(57)【要約】【課題】簡便にかつ正確な微量物質の濃度を測定する。【解決手段】リポソーム破壊酵素と、リポソームから放出される定量対象酵素を組み合わせた酵素カスケードを構築することにより、高感度に物質の濃度測定を行う。【選択図】図１
2005265737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程(1)〜(4)
(1)測定対象物質を溶解してある測定対象溶液に、リポソームを破壊可能な破壊酵素と、
前記測定対象物質もしくはその類似物質とから形成される酵素複合体を加え、前記測定対象物質と前記酵素複合体とが混合された複合体混合液を調製する混合液調製工程、
(2)前記測定対象物質との結合によりその測定対象物質を捕捉可能な結合基を形成してあ
る担体を設けてなる分離手段に、前記複合体混合液を供給し、前記測定対象物質と前記酵素複合体とを競合的に前記結合基に結合させ、前記測定対象物質のすべてが前記結合基に結合したものとみなせる状態を得、該分離手段を溶出液で処理して、酵素複合体を含む溶出液を得る競合反応工程、
(3)前記競合反応工程による溶出液中における、前記競合反応工程によっても前記結合基に結合しなかった前記酵素複合体を、基質と反応し定量対象物質を生成する酵素を内包したリポソームを保持させたリポソームカラムに供給するリポソームカラム工程、
(4)前記リポソームカラム工程において、リポソームから放出された前記リポソームに内包される酵素が基質と反応し生成する定量対象物質を定量する定量工程
を含むことを特徴とし、前記定量対象酵素量に基づき、前記測定対象物質の濃度を決定する濃度測定方法。
【請求項２】
以下の工程(1)〜(4)：
(1)測定対象物質を溶解してある測定対象溶液に、リポソームを破壊可能な破壊酵素と前
記測定対象物質もしくはその類似物質に結合可能な抗体とから形成される酵素複合体を加え、前記測定対象物質と前記酵素複合体とが混合された複合体混合液を調製する混合液調製工程、
(2)前記測定対象物質もしくはその類似物質を結合させて、前記抗体に結合する結合基を
形成してある担体を設けてなる分離手段に、前記複合体混合液を供給し、前記結合基と前記測定対象物質とが競合的に前記酵素複合体に結合し、前記酵素複合体のすべてが前記結合基または前記測定対象物質に結合したものとみなせる状態を得、該分離手段を溶出液で処理して、前記測定対象物質が結合した酵素複合体を含む溶出液を得る競合反応工程、
(3)前記競合反応工程による溶出液中における、前記競合反応工程によっても前記結合基
に結合しなかった前記酵素複合体を、基質と反応し定量対象物質を生成する酵素を内包したリポソームを保持させてあるリポソーム担体を設けてあるリポソームカラムに、前記溶出液を供給するリポソームカラム工程、
(4)前記リポソームカラム工程において、リポソームから放出された前記リポソームに内
包される酵素が基質と反応し生成する定量対象物質を定量する定量工程
を含むことを特徴とし、前記定量対象物質量に基づき、前記測定対象物質の濃度を決定する濃度測定方法。
【請求項３】
前記結合基が前記測定対象物質もしくはその類似物質を抗原とする抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結合基が前記測定対象物質もしくはその類似物質である項２に記載の方法。
【請求項５】
前記リポソームに内包される酵素がペルオキシダーゼである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記破壊酵素が脂質分解酵素であり、前記リポソームが、前記脂質分解酵素により分解可能な脂質を主成分として形成されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中に存在する微量物質の定量方法に関し、特に、環境汚染化学物質、農薬、環境ホルモン等の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中の微量物質の定量法として、リポソーム中に定量可能な物質を封入し、リポソームを破壊して、該リポソーム中の物質を定量することにより微量物質の定量ないし濃度測定する方法が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１は、標識物質を内部に封入し、抗体結合リポソームと補体の存在下で試料中の抗原と反応させて、抗原の存在を定性的或いは定量的に測定する方法を開示する。この方法では、リポソーム内部に封入された標識物質量と抗原量が対応しているため、高感度な検出は困難であり、また、測定対象物質毎に対応する抗体を組み込んだリポソームを準備する必要があった。
