(57)【要約】【課題】  高濃度の光応答分子を含有する被検溶液であっても、観測領域を３次元的に限定して光応答の相関関数を的確に算出できる３次元分析装置を提供する。【解決手段】  第１の光を発生する第１光源１１と、第１の光とは波長の異なる第２の光を発生する第２光源１２と、第１の光および第２の光を少なくとも一部分空間的に重ね合わせて試料３５に集光照射して、試料３５における光活性領域を３次元的に限定する光学系（１６，１７，２１，２２，２３，３１，３２）と、光活性領域で発生する応答光を受光する受光手段２８と、受光手段２８の出力に基づいて応答光の時間領域における相関関数を演算して、試料３５の所望の物理量を分析する演算手段４３と、を有する。【選択図】図１１
2005121432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の光を発生する第１光源と、
上記第１の光とは波長の異なる第２の光を発生する第２光源と、
上記第１の光および第２の光を少なくとも一部分空間的に重ね合わせて試料に集光照射して、上記試料における光活性領域を３次元的に限定する光学系と、
上記光活性領域で発生する応答光を受光する受光手段と、
上記受光手段の出力に基づいて上記応答光の時間領域における相関関数を演算して、上記試料の所望の物理量を分析する演算手段と、
を有することを特徴とする３次元分析装置。
【請求項２】
上記試料は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含むものであり、
上記第１の光は、上記分子を基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる波長であり、
上記第２の光は、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２の電子状態へ遷移させる波長であることを特徴とする請求項１に記載の３次元分析装置。
【請求項３】
上記第２の光の波長は、上記試料の誘導放出波長帯域にあることを特徴とする請求項２に記載の３次元分析装置。
【請求項４】
上記第２の光の波長は、上記第１の光と上記第２の光とがともに照射される空間領域における上記応答光の発生を抑制する波長領域にあることを特徴とする請求項２または３に記載の３次元分析装置。
【請求項５】
上記応答光が蛍光であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の３次元分析装置。
【請求項６】
上記試料への上記第１の光の照射強度および第２の光の照射強度を独立して調整する第１の照射強度調整手段および第２の照射強度調整手段を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の３次元分析装置。
【請求項７】
少なくとも上記第２の光はコヒーレント光であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の３次元分析装置。
【請求項８】
上記第２の光を空間変調する空間変調手段を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の３次元分析装置。
【請求項９】
上記空間変調手段は空間位相変調手段からなることを特徴とする請求項８に記載の３次元分析装置。
【請求項１０】
上記空間位相変調手段は、上記第２の光に対して空間的に不連続な（２ｍ＋１）πの位相差（ただし、ｍは整数）を発生させる位相分布領域を有することを特徴とする請求項９に記載の３次元分析装置。
【請求項１１】
上記空間位相変調手段は位相板からなることを特徴とする請求項１０に記載の３次元分析装置。
【請求項１２】
上記位相分布領域は、光学基板上に上記位相差を発生させる光学薄膜を有することを特徴とする請求項１１に記載の３次元分析装置。
【請求項１３】
上記位相分布領域は、光学基板上に上記位相差を発生させるエッチング領域を有することを特徴とする請求項１１に記載の３次元分析装置。
【請求項１４】
上記位相分布領域は、少なくとも３つの同心円状の領域を有し、かつ隣接する領域が上記（２ｍ＋１）πの異なる位相差を発生させることを特徴とする請求項１２または１３に記載の３次元分析装置。
【請求項１５】
上記位相分布領域は、２つの同心円状の領域からなることを特徴とする請求項１２または１３に記載の３次元分析装置。
【請求項１６】
上記２つの領域のうちの内側の領域の半径をｒとするとき、該位相板を透過する第２の光の光束半径が、２１／２・ｒであることを特徴とする請求項１５に記載の３次元分析装置。
【請求項１７】
上記内側の領域の中心と上記第２の光の光束径の曲率中心とを一致させたことを特徴とする請求項１６に記載の３次元分析装置。
【請求項１８】
上記第２の光の波長をλ、上記光学系の開口数をＮＡとするとき、０．２・λ／ＮＡの精度で、上記光学系による上記第１の光および第２の光の上記試料への集光点を位置決めする位置決め機構を有することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の３次元分析装置。
【請求項１９】
