(57)【要約】【課題】ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が産生するトリプシン様プロテアーゼの活性を阻害すること、さらには当該菌が産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性を阻害することで、歯周病を有効に予防及び治療し得る抗歯周病剤を提供する。【解決手段】本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が産生するトリプシン様プロテアーゼの活性阻害作用を有するジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤、並びに当該菌が産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性阻害作用を有するジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が産生するトリプシン様プロテアーゼの活性阻害作用を有するジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤。
【請求項２】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性阻害作用を有するジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤。
【請求項３】
ジュンサイ抽出物が水及び／又はエチルアルコールによる抽出物である請求項１又は請求項２記載の抗歯周病剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】歯周病は、歯周組織の炎症に始まり、歯周ポケット形成、歯周溝液貯留、歯肉退縮等を生じ、末期には歯槽骨が吸収されて歯牙の脱落をきたす、う蝕と並ぶ口腔内の二大疾患である。近年の研究で歯周病は、歯肉縁下プラークに棲息する歯周病細菌の感染によって発症、進行することが明らかにされている。
【０００３】歯肉縁下プラークに棲息する数百種を超える細菌の中で、歯周病の大部分を占める成人型歯周病の最有力原因菌はポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である。本菌は非糖分解性の嫌気性桿菌で多量のプロテアーゼを産生して歯周溝貯留液中に放出する。従来は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼが、コラーゲンを主構成成分とする歯周組織の破壊要因と考えられ、歯周病の予防及び治療のために当該コラゲナーゼを阻害する研究が精力的に進められてきた。
【０００４】例えば、松葉、丁子、ローズマリー、烏薬、櫻皮、厚朴、辛夷、及び何首鳥よりなる群から選択される生薬を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するコラゲナーゼの阻害作用を有する抗歯周病剤（特許文献１参照）、ポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するコラゲナーゼの阻害作用を有する、五味子抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤（特許文献２参照）、オトギリソウ科のマンゴスチンより得られる抽出物を有効成分とする抗う蝕、歯周病剤（特許文献３参照）等が提案されている。
【０００５】最近、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するプロテアーゼの研究が進む中、トリプシン様プロテアーゼがポルフィロモナス・ジンジバリスの病原因子として主要な役割を演じていることが判明した。即ち、トリプシン様プロテアーゼは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するプロテアーゼの総プロテアーゼ活性の少なくとも８５％を占め、宿主のマトリックスメタロプロテアーゼの産生促進及び活性化による歯周組織破壊の亢進、サイトカイン分解による免疫反応の阻害、好中球の機能抑制、宿主の補体機能の不全化等、ポルフィロモナス・ジンジバリスの歯周病における主要な病原作用を担っていることが明らかにされている（非特許文献１参照）。
【０００６】これらの事実は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの病原作用を弱めて歯周病を有効に予防・治療するには、従来のように、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するコラゲナーゼの活性を阻害するだけでは充分でなく、トリプシン様プロテアーゼの活性を阻害する必要があることを意味している。
【０００７】ジュンサイは、温帯から熱帯にかけて広く分布する多年生の水草で、我国では芽を椀たねや酢の物等で食する。ジュンサイ抽出物については抗酸化及び抗菌作用（特許文献４参照）、抗炎症作用（特許文献５参照）等が開示されている。しかし、ジュンサイ抽出物のトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性阻害作用、並びに歯周病の予防及び治療におけるジュンサイ抽出物の利用は全く報告されていない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−８１８００号公報
【特許文献２】特開２００２−１０４９８６号公報
【特許文献３】特開２００１−２４７４６９号公報
【特許文献４】特開平１−１３８２８８号公報
【特許文献５】特開平２−２８６６２２号公報
【非特許文献１】石田甫、高田春比古等編集：「歯周病―新しい治療を求めて」、株式会社寺田国際事務所／先端医療技術研究所、２０００年８月３１日、Ｐ２３７―２４７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、今まで未解決であったポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するトリプシン様プロテアーゼの活性を阻害すること、さらには当該菌が産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性を阻害することで、歯周病を有効に予防及び治療し得る抗歯周病剤を提供することにある。