【０００４】
特許文献２は、リポソーム内に反応素子を封入し、該リポソームをリポソーム破壊物質を用いて破壊し、反応素子を定量することで、リポソーム破壊物質を定量する方法を開示しているが、この方法では、ホスホリパーゼＡ２のようなリポソーム破壊物質を検出できるのみであり、リポソーム破壊作用を有しない環境汚染化学物質、農薬、環境ホルモン等の濃度測定には使用できない。
【０００５】
特許文献３は、抗原を組み込んだリポソームと補体を用いて抗体を測定する方法を開示しているが、この方法では、補体を用い、かつ、測定対象の抗体に対応する抗原をリポソームに組み込む必要があり、抗体以外の被測定物質の濃度測定には応用できない。
【０００６】
特許文献４は、内部に標識物質を封入し、抗体を結合したリポソームと補体を用いて抗原を測定する方法において、リポソーム内にリポソーム分解酵素を封入してリポソームの分解を促進する技術を開示しているが、補体を用い、リポソームに抗体を結合させることで、特許文献３と同様な問題がある。さらに、リポソーム内にリポソーム分解酵素を封入することで、リポソームが不安定化するおそれがある。
【０００７】
このような不具合を解消する方法として、特許文献５では、いわゆる競合法の改良法が利用されている。
【０００８】
ここで、競合法とは、測定対象物質を溶解してある測定対象溶液に、酵素と前記測定対象物質とから形成される酵素複合体を加え、前記測定対象物質と前記酵素複合体とが混合された複合体混合液を調製する混合液調製工程を行い、前記測定対象物質との結合によりその測定対象物質を捕捉可能な結合基を形成してある担体を設けてなる分離手段に、前記複合体混合液を供給し、前記測定対象物質と前記酵素複合体とを競合的に前記結合基に結合させ、前記測定対象物質のすべてが前記結合基に結合するとともに、前記分離手段中に含まれる結合基の残部のすべてに酵素複合体が結合したものとみなせる状態を得る競合反応工程を行い、その結合基に結合した測定対象物質に、さらに、発光要素等を結合させて、前記測定対象物質の量を測定する方法である。
【０００９】
この競合法を改良した特許文献５は、ホスホリパーゼA２をはじめとするリポソーム破
壊酵素と被測定物質を結合させたコンジュゲートを作製し、該コンジュゲートによるリポソーム破壊によってリポソーム内に封入された蛍光物質を漏出させ、この蛍光物質を測定
することにより、被測定物質の濃度を測定する方法を開示する。該方法は、被測定物質を高感度に測定可能な方法であるが、ダイオキシン、PCB等の環境汚染物質、環境ホルモン
は極く微量でその作用を発現するものが数多くあり、より高感度に微量物質の濃度を測定する方法が求められていた。
【特許文献１】特開昭63-309864号公報
【特許文献２】特開平05-056797号公報
【特許文献３】特開平07-227298号公報
【特許文献４】特開2000-235033号公報
【特許文献５】特許第３２４３５０８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、上記欠点に鑑み、簡便にかつ正確な微量物質の濃度を測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、リポソーム破壊酵素と、リポソームから放出される基質と反応し定量対象物質を生成する酵素を組み合わせた酵素カスケードを構築することにより、さらに高感度に物質の濃度測定を行えることを見出した。
【００１２】
本発明は、以下の濃度測定方法に関する。
１．  以下の工程(1)〜(4)
(1)測定対象物質を溶解してある測定対象溶液に、リポソームを破壊可能な破壊酵素と、
前記測定対象物質もしくはその類似物質とから形成される酵素複合体を加え、前記測定対象物質と前記酵素複合体とが混合された複合体混合液を調製する混合液調製工程、
(2)前記測定対象物質との結合によりその測定対象物質を捕捉可能な結合基を形成してあ
