(57)【要約】【課題】  標的細胞への遺伝子の効率的な導入法の提供。【解決手段】  標的細胞含有組成物又は生体に（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び（Ｂ）ガス含有微小粒子を添加又は投与後、低周波超音波を照射することを特徴とする標的細胞への遺伝子類導入方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞含有組成物又は生体に、（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び（Ｂ）ガス含有微小粒子を添加又は投与後、低周波超音波を照射することを特徴とする標的細胞への遺伝子類導入方法。
【請求項２】
標的細胞含有組成物が、標的細胞培養液である請求項１記載の遺伝子類導入方法。
【請求項３】
カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性ポリマーである請求項１又は２記載の遺伝子類導入方法。
【請求項４】
ガス含有微小粒子が、高分子物質又はリポソームにガスが封入された小包体である請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝子類導入方法。
【請求項５】
（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体が、（Ｂ）ガス含有微粒子に内封されている請求項１〜４のいずれか１項記載の遺伝子類導入方法。
【請求項６】
（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び（Ｂ）ガス含有微小粒子を含有する標的細胞への遺伝子類導入用キット。
【請求項７】
標的細胞含有組成物に、（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び（Ｂ）ガス含有微小粒子を添加後、低周波超音波を照射することにより使用されるものである請求項６記載のキット。
【請求項８】
生体に、（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び（Ｂ）ガス含有微小粒子を投与し、次いで標的細胞に低周波超音波を照射することにより使用されるものである請求項６記載のキット。
【請求項９】
標的細胞含有組成物が、標的細胞培養液である請求項６又は８記載のキット。
【請求項１０】
カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性ポリマーである請求項６〜９のいずれか１項記載のキット。
【請求項１１】
ガス含有微小粒子が、高分子物質又はリポソームにガスが封入された小包体である請求項６〜９のいずれか１項記載のキット。
【請求項１２】
（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体が、（Ｂ）ガス含有微粒子に内封されている請求項６〜１１のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロ及びインビボにおいて、標的細胞に効率良く遺伝子類を導入する方法及び遺伝子類導入用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
標的細胞に遺伝子類を導入する方法としては、遺伝子類を第４級アンモニウム塩含有リポソームに封入させて投与する方法（非特許文献１）、遺伝子類とともにプロタミン等を投与する方法（非特許文献２）等が知られている。しかし、これらの手段では、標的細胞への遺伝子類の導入効率は未だ満足できるものではなかった。
【０００３】
一方、アルブミンでできた薄い殻の中にオクタフッ化プロパンガス等を封入したマイクロバブルと遺伝子類とを同時に投与し、超音波を照射すると、内封されたガスのキャビテーションにより、標的細胞に対して遺伝子類を導入できることが知られている（非特許文献３）。
【非特許文献１】Felgner P.L. Cationiv liposome-mediated transfection with lipofection reagent,  Meth. Mol. Biol 91-98, 1991
【非特許文献２】Gao X and Huang L.,  A novel cationic liposome reagent for efficient trAnsfection of mammalian cells.  Biochem. Biophys. Res. Commun 179 280-285, 1991
