(57)【要約】      （修正有）【課題】アシドーシス、特に反芻動物のアシドーシスの処置のための方法、化合物、製剤および製造方法の提供。【解決手段】細菌の生産するα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼ阻害剤であり、特に、アカルボース、トレスタチン並びに下式で示される新規化合物の製剤および発酵生産方法である。2005336192.tif 000053【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシドーシスの処置のための組成物の製造における、細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの有効な阻害剤の使用。
【請求項２】
慢性アシドーシスの処置のための、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
急性アシドーシスの処置のための、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤が、10−3M以下のIC50を有する、請求項1〜3のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
阻害剤が、好ましい阻害剤に関連して本明細書に記載された阻害剤の1つから選択される、請求項1〜4のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
阻害剤が、アカルボースおよびそのより高次の相同体、トレスタチン（Trestatin）A、トレスタチンC、本明細書の実施例7の画分21の化合物、本明細書の実施例8、並びに本明細書に記載される発酵ブロス産物から選択される、請求項5に記載の使用。
【請求項７】
阻害剤が、アカルボースおよびそのより高次の相同体、トレスタチンA、トレスタチンC、本明細書の実施例7の画分21の化合物、並びに本明細書の実施例8の化合物から選択される、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
阻害剤が、アカルボースおよびトレスタチンCから選択される、請求項7に記載の使用。
【請求項９】
瘤胃アシドーシスの処置方法であって、反芻動物（ruminant）に細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの有効な阻害剤の有効量を投与することを含む、前記処置方法。
【請求項１０】
慢性アシドーシスの処置のための、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
急性アシドーシスの処置のための、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤が、10−3M以下のIC50を有する、請求項9〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
阻害剤が、好ましい阻害剤に関連して本明細書に記載された阻害剤の1つから選択される、請求項1、10〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
阻害剤が、アカルボースおよびそのより高次の相同体、トレスタチンA、トレスタチンC、本明細書の実施例7の画分21の化合物、本明細書の実施例8、並びに本明細書に記載された発酵ブロス産物から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
阻害剤が、アカルボースおよびそのより高次の相同体、トレスタチンA、トレスタチンC、本明細書の実施例7の画分21の化合物、並びに本明細書の実施例8の化合物から選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
阻害剤が、アカルボースおよびトレスタチンCから選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
動物におけるアシドーシスの処置に適した製剤であって、意図した投与経路および標準的な薬学的／獣医学的／農業的慣習に関して選択される適切な賦形剤、希釈剤またはキャリアと混合された細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの有効な阻害剤を含む、前記製剤。
【請求項１８】
阻害剤が、請求項1〜8のいずれか１項に記載されたものから選択される、請求項17に記載の製剤。
【請求項１９】
反芻動物におけるアシドーシスの処置のための細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの適切な阻害剤の同定における、本明細書に記載されたスクリーニング法のいずれか1つまたはそれ以上の使用。
【請求項２０】
反芻動物乳の品質および／または量を改善するための方法であって、反芻動物を、有効量の細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤で処置することを含む、前記方法。
【請求項２１】
阻害剤が、請求項4〜8のいずれか１項に定義されるとおりである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
式I：
【化１】
2005336192.tif 000052
の化合物、またはその獣医学的に許容しうる塩、溶媒和物（水和物を含む）若しくはプロドラッグ。
【請求項２３】
医薬における使用のための、請求項22に記載の式Iの化合物。
【請求項２４】
反芻動物におけるアシドーシスの処置における使用のための、請求項22に記載の式Iの化合物。
【請求項２５】
いずれかの実施例に関連して本明細書に記載されるような、反芻動物におけるアシドーシスの処置に有用な細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの有効な阻害剤を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載された本発明は、瘤胃（rumen；反芻動物の第一胃）アシドーシス（第一胃過酸症）、特に反芻動物における慢性アシドーシスおよび関連の状態の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
瘤胃アシドーシスは、容易に発酵してしまう炭水化物の過消費によって引き起こされる反芻動物の代謝疾患で記録により充分に立証されており、この状態に関連した問題が長年に渡って知られていた：参照Nordlund  et  al．1995，Nagaraja  et  al．1998，Owens  et  al．1998およびDirksen  1969。アシドーシスは2つの型に分けることができる：急性と慢性である。本願発明者らは、急性アシドーシスを、増大した瘤胃の乳酸塩により瘤胃のpHがpH4．0〜5．0の間にあるものとし、慢性アシドーシスを、5mMまでの標準的な濃度の乳酸塩により瘤胃のpHが5．0〜5．5の間にあるものと定義した。前記文献は、瘤胃のpHが5より下であるが高乳酸濃度に関連した症例もあれば高乳酸濃度とは関連していない症例もある、亜急性アシドーシスについても言及している。本願発明者らは前者の症例を軽度の急性アシドーシス、後者の症例を慢性アシドーシスと分類する。
【０００３】
アシドーシスの主原因は、容易に発酵する炭水化物、および／または粗飼料中にはこの炭水化物は低いのであるが、この炭水化物の含有量が、高い飼料の消費にある。慢性アシドーシスは、動物たちが容易に発酵する飼料を大量に摂取した時に起こり、生産のあらゆる段階、もしくは実際に動物たちが高度の濃厚飼料を常用している期間の間中で起こり得る。急性アシドーシスは、飼料中の濃厚飼料の量が多大に増加した時に起こり得るもので、例えば、分娩後または飼養場への移動中である。しかしながら急性アシドーシスは、過度な給餌の偶発的な産物または絶食期に続く過食のような、通常の飼料摂取パターンの崩壊に続いても起こり得る。瘤胃のpH低下は、飼料中の粗食物繊維の割合が減少することによっても、引き起こされ得る。アシドーシスの病因は、したがって、過大な量の炭水化物の絶対的な摂取量および／または配給中の塩基性食材の好ましくない割合に基づいている。穀物の種類（水分の多いトウモロコシは、回転乾燥したトウモロコシまたはサトウモロコシよりもアシドーシスを引き起こしやすい）および加工処理の種類（蒸した薄片の穀類は特に消化しやすい）が、食物繊維の種類および総量とともに、重要である。大麦、小麦および水分を多く含むトウモロコシのような、瘤胃の澱粉消化が急速な穀類は、最大量の問題を一般に引き起こす。例えば大麦、小麦粉、オート麦および蒸した薄片のトウモロコシはすべて、85％より大きい瘤胃澱粉の有用性を持つ。35〜40kgの牛乳を生産する乳牛のための飼料の指針は、飼料の25〜30％が中性の洗浄性食物繊維（そのうち75％を茎葉飼料から）、35〜40％の水準の非生体構造炭水化物、および30〜40％の澱粉、を提唱している（Nocek  1997）。
【０００４】
急性アシドーシスは、高濃度の瘤胃乳酸（50〜100mM）による瘤胃pHの急峻な低下によって特徴付けられる。瘤胃の微生物個体群は、グラム陽性乳酸生成菌、特にStreptcoccus  bovisおよびLactobacillus種の増加により、重大な変化を経験する。pH低下は、グラム陰性菌を死滅へと導き、繊毛のある原生動物を減少あるいは完全消滅へと導く。乳酸生成への代謝様式の変化は、揮発性脂肪酸（volatile  fatty  acid：VFA）の生成減少と関連がある。全身性の変化は、血液のpH低下および血中の重炭酸塩の低下、そして血中のDおよびL−乳酸塩の増加を含む。
【０００５】
急性アシドーシスは、瘤胃の鬱血や脱水症のような、ついには昏睡や死をもたらす生理機能の重篤な障害を引き起こし得る。たとえその動物が助かったとしても、けっして完全には回復しないと言ってよい。
【０００６】
慢性アシドーシスは臨床的徴候がさらにとらえにくい。動物は相変わらず機敏で飼料を多量食べるが、「元気がない」ように見える可能性がある。瘤胃のpHが5．5より下に低下することは、瘤胃内の発酵が全般的に増加することで、より多量なVFAの生成をもたらすためである。瘤胃におけるVFAの増加は、血液中における増加と非常に高い相関があるが、しかし血中のpHは有意には変化しない。瘤胃における繊毛のある原生動物の総計は、pHの低下により減少し、種によりその割合はことなるが、しかし、完全には消滅しない。生存可能な微生物の総数は、澱粉分解微生物の増加も含め、時を経て増加する。しかしながら、急性アシドーシスにみられるS．bovisおよびLactobatillus種の圧倒的な増加は、起こらない。飼養後に乳酸の生成速度が一過性に高まるが、その乳酸は直ちにVFAの生成に利用され、瘤胃内に蓄積しない。慢性アシドーシス特有の徴候は、乳酸が有意に蓄積することなく瘤胃のpHが5．0〜5．5へと低下することである。
【０００７】
【表１】
2005336192.tif 000002
【０００８】
瘤胃アシドーシスは、家畜動物生産力に重大な打撃、すなわち食肉および／または乳汁への飼料の転換の減少をもたらし得る、多くの二次状態と連合している。乳汁の質もまたアシドーシスと連合して悪くなり得る。瘤胃のpHが5．5より下では、瘤胃上皮の過角化症、乳頭状集塊および瘤胃炎を引き起こすことにより、瘤胃上皮に対する不可逆性の損傷が起こる。そういう動物は、栄養吸収が悪くなったことにより、食欲および生産力が減退し、肉牛においては体重が減少し、乳牛においては牛乳の産出高および品質が低下する。他の影響としては、蹄葉炎、間欠性の下痢、食欲および周期的な食物摂取の不振、不明確な健康上の問題による高い淘汰群の割合、体調不良、および明白な原因のない膿瘍である。慢性蹄葉炎は最も確個とした臨床徴候のひとつで、背側蹄壁の隆起、蹄底の潰瘍化、白色の線状傷、蹄底出血および蹄のゆがみを伴う。概して、英国における乳牛群のうち25％の動物は跛行であると飼育業者は報告しており、必ずしも感知可能な跛行を発生するわけではない慢性蹄葉炎の真の発生率は、それよりも高いと思われる。肝膿瘍は、アシドーシスと連結していることが知られているが、大抵の飼養場における肝膿瘍の発生率が屠殺した家畜のうち12％〜32％に達し、肝臓不良品の申し渡しの主原因となっている。肝膿瘍は、動物が生存している間は必ずしも診断する必要はないが、動物の生産力および全身の健康に対して有害な影響を及ぼす。動物は、免疫機能の低下、呼吸性疾患の高発病率および繁殖率の低減した状態にもなる可能性がある。慢性アシドーシスの問題をかかえている大抵の乳牛群は、年間の群れの回転率が45％よりも高い状態、または年間の淘汰率が31％よりも高い状態である。淘汰の理由は、通例あまり明らかにされていない。（Nocek  1997，Nordlund  1995，Nagaraja  1998，Stock  and  Britten  1998，AnimalPharm  1999，Kay  1969，McManus  1977）。
【０００９】
