(57)【要約】【課題】  前記の技術的背景から不活性化ウイルスエンベロープを用いる、より簡便で、操作性のよい、より導入効率が高い、細胞または生体組織への外来物質の導入方法を提供することが本発明の課題である。【解決手段】  不活性化ウイルスエンベロープを用いて外来物質を細胞又は生体組織へ導入する方法であって、以下；１）不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを接触させる工程、２）前記１）の工程で得られる不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを含む組成物中の界面活性剤の濃度を下げる工程、３）前記２）の工程で得られる界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープを含む組成物にさらに外来物質を混合する工程及び、４）前記３）の工程で得られる組成物を細胞又は生体組織と接触させる工程とを含む外来物質の導入方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化ウイルスエンベロープを用いて外来物質を細胞又は生体組織へ導入する方法であって、以下；
１）不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを接触させる工程、
２）前記１）の工程で得られる不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを含む組成物中の界面活性剤の濃度を下げる工程、
３）前記２）の工程で得られる界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープを含む組成物にさらに外来物質を混合する工程及び、
４）前記３）の工程で得られる組成物を細胞又は生体組織と接触させる工程、
とを含む外来物質の導入方法。
【請求項２】
不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを含む組成物中の界面活性剤濃度を下げる工程が、希釈によるものである、請求項１に記載の外来物質の導入方法。
【請求項３】
不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを含む組成物中の界面活性剤濃度を下げる工程が、遠心分離による上清の交換によるものである、請求項１に記載の外来物質の導入方法。
【請求項４】
界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープにさらに外来物質と混合する工程に、又はそれ以降に、希釈によりさらに該組成物中の界面活性剤の濃度を下げる工程を含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【請求項５】
界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープにさらに外来物質を混合する工程で得られる組成物と細胞又は生体組織とを接触させる工程を硫酸プロタミンの存在下で行なう請求項１〜４のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【請求項６】
不活性化ウイルスエンベロープがパラミクソウイルス科のウイルスの不活性化ウイルスエンベロープである請求項１〜５のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【請求項７】
不活性化ウイルスエンベロープが不活性化ＨＶＪエンベロープである請求項１〜５のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【請求項８】
外来物質が、核酸である請求項１〜７のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、蛋白質または薬物等の外来物質を細胞または生体組織へ導入するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞または生体組織へ遺伝子などの外来物質を導入するために多くのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが開発されている。非ウイルス法では、一般的にエンドサイトーシス経路により細胞内に物質が取り込まれるため、ウイルスベクターのいくつかに比べ、遺伝子等の導入効率が低いという課題を抱えていた。そこで、センダイウイルス （sendai virus；hemagglutinating virus of Ｊapan：ＨＶＪ）の膜融合能をリポソームに付与したハイブリッドベクター、すなわちセンダイウイルス とリポソームの融合体（ＨＶＪ−リポソーム）が提案された。該ウイルスの膜融合能により、培養細胞や生体組織細胞の細胞質への遺伝子等の導入が可能となり、世界的にもこの手法が動物実験レベルでは頻用されるようになった（特許文献１、非特許文献１、２）
【０００３】
しかし、このＨＶＪ−リポソーム法では、不活性化ＨＶＪエンベロープの調製に加え、リポソームの調製、融合後のＨＶＪ-リポソームの精製等、煩雑な工程が必要であったため、前記不活性化ＨＶＪエンベロープに、遺伝子等を直接封入する方法が提案された（特許文献２）。細胞内に導入すべき遺伝子等の存在下、不活性化ＨＶＪエンベロープに対して、凍結融解を繰り返すことにより、または界面活性剤による処理を施すことにより、エンベロープ内に該遺伝子等を封入する方法であり、次にこのエンベロープを導入の対象となる細胞等と接触させることにより、遺伝子等を細胞内へ導入する方法である。不活性化ＨＶＪエンベロープは量産可能であり、特に界面活性剤処理による方法は、比較的簡便に、また安定して外来物質の導入を行うことが可能なため、細胞内への外来物質導入に利用されている。
