(57)【要約】【課題】光学活性アルコールの製造に有用な新規カルボニル還元酵素を提供する。【解決手段】本発明は、２，３’−ジクロロアセトフェノンを還元して、>90%eeの(Ｒ)−２，３’−ジクロロ−１−フェニルエタノールを生成する性質を有する新規カルボニル還元酵素を提供する。また本発明は、該酵素発現するベクターおよび該ベクターが導入された形質転換体を提供する。さらに本発明は、本酵素を用いて高光学純度の光学活性アルコール製造する方法を提供する。本発明により、新規なカルボニル還元酵素が提供され、これにより高光学純度の光学活性アルコールの合成が可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質からなり、下記（１）および（２）に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドがコードするタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｅ）配列番号：１に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質。
（１）作用
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、(Ｓ)体アルコールを生成する。
（２）基質特異性
２，３'−ジクロロアセトフェノンを還元して、70%より大きい不斉選択性（>70%ee）で (Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを生成する。
【請求項２】
請求項１に記載のカルボニル還元酵素をコードするベクター。
【請求項３】
ストレプトマイセス (Streptomyces) 属細菌の少なくとも１つで該酵素を発現する、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
該ベクターが、Ｌ１１タンパク質遺伝子のプロモーターの下流に該酵素をコードするＤＮＡが機能的に連結されたＤＮＡを含む、請求項２または３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項２に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
ストレプトマイセス (Streptomyces) 属である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換体を培養し、発現したカルボニル還元酵素を回収する工程を含む、カルボニル還元酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のカルボニル還元酵素、該酵素をコードするベクターで形質転換された形質転換体、もしくは該形質転換体の処理物をケトンに接触させ、生成する光学活性アルコールを採取する工程を含む、光学活性アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性アルコールの製造に有用な新規カルボニル還元酵素および該酵素を利用した高光学純度の光学活性アルコールの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性アルコールは、各種医農薬の合成中間体として有用である。これは光学異性体が生理活性をまったく異にする場合があるためであり、たとえば対掌体の一方のみが有効な生理活性を示す場合、両者の共存によって、もう一方の異性体が単に活性を持たないという問題のみならず、有効な対掌体に対して競合阻害をもたらすこともある。従って、光学的に純粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な課題となっている。
【０００３】
この課題に対して、ラセミ体を合成した上で、それを効果的に光学分割する手法が広く用いられている。しかし合成後の分割による手法では、常に目的としない対掌体を副生成物として合成することになるので、原料の有効利用という点では問題を残す。たとえ回収された副生成物を原料として再生するとしても、常に一定量の副生成物の合成を繰り返すことには変わりは無い。したがって、副生成物や多量の廃液を生じない酵素法による光学分割が注目されている。酵素法による光学分割は、酵素の特異性を利用して、必要な対掌体を特異的に生成させる方法である。不要な対掌体の合成を低く抑えることができるので、光学的な純度に優れた生成物を容易に得ることができる。また、原料の有効利用の点でも有利である。
【０００４】
光学活性アルコールのうち、光学活性α−ハロフェニルエタノール誘導体は、各種医薬品、農薬の原料あるいは合成中間体として有用な光学活性スチレンオキサイド誘導体へと極めて容易に誘導することができる化合物であり、特に光学活性メタクロロスチレンオキサイドは、β３アドレノレセプターアゴニストの合成中間体として、極めて重要な化合物である。この光学活性なメタクロロスチレンオキサイドに誘導される(Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを酵素的に製造する方法として、酵母、バクテリアなど微生物菌体を用いた不斉還元 (特開平 4-218384、特開平 11-215995、特開2003-290、特願2002-109916) が知られている。しかし、これらの反応は、野生型の微生物を利用した反応であり、光学純度が低い、蓄積濃度が低いなどの問題がある。これを解決するための手段として、遺伝子工学的手法を利用した遺伝子組換え菌による物質生産が挙げられる。そのためには、カルボニル化合物を不斉還元して、高光学純度のアルコールを生成する酵素を見出し、効率的に発現可能な遺伝子組換え体を作成する必要がある。このような例としては、これまでにCorynebacterium sp. ST-10由来フェニルアセトアルデヒド還元酵素を発現する大腸菌による(Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールの製造法の報告 (Eur. J. Biochem. 269, 2394-2402 (2002))があるにすぎない。
【特許文献１】特開平 4-218384
【特許文献２】特開平 11-215995
【特許文献３】特開2003-290
【特許文献４】特願2002-109916
【非特許文献１】Eur. J. Biochem. 269, 2394-2402 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、光学活性アルコールの製造に有用な新規カルボニル還元酵素、該酵素を高レベルで発現することができるベクター、該ベクターが導入された宿主細胞、該酵素の製造方法、および該酵素を利用した高光学純度の光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。本発明は、特に (Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを製造するために有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、Streptomyces由来のカルボニル還元酵素を用いることを考えた。そして、Streptomyces coelicolorのゲノムプロジェクトにより推定されたORFがコードするあるアミノ酸配列 (AL939131-111) に着目した。このORFのアミノ酸配列は、Corynebacterium sp. ST-10由来フェニルアセトアルデヒド還元酵素のアミノ酸配列と65%の相同性を示していた。しかし、本ORFはゲノムプロジェクトの結果として推定されているに過ぎず、このORFが活性タンパク質をコードしているかどうか、また、その産物がケトンを還元し、高光学純度のアルコールを生成する能力を持つか否かに関しては不明であった。そこで、本発明者らは本遺伝子がコードするタンパク質に関し鋭意検討を重ねた結果、本遺伝子からカルボニル還元活性を持つタンパク質を発現させ回収することに初めて成功した。さらに本発明者らは、発現させた本タンパク質が、２，３'−ジクロロアセトフェノンを還元し、(Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを極めて高い光学純度で生成することを見出した。本発明により、２，３'−ジクロロアセトフェノンなどのケトンに本タンパク質を作用させ、光学活性アルコールを高純度で製造することが可能になる。
【０００７】
すなわち、本発明はStreptomyces属に由来する新規カルボニル還元酵素、該酵素を含むベクター、およびその形質転換体に関する。さらに本発明は、本酵素を用いた光学活性アルコールの製造法に関する。本発明は、より具体的には
〔１〕次の（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質からなり、下記（ｉ）および（ii）に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素；
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドがコードするタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｅ）配列番号：１に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするタンパク質。
（ｉ）作用
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、(Ｓ)体アルコールを生成する。
（ii）基質特異性
２，３'−ジクロロアセトフェノンを還元して、70%より大きい不斉選択性（>70%ee）で (Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを生成する。
〔２〕〔１〕に記載のカルボニル還元酵素をコードするベクター；
〔３〕ストレプトマイセス (Streptomyces) 属細菌の少なくとも１つで該酵素を発現する、〔２〕に記載のベクター；
〔４〕該ベクターが、Ｌ１１タンパク質遺伝子のプロモーターの下流に該酵素をコードするＤＮＡが機能的に連結されたＤＮＡを含む、〔２〕または〔３〕に記載のベクター；
