(57)【要約】【課題】  哺乳動物体内から摘出した細胞について、薬剤感受性試験に要する細胞の量を減ずることができ、また試験判定までに要する細胞培養期間を短縮することができる摘出細胞培養方法および薬剤感受性の評価方法を提供すること。【解決手段】  哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞を、コラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴に固定化した状態で、培養・増殖する。【選択図】          図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞を、コラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴に固定化した状態で、培養・増殖することを特徴とする摘出細胞の培養方法。
【請求項２】
哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞の増殖を、体内増殖速度に維持しつつ培養・増殖する請求項１記載の培養方法。
【請求項３】
微小穴の体積が、１〜５０ｎＬである請求項１または２記載の培養方法。
【請求項４】
微小穴の細孔サイズが、５〜１０００μｍである請求項１〜３記載の培養方法。
【請求項５】
微小穴の形態が、逆ピラミッド型である請求項１〜４記載の培養方法。
【請求項６】
逆ピラミッド型が、大きい側が４５０μｍで、小さい側が１００μｍの細孔サイズを有し、体積が１８ｎＬである請求項５記載の培養方法。
【請求項７】
固相基板が、ガラス、シリコンまたは高分子樹脂である請求項１〜６記載の培養方法。
【請求項８】
哺乳動物体内から摘出した細胞が、癌細胞である請求項１〜７記載の培養方法。
【請求項９】
同一固相基板上において、複数の微小穴にコラーゲンゲル包埋し、固定化した細胞ごとの周辺環境溶液条件を独立に制御し、培養・増殖する請求項１〜８記載の培養方法。
【請求項１０】
周辺環境溶液条件が、薬剤感受性評価に供される薬剤の種類および／または薬剤の濃度である請求項９記載の培養方法。
【請求項１１】
周辺環境溶液条件を独立に制御する方法が、固相基板上に流路を設け、固定化された細胞周辺の空間を隔絶し、隣接する細胞間で相互の環境溶液組成が混入することを防ぐ方法である請求項９記載の培養方法。
【請求項１２】
流路が、高分子膜に流路を成型し、該成型した高分子膜を固相基板上に被せることで作製される(以下、該被覆膜を「周辺環境溶液制御部」という)請求項１１記載の培養方法。
【請求項１３】
高分子膜が、天然または合成ゴム、または高分子樹脂である請求項１２記載の培養方法。
【請求項１４】
高分子樹脂が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である請求項１３記載の培養方法。
【請求項１５】
哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞を、コラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴に固定化したことを特徴とする細胞固定化基板。
【請求項１６】
哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞の増殖を、体内増殖速度に維持しつつ培養・増殖することができる請求項１５記載の細胞固定化基板。
【請求項１７】
微小穴の体積が、１〜５０ｎＬである請求項１５または１６記載の細胞固定化基板。
【請求項１８】
微小穴の細孔サイズが、５〜１０００μｍである請求項１５〜１７記載の細胞固定化基板。
【請求項１９】
微小穴の形態が、逆ピラミッド型である請求項１５〜１８記載の細胞固定化基板。
【請求項２０】
逆ピラミッド型が、大きい側が４５０μｍで、小さい側が１００μｍの細孔サイズを有し、体積が１８ｎＬである請求項１９記載の細胞固定化基板。
【請求項２１】
固相基板が、ガラス、シリコンまたは高分子樹脂である請求項１５〜２０記載の細胞固定化基板。
【請求項２２】
哺乳動物体内から摘出した細胞が、癌細胞である請求項１５〜２１記載の細胞固定化基板。
【請求項２３】
同一固相基板上において、複数の微小穴にコラーゲンゲル包埋し、固定化した細胞ごとの周辺環境溶液条件を独立に制御し、培養・増殖することができる請求項１５〜２２記載の細胞固定化基板。
【請求項２４】
周辺環境溶液条件が、薬剤感受性評価に供される薬剤の種類および／または薬剤の濃度である請求項２３記載の細胞固定化基板。
【請求項２５】
周辺環境溶液条件を独立に制御するために、固相基板上に流路が設けられた請求項２３記載の細胞固定化基板。
【請求項２６】
流路が、周辺環境溶液制御部からなる請求項２５記載の細胞固定化基板。
【請求項２７】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の細胞固定化基板および酸素濃度計測装置を用い、固定化された細胞の増殖挙動を評価することを特徴とする哺乳動物体内から摘出した細胞の薬剤感受性評価方法。
【請求項２８】
細胞固定化基板上に周辺環境溶液制御部を設けることからなる請求項２７記載の薬剤感受性評価方法。
【請求項２９】
細胞の増殖挙動の評価が、細胞固定化基板上に固定化された細胞近傍の酸素濃度分布を酸素濃度計測装置を用い計測することにより、細胞の呼吸活性を評価することからなる請求項２７または２８記載の薬剤感受性評価方法。
【請求項３０】
細胞固定化基板上に固定化された細胞を任意の薬物濃度および／または任意の暴露時間で処理した際の細胞の増殖挙動を評価することからなる請求項２７〜２９記載の薬剤感受性評価方法。
【請求項３１】
酸素濃度計測装置が、走査型電気化学顕微鏡 (scanning electrochemical microscopy；ＳＥＣＭ)である請求項２７〜３０記載の薬剤感受性評価方法。
【請求項３２】
薬剤感受性評価に用いられる薬剤が、抗癌剤である請求項２７〜３１記載の薬剤感受性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞を、コラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴中で培養する方法、微少量の摘出細胞を固相基板上の微小穴に固定化した細胞固定化基板、および、細胞固定化基板上で培養した摘出細胞の薬剤感受性を、電気化学的手法による酸素濃度分布を測定することにより評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内において細胞は、細胞外マトリックスに取り囲まれて存在している。細胞外マトリックスは、細胞や組織の結合を助け、細胞の移動や相互作用は、このマトリックスを介して行われている。細胞外マトリックスの中でもコラーゲンは、全蛋白質の３分の１を占め、細胞の発生、分化、形態形成の過程で重要な役割を果たしている。これらの性質から、細胞をコラーゲンに包埋、三次元的に培養を行うコラーゲン包埋培養が行われている。コラーゲンに包埋した細胞は、細胞の持つ固有の形態学的性質と分化機能を維持することが出来る。従って、コラーゲン包埋培養を用いることにより、細胞の増殖形態を生体内に近い条件下で培養可能であり、薬剤の感受性も生体内と類似の環境下で評価可能である（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
