(57)【要約】【課題】α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ活性を有する融合タンパク質を可溶性タンパク質として容易に効率よく大量に生産することを可能のとし、また融合タンパク質からα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩそのものも容易に得ることを可能とする。【解決手段】糖結合性タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩとの組換え融合タンパク質、及び、以下の工程（１）〜（３）を含む組換え融合タンパク質の製造方法。（１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性タンパク質をコードするＤＮＡとα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、（２）得られた形質転換体を培養して、糖結合性タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩとの融合タンパク質を生成させ、（３）得られた培養物から、該融合タンパク質を分離する【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖結合性タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩとの組換え融合タンパク質。
【請求項２】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩがヒト由来である請求項１〜４のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩが、（ａ）または（ｂ）に記載されるタンパク質である請求項１又は２に記載の組換え融合タンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ活性を有するタンパク質
【請求項４】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号４１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩが、該タンパク質の膜貫通領域の全部又は一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列を含む請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
糖結合性タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩとの間にプロテアーゼ認識配列を含む請求項１〜５のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
糖結合性タンパク質がマルトース結合性タンパク質である請求項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである請求項６記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質の製造方法。
（１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性タンパク質をコードするＤＮＡとα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（２）得られた形質転換体を培養して、糖結合性タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩとの融合タンパク質を生成させ、
（３）得られた培養物から、該融合タンパク質を分離する
【請求項１３】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩがヒト由来である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号４１〜３５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
マルトース結合性タンパク質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ  ｐ２、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ、ｐＭＡＬ  ｃ２、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｇからなる群から選択されるベクターにに由来する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法により得られる融合タンパク質から、糖結合タンパク質部分を除去してα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩを採取する工程を含む、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩの製造方法。
【請求項２０】
糖結合タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のＣ末端側にプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテアーゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去する事を特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖タンパク質プロセッシング酵素の一種である、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩを、安価に効率よく生産する方法に関する。詳細には、マルトース結合タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩタンパク質との融合タンパク質及び該タンパク質を大腸菌体内で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、細胞において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖タンパク質などとして存在している。これら糖鎖の構造は生物種や組織特異的に異なっているが、同一生物種や同一組織内でも発生時期や疾病等によっても異なることから、従来考えられていたタンパク質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等のタンパク質に対する物理的性質の付与といった機能の他に、発生・分化、神経系、免疫系、癌の転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用という点から近年非常に注目されるようになった。
【０００３】
これら糖鎖は、生体内においては糖転移酵素によって合成されている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であり、また、その糖受容体の糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、通用、１つのグリコシド結合は１つの糖転移酵素によって形成されるといわれている。これら糖転移酵素は糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な酵素である。しかしながら、天然に存在する糖転移酵素の量は、極僅かであり大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【０００４】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼは糖蛋白質或いは糖脂質の糖鎖の形成に関与する重要な酵素であり、ＧＤＰ−Ｆｕｃを糖供与体として、糖受容体である糖蛋白質或いは糖脂質のＲ１−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２構造の糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンにα１−３結合でフコースを転移し、Ｒ１−Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２構造の糖鎖を生じる活性（以下、α１−３ＦｕｃＴ活性と省略する場合もある）を有する酵素である（但し、Ｒ１はＯＨ又はシアル酸又はフコース、Ｒ２は種々の糖鎖を示す）。α１，３−フコシルトランスフェラーゼはその基質特異性により、現在、６種類（α１，３−フコシルトランスフェラーゼＩＩＩ〜ＶＩＩ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＩＸ）に分類される（例えば、非特許文献１或いは表−１参照）。
