(57)【要約】【課題】 ＮＦ−κＢの過剰発現を抑制する。【解決手段】ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、NR2B-NMDA受容体の再発現抑制剤、痛みの予防ないし治療剤、心的外傷に関連する記憶の定着抑制剤、神経細胞死の抑制剤。【選択図】図１
2005336081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、NR2B-NMDA受容体の再発現抑制剤。
【請求項２】
ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、痛みの予防ないし治療剤。
【請求項３】
痛みが神経因性の痛みである請求項２に記載の予防ないし治療剤。
【請求項４】
ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、心的外傷に関連する記憶の定着抑制剤。
【請求項５】
ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、神経細胞死の抑制剤。
【請求項６】
神経細胞死が、別の神経細胞の損傷に伴う連鎖的な神経細胞死である請求項５に記載の抑制剤。
【請求項７】
ＮＦ−κＢデコイが環状のデコイである請求項１〜６のいずれかに記載の抑制剤或いは予防ないし治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NR2B-NMDA受容体の再発現抑制剤に関し、より詳細には痛みの予防ないし治療剤、心的外傷に関連する記憶の定着抑制剤、神経細胞死の抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
NMDA型グルタミン酸受容体は神経回路網の可塑性に重要な働きをすることが知られており、特に神経系の発生や記憶・学習に非常に重要な役割を果たしている。NR2B型NMDA受容体（NR2B-NMDAR）は幼若期に発現の多い受容体分子であり、幼若期における神経回路の形成に重要であることが知られている。一方、成熟した個体ではNR2B-NMDARの発現は少ない。
【０００３】
本発明者は、成熟期においても、神経活動を抑えることにより、NR2B-NMDARの再発現が誘導されることを明らかにしてきた（非特許文献１）。また、その受容体分子の再発現によって、神経回路の接続の仕方が大きく変化し、ひとつの細胞がより多くの細胞とシナプス結合することを明らかにした（非特許文献１）。この受容体の再発現による神経回路の再接続の機構は脳の重要な機能であるとともに、この制御が可能になれば、脳機能の障害、疾病などに大きく貢献することが期待される。
【０００４】
一方、NR2B-NMDARの再発現により過剰な神経伝達が起こることが予測される。このことは、脊髄損傷や末梢神経の過剰興奮による「痛み」の原因であることが考えられる。また、幻肢現象の原因メカニズムであると考えられる。このNR2B-NMDAの発現制御が可能になれば、人類にとって非常に大きな恩恵を与える。
【０００５】
例えば、中枢で「痛み」の認識に関して、前頭(forebrain)のanterior cingulate cortex(前帯状皮質)  insular cortex(島皮質)において、マウスにNR2Bを過剰発現させたマウスでは、炎症性疼痛刺激に対する応答が上昇することが知られている（非特許文献１）。
【０００６】
また、末梢での「痛み」の伝達に関して、知覚神経から脊髄への伝達の受容にNMDARが関与することが知られている（非特許文献３）。
【０００７】
このような神経因性の痛みを根本的に治療する薬剤は知られていない。
【非特許文献１】Nakayama K et al,,  Society for Neuroscience  2003.11.8
【非特許文献２】Wei Fら、nature neuroscience, vol.4, p164-, 2001）
【非特許文献３】黒田良太郎ら、薬学雑誌、123(7)、533-546頁、2003年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、NR2B-NMDA受容体の発現を制御する技術を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、痛みの予防ないし治療剤、心的外傷に関連する記憶の定着抑制剤、神経細胞死の抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の発明に関する。
１．  ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、NR2B-NMDA受容体の再発現抑制剤。
２．  ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、痛みの予防ないし治療剤。
３．  痛みが神経因性の痛みである項２に記載の予防ないし治療剤。
４．  ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、心的外傷に関連する記憶の定着抑制剤。
５．  ＮＦ−κＢデコイを有効成分とする、神経細胞死の抑制剤。