高炭水化物および／または低食物繊維の飼料で飼養している高生産乳牛において見られるほかの問題は、アシドーシスに関連した「低乳脂肪症候群」である。瘤胃のpHが低下するため、発酵のパターンが、プロピオン酸塩をより多く、酢酸塩および酪酸塩をより少なく生成する方向へと変化する。乳脂肪の約半分が酢酸塩および酪酸塩からつくられるため、その結果として乳脂肪含量が少量になってしまう。（AT  Chamberlain＆JM  Wilkinson，Feeding  the  Dairy  Cow，Chalcombe  Publications，UK，1996）。
【００１０】
瘤胃アシドーシスおよび関連問題は、生産力を失うことにより毎年10億ドルより多くの費用が畜産業者にかかっていると見積もられている。
急性アシドーシスに対する推奨されている処置方法は、迅速に分裂する微生物を殺すために重炭酸ナトリウム、ホルムアルデヒド、酸化マグネシウムおよび木炭の混合物を投与することを含める。（NebGuide  G91−1047−A）。緩衝剤は広範に使用されるが（Horn  1979，Kennelly  1999），しかし畜産業者を満足させるに充分な効能はないようである。大抵の緩衝剤の嗜好性は低く、飼料摂取の減少を避けるために慎重な取り扱いを必要とする。モネンシン、ラサロシド（lasalocid）およびサリノマイシン（salinomycin）のようなイオン透過性担体（イオノフォア）抗生物質が、主な瘤胃における乳酸生成微生物、S．bovisおよびLactobacillus種を含むグラム陽性菌に対し、広く効果的である。（Burrin  and  Britton  1986，Coe  1999，Nagaraja  1985）。イオノフォア抗生物質は、したがって家畜が最初に飼養場に到着した時または出産後に濃厚飼料へと移行する際の急性アシドーシスを防ぐには、効果的である。イオノフォア抗生物質は、慢性アシドーシスの家畜において総VFA生成量を減じる作用をもち、したがって瘤胃のpHを安定化する。しかしながら、イオノフォア類もまた食物摂取量を減少させる。羊におけるヴァージニアマイシン（Thorniley  et  al  1998）、および、S．bovisに対して特に効果的である含硫ペプチド抗生物質のチオペプチン（thiopeptin）（Armstrong  1984）を含む、他の種類の抗生物質もまた、急性アシドーシスを予防または改善する作用を示す。しかし、抗生物質の飼料添加剤を継続的に使用することは、もはや適正な管理手段とはみなされない。（総覧参照：The  use  of  drugs  in  food  animals：benefits  and  risks，1999）。プロビオテイックコントロール（probiotic  control）は、Selenomonas  ruminantium  subsp．lactolytica株JDB201（Wiryawan  et  al  1995）、乳酸塩利用のMegasphaera  elsedenii（Das，Kung  and  Hession  1995）、およびより一般的に明確には（and  in  more  general  terms）特許WO96／17525を含む、数多くの種で実地説明されている。後者は、澱粉または食物繊維の分解を増進する酵素についても権利を主張している。他にも、バクテリオシン類を利用するもの（Teather  and  Forster  1998）、および経済的には発展できないが有機酸による瘤胃の発酵を操作すること（Martin，1988，Martin  et  al．1999）を含む処置方法が、提案されているが、商業化はされていない。
【００１１】
【化１】
2005336192.tif 000003
【００１２】
さらなる参考文献
【００１３】
【化２】
2005336192.tif 000004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ここには瘤胃アシドーシスの安全で効果的な処置方法のための、一般的な要求であり；
特に，慢性および／または急性の瘤胃アシドーシスで；
特に、牛および羊のような反芻動物において；
特に、牛および羊のような泌乳する反芻動物において；
好ましくは食物や飲料のように簡易に投与し得る；
好ましくは非抗生物質で；
好ましくは動物にとって味の良いもので；
好ましくは瘤胃においてのみ活性があり全身への影響は無く；
好ましくは肉および／または乳汁にはいかなる残留物も存在することなく、および
好ましくは抑止期間を必要とせず；
好ましくは動物および飼料を扱う人（製造業者および飼育業者）に対して毒性の無いもの；
および／または、好ましくは、pHの過度な減少を防ぎ、乳脂肪生成が不利な影響を受けないようなVFAの割合を保つことで、瘤胃発酵を安定させることができるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明者らは、慢性および急性アシドーシスの双方、および関連の状態の処置において有用であり得る効果的な方法で瘤胃のpHを復するのに利用できる、細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの、特定の阻害剤を発見した。
【００１６】
ここにおける「阻害剤」とは、個々の薬剤、および阻害活性を持つ薬剤の混合物で、それは下記に言及する発酵液生成物を含む。
本発明の一態様は、アシドーシスの処置のための組成物の製造における、細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの、効果的な阻害剤の利用である。特に興味深いのは、アミラーゼ／グルコシダーゼの阻害剤が、下文に記載したように、瘤胃微生物のなかに存在することである。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、動物に対して細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤を効果量投与することを含む、アシドーシスの処置方法である。
本発明のさらなる態様は、細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤を含む、動物のアシドーシスの処置に適当な処方である。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、特許請求の範囲において明確にされている。
好ましくは細菌性のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤は、ここに記載した瘤胃アミラーゼおよびグルコシダーゼの審査（スクリーン）において、10−3Mかそれより下のIC50を持ち、より好ましくは10−4Mかそれより下、さらに好ましくは10−5Mかそれより下のIC50を有するほうが良い。
【００１９】
好ましくは、そのアミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤は、低い抗菌活性を有し、より好ましくはここに記載した試験において最小阻止濃度（MIC：minimum  inhibitory  concentration）の値が50μg／mlよりも高く、さらに好ましくは100μg／mlよりも高い方が良い。
【００２０】
α−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤の好ましいグループは、これより下に開示された物質、およびそれらの単純な類似化合物で、これより下の実施例における物質、すなわち以下に言及した審査（スクリーン）において有効であることが見出された物質を含む（注意：ここに言及したすべての参考文献は、それら全体を本明細書に援用する。）：
【００２１】
【化３】
2005336192.tif 000005
【００２２】
【化４】
2005336192.tif 000006
【００２３】
【化５】
2005336192.tif 000007
【００２４】
【化６】
2005336192.tif 000008
【００２５】
【化７】
2005336192.tif 000009
【００２６】
【化８】
2005336192.tif 000010
【００２７】
【化９】
2005336192.tif 000011
【００２８】
【化１０】
2005336192.tif 000012
【００２９】
【化１１】
2005336192.tif 000013
【００３０】
「アカルボース（acarbose）およびそれらの高度な類似化合物」に関しては、以下に示された式のアミロスタチンを意味し、一般的および明確には、英国特許番号GB1，482，543；米国特許4，175，123；およびAgric．Biol．Chem．，46（7），1941−1945，1982、に言及されており、これらはすべて、引用することにより、本明細書に援用する。
【００３１】
【化１２】
2005336192.tif 000014
【００３２】
上記に言及したアミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害化合物に付け加えて、前記化合物の相当する誘導体が、次に続く表および以下の参考文献において開示された化学的成分置換の型の結果として、基質の適切さいかんにより作成されることができ、そしてこの成分置換の結果としてさらなるアミラーゼ−および／またはグルコシダーゼの阻害活性物質へと帰着することが期待できる。
【００３３】
好ましくは、このような成分置換のための基質は、アミロスタチン化合物（すなわち上記で述べた「アカルボースおよび高度な類似化合物」）、およびトレスタチン（trestatin）化合物、V1532，実施例7の画分21の化合物、実施例8の化合物、および下記に示す化合物（またはこれらに適切な保護基をつけた誘導体）から選択されることが望ましい：
【００３４】
【化１３】
2005336192.tif 000015
【００３５】
【化１４】
2005336192.tif 000016
【００３６】
【化１５】
2005336192.tif 000017
【００３７】
ここで言及したすべての基質は、当業者間では良く知られているが、例えばある原子の放射性同位体で、標識することができる。
好ましい阻害剤は、アカルボースおよびその高度な類似化合物、トレスタチンA、トレスタチンC、後述する実施例7の画分21の化合物、後述する実施例8の化合物を、これより下で述べる発酵液生成物と同様に、含む。
【００３８】
好ましい阻害剤のグループは、物質的に純粋で単体の化合物であり、または部分的に精製した発酵もしくは微生物転換生成物、アカルボースおよびその高度な類似化合物、トレスタチンA、トレスタチンC、後述する実施例7の画分21の化合物、後述する実施例8の化合物を含む、阻害剤である。
【００３９】
特に好ましいのは、アカルボースおよびトレスタチンCである。
阻害剤のあるものは、これより下に記載する方法のような、微生物転換／発酵によって作成することが可能である。
【００４０】
＜生物的変換（バイオトランスフォーメーション）／発酵生成物＞
Streptomyces  conglobatus  ATCC31005、Streptomyces  coelicolor  subsp．flavus  ATCC19894、Streptomyces  kursannovii  ATCC11912およびStreptomyces  lienomycini  ATCC43687の培養物は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American  Type  Culture  Collection：ATCCは、10801  University  Boulevard，Manassas，Virginia  20110−2209，U．S．A．に所在する）から得られた。日本の駿河湾の海洋堆積物から単離されたStreptomyces属KC672、および、Streptomyces属CL45763は、ブダペスト条約に従ってナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリアLtd．に寄託され、受け入れ番号NCIMB41058およびNCIMB41057をそれぞれ割り当てられた。（NICMBは、23  St．Machar  Drive，Aberdeen，U．K．  AB24  3RY．に所在する）。寄託者は、Pfizer  Central  Research，Pfizer  Limited，Ramsgate  Road，Sandwich，Kent，Ct13  9NJ，United  Kingdomである。Pfizer  Ltd．は、Pfizer  Inc．235  East  42nd  Street，New  York，New  York，USAによって全面的に所有されている子会社である。
【００４１】
