(57)【要約】      （修正有）【課題】モナスカス属は食品添加物として，健康促進効果がある。プロモーターおよび発現ベクターとその使用方法の提供。【解決手段】モナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プロプレウスに由来する、ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ（acuF）遺伝子、および熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）遺伝子の開始コドン上流配列に由来する配列を含むDNA分子。および、該DNA分子を含むプロモーター領域、および、それを含む組み換えプラスミドおよび発現ベクター。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むDNA分子であって、プロモーター活性を有するDNA分子。
【請求項２】
配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のDNA分子。
【請求項３】
配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のDNA分子。
【請求項４】
配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のDNA分子。
【請求項５】
細菌または真菌に由来する、請求項1記載のDNA分子。
【請求項６】
モナスカス種に由来する、請求項1記載のDNA分子。
【請求項７】
モナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、請求項1記載のDNA分子。
【請求項８】
食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、請求項7記載のDNA分子。
【請求項９】
BCRC 38072のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、請求項8記載のDNA分子。
【請求項１０】
配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むプロモーター領域；および
所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むコード領域
を含む、組換えDNA。
【請求項１１】
プロモーター領域が、配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項10記載の組換えDNA。
【請求項１２】
プロモーター領域が、配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項10記載の組換えDNA。
【請求項１３】
プロモーターが配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項10記載の組換えDNA。
【請求項１４】
プロモーター領域がモナスカス種に由来する、請求項10記載の組換えDNA。
【請求項１５】
プロモーター領域がモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、請求項10記載の組換えDNA。
【請求項１６】
プロモーター領域が、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、請求項15記載の組換えDNA。
【請求項１７】
プロモーター領域が、BCRC 38072のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、請求項16記載の組換えDNA。
【請求項１８】
配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、プロモーターを含む発現ベクター。
【請求項１９】
プロモーターが、配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項18記載の発現ベクター。
【請求項２０】
プロモーターが、配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項18記載の発現ベクター。
【請求項２１】
プロモーターが配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項18記載の発現ベクター。
【請求項２２】
プロモーターがモナスカス種に由来する、請求項18記載の発現ベクター。
【請求項２３】
プロモーターがモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、請求項18記載の発現ベクター。
【請求項２４】
プロモーターが、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、請求項23記載の発現ベクター。
【請求項２５】
プロモーターが、BCRC 38072のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、請求項21記載の発現ベクター。
【請求項２６】
配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むDNA分子であって、プロモーター活性を有するDNA分子。
【請求項２７】
配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項26記載のDNA分子。
【請求項２８】
配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項26記載のDNA分子。
【請求項２９】
配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項26記載のDNA分子。
【請求項３０】
細菌または真菌に由来する、請求項26記載のDNA分子。
【請求項３１】
モナスカス種に由来する、請求項26記載のDNA分子。
【請求項３２】
モナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、請求項31記載のDNA分子。
【請求項３３】
食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、請求項32記載のDNA分子。
【請求項３４】
BCRC 38072の熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、請求項33記載のDNA分子。
【請求項３５】
配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むプロモーター領域；および
所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むコード領域
を含む、組換えDNA。
【請求項３６】
プロモーター領域が、配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項35記載の組換えDNA。
【請求項３７】
プロモーター領域が、配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項35記載の組換えDNA。
【請求項３８】
プロモーターが配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項35記載の組換えDNA。
【請求項３９】
プロモーター領域がモナスカス種に由来する、請求項35記載の組換えDNA。
【請求項４０】
プロモーター領域がモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、モナスカス・プルプレウスに由来する、請求項35記載の組換えDNA。
【請求項４１】
プロモーター領域が、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、請求項40記載の組換えDNA。
【請求項４２】
プロモーター領域が、BCRC 38072の熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、請求項41記載の組換えDNA。
【請求項４３】
配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、プロモーターを含む発現ベクター。
【請求項４４】
プロモーターが、配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項43記載の発現ベクター。
【請求項４５】
プロモーターが、配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項43記載の発現ベクター。
【請求項４６】
プロモーターが配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、請求項43記載の発現ベクター。
【請求項４７】
プロモーターがモナスカス種に由来する、請求項43記載の発現ベクター。
【請求項４８】
プロモーターがモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、請求項43記載の発現ベクター。
【請求項４９】
プロモーターが、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、請求項48記載の発現ベクター。
【請求項５０】
