(57)【要約】      （修正有）【課題】分化誘導後に残る未分化ＥＳ細胞の除去を簡便に行うための方法および安全性を高めた移植専用のＥＳ細胞株の樹立を目的とする。【解決手段】Ｓｔｍ１などの未分化特異的なマーカーのプロモーターを利用して、分化誘導後に残る未分化細胞を選択することを容易にし、除去することによって上記課題を解決した。前記プロモーター配列は、特定配列に記載の塩基配列又はそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチドまたはその改変体であり得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔｍ１のプロモーター配列を含む核酸構築物。
【請求項２】
前記プロモーター配列は、
（ａ）配列番号３４に記載の塩基配列もしくはそれに対応する塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３４に記載の塩基配列もしくはそれに対応する塩基配列の対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
少なくとも１０の連続するヌクレオチド長を有する、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記生物学的活性は、プロモーター活性である、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記プロモーターとは異なる由来の外来遺伝子をコードする配列を、前記プロモーター配列に対して作動可能に連結されて、含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記外来遺伝子は、選択マーカーをコードする、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記選択マーカーは、前記核酸構築物が導入される宿主の培地での選択を可能にする、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記選択マーカーは、前記核酸構築物が導入される宿主での視覚での選択を可能にする、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記選択マーカーは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、または緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）からなる群より選択される蛍光マーカーを含む、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記選択マーカーは、前記核酸構築物が導入される宿主に対して実質的に毒性を示さない、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、細胞。
【請求項１３】
前記細胞は、前記プロモーター配列とは異種である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、組織。
【請求項１５】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、臓器。
【請求項１６】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、生物。
【請求項１７】
未分化細胞から未分化細胞を実質的に含まない分化細胞の集団を生産する方法であって、
ａ）選択マーカーを含まない未分化細胞を提供する工程；
ｂ）未分化状態に特異的なプロモーターをコードする配列と該選択マーカー遺伝子とコードする配列とが作動可能に連結された配列を有する核酸構築物を、該未分化細胞に導入する工程；
ｃ）該選択マーカーを含む細胞を選択的に増殖させる培地に該未分化細胞を配置する工程；
ｄ）該未分化細胞を分化誘導する工程；および
ｅ）該選択マーカーの発現の有無を選択し得る培地に分化された該未分化細胞を配置し、培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記未分化状態に特異的なプロモーターは、Ｓｔｍ１のプロモーター配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｓｔｍ１のプロモーター配列は、ＴＴＴＴＧＣＡＴ  ＴＡＣＡＡＴＧ（Ｏｃｔ／Ｓｏｘモチーフ配列）またはその改変体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｓｔｍ１のプロモーター配列は、配列番号３１、３２または３３に示す配列またはその改変体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｓｔｍ１のプロモーター配列は、配列番号３１、３２または３３に示す配列またはその改変体を含み、かつ、転写開始配列の上流約２．３ｋｂの全部あるいは一部を含む配列またはその改変体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択マーカーは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、または緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）からなる群より選択される蛍光マーカーを含むを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記未分化細胞は、胚性幹細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記分化誘導は、神経細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、色素細胞、幹細胞、血球系細胞、膵細胞、血管内皮細胞、粘膜上皮細胞および皮膚細胞からなる群より選択される細胞への分化を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養後、未分化状態に特異的なマーカーによって、未分化細胞の混入率を確認する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記未分化状態に特異的なマーカーは、Ｓｔｍ抗体またはＯｃｔ３／４抗体を含む、請求工２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記選択マーカーを含まない未分化細胞を樹立する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、マウス、サルおよびヒトからなる群より選択される細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子の導入は、トランスフェクション、形質転換および形質導入からなる群より選択される技術を用いる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記分化誘導は、培養条件下での分化誘導、胚様体形成による初期胚組織細胞への分化誘導、免疫不全動物への移植による奇形腫形成、胚盤胞または初期胚への移植によるキメラ胚形成、および除核未受精卵への核移植へのクローン胚または動物の作製からなる群より選択される誘導を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
前記培養後、分化細胞のみを選択する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１７に記載の方法によって生産される、分化細胞集団。
【請求項３３】
請求項１７に記載の方法によって生産される分化細胞集団に由来する、組織。
【請求項３４】
請求項１７に記載の方法によって生産される分化細胞集団に由来する、臓器。
【請求項３５】
未分化細胞から未分化細胞を実質的に含まない分化細胞の集団を生産する方法であって、
ａ）Ｓｔｍ１のプロモーター配列と該選択マーカー遺伝子とコードする配列とが作動可能に連結された配列を有する核酸構築物を、未分化細胞に導入する工程；
ｂ）該未分化細胞を培養し分化誘導する工程；および
ｃ）該選択マーカーの発現の有無に基づいて未分化細胞を除去する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記選択マーカーは、視覚による識別を可能にする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記選択マーカーは、ＧＦＰである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記除去は、セルソーターを用いて行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法によって生産される、分化細胞集団。
【請求項４０】
請求項３５に記載の方法によって生産される分化細胞集団に由来する、組織。
【請求項４１】
請求項３５に記載の方法によって生産される分化細胞集団に由来する、臓器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の未分化状態マーカープロモーターおよびその利用に関する。より詳細には、本発明は、分化した幹細胞の移植の安全性を高めるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の個体は特有の機能を発揮する様々な組織細胞の集合体として形作られている。高等生物では、この源となる細胞はたった１個の受精卵である。この受精卵と同様の多分化能をもつ細胞が幹細胞である。多分化能とはどの様な分子機構によって獲得および維持されるものかという基礎生物学的な興味に加え、近年では再生医療への応用が脚光を浴び、幹細胞研究の重要性が増している。幹細胞研究を推進する上で未分化細胞に特異的に発現する遺伝子の同定が必須になる。これまで未分化細胞特異的遺伝子として、Ｏｃｔ３／４，ＵＴＦ１，Ｓｏｘ１，Ｒｅｘ１等の遺伝子が報告されているがＵＴＦ１，Ｓｏｘ１，Ｒｅｘ１は分化細胞でも発現が見られる。したがって、現在知られる未分化細胞特異的遺伝子としては、Ｏｃｔ３／４のみが未分化細胞に比較的厳密に特異的といえる。
【０００３】
Ｏｃｔ３／４は遺伝子欠損の実験から未分化維持に必須であることが明らかになっている。また、この遺伝子の遺伝子発現量により分化の方向が決定されているらしい（非特許文献１）。Ｏｃｔ３／４を中心としてその上流および下流に位置する遺伝子の同定により未分化維持機構の解明が待たれている。Ｏｃｔ３／４遺伝子の発現が未分化のどの状態を反映するかは現在も不明のままであるが、未分化細胞の重要なマーカー遺伝子であることは間違いない。Ｏｃｔ３／４遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター蛍光遺伝子であるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等をつないだ外来遺伝子を導入したトランスジェニックマウスでは、ＧＦＰの発現により未分化な生細胞の精製が可能になってきている。
【０００４】
上述のように、Ｏｃｔ３／４のような未分化状態を判定するためのツールはあるものの、Ｏｃｔ３／４などの遺伝子は、未分化状態でない場合にも発現することがあることから、真の意味でのマーカーとして使用することができない。また、Ｏｃｔ３／４は、胚性幹細胞で発現がみられるものの、未受精卵細胞において発現が見られたり、他の幹細胞（たとえば組織幹細胞）では発現が消失することから、多能性のマーカーとしての精確度は完全ではなく、その用途も限定されている。
【０００５】
近年胚性幹（ＥＳ）細胞のような未分化細胞の利用が頻繁に行われるようになっている。なぜなら、胚性幹細胞は、あらゆる組織細胞に分化誘導可能なことから、細胞移植治療の細胞供給源として利用できるからである。しかし、移植細胞には拒絶反応があり、かつ、分化しそこなった幹細胞が移植後にテラトーマを形成する可能性を否定てきないという大きな問題がある。
【非特許文献１】Ｎｉｗａ，  Ｈ．，  Ｍｉｙａｚａｋｉ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ａ．  Ｇ．  （２０００）．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｃｔ−３／４  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４，  ３７２−３７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、分化誘導後に残る未分化ＥＳ細胞の除去を簡便に行うための方法および安全性を高めた移植専用のＥＳ細胞株の樹立を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ｓｔｍ１などの未分化特異的なマーカーのプロモーターを、利用して、分化誘導後に残る未分化細胞を洗濯することを容易にし、除去することによって上記課題を解決した。
【０００８】
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）  Ｓｔｍ１のプロモーター配列を含む核酸構築物。
（２）  上記プロモーター配列は、
（ａ）配列番号３４に記載の塩基配列もしくはそれに対応する塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３４に記載の塩基配列もしくはそれに対応する塩基配列の対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
項目１に記載の核酸構築物。
（３）  少なくとも１０の連続するヌクレオチド長を有する、項目１に記載の核酸構築物。
（４）  上記生物学的活性は、プロモーター活性である、項目２に記載の核酸構築物。
（５）  上記プロモーターとは異なる由来の外来遺伝子をコードする配列を、上記プロモーター配列に対して作動可能に連結されて、含む、項目１に記載の核酸構築物。
（６）  上記外来遺伝子は、選択マーカーをコードする、項目５に記載の核酸構築物。
（７）  上記選択マーカーは、上記核酸構築物が導入される宿主の培地での選択を可能にする、項目６に記載の核酸構築物。
（８）  上記選択マーカーは、上記核酸構築物が導入される宿主での視覚での選択を可能にする、項目６に記載の核酸構築物。
（９）  上記選択マーカーは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、または緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）からなる群より選択される蛍光マーカーを含む、項目６に記載の核酸構築物。
（１０）  上記選択マーカーは、上記核酸構築物が導入される宿主に対して実質的に毒性を示さない、項目６に記載の核酸構築物。
（１１）  項目１に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
（１２）  項目１に記載の核酸構築物を含む、細胞。
（１３）  上記細胞は、上記プロモーター配列とは異種である、項目１２に記載の細胞。
（１４）  項目１に記載の核酸構築物を含む、組織。
（１５）  項目１に記載の核酸構築物を含む、臓器。
（１６）  項目１に記載の核酸構築物を含む、生物。
（１７）  未分化細胞から未分化細胞を実質的に含まない分化細胞の集団を生産する方法であって、
ａ）選択マーカーを含まない未分化細胞を提供する工程；
ｂ）未分化状態に特異的なプロモーターをコードする配列と上記選択マーカー遺伝子とコードする配列とが作動可能に連結された配列を有する核酸構築物を、上記未分化細胞に導入する工程；
ｃ）上記選択マーカーを含む細胞を選択的に増殖させる培地に上記未分化細胞を配置する工程；
ｄ）上記未分化細胞を分化誘導する工程；および
ｅ）上記選択マーカーの発現の有無を選択し得る培地に分化された上記未分化細胞を配置し、培養する工程、
を包含する、方法。
（１８）  上記未分化状態に特異的なプロモーターは、Ｓｔｍ１のプロモーター配列を含む、項目１７に記載の方法。
（１９）  上記Ｓｔｍ１のプロモーター配列は、ＴＴＴＴＧＣＡＴ  ＴＡＣＡＡＴＧ（Ｏｃｔ／Ｓｏｘモチーフ配列；ここで、ＴＴＴＴＧＣＡＴは、Ｏｃｔモチーフ配列であり、ＴＡＣＡＡＴＧはＳｏｘモチーフ配列である）またはその改変体を含む、項目１８に記載の方法。
（２０）  上記Ｓｔｍ１のプロモーター配列は、転写開始点から上流３９０ｂｐ（例えば、配列番号３１、３２または３３に示す配列）またはその改変体を含む、項目１８に記載の方法。
（２１）  上記Ｓｔｍ１のプロモーター配列は、配列番号３１、３２または３３に示す配列またはその改変体を含み、かつ、転写開始配列の上流約２．３ｋｂの全部あるいは一部を含む配列またはその改変体を含む、項目１８に記載の方法。
（２２）  上記選択マーカーは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、または緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）からなる群より選択される蛍光マーカーを含むを含む、項目１７に記載の方法。
（２３）  上記未分化細胞は、胚性幹細胞を含む、項目１７に記載の方法。
（２４）  上記分化誘導は、神経細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、色素細胞、幹細胞、血球系細胞、膵細胞、血管内皮細胞、粘膜上皮細胞および皮膚細胞からなる群より選択される細胞への分化を含む、項目１７に記載の方法。
（２５）  上記培養後、未分化状態に特異的なマーカーによって、未分化細胞の混入率を確認する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（２６）  上記未分化状態に特異的なマーカーは、Ｓｔｍ抗体またはＯｃｔ３／４抗体を含む、請求工２５に記載の方法。
（２７）  上記選択マーカーを含まない未分化細胞を樹立する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（２８）  上記細胞は、マウス、サルおよびヒトからなる群より選択される細胞を含む、項目１７に記載の方法。
（２９）  上記遺伝子の導入は、トランスフェクション、形質転換および形質導入からなる群より選択される技術を用いる、項目１７に記載の方法。
（３０）  上記分化誘導は、培養条件下での分化誘導（例えば、神経細胞、血管内皮細胞、筋肉細胞、色素細胞、膵細胞などの特定組織細胞への分化誘導）、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）形成による初期胚組織細胞への分化誘導（例えば、神経、血球系、生殖細胞など）、免疫不全動物への移植による奇形腫（テラトーマ）形成、胚盤胞または初期胚への移植によるキメラ胚形成、および除核未受精卵への核移植へのクローン胚または動物の作製からなる群より選択される誘導を含む、項目１７に記載の方法。
（３１）  上記培養後、分化細胞のみを選択する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（３２）  項目１７に記載の方法によって生産される、分化細胞集団。
（３３）  項目１７に記載の方法によって生産される分化細胞集団に由来する、組織。
（３４）  項目１７に記載の方法によって生産される分化細胞集団に由来する、臓器。
（３５）  未分化細胞から未分化細胞を実質的に含まない分化細胞の集団を生産する方法であって、
ａ）Ｓｔｍ１のプロモーター配列と上記選択マーカー遺伝子とコードする配列とが作動可能に連結された配列を有する核酸構築物を、未分化細胞に導入する工程；
ｂ）上記未分化細胞を培養し分化誘導する工程；および
ｃ）上記選択マーカーの発現の有無に基づいて未分化細胞を除去する工程、
を包含する、方法。
（３６）  上記選択マーカーは、視覚による識別を可能にする、項目３５に記載の方法。
（３７）  上記選択マーカーは、ＧＦＰである、項目３５に記載の方法。
（３８）  上記除去は、セルソーターを用いて行われる、項目３５に記載の方法。
（３９）  項目３５に記載の方法によって生産される、分化細胞集団。
（４０）  項目３５に記載の方法によって生産される分化細胞集団に由来する、組織。
（４１）  項目３５に記載の方法によって生産される分化細胞集団に由来する、臓器。
【０００９】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および添付の図面、ならびに当上記分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００１０】
未分化状態の判定、全能性、多能性のより詳細な判定など、従来の因子では不可能であった、幹細胞の精確な判定が達成された。また、本発明の方法を用いれば、ＥＳ細胞、胚細胞などの幹細胞の精製を効率よく行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１２】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１３】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００１４】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞も使用され得る。
【００１５】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００１６】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【００１７】
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞が使用され得る。
【００１８】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
【００１９】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では、樹立された幹細胞を使用することは、宿主から新たに幹細胞を採取するという工程を回避することができるので好ましい。
【００２０】
本明細書において、「非胚性」とは、初期胚に直接由来しないことをいう。従って、初期胚以外の身体部分に由来する細胞がこれに該当するが、胚性幹細胞に改変（例えば、遺伝的改変、融合など）を加えて得られる細胞もまた、非胚性細胞の範囲内にある。
【００２１】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。従って、本発明の１つの実施形態において、本発明のＳｔｍ遺伝子を発現させた細胞は、起源として分化細胞を用いても、多能性を獲得することができる。
【００２２】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。従って、本発明のＳｔｍ遺伝子は、未分化細胞のマーカーとして非常に有用であり得る。
【００２３】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２４】
本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ただし、明確に区別する場合は、全能性と多能性とは区別され得、前者はどのような細胞へも分化し得る能力をいい、後者は、複数の方向を有するが、生物が可能なすべての方向には分化できない能力を有することをいう。また、１つの方向にのみ分化する能力は、単能性ともいう。
【００２５】
