(57)【要約】【課題】  光学活性環状アミノ酸の安価な製造法を提供すること。【解決手段】  下記一般式（Ｉ）2005095167.tif 000042（式中、Ａは、鎖長が１〜６原子であり、硫黄原子、酸素原子および窒素原子よりなる群から選ばれる少なくとも1種のヘテロ原子を鎖中または末端に含んでいてもよく、かつ、置換されていてもよいアルキル鎖を示す）で表される１位に二重結合をもつ環状アミノ酸に、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（II）2005095167.tif 000043（式中、Ａは前記と同義である）で表されるＬ体環状アミノ酸を生成させる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
2005095167.tif 000033
（式中、Ａは、鎖長が１〜６原子であり、硫黄原子、酸素原子および窒素原子よりなる群から選ばれる少なくとも1種のヘテロ原子を鎖中または末端に含んでいてもよく、かつ、
置換されていてもよいアルキル鎖を示す）で表される１位に二重結合をもつ環状アミノ酸に、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（II）
【化２】
2005095167.tif 000034
（式中、Ａは前記と同義である）で表されるＬ体環状アミノ酸を生成させることを特徴とする、Ｌ体環状アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に示すポリペプチドである、請求項１に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
【請求項３】
Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが、以下の理化学的性質を有するＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の製造方法：
（Ａ）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；
（Ｂ）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さない；
（Ｃ）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とした場合の至適ｐＨが１０付近；及び、
（Ｄ）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定であるｐＨが５〜１０．５付近：
【請求項４】
Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを含む細胞が、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）
または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項４に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、請求項４に記載の製造方法：
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列において1または数個の塩基が置換、欠失もしくは
付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
前記一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物において、Ａが炭素数１〜４の直鎖状のアルキル鎖であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物において、Ａが、−ＣＨＯＨＣＨ2−、
−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−、−ＳＣＨ2−、−ＳＣ2Ｈ4−、−ＳＣ3Ｈ6−、−ＯＣＨ2−、−ＯＣ2Ｈ4−、−ＯＣ3Ｈ6−、−ＮＨＣＨ2−、−ＮＨＣ2Ｈ4−、−ＮＨＣ3Ｈ6−、−ＮＨ
ＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−Ｃ2Ｈ4ＮＨＣＯ−、−Ｃ2Ｈ4ＮＨＣＮ−、−Ｃ2Ｈ4ＣＨＣＯＯ
Ｈ−、−ＳＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−ＳＣ2Ｈ4ＣＨＣＯＯＨ−、−Ｃ3Ｈ6ＮＨＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−ＮＨＣＨＣＯＯＨＣＨ2−、および−ＣＨ2ＮＨＣＨＣＯＯＨＣ2Ｈ4−よりなる群から選ばれるヘテロ原子を含むアルキル鎖であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物において、Ａが好ましくは、炭素数２〜４の直鎖状のアルキル鎖（-Ｃ2Ｈ4-、−Ｃ3Ｈ6-、-Ｃ4Ｈ8-）、-ＣＨＯＨＣＨ2-、-Ｃ2Ｈ4ＣＨＯＨＣＨ2-、-ＳＣＨ2-、-ＳＣ2Ｈ4-、-ＳＣ3Ｈ6-、-ＯＣ2Ｈ4-、よりなる群から選ばれるヘテロ原子を含むアルキル鎖であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
下記一般式（III）
【化３】
2005095167.tif 000035
（式中、Ａは前記と同義である）で表される鎖状のα，ω−ジアミノ酸に、ジアミノ酸のα位のアミノ基をケト基に変換しαケト酸を生成することのできる酵素を反応させ、下記一般式（Ｉ）
【化４】
2005095167.tif 000036
（式中、Ａは前記と同義である）で表される１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成させた後、得られた１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により、下記一般式（II）
【化５】
2005095167.tif 000037
（式中、Ａは前記と同義である）で表されるＬ体環状アミノ酸を生成させることを特徴とする、Ｌ体環状アミノ酸の製造方法。
【請求項１１】
ジアミノ酸のα位のアミノ基をケト基に変換しαケト酸を生成することのできる酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ、および、Ｌ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素である請求項１０に記載のＬ体環状アミノ酸の製造方法。
【請求項１２】
下記一般式（IV）
【化６】
2005095167.tif 000038
（式中、Ａは前記と同義である）で表される環状アミノ酸に、１位のアミノ基を酸化できる酵素を作用させ、下記一般式（Ｉ）
【化７】
2005095167.tif 000039
（式中、Ａは前記と同義である）で表される１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成させた後、得られた１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により、下記一般式（II）
【化８】
2005095167.tif 000040
（式中、Ａは前記と同義である）で表されるＬ体環状アミノ酸を生成させることを特徴とする、Ｌ体環状アミノ酸の製造方法。
【請求項１３】
環状アミノ酸の１位のアミノ基を酸化し、１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成することのできる酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素である、請求項１２に記載のＬ体環状アミノ酸の製造方法。
【請求項１４】
下記化学式に示す環状アミノ酸[1,4] チアゼパン−３−カルボン酸（[1,4]thiazepane-3-carboxylic acid）。
【化９】
2005095167.tif 000041
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業的に有用である光学活性環状アミノ酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
環状アミノ酸の化学的製造方法としては、L-アゼチディン-2-カルボン酸（L-azetidine-2-carboxylic acid）の製法（非特許文献１、特許文献１）、ピペコリン酸（pipecolic acid）の製法(非特許文献２) 、４−および５−ヒドロキシピペコリン酸(hydroxypipecolic acid)の製法(非特許文献３)、 チアザンカルボン酸(1,4-thiazane-3-carboxylic acid)の製法(非特許文献４、５)、Ｌ−モルフォリンカルボン酸(L-3-Morpholine carboxylic acid)の製法(非特許文献６)、 Ｓ−アゼパン−２−カルボン酸（(S)-azepane-2-carboxylic acid）の製法 (非特許文献７)などが知られていた。
生物化学的に環状アミノ酸をつくる方法としては、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ（EC 1.5.1.2）を利用したＬ−リジン（L-lysine）からのL-ピペコリン酸(L-pipecolic acid)の製法（非特許文献８）、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ（EC 1.5.1.2）を利用したL-オルニチン(L-ornithine)からのL-プロリン(L-Proline) の製法（非特許
文献９、１０）、オルニチンシクロデアミナーゼによるL-オルニチンからのL-プロリンの製法（非特許文献１１）、オルニチンシクロデアミナーゼによる各種ジアミノ酸(diamino
acid)からの各種環状アミノ酸の製法（特許文献２）などが知られていた。
【０００３】
一方、１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を還元する酵素としては、たとえば動物由来またはカビ由来のピロリン−２−カルボン酸還元酵素(pyrroline-2-carboxylate reductase : EC 1.5.1.1)がΔ-１-ピロリン-2-カルボン酸（Δ-１-pyrroline-2-carboxylic acid）、およびΔ-１-ピペリジン-2-カルボン酸（Δ-１-piperidine-2-carboxylic acid）を
還元しそれぞれプロリン、およびピペコリン酸が生成する事が知られていた（非特許文献１２）。
【０００４】
また、Ｄ―リジンからΔ-１-ピペリジン-2-カルボン酸（Δ-１-piperidine-2-carboxylic acid）を中間体としてＬ−ピペコリン酸を生成するというシュードモナス（Pseudomonas）属細菌の代謝の報告があり、その中でピペリデイン-2-カルボン酸還元酵素(piperideine-2-carboxylate reductase : EC 1.5.1.21)が還元反応を行っているとの報告もある（非特許文献１３）。
【０００５】
また、豚肝臓由来のケチミン還元酵素(ketimine-reducing enzyme : EC 1.5.1.25)が、S-アミノエチルシステイン  ケチミン（S-aminoethylcysteine ketimine）、ランチオニ
ン  ケチミン（lanthionine ketimine）、シスタチオニン  ケチミン（cystathionine ketimine）を還元することが見いだされている（非特許文献１４）。
しかしながら、Fujiiら（非特許文献８）により報告されていた方法はL-リジン（L-lysine）にL-lysine 6-aminotransferaseを用い中間体としてΔ-１-piperidine-６-carboxylic acidを生成せしめ、さらにそれに還元酵素を作用させＬ−ピペコリン酸(L-pipecolic acid)を得るものである。この方法は原料がＬ−リジンの場合しか対応できず、他の環状
アミノ酸の製造には適応できない。
【０００６】
また、Costilowら（非特許文献１１）の報告はL-オルニチン（L-ornithine）にOrnithine Cyclaseを用いＬ−プロリン(L-Proline)を得るものであるが、これもプロリン以外の
生成物に関しては記載が無い。またDenisら（特許文献２）はOrnithine Cyclaseを用いL-ピペコリン酸(L-pipecolic acid)、L-チオモルフォリン-2-カルボン酸（L-Thiomorpholine-2-carboxylic acid）、5-ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（5-hydroxy-L-pipecolic aci
d）等を得る方法を報告しているが収率や光学純度などの記載はない。
【０００７】
上記いずれの方法も、生成物の環状アミノ酸の光学純度は原料のアミノ酸の光学純度によるものであり、全くラセミ体の原料から高効率で光学活性環状アミノ酸は得られない。
一方、中間体として１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を経る方法は、原料にラセミ
体の環状アミノ酸や、ジアミノ酸を用いることが出来、工業的に有利である。
Ｌ−プロリン(L-Proline)およびＬ−ピペコリン酸(L-pipecolic acid)、Ｌ−チオモル
フィン（L-Thiomorphine）等に対応する酵素反応がそれぞれ確認されているが、いずれも酵素反応を生化学的に確認されているのみで、工業的な生産の例は知られていなかった。また、動物由来の酵素は非常に不安定だとの記載もありこれらの酵素を用いての実用化は困難であった。
【特許文献１】US 5942630
【特許文献２】WO 02/101003
【非特許文献１】Stephen Hanessian et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (1999) vol.9, pp.1437-1442
【非特許文献２】Concepcion F Garcia et al., Tetrahydron Asymmetry (1995) vol.6, pp.2905-2906
【非特許文献３】Roland E.A. Callens, et al, Bull. Soc. Chim. Belg. (1982) vol.91,  pp.713-723
