(57)【要約】【課題】  リンパ球ＣＤ２抗原ならびに様々な腫瘍抗原のいずれかを認識する、高効率な新規の二特異性抗原フラグメントを提供する。【解決手段】  二特異性抗原フラグメントは、腫瘍細胞のエピトープと結合する第一結合部位およびＣＤ２抗原のエピトープと結合する第二結合部位からなり、ＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙと表される。但し、ＢＡｂは二特異性抗体を意味し、Ｘは、腫瘍抗原を認識する抗体決定基であり、ＡＩＣＤ２．Ｍ１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２はＣＤ２抗原を認識するモノクローナル抗体であり、そしてＹは全抗体の一部分である。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の溶解に有用な二特異性分子であり、これは腫瘍細胞のエピトープと結合する第一結合部位およびＣＤ２抗原のエピトープと結合する第二結合部位からなり、ＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙと表される。
但し、
ＢＡｂは二特異性抗体を意味し、
Ｘは腫瘍抗原を認識する抗体決定基であり、
ＡＩＣＤ２．Ｍ１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２はＣＤ２抗原を認識するモノクローナル抗体であり、そして
Ｙは全抗体の一部分である。
【請求項２】
Ｘがモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５、ＭＡｂ３６１またはＭＡｂ１５に由来する抗体決定基である請求項１に記載の二特異性抗体フラグメント。
【請求項３】
ＹがＦ（ａｂ’）2分子である請求項１または２に記載の二特異性抗体フラグメント。
【請求項４】
次の群から選択される請求項１、２または３に記載の二特異性抗体フラグメント。
ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
【請求項５】
腫瘍細胞のエピトープとの第一結合部位および抗原ＣＤ２のエピトープとの第二結合部位からなる腫瘍細胞の溶解に有用な二特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2フラグメントの調製法であって、
これはそれぞれ二つの同一のＬ（軽鎖）−Ｈ（重鎖）半分子からなり一つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって連結されている二つの異なるモノクローナル抗体を二つのＦ（ａｂ’）2分子に酵素的変換すること、
それぞれのＦ（ａｂ’）2分子を還元条件下でＦａｂ’チオールへ分割すること、各抗体のこれらＦａｂ’分子の一つをチオール活性化剤を用いて誘導体化することおよび、
所望の二特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを得るために腫瘍特異性を有する活性化ａｂ’分子を白血球特異性を有する一つの非活性化Ｆａｂ’分子と（または逆にして）組み合わせることによるが、
これはモノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２を白血球抗原を認識する抗体として使用することを特徴とする。
【請求項６】
ＭＡｂ４２５、ＭＡｂ３６１またはＭＡｂ１５を腫瘍細胞抗原を認識する抗体として用いることを特徴とする請求項５に記載の二特異性抗体フラグメントの調製法。
【請求項７】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２１１８の寄託番号下で寄託された細胞系１Ｈ１０からの単離によって得られる抗原ＣＤ２を認識するモノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ１。
【請求項８】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２１１９の寄託番号下で寄託された細胞系７Ｄ３からの単離によって得られる抗原ＣＤ２を認識するモノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ２。
【請求項９】
活性成分としての請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも一つの二特異性抗体フラグメント、および一つまたはそれ以上の薬物学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤を組み合わせてなる薬剤調製物。
【請求項１０】
二特異性抗体フラグメントＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙからなる請求項９に記載の第一薬剤調製物（Ｉ）および、ＭＡｂ  ＡＩＣＤ２．Ｍ１またはＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｙからなる第二の別の薬剤調製物（II）［ここでＸおよびＹは既記の意味を有する］からなる薬剤組成物キット。
【請求項１１】
二特異性抗体フラグメントＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｙからなる請求項９に記載の第一薬剤調製物（Ｉ）および、ＭＡｂ  ＡＩＣＤ２．Ｍ２またはＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙからなる第二の別の薬剤調製物（II）［ここでＸおよびＹは既述の意味を有する］からなる薬剤組成物キット。
【請求項１２】
調製物（Ｉ）が二特異性抗体フラグメントＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2またはＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2またはＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2からなり、調製物（II）がＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2からなる請求項１１に記載の薬剤組成物キット。
【請求項１３】