プロモーターが、BCRC 38072の熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、請求項49記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロモーターおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
歴史的に見て、モナスカス属は中国およびアジア諸国において食品添加物として広く用いられてきた。発酵物は、元の米粒構造をよく保存した紅色から赤紫色の穀物として得られる。さらに伝統的に、生成物には健康促進効果があるとされている。日本酒製造においてモナスカスを利用するのは、デンプンからグルコースへの変換を促進するαアミラーゼの含量が高いためである。科学的研究により、モナコリンK(Monacolin K)、メビノリン等のモナスカス発酵物の薬理効果が確認されている。また、モナスカス発酵物の防腐効果も確認されている。
【０００３】
本分野における研究は、モナスカス(Monascus spp.)の遺伝子産物に焦点を当てており、モナスカスESTデータベースにより組換えDMA技術のためのさらなる情報が提供されることに関心が高まっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、プロモーターおよびその使用法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
本発明者らは、食品工業開発研究所(Food Industry Research and Development Institute)に寄託されたBCRC 38072のモナスカスESTデータベースを検索した。高い発現率を有する2つの遺伝子が得られ、これらはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)遺伝子および熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子と一致した。2つの遺伝子の上流領域を調べ、2つのプロモーター領域を同定した。その結果、本発明が達成された。
【０００６】
本発明に係るDNA分子においては、（１）配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むDNA分子であって、プロモーター活性を有するDNA分子であることを特徴とする。
【０００７】
本発明に係るDNA分子においては、（２）配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(1)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【０００８】
本発明に係るDNA分子においては、（３）配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(1)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【０００９】
本発明に係るDNA分子においては、（４）配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(1)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係るDNAにおいては、（５）細菌または真菌に由来する、上記(1)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００１１】
本発明に係るDNA分子においては、（６）モナスカス種に由来する、上記(1)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００１２】
本発明に係るDNA分子においては、（７）モナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、上記(1)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００１３】
本発明に係るDNA分子においては、（８）食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、上記(7)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００１４】
本発明に係るDNA分子においては、（９）BCRC 38072のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、上記(8)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（１０）
配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むプロモーター領域；および
所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むコード領域
を含む、組換えDNAであることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（１１）プロモーター領域が、配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(10)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（１２）プロモーター領域が、配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(10)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（１３）プロモーターが配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(10)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００１９】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（１４）プロモーター領域がモナスカス種に由来する、上記(10)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００２０】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（１５）プロモーター領域がモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、上記(10)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（１６）プロモーター領域が、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、上記(15)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００２２】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（１７）プロモーター領域が、BCRC 38072のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、上記(16)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（１８）配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、プロモーターを含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００２４】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（１９）プロモーターが、配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(18)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００２５】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（２０）プロモーターが、配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(18)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（２１）プロモーターが配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(18)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（２２）プロモーターがモナスカス種に由来する、上記(18)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００２８】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（２３）プロモーターがモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、上記(18)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００２９】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（２４）プロモーターが、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、上記(23)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００３０】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（２５）プロモーターが、BCRC 38072のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、上記(21)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００３１】
