(57)【要約】【課題】透析用低分子抗凝固製剤を提供する。【解決手段】  下記式、【化１】2005046377.tif 000013で表される、４−［（２−アミジノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イルオキシ）メチル］−１−（４−ピリジニル）ピペリジン−４−カルボン酸、特にそのモノメタンスルホン酸（4-[(2-amidino-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-7-yloxy)methyl]-1-(4-pyridinyl)piperidine-4-carboxylic acid monomethanesu1fonate）もしくはその薬学的に許容される塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する抗凝固剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−［（２−アミジノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イルオキシ）メチル］−１−（４−ピリジニル）ピペリジン−４−カルボン酸もしくはその薬学的に許容される塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する血液体外循環回路用抗凝固剤。
【請求項２】
４−［（２−アミジノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イルオキシ）メチル］−１−（４−ピリジニル）ピペリジン−４−カルボン酸  モノメタンスルホン酸３水和物を有効成分として含有する血液体外循環回路用抗凝固剤。
【請求項３】
腎不全患者の透析治療のための請求項１または２に記載の血液体外循環回路用抗凝固剤。
【請求項４】
注射用水またはブドウ糖注射液を含有する請求項１乃至３のいずれかに記載の血液体外循環回路用抗凝固剤。
【請求項５】
密封された注射筒に装填されてなる請求項１乃至４のいずれかに記載の血液体外循環回路用抗凝固剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファクターＸａ阻害剤を有効成分とする透析等の血液体外循環回路用の抗凝固剤に関するものであり、特に出血性の慢性腎不全患者を対象とした透析に適した抗凝固剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腎臓の働きは、老廃物の除去である。体にとって不要な老廃物（UN、クレアチニンなど、たんぱく質が分解されてできた物質をはじめとする尿毒症物質）は、血液とともに腎臓に運ばれ、糸球体を通る間に濾過され尿として排泄される。一方、体に必要なナトリウムやアミノ酸などは、尿が尿細管を通る間に再吸収されて再び血液に戻される。このように、腎臓は老廃物の排泄の他、水分の調節、電解質のバランスの調節、ビタミンＤの活性化やホルモンの生成等、人体にとって不可欠な重要な役割を担っている。
【０００３】
この腎臓の機能が慢性的に低下しまたは無機能に陥った状態が慢性腎不全である。慢性腎不全の主な原因は、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、膠原病である。慢性腎不全は、末期に至るまで無症状で経過し、ある日突然尿毒症症状に見舞われる場合が多い。尿毒症になると体内に老廃物や有害な物質が蓄積し、体内のバランスが保てなくなる。
【０００４】
腎不全の主な治療方法は、血液透析、腹膜透析、腎移植である。このうち血液透析は、腎臓の働きを代行する治療法であり、体内に蓄積した尿毒症の原因物質や老廃物を排泄し、血液中のナトリウム、カリウム、カルシウム等の電解質および酸性・アルカリ性のバランスを維持し、体液量を調節する治療法である。毎週、各３回の透析で健康な腎臓の１５％相当の働きをすると言われている。
【０００５】
一般に、透析は、図１で示される血液体外循環回路を利用することによって行われる。患者の動脈から導かれた動脈血は、血液ポンプ２の働きによって動脈側血液回路１を通って動脈エアートラップ４に搬送される。トラップ４に血液が流入するに先立って抗凝固剤注入ポンプ３から抗凝固剤が添加される。抗凝固剤が添加された血液はダイアライザー５に送り込まれ、ここで透析液供給装置６から送り込まれた透析液と透析膜を介することによって溶質の濃度差による拡散と、静力学的な圧力差による限外濾過作用によって、溶質すなわち老廃物が除去され、同時に水分の除去が行なわれて血液が浄化される。浄化された血液は、静脈エアートラップ７を経て、最終的に静脈側血液回路８を通って再び体内の静脈に戻される。
【０００６】
透析は、まず、一定量の抗凝固剤を含有させた生理食塩水を回路内に充填しておくか（プライミング）、もしくは透析開始時に回路内に一定量をボーラス投与し（初回投与）、血液が回路内を循環し始めた段階で血中に同抗凝固剤を連続的に少量ずつ投与（持続投与）することにより行われる。
【０００７】
