(57)【要約】【課題】  製造工程に加熱工程のない飲食品へも適用することができ、しかも、加圧履歴を有する飲食品に広く適用することができる、飲食品中への昆虫の混入時期の判定方法を提供すること。【解決手段】  飲食品中に混入した昆虫が、その混入後の雰囲気の相違、例えば飲食品の加圧履歴の有無等により生ずる昆虫体内の構成成分の残存量の変化の相違を測定することにより、昆虫の飲食品中への混入時期を判定する。昆虫体内成分の変化の測定としては、例えば、昆虫の主に複眼部分に含まれる色素成分及び胸部、脚部に含まれるタンパク質成分等の昆虫体の構成成分の残存量等が挙げられる。本発明の方法は、製造工程に加熱工程のない飲食品へも適用することができ、しかも、加圧履歴を有する飲食品に広く適用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
飲食品中に混入した昆虫のその後の雰囲気の相違により生じる昆虫体内の構成成分の残存量の変化の相違を測定して、昆虫の飲食品中への混入時期を判定することを特徴とする昆虫混入時期の判定方法。
【請求項２】
飲食品中に混入した昆虫のその後の雰囲気の相違が、混入後の加圧履歴の有無であることを特徴とする請求項１記載の昆虫混入時期の判定方法。
【請求項３】
昆虫体の構成成分が、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）であることを特徴とする請求項１又は２記載の昆虫混入時期の判定方法。
（ａ）昆虫複眼色素
（ｂ）昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質
【請求項４】
昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質の測定が、昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質の総タンパク質量又はミオシン量の測定であることを特徴とする請求項３記載の昆虫混入時期の判定方法。
【請求項５】
加圧履歴の有無が、炭酸ガスによる加圧履歴の有無であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の昆虫混入時期の判定方法。
【請求項６】
加圧履歴が、飲食品の製造工程における加圧履歴及び／又は飲食品の流通過程における加圧履歴であることを特徴とする請求項５記載の昆虫混入時期の判定方法。
【請求項７】
飲食品中に混入した昆虫を、洗浄後、昆虫頭部を取得し、酸の存在下で水抽出を行い、抽出液の色素量を測定することを特徴とする昆虫混入時期の判定方法。
【請求項８】
飲食品中に混入した昆虫を洗浄後、昆虫胸部及び／又は脚部を取得し、中性緩衝液下で抽出を行い、抽出液中の総タンパク質量、又は、ミオシン量を測定することを特徴とする昆虫混入時期の判定方法。
【請求項９】
飲食品が、炭酸アルコール飲料又は炭酸非アルコール飲料であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の昆虫混入時期の判定方法。
【請求項１０】
飲食品中に混入した昆虫が、ハエであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の昆虫混入時期の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食品中への昆虫の混入時期の判定方法に関する。より詳細には、炭酸性のアルコール飲料や非アルコール飲料のような加圧履歴を有する飲食品に広く適用することができる飲食品中への昆虫の混入時期の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲食品中に、昆虫の混入が発見された場合、いつの時点で昆虫が混入したかを判定することは飲食品製造業者にとって重要な問題である。すなわち、飲食品への昆虫の混入が飲食品の製造工程中であるのか、或いは、飲食品等の製品の流通販売後或いは開封（開栓）後、すなわち、製品使用時（飲食時）であるのかを正確に判定することは、その後の処置や対応に重要な影響を与える。例えば、もし昆虫の混入が飲食品の製造工程中であったことが明らかになった場合には、全ての製造工程を厳重に確認し、再度このような混入事故がないように対策を講ずる必要がある。
【０００３】
従来より、このような飲食品中への昆虫の混入時期の判定方法として、いくつかの方法が提案されている。まず、その一つの判定方法として、飲食品中に混入した昆虫等のカタラーゼ活性の有無を調べることにより、その昆虫等の混入した時期を判定する方法が提案されている（沼本敬直著「食品衛生研究」、２８．１、１９７８）。カタラーゼは、過酸化水素の分解反応２Ｈ2Ｏ2→２Ｈ2Ｏ＋Ｏ2を触媒する酵素であるが、カタラーゼは熱により失活すること、及び、カタラーゼが過酸化水素を分解し、酸素を発生するという性質を有していることから、この判定方法では過酸化水素水を昆虫等にかけて、酸素の泡の発生の有無によってカタラーゼ活性が残存しているかどうかを判断し、これにより昆虫の混入時期を判定している。飲食品の製造工程中で加熱処理が行われる飲食品から、昆虫等が発見された場合、その昆虫にカタラーゼ活性が残存していれば、その昆虫等は飲食品の加熱処理後に混入したことになる。この方法では、酸素の発生量の測定により、昆虫の死亡後のおおよその経過日数を判定することもでき、この過酸化水素の変化に応じた測定を行うために、過酸化水素の減少量を電気化学的に測定する方法も開示されている（特開２００３−１６９６９８号公報）。
