(57)【要約】【課題】本発明は、アルカロイドの工業的な製造のために必須のアルカロイド合成酵素の遺伝子を提供することを目的としている。【解決手段】本発明は、マメ科ルピナス属植物のエステル型アルカロイドの生合成に関わる１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるベクター、当該遺伝子で形質転換してなる形質転換細胞、及び当該形質転換細胞を培養して、１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）を製造する方法に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マメ科ルピナス属植物のエステル型アルカロイドの生合成に関わる１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（以下、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示される塩基配列、又はこの相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものである請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含有してなるベクター。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の遺伝子が、翻訳領域からなるものである請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
宿主細胞を、請求項１又は２に記載の遺伝子で形質転換してなる形質転換細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の遺伝子が、翻訳領域からなるものである請求項５に記載の形質転換細胞。
【請求項７】
細胞が、植物細胞である請求項５又は６に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の形質転換細胞を培養して、１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルカロイドの生合成酵素をコードする遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、マメ科ルピナス属植物のエステル型アルカロイドの生合成に関わる１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（以下、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅという。）をコードする遺伝子に関する。また、本発明は、当該遺伝子を含有してなるベクター、それを用いて形質転換された形質転換細胞、それを用いてＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルカロイドは、天然に存在する含窒素二次代謝物の総称で、もともとは「アルカリ様物質」の意味として使用されていたものである。現在までに知られているアルカロイドは、約１万種類にものぼり、その大部分は高等植物が産生するものであるが、麦角菌が産生する麦角アルカロイド、動物の両生類の一部が産生するサンショウウオアルカロイドなどがある。自然界におけるアルカロイドの役割としては、一部については個体を防衛するための自己防御機構に作用するとされているが、多くの植物についてはアルカロイドの役割は不明のものが多い。多くの植物では、アルカロイドは根、皮、種子などに局在化しており、死細胞よりも生きた細胞の方が多量に含有している。また、その含有量は一般に時間と共に激しく変化し、合成の場と蓄積の場が必ずしも一致していない。
アルカロイドは、抽出母体となる植物の系統に基づいて、アヘンアルカロイド、トコンアルカロイドなどのように呼ばれることも多いが、化学構造に基づいてピリジン系アルカロイド、キノリン系アルカロイドなどのように呼ばれる。
このようなアルカロイドは、ヒトや動物に対して顕著な生理活性を示すものが多く、医薬品の有効成分として今日でも多数のものが使用されている。
【０００３】
一般のアルカロイドは極めて特異的な化学構造を有するものが多く、また構造中に多数の光学活性炭素原子を有することから、工業的にこれを合成することは困難な場合が多く、現在でもその多くは植物から抽出して製造されている。植物体の中では、これらのアルカロイドは多数の酵素の反応により生合成されているが、現在においてもこれらの酵素の多くは未解明である。これらの酵素群の解明ができれば、アンモニアや、オルニチン、トリプトファン、アントラニル酸などのアミノ酸を原料として各種のアルカロイドを工業的な規模で製造することが可能となる。しかし、これらの酵素は植物の特定の時期に、特定の器官に極微量しか存在しておらず、これを単離し同定することは極めて困難なことである。そして、当該酵素をコードする遺伝子を見出すことも、通常のクローニングには無い多くの困難性を伴い、今日に至ってもこれらの酵素の単離・同定のみならず、遺伝子のクローニングもほとんどなされていないのが現状である。
【０００４】
本発明は、このようなアルカロイドの生合成酵素の１種に関するものである。
ルピン系アルカロイド（キノリチジンアルカロイド）は分子内にキノリチジン環を有する一群の植物アルカロイドであり、マメ科植物に豊富に存在する。一般に、この群のアルカロイドは鎮痛作用や血糖降下作用を始めとする動物に対する多様な薬理作用のほか、昆虫や線虫に対する忌避作用や他の植物の発芽を抑制するアレロパシー作用を有することも知られている。
ルピン系アルカロイドに関する研究は、１８９０年代の長井長義らによるマトリンの単離に端を発する。これらアルカロイドについてその単離や構造解析・合成、そして、トレーサーを使った生合成研究が古くから行われてきた。一方で、詳細な生合成反応のメカニズムや制御に関する生化学的・分子生物学的研究は少ない。特に、その生合成の各段階を触媒する酵素をコードする遺伝子はこれまで単離されていなかった。
