(57)【要約】【課題】本発明の目的は、病原性寄生原虫、ネオスポラの弱毒生培養物および哺乳動物における臨床的疾患および流産の予防に有用なこれから作られるネオスポラ病に対する生ワクチンを提供することである。【解決手段】本発明生ワクチンは、細胞が親株ものと比較して弱毒した病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫斑の引き金を引くことができる、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の細胞の培養物を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病（neosprosis）に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる、ネオスポラ（Neospora）種の病原性親株に由来する温度感受性株の細胞培養物。
【請求項２】
親株の種がネオスポラ  カニナム（N. caninum）である請求項１の培養物。
【請求項３】
ネオスポラ  カニナムの親株がATCC受託番号No. CRL-12231を有するMARC 145サル腎臓細胞に存在するNC-1である請求項２の培養物。
【請求項４】
弱毒化細胞の株が、ATCC受託番号No. CRL-12230を有するMARC 145サル腎臓細胞に存在するNCTS-8である請求項３の培養物。
【請求項５】
ネオスポラ種の病原性親株に由来する温度感受性株の生細胞であって、親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる細胞の免疫学的に有効量、並びに獣医学的に許容可能な担体とを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護するワクチン。
【請求項６】
細胞が請求項１−４のいずれか１項に定義されたものである請求項５のワクチン。
【請求項７】
さらに、アジュバントを含む請求項５または請求項６のワクチン。
【請求項８】
アジュバントが水中油型エマルジョンである請求項７のワクチン。
【請求項９】
ネオスポラ種の病原性親株からの細胞を変性し；親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示す一つ以上の変性した温度感受性の細胞を選択し、クローン増殖させ；そして、生ワクチンとして投与された場合、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる一つ以上の温度感受性の弱毒細胞を選択し、クローン増殖させることを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護するワクチンに使用するためのネオスポラ種の弱毒細胞の培養物を調製する方法。
【請求項１０】
細胞が請求項１−４のいずれか一項に定義されたものである請求項９の方法。
【請求項１１】
ネオスポラ種の病原性親株からの細胞を変性し；親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示すが生ワクチンとして投与された場合、哺乳動物においてネオスポラ病に対し保護する免疫反応の引き金を引くことができる変性した温度感受性の細胞を選択し、クローン増殖させ；そして、哺乳動物に対する生ワクチンとして投与されるのに適する形態となるように、弱毒細胞の免疫学的に有効な量を獣医学的に許容可能な担体とともに組み合わせることを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護するワクチンを調製する方法。
【請求項１２】
細胞が請求項１−４のいずれか一項に定義されたものである請求項１１の方法。
【請求項１３】
ネオスポラ種の病原性親株に由来する温度感受性株の生細胞であって、親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示すが生ワクチンとして投与された場合、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる細胞の免疫学的に有効な量；疾患または病状に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引く一つ以上の他の抗原；並びに獣医学的に許容可能な担体とを含む混合ワクチン。
【請求項１４】
ネオスポラ種の病原性親株に由来する温度感受性株の生細胞であって、親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる生細胞、並びに獣医学的に許容可能な担体、とを含むワクチンの免疫学的に有効な量を哺乳動物へ投与することを含む、ネオスポラ病に対してヒト以外の哺乳動物にワクチン接種するための方法。
【請求項１５】
親株の種がネオスポラ  カニナム（N. caninum）である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ネオスポラ  カニナムの親株が、ATCC受託番号No. CRL-12231を有するMARC 145サル腎臓細胞に存在するNC-1である請求項１５の方法。
【請求項１７】
弱毒化細胞の株が、ATCC受託番号No. CRL-12230を有するMARC 145サル腎臓細胞に存在するNCTS-8である請求項１６の方法。
【請求項１８】
ワクチンがさらにアジュバントを含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
アジュバントが水中油型エマルジョンである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
哺乳動物が、イヌ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、およびウマからなるグループから選択される、請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は病原性原虫、ネオスポラ(Neospora)の弱毒株、並びに哺乳動物おける臨床的疾患および流産の予防に有用である弱毒株から調製されるネオスポラ病（ｎｅｏｓｐｏｒｏｓｉｓ）に対する生ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ネオスポラは、動物の病原性寄生原虫であって、哺乳動物における流産、新生児死亡、先天的感染症および脳疾患の主な原因として最近認識されてきた。デュベイおよびリンドセイ(Dubey and Lindsay) 、1993、Parasitology Today, 9:452-458。ネオスポラ  カニナム(N. caninum)はイヌに感染し、先天的に子犬に感染し、これがしばしば脳性麻痺（ｐｒａｌｙｓｉｓ）に繋がる。ネオスポラ  カニナムのタキゾイトは自然に感染した子犬から単離された。リンドセイおよびデュベイ、1989、J. Parasitol.、75:163-165。ネオスポラ種は家畜牛（ｄａｉｌｙ  ｃａｔｔｌｅ）における流産の主な原因である。ネオスポラ関連疾患、すなわちネオスポラ病のケースはヤギ、ヒツジおよびウマにおいても報告されている。
【０００３】
ネオスポラ  カニナムは病原体、トキソプラズマ  ゴンジ(Toxoplasma gondii)と表面的には類似しているが、ネオスポラ  カニナムとトキソプラズマ  ゴンジは抗原性および微細構造的には相互に区別されてきた。デュベイおよびリンドセイ、1993、前出。さらに、流産したウシ胎児の脳から単離されそしてインビトロで連続培養したネオスポラ様の寄生原虫は、抗原的にも微細構造的にもトキソプラズマ  ゴンジおよびハモンディア  ハモンジ(Hammondia hammondi)とは異なり、ネオスポラ  カニナムと最も類似している。コンラッドら(Conrad et al.)、1993、Parasitology 106:239-249。さらに、核の小サブユニットリボソームRNA 遺伝子の分析により、ウシおよびイヌから単離されるネオスポラ種の間にヌクレオチドの差がないことが証明されたが、しかしトキソプラズマ  ゴンジとの一定の差を示した。マルシュら、1995, J.Parasitol. 81:530-535。
【０００４】
ネオスポラのウシからの単離物の、ウシの流産および先天的疾患における病因論的役割が確認された。バールら(Barr et al.)、1994, J.Vet. Diag. Invest. 6: 207-215。中枢神経系ネオスポラ病の囓歯目動物モデルがネオスポラ  カニナムに感染した同系BALB/cマウスを用いて開発された。リンドセイら、1995, J. Parasitol. 81:313-315。さらに、妊娠した異系および同系マウスにおけるネオスポラ  カニナムの経胎盤伝達を研究するためのモデルがコーレら(Cole et al.)、1995, J.Parasitol. 81:730-732 およびロングら(Long et al.)、1996, J.Parasitol. 82:608-611 にそれぞれ記載されている。さらに、自然獲得されたネオスポラ−誘因家畜流産と非常に似ている実験用ネオスポラ  カニナム小型ヤギ(pygmy goat)のモデルが示されている。リンドセイら、1995, Am. J. Vet. Res. 56:1176- 1180。
【０００５】
