(57)【要約】【課題】  ２種以上の異なるシグナル伝達系を融合蛋白質を用いて調節する方法を提供する。【解決手段】  シグナル伝達活性を有する第一の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインに該第一の蛋白質とは異なるシグナル伝達活性を有する第二の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインとを連結させてなる融合蛋白質と、該第二のリガンド結合ドメインに対する特異的リガンド分子と、該第二のリガンド結合ドメインと特異的リガンド分子との結合を阻害する物質とを用いて、該第一の蛋白質のシグナル伝達活性を抑制又は脱抑制する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル伝達活性を有する第一の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインに該第一の蛋白質とは異なるシグナル伝達活性を有する第二の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインとを連結させてなる融合蛋白質と、該第二のリガンド結合ドメインに対する特異的リガンド分子と、該第二のリガンド結合ドメインと特異的リガンド分子との結合を阻害する物質とを用いて、該第一の蛋白質のシグナル伝達活性を制御する方法。
【請求項２】
シグナル伝達活性を有する細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインがSH3 (sarc homology 3)ドメイン、TPR（tetratricopeptide repeat）ドメイン、ＤＨドメイン、ＰＤＺドメイン、及びＰＢ１ドメインよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
第二の蛋白質のリガンド結合ドメインがVPPPVPPRRRからなるアミノ酸配列またはRHYRPLPPLPからなるアミノ酸配列及びよりなるドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第二のリガンド結合ドメインに対する特異的リガンド分子がＧｒｂ２蛋白質であり、該第二のリガンド結合ドメインと特異的リガンド分子との結合を阻害する物質がVPPPVPPRRR（X)nRHYRPLPPLPなるアミノ酸配列からなるペプチドであり、ここでXは任意のアミノ酸残基を示し、ｎは１〜１０の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下のａ）又はｂ）の蛋白質
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されており、かつｐ２２ｐｈｏｓ蛋白質及びＧｒｂ２蛋白質に結合することのできる蛋白質。
【請求項６】
請求項５に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項７】
配列番号１に示される核酸配列からなる請求項６に記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞シグナル伝達経路を介したシグナル伝達を任意に調整する方法、該方法に使用する新規融合蛋白質とそれをコードする遺伝子、ならびに新たな蛋白質改変技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内シグナル伝達系とは、細胞表面の増殖因子受容体から核に伝達される機構はもちろんのこと、細胞周期、接着、運動、極性、形態形成、分化、生存と死など、細胞の多様な応答を可能とする一連のシステムであり、細胞の生命活動そのものを司っている。細胞間で協調的に情報のやりとりをする必要がある多細胞生物においては、その伝達システムは高度に発達しており、精緻な制御系を構成しているが、未解明な部分も多い。
【０００３】
生体内においてシグナル伝達の直接の担い手は、ヌクレオチドやカルシウムイオンなど様々であるが、その中でも蛋白質−蛋白質相互作用、その結果生じるリン酸化や構造変化は、非常に重要である。シグナル伝達蛋白質は、特定のアミノ酸配列相同領域（ドメイン）が複数組み合わされた構成となっており、ドメインはそれ自体単独で存在することのできる立体構造と固有の機能を有している。このドメイン同士の分子内および分子間相互作用が高度なシグナル伝達ネットワークを構築している。
【０００４】
この様なネットワークに関与するシグナル伝達蛋白質、特に当該蛋白質において重要な機能を担うドメイン構造とその機能を明らかにすることは、生体のシグナル伝達を分子レベルで理解する上で大変に重要であるとの認識から、主にシグナル伝達系全体の機構、あるいは各蛋白質の機能の解明に関する研究は盛んに行われてきた。しかし、シグナル伝達系において機能するシグナル伝達蛋白質を改変して、それとは別のシグナル伝達系と相互作用させようとする試みは未だなされていない。