【０００５】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＩＩＩ（以下、ＦＵＴ３と省略する場合もある）はルイス酵素とよばれる酵素であり、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、ＩＩ型糖鎖と省略する場合もある）又はα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、シアリルＩＩ型糖鎖と省略する場合もある）又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、ＨＩＩ型糖鎖と省略する場合もある）を基質とし、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、ＬｅＸと省略する場合もある）又はα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、ｓＬｅＸと省略する場合もある）又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、ＬｅＹと省略する場合もある）を合成することができる。さらに、ＦＵＴ３はＧＤＰ−Ｆｕｃを糖供与体としてＲ１−Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２構造の糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンにα１−４結合でフコースを転移しＲ１−Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２構造の糖鎖を生じる活性（以下、α１−４ＦＵｃＴ活性と省略する場合もある）も有する。この、明確なα１−４ＦｕｃＴ活性を有するのは、６種類の内ＦＵＴ３のみであり、本活性によりＧａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、Ｌｅａと省略する場合もある）又はα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、ｓＬｅａと省略する場合もある）又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２（以下、Ｌｅｂと省略する場合もある）を合成することができる（例えば、非特許文献１或いは表−１参照）。
【０００６】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＩＶ（以下、ＦＵＴ４と省略する場合もある）はミエロイド型α１−３ＦｕｃＴとよばれる酵素であり、ＩＩ型糖鎖又はシアリルＩＩ型糖鎖又はＨＩＩ型糖鎖を基質とし、ＬｅＸ又ｓＬｅＸ又はＬｅＹを合成することができる。しかしながら、ｓＬｅＸ合成活性は非常に弱い（例えば、非特許文献１〜２或いは表−１参照）。
【０００７】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶ（以下、ＦＵＴ５と省略する場合もある）はＩＩ型糖鎖又はシアリルＩＩ型糖鎖又はＨＩＩ型糖鎖を基質とし、ＬｅＸ又ｓＬｅＸ又はＬｅＹを合成することができる。また、非常に弱いながらもα１−４ＦｕｃＴ活性を示し、Ｌｅａ又はｓＬｅａ又はＬｅｂを合成することができる（例えば、非特許文献１或いは３或いは表−１参照）。
【０００８】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（以下、ＦＵＴ６と省略する場合もある）は本発明における酵素であり、プラズマ型α１−３ＦＵｃＴとも呼ばれる。ＦＵＴ６はＩＩ型糖鎖又はシアリルＩＩ型糖鎖又はＨＩＩ型糖鎖を基質とし、ＬｅＸ又はｓＬｅＸ又はＬｅＹを合成することができ、その比活性は最も強い（例えば、非特許文献１〜２或いは表−１参照）。また、短いオリゴ糖を基質にしても強い転移活性を発揮できる（非特許文献１〜２参照）。
【０００９】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（以下、ＦＵＴ７と省略する場合もある）は最も基質特異性が厳密で、シアリルＩＩ型糖鎖ｓＬｅＸを合成する反応のみを触媒する。ＦＵＴ７は白血球やリンパ球細胞上のｓＬｅＸ糖鎖の合成に関与していると考えられている（例えば、非特許文献１〜２或いは非特許文献４〜６或いは表−１参照）。
【００１０】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼＩＸ（以下、ＦＵＴ９と省略する場合もある）はＩＩ型糖鎖又はＨＩＩ型糖鎖を基質とし、ＬｅＸ又はＬｅＹを合成することができるが、ｓＬｅＸ合成活性はない。ＦＵＴ９は非還元末端のラクトサミン単位のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを転移する活性が極めて強く、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６は逆に内部のラクトサミン単位のＮ−アセチルグルコサミンに転移する活性が強い（非特許文献１或いは７参照）。
【００１１】
このように、α１，３−フコシルトランスフェラーゼは癌の転移等に深く関わっていると考えられているルイス構造糖鎖の合成に深く関与しており、特に、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、ＬｅＹに対する高い合成能を有するという点で、糖鎖の合成用途としては、ＦＵＴ６が重要であった。
【００１２】
上記の理由から、ＦＵＴ６の安定した供給が望まれていた。
【００１３】
この、ＦＵＴ６は、各種動物の臓器に存在することが知られているが、大量且つ安定した臓器の入手は困難であり、かつ、単一のタンパク質にまで精製しようとすると非常に手間のかかることから、遺伝子組換えによる生産が期待されている。
【００１４】
該酵素をコードするｃＤＮＡは、ヒト由来（例えば、非特許文献８或いは９参照）、チンパンジー由来（例えば、非特許文献１０参照）、及びウシ由来（例えば、非特許文献１１参照）のものが既に単離されている。
【００１５】
組換えタンパク質の大量生産には、コスト的な点を考慮すれば、細菌や酵母などの微生物で該タンパク質を発現させる方法が有利である。しかしながら、微生物の発現系では、発現したタンパク質の多くが不溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）として存在することがあり、精製に先立って可溶化・再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）の工程を必要とするので、効率的とは言えなかった。さらに、一部可溶性タンパク質として発現した酵素についても、それを高純度で得るためには、各種クロマトグラフィー処理を含む多くの精製工程が必要であり、多大な時間及びコストがかかるため、商業生産用の発現としては十分ではなかった。
【００１６】
一方、目的とする遺伝子を大量に発現させ、かつ、発現産物の精製を容易にする方法として、目的タンパク質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やプロテインＡなどとの融合タンパク質として発現させる方法がある。該方法では、ＧＳＴとの融合タンパク質は。グルタチオンをリガンドとするアフィニティカラムムロマトグラフィーにより、また、プロテインＡとの融合タンパク質はＩｇＧをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィーにより、それぞれ容易に精製することができる。しかしながら、この方法を用いた場合、前期と同様に封入体を生成する可能性が高い。このような理由から、ＦＵＴ６を大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【００１７】
