(57)【要約】【課題】シトリルＣｏＡを立体選択的かつ効率的に合成するための酵素、および、該酵素を用いて効率よくシトリルＣｏＡを得る方法を提供する。【解決手段】ＣｏＡとＡＴＰからシトリルＣｏＡを合成する反応を触媒する酵素シトリルＣｏＡシンテターゼ。および、クエン酸とＣｏＡとＡＴＰから該酵素を用いてシトリルＣｏＡを製造する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸とＣｏＡとＡＴＰからシトリルＣｏＡを合成する反応を触媒する酵素シトリルＣｏＡシンテターゼ。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる大サブユニットと配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された蛋白質。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる大サブユニットと、配列番号４で表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された、シトリルＣｏＡシンテターゼ活性を有する蛋白質。
【請求項４】
請求項２または３に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項１、２または３に記載の蛋白質を用い、クエン酸とＣｏＡとＡＴＰからシトリルＣｏＡを製造することを特徴とするシトリルＣｏＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クエン酸とＣｏＡとＡＴＰからシトリルＣｏＡを合成する反応を触媒する新規な酵素シトリルＣｏＡシンテターゼ、および該酵素を利用してシトリルＣｏＡを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトリルＣｏＡはクエン酸のＣｏＡエステルであり、化学的に合成することが可能である（非特許文献１）。しかしながら、化学合成法によりシトリルＣｏＡを製造すると、シトリルＣｏＡのうちの特定の異性体を選択的に合成することができない。
【０００３】
酵素を利用したシトリルＣｏＡ合成法としては、部分失活させたシトレートリアーゼの副反応を利用した方法が報告されている。シトレートリアーゼはクエン酸をオキサロ酢酸に開裂させる酵素であるが、副反応としてアセチルＣｏＡ存在下にシトリルＣｏＡを開裂させる反応も触媒できる（非特許文献２）。この反応をＥＤＴＡ存在下で行うと、シトリルＣｏＡ開裂反応が阻害され、シトリルＣｏＡが蓄積する（非特許文献２）。シトレートリアーゼの副反応を利用したシトリルＣｏＡ合成法は、この原理を利用したものである（非特許文献３、４）。この方法は、シトリルＣｏＡのうちの特定の異性体を選択的に合成することができるという利点をもつが、酵素本来の触媒反応を利用したものではなく、副反応を利用したものであるため、効率が非常に低い。また、この方法は、副反応の進行をＥＤＴＡで阻害させて行うため、微妙な条件設定が必要とされ、再現性よくシトリルＣｏＡを得ることは困難である。
【０００４】
【非特許文献１】Srere, P. A. (1961) The citrate cleavage enzyme. J. Biol. Chem. 236, 50-53.
【非特許文献２】Buckel, W., Ziegert, K., and Eggerer, H. (1973) Acetyl-CoA dependent cleavage of citrate on inactivated citrate lyase. Eur. J. Biochem. 37, 295-304.
【非特許文献３】Loehlein, G., and Eggerer, H. (1982) Nicotinic acid metabolism. Stereochemical course of the (2R,3S)-2,3-dimethylmalate lyase reaction. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363, 1103-1109.
【非特許文献４】Kurz, L. C., Shah, S., Frieden, C. Nakra, T., Stein, R. E., Drysdale, G. R., Evans, C. T., and Srere, P. A. (1995) Biochemistry 34, 13278-13288.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
シトリルＣｏＡ合成反応を触媒する酵素はこれまでに知られていない。本発明の課題は、特定の異性体のシトリルＣｏＡを選択的かつ効率的に合成するための酵素を提供し、該酵素を用いて効率よくシトリルＣｏＡを得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明では、Hydrogenobacter thermophilus TK-6株からクエン酸とＣｏＡとＡＴＰからシトリルＣｏＡを合成する反応を触媒する新規な酵素シトリルＣｏＡシンテターゼを見い出し、その諸性質を明らかにし、該酵素をコードする遺伝子の構造を明らかにした。さらに、本酵素を用いることによりシトリルＣｏＡを効率的に合成できることを見い出し、下記本発明を完成するに至った。
【０００７】
＜１＞：クエン酸とＣｏＡとＡＴＰからシトリルＣｏＡを合成する反応を触媒する酵素シトリルＣｏＡシンテターゼ。
【０００８】
＜２＞：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる大サブユニットと配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された蛋白質。
【０００９】
＜３＞：配列番号２で表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる大サブユニットと、配列番号４で表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された、シトリルＣｏＡシンテターゼ活性を有する蛋白質。
【００１０】
