(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物オキシドシクアレンシンターゼ（ＯＳＣ）の結晶形及びそれから得られる結晶構造情報、そのような結晶形の調製方法、並びにＯＳＣ活性の阻害物質の同定及び／又は設計のための方法を提供する。【解決手段】哺乳動物ＯＳＣ及びＯＳＣのリガンドとの複合体について、充分に高い分解能でＸ線回折して三次元構造を決定することにより、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症、血管疾患、真菌症、寄生虫感染症及び胆石を包含するＯＳＣ関連疾患を治療及び／若しくは予防するための、並びに／又は耐糖能異常、糖尿病、腫瘍及び／若しくは過増殖性障害を治療及び／又は予防、好ましくは、高コレステロール血症及び／若しくは高脂血症を治療及び／若しくは予防するための医薬組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物ＯＳＣの結晶形。
【請求項２】
空間群Ｃ２２２1及び非対称単位中にＯＳＣの単量体１個を有することを特徴とする、請求項１に記載の結晶形。
【請求項３】
該結晶が、以下の単位格子寸法：
ａは、１８６〜１９４Å；
ｂは、１９８〜２０６Å；
ｃは、５８〜６６Å；
及び、Ｃ２２２1対称性を有する、請求項１又は２に記載の結晶形。
【請求項４】
表３の原子構造座標を特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結晶形。
【請求項５】
哺乳動物ＯＳＣとその活性部位に結合しているリガンドとの共結晶形。
【請求項６】
空間群Ｃ２２２1及び非対称単位中にＯＳＣの単量体１個を有することを特徴とする、請求項５に記載の共結晶形。
【請求項７】
該共結晶が、以下の単位格子寸法：
ａは、１８６〜１９４Å；
ｂは、１９８〜２０６Å；
ｃは、５８〜６６Å；
及び、Ｃ２２２1対称性を有する、請求項６に記載の共結晶。
【請求項８】
哺乳動物ＯＳＣとアロステリック結合部位に結合しているリガンドとの共結晶。
【請求項９】
哺乳動物ＯＳＣの三次元構造を決定するための請求項１〜８のいずれか１項記載の結晶形又は共結晶形。
【請求項１０】
哺乳動物ＯＳＣを結晶化させる方法であって、２mg／mL〜４０mg／mLの濃度の単分散哺乳動物ＯＳＣを含むｐＨ７.５〜９.５の緩衝化水溶液を提供することを含む、前記方法。
【請求項１１】
（ａ）β−ＯＧミセル中の２mg／mL〜４０mg／mLの濃度の哺乳動物ＯＳＣを含むｐＨ７.５〜９.５の緩衝化水溶液を提供するステップ；
及び、
（ｂ）２％〜２５％の両親媒性小有機分子及び１０％〜３５％のＰＥＧを含む緩衝化沈澱剤溶液を用いて結晶形を成長させるステップ；
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）における哺乳動物ＯＳＣをP. pastorisに産生させる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物ＯＳＣと活性部位リガンドを共結晶化させる方法であって、２mg／mL〜４０mg／mLの濃度の単分散哺乳動物ＯＳＣを含むｐＨ７.５〜９.５の緩衝化水溶液を提供すること及び該哺乳動物ＯＳＣの水溶液に活性部位リガンドを添加することを含む、前記方法。
【請求項１４】
（ａ）β−ＯＧミセル中の２mg／mL〜４０mg／mLの濃度の哺乳動物ＯＳＣを含むｐＨ７.５〜９.５の緩衝化水溶液を提供するステップ；
（ｂ）該哺乳動物ＯＳＣの水溶液に活性部位リガンドを添加するステップ；
及び、
（ｃ）２％〜２５％の両親媒性小有機分子及び１０％〜３５％のＰＥＧを含む緩衝化沈澱剤溶液を用いて共結晶形を成長させるステップ；
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）における哺乳動物ＯＳＣをP. pastorisに産生させる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法で生成された哺乳動物ＯＳＣの結晶形又は共結晶形。
【請求項１７】
哺乳動物ＯＳＣの結晶形の三次元構造を３.５Å又はそれより良好な分解能まで決定する方法であって、
（ａ）哺乳動物ＯＳＣを結晶化させるステップ；
及び、
（ｂ）哺乳動物ＯＳＣの結晶形の三次元構造を決定するために哺乳動物ＯＳＣの結晶形をＸ線回折により分析し、それにより、哺乳動物ＯＳＣの結晶形の三次元構造を３.５Å又はそれより良好な分解能まで決定するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１８】
機械読み取り可能なデータ記憶媒体であって、該データを用いるための命令がプログラムされている機械を用いた場合、配列番号５のアミノ酸配列を含み且つ表３に挙げられている構造座標で表される該アミノ酸のα炭素骨格原子を表す点から約１.５Åより小さな二乗平均平方根偏差を有する一組の点によって画定されるリガンド結合活性部位を含む哺乳動物ＯＳＣの少なくとも一部を含む分子又は分子複合体の図式的な三次元の描写を表示する機械読み取り可能なデータがコード化されているデータ記憶材料を含む、前記データ記憶媒体。
【請求項１９】
ＯＳＣと相互作用する化合物を同定する方法であって、
（ａ）表３に挙げられている構造座標を用いてＯＳＣの三次元モデルを作製するステップ（ここで、該アミノ酸のα炭素骨格原子からの二乗平均平方根偏差は１.５Å未満である）；
及び、
（ｂ）該三次元モデルを用いて、ＯＳＣと相互作用する化合物を設計又は選択するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項２０】
（ｃ）同定された化合物を得るステップ；
及び、
（ｄ）得られた化合物が有するＯＳＣ活性に対する作用を決定するために該化合物をＯＳＣと接触させるステップ；
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物がＯＳＣの活性部位と相互作用する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物がＯＳＣのアロステリック結合部位と相互作用する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がＯＳＣ活性の阻害物質である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
コンピューター支援方法である、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法で同定された化合物。
【請求項２６】
請求項２５に記載された化合物と薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項２７】
高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症、血管疾患、真菌症、寄生虫感染症及び胆石を包含するＯＳＣ関連疾患を治療及び／若しくは予防するための薬物を調製するための、並びに／又は、耐糖能低下、糖尿病、腫瘍及び／若しくは過増殖性障害を治療及び／若しくは予防するための薬物を調製するための、好ましくは、高コレステロール血症及び／若しくは高脂血症を治療及び／若しくは予防するための薬物を調製するための、請求項２５に記載の化合物の使用。
【請求項２８】
ＯＳＣ活性の阻害物質を同定及び／又は設計するための、請求項１〜９及び１６のいずれか１項に記載の結晶形又は共結晶形の使用。
【請求項２９】
特に実施例に関連して、本明細書において実質的に記載されている、新規な結晶形、方法、化合物、組成物及び使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、充分な量の哺乳動物オキシドシクアレンシンターゼ（ＯＳＣ）を組換え発現させる方法、哺乳動物ＯＳＣの結晶形及びその三次元Ｘ線結晶構造、新機構造のモデル化、ＯＳＣリガンドの結合様式、並びに、そのようなデータの使用に基づく合理的な薬物設計法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２，３−オキシドスクアレン:ラノステロールシクラーゼ（ＯＳＣ、Ｅ.Ｃ.５.４.９９.７）は、真核細胞の小胞体に関連するモノトピック膜内在性タンパク質である。それは、線状トリテルペン（３Ｓ）−２，３−オキシドスクアレンの縮合環化合物（例えば、哺乳動物及び真菌類におけるラノステロール、又は植物におけるシクロアルテノールなど）への変換において鍵となるステップを触媒する。ラノステロールは、コレステロール及び多くのステロイドホルモンの前駆物質である。骨格転位において高度な立体選択性及び精度を有することにより、半世紀近くにわたって研究者の興味をそそり、複合酵素により触媒される環化カスケードにおけるメカニズム的な詳細の研究のデータが集められた（Viola, F., et al.(2000), Rationally designed inhibitors as tools for comparing the mechanism of squalenehopene cyclase with oxidosqualene cyclase, Lipids 35, 297−303）。今日、シクラーゼについての関心はまだ衰えていないが、それは、ＯＳＣが抗真菌薬及びコレステロール低下薬を開発するための標的となったからである（Morand, O.H., et al.(1997), Ro 48-8.071, a new 2,3-oxidosqualene:lanosterol cyclase inhibitor lowering plasma cholesterol in hamsters, squirrel monkeys, and minipigs: comparison to simvastatin, J Lipid Res 38, 373−90）。ＯＳＣは、イソプレノイド及び補酵素Ｑの合成の先のファルネシル−ピロホスフェートの下流である。ハムスターにおいて、スタチンは、摂食量及び体重を低減させ、血漿ビリルビン、肝重量及び肝トリグリセリド含有量を増大させたが、それとは対照的に、薬理学的に活性な用量のＯＳＣ阻害薬は有害な副作用は示さなかった（Morand et al., J. Lipid Res. 38, 1997, 373−390）。ＯＳＣの阻害は、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロールの産生を含む間接的な負のフィードバック調節機構のために、ＨＭＧＲの過剰発現を誘発しない（Peffley et al., Biochem. Pharmacol. 56, 1998, 439−449； Nelson et al., J. Biol. Chem. 256, 1981, 1067−1068； Spencer et al., J. Biol. Chem. 260, 1985, 13391−13394； Panini et al., J. Lipid Res. 27, 1986, 1190−1204； Ness et al., Arch. Biochem. Biophys. 308, 1994, 420−425）。この負のフィードバック調節機構は、ＯＳＣ阻害の概念にとって根本的なものであるが、それは、（i）それが、ＨＭＧＲの間接的なダウンレギュレーションを伴う一次阻害効果を相乗効果的に高めること、及び、（ii）それが、前駆物質であるモノオキシドスクアレンが肝臓に多量に蓄積するのを防止することによる。さらに、２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロールは、核内受容体ＬＸＲの最も強力な作動物質の１つであることが見いだされた（Janowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1999, 266−271）。２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロールがＯＳＣ阻害の副生成物であることを考慮すると、ＯＳＣの阻害は、（i）コレステロール−７α−ヒドロキシラーゼを間接的に活性化して胆汁酸ルートを介してコレステロールの消費を増大させることや、（ii）コレステロール逆輸送を刺激して血漿ＨＤＬ−Ｃレベルを増大させる潜在能力を有するＡＢＣタンパク質の発現を活性化するなど、間接的に、ＬＸＲ依存性経路を活性化することもできるという仮説（Venkateswaran et al., J. Biol. Chem. 275, 2000, 14700−14707； Costet et al., J. Biol. Chem. June 2000, in press； Ordovas, Nutr Rev 58, 2000, 76−79； Schmitz and Kaminsky, Front Biosci 6, 2001, D505−D514）、及び／又は、コレス���ロールの腸内吸収を阻害することもできるという仮説（Mangelsdorf、XIIth International Symposium on Atherosclerosis、Stockholm、June 2000）が立てられる。さらに、肝臓ＬＸＲが介在するコレステロールの代謝と脂肪酸の間にクロストークが存在し得るという仮説も立てられてきた（Tobin et al., Mol. Endocrinol. 14, 2000, 741−752）。したがって、ＯＳＣを阻害する化合物は、コレステロール、エルゴステロール及び別のステロール類の生合成も阻害し、血漿コレステロールレベルを低下させる。したがって、そのような化合物は、一般に、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症及び血管疾患の治療及び予防においても使用することができる。さらに、そのような化合物は、真菌症、寄生虫感染症、胆石、胆汁鬱滞性肝障害、腫瘍及び過増殖性障害、例えば、過増殖性皮膚障害及び過増殖性血管障害などの治療及び／又は予防において使用することもできる。さらに、これらの化合物は、糖尿病などの関連疾患を治療及び／又は予防するために耐糖能を改善するのに治療的に有用でもあり得る。
【０００３】
細菌のスクアレンホペンシクラーゼの構造が、阻害物質と複合させて解明された（Lenhart, A., Weihofen, W.A., Pleschke, A. E. and Schulz, G.E., Chemistry & Biology, 2002, Vol. 9, 639−645）。しかしながら、哺乳動物ＯＳＣとは対照的に、細菌のスクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）は、二量体であり（Wendt, K.U., Poralla, K., Schulz, G.E., (1997) Structure and function of a squalene cyclase, Science, 277, 1811−1815）、ＯＳＣと比較して異なった遊離体及び生成物の反応を触媒する。したがって、哺乳動物ＯＳＣとＳＨＣの間には、ＯＳＣリガンドの設計において考慮することが必要な基質結合ポケット及び活性部位領域において著しい相違がある。
【０００４】
