(57)【要約】【課題】  オカラを有用微生物の担持担体とした微生物製剤およびその利用方法の提供。【解決手段】  本発明によれば、有用微生物をオカラに担持させてなる微生物製剤が提供される。本発明によればまた、オカラおよび／または本発明による微生物製剤を有機性廃棄物と混合する工程を含んでなる有機性廃棄物の処理方法が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用微生物をオカラに担持させてなる、微生物製剤。
【請求項２】
有用微生物をオカラに接種し、培養することにより得られる、請求項１に記載の微生物製剤。
【請求項３】
有用微生物が、有機性廃棄物処理に有用な微生物である、請求項１または２に記載の微生物製剤。
【請求項４】
有機性廃棄物処理に有用な微生物が、約３０℃〜約６０℃、ｐＨ約５〜ｐＨ約１０で生育可能であり、かつ有機物の資化能力がある微生物である、請求項５に記載の微生物製剤。
【請求項５】
有機性廃棄物処理に有用な微生物が、オカラ、コーンコブ、土壌、または有機性廃棄物処理物から単離された菌である、請求項４に記載の微生物製剤。
【請求項６】
有機性廃棄物処理に有用な微生物が、オカラから単離された菌（オカラ常在菌）である、請求項５に記載の微生物製剤。
【請求項７】
オカラ常在菌が、約３０℃〜約６０℃、ｐＨ約５〜ｐＨ約１０で生育可能であり、かつ有機物の資化能力がある菌である、請求項６に記載の微生物製剤。
【請求項８】
オカラ常在菌が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）である、請求項６または７に記載の微生物製剤。
【請求項９】
オカラ常在菌が、ＩＯ５５３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５５）、ＩＯ５５６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５６）、およびＩＯ５５８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４５７）からなる群から選択される菌株である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の微生物製剤。
【請求項１０】
有機性廃棄物処理に有用な微生物が、バチルス・アミロリカファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）である、請求項５に記載の微生物製剤。
【請求項１１】
有機性廃棄物処理に有用な微生物が、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）である、請求項５に記載の微生物製剤。
【請求項１２】
有用微生物が、土壌改良に有用な微生物である、請求項１または２に記載の微生物製剤。
【請求項１３】
土壌改良に有用な微生物が、光合成細菌、乳酸菌、酵母菌、放線菌、および糸状菌からなる群から選択される１種以上の微生物群からなる、請求項１２に記載の微生物製剤。
【請求項１４】
オカラおよび／または請求項３〜１１に記載の微生物製剤を、有機性廃棄物と混合する工程を含んでなる、有機性廃棄物の処理方法。
【請求項１５】
オカラおよび／または微生物製剤を有機性廃棄物と混合した後、有機性廃棄物を発酵させる工程を更に含んでなる、請求項１４に記載の処理方法。
【請求項１６】
有機性廃棄物を約４０℃〜約６０℃で発酵させる、請求項１５に記載の処理方法。
【請求項１７】
有機性廃棄物が、焼酎粕、野菜屑、生ゴミ、果物絞り粕、および残飯からなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の処理方法。
【請求項１８】
請求項１２または１３に記載の微生物製剤を土壌と混合する工程を含んでなる、土壌改良方法。
【請求項１９】
オカラおよび／または請求項３〜１１のいずれか一項に記載の微生物製剤を含んでなる、発酵母剤。
【請求項２０】
廃棄物処理における発酵に用いられる、請求項１９に記載の発酵母剤。
【請求項２１】
請求項１２または１３に記載の微生物製剤を含んでなる、土壌改良剤。
【請求項２２】
ＩＯ５５３菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５５）。
【請求項２３】
ＩＯ５５６菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５６）。
【請求項２４】
ＩＯ５５８菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５７）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オカラを有用微生物の担持担体として利用した微生物製剤およびその利用方法に関し、更に詳細には、有機性廃棄物処理に有用な微生物製剤および有機性廃棄物の処理方法に関する。
【従来技術】
【０００２】