同原骨髄移植において請求項１０または１２に記載の薬剤組成物キットを用いて、適宜追加のＴリンパ球の存在下で、エックスビボで腫瘍細胞を洗浄する方法であって、これは最初に細胞を調製物（Ｉ）で処理した後で調製物（II）で処理して、適宜従来の精製工程を続けることによって行われる。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の二特異性抗体フラグメントのヒト腫瘍の治療のための薬物の調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ球ＣＤ２抗原および任意の可変腫瘍抗原を認識する新規の二特異性抗体フラグメントに関する。好ましくは上皮増殖因子レセプター（ＥＦＧ−Ｒ）の抗原決定基を腫瘍抗原として用いる。さらに本発明はＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２と称する二つの新規のモノクローナル抗体およびそれらの合わせての腫瘍溶解への正の影響に関し、少なくともそれらの一つが二特異性抗体フラグメントである。抗体および抗体フラグメントは腫瘍の治療および診断に有効に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞を排除する場合、Ｔリンパ球はおそらく最も有効な免疫系構成要素である。しかし、ほとんどの癌患者は腫瘍細胞と特異的に反応する細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を充分には保持していない（例えば、Ｋｎｕｔｈら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１、３５１１）。ＣＴＬの溶解能をすべて活性化するためには、これら細胞が天然特異性を有しない腫瘍細胞に対することができるように全細胞を処理しなければならない。腫瘍細胞上のある種の卷く抗原にモノクローナル抗体を結合させることによって、Ｔ細胞は活性化されて増殖、サイトカイン分泌および細胞溶解活性が認められる。
【０００３】
腫瘍関連抗原を一方の結合肢で認識してＴ細胞マーカーをもう一方の結合肢で認識する二特異性抗体（ＢＡｂ）は、一特異性ＣＴＬと悪性細胞とを架橋することが示された（例えば、Ｓｔａｅｒｚら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４、６２８）。
【０００４】
これら人工的抗体によるＴ細胞活性化はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を通して起き得るが、ここでＴＣＲは抗原認識およびＴＣＲ−抗原相互作用によって生じるシグナルのトランスダクションのためのＣＤ３エピトープに関与する（例えば、Ｈ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ、Ｍａｙ１９９１、１６３の総説およびその引用文献を参照されたい）。
【０００５】
エフェクター細胞活性化は、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に存在する糖タンパク質であるＣＤ２抗原を介して起きる（例えば、Ｈｕｅｎｉｇら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２６、２９８）。ＣＤ２は、エフェクター細胞と標的細胞上の天然リガンドＬＦＡ３（ＣＤ５８）との相互作用を支持する。三つの機能的に重要なエピトープ（Ｔ１１．１、Ｔ１１．２およびＴ１１．３）がＣＤ２上に同定された。抗体結合の際に転形（モジュレーション）を起こすＣＤ３抗原とは対照的に、ＣＤ２を抗体で標的攻撃した後のＣＤ２転形は今までのところ報告されていない。抗ＣＤ２抗体を活性化に用いた以前の研究によると、ＣＤ２抗原を介しての二段階活性化が現実的のようである。これまで活性化に用いられてきた共働的に作用する抗ＣＤ２特異性は、抗Ｔ１１．２プラス抗Ｔ１１．１またはＴ１１．２プラス抗Ｔ１１．３などの抗体によって特徴づけられる。Ｔ１１．３は抗Ｔ１１．２による活性化の後にアクセス可能になる、隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）エピトープであることが報告されている。今までのところ用いられる抗体のほとんどが、天然ＣＤ２リガンドＬＦＡ−３と結合を競合することが明かである（例えば、Ｂｏｌｈｉｕｓら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ．３４、１およびその引用文献）。
【非特許文献１】Ｋｎｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），  Ｖｏｌ．８１，  ３５１１  （１９８４）
【非特許文献２】Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３１４，  ６２８  （１９８５）
【非特許文献３】Ｈ．Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｍａｙ  １９９１，  １６１
【非特許文献４】Ｈｕｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３２６，  ２９８  （１９８７）
【非特許文献５】Ｂｏｌｈｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ．，  Ｖｏｌ．３４，１  （１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、抗腫瘍抗体に由来する新規の二特異性抗体、および二段階活性化の後に影響を受けないＣＤ２／ＬＦＡ３を介して細胞の正常の交叉反応（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）を維持しながら細胞毒性を発揮することができる一対の共働的に作用する抗ＣＤ２抗体を開発することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による新規の二特異性抗体は次のような好ましい性質を有することが見出だされた。すなわち、腫瘍細胞に対する強い親和性、Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する強い親和性、ＬＦＡ３に対する非競合性、ＬＦＡ３との非共働性、非レセプター転形性、高いＮＫ細胞およびＴ細胞特異性、二段階活性化を介してのみの有効性（これはそのような一つのＢＡｂはＴ細胞活性化および腫瘍細胞溶解にそれぞれ影響しないことを意味する）である。
【０００８】
したがって本発明の目的は、腫瘍細胞の溶解に有用な二特異性分子であり、これは腫瘍細胞のエピトープと結合する第一結合部位およびＣＤ２抗原のエピトープと結合する第二結合部位からなり、ＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙで表される。但し、ＢＡｂは二特異性抗体を意味し、Ｘは腫瘍抗原を認識する抗体決定基であり、ＡＩＣＤ２．Ｍ１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２はＣＤ２抗原を認識する新規のモノクローナル抗体であり、そしてＹは全抗体の一部分である。
【０００９】
ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２は新規のモノクローナル抗体であり、これは遺伝子工学的に作出されたＣＤ２抗原でマウスを免疫して、適当なマウスハイブリドーマ細胞から抗体を分離して精製することによって得られ（詳細は実施例を参照されたい）、Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ２抗原に高い特異性を示す。
【００１０】