ＷＯ第9525541号にはウシネオスポラの生物学的に純粋な培養物、抗- ネオスポラ抗体およびネオスポラ- 特異的核酸を検出する方法、並びにワクチンとして使用するためのウシネオスポラ抗原および担体を含む組成物を記載している。しかしながら、WO第9525541号にはネオスポラの弱毒した生培養物、またはこれから調製されるワクチン接種した動物における保護免疫反応の引き金を引くことができる生ワクチンについては記載されていない。
【特許文献１】ＷＯ第9525541号公開パンフレット
【非特許文献１】デュベイおよびリンドセイ(Dubey and Lindsay) 、1993、Parasitology Today, 9:452-458
【非特許文献２】リンドセイおよびデュベイ、1989、J. Parasitol.、75:163-165
【非特許文献３】コンラッドら(Conrad et al.)、1993、Parasitology 106:239-249
【非特許文献４】マルシュら、1995, J.Parasitol. 81:530-535
【非特許文献５】バールら(Barr et al.)、1994, J.Vet. Diag. Invest. 6: 207-215
【非特許文献６】リンドセイら、1995, J. Parasitol. 81:313-315
【非特許文献７】コーレら(Cole et al.)、1995, J.Parasitol. 81:730-732
【非特許文献８】ロングら(Long et al.)、1996, J.Parasitol. 82:608-611
【非特許文献９】リンドセイら、1995, Am. J. Vet. Res. 56:1176- 1180
【発明の開示】
【０００６】
第一の見地において、本発明は、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の細胞であって、該細胞が親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが生ワクチンとして投与した場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができるものの培養物を提供することである。
【０００７】
第二の見地において、本発明は、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって、親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが生ワクチンとして投与した場合、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる細胞の免疫学的に有効な量、並びに獣医学的に許容可能な担体とを含む、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護するためのワクチンを提供することである。本発明のワクチンはさらに一つ以上の他の成分、たとえばアジュバントを含んでよい。本発明のワクチンはネオスポラにより起こされる感染症および疾患に感受性のある哺乳動物種、たとえば非限定的に、イヌ、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびウマへ投与されうる。
【０００８】
第三の見地において、本発明は、ネオスポラ種の病原性親株からの細胞を変性し；親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示す変性した細胞の一つ以上を選択し、クローン増殖させ；そして、生ワクチンとして投与された場合、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる弱毒細胞の一つ以上を選択し、クローン増殖させることを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護するワクチンに使用するためのネオスポラ病原性親株からの弱毒細胞の培養物を調製する方法を提供することである。
【０００９】
第四の見地において、本発明は、ネオスポラ種の病原性親株からの細胞を変性し；親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合、哺乳動物においてネオスポラ病に対し保護する免疫反応の引き金を引くことができる変性された細胞を選択し、クローン増殖させ；そして哺乳動物に対する生ワクチンとして投与されるのに適する形態となるように、弱毒細胞の免疫学的に有効な量を獣医学的に許容可能な担体とともに組み合わせることを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護するワクチンを調製する方法を提供することである。
【００１０】
第五の見地において、本発明は、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって、親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる生細胞、並びに獣医学的に許容可能な担体、とを含むワクチンの免疫学的に有効な量を哺乳動物へ投与することを含む、ネオスポラ病に対して哺乳動物にワクチン接種するための方法を提供することである。
【００１１】
第六の見地において、本発明は、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって、親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる細胞の免疫学的に有効な量；疾患または病状に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引く一つ以上の他の抗原；並びに獣医学的に許容可能な担体とを含む、混合ワクチンを提供するものである。この混合ワクチンはさらに一つ以上の他の成分たとえばアジュバントを含むことができる。
【００１２】
出願人は、ネオスポラ種の病原性株の細胞を弱毒化し、その得られた弱毒細胞が生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができることを発見した。したがって本発明は、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の細胞であって、親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが生ワクチンとして投与した場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる細胞の培養物を提供するものである。
【００１３】
本発明はさらに、ネオスポラ種の病原性親株からの細胞をたとえば高次の連続継代培養または突然変異誘発剤への暴露により、あるいは組換えDNA 技術を用いた遺伝子工学により変性し；親株の細胞と比べて弱毒の病原性を示す一つ以上の変性した細胞を選択し、クローン増殖させ；そして、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる弱毒細胞の一つ以上を選択し、クローン増殖させることを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護するワクチンに使用するためのネオスポラ種の弱毒細胞の培養物を調製する方法を提供する。
【００１４】
本明細書中で使用される用語“ネオスポラ病(neosporosis) ”とは、ネオスポラの種または株による哺乳動物の感染、またはネオスポラによる哺乳動物の感染に伴う臨床的症候群、症状、状態または病状のいずれかに関する。
【００１５】
本明細書中で使用する用語“弱毒された、弱毒の（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）”とは、そこから弱毒細胞、培養物または株が由来するネオスポラの親株のものと比較してインビトロまたはインビボで感染力または菌力において検出可能な低下を示す、ネオスポラの細胞、培養物または株を示す。菌力における低下は、たとえばインビトロまたはインビボにおける感染力を含む菌力の特性、または感染に伴う臨床的症候群または症状の程度または進行速度におけるいずれかの低下を含む。
【００１６】
用語“親株”は、インビボまたはインビトロで一つ以上の継代によりまたは弱毒工程によりこれから由来する弱毒株より、哺乳動物へ投与されたとき比較的高い病原性を示すネオスポラの株に関する。
【００１７】
さらに本発明は特定の哺乳動物種において病原性ではない株または種から由来するネオスポラの株の細胞であって、この細胞がその哺乳動物種のメンバーにおいて保護免疫反応の引き金を引くことのできるように化学的または遺伝的手段により変性された細胞のワクチンの調製およびその使用を含む。
【００１８】
本発明の弱毒生細胞は、生ワクチンとして一回以上の投与後ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる。“保護免疫反応”は、哺乳動物において抗体もしくは細胞仲介免疫のいずれかまたは両方が生じて、次の感染を予防するかもしくはかなり低下させ、またはネオスポラ病に伴う一つ以上の臨床的徴候または症状を除くかもしくはその程度をかなり軽減しまたは進行速度をかなり低下させる、いずれかの免疫学的反応として定義されうる。用語“免疫学的有効量”は、哺乳動物へ投与された場合、保護免疫反応の引き金となるワクチンまたは抗原の量または投与量に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ネオスポラの弱毒株の調製
