(57)【要約】【課題】  ペプチドのリン酸化または脱リン酸化などの生物学的分子における化学反応を簡便に検出する方法を提供すること。【解決手段】  サンプル中の生物学的分子に結合した、化学基、特にリン酸基の有無の測定方法を提供する。ここでかかる分子は蛍光マーカーをタグ付加され、かかる蛍光マーカーはサンプルを光で照射することによって活性化される。該方法は以下の工程によって特徴付けられる：ａ）蛍光マーカーの使用。この蛍光存続期間が生物分子に結合したリン酸基の有無に応じて異なる値を示す；ｂ）生物分子に結合した、工程ａ）にしたがって選択された蛍光マーカーの蛍光存続時間の測定；ｃ）それぞれことなる存続時間に基づく、生物分子に結合したリン酸基の有無による生物分子の分類。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の生物学的分子に結合したリン酸基の存在または不在を測定する方法であって、該分子は蛍光マーカーをタグ付加されており、該蛍光マーカーはサンプルに光を照射することによって活性化される、ここで該方法は以下の工程を含む：
ａ）その蛍光存続時間が生物分子に結合したリン酸基の存在または不在に応じて異なる値を示す蛍光マーカーを使用する工程；
ｂ）生物分子に結合した、工程ａ）で選択された蛍光マーカーの蛍光存続時間を測定する工程；
ｃ）蛍光存続時間の差異に基づき生物分子に結合したリン酸基の存在または不在に応じて生物分子を分類する工程。
【請求項２】
該生物学的分子が、アミノ酸配列を含む群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸配列がタンパク質、ペプチド、糖タンパク質およびリポタンパク質である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
蛍光マーカーが、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体を含む群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
サンプルの生物学的分子が、リン酸化状態の測定の前にホスファターゼまたはホスホキナーゼとともにインキュベートされる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
生物学的分子のマーキング、アッセイの活性化および蛍光存続時間の測定からなる群から選択される１または複数の工程が、複数ウェルプレートで、生物分子またはサンプルをそれぞれ自動的に分類するコンピュータを用いて行われる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
複数ウェルプレートが９６、３８４または１５３６ウェルを有するマイクロプレートである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
蛍光存続時間の測定が時間相関一光子計数（ＴＣＳＰＣ）または位相変調技術によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
アッセイにおける２種の生物分子の比率が較正によって定量される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
医薬上有効な物質について化学物質を創薬スクリーニングするための請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
医薬組成物を製造するための、化学物質を創薬スクリーニングするための請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ヒトまたは動物の酵素における欠陥を検出するための請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
分類IからVIのいずれかの酵素が関与する反応を検出するための請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