〔５〕〔２〕に記載のベクターで形質転換された形質転換体；
〔６〕ストレプトマイセス (Streptomyces) 属である、〔５〕に記載の形質転換体；
〔７〕〔５〕または〔６〕に記載の形質転換体を培養し、発現したカルボニル還元酵素を回収する工程を含む、カルボニル還元酵素の製造方法；
〔８〕〔１〕に記載のカルボニル還元酵素、該酵素をコードするベクターで形質転換された形質転換体、もしくは該形質転換体の処理物をケトンに接触させ、生成する光学活性アルコールを採取する工程を含む、光学活性アルコールの製造方法、を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、光学活性アルコールを生成する新規なカルボニル還元酵素が提供された。また本発明により、該酵素を含むベクター、および形質転換体が提供された。本酵素は、２，３'−ジクロロアセトフェノンを還元して、>70%eeの(Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを生成する性質を有する。本発明により、高光学純度の光学活性アルコール製造法が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むカルボニル還元酵素に関する。本発明はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。本発明のカルボニル還元酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００１０】
本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が以下に示す理化学的性質を有することを意味する。
（１）作用
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、(Ｓ)体アルコールを生成する。
（２）基質特異性
２，３'−ジクロロアセトフェノンを還元して、>７０％ｅｅの (Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを生成する。
【００１１】
また、好ましくは本発明のタンパク質は、ケトンを基質として 75％eeより高い、望ましくは80％eeより高い、より好ましくは90％eeより高い光学純度の光学活性アルコールを生成することができるタンパク質である。生成物の光学純度は、反応生成物の光学分割カラムなどによる解析によって確認できる。
なお本発明における「光学活性アルコール」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるアルコール、もしくはある光学異性体のみからなるアルコールを意味する。さらに、本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
したがって、ケトンを不斉還元して光学活性アルコールを生成しうる酵素とは、あるケトン化合物を基質として与えたときに、対応する光学活性アルコールを生成しうる酵素と定義される。
【００１２】
当業者であれば、配列番号：１に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより本カルボニル還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのカルボニル還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載のカルボニル還元酵素のホモログを得ることが可能である。
【００１３】
さらに、本発明のカルボニル還元酵素のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。アミノ酸配列の同一性は、比較したい２つの配列を、アミノ酸がなるべく一致するように適宜ギャップを挿入して整列させ、配列番号：２全長に対する一致するアミノ酸の割合として算出することができる。アミノ酸配列の整列（アライメント）は、所望のコンピュータプログラムを利用することができ、例えばCLUSTAL W（Higgins, D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）、またはBLAST（National Center for Biothchnology Information）などを用いることができる。ギャップはミスマッチしたアミノ酸と同様に扱い、配列全長のアミノ酸数（ギャップを含む）のうち、両者の配列で一致したアミノ酸数の割合として同一性が決定される。但し、両方の配列の同じ位置に共にギャップを入れた場合には、そのギャップは計算から除外する。
【００１４】
タンパク質のホモロジー検索は、具体的にはBLAST（National Center for Biothchnology Information, Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410）、FASTA（W. R. Pearson and D. J. Lipman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-448, 1988）などのプログラムを利用して、各種のアミノ酸配列データベースやDNAデータベースを対象にして行うことができる。データベースには、たとえばDAD、SWISS-PROT、PIRなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGenebankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを用いることができる。これらのデータベースは、いずれもインターネットを通じて利用することができる。
【００１５】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてDADを対象にBLASTプログラムを用いてホモロジー検索を行った。その結果、Identityで70%以上のホモロジーを有するタンパク質は見出されなかった。最も高いホモロジーを示したロドコッカス・ルバー (Rhodococcus ruber) 由来２級アルコール脱水素酵素に対するホモロジーは、Genetyx-win（ソフトウェア開発株式会社製）ソフトのMaximum Matchingプログラムを用いて計算（J. Biochem., 92 , 1173-1177 (1984)）した結果、６６％であった。本発明の７０％以上のホモロジーとは、例えば、Maximum Matchingプログラムを用いた相同性の値を表す。
【００１６】
本発明のカルボニル還元酵素は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な活性を有する限り、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また本発明のカルボニル還元酵素、あるいはそのホモログは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な活性を有する限り、断片であってもよい。
【００１７】
本発明のカルボニル還元酵素をコードするポリヌクレオチド（DNAであってもRNAであってもよい）は、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
たとえば配列番号：１に記載の塩基配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを得ることができる。
さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のカルボニル還元酵素をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
なお本発明のカルボニル還元酵素をコードするポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
【００１８】
ハイブリダイゼーションにおいては、配列番号：１の相補配列またはその部分配列からなる核酸（DNAまたはRNA）をプローブとして、対象とする核酸に対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した20塩基以上、好ましくは25塩基以上、さらに好ましくは30塩基以上、さらに好ましくは40塩基以上、さらに好ましくは80塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上（例えば配列番号：１全長）を用いる。プローブに配列番号：１またはその相補配列以外の無関係な配列（ベクター由来の配列など）が含まれる場合には、ネガティブコントロールとしてその配列だけをプローブにして同様にハイブリダイゼーションを行い、同様の条件下で洗浄後にそのプローブが対象とする配列に有意にハイブリダイズしないことを確認してもよい。ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。
【００１９】
ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件を具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００２０】
このようにして単離された、本発明によるカルボニル還元酵素をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、カルボニル還元酵素発現ベクターが提供される。
【００２１】
本発明はまた、本発明のベクターを発現可能に保持した形質転換体に関する。
本発明においてカルボニル還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、カルボニル還元酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、カルボニル還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
ストレプトマイセス(Streptomyces)属
