(57)【要約】  【課題】  血液中に含まれる基質を定量するに際し、血液のＨｃｔによる測定誤差を減少させる為の測定方法を提供する。  【解決手段】  血液前処理のための電圧印加工程（Ｔ０−Ｔ１）、データ補正のための電圧印加工程（Ｔ２−Ｔ３）、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程（Ｔ４−Ｔ５）を包含し、前記補正のための電圧印加工程より得られたピーク電流値(ｉ２)と、前記一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程より得られたピーク電流値（ｉ４）との比に基づいてヘマトクリットに依存したパラメータを算出し、前記パラメータにより基質量を補正する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁基板上の少なくとも一部に形成された対電極、測定電極を含む電極部、当該電極部上または周辺に少なくとも酵素、電子伝達体を含む試薬層を有するバイオセンサと、当該電極部の各電極に電位を印加する為の接続端子及び駆動電源を有する測定装置を用い、当該駆動電源によって前記電極部に電位を印加させて出力される電流を検知し、血液中に含まれる基質を定量する測定方法であって、断続的な３回以上の電圧印加工程を包含することを特徴とする基質濃度の測定方法。
【請求項２】
前記断続的な電圧印加工程が、少なくとも血液前処理のための電圧印加工程、データ補正のための電圧印加工程、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程を包含することを特徴とする、請求項１記載の基質濃度の測定方法。
【請求項３】
前記電圧印加工程において、血液前処理のための電圧印加工程の後に、データ補正のための電圧印加工程が実施され、当該データ補正のための電圧印加工程の後に、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程が実施されることを特徴とする、請求項２記載の基質濃度の測定方法。
【請求項４】
前記データ補正のための電圧印加工程より得られたピーク電流値と、前記一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程より得られたピーク電流値との比に基づいてヘマトクリットに依存したパラメータを算出し、前記パラメータにより基質量を補正することを特徴とする請求項２〜３記載の基質濃度の測定方法。
【請求項５】
前記パラメータを判別係数とする判別関数を用いてヘマトクリットを補正することを特徴とする請求項４記載の基質濃度の測定方法。
【請求項６】
前記血液前処理のための電圧印加工程およびデータ補正のための電圧印加工程における印加電圧が、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程における印加電圧よりも大きいことを特徴とする請求項１〜５記載の基質濃度の測定方法。
【請求項７】
前記血液前処理のための電圧印加工程における電圧印加時間が０．２秒〜２秒であることを特徴とする請求項１〜６記載の基質濃度の測定方法。
【請求項８】
前記データ補正のための電圧印加工程直前の開回路時間が０．２秒〜１秒であることを特徴とする請求項１〜７記載の基質濃度の測定方法。
【請求項９】
前記データ補正のための電圧印加工程における電圧印加時間が０．２秒〜２秒であることを特徴とする請求項１〜８記載の基質濃度の測定方法。
【請求項１０】
前記一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程直前の開回路時間が１秒〜６秒であることを特徴とする請求項１〜９記載の基質濃度の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中に含まれる基質を定量するために、バイオセンサ及びこのバイオセンサが装着される測定装置を用いる測定方法に関するものであり、特に血液中のヘマトクリットによる測定誤差を減少させる為の新規な定量方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサとは、微生物、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生物材料の分子認識能を利用し、生物材料を分子識別素子として応用した、試料液中の基質含有量を定量するセンサである。即ち、生物材料が目的の基質を認識したときに起こる反応、例えば微生物の呼吸による酸素の消費、酵素反応、発光等、を利用して試料液中に含まれる基質を定量するのである。そして各種バイオセンサの中でも酵素センサの実用化は進んでおり、例えば、グルコース、乳酸、コレステロール、アミノ酸用のバイオセンサである酵素センサは医療計測や食品工業に利用されている。この酵素センサは、例えば検体である試料液に含まれる基質と酵素などとの反応により生成する電子によって電子伝達体を還元し、測定装置がその電子伝達体の還元量を電気化学的に計測することにより、検体の定量分析を行うようになっている。
【０００３】