【非特許文献４】T. Shiraiwa, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., vol62, pp2382-2387
【非特許文献５】U. Larsson et al., Acta Chemica Scandinavica (1994) vol.48 pp517-525
【非特許文献６】Y. Kogami et al., Bull. Chem. Soc. Jpn (1987) vol.60, pp2963-2965
【非特許文献７】D. Seebach et al., Liebigs. Ann. Chem. (1989) pp.1215-1232
【非特許文献８】Tadashi Fujii et al., Bioscience Biotechnology Biochem (2002) vol.66, pp.1981-1984
【非特許文献９】Janet Kenklies et al., Microbiology (1999), vol.145, pp.819-826
【非特許文献１０】Ralph N Costilow et al., Journal of Bacteriology (1969) vol.100, pp.662
【非特許文献１１】Ralph N Costilow et al., Journal of Biological Chemistry (1971) vol.246, pp.6655-6660
【非特許文献１２】Alton Meister et al., Journal of Biological Chemistry (1957) vol.229, pp.789-800
【非特許文献１３】Cecil W Payton et al., Journal of Bacteriology (1982) vol.149, pp.864-871
【非特許文献１４】Mirella Nardini et al., European Journal of Biochemistry (1988) vol.173, pp.689-694
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
酵素学的に安定な、１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を還元する酵素で、各種の基質に広く反応する酵素を単離し、その固定化酵素を用いるか、あるいは当該遺伝子を組み込んだ組み替え微生物を用いれば、上記問題は解決され、工業的に安価に光学活性環状アミノ酸を収率よく製造すると考えられる。
さらに、本発明は工業的に安価なジアミノ酸やラセミ体の環状アミノ酸から中間体として１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を得て、これを還元する酵素を用いることにより工業的に安価な各種光学活性環状アミノ酸の製造方法を提供する事を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を還元し効率よく光学活性環状アミノ酸を生成する事を見いだした。また、１位に二重結合をもつ環状アミノ酸は、ラセミ体の環状アミノ酸、或いはジアミノ酸から対応する既知の酵素を用いて効率的に製造することができ、化学的に得ることもできる。よってこの１位に二重結合をもつ環状アミノ酸生成反応および立体選択的還元反応の組み合わせにより工業的に安価な光学活性環状アミノ酸を製造することができる。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、以下のＬ体環状アミノ酸の製造法が提供される。
（１）  下記一般式（Ｉ）
【００１１】
【化１】
2005095167.tif 000002
【００１２】
（式中、Ａは、鎖長が１〜６原子であり、硫黄原子、酸素原子および窒素原子よりなる群から選ばれる少なくとも1種のヘテロ原子を鎖中または末端に含んでいてもよく、かつ、
置換されていてもよいアルキル鎖を示す）で表される１位に二重結合をもつ環状アミノ酸に、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（II）
【００１３】
【化２】
2005095167.tif 000003
【００１４】
（式中、Ａは前記と同義である）で表されるＬ体環状アミノ酸を生成させることを特徴とする、Ｌ体環状アミノ酸の製造方法。
（２）  Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に示すポリペプチドである、（１）に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；（３）  Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが以下の理化学的性質を有するＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼである、（１）に記載の製造方法：
（Ａ）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；
（Ｂ）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さない；
（Ｃ）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とした場合の至適ｐＨが１０付近；
及び、
（Ｄ）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定であるｐＨが５〜１０．５付近：
（４）  Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを含む細胞が、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、（１）に記載の製造方法。
（５）  Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、（４）に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１５】
（６）  Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、（４）のいずれかに記載の製造方法：
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列において1または数個の塩基が置換、欠失もしくは
付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１６】
（７）  前記一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物において、Ａが炭素数１〜４の直鎖状のアルキル鎖であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）  前記一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物において、Ａが、−ＣＨＯＨＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−、−ＳＣＨ2−、−ＳＣ2Ｈ4−、−ＳＣ3Ｈ6−、−ＯＣＨ2−、−ＯＣ2Ｈ4−、−ＯＣ3Ｈ6−、−ＮＨＣＨ2−、−ＮＨＣ2Ｈ4−、−ＮＨＣ3Ｈ6−、−ＮＨＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−Ｃ2Ｈ4ＮＨＣＯ−、−Ｃ2Ｈ4ＮＨＣＮ−、−Ｃ2Ｈ4ＣＨ
ＣＯＯＨ−、−ＳＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−ＳＣ2Ｈ4ＣＨＣＯＯＨ−、−Ｃ3Ｈ6ＮＨＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−ＮＨＣＨＣＯＯＨＣＨ2−、および−ＣＨ2ＮＨＣＨＣＯＯＨＣ2Ｈ4−よりなるから選ばれるヘテロ原子を含むアルキル鎖であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（９）  前記一般式（Ｉ）および（II）で表される化合物において、Ａが好ましくは、炭素数２〜４の直鎖状のアルキル鎖（-Ｃ2Ｈ4-、−Ｃ3Ｈ6-、-Ｃ4Ｈ8-）、-ＣＨＯＨＣＨ2-、-Ｃ2Ｈ4ＣＨＯＨＣＨ2-、-ＳＣＨ2-、-ＳＣ2Ｈ4-、-ＳＣ3Ｈ6-、-ＯＣ2Ｈ4-、よりなる群から選ばれるヘテロ原子を含むアルキル鎖であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）  下記一般式（III）
【００１７】
【化３】
2005095167.tif 000004
【００１８】
（式中、Ａは前記と同義である）で表される鎖状のα，ω−ジアミノ酸に、ジアミノ酸のα位のアミノ基をケト基に変換しαケト酸を生成することのできる酵素を反応させ、上記一般式（Ｉ）で表される１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成させた後、得られた１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を、（１）〜（９）のいずれか一項に記載の方法により、上記一般式（II）で表されるＬ体環状アミノ酸を生成させることを特徴とする、Ｌ体環状アミノ酸の製造方法。
（１１）  ジアミノ酸のα位のアミノ基をケト基に変換しαケト酸を生成することのできる酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ、および、Ｌ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素である（１０）に記載のＬ体環状アミノ酸の製造方法。
（１２）  下記一般式（IV）
【００１９】
【化４】
2005095167.tif 000005
【００２０】
（式中、Ａは前記と同義である）で表される環状アミノ酸に、１位のアミノ基を酸化できる酵素を作用させ、上記一般式（Ｉ）で表される１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成させた後、得られた１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を、（１）〜（９）のいずれか一項に記載の方法により、上記一般式（II）で表されるＬ体環状アミノ酸を生成させることを特徴とする、Ｌ体環状アミノ酸の製造方法。
（１３）  環状アミノ酸の１位のアミノ基を酸化し、１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成することのできる酵素が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素である（１２）に記載のＬ体環状アミノ酸の製造方法。
（１４）下記化学式に示す環状アミノ酸[1,4] チアゼパン−３−カルボン酸（[1,4]t    
hiazepane-3-carboxylic acid）。
【００２１】
【化５】
2005095167.tif 000006
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、工業的に安価なジアミノ酸やラセミ体の環状アミノ酸から、中間体として１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を得て、これをＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを用いて還元することにより工業的に安価で、高純度な各種光学活性環状アミノ酸製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に、本発明を詳細に説明する。
前記一般式（I）、（II）、（III）および（IV）において、Ａの定義中の原子及び基を具体的に説明する。
本発明において、アルキル鎖としては、例えば、−ＣＨ2−、−Ｃ2Ｈ4−、−Ｃ3Ｈ6−
、−Ｃ2Ｈ3ＣＨ3−、−Ｃ4Ｈ8−、−Ｃ3Ｈ5ＣＨ3−、−ＣＨ2ＣＨＣＨ3ＣＨ2−、−Ｃ5Ｈ10−、−Ｃ4Ｈ7ＣＨ3−、−Ｃ2Ｈ4ＣＨＣＨ3ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨＣＨ3Ｃ2Ｈ4−、−Ｃ
Ｈ2Ｃ(ＣＨ3) 2ＣＨ2−、−Ｃ6Ｈ12−等の炭素数１〜６の直鎖、分岐鎖アルキル鎖が挙げられる。これらの中で、５員環〜７員環の環状アミノ酸を形成することができる炭素数２〜４の直鎖状のアルキル鎖が好ましく、特に炭素数２の場合はＬ−プロリン(Proline)、
などの５員環アミノ酸、炭素数３の場合はＬ−ピペコリン酸(pipecolic acid)などの６員環アミノ酸を形成し、炭素数４の場合はアゼパン−２−カルボン酸（azepane-2-carboxylic acid）などの７員環アミノ酸を形成し、特に好ましい。これら化合物の化学式を次に
示す。
【００２４】
【化６】
2005095167.tif 000007
【００２５】
また、上記のアルキル鎖中には硫黄原子、酸素原子、窒素原子等のヘテロ原子を鎖中又は末端に含んでいてもよく、これらへテロ原子を含むアルキル鎖により複素環を形成することができる。アルキル鎖中に含まれる硫黄原子、酸素原子、窒素原子等のヘテロ原子は複数種または複数個含まれていてもよく、含まれるヘテロ原子の数としては、１〜３個が好ましい。ヘテロ原子を含むアルキル鎖としては、例えば−ＣＨＯＨＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ2−、−ＳＣＨ2−、−ＳＣ2Ｈ4−、−ＳＣ3Ｈ6−、−ＯＣＨ2−、−ＯＣ2Ｈ4
−、−ＯＣ3Ｈ6−、−ＮＨＣＨ2−、−ＮＨＣ2Ｈ4−、−ＮＨＣ3Ｈ6−、−ＮＨＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−Ｃ2Ｈ4ＮＨＣＯ−、−Ｃ2Ｈ4ＮＨＣＮ−、−Ｃ2Ｈ4ＣＨＣＯＯＨ−、−ＳＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−ＳＣ2Ｈ4ＣＨＣＯＯＨ−、−Ｃ3Ｈ6ＮＨＣＨ2ＣＨＣＯＯＨ−、−ＮＨＣＨＣＯＯＨＣＨ2−、および−ＣＨ2ＮＨＣＨＣＯＯＨＣ2Ｈ4−などが挙げられる。
【００２６】
Ａが、硫黄原子を含むアルキル鎖の場合、光学活性環状アミノ酸としては、チオプロリン、３−チオモルフォリンカルボン酸、[1,4] チアゼパン−３−カルボン酸（[1,4]thiazepane-3-carboxylic acid）等が挙げられる。Ａが、酸素原子を含むアルキル鎖の場合、