トリテルペンシンターゼのような膜タンパク質についての研究は、しばしば、細胞に存在するタンパク質の量が一般に少ないこと、過剰発現系を確立するのが困難であること、そのようなタンパク質の溶解性及び結晶化能（crystalizability）が限られていることによって妨げられる。さらにまた、ＯＳＣの場合は、純粋なタンパク質は限られた量しか入手することができない（Cattel, L. & Ceruti M.(1998) Inhibitors of 2,3-oxidosqualene cyclase as tools for studying the mechanism and function of the enzyme. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 353−373）。殆どの場合、ラットのＯＳＣについて成されたように、該タンパク質は天然源から精製される（Kusano, M., Abe, I., Sankawa, U. & Ebizuka, Y.(1991). Purification and some properties of squalene−2,3−epoxide:lanosterol cyclase from rat liver. Chem Pharm Bull (Tokyo) 39,239-241）。酵母内においてラットＯＳＣを異種発現させても組換えタンパク質は少量しか得られなかった（Abe, I. & Prestwich, G.D.(1995). Molecular cloning, characterization, and functional expression of rat oxidosqualene cyclase cDNA. Proc. Nad. Acad. Sci. USA 92, 9274−9278）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、充分量のＯＳＣを組換え発現させる方法、ＯＳＣの結晶形及びそれらの結晶構造情報、そのような結晶の調製方法、並びに、これら結晶を有するＯＳＣ阻害物質を構造に基づく薬物設計により同定及び／又は設計する方法を提供することにより、ＯＳＣ活性の阻害物質の同定及び／又は設計についての問題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、哺乳動物ＯＳＣの結晶形及びそれらから得られる結晶構造情報、充分量のＯＳＣを組換え発現させる方法、そのような結晶形の調製方法、並びに、ＯＳＣ活性の阻害物質を同定及び／又は設計するためのそれらの使用に関する。本発明のさらなる主題は、ＯＳＣ活性の阻害化合物を同定及び／又は設計する方法、そのような方法で同定されたＯＳＣ活性の阻害化合物、並びに高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症、血管疾患、真菌症、寄生虫感染症及び胆石を包含するＯＳＣ関連疾患を治療及び／又は予防するための医薬組成物における使用、及び／又は、耐糖能低下、糖尿病、腫瘍及び／又は過増殖性障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物における使用、好ましくは、高コレステロール血症及び／又は高脂血症を治療及び／又は予防するための医薬組成物における使用である。
【０００７】
本発明は、哺乳動物ＯＳＣの発現方法、哺乳動物ＯＳＣの精製方法、及び、充分に高い分解能でＸ線を回折してＯＳＣ又はその一部若しくはサブドメインの三次元構造を決定することを可能にする結晶を形成させるための哺乳動物ＯＳＣの結晶化方法を提供する。三次元構造は、ＯＳＣのリガンドを合理的に設計するのに有用である。そのような結晶は、潜在的なリガンドを該結晶に吸収させ、次いで、その複合体の構造を決定することにより、潜在的なリガンド（例えば、阻害物質）の結合様式を決定するのに用いることができる。
【０００８】
一態様において、本発明は、哺乳動物ＯＳＣの結晶形、好ましくは、空間群対称Ｃ２２２1（空間群Ｎｏ.２０）を有し、非対称単位の中にＯＳＣの単量体１個を有する結晶形を提供する。好ましくは、結晶は、寸法ａ、ｂ及びｃを有する単位格子を含み、ここで、ａは１８６Å〜１９４Åであり、ｂは１９８Å〜２０６Åであり、ｃは５８Å〜６６Åであり；そしてα＝β＝γ＝９０°である。好ましくは、結晶は表３に挙げられている原子構造座標により表される空間関係に配置されている原子を含み、この結晶の任意の三次元構造は、図２に示されている全体的なフォールドを有し、そしてこの結晶は、配列番号５の中のアミノ酸の少なくとも約８０％を含むタンパク質のものである。ＯＳＣ又はそのフラグメント、類似体若しくは変異体の原子座標を用いて、ＯＳＣタンパク質又はＯＳＣ関連タンパク質をモデル化することができる。モデルは、本明細書において同定された結合部位に基づいて作ることもできる。好ましくは、結晶は、配列番号５の天然タンパク質のアミノ酸配列を含むＯＳＣ及び活性部位を形成するのに必要な全てのアミノ酸を含む該ＯＳＣのより短い変異体も含む。本発明の結晶は、配列番号６のアミノ酸配列を含む、Ｈｉｓ−タグを有する哺乳動物ＯＳＣの結晶のように、Ｃ末端タグなどの、Ｃ末端にアミノ酸が付加された哺乳動物ＯＳＣであってもよい。
【０００９】
本発明の結晶は、アポ結晶及び共結晶を包含する。本発明のアポ結晶は、結合した活性部位又はアロステリックリガンドを含まずに形成された哺乳動物ＯＳＣの結晶のことを示すが、結合した界面活性剤及び／又は脂質を包含し得る。共結晶は、一般に、活性部位又はアロステリック部位に結合したリガンドを有するＯＳＣを含む。「活性部位」は、概して、酵素によって触媒される酵素反応が起こる部位のことを表す。活性部位リガンドは、哺乳動物ＯＳＣの活性部位に特異的に結合する任意の化合物を意味する。いくつかのデータは、非競合阻害を示すことによりＯＳＣのアロステリック部位の手掛りをも与える（Abe, I., Zheng, Y.F. & Prestwich, G.D. （1998） Photoaffnity labeling of oxidosqualene cyclase and squalene cyclase by a benzophenone−containing inhibitor. Biochemistry 37, 5779−5784）。
【００１０】
好ましくは、本発明の共結晶形は、空間群Ｃ２２２1（空間群Ｎｏ.２０）を有すること及び非対称単位中にＯＳＣの単量体１個を有することを特徴とする。
【００１１】
さらに好ましくは、本発明の共結晶形は、ａが１８６Å〜１９４Åであり、ｂが１９８Å〜２０６Åであり、ｃが５８Å〜６６Åである単位格子寸法を有し、α＝β＝γ＝９０°であり、また、Ｃ２２２1対称を有する。
【００１２】
本発明の共結晶形は、概して、ポリペプチドの活性部位又はアロステリック部位で１つ以上の化合物が会合している結晶性ＯＳＣポリペプチドを含む。会合は、共有結合又は非共有結合であり得る。
【００１３】
本発明のＯＳＣ（２，３−オキシドスクアレン:ラノステロールシクラーゼ（Ｅ.Ｃ.５.４.９９.７））は、哺乳動物ＯＳＣであり得る。好ましくは、本発明のＯＳＣは、ヒトＯＳＣ（ｈＯＳＣ）である。好ましくは、ＯＳＣは、配列番号５に記載されているアミノ酸配列を含み、活性部位を形成するのに必要な全てのアミノ酸を含む該アミノ酸配列の、より短い変異体又は配列番号６に記載されているＣ末端アミノ酸付加を含む、より長い変異体も含む。
【００１４】
本発明のＯＳＣ結晶形は、自然界で産生された、あるいは組換え的に産生されたＯＳＣを包含する天然ＯＳＣの結晶形に限定されないのは理解されるべきである。実際、本発明の結晶は、天然ＯＳＣの突然変異体を包含する。天然ＯＳＣの突然変異体は、天然ＯＳＣ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することにより得られるか、又は、天然ポリペプチド内又は天然ポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端にアミノ酸残基を付加するか又はそこからアミノ酸残基を欠失させることにより得られ、そのような突然変異体がそれから由来した元の天然ＯＳＣと実質的に同じ三次元構造を有する。
【００１５】
実質的に同じ三次元構造を有するとは、天然ＯＳＣの原子構造座標と重ね合わせ、ＯＳＣのα炭素原子の少なくとも５０％が重ね合わせに含まれる場合に、約１.５Å以下の二乗平均平方根偏差を有する、アポ結晶又は共結晶の原子構造座標のセットを有することを意味する。
【００１６】
場合によっては、こうしたポリペプチドをコードするｃＤＮＡ内の都合のよいクローニング部位を提供することや、そうしたポリペプチドの精製を容易にすることなどを目的として、天然ＯＳＣのアミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加が、特に都合よいか又は有利であり得る。天然ＯＳＣの三次元構造を実質的に変えないそのような置換、欠失及び／又は付加は、当業者には明らかであろう。
【００１７】
本明細書で意図されている突然変異体がＯＳＣ活性を示す必要がないことは注目すべきである。実際、ＯＳＣの酵素活性を妨害するが、そのドメインの三次元構造を実質的に変えないような、アミノ酸の置換、付加又は欠失が、本発明においては特に意図されるものである。そのような結晶性ポリペプチド又はそれから得られる原子構造座標を用いて、天然の酵素に結合する化合物を同定することができる。それらの化合物は、天然の酵素の活性に影響を及ぼし得る。
【００１８】
本明細書に記載されている天然ＯＳＣポリペプチド又は突然変異ＯＳＣポリペプチドは、自然源から単離してもよいし、又は、分子生物学の技術分野における当業者に周知の方法で調製してもよい。使用する発現ベクターは、天然又は突然変異ＯＳＣポリペプチドをコードする配列、及び、適切な転写及び／又は翻訳調節シグナルを含み得る。これらの方法は、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術及びin vivo組換え／遺伝子組換えを包含する。例えば、以下の文献に記載されている技術を参照されたい：Maniatis et al.(1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY and Ausubel et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY。
【００１９】
様々な宿主−発現ベクター系を用いて、ＯＳＣをコードする配列を発現させることができる。そのようなものとしては、ＯＳＣをコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；ＯＳＣをコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ＯＳＣをコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＯＳＣをコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させたか又はＯＳＣをコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は、動物細胞系などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの系の発現エレメントは、その強度及び特異性において様々である。使用する宿主／ベクター系に応じて、バクテリオファージμのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの構成的プロモーター及び誘導性プロモーターを包含する数多くの適切な転写エレメント及び翻訳エレメントのいずれでも使用することができる。昆虫細胞系内でクローニングする場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用することができる。植物細胞系内でクローニングする場合、植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット用のプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質用プロモーター）又は植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を使用することができる；哺乳動物細胞系内でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス  ７.５Ｋプロモーター）を使用することができる。ＯＳＣをコードする配列の複数コピーを含む細胞系を作製する場合、適切な選択マーカーと共に、ＳＶ４０系、ＢＰＶ系及びＥＢＶ系ベクターを使用してもよい。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、配列番号４のヌクレオチド配列を含むｈＯＳＣをコードする単離核酸配列が提供される。
【００２１】
さらに、配列番号４のヌクレオチド配列を含むｈＯＳＣをコードする単離核酸配列を含む発現ベクターが提供される。好ましくは、発現ベクターは、Pichia pastoris においてタンパク質を発現するための発現ベクターである。さらに、こうした発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。好ましくは、宿主細胞は、Pichia pastoris である。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、ｈＯＳＣの製造方法に関し、該方法は、宿主細胞がｈＯＳＣを発現することができる条件下で該発現ベクターを有する宿主細胞を培養することを含む。好ましくは、宿主細胞は、P. pastoris である。本発明は、この方法で産生されたｈＯＳＣも提供する。好ましくは、ｈＯＳＣが、高分解能構造決定に適する品質でＯＳＣの結晶形を得るのに充分な量で産生される。
【００２３】
本発明のアポ結晶、誘導体結晶及び共結晶は、バッチ法、液体ブリッジ法、自由界面拡散法、透析法、蒸気拡散法及び懸滴（hanging drop）法などのタンパク質結晶学の技術分野で周知の技術により得ることができる（例えば以下の文献を参照されたい：McPherson (1982), Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley, NY； McPherson (1990), Eur. J. Biochem. 189：1−23； Webber (1991) Adv. Protein Chem. 41：1−36； Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, Edited by Arnaud Ducruix and Richard Giege, Oxford University Press； Protein Crystallization Techniques, Strategies, and Tips, Edited by Terese Bergfors, International University Line, 1999）。一般に、本発明のアポ結晶又は共結晶は、可溶性で実質的に純粋なＯＳＣポリペプチドを、タンパク質を沈殿させるのに必要な濃度よりわずかに低い濃度の沈澱剤を含む水性バッファー中におくことにより成長させる。次いで、制御下蒸発により溶液から水を除去して結晶化条件を作成し、その条件を結晶の成長が停止するまで維持する。
【００２４】
好ましくは、ＯＳＣの結晶形は、哺乳動物ＯＳＣを結晶化させるための方法により産生し、該方法は、２mg／mL〜４０mg／mLの濃度の単分散哺乳動物ＯＳＣを含むｐＨ７.５〜９.５の緩衝化水溶液を提供することを含む。より好ましくは、哺乳動物ＯＳＣは、アルキルグルコシド（例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（β−ＯＧ））、アルキルマルトシド（例えば、ＤＤＭ（ドデシルマルトシド））、アルキルオリゴオキシエチレン（例えば、Ｃ8Ｅ5）及び多分散ポリオキシエチレン（例えば、Triton）を包含する非イオン性界面活性剤、並びに、スルホベタイン（例えば、Zwittergent）及びベタインを包含する双性イオン性界面活性剤（両性界面活性剤）、並びに、アルキルジメチルアミンオキシド（例えば、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ））及びＣＨＡＰＳシリーズ（例えば、ＣＨＡＰＳ）を包含するカチオン性界面活性剤からなる群より選択される界面活性剤のミセル内に含まれた状態で提供される。好ましくは、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤又はカチオン性界面活性剤である。さらに好ましくは、界面活性剤は、アルキルグルコシド、例えば、０.３％w／v〜３％w／vの濃度で存在するβ−ＯＧである。最も好ましくは、ＯＳＣの結晶形は、（ａ）β−ＯＧミセル中に２mg／mL〜４０mg／mLの濃度の哺乳動物ＯＳＣを含むｐＨ７.５〜９.５の緩衝化水溶液を提供すること；及び、（ｂ）２％〜２５％の両親媒性有機小分子及び１０％〜３５％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む緩衝化沈澱剤溶液を用いて結晶形を成長させることを含む、哺乳動物ＯＳＣを結晶化させるための方法により生成する。好ましくは、両親媒性有機小分子は、グリセロール、エチレングリコール、ブチルエーテル、ベンズアミジン、ジオキサン、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、メチルペンタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタントリオール及びスクロースからなる群より選択される。好ましくは、哺乳動物ＯＳＣを、酵母菌 Pichia pastoris （P. pastoris）内で生成させる。