上記第１の光および第２の光を上記試料に対して、上記光学系の光軸と直交する平面内で２次元的に走査する２次元走査手段を有することを特徴とする請求項１〜１８のいずれか一項に記載の３次元分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に染色した試料の観測領域を３次元的に限定して、その観測領域から発生する光応答に基づいて試料中の分子の大きさや数に関連する物理量を分析する３次元分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この種の３次元分析装置で採用される分析法として、例えば蛍光相関法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。この蛍光相関法は、ブラウン運動などの粒子の拡散運動に関する解析に古くから用いられてきた方法で、例えば図１３に原理図を示すように、希薄な蛍光分子の溶液に励起光として細いレーザビームを照射し、そのレーザビームが照射される観測領域における蛍光強度を長時間測定して、蛍光の揺らぎの大きさと時間との蛍光相関関数を算出し、その蛍光相関関数に基づいて蛍光分子の大きさや数に関連する物理量を分析するものである。ここで、観測領域に入っている蛍光分子数をＮとすると、蛍光強度はＮに比例するので、揺らぎの大きさをＳ／Ｎで表現すると、（１／Ｎ）１／２となる。
【０００３】
かかる蛍光相関法において、物理量である蛍光相関関数が１／２に減少する時間、すなわち相関時間をτ０とすると、τ０は下記の（１）式で表わされる。なお、（１）式において、Ｄは蛍光分子の並進拡散係数であり、Ｗはレーザビームの動径方向の強度分布関数がガウス分布であるときのビーム半径である。このτ０は、物理的には、蛍光分子が拡散によってレーザビームを横切る時間に相当する。
【０００４】
【数１】
2005121432.tif 000003
【０００５】
蛍光相関法による蛍光の揺らぎは、一般には、蛍光を受光する光電子増倍管の出力電流ｆ（ｔ）によって測定するが、そのｆ（ｔ）は、レーザビームの径が極端に大きくない場合には蛍光量に比例する。蛍光相関関数は、このｆ（ｔ）について、時間に関する相関関数を求めることに他ならず、これをＧ（τ）とすると、蛍光相関関数Ｇ（τ）は下記の（２）式で与えられ、その際に、レーザビーム強度がガウス分布に近いときは、下記の（３）式のように簡略化して表現できる。
【０００６】
【数２】
2005121432.tif 000004
【０００７】
蛍光相関法は、前述したように蛍光分子の並進拡散係数が得られる物理量であるが、基本的は蛍光の揺らぎを与える熱力学量であれば、どんな量でも同じ原理で測定することができる。一例として、蛍光分子の流動によってレーザビームを横切れば、蛍光の揺らぎを観測することができる。また、化学反応などで蛍光分子が他の分子と結合することで、分子の速度を揺らぎとして観測することができる。すなわち、化学反応の進行をリアルタイムで知ることができる。また、偏光解析をすることで、分子の回転運動も測定することができる。
【０００８】
さらに、蛍光相関関数Ｇ（τ）の強度から、観測領域に存在する分子数も直接測定することができる。具体的には、図１４に示すように、期待する揺らぎ現象が完結するような特定の計測時間内の揺らぎｆ（ｔ）を測定し、その測定したｆ（ｔ）より式（２）を用いて相関関数を求める。この際、励起光源としては、一般にはＣＷ（連続光源）のアルゴンレーザやクリプトンレーザを用いて、色素分子の蛍光相関分析を行うのが主流である。図１５に蛍光相関分析を行う従来の代表的なシステムを示す。
【０００９】
図１５に示すシステムでは、励起光源としてアルゴンレーザ５１を用い、そのレーザビームをビームスプリッタ５２を透過させた後、レンズ５３により蛍光分子を含有した試料溶液５４に集光照射している。また、試料溶液５４での蛍光は、レンズ５３でコリメートした後、ビームスプリッタ５２で反射させてレンズ５５により集光し、その集光された蛍光をピンホール５６を通過させて光電子増倍管やＣＣＤなどの検出器５７で受光し、その出力をプリアンプ５８で増幅された後、アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器５９でデジタルデータに変換してコンピュータ等からなる演算装置６０に取り込み、ここで相関関数Ｇ（τ）を計算している。
【００１０】
なお、図１５に示したシステムと同様のシステムは、非特許文献１にも開示されている。
【００１１】
【非特許文献１】金城政孝，「蛍光相関分光法によるＤＮＡの検出」，精密工学会誌，ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．２，１９９９，ｐ．１７５−１８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、本発明者らによる種々の実験検討によると、前述した蛍光相関分析を行う従来のシステムにあっては、実用上、以下に説明するような改良すべき点があることが判明した。
【００１３】
すなわち、蛍光相関法は揺らぎを検出することを基礎とするので、観測領域に存在する蛍光分子の量はできるだけ少なく、可能であれば１分子であることが望ましい。しかし、蛍光を誘起する光照射領域は、下記の（４）式からレンズ５３の開口数ＮＡと光の波長λとにより下限が限定される。これは、回折限界と呼ばれるものである。したがって、蛍光分子の絶対量が多くなると、それに対応して観測領域内を横切る蛍光分子数を少なくするために、光照射領域を狭くする必要がある。