本発明に係るDNA分子においては、（２６）配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むDNA分子であって、プロモーター活性を有するDNA分子であることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係るDNA分子においては、（２７）配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(26)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係るDNA分子においては、（２８）配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(26)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００３４】
本発明に係るDNA分子においては、（２９）配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(26)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００３５】
本発明に係るDNA分子においては、（３０）細菌または真菌に由来する、上記(26)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００３６】
本発明に係るDNA分子においては、（３１）モナスカス種に由来する、上記(26)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００３７】
本発明に係るDNA分子においては、（３２）モナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、上記(31)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００３８】
本発明に係るDNA分子においては、（３３）食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、上記(32)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００３９】
本発明に係るDNA分子においては、（３４）BCRC 38072の熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、上記(33)記載のDNA分子であることを特徴とする。
【００４０】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（３５）
配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むプロモーター領域；および
所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むコード領域
を含む、組換えDNAであることを特徴とする。
【００４１】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（３６）プロモーター領域が、配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(35)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００４２】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（３７）プロモーター領域が、配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(35)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００４３】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（３８）プロモーターが配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(35)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００４４】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（３９）プロモーター領域がモナスカス種に由来する、上記(35)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００４５】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（４０）プロモーター領域がモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、モナスカス・プルプレウスに由来する、上記(35)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００４６】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（４１）プロモーター領域が、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、上記(40)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００４７】
本発明に係る組換えDNAにおいては、（４２）プロモーター領域が、BCRC 38072の熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、上記(41)記載の組換えDNAであることを特徴とする。
【００４８】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（４３）配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、プロモーターを含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００４９】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（４４）プロモーターが、配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(43)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００５０】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（４５）プロモーターが、配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(43)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００５１】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（４６）プロモーターが配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む、上記(43)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００５２】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（４７）プロモーターがモナスカス種に由来する、上記(43)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００５３】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（４８）プロモーターがモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスに由来する、上記(43)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００５４】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（４９）プロモーターが、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072に由来する、上記(48)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００５５】
本発明に係る発現ベクターにおいては、（５０）プロモーターが、BCRC 38072の熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子の開始コドンの上流配列に由来する、上記(49)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００５６】