加えて、Streptomyces  conglobatus  ATCC31005，Streptomyces  coelicolor  subsp．flavus  ATCC19894，Streptomyces  kursannovii  ATCC11912，Streptomyces  lienomycini  ATCC43687，Streptomyces  sp．KC672およびStreptomyces  sp．CL45763の、突然変異株を利用することが可能である。これらの突然変異株は自然発生的に、または、電離放射線、紫外線および／または、N−メチル−N−ニトロソウレタン、N−メチル−N´−ニトロ−N−ニトロソグアナジン、エチルメチルスルフェイト等のような突然変異原化学物質に曝露するというような既知の技術の適用により、得ることができる。遺伝子的に形質転換され、および組換えられた微生物体は、突然変異体、および遺伝子工学技術、例えば組み換え、形質転換、形質導入、プロトプラスト融合法などにより作られた遺伝子変異体を含む。
【００４２】
Streptomyces  conglobatus  ATCC31005、Streptomyces  coelicolor  subsp．flavus  ATCC19894、Streptomyces  kursannovii  ATCC11912およびStreptomyces  lienomycini  ATCC43687、Streptomyces  sp．KC672およびStreptomyces  sp．CL45763の培養物の発酵は、当業者間でよく知られたStreptomyces属の糸状菌のための標準的な手順を利用して実施することができる。例えば微生物の生育は、適切な固形培地または液体培地上で好気性条件下、24〜35℃の範囲内で、炭素、窒素、および鉄、亜鉛、マンガンのような微量元素の、適切な供給源を用いて2〜30日間で実施しうる。
【００４３】
以下の発酵培地を用いる。
【００４４】
【表２】
2005336192.tif 000018
【００４５】
【表３】
2005336192.tif 000019
【００４６】
【表４】
2005336192.tif 000020
【００４７】
記載したすべての培地は、他の澱粉、部分的に加水分解された澱粉または水溶性澱粉、およびまたはD−キシロース、D−リボース、D−マルト−ス、D−マルトトリオース、D−セドヘプツロース、D−トレハロース、D−グルコースのような糖類、およびまたはアスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミンのような窒素供給源を追加することが可能である。
【００４８】
＜実施例1＞
Streptomycrs  conglobatus  ATCC31005からの、瘤胃液αアミラーゼ阻害活性を示す発酵ブロスの調製：
1／4強度のATCC172傾斜寒天培地（agar  slope）上に維持されたStreptomyces  conglobatus  ATCC31005を、1／2濃度のMECO培地を50mlずつ入れた2個の300ml容三角フラスコに、一白金耳の胞子として（as a loopful of spores）接種した。それらを28℃にて7日間、振盪機（Infors  Multitron  Shaker）上で200rpm、揺れ幅1"（2．5cm）でインキュベートした。この時点で、ブロスを3500rpmにて遠心分離し、その上清を菌糸体から分離した。上清のα−アミラーゼ阻害活性を測定した。以下の表に要約する。
【００４９】
【表５】
2005336192.tif 000021
【００５０】
＜実施例2＞
Streptomyces  sp．CL45763からの、瘤胃液α−アミラーゼ阻害活性を示す発酵ブロスの調製：
Bacto  ISP−3の傾斜寒天培地上に維持されたStreptomyces  sp．CL45763を、AP5−H培地を50mlずつ入れた4個の300ml容三角フラスコに、一白金耳の胞子として摂取した。それらを次に28℃で9日間、振盪機（Infors  Multitron  Shaker）上で200rpm、揺れ幅1"（2．5cm）でインキュベートした。この時点で、ブロスを会わせ、3500rpmで遠心分離し、その上清を菌糸体から分離した。上清のα−アミラーゼ阻害活性を測定した。以下の表に要約する。
【００５１】
【表６】
2005336192.tif 000022
【００５２】
＜実施例3＞
Streptomyces  coelicol  subsp．flavus  ATCC19894からの、瘤胃液α−アミラーゼ阻害活性を示す発酵ブロスの調製：
1／4強度のATCC172傾斜寒天培地上に維持されたStreptomyces  coelicolor  subsp．flavus  ATCC19894を、50mlずつのAP5−H培地を入れた10個の300ml容三角フラスコに、一白金耳の胞子として摂取した。それらを次に28℃で4日間、振盪機（Infors  Multitron  Shaker）上で200rpm、揺れ幅1"（2．5cm）でインキュベートした。この時点で、ブロスを3500rpmで遠心分離し、その上清を菌糸体から分離した。合わせた上清のα−アミラーゼ阻害活性を測定した。以下の表に要約する。
【００５３】
【表７】
2005336192.tif 000023
【００５４】
＜実施例4＞
Streptomyces  kursannovii  ATCC11912からの瘤胃液α−アミラーゼ阻害活性を示す発酵ブロスの調製：
1／4強度のATCC172傾斜寒天培地上に維持されたStreptomyces  kursannoviiATCC11912を、50mlずつのAP5−H培地を入れた2個の300ml容三角フラスコに、一白金耳の胞子として摂取した。それらを次に28℃で5日間、振盪機（Infors  Multitron  Shaker）上で200rpm、揺れ幅1"（2．5cm）でインキュベートした。この時点でブロスを3500rpmで遠心分離し、その上清を菌糸体から分離した。上清のα−アミラーゼ阻害活性を測定した。以下の表に要約する。
【００５５】
【表８】
2005336192.tif 000024
【００５６】
＜実施例5＞
Streptomyces  lienomycini  ATCC43687からの瘤胃液α−アミラーゼ阻害活性を示す発酵ブロスの調製：
1／4強度のATCC172傾斜寒天培地上に維持されたStreptomyces  lienomyciniATCC43687を、50mlずつの改良ANG−3培地を入れた3個の300ml容三角フラスコに、一白金耳の胞子として摂取した。それらを次に28℃で5日間、振盪機（Infors  Multitron  Shaker）上で200rpm、揺れ幅1"（2．5cm）でインキュベートした。この時点でブロスを3500rpmで遠心分離し、その上清を菌糸体から分離した。上清のα−アミラーゼ阻害活性を測定した。以下の表に要約する。
【００５７】
【表９】
2005336192.tif 000025
【００５８】
＜実施例6＞
Streptomyces  sp．KC672からの、瘤胃液α−アミラーゼ阻害活性を示す発酵ブロスの調製：
1／4強度のATCC172傾斜寒天上に維持されたStreptomyces  sp．KC672を、50mlずつのAP5−H培地を入れた2個の300ml容三角フラスコに、一白金耳の胞子として摂取した。それらを次に28℃で7日間、振盪機（Infors  Multitron  Shaker）上で200rpm、揺れ幅1"（2．5cm）でインキュベートした。この時点でブロスを3500rpmで遠心分離し、その上清を菌糸体から分離した。上清のα−アミラーゼ阻害活性を測定した。以下の表に要約する。
【００５９】
【表１０】
2005336192.tif 000026
【００６０】
＜実施例7＞
Streptomyces  conglobatus  ATCC31005からの、瘤胃液α−アミラーゼ阻害剤の単離：
1／4強度のATCC172寒天上に維持されたStreptomyces  conglobatus  ATCC31005の一白金耳を、50mlずつのAP5−H培地を入れた2個の300ml容三角フラスコに接種した。200rpm、揺れ幅1"（2．5cm）の振盪機（Infors  Multitron  Shaker）上で28℃にて24時間、インキュベートした後、これらのフラスコを、3．5リットルのAP5−H培地を入れた2個の5リットル容ミニジャー（ElectrolabTM，Gloucester，U．K）への接種に用いた。これらのブロスは、1分あたり3リットルの通気をしながら300rpmにて撹拌し、28℃にて6日間インキュベートした。回収時、ブロスを2500rpmにて遠心分離し、上清を別の容器に移した。それらをそれぞれ2回ずつ、45分間86gのチャコールとともに撹拌し、次に500gのArbocelTMの層で濾過した。この段階でのpHはpH7であった。カーボンケークをそれぞれ、濃塩酸の添加でpH2〜3に維持しながら860mlの水−アセトン（1：1）で2回抽出した。4個の水−アセトン抽出物を、一部蒸発させ、合わせ、凍結乾燥し、40gの茶色固形物を得た。固形物を次に500mlsの脱イオン水に溶解し、750mlのAmberlite  IR120（H＋型）のカラムに流速2ml／分にてアプライした。カラムを次に1リットルの水で洗浄し、次に5Nのアンモニア溶液で50mlずつの画分を集めながら溶出した。画分13〜28を凍結乾燥して、1．4gの濃茶色粉末を得た。これを次に15mlの水に溶解し、濾過し、濾液を5mlのアセトニトリルで希釈した。これを2mlの容積でCosmosil  NH2−MSカラム（20×250ml）にインジェクトし、アセトニトリル水（60：40）で流速20ml／分にて溶出した。画分を30秒ずつ集め、Finnegan  AQATM機器を用いたLC−MSで分析した。M＋H＋970を含む画分を合わせ、乾燥し、70mgずつの粘性固形物を得た。固形物を次に、2mlずつの水に溶解し、濾過して2分の1ずつを、ダイオードアレイ検出器を有するWaters  Delta  PrepTM  4000システムを用いながら、aters  AquaTM5ミクロン125Aカラム（21×150mm）にインジェクトした。画分を集め、M＋H＋970のピークを含む2つの、すなわち両方の画分21を合わせ、結果、白色固形物6．5mgを得た。
【００６１】
正確なMSデータは、Bruker  Apex  II  FT−ICR−MS  4．7T機器で収集した。このとき試料は、メタノール／水／酢酸（50：50：1）に約0．5mg／mlずつ溶解し、4μl／分で直接注入することにより、Analytica  electrospay  sourceとした。
【００６２】
m／z（ESI，FTMS）［M＋H］＋＝970．3601、C37H64NO28の計算値は970．3609である。
m／z（ESI，FTMS）［M＋Na］＋＝992．3452、C37H63NO28Naの計算値は992．3429である。
【００６３】
画分21の化合物のNMR（プロトン、カーボン−13、TOCSY、HSQCおよびHMBC）およびMSスペクトルは、「6942／99／1」としても知られている、以下に示す構造と矛盾がない。
【００６４】
【化１６】
2005336192.tif 000027
【００６５】
上記の化合物は、GB特許1 482 543および［Ag．Biol．Chem．46（7）（1982）1941］に開示されている。
表：6942／99／1の1Hおよび13C  NMRケミカルシフト（内部標準のジオキサンに比較したppmにおけるδ）
【００６６】
【表１１】
2005336192.tif 000028
【００６７】
「画分21の化合物」は、本明細書で言及したアミラーゼスクリーニングにおける阻害効果を有することが見出された。
＜実施例8＞
Streptomyces  conglobatus  ATCC31005からの、瘤胃液α−アミラーゼ阻害剤の単離：
上記のAP5−H生産培地を発酵培地として使用した。
【００６８】
1／4強度のATCC172傾斜寒天上に維持されたStreptomyces  conglobatus  ATCC31005の一白金耳を、50mlずつのAP5−H培地を入れた2個の300ml容三角フラスコに接種した。これらを、振盪機（Infors  Multitron  Shaker）上で200rpm、揺れ幅1"（2．5cm）で、28℃、24時間インキュベートした。この時点で、接種物を1リットルのAP5−H培地を入れた3リットル容のFernbachフラスコに移し、三角フラスコについて記載したのと同じ条件で、さらに24時間インキュベートした。この接種物を次に、30リットル容のNew  Brrunswick  MirosTMステンレススチールファーメンター中のあらかじめ滅菌した20リットルのAP5−H培地へ移した。ブロスを、300rpm、28℃にて、1分あたり20リットルの通気をしながら激しく撹拌し、112時間インキュベートし、回収した。回収したブロスはCarr  PowerfugeTMを用いて20000Gにて遠心分離した。自然状態のpH7．8の上清に対して、500gの活性脱色チャコール（Aldrich  16155−1）を添加し、混合物を16時間撹拌した。ArbocelTMのような濾過器具を使っての濾過に続き、上清をさらに500gのチャコールで1時間ほど同様に処理した。合わせたチャコールケークを、水メタノール（10リットル  1：1）で洗浄し、次に、水アセトン（10リットル  1：1）を用い、1時間撹拌した後に濾過器具で濾過することによる抽出を2回行った。続いて一部を回転蒸発させ、そして凍結乾燥し、98．7gの生物学的に活性のある物質を得た。
