(57)【要約】      （修正有）【課題】  ヒトにおける代謝系をin vitro系において再現する化合物の安全性評価方法。【解決手段】  ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１ならびにヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種について、酵母内で(i) 上記の分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を作製する工程、作製された酵母菌体または該菌体破砕物を検体である化合物と反応する工程、反応液中に存在する代謝産物を分析することによって、検体である化合物の解毒代謝の有無または発癌物質への代謝の有無を判定する工程、からなる化合物の安全評価方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体である化合物と下記の試薬との接触後の反応液中に存在する代謝産物を分析することによって、検体である化合物の解毒代謝の有無または発癌物質への代謝の有無を判定し、当該判定により、（ａ）検体である化合物の解毒代謝の存在（有）または発癌物質への代謝の非存在（無）の場合、検体である化合物を安全と評価し、または、（ｂ）検体である化合物の解毒代謝の非存在（無）または発癌物質への代謝の存在（有）の場合、検体である化合物を非安全と評価するための試薬としての、下記の工程により作製された酵母菌体または該菌体破砕物の使用。
＜作製工程＞
ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１ならびにヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種について、
（１）(a) 酵母内で発現させるためのプロモーターならびに(b)(i)上記の分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを構築する工程、及び
（２）構築された酵母内発現プラスミドを酵母に導入することにより、酵母内で(i) 上記の分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を作製する工程
【請求項２】
検体である化合物と下記の試薬との接触後の反応液中に存在する代謝産物を栄養要素要求性の微生物に作用させることによって、該栄養要素に対して非要求性となった微生物の存在量を測定し、当該測定により、（ａ）栄養要素に対して非要求性となった微生物が、上記の酵母内発現プラスミドが導入されていない酵母菌体を用いて上記の測定と同様な測定を行う場合（コントロール）と同程度に存在する場合、検体である化合物を変異原性無と評価し、または、（ｂ）栄養要素に対して非要求性となった微生物が、上記の酵母内発現プラスミドが導入されていない酵母菌体を用いて上記の測定と同様な測定を行う場合（コントロール）と比較して実質的に多く存在する場合、検体である化合物を変異原性有と評価するための試薬としての、下記の工程により作製された酵母菌体または該菌体破砕物の使用。
＜作製工程＞
ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１ならびにヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種について、
（１）(a) 酵母内で発現させるためのプロモーターならびに(b)(i)上記の分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを構築する工程、及び
（２）構築された酵母内発現プラスミドを酵母に導入することにより、酵母内で(i) 上記の分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を作製する工程
【請求項３】
検体である化合物と下記の試薬との接触後の反応液中に存在する代謝産物を分析することによって、上記の分子種群に含まれる１種類の(i)ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の場合のみ、特異的に存在する代謝産物の有無を判定し、当該判定により、（ａ）１種類の(i)ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の場合のみに特異的に存在する代謝産物が存在する場合、該検体化合物を該チトクロムＰ４５０分子種の代謝プローブとして有効であると評価し、また（ｂ）特異的に存在する代謝産物が非存在の場合、該検体化合物を該チトクロムＰ４５０分子種の代謝プローブとして有効でないと評価するための試薬としての、下記の工程により作製された酵母菌体または該菌体破砕物の使用。
＜作製工程＞
ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１ならびにヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種について、
（１）(a) 酵母内で発現させるためのプロモーターならびに(b)(i)上記の分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを構築する工程、及び
（２）構築された酵母内発現プラスミドを酵母に導入することにより、酵母内で(i) 上記の分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を作製する工程
【請求項４】
作製された酵母菌体または該菌体破砕物が、前記全ての分子種における酵母菌体が混合されてなる酵母菌体または該菌体破砕物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの請求項に記載される使用。
【請求項５】
作製された酵母菌体または該菌体破砕物が、ヒト肝臓から調製されたミクロソーム画分が有するヒト由来のチトクロムＰ４５０の代謝回転速度とオーダー的に一致する代謝回転速度を有する酵母菌体または該菌体破砕物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの請求項に記載される使用。
【請求項６】
ヒト肝臓から調製されたミクロソーム画分が有するヒト由来のチトクロムＰ４５０の代謝回転速度が、１．０〜５．９［product nmol/nmol P450/min］の範囲内に含まれる代謝回転速度であることを特徴とする請求項５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新規化合物の開発では、化合物の、ヒトにおける代謝・薬効・毒性を早期に予測・評価する必要がますます高くなってきている。特に、農薬、一般化合物などのように、ヒトへの投与による安全性評価試験を行なうことが不可能な場合、実験動物への投与による安全性評価試験の結果をヒトへ外挿することにより安全性評価を行っている。
しかしながら、近年チトクロムＰ４５０を始めとする薬物代謝酵素系の動物種間による違いが明らかになりつつある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
その結果、実験動物を安全性評価試験に用いることは、ヒトにおける代謝・薬効・毒性を早期に予測・評価するのに必ずしも常に充分なものであるとはいえなくなった。このために、新規化合物をヒトへの投与する安全性評価試験、または入手が倫理的、技術的に困難であるヒト肝臓等の生体組織を用いる安全性評価試験を行なうことなく、ヒトにおける代謝系をin vitro系において再現する評価方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の状況を鑑み、よりすぐれたヒトにおける代謝系をin vitro系において再現する評価方法を見い出すべく、鋭意検討を重ねた結果、酵母発現系は酵母菌体の優れた増殖能力によりヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種あるいは該分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を大量生産するのに適すること、かつ (i)ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを用いることにより著しく大量の代謝産物が短時間でしかも安定して得られるために精密な分析が可能であること、さらにある種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を必須的に組み合せて用いることによりヒト肝臓における代謝系をin vitroで再現できることを見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、（Ｉ）ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１ならびにヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種について、
（１）(a) 酵母内で発現させるためのプロモーターならびに(b)(i)上記の分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを構築する工程（工程１）、
（２）構築された酵母内発現プラスミドを酵母に導入することにより、酵母内で(i) 上記の分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を作製する工程（工程２）、
（３）作製された酵母菌体または該菌体破砕物を検体である化合物と反応する工程（工程３）、
（４）反応後、反応液中に存在する代謝産物を分析することによって、検体である化合物の解毒代謝の有無または発癌物質への代謝の有無を判定する工程（工程４Ａ）、
（５）上記の判定により、（ａ）検体である化合物の解毒代謝の存在（有）または発癌物質への代謝の非存在（無）の場合、検体である化合物を安全と評価し、または、（ｂ）検体である化合物の解毒代謝の非存在（無）または発癌物質への代謝の存在（有）の場合、検体である化合物を非安全と評価する工程（工程５Ａ）、
からなることを特徴とする評価方法（以下、評価方法と記す。）、および
(II)   ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１ならびにヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種について、
（１）(a) 酵母内で発現させるためのプロモーターならびに(b)(i)上記の分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを構築する工程（工程１）、
（２）構築された酵母内発現プラスミドを酵母に導入することにより、酵母内で(i) 上記の分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を作製する工程（工程２）、
（３）作製された酵母菌体または該菌体破砕物を検体である化合物と反応する工程（工程３）、
（４）反応後、反応液中に存在する代謝産物を栄養要素要求性の微生物に作用させることによって、該栄養要素に対して非要求性となった微生物の存在量を測定する工程（工程４Ｂ）、
（５）上記の測定により、（ａ）栄養要素に対して非要求性となった微生物が、上記の酵母内発現プラスミドが導入されていない酵母菌体を用いて上記（３）および（４）を行う場合（コントロール）と同程度に存在する場合、検体である化合物を変異原性無と評価し、または、（ｂ）栄養要素に対して非要求性となった微生物が、上記の酵母内発現プラスミドが導入されていない酵母菌体を用いて上記（３）および（４）を行う場合（コントロール）と比較して実質的に多く存在する場合、検体である化合物を変異原性有と評価する工程（工程５Ｂ）、
からなることを特徴とする評価方法（以下、変異原性評価方法と記す。）、さらに
(III)  ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１ならびにヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種について、
（１）(a) 酵母内で発現させるためのプロモーターならびに(b)(i)上記の分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを構築する工程（工程１）、
（２）構築された酵母内発現プラスミドを酵母に導入することにより、酵母内で(i) 上記の分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)上記の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を作製する工程（工程２）、
（３）作製された酵母菌体または該菌体破砕物を検体である化合物と反応する工程（工程３）、
（４）反応後、反応液中に存在する代謝産物を分析することによって、上記の分子種群に含まれる１種類の(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の場合のみ、特異的に存在する代謝産物の有無を判定する工程（工程４Ｃ）、
