(57)【要約】  【課題】  鮭の鼻軟骨等の原料物質をアルカリ処理或いは酵素処理することにより得られる、“少なくとも分子量８０００〜５０万の分子量分布を持つコンドロイチン硫酸並びにタンパク質及び／又はその分解物”を含む抽出物から、適度な分子量分布を有する高純度のコンドロイチン硫酸ナトリウムを簡便に且つ低コストで得る方法を提供する。  【解決手段】  前記抽出物の水溶液を準備し、準備された水溶液と、当該水溶液中に含まれる原料組成物に対して５０〜５００重量％となる量の比表面積が１．２〜１．６ｍ２／ｇである活性炭とを接触させることにより、タンパク質及び／又はその分解物並びに低分子量及び高分子量のコンドロイチン硫酸を該活性炭に選択的に収着させと除去することにより、分子量１万〜３０万の分子量分布を持つ純度９５重量％以上のコンドロイチン硫酸を得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）少なくとも分子量８０００〜５０万の分子量分布を持つコンドロイチン硫酸並びにタンパク質及び／又はその分解物からなる原料組成物を含有する水溶液を準備する原料水溶液準備工程及び
（２）該原料水溶液と、当該原料水溶液中に含まれる原料組成物に対して５０〜５００重量％となる量の比表面積が１．２〜１．６ｍ２／ｇである活性炭とを接触させた後、該活性炭と水溶液とを分離する活性炭処理工程
を含むことを特徴とする分子量１万〜３０万の分子量分布を持つ純度９５重量％以上のコンドロイチン硫酸の製造方法。
【請求項２】
前記活性炭処理工程の前工程として、前記原料水溶液をｐＨ８〜１３の状態に０．０１〜１２時間保つアルカリ前処理工程を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分子量１万〜３０万の分子量分布を持つ純度９５重量％以上のコンドロイチン硫酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物、飼料等の分野において種々の用途が期待されるコンドロイチン硫酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖とは、広義には動物から得られた多糖類を意味し、その原料としては、鮫、鮭等の魚類；鯨、エイ、ナマコ等のその他の水生動物；および牛、豚、鶏、馬等の陸上動物から取り出した骨、軟骨、皮、魚の鱗等が知られている。ムコ多糖の代表的な物質としては、グリコサミノグルカンを挙げることが出来る。グリコサミノグルカンは、一般にコアタンパク質に共有結合したプロテオグルカンとして存在する。グリコサミノグルカンは、繰り返し二糖で構成され、二糖の内のひとつはＤ−グルコサミンまたはＤ−ガラクトサミンのいずれかである。グルコサミノグルカンの例としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ケタラン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸及びデルマタン硫酸等が知られている。
【０００３】
これらのなかでコンドロイチン硫酸は、動物の粘質性分泌液、軟骨等から得られるムコ多糖の一種であり、動物、人体の保水をはかり、これによって新陳代謝を潤滑にし、細胞の賦活機能を果たしていると推定されており、医薬品、化粧品、健康食品として広く用いられている。コンドロイチン硫酸の生理作用としては、細胞外液の容量調節と水分代謝、細胞外液のイオン移動と調節、関節組織の円滑化、脂血清澄作用と血液凝固阻止作用、抗炎症作用、抗ガン作用、角膜透明度維持、感染防止等が知られている。食品、飲料、化粧品または医薬品の有効成分として、これらの生理機能を十分に発揮するために、簡便で安価な高純度コンドロイチン硫酸の製造方法の開発が求められている。
【０００４】
一般にコンドロイチン硫酸を製造する方法としては、骨、軟骨、皮等の原料をアルカリ液で分解し、ムコ多糖を抽出するアルカリ処理法、中性塩液で抽出する中性塩処理法、プロテアーゼ、プロナーゼ等のタンパク質分解酵素で処理する酵素法等の方法が知られている。またこれらの方法を組み合わせた処理法によりコンドロイチン硫酸を得ることもできる。
【０００５】
これらの処理では、コンドロイチン硫酸が共有結合したコアタンパク質を切断することにより原料からコンドロイチン硫酸を取り出す（抽出する）。しかしながら、このような処理により得られる抽出物中には、タンパク質やその分解物が多量に含まれている。コンドロイチン硫酸へのタンパク質及び／又はその分解物の混在は、特に医薬品、化粧品分野での使用に支障をきたすことがある。例えば、注射薬用医薬剤として用いる場合には、これらタンパク質等が混在するとアレルギー反応を引き起こしやすくなり、化粧品用途では経時的な褐変を生じるなど安定性に問題を生じやすくなる。
【０００６】
そこで、これらの方法で得られた抽出物からタンパク質やその分解物等のコンタミネーションを除去し、コンドロイチン硫酸の高純度化を図る必要がある。そのための方法としては、エタノール分画処理、イオン交換クロマトグラフィー処理、エタノールによる沈殿回収とイオン交換樹脂処理との組合せ、限外ろ過処理等が知られている。
【０００７】
