(57)【要約】      （修正有）【課題】メタンをメタノールに変換するメタン資化性菌由来の酵素タンパク質メタンモノオキシゲナーゼの大量発現系を提供する。【解決手段】発現ベクターにβ−ガラクトシダーゼのプロモーター、Tag配列のついた細菌用発現ベクターシステムを活用することにより、メタンをメタノールに変換する酵素タンパク質のヒドロキシラーゼ部分のα、β、又はγ−サブユニットタンパク質の発現量を、大腸菌において飛躍的に向上させることができる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタン資化性菌の遺伝子を利用してメタンをメタノールに変換する酵素タンパク質（目的酵素タンパク質）を製造する方法において、
1). メタン資化性菌のメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の遺伝子（目的遺伝子）の配列をもとにプライマーを合成する工程、
2). メタン資化性菌から抽出した染色体を鋳型とし、前記合成プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を利用して目的遺伝子を増幅させる工程、
3). 前記ＰＣＲ反応生産物のクローニングベクターへのクローニング及び発現ベクターへのサブクローニング工程（ＰＣＲ反応生産物を組込んだクローニング用ベクターから発現用ベクターへ目的遺伝子を移す工程）、
4). 発現用ベクターを宿主（発現用細菌）に導入して形質転換を行うとともに形質転換株（発現用ベクターを宿主に導入して得られるもの）を培養する工程、
5). タンパク質発現誘発剤を用いて形質転換株内で目的酵素タンパク質を誘導（発現）させる工程、
6). 合成された目的酵素タンパク質の形質転換株からの回収工程、
の各工程から成ることを特徴とするメタンをメタノールに変換する酵素タンパク質（目的酵素タンパク質）の製造方法。
【請求項２】
請求項１の工程「1).」〜「6).」のうち工程「4).」及び「5).」を省略し、工程「3).」で得られたベクターを直接用いて無細胞系において目的酵素タンパク質を発現させることを特徴とするメタンをメタノールに変換する酵素タンパク質（目的酵素タンパク質）の製造方法。
【請求項３】
メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．Ｍ．、及びＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｂａｔｈ）から選ばれた少なくとも１種である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
目的遺伝子が、メタンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼ（α−，β−あるいはγ−サブユニット）の遺伝子である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項５】
ベクターが、プロモーターとしてタンパク質の高発現を誘導するプロモーターを含んでいるものであり、かつ、目的遺伝子を組み込めるＴａｇ配列を含むベクターである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項６】
目的酵素タンパク質の大腸菌内での発現において、大腸菌が、ＩＰＴＧを含む誘導剤でベクター内のプロモーター下流に組み込んだ目的遺伝子のタンパク質発現を誘導するものである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項７】
無細胞系での目的酵素タンパク質の発現において、大腸菌ライセートを用いる請求項２に記載の製造方法。
【請求項８】
工程「6).」 が、合成された目的酵素タンパク質の形質転換株からの回収工程、回収タンパク質の可溶化・再構成工程、及び、精製工程からなるものである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項９】
工程「6).」において使用する不溶性の発現タンパク質の可溶化剤が、Ｎ−ラウリルザルコシン、尿素、あるいは塩酸グアニジンから選ばれ少なくとも１種である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
工程「6).」において、可溶化処理をした不溶性の発現タンパク質の再構成の方法が、透析膜を用いて可溶化剤を除去するものである請求項８に記載の製造方法。
【請求項１１】
工程「6).」 において、Ｔａｇ配列と特異的に結合するゲル担体を用いて発現タンパク質を精製するものである請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メタン資化性菌を利用してメタンをメタノールに経済的かつ効率的に変換する酵素タンパク質（以下、目的酵素タンパク質ということがある。）の製造方法に関する。
【０００２】
更に詳しくは、本発明は、抽出したメタン資化性菌の染色体を鋳型してＰＣＲ反応により目的遺伝子を増幅するとともに、タンパク質の高発現を誘導するプロモータを含んだ発現ベクターを用いて宿主での目的遺伝子の強力な転写を利用し、メタン資化性菌の目的酵素タンパク質を経済的に製造する新規な方法を提供しようとするものである。
【０００３】
【従来の技術】
従来、メタン（ＣＨ4）をメタノール（ＣＨ3ＯＨ，ＭｅＯＨ）に変換する酵素タンパク質（目的酵素タンパク質）の製造方法に関しては、
1). メタン資化性菌を培養し、当該細菌からメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の全てのサブユニットを抽出する方法、
2). 抽出した目的酵素タンパク質の遺伝子を大腸菌内で発現させ、目的酵素タンパク質のヒドロキシラーゼ中のα−サブユニット及びβ−サブユニットのみを製造する方法、
などが開発されている。
【０００４】
例えば、Ｂ．Ｇ．ＦｏｘとＪ．Ｄ．Ｌｉｐｓｃｏｍｂは、メタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ）を培養し、当該細菌からメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質のヒドロキシラーゼ部位を抽出する方法を開発している（Ｂ．Ｇ．Ｆｏｘ，Ｊ．Ｄ．Ｌｉｐｓｃｏｍｂ，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」、第１５４巻、Ｎｏ．１，Ｐ１６５，１９８８年）。