る担体を設けてなる分離手段に、前記複合体混合液を供給し、前記測定対象物質と前記酵素複合体とを競合的に前記結合基に結合させ、前記測定対象物質のすべてが前記結合基に結合したものとみなせる状態を得、該分離手段を溶出液で処理して、酵素複合体を含む溶出液を得る競合反応工程、
(3)前記競合反応工程による溶出液中における、前記競合反応工程によっても前記結合基に結合しなかった前記酵素複合体を、基質と反応し定量対象物質を生成する酵素を内包したリポソームを保持させたリポソームカラムに供給するリポソームカラム工程、
(4)前記リポソームカラム工程において、リポソームから放出された前記リポソームに内包される酵素が基質と反応し生成する定量対象物質を定量する定量工程
を含むことを特徴とし、前記定量対象酵素量に基づき、前記測定対象物質の濃度を決定する濃度測定方法。
２．  以下の工程(1)〜(4)：
(1)測定対象物質を溶解してある測定対象溶液に、リポソームを破壊可能な破壊酵素と前
記測定対象物質もしくはその類似物質に結合可能な抗体とから形成される酵素複合体を加え、前記測定対象物質と前記酵素複合体とが混合された複合体混合液を調製する混合液調製工程、
(2)前記測定対象物質もしくはその類似物質を結合させて、前記抗体に結合する結合基を
形成してある担体を設けてなる分離手段に、前記複合体混合液を供給し、前記結合基と前記測定対象物質とが競合的に前記酵素複合体に結合し、前記酵素複合体のすべてが前記結合基または前記測定対象物質に結合したものとみなせる状態を得、該分離手段を溶出液で処理して、前記測定対象物質が結合した酵素複合体を含む溶出液を得る競合反応工程、
(3)前記競合反応工程による溶出液中における、前記競合反応工程によっても前記結合基
に結合しなかった前記酵素複合体を、基質と反応し定量対象物質を生成する酵素を内包したリポソームを保持させてあるリポソーム担体を設けてあるリポソームカラムに、前記溶
出液を供給するリポソームカラム工程、
(4)前記リポソームカラム工程において、リポソームから放出された前記リポソームに内
包される酵素が基質と反応し生成する定量対象物質を定量する定量工程
を含むことを特徴とし、前記定量対象物質量に基づき、前記測定対象物質の濃度を決定する濃度測定方法。
３．  前記結合基が前記測定対象物質もしくはその類似物質を抗原とする抗体である項１に記載の方法。
４．  前記結合基が前記測定対象物質もしくはその類似物質である項２に記載の方法。
５．  前記リポソームに内包される酵素がペルオキシダーゼである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．   前記破壊酵素が脂質分解酵素であり、前記リポソームが、前記脂質分解酵素によ
り分解可能な脂質を主成分として形成されたものである項１〜５のいずれかに記載の方法。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１３】
本第１発明の方法では、測定対象物質を溶解してある測定対象溶液に、リポソームを破壊できる酵素と前記測定対象物質もしくはその類似物質とから形成される酵素複合体を加え、前記測定対象物質と前記酵素複合体とが混合された複合体混合液を調製する混合液調製工程を行うと、前記測定対象物質、および、その測定対象物質と同様の挙動を示し、酵素としての機能を失っていない酵素複合体とを含む複合体混合液を得ることができる。
【００１４】
このような複合体混合液を前記測定対象物質との結合によりその測定対象物質を捕捉可能な結合基（例えば前記測定対象物質もしくはその類似物質を抗原とする抗体）を形成してある担体を設けてなる分離手段に供給すると、前記測定対象物質と前記酵素複合体とが、競合的に前記結合基に結合しようとする。このとき、通常前記酵素複合体は、酵素の存在により前記測定対象物質よりも、前記結合基に対する結合性が抑制されているので、前記結合基には、前記測定対象物質が優先的に結合するとともに、前記結合基のうち前記測定対象物質の結合していない残部には、前記酵素複合体が結合した状態を作ることが出来る。この競合反応工程では、余っている結合基が存在してもよく、例えば検量線を作製することで、余っている結合基が存在しても測定対象物質の濃度を決定することができる。
【００１５】
なお、本第１及び第２発明において、該酵素複合体は、分離カラムの結合基よりも測定対象物質に結合親和性が高く、酵素複合体としては、このように測定対象物質よりも結合基に対する結合親和性の低いものを選択して用いるのが望ましい。