本明細書において全能性と多能性とは、例えば、受精後の日数により判定することができ、例えば、マウスであれば、受精後約８日を基準として区別され得る。理論に束縛されないが、マウスでは、受精後、以下のような経過をたどることが通常である。受精後６．５日（Ｅ６．５とも表記する）では、原始線条（原条ともいう）がエピブラストの片側に出現し、胚の将来の前後軸が明らかになる。原条は、胚の将来の後方端を示し、外胚葉を横切って円筒の遠位端まで達する。原条は、細胞運動が行われる領域であり、その結果、将来の内胚葉と中胚葉とが形成されることになる。Ｅ７．５までに結節の前方に頭部突起が出現し、この部分には脊索と、それを取り囲んで下層には将来の内胚葉、上層には神経板が形成されることになる。結節は、Ｅ６．５日ごろから現れ、後方へと移動し、軸構造が前から後ろへと形成される。Ｅ８．５日までに胚は幾分丈が長くなり、その前端には大部分前方神経板からなる大きな頭部ヒダが形成される。体節はＥ８日から１．５時間に１個の割合で前方から後方へと形成され始める。この時期を越えた細胞は、仮に胎盤に戻したとしても、脱分化をしない限りもはや全能性を示さず、個体を形成しない。これより前では特別の処理をしなくても全能性を示し得ることから、この点が全能性の分岐点であるといえる。このことは、ＥＳ細胞がこれ以降の胚から樹立することが困難であり、これ以降の胚からは通常ＥＧ（生殖細胞由来）細胞と呼ばれる細胞が樹立されることから、そのような意味でも分岐点であるといえる。したがって、１つの局面において、本発明のＳｔｍ１は、全能性の有無またはＥＳ細胞の出発材料としての適切性を判断するのに使用することができるといえる。
【００２６】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。
【００２７】
本発明が対象とする臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明の多能性細胞から分化した細胞としては、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００２８】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／-または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。
【００２９】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００３０】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００３１】
用語「核酸分子」もまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、Ｓｔｍ１遺伝子には、Ｓｔｍ１のスプライス変異体もまた包含され得る。また本明細書においてＳｔｍ１遺伝子と言う場合には、Ｓｔｍ１遺伝子領域の全てまたは一部を含む転写産物を包含する。
【００３２】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、Ｓｔｍ遺伝子またはその産物と同様の機能を有する限り、そのような複合分子も使用することができる。
【００３３】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００３４】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。  
【００３６】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、Ｓｔｍ遺伝子というときは、通常、Ｓｔｍの構造遺伝子およびＳｔｍのプロモーターの両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００３７】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
【００３８】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００３９】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
【００４０】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【００４１】
用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００４２】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００４３】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌクレオチドのアンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。本明細書において、Ｓｔｍ２遺伝子とＳｔｍ１遺伝子とは、相違する部分があるが、このような相違する部分は、他の種のＳｔｍ２遺伝子とＳｔｍ１遺伝子とにおいて対応するといえる。
【００４４】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウスＳｔｍ遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスＳｔｍ１遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００４５】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００４７】
本明細書において「Ｓｔｍ」または「Ｓｔｍ遺伝子」とは、Ｓｔｍ１遺伝子のＤＮＡ塩基配列との比較により何らかの相同性が見いだされる遺伝子全てを示す。遺伝子発現が見られるものでは、未分化細胞、初期胚もしくは生殖細胞のいずれかまたはいくつかの細胞において発現する。そのようなＳｔｍ遺伝子としては、例えば、
（Ａ）（ａ）配列番号１、３、５、７、９または２９に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０または３０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９または２９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子；あるいは
（Ｂ）（ａ）配列番号２、４、６、８、１０または３０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０または３０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９または２９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０または３０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、
ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられるがそれらに限定されない。Ｓｔｍ遺伝子は好ましくは、
（Ａ）  （ａ）配列番号１、３、５または２９に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１、３、５または２９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子；あるいは
（Ｂ）（ａ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、５または２９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、
ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４８】
Ｓｔｍ遺伝子は、Ｓｔｍ１遺伝子、Ｓｔｍ２遺伝子、Ｓｔｍ３遺伝子、Ｓｔｍ４遺伝子を含む。本明細書において特に区別するとき、遺伝子は斜字体で記載し、マウスのものはＳｔｍ、ヒトのものはＳＴＭと標記するが、通常は特定の種を意味しない。他方、タンパク質は斜字体ではないＳＴＭと示して区別することがあるが、通常は特定の種を意味しない。
【００４９】
本明細書において「Ｓｔｍ１」および「Ｓｔｍ１遺伝子」とは、配列番号１、３、５または２９に記載される核酸配列または配列番号２、４、６または３０に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む遺伝子ならびにそれに対応する遺伝子（種相同体を含む）をいう。Ｓｔｍ１のその遺伝子産物を特定するためには、好ましくは、全長アミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製した特異的な抗体を用いる。Ｓｔｍ１遺伝子は、Ｎａｎｏｇと呼ばれる遺伝子と同一であることがわかっている。
【００５０】
本明細書において「Ｓｔｍ２」および「Ｓｔｍ２遺伝子」とは、配列番号７または９に記載される核酸配列または配列番号８または１０に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む遺伝子ならびにそれに対応する遺伝子（種相同体を含む）をいう。マウスＳｔｍ２はＳｔｍ１に対してｍＲＮＡのコーディング領域の塩基配列が９９．６％相同性のある遺伝子である。しかし、Ｓｔｍ２遺伝子はイントロンレスのシングルエクソンからなる遺伝子構造をもち、４個のエクソンと３個のイントロンをもつＳｔｍ１とは構造が異なる上、Ｓｔｍ１とＳｔｍ２は異なる染色体上に位置することが解っている。本発明によって、Ｓｔｍ２は、マウス７番染色体７Ｅ３に位置することが明らかになった。なお、Ｓｔｍ１とＳｔｍ２とは、マウスの場合９９．６％の相同性を有する。
【００５１】
Ｓｔｍ１とＳｔｍ２との決定的な相違は、細胞における発現の有無である。Ｓｔｍ１は発現される遺伝子であるのに対し、Ｓｔｍ２は、通常の細胞では発現されず、偽遺伝子であることが判明している。
【００５２】
本明細書において、「ＳＴＭ」、「ＳＴＭタンパク質」、「ＳＴＭ１」、「ＳＴＭ１タンパク質」、「ＳＴＭ２」、「ＳＴＭ２タンパク質」という表現は、それぞれの遺伝子（Ｓｔｍ、Ｓｔｍ１、Ｓｔｍ２など）のタンパク質形態を示すために使用される。
【００５３】
本明細書において「未分化状態に特異的なマーカーのプロモーター」とは、細胞の未分化状態において、他の少なくとも１つの状態よりも多く発現を促進することを特徴とするプロモーターをいう。このような未分化状態に特異的なマーカーとして、Ｓｔｍ１、Ｏｃｔ３／４、Ｕｔｆ−１、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｆｂｘ１５などが挙げられるがそれらに限定されない。Ｏｃｔ３／４では、組織特異的なエンハンサー（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）の存在が知られ、本来の発現パターンを反映させようとする場合には、そのようなエンハンサーの存在を考慮する必要がある。このためには、１０ｋｂｐ以上の配列が必要となることがあり、そのために、Ｂａｃクローンなどでは、１０ｋｂｐ以上必要となることから、Ｏｃｔ３／４のプロモーターを利用するよりは、本発明の好ましい実施形態であるＳｔｍ１のプロモーターを利用することがはるかに有利であり得る。
【００５４】
本明細書において、「Ｓｔｍ１のプロモーター配列」は、Ｓｔｍ１遺伝子に関連するプロモーター配列をいう。そのような配列は、配列番号３４（マウス）またはそれに対応する配列などが挙げられるがそれらに限定されない。Ｓｔｍ１遺伝子の発現制御には、転写開始点から上流３９０ｂｐがあることが好ましく、その塩基配列としては、配列番号３１（ヒト）、３２（マウス）、３３（カニクイサル）に示される配列などが挙げられる。その中でも、Ｏｃｔ／Ｓｏｘ（転写開始点を起点とすれば−１８０位〜−１６６位、ＴＴＴＴＧＣＡＴ  ＴＡＣＡＡＴＧ（Ｏｃｔ／Ｓｏｘモチーフ配列；ここで、ＴＴＴＴＧＣＡＴは、Ｏｃｔモチーフ配列であり、ＴＡＣＡＡＴＧはＳｏｘモチーフ配列である））がモチーフとなることが、塩基配列置換の実験から明らかになった。
【００５５】
本明細書において「外来遺伝子」とは、ある生物において、その生物には天然には存在しない遺伝子をいう。そのような外来遺伝子は、その生物に天然に存在する遺伝子を改変したものであってもよく、天然において他の生物に存在する遺伝子（例えば、Ｓｔｍ１遺伝子）であってもよく、人工的に合成した遺伝子であってもよく、それらの複合体（例えば、融合体）であってもよい。そのような外来遺伝子を含む生物は、天然では発現しない遺伝子産物を発現し得る。
【００５６】
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。本明細書において用いられる「増殖因子」とは、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
【００５７】
本発明において、発現されるべき外来遺伝子は、上述の天然型の外来遺伝子と相同性のあるものが使用され得る。そのような相同性を有する外来遺伝子としては、例えば、Ｂｌａｓｔのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、比較対照の外来遺伝子に対して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有する核酸配列を含む核酸分子または少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド分子が挙げられるが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５８】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００５９】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００６０】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００６１】
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子（例えば、Ｓｔｍ）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。このようなアンチセンス活性を有する分子をアンチセンス分子という。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。
【００６２】
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【００６３】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００６４】
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【００６５】
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【００６６】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
【００６７】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
【００６８】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００６９】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【００７０】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００７１】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
【００７２】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００７３】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００７４】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００７５】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７６】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００７７】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００７８】
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基をいう。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【００７９】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
【００８０】
本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」とは、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルが、その核酸分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド（例えば、転写因子など）などが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプター−リガンドの対のいずれか一方、酵素−基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８１】
本明細書において用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
【００８２】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、同質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。
【００８３】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら（１９８２）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １８：３７７）を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合したタンパク質で免疫化し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞を解離する。必要に応じて、この脾臓細胞は、非特異的接着細胞の除去後、抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することにより、スクリーニングされ得る。抗原に特異的なイムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞（すなわちすべての剥離した脾臓細胞）をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させる。
【００８４】
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。
【００８５】
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００８６】
（遺伝子の改変）
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００８７】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【００８８】
親水性指数もまた、ポリペプチドの設計において考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００８９】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００９１】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。本明細書では、好ましくは、この保存的置換は、Ｓｔｍ１遺伝子とＳｔｍ２遺伝子との間で共通する部分の置換であることが有利であり得る。保存的置換があったとしてもＳｔｍ１遺伝子とＳｔｍ２遺伝子とを識別することがなおも可能であるからである。
【００９２】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００９３】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
【００９４】
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
【００９５】
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【００９６】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００９７】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００９８】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
【００９９】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１００】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１０１】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該分野において多数存在し、販売元により、微妙な違い（例えばマルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を変えて販売されている。例えば、Ｉｎ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３  （Ｖｏｌｕｍｅ  ３），  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａ３．２  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＵＳＡ，  ２００１）  に代表的なものが記載（発売元も記載）されており、そのようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
【０１０２】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１０３】
本明細書において使用される組み換えベクターとしては、例えば、ゲノムライブラリーのスクリーニングにはラムダＦＩＸベクター（ファージベクター）を、ｃＤＮＡのスクリーニングではラムダＺＡＰベクター（ファージベクター）を利用することができる。ゲノムＤＮＡのクローニングにはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−，  ｐＧＥＭ，  ｐＣＲ２．１  ベクター（プラスミドベクター）を主に使用することができる。発現ベクターとしてｐＳＶ２ｎｅｏベクター（プラスミドベクター）を利用することができる。このようなベクターは、前出のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ３．２を参考にして適宜実施することができる。