このようなバイオセンサを用いた測定方法について様々な形態のものが提案されている。そこで従来の測定方法について説明する。（例えば特許文献１参照。）試料液中の基質含有量を定量するには、バイオセンサを測定装置に挿入後、後述するバイオセンサの電極に測定装置によって一定電圧が印加された状態で、試料液を試料点着部に供給する。点着された試料液がバイオセンサの内部に吸引されて試薬層の溶解が始まる。測定装置はバイオセンサの電極間に生じる電気的変化を検知して定量動作を開始するようになっている。
【０００４】
試料液供給検知後のプロファイルを図５に示す。本プロファイルには三つの連続期間からなり、例えば時刻ｔ０からｔ１の第１印加期間、時刻ｔ１からｔ２の待機時間、時刻ｔ２からｔ３の第２印加期間からなる。この第１印加期間を設けることでヘマトクリットによる測定誤差を抑制することができる。
【０００５】
また、誤差影響を補正して分析対象物の濃度を求めるバイオセンサの測定方法について説明する。（例えば特許文献２参照。）バイオセンサに定められた電圧を２回印加して電気化学反応を促進させ、その結果得られる電流値から下記パラメータＰ１及びＰ２を算出し、これらのパラメータから統計的手法により誤差を補正して分析対象物濃度を算出する。Ｐ１：１回目励起における電流の最大値または最大値以降の電流値（Ｉｆ）と２回目励起の任意の時点における電流値（Ｉｂ）の比（Ｉｆ／Ｉｂ）。Ｐ２：２回目励起の任意の時点における電流値（Ｉｂ）。
【特許文献１】特開２００３−１５６４６９号公報
【特許文献２】国際公開第９９／６０３９１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら従来の測定方法には、血液のヘマトクリットが測定感度に影響を及ぼすという問題があった。ヘマトクリットとは血液中に占める有形成分の体積比（％）である。一般的に貧血のない人では赤血球が４０〜５０％を占める。慢性腎不全になり腎性貧血になるとヘマトクリットは下がり１５％を下回る状態になる場合もあり、個人差、男女差も大きい。
【０００７】
一方、近年のバイオセンサに要求されるスペックとして測定時間の短縮化が望まれている。バイオセンサを用いて迅速に基質の測定を行う場合、試料の粘性がその測定精度に大きな影響を与える。特に、人体の血液を試料液とする場合、粘性の高い（Ｈｃｔが高い：以下、高Ｈｃｔ）血液の場合は応答レベルが相対的に低下し、粘性の低い（Ｈｃｔが低い：以下、低Ｈｃｔ）血液の場合は応答レベルが相対的に高くなり、この傾向は測定時間の短縮化が進むにつれ顕著になる場合がある。この現象は、試薬層の血液への溶解性、および溶存種の拡散速度がＨｃｔの影響を受けていることを示唆する。
【０００８】
図６は測定時間とヘマトクリットの関係を示す図である。これは、図５で示した特許文献１の測定手法に準じて測定を行った結果である。測定時間とは図５で示したｔ３であり、低Ｈｃｔおよび高Ｈｃｔの血液を用いて測定した時のｔ３における電流値をそれぞれプロットしたものである。図６から明らかなように、測定時間が短くなるとヘマトクリットの差異による電流値の差が大きくなることが分かる。とりわけ、測定時間が５秒程度の場合にはヘマトクリットの影響を大きく受ける。その為、特許文献１の測定法で時間短縮を行うことはヘマトクリットによる測定誤差が顕著となり、非常に困難であった。
【０００９】
特許文献２に示される従来の測定方法は、１回目励起における電流の最大値または最大値以降の電流値と、２回目励起の任意の時点における電流値の比を試料物性による影響をより大きく受けるパラメータとして使用している。１回目励起は溶解初期の段階であることから、試薬層の血液への溶解性および溶存種の拡散速度が律速になり、ヘマトクリットに依存した電流値が得られやすいが、血液の供給速度、手技の差によって電流値がばらつきやすい。さらに血液中に含まれる易酸化性物質が１回目励起の際に電流値として検出されやすく、血中易酸化性物質の個人差により１回目励起の電流値は誤差が生じやすい。また、１回目励起の電流の最大値または最大値以降の電流を補正に用いるためには、ある程度の印加時間が必要である。しかし初期段階（１回目励起）で長時間電位をかけると、還元性電子伝達体が過剰量酸化されるため、待機時間を長くして還元性電子伝達体を再び蓄積しなければ２回目励起期間で検知される応答値の基質依存性が悪くなる可能性がある。その為特許文献２の測定方法では、ばらつきを抑えた測定を行うこと、測定時間の短縮を行うことが非常に困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記従来の課題を解決するために、本発明の基質濃度の測定方法は、絶縁基板上の少なくとも一部に形成された対電極、測定電極を含む電極部、当該電極部上または周辺に少なくとも酵素、電子伝達体を含む試薬層を有するバイオセンサと、当該電極部の各電極に電位を印加する為の接続端子及び駆動電源を有する測定装置を用い、当該駆動電源によって前記電極部に電位を印加させて出力される電流を検知し、血液中に含まれる基質を定量する測定方法であって、断続的な３回以上の電圧印加工程を包含する。
【００１１】
また、前記断続的な電圧印加工程が、少なくとも血液前処理のための電圧印加工程、データ補正のための電圧印加工程、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程を包含してもよい。