【０００５】
これまでに、遺伝子工学的な手法を用いて蛋白質を改良する研究はすでに多数報告されている。しかしそのほとんどは、酵素の活性や熱安定性を高めたりするものであって、細胞内シグナル伝達系に関わる蛋白質を改変して、生体内シグナル伝達機構の制御を行おうとするものではない。
【０００６】
例えば、好中球における活性酸素誘導系に関わる食細胞NADPHオキシダーゼのp67phoxとp47phoxの活性に必要な部分を融合させたものを作成した例があるが（非特許文献２）、これは単に酵素の安定化を目的としているもので、シグナル伝達系の制御を目指しているものではない。
【０００７】
また、細胞内シグナル伝達を利用した例として、カルモジュリンにGFP（green fluorescent protein）をつなげ、Ca2+のセンサーとして設計した報告がある（非特許文献３）。しかし、これはいわゆるリポーター蛋白質の提供であって、異なるシグナル伝達系の相互作用を構築するものではない。さらに、FKBPをレセプター細胞質ドメインにつなげ、FKを加えることで二量体化できるようにした例（非特許文献４）などがあるが、これは２量体化を目的としたものに過ぎず、シグナル伝達系の制御機構を備えた蛋白質ではない。
【非特許文献１】Bernard M. Babior, Blood 93巻, 1464-1476頁.1999年
【非特許文献２】Ebisu K, Nagasawa T, Watanabe K, Kakinuma K, Miyano K, and Tamura M. ,  J. Biol. Chem. 276巻, 24498-505頁、2001年
【非特許文献３】Trung K, Sawano A, Mizono H, Hama H, Tong KI, Mal TK, Miyawaki A, Ikura M,  Nat. Struct. Biol., 8巻, 1069-73頁, 2001年
【非特許文献４】Pruschy MN, Spencer DM, Kapoor TM, Miyake H, Crabtree GR, Schreiber SL, Chem. Biol., 1巻 163-72頁、1994年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生体内の複数の異なるシグナル伝達系を相互に関連させることにより、これらが関与するシグナル伝達のオン／オフを任意に調節する技術、あるいはあるシグナルの入力に始まる一のシグナル伝達を別のシグナル伝達系に対する入力へと人為的に誘導する技術が開発されれば、これらは医薬やバイオセンサー関連技術において有用となり得ると期待される。本発明はかかる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、異なったシグナル伝達系に関与する異なる蛋白質分子のドメイン同士を連結させた融合蛋白質を利用することにより、複数のシグナル伝達系を相互に機能的に連結させ、さらには細胞内シグナル伝達系の人為的な制御、例えば一方のシグナル入力によって他方のシグナル伝達系の活性化あるいは不活性化を行うことができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、シグナル伝達活性を有する第一の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインに該第一の蛋白質とは異なるシグナル伝達活性を有する第二の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインとを連結させてなる融合蛋白質と、該第二のリガンド結合ドメインに対する特異的リガンド分子と、該第二のリガンド結合ドメインと特異的リガンド分子との結合を阻害する物質とを用いて、該第一の蛋白質のシグナル伝達活性を制御する方法に関する。
【００１１】
ここにいう「制御」とは、シグナル伝達活性を抑制あるいは抑制状態の解除、さらには定常状態からの活性化を意味する。
【００１２】
特に本発明は、シグナル伝達活性を有する第一の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインがSH3 (sarc homology 3)ドメインであり、第二の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインがVPPPVPPRRR及び／またはRHYRPLPPLPからなるアミノ酸配列からなるドメインであり、第二の細胞質蛋白質に対するリガンドがＧｒｂ２蛋白質であり、Ｇｒｂ２蛋白質と第二の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインとを用いて、融合蛋白質が有するＳＨ３ドメインのｐ２２ｐｈｏｓへの結合によるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性発現を調節する方法である。
