(57)【要約】【課題】  本発明は、次世代に高効率で子孫伝達可能なヒト人工染色体とその利用方法に関する。【解決手段】  （a）再配列されていないヒト抗体重鎖遺伝子座、（b）再配列されていないヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、および（c）再配列されていないヒト抗体λ軽鎖遺伝子座を保持するヒト抗体産生マウスであって、（a）、（b）および（c）の少なくとも一つがヒト由来染色体断片上に保持されており、（a）、（b）および（c）の少なくとも一つがマウス染色体に挿入されており、さらに少なくとも内因性重鎖の両アレルおよび内因性κ軽鎖の両アレルが不活性化されており、該マウスの血清中にヒト抗体重鎖、ヒト抗体κ軽鎖、およびヒト抗体λ軽鎖を発現する、前記マウス。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）再配列されていないヒト抗体重鎖遺伝子座、（b）再配列されていないヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、および（c）再配列されていないヒト抗体λ軽鎖遺伝子座を保持するヒト抗体産生マウスであって、（a）、（b）および（c）の少なくとも一つがヒト由来染色体断片上に保持されており、（a）、（b）および（c）の少なくとも一つがマウス染色体に挿入されており、さらに少なくとも内因性重鎖の両アレルおよび内因性κ軽鎖の両アレルが不活性化されており、該マウスの血清中にヒト抗体重鎖、ヒト抗体κ軽鎖、およびヒト抗体λ軽鎖を発現する、前記マウス。
【請求項２】
ヒト由来染色体断片上に保持された再配列されていないヒト抗体重鎖遺伝子座、マウス染色体に挿入された再配列されていないヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、およびヒト由来染色体断片上に保持されたヒト抗体λ軽鎖遺伝子座を保持するものである、請求項１に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項３】
ヒト抗体重鎖遺伝子座が、ヒト由来染色体断片上に保持されるものである、請求項１に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項４】
ヒト抗体重鎖遺伝子座が、ΔHACまたはΔΔHAC上に保持されるものである、請求項３に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項５】
ヒト抗体λ軽鎖遺伝子座が、ヒト由来染色体断片上に保持されるものである、請求項１に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項６】
ヒト抗体λ軽鎖遺伝子座が、ΔHACまたはΔΔHAC上に保持されるものである、請求項５に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項７】
ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座がマウス染色体に挿入されたものである、請求項１に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項８】
ヒト抗体κトランスジーンKco5がマウス染色体に挿入されている、請求項７に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項９】
ヒト抗体重鎖遺伝子座およびλ軽鎖遺伝子座がΔHACまたはΔΔHAC上に保持されたものであり、ヒト抗体κトランスジーンKco5がマウス染色体に挿入されている、請求項１に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項１０】
マウスがキメラマウスではないことを特徴とする、請求項１に記載のヒト抗体産生マウス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマウスを免疫し、該マウスよりポリクローナル抗体を得ることを含む、抗体の作製方法。
【請求項１２】
ポリクローナル抗体がマウスの血液から得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマウスを所望の抗原で免疫し、次いで、該マウス由来の脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖を含むモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマウスを所望の抗原で免疫し、次いで、該マウス由来の脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマからヒト抗体遺伝子の少なくとも可変領域部分を単離し、該ヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、該抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖の少なくとも可変領域部分を含むモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマウスを所望の抗原で免疫し、該マウスのB細胞由来のヒト抗体遺伝子の少なくとも可変領域部分をファージディスプレイ法により選抜し、選抜されたヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、該抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖の少なくとも可変領域部分を含むモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体あるいはその断片を改変し、次世代に高効率で子孫伝達可能となるヒト人工染色体、該ヒト人工染色体を次世代に高効率で子孫伝達する非ヒト動物およびその子孫、該非ヒト動物またはその子孫からの抗体の作製方法、ならびにヒト抗体産生マウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体断片を含むミクロセルと分化多能性を有する細胞との融合により得られるハイブリッド細胞からキメラ動物を作製する技術（WO97/07671；特許文献１）の開発により、従来不可能であった長大な外来遺伝子を保持する非ヒト動物の作製が可能になった。
【０００３】
非ヒト動物に導入される染色体断片を改変することにより、（１）不要な遺伝子の除去、（２）所望の遺伝子の付加、（３）染色体断片の安定化等を行い得ることは有用である。WO98/37757（特許文献２）には、非ヒト動物に導入される染色体断片の改変方法の概要ならびにニワトリ由来のDT-40細胞に保持されたヒト染色体にテロメア配列をターゲティングし、高効率で所望の欠失染色体を取得できたことが記載されている。また、マウスＥＳ細胞およびマウス個体において安定に保持され、かつ子孫伝達効率の高いヒト染色体断片について記載されている。さらに、WO00/10383（特許文献３）には、ヒト染色体上の所望の領域を安定な染色体断片（染色体ベクター）に転座させた、より安定なヒト人工染色体（Human Artificial Chromosome；以下、HACと略記することがある）の作製方法が記載されている。
【０００４】
近年、黒岩ら（Nature Biotech. 18:1086, 2000；非特許文献１）は、メガベース（Mb）サイズの特定ヒト染色体領域をインサートとして保持するヒト人工染色体（HAC）の作製に世界で初めて成功した。このHAC（λHAC）は、安定かつ子孫伝達可能なヒト14番染色体由来のSC20断片を染色体ベクターとして用い、このベクターにヒト22番染色体上のヒト抗体λ軽鎖遺伝子を含む10Mbサイズの染色体領域をインサートとして転座しクローニングすることによって得られた人工染色体である。彼らは、このλHACがベクターとして用いたSC20断片とほぼ同等の安定性を持つことを示し、様々な不安定染色体由来の領域をSC20へ転座クローニングすることで安定化できる可能性を示した。さらに、このλHACをマウスへ導入し、安定にλHACを保持するキメラマウスの作出に成功した。
【０００５】
非ヒト動物における導入ヒト染色体の次世代への子孫伝達は、交配による均一な性質を持ったトランスクロモソミック動物(異種染色体断片が生殖系列を経由して子孫伝達された、非ヒト動物のことをいう。)の大量生産という点のみならず、導入ヒト染色体の生殖系列を介した構造・機能解析という点でも重要である。今まで、数種類のヒト染色体がマウスへ導入されてきたが、その子孫伝達能は導入ヒト染色体の構造に依存していると考えられる。子孫伝達のためには、第一にES細胞が高い効率で生殖細胞へ寄与しているキメラ率の高いキメラマウスを得ることが必須条件であるが、このキメラ率は導入染色体上にどのようなヒト遺伝子が存在しているのかという導入ヒト染色体の構造が関与していると考えられる。例えば、ヒト2番、14番染色体断片を導入した場合には100%キメラ率に近いキメラマウスが得られ、その子孫伝達効率も高い（Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-727, 2000；非特許文献２）のに対して、ヒト22番染色体断片を導入した場合には50%以下の低キメラマウスがほとんどである。これは、ヒト22番染色体上にはマウスの発生に悪影響を及ぼす有害なヒト遺伝子が存在していることに起因しているかもしれない。実際に、ヒト抗体Igλ遺伝子が存在するヒト22番染色体上の22q11領域には猫目症候群、DiGeorge症候群、der22症候群などの遺伝子発現量依存性の遺伝病原因領域が存在していることが報告されている（例えば、A.Puechら、PNAS 97:10090, 2000；非特許文献３）。前述したように、これらの遺伝病領域を取り除き、ヒト22番染色体上のHCF2遺伝子座からLIF遺伝子座までの10MbのみをSC20染色体ベクターへ転座クローニングしてλHACを構築し、マウスへ導入した結果、λHACを保持するES細胞から誕生したキメラマウスのキメラ率はヒト22番染色体全長を導入した場合と比較すると高まったことが報告されている。
【特許文献１】WO97/07671号パンフレット
【特許文献２】WO98/37757号パンフレット
【特許文献３】WO00/10383号パンフレット
【非特許文献１】黒岩ら、Nature Biotech. 18:1086, 2000年
【非特許文献２】Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-727, 2000年
【非特許文献３】A.Puechら、PNAS 97:10090, 2000年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況下で、本発明者らは、従来のλHACに比してより効率的な子孫伝達を達成する目的で、さらなるヒト人工染色体の改良を試み、その子孫伝達効率の検討を行った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ヒト22番染色体あるいはその断片を改変し、次世代に高効率で子孫伝達可能であるヒト人工染色体、ならびに該ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物およびその子孫を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明はまた、該非ヒト動物またはその子孫を用いてヒト抗体を作製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒト22番染色体を改変し、抗体λ軽鎖遺伝子（Igλ）領域を含む構造が明らかな２種類の領域を選出し、該選出領域の各々をヒト14番染色体断片に転座させたヒト人工染色体を構築し、これらを保持する高キメラ率マウスを作出した。その結果、本発明者らは、該キメラマウスにおいて、該ヒト人工染色体が減数分裂を経て次世代の子孫へ高効率で伝達することを観察し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明は、一の態様において、ヒト22番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む約3.5Mb〜約1Mb領域と、非ヒト動物の生殖系列を経由して子孫伝達されうる別のヒト染色体由来の染色体断片が結合したものである、ヒト人工染色体を提供する。