【００１４】
【数３】
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【００１５】
このため、図１５において、例えばレンズ５３としてＮＡ＝１．４の油浸レンズを用い、励起光としてλ＝５００ｎｍのレーザビームを用いても、そのレーザビームの集光径Ｗは、せいぜい４３６ｎｍである。さらに、光の深さ方向に関しては、基本的には溶液試料５４の厚みそのものになる。したがって、実際の計測の現場では、分析する溶液試料５４における蛍光分子の濃度を極めて希薄にすることが要求され、これが実用性の大きな制限となっている。
【００１６】
なお、光の深さ方向の観測領域を制限するために、一般には共焦点位置にピンホール５６を設置して、焦点面以外の領域で発光した蛍光をカットするようにしている。しかし、これでも深さ方向の分解能は数μｍ程度にとどまっている。また、ピンホール５６の位置合わせは微妙であり、測定対象の蛍光もカットされてしまうことが多い。
【００１７】
以上の理由から、図１５に示したような従来のシステムでは、高濃度の溶液に対しては蛍光相関法を適用しにくく、しかも高い３次元的な空間分解能も期待できない。
【００１８】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、高濃度の光応答分子を含有する被検溶液であっても、観測領域を３次元的に限定して光応答の相関関数を的確に算出できる３次元分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的を達成する請求項１に係る３次元分析装置の発明は、第１の光を発生する第１光源と、
上記第１の光とは波長の異なる第２の光を発生する第２光源と、
上記第１の光および第２の光を少なくとも一部分空間的に重ね合わせて試料に集光照射して、上記試料における光活性領域を３次元的に限定する光学系と、
上記光活性領域で発生する応答光を受光する受光手段と、
上記受光手段の出力に基づいて上記応答光の時間領域における相関関数を演算して、上記試料の所望の物理量を分析する演算手段と、
を有することを特徴とするものである。
【００２０】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の３次元分析装置において、上記試料は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含むものであり、
上記第１の光は、上記分子を基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる波長であり、
上記第２の光は、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２の電子状態へ遷移させる波長であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の３次元分析装置において、上記第２の光の波長は、上記試料の誘導放出波長帯域にあることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項４に係る発明は、請求項２または３に記載の３次元分析装置において、上記第２の光の波長は、上記第１の光と上記第２の光とがともに照射される空間領域における上記応答光の発生を抑制する波長領域にあることを特徴とするものである。
【００２３】
請求項５に係る発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の３次元分析装置において、上記応答光が蛍光であることを特徴とするものである。
【００２４】
請求項６に係る発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の３次元分析装置において、上記試料への上記第１の光の照射強度および第２の光の照射強度を独立して調整する第１の照射強度調整手段および第２の照射強度調整手段を有することを特徴とするものである。
【００２５】
請求項７に係る発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の３次元分析装置において、少なくとも上記第２の光はコヒーレント光であることを特徴とするものである。
【００２６】
請求項８に係る発明は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の３次元分析装置において、上記第２の光を空間変調する空間変調手段を有することを特徴とするものである。
【００２７】
請求項９に係る発明は、請求項８に記載の３次元分析装置において、上記空間変調手段は空間位相変調手段からなることを特徴とするものである。
【００２８】
請求項１０に係る発明は、請求項９に記載の３次元分析装置において、上記空間位相変調手段は、上記第２の光に対して空間的に不連続な（２ｍ＋１）πの位相差（ただし、ｍは整数）を発生させる位相分布領域を有することを特徴とするものである。
【００２９】