【００２５】
好ましくは、共結晶を、哺乳動物ＯＳＣ及び活性部位リガンドを共結晶化させるための方法により生成させ、ここでその方法は、２mg／mL〜４０mg／mLの濃度の単分散哺乳動物ＯＳＣを含むｐＨ７.５〜９.５の緩衝化水溶液を提供すること及び該哺乳動物ＯＳＣ水溶液に活性部位リガンドを添加することを含む。より好ましくは、哺乳動物ＯＳＣが、アルキルグルコシド（例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（β−ＯＧ））、アルキルマルトシド（例えば、ＤＤＭ（ドデシルマルトシド））、アルキルオリゴオキシエチレン（例えば、Ｃ8Ｅ5）及び多分散ポリオキシエチレン（例えば、Triton）を包含する非イオン性界面活性剤、並びに、スルホベタイン（例えば、Zwittergent）及びベタインを包含する双性イオン性界面活性剤（両性界面活性剤）、並びに、アルキルジメチルアミンオキシド（例えば、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ））及びＣＨＡＰＳシリーズ（例えば、ＣＨＡＰＳ）を包含するカチオン性界面活性剤からなる群より選択される界面活性剤のミセル内に含まれた状態で提供される。好ましくは、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤又はカチオン性界面活性剤である。さらに好ましくは、界面活性剤は、アルキルグルコシド、例えば、０.３％w／v〜３％w／vの濃度で存在するβ−ＯＧである。最も好ましくは、ＯＳＣの結晶形は、（ａ）β−ＯＧミセル中の２mg／mL〜４０mg／mLの濃度の哺乳動物ＯＳＣを含むｐＨ７.５〜９.５の緩衝化水溶液を提供するステップ；（ｂ）該哺乳動物ＯＳＣの水溶液に活性部位リガンドを添加するステップ；及び、（ｃ）２％〜２５％の両親媒性有機小分子及び１０％〜３５％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む緩衝化沈澱剤溶液を用いて共結晶形を成長させるステップを含む、哺乳動物ＯＳＣを結晶化させるための方法により生成する。好ましくは、両親媒性有機小分子は、グリセロール、エチレングリコール、ブチルエーテル、ベンズアミジン、ジオキサン、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、メチルペンタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール及びスクロースからなる群から選択される。好ましくは、哺乳動物ＯＳＣを、酵母菌 Pichia pastoris （P. pastoris）内で生成させる。好ましくは、活性部位リガンドは、モル過剰量で添加する。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のＯＳＣ結晶化法又はＯＳＣ共結晶化法により生成したＯＳＣの結晶形又は共結晶形に関する。
【００２７】
さらに、本発明は、哺乳動物ＯＳＣの三次元構造を決定するための、ＯＳＣの結晶形又は結合リガンドを有するＯＳＣの共結晶形を提供する。
【００２８】
本発明の別の態様は、潜在的なＯＳＣリガンドを同定するための、該結晶形と活性部位の使用である。原子座標／Ｘ線回折データを用いて物理的モデルを作ることができ、次に、そのモデルを用いて、ＯＳＣの確定した活性部位、結合部位又は別の構造的若しくは機能的ドメイン若しくはサブドメインと相互作用し得る化合物の分子モデルを設計することができる。あるいは、複合体の原子座標／Ｘ線回折データを、コンピューター読み取り可能媒体上の原子モデル出力データとして表すことができ、これを、コンピューターモデリングシステムで使用して、ＯＳＣの確定した活性部位、結合部位又は別の構造的若しくは機能的ドメイン若しくはサブドメインと相互作用することが期待される種々の分子を計算することができる。例えば、データをコンピューター解析することにより、ＯＳＣとリガンドの三次元的相互作用を計算して、リガンドがＯＳＣの特定のドメイン若しくはサブドメインに結合しているか又はＯＳＣの特定のドメイン若しくはサブドメインのコンホメーションを変えていることを確認することができる。次いで、物理的モデル又はコンピューターモデルの解析により同定されたリガンドを合成して、適切なアッセイを用いて生物学的な活性を試験することができる。
【００２９】
本発明の原子座標／Ｘ線回折データは、一般に、コンピューター読み取り可能媒体上に提供される。次いで、当業者はデータにアクセスして、コンピュータベースシステムを用いて構造決定及び／又は合理的リガンド（例えば、阻害物質）設計に関してそれを解析することができる。典型的なコンピューターシステムには、ハードウェア手段、ソフトウェア手段及びデータ記憶手段が含まれる。ハードウェア手段には、典型的には、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段及びデータ記憶手段が含まれる。当業者は、現在利用可能なコンピューターベースシステムのどれを用いるのが本発明の実施に適しているか容易に理解できる。
【００３０】
コンピューターベースシステムでデータを解析及び比較するために、市販されている様々なソフトウェアプログラムを利用することができる。当業者は、コンピューター解析を行うために利用可能なアルゴリズム又は実行ソフトウェアパッケージのどれをコンピューターベースシステムで利用することができるか又はコンピューターベースシステムでの使用に適合させることができるかについて容易に認識できる。標的構造モチーフ又は標的モチーフは、任意の合理的に選択された配列又は配列の組合せであり、その際、配列は、標的モチーフが折りたたまれたときに形成される三次元的配置又は電子密度マップに基づいて選択される。当技術分野では、様々な標的モチーフが知られている。タンパク質標的モチーフとしては、酵素の活性部位、構造サブドメイン、エピトープ、機能ドメイン及びシグナル配列などを挙げることができるが、これらに限定するものではない。入力手段及び出力手段のための様々な構造フォーマットを用いて、本発明のコンピューターベースシステムに情報を入力及び出力することができる。
【００３１】
様々な比較手段を用いて、標的配列又は標的モチーフをデータ記憶手段と比較して、構造モチーフを同定するか、又は、原子座標／Ｘ線回折データからその一部が得られる電子密度マップを解釈することができる。当業者は、用いることができる公衆に利用可能なコンピューターモデリングプログラムのいずれについても容易に認識できる。
【００３２】
タンパク質を見る、解析する、設計する、及び／又は、モデル化するのに使用することができる適切なソフトウェアには以下に挙げるものなどがある：ＭＯＬＯＣ（Roche, 1985）、ＦＲＥＤ、ＭＡＩＮ、ＦｌｅｘＸ、Ｇｏｌｄ、ＸｔａｌＶｉｅｗ、Ａｌｃｈｅｍｙ（商標）、ＬａｂＶｉｓｉｏｎ（商標）、Ｓｙｂｙｌ（商標）、Ｍｏｌｃａｄｄ（商標）、Ｌｅａｐｆｒｏｇ（商標）、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ（商標）、Ｇｅｎｅｆｏｌｄ（商標）及びＳｉｔｅｌ（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ．から入手可能）；  Ｑｕａｎｔａ（商標）、Ｃｅｒｉｕｓ２（商標）、Ｘ−Ｐｌｏｒ（商標）、ＣＮＳ（商標）、Ｃａｔａｌｙｓｔ（商標）、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（商標）、ＣｈｅｍＸ（商標）、Ｌｕｄｉ（商標）、Ｉｎｓｉｇｈｔ（商標）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（商標）、Ｃａｍｅｌｅｏｎ（商標）及びＩｄｉｔｉｓ（商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ＮＪから入手可能）；  Ｒａｓｍｏｌ（商標）（Ｇｌａｘｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，  Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，  Ｕ．Ｋ．から入手可能）；ＭＯＥ（商標）（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｃａｎａｄａから入手可能）；Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）（Ｓｈｒｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ．から入手可能）；Ｍｉｄａｓ／ＭｉｄａｓＰｌｕｓ（商標）（ＵＣＳＦ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡから入手可能）；ＶＲＭＬ（インターネット上のウェブビューアー−フリーウェア）；Ｃｈｉｍｅ（ＭＤＬ−インターネット上のフリーウェア）；ＭＯＩＬ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，  ＩＬから入手可能）；ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（商標）及びＧＲＡＳＰ（商標）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹから入手可能）；Ｒｉｂｂｏｎ（商標）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ，  Ｔｕｓｃａｌｏｏｓａ，  Ａｌａｂａｍａから入手可能）；ＮＡＯＭＩ（商標）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫから入手可能）；Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｅｙｅｃｈｅｍ（商標）（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ．から入手可能）；Ｕｎｉｖｉｓｉｏｎ（商標）（Ｃｒａｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡから入手可能）；Ｍｏｌｓｃｒｉｐｔ（商標）及びＯ（Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）；Ｃｈｅｍ  ３Ｄ（商標）及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒｔ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）；並びに、上記で挙げたもののアップグレード版。
【００３３】
結晶は、データを収集する前に凍結させてもよい。
凍結した結晶のモザイクの広がりは、場合によっては、アニーリングにより縮小させることができるが、その際、冷窒素ガス流を一時的に遮断することにより、凍結していた結晶を解凍状態にして、その直後、窒素ガス流中で再凍結する。
【００３４】
Swiss Light Source（SLS, Villigen, Switzerland）でシンクロトロンビームラインＰＸ６Ａで、凍結した結晶から、一般に２.２Åまで広がっている回折データを収集した。最適条件下では、１.８Åまで広がるデータが記録された。好ましくは、３.５Å又はそれより良好な分解能までデータを収集する。より好ましくは、２.７Å又はそれより良好な分解能までデータを収集する。
【００３５】
本発明の誘導体結晶は、Ｘ線結晶学の技術分野の当業者に周知の方法に従い、重金属原子の塩を含有する母液にアポ結晶又は共結晶を浸すことにより得ることができる。
【００３６】
本発明の共結晶は、活性部位に結合するリガンドを含有する母液にアポ結晶を浸すことにより得ることができるか、又は、活性部位若しくはアロステリック部位に結合する１種以上のリガンドの存在下でＯＳＣポリペプチドを共結晶化させることにより得ることができる。好ましくは、共結晶は、酵素により変換されない活性部位ＯＳＣリガンドを用いて形成させる。そのような活性部位リガンドの一例は、［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）−ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）メタノンフマレートである。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態において、哺乳動物ＯＳＣの結晶形の三次元構造を３.５Å又はそれより良好な分解能まで決定する方法が提供され、ここで、該方法は、
（ａ）哺乳動物ＯＳＣを結晶化させるステップ；
及び、
（ｂ）哺乳動物ＯＳＣの結晶形の三次元構造を決定するために哺乳動物ＯＳＣの結晶形をＸ線回折により分析し、それにより、哺乳動物ＯＳＣの結晶形の三次元構造を３.５Å又はそれより良好な分解能まで決定するステップ；
を含む。
【００３８】
本発明は、さらに、機械読み取り可能なデータ記憶媒体に関し、ここで、該機械読み取り可能なデータ記憶媒体は、そのようなデータを用いるための命令がプログラムされている機械を用いた場合、配列番号５のアミノ酸配列を含み、且つ表３に列挙された構造座標で表されるアミノ酸の骨格α炭素原子を表す点から約１.５Åより小さな二乗平均平方根偏差を有する一組の点によって画定されるリガンド結合活性部位を含む哺乳動物ＯＳＣの少なくとも一部を含む分子又は分子複合体の図式的三次元描写を表示する機械読み取り可能なデータがコード化されているデータ記憶材料を含む。
【００３９】
本発明の結晶、及び、特に、それから得られる原子構造座標は、多様な用途を有する。例えば、本明細書に記載されている結晶及び構造座標は、新しい治療薬を開発するためのアプローチとして、ＯＳＣと相互作用する化合物を同定するのに特に有用である。該化合物の医薬組成物を開発することができ、該化合物を用いて、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症、血管疾患、真菌症、寄生虫感染症及び胆石を包含するＯＳＣ関連疾患を治療及び／若しくは予防するための薬物、並びに／又は、耐糖能異常、糖尿病、腫瘍及び／若しくは過増殖性障害を治療及び／若しくは予防するための薬物、好ましくは、高コレステロール血症及び／若しくは高脂血症を治療及び／若しくは予防するための、該化合物を含有する医薬を製造するために使用することができる。過増殖性障害としては、過増殖性皮膚障害及び過増殖性血管障害が特に考慮される。
【００４０】
したがって、本発明は、ＯＳＣ活性の阻害物質を同定及び／又は設計するための本発明の結晶形又は共結晶形の使用に関する。
【００４１】
さらに、本発明は、ＯＳＣと相互作用する化合物を同定する方法に関し、該方法は、
（ａ）表３に列挙された構造座標を用いてＯＳＣの三次元モデルを作製するステップ（ここで、該アミノ酸の骨格α炭素原子からの二乗平均平方根偏差は１.５Å未満である）；
及び、
（ｂ）該三次元モデルを用いて、ＯＳＣと相互作用する化合物を設計又は選択するステップ；
を含む。
【００４２】
別の態様において、前記方法は、さらに、
（ｃ）同定された化合物を得るステップ；
及び、
（ｄ）得られた化合物が有するＯＳＣ活性に対する作用を確認するために該化合物をＯＳＣと接触させるステップ；
を含む。
【００４３】
これらの方法における化合物は、ＯＳＣの活性部位と相互作用する化合物であり得るか、又は、ＯＳＣのアロステリック部位と相互作用する化合物であり得る。ＯＳＣの活性部位と相互作用する化合物が好ましい。さらに好ましい化合物は、本発明の上記方法のステップ（ｄ）でＯＳＣの活性に対して阻害作用を示す化合物である。