【非特許文献３】Tachibana K, Uchida T, Ogawa K. Yamashita N. Tamura K., Induction of cell-membrane porosity by ultrasound. Lancet 353, 1409, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、前記マイクロバブルを使用した手段によってもその遺伝子導入効率は低く、さらに導入効率の高い方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、遺伝子類とマイクロバブルをそのまま使用するのでなく、予め遺伝子類とカチオン性物質とを複合化させ、その表面荷電を正にした複合体とし、これとマイクロバブルとを組み合せ、超音波照射すれば、標的細胞への遺伝子類の導入効率が１０倍から１００００倍に飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、標的細胞含有組成物又は生体に、（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び（Ｂ）ガス含有微小粒子を添加又は投与後、低周波超音波を照射することを特徴とする標的細胞への遺伝子類導入方法を提供するものである。
また本発明は、（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び（Ｂ）ガス含有微小粒子を含有する標的細胞への遺伝子類導入用キットを提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明方法によれば、インビトロ及びインビボのいずれにおいても、標的細胞に、目的とする遺伝子類を極めて効率良く導入できる。従って、本発明を用いれば、従来導入効率が低いことが原因で不可能だった形質転換細胞の生成率が向上する。また、遺伝子治療の有効率も飛躍的に向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体を用いることを特徴とする。ここで、遺伝子類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ＳｉＲＮＡ、デコイ、治療用オリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、カチオン性物質としては、プロタミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、オルニチン等のカチオニックペプチド；ポリエチレンイミン、カチオニックデンドリマー、キトサン等のカチオニックポリマー等が挙げられる。これら遺伝子類とカチオン性物質とからなる複合体は、例えばこれらを精製水中で混合することにより製造することができる。溶媒によっては凝集がおこるので事前の検討が必要である。このとき、得られる複合体全体の荷電を正になるようにすることが必要である。当該荷電は、ゼータ電位で＋５〜＋２０mVとなるように調整するのが好ましい。ゼータ電位は、通常のゼータ電位測定装置で測定できる。
【０００９】
また、当該複合体の粒子径は、１００〜３００nm程度にするのが、遺伝子導入効率の点で好ましい。この粒子径はレーザー光散乱微粒子測定装置によって測定できる。
【００１０】
ここで用いる遺伝子類とカチオン性物質とは、重量比で１：１００〜１００：１、より好ましくは１：１０〜１０：１の割合で混合するのが好ましい。
【００１１】
一方、（Ｂ）ガス含有微小粒子としては、従来からマイクロバブルとして利用されているもの、例えばアルブミン小包中にガスを封入したものの他、ガス封入リポソームを用いることができる。ここで、公知のマイクロバブルとしては、Alubunex(Molecular Biosystems)、Levovist(Schering)、Sonavist(Schhering)、Echovist(Schhering)、Sonazoid(Nycomed)、Optison(Nycomed-Amersham)、Definity(DuPont Pharmaceutical)、SonoVue(Bracco)等が挙げられる。
【００１２】
ガス封入リポソームとしては、内容積の２０〜８０％リポソーム懸濁液を含有する密封容器の空隙部にフッ化ガス又は窒素ガスを充填し、超音波処理することにより得られるガス封入リポソームが挙げられる。
【００１３】
ここでリポソームの膜構成成分として用いられる脂質類としては、リン脂質、グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の他、これらの脂質に、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基又は第４級アンモニウム基が導入されたカチオン性脂質、これらの脂質にポリアルキレングリコールが導入された脂質、さらに各種細胞、組織等に対するリガンドが結合した脂質類が挙げられる。
【００１４】
リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質等の天然又は合成のリン脂質等が挙げられる。
【００１５】
グリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等が挙げられる。
【００１６】