本発明により、プロモーターおよびその使用法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
したがって、本発明の1つの態様では、配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:1にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子を提供する。DNA分子はプロモーター活性を有する。
【００５８】
また、プロモーター領域およびコード領域を含む組換えDNAを提供する。プロモーター領域は、配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:1にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有し、コード領域は所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５９】
本発明の別の態様では、プロモーターを含む発現ベクターを提供する。プロモーターは、配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:1にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する。
【００６０】
本発明のさらに別の態様では、配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:2にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むDNA分子を提供する。DNA分子はプロモーター活性を有する。
【００６１】
さらに、本発明の別の態様では、プロモーター領域およびコード領域を含む組換えDNAを提供する。プロモーター領域は、配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:2にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有し、コード領域は所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００６２】
さらに、本発明の別の態様では、配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:2にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有するプロモーターを含む発現ベクターを提供する。
【００６３】
詳細な説明
食品工業開発研究所に収集されたBCRC 38072のモナスカスESTデータベースを検索することにより、高い発現率を有する2つの遺伝子が得られ、これらはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)遺伝子および熱ショックタンパク質(hsp)遺伝子と一致した。2つの遺伝子は上流の強力なプロモーターによって調節され、そのプロモーターをタンパク質の過剰発現に用い得ることを提唱した。
【００６４】
モナスカスBCRC 38072は、以下の特徴を有すると認められた。
【００６５】
巨視的特徴：
CYA、25℃、7日間。直径25〜26 mmのコロニー、菌糸は最初は白いが、薄い赤みがかったオレンジ色になり、裏側は濃い赤みがかったオレンジ色になる。
MEA、25℃、7日間。直径48 mmのコロニー、明るい赤みがかったオレンジ色で、裏側は鮮明な赤みがかったオレンジ色である。    
G25N、25℃、7日間。直径28〜29 mmのコロニー、濃い赤みがかったオレンジ色で、中心は濃い黄色みがかったオレンジ色である。    
【００６６】
微視的特徴：
個々にまたは時に短鎖状でアレウリオ型分生子が生じ、倒洋ナシ形〜球形で、10〜13 × 8〜10μm。閉鎖子嚢果は球形で、直径37〜72μm。子嚢胞子は透明の楕円形で、4.6〜6.3(〜6.6) × 3.3〜4.2μm。
【００６７】
HawksworthおよびPitt (1983)の分類系によると、BCRC 38072は以下のように同定された。
【００６８】
形態学的特徴：
BCRC 38072は、M. ピロサス(pilosus)とM. ルバー(rubber)の間に位置する。
1. BCRC 38072は、コロニーの色および増殖速度においてM. ピロサスに類似している。
2. BCRC 38072は、子嚢胞子の形態においてM. ルバーに類似している。
【００６９】
配列解析：
BCRC 38072、M. ルバー、およびM. ピロサスは、rDNA ITS断片およびβチューブリン遺伝子において100%の配列類似性を共有する。
【００７０】
種の同定：
BCRC 38072は、一時的に、モナスカス・ピロサス K. Sato ex D. Hawksw. & Pitt.と命名された。
【００７１】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)は動物における糖新生に重要であり、細胞内で持続的にかつ強力に発現される。
【００７２】
動物での糖新生は、ピルビン酸カルボキシラーゼによりピルビン酸からオキサロ酢酸に移行する段階、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによりオキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に移行する段階を含む。反応は以下の通りである。
2005168504.tif 000003
【００７３】
熱ショックタンパク質(Hsp)は高度に保存された遺伝子を有するタンパク質ファミリーであり、原核生物および真核生物に広く行きわたっている。このタンパク質ファミリーは4つのサブファミリーを含む：分子量により分類される、Hsp 90ファミリー（83〜90 KDa）、Hsp 70ファミリー（66〜78 KFa）、Hsp 60ファミリー、および小さいHspファミリー。環境刺激により、動物においてこれらのタンパク質の過剰発現が誘導される。
【００７４】
BLASTにより、acuFおよびHsp遺伝子のプロモーターを公表されたデータベースと比較したが、類似の配列は認められなかった。次に、acuFまたはHspプロモーターと、Hph（ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ）および強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)の融合タンパク質を含むpHygEGFPとの組換えにより、組換えベクターを調製した。これらの組換えベクターを用いたEGFP発現の知見から、2つのプロモーターは下流の遺伝子を開始する活性を有することが立証された。
【００７５】
(I) acuFプロモーター
したがって、本発明の1つの態様では、配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:1にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子を提供する。DNA配列はプロモーター活性を有する。プロモーター活性を有するDNA分子は、配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチド、詳細には配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチド、より詳細には配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドを含み得る。さらに、このDNA分子は、細菌または真菌、詳細にはモナスカス種、より詳細にはモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウス(Monascus purpureus)から得られる。このDNA分子は、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)の開始コドンの上流配列から、遺伝子操作によってクローニングすることができる。遺伝子操作には、遺伝子ライブラリーの作製、コロニーハイブリダイゼーション、プライマーウォーキング、またはPCRが含まれる。さらに、本発明に開示するDNA配列に従ってPCR、ハイブリダイゼーション、および人工合成することにより、DNA配列または実質的なプロモーター領域を得ることは、当業者にとって容易である。ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、欧州特許第1325959 A1号、7ページに見出すことができる(Transformation system of fungus belonging to the genus Monascus. 欧州特許第1325959 A1号)［0036］。
【００７６】