また、前記特許文献２では不活性化ウイルスを界面活性剤の存在化で外来遺伝子と混合する方法について触れられているが（第５頁２６行目から第６頁１行目）、外来遺伝子を混合する工程の前に、界面活性剤を不活性化ウイルスと接触させる方法については、言及されず、その効果について具体的な開示もされていない。
【０００４】
一方、細胞や生体組織内での、遺伝子や薬物の機能解析においては、多種類のサンプルを如何に短時間で導入処理できるかが大きな課題であり、より高効率で、さらに簡便な方法が求められている。
【０００５】
【特許文献１】米国特許５，６３１，２３７
【特許文献２】ＷＯ０１／５７２０４
【非特許文献１】Ｄｚａｕ，Ｖ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１１４２１〜１１４２５（１９９６）
【非特許文献２】Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、５、２９８〜３０３（１９９９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記の技術的背景から不活性化ウイルスエンベロープを用いる、より簡便で、操作性のよい、より導入効率が高い、細胞または生体組織への外来物質の導入方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、不活性化ウイルスエンベロープを用いて、外来物質を細胞又は生体組織へ導入する方法を鋭意検討した結果、不活性化ウイルスエンベロープと外来物質とを混合する工程に先立ち、不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤を接触させることにより、意外にも、外来物質の導入が高効率となることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、次なるものを提供するものである。
（１）不活性化ウイルスエンベロープを用いて外来物質を細胞又は生体組織へ導入する方法であって、以下；
１）不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを接触させる工程、
２）前記１）の工程で得られる不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを含む組成物中の界面活性剤の濃度を下げる工程、
３）前記２）の工程で得られる界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープを含む組成物にさらに外来物質を混合する工程及び、
４）前記３）の工程で得られる組成物を細胞又は生体組織と接触させる工程
とを含む外来物質の導入方法。
【０００９】
（２）不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを含む組成物中の界面活性剤濃度を下げる工程が、希釈によるものである、（１）に記載の外来物質の導入方法。
【００１０】
（３）不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを含む組成物中の界面活性剤濃度を下げる工程が、遠心分離による上清の交換によるものである、（１）に記載の外来物質の導入方法。
前記界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープに外来物質を混合する工程において又はその後に、該組成物中の界面活性剤の濃度をさらに下げることができる。この場合、水又は緩衝液など水性溶液を添加する希釈によって、界面活性剤の濃度を下げることが可能である。従って、本発明は以下のものも提供する。
【００１１】
（４）界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープにさらに外来物質と混合する工程に、又はそれ以降に、希釈によりさらに該組成物中の界面活性剤の濃度を下げる工程を含む、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
前記（１）の４）の工程、即ち、界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープにさらに外来物質を混合する工程で得られる組成物と細胞又は生体組織とを接触させる工程は、必要に応じて硫酸プロタミンの存在下で行なわれても良い。従って、本発明は以下のものも提供する。
【００１２】
（５）界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープにさらに外来物質を混合する工程で得られる組成物と細胞又は生体組織とを接触させる工程を硫酸プロタミンの存在下で行なう前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【００１３】
（６）不活性化ウイルスエンベロープがパラミクソウイルス科のウイルスの不活性化ウイルスエンベロープである前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【００１４】
（７）不活性化ウイルスエンベロープが不活性化ＨＶＪエンベロープである前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【００１５】
（８）外来物質が、核酸である前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の外来物質の導入方法。
【発明の効果】
【００１６】