【非特許文献１】
「蛋白質  核酸  酵素  １９９８年１２月号増刊  糖鎖生物学  糖鎖情報発信から受信のメカニズムまで」，共立出版株式会社，ｐ７７，１９９８年
【００１８】
【非特許文献２】
「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，２７３巻，ｐ１３１，１９９７年
【００１９】
【非特許文献３】
「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２７２巻，ｐ８７６４，１９９７年
【００２０】
【非特許文献４】
「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２６９巻，ｐ１４７３０，１９９４年
【００２１】
【非特許文献５】
「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２６９巻，ｐ１６７８９，１９９４年
【００２２】
【非特許文献６】
「セル（Ｃｅｌｌ）」，８６巻，ｐ６４３，１９９６年
【００２３】
【非特許文献７】
「フェブス  レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ）」，４６２巻，ｐ２８９，１９９９年
【００２４】
【非特許文献８】
「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，１８７巻，ｐ１５２，１９９２年
【００２５】
【非特許文献９】
「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２６７巻，ｐ２４５７５，１９９２年
【００２６】
【非特許文献１０】
「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２７２巻，ｐ２９７２１，１９９７年
【００２７】
【非特許文献１１】
「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２７２巻，ｐ８７６４，１９９７年
【００２８】
【非特許文献１２】
「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２５９巻，ｐ１０６０６，１９８４年
【００２９】
【非特許文献１３】
「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブザ  ユナイティッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，６９巻，ｐ２１１０，１９７２年
【００３０】
【非特許文献１４】
「モレキュラー  ジェネティクス  アンド  ゲノミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」，１６８巻，ｐ１１１，１９７９年
【００３１】
【非特許文献１５】
「ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，５６巻，ｐ２０９，１９７１年
【００３２】
【非特許文献１６】
「細胞工学別冊  実験プロトコールシリーズ  グライコバイオロジー実験プロトコール  糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン」，秀潤社，１９９６年
【００３３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、遺伝子操作によりＦＵＴ６を、マルトース結合タンパク質（以下、ＭＢＰと省略する場合もある）等の糖結合性タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させると、ＦＵＴ６を可溶性タンパク質として得ることができ、また、該タンパク質は糖結合性タンパク質の特異的親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィーによって容易に精製でき、得られた融合タンパク質がＦＵＴ６活性を有する事を見いだした。
【００３４】
さらに、本発明者らは、糖結合タンパク質とＦＵＴ６との融合部位の配列を特異的に切断するプロテアーゼにより、該融合タンパク質からＦＵＴ６も取得できることを見いだした。
【００３５】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００３６】
項１．糖結合性タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩとの組換え融合タンパク質。
項２．α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩがヒト由来である項１に記載の組換え融合タンパク質。
項３．α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩが、（ａ）または（ｂ）に記載されるタンパク質である請求項１又は２に記載の組換え融合タンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ活性を有するタンパク質
項４．α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号４１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含む、項３に記載のタンパク質。
項５．α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩが、該タンパク質の膜貫通領域の全部又は一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列を含む項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
項６．糖結合性タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩとの間にプロテアーゼ認識配列を含む項１〜５のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
項７．糖結合性タンパク質がマルトース結合性タンパク質である項１〜５のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
項８．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである請求項６記載の組換え融合タンパク質。
項９．項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
項１０．項９記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
項１１．項１０記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
項１２．以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質の製造方法。
（１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性タンパク質をコードするＤＮＡとα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（２）得られた形質転換体を培養して、糖結合性タンパク質とα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩとの融合タンパク質を生成させ、
（３）得られた培養物から、該融合タンパク質を分離する
項１３．α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩがヒト由来である項１２記載の方法。
