(57)【要約】【課題】特定の細胞外マトリックス蛋白質、この蛋白質を使用する方法、およびこの蛋白質を用いて被覆した成形品を開示する。【解決手段】これらは、その上で成長する細胞における細胞付着およびヘミデスモゾーム形成を刺激し、胎児膵島細胞前駆体を含む、マトリックス上で成長した内分泌細胞前駆体は、生物学的機能および分化を維持する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内分泌前駆細胞を、ラミニン様蛋白質材料と接触させて培養することを含む、内分泌前駆細胞を成長させる方法であって、前記蛋白質材料が、
(a) 前記蛋白質材料なしで成長した内分泌前駆細胞に比較して前記細胞の良好な成長を促進することができ、
(b) ８０４Ｇ細胞によって分泌されるマトリックスの成分であり、
(c) その上で培養される上皮細胞におけるヘミデスモソーム形成を促進する能力を有し、
(d) コンカナバリンに結合し、
(e) ８０４Ｇ細胞によって分泌されるマトリックスを接種したウサギの血清中に存在するポリクローナル抗体によって結合される
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記内分泌前駆細胞が膵島細胞前駆体である請求項１記載の方法。
【請求項３】
培養の前に、胎児膵臓を酵素的に消化し、島様の細胞凝集体が形成されるまで、消化した膵臓を細胞培養培地中でインキュベートすることを更に含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記膵臓が哺乳動物に由来する請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記膵臓がヒトのものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記蛋白質材料が基体に付着しており、前記内分泌前駆細胞を前記蛋白質材料上で成長させる請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記蛋白質材料が８０４Ｇラット膀胱がん腫細胞によって生成されたものである請求項１記載の方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法により伸長した内分泌前駆細胞を準備し、前記伸長した内分泌前駆細胞をヒトを除く哺乳動物に移植することを含む、ホルモン生産細胞を生成する方法。
【請求項９】
前記細胞が膵島細胞である請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記ホルモンがインシュリンである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、腎臓、肺または肝臓中に、またはこれに隣接して移植される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記蛋白質材料が、８０４Ｇ細胞によって沈着するマトリックスの１５０ｋＤ、１４０ｋＤおよび１３５ｋＤの蛋白質を含む請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記１５０ｋＤ、１４０ｋＤおよび１３５ｋＤの蛋白質が８０４Ｇ細胞から単離される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記１５０ｋＤ、１４０ｋＤおよび１３５ｋＤの蛋白質が組み換えＤＮＡから製造される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記組み換えＤＮＡがヒト起源のものである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記組み換えＤＮＡがマウス起源のものである請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記培養工程が、前記細胞を伸長させるよう作用する請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細胞マトリックスに刺激された細胞付着およびヘミデスモゾームの構成
【背景技術】
【０００２】
背景
体の器官が形成される際には、これらは整然と組織化された配列で発達する。多くの場合、基底膜と呼ばれる平坦な小片状の結合組織によって、１つの種類の細胞群が他の種類の細胞から分離される。例えば皮膚においては、表皮細胞の表面層が、その下にある基底膜に付着する。皮膚の基底膜は、外側の表皮細胞と下部の真皮細胞との間のバリアーとして作用する。同様の細胞の配置は、消化管の内面にもある。
【０００３】
基底膜は、その上にある細胞集団の成長、付着、移動、修復および分化に関与している。基底膜においては次の３つの層が特定されている。それらは、a)その上にある細胞に近接して存在する電子顕微鏡的に明瞭な領域である希薄層（lamina lucida ）、b)幅20〜300 nmの電子密度の高い領域である稠密層（lamina densa）、および、c)定着フィブリル、微小繊維束およびコラーゲン繊維を含む網状層（sublamina densa）である。
【０００４】
現在では、多くの種々の種類の化合物が基底膜に局在化するとされている。このような化合物として、ラミニン、コラーゲンIVおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンがある（Verrandoら、Exp. Cell Res. (1987), 170: 116-128）。更に、特定の基底膜は、他の生物学的に活性な化合物、例えばニドゲンやエンタクチンを含む。
【０００５】
表皮細胞が基底膜に付着するための主要な細胞接着受容体は、α６β４と呼ばれている。この膜貫通受容体は、２つの蛋白質部分、α６およびβ４の組み合わせによって形成されている。α６およびβ４蛋白質は、インテグリンファミリーの一部であることが分かっている異なる遺伝子に由来する。
【０００６】
インテグリンは、多様なファミリーの細胞接着受容体である。ここまでに、インテグリンファミリーにおいて、約20の構成要素が発見されている。これらの分子は、体内での多くの種類の細胞接着現象に関与している。インテグリンは、環境による信号を細胞における指示に翻訳するシグナル化分子である。更に、インテグリンは、シグナルを細胞内から細胞外へと逆の方向に伝えることもできる。これは、リンパ球のような非接着性細胞において示されている。
【０００７】
Ｔ細胞抗原受容体またはCD3 複合体の刺激により、そのそれぞれのリガンドに対する所定のインテグリンの親和力が増加する。残念ながら、接着性の細胞においては、インテグリンの親和力の変化は、説明するのが困難である。しかしながら、分化する表皮ケラチン細胞におけるある種のインテグリンの親和力の変化が、Adams らによって記載されている（Cell, 63: 425-435, 1990 ）。このために、他の受容体の活性化または分化によって開始される細胞の状態の改変は、インテグリンの親和力に影響を与える可能性があり、更に最終的には、細胞の接着挙動に影響を与える可能性がある。更に、表面への接着の結果として、インテグリンは、細胞の形状または移動の変化に大きく寄与する可能性がある。
【０００８】
多くの上皮細胞は、ヘミデスモゾーム（半接着斑、hemidesmosome ）と呼ばれる接合部を介して、その下にある細胞外マトリックスと相互作用する（Staehelin, (1974) Int. Rev. Cytol., 39: 191-278 ）。最近数年間の間に、この接合部の生化学的特徴付けについて相当な進展が見られた（Schwartzら、(1990) Annu. Rev. Cell Biol., 6: 461-491）。
ヘミデスモゾームは、中間フィラメントや定着フィブリルのようなその随伴する構造体と共に、接着複合体を形成する。上皮−結合組織相互作用の破壊は、多くの場合、ヘミデスモゾーム複合体の破壊を伴う。例えば、上皮細胞−結合組織の相互作用が異常となる連結性表皮水疱症のようなある種の水疱性皮膚疾患においては、ヘミデスモゾームの基底膜帯域随伴成分の生化学的変化または喪失があることが提唱されている。
