(57)【要約】    【課題】  骨破断強度のみならず骨靭性をも向上させて骨の脆弱化や骨折を予防することができる骨靭性向上用素材を提供する。    【解決手段】  本発明にかかる骨靭性向上用素材は、コラーゲンおよび／またはゼラチンを、脊椎動物・魚類・甲殻類の筋肉または臓器、放線菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｓ属細菌、糸状菌、担子菌、黄色コウジカビ、酵母からなる群より選ばれた少なくとも１つに由来するプロテアーゼのうちの１種以上で加水分解してなるペプチドを有効成分とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンおよび／またはゼラチンを、脊椎動物・魚類・甲殻類の筋肉または臓器、放線菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｓ属細菌、糸状菌、担子菌、黄色コウジカビ、酵母からなる群より選ばれた少なくとも１つに由来するプロテアーゼのうちの１種以上で加水分解してなるペプチドを有効成分とする、骨靭性向上用素材。
【請求項２】
前記プロテアーゼが、黄色コウジカビまたはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来するプロテアーゼである、請求項１に記載の骨靭性向上用素材。
【請求項３】
骨組織中のカルシウム（Ｃａ）とリン（Ｐ）とのモル比（Ｃａ／Ｐ）を１．６７以上にする、請求項１または２に記載の骨靭性向上用素材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨の靭性を向上させて骨を強化させるための骨靭性向上用素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は骨細胞、骨芽細胞および破骨細胞などの骨構成細胞とその間を埋める大量の骨基質から構成されている。さらに、骨基質はコラーゲンを主体とする有機性成分とヒドロキシアパタイトと呼ばれるリン酸カルシウム結晶を主体とする無機性成分でできている。骨は支持組織であると同時にカルシウムの貯蔵庫としての機能をもっている。すなわち、成長が停止した後も活発な破骨細胞の骨吸収と骨芽細胞の骨形成により再構築（リモデリング）を繰り返し、両過程間の動的平衡によってその形態と強度を維持している。この平衡関係が崩れたときに、骨粗鬆症をはじめとする様々な骨疾患が生じる。
骨粗鬆症は骨量の持続的な低下と骨強度の低下を特徴とする疾患であり、医学的には「低骨量と骨組織の微小構造の破綻によって特徴づけられる疾患であり、骨の脆弱性亢進と骨折危険率の増大に結びつく疾患」と定義され、我が国においては１０００万人を超す患者が存在すると推定されている。骨粗鬆症が進行すると、疼痛、関節痛、歩行障害や病的な骨折を伴うことが多く、日常生活に支障をきたす脊椎骨折や大腿骨頸部骨折を起こし易いことがこの疾患の大きな問題になっている。特に、高齢者では大腿骨頸部骨折で入院した場合、約４０％の患者が退院できず寝たきりの状態となり、骨折後１年以内に１０〜２０％の患者が死亡するといわれている。
【０００３】
骨粗鬆症の発症には、骨代謝に関係するホルモンバランスの変化、老化および栄養状態の低下などが原因すると考えられている。そこで、従来、骨粗鬆症の治療にあたっては、例えば、エストロゲン、カルシトニン、ビタミンＤなどの薬剤が用いられているが、長期にわたり大量に服用する場合が多く、性器出血、高カルシウム血症および高カルシウム尿症とそれに伴う尿路結石などの副作用や治療抵抗性の発現が問題となっている。なお、高齢者や閉経後女性の骨粗鬆症に対してはカルシウム補充療法が有効であることが知られているが、これだけでは顕著な改善効果は得られにくいのが現状である。
このように、骨粗鬆症の治療には長い期間を必要とするため、食品としても利用可能な素材を用いた安全性の高い薬剤開発が要望されており、この要望に答えるものとして、コラーゲンまたはゼラチンをブロメライン、パパイン、フィシンなどの植物由来の蛋白質分解酵素で処理して得られる酵素分解物を有効成分とする骨粗鬆症予防・治療剤が提案されている（特許文献１参照）。この骨粗鬆症予防・治療剤は、骨の破断強度の低下を抑制することにより、骨粗鬆症を予防・治療しようとするものである。