本発明はネオスポラの病原性株の細胞が弱められ、そして得られた弱毒細胞が生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金となりうるという発見に基づくものであり、本発明の実施が弱毒化の特定の方法に制限されるものではない。むしろ、ネオスポラの病原性株の細胞の弱毒化は、この分野で公知の技術または手法のいずれかを用いて、たとえば非限定的例であるが、高次継代培養、または突然変異誘発剤への暴露、または組み換えDNA 技術を用いた遺伝子工学、またはこれらの組合せにより行われうる。
【００２０】
高次継代培養は、感受性宿主細胞におけるネオスポラの病原性株の細胞のインビトロ培養を十分な弱毒化が生じるまで繰り返し行うことにより行われる。継代は弱毒化細胞を選択するための特別な環境条件下で行ってもよい。たとえば、継代培養は、哺乳動物へワクチンを投与する場合、増殖しないかまたは低速で増殖するだけのネオスポラの温度感受性株を選択するために、ワクチン接種した意図する哺乳動物の体温より低い温度で行いうる。
【００２１】
突然変異誘発は、当該技術分野で記載されているように、化学的突然変異原または放射線へネオスポラ細胞を晒すことにより行いうる。本発明の実施に有用な化学的突然変異原の非限定的例は、N-メチル- N'- ニトロ- N-ニトロソグアニジン(MNNG)(シグマ）であり、その使用が以下の実施例１に記載されている。放射線は紫外線またはイオン化放射線のいずれかから選択されうる。
【００２２】
突然変異原への暴露の程度、すなわち化学的突然変異原の濃度、または放射線のレベル、ならびに暴露期間は、弱毒レベルの病原性を示すが、哺乳動物へ生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して保護する免疫反応の引き金となりうるネオスポラの一つ以上の生細胞が得られる量であることが好ましい。突然変異誘発剤の使用に好適なパラメーターは標準技術を用いて経験的に決定されうる。
【００２３】
ネオスポラの病原性株はまた、当該分野で公知の技術に従って組み換えDNA 技術を用いて弱められ、本発明はこれから調製される変性した株およびワクチンを含むものである。本発明を実施するために使用されうる組換えDNA 技術の非限定的例は、一つ以上の遺伝子を無力化し、その結果弱毒病原性を有する株を得る遺伝子置換または遺伝子ノックダウンを含む。無力化されうる遺伝子は、たとえば必須代謝遺伝子、または菌力ファクターをコードする遺伝子、または哺乳動物宿主において免疫反応を調節する役割を果たす表面抗原をコードする遺伝子を含む。
【００２４】
ネオスポラゲノムにおける分裂の標的にされうる必須代謝遺伝子の非限定的例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ- チミジル酸  シンターゼ(DHFR-TS) 遺伝子である。チタスら(Titus et al.)、1995, Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A. 、92: 10267-10271 は、DHFR-TS 遺伝子をノックアウトして安全な生ライシュマニアワクチン(Leishmania vaccine)を作ることを記載している(文献は、参考文献として援用される）。ネオスポラにおけるDHFR-TS 遺伝子を分裂させることにより、継続する増殖に対しチミジンを必要とし、弱められた病原性を示し、そして生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対し哺乳動物において保護する免疫反応の引き金となりうる栄養要求性突然変異体が作り出されるであろう。
【００２５】
遺伝子置換または遺伝子ノックダウンのための組換えDNA 技術が当該技術で公知であり、これに限定されるものでないが、相同組換えの利点を有するものを含む。たとえば、ネオスポラの病原性株において、必須の代謝遺伝子好ましくは一本のコピー遺伝子に通常は近接するかまたは内部に位置する相同ヌクレオチド配列を含むベクターたとえばプラスミドを用いて、ネオスポラの病原性株の細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトしてもよい。相同ヌクレオチド配列の間またはその内部において、ベクターは、病原性株におけるヌクレオチド配列に相当するがしかしたとえば病原性株の配列と比較して一つ以上のヌクレオチドにおいて非- サイレント( non-silent) " 変化または欠失を有する結果として不完全であるヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。ベクターを用いた病原性株の細胞の形質転換に続いて、ネオスポラゲノムへ不完全な遺伝子配列を組み込み、これはまた本来のすなわち野性型 "配列を置換するために働く。したがって、標的遺伝子が形質転換細胞において無力化される。次いで形質転換細胞を、弱毒病原性を示すこれらの細胞についてスクリーニングする。次いで弱毒病原性を示す形質転換細胞を、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して保護する哺乳動物における免疫反応の引き金になりうるこれらの細胞について再びスクリーニングする。
【００２６】
形質転換体の選択を助けるために、ベクターはさらにレポーター遺伝子生成物または他の選択性マーカーをコードする配列を含むように設計されうる。本発明に有用なレポーター遺伝子はこの技術でよく知られており、たとえばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT) をコードする遺伝子、またはルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む。レポーター遺伝子のさらに別の非限定的例は、大腸菌β- ガラクトシダーゼをコードする配列であり、これはベクターへ挿入されそしてたとえば赤色- β- D-ガラクトピラノシドのような基質を着色生成物へ転化することを介して酵素活性を検出することにより形質転換体を確認することに使用される。シーバーおよびブースロイド(Seeber and Boothroyd)、1996, Gene, 169:39-45 は、トキソプラズマ  ゴンジにおける形質転換体を検出するためにこのレポーター酵素を使用し、この文献は参考文献として本明細書中に援用される。
【００２７】
本発明に有用な選択性マーカーをコードするコード配列は、当該技術でよく知られており、抗生物質または抗- 代謝産物に対する抵抗性を付与するかまたは栄養要求性を供給する遺伝子産物をコードするものを含む。このような配列の例は、ヒグロマイシン、またはネオマイシン、またはフレオマイシンに対する抵抗性を付与するものを含む。異なる病原菌における耐微生物性マーカーの使用の例がメシナら(Messina et al.)、1995, Gene,165:213-217により記載されており、ここにはトキソプラズマ  ゴンジにおいて安定な形質転換体を構築するためにフレオマイシンに対する耐性マーカーを使用することが記載されており、参考文献として援用される。
【００２８】
レポーター遺伝子産物または選択性マーカーに対するコード配列のいずれも、調節要素コード配列と機能可能なように結合してベクターへ挿入されるのが好ましい。ここで使用する調節要素 "とは、非限定的に、非- 誘因性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび他の発現を行いおよび／または調節するために働く当該技術で公知の他の要素を含む。また、ここで使用されるDNA コード配列は、一つ以上の調節要素と機能可能な結合(operative association) " にあり、ここで調節要素はDNA コード配列の転写および／または相当するmRNAの翻訳を効果的に調節し行う。たとえば、ネオスポラ細胞において選択性マーカーble を発現するベクターは、ネオスポラの遺伝子からまたは非常に類似したアピコンプレキサ(Apicomplexa) 、トキソプラズマからの調節領域とともにble オープンリーディングフレーム(ORF) を側部に位置させることにより構築されうる。別の一本鎖コピーネオスポラまたはトキソプラズマ遺伝子からの5'側部領域を使用してble を発現してもよい。一本鎖コピートキソプラズマ遺伝子の例は次のようである；（i)SAG1, 主なタキゾイト表面抗原、p30 をコードする( ブルグら(Burg et al.) 、1988, J. Immunol. 141:3584-3591)；（ii）GRA1, 分泌たんぱく質、 p23をコードする( セスブロン- デラウら(Cesbron-Delauw et al.) 、1989, Proc. Natl.Acad. Sci.86:7537-7541))；（iii ）GRA2, 分泌たんぱく質、 p28をコードする( メルサーら( Mercier et al.) 、1993,Mol. Biochem. Parasitol.58:71-82)。；一本鎖コピーネオスポラ遺伝子の例は次のものを含む：（i)トキソプラズマSAG1,GRA1 およびGRA2遺伝子の相同体、たとえば公開されているトキソプラズマ配列に基づいて標準PCR 法を用いて同定；（ii）ネオスポラ  カニナムタキゾイトの主要な細胞表面たんぱく質、NC-p43をコードする遺伝子( ヘムフィル( Hemphill）、1996,Infect. Immun. 64:4279-4287) ；および（iii ）免疫優性17- 、29-、30- および37kDa 排泄/ 分泌たんぱく質をコードする遺伝子( ブジェルカスら(Bjerkas et al.)、1994, Clin. Diag. Lab. Immun. 1:214-221)。SAG1遺伝子からの3'側部領域を使用してポリアデニル化配列を提供してもよい。5'プロモーター、ble 遺伝子および3'ポリアデニル化配列の挿入のためのベクターの基本骨格は、標準的な市販のプラスミドのいずれか、たとえばpBLUESCRIPT TM( ストラタジーン）でよい。