【００１１】
その一の実施形態において、前記の別のヒト染色体由来の染色体断片は、安定でかつ子孫伝達可能な任意のヒト染色体断片であればいずれでもよく、例えば、ヒト14番染色体断片、ヒト21番染色体またはその断片、あるいはヒト1番染色体1p22領域を含むSAC(small accessory chromosome) (Genome Res., 11:124-136, 2001)など、好ましくはヒト14番染色体断片、例えば、ヒト14番染色体由来のSC20染色体ベクター（黒岩ら、前出）である。該SC20染色体ベクターは、例えば、14p12部位に位置するRNR2遺伝子座にloxP配列を相同組換えにより挿入することにより、所望の染色体断片をクローニングするために使用することができる（黒岩ら、前出）。SC20染色体ベクターを保持するニワトリDT-40細胞（SC20）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００１年５月９日付けで国際寄託され、受託番号FERM BP−7583が与えられている。前記の別のヒト染色体由来の染色体断片は、WO97/07671に開示された方法により、好ましくは大きさが約20Mb以下の種々のヒト染色体断片について該染色体断片を保持するキメラ非ヒト動物を作製し、前記キメラ非ヒト動物の子孫において前記ヒト染色体断片が安定に保持されるものを選抜することによっても取得することができる。前記ヒト22番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域と、子孫伝達可能なヒト染色体断片との結合は、loxP配列などの、部位特異的組換え配列を介した転座あるいは挿入により行われる。抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域が、後述の実施例において示される如く、テロメア配列とloxP配列を両端として切り出される場合には転座による結合が起こる。一方、両端にloxP配列を挿入することにより抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域が切り出される場合には、子孫伝達可能なヒト染色体断片上のloxP配列部位への挿入が起こる。
【００１２】
別の実施形態において、ヒト22番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域は、約2.5Mb〜約1.5Mbの大きさである。
別の実施形態において、ヒト22番染色体由来の抗体λ軽鎖遺伝子を含む領域は、約2.5Mbまたは約1.5Mbの大きさである。このような大きさの該領域の具体例はそれぞれ、受託番号FERM BP-7582であるニワトリDT-40細胞（ΔHAC）に保持されるΔHAC、および受託番号FERM BP-7581であるニワトリDT-40細胞（ΔΔHAC）に保持されるΔΔHACからなるヒト人工染色体である(後述の実施例参照)。
【００１３】
本発明はまた、別の態様において、上記の本発明ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物を提供する。本明細書中、非ヒト動物とは、ヒトを除く脊椎動物、好ましくは哺乳動物をいう。
その一の実施形態において、非ヒト動物は、ΔHACまたはΔΔHACのいずれかのヒト人工染色体を保持する。
その別の実施形態において、非ヒト動物が哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、マウスである。
【００１４】
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明ヒト人工染色体を非ヒト動物の胚性幹細胞（ES細胞）中にミクロセル法により導入すること、得られたES細胞を該非ヒト動物の胚に注入すること、得られた注入胚を仮親に移植すること、該仮親からキメラ非ヒト動物を出産により得ること、該キメラ非ヒト動物を、該ヒト人工染色体についてスクリーニングすることを含む、非ヒト動物の作製方法を提供する。
【００１５】
ES細胞への導入に際して、ヒト人工染色体を保持するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を作製し、該CHO細胞を介して該ヒト人工染色体をES細胞に導入してもよい。
【００１６】
その一の実施形態において、上記方法は、上記スクリーニングされたキメラ非ヒト動物の子孫を作出し、該子孫を上記ヒト染色体についてスクリーニングすることをさらに含む。
【００１７】
別の実施形態において、前記方法によって得られる非ヒト動物は、ヒト抗体免疫グロブリン重鎖およびλ鎖蛋白質を発現可能である。
また別の実施形態において、非ヒト動物が哺乳動物、好ましくはマウスである。
【００１８】
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明方法によって得ることができる、上記の本発明ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明非ヒト動物の子孫動物を提供する。子孫動物は、本発明ヒト人工染色体を保持することを特徴とする。
【００２０】
その一の実施形態において、子孫動物は、ヒト抗体免疫グロブリン重鎖およびλ軽鎖蛋白質を発現可能である。
別の実施形態において、子孫動物は、ヒト抗体免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖およびλ軽鎖蛋白質を発現可能である。
別の実施形態において、子孫動物はマウスである。
【００２１】
本発明はさらに、上記の本発明非ヒト動物、または上記の本発明子孫動物を、所望の抗原で免疫し、該動物から該抗原に対するヒトポリクローナル抗体を得ることを含む、抗体の作製方法を提供する。
その実施形態において、前記ヒトポリクローナル抗体は動物の血液から得られる。
【００２２】
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明マウス、あるいは上記の本発明子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスからの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明マウス、あるいは上記の本発明子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスからの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマからヒト抗体遺伝子を単離し、該ヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明マウス、あるいは上記の本発明子孫マウス、を所望の抗原で免疫し、次いで、該マウスのＢ細胞由来の抗体遺伝子をファージディスプレイ法により選抜し、選抜されたヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、抗体の作製方法を提供する。
【００２５】
ここで上記発現のための方法は、公知の方法（例えば、Sambrookら, Molecular Cloning A Laboratory Manual, second ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される方法）によって実施し得る。宿主としての動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞は、例えば、CHO細胞、BHK細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、パン酵母細胞、SF9細胞等である。
【００２６】
本発明はさらに、別の態様において、血清中にヒト抗体Ｉｇγアイソタイプを含むヒト抗体重鎖、ヒト抗体κ軽鎖およびヒト抗体λ軽鎖を発現する、ヒト抗体産生マウスを提供する。当該ヒト抗体産生マウスは、再配列されていない、ヒト抗体重鎖遺伝子座、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座を保持し、少なくとも内因性抗体重鎖およびκ軽鎖の両アレルが破壊または不活性化されている。
【００２７】
上記ヒト抗体産生マウスでは、Ｂ細胞の分化に伴いヒト抗体遺伝子の再配列による特定可変領域断片の連結（重鎖ではＶ−Ｄ−Ｊ、軽鎖ではＶ−Ｊ）が生じ、好ましくはＢ細胞の成熟に伴い抗体遺伝子の可変領域における体細胞変異を経た後、血清中に当該遺伝子産物であるヒト抗体が産生される。
【００２８】
すなわち、「再配列されていない」とは、抗体遺伝子座が、重鎖においてはＶ−Ｄ−Ｊ組換え、軽鎖においてはＶ−Ｊ組換えを起こしておらず、Ｂ細胞の分化に伴い重鎖においてはＶ−Ｄ−Ｊ組換え、軽鎖においてはＶ−Ｊ組換えを起こしうる状態で、マウスの未分化なＢ細胞に保持されていることをいう。
【００２９】
その一の実施形態において、上記ヒト抗体産生マウスは、ヒト抗体κ軽鎖の可変領域の少なくとも40％を保持する。
別の実施形態において、上記ヒト抗体産生マウスは、ヒト抗体重鎖、ヒト抗体κ軽鎖、およびヒト抗体λ軽鎖のすべての可変領域を保持する。
また別の実施形態において、ヒト抗体重鎖遺伝子座、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座は、ヒト由来の染色体断片上に保持される。
さらに別の実施形態において、ヒト抗体重鎖遺伝子座およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座は、ΔHACまたはΔΔHACのいずれかのヒト人工染色体上に保持される。
さらに別の実施形態において、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座は、ヒト由来の染色体断片上に保持される。
さらに別の実施形態において、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座は、マウス染色体に挿入される。
【００３０】
さらにまた別の実施形態において、上記ヒト抗体産生マウスはキメラマウスではないことを特徴とし、好ましくは上記ヒト抗体重鎖遺伝子座、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子座、およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子座を子孫伝達しうる。
【発明の実施するための最良の形態】
【００３１】
１．ヒト人工染色体（HAC）、およびトランスクロモソミック非ヒト動物の作製とその利用
本発明は、ヒト22番染色体上のIgλ遺伝子を含む断片を、ヒト14番染色体に由来する染色体断片に転座、クローニングした新規ヒト人工染色体の構築、該ヒト人工染色体のマウスでの子孫伝達および該ヒト人工染色体を保持するトランスクロモソミック非ヒト動物（例えば、マウスなどの哺乳動物）の作製に関する。
【００３２】
本明細書中において、ヒト人工染色体とは、ヒト染色体上の所望の領域を安定な染色体断片（染色体ベクター）に転座させて作製された、人工染色体（HAC:Human Artificial Chromosome）をいう。また、トランスクロモソミック非ヒト動物とは、異種染色体断片が生殖系列を経由して子孫伝達された、ヒト以外の動物をいう。
【００３３】
ヒト人工染色体は、例えば、loxP配列およびヒトテロメア配列をヒト染色体上の目的遺伝子領域の近傍に相同組換えにより挿入し、両配列に挟まれた目的遺伝子領域周辺のみを別の染色体断片（安定でかつ子孫伝達可能な染色体断片であることが望ましい；ヒト14番染色体由来SC20染色体ベクターなど）上の対応loxP配列挿入部位に特異的に転座させることによって、目的遺伝子領域周辺のみをインサート（染色体インサート）として保持するヒト人工染色体として作製される（黒岩ら,Nature Biotech., 18:1086, 2000）。