透析器の心臓部ともいえるダイアライザーはほぼ円筒形で、内部には縦方向に数千〜１万数千本の中空糸状の透析膜（内径175〜280μ、膜厚7〜50μ）を有しており、それら各々の中空糸が透析膜として機能する。動脈血は該中空糸の中を流れ、一方で、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の電解質等を含む透析液がこれら中空糸の外側の間隙を通る構造となっている。中空糸を構成する透析膜素材は、再生セルロース(ＲＣ)、表面改質再生セルロース、セルロースアセテート(ＣＡ)等の天然高分子のセルロース系素材と、ポリアクリロニトリール(ＰＡＮ)、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)、エチレンビニルアルコール共重合体(ＥＶＡＬ)、ポリスルホン(ＰＳ)、ポアミド(ＰＡ)、ポリエステル系ポリマーアロイ(ＰＥＰＡ)等の合成高分子系素材の２つに大別される。
【０００８】
これらダイアライザーを構成する中空糸をはじめとする血液体外循環回路素材は生体にとって異物であり、これら素材、特にダイアライザーの中空糸内壁と血液が接触することによって、回路内壁や中空糸内で血液が凝固し、目詰まり起こし、治療を継続できなくなるという問題がある。
【０００９】
そこで、回路内での血液凝固、特にダイアライザーでの目詰まりを防止するため、透析などの血液体外循環治療を行う場合、ヘパリン等の抗凝固剤が抗凝固剤注入ポンプから動脈側血液回路内に持続的に注入されている。
【００１０】
現在、透析に使用されている抗凝固剤は、ヘパリン、低分子ヘパリンまたはメシル酸ナファモスタットであり、これらはそれぞれ状況に応じて使い分けられている。
【００１１】
上記３剤のうち、最も歴史が長いのがヘパリンである。ヘパリンは血漿中のアンチトロンビンIII（ＡＴIII）に結合して活性化し、トロンビンIIａおよびファクターＸａを失活させることにより抗血液凝固作用を示す。ヘパリンは回路内において十分な抗凝血作用を示すが、半減期が数時間と比較的長いので、患者にとって無用の抗凝固作用が数時間にわたって全身的に及んでしまうという欠陥を有している。すなわち、ヘパリンの使用量が少なすぎれば回路内で血液凝固を生じ、多すぎると凝固時間の延長により望ましくない出血（痔、生理出血、鼻血、抜歯後出血など）を誘発する等の問題を生じていた。また、出血傾向のある患者（例えば、頭蓋内出血、出血性脳梗塞、血小板減少性紫斑病、血管障害による出血傾向、血友病その他の凝固障害を伴う患者、月経期間中、手術時、消化管出血、尿路出血、喀血、流早産・分娩直後等性器出血を伴う患者、脳塞栓またはそのおそれ、重大な意識障害を伴う大梗塞、過敏歴、消化管潰瘍、内臓腫瘍、消化管の憩室炎、大腸炎、亜急性細菌性心内膜炎、重症高血圧症、重症糖尿病の患者、脳出血の既往歴のある患者、血小板の減少している患者、重大な視力障害に至る可能性が著しく高い進行性眼底出血を有する患者等）に使用できない等の致命的な問題も生じていた。
【００１２】
さらに、ヘパリンは、ブタやヒツジの腸粘膜から抽出精製される所謂生物薬剤であることから、未知の感染経路になる可能性がある。また、ヘパリンは、ATIII依存的に抗凝固作用を示すので、先天性ATIII欠乏患者およびATIII低下を伴う患者に使用できないという問題点もあった。
【００１３】
一方、低分子ヘパリンは、主に抗ファクターＸａ作用による抗凝固剤であって、抗トロンビンIIａ作用が少なく、従来のヘパリンに比べて出血傾向を起こしにくい。また、ヘパリン投与で問題となっていた、血小板凝集の亢進や脂質代謝への悪影響も、低分子ヘパリンでは少ないことが示されている。
【００１４】
しかし、低分子ヘパリンは、ヘパリン同様、ブタやヒツジの腸粘膜から抽出精製される生物薬剤であり、未知の感染経路になる可能性がある。また、低分子ヘパリンは、ヘパリン同様、ATIII依存的に抗凝固作用を示すので、先天性ATIII欠乏患者およびATIII低下を伴う患者に使用できないという問題点があった。
【００１５】
一方、腎不全に至る原因を見ると、透析治療に移行する原因疾患の約３割は糖尿病性腎症であり、糖尿病の罹病期間、重症度を勘案すると、網膜症等の合併率も高いことが予想され、出血のリスクが非常に高い状態にある。さらに透析患者の高齢化も出血性合併症の増加の原因となっている。このようなことから、透析を必要とする患者のうち明らかなあるいは潜在的な出血リスクを抱える患者はかなりの数にのぼると予想される。
【００１６】
現在、このような出血性病変または出血傾向を有する患者には、低分子ヘパリンの他、蛋白分解酵素阻害作用を有する低分子化合物であるメシル酸ナファモスタットが使用されている。
【００１７】
メシル酸ナファモスタットは、血中半減期が５乃至８分と短く、血中で速やかに代謝されて不活化し、しかも透析膜を介してその一部が除去される。このようにメシル酸ナファモスタットは、透析回路内では良好な抗凝固作用を示すが、生体内ではほぼ不活性となることから、出血性の患者、具体的には生命に危険を及ぼす程度の重篤な出血性合併症（頭蓋内出血、消化管出血）を有する患者、および、重大な視力障害に至る可能性が著しく高い進行性眼底出血を有する患者を対象とした透析用抗凝固剤としては、ほぼ理想的なプロファイルを有している。しかし、メシル酸ナファモスタットは、ショック等の副作用が報告されており、安全性が懸念されている。