エタノール分画処理は、本来は広い分子量分布を有するコンドロイチン硫酸組成物の中から特定の分子量範囲のコンドロイチン硫酸を得るための方法であり、分子量によりエタノールに対する溶解性が異なることを利用した方法である。“タンパク質及び／又はその分解物”のエタノールに対する溶解度はコンドロイチン硫酸のそれに比べて有意に高いため、結果としてこの方法によりこれら夾雑物を分離除去することができる。しかしながら、エタノール濃度を変えながら、分画処理する操作は複雑であるためコストが高く、工業生産には適さない。なお、該エタノール分画処理においては、コンドロイチン硫酸の水溶液に単にエタノールを加えてもコンドロイチン硫酸はなかなか析出してこないため、析出を促進する目的で酢酸ナトリウムや酢酸カルシウムなどを僅かに（通常５重量％以下）添加することが行なわれている（非特許文献１参照）。また、エタノールによる沈殿回収とイオン交換樹脂処理との組合せ（特許文献１参照）においては、コンドロイチン硫酸を含む抽出物水溶液にエタノールを添加して沈殿回収されるコンドロイチン硫酸の純度は一般に低いため、更に高純度化を図るためにはイオン交換樹脂を用いた処理を行なうことが必須となっている。更に、限外ろ過処理（特許文献２参照）においては、高価な設備が必要であるという問題点がる。
【０００８】
なお、コンドロイチン硫酸を含む抽出物の脱脂・脱臭・脱色を目的に、有抽出物に対して２．５重量％の活性炭で処理する方法が提案されているが、該活性炭処理によって得られる組成物はコンドロイチン硫酸２０〜４０重量％の他にコラーゲン１０〜４０重量％、アミノ酸２０〜４０重量％を含むものであり（特許文献３参照）、該活性炭処理では高純度のコンドロイチン硫酸は得られていない。
【０００９】
【非特許文献１】日本生化学会編  新生化学実験講座３  「糖質ＩＩ」，東京化学同人，１９９１年，ｐ．２８
【特許文献１】特開２００１−２３１４９７号公報
【特許文献２】特開２０００−２７３１０２号公報
【特許文献３】特開２００３−２９９４９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、タンパク質やタンパク質の分解物等の夾雑物を含むムコ多糖含有抽出物から夾雑物を簡便且つ低コストで除去し、高純度のムコ多糖を得る方法はこれまで知られていない。
【００１１】
また、ムコ多糖の中でもコンドロイチン硫酸に関しては、前記したような生理機能の効果はコンドロイチン硫酸に含まれる硫酸根の量（イオウ含量に対応する）に依存するといわれており、イオウ含量を好適な範囲（例えば５．０〜８．０重量％、好適には５．５〜７．５重量％）とするために、適度な分子量（例えば１万〜３０万、好適には２万〜２５万）のものが望まれる傾向にある。ところが、前記のような抽出法により得られる抽出物中に含まれるコンドロイチン硫酸の分子量分布は非常に広い（例えば、魚類の軟骨から酵素法により抽出した抽出物中のコンドロイチン硫酸は、通常、分子量８０００〜６０万の分子量分布を持つ）。したがって、抽出法によって得られた抽出物から上記のような分子量のコンドロイチン硫酸を得るためにはエタノール分画処理法を採用せざるを得ず、操作の煩雑性の点およびコストの点で問題があった。
【００１２】
そこで、本発明は、簡便に且つ低コストで、抽出法により得られる抽出物から夾雑物、低分子量および高分子量のコンドロイチン硫酸を除去し、高純度でかつ適度な分子量分布を有するコンドロイチン硫酸を効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった。その結果、魚類の軟骨から酵素法により抽出した抽出物を、特定の比表面積を有する活性炭を用いて処理した場合には高純度で適度な分子量分布を持つコンドロイチン硫酸が得られる場合があるという知見を得るに至った。そして該知見に基づいて更に検討を行なったところ、再現性よくこのようなコンドロイチン硫酸を得るためには、活性炭の使用量を前記該抽出物に対して特定の範囲とする必要があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は、
（１）少なくとも分子量８０００〜５０万の分子量分布を持つコンドロイチン硫酸並びにタンパク質及び／又はその分解物からなる原料組成物を含有する水溶液を準備する原料水溶液準備工程及び
（２）該原料水溶液と、当該原料水溶液中に含まれる原料組成物に対して５０〜５００重量％となる量の比表面積が１．２〜１．６ｍ２／ｇである活性炭とを接触させた後、該活性炭と水溶液とを分離する活性炭処理工程
を含むことを特徴とする分子量１万〜３０万の分子量分布を持つ純度９５重量％以上のコンドロイチン硫酸の製造方法である。
【００１５】