【００４４】
本発明のさらに別の態様において、ＯＳＣと相互作用する化合物を同定する方法は、コンピューター支援方法である。好ましくは、該化合物が該分子若しくは分子複合体への結合又は妨害が期待されるか否かを決定することは、該化合物と該分子若しくは分子複合体の結合部位又は基質結合表面との間の当てはめ操作を行った後、当てはめ操作の結果をコンピューターで解析して、該化合物と該結合部位の間の会合又は干渉を定量化することを含む。場合により、該方法は、化合物ライブラリーをスクリーニングすることをさらに含む。場合により、該方法は、該化合物を供給又は合成し、次いで、該化合物をアッセイに付して、それが哺乳動物ＯＳＣと相互作用して該ＯＳＣの活性に影響を与えるか否かについて決定することを含む。
【００４５】
本発明は、ＯＳＣと相互作用する化合物を同定するための前記方法により同定された化合物にも関する。
【００４６】
本明細書に記載されている構造座標を、別の天然型ＯＳＣ又は突然変異型ＯＳＣの結晶構造及びそのようなＯＳＣとそれに結合している活性部位阻害物質又は活性化物質との共結晶の構造を決定する上でのフェージングモデルとして用いることができる。該構造座標及びそれから得られた三次元構造のモデルを用いて、天然型ＯＳＣ又は突然変異型ＯＳＣの溶液に基づく構造、例えば、ＮＭＲで得られた構造などを解明するのを助成することもできる。したがって、本発明の結晶及び原子構造座標は、ＯＳＣ及び別のシクラーゼ類の構造と機能を解明するための便利な手段を提供する。
【００４７】
明瞭にし、検討することを目的として、本発明の結晶形は、特定のＯＳＣの代表的なアポ結晶及び共結晶を参照して記載される。当業者は、本明細書に記載されている原理が、ｈＯＳＣを包含し、それには限定されない任意の哺乳動物ＯＳＣの結晶形に一般に適用可能であることを理解する。
【００４８】
したがって、本発明のさらに別の態様において、本発明の方法によりＯＳＣ活性に対して作用する化合物として同定された化合物又はその薬学的に許容される塩と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００４９】
表現「薬学的に許容される」は、本明細書において、正常な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答又は別の問題若しくは合併症を伴うことなく、相応のリスク／受益比をもって、ヒト及び動物の組織と接触させて用いるのに適している化合物、材料物質、組成物及び／又は投与剤形を示すために使用される。
【００５０】
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」は、開示されている化合物の誘導体において、その親化合物がその酸性塩又は塩基性塩を形成することにより修飾されている誘導体を意味する。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩又は有機酸塩、及び、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などがあるが、これらに限定するものではない。薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の無機酸又は有機酸から形成される、親化合物の従来からの非毒性塩又は第四級アンモニウム塩などが包含される。例えば、そのような従来からの非毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸などの無機酸から誘導される塩；及び、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸及びイセチオン酸などの有機酸から調製される塩などが挙げられる。
【００５１】
本発明の薬学的に許容される塩は、従来からの化学的方法により、塩基性部分又は酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、水中若しくは有機溶媒中で、又は水と有機溶媒の混物中で、化合物の遊離酸又は遊離塩基形態を化学量論的な量の適切な塩基又は酸と反応させることにより調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール又はアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストが、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418 に記載されている。前記文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れる。
【００５２】
「安定な化合物」及び「安定な構造」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離操作及び有効な治療薬への製剤化に耐えられるほど充分に強い化合物を示すものである。
【００５３】
さらに、本発明の方法により、治療活性物質として用いるためのＯＳＣ活性に対する作用を有する化合物として同定された化合物、特に、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症、血管疾患、真菌症、寄生虫感染症及び胆石を包含するＯＳＣ関連疾患を治療及び／若しくは予防するための、並びに／又は、耐糖能異常、糖尿病、腫瘍及び／若しくは過増殖性障害を治療及び／若しくは予防するための、好ましくは、高コレステロール血症及び／若しくは高脂血症を治療及び／若しくは予防するためのＯＳＣ活性に対する作用を有する化合物として同定された化合物が提供される。過増殖性障害としては、過増殖性皮膚障害及び過増殖性血管障害が特に考慮される。
【００５４】
本発明のさらに別の態様は、本発明の方法によりＯＳＣ活性に対する作用を有する化合物として同定された化合物の、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症、血管疾患、真菌症、寄生虫感染症及び胆石を包含するＯＳＣ関連疾患を治療及び／若しくは予防するための薬物を調製するための使用、並びに／又は、耐糖能低下、糖尿病、腫瘍及び／若しくは過増殖性障害を治療及び／若しくは予防するための薬物を調製するための使用、好ましくは、高コレステロール血症及び／又は高脂血症を治療及び／又は予防するための医薬を製造するための使用に関する。過増殖性障害としては、過増殖性皮膚障害及び過増殖性血管障害が特に考慮される。
【００５５】
これまで本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、特定の実施例を参照することでさらによく理解されるであろう。そのような実施例は、例証のみを目的として本明細書に含まれているものであり、以下の図面に関連して、別段の断りがない限り、限定することを意図するものではない。
【００５６】
図１：精製後のｈＯＳＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：ゲル濾過後の精製されたｈＯＳＣ−タグ；レーンＭ：分子量がkDaで与えられる標準タンパク質；レーン２：ｍｙｃ−エピトープに対する抗体による、同じタンパク質サンプルの対応ウェスタンブロット。
【００５７】
図２：界面活性の活性に対する影響。１時間でラノステロールに変換されたＭＯＳの量を、記載された放射性アッセイによって測定した。ラノステロールの割合（％）を本アッセイで用いたｈＯＳＣ−タグのタンパク質濃度（０.１〜１μg／mL）に対してプロットした。アッセイバッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７.４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオトレイトール）を適切な界面活性剤（０.２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（λ）、０.６％Ｃ8Ｅ5（τ）、０.８％β−ＯＧ（ν）、０.２％β−ＯＧ（ｏ）及び０.０２％ＤＤＭ（σ））で補足することにより、種々の界面活性剤の影響を試験した。分析用超遠心分離実験（表１）において特定の濃度で単分散タンパク質を与えた界面活性剤には下線を引いた。
【００５８】
図３：ｈＯＳＣの立体リボンダイアグラム。２つの（α／α）バレルドメイン（灰色＝外部バレルヘリックス, 薄灰色＝内部バレルヘリックス）並びにＣ末端及びＮ末端を標識した。ヘリックス８（白色）は、膜に挿入されている非極性プラトーの一部を有する。結合した阻害物質（黒色）は、中心の活性部位の空洞を示している。
【００５９】
図４：（Ａ）結晶化スクリーン（条件２２, 結晶スクリーン１, Hampton Research）内に見いだされた結晶。相分離及び界面活性剤の小さな結晶が見られる。
（Ｂ）リザーバー溶液中の２５％  ＰＥＧ３３５０、０.４Ｍ  酢酸ナトリウム、０.１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.５、１０％（w／v）グリセロールを含む懸滴中で成長させた最適化結晶。結晶化にβ−ＯＧで飽和したタンパク質溶液を用いたが、相分離は起こらなかった。
【００６０】
図５：（Ａ）選択された相互作用側鎖と一緒に阻害物質［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）−メタノンフマレートが結合しているＯＳＣの立体図。灰色の側鎖は、活性部位ポケットを非極性基質取り込みチャンネルから分ける、くびれ部位を形成する。
（Ｂ）阻害物質［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）−メタノンフマレートのプラスに帯電したアミノ基と相互作用するＯＳＣ残基。同様の相互作用は、環化反応におけるプラスに帯電した初期の高エネルギー中間体を安定化する。トリプトファンＴｒｐ３８７及びＴｒｐ５８１は、カチオン−π相互作用によって、アミノＮ原子の位置において、プラスの電荷を安定化することができる。阻害物質のアミノ基は、触媒性アスパラギン酸Ａｓｐ４５５に水素結合する。
（Ｃ）阻害物質のベンゾフェノン基とタンパク質の間の相互作用。末端ブロモフェニル基は、Ｔｒｐ１９２（３.６Å）及びＴｒｐ２３０（３.７Å）とｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ型の相互作用を有し、Ｐｈｅ５２１（４.６Å）とｆａｃｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ型の相互作用を有する。フルオロフェニル基は、Ｐｈｅ６９６（３.７Å）とＨｉｓ２３２イミダゾール環（３.１Å）の間に積み重ねられて（stacked）いる。構築部位（灰色）内のＴｙｒ２３７側鎖のコンフォーメーション変化は、活性部位の空洞を基質入り口チャンネルと連結させることができる。
【００６１】
図６：阻害物質［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）−メタノンフマレートの構造式。
【００６２】
図７：触媒残基領域の重ね合わせ：ＯＳＣ−灰色、ＳＨＣ−黒色。疎水性トンネルの頂部にある芳香族残基（図中ではアステリスクで示されている）は、ＯＳＣ及びＳＨＣが属しているシクラーゼファミリーのメンバーの間で高度に保存されている。これらの残基の側鎖は、スクアレン（ＳＨＣ）及び２，３−オキシドスクアレン（ＯＳＣ）の環化カスケードにおいて、π−カチオン−相互作用を介してカチオンを安定化させるのに重要であると考えられる。疎水性トンネルの頂部におけるこれら残基が高度に保存されているということは、Ａ−環形成についての仮定環化メカニズムによく類似している。しかしながら、シクラーゼが触媒する過程の開始において相違が生じる。ＳＨＣは、スクアレンのＣ＝Ｃ二重結合のプロトン化（オレフィンのプロトン化）によって環化カスケードを開始する必要があるが、ＯＳＣで触媒される環化は、２，３−オキシドスクアレンのエポキシドをプロトン化することによって開始される。
【００６３】
図８：触媒性ＡＳＰの側鎖（ＯＳＣ−灰色，ＳＨＣ−黒色）の配向の相違。
【実施例】
【００６４】
実施例中で言及されている市販試薬は、別段の断りがない限り、製造元の指示にしたがって使用した。
【００６５】
用いた略語は以下のとおりである：β−ＯＧ（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）；ＤＤＭ（ドデシルマルトピラノシド）；Ｃ8Ｅ5（ｎ−オクチル−ペンタオキシエチレン）；ＬＤＡＯ（ラウリルジメチルアミンオキシド）。
【００６６】
実施例１：  ｈＯＳＣの異種発現及び精製
ＤＮＡ操作及び配列解析
ＤＮＡプローブの調製、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ＤＮＡライゲーション及びE.coli株の形質転換は、Sambrookの記述（Sambrook, J., et al.(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)）にしたがって行った。ＤＮＡのシークエンシングには、ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット及びABI PRISM 310 Geneticアナライザーを用いた。ＰＣＲは、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、T3 Thermocycler（Whatman Biometra）で行った。
【００６７】
ヒトＯＳＣ（ｈＯＳＣ）は、ｃＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドは、Ｈｉｓタグを有するｈＯＳＣに対しては、ＳｆｕＩ部位（下線）を有する５'−ＧＴＡＣＣＴＴＴＣＧＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧ−３'（配列番号１）及び５'−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧ−３'（配列番号２）、又は、野生型ｈＯＳＣ（配列番号４）に対しては、５'−ＧＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧ−３'（配列番号３）を用い、配列番号２及び３のプライマーは、いずれもＸｂａＩ部位（下線）を有した。２種類の新しい制限部位を用いて、両方の増幅したＤＮＡフラグメントをｐＰＩＣＺＢベクター（Invitrogen）にクローニングした。それにより、タグを有する構築物のＣ末端でｍｙｃ−エピトープと６ｘＨｉｓ−タグが融合した。配列は、シークエンシングにより確認した。ｐＰＩＣＺＢ−ｈＯＳＣをＰｍｅＩで線状にし、エレクトロポレーションにより、P. pastoris菌株ＧＳ１１５中に形質転換し、得られたコロニーの表現型を、販売元であるInvitrogenの推奨にしたがってチェックした。
【００６８】
モノトピック（monotopic）膜タンパク質ｈＯＳＣをｐＰＩＣＺＢベクターにクローニングして、タグを有する構築物及びタグを有さない構築物を得た。タグを有する変異体について、クローニングによって、最後のアミノ酸であるプロリンがロイシンに変化し、次いで、ｍｙｃ−エピトープ及び６ｘＨｉｓ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ）が続いた。全遺伝子のシークエンシングを行うことにより、報告されている配列（Sung, C.K., et al.(1995), Molecular cloning of cDNA encoding human lanosterol synthase, Biol Pharm Bull 18, 1459-61 及び Young, M., et al., (1996), The human lanosterol synthase gene maps to chromosome 21q22.3, Hum Genet 97, 620-4）との比較において、１つの突然変異Ｌ６４２Ｖが示された。この保存的突然変異（conservative mutation）は一塩基多型（ＳＮＰ）として文献に記載されており、極めて一般的なもであると思われる（Roessler, J., et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1999)）。