【０００４】
次に、飲食品中に混入した昆虫等の混入時期の判定方法として、特に、その飲食品の製造工程中で加熱処理を行わない飲食品にも適用可能な方法が提案されている（緒方一喜、光楽昭雄著「食品・薬品の混入異物対策」新思想社、ｐｐ１８２−１９０、１９８４）。すなわち、この方法では、飲食品中に混入した昆虫自身の持つ酵素の減少度合いを比較することにより、死後日数（混入死亡してからの日数）を推定し、その昆虫が製造工程中において混入したのか、或いは、開封（開栓）後に混入したのかを判定する。この判定方法で使用される酵素としては、（１）日数が経つにつれて減少し続けること、（２）飲食品中での残存日数が長いこと、（３）昆虫の個体間で酵素量のばらつきが少ないこと等から、カタラーゼやコリンエステラーゼが挙げられている。
【０００５】
更に、飲食品中に混入した昆虫等の混入時期の判定方法として、上記のような昆虫体内に残存する酵素の活性を測定して昆虫等の混入時期を判定する方法の問題点、例えば、カタラーゼの場合は、活性値が死後再度増加するという問題、また、コリンエステラーゼの場合は、死後２０日以上経過しても活性の低下が少なく、耐久性が強すぎるという問題を解消するために、死亡昆虫のアセチルコリン・エステラーゼ（ＡＣｈＥ）の残存活性を測定し、その残存活性値から死亡後の期間を判定する方法が開示されている（特開平８−５６６９６号公報）。また、該方法のアセチルコリン・エステラーゼの残存活性の測定を、電気伝導度検出器付きイオンクロマト法により行う方法も開示されている（特開平１０−２５３６１１号公報）。
【０００６】
上記する飲食品中に混入した昆虫等の混入時期の判定手法の、従来の方法を整理すると以下のようになる。
（１）カタラーゼ活性測定法
飲食品の製造工程中で加熱処理が行われる飲食品から、昆虫等が発見された場合に、その昆虫に残存するカタラーゼ活性の有無で昆虫等の混入時期を判断する手法である。過酸化水素水を直接昆虫にかけ、酸素の泡の有無によって酵素が残存しているかどうかを判定する。視覚的に判定しやすい手法ではあるが、飲食品の製造工程中で加熱処理が行われる飲食品の場合しか適用できないこと、カタラーゼの活性値が昆虫の死後再度増加すること、及び、昆虫の体表に付着した微生物由来のカタラーゼ活性を検出してしまうという問題がある。
（２）コリンエステラーゼ活性測定法
昆虫の飲食品への混入死後、昆虫に残存するコリンエステラーゼ（カタラーゼを測定する場合もある）活性の値から混入時期を判断する手法である。この方法は、飲食品の製造工程中で加熱処理が行われない飲食品にも適用することができる。しかし、コリンエステラーゼの場合は、死後２０日以上経過しても活性の低下が少なく、耐久性が強すぎるという問題点がある（カタラーゼの場合は、上記と同様、活性値が死後再度増加するという問題がある）。
（３）アセチルコリン・エステラーゼ活性測定法
コリンエステラーゼ活性測定法と同様に、昆虫体内に残存する活性の値から死亡時期を判断する手法である。この方法は、飲食品の製造工程中で加熱処理が行われない飲食品にも適用することができる。室温で活性は経時的に減少していき、やがて失活する。コリンエステラーゼ活性に比べばらつきが少ない。しかし、例えば既に酵素が失活した昆虫の事後混入や、混入から調査まで長期間経過した昆虫に対する適用は困難である。
【０００７】
以上のように、従来の方法では、基本的には製造工程における加熱履歴を前提とした酵素の失活を指標とするもので、製造工程に加熱工程のない飲食品へは適用することができない手法であったり、或いは、製造工程に加熱工程のない飲食品へも適用することができるが、昆虫の死後の酵素活性の減少に問題があったり、酵素が失活した昆虫の事後混入や、混入から調査まで長期間経過した昆虫の場合の適用に問題があったりして、従来の方法は飲食品への昆虫の混入時期の判定方法として必ずしも満足のゆくものではなかった。
【特許文献１】特開平８−５６６９６号公報。
【特許文献２】特開平１０−２５３６１１号公報。
【特許文献３】特開２００３−１６９６９８号公報。
【非特許文献１】沼本敬直著「食品衛生研究」、２８．１、１９７８。
【非特許文献１】緒方一喜、光楽昭雄著「食品・薬品の混入異物対策」新思想社、ｐｐ１８２−１９０、１９８４。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、飲食品中への昆虫の混入時期を判定する方法を提供すること、より詳細には、炭酸性のアルコール飲料や非アルコール飲料のような製造工程に加熱工程のない飲食品へも適用することができ、更に、加圧履歴を有する飲食品に広く適用することができ、しかも、飲食品中への昆虫の混入時期を確実に判定することが可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、炭酸性のアルコール飲料や非アルコール飲料のように製造工程に加熱工程のない飲食品へも適用することができ、かつ、昆虫個体間でのばらつきの少ない、混入時期の確実な判定が可能な、飲食品への昆虫の混入時期の判定方法について鋭意探索した結果、飲食品中に混入した昆虫が、その混入後の雰囲気の相違、例えば飲食品の加圧履歴の有無等により生ずる昆虫体内の構成成分の残存量の変化の相違を測定することにより、昆虫の飲食品中への混入時期を確実に判定できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