本発明の別の態様では、プロモーター領域およびコード領域を含む組換えDNAを提供する。プロモーター領域は、配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:1にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む。詳細には、プロモーター領域は、配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチド、より詳細には配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチド、または配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドも含む。プロモーター領域は、モナスカス種、詳細にはモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスから得られ、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC 38072のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(acuF)の開始コドンの上流配列から、遺伝子操作によってクローニングすることができる。コード領域は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。所望のタンパク質には、プロテアーゼ、ポリケチド合成酵素、およびリパーゼ等の酵素；活性化因子およびRNAポリメラーゼ等の転写因子；ならびにインスリンおよび増殖因子等のホルモンが含まれる。
【００７７】
本発明のさらに別の態様では、配列番号:1のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:1にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有するプロモーターを含む発現ベクターを提供する。プロモーターは、組換えDNAの態様のプロモーター領域において定義した通りである。発現ベクターの態様を構築するための材料には、プラスミド、ファージ、またはウイルス等の、宿主細胞内で自己増幅するために適した、または宿主染色体への組み込みに適した分子配列が含まれる。発現ベクターは選択的に所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、所望のタンパク質には、プロテアーゼ、ポリケチド合成酵素、およびリパーゼ等の酵素；活性化因子およびRNAポリメラーゼ等の転写因子；ならびにインスリンおよび増殖因子等のホルモンが含まれる。
【００７８】
本発明の別の局面は、所定の発現ベクターを含む発現系、および所望のタンパク質の発現に適した宿主細胞に関する。ベクターは、形質転換操作により宿主細胞内に形質転換される。宿主細胞は、所望のタンパク質の発現に適した任意の細胞を示す。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれる。糸状菌はモナスカス種、詳細にはモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウス、より詳細にはBCRC38072であってよい。従来の周知である宿主-ベクター系を用いて、アスペルギルス属に属する糸状菌の形質転換法を適用することにより、形質転換を完了することができる。欧州特許第1325959 A1号、5ページを参照されたい(Transformation system of fungus belonging to the genus Monascus. 欧州特許第1325959 A1号)［0022］。
【００７９】
本発明はまた、a) 配列番号:1、b) 配列番号:1の約117〜約1116の連続したヌクレオチド、c) 配列番号:1の約367〜約1116の連続したヌクレオチド、もしくはd) 配列番号:1の約517〜約1116の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で上記のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む形質転換体に関する。形質転換体は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００８０】
本発明はまた、タンパク質の発現法に関する。本方法は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む形質転換体の態様を培地中で培養する段階、形質転換体から培地へ所望のタンパク質を産生させるおよび蓄積する段階、ならびに培地から所望のタンパク質を回収する段階を含む。
【００８１】
(II) Hspプロモーター
本発明の1つの態様では、配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:2にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子を提供する。DNA分子はプロモーター活性を有する。プロモーター活性を有するDNA分子は、配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチド、詳細には配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチド、より詳細には配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドを含み得る。このDNA分子は、細菌または真菌、詳細にはモナスカス種、より詳細にはモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスから得られる。このDNAは、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC38072の熱ショックタンパク質(hsp)の開始コドンの上流配列から、遺伝子操作によってクローニングした。遺伝子操作には、遺伝子ライブラリーの作製、コロニーハイブリダイゼーション、ショットガン、およびPCRが含まれる。さらに、当業者は、本発明に開示す配列に従ってPCR、ハイブリダイゼーション、および人工合成することにより、DNA配列または実質的なプロモーター領域を得ることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、欧州特許第1325959 A1号、7ページに見出すことができる(Transformation system of fungus belonging to the genus Monascus. 欧州特許第1325959 A1号)［0036］。
【００８２】
本発明の別の局面では、プロモーター領域およびコード領域を含む組換えDNAを提供する。プロモーター領域は、配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:2にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む。詳細には、プロモーター領域は、配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチド、より詳細には配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチド、または配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドも含む。このDNA分子は、細菌または真菌、詳細にはモナスカス種、より詳細にはモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウスから得られる。このDNAは、食品工業開発研究所に寄託されたBCRC38072の熱ショックタンパク質(hsp)の開始コドンの上流配列から、遺伝子操作によってクローニングした。コード領域は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。所望のタンパク質には、プロテアーゼ、ポリケチド合成酵素、およびリパーゼ等の酵素；活性化因子およびRNAポリメラーゼ等の転写因子；ならびにインスリンおよび増殖因子等のホルモンが含まれる。
【００８３】
本発明のさらに別の態様では、配列番号:2のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で配列番号:2にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有するプロモーターを含む発現ベクターを提供する。プロモーターは、組換えDNAの態様のプロモーター領域において定義した通りである。発現ベクターの態様を構築すための材料には、プラスミド、ファージ、またはウイルス等の、宿主細胞内で自己増幅するために適した、または宿主染色体への組み込みに適した分子配列が含まれる。発現ベクターは選択的に所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、所望のタンパク質には、プロテアーゼ、ポリケチド合成酵素、およびリパーゼ等の酵素；活性化因子およびRNAポリメラーゼ等の転写因子；ならびにインスリンおよび増殖因子等のホルモンが含まれる。
【００８４】
本発明の別の局面は、所定の発現ベクターを含む発現系、および所望のタンパク質の発現に適した宿主細胞に関する。発現ベクターは、形質転換操作により宿主細胞内に形質転換される。宿主細胞は、所望のタンパク質の発現に適した任意の細胞を含む。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれる。糸状菌はモナスカス種、詳細にはモナスカス・ピロサス、モナスカス・ルバー、またはモナスカス・プルプレウス、より詳細にはBCRC38072であってよい。従来の周知である宿主-ベクター系を用いて、アスペルギルス属に属する糸状菌の形質転換法を適用することにより、形質転換を完了することができる。欧州特許第1325959 A1号、5ページを参照されたい(Transformation system of fungus belonging to the genus Monascus. 欧州特許第1325959 A1号)［0022］。
【００８５】