【０１０４】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０１０５】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【０１０６】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１０７】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１０８】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。  そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１０９】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１１０】
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１１１】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示され、そのような細胞は、Ｉｎ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３  （Ｖｏｌｕｍｅ  ３），  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａ３．２  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＵＳＡ  ２００１）  に記載されている。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５が例示され、好ましくは、例えば、Ｃｏｓ１，  ＮＩＨ３Ｔ３，  ＥＳ  （Ｒ１，  ＴＭＡ，  ＮＲ２）細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
【０１１４】
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。
【０１１５】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法  ・  中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１１６】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１１７】
（ポリペプチドの製造方法）
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
【０１１８】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１１９】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【０１２０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【０１２１】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
【０１２２】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１２３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【０１２４】
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【０１２５】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
【０１２６】
また、本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【０１２７】
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１２８】
また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。
【０１２９】
さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
【０１３０】
上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても本発明のポリペプチドを製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
【０１３１】
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明の新規ｐｓ２０様ポリペプチドの生理活性は、公知の測定法［Ｃｅｌｌ，７５，１３８９（１９９３）、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．ｌ１４６，２３３（１９９９）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，１２３８（１９９８）、Ｎｅｕｒｏｎ  １７，１１５７（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，１１９７（２０００）］に準じて測定することができる。
【０１３２】
（変異型ポリペプチドの作製方法）
本発明ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
【０１３３】
（免疫化学）
本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。
【０１３４】
抗体を生産する場合、投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。その抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）またはウシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。その抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で確認する。
【０１３５】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。モノクローナル抗体の作製もまた当該分野において周知である。抗体産性細胞の調製のために、まず、免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどより、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。このようにして得たハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体は種々の目的に使用することができる。
【０１３６】
このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法に使用することができ、本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的検出法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。
【０１３７】
また、本発明ポリペプチドの免疫学的定量方法にも使用することができる。本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２６Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のタンパク質と本発明のタンパク質を認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等を挙げることができる。
【０１３８】
本発明ポリペプチドのｍＲＮＡの定量方法もまた、当該分野において周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドあるいはＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレベルで定量することができる。このような技術は、当該分野において周知であり、本明細書において列挙した文献にも記載されている。
【０１３９】
当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに次いでＰＣＲによるこの連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０１４０】
抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸から作製することができる。ある抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリーまたは抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得ることができる。ＰＣＲによって作製された増幅された核酸は、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１４１】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し得る。
【０１４２】
特定の実施形態において、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０１４３】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体などの非ヒト抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂなどの非ヒトｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０１４４】
単鎖抗体を製造する場合、単鎖抗体の産生に関する記載された公知の技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９））が、利用され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１４５】
（抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。
【０１４６】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開  ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
【０１４７】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、次いで、このトランスフェクトされた細胞は、本発明の抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
【０１４８】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。
【０１４９】
本明細書において、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」ともいう。この場合、本発明の抗体または単鎖抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の遺伝子の転写産物・翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。
【０１５０】
これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような細胞増殖および／または分化を起こし得るかまたは未分化状態への改変処置を行ったような細胞集団のような、未分化の細胞（例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞など）を含む細胞集団についてスクリーニングするために利用され得る。
【０１５１】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０１５２】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【０１５３】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０１５４】
（治療活性または予防活性の証明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０１５５】
（治療／予防のための投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０１５６】
本発明の核酸分子またはポリペプチドが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０１５７】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０１５８】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１５９】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【０１６０】
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
【０１６１】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版、その追補またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【０１６２】
本発明の処置方法において使用される糖鎖組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１６３】
（再プログラム化）
本明細書において「再プログラム化」とは、細胞（たとえば、体細胞）に作用して、その細胞を未分化状にさせ、多能性を増加または獲得させることをいう。従って、再プログラム化の活性は、ある因子を、分化した細胞（たとえば、体細胞）に、測定すべき量を一定時間（例えば、数時間など）暴露させた後に、多能性を測定し、暴露前のその細胞の多能性と比較して、有意な差異が見出されるかどうかを判定することによって測定される。再プログラム化のレベルは、種々存在し、再プログラム化された細胞の多能性のレベルに対応する。したがって、全能性の幹細胞由来の再プログラム化因子を用いる場合には、再プログラム化は全能性に対応することがあり得る。したがって、再プログラム化状態は、本明細書において、未分化状態とほぼ１：１の関係にある。
【０１６４】
本明細書において、「再プログラム化因子」または「再プログラム化する因子」とは、細胞に作用し、その細胞を未分化細胞化する因子である。胚性幹細胞は体細胞核のインプリントを再プログラム化することはできないが、生殖細胞の発達は可能とするよう、体細胞核のエピジェネティクス状態を再プログラム化した。従って、胚性幹細胞中にそのような再プログラム化因子が含まれることは明らかである。また、胚性幹細胞以外の他の幹細胞にも体細胞を再プログラム化する因子がある可能性があり、本発明の再プログラム化因子はまたこれらの因子をも包含する。体細胞に作用させる胚性幹細胞由来の成分としては、胚性幹細胞中に含まれる成分であれば特に限定されないが、細胞質成分、核成分等、また個々のＲＮＡおよびタンパク質等が挙げられる。雑多な分子を含む細胞質成分または核成分を作用させる場合、慣用な手段により（例えば、クロマトグラフィー等）ある程度の分画を行い、分画された各画分を体細胞に対して作用させても良い。特定の画分が再プログラム化因子を含むことが判明した場合には、該画分をさらに精製し、最終的には一つの分子として特定し、それを利用することもできる。また代わりに、この再プログラム化因子が含まれる画分をそのまま、何ら精製することなく体細胞の再プログラム化に用いることも可能である。また、再プログラム化因子は、一分子が単独でそのような作用を示す場合も考え得るが、複数の分子が相互作用により、体細胞を未分化様細胞へと変化させることも考えられる。従って、本発明の「再プログラム化因子」には、単一分子からなる因子、複数分子からなる因子、および、前記単一分子または複数分子が含まれる組成物が包含される。
【０１６５】
本発明の再プログラム化因子のスクリーニング方法としては、胚性幹細胞由来の成分を体細胞に接触、注入等の手段により作用させ、本発明のＳｔｍ遺伝子−ＧＦＰマーカー遺伝子の発現、Ｘ染色体の活性化等の再プログラム化の指標となる活性を基にその作用を検出し、そして、再プログラム化活性を有していた成分を選択することにより行うことができる。
【０１６６】
本発明の「胚性幹細胞中に含まれる再プログラム化因子」は、上述のようなスクリーニング方法によりスクリーニングし、取得することができる。再プログラム化因子は、ヒストンＨ３−Ｌｙｓ４のメチル化酵素またはメチル化に関わる因子であり得る。また、このような成分が胚性幹細胞以外（例えば、組織幹細胞）にも含まれる可能性があるが、一度、胚性幹細胞から上述の方法によって、再プログラム化因子が特定されれば、その再プログラム化因子を基に、その他の材料より再プログラム化因子を得ることも、製造することも可能である。例えば、上述の方法により得られた再プログラム化因子がＲＮＡであれば、そのＲＮＡの配列決定を行い、同じ配列のＲＮＡを周知の手法により合成することが可能である。また、再プログラム化因子がタンパク質であった場合には、そのタンパク質に対する抗体を作製し、抗体への結合性を利用してその他、そのような因子が含まれ得る材料より再プログラム化因子を取得することができる。また代わりに、このタンパク質の部分アミノ酸配列決定を行い、該アミノ酸をコードする遺伝子とハイブリダイズするようなプローブを作製し、ハイブリダイズ法により該タンパク質をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを得ることもできる。また、プライマーを作製し、ＰＣＲ法により、そのような遺伝子を増幅して取得することも考え得る。前述のいずれの方法を含む種々の方法により得られた再プログラム化因子をコードする遺伝子を用いて、周知の遺伝子組換えの手法により目的とする再プログラム化因子を製造することができる。従って、本発明の「胚性幹細胞中に含まれる再プログラム化因子」は、必ずしも胚性幹細胞から得る必要はなく、多能性を有する細胞（たとえば、組織幹細胞）などからも得ることができる。従って、再プログラム化因子には、体細胞を再プログラム化させ得るような全ての因子が包含される。
【０１６７】
再プログラム化する因子をスクリーニングする方法は、適当な体細胞に対して、胚性幹細胞由来の成分を作用させ、該成分の体細胞を再プログラム化する活性を検出し、そして、再プログラム活性を有する成分を選択することにより達成され得る。本明細書において用いられ得る体細胞としては、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞等を例示することができる。特に、これらに限定されるわけではなく、正常な染色体を有した体細胞であり、安定に増殖させることができ、再プログラム化因子の作用により多分化能を有する未分化細胞様に変化することができれば特に限定されない。特に、作用させる胚性幹細胞由来の成分が由来する種由来であることが好ましい（例えば、胚性幹細胞由来の成分がヒト由来である場合、ヒト由来の体細胞）。既に確立されている細胞株を用いることも可能である。
【０１６８】
本発明の細胞より細胞、組織または臓器を製造する方法において、細胞を分化させる方法は、その細胞の核型が実質的に保持されるような状態で細胞、組織または臓器が分化され得るのであれば特に限定されない。例えば、胚盤胞への導入、マウス等の動物への皮下注射によりテラトーマを形成させること等により細胞、組織、および臓器へと分化させることが可能である。所望の細胞、組織または臓器は、それらの分化された胚盤胞またはテラトーマから単離することができる。インビトロで目的とする種類の細胞を得るために必要とされる細胞増殖因子、成長因子等を添加し、細胞から所望の細胞、組織または臓器を誘導してもよい。現在までに、血管、神経細胞、筋肉細胞、造血細胞、皮膚、骨、肝臓、膵臓等への胚性幹細胞からの誘導が報告されており、本発明の多能性幹細胞からの移植個体に対応する細胞、組織または臓器の製造においても、それらの技術を適用することができる（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｅ．Ｔ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｌ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１０７１６−２１；Ｂｏｈｅｌｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｃｚｙｚ，Ｊ．，Ｔｗｅｅｄｉｅ，Ｄ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．Ｔ．，Ａｎｉｓｉｍｏｖ，Ｓ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｗｏｂｕｓ，Ａ．Ｍ．（２００２）．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９１，１８９−２０１）。
【０１６９】
本発明の細胞からの細胞、組織または臓器の製造方法において幹細胞（たとえば、胚性幹細胞）を使用する場合、適当な個体から幹細胞（たとえば、神経幹細胞、胚性幹細胞）を確立して用いることも可能であるが、既に確立されている、種々の生物由来の幹細胞（たとえば、神経幹細胞、胚性幹細胞）を利用することが好ましい。例えば、マウス、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ミンク、ウサギ、アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類、およびヒトの幹細胞（たとえば、胚性幹細胞）を挙げることができる。好ましくは、使用する体細胞と同じ種由来の幹細胞（たとえば、胚性幹細胞）を用いる。
【０１７０】
（Ｓｔｍ遺伝子の説明）
初期胚由来の胚性幹細胞、胚性幹細胞と始原生殖細胞由来の生殖性幹細胞、ＥＧ細胞のｍＲＮＡを比較し両細胞で高発現する遺伝子を同定した。本新規遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。また、マウスゲノムでの遺伝子の構造を決定した。サザンハイブリダイゼーション解析の結果から、マウスには４個の相同遺伝子があることが推測された。そのうち、ｃＤＮＡの塩基配列を用いたデータベースの検索から少なくとも１つの相同遺伝子の塩基配列が明らかになっている。また、ヒトデーターベース検索の結果から、同様に４個の相同遺伝子の存在が推測された。
【０１７１】
Ｓｔｍ遺伝子の発現パターンを解析する目的で、初期胚と生殖細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。１２．５日齢胚では発現しないが、雌雄生殖巣では発現が認められた。また、未受精卵では発現が検出されなかったが、胚盤胞から７．５日齢胚で発現が検出された。より発生後期の胚では発現が抑制されていた。これらの結果は、本遺伝子が未分化細胞得的に発現することを示している。他の未分化特異的発現遺伝子Ｏｃｔ４との比較により、少なくとも未受精卵での発現パターンが異なる事が示された。胚性幹細胞ではＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンハイブリダイゼーション法により高発現が認められている。初期胚における本遺伝子の発現部位決定を目的に、現在本遺伝子の制御下にレポーター遺伝子の導入を進めている。
【０１７２】