本発明の対象は、したがって、ＡＩＣＤ２．Ｍ１と称するモノクローナル抗体であって、これはＣＤ２抗原を認識し、ＤＳＭ ＡＣＣ２１１８のアクセス番号の下に寄託されている細胞系１Ｈ１０からの単離によって得ることができる。
【００１１】
本発明の対象はまた、ＡＩＣＤ２．Ｍ２と称するモノクローナル抗体であって、これはＣＤ２抗原を認識し、ＤＳＭ ＡＣＣ２１１９のアクセス番号の下に寄託されている細胞系７Ｄ３からの単離によって得ることができる。
【００１２】
該抗体を産生する新規の細胞系は、ブダペスト条約に従って、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ」（ＤＳＭ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＦＲＧ）に１９９３年２月２３日に寄託された。
【００１３】
本発明はまた、ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２の天然または人工的な変種または突然変異体であって、遺伝子的に修飾または操作されたモノクローナル抗体に関し、好ましくはヒト遺伝子と結合させたものおよびキメラ型が含まれる。
【００１４】
本発明による二特異性分子は、ＡＩＣＤ２．Ｍ１またはＡＩＣＤ２．Ｍ２の結合肢および、任意の腫瘍抗原を認識する抗体の別の結合肢からなる。抗腫瘍抗原の選択は、二特異性抗体のＴ細胞活性化および腫瘍細胞溶解に関する有効性には重要な影響を及ぼさない。本発明の好ましい実施態様において、該第二結合肢はモノクローナル抗腫瘍抗体ＭＡｂ４２５、ＭＡｂ３６１またはＭＡｂ１５の結合肢に代表されるが、本発明によれば、修飾された、好ましくはヒト化されたものまたはキメラ型および遺伝子操作による最小フラグメントが含まれる。
【００１５】
本発明の対象は、したがって、上記および請求の範囲に定義された二特異性抗体フラグメントを提供することにあり、ここでＸはモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５、ＭＡｂ３６１またはＭＡｂ１５に由来する抗体決定基である。
【００１６】
ＭＡｂ４２５は、広く公知のヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）に対して作出されたネズミモノクローナル抗体であって、ヒトＥＧＦ−Ｒの外側ドメインのポリペプチドエピトープと結合して、ＥＧＦの結合を阻害する。ＭＡｂ４２５（ＡＴＣＣ  ＨＢ９６２９）は、インビトロで腫瘍細菌毒性を媒介して、類表皮腫および結腸直腸癌腫由来の細胞系の腫瘍細胞増殖をインビトロで抑制することが見出だされた（Ｒｏｄｅｃｋら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７、３６９２）。ＭＡｂ４２５のヒト化およびキメラ型はＷＯ９２／１５６８３に開示された。
【００１７】
ＭＡｂ３６１は、ＩｇＧ２ａネズミモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ  ＨＢ９３２５）であって、ガングリオシドＧＤ２抗原およびＧＤ３抗原に特異的に結合する。これらガングリオシドは黒色腫に富んでいる（ＥＰ  ０２８０  ２０９、ＵＳＳＮ０１６９０２）。
【００１８】
ＭＡｂ３６１は、ＧＤ２抗原を発現する腫瘍細胞に対してインビトロで有意なレベルの細胞毒性を示す（Ｔｈｕｒｉｎら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７、１２２９）。
【００１９】
ＭＡｂ１５は、ヒト小細胞肺癌細胞ＴＫＢ−２による免疫で生じたＩｇＧ１ネズミモノクローナル抗体である（Ｅｎｄｏら、１９８６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６、６３６９）。抗体は早期分化抗原を認識する。
【００２０】
本発明による二特異性抗体は、全抗体のフラグメントであり、例えば、Ｆ（ａｂ’）2分子またはミニ抗体（Ｆｖ分子）、好ましくはＦ（ａｂ’）2分子である。全抗体と対照的に、Ｆ（ａｂ’）2およびミニ抗体のようなフラグメントは、固体腫瘍の腫瘍実質により容易に浸入して、細胞毒性および腫瘍内部での細胞溶解力を発揮することができる。さらに、ネズミ起源に由来するＦ（ａｂ’）2分子およびミニ抗体は通常、低減したヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を示す。
【００２１】
したがって、本発明の好ましい目的は、上記に定義した二特異性抗体フラグメントを提供することであって、ここでＹはＦ（ａｂ’）2分子である。とくに好ましい実施態様は以下の群から選択される。
【００２２】
ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ'）2
ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
完全な抗体またはフラグメントを基にして二特異性抗体を産生する種々の方法が記述されている（例えば、Ｂｒｉｓｓｉｎｃｋら、１９９２、Ｄｒｕｇｓ ｏｆｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ １７（１１）、１００３の総説を参照されたい）。二特異性抗体フラグメントを構築する一つの方法としては、全抗体をタンパク質分解によって（一特異性）Ｆ（ａｂ’）2分子に変換して、これらフラグメントをＦａｂ’分子に分割して、異なる特異性を有するＦａｂ’分子を組み替えて二特異性Ｆ（ａｂ’）2分子にする方法がある（例えば、ＥＰ０１７９８７２Ｂ１を参照されたい）。
【００２３】
このように、本発明の目的は腫瘍細胞のエピトープへの第一結合部位およびＣＤ２抗原のエピトープへの第二結合部位からなる腫瘍細胞の溶解に有用な二特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2フラグメントの調製法を提供することであって、これは各二つの同一のＬ（軽鎖）−Ｈ（重鎖）半分子からなっていて一つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって連結されている二つの異なるモノクローナル抗体を酵素的変換によって二つのＦ（ａｂ’）2分子にすること、各Ｆ（ａｂ’）2分子を還元条件下でＦａｂ’チオールへ分割すること、各抗体のこれらＦａｂ’分子の一つをチオール活性化剤を用いて誘導体化することおよび、所望の二特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを得るために腫瘍特異性を有する活性化Ｆａｂ’分子を白血球特異性を有する非活性化Ｆａｂ’分子と（または逆にして）組み合わせることによって行うが、これはモノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２を白血球抗原を認識する抗体として使用することを特徴とする。
【００２４】