項１４．α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号４１〜３５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項１３記載の方法。
項１５．α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
項１６．α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
項１７．糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
項１８．マルトース結合性タンパク質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ  ｐ２、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ、ｐＭＡＬ  ｃ２、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ、ｐＭＡＬ  ｃ２Ｇからなる群から選択されるベクターにに由来する項１７に記載の方法。
項１９．項１２〜１８のいずれかに記載の方法により得られる融合タンパク質から、糖結合タンパク質部分を除去してα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩを採取する工程を含む、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩの製造方法。
項２０．糖結合タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のＣ末端側にプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテアーゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去する事を特徴とする請求項１９記載の方法。
項２１．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである請求項２０記載の方法。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＦＵＴ６活性を有するタンパク質を、ＦＵＴ６と糖結合タンパク質との融合タンパク質としたこと、該融合タンパク質は可溶性タンパク質であることを特徴とするものである。
【００３８】
さらに、本発明は、ＦＵＴ６を糖結合タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させることにより、ＦＵＴ６を可溶性融合タンパク質として生成させるのを可能にしたこと、並びに糖結合タンパク質の有する特異的親和性を利用して融合タンパク質及びＦＵＴ６を容易且つ大量に精製するのを可能にしたことを特徴とする。
【００３９】
本発明の融合タンパク質
本発明において、ＭＢＰなどの糖結合タンパク質とＦＵＴ６との融合タンパク質（以下、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質の場合には、「ＭＢＰ−ＦＵＴ６」と省略する場合もある）は、糖結合タンパク質の有する特異的親和性、すなわちＭＢＰの場合にはマルトース並びにマルトース残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持し、且つＦＵＴ６が有する酵素活性を保持する限り、いかなる形態のものであってもよい。さらに、図１に示すごとく、少なくとも糖結合タンパク質部分を除去した後に得られるＦＵＴ６が本来の酵素活性を保持するものがよい。
【００４０】
好ましくは、該融合タンパク質は、糖結合タンパク質のＣ末端側にＦＵＴ６が連結されたものであり、特に好ましくは糖結合タンパク質とＦＵＴ６が融合部位において、酵素学的または化学的手段により容易に切断され得る構造を有するものである。
【００４１】
糖結合タンパク質とは、糖並びに糖残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持するタンパク質であって、例えば、各種レクチン、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質などが例示できる。好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質などであり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質（以下、ＭＢＰと省略することがある。）である。
【００４２】
糖結合タンパク質は、いかなる生物種由来のものであっても良いが、このましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
【００４３】
また、該ＭＢＰは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する限り、必ずしも全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであっても良い。公知のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有するタンパク質が例示できる。
【００４４】
本発明においては、ＭＢＰをコードする遺伝子としてｐＭＡＬ  ｐ２或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ或いはｐＭＡＬ  ｃ２或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｇ（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に由来するものを使用することができる。
【００４５】
本発明の糖結合タンパク質は、該タンパク質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩ、トロンビン、レニンなどが挙げられるが、好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）又はＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）、エンテロキナーゼ認識配列、すなわち、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号５）、ゲネナーゼＩ認識配列、すなわち、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号６）又はＴｙｒ−Ｈｉｓ（配列番号７）であり、より好ましくは第Ｘａ因子認識配列又はエンテロキナーゼ認識配列である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ−ＦＵＴ６の精製後に該プロテアーゼを作用させて、ＭＢＰ部分を容易に除去することができる。
【００４６】
また、より好ましい態様においては、糖結合タンパク質は、糖結合タンパク質部位とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合タンパク質はＦＵＴ６から遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩ融合タンパク質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。本発明の場合には、配列番号９（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ−  Ａｓｎ）のスペーサー配列を含むｐＭＡＬ  ｐ２或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ或いはｐＭＡＬ  ｃ２或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｇ（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用することができる。
【００４７】