【００１８】
出血性患者への適用を考えると、半減期が適当に短いものが好ましく、また、濾過膜により除去されることが望ましいことから、低分子化合物が好ましい。また、ファクターＸａ阻害作用を有する化合物は他のメカニズムを有する化合物よりも出血時間の延長が認められないことが知られており、ファクターＸａ阻害作用に基づく低分子抗凝固製剤が好ましい。しかしながら、現在、実用化されている低分子化合物製剤は蛋白分解酵素阻害作用に基づくナファモスタット製剤のみであり、ファクターＸａ阻害作用に基づく低分子抗凝固製剤は未だ実用化に至っていない。
【００１９】
ところで、一般的な低分子抗凝固剤としては、ヘパリン、低分子ヘパリンの他、ワルファリンカリウム、ダナパロイドナトリウム，アルガトロバン等が実用化されており、その他にも多くの化合物が知られている。
【００２０】
主たる適応症を血栓症とする、ファクターＸａ阻害作用を有する抗凝固剤化合物として、下記化合物を含む種々の化合物が知られている（例えば、特許文献１〜４参照。）。
【００２１】
【化１】
2005046377.tif 000002
【００２２】
ここで、同じ抗凝固剤であっても、血栓治療を目的とした場合と透析を目的とした場合とでは、要求される機能、特性が異なることから、これら公知のファクターＸａ阻害剤が全て透析用抗凝固剤として使用できるとは限らない。透析用抗凝固剤としてとして要求される機能、特性として、例えば、抗凝固能力、透析膜との非反応性・非吸着性、適切な半減期等が挙げることができ、これら透析のための諸機能、特性を全て満たすことにより初めて透析用抗凝固剤としての使用が可能となる。主たる適応症を血栓症とする、ファクターＸａ阻害作用を有する抗凝固剤化合物は多数知られているが、当該諸機能、特性を全て満足するような抗凝固剤は未だ知られていなかった。
【特許文献１】特開２０００‐１３６１９０号公報
【特許文献２】国際公開第９９／５２８９５号パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開１０７０７１４号明細書
【特許文献４】米国特許第６５６２８２８明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、上述の状況から、回路内では十分な抗凝固作用を有し、透析膜を介してその殆どが除去され、体内で抗凝固作用を示さない抗凝固剤の提供を課題とする。即ち、本発明は、十分な抗凝固作用を有する一方で出血傾向が少ない抗凝固剤、具体的には、安全性が高く、望ましくはダイアライザー濾過膜で大部分が濾過除去される低分子抗凝固剤の提供を課題とする。また、本発明は、先天性ATIII欠乏患者およびATIII低下を伴う患者に使用するため、ヘパリンおよび低分子ヘパリンのようにATIIIを介した作用ではなく、ファクターＸａを直接阻害することにより作用が発現する抗凝固剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、新たな作用機序により抗凝固作用を示す低分子化合物を有効成分として含有する血液体外循環回路用抗凝固剤を見出し、本発明を完成した。
【００２５】
より具体的には本発明は、次のとおりである。
（１）  ４−［（２−アミジノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イルオキシ）メチル］−１−（４−ピリジニル）ピペリジン−４−カルボン酸もしくはその薬学的に許容される塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する血液体外循環回路用抗凝固剤、
（２）  ４−［（２−アミジノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イルオキシ）メチル］−１−（４−ピリジニル）ピペリジン−４−カルボン酸  モノメタンスホン酸３水和物を有効成分として含有する血液体外循環回路用抗凝固剤、
（３）  腎不全患者の透析治療のための(１)または(２)に記載の血液体外循環回路用抗凝固剤、
（４）  注射用水またはブドウ糖注射液を含有する(１)乃至(３)のいずれかに記載の血液体外循環回路用抗凝固剤、および、
（５）  密封された注射筒に装填されてなる(１)乃至(４)のいずれかに記載の血液体外循環回路用抗凝固剤。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の抗凝固剤は、毒性や副作用がなく、透析時の血液凝固を有意に抑制し、かつ体内における出血傾向も少ないことから、出血傾向ある患者に安全に使用することができる。また、本発明の抗凝固剤は、ファクターＸａを直接阻害するため、先天性ATIII欠乏患者およびATIII低下を伴う患者にも安全に使用し得るものである。
【００２７】
