(57)【要約】【課題】  再生医療において患者に移植したときに組織又は器官の再生の足場になる再生医療用支持体、血管再生用支持体、神経再生用支持体、及び、これらを用いた治療方法を提供する。【解決手段】  基材の表面に、目的とする細胞の表面の特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質が結合されている再生医療用支持体。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材の表面に、目的とする細胞の表面の特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質が結合されていることを特徴とする再生医療用支持体。
【請求項２】
タンパク質は、サイトカインであることを特徴とする請求項１記載の再生医療用支持体。
【請求項３】
サイトカインは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、骨形成因子（ＢＭＰ）、又は、インターロイキン（ＩＬ）であることを特徴とする請求項２記載の再生医療用支持体。
【請求項４】
タンパク質は、目的とする細胞の表面の特異的な抗原に対応する抗体であることを特徴とする請求項１記載の再生医療用支持体。
【請求項５】
基材は、生体内吸収性高分子材料からなることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の再生医療用支持体。
【請求項６】
血管の再生を行うための血管再生用支持体であって、基材の表面に、血管内皮前駆細胞の表面の特異的な抗原に対応する抗体が結合されていることを特徴とする血管再生用支持体。
【請求項７】
抗体は、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１４４抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｋ−２抗体、抗Ｆｌｋ−３抗体、抗Ｆｌｋ−４抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体、抗Ｆｌｔ−２抗体、抗Ｆｌｔ−３抗体、抗Ｆｌｔ−４抗体、抗ｔｉｅ−２抗体、抗ＰＥＣＡＭ抗体、抗ＶＥカドヘリン抗体及び抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項６記載の血管再生用支持体。
【請求項８】
基材は、生体内吸収性高分子材料からなることを特徴とする請求項６又は７記載の血管再生用支持体。
【請求項９】
神経の再生を行うための神経再生用支持体であって、基材の表面に、シュワン細胞又は神経細胞の表面の特異的なレセプターに対応するサイトカイン、又は、特異的な抗原に対する抗体の何れかが単独又は複合して結合されていることを特徴とする神経再生用支持体。
【請求項１０】
サイトカインは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及びニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項９記載の神経再生用支持体。
【請求項１１】
抗体は、抗シュワン細胞表面マーカー抗体、抗神経細胞表面マーカー抗体、抗神経栄養因子レセプター抗体、抗ＮＧＦ受容体抗体、抗ＢＤＮＦ受容体抗体、抗ＣＮＴＦ受容体抗体、抗ＮＴ−３受容体抗体又は抗ＮＴ−４受容体抗体からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項９記載の神経再生用支持体。
【請求項１２】
基材は、生体内吸収性高分子材料からなることを特徴とする請求項９、１０又は１１記載の神経再生用支持体。
【請求項１３】
請求項１、２、３、４又は５記載の再生医療用支持体を、移植することを特徴とする治療方法。
【請求項１４】
請求項１、２、３、４又は５記載の再生医療用支持体に細胞を播種した後、移植することを特徴とする治療方法。
【請求項１５】
請求項６、７又は８記載の血管再生用支持体を、血管に移植することを特徴とする治療方法。
【請求項１６】
請求項６、７又は８記載の血管再生用支持体に血管内皮前駆細胞を播種した後、血管に移植することを特徴とする治療方法。
【請求項１７】
請求項９、１０、１１又は１２記載の神経再生用支持体を、神経に移植することを特徴とする治療方法。
【請求項１８】
請求項９、１０、１１又は１２記載の神経再生用支持体にシュワン細胞を播種した後、神経に移植することを特徴とする治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療において患者に移植したときに組織又は器官の再生の足場になる再生医療用支持体、血管再生用支持体、神経再生用支持体、及び、これらを用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、組織又は器官の再生の足場になる支持体を患者に移植することが行われている。このような支持体としては、例えば、特許文献１に、コラーゲン単糸からなる移植用基材が開示されている。