従来、有機性廃棄物処理や土壌改良材に用いられる微生物製剤は、クレー、シリカ等の無機物を担体とするものや、木材チップ、おが屑、ぬか等を担体とするものなどが知られている。しかしながら、これらの微生物製剤を利用、特に、有機性廃棄物処理や土壌改良処理については、その発酵能力の持続性等が必ずしも充分なものであるとはいえない。さらに、有機性廃棄物の処理後の処理残渣の再利用において、微生物製剤に用いた担体により再利用が妨げになるという問題があった。従って、汎用性、実用性の高い微生物製剤の開発が切望されてきたと言える。
【０００３】
特開２００１−３００４７７号公報（特許文献１）には、複数の有用分解菌群を定着させた微生物製剤を有機性廃棄物とともに混合することにより、高速かつ安定に有機物質を発酵分解することを特徴とする廃棄物処理方法が開示されている。また、特開２００２−１７３３８号公報（特許文献２）には、コーンコブに単数または複数の有用醗酵分解微生物を固定し、有機性廃棄物とともに混合攪拌することにより高速かつ安定に有機物質を醗酵分解できるように構成したことを特徴とする微生物製剤が開示されている。しかし、オカラを有用微生物の担持担体として利用した微生物製剤はこれまで知られていない。
【特許文献１】特開２００１−３００４７７号公報
【特許文献２】特開２００２−１７３３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はオカラを有用微生物の担持担体とした微生物製剤およびその利用方法の提供をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、有用微生物をオカラに担持させてなる微生物製剤が提供される。
【０００６】
本発明によればまた、オカラおよび／または有機性廃棄物の処理に有用な微生物をオカラに担持してなる微生物製剤を、有機性廃棄物と混合する工程を含んでなる有機性廃棄物の処理方法が提供される。
【０００７】
本発明によれば更に、オカラおよび／または土壌改良に有用な微生物をオカラに担持してなる微生物製剤を、土壌と混合する工程を含んでなる土壌改良方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
微生物製剤
本発明による微生物製剤の原料である「オカラ」は、豆類の絞り粕を意味する。豆類としては、大豆、そら豆等が挙げられる。本発明においては、好ましくは、大豆から豆腐を製造する際の豆乳の絞り滓を用いることができ、より好ましくは、呉を豆乳とオカラに分離する絞り機から出た直後のオカラを用いることができる。原料として使用できるオカラとしては、豆腐用オカラ、油揚げ生地用オカラ、高野豆腐用オカラ、飲用豆乳用オカラ、および乾燥オカラが挙げられる。オカラは必要に応じて磨砕、粉砕、あるいは殺菌処理を行うことができる。
【０００９】
本発明による微生物製剤において、オカラに担持させることができる有用微生物としては、オカラ中の栄養分を利用して培養することができ、かつオカラと共に製剤化しうる有用微生物であれば特に限定されない。例えば、有機性廃棄物処理に有用な微生物や土壌改良に有用な微生物が挙げられる。
【００１０】
有機性廃棄物処理に有用な微生物としては、有機物（例えば、糖、デンプン、タンパク質、脂質、セルロース等）の資化能力がある微生物を使用することができる。このような微生物は市販のものを用いても、有機物の資化能力を指標に菌株を単離して用いてもよい。菌株のスクリーニングは公知の方法に従って行うことができる。
有機性廃棄物処理に有用な微生物としては、高温・高ｐＨでの発酵処理の観点から、約３０℃〜約６０℃、ｐＨ約５〜ｐＨ約１０で生育可能で、かつ有機物（例えば、糖、デンプン、タンパク質、脂質、セルロース等）の資化能力がある微生物を使用することができる。このような微生物は、例えば、サンプルを標準寒天培地に塗布し、約５０℃〜約６０℃で約２４時間〜約４８時間培養して形成されるコロニーを選択し、更にグルコース、デンプン、カゼイン、ペクチン、ラード、セルロース等有機物の資化性を有する菌株を選択することにより単離することができる。単離源としては、オカラ、コーンコブ、土壌、および有機性廃棄物処理物が挙げられる。有機性廃棄物処理により得られた最終生産物を有効利用する観点から、単離源は安全性が確認された食品が望ましい。
【００１１】
本発明者らは、大豆を湿式磨砕した呉が豆乳を搾る直前まで高温に加熱されているため、製造直後のオカラ中に存在する微生物群は、高温に耐性を持つ好気性微生物であるバチルス属が大部分を占めることを見出した。本発明者らはまた、オカラ中にはタンパク質や繊維質を主体として、様々な有機物質を含むため、残留している微生物群がそれら各種有機物質に対する優れた資化性有することを見出した。すなわちオカラから単離された菌は、食中毒菌等の雑菌の増殖を抑制できる約４５℃〜約６５℃の高温領域でも利用可能な点、およびタンパク質やデンプン等の各種有機物質の資化性が優れている点で有利である。また、本発明者らは、有機性廃棄物の発酵処理物を食中毒菌等の雑菌が死滅する６０℃以上の高温で乾燥させた場合でも、オカラ由来の有用微生物は死滅しないことを見出した。すなわち、有機性廃棄物の発酵残さを繰り返し微生物製剤として用いることができるため、資源の有効利用の観点から極めて有利である。更に、有機性廃棄物の発酵残さは飼料等に再利用できる点でも有利である。
【００１２】