また、他の本発明は、分子量１万〜３０万の分子量分布を持つ純度９５重量％以上のコンドロイチン硫酸である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の製造法によれば、簡便且つ低コストで、抽出法により得られる抽出物から夾雑物、低分子量および高分子量のコンドロイチン硫酸を除去し、高純度でかつ適度な分子量分布を有するコンドロイチン硫酸を効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明では、少なくとも分子量８０００〜５０万の分子量分布を持つコンドロイチン硫酸並びにタンパク質及び／又はその分解物からなる原料組成物から分子量１万〜３０万の分子量分布、好適には２万〜２５万の分子量分布を持つ純度９５重量％以上のコンドロイチン硫酸を得る。なお、少なくとも分子量８０００〜５０万の分子量分布を持つコンドロイチン硫酸とは、分子量の異なるコンドロイチン硫酸の混合物であって、該混合物には分子量分布を測定した場合に分布の最低分子量は必ず８０００未満であり、分布の最高分子量は必ず５０万を超えることを意味する。また、分子量分布１万〜３０万のコンドロイチン硫酸とは、分子量の異なるコンドロイチン硫酸の混合物であって、該混合物には分子量が１万未満のコンドロイチン硫酸及び分子量が３０万を超えるコンドロイチン硫酸が実質的に存在しないものを意味する。
【００１８】
本発明で使用する原料組成物は、例えば各種原料動物由来の原料物質をアルカリ或いは酵素で処理してムコ多糖であるコンドロイチン硫酸が共有結合したコアタンパク質を切断することにより得ることができる。ここで、上記原料動物としては、鮫、鮭等の魚類；鯨、エイ、ナマコ等のその他の水生動物；又は牛、豚、鶏、馬等の陸上動物等が使用できるが、得られる原料組成物の純度が比較的高く、臭気を少なくすることができることから、水生動物、特に鮭を使用するのが好適である。また、原料物質としては骨、軟骨、皮、魚の鱗等、ムコ多糖成分を含む組織であれば特に制限されないが、取り扱いが容易で、コンドロイチン硫酸の含量が高いことから特に鼻軟骨等の軟骨を使用するのが好適である。なお、用いる原料物質は、あらかじめ水洗、有機溶媒洗浄等により肉、脂肪等の夾雑物を除去することが好ましい。これら原料を、処理前に切断、粉砕、水を添加し加圧する等の処置により、処理の効率を高めることが通常行われる。
【００１９】
また、原料物質から原料組成物を得る方法としては、従来採用されている方法、即ち、原料物質をアルカリ液で分解し、コンドロイチン硫酸を抽出するアルカリ処理法、原料物質からコンドロイチン硫酸を中性塩液で抽出する中性塩処理法、原料物質にプロテアーゼ、プロナーゼ等のタンパク質分解酵素を作用させて分解し、コンドロイチン硫酸を抽出する酵素法、又はこれらの方法の組み合わせが制限なく使用できるが、コンドロイチン硫酸の回収率が高いという理由からこれらの方法の中で、アルカリ処理法及び酵素法による処理が好ましく、特に酵素処理が好ましい。これらの処理により、少なくとも分子量８０００〜５０万の分子量分布を持つコンドロイチン硫酸を含む水溶液成分を得ることが出来る。このとき切断されたタンパクやその分解物（タンパクの分解物）も不可避的に上記水溶液に含まれることになる。このような処理によって得られる原料物質由来の組成物は、コンドロイチン硫酸含有抽出物と呼ばれることもあるが、その大部分は原料組成物（即ち、少なくとも分子量８０００〜５０万の分子量分布を持つコンドロイチン硫酸並びにタンパク質及び／又はその分解物）である。
【００２０】
上記のような処理により得られるコンドロイチン硫酸含有抽出物の水溶液は、そのまま或いは水分量を調節して原料水溶液として使用することもできるが、遠心分離、ろ過等によって不溶物の除去を行い、さらに必要に応じて、ろ過助剤を用いてもよいろ過、抽出物に対して２．５重量％程度の少量の活性炭を用いた活性炭処理等を行うことにより、濁り成分の除去、脱臭、脱色、脱脂等を行うのが好適である。さらに、取扱いの容易性からスプレードライ（噴霧乾燥）、蒸発乾燥、凍結乾燥等の方法で一旦、固化・粉末化し、必要時に水に溶解して原料水溶液とするのが好適である。
【００２１】
原料組成物に含まれるコンドロイチン硫酸は、少なくとも分子量８０００〜５０万の分子量分布を持つが、コンドロイチン硫酸全体に占める１万未満の分子量のもの及び３０万を超える分子量のもの合計の割合は通常１〜３０重量％、好適には５〜２５重量％である。また、本発明で使用する原料組成物におけるコンドロイチン硫酸並びにタンパク質及び／又はその分解物の含有量は特に限定されないが、上記したような方法で得られる抽出物におけるコンドロイチン硫酸の含有率は、“コンドロイチン硫酸”と“タンパク質及び／又はその分解物”との合計重量を基準とした“コンドロイチン硫酸”の重量％で表して、通常１０〜９０重量％の範囲である。本発明においてはこのような組成範囲の原料組成物が何ら問題なく使用できる。
【００２２】
なお、コンドロイチン硫酸の分子量分布は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析により知ることができる。ＧＰＣ分析は、例えば次のような条件で好適に行なうことができる。検出器：示差屈折計、カラム：ＳＨＯＤＥＸ  ＯＨＰＡＫ  ＳＢ−８０６ＭＨＱを二本連結（固定相）、カラム温度：４０℃、移動相：亜硝酸ナトリウム０．１ｍｏｌ／Ｌ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ。
【００２３】