【００２９】
適当なベクターを構築すると、これを用いてネオスポラの親株からの一つ以上の細胞を形質転換またはトランスフェクトする。ベクターは、たとえば非限定的例であるが、エレクトロポレーション、微量注入、ウィルストランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、微量発射爆撃(microprojectile bombardment）のような公知技術により細胞へ導入される。
【００３０】
ベクターをネオスポラ細胞へ導入すると、宿主細胞ゲノム、またはエピソームへ導入されたコード配列の存在、組み込みおよび維持は、非限定的例であるが、たとえばサザンハイブリッド化分析；逆転写酵素- PCR (RT-PCR)を含むPCR 分析；予想されるたんぱく質生成物に対する免疫学的または比色計による分析；マーカー遺伝子機能たとえば新規栄養要求性の出現の有無の検知；または病原性における弱毒性の検知を含む標準技術により確認されそしてモニターされる。
【００３１】
ベクター構築、形質転換、形質転換体の選択、宿主細胞発現等の例、たとえば特に病原性原虫へ適用されるものは、以下の刊行物に記載されており、これらは本明細書中に参考文献として援用される。：シーバーおよびブースロイド、1996, 前出；ティタスら、1995, 前出；メッシーナら、1995, Gene, 165: 213-217;シブリーら(Sibley et al.) 、1994,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:5508-5512 ；ドナルドおよびロース(Donald and Roos), 1994, Mol.Biochem. Parasitol., 63:243-253；キムら(Kim et al.), 1993, Science, 262:911-914；リアンら(Ryan et al.)、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90: 8609-8613；ソルダティおよびブースロイド( Soldati and Boothroyd)、1993, Science, 260:349-352；エイドおよびソルナー- ウェッブ(Eid and Sollner-Webb),1991, Proc. Natl. Acad. Sci.USA , 88: 2118-2121 ;レボウィッツら(LeBowitz et al.), 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 87: 9736-9740 ; リーおよびファンデルプレグ(Lee and Van der Ploeg), 1990, Science, 250:1583-1586 ；アスブレークら(Asbroek et al.), 1990, Nature, 348:174 -175；クルツおよびベベルレイ(Cruz and Beverley), 1990, Nature, 348:171 -173 ；およびラバンら(Laban et al.),Nature, 343:572 -574。
【００３２】
ベクター構築、形質転換、形質転換体の選択、宿主細胞発現等を含む遺伝子組換えの一般的技術は、さらにマニアティスら(Maniatis et al.) 、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;アウスベルら(Ausubel et al.)1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y. ; サムブルックら( Sambrook et al. ） 1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; イニスら( Innis et al.）、(eds), 1995, PCR Strategies , Academic Press, Inc., San Diego, Ca;エールリッヒ( Erlich） (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, に記載されており、これらは参考文献として援用される。
【００３３】
弱毒工程の後で、弱毒病原性の一つ以上の指標を示す細胞を培養物から選択し、限界希釈後にクローン増殖する。このような指標の例は、非制限的であるが、インビトロで新規の温度感受性もしくは新規の栄養要求性の出現、または菌力特性たとえば感染性、あるいはとりわけ親株を用いた感染と比べて株の細胞の投与後哺乳動物における一つ以上の徴候または症状の程度もしくは進行速度の低下を含む。本発明を実施するのに有用な温度感受性の特別な非限定的な例は、32℃で増殖するがしかし37℃では増殖しない弱毒株の細胞である。このような温度感受性株は32℃で感染した宿主細胞の溶解を起こし、その結果宿主細胞単層に損傷またはプラークが出現する。37℃で増殖すると、弱毒株は十分に複製せず、したがって宿主細胞単層にプラークが生じない。
【００３４】
ネオスポラの弱毒株は、非限定的であるがネオスポラ  カニナムのような属のいずれかの種のいずれかの病原性株から由来するものである。弱毒株が実際に由来するネオスポラ  カニナムの特定病原性株の非限定的例は、米国、メリーランド州20852 、ロックビレ、パークタウンドライブ12301 のアメリカン  タイプカルチュー  コレクション(ATCC)からの感染したMARC 145サル腎臓細胞に存在する株NC-1(ATCC 受託番号 No. CRL-12231) である。NC-1株はまたデュベイら,1988, J. Am. Vet. Med. Assoc. 193:1259-63に記載されており、この文献は参考文献として援用される。これに代わって、ネオスポラの病原性株は、ネオスポラ病の臨床的症状を示す感染動物の組織、器官または体液から、たとえば前記の文献に記載されているように、標準単離技術を用いて得られうる。ネオスポラ  カニナムのNC-1株から由来する弱毒生株の非限定的例はNCTS-8であり、これはATCCからの感染したMARC 145サル腎臓細胞(ATCC 受託番号 No. CRL-12230) に存在するものである。
【００３５】
ネオスポラの親株および弱毒株の両方とも、当該技術で公知の技術に従って株のタキゾイトを感受性細胞系のいずれか、好ましくは哺乳動物細胞系に感染させることによりインビトロで培養されうる。ネオスポラのタキゾイトが培養されうる哺乳動物細胞系は、とりわけたとえばヒト包茎（ｆｏｒｅｓｋｉｎ）線繊芽細胞( リンドセイら、1993, Am. J. Vet. Res. 54:103-106)；ウシ心肺大動脈内皮細胞( マルシュら、1995, 前出）；およびウシ単球( リンドセイおよびデュベイ、1989, 前出）である。たとえば、ネオスポラ  カニナムのタキゾイトは、Hs68ヒト包茎線繊芽細胞(ATCC 受託番号No. CRL-1635) の単層において培養されうる( リンドセイら、1993、前出) 。ブラディゾイトもまた同様に培養されそして取り扱われる。
【００３６】
哺乳動物細胞培養物が増殖され、そしてネオスポラを感染した細胞培養物が当該技術において記載されている幾つかの培養培地の一つで維持される。たとえば、ネオスポラ  カニナムのタキゾイトに感染したウシ心肺大動脈内皮細胞の静置単層培養が、熱不活化ウシ胎児血清(FBS) または成人ウマ血清( ES)10%v/v 、2mM L-グルタミン、50 U/ml ペニシリンおよび50μg / mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ最小必須培地(DMEM : ニューヨークのＧｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において増殖されうる( コンラッドら、 1993 、前出) 。Hs68ヒト包茎線繊芽細胞の単層は、2%(v/v) ウシ胎児血清、1.0mM ピルビン酸ナトリウム、1 x 104U/mlペニシリン、1 x 10 4μg / mlストレプトマイシン、5 x 10 -2 mM 2- メルカプトエタノール並びに0.3mg/ml L- グルタミンを含むRPIM 1640(Ｇｉｂｃｏ）(維持培地）において維持されうる。ネオスポラに感染したHs 68 ヒト包茎線繊芽細胞の単層培養物は、同定培地ではあるがウシ胎児血清が10%(v/v)まで増加した培地(増殖培地）に維持される。新規栄養要求性を有するネオスポラの弱毒株は当該技術で公知のように、増殖を支持するために培養基に対し適当な修正を要求するであろう。
【００３７】
哺乳動物細胞のネオスポラ感染単層培養物は、一般的には標準的組織培養条件たとえば37℃で5% CO 2 で維持される。タキゾイトは一般に、培養物における哺乳動物細胞の70-90%が感染した場合、非感染単層培養物に継代培養させ、これは標準的技術を用いて顕微鏡的に決定されるであろう。タキゾイトは、標準的技術を用いて宿主細胞を溶解しタキゾイトの生育力を維持し、そしてたとえば濾過または遠心分離によりタキゾイトを集めることにより、感染した哺乳動物細胞培養物から集められうる。