光学活性アミノ酸としては、４−オキザゾリジンカルボン酸、３−モルフォリンカルボン酸等が挙げられる。Ａが、窒素原子を複数含むアルキル鎖の場合、光学活性環状アミノ酸としては、ピペラジン−２−カルボン酸、が挙げられる。これら化合物の化学式を次に示す。
【００２７】
【化７】
2005095167.tif 000008
【００２８】
また、上記アルキル鎖または、へテロ原子を含むアルキル鎖の置換基としては、  反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、  アリール基、アルコキシ基、カルボキシル基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、  ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。置換基を含む環状アミノ酸としては  例えばヒドロキシプロリン(hydroxyproline)、ヒドロキシピペコリン酸等があげら  れる。これらの化学式を次に示す。
【００２９】
【化８】
2005095167.tif 000009
【００３０】
次に、本発明でいうＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼとは、例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＡＴＣＣ１２６３３株由来のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼに代表される様に還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）（以下、両者をまとめて「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」と略記することがある）を補酵素としてピルビン酸、フェニルピルビン酸等のαケト酸にメチルアミンを付加させてＮ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニン等のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸を生成する酵素である（下記反応式参照）。
【００３１】
【化９】
2005095167.tif 000010
【００３２】
本発明で用いるＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼとしては以下の理化学的性質を有するものを挙げることができる。
（Ａ）作用：ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨを補酵素としてピルビン酸とアルキルアミン又はジアルキルアミンからＮ−アルキル−Ｌ−アラニンを生成する；
（Ｂ）基質特異性：アルキルアミン又はジアルキルアミンに対して活性を示すがアンモニアには活性を示さない；
（Ｃ）フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とした場合の至適ｐＨが１０付近；及び、
（Ｄ）３０℃で３０分処理したときの酵素が安定であるｐＨが５〜１０．５付近：
本発明のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼは、例えば、フェニルピルビン酸のようなジカルボニル基含有化合物と、ＮＡＤＰＨおよび／又はＮＡＤＨの存在下で、アンモニア、アルキルアミン及びジアルキルアミンを反応させ、反応性生物を解析して、デヒドロゲナーゼ活性の有無とその程度を検出するスクリーニングを行うことにより、取得することができる。
【００３３】
スクリーニングに当たっては、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する微生物の培養物から増殖菌体、該菌体破砕物、又はこれから通常の操作により単離した粗酵素又は精製酵素を用いることができる。
加えて、酵素の安定なｐＨが５〜１０．５付近である上で、至適ｐＨが１０付近となるといった特性を有することが上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの特性である。
【００３４】
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼは、例えば、シュードモナス・プチダに属する微生物、特に好ましくは、シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株より単離することができる。
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、並びにそのホモログであってＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するものが挙げられる。
【００３５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの性質としては、上記（Ａ）〜（Ｄ）で示される性質の他に以下のような特性も示す。
（Ｅ）Superose 12HR10/30（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いたゲル濾過法分析により測定される分子量が約８０〜９３キロダルトンであり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動において、少なくとも約３６キロダルトンと推定されるポリペプチドのバンドを示す。
【００３６】
（Ｆ）フェニルピルビン酸とメチルアミンを基質とした場合の活性測定による至適温度は３５℃付近である。
（Ｇ）至適ｐＨ（フェニルピルビン酸とメチルアミンとを基質とした場合＝ｐＨ１０）において３０分処理したときの熱安定性は、約３０℃未満である。
（Ｈ）ピルビン酸だけでなく、少なくとも２−ケトヘキサン酸、フェニルピルビン酸、２−オキソ酪酸、β―フルオロピルビン酸、２−ケト−ｎ−吉草酸にも活性を示す。
【００３７】
（Ｉ）０．０１ｍＭの塩化水銀（ＨｇＣｌ2）及び０．０１ｍＭの塩化銅（ＣｕＣｌ2）といった２価の重金属によって活性が阻害される。
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼのホモログとしては、  配列番号1 で表されるアミノ酸配列において１から複数個（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；が挙げられる。
【００３８】
尚、上記ポリペプチドのホモロジー検索は、例えば、DNA Databank of JAPAN(DDBJ)を
対象に、FASTA programやBLAST programなどを用いて行うことができる。
また、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性とは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ等を酸化還元反応に関する補酵素として、ピルビン酸、フェニルピルビン酸等のαケト酸にメチルアミンを付加させて、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニン等のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸を合成する活性をいう。
【００３９】
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの取得方法としては、上述したようＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸にデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物の培養物から単離・精製する方法のほか、後述するように上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作成したプローブを用いることにより、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する任意の微生物からＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを単離した後、それを元に遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。
【００４０】
あるいは、上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼは、Fmoc法(フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced Chem Tech社製)、パーキンエルマージャバン(米国Perkin Elmer社製)、アマシャムファルマシアバイオテク(Amersham Pharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラ
ボウ(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００４１】
本発明の製造方法において、１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を還元する際に用いる細胞としては、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを持つ微生物であればいずれを用いても構わない。望ましくはＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡで形質転換した微生物がよい。
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００４２】
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡのホモログとしては、配列番号２で表される塩基配列において１から複数個（好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個程度）の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが
挙げられる。
【００４３】
当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄ  Ｅｄｔ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、"モレキュラークローニング第２版" と略す）、ＰＣＲ −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより所望のホモログを得ることが可能である。
【００４４】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。
【００４５】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
上記したＤＮＡのホモログとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の相同性を有し、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものが挙げられる。
【００４６】
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
まず、上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、染色体ＤＮＡからＰＣＲ法を用いたクローニング等の通常の遺伝子工学的解析手法を用いて、目的とするＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解析することができる。また、本発明により、その塩基配列が明らかになったため、当該塩基配列を元にプライマーを設定し、目的とする遺伝子をクローニングすることもできるし、ＤＮＡ合成装置により合成することもできる。
【００４７】
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡは、後述するとおり、公知の発現ベクターに挿入することにより、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ発現ベクターを提供することができる。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを該形質転換体から得ることができる。
【００４８】
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを発現させるための形質転換の対象となる微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌；
ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクタ
ー系の開発されている放線菌；
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；
ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ。
【００４９】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属であり、特に好ましくは、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属である。
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、モレキュラークローニング第２版などを参照）。
【００５０】
具体的には、微生物等の細胞中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入するか、もしくは、上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを染色体上に組み込むことによって直接宿主ゲノム中に導入することにより細胞に形質転換し、そのＤＮＡを細胞中で発現させることができる。
【００５１】
このとき、プロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５'−側上流に、より好ましくはターミ
ネーターを３'−側下流にそれぞれ組み込むことが好ましい。本発明で用いることができ
るプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv.
Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488(1992)、などに詳細に記述されている。
【００５２】
具体的には、例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミドが挙げられ、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λ ファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネータ
ーとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００５３】
バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミド
などを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで開発されている一
般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを
基本にした広宿主域ベクター（RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む
）pKT240を挙げることができる。
【００５４】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、ベクターとしては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))など
のプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、ベクターとしては、pCS11(特開昭57-183799号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００５５】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces  cerevisiae) においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラス
ミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５６】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、ベクターとしては、Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用で
きる。
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研
究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００５７】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が開発されており、それらを適宜使用することができる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が開発されており、好適に利用できる。
【００５８】
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを有する形質転換体を培養し、培養物から公知の方法で上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを単離精製することができる。
上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを有する形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５９】
本発明で用いる形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常15〜40℃であり、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６０】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPM11640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(195
9)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常ｐＨ
６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必
要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６１】
形質転換体の培養物から、上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化学社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロー
ス、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００６２】
また、上記のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを回収後、該Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００６３】
形質転換体を作用させるに当たっては、該形質転換体をそのまま、該形質転換体をアセトン、ＤＭＳＯ、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該形質転換体中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを用いることができる。
【００６４】
Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを用いて還元すべき、環状アミノ酸生成反応の基質である下記一般式（Ｉ）
【００６５】
【化１０】
2005095167.tif 000011
【００６６】
（式中、Ａは前記と同義である）で表される１位に二重結合をもつ環状アミノ酸は、いかなる手段によって製造されたものも使用することが出来る。
たとえば対応するジアミノ酸やラセミ体の環状アミノ酸から生物学的、あるいは化学的
に導くことが出来る。
ジアミノ酸から導く場合、下記反応式のとおり、ジアミノ酸のα位のアミノ基をケト基に変換しαケト酸が生成させれば、該αケト酸は非酵素的脱水閉環が起こり１位に二重結合をもつ環状アミノ酸となる。なお、下記反応式中、Ａは前記と同義である。
【００６７】
【化１１】
2005095167.tif 000012
【００６８】
通常、該αケト酸と１位に二重結合をもつ環状アミノ酸は水溶液中で平衡混合物として存在するので、これらのものは等価のものと見なされる。すなわち、本発明の反応系中には１位に二重結合をもつ環状アミノ酸そのもの、あるいは該αケト酸と１位に二重結合をもつ環状アミノ酸の混合物、あるいは該αケト酸を添加、あるいは含有することが出来、これらいずれの態様も本発明に包含される。
【００６９】
上記反応を触媒するものとしては、ジアミノ酸のα位のアミノ基をケト基に変換しαケト酸が生成する事の出来る触媒であれば特に限られないが、具体的にはアミノ酸オキシダーゼ（D-amino acid oxidase, L-amino acid oxidase）、アミノ酸デヒドロゲナーゼ（D-amino acid dehydrogenase, L-amino acid dehydrogenase）やアミノ酸トランスフェラーゼ（D-amino acid aminotransferase, L-amino acid aminotransferase）などの酵素があげられる。
【００７０】
これらの中で、基質特異性の広い酵素が好ましい。具体的にはEnzyme and Microbial Technology vol.31(2002) p77-87に記載されているＬ−アミノ酸オキシダーゼ、シグマ社
製のＤ−アミノ酸オキシダーゼなどがあげられる。
用いられるアミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼやアミノ酸トランスフェラーゼは、ジアミノ酸にのみ反応するものであり、かつ本反応で用いられる補酵素に対応するものを使用できると補酵素の再生システムの代替ともなり好ましい。すなわち、本反応の還元反応において、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いた場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは本反応の還元化に伴い酸化型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤ+）または酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）（両者をまとめて「ＮＡ
Ｄ（Ｐ）+」と略記することがある）となるが、一方で、ジアミノ酸類から１位に二重結
合をもつ環状アミノ酸を製造するに当たり、このＮＡＤ（Ｐ）+を利用してＮＡＤ（Ｐ）
Ｈへ変換することとなる。
【００７１】
またラセミ体の環状アミノ酸化合物から１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を導く場合、最終的に生成する光学活性環状アミノ酸と光学活性が異なる環状アミノ酸を選択的に酸化し１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成する反応を用いるか、あるいは全てを１位に二重結合をもつ環状アミノ酸に導く反応を用いる事ができる。
すなわち下記反応式に説明されるように所望の光学活性環状アミノ酸すなわちＬ体の環状アミノ酸はそのままに残し、所望とは反対の光学活性体すなわちＤ体を１位に二重結合をもつ環状アミノ酸に変換しこれを本発明のＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを用いて還元する方法、あるいは全てを１位に二重結合をもつ環状アミノ酸に変換させた後にそれを単離して次の還元反応に用いることも出来る。なお、下記反応中、Ａは前記と同義である。
【００７２】
【化１２】
2005095167.tif 000013
【００７３】
Ｄ体の光学活性体を１位に二重結合をもつ環状アミノ酸に変換する触媒としては、その活性を有するものであれば特に限定はされないが、酵素が好ましく用いられる。酵素としては、例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ（D-amino acid oxidase）、 Ｄ−アミノ酸デヒ
ドロゲナーゼ（D-amino acid dehydrogenase）、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（D-amino acid aminotransferase）などが挙げられる。
【００７４】
これらの中で、は基質特異性の広い酵素が好ましい。具体的にはシグマ社製のＤ−アミノ酸オキシダーゼなどがあげられる。
用いられるアミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼやアミノ酸トランスフェラーゼは、Ｄ体の光学活性体を１位に二重結合をもつ環状アミノ酸にのみ反応するものであり、かつ本反応で用いられる補酵素に対応するものを使用できると補酵素の再生システムの代替ともなり好ましい。すなわち、本反応の還元反応において、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いた場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは本反応の還元化に伴いＮＡＤ（Ｐ）+となるが
、一方で、所望とは反対の光学活性体を１位に二重結合をもつ環状アミノ酸から１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を製造するに当たり、このＮＡＤ（Ｐ）+を利用してＮＡＤ（
Ｐ）Ｈへ変換することとなる。
【００７５】
また１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を得るために各種アミノ酸オキシダーゼを用いる場合、該反応に伴い過酸化水素が生成され、それが酵素活性の低下など反応に悪影響を及ぼすことが考えられるので、過酸化水素を除去するために別の酵素を組み合わせることも望ましい。過酸化水素を除去する酵素としては、過酸化水素に反応する酵素であれば特に限定はされないが、具体的にはカタラーゼやパーオキシダーゼが好ましい。添加量としては生成する過酸化水素が効率よく除去される範囲であれば限定はされないが、具体的には該オキシダーゼに対し０．１〜１００万倍活性、好ましくは１〜１０万倍活性の範囲で用いられる。
【００７６】
さらにオキシダーゼを用いる場合、補酵素のフラビンアデニンジヌクレチド（ＦＡＤ）をさらに追加することにより活性を高めることも出来る。添加濃度は反応液中に０．００００１〜１００ミリモル濃度、好ましくは０．００１〜１０ミリモル濃度の範囲で用いられる。
本発明の製造方法において、反応基質となる１位に二重結合をもつ環状アミノ酸の反応液中の濃度は、通常、０．０００１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．０１〜３０％ｗ／ｖの範囲である。これらは、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００７７】
反応基質をジアミノ酸類とする場合は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲である。
反応基質をラセミ体の環状アミノ酸とする場合は通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。
また、本反応においては、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）+もしくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加するの
が好ましく、通常、０．００１mM〜１００mM、好ましくは０．０１〜１０mM添加する。
【００７８】
上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、上記再生方法としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤ（Ｐ）+還元能を利用する方法、２）ＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法が挙げられる。
【００７９】
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加するのが好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、上記再生酵素類をコードするＤＮＡで形質転換された微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
【００８０】
この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、Ｎ−メチル-Ｌ-アミノ酸デヒドロゲナーゼに比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなど、の添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料であるジカルボニル基含有化合物に対して、通常０．１〜１００モル倍量、好ましくは０．５〜２０モル倍量添加する。
【００８１】
また、上記３）の方法においては、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼのＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
【００８２】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
本反応は、反応基質及び形質転換体並びに必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。
【００８３】
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、エタノール、プロパノール、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド等の水溶性有機溶媒や酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等の非水溶性有機溶媒などから適宜反応基質の溶解度が高い物を使用することができる。
本反応は、通常、４〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃の反応温度で、通常ｐＨ４〜１
１、好ましくはｐＨ５〜１０で行われる。
【００８４】
また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本反応により生成する環状アミノ酸は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００８５】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００８６】
＜シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＡＴＣＣ１２６３３株由来Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの酵素精製＞
Ｎ−メチル-Ｌ-アミノ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性は下記のような方法で測定した。
測定対象となる粗酵素液にフェニルピルビン酸ナトリウム（最終濃度１５ｍＭ）、メチルアミン−硫酸緩衝液（ｐＨ１０）（最終濃度４００ｍＭ）、ＮＡＤＰＨ（最終濃度１０ｍＭ）を加え全量５０μＬとした。３７℃で１時間反応させた。反応終了後、５μＬの１０％トリクロロ酢酸液を加え１３０００ｒｐｍ、５分間遠心を行った。遠心上清１０μＬを４０μＬの高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）溶離液で希釈し０．４５μｍのフィルターで濾過後高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）にて分析した。
【００８７】
ＨＰＬＣの条件は、次のとおりである。
カラム：Ｕｌｔｒｏｎ  ＥＳＰｈ−ＣＤ（信和化工株式会社）
温度：４０℃
溶離液：２０％アセトニトリル、８０％  ２０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、Ｈ3ＰＯ4  ０．
４ｍｌ／Ｌ（ｐＨ３）
流速：０．８５ml/min. 