【００３４】
本発明者らは、ヒト人工染色体の作製において、マウスなどの被染色体導入動物の発生に悪影響を与えないように、悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を染色体インサート上から可能な限り除去することが望ましいと考えてきた。しかし、従来は、ヒト染色体の詳細な配列等の構造に関する情報がないか、または不足していたため、目的遺伝子の近傍に、例えば、loxP配列およびヒトテロメア配列を挿入することが困難な場合があった。この場合、両配列に挟まれた領域には目的遺伝子以外にも、その他多くの遺伝子が含まれるので、これら余剰遺伝子がマウスなどに導入された場合に、発生に悪影響を及ぼすことが危惧された。さらにまた、目的遺伝子を含む染色体インサートのサイズと、被染色体導入動物のキメラ率および子孫伝達効率との関係が不明であった。
【００３５】
本発明者らは、Igλ遺伝子が存在するヒト22番染色体の構造に関する情報（例えば、I.Dunhamら、Nature 402:489, 1999）に基づき、ある特定サイズ範囲の、Igλ遺伝子含有染色体インサートについて、被染色体導入動物のキメラ率および子孫伝達効率がいずれも有意に上昇することを今回見出した。このように余剰遺伝子をヒト人工染色体から取り除くことによって、特定されたIgλ遺伝子領域周辺をインサートとして保持する新規ヒト人工染色体を作製することが可能となった。本明細書中、余剰遺伝子とは、被染色体導入動物の発生に悪影響を与える有害遺伝子を指し、例えば、遺伝子発現量依存性の遺伝病原因領域などである。本発明のヒト人工染色体は、従来のIgλ遺伝子領域周辺10Mbをインサートとして保持するλHACと比べて、その全体の大きさが縮小しており、また高い子孫伝達効率を有している。
【００３６】
このように、ヒト22番染色体の改変により、マウスなどの発生に悪影響を与え得る有害遺伝子が除去され、特定の目的Igλ遺伝子領域のみをインサートとして保持するヒト人工染色体を作製できる。また、上記改変の結果、導入されるヒト人工染色体全体のサイズ縮小化をもたらすとともに、減数分裂時における異常染色体（この場合、導入ヒト人工染色体）の排除機構（例えば、P.Huntら、Hum.Mol.Genet., 4:2007, 1995）を回避できる。さらにまた、従来のλHAC（黒岩ら、前出）と比較して、導入ヒト人工染色体をヒト人工染色体導入動物（例えば、マウス）の子孫に伝達させることがより容易になるし、またヒト抗体重鎖・λ軽鎖全領域を保持するトランスクロモソミック非ヒト動物の作製をより効率的に行うことが可能である。
【００３７】
上記のようにして得られるトランスクロモソミック非ヒト動物を利用して、外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物を回収することにより、生物学的に活性な物質を製造することができる。具体的には、トランスクロモソミック非ヒト動物個体を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で飼育し、その後、発現産物を動物の血液、腹水などから回収することができる。
【００３８】
また、トランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞あるいはそれを不死化したもの（例えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイブリドーマ）などを、外来染色体またはその断片上の遺伝子が発現しうる条件下で培養し、その後、発現産物を培養物から回収することができる。
【００３９】
あるいはまた、これらトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、またはそれを不死化したものから抽出した外来染色体もしくはその断片、この外来染色体もしくはその断片を構成するDNA、またはトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、またはそれを不死化したものに保持された外来染色体もしくはその断片に由来するｃDNAを、動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、パン酵母細胞、ＳＦ９細胞等）に導入し、該細胞を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、その後、発現産物（例えば、特定の抗原特異的な抗体タンパク質等）を培養物から回収することができる。発現産物は遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、さらに硫安分画、分配クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィーなどの公知の方法に従って精製することができる。生物学的に活性な物質は、外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、例えば、抗体、特にヒト抗体などを挙げることができる。例えば、得られたトランスクロモソミック非ヒト動物の脾細胞あるいはそのハイブリドーマなどの不死化細胞から該染色体上のヒト抗体遺伝子をクローニングし、チャイニーハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）やミエローマ細胞に導入してヒト抗体を産生することができる（Lynetteら, Biotechnology, 10:1121, 1992；Bebbingtonら, Biotechnology, 10:169, 1992; Babcookら, PNAS, 93: 7843, 1996）。
【００４０】
ハイブリドーマを選抜することにより所望の抗体産生細胞を選抜するという従来の方法に加えて、近年開発されたファージディスプレイ法により、所望の抗体を選抜することも可能である（Winterら, Annu. Rev.Immunol., 12:433, 1994）。様々な特異性を持つヒト抗体をその表面に発現するファージライブラリーを得るためには、抗原未感作あるいは、特定の抗原を感作した本発明のトランスクロモソミック非ヒト動物の脾臓やリンパ組織由来のヒト免疫グロブリン遺伝子重鎖および軽鎖可変領域ｃDNAを用いることができる。
【００４１】
以下に、子孫伝達効率の高いヒト人工染色体の作製方法について、さらに詳細に述べる。
【００４２】
望みのヒト染色体領域を含み、それを安定保持し、子孫伝達するような非ヒト動物を作製するためには、偶発的に生じた染色体断片ではなく、ヒト染色体を所望の部位で切断することにより、有害遺伝子を取り除いたり、所望の染色体断片のみを安定かつ子孫伝達可能な別の染色体につなげるなど、染色体を自在に加工する技術が望まれる。このような技術は、染色体工学と呼ばれ、これまで主にマウスES細胞中で内在性マウス染色体を部位特異的に切断したり（WO 98/54348）、相同染色体間で組換え（転座）を起こさせることで特定の遺伝子領域を欠失・逆位・倍加させ、そのような改変染色体を有する変異マウスが作製されてきた（R.Ramirez-Solisら、 Nature 378:720, 1995）。本発明においても、この技術を利用できる。
【００４３】
ヒト染色体あるいはその断片を保持するES細胞が生殖細胞へ寄与するような高キメラ率の非ヒト動物（例えば、マウスなどの哺乳動物）が得られた場合、次は導入ヒト染色体が減数分裂において除外されることなく、導入ヒト染色体を保持する精子あるいは卵子が形成されるかが問題である。前述したように、一般に、異常染色体は減数分裂時に除外される機構があると考えられており、導入ヒト染色体を保持する細胞は減数分裂において除外され、結果的に精子あるいは卵子に分化できない可能性が考えられる。これは減数分裂時には相同染色体間でのペアリングが必要であるが、導入ヒト染色体は１本しか存在しないので、基本的にはペアリングできないと考えられる。それ故に、導入ヒト染色体は減数分裂から除外される可能性がある。実際、富塚ら（Nature Genet., 16:133, 1997）は、およそ50Mb以上のヒト14番染色体断片の導入は雄キメラマウスの不妊をもたらしたと報告している。一方、サイズが10〜20Mb前後と推定されるヒト2番、14番染色体断片（SC20）の子孫伝達では、減数分裂の通過のためには導入染色体のサイズが重要な因子であることが示唆された（Tomizukaら, Nature Genet., 16:133, 1997, Proc. Natl. Acad.Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）。SC20染色体ベクター（10〜20Mb）は子孫伝達可能であると共に、マウスES細胞および個体において高い安定性をもっている（Shinoharaら, Chromosome Res., 8: 713-725, 2000）。このような子孫伝達可能かつマウス個体で安定な自然発生染色体断片は、WO97/07671およびWO98/37757に記された方法で取得、選抜することができる。また、子孫伝達し、マウス個体で安定な自然発生ヒト染色体断片についてはVoetらの報告（Genome Res., 11: 124-136, 2001）にも記載されている。さらに、キメラマウスにおいて安定に保持されるヒト14番染色体（約100Mb、Tomizukaら, Nature Genet., 16:133, 1997）や21番染色体（約50Mb、篠原ら、第45回日本人類遺伝学会大会、2000年10月）を出発材料として、これを染色体工学的手法（Kuroiwaら、Nature Biotech. 18:1086, 2000）により10〜20Mb以下のサイズに縮小化することができる。本発明によれば、上記の手法を利用して導入染色体を特定のサイズ範囲に縮小することによって、マウス個体において安定かつ子孫伝達効率の高い人工染色体を得ることができる。
【００４４】
例えば、子孫伝達可能なSC20ベクターに特定サイズ範囲の目的遺伝子領域のみを転座、クローニングして構築されたHACは、SC20断片のベクター効果によって子孫伝達することが可能となる。この場合、転座によってSC20の安定構造が変化すること、さらにHAC全体の大きさが元来のSC20ベクターよりも大きくなる可能性も考えられるので、転座させる染色体インサート（ヒト22番染色体上の免疫グロブリンλ遺伝子を含む。）の大きさは、λHAC（10Mb）よりも小さいサイズ、通常約3.5Mb〜約１Mb、好ましくは約３Mb〜約1.2Mb、さらに好ましくは約2.5Mb〜約1.5Mbとしうる。前記転座させる染色体インサートのセントロメア側の端は、好ましくはHCF2遺伝子座であり、より好ましくはAP000553領域（I.Dunhamら、Nature 402:489, 1999）である。このような厳密な染色体の改変のためには、ヒト22番染色体のように改変すべき染色体の全配列の解明が大きく貢献する。すなわち、全ヒト染色体の配列が明らかとなれば、ヒト22番染色体のみならず様々なヒト染色体上の目的遺伝子を含む周辺領域のみを厳密にSC20染色体ベクターへ転座、クローニングし、効率よく子孫伝達させることが可能になる。
【００４５】
上述したように、導入ヒト染色体のマウス等の非ヒト動物での子孫伝達を達成するためには、幾つかの障害があり、特にヒト22番染色体上のIgλ遺伝子領域を効率良く子孫伝達させることは、困難であると考えられてきたが、本発明により、この課題が解決される。
【００４６】
具体的には、本発明により、ヒト22番染色体上の抗体λ軽鎖遺伝子を含む2.5Mbおよび1.5Mb領域をSC20染色体ベクターに転座、クローニングして得られたヒト人工染色体（ΔHACおよびΔΔHAC）を作製し、次いでΔHACおよびΔΔHACの各々をマウス個体へ導入し、キメラマウスにおけるキメラ率についてλHAC（黒岩ら、前出）と比較し、キメラ率の向上とヒト人工染色体の効率的な子孫伝達の達成を確認した。キメラ率は、キメラ動物におけるＥＳ細胞の寄与率を示すものであり、通常キメラ動物の体表面におけるＥＳ細胞に由来する体毛色の占める割合を視覚的に評価することにより決定されうる。以下に、この特定例について、具体的に説明する。