【００６９】
この物質を1800mlの脱イオン水に溶解し、3．5リットルAmberlite  IR  120（H）TMのカラムに流速5ml／分で流した。水洗浄（2リットル）の後、生成物を1リットルずつの5Nアンモニア溶液で溶出した。凍結乾燥の後、最も活性の高い画分（5〜8）を集め、10．8gの茶色固形物を得た。
【００７０】
この物質の1．1gを、Waters  Delta  Prep4000TMクロマトグラフィーシステム（250×21．2mmCromasilNH2（Phenomenex）、流速24ml／分にて67％アセトニトリル33％水から50／50へ20分かけグラジエントする）を用いて、5回の等量のインジェクションのクロマトグラフィーにて精製された。12mlずつの画分を集めた。
【００７１】
重要なピークを含む画分（各操作からの31〜35）を合わせ、138mgの白色固形物を得た。この物質を再びクロマトグラフにかけた。今回は150×21．2mmAquaカラム（Phenomenex）、流速21．2ml／分、100％の水から90％水10％アセトニトリルへ15分かけて行うグラジエントを利用し、30秒の間隔で画分を集めた。画分22および23より、本発明者は総量43mgの求める生成物を得た。
【００７２】
観測されたデータは、本明細書では「実施例8の化合物」として言及される、以下の構造式と首尾一貫している：
【００７３】
【化１７】
2005336192.tif 000029
【００７４】
M／z（ESI，FT−MS）［M＋H］＋＝1435．546、対応する分子式C56H95N2O40（＋／−  3．028ppm）。
M／z（ESI，FT−MS）［M＋Na］＋＝1457．528、対応する分子式C56H94N2O40Na（＋／−  1．914ppm）。
【００７５】
以下に掲げるすべてのNMRデータは、Varian  Innova  600MHz装置で、3mmのプローブを用い、D2O中10℃にて記録された。
【００７６】
【表１２】
2005336192.tif 000030
【００７７】
注）上記の表で「？」が現れるところは、シビアなシグナルの重複があり、明白な割り当てができなかったことを意味する。
＜アカルボースおよび他の関連するα−アミラーゼ、並びに／またはα−グルコシダーゼの阻害剤の改変＞
＜生物的変換＞
微生物的変換：
アカルボース若しくは他の関連するα−アミラーゼ、および／またはα−グルコシダーゼの阻害剤のグリコシル化が可能な微生物の全生物体が、α−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼ阻害活性を増大させるために使用することができ、これはBacillus  subtilis  ATCC550601、Saccharopolyspora  erythrae  ATCC116352およびS．avermitilis  ATCC535673のブロック突然変異（blocked  mutant）を含む。グルコシド化（glucosidate）することができる他の微生物は、Cunninghamella  sp．NRRL569514、およびBeauvaria  bassiana  DSM  875およびDSM  134415を含む。さらに、ルチンを与えたActinoplanes  sp．CBS793．964によるアカルボースの微生物による直接生合成は、他のα−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害剤を生成する微生物を用いても使用できる。これらは、α−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害活性増大を示すアカルボースの類似体（analogue）または関連するアカルボース類似の相同体（homologue）を与えうる。さらには、O−アシル化16、酸化（エポキシ化17およびケトン18形成を含む）、ヒドロキシメチル化19、O−メチル化20、などが可能な微生物体は、α−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼの阻害活性増大を立証しうるアカルボースの新規類縁体および関連する類似体を作り出すのにも使用できる。
【００７８】
粗製の、部分精製した、および精製した酵素の生物的変換：
グリコシル化の酵素的方法は、オリゴサッカライド類の合成または改変に使用できる。ヒドロキシル基の特有の保護および脱保護は不必要であり、酵素は1個または2個のヒドロキシル基を転移するだけである。このことはしばしば，より少ない反応段階、そしてより簡便化した精製手順へと導く。Bacillus  stearothermophilusマルトジェニックアミラーゼ（maltgenic  amylase）（BSMA）による、アカルボースまたは様々なアクセプターのトランスグリコシル化が用いられているが、そこでの酵素はBSMA遺伝子5をもつEscherichia  coli形質転換体である。ここでBSMAは、アカルボースの第1グリコシド結合を開裂させて擬似トリサッカリド（PTS）とし、次にグルコース単位をα（1→6）位に付加してイソアカルボースを与え、ここでアカルボース自体は末端グルコースにおいてα（1→4）結合をもつ。消化物への多数の様々な炭水化物の付加は、転移生成物を与え、そこではPTSは主にα（1→6）結合で、D−グルコース、D−マンノース、D−ガラクトースおよびメチルα−D−グルコピラノシドへ結合する。D−フルクトピラノースおよびD−キシロピラノースに対して、PTSはそれぞれα（1→5）およびα（1→4）で連結される。α−αトレハロースおよびマルチトール（maltitol）は両方とも、グルコピラノシド残基に対してPTSがα（1→6）およびα（1→4）で連結した2種の主要生成物を与える。PTSは主に、マルトース、セロビオース、ラクトースおよびゲンチオビオースのC−6位の非還元残基に対して転移される。スクロースは、グルコース残基にα（1→4）で連結したPTSを与える。ラフィノースは、D−ガラクトピラノース残基にα（1→6）およびα（1→4）で連結したPTSをもつ2種の主要生成物を与える。マルトトリオースは、非還元末端グルコピラノース残基にα（1→6）およびα（1→4)で連結したPTSをもつ2種の主要生成物を与える。キシリトールは、主要生成物として、α（1→5）で連結したPTSを、そしてD−グルシトール（ソルビトール）は唯一の生成物としてα（1→6）で連結したPTSを与える。これらすべての例は、向上したαアミラーゼ阻害活性を示しうる。
【００７９】
酵素の他のグループは、アカルボース若しくは利用可能な糖または水酸基を有する他のアミラーゼ、および／またはα−グルコシダーゼの阻害剤が、グリコシド化された類似体を製造するのに使用できる。使用可能な酵素的調製は、α−およびβ−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−マンノシダーゼ、β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、β−N−アセチルガラクトアミニダーゼおよびα−L  フコシダーゼを含む6。グリコシド化は、アカルボースのバリエナミンまたはシクリトール単位のどちらの末端でも起こり得て、経験では、グリコシル転移は基質のモノサッカリドの非還元末端で起こりやすいことが示されている7。エンドグリコシダーゼを用いた研究では、分枝した構造をもたらし得る。記載した酵素による調製は、微生物由来、例えば、Aspergillus  niger、A．terreus、A．oryzae、Bacillus  circulans、B．stearothermophilus、Coccobacillus、または虫液（insedt  juice）、例えばカタツムリ、または植物由来、例えばリンゴ、キノコ、アルファルファの種、脱脂したアーモンドの粗びき粉等などから得ることができる6。
【００８０】
グリコシルトランスフェラーゼは、アカルボースおよびα−アミラーゼ阻害活性を示す関連した類似体のグリコシル化にも用いることできるが、かなり希少な酵素である8。これらグルコシルトランスフェラーゼの多くが、クローン化されている。それらはしばしば末端の1〜2個の糖部分に対してかなり緊密（stringent）であるとして言及され、そしてグリコシルドナーに対しても非常に特異的である。それらは、位置選択性および立体選択性の優位、および高収率を維持しながら、本質的でない（unnatural）ドナーおよび／またはアクセプター双方と作用しうる。わずか２、３のグリコシルトランスフェラーゼが容易に入手可能であり、多くの実験はガラクトシルトランスフェラーゼ  Gal  T9を用いて実施されてきている。
【００８１】
グリコシルトランスフェラーゼの特殊なグループとしては、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTase）がある。これらの酵素は、微生物によって産生され、多くが商業上入手可能である。これらは澱粉のシクロデキストリン化を触媒するが、1個またはそれ以上のα−グルコシル単位を様々なアクセプターへと転移させる。それらはグリコシドの伸張または多くの化合物のα−グルコシル化に用いることができる。B．stearothermophilus由来のCGTアーゼは、ルチンのトランスグルコシル化に利用され、そのトランスグルコシル化においてグルコシル単位は1個またはそれ以上のグルコース単位により伸張される10。同様のアプローチが、アカルボースおよび関連するグルコース単位を含むα−アミラーゼ、並びに／またはα−グルコシダーゼの阻害剤に関して用いうる。
【００８２】
他のアプローチは、α（1→4）グルカン類の形成または分解を担う酵素として良く知られているグリコーゲンホスホリラーゼを用いることである。ホスホリラーゼは、グルコシルホスフェートエステルのような活性化された基質を必要とする。この基質を用い、グルカン鎖、すなわちプライマー単位はリン酸塩の放出とともにグルコース単位で伸張されうる11。
【００８３】
アカルボースおよび糖単位を含む関連するα−アミラーゼ、並びに／またはα−グルコシダーゼの阻害剤の改変は、糖単位の開裂またはトランスグリコシル化のどちらも可能なαアミラーゼ自体による選択的加水分解を用いることによっても実施可能である12、13。
【００８４】
本節の参考文献：
【００８５】
【化１８】
2005336192.tif 000031
【００８６】
本明細書で言及した基質のあるものは、1またはそれ以上の幾何異性および／または立体異性の型で存在しうる。本明細書は、そのような個々の異性体および塩類およびそれらのプロドラッグのすべてを含む。本明細書で言及した化合物のあるものは、1個より多くの互変異性体で存在しうるであろう。同様に本明細書で言及した化合物のあるものは、両性イオンの形態をもちうる。本明細書は、このような互変異性体、両性イオンおよびそれらの誘導体のすべてを包含することが理解されよう。
【００８７】
本開示は、適切な場合、酸添加および塩基性塩を含む、本明細書に言及される化合物の獣医学的に許容しうる塩を含む。適切な酸添加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成され、そしてその例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、およびp−トルエンスルホン酸塩である。適切な塩基性塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成され、そしてその例は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛およびジエタノールアミン塩である。適切な塩に関する概説には、Bergeら，  J．  Pharm．  Sci．，  66，  1−19（1977）を参照されたい。
【００８８】
最終脱保護工程の前に作成される可能性がある、本明細書に言及される化合物の特定の保護誘導体は、それだけでは、望ましい生物学的活性を持たない可能性があるが、特定の場合には、体に投与された後、例えば代謝により、変換され、生物学的に活性である、本明細書に言及される化合物を形成する可能性があることが、当業者に認識されるであろう。こうした誘導体は、「プロドラッグ」という用語に含まれる。さらに、当業者に「プロ部分（pro−moieties）」として知られる特定の部分、例えばH  Bundgaardによる“Design  of  Prodrugs”（Elsevier）  1985に記載されるようなものを、適切な官能性が本明細書に言及される化合物に存在する場合、こうした官能性上に置き、やはり「プロドラッグ」を形成してもよいことが、当業者に認識されるであろう。さらに、本明細書に言及される特定の化合物は、本明細書に言及される他の化合物のプロドラッグとして作用する可能性がある。本明細書に言及される化合物のすべての保護誘導体、およびプロドラッグは、本開示の範囲内に含まれる。