しかしながら、この方法によると、目的酵素タンパク質の発現量が極めて少なく、例えば、２００ｇの細胞を１週間かけて培養した培養液１０ｌ（１０リットル）から８３５ｍｇのヒドロキシラーゼタンパク質しか回収されない。
即ち、培養液１ｌ（１リットル）、培養時間１週間当たり、α−サブユニットタンパク質に換算してわずかに０．０４ｇの回収量というものである。
【０００５】
また、Ｎａｋａｊｉｍａらは、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ  Ｍ．から目的酵素タンパク質の精製を試みているが、１００ｇの細胞を培養した５０ｌ（５０リットル）の培養液からわずか１１９ｍｇのヒドロキシラーゼしか得ていない。これは、１ｌ（１リットル）当たり０．００１ｇのα−サブユニット回収量というものである（Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｏ．Ｙａｇｉ，Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ、「Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第５６巻、Ｐ７３６、１９９２年）。
【０００６】
更にまた、Ｊ．Ｃ．Ｍｕｒｒｅｌｌらは、メタン資化性菌から抽出したメタンをメタノールに変換する目的酸素タンパク質の遺伝子（目的遺伝子）を大腸菌に発現させ、目的酵素タンパク質のヒドロキシラーゼ部位のみを製造する方法を開発している（Ｄ．Ｃ．Ｃａｒｄｙ，Ｖ．Ｌａｉｄｌｅｒ，Ｇ．Ｐ．Ｃ．Ｓａｌｍｏｎｄ，Ｊ．Ｃ．Ｍｕｒｒｅｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，第５巻，Ｎｏ．２，Ｐ３３５，１９９１年）。
しかしながら、この方法のもとにおいても、目的酸素タンパク質（ヒドロキシラーゼのα−，β−サブユニット部位）は痕跡量程度しか製造できないという欠点がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記した従来技術の限界に鑑み、メタンをメタノールに変換する高活性の目的酵素タンパク質の高効率、大量発現を達成する新たな目的酵素タンパク質の製造方法を提供しようとするものである。
【０００８】
本発明者は、前記した目的達成のために鋭意検討を重ねた結果、
・  メタン資化性菌から抽出した染色体を鋳型として、メタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の遺伝子（目的遺伝子）をＰＣＲ反応により増幅させ、クローニングする手段、
・  サブクローニング手段（クローニング用ベクターから発現用ベクターへの遺伝子の移しかえ手段）、及び、
・  発現用ベクターの宿主細胞（発現用細菌）への形質転換手段及び形質転換株（発現用ベクターを宿主に導入して得られるもの）の培養手段、
・  形質転換株内で目的遺伝子の強力な転写反応の誘導手段、
を有機的に一体化することにより、従来法に比較して目的酵素タンパク質を高効率でかつ大量発現させることができる、という知見を見い出した。
【０００９】
本発明は、前記知見をベースに完成されたものである。
本発明により、アルコール燃料のみならず、燃料電池自動車やメタノール・ＤＭＥ自動車の燃料、低オクタン化ガソリンの添加剤、電子機器用ホルマリン樹脂の原料、などに有用なメタノールを高効率でかつ大量発現させることができるメタンをメタノールに変換するための酵素タンパク質（目的酵素タンパク質）の新規な製造方法が提供される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第一の発明は、メタン資化性菌の遺伝子を利用してメタンをメタノールに変換する酵素タンパク質（目的酵素タンパク質）を製造する方法において、
1). メタン資化性菌のメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の遺伝子（目的遺伝子）の配列をもとにプライマーを作成する工程、
2). メタン資化性菌から抽出した染色体を鋳型とし、前記プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を利用して目的遺伝子を増幅させる工程、
3). 前記ＰＣＲ反応生産物のクローニングベクターへのクローニング及び発現ベクターへのサブクローニング工程（ＰＣＲ反応生産物を組込んだクローニング用ベクターから発現用ベクターへ目的遺伝子を移す工程）、
4). 発現用ベクターを宿主（発現用細菌）に導入して形質転換を行うとともに形質転換株（発現用ベクターを宿主に導入して得られるもの）を培養する工程、
5). タンパク質発現誘発剤を用いて形質転換株内で目的酵素タンパク質を誘導（発現）させる工程、
6). 合成された目的酵素タンパク質の回収工程、
の各工程から成ることを特徴とするメタンをメタノールに変換する酵素タンパク質（目的酵素タンパク質）の製造方法に関するものである。
【００１１】
また、本発明の第二の発明は、前記第一の発明における第４〜第５工程を省略して、第３工程において得られたベクターを直接用い、無細胞系で目的酵素タンパク質を製造する方法に関するものである。
【００１２】
以下、本発明の技術的構成及び実施態様について詳しく説明する。
【００１３】
本発明のメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の製造方法における最大の特徴点は、目的酵素タンパク質をメタン資化性菌から分離・精製するのではなく、目的酵素タンパク質の遺伝子を用いて、大腸菌内あるいは大腸菌ライセート中で転写およびタンパク合成を行わせることにより、短時間の培養時間で大量の目的酵素タンパク質を得ることにある。
【００１４】
前記した本発明の技術的構成にみられる特徴点は、本発明者の以下の技術思想（発明の動機）を反映するものである。
メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）は、メタンを唯一の炭素源とするメタン資化性菌に含まれている金属酵素であり、メタンをメタノールに酸化する。多くのメタン資化性菌には可溶性（ｓＭＭＯ）と膜結合性（ｐＭＭＯ）の２種類のＭＭＯが存在する。メタンなどのエネルギー物質の有効利用を考える上で、ＭＭＯは着目すべき酵素である。