【０００５】
本発明者らは、ルピン系アルカロイド生合成に関わる遺伝子を単離することを目的とした研究を行い、マメ科ルピナス属植物よりエステル型アルカロイドの生合成に関わる１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニンＯ−チグロイル転移酵素（以下、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅという。）を単離してきた（非特許文献１参照）。ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅは次式、
【０００６】
【化１】
2005046022.tif 000002
【０００７】
で表される反応における酵素である。（−）−１３α−ヒドロキシマルチフロリンの１３位の水酸基をチグロイル基でエステル化し、また同様に（＋）−１３α−ヒドロキシルパニンの１３位の水酸基をチグロイル基でエステル化する酵素である。この酵素の基質となる（−）−１３α−ヒドロキシマルチフロリン及び（＋）−１３α−ヒドロキシルパニンは、いずれも四環性のキノリジジン環の７位及び９位の炭素原子の立体配置が（７Ｓ，９Ｓ）のものである。その対掌体である（７Ｒ，９Ｒ）体に対してはこの酵素は活性を持っていない。
【０００８】
本発明者らは、１９９４年にこの酵素を単離した。得られた酵素は、分子量が約５０ｋＤａで、等電点が７．８と７．６の２種の異性体から成っていた（非特許文献１参照）。得られた酵素についてＮ末端のアミノ酸配列を知るためにエドマン分解を試みたが、この酵素は通常のエドマン分解をすることができなかった。また、他の方法でアミノ酸配列の一部を知ろうと努力したが、得られた酵素の量も極微量であり、アミノ酸配列の一部も知ることができなかった。そこで本発明者らは、マメ科植物のＬｕｐｉｎｕｓ  ｔｅｒｍｉｓ（以下、Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓともいう。）よりＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの精製を改めて行った。非特許文献１に記載の方法では極微量のＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅしか得ることができないので、新たな精製方法を開発してきたが、この方法では、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ活性のある画分には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により３０ｋＤａと２５ｋＤａのバンドが検出され、約５０ｋＤａのシングルバンドのものを得ることが困難であった。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｈ．，  Ｍｕｒａｋｏｓｈｉ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，  Ｋ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９，  １５８５３−１５８６０
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
アルカロイドを立体選択的に工業的に生産するには、酵素反応を利用しなければならないが、天然物から得られる酵素の量は極微量に過ぎず、かつその精製方法が技術的にも困難なものが多く、コスト的にも工業的な製造は不可能なのが現実であり、天然物からの抽出に限定されているのが現状である。しかし、生理活性を有する有効な成分を安価に供給することができれば、より多くの人が安価に健康を維持することが可能となり、またアルカロイドの生理学的な研究のためにも大量の安価なアルカロイドの供給が望まれている。
アルカロイドを工業的に製造するには、酵素が必要であり、これを工業的な規模で供給するには遺伝子工学的な手法による酵素の生産が必要であり、当該酵素をコードする遺伝子を提供することが必要である。
本発明者らは、アルカロイドの生合成酵素のひとつであるＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅを精製・単離してきたが、この酵素は精製が難しく、精製された酵素は極微量しか得ることができず、エドマン分解することができず、また経時安定性が悪く長期間に亘って保存することができず、比較的短時間で２５ｋＤａと３０ｋＤａに分解するなど、その一部のアミノ酸配列を決定することも困難なものであった。  本発明は、アルカロイドの工業的な製造のために必須のアルカロイド合成酵素の遺伝子を提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、単離精製してきたＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅのＮ末端のアミノ酸配列を解明するために、最初このＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅをエドマン分解法によりＮ末端のアミノ酸を解明しようとした。しかし、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅはエドマン分解することができなかった。この原因について長年に亘って検討して来た結果、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅのＮ末端のアミノ基は遊離の形ではなく、Ｎ末端のアミノ基が何らかの原因によりブロックされているために分解できないことがわかった。