【００８９】
本明細書に言及される特定の物質は、先に記載されるものと異なる方法により、本明細書に記載される方法の適合および／または当業に知られる方法、例えば本明細書に記載される業の適合により、または例えば
【００９０】
【化１９】
2005336192.tif 000032
【００９１】
などの標準的な教科書および該教科書中の参考文献を指針として用い、作成することが可能であることを、当業者は認識するであろう。
本明細書に言及される合成的変換法は、代表的であるのみであり、そして望ましい化合物を効率的に組み立てることが可能であるように、多様な異なる順序で行ってもよい。化学者は、既定の標的化合物の合成のため、最も効率的な反応順序に関し、自身の判断および技術を働かせるであろう。例えば、特定の反応と連係し、後に言及されるものと異なる中間体に置換基を添加し、および／または化学変換を行ってもよい。これは、とりわけ、特定の基質に存在する他の官能基の性質、重要な中間体の入手可能性および（あるとすれば）採用しようとする保護基戦略などの要因に応じるであろう。明らかに、含まれる化学反応の種類が、前記合成工程に用いられる試薬の選択、使用される保護基の必要性および種類、並びに合成を達成するための順序に影響を与えるであろう。該方法は、標準的な教科書および以下に提供される例を参照することにより、当業者に明らかになるであろう方式で、反応物、試薬および他の反応パラメーターに適切なように適合されるであろう。
【００９２】
本発明の化合物の合成中に、感受性官能基が保護され、そして脱保護される必要がある可能性があることが、当業者には明らかであろう。これは、慣用的方法により、例えばTW  GreeneおよびPGM  Wutsによる“Protective  Groups  in  Organic  Synthesis”，  John  Wiley  ＆  Sons  Inc（1999）、および該文献中の参考文献に記載されるように、達成してもよい。保護することが望ましい可能性がある官能基には、オキソ、ヒドロキシ、アミノおよびカルボン酸が含まれる。オキソの適切な保護基には、アセタール類、ケタール類（例えばエチレンケタール類）およびジチアン類が含まれる。ヒドロキシの適切な保護基には、トリアルキルシリルおよびジアリールアルキルシリル基（例えばtert−ブチルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）およびテトラヒドロピラニルが含まれる。アミノの適切な保護基には、tert−ブチルオキシカルボニル、9−フルオレニルメトキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルが含まれる。カルボン酸の適切な保護基には、C1−6アルキルまたはベンジルエステルが含まれる。
【００９３】
アシドーシスおよび関連する異常の処置のため、アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼ阻害剤を、単独で、または適切なように、疾患の処置（予防を含む）に、あるいは症状の減少または抑制に用いられる、1つまたはそれ以上の薬剤と組み合わせて、投与してもよい。こうした薬剤の例（例示の手段としてのみ提供され、そして限定とみなしてはならない）には、緩衝剤、イオノホア類、生菌（probiotics）、有機酸およびバクテリオシン類を含む抗生物質、抗寄生虫剤、例えばフィプロニル、ルフェヌロン、イミダクロプリド、アベルメクチン類（例えばアバメクチン、イベルメクチン、ドラメクチン）、ミルベマイシン類、有機リン酸塩類、ピレスロイド類；抗ヒスタミン剤、例えばクロルフェニラミン、トリメプラジン、ジフェンヒドラミン、ドキシラミン；抗真菌剤、例えばフルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、グリセオフルビン、アンホテリシンB；抗細菌剤、例えばエンロフラキサシン、マルボフロキサシン、アンピシリン、アモキシシリン；抗炎症剤、例えばプレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、カルプロフェン、ケトプロフェン；食餌補足剤（dietary  supplement）、例えばガンマ−リノール酸；並びに緩和剤（emollients）が含まれる。
【００９４】
アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼ阻害剤は、単独で投与してもよいが、一般的には、意図される投与経路および標準的な薬学／獣医学／農業的慣習に関し選択される、適切な賦形剤、希釈剤またはキャリアと混合し、投与されるであろう。
【００９５】
好都合に、ヒツジおよびウシなどの家畜動物の処置には、適切な標準法を用い、例えば動物の飼料と混合し、飲料水中に入れ、または瘤胃に直接搬送される大丸薬を介し、経口投与してもよい。飼料中の投与には、通常の動物飼料と混合するため、濃縮飼料添加剤またはプレミックスを提供してもよい。さらなる物理的および化学的安定化剤もまた、前記処方中の活性剤の安定性を維持するまたは亢進するために含んでもよい。
【００９６】
活性剤を投与してもよい方法には、カプセル、大丸薬、錠剤または水薬（drench）による経口投与が含まれ、あるいは、活性剤は、注射により、または瘤胃への移植物として投与してもよい。こうした処方は、標準的獣医学的慣習と一致し慣用的な方式で調製することが可能である。
【００９７】
例えば、活性剤は、即時、遅延、修飾、持続、パルス、または調節放出適用のため、調味料または着色料を含んでもよい、溶液、粉末または懸濁物の形で経口投与してもよい。
ウシの通常の食餌の一部と一緒の飼料中または飲料中投与に加え、活性剤は、通常給餌および給水の間に、例えば糖蜜を基とする処方中などの、おいしい「ごちそう」の形で、別個に投与してもよいことが予想される。
【００９８】
水性懸濁物および／またはエリキシル剤には、活性剤を、多様な甘味料または調味料、着色料または染色剤と、乳化剤および／または懸濁剤と、そして水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの希釈剤と、並びにそれらの組み合わせと、組み合わせてもよい。さらなる物理的および化学的安定化剤もまた、前記処方中の活性剤の安定性を維持するまたは亢進するために含んでもよい。
【００９９】
活性剤はまた、長期作用大丸薬処方を介し、瘤胃に直接搬送してもよく、ここで処方装置は延長された期間、瘤網胃嚢内に保持され、持続放出を容易にする。この場合に記載されるような処方装置の瘤胃保持は、密なマトリックスあるいはアルミニウムまたは鋼鉄のシリンダーに基づく容器、あるいは粘土、薬剤および他の成分の混合物から形成されるペレットを用い、達成することが可能である。
【０１００】
活性剤はまた、特定の場合、非経口的に、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋内または皮下投与してもよく、あるいは注入技術により投与してもよい。こうした非経口投与には、活性剤は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含んでもよい、無菌水性溶液の形で用いるのが最適である。水性溶液は、必要な場合、（好ましくは3ないし9のpHに）適切に緩衝されているべきである。適切な無菌非経口処方の調製は、最終滅菌方法論により、または当業者に周知の標準的薬学的技術を用いた無菌製造により、容易に達成される。
【０１０１】
例えば、活性剤の単位用量は、適切なように、一度に1または2またはそれ以上の投与のため、0．001mgないし20gの活性剤を含んでもよい。例えば、アカルボースは2回の別個の飼料で、1日当たり動物当たり15gが投与されてきている。活性化合物の標的範囲は、およそ3g／動物／日までである。いかなる場合でも、獣医／農業経営者が、いかなる個々の動物または動物群に対しても、最も適しているであろう、実際の用量を決定するであろうし、そして該用量は、特定の動物の年齢、体重、食餌および反応により、異なるであろう。上述の投薬量は、平均的な場合の例である。もちろん、より高いまたはより低い投薬範囲が正当である個々の場合がありうるし、そしてこうしたものは本発明の範囲内である。急性アシドーシスなどの特定の異常の処置において、必要とされるまたは望ましいように、活性剤を単回用量として投与してもよいことを、当業者は認識するであろう。
【０１０２】
活性剤は、通常、経口的に、または他のいかなる適切な経路でもよいもの（最終的に瘤胃に到達することが可能なもの）により、活性成分を含む調製の形で、所望により、非毒性有機または無機、酸または塩基、添加塩の形で、許容しうる獣医学的／薬学的投薬型で、投与されるであろう。処置しようとする障害および動物と共に、投与経路に応じ、組成物は異なる用量で投与してもよい（以下を参照されたい）。
【０１０３】
いかなる処方もなしに、活性剤を直接投与することが可能であるが、活性剤は、好ましくは、薬学的にまたは獣医学的に許容しうるキャリア、希釈剤または賦形剤および活性剤を含む、薬剤または獣医学的処方の形で使用される。キャリア、希釈剤または賦形剤は、意図される投与経路および標準的薬学的および／または獣医学的慣習に関し、選択してもよい。活性剤を含む組成物は、重量0．1パーセントないし重量90．0パーセントの活性成分を含む可能性がある。
【０１０４】
処方は、処置しようとする動物種、異常の重症度および種類、並びに動物の体重に応じ、処方中に含まれる活性化合物の重量に関し、異なるであろう。非経口および経口投与には、活性成分の典型的な用量範囲は、動物体重kg当たり0．0001ないし1000mgである。好ましくは、範囲はkg当たり0．001ないし20mgである。例えばアカルボースは、16mg／kgで投与された。より好ましくは、範囲は0．001ないし5mg／kgであり、そして最も好ましくは0．001ないし0．5mg／kgである。
【０１０５】
処置に関する本明細書中の言及はすべて、治癒、緩和および予防処置を含むと認識すべきである。
薬剤の有効性は、以下の試験法を用い、立証することが可能であり、ここでは適切なアミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼ阻害剤の例として、アカルボースを用いる。
【０１０６】
＜試験法＞
瘤胃細菌アミラーゼアッセイ−プロトコル1：
該アッセイは、Sigmaアミラーゼキット（577）を利用し、化合物が瘤胃液上清アミラーゼの作用を阻害するか測定する。アッセイに含まれる酵素的反応は以下のとおりである：
【０１０７】
【化２０】
2005336192.tif 000033
【０１０８】
αアミラーゼは、4，6−エチリデン−G7−PNP（ET−G7PNP）を、G2、G3およびG4PNP断片に加水分解する。α−グルコシダーゼ（α−1，4−グルカン糖加水分解酵素（glucohydrolase）EC3．2．1．3）は、G2PNPおよびG3PNPを加水分解し、p−ニトロフェノールおよびグルコースを生じる。5モルの基質（ET−G7PNP）が加水分解されると、4モルのp−ニトロフェノールが生じる。p−ニトロフェノールは、405nmの光を吸収し、そして2分の遅延時間後、405nmの吸光度の増加率は、ウェル中のα−アミラーゼ活性に正比例する。
【０１０９】
食餌GH313を与えた4ヶ月のHereford  x  Friesian仔ウシ（calves）（125−135kg、Cwmnant  Calves  Ltd．Cwmnant、Tregaron、Ceredigionより供給）から、瘤胃液を収集した。瘤胃液は、安楽死後できるだけ早く、屠殺仔ウシから、あらかじめ温めた真空フラスコ中に収集した。その後、該液を、吸収ガーゼ（Robert  Bailey  plc、ストックポートのAbsorbent  gauze  BP、GAUZ4）の二重層を通じ、ろ過し、干草および飼料粒子を除去した。23，300の相対遠心力で、60分間、該液体を遠心分離し、そして注意深く注ぐことにより、ペレットのゆるい最上層からの混入を避けながら、上清をデカントした。その後、上清を50ml  プラスチック試験管中に等分し、そして−20℃で凍結した。アッセイに使用するのに必要とされる場合、冷水中に試験管を立てることにより、瘤胃液上清を融解した。試験化合物またはコントロールを、4μl／ウェルで96ウェルアッセイプレートに分配した。その後、ウェル当たり100μlのSigmaアミラーゼ試薬577（指示に記載される体積の半分近く（すなわち577−20バイアルでは10ml））を各ウェルに添加した後、瘤胃液上清をウェル当たり100μl添加した。Anthosプレート読み取り装置を用い、この段階で405nmでのT＝0読み取りを行った。その後、およそ1．000Uの光学密度幅（window）が見られるまで（典型的には、37℃で1時間または室温で3時間）、プレートを室温または37℃でインキュベーションした。第二の読み取りを405nmで行い、そして第一の読み取り値をそこから減じた。活性化合物は、試験する薬剤を含まないコントロールと比較した際、光学密度読み取りに減少を引き起こす（図１）。