これまでにｓＭＭＯは単離精製されその化学的性質が盛んに調べられている。しかし、この酵素は非常に複雑な構造を持っており、精製が困難であるとともに、安定性が低い。また、大量のメタン資化菌から少量のＭＭＯしか得る事ができない（１０Ｌの培養液から０．８ｇの精製タンパク）という欠点がある。
【００１５】
メタン資化性菌そのものをメタン−メタノール変換にバイオリアクターとして利用することも考えられるが、メタン資化性菌は、増殖速度が遅いため、大量の菌体を得るのに時間がかかる点、またメタン資化性菌内においてはメタンから変換されたメタノールは、さらに酸化され、二酸化炭素にまで変換されてしまうため、メタノールを取り出すことが困難である点などを考えあわせると、ＭＭＯ酵素タンパク質を利用した反応系の構築が有効であると考える。そして、メタン−メタノールの工業的酸化反応の実用化を考えると、酵素の安価で簡便な大量精製が必要となり、酵素の大量発現系の確立が強く望まれていると考える。
【００１６】
近年、タンパク質の構造や機能の研究の場において、遺伝子をもとに大腸菌などを利用して組み替えタンパク質を発現させ、大量に入手する手法が広く取り入れられている。また、このような手法に用いられるベクターや発現用キットも数多く開発されている。ｓＭＭＯ遺伝子の配列は、すでにいくつかの菌株で報告されているが、これまで、ＭＭＯの大腸菌内での発現は、一例しか報告されておらず（Ｄ．Ｌ．Ｎ．Ｃａｒｄｙ，Ｖ．Ｌａｉｄｌｅｒ，Ｇ．Ｐ．Ｃ．Ｓａｌｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９１，５，３３５−３４２）、この報告では、ヒドロキシラーゼのα−およびβ−サブユニットがほんの痕跡程度に発現しただけであり、大量発現には成功していない。しかし、ＭＭＯ酵素タンパク質の発現に適した発現ベクターの探索、宿主細胞の選択および発現条件の検討を行えば、大腸菌での大量発現系の確立への道が開けると考える。
【００１７】
以下、本発明のメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の製造プロセスにおける主要な工程について、詳しく説明する。
以下の各工程の説明において、その運転・操作条件、または使用する試薬等は適宜、当業者において変更することができることはいうまでもないことである。
【００１８】
(1).メタン資化性菌の染色体の抽出工程：
メタン資化性菌としては、例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｃｏｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｂａｔｈ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｒｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．Ｍ．などを用い、その染色体を「ＩＳＯＰＬＡＮＴ」（ニッポンジーン社製）を用いて抽出すればよい。
本発明において、使用する目的酵素タンパク質は、特に限定されず、細胞内膜に含まれる膜結合型のもの（ｐＭＭＯ）であってもよいが、好ましくは細胞質に存在する可溶性酵素（ｓＭＭＯ）である。
【００１９】
(2).プライマーの合成とＰＣＲ反応を利用した目的遺伝子の増幅工程：
(2)-1.プライマーの合成法としては、前記メタン資化性菌株のｓＭＭＯ遺伝子配列をもとにして、その全領域、または、ヒドロキシラーゼのα領域、β領域、γ領域の両端に相補的な２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを作成すればよい。
【００２０】
前記ｓＭＭＯは、分子量が約２５万〜３０万の酵素タンパク質であり、
・  ヒドロキシラーゼ（分子量：約２１万）、
・  リダクターゼ    （分子量：約４万）、
・  コンポーネントＢ（分子量：約１．５〜２万）、
から構成されているものである。
そして、前記ヒドロキシラーゼは、３種のサブユニット、即ちα−サブユニット（分子量約６万）、β−サブユニット（分子量約４万）、及びγ−サブユニット（分子量約２万）が２つずつ結合した構造をもっているものである。ヒドロキシラーゼ分子は、リダクターゼ及びコンポーネントβが存在しなくても酵素活性を持つことが知られている。このため、本発明においては、後者の２成分については対象としなくてよい。
なお、前記した３種のサブユニット（α，β，γ）は、塩基配列から予想されるタンパク質配列や電気泳動分析により分子量を測定することによって同定可能である。更には、Ｈｉｓ−ｔａｇあるいはｓ−ｔａｇ配列に特異的な抗体を用いることによって、大腸菌由来のタンパク質と区別することができる。
【００２１】
(2)-2.本発明においてＰＣＲ反応による目的遺伝子の増幅工程の具体的内容は次の通りである。
本発明においてＰＣＲ反応とは、前記（１）の抽出工程で得られた染色体（鋳型となるＤＮＡ）、ＤＮＡ合成基質となるデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、から成る反応液に、前記（２）−１で得られたプライマー（これはＤＮＡの離れた２点間に結合するという特性を有する。）、及び、耐熱性のポリメラーゼ（宝酒造製、ＬＡ  Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ）を加え、前記２点間のＤＮＡだけを数十万倍のレベルで増幅させることを意味する。
なお、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応は、Ｋａｒｙ  Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓにより発明され、それ自体は公知のものである。
【００２２】
前記ＰＣＲ反応の基本的なステップとしては、
▲１▼．鋳型となるＤＮＡの熱変性、
▲２▼．鋳型となるＤＮＡとプライマーのアニーリング、
▲３▼．耐熱性のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの合成、
の３ステップがあり、このステップを数十回繰り返すことにより、２つのプライマーの間にはさまれたＤＮＡ領域が強力に増幅される。