【００１３】
好ましくは、ＴＲＰドメイン、第二の細胞蛋白質のリガンド結合ドメインであるVPPPVPPRRRからなるアミノ酸配列、第一のリガンド結合ドメインであるＳＨ３ドメイン及び第二のリガンド結合ドメインであるRHYRPLPPLPからなるアミノ酸配列をこの順序でN末端側から有する蛋白質を融合蛋白質として、Ｇｒｂ２蛋白質を第二の蛋白質に対する特異的リガンドとして、第二のリガンド結合ドメインと特異的リガンド分子との結合を阻害する物質としてVPPPVPPRRR（X)nRHYRPLPPLPというアミノ酸配列を有するペプチド（VPPRHYペプチド、ここでXは任意のアミノ酸残基を示し、ｎは１〜１０の整数である）とを用いることによって、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性発現を調節する方法である。
【００１４】
シグナル伝達系に関わる蛋白質は多くの構造的、機能的ドメインより構成されている。たとえば、リン酸化チロシンを含む配列に結合するSH2ドメイン、プロリンに富む配列に結合するSH3ドメインは、機能性ドメインの代表である。細胞内のシグナル伝達において、これらの機能性ドメインは分子内あるいは分子間における標的配列との相互作用を介して異なるシグナル伝達系間のクロストークを可能とし、高度に発達したシグナル伝達ネットワークを作り上げている。
【００１５】
シグナル伝達のもう一つの特徴は、機能性ドメイン間の相互作用を介してシグナル伝達のスイッチをオン／オフする制御機構を有している点で、これらは外界からの刺激に細胞が柔軟に対応するために不可欠なシステムと考えられる。
【００１６】
本発明で行われているような蛋白質の機能ドメインの改変、修飾、あるいはドメイン単位の連結あるいは組換えという試みは、「ドメイン工学」と称することができる。このドメイン工学の目的は、天然には存在しない新たな機能を持つ蛋白質を設計すること、さらに新たなシグナル伝達系を作り出すことにより、シグナル伝達ネットワークの理解を進めるとともに、生理活性蛋白質においては医薬やバイオセンサーなどとして医療への応用を図ることである。
【００１７】
ドメイン工学の基礎技術としては、（1）ドメインの改変、（2）ドメインの交換、（3）ドメインの削除、（4）ドメインの挿入、（5）ドメイン間の相互作用を制御する新たなスイッチ機構の導入が考えられる。しかし、これらの基礎的技術を利用した新たな機能性蛋白質を創出する試みはあっても、シグナル伝達機能の制御、調節を目的とした例はない。
【００１８】
本発明は、このシグナル伝達機能の制御、調節を目的とした融合蛋白質を提供するものである。特に本発明では、Ｇｒｂ２という様々なシグナル伝達に関わっているアダプター蛋白質に着目し、この蛋白質が特異的に認識するアミノ酸配列とＧｒｂ２とは全く異なる別のシグナル伝達系蛋白質の機能性ドメインとの融合蛋白質を設計、使用して、当該シグナル伝達をＧｒｂ２の制御下に調節するものである。
【００１９】
具体的には、本発明の融合蛋白質は、Ｇｒｂ２が認識し結合することのできる特異的なアミノ酸配列であるVPPPVPPRRRからなるアミノ酸配列（VPPペプチド配列）、RHYRPLPPLPからなるアミノ酸配列（RHYペプチド配列）を介して、Ｇｒｂ２と結合することができる。また第一のドメインを介してＧｒｂ２とは異なる別のシグナル伝達系蛋白質と結合することもできる。従って、このシグナル伝達活性を有する第一の細胞質蛋白質のリガンド結合ドメインを適宜選択し、これにVPPペプチド配列またはRHYペプチド配列を付与して融合蛋白質を設計しこれを発現させることで、当該ある種のシグナル伝達系蛋白質が関与するシグナル伝達をＧｒｂ２蛋白質とVPPRHYペプチドとを用いることにより、遮断したり、活性化したりすることができる。
【００２０】
以下、本発明の融合蛋白質を、好中球、好酸球、単球などの食細胞におけるスーパーラジカルによる殺菌作用に関与するNADPHオキシダーゼを例にして説明する。
【００２１】
白血球は細菌やウイルスの感染から生体を防御する細胞であり、好中球、好酸球、好塩基球、単球（およびその組織型であるマクロファージ）、リンパ球などの細胞が存在する。特に好中球、好酸球、単球は食細胞とも呼ばれ、普段は休止状態にあるが、病原性微生物が生体内に侵入してくると、そこへすみやかに遊走して、微生物を認識して貪食、殺菌を行う食作用を有している。食細胞が働いているときは、血管の透過性の昂進や血球および血漿の局所への集積など、組織反応を伴う複雑な現象が起きて、結果的に炎症となる。つまり食細胞による生体防御は炎症の本態といえる。
食細胞による殺菌は主に、病原性微生物を取り込んで形成された食胞内で行われる。食胞内での殺菌においては、NADPHオキシダーゼという酵素が関与している。
【００２２】