すなわち、有機性廃棄物処理に有用な微生物としては、好ましくは、オカラから単離された菌（以下「オカラ常在菌」という）を用いることができる。具体的には、高温・高ｐＨでの発酵処理の観点から約３０℃〜約６０℃、ｐＨ約５〜ｐＨ約１０で生育可能で、かつ有機物（例えば、糖、デンプン、タンパク質、脂質、セルロース等）の資化能力があるオカラ常在菌、好ましくは、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）を用いることができ、特に、菌株ＩＯ５５３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５５）、菌株ＩＯ５５６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５６）、および菌株ＩＯ５５８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５７）が好ましい。これら特定の菌株の性質等については試験例１において詳述する。
【００１３】
有機性廃棄物処理に有用な微生物としては、オカラ常在菌以外に、バチルス・アミロリカファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）およびバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）を用いることができる。これらの菌は、単独で、あるいはオカラ常在菌と組み合わせて使用できることは言うまでもない。
【００１４】
土壌改良に有用な微生物としては、光合成細菌、乳酸菌、酵母菌、放線菌、および糸状菌からなる群から選択される１種以上の微生物群が挙げられる。土壌改良に有用な微生物は市販のものを用いてもよい。
【００１５】
本発明による微生物製剤は、産業廃棄物であるオカラを利用するとともに、後述するように有機性廃棄物処理に用いた後に微生物製剤として、あるいは飼料等として再利用することが可能である。従って本発明による微生物製剤は、資源の有効利用の観点から極めて有利である。また、有用微生物としてオカラ常在菌を使用した場合には、安全性の面からも有利である。更に、オカラは年間数十万トンもの量が発生するため、有用微生物の担体として、年間を通じて安定した供給が可能となる。
【００１６】
微生物製剤の製造
本発明による微生物製剤は、有用微生物をオカラに接種した後、培養し、必要であれば乾燥処理により水分調整することにより得ることができる。培養温度や培養期間は、使用する有用微生物の性質に応じて適宜決定することができる。
【００１７】
接種する微生物がオカラ常在菌の場合には、下記のようにして微生物製剤を製造することができる。すなわち、オカラにオカラ常在菌を接種し、温度環境を約４５℃〜約６５℃に保ちながら約２４時間〜約４８時間常時撹拌することにより培養し、次いで約８０℃〜約１５０℃での通風乾燥を行うことにより本発明による微生物製剤を製造することができる。こうして得られた微生物製剤は、水分含量が約４％〜約２０％まで低下している。従って、本発明による微生物製剤は、有機性廃棄物処理において、微生物製剤としてだけではなく水分吸収材あるいは撹拌用母材としての役割を果たす点でも有利である。
【００１８】
接種する微生物がオカラ常在菌以外の微生物である場合には、使用する微生物の性質（至適温度、至適ｐＨ等）に従って上記方法を適宜改変して、本発明による微生物製剤を製造することができる。例えば、バチルス・アミロリカファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）を使用する場合には、オカラに同菌株を接種後温度環境を約４０℃〜約６０℃に保ちながら約１２〜約２４時間常時撹拌することにより培養し、次いで約８０℃〜約１５０℃での通風乾燥を行う事により製造するか、あるいは同菌株を接種後温度環境を約４０℃〜約６０℃に保ちながら約４８時間〜約７２時間常時撹拌することにより、本発明による微生物製剤を製造することができる。水分含量は、オカラ常在菌を使用した場合と同様に約２０％以下となることから、有機性廃棄物処理において水分吸収材あるいは撹拌用母材としての役割をも果たすことは言うまでもない。
【００１９】
有機性廃棄物の処理
本発明によれば、オカラをそのまま有機性廃棄物と混合するか、あるいは本発明による微生物製剤であって有機性廃物処理に有用な製剤を有機性廃棄物と混合する工程を含む、有機性廃棄物の処理方法が提供される。
【００２０】
本発明による処理方法により処理可能な有機性廃棄物としては、食品性廃棄物が挙げられ、例えば、焼酎粕、野菜屑、生ゴミ、食材屑、果物絞り粕、残飯が挙げられる。
【００２１】
本発明による処理方法の実施に当たっては、まず、本発明による微生物製剤を有機性廃棄物と混合する。有機性廃棄物１００ｋｇに対して、本発明による微生物製剤約２０ｋｇ〜約５０ｋｇを添加することができる。
【００２２】
本発明による処理方法の実施に当たっては、オカラを単独で、あるいは本発明による微生物製剤とともに有機性廃棄物と混合してもよい。例えば、有機性廃棄物１００ｋｇに対して、オカラ約３０ｋｇ〜約１００ｋｇを単独で添加することができ、あるいは、有機性廃棄物１００ｋｇに対して、本発明による微生物製剤約１０ｋｇ〜約３０ｋｇとともに、オカラ約２０ｋｇ〜約８０ｋｇを添加することができる。使用するオカラは生オカラであっても、乾燥オカラであってもよいが、乾燥オカラは水分吸収材あるいは撹拌用母材としての役割を果たす点で有利である。