【０００９】
ヘミデスモゾームの２つの高分子量の細胞内成分が同定され、水疱性天疱瘡に罹患した患者由来の抗血清を用いて特徴が調べられている。この自己免疫疾患は、同時にヘミデスモゾームの完全性の喪失を伴う、上皮細胞と結合組織との間の相互作用の破壊に帰着するものである（Champmanら、(1990) British. J. Dermatol., 123: 137-144）。よって、水疱性天疱瘡の患者は、ヘミデスモゾームの成分に対する抗体を生成していたことが見出されている。２つのヘミデスモゾームに関連する水疱性天疱瘡（bullous pemhigoid, BP ）抗原が、既に報告されている（Klatteら、1989）。
【００１０】
１つのBP抗原は、ヘミデスモゾームのプラーク（plaque、斑）の細胞骨格要素に対するアンカーとして作用し得る230 kDのポリペプチドである（Jones とGreen, 1991 ）。第２のBP抗原は、コラーゲン様の細胞外ドメインを有するタイプII膜蛋白質である（Giudice ら、1991; Hopkinson ら、1992）。更に、ヘミデスモゾームとその下にある結合組織との相互作用は、α６  β４  インテグリンヘテロ二量体を必要とすることが示されている（Stepp ら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8970-8974; Jones ら、(1991) Cell Regul., 2: 427-438; Sonnenbergら、(1991) J. Cell Biol., 113: 907-917; Kurpakusら、(1991) J. Cell Biol., 115: 1737-1750）。α６  β４  ヘテロ二量体は、ラット膀胱がん腫細胞ライン804Gの基部表面に沿ってヘミデスモゾームに局在化するとされた（Jones ら、Cell Regulation (1991), 2: 427-438）。これらの結果は、インテグリン（例えばα６  β４  ）は、ヘミデスモゾームの構成（assembly）および接着機能において重要な役割を果たしている可能性があることを示唆している。
【００１１】
従来技術における種々の試みは、基底膜に見出される接着促進蛋白質を精製することに焦点を合わせたものであった。例えば、Burgesonら、特許協力条約出願（第WO92/17498号）には、カリニンと呼ばれる蛋白質が開示されている。カリニンは、基体に対する細胞の接着を促進すると言われているが、この物質は、ヘミデスモゾーム形成に関しては明らかに不活性である。Marinkovich ら、J. Cell Biol. (1992), 119: 695-703（k-ラミニン）、Rouselleら、J. Cell. Biol. (1991), 114: 567-576 （カリニン）、および、Marinkovich ら、J. Biol. Chem. (1992), 267: 17900-17906 （カリニン）を併せて参照することができる。
【００１２】
同様に、93.5kD〜150 kDの範囲のポリペプチドにより構成される約600 kDの基底糖蛋白質が同定されており、GB3 またはニセインとして知られている。例えば、Verrandoら、Biochim. Biophys. Acta (1988), 942: 45-56 、およびHsi ら、Placenta (1987), 8: 209-217 を参照することができる。これらの物質の内で、試験管内または生体内において、ヘミデスモゾームの形成を生ずるのに有効なものはない。
【００１３】
組織培養用プラスチック上で試験管内で培養した場合、大半の上皮細胞は、前記したヘミデスモゾームのプラークおよび膜貫通成分の全てを発現すると認められるにも拘わらず、実際にはヘミデスモゾームを構成しない。実際に、通常の培養条件下で試験管内でヘミデスモゾームを容易に構成する能力を有するものとして、804Gのような細胞ラインが発見されたのはつい最近である（Riddelleら、(1991) J. Cell Biol., 112: 159-168; Hieda ら、(1992) J. Cell Biol., 116: 1497-1506）。このような細胞により、最終的に、ヘミデスモゾーム構成の動力学の詳細な細胞的および生化学的解析が可能となりつつある。
【００１４】
例えば、抗ヘミデスモゾーム抗体による基層関連染色は、試験管内で創傷部位に入る804G培養細胞において大きく減少することが報告されている（Riddelleら、(1992) J. Cell
Sci., 103: 475-490 ）。しかし、創傷の閉鎖が完全となるにつれて、基層付着表面に沿った抗ヘミデスモゾーム染色は、細胞内で明白となった。
【００１５】
しかしながら、種々の成長因子で処理した後であっても、多くの上皮細胞が、通常の様式では組織培養皿に付着しない。これらの細胞は、正常なヘミデスモゾームを生成しないか、または生体内での表現型のようには成長しない。細胞がその正常な表現型を維持しながら、試験管内で上皮細胞の成長を維持し得る系があれば、甚だしい利点が得られる。
【００１６】
約２百万のアメリカ人が、タイプＩ（インシュリン依存性）の糖尿病に苦しめられている。この疾患では、膵臓の膵島細胞内に見出されるインシュリン分泌性β細胞が破壊される自己免疫障害のために、膵臓がインシュリンを分泌する能力を喪失している。インシュリンの注射によりβ細胞の破壊を補償することはできるが、血中の糖レベルはなお大きく変動し得る。血液からグルコースを取り込む能力が損なわれる結果、毒性の生成物が蓄積する副作用が起こり、失明、腎臓疾患、神経障害、更に最終的には昏睡および死亡を含む合併症に至ることとなる。
【００１７】
研究者らは、少量でより頻繁なインシュリンの投与や膵臓の作用を模倣する機械的ポンプを試みているが、結果は理想的なものからほど遠い。他の選択肢である膵臓移植は、大手術を必要とし、多くの合併症を伴うものである。更に、ドナー膵臓の数が限られていることにより、相当な数の糖尿病患者が移植の希望を持つことなく放置されている。
【００１８】
よって、最も有望な選択肢は、死体またはヒト胎児由来の組織を使用する膵島細胞の移植である。この方法は程々の成功を収めている。世界中で行われている死体からの移植の内、移植された組織は、約20% の受容者においてまる１年生存している。このような受容者の内10人は今やインシュリンに依存性せず、また、他はインシュリンの必要性が大きく減少している。膵島細胞の移植に随伴する主要な問題には、免疫系による拒絶および自己免疫障害があり、これにより最初に疾患が生じ、チェックされないまま放置されると、移植した膵島細胞もが破壊されることとなる。
【００１９】
膵島様細胞クラスター（islet-like cell clusters, ICC）は、異種の細胞集団により構成されている。分化して内分泌組織、外分泌組織および腺管組織を形成する上皮細胞に加えて、このクラスターは、多くの間質細胞、一次繊維芽細胞および内皮細胞を含む。多数の間質細胞が存在することは、細胞当たりのインシュリン含有量のような分化の重要な尺度を定量するのが困難となるために、問題を複雑なものとしている（Beattie ら、(1991) J. Clin. Endocrinol. Metab., 73: 93-98 ）。また、ICC由来の内分泌前駆細胞に対する成長因子および分化因子の効果が、間質細胞の存在によって複雑なものとなっている。
【００２０】
胎児の膵臓組織は、膵島細胞の供給源として、成人の膵臓に対して、質量の割には膵島の含有量が大きく、内分泌細胞がより未成熟であり、成長の能力が大きいことなどの幾つかの利点を有している（Vossら、(1989) Transplantation Proc., 21: 2751-2756 ）。胎児の膵島細胞移植体が、血中糖レベルを制御する多数の患者において、糖尿病のインシュリン依存性を劇的に低減または除去し、これにより最も重篤な糖尿病性合併症を最小限度とすることが望まれている。
【００２１】