昆虫体内の構成成分の残存量の変化の相違の測定としては、例えば、昆虫の主に複眼部分に含まれる色素成分及び胸部、脚部に含まれるタンパク質成分等の昆虫体の構成成分の残存量等が挙げられる。本発明の方法は、製造工程に加熱工程のない飲食品へも適用することができ、しかも、加圧履歴を有する飲食品に広く適用することができる。
【００１１】
すなわち、本発明者は、炭酸性のアルコール飲料や非アルコール飲料のような製造工程に加熱工程のない飲食品においては、昆虫の混入後の飲食品の加熱処理以外の処理の履歴の有無により、混入した昆虫の変化の相違を検知し、昆虫の混入時期を判定することが必要であると考えた。そこで、本発明者は、昆虫体内に存在する数多くの成分の中から(i)適度な耐久牲、(ii)昆虫個体間でのバラツキの少なさ、(iii)打栓等により密閉させた状態で減少の度合いに差異が生じるもの、(iv)測定が簡便なものを選択の条件として検討した結果、加圧履歴を経た飲食品を対象とした場合に、昆虫の主に複眼部分に含まれる色素成分及び胸部、脚部に含まれるタンパク質成分(例えばミオシン成分等)がその条件を満足させ、確実な昆虫混入時期の判定方法として、実用化できることを見い出した。この知見をもとに本発明の昆虫混入時期の判定方法を構築した。
【００１２】
本発明の昆虫の混入時期の判定方法は、その好ましい対象として、壜入りや缶入り等の炭酸性のアルコール飲料や非アルコール飲料等、或いは、レトルトの缶詰や袋詰食品等、密閉状態で加圧下にある（飲食品の流通過程における）、或いは、その製品の製造工程で加圧された履歴をもつ飲食品に対して適用されるものである。該飲食品において、開封後に死亡昆虫の混入が発見された場合、死亡昆虫のそれら体内成分の残存量を測定し、その測定値から昆虫が密閉された容器内に混入していたものかどうか（加圧された履歴）を判定することを可能とするものである。すなわち、本発明は、昆虫が、飲食品の製品の製造工程で混入し、密閉状態で加圧下にある雰囲気下に存在していたのか、或いは、その飲食品の利用時（飲食時）に密閉容器を開封した後に昆虫が混入したのかを、死亡昆虫体内成分の残存量等を測定し、その残存量等の相違から的確に判定するものである。
【００１３】
具体的には本発明は、飲食品中に混入した昆虫のその後の雰囲気の相違により生じる昆虫体内の構成成分の残存量の変化の相違を測定して、昆虫の飲食品中への混入時期を判定することを特徴とする昆虫混入時期の判定方法（請求項１）や、飲食品中に混入した昆虫のその後の雰囲気の相違が、混入後の加圧履歴の有無であることを特徴とする請求項１記載の昆虫混入時期の判定方法（請求項２）や、昆虫体の構成成分が、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）であることを特徴とする請求項１又は２記載の昆虫混入時期の判定方法。（ａ）昆虫複眼色素（ｂ）昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質（請求項３）や、昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質の測定が、昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質の総タンパク質量又はミオシン量の測定であることを特徴とする請求項３記載の昆虫混入時期の判定方法（請求項４）からなる。
【００１４】
また本発明は、加圧履歴の有無が、炭酸ガスによる加圧履歴の有無であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の昆虫混入時期の判定方法（請求項５）や、加圧履歴が、飲食品の製造工程における加圧履歴及び／又は飲食品の流通過程における加圧履歴であることを特徴とする請求項５記載の昆虫混入時期の判定方法（請求項６）や、飲食品中に混入した昆虫を、洗浄後、昆虫頭部を取得し、酸の存在下で水抽出を行い、抽出液の色素量を測定することを特徴とする昆虫混入時期の判定方法（請求項７）や、飲食品中に混入した昆虫を洗浄後、昆虫胸部及び／又は脚部を取得し、中性緩衝液下で抽出を行い、抽出液中の総タンパク質量、又は、ミオシン量を測定することを特徴とする昆虫混入時期の判定方法（請求項８）や、飲食品が、炭酸アルコール飲料又は炭酸非アルコール飲料であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の昆虫混入時期の判定方法（請求項９）や、飲食品中に混入した昆虫が、ハエであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の昆虫混入時期の判定方法（請求項１０）からなる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の飲食品中への昆虫の混入時期を判定する方法は、炭酸性のアルコール飲料や非アルコール飲料のような製造工程に加熱工程のない飲食品へも適用することができ、更に、加圧履歴を有する飲食品に広く適用することができる。