【００４７】
２．ΔHAC、ΔΔHAC、およびトランスクロモソミックマウスの作製とその利用
ヒト抗体λ軽鎖遺伝子を含むヒト22番染色体あるいはその断片は、周知の方法で取得しうる。すなわち、ミクロセル法によりヒト染色体あるいはその断片をマウスＡ９細胞にライブラリ化することができる（Koiら, Jpn. J. Cancer Res. 80:413-418, 1989）。得られたライブラリから、ＰＣＲ等によりヒト抗体λ軽鎖遺伝子特異的な配列を検出することにより、ヒト22番染色体あるいはその断片を保持するクローンを選抜することができる。ヒト22番染色体あるいはその断片は、その後の改変の便宜のため、さらにミクロセル法により好ましくはニワトリDT-40細胞（理研セルバンク：RCB1464、ATCC：CRL-2111）に移入させることができる。
【００４８】
ヒト抗体λ軽鎖遺伝子クラスターは22番染色体上の22q11.2に存在する（例えば、J.E.Collinsら、Nature 377:367, 1995）。前述のλHACにおいては、HCF2遺伝子座からLIF遺伝子座までの10Mb領域が染色体インサートとして転座クローニングされていた。この10Mbインサートにおいて、Igλ遺伝子領域よりもテロメア側には7Mbの、セントロメア側には1Mbの余分な染色体領域が含まれている。そこで、まず7Mb領域を取り除くために、22番染色体あるいは、その改変断片（loxP配列がHCF2遺伝子座に挿入され、LIF遺伝子座でテロメアトランケーションされている断片）をIgλ遺伝子領域の極く近傍かつテロメア側（約400Kbテロメア側）に存在するAP000344領域（I.Dunhamら、Nature 402:489, 1999）でテロメアトランケーション（例えば、黒岩ら、Nucleic Acid Research, 26:3447, 1998）することで切断する。次に、Igλ遺伝子領域の極く近傍かつセントロメア側（約300Kbセントロメア側）に位置するAP000553領域（I.Dunhamら、Nature 402:489, 1999）にloxP配列を相同組換えにより挿入する。これらの改変により、HCF2-Igλ-AP000344断片（約2.5Mb）あるいはAP000553-Igλ-AP000344断片（約1.5Mb）のみを染色体インサートとしてSC20染色体ベクターへ転座クローニングできる。構築されたHACは従来の方法でマウスES細胞へ導入後、キメラマウスを作製できる。キメラマウスにおけるHACの保持を確認後、交配し、仔マウスを得る。得られた仔マウスにおいてHACの保持を確認することによって、HACの子孫伝達を判定できる。
【００４９】
本発明により、ΔHACによるヒト抗体λ軽鎖遺伝子Igλ全領域の子孫伝達を介して、ヒト抗体重鎖遺伝子とλ軽鎖遺伝子を共に保持するトランスクロモソミック非ヒト動物（例えば、マウスなどの哺乳動物）の効率のよい作出が可能になる。これは、医薬品の候補となり得るヒト抗体を産生する非ヒト動物として有用であると考えられる。ヒト血清中でλ軽鎖を含む抗体は約40%を占めること、Vλ遺伝子断片の数（70個）がVκ鎖遺伝子（76個）と同等数存在することなどから、ヒト抗体の多様性構築にはλ鎖を含む抗体が大きく寄与していると考えられている（Popov, AV., J. Exp. Med., 189:1611, 1999）。一方、現在世界で医薬品として用いられているヒト化抗体やヒト抗体の多くはその軽鎖がκ軽鎖から成っている。本発明のΔHAC、ΔΔHACトランスクロモソミックマウスはλ軽鎖を含むヒト抗体医薬開発に有用である。ΔHAC、ΔΔHACトランスクロモソミックマウスは異種染色体断片の子孫伝達が可能であるので、交配により均一な形質を持ったトランスクロモソミックマウスの大量生産が可能になるだろう。さらに、ヒト抗体κ軽鎖遺伝子を含む染色体断片を保持するマウス（Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, 722-727, 2000）、あるいはヒト抗体κ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウス（Fishwild et al., Nature Biotechnol., 14: 845-851, 1996; Mendez et al., Nature Genet., 15: 146-156, 1997）と該ΔHACまたはΔΔHACトランスクロモソミックマウスとを交配させることによって、ヒト抗体重鎖、κ軽鎖、およびλ軽鎖の全てから成るヒト抗体を産生するヒト抗体産生マウスを作製することも可能となる。ヒト重鎖、κ鎖、λ鎖を同時に発現するマウス系統についてはNicholsonらの報告（J. Immunol., 163: 6898, 1999）がある。彼らはヒトIg重鎖、κ鎖、λ鎖の一部をそれぞれ含む酵母人工染色体（YAC）を導入したトランスジェニックマウスと内在性Ig重鎖、κ鎖ノックアウトマウスの組み合わせによりヒト重鎖/κ鎖、ヒト重鎖/λ鎖分子を免疫グロブリンの主な成分とするマウスを構築した。しかし、当該マウス系統にて発現するヒト免疫グロブリンの多様性、分子構成は本来のヒトにおけるものと大きく異なる。例えば、(i)ヒトIg重鎖YACにはμ、δ定常領域のみが含まれ、該マウス系統においては他のアイソタイプ、特に最も大きな成分であるIgγアイソタイプが発現していない、(ii)3種のYACに含まれている可変領域の数が少なく、該マウス系統で発現するヒト抗体の多様性も限定的であると想像される。
【００５０】
本明細書で開示されるヒトIg重鎖、κ鎖、λ鎖を同時に発現するマウス系統においては、ヒトで発現している抗体の多様性、分子構成等がより忠実に再現される。例えば、(i)Igγアイソタイプ（4つのサブクラス全て）が発現している、(ii)重鎖、λ鎖、κ鎖について全ての可変領域を含むため、ヒトにおけるのと同様な多様性が再現される。
【００５１】
これらのヒト抗体産生トランスクロモソミックマウスを適当な抗原により免疫し、その脾臓細胞とマウスミエローマを融合することにより得られる、ハイブリドーマ（安東・千葉, 単クローン抗体実験操作入門, 講談社サイエンティフィク, 1991）をELISAによりスクリーニングすることにより、ヒト免疫グロブリン重鎖およびλ軽鎖からなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。これらのヒトモノクローナル抗体は医薬品用抗体として用いることができる。
【００５２】
また、感染症などの治療用抗体医薬としては、モノクローナル抗体よりもポリクローナル抗体の方が治療効果は大きいと考えられる。さらに、ヒトポリクローナル抗体はいわゆるγグロブリン製剤として開発することもできる。本発明によって構築されるΔHACまたはΔΔHACを保持するES細胞からは、実際高キメラ率（約80％〜100％、好ましくは約85％〜100％）でキメラマウスが得られ、導入ヒト人工染色体は高効率で子孫伝達し、受精卵の段階から仔マウスとして生まれる全発生過程において保持され続けることが示された。マウス等の非ヒト動物に、それと異種の抗原を免疫することにより、大量の抗原特異的ヒトポリクローナル抗体（ヒトλ軽鎖含有抗体）を産生することができ、これは大量生産が難しいモノクローナル抗体に代わる抗体医薬として期待できる。
【００５３】
また、本発明のヒト人工染色体は、マウスのみならず他の非ヒト動物、例えば、ラット、ブタ等の哺乳類に導入しうる。マウス以外の動物種におけるES細胞あるいはES様細胞の樹立はラット（Iannacconeら、Dev. Biol., 163:288, 1994）、ブタ（Wheelerら、Reprod. Fertil. Dev., 6:563, 1994）において報告され、さらにメダカ、ニワトリ等でも試みられている（トランスジェニック動物、蛋白質核酸酵素、1995年10月号増刊、共立出版）。これらのESあるいはES様細胞を受容細胞として、ヒト人工染色体を移入すれば、マウスの場合と同様に、ヒト人工染色体あるいはその断片を保持し、該ヒト人工染色体上の遺伝子を発現する非ヒト動物が作製可能である。さらに、これらの非ヒト動物を利用して、ヒトλ軽鎖含有抗体の作製も可能である。
【００５４】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願2001-142371号の明細書に記載された内容を包含する。
【００５５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５６】
以下の実施例1〜実施例14において、ヒト22番染色体上の抗体λ軽鎖遺伝子周辺領域2.5Mbと1.5MbをSC20染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔHAC、ΔΔHACの作製について説明する(図1)。さらには、作製された各HACのマウス個体への導入およびHACのキメラマウス子孫への伝達について説明する。
【実施例１】
【００５７】
カセットベクターpTELhisDの作製
カセットベクターpTELPuro（黒岩ら、Nature Biotech., 18:1086-, 2000）を制限酵素NotI（ベーリンガー）で切断し、DNA Bluntingkit（東洋紡）を用いて72℃、５分間で末端を平滑化した。平滑後、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造）を用いて65℃、１時間で脱リン酸化した。その後、制限酵素BglIIリンカー（宝酒造）を加え、ライゲーションキット（宝酒造）を用いてライゲーションを行った。これで、pTELPuroプラスミド中のPGKPuroカセットがBglIIリンカーで置換されたプラスミドpTELBgが作製された。このプラスミドを制限酵素BglIIで切断し、同様に脱リン酸化後、CHROMA SPIN-TE400（クローンテック）を用いてゲル濾過することで精製した。次にプラスミド#1-132（京都大学  武田俊一教授より分与）から制限酵素BamHIで切り出したhisD断片を加え、同様にライゲーション反応を行った。これで、pTELPuroプラスミド中のPGKPuroカセットがhisDカセットに置換されたカセットベクターpTELhisDが作製された（図２）。
【実施例２】
【００５８】
ターゲティングベクターpTELhisDlIの作製
ヒト22番染色体上のIgλ遺伝子座のごく近傍かつテロメア側（約400Kbテロメア側）に位置するAP000344領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターpTELhisDλIを以下のようにして作製した。まず、AP000344ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。
1269D1-F; 5'-TCGAGGATCCGACAAGTTCTCTTCTCTTTTCCTTCTGCCC-3'（配列番号1）
1269D1-R; 5'-TCGAGGATCCGCTGCTAAGCTACTGTTCTCTTTTTTCCCC-3'（配列番号2）
【００５９】
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を用い、バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃１分の熱変性後、98℃10秒、68℃11分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースK（ギブコ）処理した後、CHROMA SPIN-TE400（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素BamHI（ベーリンガー）で切断し、CHROMA SPIN-TE1000（クローンテック）でゲル濾過した。このPCR断片をプラスミドpTELhisDのBamHI部位にクローニングした。AP000344ゲノムシークエンスの方向はセントロメア→テロメアなので、クローニングされたAP000344ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターpTELhisDλI とした（図３）。
