(57)【要約】      （修正有）【課題】アレイ法において核酸解析を高精度に円滑に進めるために、高純度で迅速、簡便、かつ自動化できる抽出方法を提供する。【解決手段】核酸を含む試料溶液を圧力差により溶液が通過可能な、核酸吸着性固相を収容した核酸分離精製カ−トリッジの一の開口に注入し、核酸分離精製カ−トリッジト内を加圧状態で注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程、当該カ−トリッジに洗浄液を注入し、加圧状態で当該多孔膜を通過させることによって、核酸が吸着した状態で洗浄する工程、ついで回収液を注入して当該多孔膜を通過させ他の開口より排出することによって当該多孔膜内から核酸を脱着させ核酸分離精製カ−トリッジ容器外に排出する工程、を含む分離精製方法によって分離精製した核酸を、アレイ法で解析することを特徴とする解析方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、圧力差により溶液が通過可能な、核酸吸着性固相を収容した核酸分離精製カ−トリッジの一の開口に注入する工程、  (b)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程、  (c)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程  (d)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程  (f)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カ−トリッジ容器外に排出する工程、を含む分離精製方法によって分離精製した核酸をアレイ法で解析することを特徴とする解析方法。
【請求項２】
分離精製した核酸を核酸標識体とし、この核酸標識体を請求項１の核酸分離精製法で精製した後、アレイ法で解析することを特徴とする、請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
核酸がＤＮＡであり、ＰＣＲ法、ランダムプライム法を用いて標識したＤＮＡをアレイ法で解析することを特徴とする、請求項１に記載の解析方法。
【請求項４】
ＰＣＲ法、ランダムプライム法を用いて標識したＤＮＡを請求項１の核酸分離方法で精製したＤＮＡをアレイ法で解析することを特徴とする、請求項３に記載の解析方法。
【請求項５】
核酸がＤＮＡであり、ＰＣＲ法、ランダムプライム法を用いてＤＮＡを合成し、次いでインビトロトランスレーションにより標識したＲＮＡを合成し、該ＲＮＡをアレイ法で解析することを特徴とする、請求項１に記載の解析方法。
【請求項６】
ＰＣＲ法、ランダムプライム法を用いて合成したＤＮＡを請求項１の核酸分離方法で精製するか、及び／又はインビトロトランスレーションにより標識したＲＮＡを請求項１の核酸分離方法で精製することを特徴とする、請求項５に記載の解析方法。
【請求項７】
解析が、核酸配列の読み取り、又は一塩基多型の解析であることを特徴とする、請求項１から６の何れかに記載の解析方法。
【請求項８】
核酸がＲＮＡであり、逆転写反応法あるいは逆転写反応とＰＣＲ法を用いて標識したＤＮＡをアレイ法で解析することを特徴とする、請求項１に記載の解析方法。
【請求項９】
核酸がＲＮＡであり、逆転写反応法あるいは逆転写反応とＰＣＲ法を用いて標識したＤＮＡを請求項１の核酸分離方法で精製したＤＮＡをアレイ法で解析することを特徴とする、請求項１に記載の解析方法。
【請求項１０】
核酸がＲＮＡであり、逆転写反応法あるいは逆転写反応とＰＣＲ法を用いてＤＮＡを作成し、インビトロトランスレーションで標識したＲＮＡをアレイ法で解析することを特徴とする、請求項１に記載の解析方法。
【請求項１１】
逆転写反応法あるいは逆転写反応とＰＣＲ法を用いて作成したＤＮＡを請求項１の核酸分離方法で精製するか、及び／又は、インビトロトランスレーションで標識したＲＮＡを請求項１の核酸分離方法で精製することを特徴とする、請求項１０に記載の解析方法。
【請求項１２】
解析が遺伝子発現解析であることを特徴とする、請求項８から１１の何れかに記載の解析方法。
【請求項１３】
核酸吸着性固相が、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着することのできる有機高分子である、請求項１から１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
核酸吸着性固相が、水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜である、請求項１から１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜が、アセチルセロ−スの多孔膜を鹸化処理した多孔膜である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜がトリアセチルセロ−スの多孔膜を鹸化処理した多孔膜である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
多孔膜が平均孔径０．１〜１０．０μｍの多孔膜である、請求項１４から１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
多孔膜が厚さ５０〜５００μｍの多孔膜である、請求項１４から１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
核酸を含む試料溶液が、核酸の水溶液または核酸のバッファ溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
核酸を含む試料溶液が、細胞又はウイルスを含む検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールである、請求項１９又は２０に記載の方法
【請求項２２】
核酸可溶化試薬が、グアニジン塩、および界面活性剤を含む溶液である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
洗浄液が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０〜１００重量％含む溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
回収液が、塩濃度が０．５Ｍ以下の溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
圧力発生装置が、核酸分離精製カ−トリッジの一の開口に着脱可能に結合されるポンプである請求項１に記載の核酸分離精製方法。