癌化学療法において、抗癌剤の効果は患者により異なるため、個々の患者の抗癌剤感受性を知ることは重要である。抗癌剤を投与する前に、摘出した腫瘍組織を用いて抗癌剤感受性試験を行い、有効な抗癌剤を選択することにより効率の良い治療が可能となる。これまでに開発されてきた様々な感受性試験方法の中には、既にヒト摘出細胞を用いて抗癌剤感受性試験を実施し、臨床での化学療法試験成績との相関を検討する段階にまで踏み込んだ研究例がいくつかある。例えば、コハク酸脱水素酵素活性（succinic dehydrogenase inhibition；ＳＤＩ） 法による感受性試験は、安価で簡便であるために広く用いられており、臨床においても利用されている。１９９４年に胃癌患者を対象にＳＤＩ法を用いて、化学療法前に感受性試験を行うことの有効性が報告された（例えば、非特許文献２参照）。ＳＤＩ法により有効な抗癌剤を選択したグループでは、術後３年の生存率がおよそ４０％であるのに対し、選択を行わずに治療したグループでは２年後には生存率が０％であった。
【０００４】
また、１９９５年には固形癌組織培養薬剤感受性試験（histoculture drug response assay；ＨＤＲＡ）によって、臨床との比較により感受性試験の有効性が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。２００２年には、コラーゲン包埋培養法を基盤技術とするコラーゲンゲル包埋培養薬剤感受性試験（collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test；ＣＤ−ＤＳＴ）法によって、癌患者化学療法試験成績との比較により感受性試験の有効性が報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００５】
中でも、ＣＤ−ＤＳＴ法は、摘出細胞の培養成功率が高く、癌細胞以外の正常細胞の増殖を抑制することが可能であるため、摘出細胞の評価法として注目されている。これまでにＣＤ−ＤＳＴ法を用いた摘出腫瘍による感受性試験の有効性が多数報告されている（例えば、非特許文献５、６、７参照）。これまでに、培養細胞を固相基板上で培養し、数センチメ-トル四方内のサイズに集積化したいわゆる「細胞チップ」の作製は多数報告例がある。既往の細胞チップは、主に以下の二種類に分類できる。
ａ）神経細胞など生体内で情報伝達を担う細胞系を試料とし、細胞内、細胞内−外、細胞−細胞間の伝達挙動をリアルタイムで観測する実験系がある。微小電極を用いた検出の試みも盛んに行われているが、その際は試料の細胞のみならず、検出系である電極を複数個配列−集積化した研究例が多くある（例えば、非特許文献８、９参照）。バイオコンピューターなどへの応用を目標に掲げ、固相基板上で自在に細胞パターンを制御することが実現されつつある（例えば、非特許文献１０、１１、１２、１３参照）。コラーゲンに包埋した細胞を固相基板上に薄膜固定化することで、生体内に近い環境下での培養を可能とする手法が報告されている（例えば、非特許文献１４参照）。
ｂ）ＤＮＡチップ型の多検体並列スクリーニングは、基本的に同一の検出原理を共有し、プロテインチップ、糖鎖チップなど多数提案されている（例えば、非特許文献１５、１６参照）。即ち、種類の異なる機能分子（核酸、タンパク質、糖鎖）を配列−アドレス化した固相基板を用意し、標識分子が応答したアドレスを根拠に、特異的な分子間相互作用が生じたことを判別する。最近、ｃＤＮＡを配列−アドレス化した基板上で細胞培養することにより、基板上においてアドレス固有のｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を細胞に発現させ、遺伝子組換細胞アレイを有する細胞チップの作製が報告されている（例えば、非特許文献１７参照）。この研究は、基本的に多検体並列スクリーニングの延長上に分類することができる。組換遺伝子導入を確認するために、常套手段どおり、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子を目的遺伝子と連結して導入する。
【０００６】
上述の細胞チップでは、検出系として電気化学計測が実施される場合には、検出用電極を固相基板上に集積化するための工夫が積極的に取り入れられることが多い。電気刺激を入力する場合にも刺激入力用の電極を固相基板上に集積化する考案が報告されている。
【０００７】
走査型電気化学顕微鏡 (scanning electrochemical microscopy；ＳＥＣＭ) は、探針である微小電極を試料表面に近接し走査することにより、電極活性種の分布を測定する装置である（例えば、非特許文献１８、１９参照）。ＳＥＣＭは空間分解能および画像化能を有し、上述の多検体並列スクリーニングに適用可能である。これまでに、抗原−抗体（例えば、非特許文献２０参照）、酵素（例えば、非特許文献２１参照）、大腸菌（例えば、非特許文献２２参照）、ハネモプロトプラスト（例えば、非特許文献２３参照）、動物培養細胞（例えば、非特許文献２４参照）を対象に生体機能活性評価が報告されている。
【０００８】
ＣＤ−ＤＳＴ法の細胞活性測定原理は、色素ニュートラルレッドの取り込み量を比色法により定量する方法に基づいている（例えば、特許文献１、非特許文献２５参照）。細胞活性を評価するにあたり、測定時点を決定し色素を添加する必要がある。従って、一度測定を実施すれば、継続培養は困難である。ＣＤ−ＤＳＴ法の検出系は、焦点深度の浅い光学系、励起光源、ＣＣＤ検出器および画像処理ソフトで構成されており、高額である。ＣＤ−ＤＳＴ法では、判定までに８〜１４日程度の被測定細胞を培養する期間を要する。ＣＤ−ＤＳＴ法の細胞−コラーゲンマトリックスの試料体積は、およそ３０μＬ程度である。
【０００９】
試料体積を微小化した技術として、シリコン基板上に作製した１８ｎＬの穴に２種類の株化培養細胞（Ｋ５６２ とＫ５６２／ＡＤＭ）を配列化し、アドリアマイシン（ＡＤＭ）に対する細胞薬剤感受性を試験する方法が報告されている（例えば、非特許文献２６、２７参照）。この方法では、ＳＥＣＭを応用し、細胞を固定化した基板の酸素濃度プロファイルを継続的に測定することにより、基板上での細胞速度を評価する方法が提案されている。Ｋ５６２の増殖速度がＫ５６２／ＡＤＭより遅いことについて言及している。しかし、基板に固定化した細胞の増殖速度と常法であるフラスコ培養の増殖速度の関係について、また、同一基板上で異なる薬剤暴露条件（薬物の種類・薬物の濃度）下で細胞培養する方法に関しては知られていない。更に、摘出細胞についての増殖に関しても知られていない。
【００１０】
試料体積が4．５ｎＬの固相基板での大腸菌の培養について報告されている（例えば、非特許文献２８参照）。また、摘出細胞のコラーゲンゲル包埋培養法が報告されているが、その試料表面積は、０．０１〜２５．０ｃｍ2と、大容量である（例えば、特許文献１、２参照）。
【００１１】
これまで、哺乳動物からの微少量の摘出細胞を対象として、該細胞を固相基板上に固定化し、無侵襲的計測工程により生体機能活性評価と継続培養を何度でも繰返し実施可能な細胞増殖・培養方法は知られていない。
【特許文献１】日本特許第２８７９９７８号広報
【特許文献２】特開２００３−９８５３号公報
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7, 3401-3405, 1979
【非特許文献２】Jpn. J. Cancer Res., 85, 762-765，1994
【非特許文献３】Clin．Cancer Res．，1，1537-1543，1995
【非特許文献４】Int．J．Cancer，98，450-455，2002
【非特許文献５】J. Jpn. Soc. Cancer Ther.，29, 946-956，1994