【００２３】
微生物製剤を有機性廃棄物と混合した後、混合物を約４０℃〜約６０℃で約１２時間〜３日放置することにより有機性廃棄物を発酵させることができる。発酵をまんべんなく進行させるために、混合物を適宜攪拌してもよい。
【００２４】
本発明による処理方法においては、発酵開始後約１２時間〜３日目に、有機性廃棄物を追加投入してもよい。適度な発酵を維持するため、追加投入量は最初の投入量と同程度とすることができ、追加投入を数回に分けて行ってもよい。
【００２５】
発酵の終了は減重量率および水分率を目安にすることができる。発酵工程終了後、最終生成物である処理残さを約８０℃〜約１５０℃で約３時間〜約２４時間かけて乾燥させることができる。
【００２６】
得られた処理残さは微生物製剤として再び有機性廃棄物処理に利用することができる（実施例６参照）。従って、本発明による微生物製剤および本発明による有機性廃棄物の処理方法は、資源の有効利用の観点から極めて有利である。
【００２７】
また発酵終了後の処理残さあるいは乾燥処理後の処理残さは、家畜やペットの飼料等として利用することができる。これまで、クレー、シリカ、木材チップ等を有機性廃棄物処理に用いた場合には最終生成物の飼料等への再利用は困難であった。本発明では、食品として長年使用され、安全性が確立しているオカラを微生物の担持担体として使用していることから、最終生成物を有効に再利用することができ、資源の有効利用の観点から極めて有利である。特に、有機性廃棄物処理に有用な微生物として、オカラ常在菌やコーンコブ等の食品由来の微生物を用いた場合には、安全性の観点から有利である。
【００２８】
このように、本発明による処理方法においては、産業廃棄物であるオカラを微生物製剤として利用するとともに、有機性廃棄物を処理した後の処理残さを廃棄することなく微生物製剤や飼料として再利用することが可能である。従って、本発明は廃棄費用を低減できる点でも有利である。
【００２９】
本発明によれば、オカラおよび／または本発明による微生物製剤を含んでなる、発酵母剤が提供される。本発明による発酵母剤は、好ましくは、有機性廃棄物処理のための発酵母剤として使用される。本発明による発酵母剤は、本発明による有機性廃棄物の処理方法の実施態様に従って、実施することができる。
【００３０】
土壌の改良
本発明によれば、本発明による微生物製剤であって、土壌改良に有用な微生物を担持してなる製剤を土壌と混合する工程を含む、土壌の改良方法が提供される。本発明によれば、また、本発明による微生物製剤であって、土壌改良に有用な微生物を担持してなる製剤を含んでなる、土壌改良剤が提供される。
【００３１】
本発明による土壌改良法の実施に当たっては、例えば、本発明による微生物製剤を土壌１立方メートル当たり、約１０ｋｇ〜約１００ｋｇ混合することができる。
【実施例】
【００３２】
以下の例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３３】
試験例１：オカラ常在菌の単離
オカラ圧搾機から排出されたオカラを室温で１２時間放置し、その後８０℃で３０分間加温した。このうち１ｇを生理的食塩水９ｍｌに加え、ボルテックスミキサーを用いて３分間よく撹拌した。そのうち１００μｌを、標準寒天培地プレートに塗抹し、５５℃で２４時間培養した結果、数種類のコロニーを得た。
【００３４】
得られたコロニーを上記の方法で、コロニーの形態の相違に基づいてスクリーニングし、最終的に３種類の微生物を単離した。単離した菌株を、株式会社エヌシーアイエムビージャパン（静岡県静岡市）に委託し，学名を決定した。その結果得られたＩＯ５５３、ＩＯ５５６、ＩＯ５５８からなる３種の菌株は、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）に含まれる、異なる新規菌株であった。これらの菌株はそれぞれ、平成１５年７月３０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５５、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５６、およびＦＥＲＭ  Ｐ−１９４５７のもと寄託された。
【００３５】
単離した微生物は、最小培地にグルコース５，０００ｐｐｍ（糖質選択培地）、可溶性デンプン５，０００ｐｐｍ（デンプン質選択培地）、カゼイン５，０００ｐｐｍ（タンパク質選択培地）、ペクチン１，０００ｐｐｍ（ペクチン選択培地）あるいはラード１０ｐｐｍ（脂質選択培地）を添加した各種選択培地を作製した。これに生理的食塩水で１０倍希釈した各微生物菌株（ＩＯ５５３、ＩＯ５５６、ＩＯ５５８）１００μｌを塗抹し，３７℃で２４時間インキュベートし，菌株の生育を評価した。また、対照実験として，完全培地に上記方法で塗抹した菌株の生育を確認した。
【００３６】
評価方法は５段階評価とし、完全培地での生育と同程度であり、非常に良い生育を示したものを５、良好な生育を示したものを４、問題なく生育したものを３、やや劣るものを２、劣るものを１とした。また、生育しなかったものは０とした。その結果を表１に示した。
【表１】
2005046122.tif 000002
得られた菌株は，脂質以外の基質に対する資化性は非常に優れていた。
【００３７】