【特許文献１】特開平１１−１２１９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、骨の脆弱化や骨折をより効果的に予防するためには、骨の破断強度を向上させることだけでは不充分であり、破断強度と併せて、基質の改善、とりわけ骨靭性（すなわち、骨のしなやかさ）をも向上させることが重要であると考えられる。ここで、「骨靭性」とは、一定の重量負荷をかけて骨が破断するまでに要するエネルギー量（破断エネルギー量）で表されるものであり、これに対し、「破断強度」は、一定の重量負荷をかけたときに骨が破断せずに耐えうる力の最大値で表されるものである。前記特許文献１においては、骨靭性については全く言及されておらず、本発明者が確認したところ、前記特許文献１で開示されている骨粗鬆症予防・治療剤は、骨の破断強度は向上させうるものの、骨靭性については充分な向上効果が期待できるものではなかった。
【０００５】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、骨破断強度のみならず骨靭性をも向上させて骨の脆弱化や骨折を予防することができる骨靭性向上用素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、骨靭性を向上させるには、骨組織中のコラーゲン含量、とりわけ無機成分（すなわち、カルシウム、マグネシウム、およびリン）含量に対するコラーゲン含量の重量比を増加させればよいことを見出した。そして、コラーゲン含量を効果的に増加させうる素材として、コラーゲンまたはゼラチンを種々のプロテアーゼで加水分解して得られる様々なペプチドを検討したところ、コラーゲンおよび／またはゼラチンを特定の動物の筋肉や臓器もしくは特定の微生物に由来するプロテアーゼで加水分解してなるペプチドが、コラーゲン含量ひいては無機成分含量に対するコラーゲン含量の重量比を増加させるのに有効であることを見出し、とりわけ、前記プロテアーゼとして黄色コウジカビまたはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来するプロテアーゼを用いてコラーゲンおよび／またはゼラチンを加水分解してなるペプチドは、特に、コラーゲン含量を極めて顕著に増加させ、無機成分含量に対するコラーゲン含量の重量比を大幅に向上させることを見出した。
【０００７】
また、本発明者は、骨組織中のカルシウム（Ｃａ）とリン（Ｐ）とのモル比（Ｃａ／Ｐ）が１．６７以上であると、骨破断強度をより向上させることができるとともに、エストロゲン欠乏した状態であっても骨形成マーカーの低下が抑制され、骨形成が阻害されることがないという効果も得られることを見出し、前述した特定の動物の筋肉や臓器もしくは特定の微生物に由来するプロテアーゼ、好ましくは黄色コウジカビまたはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来するプロテアーゼを用いて得られるペプチドを摂取することにより、この骨組織中のカルシウム（Ｃａ）とリン（Ｐ）とのモル比（Ｃａ／Ｐ）を容易に前記範囲にすることが可能になることをも見出した。
【０００８】
本発明はこれらの知見により完成したものである。
すなわち、本発明にかかる骨靭性向上用素材は、コラーゲンおよび／またはゼラチンを、脊椎動物・魚類・甲殻類の筋肉または臓器、放線菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｓ属細菌、糸状菌、担子菌、黄色コウジカビ、酵母からなる群より選ばれた少なくとも１つに由来するプロテアーゼのうちの１種以上で加水分解してなるペプチドを有効成分とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、骨破断強度のみならず骨靭性をも向上させて骨の脆弱化や骨折を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明にかかる骨靭性向上用素材について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
