(57)【要約】【課題】昆虫の性フェロモンを特異的に認識することのできる、性フェロモン受容体タンパク質を見出し、その利用方法を提供すること。【解決手段】カイコガ由来のＢｍＯＲ−１タンパク質は、性フェロモン受容体タンパク質であり、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有し、カイコガ由来性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌを特異的に認識し、ｂｏｍｂｙｋａｌを認識しない。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫由来の性フェロモンを特異的に認識する受容体タンパク質であって、膜貫通領域を有し、細胞膜に局在する状態で細胞内にてＧタンパク質と結合する受容体タンパク質。
【請求項２】
カイコガ由来であり、カイコガの性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌを特異的に認識する請求項１記載の受容体タンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、昆虫由来の性フェロモンを特異的に認識するタンパク質。
【請求項４】
請求項３記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する請求項４記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、昆虫由来の性フェロモンを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか１項に記載のタンパク質を認識する抗体。
【請求項８】
請求項４〜６の何れか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項４〜６の何れか１項に記載の遺伝子を導入してなる形質転換体。
【請求項１０】
請求項４〜６の何れか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項１１】
下記▲１▼または▲２▼の物質を含む性フェロモン検出剤。
▲１▼  請求項１〜３の何れか１項に記載のタンパク質
▲２▼  請求項４〜６の何れか１項に記載の遺伝子
【請求項１２】
請求項１〜３の何れか１項に記載のタンパク質を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載のスクリーニング方法を用いて得られた物質を含む害虫駆除剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫、特にカイコガにより分泌される性フェロモンに特異的に応答する受容体タンパク質、およびその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
メスのガにより分泌される性フェロモンは、同種のオスの触角の嗅覚感覚子において、高い特異性と高感度とで検出される。カイコガＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（Ｂ．  ｍｏｒｉ）の性フェロモンであるｂｏｍｂｙｋｏｌは、性フェロモンとして初めて同定された。
【０００３】
このｂｏｍｂｙｋｏｌは、高い特異性を持つ性フェロモンであり、メスのカイコガのフェロモン腺から分泌され、オスのカイコガの行動を操る（例えば非特許文献１，３，４参照）。ｂｏｍｂｙｋｏｌの酸化物であるｂｏｍｂｙｋａｌも、メスのカイコガのフェロモン腺から分泌され、オスのカイコガのフェロモン受容ニューロンにおいて電気反応を引き起こすが、行動応答を誘導することはない（例えば非特許文献２参照）。これは、フェロモンの認識プロセスにおいて、非常に特異的な分子識別が起きていることを例示している。この分子識別は、ｂｏｍｂｙｋｏｌまたはｂｏｍｂｙｋａｌに対する特定の受容体によってなされると考えられている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｂｕｔｅｎａｎｄｔ，  Ｖ．  Ａ．，  Ｂｅｃｋｍａｎｎ，  Ｒ．，  Ｓｔａｍｍ，  Ｄ．  ＆  Ｈｅｃｋｅｒ，  Ｅ．  Ｕｂｅｒ  ｄｅｎ  ｓｅｘｓｕａｌ−ｌｏｃｋｓｔｏｆｆ  ｄｅｓ  ｓｅｉｄｅｎｓｐｉｎｎｅｒｓ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｒｅｉｎｄａｒｓｔｅｌｌｕｎｇ  ｕｎｄ  ｋｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．  Ｚ．  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｇ．  １４ｂ，  ２８３−２８４  （１９５９）
【０００５】
【非特許文献２】
Ｋａｉｓｓｌｉｎｇ，  Ｋ．  −Ｅ．，  ＆  Ｋａｓａｎｇ，  Ｇ．  Ａ  ｎｅｗ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ  ｍｏｔｈ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ６５，  ３８２−３８４  （１９７８）
【０００６】
【非特許文献３】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｄ．  Ｉｎｓｅｃｔ  ｏｌｆａｃｔｉｏｎ：  Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｓｓａｇｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６３，  １０３１−１０３７  （１９６９）
【０００７】
【非特許文献４】
Ｋａｉｓｓｌｉｎｇ，  Ｋ．−Ｅ．  Ｒ．  Ｈ．  Ｗｒｉｇｈｔ  ｌｅｃｔｕｒｅｓ  ｏｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｏｌｆａｃｔｉｏｎ．  （Ｓｉｍｏｎ  Ｆｒａｓｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｂｕｒｎａｂｙ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｃａｎａｄａ，  （１９８７）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
性フェロモン受容体は、性フェロモンの認識、輸送、保護、不活性化のいずれか、あるいは、それらの組み合わせに関与するため、フェロモン受容体の分離および同定は、フェロモン情報伝達の分子機構を解読するのに利用可能なモデルを提供することができる。しかし、昆虫の性フェロモンに応答する受容体は、昆虫の触角上にある化学感覚毛の中に存在する感覚受容細胞の表面にあると考えられてきたが、これまでに単離され同定された例はない。そのため、性フェロモンと性フェロモン受容体との応答等におけるフェロモン情報伝達の分子機構は、未解明のままである。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、昆虫の性フェロモンを特異的に認識することのできる、性フェロモン受容体タンパク質及びその利用を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、性フェロモン受容体の存在についてカイコガＢ．  ｍｏｒｉの調査検討を進めた結果、Ｂ．  ｍｏｒｉのオスの触角に特異的に存在し、Ｇタンパク質に結合する嗅覚受容体をコードする遺伝子を同定した。この遺伝子を用いた組み換えバキュロウイルスに感染させたメスの触角は、性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌに対して電気生理学的応答を示したが、ｂｏｍｂｙｋａｌに対しては示さなかった。すなわち、性フェロモン応答は、上記遺伝子の発現により、メスの触角において再形成された。本発明者らは、これらの結果から、上記遺伝子が発現するタンパク質が、オスのカイコガにおいて、ｂｏｍｂｙｋｏｌを認識し、Ｇタンパク質に結合する性フェロモン受容体であること等を見いだし、本発明を完成するに至った。なお、本発明者らにより、上記性フェロモン受容体はＢｍＯＲ−１と名付けられた。
【００１１】
即ち、本発明は、学術上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｍ）の発明を含むものである。
【００１２】
Ａ）昆虫由来の性フェロモンを特異的に認識する受容体タンパク質であって、膜貫通領域を有し、細胞膜に局在する状態で細胞内にてＧタンパク質と結合する受容体タンパク質。
【００１３】
Ｂ）カイコガ由来であり、カイコガの性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌを特異的に認識するＡ）の受容体タンパク質。
【００１４】
Ｃ）以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、昆虫由来の性フェロモンを特異的に認識するタンパク質。
【００１５】
Ｄ）Ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子。
【００１６】
Ｅ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有するＤ）の遺伝子。
【００１７】
Ｆ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、昆虫由来の性フェロモンを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１８】
Ｇ）Ａ）〜Ｃ）の何れかのタンパク質を認識する抗体。
【００１９】
Ｈ）Ｄ）〜Ｆ）の何れかの遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【００２０】
Ｉ）Ｄ）〜Ｆ）の何れかの遺伝子を導入してなる形質転換体。