ＦＵＴ６も、いかなる生物種由来のものであってよいが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。さらに、本発明において、ＦＵＴ６は、ＦＵＴ６活性を保持する限りＦＵＴ６全長配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであっても良い。例えば、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質や（ｂ）上記（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ活性を有するタンパク質であってよい。
【００４８】
特に、ＦＵＴ６はゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、ＭＢＰ−ＦＵＴ６を可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメイン領域の全部又は一部を除いたＦＵＴ６の一部を使用することも、本発明の好ましい実施態様の１つである。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも４１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。
【００４９】
また、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも４１〜３５９で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、ＦＵＴ６活性を有するタンパク質であってもよい。
【００５０】
本発明の融合タンパク質の製造方法
本発明において、糖結合タンパク質―ＦＵＴ６は、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡとＦＵＴ６をコードするＤＮＡを、結果的に上記性質を有する融合タンパク質として転写・翻訳されるように−すなわちインフレームに（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）−連結したキメラＤＮＡを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより取得される。
【００５１】
本発明において、ＦＵＴ６をコードするＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであっても良いが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。さらに、本発明において、ＦＵＴ６をコードするＤＮＡは、その転写翻訳産物がＦＵＴ６活性を保持する限りＦＵＴ６遺伝子の全コード量ＩＩを含む必要はなく、該コード領域に一部を含むものであっても良い。特に、ＦＵＴ６はゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、糖結合タンパク質―ＦＵＴ６を可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメインをコードする領域を除いたＦＵＴ６コード配列を使用することも、本発明の好ましい実施態様の１つである。
【００５２】
ＦＵＴ６をコードするＤＮＡは、公知のＦＵＴ６遺伝子配列（例えば、非特許文献８〜１１参照）の配列等に基づいて、自体公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のＦＵＴ６遺伝子配列を基に、ＦＵＴ６のコード領域の全部または一部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、ＦＵＴ６を発現する細胞又は組織から抽出した全ＲＮＡもしくはポリＡ（＋）ＲＮＡ或いは染色体ＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行うことによりクローニングすることができる。このとき、その後ろのベクターへのクローニングを容易にするために、用いるオリゴプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加することもできる。
【００５３】
あるいは、公知のＦＵＴ６遺伝子配列を基に適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてＦＵＴ６を発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーをプラーク（またはコローニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００５４】
さらに、ＦＵＴ６をコードするＤＮＡは、部分または完全精製されたＦＵＴ６の全部又は一部を抗原として常法により抗体を作成し、これを用いてＦＵＴ６を発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００５５】
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のＦＵＴ６遺伝子配列を基にＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲ法によってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
【００５６】
本発明の好ましい態様においては、ヒト由来α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（以下、ｈＦＵＴ６と省略する場合もある）をコードするＤＮＡの全部または一部を含むものである。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号４１〜３５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは配列番号１に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号１２１〜１０７７で示される塩基配列を含むＤＮＡである。或いは、ｈＦＵＴ６をコードするＤＮＡは、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含むＤＮＡである。ｈＦＵＴ６の膜貫通ドメインは、疎水性プロット分析の結果から、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号１５〜３４で示される部分であると推定されている。したがって、該ドメインをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号１に示される塩基配列中、塩基番号４３〜１０２で示される塩基配列である。
【００５７】
もちろん、ｈＦＵＴ６をコードするＤＮＡは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全部をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、好ましくは配列番号１に示される塩基配列の全部を含むＤＮＡであってもよい。
【００５８】
本発明において、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡは、上述の各種タンパク質をコードするＤＮＡが例示され、好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロール結合タンパク質またはキチン結合タンパク質をコードするＤＮＡであり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００５９】
また、該ＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
【００６０】
また、該ＭＢＰをコードするＤＮＡは、マルトースマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。
【００６１】