そして、本発明の方法においては、特に、加圧履歴を経た飲食品を対象とした場合に、昆虫体内に存在する数多くの成分の中から(i)適度な耐久牲、(ii)昆虫個体間でのバラツキの少なさ、(iii)打栓等により密閉させた状態で減少の度合いに差異が生じるもの、(iv)測定が簡便なものを選択の条件として検討し、昆虫の主に複眼部分に含まれる色素成分及び胸部、脚部に含まれるタンパク質成分（例えばミオシン成分等）のような昆虫体の構成成分を選択した結果、従来用いられていた酵素を指標として用いられていた方法と比較して、極めて正確な昆虫混入時期の判定ができる。更に、本発明の方法は、加圧履歴による昆虫体の構成成分の変化の相違を指標にしたので、従来の方法では判定が困難であった、密閉容器を開封した後に死亡した昆虫が混入された場合にも適用することができる。したがって、本発明の方法は、確実な昆虫混入時期の判定方法として実用化することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、飲食品中に混入した昆虫のその後の雰囲気の相違により生じる昆虫体内の構成成分の残存量の変化の相違を測定して、昆虫の飲食品中への混入時期を判定することよりなる。本発明において、飲食品中に混入した昆虫のその後の雰囲気の相違としては、飲食品中に混入した昆虫の加圧履歴の有無を挙げることができる。壜入りや缶入り等の炭酸性のアルコール飲料や非アルコール飲料等、或いは、レトルトの缶詰や袋詰食品等、の飲食品においては、その飲食品の製造工程で加圧下の処理が行われ、また、密閉状態で加圧下の製品として、流通過程におかれる。したがって、これらの製品においては、昆虫の混入の時期によって、加圧履歴の有無が決定される。すなわち、昆虫が、飲食品の製品の製造工程中で混入すれば、その昆虫は、密閉状態で加圧下にある雰囲気下に曝されることになり、加圧履歴を有することになる。一方で、もし、昆虫がその飲食品の利用時（飲食時）に密閉容器を開封した後に混入したとすれば、該開封した容器は再度密閉加圧されることは無いから、該昆虫は加圧下にある雰囲気下に曝されることはなく、したがって、加圧履歴を有することは無い。壜入りや缶入り等の炭酸性のアルコール飲料や非アルコール飲料等においては、炭酸ガスによる加圧条件下におかれる。
【００１７】
本発明の昆虫混入時期の判定方法で測定する昆虫体内の構成成分としては、特に好ましくは（ａ）昆虫複眼色素、（ｂ）昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質の変化を挙げることができる。測定は、混入した昆虫のその後の雰囲気の相違、例えば、加圧履歴の有無による、これらの昆虫体の構成成分の残存量の相違を測定することにより行うことができる。昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質について測定する場合は、昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質の総タンパク質量として、或いは、ミオシン量として測定することができる。
【００１８】
本発明の昆虫混入時期の判定方法による測定では、混入した昆虫が加圧履歴を有する場合は、昆虫複眼色素の色素成分や昆虫胸部及び／又は脚部由来タンパク質のタンパク質成分が激減することが確認されている。
【００１９】
本発明の昆虫混入時期の判定方法における対象昆虫としては、昆虫類に属するもので特に制限は無いが、一般的には、飲食品への混入が問題となる、ハエ、ゴキブリ、ハチ、アリなどが対象として挙げられ、この中でも特に混入の苦情が寄せられる可能性があるハエが重要となる。
【００２０】
本発明において対象となる飲食品は、加圧履歴を有する飲食品であり、製造工程で加圧処理されたか、製品自体加圧状態で流通される飲食品が対象として挙げられる。前者の飲食品としては、密閉後に高温加圧殺菌処理を行う缶詰や袋詰レトルト食品等を、後者の飲食品としては、炭酸アルコール飲料又は炭酸非アルコール飲料等を挙げることができる。炭酸アルコール飲料として代表的なものとしては、ビール、発泡酒、発泡性アルコール飲料等がある。本発明の方法は、その製造工程において、加熱工程のない飲食品へも適用することができる。
【００２１】
以下に、本発明の方法によって、飲食品中への昆虫の混入時期を判定するための測定の操作手順について説明する。
【００２２】
まず、本発明方法に従って昆虫の主に複眼中に含まれる色素を指標とした場合の昆虫の混入時期を判定する好ましい分析操作手順について説明する。
【００２３】
本発明方法において、飲食品中に発見された死亡昆虫は、測定対象とする体内成分に応じて測定までの処理が異なるが、少なくとも、アッセイ系への飲食品成分の混入を防ぐ為に、前処理とし洗浄を行うことが望ましく、水洗浄或いは試料状態が水洗浄だけでは不十分と思われる場合には水洗浄前に極性有機溶媒、例えばエタノール、による予備洗浄を行なってもよい。
【００２４】
まず試料に含まれる昆虫を取り出し、エタノールで表面を洗ったのち純水で洗浄する。通常風乾後、水を加え乳鉢ですりつぶす。そこに、酸性溶液を添加しさらにすりつぶし、抽出液の色素量により判定する。好ましくは、抽出液を遠心分離した上清を色素量判定に用いる。色素が最も多く含まれる頭部のみを切断して試料とする方がより好ましい。また、酸性溶液としては、１％以上の濃度のトリクロロ酢酸が好ましいが、そのほか、塩酸、酢酸等の酸溶液を用いても同様の実験を行うことが可能である。抽出液をチューブにとる。この時、同一昆虫を密閉容器内で試料中に浸漬させた場合には抽出液は赤色に近くなり、開封容器内で浸漬させた場合の抽出液は、赤橙色になる。またその抽出液を遠心分離にかけると赤色物質が除去され、密閉容器内浸漬の場合は無色になり、開封容器内浸漬の場合は、黄色になる。その結果を利用して、抽出液を目視で確認することにより、密閉容器内で死んだ昆虫かまたは容器開封後に混入して死んだ昆虫かの判定を行う。