【００２１】
Ｊ）Ｄ）〜Ｆ）の何れかの遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【００２２】
Ｋ）下記▲１▼または▲２▼の物質を含む性フェロモン検出剤。
▲１▼  Ａ）〜Ｃ）の何れかのタンパク質。
▲２▼  Ｄ）〜Ｆ）の何れかの遺伝子。
【００２３】
Ｌ）Ａ）〜Ｃ）の何れかのタンパク質を調節する物質のスクリーニング方法。
【００２４】
Ｍ）Ｌ）のスクリーニング方法を用いて得られた物質を含む害虫駆除剤。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００２６】
（１）本発明に係るタンパク質およびその遺伝子の構造
本発明に係るタンパク質は、昆虫由来の性フェロモンを特異的に認識する受容体タンパク質であって、カイコガの性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌを特異的に認識する受容体タンパク質である。本実施の形態では、本発明に係るタンパク質として、カイコガＢ．  ｍｏｒｉ由来の性フェロモン受容体タンパク質ＢｍＯＲ−１（説明の便宜上、ＢｍＯＲ−１タンパク質と称する）を挙げて説明する。
【００２７】
（１−１）本発明に係るタンパク質
ＢｍＯＲ−１タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなり、オスの触角に特異的に発現する。上記ＢｍＯＲ−１タンパク質は、カイコガ由来の性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌを特異的に認識する。ここで、特異的に認識するとは、特定の性フェロモンにのみ応答を示し、他のフェロモンに関しては、応答しないということである。なお、上記応答とは、本発明に係るタンパク質を発現する組織において、特定のフェロモンに対する電気生理学信号を計測することで、観測することができる。例えば、上記組織が触角である場合、電気生理学信号を計測するには、例えば、触角電位図法（ＥＡＧ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎｔｅｎｎｏｇｒａｍ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）等を利用することができる。
【００２８】
このように、本発明に係るタンパク質は、性フェロモン情報伝達の機構の解明に利用することができる。
【００２９】
ここで、本発明に係るＢｍＯＲ−１タンパク質が認識する性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌは、（１０Ｅ，１２Ｚ）−ヘキサデカジエン−１−オール（（１０Ｅ，  １２Ｚ）−Ｈｅｘａｄｅｃａｄｉｅｎ−１−ｏｌ）とも称し、次に示す構造を有している。
【００３０】
【化１】
2005046033.tif 000002
【００３１】
上記ＢｍＯＲ−１タンパク質は上記ｂｏｍｂｙｋｏｌを認識するが、このｂｏｍｂｙｋｏｌにおける末端のアルコール性水酸基をアルデヒドに置換した類縁化合物ｂｏｍｂｙｋａｌは認識しない。したがって、後述する実施例に示すように、ｂｏｍｂｙｋａｌはＢｍＯＲ−１タンパク質によるｂｏｍｂｙｋｏｌの受容状態を比較するためのコントロールとして用いることができる。なお、ｂｏｍｂｙｋａｌは、（１０Ｅ，１２Ｚ）−ヘキサデカジエン−１−アール（（１０Ｅ，  １２Ｚ）−Ｈｅｘａｄｅｃａｄｉｅｎ−１−ａｌ）とも称し、次に示す構造を有している。
【００３２】
【化２】
2005046033.tif 000003
【００３３】
ｂｏｍｂｙｋｏｌは後述する合成例に示すように、公知の有機合成技術により合成（製造）することができる。また、ｂｏｍｂｙｋａｌは、公知の方法によってｂｏｍｂｙｋｏｌの末端のアルコール性水酸基を酸化してアルデヒドとすることにより合成することができる。
【００３４】
上記ＢｍＯＲ−１タンパク質は、７回膜貫通型受容体と考えられており、図１にもアミノ酸配列が１文字表記によって示される。図１中、四角で囲まれているアミノ酸領域は、ＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｏｓｕｉ．ｃｇｉ？／ｓｏｓｕｉ＿ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）とＴＭＰＲＥＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）とにより予測された膜貫通領域と考えられている部分である。
この領域は、Ｇタンパク質結合受容体スーパーファミリーとして特徴付けられている。なお、本図において矢頭は、イントロンとエキソンとの境界である。
【００３５】
上記ＢｍＯＲ−１タンパク質は、上記膜貫通領域により細胞膜に局在するタンパク質であって、その局在状態は、Ｎ末端側が細胞外でＣ末端側が細胞内となっている。そして、細胞膜に局在する状態で細胞内にてＧタンパク質と結合する。なお、本発明に係るタンパク質に結合するＧタンパク質はα・β・γのサブユニットからなる３量体Ｇタンパク質であり、低分子量Ｇタンパク質ではない。
【００３６】
上記ＢｍＯＲ−１タンパク質のアミノ酸配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｉｍｕｌａｎｓのような昆虫種における、におい物質に対する受容体（におい物質受容体）と重要な領域での配列が共通している（３８％以上）。
【００３７】
図２に様々な昆虫種のにおい物質受容体とされるタンパク質の系統樹を示す。なお、図２において、タンパク質の名称が、Ｏｒ、ＧＰＲ、ＨＲ、ＢｍＯＲで始まっているものは、それぞれ、キイロショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、翅斑蚊Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ、タバコガＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、カイコガＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのにおい物質受容体である。図２に示すように、上記ＢｍＯＲ−１タンパク質は、系統発生学分析に基付いて、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓのにおい物質受容体と推定されているＨＲ６とごく近いものであることがわかる。
【００３８】
なお、本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合タンパク質であってもよい。したがって、上記ＢｍＯＲ−１タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外に、他の構造を含む複合タンパク質であっても良い。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００３９】
あるいは、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明に係るタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００４０】
また、本発明に係るタンパク質は、後述する本発明に係る遺伝子（本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよい。また、上記宿主細胞での発現条件によっては、本発明に係るタンパク質は、他のタンパク質とつながった融合タンパク質であってもよい。さらに本発明に係るタンパク質は、化学合成されたものであってもよい。
【００４１】
さらに、本発明に係るタンパク質は、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。即ち、本発明に係るタンパク質には、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＢｍＯＲ−１タンパク質のみならず、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、昆虫由来の性フェロモンを特異的に認識するするタンパク質、すなわちＢｍＯＲ−１変異タンパク質も含まれる。
【００４２】
上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質である。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００４３】
（１−２）本発明に係る遺伝子
本発明に係る遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。本発明に係る遺伝子を適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入すれば、本発明に係るタンパク質をその宿主内で発現させることができる。また、例えば、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに導入し、組み換えバキュロウイルスを作成し、このバキュロウイルスに昆虫の組織を感染させると、本発明のタンパク質を発現しない昆虫の組織において、本発明のタンパク質を転移発現させることができる。節足動物を感染対象とした場合、バキュロウイルス、特に核多角体病ウイルスを好適に用いることができる。
【００４４】
本発明に係る遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係る遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００４５】