また、その当時の精製技術のレベルでは、３キログラムの植物体（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ｔｅｒｍｉｓ）より９段階の精製手順を経て、３０マイクログラム（１０８分の１）の収量を得ることが限界であり、最終的な収量を得ることや、精製タンパク質の解析などの一連の実験を行うために４年以上の期間を要した。そして、このような一連の実験を進めてきたにもかかわらず、精製タンパク質のＮ末端側のブロッキングにより、当時のアミノ酸配列解析技術ではＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅタンパク質の内部アミノ酸配列の決定に至らなかった。
そのため、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅタンパク質の精製、および、アミノ酸配列解析を完遂するためには、これらの手法の技術的な進歩を必要とした。その後、そういった条件がほぼ満たされたと考えた本発明者らは、１９９４年の精製方法とは別の異なった技術・手法を用いて、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅを多量に得るための新たな精製方法を開発してきた。この新たな手法の概要とその結果を次の表１に示す。
【００１２】
【表１】
2005046022.tif 000003
【００１３】
この手法の開発により比較的多量のＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅタンパク質を精製することが可能となった。ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅは、５０ｋＤａの単量体であることがすでに示されているが、この方法で精製されたＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ活性のある画分には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により３０ｋＤａと２５ｋＤａのバンドが検出され、さらに約６０ｋＤａのバンドも検出された。得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図１に図面に代わる写真で示す。図１の左側のレーンは分子量マーカーであり、右側のレーンが精製されたＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅのものである。
３０ｋＤａと２５ｋＤａのバンドで示されるものは、単独ではＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの活性を示さないが、両者を共存させるとＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅを示した。
また、約６０ｋＤａのバンドのものも弱いながらもＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ活性があると思われる挙動パターンを示した。
本発明者らは、これらの内部アミノ酸配列を決定した。その結果、２５ｋＤａのバンドより決定したアミノ酸配列中に、ある種の植物由来アシル基転移酵素間に保存されているアミノ酸配列のモチーフが存在した（２００２年３月、日本薬学会、第１２２年会、２６［Ｐ］Ｉ−１７１）。
【００１４】
得られた３箇所のバンドから、次の内部アミノ酸配列が決定された。決定されたアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で次に示す。
2005046022.tif 000004
２５ｋＤａのバンドのＤＶＤＦＧＷＧＫ、特にＤＦＧＷＧＫのアミノ酸配列が、ある種の植物由来アシル基転移酵素間に保存されているアミノ酸配列のモチーフであると推察された部分である。
【００１５】
得られたアミノ酸配列の部分を用いて、常法にしたがってオリゴヌクレオチドプローブを調製し、Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたが、目的の遺伝子を得ることはできなかった。また、同様に、オリゴヌクレオチドプライマーを調製し、Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを試みたが、この方法によっても目的の遺伝子を得ることはできなかった。さらに、あらゆる種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓ  のｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲを試みたが、やはり目的の遺伝子を得ることはできなかった。
この原因については様々なことが考えられるが、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ遺伝子のｍＲＮＡへの発現量が低いことがタンパク精製などから推測されるため、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングやｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲでは、特異的にＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの単離を行うことが困難であることが最も大きな理由であろうと思われる。また、ゲノムＰＣＲについては、何度も試みたが、プライマーのアニーリング位置がイントロンの重複により阻害されている可能性、および、ＰＣＲ増幅部位に配置されているイントロンの長さによる反応阻害などとの関連が示唆される。
このように、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ遺伝子の単離は困難を極めたのであるが、酵素の単離精製から約９年を経て、遂に本発明者らにより、この遺伝子の単離・同定に成功し、この酵素を遺伝子工学的方法により大量に製造できる手法を確立することが初めて可能となった。
【００１６】