膵臓の膵島細胞を培養する初期の試みは、繊維芽細胞の混在のため、複雑なものであった（Leach ら、(1973) J. Endocrinol., 59: 65-79）。部分的に消化した胎児膵臓を使用してICCが製造されていたが、膵臓当たり100 〜200個しか得ることができないために、こ
れらのクラスターの臨床使用は限定されている（Sandler ら、(1985) Diabetes, 34: 1113-1119; Otonkoski ら、(1988) Acta. Endocrinol., 118: 68-76）。Kover とMoore （Diabetes, 38: 917-924, 1989 ）は、17週の胎児膵臓から200 〜300 個の膵島を得たが、臨床的に有用であるにはなお十分ではなかった。Simpson ら（Diabetes, 40: 800-808, 1991 ）は、ウシ角膜マトリックス上で培養したヒト胎児膵臓の、インシュリン分泌性で繊維芽細胞を含有しないモノレイヤーを生成することができたが、臨床移植のために適切な数の細胞はなお得られなかった。種々の膵臓ホルモンについて、陽性に染色されるのはクラスター内の少数の細胞のみであるにも拘わらず、これらは、ヌードマウスに移植した後に、成熟した内分泌細胞へと効率的に分化する（Sandler ら、(1985) Diabetes, 34: 1113-1119）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
現在の技術では、日常的な移植のために十分な細胞を製造し得ないことから、移植のために利用可能な膵島細胞のプールを拡張することが望まれている。
【００２３】
発明の要旨
本発明の１つの態様は、哺乳動物の生体内での使用に適合した、生体適合性の成型品と、成形品上のヘミデスモゾーム形成促進蛋白質組成物とを含む製造物品である。有利には、物品上の蛋白質組成物は、上皮起源の腫瘍細胞ラインによって沈着させる。好ましくは、この細胞ラインは、ラットがん腫細胞ライン804GまたはNBTII である。この好適な態様の一つでは、蛋白質組成物は、細胞ライン804Gによって沈着する細胞外マトリックスの約100 kD、135 kD、140 kD、150 kDおよび400 kDの蛋白質の少なくとも１腫を含む。この物品は、有利にはコラーゲン、再生コラーゲンまたはポリ乳酸により被覆することができ、生体適合性の金属で作製するか、またはこれを用いて被覆することができる。好ましくは、金属は、ステンレス鋼またはチタンである。あるいは、セラミック材料を用いて物品を作製または被覆することができる。好ましくは、この材料はヒドロキシアパタイトである。この好適な態様のもう一つでは、合成高分子を用いて物品を作製または被覆する。好ましくは、この高分子はポリエステルまたはナイロンである。
【００２４】
本発明の他の態様は、哺乳動物細胞を成長させるための組成物である。この組成物は、医薬的に許容し得るキャリヤー中に、哺乳動物細胞の細胞外マトリックス蛋白質を含み、この蛋白質は、この蛋白質に接触する細胞におけるヘミデスモゾーム形成を促進する性質を有する。
【００２５】
本発明の別の態様は、実質的に単離された形態の、細胞ライン804Gによって沈着する蛋白質性細胞外マトリックス蛋白質である。
【００２６】
本発明の更に他の態様は、配列番号：１の配列を含む150 kDの804Gマトリックス蛋白質から本質的になる、ヘミデスモゾーム促進活性を有する単離されたポリペプチドである。
【００２７】
他の好適な態様では、成形品上で表皮細胞を培養し、皮膚成長促進条件下で細胞を成長させることを含む、同種移植用皮膚を製造する方法が提供される。
【００２８】
この発明の更なる態様は、804Gマトリックスを用いて表面を被覆することを含む、目標表面に対する表皮細胞の接着を促進する方法である。好ましくは、細胞は歯周細胞である。この好適な態様の一つでは、細胞接着は生体外で起こるものである。あるいは、細胞接着は生体内で起こり得る。
【００２９】
本発明の他の面では、804Gマトリックス中に見出される１種以上の蛋白質の存在下に細
胞を培養することにより、内分泌前駆細胞の成長を増強させる方法が提供される。好ましくは、内分泌前駆細胞は、膵島細胞の前駆体である。更にこの態様によれば、培養の前に、胎児膵臓を酵素的に消化し、島様の細胞凝集体が形成されるまで、消化した組織を培地中でインキュベートすることが提供される。好ましくは、膵臓は哺乳動物のものである。最も好ましくは、膵臓はヒトのものであり、804Gマトリックス蛋白質は、基体に付着した固相蛋白質である。この発明の他の面によれば、804Gマトリックスがラット膀胱がん腫細胞由来のものである。
【００３０】
この発明の他の態様は、伸長した内分泌前駆細胞を生成し、これらの細胞を哺乳動物に移植することにより、ホルモン生産細胞を生成する方法である。好ましくは、これらの細胞は膵島細胞であり、ホルモンはインシュリンであり、移植部位は腎臓、肺または肝臓である。
【００３１】
また本発明によれば、好ましくは胎児膵島前駆細胞である伸長した内分泌前駆体細胞が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
詳細な説明
本発明は、後にマトリックス上で成長させる他の細胞において細胞接着およびヘミデスモゾームの構成を刺激し得る細胞外マトリックスを、ある種の細胞ラインが生産するという発見に基づくものである。この種の細胞ラインの１つは、膀胱がん腫細胞ライン804Gである。この細胞ラインはIzumi らにより記載され（Cancer Res., 41: 405-409, 1981）、発明者であるJonathan C. R. Jones（この者から細胞ラインを容易に入手することができる）の研究室の永久コレクションとして維持されている。この細胞ラインは、Ryoichi Oyasu 、病理学部、ノースウエスタン大学メディカルスクール、イリノイ州シカゴ、からも入手可能である。804G細胞ラインは、1994年２月24日になされたブダペスト条約の特許寄託により、受託番号ATCC CRL 11555として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州ロックビル、USA でも維持されている。
【００３３】
特に有用な804Gマトリックス蛋白質（150 kD蛋白質）の一部を配列決定した。その部分配列を配列番号：１として本明細書に示す。本発明は、配列番号：１の配列を含む150 kDのヘミデスモゾーム形成促進蛋白質を包含するものである。
【００３４】
804Gマトリックスは、多数の細胞に、成熟したヘミデスモゾームを発達させると共に、その成長基体に付着させることを示す超微細構造に関するデータが得られている。更に、804Gマトリックスは、ヘミデスモゾームの構成に関与する新規なラミニン様分子を含むことが見い出されている（従来技術で精製されたラミニンおよび関連する分子とは異なる）。
【００３５】
従って、その上で維持された関連しない細胞においてヘミデスモゾーム抗原の組織化を変調させ得る新規なマトリックスは、804G細胞のような細胞によって生産ないし調製することができる。この効果は、本発明のマトリックス上で維持された細胞において接着プラーク成分の局在性が明らかに変化しないため、ヘミデスモゾームの要素に特異的であると認められる。
【００３６】
この新しい発見を説明するために、マウス804Gマトリックスが、ヒト表皮がん腫（SCC12 ）細胞において「成熟」ヘミデスモゾームの構成を誘導し得ることの証拠を示す。ヒトの組織に対してこのような絶大な効果を有する化合物をマウスの細胞から見い出すことは普通のことではないと考えられる。後により詳細に説明する実験において、ラットの尾部コラーゲン上でSCC12 細胞を成長させた対照実験と比較して、804Gマトリックス上で維持
したSCC12 細胞においては、ヘミデスモゾーム様構造の数の増加が見出された。更に、804Gマトリックスで成長させた細胞におけるこれらのヘミデスモゾーム様構造の大部分は、細胞基体と接触しており、基底デンスプレート（basal dense plate）を有していた。後者の構造は、成熟したまたは形成されたヘミデスモゾームの指標としてしばしば使用されるものである（KrawczykとWilgram, J. Ultrastruct. Res., 45: 93-101, 1973 ）。