本発明において、前記した熱変性、アニーリング、ＤＮＡの合成の各ステップでの温度や反応時間などの条件はプライマーの塩基配列や増幅されるＤＮＡの長さによって適当な条件を選択すればよい。
なお、本発明において、前記（１）工程及び（２）工程は同時並行して行なっても、あるいはいずれかを選考して行なってもよいものである。
【００２３】
(3).前記ＰＣＲ反応の生産物（目的遺伝子）のクローニング工程及びサブクローニング工程：
(3)-1.クローニング工程：
本発明において、この工程のもとで、まず、前記ＰＣＲ反応の生産物をクローニング用ベクターに組込み、これを大腸菌で増幅させることが行われる。
より具体的には、前記（２）工程で得られたＰＣＲ産物を、「Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｂｌｕｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ」（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使用してクローニング用ベクター「ＰＴ７  Ｂｌｕｅ」（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組込み、これを大腸菌を利用して増幅させ、目的遺伝子を持つ大腸菌を選択する。
【００２４】
(3)-2.サブクローニング工程：
次いで、発現させたい部分（例えば、α−サブユニット遺伝子）をクローニング用ベクターから発現用ベクターへ遺伝子を移すこと、即ち、サブクローニング工程が実施される。
より具体的には、発現させたい部分（例えばα−サブユニット遺伝子）をもつクローニング用ベクターを、「ＥＫ／ＬＩＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｋｉｔ」（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、Ｔ７プロモータを有するとともにＮ末にＨｉｓ−ｔａｇ配列及びＳ−ｔａｇ配列のついた発現用ベクター（ｐＥＴ−３０ＥＫ／ＬＩＣ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組込み、発現させればよい。本発明において、発現用ベクターは、前記ｐＥＴシステムに限られず、タンパク質の高発現を誘導可能なプロモータを含んでいるものであれば、いずれも使用することができる。例えば、ＰＩＶＥＸ２．３（ロッシュ社製）などを使用することができる。また、Ｔａｇ配列はＣ末につけたものであってもよい。
【００２５】
前記したように、本発明の発現用ベクターはその種類に限定されないが、Ｔａｇ配列認識抗体を用いた発現チェックやＴａｇ配列によるアフィニティクロマトグラフィーでの精製などの手法を使用可能とする利便性を考慮すると、Ｔａｇ配列のついた発現用ベクターが望ましく、また、タンパク質の高発現を可能とするβ−ガラクトシラーゼのプロモータ（Ｔ７プロモータからなる）を設けている細菌用発現ベクターシステムが好ましい。
【００２６】
本発明において、発現用ベクターに挿入された遺伝子（酵素タンパク質）部分は、ダイデオキシ法で塩基配列を調べ、既知（公知）の遺伝子配列と比較して同定することができる。
【００２７】
(4).発現用ベクターを宿主（発現用細菌）に導入する形質転換及び形質転換株の培養工程：
(4)-1.本発明において、この工程のもとで、まず発現用ベクターを宿主（発現用細菌）へ導入するための形質転換が行われる。
より具体的には、発現用ベクターを宿主である大腸菌に導入することが行われる。
一般的な形質導入法としては、ヒートショック法あるいはエレクトロポレーションなどが知られており、本発明においてもこれらの手法を採用することができる。
発現用ベクターを導入する宿主である大腸菌としては、即ち、Ｔ７プロモーターを持つベクターの宿主としては、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いればよい。前記ＢＬ２１（ＤＥ３）は、Ｌａｃ  ＵＶ５プロモーター下流にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つλファージλＤＥ３の溶原菌である。
(4)-2.次に、形質転換株の培養が実施される。
例えば、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）で組換え体を培養し、次いでｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）で誘導をかけると、まずＩＰＴＧとＬａｃリプレッサーとが結合することにより、Ｌａｃプロモーターの抑制が解除されてＴ７ＲＮＡポリメラーゼが発現し、続いて目的遺伝子の強力な転写が始まる。
【００２８】
(5).形質転換株内での目的酵素タンパク質の誘導（発現）工程：
より具体的には、目的遺伝子（例えばα，β，γ−サブユニット遺伝子）を組込んだ発現用ベクターにより形質転換した大腸菌を一晩増殖させる。次いで、新たな培養液に殖菌し、１時間培養した後、ＩＰＴＧを添加し、培養を３〜５時間継続する。
発現により得られる目的酵素タンパク質は、大腸菌内においては、
1). α，β−サブユニットタンパク質は、不溶性画分に検出され、
2). γ−サブユニットタンパク質は、可溶性画分に検出されることになる。
【００２９】
本発明において、無細胞系で目的酵素タンパク質を発現させる場合、前記した「(4).発現用ベクターを宿主（発現用細菌）に導入する形質転換及び形質転換株の培養工程」及び「5). タンパク質発現誘発剤を用いて形質転換株内で目的酵素タンパク質を誘導（発現）させる工程」が省略されることはいうまでもないことである。
本発明において、無細胞系で目的酵素タンパク質を発現させるには、目的遺伝子を組込んだ発現用ベクターを大腸菌ライセートを含む反応液中に加え、３０℃、２４時間反応させてタンパク質合成を行う。この場合、α−、β−、γ−サブユニットタンパク質は、いずれも可溶性画分に検出されることになる。
【００３０】
(6).合成されたメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の回収工程：
本発明において、この回収工程は広義に解釈し、合成された目的酵素タンパク質の形質転換株からの回収工程、回収タンパク質の可溶化・再構成工程、及び、精製工程を含むものである。