Ｓｔｍ遺伝子の医療応用としては以下のようなものが挙げられる。例えば、胚性幹細胞および組織幹細胞などの多分化能性細胞を特異的な組織細胞に分化させ、その細胞移植により機能を肩代わりさる再生医療が近未来の治療法として注目されている。胚性幹細胞および他の多能性幹細胞が未分化状態を維持しているかの確認のためには複数のマーカー分子が必要である。本遺伝子は未分化細胞のマーカー遺伝子の一つとして最適である。また、個人の体細胞から再プログラム化という過程を経て再生医療に応用可能な多能性細胞を生み出す機構および因子の解明に世界が注目している。体細胞核の再プログラム化の機構を知るには複数の未分化特異的マーカーを使い再プログラム化がどの程度進んでいるか知る必要がある。本遺伝子は再プログラム化のマーカーとしても重要な役割を果たす可能性がある。
【０１７３】
本発明で明らかになったことによれば、Ｓｔｍ遺伝子はＯｃｔ３／４と似た遺伝子発現のパターンを示すが、相違点も多々ある。また、ホメオボックスをもち転写因子として働くことが予想される。あるいは、テロメアサイズとの関連、細胞老化マーカーとしてのβガラクトシダーゼ活性との関連も注目される。事実、本発明者らのデータから核への局在が示唆されており未分化性維持に重要な働きを果たすことは確実である。従ってＳＴＭタンパク質は、細胞の若返りをもたらす新薬またはそのスクリーニングのツールとして有用であり得る。
【０１７４】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１７５】
（Ｓｔｍ遺伝子の核酸形態）
従って、１つの局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子に関する。そのようなＳｔｍ遺伝子は、
（ａ）配列番号１、３、５または２９に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１、３、５または２９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子であり得る。
【０１７６】
１つの好ましい実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、Ｓｔｍ１遺伝子産物と類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
【０１７７】
別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、未分化性維持などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、そのような生物学的活性は、未分化性維持を含む。Ｓｔｍは細胞の未分化性維持に重要な働きをしていると考えられる。具体的にはホメオドメインをもつことから組織細胞に分化を誘導する様な下流遺伝子の発現を抑制していると推測される。この活性を測定するためには、遺伝子欠損実験、ＲＮＡｉ実験、抗体によるタンパク質機能阻害実験等が考えられる。
【０１７８】
別の好ましい実施形態において、対立遺伝子変異体は、配列番号１、３、５または２９に示す核酸配列と少なくとも９０％の相同性を有することが好ましい。同一系統内のものなどでは、例えば、そのような対立遺伝子変異体は少なくとも９９％の相同性を有することが好ましい。さらに好ましくは、そのような対立遺伝子変異体は、９９．７％以上の相同性を有することが有利である。特に、そのような対立遺伝子変異体は、Ｓｔｍ１遺伝子とＳｔｍ２遺伝子との間で相違する配列は相違したままであることが好ましい。
【０１７９】
上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明のＳｔｍ遺伝子をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明のＳｔｍ遺伝子の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号１、３、５または２９に示す核酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。種相同性は、好ましくは、配列番号１、３、５または２９に示す核酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有する。
【０１８０】
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０１８１】
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、少なくとも８の連続するヌクレオチドであり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、マーカー）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１、３、５または２９に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０１８２】
より好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１、３、５または２９に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；または（ｂ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであり得る。
【０１８３】
ある好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、（ａ）配列番号３に記載の塩基配列の１０３７位〜１６０７位もしくは２４４位〜１１２６位またはそれらに対応する位置の塩基配列、あるいはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含み得る。ここで、Ｓｔｍマーカーとして使用することができる配列は、例えば、配列番号３における１０３７−１０５６位（Ｆ１  ｐｒｉｍｅｒ）と１６０７−１５８７位（Ｒ１  ｐｒｉｍｅｒ）との間の領域、２４４−２５３位（Ｆ２  ｐｒｉｍｅｒ）と１１２６−１１０７位（Ｒ２  ｐｒｉｍｅｒ）との間の領域、ならびにそれらに対応する遺伝子（例えば、配列番号１または５、あるいは配列番号７または９に示される配列によってコードされる遺伝子）の対応する位置のものがあるがそれらに限定されない。
【０１８４】
ここで、より好ましい実施形態では、上記（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０１８５】
好ましい実施形態において、本発明のＳｔｍ遺伝子をコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１、３、５または２９に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０１８６】
別の好ましい実施形態において、本発明は核酸分子、配列番号１、３、５または２９において、配列番号７もしくは９またはそれに対応するＳｔｍ２の核酸配列の対応する配列と相違する配列を少なくとも１つの位置において有する。このような位置は、対象となる少なくとも２つの配列をアラインメントすることによって容易に決定することができる。このような配列は、Ｓｔｍ１遺伝子のみに特異的であり得ることから、Ｓｔｍ１とＳｔｍ２とを識別することが必要なときに有用である。好ましい実施形態では、この相違する配列を有する部分は、制限酵素で消化され得る。このような制限酵素は、配列が与えれると、当業者は容易に決定することができる。例えば、本発明では、配列番号３と９とを比較する場合、ＢｓａＭＩ（ＧＡＡＴＧＣを認識する）およびＮｌａIII（ＣＡＴＧを認識する）の少なくとも２種類の制限酵素を使用することができる。
【０１８７】
（Ｓｔｍ遺伝子のポリペプチド形態）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子産物（本明細書においてＳｔｍポリペプチドともいう）に関する。
【０１８８】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、
（ａ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、５または２９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、ポリペプチドであり得る。
【０１８９】
１つの好ましい実施形態において、上記（ｂ）における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、Ｓｔｍ１遺伝子産物と類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
【０１９０】
別の好ましい実施形態において、上記（ｃ）における対立遺伝子変異体は、配列番号２、４、６または３０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９０％の相同性を有することが好ましい。好ましくは（ｃ）における対立遺伝子変異体は、配列番号２、４、６または３０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９９％の相同性を有する。
【０１９１】
別の好ましい実施形態において、上記種相同体は、本明細書中上述のように同定することができ、配列番号２、４、６または３０に示すアミノ酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。種相同性は、好ましくは、配列番号１、３、５または２９に示す核酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有する。
【０１９２】
別の好ましい実施形態において、上記（ｅ）における上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、転写制御活性、未分化性維持などが挙げられるがそれらに限定されない好ましくは、そのような生物学的活性は、未分化性維持を含む。Ｓｔｍは細胞の未分化性維持に重要な働きをしていると考えられる。具体的にはホメオドメインをもつことから組織細胞に分化を誘導する様な下流遺伝子の発現を抑制していると推測される。この活性を測定するためには、遺伝子欠損実験、ＲＮＡｉ実験、抗体によるタンパク質機能阻害実験等が考えられる。
【０１９３】
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０１９４】
本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも３の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも４アミノ酸長、より好ましくは５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、目的とする用途（例えば、免疫原、マーカー）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号２、４、６または３０に示す配列の全長と同一であってもよく、それを超える長さであってもよい。
【０１９５】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１５７位〜２１８位（ホメオドメイン）、２６１位〜３０１位（Ｗリッチ領域）もしくは３９９位〜４５５位（Ｂ２反復配列領域）またはそれに対応する位置のアミノ酸配列、またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；または
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、ポリペプチドであり得る。そのようなＳｔｍマーカーとして使用することができるポリペプチドの特徴的ドメインとしては、ｃＤＮＡの位置（配列番号３）に対応させると、
特徴的ドメイン          ｃＤＮＡポジション
ホメオドメイン          ｃＤＮＡポジション；  ４６９ｂｐ−６５４ｂｐ
Ｗリッチ領域            ｃＤＮＡポジション；  ７８１ｂｐ−９０３ｂｐ
Ｂ２反復配列領域        ｃＤＮＡポジション；  １１９５ｂｐ−１３６５ｂｐ
オクタマー結合配列      ｃＤＮＡポジション；  １７８９ｂｐ−１７９６ｂｐ  （ＡＣＴＡＧＣＡＴ）
によってコードされる領域ならびにそれらに対応する遺伝子（例えば、配列番号１または５、あるいは配列番号７または９に示される配列によってコードされる遺伝子）の対応する位置のものがあるがそれらに限定されない。上記領域は、ポリペプチド配列では、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１５７位〜２１８位（ホメオドメイン）、２６１位〜３０１位（Ｗリッチ領域）もしくは３９９位〜４５５位（Ｂ２反復配列領域）またはそれに対応する位置のアミノ酸配列、またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド、あるいはそれらに対応するポリペプチド（例えば、配列番号２または６、あるいは配列番号８または１０に示される配列によってコードされる遺伝子）の対応する位置のものがあるがそれらに限定されない。
【０１９６】
ここで、さらに好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０１９７】
別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２、４、６または３０において、配列番号８もしくは１０またはそれに対応するＳｔｍ２のアミノ酸配列の対応する配列と相違する配列を少なくとも１つの位置において有する。このような位置は、対象となる少なくとも２つの配列をアラインメントすることによって容易に決定することができる。このような配列は、Ｓｔｍ１ポリペプチドのみに特異的であり得ることから、Ｓｔｍ１とＳｔｍ２とを識別することが必要なときに有用である。好ましい実施形態では、このような相違する配列を有する部分は、ペプチダーゼまたはプロテアーゼで消化され得る。このような酵素は、当業者であれば、配列情報にもとづいて当該分野において周知の方法を用いて決定することができる。
【０１９８】
（Ｓｔｍ遺伝子の核酸形態に対する因子）
１つの局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子をコードする核酸分子に対して特異的に相互作用する因子を含む、組成物を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載される任意のＳｔｍ遺伝子をコードする核酸分子またはその改変体もしくはフラグメントに対して特異的な因子を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明では、Ｓｔｍ１遺伝子の発現が、未分化状態（特に、多能性、より特定すると全能性）に対応していることが明らかになったことによって、そのような状態、性質を同定するために効率よく使用される。特に、従来のＯｃｔ３／４よりも多能性、全能性に対する親和性が高く、その検出効率は格段に上がるものと考えられる。このような効果は従来知られておらず、したがって、本発明の因子は、従来技術により提供されるものより優れた効果を示す。
【０１９９】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される因子であり得る。このような因子は、本発明の核酸分子に特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。
【０２００】
好ましい実施形態では、本発明の因子は、核酸分子である。本発明の因子が核酸分子である場合、そのような核酸分子は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得、好ましくはＳｔｍの核酸配列（例えば、配列番号１、３、５または２９）に対して特異的に結合し得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ）として使用することができるかまたは所定の因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１、３、５または２９などに示す配列またはその相補体の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０２０１】
従って、１つの例示的な実施形態において、本発明の因子は、Ｓｔｍ遺伝子をコードするポリヌクレオチドの核酸配列に対して相補的な配列またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有する核酸分子であり得る。
【０２０２】
別の例示的な実施形態において、本発明の因子は、（ａ）配列番号１、３、５または２９に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２、４、６または３０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、のいずれかのＳｔｍ遺伝子の核酸配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であり得る。ストリンジェンシーは、高くても、中程度であっても、低くてもよく、程度は、当業者が適宜状況に応じて決定することができる。
【０２０３】
あるいは、本発明の因子は、配列番号１、３、５または２９で示される配列またはその相補体を含む核酸分子に対して特異的な因子であることが好ましい。このような配列は、未分化または多能性を有する（特に、全能性を有する）組織において存在する形態のＳｔｍ１遺伝子発現を同定することができることから、ある組織または個体の分化の程度を調べるために有用である。
【０２０４】
（Ｓｔｍ遺伝子のポリペプチド形態に対する因子）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する因子およびそれを含む組成物に関する。そのような因子としては、例えば、ポリペプチド（例えば、抗体、単鎖抗体）、ポリヌクレオチド、糖鎖、脂質、およびそれらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。このような因子は、本発明のポリペプチドに特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。より好ましくは、本発明の因子は、抗体またはその誘導体（例えば、単鎖抗体）である。従って、本発明の因子は、プローブおよび／またはインヒビターとして使用することができる。  好ましい実施形態において、本発明の因子は、標識されているかまたは標識と結合し得るものであることが有利であり得る。そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および／または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。
【０２０５】
好ましい実施形態では、本発明の上記因子は、抗体であり得る。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体であってもよく、それらの、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体などであってもよい。このような抗体は、本発明の遺伝子の発現を判定する道具として用いることができ、従ってスクリーニングに使用することができる。
【０２０６】
（本発明の核酸分子の遺伝子工学形態）
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現カセットおよびベクターに関する。本発明の発現カセットおよびベクターは、好ましくは、本発明の核酸分子に作動可能に連結された制御配列をさらに含む。このように制御配列を含むことによって、本発明の核酸分子の発現の制御が容易になる。そのような制御配列としては、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、イントロン配列などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、そのような制御配列は、本発明の核酸分子の発現を誘導することができる。
【０２０７】
さらに好ましい実施形態において、本発明の発現カセットおよびベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含み得る。そのような選択マーカーとしては、例えば、外来遺伝子、細胞性遺伝子、および抗生物質耐性遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるがそれらに限定されない。細胞性遺伝子としては、例えば、増殖因子のようなサイトカインをコードする遺伝子、増殖因子レセプターをコードする遺伝子、シグナル形質導入分子をコードする遺伝子、および転写因子をコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。別の好ましい実施形態では、選択マーカーは、不死化遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２）であり得る。あるいは、選択マーカーは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、毒性産物をコードする遺伝子、自殺基質と組合せて条件により活性な毒性遺伝子産物（例えば、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）と組合せた単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ））、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子であり得る。
【０２０８】
（細胞形態）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子をコードする核酸配列（例えば、本発明の核酸分子）を含む細胞に関する。本発明の核酸分子を細胞に導入する方法は、当該分野において周知であり、本明細書において上記節において詳述されている。あるいは、そのような細胞は、細胞を含むサンプル中において、その核酸分子を含む細胞をスクリーニングすることによって、同定することができる。本発明の核酸分子を含む細胞は、好ましくは、未分化状態であり得る。本発明の核酸分子が発現している細胞は、通常未分化状態である。したがって、そのような核酸分子が制御可能に発現されるように導入された細胞は、その未分化状態を制御することができる。あるいは、そのような細胞を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０２０９】
（組織形態）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子をコードする核酸配列を含む組織に関する。そのような核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。そのような組織は、動物組織であってもよく、他の生物（例えば、植物）の組織であってもよい。あるいは、そのような組織を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０２１０】
（生物形態）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子をコードする核酸配列を含む生物（例えば、動物）に関する。そのような核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。そのような生物は、動物であってもよく、他の生物（例えば、植物）であってもよい。あるいは、そのような生物を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。Ｓｔｍ遺伝子が分化細胞に特異的な遺伝子の発現を抑制するとすれば、ある方向への分化誘導を抑制する可能性がある。つまり、分化の方向を決定づける働きがあり再生医療への応用の可能性が考えられる。