分類IからVIのいずれかの酵素が関与する反応を定量するための請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００３年４月１０日出願のスイス特許出願第ＣＨ０６５３／０３号からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、生物学的分子に結合した化学基の測定方法、特に、生物学的分子に結合したリン酸基の有無を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的分子へのリン酸残基の結合を触媒する酵素（ホスホキナーゼ）および／または生物学的分子からのリン酸残基の除去を触媒する酵素（ホスファターゼ）の２つのクラスの酵素は生物学的および医薬上非常に重要である。酵素の機能の効率を測定するために、とりわけ反応の反応物または生成物の濃度を利用すること、例えば、サンプル体積中のリン酸化された生物分子の量を利用することが可能である。
【０００４】
生物学的分子に結合した化学基、例えばリン酸基の存在および／または不在を測定する方法は公知であり、例えば、蛍光分極化(fluorescence polarization)の使用が含まれる。かかる蛍光分極化測定は、測定に供される分子の体積の変化に基づく。体積の増加に基づく生物学的プロセスが関与する多くの反応、例えば、受容体−リガンド結合を伴うもの、抗体−抗原結合を伴うもの、ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡタンパク質結合、および、体積の減少を伴うプロセス、例えば、酵素による分解または解離反応は、蛍光分極化手段によって直接測定することができる。
【０００５】
かかる試験は以下のアプローチを採用する：非リン酸化生物分子が、その分子にリン酸基を結合させる酵素、すなわちホスホキナーゼとともにインキュベートされるか、またはリン酸化ペプチドがそのペプチドからリン酸基を除去する酵素、すなわちホスファターゼとともにインキュベートされる。小化学基、たとえばリン酸、硫酸またはシュウ酸基の付加または除去による生物学的分子の体積変化は、蛍光分極化によって直接検出するには十分に有意ではない。原則として体積効果を増強するために、分析される生物学的分子に補助的分子が結合される。これら補助的分子は、抗体の形態の場合、分析されるペプチドが真にリン酸基を含む場合にそのペプチドと結合を形成するように選択する必要がある。これによって蛍光分極化によって測定されるホスホペプチド／抗体複合体と、補助的分子が結合していない非リン酸化ペプチドの間の体積の有意差が確証される。この市販のアプローチは元は、酵素機能の追跡を容易にするための非破壊的マーカーを提供するために開発された。化学物質の薬理学的効果が試験される場合（すなわち創薬の場合）、かかるアッセイ物質が系に添加され、標準的な蛍光分極化測定により、アッセイ物質が酵素に対して所望の調節効果を与えるか否かの情報が提供される。
【０００６】
リン酸化および／または脱リン酸化を確認するための既知の方法はすべて補助的分子の添加に基づく。例えば特許文献１の方法などがそれに含まれる。抗体以外に、生物分子のリン酸化を検出するためのその他の化学物質も補助的分子として採用されており、それによってリン酸化の状態を区別することが可能となっている。別の方法によってリン酸化反応のその他の反応物または生成物の濃度を測定しようと試みる場合、蛍光分極化の場合よりも複雑な付加物をともなう化学方法を用いなければならないだろう。
【特許文献１】米国特許第６４１０２５５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ペプチドのリン酸化または脱リン酸化などの生物学的分子における化学反応を簡便に検出する既存のものの代わりとなる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、以下の方法：
サンプル中の生物学的分子に結合したリン酸基の存在または不在を測定する方法であって、該分子は蛍光マーカーをタグ付加されており、該蛍光マーカーはサンプルに光を照射することによって活性化され、ここで該方法は以下の工程を含む：
ａ）その蛍光存続時間が生物分子に結合したリン酸基の存在または不在に応じて異なる値を示す蛍光マーカーを使用する工程；
ｂ）生物分子に結合した、工程ａ）で選択された蛍光マーカーの蛍光存続時間を測定する工程；
ｃ）蛍光存続時間の差異に基づき生物分子に結合したリン酸基の存在または不在に応じて生物分子を分類する工程：
によって達成される。本発明による方法の好適な態様および／またはさらなる発明的要素はこの方法から派生する。
【０００９】