即ち、本発明は、マメ科ルピナス属植物のエステル型アルカロイドの生合成に関わる１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるベクター、当該遺伝子で形質転換してなる形質転換細胞、及び当該形質転換細胞を培養して、１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）を製造する方法に関する。
本発明のマメ科ルピナス属植物のエステル型アルカロイドの生合成に関わる１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）をコードする遺伝子としては、当該酵素活性を有するものであって、配列表の配列番号１に示される塩基配列、又はこの相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものなどが挙げられる。
【００１７】
本発明者らは、当初、３０ｋＤａと２５ｋＤａのバンドのアミノ酸配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、考えられる全ての組み合わせによりＲＴ−ＰＣＲを行った。しかしながら、上述の通りｍＲＮＡの発現量が低いこと、また、プライマーの縮重度のため、遺伝子の単離には至らなかった。
しかしながら、得られた酵素の量には限りがあり、さらなる別のアミノ酸配列を決定するだけの酵素の量も無かった。そこで、本発明者らは、得られたアミノ酸配列をさらに詳細に検討した結果、２５ｋＤａのバンドより決定したアミノ酸配列中に、植物由来のアシル基転移酵素間に保存されているアミノ酸配列のモチーフが存在することに着目した。本発明者らは、この２５ｋＤａのバンドから得られたアミノ酸配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーに絞ってさらに精密なＲＴ−ＰＣＲを行うことにした。その方法を以下に示す。
まず、逆転写に関して、ｍＲＮＡの３’側のポリＡテイルに特異的にアニーリングする、ポリＴ−アダプタープライマーを用いた逆転写反応を行った。次いで、得られた逆転写産物を鋳型とした、２５ｋＤａのバンドのアミノ酸配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーのフォワード側プライマーと、ポリＴの後のアダプター領域にアニーリングするアダプタープライマーとのＰＣＲを行った。そして、そのＰＣＲ産物を鋳型として、２５ｋＤａのバンドのアミノ酸配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーのフォワード側プライマーと、リバース側プライマーによるネストＰＣＲを行った。
このときに使用した２５ｋＤａのバンドのアミノ酸配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーを次の表２に示す。
【００１８】
2005046022.tif 000005
【００１９】
表２中におけるアミノ酸配列はアミノ酸の１文字表記で示す。また、塩基配列における、ＮはＧ、Ｔ、Ｃ、又はＡを示し、ＷはＡ又はＴを示し、ＳはＣ又はＧを示し、ＹはＣ又はＴを示し、ＲはＡ又はＧをそれぞれ示す。
これらの縮重度を組み合わせて、ほとんど天文学的数の組み合わせについて、ネストＰＣＲを行った結果、Ｐ２５Ｋ３−２−Ｆのフォワード側プライマーに対して、Ｐ２５Ｋ１−Ｒ、および、Ｐ２５Ｋ２−Ｒの２種類のリバース側プライマーを用いた組み合わせでのＰＣＲ産物として図２に示すそれぞれ２４２ｂｐおよび８９ｂｐのフラグメントを得た。図２の右向きの太い矢印はＰ２５Ｋ３−２−Ｆのフォワード側プライマーを示す。そのあとの点線で示した部位は、内部アミノ酸配列解析により同定したアミノ酸配列との一致を示している。このとき用いたプライマーは縮重型であり、プライマーのアニーリング部位は塩基置換が起こる可能性があり、Ｐ２５Ｋ３−２−Ｆのアミノ酸コードのＮ末端から２番目の「Ｓ」が「Ｒ」に変化したものが得られた。しかし、幸運にも結果的にはその後の実験に影響を与えなかった。
図２の８９番目からの左側向きの矢印はＰ２５Ｋ２−Ｒのリバース側プライマーを示し、末端側の左側向きの矢印はＰ２５Ｋ１−Ｒのリバース側プライマーを示す。そして、このうちの塩基配列の長いＰＣＲ産物、つまり２４２ｂｐのフラグメントを用いて、これをプローブとしたＬ．ｔｅｒｍｉｓのｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングを行い、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ遺伝子を単離することに成功した。
【００２０】
即ち、２４２ｂｐのＰＣＲ産物をプローブとして、Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、陽性クローンを単離した。このクローンの完全長ｃＤＮＡを得るために５’ＲＡＣＥを行い、１３６２ｂｐのＯＲＦを得た。さらに、２５ｋＤａと３０ｋＤａの両ペプチドについてＮ末端アミノ酸配列解析を行い、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの分解位置を同定した。
また、このＯＲＦ内には、２５ｋＤａのバンドをコードする領域のさらに上流側に３０ｋＤａのバンドより得られた内部アミノ酸配列をコードする領域が存在した。つまり、２５ｋＤａと３０ｋＤａの両ペプチドは、同一の遺伝子によりコードされていることが明らかとなった。
得られたＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示し、そのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