また、菌株の温度依存性を確認するため，完全培地に上述した方法で希釈した各菌株１００μｌを塗抹し，３０℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃の各温度で２４時間インキュベートし，菌株の生育を評価した。結果は５段階評価で評価した。その結果を表２に示した。
【表２】
2005046122.tif 000003
表２より、得られた菌株は，比較的高温度である５５℃でも非常に良い生育を示し，６０℃でも生育可能であることが明らかとなった。
【００３８】
次に，ｐＨに対する影響を確認した。リン酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液を用いてｐＨを５から１０まで変化させた完全培地を作製し，菌株の希釈液を塗抹した。これを３７℃で２４時間インキュベートし，５段階評価で生育を評価した。その結果を表３に示した。
【表３】
2005046122.tif 000004
この結果から、ｐＨに対する依存性においても比較的広い範囲での生育が可能であることが分かった。
【００３９】
実施例１：オカラを担持担体とした微生物製剤の製造（１）
オカラ圧搾機から出た直後の水分８０％、固形分２０％の原料オカラ１００Kgを培養装置に投入し、オカラ中より単離したバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＩＯ５５６菌株３ｇを０．５％ショ糖溶液１，５００ｍｌに溶解させ、均一に噴霧した。
【００４０】
培養装置槽内の温度を４５℃に保ち、常時撹拌しながら４８時間かけて培養を行うことで、乾燥粉末状のオカラ微生物製剤を得た。
【００４１】
この時の水分率、培養温度による菌数変化を表４に示した。
【表４】
2005046122.tif 000005
これより、培養時間が進むにつれ水分率は低下し、４８時間後にはパウダー状に乾燥した微生物製剤が完成した。また、一般生菌数も培養時間が長くなるにつれて増加し、乾燥後も一般生菌数の減少は認められなかった。一般生菌数は、５５℃でも良く生育し、本微生物製剤は、比較的高温領域でも利用することが可能であることが確認できた。
【００４２】
実施例２：オカラを担持担体とした微生物製剤の製造（２）
オカラ圧搾機から出た直後の水分８０％、固形分２０％の原料オカラ１００Kgを培養装置に投入し、オカラ中より単離したバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＩＯ５５６菌株３ｇを０．５％ショ糖溶液１５００ｍｌに溶解させ、均一に噴霧した。培養槽内の温度を４５℃に保ち、常時撹拌しながら２４時間かけて培養を行った。
【００４３】
培養終了後、１５０℃の熱風送風を３時間行う事で乾燥させることにより、乾燥粉末状のオカラ微生物製剤を得た。この時の水分率、培養温度による菌数変化を表５に示した。
【表５】
2005046122.tif 000006
これより、一般生菌数は５５℃でも良く生育し、本微生物製剤は、比較的高温領域でも利用することが可能であることが確認できた。  
次に、実施例１で得られた微生物製剤を用いて、各種有機性廃棄物処理を行った。なお、有機性廃棄物処理後に、最終生成物の分解率、発酵処理後の残渣量、処理残渣物のｐＨ、水分率、有機物率、無機物率、一般生菌数、食中毒菌の有無を測定することで評価した。
【００４４】
実施例３：焼酎粕処理（１）
麦焼酎粕８０ｋｇに対して、実施例１に従って製造したオカラ乾燥製剤（バチルス・リケニフォルミス含有）４５ｋｇを加え、４５℃に槽内を保ち、常時撹拌しながら発酵、分解処理を行った。２４時間後、さらに焼酎粕８０ｋｇを投入し、同様に処理した。これを５日間連続で行い、５日目に投入した焼酎粕処理が終了した時点を最終生成物とした。その間処理物は一度も排出しなかった。
【００４５】
この処理工程間での上記測定項目の結果を表６および表７に示した。また、合計４００ｋｇの焼酎粕を投入したのに対し、最終生成物重量は、６８ｋｇであった。そのうちオカラ乾燥製剤重量を差し引き、減量率を算出すると、発酵処理による最終的な分解率は、９４％となった。
【表６】
2005046122.tif 000007
【表７】
2005046122.tif 000008
焼酎粕は、５日間連続投入しても、最終生成物の分解率は９４％と高い分解能を維持していることが確認できた。最終生成物は褐色の乾燥粉末状であった。また、麦焼酎粕は水分率が８６．９％と高水分であったが、発酵過程において、水分過多の影響による塊の形成などは見られなかった。これより、焼酎粕のような主として炭水化物より成る有機性廃棄物の処理に本微生物製剤が利用可能であることが明らかとなった。
【００４６】
また、一般生菌数は最終生成物において５５℃培養菌で１０７ｃｆｕ／ｇ存在し、さらに処理期間中食中毒菌等による汚染は見られなかった（データ省略）。
【００４７】
実施例４：廃棄野菜処理
廃棄物処理槽内に投入した、実施例１で作製した微生物製剤１５ｋｇに対し、青果店より得た廃棄野菜（キャベツ２０％、レタス２０％、玉葱１５％、人参１５％、大根１５％、その他数種類の野菜が数％ずつ）を２ｃｍ２程度に破砕したものを３０ｋｇ加え、４５℃に槽内を保ちながら常時撹拌し、２１時間発酵、分解処理を行った。その後槽内温度を６５℃に加温し、２時間常時撹拌することで発酵、分解処理物を乾燥した。乾燥後、さらに破砕した廃棄野菜３０ｋｇを投入し、同様に処理した。これを５日間連続で行い、５日目に投入した廃棄野菜処理が終了した時点を最終生成物とした。その間処理物は一度も排出しなかった。