大腸菌由来のＭＢＰは、ペリプラズムに存在する分泌タンパク質であり、初期翻訳産物はそのＮ末端にシグナルペプチドを含む。本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、宿主大腸菌で機能し得るシグナルペプチドをコードする塩基配列（シグナル配列）を含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有するグラム陰性菌であるから、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナル配列を含む場合であっても、発現したＭＢＰ−ＦＵＴ６が培地中にまで分泌される可能性は低い。しかしながら、ＭＢＰ−ＦＵＴ６がペリプラズム空間に蓄積すれば、菌体を完全に破砕せずにスフェロプラスト化することにより該融合タンパク質を回収することができるので、その後の精製をより容易に行うことができる。但し、この場合には、特にＦＵＴ６の膜貫通ドメインを削除しておくことが好ましい。該ドメインが存在すると、ＭＢＰ−ＦＵＴ６はペリプラズム空間に到達せずに内膜にとどまる可能性があり、該融合タンパク質の回収が煩雑になるからである。
【００６２】
本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、該タンパク質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩ、トロンビン、レニンなどが挙げられるが、好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）又はＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）、エンテロキナーゼ認識配列、すなわち、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号５）、ゲネナーゼＩ認識配列、すなわち、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号６）又はＴｙｒ−Ｈｉｓ（配列番号７）であり、より好ましくは第Ｘａ因子認識配列又はエンテロキナーゼ認識配列である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ−ＦＵＴ６の精製後に該プロテアーゼを作用させて、ＭＢＰ部分を容易に除去することができる。
【００６３】
より好ましい態様においては、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡは、糖結合タンパク質コード領域とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合タンパク質はＦＵＴ６から遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩ融合タンパク質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。
【００６４】
ＭＢＰをコードするＤＮＡは、公知のＭＢＰ遺伝子配列［例えば、大腸菌由来ＭＢＰ（非特許文献１２）を基に、ＦＵＴ６をコードするＤＮＡについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることができ、また、常法によりＭＢＰのＣ末端側に上記のプロテアーゼ認識配列およびスペーサー配列を導入することができる。本発明の場合には、配列番号８のスペーサー配列を含む。
【００６５】
また、大腸菌由来ＭＢＰをコードするＤＮＡは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製のｐＭＡＬ  ｐ２（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｅ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬ  ｐ２Ｇ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬ  ｃ２（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｅ（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｇ（シグナル配列を欠失する）のような市販のベクターから得ることができる。
【００６６】
糖結合タンパク質−ＦＵＴ６融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。ＦＵＴ６をコードするＤＮＡをベクター中にクローニングする際に、ＦＵＴ６のＮ末端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡにも同じ制限酵素認識部位（もしくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。
【００６７】
本発明の発現ベクターは、上記の糖結合タンパク質−ＦＵＴ６をコードするキメラＤＮＡが、大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモータ領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域および−１０領域が含まれる。所望の組換えタンパク質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより望ましい。このようなプロモーター領域としてｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサータンパク質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサータンパク質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、糖結合タンパク質−ＦＵＴ６をコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネーターを用いることができる。本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自立複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、Ｍ１３  ｏｒｉなどが挙げられる。
【００６８】
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００６９】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより調製することができる。宿主の菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
【００７０】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）（非特許文献１３参照）、プロトプラスト法（非特許文献１４参照）、コンピテント法（非特許文献１５参照）、エレクトロポレーション法等が挙げ有られる。
【００７１】
糖結合タンパク質−ＦＵＴ６は、上記の糖結合タンパク質−ＦＵＴ６をコードするキメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物から糖結合タンパク質−ＦＵＴ６を回収することにより得ることができる。
【００７２】
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、多の栄養源［例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など］を培地中に添加しても良い。
【００７３】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
【００７４】
培養を大型タンク内で行う場合は、目的タンパク質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた種培養液を大型タンク中に接種するのが好ましい。
【００７５】
糖結合タンパク質−ＦＵＴ６の発現が、誘導タンパク質遺伝子のプロモーター系によって制御される場合、誘導物質は誘導開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．６になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧと省略する場合もある）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加速度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類によって適宜変更することができる。