NADPH オキシダーゼは細胞質のNADPHから電子を受け取り、それを酸素分子に渡してO2-を生成する酵素である。この酵素は、電子伝達を担う細胞膜貫通型蛋白質チトクローム b558（cyt b558）と、細胞質因子と呼ばれるp67phox、p47phox、p40phox、および低分子GTP結合蛋白質Racとから成る多成分酵素である（肩文字のphoxはファゴサイト（phagocyte） オキシダーゼを、数字は分子量（kDa）を意味する）。
【００２３】
cyt b558はさらにgp91phoxとp22phox の2つのサブユニットから成る。gp91phoxは2つのヘムと1つのフラビン（FAD）を持ち、NADPH→FAD→ヘム→酸素分子というオキシダーゼ活性（O2-生成）に必要な電子伝達系をすべて含んでいる。一方のp22phoxはgp91phoxの安定化に必要であり、後述のように細胞質因子と結合して、アンカーとしての役割を持つ。
【００２４】
NADPHオキシダーゼによって生成されたO2−（スーパーオキシド、活性酸素）は、非酵素的に過酸化水素（H2O2）やヒドロキシラジカル（OH・）となり、ヒドロキシラジカルはさらにミエロペルオキシダーゼによって次亜塩素酸（HOCl）となって、強力な殺菌作用を発揮する。
【００２５】
休止状態の細胞では上記の電子伝達は全く行われず、O2−は生成されない。NADPHオキシダーゼのcyt b558を活性化してO2−生成の電子伝達を引き起こすためには、一群の細胞質因子が細胞質から膜へと移行し、cyt b558と相互作用することが必要である（図１）。この活性化には主に２つのスイッチがあるといわれている。
【００２６】
1つは細胞質因子であるRacの活性化（GDP型からGTP型への変換）と細胞膜への移行である。Racは細胞休止時にはGDP型として細胞質に存在するが、活性化してGTP型になると、p67phoxのTPR（tetratricopeptide repeat）ドメインを認識して結合し、細胞膜へと移行し、活性型NADPHオキシダーゼの構成成分となる。
【００２７】
もう1つのスイッチは細胞質因子であるp47phoxの構造変化と細胞膜への移行である（図２）。p47phoxは図２左に示したようなドメイン配置をした蛋白質で、そのSH3（src homology 3）ドメインが2つ並列に並んだ領域（SH3タンデムドメイン）が、p22phoxのPRR（proline rich region）と結合することが知られている。
【００２８】
細胞休止時には、p47phox のSH3タンデムドメインは、自身のN末端側PXドメインおよびC末端側poly basic regionの分子内相互作用により覆い隠された状態となっており、p22phoxのPRRと結合することができない。しかし細胞活性化時には、リン酸化とアラキドン酸によって分子内相互作用が壊され、SH3タンデムドメインがさらされるので、p47phoxはp22phoxのPRRと結合できるようになり、細胞質因子は膜へと移行し、活性型HADPHオキシダーゼの構成成分となる。
【００２９】
以上を纏めると次のように説明することができる。好中球活性酸素発生系の構成因子は、シグナルが伝達されない休息時には、細胞質因子p47phox、 p67phox、 p40phoxは三量体として細胞質に存在するが、貪食シグナルを受けとると、三量体の構造変化が誘起され、p47phoxに含まれるタンデムのSH3ドメインは閉構造より開構造に変化する（図２）。開構造に変化したタンデムSH3ドメインはp22phoxの細胞質側に存在するプロリンに富んだ領域と結合し、またp67phoxのTPRモチーフが活性化型のRacと結合することにより膜に移行し、cyt b558 を活性化して活性酸素を発生する（図１）。このように、p47phoxタンデムSH3とp67phox TPRモチーフは活性酸素の発生に重要な役割を果たしている。
【００３０】
この好中球活性酸素発生系は、微生物の貪食・殺菌作用として免疫には重要な機構であるが、このシステムに異常をきたすと、重篤な感染症を繰り返す慢性肉芽症、慢性関節リウマチ、脊椎関節症などの様々な疾患を引き起こすことが知られている。このような炎症性難治疾患にはまだ十分な治療法がなく、新たな治療法や治療薬の開発が期待されている。そのため、好中球活性酸素発生系のシグナル伝達機構に関わる分子を制御する技術はそのひとつの解決策であり、その開発が待ち望まれている。
【００３１】
本発明者らは、このp47phoxのSH3タンデムドメイン（アミノ酸151-286、配列番号２）と、p67phoxのTPRドメイン（アミノ酸1-242、配列番号３）、およびRacさえあれば、cyt b558と複合体を形成してNADPH オキシダーゼ活性は生じうることを想定し、これを全く別のシグナル情報に関与するＧｒｂ２の制御下に置くことを試みた。
【００３２】