請求項１１に係る発明は、請求項１０に記載の３次元分析装置において、上記空間位相変調手段は位相板からなることを特徴とするものである。
【００３０】
請求項１２に係る発明は、請求項１１に記載の３次元分析装置において、上記位相分布領域は、光学基板上に上記位相差を発生させる光学薄膜を有することを特徴とするものである。
【００３１】
請求項１３に係る発明は、請求項１１に記載の３次元分析装置において、上記位相分布領域は、光学基板上に上記位相差を発生させるエッチング領域を有することを特徴とするものである。
【００３２】
請求項１４に係る発明は、請求項１２または１３に記載の３次元分析装置において、上記位相分布領域は、少なくとも３つの同心円状の領域を有し、かつ隣接する領域が上記（２ｍ＋１）πの異なる位相差を発生させることを特徴とするものである。
【００３３】
請求項１５に係る発明は、請求項１２または１３に記載の３次元分析装置において、上記位相分布領域は、２つの同心円状の領域からなることを特徴とするものである。
【００３４】
請求項１６に係る発明は、請求項１５に記載の３次元分析装置において、上記２つの領域のうちの内側の領域の半径をｒとするとき、該位相板を透過する第２の光の光束半径が、２１／２・ｒであることを特徴とするものである。
【００３５】
請求項１７に係る発明は、請求項１６に記載の３次元分析装置において、上記内側の領域の中心と上記第２の光の光束径の曲率中心とを一致させたことを特徴とするものである。
【００３６】
請求項１８に係る発明は、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の３次元分析装置において、上記第２の光の波長をλ、上記光学系の開口数をＮＡとするとき、０．２・λ／ＮＡの精度で、上記光学系による上記第１の光および第２の光の上記試料への集光点を位置決めする位置決め機構を有することを特徴とするものである。
【００３７】
請求項１９に係る発明は、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の３次元分析装置において、上記第１の光および第２の光を上記試料に対して、上記光学系の光軸と直交する平面内で２次元的に走査する２次元走査手段を有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、波長の異なる第１の光および第２の光を少なくとも一部分空間的に重ね合わせて試料に集光照射することにより、試料の光活性領域を３次元的に限定して、その光活性領域で発生する応答光の相関関数を演算して、試料の所望の物理量を分析するようにしたので、高濃度の光応答分子を含有する被検溶液であっても、光応答の相関関数を的確に算出でき、所望の物理量を高精度で分析することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明による３次元分析装置の実施の形態について説明する。
【００４０】
本実施の形態による３次元分析装置は、基底状態を含む３つ量子状態を有する分子に波長の異なる２つの光を照射して２重共鳴吸収過程を誘導し、その結果として誘起される蛍光抑制効果を基礎としている。
【００４１】
先ず、上記の蛍光抑制効果について説明する。図１は分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子に波長λ１の光を照射して、図２に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）に励起する。この励起状態により、通常分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図３に示すように基底状態に戻る。しかし、別の波長λ２の光により同様に励起すると、図４に示すように第２電子励起状態（Ｓ２状態）となる。この励起状態により、図５に示すように多くの分子は蛍光を出さず、励起エネルギーを外界の媒質に熱として与えてＳ０状態に戻る。
【００４２】
最近では、この二重共鳴吸収過程による蛍光抑制効果を用いて回折限界を越える高い空間分解をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特開２００１−１００１０２号公報参照）。
【００４３】
上述したような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図６は、図５と同じく二重共鳴吸収過程の概念図を示すもので、横軸Ｘは空間的距離の広がりを示すもので、波長λ２の光が照射された空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とが示されている。
【００４４】
図６において、空間領域Ａ０では波長λ１の光励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子が即座にほとんど高位のＳ２状態に励起され、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかも、Ｓ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０のみ蛍光が発することになる。