（５）上記の判定により、（ａ）１種類の(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の場合のみに特異的に存在する代謝産物が存在する場合、該検体化合物を該チトクロムＰ４５０分子種の代謝プローブとして有効であると評価し、または（ｂ）特異的に存在する代謝産物が非存在の場合、該検体化合物を該チトクロムＰ４５０分子種の代謝プローブとして有効でないと評価する工程（工程５Ｃ）、
からなることを特徴とする評価方法（以下、代謝プローブ評価方法と記す。）を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明は、よりすぐれたヒトにおける代謝系をin vitro系において再現する安全性評価方法であり、高精度で代謝・薬効・毒性を早期に予測・評価することを可能にした。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
ヒトにおける代謝系をin vitroで再現する安全性評価方法としては、従来ラット等の実験動物の肝臓ホモジネートを用いる試験等が使用されている。
一方、近年ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子をヒト培養細胞に導入したシステムもすでに構築されているが、ヒト培養細胞は増殖能力が低く、かつ高密度培養が困難であることから大量のチトクロムＰ４５０分子種を得ことができず、代謝産物の分析には適さない。また、酵母等の微生物と比較すると、培養コストも高く、かつ高度な培養技術を必要とする。
上記のような欠点を解消するために、本発明では、ある種の(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を用いている。そのために、酵母内で発現させるためのプロモーター、ある種の(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを構築する必要がある。
以下に説明する。
【０００７】
本発明では、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種としてＰ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｃ９、２Ｅ１ならびにＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種を組み合せて用いることが必須である。これは、ヒト肝臓における各種チトクロムＰ４５０分子種の種類・存在量は人種差、個人差があるが、しかしながらいずれのヒトの場合においても、上記の分子種群に含まれる全てのチトクロムＰ４５０分子種を必須的に組み合せて用いることにより、ヒト肝臓における代謝系をin vitroで効率的に再現することが可能なためである。なお、本発明システムでは、上記の工程１から工程３、ならびに工程４Ａ、４Ｂおよび４Ｃの各工程を上記のチトクロムＰ４５０分子種ごとに独立した状態（チトクロムＰ４５０分子種をおのおの別々の系で並列的に存在させる状態を意味する。）または複数のチトクロムＰ４５０分子種を混合した状態（複数のチトクロムＰ４５０分子種を混合し、１つの系で同時に存在させる状態を意味する。）あるいは両者の中間的な状態（一部は独立した状態で、一部は混合した状態で存在させる状態を意味する。）で行ない、次に工程５Ａ、５Ｂおよび５Ｃにおいて、上記の全ての分子種について検討、評価してもかまわない。さらに必要に応じて、上記の分子種群に含まれるチトクロムＰ４５０分子種の他に、たとえば、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９またはＰ４５０  ２Ｄ６等の他のチトクロムＰ４５０分子種を補助的に組み合わせることによって、ヒト肝臓における代謝系をin vitroでより精度よく再現することができる。
本発明において用いられるヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の必須的な組み合わせ（Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｃ９、２Ｅ１ならびにＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群）でヒト肝臓における全チトクロムＰ４５０の約85％程度を網羅することができ、さらに、たとえば該分子種群にＰ４５０  ２Ａ６および／またはＰ４５０  ２Ｃ１９および／またはＰ４５０  ２Ｄ６を補助的に加えることにより約90％以上を網羅することができると推測される。
また、具体的には、たとえばＰ４５０  ３Ａ４（約３５±１０％）、Ｐ４５０  Ｐ４５０  ２Ｃ９（約２５±１０％）、Ｐ４５０  １Ａ２（約２３±１０％）、Ｐ４５０  ２Ｅ１（約１７±１０％）等の存在量の割合の組み合せをあげることができる。なお、上記の例にかかることなく適宜増加させたり、減少させることができることは言うまでもなく、この割合を変えることにより、ヒトにおける人種差、個人差にもより正確に対応することもできる。
【０００８】
つぎに酵母内発現プラスミドを構築する工程（工程１）に関して説明する。
上記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列は配列番号１から配列番号７で示される塩基配列中に開示されている。なお、これらのヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子は、たとえば、(1)(a)該遺伝子のmRNAを含むmRNA画分を調製し、逆転写酵素を用いてcDNAを作製後、該cDNAをファージベクター及びプラスミドベクターに挿入して得たcDNAライブラリー  、または(b) 市販のヒト肝由来のcDNAライブラリー、から目的とする遺伝子を、(i) その遺伝子と相同性を有するＤＮＡ断片、あるいは(ii)その遺伝子により産生されるタンパク質を認識する抗体、を用いるような通常の方法に従いクローニングする方法、または(2) 上記(1) 記載のcDNAライブラリーからPCR 法を用いてクローニングする方法、等の通常の方法により調製することができる。
【０００９】
一方、酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子は、たとえば、(1) (a) 該遺伝子のmRNAを含むmRNA画分を調製し、逆転写酵素を用いてcDNAを作製後、該cDNAをファージベクター及びプラスミドベクターに挿入して得たcDNAライブラリー  、または(b) 市販の酵母由来のcDNAライブラリー、から目的とする遺伝子を、(i) その遺伝子と相同性を有するＤＮＡ断片、あるいは(ii)その遺伝子により産生されるタンパク質を認識する抗体、を用いるような通常の方法に従いクローニングする方法、または(2) 上記(1) 記載のcDNAライブラリーからPCR 法を用いてクローニングする方法、等の通常の方法により調製することができる。具体的には、たとえば、特開昭62-19085号公報に記載される方法等により単離することができる。
【００１０】
本発明において用いられる酵母内で発現させるためのプロモーターとしては、通常の酵母発現系において用いられるプロモーターであれば特に制限されるものではないが、たとえば酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（以下、ADH プロモーターと記す。）、グリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素（以下、GAPDH プロモーターと記す。）、フォスフォグリセリン酸キナーゼ（以下、PGK プロモーターと記す。）等をあげることができる。なお、ADH プロモーターは、たとえば酵母ADH1プロモーターおよび同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターpAAH5(Washington Research Foundationから入手可能、Ammerer ら、Methods in Enzymology,101,p.192-201)から通常の遺伝子操作方法により調製することができる。酵母ADH1プロモーターは、Washington Research Foundationの米国特許第299,733(1981/9/31)に含まれており、米国において、工業的、商業的目的で使用する場合は権利者からの権利許諾を必要とする。
【００１１】
上記の酵母内で発現させるためのプロモーター、前記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および前記の酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドは通常の遺伝子組み換え方法を用いて構築することができる。たとえば、特開平2-21180 等に記載されるＡＤＨプロモーターとＡＤＨターミネーターを保有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５Ｎから調製したＮｏｔＩ断片と特開平2-211880等に記載される酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を保有するプラスミドｐＡＲＲＮのＮｏｔＩ部位に挿入し、得られたプラスミドｐＡＨＲＲのＨｉｎｄ III部位にヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子を挿入することにより構築する方法等をあげることができる。また必要に応じてpAAH5NベクターのHind III部位を別な制限酵素用の部位に交換したベクターを利用して構築する方法もあげられる。
【００１２】
さらに本発明では、前記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子および前記の酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子の他に、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素（ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の有する１原子酸素添加活性および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の有するＮＡＤＰＨからの還元力供給能を同一分子内に有する酵素）をコードする塩基配列を有する遺伝子を用いることもできる。  このような遺伝子は、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を通常の遺伝子操作方法により接続し、単一の遺伝子とすることにより構築することができる。そして構築された遺伝子を特開平2-21180 等に記載されるＡＤＨプロモーターとＡＤＨターミネーターを保有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５ＮのＨｉｎｄ III部位に挿入することにより酵母内発現プラスミドを構築する方法をあげることができる。
また、複数種の分子種を同時に発現するような単一の酵母内発現プラスミドを調製することもできる。
【００１３】
つぎに酵母内で(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体を作製する工程（工程２）に関して説明する。
酵母内でヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる酵母菌体は、構築された酵母内発現プラスミドをたとえばプロトプラスト法、アルカリ金属(LiCl)法等の通常の方法によって酵母に導入することで得ることができる。
本発明システムにおいて用いられる酵母菌株としては、たとえばサッカロミセス・セレビシェー（Saccharomyces cerevisiae）等をあげることができる。好ましくはサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株（ＡＴＣＣ３８６２６）があげられる。
また、複数種の分子種を同時に発現するように複数種の酵母内発現プラスミドを単一の酵母菌株に導入することもできる。
【００１４】
このように作製させた酵母菌体を用いることによって、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種内における電子伝達効率を上昇させ、そしてヒト由来のチトクロムＰ４５０あるいはヒト由来のチトクロムＰ４５０の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の一原子酸素添加活性を著しく向上させることが可能になる。
【００１５】
つぎに作製された酵母菌体または該菌体破砕物を検体である化合物と反応させる工程（工程３）に関して説明する。