具体的には、本発明の抗凝固剤は、活性化型血液凝固第Ｘ因子(Ｘａ因子またはファクターＸａ)を選択的に阻害する(Ki値:0,019μＭ)ことにより、外因性および内因性の凝固反応を抑制する。本発明の抗凝固剤は、ラット単回静脈内投与試験(50、75、100mg/kg  bo1us)において概略の致死量が、雌雄とも100mg/kgである。また、本発明の抗凝固剤は、モルモットにおける全身性アナフィラキシー試験およびマウス/ラットにおけるPCA反応試験において、いずれも抗原性が認められていない。さらに、本発明の抗凝固剤は、ヒトに対する安全性も既に確認された。また、本発明の製剤は、40℃、75%RH保存で6ヶ月間安定であり、25℃60%RH保存では12ヶ月間安定であることから、医薬品として十分に安定であることが確認された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の血液体外循環回路用抗凝固剤は、下記式
【００２９】
【化２】
2005046377.tif 000003
で表される、４−［（２−アミジノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イルオキシ）メチル］−１−（４−ピリジニル）ピペリジン−４−カルボン酸、特にそのモノメタンスルホン酸（4-[(2-amidino-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-7-yloxy)methyl]-1-(4-pyridinyl)piperidine-4-carboxylic acid monomethanesu1fonate）（以下、「化合物Ｉ」という。）もしくはその薬学的に許容される塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する。
【００３０】
本発明の化合物Ｉは、塩基性のアミノ基を有するため、酸と反応して塩を形成することができ、また、酸性のカルボキシ基を有するため、塩基と反応して塩を形成することができる。
【００３１】
酸との塩としては、塩酸塩、塩化物塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸の塩、酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩などのカルボン酸の塩、スルホン酸、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸の塩またはグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸の塩を挙げることができる。
【００３２】
塩基との塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩；トリエチルアミン塩、トリメチルアミン塩のような有機塩基の塩を挙げることができる。
【００３３】
本発明の化合物Ｉの塩は、医薬として使用できるものであれば特に限定はないが、好ましくは、塩酸塩またはメタンスルホン酸塩であり、より好適には、メタンスルホン酸塩である。
【００３４】
さらに、本発明の化合物Ｉは、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があるが、そのような水和物も本発明に包含される。
【００３５】
また、本発明の化合物Ｉは、他のある種の溶媒を吸収し、溶媒和物となる場合があるが、そのような溶媒和物も本発明に包含される。
【００３６】
本発明の血液体外循環回路用抗凝固剤の有効成分として好適には、
１）化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩の水和物、
２）化合物Ｉの薬学的に許容される塩の水和物、
３）化合物Ｉの塩酸塩またはメタンスルホン酸塩の水和物、
３）化合物Ｉのメタンスルホン酸塩の水和物、および、
４）下記式
【００３７】
【化３】
2005046377.tif 000004
で表される、４−［（２−アミジノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イルオキシ）メチル］−１−（４−ピリジニル）ピペリジン−４−カルボン酸  モノメタンスルホン酸３水和物（4-[(2-amidino-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-7-yloxy)methyl]-1-(4-pyridinyl)piperidine-4-carboxylic acid monomethanesu1fonate trihydrate）（以下、「本願化合物」という。）である。
【００３８】
本願化合物は、当業者周知の方法で製造することができ、そのような方法であれば特に限定はないが、例えば、特開２０００‐１３６１９０号公報に記載の方法により製造することができる。
【００３９】
（抗凝固剤の調整）
本抗凝固剤は、透析という目的からして、蒸留水または生理食塩水からなる注射用水に溶解させて溶液状態で、予め密封された注射筒に装填しておくかまたはバイアルに装填しておくことが望ましい。バイアルを使用する場合、必要量の本製剤をバイアル中に封入しておき、使用時に注射用水（蒸留水または生理食塩水）で所望の濃度となるように希釈して使用することができる。
【００４０】