本発明に係る遺伝子の一例として、上記ＢｍＯＲ−１タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＢｍＯＲ−１遺伝子と称する）を挙げることができる。このＢｍＯＲ−１遺伝子は、配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として有しており、ゲノミックの遺伝子は、図３に示すような構造を有している。すなわち、図３に示すように、ＢｍＯＲ−１遺伝子は、９８７０ｂｐのゲノムＤＮＡの中で、８つのエキソンと７つのイントロンとからなっている。このゲノムＤＮＡは、Ｂ．  ｍｏｒｉの性染色体の一つ、Ｚ染色体に位置づけられている。このＢｍＯＲ−１遺伝子は、オスのカイコガの触角における嗅覚ニューロンで発現することが明らかとなっている。
【００４６】
さらに、本発明に係る遺伝子は、上記配列番号２に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子に限定されるものではなく、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００４７】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００４８】
（２）本発明に係るタンパク質および遺伝子の取得方法
本発明に係るタンパク質および遺伝子の取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。
【００４９】
（２−１）タンパク質の取得方法
本発明に係るタンパク質を取得する方法（生産方法）は、上述したように特に限定されるものではないが、まず、本発明に係るタンパク質を発現する細胞、組織などから単純精製する方法を挙げることができる。なお、本発明に係るタンパク質を発現する細胞、組織は、自然発生型のものでもかまわないし、例えば、上記で説明したように、組み換えバキュロウイルスに感染した細胞、組織であってもかまわない。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法で細胞や組織から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。
【００５０】
また、本発明に係るタンパク質を取得する方法として、遺伝子組み換え技術等を用いる方法も挙げられる。この場合、例えば、本発明に係る遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、公知の方法により、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記タンパク質を精製するという方法などを採用することができる。遺伝子の導入（形質転換）や遺伝子の発現等の具体的な方法については後述する。
【００５１】
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を精製する方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
【００５２】
変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、上記（ａ）のタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００５３】
本発明に係るタンパク質の取得方法は、上述に限定されることなく、例えば、化学合成されたものであってもよい。例えば、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明に係る遺伝子から本発明に係るタンパク質を合成してもよい。
【００５４】
（２−２）遺伝子の取得方法
本発明に係る遺伝子を取得する方法（生産方法）も上述したように特に限定されるものではないが、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（サブトラクションクローニング）を利用する方法を挙げることができる。この方法では、公知の技術に従って、試験管内での直接的ハイブリダイゼーションを繰り返し、目的のｃＤＮＡ（本発明に係る遺伝子）を濃縮すればよい。
【００５５】
上記ディファレンシャルスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。これによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００５６】
また、本発明に係る遺伝子を取得する方法として、公知の技術により、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、上記ｃＤＮＡ配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。
【００５７】
また、上記プローブの配列を、他の昆虫種間で良好に保存されている領域の中から選択し、他の昆虫のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記タンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００５８】
なお、本発明に係る遺伝子の組織的同定を行うには、例えば、各組織からの総ＲＮＡに対して、ＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−ＰＣＲを用いて、同定することができる。
【００５９】
あるいは、本発明に係る遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明に係る遺伝子のｃＤＮＡ配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６０】
（３）本発明に係るタンパク質およびその遺伝子の利用方法（有用性）
本発明に係るタンパク質は、昆虫の特定の性フェロモンを特異的に認識できるため、性フェロモンの応答及び伝達のメカニズムと、そして、脳内で続けて起こるカスケードに関するシステムの解明に利用できる。また、他の昆虫種からの性フェロモン受容体の同定と機能解析にも利用することができ、このことは、種に特異的な性フェロモンとそれらの受容体の分子的な進化の洞察を与えることができる。
【００６１】
さらに、本発明に係るタンパク質および遺伝子は、上記のような学術的利用だけでなく、例えば、産業上の利用も可能である。例えば、貯穀害虫防除等に本発明のタンパク質及びその遺伝子は利用可能である。そこで、本発明の利用方法（および有用性）として、スクリーニング方法、組換え発現ベクター、形質転換体、遺伝子検出器具、抗体、薬剤等を例に挙げてより具体的に説明する。
【００６２】
（３−１）スクリーニング方法
本発明に係るタンパク質の産業上の利用可能性について一例を挙げると、まず、本発明に係るタンパク質と性フェロモンとの結合を阻害して、性フェロモンの応答機構を妨げることで、害虫とされる昆虫の繁殖を妨害または抑制する害虫駆除剤のスクリーニングに応用することが考えられる。逆に、性フェロモンの応答機構を促進することで、カイコやミツバチ等の家畜昆虫を効率的に繁殖させたりすることも可能となり、家畜昆虫用の薬剤のスクリーニングとしても利用可能である。
【００６３】
したがって、本発明に係るタンパク質およびその遺伝子は、上述した薬剤の候補分子のスクリーニングに有用である。本発明に係るスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。
【００６４】
例えば、上記ＢｍＯＲ−１タンパク質は、カイコガの性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌを受容するとともに、Ｇタンパク質にも結合する。そこで、例えば、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ）または細胞内において、下記▲１▼〜▲３▼のいずれかの物質と下記▲４▼〜▲８▼のいずれかの物質とを発現させ、両分子の結合を阻害する分子等を候補分子の中からＥＬＩＳＡ法等によって検出するスクリーニング方法などが挙げられる。
▲１▼  本発明に係るタンパク質（ＢｍＯＲ−１タンパク質等）。
▲２▼  本発明に係るタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくとも性フェロモン受容体部分またはＧタンパク質結合部分を含む部分タンパク質。
▲３▼  上記▲１▼のタンパク質または上記▲２▼の部分タンパク質の改変体。
▲４▼  昆虫の性フェロモン（ｂｏｍｂｙｋｏｌ等）。
▲５▼  昆虫の性フェロモンの類縁化合物。
▲６▼  Ｇタンパク質。
▲７▼  Ｇタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくとも本発明に係るタンパク質と結合する部分を含む部分タンパク質。
▲８▼  上記▲６▼のＧタンパク質または▲７▼の部分タンパク質の改変体。
【００６５】
なお、上記「（タンパク質の）改変体」とは、当該タンパク質の１個または数個（好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された改変体をいい、当該タンパク質がＨｉｓ  やＭｙｃ  等のタグによって標識される場合や、当該タンパク質を蛍光タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させる場合、当該タンパク質にリン酸化や糖鎖結合等により修飾を施す場合などをも含む意味で用いている。
【００６６】
（３−２）組換え発現ベクター
本発明に係る組換え発現ベクターは、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものである。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
【００６７】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【００６８】
本発明に係る遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。
例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明に係る遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