【非特許文献６】J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 5, 261-268，1998
【非特許文献７】Kurume Medical J., 46, 163-166，1999
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci．USA，98, 10457-10462，2001
【非特許文献９】Neuroscience Letters，304, 112-116，2001
【非特許文献１０】J. Am. Chem. Soc.，114, 8435，1992
【非特許文献１１】Langmuir，11, 2267，1995
【非特許文献１２】Science，276, 1425-1428，1997
【非特許文献１３】Langmuir，18, 3645-3649，2002
【非特許文献１４】Biosens. Bioelectron.，14, 871-881，2000
【非特許文献１５】Science，251, 767-773，1991
【非特許文献１６】Science，270, 467-470，1995
【非特許文献１７】Nature，411, 107-110，2001
【非特許文献１８】Anal. Chem.，61, 132-138，1989
【非特許文献１９】Anal. Chem.，61, 1099A-1104A，1989
【非特許文献２０】Anal. Chem.，68, 1276-1278，1996
【非特許文献２１】Anal. Chim. Acta，458, 263-270，2002
【非特許文献２２】Biotechnol. Bioeng.，76, 391-394，2001
【非特許文献２３】Chem. Lett.，975-976，1999
【非特許文献２４】Langmuir，18, 3645-3649，2002
【非特許文献２５】癌と化学療法，22，1933-1939，1995
【非特許文献２６】第17回生体機能関連化学シンポジウム講演要旨集p．84-85（2002．9．10発行）
【非特許文献２７】Anal. Chem.，75，2154-2158，2003
【非特許文献２８】第17回生体機能関連化学シンポジウム講演要旨集p．376-377（2002．9．10発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞を、コラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴に固定化、培養することにより、薬剤感受性試験に要する細胞の量を大幅に減ずることができ、また、試験判定までに要する細胞培養期間を大幅に短縮することができる摘出細胞培養方法および細胞固定化基板を提供することにあり、更には、細胞活性を測定する場合、色素の添加が不要であるため、無侵襲的計測工程を特徴とし、一度計測を実施した後も固相基板の細胞増殖挙動が正常性を示し、従ってその後も継続培養および複数回計測を実施することが可能である薬剤感受性の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞をコラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴に固定化し、培養した場合、in vivo培養の場合と同等の増殖速度であること、つまり、摘出細胞の増殖を体内増殖速度に維持しつつ培養することが可能であること、加えて、同一固相基板上の各々の微小穴において細胞が暴露される溶液環境を独立に制御し、培養することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞を、コラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴に固定化した状態で、培養・増殖することを特徴とする摘出細胞の培養方法（請求項１）、哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞の増殖を、体内増殖速度に維持しつつ培養・増殖する請求項１記載の培養方法（請求項２）、微小穴の体積が、１〜５０ｎＬである請求項１または２記載の培養方法（請求項３）、微小穴の細孔サイズが、５〜１０００μｍである請求項１〜３記載の培養方法（請求項４）、微小穴の形態が、逆ピラミッド型である請求項１〜４記載の培養方法（請求項５）、逆ピラミッド型が、大きい側が４５０μｍで、小さい側が１００μｍの細孔サイズを有し、体積が１８ｎＬである請求項５記載の培養方法（請求項６）、固相基板が、ガラス、シリコンまたは高分子樹脂である請求項１〜６記載の培養方法（請求項７）、哺乳動物体内から摘出した細胞が、癌細胞である請求項１〜７記載の培養方法（請求項８）、同一固相基板上において、複数の微小穴にコラーゲンゲル包埋し、固定化した細胞ごとの周辺環境溶液条件を独立に制御し、培養・増殖する請求項１〜８記載の培養方法（請求項９）、周辺環境溶液条件が、薬剤感受性評価に供される薬剤の種類および／または薬剤の濃度である請求項９記載の培養方法（請求項１０）、周辺環境溶液条件を独立に制御する方法が、固相基板上に流路を設け、固定化された細胞周辺の空間を隔絶し、隣接する細胞間で相互の環境溶液組成が混入することを防ぐ方法である請求項９記載の培養方法（請求項１１）、流路が、高分子膜に流路を成型し、該成型した高分子膜を固相基板上に被せることで作製される(以下、該被覆膜を「周辺環境溶液制御部」という)請求項１１記載の培養方法（請求項１２）、高分子膜が、天然または合成ゴム、または高分子樹脂である請求項１２記載の培養方法（請求項１３）、および、高分子樹脂が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である請求項１３記載の培養方法（請求項１４）に関する。
【００１５】
また本発明は、哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞を、コラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の微小穴に固定化したことを特徴とする細胞固定化基板（請求項１５）、哺乳動物体内から摘出した微少量の細胞の増殖を、体内増殖速度に維持しつつ培養・増殖することができる請求項１５記載の細胞固定化基板（請求項１６）、微小穴の体積が、１〜５０ｎＬである請求項１５または１６記載の細胞固定化基板（請求項１７）、微小穴の細孔サイズが、５〜１０００μｍである請求項１５〜１７記載の細胞固定化基板（請求項１８）、微小穴の形態が、逆ピラミッド型である請求項１５〜１８記載の細胞固定化基板（請求項１９）、逆ピラミッド型が、大きい側が４５０μｍで、小さい側が１００μｍの細孔サイズを有し、体積が１８ｎＬである請求項１９記載の細胞固定化基板（請求項２０）、固相基板が、ガラス、シリコンまたは高分子樹脂である請求項１５〜２０記載の細胞固定化基板（請求項２１）、哺乳動物体内から摘出した細胞が、癌細胞である請求項１５〜２１記載の細胞固定化基板（請求項２２）、同一固相基板上において、複数の微小穴にコラーゲンゲル包埋し、固定化した細胞ごとの周辺環境溶液条件を独立に制御し、培養・増殖することができる請求項１５〜２２記載の細胞固定化基板（請求項２３）、周辺環境溶液条件が、薬剤感受性評価に供される薬剤の種類および／または薬剤の濃度である請求項２３記載の細胞固定化基板（請求項２４）、周辺環境溶液条件を独立に制御するために、固相基板上に流路が設けられた請求項２３記載の細胞固定化基板（請求項２５）、および、流路が、周辺環境溶液制御部からなる請求項２５記載の細胞固定化基板（請求項２６）に関する。
【００１６】