【００４８】
この処理工程間での上記測定項目の結果を表８、９に示した。また、破砕後の廃棄野菜を合計１５０ｋｇ投入したのに対し、最終生成物重量は、３８ｋｇであった。そのうち微生物製剤重量を差し引き、減量率を算出すると、最終的な処理分解率は８５％となった。
【表８】
2005046122.tif 000009
【表９】
2005046122.tif 000010
廃棄野菜は、５日間連続投入しても高い分解能を維持していることが確認できた。最終生成物は褐色の乾燥粉末状であった。これより、廃棄野菜のような食物繊維が豊富で水分含量が高い有機性廃棄物の処理に本微生物製剤が利用可能であることが明らかとなった。
【００４９】
また、一般生菌数は最終生成物において５５℃培養菌で１０７ｃｆｕ／ｇ存在し、さらに処理期間中食中毒菌等による汚染は見られなかった（データ省略）。
【００５０】
実施例５：生ゴミ処理
廃棄物処理槽内に投入した、実施例１で作製した乾燥製剤１５ｋｇに対し、レストランや割烹より得た生ゴミを３０ｋｇ加え、４５℃に槽内を保ちながら常時撹拌し、２１時間発酵、分解処理を行った。その後槽内温度を６５℃に加温し、２時間常時撹拌することで発酵、分解処理物を乾燥した。乾燥後、さらに生ゴミ３０ｋｇを投入し、同様に処理した。これを５日間連続で行い、５日目に投入した生ゴミ処理が終了した時点を最終生成物とした。その間処理物は一度も排出しなかった。
【００５１】
この処理工程間での上記測定項目の結果を表１０、１１に示した。また、生ゴミを合計１５０ｋｇ投入したのに対し、最終生成物重量は、３５ｋｇであった。そのうち本微生物製剤重量を差し引き、減量率を算出すると最終的な処理分解率は、８７％となった。
【表１０】
2005046122.tif 000011
【表１１】
2005046122.tif 000012
生ゴミは、５日間連続投入しても高い分解能を維持していることが確認できた。最終生成物は褐色の乾燥粉末状であった。これより、生ゴミのような処理物が雑多で水分含量が高い有機性廃棄物の処理に本微生物製剤が利用可能であることが明らかとなった。
【００５２】
また、一般生菌数は最終生成物において５５℃培養菌で１０７ｃｆｕ／ｇ存在し、処理期間中大腸菌群等の食中毒菌による汚染は見られなかった（データ省略）。
【００５３】
実施例６：焼酎粕処理後残渣を初期の微生物製剤として再利用した際の焼酎粕処理
実施例３で得られた焼酎粕処理残渣１５ｋｇに対し麦焼酎粕３０ｋｇを加え、４５℃に槽内を保ちながら、常時撹拌しながら発酵、分解処理を行った。２４時間後、さらに焼酎粕３０ｋｇを投入し、同様に処理した。これを５日間連続で行い、５日目に投入した焼酎粕処理が終了した時点を最終生成物とした。その間処理物は一度も排出しなかった。
【００５４】
焼酎粕処理工程間での測定項目の結果を表１２および表１３に示した。また、焼酎粕合計１５０ｋｇ投入したのに対し、最終生成物重量は３０ｋｇであった。そのうち本微生物製剤重量を差し引き、減量率を算出すると、最終的な処理分解率は、９０％となった。
【表１２】
2005046122.tif 000013
【表１３】
2005046122.tif 000014
焼酎粕は、焼酎粕処理物を初期の微生物製剤として再利用し，新たに焼酎粕を５日間連続投入しても、最終生成物の分解率は９０％と高い分解能を維持していることが確認できた。また、最終生成物は褐色の乾燥粉末状であった。
【００５５】
また、一般生菌数は最終生成物において５５℃培養菌で１０７ｃｆｕ／ｇ存在し、さらに処理期間中食中毒菌等による汚染は見られなかった（データ省略）。
【００５６】
試験例２：オカラを微生物の担持担体とした場合の微生物製剤内細菌群の遺伝子解析
本微生物製剤を作製する際，初期に接種した微生物がどのような挙動を示すのかを明らかとするため、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＣＤＧＥ法）を用いた遺伝子解析を行った。
【００５７】
（１）各検体からの菌体の調製
実施例１に基づいた微生物製剤の作製において、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＩＯ５５６、オカラ、ＩＯ５５６をオカラに接種し、２４時間培養後，４８時間培養後の各検体の１０２倍希釈溶液１００μｌを標準寒天培地にプレーティングし、４５℃で２４時間培養した。多種の微生物群が生育した培養後のプレートに滅菌水３ｍｌを加え、コンラージ棒で菌体を掻きとり、エッペンドルフ管に移した。これを遠心分離機（日立製作所）を用いて、１２，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離することで、菌体を得た。
【００５８】
（２）トータルＤＮＡの単離と増幅