【００６９】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、カイコガ由来の細胞をはじめとして、キイロショウジョウバエ等の昆虫、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００７０】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るタンパク質を昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を好適に採用することができる。
【００７１】
（３−３）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子、すなわち、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【００７２】
本発明に係る形質転換体の作製方法（生産方法）は、上述した組換え発現ベクターを形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記ホスト細胞で例示した各種微生物や動物を挙げることができる。また、プロモーターやベクターを選択すれば、植物も形質転換の対象とすることが可能である。
【００７３】
中でも、対象となる生物としては、カイコガやキイロショウジョウバエ等がより好ましい。これら昆虫は、実験用の昆虫として各種実験技術が整備されており、実験昆虫として好ましく用いられる。さらにカイコガは、家畜昆虫としても古い歴史を有しており、近年タンパク質の生産系としても注目されていること、本発明に係るタンパク質として、カイコガ由来の前記ＢｍＯＲ−１タンパク質が挙げられることから、昆虫の生理機能解明だけでなく、本発明に係るタンパク質の大量生産等にも有用である。
【００７４】
（３−４）遺伝子検出器具
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明に係る遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用することができる。
【００７５】
本発明に係る遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
【００７６】
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができる。具体的には、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１２６８，  １９９７；  Ｃｅｌｌ  ８８：２４３，  １９９７；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４，  １９９５；  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：３００，  １９９７；  米国特許第５，６９５，９３７  号）等を挙げることができる。
【００７７】
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
【００７８】
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
【００７９】
（３−５）抗体
本発明に係る抗体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質（本発明に係るタンパク質）、またはその部分タンパク質・部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」」に記載の方法が挙げられる。このようにして得られる抗体は、本発明に係るタンパク質の検出・測定などに利用できる。他にも、例えば、農薬用としてフェロモントラップなどに利用できる可能性がある。
【００８０】
（３−６）薬剤
本発明には、本発明に係るタンパク質や遺伝子を含む薬剤、あるいは、上述したスクリーニング方法により得られる物質を含む薬剤も含まれる。例えば、本発明に係る薬剤の一例として、本発明に係る受容体タンパク質または本発明に係る遺伝子を含む性フェロモン検出剤を挙げることができる。これらを用いた性フェロモン検出剤の具体的な構成は特に限定されるものではなく、用途や目的に応じて、種々の添加剤や緩衝液を加えればよい。このような性フェロモン検出剤は、例えば、バイオセンサー等に応用することが可能となる。
【００８１】
また、上述した、本発明に係る受容体タンパク質を調節する物質をスクリーニングすることにより、得られた物質を害虫駆除剤として利用することもできる。すなわち、本発明に係る害虫駆除剤は、上記スクリーニング方法により得られた物質を含む構成であればよい。なお、害虫駆除剤の具体的な構成も特に限定されるものではなく、上記性フェロモン検出剤と同様に、用途や目的に応じて、種々の添加剤や緩衝液を加えればよい。このような害虫駆除剤を用いることで、例えば、ポストハーベストペストの制御といった利用が可能となる。
【００８２】
以下にいくつかの実施例、並びに図面を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【００８３】
【実施例】
以下の実施例にて用いた実験材料や実験方法のうち、ｂｏｍｂｙｋｏｌおよびｂｏｍｂｙｋａｌの合成、並びに実験動物について、先に具体的に説明する。
【００８４】
〔ｂｏｍｂｙｋｏｌ及びｂｏｍｂｙｋａｌの合成例〕
次に示す構造を有するｂｏｍｂｙｋｏｌ、
【００８５】
【化３】
2005046033.tif 000004
【００８６】
すなわち（１０Ｅ，１２Ｚ）−ヘキサデカジエン−１−オール（（１０Ｅ，  １２Ｚ）−Ｈｅｘａｄｅｃａｄｉｅｎ−１−ｏｌ）は、１−ペンチン（１−ｐｅｎｔｙｎｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）および１０−ウンデシン−１−オール（１０−ｕｎｄｅｃｙｎ−１−ｏｌ、東京化成社製）を出発物質として立体特異的に合成した。具体的な合成方法は、Ｍｉｙａｕｒａ，  Ｎ．  ＆  Ｓｕｇｉｎｏｍｅ，  Ｈ．  Ｎｅｗ  ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ｏｆ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｂｏｍｂｙｋｏｌ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｒｅｅ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９，  ３２７１−３２７７  （１９８３）に記載されたプロトコルに従った。蒸留して精製したｂｏｍｂｙｋｏｌの構造は、１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ）を測定することにより確認した。
【００８７】
また、次に示す構造を有するｂｏｍｂｙｋａｌ、
【００８８】
【化４】
2005046033.tif 000005
【００８９】
すなわち（１０Ｅ，１２Ｚ）−ヘキサデカジエン−１−アール（（１０Ｅ，  １２Ｚ）−Ｈｅｘａｄｅｃａｄｉｅｎ−１−ａｌ）は、ｂｏｍｂｙｋｏｌをＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ酸化することにより合成した。
【００９０】
〔実験動物：カイコガＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ〕
カイコガＢ．  ｍｏｒｉは、２５℃で１２時間：１２時間（Ｌ：Ｄ）のライトサイクルで成育した。また、成育したカイコガより得られた組織は、液体窒素で凍結し、−８０℃で必要になるまで保存した。
【００９１】
〔実施例１：ディファレンシャルスクリーニングによるＢｍＯＲ−１遺伝子の同定〕
カイコガＢ．  ｍｏｒｉの触角のｃＤＮＡライブラリーは、低濃度（１０００〜１５００ｐｆｕ／１４０×１００ｍｍプレート）で平板培養し、ファージＤＮＡを、三重のニトロセルロース膜に、公知の方法で転写した。何れのニトロセルロース膜についても、蛍光ラベルされたプローブの１つを用いて、きわめて厳格に、分離してハイブリダイズした。このハイブリダイズでは、ＧｅｎｅＩｍａｇｅｓ  ＣＤＰ−Ｓｔａｒ検出モデル（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた。ここで用いた、蛍光ラベルされたプローブは、１日齢のオスにおける触角由来のｃＤＮＡ（ポジティブコントロール）、１日齢のオスにおける胴体（触角と翅とのないもの）由来のｃＤＮＡ（ネガティブコントロール）、または、カイコガＢ．  ｍｏｒｉのフェロモン結合タンパク質（ＰＢＰ）であるＧＯＢＰ１、ＧＯＢＰ２およびＡＢＰＸ（文献名Ｍａｉｄａ，  Ｒ．，  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｔ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｚｉｅｇｅｌｂｅｒｇｅｒ，  Ｇ．  ＆  Ｐｅｌｏｓｉ，  Ｐ．  Ｔｈｅ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ：  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２３，  ２４３−２５３  （１９９３），およびＫｒｉｅｇｅｒ，  Ｊ．，  ｖｏｎ  Ｎｉｃｋｉｓｃｈ−Ｒｏｓｅｎｅｇｋ，  Ｅ．，  Ｍａｍｅｌｉ，  Ｍ．，  Ｐｅｌｏｓｉ，  Ｐ．  ＆  Ｂｒｅｅｒ，  Ｈ．  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａｎｔｅｎｎａｅ  ｏｆ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２６，  ２９７−３０７  （１９９６））のｃＤＮＡを混合したもの（ネガティブコントロール）である。