酵母菌体としては通常、生菌体が使用される。菌体破砕物としては、たとえばミクロソームを含む菌体破砕液、ミクロソーム画分、またはミクロソームならびに細胞質の両者を含む画分等をあげることができる。これらの調製法は、たとえばＤＮＡ，Vol.４，No. ３，ｐ２０３−ｐ２１０（1985）等に記載される通常の方法でよい。なお、上記のうち、菌体破砕物を検体である化合物と反応させることが特に好ましい。菌体破砕物のなかでも、一般的には、ミクロソーム画分を検体である化合物と反応させることが好ましいが、たとえば後述するような生物学的分析方法（変異原性または毒性評価）においてはこの限りではなく、ミクロソームならびに細胞質の両者を含む画分の方が好ましい場合がある。
反応は、酵母菌体または該菌体破砕物を含む培養液、緩衝液等の溶液に検体である化合物を添加し、該混合物をたとえば約１０℃〜約４０℃で、約0.１時間〜約４８時間インキュベートすることにより行なうことができる。なお、酵母菌体または該菌体破砕物の溶液中、存在量および検体である化合物の添加量は、反応温度、反応時間、検体である化合物の種類等の各種条件によって異なるが、たとえば、酵母菌体または該菌体破砕物の溶液中存在量としては溶液１mlあたり約１０10〜約１０15程度のＰ４５０分子数（酵母菌体として溶液１mlあたり約１０5 〜約１０10程度の菌体数）、好ましくは溶液１mlあたり約１０12〜約１０13のＰ４５０分子数（酵母菌体として溶液あたり約１０7 〜約１０8 の菌体数）であり、検体である化合物の添加量としては、溶液１mlあたり約0.01μmol 〜約１μmol 程度の範囲が望ましい。なお、上記の範囲にかかることなく適宜増加させたり、減少させることができることは言うまでもない。
【００１６】
つぎに反応後、反応液中に存在する代謝産物を分析することによって、検体である化合物の解毒代謝の有無または発癌物質への代謝の有無を判定する工程（工程４Ａ）および検体である化合物の安全性を評価する工程（工程５Ａ）に関して説明する。
反応後、反応液中に存在する代謝産物を分析する方法は、監修  塩川二郎ら機器分析のてびき(2) （増補改訂版）第１刷，化学同人発行（1985年）、R. M. SILVERSTEIN ら，有機化合物のスペクトルによる同定法  第４版  第３刷，東京化学同人発行（1984年）等に記載される通常の分析方法を用いることができる。
そして上記の分析結果に基づいて、検体である化合物の解毒代謝の有無または発癌物質への代謝の有無を判定すればよい。
【００１７】
また反応液中に存在する代謝産物を分析する方法として、たとえば下記のような生物学的分析方法を利用することもできる（工程４Ｂ）。この場合、たとえば「反応液中に存在する代謝産物を分析する」ために、「反応液中に存在する代謝産物を栄養要素要求性の微生物に作用させる」ことによって、該栄養要素に対して非要求性となった微生物の存在量を測定し、該測定によって、（ａ）栄養要素に対して非要求性となった微生物が、上記の酵母内発現プラスミドが導入されていない酵母菌体を用いて上記（３）および（４）を行う場合（コントロール）と同程度に存在する場合、検体である化合物を変異原性無と評価し、または、（ｂ）栄養要素に対して非要求性となった微生物が、上記の酵母内発現プラスミドが導入されていない酵母菌体を用いて上記（３）および（４）を行う場合（コントロール）と比較して実質的に多く存在する場合、検体である化合物を変異原性有と評価する（工程５Ｂ）ことにより検体である化合物の変異原性を決定することができる。さらに具体的には、たとえばヒスチジン要求性のサルモネラ菌株〔Salmonella typhimurium (his - ) 〕またはトリプトファン要求性の大腸菌株〔Escherichia coil (trp - ) 〕に反応液中に存在する代謝産物を作用させ、該菌株のアミノ酸に対して非要求性（His + またはTrp + ) となった菌、すなわち復帰突然変異菌がコロニーを形成するか否（復帰突然変異誘発性の有無）または形成したコロニーの数（復帰突然変異誘発性の強弱）を調べる生物学的分析方法をあげることができる。なお、上記の生物学的分析方法を用いる場合には、(a) 作製された酵母菌体または該菌体破砕物を検体である化合物と反応させる工程（工程３）と(b) 反応後、反応液中に存在する代謝産物を分析することによって、解毒代謝または発癌物質への代謝を判定する工程（工程４Ａ）を同時に進行させることも可能である。
アリールアミン系化合物の多くはヒト肝臓において代謝活性化を受けることにより、変異原性を示すようになるため、上記の生物学的分析方法を用いる本発明を利用することが有利である。たとえば、チトクロムＰ４５０  １Ａ２を２０ｐｍｏｌ存在させる系の場合、約０．１μｇ程度の２−アミノアントラセンの変異原性を検出することができる。
また、上記の微生物の代わりに哺乳動物由来の細胞を用いた生物学的分析方法も可能である。たとえば、米国特許第４５３２２０４号に記載されるヒトＢリンパ芽球細胞ＡＨＨ−１の変異体であるＬ３細胞株から誘導されるＭＣＬ−５細胞株（親株と比較して多くの化合物の細胞毒性に対してより感受性が高い細胞株）に、反応液中に存在する代謝産物を作用させ、該細胞株の個体数増加を調べる。代謝産物を作用させた細胞株の個体数増加を代謝産物を作用させていない細胞株の個体数増加と比較してその検体である化合物の毒性を前記の微生物を用いる生物学的分析方法の場合と同様に評価することもできる。
【００１８】
また本発明を利用することにより、代謝プローブをスクリーニングすることができる。
代謝プローブは、生体内において薬物代謝の中心的な役割を果たす前記の分子種群に含まれるチトクロムＰ４５０の分子種の存在量を調べるのに用いられる。
すなわち、代謝プローブとしてある種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の特異的な基質となる化合物をヒトに投与し、血中や尿等の排泄物中の特異的な代謝産物を分析することにより、ヒト肝臓における該Ｐ４５０分子種の存在量を推定することができる。したがって、前記の分子種群に含まれる１種類のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種あるいはヒト由来のチトクロムＰ４５０の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の場合のみに特異的に存在する代謝産物を見い出すことができれば、その検体である化合物は前記の分子種群に含まれるチトクロムＰ４５０の分子種に関する代謝プローブとして利用可能である。すなわち、反応後、反応液中に存在する代謝産物を分析することによって、上記の分子種群に含まれる１種類の(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の場合のみ、特異的に存在する代謝産物の有無を判定する工程（工程４Ｃ）、上記の判定により、（ａ）１種類の(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０の分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の場合のみに特異的に存在する代謝産物が存在する場合、該検体化合物を該チトクロムＰ４５０分子種の代謝プローブとして有効であると評価し、または（ｂ）特異的に存在する代謝産物が非存在の場合、該検体化合物を該チトクロムＰ４５０分子種の代謝プローブとして有効でないと評価する工程（工程５Ｃ）により代謝プローブをスクリーニングすることもできる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例についてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にはなんら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子の取得）
市販のヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontech社）から図１〜図４記載のヒト由来のチトクロムＰ４５０遺伝子クローニング用プライマーを用いるＰＣＲ法および図５記載のヒト由来のチトクロムＰ４５０遺伝子クローニング用合成リンカー等を用いることによりヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡの塩基配列および検定アミノ酸配列を配列表に記載した。
なお、下記に示す配列番号とヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種との関係は、
１．本発明に必須的なヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種
（１）配列番号１  １Ａ２
（２）配列番号２  ２Ｃ９
（３）配列番号３  ２Ｅ１
（４）配列番号４  ３Ａ４
２．本発明に補助的なヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種
（１）配列番号５、６、７  １Ａ１
（２）配列番号８、９  ２Ａ６
（３）配列番号10  ２Ｂ６
（２）配列番号11、12、13  ２Ｃ８
（４）配列番号14  ２Ｃ１８
（５）配列番号15  ２Ｃ１９
（６）配列番号16、17、18、19  ２Ｄ６
である。
【００２１】
実施例２  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ１Ａ２、ｐ１Ａ２Ｒ）
図６にヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図１で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２遺伝子のタンパク質コーディング領域のＮ末端約４０ｂｐを除く約1.５ｋｂを増幅した。得られた約1.５ｋｂ断片は、ＳａｃＩで切断し、ｐＵＣ１１８ベクターにサブクローン化した。Ｎ末端約４０ｂｐは図５で示す合成リンカーを用い、ｐＵＣ１１８ベクターのＨｉｎｄ III、ＳａｃＩ部位にサブクローン化した。1.５ｋｂ断片を持つベクターは、Ｈｉｎｄ IIIで処理後、平滑化し、ＥｃｏＲＩリンカーを挿入した。これをＥｃｏＲＩとＳａｃＩで切り出し、Ｎ末端４０ｂｐを含むベクターと連結した後、ＥｃｏＲＩで処理、平滑化し、Ｈｉｎｄ IIIリンカーを挿入、さらにＨｉｎｄ IIIで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２の酵母内発現プラスミドｐ１Ａ２、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ１Ａ２Ｒを構築した。
【００２２】
実施例３  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ９、ｐ２Ｃ９Ｒ）
図７にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図１で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９遺伝子のタンパク質コーディング領域を約0.９ｋｂと約0.６ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約0.９ｋｂ断片はＰｓｔＩで切断してｐＵＣ  Ｂベクター（pUC19 が有するEcoRI 部位をHindIII 部位に改変し、形成されたHindIII とHindIII 部位の間のクローニングサイトを下記のクローニングサイト（化１）：
【００２３】
【化１】
2005095181.tif 000002
に交換することにより作製されたサブクローン用のプラスミド）にサブクローン化し、さらに約0.６ｋｂ断片をＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んで、２つの断片を連結させた。このプラスミドのＫｐｎＩ部位を平滑化し、ＸｂａＩリンカーを挿入したものからコーディング領域を含むＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣベクター中にＡＤＨプロモーター、ターミネーター領域を持つｐＵＣＡＮベクター（市販されるpUC19 ベクターが有するEcoRI 部位とＨindIII部位をそれぞれNotI部位に改変し、形成されたNotI部位とNotI部位の間にpAAH5Nから調製したNotI断片を組み込んで得たベクター）のＨｉｎｄ III部位を平滑化、ＸｂａＩリンカーを導入したｐＵＣＡＮＸに挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ９及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ９Ｒを構築した。
【００２４】
実施例４  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｅ１、ｐ２Ｅ１Ｒ）