【実施例３】
【００６０】
ターゲティングベクターp553loxPHygの作製
ヒト22番染色体上のIgλ遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約300Kbセントロメア側）に位置するAP000553領域にCre組換え酵素の認識配列loxPを挿入するためのターゲティングベクターp553loxPHygを以下のようにして作製した。まず、AP000553ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。
553-F3; 5'-TCGAGTCGACTGTAGCTGACTTTAGCCACCCACAAGTAC-3'（配列番号3）
553-R3; 5'-TCGAGTCGACCTTGCTGATTATACCTCATCTCCTTCCCTC-3'（配列番号4）
【００６１】
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を用い、バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃１分の熱変性後、98℃10秒、68℃15分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースK（ギブコ）処理した後、CHROMA SPIN-TE400（クローンテック）でゲル濾過した。その後、制限酵素SalI（ベーリンガー）で切断しCHROMA SPIN-TE1000（クローンテック）でゲル濾過した。このPCR断片をプラスミドpBluescriptII（予めNotI部位を欠失後、SacII部位にSrfIリンカーを挿入したもの）のSalI部位にクローニングした（pBS553）。次に，pBS553を制限酵素HpaI（ベーリンガー）で切断し脱リン酸化後、NotIリンカーをライゲーションにより挿入した（pBS553N）。pBS553Nを制限酵素NotIで切断し脱リン酸化後、カセットベクターploxPHygから制限酵素NotI（ベーリンガー）でloxPを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションした。LoxP配列の方向がクローニングしたAP000553ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターp553loxPHygとした（図４）。
【実施例４】
【００６２】
ニワトリDT-40細胞中でのヒト22番染色体の部位特異的切断
WO98/37757に記載された方法で作製されたヒト22番染色体全長を保持するニワトリDT-40細胞（クローン52-18）と既にLIF遺伝子座で切断済みのヒト22番染色体断片を保持するDT-40細胞（クローンHF38）に上記実施例２で作製したターゲティングベクターpTELhisDλIをトランスフェクションし、AP000344ゲノム領域にヒトテロメア配列を挿入することによって、その挿入部位で22番染色体を切断することを試みた。
【００６３】
ニワトリDT-40細胞の培養は10%ウシ胎児血清（ギブコ、以下FBSで記す）、1%ニワトリ血清（ギブコ）、10-4M 2-メルカプトエタノール（シグマ）を添加したRPMI1640培地（ギブコ）中で行った。約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5 mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素SrfI（東洋紡）で線状化したターゲティングベクターpTELhisDlIを25-30 μg加え、エレクトロポレーション用のキュベット（バイオラッド）に移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサー（バイオラッド）にセットし、550 V、 25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、24時間培養した。24時間後、ヒスチジノール（0.5 mg/ml）を含む培地に交換し、96穴培養プレート１０枚に分注して約２週間の選択培養を行った。ヒスチジノール耐性クローンからPuregene DNA Isolation Kit（GentraSystem社）を用いてゲノムDNAを抽出して、HCF2（黒岩ら、Nature Biotech. 18:1086, 2000）、Igλ（富塚ら, Nature Genet., 16:133, 1997）、D22S1174, D22S315, D22S275（BIOS社）、そしてLIF（黒岩ら、Nucleic Acid Research, 26:3447-3448, 1998）を検出するプライマーを用いたPCRにより、ヒト22番染色体がAP000344ゲノム領域で切断されていることを確認した。
【００６４】
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を用い、バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃１分の熱変性後、98℃10秒、56℃30秒、72℃30秒を35サイクル行った。52-18をトランスフェクションした場合、48クローンをスクリーニングして1クローン（T32）が目的のクローンであった。HF38をトランスフェクションした場合、96クローンをスクリーニングして２クローン（HT69, HT72）が目的のクローンであった。
【００６５】
さらに、AP000344領域で22番染色体の切断が起こっているか否かをFISH解析により、確認した。
【００６６】
ヒト22番染色体がAP000344ゲノム領域で切断されていることを視覚的に判断するためにターゲティングベクター中のhisD耐性遺伝子を検出できるプローブを用いたFISH解析を行った。方法は黒岩ら（Nucleic Acid Research, 26:3447-3448, 1998）に従った。COT1染色（ローダミン標識、赤色）により、全長のヒト22番染色体と比較してT32, HT69, HT72では、22番染色体が断片化していることが分かる。さらに、hisDプローブ由来のシグナル（FITC標識、黄色）がテロメア一端に検出された。このことはターゲティングベクターが挿入されたAP000344が22番染色体断片のテロメア一端になっていることを示している。
【００６７】
以上の結果から、T32, HT69, HT72において、ヒト22番染色体がAP000344領域で切断されていると結論できた。
【実施例５】
【００６８】
ニワトリDT-40細胞中でのloxPHygカセットのヒト22番染色体上への部位特異的挿入
上記HT69、72においては、既にHCF2遺伝子座（Igλ遺伝子座よりも約1Mbセントロメア側）にloxP配列が挿入されている。そこで、クローンT32において、Igλ遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側（約300Kbセントロメア側）に位置するAP000553領域に上記実施例３で作製したターゲティングベクターp553loxPHygをトランスフェクションし、loxP配列の挿入を試みた。
【００６９】
上記と同様に、制限酵素SrfI（東洋紡）で線状化したターゲティングベクターp553loxPHygをクローンT32にトランスフェクションし、ハイグロマイシンB（1 mg/ml）を含む培地で約２週間の選択培養を行った。ハイグロマイシンB耐性クローンからゲノムDNAを抽出し、以下の２組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。
553-F4; 5'-GCTAAGGCACTTCGGTTCTCTTTGTGTTC-3'（配列番号５）
553-R4; 5'-GGTTGTCTTTAAAAGCAGGGATAAGGATG-3'（配列番号６）
553-F5; 5'-AGAAGAAAGGAGTGGGTGCTAAACATTCAG-3'（配列番号７）
553-R5; 5'-GGTTAGATGGCACCAAATGAAAGGAGAAG-3'（配列番号８）
【００７０】
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を用い、バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃１分の熱変性後、98℃10秒、68℃15分を35サイクル行った。６９クローンをスクリーニングした結果、３クローン（553-2, 6, 14）が相同組換え体として同定された。
【実施例６】
【００７１】
ヒト抗体λ軽鎖遺伝子領域周辺（HCF2-Igλ-AP000344）2.5MbをSC20染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔHACの構築
まず、最初に上記実施例４で得られたクローンHT72をSC20染色体ベクターを保持するDT-40細胞Rクローン（黒岩ら、Nature Biotech. 18:1086, 2000）と細胞融合することによって、ヒト22番染色体断片と14番染色体断片SC20断片の両者を保持するDT-40ハイブリッドを作製した。
（１）ヒト22番染色体断片とSC20染色体ベクターの両者を保持するDT-40ハイブリッドの作製
RクローンはブラストサイジンS（10 μg/ml）含有RPMI1640培地で、HT72クローンはハイグロマイシンB（1 mg/ml）含有RPMI1640培地で培養した。1〜2 x 107個の両クローンを混合し遠心後、無血清RPMI1640培地で２回洗浄した。残量培地を完全に取り除いた後に、予め37℃で保温しておいた50% PEG 1500（ベーリンガー）0.5 mlを静かに加え、約２分間ピペットで激しく混合した。その後、無血清RPMI1640培地1 mlを１分間かけてゆっくり加え、続いて無血清RPMI1640培地9 mlを約３分間かけて加え、37℃で１０分間静置した。その後，1,200 rpmで５分間遠心し、血清を含むRPMI1640培地で24〜48時間培養した。その後、ブラストサイジンS（10 μg/ml）・ハイグロマイシンB（1 mg/ml）含有RPMI1640培地に交換し、24穴培養プレート５枚に分注し、3-4週間培養した。ダブル耐性クローンからゲノムDNAを抽出して、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト14番染色体断片（SC20染色体ベクター）、22番染色体断片の２本が保持されていることを確認した。
ヒト14番染色体検出用プライマー
VH3-F; 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3'（配列番号９）
VH3-R; 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3'（配列番号１０）
ヒト22番染色体検出用プライマー
Igλ-F; 5'-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3'（配列番号１１）
Igλ-R; 5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3'（配列番号１２）
【００７２】
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、Taq ポリメラーゼはEx Taq（宝酒造）を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃１分の熱変性後、98℃10秒、56℃30秒、72℃30秒を35サイクル行った。PCRの結果、６クローン（56HT2, 3, 4, 5, 6, 7）が陽性であった。さらに、ヒトCOT1 DNAをプローブに用いてFISH解析を行った結果、これらのクローンは全て２本のヒト染色体断片を独立した状態で保持していることが明らかとなった。以上の結果から、これらの６ハイブリッドクローンはヒト14番染色体断片（SC20染色体ベクター）、22番染色体断片の２本を保持していると判断できた。
【００７３】