【請求項２６】
請求項１〜１２に記載の、核酸分離精製工程に続いてアレイ法による核酸の検出を行うための装置。
【請求項２７】
請求項１〜１２に記載の、核酸分離精製工程に続いてアレイ法による核酸の検出を行うための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、簡便に核酸を分離精製してアレイ法に用いることに関する。より詳細には、本発明は、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性固相を収容した核酸分離精製カ−トリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸の分離精製を行い、アレイ法に用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を含有する試料から核酸を得る方法としては、フェノール・クロロホルム法が古くから利用されている。この方法はフェノール・クロロホルムを用いてタンパク質、脂質等の水難溶性検体成分を変性、溶解、または沈澱させ、核酸を水相に溶解する溶解度の違いを利用する。しかしながらこの方法は、有毒な有機溶媒を使用すること、煩雑な操作を必要とするため抽出される核酸の精製度が実験者の腕に委ねられること等の問題を有している。
【０００３】
また、広く知られた精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって精製する方法がある（例えば、特公平７−５１０６５号公報）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、種々の形状に加工しがたい、また吸着液に腐食性のカオトロピックイオンをしばしば用いるために取扱いが不便等の問題点がある。
【０００４】
そこで、核酸抽出および精製に関しては、高純度核酸を迅速、簡便、かつ自動化できる方法で核酸を含む試料から単離できる手段が望まれている。
【０００５】
また、このような抽出精製された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応や制限酵素で消化するといった酵素反応や、サザンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションといった核酸解析に用いられる。そのなかでも、近年、一度に大量に遺伝子情報を得ることが出来るＤＮＡマイクロアレイ法に代表されるアレイ法が注目されている。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイ法の開発は、１９８０年代後半のヒトゲノム計画の開始とともに、大量の塩基配列の高速解析が要求されるようになったことに端を発する。新しい原理に基づいたシークエンス法の１つとして、Ｄｒｍａｎａｃらによって、ＤＮＡがマトリックス状に並べられた基板上で、複数のハイブリダイゼーション反応を並行して行い、それによって得られるハイブリダイゼーションシグナルを解析することで、ＤＮＡ塩基配列を知るというＳＢＨ法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：米国特許第５２０２２３１号）が提唱され、これがＤＮＡマイクロアレイ開発の契機となった。
【０００７】
その後、Ｓｏｕｔｈｅｒｎらにより、基板上にオリゴヌクレオチドを直接合成し、これを遺伝子の機能解析に用いることが可能であることが示された（米国特許第５７００６３７号）。さらに、ＳＢＨ法を発展させ、高密度オリゴヌクレオチドアレイＤＮＡの作成方法がＦｏｄｅｒらにより開発された。これは、光照射で選択的に除去される保護基を使用し、半導体製造に用いられるフォトリソグラフィ技術と固相合成技術を利用して、固相担体上の多数の微小なマトリックスで、組合せ反応（コンビナトリアル・シンセシス）により、多種類のオリゴヌクレオチドを同時に合成する方法である（Fodor, S.P.A. et al, Science, 251, 767-773(1991)）。
【０００８】
この方法は、現在では、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調べることが可能である「ＧｅｎｅＣｈｉｐ」として、市販されている。
【０００９】
その他のＤＮＡマイクロアレイを作製する方法として、「スタンフォード方式」として知られる予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に固定する方法などがある。この方法は、予め調製したＤＮＡ断片試料などのプローブ材料を固相担体表面に点着させることにより共有結合あるいはイオン結合を利用して結合固定する方法であり、プローブ材料の種類や固相担体の種類に応じて下記のように分類することができる。
【００１０】
（１）固相担体に固定するプローブ分子がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）あるいはＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）などのＤＮＡ断片試料である場合には一般に、これらをＤＮＡマイクロアレイ作製装置に備えられたスポット装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し、ＤＮＡ断片試料の荷電を利用して固相担体に静電結合させて固定する（Schena, M. et al, Science, 270, 467-470(1995)）。
【００１１】
（２）固定するプローブ材料が合成物（オリゴヌクレオチド）の場合には、予め反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、これらを表面処理した固相担体表面にスポット装置を用いて点着し、共有結合を介して固定させる（「蛋白質・核酸・酵素」、43、2004-2011(1998); Lamture, J.B. et al., Nucl. Acids Res., 22, 2121-2125(1994); 及び Guo, Z. et al., Nucl. Acids Res., 22,5456-5465(1994)）。オリゴヌクレオチドに導入する反応活性基としては、アミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどが用いられる。固相担体の表面処理には、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種のシランカップリング剤が用いられる。この共有結合による場合には、（１）の静電結合による場合に比べて、プローブを固相担体表面に安定に固定することができる。