本発明はまた、a) 配列番号:2、b) 配列番号:2の約443〜約1478の連続したヌクレオチド、c) 配列番号:2の約759〜約1478の連続したヌクレオチド、d) 配列番号:2の約982〜約1478の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で上記のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む形質転換体に関する。形質転換体は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００８６】
本発明はまた、タンパク質の発現法に関する。本方法は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む形質転換体を培地中で培養する段階、形質転換体から培地へ所望のタンパク質を産生させるおよび蓄積する段階、ならびに培地から所望のタンパク質を回収する段階を含む。
【００８７】
本明細書に実施例を記載する。
【実施例１】
【００８８】
acuFプロモーター
1．材料
（1）宿主細胞：モナスカス BCRC 38702（食品工業開発研究所）。
（2）コンピテント細胞：ECOS（商標）大腸菌コンピテント細胞DH5α（Yeastern Biotech Co., Ltd.）。
（3）プラスミド：pHygEGFP（BD Biosciences）、pGEM（登録商標）-T Easy Vector（PROMEGA）。
（4）培地
a．大腸菌用：LBブロス（UBS）、寒天（UBS）。
b．モナスカス属およびアカパンカビ（Neurospora crassa）用：PDA（DIFICO）、PDB（DIFICO）、Vogel培地（＊を参照のこと）、およびtop寒天。
（5）抗生物質：アンピシリン、ハイグロマイシンB（SIGMA）。
＊Vogel培地
1．微量元素溶液：95mlのddH2O中、5gのクエン酸・H2O、5gのZnSO4・7H2O、1gのFe(NH4)2(SO4)2・6H2O、250mgのCuSO4・5H2O、50mgのMnSO4・H2O、50mgのH3BO3、50mgのNa2MoO4・2H2O。最終体積：100ml。
2．ビオチン溶液：199mlの5％エタノール中、ビオチン（Sigma）5mg。
3．50×Vogel塩ストック：750mlのddH2O中、150gのクエン酸ナトリウム・5H2O、250gのKH2PO4、100gのNH4NO3、10gのMgSO4・7H2O、5gのCaCl2・2H2O（それぞれ20mlの水に予めゆっくり溶解させる）に、5mlの微量元素溶液および5mlのビオチン溶液を添加する。最終体積：1リットル。濾過滅菌後、溶液を室温で保存する。
4．Vogel改変培地：1×Vogel塩中、1％グルコース。
【００８９】
2．手順
acuFプロモーターに関する手順を図1に示す。高度に発現した遺伝子コンティグID：MPTC00008457は、食品工業開発研究所（FIRDI）のモナスカス BCRC 38072 ESTデータベースから見出され、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（acuF）遺伝子と同定された。この遺伝子は強力なプロモーターによって調節されると推定された。次いで、acuF遺伝子の5'末端配列にしたがって465bpのプローブを設計した。acuFプローブをモナスカス染色体からPCRによって増幅した。その後、PCR産物を、pGEM（登録商標）-T Easy Vectorにライゲーションし、DIG（ジゴキシゲニン）での標識によってacuFプローブを得た。このプローブを使用してモナスカス BRCR 38072のフォスミドライブラリー中でコロニーハイブリダイゼーションを行い、acuF遺伝子を含むフォスミドをスクリーニングした。フォスミドmpf01014A4を、プライマーウォーキングによって配列決定し、acuF遺伝子上流の暫定的（tentative）プロモーター配列を位置付けた。1116bpの暫定的プロモーター配列の配列決定に成功し、次いで、BLASTデータベースと比較したが、類似の遺伝子は見出されなかった。1116bpの暫定的acuFプロモーター配列を、BglIIおよびKpnIの制限部位によってpHygEGFPにライゲーションし、図2に示すように（右側）得られたプラスミドをpMS-a1と命名した。pMS-a1でモナスカスを形質転換し、図3に示すようにEGFP発現が認められた（図3Aは明視野であり、図3Bは蛍光フィルター下である）。結果により、暫定的acuFプロモーターはプロモーター活性を有することが確認された。大腸菌DH5αを形質転換したpMS-a1は、2003年12月10日にAmerican Type Culture CollectionにPTA-5687として寄託されていたことに留意すべきである。手順を以下に詳述する。
【００９０】
A．acuFプローブ遺伝子断片の獲得
acuFプローブを、BCRC38072からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってクローニングした。
【００９１】
モナスカスESTデータベースにしたがって、プライマーを設計した。
2005168504.tif 000004
【００９２】
反応条件を以下に列挙した。
2005168504.tif 000005
【００９３】
2005168504.tif 000006
【００９４】
反応後、増幅断片を、同体積のフェノール/クロロホルム（24/25）によって抽出し、1/10体積の3M酢酸ナトリウムおよび2倍体積の100％エタノールによって沈殿させた。沈殿DNAを、70％エタノールで洗浄し、遠心分離し、風乾させた。産物をddH2Oに溶解し、-20℃で保存した。
【００９５】
B．プラスミドTA-acuFの組換え
acuFプローブのPCR産物を精製および回収した。DNAを、pGEM（登録商標）-T Easy Vectorと3：1の比で混合した。1μlのT4 DNAリガーゼおよび10×ライゲーション緩衝液を添加し、適量のddH2Oを最終体積10μlまで添加した。室温で1時間ライゲーション反応を行った。ライゲーション後、形質転換のために、5μlのライゲーション産物を、100μlのECOSTM大腸菌コンピテント細胞DH5αに添加した。3483bpの組換えプラスミドをスクリーニングし、PCRで確認した。組換えプラスミドTA-acuFを得た。
【００９６】
C．acuFプロモーター断片の獲得
acuFプロモーター遺伝子を、フォスミド（mpf01014A4）からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってクローニングした。
【００９７】
ここで使用したプライマーおよび反応条件を、以下に列挙する。
2005168504.tif 000007
【００９８】
2005168504.tif 000008
【００９９】
2005168504.tif 000009
【０１００】
反応後、増幅断片を、同体積のフェノール/クロロホルム（24/25）によって抽出し、1/10体積の3M酢酸ナトリウムおよび2倍体積の100％エタノールによって沈殿させた。沈殿DNAを、70％エタノールで洗浄し、遠心分離し、風乾させた。産物をddH2Oに溶解し、-20℃で保存した。
【０１０１】
D．組換えpMS-a1の調製
プロモーターacuFのPCR産物およびクローニングベクターpHygEGFPを、BglIIおよびKpnIによって4時間個別に消化した。得られた断片を、DNA電気泳動によって分離し、QIAquick（登録商標）GEL EXTRACTION KITで抽出した。ベクターおよびプロモーターacuFを、1：3の比で混合し、最終体積10μlまでddH2Oを添加した。16℃で4時間ライゲーションを行った。ライゲーション後、形質転換のために、5μlの反応物を100μlのECOSTM大腸菌コンピテント細胞DH5αに添加した。6.1kbのプラスミドをスクリーニングし、PCRで確認した。組換えプラスミドpMS-a1を得た。
【０１０２】
E．モナスカスプロトプラストの調製
モナスカス胞子溶液を、PDAスラントにプレートし、30℃で5〜7日間インキュベートした。胞子を滅菌水で剥ぎ取り、2層滅菌ミラクロス（miracloth）で濾過して菌糸および寒天を除去した。濾過した胞子を、光学顕微鏡下で血球計算板によって計数した。胞子を、50mlのVogel改変培地中に107胞子/mlの濃度で採取し、200rpmで振盪しながら30℃で16〜18時間インキュベートした。発芽胞子を、2層ミラクロスで濾過し、滅菌水で洗浄した。酵素消化緩衝液で菌糸を濯いだ。
【０１０３】
ミラクロス上の菌糸を、10mlの酵素消化緩衝液で洗浄し、5mlの酵素混合物に添加した。混合物を室温で30分間ボルテックスした。90％の菌糸からプロトプラストが放出されるまで、ボルテックスの間10分毎に光学顕微鏡下で細胞壁の分解を観察した。混合物を、2層ミラクロスで濾過し、濾過溶液を4℃、1500rpmで15分間遠心分離してプロトプラストを回収した。上清を破棄し、ペレットを酵素消化緩衝液で2回洗浄し、STCで2回洗浄した。1.5mlのSTC、20μlのDMSO、および0.4mlのPTCを溶液に添加し、プロトプラストを顕微鏡下で計数した。プロトプラストを、107プロトプラスト/mlの濃度で分配し、-80℃で保存した。
【０１０４】
F．形質転換
プロトプラストを、STCで2回洗浄し、4℃、1500rpmで15分間遠心分離した。上清を破棄し、プロトプラストのペレットを、50μlのSTCに溶解した。1〜10μgのプラスミドDNAを溶液に添加した。200Ω、25μF、0.7KVの条件下で、エレクトロポレーションを行った。1mlの再生緩衝液を混合物に添加し、混合物を30℃で一晩静置した。30μg/mlのハイグロマイシンBを含む50℃の10mlのtop寒天を混合物に添加し、混合物を30μg/mlハイグロマイシンBを含むtop寒天上に注いだ。30℃で3〜5日の培養後、形質転換体が認められた。
