のエネルギー物質、クレアチンキナーゼ、ＲＮａｓｅインヒビターおよび各種アミノ酸等が含まれていても良い。
【００８１】
このようにして準備した細胞性膜組成物がその活性を保持しているか否かについては、実際にタンパク質を合成し確認することが望ましい。その方法の一つとして、シナプトタグミン−２というタンパク質を合成し、その移動度を検出する方法（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２００１，  Ｖｏｌ．５０７，  ３４１−３４５、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０００，  Ｖｏｌ．１５０，  ７１９−７２９）が好適である。このタンパク質は主に脳や内分泌細胞中に存在し、カルシウムイオン依存性の神経伝達物質の放出機構に関わっていると考えられるもので、その分子内部に糖鎖の付加を受ける部位を持っている。活性のある細胞性膜組成物を無細胞系に共存させ、このシナプトタグミン−２タンパク質を合成し、その得られた生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、糖鎖付加の有無を確認できる。ここで合成されたタンパク質が活性を持った形で発現していれば、本来のバンドの他に移動度が減少したバンドが観察される。このバンドは糖鎖が付加しているため相対的に分子量が増大しており、ゲルの上から下へ向けて電気泳動した場合に見かけ上オリジナルのバンドの上側に現れ、そのバンドが下側のバンドに対し濃いほど、活性のあるタンパク質がより多く生成していると予想される。従って、これらのバンドを視覚化し数値化して、上側のバンドの相対的な量を調べることで、活性のあるタンパク質が効率よく合成されているか否かを判断することができる。
【実施例】
【００８２】
以下に本発明の実施例をあげることにより、本発明による効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
【００８３】
実施例１：細胞性膜組成物調製用の緩衝溶液の調製
細胞性膜組成物調製用の緩衝溶液の調製方法について以下に示す。
（１）２３８ｇのＨＥＰＥＳを滅菌水に溶解し、１モル／リットル濃度の水酸化カリウム溶液でｐＨを７．５に調製する。その後滅菌水で１リットルにし、ＨＥＰＥＳの１モル／リットル溶液とする。使用時に、必要な濃度に調製して使用する。
（２）１８２ｇのソルビトールをはかりとり、滅菌水に溶解し５００ｍｌとする。これを２モル／リットルのソルビトール溶液とし、使用時に必要な濃度に調製して使用する。
これらの溶液をベースにして、以下の緩衝液系を調製し、使用した。
【００８４】
実施例２：小胞体成分（ミクロソーム画分）の調製
（１）イヌから摘出した膵臓を氷冷した調製液Ａ（５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．５、５０ｍＭ−酢酸カリウム、６ｍＭ−酢酸マグネシウム、１ｍＭ−エチレンジアミン四酢酸、１ｍＭ−ジチオスレイトール、０．５ｍＭ−フェニルメタンスルホニルフルオリド、０．２５Ｍ−ソルビトール）で洗浄し、重量を測定した後細かく切断した。
（２）膵臓の重量に対して四倍量の上記調製液Ａを加えてよくホモジナイズした。この溶液を、  約１，０００×ｇで１０分間遠心分離し上清を集めた。この上清を約１０，０００×ｇで１０分間再度遠心分離し、同様に上清を集めた。
（３）この上清溶液を遠心管に入れ、１／３容量の調製液Ｂ（ソルビトール濃度を１．３Ｍとした以外は調製液Ａと同じ組成のもの）を遠心管の底に重層し、１４０，０００×ｇで２．５時間遠心分離した。
（４）沈澱物を集め、上記（２）の膵臓の重量と等量の調製液Ｃ（５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．５、１ｍＭ−ジチオスレイトール、０．２５Ｍ−ソルビトール）に懸濁し、よくホモジナイズした。この溶液を少量とって１％−ＳＤＳ溶液を用いて希釈し、ＯＤ２８０値を測定した。この時、ＯＤ２８０値が４０ＯＤよりも濃い場合は上記調製液Ｃで４０ＯＤ濃度となるように希釈した。逆に４０ＯＤよりも薄い場合は、（３）に記載の方法で再度超遠心分離し、より少量の調製液Ｃで懸濁した。