抗体をそのＦ（ａｂ’）2分子に変換するために適する酵素としては、ペプシンおよびパパインが用いられる。場合によってはトリプシンまたはブロメリンが適している。しかし、ペプシンが本発明の工程では好ましく用いられる。ジスルフィド結合の遊離のＳＨ−基（Ｆａｂ’分子）への変換は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノールおよびメルカプトエチルアミンなどの還元試薬によって行うことができる。チオール半分子の再結合を防ぐ本発明によるチオール活性化剤は、５、５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、二硫化２、２’−ジピリジン、二硫化４、４−ジピリジンまたはテトラチオナート／亜硫酸ナトリウム（Ｒａｓｏら、１９８２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２、４５７およびその引用文献もまた参照されたい）である。好ましくはＤＴＮＢが本発明による工程に用いられる。
【００２５】
チオール活性化剤を用いる処理は、二つのＦａｂ’フラグメントの一つとのみ行われる。原則的には、二つのＦａｂ’のうちのどちらを活性化Ｆａｂ’フラグメント（例えばＦａｂ’ＴＮＢ）に変換しても違いはない。しかし、一般に、より不安定なＦａｂ’フラグメントがチオール活性化剤で修飾される。本発明の場合、抗腫瘍特異性を有するフラグメントの方がわずかにより不安定であり、したがって、好ましくはこの工程に用いられる。二価Ｆ（ａｂ’）2抗体を作出するための第二Ｆａｂ’分子の遊離ヒンジ−ＳＨ基と活性化Ｆａｂ'誘導体との抱合は、０〜３０℃の温度で自然に起きる。精製Ｆ（ａｂ’）2抗体の収率は２０〜４０％（全抗体から出発して）である。
【００２６】
上記したように、本発明はまた、二特異性ミニ抗体を含む。ミニ抗体は二つの一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖフラグメントは、通常遺伝子工学的に、ＶH−リンカー−ＶLまたはＶL−リンカー−ＶHとして結合されている）からなる抗体フラグメントであって、これらは自己凝集によってまたはＣ末端でヒンジ領域と互いに融合することによって結合されており、（適宜）可変性を提供するか、そして／または両親媒性ヘリックスを提供して二量体形成をする。ヘリックスは、四ヘリックス団デザインまたはロイシンジッパーから得られる（例えば、ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１、１５７９）。上記に定義されたミニ抗体の調製は、例えばＷＯ９３−０００８２に開示されている。
【００２７】
本発明による二特異性抗体フラグメントを、次のような性質に関してインビトロ／エックスビボで試験した。すなわち、特異的腫瘍細胞およびＴ細胞への結合能、免疫修飾（Ｔ細胞増殖）および細胞毒性（腫瘍細胞溶解）である。試験は標準的文献に記載の方法による。詳細および結果は実施例に示す。
【００２８】
本発明による二特異性抗体フラグメントは、ヒト患者に治療のために投与することができる。したがって、本発明の目的はまた、活性成分として上記および請求の範囲に定義した二特異性抗体フラグメントの少なくとも一つを、一つまたはそれ以上の製薬学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含んでなる薬剤調製物を提供することである。
【００２９】
多くの場合、本発明の抗体フラグメントは静脈注射によって非経口的に投与される。一般に、二特異性抗体フラグメントは所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果を生じるのに十分な範囲の用量で投与される。投与量は、年齢、健康状態、性別および患者の病気の程度によって異なるが、０．１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの範囲まで変化することができる。１日に１回またはそれ以上の投与で０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ／投与で１日または数日の投与が好ましい。
【００３０】
非経口投与の調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれらの目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられる。本発明の二特異性抗体は、生理学的に容認し得る担体からなる組成物中に用いることができる。そのような適当な担体の例としては、生理的食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液または乳酸塩化リンゲル液などがある。また、保存剤および抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などの他の添加剤を薬剤調製物に含ませてもよい。二特異性抗体フラグメントはまた、それらの細胞毒性を維持するためにＩＬ−２などのサイトカインを公知の方法によって抱合させることができる。
【００３１】
本発明の薬剤調製物は、黒色腫、神経膠腫、癌腫それに循環系の腫瘍および固体腫瘍などのあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。好ましい調製物は、一つの結合肢がモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５、ＭＡｂ３６１およびＭＡｂ１５の結合部位を有する二特異性抗体フラグメントからなる。
【００３２】
本発明は、二つの異なる抗体または二特異性抗体フラグメントをそれぞれ投与することによるきわめて効果的な白血球の二段階活性化を開示する。
【００３３】
したがって、本発明の目的はまた、二特異性抗体フラグメントＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙからなる上記または請求の範囲に定義した第一薬剤調製物（Ｉ）および、ＭＡｂ ＡＩＣＤ２．Ｍ１またはＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｙからなる第二の別の薬剤調製物（II）［ここでＸおよびＹは既記の意味を有する］からなる薬剤組成物キット（Ａ）を提供することである。この薬剤組成物キットにおいて、調製物（Ｉ）はＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ２上に、調製物（II）はＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ１上に見出だされる。
【００３４】
あるいはまた、本発明は、調製物（Ｉ）がＭＡｂ ＡＩＣＤ２．Ｍ１に基づき、調製物（II）がＭＡｂ ＡＩＣＤ２．Ｍ２に見出だされる組成物キット（Ｂ）に関する。このように、本発明のさらなる目的は、二特異性抗体フラグメントＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｙからなる第一薬剤調製物（Ｉ）および、ＭＡｂ ＡＩＣＤ２．Ｍ２またはＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙからなる第二の別の薬剤調製物（II）［ここでＸおよびＹは既記の意味を有する］からなる薬剤組成物キットを提供することである。