ロドコッカス(Rhodococcus)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００２２】
放線菌由来の遺伝子発現には、しばしば困難が伴う。放線菌遺伝子はＧＣ含量が高く、コドン使用頻度にも偏りが見られる。また、RNAが複雑な高次構造をとることも予想される。このことから、放線菌由来の遺伝子を他の属の宿主、たとえば大腸菌で発現させる場合にはタンパク質が発現しない場合がある。実際、本発明において、ストレプトマイセス属由来の配列 (配列番号：１) を持つポリヌクレオチドを大腸菌の発現ベクターpSE420D (特開2000-189170) に挿入することで発現ベクターを構築し、大腸菌に導入したが、カルボニル還元酵素は発現しなかった。
しかし、本発明者らは、ストレプトマイセス属の放線菌において発現可能に構築されたベクターpSK1127 (参考例２) に配列番号：１のポリヌクレオチドを導入することにより、ストレプトマイセス属の放線菌でカルボニル還元酵素を高発現させることに成功した。従って本発明の酵素は、ストレプトマイセス属等の放線菌で発現させることが好ましく、この場合の発現ベクターとして、実施例に記載のpSK1127およびpSK811で用いられたようにL11タンパク質遺伝子（rplK遺伝子）のプロモーター等の放線菌で機能するプロモーターを持つものが好適である。但し、多様な属で効率よく発現させるために、配列番号：１のポリヌクレオチドは各宿主に適した形に変異させ得る。たとえば他の属の宿主における発現の効率を上げるために、宿主のコドン使用頻度に応じてポリヌクレオチドは変更してもよい。
【００２３】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明のカルボニル還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に放線菌に関しては、Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation (2000)、酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００２４】
例えばストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、pIJ101、SCP2*系プラスミド、oriT (RK2) ベクターなどが利用可能である。中でも、rplKプロモーターとssgAターミネーターを組み込んだベクターpSK1127およびpSK811 (参考例２) が好適に利用できる。
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００２５】
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のpSE420（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターpSE420D（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr (アルカリプロテアーゼ)、npr (中性プロテアーゼ)、amy (α−アミラーゼ)などが利用できる。
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ (Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア (Pseudomonas cepacia) などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター (RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む) pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００２６】
ブレビバクテリウム属、特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム (Brevibacterium lactofermentum) においては、pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)) などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) においては、pCS11 (特開昭57-183799)、pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)) などのプラスミドベクターが利用可能である。
ストレプトコッカス (Streptococcus) 属においては、pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
ラクトバチルス (Lactobacillus) 属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００２７】
サッカロマイセス (Saccharomyces) 属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ (Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH (アルコール脱水素酵素)、GAPDH (グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO (酸性フォスファターゼ)、GAL (β−ガラクトシダーゼ)、PGK (ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO (エノラーゼ) などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス (Kluyveromyces lactis) においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００２８】
シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces) 属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子) 及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
チゴサッカロマイセス属 (Zygosaccharomyces) においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii) 由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００２９】
ピキア (Pichia) 属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH (ギ酸脱水素酵素) のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス (Pichia pastoris) などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ (Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス (Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス (Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス (Candida utilis) などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００３０】
アスペルギルス (Aspergillus) 属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
トリコデルマ (Trichoderma) 属においては、トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる
【００３１】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories、1989年; 微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版）。例えば、ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って実施することができる。形質転換は、例えば文献（Hopwood, D. A., M. J. Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, H. M. Kieser, D.J. Lydiate, C. P. Smith, J. M. Ward, and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces: a laboratory mannual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom）記載の方法に準じて実施することができる。
【００３２】
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のカルボニル還元酵素を組換え体から得ることができる。
上記組換え体は、宿主の生育に適した培地で培養される。十分に増殖させた後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェニルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤やプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより本発明のカルボニル還元酵素を精製することができる。
【００３３】
