(57)【要約】      （修正有）【課題】  アルファ-1-酸糖タンパク質（オロソムコイド）の精製およびその利用。【解決手段】  ヒュームドシリカなどの微粉非毒性樹脂に接触させて、アルファ-1-酸糖タンパク質（オロソムコイド）の調製物から発熱物質である内毒素リポ多糖（ＬＰＳ）を除去する方法に関する。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーなどによる脱発熱物質工程を含むアルファ-1-酸糖タンパク質の精製方法と、脱発熱物質された製品およびその医療用途に関する。【選択図】  図１
2005336193.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.1 Eu/mg AAG以下のLPS濃度を有する、実質的にLPSを含まないAAG。
【請求項２】
0.075 Eu/mg AAG未満のLPSレベルを有する請求項１に記載のAAG。
【請求項３】
0.050 Eu/mg AAG未満のLPSレベルを有する請求項１または２に記載のAAG。
【請求項４】
ウィルスを不活性化した、あるいはウィルスを除去した、請求項１〜３のいずれか１項に記載のAAGの調製物。
【請求項５】
治療に用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のAAG。
【請求項６】
薬剤毒性の処置に用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のAAG。
【請求項７】
薬剤毒性の処置に用いられる薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載のAAGの使用。
【請求項８】
１種以上の薬理学上許容される担体または賦形剤とともに請求項１〜３のいずれか１項に記載のAAGを含む薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファ-1-酸糖タンパク質（alpha-1-acid glycoprotein）の改善された精製方法、および高度に精製されたアルファ-1-酸糖タンパク質の治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルファ-1-酸糖タンパク質(AAG)は、分子量約41kDの血漿糖タンパク質である。AAGは
急性期タンパク質であり、健康な人の血漿において0.5〜１g/lの間の濃度で存在し、疾病状態、特に炎症性疾患で増加して約2g/lのレベルまで上昇する。AAGの生理的役割は充分
に知られていない。急性期タンパク質として、AAGの血清レベルは感染、外傷、やけど等
の数々のストレスおよび外傷に反応して増加する。AAGは広範囲の細胞に作用することが
知られており、AAGが免疫反応において役割を果たし得ることが示唆されている。加えて
、AAGが様々な薬剤、特に塩基性および親油性薬剤に結合することが示された。後者の観
点に基づくAAGの治療用途は文献に示唆されているが、医療に関する限り、実質的な開発
はなされていない。
【発明の開示】
【０００３】
我々は、これの一つの理由が、いわゆる高度精製製品においてでさえ残存する比較的高レベルの汚染物質にあると考える。バクテリア細胞壁から誘導された内毒素リポ多糖(LPS)（発熱物質としても知られている）は、このような汚染物質の一つである。
【０００４】
LPSは、特に入院患者及び免疫傷害（immuno-compromised）患者における、グラム陰性
バクテリア感染に続く罹患状態の主な原因である敗血性ショックの原因物質である。AAG
調製品中のLPSの存在は、この薬剤をヒトの治療に適さなくする。
【０００５】
現在適用できるAAG精製方法は、労力および時間を要し、多くの個別の行程を含んでい
る。さらに、これらの方法は、大規模な製造プロセスには不適である。このような技術の一つが、HaoおよびWickerhauser (Biochem. Biophys. Acta. 322, 99-108 (1973))によって説明されている。これは、DEAE  SephadexへのコーンフラクションV上澄み液(Cohn Fraction V  supernatant)の吸着および溶出、濃縮、透析、カルボキシメチルセルロースへ
の吸着および溶出、透析、および最後の凍結乾燥を含んでいる。両透析工程は、おのおの48時間を要し、プロセス全体は１週間かかる。さらに、HaoおよびWickerhauserの示唆に
も係わらず、これに反して、この技術は、商業的製造者により取り扱われる量の出発原料処理のために、スケールアップすることが困難である（典型的には、コーンフラクションV上澄み液１バッチに付き、１週間で10,000ｌまでの数バッチ）。より重要なことは、こ
のプロセスでは、汚染物質LPSの限度レベルを医療用途で許容されるレベルに減少させる
ことができなかった。
【０００６】
他の従来のAAG精製方法では、AAG調製品からLPSを、医療用途で許容されるレベルまで
減少させることができなかった。このような方法の一つは、AAG調製品のデトキシゲル(Detoxigel)樹脂への吸着および溶出を含んでいる(Boutten et al., Eur. J. Immunol. 22, 2687-2695 (1992))。この方法の目的は、追加LPSのサイトカイン生産における効果を試験するインビトロでの研究に使用するためのAAG調製品からLPSを確実に減少させるためのものである。しかしながら、このクロマトグラフィー媒体はヒトに投与するための製品の製造には適しておらず、いずれにせよ、LPSレベルは、単に200pg/mgタンパク質（約２EU/mg）に減少するだけであった(EU＝内毒素単位)。このレベルは、ヒトへの使用を意図する製品のためには、特に治療的に要求される（例えば薬剤毒の処置において要求される）AAG
投与量（例えば１投与量について10gから30g）において、未だ高すぎる。
【０００７】
我々は、AAG含有製品からLPSを除去する新規な方法を開発した。
従って、最も広い観点において、本発明は、上記製品を微粉非毒性樹脂に接触させることを含む、AAG含有製品からLPSを除去する方法を提供する。