さらに本発明は、請求項１５〜２２のいずれかに記載の細胞固定化基板および酸素濃度計測装置を用い、固定化された細胞の増殖挙動を評価することを特徴とする哺乳動物体内から摘出した細胞の薬剤感受性評価方法（請求項２７）、細胞固定化基板上に周辺環境溶液制御部を設けることからなる請求項２７記載の薬剤感受性評価方法（請求項２８）、細胞の増殖挙動の評価が、細胞固定化基板上に固定化された細胞近傍の酸素濃度分布を酸素濃度計測装置を用い計測することにより、細胞の呼吸活性を評価することからなる請求項２７または２８記載の薬剤感受性評価方法（請求項２９）、細胞固定化基板上に固定化された細胞を任意の薬物濃度および／または任意の暴露時間で処理した際の細胞の増殖挙動を評価することからなる請求項２７〜２９記載の薬剤感受性評価方法（請求項３０）、酸素濃度計測装置が、走査型電気化学顕微鏡 (scanning electrochemical microscopy；ＳＥＣＭ)である請求項２７〜３０記載の薬剤感受性評価方法（請求項３１）、および、薬剤感受性評価に用いられる薬剤が、抗癌剤である請求項２７〜３１記載の薬剤感受性評価方法（請求項３２）に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の摘出細胞培養方法により、癌患者の化学療法実施に先立ち、癌患者より摘出した腫瘍細胞を用いて、抗癌剤感受性試験を実施し、その結果を基に、各々の患者に最適の抗癌剤を選択することが可能になる。本発明では、必要摘出細胞数が極めて微少でかつ、迅速に、また、摘出細胞の増殖を体内増殖速度に維持しつつ培養可能であることから、より生体に近い環境での判定が期待できる。
【００１８】
さらには、同一基板上に種類の異なる培養株細胞を配列−アレイ化することにより、また各々の細胞固定化微小穴に対し異なる組成の溶液を暴露させることにより、前臨床試験段階で実施されているような大掛かりな薬剤スクリーニングにおいても、現行のシステムと比較して大幅な時間、コストの削減およびハイ−スループット化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明における哺乳動物体内から摘出した細胞とは、ヒトを含む哺乳動物体内で増殖した臓器、組織等の生体組織から摘出される細胞をいい、生体組織から得られる細胞であれば特に制限はないが、薬剤感受性の評価には、癌細胞が好ましく用いられる。他に、初代培養技術が応用可能な正常組織由来細胞も用いられる。
【００２０】
癌細胞としては、臨床的にはヒトの細胞が、また薬剤スクリーニング等前臨床的には、マウス、ラット等の動物細胞が用いられる。培養に用いられる癌細胞としては特に制限はないが、好ましくは、肺がん、胃がん、大腸がん、卵巣がん、脳腫瘍、乳がん、前立腺がん、皮膚がんおよび白血病細胞等の癌細胞が用いられる。また、薬剤感受性に用いられる薬剤としては、抗癌剤が好ましく、例えば、アルキル化剤、シスプラチン系抗癌剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質等の抗癌剤が例示される。
【００２１】
哺乳動物体内で増殖した細胞を試料に用いる場合、生体組織から所定の方法で細胞増殖部を摘出し、初代培養法に準ずる方法で細胞−コラーゲン混合溶液を調整する。混合溶液は、10 3〜10 9ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞を０．０１〜１．０ ％コラーゲン溶液、培養液および緩衝液の混合液に懸濁し、調整することができる。コラーゲンとしては、何れのコラーゲンでも用いることができるが、Ｉ型コラーゲンが好ましく用いられる。また、コラーゲンの他にも、細胞外マトリックスに代表される生体材料を用いることもできる。
【００２２】
上記調整した細胞−コラーゲン混合溶液は、マイクロピペットを用い、固相基板上の微小穴に充填後、３７℃で ３〜６０分間インキュベートし、コラーゲンをゲル化させることにより、細胞をコラーゲンゲルに包埋し、固定化した細胞固定化基板を得ることができる。該細胞固定化基板を培養液中静置することにより、固定化された摘出細胞は、培養・増殖することができる。培養温度は、通常３０〜３９℃で、培養時間は、通常６〜３００時間を要する。
【００２３】
ここで、固相基板としては、ガラス、シリコンまたは高分子樹脂等の素材が、基板として用いられる。シリコンとしては、単結晶シリコンまたはその他のシリコン化合物材料が例示される。また、高分子樹脂としては、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂の何れの樹脂も使用することができ、熱可塑性樹脂としては、例えば、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂またはフッ素樹脂等が、熱硬化性樹脂としては、例えば、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂またはシリコーン樹脂等が例示される。
【００２４】
固相基板上の微小穴は、従来、ＣＤ−ＤＳＴ法で用いられている、例えば３０μＬに比べ極めて微小のものであり、容量としてナノリットルオーダーを有するものが好ましく、例えば、１〜５０ｎＬの体積を有しているものがより好ましく、５〜３０ｎＬの体積を有しているものがさらに好ましい。穴の細孔サイズは、１００マイクロメートルオーダー、好ましくは５〜１０００マイクロメートル、より好ましくは５０〜６００マイクロメートルのサイズの穴を有する固相基板が用いられる。また、微小穴の形態としては、例えば、円筒、多面体等いかなる形態でも使用可能であり、三次元微細加工技術である異方性エッチングにより作製することができる。なお、後述する実施例で用いている逆ピラミッド型の微小穴は、逆ピラミッド型溝の細孔サイズの大きい側（４５０μｍ）を細胞−コラーゲン混合液注入口、小さい側（１００μｍ）を検出口とし、該逆ピラミッド型の体積は、微小穴のディメンジョンにより規定され、１８ｎＬとなる。単一の微小穴に充填された細胞−コラーゲン混合液は、本発明において細胞活性を評価する際の基本ユニットであり、以下、「細胞パネル」という。
【００２５】
固相基板上の微小穴の数、配置、サイズ、形態等は、基板設計時に自在に変えることが可能である。微小穴が基板を貫通しない基板設計も可能であり、その場合は細胞−コラーゲン混合液注入口および検出口は同一となる。
【００２６】
コラーゲンゲルに包埋し、固相基板上の懸かる微小穴に固定化した状態で培養・増殖する摘出細胞の増殖速度は、フラスコ培養の場合の６分の１以下に抑制され、in vivo培養の場合とほぼ同等の増殖速度となることから、哺乳動物体内における同一細胞の増殖速度と比較してほぼ等しくなる。つまり、本発明は、極微少量の摘出細胞の増殖を体内増殖速度に維持しつつ培養することを可能にする。
【００２７】
さらに、本発明では、各々の微小穴において細胞が暴露される溶液環境を独立に制御することができる。即ち、固相基板上に流路を設け、細胞パネル周辺の空間を隔絶し、隣接する細胞パネル間で相互の環境溶液組成が混入することを防ぐことにより、細胞パネル周辺の薬剤暴露条件が同一の基板上で、（例えば、薬物の種類・薬物の濃度等）異なる薬剤暴露条件下で細胞培養することを可能にする。
【００２８】