【０２１１】
（濃縮組成物形態）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ１遺伝子をコードする核酸分子のような本発明の核酸分子を含む細胞が濃縮された、組成物に関する。このような細胞は、Ｓｔｍ遺伝子が発現される場合、通常、未分化状態を有することから、そのような細胞が濃縮された組成物は、通常より多くの未分化状態の細胞（例えば、多能性幹細胞、胚性幹細胞など）を含むといえる。そのような核酸分子を含む細胞を濃縮する方法は、当該分野において周知であり、例えば、免疫表現型分類を利用する方法（例えば、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、パニング、フローサイトメトリーなど）が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１２】
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子のプロモーター部分の配列を含む核酸分子に関する。そのようなプロモーター部分は、配列番号１、３、５または２９に示す配列の転写開始点（ＡＴＧ）から上流１３００−１５００ｂｐの２００ｂｐの間の領域であり得る。この領域には、Ｓｐ１およびＡＰ−２の結合可能配列が存在し、この領域が発現制御に重要な働きをすることが予想されるからである。Ｓｔｍ遺伝子では、Ｓｔｍ１のゲノム塩基配列で、転写開始点から５プライム上流２．５  ｋｂとｐｏｌｙＡ配列から３プライム下流３．９  ｋｂ  を含むトランスジーンで発現が見られることから、このことから少なくともこれらの領域に転写を誘導するために必要十分な塩基配列（プロモーター領域）を含むと推測される。正確な位置は、当業者であれば、容易に決定することができ、そのような技術は周知慣用されている。したがって、そのような技術によって同定されたプロモーターの正確な位置もまた本発明の範囲内にある。
【０２１３】
（プロモーター形態）
１つの局面において、本発明は、Ｓｔｍ１のプロモーターに関する。このようなプロモーターは、Ｓｔｍ１の発現特性を担うと考えられることから、未分化状態に特異的な構築物を作製するために利用することができる。
【０２１４】
従って、１つの局面において、本発明は、Ｓｔｍ１のプロモーター配列を含む核酸構築物を提供する。このプロモーター配列を含む核酸構築物は、未分化細胞の選択に使用することができる。
【０２１５】
特定の好ましい実施形態において、本発明のプロモーター配列は、
（ａ）配列番号３４またはそれに対応する配列（典型的には、転写開始配列の上流２．３ｋｂ）に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３４またはそれに対応する配列（典型的には、転写開始配列の上流２．３ｋｂ）の対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
の内のプロモーター活性領域を含む。このような活性領域の特定は、当該分野において周知の技法を用いて行うことができる。
【０２１６】
より好ましくは、本発明のプロモーター配列は、
（ａ）配列番号３１、３２または３３に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３１、３２または３３に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、核酸配列である。
【０２１７】
ここで、本発明のＳｔｍ１のプロモーターは、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長を有し、好ましくはこのヌクレオチド長は、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長であり得る。別の好ましい実施形態では、本発明のＳｔｍ１のプロモーターは、不連続のヌクレオチドが連結された構造をとっていてもよい。プロモーター活性は、連続しない複数の領域が担っていることがあり得るからである。したがって、そのような不連続な構造もまた、本発明の範囲内にあり、そのような不連続構造は、本明細書の開示に基づき当業者が容易に作製することができる。
【０２１８】
特定の好ましい実施形態において、上記生物学的活性は、プロモーター活性であるがそれに限定されない。プロモーター活性は、当該分野において周知の技法を用いて測定することができ、そのような技法は、本明細書においても記載されており、実施例において例示されている。
【０２１９】
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子のプロモーター部分（本明細書においてＳｔｍ遺伝子プロモーターともいう）の核酸配列を含むベクターに関する。本発明のベクターにおいて、好ましくは、Ｓｔｍ遺伝子のプロモーター部分の核酸配列には、外来遺伝子（例えば、マーカー遺伝子）が作動可能に連結されている。このような構造を含むベクターで細胞を形質転換することによって、その細胞の未分化状態が、上記外来遺伝子の発現として観察することができるようになる。したがって、マーカー遺伝子として蛍光物質をコードする遺伝子（例えば、緑色蛍光遺伝子など）を用いることにより、未分化状態の細胞を容易に観察することができるようになる。そのような外来遺伝子は、好ましくは、その細胞にとって無害であることが好ましい。より好ましくは、移植が意図される場合、その移植の宿主にとって無害であることが有利であり得る。
【０２２０】
１つの好ましい実施形態において、本発明の、Ｓｔｍ遺伝子プロモーターを含むベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含み得る。このような選択マーカーとしては、例えば、例えば、外来遺伝子、細胞性遺伝子、および抗生物質耐性遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるがそれらに限定されない。細胞性遺伝子としては、例えば、増殖因子のようなサイトカインをコードする遺伝子、増殖因子レセプターをコードする遺伝子、シグナル形質導入分子をコードする遺伝子、および転写因子をコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。別の好ましい実施形態では、選択マーカーは、不死化遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２）であり得る。あるいは、選択マーカーは、ＨＰＲＴ、毒性産物をコードする遺伝子、自殺基質と組合せて条件により活性な毒性遺伝子産物、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子であり得る。
【０２２１】
本発明の核酸構築物は、本発明のプロモーターとは異なる由来の外来遺伝子をコードする配列を、本発明のプロモーター配列に対して作動可能に連結されて、含み得る。このような核酸構築物は、未分化状態に特異的に外来遺伝子を発現させることができる。ここで、１つの実施形態では、外来遺伝子は、選択マーカーをコードする。
【０２２２】
１つの実施形態では、選択マーカーとしては、例えば、核酸構築物が導入される宿主の培地での選択を可能にするものが選択される。そのような選択マーカーとしては、例えば、ポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２３】
別の実施形態において、本発明の核酸構築物において使用される選択マーカーは、核酸構築物が導入される宿主での視覚での選択を可能にするものであり得る。そのような選択マーカーとしては、例えば、緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）などの生細胞での観察が可能な蛍光色素マーカーまたは色素マーカー遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２４】
別の実施形態では、上記選択マーカーは、本発明の核酸構築物が導入される宿主に対して実質的に毒性を示さないことが好ましい。
【０２２５】
（プロモーターを有する細胞）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子プロモーターまたはそのプロモーターを含む核酸構築物を含む細胞に関する。本発明のＳｔｍ遺伝子プロモーターをコードする核酸配列を細胞に導入する方法は、当該分野において周知であり、本明細書において上記節において詳述されている。あるいは、そのような細胞は、細胞を含むサンプル中において、Ｓｔｍ遺伝子プロモーターを含む細胞をスクリーニングすることによって、同定することができる。外来遺伝子（例えば、マーカー遺伝子）がＳｔｍ遺伝子のプロモーター部分の核酸配列に作動可能に連結されている場合、そのような外来遺伝子の発現を観察することによって、その細胞の未分化状態を判定することができる。従って、好ましい実施形態では、本発明の細胞は、それ以外の細胞、種に由来する（例えば、異種の）Ｓｔｍ１のプロモーターを有し得る。
【０２２６】
（プロモーターを有する組織）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子プロモーターをコードする核酸配列またはそのプロモーターを含む核酸構築物を含む組織に関する。そのような核酸分子は、外来遺伝子（例えば、マーカー遺伝子）に作動可能に連結されることが好ましい。そのような組織は、動物組織であってもよく、他の生物（例えば、植物）の組織であってもよい。
【０２２７】
（プロモーターを有する生物）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ遺伝子プロモーターをコードする核酸配列またはそのプロモーターを含む核酸構築物を含む生物（例えば、動物）に関する。そのような核酸分子は、制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。そのような生物は、動物であってもよく、他の生物（例えば、植物）であってもよい。Ｓｔｍ遺伝子が分化細胞に特異的な遺伝子の発現を抑制するとすれば、ある方向への分化誘導を抑制する可能性がある。つまり、分化の方向を決定づける働きがあり再生医療への応用の可能性が考えられる。
【０２２８】
（プロモーターを有する細胞濃縮組成物）
別の局面において、本発明は、Ｓｔｍ１遺伝子プロモーターをコードする核酸配列が発現されたを含む細胞が濃縮された、組成物に関する。このような細胞は、Ｓｔｍプロモーターが発現を誘導する遺伝子が発現される場合、通常、未分化状態を有することから、そのような細胞が濃縮された組成物は、通常より多くの未分化状態の細胞（例えば、多能性幹細胞、胚性幹細胞など）を含むといえる。そのような核酸分子を含む細胞を濃縮する方法は、当該分野において周知であり、例えば、免疫表現型分類を利用する方法（例えば、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、パニング、フローサイトメトリーなど）が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２９】
（判定組成物）
別の局面において、本発明は、細胞の未分化状態を判定するための組成物に関する。この組成物は、Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に反応する因子を含む。このような因子は、Ｓｔｍ遺伝子に特異的に相互作用する因子（例えば、相補配列を有する核酸分子、転写因子のようなポリペプチドなど）、あるいは、Ｓｔｍ遺伝子産物に対する抗体、単鎖抗体などが挙げられるがそれらに限定されない。ここで使用されるＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物は、本明細書において上述したような配列を有する核酸分子またはポリペプチドであり得るがそれらに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２３０】
本発明の細胞の未分化状態を判定するための組成物の判定対象は、好ましくは、幹細胞を包含する。本発明において、従来の因子（例えば、Ｏｃｔ３／４など）よりも普遍的に幹細胞（例えば、神経幹細胞）に発現することが判明した。また、幹細胞でない細胞（未受精卵細胞）には発現しない。このような特徴は、従来のＯｃｔ３／４のような因子ではなかった。したがって、本発明のこのような組成物は、従来の因子を用いた系よりも、より普遍的に幹細胞を含むかどうかを判定することができるという利点を有する。そのような利点は、Ｏｃｔ３／４などの従来の因子では達成が困難であった格別の効果であるといえる。また、下流遺伝子の発現制御について、Ｏｃｔ３／４とＳｔｍとの関係について考慮するとより精度の高い判定を行うことができるといえる。
【０２３１】
ある好ましい実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞、および組織幹細胞からなる群より選択される細胞であり得る。本発明の組成物は、特に、組織幹細胞を含む多能性幹細胞全般の判定に使用することができるという新たな利点を有する。なぜなら、従来のマーカーでは、胚性幹細胞、受精卵細胞のような全能性の幹細胞は判別することができたが、ある程度分化の程度が進んだ組織幹細胞は判定することが困難であったからである。本明細書において意図される幹細胞としては、通常、受精卵細胞、胚性幹細胞のほか、神経幹細胞、網膜幹細胞、毛嚢幹細胞、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、性腺幹細胞、表皮幹細胞、間充組織幹細胞、胚性幹細胞、生殖性幹細胞などが挙げられるがそれに限定されない。好ましくは、そのような幹細胞としては、神経幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、間充組織幹細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３２】
本発明の組成物が対象とする細胞は、遺伝子改変されたものであっても、遺伝子改変されていないもの（すなわち、天然に存在する細胞）であってもよい。遺伝子改変の方法は、当該分野において周知であり、そのような方法は、本明細書に記載した文献に詳述されている。当業者は、そのような周知慣用技術を用いて、適宜細胞を遺伝子改変することができる。したがって、そのような細胞は、分化細胞に対して、未分化化（すなわち、多能性付与）するような遺伝子操作がされていてもよい。
【０２３３】
（未分化判定法）
別の局面において、本発明は、細胞の未分化状態を判定する方法を提供する。この方法は、（Ｉ）判定されるべき細胞を提供する工程；（ＩＩ）Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に反応する因子を、該細胞に接触させる工程；および（ＩＩＩ）該Ｓｔｍ遺伝子が該細胞において発現しているかどうかを確認する工程、を包含する。ここで提供される細胞は、判定が所望される細胞であれば、どのような細胞であってもよい。そのような細胞は、どのような状態でも提供され得るが、好ましくは、アッセイに適切な形態で提供され得る。そのようなアッセイに適切な形態としては、例えば、適切な培地または緩衝液中での提供などが挙げられるがそれに限定されない。Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に反応する因子は、Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に反応することができる限り、どのような形態でもよい。そのようなＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物は、判定を目的とする細胞の生物種と同一種由来のものであることが好ましい。同一種由来であれば、ほぼ１：１の関係でＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物の有無を判定することができるからである。ただし、上記因子に関するＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物の由来種は、Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物の判定をすることができる限り、判定を目的とするＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物の由来種と異なっていてもよい。種間で交叉反応することが頻繁に発生するからである。上記Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物は、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２３４】
本発明の細胞の未分化状態を判定する方法は、好ましくは、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する工程をさらに包含する。他の幹細胞マーカーの発現を判定することによって、より精確度の高い未分化状態の判定が行うことができるからである。そのような他の幹細胞マーカーとしては、例えば、Ｏｃｔ３／４、ＵＴＦ１、Ｓｏｘ１、Ｒｅｘ１などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明において用いられるＳｔｍ遺伝子は、Ｓｔｍ１遺伝子を含むことが好ましい。Ｓｔｍ１は、幹細胞との連動が明確に示されているからである。
【０２３５】
（未分化細胞調製法）
別の局面において、本発明は、未分化状態の細胞を調製する方法に関する。この調製方法は、（Ｉ）未分化状態の細胞を含むかまたは含むと予測されるサンプルを提供する工程；（ＩＩ）Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に反応する因子を、該サンプルに接触させる工程；（ＩＩＩ）該因子と該Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物との特異的反応を検出することによって、該Ｓｔｍ遺伝子が該サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する工程；および（ＩＶ）該Ｓｔｍ遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する工程、を包含する。上述のサンプルは、未分化状態の細胞を含むかまたは含むと予測されるものであれば、どのようなものでもよい。ここで用いられる細胞はどのような細胞であってもよいが、好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目）の細胞であり、より好ましくは、ヒトの細胞であり得る。サンプルの調製方法は当該分野において周知の技術を使用することができる。そのような技術は、本明細書において記載された文献にも詳述されており、例えば、細胞を動物から取り出し、その後、適切な培地または緩衝液中に入れることなどが挙げられるがそれらに限定されない。サンプルと、本発明の因子とを接触させる方法は、当該分野において周知の技術を用いることができる。そのような方法としては、例えば、サンプル中に、本発明の因子を含む溶液を加えることなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の因子とＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物との特異的反応の検出は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。検出の簡便のため、その因子は標識されていることが好ましい。そのような標識は、どのような標識でもよく、例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射能標識などが挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。遺伝子の発現は、そのような特異的反応の有無と相関付けることができる。例えば、発現の程度が既知である細胞の発現レベルと、特異的反応の強度とを相関付けて標準曲線を作成し、このような標準曲線を利用することによって特異的反応から遺伝子発現を定性的または定量的に判定することができる。
【０２３６】
未分化状態の細胞を調製する方法において用いられるＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物は、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２３７】
（未分化細胞調製法）
別の局面において、本発明は、未分化状態の細胞を調製する別の方法を提供する。この方法は、（Ｉ）細胞を提供する工程；および（ＩＩ）該細胞中のＳｔｍ遺伝子の発現を誘導する工程を包含する。ここで用いられる細胞はどのような細胞であってもよいが、好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目）の細胞であり、より好ましくは、ヒトの細胞であり得る。細胞中に遺伝子を導入する方法は、当該分野において周知であり、目的の遺伝子（たとえば、Ｓｔｍ遺伝子）を導入することができる技術であればどのような技術を用いてもよい。そのような技術としては、例えば、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられるがそれらに限定されない。Ｓｔｍ遺伝子は、好ましくは、ベクターを用いて細胞中に導入される。そのようなベクターは、どのようなものを用いてもよいが、好ましくは、ｐＧＥＭやｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋／などを用いることができる。
【０２３８】
Ｓｔｍ遺伝子の発現を誘導する工程を特徴とする未分化状態の細胞を調製する方法において用いられるＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物もまた、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２３９】
（未分化細胞濃縮法）
別の局面において、本発明は、未分化状態の細胞を分離および／または増殖および／または濃縮する方法を提供する。この方法は、（Ｉ）細胞を提供する工程；（ＩＩ）該細胞にＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子プロモーターを導入する工程；および（ＩＩＩ）該Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子プロモーターを発現する細胞を選択する工程を包含する。ここで用いられる細胞はどのような細胞であってもよいが、好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目）の細胞であり、より好ましくは、ヒトの細胞であり得る。細胞中に遺伝子を導入する方法は、当該分野において周知であり、目的の遺伝子（たとえば、Ｓｔｍ遺伝子）を導入することができる技術であればどのような技術を用いてもよい。そのような技術としては、例えば、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられるがそれらに限定されない。Ｓｔｍ遺伝子は、好ましくは、ベクターを用いて細胞中に導入される。そのようなベクターは、どのようなものを用いてもよいが、好ましくは、ｐＧＥＭやｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋／などを用いることができる。