また、特許文献２及び特許文献３には、生体吸収性素材の発泡体と、同様素材により補強した心血管系組織培養基材、並びにチューブ状の神経再生基材が開示されている。
更に、特許文献４には、スポンジ状または、不織布状の高分子材料成形物からなる骨格の内部に細胞を分散したゲルを有する医用材料が開示されている。
【０００３】
支持体を用いる再生医療の手法としては、例えば、細胞の接着していない支持体を患者の体内に移植し、周りの組織又は器官から細胞を支持体中に侵入させ増殖分化させて組織又は器官を再生する方法；予め自家又は他家の組織又は器官から採取した細胞を支持体中に播種、培養し、これを患者に移植して、その細胞を増殖分化させたり、その細胞から分泌されるサイトカイン等により周りの組織又は器官の細胞を誘導して支持体中に侵入させたりすることにより組織又は器官を再生する方法等挙げられる。
【０００４】
ところでヒトの組織又は器官は、通常複数種の細胞が特定の位置に配置され、特定の状態に分化することにより形作られている。再生医療においても、このような複雑な組織又は器官をいかに再生するかが大きな問題となっている。即ち、支持体を移植して再生を行う場合、支持体上においても実際の組織又は器官と同様に、複数種の細胞がそれぞれ特定の位置に配置され、特定の状態に分化していなければ、組織又は器官が正常にその機能を回復することがない。
【０００５】
しかしながら、従来の再生医療用支持体では、特定の細胞のみを接着させたり、特定の位置にのみ細胞を配置したりすることは困難であった。例えば、細胞を播種していない支持体を患者の体内に移植した場合、比較的遊走能の高い細胞のみが支持体内に侵入、増殖してしまい、正常な組織又は器官を再生することができないことがあった。また、予め組織又は器官から採取した細胞を支持体中に播種してから移植する場合にはある程度細胞の配置をコントロールすることも可能ではあるが、そのためには目的とする細胞種を単離してから播種する必要がある。医療の現場において、組織又は器官から採取した雑多な細胞のなかから目的とする細胞のみを単離する操作を行うことは事実上不可能であった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１９３３２８号公報
【特許文献２】特開２００１−７８７５０号公報
【特許文献３】特開２００３−１９１９６号公報
【特許文献４】特開２００３−２０４８０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記現状に鑑み、再生医療において患者に移植したときに組織又は器官の再生の足場になる再生医療用支持体、血管再生用支持体、神経再生用支持体、及び、これらを用いた治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、目的とする細胞の表面の特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質が結合されている再生医療用支持体である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、細胞の表面には通常細胞同定のマーカーとされる特異的なレセプターが存在することに着目し、鋭意検討した結果、これらの特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質を基材の表面に結合させることにより、目的とする細胞が選択的に接着し再生医療に好適に用いることができる再生医療用支持体（以下、単に支持体ともいう）が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
ここで目的とする細胞としては、目的とする組織又は器官を構成する細胞や、目的とする組織又は器官を構成する細胞に分化し得る細胞等が挙げられる。また、このような細胞以外にも、特定のサイトカイン等を分泌することにより、目的とする組織又は器官を構成する細胞や目的とする組織又は器官を構成する細胞に分化し得る細胞が支持体内に侵入するのを促したり、これらの細胞が分化するのを誘導したりする細胞等も挙げられる。
【００１１】
上記組織又は器官を構成する細胞、組織又は器官を構成する細胞に分化し得る細胞としては特に限定されず、例えば、ヒト又は動物由来の間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、角化細胞、繊維芽細胞、骨髄細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、血管内皮前駆細胞等が挙げられる。
上記サイトカイン等を分泌する細胞としては特に限定されず、上記組織又は器官を構成する細胞、組織又は器官を構成する細胞に分化し得る細胞等が挙げられる。
【００１２】
本発明の再生医療用支持体は、基材の表面にタンパク質が結合されているものである。
上記基材としては特に限定されず、公知の無機材料又は有機材料を用いることができるが、なかでも生体内吸収性高分子材料を用いる場合には、移植後に生体内に分解吸収され再手術により取り出す必要がないことから好適である。