（５）この溶液に対し等量の調製液Ｄ（調製液Ｃに５０ｍＭ−ＥＤＴＡを添加したもの）を加え、４℃で１５分おいた。
（６）この溶液を遠心管に入れ、１／３容量の調製液Ｅ（ソルビトール濃度を０．５Ｍとした以外は調製液Ｃと同じ組成のもの）を遠心管の底に重層し、１４０，０００×ｇで１時間遠心分離した。
（７）  沈澱物を集め、上記（４）で調製した溶液の半量の調製液Ｃに懸濁し、よくホモジナイズした。この溶液を少量とって１％−ＳＤＳ溶液を用いて希釈し、ＯＤ２８０値を測定した。この時、ＯＤ２８０値が４０ＯＤよりも濃い場合は調製液Ｃで４０ＯＤ濃度となるように希釈した。逆に４０ＯＤよりも薄い場合は、（６）に記載の方法で再度超遠心分離し、より少量の調製液Ｃで懸濁した。
このようにして調製した細胞性膜組成物を、無細胞タンパク質合成に使用した。
【００８５】
実施例３：無細胞タンパク質合成用ｍＲＮＡの調製
コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系において使用する、マウスのシナプトタグミン−２（以下ＳＹＴ２）タンパク質をコードするｍＲＮＡの調製を行った。
このタンパク質をコードする遺伝子（コード配列の長さ１，２６９塩基対）の配列を、配列表に記載のプライマー対（配列番号１および２）を使用し、マウスｃＤＮＡからＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を使ってＰＣＲ増幅し（下流プライマーにＢａｍＨＩ配列を導入）、タンパク質発現用ベクターであるｐＥＵ３−ＮＩＩプラスミドのＥｃｏＲＶ部位とＢａｍＨＩ部位の間に挿入し、発現可能な組換えプラスミドｐＳＹＴ−９Ｅを構築した。次にこのプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ｐＳＹＴ−９Ｅを保持した大腸菌を得、これを３７℃で培養し菌体を集め、そこからプラスミド溶液を抽出、精製した。具体的には、ＱＩＡＧＥＮ社のプラスミド精製キットを用いて精製した後、フェノール・クロロホルム処理を行い、更に精製したものを用いた。ｍＲＮＡの合成は、調製したプラスミドを鋳型としてＴｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用い、取扱い説明書に従って行った。合成後、Ｇ−２５マイクロスピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲル濾過精製（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，  ｐＨ７．６）を行った後、１μｇ／μｌに調整した。
【００８６】
実施例４：ＳＹＴ２タンパク質の無細胞合成
上記実施例３で調製したｍＲＮＡを用いて、無細胞タンパク質合成を実施した。無細胞タンパク質合成には、高効率コムギ胚芽無細胞タンパク質合成キット「ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ」（東洋紡製）を用い、取扱い説明書に記載してあるバッチ法に従って合成反応を行った。このキットは、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（２），５５９−５６４（２０００）に記載の方法に従って調製されたものである。この検討において細胞性膜組成物（４０  ＯＤ）を反応系あたり１０％、１５％そして２０％添加し、検討を行った。また反応液中には、放射性同位元素３５Ｓでラベルしたメチオニン（アマシャムバイオサイエンス社製）を加え、合成されたタンパク質のラベルを行った。
合成反応は、容量２５μｌで２６℃、３時間行った。その他の反応条件等は、特に述べない限りキットに添付の取扱説明書に準じた。
【００８７】
比較例１：従来法による細胞性膜組成物（ミクロソーム画分）の調製
実施例２の方法によって調製された細胞性膜組成物と比較するため、従来法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ８４−９３）に基づいて調製を行った。得られたミクロソーム画分は、実施例４と同様の方法および容量で無細胞タンパク質合成によりマウスＳＹＴ２タンパク質の合成に使用した。この方法で調製したミクロソーム溶液は、５０ｍＭのトリエタノールアミン、および０．２５Ｍのスクロースを含有する。