本発明の骨靭性向上用素材は、コラーゲンおよび／またはゼラチンを、脊椎動物・魚類・甲殻類の筋肉または臓器、放線菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｓ属細菌、糸状菌、担子菌、黄色コウジカビ、酵母からなる群より選ばれた少なくとも１つに由来するプロテアーゼ（以下「特定プロテアーゼ」と称することもある）のうちの１種以上で加水分解してなるペプチド（以下「加水分解ペプチド」と称することもある）を有効成分とするものである。本発明においては、前記特定プロテアーゼを加水分解酵素として選択することが重要であり、これにより得られる特定の加水分解ペプチドを摂取することにより、骨組織中のコラーゲン含量、とりわけ骨組織中の無機成分であるカルシウム・マグネシウム・リンの合計含量に対するコラーゲン含量の重量比を増加させることができ、その結果、骨靭性（すなわち、破断エネルギー）を格段に向上させることができるのである。これは、前記加水分解ペプチドを摂取すると、これが腸管から吸収されたのち、骨組織中で骨芽細胞にシグナルとして作用し、コラーゲンの合成・分泌を促進するからであると推察される。
【００１１】
前記加水分解ペプチドの好ましい態様は、骨組織中のカルシウム（Ｃａ）とリン（Ｐ）とのモル比（Ｃａ／Ｐ）を１．６７以上にするものである。すなわち、カルシウム（Ｃａ）とリン（Ｐ）の結晶形態は水酸アパタイト（ＨＡ）が安定であるが、骨組織中のアパタイトはカルシウム欠損水酸アパタイトの結晶形態をとり、そのＣａ／Ｐモル比は、通常、健康な骨であっても化学量論的水酸アパタイト（ｓＨＡ）のＣａ／Ｐモル比（１．６７）未満（具体的には１．６６程度）であることが知られているところ、前記加水分解ペプチドを摂取すると、容易に骨組織中のＣａ／Ｐモル比を１．６７以上にすることが可能になる。このように骨組織中のＣａ／Ｐモル比が１．６７以上であると、骨破断強度が格段に向上するとともに、エストロゲン欠乏した状態であっても骨形成マーカーの低下が抑制され、骨形成が阻害されることがないという効果も期待できる。これは、前記加水分解ペプチドを摂取すると、これが腸管から吸収されたのち、骨組織中で骨芽細胞にシグナルとして作用し、コラーゲンの合成・分泌とともに、骨形成マーカーであるオステオカルシンの合成・分泌を促進し、その結果、新生された骨組織中において、ＣａとＰの結晶形態が化学量論的水酸アパタイト（ｓＨＡ）の形態をとり、しかも過剰のＣａが新生されたコラーゲンもしくは分泌・沈着したオステオカルシン分子中のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル基と結合した構造を形成することとなるからであると推察される。
【００１２】
前記コラーゲンとしては、特に限定されるものではなく、例えば、魚類、ほ乳類、家禽類などの鱗、皮膚、骨、腱などの生体組織に由来するあらゆるコラーゲン等を挙げることができる。また、前記ゼラチンとしては、前記コラーゲンの熱変性物等が挙げられる。これらコラーゲンおよびゼラチンは、１種のみを用いてもよいし２種以上を併用してもよく、また、コラーゲンとゼラチンを併用することもできる。
前記特定プロテアーゼは、前述したように、脊椎動物・魚類・甲殻類の筋肉または臓器、放線菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｓ属細菌、糸状菌、担子菌、黄色コウジカビ、酵母からなる群より選ばれた１つに由来するプロテアーゼであるが、これら特定プロテアーゼの中でも特に、黄色コウジカビまたはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来するプロテアーゼが好ましい。すなわち、本発明においては、前記コラーゲンおよび／またはゼラチンを黄色コウジカビまたはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来するプロテアーゼのうちの１種以上で加水分解してなるペプチドを有効成分とすることが好ましいのである。これは、黄色コウジカビまたはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来するプロテアーゼを用いてコラーゲンおよび／またはゼラチンを加水分解してなるペプチドは、前記加水分解ペプチドの中でもとりわけ、コラーゲン含量を増加させ無機成分含量に対するコラーゲン含量の重量比を向上させるという点で優れた性能を発揮するものであり、その結果、より優れた骨靭性（すなわち、破断エネルギー）の向上効果が得られるからである。