【０００８】
このようにして、AAG含有製品からLPSを、これら製品の治療的使用に適合するレベルに減少させることができる。
好ましい樹脂は、非置換樹脂である。
【０００９】
好ましくは、上記樹脂は、粒状樹脂、特に無機粒状樹脂およびさらに好ましくは親水性樹脂である。多孔性表面を有する樹脂、例えばシリカ基材樹脂など、例えばヒュームドシリカなどが特に好ましい。本発明の方法で用いることができるこのようなヒュームドシリカの一つは、市販ヒュームドシリカ製品AerosilTM (Degussa AG, Frankfurt)であり、こ
れは粒子表面にシロキサン基およびシラノール基を有している。
【００１０】
以前では、AerosilTMおよび類似の樹脂は両者共、例えば錠剤および軟膏の処方におい
て、および血漿または血漿誘導製品からの脂質、脂質様物質およびリポタンパク質の除去において、成分として薬剤工業で使用されてきた。我々は、AAGからの脱発熱物質剤とし
てのAerosilまたは他の微粉粒状樹脂の使用が以前から示唆されていたという認識がない
。Aerosilの非毒性は、治療用途に適さない材料を用いた分離技術に依存する従来のAAG精製方法よりも、明らかな利益を与える。
【００１１】
本発明の方法で用いるためには、粒子は高い対重量表面比、例えば1 m2/gから1000 m2/g、好ましくは50 m2/gから700 m2/g、さらに好ましくは330 m2/gから430 m2/g、例えば380 m2/gの対重量表面比を有していてもよい。
【００１２】
また、我々は、我々の新規脱発熱物質工程を含み、治療用途に適した脱発熱物質製品を製造する新規で簡単な精製方法を開発した。従って、この新規精製方法は、従来のAAG精
製方法に伴う上述の不利益を克服する。
【００１３】
他の観点から、本発明は、AAG含有製品を陰イオン交換マトリックスと接触させ、該マ
トリックスからAAGリッチフラクションを溶出させ、かつ微粉非毒性樹脂に接触させ次い
でLPS減少AAGフラクションを溶出させてAAGリッチフラクションから発熱物質を除去する
ことを含むAAGの精製方法を提供する。
【００１４】
このような技術を用いて、0.016 EU/mgの少ないAAGタンパク質を含むAAG調製品を得る
ことができる。
様々なAAG含有出発材料、例えば血漿、凍結上澄み液、および血漿フラクション例えば
フラクションV上澄み液、フラクションIV上澄み液などを用いることができる。組み換えAAG調製品の場合、この技術は細胞カルチャー、細胞カルチャー上澄み液およびそのフラクションに用いることもできる。経済的な理由から、フラクションV上澄み液は、このフラ
クションがアルブミンの精製における廃棄生成物でありかつAAGリッチであり、与えられ
た血漿を最大限に利用することを可能とするため、好ましい出発原料である。フラクションV上澄み液は、典型的には、40%のエタノールと、10 mMのクエン酸塩と、50 mMの酢酸pH4.8を含む。またこの液は、低タンパク質含量(<2 g/l)を有し、80%UV吸収材料(OD280)は
、<10,000ドルトンの分子量を有している。AAGは比較的低分子量であり、非常に可溶性であるため、低温エタノール分画工程の間沈殿せず、したがってほとんど（〜60から80%）
がフラクションV上澄み液の溶液中に見いだされる。コーンフラクションV上澄み液中のAAG濃度は、典型的には、0.2から0.35 g/lの範囲である。
【００１５】
いかなる従来の陰イオン交換体も使用可能である。ただし、勿論AAG結合能力を有して
いる。その例としては、寒天、例えばAAGに結合する能力を有する基、例えば、ジエチル
アミノエチル(DEAE)、ジエチル-(2-ヒドロキシプロピル)-アミノエチル(QAE)および第４
アンモニウムなどの正に荷電された基を有する、Sepharoseなどの寒天を例示できる。高
性能の樹脂が好ましく、特に高粒子サイズ(100から300 μm)の樹脂が好ましい。大きなビーズの増加した定植安定性(bed stability)は、フラクションV上澄み等の粘凋な材料の処理において有利であり、本方法をカラムクロマトグラフィーで行う場合に最低限の背圧を許容し、さらにAAG-含有フラクションは、迅速に除去され、AAG回収を最大とし、工程時
間を減少させる。好ましい材料としては、Q-Sepharose  Big Bead、Q Hyper D およびToyopearl Super Qを例示できる。全て、AAGについて高い性能を有している。
【００１６】
AAG含有出発材料は、便利には、30から45%、好ましくは35から45%、より好ましくは約40%の濃度のエタノール性溶液の存在下、調整の必要はないがpH約4.5から5.5で、2oから30℃、好ましくは5oから15℃、より好ましくは約10℃の範囲の温度にて、陰イオン交換体と接触させることができる。
【００１７】
陰イオン交換体マトリックスは、バッチ形態またはカラム形態のいずれで供給されてもよく、後者が迅速性及び利便性の両方から好ましい。
一般的に、マトリックスは、マトリックスに対するAAG含有材料の比で、1000：１から5:1、便利には約200:1（体積）にて用いられる。
【００１８】
本方法のカラムでの操作において、陰イオン交換体媒体は、通常カラムに装填され、次いで4.0から5.5、好ましくは4.0から4.8の範囲、より好ましくは約4.1のpHの、比較的低
イオン強度の緩衝液で平衡化される。有用な緩衝液は、酢酸緩衝液、例えば0.02 Mから0.2 M、好ましくは0.1 Mから0.13 M、さらに好ましくは約0.13 Mの濃度の酢酸ナトリウムである。
【００１９】
AAG含有材料をカラムに導入した後、非結合タンパク質は、低イオン強度緩衝液、例え
ばカラムの予備平衡化に用いた緩衝液で洗浄することにより除去することができる。
AAGは、様々な方法で溶出することができる。このような方法の一つは、平衡化緩衝液
を基準としてイオン強度が増加した緩衝液を用いる方法である。一般的には、電解質は塩化ナトリウムであるが、他の塩、例えば酢酸ナトリウムを用いることもできる。AAGは、