【００６９】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける組換えヒトＯＳＣの発現
Ｐｍｅｌで線状としたｈＯＳＣタグ−ｐＰＩＣＺＢ及びｈＯＳＣ−ｐＰＩＣＺＢを用いたＧＳ１１５への形質転換により、１００μg／mLのＺｅｏｃｉｎを含む選択プレート上に非常に多くのコロニー中に両方の構築物が得られた。各々の構築物について、表現型ＭｕｔＳを有する８つのクローン及びｐＰＩＣＺＢを有する対照ＧＳ１１５について、ｈＯＳＣの発現を試験した。この小規模発現試験のために、コロニーをＺｅｏｃｉｎ（１００μg／mL）を含むＹＰＤ培地（１％酵母抽出物, ２％ペプトン, ２％グルコース）中、３０℃でＯＤ６００の値が１０〜１２になるまで増殖させた。細胞を遠心により採集し、２％メタノールを補充したＹＰ培地中に再懸濁させた。同じ量のメタノールを２４時間毎に加えた。４８時間後、細胞を回収し、ガラスビーズ溶菌により粉砕した。上清をｍｙｃ−エピトープに対するモノクローナル抗体（Invitrogen）又は合成ペプチド（Ｃ471−Ｐ−Ｈ−Ｖ−Ｔ−Ｅ−Ｈ−Ｉ−Ｐ−Ｒ480；配列番号７）に対してウサギを免疫感作することにより産生されたポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットした。P. pastoris細胞のガラスビーズ溶菌の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、トランスファーバッファーとして１２ｍＭ Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ、９６ｍＭグリシン及び１０％メタノールを使用して、２５Ｖで１２０分間トランスファー電気泳動によりＰＶＤＦ膜（Invitrogen）に固定化した。ブロッキング及び検出のために、Roche Diagnostics製のＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔplus−キットを製造元の推奨にしたがって用いた。
【００７０】
両方の構築物に関し、ポリクローナルｈＯＳＣ抗体を用いたウェスタンブロットにおいて顕著なシグナルを有するクローンを１つのみ同定することができた。
【００７１】
大規模発現のために、ウェスタンブロットで最も強いシグナルを有した形質転換細胞系の１リットル培養（培地５００ｍＬを含む２Ｌの振盪フラスコ×２）を上記のプロトコルと同じプロトコルで行った。生成物のレベルはあまり高くなくて、タグを有する変異体とタグを有さない変異体ついて、細胞塊１グラム当たり、それぞれ、１〜２mg及び０.５mgであった。
【００７２】
６ｘＨｉｓ−タグを有するｈＯＳＣの精製
１リットル培養から回収したｈＯＳＣ６ｘＨｉｓ−タグ（配列番号６）を発現する細胞（４０g）を、５０mL当たり１ｍＭのＤＮＡｓｅ（Roche Diagnostics）及び２錠剤の完全プロテアーゼ阻害薬（Roche Diagnostics）を補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.５、５％グリセロール、２ｍＭ  ＴＣＥＰ及び２ｍＭ Ｍｇ2Ｃｌ2（バッファーＡ）中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、Ｂａｓｉｃ  Ｚ  モデルセルホモジナイザー（Constant Systems LTD）中で１.９ｋｂａｒで粉砕し、３分間超音波処理し（５０％, レベル５, ０℃）、セルホモジナイザーに再度かけた。粗抽出物にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Fluka）を最終濃度０.２％で添加し、４℃で１時間インキュベーションした。３１，０００×ｇ（JA20,Beckman）で３０分間遠心した後、上清をバッファーＡ＋０.２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ−アガロースカラム（１０×２.５cm）上にのせた。カラムを１カラム容積（ＣＶ）の同じバッファー及び５ＣＶのバッファーＡ＋０.２％Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（β−ＯＧ, Applichem）で洗浄した。次いで、Ｈｉｓ−タグ結合タンパク質をバッファーＡ中の０.５Ｍイミダゾールまでの直線勾配で溶離させた。集めたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でスクリーニングした。ｈＯＳＣを含むフラクションをプールし、ミリポアフィルター装置で濃縮した。濃縮されたタンパク質溶液を、バッファーＡ＋０.８％β−ＯＧで平衡化したFractogel EMD Biosecサイズ排除カラム（１.６cm×６０cm, Merck）上にのせた。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、約９５％の純度を示した。貯蔵のために、プールしたフラクションを液体窒素中で衝撃凍結（shock frozen）させ、−８０℃で貯蔵した。
【００７３】
可溶化するために、２種類の界面活性剤、β−ＯＧ（０.８％）及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０.２％）を試験した。有効性は、Ｎｉ−ＮＴＡ−キレートカラム後に得られた収率で評価した。収率において、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で最も良好な結果が得られた。さらに、インキュベーション時間も極めて重要であり、１時間を超えるインキュベーションを行うと、アフィニティーカラムに結合する１種類の主要なコンタミネーションが生じた。３１，４００×ｇ（JA20, Beckman）で遠心を行った後、上清をＮｉ−ＮＴＡ−キレートカラムにかけた。洗浄及び溶離ステップに関して、β−ＯＧとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の両方の種々の組合せ、それぞれの単独、及び、β−ＯＧについてＣＭＣより高濃度又は低濃度にして試験した。洗浄及び溶離バッファー中、ＣＭＣ（０.６％）より低濃度の０.２％β−ＯＧで、最も良好な結果が得られた。Ｎｉ−キレートカラムを用いた精製において、ｈＯＳＣの２つのピークが得られた。１番目は、界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からβ−ＯＧに代わった直後であり、２番目は、正常なイミダゾール勾配中である。２つを別々にプールした。界面活性剤交換プールにおいて最大量（１００mg）のタンパク質が見いだされたが、イミダゾール勾配中に溶離されたのは、１／４に過ぎなかった。Ｎ末端のシークエンシングにより、両方のプールにおいて、タンパク質がそのＮ末端のメチオニンを失っていることが示された。さらに、質量分析により、１つのヒスチジンに相当する質量差が明瞭に示された。したがって、界面活性剤交換により直接的に溶離されたＯＳＣは、Ｃ末端に５つのヒスチジンしか有しておらず、６つのヒスチジンを有しているＯＳＣよりも結合が弱い可能性もある。可溶化されたｈＯＳＣは、ＣＭＣの濃度（β−ＯＧについては、０.２％）よりも低い界面活性剤濃度で、１日又は２日間、充分に安定であった。２種類のプールを、別々に処理した。両方のプールをサイズ排除クロマトグラフィーに付した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断して、タンパク質の純度は９５％であった（図１）。該タンパク質は、１０％グリセロールを補充したゲル濾過バッファー中で安定であり、−８０℃で、少なくとも半年間、活性を顕著に失うことなく貯蔵することができた。両方のプールで得られたタンパク質の総量は１０５mgであったが、これは、１gのバイオマス当たり２mgのｈＯＳＣに相当する。
【００７４】
ｈＯＳＣ野生型の精製
１リットル培養から回収したｈＯＳＣ野生型（配列番号５）を発現する細胞（４５g）を、バッファーＡに再懸濁させ、６ｘＨｉｓ−タグを有する変異体について記載したように粉砕した。３１，０００×ｇ（JA20,Beckman）で３０分間遠心した後、上清を、さらに、超遠心分離機（Centrikon T2070,Kontron）で４０，０００×rpmで６０分間遠心して、膜フラクションを単離した。得られたペレットを、０.２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を補充したバッファーＡに再懸濁させ、再度、４０，０００×rpmで６０分間遠心した。上清を、再懸濁バッファーで平衡化したＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（１.６cm×１３cm, Merck）にのせた。該カラムを、０.２％のβ−ＯＧを補充した６カラム容積（ＣＶ）のバッファーＡで洗浄し、同じバッファー中の０.５Ｍ塩化ナトリウムまでの直線勾配で溶離させた。集めたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でスクリーニングした。ｈＯＳＣを含むフラクションをプールした。最後のステップとして、Ｈｉｓ−タグを有する変異体について記載したように、ゲル濾過を行った。
【００７５】
タグを有しないｈＯＳＣの場合は、主要な成分としてｈＯＳＣを含む膜フラクションを最初の精製ステップとして単離した。選択的可溶化プロセスに関しては、３種類の異なった界面活性剤、β−ＯＧ（０.８％）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０.２％）及びオクチル−ＰＯＥ（０.６％）を試験した。量と純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。収率及び純度における最も良好な結果は、再度、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で得られた。可溶化されたタンパク質は、慣行にしたがって陰イオン交換体に結合させ、カラムを５カラム容積で洗浄することにより界面活性剤をβ−ＯＧに代え、約１００ｍＭ塩化ナトリウムにおいて単一ピーク中に溶離した。タンパク質は、やはりＮ末端メチオニンを欠いており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断した純度は９０％であった。安定性及び貯蔵条件に関しては、タグを有する変異体と同様の挙動を示した。
【００７６】
実施例２：  発現されたｈＯＳＣの特徴づけ
分析的方法
ｈＯＳＣの精製後、１０〜２０％Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳポリアクリルアミド勾配ゲルでの電気泳動に付した。タンパク質濃度は、Bradford（Bradford,M.M.(1976).A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem 72,248-2541976）にしたがって決定したか、又は、純粋なタンパク質については、２８０nmでの計算による分子吸光係数１８１２４０Ｍ−1cm−1を用いて、吸収分光法（Pace, C.N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gray, T. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4, 2411-2423.）により決定した。
【００７７】
ＯＳＣの活性
活性についてのアッセイ及びＩＣ50の決定は、肝ミクロソーム調製物に関する記述（Lenhart, A., et al. (2003), Binding structures and potencies of oxidosqualene cyclase inhibitors with the homologous squalene-hopene cyclase, J Med Chem 46, 2083-92, 2003）に準じて行った。反応バッファーのみは、界面活性剤を添加して改変した。ＩＣ50を測定するための最終的な条件は、０.５％のアルブミン及び２％未満のエタノールを含む、総容積８０μLの反応バッファー（５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７.４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオトレイトール及び０．８％のβ−ＯＧ）中に３０μＭの［14Ｃ］Ｒ,Ｓ−ＭＯＳを含んだ。組換えｈＯＳＣのタンパク質濃度は、０.４μg／mLであった。種々の界面活性剤の活性に及ぼす影響を試験するために、０.２％のβ−ＯＧ、０.６％のＣ8Ｅ5、０.１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又は０．０１６％のＤＤＭの存在下で、タンパク質濃度を０.１μg／mLと１０μg／mLの間で変動させた。陽性対照として、界面活性剤を含まないヒト肝ミクロソームを０.４mg／mLの最終濃度で使用した（Lenhart, A., et al. （2003）, Binding structures and potencies of oxidosqualene cyclase inhibitors with the homologous squalene−hopene cyclase, J Med Chem 46,2083−92 2003）。
【００７８】
アッセイバッファー（ＤＤＭ,Ｃ8Ｅ5, β−ＯＧ又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；全てＣＭＣより高濃度）で種々の界面活性剤を用いて組換え酵素の活性を試験した。最も高い活性は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で観察され、次いで、Ｃ8Ｅ5及びβ−ＯＧであった（図２）。ＤＤＭの濃度はＣＭＣの２倍であったが、ＣＭＣより低濃度のβ−ＯＧと比較して、同様に低い活性しか観察されなかった。ヒト肝ミクロソーム由来のＯＳＣと組換え酵素をさらに精密に比較するために、０.８％のβ−ＯＧの存在下で、ＯＳＣの周知の阻害物質であるＲＯ−４８８０７１（Morand, O.H., et al., (1997). Ro 48−8.071, a new 2,325 oxidosqualene：lanosterol cyclase inhibitor lowering plasma cholesterol in hamsters, squirrel monkeys, and minipigs： comparison to simvastatin, J Lipid Res 38, 373−90）に対するＩＣ50を決定した。組換えヒトＯＳＣは、肝ミクロソーム由来のＯＳＣについてのＩＣ50値である６.５ｎＭと比較して、８.０ｎＭのＩＣ50値を示した。
【００７９】
ＯＳＣのオリゴマー形成状態
Ｏｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ｉ分析用超遠心機（BeckmanCoulter, Palo Alto）を用いて、２０℃、１００μLのサンプル容積で、沈降平衡（ＳＥ）実験を様々な速度で行った。初期のタンパク質濃度は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１  ｐＨ７.５、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ、０.８％のβ−ＯＧ及び１ｍＭのＭｇＣｌ2（バッファーＢ）中０.２〜０.６mg／mLであった。平衡吸収プロフィールを、２８０nmで２０時間後に記録した。２時間後にさらに記録を取って、平衡に達していることを証明した。
【００８０】