【００１２】
ＤＮＡ等の核酸の検出に際しては、まず固相担体表面に高密度に整列したＤＮＡ断片などのプローブに対して、ラジオアイソトープ（ＲＩ）や蛍光で標識した核酸断片試料（ターゲット核酸資料）をハイブリダイズさせる。このとき、ターゲット核酸中の、プローブと相補的な塩基配列をもつ分子は、プローブと相補的に結合（ハイブリダイズ）する。次いで、このハイブリダイズしている標識したターゲット分子のシグナルを測定し、ハイブリダイズされたプローブ分子を同定する。具体的には、ＲＩや蛍光イメージスキャナーでマイクロアレイ上の放射線強度または蛍光強度を測定し、そして得られた画像データを解析処理する。従って、ＤＮＡマイクロアレイによれば、数千乃至数万個の分子を同時にハイブリダイズさせて検出することができ、微量の試料で短時間のうちに大量の遺伝子情報を得ることができる。
【００１３】
試料としては、遺伝子発現解析の場合、Ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡあるいはＴｏｔａｌＲＮＡのいずれかが、遺伝子多型解析等の場合、ゲノム核酸が使用される。しかしながら、試料が少量であるほど蛍光強度が減弱しデータの信頼度が低下する。そのため、「ＧｅｎｅＣｈｉｐ」等においては、ＲＮＡ等の発現頻度分布を変えることなく、試料を増幅する手法がしばしば用いられる。これは、試料ＲＮＡ（もしくはゲノムＤＮＡ）から、Ｔ７プロモーター等のプロモーター配列を有するオリゴを用いてｃＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼにより、ｃＲＮＡを合成する方法である。ＲＮＡを合成する過程で試料核酸は約１００倍に増幅される。さらに、「ＧｅｎｅＣｈｉｐ」の場合、ｃＲＮＡの立体構造を破壊するため、断片化が行われる。蛍光検出に関しては、ＲＮＡの合成過程でビオチン標識ｄＮＴＰ体が取りこまれ、これに対してアビジン-フィコエリスリンが結合し、蛍光検出される。
【００１４】
このようなＲＮＡをＤＮＡに変換し、さらにＲＮＡに増幅するような実験系においては、その過程の間にしばしば試料を精製する工程が含まれる。アレイの実験においては、精度の高いデータを得るために、サンプルは高度に精製されていることが必須である。精製過程におけるメカニズムは抽出工程と同じであるため、前述したのと抽出時と同様の課題（高純度核酸を迅速、簡便、かつ自動化できる方法）を有している。
【特許文献１】特公平７−５１０６５号公報
【特許文献２】米国特許第５２０２２３１号公報
【特許文献３】米国特許第５７００６３７号
【非特許文献１】Fodor, S.P.A. et al, Science, 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Schena, M. et al, Science, 270, 467-470(1995)
【非特許文献３】「蛋白質・核酸・酵素」、43、2004-2011(1998)
【非特許文献４】Lamture, J.B. et al., Nucl. Acids Res., 22, 2121-2125(1994)
【非特許文献５】Guo, Z. et al., Nucl. Acids Res., 22, 5456-5465(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、アレイ法において核酸解析を高精度に円滑に進めるために、高純度で、迅速、簡便、かつ自動化できる抽出方法を提供することにある。同時に、アレイ法に用いるサンプルを調製する時に、高純度で、迅速、簡便、かつ自動化できる方法で核酸を精製することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔膜に吸着及び脱着させる過程を含む核酸の分離精製方法において、所定の条件で、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カ−トリッジを使用することによって、迅速、簡便に核酸を含む検体から核酸を分離することができることを見出した。また、この方法が、アレイ法のサンプルの調製時における精製にも利用できることを併せて見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１７】
即ち、本発明によれば、従来法にはない迅速さと簡便さを併せ持つ、核酸の分離精製方法が提供され、アレイ法等の解析に利用される。
【００１８】
本発明によれば、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、圧力差により溶液が通過可能な、核酸吸着性固相を収容した核酸分離精製カ−トリッジの一の開口に注入する工程、  (b)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程、  (c)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程  (d)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程  (f)核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カ−トリッジ容器外に排出する工程、を含む分離精製方法によって分離精製した核酸をアレイ法で解析することを特徴とする解析方法が提供される。
【００１９】
好ましくは、分離精製した核酸を核酸標識体とし、この核酸標識体を上記の核酸分離精製法で精製した後、アレイ法で解析する。好ましくは、核酸はＤＮＡであり、ＰＣＲ法、ランダムプライム法を用いて標識したＤＮＡをアレイ法で解析する。好ましくは、ＰＣＲ法、ランダムプライム法を用いて標識したＤＮＡを上記の核酸分離方法で精製したＤＮＡをアレイ法で解析する。好ましくは、核酸はＤＮＡであり、ＰＣＲ法、ランダムプライム法を用いてＤＮＡを合成し、次いでインビトロトランスレーションにより標識したＲＮＡを合成し、該ＲＮＡをアレイ法で解析する。好ましくは、ＰＣＲ法、ランダムプライム法を用いて合成したＤＮＡを上記の核酸分離方法で精製するか、及び／又はインビトロトランスレーションにより標識したＲＮＡを上記の核酸分離方法で精製する。好ましくは、解析は、核酸配列の読み取り、又は一塩基多型の解析である。
【００２０】