【０１１０】
【表１３】
2005336192.tif 000034
【０１１１】
瘤胃液グルコシダーゼアッセイプロトコル：
本アッセイを用い、比色アッセイを用いて、ウシ瘤胃液細胞懸濁物（RFCS）由来の細菌グルコシダーゼ活性阻害剤のIC50値を測定する。
【０１１２】
該アッセイは、マルトースのグルコースへの変換を測定する。瘤胃液細胞を、阻害剤の存在下でマルトースとインキュベーションし、そして産生されるグルコースの量を、赤色の比色終点を用い、評価する。阻害レベルがより高ければ、産生されるグルコースはより少なく、そして産生される赤色はより少ない。プレートは450nmで読み取る。
【０１１３】
主反応：
・マルトース  ＋  グルコシダーゼ  →  グルコース
グルコースアッセイ
・グルコース  ＋  ATP  →  G−6−PおよびADP（ヘキソキナーゼおよびMg2＋）
・G−6−PおよびNADP  →  6−ホスホグルコン酸（6−PG）およびNADPH
・NADPH  ＋  フェナジンメトスルフェート（PMS）  →nADP  ＋  PMSH
・PMSH  ＋  INT（塩化ヨードニトロテトラゾリウム）  →  PMS  ＋  INTH
INTHは深赤色である。
【０１１４】
1日2回、1．4kgのGH313および2．3kgの干草を与えた、瘻を形成した（fistulated）5歳齢の乳が出ない（dry）Guernseyドナー雌ウシ（cow）から、瘤胃液を収集した。瘤胃液は、あらかじめ温めた真空フラスコに収集した。その後、該液を、吸収ガーゼ（Robert  Bailey  plc、ストックポートのAbsorbent  gauze  BP、GAUZ4）の二重層を通じ、ろ過し、干草および飼料粒子を除去した。液体を相対遠心力650で、15分間、遠心分離し、飼料粒子および原生動物を除去した。上清を新たな試験管にデカントし、そして23，300の相対遠心力で、60分間、遠心分離した。上清およびペレットのゆるい最上層を廃棄した。ペレットを、元来の体積の1：8のPBS、すなわち400mlの瘤胃液由来のペレットでは50mlのPBSに再懸濁し、そして−20℃で凍結した。使用に必要とされる場合、冷水中に試験管を立てることにより、細胞を融解し、そしてその後、4．5μlの細胞／ウェル（45μl／ml）に希釈した。
【０１１５】
試験化合物またはコントロールを、2μl／ウェルで96ウェルアッセイプレートに分配した後、ウェル当たり50μlの10mMマルトースおよび50μl／ウェルの瘤胃液細胞懸濁物を添加した。プレートを37℃で1時間インキュベーションした。17mlのMillipore水および4mlの呈色試薬を各バイアルに添加することにより、Sigmaグルコース検出キット115Aを再構築した。ウェル当たり本溶液100μlを添加し、そしてプレートを37℃インキュベーターに45分間戻した。その後450nmでプレートを読み取った。活性化合物は、阻害剤を含まないコントロールウェルと比較した際、光学密度読み取りに減少を生じる。
【０１１６】
【表１４】
2005336192.tif 000035
【０１１７】
瘤胃細菌アミラーゼアッセイ−プロトコル2：
該アッセイはRemazol  Brilliant  Blue  Rに共有結合しているアミロースの消化を利用し、化合物が瘤胃液上清アミラーゼの作用を阻害するか測定する。不溶性基質をアミラーゼとインキュベーションすると、青い染料がウェル中に放出される。これを分光光度的に測定し、どのくらい多くのアミラーゼ活性が存在し、そして試験化合物がアミラーゼの阻害剤であるかどうかを決定することが可能である。
【０１１８】
1日2回、1．4kgのGH313および2．3kgの干草を与えた、瘻を形成した5歳齢の乳が出ないGuernseyドナー雌ウシから、瘤胃液を収集した。瘤胃液は、あらかじめ温めた真空フラスコに収集した。その後、該液を、吸収ガーゼ（Robert  Bailey  plc、ストックポートのAbsorbent  gauze  BP、GAUZ4）の二重層を通じ、ろ過し、干草および飼料粒子を除去した。23，300の相対遠心力で、60分間、該液体を遠心分離し、そして注意深く注ぐことにより、ペレットのゆるい最上層からの混入を避けながら、上清をデカントした。その後、上清を50ml  プラスチック試験管中に等分し、そして−20℃で凍結した。アッセイに使用するのに必要とされる場合、冷水中に試験管を立てることにより、瘤胃液上清を融解した。ウェル当たり100μlの2％  アミロース・アズール懸濁物（Sigma  A3508）を、基質の均一な分布を確実にするため、終始攪拌したビーカーから、各ウェルに添加した。試験化合物またはコントロールを、4μl／ウェルで96ウェルアッセイプレートに分配した後、瘤胃液上清をウェル当たり100μl添加した。その後、プレートを37℃で2．25時間、インキュベーションした。12チャンネルピペットを用い、各ウェルから100μlの液体を静かに除去し、新たな96ウェルプレートに移し、そして620nmで読み取った。活性化合物は、阻害剤を含まないコントロールウェルと比較した際、光学密度読み取りに減少を引き起こす。
【０１１９】
【表１５】
2005336192.tif 000036
【０１２０】
好気性生物における最小阻害濃度（MIC）の測定のためのプロトコル：
MICは、National  Committee  for  Clinical  Laboratory  Standards（NCCLS，M7  Edition  A2）にしたがい、標準的寒天希釈技術により、測定した。使用した方法の概略は、以下に詳細に記載する。
【０１２１】
MICは標準的試験培地、Mueller  Hinton（MH）寒天（Unipath）を用い、測定した。
寒天プレートの調製：19mlの培地を試験化合物の適切な二倍希釈（1ml）に添加し、そして完全に混合した。混合物をペトリ皿（90mm）に注ぎ、そして寒天を固まらせた。
【０１２２】
接種原（inoculum）の調製：試験生物の4ないし5つのコロニーをMH寒天プレートから10ml  MHブロス（Unipath）に接種した。ブロスが視覚的に濁るまで、37℃でインキュベーションした。生理食塩水（0．85％  v／v）の添加により、培養の密度を、0．5  McFarland標準のものと等価の濁度に調整した。
【０１２３】
寒天プレートの接種：プレートを、37℃インキュベーター中で、およそ1時間乾燥させた。Multipoint  Inoculator（Denley）を用い、プレートに接種した。本装置上のピンは、プレートに0．001mlの接種原（104−105生物に同等）を搬送する。
【０１２４】
プレートのインキュベーション：プレートを反転させ、そして37℃で18時間インキュベーションした。
終点の測定：MICは、単一コロニーまたは接種原により引き起こされるかすかな濁りを無視し、増殖を完全に阻害する、試験化合物の最低濃度として記録した。
【０１２５】
本節の参考文献：
【０１２６】
【化２１】
2005336192.tif 000037
【０１２７】
【表１６】
2005336192.tif 000038
＜以下の試験に用いられる食餌＞
（すべての食餌は、Grain  Harvesters  Ltd，  The  Old  Colliery，  Wingham，  Canterbury，  Kent  CT3  1LS，  Englandにより提供された。）
【０１２８】
【表１７】
2005336192.tif 000039
【０１２９】
【表１８】
2005336192.tif 000040
【０１３０】
【表１９】
2005336192.tif 000041
【０１３１】
【表２０】
2005336192.tif 000042
【０１３２】
＜慢性アシドーシスのモデルとして瘤胃シミュレーション技術（RUSITEC）を用いた、薬剤の評価＞
CzerkawskiおよびBreckenridge（1977）に最初に記載された、in  vitro瘤胃シミュレーション技術（RUSITEC）を用い、商業的なウシ濃縮飼料（GH313、以下を参照されたい）を用いて、毎日のpHプロフィールおよびVFA産生に対する、細菌α−アミラーゼおよび／またはα−グルコシダーゼ阻害剤アカルボースの効果を評価した。本飼料30g／日と共に2．5g／日のオオムギ（barley）藁を与えることにより、150mM以上の濃度、すなわちin  vivoで慢性アシドーシスと関連する濃度の総揮発性脂肪酸（VFA）を生じることが、以前見出されていた（Nagaraja，  Galyean  ＆  Cole、1998、上記）。
【０１３３】
装置：装置は、各々4つの発酵容器を含む、2つのRUSITEC装置からなる。各容器は、1リットルの体積を有し、そして水槽中で39℃に加熱した。ナイロンバッグ（14  x  9  cm、50μm）に入れ、そしてピストン手段（8打／分）を用い、飼料を穏やかに攪拌した。8チャンネル蠕動ポンプ（Watson  Marlow）により、およそ750ml／日の速度で、緩衝液（McDougall、1948）を連続注入した。20mlのシュウ酸溶液（12g／脱イオン水100ml）を含む1リットルのガラス瓶中に、流出物を収集した。これはさらなる微生物活性を阻害するため添加した。
【０１３４】
供給：各容器には、30gの商業的ペレット化飼料GH313（89％乾燥成分）および1−2  cmの長さに切断した2．5gのオオムギ藁（90％乾燥成分）を含むバッグを供給した。7gのコーンスターチ（Sigma  Cat．No．S4126）を、実験の最後の4日の供給時に、すべての発酵容器の液相に添加し、急性アシドーシスをシミュレーションした。
【０１３５】
瘤胃液ドナー：瘤胃液は、5歳齢の乳が出ないGuernsey雌ウシから収集した。動物に1．4kgのGH313および2．3kgの干草を1日2回与えた。瘤胃内容物は、瘤胃瘻を介し、収集した（Bar  Diamond  Inc．  P．O．  Box．  60．  Bar  Diamond  Lane．  Parma．  Idaho．  83660−0060．  U．S．A．）。
【０１３６】
容器接種：瘤胃内容物を、08：00時（朝の給餌前）に、瘻形成ドナー動物から採取した。成分をあらかじめ温めた保温フラスコ中で実験室に運び、そしてその後、4層のワタガーゼを通じ、別のあらかじめ温めた保温フラスコに漉し入れた。70gの固体残渣を8つのナイロンバッグ各々に量りいれた。瘤胃固体を含む1つのバッグ、および新鮮な飼料を含む新たなバッグを、各容器の飼料チャンバーに入れた。各容器の液体内容物は、100mlの脱イオン水、200mlの人工緩衝液および500mlの瘤胃液であった。容器を組み立てそして密封した後、水槽に入れ、そしてピストン棒を駆動バーに取り付けた。流出管は、収集フラスコ中に入れた。各容器の上部空間（head  space）にCO2を2分間流し、その後ピストン駆動モーターおよび緩衝液注入ポンプを始動させた。
【０１３７】
毎日の維持および試料採取法：これらの方法は、毎日同じ時間に行った。8つの飼料バッグを調製し、そして注入緩衝液を含む11の分配瓶を39℃に温めた。
1．駆動モーターを停止し、そして注入ポンプを止めた。注入ラインを締め、そしてポンプからはずした。
2．発酵容器を水槽から除きそして順に手入れした。
3．各容器に関し、飼料チャンバーを抜き取り、そして飼料バッグを交換した。第2日に新たなバッグで瘤胃固体を含むものを取り替え、一方、次の日、新たなバッグですでに48時間インキュベーションしたものを取り替えた。その後、チャンバーを発酵容器中に戻した。
4．除いたバッグを小さいプラスチックバッグ中に入れ、そして分配装置から25mlの緩衝液を添加した。緩衝液中で20秒間圧搾することにより、バッグを洗浄し、その後、液体を容器に注いだ。この洗浄過程を新鮮な緩衝液で2回繰り返した。
5．容器を再度組み立てた後、水槽に戻し、そして駆動バーに取り付けた。緩衝液ラインを再度つなぎ、そしてpH電極を再配置した。流出収集瓶を交換し、そして次の容器を手入れする間、容器上部空間をCO2で一掃した。
6．本過程をすべての容器に関して繰り返し、その後、ガス供給が完了したら、駆動モーターおよび注入ポンプを再始動した。最後の容器では、ガス供給は他の容器と同様の持続期間であった。
【０１３８】
アカルボースでの処理：アカルボースはGlucobayTM錠剤（Bayer、AAH  Pharmaceuticals）として得た。各錠剤は、100mgのアカルボースを含む。2つの飼料バッグの各々に1つの錠剤を添加し、100mg／容器／日を生じることにより、2つ組容器を0、1、10および100mg／日のアカルボースで処理した。より低い用量は、錠剤を10mlの緩衝液に溶解する／懸濁することにより（10mg／mlアカルボース溶液を生じる）、調製した。その後、本溶液の1mlを9mlの緩衝液に添加し、1mg／ml溶液を生じた。その後、各溶液の1mlを2つの飼料バッグの中身に添加し、10および1mg／容器／日を生じた。最後に、バッグを室温で一晩放置することにより、アカルボースを飼料上で乾燥した。