図８にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図１で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子のタンパク質コーディング領域を約0.５ｋｂと約1.０ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約0.５ｋｂ断片はＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断してｐＵＣ１１８ベクターにサブクローン化し、さらに約1.０ｋｂの断片をＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ部位に組み込んで２つの断片を連結させた。これをＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩで切断し、一旦ｐＵＣ  Ｂに挿入後、Ｈｉｎｄ IIIで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲベクターに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１の酵母内発現プラスミドｐ２Ｅ１、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｅ１Ｒを構築した。
【００２５】
実施例５  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ３Ａ４、ｐ３Ａ４Ｒ）
図９にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図２で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４遺伝子のタンパク質コーディング領域を約0.６ｋｂと約0.９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約0.６ｋｂ断片はＳａｃＩで切断してｐＵＣ１１８ベクターにサブクローン化した。その後、ＥｃｏＲＩで切断、平滑化し、ＸｂａＩリンカーを導入したものに、ＸｂａＩ、ＳａｃＩで切断した0.９ｋｂ断片を組み込み、２つの断片を連結させた。このプラスミドをＳｐｈＩで切断後、平滑化し、ＸｂａＩリンカーを導入したものからＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣＡＮＸのＸｂａＩ部位に挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４の酵母内発現プラスミドｐ３Ａ４、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ３Ａ４Ｒを構築した。
【００２６】
実施例６  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ１Ａ１、ｐ１Ａ１Ｒ）
図１０にヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図２で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１遺伝子のタンパク質コーディング領域を、約1.０ｋｂと約0.５ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約1.０ｋｂの断片は、ＸｂａＩとＳａｃＩにより切断し、ｐＵＣＡベクター（pUC19 が有するEcoRI 部位をHindIII 部位に改変し、形成されたHindIII とHindIII 部位の間のクローニングサイトを下記のクローニングサイト（化２）：
【００２７】
【化２】
2005095181.tif 000003
に交換することにより作製されたサブクローン用のプラスミド）にサブクローンした。増幅した約0.５ｋｂ断片は、一旦ｐＵＣ  １９ベクターをＨｉｎｃIIで切断したものにサブクローン化し、ＳａｃＩで切断後、1.０ｋｂ断片を持つベクターと連結した。こうして得られた１Ａ１遺伝子のコーディング領域をＨｉｎｄ IIIで切り出した後、ＡＤＨプロモーターおよびターミネーター領域を有する酵母発現用ベクターｐＡＡＨ５Ｎ、及びその上流に酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素遺伝子を有するＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時発現用ベクターｐＡＨＲＲのＨｉｎｄ III部位に挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａ１の酵母内発現プラスミドｐ１Ａ１、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａ１と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ１Ａ１Ｒを構築した。
さらに、ごく一部の塩基配列のみが異なる２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１遺伝子断片を上記と同様に得て、２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１の酵母内発現プラスミドｐ１Ａ１ Variant１、ｐ１Ａ１ Variant２、及び２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ１Ａ１Ｒ Variant１、ｐ１Ａ１Ｒ Variant２を構築した。
【００２８】
実施例７  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ａ６、ｐ２Ａ６Ｒ）
図１１にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図３で示すプライマー用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６遺伝子のタンパク質コーディング領域を、約0.６ｋｂと約0.９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。その結果、ごく一部の塩基配列のみが異なる２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６遺伝子断片が得られた。
得られた約0.６ｋｂの断片は、ＸｂａＩとＨｉｎｃIIで切断してｐＵＣ  Ａベクターにサブクローン化し、さらに0.９ｋｂ断片をＨｉｎｃII、ＫｐｎＩ部位に組み込んで２つの断片を連結させた。これをＨｉｎｄ IIIで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ及び、ｐＡＨＲＲに挿入し、２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６の酵母内発現プラスミドｐ２Ａ６、ｐ２Ａ６ Variant１及び２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ａ６Ｒ、ｐ２Ａ６Ｒ Variant１を構築した。
【００２９】
実施例８  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｂ６、ｐ２Ｂ６Ｒ）
図１２にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図３で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６遺伝子全タンパク質コーディング領域を増幅した。得られた断片は、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断してｐＵＣ  Ａにサブクローン化した。これをＨｉｎｄ IIIで部分消化し、ｐＡＡＨ５Ｎ及び、ｐＡＨＲＲベクターに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６の酵母内発現プラスミドｐ２Ｂ６及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｂ６Ｒを構築した。
【００３０】
実施例９  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ８、ｐ２Ｃ８Ｒ）
図１３にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図３で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８遺伝子全タンパク質コーディング領域を増幅した。その結果、ごく一部の塩基配列のみが異なる３種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８遺伝子が得られた。得られた断片は、ＸｂａＩで部分消化して、一旦ｐＵＣ  Ａにサブクローン化した。これをＨｉｎｄ IIIで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ及び、ｐＡＨＲＲベクターに挿入し、３種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８の酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ８、ｐ２Ｃ８ Variant１、ｐ２Ｃ８ Variant２、及び３種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ８Ｒ、ｐ２Ｃ８Ｒ Variant１、ｐ２Ｃ８Ｒ Variant２を構築した。
【００３１】
実施例１０  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ１８、ｐ２Ｃ１８Ｒ）
図１４にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図３で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８遺伝子のタンパク質コーディング領域を約1.４ｋｂと約0.９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約1.４ｋｂ断片はＰｓｔＩで切断してｐＵＣ  Ａベクターにサブクローン化し、さらに約0.９ｋｂ断片をＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んで、２つの断片を連結させた。このプラスミドをＳｍａＩで切断後、ＸｂａＩリンカーを導入したものからＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣＡＮＸのＸｂａＩサイトに挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８の酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１８及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１８Ｒを構築した。
【００３２】
実施例１１  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ１９、ｐ２Ｃ１９Ｒ）
図１５にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。配列番号２０から２６で示される塩基配列を有するプライマーNo.1、No.2、No.3およびNo.4、ならびにNo.5およびNo.6、ならびにNo.5およびNo.7をそれぞれ用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域の一部を増幅した（断片ａ，ｂ，ｃ）。他の領域については、配列番号２７から４０で示される塩基配列を有するプライマーNo.8からNo.21 までを用いて、ＰＣＲ法によってヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９遺伝子に変異を導入しながらヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域の一部を増幅（断片ｅ，ｆ）し、さらに残りの領域については、直接的にＤＮＡを合成することによって配列番号４１および４２で示される塩基配列を有するリンカーNo.1およびNo.2を得た（断片ｄ）。このようにして、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域全体をカバーする断片を調製した。
なお、以下に配列番号とプライマーNo．との関係を示す。
配列番号２０：プライマーNo.1  配列番号２１：プライマーNo.2  配列番号２２：プライマーNo.3  配列番号２３：プライマーNo.4  配列番号２４：プライマーNo.5  配列番号２５：プライマーNo.6  配列番号２６：プライマーNo.7  配列番号２７：プライマーNo.8  配列番号２８：プライマーNo.9  配列番号２９：プライマーNo.10   配列番号３０：プライマーNo.11   配列番号３１：プライマーNo.12   配列番号３２：プライマーNo.13   配列番号３３：プライマーNo.14   配列番号３４：プライマーNo.15   配列番号３５：プライマーNo.16   配列番号３６：プライマーNo.17   配列番号３７：プライマーNo.18   配列番号３８：プライマーNo.19   配列番号３９：プライマーNo.20   配列番号４０：プライマーNo.21   配列番号４１：リンカーNo.1  配列番号４２：リンカーNo.2