【０１０５】
G．形質転換体のスクリーニングおよび確認
（1）形質転換体の数個の菌糸および胞子をスライドガラス上にサンプリングし、1滴の蒸留水を添加し、スライドガラスをカバーガラスで覆った。次いで、試料を光学顕微鏡下で観察した。GFPフィルター下に菌糸および胞子の緑色蛍光が認められた（励起430〜510nm；発光475〜575nm）。
【０１０６】
（2）形質転換体を、200rpmで振盪しながら5〜10日間30℃のPDB（ポテトデキストロースブロス）中で成長させた。培養物をホモジナイズし、染色体DNAを抽出した。HPH-EGFP特異的プライマーを使用してPCRを行い、1740bpの産物を得た。
【０１０７】
H．プロモーター活性を有する最小断片の確認
プロモーター活性を有するacuFプロモーター（1116bp）の最小断片をさらに確認するために、acuFプロモーターの1000bp、750bp、600bp、および500bpの断片を有するPCR産物をpMS-a1から調製した。これらのPCR産物の調製のためのプライマーを以下に列挙する。
2005168504.tif 000010
【０１０８】
acuFプロモーターの1000bp、750bp、600bp、および500bpの断片を有するPCR産物をpMSにクローニングし、pMS-a2、pMS-a3、pMS-a4、およびpMS-a5と命名した。次いで、これらのプラスミドで、モナスカス BCRC 38072を形質転換し、Hygr 30μg/mlを含むPDAプレートでスクリーニングした。結果を以下に示す。
【０１０９】
2005168504.tif 000011
1：R：耐性；N.R.：非耐性
2：＋：陽性；−：陰性
N.D.：検出されず
【０１１０】
プロモーター活性を有する最小断片は600bpである。600bpの断片を含む形質転換体中で蛍光を検出することができる。
【０１１１】
これらのプラスミドでモナスカス・ピロサス BCRC 31527も形質転換し、Hygr 50μg/mlを含むPDAプレートでスクリーニングした。結果を以下に示す。
【０１１２】
2005168504.tif 000012
1：R：耐性；N.R.：非耐性
2：＋：陽性；−：陰性
N.D.：検出されず
【０１１３】
プロモーター活性を有する最小断片は600bpである。600bpの断片を含む形質転換体中で蛍光を検出することができる。
【０１１４】
これらのプラスミドでアカパンカビ BCRC 32685も形質転換し、Hygr 50μg/mlを含むPDAプレートでスクリーニングした。結果を以下に示す。
【０１１５】
2005168504.tif 000013
1：R：耐性；N.R.：非耐性
N.D.：検出されず
【０１１６】
結果により、プロモーター活性を有する最小断片が600bpであることも確認された。
【０１１７】
プロモーター活性を有するacuFプロモーターの最小断片は600bpであることが確認され（配列番号：18）、モナスカス BCRC 38072、モナスカス・ピロサス BCRC31527、およびアカパンカビ BCRC326で発現させることができる。
【実施例２】
【０１１８】
Hspプロモーター
1．材料
（1）宿主細胞：モナスカス BCRC 38702（食品工業開発研究所）
（2）コンピテント細胞：ECOS（商標）大腸菌コンピテント細胞DH5α（Yeastern Biotech Co., Ltd.）
（3）プラスミド：pHygEGFP（BD Biosciences）、pGEM（登録商標）-T Easy Vector（PROMEGA）
（4）培地
a．大腸菌用：LBブロス（UBS）、寒天（UBS）
b．モナスカス種およびアカパンカビ用：PDA（DIFICO）、PDB（DIFICO）、Vogel培地（上記）、およびtop寒天
（5）抗生物質：アンピシリン、ハイグロマイシンB（SIGMA）
【０１１９】
2．手順
Hspプロモーターに関する手順を図4に示す。モナスカス BCRC 38072 cDNAライブラリーから得た熱ショックタンパク質（Hsp）は、25℃で3日間のインキュベーション後に高度に発現することが見出された。Hsp用のプローブを、Hsp遺伝子配列の5'末端にしたがって設計し、PCRによってモナスカス染色体から増幅させた。PCR産物を、pGEM（登録商標）-T Easy Vectorにライゲーションし、得られた配列をTA-Hspと命名した。TA-HspをDIG（ジゴキシゲニン）で標識し、PCRで増幅させてDIG標識を有するプローブを得た。このプローブを使用してモナスカス BCRC38072のフォスミドライブラリー中でコロニーハイブリダイゼーションを行い、Hspを含むフォスミドを見出した。ショットガンを使用したフォスミドの配列決定の結果からHsp遺伝子配列および5'領域を位置付けた。Hsp遺伝子の5'領域からプライマーを設計した。1478bpの領域を、PCRによってモナスカス染色体から増幅させた。1478bpの領域をBglIIおよびXhoI制限部位で消化し、市販のベクターpHygEGFPにライゲーションした。図5に示すように（右側）、得られたプラスミドをpMS-hspと命名した。ベクターpMS-hspでモナスカス BCRC38072を形質転換し、形質転換体をハイグロマイシンBによってスクリーニングした。得られた形質転換体におけるEGFP発現の蛍光顕微鏡下での所見は、図6に示すように、1478bpの領域がプロモーター活性を有することを示す。図6Aは明視野下であり、図6Bは蛍光フィルター下である。モナスカス BCRC38072の形質転換体の染色体DNAを、QIAGEN DNeasy（登録商標）Plantキットによって抽出し、HPH-EGFP特異的プライマーを使用したPCR反応の鋳型として使用した。図7に示すように、1740bpのPCR産物を得た。レーン1は1kbのマーカー（Bio-1KbTM DNAラダー）を示し、レーン2〜5は番号1〜4の形質転換体を示し、レーン6はBCRC 38072野生型（(−)対照）を示し、レーン7はpHygEGFP（(＋)対照）を示す。大腸菌DH5αを形質転換したpMS-hspは、2003年12月10日にAmerican Type Culture CollectionにPTA-5688として寄託されたことに留意すべきである。手順を以下に詳述する。
【０１２０】
A．Hspプローブ遺伝子断片の獲得
Hspプローブを、モナスカス BCRC38072からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってクローニングした。
【０１２１】
モナスカスESTデータベースにしたがって、プライマーを設計した。
2005168504.tif 000014
【０１２２】
反応条件を、以下に列挙した。
2005168504.tif 000015
【０１２３】
2005168504.tif 000016
【０１２４】
反応後、増幅断片を、同体積のフェノール/クロロホルム（24/25）によって抽出し、1/10体積の3M酢酸ナトリウムおよび2倍体積の100％エタノールによって沈殿させた。沈殿DNAを、70％エタノールで洗浄し、遠心分離し、風乾させた。産物をddH2Oに溶解し、-20℃で保存した。
【０１２５】
B．プラスミドTA-Hspの組換え
HspプローブのPCR産物を精製および回収した。DNAを、pGEM（登録商標）-T Easy Vectorと3：1の比で混合した。1μlのT4 DNAリガーゼおよび10×ライゲーション緩衝液を添加し、適量のddH2Oを最終体積10μlまで添加した。室温で1時間ライゲーション反応を行った。ライゲーション後、形質転換のために、5μlのライゲーション産物を、100μlのECOSTM大腸菌コンピテント細胞DH5αに添加した。3482bpの組換えプラスミドをスクリーニングし、PCRで確認した。組換えプラスミドTA-Hspを得た。
【０１２６】
C．Hspプロモーター断片の獲得
Hspプロモータープライマーをモナスカス ESTデータベースから設計し、Hspプロモーター遺伝子を、BCRC 38072からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってクローニングした。
【０１２７】
ここで使用したプライマーおよび反応条件を、以下に列挙する。
2005168504.tif 000017
【０１２８】
2005168504.tif 000018
【０１２９】
2005168504.tif 000019
【０１３０】
反応後、増幅断片を、同体積のフェノール/クロロホルム（24/25）によって抽出し、1/10体積の3M酢酸ナトリウムおよび2倍体積の100％エタノールによって沈殿させた。沈殿DNAを、70％エタノールで洗浄し、遠心分離し、風乾させた。産物をddH2Oに溶解し、-20℃で保存した。
【０１３１】
D．組換えpMS-hspの調製
HspプロモーターのPCR産物およびクローニングベクターpHygEGFPを、BglIIおよびXhoIによって16時間個別に消化した。得られた断片を、DNA電気泳動によって分離し、QIAquick（登録商標）GEL EXTRACTION KITで抽出した。ベクターおよびHspプロモーターを、1：3の比で混合し、最終体積10μlまでddH2Oを添加した。16℃で16時間ライゲーションを行った。ライゲーション後、形質転換のために、5μlの反応物を100μlのECOSTM大腸菌コンピテント細胞DH5αに添加した。6215bpのプラスミドをスクリーニングし、PCRで確認した。組換えプラスミドpMS-hspを得た。
【０１３２】
E．モナスカスプロトプラストの調製