【００３８】
ワクチンの調製および使用
本発明は、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって、親株のものと比べて弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金となりうる細胞の免疫学的に有効な量、並びに獣医学的に許容可能な担体とを含む、ネオスポラ病に対するワクチンを提供する。
【００３９】
本発明はさらに、ネオスポラ種の病原性親株からの細胞を変性し；親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合、哺乳動物においてネオスポラ病に対して保護する免疫反応の引き金となりうる変性細胞を選択し、クローン増殖させ；そして、哺乳動物に対する生ワクチンとして投与されるのに好適な形態となるように、弱毒細胞の免疫学的に有効な量を獣医学的に許容可能な担体とともに組み合わせることを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護するワクチンを調製する方法を提供する。
【００４０】
本発明はさらに、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって、親株のものと比べて弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金となりうる生細胞、並びに獣医学的に許容可能な担体とを含むワクチンの、免疫学的に有効な量を哺乳動物に投与することを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物へワクチン接種する方法を提供するものである。
【００４１】
本発明のワクチンは、ネオスポラの弱毒株の生細胞を、単独の抗原性成分とし、あるいはネオスポラ病に関係するかまたは関係しないかもしれない疾患または病気に対し哺乳動物を保護する免疫反応の引き金となる他の抗原一つ以上と組合せとしてのいずれかで含む。すなわち、本発明はさらに、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示すが生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる細胞の免疫学的に有効な量；疾患または病気に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金となる一つ以上の他の抗原；および獣医学的に許容可能な担体とを含む組合せワクチンを提供するものである。組合せワクチンはさらに他の成分の一つ以上たとえばアジュバントを含んでよい。
【００４２】
ワクチンは、非経口投与たとえば皮下または筋肉内注射により投与されるのが都合がよい。しかしながら、ワクチンはまた腹腔内もしくは静脈内注射により、あるいは他のルート、たとえば経口、経鼻、直腸もしくは経膣投与されてもよく、ワクチンがこのように投与される場合、獣医学的に許容可能な担体が好適に選択される。ワクチンは単に培養液に弱毒細胞を含んだだけでもよく、これは哺乳動物へ直接投与される。あるいは、ワクチンは投与経路およびその細胞生存性を維持する能力に基づいて当該技術で公知のものから選択される獣医学的および薬剤的に許容可能な担体と組み合わせた弱毒細胞を含むものでもよい。このような担体の非限定的例は、水、生理食塩水、緩衝化ビヒクル等である。好適な他のワクチンビヒクルおよび添加剤は知られているか、または当業者であれば明白であろう。たとえば、レミントン(Remington) 、Pharmaceutical Science, 18th ed. 1990 ,Mack Publishingを参照、これは参考文献として援用される。
【００４３】
ワクチンはさらに一つ以上の他の成分、たとえば免疫調節剤、たとえばインターロイキン-1、または他の免疫強化物質たとえば獣医学的に許容可能なアジュバントを含むことができる。アジュバントの非限定的例は、フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバント、無機質ゲルたとえば水酸化アルミニウム、および水中油型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）または油中水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ）親株のものと比較して弱毒の病原性を示すが配合剤を含む。免疫調節剤は、弱毒ネオスポラ細胞の生育力およびワクチン接種した哺乳動物における保護免疫反応の引き金を引く細胞の能力の両方を維持するこれらの能力に基づいて選択される。
【００４４】
本発明のワクチンにおいてアジュバントとして有用な水中油型配合剤の非限定的例は、以下のようなエマルジョン1-3 を含む。エマルジョン1 は次のものからなる：（a) ME6201( 5%v/vスクワレン、0.1% v/vビタミンE 、および0.8% v/vトゥイーンTM 80 分散剤）; （b)クィル A (QA) サポニン製剤( スーパーホス(Superfos)(200μg / ml) ; および(c) コレステロール(chol.)(100 μg / ml) 。エマルジョン2 は次のものからなる；（a) ME6201 ；および（b)アブリジンリポイドアミン(1mg/ml)。エマルジョン3 は ME6210( 5%v/vスクワレン、1.0% v/vビタミンE 、および0.8% v/vトゥイーンTM 80 分散剤）からなる。
【００４５】
効果的投与量は通常の方法により決められ、弱毒細胞の低投与量から始まり次いで効果を調べながら投与量を増加し、さらに系統的に投与量を変化させる。動物に対する最適投与量を決定する場合多数の要因が考慮される。これらのうち主なものは、種、動物の大きさ、動物の年齢、動物の全身的状態、動物における他の薬剤の存在、ワクチン接種されている動物に対するネオスポラの特定株の菌力等である。実際的投与量は他の動物研究の結果を考慮した後に選択されるのが好ましい。
【００４６】
ワクチンレジメはまた前記要因に基づいて選択される。動物はいずれの時点でワクチン接種してもよく、たとえば繁殖の直前またはその時点でもよい。完全予防のためには補給投与、すなわちブースターが必要なこともある。適切な免疫保護が達成されたかどうかを検出する一つの方法は、ワクチン接種後に動物においてセロコンバーション（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）および抗体価を測定することである。すなわち、本発明のワクチンは、幾つかの要因たとえば別の動物の間でネオスポラ病が大量発生するタイミングなどに従って、ワクチン接種すべき特定の動物の生活のいずれかの時点で投与されうる。ワクチンは、離乳期もしくはそれより幼い時期の動物へ、またはより成長した動物へ、たとえばネオスポラ関連先天的疾患または流産に対し保護するために繁殖前ワクチンとして投与される。効果的ワクチン接種は一次ワクチン接種だけを必要とするか、または一次ワクチン接種とブースターワクチン接種一回以上を必要とする。ブースターワクチン接種は、一次ワクチン接種後のいずれかの時点で、たとえば一次ワクチン接種後の免疫反応、大発生の程度、大発生を起こすネオスポラの株の菌力、ワクチン接種された動物の健康などに従って投与される。ワクチン接種のタイミングおよび追加免疫の回数(もし、行う場合）は、すべての関連した要因の分析に基づいて獣医が決めるのが好ましく、その幾つかは前述した通りである。
【００４７】
ワクチンに使用されるネオスポラ細胞はタキゾイト( tachyzoites )が好ましいが、しかしブラディゾイト( bradyzoites )、またはオーシスト( oocyst )、またはこれらの組み合わせたものに代えてもよい。ワクチンにおける弱毒細胞の濃度は、好ましくは約1 x 10 3 /mlから約1 x 10 8/ ml、およびより好ましくは約2 x 10 6/mlから約2 x 10 7/ mlである。好適な投与サイズの範囲は約0.5mlから約1.0ml である。
【００４８】
一般的には、予備投与に基づいて、動物へ投与される弱毒細胞の数は、好ましくは約2 x 10 4から約2 x 10 8、より好ましくは約2 x 10 5から約 2 x 10 7；そして最も好ましくは約1 x 10 6から約 1 x 10 7である。
【００４９】
本発明ワクチンは、ネオスポラにより起こされる感染症または疾患に対し哺乳動物を保護する。ワクチンは、たとえば非限定的例であるが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌおよびウマ種を含む妊娠または非妊娠哺乳動物の両方を保護することに有用である。用語“保護”は広い意味で使用され、ネオスポラによる感染の完全な予防に限定されず、感染性における低下または感染の結果生じる疾患または症状の程度における低下（感染の結果生じる、一つ以上の病理学的作用もしくは徴候の検出可能な低下を含む）、またはこのような病理学的作用もしくは徴候の一つ以上の進行速度における検出可能な低下を含む。本発明のワクチンはまた安全であり、すなわちワクチン接種した哺乳動物に疾患または重度の副作用を起こさない。
【００５０】
以下の実施例を本発明の組成物および方法を説明するために提供するが、しかしこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１:ネオスポラ  カニナムの温度依存性株の確立およびBALB/cマウスにおける病原性の分析