(6)-1.目的タンパク質の回収工程：
本発明の最終工程であり、合成された目的とする酵素タンパク質、例えば目的とするα，β，γ−サブユニットタンパク質の回収が実施される。
宿主として大腸菌を用いて発現させた場合、菌体を塩化リゾチームで処理し、次いで超音波で破損し、回収すればよい。なお、無細胞系で発現させた場合、前記した処理は不要である。
【００３１】
次に、細胞破砕液を遠心分離し、可溶性画分と不活性画分を得る。
1). 目的タンパク質が可溶性画分にある場合、硫安分画の後、ゲルろ過クロマトグラフィーにより目的タンパク質の分子量付近を集めた後、Ｈｉｓ−ｂｉｎｄレジン等を使用したアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。  2). 目的タンパク質が不溶性画分にある場合、次ぎに説明する可溶化、再構成の工程の後、ゲルろ過クロマトグラフィーで目的タンパク質の分子量付近を集めた後、Ｈｉｓ−ｂｉｎｄレジン等を使用したアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。
【００３２】
(6)-2.α，β−サブユニットタンパク質の可溶化工程：
γ−サブユニットタンパク質は、もともと可溶性画分に生成するため、可溶化工程が不要である。
前記した不溶性画分の可溶化処理としては、例えばｐＨ＝１１のＣＡＰＳ緩衝液に、タンパク質伸長剤としてＮ−ラウリルザルコシン、尿素、あるいは塩酸グアニジン等を加え、１５分間反応させる。
可溶化に用いる緩衝液の種類は限定されず、ｐＨ＝６〜ｐＨ＝１１のものであればよく、基本的にはアルカリ性であることが好ましい。
次に、不溶なタンパク質を除くため、前記反応液を遠心分離し、上澄みを可溶化タンパク質溶液とすればよい。
(6)-3.α，β−サブユニットタンパク質の再構成工程：
前記可溶化工程で作成した可溶化タンパク質溶液を、例えば、硫酸鉄またはシュウ酸鉄の存在下でトリス塩酸系緩衝液またはリン酸系緩衝液で透析を繰り返し、タンパク質伸長剤を除くことにより再構成すればよい。
【００３３】
前記した本発明のメタン資化性菌を利用したメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質（目的遺伝子）の製造方法において、ｓＭＭＯ遺伝子のα，β、またはγ−サブユニット遺伝子から形質転換、誘導、発現工程を介して、大腸菌（又は大腸菌ライセート）中で高効率（菌体タンパク質の少なくとも５０％以上）に目的酵素タンパク質を発現させることができる。
【００３４】
より具体的には、本発明のメタン資化性菌のメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の製造方法においては、前記出発材料から少なくとも培養液１ｌ（１リットル）、かつ、培養時間３〜７時間当たり０．３〜０．４ｇの目的酵素タンパク質の発現量を実現することができる。
これに対して、従来方式では、先の従来技術の説明の項で説明したように、培養液１ｌ（１リットル）、かつ培養時間１週間（本発明と比較して著しく長時間であることに留意すべきである。）当たり、α−サブユニットタンパク質に換算してわずかに０．０４ｇの発現量にとどまるものである。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び比較例により更に詳しく説明する。
なお、以下の実施例において目的酵素タンパク質としてα−サブユニットタンパク質の製造例を説明するが、本発明は実施例のものに限定されないことはいうまでもないことである。
【００３６】
(1).ＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ（染色体）の抽出
メタン資化性菌を利用してメタンをメタノールに変換する酵素タンパク質（目的遺伝子）の抽出は、次ぎのようにして行った。
メタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ）のスラントから０．０３ｇの菌体をかきとり、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いて染色体を抽出した。
【００３７】
(2).ＰＣＲによる目的遺伝子の増幅
既知の目的遺伝子（ＯＢ３ｂ株ｓＭＭＯ遺伝子）の塩基配列をもとに目的タンパク質（α−サブユニット）の両端に相補的なプライマーを作成し、前記抽出工程により得られた染色体を鋳型として、ＰＣＲ反応により目的遺伝子を増幅させる工程を、次のようにして行った。
ＯＢ３ｂ株ｓＭＭＯ遺伝子の５´末端に相補的なプライマー（ＭＴＭＭＯＦ１：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＧＣＧＴＣＴＣＧＣＡＴＴＧＣ）と、３´末端に相補的なプライマー（ＭＴＭＭＯＲ１：ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＣＴＣＴＡ）の作成をアマシャム・ファルマシア・バイオテク社に依頼した。
次いで、前記（１）工程で抽出した染色体２０ｎｇを鋳型として、０．５ｍＭ  ＭＴＭＭＯＦ１プライマー／０．５ｍＭ  ＭＴＭＭＯＲ１プライマーと、１×ＬＡＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ／０．２ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ／２．５  Ｕ  ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて、熱変性温度９６℃で３０秒、アニーリング温度６４℃で１分、伸長反応温度７２℃で６分のＰＣＲを３０サイクル行い、ｓＭＭＯ遺伝子断片の増幅を行った。
【００３８】
(3).ＰＣＲ産物のクローニング及びサブクローニング
前記（２）工程で得られたＰＣＲ産物のクローニングとベクターの増幅を次のようにして行った。
(3)-1. ＰＣＲ産物のクローニング：