上記生体内吸収性高分子材料としては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、乳酸−ε−カプロラクトン共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子；デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。
【００１３】
上記基材の形状は特に限定されず、例えば、スポンジ等の多孔質体、フィルム等のいずれであってもよい。なかでも、多数の微細小孔を有する多孔質体である場合には、接着した細胞が微細小孔内に接着して三次元的に伸展することが可能となり、また、接着した細胞へ充分な栄養を供給することが可能となり、細胞を正常に増殖、分化させることができることから好ましい。
【００１４】
上記基材が多数の微細小孔を有する多孔質体である場合に、上記微細小孔の平均孔径としては再生しようとする組織又は器官により最適な値を選択することができるが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は５００μｍである。１０μｍ未満であると、支持体の内部に細胞が侵入できず細胞接着性が極端に劣ったり、接着した細胞が三次元的に伸展できなかったりすることがあり、５００μｍを超えると、細胞の密度が低くなり組織又は器官を再生できないことがある。また、本発明の再生医療用支持体を血管の再生に用いる場合には、上記微細小孔の平均孔径のより好ましい上限は５０μｍである。５０μｍを超えると、血管として必要な耐水圧性が得られず、血液が漏れだしたりすることがある。
【００１５】
上記基材は、横編地、縦編地、組紐、織地、不織布等の補強材により補強されていてもよい。補強材により補強することにより、得られる本発明の再生医療用支持体の強度が向上し、取扱い性等が向上する。上記補強材を構成する材料と上記基材本体を構成する材料とは同一であってもよいし、異なっていてもよいが、上記基材が生体内吸収性高分子材料からなる場合には、上記補強材も生体内吸収性高分子材料からなることが好ましい。
【００１６】
目的とする細胞の表面の特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質としては特に限定されないが、サイトカイン、抗体等が挙げられる。
上記サイトカインとしては特に限定されないが、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、骨形成因子（ＢＭＰ）、又は、インターロイキン（ＩＬ）等が挙げられる。
例えば、目的とする細胞がシュワン細胞又は神経細胞である場合には、これらの細胞に特異的なレセプターに対して神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及びニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）等のサイトカインが特異的に結合し得る。従って、本発明の再生医療用支持体を神経再生用支持体として用いる場合には、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及びニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインを結合させる。
神経の再生を行うための神経再生用支持体であって、基材の表面に、シュワン細胞又は神経細胞の表面の特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質が結合されている神経再生用支持体もまた、本発明の１つである。
【００１７】
上記抗体としては、目的とする細胞の表面の特異的な抗原に対応する抗体を用いる。
例えば、血管内皮細胞又は血管内皮前駆細胞、あるいは、シュワン細胞又は神経細胞の表面に特異的に存在する表面マーカーに対する抗体（抗細胞表面マーカー抗体）、血管内皮細胞又は血管内皮前駆細胞、あるいは、シュワン細胞又は神経細胞に特異的に働くサイトカインの受容体に対する抗体（抗サイトカイン受容体抗体）等が挙げられる。
【００１８】
具体的には、例えば、血管内皮を構成する細胞に分化し得る血管内皮前駆細胞の表面には、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１４４、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｋ−２、Ｆｌｋ−３、Ｆｌｋ−４、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−２、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、ｔｉｅ−２、ＶＥカドヘリン、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体等の特異的な抗原が存在し、血管内皮前駆細胞を同定する際のマーカーとして用いられている。従って、本発明の再生医療用支持体を血管再生用支持体として用いる場合には、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１４４抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｋ−２抗体、抗Ｆｌｋ−３抗体、抗Ｆｌｋ−４抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体、抗Ｆｌｔ−２抗体、抗Ｆｌｔ−３抗体、抗Ｆｌｔ−４抗体、抗ｔｉｅ−２抗体、抗ＰＥＣＡＭ抗体、抗ＶＥカドヘリン抗体又は抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体を結合させる。