Ｇｒｂ２はさまざまなシグナル伝達に関わっているアダプター蛋白質である（Bruce Alberts他著、中村桂子他訳『細胞の分子生物学  第３版』、1995年、Newton Press発行、1074頁、Anthony J. Pawson編集、竹縄忠臣監訳『実験医学増刊  情報伝達におけるタンパク質モジュール』、1998年、羊土社発行、20頁、竹縄忠臣編集『実験医学増刊  プロテオーム研究とシグナル蛋白ドメイン』、2000年、羊土社発行、95頁）、SH3-SH2-SH3というドメイン配置を有し、N末端側のSH3ドメインがVPPPVPPRRRというアミノ酸配列（VPPペプチド配列、配列番号４）と、C末端側のSH3ドメインがRHYRPLPPLPという配列のペプチド（RHYペプチド配列、配列番号５）をそれぞれ認識し結合することが知られている。
【００３３】
本発明者らは、まず（1）p47phoxタンデムSH3とp67phox TPRとの融合蛋白質を創製し、恒常的に活性酸素を発生する系を作ることに成功した。
【００３４】
次にＧｒｂ２のSH3結合部位を構成するプロリンに富むペプチド配列すなわちVPPペプチド配列ならびにRHYペプチド配列を、上記p47phoxタンデムSH3とp67phox TPRとの融合蛋白質のリンカー部およびテール部に連結させた。この融合蛋白質は、TPR-VPP-(SH3)2-RHY、すなわちTPRドメインとSH3タンデムドメインの間にVPPペプチド配列を、SH3タンデムドメインのC末端側にRHYペプチド配列をそれぞれ連結した構造を有している（以下、この融合蛋白質をTVSR蛋白質と呼ぶことにする）。
【００３５】
TVSR蛋白質のドメイン配置と、Ｇｒｂ２ によるNADPH オキシダーゼ 活性阻害の分子モデルを図３左に示す。この構造は、Ｇｒｂ２のN末端側SH3ドメイン (nSH3)とC末端側SH3ドメイン (cSH3) が、それぞれVPPペプチドとRHYペプチドと結合するように設計したものである。
【００３６】
このTVSR蛋白質は、図４に示すように、cyt b558ともにNADPH オキシダーゼ活性を再構成して濃度依存的に活性酸素を生成させることができ、好中球活性酸素発生系のシグナル伝達の機能分子として機能する融合蛋白質である。
【００３７】
このＴＶＳＲ蛋白質の上記の機能は、同蛋白質が自身の２つのSH３ドメインでＧｒｂ２と結合することにより発揮される。従ってここにＧｒｂ２を添加することで、該融合蛋白質のp47phox SH3タンデムドメインとp22phoxとの結合を阻害することができる。その結果、NADPH オキシダーゼ活性を抑制し、活性酸素の発生を抑制することが可能となる（図５）。
【００３８】
このように、シグナル伝達を司る機能蛋白質をＧｒｂ２結合ペプチド配列を有する融合蛋白質に改変することにより、Ｇｒｂ２が関与するシグナル伝達の制御下に異なる細胞内シグナル伝達系を置くことが可能となる。実際に、シグナル伝達の最終反応段階であるNADPH オキシダーゼ活性の抑制に成功したことから、活性酸素が引き起こす炎症反応を制御し得る可能性を示したものといえる。
【００３９】
さらに本発明の融合蛋白質のNADPH オキシダーゼ活性に対する阻害は、VPPペプチド配列とRHYぺプチドとを直接あるいは適当なリンカー配列を介して連結させたポリペプチドすなわちVPPRHYペプチド（配列番号６）を添加することで、解除させることもできる。図６に示したように、TVSR蛋白質を用いて再構成されたNADPHオキシダーゼにTVSR蛋白質に対して10等量のＧｒｂ２を加えて、NADPHオキシダーゼ活性を阻害させた状態に、さらにＧｒｂ２の100倍量のVPPRHYポリペプチドを添加することにより、NADPHオキシダーゼ活性を回復させることができる。
【００４０】
このように本発明では、NADPHオキシダーゼの活性酸素発生シグナルを、Ｇｒｂ２という全く別のシグナルに関わる蛋白質を制御抑制因子として利用すること、さらにＧｒｂ２の結合部位のペプチドを制御抑制の解除因子として利用することを可能にし、結果として活性酸素発生系のシグナル伝達を人為的に自由に制御することができる。
【００４１】
すなわち、本発明に従えば、食細胞NADPH オキシダーゼの活性酸素発生シグナルに関わる蛋白質のリガンド結合ドメインを選択して本発明の融合蛋白質を調製することで、活性酸素発生をＧｒｂ２蛋白質という全く別のシグナルに関わる蛋白質によって、人為的に細胞内シグナル伝達系をオン／オフ制御することができる。NADPHオキシダーゼが関わる食細胞による食作用は炎症の本態であるから、このようなシグナル制御によって、炎症を抑えることが可能となる。
【００４２】
以上が、HADPHオキシダーゼを構成する酵素のリガンド結合ドメインを利用した場合の、本発明の融合蛋白質の例示である。
【００４３】
しかしながら、本発明は、食細胞NADPH オキシダーゼの活性酸素発生シグナルに関わる蛋白質に限定されることなく、他のシグナル伝達に関わる蛋白質において既に特定されているリガンド結合ドメイン、あるいは更なる研究により解明されるであろうリガンド結合ドメインを利用し、これらを直接融合させることで各ドメインが関与するシグナル伝達系を相互に関連させることができる。例えば、Cdc24とCRIBモチーフ等も利用することができる。