【００１０】本発明者らは係る課題に鑑みて鋭意研究したところ、ジュンサイ抽出物がポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性阻害作用を有することを見出し、当該抽出物を有効成分として含有せしめることで歯周病を有効に予防及び治療し得ることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
【問題を解決するための手段】本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が産生するトリプシン様プロテアーゼの活性阻害作用を有するジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤、並びに当該菌が産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼの活性阻害作用を有するジュンサイ抽出物を有効成分として含有する抗歯周病剤である。
【００１２】本発明に係るジュンサイとは、キンポウゲ目スイレン科ジュンサイ属のジュンサイ（Ｂｒａｓｅｎｉａ  ｓｃｈｒｅｂｅｒｉ  Ｊ．Ｆ．Ｇｍｅｌ．）である。ジュンサイは葉、茎、根等の何れの部位も使用できるが、特に粘質物で覆われた芽或いは若葉を用いるのが好ましい。又、必要に応じてそのままの状態、破砕物、或いは乾燥物等を適宜選択して抽出操作に付することができる。
【００１３】抽出溶媒としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール等の低級１価アルコール類、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等のエーテル類、及び水等が挙げられる。これらの溶媒は、１種又は２種以上を適宜選択して用いることができる。当該溶媒の中でも水、エチルアルコール、或いは水とエチルアルコールの混合溶媒を用いるのがより好ましい。
【００１４】抽出は、冷浸或いは温浸等の浸漬する方法、加熱攪拌等による方法、或いはパーコレーション法等の通常の抽出方法を用いることができる。得られた抽出液は、必要に応じてろ過又は遠心分離等により固形物を除去する。又、抽出液から溶媒を留去して濃縮液或いは乾燥物とすることもできる。乾燥には、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の通常の乾燥手段を用いることができる。
【００１５】本発明に係る抗歯周病剤は、ジュンサイ抽出物を乾燥物若しくは液としてそのまま、或いはジュンサイ抽出物を水、エチルアルコール等の溶媒で適宜希釈した形態で用いることができる。又、ジュンサイ抽出物を含有せしめた歯磨、洗口液、トローチ、チューインガム、或いは飴等の食品、化粧品、医薬部外品、及び医薬品の分野で通常用いられている形態で実施することもできる。
【００１６】本発明に係る抗歯周病剤におけるジュンサイ抽出物の含有量は、適用形態、適用方法等が異なるため一概に規定できないが、乾燥物としてのジュンサイ抽出物に換算して０．０００１〜２５重量％が好ましく、特に０．００１〜１０重量％がより好ましい。
【００１７】又、発明の効果を損なわない範囲において食品、化粧品、医薬部外品、医薬品において一般的に用いられている成分を配合することができる。例えば、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム、シリカ、ハイドロキシアパタイト等の研磨剤、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウム等の殺菌剤、ステビア、サッカリン、スクラロース、アスパルテーム等の高甘味度甘味料、ショ糖、乳糖、ブドウ糖等の糖類、デンプン、デキストリン、セルロース等の多糖類、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、ソルビトール、エリスリトール、マルチトール、キシリトール等の糖アルコール、ゼラチン、プルラン、シェラック、ツェイン等の糊剤、カラギーナン、キサンタンガム、セルロースガム等の増粘剤、チクル、グッタペルカ、グアヤク脂等のガムベース、ナイアシン、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン、安息香酸塩、パラオキシ安息香酸エステル等の保存料、ウィキョウエキス、カミツレエキス、セージエキス等の生薬エキス、並びに色素、香料、エタノール等を適宜配合することができる。
【実施例】
【００１８】次に本発明を詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、実施例に示す％は重量％を示す。
【００１９】実施例１
ジュンサイの芽２０００ｇに水２０ｌを加え、９５℃で２時間抽出した。ろ液を減圧下で濃縮し、更に真空凍結乾燥することでジュンサイ抽出物２０ｇを得た。
【００２０】実施例２
ジュンサイの芽１０００ｇに水１０ｌを加え、９０℃で２時間抽出した。ろ液を減圧下で濃縮し、パラオキシ安息香酸メチル２ｇを加え、更に水で全量が１０００ｇとなる様に調製してジュンサイ抽出液を得た。当該抽出液は、乾燥物としてのジュンサイ抽出物を８ｇ含む。
【００２１】実施例３
ジュンサイの芽の乾燥物２００ｇにエチルアルコール１ｌを加え、常温で７日間抽出した。ろ液を減圧下で濃縮乾固してジュンサイ抽出物５ｇを得た。
【００２２】実施例４
ジュンサイの芽の乾燥物１０００ｇに５０％エチルアルコール水溶液８ｌを加え、８０℃で５時間抽出した。ろ液を減圧下で濃縮した後、噴霧乾燥してジュンサイ抽出物３５ｇを得た。
【００２３】実施例５  練歯磨
2005035907.tif 000002
＜製法＞
成分３〜１０をよく混合した後、成分１及び２を加えて練和し、脱泡後チューブに充填して練歯磨を得た。
【００２４】実施例６  洗口液
2005035907.tif 000003
＜製法＞
成分９に成分２〜８を溶解した後、成分１加えて洗口液を得た。
【００２５】実施例７  トローチ
2005035907.tif 000004
＜製法＞
成分１〜４を混合し、流動層造粒装置で造粒する。得られた顆粒に成分５を加えて打錠し、１錠１０００ｍｇのタブレットを得た。
【００２６】実施例８  チューインガム
2005035907.tif 000005
＜製法＞
加温した成分１に、成分２及び３を加えて練和する。更に成分４及び５を加えてよく練和した後、圧延してシート状にし、切断してチューインガムを得た。
【００２７】
【発明の効果】本発明の効果を実証する為、実施例１のジュンサイ抽出物のポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するトリプシン様プロテアーゼ及びコラゲナーゼに対する活性阻害作用を測定した。