そして、図３にその塩基配列とアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記によるカラー表示で示す。図３における６９６番目の塩基と６９７番目の塩基の間の上下の赤い矢印は、Ｎ末端アミノ酸配列解析より明らかとなったＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの分解される位置を示し、その前半部分が３０ｋＤａの部分を示し、図３ではオレンジ色でアミノ酸を表示している。その後半部分は２５ｋＤａの部分を示し、図３では青色でアミノ酸を表示している。オレンジ色（２カ所）と青色（３カ所）の点線で囲まれたボックス部分は、それぞれ３０ｋＤａのバンドと２５ｋＤａのバンドの内部アミノ酸配列を示す。１１６５から１１８２番までの下線部分は、ある種の植物に共通しているアシルトランスフェラーゼの保存領域を示す。１０９３から１３３４番までの下線部分は、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いたプローブとのハイブリダイゼーション部位を示す。
プローブに用いた２４２ｂｐの配列は、１０９３から１３３４番の配列が該当している。図２に示す２４２ｂｐのプローブでは、１〜１０番目がＣＣＣＡＧＧＴＡＴＴ（アミノ酸配列ではＰＲＹ・・）となっていたが、図３に示す遺伝子ではＣＣＣＴＣＡＴＡＣＴ（アミノ酸配列ではＰＳＹ・・）となっており、最初に決定されたアミノ酸配列のほうが結果的に正しいこともわかったが、２４２ｂｐのプローブが機能したことは幸運であった。
【００２１】
このようにして得られた遺伝子のＯＲＦ領域をｐＧＥＸベクターに組み込み、これを用いて大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。比較対照として外来遺伝子を導入していないｐＧＥＸベクターで形質転換した大腸菌株を用いてＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ遺伝子の発現を確認するために、形質転換された大腸菌の培養物からの粗抽出物の酵素活性を測定した。（−）−１３α−ヒドロキシマルチフロリンの１３位の水酸基をチグロイル基でエステル化する酵素反応におけるエステル化生成物、即ち、（−）−１３α−チグロイルオキシマルチフロリンに特異的なピークをＨＰＬＣにより測定した。結果を図４に示す。図４の左側の（ａ）は外来遺伝子を導入していないｐＧＥＸベクターで形質転換した大腸菌株からの抽出物を使用した場合であり、図４の右側の（ｂ）はｐＧＥＸ−ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅベクターを用いて形質転換した大腸菌株からの抽出物を使用した場合を示す。検出は３２７ｎｍのＵＶで行った。図４の縦軸は吸収強度を示し、横軸はリテンションタイム（分）を示す。この結果、外来遺伝子を導入していないベクターからの抽出物では反応生成物のピークは見られなかったが、ｐＧＥＸ−ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅベクターを用いて形質転換した大腸菌株からの抽出物の場合には、リテンションタイムが１３．１８のところに生成物の大きなピークを確認することができた。即ち、ｐＧＥＸ−ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅベクターを用いて形質転換した大腸菌株からの抽出物の場合には酵素活性を確認することができ、酵素の発現が確認された。
ＨＰＬＣのピークをなしている生成物を更に、確認するために、ピークの分取質量分析を行った。結果を図５に示す。図５の上段は分取用に行ったＨＰＬＣの結果を示し、中段はＥＳＩ−ＭＳの結果を示し、下段はＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの結果を示す。得られたエステル体のスペクトルを［Ｍ＋Ｈ］＋＝  ３４５．２３（計算値：３４５．２１７８）に確認できた。また、そのフラグメンテーションにより生成するエステル部分がキノリチジン環より解裂した分子のスペクトルを［Ｍ−Ｃ５Ｈ７Ｏ２］＋＝  ２４５．１５（計算値：２４５．１６５４）に確認することができた。
【００２２】
本発明者らは、さらに、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ組換えタンパク質を用いて基質特異性の検討を行うと同時に、サザン解析、ノーザン解析などを行っている。また、このアミノ酸配列のＮ末端には、細胞内タンパク質のミトコンドリアへの輸送に関わるシグナルペプチド領域が存在した。このことは、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの細胞内におけるミトコンドリア局在性を示唆しており、生化学的実験により示唆されていた結果と一致する。これらの結果をもとに、分子レベルでのＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの細胞内局在性についての検討も行っている。
また、精製の過程における約６０ｋＤａのバンド（図１参照）には弱いながらもＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの活性があると思われる挙動パターンを示したが、このバンドが何であるかということは現段階では解明されていない。しかしながら、約３０ｋＤａ、及び約２５ｋＤａのバンドは、全長の４５３個のアミノ酸のうち第一番目のメチオニンの解裂を考慮して考えると、それぞれ２２７個のアミノ酸からなるペプチドと、２２５個のアミノ酸からなるペプチドに分解した結果であることが判明した。このことより、本来５０ｋＤａの単量体であるＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅが、今回の精製過程において何らかの分解を受けた結果、２５ｋＤａと３０ｋＤａのヘテロ二量体として観察されたことが示される。そして、この酵素は、全長のアミノ酸配列を維持しなくても、約３０ｋＤａと約２５ｋＤａの部分に分解していても両者が共存している限り活性を示すものであることも判明した。