蛍光マーカーをタグ付加されたサンプルによって放射される蛍光分極化シグナルは単にリン酸基を付加または除去することによっては有意に変化しないことおよび電荷が蛍光色素の蛍光存続時間を変化させることができることが長らく知られてきた。しかし、有効なシグナルを生じさせるために、蛍光マーカーを付加した生物分子にリン酸基を付加することが十分であるということはまったく驚くべきことであった。
【００１０】
したがって、本発明は生物学的分子にリン酸基を付加するかまたは生物学的分子からリン酸基を除去することによって、サンプルに結合させたフルオロフォア(fluorophore)の蛍光存続時間が、それぞれリン酸基の有無を反映して、有意に変化するという予期せぬ驚くべき発見に基づく。
【００１１】
（発明の詳細な記載）
本発明の基礎となるメカニズムは完全には理解されていない。しかし、それには蛍光マーカーと荷電残基の間の相互作用が関与していると考えられる。荷電残基は同じ生物学的分子上で蛍光マーカーの結合部位の近くに結合している、および／または蛍光マーカーの空間的範囲内に位置する。フルオレセインが蛍光マーカーであることが判明し、その蛍光存続時間がリン酸基の有無に応答して有意に変化する。しかし、本発明はフルオレセインの使用のみを含むものではない；１または複数の荷電化学残基を生み出す、生物分子が関与するあらゆる化学反応が、蛍光存続時間を測定することによって適切に検出されうるという一般的仮説が立てられる。本発明によると、対応する生物分子に結合した好適な蛍光マーカーの蛍光存続時間が測定されると、その他の酵素反応の存在を確認するためにもこのようなまたは類似の結果が利用できるという仮説が立てられる。
【００１２】
酵素は様々なタイプの化学反応を触媒することが知られている。以下の表は生物系において観察されるもっとも一般的な反応およびかかる反応において重要な役割を果たす関連する酵素の分類を挙げるものである。
【００１３】
【表１】
2005095144.tif 000002
【００１４】
本発明による方法を用いると、触媒的プロセスによって分子を濃縮する(enrich)酵素反応が検出および定量できる。
【００１５】
酵素分類Ｉ
オキシドレダクターゼは酸化還元反応を触媒し、酸化の結果電子が欠損し、還元によって電子が獲得される。したがって、例えば、蛍光存続時間シグナルの変調は、オキシドレダクターゼの活性部位のすぐ近くに近接する蛍光マーカーについて観察され、触媒的遷移の間酵素または基質内の様々なアミノ酸鎖を通る電子の移動が示される。この蛍光鎖は分類Ｉの酵素においてすでに検出されている。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへのデヒドロゲナーゼによる還元により、ＮＡＤＨと比較してＮＡＤ＋は蛍光ではないということが示された。
【００１６】
酵素分類ＩＩ
トランスフェラーゼは１つの基質から他の基質への官能基の転移を触媒する酵素である。官能基の転移は同一分子内のものでも異なる分子間のものでもよい。この分類の典型例はキナーゼであり、ＡＴＰをタンパク質またはペプチドに転移させる。以下に記載するホスホキナーゼ反応と同様の蛍光存続時間が関与する効果がチオラーゼ(thiolase)およびその他のトランスフェラーゼについても期待される。
【００１７】
酵素分類III
加水分解酵素はカルボン酸エステル、ヘミアセタールエステル（グリコシル化合物）、チオエステル、アミド（ペプチド結合）および酸無水物の加水分解を触媒する酵素である。この分類にはホスファターゼも含まれる。というのは、ホスファターゼはリン酸基を水へと切断するからである。分類Ｉおよび分類ＩＩについての情報はこの分類にも適用される。
【００１８】
酵素分類IV
リアーゼは化学基の脱離または付加を触媒する酵素である。１つの例はＣＯ基の除去であり、脱炭酸として知られる。デカルボキシラーゼは一般に脱炭酸反応を触媒するために電子対を産生することから、基質の「電子サイン(electronic signature)」の変化が脱炭酸反応の過程で起こることが予測されるため、この分類の反応および／または酵素も存続時間蛍光定量法を用いて分析することができる。
【００１９】
酵素分類Ｖ
イソメラーゼはラセミ化、エピマー化、シス−トランス変換およびエノール−ケト互変異性などの分子内の特定の再編成を触媒する。エノール−ケト互変異性においても大量の電子の移動が予測されることから、この場合においても蛍光存続時間の変化を測定することが可能である。