【００８８】
実施例５：合成されたＳＹＴ２タンパク質の検出
合成されたタンパク質溶液を１０μｌ取り、８．５％のアクリルアミドを含むＳＤＳポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を実施した。泳動後のゲルを濾紙に加熱しながら固定し、このゲルを固定した濾紙をイメージング装置ＢＡＳ−１８００（富士フィルム社製）用のイメージングプレートに転写した。タンパク質合成溶液中に使用した、放射性同位元素３５ＳでＳＨ基をラベルしたメチオニンの放射活性をＢＡＳ−１８００で視覚化し、定量モードにより数値化した。ここで、ＳＹＴ２タンパク質はその分子内に糖鎖によって修飾される部位を持ち、添加した細胞性膜組成物がその活性を保持していればタンパク質内に糖鎖の付加を生じる。ＳＹＴ２タンパク質は４２２アミノ酸から成り、その分子量は通常４８ｋＤａ程度であるが、糖鎖が付加するとその分子量は糖鎖の分増加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動度が減少し、異なった位置にバンドを生じる。具体的には、細胞性膜組成物を加えないと生じるバンドは１本のみであるのに対し、活性のある細胞性膜組成物が存在すると元々のバンドよりも上側にもう１本のバンドが生じ、見かけ上２本のバンドが現れる。そしてこの２本のバンドのうち、上側のバンドは修飾されたタンパク質の合成量を反映し、その測定値が大きければ大きいほど、活性型のタンパク質をより多く合成できていることになる。また、下側のバンドに対する上側のバンドの比が大きいほど、合成されたタンパク質のうち相対的に多くのものが活性型で合成されていると判断できる。
ここで、この細胞性膜組成物が、タンパク質合成に対して何らかの阻害的影響を与えるような物質を含んでいれば、この上側バンドおよび下側バンドの、合計の検出量が非常に少なくなる。また、細胞性膜組成物の活性が低下していれば、上側のバンドに対する下側のバンドが非常に濃くなり、その結果合成タンパク質中に占める修飾されたタンパク質の含量が極めて低くなるため、有用ではない結果となる。
上記実施例１および２の方法によって得られた細胞性膜組成物を使用して、実施例５の方法でＳＹＴ２タンパク質を合成し、得られた二本のバンドのうち、上側のバンドを視覚化した結果を表１の（Ａ）に示す。また比較例１の方法で調製したミクロソーム画分を用いて同様にＳＹＴ２タンパク質を無細胞合成した結果を表１の（Ｂ）に示す。
表１に、上記実施例４の方法（本発明法）で実施した結果を、１０、１５そして２０％と細胞性膜組成物の添加量の順に示した。また比較例１（従来法）で得られた測定値も同様に表１に示した。ここで（Ａ）の値を（Ｂ）の値で割った値を（Ａ）／（Ｂ）として表記した。この値が大きいほど、本発明の方法が優位である。また、同様の検討を重層法のプロトコールを用いても実施し、バッチ法と同様の結果を得た。
【００８９】
【表１】
2005168314.tif 000002
【００９０】
表１は、細胞性膜組成物を添加した無細胞タンパク質合成系によるＳＹＴ２タンパク質の検出量を示している。表中で、添加量は無細胞合成反応液中に含まれる細胞性膜組成物の量である。本発明法（Ａ）の値は、実施例２によって得られたものを使用して行った反応溶液１０μｌを検出に使用し、得られた二本のバンドのうち、上側のバンドを視覚化してそれを読み取ることによって算出した数値である。同様に、従来法（Ｂ）の値は、比較例１で得られたものを使用した反応溶液１０μｌを検出に使用し視覚化して読み取り算出した数値である。（Ａ）／（Ｂ）は、（Ａ）値を（Ｂ）値で割ったもので、本発明法／従来法の比を表している。従って、その数値が１よりも大きいということは、本発明が優位であることを示している。
【００９１】