１回の透析治療に要する量は、性別、年齢、症状等の投与条件に応じて適宜決定することができ、当該分量を１注射筒または１バイアル、即ち１容器に封入しておくことができる。具体的には、注射筒の場合、１容器あたり７．５ｍｇ乃至２５ｍｇの化合物Ｉを５ｍＬの注射用水に溶解して密封しておくことができる。また、バイアルの場合、１容器あたり１．０ｍｇ乃至５０ｍｇの化合物Ｉを封入しておき、これを使用時に注射用水で５ｍＬに希釈調整することができる。
【００４１】
本抗凝固剤を溶液に調整する場合、Ｄ−ソルビトール等の等張化剤、氷酢酸または水酸化ナトリウム等のｐＨ調節剤をそれぞれ適量添加することができる。
【００４２】
本抗凝固剤を溶液に調整する場合のｐＨは、好ましくは４.０乃至５．０５である。また、本抗凝固剤を溶液に調整する場合の浸透圧比は、好ましくは１.０乃至１.３である。
【００４３】
（透析回路および透析方法）
透析回路および透析方法は、それぞれ当業者周知の回路および方法を使用することができる。好ましくは、低分子化合物であるナフォモスタットの場合と同様の方法を使用する。
【００４４】
ダイアライザーの透析膜素材は、本願化合物を吸着するなどの悪影響がない限り特に限定されるものではないが、ポリスルホン（ＰＳ）膜が特に好ましい。
【００４５】
本抗凝固剤の投与は、透析開始時に透析回路内にボーラス投与する「初回投与」および／または透析中に一定量を投与する「持続投与」により行うことができる。初回投与は、例えば、７．５ｍｇ乃至２５ｍｇの本製剤化合物を５ｍLの注射用水に溶解した後、５００ｍＬの整理食塩水に溶解し、血液回路内を洗浄・充填することにより行うことができる。また、持続投与は、初期投与と同様にして調整した注射用水をさらに５００ｍＬ乃至１０００ｍＬの５％ブドウ糖注射液で希釈し、これを抗凝固剤注入ポンプから持続的に回路内に注入することにより行うことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【試験例１】
【００４７】
ブタ血液透析モデルを用いた本願化合物の抗凝固作用の検討
本願化合物を抗凝固剤として用いた場合の透析可能時間につき、ブタを使用して検討した。
【００４８】
１−１．ブタ血液透析モデル
ブタ(体重30〜42Kg)をケタミンで導入麻酔し、人工呼吸下ハロタンで麻酔を維持した。背部を切開して左右腎動脈を結紮し、右大腿動脈より導出した血液を血液透析装置NCU-11型(ニプロ)により透析し、右大腿静脈に戻す回路を作成した。血液透析ダイアライザーはトレスノレホンBS-1.6U(ポリスルホン膜;東レ)を用いた。透析回路の血液流量は200mL/min、透析液流量は400mL/min、除水液量は600mL/hr(補液は300mL/hr)に設定した。
【００４９】
被験薬は、溶媒からなる対照（生理食塩水）、本願化合物およびヘパリンとした。本願化合物投与群については、初回投与量(mg/Kg)および持続投与量(mg/Kg/hr)がそれぞれ０．３＋０．３（低用量）、０．３＋１．０（中用量）、０．３＋３．０（高用量）の３群とした。ヘパリン投与は、初回投与量（U/Kg）および持続投与量(U/Kg/hr)がそれぞれ１５＋７．５、５０＋２５となるようにした。ブタは各試験とも５例とした。
【００５０】
１−２．透析可能時間の検討
（１）試験方法
回路内又はダイアライザー内で血液が凝固すると、動脈側の回路内圧が上昇する。そこで、回路又はダイアラザー内の血液凝固を判定する指標として、以下のように回路内圧の経時的変化を測定した。
【００５１】
回路内圧は、ダイアライザーの脈側ドリップチャンバー圧を圧トランスデューサーで連続的に測定し、動脈側ドリップチャンバー圧が約350mmHgに達し、2分以上継続した時点を透析可能時間とした。尚、4時間経過しても、約350mmHgに達しない場合は透析可能時間を4時間とした。被験薬(対照、本願化合物またはヘパリン)は、透析開始と同時に回路内の動脈側に単回投与し、引き続き持続注入した。
【００５２】
（２）試験結果 
各個体の透析可能時間とその平均値を図２に示した。溶媒(生理食塩液)投与群の透析可能時間は123±17分であった。それに対して本願化合物は、0.3mg/kg＋1.0mg/kg/hr投与群では201分、0.3mg/kg+3.0mg/kg/hr投与群で239分と透析可能時間を有意に延長した。本願化合物の0.3mg/kg十1.0mg/kg/hr投与群による透析可能時間の延長はヘパリン15U/kg+7.5U/kg/hr投与群(透析可能時間200分)と同程度であり、透析を4時間まで継続することができた例数は両群3例であった。本願化合物の0.3mg/kg＋3.0mg/kg/hr投与群では、透析可能時間は全例において４時間以上であった。
【００５３】
このように、ブタの血液透析モデルにおいて、本願化合物の0.3mg/kg+1〜3mg/kg/hr回路内投与はヘパリン相当と同程度の抗凝固作用を示した。
【００５４】
１−３．本願化合物の除去率およびブタ体中血漿中濃度の検討
本願化合物が透析器を通過する間の本願化合物の除去率について試験を行った。また、透析中および透析後における本願化合物のブタ体中血漿中濃度についても検討を行った。
（１）試験方法
【００５５】
透析開始５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１２０分および２４０分後に、透析器入口および透析器出口より血液を採取し、遠心分離により血漿を分離し、本願化合物の濃度をLC-MSにて測定した。