【０２４０】
本発明の、未分化状態の細胞を分離および／または増殖および／または濃縮する方法において用いられるＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物もまた、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２４１】
（未分化判定キット）
別の局面において、本発明は、細胞の分化状態を判定するキットを提供する。このキットは、（ａ）Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に反応する因子；および（ｂ）該Ｓｔｍ遺伝子が該細胞において発現しているかどうかを確認するための手段を備える。Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に反応する因子としては、本明細書において記載されるような因子であれば、どのようなものでも使用することができ、そのような因子としては、例えば、抗体、核酸分子などが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、このような因子は、Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に相互作用する因子（例えば、相補配列を有する核酸分子、転写因子のようなポリペプチドなど）、あるいは、Ｓｔｍ遺伝子産物に対する抗体、単鎖抗体などが挙げられるがそれらに限定されない。遺伝子発現の確認手段は、当該分野において周知の技術を用いて実施することができる。そのような確認手段としては、例えば、ドットブロット分析、ノーザンブロット分析のような遺伝子産物としてのｍＲＮＡの分析、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡなどの遺伝子産物としてのポリペプチドの分析など挙げられるがそれに限定されない。そのような分析には、例えば、マイクロタイタープレート、マイクロアレイなどを用いることができる。
【０２４２】
本発明の、細胞の分化状態を判定するキットにおいて用いられるＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物もまた、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２４３】
好ましい実施形態において、本発明の細胞の分化状態を判定するキットは、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段をさらに備える。そのような他の幹細胞マーカーの発現を確認する手段は、原理的には、本発明のＳｔｍ遺伝子の発現を確認する手段と同じものを使用してもよく、異なる原理のものを使用してもよい。好ましくは、そのような他の幹細胞マーカーの発現を確認する手段によって提示される結果は、本発明のＳｔｍ遺伝子の発現を確認する手段が提示する結果と混同しないような表示（例えば、異なる色、異なる蛍光など）をすることが好ましい。そのような他の幹細胞マーカーとしては、例えば、Ｏｃｔ３／４、ＵＴＦ１、Ｓｏｘ１、Ｒｅｘ１などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２４４】
好ましい実施形態において、本発明のキットにおいて使用されるＳｔｍ遺伝子は、Ｓｔｍ１遺伝子を含む。
【０２４５】
（未分化細胞調製キット）
別の局面において、本発明は、未分化状態の細胞を調製するためのキットを提供する。このキットは、（Ｉ）Ｓｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に反応する因子；（ＩＩ）該Ｓｔｍ遺伝子が該サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する手段；および（ＩＩＩ）該Ｓｔｍ遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する手段、を備える。
【０２４６】
本発明の未分化状態の細胞を調製するためのキットにおいて使用されるＳｔｍ遺伝子またはＳｔｍ遺伝子産物に特異的に反応する因子は、原理的には、本発明の細胞の分化状態を判定するキットにおいて使用されるものと同様のものが使用され得る。好ましくは、細胞の分離または濃縮に適切な形態の因子が使用され得る。例えば、抗Ｓｔｍ１抗体を用いた細胞ソーティングキットで、セルソーターをもちたいり、Ｓｔｍ１抗体のついたビーズを用いた精製等が考えられる。
【０２４７】
Ｓｔｍ遺伝子がサンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する手段もまた、原理的には、本発明の細胞の分化状態を判定するキットにおいて使用されるものと同様のものが使用され得る。好ましくは、未分化状態の細胞を調製するためのキットにおいても、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段をさらに備え得る。そのような他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段は、原理的には本発明の細胞の分化状態を判定するキットにおいて使用されるものと同様のものが使用され得る。
【０２４８】
本発明の未分化状態の細胞を調製するためのキットにおいて使用されるＳｔｍ遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する手段は、当該分野において使用される細胞分離または濃縮手段であれば、どのようなものでも使用することができる。そのような細胞分離または濃縮手段としては、例えば、磁気分離、パニング、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、アフィニティークロマトグラフィーなどを使用することができる。
【０２４９】
（未分化細胞調製キット）
別の局面において、本発明は、未分化状態の細胞を調製するキットを提供する。このキットは、（Ｉ）細胞中のＳｔｍ遺伝子の発現を誘導する手段、を備える。このようなＳｔｍ遺伝子の発現誘導手段は、当該分野において周知の技術を用いることができる。本明細書において記載されるように、本発明のポリペプチドを利用した抗体およびセルソーティングは本明細書の記載に基づいて実施することができる。したがって、この場合は、キットという形態で実施されてもよいが、抗体の販売もしくは抗体と至適バッファーキットという形態で実施することもできる。表面抗原であればビーズに抗体をつけて精製することが可能であるが、Ｓｔｍ１は核局在であるので、その点に留意すれば実施することは容易である。ここで使用される、Ｓｔｍ遺伝子もまた、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２５０】
別の局面において、本発明の未分化状態の細胞を調製するキットは、（Ｉ）制御配列に作動可能に連結されたＳｔｍ遺伝子を含むベクターを備える。制御配列としては、当該分野において周知のプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを使用することができる。ベクター中に含まれるＳｔｍ遺伝子もまた、本明細書に記載されるような核酸分子またはポリペプチドであってもよいが、それに限定されない。当業者は、このような核酸分子およびポリペプチドを、当該分野において周知の技術を用いて改変することができる。そのような改変は、目的とする用途によって当業者が適宜変更することができる。
【０２５１】
（プロモーターの利用）
別の局面において、本発明は、未分化細胞から未分化細胞を実質的に含まない分化細胞の集団を生産する方法を提供する。この方法は、ａ）選択マーカーを含まない未分化細胞を提供する工程；ｂ）未分化状態に特異的なプロモーター（例えば、本発明のＳｔｍ１プロモーター、Ｏｃｔ３／４プロモーターなど）をコードする配列と該選択マーカー遺伝子とコードする配列とが作動可能に連結された配列を有する核酸構築物を、該未分化細胞に導入する工程；ｃ）該選択マーカーを含む細胞を選択的に増殖させる培地に該未分化細胞を配置する工程；ｄ）該未分化細胞を分化誘導する工程；およびｅ）該選択マーカーの発現の有無を選択し得る培地に分化された該未分化細胞を配置し、培養する工程、を包含する。
【０２５２】
ここで、未分化細胞としては、例えば、幹細胞（胚性幹細胞、組織幹細胞）が挙げられるいがそれらに限定されない。従って、分化細胞を再プログラム化した細胞もまた本発明の対象の範囲内にある。
【０２５３】
ここで、未分化状態に特異的なプロモーターとしては、例えば、Ｓｔｍ１プロモーター配列、Ｏｃｔ３／４プロモーター配列などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の開示までは、未分化状態に特異的な遺伝子のプロモーター領域が特定されたという報告はなく、本発明によって初めて達成された発明である。また、組織特異的なエンハンサーの存在が知られいる場合（例えば、Ｏｃｔ３／４）などは、発現パターンの再現には、大きな領域が必要である可能性がある。
【０２５４】
特定の実施形態において、本発明において利用されるＳｔｍ１プロモーター配列は、配列番号３４またはそれに対応する配列（典型的には、転写開始配列の上流２．３ｋｂ）またはその改変体が挙げられ、より好ましくは配列番号３１、３２または３３に示す配列またはその改変体を含む。あるいは、そのようなプロモーター配列は、本明細書において別の場所において記載されるような特定の任意の形態をとり得る。別の好ましい実施形態では、本発明において利用されるＳｔｍ１プロモーターは、配列番号３１、３２または３３に示す配列またはその改変体を含み、かつ、転写開始配列の上流約２．３ｋｂの全部あるいは一部を含む配列またはその改変体を含む。
【０２５５】
本発明において使用される選択マーカーとしては、例えば、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、または緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）からなる群より選択される蛍光マーカーが挙げられるがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、本発明において使用される選択マーカーは、ｈｐｒｔを含む。ｈｐｒｔは、グアニンの代謝阻害物質である８−アザグアニンによって選択可能となる。８−アザグアニンは、細胞の発育阻害作用を示し、腫瘍抑制効果がある。6-チオグアニン(6-thioguanine)も同様の作用をもつ。このような阻害作用は、グアニンあるいはグアノシンの投与で解除される。いったん核酸中にとりいれられて阻害作用を示すものと考えられており、プリンヌクレオチド生合成のレベルでも阻害していると考えられる。生体内ではグアニンデアミナーゼ(guaninedeaminase)により8-アザキサンチンに分解される。従って、ｈｐｒｔ欠損細胞（ｈｐｒｔ−）は，8-アザグアニンに耐性を示す。このようにして選択を行うことができる。
【０２５６】
本発明の特定の実施形態において、分化誘導は、任意の分化が企図されるが、例示すると、例えば、神経細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、色素細胞、幹細胞、血球系細胞、膵細胞、血管内皮細胞、粘膜上皮細胞および皮膚細胞からなる群より選択される細胞への分化を含む。
【０２５７】
本発明の方法では、好ましくは、培養後、Ｓｔｍ抗体またはＯｃｔ３／４抗体によって、未分化細胞の混入率を確認する工程をさらに包含して未分化細胞がないことを確認することができる。
【０２５８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、選択マーカーを含まない未分化細胞を樹立する工程をさらに包含する。選択マーカーを含まない未分化細胞の樹立は、当該分野において周知の技法を応用して行うことが可能である。そのような技法としては、例えば、受精後３．５日齢のマウスから回収した胚盤胞を白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む任意のＥＳ細胞培地で培養する。このとき、不活性化したマウスフィーダー細胞をフィーダー細胞として用いる。増殖してきた内部細胞塊由来の細胞をトリプシン溶液で解離し、再びフィーダー細胞上で培養し、胚性幹細胞を得る。より詳細な条件決定については、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡを参照）。組織幹細胞では、幹細胞が存在すると思われる組織を解離し、または解離後にセルソーターなどを用いて特定の性質を有する細胞を分取した後、特定の細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ）等を含む培地で培養し、自己増殖脳および分化能を有する細胞を得る（神経幹細胞、血球幹細胞などがよい例）。
【０２５９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、上記のような選択マーカーを欠損させた未分化細胞を提供する。このような細胞は、未分化細胞を選択除去することが容易であり、従って、顕著な効果を奏する。
【０２６０】
別の実施形態において、本発明が対象とする細胞は、マウス、サルおよびヒトからなる群より選択される細胞を含む。ここで細胞に遺伝子を導入する方法は、当該分野において周知の任意の方法を利用することができるが、遺伝子の導入技術としては、トランスフェクション、形質転換および形質導入などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２６１】
別の実施形態において、本発明の方法は、培養後、分化細胞のみを選択する工程をさらに包含することが好ましい。分化細胞のみを選択する技法は当該分野において公知の方法を利用して行なう。
【０２６２】
別の局面において、本発明は、このような未分化細胞を実質的に除去した分化細胞の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、そのような細胞集団から誘導される組織、臓器、生物などを提供する。
【０２６３】
別の局面では、本発明は、未分化細胞から未分化細胞を実質的に含まない分化細胞の集団を生産する別の方法を提供する。この別の方法は、ａ）Ｓｔｍ１のプロモーター配列と該選択マーカー遺伝子とコードする配列とが作動可能に連結された配列を有する核酸構築物を、未分化細胞に導入する工程；ｂ）該未分化細胞を培養し分化誘導する工程；およびｃ）該選択マーカーの発現の有無に基づいて未分化細胞を除去する工程、を包含する、方法。
【０２６４】
ここで、本発明において使用される選択マーカー、視覚による識別を可能にする。このような選択マーカーとしては、例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰおよびｄｓＲｅｄなどの蛍光マーカーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２６５】
この場合、本発明の方法における未分化細胞の除去は、セルソーターを用いて行なうことができる。このようなセルソーターは、当該分野において周知の物を利用することができ、例えば、ベクトンディッキンソン（ＢＤ）などから市販されているセルソーターを用いることができるがそれらに限定されない。本来未分化細胞で発現が認められないまたは亜種もしくは異種に由来するものであり抗体により区別可能なすべての細胞表面マーカー遺伝子に加え、本明細書において列挙される色素蛍光タンパク質もまた用いることができる。
【０２６６】
別の局面において、本発明は、このような未分化細胞を実質的に除去した分化細胞の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、そのような細胞集団から誘導される組織、臓器、生物などを提供する。
【０２６７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０２６８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２６９】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、京都大学において規定される基準を遵守した。
【０２７０】
（実施例１：ＲＮＡの回収）
本実施例では、Ｓｔｍ遺伝子の同定を行った。
【０２７１】
各組織からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用い、添付のプロトコールに従って回収した。組織は、８週齢の成体マウスの脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、精巣、卵巣、筋肉、およびＥ６．５、Ｅ７．５、Ｅ８．５、Ｅ９．５、Ｅ１２．５、Ｅ１８．５日齢のマウス胎児を用いた。さらに、Ｅ１２．５日齢雄および雌マウス胎児の生殖隆起、未受精卵、桑実胚、胚盤胞、胚性幹細胞およびＥＧ細胞からもＲＮＡを回収し実験に用いた。
【０２７２】
（実施例２：ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析）
汎用プロトコール  （Ａｌｗｉｎｅ  ｅｔ．ａｌ．，  １９７７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ７４：  ５３５０．）をもとにノーザンブロットハイブリダイゼーション解析を行った。胚性幹細胞、ＥＧ細胞およびＥ１２．５日齢のマウス胎児から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １０ｕｇを水に溶かして１％  ホルムアルデヒド変性ゲルで電気泳動を行った後Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ｍｅｍｂｒａｎｅ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  に一晩ブロットした。ブロットしたメンブレンは４２℃でプレハイブリダイゼーションを２時間、特異的なプローブでのハイブリダイゼーションを一晩行った後、６５℃２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで２回、０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで１回洗った。プローブは、Ｓｔｍ１  ｃＤＮＡの全長に対してＭｅｇａｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて［α−３２Ｐ］  ｄＣＴＰ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  ＲＩ標識した。
【０２７３】
（実施例３：ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析）
ＲＴ−ＰＣＲによるＳｔｍ１、Ｏｃｔ４、Ｇ３ｐｄｈ遺伝子の発現解析を目的に、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを使用しｃＤＮＡ合成を行った。ＤＮａｓｅＩ  でＲＮＡサンプルを処理した後、ＲＴ反応はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて製品のプロトコールに従って行った。ＰＣＲ増幅はｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １  μｇを用いて行った。用いたプライマーセットを以下に記載する。
【０２７４】
Ｆ１：  ５’−ＧＣＧＣＡＴＴＴＴＡＧＣＡＣＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号１１）および
Ｒ１：  ５’−ＧＴＴＣＴＡＡＧＴＣＣＴＡＧＧＴＴＴＧＣ−３’（配列番号１２）；
Ｆ２：  ５’−ＧＡＡＴＴＣＴＧＧＧＡＡＣＧＣＣＴＣＡＴ−３’（配列番号１３）および
Ｒ２：  ５’−ＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＣＧＴＡＡＧＴＣＴＣ−３’（配列番号１４）；
Ｏｃｔ４ＲＴ／１：  ５’−ＧＧＣＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧＴＧＴＴＣ−３’（配列番号１５）および
Ｏｃｔ−４ＲＴ／２：  ５’−ＣＴＣＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴ−３’（配列番号１６）；
Ｇ３ＰＤＨ−５：  ５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１７）および
Ｇ３ＰＤＨ−３：  ５’−ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１８）。
【０２７５】
ＰＣＲ反応は９４℃で５分インキュベーションした後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で５分インキュベーションする条件で行った。
【０２７６】
（実施例４：Ｓｔｍ１遺伝子の細胞内発現）
Ｓｔｍ１遺伝子の細胞内発現を見る目的で、Ｓｔｍ１遺伝子にｍｙｃタグをつけたｍｙｃ−Ｓｔｍ１コンストラクトを作製した。Ｓｔｍ１のｃＤＮＡは以下のプライマーセットを用いて得られた産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）でＴＡクローニングしたものを用いた。
【０２７７】
Ｓｔｍ−ｆ：  ５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧ  Ｇ−３’（配列番号１９）および
Ｓｔｍ−ｒ：  ５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２０）
このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで切断し、平滑末端処理したｃＤＮＡフラグメントをｐＣＭＶ−ｍｙｃ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）  のＳａｌＩサイトの平滑末端処理した部分にクローニングすることでｐＣＭＶ−ｍｙｃ−Ｓｔｍ１プラスミドを作製した。１ｘ１０５の胚性幹細胞にｐＣＭＶ−ｍｙｃ−Ｓｔｍ１１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用して遺伝子導入した。
【０２７８】
（実施例５：細胞免疫染色）
ｐＣＭＶ−ｍｙｃ−Ｓｔｍ１を遺伝子導入した胚性幹細胞を、４％  ＰＦＡで固定し標準的な培養細胞の免疫染色法（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，  １９８５．Ａｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ＦＬ，  ｐｐ．１−１３．）  に従い免疫染色を行った。ブロッキングは０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ／ＰＢＳ／２％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋを用い室温で一時間、洗いは０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳを用い室温で５分を４回行った。一次抗体はｃ−ｍｙｃ  モノクローナル抗体  ２００  μｇ／ｍｌ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を１／１００希釈したものを、二次抗体はＦＩＴＣ標識ｇｏａｔ  抗−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  （ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，  ＩＮＣ）を１／２００希釈したものを使用した。二次抗体の反応後はｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ），  ＤＡＰＩ（ＳＩＧＭＡ）の順に染色を行いシグナルを検出した。