また、黄色コウジカビまたはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来するプロテアーゼを用いてコラーゲンおよび／またはゼラチンを加水分解してなるペプチドは、前記加水分解ペプチドの中でも、極めて容易に骨組織中のＣａ／Ｐモル比を１．６７以上にすることが可能になるものであり、骨破断強度の向上効果やエストロゲン欠乏した状態において骨形成マーカーの低下を抑制して骨形成が阻害されないようにする効果についても、より優れた結果が得られるものである。なお、前記特定プロテアーゼは、１種のみを用いても２種以上を併用してもよく、例えば、特に好ましい黄色コウジカビ由来のプロテアーゼとＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のプロテアーゼとを併用することもできる。
【００１３】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（バチルス属）細菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  Ｊ４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ等が好ましく挙げられる。
前記コラーゲンおよび／またはゼラチンを前記特定プロテアーゼで加水分解して前記加水分解ペプチドを得るに際しては、加水分解の反応条件（具体的には、例えば、酵素添加量、反応温度、反応ｐＨおよび反応時間など）は特に限定されるわけではなく、原料とするコラーゲンやゼラチンの種類等に応じて、適宜設定すればよい。例えば、豚皮由来コラーゲンの熱変性物であるゼラチンを加水分解する場合には、乾燥ゼラチン重量に対して１０〜１００００ｐｐｍの量で前記特定プロテアーゼを添加し、ｐＨ３．０〜８．０、温度４０〜６０℃で３０〜１８０分間反応させることにより、酵素加水分解処理を施すことができる。
【００１４】
前記加水分解ペプチドは、前記加水分解反応を行った後、前記特定プロテアーゼを失活させる処理を施したものであることが好ましい。特定プロテアーゼを失活させる方法としては、特に限定はされないが、例えば、７０〜１００℃で５〜６０分間程度加熱する方法等を挙げることができる。
前記加水分解ペプチドは、前記加水分解の後、得られた加水分解物をさらに発酵させる処理を施したものであってもよい。発酵方法としては、従来公知の各種発酵方法を採用すればよく、特に限定されるわけではない。具体的には、例えば、前述した特定プロテアーゼを失活させる処理を施した後、糖分とともに食用の酵母や乳酸菌などの発酵微生物等を添加し、２５〜３５℃で４〜４８時間発酵させるようにすればよい。前記食用の酵母や乳酸菌としては、特に限定はされないが、例えば、アルコール飲料、発酵乳食品、パン等の生産において用いられる各種酵母および乳酸菌等が挙げられる。
【００１５】
前記加水分解ペプチドは、前記加水分解により得られた加水分解物を分画・精製したものであってもよい。分画・精製の方法としては、特に制限はなく、例えば、限外濾過や、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィーや、これらを組み合わせた方法等のような従来公知の方法によればよい。
前記加水分解ペプチドの重量平均分子量は、特に制限されないが、２５０〜９，５００であることが好ましい。
本発明の骨靭性向上用素材中に占める前記加水分解ペプチドの含有量は、特に制限されないが、例えば、０．００５重量％以上の範囲とするのが好ましい。
【００１６】
本発明の骨靭性向上用素材は、有効成分である前記加水分解ペプチド以外にも、薬剤学的に許容される他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特に限定はされないが、例えば、水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、植物油等の担体；生理食塩水やリンゲル液などの水溶性溶剤、植物油や脂肪酸エステルなどの非水溶性溶剤等の希釈剤；ブドウ糖や塩化ナトリウム等の等張化剤；溶解補助剤；安定化剤；防腐剤；懸濁化剤；乳化分散剤；従来から骨粗鬆症治療に用いられてきた各種薬剤（例えばビタミンＤやカルシウム剤など）；等が挙げられる。これら他の成分の含有量は、有効成分となる前記加水分解ペプチドにより発揮される本発明の効果を損なわない範囲で適宜設定すればよい。