【００３５】
組成物（Ａ）と（Ｂ）との間の違いは、通常あまり重要ではない。ＭＡｂ４２５の場合は、調製物（Ｉ）がＭＡｂ ＡＩＣＤ２．Ｍ１に基づく組成物（Ｂ）の方がより有効であることが認められた。
【００３６】
組成物（Ａ）と（Ｂ）との間の腫瘍結合部位の違いもまた、あまり重要ではない。しかし、本発明による薬剤組成物キットの結合能、免疫修飾（白血球増殖）および細胞毒性に関する有効性は、抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２に由来する二特異性抗体フラグメントの結合部位の影響に依存する。本発明の好ましい実施態様では同様の性質を示す。
【００３７】
調製物（II）（あるいはまた、全抗体、一特異性抗体フラグメントまたはＢＡｂ）に関しての治療効果の違いはまた、著しく大きくはない。しかし、適当な一特異性抗体フラグメントからなる調製物（II）が好ましい。
【００３８】
薬剤組成物キットは次のようにして用いられる。医療処理は本発明による薬剤組成物キットの一つである調製物（Ｉ）を患者に注射することによって開始される。二特異性抗体はその特異性によって腫瘍の表面のみに結合するのではなく、その小サイズの故に固体腫瘍塊に浸入する。本発明による二特異性抗体フラグメントの投与によって、注射された免疫グロブリンが腫瘍の局部領域において富化されるが、有意な免疫応答を引き起こすまでには到らない。数時間から数日のそれぞれの期間（病気の程度、腫瘍の種類、健康状態、患者の性別および年齢などによって異なる）の後に、調製物（II）を投与する。免疫学的応答がただちに誘導される。調製物（Ｉ）および（II）は好ましくは等モル量が投与される。エックスビボ実験によって、通常は腫瘍に対して有意な細胞毒性（細胞溶解）を誘導することができない同原および同種の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を該処理によって高度に活性化することができる（図６ａ、ｂ，図７）。
【００３９】
本発明の薬剤組成物キットを使用することによって、エックスビボ腫瘍細胞を骨髄調製物中で一掃することが可能である。細胞毒性効果を強めるために、外来性Ｔリンパ球を加えることも可能である。
【００４０】
したがって、最後に、本発明の目的はまた、同原骨髄移植において上記および請求の範囲に定義した薬剤組成物キットを用いて、適宜追加のＴリンパ球の存在下で、エックスビボで腫瘍細胞を洗浄する方法を提供することであって、これは最初に細胞を調製物（Ｉ）で処理して、その後で調製物（II）で処理して、適宜従来の精製工程を続けて行う。エックスビボの骨髄洗浄の手法は当業者に自体公知である。
（図面の簡単な説明）
［図１］  ＢＡｂの合成を示した模式図である。
【００４１】
［図２］  抗体フラグメントおよびＢＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した説明図である。
レーン１：分子量マーカー
レーン２：ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2（ＤＴＴによる還元前）
レーン３：ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ’）2（ＤＴＴによる還元前）
レーン４：ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2（ＤＴＴによる還元およびＤＴＮＢによる誘導体化後）
レーン５：ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ’）2（ＤＴＴによる還元およびＤＴＮＢによる誘導体化後）
レーン６：ＢＡｂ（精製前）
レーン７：ＢＡｂ（精製後）
［図３］  ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2のヒドロキシアパタイト上のクロマトグラフィー溶出図である。
左縦軸：吸光度ＯＤ（２８０ｎｍ）、
右縦軸：リン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．０）濃度、
横軸：溶出時間（分）。二特異性抗体フラグメントはピークIIで示される。ピークＩおよびIIIは少量不純物である。
【００４２】
［図４］  ＢＡｂ／ＭＡｂのＥＧＦ−Ｒへの競合的結合を示す説明図である。
縦軸：％吸光度（４９０ｎｍ）、
横軸：抗体フラグメント濃度（ｍｏｌ／リットル、対数目盛り）。ビオチン標識ＭＡｂ４２５を非標識ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ’）2またはＢＡｂとのＥＧＦ−Ｒへの結合に対する競合に用いた。
●  ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
▽  ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
□  ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ’）2
［図５］  ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）の増殖を示す説明図である。
縦軸：3Ｈ−チミジンの％取り込み量、
横軸：抗体フラグメント濃度（μｇ／ｍｌ）。
●  ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
▽  ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
★  ＢＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
□  ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
■  ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ’）2
［図６］  ａは、ＢＡｂ誘導腫瘍溶解（エフェクター細胞としての同種ＴＩＬを使用）を説明するグラフ図である。
縦軸：％細胞毒性、
横軸：
１＝ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ'）2
２＝ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
３＝ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
４＝ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ’）2
ｂは、ＢＡｂ誘導腫瘍溶解（エフェクター細胞としての同原ＴＩＬを使用）を説明するグラフ図である。
縦軸：％細胞毒性、
横軸：
１＝ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2