【００１２】
また、前記電圧印加工程において、血液前処理のための電圧印加工程の後に、データ補正のための電圧印加工程が実施され、当該データ補正のための電圧印加工程の後に、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程が実施されてもよい。
【００１３】
また、前記データ補正のための電圧印加工程より得られたピーク電流値と、前記一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程より得られたピーク電流値との比に基づいてヘマトクリットに依存したパラメータを算出し、前記パラメータにより基質量を補正してもよい。
【００１４】
また前記パラメータを判別係数とする判別関数を用いてヘマトクリットを補正してもよい。
【００１５】
また、前記血液前処理のための電圧印加工程およびデータ補正のための電圧印加工程における印加電圧が、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程における印加電圧よりも大きいことを特徴とする測定方法としてもよい。
【００１６】
また、前記血液前処理のための電圧印加工程における電圧印加時間が０．２秒〜２秒であることを特徴とする測定方法としてもよい。
【００１７】
また、前記データ補正のための電圧印加工程直前の開回路時間が０．２秒〜１秒であることを特徴とする測定方法としてもよい。
【００１８】
また、前記データ補正のための電圧印加工程における電圧印加時間が０．２秒〜２秒であることを特徴とする測定方法としてもよい。
【００１９】
また、前記一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程直前の開回路時間が１秒〜６秒であることを特徴とする測定方法としてもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の基質濃度の測定方法によれば、絶縁基板上の少なくとも一部に形成された対電極、測定電極を含む電極部、当該電極部上または周辺に少なくとも酵素、電子伝達体を含む試薬層を有するバイオセンサと、当該電極部の各電極に電位を印加する為の接続端子及び駆動電源を有する測定装置を用い、当該駆動電源によって前記電極部に電位を印加させて出力される電流を検知し、血液中に含まれる基質を定量する測定方法であって、血液前処理のための電圧印加工程、データ補正のための電圧印加工程、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程を包含し、前記補正のための電圧印加工程より得られたピーク電流値と、前記一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程より得られたピーク電流値との比に基づいてヘマトクリットに依存したパラメータを算出し、前記パラメータにより基質量を補正することで、測定精度の良好な測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本発明の基質濃度の測定方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００２２】
（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施例における基質濃度の測定方法のプロファイル図を示す。
【００２３】
図１におけるプロファイルにおいて、血液が供給されたことを検知した時刻をT０とする。図１のプロファイルにおいては、５つの工程からなり、Ｔ０からＴ１を第１工程（血液前処理の為の電圧印加工程）、Ｔ１からＴ２を第２工程（開回路）、Ｔ２からＴ３を第３工程（データ補正のための電圧印加工程）、Ｔ３からＴ４を第４工程（開回路）、Ｔ４からＴ５を第５工程（一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程）とする。
【００２４】
血液前処理のための第１工程では、溶解初期の段階で酵素反応の結果生成した還元型電子伝達体が酸化されると同時に、血液中に含まれる易酸化性物質が最初の電圧印加工程である第１工程で酸化される。
【００２５】
次に第２工程を開回路にすることで、酵素反応により生成した還元型電子伝達体が蓄積されていく。
【００２６】
データ補正のための第３工程では、第２工程の開回路時間を十分に持たせずに印加を開始するので、特に高Ｈｃｔの血液になるほど、還元型電子伝達体を十分に蓄積できず、ピーク電流ｉ２はヘマトクリットの影響を大きく受けた値となる。
【００２７】
本発明においては、データ補正に使用する第３工程以外に血液前処理として第１工程を設けることで、血液の供給速度、手技の差によるばらつきや血中の還元性物質の影響を除去することができ、ヘマトクリットの影響のみを受けたパラメータが第３工程で得られる。更にこの第１工程の存在により、血中の易酸化性物質の影響を軽減させた最終応答値を得ることが同時に可能となる。
【００２８】
次に第４工程で再び開回路にし、再度、還元型電子伝達体を蓄積する。このとき、一定時間以上時間をとることで、高Ｈｃｔの血液においても十分量の還元型電子伝達体が蓄積される。