【０２７９】
（Ｓｔｍ遺伝子の発現パターン）（図１，２）
Ｓｔｍ遺伝子はＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ）細胞およびＥＧ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ）細胞のｍＲＮＡのサブトラクションにより胚性幹細胞およびＥＧ細胞に発現するが１２．５日齢胚に発現が見られない遺伝子として本発明者らによって同定された（図１Ｂ）。Ｓｔｍは約２．１  ｋｂの遺伝子でホメオドメイン、Ｂ２リピート配列、Ｗリッチ領域により特徴づけられる（図１Ａ）。成体各組織から回収したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、どの組織からも発現が検出されず、その発現は未分化細胞（ＥＳ細胞およびＥＧ細胞）に対して非常に高い特性をもっていた（図１Ｃ）。Ｓｔｍにｍｙｃタグをつけたコンストラクトを胚性幹細胞に強制発現させ、その局在を抗ｍｙｃ抗体により検出してみると、核への局在が明らかであった（図１Ｄ）。この事実はＳｔｍがホメオボックスをもつ転写因子として機能する可能性を示唆している。より詳細な発現パターンを未分化細胞が存在する初期胚および生殖巣でＲＴ−ＰＣＲ法により解析した（図２）。発現はホメオドメインを挟むプライマー、Ｆ２−Ｒ２により検出した  （図２Ａ）。Ｅ６．５−Ｅ１８．５の着床直後から誕生直前までの胚において解析した結果、未分化細胞が存在するＥ７．５日齢胚まで発現が見られたが、その後急激に消失した（図２Ａ）。これは、Ｅ７．５以降急速に全能性が失われることと関係しているようである。発生が進んだＥ８．５日齢以降の胚でもわずかながら発現が見られたがこれはわずかに含まれる生殖細胞での発現を反映したものであることが以降の実験から示された。Ｓｔｍの発現パターンはＯｃｔ３／４の発現パターンとは異なるようであることがわかった。特に未受精卵ではＳｔｍは発現しないことから、より密接に多能性、全能性に本発明のＳｔｍ１遺伝子の発現が相関していることが明らかになった。着床前胚では、双実胚および胚盤胞でＳｔｍおよびＯｃｔ３／４共に発現が見られたが、未受精卵ではＯｃｔ３／４のみが検出されＳｔｍは見られなかった（図２Ｂ）。このことは、Ｓｔｍの発現が受精後の核の活性化によるｚｙｇｏｔｉｃな発現に起因することを示している。次に、生殖細胞での発現を見るためにＥ１２．５日齢胚の雌雄生殖巣を解析した。その結果、ＳｔｍもＯｃｔ３／４も同様に発現していた。この発現が生殖細胞からのものであることを示すために、生殖巣から始原生殖細胞を精製した。生殖細胞の精製度は生殖細胞に特異的な表面抗原への抗体ＳＳＥＡ−１を用いて行った。３００個以上の細胞を解析した結果９５％以上の細胞がＳＳＥＡ−１陽性であった  （図２Ｃ；赤く発色）。これらの始原生殖細胞でのＳｔｍ発現をみると、Ｏｃｔ３／４同様に陽性であった（図２Ｃ右；ＤＡＰＩによる発色）。
【０２８０】
同様の傾向がＳｔｍ２にもあるかどうかを、特異的制限酵素を用いて調べた。その結果を図２Ｄに示す。この図からも明らかなように、Ｓｔｍ１の発現は、顕著であったが、Ｓｔｍ２の発現は調べたどの段階（ＥＳ細胞、Ｅ７．５、Ｅ１２．５、胚盤胞）でも明らかではなかった。
【０２８１】
したがって、Ｓｔｍ遺伝子はＯｃｔ３／４遺伝子と似た未分化細胞に特異的な発現パターンを示すが、全く同じではなく機能的な違いがあることが判明した。
【０２８２】
（抗体作製）
次に、Ｓｔｍ１の全長アミノ酸配列を用いてウサギポリクローナル抗Ｓｔｍ１遺伝子産物の抗体を作製した。この抗体量を用いることによって、ＲＮＡ量に対応した細胞内のＳｔｍ１タンパク質を検出することができた（図２Ｅ）。
【０２８３】
次に、これらの抗体をもちいて、未分化細胞での局在を調べたところ、Ｓｔｍ１タンパク質は、未分化細胞の核内に局在していることが明らかになった（図２Ｆ）。
【０２８４】
マウスＳｔｍ抗体がＯｃｔ３／４に類似する染色像を示し、共培養しているフィーダー細胞には染色されていないことから、マウス同様に、ヒト、サル、ラットのＥＳ細胞でもＳｔｍが発現していることが明らかになった（図２Ｇ上欄）。
【０２８５】
次に、マウスＥＳ細胞とリンパ球とが混在するサンプルをＳｔｍ抗体染色すると、マウスＥＳ細胞のみが染色される（図２Ｇ中欄）
次に、Ｓｔｍタンパク質は、未分化細胞の核内に局在することが示された（図２Ｇ下欄）。
【０２８６】
次に、Ｓｔｍ抗体を用いて、マウス初期胚発生でのＳｔｍ１タンパク質の局在性を詳細に解析した。これによると、桑実胚まででは発現がないこと、およびＥ６．５日およびＥ７．５日では、胚体外胚葉部（エピブラスト）でのみ発現していることが明らかになった。Ｅ８．５日では、その発現は、かなり消失していた。さらに、Ｅ６．５日では、胚体害組織との境界近傍およびＥ７．５日では尾部原条近傍が強く染色されていることがわかった（図２Ｈ）。
【０２８７】
これらを総合すると、本発明の遺伝子は、未分化な胚性幹細胞で発現しているとして知られるＯｃｔ３／４よりも未分化で多能性を示す領域に特異的であることが示されていることになる。したがって、本発明の遺伝子は、未分化性または多能性（好ましくは、全能性）の特定を、従来では達成できなかった効率で達成するという効果を提供する。。
【０２８８】
（実施例６：ゲノムＤＮＡの回収）
汎用プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  １９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ）に従いゲノムＤＮＡの抽出を行った。抽出ｂｕｆｆｅｒで細胞を懸濁した後、ＲＮａｓｅＡで３７℃一時間処理、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで３７℃一晩処理を行った。その後フェノール抽出を２回かけてエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。
【０２８９】
（実施例７：サザンブロットハイブリダイゼーション解析）
汎用プロトコール（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ９８：  ５０３−５１７）に従いサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。まず胚性幹細胞から抽出したゲノム２０  μｇを水に溶かして１％  アガロースゲルで電気泳動を行った後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ｍｅｍｂｒａｎｅに一晩ブロットした。ブロットしたメンブレンは４２℃でプレハイブリダイゼーションを２時間、ハイブリダイゼーションを一晩行った。メンブレンは６５℃の２ｘＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで２回、０．１ｘＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで１回洗った。プローブは、
ｅｘｏｎ２Ｆ：  ５’−ＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号２１）および
ｅｘｏｎ２Ｒ：  ５’−ＣＴＧＣＴＴＡＴＡＧＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号２２）
プライマーセットによりゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によりえられたフラグメントを用いた。Ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い［α−３２Ｐ］  ｄＣＴＰ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  によりＲＩ標識されたＤＮＡをプローブとして用いた。
【０２９０】
（Ｓｔｍ遺伝子の同定）
Ｓｔｍのホメオボックス領域をプローブとしてマウスゲノムに対するサザンブロットハイブリダイゼーション解析を行うと４つのエクソンからなるＳｔｍ１遺伝子とイントロンレスのＳｔｍ２遺伝子が同定された（図３Ａ，Ｂ）。Ｓｔｍ１遺伝子はマウス第６番染色体上に、Ｓｔｍ２遺伝子は７番染色体上に位置しそれぞれ異なる遺伝子座にマップされた。Ｓｔｍ２遺伝子は、正確には７Ｅ３にマッピングされた（図３Ｅ）。Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２の存在は、Ｅｘ３Ｆ−Ｒ２およびＩｎｔ３Ｆ−Ｒ２プライマーを用いたゲノムＰＣＲ解析によっても再確認された（図３Ｃ）。データベースのコンピューター解析により第１２番染色体およびＸ染色体上にホメオドメインへの部分的相同領域を認めた。Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２からの遺伝子発現を区別する目的で、Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２のゲノム上のｃＮＤＡ領域の配列を比較した。その結果、９５％以上の塩基配列が一致していたが、異なる部分を認識する制限酵素でＳｔｍのＲＴ−ＰＣＲ産物を消化することでその由来を決定した。Ｆ４−Ｒ４のプライマーセットで転写産物の５プライム側を増幅した。ＢｓａＭＩ酵素で消化するとＳｔｍ１の産物は消化され１８３および４１４  ｂｐになるのに対してＳｔｍ２の産物は消化されない。実際、ＲＴ−ＰＣＲ産物の全てが消化されており、Ｓｔｍ１の産物のみが発現していることが示された（図３Ｄ）。同様に、Ｆ３−Ｒ３のプライマーセットにより増幅された３プライム側の転写産物をＮｌａＩＩＩ酵素で消化すると、検出されるＤＮＡフラグメントはＳｔｍ１のみに由来するものであった（図３Ｄ）。第１２染色体の産物も同様に解析を試みたが、発現は認められなかった。これらの結果から、Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２は酷似する配列のＲＮＡをコードするが、実際に転写されるのはＳｔｍ１からのみであり、Ｓｔｍ２はＳｔｍ１の擬遺伝子であると結論つけられた。図１および２で検出された転写産物を同様の制限酵素で解析した結果、転写は全てＳｔｍ１由来であることを確認している。
【０２９１】
（実施例８：ゲノムの多型解析）
亜種関係にあるＭｕｓ  ｍｕｓｕｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（汎用実験マウス）およびＭ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ  （実験動物化野性マウス）由来の胚性幹細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、前出のＦ１およびＲ１プライマーでＰＣＲ増幅を行った。産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍでＴＡクローニングし、Ｍ１３  ｆｏｒｗａｒｄおよびＭ１３  ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いたシークエンス反応により両方向からのＤＮＡ塩基配列を決定した。シークエンスはキャピラリーシークエンサーＣＥＱ  ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）  を用いて行った。塩基配列データを亜種間で比較し、由来を区別できる塩基配列を決定した。また、Ｆ１およびＲ１プライマーを用いてえられたＲＴ−ＰＣＲ産物を制限酵素ＳｎａＢＩで切断し、ＳｎａＢＩ認識部位の塩基配列の違による感受性の違いから産物の由来を決定した。
【０２９２】
（実施例９：Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２の発現解析）
Ｓｔｍ１の類似遺伝子Ｓｔｍ２がゲノム上に存在することを、ゲノムＤＮＡを鋳型に
Ｅｘ３Ｆ：  ５’−ＧＴＧＧＴＴＧＡＡＧＡＣＴＡＧＣＡＡＴＧＧ−３’（配列番号２３）、
Ｉｎｔ３Ｆ：  ５’−ＣＴＡＴＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡ−３’（配列番号２４）およびＲ２
の３種類のプライマーを組み合わせてＰＣＲを行い確認した。ＰＣＲは、９４℃で５分インキュベーションした後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で５分インキュベーションの条件で行った。Ｅｘ３Ｆ−Ｒ２のプライマーの組み合わせではＳｔｍ１およびＳｔｍ２の産物のサイズが異なり、Ｉｎｔ３Ｆ−Ｒ２のプライマーの組み合わせではＳｔｍ１のみが検出された。両遺伝子のゲノム上での存在が示された。
【０２９３】
Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２の発現を区別する目的で、Ｍ．ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの胚性幹細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、
Ｆ３：  ５’−ＣＴＴＴＧＡＡＣＴＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡ−３’（配列番号２５）および
Ｒ３：  ５’−ＴＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２６）；
Ｆ４：  ５’−ＣＡＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＧ−３’（配列番号２７）および
Ｒ４：  ５’−ＧＡＧＣＡＣＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２８）；
のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。Ｆ３−Ｒ３およびＦ４−Ｒ４産物をクローニング、シークエンスし塩基配列を決定および比較した。Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２産物の塩基配列の違いからその由来を決定できた。次に、胚性幹細胞のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、Ｆ３−Ｒ３およびＦ４−Ｒ４のＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニング、シークエンスした。その結果、得られた転写産物はＳｔｍ１遺伝子の発現によることが明らかになった。このことは、Ｆ３−Ｒ３およびＦ４−Ｒ４のＲＴ−ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｌａＩＩＩおよびＢｓａＭＩでそれぞれ切断することによりＳｔｍ１型の転写産物であることから確認された。
【０２９４】
（実施例１０：再プログラム化マーカー遺伝子としてのＳｔｍ１）
体細胞核が再プログラム化され未分化細胞と同様に振る舞うことが可能であることが、体細胞および胚性幹細胞の細胞融合および体細胞核の除核未受精卵への核移植実験により明らかになっている。前者はクローン細胞を、後者はクローン個体を作製するために有効な方法であることが経験的に明らかになっているが、再プログラム化の機構は全くわかっていない。未分化細胞に特異的なＳｔｍ１遺伝子は、少なくとも以下の２つの応用が考えられる。１）体細胞核の未分化細胞核への再プログラム化マーカー、２）Ｏｃｔ３／４遺伝子との比較による再プログラム化機構の解明。１）に迫る目的で細胞融合および核移植の実験を行った。
【０２９５】
（細胞融合および核移植）
細胞融合実験において、体細胞核からおよび胚性幹細胞核からのＳｔｍ１転写産物を区別する目的で、胚性幹細胞または体細胞をＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来のものを用いた。Ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来の胚性幹細胞は当研究室で新たに樹立した。Ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓゲノムは汎用されるマウス系統  Ｍ．ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓに対して塩基配列の多型に富むため、ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓおよびｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの融合細胞を用いることで転写産物の由来を決定できる。融合細胞作製の方法を図４Ａに示した。Ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来の胚性幹細胞を用いた融合細胞がＭｘＲ，ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来の体細胞を用いた融合細胞がＨ×Ｊである。Ｓｔｍ１は体細胞である胸腺細胞での発現が認められない、一方胚性幹細胞では発現している。Ｍ×ＲおよびＨ×Ｊの融合細胞クローン全てにおいてＳｔｍ１が発現していることがわかる（図４Ｂ）。Ｓｔｍ１遺伝子が胚性幹細胞核および再プログラム化体細胞核両者から発現していることを確認する目的で、Ｆ１−Ｒ１プライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ産物をＳｎａＢＩ制限酵素で消化した。Ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来の転写産物はＳｎａＢＩ消化に感受性があり、５７０  ｂｐのバンドが２３０および３４０  ｂｐの２本のバンドになる。これに対して、ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ転写産物はＳｎａＢＩによって消化されず５７０  ｂｐのバンドとして残る。Ｍ×Ｒ及びＨ×Ｊ融合細胞ではＳｎａＢＩによって消化されたバンドおよび消化されないバンドの両方が検出された。このことから胚性幹細胞核および再プログラム化体細胞核の両方からＳｔｍ１が転写されていることが示された（図４Ｃ）。Ｓｔｍ１遺伝子は体細胞核の再プログラム化マーカー遺伝子として応用可能である。
【０２９６】
（未分化マーカー）
Ｓｔｍ１が体細胞核移植での再プログラム化マーカー遺伝子として応用可能か否かを確かめる目的で、（Ｂ６×ＣＢＡ）Ｆ１マウス（ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）の未受精卵から核を除き、ＪＦ１マウス（ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ）卵丘細胞（体細胞）核を移植した（図４Ｄ）。得られたクローン胚盤胞でのＳｔｍ１の発現を観察した。卵丘細胞では発現していなかったＳｔｍ１がクローン胚盤胞では発現していた（図４Ｅ）。また、核移植胚盤胞で体細胞由来のＳｔｍ１が発現していることも示された。Ｓｔｍ１転写転写産物の由来は、ＳｎａＢＩ消化に対する感受性の違いから確認した。クローン胚盤胞ではｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ由来のＳｔｍ１が発現していた。体細胞および胚性幹細胞の細胞融合および体細胞核核移植の実験からＳｔｍ１が再プログラム化マーカー遺伝子として有用であることが示された。
【０２９７】
次いで、体細胞核移植クローン胚盤胞におけるＳｔｍ１遺伝子の発現を調べた。（ｍｏｌｘｄｏｍ）Ｆ１クローン胚盤胞由来のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡをＦ１−Ｒ１プライマー（図１Ａ参照）を用いてＰＣＲ増幅した。陽性コントロールとしてＯｃｔ３／４遺伝子を用いた。得られたＳｔｍ１産物を制限酵素ＳｎａＢＩで消化した。ｍｏｌ由来の産物はＳｎａＢＩ消化感受性であるのに対し、ｄｏｍ由来の産物はＳｎａＢＩ消化耐性である。Ｆ１クローン胚盤胞ではｄｏｍのみならずｍｏｌ由来の産物も検出され、核移植により体細胞核由来のＳｔｍ１が再活性化することが示された。
【０２９８】
（実施例１１：組織幹細胞マーカー遺伝子としてのＳｔｍ１）
胚性幹細胞と並んで組織幹細胞が再生医療への応用から注目を集めている。組織幹細胞は組織の新陳代謝に伴う新たな細胞を供給するための源となる細胞であり、各組織に存在すると考えられているがその樹立方法および精製のための方法は確立されていない。組織幹細胞の精製における壁の一つが特異的マーカーである。Ｏｃｔ３／４を発現する組織幹細胞として報告されているのは、骨髄の間質組織幹細胞、ＭＡＰＣのみである。多能性をもつ幹細胞としてＭＡＰＣに加えて脳性幹細胞（ＮＳ；  Ｎｅｕｒｏｓｈｅｒｅ）がある。しかし、ＮＳでのＯｃｔ３／４の発現はまだ報告されていない。ＭＡＰＣ様細胞およびＮＳでのＳｔｍ１の発現を調べたところ、Ｏｃｔ３／４が発現していないにもかかわらずＳｔｍ１の発現が見られた（図５）。このプライマーセットでは、産物のサイズからＳｔｍ１のゲノムおよびＲＮＡが検出できることから、ＲＮＡを検出したことは明らかである。このことはＳｔｍ１の発現制御がＯｃｔ３／４と独立したものである可能性と、Ｏｃｔ３／４の上流に位置しＯｃｔ３／４が発現される以前の初期未分化細胞を同定するためのマーカー遺伝子になり得ることを示唆している。また、Ｓｔｍ１の相同遺伝子は霊長類であるカニクイザルおよびヒトにも存在する。カニクイザル胚性幹細胞およびヒトＥＣ細胞においてもＳｔｍ１の発現を確認している。これらの事実は、Ｓｔｍ１の再生医療への応用の可能性を示唆している。
【０２９９】
（実施例１２：未分化細胞の分離）
本実施例では、Ｓｔｍ１の再生医療応用への展開として、Ｓｔｍ１を用いた幹細胞の分離を行った。
【０３００】
Ｓｔｍ１が幹細胞すべての未分化細胞マーカーとして応用可能であることから、Ｓｔｍ１のプロモーター制御下に蛍光マーカー遺伝子、ＧＦＰを導入しその発現をモニターした。組織細胞そのものまたはその培養細胞からＧＦＰの発現を目印にセルソーターによって組織幹細胞の生細胞を濃縮することが可能になった。また、胚性幹細胞の中でも高い未分化性を維持する細胞のみを選択することが可能である。Ｓｔｍ１の遺伝子機能を欠損した胚は、胚発生致死になることが相同組み換えによる遺伝子ノックアウトの実験から明らかになっている。このことはＳｔｍ１が未分化性維持のために必須であることを示唆している。
【０３０１】
したがって、Ｓｔｍ遺伝子のプロモーターもまた、未分化細胞のマーカーとして使用することができることが判明した。
【０３０２】
（実施例１３：Ｓｔｍ遺伝子の改変体の機能）
Ｓｔｍ１遺伝子は、ホメオドメイン、Ｂ２反復配列およびＷリッチ領域によって特徴づけられる。これらの塩基配列にポイントミューテーション（例えば、配列番号３（マウスＳｔｍ遺伝子）の５００位（ＴをＡにした）、８００位（ＡをＴにした）、１２００位（ＴをＡにした））を入れることでコードするアミノ酸配列を変更し、それぞれのミューテーションをもとに領域のもつ機能を検索した。領域を部分的に（例えば、５００位〜５５０位、８００位〜８５０位、および１２００位〜１２５０位）ノックアウトすることで、それぞれの機能を検討した。
【０３０３】