以下に、放線菌において本発明のカルボニル還元酵素を発現させるために適した発現ベクターを例示する。このベクターは、L11タンパク質遺伝子（rplK）のプロモーター配列の下流に本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡが機能的に連結されたＤＮＡを含む発現ベクターである。本発明においてL11タンパク質遺伝子とはリボゾームタンパク質L11をコードする遺伝子を言い、具体的には配列番号：３に記載のS.griseus rplK遺伝子および他の放線菌におけるそのカウンターパートが含まれる。L11タンパク質遺伝子は極めて保存性の高い遺伝子であるので、当業者にとってはこの遺伝子を同定することは容易である。L11タンパク質遺伝子として、以下の核酸を示すことができる。
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、リボソームタンパク質をコードする核酸、
（ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と70％以上のホモロジー（同一性）を有するアミノ酸配列を含み、リボソームタンパク質をコードする核酸、および
（ｄ）配列番号：３に記載のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含み、リボソームタンパク質をコードする核酸
上記（ｂ）において改変されるアミノ酸数は、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下である。配列番号：４とのアミノ酸配列のホモロジーは、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上である。ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、上述した通りである。
【００３４】
このL11タンパク質遺伝子（L11遺伝子とも言う）の翻訳開始コドンの上流領域のDNAを、本発明のカルボニル還元酵素を発現する発現ベクターの構築のために好適に用いることができる。このベクターの１つの態様は、配列番号：５に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するDNAの塩基配列の下流に、本発明のカルボニル還元酵素をコードするDNAが機能的に結合された塩基配列を含む発現ベクターであって、放線菌において本発明の酵素を検出可能に発現するものである。プロモーター活性とは、下流に連結した遺伝子を転写する活性である。プロモーター活性は、例えば本発明の酵素のコード配列を基に設計したプライマーを用いたRT-PCR、あるいは本発明の酵素に結合する抗体を用いたウェスタンブロッティング等により検出することができる。なお、下流とは、転写される側のポリヌクレオチド鎖の3'方向のことであり、上流とは、転写される側のポリヌクレオチド鎖の5'方向のことである。
【００３５】
また本発明において遺伝子とは、転写されるべき塩基配列を含む核酸を言う。本発明のDNAベクターは通常は２本鎖DNAであるが、放線菌に導入した時に２本鎖DNAを生じる限り、どちらか一方の鎖からなるDNAを含むベクター（例えば一本鎖DNAを含むファージなど）であってもよい。すなわち本発明においてある塩基配列を含むDNAベクターとは、その塩基配列を含む２本鎖DNAを生じることができるように、該塩基配列および／またはその相補配列を含むDNAベクターのことである。
【００３６】
配列番号：５に示した配列は、放線菌 S.griseusのL11遺伝子のプロモーター断片であって、強力なプロモーター活性を持っている。本発明者らが、S.griseus, S.lavendulae（配列番号：７）, S.virginia（配列番号：８）, および S.coelicolor（配列番号：９）を含む放線菌においてL11遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析したところ、この領域の配列は極めて保存性が高いことが判明した（Puttikhunt,C. et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 247: 118-122）。調べた放線菌４菌株で、-10領域、転写開始点、およびShine-Dalgarno (SD) 配列は100%保存されており、それ以外の領域の保存性も極めて高かった。本発明においては、これらの放線菌のL11タンパク質遺伝子のプロモーター配列を好適に用いることができる。例えば、好ましい発現ベクターとしては、所望の放線菌のリボゾームタンパク質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列を含み、その下流に機能的に本発明の酵素をコードする遺伝子の塩基配列および転写終結配列が結合された発現カセットを有する発現ベクターが含まれる。
【００３７】
またプロモーターとしては、L11遺伝子上流領域を、翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列よりも広範囲にわたって有していてもよい。例えば、配列番号：５より長くL11遺伝子の上流領域を含むDNA断片である配列番号：６を好適に用いることができる。より具体的に例示すれば、放線菌リボゾームタンパク質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流、約3塩基から約197塩基までの塩基配列、より好ましくは約3塩基から約277塩基までの塩基配列を含んでもよい。
【００３８】
また、プロモーターとして、放線菌L11タンパク質遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（例えば配列番号：５）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：６）において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または付加した塩基配列を含みプロモーター活性を有する塩基配列を用いることもできる。このような塩基配列としては、S.lavendulae, S.virginia, および S.coelicolor由来の配列（それぞれ配列番号：７、８、および９）を含むDNAが挙げられる。また、このような配列は人為的に変異させたものであってもよく、または天然に変異した配列であってもよい。例えば部位特異的変異導入による塩基置換、あるいは１または複数の塩基の欠失または挿入などにより塩基配列を改変し、プロモーター活性を上昇させたり、あるいはプロモーター活性に影響を与えない配列を除去することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。このように改変した配列のプロモーター活性は、実施例に示したように発現ベクターを構築し、下流に連結した遺伝子の発現を調べることにより評価することができる。改変前の配列とプロモーター活性を比較し、プロモーター活性が維持された（またはより強い）配列を適宜選択することができる。
【００３９】
プロモーターとして用いるために適した塩基配列としては、具体的には、放線菌リボゾームタンパク質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（特に配列番号：５）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：６）において、50塩基以内、好ましくは40塩基以内、より好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは20塩基以内、最も好ましくは10塩基以内（例えば5塩基以内）の塩基が置換、欠失、および/または付加した塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列である。置換、欠失、および付加は任意に組み合わせてよい。塩基の改変にあたっては、野生型L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約60塩基目から約84塩基目までの配列が改変されずに保持されていることが好ましい。より特定すれば、放線菌L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約57塩基目から約84塩基目までで保存された 5'-ATACCCGTTATCGT[G/T]GTGCGGTATGCCT-3' (配列番号：10) を含む（スラッシュはいずれかの塩基であることを示す）ことが好ましい。さらに好ましい態様では、野生型L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約101塩基目から約115塩基目までの配列が改変されずに保持されていることが好ましい。より具体的に記載すれば、L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約98塩基目から約115塩基目までで保存された 5'-TCTGACCTGCT[G/C]GGTTTT-3' (配列番号：11) を含む（スラッシュはいずれかの塩基であることを示す）ことが好ましい。
【００４０】
また、プロモーターに適した塩基配列としては、放線菌リボゾームタンパク質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（例えば配列番号：５）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：６）と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、最も好ましくは90%以上（例えば95%以上）の同一性を有する塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。
【００４１】
あるいは、放線菌リボゾームタンパク質L11遺伝子の翻訳開始コドンから上流約3塩基から約176塩基までの塩基配列（特に配列番号：５）またはその相補配列を含むDNAまたはRNA、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約3塩基から約277塩基までの塩基配列（例えば配列番号：６）またはその相補配列を含むDNAまたはRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件は、本明細書に記載したものとすればよい。