【００２９】
第５工程で電位Ｖ３を印加した際に得られるピーク電流ｉ４は、見かけ上ヘマトクリットの影響が小さい値となる。その後基質濃度との最も依存性が高い電流値を示すｉ５の電流値を測定する。このｉ５を最終応答値とする。そして、ヘマトクリットの最終応答値に与える影響を低減させるため、データ補正のための第３工程で求めたｉ２を利用して、ｉ４／ｉ２のパラメータを算出し、応答値ｉ５にこのパラメータを基に予め決めておいた補正を加える。
【００３０】
本測定方法では、データ補正のための電圧印加工程の前の開回路時間Ｔ１〜Ｔ２は使用する酵素の能力によって異なるが、０．２秒から１秒が好ましい。また、血液前処理のための電圧印加工程の時間Ｔ０〜Ｔ１及びデータ補正のための電圧印加工程の時間Ｔ２〜Ｔ３は使用する酵素の能力によって異なるが、０．２秒から２秒が好ましい。また、前記血液前処理のための電圧印加工程およびデータ補正のための電圧印加工程における印加電圧が、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程における印加電圧よりも大きいことが好ましい。さらに、電圧Ｖ２は０．１Ｖ〜０．８Ｖが好ましい。また一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程直前の開回路時間は１秒〜６秒であることが好ましい。
【００３１】
また、データ補正のための電圧印加を数回行い、数回のデータ補正のための電圧印加で得られた複数の電流値を補正に用いることでさらに精度が向上する。その際の電圧は違う電圧を印加してもよい。
【００３２】
また、前記データ補正の為の電圧印加工程、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程で得られた電流値を、上記特許文献２に示されたような方法で、判別係数とする判別関数を用いてヘマトクリットを補正してもよい。
【００３３】
データ補正のための電圧印加工程ではヘマトクリットの影響を大きく受けた値が得られればどのポイントの電流値を用いても可能であるが、誤差の少ない補正を行う為にはその影響が顕著に出やすいピーク電流を用いることが、好ましい。
【実施例１】
【００３４】
本発明のより具体的な実施の形態について図面とともに詳細に説明する。以下の構成からなるバイオセンサをセンサの一例として用いた。
【００３５】
図２（ａ）はバイオセンサの分解斜視図であり、図２（ｂ）はバイオセンサの上面から見た電極部の構成を示す図である。１９はポリエチレンテレフタレート等からなる絶縁性の基板（以下、「基板」とする。）であって、基板１９の表面にはパラジウムからなる導体層がスパッタリングによって形成されている。２６は中央部に空気孔２７が設けられた絶縁性の基板であって、切欠部２５を有するスペーサ２４を基板１９との間に挟みこんで基板１９と一体に配置される。
【００３６】
基板１９上には、複数のスリットによって導体層が分割されて対電極２１、測定電極２０および検知極２２が形成されている。
【００３７】
スペーサ２４は基板１９上の対電極２１、測定電極２０および検知電極２２を覆うように配置され、検体供給路２５ａが形成される。スペーサ２４の切欠部２５から露出している対電極２１、測定電極２０および検知電極２２上に、酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ、電子伝達体としてフェリシアン化カリウム等を含有する試薬を塗布し試薬層２３を形成させる。
【００３８】
この酵素と電子伝達体が含まれる試薬層が検体供給路に吸引された血液に溶解し、血液中の基質であるグルコースとの間で酵素反応が進行し電子伝達体が還元されて還元型電子伝達体が生成される。この還元型電子伝達体を電気化学的に酸化し、このとき得られる電流値から血液中のグルコース濃度が測定される。このような一連の反応は、対電極２１、測定電極２０及び検知電極２２によって電気化学的変化に伴う電流値を読み取る。
【００３９】
図３はＨｃｔが２５％（低Ｈｃｔ）、４５％、６５％（高Ｈｃｔ）の血液を用いて、本測定方法において算出したパラメータである。第１工程（血液前処理のための電圧印加）が０．５Ｖ印加で０．５秒、第２工程（開回路）が０．５秒、第３工程（データ補正のための印加）が０．５Ｖ印加で０．５秒、第４工程（開回路）が１．５秒、第５工程（一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加）が０．２Ｖ印加で２秒となっている。そして第３工程での電圧印加開始より０．１秒後の電流値ｉ２と第５工程での電圧印加開始より０．１秒後の電流値ｉ４を測定して算出したｉ４／ｉ２が図３のパラメータとなる。横軸が第５工程での電圧印加開始より２秒後の最終応答値ｉ５、縦軸がｉ４／ｉ２である。ヘマトクリット値を判別することの困難な点は、低Ｈｃｔの低基質濃度の血液と、高Ｈｃｔの高基質濃度の血液とｉ５において、同じ電流値が得られる場合があることである。図５のパラメータを用いることによって、ｉ５が同じ電流値を示す場合でもヘマトクリットごとに分別することができることが明らかである。
【００４０】