線形塩勾配または段階的増加のいずれの塩濃度（0から飽和 (>3M) 塩化ナトリウム、好ましくは0から1.0 M、より好ましくは0から0.2 Mの勾配）によって溶出してもよい。AAG溶
出のために有用な緩衝液は0.13 M酢酸ナトリウム0.2 M塩化ナトリウムpH4.1である。
【００２０】
他の方法において、AAGは、例えばpH2.0から3.0の適当な緩衝液、例えば0.1 M燐酸ナトリウムを加えることにより、緩衝液のpHをpH4.1未満に減少させることにより溶出させる
ことができる。
【００２１】
AAGリッチ製品は、次いで、本発明に係り、かつ以下に説明される脱発熱物質に先だち
、水酸化ナトリウムを用いて中和される。
上述したような微粉粒子を用いた脱発熱物質は、便利には、従来法、例えば少なくとも1時間0.5 M NaOHなどのアルカリ中に浸漬するか、または1時間を越えて200℃より高い温
度で加熱することで脱発熱物質された装置を用いた、バッチプロセスとして行うことができる。
【００２２】
一般的に、部分的に精製されたAAG調製品は、接触時間15分以上から一夜、例えば数時
間例えば２時間、一般的には約1時間の間、4oから70℃、好ましくは4oから37℃、特に好
ましくは約20℃の温度で粒子と接触させられる。
【００２３】
粒子は、AAGタンパク質に対する粒子の重量:重量比、50:1から0.2:1（重量）、好まし
くは5:1から0.1:1、より好ましくは2:1から1:1、特に好ましくは1:1で、濃度0.1 g/lから250 g/l、好ましくは2から50 g/l、特に好ましくは約3 g/lの濃度の溶液中のAAGと接触させることができる。
【００２４】
AAG調製品は、治療用途のために、限外濾過や凍結乾燥などの従来法を用いて濃縮する
ことができる。限外濾過(UF)は、便利には、10 kD UFカセット（即ち、10,000ドルトン分子量カットオフを有するフィルタ）を用い、接線流(tangential flow)を適用して10から250 g/lの範囲の濃度、便利には100 g/lに到達させて行うことができる。
【００２５】
脱発熱物質は、この濃縮工程の前後のいずれで行ってもよいが、我々は、濃縮工程後の脱発熱物質が、脱発熱物質でのAAGロスを減少させ、収量を改善させることから好ましい
ことを見いだした。
【００２６】
さらに精製AAGを治療用途に適した形態に加工するために、製品を、ヒトへの投与に適
した適当な緩衝液、例えばpH7.5の燐酸緩衝生理食塩水に透析濾過(diafilter)することができる。
【００２７】
AAG調製品は、一連のウィルス不活性化工程に付してもよく、これは現在、血液および
血漿誘導製品について、多くの国で必須の要請である。我々は、本発明の方法に従って精製されたAAGが、延長された高温での加熱に適していることを発見した。したがって、好
ましいウィルス不活性化工程は、58℃から70℃の低温殺菌温度にて、少なくとも２時間、好ましくは10時間、任意に、承認された安定剤、例えば塩、アミノ酸または糖、例示すると塩化ナトリウム、グリシンまたはシュークロースなどの存在下（安定剤はこのようなAAG調製品のために必ずしも要求されない）で溶液中の精製AAGを加熱することを含む。
【００２８】
主要なタンパク質と比較して、AAGは比較的小さな分子であり、従って本発明に係るAAG調製品からウィルスを除去する他の方法は、孔サイズ<50 nm、好ましくは15 nmのフィル
タを介したウィルス濾過である。
【００２９】
特許医薬品欧州委員会(proprietary medicinal products European Commission)のための委員からの現在の勧告は、血漿から製造された静脈注射用製品のための二つの独立したウィルス不活性化／除去工程に付いてである。これらの方法は、両方とも、本発明に係るAAG調製品の処理に順次使用することができる。他の使用可能な方法は、例えば本発明に
係る凍結乾燥AAGのEdwards et al., Vox. Sang. 52, 53-59 (1987)に説明されるような溶媒界面活性処理、及びその熱処理である。
【００３０】
本発明の方法を用いることにより、フラクションV上澄み液からAAGを、平均収量80%か
つ酢酸セルロース電気泳動で測定した純度>98%で精製することができる。さらに、この方法を用いることにより初めて、この種の物質のための欧州薬局方動物発熱テストに合格する、実質的に脱発熱物質された0.1 Eu/mgタンパク質未満のLPS濃度を有するAAG調製品を
製造することが可能となる。
【００３１】
したがって、別の観点から、本発明は実質的にLPSを含まないAAGを提供し、このAAGは
、0.1 Eu/mg以下、好ましくは0.075 Eu/mg未満、より好ましくは0.050 Eu/mg未満、特に
好ましくは0.02 Eu/mg未満のLPS濃度を有している。このような実質的にLPSを除去された本発明のAAG調製品は、以下Apo-AAGと記載する。
【００３２】
更なる観点によれば、本発明はウィルス不活性化またはウィルス除去Apo-AAG調製品を
提供する。不活性化は、上記溶媒界面活性処理または低温殺菌を含み、除去方法は上記ウィルスフィルトレーションを含む。
【００３３】
より更なる観点によれば、本発明は、治療において使用するための本発明のApo-AAGを
提供する。
AAGは有用な薬剤結合特性を有することが知られており、我々の新規高度精製Apo-AAGは、薬剤過剰投与、例えば過剰投与が致死となる三環性抑制薬の場合などの診療マネージメントに特に有用である。  更なる観点から見て、本発明は処置に必要な場合に効果量のApo-AAGを患者に投与することを含む薬剤毒性の処置方法を提供する。
【００３４】
他の観点において、本発明は、薬剤毒性の処置に使用する薬の製造におけるApo-AAGの
使用を提供する。
この観点は、特に塩基性薬、例えばキニーネ、リグノカイン、プロプラノルオールおよび特に三環性抑制薬、例えばアミトリプチリン、デシプラミンおよびノルトリプチリンなどの過剰投与に伴う毒性効果の処置に有用である。
【００３５】
本発明に係る治療のためには、AAGは、例えばRemingtons Pharmaceutical Sciences ed
Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania USA (1990)に記載された薬理学上許容されるような賦形剤、担体または希釈剤とともに、薬剤の従来法にしたがって処方してもよい。防腐剤のような追加成分を用いてもよい。AAGは、例えば経直腸または非経口な
どのいずれかの便利な経路、例えば経直腸などの粘膜を介した供給、または静脈、筋肉または皮下注射による投与のための組成物に処方される。
【００３６】
更なる観点から、本発明は、AAGを、１種以上の薬理学上許容される担体または賦形剤
とともに含む薬剤組成物を提供する。これら組成物は、例えば、溶液、エマルジョン、膣座剤および座剤の形態を、他の安定化された提出形態、例えば凍結乾燥栓、発泡剤およびガラス瓶とともに採ることができる。この処方は、非経口（例えば腹膜組織内、皮下、筋肉内、皮内、静脈内）または粘膜（例えば、経口、経鼻、経膣、経直腸および経眼球経路）を含む従来方法の全てによる投与経路に、適切であるとして選択され得る。
【００３７】
実際の処置レジメまたは予防レジメ、および投与量は、かなりの程度まで個々の患者に依存し、医療従事者が個々の状況に基づいて組み立てることができる。投与は、10から30g AAGの範囲であり得る。
【実施例】
【００３８】
本発明を、以下の非限定的な実施例により、添付図を参照して説明する。
以下の実施例では、LPSは、陽性コントロールとしてAltas Bioscan E. Coli 内毒素を
有するLimulus Amoebocyteを用いた内毒素のためのゲルクロットアッセイによって測定した。
【００３９】
このアッセイは、購入試薬および注射用水(WFI)を用いて行った。一連の試験材料の希
釈物を、WFIにて希釈することにより二つ一組で調製した。サンプルは常にpH6.5から7.5
の範囲であったため、pH調節の必要はなかった。アッセイは、希釈テストサンプル；陽性コントロール（希釈内毒素基準、欧州薬局方Ph. Eur: V2.1.9による）および陰性コント
ロール(WFI)について、二つ一組で行った。
アッセイ方法
これは、欧州薬局方Ph. Eur: V2.1.9に準じた。0.1 mlの希釈サンプルまたはコントロ
ールを、0.1 mlの溶解液（予め実証されている）を含む発熱物質を含まないソーダガラス管に加え、緩やかに管を振盪して混合した。管を、水浴中、37℃で１時間インキュベートし、キャップを外した。
【００４０】
各の管を注意深く180o反転させることで、テストの判断をした。陽性テストは、管を180o反転させたときにゲルクロットがそのまま残った場合に記録した。二つ一組に付いての終点陽性(end point positive)は、各の２分の１（one two-hold）希釈の範囲内であるべきである。終点陽性が同一でなかった場合、終点陽性における内毒素レベルをかけ合わせ、２乗根をもとめて計算した。結果は、Eu/mgで表され、AAG溶液のタンパク質濃度を用いてEu/mg AAGに変換した。
【００４１】
陽性コントロール(0.06 Eu/ml)および陰性コントロール(希釈液としてのWFI)を、サン
プルの全てのランとともにテストした。陽性コントロールにおいてクロットが形成されなかった場合、溶解液の品質を新しい溶解液を用いてチェックした。これが、陰性的結果の犯人として貧溶解液を強調しなかった場合、実証方法によって、新しい陽性コントロールを製造してテストした。
【００４２】
クロットが形成される最低希釈でのテストサンプルは、0.06 Eu/mlと等価であり、結果は0.06 X 希釈ファクターとなる。サンプルは、以下のシリーズに従って希釈した：
ニート、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128および1/256。
【００４３】
実施例１Ａ
フラクションV上澄みからの工業グレードのアルファ-1-酸糖タンパク質(AAG)の精製
DEAE Sephadex A-50ゲル(Pharmacia)が乾燥粉体として供給された。675gの乾燥ゲルを100リットルの0.25M酢酸ナトリウム(NaAc)(pH未調節)中で一夜膨潤させた。膨潤後、ゲル
を、4アリコートの0.13M NaAc（pH4.1、導電率= 1.85 mS/cm）を用いて、バッチで平衡化させた。ゲルを、各アリコートの後に、水抜きした。全体で250リットルの平衡緩衝液を
用いた。KistlerおよびNitschmann 血漿分画(Vox Sang. 7, 414-424, 1962)で得られた約450リットルのフラクションV上澄み液を平衡化したゲルに加え、90分間混合した。非結合タンパク質溶液をゲルから抜き出した。ゲルを、4アリコートの0.13M NaAc（pH4.1、導電率= 1.85 mS/cm）を用いて洗浄した。得られた洗浄ゲルのケーキを、35リットルの0.13M NaAc、 1M 塩化ナトリウム(NaCl)（pH4.1）を用いてバッチで溶出させた。これによって
、41.8 Kgの溶出溶液が製造された。3リットルの1M水酸化ナトリウム(NaOH)を溶出液に加えてpH６.4とした。PHを調製した溶出液を限外濾過により1リットルに濃縮し、4リットルの10mM燐酸ナトリウム(pH7.0)に対して透析濾過した。最終タンパク質濃度約100g/lが得
られた。
【００４４】
実施例１Ｂ
フラクションV上澄みからの医療グレードα1酸糖タンパク質(AAG)の精製
カラム調製
Q Sepharose Bigビーズ(25.2 cm x 19 cm x 9.5リットル)を、30リットルの0.5M水酸化ナトリウム(NaCl)を用いて1時間脱発熱物質させた。ゲルを50リットルの0.13M 酢酸ナト
リウム(NaAc)pH4.1を用いて平衡化した。
フラクションV上澄み液調製物
これは、KistlerおよびNitschmann の方法(Vox Sang. 7, 414-424, 1962)の方法に従って調製した。
AAG調製物
１．１  750リットルのフラクションV上澄み液を<0℃にてデプスフィルターで濾過し、10℃に暖め、次いで毎分2リットルでゲルにかけた。ゲルにかけた後、カラムを0.13M NaAc pH4.1で洗浄し、非結合タンパク質を洗い流した。