本研究の目的は、ネオスポラ  カニナムの温度感受性株(NCTS)を確立し、血清抗体反応、組織嚢および脳病変物、並びにネオスポラ病に対し高い感受性であることが知られているBALB/cマウスにおける臨床的症状の発生を分析することにより、これらの株の病原性を試験することである。
【００５２】
材料および方法
ネオスポラ  カニナムのNC-1株( デュベイら、1988、前出）のタキゾイトを、記載(リンドセイおよびデュベイ、 1989,前出）したように、限界希釈し37℃に維持することにより二度クローン化した。タキゾイトを25 cm2 フラスコに播種し、Hs68ヒトの包皮線繊芽細胞の単層を含む96ウェルプレートにおいてクローン化した( ATCC  受託番号 No. CRL-1635)( リンドセイら、1993, 前出）。Hs68細胞を、2%(v/v) ウシ胎児血清、1.0mM ピルビン酸ナトリウム、1 ×104 U/mlペニシリン、1 ×104 μg / mlストレプトマイシン、5 ×10-2mM 2- メルカプトエタノールおよび0.3mg/ml L- グルタミンを含むRPMI 1640 ( 維持培地）において予め増殖した。感染した細胞培養物単層を同一培地において維持するが、しかしこの培地においてウシ胎児血清を10%(v/v)まで増加した( 増殖培地）。クローンを単離し、実験ではNC-1-2C 系と命名したが、ここでは簡単にNC-1株と呼ぶ。
【００５３】
NC-1株のタキゾイトを、増殖培地において0.5 μM N-メチル- N'- ニトロ- N-ニトロソグアニジン(シグマ）へ24時間晒すことにより突然変異誘発し、次いで維持培地においてHs68細胞中で3 カ月間32.5℃にて増殖し、その後タキゾイトを限界希釈によりクローン化した。最初に12個のクローンを単離した。維持培地において32.5℃で8 カ月以上Hs68中で連続培養にて維持した後、3 個のクローンをさらに別の研究のために選択し、NCTS-4、NCTS-8およびNCTS-12 と命名した( NCTS = N. caninum, temperature-sensitive( ネオスポラ  カニナム温度感受性））。
【００５４】
マウスの血清学的試験を以下のように行った。間接免疫蛍光抗体試験(IFAT)(デュベイら、1988, 前出）を使用してネオスポラ  カニナムに対する抗体の存在についてマウスからの血清を分析した。マウス血清を、ワクチン接種研究において接種を始める直前に得た。血清をまた病原性実験を生き残ったマウスの全てからも得た。血清を1:50から始まる二倍希釈で試験し、終末点を滴定した。タキゾイトを抗原として使用した。陽性サンプルは完全なタキゾイト表面蛍光を示した。陰性サンプルは蛍光を示さないかまたは先行する最終蛍光(anterior end fluoresence ) を示すだけであった。
【００５５】
ネオスポラ  カニナムの別々の株で誘発されたマウスの脳における病変部の存在を以下のように調べた。各マウスからの脳を解剖時に摘出し、最初の半分を組織病理学的検査のために10%v/v中性緩衝ホルマリン溶液に定着した。組織切片を通常の組織学的技術を用いて作り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して顕微鏡的に病変部の存在を検出した。
【００５６】
ヘマトキシリン- およびエオシン- 染色脳組織切片の病変部の点数をリンドセイら、1995, J. Parasitol. 81: 313-315 に記載の基準に従って付けた。
【００５７】
【数１】
2005230018.tif 000002
【００５８】
病変部点数の平均が前記した三つの値を用いて得られた。正常な、非- 感染マウスの脳は平均病変部の点数が3.0 であった。平均病変部の点数はクルシカル-ウァリス(Kruskal-Wallis)ノンパラメトリック試験(nonparametric test)、および分布自由倍数比較法(distribution free multiple comparision methods)を用いて評価された。病変部を有する各群におけるマウスの数をフィッシャーの精密試験(Fisher's exact test) を用いて調べた。統計的有意差がP<0.05のカットオフで確立された。
【００５９】
各マウスからの脳の切片を、アビジン- ビオチンペルオキシダーゼ複合体(ABC) 免疫組織化学的試験と組み合わせてネオスポラ  カニナムに特異的なネズミモノクロナール抗体、6G7 を用いて検査し、ネオスポラ  カニナムの段階を検出した( コーレら、1993,J.Vet.Diag. Invest. 5:574-589) 。
【００６０】
各マウスの脳の第二の半分を、酸- ペプシンで消化し、これを用いて哺乳動物細胞培養物に接種し、ネオスポラ  カニナムの組織嚢の存在を調べた。消化するために、マウスの脳の第二の半分をハンクスの平衡塩溶液(HBSS)3ml に入れ、23ゲージ針を有する注射器に二度通した。酸- ペプシン溶液3 ml(0.52g  ペプシン、 0.50g NaCl 、98.6ml d H 2O 、 1.4ml濃HCl 、pH 0.8）をホモジネートへ添加して、水浴中で37℃にて10分間インキュベーションした。酸ペプシン溶液を遠心分離により除去し、第二の脳の半分全体を表すペレットを、前記のように培養したHs68ヒト包茎線繊芽細胞の単層を含む一本の25cm2組織培養フラスコへ播種した。30分後、播種物を除去し、Hs68細胞単層を洗浄し、前記の新鮮な維持培地にてインキュベーションした。細胞培養物を次いで30日間試験してネオスポラ
カニナムの存在を調べた( リンドセイおよびデュベイ、1989、前出）。
【００６１】
ネオスポラ  カニナムのNC-1および三個の選択されたNCTS株、すなわちNCTS-4、NCTS-8およびNCTS-12 の病原性を以下のように調べた。BALB/cマウス( 8 週齢、雌）(Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ(HSD))に、HBSS( 対照）またはHBSS中のネオスポラ  カニナムのNC-1、NCTS-4、NCTS-8またはNCTS-12 株のいずれかの5 ×105 タキゾイト( 0.5-1.2ml 全量）を皮下接種した。接種後(PI)42または56日目の解剖時に、生き残ったマウスを検査した( 表 1参照）。解剖時に生き残ったマウスから血清を集めた。これらのマウスの脳を病変部の点数と免疫組織学的について検査し、各脳の1/2 を酸- ペプシン消化に用いて、前記のように組織嚢の存在を調べた。
【００６２】
【表１】
2005230018.tif 000003
【００６３】
【表２】
2005230018.tif 000004
【００６４】
【表３】
2005230018.tif 000005
【００６５】
結果
臨床的ネオスポラ病および死亡は、NC-1株を接種したBALB/cマウスのみに発生した( 表1)。BALB/cマウス10匹中3 匹だけがNC-1株感染で生き残った。NCTS-4、NCTS-8、およびNCTS-12 株はBALB/cマウスにおいて死亡を起こさなかった。
【００６６】
平均病変部点数を表2 に示す。病変部はNCTS株を接種したマウスの何匹かの脳において見られたが、しかし平均病変部点数は対照(HBSS)と比較した場合統計的に有意差はなかった。平均病変部点数および病変部を有するマウスの数における有意差は、NC-1株を接種したマウスがHBSS( 対照）またはネオスポラ  カニナムのNCTS株のいずれかを接種したマウスと比較した場合に見られた。
【００６７】
血清抗体価を表3 に示す。NCTS株で誘発されたすべてのマウス(30/30) においてかなりのIFAT価( ≧400)が検出された。これはNCTS株が、免疫学的に無傷であるが、遺伝的には感受性である動物において、B 細胞反応を刺激することができることを示唆する。NCTSで誘発されたマウスにおけるIFAT価は、NC-1で誘発されたマウスにおけるものと等しいか、または高い場合もある。
【００６８】
組織嚢は、前記のような酸- ペプシン消化技術を用いて検査した半分の脳のいずれにも検出されなかった。これは、組織嚢はもし存在しているとしても、ネオスポラ  カニナムのNCTSまたはNC-1株を接種したマウスにおいて数的には少ないことを示唆する。
【００６９】
実施例 2 : HSD:ICR異系マウスにおけるネオスポラ  カニナムのNCTS株の病原性分析
この研究の目的は、免疫競合であり同系BALB/cマウスにおけるものよりネオスポラに耐性があるHSD:ICR 異系マウスにおけるネオスポラ  カニナムのNCTS株の病原性を調べることにであった。
【００７０】
材料および方法
この実験ではHSD:ICR マウス(4週齢、雌）を使用した。対照を除くすべてのHSD:ICR マウスに、HBSS中のネオスポラ  カニナムの適当な株の5 ×105 タキゾイトを接種した( 全量0.5-1.2ml)。対照マウスにはHBSSのみを接種した。生き残ったマウス全てを56日PIで屠殺した。血清をIFAT試験のために集めた。これらのマウスから脳を集め、最初の半分を前記したように、病変部点数および免疫学的組織構造のために使用した。各脳の第二の半分を、前記したように、組織嚢を検出するために酸- ペプシン消化に使用した。
【００７１】
結果
NC-1を含む試験したネオスポラ  カニナム株のいずれもHSD:ICR マウスにおいて死亡を起こさず( 表4 ）、誘発されない対照物と比べて病変部を有するマウスの数または平均病変部点数になんらの有意差も見られなかった(表5)。組織切片またはABC 染色した切片において脳の組織嚢はなんら観察されなかった。細胞培養物において寄生虫は単離されなかった。