【００２０】
酵素分類VI
リガーゼはＡＴＰ（または類似のヌクレオシド三リン酸）の切断から得るエネルギーを用いて分子間の結合を触媒する酵素である。この分類には例えば脂肪酸合成酵素およびＤＮＡポリメラーゼが含まれる。同様に、これらの酵素によって生み出される触媒反応の結果、酵素の活性部位の近隣に位置するフルオロフォアの蛍光存続時間が有意に変化する可能性が高いということがこれらの酵素についても予測される。
【００２１】
本発明によると、生物分子上の化学的に活性な基の近隣および／または影響空間内に位置すれば、単一の蛍光マーカーで十分である。蛍光マーカーに関する１つの条件は、それがその直接の分子環境における電荷密度および／または立体配置の変化に応じて、その蛍光存続時間を変化させることによって反応することである。このようにして生じるシグナルはしたがって、補助的分子の付加および結合を伴う当該技術分野で周知の方法と比べてより直接的である。
【００２２】
本発明に関して本明細書において提供する（天然または合成起源の）生物学的分子の例は、単に例示的なものであって他を排除するものではない。
【００２３】
タンパク質、ペプチド、糖タンパク質およびリポタンパク質などのアミノ酸配列を含む生物学的または合成手段によって生じた分子。
ＤＮＡおよびＲＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドなどの核酸配列を含む生物学的または合成手段によって生じた分子。
環状アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）またはグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）などの生物学的プロセスの結果得られるかまたはかかるプロセスに役立つその他の分子。
単糖類、多糖類およびその他の巨大分子。
【００２４】
複数ウェルのプレートは本発明に関して開口または閉口チャンバの配列として規定される。この配列は好ましくは規則的であり、格子状のサンプル容器またはサンプルホルダーのアレイを構成する。このタイプの既知の多数ウェルのプレートは例えばいわゆるマイクロプレートであり、直角の格子に配列された９６、３８４または１５３６のウェルを有するものである。サンプルは必ずしも凹部に配置される必要はない。より少量のサンプルをアレイにおける平坦な表面に配置させてもよいし、単に疎水性の区切りまたは小さな凸部によって互いに分離しても良い。好ましくは、複数ウェルのプレートは共通して、位置指定可能な位置にて同時にまたは実質的に同時に処理されうる多数のサンプルを有する。
【００２５】
とりわけ、蛍光存続時間を測定するための既存の方法は、位相変調技術(phase modulation technique)および時間相関一光子計数(time correlated single photon counting)（ＴＳＣＰＣ）である。本発明を選択した例示的な実施例を参照して詳細に説明する。
【実施例１】
【００２６】
本実施例において、蛍光存続時間を測定するための公知の方法である、時間相関一光子計数（ＴＳＣＰＣ）を用いた。
【００２７】
Ａ）技術の詳細
市販の化学物質を用いて実験を行った。このため以下の化学物質を用いた。
トレーサーペプチドとして、PTK Green、濃度２ｎＭ、PANVERAからのP-2843（PANVERA, 501 Charmany Drive, Madison WI USA)。これはキット番号P-2873による「グリーン」キナーゼアッセイの一部として用いた。
PTP1Bホスファターゼ、BIOMOLからのSE-332（BIOMOL Research Laboratories, Inc., 5120 Butler Pike, Plymouth Meeting PA USA 19462-1202)；
フルオレセインおよびＰＢＳバッファー。
【００２８】
サンプルを最終体積７０μｌとなるようにGREINER(GREINER Bio-One GmbH, Bad Haller Strasse 32, 4550 Kremsmunster, Austria)からの黒色３８４ウェルマイクロプレートに調製した。酵素濃度は１００ｐＭから１００ｎＭとした。インキュベーションは３０分間行った。
【００２９】