【００１７】
本発明の骨靭性向上用素材は、そのまま骨疾患の予防・治療薬として使用してもよいし、例えば、他の成分として前述した坦体や乳化分散剤等によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、粉剤等の経口剤や注射剤等の形態に製剤化し、予防・治療薬として用いるようにしてもよい。また、本発明の骨靭性向上用素材は、例えば、清涼飲料、乳酸飲料、調味料、スープ、チーズ、ハム、菓子類などの様々な食品中に添加して、機能性食品や特定保健用食品等として用いてもよい。
本発明の骨靭性向上用素材の摂取方法は、特に制限されず、経口摂取でもよいし、注射（皮下、静脈内等）や直腸投与等の非経口投与でもよいが、経口摂取が好適である。
【００１８】
本発明の骨靭性向上用素材を投与・摂取する場合の投与・摂取量は、例えば、患者の症状、年齢、体重などに応じて適宜決定すればよく、特に制限されないが、成人に対する一日量の目安としては、有効成分（前記加水分解ペプチド）で０．１〜１０ｇの範囲が好ましい。
【実施例】
【００１９】
以下に、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、各実施例で得られた粉末化したペプチドの重量平均分子量は、下記の方法で測定した。
＜重量平均分子量の測定＞
パギイ法（高速液体クロマトグラフィーを用いたゲル濾過法によってクロマトグラムを求め、分子量分布を推定する方法）で測定した。具体的な操作は以下のとおりである。
（１）試料０．２ｇを１００ｍＬメスフラスコに取り、溶離液（０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム溶液と０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム溶液の等量混合液）を加え、１時間膨潤させた後、４０℃で６０分間加温して溶かす。室温まで冷却したあと、溶離液を標線まで加える。
（２）得られた溶液を溶離液で正確に１０倍希釈し、検液とする。
（３）検液を用い、ゲル濾過法によってクロマトグラムを求める。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ  ６２０  ７Ｇを２本直列
溶離液の流速：１．０ｍＬ／分
カラムの温度：５０℃
検出方法：測定波長２３０ｎｍの吸光度
（４）保存時間を横軸にとり、対応した２３０ｎｍの吸光度値を縦軸にして、試料の分子分布曲線を作成し、重量平均分子量を算出する。
【００２０】
〔実施例１〕
魚由来コラーゲン（Ｉ型コラーゲン）の熱変性物であるゼラチン１ｋｇを７５℃の温水４ｋｇに溶解させ、６０℃に温度調整したのち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で１２０分間保持することにより加水分解処理を行なった。次いで、加水分解処理で得られた溶液を８５℃で１０分間加熱してＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来プロテアーゼを失活させ、その後、６０℃に冷却し、活性炭とろ過助剤（珪藻土）とを用いてろ過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥することにより、粉末化したペプチド（重量平均分子量５，０００、水分量５重量％）７００ｇを得、これを本発明の骨靭性向上用素材とした。
【００２１】
〔実施例２〕
豚皮由来コラーゲン（Ｉ型コラーゲン）の熱変性物であるゼラチン１ｋｇを７５℃の温水４ｋｇに溶解させ、６０℃に温度調整したのち、黄色コウジカビ由来プロテアーゼ１０ｇを添加し、ｐＨ５．０〜６．０、温度４５〜５５℃で１２０分間保持することにより加水分解処理を行なった。次いで、加水分解処理で得られた溶液を８５℃で１０分間加熱して黄色コウジカビ由来プロテアーゼを失活させ、その後、６０℃に冷却し、活性炭とろ過助剤（珪藻土）とを用いてろ過し、得られた母液に１２０℃で３秒間高温殺菌処理した。そして、殺菌後の母液を噴霧乾燥することにより、粉末化したペプチド（重量平均分子量３，０００、水分量５重量％）７００ｇを得、これを本発明の骨靭性向上用素材とした。