したがって、本発明のＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ遺伝子は、配列表の配列番号１に示される全長を一度に発現させる方法の他、２２７個のアミノ酸からなるペプチドと、２２５個のアミノ酸からなるペプチドをそれぞれコードする遺伝子としてこれらを共発現させたときにも、同様に活性を保持していることが考えられる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以上のように、本発明者らは、ルピン系アルカロイド生合成に関わる遺伝子を単離することを目的とした研究を行い、マメ科ルピナス属植物よりエステル型アルカロイドの生合成に関わる１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）遺伝子を世界で初めて単離し、その機能解析を行った。
このことはアルカロイドの工業的な製造を可能とすることを示しており、アルカロイドの生合成に関与する一連の酵素類の遺伝子の単離の可能性を本発明は提供するものである。
【００２４】
本発明の１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）をコードする遺伝子としては、具体的には配列表の配列番号１に示される塩基配列が挙げられるが、この配列に限定されるものではなく、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの活性を有する酵素を発現することができ、配列表の配列番号１に示される塩基配列と相同性を有するものであれば、本発明のＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅをコードする遺伝子に包含されるものである。また、配列表の配列番号１に示される塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの活性を有する酵素を発現することができるものであれば、当然に本発明の遺伝子に包含されるものである。
これらの遺伝子は必要に応じてプロモーター部分が接続されていてもよく、プロモーターとしては発現可能なものであれば特に制限はない。
【００２５】
また、本発明は、前記してきた本発明のＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅをコードする遺伝子を含有してなるベクターを提供するものである。本発明のベクターとしては、プラスミド以外にも通常のベクターを使用することができる。これらのベクターは宿主細胞において発現可能なプロモーターを有するものであってもよい。このような場合には、本発明のＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅをコードする遺伝子としては翻訳領域（ＯＲＦ）のみからなるものであってもよい。
本発明の遺伝子をベクターに挿入する方法としては、通常の制限酵素を用いた手法により行うことができる。
【００２６】
また本発明は、前記してきた本発明の遺伝子を含有するベクターを用いて宿主細胞を形質転換してなる形質転換細胞を提供する。本発明の宿主細胞としては、動物細胞や植物細胞や微生物の細胞などを使用することができるが、発現の容易さや、抽出の容易さなどを考慮すれば植物細胞や大腸菌などの微生物の細胞が好ましい。植物細胞としては、各種の高等植物の細胞や下等植物の細胞を使用することができる。
さらに、本発明は、前記してきた本発明の形質転換細胞を培養して、１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）を製造する方法を提供するものである。本発明の製造方法は、通常の遺伝子工学的手法による方法を適用することができ、本発明のＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅをコードする遺伝子を発現ベクターなどに組み込み、これを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養又は育成等して、発現するＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅを精製・分離することを包含するものである。本発明のこの方法によって製造された酵素は、必ずしも十分に精製されたものでなくともよく、当該酵素反応に悪影響を与えないのであれば粗抽出物をそのまま本発明の酵素として使用することもできる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  （ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅの精製・分離）
１３日齢の実生Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓの根及び胚軸を、緩衝液Ａ（２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液［ｐＨ  ８．０］、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭＥＤＴＡ［ｐＨ  ８．０］、２５０ｍＭ  シュークロース）中、ポリビニルポリピロリドンの存在下ホモジナイズし、濾過する。この濾液に最終濃度３０％になるよう硫酸アンモニウムを加え生成した沈殿を除去した後、分取した上清に最終濃度８０％になるよう硫酸アンモニウムを加えて生成する沈殿を分取する。
これを緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液［ｐＨ  ６．３］、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に溶解する。セファデックス  Ｇ−２５で脱塩した後、前記表１に記載されているように、ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０  ブチルで精製し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／２０  スーパーデックス２００ｐｇで精製し、ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０  ＳＰ  ＸＬで精製し、スーパーデックス２００ＨＲ  １０／３０で精製し、さらにリソースＳで精製した。