【００４４】
また、かかる融合蛋白質にさらにVPPペプチド配列及び／又はRHYペプチド配列を取り込ませることで、様々なシグナル伝達をＧｒｂ２系下に制御することができる。
【００４５】
以上のとおり、本発明は、好中球活性酸素発生系を代表例として、新たな機能を有する蛋白質とその作製方法を提供し、さらにそれによって実施される広範な細胞内シグナル伝達制御により、医薬やバイオセンサーなどへの利用し得る有用な技術を提供する。
【発明の効果】
【００４６】
本発明によれば、シグナル伝達系に関与する蛋白質のドメインを組み合わせた融合蛋白質を作成することで、生体のシグナル伝達を任意に制御することが可能となる。これらによって、シグナル伝達を制御した新たな疾患の治療法や新薬の開発、生体反応を調べる評価系の開発、生体機能をミミックしたセンサーの開発など、学術的価値のみならず産業上価値の高い技術の開発も可能となる。
【００４７】
特に本発明は、好中球活性酸素が関与する炎症性疾患等に対する新たな治療法や治療薬、細胞機能評価システム、バイオセンサー等の開発などの産業上有用な技術を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明でいうドメインは、シグナル伝達に関与するポリペプチド構造体であれば、特に限定されないが、好ましくは構成因子であるサブユニット間で相互作用する因子が選択される。ドメインの加工操作技術は、アミノ酸の置換技術であれば特に限定されない。
【００４９】
本発明で利用可能なリガンド結合ドメインとしては、上記のSHドメインやTRPドメインの他に、ドメインそれ自体が独立した機能性ポリペプチドとして存在し得るものであればよく、例えば、ＰHドメイン、ＰＤＺドメイン（いずれもAnthony J. Pawson編集、竹縄忠臣監訳『実験医学増刊  情報伝達におけるタンパク質モジュール』、1998年、羊土社発行）、ＰＢ１ドメイン（Yoshinagaら, EMBO J. ２２巻、4888−4897頁、2003年）などを挙げることができるが、これらには限定されない。
【００５０】
また、ドメインの加工操作後の、シグナル伝達による生理活性発現の評価系は、対象となるシグナル伝達系の機能表現を反映する系が選択され、たとえば、本発明の実施例である活性酸素発生を指標とすることのみならず、ロドプシン等のGPCR（G蛋白質共役型受容体）の場合ではイオンの流入が活性評価の指標とでき、成長因子受容体下流のシグナル伝達においては特定の蛋白質のリン酸化を指標とできる。
【００５１】
これら例示したドメインを構成するアミノ酸配列は公知であるので、一般的な遺伝子組換え手法を利用することにより、容易に本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子を調製することができる。当然、今後の蛋白質全般の研究の進展により、さらに多くの機能性ポリペプチドとして存在し得るリガンド結合ドメインが報告されることが想定されるが、この様なドメインも本発明に利用可能である。
【００５２】
本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子は、一般に用いられている遺伝子組換え手法を用いて、当業者が容易に調製することができる。すなわち、融合すべきリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を選択した後は、かかるアミノ酸配列をコードする核酸配列をDNAシンセサイザー等の機器を用いて調製してもよく、また既に単離されている各種遺伝子クローンからPCR等を用いて必要な部分配列をサブクロ−ニングし、これらを相互に連結させ、あるいは更にＶＰＰペプチド配列及び／又はＲＨＹ配列をコードする核酸配列を連結させてもよい。この様な実験的手法それ自体は、完全に当業者にとって周知の方法である。
【００５３】
また、この様な融合蛋白質をコードする遺伝子を発現するために使用する宿主、プロモーター、ベクターなども適宜利用可能であり、格別の制限はない。ただし、本発明の融合蛋白質あるいはその発現は、シグナル伝達を任意に調節するためのものであることから、かかる調節を必要とする細胞での発現が好ましいのは言うまでもない。
【００５４】
再び、本発明の融合蛋白質にかかる実施に形態について、ＴＶＳＲ蛋白質を例にして説明する。
【００５５】
表１にTVSR蛋白質遺伝子のPCR に用いたプライマー（TVSR蛋白質の遺伝子を得るために使用したオリゴヌクレオチド）を示す。この配列中に組み込まれる制限酵素認識部位は、Nde IとEco RI等のp67phox TPRドメインとp47phox タンデムSH3 ドメインを切断しないものであれば、どのような制限酵素を使ってもかまわない。PCR反応に使用するDNAポリメラーゼについても、KOD DNA polymerase（東洋紡）等、DNAポリメラーゼであれば特に限定されず、またPCRの条件も一般的な条件であれば足りる。