本発明の製造方法では、上記原料組成物を含む原料水溶液を活性炭で処理する。このとき、処理効率の観点から水溶液中のコンドロイチン硫酸の濃度は、あまり薄いと経済的ではなく、濃度が高すぎると高粘度の水溶液となり後工程の活性炭との接触が不十分になることから、コンドロイチン硫酸が調製した水溶液の０．２〜６０重量％、好ましくは０．５〜３０重量％の範囲であるのが好適である。なお、原料水溶液においては、原料組成物の全ての成分が溶解している必要はなく、一部は懸濁状態であってもよい。また、原料水溶液には前記原料組成物のほかに、塩類、灰分、無機物等が含まれていてもよい。これらその他の成分は上記合計重量を基準として０〜５００重量％であるのが好適ある。
【００２４】
原料水溶液の調製は、原料組成物が粉末等の固体である場合には水を加えることにより行なうことができる。また、原料組成物が抽出処理により得られたコンドロイチン硫酸含有抽出物の水溶液である場合には、水を加える或いは水分を蒸発させる等して水分量を調節することにより原料水溶液を調製してもよい。
【００２５】
本発明の製造方法においては、原料水溶液を活性炭処理工程に供する前に、アルカリ前処理をするのが好適である。アルカリ前処理をすることにより、原料組成物中のタンパク質及び／又はその分解物との物理的な相互作用が解きほどくされ（以後、このような効果を分散効果ともいう）、活性炭処理後に得られるコンドロイチン硫酸の純度がより向上する。アルカリ前処理は、原料水溶液にアルカリを添加し、水溶液のｐＨを８〜１３、好適には８．５〜１３の範囲に調整し、所定時間保持することにより行なわれる。このとき好適に使用できるアルカリを例示すると、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カルシウム等の炭酸塩、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド等の有機水酸化物等があげられる。これらの中で、入手の容易さや経済性等から水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、特に水酸化ナトリウムが好ましい。アルカリの添加量は、となるように選択するとよい。
【００２６】
アルカリ前処理においては、コンドロイチン硫酸は、上記のようなｐＨのアルカリ水溶液として長時間保存されると変性することがあるため、アルカリ前処理時間は０．００１〜１００時間、好ましくは０．０１〜５０時間、さらに好ましくは０．０１〜１２時間とする必要がある。また、アルカリ前処理における液温は、分散効果の観点から、−１０〜１２０℃、好ましくは−５〜１００℃、さらに好ましくは０〜８０℃の範囲から適宜選択すればよい。アルカリ前処理は、所定時間経過後に酸を添加し、水溶液のｐＨを５〜１０、好ましくは５〜８に調節することにより停止（終了）される。このとき、アルカリとして水酸化ナトリウム等の強アルカリを使用した場合には、酸を当量添加するのが好適である。アルカリ処理後に添加する使用する酸を例示すると酢酸、クエン酸、酒石酸等の有機カルボン酸、リン酸、塩酸、硫酸等の無機酸を用いることが出来る。
【００２７】
アルカリ処理においては、分散効果を補助する目的で、原料水溶液に有機カルボン酸塩や食塩を添加してもよい。有機カルボン酸の塩としては、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸、マロン酸等の１価または２価以上の有機カルボン酸を用いることが出来るが、水への溶解性の観点から、特に酢酸塩が好ましい。塩の対イオン（カチオン種）としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオン等を用いることが出来るが、精製効率の点で特にナトリウムイオンが好ましい。特に好適な有機カルボン酸塩として、酢酸ナトリウムを挙げることが出来る。また、酢酸ナトリウムは酢酸と水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどと水溶液中で反応させて、用時調達（その場で塩を形成させること）してもよい。また、前述の有機カルボン酸塩や食塩は単独または二種類以上組み合わせて添加してもよい。アルカリ処理時における有機カルボン酸塩または食塩の濃度は特に制限されないが、溶解度やアルカリ処理における分散効果を高める目的から、調製した水溶液中濃度が通常８〜６０重量％、好ましくは９〜５０重量％、特に好ましくは１０〜４０重量％である。アルカリ前処理におけるアルカリ、有機カルボン酸塩、食塩の添加は分散効果に加えて、菌・カビ等の発生（腐敗）防止を図る効果も兼ねている。
【００２８】
また、アルカリ前処理時に防腐剤を添加してもよい。好適に使用できる防腐剤を例示するとエタノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、ポリヘキサメチレン等のグアニジン類、塩化ベンザルコニウム等の逆性石鹸、アルキルポリアミノエチルグリシン等の表面活性剤、次亜塩素酸ナトリウム等のハロゲン系殺菌剤、過酸化水素、過酢酸等の過酸化物等を用いることが出来る。これら防腐剤の使用量は、処理温度等によって適宜調整すればよい。
【００２９】