【００５６】
0.3mg/kg+3mg/kg/hr投与群については本願化合物の体内血漿中の濃度を透析中および透析終了後に測定した。透析終了後における血漿中濃度は、透析終了後直ちに透析器を回路ごと外し、透析終了後１５分、３０分、６０分、１２０分および２４０分後に動脈(血液回路動脈側接続部位)より血液を採取し、遠心分離により血漿を分離した後、LC-MSにて測定した。
【００５７】
（２）試験結果
（２）−１．濾過膜による本願化合物の除去
透析器入口および出口における本願化合物の血漿中濃度を測定し、下記式に従って除去率を求めた。結果を表１に示す。
【００５８】
除去率＝１００−（透析器出口濃度／透析器入口濃度）×１００
【００５９】
【表１】
2005046377.tif 000005
【００６０】
透析器を通過することにより、低用量、中用量、高容量のいずれの場合も約５０％から約８０％の本願化合物が効率的に除去された。
【００６１】
（２）−２．本願化合物の血漿中濃度推移
透析時および透析後における本願化合物の血漿中濃度変化の結果を図３に示す。本結果によれば、0.3mg/kg+3mg/kg/hr投与群の透析終了後の生体血漿中濃度は時間と共に低下し、透析終了時の生体血漿中濃度2795ng/mLから透析終了後1時間で885mg/mLにまで低減した。
【００６２】
抗凝固剤の働きが不十分な場合、透析回路内で血液が凝固する。透析回路内で血液凝固が起こると透析は続行不可能となり、その時点で透析を中止しなければならない。また、透析の際用いる抗凝固剤は、その目的から透析回路内では抗凝固剤としての十分な作用を示すが、体内においては出血の要因となりうる抗凝固作用を示さないものが好ましい。即ち、抗凝固剤の特徴として半減期が短く、かつ、ダイアライザーを通過するときに老廃物とともに濾過膜から除去されるようなものが好ましい。
【００６３】
以上の試験結果から明らかなとおり、本願化合物は、ダイアライザー内では抗凝固剤として十分にその機能を発揮する一方、役割を果たし終わった本願化合物は透析膜から効果的に除去され、さらには透析終了後においては体内にもほとんど残存せず、理想的な抗凝固剤の特徴を有することが示された。
【試験例２】
【００６４】
ヒトによる臨床試験
血液体外循環回路用抗凝固剤としての本願化合物の効果を確認するために、出血性病変や出血性素因を合併しておらず、かつ、ヘパリンを用いた血液透析療法を受けている8名の安定期の慢性腎不全患者を対象として臨床試験を行った。本願化合物を高用量(初回投与12mg、持続投与40mg/hr；投与期I)、中用量(初回投与6mg、持続投与20mg/hr；投与期ＩＩ)、低用量(初回投与3mg、持続投与10mg/hr；投与期ＩＩＩ)の順で同一被験者に投与し、ヘパリンを用いた場合の通常の血液透析療法(対照法。観察期)を基準として比較検討した。評価項目は、「透析器内残血」、「ドリップチャンバー内凝血」、「透析効率」、「穿刺部止血時間」、「プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）」、「血漿中薬物濃度」、「透析器内薬物濃度」とした。
【００６５】
２−１．被験者
出血性病変や出血性素因を合併しておらず、かつ、週３回のヘパリンを用いた血液透析治療を受けている8名の安定期の慢性腎不全患者を対象として臨床試験を行った。総症例は８例であり、被験者の年齢、身長、体重は表２に示すとおりである。８例の男女構成は、男性が7人、女性が1人であった。
【００６６】
【表２】
2005046377.tif 000006
【００６７】
２−２．投与方法
ダイアライザーはＡＰＳ(アサヒメディカル)を使用した。透析中血液流量は200mL/minとし、３週間にわたって各週３回、計９回の血液透析をそれぞれ4時間かけて行った。より具体的には、同一被験者に対して投与期を１週間単位で投与期Ｉ、投与期ＩＩ、投与期ＩＩＩの3期に分け、本願化合物を第１週初日、第２週初日、第３週初日にそれぞれ１週間間隔で高用量、中用量、低用量の順で同一被験者に投与した。１週間のうち第２回目、第３回目は従来と同様ヘパリンを使用した。抗凝固剤は、透析開始時に初回投与量を透析回路内にボーラス投与し、透析終了まで維持量を持続注入した。
【００６８】
こうして得られた結果を従前のヘパリンによる血液透析療法(対照法。各週３回、計９回ともヘパリンを使用。)を基準として比較した。
【００６９】
２−３．投与量
投与期Ｉ、投与期ＩＩ、投与期ＩＩＩにおける投与量は次のとおりである。
投与期I  ；高用量(初回投与12mg、持続投与40mg/hr)、
投与期ＩＩ  ；中用量(初回投与6mg、持続投与20mg/hr)、
投与期ＩＩＩ  ；低用量(初回投与3mg、持続投与10mg/hr)
ここで、「初回投与」とは透析開始時の回路内へのボーラス投与を意味し、「持続投与」とは、４時間にわたる透析時における継続的な抗凝固剤の投与を意味する。
【００７０】
２−４．採血部位
検査のための採血部位は、抗凝固剤投与部位より手前の動脈側回路部位（以下、これを「Ａ点」と呼ぶ。図１参照。）、抗凝固剤投与部位からダイアライザーに至る動脈側回路部位（以下、これを「Ｂ点」と呼ぶ。図１参照。）、およびダイアライザーから後方の静脈側回路部位（以下、これを「Ｃ点」と呼ぶ。図１参照。）の３点とした。なお、透析開始前、透析終了後は抹消静脈またはブラッドアクセスから採血した。