固相基板上への流路の設置は、高分子膜を成型し、あらかじめ流路を設けた該高分子膜を固相基板上に被せることで作製することができる(以下、該被覆膜を「周辺環境溶液制御部」という)。流路作製に用いられる高分子膜としては、天然または合成のゴム、または高分子樹脂等が挙げられる。合成ゴムとしては、例えば、ブタジエンスチレンゴム、ブタジエンアクリロニトリルゴム、ブチルゴム、フッ素ゴムまたはシリコーンゴム等が例示されるが、特に、シリコーンゴムが好んで用いられる。また、高分子樹脂としては、前記した樹脂と同様のものを用いることができる。特に、シリコーン樹脂が好ましく、具体的には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が例示される。膜上の流路の作製は、炭酸ガスレーザーにより高分子膜上に溝を掘るか、或いは高分子膜を貫通させることにより作製することができる。周辺環境溶液制御部を構成する高分子膜の厚さは０．０１〜１０ｍｍ、好ましくは、１〜５ｍｍである。
【００２９】
本発明では、細胞を微少量で配列化した各々の細胞パネル内で、細胞を正常に増殖させることができる。即ち、コラーゲンゲル−包埋培養法の長所を損なうことなく、数１００マイクロメートルオーダーの空間を確保すると共に、その空間内において正常な細胞増殖挙動および薬剤感受性試験が実現可能である。
【００３０】
薬剤感受性試験において、細胞増殖挙動を制御することは極めて重要である。元来、抗癌剤は作用機序においてＤＮＡ合成酵素阻害、ＤＮＡ架橋、有糸分裂阻害など種々に分類されるが、殺細胞能は正常細胞と癌細胞の増殖速度の違いに帰結する。実際、in vitroにおける薬物スクリーニングの結果が、in vivo実験や臨床実験の結果を反映しないケースが多く、問題になっている。臨床を反映する増殖速度や三次元的環境をin vitroで再現する培養系として、コラーゲン-ゲル包埋法が注目されつつある。本発明では、上述のコラーゲン-ゲル包埋法の長所が、チップ化されて固相基板上の微小環境においても活かされていることを強く示唆する。特に、摘出細胞の増殖挙動に関しては、生体内における増殖挙動を理想的に再現していると言える。
【００３１】
本発明における細胞の薬剤感受性評価方法は、細胞固定化基板および酸素濃度計測装置を用い、固定化された細胞の増殖挙動を評価することからなり、該細胞増殖挙動から薬剤の感受性を評価することができる。また、同一の固相基板上で、異なる薬剤暴露条件で細胞培養する場合には、さらに、細胞固定化基板上に周辺環境溶液制御部を設けることが好ましい。
【００３２】
細胞増殖挙動の評価は、固相基板上の細胞パネル近傍の酸素濃度分布を計測することにより、固定化した細胞の呼吸活性を評価する。酸素濃度分布の計測には、酸素濃度計測装置が用いられる。該計測装置の検出系として電気化学計測を実施する場合には、検出用電極を固相基板上に集積化するための工夫が必要であり、電気刺激を入力する場合にも、刺激入力用の電極を固相基板上に集積化する必要がある。本発明においても、呼吸測定用の電極を固相基板上に設計することは可能であり、電極を固相基板上に集積化する場合は、電極表面が細胞や培養液に直接接触することを防ぐために、電極を酸素透過性膜で被覆することが必要である。
【００３３】
本発明において、酸素濃度計測装置としては、ＳＥＣＭを好適に用いることができる。ＳＥＣＭ は、電極を固相基板上に集積化する必要はなく、基板上に配列−アドレス化された複数の計測対象に対し、単一のプローブ電極を走査させることにより連続的に計測対象由来の応答を記録することができる。また、細胞を固相基板ごと培養する工程において、検出電極をインキュベーターに搬入する必要がない。このことは、固相基板上に電極を集積化したタイプの細胞チップと比較して大きな利点となる。すなわち、固相基板培養工程において、検出電極が汚染する可能性および電極および電極反応生成物質が細胞に悪影響を与える可能性を排除することができる。
【００３４】
酸素濃度分布の計測は、微小電極を走査し、細胞パネル近傍および細胞パネルの充分沖合いにおける酸素濃度を計測し、両者の差あるいは比を基準に細胞呼吸活性を定量する。単一の微小電極を走査する代わりに、細胞パネル近傍から細胞パネルの充分沖合いまでの空間において、任意の地点に複数の微小電極を配列することにより、各々の微小電極で酸素濃度を同時に計測することも可能である。
【００３５】
細胞の呼吸（酸素消費）に起因する酸素の物質移動速度は、周辺溶液中における酸素濃度プロファイルと酸素拡散係数の積より得られる。したがって、酸素濃度分布を計測することにより、固定化した細胞の呼吸活性を評価できる。呼吸活性は細胞パネルに含まれる細胞数と比例関係にあるため、該細胞呼吸活性をもとに細胞増殖挙動を評価できる。さらに、細胞を任意の薬物濃度、任意の暴露時間で処理した際の細胞増殖挙動から薬剤感受性を評価する。薬剤を暴露しない条件下（コントロール）の細胞増殖を基準として、薬剤暴露に起因する細胞増殖の抑制を％コントロールで表示することで薬剤感受性を評価できる。
【００３６】
ＳＥＣＭによって酸素濃度分布を計測する場合には、計測溶液に酸素濃度感応性の標識分子を添加することの必要性は生じない。かつ、無侵襲的計測工程を特徴とし、一度計測を実施した後も固相基板の細胞増殖挙動が正常性を示し、従って、その後も継続培養および複数回計測を実施することが可能である。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３８】
なお、以下の実施例および参考例では、同一細胞の細胞株をフラスコ培養法（in vitro法）および生体内培養法（in vivo法）で培養し、各々の細胞を基板上に固定化した状態で、抗癌剤感受性試験を実施した。図１に実験概略を示す。以下の本文中では、細胞を固定化した基板を「細胞チップ」と、また、細胞チップでの培養を「細胞チップ培養法」と称す。生体内培養法では、免疫不全マウスにヒト癌細胞株を移植する異種移植モデルを用いた。以下、生体内培養後、常法により摘出した細胞を「摘出細胞」と、また、通常のフラスコ培養法で培養した細胞は「フラスコ培養細胞」と称す。
【００３９】
細胞活性（増殖挙動）測定には、細胞チップ培養法においてはＳＥＣＭを、フラスコ培養法においてはＳＤＩおよび血球計算版による生細胞数算出を、生体内培養法においては腫瘍体積算出を各々採用した。
【００４０】
また、抗癌剤にはadriamycin（ＡＤＭ）、cisplatin（ＣＤＤＰ）、5-Fluorouracil（５−ＦＵ）およびetoposide（ＶＰ−１６）を用いた。ＡＤＭは、ＤＮＡにインターカレートしてＤＮＡ合成を阻害する抗癌剤である。また、ＶＰ−１６は、ＤＮＡ修復酵素であるトポイソメラーゼと結合してＤＮＡの複製または転写を阻害することにより、ＤＮＡ合成を阻害する抗癌剤である。したがってＡＤＭおよびＶＰ−１６は、ＤＮＡ合成期であるＳ期に主として作用する。一方、ＣＤＤＰは、ＤＮＡ鎖と架橋反応をして、ＤＮＡの複製とＲＮＡへの転写を阻害することを主な作用機序とする。また、５−ＦＵは、ＤＮＡ合成に必要な代謝過程であるチミジル酸合成酵素と結合しＤＮＡ合成を阻害する。したがってＣＤＤＰおよび５−ＦＵは、細胞周期の全般に亘って一定の活性を示す。表１に、これら４種の抗癌剤の最大血中濃度（Ｃｍａｘ）およびＣＤ−ＤＳＴ法によりin vivo法との相関性が報告されている薬剤投与条件を示した。接触時間は２４時間とした。
【００４１】
【表１】
2005095058.tif 000003
【００４２】
〔参考例１〕（生体内培養における細胞の増殖挙動）
免疫不全マウスにヒト癌細胞株を移植する、異種移植モデルを用いた。免疫不全マウスには、６〜８週齢の雌のＳＣＩＤマウス（severe combined immunodeficiency）（ＣＢ−１７−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ、日本クレア社製）を用い、マウス皮下にヒト前骨髄性白血病細胞株（ＨＬ−６０）（東北大学加齡研究所付属医用細胞資源センター提供）を移植した。マウス１匹につき１．０×１０7程度の細胞を用意し、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ、Becton Dickinson Labware社製）に懸濁した。マウス皮下に細胞混合液１００μＬを注入した。皮下に形成された腫瘍サイズは、キャリパーを用いて計測した。腫瘍サイズは、その短径および長径を計測、その値から式１により近似的に体積を求めた。その結果を、図３に示す。