【００２５】
また同様に取得した抽出液を、目視に代えて４００〜５００ｎｍでいずれかの吸収を分光光度計で測定し判定することもできる。抽出時にトリクロロ酢酸を用いた場合は４４０ｎｍの吸収が好ましい。４４０ｎｍでの吸光度を、あらかじめ同一昆虫を密閉容器内で試料中に浸漬させた場合と開封容器内で浸漬させた場合の死後経時的に同一測定条件で求めておいた検量線を作成し、比較すると密閉容器内での浸漬の場合４４０ｎｍの吸光度が激減するのに対し、開封容器内の場合では殆ど減少しない。この歴然とした差を利用し、被験昆虫の４４０ｎｍの吸光度を求めることにより、密閉容器内で死んだ昆虫か、又は、容器開封後に混入して死んだ昆虫かの判定を行う。
【００２６】
又は、同様に取得した抽出液中の４００〜５００ｎｍ範囲で吸収を示す物質を液体クロマトグラフィーで分離、定量することにより判定することもできる。抽出時にトリクロロ酢酸を用いた場合は４４０ｎｍの吸収物質の定量が好ましい。分離カラムには、逆相カラムを用いることが好ましい。４４０ｎｍ吸収物質の量を、あらかじめ同一昆虫を密閉容器内で試料中に浸漬させた場合と開封容器内で浸漬させた場合の死後経時的に同一測定条件で求めておいた検量線を作成し、比較すると密閉容器内での浸漬の場合４４０ｎｍ吸収物質量が激減するのに対し、開封容器内の場合では殆ど減少しない。この歴然とした差を利用し、被験昆虫の４４０ｎｍ吸収物質の量を求めることにより、混入して密閉容器内で死んだ昆虫か、又は、容器開封後に混入して死んだ昆虫かの判定を行う。
【００２７】
次に、本発明方法に従って昆虫の主に胸脚部に含まれる蛋白質を指標とした場合の、飲食品中への昆虫の混入時期を判定する好ましい分析操作手順について説明する。まず試料に含まれる昆虫を取り出し、エタノールで表面を洗ったのち純水で洗浄する。通常風乾後、適当な緩衝液中でホモジネートして抽出液とする。この際、頭部、腹部、羽を切除し胸部と脚部を試料とする方がより好ましい。また、緩衝液としてはｐＨ６．５〜７．５の範囲で塩濃度が１００ｍＭ以上のものが好ましく、更に好ましくは緩衝液中に界面活性剤を含有させてもよい。具体的な緩衝液としては、例えば食塩とTween２０などの界面活性剤を含んだリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）があげられるが、この場合、塩濃度が１００ｍＭ以上で０．０５％（容量％）以上の濃度のTween２０を含んだ級衝液であれば、蛋白質の定量に支障を与えない限り、成分の配合割合あるいは他成分の添加など、多少の変更があっても同等の緩衝液として使用することができる。界面活性剤としては、蛋白質との作用が温和な非イオン性界面活性剤が好ましく、前述のTween２０のほかに、例えば他のTweenシリーズのものやTritonX-100やBrij３５或いは５８等を挙げることができる。
【００２８】
上述のようにして得られた抽出液中の蛋白質量を測定する。この値で、あらかじめ同一昆虫を密閉容器内で試料中に浸漬させた場合と開封容器内で浸漬させた場合の混入死後経時的に同一測定条件で蛋白質量を求めて検量線を作成し比較すると密閉容器内での浸漬の場合蛋白質量が激減するのに対し、開封容器内ではその減少は緩やかである。この歴然とした差を利用することにより、被験昆虫の蛋白質量を測定することにより、混入して密閉容器内で死んだ昆虫か、又は、容器開封後に混入して死んだ昆虫かの判定を行う。蛋白質量の測定は、蛋白質量を正確に測定できるものであれば任意の方法を利用することができる。そのような方法の具体例としては、Protein Assay（Bio-Rad社製）法、ＢＣＡ Protein Assay Kit（ＰＩＥＲＣＥ社製）法を用いた方法が挙げられる。
【００２９】
また、上記と同様の方法で取得した抽出液につき、総蛋白質量に代えてミオシン含量を測定し判定することもできる。ミオシン含量の測定方法としては、例えばSandwich ELISA法を利用したInsect Detect KitTM（Biotect Inc.社製）を用いて測定し判定することができる。密閉容器内で試料中に浸漬させた場合の昆虫は、昆虫体内のミオシン量が激減し殆ど検出されなくなるのに対し、開封容器内で浸漬させた場合は、残存し続ける。このことから、Insect Detect KitTMを用いて被検昆虫中のミオシンの有無により、混入して密閉容器内で死んだ昆虫か、又は、容器開封後に混入して死んだ昆虫かの判定を行う。
【００３０】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
［ビールを対象とした色素量による判定（２５℃保存）］