アルカリ前処理の方法（各添加剤の添加順序等）は特に制限されず、例えば次のような方法により好適に行なうことができる。即ち、まず反応釜に夫々所定量の原料組成物の粉末及び水を入れた後に攪拌しながら原料組成物を溶解あるいは懸濁させて原料水溶液を調製する。次いで、原料水溶液に有機カルボン酸塩または食塩等を添加してこれらを溶解または懸濁させた後、アルカリをそのままあるいは水溶液として添加する。そして、十分に攪拌して所定時間のアルカリ前処理を行った後、酸を添加してｐＨ調整を行えばよい。
【００３０】
本発明の製造方法では、原料水溶液、好適にはアルカリ前処理を施した原料水溶液から分子量１万〜３０万の分子量分布を持つ純度９５重量％以上のコンドロイチン硫酸を得るために、原料水溶液を、当該原料水溶液中に含まれる原料組成物に対して５０〜５００重量％となる量の比表面積が１．２〜１．６ｍ２／ｇである活性炭で処理する。比表面積が上記の範囲外である活性炭を用いた場合には初期の分子量分布を有するコンドロイチン硫酸を得るのが困難となり、また使用する活性炭の量が上記範囲からはずれる場合には、分子量分布の制御が困難となるばかりでなく所期の純度のコンドロイチン硫酸を得るのが困難となる。効果の観点から、活性炭処理工程で使用する活性炭の使用量は上記基準で５０〜５００重量％、特に７０〜４５０重量％であるのが好適である。
【００３１】
活性炭処理工程で使用する活性炭は、その比表面積が１．２０〜１．６０ｍ２／ｇ、好適には１．２５〜１．５５ｍ２／ｇであるものであれば工業的に又は試薬として入手可能なものが制限無く使用できる。本発明で使用できる活性炭を示せば、日本ノーリット社のＰＫ、ＰＫＤＡ  ＭＥＳＹ／ＭＲＸ、ＥＬＯＲＩＴ、ＡＺ０、ＤＡＲＣＯ、ＨＹＤＲＯＤＡＲＣＯ  ３０００／４０００、ＤＡＲＣＯ  １２Ｘ２０ＬＩ、ＤＡＲＣＯ１２Ｘ２０ＤＣ、ＰＥＴＲＯＤＡＲＣＯ、ＤＡＲＣＯ  ＭＲＸ、ＧＡＣ、ＧＡＣ  ＰＬＵＳ、ＤＡＲＣＯ  ＶＡＰＵＲＥ、ＧＣＮ、Ｃ−ＧＲＡＮＵＬＡＲ等の破砕活性炭類、ＣＡ、ＣＮ、ＣＧ、ＤＡＲＣＯ  ＫＢ／ＫＢＢ、Ｓ−５１、Ｓ−５１−ＨＦ、Ｓ−５１−ＦＦ、ＰＲＥＭＩＵＭ  ＤＡＲＣＯ、ＤＡＲＣＯ  ＧＦＰ、ＨＤＣ／ＨＤＲ／ＨＤＨ、ＧＲＯ  ＳＡＦＥ、ＦＭ−１、ＤＡＲＣＯ  ＴＲＳ、ＤＡＲＣＯ  ＦＧＤ、ＳＸ、ＳＸ  ＵＬＴＲＡ、ＳＡ、Ｄ−１０、ＰＮ、ＺＮ、ＳＡ−ＳＷ、Ｗ、ＧＬ、ＨＢ  ＰＬＵＳ等の粉末活性炭類、ＲＯＷ、ＲＯ、ＲＯＸ、ＲＢ、Ｒ、Ｒ．ＥＸＴＲＡ、ＳＯＲＢＯＮＯＲＩＴ、ＧＦ  ４０／５０、ＣＮＲ、ＲＯＺ、ＲＢＡＡ、ＲＢＨＧ、ＲＺＮ、ＲＧＭ等の成型活性炭・添着活性炭類、ＰＩＣＡ社の粒状活性炭類、球状活性炭類、粉末活性炭類、日本エンバイロケミカル社のモルシーボン、ＷＨＡ、粒状白鷺（Ｘ２Ｍ、ＧＭ２Ｘ、ＧＨ２Ｘ、ＧＨＸＵＧ、ＧＳ１Ｘ、ＧＳ３Ｘ、ＧＴＸ、ＧＴＳＸ、Ｇ２Ｘ、ＧＳ２Ｘ、ＧＡＡＸ、ＭＡＣ−Ｗ、ＧＯＣ、ＧＯＸ、ＧＯＨＸ、ＡＰＲＣ、ＴＡＣ、ＭＡＣ、ＸＲＣ、ＮＣＣ、ＳＲＣＸ）等の機能性活性炭類、粒状白鷺（Ｇ２Ｃ、Ｃ２Ｃ、ＷＨ２Ｃ、Ｗ２Ｃ、ＷＨ５Ｃ、Ｗ５Ｃ、ＬＧＫ−４００、ＬＧＫ−１００、ＬＨ２Ｃ、ＫＬ、Ｇ２Ｘ、ＧＨ２Ｘ、ＷＨ２Ｘ、Ｓ２Ｘ、Ｃ２Ｘ、Ｘ７０００Ｈ、Ｘ７１００Ｈ、Ｘ７００Ｈ−３、Ｘ７１００Ｈ−３、ＬＧＫ−７００、ＤＸ７−３）、Ｘ−７０００、Ｘ−７１００、Ｘ−７０００−３、Ｘ−７１００−３、等の粒状活性炭類、白鷺（Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ＰＨＣ、ＦＡＣ−１０）、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、精製白鷺２、特製白鷺、白鷺ＤＯ−２、白鷺ＤＯ−５、白鷺ＤＯ−１１等の粉末活性炭類、ハニカムカーボ白鷺、モールドカーボン、カーボンペーパー、白鷺Ｃ−ＤＣ、カルボラフィンＤＣ、粒状白鷺ＤＣ、アルデナイト、アルデナイトＳＰ等の活性炭加工品類二村化学工業社のＳＧ、ＳＧＰ等の顆粒活性炭類、ＴＡ、ＴＳ、ＴＧ、ＴＭ等の造粒活性炭類、Ｓ、ＦＣ、ＳＡ１０００、Ｋ、Ａ、ＫＡ、ＡＣ、Ｍ、Ｐ、ＩＣ、ＩＰ、ＣＢ、ＧＢ、ＧＬＰ、ＣＬＰ、Ｗ等の粉末活性炭類、ＣＧ４８Ｂ、ＣＧ４８ＢＲ、ＣＷ１３０Ｂ、ＣＷ１３０Ａ、ＣＷ１３０ＢＲ、ＣＷ１３０ＡＲ、ＣＷ４８０ＳＺ、ＣＷ６１００ＳＺ、ＧＬ１３０Ａ、ＧＬ２４０Ａ、ＧＭ１３０Ａ、ＧＭ２４０Ａ、ＧＭＣ等の破砕活性炭類を挙げることができる。これら活性炭の中から比表面積が前記条件を満足するものを適宜選択して使用すればよい。
【００３２】
これらの活性炭の中でも処理効果の観点から、ＣＡ、ＣＮ、ＣＧ、ＤＡＲＣＯ  ＫＢ／ＫＢＢ、Ｓ−５１、Ｓ−５１−ＨＦ、Ｓ−５１−ＦＦ、ＰＲＥＭＩＵＭ  ＤＡＲＣＯ、ＤＡＲＣＯ  ＧＦＰ、ＨＤＣ／ＨＤＲ／ＨＤＨ、ＧＲＯ  ＳＡＦＥ、ＦＭ−１、ＤＡＲＣＯ  ＴＲＳ、ＤＡＲＣＯ  ＦＧＤ、ＳＸ、ＳＸ  ＵＬＴＲＡ、ＳＡ、Ｄ−１０、ＰＮ、ＺＮ、ＳＡ−ＳＷ、Ｗ、ＧＬ、ＨＢ  ＰＬＵＳ、白鷺（Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ＰＨＣ、ＦＡＣ−１０）、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、精製白鷺２、特製白鷺、白鷺ＤＯ−２、白鷺ＤＯ−５、白鷺ＤＯ−１１、Ｓ、ＦＣ、ＳＡ１０００、Ｋ、Ａ、ＫＡ、ＡＣ、Ｍ、Ｐ、ＩＣ、ＩＰ、ＣＢ、ＧＢ、ＧＬＰ、ＣＬＰ、Ｗ等の粉末活性炭類、粒状白鷺（Ｇ２Ｃ、Ｃ２Ｃ、ＷＨ２Ｃ、Ｗ２Ｃ、ＷＨ５Ｃ、Ｗ５Ｃ、ＬＧＫ−４００、ＬＧＫ−１００、ＬＨ２Ｃ、ＫＬ、Ｇ２Ｘ、ＧＨ２Ｘ、ＷＨ２Ｘ、Ｓ２Ｘ、Ｃ２Ｘ、Ｘ７０００Ｈ、Ｘ７１００Ｈ、Ｘ７００Ｈ−３、Ｘ７１００Ｈ−３、ＬＧＫ−７００、ＤＸ７−３）、Ｘ−７０００、Ｘ−７１００、Ｘ−７０００−３、Ｘ−７１００−３等の粒状活性炭類が好ましく、中でも粉末活性炭類の精製白鷺および精製白鷺−２が特に好ましい。