つぎに、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理された断片ａおよびＢａｍＨＩとＰｓｔＩで処理された断片ｂを同時にＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入し、さらにＸｂａＩとＸｈｏＩで処理された断片ｅを得られたプラスミドのＸｂａＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入することによって断片ａ，ｂ，ｅを含むプラスミドを得た。さらに、ＰｓｔＩとＫｐｎＩで処理された断片ｃおよびリンカーである断片ｄを同時にＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入後、再びＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩで切り出すことによって得られた断片（断片ｃ，ｄ含む断片）およびＥｃｏＲＩで処理された断片ｆを同時に前記のプラスミド（断片ａ，ｂ，ｅを含むプラスミド）のＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。このようにしてヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域全体を含むプラスミドを構築した。構築されたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、同様にＨｉｎｄＩＩＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１９及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１９Ｒを構築した。
【００３３】
実施例１２  （酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｄ６、ｐ２Ｄ６Ｒ）
図１６にヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の酵母内発現プラスミドの構築方法を示す。図４で示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子のタンパク質コーディング領域のＮ末端約２００ｂｐを除くを1.３ｋｂを約0.４ｋｂと約0.９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約0.９ｋｂ断片はＫｐｎＩで切断してｐＵＣ  Ａにサブクローン化した。Ｎ末端２００ｂｐは、図５で示した３本の合成リンカーを用い、まずＮ末端側の２本のリンカーをBlue Script （＋）ベクターのＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込み、その後もう一本のリンカーをそのＳｍａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んだ。さらにこのプラスミドのＰｓｔＩ、ＨｉｎｃII部位にＰＣＲ法で得られた約0.４ｋｂ断片を組み込み、その後ＮｓｐＶ、ＸｂａＩで切断し、0.９ｋｂ断片を含むプラスミドに挿入してコーディング領域を連結させた。これをＨｉｎｄ IIIで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲベクターに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６Ｒを構築した。
さらに、ごく一部の塩基配列のみが異なる３種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子断片を上記と同様に得て、３種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６ Variant１、ｐ２Ｄ６ Variant２、ｐ２Ｄ６ Variant３、及び２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６Ｒ Variant１、ｐ２Ｄ６Ｒ Variant２、ｐ２Ｄ６Ｒ Variant３を構築した。
【００３４】
実施例１３  （人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドの構築）
図１７にしたがってプラスミドを構築した。プラスミドp3A4を鋳型とし、図４に示したプライマーを用いてXbaI-XhoI 断片を得た。また、プラスミドpBFCR1 (特願平4-209226) から得た約2.1kb のXhoI-HindIII断片を市販のベクターBlue Script(+)のXhoI、HindIII 部位に挿入した後、制限酵素XhoIおよびXbaIで同時消化し、断片を得た。これら両断片を同時に、ベクターpUCAN のXbaI部位に挿入することにより得られたプラスミドを制限酵素NotIにより消化して約5.６kbの断片を得た。この断片とベクターpAAH5Nから得た約10.5kbのNotI断片を連結することにより目的とする人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドpF3A4 を得た。該人工融合酵素は1156アミノ酸残基から成り、その構造はＮ末端からヒト肝チトクロムP450 3A4をコードする全アミノ酸配列(503残基) 、リンカーに由来する配列 (Ala-Arg-Ala)、酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素Ｎ末端４２番目からＣ末端と続いている。
【００３５】
実施例１４  （形質転換酵母菌体の作製）
ＹＰＤ培地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン、２％グルコース）1.０mlにサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、遠心分離（5000Xg、10分間) により集菌した。得られた菌体を1.０mlの0.２Ｍ  ＬｉＣ１溶液に懸濁した後、再度遠心分離（5000Xg、10分間) し、得られたペレットに２０μｌの１Ｍ  ＬｉＣ１溶液、３０μｌの７０％ポリエチレングリコール4000溶液、約1.０μｇの実施例２から１３によって構築された各種の(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドあるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素の酵母内発現プラスミドをおのおの単独で含む１０μｌの溶液を添加した。これを十分に混合した後、３０℃で１時間インキュベートし、さらに１４０μｌの滅菌水を加えて攪拌した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（2.０％グルコース、0.67％窒素源アミノ酸不含（Nitrogen base w/o amino acids, Difco製）、２０μｇ／mlヒスチジン2.０％寒天）上に蒔き、３０℃で３日間インキュベートし、上記の酵母内発現プラスミドを保有する形質転換酵母菌体を選抜した。このようにして、酵母内で(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体を作製した。
【００３６】
実施例１５  （酵母内で発現したヒト由来のチトクロムＰ４５０の定量）
実施例１４によって作製された(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体のおのおのの培養液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約1.５×１０7 菌体／ml）２００mlを集菌し、該菌体を１０mlの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.０）を懸濁した後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。得られたペレットを新たに2.０mlの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.0 ）に懸濁し、２本のキュベットに1.０mlずつ分注した。サンプル側のキュベットに一酸化炭素を吹き込んだ後、両キュベット内にジチオナイト５−１０mgを添加し、攪拌したのち４００−５００ｎｍの差スペクトルを測定し、酵母内に存在する(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素濃度を算出した。各種の形質転換酵母菌体における各種の(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の発現量はすべて約１０5 −約１０6 分子／菌体のレベルであった。
【００３７】
実施例１６  （酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分、細胞質画分およびミクロソーム画分の調製）
実施例１４によって作製された(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体のおのおのの培養液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約1.０×１０8 菌体／ml）3.８ｌを集菌し、得られた菌体を４００mlの緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.５），２Ｍ  ソルビトール，0.１ｍＭ  ＤＴＴ，0.２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、１６０mg  ザイモリエイス 100,000（zymolyase100T)を加え、３０℃で６０分間インキュベートした。遠心分離（5000×ｇ、１０分間）して得られたスフェロプラストを１００mlの緩衝液Ａに懸濁した後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。同じ遠心分離操作をもう一度繰り返してスフェロプラストの洗浄を行った後、スフェロプラストを２００mlの緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ7.５），0.65Ｍ  ソルビトール，0.１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し超音波破砕（５０Ｗ，５分間）した。該破砕物を遠心分離（9000×ｇ、２０分間）して、上清を回収することにより酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分を得た。また、これをさらに遠心分離（125000×ｇ、７０分間）して沈澱を集め、0.１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.４）１０mlに再懸濁することによりミクロソーム画分を得た。一方、上清を回収することにより細胞質画分を得た。
【００３８】
実施例１７  （ＧＡＰＤＨプロモーターを用いる酵母内発現プラスミドの構築および酵母内発現）
図１８に、ＧＡＰＤＨプロモーターを用いる酵母内発現プラスミドの構築法示す。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで切断し平滑化した後、ＮｏｔＩリンカーを挿入して得たプラスミドｐＵＮのＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＡＲＲＮから得たＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．０Ｋｂ）を挿入し、ｐＵＲを得た。一方、プラスミドｐＡＡＨ５のＸｈｏＩ部位を平滑化し、ＸｂａＩリンカーを挿入した後、制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩにより切断し、得られた断片（約２．２Ｋｂ）をｐＵＣ１９のＸｂａＩ、ＳａＩＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをＸｂａＩおよびＰｓｔＩにより切断して得た断片（約２．２Ｋｂ）、サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株から調製した２μｍＤＮＡから切り出したＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片（約１．３Ｋｂ）、およびｐＵＲをＰｓｔＩで切断して得た断片、の３断片を連結することによりｐＵＲＬを得た。さらに、ｐＵＲＬをＨｉｎｄＩＩＩで切断し平滑化した後連結することによりＨｉｎｄＩＩＩ部位を消失させた。次に、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびターミネーターを含むＮｏｔＩ断片（約１．６Ｋｂ）〔Agric. Biol. Chem.,51,1641-1647(1987), J. Biol. Chem.,267,16497-16502(1992) に記載される方法により得る〕をｐＵＲＬのＮｏｔＩ部位に挿入することによりｐＵＲＬＧを得た。ｐＵＲＬＧのＨｉｎｄＩＩＩ部位に、実施例９に準じて得られたヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６  ｃＤＮＡを挿入することにより、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐＧ２Ｄ６Ｒを得た。このプラスミドをサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株に実施例１４に準じて導入したところ、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の産生が認められた。