好ましくは、核酸はＲＮＡであり、逆転写反応法あるいは逆転写反応とＰＣＲ法を用いて標識したＤＮＡをアレイ法で解析する。好ましくは、核酸はＲＮＡであり、逆転写反応法あるいは逆転写反応とＰＣＲ法を用いて標識したＤＮＡを上記の核酸分離方法で精製したＤＮＡをアレイ法で解析する。好ましくは、核酸はＲＮＡであり、逆転写反応法あるいは逆転写反応とＰＣＲ法を用いてＤＮＡを作成し、インビトロトランスレーションで標識したＲＮＡをアレイ法で解析する。好ましくは、逆転写反応法あるいは逆転写反応とＰＣＲ法を用いて作成したＤＮＡを上記の核酸分離方法で精製するか、及び／又は、インビトロトランスレーションで標識したＲＮＡを上記の核酸分離方法で精製する。好ましくは、解析は遺伝子発現解析である。
【００２１】
好ましくは、核酸吸着性固相は、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着することのできる有機高分子である。好ましくは、核酸吸着性固相は、水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜である。好ましくは、水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜は、アセチルセロ−スの多孔膜を鹸化処理した多孔膜である。好ましくは、水酸基を有する有機高分子からなる多孔膜はトリアセチルセロ−スの多孔膜を鹸化処理した多孔膜である。好ましくは、多孔膜は平均孔径０．１〜１０．０μｍの多孔膜である。好ましくは、多孔膜は厚さ５０〜５００μｍの多孔膜である。
【００２２】
好ましくは、核酸を含む試料溶液は、核酸の水溶液または核酸のバッファ溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である。好ましくは、核酸を含む試料溶液は、細胞又はウイルスを含む検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である。好ましくは、水溶性有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールである。好ましくは、核酸可溶化試薬は、グアニジン塩、および界面活性剤を含む溶液である。好ましくは、洗浄液は、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０〜１００重量％含む溶液である。好ましくは、回収液は、塩濃度が０．５Ｍ以下の溶液である。好ましくは、圧力発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されるポンプである。
【００２３】
本発明の別の側面によれば、上記した核酸分離精製工程に続いてアレイ法による核酸の検出を行うための装置が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の核酸分離精製工程に続いてアレイ法による核酸の検出を行うための試薬キットが提供される。
【発明の効果】
【００２４】
マイクロアレイ法に用いられるサンプルの調製において、煩雑で時間がかかっていたことが、本発明の核酸の分離精製方法により、分離性能良く、簡便で、迅速に、自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を分離精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２６】
本発明における核酸の分離精製方法は、核酸を含む検体から核酸を分離精製する方法に関するものであり、核酸吸着性多孔膜に核酸を吸着及び脱着させる工程を含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明において「核酸」は一本鎖、二本鎖のいずれでもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。
【００２８】
核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取り扱い上の観点からは、核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。
【００２９】
少なくとも２個の開口を有する核酸分離精製カ−トリッジに、核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カ−トリッジと、核酸分離精製カ−トリッジの少なくとも２つの開口の間に圧力差を発生させる装置を用いて、核酸の吸着及び脱着を行う場合、核酸の分離精製方法について以下に具体的に説明する。本発明では、好ましくは、核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜中を通過させることにより試料溶液中の核酸を多孔膜に吸着させ、次いで、多孔膜に吸着させた核酸を、好適な溶液を用いて膜から脱着させる。
【００３０】
本発明において使用できる核酸を含む試料溶液に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。
【００３１】
最初にこれらの検体を、細胞膜を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散する。
【００３２】
細胞膜の溶解および核酸の可溶化のためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、（１）赤血球の除去、（２）各種タンパク質の除去、及び（３）白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。（１）赤血球の除去および（２）各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔膜の目詰まりを防ぐために、（３）白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、（３）白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程で核酸を可溶化することが必要である。
【００３３】
本発明で用いる核酸可溶化試薬としては、グアニジン塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。
グアニジン塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のグアニジン塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン）を使用することもできる。グアニジン塩の溶液中の濃度は、０.５Ｍ以上６Ｍ以下  好ましくは  １Ｍ以上５Ｍ以下である。
【００３４】