【００５６】
TVSR蛋白質の調製では、宿主細胞とベクター系は大腸菌BL21 (DE3)株とpET28a (Novagen)を用いたが、これら以外でも従来使用される組換え蛋白質の発現方法であれば、いずれも利用可能である。また、大腸菌以外でも、哺乳動物細胞、昆虫細胞、カイコを用いた発現系、あるいは小麦胚芽の無細胞系蛋白質発現も用いることができる。また目的とする融合蛋白質にヒスチジン残基からなるタグ（His-tag）を付し、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーを用いることで、目的とする蛋白質の精製が容易となるが、この様な操作も当業者に一般的な手法に従えばよく、特に限定はされない。
【００５７】
以下、本発明を、非限定的な実施例を示してさらに詳述する。
【実施例１】
【００５８】
＜ＴＶＳＲ蛋白質の調製＞
表１に示した核酸配列からなるプライマーAとBを用い、p67phox全長遺伝子を鋳型としてPCRを行った。
【００５９】
【表１】
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プライマーAには制限酵素Nde Iの認識配列、プライマーBにはVPPペプチドの遺伝子配列が含まれており、結果として5’末端にNde Iサイト、3’末端にVPPペプチドの遺伝子配列があるTPRドメインの遺伝子をPCR産物として得ることができる。
【００６０】
同時に、プライマーCとDを用いてp47phox全長遺伝子を鋳型としてPCRを行った。プライマーCにはVPPペプチドの遺伝子配列、プライマーDにはRHYペプチドの遺伝子配列、ストップコドン、および制限酵素Eco RIの認識配列が含まれており、結果として5’末端にVPPペプチドの遺伝子配列、3’末端にRHYペプチドの遺伝子配列、ストップコドン、Eco RIの認識配列を持つ、SH3タンデムドメインの遺伝子をPCR産物として得ることができる。
【００６１】
この２つのPCR産物を混ぜ、98℃15秒間熱変性し、74℃まで温度を下げ、DNA ポリメラーゼで伸長反応を行った。この反応産物をさらに鋳型としたPCR反応を、プライマーAとDを用いて行った。このようにして得られた5’-TPR-VPP-SH3タンデム-RHY-3’遺伝子は、Nde I-Eco RIサイトで開環させた蛋白質発現用ベクターpET28a (Novagen)にクローニングした。
【００６２】
このプラスミドで大腸菌BL21 (DE3)を形質転換し、LB培地で培養し、波長600nmにおける吸光度が０．５のときに、1 mM IPTGを添加して25℃で蛋白質発現を誘導した。遠心機で集菌し、細胞を超音波破砕し、再度遠心して溶菌液を回収した。そのあとNi-NTAカラム（QIAGEN）を用いてヘキサ−ヒスチジンタグ（hexa-histidine tag、His-tag）によるアフィニティー精製を行い、溶出液をSuperdex 75カラム（Amersham Bioscience）でゲルろ過精製し、これを最終精製物とした。この操作により、LB培地1Lあたり、およそ100mg のTVSR蛋白質を得た。
【００６３】
＜Ｒａｃ２及びＧｒｂ２の調製＞
Ｒａｃ２活性型ドメイン（dominant active）体Q61Lを、His-tag融合蛋白質としてTVSR蛋白質と同様に宿主大腸菌を用いて発現、精製を行った。
【００６４】
また、Ｇｒｂ２の全長遺伝子をpGEX-6P（Amersham Bioscience）にクローニングし、これにより形質転換した大腸菌BL21 (DE3)を宿主とすることで、Ｇｒｂ２をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として発現させ、細胞を超音波破砕した溶菌液からGlutathione Sepharose 4B (Amersham Biscience)を用いて精製した。GSTをPreScission protease (Amersham Bioscience)で切断し、Glutathione Sepharose 4Bでリカラムし、素通り画分を回収した後、さらにSuperdex 75で精製した。
【００６５】
＜ブタ由来チトクロームb558（cyt b558）の調製＞
ブタ末梢血液から、ポリビニルピロリドン沈殿法およびFicoll-Paque遠心法によって好中球を得た。好中球はリン酸緩衝液(PBS)に懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤1 mM フェニルスルホニルメチルフルオライド(PMSF)、1 mM EGTA、1 mM MgCl2、1 mM NaN3を加えて超音波破砕を行った。破砕後は遠心で未破壊細胞などを除き、その後100、000×gの遠心で、上清の細胞質と、ペレットの膜蛋白質に分離した。cyt b558を含む膜蛋白質は界面活性剤ヘプチルD-チオグルコシド(HTG)で可溶化し、イオン交換クロマトグラフィーにてイオン性で膜に結合している夾雑物を除き、精製cyt b558を得た。