【００３９】
つぎに、ヒト肝臓における代謝系をin vitroで効率的に再現するためにはヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種としてＰ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｅ１ならびにＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種を組み合せて用いることが必須であること、また上記の分子種群にＰ４５０  ２Ａ６および／またはＰ４５０  ２Ｃ１９および／またはＰ４５０  ２Ｄ６を補助的に加えることがより好ましいこと、さらにＰ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９またはＰ４５０  ２Ｄ６等の他のチトクロムＰ４５０分子種を補助的に組み合わせることによって精度が向上することを示すために複数の試験例により以下に説明する。まず実施例１４または１６によって作製された酵母菌体または該菌体破砕物を各種の化合物と反応させる試験を行った。
【００４０】
試験例１  （形質転換酵母生菌体を用いる７−エトキシクマリンＯ−脱エチル化反応および代謝産物の分析）
実施例１４によって作製された(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体のおのおのの培養液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約2.０×１０7 菌体／ml）６mlに７−エトキシクマリンを終濃度0.５ｍＭになるように添加し、３０℃で２あるいは５時間インキュベートした後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）し上清を得た。これに62.5μｌの１５％  ＴＣＡ、２mlのクロロホルムを加え、よく攪拌した後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。分離した層からクロロホルム層を回収し、これに0.１Ｍ  ＮａＣｌを含む0.01Ｎ  ＮａＯＨを４ml添加し、よく攪拌した後、再び遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。上清を回収した後、該上清画分について蛍光（ｅｘ．３６６ｎｍ，ｅｍ．４５２ｎｍ）を測定し、生成した７−ヒドロキシクマリンを定量した。その結果、１１種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる各種の酵母菌体すべてにおいて７−エトキシクマリンＯ−脱エチル化活性がみられた。各分子種における活性の程度は、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  ２Ｂ６では強いものであり、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｅ１、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｄ６では充分なものであった。またＰ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ３Ａ４、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９では弱いものであった。
【００４１】
試験例２  （形質転換酵母生菌体を用いるトルブタミド水酸化反応および代謝物の分析）
試験例２と同様に、(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体のおのおのの培養液にトルブタミドを終濃度1.０ｍＭになるように添加し、３０℃で１５時間インキュベートした後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）し上清を得た。これに２mlのジクロロメタンを加え、よく攪拌した後、再び遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。分離した層からジクロロメタン層を回収し、減圧下で溶媒を除去した。得られた残渣を１００μｌのアセトニトリルに溶解し、該溶液を下記の条件下でＨＰＬＣにより分析した。その結果、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９  Ｐ４５０  、２Ｃ１８および  Ｐ４５０  ２Ｃ１９発現酵母菌体においてトルブタミド水酸化物が検出された。各分子種における活性の程度は、Ｐ４５０  ２Ｃ９  では強いものであり、Ｐ４５０  ２Ｃ１９では充分なものであった。またＰ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ１８では弱いものであった。一方、それ以外の分子種を発現させる酵母菌体では検出されなかった。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８（Waters社製）
キャリヤー：１０−７０％  アセトニトリル−dist. water 
（直線濃度勾配  ２０分）
温度：５０℃
検出：ＵＶ  ２３０ｎｍ
試料量：５０μｌ
【００４２】
試験例３  （形質転換酵母生菌体を用いるテストステロン水酸化反応および代謝産物の分析）
試験例１と同様に、(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体のおのおのの培養液にテストステロンを終濃度0.05ｍＭになるように添加し、３０℃で１５時間インキュベートした後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）し、上清を得た。これに２mlのジクロロメタンを加え、よく攪拌した後、再び遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。分離した層からジクロロメタン層を回収し、減圧下で溶媒を除去した。得られた残渣を１００μｌのアセトニトリルに溶解し、該溶液を下記の条件下でＨＰＬＣにより分析した。その結果、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  ２Ｃ８および  Ｐ４５０  ３Ａ４発現酵母菌体においてテストステロン水酸化物が検出された。各分子種における活性の程度は、Ｐ４５０  ３Ａ４では強いものであり、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  ２Ｃ８では弱いものであった。一方、それ以外の分子種を発現させる酵母菌体では検出されなかった。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８（Waters社製）
キャリヤー：２０−７０％  アセトニトリル−dist. water  （直線濃度勾配  ２５分）
温度：５０℃
検出：ＵＶ  ２５４ｎｍ
試料量：５０μｌ
【００４３】
試験例４  （形質転換酵母生菌体およびミクロソーム画分を用いるクロロゾキサゾン水酸化反応および代謝産物の分析）
形質転換酵母生菌体を用いる場合には、試験例１と同様に、(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体のおのおのの培養液にクロロゾキサゾンを終濃度0.５ｍＭになるように添加し、３０℃で１５時間インキュベートした後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）し、上清を得た。これに２mlのジクロロメタンを加え、よく攪拌した後、再び遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。分離した層からジクロロメタン層を回収し、減圧下で溶媒を除去した。得られた残渣を１００μｌのアセトニトリルに溶解し、該溶液を下記の条件下でＨＰＬＣにより分析した。
一方、ミクロソーム画分を用いる場合には、実施例１６によって得られた(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母ミクロソーム画分にＮＡＤＰＨとクロロゾキサゾンをそれぞれ終濃度0.５ｍＭ、２５０μＭになるように添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、トリクロロ酢酸を終濃度約１０％(v/v) になるように添加した。これに２mlのジクロロメタンを加え、よく攪拌した後、再び遠心分離（15000 ×ｇ、５分間）した。分離した層からジクロロメタン層を回収し、減圧下で溶媒を除去した。得られた残渣を１００μｌのアセトニトリルに溶解し、該溶液を下記の条件下でＨＰＬＣにより分析した。
その結果、１１種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる各種の酵母菌体すべてにおいてクロロゾキサゾン水酸化物が検出された。各分子種における活性の程度は、Ｐ４５０  ２Ｅ１では強いものであり、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｄ６では充分なものであった。またＰ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９、Ｐ４５０  ３Ａ４では弱いものであった。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８（Waters社製）
キャリヤー：２０−７０％  アセトニトリル−dist. water  （直線濃度勾配  ２５分）
温度：５０℃
検出：ＵＶ  ２５４ｎｍ
試料量：５０μｌ
【００４４】
試験例５  （酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分およびミクロソーム画分を用いる２−アミノアントラセン水酸化反応および代謝産物の分析：エイムズ試験）
エイムズ試験方法は、Mutat. Res.(1975) 31,347等に記載される通常の方法に従った。なお、検体である化合物としてアリ−ルアミン系化合物である２−アミノアントラセンを使用した。ただし、代謝活性化源として、(1) 各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０発現酵母菌体から得た酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分、(2) 該酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分から調製されたミクロソーム画分、あるいは(3) １サンプルあたり約1200pmolのヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を含むラットＳ−９  Ｍｉｘ〔比較例：肝臓をホモジナイズした後、遠心分離（9000×ｇ、１０分間）により得られた上清画分（キッコーマン製）〕をエイムズ試験に使用した。その結果、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６発現酵母菌体（サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２／ｐ２Ａ６Ｒ）、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８発現酵母菌体（サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２／ｐ２Ｃ８Ｒ）およびヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４発現酵母菌体（サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２／ｐ３Ａ４Ｒ）から得られた酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分および該酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分から調製されたミクロソーム画分を用いた場合には、復帰突然変異コロニーが検出されなかったが、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２発現酵母菌体（サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２／ｐ１Ａ２Ｒ）およびヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１発現酵母菌体（サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２／ｐ２Ｅ１Ｒ）から得られた酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分および該酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分から調製されたミクロソーム画分を用いた場合には、供試量１μｇ／プレート（直径９０mm）において１,000個以上の復帰突然変異コロニーが検出された。検出された復帰突然変異コロニー数から判断して、Ｐ４５０１Ａ２分子種は強い代謝活性を有していたが、Ｐ４５０  ２Ｅ１分子種は弱い代謝活性しか存在しなかった。