界面活性剤としてはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を使用することができるが、この他にも、ＳＤＳ、コール酸ナトリウム又はサルコシンナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０又はメガファック等のノニオン性界面活性剤、その他各種両性界面活性剤を使用することもできる。本発明では、ポリオキシエチレンオキチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）等のノニオン性界面活性剤を使用することが好ましい。界面活性剤の溶液中の濃度は、通常０．０５重量％〜１０重量％  特に好ましくは０．１重量％〜５重量％である。
【００３５】
核酸可溶化試薬にタンパク質分解酵素を用いる場合は、プロテアーゼＫを使用することはできるが、他のプロテアーゼでも同様の効果を得ることができる。プロテアーゼは酵素であるため加温するのが好ましく、３７℃〜７０℃で使用することが好ましく、特に５０℃〜６５℃で使用することが好ましい。
【００３６】
このように核酸が分散した水溶液中に、水溶性有機溶媒を添加して、核酸吸着性多孔膜内を一方の面から他方の面へと通過させる。この操作により、試料溶液中の核酸が核酸吸着性多孔膜に吸着される。本明細書中上記した操作で可溶化された核酸を、核酸吸着性多孔膜に吸着させるためには、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することが必要である。
【００３７】
ここで用いる水溶性有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール又はプロパノールなどが挙げられ、中でもエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度は、好ましくは５重量％〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０重量％〜６０重量％である。エタノールの添加濃度は、擬集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。
【００３８】
得られた核酸混合液中に存在する塩としては、各種カオトロピック物質（グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム）や塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム等が好ましい。特にグアニジウム塩は、細胞膜の溶解および核酸の可溶化の効果を併有するので特に好ましい。
【００３９】
次いで、この核酸が吸着した核酸吸着性多孔膜内に洗浄液を通過させる。この溶液は核酸と一緒に核酸吸着性多孔膜に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する。従って、核酸吸着性多孔膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成を有する必要がある。洗浄液は主剤と緩衝剤からなる。主剤としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の約１０〜１００重量％（好ましくは約２０〜１００重量％、さらに好ましくは約４０〜８０重量％）の水溶液である。
【００４０】
次に、回収液を、上記洗浄後の核酸吸着性多孔膜内を通過させる。核酸吸着性多孔膜を通過した、この溶液には目的とする核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供する。核酸を脱着せしめうる溶液としては、塩濃度が低いことが好ましく、特に好ましくは０．５Ｍ以下の塩濃度の溶液を使用する。この溶液としては、精製蒸留水、ＴＥバッファ等が使用できる。
【００４１】
本発明で使用する核酸分離精製カ−トリッジは、少なくとも２個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を有する膜を収容した核酸分離精製カ−トリッジである。
【００４２】
容器の材料に特別な限定はなく、核酸吸着性多孔膜が収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができればよいが、製造の容易性からプラスチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは不透明の樹脂を用いるのが好ましい。
【００４３】
上記カ−トリッジに収容される核酸吸着性多孔膜の形状にも特別な限定は無く、円形、正方形、長方形、楕円等、任意の形状で良いが、製造適性の点からは、円が好ましい。
【００４４】
圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合されている。
【００４５】
本発明で用いられるアレイ法について詳細に説明する。本発明で用いられるアレイは、通常、マイクロアレイと称されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の「ＧｅｎｅＣｈｉｐ」はもちろんのこと、Ａｇｉｌｅｎｔ社、ＴａＫａＲａ社、日立ソフト社等の市販のマイクロアレイも用いる事が出来る。また、松浪ガラス社、旭テクノグラス社等で市販されているスライドガラスを購入し、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ社等から市販されているスポッターを用いて、自ら作成してもよい。また、マクロアレイと呼ばれる多孔膜にＤＮＡがスポットされているものを用いることも可能である。これらは、例えば、ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社等より購入することが出来る。
【００４６】
アレイ法におけるサンプル調製時に用いられる手法としては、試料がＲＮＡの場合、ＲＮＡから逆転写反応（ＲＴ反応）によりｃＤＮＡを合成する方法はもちろんのこと、さらにサンプルを増幅するために、あらかじめＴ７等のプロモーター配列を有するプライマーで逆転写反応を行ってｃＤＮＡを合成しておき、  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法を用いてｃＲＮＡを合成する方法を用いることも出来る。この時、Ｔ７プロモーター以外にもＴ３やＳＰ６プロモーターを利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法を行うことももちろん可能である。
【００４７】
また、試料がＤＮＡの場合は、ＰＣＲ法を用いて、ゲノムＤＮＡの特定領域を増幅することが出来る。これ以外にも、ランダムプライマーを用いて不特定領域を増幅する方法等を用いることが出来る。