【００７１】
２−５．ヒト各種臨床試験結果
（１）透析器内残血
透析終了後に回路内残血を目視により、「なし」、「軽度」、「中等度」、「高度」の4段階で判定した。
【００７２】
血液の損失原因となる回路内残血については、対照法（観察期）、投与期I(高用量)、投与期ＩＩ(中用量)、投与期ＩＩＩ(低用量)ともに全例とも残血は認められなかった（表３）。このことから、本願化合物は、回路内残血については透析用抗凝固剤として汎用されているヘパリンと少なくとも同等の作用を有することが確認された。
【００７３】
【表３】
2005046377.tif 000007
【００７４】
（２）ドリップチャンバー内凝血
透析終了後に動脈側および静脈側ドリップチャンバー凝血をそれぞれについて目視により、「なし」、「軽度」、「中等度」、「高度」の4段階で判定した。
【００７５】
下記表４、表５に示すように、動脈側ドリップチャンバー内の凝血で「軽度」または「なし」と判定された割合は、対象法、投与期I(高用量)、投与期ＩＩ(中用量)、投与期ＩＩＩ(低用量)でそれぞれ、87.5％、100％、100％、87.5％であり、静脈側ドリップチャンバー内の凝血に関しては、対照法、投与期I、投与期ＩＩ、投与期ＩＩＩでそれぞれ100％、87.5％、100％、100％であった。中等度と判定された例が、対照法の動脈側、投与期Iの静脈側、投与期ＩＩＩの動脈側にそれぞれ1件認められたが、血液透析の実施に問題ない程度であった。
【００７６】
このように、本試験例からしても、本願化合物が抗凝固剤として臨床的に十分に機能していることが確認された。
【００７７】
【表４】
2005046377.tif 000008
【００７８】
【表５】
2005046377.tif 000009
【００７９】
（３）透析効率
透析効率の指標として、血中ＢＵＮ、クレアチニン、尿酸、Ｐ(無機リン)を透析前後に測定し、除去量を算出した。表６に示すとおり、全項目について各投与期とも対照法と同等の成績であり、本願化合物がヘパリンと同等の透析効果を有することが確認された。
【００８０】
【表６】
2005046377.tif 000010
【００８１】
（４）穿刺部止血時間
出血性の目安として穿刺部における止血時間を測定した。
動脈側の穿刺部止血時間の測定値(分:平均値±ＳＤ)は、対照法、投与期I(高用量)、投与期ＩＩ(中用量)、投与期ＩＩＩ(低用量)でそれぞれ、2.4±0.4、3.3±1.2、4.1±3.1、2.5±1.1であり、投与期Iおよび投与期ＩＩでは対照法と比較して若干の延長傾向が認められたが臨床上問題ない程度であった。
【００８２】
（５）プロトロンビン時間(ＰＴ)、活性化部分トロンボプラスチン時間(ａＰＴＴ)
血液凝固反応は、セリンプロテアーゼの前駆体として血中に存在する凝固因子が順次活性化され、最終的にはフィブリノゲンからフィブリンが生成する反応である。組織因子（組織トロンボプラスチン）の血中への流入により起こる外因系の凝固活性を総合的に判定するスクリーニング検査としてプロトロンビン時間（ＰＴ）が用いられ、異物表面との接触による血液凝固因子因子の活性化によって始まる内因系の凝固活性判定には活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）が用いられている。
【００８３】
ＰＴ推移およびａＰＴＴの推移を調べることによって、本願化合物の抗凝固能について試験を行った。
【００８４】
プロトロンビンとは、血液凝固因子のことであり、プロトロンビン時間（ＰＴ）とは、外因系の凝固因子プロトロンビンII、ＶII、Ｘ、Ｖの濃度を反映する、即ち外因系凝固機能を反映する値である。測定は、透析開始前、透析終了後は抹消静脈またはブラッドアクセスから、透析中および透析終了時は「Ａ点」から採血し、検体に組織トロンボプラスチンとＣａを加えてフィブリンが析出するまでの凝固時間を測定することによって行った。一般にＰＴ値は抗凝固剤の存在によって延長される傾向にある。
【００８５】
なお、ＩＮＲは、検体血漿のＰＴを正常血漿のＰＴで割った値（プロトロンビン比：ＰＲ）を組織トロンボプラスチン試薬の感度を国際標準品の感度と比較した値（ＩＳＩ）で補正した値（ＰＲ  ＩＳＩ）である。
【００８６】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）とは、血液の部分トロンボプラスチン時間（フィブリンゲン、プロトロンビン、Ｖ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩの各因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲン等による凝固能力）を計測する検査である。ＡＰＴＴはこれらの前記因子の減少、機能低下および抑制物質の存在を総括的に反映する検査であり、これによって内因系凝固機能を知ることができる。
【００８７】