【０１３９】
解析：洗浄バッグ内容物を、オーブン中で、65℃で23時間、乾燥させることにより、48時間のインキュベーション後のナイロンバッグ由来の乾燥成分損失を測定した。流出試料（10ml）を毎日採取し、そして続くVFAおよび乳酸解析のため、−20℃で貯蔵した。Philip  Harris  Educationにより供給される装置を用い、pHは17分間隔で自動的に記録した。コンビネーション電極は、ふたの気密ポートを介し、各容器に取り付けた。各電極をSensorMeterにつなぎ、そして4つのSensorMeterを128のデータ自記計を加えた1つのDLにつないだ。記録されたpH値をPC作動Datadisk  32ソフトウェア（Philip  Harris  Education）にダウンロードし、そしてその後、さらなる解析のため、スプレッドシートに移した。電極を容器から除き（飼料バッグを交換する際）、リンスし、そしてpH  7．0標準緩衝液に入れた。読み取りは、実験を通じ、7．0±0．1単位であった。電極を容器に戻す前に、pH  7．0に再較正した。VFAは、25g／100mlのメタリン酸および1．2g／100mlのクロトン酸の混合物を含む溶液0．1mlを、1mlの流出物に添加することにより、測定した。本混合物を12000gで10分間、遠心分離し、そして上清のアリコットを自動試料採取バイアルに移した。VFAを分離し、そして自動試料採取装置およびフレームイオン化検出装置を備えたHewlett  Packard  6890シリーズ・ガスクロマトグラフ上で定量化した。酸を、SGE  Ltd  25メートルBP21カラム（0．33mm  O．D．、0．22mm  I．D．、0．25μmフィルム厚）上で分離した。キャリアガスとして、窒素を流速1．9ml／分で用いた。オーブンの温度は165℃であり、そして注入ポートおよび検出装置は250℃で維持した。濃度は、クロトン酸を内部標準として用いることにより計算し、そして酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸およびn−吉草酸を含む、標準溶液を用い、系を較正した。L−乳酸はSigmaキット826を用いて測定し、そしてD−乳酸は、L−LDHをD−LDH（SigmaカタログNo．L2011）で置き換え、そしてL−乳酸をD−乳酸（SigmaカタログNo．L0625）で置き換えた以外、同一の方法を用いて測定した。アッセイは96ウェルマイクロタイタープレート上で行い、そして340nmフィルターを備えたAnthosマイクロタイタープレート読取装置を用い、吸光度を測定した。0ないし100mMのD−およびL−乳酸溶液を調製することにより、系を較正した。
【０１４０】
スケジュール：
日
0    接種。
3    流出物収集開始。
5    毎日のpH測定開始。
10  容器対にアカルボースの投与開始（0、1、10または100mg／容器／日）。実験終了まで続ける。
18  すべての容器に追加のデンプンを添加する。
22  実験終了。
【０１４１】
本節の参考文献：
【０１４２】
【化２２】
2005336192.tif 000043
【０１４３】
＜Rusitecの結果：アカルボース＞
処理期間を、先行するコントロール期間と比較することにより、アカルボース100、10、1および0mg／容器／日の添加に反応し、−16％、−10％、＋3％および−3％のVFA産生における用量関連変化が示された。コントロールおよび処理期間の間のすべての処理で、酢酸およびプロピオン酸から酪酸への発酵産物の一般的なシフトがあり、上記の用量に関し、それぞれ134％、76％、27％および24％の酪酸産生の増加を生じた。本研究において、L−乳酸集積はなく、本モデルが急性アシドーシスより慢性アシドーシスに相当することが確認された（図２）。
【０１４４】
＜実施例8およびアカルボースを用いたRUSITECの結果＞
実験概要：
日々の維持は、アカルボースに関し上述されたとおりである。
【０１４５】
瘤胃液ドナー雌ウシ−GH313ペレットに加えオオムギ藁を与える。
日々の供給−30gのGH313ペレットに加え2．5gの切断オオムギ藁。
処理調製
アカルボース：錠剤1つを各バッグに添加し、100mg／容器／日を生じる。
【０１４６】
実施例8：8  x  57mgのあらかじめ重量測定した試料を380  2．1中で冷蔵庫に貯蔵した。飼料バッグをRUSITECに入れる前日、57mgの試料を2．28mlの緩衝液に溶解した（25mg／ml）。本溶液0．21mlを1．9mlの緩衝液に添加し、2．5mg／ml溶液を生じた。各溶液1mlを調製飼料バッグに添加し、25および2．5mg／mlを生じ、そして室温で一晩乾燥させた。
【０１４７】
スケジュール：
日
0    接種。
3    流出物収集開始。
5    毎日のpH測定開始。
9    データを再検討。容器を処理に割り当てる。
10  処理開始。
18  実験終了。
【０１４８】
結果および結論：本実験において、0．02mMの実施例8は、毎日のpHの平均において、0．2mMのアカルボースの0．7単位の増加に比較し、0．3単位の増加を生じた。1日当たり容器当たり、100mgのアカルボース、25または2．5mgの実施例8での処理、または未処理（コントロール）は、先行するコントロール期間と比較した際、総VFA産生において、−15％、−8％、−1％および−11％の変化を引き起こした。発酵産物の再分布には傾向があり、酪酸産生はコントロールと比較し、処理期間で増加していた。比率増加はそれぞれ、113％、20％、18％および1％であった。本研究において、L−乳酸集積はなく、本モデルが急性アシドーシスより慢性アシドーシスに相当することが確認された（図３）。
【０１４９】
＜in  vitro瘤胃プロピオン酸スクリーニング＞
試薬
瘤胃液：瘤胃瘻を備えた8歳齢の乳が出ないGuernsey雌ウシ（Bar  Diamond  Inc．  P．O．  Box．  60．  Bar  Diamond  Lane．  Parma．  Idaho．  83660−0060．  U．S．A．）に1．4kgのGH633および2．3kgの干草を1日2回与えた。本動物は瘤胃内容物の供給源として用い、該内容物は08：00時（朝の給餌前）に採取した。あらかじめ温めた保温フラスコ中で成分を実験室に運び、そしてその後、4層のワタガーゼを通じ、別のあらかじめ温めた瓶に漉し入れ、胃液をアッセイ試験管に分配するまで、該瓶を40℃のインキュベーターに貯蔵した。
【０１５０】
緩衝液：以下を脱イオン水に溶解する。
【０１５１】
【表２１】
2005336192.tif 000044
【０１５２】
1M  NaOHでpH  7．0に調整する。
酸素不含ガス混合物（窒素中の10％  CO2、5％  H2）を少なくとも5分間通気することにより、脱酸素する。
【０１５３】
基質混合物：
68g  コーンスターチ、例えばSigmaカタログS−4126。
17g  α−セルロース、例えばSigmaカタログC−6429。
【０１５４】
15g  I型ダイズ粉末、例えばSigmaカタログS−9633。
よく混合する。
使用直前、200mg／mlで緩衝液に懸濁する。
【０１５５】
メタリン酸／クロトン酸溶液：
以下を脱イオン水に溶解した。
25％（w／v）メタリン酸、例えばBDHカタログ291904Aに加え
1．2％（w／v）クロトン酸、例えばSigmaカタログC−4630
VFA標準混合物：
以下を100mlの脱イオン水に溶解した。
【０１５６】
【表２２】
2005336192.tif 000045
【０１５７】
1mlのメタリン酸／クロトン酸溶液を10mlのVFA混合物に添加し、その後、自動液体試料採取バイアルに等分した。
方法：
アッセイは、16mlのSorvall遠心管中で行った。
【０１５８】
100mgのアカルボースを含む錠剤を、10mlの緩衝液に入れ、そして錠剤が完全に破壊されるまで震蘯し、アカルボースの10mg／mlの溶液を得た。本溶液を、緩衝液で、2、0．4、0．08および0．016mg／mlに連続希釈した。
【０１５９】
これらの溶液の1mlを3つ組アッセイ試験管に添加した（最終アッセイ混合物濃度1000、200、40、8および1．6μg／mlを得た）。コントロール試験管は、アカルボース溶液を緩衝液で置き換えることにより、調製した。1mlの基質懸濁物をすべてのアッセイ試験管に添加した後、3mlの温めた脱気緩衝液を添加し、そしてその後、5mlの濾した瘤胃液を添加した。Suba−Seal栓（No．29）を取り付け、試験管の内容物が泡で覆われるまで、真空ラインにつながれている皮下注射針を栓に通すことにより、試験管の上部圧を減少させた。その後、試験管を40℃のインキュベーターに6時間入れ、そして1時間ごとに震蘯した。
【０１６０】
インキュベーション前のVFA濃度は、インキュベーションに関し3つの試験管を調製することにより測定したが、瘤胃液添加直後にメタリン酸／クロトン酸溶液1mlを添加した。これらの試験管は、4℃に貯蔵し、そしてインキュベーション後の試験管と共に処理した。
【０１６１】
栓を除去し、そして1mlのメタリン酸／クロトン酸溶液を添加することにより、6時間後にインキュベーションを終結した。その後、試験管を、4℃で、18，000gで8分間、遠心分離し、そして上清のアリコットを、ガスクロマトグラフィーによるVFA解析（RUSITECプロトコルで記載されるようなもの）に必要とされるまで、自動液体試料採取バイアルに貯蔵した。
【０１６２】
結果の計算：
インキュベーション中の総VFAおよびプロピオン酸産生は、以下のように決定した。まず、インキュベーション前試料の解析の手段として、インキュベーション前の総VFAおよびプロピオン酸濃度を計算した。その後、各インキュベーション試料に関し、インキュベーション後の濃度からインキュベーション前の濃度を引き、インキュベーション中の産生を得た。インキュベーション中に産生された総VFA中のプロピオン酸のモル比率もまた、計算した。
【０１６３】
総VFAおよび％プロピオン酸値を、複製試験管に関し平均し、そして平均コントロール総VFAおよび％プロピオン酸値を100％に規準化し、その後、試験処理により引き起こされた変化を、この値に相対し、表した。
【０１６４】
【表２３】
2005336192.tif 000046
【０１６５】
＜瘻形成ウシにおけるin  vivo試験＞
目的：試験するための薬剤、この場合はアカルボースの、瘻形成ウシにおいて誘導された慢性瘤胃アシドーシスに対する影響を決定すること。慢性アシドーシスに典型的な瘤胃pHプロフィールは、指定の食餌の濃縮給餌レベルの段階的な増加、および提供される粗飼料の減少により、誘導された。この後、永続的な瘤胃瘻を介し投与されるアカルボースで、各動物を処置し、瘤胃pHを正常化する能力を評価した。
【０１６６】
実験動物：6頭の瘻形成Hereford  x  Friesian雄ウシ（steer）、体重170−230kg（Cwmnant  Calves  Ltd．Cwmnant、Tregaron、Ceredigionより供給）
処置：Glucobay（登録商標）。錠剤当たり、アカルボース100mg。
【０１６７】
管理：ウシには、GH651ウシ高シリアル肉牛ペレット（多様な量）をオオムギ藁（多様な量）と共に、2つの等量の給餌に分け、毎日およそ08．00時および14．30時に与えた。正確な給餌時間を記録した。水は好きなときに入手可能であった。ウシは、環境的に16℃に調節された建物中で、個別に囲い（囲い当たり9平方メートル）に収容した。
【０１６８】
【表２４】
2005336192.tif 000047
【０１６９】
慢性アシドーシスが誘導されている間、手動のpH測定は、朝の給餌のおよそ5および8時間後に行った。VFAおよび乳酸解析のため、瘤胃液試料を採取した。適切なpHプロフィールが生成されたら（方法の項を参照されたい）、直ちに、各雄ウシに引き具を付け、自動化pH試料採取および記録装置（Philip  Harris  Plus  128  Data  logger  ＋  p．H．  First  Sense  Recorder）に取り付けた。瘤胃pH値は、最大21日間、17分ごとに自動的に記録した。瘤胃液試料（10ml）はVFAレベル、モル比および乳酸レベルの測定のため、1日2回採取した。これらは両方の投薬時間に瘤胃にアカルボースを添加する直前に収集した（瘤胃内容物試料を、小さいステンレス鋼ひしゃくで手で除去し、ろ過し、そして10mlポリプロピレン試験管に移すことによる）。pHプローブは、朝の給餌直前に、清浄にし、そして再較正するため、除去した。
【０１７０】
結果：毎日のpH曲線は、瘤胃pHがpH  5．5以下になる期間、そしてしたがって慢性アシドーシスを示す期間を計算するのに用いた。
瘤胃液は、13：00および16：00、すなわち午後の給餌前および後に採取した。13：00の試料では総VFA濃度にほとんど違いはなかったが、14：00の試料のVFA濃度は、処置期間中に低下した。これはpHプロフィールと一致した。すべての試料採取時間で、プロピオン酸のパーセンテージは、処置期間中に低かった。瘤胃液試料中に乳酸の集積はなく、動物が該実験中に急性アシドーシスを経験しなかったことを示す（図４）。