【００４２】
本発明の酵素を発現する発現ベクターは、好ましくは本発明の酵素のコード配列の下流に転写終結配列（ターミネーター）を含む。転写終結配列は、その上流のプロモーターからの転写を終結させる能力を持つ所望の配列を用いることができ、例えば所望の放線菌遺伝子の転写終結配列を用いることができる。転写終結配列としては、好ましくはRho因子非依存的に転写を終結させることができる転写終結配列（すなわちintrinsic terminator）が用いられる。最強な転写終結活性を持つターミネーターを組み合わせることにより、mRNAの安定化の向上が期待できる。このような転写終結配列は、一般に 7 bpから20 bpまたはそれ以上のステムループ構造をつくるパリンドローム配列を有している。また一般にGCに富む。特に、ステムループを形成させたときの自由エネルギー低下（ΔG）が-50 Kcal以下、より好ましくは-55 Kcal以下、より好ましくは-60 Kcal以下、より好ましくは-65 Kcal以下、より好ましくは-70Kcal以下となる配列が好ましい。ステムループのΔGは、例えばRNA二次構造予測プログラムを用いて計算することができる。具体的には、DNASIS（Hitachi Software Engineering Co., Ltd.）を利用することができる。
【００４３】
ステム部分は全域にわたって塩基対を形成しなくてもよい。好ましくは、20塩基以上の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。さらに好ましくは、30塩基の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。さらに好ましくは、35塩基の領域にわたって70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。ループ部分の大きさは特に制限はないが、典型的には2〜100塩基、例えば3〜50塩基である。
【００４４】
より好ましい態様では、転写終結配列としては放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列が用いられる。ssgAの転写終結配列は20塩基対以上のステムを形成しRho非依存的に転写を終結させることができる。ssgAの転写終結配列を用いることによって、より性能の高い発現ベクターを構築することが可能である。好適に用いられるssgAのRho非依存的転写終結配列を配列番号：12に例示した。この配列はS. griseus ssgAの転写終結配列に由来し、20塩基以上のステムを形成する。本発明のベクターにおいては、ssgAの翻訳停止コドンの次の塩基から200、250、または300塩基を含む領域を用いてよい。例えば、配列番号：13に示した塩基配列を含むDNAを転写終結配列として好適に用いることができる。また本発明においては、放線菌 ssgAの転写終結配列（例えば配列番号：12または13）の塩基配列、または該配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および/または付加した塩基配列を含み、転写を終結させる活性を有する塩基配列を好適に用いることができる。
【００４５】
具体的に例示すれば、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：12、より好ましくは配列番号：13）において50塩基以内、好ましくは40塩基以内、より好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは20塩基以内、最も好ましくは10塩基以内（例えば5塩基以内）の塩基が置換、欠失、および/または付加した塩基配列であって、転写を終結させる活性を有する塩基配列である。置換、欠失、および付加は任意に組み合わせてよい。塩基の改変にあたっては、上記したように、ΔGが-50 Kcal以下、好ましくは-55 Kcal以下、より好ましくは-60 Kcal以下、より好ましくは-65 Kcal以下、より好ましくは-70 Kcal以下となるように調整する。また、ステムの長さおよび塩基対の割合は上記に従うことが好ましい。あるいは転写終結配列は、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：12、より好ましくは配列番号：13）と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、最も好ましくは90%以上（例えば95%以上）の同一性を有する塩基配列、あるいは、放線菌ssgA遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：12、より好ましくは配列番号：13）またはその相補配列を含むDNAまたはRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列であって、転写を終結させる活性を有する塩基配列を好適に用いることができる。塩基配列の同一性の算出、およびハイブリダイゼーションの条件は、本明細書に記載した通りである。
【００４６】
発現ベクターの１つの態様はプラスミドベクターである。プラスミドには、放線菌で増幅するための複製起点（ori）が含まれている。さらに大腸菌で増幅するための複製起点を有していてもよい。放線菌と大腸菌の両方で増幅可能なベクターは、大腸菌−放線菌シャトルベクターとして利用することができる。放線菌で増幅するための複製起点（ori）は、低コピー型であっても多コピー型であってもよい。低コピープラスミドとは、放線菌内で1から10コピー程度のプラスミド増幅をもたらすプラスミドを言い、多コピープラスミドとはそれより多いもの、具体的には40コピーから400コピー程度またはそれ以上のコピー数をもたらすプラスミドを言う。低コピーのoriを例示すれば、例えば SCP2* ori（Lydiate, D.J. et al. (1985) Gene 35(3):223-235）が挙げられる。高コピーのoriとしては、例えば pIJ101 ori（Katz, E. et al., (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714）が挙げられる。またプラスミドベクターは、これを保持した宿主を選択できるように、適当な薬剤耐性遺伝子または代謝酵素などのマーカー遺伝子を含むことが好ましい。このようなマーカー遺伝子は、例えばアンピシリン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、およびアプラマイシン耐性遺伝子などが含まれ、これらはいずれも当業者にはよく知られている。また、放線菌プラスミドの構築には、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995))、pIJ702（Katz, E. et al., (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714）、pIJ8600（Sun, J. et al. (1999) Microbiology 145:2221-2227）などの配列を利用することができる。
【００４７】
また発現ベクターの他の１つの態様は、ゲノム組み込み型ベクターである。ゲノム組み込み型ベクターとは、放線菌に導入されたときに、放線菌ゲノムに組み込まれて、ゲノム上から組み込んだ遺伝子を発現できるベクターである。放線菌に導入する前では、このベクターは、プラスミドの形態で調製することもできる。ゲノム組み込み型ベクターの作成においては、放線菌ファージが持つ、宿主ゲノムへのファージDNAの組み込みに必要な組み換え配列を利用することができる。具体的には、例えばφ31ファージのint遺伝子とattPをベクターに挿入すればよい（Bierman, M. et al., (1992) Gene 116: 43-49）。プラスミドを菌体内で保持させ続けるには、通常プラスミドに組み込んだ薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤により選択し続ける必要があるが、ゲノム組み込み型の発現ベクターは安定であるため、一度組み換え菌を得た後では、薬剤選択の必要がない点で優れている。
【００４８】
以上に示した放線菌発現ベクターに本発明のカルボニル還元酵素をコードする遺伝子を組み込み、放線菌に形質転換することにより、本発明の酵素を効率的に生産する形質転換体を得ることが可能である。このような形質転換体の一例としては、受託番号 FERM Ｐ−１９４６５として寄託された放線菌が挙げられるが、これに限定されない。
【００４９】
本発明の放線菌形質転換体から得られる酵素活性は、好ましくは 0.01 U/mg蛋白質 (無細胞抽出液中のタンパク質1 mg当たりのユニット) 以上、好ましくは0.10 U/mg蛋白質以上、好ましくは0.30 U/mg蛋白質以上、より好ましくは0.50 U/mg蛋白質以上、より好ましくは0.70 U/mg蛋白質以上、より好ましくは0.80 U/mg蛋白質以上、より好ましくは1.00 U/mg蛋白質以上である。ここで１Uの酵素活性とは、本発明による形質転換体から得られた無細胞抽出液において、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量を言う。酵素活性は、100 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.5)、0.2 mM NADH、20 mM アセト酢酸エチル、及び上記無細胞抽出液を含む反応液中で30℃で反応させる条件において、測定することができる。本発明による形質転換体は、好ましい態様において、pIJ101 oriなどを含む多コピープラスミド（例えばpSK1127）に組み込まれた形態で放線菌、好ましくはStreptomyces lividans、より好ましくは S. lividans TK21株（Parro, V., et al., 1999, Microbiology 145:2255-2263; Hopwood, D.A. et al. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual (The John Innes Foundation, Norwich, England)）(John Innes Institute, Norwich, England から入手可能) に形質転換することによって得ることができる。