前記（２）工程で増幅されたｓＭＭＯ遺伝子断片を、０．７％ＧＴＧアガロースゲル電気泳動により分離し、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へ組込んだ。そのｓＭＭＯ組換えベクターで、ヒートショック方により大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換し、６０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天倍地にまき、３７℃で一晩培養した。得られた形質転換体コロニーを、６０ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体倍地に殖菌し、３７℃で一晩振盪培養した。その培養液からＦｌｅｘ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔｓ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いてプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドについて、ダイデオキシ法により塩基配列を決定し、ＯＢ３ｂ株ｓＭＭＯ遺伝子であることを確認した。
【００３９】
(3)-2. 発現用ベクターへのサブクローニング
発現用ベクターへのサブクローニング工程を、次のようにして行った。
まず、ＥＫ／ＬＩＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に従い、α−サブユニットタンパク質としての翻訳読み枠を合わせるために、α−サブユニット遺伝子の両端に相補的でかつＥＫ／ＬＩＣ部位を含む、Ｌ１ＣｍｍｏＸＳプライマー（ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＣＧＣＴＡＣＧ）とＬ１ＣｍｍｏＸＡプライマー（ＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＡＴ）との作成をアマシャム・ファルマシア・バイオテク社に依頼した。
次に、前記（３）工程で塩基配列を確認したＯＢ３ｂ株ｓＭＭＯ遺伝子を含むプラスミドｐＴ７ＭＭＯ３０ｎｇを鋳型として、０．５ｍＭ  ＬＩＣｍｍｏＸＳプライマー／０．５ｍＭ  ＬＩＣｍｍｏＸＡプライマーと１×ＬＡＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ／０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ／２．５Ｕ  ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて、熱変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６６℃で１分、伸長反応温度７２℃で２分のＰＣＲを３０サイクル行い、両端にＥＫ／ＬＩＣ部位を持つＯＢ３ｂ株α−サブユニット遺伝子断片を増幅した。
前記のようにして増幅されたα−サブユニット遺伝子断片を、１．５％ＧＴＧアガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。精製したαサブユニット遺伝子断片を、ＥＫ／ＬＩＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、Ｔ７プロモーターを持ちＮ末にＨｉｓ−Ｔａｇ及びＳ−Ｔａｇが存在するｐＥＴ−３０  ＥＫ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へ組込んだ。そのベクターを、ヒートショック法により大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にまき、３７℃で一晩培養した。得られた形質転換体コロニーを、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１００ｍｌＬＢ液体培養地に殖菌し、Ｆｌｅｘｉ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔｓ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いてプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドｐＥＴｍｍｏＸ３について、ダイデオキシ法により塩基配列を決定し、ＯＢ３ｂ株αサブユニット遺伝子であることを確認した。
【００４０】
(4).発現用ベクターの形式転換と形式転換株の培養
ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に従い、前記（４）工程で抽出した８０ｎｇのプラスミドｐＥＴｍｍｏＸ３をヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にまき、３７℃で一晩培養した。
【００４１】
(5).目的酵素タンパク質（α−サブユニットタンパク質）の誘導（発現）
(5)-1.大腸菌内で発現させた場合：
前記（４）工程で得られた形質転換体コロニーを、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（ＬＢkan）で一晩増殖させた後、１ＬのＬＢkanに殖菌し、１時間培養した。６００ｎｍにおける濁度が０．６前後になっていることを確認した後、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ，０．４ｍＭ）を添加し、タンパク合成の誘導を開始した。ＩＰＴＧの添加で、大腸菌内でまずＴ７プロモーターが発現し、続いてベクター上の目的遺伝子の強力な転写が始まる。３７℃で３〜６時間培養したのち、遠心分離により菌体を集めた。１Ｌの培養液より、約３ｇ（湿重量）の菌体が得られた。
図１に３７℃で培養した大腸菌内で誘導されたα−サブユニットタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による確認を示す。分子量が６〜６．５万付近に見られる濃いバンドが発現されたα−サブユニットタンパク質である。ＩＰＴＧで誘導を開始して、０．５時間後には発現が見られ、その後３時間まで増加する。３時間以上の培養では一定の量を示した。
(5)-2.無細胞系で発現させた場合：
なお、無細胞系での発現プロセスにおいては、前記（４）及び（５）−１工程の操作は不要である。