＜４＞：上記＜２＞または＜３＞に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【００１１】
＜５＞：上記＜１＞、＜２＞または＜３＞に記載の蛋白質を用い、クエン酸とＣｏＡとＡＴＰからシトリルＣｏＡを製造することを特徴とするシトリルＣｏＡの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、立体選択的かつ効率的にシトリルＣｏＡを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の酵素シトリルＣｏＡシンテターゼ（以下、本酵素ともいう）は、クエン酸とＣｏＡとＡＴＰからシトリルＣｏＡを合成する反応を触媒する活性を有する蛋白質である。本酵素はHydrogenobacter thermophilus TK-6株から精製することができる。しかし、シトリルＣｏＡシンテターゼ活性を有する酵素であれば、本酵素の由来は特に制限されるものではない。
【００１４】
本発明者は、Hydrogenobacter thermophilus TK-6株から本酵素を精製し、それが２つのサブユニット（大サブユニットと小サブユニット）から構成される蛋白質であることを明らかにした。次いで、各サブユニットのＮ末端アミノ酸配列を解析し、それに基づき各サブユニットに対するＤＮＡプローブを合成し、このＤＮＡプローブを用いてHydrogenobacter thermophilus TK-6株のゲノムから各サブユニットの遺伝子を得てその配列を明らかにした。さらに、その遺伝子配列から各サブユニットのアミノ酸配列を決定した。
【００１５】
本発明におけるHydrogenobacter thermophilus TK-6株由来のシトリルＣｏＡシンテターゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる大サブユニットと配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された蛋白質である。しかし、本酵素は、シトリルＣｏＡシンテターゼ活性を有する蛋白質であれば、このアミノ酸配列に限定されるものではなく、配列番号２で表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる大サブユニットと、配列番号４表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された、上記蛋白質以外のシトリルＣｏＡシンテターゼ活性を有する蛋白質であってもよい。すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる大サブユニットと配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された蛋白質、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる大サブユニットと配列番号４で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された蛋白質、または、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる大サブユニットと配列番号４で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる小サブユニットとから構成された蛋白質、であってもよい。
【００１６】
本発明のシトリルＣｏＡシンテターゼは、該酵素を生産する種の細胞から直接精製して得ることができる。例えば、Hydrogenobacter thermophilus TK-6の細胞抽出液を、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを使用して精製を行うことができる。しかし、本酵素の精製法は、これに限定されるものではなく、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、陽イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの方法で目的の本酵素を精製して取得することもできる。
【００１７】
また、上記本酵素をコードする遺伝子（以下、シトリルＣｏＡシンテターゼ遺伝子という）を異種宿主中で発現させて組換え蛋白質として本酵素を得ることもできる。例えば、公知の遺伝子工学的手法を用いて、シトリルＣｏＡシンテターゼ遺伝子（配列番号１で表される大サブユニットの遺伝子と配列番号３で表される小サブユニットの遺伝子）を異種宿主中で発現させることにより、上記配列の組換え蛋白質を得ることができる。すなわち、該遺伝子を蛋白質を発現させるための発現ベクターに組み込み、その発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、その形質転換体から本酵素を発現させ、上記の方法などで本酵素を精製して取得することができる。発現ベクターは、適当な発現調節配列（プロモーター）、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、転写ターミネーターなどを含み、さらに、選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、緑膿菌などの原核細胞、酵母などの真核単細胞、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞などの動物細胞、植物細胞などを挙げることができる。
【００１８】
本発明はまた本酵素を使用したシトリルＣｏＡの製造方法である。クエン酸、ＣｏＡ、ＡＴＰを含む反応溶液に本酵素を添加してインキュベートし、シトリルＣｏＡ合成反応を進行させた後、反応液中のシトリルＣｏＡを精製することによりシトリルＣｏＡを得ることができる。反応溶液には通常マグネシウムイオンを存在させて酵素活性を高めることが好ましい。反応終了後反応溶液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけることにより、未反応のＣｏＡを除去した後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーをかけて脱塩し、シトリルＣｏＡを精製することができる。しかし、反応溶液からシトリルＣｏＡを精製する方法はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