製品ビール小壜にイエバエを入れ、一方は打栓をし、他方は打栓をせずに２５℃下で保存した。打栓をしたビール及び打栓をしていないビールそれぞれから１、３、６、１１、２０及び２８日後にそれぞれ６匹ずつ取り出し、エタノールでリンスした後、純水で洗浄して風乾させる。イエバエの頭部を切断しこれをサンプルとした。これを乳鉢に入れ、純水２５０μＬ添加し乳鉢で全体が均一になるまですりつぶす。次に１６％トリクロロ酢酸（和光純薬工業）２５０μＬを添加し、更にすりつぶす。その後３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過し、これを抽出液とする。１１日間が経過した時点で、抽出液には目視で確認できるほど打栓の有無による差異が生じていた。打栓有りのイエバエ抽出液では、無色に近くなるのに対し、打栓無しのイエバエ抽出液は黄色であった（図１参照）。また吸光光度計（ＢＥＣＫＭＡＮ社製）でそれぞれの４４０ｎｍでの吸光度の経時変化を比較すると、打栓有りの場合４４０ｎｍでの値が減少していくのに対して、打栓無しでは減少しない（図２参照）ことがわかる。以上の結果から、イエバエ頭部から得られる色素量を定量することで製造工程中に混入されたイエバエなのか製造後混入したものなのかの判定が可能である。
【実施例２】
【００３２】
［ビールを対象とした色素量による判定（４℃保存）］
製品ビール小壜にイエバエを入れ、一方は打栓をし、他方は打栓をせずに４℃で保存した。打栓をしたビール及び打栓をしていないビールそれぞれから３，６，１１、２０及び３０日後にそれぞれ６匹ずつ取り出し、エタノールでリンスした後純水で洗浄して風乾させる。イエバエの頭部を切断しこれをサンプルとした。これを乳鉢に入れ、純水２５０μＬ添加し乳鉢で全体が均一になるまですりつぶす。次に１６％トリクロロ酢酸（和光純薬工業）２５０μＬを添加し、更にすりつぶす。その後３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過し、これを抽出液とする。２５℃で保存した時と同様に、１１日間が経過した時点で、抽出液には目視で確認できるほど打栓の有無による差異が生じていた。打栓有りイエバエ抽出液では、無色に近くなるのに対し、打栓無しのイエバエ抽出液は黄色であった。また吸光光度計（ＢＥＣＫＭＡＮ社製）それぞれの４４０ｎｍでの吸光度の経時変化を比較すると、打栓有りの場合４４０ｎｍでの値が減少していくのに対して、打栓無しでは減少しないことがわかる(図３)。以上の結果から、イエバエ頭部から得られる色素量を定量することで製造工程中に混入されたイエバエなのか製造後混入したものなのかの判定が可能である。
【実施例３】
【００３３】
［ビールを対象とした蛋白質量による判定］
実施例１に準じて、１，４，１０，２０及び３０日後にそれぞれ３匹ずつ取り出し、エタノールでリンスした後、純水で洗浄して風乾させる。イエバエの頭部、羽、腹部を切除し、残った胸部及び脚部を２ｍｌ容チューブに入れ、抽出バッファー［０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１％bovin serum albumin０．０５％  Tween２０］２５０μｌを添加し、自動ホモジナイザー（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて５分間すりつぶす。これを１００００ｒｐｍで遠心分離し、その上清をサンプルとした。サンプルの蛋白質量をＢＣＡ  Protein Assay Kit（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定し、打栓した場合としない場合とでの経時変化を比較したところ、打栓ありの場合には１０日間経過ご激減するのに対し打栓無しでは、緩やかに減少することがわかる（図４）。
【００３４】
以上の結果から、イエバエ胸脚部から得られる蛋白質量を定量することで製造工程中に混入されたイエバエなのか製造後混入したものなのかの判定がある程度可能である。また同様に得たサンプル中のミオシン量をInsect Detect KitTM（Biotect Inc.社製）で測定し、それぞれのミオシン量を蛋白質量で割って補正値を求め、打栓の有無での経時変化のグラフを作成した（図５）。打栓の有無で比較したところ、打栓有りの場合では１０日間経過後で、ミオシンは殆ど不検出になることが判明した。また打栓無しの場合、ミオシン量は減少せず、全蛋白質量に対するミオシン量が増加するため蛋白質量で補正したミオシン量は、増加する傾向にあることが判明した。このことは、蛋白質の中でミオシンが打栓有りの状態で特異的に減少する蛋白質であることを示している。以上の結果から、イエバエ胸脚部から得られるミオシン量を定量することで製造工程中に混入されたイエバエなのか製造後混入したものなのかの判定が可能である。
【実施例４】
【００３５】
［色素を指標とした測定法における抽出条件の検討］
製品ビール小壜にイエバエを入れ、一方は打栓をし、他方は打栓をせずに２５℃下で１１日間保存した。打栓をしたビール及び打栓をしていないビールそれぞれからイエバエを取り出し、エタノールでリンスした後純水で洗浄して風乾させる。イエバエの頭部を切断しこれをサンプルとした。これを乳鉢に入れ、純水２５０μＬを添加し、乳鉢で全体が均一になるまですりつぶす。次に、以下の５種類の溶液２５０μＬをそれぞれに添加することにより、抽出液の色の変化を検討した。
（１）１％トリクロロ酢酸
（２）４０％トリクロロ酢酸
（３）酢酸
（４）５Ｎ塩酸
（５）０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