前記プロフィールの解析は、Ｂｅｃｋｍａｎソフトウェアパッケージ及びＳｃｈｕｃｋプログラムＤＩＳＣＲＥＥＱ（Schuck P. （1994）。Optima XL-A分析用遠心を用いて、行なった。回転半径及び波長の同時分析を行なった。（Progr.Colloid Polym.Sci. 94, 1−13）。全ての溶媒の密度は、スクロース添加により界面活性剤の密度にマッチさせたか又は調和させなかったが、それは、ＰＡＡＲ密度計ＤＭＡ４５００型（Anton Paar, Graz, Austria）を用いて測定した。それらの密度を表２に記載した。界面活性剤密度は、個別のＳＥ実験に由来するタンパク質を含まないバッファー中で評価したが、その際、非吸収性界面活性剤には干渉検出顕微鏡（interference detection optics）を使用した。Ｅｄｓａｌｌ（Edsall JT, in Cohn EJ, Edsall JT （eds） （1943） Protein, amino acids and peptides as ions and dipolar ions. Reinhold, New York, 370−381）にしたがってアミノ酸配列から計算した部分比容は、０．７２９cm3／gであった。スクロースを添加しているので、タンパク質の水和状態を考慮しなければならない。ｖｂａｒの推定値は、完全に水和しているタンパク質のｖｂａｒ値である０.７８７cm3／g（Rickwood D. and Chambers J.A.A. （1984） in Centrifugation, a practical approach, 2nd Edition, Edited by D. Rickwood, IRL Press, Oxford）と上記の水和されていないタンパク質の平均により与えられる。しかしながら、最良の当てはめは、ｖｂａｒ＝０.７６６cm3／gについて得られた。したがって、この値を用いた。ＬＤＡＯの場合は、０.９１４g／cm3の密度は補償しなかった。該プロフィールは、様々な数の結合ミセル（bound micelle）を有するモデルにより分析した。最良の当てはめは、１つの結合ミセルで得られた。したがって、この仮定の下で分析を行って、ｖｂａｒ値として０.７９１cm3／gを得た。同様に、ＣＭＣより低い濃度でのβ−ＯＧとの非密度マッチサンプルは、ｖｂａｒ＝０.７４６cm3／gで分析した。この値は、１０の結合β−ＯＧ（10 bound β−OG）に相当する。
【００８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の精製されたＯＳＣは、８０kDaの分子質量に相当するタンパク質のバンド１本を示したが、これは、予測された分子質量の値８５,６９０Daよりも僅かに小さな値であった。該タンパク質の質量スペクトル解析では、８５,７００Daの質量が得られた。この結果は、Ｎ末端メチオニンがないｈＯＳＣ−タグについて理論的に予測された質量と殆ど同一であり、このことは、該タンパク質がグリコシル化又は翻訳後に修飾されていないことを示す。
【００８２】
精製したｈＯＳＣ−タグは、分析用超遠心機を用いて沈降平衡実験により特徴づけを行った。溶媒密度は、Lustigら（Lustig, A., Engel, A., Tsiotis, G., Landau, E.M. & Baschong, W. (2000). Molecular weight determination of membrane proteins by sedimentation equilibrium at the sucrose or nycodenz-adjusted density of the hydrated detergent micelle. Biochim Biophys Acta 1464, 199-206）によって確立されたアプローチにしたがって、界面活性剤の密度に調節した。０.８％のβ−ＯＧの濃度で、該タンパク質は分子量８６kDaの単量体であった。同様のオリゴマー形成状態が、野生型ｈＯＳＣについても認められた。０.２％の濃度で、４００kDaを超える分子質量の凝集体についての大減損、及び二量体、三量体と四量体との間での広い分布（表２）が観察された。分析用超遠心を行うと、オリゴマー形成状態について上記のような詳細な絵を描くことが可能となるので、この方法を用いて、オリゴマー形成状態に対する別の界面活性剤の影響についても試験した。バッファー中の０.２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下において、該タンパク質も単量体であり、単分散である。同様のことが０.６％のＣ8Ｅ5（ＣＭＣ  ０.２％）においても認められたが、タンパク質の５０％は大きな凝集体（＞４００kDa）として失われた。ＬＤＡＯやＤＤＭなどの界面活性剤中では、タンパク質は、単量体、二量体及び四量体の混合物を含む多分散であった。また、５０％を超える該タンパク質が大きな凝集体として失われた。この作用は、ＤＤＭでより顕著であった。活性測定との相関関係により、単量体のｈＯＳＣを含む界面活性剤が最も高い活性を有することが示された（図２）。
【００８３】
実施例３：  結晶化
結晶化するために、０.３％（w／v）のβ−ＯＧを含有するバッファー中で、ｈＯＳＣを約１０mg／mLまで濃縮した。結晶化に先立って、ＣＭＣを上回る濃度まで界面活性剤を添加した。阻害物質複合体共結晶については、結晶化の前にタンパク質を、５ｍＭの［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）−ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモフェニル）−メタノンフマレートと共に（図６）一晩インキュベーションした。結晶は、等容積のタンパク質溶液を２５％のＰＥＧ３３５０、０.４Ｍの酢酸アンモニウム、０.１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８.５、１０％（w／v）エチレングリコールからなるリザーバー溶液を混合することにより、室温で懸滴中で成長させた。いったん初期の結晶化条件が確立された後は、結晶は、播種法（seeding method）を用いて成長させた。
【００８４】
最初のｈＯＳＣ結晶は、室温で、等容積の、０.１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８.５）中に３０％（w／v）のＰＥＧ４０００及び０.２Ｍの酢酸ナトリウムを含有するリザーバー溶液と２.４％（w／v）のβ−ＯＧを含有するタンパク質溶液を混合することにより得た。得られたβ−ＯＧの濃度は結晶化条件におけるβ−ＯＧの飽和濃度よりも充分に高いものであり、β−ＯＧの結晶は、結晶化状況（setup）でタンパク質結晶と一緒に成長した（図４Ａ）。
【００８５】
ｈＯＳＣは、ｐＨが約８.５であり且つ沈澱剤がＰＥＧである限りは、多数の条件下で結晶化させることができた。ＰＥＧ濃度を２０％〜３０％（w／v）のＰＥＧ３３５０及びＰＥＧ４０００で変動させて、ｈＯＳＣを結晶化させた。１００ｍＭ〜４００ｍＭの塩、好ましくは、酢酸アンモニウム又は酢酸ナトリウムを添加して、結晶化を促進した。しかしながら、ｈＯＳＣは、塩の非存在下でも結晶化させることができるし、また、以下に示すどの塩の存在下でも結晶化させることができた：酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、マロン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸リチウム。構造決定に適する大きくて双晶になっていない（untwinned）ｈＯＳＣ結晶は、５％〜１５％（w／v）の範囲の濃度の両親媒性有機小分子であるグリセロール、エチレングリコール又はスクロースの存在下で結晶化させることができた。これらの分子は、β−ＯＧの相挙動に影響を与える両親媒特性を有しており、それによって、結晶化液滴（crystallization drop）内の相の分離を防いだ。また、これらの分子は溶液の粘度を上げるので、結晶の成長速度を低下させる。さらに、これらの分子は、凍結保護剤として作用する。
【００８６】
膜タンパク質の充分に回折する結晶は、相分離が観察されないときは、しばしば、曇り点に近い結晶化条件で成長する（Rosenow, M., et al.(2001), Amphiphiles modify the properties of detergent solutions used in crystallization of membrane proteins, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57, 925−7 2001）。β−ＯＧの相挙動は、酢酸塩の濃度を変えることにより、また、結晶化液滴内の相分離回避のための小さな両親媒性物質を添加することにより調節した。動的光散乱法を用いて、凝集状態を評価することにより可溶性タンパク質の結晶化特性を推定した。単分散タンパク質は、より結晶化しやすかった（D'Arcy, A. （1994）, Crystallizing Proteins - a Rational Approach?, Acta Cryst D50, 469−471）。膜タンパク質ｈＯＳＣの場合、分析用超遠心分離によるタンパク質凝集の評価が、結晶化能を予測するための手段であることが分かった。分析用超遠心分離によって得られた凝集についての結果に一致して、ＣＭＣを上回る濃度の界面活性剤β−ＯＧで単分散的に可溶化にされたｈＯＳＣを結晶化させることのみが可能であった。
【００８７】
実施例４：  Ｘ線データ収集及び解析
結晶をループ内部に装填して、液体窒素中で急速に冷却した。顕微鏡だけでは容易に見ることができない結晶の乱れを検出するために、家庭の電源でＣｕＫα線を用いて、幾つかの結晶配向性における回折イメージを収集した。Swiss Light Source（Villigen, Switzerland）で、１２０ＫのビームラインＰＸ６Ａでのシンクロトロン放射を用いて、完全なデータセットを収集するために双晶化していない、結晶を選択した。結晶は、ビームラインＸ０６Ａで、最大１.８Åの分解能で回折した。該結晶は、約１９０Å、２０２Å及び６２Åの格子サイズを有する空間群Ｃ２２２1に属する。データは、ＤＥＮＺＯ（Otwinowski, Z. & Minor, W.M. Processing of X−ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307−326 (1997)）及びＸＤＳ（Kabsch, W. (1993) Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants J. appl. Cryst. 26, 795800）で処理した。
【００８８】
構造決定及び精密化
構造は、検索モデルとしてスクアレンホペンシクラーゼ（Wendt, K.U., Lenhart A., Schulz, G.E. The structure of the membrane protein squalene hopene cyclase at 2.0 Å resolution, J.Mol. Biol. 286, 175−187, （1999）, pdb−entry 2sqc）を用いて、ＣＣＰ４（Collaborative Computational Project, Number 4, The CCP4 Suite： Programs for Protein Crystallography Acta Cryst. D 50, 760−763（1994））プログラムＭＯＬＲＥＰ（A.Vagin, A.Teplyakov, MOLREP: an automated program for molecular replacement., J. Appl. Cryst. 30, 1022−1025. (1997)）で、分子置換により解明し、プログラムＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Morris, Perrakis & Lamzin, Acta Cryst. D58：968−975,2002）を用いて、自動的に再構築及び精密化した。このモデルにリガンドを加え、分子グラフィックスプログラムＭＯＬＯＣ（Gerber P.R., Muller K., The MOLOC program with the MAB force field, J. Comput. Aided Mol. Design 9, 251−268 （1995））を用いてタンパク質にマニュアルで小さな修正を加えた後で、ＲＥＦＭＡＣ（Murshudow, G.N., Vagin, A.A. & Dodson, E.J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelyhood method. Acta Crystallogr. D53, 240-255(1997)）を用いて精密化を行った。
【００８９】
ｈＯＳＣの単量体構造
典型的な膜タンパク質ｈＯＳＣは界面活性剤が存在しないと不溶性であるので、安定で活性な酵素を得るために、界面活性剤を加えなくてはならなかった。ｈＯＳＣの結晶をβ−ＯＧミセルの存在下で成長させ、構造を、分子置換により解明した。本発明者らのゲル濾過による結果及び界面活性剤で可溶化されたｈＯＳＣについての分析用超遠心のデータ（表２）に一致して、ｈＯＳＣは結晶中では単量体であった。これは、ゲル濾過実験（Kusano et al.(1991) Chem Pharm Bull 39, 239−241）で観察されたラット肝調製物由来のＯＳＣの二量体的挙動とは矛盾した。空間群Ｃ２２２1の結晶学的２回軸を適用することにより作り出されるｈＯＳＣ分子の対は、異なった方向に向いた膜の一部を有する。したがって、それらは、生物学的な二量体ではありえない。ＯＳＣは、ループ及び４つの小さなβ構造によって連結された２つの（α／α）バレルドメインからなる。ドメイン１は、（α／α）６バレルであり、ドメイン２は、ドメイン１に挿入されており、幾つかのヘリックスが欠けているドメイン１の（α／α）６バレルの進化した形態のように見える（α／α）バレルを含む（Wendt, K.U., Poralla, K., Schulz, G.E., Structure and function of a squalene cyclase, Science 277, 1811−1815(1997)）。両方のバレルドメインの全ての内部へリックスのアミノ末端は分子の中心に向いていた。へリックス及びＮ末端領域をそのβ構造と連結しているループは、バレルドメインの間の空間を満たし、ｈＯＳＣ分子の中心に位置する大きな活性部位の空洞を囲んでいた（図３）。ドメイン２は、モノトピック膜タンパク質ｈＯＳＣの膜内挿入点である疎水性プラトーの一部を形成するさらなるへリックスを有する。
【００９０】
５つのＱＷ−配列モチーフは、外部バレル環の幾つかのヘリックスのＣ末端に位置し（Poralla et al. （1994） Trends Biochem. Sci. 19, 157）、Ｑ及びＷの積み重ねられた（stacked）側鎖を有するコンフォーメーションを呈していた。古細菌のホモログ（archeal homologue）スクアレンホペンシクラーゼの構造においても観察される、それらは、水素結合により外部ヘリックスを内部ヘリックスに連結しており、シクラーゼの熱力学的安定性に寄与していると思われる（Wendt, K.U., Poralla, K., Schulz, G.E. (1997), Structure and function of a squalene cyclase, Science 277, 1811−1815）。
【００９１】
基質結合ポケット
大きな活性部位の空洞は、ＯＳＣ分子の中心の２つの（α／α）バレルドメインの間に位置していた。それは、ループと幾つかのβシートで囲まれていた。その内側は、殆ど、疎水性及び芳香族残基で覆われている。空洞は、「頂部」の触媒性Ａｓｐ４５５から、疎水性プラトーで酵素の表面に達する下方のチャンネルまで広がっている。このチャンネルは、残基Ｔｒｐ１９２、Ｃｙｓ２３３、Ｔｙｒ２３７、Ｉｌｅ５２４及びＭ５２５の側鎖によって作られているくびれ（consriction）によって、該空洞から分けられている（図５）。チャンネルをブロッキングする、このくびれ内のＴｙｒ２３７の側鎖により、基質は、別のコンフォーメーションを適合させることで、活性部位空洞まで通過することができる。このチャンネルは、基質取り込みチャンネルであると考えられ、疎水性の基質が無極性環境中でｈＯＳＣの触媒性残基に到達するのを可能にしている（Wendt & Schulz, Science 1998）。ドメイン１の親水性表面から活性部位空洞へと通じる別のチャンネルが存在する。このチャンネルは、残基Ｐｈｅ３９１、Ｐｈｅ５９１及びＧｌｕ４５９の側鎖によって活性部位空洞から分けられている。