（２）DT-40ハイブリッドクローン（56HT2）におけるヒト22番染色体領域（HCF2-Igλ-AP000344）2.5MbのSC20染色体ベクターへの部位特異的転座
（２)−１  Cre組換え酵素安定発現ベクターpBS185Puroの構築
黒岩ら（前出）の方法に従って、ヒト染色体間の部位特異的転座はCre-loxPシステムを用いることによって行った。このシステムにおいても、今回のように非相同染色体間での組換え効率は非常に低いことが予想されるため、Cre酵素を一過性ではなく安定発現させることを考え、以下のような発現ベクターを構築した。
【００７４】
プラスミドPGKPuro（WHITEHEAD INSTITUTE, Dr. Peter W. Lairdから分与）中のNotI部位をEcoRI部位に置換したプラスミドから制限酵素EcoRIにて切り出したPGKPuro断片をCre組換え酵素発現ベクターpBS185(ギブコ)中のEcoRI部位にクローニングした（pBS185Puro）。
【００７５】
（２）−２  Cre-loxPシステムを用いたDT-40ハイブリッドクローンにおけるヒト22番染色体領域（HCF2-Igλ-AP000344）2.5MbのSC20染色体ベクターへの部位特異的転座
上記と同様にして、制限酵素KpnI（ベーリンガー）で線状化したCre組換え酵素安定発現ベクターpBS185Puroを56HT2ハイブリッドクローンにトランスフェクションし、２４穴プレートへ分注し、ピューロマイシン（3μg/ml）存在下で約２週間選択培養した。それぞれのウェルからゲノムを抽出し、以下の２組のプライマーを用いたネステッド（nested） PCRを行い、SC20染色体ベクターとヒト22番染色体断片間で転座が起こったか否かを検討した。
PGK-1;5'-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3'（配列番号１３）
GFP-1;5'-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3'（配列番号１４）
PGK-2;5'-TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3'（配列番号１５）
GFP-2;5'-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3'（配列番号１６）
【００７６】
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq（宝酒造）を用い、バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。まず、第一のPCRは、94℃１分の熱変性後、98℃10秒、61℃30秒、72℃1分をPGK-1とGFP-1をプライマーとして35サイクル行った。この反応液の一部を鋳型として、98℃10秒、59℃30秒、72℃30秒をPGK-2とGFP-2をプライマーとして35サイクル行った。PCR陽性で転座が確認できたウェル中の細胞プールを107細胞数になるまで増やし、プールを5% FBSと1 μg/mlのプロピディアムアイオダイド（PI）を添加したPBS（リン酸緩衝溶液） 4mlに懸濁し、FACS Vantage（ベクトン・ディッキンソン）により解析した。黒岩ら（前出）の報告にあるように、loxP間での組換え転座が起こるとGFP遺伝子が再構築され発現するので転座を起こした細胞をFACSで検出できる。GFP陽性と思われる細胞画分のソーティングを２回繰り返した。毎回のソーティング後の培養はハイグロマイシンB（1mg/ml）含有RPMI1640培地で行った。その結果、GFP陽性細胞を98-99%の純度で濃縮することができた。
【００７７】
次に、FACSでクローニングされたGFP陽性クローン（ΔH21）において、期待通りloxP間で組換えが起こっていることを前記PGK-2とGFP-2をプライマーとして用いたPCRによって確認した。さらに、クローンΔH21に対して、ヒト14番染色体特異的プローブ（ローダミン標識）とヒト22番染色体特異的プローブ（FITC標識）を用いたFISH解析（黒岩ら、前出）を行った結果、確かにヒト22番染色体領域がSC20染色体ベクター（ヒト14番染色体断片）に転座した人工染色体の存在が確認された。
【００７８】
以上の結果から、クローンΔH21において、ヒト抗体λ軽鎖遺伝子領域周辺（HCF2-Igλ-AP000344）2.5MbがSC20染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔHACが構築できたと結論付けた。
【００７９】
ΔHACを保持するニワトリDT-40細胞（ΔHAC）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６)に２００１年５月９日付けで国際寄託され、受託番号FERM BP-7582が与えられた。
【実施例７】
【００８０】
ヒト抗体λ軽鎖遺伝子領域周辺（AP000553-Igλ-AP000344）1.5MbをSC20染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔΔHACの構築
上記ΔHACにおいては、Igλ-HCF2間に約1Mbの余分な領域がまだ残存している。そこで、厳密に余分な染色体領域を取り除き、Igλ遺伝子領域周辺のみを転座クローニングする目的で、AP000553-Igλ-AP000344領域1.5MbをSC20染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔΔHACを構築することを試みた。
まず、最初に実施例５で得られたクローン553-2をRクローンと細胞融合することによって、ヒト22番染色体断片と14番染色体断片SC20染色体ベクターの両者を保持するDT-40ハイブリッドを作製した。
【００８１】
（１）ヒト22番染色体断片とSC20染色体ベクターの両者を保持する DT-40ハイブリッドの作製
RクローンはブラストサイジンS（10μg/ml）含有RPMI1640培地で、クローン553-2はハイグロマイシンB（1 mg/ml）含有RPMI1640培地で培養した。1〜2 x 107個の両クローンを混合し遠心後、無血清RPMI1640培地で２回洗浄する。残量培地を完全に取り除いた後に、予め37℃で保温しておいた50% PEG 1500（ベーリンガー）0.5 mlを静かに加え、約２分間ピペットで激しく混合した。その後、無血清RPMI1640培地1 mlを１分間かけてゆっくり加え、続いて無血清RPMI1640培地9 ml を約３分間かけて加え、37℃で１０分間静置した。その後、1,200 rpmで５分間遠心し、血清を含むRPMI1640培地で24〜48時間培養した。その後、ブラストサイジンS（ 10 μg/ml）・ハイグロマイシンB（1 mg/ml）含有RPMI1640培地に交換し、24穴培養プレート５枚に分注し、3〜4週間培養した。得られたハイブリッドクローン（例えば、クローン553R1）からゲノムDNAを抽出して、実施例６と同じプライマーを用いてPCRを行い、ヒト14番染色体断片、22番染色体断片の２本が保持されていることを確認した。さらに、ヒト COT1 DNAをプローブに用いてFISH解析を行い、２本のヒト染色体断片が独立した状態で存在していることを確認した。以上の実験から、ハイブリッドクローン553R1がヒト14番染色体断片（SC20染色体ベクター）、22番染色体断片の２本を保持していると結論付けた。
【００８２】
（２）DT-40ハイブリッドクローン（553R1）におけるヒト22番染色体領域（AP000553-Igλ-AP000344）1.5MbのSC20染色体ベクターへの部位特異的転座
上記と同様にして、制限酵素KpnI（ベーリンガー）で線状化したCre組換え酵素安定発現ベクターpBS185Puroを553R1ハイブリッドクローンにトランスフェクションし、12穴プレートへ分注し、ピューロマイシン（3μg/ml）存在下で約２週間選択培養した。それぞれのウェルからゲノムを抽出し、以下の２組のプライマーを用いたnested PCRを行い、SC20染色体ベクターとヒト22番染色体断片間で転座が起こったか否かを検討した。
PGK-1;5'-ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3'（配列番号１３）
GFP-1;5'-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3'（配列番号１４）
PGK-2;5'-TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3'（配列番号１５）
GFP-2;5'-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3'（配列番号１６）
【００８３】
PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEx Taq（宝酒造）を用い、バッファーやdNTP（dATP,dCTP, dGTP, dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。まず、第一のPCRは、94℃１分の熱変性後、98℃10秒、61℃30秒、72℃1分をPGK-1とGFP-1をプライマーとして35サイクル行った。この反応液の一部を鋳型として、98℃10秒、59℃30秒、72℃30秒をPGK-2とGFP-2をプライマーとして35サイクル行った。PCR陽性で転座が確認できたウェル中の細胞プール（DDH5,6の２プール）を107細胞数になるまで増やし、プールを5% FBSと1 μg/mlのプロピディアムアイオダイド（PI）を添加したPBS（リン酸緩衝溶液） 4mlに懸濁し、FACSVantage（ベクトン・ディッキンソン）により解析した。GFP陽性と思われる細胞画分のソーティングを２回繰り返した。毎回のソーティング後の培養はハイグロマイシンB（1 mg/ml）含有RPMI1640培地で行った。その結果、GFP陽性細胞を98〜99%の純度で濃縮することができた。
【００８４】
次に、FACSでクローニングされたGFP陽性クローン（ΔΔH5,6）において、期待通りloxP間で組換えが起こっていることを前記PGK-2とGFP-2をプライマーとして用いたPCRによって確認した。さらに、クローンΔΔH5,6に対して、ヒト14番染色体特異的プローブ（ローダミン標識）とヒト22番染色体特異的プローブ（FITC標識）を用いたFISH解析（黒岩ら、前出）を行った結果、両クローン共に、確かにヒト22番染色体領域がSC20染色体ベクター（ヒト14番染色体断片）に転座した人工染色体の存在が確認された。
【００８５】
以上の結果から、２クローンΔΔH5,6において、ヒト抗体λ軽鎖遺伝子領域周辺（AP000553-Igλ-AP000344）1.5MbがSC20染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体ΔΔHACが構築できたと結論付けた。
【００８６】
ΔΔHACを保持するニワトリDT-40細胞（ΔΔHAC）は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６)に２００１年５月９日付けで国際寄託され、受託番号FERM BP-7581が与えられた。
【実施例８】
【００８７】
ΔHAC含有DT-40ハイブリッド細胞とチャイニーズハムスターCHO細胞との細胞融合
黒岩ら（前出）の報告にあるように、構築されたHACをマウスES細胞へ導入するために、まずCHO細胞への導入を試みた。しかしながら、ΔHAC含有DT-40ハイブリッド細胞ΔH21はミクロセル形成能が低く、ΔHACのミクロセル法によるCHO細胞への導入（WO00/10383）は成功しなかった。そこで、新しい試みとして、ΔHAC含有DT-40ハイブリッド細胞ΔH21とCHO細胞との細胞融合によるΔHACのCHO細胞への導入を試みた。
【００８８】