血管の再生を行うための血管再生用支持体であって、基材の表面に、血管内皮前駆細胞の表面の特異的な抗原に対応する抗体が結合されている血管再生用支持体もまた、本発明の１つである。
【００１９】
同様に神経の再生においても、基材の表面に、シュワン細胞又は神経細胞の表面の特異的なレセプターに対応するサイトカイン、又は、特異的な抗原に対する抗体の何れかが単独、又は複合して結合される。
このようなサイトカインとしては、例えは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及びニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）等が、また、抗体としては、抗シュワン細胞表面マーカー抗体、抗神経細胞表面マーカー抗体、抗神経栄養因子レセプター抗体、具体的には、抗ＮＧＦ受容体抗体、抗ＢＤＮＦ受容体抗体、抗ＣＮＴＦ受容体抗体、抗ＮＴ−３受容体抗体、抗ＮＴ−４受容体抗体等が挙げられる。
【００２０】
目的とする細胞の表面の特異的なレセプターが複数種ある場合には、そのうちのいずれかに対応するサイトカイン又は抗体を１種のみ用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上のサイトカイン又は抗体を併用する場合には、より高い効率で選択的に目的とする細胞を結合させることができる。
【００２１】
上記サイトカインや抗体を調製する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。また、近年では、各種のサイトカインや主な細胞の表面抗原に対応する抗体が市販されているので、これを用いてもよい。
【００２２】
上記タンパク質は上記基材に結合されている。上記タンパク質と基材との結合の態様としては特に限定されず、例えば、共有結合、イオン結合等が挙げられる。また、物理的な吸着により結合されていてもよい。
上記基材としてポリ乳酸等を用いる場合には、例えば、ポリ乳酸の表面をアルカリ等を用いて加水分解してカルボキシル基を露出させた後、このカルボキシル基に水溶性カルボジイミドの一種である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を反応させ、このＥＤＣ活性基を利用してタンパク質のアミノ基を共有結合させることにより、基材とタンパク質とを結合させることができる。また、上記基材の表面にプラズマ加工処理、オゾン処理等を施すことによっても、基材の表面にカルボキシル基が露出することから、このカルボキシル基を利用してタンパク質を結合させることができる。上記基材がカルボキシル基を持つ場合には、直接タンパク質を共有結合させることができる。なお、上記基材の表面に残存した未反応のＥＤＣ活性基は、細胞の接着を阻害したり、患者に移植したときに悪影響を与えたりする可能性もあることから、タンパク質結合処理後に２−アミノエタノール等と反応させる等のキャッピング処理を施すことが好ましい。
【００２３】
上記基材としてコラーゲンを用いる場合には、例えば、コラーゲンを構成するアミノ酸の官能基を利用して、ジアルデヒド類、エポキシ化合物、酸無水物等の種々の二価性架橋剤を介して上記タンパク質を共有結合させることができる。
【００２４】
上記タンパク質の結合量としては特に限定されないが、可能な範囲で高濃度に結合させることが好ましい。
上記タンパク質は、上記基材の全体に結合されていてもよいし、目的の細胞を結合させたい部分にのみ結合させてもよい。例えば、本発明の再生医療用支持体を血管の再生の目的に用いる場合には、血管の内壁を構成させる部分にのみ抗ＣＤ３４抗体等の血管内皮前駆細胞の表面の特異的な抗原に対応する抗体を結合させることが好ましい。また、基材の部分ごとに異なる細胞の特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質を結合させれば、１つの支持体中で複数種の細胞を選択的に配置させることも可能である。
【００２５】
本発明の再生医療用支持体は、基材の表面に目的とする細胞の表面の特異的なレセプターに対応するリガンドを有するタンパク質が結合されているものであることから、目的とする細胞を選択的に結合させることができる。本発明の再生医療用支持体をそのまま、又は、予め細胞を播種してから患者に移植することより、複雑な組織又は器官を高い効率で再生させることができる。
【００２６】