【００３７】
804G細胞マトリックスの製造および単離に関する方法を特に記載するが、細胞の接着およびヘミデスモゾームの構成を支持する能力を有するあらゆる細胞マトリックスが、本発明の範囲内であると考えることができる。ネズミ膀胱がん腫細胞ラインNBTII （ATCC CRL
1655 ）のような他の細胞型に由来するマトリックスも、試験管内で付着およびヘミデスモゾームの構成を誘導することができると認められる。NBTII 細胞ラインも、1994年２月24日になされたブダペスト条約の特許寄託により、受託番号ATCC CRL 11556として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州ロックビル、USA で維持されている。「804Gマトリックス」という用語は、細胞の付着およびヘミデスモゾームの形成を刺激する能力を有するあらゆる細胞マトリックスに包括的に言及するものである。
【発明の効果】
【００３８】
本発明のマトリックスの活性成分について企図する１つの主要な使用は、細胞の成長および付着におけるものである。その上で細胞を成長させる基体を、マトリックスにより、またはそれを精製したヘミデスモゾーム促進成分により被覆する。その後、成長させる細胞を、基体上で培養するか基体に接触させ、マトリックス上で成長させる。試験管内および生体内におけるヒトの細胞を含むこのような細胞は、基体上で組織化された様式で成長し、ヘミデスモゾームを形成することとなる。ヘミデスモゾームの形成は、基体に対する細胞の付着を大いに増強するものであるため、重要な利点となる。更に、本発明のマトリックスを用いずに成長させた細胞と比較して、マトリックス上で成長させた細胞は組織化が有意に進行したものとなり、より組織に似たものとなる。
【００３９】
ここで使用する基体は、あらゆる所望の基体とすることができる。実験室用としては、基体は、ガラスまたはプラスチックのような単純なものとしてよい。生体内用としては、基体は、細胞がその上で成長できる任意の生体適合性の材料でよい。適切な基体材料には、例えば、コラーゲン、再生コラーゲン、ポリ乳酸、ステンレス鋼およびチタンのような生体適合性の金属、ヒドロキシアパタイトのような補綴材料を含むセラミック材料、ポリエステルおよびナイロンを含む合成高分子、生物学的分子が容易に接着し得る事実上あらゆる他の材料などの材料により作製されたか、または被覆された成形品がある。
【００４０】
本発明の特定の用途は、同種移植用皮膚の製造である。例えば、本発明の基体上に表皮細胞が接種される。このような細胞を、栄養素および成長因子など、従来の皮膚成長条件を使用して、基体上で成長させる。本発明の特徴、すなわち基体上でヘミデスモゾーム促進マトリックスを使用することにより、このマトリックスを使用しない従来技術に比べ、このような皮膚の生体外での成長が改良される。
【００４１】
また、本発明の特定の用途は、標的表面に対する表皮細胞の接着の促進である。例えば、歯科移植のための補綴体を804Gマトリックスにより処理し、歯周細胞の付着を刺激することができる。歯肉炎のような歯肉（接合上皮）疾患の治療のために、マトリックスを用いて既存の歯を同様に被覆することができる。編織または結合させたコラーゲンまたはポリ乳酸のような、シートまたは繊維の形態の天然または合成の生体受食性材料で基体を作製する場合は、マトリックス材料をその表面に塗布するか、または組成物と混合すればよい。その後、細胞（例えば表皮細胞）を生体外でマトリックス上に成長させ、移植可能または埋込可能な材料を形成するか、あるいは、材料を移植し、細胞を生体内で付着させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の特定の一態様では、成長中のマトリックス分泌細胞により直接、または特定の物品上へマトリックスを被覆することにより、マトリックスを適用する。本発明の特定の態様であるこのような物品には、上皮細胞に接触させて置かれるか、または上皮細胞を介して延びるあらゆる埋込可能な物品が含まれる。例えば、特に、個体の内部から皮膚を介して外部へ延びる物品が含まれる。このような物品には、電極、他のセンサー、針、カニューレ、カテーテル、腔部器具、縫合糸、骨固定用のピン、ねじ、プレートおよび棒体、歯科埋込体、口腔用または他の用途のためのチタンねじおよびソケット、組織増量剤を含む形成手術用具、および、美容用移植のための天然および人工の毛髪が含まれる。これらの物品の全ては、本発明の１種以上のヘミデスモゾーム促進蛋白質により被覆することができ、またはこれをその構造内に組み込むことができる。
【００４３】
また、本発明の範囲には、シリコーン、天然または合成のコラーゲン等のようなあらゆる適切な材料により作製された、移植可能なレンズを含む目に関する移植体も含まれる。更に、コラーゲンのコンタクトレンズまたは他の永久的なコンタクトレンズを、角膜へ永久的に付着させるために、本蛋白質またはマトリックスを用いて被覆または含浸することができる。
【００４４】
本発明の他の好適な態様は、多数の内分泌前駆細胞を成長させる方法である。特には、膵島細胞の前駆体に関する。例えば、糖尿病患者への移植のために、１種以上の804Gマトリックス型蛋白質の存在下で、胎児膵島様細胞クラスターを試験管内で成長させることができる。これらのマトリックス蛋白質は、移植のための胎児ICCの収率を増加させ得るため、より多数のこのような細胞の、確立した需要を解決し得るものである。NBTII ラット膀胱がん腫細胞ラインのマトリックスも、増加した表皮細胞の成長を促進することができることから、胎児膵臓ICCの成長のためのマトリックスとしてこれを使用することが、表皮細胞のヘミデスモゾーム形成を促進し得る細胞ラインによって分泌される全てのこの種の蛋白質を含む、この種のあらゆる「804G」マトリックス蛋白質と同様に、有利に想定される。更に、ICC 培養培地に成長因子を含有させれば、胎児膵臓ICCの収率が更に増加するであろう。
【００４５】
この結果得られる細胞クラスターは、哺乳動物、好ましくはヒトへの移植の後に、機能性の膵臓内分泌細胞へと分化し、インシュリン注射の必要性を低減または除去することとなろう。興味深いことに、804Gマトリックス蛋白質は種交差活性を有し、ラット膀胱がん腫由来のマトリックスであっても、ヒト組織において成長およびヘミデスモゾーム形成を促進する能力を有する。
【００４６】
804Gマトリックス蛋白質は、ヘミデスモゾームの形態形成、細胞外マトリックスとα６
β４  インテグリンの相互作用に関する研究に、また後記するラミニンB2t 様ラット分子のような新しいマトリックス成分の機能・構造解析にも有用である。実際、804Gマトリックスは、分子レベルにおける上皮細胞とその下にある結合組織との間のヘミデスモゾームに媒介された相互作用の特定を可能とする道具であることが証明される。
【００４７】
本発明の804Gマトリックスは、約135 kD、140 kD、150 kDおよび400 kDの４つのコンカナバリン結合性グリコシル化蛋白質と、約100 kDのグリコシル化されていない非コンカナバリン蛋白質とから構成され、これらの全ては、804Gマトリックスに対して産生したポリクローナル抗体によって認識される。本発明は、804G細胞由来の完全で活性なマトリックスを用いて、または他の細胞由来の機能的に等価なマトリックスを用いて実施することができ、更にヘミデスモゾーム形成を促進するマトリックスの個々の蛋白質成分のいずれか１つを用いて実施することもできる。（この種の成分は、本明細書に記載する方法に従い
、それぞれの成分を単離し、これを試験することにより実験的に決定することができる。）
【００４８】
活性なマトリックスおよびその活性成分に加えて、本発明は、このような材料で被覆された成形品も包含する。好ましくは、このような成形品は、ガラス以外の材料により形成し、シート、繊維、補綴体、金属物品、生体受食性物品、および埋込可能物品のような形態のものを含む。