【００３３】
活性炭処理は、原料水溶液、好適にはアルカリ前処理を施した原料水溶液と所定量の活性炭とを混合・攪拌する等して両者を接触させた後、処理された水溶液から活性炭を分離すればよい。原料水溶液と活性炭との接触時間は、短すぎると効果が発現せず、長すぎると経済的ではないので、通常、０．０１〜１００時間、好ましくは０．１〜２４時間、さらに好ましくは０．２〜１０時間の範囲の中から適宜選択すると良い。また、接触時における原料水溶液の接触温度は、操作性及び効率を考慮して−１０〜１２０℃、好ましくは−５〜１００℃、さらに好ましくは０〜８０℃の範囲から適宜選択すればよい。
【００３４】
活性炭処理後に水溶液から活性炭を分離する方法としては、遠心分離ろ過、過圧ろ過、減圧濾過、デカンテーション、フィルタープレス等の分離方法が採用できるが、分離効率及び操作の簡便性から、ケイソウ土等のろ過助剤を使用した加圧ろ過、減圧濾過あるいはフィルタープレスにより分離するのが好適である。ろ過助剤は水溶液中に添加してもよく、ろ過器に添加してもよく、両方組み合わせてもよい。さらに、ろ過後の水溶液を０．１〜１．０μｍの精密ろ過（メンブランフィルター、ポールフィルター）をすることがより好ましい。ここで、除去されたタンパク質及び／又はその分解物並びに低分子量或いは高分子量のコンド路イチン硫酸を吸着した活性炭は、水田、田畑、果樹園、森林、花畑、野菜畑の肥料として有効利用することができる。
【００３５】
上記のような方法により活性炭を分離して得られる水溶液中に含まれるコンドロイチン硫酸は、分子量１万〜３０万、好適には２〜２８万の分子量分布を持つ。また、該水溶液中に含まれるタンパク質及び／又はその分解物は通常コンド路イチン硫酸に対して０．１重量％以下である。したがって、該水溶液から回収されるコンドロイチン硫酸は、硫酸根の含有率が比較的高いため、高い生理機能を有することが期待されるばかりでなく純度も極めて高い。本発明の方法により得られるコンドロイチン硫酸は、高純度品と呼べるものであり、医薬品、やその他の食品、化粧品分野において幅広く使用される。
【００３６】
分離された水溶液から目的物であるコンドロイチン硫酸を固体として分離・回収する方法としては、凍結乾燥（フリーズドライ）および噴霧乾燥（スプレードライ）等の乾燥法も適用できるが、活性炭処理後に活性炭と分離して回収された水溶液中に含まれる酸、アルカリ、有機カルボン酸塩、食塩、防腐剤等を効率よく除去できるという理由から、該水溶液とアルコール等の貧溶媒とを混合してコンドロイチン硫酸を析出させた後に分離回収する析出法が好適に採用できる。
【００３７】
このとき使用する貧溶媒としては、コンドロイチン硫酸の溶解度が低く水溶性を有するアルコールを使用するのが好適である。好適に使用できるアルコールを例示すると、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類が挙げられ、なかでも、メタノール、エタノールが好ましく、エタノールが特に好ましい。
【００３８】
アルコール等の貧溶媒と水溶液との混合は、貧溶媒に水溶液を滴下してもよく、水溶液に貧溶媒を滴下してもよいが、作業性からは後者の方が好ましい。また、混合に際しては、コンドロイチン硫酸が析出し易く回収率も高くなるという理由から溶液中のコンドロイチン硫酸の濃度は０．０１〜１０重量％の範囲となるように調整しておくのが好ましい。さらに、析出速度を速めるため、酢酸ナトリウムを０．１〜５重量％となるように添加して溶解させておくと良い。このとき、前工程のアルカリ前処理等で酢酸ナトリウムを使用し、水溶液中に存在している場合には、酢酸ナトリウムの濃度が０．１〜５重量％となるように水の量を調整すればよい。また、使用する貧溶媒の量は、貧溶媒と混合後の貧溶媒の濃度が、３０〜８０重量％となるように選択すればよい。また、混合液からコンドロイチン硫酸を析出させるときの液温は、−２０〜７０℃、特に−１０〜６０℃とするのが好ましく、−５〜５５℃とするのが最も好ましい。さらに、コンドロイチン硫酸を析出される際には混合液を攪拌しておくことが好ましく、攪拌翼のせん断速度が０．７〜５０ｍ／秒となるように攪拌速度を調節するとよい。
【００３９】
このような方法により析出したコンドロイチン硫酸は、遠心分離ろ過、過圧ろ過、減圧濾過、デカンテーション、フィルタープレス等の一般的な固液分離操作により回収することができる。さらに、分離した固体をアルコール、アルコール／水の混合溶液で洗浄しても良い。このようにして単離された固体状のコンドロイチン硫酸は、必要に応じて乾燥、粉砕・分級（例えば３．５〜６３５メッシュ）することによって粉末とされる。
【００４０】