一方、ラットＳ−９  Ｍｉｘとの比較において、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２発現酵母菌体（サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２／ｐ１Ａ２Ｒ）から得られた酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分および該酵母Ｓ−９  Ｍｉｘ画分から調製されたミクロソーム画分を用いた場合には、ラットＳ−９  Ｍｉｘを用いた場合に比べて、供試したＰ４５０の量が少ない（1/500 および1/30以下）にもかかわらず、２倍以上の復帰突然変異コロニーが検出された。
【００４５】
試験例６  （形質転換酵母生菌体を用いるアセトアニリド水酸化反応および代謝産物の分析）
試験例１と同様に、(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体のおのおのの培養液にアセトアニリドを終濃度５ｍＭになるように添加し、３０℃で１５時間インキュベートした後、遠心分離(5000xg,１０分間）し、上清を得た。得られた上清画分を下記の条件下でＨＰＬＣにより分析した。その結果、１１種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる各種の酵母菌体すべてにおいてアセトアニリド水酸化物が検出された。各分子種における活性の程度は、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｄ６では強いものであり、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９、Ｐ４５０  ２Ｅ１では充分なものであった。またＰ４５０  ３Ａ４では弱いものであった。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８（Waters社製）
キャリヤー：メタノール：水：酢酸＝１５：８４：１
温度：３０℃
検出：ＵＶ  ２４５ｎｍ
試料量：５０μｌ
【００４６】
試験例７  （形質転換酵母生菌体を用いるクマリン７位水酸化反応および代謝産物の分析）
実施例１４によって作製された(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母菌体のおのおのの培養液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約2.０×１０7 菌体／ml）６mlにクマリンを終濃度0.５ｍＭになるように添加し、３０℃で２あるいは５時間インキュベートした後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）し上清を得た。これに62.5μｌの１５％  ＴＣＡ、２mlのクロロホルムを加え、よく攪拌した後、遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。分離した層からクロロホルム層を回収し、これに0.１Ｍ  ＮａＣｌを含む0.01Ｎ  ＮａＯＨ、を４ml添加し、よく攪拌した後、再び遠心分離（5000×ｇ、１０分間）した。上清を回収した後、該上清画分について蛍光（ｅｘ．３６６ｎｍ，ｅｍ．４５２ｎｍ）を測定し、生成した７−ヒドロキシクマリンを定量した。その結果、ヒトＰ４５０  ２Ａ６発現酵母菌体のみにおいて特異的に活性が検出され、それ以外のヒトＰ４５０発現酵母菌体では検出されなかった。
【００４７】
試験例８  （酵母ミクロソーム画分を用いるデブリキソン水酸化反応および代謝産物の分析）
実施例１６によって作製された(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母ミクロソーム画分にＮＡＤＰＨと1 4 Ｃで標識したデブリキソンをそれぞれ終濃度６ｍＭ、１００μＭになるように添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、過塩素酸を終濃度１０％(v/v) になるように添加し、よく攪拌した後、遠心分離（15000 ×ｇ、５分間）し上清を得た。得られた上清画分を下記の条件下でＨＰＬＣにより分析した。その結果、ヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａ１、Ｐ４５０  ２Ｄ６発現酵母ミクロソーム画分においてデブリキソン水酸化物が検出された。各分子種における活性の程度は、Ｐ４５０  ２Ｄ６では強いものであり、Ｐ４５０  １Ａ１では充分なものであった。一方、それ以外のヒト由来のチトクロムＰ４５０発現酵母菌体では検出されなかった。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８（ナカライテスク社製）
キャリアー：Ａ液：アセトニトリル、Ｂ液：20mM過塩素酸ナトリウム(pH2.5）
０〜１５分  Ａ／Ｂ＝９／９１
１５〜３０分  Ａ／Ｂ＝９／９１から２５／７５に直線勾配
３０〜３２分  Ａ＝１００％
３２〜４２分  Ａ／Ｂ＝９／９１
カラム温度：室温
検出器：ＲＩ（1 4 Ｃ）
試料量：１００μｌ
【００４８】
試験例９  （酵母ミクロソーム画分を用いるＳ−メフェイトニン水酸化反応および代謝産物の分析）
実施例１６によって作製された(i) ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種および酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素あるいは(ii)ヒト由来のチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素を発現させる各種の酵母ミクロソーム画分にＮＡＤＰＨと1 4 Ｃで標識したＳ−メフェイトニンをそれぞれ終濃度３ｍＭ、２５μＭになるように添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、該反応液と等量のメタノールを添加し、よく攪拌した後、遠心分離（15000 ×ｇ、５分間）し上清を得た。得られた上清画分を下記の条件下でＨＰＬＣにより分析した。その結果、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９発現酵母菌体のみにおいて特異的に活性が検出され、それ以外のヒト由来のチトクロムＰ４５０発現酵母菌体では検出されなかった。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８（ナカライテスク社製）
キャリアー：Ａ液：メタノール／10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0) ＝４０／６０混合液、Ｂ液：メタノール
０〜１８分  Ａ＝１００％
１８〜２０分  Ｂ＝１００％
２０〜３５分  Ａ＝１００％
カラム温度：室温
検出器：ＲＩ（1 4 Ｃ）
試料量：１００μｌ
【００４９】
上記の試験例１から試験例９の結果をまとめて下記の表に示した。
ヒト肝臓における代謝系をin vitroで再現するためには、できるだけ多くのチトクロムＰ４５０分子種を選択すればよいが、効率的に再現するには、ヒト肝臓における代謝系への各分子種の寄与度を判断すればよく、簡単には、代謝活性の高いものおよび／またはできるだけ多くの化合物を代謝するものを適切に選択すればよい。
そこで、まずトルブタミドに対して代謝活性の高いチトクロムＰ４５０分子種の選択を検討した。代謝活性を有するチトクロムＰ４５０分子種は、Ｐ４５０２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９であった。このうち、特に代謝活性の高いチトクロムＰ４５０分子種はＰ４５０  ２Ｃ９のみであったので、この分子種を選択した。つぎにテストステロンに対して代謝活性の高いチトクロムＰ４５０分子種の選択を検討した。代謝活性を有するチトクロムＰ４５０分子種は、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ３Ａ４、Ｐ４５０  １Ａ１であった。このうち、代謝活性の高いチトクロムＰ４５０分子種はＰ４５０  ３Ａ４のみであったので、この分子種を選択した。さらに２−アミノアントラセン、クロロゾキサゾンに対して代謝活性の高いチトクロムＰ４５０分子種の選択を検討した。２−アミノアントラセンに対して代謝活性を有するチトクロムＰ４５０分子種は、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｅ１であった。このうち、代謝活性の最も高いチトクロムＰ４５０分子種はＰ４５０  １Ａ２であったので、この分子種を選択した。クロロゾキサゾンに対しては全てのＰ４５０分子種で代謝活性を有した。このうち、代謝活性の最も高いチトクロムＰ４５０分子種はＰ４５０  ２Ｅ１であったので、この分子種を選択した。つぎにアセトアニリド、７−エトキシクマリンに対して代謝活性の高いチトクロムＰ４５０分子種の選択を検討した。その結果、上記で選択された４種類の分子種で対応できることが分かったので他の分子種の選択はしないことにした。このようにして選択された４種類の分子種で９種の供試化合物のうち、代表的な６種の供試化合物に対して代謝反応を可能とした。そこで、残りの３種の供試化合物（クマリン、デブリソキン、Ｓ−メフェイトニン）に対して代謝活性の高いチトクロムＰ４５０分子種の選択を検討した。いずれの供試化合物においても、代謝には特異的な分子種が関与しており、ヒト肝臓における代謝系をin vitroで効率的に再現するためには、必ずしも必須的なものではなく、上記の選択された４種類の分子種に補助的に組み合わせることによってヒト肝臓における代謝系をin vitroでより精度よく再現することができるものであることがわかった。以上より、本発明では、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種としてＰ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｅ１ならびにＰ４５０  ３Ａ４からなる分子種群に含まれる全ての分子種を組み合せて用いることが必須であることがわかる。
【００５０】
【表１】
2005095181.tif 000004
【００５１】
実施例１８  （混合ミクロソーム画分を用いたクロロゾキサゾンの代謝活性の測定）
実施例１６で作製された各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０発現酵母のミクロソーム画分を混合し、これを用いてクロロゾキサゾンの水酸化活性を測定した。各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の混合割合は、
(1) Ｐ４５０  ３Ａ４（３５％）、Ｐ４５０  ２Ｃ９（２５％）、Ｐ４５０  １Ａ２（２３％）、Ｐ４５０  ２Ｅ１（１７％）（以下、混合系Ａと記す。）
(2) Ｐ４５０  ３Ａ４（３３％）、Ｐ４５０  ２Ｃ９（５.８％）、Ｐ４５０  ２Ｃ８（５.８％）、Ｐ４５０  ２Ｃ18（５.８％）、Ｐ４５０  ２Ｃ19（５.８％）、Ｐ４５０  １Ａ２（１９％）、Ｐ４５０  ２Ｅ１（１５％）、Ｐ４５０  １Ａ１（２.４％）、Ｐ４５０  ２Ａ６（３.０％）、Ｐ４５０  ２Ｂ６（２.４％）、Ｐ４５０  ２Ｄ６（２.４％）（以下、混合系Ｂと記す。）
を用いた。各混合系で混合された酵母ミクロソーム画分に、基質として1 4 Ｃで標識したクロロゾキサゾンと補酵素ＮＡＤＰＨをそれぞれ３８２μＭ、３ｍＭとなるように添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、ジクロロメタンを１ｍＬを添加し、反応を停止した。攪拌後、遠心分離（１０，０００ｘｇ、５分間）によりジクロロメタン層を回収し、窒素気流で溶媒を除去した。得られた残渣にアセトニトリル５４μＬ、水１４６μＬを加えて溶解し、得られた溶液を下記の条件下でＨＰＬＣで分析した。その結果、混合系Ａ，ＢともPeter らがヒト肝ミクロソーム画分を用いたクロロゾキサゾンの代謝で報告している（Chem.Res.Toxicol.Vol.3,p566-573,1990) のと類似したクロロゾキサゾン代謝物のパターンが得られた。
＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８（ナカライテスク社製）
キャリアー：Ａ液：アセトニトリル／水＝２７／７３混合液、Ｂ液：アセトニトリル
０〜１５分  Ａ＝１００％
１５〜１７分    Ｂ＝１００％
１７〜２５分    Ａ＝１００％
カラム温度：室温
検出器：ＲＩ（1 4 Ｃ）
試料量：１００μｌ
さらに、各混合系で混合された酵母ミクロソーム画分およびヒト肝ミクロソーム画分（Peter らの報告）でのヒト由来のチトクロムＰ４５０の代謝回転速度を算出した。混合系Ａの場合、１．８〔product nmol/nmol P450/min〕で、混合系Ｂの場合、１．６〔product nmol/nmol P450/min〕であった。一方、ヒト肝ミクロソーム画分の場合、文献記載のＶmax とＫm ならびに基質濃度〔Ｓ〕を用いて下記に示す方法により代謝回転速度Ｖを算出した結果（表２に示す）、個体差による変動幅は存在しているものの、下限が１．０〔product nmol/nmol P450/min〕で、上限が５．９〔product nmol/nmol P450/min〕であった。この範囲内に混合系Ｂでの代謝回転速度Ｖはもちろん、本発明である混合系Ａでの代謝回転速度Ｖも充分に含まれるものであった（オーダー的には全く一致しているものであった。）
したがって、選択された４種類の分子種のみでも充分にヒト肝臓における代謝系をin vitroでよく再現することができるものであることがわかった。
＜算出方法＞
Peter らの文献記載のＶmax とＫm ならびに本実施例で用いられた基質濃度〔Ｓ〕を、ミカエリス−メンテン式
（数１）
Ｖ＝（Ｖmax ＊〔Ｓ〕）／（Ｋm ＋〔Ｓ〕）
に代入することによって、任意の基質濃度〔Ｓ〕におけるヒト由来のチトクロム
Ｐ４５０の代謝回転速度Ｖを算出する。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
実施例１９  （混合ミクロソーム画分を用いたデブリソキンの代謝活性の測定）
実施例１６で作製された各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０発現酵母のミクロソーム画分を混合し、これを用いてデブリソキンの水酸化活性を測定した。各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の混合割合は、Ｐ４５０  ３Ａ４（３３％）、Ｐ４５０  ２Ｃ９（５.8％）、Ｐ４５０  ２Ｃ８（５.8％）、Ｐ４５０  ２Ｃ１８（５.8％）、Ｐ４５０  ２Ｃ１９（５.8％）、Ｐ４５０  １Ａ２（１９％）、Ｐ４５０  ２Ｅ１（１５％）、Ｐ４５０  ２Ｂ６（２.4％）、Ｐ４５０  ２Ｄ６（２.4％）を用いた。混合された酵母ミクロソーム画分に、基質として1 4 Ｃで標識したデブリソキンと補酵素ＮＡＤＰＨをそれぞれ１００μＭ、６ｍＭとなるように添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、６０％過塩素酸５０μＬ（終濃度として１２．５％(v/v) ）を添加し、反応を停止した。攪拌後、遠心分離（１５，０００ｘｇ、５分間）により上清を回収し、反応生成物をＨＰＬＣで分析した（分析条件は試験例８に記載のものと同様）。その結果、Kronbachらがヒト肝ミクロソームを用いたデブリソキンの代謝で報告している（Methods in Enzymology,Vol.206,p509-517(1991)） のと類似したデブリソキン代謝物のパターンが得られた。
【００５４】
実施例２０  （混合ミクロソーム画分を用いたＳ−メフェイトニンの代謝活性の測定）
実施例１６で作製された各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０発現酵母のミクロソーム画分を混合し、これを用いてＳ−メフェイトニンの水酸化活性を測定した。各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の混合割合は、実施例１８に記載された混合系Ｂで示されるものを用いた。混合された酵母ミクロソーム画分に、基質として1 4 Ｃで標識したＳ−メフェイトニンと補酵素ＮＡＤＰＨをそれぞれ２８μＭ、６ｍＭとなるように添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、メタノールを２５０μＬを添加し、反応を停止した。攪拌後、遠心分離（１５，０００ｘｇ、５分間）により上清を回収し、反応生成物をＨＰＬＣで分析した（分析条件は試験例９に記載のものと同様）。その結果、Goldstein らがヒト肝ミクロソームを用いたＳ−メフェイトニンの代謝で報告している（Biochemistry Vol.33,p1743-1752,(1994))  のと類似したＳ−メフェイトニン代謝物のパターンが得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、よりすぐれたヒトにおける代謝系をin vitro系において再現する安全性評価方法であり、高精度で代謝・薬効・毒性を早期に予測・評価することを可能にした。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号２０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.1）
配列番号２１
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.2）
配列番号２２
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.3）
配列番号２３
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.4）
配列番号２４
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.5）
配列番号２５
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.6）
配列番号２６
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.7）
配列番号２７
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.8）
配列番号２８
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.9）
配列番号２９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.10）
配列番号３０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.11）
配列番号３１
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.12）
配列番号３２
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.13）
配列番号３３
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.14）
配列番号３４
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.15）
配列番号３５
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.16）
配列番号３６
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.17）
配列番号３７
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.18）
配列番号３８
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.19）
配列番号３９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.20）
配列番号４０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーNo.21）
配列番号４１
リンカーのために設計されたオリゴヌクレオチド（リンカーNo.1）
配列番号４２
リンカーのために設計されたオリゴヌクレオチド（リンカーNo.2）
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｃ９およびＰ４５０２Ｅ１遺伝子クローニング用プライマーを示す図である。
【図２】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４、Ｐ４５０  １Ａ１およびＰ４５０２Ａ６遺伝子クローニング用プライマーを示す図である。
【図３】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８およびＰ４５０２Ｃ１８遺伝子クローニング用プライマーを示す図である。
【図４】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９、Ｐ４５０  ２Ｄ６およびＰ４５０  ３Ａ４(XbaI-XhoI断片）遺伝子クローニング用プライマーを示す図である。
【図５】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２およびＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子クローニングに用いた合成リンカーを示す図である。
【図６】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ１Ａ２，ｐ１Ａ２Ｒ）の構築法を示す図である。
【図７】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ２Ｃ９，ｐ２Ｃ９Ｒ）の構築法を示す図である。
【図８】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ２Ｅ１，ｐ２Ｅ１Ｒ）の構築法を示す図である。
【図９】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ３Ａ４，ｐ３Ａ４Ｒ）の構築法を示す図である。
【図１０】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ１Ａ１，ｐ１Ａ１Ｒ）の構築法を示す図である。
【図１１】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ２Ａ６，ｐ２Ａ６Ｒ）の構築法を示す図である。
【図１２】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ２Ｂ６，ｐ２Ｂ６Ｒ）の構築法を示す図である。
【図１３】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ２Ｃ８，ｐ２Ｃ８Ｒ）の構築法を示す図である。
【図１４】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ２Ｃ１８，ｐ２Ｃ１８Ｒ）の構築法を示す図である。
【図１５】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ２Ｃ１９，ｐ２Ｃ１９Ｒ）の構築法を示す図である。
【図１６】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐ２Ｄ６，ｐ２Ｄ６Ｒ）の構築法を示す図である。
【図１７】ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミド（ｐＦ３Ａ４）の構築法を示す図である。
【図１８】ＧＡＰＤＨプロモーターを用いた酵母内発現プラスミドの構築法を示す図である。
【図１】
2005095181.tif 000006
【図２】
2005095181.tif 000007
【図３】
2005095181.tif 000008
【図４】
2005095181.tif 000009
【図５】
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【図６】
2005095181.tif 000011
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2005095181.tif 000017
【図１３】
2005095181.tif 000018
【図１４】
2005095181.tif 000019
【図１５】
2005095181.tif 000020
【図１６】
2005095181.tif 000021
【図１７】
2005095181.tif 000022
【図１８】
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【配列表】
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