【００５０】
また本発明は、前記本発明のカルボニル還元酵素、本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株、または、その処理物、をケトンに作用させ、生成する光学活性アルコールを回収する工程を含む光学活性アルコールの製造方法に関する。処理物とは、生物細胞に対して、物理処理、生化学的処理、あるいは化学的処理等を行った産物を指す。例えば、形質転換株の破砕物、該形質転換体から得られた粗精製酵素等は処理物に含まれる。生物細胞は、上記酵素を含む細胞もしくは微生物に加え、当該酵素の遺伝子を発現可能に保持する形質転換体も含まれる。また処理物を得るための物理処理には、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、あるいは磨砕処理等が含まれる。また生化学的処理とは、具体的にはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理を示すことができる。更に、化学的処理としては、界面活性剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶媒との接触処理などが挙げられる。このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
また、本発明の微生物菌体あるいは菌体処理物は、たとえばポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（κ-カラギーナンゲル法など）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法、イオン交換樹脂法などの公知方法により固定化して使用することもできる。
【００５１】
本発明の製造方法において、微生物、その菌体またはその処理物を反応基質に作用させる方法は任意である。たとえば、溶液中で両者を混合することにより、微生物、その菌体またはその処理物を作用させることができる。あるいは、反応基質の交換が可能な膜を介して微生物、その菌体またはその処理物を作用させることもできる。膜を利用することによって、反応生成物の回収における微生物菌体の分離を省略することができる。あるいは両者を混合する場合には、固定化された微生物、その菌体またはその処理物を用いることによって、反応生成物を容易に分離することができる。
【００５２】
反応条件としては、たとえば以下の条件を示すことができる。
pH 4.0から9.0、好ましくはpH 6.0から8.0、
温度15から50℃、好ましくは20から35℃、
反応時間は、4時間から7日間接触させる
【００５３】
本発明の製造方法において、微生物、その菌体またはその処理物は、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元体（NADH）の存在下で、基質化合物に作用させることができる。一般に微生物による基質の還元反応は、還元エネルギー源を供給することにより増強される。β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元体は、本発明の製造方法のための還元エネルギー源として望ましい。
本発明において、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元体、またはβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元体は、これらの化合物を添加することによって供給することができる。また、上記反応に伴って生成する、これら還元エネルギー源の酸化体を、還元体に再生するための反応系を組み合せることもできる。
【００５４】
上記還元反応に付随して還元エネルギー源から生成する酸化体の、還元体への再生は、微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるアルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。また、本発明のカルボニル還元酵素の持つアルコール酸化活性を利用して、反応系に２−プロパノールや２−オクタノールなど本発明の酵素の酸化反応に適する基質を添加することにより、該酵素自身を用いてＮＡＤＨの再生を行うこともできる。これらの化合物は、基質ケトンに対してモル比で例えば０．１−２０、好ましくは１−１５倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などの、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）再生用の酵素は、本発明のカルボニル還元酵素に比較して酵素活性で例えば０．１−１００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができる。
【００５５】
また還元エネルギー源として、糖類、アルコール類、あるいは糖アルコール類などの存在下で不斉還元反応を行うことにより、さらに効率的な反応が期待できる。使用する還元エネルギーとしては、該微生物が還元エネルギーとして使用できるものであれば、特に制限はなく、例えば糖類としては、グルコース、フルクトース、シュクロース等を用いることができる。アルコール類としては、エタノール、イソプロパノール、グリセロール等が利用できる。またソルビトールなどを糖アルコール類として示すことができる。還元エネルギーのために添加する化合物は、反応基質量に応じて添加することができる。
還元エネルギー源の消費に伴って、反応液のpHに変化が見られる場合には、適当な酸、アルカリを用いてpHを一定範囲内に調節することで、さらに良好な反応性を維持して、反応を行なうことも可能である。
【００５６】
また本発明のカルボニル酵素を発現ベクターで発現させる際に、還元体（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）への再生活性の高い微生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、還元体への再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、還元体への再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子（補酵素再生用脱水素酵素遺伝子）を、本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的に還元体への再生と本発明のカルボニル還元酵素の発現、および還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００５７】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００５８】
本発明による光学活性なアルコールの製造方法におけるケトンとしては、好ましくはβ−ケトエステル類、より具体的には２，３'−ジクロロアセトフェノン、アセトフェノン、アセト酢酸エチルなどが挙げられ、これらを基質として光学活性アルコールを製造することができる。
【００５９】
本発明における反応基質であるケトン、たとえば２，３'−ジクロロアセトフェノンは、目的とする生成物を効率的に生成できるように、反応を阻害しない範囲で、適切な濃度で用いることができる。２，３'−ジクロロアセトフェノンの反応液中における濃度として、たとえば０．１から５０%w/v、好ましくは１から２０%w/vを示すことができる。
２，３'−ジクロロアセトフェノンは、一般に水に対する溶解度が低い。したがって高濃度の基質を加えても、溶解した基質しか反応しないため、基質の添加量に比べて反応速度が低くなることがある。基質の溶解度を高めるために、メタノール、エタノール、アセトン、テトラハイドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水溶性溶媒を添加することもできる。
２，３'−ジクロロアセトフェノンは、一括（バッチ法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加（フィード法）等の任意の方法で添加することができる。また、基質、生成物の菌体に対する毒性を低減、回避することを目的として、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエンなどの水に不溶な有機溶媒を添加することもできる。
【００６０】
本発明の不斉還元反応においては、好気的条件下では通常副生成物が多くなることもある。この場合には、嫌気的、あるいは酸素の制限条件下で反応を行うことにより、高い収率を期待できる。具体的には、たとえば窒素を液中もしくは気相中に通じて反応させることにより、収率の向上を期待できる。
かくして、本発明の反応により、２，３'−ジクロロアセトフェノンは不斉還元され光学活性な (Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールが生成する。生成した光学活性 (Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールは、常法に従って容易に単離することができる。たとえば、反応液から、直接もしくは菌体などの不溶性物質を除去した後、酢酸エチル、ヘキサン、ジエチルエーテルなどで抽出後、これを減圧濃縮することにより、光学活性(Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを採取することができる。
【００６１】
さらに反応生成物の純度を上げるには、このものを少量の溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なうことで高度に精製することができる。