２＝ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
３＝ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2
４＝ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ'）2
５＝ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ’）2
棒グラフの上の線：平均偏差
［図７］  ＢＡｂ媒介Ｔ細胞標的攻撃および腫瘍細胞溶解を示す写真図である。
図７ＡおよびＢは４０／１のエフェクター／標的比における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と同原悪性細胞の培養物を示す。
共培養はＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2を含まない（図７Ａ、対照）および含む（各２０μｇ／ｍｌ、図７Ｂ）状態で４時間インキュベートして行った。ＣＤ２ＢＡｂの存在下で、多数のＴリンパ球が同原腫瘍細胞に付着して密集し、続いて黒色腫細胞を傷害する。
図７Ｂの矢印はＴＩＬの破壊された黒色腫との抱合を示す。ＴＩＬと黒色腫細胞との共培養は、１０％ＦＣＳを含む培養培地中において、２４ウェルプレート中で行った。
顕微鏡写真は反射型顕微鏡（改良位相差コントラスト、オリジナルの倍率１００）を用いて行った。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例によって本発明を詳細に説明する。
【００４４】
［実施例１］
ＭＡｂ  ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２の調製：
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを遺伝子工学的に作出したＣＤ２によって２週間のうちに４回免疫した。ヒトＣＤ２のＤＮＡ配列およびそのクローニングは、Ｓａｙｒｅら（１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８４、２９４１）によって記述されている。ＣＤ２遺伝子発現は文献（Ｆｒａｓｅｒ  １９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８、１３１およびその引用文献）によって公知の方法によってバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）系において行った。
【００４５】
免疫したマウスの脾臓細胞を分離して、黒色腫細胞系（Ａｇ８．６５３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と融合させた。ヒトＴリンパ球（ＣＤ２陽性）上で増殖しているハイブリドーマの上清を蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を用いて試験することによって、ハイブリドーマを特異的モノクローナル抗体産生についてスクリーニングした。陽性ハイブリドーマを「限定希釈クローニング」の方法によって回収した。選択されたハイブリドーマの上清を免疫沈降反応およびウエスタンブロット分析によって調べた。選択されたモノクローナル抗体の単離は、Ｅｙら（１９７８、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５、４２９）による培養上清物の精製によって行った。
【００４６】
抗体に対するＣＤ２抗原の機能的分析は、増殖試験（3Ｈ−チミジンの取り込み）によって行った。ＣＤ２抗原と反応する一連のモノクローナル抗体から選択された二つの抗体はＴ細胞の増殖を強く誘導した。これらモノクローナル抗体はＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２と命名して、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託した。
【００４７】
用いた方法はすべて、標準的手法によって行った。その多くは、例えば「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）およびその引用文献）に開示されている。
【００４８】
［実施例２］
ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2の合成：
合成は、１０ｍｇの抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ１および１０ｍｇの抗体ＭＡｂ４２５から出発した。用いられる抗体はクエン酸緩衝液（３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５）中で前活性化パパイン処理（１０ｍｇ／ｍｌ）した。タンパク質分解の後、Ｆ（ａｂ’）2をタンパク質Ａセファロースカラムの溶出液から回収した。Ｆ（ａｂ’）2の回収率は通常ほぼ１００％である。０．５ｍＭ  ＤＴＴを用いて３０℃で４０分間処理することによって両Ｆ（ａｂ’）2フラグメントをそれぞれＦａｂ’フラグメントに変換した。還元工程後、ゲル濾過（スパーデックス（登録商標）２００）を介して過剰のＤＴＴを除去してＦａｂ’を回収した。工程の進行中に、ＭＡｂ４２５フラグメントを０．５ｍＭエルマン試薬（５、５−ジチオール−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ））を用いて４℃で６０分間処理することによってＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体が生じた。過剰のＤＴＮＢをゲル濾過によって除去した。６ｍｇのそれぞれの抱合相手（Ｆａｂ’−ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＦａｂ’−ＴＮＢ  ＭＡｂ４２５）を抱合相手混合物を４℃で１８時間攪拌することによって最終抱合工程に用いた。二特異性抗体を反応混合物からゲル濾過クロマトグラフィー（スーパーデックス（登録商標）２００）によって回収した。合成Ｆ（ａｂ’）2調製物の収量は３〜４ｍｇ（約３０％）であった。ＢＡｂ合成のための一連の操作概要を図１に示した。
【００４９】
［実施例３］
ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2の合成：
実施例２と同様にして、二特異性抗体をＭＡｂ  ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＭＡｂ３６１から出発して調製した。ＢＡｂの収率は約３４％であった。
【００５０】
［実施例４］
ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2の合成：
実施例２と同様にして、二特異性抗体をＭＡｂ  ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＭＡｂ１５から出発して調製した。ＢＡｂの収率は約２３％であった。