【００２８】ポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液の調製
ポルフィロモナス・ジンジバリスＪＭＣ８５２５株を、牛血清を含むブレインハートインフュージョン培地１００ｍｌに接種し、３７℃で３日間嫌気培養した。培養液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分間）し、上清に硫酸アンモニウムを飽和（８０％）させて沈殿を生じさせた。再度遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分間）し、得られた沈殿物を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、５ｍＭ塩化カルシウム）１００ｍｌに溶解し、同緩衝液を用いて十分に透析を行った。透析内液を０．２２μｍのメンブランフィルターでろ過し、ポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液とした。
【００２９】トリプシン様プロテアーゼの活性阻害試験
実施例１のジュンサイ抽出物を０．４ｍｇ／ｍｌ及び２．０ｍｇ／ｍｌ（最終測定液中で０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ）含むように、それぞれ１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）で調製し、ジュンサイ抽出物試料液とした。基質としてα−Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミドを１０ｍＭ含む溶液１０μｌ、ポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液２４０μｌ、ジュンサイ抽出物試料液２５０μｌ、及び１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）５００μｌを混合し、遮光下にて３７℃で２０分間反応させた。１００ｍＭモノクロロ酢酸を含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）を１ｍｌ加えて反応を停止した後、蛍光強度（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を測定した。対照にはジュンサイ抽出物試料液の代わりに１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）を用い、ブランクとしてポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液の代わりに１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシウム）を用いた。ジュンサイ抽出物のトリプシン様プロテアーゼの活性阻害率は、以下の式から求めた。
阻害率（％）＝（１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ））×１００
Ａ：対照の蛍光強度、Ｂ：対照ブランクの蛍光強度、Ｃ：試料の蛍光強度、Ｄ：試料ブランクの蛍光強度
【００３０】コラゲナーゼの活性阻害試験
実施例１のジュンサイ抽出物を０．４ｍｇ／ｍｌ及び２．０ｍｇ／ｍｌ（最終測定液中で０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ）含むように、それぞれ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）で調製し、ジュンサイ抽出物試料液とした。基質としてフルオレッセインイソチオシアネートで標識したＩ型コラーゲンを０．５ｍｇ／ｍｌ含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）１００μｌ、ポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液５０μｌ、及びジュンサイ抽出物試料液５０μｌを混合し、遮光下にて３７℃で３時間反応させた。８０ｍＭのオルトフェナントロリン１０μｌを加えて反応を停止した後、エタノールと１７０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．５，６７０ｍＭ塩化ナトリウム）が７：３の混合液を２００μｌ加え、３０分間室温にて静置した。その後遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清の蛍光強度（励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を測定した。対照にはジュンサイ抽出物試料液の代わりに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）を用い、ブランクとしてポルフィロモナス・ジンジバリス産生酵素液の代わりに５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５，２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）を用いた。ジュンサイ抽出物のコラゲナーゼ阻害率は、以下の式から求めた。
阻害率（％）＝（１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ））×１００
Ａ：対照の蛍光強度、Ｂ：対照ブランクの蛍光強度、Ｃ：試料の蛍光強度、Ｄ：試料ブランクの蛍光強度
【００３１】試験結果
トリプシン様プロテアーゼの活性阻害試験結果を表１に、コラゲナーゼの活性阻害試験結果を表２に示す。
【００３２】
2005035907.tif 000006
【００３３】
2005035907.tif 000007
【００３４】上記の結果より、本発明に係るジュンサイ抽出物は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの産生するトリプシン様プロテアーゼとコラゲナーゼの活性を強く阻害していることがわかる。
【００３５】即ち本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの主要な病原作用を担うトリプシン様プロテアーゼ及び歯周組織を破壊するコラゲナーゼの活性を強力に阻害する、歯周病の予防及び治療に極めて有用な抗歯周病剤である。又、古来より食され安全性の高いジュンサイの抽出物を有効成分とするものであるから、歯磨、洗口液、飴、チューインガム等の様々な形態の抗歯周病剤として広く用いることができる。