【００４８】
試料がＲＮＡ、ＤＮＡに関わらず、上記のどのサンプル調製法を行ったとしても、本発明における核酸の分離精製方法は好ましく用いることができる。
【００４９】
アレイ法においては、蛍光色素等の被検出体をサンプル核酸に標識している。この標識方法としては、あらかじめ被検出体が標識されたプライマーを用いて前記のＰＣＲ反応やＲＴ反応を行わせたり、標識されたｄＮＴＰ体をＰＣＲ反応やＲＴ反応時に取り込ませる方法等用いる事が出来る。
【００５０】
これらの被検出体を標識する場合、反応後に未反応の被検出体を除去することが必要となるが、この除去にも本発明の核酸分離方法を用いる事ができる。
【００５１】
標識法としては、上記以外にも、例えばビオチン標識されたｄＮＴＰ体やプライマーを用いて、ＰＣＲ反応やＲＴ反応を行わせて、ハイブリ反応後にアビジン標識された検出体を結合させる方法も知られている。
【実施例】
【００５２】
実施例１  核酸吸着性多孔膜を用いたＲＮＡ抽出
（１）核酸精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸精製カートリッジをハイインパクトポリスチレンで作成する。核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロ−スの多孔膜を使用し、上記（１）で作成した核酸精製カートリッジの核酸吸着性多孔膜収納部に収容する。
【００５３】
（２）核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液の調製
表１に示す処方の核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製する。
【００５４】
（表１）
（核酸可溶化試薬溶液）                                    
塩酸グアニジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）      １２．１ｇ
Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００（ＩＣＮ社製）           １０ｇ
蒸留水                                １０００ｍｌ      
（洗浄液）                                                
１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ    ６５％エタノール        
【００５５】
（３）核酸精製操作
急性骨髄性白血病患者由来の細胞（ＨＬ６０）培養液を用意する。この培養液２００μｌに核酸可溶化試薬溶液２００μlを添加して６０℃で１０分間インキュベートする。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え、攪拌する。攪拌後、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に回収液を注入し、核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収する。核酸を含む試料溶液をカートリッジに注入してから回収するまでの操作時間は、約２分である。
【００５６】
実施例２  GeneChipによる遺伝子発現解析
（１）DNAチップ用のcDNA合成
実施例1により抽出してきた全RNA 2〜5μgから、T7-(dT)24 (Amersham Pharmacia Biotech)をプライマーとして、Affymetrix社のExpression Analysis Technical  Manualの方法に従いSuperscript II  Reverse  Transcriptase (Invitrogen社)を用いて逆転写し１本鎖 cDNAを作製する。T7-(dT)24プライマーは、以下のようにT7プロモーターの塩基配列にd(T)24を付加した塩基配列からなる。
T7-(dT)24プライマー： 5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(dT)24-3'（配列番号：１）
【００５７】
次に、Expression Analysis Technical Manualに従い、DNA Ligase、 DNA polymerase I、およびRNase Hを加え、2本鎖cDNAを合成する。cDNAを実施例1記載の核酸吸着多孔質膜を用いる方法で精製する。（約２分）  さらに、BioArray High Yield RNA Transcription Labeling Kitを用い、ビオチンラベルしたcRNAを合成する。再び実施例1記載の方法を用いてcRNAを精製し（約2分）、熱処理により断片化する。そのうち12.5 μgのcRNAをExpression Analysis Technical Manualに従いHybridization Cocktailに加える。これをアレイに入れ、45℃で16時間ハイブリダイゼーションする。DNAチップとしてはGeneChipR HumanGenome-U133（Affymetrix社製）を用いる。DNAチップを洗浄した後、Streptavidin Phycoerythrinを加え染色した洗浄後、スキャナーにセットし、DNAチップ解析ソフトにて解析する。
【００５８】
（２）DNAチップ解析
DNAチップ解析ソフトであるArray  Gauge（富士写真フイルム社製）を用いて発現蛍光感度を測定し、データ解析を行う。まず全てのチップについてAbsolute analysisを行い、用いたサンプル各々の遺伝子発現量を測定する。1個のチップデータの解析は、プローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、positiveとnegativeを決定する。β-ＡｃｔｉｎとＧＡＰＤＨの２遺伝子の蛍光強度を測定した結果、ともにｐｏｓｉｔｉｖｅの結果である。
【００５９】
比較例１  ｋｉｔによるＲＮＡ抽出