各溶液添加後、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過し、これを抽出液とする。目視にて抽出液の色を観察したところ、（１）〜（４）の酸溶液では、目視にて明らかにイエバエ保存状態での打栓の有無による相対的な濃淡差が生じたのに対し、中性域の緩衝液では、全く差が生じなかった。また酸溶液においても、濃度が大きくなるにつれ、差異が出にくくある傾向が確認された。
【実施例５】
【００３６】
［発泡性果実酒を対象とした色素量による判定］
発泡性レモン果実酒（以下果実酒）にイエバエを入れ、一方は打栓をし、他方は打栓をせずに２５℃下で保存した。打栓をしたビール及び打栓をしていない果実酒それぞれから１，３，１０及び２０日後にそれぞれ３匹ずつ取り出し、エタノールでリンスした後純水で洗浄して風乾させる。イエバエの頭部を切断しこれをサンプルとした。これを乳鉢に入れ、純水２５０μＬを添加し、乳鉢で全体が均一になるまですりつぶす。次に１６％トリクロロ酢酸（和光純薬工業）２５０μＬを添加し、さらにすりつぶす。その後３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過し、これを抽出液とする。吸光光度計（ＢＥＣＫＭＡＮ社製）を用いてそれぞれの４４０ｎｍでの吸光度の経時変化を比較した(図６)。図６から明らかなように、打栓有りの場合の方が、４４０ｎｍでの値の減少速度が大きいことがわかる。以上の結果から、ビール以外の炭酸アルコール飲料でも、イエバエ頭部から得られる色素量を定量することで製造工程中に混入されたイエバエなのか製造後混入したものなのかの判定が可能である。
【実施例６】
【００３７】
［発泡性果実酒を対象とした蛋白質量による判定］
実施例５と同様、発泡性レモン果実酒（以下果実酒）にイエバエを入れ保存した後、打栓をしたビール及び打栓をしていない果実酒それぞれから２０日後にそれぞれ３匹ずつ取り出し、エタノールでリンスした後純水で洗浄して風乾させる。イエバエの頭部、羽、腹部を切除し、残った胸部及び脚部を２ｍｌ容チューブに入れ、抽出バッファー［０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１％bovin serum albumin、０．０５％  Tween２０］２５０μｌを添加し、自動ホモジナイザー（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて５分間すりつぶす。これを１００００ｒｐｍで遠心分離し、その上清をサンプルとした。得られたサンプル中の蛋白質量をＢＣＡ Protein Assay Kit（ＰＩＥＲＣＥ社製）で、ミオシン量をInsect Detect KitTM（Biotect Inc.社製）で測定し、それぞれのミオシン量を蛋白質量で割って補正値を求めた（図７）。打栓有りの場合、ミオシンは不検出になり、打栓無しの場合では、ミオシンが残存していることが判明した。以上の結果から、ビール以外の炭酸アルコール飲料においてもイエバエ胸脚部のミオシン量を定量することで、製造工程中に混入されたイエバエなのか製造後混入したものなのかの判定が可能である。
【実施例７】
【００３８】
［非アルコール性炭酸飲料を対象とした液体クロマトグラフィーによる色素量による判定］
壜詰炭酸飲料にイエバエを入れ打栓をし、２５℃下で保存した。１，３，６，１０，２１及び３２日後にそれぞれ３匹ずつイエバエを取り出し、エタノールでリンスした後純水で洗浄して風乾させる。イエバエの頭部を切断しこれをサンプルとした。これを乳鉢に入れ、純水２５０μＬ添加し乳鉢で全体が均一になるまですりつぶす。次に１６％トリクロロ酢酸（和光純薬工業）２５０μＬを添加し、さらにすりつぶす。その後３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を０・４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過し、これを抽出液とする。本抽出液を液体クロマトグラフィー（Agilent社製）に供した。分離には、逆相カラム（資生堂社製）を用い、移動相はメタノール溶液を用い、５〜９５％のグラジエントで溶出を行った。また溶出液の検出は、４４０ｎｍで行った。本分析から、リテンションタイム約１５分の時に、ピークが検出され（図８）、本ピークのエリア面積を算出して、この値の経時変化を見た。図９に示すように、打栓有りの場合、対象試料がビールの時と同様に、減少していくことが確認できた。このことから、液体クロマトグラフィーを用いて色素量の定量を行い、昆虫混入時期の判定が可能である。
【実施例８】
【００３９】
［非アルコール性炭酸飲料を対象とした蛋白質量による判定］
実施例７と同様、炭酸飲料にイエバエを入れ打栓して保存した後、１，３，１０，２０日後にそれぞれ３匹ずつのイエバエを取り出し、エタノールでリンスした後、純水で洗浄して風乾させる。イエバエの頭部、羽、腹部を切除し、残った胸部及び脚部を２ｍｌ容チューブに入れ、抽出バッフアー［０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１％bovin serum albumin、０．０５％  Tween２０]２５０μｌ添加し、自動ホモジナイザー（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて５分間すりつぶす。これを１００００ｒｐｍで遠心分離し、その上清をサンプルとした。サンプルの蛋白質量をＢＣＡ Protein Assay Kit（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定しその経時変化を見たところ、蛋白質量は２０日間経過後激減していた（図１０）。以上の結果から、イエバエ胸脚部から得られる蛋白質量を定量することで製造工程中に混入されたイエバエなのか製造後混入したものなのかの判定が可能である。