精製の結果を表１に示す。
また、得られた精製ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を図１に示す。
【００２９】
実施例２  （各バンドのアミノ酸配列の決定）
図１に示される約６０ｋＤａのバンド、３０ｋＤａと２５ｋＤａのバンドの各々について、これらの内部アミノ酸配列を決定した。
得られた３箇所のバンドから、次の内部アミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で次に示す。
2005046022.tif 000006
であった。
【００３０】
実施例３（オリゴヌクレオチドプライマーを用いた、１０日齢のＬ．  ｔｅｒｍｉｓの根由来ｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ）
（１）ｍＲＮＡの３’側のポリＡ末端領域に特異的にアニーリングする、次に示すポリＴ−アダプタープライマーを用いて、ＡＭＶ逆転写酵素ＸＬ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ（ＴａＫａＲａ社））の逆転写酵素により逆転写反応を行った。
アダプターの塩基配列      ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ・・・
（式中、・・・はｐｏｌｙＴを示す。）
（２）前記（１）の逆転写産物を鋳型とした、２５ｋＤａのバンドのアミノ酸配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーのフォワード側プライマーと、ポリＴの後のアダプター領域にアニーリングするアダプタープライマーとを用いて次に示す条件でＰＣＲを行った。
2005046022.tif 000007
（３）前記（２）のＰＣＲ産物を鋳型とした、２５ｋＤａのバンドのアミノ酸配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーのフォワード側プライマーと、リバース側プライマー、各４種類間について、理論的に考え得る全ての組み合わせにより、次の条件でＰＣＲを行った。但し、Ｐ２５Ｋ３−１−Ｆ及びＲ、並びにＰ２５Ｋ３−２−Ｆ及びＲは共に同アミノ酸配列由来であるため、これらのプライマー間についてはＰＣＲを行わなかった。
2005046022.tif 000008
【００３１】
実施例４  （Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓのｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング）
実施例３で得られた２４２ｂｐのフラグメントを用いて、これをプローブとしたＬ．  ｔｅｒｍｉｓ  ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングを行い、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ遺伝子を単離した。
即ち、１０日齢の実生Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓの根より、フェノール・グアニジンイソチオシアネート試薬を用いてトータルＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＴ−セルロースカラムを用いてｍＲＮＡの精製を行った。これを鋳型として、逆転写酵素（ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社））を用いた逆転写反応を行った。逆転写反応からｃＤＮＡの合成、制限酵素認識部位を持つアダプターの連結を経た後、ラムダファージタイプベクターであるλＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で導入した。この組換えλＺＡＰＩＩベクターに対して、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）パッケージング（Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社））を行い、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
スクリーニングのプローブには、Ｐ２５Ｋ３−２−Ｆのフォワード側プライマーとＰ２５Ｋ１−Ｒのリバース側プライマーを用いた組み合わせにより得られた２４２ｂｐのＰＣＲ産物を［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰにより標識したものを用いた。
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは２．０×１０５のプラーク群に対して行った。核酸転写用ナイロンメンブレンへの転写後のプローブとのハイブリダイゼーション条件は以下の通りである。
ハイブリダイゼーション：６５℃にて以下の溶液中一晩ハイブリダイゼーション。５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、２０μｇ／μＬ  サケ精子ＤＮＡ溶液。
メンブレン洗浄        ：６５℃にて以下の溶液中１５分洗浄した後さらに１０分洗浄。０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ。
上記の条件下、一次スクリーニングに続いて二次スクリーニングを行い、陽性クローンを単離した。単離したクローンはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）エキシジョン法によりサブクローニングした後、塩基配列の解析を行った。