〔式１〕
体積 = １／２×（長径）×（短径）2
図３には、ＳＣＩＤマウス皮下に移植した細胞の増殖曲線を示した。図の横軸は、マウス皮下にＨＬ−６０を移植した日を０日目とし、縦軸は対数で表記した腫瘍体積であり、マウス皮下の腫瘍組織が対数増殖を続けていることがわかる。ＨＬ−６０をマウス皮下に移植した研究例は少ないが、ＨＬ−６０のマウス皮下における増殖挙動は、移植例のある他のヒト細胞の増殖挙動、特にＨＬ−６０と同じく造血系に属する培養細胞の増殖挙動と較べて妥当であると言える。
【００４３】
〔参考例２〕（フラスコ培養におけるフラスコ培養細胞および摘出細胞の増殖挙動）
培地（ＲＰＭＩ１６４０、Gibco社製）中、フラスコ培養細胞および摘出細胞の細胞数が１〜５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度になるよう調整し、常法に従って、７５ｍＬのフラスコ（Falcon社製）での培養を行った。
【００４４】
なお、摘出細胞は、以下のようにして調整した。参考例１の方法に準じて、ＨＬ−６０を皮下移植したマウスを、移植後３１日目に頚椎脱臼により安楽死させた。腫瘍を摘出し、ハンクス液（Gibco社製）を加えながら細分化した。分散酵素処理（ＥＺ酵素、新田ゼラチン社製）、トリプシン処理（Gibco社製）、３００μｍナイロンメッシュろ過の後、培地に懸濁した。細胞数が１〜５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度になるよう調整した。
【００４５】
増殖評価は、トリパンブルー染色後の細胞を血球計算版により生細胞数を算出した。その結果を図４に示す。
【００４６】
図４には、フラスコで浮遊継代培養したフラスコ培養細胞と摘出細胞の増殖挙動を示した。フラスコ培養ＨＬ−６０における増殖速度は、マウス皮下の増殖速度の７倍以上に相当する。増殖速度の違いは、生体内と培地中では細胞環境が著しく異なることに起因する。次に、摘出ＨＬ−６０の増殖挙動に注目する。摘出細胞は、フラスコ培養細胞と比較して、最初の２日間程増殖速度が小さい。しかし、摘出後４日以降は増殖速度が上昇し、フラスコ培養細胞の増殖速度とほとんど違いが見られなくなる。摘出細胞は、マウス皮下から培地中に移動されたことにより増殖挙動が大きく変化し、細胞自体の性質／機能も変化している可能性が高い。
【実施例１】
【００４７】
（細胞固定化基板（細胞チップ）の作製）
細胞の固相基板にはシリコンを用い、三次元微細加工技術である異方性エッチングにより逆ピラミッド型の微小穴を作製した。逆ピラミッド型溝の細孔サイズの大きな側（４５０μｍ）に細胞−コラーゲン混合液注入口、小さい側（１００μｍ）を検出口とした。微小穴の体積は、微小穴のディメンジョンにより規定され、１８ｎＬであった。なお、固相基板上の微小穴の数、配置、サイズ、形態等は、以下の実施例の目的に応じ自在に変えることが可能である。
【００４８】
細胞には、参考例２の方法に準じ調整したＨＬ−６０の摘出細胞を用い、０．２４％Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン社製）、培養液（新田ゼラチン社製）および再構成用緩衝液（新田ゼラチン社製）の混合液に１．５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨＬ−６０を懸濁し、シリコン基板上の微小穴に、該細胞−コラーゲン混合液をマイクロピペットを用いスポットした。スポット後、３７℃で１０分間インキュベートし、コラーゲンをゲル化させることにより細胞チップを作成した。
【実施例２】
【００４９】
（細胞チップ培養における摘出細胞の増殖挙動）
参考例２の方法に準じ調整したＨＬ−６０の摘出細胞を用い、実施例１の方法に準じ細胞チップを作製した。培養液中に細胞チップを静置することにより培養を行った。
【００５０】
チップ化した細胞の活性（増殖挙動）評価は、ＳＥＣＭを用いて行った。図２にＳＥＣＭによる細胞活性評価法を示す。ＳＥＣＭの探針であるマイクロ電極の電位を銀／塩化銀参照電極に対して−０．５Ｖに設定し、酸素還元電流を観測した。測定は、マイクロ電極を基板から３０μｍの位置に保持し、シリコン基板における微小穴の中央を、電極を走査することで、細胞近傍における酸素濃度プロファイルをモニターした（図２参照）。測定に要する時間は、一つの微小穴あたり1分程度である。評価結果を、図５に示す。縦軸は、ＳＥＣＭにより測定された０日目の細胞の呼吸活性を基準とした呼吸活性を表す。
【００５１】
〔参考例３〕
（細胞チップ培養におけるフラスコ培養細胞の増殖挙動）
ヒト癌細胞株であるＨＬ−６０を用い、実施例２の方法に準じ作製した細胞チップを培養し、ＳＥＣＭによる細胞活性評価法を行った。その結果を、実施例２と同じく、図５に示す。
【００５２】
増殖挙動は、細胞周辺の環境に関して有用な情報を与える。図５には、基板上（細胞チップ）に固定化した細胞−コラーゲンマトリックス内における摘出細胞およびフラスコ培養細胞の、ＳＥＣＭ計測による活性の経時変化を示した。ＨＬ−６０の摘出細胞は、通常のフラスコ培養細胞よりも増殖率が低いことがわかる。細胞の固定化および培養条件は、両細胞ともに全く同じであり、増殖が抑制される原因が細胞のチップ化にあるとは考え難い。
【００５３】
ここで、細胞チップにおける活性変化とフラスコ培養における増殖変化における、測定開始後２日目から６日目の４日間での増加量を比較した結果を表２に示す。摘出細胞の細胞チップ培養法では、およそ１．９倍、フラスコ培養法では１２．５倍であった。さらにＳＣＩＤマウス皮下における４日間での増殖量を平均的に見積もると、およそ１．７５倍であった。このように、細胞チップ培養法における増加率とＳＣＩＤマウス内での生体内培養法とが比較的近い値となった。細胞チップ培養法において、細胞はコラーゲンに包埋され、三次元的に培養されており、生体内の環境に比較的近い。そのため、摘出した細胞をコラーゲンに包埋することで、マウス皮下における増殖形態をそのまま維持し、フラスコ培養継代時と較べて増殖率が低い値になったと考えられる。
【００５４】
【表２】
2005095058.tif 000004
【００５５】
〔参考例４〕（細胞チップ培養におけるフラスコ培養細胞の抗癌剤感受性評価）
ヒト癌細胞株であるＨＬ−６０を用い、実施例１の方法に準じ作製した細胞チップを２４時間培養した後、ＳＥＣＭにより細胞の活性を評価した。その後、抗癌剤を含む培養液中で２４時間培養し、ＰＢＳ (−) により洗浄後、通常の培養液に交換して培養を行った。活性の評価は、抗癌剤を添加してから２、４および６日後に行った。培養液は測定ごとに交換した。ＳＥＣＭ測定は、緩衝液(ＨＥＰＥＳ、Gibco社製)中で行い、呼吸活性の経時変化または抗癌剤感受性の経時変化で評価した。抗癌剤の感受性は、抗癌剤を加えていない場合のチップ化細胞の呼吸活性をコントロールとし、コントロールに対するパーセント表示した。結果を図６に示す。
【００５６】