【００９２】
上記ハイブリダイズにおいては、触角由来のｃＤＮＡプローブでハイブリダイズされ、かつ、胴体およびＯＢＰのｃＤＮＡプローブではハイブリダイズされなかったクローンを同定した。これらのｃＤＮＡクローンのヌクレオチドシークエンスは、ＡＢＩ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて決定した。
【００９３】
ＢｍＯＲ−１遺伝子クローンは、Ｂｌａｓｔｘアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて、昆虫のにおい物質受容体に似た配列の検索により、カイコガＢ．  ｍｏｒｉのにおい物質受容体遺伝子として同定した。
【００９４】
〔実施例２：ＢｍＯＲ−１遺伝子のゲノムシークエンス〕
成虫のオスのカイコガＢ．  ｍｏｒｉからゲノムＤＮＡを抽出した。抽出には、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ  ｃｅｌｌおよびＴｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔｓ（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた。ＢｍＯＲ−１遺伝子は、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）と、次に示す各プライマー１・２を用いて、カイコガＢ．  ｍｏｒｉのゲノムＤＮＡから増幅させた。
プライマー１：５’−ＧＧＡＴＡＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＴＣＧＣ−３’（配列番号３）
プライマー２：５’−ＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＧＴＴＣＧＡＡＧＣＡＴＣＡＣＧ−３’（配列番号４）
なお、上記プライマーは、ＢｍＯＲ−１遺伝子のｃＤＮＡの配列におけるヌクレオチドの２５−４７あるいは、１３２６−１３５０番目と一致している。
【００９５】
ＰＣＲによるＢｍＯＲ−１遺伝子の増幅は、１分間加熱した後、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、６８℃で１０分を３０サイクル、７２℃で１０分を１サイクルの条件で行った。このＰＣＲにより９．４ｋｂの長さのＰＣＲ断片を得た。この断片を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込み、ベクター特異的あるいは、シークエンス特異的なプライマーを用いて配列を決定した。ＰＣＲ産物には含まれていないＢｍＯＲ−１遺伝子のゲノム配列の終端部は、次の実施例３で説明するＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローンを用いて配列を決定した。
【００９６】
〔実施例３：ＢＡＣクローンの同定およびＢｍＯＲ−１遺伝子のシークエンス位置の決定〕
カイコガＢ．  ｍｏｒｉのＢＡＣライブラリーを、ＢｍＯＲ−１遺伝子の長さの違う断片に対する特異的な２組のプライマーを用いて、Ｗｕ，  Ｃ．，  Ａｓａｋａｗａ，  Ｓ．，  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｎ．，  Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｓ．  ＆  Ｙａｓｕｋｏｃｈｉ，  Ｙ．  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ，  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２６１，  ６９８−７０６  （１９９８）に記載された方法で、ＰＣＲによりスクリーニングした。上記２組のプライマーとしては、次に示すように、６１０ｂｐ断片に対する各プライマー３・４、並びに、６０２ｂｐ断片に対するプライマー５・６を用いた。
【００９７】
用いたプライマーは、
プライマー３：５’−ＡＡＣＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＡＣＧＡ−３’（配列番号５）
プライマー４：５’−ＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号６）
プライマー５：５’−ＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡ−３’（配列番号７）
プライマー６：５’−ＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧＧＴＧＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号８）
である。
【００９８】
同定されたクローンの１つは、Ｂ１７Ｆ１０Ｅ９配列を含んでいた。この配列は、カイコガＢ．  ｍｏｒｉのＺ染色体のマーカー配列として知られている。
【００９９】
このように実施例２および３の結果から、ＢｍＯＲ−１遺伝子は、図３に示すように、９８７０ｂｐのゲノムＤＮＡ中で、８つのエキソンおよび７つのイントロンからなる構造であり、カイコガＢ．  ｍｏｒｉのＺ染色体に位置していることがわかった。また、データは示さないが、サザンブロット解析からＢｍＯＲ−１遺伝子は、ゲノムにおいて、シングルコピー遺伝子であることがわかった。
【０１００】
〔実施例４：組織から同定されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ〕
１日齢の成虫のオスのカイコガＢ．  ｍｏｒｉにおいて、その触角、頭部、脚、翅、胸部、及び腹部の組織から、総ＲＮＡを分離して抽出した。総ＲＮＡの抽出方法は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．  ＆  Ｓａｃｃｈｉ，  Ｎ．  Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６２，  １５６−１５９  （１９８７）に記載された、酸性グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法により行った。抽出したＲＮＡは、ＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、再沈殿させた。このＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）アダプタープライマー（Ｔａｋａｒａ社製）とＡＭＶ逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ社製）とを用いて、４２℃、３５分間で逆転写した。
【０１０１】
ＢｍＯＲ−１、ＢｍＯＲ−２、ＰＢＰ、および、Ｂ．  ｍｏｒｉアクチン１（Ｍｏｕｎｉｅｒ，  Ｎ．  Ｇａｉｌｌａｒｄ，  Ｊ．  ＆  Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ，  Ｊ．  −Ｃ．  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｃｔｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５，  ２７８１  （１９８７）  に記載）のｃＤＮＡを、次に示す各プライマーのペアを用いて、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）により増幅させた。
【０１０２】
上記プライマーのペアとしては、ＢｍＯＲ−１のｃＤＮＡに対してはプライマー７・８のペア、ＢｍＯＲ−２のｃＤＮＡに対してはプライマー９・１０のペア、ＰＢＰのｃＤＮＡに対してはプライマー１１・１２のペア、Ｂ．  ｍｏｒｉアクチン１に対してはプライマー１３・１４のペアをそれぞれ用いた。
【０１０３】
用いたプライマーは、
プライマー７：５’−ＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＴＣＧＴＴＣ−３’（配列番号９）
プライマー８：５’−ＣＧＧＴＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＣＡＧＣＣＣ−３’（配列番号１０）
プライマー９：５’−ＣＧＣＴＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１１）
プライマー１０：５’−ＡＡＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号１２）
プライマー１１：５’−ＧＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号１３）
プライマー１２：５’−ＡＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＧＡＧＣ−３’（配列番号１４）
プライマー１３：５’−ＡＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＣＧＣ−３’（配列番号１５）
プライマー１４：５’−ＣＧＡＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧ−３’（配列番号１６）
である。
【０１０４】
ＰＣＲは、９５℃で１分間加熱を行いその後、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の条件で３０サイクル行い、その後７２℃で１０分間の条件で１サイクル行った。総量が同量のＰＣＲ産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた電気泳動により分離した。さらなる解析のために、総ＲＮＡを、卵、第５齢の幼虫の頭部、並びに、サナギ及び成虫の触角から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲは上述と同様に行った。逆転写の間、逆転写酵素を用いない場合には、ＰＣＲ産物は産出されなかった。そして、シークエンス解析により、ｃＤＮＡ産物の同定が裏付けられた。その結果を図４（ａ）・（ｂ）に示す。