【００４５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡などでは、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して試料上を走査するが、その際、マイクロビームのサイズは集光レンズの開口数と波長で決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００４６】
ところが、図６の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域は集光レンズの開口数と波長で決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる（以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光と呼ぶ）。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡が実現可能となる。
【００４７】
図６に示したように、イレース光を照射領域と非照射領域とを持つように都合よく集光するためには、例えば、図７に示すようなイレース光空間変調用の位相板１を用いる方法が知られている。この位相板１は、光学基板上に、光軸対称の位置で通過したイレース光の位相が反転するように調整された光学薄膜を蒸着して構成したものである。すなわち、光軸の周りに独立した４つの領域２ａ〜２ｄを有し、これらの領域２ａ〜２ｄの位相をイレース光の波長に対して４分１ずつ異ならせている。この位相板１を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺されるので、中空状のイレース光を生成することができる。
【００４８】
本実施の形態では、上記の超解像顕微鏡技術を応用し、選択した空間領域の蛍光を消去することで、３次元的に限定された観測領域からのみ発する蛍光を計測して、その蛍光相関関数を求める。
【００４９】
図７に示した位相板１は、イレース光の光軸上で光強度が常にゼロになるように位相を制御するものであるが、このような位相板１に代えて、図８に示すように、半径Ｒの光学系の瞳内で、光軸を中心とする瞳と同心円状の半径ｒ（ｒ＜Ｒ）の円形領域６の光の位相を（２ｍ＋１）πだけ変化させる位相板５を用いて、イレース光を透過させることにより、集光点の領域のみイレース光が当たらないようにすることもできる。ここで、ｍは任意の整数である。なお、位相差は、通常、エッチング加工あるいは薄膜蒸着により発生させることができる。
【００５０】
一般に、集光レンズに入射する波長λの光が、ｆ（ξ,ζ,η）の位相変調を受けたときの集光パターンは、図９の座標系用いると、波動光学の理論を用いて下記の（５）式で与えられる。
【００５１】
【数４】
2005121432.tif 000006
【００５２】
上記（５）式において、ｆは光学系の焦点距離、点（ｘ，ｙ，ｚ）は観測点、（ξ，ζ，η）は積分変数を示す。また、積分範囲は、光学系瞳面の全体に対応する開口数ＮＡである。特に、イレース光の瞳面（ξ，ζ）において、図８に示したような位相分布を与えれば、（５）式は空間変調を受けたときの集光パターンを与えることになる。具体的には、瞳の半径をＲとすれば、ξ２＋ζ２＜ｒ２の領域では、（２ｍ＋１）πの位相差を与え、ｒ２≦ξ２＋ζ２＜Ｒ２の領域では位相差を与えない。この場合、相対的な位相差が問題なので、ξ２＋ζ２＜ｒ２の領域では位相差を与えず、ｒ２≦ξ２＋ζ２＜Ｒ２の領域では±（２ｍ＋１）πの位相差を与える場合でも、状況は全く同等である。
【００５３】
ここで、一様の強度分布のイレース光を、半径Ｒで図８に示した位相板５に入射させて、その透過光を集光レンズで集光する場合には、Ｒ＝２１／２・ｒとすると、焦点（０，０，０）の近傍におけるイレース光の強度がゼロとなる。なぜなら、図８において、内側の円形領域６と外側の輪帯領域７との面積が同じになり、しかも互いの位相が反転しているので、全ての光が１点に集まる焦点では、イレース光の強度が完全にゼロとなる。
【００５４】
これに対して、焦点から多少でも外れた位置では、イレース光の強度は増大する。具体的に、（５）式を用いて焦点付近の強度分布をシミュレーションすると、図１０に示すようになる。すなわち、λ／ＮＡを単位として、ｘ−ｙ平面内（焦点面内）でほぼλ／ＮＡ、ｘ−ｚ平面内またはｙ−ｚ平面内（光軸方向）で０．２×λ／ＮＡの回転楕円体状の光強度が無い領域が出現する。
【００５５】
例えば、イレース光の波長λを５００ｎｍ、集光レンズの開口数ＮＡを１．４とすれば、ｘ−ｙ平面内でほぼ３５７ｎｍ、ｘ−ｚ平面内またはｙ−ｚ平面内でほぼ７２ｎｍの大きさを有し、体積がほぼ５．９×１０−１５ｃｍ３の光の届かない回転楕円体状からなる極微小空間領域を形成することができる。
【００５６】
したがって、このような空間領域をもつイレース光にポンプ光を焦点で重ね合わせれば、分子の蛍光が観測できる領域は、蛍光抑制効果により上記の極微小空間領域に限定されることになる。さらに、特開２００１−１００１０２号公報に開示されているように、イレース光強度を最適化すれば、蛍光抑制効果が働く領域をλ／ＮＡよりもさらに狭くできるので、実質上の観測領域を、例えばイレース光が当たらない領域の６分１程度まで更に微小化でき、体積的に更に二桁小さい極微小観測領域を形成することができる。