図６には、４種抗癌剤におけるＳＥＣＭ計測による細胞活性の経時変化を示す。ＣＤＤＰおよび５−ＦＵにおいては、コントロールに較べて活性は小さいが、６日間活性が増加を続けており、細胞の増殖が抑制されていないことがわかる。したがって、この２種類の抗癌剤は、培養ＨＬ−６０に対して効果を示さないことがわかる。一方、ＡＤＭにおいては、添加後２日目以降はほとんど活性に変化が認められず、ＶＰ−１６においては、添加後ほとんど活性に変化が認められなかった。従って、この２種の抗癌剤はＨＬ−６０の増殖を抑制しており、白血病細胞に対して有効な抗癌剤であると言える。
【００５７】
〔参考例５〕（フラスコ培養細胞のＳＥＣＭ計測およびＳＤＩ法による抗癌剤感受性の比較）
ヒト癌細胞株であるＨＬ−６０を用い、ＳＥＣＭ計測は、参考例４の方法に準じて行った。抗癌剤の感受性は、呼吸活性をコントロールに対する比としてパーセント表示した。
【００５８】
ＳＤＩ法は、測定にはＷＳＴ−８［２−（メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムナトリウム、Dojindo社製］を用い、抗癌剤添加後２、４および６日におけるＨＬ−６０の感受性を評価した。測定手順は、ＨＬ−６０をフラスコで1日培養後、表１中の接触濃度の抗癌剤を添加して２４時間培養した。その後、遠心分離により抗癌剤を除去後、培養液を加えて再び遠心分離により洗浄した後、フラスコで培養した。更に、抗癌剤添加後２、４および６日目に９６穴ウェルプレートに細胞懸濁液を分注し、5 ｍＭ、ＷＳＴ−８および２００μＭ 1―メトキシ−５−メチルフェナイニウムメトサルフェート（Dojindo社製）を１０ｗｔ％加えて、３７℃で４時間インキュベートした後、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。抗癌剤添加後６日目に測定するフラスコにおいては、３日目に培養液を交換した。抗癌剤の感受性は、抗癌剤を加えていない場合をコントロールとし、コントロールに対する比でパーセント表示した。コントロール群の細胞も同様の条件で培養し、２４時間後には遠心分離の操作を行った。抗癌剤投与開始日が０日目に相当する。結果を図７に示す。
【００５９】
図７には、ＳＥＣＭ計測（ａ）およびＳＤＩ法（ｂ）により得られた4種抗癌剤の感受性を示した。縦軸はコントロールに対する細胞活性の比でパーセント表示した。細胞活性について、ＣＤＤＰにおいては、両評価法ともに添加後２日目以降、ほとんど感受性に変化がないことがわかる。また、５−ＦＵにおいては、両評価法ともに添加後４日目以降、感受性にほとんど変化がないことがわかる。このように、この２種の抗癌剤においては、ＳＥＣＭ、ＳＤＩ両評価法による感受性が良好に一致した。さらに、ＣＤＤＰ、５−ＦＵの両抗癌剤は、添加後６日目においても、細胞の活性がコントロールに比して５０％以上あることから、ＨＬ−６０に効果を示していないことがわかる。ＡＤＭおよびＶＰ−１６においては、時間経過にともない感受性が増加、ＳＤＩ法でＡＤＭでは４日後に、ＶＰ−１６では２日後にほとんど活性が消失した。しかし、ＳＥＣＭ計測においては、時間経過にともない感受性が増加するものの、活性の消失は認められなかった。このように、この２種の抗癌剤においては、両評価法による感受性が異なり、ＳＥＣＭの方が低い感受性を示した。しかし、この２種の抗癌剤の感受性は、両評価法ともに、ＡＤＭでは添加後４日、ＶＰ−１６では添加後２日で、細胞の活性がコントロールの５０％以下に減少しており、ＨＬ−６０に効果を示すことが判定できる。つまり、両評価法ともに、抗癌剤の抗腫瘍効果の判定は一致していることになる。
【００６０】
細胞チップ上におけるＳＥＣＭ計測に基づく抗癌剤感受性試験の結果は、基本的にＳＤＩ法の結果と良く一致した。特に、効果を示さない抗癌剤（ＣＤＤＰ、５−ＦＵ）においては、両評価法がよく一致していると言える。一方、効果を示す抗癌剤（ＡＤＭ、ＶＰ−１６）においては、ＳＤＩ法の結果がＳＥＣＭの結果と較べて、感受性が高い方にシフトする傾向があった。この結果は、細胞に作用する抗癌剤濃度と抗癌剤作用時間の積（ＡＵＣ；the area under the concentration-time curve）が同一である場合に、増殖速度が大きい系において薬物感受性が高く判定されることで説明できる。加えて２つの実験系では、増殖速度だけでなく、細胞活性測定原理なども異なる。ＳＤＩ法では、測定準備工程として、培養液の交換および薬剤洗浄時の遠心分離等操作等が必要で、細胞に対して外的要因が作用している。これらのことを総合的に判断すると、２つの感受性試験結果に僅かな違いがあることは、妥当であると考えられる。
【実施例３】
【００６１】
（細胞チップ培養における摘出細胞の抗癌剤感受性評価）
参考例２の方法に準じ調整したＨＬ−６０の摘出細胞は、フラスコで１日培養した後、実施例１の方法に準じシリコン基板へ固定化した。以下、参考例４の方法に準じ抗癌剤の感受性評価を行った。細胞をチップ化した日が抗癌剤投与開始日０日目に相当する。結果を図８に示す。
【００６２】
図８（ａ）には、２種抗癌剤に対するＳＥＣＭ計測による細胞活性の経時変化を、（ｂ）は、抗癌剤を加えていない場合のチップ化細胞の呼吸活性をコントロールとし、コントロールに対する比でパーセント表示した。抗癌剤には、フラスコ培養ＨＬ−６０に対して最も抗腫瘍効果を示したＶＰ−１６および最も効果を示さなかったＣＤＤＰを用いた。
【００６３】
このように、細胞チップとＳＥＣＭ計測を組み合わせた感受性評価法により、連続的な感受性評価が可能となり、抗癌剤添加後の細胞増殖が経時的に評価可能である。また、抗癌剤の接触条件に、ＡＵＣ値に基づく値を用いることで、臨床を反映した感受性評価が可能となる。実際、ＶＰ−１６においては、白血病に対する第２選択の治療薬として臨床で用いられている。先に、抗癌剤添加後の６日間における活性変化を評価することで、長期間の評価が可能であることを示したが、今回得られた本発明の結果から、４日程度での感受性評価が可能と言える。ＣＤ−ＤＳＴ法においては、評価までに８日程度を要しており、本手法を用いることで短時間での感受性評価が可能となる。
【００６４】
〔参考例６〕（摘出細胞のＳＥＣＭ計測およびＳＤＩ法による抗癌剤感受性の比較）
参考例２の方法に準じ調整したＨＬ−６０の摘出細胞を用い、参考例５の方法に準じてＳＤＩ法による抗癌剤感受性試験を行った。摘出細胞のＳＥＣＭ計測およびＳＤＩ法による抗癌剤感受性の比較結果を図９に示す。
【００６５】
図９の（ａ）には、実施例３（ｂ）のＳＥＣＭ計測結果（図８（ｂ）と同一図である）について、（ｂ）は、ＳＤＩ法により得られたＣＤＤＰおよびＶＰ−１６の感受性結果について示した。縦軸はコントロールに対する細胞活性の比でパーセント表示した。
【００６６】
フラスコ培養細胞の場合と同様に、摘出細胞に対する抗癌剤感受性試験の結果は、細胞チップ上におけるＳＥＣＭ評価法とＳＤＩ法の結果は良く一致した。両評価方法の結果の僅かな違いについても、参考例５のフラスコ培養細胞の解釈で十分説明可能である。
【００６７】
次に、摘出細胞とフラスコ培養細胞の感受性の違いについて言及する。まず、チップ化した摘出細胞およびフラスコ培養細胞の感受性の違いに着目し、図９（ａ）と図７（ａ）を比較した。ＣＤＤＰに対する感受性おいて、摘出細胞とフラスコ培養細胞で少しの違いはあるが比較的近く、薬剤投与後、どの点においてもコントロールに対して５０％以上の活性が認められた。一方、ＶＰ−１６においては、摘出細胞とフラスコ培養細胞の感受性がほぼ一致した。次に、ＳＤＩ法（フラスコ培養法）における摘出細胞およびフラスコ培養細胞の感受性の違いに着目し、図９（ｂ）と図７（ｂ）を比較した。ＳＤＩ法においても、ＣＤＤＰおよびＶＰ−１６の感受性はよく一致している。参考例２（図４参照）で指摘したように、フラスコ培養法では摘出細胞の増殖挙動を２日以降維持することは困難であり、摘出細胞の感受性試験自体が無意味であることを示唆する。即ち、摘出細胞の増殖挙動を維持するためには、コラーゲン包埋培養法が適しており、通常の浮遊培養法（フラスコ培養法）は不適である。従って、in vitroで摘出細胞の抗癌剤感受性試験を実施する際には、生体内の細胞育成環境を維持する為の工夫が不可欠であり、コラーゲン包埋培養法はその目的に十分適っていると言うことができる。このように、同じ細胞株であっても、in vivoとin vitroでは増殖形態に違いが生じており、コラーゲンに細胞を包埋することで、より生体内を反映した状況下で培養可能であることが示唆された。感受性試験で必要なコラーゲン包埋培養期間は、ＣＤ−ＤＳＴ法で８〜１４日程度に対し、本発明において４日程度となる。