【００４９】
更に、活性なマトリックスまたはその活性成分の医薬調製物も企図する。このような調製物はあらゆる適切な形態とすることができ、一般に周知の医薬的に許容し得るキャリヤーのいずれかと組み合わせた活性成分を含むものである。マトリックス材料は、適切なマトリックス沈着細胞を成長させた表面から、（例えば、掻き取り、剥ぎ取り、または低濃度のSDS を用いた処理により）回収することができる。あるいは、マトリックス材料は、合成により、または組み換えDNA 技術により、または沈着させたマトリックス材料の精製により調製することができる。このようなキャリヤーには、注射可能なキャリヤー、局所用キャリヤー、経皮用キャリヤー等が含まれ得る。調製物は、有利には軟膏、ゲル、クリーム、スプレー、分散物、懸濁物またはペーストのような局所投与のための形態とし得る。更に、調製物は、有利には従来と同様の組成および量で、保存料、抗細菌剤、抗カビ剤、抗酸化剤、浸透圧剤および類似する材料を含み得る。本発明の組成物を処方する際の補助として、Remington's Pharmaceutical Sciences 、第15版、マーク・パブリシング社、イーストン、PA (1975) を参照することができる。
【００５０】
最後に、基体上で、または、本明細書に企図する組成物を用いて、種々の種類の上皮細胞を成長させることができる。
【実施例１】
【００５１】
実施例１
804G細胞マトリックスの調製
804G細胞によって分泌されるマトリックスの生化学的特徴付けを開始するために、Gospodarowicz (1984)の手順に従った。簡略に説明すると、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、および10% FCS （ギブコ、グランド・アイランド、NY）を補充したアール塩を含むMEM中、ラット膀胱がん腫804G細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、MD、ATCC CRL 11555）を37℃で維持した。この培地は、約1.9 mMのCa２＋を含有するものである。
【００５２】
804G細胞を、プラスチックのペトリ皿またはガラスのカバーグラス上で集密状態となるまで成長させた。その後、培養培地を廃棄し、滅菌したPBS 中で細胞を洗浄した。滅菌した20mMのNH４  OH中で５分間処理した後、滅菌した蒸留水を用いて迅速に３回洗浄することにより、マトリックスから細胞を取り除いた。
【００５３】
10mMトリス、pH6.8 中の8M尿素、1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）溶液で可溶化することにより、マトリックスを基体から取り去った。当業者に公知の日常的な実験方法を使用し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により、804Gマトリックスポリペプチドのプロフィールを分析した。
【００５４】
約20μg の可溶化した804G細胞マトリックスを含む調製物を、アクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を行った。対照として、レーン当たり約20μg の取り除いた804G細胞の抽出物を、同様にアクリルアミドゲルにロードした。ゲル電気泳動の後、150 〜135 kDの分子量の範囲で、マトリックス調製物中に３つの主要なポリペプチドがあることが認められた。マトリックス調製物には、少量の100 kDのポリペプチドも存在していた。PAGEの後
、標準的な周知の方法によって、分離したポリペプチドをニトロセルロースに移した。染色した蛋白質サンプルのアミドブラック染色物がニトロセルロースに移り、ウエスタンブロットの手順が成功裏に完了したことが示された。
【実施例２】
【００５５】
実施例２
804Gマトリックスに対するコンカナバリンの結合
分離したマトリックス蛋白質を含むウエスタンブロットのニトロセルロースの小片を、コンカナバリンＡと共にインキュベートした。PBS 中の2%（w/v ）ポリビニルピロリドン溶液を用いて室温で30分間小片を最初にインキュベートすることにより、マトリックス分子に対する非特異的な蛋白質の結合をブロックした。ブロック緩衝液にコンカナバリンＡを添加した後、室温で穏やかに振盪しながらフィルターをインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP ）を添加し、コンカナバリンＡの結合を目視可能とした。
【００５６】
135 、140 、150 および400 kDの４つのマトリックスポリペプチドが、コンカナバリンＡによって認識された。当業界で公知のように、コンカナバリンＡの結合は、これらのマトリックス成分がグリコシル化されていることを示す。マトリックスに特異的なウエスタンブロット上の蛋白質を同定するために、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生させることとした。
【実施例３】
【００５７】
実施例３
804Gマトリックスに対するポリクローナル抗体の製造
前記したように尿素/SDSで可溶化した804G細胞マトリックスを標準的な方法によってウサギに注射することにより、抗血清を調製した。簡略に説明すると、可溶化した804Gマトリックスをフロイントのアジュバントと混合し、ウサギに注射した。HarlowとLaneにより詳述されたように（Antibodies: A LoboratoryManual 、第116 〜117 頁および第222 〜223 頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、NY）、１回の追加免疫注射の後に、３週間の間隔で血清を集めた。
【００５８】
単離したポリクローナル抗血清（J18 ）は、コンカナバリンＡに結合する４つの135 〜400 kDの分子種、および100 kDのポリペプチドを認識する抗体を有していた。したがって、４つの付加的なグリコシル化されたポリペプチドと共に、グリコシル化されていない100 kDの分子種がマトリックス中にあると考えられる。
【００５９】
ポリクローナル抗体を用いた実験の後、以下の方法によって804Gマトリックスに特異的なモノクローナル抗体を製造した。
【実施例４】
【００６０】
実施例４
804Gマトリックスに対するモノクローナル抗体の製造
可溶化した804G細胞マトリックスサンプルを数匹のマウスに注射することにより、804G細胞マトリックスに対するマウスモノクローナルIgG （5C5 ）を調製した。最初の注射の２週間後および３週間後に、804Gマトリックスを更に注射してマウスを追加免役した。最後の追加免疫から５日後、その脾臓を取り出し、標準的な技術を使用して（GalfreとMilstein, (1981) Meth. Enzymol., 73: 3-46 ）、ハイブリドーマを作製するために、単離した脾臓細胞とミエローマ細胞ラインSp2 とを融合させた。免疫ブロットおよびマトリックスサンプルに対する免疫蛍光反応性に基づいて、マトリックス要素に対する抗体を生産するハイブリドーマ細胞を選択した。HarlowとLane（1988）によって記載されたように、選択したハイブリドーマ細胞を限界細胞希釈により２回クローン化した。
【００６１】
マウスモノクローナルIgG 抗体（5C5 ）の１つを用いたウエスタンブロットでは、マトリックス調製物中の150 kDおよび140 kDポリペプチドのみが認識された。そこで、マトリックスにおける潜在的な蛋白質−蛋白質相互作用を検討するために、免疫沈殿の検討では、抗体5C5 およびJ18 血清を使用した。
【実施例５】
【００６２】
実施例５
マトリックスの免疫沈殿の検討
従来の方法論を使用し、804Gマトリックスの免疫沈殿を行った。簡略に説明すると、RIPA緩衝液（0.15 M NaCl、1% Triton X100、0.1% SDS、1%デオキシコール酸ナトリウム、10 mM EDTA、1 mMフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する0.1 M トリス−HCl 、pH7.2