１．２  AAGを50リットルの0.13M NaAc, 0.2M 塩化ナトリウム(NaCl) pH4.1を用い、毎分1リットルで溶出した。次にゲルを、50リットルの0.13M NaAc, 1M NaCl pH4.1、次いで20リットルの0.5M NaOHを用いて清浄とし、10 mMのNaOH中に貯蔵した。
１.３  滅菌濾過に先立ち、溶出AAGをNaOHで中和した。
１.４  精製段階で、27.4リットルの5.7g/l  AAG、全体で156gのAAGが収集された。
１.５  154gのAAGを154gのAerosil 380で処理して発熱物質を除去した。20℃で2時間混合した後、Aerosilをグラスファイバーフィルターを介する濾過で除去した。
１.６  脱発熱物質されたAAGを、10,000分子量カットオフの膜を用いた限外濾過により、120g/lに濃縮した。濃縮溶液を、4リットルの10mM燐酸ナトリウム、150mM NaCl pH7.5(PBS)に対して透析濾過した。
１.７  AAG濃縮物のウィルス不活性化を、孔サイズ15 nmのウィルスフィルターを用い
て行った。滅菌充填(sterile filling)の後、製品の不活性化を60℃10時間の低温殺菌で
行った。
１.８  全ての工程は、清浄な条件下で、製品と接触する表面はNaOHを用いて脱発熱物
質して行われた。
１.９  出発物質および製品を、Ciba Corningからの予め注入された1%寒天ゲルを用い
た寒天ゲル電気泳動によって分析した。5から10g/lのフラクションV上澄み液（生理食塩
水に対して透析濾過し塩およびエタノールを除去）および精製AAGを60 mM Barbitone 緩
衝液 pH 8.6中での電気泳動に付した。図１は、クマシーブルー染色ゲルを示す。
【００４５】
この方法を用いて、0.016 EU/mg AAGの濃度のAAG調製物が得られた。
【００４６】
実施例２
次工程である脱発熱物質のためにフラクションV上澄み液からAAGを調製するのに使用するための適切な陰イオン交換樹脂の選択
高濃度(40%)のエタノールは、フラクションV上澄みの加工を非常に困難なものとする。これは、その高い相対粘度（20℃で2.8）による。
最初のアプローチは、限外濾過によるエタノールの除去および濃縮であったが、大容量であることおよび低流速度であること（エタノールによる）が、工程時間を非常に長くしてしまうことがわかった。その代わりに、フラクションV上澄み液からの直接的なクロマ
トグラフィーによる捕獲が、完ぺきにpH調整またはエタノール濃縮をすることなく、選択された。殆どの陰イオン交換体がこれら条件下では非常に能力が低く、高い背圧では単に低い処理量しか得られず、かつ大容量の陰イオン交換体が要求される。したがって、工程実行可能性を改善するために、高流出速度で良好な能力(>10g  AAG/L gel)を有する陰イ
オン交換体を探した。
方法
広範な陰イオン交換樹脂が選択され、QおよびDEAE両方の誘導体が調査された。樹脂は
、製造者が推奨する流動速度でクロマトグラフィーカラムに充填された。0.13M NaAc pH4.1で平衡化した後、フラクションV上澄み液をカラムに過剰に充填したが；過剰背圧によ
り多くのゲルで流動速度を減少させなければならなかった。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗浄し；結合AAGを1M NaCl、0.13M NaAc pH4.1で溶出させた。樹脂の能力は、用いた樹脂の体積で溶出した全AAGを除して計算した。結果を表１に示した。
結果
【００４７】
【表１】
2005336193.tif 000003
【００４８】
結論
能力に基づき、  Q Hyper D、Q Sepharose Big Bead (QSBB)およびToyopearl Super Q
が用いた試験条件において、許容できるAAG能力を有していた。
【００４９】
実施例３
陰イオン交換樹脂からの溶出条件の最適化
QSBBの1 mlカラム(0.5 x 5cm)を、0.13M酢酸ナトリウムpH 4.1で平衡化した。実施例１Ａに従って調製し、次いで平衡化緩衝液で３倍とした精製AAG調製物を、過剰充填となる
ようにカラムに充填した。次いで、充填したタンパク質を平衡化緩衝液で洗浄して、UVモニターした流出物をベースライン記録のために戻した。連続的線形塩勾配を、15カラム体積に亘って、0から1M NaClまでカラムに供給した。溶出を、限定した濃度まで、さらに5
カラム体積まで続けた。溶出液は、280nmでのUV吸収でモニターした。
結果
調製物の溶出は、0.17M NaClの濃度で始まった。タンパク質溶出ピークは、  0.26M NaClと一致した。
結論
QSBBに精製AAG調製物を充填した場合、0.17 M 以上のNaClを含む適切な緩衝液が、カラムからの結合タンパク質の溶出を開始するために必要であることが示された。
【００５０】
実施例４
溶出条件の最適化（続き）
QSBBの1 mlカラムを、0.13M酢酸ナトリウムpH 4.1で平衡化した。5体積のフラクションV上澄み液（方法の出発材料）をカラムに供給した。フラクションV上澄み液充填物を平衡化緩衝液で洗浄して、UVモニターした流出物をベースライン記録のために戻した。連続的線形塩勾配を、15カラム体積に亘ってカラムに供給した。塩勾配は0から0.5M NaClまで供給した。次いで、勾配を1M NaClに上げ、5カラム体積の間維持した。溶出液は、280nmで
のUV吸収でモニターした。
結果
調製物の溶出は、0.13M NaClの濃度で始まった。タンパク質溶出ピークは、  0.15M Na
Clと一致した。
結論
QSBBにフラクションV上澄み液を充填した場合、0.13 M 以上のNaClを含む適切な緩衝液が、カラムからの結合タンパク質の溶出を開始するために必要であることが示された。
【００５１】
実施例５Ａ〜Ｂ
溶出条件の確認
段階的勾配溶出が、商品化スケールクロマトグラフィーの好ましい方法である。実施例３および４は、線形勾配を用いた場合、カラムからのAAGの溶出を開始するためには、0.13M NaClの最低塩濃度が必要であることを示した。段階的勾配では、適切な体積での溶出