表１から明らかなように、実施例１〜２で調製した細胞性膜組成物を用いてＳＹＴ２タンパク質を合成した結果は、比較例１で調製したものを使用して行った結果よりも高い測定値を示した。タンパク質合成反応溶液に細胞性膜組成物を１０％添加した系では、その測定値は３．３７倍高く、同様に１５％では３．３５倍、２０％では２．９８倍であった。細胞性膜組成物の添加量については、添加量を増やすとタンパク質の検出量としてはやや減少するが、添加量１０〜２０％の範囲で約２．９〜３．４倍と安定しており、本発明の細胞性膜組成物がタンパク質合成において優位であることが明白である。加えて、合成されたタンパク質のうち、糖鎖が付加されたとみられる上側のバンドと下側のバンドの比も、従来法では上／下が約４０〜７０％であるのに対し、本発明の方法では約１５０％と高く、より多くの合成されたタンパク質が活性型となっていた。以上のことから、本発明の細胞性膜組成物が従来の方法によって調製されたものに対して飛躍的に効果のあるものを提供し、高い進歩性を有していることが明らかである。
【００９２】
実施例６：各種の糖類並びに糖アルコール類を共存させた時のタンパク合成量の比較
各糖類および糖アルコール類を無細胞タンパク質合成の際に共存させ、合成量に対する影響を調べた。スクロース、トレハロース、それに糖アルコール類であるソルビトール、イノシトール、キシリトールを滅菌水に懸濁し、それぞれ最終濃度が１．２％になるよう合成用の反応系に加えた。具体的なタンパク質合成の方法は、上記実施例４で使用した、コムギ胚芽由来の抽出物を使用した無細胞タンパク質合成試薬キット「ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ」（和研薬、東洋紡製）を用い、取扱説明書に記載の方法に基づいてＲＩ−バッチ法で行った。本方法においては、１４Ｃで標識されたロイシンを無細胞合成反応に加え、２６℃で３時間反応させ、その反応液を濾紙にスポットし、その放射活性を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。その結果を、以下の図１に示す。
【００９３】
図１より明らかなように、糖類としてスクロースを添加した場合には、添加しない場合と比較してタンパク質の合成量はおよそ３０％程度減少していた。これに対し、それ以外の各糖類または糖アルコール類を添加した時には活性の低下は見られなかった。むしろ、ソルビトール、イノシトールおよびキシリトールのような糖アルコール類を添加した時にはやや合成量が増加していた。以上のことから、無細胞合成反応液中にスクロースを含む組成物が存在することは合成に悪影響を及ぼし、逆に糖アルコール類等の物質を含む緩衝溶液中で調製された細胞性膜組成物を含んでいても差し支えないまたはむしろ良い結果が得られることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の細胞性膜組成物は、膜に標的化されるタンパク質を合成する際にその効力を発揮し、特にこのような膜系タンパク質を、活性を保った形で合成・発現するのに有用である。現在、受容体等に代表される膜中に埋め込まれた形で存在するタンパク質については、生理活性の発現や各種調節機構等についてその医学的に果たしていると考えられる役割がクローズアップされており、膜系タンパク質の合成が容易に実施可能となることは、産業界に寄与できるところが非常に大である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、各種糖類または糖アルコール類を、無細胞タンパク質合成系に加えて反応させた結果を示している。各糖類を、最終濃度１．２％濃度で添加し、無細胞タンパク質合成を実施、合成されたタンパク質に取り込まれた１４Ｃ標識ロイシンの液体シンチレーションカウンターによる測定値を示す。従来、細胞性膜組成物の調製およびその懸濁に使用されていたスクロースは、無細胞合成系においてそのタンパク質合成量を減少させた。これに対し、トレハロースや糖アルコール類であるソルビトール、イノシトール、キシリトールは、影響がなく、これらの成分を含む緩衝溶液中に調製された細胞性膜組成物が反応系に存在しても、合成量に関して影響がないことは明白である。
【図１】
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【配列表】
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