前記（３）工程で作成したα−サブユニット遺伝子を組込んだ発現ベクター１５μｇを、大腸菌ライセートを含むラピッドトランスレーションシステム反応液（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）に加え、ＲＴＳ５００コントロールユニット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）中で３０℃２４時間反応させた。α−サブユニットタンパクは可溶性の状態で発現された。
【００４２】
(6).目的酵素タンパク質（α−サブユニットタンパク質）の回収
(6)-1.大腸菌内で発現させた場合：
▲１▼．菌体の破砕と不溶性画分の回収
前記（６）工程で得られた菌体をトリス緩衝液で洗った後、塩化リゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）で１５分処理し、その後、超音波で破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１４，０００ｘｇ，１０分）し、上澄み（可溶性画分）と沈殿（不溶性画分）に分けた。このときのそれぞれの両分のタンパク量は、１８０ｍｇ、３４０ｍｇであった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分析の結果、α−サブユニットタンパク質は不溶性画分に入っていることが確認された。
図２は、発現されたα−サブユニットタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動のコマシーブルー染色（上）及びウエスタンブロッティング（下）による大腸菌内での局在の確認を示す。図中の１は全タンパク質、２は培地画分、３はペリプラズム（外膜と細胞質膜の間）画分、４は可溶性画分、５は不溶性画分を示す。上図の、コマシーブルー染色の結果において、α−サブユニットと想定される濃いバンドは、不溶性画分にのみ存在していることがわかる。さらに下図のＳ−ｔａｇに特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロットの結果においては、上図でα−サブユニットと想定された不溶性画分の濃いバンドのみが検出されていることから、α−サブユニットタンパク質は、形質転換体においては不溶性画分にのみ分布していることが確認された。
▲２▼．不溶性タンパクの可溶化
不溶性画分は、トリス緩衝液で洗った後、遠心分離により集め、０．３％Ｎ−ラウリルザルコシン，０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＤＴ）を含むＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）中で可溶化した。室温で１５分反応させた後、遠心分離し（１０，０００ｘｇ，１０分）、可溶化されずに残ったタンパク質を取り除いた。
▲３▼．可溶化タンパク質の透析による再構成
可溶化されたタンパク質溶液は、容積の５０倍量のトリス緩衝液（またはリン酸緩衝液）に０．１ｍＭのＤＤＴを加え、４〜５時間透析を行い、可溶化剤を取り除いた。さらに同じ溶液でもう一度透析を行った後、ＤＤＴを含まない緩衝液でさらに２度透析を繰り返した。透析後のタンパク溶液は、円偏光二色性スペクトル測定により、再構成されていることが確認された。
図３は、再構成したα−サブユニットタンパク質の円偏光二色性スペクトルを示す。円偏光二色性スペクトルを測定すると、タンパク質の溶液中での二次構造を知ることができるが、α−サブユニットは、その構造中に２７個のα−ヘリックスと２個のβ−シートを持つが、得られたスペクトルは、２０８と２２２ｎｍの２つの負の極大と１９０ｎｍに見られる正の極大というα−ヘリックスの特徴的なスペクトルを示しており、再構成α−サブユニットにおいては、タンパク質の二次構造が保持されていることが確認された。
▲４▼．α−サブユニットタンパク質のアフィニティクロマトグラフィーによる
精製
得られたα−サブユニットタンパク質を含むタンパク溶液を、０．１Ｍの硫酸ニッケル溶液でチャージしたＨｉｓ−ｔａｇ結合ゲル担体（Ｃｈｅｌａｔｉｏｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）と混ぜ、α−サブユニットタンパク質を充分ゲルに結合させた。ゲルを緩衝液で洗い、非特異的に結合していたタンパク質を除いた後、緩衝液中のイミダゾール濃度を増加することによりα−サブユニットタンパク質をゲルから外した。得られた溶液を限外ろ過膜を用いて遠心濃縮し、α−サブユニットタンパク質を得た。１Ｌの培養液から得られたα−サブユニットタンパク質は、約３００ｍｇであった。
(6)-2.無細胞系で発現させた場合：
このケースの場合、前記した▲１▼、▲２▼、▲３▼のステップは不要であり、前記▲４▼ステップの内容を以下のものに変更する。
▲４▼．α−サブユニットタンパク質のアフィニティクロマトグラフィーによる精製
得られたＲＴＳ反応液を、０．１Ｍの硫酸ニッケル溶液でチャージしたＨｉｓ−ｔａｇ結合ゲル担体（Ｃｈｅｌａｔｉｏｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｅ  Ｆｌｏｗ，アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）と混ぜ、α−サブユニットタンパク質を充分ゲルに結合させた。ゲルを緩衝液で洗い、非特異的に結合していたタンパク質を除いた後、緩衝液中のイミダゾール濃度を増加することによりα−サブユニットタンパク質をゲルから外した。得られた溶液を限外ろ過膜を用いて遠心濃縮し、α−サブユニットタンパク質を得た。１ｍＬの反応液から得られたα−サブユニットタンパク質は、約３００〜４００μｇであった。
【００４３】
【比較例】
(1).Ｍｕｒｒｅｌｌらは、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂのヒドロキシラーゼ遺伝子を大腸菌で発現させる試みを行っているが（Ｄ．Ｌ．Ｎ．Ｃａｒｄｙ，Ｖ．Ｌａｉｄｌｅｒ，Ｇ．Ｐ．Ｃ．Ｓａｌｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９１，５，３３５−３４２）、〔35Ｓ〕でラベルして、非常に感度を上げた状態の検出でも、分子量からヒドロキシラーゼのα−サブユニットとβ−サブユニットと推測されるタンパク質が痕跡程度検出されているのみであり、量的な記述はなく、また抗体等を用いた確認等もなされていない。従って正確な量的な比較は出来ないが、本発明の発現方法は、前記Ｍｕｒｅｌｌらの方法と比較して少なくとも数十〜数百倍の発現量に達していると認められる。