【０１０５】
図４（ａ）に示すように、ＢｍＯＲ−１遺伝子は、Ｂ．  ｍｏｒｉのオスの触角でのみ発現することがわかった。また、図４（ｂ）に示すように、ＢｍＯＲ−１遺伝子の転写は、羽化前４日で初めて検出され、さなぎ末期の間に増加し、成虫期の間にオスの触角で検出され続けることが分かった。なお、データは示さないが、ＢｍＯＲ−１のｍＲＮＡは、第５齢幼虫の頭部や卵では検出されない。
【０１０６】
〔実施例５：ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション〕
ＢｍＯＲ−１のｃＤＮＡ（ヌクレオチド位置６１−５５５）をコードした領域、または、ＰＢＰのｃＤＮＡ（ヌクレオチド位置１３６−３５３）をコードした領域を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングした。Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ標識されたＢｍＯＲ−１のＲＮＡプローブ、およびＦＩＴＣ標識されたＰＢＰのＲＮＡプローブを、ＳＰ６／Ｔ７トランスクリプションキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、取り扱い説明書に従って、線状の組み換えｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターから合成した。
【０１０７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｔａｕｔｚｓ，  Ｄ．  ＆  Ｐｆｅｉｆｆｌｅ，  Ｃ．  Ａ  ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｈｕｎｃｈｂａｃｋ．  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  ９８，  ８１−８５  （１９８９）  に記載された方法に、いくつかの修正を加えて行った。
【０１０８】
具体的には、羽化１か２日前のサナギの触角を解剖して断片化し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて４℃で一晩固定し、５０μｇ／タンパク質分解酵素Ｋ／ＰＢＳを用いて１時間３７℃で処理した。そして、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて５分間で固定して、最終的な試料とした。この試料に対して、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ（ＰＢＡＴ）を用いて、室温で、５分間の洗浄を３回行った。続けて、この試料に、ＰＢＳＴ：ハイブリダイゼーションバッファー（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０μｇ／ｍｌヘパリン、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１００  μｇ／ｍｌ  ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ）＝１：１を用いて、５分間インキュベーションを行った。ハイブリダイゼーション反応は、１６時間で６０℃の条件にて、５００ｎｇ／ｍｌ濃度のＢｍＯＲ−１遺伝子プローブを用いて行った。ハイブリダイズされた触角の試料を、ハイブリダイゼーションバッファーで１０分６０℃の条件にて洗浄し、さらに、ＰＢＳＴ：ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ＝１：１の混合液で１０分間洗浄し、その後、３回ＰＢＳＴでそれぞれ１０分間洗浄した。ハイブリダイゼーションを、アルカリ性のホスファターゼ共役アンチＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製；１：５０００  ｉｎ  ＰＢＳＴ）を用いて検出し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰにより染色した。その後触角は、Ｅｐｏｎ−８２  ｒｅｓｉｎ（ＴＡＡＢ社製）に包埋し、２μｍプラスチック断片に切断した。
【０１０９】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは次のようにして行った。すなわち、１日齢の成虫のカイコガＢ．  ｍｏｒｉの触角を、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて一晩４℃で固定し乾燥させた後、パラフィンで包埋し、１０μｍ断片に切断した。得られた組織断片を、１６時間６０℃の条件で、ラベルされたプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー１００μｌを用いてインキュベートした。なお、ハイブリダイゼーションバッファー中のプローブとしては、ＤＩＧラベルされたＢｍＯＲ−１遺伝子プローブおよびＦＩＴＣラベルされたＰＢＰ抗ＲＮＡプローブの両方を用い、その濃度は、それぞれ５００ｎｇ／ｍｌとした。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション後の断片は、上述したように洗浄し、ハイブリダイゼーション信号を、ＴＳＡ  Ｐｌｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて増幅し、信号検出に関しては、メーカー指示に従って行った。ＤＩＧラベルされたプローブを、基質としてのＴＭＲチラミドを有する抗ＤＧＩ−ＰＤＯ（Ｒｏｃｈｅ社製；１：１００）で視覚化し、ＦＩＴＣラベルされたプローブは、基質としてのＦＩＴＣチラミドを有する抗ＦＩＴＣ−ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社製；１：１００）を用いて視覚化した。
【０１１１】
図５（ａ）〜（ｅ）に示すように、上記のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験から、ＢｍＯＲ−１のｍＲＮＡは、オスの触角において、化学感覚毛が在る側の上皮組織に特異的な細胞に局在していることが分かった。なお、図５（ｄ）、（ｅ）は、ＢｍＯＲ−１とＰＢＰの発現を二重染色で確認したものである。図５（ｄ）、（ｅ）において、点線で囲まれている箇所にＰＢＰが発現しており、それ以外の発光がみられる箇所にＢｍＯＲ−１が発現している。また、図５（ｆ）に示すように、ハリブリダイゼーション信号は、メスの触角では検出されなかった。オスのカイコガＢ．  ｍｏｒｉにおける長い化学感覚毛の感覚子ｔｒｉｃｈｏｄｅｕｍは、一対のフェロモン受容体ニューロンを含んでおり、それぞれ、ｂｏｍｂｙｋｏｌ、あるいは、ｂｏｍｂｙｋａｌだけに応答するように最適化されている。ラベルされた細胞の分布および密度は、長い感覚子ｔｒｉｃｈｏｄｅｕｍの分布および密度に類似している。さらに、図５（ｃ）に示すように、２μｍプラスチック片において観察すると、ＢｍＯＲ−１反応細胞は、わずかに楕円形であり、触角器官の下５−１０μｍに存在する嗅覚器官ニューロンと同定された。データは示さないが、センスＲＮＡプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕのハイブリダイゼーション実験ではどの細胞もラベルされなかった。
【０１１２】
フェロモン検出に関与していると考えられているフェロモン結合蛋白質（ＰＢＰ）の発現特性は、データは示さないが、メスの成虫およびさなぎの触角においてＰＢＰのｍＲＮＡが低レベルで検出されたことを除いては、ＢｍＯＲ−１の発現特性と似ている。オスの成虫の触角組織の切片をＢｍＯＲ−１とＰＢＰアンチセンスＲＮＡｓでダブルラベリングすると、ＢｍＯＲ−１ラベルされた細胞は、感覚上皮組織側に位置し、ＰＢＰラベルされた細胞に囲まれていた。これらの結果は、これまでの知見と一致する。これらの結果から、ＢｍＯＲ−１遺伝子は、オスの蛾の触角において、フェロモン受容ニューロンでのみ発現すると推測される。
【０１１３】
〔実施例６：Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの卵母細胞での遺伝子発現および電気生理学レコーディング〕
アフリカツメガエルＸ．  ｌａｅｖｉｓの第Ｖ−ＶＩＩ期の卵母細胞を、Ｃａ２＋フリーの塩の溶液中（溶液の組成：８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２ｍＭ  ＫＣｌ，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．５）のｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２ｍｇ／ｍｌを用いて、１、２時間、室温で処理した。処理後の卵母細胞に対して、Ｋａｔａｄａ，  Ｓ．，  Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｔ．，  Ｋａｔａｏｋａ，  Ｈ．  ＆  Ｔｏｕｈａｒａ，  Ｋ．  Ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕ．  ３０５，  ９６４−９６９  （２００３）  に記載のマイクロインジェクション法に従って、ＢｍＯＲ−１のｃＲＮＡおよびＢｍＧαｑ（Ｇαｑファミリーに属するカイコガＢ．  ｍｏｒｉのＧタンパク質のαサブユニット）のｃＲＮＡを注入した。このとき用いたＢｍＯＲ−１のｃＲＮＡは、ｐＳＰＵＴＫ−ＢｍＯＲ−１から合成し、導入には５０ｎｇ用いた。同じく、ＢｍＧαｑのｃＲＮＡは、ｐＳＰＵＴＫ−ＢｍＧαｑから合成し、導入には２５ｐｇ用いた。なお、ネガティブコントロールとしては、ＢｍＯＲ−１のｃＲＮＡを５０ｎｇのみ注入した卵母細胞、あるいは、ＢｍＧαｑのｃＲＮＡを２５ｐｇを注入した卵母細胞を用いた。