【００５１】
［実施例５］
ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2の合成：
実施例２と同様にして、二特異性抗体をＭＡｂ  ＡＩＣＤ２．Ｍ２およびＭＡｂ４２５から出発して調製した。ＢＡｂの収率は約３０％であった。
【００５２】
［実施例６］
ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞（ｓｃＦｖ）2の合成：
ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＭＡｂ４２５のＶLおよびＶHドメインからなる二つの一本鎖タンパク質を分子工学的手法（Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９、２９３〜２９９）によって調製した。発現プラスミドはｐＨＥＮ１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９、４１３３〜４１３７）に由来するものであって、これは抗−ＥＧＦ−Ｒネズミハイブリドーマ（ＭＡｂ４２５）または抗−ＣＤ２ネズミハイブリドーマ（ＡＩＣＤ２．Ｍ１）のいずれかに由来するＶLおよびＶHドメインの構造遺伝子を含む。ＰｅｌＢリーダー配列を大腸菌中におけるペリプラズム分泌の媒介に用いた。ｓｃＦｖをアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、二特異性ｓｃＦｖの構築に用いた。ＥＧＦ−ＲとＣＤ２−特異性ｓｃＦｖの化学的交差を試薬２−イミノチオランおよびヘテロ二官能基クロスリンカーＳＰＤＰを用いて行った。１０ｍｇのＭＡｂ＜４２５＞ｓｃＦｖから出発して、本発明者はＳＰＤＰを介してｓｃＦｖ分子当たり１分子の２−ピリジルジスルフィドの統計的取り込み量に近づいた。誘導体の精製は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて行った。反応性−ＳＨ基のＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ｓｃＦｖへの導入は１０ｍｇのｓｃＦｖの２−イミノチオランを用いる誘導体化によって達成された。誘導体の精製をゲル濾過クロマトグラフィーによって行った。等モル量の２−ピリジルジスルフィド活性化ＭＡｂ＜４２５＞ｓｃＦｖおよび２−イミノチオラン修飾ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ｓｃＦｖを中性ｐＨで一緒にカップリングさせた。カップリング反応をピリジン２−チオンの放出をモニターすることによって追跡した。最終二特異性産生物をゲル濾過クロマトグラフィーで回収して、約５％の収量を得た。
【００５３】
［実施例７］
二特異性抗体の特徴づけ：
ＢＡｂ合成の各工程を、通常の公知の手法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした。化学合成の中間体および最終二特異性産生物を図２に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に加えて、ＢＡｂの純度および均質性をヒドロキシアパタイトカラム上のクロマトグラフィーによって評価した。ＢＡｂの溶出をリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．０、０〜０．３モル／リットル）の勾配によって行った。図３は、ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2のクロマトグラフ溶出図を示す。ＢＡｂは主要ピークIIによって表され、小ピークＩおよびIIIは少量の混入物である。
【００５４】
［実施例８］
ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2のＥＧＦ−Ｒへの結合特性：
二特異性抗体の結合特性を競合的ＥＬＩＳＡ分析によって比較した。すなわち、ビオチン標識したＭＡｂ４２５を非標識抗体またはＢＡｂとのＥＧＦ−Ｒへの結合を競合させるために用いた。ＥＧＲ−ＲをＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５５５）から公知の方法によって単離した。Ａ４３１細胞はＣＤ２陰性である。検出をＰＯＤ−抱合ストレプトアビジンおよび基質とインキュベートした後に行った。データから阻害曲線を作図した（図４）。右にシフトした両ＢＡｂの阻害曲線は、二価から一価の結合に変化したための親和性の欠失を示す。
【００５５】
［実施例９］
ＢＡｂ＜ＭＡｂ４２５、ＭＡｂ ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2のＥＧＦ−Ｒへの結合特性：
実施例８と同様にして、二特異性抗体の結合特性を調べた（図４）。両ＢＡｂはそれらの抗原標識に対して同じ親和性を示した。
【００５６】
［実施例１０］
二特異性および一特異性抗体フラグメントのＣＤ２抗原への結合特性：
ジャーカット細胞（ヒト急性Ｔ細胞白血病、ＣＤ２、ＣＤ３陽性、ＥＧＦ−Ｒ陰性、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ１５２、１×１０6細胞／サンプル）を二特異性／一特異性抗体フラグメントの対数希釈液とともに４℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、第二段階抗血清としてのヤギ−抗マウス−κ−ＦＩＴＣとともにインキュベートした。細胞を再び洗浄して、免疫蛍光をファクスター・プラス（ＦＡＣＳｔａｒ  ｐｌｕｓ、登録商標）を用いて分析した。リスト・モード・データ取得と、単レーザー励起を用いるファクスター・プラスを、生細胞の抗体染色を分析するために使用した。全細胞群の特異的蛍光強度および抗体反応性細胞の割合を決定した。第二段階抗血清で染色した細胞の蛍光分布は陰性対照としてのみ用いられる。
ジャーカット細胞上の異なる二特異性／一特異性抗体フラグメントの結合強度の測定値として、半飽和濃度を以下に表示する。１／２飽和濃度値は、滴定曲線（蛍光強度（直線）対抗体濃度）に基づき読み取るが、従って、凡その推定値である。
【００５７】
抗体フラグメント                                      １／２飽和濃度
ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2                ３×１０8
ＢＡｂ＜４２５，ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2      ＞１×１０7（非飽和）
ＢＡｂ＜３６１，ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2        １×１０7（非飽和）
ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2                ２×１０8