【００５７】
本発明者らは、種々の実験検討により、以上のようにイレース光の空間領域を適切に制御して、イレース光とポンプ光とを集光レンズの焦点で重ね合わせれば蛍光発光領域を極微小空間領域に限定できることを見出し、このようなイレース光とポンプ光とを照射する方法を蛍光相関法に導入すれば、極微小の立体空間である観測領域における１分子の挙動を精度良く解析できることを見出して本発明に至ったものである。
【００５８】
したがって、本発明に係る３次元分析装置によれば、濃度の濃い溶液であっても、従来法で不可能であった１分子分析が可能となる。しかも、イレース光の光強度の最適化により観測領域を、１．０×１０−１４ｃｍ３よりも更に微小な空間にして解析することもできる。特に、本発明に係る３次元分析装置では、イレース光とポンプ光とを照射することによって、光軸方向も含む３次元分解能が得られるので、従来のシステムとは異なり光軸方向の空間分解能を得るための径の小さい空間フィルタを必要とせず、迷光を避ける程度の径の大きい空間フィルタを検出器の手前に配置するだけで済み、光学系の調整が非常に容易となる。
【００５９】
次に、本実施の形態に係る３次元分析装置について、図１１および図１２を参照して説明する。
【００６０】
図１１は３次元分析装置の概略構成示すもので、この３次元分析装置は、主として、光源ユニット１０、スキャンユニット２０、顕微鏡ユニット３０および演算ユニット４０の独立した４つのユニットを有している。以下、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を分析する場合を例にとって説明する。
【００６１】
なお、ローダミン６Ｇは、波長５３０ｎｍ近傍に基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）に励起される吸収帯があり、また、波長６００ｎｍ〜６５０ｎｍの帯域に第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態（Ｓ２）に励起される二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、E.Sahar and D.Treves:IEEE,J.Quantum Electron.,QE-13,692(1977)参照）。
【００６２】
このため、本実施の形態では、光源ユニット１０に、第１の光源として波長５３２ｎｍ（２倍高調波）のポンプ光を発生するコヒーレント光源であるＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ１１と、第２の光源として波長６４７．１ｎｍのイレース光を発生するコヒーレント光源である連続発振型のＫｒレーザ１２とを設ける。また、光源ユニット１０には、ポンプ光の光強度を調整する第１の照射強度調整手段である回転ＮＤフィルタ１３と、イレース光の強度を調整する第２の照射強度調整手段である回転ＮＤフィルタ１４と、イレース光のビーム径を調整するアイリス１５と、イレース光を空間変調する空間位相変調手段である位相板１６と、ポンプ光およびイレース光を同軸上に融合するビームコンバイナ１７とを設ける。
【００６３】
この光源ユニット１０では、Ｋｒレーザ１２からイレース光を連続発振させて、回転ＮＤフィルタ１４、アイリス１５および位相板１６を経てビームコンバイナ１７に入射させると共に、ＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からポンプ光をパルス発振させて、回転ＮＤフィルタ１３を経てビームコンバイナ１７に入射させ、これらポンプ光とイレース光とをビームコンバイナ１７で同軸上に合成してスキャンユニット２０に出射させる。
【００６４】
ここで、位相板１６は、後述する顕微鏡ユニット３０の対物レンズの焦点近傍で、３次元的にイレース光の当たらない領域を形成するようにイレースを空間変調するもので、例えば図１２（ａ）および（ｂ）に平面図および断面図を示すように、光学研磨された石英基板１６ａに、エッチングにより形成した半径１．７６ｍｍ、深さ７１８ｎｍの円形エッチング領域１６ｂを含む位相分布領域を有して構成する。なお、円形エッチング領域１６ｂは、具体的には、化学エッチング法により石英基板１６ａを浸蝕してλ／２の光路長差を持たせるように形成する。
【００６５】
このように位相板１６に位相分布領域を形成すれば、波長６４７．１ｎｍのイレース光に対する石英基板１６ａの屈折率は１．４６であるので、円形エッチング領域１６ｂを通過するイレース光は、それ以外の領域を通過するイレース光に対してπの位相差を持つことになる。したがって、この位相板１６を透過したイレース光を後述する顕微鏡ユニット３０の対物レンズ３２によりローダミン６Ｇで染色された生体試料３５に集光すれば、焦点近傍において、干渉効果により焦点近傍領域のみ３次元的に光強度がゼロとなるイレース光が得られ、これによりローダミン６Ｇの蛍光を止めることができる。
【００６６】