カチオン性脂質としては、上記リン脂質、グリセロ糖脂質又はスフィンゴ糖脂質に、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、モノアシルオキシアルキル−ジアルキルアンモニウム基、ジアシルオキシアルキル−モノアルキルアンモニウム基等の第４級アンモニウム基が導入された脂質が挙げられる。また、ポリアルキレングリコール修飾脂質としては、上記リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質に、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が修飾した脂質、例えばジ−Ｃ12-24アシル−グリセロール−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ等が挙げられる。
【００１７】
また必要に応じて膜安定化剤としてコレステロール類、抗酸化剤としてトコフェロール類、ステアリルアミン、ジセチルホスフェート、ガレグリオシドを用いてもよい。
【００１８】
また、標的細胞、標的組織、標的病巣に対するリガンドとしては、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース、マンノースなどの癌細胞に対するリガンド等が挙げられる。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体もリガンドとして使用できる。
【００１９】
また、予め作成されるリポソームの内部には、水相であればよいが、遺伝子類等を含有してもよい。
【００２０】
リポソームの製造には、公知のリポソームの調製法を適用することができ、例えばバンガム（Bangham）らのリポソーム調製法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 13, 238(1965)］、エタノール注入法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J. Cell. Biol.), 66, 621(1975)］、フレンチプレス法［フェブス・レター(FEBS Lett.), 99, 210(1979)］、凍結融解法［アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch. Biochem. Biophys.), 212, 186(1981)］、逆相蒸発法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 4194(1978)］等が挙げられる。例えば、脂質類等を有機溶媒に溶解し、これに水性溶液を加え、次いで、超音波処理してリポソーム懸濁液を得る。次いで必要によりこれをエクストルーダー及び／又はメンブランフィルターを用いて、整粒する。このとき、粒子径は、１μm以下、さらに１００〜８００nm、特に１００〜６００nmに整粒するのが好ましい。
【００２１】
得られたリポソーム懸濁液は密封容器に注入する。このとき、容器の空隙率は内容積の２０〜８０％、さらに３０〜８０％、特に５０〜８０％にするのが好ましい。２０％未満では、得られるリポソームのガス導入率が低すぎる。一方、８０％を超えると経済的でない。
【００２２】
この空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填する。フッ化物ガスとしては、硫化ヘキサフルオライド、パーフルオロ炭化水素ガス、例えば、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ5Ｆ12、Ｃ6Ｆ14等が挙げられ、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ5Ｆ12が特に好ましい。また、窒素ガスも使用できる。充填した後の圧力は１気圧（ゲージ圧）以上、特に１〜１．５気圧が好ましい。充填手段としては、ゴム栓等から注射器等により、注入するのが簡便であるが、注入用シリンダーを用いてもよい。
【００２３】
次いで超音波処理する。超音波処理は、例えば、２０〜５０kHzの超音波を１〜５分照射すればよい。当該超音波処理により、リポソーム内部の水溶液とフッ化物ガス又は窒素ガスとが置換し、ガス封入リポソームが得られる。得られたガス封入リポソームの粒子径は、原料リポソームのそれとほぼ同じである。従って、リポソーム調整時に整粒しておけば、粒子径が一定範囲、例えば１μm以下、さらに５０〜８００nm、特に１００〜６００nmのガス封入リポソームが簡便に得られる。
【００２４】
なお、フッ化物ガス又は窒素ガスを充填したリポソーム懸濁液含有密封容器を調製しておき、これを病院等に供給すれば、現場で超音波処理するだけで容易にガス封入リポソームを得ることができる。
【００２５】
かくして得られたガス封入リポソームは、粒子径が小さく、その粒度分布も一定にすることができるので、微小血管、深部組織等への移行が可能である。
【００２６】
また、本発明においては、前記複合体（Ａ）は、ガス含有微小粒子（Ｂ）に内封されていてもよい。内封手段としては、ガス含有微小粒子の調製段階で行う方法、及びガス含有微小粒子を調製後に前記複合体（Ａ）を添加し、混合する方法が挙げられる。
【００２７】