下記表７、表８にそれぞれまとめるように、ＰＴおよびａＰＴＴは本願化合物の投与によって用量依存的に延長され、本願化合物の抗凝固作用が臨床的に確認された。透析終了時における投与期I(高用量)、投与期1I(中用量)、投与期ＩＩＩ(低用量)のＰＴの平均値（１ＮＲ）は、それぞれ3.310、2.399、1.720であり、ａＰＴＴ（秒）については52.00、46.81、41.34であった。投与終了(透析終了)後、ＰＴの延長作用は投与期ＩＩおよび投与期ＩＩＩでは30分後でも作用の持続が確認されたが、ａＰＴＴは速やかに減少した。投与実施目の2日後の次回来院時点でＰＴ、ａＰＴＴともに臨床上問題ない程度であったが作用の持続が確認された。
【００８８】
【表７】
2005046377.tif 000011
【００８９】
【表８】
2005046377.tif 000012
【００９０】
（６）透析器内でのＰＴ、ａＰＴＴへの影響
本治験では回路内と生体内での抗凝固作用の較差の確認を目的に、透析終了時に透析器前(Ｂ点)、透析器後(Ｃ点)から採血し、ＰＴ、ａＰＴＴを測定した。Ｂ点での投与期I、投与期1I、投与期ＩＩＩのＰＴ平均値(ｌＮＲ)はそれぞれ、12.296、8.155、10.356であり、Ｃ点ではそれぞれ、5.480、4.230、2.289であった。ａＰＴＴ(秒)については、Ｂ点でそれぞれ、113.67、117.45、96.53であり、Ｃ点ではそれぞれ、63.01、54.64、45.74であった。このことから、本願化合物はダイアライザー内では有意な抗凝固作用を示すが、体内においては同抗凝固作用が減弱され無害化されていることがうかがい知れる。
【００９１】
（７）透析器内薬物濃度
本治験では回路内と生体内での血漿中濃度の相違の確認および透析による本願化合物の除去率を算出することを目的に、透析終了時に透析器前(Ｂ点)、透析器後(Ｃ点)から採血し、薬物濃度を測定した。Ｂ点での投与期I、投与期ＩＩ、投与期ＩＩＩの薬物濃度の平均値(mg/mL)はそれぞれ、30085.66、30531.21、14570.65であり、Ｃ点ではそれぞれ、2704.50、1663.75、674.44であった。これらのＢ点とＣ点の薬物濃度の成績から算出された投与期Ｉ、投与期ＩＩ、投与期ＩＩＩの除去率の平均値(％)はそれぞれ、70.41、73.37、73.69であった。このことから、本願化合物はダイアライザー内では有意な抗凝固作用を示した後、透析膜を介して速やかに回路外に除去されていることが確認された。
【００９２】
（８）ヒト臨床試験結果のまとめ
ブタの血液透析モデルにおいて、本願化合物の0.3mg/kg+1〜3mg/kg/hrの回路内インフュージョンはヘパリンと同程度に透析時間を延長させた。また、本願化合物は透析器を通過することにより除去され、その除去率は53.4〜81.8%であった。左右腎動脈結紮の条件において、透析終了後の本願化合物の生体血漿中濃度も経時的に減少することが認められた。
【００９３】
ヒト臨床試験の結果によれば、「透析器内残血」、「動静脈チャンバー内凝血」、「回路内圧の推移」、「透析効率」等の各項目において、従来のヘパリンを用いた透析法（対照法）と比較して全投与期ともにほぼ同等の結果であった。「動静脈チャンバー内凝血」に関しては一部凝血が確認されたが血液透析の実施には問題ない程度であった。
【００９４】
動脈側の穿刺部止血時間の測定値(分:平均値±ＳＤ)は、観察期、投与期I(高用量)、投与期ＩＩ(中用量)、投与期ＩＩＩ(低用量)でそれぞれ、2.4±0.4、3.3±1.2、4.1±3.1、2.5±1.1であり、臨床上問題ない程度であった。有害事象については、重篤なものは認められなかった。血液凝固傾向を示す値であるプロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）はいずれも用量依存性に延長が認められた。血漿中薬物濃度については用量依存性に上昇したが、投与終了(透析終了)後、血漿中濃度は速やかに減少した。
【００９５】
薬物血漿中濃度およびＰＴ/ａＰＴＴ延長作用は，生体側では回路内より低い値が示されたことから，透析膜を介して薬物が除去されることが示唆され，透析回路側で抗凝固作用を十分に示しても，生体側への影響は少ないことが期待される結果であった。
【００９６】
上記のとおり、本発明の抗凝固剤は、毒性や副作用もなく、ブタモデルやヒト臨床試験結果からも明らかなように透析時の血液凝固を有意に抑制し、かつ出血傾向も少ないことが期待される極めて優れた抗凝固剤である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】血液体外循環回路を示す。
【図２】ブタ血液透析モデルに本願化合物またはヘパリンを適用した場合の透析時間の延長を示す。
【図３】高用量群における本願化合物の血漿中濃度の推移を示す。かぎ括弧内の数字はｎ数を示し、かぎ括弧表示のないものはｎ＝５を意味する。
【符号の説明】
【００９８】
１は動脈側血液回路
２は血液ポンプ
３は抗凝固剤注入ポンプ
４は動脈側ドリップチャンバー
５はダイアライザー
６は透析液供給装置
７は静脈側ドリップチャンバー
８は静脈側血液回路
【図１】
2005046377.tif 000014
【図２】
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【図３】
2005046377.tif 000016