【００２２】
〔評価１〕
実施例１および実施例２で得られた骨靭性向上用素材の骨に対する影響を骨粗鬆症モデル動物を用いた以下の試験にて調べた。
ウィスター系雌ラット（６週齢、初体重１５０ｇ）２８頭を固形飼料で３日間飼育した後、２０％カゼイン食に切り替えて１週間飼育した。その後、体重を揃えて、４頭（第１群）には偽手術を、２４頭（第２群〜第４群、各群８頭ずつ）には閉経後骨粗鬆症モデルとなるよう左右の卵巣摘出手術を、それぞれ施した。手術後、１５％カゼイン食（０．２％Ｃａ）で１０日間飼育して回復させたのち、各群ごとに表１に示す組成の食餌に切り替えて１２週間飼育した。この間、摂食量は制限せず、イオン交換水は自由摂取させた。なお、各ラットの飼育は、食餌の種類以外は全く同一の環境で行った。
【００２３】
表１中の数値の単位はいずれも「ｇ」であり、各成分の詳細は下記の通りである。
・カゼイン（オリエンタル酵母工業（株）製）
・デンプン（オリエンタル酵母工業（株）製）
・コーン油（ボーソー油脂社製）
・セルロース（オリエンタル酵母工業（株）製）
・ミネラル混合物（オリエンタル酵母工業（株）製「ＡＩＮ−７６」：Ｃａフリー）
・ビタミン混合物（オリエンタル酵母工業（株）製「Ａ．Ｅ．Ｈａｒｐｅｒ’５７」：山口配合）
・カルシウム（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、和光純薬製）
【００２４】
【表１】
2005343852.tif 000002
【００２５】
各群ごとに表１に示す組成の食餌に切り替えた日を０週目として、４週目、８週目、１２週目に、各ラットの尾静脈から採血し、骨形成マーカーとして血清オステオカルシンのＧＬＡ蛋白質（ＯＣ−ＧＬＡ）濃度を次のようにして測定した。すなわち、ＴａＫａＲａ社製のＥＩＡ測定キット（コード「ＭＫ１２１」）を用い、採血から得られた血清を３倍に希釈した試料を、特異的なモノクローナル抗体をコーティングした９６穴プレートにて、ビオチン化したＧＬＡ型オステオカルシンと競合させたのち、アビジン化ペルオキシダーゼで可視化し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにて比色定量した。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
2005343852.tif 000003
【００２７】
表２の結果から、第２群〜第４群では、卵巣摘出によりエストロゲンが欠乏した状態にあるために骨吸収抑制作用が解除され、既存骨組織中のＯＣ−ＧＬＡの血清中への経時的溶出が生じるが、本発明の骨靭性向上用素材を含む食餌を与えた第３群および第４群は、４週以降、とりわけ骨吸収が優勢となる８週目では血清中のＯＣ−ＧＬＡ量の減少を緩和し、血清中のＯＣ−ＧＬＡ量を一定に保つことができている。これに対し、通常のカゼイン食を与えた第２群では、骨のリモデリングに伴うＯＣ−ＧＬＡ量の変動が大きく、特に８週目では顕著に低下している。このことから、本発明の骨靭性向上用素材を摂取すると、エストロゲン欠乏した状態であっても骨形成マーカーの低下が抑制され、骨形成が阻害されることがない、ことが判った。
【００２８】
次に、各群ごとに表１に示す組成の食餌に切り替えてから１２週間飼育後、各ラットの大腿骨を取り出し、骨破断特性測定装置（Ｒｈｅｏｌｏｍｅｔｅｒ製「ＭＡＸ  ＲＸ−１６００」）およびマイクロコンピュータ（ＮＥＣ製「ＰＣ−９８０１ＲＸ」）を用い、３点曲げ試験により大腿骨中間部の最大曲げ荷重量と破断エネルギーを測定した。測定は、支点間距離２０ｍｍ、破断速度１０ｍｍ／分、負荷重量２ｋｇで行った。結果を表３に示す。なお、結果は、各ラットの体重を考慮し、得られた実測値を体重１００ｇあたりに換算した値で示した。
【００２９】
【表３】
2005343852.tif 000004
【００３０】
表３の結果から、本発明の骨靭性向上用素材を含む食餌を与えた第３群および第４群は、通常のカゼイン食を与えた第２群に比べ、最大曲げ荷重量および破断エネルギーが統計的に有意に向上していることが明らかである。