本発明においては、標的細胞含有組成物又は生体に、前記複合体（Ａ）及びガス含有微小粒子（Ｂ）を添加又は投与する。ここで、標的細胞含有組成物としては、標的細胞培養液が挙げられる。一方、生体としては、ヒトを含む哺乳類、鳥類、魚類、ハ虫類、昆虫、植物等が挙げられる。標的細胞は遺伝子を導入しようとする細胞又は細胞を含む組織である。
【００２８】
ここでインビトロの場合には、標的細胞培養液に、前記複合体（Ａ）及びガス含有微小粒子（Ｂ）を添加後、低周波超音波を照射すればよい。一方、インビボの場合には、生体に前記複合体及びガス含有微小粒子を投与した後、診断用超音波（２〜６MHz）を照射し、標的細胞への移行を確認した後、低周波超音波を照射すればよい。このときの投与法は、局所投与でもよく、静脈内投与でもよい。
【００２９】
ガス含有微小粒子（Ｂ）は、０．５〜２MHzの共振周波数を含む低周波超音波を照射すると、微小粒子の崩壊とガスの微小気泡によるキャビテーションを生じる。この結果、その近傍に存在する前記複合体（Ａ）、又はガス含有微粒子中の前記複合体（Ａ）は、標的細胞に対して、効率良く導入される。この複合体（Ａ）が、標的細胞に効率良く導入される理由は、明らかではないが、正荷電であるため細胞表面に接触しやすい状態になっているためと考えられる。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
以下、実施例で用いる略語は次のとおりである。
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＴＡＰ：１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン
【００３１】
実施例１
（１）ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡとプロタミンを混合し、ＤＮＡ−プロタミン複合体を作製し、コンパクトなサイズにした。このとき、複合体全体の荷電を正（ゼータ電位で＋０．５から＋２０mV）となるようにした。比較のために複合体全体の荷電を負（ゼータ電位で−７mV）となるようにした。
【００３２】
（２）ＤＰＰＣリポソーム
ＤＰＰＣ：コレステロール（１：１（m／m））の脂質をクロロホルム：イソプロピルエーテル（１：１v／v）の有機溶媒に溶解し、生理食塩水などの水溶液（または薬物を含む水溶液）を有機溶媒の１／２容量を加えて（このとき、クロロホルム：イソプロピルエーテル：水溶液＝１：１：１v／v）混和しエマルジョンとした。これを用いて逆相蒸発法（ＲＥＶ法）でリポソームを調製した。エクストルーダーで４００nm、２００nm、１００nmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。
【００３３】
（３）ＤＯＴＡＰリポソーム
ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ＝１：１w／wをクロロホルムに溶解し、梨型フラスコ中に入れ、ロータリーエバポレートで回転しながら有機溶媒をエバポレートして脂質の薄い膜を壁に作製した（lipid filmの作製）。生理食塩水などの溶媒で水和（hydration）して、リポソームを作製した。超音波処理によってサイズを小さくする。または、エクストルーダーで４００nm、２００nm、１００nmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。
【００３４】
（４）市販のカチオニックリポソームからなる遺伝子導入用の試薬として、以下の試薬を用いた。
LipofectinTM(DOTMA:DOPE=1：1 w/w)
LipofectACETM(DDAB:DOPE=1：1.25 w/w)
【００３５】
（５）パーフルオロプロパンガス封入
バイアル瓶（５mL、１０mL、２０mLなど）に容量の３０％（１．５mL、３mL、６mL）に相当するリポソーム水溶液（脂質濃度は５mg／mL）を入れ、パーフルオロプロパンガスを空気と置換するように入れた。ゴム栓をしてシールしゴム栓を通じて注射器でさらにパーフルオロプロパンを加えた。パーフルオロプロパンは全量で内容積の１．５倍で１．５気圧程度の加圧状態にした。バス型超音波装置（４２kHz）に水を張り静置し、１分間照射処理した。
【００３６】
（６）４８穴のプレートにAsPC−１細胞（４×１０4細胞／well）培養し、ＤＮＡ−プロタミン複合体（１μg  DNA、lipid：DNA＝12:1 w/w）とガス封入ＰＥＧ−リポソームを添加し、１MHzの超音波を３秒間パルス照射し、直ちに培養液を３〜４回繰り返し洗浄し、培養液を加えて２日間培養した。その後、ルシフェラーゼ活性を常法により測定した。得られた結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2005168312.tif 000002
【００３８】
結果から、パーフルオロプロパンガス封入カチオニックリポソームと正荷電状態のＤＮＡ／プロタミン複合体に対して低周波超音波を照射した場合に、高い発現量が得られた。