【００６８】
〔参考例７〕（生体内培養細胞の抗癌剤感受性評価）
参考例１の方法に順じ、６〜８週齢の雌のＳＣＩＤマウス皮下にヒト癌細胞株であるＨＬ−６０を移植した。腫瘍体積が３００〜５００ｍｍ3に達したところで抗癌剤を投与、その後２１日間、週２回腫瘍サイズ計測を行った。抗癌剤投与条件は、臨床治療量等価量（clinically equivalent dose；ＣＥＤ）値に従った。ＣＤＤＰにおいては、１６０μｇ（８ｍｇ／ｋｇ）を１回、ＶＰ−１６においては３２０μｇ（１６ｍｇ／ｋｇ）を５回、連日投与した。感受性の評価は、投与後２１日目における腫瘍サイズを抗癌剤投与群と投与していない群（コントロール）とで比較することにより行った。本実験系では、腫瘍移植後１０日で腫瘍サイズがおよそ４００ｍｍ3に達した。したがって、移植後１０日目に抗癌剤を投与、３１日目に抗癌剤感受性を評価した。実験には、１群６匹のマウスを用い、その平均値より評価した。
【００６９】
腫瘍成長率は、ＣＤＤＰ投与においては８４％、ＶＰ−１６においては６２％であった。この値をＳＥＣＭ計測により得られた細胞活性（図８（ｂ））と比較すると、ＣＤＤＰにおいては２日目から６日目に亘りおよそ８０％であり、生体内培養法（in vivo法）による評価と良好に一致した。一方、ＶＰ−１６においては、ＳＥＣＭ計測では２日目以降、４０％、１８％、１０％であり、大きく異なった。しかし、in vivo法が臨床における結果を必ずしも反映しているわけではない。以前の報告では、ヌードマウスに急性白血病細胞株を移植したモデルにおいて、Vincristine（ＶＣＲ）の腫瘍成長率は６２％であり、効果を示さないと判定されている［稲葉實ら、ヌードマウスと抗癌剤評価, 蟹書房, 東京、1991］。ＶＣＲは、本発明で用いたＶＰ−１６と同じ植物アルカロイドに属し、急性白血病における第２選択の治療薬として用いられている。このように、in vivo抗癌剤感受性評価において、植物アルカロイドが急性白血病細胞に効果を示さなかったという報告例がいくつかあり、in vivo法における評価が必ずしも臨床を反映しているわけではない。
【実施例４】
【００７０】
（周辺環境溶液制御部を設けた固相基板の作製）
固相基板にはシリコンを用い、実施例１の方法に準じ、逆ピラミッド型の微小穴を有するシリコン基板を作製した。周辺環境溶液制御部は、厚さ２ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）膜を用い、炭酸ガスレーザーにより成型し、流路を作製した。周辺環境溶液制御部の概要を図１１に示す。流路を設けた該膜を、シリコン基板上に被せることで、流路を設けた固相基板を作製した。その概略を図１０に示す。
【実施例５】
【００７１】
（同一基板上で細胞パネルごとの環境溶液条件の独立制御）
細胞には、ＨＬ−６０の摘出細胞に代えヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ−７を用い、０．２４％のＩ型コラーゲンを含む緩衝溶液に細胞（１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を懸濁後、実施例４で作製したシリコン基板の微小穴に流し込み、ゲル化させることで細胞を固定化した。環境溶液制御部の流路に、培地あるいは２００ｍＭ ＫＣＮを含む培地を導入した状態で、培養と測定を交互に実施した。測定は、１１．２ｍＭグルコースを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で行った。蛍光計測においては、生・死細胞を染め分ける二重染色により行った。ＳＥＣＭ計測においては、−０．５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌにおける酸素還元電流値を計測、微小穴近傍の酸素濃度プロファイルを検出することにより細胞活性を評価した。結果を図１２および１３に示す。
【００７２】
図１２には、環境溶液制御部の流路に培地あるいは２００ｍＭ ＫＣＮを含む培地を添加後２日目の蛍光イメージを示す。（Ａ）に示すように、中央の流路のみにＫＣＮを添加した。（Ｂ）において、ＫＣＮを添加した中央の微小穴においては、死細胞を示す蛍光のみが認められた。一方、ＫＣＮを含まない微小穴においては、生細胞を示す蛍光のみが認められた。よって、ＰＤＭＳの流路により各々の微小穴が隔絶されており、相互に溶液が交換していないことがわかる。
【００７３】
図１３には、同様に、ＫＣＮ添加による細胞活性をＳＥＣＭにより評価した結果を示す。（Ａ）に示す右側の微小穴にのみ２００ｍＭ ＫＣＮを添加した。図の（Ｂ）はＫＣＮ添加前、（Ｃ）は添加後２日目の呼吸応答である。添加前（Ｂ）においては、両微小穴（ａ）、（ｂ）共に同程度の呼吸応答が認められ、共に生細胞であることがわかる。添加後２日目、（Ｃ）においては、左側（ａ）の微小穴における呼吸応答は、添加前（Ｂ）の（ａ）に較べて１．５倍程度増加しており、基板上に固定化された細胞が正常に増殖していることが示唆される。一方、右側（ｂ）の微小穴においては、呼吸応答が完全に消失しており、細胞が死滅していることがわかる。
【００７４】
このように、本発明により薬剤添加における細胞の増殖挙動をモニター可能となる。異なる種類の抗癌剤あるいは異なる濃度の抗癌剤における細胞の増殖挙動の評価も同様に可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ＨＬ−６０細胞を用いた実験概略を示す図である。
【図２】ＳＥＣＭによる測定概略を示す図である。
【図３】ＳＣＩＤマウス皮下におけるＨＬ−６０の増殖挙動を示す図である。
【図４】フラスコ培養法におけるフラスコ培養細胞および摘出細胞の増殖挙動を示す図である。
【図５】細胞チップ培養法におけるフラスコ培養細胞および摘出細胞の増殖挙動を示す図である。
【図６】細胞チップ培養法におけるフラスコ培養細胞の４種抗癌剤に対する呼吸活性の経時間変化を示す図である。
【図７】フラスコ培養細胞のＳＥＣＭ計測およびＳＤＩ法における抗癌剤感受性を示す図である。
【図８】細胞チップ培養法における摘出細胞の２種抗癌剤に対する呼吸活性の経時間変化および抗癌剤感受性を示す図である。
【図９】摘出細胞のＳＥＣＭ計測およびＳＤＩ法における抗癌剤感受性を示す図である。
【図１０】周辺環境溶液制御部を設けた固相基板の概略を示す図である。
【図１１】周辺環境溶液制御部の概要を示す図である。
【図１２】周辺環境溶液制御部に培地あるいはＫＣＮを含む培地を添加した場合の実験概略図と蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。
【図１３】周辺環境溶液制御部に培地あるいはＫＣＮを含む培地を添加した場合の実験概略図とＳＥＣＭ計測の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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