1〜2 x 107個のΔH21クローンと1 x 107個のCHO細胞とを混ぜ、遠心後、無血清DMEM培地で２回洗浄した。残量培地を完全に取り除いた後に、予め37℃で保温しておいた50% PEG 1500（ベーリンガー）0.5 mlを静かに加え、約２分間ピペットで激しく混合した。その後、無血清DMEM培地1 mlを１分間かけてゆっくり加え、続いて無血清DMEM培地9 mlを約３分間かけて加え、37℃で１０分間静置した。その後、1,200 rpmで５分間遠心し、血清を含むF12培地（ギブコ）で24時間培養した。その後、G418（1 mg/ml）・ハイグロマイシンB（0.6 mg/ml）含有f12培地に交換し、24穴培養プレート3枚に分注し、3〜4週間培養した。
【００８９】
耐性クローンからゲノムを抽出し、上記実施例６と同様にVH3とIgλ検出用プライマーを用いてPCRを行った。その結果、２クローン（D15, ΔC30）がPCR陽性であった。さらに、これら２クローンに関して、上記実施例６と同様にしてヒト14番染色体特異的プローブとヒト22番染色体特異的プローブを用いた２重染色によるFISH解析を行い、ΔHACの存在を確認した。DT40とCHOの融合細胞であるが、DT40由来の染色体はほとんど脱落しており、核型は野生型CHO細胞とほぼ同じであった。このことから、DT40細胞とCHO細胞との細胞融合によって、結果的にはΔHACを保持したCHOクローンを得ることができた。DT40クローンのミクロセル形成能が低い場合の代替法として有用である可能性が示された。
【実施例９】
【００９０】
ΔΔHAC含有DT-40ハイブリッド細胞からのCHO細胞へのΔΔHACの導入
ΔΔHAC含有DT-40ハイブリッドクローンΔΔH5, 6のミクロセル形成能は悪くなかったので、黒岩ら（前出）の報告にあるように、ミクロセル法を用いた。
【００９１】
DT-40ハイブリッドクローンΔΔH5, 6をそれぞれT225フラスコ（スミロン）８本で培養し、コンフルエントになった時点で20% FBS、1% ニワトリ血清、10-4M 2-メルカプトエタノール、0.05 μg/mlコルセミドを添加したRPMI1640培地に交換し、さらに２４時間培養してミクロセルを形成させた。細胞を24mlの血清RPMI1640培地に懸濁し、予め100 μg/mlのポリL-リジンでコートした遠心用25 cm2フラスコ１２本（コーニング）に2 mlずつ分注し、37℃で１時間培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。培養液を除去し、予め37℃で保温したサイトカラシンB（10 μg/ml, シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃、8000 rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8 μm, 5μm, 3μmフィルターにて精製した。精製後、1700 rpm, 10分間遠心し、無血清DMEM培地5 mlに懸濁した。一方、約107個のCHO細胞をトリプシン処理によりはがし、無血清DMEM培地で２回洗浄し、無血清DMEM培地5 mlに懸濁した。再度、ミクロセルを1700 rpm、10分間遠心し、上清を除かずに先のCHO懸濁液5mlを静かに重層した。遠心後、培養液を除去し、PEG1500溶液（ベーリンガー）0.5 mlを加え、約２分間ピペットで激しく攪拌した。その後、無血清DMEM培地10mlを約３分間かけてゆっくり加え、37℃で10分間静置した。遠心後、10% FBS添加F12培地（ギブコ）に細胞を懸濁し、24穴培養プレート5-6枚に分注し、37℃で24時間培養した。その後、G418 800μg/ml含有F12培地に交換し、3〜4週間選択培養した。
【００９２】
G418耐性クローンからゲノムDNAを抽出してIgλとVH3検出用プライマーおよびPGK-2、GFP-2プライマーを用いて、前述と同様の条件でPCRを行い、ΔΔHACを保持するCHOクローンを同定した（例えば、ΔΔC10, 13）。さらに、上記PCRで陽性だったクローンに対して、ヒト14番染色体、22番染色体特異的プローブを用いてFISH解析を行い、視覚的にΔΔHACの存在を確認した。これらの結果から、ΔΔHACを保持するCHO細胞クローンが得られたと結論できた。
【実施例１０】
【００９３】
CHO細胞からのΔHACあるいはΔΔHACのマウスES細胞への移入
ΔHACあるいはΔΔHACを保持するキメラマウスを作製するために、実施例８、実施例９で得られたΔHACあるいはΔΔHACを保持するCHO細胞からマウスES細胞（野性型TT2F）へミクロセル法により導入した。
【００９４】
富塚ら（Nature Genet. 16:133, 1997）の方法に従い、約108個のΔHACあるいはΔΔHACを保持するCHO細胞（D15, ΔΔC10, ΔΔC13など）からミクロセルを精製し、DMEM 5 mlに懸濁した。約107個のマウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで３回洗浄後DMEM 5 mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250 rpmで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4 PEG溶液 [5g PEG 1000(和光純薬)、1 ml DMSO（シグマ）をDMEM 6 mlに溶解] 0.5 mlを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、DMEM 10mlをゆっくり加え、1250 rpmで１０分間遠心し、30 mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100 mmシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。24時間後、300 μg/mlのG418を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。
【００９５】
その結果、D15クローン（ΔHAC保持）からは14クローン、ΔΔC10（ΔΔHAC保持）からは8クローン、ΔΔC13（ΔΔHAC保持）からは８クローンがIgλとVH3検出用プライマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、ヒトCOT1 DNAプローブを用いてFISH解析（Tomizukaら、Nature Genet. 16:133, 1997）を行った結果、COT1プローブにより特異的に検出されるΔHACあるいはΔΔHACの存在が確認された。
【００９６】
以上のことから、ΔHAC保持TT2F細胞が１４クローン、ΔΔHAC保持TT2F細胞が１６クローン得られたと結論付けた。
【実施例１１】
【００９７】
ヒト人工染色体ΔHAC、ΔΔHACを保持するキメラマウスの作製
実施例１０で得られたES細胞クローンを用いて富塚らの方法（Nature Genet., 16:133, 1997）でキメラマウスを作製した。宿主としてはMCH（ICR）（白色、日本クレア社より購入）、あるいは抗体重鎖ノックアウトマウス（Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）の雌雄交配により得られる８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。野性型TT2F/ΔHACクローン（TΔ#6、実施例１０で取得）を注入した400個の胚を仮親に移植した結果、７匹のキメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。すなわち、ヒト人工染色体ΔHACを保持するES細胞株（TT2F）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【００９８】
上記と同様にして、実施例１０で得られた野性型TT2F/ΔΔHACクローン(TΔΔ＃21)を注入した180個の胚を仮親に移植した結果、2匹のキメラマウス(毛色に濃茶色の部分の認められる)が誕生した。うち1匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約100％の個体であった。すなわち、ヒト人工染色体ΔΔHACを保持するES細胞株（TT2F）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例１２】
【００９９】
ヒト人工染色体ΔHAC、ΔΔHACを保持するES細胞より作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
実施例１１でTT2F/ΔHACクローン（TΔ#6）より作製されたキメラマウス（キメラ率約85%）の尻尾から富塚らの報告（Nature Genet., 16:133, 1997）に記された方法でゲノムDNAを調製し、IgλおよびVH3検出用プライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、ΔHACの保持を検討した。その結果、2種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス体細胞におけるΔHACの保持が確認された。また、キメラマウス（キメラ率約85％）およびTΔ＃６より作製された他のキメラマウス（キメラ率約90％）より血清を採取し、ELISA法（Tomizukaら, Nature Genet., 16:133, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）によって、ヒトμ鎖およびヒトλ鎖タンパク質の発現を検討した。その結果、2匹のキメラマウス共に、ヒトμ鎖、λ鎖の両者が陽性であった。
【０１００】
同様に、ΔΔHACを保持するES細胞クローン(TΔΔ＃21)由来のキメラマウス(キメラ率約100％、実施例１１)の尻尾由来DNAにおいても上記2種のプライマー陽性であり、ΔΔHACの保持が確認された。さらには、上記同様のELISA解析により、該ΔΔHAC保持キメラマウス血清においてはヒトμ鎖、λ鎖両者が陽性であることが示される。
【０１０１】
λHACを保持するES細胞から得られたλHAC保持キメラマウスのキメラ率は最高で約80％であったが、ΔHACにおいては約85％および90％、ΔΔHACにおいては約100％のキメラ率を有するキメラマウスが得られた。より高いキメラ率のキメラマウスの使用はより高い効率の導入染色体保持ES細胞の生殖細胞への分化と該導入染色体の子孫伝達をもたらすと考えられる。すなわちΔHAC、ΔΔHACの使用により、抗体免疫グロブリンλ鎖遺伝子を含むヒト22番染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まることが期待される。
【実施例１３】
【０１０２】
ヒト人工染色体ΔHAC、ΔΔHACを保持するキメラマウスからの人工染色体子孫伝達
実施例１１でTT2F/ΔHACクローン（TΔ#6）より作製された雌キメラマウス（キメラ率約85%）をMCH（ICR）（白色、日本クレア社より購入）雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した10匹の仔マウスのうち、4匹がES細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちΔHACを保持するES細胞株、TΔ#6は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。濃茶色仔マウス4匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムDNAを調製した。得られたDNAについてIgλおよびVH3検出用プライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、ΔHACの保持を検討した結果、4匹全てにおいて2種のプライマー共に陽性であり、キメラマウス子孫におけるΔHACの保持が確認された。さらに4匹中3匹の血清を採取し、ELISA法（Tomizukaら, Nature Genet., 16:133, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）によって、ヒトμ鎖およびヒトλ鎖の発現を検討した。その結果、調べた3匹全てにおいてヒトμ鎖、λ鎖の両者が陽性であった。実施例１１でTT2F/ΔΔHACクローンより作製されるキメラマウスからのΔΔHAC子孫伝達も同様な方法で示される。