乾燥方法としては、減圧乾燥、温風乾燥、調湿乾燥、風乾、棚段乾燥等の公知の乾燥方法が特に制限無く適用でき、更に棚式で乾燥しても、コニカルドライヤーのように回転させて乾燥させてもよい。乾燥温度は乾燥効率およびコンドロイチン硫酸の安定性の観点から−１０〜１２０℃、特に１０〜１００℃の範囲とするのが好適である。
【００４１】
また、粉砕方法としてはジョークラッシャー、ジャイレトリー・クラッシャー、コーンクラッシャー、ハンマークラッシャー、シュレッダー、ロールクラッシャー、ハンマーミル、ディスインテグレーター、カッターミル、円盤ミル、ピンミル、スタンプミル、フレットミル、ロッドミル、ローラーミル、テーブルミル、リングロールミル、リングロールミル、エロフォールミル、ターボ系粉砕機、スクリーンミル、遠心分級ミル、縦型ジェット粉砕機、マイクロナイザージェット粉砕機、衝突式ジェット粉砕機、ポットミル、チューブミル、コニカルミル、ラジアルミル、塔式粉砕機、円形振動ミル、らせん系振動ミル、遊星型粉砕機、サンドミル、コロイドミル、乳鉢、石臼、薬研等の公知の粉砕方法が特に制限無く適用できる。また、分級方法としては、重力流動式、機械的強制流動式、振動流動式、気流同伴流動式等のふるい分け法等が適用できる。メッシュのサイズは３．５〜６３５メッシュの範囲から、適宜選択すればよい。
【００４２】
このようにして得られた本発明のコンドロイチン硫酸は、分子量が１万〜３０万、好適には２万〜２８万という分子量分布を有するばかりでなく、タンパク質及び／又はその分解物の含量が少なくその純度が９５重量％以上、好適には９７重量％以上という高純度品であり、特に医薬品、化粧品用途に適している。
【００４３】
なお、前記原料組成物や本発明のコンドロイチン硫酸のように不純物を含むか含み得るコンドロイチン硫酸中に含まれる各成分の量は、次のような分析法により知ることができ、これらの結果に基づいてコンドロイチン硫酸の純度を決定することができる。
【００４４】
（１）コンドロイチン硫酸
コンドロイチン硫酸の構成ユニットのひとつであるウロン酸分析により分析できる。ウロン酸分析法としては、一般にカルバゾール法を用いることが出来る。またコンドロイチン硫酸は、硫酸基を有するので硫酸バリウム比濁法、ロジゾン酸法等の硫酸基定量法を用いることが出来る。
【００４５】
混在する不純物の特性ピークが明確であり、コンドロイチン硫酸のシグナルと分離可能な場合には、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1H-NMR）においても純度分析をすることが可能である。またゲルパーミエイションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって、純度分析が可能である。
【００４６】
なお、コンドロイチンのイオウ含量は、日本薬局方一般試験法に基づき、酸素フラスコ燃焼法により分析することが出来る。
【００４７】
（２）タンパク質及び／又はその分解物
タンパク質を水中で分解し、生成したアミノ酸をニンヒドリン反応により呈色することを利用するニンヒドリン法を用いることが出来る。また、硫酸と強熱して窒素をすべてアンモニウムイオンとして定量する方法であるケルダール法、２つ以上のペプチド結合が近接して存在する場合に、強アルカリ性側で２価の銅と錯塩を形成する反応を利用するビュレット法、フェノール試薬とタンパク質中の芳香族アミノ酸に由来する呈色反応であるローリー法、芳香族アミノ酸含量を指標とするＵＶ法、過剰の酸（又は塩基性）色素を添加して、タンパク質との間に不溶性の塩を形成させ、沈殿させて、未反応の色素量を分光光度計で測定し、算出した結合色素量からタンパク量を求める色素結合法等、一般にタンパク質を分析する方法を用いることが出来る。これら分析法の中でも、一般に妨害物質の影響を受けにくいこと、検出感度が高いことから好適にはニンヒドリン法を用いるのが好適である。
【００４８】
なお、タンパク質及び／又はその分解物の特性ピークが明確であり、コンドロイチン硫酸のシグナルと分離可能な場合には、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1H-NMR）においても混在量を分析することが可能である。
【００４９】
（３）有機カルボン酸塩
イオン交換クロマトグラフィー法にて分析することが出来る。また、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1H-NMR）によっても有機カルボン酸塩由来の特性シグナルに基づいて、定量することも可能である。
【００５０】
（４）微生物分析法
公知方法によって可能であるが、例えば日本薬局方一般試験法に基づく、微生物限度試験法生菌数試験（メンブランフィルター法）を用いることができる。
【００５１】
（５）水溶性有機溶媒含量
ガスクロマトグラフィー法（ＧＣ）で測定することが可能である。また、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1H-NMR）によっても水溶性有機溶媒由来の特性シグナルに基づいて、定量することも可能である。
【００５２】