以下に記載する実施例は、本発明をさらに詳細に説明するのであるが、本発明の技術的範囲はこの実施例に限定されるものではない。
【００２０】
（実施例１）：シトリルＣｏＡシンテターゼの精製
Hydrogenobacter thermophilus TK-6湿菌体１０グラムを４０mlのTris-HCl(pH8.0)溶液に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離（15,000g、２０分間）により不溶物を除去して得た上清を、Tris-HCl(pH8.0)溶液に対して透析して脱塩した後、DE52（Whatman社製）カラムにかけた。カラムをTris-HCl(pH8.0)溶液で充分洗浄した後、0.5MNaClを含むTris-HCl(pH8.0)溶液で溶出した。溶出分画をTris-HCl(pH8.0)溶液に対して透析した後、硫酸アンモニウムを３０％飽和となるように加え、ブチルトヨパール（東ソー社製）カラムにかけた。カラムを３０％飽和硫酸アンモニウムを含むTris-HCl(pH8.0)溶液で充分洗浄した後、３０％から０％飽和までの硫酸アンモニウムグラジエントで溶出した。活性のあるフラクションをTris-HCl(pH8.0)溶液に対して透析した後、MonoQ（Pharmacia社製）カラムにかけた。カラムをTris-HCl(pH8.0)溶液で充分洗浄した後、0Mから0.5MまでのNaClグラジエントで溶出した。活性のあるフラクションをYM10（Amicon社製）膜で濃縮した後、Superose6（Pharmacia社製）カラムにかけ、200mMNaClを含むTris-HCl(pH8.0)溶液で溶出した。活性のあるフラクションをTris-HCl(pH8.0)溶液に対して透析し、精製酵素を得た。
【００２１】
得られた酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約４６kDaと約３６kDaの２本のバンドが検出され、そのモル比は１：１であった（図１）。したがって、得られた酵素は２種類のサブユニットからなることが明らかになった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したサブユニットを各々ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad社製 Sequi-Blot）にブロットし、アミノ酸シーケンサー（Applied Biosystems社製 model 491）にかけたところ、大サブユニットのＮ末アミノ酸配列は配列番号５で表される配列であり、小サブユニットのＮ末アミノ酸配列は配列番号６で表される配列であることが明らかになった。
【００２２】
なお、図１はHydrogenobacter thermophilus TK-6から精製したシトリルＣｏＡシンテターゼ３μｇ（レーン１）を１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシー染色して得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図である。レーンＭはサイズマーカーである。
【００２３】
（実施例２）：シトリルＣｏＡシンテターゼ遺伝子の単離と構造決定
シトリルＣｏＡシンテターゼ大サブユニット遺伝子をクローニングするため、大サブユニットのＮ末アミノ酸配列に基づき、配列番号７で表される配列をもつオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。このオリゴヌクレオチドをプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、Hydrogenobacter thermophilus TK-6ゲノムライブラリをスクリーニングしたところ、約2.7kbのSac I断片と、約3.8kbのEco RI断片が得られた。得られた遺伝子断片の全塩基配列を両方向から決定したところ、この２つの遺伝子断片は重なりあっており、シトリルＣｏＡシンテターゼ大サブユニット遺伝子の全長が含まれていることが明らかになった（図２a）。得られた遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１に、それを翻訳して得た蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２４】
シトリルＣｏＡシンテターゼ小サブユニット遺伝子をクローニングするため、小サブユニットのＮ末アミノ酸配列に基づき、配列番号８で表される配列をもつオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。このオリゴヌクレオチドをプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、Hydrogenobacter thermophilus TK-6ゲノムライブラリをスクリーニングしたところ、約2.1kbのHind III断片が得られた。得られた遺伝子断片の全塩基配列を両方向から決定したところ、シトリルＣｏＡシンテターゼ小サブユニット遺伝子の全長が含まれていることが明らかになった（図２b）。得られた遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号３に、それを翻訳して得た蛋白質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２５】
図２の(a)は、Hydrogenobacter thermophilus TK-6由来シトリルＣｏＡシンテターゼ大サブユニット遺伝子（ccsA）周辺の制限酵素地図を示す。遺伝子上流には別に２つのオープンリーディング（orf2、orf3）が見い出された。図中HはHind IIIサイトを、PはPst Iサイトを示す。図２の(b)は、Hydrogenobacter thermophilus TK-6由来シトリルＣｏＡシンテターゼ小サブユニット遺伝子（ccsB）周辺の制限酵素地図を示す。遺伝子の上流と下流には、別のオープンリーディング（orf4、orf5）の一部が見出された。