また、上記測定後の大腿骨を用いて、以下の方法でコラーゲン含量とカルシウム・マグネシウム・リン含量を測定した。結果を表４に示す。
＜コラーゲン含量＞  大腿骨の粉末１００ｍｇを６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解し、得られた加水分解液を濾過したのち、濾液を濃縮乾固した。次いで、得られた乾固物を炭酸カリウム水溶液で中和して２５ｍＬに定容し、その０．２ｍＬを用いてＦｉｒｓｃｈｅｉｎ＆Ｓｈｉｌｌ法にてヒドロキシプロリンを比色定量して求めた。
【００３１】
＜カルシウム・マグネシウム・リン含量＞  大腿骨を凍結乾燥後、クロロホルム／メタノール混合液で脱脂した。その後、溶媒を除去したのち、粉砕した。得られた粉末５０ｍｇを硝酸加熱分解し、１００ｍＬに定容したのち、カルシウム・マグネシウム・リン酸を誘導プラズマ発光分光法（ＩＣＰ、セイコー社製「１２００」使用）にて定量した。
【００３２】
【表４】
2005343852.tif 000005
【００３３】
表４の結果から、カルシウムとリンとのモル比（Ｃａ／Ｐ（モル比））は、通常のカゼイン食を与えた第１群および第２群では１．６７未満であるのに対し、本発明の骨靭性向上用素材を含む食餌を与えた第３群および第４群では１．６７以上となっていることが判る。また、無機成分であるカルシウム・マグネシウム・リンの合計含量に対するコラーゲン含量の重量比（コラーゲン含量／Ｃａ＋Ｍｇ＋Ｐの合計含量（重量比））は、第１群を１００％として相対比で見ると、本発明の骨靭性向上用素材を含む食餌を与えた第３群および第４群はそれぞれ１１７．５％および１２３．５％となっており、通常のカゼイン食を与えた第２群（１０８％）と比べても大幅に増加していることが判る。
【００３４】
〔評価２〕
足や腰の関節に痛みやしびれを訴えていた被験者６８人に、実施例１で得られた骨靭性向上用素材を１日１０ｇずつ３０日間経口摂取（摂取方法は、コーヒー等の飲料やヨーグルト・味噌汁等の食品に混ぜるなど、任意の方法で良いものとした）して貰い、その効果を聞き取り調査した。その結果、３９人（５７％）の被験者が「関節の痛みが和らいだ」と答え、７人（１０％）の被験者が「しびれを感じることが少なくなった」「関節がスムーズに動くようになった」と答えた。また、骨靭性向上用素材の摂取前後の被験者６８人の骨密度を測定したところ、骨靭性向上用素材の摂取によって４人（６％）の被験者に骨密度の向上が認められた。
【００３５】
〔参考例〕
実施例１および２で得られた本発明の骨靭性向上用素材（粉末化したペプチド）を各種用途に用いる場合の処方例を記載するが、これらに限定されるものではない。
（参考例１）
下記配合成分を混合し、打錠成型器を用いて、チュアブルタイプのタブレットを調製した。
実施例１の骨靭性向上用素材        ５０．０ｋｇ
アスコルビン酸                    １０．０ｋｇ
三共フーズ（株）製「ミクロカルマグ」４．６ｋｇ
（株）林原商事製「マビット」      １９．０ｋｇ
結晶セルロース                    １０．０ｋｇ
乳化剤                              ３．２ｋｇ
アスパルテーム                      ０．５ｋｇ
発酵乳パウダー                      １．４ｋｇ
粉末香料                            １．０ｋｇ
クエン酸                            ０．３ｋｇ
合計１００．０ｋｇ
（参考例２）
下記配合成分を混合して、１００〜１４０ｍＬのお湯に溶解させて飲用する粉末コンソメスープを調製した。
実施例２の骨靭性向上用素材        ３５．０ｋｇ
チキンエキスパウダー              ２５．０ｋｇ
食塩                              １８．０ｋｇ
ブドウ糖                            ７．７ｋｇ
乳酸カルシウム                      ７．０ｋｇ
グルタミン酸ナトリウム              ４．０ｋｇ
オニオンエキスパウダー              １．０ｋｇ