【０１０３】
ΔHACあるいはΔΔHACをそれぞれ保持し、子孫伝達するマウス系統における各HACの安定保持を、尻尾より調製した繊維芽細胞のFISH解析等で検討する。その結果、当該マウス系統体細胞における各HACの安定保持が示される。
【０１０４】
また、ΔHACあるいはΔΔHACを保持し子孫伝達するマウス系統において、ヒトIgλ鎖/重鎖からなる完全なヒト抗体分子の発現はELISA法等で確認される。さらにΔHACあるいはΔΔHACを保持し子孫伝達するマウス系統を内在性抗体重鎖、軽鎖κ遺伝子を欠損しているマウス系統と繰り返し交配し、各HACを保持しかつ内在性抗体重鎖およびκ鎖遺伝子欠損についてホモであるマウス系統を得ることができる。これらのマウス系統においては主としてヒトIg重鎖とλ鎖からなる完全なヒト抗体が産生される。
【実施例１４】
【０１０５】
ヒト免疫グロブリン重鎖、軽鎖λ、軽鎖κを同時に発現するマウス系統の構築
ヒトIg重鎖、軽鎖κ、軽鎖λを同時に産生し、かつヒトIg重鎖と軽鎖κあるいは軽鎖λからなる分子を主成分とする抗体を産生するマウス系統は以下の（A）、（B）系統間の交配により作製できる。
【０１０６】
（A）ΔHACを保持し子孫伝達するマウス系統、TC（ΔHAC）あるいはΔΔHACを保持し子孫伝達するマウス系統、TC（ΔΔHAC）（実施例１３参照）。
【０１０７】
（B）内因性抗体重鎖、κ鎖遺伝子欠損についてホモ接合体かつ2番染色体断片W23を保持し子孫伝達するマウス系統TC（W23）/ΔH/Δκ（Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727,2000）。
【０１０８】
系統(A)と系統(B)の交配により得られる仔マウスは、実施例１３および富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）に記載された方法で解析する。本交配により得られる仔マウスは全て内因性抗体重鎖欠損、κ鎖欠損についてヘテロ接合体であるが、そのうちΔHAC（あるいはΔΔHAC）を保持する個体とW23断片を保持する個体を交配してさらに子孫を得る。最終的には内因性抗体重鎖欠損、κ鎖欠損について共にホモ接合体であり、かつΔHAC（あるいはΔΔHAC）およびW23断片を同時に保持する個体（系統（D））を選抜する。
【０１０９】
系統(D)におけるヒト免疫グロブリン重鎖、κ鎖、λ鎖の発現は富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）および（WO98/37757）に記載された方法で確認される。
【実施例１５】
【０１１０】
ΔHACを保持し、かつ内因性Ig重鎖、κ鎖遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
実施例１３で作製されたTC（ΔHAC）を、富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）に記載された内因性Ig重鎖、κ鎖ノックアウトマウス系統に戻し交配し、得られたマウス個体について、PCR法、ELISA法を用いて遺伝子型の解析を行った（実施例１２および富塚らの報告参照）。
【０１１１】
その結果、ΔHACを保持し、内因性Ig重鎖ノックアウトについてホモ接合体、かつ内因性Igκ鎖ノックアウトについてホモ接合体である個体（以下、TC（ΔHAC）/ΔH/Δκと記す）を得た。
【０１１２】
２匹のTC（ΔHAC）/ΔH/Δκ個体（8週齢）の血清中におけるヒトIg重鎖およびλ鎖タンパク質の発現を、黒岩らの報告（Nature Biotechnol., 18:1086-, 2000）に記載されたELISA法にて解析した結果、それぞれ、ヒトIgμ鎖：430μg/ml、Igγ鎖：180μg/ml、Igλ鎖：330μg/mlおよび、ヒトIgμ鎖：720μg/ml、Igγ鎖：320μg/ml、Igλ鎖：520μg/mlであった。
【実施例１６】
【０１１３】
ΔHACおよびヒトIgκ鎖遺伝子を含むヒト2番染色体断片を保持し、かつ内因性Ig重鎖、κ鎖遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）に記載の内因性Ig重鎖、κ鎖ノックアウトマウスの遺伝的背景にヒトIgκ鎖遺伝子を含むヒト2番染色体断片（hCF（W23））を保持するマウス系統（以下、TC（W23）/ΔH/Δκと記す）と実施例１５で作製されたTC（ΔHAC）/ΔH/Δκ系統を交配し、得られたマウス個体について、実施例１５と同様に遺伝子型の解析を行った。
【０１１４】
その結果、ΔHACおよびhCF(W23)を同時に保持し、内因性Ig重鎖ノックアウトについてホモ接合体、かつ内因性Igκ鎖ノックアウトについてホモ接合体である個体（以下、TC（ΔHAC）/TC（W23）/ΔH/Δκと記す）を得た。
【０１１５】
さらに、TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκ個体の血清を、富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000）および黒岩らの報告（Nature Biotechnol., 18:1086-, 2000）に記載されたELISA法で解析することにより、ヒトIgμ鎖、γ鎖、λ鎖、κ鎖タンパク質の発現が検出される。
【実施例１７】
【０１１６】
ΔHACおよびヒトIgκ鎖遺伝子を含む酵母人工染色体を保持し、かつ内因性Ig重鎖、κ鎖遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築
Fishwildらの報告（Nature Biotechnol., 14: 845-851, 1996）に記載された内因性Ig重鎖、κ鎖ノックアウトマウスの遺伝的背景にヒトIgκ鎖遺伝子を含むトランスジーン（KCo5：ヒトκ軽鎖遺伝子の可変領域の約40％を含む）を保持するマウス系統（米国Medarex社より入手。以下、KCo5/ΔH/Δκと記す）と、実施例１５で作製されたTC（ΔHAC）/ΔH/Δκ系統を交配して得られたマウス個体について、実施例１５と同様にPCR法、ELISA法を用いて遺伝子型の解析を行った。
【０１１７】
その結果、ΔHACおよびKCo5を同時に保持し、内因性Ig重鎖ノックアウトについてホモ接合体、かつ内因性Igκ鎖ノックアウトについてホモ接合体である個体（以下、TC（ΔHAC）/KCo5/ΔH/Δκと記す）を得た。
【０１１８】
なお、トランスジーンKCo5を構成する酵母人工染色体とプラスミドを保持する微生物は、米国ATCCに寄託されている。受託番号は下記のとおりである。酵母人工染色体y17を保持する酵母：ATCC No. PTA-3842、プラスミドpKV4を保持する大腸菌：ATCC No. PTA-3843、プラスミドpKCIBを保持する大腸菌：ATCC No. PTA-3844。
【０１１９】
TC(ΔHAC)/KCo5/ΔH/Δκ個体の血清を、実施例16と同様にELISA法にて解析した結果、ヒトIgμ鎖、γ鎖、λ鎖、κ鎖タンパク質が検出された。また、測定した3個体におけるγ鎖の値の平均値はμ鎖の平均値よりも高かった。
【実施例１８】
【０１２０】
TC（ΔHAC）/ΔH/Δκマウス系統における抗G-CSF抗体産生
実施例１５で作製されたTC（ΔHAC）/ΔH/Δκマウス2個体をヒトG-CSFにより免疫した。アジュバントとしてはTiterMaxGold(CytRx)を用いた。初回は計37.5μｇのヒトG-CSFを３箇所に分けて皮下に免疫した。2回目および3回目は初回免疫後14日目および38日目に計10μｇを初回免疫と同様に3箇所に分けて皮下に免疫した。初回免疫後48日目の最終免疫は10μgのG-CSFをアジュバントなしで静注した。最終免疫より3日後に採血を行い、血清中の抗G-CSFヒトIgG抗体価およびヒトIgλ抗体価を黒岩らの報告（Nature Biotechnol., 18:1086-, 2000）に記載されたELISA法にて測定した。その結果、2個体共に抗ヒトG-CSFヒトIgG抗体価およびヒトIgλ抗体価の上昇が観察された。
【０１２１】
さらに、上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより得られる、ハイブリドーマ（安東、千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク、１９９１）をELISAによりスクリーニングすることにより、ヒトIg重鎖および軽鎖λからなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【実施例１９】
【０１２２】
TC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκマウス系統における抗G-CSF抗体産生
実施例１６で作製されたTC(ΔHAC)/TC(W23)/ΔH/Δκマウス個体を、実施例１８と同様に、ヒトG-CSFにより免疫する。このマウスの血清中の抗G-CSFヒトIgG抗体価、ヒトIgλ抗体価およびヒトIgκ抗体価をELISA法で測定し、抗ヒトG-CSFヒトIgG抗体価、ヒトIgλ抗体価およびヒトIgκ抗体価の上昇を確認する。
【０１２３】
さらに、実施例１８と同様に、上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより、ヒトIg重鎖および軽鎖λあるいは軽鎖κからなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【実施例２０】
【０１２４】
TC（ΔHAC）/KCo5/ΔH/Δκマウス系統における抗G-CSF抗体産生
実施例１７で作製されたTC（ΔHAC）/KCo5/ΔH/Δκマウス個体を、実施例１８と同様に、ヒトG-CSFにより免疫し、血清中の抗G-CSFヒトIgG抗体価、ヒトIgλ抗体価およびヒトIgκ抗体価をELISA法で測定した。その結果、抗ヒトG-CSFヒトIgG抗体価、ヒトIgλ抗体価およびヒトIgκ抗体価の上昇が確認された。
【０１２５】
さらに、実施例１８と同様に、上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより、ヒトIg重鎖および軽鎖λあるいは軽鎖κからなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができた。
【０１２６】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明により、ヒト抗体重鎖およびλ軽鎖遺伝子全領域を保持し、かつ次世代へ高効率で子孫伝達可能なヒト人工染色体が提供される。また、本発明により、該ヒト人工染色体を高効率で次世代に子孫伝達する非ヒト動物およびその子孫が提供される。さらに本発明によりヒト抗体の作製が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、ヒト人工染色体ΔHAC、ΔΔHACの作製を示す。
【図２】図２は、カセットベクターpTELhisDを示す。
【図３】図３は、ターゲティングベクターpTELhisDλIを示す。
【図４】図４は、ターゲティングベクターp553loxPHygを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
配列番号１−人工配列の説明：プライマー
配列番号２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
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配列番号１３−人工配列の説明：プライマー
配列番号１４−人工配列の説明：プライマー
配列番号１５−人工配列の説明：プライマー
配列番号１６−人工配列の説明：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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