全RNA抽出は、RNA抽出キットISOGEN (ニッポンジーン社)を用いてその説明書に従って行う。急性骨髄性白血病患者由来の細胞（ＨＬ６０）培養液を用意する。培養後の細胞を3 mLのIsogen (4M guanidium thiocyanate, 25mMsodium cianate, 0.5% Sarcosyl, 0.1M β-メルカプトエタノール,pH7.0)に溶解させる。室温で５分間静置させ、CHCl3 を0.6 mL（Isogenの1/5量）加えて、ミキサーで15秒間混合させた後、再び室温で2〜3分間静置させる。4℃で15,000 rpm、15分間遠心を行う。上清を新しいチューブに移し、Ethachinmate (ニッポンジーン)3μL、イソプロパノール1.5 mL（Isogenの1/2量）を加え、転倒混和して室温に10分間静置させる。4℃で15,000rpm、15分間遠心を行い、沈殿物に75% エタノール3 mL（Isogenの等量）を加え、15,000 rpm、4℃で5分間遠心する。沈殿物を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させる。RNase-free DWを10μL加えてRNA溶液とする。この間の操作時間は、約１．５時間である。
【００６０】
比較例２  GeneChipによる遺伝子発現解析
比較例1より抽出してきたTotalRNAを用いて、実施例２と同じくＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて遺伝子発現解析を行う。このとき、比較のため２本鎖ｃＤＮＡの精製には、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社：約１５分）、ｃＲＮＡの精製には、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社：約１５分）を用いる。実施例２と同様のプローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、positiveとnegativeを決定する。β-ＡｃｔｉｎとＧＡＰＤＨの２遺伝子の蛍光強度を測定した結果、ともにｐｏｓｉｔｉｖｅの結果である。
【００６１】
実施例と比較例から明らかなように、本発明用の方法を用いることにより、核酸抽出段階において、約１．５時間、アレイ解析において約２０分、測定時間を短縮できる。これより、本発明の方法を用いることにより、ＲＮＡ試料を迅速に、かつ簡便に回収及び精製でき、また、マイクロアレイ解析時間も短縮できることが分かる。
【００６２】
実施例３  核酸吸着性多孔膜を用いたゲノムＤＮＡ抽出
（１）核酸精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸精製カートリッジをハイインパクトポリスチレンで作成する。核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロ−スの多孔膜を鹸化処理した多孔膜を使用し、上記（１）で作成した核酸精製カートリッジの核酸吸着性多孔膜収納部に収容する。
【００６３】
（２）核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液の調製
表２に示す処方の核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製する。
【００６４】
（表２）
（核酸可溶化試薬溶液）                                  
塩酸グアニジン（インビトロジェン社製）      ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（インビトロジェン社製）          １２．１ｇ
Triton-X100（ＩＣＮ製）                       １０ｇ
蒸留水                                    １０００ｍｌ  
（洗浄液）                                              
１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ    ６５％エタノール        
【００６５】
（３）核酸精製操作
ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型それぞれのヒト全血試料を準備する。この全血試料２００μｌに核酸可溶化試薬溶液２００μlとプロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）溶液２０μｌを添加して６０℃で１０分間インキュベートする。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え、攪拌する。攪拌後、上記（１）及び（２）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カ−トリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に回収液を注入し、核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収する。核酸を含む試料溶液をカートリッジに注入してから回収するまでの操作時間は、約２分である。
【００６６】
実施例４  マイクロアレイ法を用いたＳＮＰ検出
（１）ＤＮＡチップの作製
２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化合物被覆スライドを作成した。次いで、このシラン化合物被覆スライドを、５重量％１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下にて乾燥し、ビニルスルホニル基が導入されたスライドを得る。
ＡＬＤＨ２をコードする遺伝子のＳＮＰ（Ｇｌｕ４８７Ｌｙｓ）を中央に含む以下に示す配列を有する５'末端にアミノ基が結合した２種類のオリゴＤＮＡ断片（Sigmagenosys社製）を滅菌水に分散する。
【００６７】
正常型）5'(NH2)-caggcatacactgaagtgaaaactg-3'（配列番号２）
変異型）5'(NH2)-caggcatacactgaagtgaaaactg-3'（配列番号３）
【００６８】
その水溶液（１×１０-5Ｍ）を上記のスライドに市販のスポッター（SP-BIO：日立ソフト社製）を用いて点着した。そのスライドを、２５℃、湿度７０％にて一晩放置した後、４×ＳＳＣ（ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）水溶液で５分間洗浄し、さらに０．５Ｍグリシン水溶液（ｐＨ８．５）で１時間洗浄した。次いで、そのスライドを滅菌水で３分間洗浄し、余分なオリゴＤＮＡ断片を除去した。そして、スライドを室温で乾燥させて、ＡＬＤＨ２のＳＮＰが測定可能なＤＮＡマイクロアレイを得る。
【００６９】
（２）ＤＮＡ試料液の調製