）を用いて804Gマトリックスを処理し、遠心分離によって清澄化し、ウサギ血清J18 またはモノクローナル抗体5C5 と共にインキュベートした。当業者に公知の方法により、Staphylococcus aureusプロテインＡを用いて、得られた抗体−抗原複合体を免疫沈殿させた。
【００６３】
免疫沈殿させた分子をSDS-PAGEにより分離し、先に詳述した方法によりウエスタンブロットに移した。目視可能とするためにHRP と複合体にしたヤギ抗ウサギ抗体またはヤギ抗マウス抗体を用いて、ゲルのレーン１および２を免疫ブロットした。
【００６４】
ポリクローナルJ18 抗体は、マトリックスおよび5C5 免疫沈殿物の両方において類似する一群のポリペプチドを認識した。主要な蛋白質のバンドは、両方のサンプルにおいて、150 、140 および135 kDに認められた。この結果は、J18 血清は、マトリックスの主要な蛋白質の全てに対する抗体を含むことを示す。
【００６５】
5C5 抗体は、804GマトリックスおよびJ18 免疫沈殿物の両方において、主として150 kDおよび135 kDのポリペプチドを認識した。5C5 抗体は、明らかに、J18 血清抗体によって認識されたマトリックス中の全ての分子種を沈殿させた。これに対して、5C5 抗体は、マトリックス調製物およびJ18 血清免疫沈殿物の両方において、150 および135 kDのポリペプチドのみを認識した。5C5 抗体は、マトリックス蛋白質の大半を沈殿させることができたが、変性ゲル上では２つの蛋白質のみを特定したため、主要な蛋白質は、その通常の状態では互いに相互作用し会合するものであると考えられる。よって、これらの２つの主要な804Gマトリックス蛋白質は、先に同定した種々の蛋白質を含むサブユニットで構成されていると考えられる。
【００６６】
804Gマトリックスの蛋白質組成を検討するために、エンゲルブレス−ホルム−スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm, EHS）ラミニンの400 kDおよび200 kDの鎖に対するポリクローナル血清をプローブとして用いて、可溶化したマトリックス蛋白質のウエスタンブロットを検討した。
【実施例６】
【００６７】
実施例６
抗ラミニン抗体をプローブとして用いたマトリックス蛋白質のウエスタンブロット
EHS ラミニンの400 kDおよび200 kD鎖に対するポリクローナル抗体は、コラボラティブ・リサーチ・インコーポレーティド（Collaborative Research Incorporated, Bedford, MA ）から購入した。ラミニンの調製物（レーン当たり約10μg ）および可溶化した804G細胞マトリックスの調製物（レーン当たり約20μg ）を変性させ、SDS ゲル上で泳動した後、ニトロセルロースに移した。レーン１および２で泳動した蛋白質のアミドブラック染色物は、ニトロセルロースフィルターに移り、ブロットが成功したことを示した。
【００６８】
HRP 複合抗ラミニンポリクローナル抗体とインキュベートした結果、ラミニンのレーンでは強い反応性が得られたが、ラミニンポリクローナル抗体と804G細胞マトリックス調製物との間には検出し得る反応性は殆どなかった。関連する実験では、それぞれウサギポリクローナル抗804G血清J18 またはモノクローナル抗体5C5 の標識したサンプルを用いて、ウエスタンブロットを免疫ブロットした。これらの抗体は、ラミニンポリペプチドは何ら認識できなかったが、前記した先の実験から予期されるように、これらはマトリックス調製物中のポリペプチドを認識した。
【００６９】
ラミニンと804Gマトリックスとの間には、抗体交差反応性は殆どないと考えられる。このために、J18 抗804G抗体と反応性のポリペプチドを発現する遺伝子を単離することを試みた。
【実施例７】
【００７０】
実施例７
マトリックスポリペプチドに対応するクローンの単離
ヒトケラチン細胞のλgt11発現ライブラリーを、クロンテック・ラブス・インコーポレーティド（Clontech Labs., Inc., Palo Alto, CA ）から購入し、Huynh らに従って（DNA Cloning: A Practical Approach 、第Ｉ巻、D. Glover 編、IRL プレス、オックスフォード、1985）、804Gマトリックスポリクローナル血清J18 を用いて検索した。２つのクローンの融合蛋白質産物によって吸着された抗体が、804Gマトリックス調製物およびSCC12 細胞の全細胞抽出物において、140 kDおよび100 kDの分子量の分子種に対して反応性を示した。同様にJ18 血清を使用し、ラット804G発現ライブラリーを検索した。140 kD/100 kD ポリペプチド成分に対する抗体をエピトープにより選択した２つの独立したクローンが、ラミニンB2t と命名されたラミニンのB2鎖の最近同定された変種（Kallunkiら、(1992)
J. Cell Biol., 119: 679-695）の、ドメインIVにおける94残基、およびドメインI/IIにおける86残基の範囲に対して、85% を超える同一性を示した。B2t 変種は、EHS ラミニンには含まれておらず、したがって新しいサブユニットを示している。更に、ラット150 kD成分に対する抗体をエピトープにより選択した５つのクローンを単離した。
【００７１】
陽性のクローンを更に特徴付けるために、ニトロセルロースに結合した融合蛋白質のプラークリフト（plaque lifts）を使用し、抗体をエピトープにより選択した（Sambrookら、(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、NY）。cDNA挿入物をM13 ベクターにサブクローン化し、Sangerのジデオキシ鎖終止法により配列決定した（Sangerら、(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467）。GCG 配列解析ソフトウェアパッケージ（ウイスコンシン大学、バイオテクノロジーセンター、マジソン、WI）を使用して配列解析を行った。
【００７２】
140 kDa のクローンのヌクレオチド配列により、これはヒトラミニンB2t のドメインI/IIのアミノ酸550 〜810 に渡る領域をコードすることが明らかとなった。この実験は、マトリックスに随伴するポリペプチドのラミニンB2t 変種に対する交差反応性を示すものである。150 kDのクローンは、ショウジョウバエのラミニンＡ鎖（Garrisonら、(1991) J. Biol. Chem., 266: 22899-22904 ）に対する配列類似性を示す領域をコードしていた。ラット150 kD配列の294 アミノ酸（配列番号：１）とショウジョウバエのラミニンＡ鎖のアミノ酸残基2365〜2724（配列番号：２）との間の全体的な配列同一性は25% であり、ラットとショウジョウバエとの間の進化の差を考慮すれば、有意な重複である。配列番号：１は、ラミニンＡのイソフォームであるヒトメロシンのアミノ酸1634〜1970（配列番号：３）に対して21% の同一性も示した。
この実験の後、無傷の組織サンプルにおける804Gマトリックスポリペプチドの分布を確
認する試みを行った。
【実施例８】
【００７３】
実施例８
無傷の組織における804Gマトリックス抗原の免疫蛍光による局在性確認
5C5 モノクローナル抗体およびJ18 ポリクローナル抗体を使用し、免疫蛍光のために804G細胞を処理した。最初に、抗体とインキュベートする前に、804G細胞を固定し、20℃のアセトン中で２〜３分間抽出した。前記したように二重標識を行った。
【００７４】
先ず、一次抗体の混合物中で、カバーグラス上の細胞を37℃で１時間インキュベートした。PBS 中でカバーグラスを十分に洗浄した後、周知の方法により、ローダミンおよびフルオレセイン複合二次抗体の適切な混合物を被せた。エピ蛍光光学系を装着したツァイスのフォトミクロスコープIII により、処理した組織を観察する一方、二重蛍光共焦画像形成のためのアルゴンおよびHeNeレーザーを備えたツァイスレーザースキャン顕微鏡（LSM 10）（カール・ツァイス、ソーンウッド、NY）により、培養細胞を観察した。免疫蛍光分析における対照として、非特異的な抗体結合による染色を評価するために、二次抗体単独に加えて、通常のマウス、ラットまたはウサギのIgG と共に細胞をインキュベートした。