図３で得られたパラメータの各数値に対する補正値を下記のテーブル１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
このテーブルに従い、補正値を最終応答値ｉ５に掛ける。
【００４３】
図４は本発明の測定手法、従来の手法を用いて測定した際のヘマトクリットの影響を示す図である。従来の測定方法は、第１印加として０．５Ｖを６秒、待機時間を６秒、第２印加として０．２Ｖを３秒のトータル測定時間が１５秒の場合と、第１印加として０．５Ｖを２秒、待機時間を２秒、第２印加として０．２Ｖを１秒のトータル測定時間を５秒に短縮した場合を示す。従来の測定方法は１５秒から５秒に時間短縮を行うことによって、Ｈｃｔ２５％の低Ｈｃｔ血液は測定結果が基準のＨｃｔ４５％比べて相対的に高く、Ｈｃｔ６５％の高Ｈｃｔ血液は相対的に低くなる。
【００４４】
本測定方法を用いることによって、トータルの測定時間は等しいにも関わらず、ヘマトクリットのバラツキを低減することが可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明にかかるバイオセンサの測定方法は、絶縁基板上の少なくとも一部に形成された対電極、測定電極を含む電極部、当該電極部上または周辺に少なくとも酵素、電子伝達体を含む試薬層を有するバイオセンサと、当該電極部の各電極に電位を印加する為の接続端子及び駆動電源を有する測定装置を用い、当該駆動電源によって前記電極部に電位を印加させて出力される電流を検知し、血液中に含まれる基質を定量する測定方法であって、血液前処理のための電圧印加工程、データ補正のための電圧印加工程、一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程を包含し、前記補正のための電圧印加工程より得られたピーク電流値と、前記一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程より得られたピーク電流値との比に基づいてヘマトクリットに依存したパラメータを算出し、前記パラメータにより基質量を補正することで、血液中に含まれる基質濃度を定量するバイオセンサの測定精度の良好な測定方法等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の測定方法のプロファイルを示す図
【図２】本発明に関わるバイオセンサの分解斜視図
【図３】本発明の測定方法をより算出されたパラメータと測定感度の関係を示す図
【図４】本発明の測定方法、従来の手法を用いて測定した場合のＨｃｔの影響を示す図
【図５】従来の測定方法のプロファイルを示す図
【図６】Ｈｃｔ、測定時間および測定感度の関係を示す図
【符号の説明】
【００４７】
１  ｔ０  従来の測定方法における血液が供給された時間
２  ｔ１  従来の測定方法における第１印加期間が終了し開回路が開始される時間
３  ｔ２  従来の測定方法における第２印加期間が開始される時間
４  ｔ３  従来の測定方法における最終応答値として電流値を読み取る時間
５  ｖ１  従来の測定方法における第１印加期間の電圧
６  ｖ２  従来の測定方法における第２印加期間の電圧
７  Ｔ０  本発明の測定方法における血液が供給された時間
８  Ｔ１  本発明の測定方法における血液前処理のための電圧印加工程が終了する
時間
９  Ｔ２  本発明の測定方法におけるデータ補正のための電圧印加工程が開始する
時間
１０  Ｔ３  本発明の測定方法におけるデータ補正のための電圧印加工程が終了する
時間
１１  Ｔ４  本発明の測定方法における一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体を酸化するための電圧印加工程が開始する時間
１２  Ｔ５  本発明の測定方法における最終応答値として電流値を読み取る時間
１３  Ｖ１  本発明の測定方法における血液前処理のための印加電圧
１４  Ｖ２  本発明の測定方法におけるデータ補正のための印加電圧
１５  Ｖ３  本発明の測定方法における一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体
を酸化するための印加電圧
１６  ｉ２  本発明の測定方法における血液前処理のための電圧印加工程で得られる
ピーク電流
１７  ｉ４  本発明の測定方法における一定時間経過後に生成した還元型電子伝達体
を酸化するための電圧印加工程で得られるピーク電流
１８  ｉ５  本発明の測定方法における最終応答値
１９    絶縁性の基板
２０    測定電極
２１    対極
２２    検知電極
２３    試薬層
２４    スペーサ
２５    切欠部
２５ａ  検体供給路
２６    絶縁性の基板
２７    空気孔
【図１】
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【図２】
2005147990.tif 000005
【図３】
2005147990.tif 000006
【図４】
2005147990.tif 000007
【図５】
2005147990.tif 000008
【図６】
2005147990.tif 000009