【００４４】
(2).Ｍｕｒｒｅｌｌらは、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｂａｔｈ）のＭＭＯ遺伝子についても大腸菌での発現を試みているが（Ｃ．Ａ．Ｗｅｓｔ，Ｇ．Ｐ．Ｃ．Ｓａｌｍｏｎｄ，  Ｈ．ｄａｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｍｕｒｒｅｌｌ，  Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９２，１３８−１０１−１３０７）、発現の報告は、リダクターゼやコンポーネントＢについてのみであり、これまでにヒドロキシラーゼについての発現の報告はない。
【００４５】
(3).メタン資化性菌から、ＭＭＯのヒドロキシラーゼを精製した例としては、２００ｇ（１０Ｌ相当）のＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｂａｔｈ）から１５６ｍｇ（（Ｍ．Ｐ．Ｗｏｏｄｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈ．Ｄａｌｔｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８４，２５９，５３〜５９）、１００ｇ（４０Ｌ相当の）Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ｓｔａｉｎ  ＣＲＬ−２６から４００ｍｇ（Ｒ．Ｎ．Ｐａｔｅｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｓａｖａｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９８７，１６９，２３１３−２３１７）、２００ｇ（１０Ｌ相当）のＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂから８３５ｍｇ（Ｂ．Ｇ．Ｆｏｘ，Ｗ．Ａ．Ｆｒｏｌａｎｄ，Ｊ．Ｅ．Ｄｅｇｅａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｌｉｐｓｃｏｍｂ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，２６４，１００２３−１００３３）、１００ｇ（５０Ｌ相当）のＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．Ｍ．から１１９ｍｇ（Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｏ．Ｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｂｉｏｓｅｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，５６，７３６−７４０）等の報告がある。菌体の培養液１０Ｌから得られる目的酵素タンパク質のモル数で収量を比較すると、本発明の収量は、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂと比べて６．６倍、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｂａｔｈ）と比べて３５倍、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＣＲＬ−２６と比べて５５倍、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．Ｍと比べて２３０倍であり、本発明の優位性が判る。
【００４６】
更に、菌体の培養効率を見ると、従来は前記した収量を得るのに約１週間から１０日必要であるが、本発明プロセスでは大腸菌であるため増殖に１時間程度、目的酵素タンパク質の発現する時間を含めて３〜６時間で十分であった。このように本発明の方法（目的酵素タンパク質の発現方法）を用いることにより、短時間で、大量のＭＭＯヒドロキシラーゼタンパク質を得ることが可能となる。
【００４７】
【発明の効果】
本発明のメタン資化性菌を利用したメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の製造方法により、即ち、発現ベクターにβ−ガラクシラーゼのプロモータを設け、Ｔａｇ配列のついた細菌用発現ベクターシステムを活用することにより、α，β，またはγ−サブユニットタンパク質（目的酵素タンパク質）の発現量を従来技術に比較して飛躍的に向上させることができる。
【００４８】
そして、本発明は、前記のようにして発現させた目的酵素タンパク質を回収、可溶化、再構成するということにより、メタンから有用物質であるメタノールへ高効率に変換することができる変換酵素（最終製品としての目的酵素タンパク質）を得るものである。
【００４９】
このため、本発明は、メタンを有用物質であるメタノールへ変換する変換酵素（目的酵素タンパク質）の製造において、簡便かつ効率的な製造方法を提供することができる。
そして、本発明のメタンをメタノールに変換する目的酵素タンパク質の製造方法は、実験室的規模の製造や工業的規模の製造に柔軟に対応することができるため、その意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ３７℃で大腸菌内で誘導されたα−サブユニットタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による確認を示す。
【図２】  発現されたα−サブユニットタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のコマシーブル染色（上）及びウェスタンブロッティング（下）による大腸菌内での局在の確認を示す。
【図３】  再構成したα−サブユニットタンパク質（目的酵素タンパク質）の円偏光二色性スペクトルを示す。
【図１】
2005095002.tif 000003
【図２】
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【図３】
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