【００７５】
J18 血清、5C5 抗体、およびラミニンB2t 融合蛋白質を使用してJ18 血清から選択した抗体は、免疫蛍光顕微鏡分析により、ラットの上皮組織の凍結切片上で局在性が確かめられた。これらの抗体調製物は全て、上皮−結合組織相互作用の領域に沿って強い染色を示す。
【００７６】
前記した実験は全て、804Gマトリックスの構造と機能に関するものである。よってここまでで、804Gマトリックスペプチドは、B2t ラミニン変種と免疫学的に関連しており、マトリックス蛋白質に対する抗体は、上皮−結合組織接合部に見出されることが判明した。
【００７７】
本発明の１つの重要な点は、先に詳述した804Gマトリックスが、予期しないことに、試験管内で上皮細胞の成長を刺激し得る基体を提供することができることを見い出したことにある。804Gマトリックス上で成長した上皮細胞は、生体内での形態を示す正常な細胞から期待されるように、ヘミデスモゾームを生成することを見い出した。本発明のこの要点を説明するために、以下の実験を行った。最初に、SCC12 ヒト腫瘍細胞ラインを804Gマトリックス上で成長させ、試験管内での正常な成長についてのその可能性を評価した。
【実施例９】
【００７８】
実施例９
804Gマトリックス上で成長した上皮細胞の機能解析
ヘミデスモゾームの230 kDプラーク成分に対する抗体は、先に詳述されている（Klatteら、1989）。ヘミデスモゾームの180 kDタイプII膜要素の細胞質ドメイン（N-末端）に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、Hopkinsonら(1992)およびRiddelle ら(1992)により記載されている。β４  インテグリンサブユニットに対する抗体は、 テリオス（Telios、サンジェゴ、CA）から購入した。
【００７９】
SCC12 細胞を804G細胞マトリックス上で24時間維持し、通常の状況では試験管内でヘミデスモゾームを実際に構成しない腫瘍細胞ラインにおける、ヘミデスモゾーム蛋白質の局在性に対するマトリックスの影響を評価した。Carterら(1990)が可能性があると論じた、添加した細胞によるマトリックスの分解および／または修飾を最小にするために、試験を24時間で完了させることを選択した。それぞれの実験は少なくとも４回繰り返し、500 以上の細胞の分析を含むものとした。対照として、ガラスおよびラット尾部コラーゲンのような他のマトリックス上で、SCC12 を培養した。24時間後に、ヘミデスモゾームの230 kD
、180 kDおよびα６  β４  インテグリン成分に対する抗体を使用し、間接免疫蛍光のために細胞を処理し、804G細胞マトリックスに対する抗体を用いて二重標識した。
【００８０】
一次抗体の混合物中で37℃で１時間、カバーグラス上の細胞を先ずインキュベートした。カバーグラスをPBS 中で十分に洗浄した後、ローダミンおよびフルオレセイン複合二次抗体の適切な混合物を被せた。エピ蛍光光学系を装着したツァイスのフォトミクロスコープIII により、処理した組織を観察した。対照として、非特異的なバックグラウンドによる染色を評価するために、二次抗体単独に加えて、通常のマウス、ラットまたはウサギのIgG により細胞をインキュベートした。
【００８１】
ガラスおよびラット尾部コラーゲン上で24時間維持したSCC12 細胞では、230 kD、180 kD、α６  β４  インテグリンサブユニットは、その基層付着表面に沿って、細胞の周囲に局在していた。染色は、往々にして細胞の周囲を取り囲むぼやけたバンド、または細胞の縁部近傍の線状の縞に類似していた（Hopkinson ら、1991も参照することができる）。J18 血清における抗マトリックス抗体は、ラット尾部コラーゲン上で維持された細胞における細胞−基体相互作用の領域に沿って拡散性の染色を生成し、ヘミデスモゾーム抗体プローブにより生成される染色とは明白な相関関係はなかった。免疫蛍光によるSCC12 細胞に対するJ18 抗体の反応性は、ヒトラミニンB2t 融合蛋白質によりJ18 血清から選択した抗体を使用する陽性の免疫ブロットの反応性と一貫性のあるものである。J18 血清中の抗体は、ラット尾部コラーゲンのみを認識できないため、この結果は、SCC12 細胞自体が分泌するマトリックスに関する幾つかの情報を与えるものである。
【００８２】
804G細胞マトリックス上で維持されたSCC12 細胞では、ラット尾部コラーゲンまたはガラス上で維持された細胞で観察した場合と比較して、230 kD、180 kD、およびα６  β４
インテグリンは、劇的に異なる分布のパターンを示す。このようなヘミデスモゾーム抗体が生成するパターンは、前記したように同じ抗体を使用して免疫蛍光のために処理した804G細胞で認められるものと同様である。更に、この染色は、多くの場合において、J18 血清全体中の抗体によって生成されたようなパターンと一致するようである。
【００８３】
更に、5C5 抗体、またはラミニンB2t 融合蛋白質をエピトープとして選択されたJ18 抗体も、804Gマトリックス上で維持されたSCC12 細胞で局在化していた。これらの抗体の分布は、230 kDヘミデスモゾームプラーク成分の場合に匹敵するものであった。SCC12 細胞における230 kD抗原の分布が、5C5 およびエピトープにより選択された抗体によって生成した染色の分布を反映するものであることは注目される。
【００８４】
804G細胞マトリックス上で24時間維持したSCC12 細胞における230 kDおよび180 kDヘミデスモゾーム成分の両方の量が、他のマトリックス上で同じ長さの時間維持したSCC12 細胞と比較して変化するか否かを検討するために、免疫ブロット分析を行った。この方法で評価したところ、種々のマトリックス上で維持されたSCC12 細胞における230 kDおよび180 kDポリペプチドの両方の量に明白な差異はなかった。
【００８５】
ヘミデスモゾーム成分とは対照的に、ミクロフィラメント関連接着プラークの成分であるα５  β１  インテグリン複合体（Burridgeら、1988）は、ラット尾部コラーゲンまたは804G細胞マトリックスのいずれの上で維持されたかに関わらず、主としてSCC12 細胞の周囲細胞基層随伴表面に局在化する。
【００８６】
804Gマトリックス上での上皮細胞の成長の検討は、SCC12 細胞に限定されたものではない。正常なヒトケラチン細胞（ヒト包皮由来）、HaCaT （不死化した細胞）、およびSCC13 細胞も、804Gマトリックス上で成長させた場合、先に論じたSCC12 細胞と比較して、殆ど同一の応答を示した。これらの細胞型のそれぞれにおいて、804Gマトリックス上での成
長は、インテグリンの再分布および成熟したヘミデスモゾームの形成を導くものであった。
【００８７】
更に、NBTII 細胞ライン（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、MD、ATCC CRL 11556）が生産したマトリックス上で、前記したものと類似する実験を行った。これらの実験の結果は、804Gマトリックスについて示したものと実質上同一である。NBTII マトリックス上で成長した細胞は刺激を受けて、成熟したヘミデスモゾームを形成し、細胞内インテグリンを再分布させた。
804Gマトリックス上で上皮細胞を成長させる効果を更に検討するために、電子顕微鏡によりSCC12 細胞を調べた。
【実施例１０】
【００８８】
実施例１０
SCC12 細胞におけるヘミデスモゾームの構成に対する804G細胞マトリックスの影響の電子顕微鏡による検討
随所に記載されているように（Riddelleら、1991）、SCC12 細胞を固定し、電子顕微鏡観察のために処理した。基体に垂直に細胞の薄い切片を作製し、300 メッシュの電子顕微鏡グリッド上に載置し（Tousimis社、ロックビル、MD）、染色した後、JEOL 100CX電子顕微鏡により60kVで観察した。