次に本発明の再生医療用支持体を用いた治療方法について好ましい態様を挙げて説明する。
第１の態様においては、本発明の再生医療用支持体を予め細胞等を播種することなく直接患者に移植する。
例えば、乳酸−カプロラクトン共重合体からなる平均孔径が１０〜５０μｍ程度である微細小孔を有する多孔質体からなるシート状基材の片面に、抗ＣＤ３４抗体等を結合させた本発明の再生医療用支持体（血管再生用支持体）を、抗体が結合された側が血管の内側を向くようにして患者の血管に移植する。血液中には、血管内皮前駆細胞が含まれていることから、血液中に含まれる細胞のうち血管内皮前駆細胞が選択的に本発明の再生医療用支持体に接着する。これにより、従来の支持体を用いた場合に比べて、短期間かつ高い再現性で血管内皮が再生される。
本発明の再生医療用支持体、血管再生用支持体又は神経再生用支持体を、移植することを特徴とする治療方法もまた、本発明の１つである。
【００２７】
第２の態様においては、本発明の再生医療用支持体に予め自家又他家の組織又は器官から採取した細胞を播種してから患者に移植する。
例えば、乳酸−カプロラクトン共重合体からなる平均孔径が１０〜５０μｍ程度である微細小孔を有する多孔質体からなるシート状基材の片面に、抗ＣＤ３４抗体等を結合させた本発明の再生医療用支持体（血管再生用支持体）に、患者から常法により採取した骨髄液を播種する。骨髄液には血管内皮前駆細胞をはじめとする雑多な細胞が含まれるが、そのうち血管内皮前駆細胞が選択的に再生医療用支持体に接着する。この際、骨髄液中に含まれる血管内皮前駆細胞をできる限り有効に利用するために、骨髄液を循環させる装置を用いて支持体に繰り返し骨髄液を播種してもよい。このような方法により、一方の面に血管内皮前駆細胞が選択的に接着した支持体を、血管内皮前駆細胞が結合された側が血管の内側を向くようにして患者の血管に移植すれば、従来の支持体を用いた場合に比べて、短期間かつ高い再現性で血管内皮が再生される。
本発明の再生医療用支持体、血管再生用支持体又は神経再生用支持体に細胞（血管再生用支持体の場合には血管内皮前駆細胞が、神経再生用支持体の場合にはシュワン細胞が好ましい）を播種した後、移植することを特徴とする治療方法もまた、本発明の１つである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、再生医療において患者に移植したときに組織又は器官の再生の足場になる再生医療用支持体、血管再生用支持体、神経再生用支持体、及び、これらを用いた治療方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）
（１）乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジの作製
乳酸−カプロラクトン共重合体の４重量％ジオキサン溶液を型枠に流延し、凍結後、凍結乾燥することにより、平均孔径が２０μｍの微細小孔を有する乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジを作製した。この乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジを直径２ｍｍ、厚さ０．７ｍｍの円盤状に打ち抜いたものを以下の操作に供した。
【００３１】
（２）抗ＣＤ３４抗体の固定
得られた乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジを０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に２５℃、５分間浸漬して、表面を加水分解した。次いで、加水分解された乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジを０．１Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）溶液に４℃、２時間浸漬して、表面のカルボキシル基を活性化した。次いで、ＥＤＣ活性化乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジを０．０４ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤ３４抗体−リン酸緩衝溶液中に４℃、３６．５時間浸漬して、表面に抗ＣＤ３４抗体を結合した。
最後に１０ｍＭ２−アミノエタノール−リン酸緩衝溶液中に４℃、２時間浸漬して未反応の活性化カルボキシル基をキャッピングして支持体を得た。
【００３２】
（比較例１）
実施例１で作製した無処理の乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジを支持体とした。
【００３３】
（比較例２）