６．  神経細胞死が、別の神経細胞の損傷に伴う連鎖的な神経細胞死である項５に記載の抑制剤。
７．  ＮＦ−κＢデコイが環状のデコイである項１〜６のいずれかに記載の抑制剤或いは予防ないし治療剤。
以下、本発明をより詳細に説明する。
なお、以下において、上記のNR2B-NMDA受容体の再発現抑制剤、痛みの予防ないし治療剤、心的外傷に関連する記憶の定着抑制剤、神経細胞死の抑制剤を総称して「本発明の薬剤」と記載することがある。
NFｋBデコイを用いたNR2B型NMDA受容体（NR2B-NMDAR）の発現制御
本発明者は、NFｋBデコイを使用することによりNR2B-NMDARの再発現を抑制できることを初めて見出した。
【００１０】
NMDA型グルタミン酸受容体（NMDAR）は神経回路網の可塑性に重要な働きをし、神経系の発生や記憶・学習に非常に重要な役割を果たしている。特にNR2B型NMDA受容体（NR2B-NMDAR）は幼若期に発現の多い受容体分子であり、幼若期における神経回路の形成に重要であることが知られている。一方、成熟した個体では発現は少ない。
【００１１】
本発明者は、成熟期においても、例えばテトロドトキシン（ＴＴＸ）により神経活動を抑えることにより、NR2B-NMDARの再発現が誘導されることを明らかにしてきた。
【００１２】
NR2B-NMDARの再発現は、神経回路の接続の仕方を変化させ、一つの細胞がより多くの細胞とシナプス結合する結果となる。このシナプス結合の増大は、例えば神経活動の低下を伴う外傷体験などの生命や身体への重大な脅威となる出来事に巻き込まれることにより生じた、心的外傷を起こすような記憶の定着に関与する。従って、このような出来事に遭遇したときに、遭遇後早期に心的外傷となる記憶を一時的に減弱することで、ＰＴＳＤなどの心的外傷を軽減ないし治療することが可能である。
【００１３】
NR2B-NMDARはまた、過剰な神経伝達に起因する痛みの原因にもなる。例えば脊髄損傷や末梢神経の損傷などにより周辺の神経細胞のシナプスにおいてNR2B-NMDARの亢進が起こると、痛みに対する閾値が低下し、痛みを感じやすくなる。このような状況でNFｋBデコイを使用すると、神経細胞のシナプスにおけるNR2B-NMDARの過剰発現が抑制され、痛みの感受性が正常レベルまで低下する。NFｋBデコイを投与することにより、痛み、特に神経損傷の結果として起こる代償性の痛みの亢進を抑制できるので、本発明は痛みの予防ないし治療剤、例えば鎮痛剤として使用することができる。中枢神経、脊髄、末梢神経などの神経損傷に伴う周辺神経における痛みの亢進は一時的なものであり、神経損傷から時間を経過するに従って抑制される。従って、本発明の薬剤は、神経損傷後速やかに投与することにより、幻肢痛などの痛みの程度を低減させることが可能になる。
【００１４】
また、局所的に神経細胞の損傷が起こるとその周辺にNR2B-NMDARの過剰発現が誘導され、神経細胞は刺激に弱くなり細胞死（アポトーシス）を起こしやすくなる。NFｋBデコイを投与すると、周辺神経細胞におけるNR2B-NMDARの過剰発現が抑制され、刺激に対する感受性が低下するので、結果として神経細胞のアポトーシスを抑制することが可能になる。シナプス外NMDAR（NR2Bを含むものが大部分）の活性化は、一過的なCREBのリン酸化しか起こらないため、CRE依存的な遺伝子発現は起こらず、その結果、神経細胞死に至ることが知られている（nature neuroscience vol.5, p405-, 2002）。従って、デコイによりNR2Bの発現を抑えることで、グルタミン酸毒性と関連した神経病や脳卒中による神経細胞死・神経脱落を抑えることが可能になる。
【００１５】
さらに、痛みに関しては、以下のことが知られている。
【００１６】
例えば、中枢で「痛み」の認識に関して、マウス前頭の前帯状皮質、島皮質にNR2Bを過剰発現させたマウスでは、炎症性疼痛刺激に対する応答が上昇した（Wei Fら、nature neuroscience, vol.4, p164-, 2001）。また、末梢での「痛み」の伝達に関して、知覚神経から脊髄への伝達の受容にNMDARが関与していることが知られている（薬学雑誌、123(7)、533-546頁、2003年）。本発明の薬剤において、デコイは、NR2B-NMDARの再発現を抑制することにより、痛み、特に神経性疼痛を抑えることができる。
【００１７】
なお、NR2B-NMDARの過剰発現は、外傷などにより神経が損傷を受けた場合に誘導されるが、これに限らず、ヘルペス後疼痛などの感染症を含む疾患により神経細胞が損傷を受けた場合にも同様な過剰発現が起こる場合があり、このようなケースでも本発明の有効成分（NFｋBデコイ）は、NR2B-NMDARの再発現、痛み、神経細胞死、心的外傷に関連する記憶の定着などの抑制に有用である。
【００１８】
本発明者は、NR2B-NMDARの再発現の抑制に関し、様々な分子を検索した結果、NFｋBのデコイ（特にリボン型デコイ（環状デコイ））を用いることによって、この受容体分子の発現を抑制することに成功した。そして、この受容体分子の発現抑制により、神経回路の過剰／異常なネットワークの形成が妨げられ、痛み、神経細胞死、心的外傷に関連する記憶を抑制することに成功した。
【００１９】