【００７２】
【表４】
2005230018.tif 000006
【００７３】
【表５】
2005230018.tif 000007
【００７４】
【表６】
2005230018.tif 000008
【００７５】
生き残りマウスの抗体価を表6 に示す。かなりのIFAT価( ≧400)がNCTS株で誘発されたマウスの大部分(13/15) において検出され、これはこれらの株が免疫学的には無傷であるが（ｉｎｔａｃｔ）が遺伝的に耐性のある動物におけるB 細胞反応を起こすことができることを示す。
【００７６】
組織嚢は組織学的に、免疫組織学的にまたは酸- ペプシン消化法により検査された脳の一部に検出されなかった。これらの結果は、BALB/cマウスを用いた前記のような実施例1 にて示されたものを追認する。
【００７７】
実施例3:免疫抑制されたHSD:ICR マウスにおけるネオスポラ  カニナムのNCTS株の病原性の分析
この研究の第一の目的は、免疫抑制されたHSD:ICR マウスにおけるネオスポラ  カニナムのNCTS株の病原性を測定することであった。この研究の第二の目的は、37℃でネオスポラ  カニナムのNCTS株のインビトロ継代培養後に病原性が復元するかどうかを測定することであった。
【００７８】
材料および方法
HSD:ICR マウス(4週齢、雌）を、-7、0 および7 日PIに2mg メチルプレドニゾロンアセテート(MPA)(ユピオン- ファルマシア）の筋肉内投与により免疫抑制した。リンドセイおよびデュベイ、1989、J.Parasitology 75:772-779 。
【００７９】
免疫抑制したHSD:ICR マウスに、0 日にてNC-1、NCTS-4、NCTS-8およびNCTS-12 のいずれかのタキゾイト2 ×105 を接種し、またはHBSS中のNCTS-4-37 、NCTS-8-37 またはNCTS-12-37と命名した復元の可能性のある対照物(potential reversion controls ) の一つを接種した( 全量  0.5-1.2ml)。次いでマウスを前記のように血清学的、組織学的および臨床的に検査した。
【００８０】
NCTS-4、NCTS-8およびNCTS-12 クローンを、37℃で88日間増殖し( 25細胞培養継代）、続いて免疫抑制したHSD:ICR マウスに接種することにより病原性の復元に関して検査した( 可能性のある復元株はNCTS-4-37 、NCTS-8-37 およびNCTS-12-37と命名する）。
【００８１】
結果
ネオスポラ  カニナムのNC-1、NCTS-4-37 およびNCTS-12-37株は免疫抑制したHSD:ICR マウスにおいて100%の死亡率を起こした( 表7)。NCTS-4、NCTS-8、NCTS-12 およびNCTS-8-37 株は免疫抑制したHSD:ICR マウスに対して病原性が低く死亡率0-20% を起こしただけであった。平均病変部点数を表8 に示す。PI 56 日目の解剖時に検査したマウスのいずれからも酸- ペプシン消化物においてタキゾイトは検出されなかった。
【００８２】
生存マウスの抗体価を表9 に示す。かなりのIFAT価( ≧800)が誘発後56日目にNCTS-4、-8および-12 ならびにNCTS-8-37 マウスにおいて検出され、これらの株が免疫学的に無傷であるが遺伝的に耐性がある動物におけるB 細胞反応を刺激することができることを示す。
【００８３】
【表７】
2005230018.tif 000009
【００８４】
【表８】
2005230018.tif 000010
【００８５】
【表９】
2005230018.tif 000011
【００８６】
NCTS株は、NC-1、NCTS-4-37 およびNCTS-12-37株よりも免疫抑制HSD:ICR マウスにおいて病原性が低かった。NCTS-4-37 またはNCTS-12-37復元株を接種したマウスの100%死亡率と比較してNCTS-8-37 復元株を接種したマウスの比較的高い生存率(4/5) は、NCTS-8-37 復元株が37℃での継続する継代培養の間弱毒化した病原性を維持することを示唆する。この示された弱毒化病原性の維持に基づいて、ネオスポラ  カニナムのNCTS-8株が強力なワクチン候補として選択されそして以下に示すようにさらに別の研究に使用される。
【００８７】
実施例4:  脳炎誘発ネオスポラ  カニナムに対するBALB/cマウスのワクチン接種
この研究の第一の目的は、ネオスポラ  カニナムの生の温度感受性株を用いたワクチン接種が、ネオスポラ  カニナムの病原性株たとえばNC-1を用いて行ったその後の誘発により生じる疾患に対して保護をもたらすことができることを示すものである。この研究の第二の目的は、ネオスポラ  カニナムのNC-1株を用いてその後に誘発された死滅( 凍結）NCTS-8タキゾイトを用いたBALB/cマウスのワクチン接種によりもたらされる保護のレベルを測定することであった。
【００８８】
材料および方法
BALB/cマウス(9週齢、雌）に、HBSS( 対照）(0.5ml) またはHBSS中のNCTS-8株の5 ×10 5生タキゾイト(0.5ml) 、またはHBSS中の2 ×10 6死滅（凍結）タキゾイト(0.5ml) のいずれかを皮下注射することによりワクチン接種した( 表10) 。ワクチン接種を受けた動物に最初の注射と同じ材料でPI 21 日目に追加免疫を行った。次いで、追加免疫後14日目に、HBSS中のネオスポラ  カニナムのNC-1株の1 ×106 タキゾイトまたはHBSS単独( 対照）を皮下注射( 全量0.5ml)することによりマウスを攻撃した。
【００８９】
IFATを使用して、前記したネオスポラ  カニナムに対する抗体の存在についての実験を生き抜いたマウスからの血清を試験した。各マウスからの脳を解剖時に摘出した。最初の半分を組織病理学および免疫組織学的に使用し、そして第二の半分を前記したように酸- ペプシン消化に使用した。凍結後のタキゾイトの生存能力は、前記したように、Hs68ヒト包茎線繊芽細胞の単層培養物を接種することにより決定された。
【００９０】
結果
試験群のいずれのマウスも一回目のワクチンまたはブースターワクチンの接種後に死ななかった。HBSS(対照）をワクチン接種したマウス10匹のうち2 匹、および死滅NCTS-8タキゾイトをワクチン接種したマウス10匹のうち3 匹がNC-1タキゾイトで攻撃後に死亡した。生き残ったマウスの平均病変部点数を表11に示す。
【００９１】
生き残りマウスの抗体価の逆数を表12に示す。有意のIFAT価( ≧800)が、生NCTS-8タキゾイトをワクチン接種し次いでブースターを行ったマウスにおいて検出され、これは前記した先の結果を確認する。これと対照的に、攻撃前に死滅NCTS-8タキゾイトをワクチン接種したマウスのいずれにも有意のIFAT価が存在せず、これは遺伝的に感受性の高い宿主において死滅タキゾイトが有意の抗体反応を引き起こすことができなかったことを示す。
【００９２】
ネオスポラ  カニナムのタキゾイトは、偽- ワクチン接種し攻撃した2 匹のマウス(24 群、マウスNo.1および2 ）および死滅NCTS-8タキゾイトをワクチン接種した1 匹のマウス( 31群、マウスNo.5）からの酸- ペプシン消化脳組織を接種した細胞培養物から単離された。タキゾイトは、他のいずれのマウスの脳組織を接種した培養物からも単離されなかった。
【００９３】
【表１０】
2005230018.tif 000012
【００９４】
【表１１】
2005230018.tif 000013
【００９５】
【表１２】
2005230018.tif 000014
【００９６】
ネオスポラ  カニナムのNCTS-8株の生タキゾイトをワクチン接種したマウスは死亡しないかまたは臨床的疾患症候群を発症しなかった。NCTS-8株の生タキゾイトをワクチン接種し続いてNC-1株のタキゾイトで攻撃したマウス( 表11、群 28+29) は、NCTS-8株の生タキゾイトをワクチン接種し続いてHBSSを投与したマウス( 表 11,群26+27)の幾つかと殆ど同じ点数であった。これは、NCTS-8株の生タキゾイトのワクチン接種がネオスポラ  カニナムのNC-1株で感染したことにより起こされる疾患に対してかなり保護していることを示す。NCTS-8株の死滅タキゾイトをマウスにワクチン接種すると、ネオスポラ病から僅かに保護される( 表11、群30+31)。
【００９７】
実施例 5: ネオスポラ  カニナムのNCTS-8株の低投与量を用いたワクチン接種
本研究の目的は、ネオスポラ  カニナムのNCTS-8株の低投与量すなわち5 ×104 タキゾイトがその後の攻撃感染に対して保護することができるかどうかを調べることであった。
【００９８】
材料および方法
BALB/cマウス( 7 週齢、雌）に、HBSS(0.5ml) またはHBSS中のNCTS-8株の5 ×10 4タキゾイト(0.5ml) のいずれかを皮下注射することによりワクチン接種した( 表13) 。タキゾイトのこの投与量は前記実施例に使用された量の1/10であった。最初の注射と同じ材料でPI 21 日目にマウスに追加免疫を行った。次いで、追加免疫後14日目に、マウスをネオスポラ  カニナムのNC-1株の1 ×106 タキゾイトで誘発した。
【００９９】
IFAT を使用して、前記のようにネオスポラ  カニナムに対する抗体についての実験を生き抜いたマウスからの血清を試験した。各マウスからの脳を解剖により摘出した。最初の半分を組織病理学および免疫組織学に使用し、そして残りの第二の半分を前記したように酸- ペプシン消化に使用した。