本発明のコンドロイチン硫酸の用途としては、医薬品、化粧品、日用品、食品、飲料、調味料、飼料等が挙げられる。医薬としては、関節組織の円滑化、脂血清澄作用、血液凝固阻止作用、抗炎症作用、抗ガン作用を利用した医薬が挙げられる。化粧品としてはローション類、乳液類、クリーム類、パック類を挙げることができ、日用品としては、浴用剤、洗顔剤、浴用石ケン、浴用洗剤等を挙げることができる。
【００５３】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５４】
製造例  原料組成物を含む抽出物（コンドロイチン硫酸含有抽出物）の調製
鮭頭部より鼻軟骨を採取し、粉砕した。次いで固形分に対して、２倍量のイオン交換水を加えｐＨを中性付近に調製し、０．２重量％のタンパク質分解酵素（アルカリ性プロテアーゼ）を加えて、５０℃前後で１〜２時間処理した後、９０℃に加熱し酵素を失活させた。冷却後、遠心分離して、活性炭を０．２重量％添加し、攪拌した。次いでろ過助剤（ケイソウ土、ラヂオライト３００）を入れてろ過した後、スプレードライヤを用いて濾液を乾燥させ、微黄色粉末のコンドロイチン硫酸含有抽出物を得た。得られたコンドロイチン硫酸含有抽出物を分析したところ、コンドロイチン硫酸純度は、約４３％、タンパク質及び／又はその分解物は、ケルダール分析法にて約５５％であることが判った。また、検出器：示差屈折計、カラム：ＳＨＯＤＥＸ  ＯＨＰＡＫ  ＳＢ−８０６ＭＨＱを二本連結（固定相）、カラム温度：４０℃、移動相：亜硝酸ナトリウム０．１ｍｏｌ／Ｌ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎの条件下でＧＰＣ測定したところ、分子量分布は８０００〜５８万であり、分子量３０万以上の全体に占める割合は２４重量％であった。以下、単にＧＰＣと略す場合は該条件を意味する。
【００５５】
実施例１
３リットル（ｌ）四つ口フラスコに、スリーワンモーター（３５Ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着した。これに、イオン交換水１９００ｍｌ、前記製造例で得たコンドロイチン硫酸含有抽出物１００．０ｇ｛コンドロイチン硫酸ナトリウム４３重量％（４３．０ｇ）、タンパク質５５重量％（５５．０ｇ）、食塩２重量％（２．０ｇ）；コンドロイチン硫酸のＮＭＲ純度４３％｝を加え、４０℃で攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら溶解させた。さらに、８．４重量％水酸化ナトリウム水溶液１００．０ｇ（水酸化ナトリウム８．４ｇ、イオン交換水９１．６ｇ）を加え、４０℃で２時間攪拌した。次に、２２℃まで冷却し、酢酸１２．６ｇを加えた。その後、活性炭（精製白鷺２、比表面積１．４４ｍ２／ｇ）を２００ｇ添加し、２５℃で２時間攪拌した（活性炭処理工程）。攪拌終了後、ケイソウ土（ラヂオライト３００）をろ過助剤とし、活性炭を減圧濾過して取り除き、さらに０．４５μｍのメンブランフィルターで精密加圧ろ過を行った。そのろ液を５℃に冷却後、攪拌速度をせん断速度が２ｍ／秒となるように調節し、９５重量％エタノール２６００ｇ（エタノール２４７０ｇ、イオン交換水１３０ｇ）を２時間かけて滴下した。滴下後、１０℃以下で１時間さらに攪拌して、減圧ろ過により、沈殿を分離した。さらに、９５％エタノール１００ｇ（エタノール９５ｇ、イオン交換水５ｇ）で２回洗浄した。得られた湿体は６４．７ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体２５．８ｇが得られた。ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、アミノ酸自動分析（ニンヒドリン法）の結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム２５．８ｇ、タンパク質／タンパク質分解物未検出、酢酸ナトリウム未検出であった。さらに核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）測定、日本薬局方一般試験法に基づく、微生物限度試験法生菌数試験（メンブランフィルター法）、酸素フラスコ燃焼法（イオウ）を行った。結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
2005336352.tif 000002
【００５７】
比較例１
実施例１において活性炭処理工程で使用する活性炭の量を２０．０ｇとする他は同様にして３５．８ｇの乾燥体を得た。得られた乾燥体の分析結果を表２示す。
【００５８】
【表２】
2005336352.tif 000003
【００５９】
比較例２
実施例１において活性炭処理工程で使用する活性炭（比表面積０．９０ｍ２／ｇ）に変える他は同様にして４０．８ｇの乾燥体を得た。得られた乾燥体の分析結果を表３示す。
【００６０】
【表３】
2005336352.tif 000004
【００６１】
実施例２
実施例１において活性炭処理工程で使用する活性炭およびその使用量を精製白鷺（比表面積１．３０ｍ２／ｇ）１００ｇに変える他は同様にして２５．８ｇ乾燥体を得た。得られた乾燥体の分析結果を表４示す。
【００６２】
【表４】
2005336352.tif 000005