次に５’末端部を得るために５’ＲＡＣＥを行った。１０日齢の実生Ｌ．  ｔｅｒｍｉｓの根より抽出したトータルＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングより得られた陽性クローンの塩基配列に特異的な５’リン酸化逆転写用プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。
５’リン酸化逆転写用プライマー：ＡＴＣＡＣＡＣＡＴＡＧＣＡＴ
次に、Ｔ４ＲＮＡリガーゼの存在下、５’リン酸化ｃＤＮＡの環化、あるいは、コンカテマ−化を行う。このようにして生成した５’未知領域を含む環化、あるいは、コンカテマー化ｃＤＮＡに対して、５’未知領域を含む領域が増幅するように陽性クローンの既知の塩基配列よりデザインしたプライマーを用いて、次の条件でＰＣＲを行った。
2005046022.tif 000009
得られた遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。また、この塩基配列を図３に図示する。
【００３２】
実施例５  （大腸菌による発現）
（１）ベクターの構築
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、および、５’ＲＡＣＥの結果より、ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ遺伝子は１３６２ｂｐのＯＲＦによりコードされていることが明らかになった。このＯＲＦを発現ベクターｐＧＥＸ（アマシャム・バイオサイエンス社）に導入するためにその５’末端領域、および、３’末端領域の塩基配列に基づいてプライマーをデザインし、エンドツーエンド（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）ＰＣＲを行った。また、ここでデザインした両プライマーの５’末端領域には制限酵素認識部位が存在しており、これを利用してｐＧＥＸベクターへの導入を行った。
（２）形質転換・培養
宿主である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ  ２１をコンピテント細胞にした後、熱ショック法により形質転換を行った。形質転換後、２×ＹＴ液体培地（１００μｇ／μＬアンピシリン含有）に接種して２０℃で振とう培養する。波長６００ｎｍの吸光度が０．７から１．０に達するまで培養した後、組換えタンパク質への発現を誘導するために最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、さらに６時間振とう培養する。培養後、超音波処理により細胞を破砕して組換えタンパク質を含む細胞抽出液を得る。
（３）酵素反応
以下の反応溶液中で、３０℃で１時間酵素反応を行った。
2005046022.tif 000010
（４）測定
上記酵素反応により生成する（−）−１３α−チグロイルオキシマルチフロリン（Ｃ２０Ｈ２８Ｎ２Ｏ３  ＝  ３４４）をＨＰＬＣ、および、ＬＣ／ＥＳＩ‐ＭＳにより測定した。実験対照として、外来遺伝子を導入していないｐＧＥＸベクターにより形質転換された宿主大腸菌の、同条件での培養細胞の抽出液を用いた。
2005046022.tif 000011
ＨＰＬＣの結果を図４に示す。
質量分析法：前記のＨＰＬＣ（ただし、溶離液としては、１５％アセトニトリル、及び０．１％ＴＦＡを用い、流速は０．５  ｍＬ／分として。）により分離された画分を、ＥＳＩ−ＭＳ分析により、陽イオン化した物質のスペクトルを測定した。また、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析によりフラグメンテーション後のスペクトルについても測定した。
分取用ＨＰＬＣ及び質量分析の結果を図５に示す。
（−）−１３α−チグロイルオキシマルチフロリン
Ｃ２０Ｈ２８Ｎ２Ｏ３［Ｍ］として、
2005046022.tif 000012
エステル部分がキノリチジン環より解裂した分子
2005046022.tif 000013
【００３３】
【発明の効果】
本発明は、マメ科ルピナス属植物よりエステル型アルカロイドの生合成に関わる１３α−ヒドロキシマルチフロリン／１３α−ヒドロキシルパニン  Ｏ−チグロイル転移酵素（ＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅ）遺伝子を世界で初めて単離したものである。本発明の遺伝子によりＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅを工業的規模で製造することが可能となり、さらに、アルカロイドの人工的な製造に必要な酵素を本発明の遺伝子により提供することが可能となった。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法により精製されたＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明の遺伝子を単離するために使用された２４２ｂｐのプローブの配列を示す。
【図３】図３は、本発明の遺伝子の翻訳領域を主とした塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、本発明の遺伝子を大腸菌で発現させたＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅを用いた酵素反応の生成物のＨＰＬＣの結果を示す。（ａ）は対照である。
【図５】図５は、本発明の遺伝子を大腸菌で発現させたＨＭＴ／ＨＬＴａｓｅを用いた酵素反応の生成物の質量分析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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