【００８９】
ラット尾部コラーゲンまたは804Gマトリックス上で24時間維持したSCC12 細胞を、従来の電子顕微鏡法により調べた。この手順は、10ミクロンの間隔でその基体に垂直に切断したSCC12 細胞の薄い切片を、細胞の集団に渡って分析することを含むものである。この距離間隔で切片を評価することにより、同じヘミデスモゾームを２回以上観察する可能性を回避した。
【００９０】
ラット尾部コラーゲン上で24時間維持したSCC12 細胞では、細胞の周囲に向かってヘミデスモゾーム様構造が観察された。ラット尾部コラーゲン上でインキュベートした17個のSCC12 細胞では、９個のヘミデスモゾーム様構造が観察されたが、基底のデンスプレートを有するものはなかった。この計数は、306 ミクロンの距離に渡って行った（すなわち、SCC12 細胞の34ミクロンの下表面当たり１個のヘミデスモゾーム様構造）。近接して並置された３つのヘミデスモゾーム様構造が１枚の顕微鏡写真で見られたが、これは全く普通のものではない。ラット尾部コラーゲン上で成長したSCC12 細胞の多くの基底面の像では、ヘミデスモゾームは観察されなかった。
【００９１】
これに対して、103 個のヘミデスモゾーム様構造（その内92個が基底のデンスプレートを有する）が、804Gマトリックス上でインキュベートしたSCC12 細胞の断面像で観察された。この観察は、504 ミクロンの距離に渡って行った（すなわち、4.9 ミクロンのSCC12 下表面当たり１個のヘミデスモゾーム様構造）。ラット尾部コラーゲンを用いてインキュベートした細胞上で見られる「未発達の」ヘミデスモゾームとは異なり、これらのヘミデスモゾーム構造は細胞の周辺に限定されておらず、核の下部にも見い出された。SCC12 細胞は、その細胞質面に随伴した中間フィラメントの房状物を有することも認められた。
【００９２】
SCC12 細胞の電子顕微鏡観察に加えて、ヒトケラチン細胞、HaCaT 細胞およびSCC13 細胞で、ヘミデスモゾームの構成体を探索した。免疫蛍光実験に関連して先に説明したように、これらの他の哺乳動物の上皮細胞のそれぞれは、インテグリンの再分布および成熟ヘミデスモゾームの形成を開始した。電子顕微鏡による検討により、SCC12 細胞、ヒトケラチン細胞、HaCat 細胞およびSCC13 細胞に対する804Gマトリックスの影響の有意な類似性が明らかとなった。
【００９３】
804G細胞マトリックスは、可溶化後も上皮細胞の変化を誘導する能力を保持し得ることを示すために、可溶化したマトリックス要素を用いてガラスのカバーグラスを被覆した。
【実施例１１】
【００９４】
実施例１１
804Gマトリックス要素を用いたフォトリソグラフィ
単離したマトリックスサンプルが、ヘミデスモゾームおよびインテグリンの局在性の変化を誘導する能力を保持し得るか否かを決定するために、前記したように、804G細胞を成長させ、そのマトリックスから除去した。穏和なSDS 緩衝液（RIPA）を使用して可溶化し、マトリックスをその成長基体から取り去った。RIPA緩衝液中での可溶化の後に、リン酸緩衝溶液に対してマトリックス要素を十分に透析した後、Hockbergerら（J. Neurosci. (1988) 8(11): 4098-4120）により記載されたフォトリソグラフィ技術を使用し、顕微鏡的パターンでガラスのカバーグラスに被覆した。
【００９５】
簡略に説明すると、「フォトレジスト」を用いて、清浄なカバーグラスを先ずスピンコートした。フォトレジスト層の上にマスクを載置した後、UV光で照射した。マスクによって覆われていない全ての地点で、フォトレジストはガラスのカバーグラスに対してUV架橋された。その後、透析した804Gマトリックス要素をカバーグラス上に添加し、カバーグラスの全表面に沿って結合させた。アセトン処理によって、カバーグラスのUV架橋されていない領域から、フォトレジストおよびその結合したマトリックス要素を除去した。マスクとは逆の形状の804Gマトリックス要素の画成されたパターンが、更なる検討のために得られた。
【００９６】
本発明のマトリックスポリクローナル抗血清を使用する免疫蛍光による検討では、このようなカバーグラス上で成長したSCC12 細胞は、沈着した804G要素のパターンに対応する形状でヘミデスモゾームを形成することが示された。驚くべきことに、このカバーグラス上で成長したSCC12 細胞上のβ４  インテグリンの位置も、沈着したマトリックスのパターンに従うものであった。これは、穏和なSDS による変性および固体基体上への沈着の後も、マトリックスがその機能性を維持したことを示す。この手順に従うことにより、他の固体基体を804Gマトリックスで被覆し、上皮細胞におけるヘミデスモゾームの形成を刺激し得る。
【００９７】
よって、804G細胞マトリックスは、多くの種類の哺乳動物細胞において、付着およびヘミデスモゾームの構成を誘導できることが示された。
【実施例１２】
【００９８】
実施例１２
試験管内での胎児膵島細胞の伸長
冷却したHanks の平衡塩類溶液（HBSS）中で、ヒト胎児膵臓を１mmの小片に細断し、コラーゲナーゼＰを用いて水浴中37℃で15分間激しく振盪することにより消化する。HBSSを用いて４℃で数回洗浄した後、消化した組織を冷却したHBSSで洗浄し、10% のプールしたヒト血清および抗生物質を含有するRPMI-1640 培地中で、ペトリ皿に３日間置く。この操作に際しては、任意に成長因子を存在させる。
【００９９】
均一な大きさであり（50〜75μM 直径）、均質で半透明な外観を有する約50個のICCを手で選び取り、15% ウマ血清、5% FCS、抗生物質、および、任意に成長因子を含有するRPMI-1640 中で、804Gマトリックスまたはウシ角膜マトリックスで被覆した組織培養皿を用いて培養する。ICCは一夜で付着し、モノレイヤー形成は一般に24時間までに開始される。マトリックスのない場合またはウシ角膜マトリックスの場合と比較して、804Gマトリックス上で培養したICCの数が有意に増加することが観察される。
【０１００】
このような胎児内分泌細胞が、生体内でインシュリン生産細胞へと分化し得るか否かを調べるために、以下に記載するようにICCを移植する。
【実施例１３】
【０１０１】
実施例１３
ヌードマウスへのICCの移植
804Gマトリックス上で培養した実施例１２のICCを、無胸腺ヌードマウスの腎小体の下に移植し（マウス当たり約500 ICC）、３か月後に移植体を分析する。インシュリン前駆分子のプロセシングの後に血中に放出されるヒトC-ペプチドのレベルの増加が、ラジオイムノアッセイによって腹膜内グルコース投与後に、移植した動物の血中で検出され、これは、移植した細胞がインシュリンを生産可能であることを示す。更に、インシュリンに対する抗体を使用する移植細胞の免疫細胞化学分析により、前駆細胞がインシュリン生産細胞に分化していることが示される。
【実施例１４】
【０１０２】
実施例１４
糖尿病患者へのICCの移植
臨床的検討において最適化される数の胎児ICCを、ヒト糖尿病患者に投与する。恐らく、この数は、腎小体下部への移植によっても、または肝臓への直接注射によっても、成人由来細胞について使用する数である約２〜８×10５  に近いものとなろう。更に、他の正規の場所以外の器官位置での移植も企図される。C-ペプチドの産生および血中グルコースレベルを数か月に渡ってモニターし、移植した内分泌前駆細胞が、インシュリン生産細胞に分化したか否かを決定する。患者には、モニター期間の間もなおインシュリンを投与する。
【０１０３】
本発明は、詳細な説明に記載したような態様のみに限定されるものではない。本発明の精神を保持するあらゆる態様は、その範囲内にあると考えるべきである。本発明は、添付する請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【０１０４】
【配列表】
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