を達成するために、かなり高いNaClレベルがしばしば要求される。この実験の目的は0.2Mおよび0.3M NaClの溶出特性を評価し、許容できるAAG回収に要求される最低NaCl濃度を決定することにある。
【００５２】
QSBBの1 mlカラムを平衡化し、フラクションV上澄み液を充填し、実施例４と同様にし
て洗浄した。段階勾配塩溶出をカラムに適用した。第一段階の溶出の後、カラムを1M NaClで溶出させて、結合成分が溶離しないかどうかを観察した。
【００５３】
実施例５Ａ
上述したように、カラムを平衡化し、充填し0.3M NaClの段階的勾配を7ベッド体積の間供給し、次いで1M NaClを5ベッド体積供給した。
結果５Ａ
全ての検出可能なタンパク質が、0.3M NaClで溶出した。1M NaClでは、溶出ピークは見られなかった。
実施例５Ｂ
上述したように、カラムを平衡化し、充填し0.2M NaClの段階的勾配を7ベッド体積の間供給し、次いで1M NaClを5ベッド体積供給した。
結果５Ｂ
全結合タンパク質の内、96%が、0.2M NaClで溶出した。1M NaClで、残りの結合物質の
溶出が観察された；図２はそのクロマトグラフィープロフィールを示す。
結論５Ａ〜Ｂ
これらの結果は、適切な緩衝液の0.2M〜0.3M NaClの塩濃度が、結合タンパク質の許容
できる溶出を提供するために必要であることを示す。
【００５４】
実施例６〜７
内毒素レベルにおけるAerosil処理の効果の証明
材料
実施例１Ａで既に説明したように、フラクションV上澄み液からAAGを製造した。
実施例６
50 g/lのAAG溶液を調製した。これをAerosil処理せずにコントロール参照サンプルを製造した。
実施例７
50 g/lのAAG溶液を5% w/v Aerosil 380で処理し、37℃で２時間攪拌した。
【００５５】
実施例６および７の製造物をLAL分析に付した。結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
2005336193.tif 000004
【００５７】
結論：実施例６〜７
50 g/lでのAAG溶液の内毒素活性は、37℃、２時間のAerosil 380処理で劇的に減少した。
【００５８】
実施例８〜１４
Aerosil処理濃度の最適化
実施例８
50 g/lのAAG溶液を実施例１Ａで説明したように調製した。これをAerosil処理せずにコントロール参照サンプルを製造した。
実施例９
50 g/lのAAG溶液を0.1% w/vのAerosil 380で処理し、37℃で2時間攪拌した。
実施例１０
50 g/lのAAG溶液を0.3% w/vのAerosil 380で処理し、37℃で2時間攪拌した。
実施例１１
50 g/lのAAG溶液を0.5% w/vのAerosil 380で処理し、37℃で2時間攪拌した。
実施例１２
50 g/lのAAG溶液を1% w/vのAerosil 380で処理し、37℃で2時間攪拌した。
実施例１３
50 g/lのAAG溶液を3% w/vのAerosil 380で処理し、37℃で2時間攪拌した。
実施例１４
50 g/lのAAG溶液を5% w/vのAerosil 380で処理し、37℃で2時間攪拌した。
【００５９】
実施例８から１４の調製物を、LAL分析に付した。結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
2005336193.tif 000005
【００６１】
結論：実施例８〜１４
50 g/lAAG溶液を処理した場合、内毒素活性の除去は、Aerosil 380濃度とともに、最適Aerosil濃度3〜5% w/vで増加した。したがって、最適内毒素除去は、0.6から1 g Aerosil/g AAGで起こる。
【００６２】
実施例１５〜１７
最終製品の脱発熱物質における高および低AAG濃度でのAerosil 380処理結果
実施例１Ｂの１．３段階までで説明されるように製造したAAGの１バッチを、３つのア
リコートに加工したが：加工前にAAG濃度は約4g/lであった。
実施例１５
AAGの第一アリコートを、約4 g/lから約20 g/lに、10,000分子量カットオフ膜を用いた限外濾過によって濃縮した。このアリコートを、Aerosil処理せずにコントロールサンプ
ルを製造した。
実施例１６
AAGの第二アリコートを、37℃で2時間、1g:1gの比にてAerosil 380処理した。Aerosil 380を濾過で除去した。AAG溶液を実施例１５のように限外濾過によって20 g/lに濃縮した。
実施例１７
AAGの第一アリコートを、実施例１５のように約4 g/lから約20 g/lに、限外濾過によって濃縮した。このタンパク質濃縮物を、37℃で2時間、1g:1gの比にてAerosil 380処理し
た。Aerosil 380を濾過で除去した。
【００６３】
実施例１５、１６および１７の調製物を、LAL分析に付した。結果を表４に示す。
【００６４】
【表４】
2005336193.tif 000006
【００６５】
結論：実施例１５〜１７
表４に示される結果は、処理が希釈または濃縮タンパク質段階のいずれで行われたときも、同等の内毒素除去があったことを示す。
【００６６】
Aerosil 380は、高体積／重量比を有し、比較的大体積の水溶液を吸蔵することができ
る。1g:1g比でのAerosilを用いた希釈タンパク質の処理は、Aerosilの割合w/vを減少させた。この理由から、製造物のロスが非常に減少する。したがって、Aerosil 380処理は、
希釈タンパク質段階で行うことが望ましい。
【００６７】
実施例１８〜２２
処理時間の最適化
実施例１Ａで説明されたように製造された50 g/lのAAG溶液を、1g:1g比にてAerosil 380を用いて処理し、37℃で混合した。サンプルを時間間隔で取り出し、 Aerosilを遠心し
て除去した。上澄み液を、内毒素の存在について、LAL分析によってアッセイした。結果
を表５に示した。
【００６８】
【表５】
2005336193.tif 000007
【００６９】
結論：実施例１８〜２２