ＨＶＰ                              １．０ｋｇ
ビーフフレーバー                    ０．５ｋｇ
５’−リボヌクレオチド２ナトリウム  ０．５ｋｇ
ホワイトペッパー                    ０．２ｋｇ
ターメリック                        ０．１ｋｇ
合計１００．０ｋｇ
（参考例３）
下記配合成分を混合して、１００〜１５０ｍＬの水に溶解させて飲用する粉末ジュースを調製した。
実施例１の骨靭性向上用素材          ４０．４ｋｇ
アスコルビン酸ナトリウム            １．２ｋｇ
エリスリトール                    ５２．０ｋｇ
アセスルファムＫ                    ０．１ｋｇ
アスパルテーム                      ０．１ｋｇ
クエン酸ナトリウム                  ０．８ｋｇ
クエン酸（結晶）                    ４．６ｋｇ
マスカットフレーバー                ０．８ｋｇ
合計１００．０ｋｇ
（参考例４）
下記配合成分のうちの精製水に他の配合成分を溶解させ、ｐＨ３．５、Ｂ’×９％に調製したのち、１１０℃で３０秒加熱殺菌処理を施し、１０℃に冷却してから紙パックに無菌充填して、清涼飲料水を調製した。
実施例１の骨靭性向上用素材          ２．５ｋｇ
ビタミンミックスＤ                  ０．１ｋｇ
エリスリトール                      ５．５ｋｇ
アセスルファムＫ                    ０．０１５ｋｇ
アスパルテーム                      ０．００５ｋｇ
クエン酸（結晶）                    ０．６ｋｇ
フルーツミックスフレーバー          ０．１６Ｌ
ライチフレーバー                    ０．０４Ｌ
精製水                      残量（合計が１００．０Ｌになるように設定）
合計１００．０Ｌ
（参考例５）
まず、下記配合成分のうちの精製水（Ｂ）に実施例２の骨靭性向上用素材および酸処理豚皮ゼラチンを浸漬して３０分間膨潤させたのち、８０℃の湯煎で加熱し、８０℃に到達してから３０分間保持することにより完全に溶解させ、ゼラチン溶液とした。次に、下記配合成分のうちの精製水（Ａ）にミルクオリゴ糖、粉末麦芽還元糖、エリスリトール、および難消化性デキストリンを溶解させ、煮詰めた後、アスパルテーム、前記ゼラチン溶液、予め精製水（Ａ）の一部に溶解させて溶液としたクエン酸（結晶）、ペパーミントフレーバー、ミントフレーバー、レモンフレーバー、およびベニバナ黄色素を添加し、Ｂ’×７９〜８１％に調製したのち、８０℃で３０分間保持することにより脱泡し、スターチモールドに充填して室温で２４時間乾燥させ、グミゼリーを調製した。
実施例２の骨靭性向上用素材          ５．０ｋｇ
ミルクオリゴ糖                    ４１．０ｋｇ
粉末麦芽還元糖                    ３１．０ｋｇ
エリスリトール                      ５．０ｋｇ
難消化性デキストリン                ５．０ｋｇ
アスパルテーム                      ０．０５ｋｇ
酸処理豚皮ゼラチン（２５０ブルーム）７．０ｋｇ
クエン酸（結晶）                    １．２ｋｇ
ペパーミントフレーバー              ０．６Ｌ
ミントフレーバー                    ０．２Ｌ
レモンフレーバー                    ０．７Ｌ
ベニバナ黄色素                      適量
精製水（Ａ）                      ２０．０ｋｇ
精製水（Ｂ）                      １８．０ｋｇ
合計１００．０Ｌ
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明にかかる骨靭性向上用素材は、骨疾患の予防・治療を目的とした予防・治療薬、機能性食品（サプリメント）、特定保健用食品、健康食品・飲料等の素材として好適に使用することができる。