スキャンユニット２０には、ハーフミラー２１、２次元走査手段であるガルバノミラー２２および２３、投影レンズ２４、ピンホール２５、ノッチフィルタ２６および２７、受光手段である光電子増倍管２８を設け、このスキャンユニット２０において、光源ユニット１０からのポンプ光およびイレース光を、ハーフミラー２１を透過させた後、ガルバノミラー２２および２３を経て顕微鏡ユニット３０に出射させると共に、顕微鏡ユニット３０で検出される蛍光を、ガルバノミラー２３および２２を経てハーフミラー２１で反射させた後、投影レンズ２４、ピンホール２５、ノッチフィルタ２６および２７を経て光電子増倍管２８で受光する。
【００６７】
ここで、ピンホール２５は、後述する顕微鏡ユニット３０の対物レンズ３２に対して共焦点位置に配置されており、空間フィルタとして機能する。これは、顕微鏡ユニット３０にセットされる試料３５以外から発する、例えば光学系からの蛍光や散乱光をカットして測定のＳ／Ｎを高める作用をなすのと同時に、試料３５内の特定の深さ部分から発光した蛍光のみを選別するオプティカルセクショニング機能、すなわち光による断層撮影機能をもつ。また、ノッチフィルタ２６および２７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去する役目をする。
【００６８】
顕微鏡ユニット３０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、ハーフミラー３１、対物レンズ３２、位置決めステージ３３および接眼レンズ３４を有しており、スキャンユニット２０からのポンプ光およびイレース光を、ハーフミラー３１で反射させた後、集光光学系を構成する対物レンズ３２により位置決めステージ３４に搭載された試料３５に集光させ、これにより試料３５から発する蛍光を、対物レンズ３２を経てハーフミラー３１で反射させてスキャンユニット２０に出射させると共に、ハーフミラー３１を透過した蛍光を観察手段を構成する接眼レンズ３４に導くように構成する。
【００６９】
演算ユニット４０は、プリアンプ４１、アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器４２、演算手段であるパーソナルコンピュータ（ＰＣ）４３およびタイマ４４とを有し、スキャンユニット２０の光電子増倍管２８からの蛍光強度信号をプリアンプ４１で増幅した後、Ａ／Ｄ変換器４２でデジタル信号に変換してＰＣ４３に格納するように構成する。なお、Ａ／Ｄ変換器４２によるＡ／Ｄ変換のサンプリングタイミングは、ＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ１１によるポンプ光のパルス発振周期信号とＰＣ４３の基準クロック信号とに基づいてタイマ４４により制御する。
【００７０】
上記構成において、位相板１６を透過するイレース光のビーム直径は、位相板１６の円形エッチング領域１６ｂの直径の２１／２倍である５ｍｍとなるようにアイリス１５で調整すると共に、イレース光の光軸と円形エッチング領域１６ｂの中心とを一致させて、対物レンズ３２の焦点においてイレース光の強度を干渉効果により完全に相殺するようにする。これにより、例えば、対物レンズ３２として有効瞳径（直径）５ｍｍ、開口数１．４の油侵レンズを用いた場合、焦点近傍に、焦点面内で直径がほぼ４６０ｎｍ、光軸方向にほぼ９０ｎｍの扁平な回転楕円体状のイレース光の届かない微小空間領域を形成することができ、立体的な空間分解能を得ることができる。これは、１．０×１０−１４ｃｍ３という微小空間領域に対応する。また、ポンプ光およびイレース光の強度は、回転ＮＤフィルタ１３および１４により最適化し、これにより蛍光抑制効果を効果的に誘起させて、さらに立体的な空間分解能を向上させるようにする。
【００７１】
また、ポンプ光の照射によって試料３５から発する蛍光の観測領域は、光軸方向に０．２×λ／ＮＡの分解能を有するので、試料３５を搭載する位置決めステージ３４は、少なくとも光軸方向に０．２×λ／ＮＡ以上の精度を有するように構成する。例えば、対物レンズ３２として、上記のように有効瞳径５ｍｍ、開口数１．４の油侵レンズを用いた場合には、光軸方向の位置分解能がほぼ９０ｎｍとなるので、９０ｎｍよりも高い精度を有するように構成する。このため、本実施の形態では、位置決めステージ３４を、例えば圧電素子すなわちピエゾ素子を駆動源に用いた３次元インチワームステージ等で構成する。このように圧電素子を駆動源に用いれば、エンコーダを併用したコンピュータ制御により１０ｎｍまでの位置決め精度を実現することができる。
【００７２】
このようにして、本実施の形態では、対物レンズ３２による試料３５へのポンプ光およびイレース光の照射位置を、ガルバノミラー２２，２３および位置決めステージ３４により所望の位置に位置決めし、その状態で対物レンズ３２により試料３５にイレース光を連続的に照射すると共にポンプ光を間欠的に照射して、ポンプ光を照射したときに光電子増倍管２８から得られる蛍光強度信号をプリアンプ４１を経てＡ／Ｄ変換器４２で順次デジタル信号に変換してＰＣ４３に時系列的に格納し、その格納された蛍光強度信号に基づいて、ＰＣ４３により上記（５）式に従って蛍光相関関数（Ｇτ）を演算すると共に、その蛍光相関関数（Ｇτ）に基づいて計測分子の分子量や拡散係数等の所望の物理量を演算する。
【００７３】