例えば、Ｓｔｍ１は核局在の蛋白質でホメオドメインをもつことから分化誘導蛋白の発現を抑制する働きが推測される。上記変異体について、このホメオドメインを欠損することで、細胞の未分化維持機構が破綻すれば、この領域が制御に重要な役割を果たすことが明らかになる。
【０３０４】
（実施例１４：Ｓｔｍ遺伝子の機能）
コンディショナルノックアウトの実験により初期胚および生殖細胞といった特定の未分化組織細胞での機能に解析する。ＳＴＭ１タンパク質の機能の多くは不明であるが、ＳＴＭ１またはＳｔｍ１により制御される下流遺伝子の発現調節より細胞を未分化な状態へと変化させる（すなわち、若返らせる）作用があることが実証される。
【０３０５】
（実施例１５：プロモーター配列の同定）
次に、Ｓｔｍ１のプロモーター配列を同定した。
【０３０６】
転写開始点上流２３００ｂｐ（−２３００ｂｐ）から５’側を短く削った長さの異なる５’上流領域に、ルシフェラーゼ遺伝子をつなげた構築物数種を作製し（図１１Ａを参照）、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼアッセイは、ルシフェラーゼの発光の強度を測定することによって評価した。その結果、転写開始点から−３３２ｂｐから−１５３ｂｐの間に転写を正に制御するエレメントがあることが判明した。
【０３０７】
次に、そのエレメントを同定するために、転写開始点を基準として−３３２ｂｐから−１５３ｂｐの領域に存在する転写因子結合配列の中から、Ｏｃｔａｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｏｃｔモチーフ）およびＳｏｘ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｓｏｘモチーフ）が連続して存在している部位に注目した（図１１Ｂ）。
【０３０８】
それぞれのドメインまたは両方に３塩基の配列を導入し、ルシフェラーゼ活性を比較した結果を図１１Ｃに示す。この結果から、この部位が転写活性において重要であり、かつ両方のドメインが必要であることが判明した。
【０３０９】
このうち、プロモーターとして最小限必要な部分は、配列番号３２において、−３３２〜＋５０位までが記載されているが、−１８０〜−１６６位（ＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡＣＡＡＴＧ）であることが判明した（図８および図１１Ｂを参照）。
【０３１０】
（実施例１６：ｈｐｒｔを利用した未分化細胞の選択的除去）
次に、ｈｐｒｔを利用した未分化細胞の選択的除去を行なった。この除去は、以下のようなプロトコールを採用した。そのスキーム例を図９に示す。
【０３１１】
１．未分化細胞特異的に発現する遺伝子としてＳｔｍ１のプロモーターに、Ｈｐｒｔ遺伝子を組み込んだ。これは、実施例１５において同定したＳｔｍ１のプロモーター配列（配列番号３２）にＨｐｒｔ遺伝子を組み込み、Ｐｓｔｍ１：：ＨｐｒｔＯＲＦという核酸構築物を構築した。
【０３１２】
Ｓｔｍ１遺伝子の転写開始点から上流２．５ｋｂ（ＬＡ；左アーム）およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の終点直下（エキソン４の中）か下流３．９ｋｂ（ＲＡ；右アーム）に転写制御領域が含まれる。ＬＡおよびＲＡを含むプラスミド（Ｐｓｔｍ１）を作製した。このプラスミドには、ＬＡとＲＡとの間に制限酵素ＢａｍＨＩ特異的な切断部位が存在する。このＢａｍＨＩで消化したＰｓｔｍ１の切断部位を平滑末端処理した。ここに、平滑末端処理したＨｐｒｔＯＲＦのＤＮＡ断片をライゲーションした。制限酵素解析およびＤＮＡの配列決定によって導入されたＨｐｒｔＯＲＦのＤＮＡ断片の方向を決定し、正方向に導入されたプラスミドをＰｓｔｍ１：：ＨｐｒｔＯＲＦとしてＨｐｒｔ欠損ＥＳ細胞の形質転換に用いた。
【０３１３】
２．次に、Ｈｐｒｔ欠損ＥＳ細胞株を樹立する（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡを参照）か、または購入する（マウスＨｍ１細胞株、Ｍａｒｔｉｎ  Ｅｖａｎｓ博士から分与していただいた）。このような細胞は、Ｈｐｒｔ遺伝子の機能を欠損したマウスから樹立した。ＥＳ細胞の樹立は一般的な手法を用いて行った。以下に方法を記載する。受精後３．５日齢のマウスから回収した胚盤胞を白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含むＥＳ細胞培地で培養した。このとき、不活性化したマウスフィーダー細胞をフィーダー細胞として用いた。増殖してきた内部細胞塊由来の細胞をトリプシン処理して解離し、再びフィーダー細胞上で培養し胚性幹細胞を得た。
【０３１４】
３．Ｈｐｒｔ欠損ＥＳ細胞株に上記Ｐｓｔｍ１：：ＨｐｒｔＯＲＦをトランスフェクションする。トランスフェクションの条件は以下のとおりである。至適培養条件下で指数関数的に増殖しているＥＳ細胞を１×１０７細胞個準備した。遠心分離により得られた細胞ペレットを１ｍｌの無血清培地に浮遊させた。再び遠心分離した後、１ｍｌの無血清培地に浮遊させた。この細胞浮遊溶液を電極間距離が４ｍｍのエレクトロポレーション用キュベット（ＢＩＯＲＡＤ，ＧｅｎｅＰｕｌｓｅ  Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏ．９５５９５０）にいれ、５分間氷上にて冷やした。導入するＤＮＡ５０〜１００μｇを細胞溶液に加えよく混ぜた。ＢＩＯＲＡＤ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒにキュベットをセットし、２５０Ｖｏｌｔ／５００μＦの条件で電気刺激を与えた。氷上で５分間冷やした後、ＥＳ細胞用の培地に不活性フィーダー細胞を播いてある直径１００ｍｍの培養皿に細胞を播いた。細胞をよく攪拌した後、３７℃で５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。
【０３１５】
遺伝子導入処理２４時間後、ＥＳ細胞用培地にＨＡＴ（ＨＡＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ  Ｃａｔ  Ｎｏ．３１０６２−０１１；１００倍溶液中に１０ｍＭヒポキサンチン、４０μＭアミノプテリン、１．６ｍＭチミジン）を加えたＥＳ／ＨＡＴ培地中で３７℃で５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。遺伝子が導入されていないＨｐｒｔ欠損ＥＳ細胞は、ＥＳ／ＨＡＴ培地で培養後３日目から死滅し始めた。他方、Ｈｐｒｔ遺伝子が導入されたＥＳ細胞では、ＥＳ／ＨＡＴ培地でも細胞増殖を続け、選択培地での培養後７〜１０日目で肉眼でも識別できる大きさの細胞コロニーを形成した。細胞増殖しないフィーダー細胞は、ＥＳ／ＨＡＴ培地中でも生存し、ＥＳ細胞の増殖を補助することができる。出現したＨＡＴ耐性ＥＳ細胞コロニーをピックアップし解離した後、それぞれをＥＳ／ＨＡＴ培地で培養し直径６０ｍｍの培養皿いっぱいに増殖した時点を樹立１代目とした。
【０３１６】
４．この未分化細胞を、３回無血清培地にて洗浄し、血清を完全に取り除いた。ＥＳ細胞培地にウシ血清の代わりにノックアウト血清代替添加物ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８２８−０２８）を加えた培地を用いて、ＰＡ６フィーダー細胞上で未分化細胞を８−１１日間培養した（Kawasaki et al., 2000, Neuron 28; 31-40、Tada et al., 2003; Dev.Dyn., 227; 504-510.参照）。これにより、神経細胞に分化させた。
【０３１７】
５．６−ＴＧ培地（例えばSIGMA  Cat No. A4660で購入可能）で上記分化すべき細胞を培養する。ここで、Ｈｐｒｔ−細胞のみ増殖が観察される。上記Ｐｓｔｍ１：：ＨｐｒｔＯＲＦ遺伝子発現未分化細胞は、選択的に除去される。これは、遺伝子の発現と同時に達成される。
【０３１８】
６．未分化細胞混入率を必要に応じて検査する。これは、本発明のＳｔｍ抗体または市販のＯｃｔ３／４抗体によって検査することが可能である。
【０３１９】
７．分化細胞のみの細胞集団が得られる。これは、使用まで、４℃でまたは−８０℃で保存する。
【０３２０】
（実施例１７：ＧＦＰを利用した未分化細胞の選択的除去）
次にＧＦＰを利用した未分化細胞の選択的除去を行なった。そのスキームを図１０に示す。
【０３２１】
１．未分化細胞特異的に発現する遺伝子としてＳｔｍ１のプロモーターに、ＧＦＰ遺伝子を組み込んだ。これは、実施例１５において同定したＳｔｍ１のプロモーター配列（配列番号３５）にＨｐｒｔ遺伝子を組み込み、Ｐｓｔｍ１：：ＨｐｒｔＯＲＦという核酸構築物を構築する。具体的な手順は以下のとおりである。
【０３２２】
Stm1遺伝子の転写開始点から上流2.5kb（LA;left arm）とオープンリーディングフレーム (ORF) の終点直下 (Exon 4の中) から下流3.9kb (RA; right arm) に転写制御領域が含まれる。LAとRAとを含むプラスミド（Pstm1）を構築した。ここで、LAとRAとの間に制限酵素BamH1の独特の切断部位がある。BamH1で消化したPstm1の切断部位を平滑末端処理する。ここに平滑末端処理したGFP遺伝子（配列番号３５）のDNA断片をライゲーションする。制限酵素解析やDNAのシークエンスにより導入されたGFPのDNA断片の方向を決定し、正方向に導入されたプラスミドをPstm1::GFPとしてES細胞の形質転換に用いた。
【０３２３】
２．細胞を上述のように神経細胞に分化させ、セルソーター（ベクトン・ディッキンソン（BD）FACS Vantage SE）を利用して、ＧＦＰ陽性の未分化細胞を除いた。
【０３２４】
３．分化細胞のみの細胞集団が得られる。これは、使用まで、４℃でまたは−８０℃で保存する。通常、細胞は移植直前までの短期保存は４度で行い、長期保存は−８０度または−１９６度（液体窒素）で行った。
（実施例１８：選択的除去された細胞の移植）
実施例１６または１７において得られた細胞集団は、そのまま治療に使用できる。この場合、神経細胞に分化させた細胞は、神経の修復に使用可能である。あるいは、例えば肝門脈から注入により肝臓への細胞移植にも応用することが可能である。このように分化させた未分化細胞除去細胞集団は、実際に種々の臓器移植または補填治療に使用することができる。あるいは、腎臓、肝臓などの臓器への再生への利用も可能である。
【０３２５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３２６】
未分化細胞を実質的に含まない分化細胞の集団が提供される。このような細胞の集団は、種々の治療に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０３２７】
【図１Ａ】図１Ａは、マウスＳｔｍ  ｃＤＮＡの模式図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｓｔｍの胚性幹細胞、ＥＧ細胞および１２．５日齢胚（Ｅ１２．５）における発現パターンを示すノーザンブロット分析の結果である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、成体各組織から回収したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いたＳｔｍに関するＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ｓｔｍにｍｙｃタグをつけたコンストラクトを胚性幹細胞に強制発現させた結果を示す。ここで、Ａｂ（＋）は、抗体のみを示し、Ａｂ（＋）＆ＤＡＰＩは、抗体およびＤＡＰＩの存在下での写真を示す。Ａｂ（＋）＆Ａｃｔｉｎは抗体およびアクチンの存在下での写真を示す。Ａｂ（＋）＆ＤＡＰＩ／ｍｙｃ−ｖｅｃｔｏｒは、ｍｙｃベクターのみを使用した抗体およびＤＡＰＩの存在下での写真を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｓｔｍのホメオドメインを挟むプライマＦ２−Ｒ２の構造を示す。図２Ａの下のパネルは、Ｅ６．５−Ｅ１８．５の着床直後から誕生直前までの胚におけるＳｔｍのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、未受精卵、双実胚および胚盤胞におけるＳｔｍのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃ左は、Ｅ１２．５日齢胚の雌雄生殖巣の解析を示す。ここでは、マウス１２．５日齢胚の生殖細胞を含む雄雌生殖巣からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりＳｔｍ１の発現を確認したものが示されている。Ｏｃｔ３／４は未分化細胞のコントロールであり、Ｇ３ｐｄｈはＲＮＡ量のコントロールである。図２Ｃ右は、Ｅ１２．５日齢の生殖巣から精製した始原生殖細胞でのＳｔｍ１遺伝子の発現を示す。細胞の９５％以上がＳＳＥＡ１陽性細胞であることから、始原生殖細胞が精製されていることが解る。これらの細胞では、陽性コントロールのＯｃｔ３／４に加えて、Ｓｔｍ１遺伝子も発現していることがＲＴ−ＰＣＲ解析により示されている。これらの始原生殖細胞でのＳｔｍ発現をみると、Ｏｃｔ３／４同様に陽性であった。図２Ｃ右；ＤＡＰＩによる発色を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２のＥＳ細胞、Ｅ７．５、Ｅ１２．５、および胚盤胞における発現を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、抗体を用いたＳｔｍ１の発現遷移を示す。未分化細胞でのＳｔｍ１タンパク質発現のウェスタンブロット分析を行った結果である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、抗体を用いたＳｔｍ１の細胞内での発現遷移を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇ上欄は、抗体を用いたＳｔｍ１とＯｃｔ３／４との間の細胞内での発現遷移の比較を示す。マウス、サル、ヒトでも観察されていることがわかる。中欄は、マウスＥＳ細胞とリンパ球とが混在するサンプルのＳｔｍ抗体染色を示す。下欄は、Ｓｔｍ遺伝子が未分化細胞の核内に局在する様子を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、Ｓｔｍ抗体を用いて、マウス初期胚発生でのＳｔｍ１タンパク質局在性の詳細な解析である。マウス初期胚でのＳｔｍ１タンパク質の発現。桑実胚（ｍｏｒｕｌａ）ではすべての割球の核が陽性染色された。着床直前の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）では、将来胚体を形成する多能性細胞および内部細胞塊細胞の核が強染されていた。他方、将来胎盤を含む胚体外組織に運命決定付けられた栄養外胚葉（外側を囲む細胞）は全く染色されなかった。着床後3日目の６．５日齢胚では、胚体を形成するエピブラストが陽性染色されていた。特に胚体外外胚葉との境界領域が強く染色された。７．５日齢胚では、Ｓｔｍ１タンパク質の発現は、エピブラストでも原条付近（尾部）に強く見られた。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｓｔｍ１、Ｓｔｍ２、ＣｈｒＸ断片およびＣｈｒ１２断片（Ｓｔｍ３、Ｓｔｍ４ともいう）の概略図を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩで消化したときのサザンブロットハイブリダイゼーション解析を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｅｘ３Ｆ−Ｒ２およびＩｎｔ３Ｆ−Ｒ２プライマーを用いたゲノムＰＣＲ解析の結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、Ｓｔｍ１およびＳｔｍ２遺伝子の発現解析を示す。ＳｔｍのｃＤＮＡの中央部と３プライム部に、それぞれＦ４−Ｒ４およびＦ３−Ｒ３  ＲＴ−ＰＣＲプライマーを設定し検出された産物がＳｔｍ１に由来するものかＳｔｍ２に由来するものか、または両者に由来するものかを決定した。全てのＦ４−Ｒ４産物がＢｓａＭＩ制限酵素による消化により、また全てのＦ３−Ｒ３産物がＮｌａＩＩＩ制限酵素による消化により切断されることから、これらの産物はすべてＳｔｍ１遺伝子に由来し、Ｓｔｍ２遺伝子は偽遺伝子であることが示された。
【図３Ｅ】図３Ｅは、Ｓｔｍ遺伝子のマッピングを示す。左は概略図であり、右は第７染色体を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、融合細胞作製の方法を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＥＳ細胞と体細胞の融合細胞におけるＳｔｍ１遺伝子の発現を示す。Ｓｔｍ１の発現が抑制されている胸腺細胞とＥＳ細胞を細胞融合すると、ＥＳ細胞と同様に融合細胞でもＳｔｍ１の発現がＲＴ−ＰＣＲにより検出される。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＥＳ融合細胞における体細胞核由来Ｓｔｍ１遺伝子の発現を示す。亜種間（ｄｏｍ；  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓとｍｏｌ；  Ｍ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ）ＥＳ融合細胞のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ  をＦ１−Ｒ１プライマー（図１Ａ参照）を用いてＰＣＲ増幅した。体細胞由来とＥＳ細胞由来の産物は、塩基配列の多型から制限酵素ＳｎａＢＩへの感受性により区別できる。ＭｘＲ  （ＥＳ；  ｍｏｌ  ｘ  Ｔｈｙｍｕｓ；  ｄｏｍ）  および  ＨｘＪ  （ＥＳ；  ｄｏｍ  ｘ  Ｔｈｙｍｕｓ；  ｍｏｌ）融合細胞において、ともにＥＳ細胞核由来と体細胞核由来のＳｔｍ１遺伝子の発現が検出される。
【図４Ｄ】図４Ｄは、体細胞核移植によるＳｔｍ１遺伝子の再活性化を示す。Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ  （ｄｏｍ）由来の除核未受精卵に（Ｍ．ｍ．ｍｏｌｏｓｓｉｎｕｓ（ｍｏｌ）ｘｄｏｍ）Ｆ１マウス由来の繊維芽細胞の核を核移植し、クローン胚盤胞を作製する。このクローン胚盤胞でのＳｔｍ１の発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析する。
【図４Ｅ】図４Ｅは、核移植細胞におけるＳｔｍ１遺伝子の発現を示す。
【図５Ａ】図５は、脳性幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）、胚性幹細胞（ＥＳ）、胸腺、およびＭＢ  ＭＡＰＣ（多能性をもつ幹細胞）におけるＳｔｍ，Ｏｃｔ３／４、Ｇ３ｐｄｈの発現の状態を示す。図５Ａは、マウスＳｔｍ１とヒトＳｔｍ１との配列比較を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ヒトＥＣ細胞でのＳｔｍ１の発現である。Ｏｃｔ３／４は未分化細胞のコントロール、Ｇ３ＰＤＨはＲＮＡのコントロールである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、マウス１２．５日齢の脳から得られたマウス神経幹細胞  （Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）  でのＳｔｍ１の発現を示す。Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ１、２および３はそれぞれに独立に得られたものでのＳｔｍ１の発現である。Ｇ３ｐｄｈはＲＮＡのコントロールである。
【図６】図６は、Ｓｔｍを含む遺伝子（ヒト、マウスおよびサル）のアラインメントである。
【図７】図７は、マウスＳｔｍ１アミノ酸配列およびマウスＳｔｍ２アミノ酸配列のアラインメントである。＊は同一の残基を示し、．は類似する残基を示す。
【図８】図８は、Ｓｔｍ１のプロモーターの決定のためのスキームを示す。
【図９】図９は、Ｓｔｍ１のプロモーターを用いた未分化細胞除去のスキーム例を示す。
【図１０】図１０は、蛍光およびセルソーターを利用した未分化細胞除去の別のスキーム例を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｓｔｍ１プロモーターを解析する際に用いた短縮型構築物を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、マウスプロモーター領域におけるＯｃｔおよびＳｏｘモチーフの配置を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、実施例１５におけるプロモーター領域の同定の際の実験結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０３２８】
（配列表の説明）
配列番号１および２：ヒトＳｔｍ１核酸およびアミノ酸配列
配列番号３および４：マウスＳｔｍ１核酸およびアミノ酸配列
配列番号５および６：カニクイサルＳｔｍ１核酸およびアミノ酸配列
配列番号７および８：ヒトＳｔｍ２核酸およびアミノ酸配列
配列番号９および１０：マウスＳｔｍ２核酸およびアミノ酸配列
配列番号１１：Ｆ１プライマー
配列番号１２：Ｒ１プライマー
配列番号１３：Ｆ２プライマー
配列番号１４：Ｒ２プライマー
配列番号１５：Ｏｃｔ４ＲＴ／１プライマー
配列番号１６：Ｏｃｔ４ＲＴ／２プライマー
配列番号１７：Ｇ３ＰＤＨ−５プライマー
配列番号１８：Ｇ３ＰＤＨ−３プライマー
配列番号１９：Ｓｔｍ−ｆプライマー
配列番号２０：Ｓｔｍ−ｒプライマー
配列番号２１：ｅｘｏｎ２Ｆプライマー
配列番号２２：ｅｘｏｎ２Ｒプライマー
配列番号２３：Ｅｘ３Ｆプライマー
配列番号２４：Ｉｎｔ３Ｆプライマー
配列番号２５：Ｆ３プライマー
配列番号２６：Ｒ３プライマー
配列番号２７：Ｆ４プライマー
配列番号２８：Ｒ４プライマー
配列番号２９および３０：ラットＳｔｍ核酸およびアミノ酸配列
配列番号３１：ヒトＳｔｍ１核酸配列のプロモーター領域の配列
配列番号３２：マウスＳｔｍ１核酸配列のプロモーター領域の配列
配列番号３３：カニクイサルＳｔｍ１核酸配列のプロモーター領域の配列
配列番号３４：マウスＳｔｍ１核酸配列の５’上流−２３００までの配列
配列番号３５：ＧＦＰ遺伝子をコードする核酸配列
配列番号３６：ＧＦＰ遺伝子のアミノ酸配列。
【図１Ａ】
2005095027.tif 000002
【図１Ｂ】
2005095027.tif 000003
【図１Ｃ】
2005095027.tif 000004
【図１Ｄ】
2005095027.tif 000005
【図２Ａ】
2005095027.tif 000006
【図２Ｂ】
2005095027.tif 000007
【図２Ｃ】
2005095027.tif 000008
【図２Ｄ】
2005095027.tif 000009
【図２Ｅ】
2005095027.tif 000010
【図２Ｆ】
2005095027.tif 000011
【図２Ｇ】
2005095027.tif 000012
【図２Ｈ】
2005095027.tif 000013
【図３Ａ】
2005095027.tif 000014
【図３Ｂ】
2005095027.tif 000015
【図３Ｃ】
2005095027.tif 000016
【図３Ｄ】
2005095027.tif 000017
【図３Ｅ】
2005095027.tif 000018
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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