【００２６】
（実施例３）：シトリルＣｏＡシンテターゼの諸性質
シトリルＣｏＡシンテターゼ活性は、200mMHEPES-KOH (pH7.5)、100mMヒドロキシルアミン、20mMクエン酸、10mM塩化マグネシウム、10mM２−メルカプトエタノール、5mMATP、5mMCoAを含む反応液200μl中７０℃で測定した。CoAを除く反応液をガラス製小試験管に入れ、７０℃で２分間プレインキュベートした後、CoAを加えて反応を開始した。７０℃で１０分間反応した後、小試験管を氷冷して反応を停止させ、ここに200μｌの２０％トリクロロ酢酸と、60μｌの2M塩化第二鉄溶液を加え、生成したヒドロキサム酸を520nmの吸収で定量した。検量線は、既知濃度のアセチルＣｏＡを用いて作成した。１分間に１μmolのシトリルヒドロキサム酸を生成させる酵素量を、１ユニットの活性と定義した。
【００２７】
Hydrogenobacter thermophilus TK-6から精製したシトリルＣｏＡシンテターゼの比活性は31.3U/mgであった。ＡＴＰに対するKm値は0.777mM、ＣｏＡに対するKm値は0.335mM、クエン酸に対するKm値は2.53mMであり、Vmax値は39.9U/mgであった。酵素活性の至適ｐＨは6.5-8.5であった。ＡＴＰの代わりにＧＴＰを用いた場合の比活性は1.12U/mgであった。本酵素は極めて耐熱性が高く、８０℃で１０分間熱処理を施しても、活性の減少は見られなかった。クエン酸以外にも、イソクエン酸、シスーアコニット酸、トランスーアコニット酸を基質とすることができた。D,L-イソクエン酸に対するKm値は2.12mM、Vmax値は4.46U/mgであり、シスーアコニット酸に対するKm値は2.21mM、Vmax値は1.82U/mgであった。
【００２８】
（実施例４）：酵素反応産物の精製と同定
100mMBicine-KOH（pH8.0）、20mMクエン酸、10mM塩化マグネシウム、5mMATP、5mMCoAから成る反応液5mlにHydrogenobacter thermophilus TK-6から精製したシトリルＣｏＡシンテターゼ44μgを加え、７０℃で９０分間インキュベートした。反応後、反応液をSP−トヨパールカラム（東ソー社製、ベッド容積25ml、3mMHClで平衡化）に通してマグネシウムイオンを除去することにより、反応を停止させた。ＳＰ−トヨパールの素通り画分を、DEAE-トヨパールカラム(東ソー社製、ベッド容積76ml、20mMLiCl/3mMHClで平衡化)にかけ、20mMLiCl/3mMHCl-200mMLiCl/3mMHClグラジエント(5ベッド容積)によって溶出し、4ml/本ずつのフラクションに分画した。各フラクション中のシトリルＣｏＡ濃度をブタ由来シトレートシンターゼ（シグマ社製）を用いて測定したところ、シトリルＣｏＡはフラクション８６〜９１に含まれていた。測定結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
フラクション８６〜９１をまとめ（合計24ml）、ここにアスパラギン酸カリウム12.3mg（終濃度3mM）を加え、凍結乾燥した。凍結乾燥物を0.5mlの水に溶解し、セファデックスG-10カラム(ベッド容積20ml、1mMHClで平衡化)にかけ、0.7ml/本ずつのフラクションに分画した。各フラクション中のシトリルＣｏＡ濃度を測定したところ、シトリルＣｏＡはフラクション９〜１２に含まれていた。測定結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
2005168395.tif 000004
【００３２】
フラクション９〜１２をまとめ、凍結乾燥し、精製シトリルＣｏＡとした。精製シトリルＣｏＡを水に溶解して100pmol/μｌの濃度としたもの1μｌと、マトリックス（10mg/mlのα−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸）溶液1μｌとを混和して乾燥したものを、MALDI-TOF MS分析にかけたところ、943.87という値を得た。この値はシトリルＣｏＡの分子量＋１とほぼ一致しており、本酵素の反応産物がシトリルＣｏＡであることが証明された。なお、図３は、上記反応産物をMALDI-TOF MS分析した結果を示すマススペクトルである。縦軸は相対強度、横軸は分子量を示す。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
シトリルＣｏＡは、シトレートシンターゼやＡＴＰシトレートリアーゼなどの酵素反応の反応中間体と考えられており、生体内代謝で非常に重要な位置を占めている。シトレートシンターゼやＡＴＰシトレートリアーゼの反応中間体としてのシトリルＣｏＡは、酵素に強固に結合した形で存在し、酵素に結合したシトリルＣｏＡが遊離することはない。このように、シトリルＣｏＡは重要な生体内代謝物質でありながら、遊離な形でシトリルＣｏＡを得ることは困難であった。本発明は、シトリルＣｏＡを合成する反応を触媒する酵素を初めて見出したものであり、本酵素を用いて効率的にシトリルＣｏＡを合成する方法を提供するものである。本発明により、容易にシトリルＣｏＡが得られるようになれば、生体の代謝を解明する上で大いに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】：実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図。
【図２】(a)：実施例２におけるシトリルＣｏＡシンテターゼ大サブユニット遺伝子（ccsA）周辺の制限酵素地図。(b)：実施例２におけるシトリルＣｏＡシンテターゼ小サブユニット遺伝子（ccsB）周辺の制限酵素地図。
【図３】実施例４におけるMALDI-TOF MS分析した結果を示すマススペクトル。
【図１】
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【図２】
2005168395.tif 000006
【図３】
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【配列表】
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