【００１６】
本第２発明の方法では、測定対象物質を溶解してある測定対象溶液に、リポソームを破壊できる酵素と前記測定対象物質もしくはその類似物質に対する抗体とから形成される酵素複合体を加え、前記測定対象物質と前記酵素複合体とが混合された複合体混合液を調製する混合液調製工程を行うと、前記測定対象物質、および、分離手段に結合した結合基に対する結合性を有し、酵素としての機能を失っていない酵素複合体とを含む複合体混合液を得ることができる。
【００１７】
このような複合体混合液を前記測定対象物質またはその類似物質からなる結合基を形成してある担体を設けてなる分離手段に供給すると、前記測定対象物質と前記結合基とが、競合的に前記酵素複合体に結合しようとする。このとき、通常前記酵素複合体は、立体障害のある前記結合基よりも立体障害のない測定対象物質に優先的に結合するとともに、前記測定対象物質の結合していない残りの酵素複合体は、前記結合基に結合した状態を作ることが出来る。例えば、低分子の測定対象物質を抗原とする抗体は、その低分子と蛋白質の複合体を免疫して、得ることができる。
【００１８】
なお、測定対象物質の類似物質は、測定対象物質がＰＣＢやダイオキシンのようにそれ自体の使用が制限されている場合に、ＰＣＢやダイオキシンの抗体により検出されるが、それ自体は法規制の対象となっていない類似物質として通常使用される。もちろん、このような法規制の対象となっていない測定対象物質について、類似物質を使用することもできる。
【００１９】
本第１及び第２発明において、前記分離手段としては、前記担体を充填したカラムが例示される。また、リポソームを破壊できる酵素としては、ホスホリパーゼが挙げられ、好ましくはホスホリパーゼＡ2が挙げられる。また、前記リポソームは、例えばレシチン、
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールなどのホスホリパーゼにより分解可能な脂質が主成分として構成され、好ましくはレシチンが主成分であり、ホスファチジルエタノールアミン等の他のリン脂質が適宜用いられる。
【００２０】
本第１発明において、前記競合反応工程の際に、前記酵素複合体のうち、余剰分は、分離手段から溶出させられ、溶出液を得ることが出来る。この溶出液中における、前記競合反応工程によっても前記結合基に結合しなかった前記酵素複合体を定量すると、前記測定対象物質の濃度を決定することができる。通常結合基の一部はフリーの状態で存在するので、結合基（例えば抗体）の数、結合した測定対象物質の数などは計算により求めることはできない。従って、測定対象物質の濃度決定は、既知濃度の測定対象物質による測定実験により作製された検量線を用いて行われる。
【００２１】
本第２発明において、前記競合反応工程の際に、前記酵素複合体のうち、測定対象物質と結合した複合体は、分離手段から溶出させられ、溶出液を得ることが出来る。この溶出液中における、前記競合反応工程によっても前記結合基に結合しなかった前記酵素複合体を定量すると、前記酵素複合体に結合した測定対象物質の量が算出でき、前記測定対象物質の濃度を決定することができる。この第２発明においても、通常結合基の一部はフリーの状態で存在するので、結合基（例えば抗体）の数、結合した測定対象物質の数などは計算により求めることはできない。従って、測定対象物質の濃度決定は、既知濃度の測定対象物質による測定実験により作製された検量線を用いて行われる。
【００２２】
前記結合基としては、第１発明では、前記測定対象物質もしくはその類似物質を抗原とする抗体であれば、前記測定対象物質を前記結合基に選択的に結合させることが容易で、前記競合反応工程が確実に行える。尚、同様に、このような結合基としては、ペプチド、ＤＮＡ等、特定の測定対象物質に対して選択的な結合を許容するものが、有効に用いられる。また、第２発明では、結合基は、抗体と結合可能な測定対象物質もしくはその類似物質が挙げられる。
【００２３】
本発明が、基質と反応し定量対象物質を生成する酵素を内包したリポソームを保持させてあるリポソーム担体を設けてあるリポソームカラムに、前記溶出液を供給するリポソームカラム工程と、前記リポソームカラム工程において、前記溶出液中の酵素複合体が破壊したリポソームから放出された前記リポソームに内包される酵素を定量する定量工程とを含むものであれば、低濃度であっても、前記複合体量に基づく前記定量対象酵素量を決定することができる。