以上のように、本実施の形態によれば、蛍光観測領域を３次元的に極微小領域に限定することができるので、試料３５が高濃度の計測分子を含有する場合であっても、蛍光相関関数を的確に算出でき、所望の物理量を高精度で分析することができる。
【００７４】
また、本実施の形態の３次元分析装置は、２次元走査用のガルバノミラー２２および２３を有しているので、これらガルバノミラー２２および２３により試料３５上でポンプ光およびイレース光を２次元走査することにより、高度な顕微鏡として試料３５の２次元蛍光像を得ることができると共に、位置決めステージ３４により試料３５を光軸方向に順次移動させながら、ポンプ光およびイレース光を２次元走査することにより、試料３５の３次元蛍光像を得ることもできる。しかも、２次元蛍光像あるいは３次元蛍光像の各測定点における蛍光相関関数も算出できるので、従来の蛍光顕微鏡よりも格段に豊富な情報量を得ることができる。
【００７５】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、図１１に示した位相板１６は、エッチングに限らず、蒸着法により（２ｍ＋１）πの位相差を与えるように構成することもできる。例えば、フッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）は、イレース光の波長に対して、１．３８の屈折率を有するので、このフッ化マグネシウムを、例えば屈折率１．４６のガラス基板上に７６０ｎｍの厚さで蒸着して、ｍ＝０に相当するπ分の位相差を与えるように構成したり、あるいは２２８０ｎｍの厚さで蒸着して、ｍ＝１に相当する３π分の位相差を与えるように構成したりすることができる。また、位相板１６は、図７に示したように、位相分布領域として同心円状の２つの領域を有するものを用いることもできるし、３つ以上の同心円状の領域を有し、かつ隣接する領域が（２ｍ＋１）πの異なる位相差を発生させるように構成したものを用いることもできる。
【００７６】
さらに、空間位相変調手段は、位相板に限らず、例えば液晶型光空間変調器により構成することもできるし、このような空間位相変調手段に代えて、例えばデフォーマラブルミラー（可変形状鏡）のような空間変調手段によりイレース光を空間変調して観測領域を３次元的に限定することもできる。
【００７７】
また、本発明は、蛍光相関関数による試料の分析に限らず、染色物質に応じて蛍光以外の応答光、例えば燐光等の相関関数による試料の分析にも有効に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図２】図１の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図３】同じく、第１励起状態から基底状態に戻る様子を示す概念図である。
【図４】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図５】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る様子を示す概念図である。
【図６】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図７】本発明に係る３次元分析装置に使用可能な位相板の一例の構成を示す図である。
【図８】同じく、使用可能な位相板の他の例の構成を示す図である。
【図９】位相変調を受けたときの集光パターンを説明するための図である。
【図１０】図８に示した位相板で位相変調された光の焦点付近における強度分布のシミュレーション結果を示す図である。
【図１１】本発明の一実施の形態に係る３次元分析装置の概略構成を示す図である。
【図１２】図１１に示す位相板の構成を示す平面図および断面図である。
【図１３】蛍光相関法の原理を説明するための図である。
【図１４】同じく、蛍光相関法による蛍光強度の揺らぎの一例を示す図である。
【図１５】従来の蛍光相関分析システムの概略構成を示す図である。
【符号の説明】
【００７９】
１０  光源ユニット
２０  スキャンユニット
３０  顕微鏡ユニット
４０  演算ユニット
１１  ＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ（第１の光源）
１２  Ｋｒレーザ（第２の光源）
１３  回転ＮＤフィルタ（第１の照射強度調整手段）
１４  回転ＮＤフィルタ（第２の照射強度調整手段）
１５  アイリス
１６  位相板（空間位相変調手段）
１６ａ  石英基板
１６ｂ  円形エッチング領域
１７  ビームコンバイナ
２１  ハーフミラー
２２，２３  ガルバノミラー（２次元走査手段）
２４  投影レンズ
２５  ピンホール
２６，２７  ノッチフィルタ
２８  光電子増倍管（受光手段）
３１  ハーフミラー
３２  対物レンズ
３３  位置決めステージ
３４  接眼レンズ
３５  試料
４１  プリアンプ
４２  アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器
４３  パーソナルコンピュータ（ＰＣ）（演算手段）
４４  タイマ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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