【００６６】
＜細胞フリー系アッセイによるＴＶＳＲ蛋白質のアッセイ＞
得られたcyt b558とTVSR蛋白質、およびRac2で再構成したNADPH オキシダーゼの活性評価は、SOD-inhibitable cytochrome c reduction methodによって行った（Fujii, H., and Kakinuma, K.(1991) Biochim. Biophys. Acta 1095, 201-209）。
【００６７】
1 pmolの精製cyt b558と500 pmolのTVSR蛋白質、800 pmolのRac2、10 pmolのFADをキュベット中で混合した。1分間20 pmolのGTP-γ-Sで処理した後、12.5 nmolの飽和脂肪酸ミリステートで5分間活性化した。活性化後、チトクロームｃを50 pmol、反応溶液が800 μLになるようにリン酸緩衝液（50 mM phosphate、pH 7.4、1 mM EGTA、1 mM NaN3、1 mM MgCl2）を加えた。
【００６８】
150 μMのNADPHを添加して反応を開始させると、O2−が発生し、それがチトクロームｃを還元することで波長550 nmにおける吸光度が増大するので、それを測定することで再構成したNADPH オキシダーゼの活性を評価した。この測定において本当にチトクロームｃを還元しているのがO2−なのかは、最後にスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を加えて吸光度の増加が止まるかどうかで判断できる。
【００６９】
その結果、このTVSR蛋白質は、基本的にはp67phoxとp47phoxの、NADPH オキシダーゼ活性に最低限必要な部分だけを抽出して融合させた蛋白質であるが、これとRac2、cyt b558で再構成したNADPH オキシダーゼは、インビトロで非常に高い活性を示した（図４）。天然の細胞質因子を用いると、30 (mol/sec/mol of heme)前後が限界であるのに対し、倍以上の活性を持っている。
【００７０】
＜Ｇｒｂ２による再構成NADPH オキシダーゼの活性阻害＞
３）において再構成した500 pmolのTVSR蛋白質を有するNADPH オキシダーゼに、1-20等量のＧｒｂ２を加え、室温で10分間インキュベーションし、Ｇｒｂ２によってNADPH オキシダーゼ活性の阻害効果を確認した。
【００７１】
Ｇｒｂ２を加えないときの反応速度をv0、Ｇｒｂ２を加えたときの反応速度をviとしたとき、[Grb2]/[TVSR蛋白質]に対するvi / v0をプロットしたものである。その結果、図５（●印）のとおり、Ｇｒｂ２を加えることにより、NADPH オキシダーゼ活性は顕著に阻害された。20倍量を加えたときでは、8割以上の活性を阻害した。一方、TVSR蛋白質のＧｒｂ２に結合するVPPペプチドとRHYペプチドをアラニンに置き換えたアラニン変異体を用いて同様にNADPH オキシダーゼを再構成してＧｒｂ２を加えたが、多量のＧｒｂ２を加えても活性は減少しなかった。従って、TVSR蛋白質にＧｒｂ２が結合することによって、再構成したNADPH オキシダーゼの活性が阻害されたことが実証された。
【００７２】
＜VPPRHYペプチドによる活性回復＞
VPPペプチド配列とRHYペプチドとをアミノ酸配列がGSGTGからなるリンカーを介して連結させたVPPRHYペプチド（アミノ酸：VPPPVPPRRRGSGTGRHYRPLPPLP）を、ペプチドシンセザイザーを用いて合成した。
【００７３】
上記４）においてＧｒｂ２の添加によりNADPH オキシダーゼを阻害した後、Ｇｒｂ２の100倍量のVPPRHYペプチドを加えたところ、NADPHオキシダーゼ活性が再検出された。この結果を図６に示す。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】食細胞NADPH オキシダーゼ の活性化機構を模式的に表す。
【図２】p47phox の活性化機構を模式的に表す。
【図３】TVSR 蛋白質のドメイン配置と、Ｇｒｂ２ によるNADPH オキシダーゼ 活性阻害の分子モデルを示す。
【図４】再構成したNADPH オキシダーゼ のTVSR 蛋白質濃度依存的な活性発現を示す。
【図５】Ｇｒｂ２ による再構成したNADPH オキシダーゼ 活性の阻害結果を示す。
【図６】阻害されたNADPH オキシダーゼ 活性のVPP VPP-RHY peptide による回復の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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