【００９２】
阻害物質の結合
共結晶化した阻害物質は、３σコンターレベルで、初期２.２Å（Ｆｏ−Ｆｃ）電子密度マップで完全に特徴付けられた。それは、活性部位空洞内で結合していた。阻害物質のアリルアミノ基は、オキシド−スクアレンのプロトン化により環化反応を開始させる触媒性アスパルテートＡｓｐ４５５に水素結合していた。２.９Å隔てたプロトン化アミノ窒素とＡｓｐ４５５カルボキシレート基の間に、荷電した水素結合が存在した。さらに、アミノ基も、プラスに帯電した初期の高エネルギー中間体を安定化させることにより環化反応を開始させると考えられる幾つかの芳香族残基と相互作用する（図５Ｂ）。アミノＮは、４.７Å〜５.４Åの距離で、Ｔｒｐ３８７及びＴｒｐ５８１とのカチオン−π相互作用を有した。Ｔｙｒ９８及びＴｙｒ７０４のヒドロキシル基までの距離（７.７Å及び６.４Å）は、正電荷を誘電安定化させるには大きすぎる。
【００９３】
アリル−アミノとベンゾフェノン基の間のアルキルスペーサーは、充分には広がってはおらず、アミノＮ原子からエーテルＯ原子まで、僅かに６.３Åの距離を示すに過ぎない。アミン窒素とベンゾフェノンカルボニルの間の距離は、阻害物質の効力に影響を及ぼし、１０.７Åの距離で最も低いＩＣ50値を示す（Jolidon, S., Polak-Wyss, A., Hartmann, P.G., and Guerry, P.(1993). 2,3−Oxidosqualene-lanosterol cyclase： an attractive target for antifungal drug design. In： Recent Advances in the Chemistry of Anti−infective Agents, P.H. Bentley, ed. （Cambridge, U.K.： Royal Soc. Chemistry）, pp.223−233）。阻害物質［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）−メタノンフマレートのｈＯＳＣ複合体において、この距離は１２.０Åであり、これは、プロトステロールカチオンのカルボカチオンの位置とエポキシド酸素の間の距離によく匹敵する。
【００９４】
阻害物質のベンゾフェノン部分のフェニル基は、タンパク質と、幾つかの芳香環相互作用を形成した。末端ブロモフェニル基は、Ｔｒｐ１９２（３.６Å）及びＴｒｐ２３０（３.７Å）とｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ型の相互作用を有し、Ｐｈｅ５２１（４.６Å）とはｆａｃｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ型の相互作用を有した。フルオロフェニル基は、Ｐｈｅ６９６（３.７Å）とＨｉｓ２３２イミダゾール環（３.１Å）の間で積み重ねられていた（図５ｃ）。Ｈｉｓ２３２は、ベンゾフェノンカルボニル基への水素結合の距離の範囲内にはない。ベンゾフェノンカルボニル基は水分子に水素結合し、その水分子がこんどはＩｌｅ３３８のアミドＮに結合していた。この水を介した相互作用は、アリール−Ｘ−アリール基を含む化合物のＩＣ50が、リンカーＸの水素結合アクセプター特性に対して依存しない（Brown et al., 1999, J.Med.Chem 42, pp 1306−1311）という観察とよく一致する。阻害物質の末端ブロモ基は、基質取り込みチャンネルの方を向いており、チャンネルのくびれ部位の残基Ｉｌｅ５２４、Ｔｙｒ２３７、Ｓｅｒ５１８及びＳｅｒ５１８と相互作用する。
【００９５】
阻害物質が配位した（inhibitor−liganded）ｈＯＳＣと遊離ｈＯＳＣの間隔が０.３２Åのｒｍｓｄ−Ｃαによって示されるように、阻害物質が結合してもｈＯＳＣは移動しない。
阻害物質は、相同ＳＨＣとの複合体における空洞の形状と異なる形状を有する空洞の形状に適合する（Lenhart, A.； Weihofen, W.A.； Pleschke, A. E. and Schulz, G.E.； Chemistry & Biology, 2002, Vol. 9, 639−645, 2002）。
【００９６】
ｈＯＳＣとは異なって、細菌性スクアレンホペンシクラーゼ（ＳＨＣ）は二量体である（Wendt, K.U., Poralla, K., Schulz, G.E. (1997), Structure and function of a squalene cyclase, Science, 277,1811−1815）。ＯＳＣとＳＨＣは、共通するシクラーゼ鎖の折りたたみを有する。構築物を重ね合わせると、４.５Åのカットオフを適用した時に（ｐｄｂエントリー２ｓｑｃ）、１.７６Åの二乗平均平方根偏差（ｒｍｓｄ）で５５０対のα炭素原子が生じる。空間的にも、配列においても保存されている９４残基のみを重ね合わせた場合、ｒｍｓｄ−Ｃαは０.８５Åである。
【００９７】
ＳＨＣと比較した場合、ＯＳＣは７０個の付加的なＮ末端アミノ酸残基を有しており、これが、膜の結合部位と反対側の２つの（α／α）バレルドメインの間の領域に折りたたまれる小さな構造モチーフを形成する。延長ループ４２７〜４３１と一緒に、このＮ末端構造モチーフは、リガンド結合ポケットの殆どを形成するドメインの間のループを固める（solidify）ことができる。ｈＯＳＣにおける２つの（α／α）バレルドメインの相対的配位（relative orientation）は、ＳＨＣにおけるそれと僅かに異なっている。
【００９８】
ｈＯＳＣのドメイン１における（α／α）バレルは、ＳＨＣにおけるそれより幅が広く、ヘリックスの内部環を横切るＣα距離は、１.２Å〜１５.８Å（Ａ５３６ＣαからＷ７１４Ｃαまでの距離）増大している。こうしてバレルが広がっているのは、バレルのＣ末端の側部においてバレルの中心に向いているＯＳＣ側鎖がより嵩張っている結果であると思われる（例えば、Ｆ３９１、Ｗ５９０及びＷ７１４）。
【００９９】
実施例５：  ｈＯＳＣ結晶構造にドッキングさせることによる新規なＯＳＣ阻害物質の同定
方法（ドッキング）
ドッキングソフトウェアＦＲＥＤ（OpenEye Scientific Software）を用いて、ドッキング計算を行った。ドッキング法の第一段階は、形状フィッティングルーチン（ドッキングアルゴリズム）であるが、これは、入力として一組のリガンド配異性体をとり、それらを「バンプマップ（bump map）」（リガンド原子が潜在的に位置し得る真の値のブール格子）について試験する。タンパク質と衝突しているか又は活性部位から離れた配位は拒絶される。フィーチャー（feature）ドッキングの解を、さらに、特定のファーマコフォアの特性について評価し、ファーマコフォアを満足しないポーズ（poses）は全て拒絶した。次いで、形状当てはめルーチンで残ったものがスコアリング機能フィルターを通過する。ＯＳＣについてのドッキング手順において、ドッキングは、２つの異なったスコアリング機能のフィルター、ＣｈｅｍＳｃｏｒｅ及びＰＬＰを用いて２回実行した。ドッキングの２回のランの各々で５０００ポーズが戻され、そして、両方のランからの共通化合物（〜５００）のコンセンサスリストを作成した。水酸基回転異性体の最適化、剛体最適化及びねじれの最適化についてのフラッグを、スコアリング工程における「真」の値に設定した。コンセンサスリストの化合物の数を、望ましくない基礎構造（例えば、ベンズアミジン）をフィルタリングにより取り除くことにより、また、高度に類似している化合物を除くこと（構造的な多様性の最大化）により、さらに少なくした。最終的に１３８個の化合物（実質的にスクリーニングされたＲｏｃｈｅ化合物ライブラリーから０.０３％）をスクリーニングに移行させた。
【０１００】
受容体の調製
ＯＳＣのＸ線構造から水分子を除去し、該構造に、極性水素原子を加えた（Gerber P.R., Muller K. (1995), The MOLOC program with the MAB force field, J. Comput. Aid ed Mol. Design 9, 251-268）。
【０１０１】
結合部位の確定
ＦＲＥＤにおいて結合部位を確定するために、ＯＳＣ阻害物質であるトランス−メチル−｛４−［５−（メチル−プロピル−アミノ）−ペント−１−イニル］シクロヘキシル｝−カルバミン酸４−クロロ−フェニルエステルを用いた。ＦＲＥＤは、所与の（Ｘ線、マニュアルでモデル化された）リガンドの周囲に長方形のボックスを構築し、「-addbox」フラッグによりボックスのサイズを増大させるのを可能にした。トランス−メチル−｛４−［５−（メチル−プロピル−アミノ）−ペント−１−イニル］シクロヘキシル｝−カルバミン酸４−クロロ−フェニルエステルを囲むボックスを、０.５Å増大させた。
【０１０２】
化合物ライブラリーの調製
Ｒｏｃｈｅ化合物ライブラリー由来の化合物のために、ＯＭＥＧＡ（OpenEye Scientific Software）によりバイナリ・フォーマットで多重配座異性体ライブラリーを作製した。ＯＭＥＧＡの既定の設定に適用した変更は、（i）大局的極小値とのエネルギー差＞５.０kcal／molの配座異性体の拒絶（GP ENERGY WINDOW）、（ii）出力された配座異性体の最大数４００（GP NUM OUTPUT CONFS）、及び、（iii）最終的なアンサンブルに由来する配座異性体の低エネルギー選択（非ランダム選択）（GP SELECT RANDOM false）であった。
【０１０３】
結果
実施例２に記載したような肝ミクロソーム調製物を用いた活性アッセイにおいて、２０個の化合物が、１μＭで適度な阻害を示し、５０μＭで再試験した。７つの化合物は、５０μＭで２０％を超える阻害を示し、２つの化合物は、５０μＭで、６８％及び７５％という良好な阻害を示した。それらの化合物は、構造的に新しいクラスのＯＳＣ阻害物質を代表するものであり、ＯＳＣを阻害するのには塩基性窒素原子が必須であるという仮定の誤りを立証した。さらに別の化合物は、５０μＭで、３５％、３８％及び５７％の阻害を示した。
【０１０４】
薬物設計のためのＯＳＣ（ＳＨＣに対する活性部位の差）
疎水性トンネルの頂部にある芳香族残基（図７でアステリスク表示）は、ＯＳＣ及びＳＨＣが属しているシクラーゼファミリーのメンバーの間で高度に保存されている。該芳香族側鎖は、スクアレン（ＳＨＣ）及び２，３−オキシドスクアレン（ＯＳＣ）の環化カスケードにおいて、π−カチオン相互作用を介してカチオンを安定化させるのに重要と考えられている。疎水性トンネルの頂部における芳香族残基が高度に保存されていることは、両方のシクラーゼによるＡ−環形成についての仮説的環化メカニズムの類似性によく一致する。しかしながら、シクラーゼが触媒するプロセスの最初において相違が生じる。ＳＨＣは、スクアレンのＣ＝Ｃ二重結合のプロトン化（オレフィンのプロトン化）によって環化カスケードを開始する必要があるが、ＯＳＣ触媒は、２，３−オキシドスクアレンのエポキシドをプロトン化することによって開始する。
【０１０５】
ＳＨＣ触媒におけるオレフィンのプロトン化には、強力なブレンステッド酸が必要とされる。結晶学的データに基づいて、触媒Ａｓｐの酸性度はプロトン化Ｈｉｓに結合している水素によって増加し（図８）、さらに、規則的な水分子により増加することが提唱された。Ａｓｐ:Ｈｉｓ対の酸性度は、スクアレンのプロトン化に充分であるように思われる。それとは対照的に、ＯＳＣでは、ＳＨＣのＨｉｓの位置にある適切な活性化残基を欠いている（ＳＨＣ内のＨｉｓは、ＯＳＣ内のＡｌａと重ね合わせることができる）。エポキシドは、オレフィンよりも容易にプロトン化されるので、ＯＳＣ内の単独のアスパラギン酸が開始には充分であると推定された。しかしながら、実験によって、２，３−オキシドスクアレンが、中性媒体中及び氷酢酸中、室温で約１日完全に安定であることが示された。ＯＳＣについての結晶学的データにより、ＯＳＣファミリーにおいて保存されている、接近したシステインが触媒性Ａｓｐを活性化するのに重要であることが示された。２個のアスパラギン酸の活性化における相違により、触媒性残基について完全に異なった側鎖の配向性が生じる（図８）。側鎖の異なった配向性は、構造に基づく薬物設計に重要な情報を提供する。図７及び８（［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）−ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）メタノンフマレートのフラグメントのみが示されている）に示されている例により、ＳＨＣにおける触媒性Ａｓｐの側鎖の配向はリガンドのプロトン化アミンへの水素結合を形成するのに適切ではなく、［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）−ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）メタノンフマレート−ＳＨＣ複合体中の正電荷は、疎水性トンネルの底部にあるＴｒｐ側鎖のπ−カチオン相互作用により安定化されていることが示された。対照的に、触媒性Ａｓｐの側鎖は、疎水性トンネル方向に両方の酸素原子を向けていた。したがって、［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）−ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）メタノンフマレートに対する効率的な水素結合相互作用を形成する。その結果、構造誘導型薬物設計において、阻害物質は結合部位で後方にシフトし（窒素原子の位置は１.９Å異なる）、疎水性トンネルを最適に占める阻害物質の長さを達成した。さらに、直接的な水素結合を介して触媒性Ａｓｐに結合させる可能性によって、構造的に新しいクラスの化合物の構造に基づく設計において、ＯＳＣを効率的に阻害し、且つ多くの場合代謝的不安定性を伴う、阻害物質の塩基性アミン官能基を有することを回避することが可能になった。
【０１０６】
疎水性トンネルの後部では、両方のシクラーゼについて芳香族残基の数が減少するが、シクラーゼ同士の配列と構造的な相違は増大する。阻害物質［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）−ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）メタノンフマレートとの２つの複合体の構造を比較することにより、ＳＨＣでは、フッ素化芳香環が正確に２つの芳香族側鎖の間に位置することが示された。ＯＳＣには同様のπ−相互作用のための残基を欠いているため、また、触媒性Ａｓｐ側鎖の配向に起因する結合ポケット内のシフトにより、ＯＳＣにおける阻害物質のフッ素化芳香環は、疎水性トンネルの中央の近傍に位置し、近接しているＰｈｅ側鎖とπ−相互作用する。結果として、構造に基づく薬物設計において、ＯＳＣについての阻害物質のπ−システムの鎖長及び位置を、ＳＨＣの構造情報を用いて最適化することはできない。
【０１０７】
２種のシクラーゼの活性部位の間のさらに大きな相違は、疎水性トンネルの末端において明白であり、また、疎水性トンネルの入り口の形成に関与している残基においても明白であった。後部におけるＯＳＣの結合部位は、短くて水分子を収容した。したがって、立体的な不調和を避けて、ＯＳＣについての結合親和性を得るために、ＯＳＣ阻害物質は、比較されるＳＨＣ阻害物質よりも短くなければならない。芳香族残基における相違及び結合部位の入り口部分に近接しているそれらの位置における相違により、結合特性を改善するためには、ＯＳＣ阻害物質の置換基（［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）−ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）メタノンフマレートのｐ−Ｃ4Ｈ4−Ｃｌ）の異なった立体的特性及び異なった電子的特性が必要とされる。