【００２４】
基質と反応し定量対象物質を生成する酵素としては、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、キナーゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼなどが挙げられ、好ましくはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど発色、蛍光、発光などの高感度に検出可能な物理量を測定可能な反応生成物を生成する酵素が挙げら
れる。ペルオキシダーゼとしては、西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
【００２５】
前記リポソームカラムは、一度の定量工程では、一部のリポソームが破壊されるのみであるから、複数回の定量工程に再現性よく適用されるため、検量線を求めたときの条件と、前記濃度決定を行う時とで、測定条件をそろえやすいため、各検体ごとに新たな定量用プローブを作る必要がある従来の方法と比較しても、簡便で、かつ、正確な測定方法とすることができる。
【００２６】
図１に本発明法（酵素封入リポソームゲル）と従来法（蛍光色素封入リポソームゲル）の違いを示す。本発明法は、リポソーム破壊酵素を用いたリポソームの破壊だけでなく、破壊され漏出した定量対象酵素について、基質との酵素反応が行われるため、微量の測定対象物質の量がリポソーム破壊酵素量、さらには定量対象生成酵素量に変換されていく過程で、酵素反応のカスケードが生じ、微量の測定対象物質から定量対象生成酵素による大量の反応生成物（発光、発色等により定量可能）が生成され、極めて高感度に測定対象物質の濃度を測定することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、極めて微量な物質であっても高感度に物質の濃度を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
（実施例）
1.  抗ビスフェノールA抗体固定化カラムの調製
抗ビスフェノールA抗体は、HiTrap Protein G HP Column（アマシャムバイオサイエンス
株式会社）へ固定化した。5 mlのHEPES緩衝液（10 mM HEPES, pH7.4、150 mM NaCl、1 mM
CaCl2）を用いて平衡化を行った後、1 mg/mlの株式会社バイオ・アプライド・システム
ズ作製マウスモノクローナルIgG 1 mlをカラムへ添加し、室温で30分間インキュベーションを行った後、HEPES緩衝液5 mlを用いて洗浄を行い、抗ビスフェノールA抗体固定化カラムとした。
2.  リポソームゲルの調製
100 μmol卵黄ホスファチジルコリン、2 μmolビオチン結合ホスファチジルエタノール
アミン（Avanti Polar-Lipids, Inc., USA）を、ロータリーエバポレーターを用いて脱溶媒し、脂質フィルムを調製した。これに100 mM 蛍光色素カルセイン、あるいは125 mM 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）溶液を添加、懸濁し多層膜リポソームを調製した。さ
らに0.1 mmのポリカーボネートフィルターを装着したエクストルーダーを用いて高圧濾過し、ビオチン化単層膜リポソームとした。ゲルマトリクスSephacryl S-1000（アマシャムバイオサイエンス株式会社）にアビジンを固定化させ、これにビオチン化単層膜リポソームを添加してリポソーム固定化ゲルを調製した。
3.  コンジュゲートの調製
ビスフェノールA活性エステル体とホスホリパーゼA2 (PLA2)とを混合することでビスフェノールA-PLA2コンジュゲートを作製した。139 mM 4-[4-(1-(4-hydroxyphenyl)-1-methylethyl)phenyl]butyric acid (株式会社バイオ・アプライド・システムズ)、416 mM N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) (Sigma-Aldrich Co., USA)、408 mM N-エチル-N'-(3-ジメ
チルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (EDC) (株式会社同人化学研究所)、0.28 mM トリエチルアミン (和光純薬工業株式会社)を混合し、25℃で一晩振とうさせて反応を行
った。その後H2O：酢酸エチル＝3：7の溶液で5回抽出を行い、HPLCにより精製を行ってビスフェノールA活性エステル体を調製した。6.56 mM PLA2、85.8 mM ビスフェノールA活性
エステル体を80%ジメチルスルホキシド (DMSO) (和光純薬工業株式会社) 中で混合し、1
時間室温で撹拌して反応を行った。反応後の溶液は0.5% DMSOを含むHEPES緩衝液にて透析を行った。
4.蛍光色素、酵素封入リポソームゲルのPLA2による加水分解反応
ウェルの底部に親水性PVDF膜を装着した96穴マイクロタイタープレート、マルチスクリーンHV (MILLIPORE, USA) の各ウェルに、リン脂質量0.1 μmol のカルセインあるいはHRP
封入リポソームゲルを添加した。ここに種々濃度のPLA2溶液を100 μl添加し、30分間
、室温にて振とう反応を行った。反応後、マイクロプレートを多本架冷却遠心器 (LX-120, 株式会社トミー精工) を用いて180xg、1分間、4℃で遠心させて反応液を溶出させた。
蛍光色素封入リポソームゲルの場合、溶出液の漏出蛍光量の測定は、Typhoon 8600 (アマシャムバイオサイエンス株式会社) を使用した。またHRP封入リポソームゲルの場合は、
溶出液にさらに基質を加え、漏出酵素による反応を行い、発色または発光により検出を行った。発色の場合の基質液はTMB Substrate Kit (Vector Laboratories, Inc., USA)を、発光の場合の基質液はSuper Signal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate (PIERCE Biotechnology, Inc., USA) をそれぞれ使用した。その結果、蛍光色素に比べてHRP封入リポソームゲルの場合、発色法で検出した場合は約140倍、また発光法で検出した場合
は約600倍の低濃度PLA2を検出することが可能であった（図2）。
5.  ビスフェノールAの検出
0.5% DMSO/MQで調製したビスフェノールAサンプル 100 mlと1 mM PLA2コンジュゲート100
mlとの混合液を抗体固定化カラムへ注入し、300 ml HEPES緩衝液で展開後、37℃で1時間反応を行った。反応後、3 mlのHEPES緩衝液で溶出させ、溶出液はリポソームカラムへと
添加した。リポソームカラムは、蛍光色素もしくはHRP封入リポソームゲル (リン脂質量1
mmol) をバイオスピンカラム (Bio-Rad Laboratories, USA) に充填して作製した。カラムからの溶出液を2 mlずつ6本回収し、蛍光色素封入リポソームゲルの場合は蛍光分光器 F-4500 (日立製作所) を用いて、励起波長490 nm、蛍光波長520 nmにて蛍光測定を行った。HRP封入リポソームゲルの場合は、各溶出液100 mlを96穴マイクロタイタープレートへ
添加し、TMB基質液を100 ml加えて室温にて3分間反応後、1N H2SO4を50 ml添加して反応
を停止した。反応液の450 nmの吸光度をマイクロプレートリーダー Model 3550-UV (Bio-Rad Laboratories, USA)を用いて測定した。その結果、蛍光色素を用いた場合より検出感度が上昇することが明らかとなった (図3)。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】酵素封入リポソームゲルによる酵素カスケード。
【図２】PLA2による蛍光色素または酵素封入リポソームの破壊反応。
【図３】ビスフェノールAの検出結果の比較。
【図１】
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【図２】
2005265737.tif 000004
【図３】
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