蛍光存続時間はTECAN(TECAN Austria GmbH, Grodig, Salzburg, Austria)からの蛍光存続時間（ＦＬＴ）オプションを備えた「ウルトラ・エボリューション」機器を用いて測定した。蛍光レーザーは波長４４０ｎｍ、繰り返し率２０ＭＨｚにて作動させた。発光フィルターは波長５４４ｎｍ、帯域幅２５ｎｍに設定し、ウェル当たりの統合時間（integration period)は１秒とした。
【００３０】
Ｂ）結果
図１は、酵素濃度の関数としてのトレーサーペプチド（生物分子）の一部である蛍光マーカー、フルオレセインの測定蛍光存続時間を示す。さらに補助的な分子（例えば抗体など）がこれら測定結果を得るために必要ではなかったという事実は明確な参照である。酵素PTP1Bのトレーサーペプチドに対する添加の３０分後に測定を行った。蛍光存続時間はペプチドリン酸化の状態を反映し、酵素濃度が高いと作用が速く、より脱リン酸化が進んだペプチドが生じる。一方、脱リン酸化されたペプチドに結合するフルオレセインはより短い存続時間を示す。
【００３１】
非常に長時間たつと、酵素濃度にかかわらず、すべてのリン酸基がトレーサーペプチドから除去される。しかし、酵素濃度は必要とされる正確な時間を決定する。
【００３２】
図１はまた、酵素濃度が非常に低い場合、リン酸化状態は有意には変化しないことを示す；一方、非常に高濃度を用いた場合、さらに多量の酵素を添加してもさらなる効果は示されなかった。この実験においてサンプルの全基質がインキュベーション期間の間に変換され、明確な酵素機能の比率は中央において明らかである。図１は様々なホスファターゼ濃度におけるPenveraトレーサーP2843の脱リン酸化のデータに基づく。エラーバーは３連の独立した測定から得た。実線は依存性の評価を補助するためのものにすぎない。この線の位置はインキュベーション時間がより短いと右へ移動し、インキュベーション期間がより長いと左に移動する。図１において示すデータについてのｚ値は０．６２である。
【００３３】
図２は、酵素反応の時間依存特性、すなわち、様々な酵素濃度での酵素動力学を示す。酵素なしでは存続時間シグナルは安定のままである。すなわち、脱リン酸化は起こらない。中程度の濃度であると、選択された６分の間に完全なプロセスを見ることができ、非常に高濃度であると反応はあまりに速く起こるためこの実験では測定できない。様々な酵素濃度での測定点を示す記号を以下の表に表す。
【表２】
2005095144.tif 000003
【００３４】
これらの結果を確認するために異なる蛍光存続時間シグナルを有する２つのサンプルを蛍光分極化によって測定した。トレーサーペプチドのリン酸化の差異はこの既存の方法では判定できなかった。
【００３５】
ここに記載したような実験は、アッセイの発達またはハイスループットスクリーニング研究室において重要な役割を果たす。かかる研究室において以前に入手可能であった装置によっては蛍光存続時間の測定は不可能であった。
【００３６】
先に示したように、ペプチドのリン酸化または脱リン酸化をともなう酵素反応は大きな生物学的および医薬上の重要性を有する。本発明はかかる重要なプロセスを分析および表現する新規な方法を提供する。特に、本発明による方法の好適な用途には、創薬スクリーニング、すなわち、医薬上有効な物質の発見、研究、最適化または確認および／または検出、および／またはそれに組み合わせて対応する医薬品の生産が含まれる。
【００３７】
本発明の範囲において、生物分子へのリン酸基の結合は蛍光色素に直接影響を与えなければならない。このため、両方の基は互いに近接しているかあるいは生物分子の立体配置変換によって効果が伝えら、そして色素の分子環境を変調することができなければならない。両方の化学的単位、すなわちリン酸基および色素は同じ生物分子に例えば共有結合によって結合していなければならない。しかし生物分子はいくつかのサブユニットから構成されるものでもよく、ヘテロ二量体、ホモ二量体、三量体、あるいは概してオリゴマーのいずれでもよい。この場合、２つの残基は同じ生物分子の異なるサブユニットに位置していても良い。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は酵素濃度と蛍光存続時間の関係を示すグラフである。
【図２】図２はインキュベーション時間と蛍光存続時間の関係を示すグラフである。
【図１】
2005095144.tif 000004
【図２】
2005095144.tif 000005