これまで報告されている不活性化ウイルスエンベロープを用いる外来物質（例えば遺伝子）の細胞等への導入方法に比し、本発明の方法は、導入効率が著しく高くなった。また、不活性化ウイルスエンベロープと外来物質とを接触させる工程以降に、遠心分離の工程がないことを特徴としており、操作性が改善されたことにより、導入の対象となる外来物質のサンプル数が極端に多くなる場合でも、外来物質導入のための組成物の調製が容易に実施できる。それゆえ、本発明の方法では、核酸、蛋白質、薬物等の細胞内での機能に関する微量サンプルでの分析やハイスループット解析などへの適用性が増大している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明において使用されるウイルスは、細胞膜に対して膜融合活性のあるエンベロープを有するウイルスであればどのようなウイルスでも使用できるが、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、またはフラビウイルス科のウイルスが望ましく、より望ましくはパラミクソウイルス科のウイルスであり、さらに望ましくはＨＶＪである。本発明において、不活性化ウイルスエンベロープとは、不活性化されたこれらのウイルス及び／又はそのエンベロープを包含する。本発明で用いられるウイルスは、ニワトリなどの受精卵で増殖させる、あるいは哺乳類の培養細胞、培養組織への持続感染系（培養液にトリプシンなどの加水分解酵素を添加する）を利用して増殖させることができる。またクローニングされたこれらのウイルスのゲノムを培養細胞に感染させ持続感染を起こさせて増殖させたもの、それらの変異株、さらにはそれらの組換え体の全てが本発明で使用可能である。
【００１８】
本発明おいて「不活性化」とは、ウイルスについて言及されるとき、遺伝子が不活性化されることをさし、不活性化ウイルスとは、遺伝子の複製がおこなわれず、増殖・感染能を失ったものさす。ウイルスの不活性化の方法としては、ＵＶ照射、放射線照射、アルキル化剤による処理などが挙げられるが、ＵＶ照射、アルキル化剤による処理が望ましく、具体的にはＷＯ０１／５７２０４に記載の方法に準じて行うことができる。より望ましくはアルキル化剤による処理である。
【００１９】
また、本発明においてウイルスの「エンベロープ」とは、エンベロープを有する特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重膜を基本とする膜構造である。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイク蛋白質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質を含んで構成されており、それ自体は増殖能力を有していない。
【００２０】
本発明で使用される不活性化ウイルスエンベロープは、例えば、超遠心法、カラムクロマトグラフィー法により精製することが可能である。より望ましい精製法としてはイオンクロマトグラフィーを含む精製法であり、具体的には、ＷＯ０３／０１４３３８の実施例１の（１）、及び実施例７の（１）〜（５）に記載の方法が挙げられる。本発明において使用する不活性化ウイルスエンベロープの懸濁液の濃度は特に限定されないが、通常ＯＤ  ０.０５〜７.０であり、望ましくはＯＤ  ０．１〜５．０である。
【００２１】
不活性化ウイルスエンベロープを界面活性剤で処理する場合、低温度下で処理することが良く、望ましくは０℃〜２５℃であり、さらに望ましくは０〜４℃である。本発明において界面活性剤と不活性化ウイルスエンベロープとを接触させる工程での界面活性剤の最終濃度は；０.００１％から０.５％、より好ましくは０.０５％から０.３％になるように添加する。この条件で、数秒〜数時間、好ましくは３〜１０分間熟成する。  ４℃以下であれば、熟成時間を延長してもよい。本発明で用いる界面活性剤としては、オクチルグルコシド、トライトンＸ−１００及びＣＨＡＰＳ、ＮＰ-４０が挙げられる。より好ましくは、トライトンＸ−１００を使用する。
【００２２】
本発明の方法においては、不活性化ウイルスエンベロープと前記界面活性剤を接触させる工程の後、該組成物中の界面活性剤の濃度を下げるが、その方法としては、水または緩衝液など水性溶液の添加による希釈や遠心分離による上清の交換が挙げられる。希釈による方法は、外来物質を混合する工程に先立ち行なうことも可能であるが、外来物質の混合と同時に行なうこともできる。一方、遠心分離による方法は、外来物質と混合する工程に先立ち行なう必要がある。この遠心分離の条件としては、３０００〜１５，０００×Ｇで、２分間以上、より好ましくは好ましくは１００００×Ｇで、５〜２０分間であり、遠心後、上清を廃棄し、得られた沈殿については、界面活性剤を含まないＰＢＳ（-）（リン酸緩衝生理食塩水）もしくは遺伝子導入用の培地などに再懸濁することができる。本発明において、不活性化ウイルスエンベロープを懸濁するための液体としては、蒸留水、ＵＦ水等の水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液としては、ｐＨ７．０〜８．０の範囲で、例えば、リン酸緩衝液、或いはＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液）等が例示される。必要に応じて、この遠心操作を繰り返すこともできる。上述の界面活性剤の濃度を下げる工程において、界面活性剤の濃度は、５倍から５０倍希釈されていれば良いが、望ましくは１００倍以上希釈される。
【００２３】
界面活性剤を接触させた不活性化ウイルスエンベロープと外来物質とを混合する工程では、外来物質を混合した後、０℃〜２５℃の条件下で、数秒〜数時間、好ましくは３〜１０分間熟成すれば良く、４℃以下であれば、熟成時間をさらに延長してもよい。その濃度および混合比は、特に限定されず、適宜選択することができる。熟成後、不活性化ウイルスエンベロープは、外来物質を保持し、物質導入ベクターとなる。