モナスカス胞子溶液を、PDAスラントにプレートし、30℃で5〜7日間インキュベートした。胞子を滅菌水で剥ぎ取り、2層滅菌ミラクロスで濾過して菌糸および寒天を除去した。濾過した胞子を、光学顕微鏡下で血球計算板によって計数した。胞子を、50mlのVogel改変培地中に107胞子/mlの濃度で採取し、200rpmで振盪しながら30℃で16〜18時間インキュベートした。発芽胞子を、2層ミラクロスで濾過し、滅菌水で洗浄した。酵素消化緩衝液で発芽胞子を濯いだ。
【０１３３】
ミラクロス上の菌糸を、10mlの酵素消化緩衝液で洗浄し、5mlの酵素混合物に添加した。混合物を室温で30分間振盪した。菌糸から90％のプロトプラストが放出されるまで、振盪の間10分毎に光学顕微鏡下で細胞壁の分解を観察した。混合物を、2層ミラクロスで濾過し、濾過溶液を4℃、1500rpmで15分間遠心分離してプロトプラストを回収した。上清を破棄し、ペレットを酵素消化緩衝液で2回洗浄し、STCで2回洗浄した。1.5mlのSTC、20μlのDMSO、および0.4mlのPTCを溶液に添加し、プロトプラストを顕微鏡で計数した。プロトプラストは、107プロトプラスト/mlの濃度で分配し、-80℃で保存した。
【０１３４】
F．形質転換
プロトプラストを、STCで2回洗浄し、4℃、1500rpmで15分間遠心分離した。上清を破棄し、プロトプラストのペレットを、50μlのSTCに溶解した。1〜10μgのプラスミドDNAを溶液に添加した。200Ω、25μF、0.7KVの条件下で、電気形質転換を行った。次いで1mlの再生緩衝液を混合物に添加し、混合物を30℃で一晩静置した。30μg/mlのハイグロマイシンBを含む50℃のtop寒天10mlを添加し、混合物を30μg/mlハイグロマイシンBを含むtop寒天上に注いだ。30℃で3〜5日の培養後、形質転換体が認められた。
【０１３５】
G．形質転換体のスクリーニングおよび確認
（1）形質転換体の数個の菌糸および胞子をスライドガラス上にサンプリングし、1滴の蒸留水を添加し、カバーガラスで覆い、光学顕微鏡下で観察した。GFPフィルター下に菌糸および胞子の緑色蛍光が認められた（励起430〜510nm；発光475〜575nm）。
【０１３６】
（2）形質転換体を、200rpmで振盪しながら5〜10日間30℃のPDB（ポテトデキストロースブロス）中で成長させた。培養物をホモジナイズし、染色体DNAを抽出した。HPH-EGFP特異的プライマーを使用してPCRを行い、1740bpの産物を得た。
【０１３７】
H．プロモーター活性を有する最小断片の確認
プロモーター活性を有するHspプロモーター（1478bp）の最小断片をさらに確認するために、Hspプロモーターの1036bp、720bp、および497bpの断片を有するPCR産物をpMS-Hspから調製した。これらのPCR産物の調製のためのプライマーを以下に列挙する。
2005168504.tif 000020
【０１３８】
Hspプロモーターの1478bp、1036bp、720bp、および497bpの断片を有するPCR産物を発現ベクターにクローニングし、モナスカス BCRC 38072を形質転換し、Hygr 30μg/mlを含むPDAプレートでスクリーニングした。結果を以下に示す。
【０１３９】
2005168504.tif 000021
1：R：耐性；N.R.：非耐性
2：＋：陽性；−：陰性
N.D.：検出されず
【０１４０】
プロモーター活性を有する最小断片は497bpである。497bpの断片を含む形質転換体中で蛍光を検出することができる。
【０１４１】
これらのプラスミドでモナスカス・ピロサス BCRC 31527およびアカパンカビ BCRC 32685も形質転換し、Hygr 50μg/mlまたは200μg/mlを含むPDAプレートでスクリーニングした。結果を以下に示す。
【０１４２】
2005168504.tif 000022
1：R：耐性；N.R.：非耐性
2：＋：陽性；−：陰性
【０１４３】
プロモーター活性を有するHspプロモーターの最小断片は497bpであることが確認され（配列番号：24）、モナスカス BCRC 38072、モナスカス・ピロサス BCRC31527、およびアカパンカビ BCRC326で発現させることができる。
【０１４４】
他の態様
下流領域中に標識遺伝子を含むプロモーター配列の態様をPCR増幅およびライゲーションすることによって発現ベクターの態様を得ることができる。標識遺伝子は、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはhyg-GFPであってよく、発現ベクターを、形質転換スクリーニング（例えば、遺伝子クローニング効率の評価）のためのマーカーとして構築する。
【０１４５】
タンパク質反応または標的タンパク質中の活性部位のインビボまたはインサイチュー検出のために、プロモーター配列の態様を、その下流領域で標識遺伝子および所望の標的遺伝子とライゲーションすることもできる。
【０１４６】
本発明の発現系、形質転換体、およびタンパク質発現方法の態様では、プロモーターを、その下流領域で所望の酵素遺伝子（プロテアーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、フィターゼ、グルコアミラーゼなど）とライゲーションすることができる。この系を使用して、これらの酵素の産生時間を短縮することができ、産生率を非常に増加させることができる。例えば、モナスカスプロテアーゼの産生速度の増大により、培養培地としてのダイズの有効性が増大し、費用を削減することができる。さらに、モナスカスアミラーゼの産生速度の増大により、ワイン製造時のモナスカスの糖化が増大し、新規のワインの工程および開発が改善される。
【０１４７】
発現系、形質転換体、およびタンパク質発現方法の他の態様では、プロモーターを、その下流領域に二次代謝産物の遺伝子（ポリケチドシンターゼ遺伝子または非リボゾームペプチドシンターゼ遺伝子など）とライゲーションすることができる。この系により、二次代謝産物の産生時間を早め、それにより産生速度が増大し、費用が大幅に削減される。
【０１４８】
さらに、転写アクチベーター遺伝子を、ベクター中のプロモーターの態様の下流に挿入することができ、アクチベーターによって調節される遺伝子を、過剰発現したアクチベーターによって活性化することができ、それにより、産生速度が大幅に増大する。
【０１４９】
本発明を、実施例および好ましい態様によって説明しているが、本発明はこれらに制限されないと理解すべきである。
【０１５０】
参考文献
その他の文献は、以下に示す通りである。
1. Lakrod K., Chaisrisook C. および Skinner D. Z. (2003) Transformation of Monascus purpureus to hygromycin B resistence with cosmid pMOcosX reduces fertility, Electronic Journal of Biotechnology 6(2): 143-7
2. Campoy S, Perez F, Martin JF, Gutierrez S および Liras P. (2003) Stable transformants of the azaphilone pigment-producing Monascus purpureus obtained by protoplast transformation and Agrobacterium-mediated DNA transfer. Crr Genet: 43(6):
3. Lakrod K, Chaisrisook C および Skinner DZ. (2003) Expression of pigmentation genes following electroporation of albino Monascus purpureus. J Ind Microbiol Biotechnol 30(6): 369-74
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
先の説明および以下の添付の図を参照することにより、本発明の態様をさらに十分に理解することができ、さらなる利点が明らかになる。
【図１】acuFプロモーター領域の態様についての手順を示す。
【図２】acuFプロモーター領域の態様の組換えベクターを示す。acuFプロモーター領域の態様をベクターpHygEGFPにクローニングし、組換えベクターpMS-acuFとした。
【図３】pMS-acuF形質転換後のEGFP発現を示す。図3A：明視野；図3B：蛍光フィルター下。
【図４】Hspプロモーター領域の態様についての手順を示す。
【図５】Hspプロモーター領域の態様の組換えベクターを示す。Hspプロモーター領域の態様をベクターpHygEGFPにクローニングし、pMS-hspとした。
【図６】pMS-hsp形質転換後のEGFP発現を示す。図6A：明視野下；図3B：蛍光フィルター下。
【図７】PCR産物の電気泳動を示す。レーン1：1 kbマーカー（Bio-1 kb(商標) DNAラダー）；レーン2〜5：形質転換体No.1〜4；レーン6：BCRC 38072野生型、(-)対照；およびレーン7:pHygEGFP、(+)対照。
【図１】
2005168504.tif 000023
【図２】
2005168504.tif 000024
【図３】
2005168504.tif 000025
【図４】
2005168504.tif 000026
【図５】
2005168504.tif 000027
【図６】
2005168504.tif 000028
【図７】
2005168504.tif 000029
【配列表】
2005168504000001.app