【０１１４】
上記各ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を、５〜７日間１８℃で、１０μｇ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシンとを補充した溶液中（溶液の組成：８８ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＫＣｌ，  ０．３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２，  ０．４ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  １５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．６）でインキュベーションした。
【０１１５】
全ての細胞電流は、２つの電極を用いた電圧クランプ（商品名ＯＣ−７２５，  Ｗａｒｎｅｒ社製）を用い、Ｋｕｂｏ，  Ｙ．，  Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，  Ｔ．  ＆  Ｍｕｒａｔａ，  Ｙ．  Ｓｔｒｕｃｔｒｕａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｃａ２＋  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，  １７２２−１７２５  （１９９８）  に記載されている方法で記録した。データの取得および解析は、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２ＡおよびｐＣＬＡＭＰソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を用いて行った。
【０１１６】
Ｃａ２＋依存のＣｌ−電流は、−８０ｍＶに膜電位を固定し、２秒毎に＋６０ｍＶ、２００ｍ秒間の脱分極パルスを与えることにより観測された。５回目のパルスにおいて、一定の濃度になるように、４０μｌの濃度ｂｏｍｂｙｋｏｌまたは、ｂｏｍｂｙｋａｌの貯蔵液をレコーディングバス（体積１６０μｌ）に加えた。その結果をコントロールの結果とともに、図６（ａ）〜（ｄ）および図７（ａ）・（ｂ）に示す。
【０１１７】
図６（ａ）に示すように、強いＣａ２＋依存のＣｌ−電流が、図６（ｃ）・図７（ａ）に示すように、ｂｏｍｂｙｋｏｌをレコーディングバスに加えてすぐに観測されたが、図７（ｂ）に示すように、ｂｏｍｂｙｋａｌを加えたときには観測されなかった。そのとき、ＢｍＯＲ−１遺伝子は、ＢｍＧαｑ遺伝子と共に発現していた。また、図７（ａ）に示すように、ＢｍＯＲ−１のｃＲＮＡあるいはＢｍＧαｑのｃＤＮＡのみを注入した卵母細胞は、ｂｏｍｂｙｋｏｌに対して応答しなかった。さらに、図６（ｂ）・（ｄ）に示すように、ＢｍＯＲ−１およびＢｍＧαｑのｃＲＮＡを注入していないコントロール卵母細胞もｂｏｍｂｙｋｏｌに対して応答しなかった。
【０１１８】
これらの結果から、ＢｍＯＲ−１タンパク質は、ｂｏｍｂｙｋｏｌを認識し、続けてＧタンパク質（αサブユニットであるＢｍＧαｑタンパク質）と結合して、卵母細胞におけるイノシトールリン酸塩／Ｃａ２＋カスケードを活性化したと考えられる。本実施例の結果からＢｍＯＲ−１タンパク質は、異種生物の細胞システムにおいて、ｂｏｍｂｙｋｏｌの受容体として機能するということが証明された。
【０１１９】
〔実施例７：ＢｍＯＲ−１組み換えバキュロウイルスの作製〕
オスの触角で観測されるｂｏｍｂｙｋｏｌ受容体がメスの触角において、認識されるかどうかを実験するために、ＢｍＯＲ−１タンパク質をコードした配列を有するバキュロウイルス組み換え体（ＨｙＢｍＯＲ−１）を作製した。
【０１２０】
ｐＶＬ−ＢｍＯＲ−１とｐＶＬ―ＢｍＯＲ−１／ＧＦＰとを構築するために、ＢｍＯＲ−１遺伝子の配列をコードした完全なタンパク質を、トランスファーベクターｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ１３９３−ＧＦＰ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）にサブクローニングした。上記ｐＶＬ−ＢｍＯＲ−１は、ネイティブＢｍＯＲ−１タンパク質を発現するものであり、上記ｐＶＬ―ＢｍＯＲ−１／ＧＦＰは、ＢｍＯＲ−１タンパク質のＣ末端にＧＦＰが融合したキメラタンパク質を発現するものである。
【０１２１】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１−ＡＥ（Ｓｆ２１）細胞に、２μｇの合成トランスファーベクターＤＮＡと、１μｇの線状ＨｙＮＰＶ（Ｍｏｒｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３，  １８７７−１８８０  （１９９２）  参照）ゲノムＤＮＡとをリポフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて同時に導入した。なお、この後者のゲノムＤＮＡは、宿主範囲を広げたＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶに由来する。
【０１２２】
組み換えバキュロウイルスのプラークを取り除き、力価１×１０７ｐｆｕ／ｍｌに増幅した。ｐＶＬ−ＢｍＯＲ−１およびｐＶＬ−ＢｍＯＲ−１／ＧＦＰから得られた組み換えバキュロウイルスは、それぞれ、ＨｙＢｍＯＲ−１とＨｙＢｍＯＲ−１／ＧＦＰと名付けた。
【０１２３】
〔実施例８：メスのカイコガへのバキュロウイルスの感染〕
実施例７により得られたバキュロウイルスを用いて、ＢｍＯＲ−１遺伝子の転位発現に関する実験を行った。
【０１２４】
メスのカイコガＢ．  ｍｏｒｉのサナギは、羽化前に、５０μｌの組み換え型、あるいは、野生型のバキュロウイルスで４日間接種した。バキュロウイルスに感染したカイコガの触覚から、前記実施例４と同様にして総ＲＮＡを分離して抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ産物を得て、電気泳動によって分離した。その結果を図８に示す。なお、図８において、ＭＡはオスの触角、ＦＡはメスの触角、ＨＡはＨｙＢｍＯＲ−１感染したメスの触角を示す。マイナスは、逆転写酵素なしにＲＴ−ＰＣＲしたものを示している。図８に示すように、カイコガＢ．  ｍｏｒｉのメスのサナギに対して、羽化前４日目に、ＨｙＢｍＯＲ−１を感染させると、羽化後１日齢の成虫のカイコガ（メス）の触覚にＢｍＯＲ−１の転写物が検出された。
【０１２５】
また、上記バキュロウイルスに感染したカイコガの触角についてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。その結果を図９（ａ）・（ｂ）に示す。図９（ａ）がＨｙＢｍＯＲ−１／ＧＦＰを感染させた場合、（ｂ）がバキュロウイルスの野生型ホスト（ＨｙＮＰＶ）を感染させた場合のカイコガ（メス）の触角感覚子のＧＦＰ蛍光による発光である。なお、スケールバーは５０μｍを示す。
【０１２６】
図９（ａ）に示すように、ＨｙＢｍＯＲ−１／ＧＦＰに感染したカイコガ（メス）の触角には、ＢｍＯＲ−１−ＧＦＰ結合タンパク由来の蛍光が見られ、受容体タンパク質の発現がわかった。さらにこの蛍光の位置から、受容体タンパク質が嗅覚感覚子の先に位置していることがわかった。一方、図９（ｂ）に示すように、ＨｙＮＰＶで感染させられたメスのサナギは、未処理のメスのカイコガと同様、蛍光を示さなかった。なお、触角の表面は自家蛍光を示した。
【０１２７】
〔実施例９：触角電位図（ＥＡＧ）記録〕
ＢｍＯＲ−１タンパク質を有するカイコガの触角を性フェロモンにさらした場合に、そのニューロンの活動について実験した。ｂｏｍｂｙｋｏｌ、またはｂｏｍｂｙｋａｌを含む気流の下で、触角電位図（ＥＡＧ）応答を測定した。
【０１２８】
１日齢の成虫のカイコガ（オスのガおよび実施例８により得られたバキュロウイルス感染したメスのガ）の触角を根元から切り取った。ただちに不関電極を触角の先端に付けるとともに、記録電極を触角の根元に付けて、ＥＡＧ記録した。電極は０．１ＭのＮａＣｌで満たされており、ＤＣプリアンプ（日本光電社製、商品名：ＭＥＺ−７１０１）からの信号を、チャートレコーダー（Ｇｒａｐｈｔｅｃｈ社製、商品名：ＷＸ１２００）でプロットした。
【０１２９】
性フェロモンであるｂｏｍｂｙｋｏｌまたはｂｏｍｂｙｋａｌは、１００ｎｇ／μｌの濃度となるように１％ジメチルスルホキシドに溶解した溶液とし、これら溶液それぞれ４０μｌを、１．２ｃｍ２の濾紙（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ社製、Ｎｏ．  ２）に充填し、プラスチックのピペットチップに挿入した。ピペットチップを介して、活性炭で浄化した気流を、Ｔｙｇｏｎｅ管（内径４ｍｍ）を通して、約５ｍｍの距離から触角に吹きつけた。前記非特許文献４によれば、気流での匂いの刺激は、匂いの濃度と気流の速度との積で定義される。そのため、性フェロモンの投与は、５０から５００ｍｌ／ｍｉｎの気流速度になるよう制御し、性フェロモンは、弁を手動で開けたり閉めたりすることによって与えた。その結果を図１０〜図１２に示す。また、性フェロモンを与えるタイミングは、図１０・１１に示す点線で表される時間から開始し、与えた時間は図１０・１１に示すように１秒間とした。
【０１３０】
図１０・１１に示すように、ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスの触角は、ｂｏｍｂｙｋｏｌ（３５０〜５００ｍｌ／ｍｉｎ，ｎ＝１０）に応答したが、ｂｏｍｂｙｋａｌには、強度の最も強い（５００ｍｌ／ｍｉｎ，ｎ＝１０）状態でも反応しなかった。また、図１０および図１２（ｂ）に示すように、ＨｙＮＰＶに感染したメスの触角（ｎ＝３２）および感染していないメスの触角（ｎ＝７８）は、ｂｏｍｂｙｋｏｌ（５００ｍｌ／ｍｉｎ）にもｂｏｍｂｙｋａｌにも応答しなかった。一方、データは示さないが、リナロオールのような一般的なにおい物質に対する応答は、ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したカイコガでも感染していないカイコガでも、同様の感度で検出された（データなし）。