【０１００】
結果
ネオスポラ  カニナムのNC-1株のタキゾイトで次に攻撃後、一匹の対照マウス(HBSS のみを投与）が死亡した。ネオスポラ  カニナムのNCTS-8株タキゾイトの低投与量をワクチン接種したいずれのマウスにも、NC-1株タキゾイトの次の攻撃後の死亡はなかった。病変部を有するマウスの平均病変点数および数は、NCTS-8株のタキゾイトの低投与量でワクチン接種したマウスにおけるよりもHBSSのみの偽- ワクチン接種した対照マウスにおいて著しく高かった( 表14) 。抗体価の逆数を表15に示す。
【０１０１】
【表１３】
2005230018.tif 000015
【０１０２】
【表１４】
2005230018.tif 000016
【０１０３】
【表１５】
2005230018.tif 000017
【０１０４】
実施例6 : アジュバント含有または不含有ワクチンの有効性
本研究の目的は、変性- 生ネオスポラワクチンへのアジュバントの添加の効果、およびこれから得られるネオスポラ病に対する保護の程度を調べることであった。
【０１０５】
材料および方法
予め行ったインビトロ試験の結果( データは図示せず）は、少なくとも一つの変性- 生ネオスポラ  カニナム株、すなわちNCTS-8を幾つかの異なった水中油型製剤の一つとともに同時培養した場合、ある程度の生存率および伝染性をインビトロで保持することを示している。これらのインビトロの結果に基づいて、三つの特定の配合物をインビボ評価をするためにアジュバントとして選択した。
【０１０６】
15週齢の雌のBALB/cマウス10匹の群に、HBSS単独( 対照）、またはHBSS中のネオスポラ  カニナムのNCTS-8株タキゾイト5 ×105 、または以下の三つの水中油型エマルジョンの一つにおけるネオスポラ  カニナムのNCTS-8株タキゾイト5 ×105 のいずれかを、PI 0日( 一回目のワクチン接種）および21日目(追加免疫）に皮下注射(0.2ml) によりワクチン接種した。
【０１０７】
エマルジョン1 は次のものからなる：（a)ME6201 (5% v/vスクワレン、0.1%v/v ビタミンE および0.8%v/v トゥイーンTM80分散剤）；（b)クィルA サポニン製剤(QA)( スパーホス）(200μg / ml);および(c) コレステロール(chol.)(100 μg / ml) 。
【０１０８】
エマルジョン2 は次のものからなる：（a)ME6201；および（b)アブリジンリポイドアミン(1mg/ml)。
エマルジョン3 は次のものからなる：ME6201 (5% v/vスクワレン、1.0% v/v
ビタミンE および0.8% v/vトゥイーンTM80分散剤）。
【０１０９】
【表１６】
2005230018.tif 000018
【０１１０】
PI 35 日目に、すべてのマウスに、HBSS中のネオスポラ  カニナムNC-1株のタキゾイト1 ×106 ( 0.2ml)を皮下投与することにより攻撃した。ワクチンの効果を評価するために、3-5 匹の群をPI 49 および63日目に屠殺した。
【０１１１】
0 日において開始し、死亡率、ならびに毛皮の粗さの外観、不規則な動き、骨盤部分麻痺および全身的な衰弱に基づいて疾患を評価した。
組織病理学的分析を以下のように行った。肺サンプルを49日目に得、10%v/v中性緩衝化ホルマリン溶液に固定し、組織を切片化し、一般的な病理学的技術を用いて染色した。ヘマトキシリン- およびエオシン- 染色肺切片をコード化し、処理群を認識することなく病変部をブラインド方法により点数化した。以下の系を用いて肺炎病変部を点数化した：0 = なし；1 = 軽度；2 = 中度；3 = 顕著；4=重度。
【０１１２】
結果
ネオスポラ  カニナムのNCTS-8株からのタキゾイトおよびアジュバントを含む配合物をワクチン接種したマウスは、HBSS (56%)のみをワクチン接種した対照マウスと比べてネオスポラ  カニナムのNC-1株攻撃後に発生する軽度の肺炎がかなり少ない( P<0.01) 。NCTS-8をワクチン接種した非- 攻撃マウスは、ワクチン接種後9 週目に調査した場合、いずれも脳炎疾患または寄生虫炎の徴候を示さなかった(データは示さず）。これはNCTS-8の投与が臨床的疾患を起こさないことを確認する。
【０１１３】
結果は、弱毒生ネオスポラタキゾイトおよびアジュバントを含む配合物が、ネオスポラ病に対するワクチンとしての使用に関して、アジュバントを含まない同じ配合物と少なくとも同程度に有効であり、また安全であることを示す( 表17)。
【０１１４】
【表１７】
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【０１１５】
実施例 7: ネオスポラ病からの小型ヤギ(pygmy goats) の保護
本研究の目的は、ネオスポラ  カニナムの弱毒生株による小型ヤギのワクチン接種がネオスポラ病に対してヤギを保護することができるかどうかを調べる。より詳しくは、ネオスポラ誘因流産に対し小型ヤギの雌を保護するネオスポラ  カニナムのNCTS-8株の生タキゾイトを含むワクチンの能力が試験された。
【０１１６】
材料および方法
ほぼ2-5 才の範囲の小型ヤギの雌をランダムにA-E の群に分けた(表18) 。非- 偽ワクチン投与群( 群A-C)の各々における投与量は、指示した株の4 ×106 タキゾイトからなる。0 日( 一回目）および21日目(追加免疫）の皮下ワクチン接種( 1.0ml/雌）に続いて、28日および39日目に雌をＬＵＴＡＬＹＳＥTMプロスタグランジン調剤(アップジョン- ファルマシア）( 10mg/ ヤギ、筋肉内経路）を用いて同調させた。雌は、52日と56日の間に自然のサービス(natural service)により出産した。妊娠した雌は超音波で調べられ、攻撃の時点で41日と55日の妊娠期間であった。
【０１１７】
群A-D の雌は、頸静脈内投与により血清不含有維持培地(0.45ml)においてネオスポラ  カニナムのNC-1株の4 ×106 タキゾイトで攻撃された。次いで雌を、超音波および攻撃後７日間にわたって毎日検温し、そして攻撃後一週間当たり一回採血した。
【０１１８】
【表１８】
2005230018.tif 000020
【０１１９】
結果
ネオスポラ  カニナムの生NC-1株( 群A)またはネオスポラ  カニナムの弱毒生NCTS-8株( 群B,C)のいずれかをワクチン接種したヤギは全てセロコンバーション（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）し、そして追加免疫後10日目に測定可能なIFAT価を有した( 表19) 。これらのデータにより、NC-1およびNCTS-8は妊娠したヤギにおいて免疫誘発性であることが示される。群A のGMT は群B およびC よりも数値的に高く、これは弱毒NCTS-8株と比べてNC-1株の宿主において複製が強化されたことを示唆する。
【０１２０】
表20は、小型ヤギの雌をネオスポラ誘因流産から保護するためのネオスポラの弱毒生タキゾイトを含むワクチンの能力を示す。生NC-1株をワクチン接種した4匹のヤギの雌(A) は、NC-1で誘発後に流産を示した( 保護 0% ）。偽ワクチン接種したヤギの雌(D) の6 匹中5 匹がNC-1誘発後に流産を示した( 保護17%)。対照的に、NCTS-8をワクチン接種したヤギの雌(B) の5 匹中2 匹だけがNC-1で誘発後に流産し( 保護60% ）そしてアジュバントを有するNCTS-8をワクチン接種したヤギの雌(C) の4 匹中2 匹だけがNC-1で誘発後に流産した( 50% 保護）。
【０１２１】
これらの結果は、妊娠した小型ヤギの雌がネオスポラ  カニナムのNCTS-8株の弱毒した生タキゾイトのワクチン接種によりネオスポラ誘因流産に対しかなり保護されたことを示す。これは、ネオスポラの病原株から由来する弱毒した生タキゾイトのワクチン接種によりネオスポラ誘因流産に対し妊娠した哺乳動物が保護されることの第一の証明である。
【０１２２】
【表１９】
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【０１２３】
【表２０】
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【０１２４】
生物材料の寄託
以下の生物材料は、1996年11月6 日に米国、メリーランド州20852 、ロックビレ、パークローンドライブ12301 のアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託され、以下の受託番号が付けられた；
1. MARC 145 サル腎臓細胞におけるネオスポラ  カニナムのNC-1株、ATCC受託番号 No. CRL-12231.
2. MARC 145 サル腎臓細胞におけるネオスポラ  カニナムのNCTS-8株、ATCC受託番号 No. CRL-12230.
前記した全ての特許、特許出願および文献もこれら全体が、参考文献として本明細書中に援用される。
【０１２５】
本発明はここに記載した特定の実施態様により範囲を制限されるものでなく、これは単に本発明の個々の見地の例を示すだけである。機能的に等価な組成物および方法も本発明の範囲内である。実際、ここに示しそして記載したものに加えて、本発明の様々な変形が微生物学、寄生虫学、免疫学、分子生物学、獣医学用医薬および以後の記載からの関連する分野の当業者には明白であろう。このような変形は添付の請求の範囲の範囲内に属することを意図するものである。