検出器：ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）
標準サンプルとしてＳｉｇｍａ社の試薬を用い、酵素の活性単位１ｕｎｉｔを一分間に１μモルのＮ−メチル−フェニルアラニンを生成する酵素量と規定した。
（１−１）粗酵素液の調製
滅菌した液体培地１００ｍｌ（メチルアミン塩酸塩 ５g/L, グルコース １g/L, 酵母エキス ５g/L, リン酸水素二カリウム ７g/L, リン酸二水素カリウム ３g/L, 硫酸マグネシウム七水和物 ０．１g/Lを含む）×２本（５００ｍｌ坂口フラスコ）に、シュードモナス・プチダ  ＡＴＣＣ１２６３３株を接種し、２８℃で１８時間、好気的に振とう培養した（前々培養）。次に、同じ組成の滅菌した液体培地５００ｍｌ×４本（２Ｌ坂口フラスコ）に、前々培養で得られた培養液を各２Ｌ坂口フラスコに５０ｍｌずつ接種した。２８℃で８時間、好気的条件で振とう培養した（前培養）。１％ポリペプトン（ナカライテスク社製）、０．５％酵母エキス（ナカライテスク社製）、１％塩化ナトリウム（ナカライテスク社製）を添加した培地（以下、ＬＢ培地と略す）２００Ｌを滅菌して、前培養で得られた培養液２２００ｍｌをすべて接種し、２８℃で好気的に１６時間培養した（本培養）。培養後得られた培養液を遠心分離し、２．５ｋｇの湿菌体を得た。この菌体を、５Ｌの２０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕によって５．９Ｌの粗酵素液を得た。
【００８８】
粗酵素に対し硫安分画を行ったところ、硫安濃度２０〜６０％画分に活性があった。この画分を集めて１５Ｌの２０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）で５回透析した
。酵素液の量は３１００ｍｌになった。
（１−２）SuperQ-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による精製
２０ｍＭトリス−塩酸バッファー (pH 7.0)で平衡化したSuperQ-TOYOPEARL（ＴＯＳＯ
Ｈ社製）７００ｍＬに、硫安分画20〜60％飽和の画分３１００ｍＬを供した。その後２０ｍＭトリス−塩酸バッファー (pH 7.0) ４９００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には活
性が検出されなかった。
【００８９】
上記洗浄後、０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファー３
５００ｍＬで溶出した。この条件で、活性を持つタンパク質が溶出された。さらに、０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファー３５００ｍＬで溶出し
たが、この画分では活性が検出されなかった。
上記０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファーで溶出した
画分を回収し、タンパク量及び酵素活性を測定した。活性を示した溶液３９００ｍＬを、２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) に１２Ｌで３回透析し
た。透析後の酵素液は３０００ｍＬであった。
（１−３）Butyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による精製
上記（１−２）で得た酵素液３０００ｍＬを、２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で平衡化したButyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）５００ｍＬに
流した。その２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)２８００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分のタンパク量及び酵素活性を測定したところ、この画分に活性が検出された。洗浄で得た酵素液に直接硫安を加えて、硫安濃度が５〜２０％飽和の画分を取得し再びButyl-TOYOPEARLに流すことにした。
（１−４）Butyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による２回目の精製
得られた硫安画分の酵素液５７００ｍＬを、３０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で平衡化したButyl-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）５００ｍＬに流
した。その後、３０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)２３００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分のタンパク量及び酵素活性を測定したところ、この画分に活性が検出された。続いて、このカラムを１５％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で溶出した。その結果、溶出液にも活性が検出された。活性を示した上記両方の画分を回収し、60％飽和濃度になるように３０７０ｇの硫安を加えて撹拌し、濃縮した。その結果、酵素液は６００ｍＬとなった。これを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)１４Ｌで３回透析を行い、得られた酵素液は１０００ｍＬになった。
（１−５）DEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による精製
上記（１−４）において透析して得た酵素液１０００ｍＬを、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化したDEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）６００ｍＬに供した
。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)４０００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には活性がみられなかった。続いて０．１Ｍの塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)２５００ｍＬで溶出した。その結果、この画分にほとんど活性が検出されなかった。次に、塩化ナトリウム濃度が０．１〜０．３Ｍとなるようにグラジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収したところ、１７００ｍＬの酵素液が得られた。この酵素液に７６０ｇの硫安を加えて撹拌し、濃縮した。その結果、酵素液は６０ｍＬになった。これを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)８Ｌで2回透析を行った。透析後、酵素液は１００ｍＬになった。
（１−６）Green-sepharose CL-4Bによる精製
市販の膨潤Sepharose CL-4Bゲル150mlをガラスフィルター上にとり、１Lの蒸留水を用
いて吸引洗浄した。これを２Ｌ坂口フラスコに移した。これに、150mＬの水に溶かしたReactive Green 19(Sigma社製) 0.75ｇ（7.5mg色素／ｍＬゲルの割合）を加えた。さらに２２％塩化ナトリウム水溶液15mＬ（最終濃度：約2％）を加え、ゲルと色素がよく混ざり合う程度で、約30分間振とう撹拌した。１．５ｇの結晶炭酸ナトリウムを加えて、５０℃で一晩振とう撹拌した。反応終了後、ゲル懸濁液をガラスフィルターに移し、水（約１．５Ｌ）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（約１．５Ｌ）、水（約３Ｌ）の順序で、ろ液の着色が
見られなくなるまで色素ゲルを洗浄し、Green-sepharose CL-4Bを調製した。
【００９０】
上記方法で調製したGreen-sepharose CL-4B ４５０ｍＬを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化した後に上記（１−５）で得た酵素液１００ｍＬを流した。
その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)３０００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には、上記（１−５）で得られた酵素液のトータル活性の１５％ほどの活性が検出された。次に、塩化ナトリウム濃度が０〜３Ｍになるようにグラジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収したところ、２３１ｍＬの酵素液が得られた。これに、70％飽和濃度になるように硫安を１０９ｇ加えてタンパクを沈殿させた。沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)３ｍＬに懸濁し、２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)９Ｌで８時間透析した。透析後、チューブ内に沈殿物が見られたため、透析と同じバッファー８．５ｍＬを加えて懸濁した。この操作でも沈殿物が溶解しなかったため、遠心して沈殿物と上清を分離した。活性がほとんど上清の方にみられたため、上清１３ｍＬをRESOURCE PHE（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。20 mＬの２０％飽和の硫安含有２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)と20 mＬの２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)でグラジェントをかけてタンパクを溶出した。
【００９１】
回収した酵素液１９ｍＬを限外濾過で５ｍＬまで濃縮した後に、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で透析したところ、酵素液は６．５ｍＬになった。
（１−７）Blue-sepharose 4B（アマシャムバイオサイエンス社製）による精製
Blue-sepharose 4B（アマシャムバイオサイエンス社製）５ｍＬを２０ｍＭトリス−塩
酸バッファー(pH 7.0) で平衡化した後に上記（１−６）で得られた酵素液６．５ｍＬを
流した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)５０ｍＬで洗浄を行った。さらに、50 mＬの1Ｍ塩化ナトリウム水溶液と50 mＬの20mM トリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で、塩化ナトリウム濃度が０〜１Ｍとなるようにグラジエントをかけ活性画分を溶出させた。
【００９２】
上記（１−１）〜（１−７）の各精製ステップにおける酵素画分の比活性等を表１にまとめる。
【００９３】
【表１】
2005095167.tif 000014
【実施例２】
【００９４】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび部分アミノ酸配列の解析＞
各酵素精製ステップのサンプルをすべてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。
精製と共に量の増加が見られる約３５〜４０ｋＤａを通常の方法で切り出し、プロテインシーケンサーにより、エドマン法によるアミノ酸配列の解析を行い、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定した。該配列を配列表の配列番号３で示す。
【００９５】
ＢＬＡＳＴサーチにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Accession No. AE004091）と相同性が高い蛋白であることが示唆された。
【実施例３】
【００９６】
＜Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング＞
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＡＴＣＣ１２６３３株をＬＢ培地で培養し得られた菌体よりDNeasy Tissue Kit (Qiagen社製)を用いて、染色体DNAを調製した
。
実施例２で決定されたN末端アミノ酸配列及びＢＬＡＳＴサーチで見出されたリンゴ酸
デヒドロゲナーゼ（Accession No. AE004091）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を元にプライマーを合成した。それぞれの塩基配列を、配列表の配列番号４(NMPDHf)及び５ (NMPDHr1) に示す。
【００９７】
シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３株の染色体DNAを鋳型とし、NMPDHf、NMPDHr1をプライマーとして、PCR(98℃,20秒、68℃,3分)を30サイクル行い、特異的な増幅サンプルを得た。
上記で得られたＤＮＡ断片を常法に従い、クローニングベクターｐＥＴ２１ａ（宝酒造社製））に導入した。以下、このプラスミドをpENMadh株とする。
【００９８】
次に大腸菌（Escherichia coli）BL21（DE3）（Novagen社）を形質転換した。
形質転換株をアンピシリン（１００μg/mL）を含むＬＢ培地プレート（LB培地＋２％寒天）上で３７℃で生育させた。出現したいくつかの白いコロニーを培養しプラスミドの抽出を通常の条件で行った。とれたプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切
断後（３７℃で３時間）、目的ＤＮＡ断片がプラスミドに挿入されているかアガロース電気泳動で確認した。
【００９９】
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、培養１４時間目にＩＰＴＧを０．１ｍＭとなるように添加しさらに培養を３時間続けて、集菌した。菌体を超音波破砕し粗酵素を得た。
得られた粗酵素の活性測定を行って目的蛋白の発現を確認した。
目的断片が入ったコロニーから得られた粗酵素を用いるとＮ−メチル−Ｌ−フェニルアラニンの生成が確認され、プラスミドのみで形質転換した菌体破砕物ではＮ−メチル−Ｌ−フェニルアラニン生成が見られなかった。
【０１００】
活性確認されたプラスミド中の挿入断片の塩基配列を解析した。該遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
得られたＤＮＡ断片にコードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）中、３番目のアミノ酸から１８番目のアミノ酸までの配列は、実施例２で決定した精製酵素Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼのＮ末端配列（配列番号３）と完全に一致した。このことから、本実施例で得られたＤＮＡ断片は、実施例１で精製したＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードしていることが確認された。
【実施例４】
【０１０１】
＜形質転換体からのＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素精製＞
ＬＢ培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分間蒸気殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌ アンピシリン水溶液を５μＬ加えた。これに実施例３で得られた大腸菌クローン株のコロニーを無菌的に白金耳で接種して、３７℃で２４時間振とう培養した（前培養）。次にＬＢ培地５００ｍＬを２Ｌの坂口フラスコに入れて殺菌し、室温になってから１００ｍｇ/ｍｌ アンピシリン水溶液を５００μＬ加えた。これらに前培養で得られた大腸菌クローン株の培養液０．５ｍＬを接種して、３７℃で１４時間振とう培養した。この段階で１ＭのＩＰＴＧ水溶液を５００μＬ加え、さらに３７℃で３時間振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を集め、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で
２回洗浄した。得られた菌体３．３ｇを２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）２８ｍＬに懸濁し（全量３０ｍｌ）、超音波で菌体を破砕した。遠心分離により菌体断片を除き、２９ｍＬの無細胞抽出液を得た。次に実施例１で用いたGreen sepharose CL-4Bを
用いて精製を行った。
【０１０２】
Green sepharose CL-4B（樹脂１００ｍｌ量）をトリス塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化した後に上記無細胞抽出液を流した。
その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)８００ｍＬで洗浄を行った。洗浄画分には、次に、塩化ナトリウム濃度が０〜１Ｍになるようにグラジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収し、これをCentriprep（アマシャムバイオサイエンス社製）で濃縮した。これを２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)で８時間透析した。透析後、酵素液量は５９ｍｌとなった。
【０１０３】
次にDEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）による精製を行った。
上記の透析して得た酵素液を、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0) で平衡化し
たDEAE-TOYOPEARL（ＴＯＳＯＨ社製）（樹脂６０ｍＬ）に供した。その後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)５００ｍＬで洗浄を行った。次に、塩化ナトリウム濃度が０〜０．３５Ｍとなるようにグラジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収し、Centriprep（アマシャムバイオサイエンス社製）で濃縮した後、２０ｍＭトリス−塩酸バッファー(pH 7.0)に対して透析を行った。透析後、酵素液は６ｍＬになった。
【０１０４】
上記の各精製ステップにおける酵素画分の比活性比を表２にまとめる。
【０１０５】
【表２】
2005095167.tif 000015
【実施例５】
【０１０６】
＜Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの基質特異性＞
実施例４と同様な方法で大腸菌クローン株より精製酵素を得た。
これに表３に示す各種ケト酸を最終濃度10mM、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、硫酸でｐ
Ｈ１０に調整したメチルアミンを最終濃度６0mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍ
の吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。β−フェニルピルビン酸を基質としたときを100％として相対活性の結果を表３に示
した。
【０１０７】
【表３】
2005095167.tif 000016
【実施例６】
【０１０８】
＜至適ｐＨの測定＞
実施例４と同様な方法で大腸菌クローン株より精製酵素を得た。
これにβ−フェニルピルビン酸を最終濃度10mM、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、硫酸で
各ｐＨに調整したメチルアミンを最終濃度６0mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍ
の吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。一分間に１マイクロモルのβ−フェニルピルビン酸と反応する酵素量を１ｕｎｉｔととして蛋白量あたりのｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）とｐＨの関係の結果を図１に示した。反応の至適pHは10.0であった。
【実施例７】
【０１０９】
＜作用至適温度＞
実施例５と同様な反応条件のうちメチルアミン−硫酸（ｐＨ１０）にして、温度だけを変化させて活性を測定した。結果を図２に示す。至適温度は３０〜４０℃であった。
【実施例８】
【０１１０】
＜ｐＨ安定性＞
実施例４で得られた精製酵素を、緩衝液を用いてｐＨを変化させて30℃で30分間インキュベートし、残存活性を測定した。反応条件は実施例７と同様にメチルアミン−硫酸（ｐＨ１０）、３７℃で行った。結果は、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図３に示した。本発明による酵素は、ｐＨ６〜９において最も安定であった。
【実施例９】
【０１１１】
＜温度安定性＞
実施例５で得られた精製酵素を２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃および５０℃の温度で３０分間放置した後、実施例６と同様に活性を測定した。結果は、未処理（氷中放置）の活性を１００とした残存活性で表し、図４に示した。
本発明による酵素は、３０℃まで１００%の残存活性を示した。
【実施例１０】
【０１１２】
＜ＮＡＤＨを補酵素とした場合の基質特異性＞
実施例４と同様な方法で大腸菌クローン株より精製酵素を得た。
これに表４に示す各種ケト酸を最終濃度40mM（但しβ−フェニルピルビン酸は30mM）、ＮＡＤＨを最終濃度0.3mM、bis-Tris propane緩衝液（ｐＨ10.0）を最終濃度100mM、メチルアミンを最終濃度180mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べ
ることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。ピルビン酸を基質としたときを100％として相対活性の結果を表４に示した。
【０１１３】
【表４】
2005095167.tif 000017
【実施例１１】
【０１１４】
＜ＮＡＤＨを補酵素とした場合の至適ｐＨの測定＞
実施例４と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これにピルビン酸を最終濃度80mM、ＮＡＤＨを最終濃度0.3mM、硫酸で各ｐＨに調整し
たメチルアミンを最終濃度180mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化
を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。一分間に１マイクロモルのピルビン酸と反応する酵素量を１ｕｎｉｔとして蛋白量あたりのｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）とｐＨの関係の結果を図５に示した。反応の至適pHは9.5であった。
【実施例１２】
【０１１５】
＜ＮＡＤを補酵素とした場合の逆反応の検討＞
実施例４と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンを最終濃度50mM、ＮＡＤを最終濃度10mM、bis-Tris propane緩衝液（ｐＨ10.0）を最終濃度100mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の
変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。活性は7.8×10-3（ｕ／ｍｇ蛋白）であった。
【実施例１３】
【０１１６】
＜ＮＡＤＰＨを補酵素とした場合の本酵素の基質特異性＞
実施例４と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これに表５に示す各種アミン類を最終濃度60mM、ＮＡＤＰＨを最終濃度0.2mM、β−フ
ェニルピルビン酸を最終濃度10mMとなるように加えた反応液の３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３７℃にした。メチルアミンを基質としたときを100％として相対活性の結果を表５に示した。
【０１１７】
【表５】
2005095167.tif 000018
【実施例１４】
【０１１８】
＜Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとの共反応（１）＞
実施例４と同様な方法で大腸菌クローン株の精製本酵素を得た。
これに最終濃度50mMとなるようにＤＬ−ピペコリン酸（東京化成社製）、最終濃度100mM
のＮＡＤＰＨ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）を最終濃度100mMとなるように加えた反応液
１００μlにＤ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ社製  porcine kidney由来）を0.052unit加えた。このとき反応液中の本酵素の蛋白量は２６．５μｇとなるようにした。測定時の反応温度は３０℃にした。
【０１１９】
９００分後反応液にトリクロロ酢酸を最終濃度２％となるように２５μl添加し反応を
終了させた。
反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した。
カラム：CHIRALPAK WE 250 x 4.6mm （Daicel社製）
溶離液：2mM CuSO4
流速：0.5 ml/min
温度：50度
検出：ＵＶ254nm 