実施例６は実施例１８〜２２のコントロールを提供する。全ての場合（実施例１８〜２２）、内毒素活性は減少した。処理時間に係わらず、内毒素除去の程度が同一のオーダーであることは、有意である。表５に示された処理時間はAerosil 380を除去するための時
間を含んでいない。0分間の処理時間は20分間までの効果的Aerosil接触時間を有している。しかしながら、内毒素の最適除去はこの時間内に起こっている。
【００７０】
実施例２３〜２５
処理温度の最適化
実施例１Ｂで説明されるように製造されたAAGの１バッチを、３つのアリコートに加工
した。
実施例２３
約4.5 g/lのAAG溶液の第一のアリコートを限外濾過によって100g/Lまで濃縮した。これをAerosil 380処理せずにコントロールサンプルを製造した。
実施例２４
約4.5 g/lのAAG溶液の第二のアリコートを1g:1g比で室温（RT）にてAerosil 380処理し、37℃で2時間攪拌した。Aerosil 380 を濾過して除去し、限外濾過により100g/Lに濃縮
した。
実施例２５
第三のアリコートを、実施例２４のように、ただしAerosil 380処理温度を37℃にして
加工した。
【００７１】
実施例２３〜２５の調製物を、内毒素に付いてLAL分析した。結果を表６に示す。
【００７２】
【表６】
2005336193.tif 000008
【００７３】
結論：実施例２３〜２５
両方の温度でのAerosil 380処理は、コントロールと比較して、最終製品における内毒
素活性を有意に減少させた。内毒素除去において、両処理温度間に有意な差はないようである。
【００７４】
実施例２６
AAG構造における延長加熱の効果
PBS pH 7.5中のAAGを、50 g/lに希釈し、次いで3 x 1.5mlのアリコートとし；各を水浴中で18時間、60、65または70℃でインキュベートした。調製物を、0.1M 塩化ナトリウム50 mMトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、0.05%アジ化ナトリウムpH 7.5で0.5 ml/分にて平衡化したFPLC Superose 12カラム(Pharmacia High Resolution 10 x 300 mm)を用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィーで分析した。結果を表７に示
す。
結果
【００７５】
【表７】
2005336193.tif 000009
【００７６】
結論
如何なる安定剤も含まないPBS pH7.5中のAAGは高温での延長された加熱に対して安定である。これらの結果は、低温殺菌がこの調製物に対して実行可能なウィルス不活性化法であることを示し、さらなる実験が、低温殺菌された調製物が、完全に分子の無欠性を維持していることを示した。
【００７７】
実施例２７
AAGの低温殺菌における安定剤の効果
方法
PBS pH 7.5中のAAGを、他の血漿タンパク質を安定化することが知られている様々な化
合物と混合した。最終タンパク質濃度を50 g/l AAGに調節した。全てのサンプルは、コントロールを除いて、水浴中にて、62℃で18時間加熱した。冷却に際して、サンプルを、FPLC Superose 12 カラムを用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィーで分析した。
結果を表８に示した。
【００７８】
【表８】
2005336193.tif 000010
【００７９】
結論（比較）
0.15Mを越えて増加するNaClレベルは、不安定化効果を有しているようであり、NaClが
増加するにつれて、加熱に際してより多い二量体が形成される。30から160mMのグリシン
は、効果がないようである。5〜35%のシュークロースは、AAGに対して僅かに安定化効果
を有する。
【００８０】
実施例２８〜３１（比較）
AAGを脱発熱物質する他の方法の評価
実施例２８
木炭を用いた内毒素除去
Chen, R.F.(Journal of Biological Chemistry, 242(2) pp 173-181, 1967)は、活性木炭を用いたアルブミンからの脂肪酸の除去方法を開示した。LPSがリピドＡ部分を有する
ことが知られていることに基づき、木炭を用いてAAGからのLPS除去が達成できるかもしれないと推測された。
方法
Ａ）  370 mgのNorit GSX 活性木炭を実施例１Ａで説明されるように74 g/lで製造したAAG溶液10 mlに加えた。混合物を、0.2M HClを加えてpH 7.3からpH 4.0に調節した。混合物を、氷浴中で1時間攪拌した。木炭のバルクを、2000gで15分間遠心して除去した。上澄みをデカンテーションし、一連の0.8 μmおよび0.2 μm膜フィルターを介して除去した。溶液を、0.2M NaOHで最終pH 7.1に調節した。サンプルをLAL分析に付した。
【００８１】
Ｂ）  木炭を用いた内毒素除去の同様の提言に従い、木炭含浸フィルターを評価した。
木炭含浸47 mmフィルター（グレードR53 SLP）は、Cuno Process Filtrationから供給
された。このフィルターを50 mlの発熱物質を含まない水（PFW）でフラッシした。水フラッシのサンプルを採取した。実施例１Ａで説明されるように74 g/lで製造された30 mlのAAG溶液を、緩やかにフィルターに通し、接触時間を最大となるようにした。5 x 5 mlの濾過サンプルを収集した。5個の濾過サンプルを、未濾過コントロールおよびフィルター水
フラッシとともに、LAL分析に付した。
結果
実施例２８で製造されたサンプルのLAL分析結果を表９に示した。
【００８２】
【表９】
2005336193.tif 000011
【００８３】
結論２８
LALの結果は、両木炭処理方法のいずれによっても、内毒素における有意な減少はない
ことを示す。
実施例２９
水性タンパク質溶液からの内毒素除去のために設計された二つのキット、PyroBind (Sepracor)およびEND-XB15 (Atlas Bioscan Ltd.)を評価した。両キットは、脂質サポートにカップリングする特殊なリガンド、内毒素中和タンパク質（Endotoxin Neutralising Protein: ENP）からなる。END-X B15ビーズは、ENPで被覆された65 μmシリカ球状体である