従来、痛みの抑制には、鎮痛薬の全身投与、神経ブロックなどが行われてきたが、このような従来法は副作用を伴うものであり、特に神経因性の痛みのような比較的長期間にわたる痛みに対しての適用は適切ではなかった。
【００２０】
一方、本発明の方法では、例えば事故（例えば交通事故、転落、転倒など）、ケガなどの外傷を受けたような場合、外傷の発生時から比較的速やかに本発明の抑制剤或いは予防乃至治療剤を投与することにより、痛み、神経細胞死、心的外傷に関連する記憶の定着を予防したり、完全に予防できない場合であっても、痛み、神経細胞死、記憶の定着の程度を軽減することができる。また、ヘルペスウイルス等の感染症による神経損傷に基づく痛みの発現や、癌、関節炎などの痛みに対しても予防乃至治療効果を有し得る。
【００２１】
本明細書において、「デコイ」は、ＮＦ−κＢが結合する染色体上の部位、あるいはＮＦ−κＢに制御される遺伝子の他の転写因子が結合する染色体上の部位（以下標的結合部位という）に結合し、ＮＦ−κＢ（転写因子）と、これらの標的結合部位への結合について拮抗する化合物をいう。デコイは代表的には、核酸およびその類似体から構成され、通常二本鎖ＤＮＡであり、好ましくは環状の（リボン型）デコイである。
【００２２】
デコイが神経細胞の核内に存在する場合、転写因子の標的結合部位への結合について、デコイが転写因子と競合し、その結果、転写因子の標的結合部位への結合によってもたらされる生物学的機能、即ち、NR2B-NMDARの再発現を抑制し、過剰な神経ネットワークの構築が抑制される。
デコイは、標的結合配列に結合し得る核酸配列を少なくとも１つ含む。標的結合配列への結合活性を有する限り、デコイは、本発明の薬剤の有効成分として用いることができる。
【００２３】
好ましいＮＦ−κＢデコイの例として、以下のものが挙げられる。
【００２４】
【表１】
2005336081.tif 000003
【００２５】
なお、ダブルとは、転写因子の結合因子を２個含むデコイであることを意味し、シングルとは転写因子の結合因子を１個含むデコイであることを意味する。
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、またはそのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体および／または擬核酸を含むものであってもよい。また、これらのオリゴヌクレオチド、その変異体、またはこれらを分子内に含む化合物は、２本鎖であり、線状であっても環状であってもよい。変異体とは上記配列の一部が、変異、置換、挿入、欠失しているもので、ＮＦ−κＢまたはＮＦ−κＢに制御される遺伝子のその他の転写因子が結合する核酸結合部位と特異的に拮抗する核酸を示す。さらに好ましいＮＦ−κＢまたはＮＦ−κＢに制御される遺伝子のその他の転写因子のデコイとしては、上記核酸配列を１つまたは複数含む２本鎖オリゴヌクレオチドまたはその変異体が挙げられる。
【００２６】
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合部の酸素原子をイオウ原子で置換したチオリン酸ジエステル結合をもつオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、またはリン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチド等、生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクリオチド等が含まれる。
【００２７】
本発明で用いられるデコイの製造方法としては、当該分野で公知の化学合成法または生化学的合成法を用いることができる。例えば、デコイとして核酸を用いる場合、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることができ、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて目的のデコイ核酸を直接合成してもよいし、またはこれらの核酸、それを含む核酸またはその一部を合成した後、ＰＣＲ法またはクローニングベクター等を用いて増幅してもよい。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、ＤＮＡリガーゼ等を用いて結合等を行い、目的とする核酸を製造してもよい。また、さらに細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、核酸の塩基、糖、リン酸部分に、例えば、アルキル化、アシル化等の化学修飾を施してもよい。
【００２８】
本発明は、上記のデコイを単独で、または安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分または薬剤のような他の薬剤と組み合わせて使用することができる。
【００２９】
本発明の薬剤は、デコイが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられる。
【００３０】
本発明の薬剤は、任意の無菌生体適合性薬学的担体（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に許容される担体と混合する薬剤中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明の実施態様において、薬学的に許容される担体は薬学的に不活性である。