このようにして得られた光学活性(Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールは、苛性ソーダなどのアルカリを等モル以上存在させ、加熱あるいは室温放置することで容易に閉環し、光学活性なメタクロロスチレンオキサイドに変換されうる。
【実施例１】
【００６２】
以下に、本発明を実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
【００６３】
[実施例１]  放線菌 (Streptomyces coelicolor) のカルボニル還元酵素遺伝子の取得
放線菌 (Streptomyces coelicolor) M145株をYEME培地 (Difco yeast extract 3 g, Difco Bacto-peptone 5g, Oxoid malt extract 3g, Glucose 10 g, Sucrose 340 g, 5 mM MgCl2-6H2O, 0.5% Glycine / L) で培養し、得られた菌体から Hopwood, D. A.ら記載の公知の方法 (Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation (2000)) により染色体DNAを調製した。S.coelicolor M145株の AL939131-111 (配列番号：１) をPCRクローニングするため、本遺伝子の5'末端、3'末端の配列をもとに、プライマーSCP-ATG2 (GAAAGATCTAAAGGAGTTCGATCATGAAGGCACTGCAG / 配列番号：14)、SCP-TGA2 (CCGACTAGTTCAGCCGTGGGGCAGGATCACC / 配列番号：15) を合成した。S.coelicolor M145株の染色体DNAを鋳型とし、SCP-ATG2、SCP-TGA2をプライマーとして、PCR (96℃, 30秒、63℃, 30秒、72℃, 2分)を30サイクル行い、特異的な増幅DNAを得た。
【００６４】
[実施例２]  放線菌由来カルボニル還元酵素遺伝子を発現するプラスミドpSK-SCP1の構築
プラスミドpSK1127（参考例２）をBgl II, Spe Iの２つの制限酵素で二重消化し、実施例１で調製したDNA断片より同酵素で切り出した放線菌由来カルボニル還元酵素遺伝子を含むDNA断片とT4 DNAリガーゼで連結し、大腸菌 (Escherichia coli) JM109株を形質転換してプラスミドpSK-SCP1を得た。得られたプラスミド中の挿入断片は塩基配列を解析し、AL939131-111の塩基配列 (配列番号：１) と一致していることを確認した。なお、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００６５】
[実施例３]  放線菌由来カルボニル還元酵素遺伝子の発現
pSK-SCP1で形質転換した放線菌Streptomyces lividans TK21株をアプラマイシン50 mg/Lを含むYEME培地で96時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置 UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。用いられた形質転換体（pSK-SCP1で形質転換した放線菌Streptomyces lividans TK21株）は、以下のとおり特許生物寄託センターに寄託された。
【００６６】
Streptomyces lividans TK21（pSK-SCP1）の寄託：
(a)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第６（郵便番号305-8566）
(b)寄託日    平成１５年８月５日
(c)受託番号  FERM Ｐ−１９４６５
【００６７】
[実施例４]  放線菌由来カルボニル還元酵素の酵素活性
実施例３で得られた無細胞抽出液を用い、アセト酢酸エチル、２，３’−ジクロロアセトフェノン、アセトフェノン、２−プロパノール、(Ｓ)−２−オクタノールを基質とした酵素活性を測定した。還元活性の測定は、100 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.5)、0.2 mM NADH、20 mM アセト酢酸エチル (２，３’−ジクロロアセトフェノン還元活性測定の場合には2 mM ２，３’−ジクロロアセトフェノン、アセトフェノン還元活性測定の場合には5 mM アセトフェノン)、及び酵素を含む反応液中で、30℃で反応させた。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。酸化活性の測定は、50 mM トリス−塩酸緩衝液 (pH9.0)、2.5 mM NAD、200 mM ２−プロパノール ((Ｓ)−２−オクタノール還元活性測定の場合には5 mM (Ｓ)−２−オクタノール)、及び酵素を含む反応液中で、30℃で反応させた。1 Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。
【００６８】
組換え菌から得た無細胞抽出液では、NADH依存的にアセト酢酸エチル還元活性を示し、その比活性は、1.26 U/mg-蛋白質であった。一方、カルボニル還元酵素を挿入していないベクタープラスミドpSK1127で形質転換された S.lividans TK21株から得た無細胞抽出液では、0.0036 U/mg-蛋白質であった。また、組換え菌から得た無細胞抽出液の各基質に対する酵素活性を下表に示す。
【００６９】
【表１】
2005095022.tif 000002
【００７０】
[実施例５]  放線菌由来カルボニル還元酵素による (Ｒ)−２，３’−ジクロロ−１−フェニルエタノールの合成
200 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 6.5)、1mM NAD、2.5 mM ２，３’−ジクロロアセトフェノン、1 U グルコース脱水素酵素 (Bacillus sp.)、250 mM グルコース、0.1% ウシ血清アルブミン、実施例３で得られた無細胞抽出液 0.05 Uを含む1 mLの反応液を用い、25℃で一晩反応させた。
反応液より2倍量の酢酸エチルを用いて (Ｒ)−２，３’−ジクロロ−１−フェニルエタノールを抽出し、脱溶媒後、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー (カラム, ダイセル化学製キラルセルOJ; 移動相, ｎ−ヘキサン／２−プロパノール (３９／１); 検出波長, 254 nm; 流速, 1.0 mL/分) により測定した。保持時間 12.6分で ２，３’−ジクロロアセトフェノン、保持時間18.1分で(Ｒ)−２，３’−ジクロロ−１−フェニルエタノール、20.8分で (Ｓ)−２，３’−ジクロロ−１−フェニルエタノールが検出された。
その結果、変換率 99.97%で (Ｒ)−２，３’−ジクロロ−１−フェニルエタノールを生成しており、その光学純度は 96.5% ee (R)であった。
【００７１】
[参考例１]  L11リボゾームタンパク遺伝子(rplK)プロモーター領域を用いた発現カセットの構築
発現カセットの構築に際しては、約280bpのS. griseusのrplK遺伝子プロモーター領域 (配列番号：６) を、組換えプラスミドpP34 (Kawamoto, S. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:549-560) を鋳型としてPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列BamHIとEcoRIを導入した。また、約340 bpのS. griseusのssgA遺伝子ターミネーター領域 (配列番号：13) を組換えプラスミド pNY22 (Kawamoto, S. and J.C. Ensign, 1995, Actinomycetologica 9:136-151)を鋳型としてPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列EcoRIとBamHIを導入した。ベクターpGEM3Zf(-) (Promega社) をEcoRIで切断し、Klenow enzymeでfill inした後、セルフライゲーションして、クローニング部位のEcoRI認識配列を潰したプラスミドpGΔEを文献（Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sanbrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）記載の方法に準じて構築した。次に、プライマー L11PBamF (5'-GCCAGGATCCACGAGATCAACGCCG-3'／配列番号：16) (下線部は制限酵素部位) および L11PEcoR (5'-TTGGGAGGAATTCCTCTCTCCGGG-3'／配列番号：17) を用いて、rplKプロモーター領域をPCRにより増幅し、280bpのPCR産物を得た後、BamHIおよびEcoRIで切断した。また、プライマー SsgATerEF (5'-GGGTGAATTCGACGGCAACCTG-3'／配列番号：18) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：19) を用いて、ssgAターミネーター領域をPCRにより増幅し、350 bp産物を得た後、BamHIおよびEcoRIで切断した。pGΔEをBamHI切断後、BAP処理し、制限酵素処理したrplKプロモーター領域とssgAターミネーター領域のPCR産物をライゲーションし、組換えプラスミドpSK200を作製した。5'末端をキナーゼでリン酸化したプライマー PlinkF (5'-AATTCAGATCTTTAAATATTACTAGTAAGCTTG-3'／配列番号：20)および PlinkR (5'-AATTCAAGCTTACTAGTAATATTTAAAGATCTG-3'／配列番号：21) をアニーリングして、複数の制限酵素認識配列（高GC含量のDNAを持つ放線菌では稀にしか存在しないATリッチな制限酵素認識配列）を持つ合成DNAリンカーを作成し、これを制限酵素EcoRI（rplK遺伝子プロモーター領域とssgA遺伝子ターミネーター領域の接続部に唯一認識配列が存在）で切断したpSK200に挿入して組換えプラスミドpSK201を作製した。このプラスミドには、制限酵素BamHIで切り出し可能なrplK遺伝子プロモーター - クローニング部位 - ssgA遺伝子ターミネーターから構成される約700bp発現DNAカセットが挿入されている。