。PyroBindTMはカップリングされたENPを有する中空ファイバーサポートである。
END-X B15
製造者のプロトコルは以下の通り。実施例１Ａで説明したように製造したAAG溶液を20 g/lの濃度に希釈した。2 mlの希釈AAG溶液をEND-X B15ビーズを含むマイクロ遠心チュー
ブに加えた。溶液を、室温で6時間回転しながら混合した。１、4および6時間で、1000gにて処理チューブをマイクロ遠心してEND-Xビーズをペレット化し、0.5mlのサンプルを採取した。次いでビーズを再懸濁し、処理を続けた。経時サンプルを未処理コントロールとともにLAL分析に付した。
PyroBind
製造者のプロトコルは以下の通り。実施例１Ａで説明されるように製造した濃度100 g/lのAAG溶液を用いた。サンプル溶液の第二アリコートを20 g/lに希釈した。5 mlの20 g/l
AAGを含む注射器を中空ファイバーPyroBindユニットの一端に接合し、他端に空の注射器を接合した。AAG溶液に、一方の注射器から他方の注射器へ、５回ユニットを通過させた
。100 g/lのAAG 5 mlを同様に処理し、ただし溶液は、 PyroBindユニットを10回通過させた。次いで、溶液を未処理コントロールサンプルとともにLAL処理に付した。3 mlの一次
処理AAGを保持した。残りの3 mlの一次処理AAGを、さらに５回第二のPyroBindユニットに通した。一次および二次処理サンプルを、未処理コントロールサンプルとともに、LAL処
理に付した。
【００８４】
PyroBind ユニットが活性であることを示すために、ヒトアルブミン溶液（ZenalbTM 4.5, BPL）を用いたコントロール実験を行った。アルブミン溶液を、発熱物質を含まない水（PFW）を用いて22.5 g/lに希釈した。Escherichia coliコントロール標準内毒素#0113, PPE-E-434 (Associate of Cape Cod Inc.)を、PFWで再構成した。0.1 mlのない毒素標準
物質を5 mlのアルブミンに加え、混合し、次いで５回PyroBind中空ファイバーユニットに通した。処理サンプルと未処理サンプルをLAL分析に付した。
結果
実施例２９でのサンプルのLAL分析結果は、表１０に示した。
結論
コントロールアルブミンサンプルは、PyroBindユニットが、ユニットを5回通すことで
、98%の内毒素を除去することに成功したことを示す。PyroBindユニットを用いてAAG溶液から内毒素を除去した場合、多くともたった53%の内毒素除去を示すにすぎないことが示
された。END-X 15Bの結果は、PyroBindと同様で、6時間の処理後たった59%の除去を与え
るにすぎなかった。AAG溶液を処理する場合何れのキットも製造者の主張に合わず、従っ
て医療グレード調製物の製造には適さないであろう。
【００８５】
【表１０】
2005336193.tif 000012
【００８６】
実施例３０
イオン交換クロマトグラフィー
発熱物質は低いpIを有し；出版された値は変動するが、殆どが約4の値を引用し、幾つ
かは遙かに低い。したがって、多くのタンパク質、例えばアルブミンpI = 4.7のために、脱発熱物質は陰イオン交換クロマトグラフィーで行うことができる。2.7のPIを有するAAGのためには、この技術はより可能性が低い。予備実験において、AAGを、AAG非結合条件下で陰イオン交換体を通過して流動させて、発熱物質を結合させようと試みた。
【００８７】
DEAE Sepharose FF (Pharmacia)(1.6 x 12.5 cm)の25 mlカラムを、250 mlの 0.5M NaOHで脱発熱物質し、次いで250 mlの0.13M酢酸ナトリウムpH 4.1で平衡化した。実施例１Ａと同様に調製したAAGを分け採り、固体NaClを加えてNaCl濃度を0.2Mに増加させ、130 ml
のこの調製物（AAG濃度19 g/l、pH 4.4）を陰イオン交換体に充填し、流出物をフラクシ
ョンで脱発熱物質コンテナに収集した。流出物フラクションおよびAAG出発物質をpH 7に
調節し、次いでLAL分析に付した。
結果
発熱物質レベルは、単にかろうじて25〜30 EU/mlから20〜25 EU/mlに減少しただけであった。
結論
この方法はAAG調製物の発熱物質レベルを有意には減少させなかった。
実施例３１
Amberlite XAD-2を用いた内毒素の除去
Amberlite XAD-2樹脂は、水溶性有機物を吸着するためにデザインされたイオン性基を
有さない合成ポリスチレン重合体である。これは、水を脱発熱物質するために用いられる。
【００８８】
実施例１Ａに説明されるようにAAGを調製し、50 g/lに希釈した。1gの未洗浄、未平衡
化Amberlite XAD-2樹脂を、4 mlのAAG溶液に加えた。混合物を37℃で2時間振とうした。Amberliteを1000g、2時間の遠心で除去した。未ペレット化樹脂を濾過で除去した。処理前および処理後のAAGサンプルをLAL分析に付した。
結果３１
実施例３１で製造されたサンプルのLAL分析は、表１１に示した。
【００８９】
【表１１】
2005336193.tif 000013
【００９０】
結論３１
Amberlite XAD-2樹脂を用いた内毒素レベルの減少は達成されず、従ってこの方法はAAG処理方法として適していないと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】フラクションV上澄み液から精製されたAAGを示すアガロースゲルの走査イメージ。出発材料および精製AAGの両方が示されている。
【図２】Q  sepharose大ビーズカラムに供給し、0.2 M NaCl段階勾配で溶出したフラクションV上澄み液のクロマトグラフィープロフィールの図式表示。
【図１】
2005336193.tif 000014
【図２】
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