【００３１】
本発明の薬剤の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所（筋肉内、皮下など）、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。例えば末梢神経や脊髄損傷などの場合には、脊髄内に投与するのが好ましい。
【００３２】
経口投与のための本発明の薬剤は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて処方され得る。このような担体は、薬剤が患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
【００３３】
経口使用のための薬剤は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切な賦形剤は以下を含むが、それらに限定されない：ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
【００３４】
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量（すなわち用量）を特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
【００３５】
経口で使用され得る薬学的製剤は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）よりなるソフト封着カプセルを含む。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、デコイは、安定化剤とともにまたはともなわずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
【００３６】
非経口投与用の本発明の薬剤は活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の有効成分（デコイ）は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
【００３７】
局所または鼻孔投与のために、浸透されるべき特定のバリアに対して適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は一般に当該分野で公知である。
【００３８】
本発明の薬剤は、一般に用いられている遺伝子導入法で用いられる形態、例えば、センダイウイルス等を用いた膜融合リポソーム製剤や、エンドサイトーシスを利用するリポソーム製剤等のリポソーム製剤、リポフェクタミン（ライフテックオリエンタル社製）等のカチオン性脂質を含有する製剤、またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等を用いるウイルス製剤を用いるのが有利であり、特に、膜融合リポソーム製剤が好適である。
【００３９】
リポソーム製剤は、そのリポソーム構造体が、大きな１枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）のいずれであってもよい。その大きさも、ＬＵＶでは２００から１０００ｎｍ、ＭＬＶでは４００〜３５００ｎｍ、ＳＵＶでは２０〜５０ｎｍ程度の粒子系をとり得るが、センダイウイルス等を用いる膜融合リポソーム製剤の場合は粒子系２００〜１０００ｎｍのＭＬＶを用いるのが好ましい。
【００４０】
リポソームの製造方法は、デコイが保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ、Ｆら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、Ｖｏｌ．６０１ ５５９（１９８０））、エーテル注入法（Ｄｅａｍｅｒ、Ｄ．Ｗ．：Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０８ ２５０（１９７８））、界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．４５５ ３２２（１９７６））、エタノール注入法等を用いて製造することができる。
【００４１】
リポソーム構造を形成するための脂質としては、リン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般に、リン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを定法に従って水素添加したものの他、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質を用いることができる。
【００４２】
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが，２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内にもつものを用いることにより、電気的に陰性のデコイ核酸の結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。