【００２４】
培養細胞への外来物質の導入においては、必要に応じて硫酸プロタミンの存在下で、前記物質導入ベクターの懸濁液に硫酸プロタミンを加え培養細胞に添加する。硫酸プロタミンは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌになるように添加する。硫酸プロタミンを添加する場合は、上述の外来物質を混合する工程後、熟成した後、遺伝子濃度が０．１μｇ／μｌ以下になるようにＰＢＳ（-）もしくは遺伝子導入用培地で希釈する。これは、以後に添加する硫酸プロタミンと遺伝子による共沈を防ぐためである。  
【００２５】
本発明において、外来物質を導入すべき細胞としては、真核細胞、特に動物細胞系を挙げることが出来、接着細胞系と浮遊細胞系のいずれであってもよい。また、一般には導入の困難な細胞系である初期細胞系、幹細胞系、線維芽細胞系、マクロファージ細胞系等を含め、広範囲な細胞系に適用できる。これらの細胞の培養条件下、上述の外来物質導入ベクターを添加し、細胞と接触させる。また、本発明の物質導入ベクターは生体にｉｎ ｖｉｖｏ法で投与するか、または全身的な投与を行うことも可能である。すなわち、治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与することが出来、例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与するか、又は腎臓、肝臓、肺、脳、神経等の疾患の対象部位に直接投与することができる。疾患部位に直接投与すれば、臓器選択的に治療することができる。上述の添加後、若しくは投与後、常法の細胞培養の条件、若しくは通常の飼育条件等で、一定時間経過させれば、外来物質が細胞へ導入される。なお、ｅｘ ｖｉｖｏ法で投与することも可能であり、この場合には、常法に準じ、哺乳類等の対象個体の細胞（例えば、リンパ球、造血幹細胞等）を採取し、本発明の物質導入ベクターで処理を行い、その後に当該細胞を対象個体へ戻せばよい。
【００２６】
本発明において細胞又は生体組織へ導入される外来物質として、特に制限はないが、薬物、遺伝子等の使用が普通である。その具体例としては、抗生物質、化学療法剤、抗アレルギー薬、循環器官用薬、抗炎症薬、抗リウマチ薬、ホルモン、ビタミン、抗悪性腫瘍薬、リボ造影剤、生理活性を有する蛋白質、核酸等があり、使用する核酸として更に具体的には、細胞内に導入されて目的の蛋白質を発現させることのできる目的蛋白質をコードした核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、RNA干渉を起こすRNAを発現するDNA、siRNA、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子等から選択することができる。
【００２７】
本発明の望ましい態様としては以下のものが挙げられる。
（Ａ）不活性化ＨＶJエンベロープを用いて外来物質を培養細胞へ導入する方法であって、以下；
ａ）不活性化ＨＶＪエンベロープの懸濁液と界面活性剤を、界面活性剤の最終濃度が０．００１〜０．５％となるように接触させる工程、
ｂ）遠心分離により上清を交換し、界面活性剤を含まない水性液体に再懸濁する工程、
ｃ）前記ｂ）の工程で得られる界面活性剤を接触させた不活性化ＨＶＪエンベロープを含む組成物にさらに外来物質を混合する工程及び、
ｄ）前記ｃ）の工程で得られる組成物を培養細胞と接触させる工程
とを含む外来物質の導入方法。
（Ｂ）界面活性剤がトライトンＸ−１００である前記（Ａ）に記載の外来物質道入方法。
（Ｃ）外来物質が核酸である前記（Ａ）または（Ｂ）に記載の外来物質の導入方法。
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のため提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であると理解されるべきである。
【実施例】
【００２８】
実施例１（不活性化ＨＶＪエンベロープの調製）
不活性化ウイルスエンベロープは、ＷＯ０３／０１４４３８の実施例１の（１）、及び実施例７の（１）〜（５）に準ずる方法で得られた緩衝液交換後の不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液を使用した。手短には、受精鶏卵を用いて増殖させたＨＶＪを、β−プロピオラクトンで処理することにより不活性化したのち、前処理工程（フィルター濾過）、濃縮工程を経て、次いでカラムクロマトグラフィー（Q  Sepharose  FF）および限外濾過（タンジェンシャルフローフィルターモジュール（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社  ＵＦＰ−５００−Ｅ−３Ａ））を含む精製工程を経て得られる不活性化ＨＶＪエンベロープの懸濁液を使用した。
【００２９】
前記ＨＶＪエンベロープ懸濁液１５０ｍｌを、タンジェンシャルフローフィルターモジュール（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社  ＵＦＰ−５００−Ｅ−３Ａ）を用いて更に１３ｍｌまで濃縮した。この懸濁液のＯＤ（５６０ｎｍの吸光度）は２０倍希釈で０．３８であった。
【００３０】
この懸濁液に、緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）および０．５％のメチルセルロースを含む上述の緩衝を添加することにより、不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液をＯＤ５．０（２０倍希釈して測定したときのＯＤが０．２５）、メチルセルロース濃度０．１％になるように調製した。このＨＶＪエンベロープ懸濁液を０．５ｍｌ容凍結保存チューブに１５μｌずつ分注、液体窒素で急速凍結した後、−８０℃で保存した。