実施例１で作製した無処理の乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジを０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に２５℃、５分間浸漬して、表面を加水分解した。次いで、加水分解された乳酸−カプロラクトン共重合体スポンジを０．１Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）溶液に４℃、２時間浸漬して、表面のカルボキシル基を活性化した。最後に１０ｍＭ２−アミノエタノール−リン酸緩衝溶液中に４℃、２時間浸漬して未反応の活性化カルボキシル基をキャッピングして支持体を得た。
【００３４】
（評価）
実施例１及び比較例１、２で作製した支持体について、以下の方法により評価を行った。
結果を表１に示した。
【００３５】
（１）抗ＣＤ３４抗体の固定量の評価
住友ベークライト社製「ペルオキシダーゼ用発色キットＴ」を用いてＨＲＴ法により定量を行った。
支持体を０．００３％マウスＩｇＧ抗体／ＨＲＴ−リン酸緩衝溶液中に３７℃、２４時間浸漬した。次いで、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液に３７℃、２４時間浸漬して洗浄を行った。水分を除いた後、リン酸緩衝液５００μＬ及び発色液１ｍＬを添加し攪拌した後、更に基質液３０μＬを添加し、３７℃、３０分間放置した。その後、反応液０．１５３ｍＬを取り出し、反応停止液０．１ｍＬと混合した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
別に作成した検量線から、抗マウスＩｇＧ抗体／ＨＲＰの量を定量し、抗ＣＤ３４抗体の固定量の指標とした。
【００３６】
（２）細胞接着性の評価
（２）−１  ＫＧ−１ａ細胞の接着性の評価
支持体を、細胞懸濁液を循環して複数回播種することができる細胞播種装置にセットした。
ＫＧ−１ａ細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁させて、濃度が２×１０６ｃｅｌｌｓ／５０ｍＬの細胞懸濁液を調製し、この全量を細胞播種装置により５枚の支持体上に播種した。
５％ＣＯ２、３７℃で１日間培養した後、各支持体を１００μＬのリン酸緩衝液で３回洗浄した後、支持体に接着した血管内皮前駆細胞数をＷＳＴ−１（和光純薬社製）を用いて計測した。
（２）−２  イヌ骨髄単核球の接着性の評価
支持体を、細胞懸濁液を循環して複数回播種することができる細胞播種装置にセットした。
イヌの腸骨から骨髄を採取し、得られた骨髄液を密度勾配法で分画し、単核球成分を分離した。この細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁させて、濃度が３×１０７ｃｅｌｌｓ／３０ｍＬの細胞懸濁液を調製し、この全量を細胞播種装置により３枚の支持体上に播種した。
５％ＣＯ２、３７℃で１日間培養した後、各支持体を１００μＬのリン酸緩衝液で３回洗浄した後、支持体に接着したイヌ骨髄単核球数をＤＮＡアッセイ法を用いて計測した。
【００３７】
【表１】
2005168760.tif 000002
表１より、表面にＣＤ３４抗原を有するＫＧ−１ａ細胞は、比較例１、２で作製した抗体が結合していない支持体に比べ、実施例１で作製した抗体が結合された支持体の接着性が顕著に高いことが判った。
また、イヌ骨髄単核球にはＣＤ３４抗原を有する細胞が数％程度含まれると考えられるが、イヌ骨髄単核球を播種した場合においても、抗体が結合していない支持体に比べ、抗体が結合された支持体への接着性の方が高かった。しかし、ＫＧ−１ａ細胞を播種した場合に比べると、抗体の有無による接着性の差異は小さいものであった。これより、抗体が結合された支持体には、表面に抗原を有する細胞が選択的に接着されることが示唆された。
【００３８】
（実施例２）
実施例１で作製した支持体を、細胞懸濁液を循環して複数回播種することができる細胞播種装置にセットした。
ＫＧ−１ａ細胞及びＨＬ−６０細胞をリン酸緩衝液に懸濁させて、それぞれの濃度が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬである細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を細胞播種装置により支持体上に播種した。
フローサイトメトリーを用いて、播種前の細胞懸濁液中、及び、播種後に細胞播種装置から回収した細胞懸濁液中に含まれるそれぞれの細胞数を測定した。
この結果を図１に示した。
【００３９】
図１より、播種前の細胞懸濁液中においては、ＫＧ−１ａ細胞とＨＬ−６０細胞とは、ほぼ同数であったのに対し、播種後に細胞播種装置から回収した細胞懸濁液中ではＫＧ−１ａ細胞数のみが大きく減少していた。このことより、ＫＧ−１ａ細胞が選択的に支持体に接着したことが判った。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、再生医療において患者に移植したときに組織又は器官の再生の足場になる再生医療用支持体、血管再生用支持体、神経再生用支持体、及び、これらを用いた治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例２で測定したフローサイトメトリーのチャートである。
【図１】
2005168760.tif 000003