【００７６】
本発明の方法では、糖結合タンパク質−ＦＵＴ６の精製は、該融合タンパク質の存在する画分を、その糖結合タンパク質と特異的に結合する各種糖残基を含むリガンドを結合した不溶性担体をを用いたアフィニティクロマトグラフィーに付することにより、一段階で達成することができる。
【００７７】
例えば、糖結合タンパク質がＭＢＰの場合、ＭＢＰをコードするＤＮＡが、シグナル配列を欠失している場合、ＭＢＰ−ＦＵＴ６は菌体の可溶性画分に局在するので、その場合、培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理および界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をアフィニティクロマトグラフィーに用いる。
【００７８】
一方、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナル配列を有する場合、発現したＭＢＰ−ＦＵＴ６は分泌されたペリプラズム空間に蓄積している可能性が高い。したがって、その場合、リゾチーム処理等によって菌体をスフェロプラスト化してＭＢＰ−ＦＵＴ６を溶液中に遊離させ、濾過もしくは遠心分離して菌体を除去した後、得られる上清をアフィニティクロマトグラフィーに用いる。
【００７９】
アフィニティクロマトグラフィーの吸着体としては、例えば、ＭＢＰの場合には、アミロースをアガロースビーズに固定化したアミロース樹脂（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製のＡｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ等）を使用することができるが、他のＭＢＰに対するリガンド及び他の不溶性マトリックス基（例えばセルロース、デキストラン、合成ポリーマー等）を使用してもよい。
【００８０】
糖結合タンパク質−ＦＵＴ６は、上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間撹拌した後濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度の糖結合タンパク質と吸着体の結合を阻害する糖（例えば、ＭＢＰの場合にはマルトース）を含む溶離液を加えて適当な時間撹拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填して糖結合タンパク質−ＦＵＴ６含有画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度の上記溶離液をアプライしてカラムに吸着した糖結合タンパク質−ＦＵＴ６を溶出することによって得ることもできる。
【００８１】
このようにして得られた本発明のＭＢＰ−ＦＵＴ６は、ＦＵＴ６活性を有するので、このまま、酵素として使用することができる。
【００８２】
ＦＵＴ６の調製
上述のように、本発明の好ましい態様においては、糖結合タンパク質―ＦＵＴ６はその融合部位に配列特異的なプロテアーゼによって認識切断されるアミノ酸配列を含むので、上記のようにして精製された糖結合タンパク質−ＦＵＴ６に該プロテアーゼを作用させることにより糖結合タンパク質部分が除去されて、所望のＦＵＴ６が生成する。好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子である。本発明においては配列番号３の第Ｘａ因子認識配列を含むｐＭＡＬ  ｐ２、ｐＭＡＬ  ｐ２Ｘ、ｐＭＡＬ  ｃ２、或いはｐＭＡＬ  ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用することができる。糖結合タンパク質―ＦＵＴ６にプロテアーゼを作用させる際の反応温度、溶液のｐＨ、反応時間等は、使用するプロテアーゼの種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、第Ｘａ因子の場合、中性緩衝液中、４〜４０℃で１〜２５時間反応させることにより、糖結合タンパク質とＦＵＴ６とを開裂させることができる。反応終了後、反応液に上記の吸着体を加えて適当な時間撹拌することにより、遊離した糖結合タンパク質のみが吸着体に吸着するので、該吸着体を濾過することによりＦＵＴ６のみを精製することができる。あるいは、該吸着体を充填したカラムに反応液をアプライして素通り画分を回収することによってもＦＵＴ６を精製することができる。
【００８３】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
【００８４】
実施例１  ＰＣＲによるｈＦＵＴ６  ｃＤＮＡ断片の取得及び発現ベクターの構築
（１）ＰＣＲプライマーの設計
配列番号１記載のヒトα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＵＴ６）ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号１０及び１１に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１２１〜１３４で示される塩基配列であり、後者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１０６５〜１０８０で示される塩基配列である。
【００８５】
（２）ヒト扁平上皮細胞Ａ４３１株由来ＲＮＡからの逆転写反応
ヒト扁平上皮細胞Ａ４３１株からＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ：ＱＩＡＧＥＮ社製品）により抽出した５μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーを用いたＲＴ  ＰＣＲ  ｈｉｇｈ（ＲＴ  ＰＣＲ  ｈｉｇｈ：東洋紡社製）による逆転写反応を行った。得られた反応液をＡ４３１  １ｓｓｃＤＮＡ溶液とした。
【００８６】
（３）ＰＣＲ反応
上記マＡ４３１  １ｓｓｃＤＮＡ及び上記合成オリゴヌクレオチドを用いて、以下の条件によりＰＣＲ反応を行った。
［Ａ４３１  １ｓｓｃＤＮＡ  ２．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡社製）２．５μｌ、Ｘ１０ＫＯＤ  Ｂｕｆｆｅｒ    Ｎｏ．１（東洋紡社製）２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（東洋紡社製）１．０μｌ、１０ｐｍｏｌｅ／μｌの配列番号１０に記載のオリゴヌクレオチド１．０μｌ、１０ｐｍｏｌｅ／μｌの配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチド１．０μｌ、０．３Ｕ／μｌ  ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）０．５μｌ、反応液容量２５μｌ、９８℃（３０秒間）−５６℃（３０秒間）−７４℃（３０秒間）を４サイクル後、  ９８℃（３０秒間）−６２℃（３０秒間）−７４℃（３０秒間）を３１サイクル］。
ＰＣＲ反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片の確認を行った。
【００８７】
（４）塩基配列の確認及び発現ベクターの構築
該ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて切断した後、予め同制限酵素にて切断しておいたｐＭＡＬ  ｃ２或いはｐＭＡＬ  ｐ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート培地で選抜した。
大腸菌より該ＤＮＡ断片を保持するプラスミドを調製、該ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法に従って決定した結果、配列番号１に記載の塩基配列中塩基番号１２１〜１０８０で示される塩基配列と一致することが分かり、所望のｈＦＵＴ６のｃＤＮＡ断片が得られたことが確認された。また、ｐＭＡＬ  ｃ２にＰＣＲ断片を連結して構築されたベクターをｐＭＦ６−Ｃ１０１、ｐＭＡＬ  ｐ２にＰＣＲ断片を連結して構築されたベクターをｐＭＦ６−Ｐ１０１と命名し、発現ベクターの構築も同時に完了した。