各検体から得られた菌体のトータルＤＮＡは、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン）キットを用いて調製した。得られたトータルＤＮＡより、１６ＳｒＤＮＡの特定領域６００ｂｐをＧＣクランプを付加したプライマー３４１Ｆ（５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号１）およびプライマー９０７Ｒ（５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ−３’）（配列番号２）を用いてＰＣＲ法を用いて増幅した。
【００５９】
ＴａｑポリメラーゼはＧｅｎｅ  Ｔａｑ（ニッポンジーン）を用い，非特異的な増幅を抑えるため，ホットスタート法により添加した。また、自動サーマルサイクラー（エムジェイ）を用い、９５℃５分での初期変性後，８０℃、１分での変性、５５℃、１分でのアニーリングを１サイクル、その後５４℃から５０℃まで１サイクルずつ下げ、それぞれ１０サイクルずつ、計４１サイクルのアニーリングを行った。また、それぞれのステップの間で７２℃の伸長反応を行った。
【００６０】
（３）ＣＤＧＥを用いた微生物の遺伝子解析
尿素とホルムアミドを変性剤とし、変性剤濃度５５％（ｖ／ｖ）の６％ポリアクリルアミドゲルを作製した。これに上述した各検体のＰＣＲ産物をアプライし、Ｄ−Ｃｏｄｅシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、６５℃、１００Ｖで２０時間電気泳動した。その後エチジウムブロマイドで染色し、トランスイルミネーターでバンドを確認した。
【００６１】
（４）各検体における微生物の挙動
電気泳動写真を図１に示した。レーン１に示すようにオカラ中には複数の微生物由来の遺伝子バンドが確認できるが，２４時間培養後では、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＩＯ５５６と同位置にのみバンドが収束した（レーン２）。その後、４８時間培養後もＩＯ５５６と同位置のバンドのみが確認された（レーン３）。これより、本微生物製剤に存在する微生物は、接種したＩＯ５５６が優勢となっていることが確認できた。
【００６２】
試験例３：オカラを担持担体とする微生物製剤を利用した有機性廃棄物処理最終生成物の遺伝子解析
本微生物製剤を用いて有機性廃棄物を処理することで、オカラ微生物製剤中の微生物がどのような挙動を示すか、また、槽内で優勢となっている微生物を確認するため、CDGE法を用いて遺伝子解析をおこなった。
【００６３】
バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＩＯ５５６、オカラにＩＯ５５６を担持させた本微生物製剤、焼酎粕処理最終生成物、廃棄野菜処理最終生成物、生ゴミ処理最終生成物および焼酎粕処理物を初期の微生物製剤として使用し、処理した焼酎粕処理最終生成物の各検体より、試験例２で示した方法で遺伝子を単離、増幅した後ＣＤＧＥ法を用いた遺伝子解析に供した。
【００６４】
電気泳動写真を図２に示した。各処理最終生成物由来の遺伝子バンドは複数バンドが出ているものもあるが、すべての処理残渣において主たるバンドはＩＯ５５６と同位置であったことから、各処理最終生成物中に存在する微生物は、本微生物製剤に担持させたＩＯ５５６が優勢種として存在していることが明らかとなった。
【００６５】
試験例４：バチルス・アミロリカファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の単離
生ゴミの発酵処理残さ１ｇを生理的食塩水９ｍｌに加え、ボルテックスミキサーを用いて３分間よく撹拌した。そのうち１００μｌを標準寒天培地プレートに塗抹し、３７℃で培養した結果、数種類のコロニーを得た。
【００６６】
得られたコロニーを上記の方法で、コロニーの形態の相違に基づいてスクリーニングし、最終的に微生物を単離した。単離した菌株を株式会社エヌシーアイエムビージャパン（静岡県静岡市）に委託し、学名を決定した。その結果、今回単離したＥＳ３０２Ｗ（１）菌株は、バチルス・アミロリカファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）に含まれる新規菌株であった。
【００６７】
最小培地にグルコース５，０００ｐｐｍ（糖質選択培地）、可溶性デンプン５，０００ｐｐｍ（デンプン質選択培地）、カゼイン５，０００ｐｐｍ（タンパク質選択培地）、ペクチン１，０００ｐｐｍ（ペクチン選択培地）、ラード１０ｐｐｍ（脂質選択培地）あるいはセルロース５，０００ｐｐｍ（セルロース選択培地）を添加した各種選択培地に、生理的食塩水で１０倍希釈したＥＳ３０２Ｗ（１）１００μｌを塗抹し、３０℃で２４時間インキュベートし、菌株の生育を評価した。また、対象実験として、完全培地に上記方法で塗抹した菌株の生育を確認した。評価方法は５段階評価とし、完全培地での生育と同程度であり、非常に良い生育を示したものを５、良好な生育を示したものを４、問題なく生育したものを３、やや劣るものを２、劣るものを１とした。また、生育しなかったものは０とした。
【００６８】
その結果、ＥＳ３０２Ｗ（１）は、糖質資化性：０、デンプン資化性：４、タンパク質資化性：５、脂質資化性：０、セルロース資化性：０、ペクチン資化性：２となり、特にタンパク質の資化において優れていることが明らかとなった。
【００６９】