実施例３の方法で、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型それぞれのヒト全血試料から抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行う。なお、ｕｐｐｅｒ側のプライマーの５'末端に蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）が結合している。
【００７０】
＜プライマー＞
upper：５'（Ｃｙ５）−attacagggtcaactgctatg−３'（配列番号４）
lower：５'           −aggtcctgaacttccagcag−３' （配列番号５）
【００７１】
以下に示す反応液の組成で、[変性：９４℃・２０秒、アニーリング：６０℃・３０秒、ポリメラーゼ伸長反応：７２℃・１分]を３５サイクル繰り返すことでＰＣＲ増幅反応を実施する。
【００７２】
＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲバッファ−                          ５μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                            ５μＬ
５μＭプライマ−(upper)                         ２μＬ
５μＭプライマ−(lower)                         ２μＬ
Ｔａｑ                                      ０．５μＬ
実施例３で得た核酸試料液（１００ｎｇ/μＬ）  ０．５μＬ
精製水                                         ３５μＬ
【００７３】
ＰＣＲ反応後、実施例３記載の方法を用いてＤＮＡの増幅断片の精製を行う。この所要時間は、約２分である。
【００７４】
（２）試料ＤＮＡ断片の検出
上記（１）のＤＮＡマイクロアレイ上に、上記（２）で得たＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣ溶液と０．２重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液の混合溶液）５０μＬを点着する。試料であるＤＮＡ断片は、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型それぞれのヒト由来のものを用いる。点着後のＤＮＡマイクロアレイの表面を顕微鏡用カバーガラスで覆い、モイスチャーチャンバ内にて６０℃で２時間インキュベートし、室温にて０．１重量％ＳＤＳ水溶液と２×ＳＳＣ水溶液との混合溶液で、５０℃にて０．１重量％ＳＤＳ水溶液と０．２×ＳＳＣ水溶液との混合溶液で、および室温にて０．２×ＳＳＣの水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥する。乾燥後のＤＮＡマイクロアレイの表面の蛍光強度を測定し、ＤＮＡマイクロアレイ上の正常型オリゴに由来するスポットの蛍光強度と変異型のオリゴに由来するスポットの蛍光強度を測定し比較する。結果は、表３に示す通りである。
【００７５】
（表３）
正常型スポット  変異型スポット
ＡＬＤＨ２活性型試料          3850            150
ＡＬＤＨ２不活性型試料         200           4030        
【００７６】
表３の結果より、本発明における核酸の分離精製方法を用いてアレイ法により、正しくＳＮＰ解析が出来ることがわかる。しかも、この方法は、従来の方法に比べて、核酸を含む試料から核酸を抽出する工程が約２分と、迅速に行える点とサンプル調製時の精製も同様に迅速に行える点で優れている。
【配列表】
2005095003000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月1日(2004.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
界面活性剤としてはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用することができるが、この他にも、ＳＤＳ、コール酸ナトリウム又はサルコシンナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０又はメガファック等のノニオン性界面活性剤、その他各種両性界面活性剤を使用することもできる。本発明では、ポリオキシエチレンオキチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）等のノニオン性界面活性剤を使用することが好ましい。界面活性剤の溶液中の濃度は、通常０．０５重量％〜１０重量％  特に好ましくは０．１重量％〜５重量％である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
（表１）
（核酸可溶化試薬溶液）                                    
塩酸グアニジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）      １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（ＩＣＮ社製）          １０ｇ
蒸留水                                １０００ｍｌ      
（洗浄液）                                                
１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ    ６５％エタノール        
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
（表２）
（核酸可溶化試薬溶液）                                  
塩酸グアニジン（インビトロジェン社製）      ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（インビトロジェン社製）          １２．１ｇ
TritonX-100（ＩＣＮ製）                       １０ｇ
蒸留水                                    １０００ｍｌ  
（洗浄液）                                              
１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ    ６５％エタノール