【００４３】
このようにして得られるリポソームには、患部の細胞または目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えば、センダイウイルス、不活化センダイウイルス、センダウイルスから精製された膜融合促進タンパク質、ポリエチレングルコール等を添加することができる。
【００４４】
リポソーム製剤の製造法の例を具体的に説明すると、例えば、前記したリポソーム形成物質を、コレステロールとともにテトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノール等の有機溶媒に溶解し、これを適切な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリポソーム形成物質の膜を形成する。これにデコイを含有する緩衝液を加えて攪拌し、得られたリポソームにさらに所望により前記の膜融合促進物質を添加した後、リポソームを単離する。こりようにして得られるデコイを含有するリポソームは適当な溶媒中に懸濁させるか、または一旦凍結乾燥したものを、適当な溶媒に再分散させて治療に用いることができる。膜融合促進物質はリポソーム単離後、使用までの間に添加してもよい。
【００４５】
本発明の薬剤或いは予防乃至治療剤は、デコイが意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
【００４６】
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
【００４７】
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するデコイの量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ50、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ50、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ50／ＬＤ50として表され得る。大きな治療係数を呈する薬剤が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、デコイの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するデコイの種類等により適宜選択されるが、例えば、血液内投与、筋肉内投与、関節内投与では、一般に、１回あたり、１μｇ〜１００ｍｇを１日１回から数回投与することができる。
【００４８】
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬剤は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
【発明の効果】
【００４９】
本発明によれば、事故などによる外傷や、ウイルスないし細菌感染症、癌、関節炎などに起因して神経が損傷ないし圧迫されたことによる痛み、神経細胞死、心的外傷を起こす記憶の定着を予防乃至軽減でき、鎮痛剤の投与や神経ブロックなどの慣用的な鎮痛処理、精神安定剤や抗うつ薬を不要にし、或いは、緩和することができる。また、神経細胞死を抑制することで、神経系の機能低下を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１
材料と方法
I    海馬神経細胞の分散培養
胎生18日齢のラット（Sprague-Dawley rat ）から海馬を切出し、トリプシン処理により細胞を解離、0.01％ポリエチレンイミン（SIGMA）でコートしたカバーガラス（直径15mm）の上に培養をおこなった。細胞密度は6×104個／cm2であり、５％ウシ胎児血清、５％ウマ血清、50U/ｍｌペニシリン、50μg/ｍｌストレプトマイシン、1ｍM  L-glutamine（Gibco）、50μg/ml  インシュリン（Sigma）を含むDMEM（Gibco）中で、37℃、95％二酸化炭素の環境下にて培養を行った。TTX（1μM  (WaKo)）は、培養17-18日目に培地中に加えた。48−72時間処理後、電気生理実験に用いた。
II  電気生理学的手法
・溶液と薬剤
記録外液の組成は、以下のとおりである。
124mM  NaCl、5mM  KCl、25mM Hepes （Dojin）、30mM glucose、1mM CaCl2,
pH7.4、310mOsmol。
また、目的に応じて、チャネル阻害剤を以下の濃度で外液に加えた。
100μMのピクロトキシン（PTX）、1μM  テトロドトキシン（TTX、Wako）、100μM D,L-2-amino-5-phoshponovaleric acid (APV、Sigma-Aldrich)、1μM ifenprodil  (Tocris.)。  ｐH7.4、浸透圧は310mOsmolに調整した。
電極内液組成は、以下のとおりである。
110mM  CsMS, 10mM  CsCl2, 20ｍM  Hepes, ４ｍM   MgCl2, 10mM  EGTA-Cs
0.3mM  GTP-Na, 4mM  ATP-Na, ｐH7.3, 300mOsmol.