【００７２】
[参考例２]  発現プラスミドの構築
１．発現ベクターpSK210
pSK201を鋳型として、プライマー L11PSK (5'-GTCGGGATCCTCGGCCGCGAG-3'／配列番号：22) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：19) を用いて発現DNAカセットをPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端に制限酵素認識配列BamHIを導入した。5'末端のBamHI認識配列は、DNA発現カセットのrplK遺伝子プロモーター5'末端部に存在するBglII認識配列を除去するため導入した。BamHIで切断した650bp PCR産物を放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpV1（Kawamoto, S. et al., 1997, Microbiology 143:1077-1086）のBglIIクローニングサイトに挿入し発現ベクターpSK210を作製した（図１）。
pSK210は放線菌で低コピー型であり、選択マーカーはアンピシリン耐性（amp; 大腸菌）、チオストレプトン耐性（tsr; 放線菌）およびハイグロマイシン耐性（hyg; 放線菌）である。
【００７３】
２．発現ベクターpSK220
上記のBamHIで切断した650bp PCR産物を放線菌多コピーベクターpIJ702 (Katz E. et al., 1983, J. Gen. Microbiol., 129: 2703-2714）のBglIIクローニングサイトに挿入し、多コピー型の発現ベクターpSK220を作製した（図２A）。本プラスミドの選択マーカーはチオストレプトン耐性である。
【００７４】
３．放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpSK1955
ベクターpBluescript SK(+) (Stratagene社製) を鋳型として、プライマー PBlueT7C (5'-CGCTGGCATATGTAGCGGTCACGCTGCGCG-3'／配列番号：23) および PBlueT3N (5'-GCTGGGACGTCAGGTTTCCCGACTGGAAAG-3'／配列番号：24) を用いて、このプラスミドの約580bpのマルチクローニング部位-lacZ遺伝子領域をPCR増幅した。なおPCR産物の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列AatIIとNdeIを導入した。AatIIとNdeI で切断したPCR産物、放線菌多コピーベクターpIJ702から調製した約2.9 kbのNdeI-PstI DNA断片（放線菌での複製に必要なrep遺伝子とpIJ101 oriを含む）および放線菌ゲノム組込型ベクターpIJ8600 (Sun, J. et al., Microbiology 145: 2221-2227) から調製した約2.4 kbのAatII-PstI DNA断片（アプラマイシン耐性遺伝子であるacc(3)IVとpUC18 oriを含む）を連結することにより、放線菌 - 大腸菌シャトルベクターpSK1955を作製した（図２B）。pSK1955は放線菌で多コピー型であり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００７５】
４．発現ベクターpSK1127
pSK220を鋳型として、プライマー L11ClaF (5'-CCTCATCGATATCTTCGGCCGCGAGACCCC-3'／配列番号：25) (BglII siteの除去のため) およびSsgATmNde (5'-CTGGCATATGCGGGCGCGGCGCTGCCACTG-3'／配列番号：26) を用いてPCRにより605bp発現DNAカセットを増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列ClaIとNdeIを導入した。ClaIとNdeI で切断したPCR産物、およびベクターpSK1955から調製した約5.1 kbのClaI-NdeI DNA断片（rep遺伝子, pIJ101 ori, acc(3)IV遺伝子とpUC18 oriを含む）を連結することにより発現ベクターpSK1127を作製した（図３A）。放線菌 - 大腸菌シャトルベクターのpSK1127は放線菌で多コピー型のであり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００７６】
５．発現ベクターpSK811
pSK220を鋳型として、プライマー L11ClaF (5'-CCTCATCGATATCTTCGGCCGCGAGACCCC-3'／配列番号：25) (BglII siteの除去のため) および SsgATerBR (5'-GTATCCGGATCCGGAGGGACC-3'／配列番号：19)を用いてPCRにより655bp発現DNAカセットを増幅した。なおPCR産物の5'末端 と3'末端にそれぞれ制限酵素認識配列ClaIとBamHIを導入した。ClaIとBamHI で切断したPCR産物、およびゲノム組込型ベクターpIJ8600から調製した約6.3 kbのClaI-BglII DNA断片（ゲノム組込に必要なφ31ファージのint遺伝子とattP, RK2 oriT, acc(3)IV遺伝子およびpUC18 oriを含む）を連結することにより発現ベクターpSK811を作製した（図３B）。放線菌-大腸菌シャトルベクターのpSK811はゲノム組込型であり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００７７】
[参考例３]  放線菌由来カルボニル還元酵素遺伝子を含有するプラスミドpSE-PAR1の構築
AL939131-111 (配列番号：１) の5'末端、3'末端の配列をもとに、プライマーScoPAR-ATG1 (CGATCATGAAAGCACTGCAGTACCGCAC / 配列番号：27)、ScoPAR-TAA1 (CAGTCTAGATTAGCCGTGTGGCAGGATCACCGCG / 配列番号：28) を合成した。実施例２で構築したプラスミドpSK-SCP1を鋳型とし、ScoPAR-ATG1、ScoPAR-TAA1をプライマーとして、PCR (96℃, 30秒、58℃, 30秒、72℃, 1分20秒)を30サイクル行い、特異的な増幅DNAを得た。
得られたDNA断片をBspHI, XbaIの２つの制限酵素で二重消化し、プラスミドpSE420D (特開2000-189170) をNcoI, XbaIの２つの制限酵素で二重消化した断片とT4 DNAリガーゼで連結し、大腸菌 (Escherichia coli) JM109株を形質転換してプラスミドpSE-PAR1を得た。得られたプラスミド中の挿入断片は塩基配列を解析し、AL939131-111の塩基配列 (配列番号：１) と、PCRプライマーにより変異を加えた部分以外は一致していることを確認した。なお、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００７８】
[参考例４]  放線菌由来カルボニル還元酵素遺伝子の大腸菌での発現
pSE-PAR1で形質転換した大腸菌(Escherichia coli) JM109株をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地(１％バクト−トリプトン、0.5％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム)で終夜培養し、0.1 mM IPTGを加え、さらに４時間培養を行った。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置 UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
得られた無細胞抽出液のアセト酢酸エチルを基質とした酵素活性を実施例４に記載の方法で測定したが、NADH依存的なアセト酢酸エチル還元活性は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明により、光学活性アルコールの製造に有用な新規カルボニル還元酵素、該酵素を高レベルで発現することができるベクター、該ベクターが導入された宿主細胞、該酵素の製造方法、および該酵素を利用した高光学純度の光学活性アルコールの製造方法が提供された。本発明によれば、ケトンのカルボニルを還元して高純度の光学活性アルコールを生成させることができる。例えば、光学活性α−ハロフェニルエタノール誘導体は、各種医薬品、農薬の原料あるいは合成中間体として有用な光学活性スチレンオキサイド誘導体へと極めて容易に誘導することができる化合物であり、特に光学活性メタクロロスチレンオキサイドは、β３アドレノレセプターアゴニストの合成中間体として、極めて重要な化合物である。本発明によれば、この光学活性なメタクロロスチレンオキサイドに誘導される(Ｒ)−２，３'−ジクロロ−１−フェニルエタノールを非常に高い光学純度で製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】pSK210の構造を示す図である。
【図２】pSK220（パネルA）およびpSK1955（パネルB）の構造を示す図である。
【図３】pSK1127（パネルA）およびpSK811（パネルB）の構造を示す図である。
【図１】
2005095022.tif 000003
【図２】
2005095022.tif 000004
【図３】
2005095022.tif 000005
【配列表】
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