【００３１】
実施例２
前記実施例１に記載の方法で調製したＨＶＪエンベロープ懸濁液（ＯＤ５．０）２μｌを１．５ｍＬ容マイクロチューブに取り、ＰＢＳ（−）８μｌを添加した。さらに０．４％トライトンＸ−１００／ＰＢＳ（−）溶液１０μｌを加え、１０，０００×Ｇ、１５分遠心した後上清を除去した。得られた沈殿物をＰＢＳ（−）１０μｌで懸濁した後、ＤＮＡ濃度１μｇ／μｌのｐＧＬ３／ＴＥ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社  改良型ホタルルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＶｅｃｔｏｒプラスミドＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解）１０μｌを加えて混合し、氷上で５分静置した。
【００３２】
その後、前記不活性化ＨＶＪエンベロープ／プラスミド混合物に対して、ＰＢＳ（−）１５０μＬおよび１０ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミン／ＰＢＳ（−）溶液５μｌを加え混合した。得られた混合物を取り、１０μＬ／ウェル（約１／１６量）となるように、９６ウェルプレート上のＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−６１、大日本製薬より購入、５×１０３細胞／ウェル、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ  ０．１ｍｌ／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２で一夜前培養した）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間培養した。
【００３３】
培養後、培地を除去し、１ウェル当り、ＰＢＳ（＋）５０μｌを加え、次いでルシフェラーゼアッセイキットＬｕｃｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）のＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０μｌを加えて細胞を溶解し、溶解液９０μｌのルシフェラーゼ活性（発光強度）をＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＳＣＩＮＴＩＬＬＡＴＩＯＮ  ＆  ＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥ  ＣＯＵＮＴＥＲトップカウント（ＰＡＣＫＡＲＤ社）で測定した（表１）。
【００３４】
実施例３
前記実施例１に記載の方法で調製した不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液（ＯＤ５．０）２μｌを１．５ｍＬ容マイクロチューブに取り、０．４％トライトンＸ−１００／ＰＢＳ（−）溶液２μｌを加え混合し、５分間氷上に静置した。さらにＰＢＳ（−）６μｌを加え混合した後、ＤＮＡ濃度１μｇ／μｌのｐＧＬ３／ＴＥ溶液１０μＬを加え、５分間氷上に静置した。  静置後、前記混合物にＰＢＳ（−）１５０μＬ、濃度１０ｍｇ／ｍＬの硫酸プロタミン／ＰＢＳ（−）溶液５μｌを加え混合した。得られた混合物１０μｌ（約１／１６量）を前記実施例２と同様にしてＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加し、２４時間培養後、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した（表１）。
【００３５】
比較例
比較例として従来方法（界面活性剤を用いる）を行なった。ＷＯ０３／０１４３３８の実施例１の（１）、及び実施例７に記載の方法で得られた緩衝液交換後の不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液を使用した。培養細胞に対する遺伝子導入は市販されている不活性化ＨＶＪエンベロープであるＧｅｎｏｍＯｎｅ（登録商標、石原産業（株）製）のプロトコールに従って行った。
【００３６】
不活性化ＨＶＪエンベロープ懸濁液４０μｌ（ＯＤ０．２５）を１．５ｍＬ容マイクロチューブに取り、１０，０００×Ｇ、５分遠心、上清を除去した。得られた沈殿物をＰＢＳ（−）１０μｌで懸濁した後、ＤＮＡ濃度１μｇ／μＬあるいは４μｇ／μＬのｐＧＬ３／ＴＥ溶液１０μＬを加えて混合した。
【００３７】
さらに該混合物に２％トライトンＸ−１００／ＰＢＳ（−）溶液２μｌを加えて混合し、１０，０００×Ｇ、５分遠心した。
上清を除去し、得られた沈殿物をＰＢＳ（−）３０μｌで再懸濁し、濃度１０ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミン／ＰＢＳ（−）溶液５μｌを加え混合した。この混合物２μｌ（約１／１６量）を実施例２と同様にしてＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加し、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
実施例２及び３で得られた結果との比較を表１に示した（測定値は何れも３ウェルの平均値である）。本発明の遺伝子導入方法は従来法（比較例）に比し、高い導入効率を示した。
【００３８】
【表１】
2005343874.tif 000002