ＢＡｂ＜４２５，ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2      ＞１×１０7（非飽和）
ＢＡｂ＜１５，ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ’）2          １×１０7（非飽和）
ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ’）2                          陰性
［実施例１１］
白血球の精製末梢血単核白血球をＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）を添加した培地（ＲＰＭＩ１６４０）中で放射線照射（３０Ｇｙ）した同原腫瘍細胞とともに共培養した。応答細胞を同原腫瘍細胞を用いて毎週再刺激した。
【００５８】
健康な供血者または黒色腫患者から新鮮に調製したヒト末梢血白血球（ｈｕＰＢＬ）を９６ウェル平底マイクロタイタープレート中で２００μｌの最終容量で１×１０5細胞／ウェルの濃度で培養した。細胞を一特異性または一特異性＋二特異性抗体フラグメントと指示濃度でインキュベートした。７２時間後、細胞を０．５μＣｉ  3Ｈ−チミジンと混合し、一晩インキュベートして、回収した。3Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションβプレート計数によって測定して、結果を平均ｃｐｍで表した。ＭＡｂ４２５に由来する抗体フラグメントの結果の詳細を図５に見ることができる。同様の結果がＭＡｂ３６１およびＭＡｂ１５に由来する抗体フラグメントを用いても得られた。抗体フラグメントを組み合わせて投与する場合、それぞれの場合において増殖を有意に誘導する。
【００５９】
［実施例１２］
ＢＡｂ誘導腫瘍溶解高度に浸入性で自然転移性でＥＧＦ−Ｒ陽性のヒト黒色腫細胞系の細胞系Ｃ８１６１（Ｗｅｌｃｈら、１９９１、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７、２２７およびその引用文献）を、同種および同原腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）によるＥＧＦ−Ｒ依存性標的攻撃の標的として用いた。他のＥＧＦ−Ｒ陽性ヒト黒色腫細胞系を用いることもできる。ＴＩＬ大量培養は黒色腫標本から確立された。腫瘍細胞およびＴＩＬの培養条件は既述されている（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１、６１５３）。
【００６０】
安定なＣＴＬクローンの産生をＭＬＴＣ応答細胞を用いて限定希釈条件下で行った。ＭＴＬＣ応答Ｔ細胞を１ウェル当たり１細胞の割合でＩＬ−２およびＩＬ−４添加培地中に支持細胞としての同原刺激細胞および同原ＥＢＶ−変換Ｂ細胞とともに９６ウェルプレート中に接種した。コロニーを同原腫瘍細胞および支持細胞で毎週再刺激した。
【００６１】
新鮮腫瘍生検片からのＴリンパ球を固定化抗ＣＤ３抗体で活性化して、ＩＬ−２およびＩＬ−４を添加したＲＰＭＩ中で増殖展開させた。
【００６２】
インビトロ細胞毒性分析を51Ｃｒ−標識腫瘍細胞を用いて行った。標的細胞を51Ｃｒ（１００ｍＣｉ／１０7細胞）を用いて約１時間標識して、３回洗浄した。定常数の標識細胞（２×１０3／ウェル）を、一特異性または二特異性抗体または両者の組み合わせおよびエフェクターＴＩＬ（エフェクター／標識比：７／１）とともにインキュベートした。ＣＴＬを１００μｌの培地中で９６ウェルマイクロタイター中で連続希釈（各三組）した。標識細胞を加えた後、プレートを１０％ＣＯ2中で３７℃で４時間インキュベートした。分析を遠心分離によって終結させた。上清を集めて、放射活性をガイガーカウンターによって測定した。特異的51Ｃｒ放出率（％）を次式によって算出した。
特異的51Ｃｒ放出（％）＝１００×（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）
ＭＡｂ４２５に由来する抗体フラグメントに関する結果の詳細は、図６ａ、６ｂおよび図７に見ることができる。同様の結果が、ＭＡｂ３６１およびＭＡｂ１５に由来する抗体フラグメントを用いて得られた。抗体フラグメントの組み合わせの投与によって、それぞれの場合で腫瘍溶解が有意に誘導された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ＢＡｂの合成を示した模式図である。
【図２】図２は、抗体フラグメントおよびＢＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した説明図である。
【図３】図３は、ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ’）2のヒドロキシアパタイト上のクロマトグラフィー溶出図である。
【図４】図４は、ＢＡｂ／ＭＡｂのＥＧＦ−Ｒへの競合的結合を示す説明図である。
【図５】図５は、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）の増殖を示す説明図である。
【図６】図６ａは、ＢＡｂ誘導腫瘍溶解（エフェクター細胞としての同種ＴＩＬを使用）を説明するグラフ図である。図６ｂは、ＢＡｂ誘導腫瘍溶解（エフェクター細胞としての同原ＴＩＬを使用）を説明するグラフ図である。
【図７】図７は、ＢＡｂ媒介Ｔ細胞標的攻撃および腫瘍細胞溶解を示す写真図である。図７ＡおよびＢは４０／１のエフェクター／標的比における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と同原悪性細胞の培養物を示す。
【図１】
2005336207.tif 000003
【図２】
2005336207.tif 000004
【図３】
2005336207.tif 000005
【図４】
2005336207.tif 000006
【図５】
2005336207.tif 000007
【図６】
2005336207.tif 000008
【図７】
2005336207.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月10日(2005.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２１１８の寄託番号下で寄託された細胞系１Ｈ１０からの単離によって得られる、抗原ＣＤ２を認識するモノクローナル抗体であって、単独でＴ細胞の増殖を強い誘導することが可能である、モノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ１。
【請求項２】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２１１９の寄託番号下で寄託された細胞系７Ｄ３からの単離によって得られる、抗原ＣＤ２を認識するモノクローナル抗体であって、単独でＴ細胞の増殖を強く誘導することが可能である、モノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ２。