【００８８】
実施例２  ＦＵＴ６の発現確認
（１）組換え大腸菌を用いたＭＢＰ−ｈＦＵＴ６融合タンパク質の調製
実施例１で得られた発現ベクターｐＭＦ６−Ｃ１０１或いはｐＭＦ６−Ｐ１０１で形質転換された大腸菌  ＪＭ１０９株を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン、及び０．２％グルコースを含むＬＢ培地５ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３７℃にて一晩振とう培養を行った。得られた培養液５００μｌを、同培地５０ｍｌの入った５００ｍｌ培養フラスコに植菌した。３７℃にて振とう培養を行った後、ＯＤ６６０＝３．０〜４．０に達した時点で、培養温度を２５℃に低下させ、そのまま２５℃にて３０分間培養を行った後、最終濃度０．３ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに２５℃にて培養を１６時間続けた。培養後、菌体を遠心分離により集め、緩衝液１（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５    ０．２Ｍ  ＮａＣｌ    １ｍＭ  ＥＤＴＡ    １ｍＭ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ  １０ｍＭ  ２メルカプトエタノール）２０ｍｌに懸濁、超音波破砕装置にて菌体を破砕した後、遠心分離により得られた上清を粗酵素液とした。予め緩衝液１で平衡化しておいたアミロースレジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）カラム（５ｍｌ）に、該粗酵素液を通過することにより、ＭＢＰ−ｈＦＵＴ６融合タンパク質を吸着させた。緩衝液１でカラムを洗浄した後、１０ｍＭマルトースを含む緩衝液１で吸着したＭＢＰ−ｈＦＵＴ６融合タンパク質を溶出させた。溶出画分を集め、脱塩カラムＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にてマルトースを除去したものをＭＢＰ−ｈＦＵＴ６融合タンパク質溶液とした。
【００８９】
（２）ＦＵＴ６基質の調製
ＬＮｎＴ糖鎖（Ｇｌｙｋｏ社製：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＯＨ）２．０ｍｇを常法に従い（非特許文献１６参照）、２アミノピリジンにより蛍光標識・ゲル濾過精製し、ＬＮｎＴ−ＰＡ（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ）を６１６ｎｍｏｌｅを得た。
【００９０】
（３）ＦＵＴ６活性測定
０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ８．０を４μｌ、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を１μｌ、１ｍＭ  ＬＮｎＴ−ＰＡ（上記（２）で得られたもの）を１μｌ、５ｍＭ  ＧＤＰ−Ｆｕｃ（和光純薬社製）を１μｌ、上記（１）で得られたＭＢＰ−ｈＦＵＴ６融合タンパク質溶液を５μｌからなる反応液２０μｌを３７℃にて１５分間反応後、１分間の煮沸により反応を停止した。該反応液にＭｉｌｌｉＱ水８０μｌを添加、混合後、遠心分離よって得られ上清２０μｌをＨＰＬＣにより分析し、反応産物のＧＭ１ａ−ＰＡの量を測定した。その結果、ｐＭＦ６−Ｃ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９が高いＦＵＴ６活性を示した（図２）。また、ｐＭＦ６−Ｐ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９も弱いながらもＦＵＴ６活性を示した（図２）。ＦＵＴ６活性を上記反応条件により、一分間当たりに１μｍｏｌｅのフコースをＬＮｎＴ−ＰＡに転移する酵素量と定義した場合、ｐＭＦ６−Ｃ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９のＦＵＴ６の生産性は、１７０ｍＵ／Ｌ−Ｂｒｏｔｈと算出された。
【００９１】
実施例３  ＭＢＰ−ｈＦＵＴ６融合タンパク質の諸性質検討
実施例２で得られたｐＭＦ６−Ｃ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９由来のＭＢＰ−ｈＦＵＴ６融合タンパク質の諸性質の検討をおこなった。
【００９２】
（１）至適反応ｐＨの検討
同条件により、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０におけるＦＵＴ６活性の測定を行った結果、ｐＨ５．５〜８．０でＦＵＴ６活性が検出され、至適反応ｐＨはｐＨ８〜８．５付近であることが確認された（図３）。
【００９３】
（２）マンガンの影響の検討
同条件により、マンガンの活性に及ぼす影響について検討を行った結果、マンガン非存在下では、２０ｍＭマンガン存在下の約１／７に活性が低下することが明らかとなった（図４）。本結果から、ＦＵＴ６の活性にはマンガンが必要であると考えられた。
【００９４】
【表１】
2005046031.tif 000002
【００９５】
【発明の効果】
本発明の方法では、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＵＴ６）活性を有する融合タンパク質を可溶性タンパク質として容易に効率よく大量に生産することができる。また、融合タンパク質からα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＵＴ６）そのものも容易に得ることができる。
【００９６】
本発明によって得られるα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＵＴ６）は、自体糖鎖工学研究用試薬として有用で有るだけでなく、得られたα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＵＴ６）を利用することにより、研究用途或いは医薬用途として有用な種々のルイス構造糖鎖、或いはルイス構造糖鎖類似体、フコース酸含有糖鎖、フコース酸含有糖鎖を含む種々の化学物質等の糖鎖合成が容易になる。さらに、種々の有用タンパク質や種々の糖鎖含有化学物質の糖鎖修飾にも利用が可能となる。また、研究用途或いは医薬用途として有用なα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＵＴ６）抗体を容易に得ることが可能となる。
【００９７】
【配列表】
2005046031.tif 000003
2005046031.tif 000004
2005046031.tif 000005
2005046031.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、ＦＵＴ６  が触媒する反応を示した図である。詳しくは、糖ヌクレオチドであるＧＤＰ−フコース（ＧＤＰ−Ｆｕｃ）をフコース供与体として、糖受容体であるＲ１−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２にフコースをα１−３結合で転移し、Ｒ１−Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ２を生成せしめる反応を示した図である。
【図２】本図は、大腸菌で発現させたＭＢＰ−ＦＵＴ６融合タンパク質のＦＵＴ６活性測定の結果を示した図である。
【図３】本図は、大腸菌で発現したＭＢＰ−ＦＵＴ６のＦＵＴ６活性に及ぼす反応液のｐＨの影響について示した図である。
【図４】本図は、大腸菌で発現したＭＢＰ−ＦＵＴ６のＦＵＴ６活性に及ぼすマンガン濃度の影響について示した図である。
【図１】
2005046031.tif 000007
【図２】
2005046031.tif 000008
【図３】
2005046031.tif 000009
【図４】
2005046031.tif 000010