また、菌株の温度依存性を確認するため、完全培地に上述した方法で希釈した菌株１００μｌを塗抹し、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃の各温度で２４時間インキュベートし、上述したように５段階評価で生育を評価した。
【００７０】
その結果、３０℃生育：４、３５℃生育：４、４０℃生育：４、４５℃生育：５、５０℃生育：５、５５℃生育：２、６０℃生育：１であった。この結果より、本菌株は４０〜５０℃の比較的高温領域で良い生育を示すことが明らかとなり、各種選択培地での資化性と合わせて、有機性廃棄物処理において有効に利用できる菌株であることが明らかとなった。
【００７１】
実施例７：オカラを微生物の担持担体とした微生物製剤の製造（１）
オカラ圧搾機から出た直後の水分８０％、固形分２０％の原料オカラ１００ｋｇを培養装置に投入し、試験例４に従って単離したバチルス・アミロリカファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＥＳ３０２Ｗ（１）菌株３ｇを０．５％ショ糖溶液１，５００ｍｌに溶解させ，均一に噴霧した。
【００７２】
培養装置内の温度を４５℃に保ち，常時撹拌しながら４８時間かけて培養を行うことで、乾燥粉末状の微生物製剤を得た。この時の水分率，培養温度による菌数変化を表１４に示した。
【表１４】
2005046122.tif 000015
これより、培養時間が進むにつれ水分率は低下し，４８時間後にはパウダー状に乾燥した微生物製剤が完成した。また、一般生菌数も培養時間が長くなるに従って増加し，乾燥後も一般生菌数の減少は認められなかった。一般生菌数は５５℃でも良く生育し，本微生物製剤は比較的高温領域でも利用することが可能であることが確認できた。
【００７３】
実施例８：オカラを微生物の担持担体とした微生物製剤の製造（２）
水分１５％に乾燥させたオカラ２５ｋｇを培養槽内に投入し、０．５％ショ糖溶液２，０００ｍｌに溶解したバチルス・アミロリカファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＥＳ３０２Ｗ（１）菌株を均一に噴霧した。さらに０．５％ショ糖溶液１５ｌを加水した。槽内の温度を４５℃に保ち、常時撹拌しながら２４時間培養することで微生物製剤を得た。この時の水分率，培養温度による菌数変化を表１５に示した。
【表１５】
2005046122.tif 000016
２４時間培養後には、オカラを微生物の担持担体として利用した場合と同様な結果が得られた。これより、乾燥オカラを微生物の担持担体として利用することが可能であることが確認できた。
【００７４】
実施例９：焼酎粕処理（２）
廃棄物処理槽内に投入した麦焼酎粕８０ｋｇに対し，実施例７で作製した微生物製剤（バチルス・アミロリカファシエンス含有）１５ｋｇおよび水分率が１５％の乾燥オカラ３０ｋｇを加えた。槽内を４５℃に保ち、常時撹拌しながら発酵・分解処理をした。２４時間後，さらに焼酎粕８０ｋｇを投入し、同様に発酵・分解処理した。これを５日間連続で行い、５日目に投入した焼酎粕処理が終了した時点を最終生成物とした。その間処理物は一度も排出しなかった。
【００７５】
この処理工程においての水分率、有機物率、無機物率、ｐＨ、各温度での一般生菌数に関する分析結果を表１６および表１７に示した。また、合計４００ｋｇの焼酎粕を投入したのに対し、最終生成物重量は７０ｋｇであった。そのうち実施例７の方法で作製したオカラを微生物の担持担体とした微生物製剤および乾燥オカラの重量を差し引き、減量率を算出すると、発酵処理による最終的な分解率は９４％であった。
【表１６】
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【表１７】
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５日間連続して焼酎粕を投入しても、分解率は９４％と高い分解能を維持していることが確認できた。また、最終生成物は褐色の粉末状であった。
【００７６】
撹拌用母材として投入した乾燥オカラが焼酎粕の水分吸収材としての役割も果たし、塊の形成も見られず、良好な発酵、分解が確認できた。さらに処理期間中食中毒菌等による汚染は見られなかった（データ省略）。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】オカラ常在菌をオカラに担持させて微生物製剤とする過程の遺伝子解析を行った結果を示した図である。レーン１：オカラ、レーン２：培養２４時間後、レーン３：培養４８時間後、レーン４：Bacillus licheniformis ＩＯ５５６。
【図２】各処理残渣を遺伝子解析した結果を示した図である。レーン１：Bacillus licheniformis  ＩＯ５５６、レーン２：オカラ微生物製剤、レーン３：生ゴミ処理最終生成物、レーン４：焼酎粕処理最終生成物、レーン５：焼酎粕処理物を初期の微生物製剤として処理した焼酎粕処理最終生成物、レーン６：廃棄野菜処理最終生成物。
【図１】
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【図２】
2005046122.tif 000020
【配列表】
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