測定の結果D-ピペコリン酸は完全に消失しており、Ｌ−ピペコリン酸が４５ｍＭ濃度生成されていた。
【実施例１５】
【０１２０】
＜Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとの共反応（２）＞
ＤＬ−ピペコリン酸を用いる代わりにＤ−プロリンを用いた以外は実施例１４と同様に行った。６００分後Ｄ−プロリンは完全に消失しＬ−プロリンが４５ｍＭ生成していた。
【実施例１６】
【０１２１】
＜枯草菌からのグルコース脱水素酵素遺伝子のクローニング＞
枯草菌（Bacillus subtilis 株）をLB培地上で培養し、菌体を調製した。菌体から染色体DNAの調製はQiagen  kit(Qiagen社製)を用い、付属マニュアル記載の方法により行った。
NADPHの再生を行わせるために、文献（J.Bacteriol.166,238-243(1986)）記載の枯草菌由来グルコース脱水素酵素（以下「ＧＤＨ」と略記することがある）遺伝子のクローニングを行った。文献記載の塩基配列を元に、ＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム部分ののみをPCRクローニングするため構造遺伝子の5'-末端、3'-末端の配列を元にプラ
イマー  BsuG#S(配列番号６)、BsuG#A(配列番号７)を合成した。上記により調製した枯草菌染色体DNAを鋳型としてPCR（94℃、30秒、54℃、30秒、72℃1分）を30サイクル行い、
特異的な増幅DNAを得た。得られたDNA断片をEcoRIとHindIIIの2種類の制限酵素で消化し
た。プラスミドベクターpKK223-3(アマシャム−ファルマシア社製)をEcoRIとHindIIIで消化し、上記PCR増幅DNA断片をT4DNAリガーゼで連結し、pKK223-3GDHを得た。挿入断片の塩基配列解析を行った結果、データベース(DDBJ AccessionNo. M12276)に収録されている塩基配列と全て一致した。得られたGDH遺伝子の塩基配列を配列番号８に示す。
【実施例１７】
【０１２２】
＜Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼと共発現できるＧＤＨプラスミドpSTV28-GDHの構築＞
実施例１６で構築したpKK223-3GDHをEcoRI、PstIの2種類の制限酵素で消化し、枯草菌GDH遺伝子を含む断片を調製した。プラスミドベクターpSTV28(TAKARA社製)をEcoRI、PstI
で消化し、上記GDHを含む断片をT4DNAリガーゼで連結し、pSTV28-GDHを得た。
【実施例１８】
【０１２３】
＜枯草菌由来GDHとＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの大腸菌における共発
現＞
実施例２で構築したpENMadh を保持する大腸菌BL21(DE3) クローン株をpSTV28-GDHで形質転換した。組み換え大腸菌を100ug/mLのアンピシリン、25ug/mLのクロラムフェニコー
ルを含む液体LB培地に植菌し１７時間培養した後、1mM IPTGを添加し、さらに３時間培養した。集菌後、20mM Tris-HCL (pH7.0) にて懸濁し、超音波破砕によって得られた細胞粗抽出液の酵素活性を測定した。
（１）共発現株におけるＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性の測定
共発現株におけるＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性の測定は100mM bis-trispropaneバッファー（pH10.0）、0.2mM NADPH、30mM methylamine、10mM ピルビン酸
ナトリウムを含む反応液で30℃で行った。1Uは上記反応条件で1分間に1μmolのNADPHを酸化する酵素量とした。その結果、6.6U/mg蛋白であった。
（２）共発現株におけるグルコース脱水素酵素活性の測定
粗酵素１０μlにグルコースを最終濃度100mM、ＮＡＤＰを最終濃度2mM、トリス塩酸緩
衝液（ｐＨ9.0）を最終濃度100mM、となるように加えた反応液１ｍｌの３４０ｎｍの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。測定時の反応温度は３０℃にした。一
分間に１マイクロモルのグルコースと反応する酵素量を１ｕｎｉｔとして蛋白量あたりのｕｎｉｔ数（ｕ／ｍｇ）を求めた。その結果、１mg蛋白あたり3.4Uであった。
【実施例１９】
【０１２４】
＜グルコース脱水素酵素／Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ共発現形質転換体を用いたＬ−ピペコリン酸の合成＞
実施例１８で得られた大腸菌を実施例１８と同様に培養し培養液１００ｍｌを得た。培養後、遠心分離により菌体を集め、0.85％の食塩を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）４0ｍｌで２回洗浄休止菌体を得た。
この休止菌体を一度―８０度に凍結させた。凍結菌体に４ｍｌの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．０）を加え菌体を融解し強く攪拌した。これに最終濃度１ｍＭとなる
ようにＰＭＳＦを加え超音波破砕し遠心分離後蛋白濃度が１５ｇ／Ｌの粗酵素液を得た。
得られた粗酵素液に最終濃度１％のＬ−リジン（キシダ化学社製）、最終濃度0.2 mMのＮＡＤＰ、最終濃度100 ｍＭのグルコース、および最終濃度１mMのＦＡＤ（ナカライテスク社製）、最終濃度1.5 U/mlのL-Lysine oxidase（生化学工業製）、最終濃度14 u/mlの
カタラーゼ（Sigma社製）最終濃度１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）を含む反応液を加え粗酵素の蛋白量を1.5 g/Lとなるようにした。全量で１０ｍｌとした。反応
は３０℃で、１０規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを5.1〜7.6に調整しながら、撹拌しつつ行った。
５時間後  さらに０．５％のＬ−リジン、７u/mlのカタラーゼ、100ｍＭのグルコース
を加えさらに反応を１５時間まで続けた。
反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した。
カラム：CHIRALPAK WE 250 x 4.6mm （Daicel社製）
溶離液：2mM CuSO4
流速：0.75 ml/min 
温度：50度
検出：ＵＶ254nm 
１５時間反応後のＬ−ピペコリン酸の濃度は1４g/Lであった（反応収率９８％）。またＤ−ピペコリン酸のピークは見られなかった。
【実施例２０】
【０１２５】
＜グルコース脱水素酵素／Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ共発現形質転換体を用いたＬ−ヒドロキシプロリンの合成＞
実施例１９と同様に粗酵素液を得た。
得られた粗酵素液に最終濃度10mMのcis-Ｄ−ヒドロキシプロリン（渡辺化学社製）、最終濃度１mMのＮＡＤＰ、最終濃度100ｍＭのグルコース、および最終濃度0.1mMのＦＡＤ（ナカライテスク社製）、最終濃度0.5U/mlのD-amino acid oxidase（Porcine kidney 由来：和光社製）、最終濃度50u/mlのカタラーゼ（Sigma社製）最終濃度１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ ８）を含む反応液を加え粗酵素を1０分の１量加えた。全量で０．２ｍｌとした。反応は３０℃で２４時間反応させた。また同時に粗酵素液を入れないものも反応させた。
【０１２６】
反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した。
カラム：MCI GEL ＣＲＳ１０Ｗ  （4.6x500mm） （三菱化学社製）
溶離液：0.4mM CuSO4 
流速：0.5 ml/min
温度：40度
検出：ＵＶ254nm 
その結果、粗酵素液を添加したものは9.5mMのＬ−ヒドロキシプロリンが生成していた
。粗酵素液を加えないものにはＬ−ヒドロキシプロリンの生成は見られなかった。
【実施例２１】
【０１２７】
＜グルコース脱水素酵素／Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ共発現形質転換体を用いたＬ−ピペコリン酸の合成＞
実施例２０と同様にＤ−リジン（東京化成社製）、ＤＬ−ピペコリン酸（東京化成社製）、Ｄ−オルニチン（東京化成社製）で行った。
Ｄ−リジンからはＬ−ピペコリン酸が5.9mM生成していた。粗酵素を入れない方には生
成は見られなかった。
【０１２８】
ＤＬ−ピペコリン酸からはＬ−ピペコリン酸が10mM生成していた。粗酵素を入れない方には生成は見られなかった。
【実施例２２】
【０１２９】
＜グルコース脱水素酵素／Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ共発現形質転換体を用いたＬ−プロリンの合成＞
Ｄ−オルニチンからはＬ−プロリンが6.8mM生成していた。但し粗酵素を入れない方に
も生成がみられ、Ｌ−プロリンが6.1mM生成していた。これはＤ−アミノ酸オキシダーゼ
で生じたΔ１―ピロリジン２−カルボン酸が自然にラセミ体プロリンとなり、Ｄ−プロリンは再びＤ−アミノ酸オキシダーゼの作用を受けΔ１―ピロリジン２−カルボン酸となり、結果、Ｌ−プロリンが蓄積していると考えられる。
【実施例２３】
【０１３０】
＜ジアミノ酸から、環内に硫黄原子を含む光学活性環状アミノ酸および環内に酸素原子を含む光学活性環状アミノ酸の合成＞
実施例１９と同様に粗酵素液を得た。
最終濃度10mMのＬ−リジン（キシダ化学社製）、アミノエチル−Ｌ−システイン（ＩＣＮ社製）、または（Ｓ）−（＋）−２−アミノー３−（２−アミノエトキシ）プロパン酸一塩酸塩（(S)-(+)-2-Amino-3-(2-amino ethoxy) propanoic acid monohydrochrolide）
（アルドリッチ社製）各々に、最終濃度5.4mMのＮＡＤＰ、最終濃度108ｍＭのグルコース、最終濃度0.1mMのＦＡＤ（ナカライテスク社製）、最終濃度0.8U/mlのL-Lysine oxidase（生化学工業製）、最終濃度54u/mlのカタラーゼ（Sigma社製）、および最終濃度１００
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８.2）を含む反応液に粗酵素を1０分の１量加え、全量で０．２ｍｌとした。反応は３０℃で２４時間反応させた。また同時に粗酵素液を入れないものもコントロールとして反応させた。
【０１３１】
反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した。
カラム：MCI GEL ＣＲＳ１０Ｗ  （4.6x500mm） （三菱化学社製）
溶離液：0.4mM CuSO4 
流速：0.5 ml/min
温度：40度
検出：ＵＶ254nm 
その結果、Ｌ−リジンからはＬ−ピペコリン酸が９．９ｍＭ生成していた。粗酵素を加えないコントロールでは生成は見られなかった。
【０１３２】
アミノエチルシステインに粗酵素液を添加したものはリテンションタイム１２．１分の所にピークが生成していた。粗酵素液を加えないものにはこのピークの生成は見られなかった。
本生成物は以下の反応式により生じたＬ体環状アミノ酸であるＬ−３−チオモルフォリンカルボン酸（Ｒ−３−チオモルフォリンカルボン酸）と考えられる。
【０１３３】
【化１３】
2005095167.tif 000019
【０１３４】
２−アミノ−３−（２−アミノエトキシ）プロパン酸に粗酵素液を添加したものはリテンションタイム７．８分の所にピークが生成していた。粗酵素液を加えないものにはこのピークの生成は見られなかった。
本生成物は以下の反応式により生じたＬ体環状アミノ酸であるＬ−３−モルフォリンカルボン酸と考えられる。
【０１３５】
【化１４】
2005095167.tif 000020
【実施例２４】
【０１３６】
＜ＬＣ−Ｍａｓｓによる生成物の確認＞
実施例２３で生成された３−チオモルフォリンカルボン酸および３−モルフォリンカルボン酸を確認するために、精製およびＬＣ−Ｍａｓｓを用いた分析を行った。
シリカゲルのＴＬＣ（Merck社製  1.05715）にて環状アミノ酸と原料のアミノ酸を分離する条件を検討したところ、展開液にメタノール：水：アセトニトリル＝１：１：４を用いると原料のアミノ酸は原点にとどまり環状のアミノ酸は展開され効率良く分離出来ることがわかった。またニンヒドリンによる発色で環状アミノ酸は特徴的な色となり通常のアミノ酸と区別する事が出来た。例えばこの条件でピペコリン酸はＲｆ＝0.22で紫色の発色、プロリンはＲｆ＝0.20で黄色の発色である。実施例２３のアミノエチルシステインの反応液をこの条件で分析すると、Ｒｆ＝0.32にうすい群青色の発色のスポットが見られた。２−アミノー３−（２−アミノエトキシ）プロパン酸の反応液をこの条件で分析すると、Ｒｆ＝0.23にマゼンダ色の発色のスポットが見られた。
【０１３７】