【実施例９】
【００４０】
［炭酸水を用いた加圧履歴と蛋白質量の関係検討］
種々の発泡性飲料において、蛋白質や色素の量を定量することにより製造後混入かどうかを判断できることから、このような変化の差が加圧履歴に関係すると考えられた。そこで蛋白質を指標に、通常の飲料のように種々の成分を含有しない炭酸水を用いて、このことを証明するために以下の実験を行った。
【００４１】
炭酸水小壜にイエバエを入れ、打栓をして２５℃下で保存した。コントロールとして、製品ビール小壜にイエバエを入れ、一方は打栓をし、他方は打栓をせずに２５℃下で保存した。なお、炭酸水における条件をビールに近づけるため、全ての試験区においてイエバエは、エタノールでリンスした直後に添加した。それぞれの試験区から４，１０，２０日日後にそれぞれ３匹ずつ取り出し、エタノールでリンスした後、純水で洗浄して風乾させる。
【００４２】
イエバエの頭部、羽、腹部を切除し、残った胸部及び脚部を２ｍｌ容チューブに入れ、抽出バッファー［０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１％  bovin serum albumin、０．０５％  Tween２０］２５０μｌを添加し、自動ホモジナイザー（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて５分間すりつぶす。これを１００００ｒｐｍで遠心分離し、その上清をサンプルとした。それぞれのサンプルの蛋白質量をＢＣＡ Protein Assay Kit（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定した。４日間経過後のサンプルの蛋白質量を１００％として、それぞれの減少率の経時変化を比較した。その結果、打栓無しビールでは蛋白質の減少が緩やかであるのに対し、打栓ありのビールと炭酸水では共に同様の減少効果を示した（図１１）。以上のことから、蛋白質の減少には、圧力が影響していることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の実施例１において、イエバエ頭部から色素成分を抽出した際に、１１日間経過後のサンプルで密閉容器内に浸漬させた場合と開封容器に浸漬させた場合での目視による比較を示した図である。
【図２】本発明の実施例１において、昆虫がイエバエで、対象試料がビールの場合における頭部に含まれる色素成分量（４４０ｎｍでの値）の２５℃での経時的変化を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例２において、昆虫がイエバエで、対象試料がビールの場合における頭部に含まれる色素成分量（４４０ｎｍでの値）の４℃での経時的変化を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例３において、昆虫がイエバエで、対象試料がビールの場合における胸脚部に含まれる蛋白質量の経時的変化を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例３において、昆虫がイエバエで、対象試料がビールの場合における胸脚部に含まれる蛋白質量で補正したミオシン量の経時的変化を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例５において、昆虫がイエバエで、対象試料が発泡性果実酒の場合における頭部に含まれる色素成分量（４４０ｎｍでの値）の２５℃での経時的変化を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例６において、昆虫がイエバエで、対象試料が発泡性果実酒の場合における２０日間経過後の胸脚部に含まれる蛋白質量で補正したミオシン量の密閉容器内の場合と開封容器の場合とを比較した図である。
【図８】本発明の実施例７において、昆虫がイエバエで、対象試料が非アルコール性炭酸飲料の場合における頭部に含まれる色素成分量（４４０ｎｍでの値）を液体クロマトグラフィーで測定した図である。
【図９】本発明の実施例７において、昆虫がイエバエで、対象試料が非アルコール性炭酸飲料の場合における頭部に含まれる色素成分量（液体クロマトグラフィーで測定した値）の２５℃での経時的変化を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例８において、昆虫がイエバエで対象試料が非アルコール性炭酸飲料の場合における胸脚部に含まれる蛋白質量の経時的変化を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例９において、昆虫がイエバエで対象試料が炭酸水の場合における胸脚部に含まれる蛋白質量の経時的変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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