【０１７１】
＜乳を分泌している乳牛におけるアカルボースの有効性＞
本研究は、非常に発酵可能な食餌を提供することにより、慢性アシドーシスが誘導されている、乳を分泌しているウシにおける、瘤胃pH、牛乳収量および牛乳組成に対する、アカルボースの影響を測定した。本研究は、アカルボースの導入および除去に対する適応速度の測定を含んだ。
【０１７２】
実験動物は、常設瘤胃カニューレを付けた、5および11歳齢の間で、500−750kgの、6頭の乳を分泌している複産（multiparous）Holstein／Friesian雌ウシであった。動物が、初期乳分泌中であって、乳分泌のピークにないときに実験を開始し、より高い実験感度を可能にした。本研究における主な測定は、瘤胃の腹側嚢のpH、牛乳収量および牛乳組成であった。
【０１７３】
管理実施は、Housing  and  Care  of  Animals  Used  in  Scientific  Procedures（1989）に関する英国内務省実施条例に従った。
設計：研究に登録された動物は、以下に記載される開始時点から連続21日間、試験物品を投与された。
【０１７４】
【表２５】
2005336192.tif 000048
【０１７５】
方法：
マスキング／バイアス減少法：6頭の乳を分泌している複産Holstein／Friesian雌ウシを、第1日に研究に登録した。出産日（calving  date）に基づき、動物を対にした（同様の出産日のウシを共に対にした）。各対中で、1頭の動物にT01を行い、そしてもう一方にはT02を行った。処置は無作為に割り当てた。可能な場合、処置群当たりの平均飼料摂取が同様になるように、無作為化に制約を加えた。
【０１７６】
方法：第0日のおよそ2週間前に、8頭の動物で、瘤胃においてアシドーシスpHレベルを誘導する給餌計画を同定するよう設計された、予備的給餌期間を開始した。各雌ウシは、この時点から研究の完了時まで、拘束牛舎（tie  stall）に保持した。コントロール総混合飼料（TMR）を給餌し、そして必要な場合、量および組成を調整し、5．0−5．5の最小瘤胃pHを確立した。予備期間の最後の5日間に渡る平均摂取を計算し、そして試験中、この平均量を各動物に提供した。毎日朝の給餌前に、未消費の飼料を除き、そして重量測定した。
【０１７７】
TMRには、添加物を含まない（コントロール）または試験物品（アカルボース1日当たり15g）を含む、0．5kg／日の粉末化コムギを補い、そして朝および午後の給餌中、等量ずつ別個に提供した。やはり自動給水系を用い、水を好きなときに提供した。
【０１７８】
TMR組成：
【０１７９】
【表２６】
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【０１８０】
研究開始時から、1日2回、およそ06．30時および16．00時に、パイプライン系を通じ、すべての動物の搾乳をした。牛乳収量重量は、手動で記録し、そしてその後、コンピューター上の毎日の牛乳量のファイルに書き換えた。
【０１８１】
第1日に、獣外科医が各動物を身体的に調べ、身体的および臨床的正常性を評価した。動物はすべての含有規準を満たし、そしてどの排除規準も満たさなかった。
第0日に、設計に記載した試験物品給餌計画を開始した。3頭の動物は、3つの連続した試験期間で、コントロール／処置／コントロール（A／B／A）設計にしたがい、一方、第二群の3頭の動物は、反対の処置順（B／A／B）にしたがった。実験給餌期間は3週間続き、適合のための2週間および詳細な測定のための1週間からなった。
【０１８２】
動物には等しくない間隔で、およそ08．00時および15．00時（すなわち7および17時間間隔）に1日2回給餌し、pH測定のための瘤胃試料採取が最小pHの期間中（第二の給餌後、2−4時間と概算される）に集中するのを可能にした。各動物には、2つの給餌に等しく分け、そして添加物を含まない（補足物A）または試験物品を含む（補足物B）、TMRに対する0．5kg／日の粉末化コムギ補足物を提供した。
【０１８３】
各動物は、第62日の第三の実験期間の最終pH測定後、研究を完了した。
測定：自動化pH測定装置（Philip  Harris  Plus  128  Data  logger  ＋  pH  First  Sense  Recorder）を用い、17分ごとに瘤胃pH値を記録した。07．30時に採取した瘤胃液の10ml−15mlの試料およびほぼ最小pH（およそ18．00時および20．00時）で採取された2つの試料を、さらなる解析のため、−20℃で直ちに凍結した。提供されたTMRおよび拒絶されたTMRの新鮮重量を、各動物に関し毎日記録した。非測定週中（すなわち予備期間および各実験期間の適合第1週および2週）、主な飼料構成要素（草およびトウモロコシ・サイレージ）の乾燥成分（DM）をほぼ毎週（またはサイレージの視覚的評価から必要と思われた場合、より頻繁に）測定した。測定週（すなわち各実験期間の第3週）には、TMRのDMを最後の5日間、毎日測定し、一方、続く食餌解析のため、同じ5日間から、個々のTMR構成要素の各々（草サイレージ、トウモロコシ・サイレージ、濃縮混合物、粉末化コムギ）のバルクを調製した（すなわち期間当たり、主な飼料各々の1試料）。Regumaizeは単一のバルク液体であるため、試験中、1試料のみを採取した。各実験期間の最後の5日間中、拒絶されたものをDM測定のため試料採取した。脂肪、タンパク質およびラクトースのため、各適合週に、1日おきに3回、amおよびpm搾乳時に、単一の20ml牛乳試料を採取した。測定週中は、最後の連続5日間、牛乳試料を採取した。各牛乳試料は別個に解析した。さらに、測定週中、牛乳を試料採取する各場合に、さらに20mlの牛乳試料を採取し、そして続く解析の可能性に備え、およそ−20℃で直ちに凍結した。毎日の牛乳収量データは、既定の日の朝および午後の搾乳を総計することにより、生成した。各動物に関し、各実験期間中、生存重量を測定した。
【０１８４】
結果：瘤胃pHは、処置およびコントロール期間に関し、pH  5．5以下（すなわち慢性アシドーシスの状態にある）の時間として計算した。pH  5．5以下の時間は、コントロール期間では4．3時間、そして処置期間では3．4時間だった。処置動物では乳脂肪が劇的に増加し、1日当たり平均1033グラムから、1日当たり1281グラムになった。牛乳中の脂肪の比率もまた増加し、32．8g／lから46．1g／lになった。
【０１８５】
＜急性アシドーシスモデル：アカルボースの評価＞
【０１８６】
【表２７】
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【０１８７】
方法：10頭の乳が出ないHolstein雌ウシおよび未経産ウシ（heifer）を、処置前期間中、集団で収容し、そして実験期間中、個々に収容した。試料収集、処置および最初の攻撃（challenge；負荷）中、動物を前部ゲート（head  gate）に移動させた。続いて、個々の囲いで試料採取し、そして投薬した。動物には、2回の給餌で提供される、およそ5kgのムラサキウマゴヤシ（alfalfa；アルファルファ）干草、16kgのサイレージ、6kgの濃縮物および5kgの藁を、毎日、総混合飼料で与えた（60：40  濃縮物：粗飼料食餌）。動物には、処置前期間のみ、寝藁を与えた。水は好きなときに提供した。動物は、処置を投与する前に、少なくとも10日間、乳分泌飼料に適応させた。6頭の乳が出ない雌ウシおよび5頭の乳分泌していない未経産ウシの群から、先の攻撃への曝露および全身の健康状態に基づき、10頭を選択した。動物を体重により対にし、そして対内で、コントロールおよびアカルボース処置群に無作為に割り当て、未経産ウシおよび雌ウシの同様な分布を確実にした。処置第0−6日、AM（07：30）およびPM（16：00）給餌の直前に、瘤胃カニューレを通じ、〜200mlの水に溶解した1．07mgのアカルボース／kgを動物に投与した。処置1動物には、等量の水のみを投与した。第7および8日、各動物にカニューレを通じ、攻撃剤を投与した。pHが〜4．5に達し、そしてL−乳酸産生の徴候があったら、急性アシドーシスが誘導されたとみなされた。これらの規準により、動物が急性アシドーシスを経験しているとき、瘤胃内容物を除去し、そして瘤胃にドナー動物由来の瘤胃内容物を接種した。アカルボース投薬および攻撃剤量を計算するため、第1および5日に動物の重量測定をした。瘤胃液pHを測定するため、動物に引き具を付け、自動化pHデータ記録系を取り付けた。瘤胃pHは、攻撃中、動物が急性アシドーシスを経験するまで、10分ごとに記録した。ろ過試料採取管を通じ、瘤胃カニューレから瘤胃液試料を採取した（〜50ml）。試料採取時間は、各攻撃直前、および各攻撃の3、6、8、10および12時間後であった。pHは、直ちに測定した。VFAおよび乳酸解析のための試料は、10mlの瘤胃液を、収集直後に、25g／100ml  メタリン酸および1．2g／100ml  クロトン酸の混合物を含む溶液1mlに添加することにより、調製した。いくつかの場合、pH測定および酸処理前に、ガーゼを通じ試料をろ過した。本混合物を12000gで10分間、遠心分離した。Sigmaキット826を用い、直ちに乳酸解析を行うため、上清のアリコットを1つ除去し、続く乳酸解析のため、1つを凍結した。第三のアリコットは、続くVFA解析のため、自動試料採取バイアルに移した。研究中、Sigmaキット735を用い、L−乳酸の初期測定を行い、アシドーシス状態を確かめた。続いて、以下に記載されるような統計解析のため、DおよびL−乳酸を再測定した。VFAは、自動試料採取装置およびフレームイオン化検出装置を備えたHewlett  Packard  6890シリーズ・ガスクロマトグラフ上で測定した。酸を、SGE  Ltd  25メートルBP21カラム（0．33mm  O．D．、0．22mm  I．D．、0．25μmフィルム厚）上で分離した。キャリアガスとして、窒素を流速1．9ml／分で用いた。オーブンの温度は165℃であり、そして注入ポートおよび検出装置は250℃で維持した。濃度は、クロトン酸を内部標準として用いることにより計算し、そして酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸およびn−吉草酸を含む、標準溶液を用い、系を較正した。
【０１８８】
＜結果＞
結果：
pH：攻撃に関し、pHデータは、瘤胃pHが切り捨て範囲以下であった時間の計算として示す。第一の攻撃は急性アシドーシスを誘導しなかったが、第二の攻撃後、コントロールのウシの4頭が4．5以下の瘤胃pH値を有した。pH  4．5以下の期間が短いのは、この時点で研究から除外されたためであった。瘤胃pHは、すべての処置ウシで5．0より上のままであり、アカルボースが、炭水化物攻撃後の急性アシドーシスを予防したことを示す。アシドーシスになるウシの数を減少させる処置効果は、単純な分割表解析により、有意である（P＜0．5）ことが示された。
【０１８９】
乳酸：第一の攻撃後に乳酸は検出されなかったが、第二の攻撃の10時間以内に、5頭のコントロールのうち4頭に関し、レベルは＞50mMに増加し、そしてアカルボース処置動物のすべてでゼロのままであった。第五のコントロールは、〜5．0のpHを有し、乳酸は6mMの最大レベルを有した。第二の攻撃由来の平均D−、L−、および総乳酸を、表に要約する。すべての乳酸は、処置群よりコントロール群でより高く、そして処置に関し、時間相互作用による傾向があった（相違は時間と共に大きくなった）。
【０１９０】
【表２８】
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【０１９１】
図５に、第二の炭水化物攻撃に対する、個々の動物のpH反応を示す。
考察／結論：1日2回アカルボース処置を行うと、高炭水化物負荷に対するpH反応が減少し、負荷に反応したL−乳酸産生が遮断された。第一の攻撃に対するpH反応は、2つの群に関し、同様であった：違いが認められたのは、第二の攻撃であった。これは、急性アシドーシスが多数の攻撃後に誘導される、Coweら（J．  Anim．  Sci．  77：2259，  1999）の観察と同様である。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は、瘤胃細菌アミラーゼアッセイにおけるアカルボースの用量反応（アカルボース濃度はモル単位）を示す。
【図２】図２は、アカルボースで処置したRusitec慢性アシドーシスモデルにおける毎日の平均pHを示す。
【図３】図３は、Rusitec慢性アシドーシスモデルにおける毎日のpHの平均に対するアカルボースまたは実施例8での処置の効果を示す。
【図４】図４は、コントロールおよびアカルボース処置期のpH  5．5以下の時間を示す。
【図５】図５は、第二の炭水化物攻撃後の、pH切り捨て値以下の時間を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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