【０１０８】
【表１】
2005095151.tif 000002
【０１０９】
表２：  分析用超遠心機を用いて得られたオリゴマーの分布
１４,０００rpmでの平衡状態における上清中に見いだされるオリゴマーの分布。殆どの場合、溶媒密度は界面活性剤密度と同等であった（本文参照）。減損は、４００kDaを超える分子量を有するペレット化凝集体の量に相当する。初期タンパク質濃度は、バッファーＢ中で０.２〜０.６mg／mLであった。
【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
表３：  ヒトＯＳＣの構造座標
表３に、ＯＳＣ結晶のＸ線回析に由来するＯＳＣの原子構造座標を列挙する。
【０１１２】
【表３−１】
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【０１１３】
【表３−２】
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【０１１４】
【表３−３】
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【０１１５】
【表３−４】
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【０１１６】
【表３−５】
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【０１１７】
【表３−６】
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【０１１８】
【表３−７】
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【０１１９】
【表３−８】
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【０１２０】
【表３−９】
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【０１２１】
【表３−１０】
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【０１２２】
【表３−１１】
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【０１２３】
【表３−１２】
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【０１２４】
【表３−１３】
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【０１２５】
【表３−１４】
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【０１２６】
【表３−１５】
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【０１２７】
【表３−１６】
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【０１２８】
【表３−１７】
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【０１２９】
【表３−１８】
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【０１３０】
【表３−１９】
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【０１３１】
【表３−２０】
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【０１３２】
【表３−２１】
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【０１３３】
【表３−２２】
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【０１３４】
【表３−２３】
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【０１３５】
【表３−２４】
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【０１３６】
【表３−２５】
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【０１３７】
【表３−２６】
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【０１３８】
【表３−２７】
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【０１３９】
【表３−２８】
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【０１４０】
【表３−２９】
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【０１４１】
【表３−３０】
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【０１４２】
【表３−３１】
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【０１４３】
【表３−３２】
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【０１４４】
【表３−３３】
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【０１４５】
【表３−３４】
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【０１４６】
【表３−３５】
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【０１４７】
【表３−３６】
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【０１４８】
【表３−３７】
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【０１４９】
【表３−３８】
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【０１５０】
【表３−３９】
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【０１５１】
【表３−４０】
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【０１５２】
【表３−４１】
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【０１５３】
【表３−４２】
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【０１５４】
【表３−４３】
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【０１５５】
【表３−４４】
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【０１５６】
【表３−４５】
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【０１５７】
【表３−４６】
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【０１５８】
【表３−４７】
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【０１５９】
【表３−４８】
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【０１６０】
【表３−４９】
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【０１６１】
【表３−５０】
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【０１６２】
【表３−５１】
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【０１６３】
【表３−５２】
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【０１６４】
【表３−５３】
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【０１６５】
【表３−５４】
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【０１６６】
【表３−５５】
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【０１６７】
【表３−５６】
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【０１６８】
【表３−５７】
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【０１６９】
【表３−５８】
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【０１７０】
【表３−５９】
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【０１７１】
【表３−６０】
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【０１７２】
【表３−６１】
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【０１７３】
【表３−６２】
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【０１７４】
【表３−６３】
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【０１７５】
【表３−６４】
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【０１７６】
【表３−６５】
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【０１７７】
【表３−６６】
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【０１７８】
【表３−６７】
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【０１７９】
【表３−６８】
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【０１８０】
【表３−６９】
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【０１８１】
【表３−７０】
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【０１８２】
【表３−７１】
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【０１８３】
【表３−７２】
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【０１８４】
【表３−７３】
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【０１８５】
【表３−７４】
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【０１８６】
【表３−７５】
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【０１８７】
【表３−７６】
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【０１８８】
【表３−７７】
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【０１８９】
【表３−７８】
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【０１９０】
【表３−７９】
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【０１９１】
【表３−８０】
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【０１９２】
【表３−８１】
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【０１９３】
【表３−８２】
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【０１９４】
【表３−８３】
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【０１９５】
【表４−１】
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【０１９６】
【表４−２】
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【０１９７】
【表４−３】
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【０１９８】
【表４−４】
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【０１９９】
【表４−５】
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【０２００】
【表４−６】
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【０２０１】
【表４−７】
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【０２０２】
【表４−８】
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【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】精製後のｈＯＳＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図２】界面活性の活性に対する影響。
【図３】ｈＯＳＣの立体リボンダイアグラム。
【図４】（Ａ）結晶化スクリーン（条件２２, 結晶スクリーン１, Hampton Research）内に見いだされた結晶、及び（Ｂ）リザーバー溶液の懸滴中で成長させた最適化結晶。
【図５Ａ】選択された相互作用側鎖と一緒に阻害物質［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）−メタノンフマレートが結合しているＯＳＣの立体図。
【図５Ｂ】阻害物質［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）−メタノンフマレートのプラスに帯電したアミノ基と相互作用するＯＳＣ残基。
【図５Ｃ】阻害物質のベンゾフェノン基とタンパク質の間の相互作用。
【図６】阻害物質［４−［６−（アリル−メチル−アミノ）ヘキシルオキシ］−２−フルオロ−フェニル］−（４−ブロモ−フェニル）−メタノンフマレートの構造式。
【図７】触媒性残基領域の重なった状態。
【図８】触媒性ＡＳＰの側鎖の配向の相違。
【図２】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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