【０１３１】
以上の結果、すなわち、ｂｏｍｂｙｋｏｌに応答し、ｂｏｍｂｙｋａｌには応答しないことからから明らかなように、メスのカイコガの触角におけるＢｍＯＲ−１遺伝子の転移発現が実証された。なお、データは示さないが、ＨｙＢｍＯＲ−１／ＧＦＰに感染したメスの触角は、ｂｏｍｂｙｋｏｌに応答しないことがＥＡＧにより観測されている。これは、おそらくＢｍＯＲ−１タンパク質のＣ末端において大きなＧＦＰ分子がＧタンパク質結合能を弱めるためであると推測される。
【０１３２】
また、図１１および図１２（ｂ）に示すように、ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスのカイコガの触角におけるｂｏｍｂｙｋｏｌに対する応答は、初めに２５０ｍｌ／ｍｉｎで検出され、より高い流量に依存した応答がＥＡＧにより記録された。一方、図１２（ａ）に示すように、オスのカイコガの触角では、低い流量（１５０ｍｌ／ｍｉｎ）においても、ｂｏｍｂｙｋｏｌに対する応答を示した。
【０１３３】
さらに、３５０ｍｌ／ｍｉｎにおいて、ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスのカイコガの触角における応答の大きさは、オスのカイコガの触角よりも、約８倍低かった（メスのカイコガにおける応答：１．５６±０．１３３  ｍＶ  ＳＥＭ、ｎ＝１０、オスのカイコガにおける応答：１２．８２±１．５１  ｍＶ  ＳＥＭ、ｎ＝８）。ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスのカイコガの触角における感度の低下は、触覚におけるＢｍＯＲ−１遺伝子の発現が、オスの触角におけるそれよりも低レベルとなることによるものと推定された。Ｋａｉｓｓｌｉｎｇが提案しているカイコガの触角における刺激応答モデルにしたがえば、刺激応答曲線は、受容体分子が少ない場合、高濃度側にシフトし、最大応答も小さくなる。ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスのカイコガの触角の感度の低下は、たしかに、受容体ニューロン中へのＨｙＢｍＯＲ−１の感染が少ないことに原因があると考えられる。Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａの触角についても同様の観測がなされている。
【０１３４】
以上の各実施例により次のことが明らかとなった。すなわち、ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスのカイコガは、ｂｏｍｂｙｋｏｌに対して応答しなかった。これは、おそらく、メスのカイコガの触角葉には、オスのカイコガの脳において性フェロモンの情報処理をおこなっている糸球体構造が欠けているためであると思われる（（ｉ）Ｋａｎｚａｋｉ，  Ｒ．，  Ｓｏｏ，  Ｋ．，  Ｓｅｋｉ，  Ｙ．  ＆  Ｗａｄａ，  Ｓ．  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈｅｒ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｎｎａｌ  ｌｏｂｅ  ｍａｃｒｏｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｌｅ  ｓｉｌｋｍｏｔｈ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｅｎｓｅｓ  ２８，  １１３−１３０  （２００３）、および、（ｉｉ）Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，  Ｊ．  Ｇ．  ＆  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，  Ｇ．  Ｍ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ：  Ｃｏｎｖｅｒｇｉｎｇ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｐｈｙｌａ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０，  ５９５−６３１  （１９９７）  参照）。それゆえ、ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスのガの触角におけるｂｏｍｂｙｋｏｌにより引き起こされた電気的信号は脳に伝えられないために、これに関連した行動を引き起こすことができなかったと考えられる。脳における信号カスケードを伝えるメカニズムについては、さらに証明しなければならないことがある。それにも関わらず、以上の各実施例の結果により、ＢｍＯＲ−１タンパク質を持たないメスのカイコガの触角に、ＢｍＯＲ−１遺伝子が転位導入されたときに、ｂｏｍｂｙｋｏｌ受容体を獲得したということがわかった。よって、以上のことは、ＢｍＯＲ−１タンパク質が、カイコガの性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌの受容体であるという直接的な証拠となりうる。
【０１３５】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係るタンパク質は、性フェロモンｂｏｍｂｙｋｏｌのみを特異的に認識することができる。そのため、本発明に係るタンパク質や遺伝子は、性フェロモンの応答及び伝達のメカニズムの解明に利用することができる。また、他の昆虫種からの性フェロモン受容体の同定と機能解析にも利用することができ、このことは、種に特異的なフェロモンとそれらの受容体の分子的な進化の洞察を与えることができる。また、例えば、ポストハーベストぺストの制御といった農業及び産業上の利用が可能である。よって、本発明は、学術上の利用だけでなく、特に農業において有効に利用することができるため、非常に優れている。
【０１３６】
【配列表】
2005046033.tif 000006
2005046033.tif 000007
2005046033.tif 000008
2005046033.tif 000009
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2005046033.tif 000014
2005046033.tif 000015
2005046033.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るタンパク質の一例であるＢｍＯＲ−１タンパク質のアミノ酸配列および膜貫通領域を示す図である。
【図２】様々な昆虫種における物質受容体候補のアミノ酸配列の系統樹である。
【図３】図１に示すＢｍＯＲ−１タンパク質をコードするＢｍＯＲ−１遺伝子の構造を示す模式図である。
【図４】ＢｍＯＲ−１遺伝子の発現パターンを、ＢｍＯＲ−２遺伝子、ＰＢＰ、あるいはＢ．  ｍｏｒｉアクチン１の発現パターンとともに示す図である。
【図５】（ａ）〜（ｅ）はオスの、（ｆ）はメスのカイコガの触角における、ＢｍＯＲ−１のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図６】（ａ）は、ｂｏｍｂｙｋｏｌの適用前および後の、ＢｍＯＲ−１およびＢｍＧαｑのｃＲＮＡを注入した卵母細胞の電流のトレースを示すグラフであり、（ｂ）は、ＢｍＯＲ−１およびＢｍＧαｑのｃＲＮＡを注入していないコントロール卵母細胞の電流のトレースを示すグラフであり、（ｃ）は、ＢｍＯＲ−１およびＢｍＧαｑのｃＲＮＡを注入した卵母細胞において、各電流の大きさとしてプロットされた応答の時間的変化を表すグラフであり、（ｄ）は、ＢｍＯＲ−１およびＢｍＧαｑのｃＲＮＡを注入していないコントロール卵母細胞において、各電流の大きさとしてプロットされた応答の時間的変化を表すグラフである。
【図７】（ａ）・（ｂ）は、ＢｍＯＲ−１遺伝子およびＢｍＧαｑ遺伝子、または、ＢｍＯＲ−１遺伝子のみ、あるいは、ＢｍＧαｑ遺伝子のみを発現する卵母細胞において、電流の記録の時間的変化をそれぞれ表すグラフであり、（ａ）は１００μＭのｂｏｍｂｙｋｏｌを、（ｂ）はｂｏｍｂｙｋａｌを矢頭で示される時間で適用した時の結果を示すグラフである。
【図８】ＢｍＯＲ−１組み換えバキュロウイルスに感染した、１日齢の成虫のカイコガ（メス）において、その触角におけるＢｍＯＲ−１遺伝子の転移発現を表す電気泳動の結果を示す図である。
【図９】（ａ）は、組み換えバキュロウイルスであるＨｙＢｍＯＲ−１／ＧＦＰに感染したカイコガ（メス）の触角における感覚子がＧＦＰ蛍光を表す図であり、（ｂ）は野生型のバキュロウイルスであるＨｙＮＰＶに感染したカイコガ（メス）の触角における感覚子がＧＦＰ蛍光を表す図である。
【図１０】ＨｙＢｍＯＲ−１／ＧＦＰ、または、ＨｙＮＰＶに感染したメスのカイコガの触角について、５００ｍｌ／ｍｉｎの濃度でｂｏｍｂｙｋｏｌとｂｏｍｂｙｋａｌとを適用した場合のＥＡＧ記録を表す図である。
【図１１】ＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスのカイコガ触角について、１５０〜５００ｍｌ／ｍｉｎの濃度でｂｏｍｂｙｋｏｌを適用した場合のＥＡＧ記録を表す図である。
【図１２】（ａ）はオスのカイコガの触角、（ｂ）はＨｙＢｍＯＲ−１に感染したメスのカイコガの触角、および感染していない触角について、ｂｏｍｂｙｋｏｌに対するＥＡＧ応答を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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