全ての反応液をＰＬＣプレート（Merck社製  ART13793）にスポットし、十分に乾燥さ
せた後にメタノール：水：アセトニトリル＝１：１：４の組成の展開液で展開した。プレートの一部を切り取りニンヒドリンで発色させ目的物の位置を確認した。該当部分を掻き取り、メタノールにて溶出し、シリカゲルを濾紙で除去し、このメタノール溶出液を濃縮した。濃縮物を少量の水で溶かし塩酸を入れて酸性にした後に、Ｈ型に再生した強酸性のカチオン交換樹脂（三菱化学製  ＳＫ１Ｂ）に吸着させ、樹脂を蒸留水で洗浄し、１Ｎのアンモニア水で溶出した。溶出液を濃縮しメタノール少量で溶かした。ＴＬＣで環状アミノ酸部分が精製されたきたか確認後、以下の条件のＬＣ−Ｍａｓｓで分析した。
【０１３８】
ＬＣ−Ｍａｓｓ装置  ヒューレットパッカード社１１００ＭＳＤ
ＨＰＬＣカラム  Imtakt社製  UK-C18 (250 x 4.6 mm)
溶離液  １０％アセトニトリル
流速   0.5 ml／min
温度  ４０度
圧力  ９１ｂａｒ
ＵＶ２１０ｎｍ
イオン化電圧  ２０Ｖ
イオン化法  ＡＰＩ−ＥＳ法
正イオン測定モード
【０１３９】
アミノエチルシステインの反応液から精製してきたサンプルを分析するとリテンションタイム６．８のピークは分子イオンｍ／ｚ１４８．１を示し、プロトンが１個付加されているので化合物の分子量は１４７．１となり、３−チオモルフォリンカルボン酸の分子量と一致した。
２−アミノ−３−（２−アミノエトキシ）プロパン酸反応液から精製してきたサンプルはリテンションタイム５．７のピークが分子イオンｍ／ｚ１３２．１であり、プロトンが１個付加されているので化合物の分子量は１３１．１となり、３−モルフォリンカルボン酸の分子量と一致していた。
【実施例２５】
【０１４０】
＜アミノプロピルＬシステインから[1,4]チアゼパン−３−カルボン酸（[1,4]thiazepane-3-carboxylic acid）の生成反応＞
L-システインとブロモプロピルアミンより公知の方法（ＤＥ２２１７８９５）を用いてアミノプロピル−Ｌ−システインを合成した。
実施例２３と同様に反応を行った。これを実施例２４と同様にＴＬＣとＬＣ−Ｍａｓｓで分析した。ＴＬＣではＲｆ＝０．３０でマゼンダ色の発色であった。ＬＣ−Ｍａｓｓではｒｔ＝６．９に分子イオンｍ／ｚ１６２．１０のヒ゜ークが確認された。これは、[1,4] チアゼパン−３−カルボン酸の分子量１６１．１０にプロトンが付加したものと一致する。
【化１５】
2005095167.tif 000021
【実施例２６】
【０１４１】
＜[1,4] チアゼパン−３−カルボン酸（[1,4]thiazepane-3-carboxylic acid）の同定＞
実施例１９と同様に粗酵素液を得た。
最終濃度85mMのアミノプロピルＬシステイン、最終濃度0.1mMのＦＡＤ（ナカライテス
ク社製）、最終濃度0.65U/mlのL-Lysine oxidase（生化学工業製）、最終濃度123u/mlの
カタラーゼ（Sigma社製）、および最終濃度１００ｍＭトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ ８.2）
を含む反応液１０ｍｌを室温で５時間攪拌した。そこに粗酵素を１ｍｌ、最終濃度１mMのＮＡＤＰ、最終濃度233ｍＭのグルコースを加えた。２８℃で３日反応させた。
【０１４２】
これにメタノール10ml、アセトニトリル３０ml、活性炭１ｇを加え良く攪拌後遠心分離し、上清を0.20μmのフィルターで濾過後、濃縮した。これを実施例２４と同様にＰＬＣ
とＳＫ１Ｂで精製した。精製サンフ゜ルを少量のメタノールで溶解した所にアセトンを入れ晶析さ
せた。結晶は白色であった。晶析サンフ゜ルを1Ｈ−ＮＭＲおよび13C−ＮＭＲで分析した。
1Ｈ−ＮＭＲ(400MHz, D2O): δ = 4.01 (1H, t, J =6.3Hz), 3.19-3.45(3H, m), 3.10(1H, dd, J =15.9, 6.8 Hz), 2.63-2.82(2H, m), 2.14(2H, dt, J =10.9, 5.1Hz)
13C−ＮＭＲ (100MHz, D2O): δ = 31.9, 34.2, 34.5, 46.3, 64.8, 175.0
このデーターから[1,4] チアゼパン−３−カルボン酸であることが確認された。
またさらに確証を得るために以下のように高分解能の質量分析測定を行った。
【０１４３】
イオン化法；ＤＥＩ（＋）
日本電子  ＪＭＳ−７００  質量分析計
ScanMode EF
校正物質  ＰＦＫ
その結果分子量161.0509 (Err-mmu −0.1)と分子組成 C6 H11 O2 N1 S1 と測定された
。これはＮＭＲ分析より同定した構造を指示する組成式であった。
【実施例２７】
【０１４４】
＜Ｌ-３-モルフォリンカルボン酸の同定＞
実施例１９と同様に粗酵素液を得た。
159mgのＬアミノエチルセリン（和光純薬製）を蒸留水６ｍｌにとかし、1mMのＦＡＤ（ナカライテスク社製）を含んだ１２．５U/mlのL-Lysine oxidase（生化学工業製）を０．５ｍｌ、1175unitsのカタラーゼ（Sigma社製）、および１Ｍトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ ８.2）1ml加え２８度で一日攪拌した。そこに粗酵素を１ｍｌ、５０mMのＮＡＤＰを０．２
ｍｌ、５０％のグルコースを０．８ｍｌ加えた室温で反応した。７時間後L-Lysine oxidase溶液を０．４ml追加し、さらに５日反応させた。
【０１４５】
これにメタノール２0ml、アセトニトリル２０ml、活性炭１ｇを加え良く攪拌後遠心分
離し、上清を0.20μmのフィルターで濾過後、濃縮した。これを実施例２４と同様にＰＬ
ＣとＳＫ１Ｂで精製した。精製サンプルを少量のメタノールで溶解した所にアセトンを入れ晶析させた。結晶は白色であった。晶析サンプルを1Ｈ−ＮＭＲで分析した。
1Ｈ−ＮＭＲ(400MHz, D2O): δ = 4.04 (1H, dd, J =11.6, 3.0Hz), 3.82(1H, dt, J =12.4, 3.6Hz), 3.55-3.67(3H, m), 3.13(1H, dt, J =13.1, 3.0Hz), 2.98(1H, ddd, J =13.4, 10.1, 0.9Hz)
このデーターからＬ-３-モルフォリンカルボン酸であることが確認された。
【実施例２８】
【０１４６】
＜L-ホモリジンからアゼパン−２−カルボン酸（azepane-2-carboxylic acid）の生成反
応＞
L-ホモリジンは公知の方法（特開昭６０−２１８４００）を用いて合成した。
実施例２３と同様に反応を行った。これを実施例２４と同様に精製を行いＴＬＣとＬＣ−Ｍａｓｓで分析した。ＴＬＣではＲｆ＝０．２８で茶色の発色であった。ＬＣ−Ｍａｓｓではｒｔ＝７．１７に分子イオンｍ／ｚ１４５．１０のピークが確認された。これはアゼパンー２−カルボン酸の分子量１４４．１０にプロトンが付加したものと一致する。またＨ−ＮＭＲで測定したところ公知の文献(Liebigs Ann. Chem 1989, pp11215-1232)に記載されている値と一致した。
【化１６】
2005095167.tif 000022
【実施例２９】
【０１４７】
＜５−ヒドロキシ−ＤＬ−リジンから４−ヒドロキシピペコリン酸の生成反応＞
５−ヒドロキシ−ＤＬ−リジンはアルドリッチ社製のものを用いた。
実施例２３と同様に反応を行った。これを実施例２４と同様に精製を行いＴＬＣとＬＣ−Ｍａｓｓで分析した。ＴＬＣではＲｆ＝０．２６でピペコリン酸と同様の紫色の発色であった。ＬＣ−Ｍａｓｓではｒｔ＝５．６４に分子イオンｍ／ｚ１４６．２０のピークが確認された。これは４−ヒドロキシピペコリン酸の分子量１４５．１６にプロトンが付加したものと一致する。またＨ−ＮＭＲで測定したところ公知の文献(Bull. Soc. Chim. Belg. (1982) vol.91,  pp.713-723)に記載されているデーターと一致した。
本生成物は、以下の反応式により生じたＬ体環状アミノ酸であるＬ−４−ヒドロキシピペコリン酸と考えられる。
【化１７】
2005095167.tif 000023
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本願発明によれば、工業的に安価なジアミノ酸やラセミ体の環状アミノ酸から、中間体として１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を得て、これをＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを用いて還元することにより工業的に安価で、高純度な各種光学活性環状アミノ酸の製造方法を提供することができる。
光学活性環状アミノ酸は下記の化学式に示すとおりＬ−プロリン(L-Proline)、Ｌ−ヒ
ドロキシプロリン(L-hydroxyproline)などの５員環アミノ酸、Ｌ−ピペコリン酸(L-Pipecolic acid)などの６員環アミノ酸、アゼチジン−２−カルボン酸(Azetidine-2-carboxylic acid)などの４員環アミノ酸と言ったアミノ酸などがよく知られ、医薬あるいは農薬の
中間原料として注目されている有用な物質である。
【０１４９】
【化１８】
2005095167.tif 000024
【０１５０】
また複素環であるＬ−チオプロリン(L-Thioproline)やＬ−モルフォリンカルボン酸(L-3-Morpholine carboxylic acid)、および Ｌ−チオモルフォリンカルボン酸(L-3-Thiomor
pholine carboxylic acid)等も医薬あるいは農薬の中間原料として有用な物質として挙げられる。
【０１５１】
【化１９】
2005095167.tif 000025
例えば、６員環であるピペコリン酸の誘導体関連の医薬品としては、下記化学式に示すパリナビル（Palinavir）、
【０１５２】
【化２０】
2005095167.tif 000026
【０１５３】
下記化学式に示すセルフォテル（Selfotel）、
【０１５４】
【化２１】
2005095167.tif 000027
【０１５５】
下記化学式に示すアルガトロバン（Argatroban）、
【０１５６】
【化２２】
2005095167.tif 000028
【０１５７】
などが知られている（Terence P Keenan et al, Tetrahedron asymmetry vol.10 (1999) p4331-4341）。
またＴＮＦ−α変換酵素阻害剤としても、ピペコリン酸の誘導体が利用されている(Michael A Latavic et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2002) vol.12, pp1387-1390)。
【０１５８】
またプロリン誘導体関連では、下記化学式に示すゼフェノプリル（Zefenopril）、
【０１５９】
【化２３】
2005095167.tif 000029
【０１６０】
などがある(J Med Chem (1988) vol.31 p1148)。
アゼチジンカルボン酸誘導体では、ゲラチナーゼ阻害剤（gelatinase inhibitor）としての下記化学式に示すニコチアナミン（nicotianamine）、
【０１６１】
【化２４】
2005095167.tif 000030
【０１６２】
(Suzuki K et al, J antibiot (1996) vol.49 p1284-)や、喘息薬である下記化学式に
示すBMS-262084
【０１６３】
【化２５】
2005095167.tif 000031
【０１６４】
があげられる(Sutton JC et al, Bioorg Med Chem Lett. 2002 12(21) p3229-33)。
複素環では抗炎症剤Ｚ−４００３（EP0254354）
【０１６５】
【化２６】
2005095167.tif 000032
【０１６６】
にチオプロリンが用いられている。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図１は、本明細書の実施例で使用したＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの至適pHを示すグラフである。
【図２】図２は、本明細書の実施例で使用したＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの至適温度を示すグラフである。
【図３】図３は、本明細書の実施例で使用したＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼのpH安定性を示すグラフである。
【図４】図４は、本明細書の実施例で使用したＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を示すグラフである。
【図５】図５は、本明細書の実施例で使用したＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼに対するpHの影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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