電流固定の場合には、110mM  CsMSをKMSに変えた。
１．   シナプス結合の評価
100μメートル以内の隣接した2個の神経細胞をそれぞれホールセルパッチし、片側の細胞に  100ｍV、１ｍ秒の脱分極刺激を与え、もう片側の細胞を−60ｍVおよび40ｍVに電位固定し、刺激に対する応答電流を記録した。各細胞について、反対方向の実験も行った。
２．   NMDA応答電流の記録および解析
ホールセル記録を行い、膜電位固定化にて、膜電流を測定した。培養日数4日目から30日（４DIVから３０DIV）  までの各発生段階の細胞を−60ｍVにホールセルパッチクランプし、20μM NMDA（記録外液に終濃度20μMになるよう加えた）をN2ガス圧式インジェクターpicopump（WPI）を用いて投与し、これに応答する電流を記録した。この細胞で機能しているNMDA型グルタミン酸受容体のうち、NR2Bサブユニットを含むNMDA型グルタミン酸受容体の割合を調べるために、NR2Bサブユニットを含む受容体の特異的阻害剤である1μM ifenprodilを還流により投与し、NMDA応答電流を記録した。また、この電流がNMDA受容体を介した電流であることを確認するために100μM APVを還流投与、ほとんどの応答が阻害されることを確認した。潅流はチャンバーの容積２ml の5倍量を流し終えた時点でチャンバーの液が完全に入れ替わったものとした。
細胞から記録した5つのトレースを平均し、それぞれの条件の波形とした。記録外液のみのときのNMDA応答電流から、APV存在下でのNMDA応答電流を差し引いたものを100％として、ifenprodil にて阻害される電流を割合で示した。
３．NFｋBデコイのNR2B-NMDAR発現に対する評価
ラット海馬培養細胞18日目に対し、TTXを1uMとなるように添加し、神経活動を阻害した。また、同時にNFｋBリボン型デコイを培地中に添加し、2日後にNR2B-NMDARの再発現に及ぼす評価をおこなった。用いたリボン型デコイの配列と濃度は以下のとおりである。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
結果）
海馬は記憶に重要な器官である。この海馬の培養神経細胞を用いて、神経回路の再編成の機構のメカニズムを解明することを目標としている。我々の開発してきた海馬神経細胞培養系では、培養日数に応じてシナプス形成をし、ネットワークとしての活動を高めることが明らかとなっている。また、受容体の発現様式を検討すると、NMDA型受容体（NMDARｓ）のうち、NR2Bサブユニットを含むNMDAR（NR2B-NMDARｓ）が、発生初期に多く、徐々に減少し、それと対照的にNR2AサブユニットをもつNMDARｓが増加することが、明らかになっている。このことは、これまでのin vivoの系における海馬、大脳皮質の錐体細胞における変化と相同であるもので、これらのことを基準として考えると、胚齢１８日より取り出した海馬神経細胞を18日（１８DIV）以上では、十分に成熟したシナプスと神経回路を持つことが明らかである。この実験系を用いて、神経活動の低下時に誘導される、シナプスの性質、また、神経回路としての機能変化を検討した。
NFκBは転写因子であり、多くの分子の発現調節に関わっている。この、神経活動抑制において誘導されるNR2B-NMDARsの発現制御に関与しているかを検討するため、NFκBの環状型DNA（リボン型デコイ）をもちい、抑制を試みた。NFκB認識配列を2つ持つリボン型デコイ(double)をTTX投与と同時に培地中に添加した。その2日後、NMDARの性質を評価した結果、NR2B-NMDARの発現が抑えられていることが明らかとなった（図１）。
さらに、NFκBの認識部位を一箇所しか持たないリボン型デコイ（Single）の場合でも、やはり発現抑制が認められた。この効果が特異的であるかを検討するため、同じ塩基組成で配列の異なるデコイ（scramble）を用いたが、このスクランブルデコイでは、抑制効果が認めらず、神経活動を阻害した場合に誘導されるNR2B-NMDARｓの発現は、NFκBリボン型デコイによって抑制されることが明らかとなった（図２）。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】NFκBデコイのNR2B-NMDARの再発現への効果。NFκBリボン型ｔデコイ(Double)を神経活動時に同時に培地に添加すると、NR2B-NMDARの発現が抑制された。
【図２】NFκBデコイのNR2B-NMDARの再発現への効果。対照と比較し、ＴＴＸ処理によってNR2B-NMDARの再発現が誘導され、リボン型デコイ(Double)にて抑制される。また、NFκBの認識箇所を一つしか持たないリボン型デコイ(Single)でも抑制されるが、同じ塩基成分で、配列が異なるリボン型デコイ(Scramble)では抑制は起こらなかった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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