(57)【要約】【課題】短期間で被検化学物質の感作性強度をより正確に決定することができる方法を提供する。【解決手段】（１）感作性強度が既知の基準化学物質を所定濃度に溶解した基準溶液（Ａ）と、基準溶液（Ａ）と同一濃度で被検化学物質を溶解した被検溶液（Ｂ）とを調製する工程と、（２）対照用試験動物群に上記調製した溶液（Ａ）を、被検用試験動物群に溶液（Ｂ）を塗布する工程と、（３）各試験動物の耳介リンパ節を採取し、各耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標を測定する工程と、（４）対照用試験動物群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標と、被検用試験動物群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標との相対比較により、被検化学物質の感作性強度を評価する工程とを有する被検化学物質の感作性強度の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）感作性強度が既知の基準化学物質を所定濃度に溶解した基準溶液（Ａ）と、基準溶液（Ａ）と同一濃度で被検化学物質を溶解した被検溶液（Ｂ）とを調製する工程と、
（２）対照用試験動物群に上記調製した溶液（Ａ）を、被検用試験動物群に溶液（Ｂ）を塗布する工程と、
（３）各試験動物の耳介リンパ節を採取し、各耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標を測定する工程と、
（４）対照用試験動物群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標と、被検用試験動物群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標との相対比較により、被検化学物質の感作性強度を評価する工程
とを有する被検化学物質の感作性強度の評価方法。
【請求項２】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節質量である請求項１に記載の感作性強度の評価方法。
【請求項３】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節細胞数である請求項１に記載の感作性強度の評価方法。
【請求項４】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節に取込まれたＲＩ標識化合物量である請求項１に記載の感作性強度の評価方法。
【請求項５】
細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節に取込まれたＢｒｄＵ量である請求項１に記載の感作性強度の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検化学物質の感作性強度を評価する方法に関する。詳細には、感作性強度が既知の基準化学物質と被検化学物質とをそれぞれ試験動物群に投与した後、試験動物の耳介リンパ節を採取し、細胞増殖程度を比較することにより被検化学物質の感作性強度を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは現代病として社会問題になっており、化学物質によって誘発されるアレルギーを事前に予測することは生物環境の見地から極めて重要な課題となっている。
【０００３】
アレルギーの原因となる感作性物質をスクリーニングする方法としては、ギニーピッグマキシミゼーションテスト（Ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）、ビューラーテスト（Ｂｕｅｈｌｅｒ  ｔｅｓｔ）等の皮膚感作性試験がある。これらの皮膚感作性試験は試験動物を用いて遅延性過敏症の発症を観測するものであって、動物飼育期間だけでも１ヶ月以上を要し、代替試験法の開発が要求されている。
【０００４】
近年では、ローカルリンフノードアッセイ（Ｌｏｃａｌ  Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ（ＬＬＮＡ）、非特許文献１参照）が開発され、従来の皮膚感作性試験とともに用いられるようになっている。ＬＬＮＡは、試験動物に化学物質を投与した後、リンパ節を採取して細胞増殖の程度を評価することにより化学物質の感作性を評価する方法である。この方法は初回抗原刺激によるリンパ球の増殖を利用する方法で、アレルギー反応の初期段階を検出するため、従来の皮膚感作性試験と比較して短期間で行うことができる。
【非特許文献１】武吉正博等，トキシコロジー  レターズ，119, 203-208 (2001). (Takeyoshi, M. et al., Toxicology Letters, 119, 203-208 (2001).)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来用いられているＬＬＮＡは、被検化学物質を溶解した被検溶液の調製に用いる溶媒のみを塗布した動物群を対照群とし、対照群に対して３倍の活性を示す被検溶液の濃度（ＥＣ３）を求め、ＥＣ３の値から被検化学物質の感作性強度を決定する方法が提案されている。
【０００６】
しかしながら、この方法により求めたＥＣ３の値は試験毎の変動が大きく、同じ化合物に対しても動物の系統の差や、感作性強度を評価する指標により変動するため、再現性良く被検化学物質の感作性強度を求めることが困難である。
【０００７】
従って、本発明の目的は、短期間で被検化学物質の感作性強度をより正確に決定することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は鋭意研究の結果、溶媒ではなく既知の感作性強度を有する基準化学物質を溶解した基準溶液を対照群に投与し、被検溶液を投与した群と基準溶液を投与した対照群の感作による細胞増殖程度を相対比較することにより、正確に再現性良く被検化学物質の感作性強度を決定することができることを見出し本発明を完成するに到った。
【０００９】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。
【００１０】
〔１〕  （１）感作性強度が既知の基準化学物質を所定濃度に溶解した基準溶液（Ａ）と、基準溶液（Ａ）と同一濃度で被検化学物質を溶解した被検溶液（Ｂ）とを調製する工程と、
（２）対照用試験動物群に上記調製した溶液（Ａ）を、被検用試験動物群に溶液（Ｂ）を塗布する工程と、
（３）各試験動物の耳介リンパ節を採取し、各耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標を測定する工程と、
（４）対照用試験動物群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標と、被検用試験動物群の耳介リンパ節の細胞増殖程度を示す指標との相対比較により、被検化学物質の感作性強度を評価する工程
とを有する被検化学物質の感作性強度の評価方法。
【００１１】
〔２〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節質量である〔１〕に記載の感作性強度の評価方法。
【００１２】
〔３〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節細胞数である〔１〕に記載の感作性強度の評価方法。
【００１３】
〔４〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節に取込まれたＲＩ標識化合物量である〔１〕に記載の感作性強度の評価方法。
【００１４】
〔５〕  細胞増殖程度を示す指標が、リンパ節に取込まれたＢｒｄＵ量である〔１〕に記載の感作性強度の評価方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、感作性強度が既知の基準化学物質を投与した群を対照群として被検化学物質の感作性強度を決定するため、試験毎のばらつきや、測定方法、使用する動物等の違いによるばらつきが少なく、より正確に被検化学物質の感作性強度を決定することができる。本発明は、アレルギーの原因となる感作性物質をスクリーニングする方法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に用いる基準化学物質としては、ヒトや他の動物種において感作性強度が既知の物質あるいは感作性強度が決定できる物質であって、試験動物に適度に感作するものであれば制限なく使用できる。基準化学物質としては、例えばヒトに対して軽度から中等度の感作性強度を有するα−ヘキシルシンナミックアルデヒド、イソオイゲノール、ヒトに対して強度の感作性強度を有する２，４−ジニトロクロロベンゼン等を挙げることができる。
【００１７】
基準化学物質又は被検化学物質を溶解する溶媒としては、例えばアセトン・オリーブ油混液、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアルデヒド、メチルエチルケトン、プロピレングリコール、ジメチルスルホキサイド等を挙げることができる。
【００１８】
本発明の評価方法は、以下の手順で行う。
【００１９】
まず感作性強度が既知の基準化学物質を溶解した基準溶液と、被検化学物質を溶解した被検溶液とを調製する。基準溶液と被検溶液の濃度は同一濃度とし、溶解させる溶媒も同じものとする。これらの溶液の濃度は使用する基準化学物質の感作性強度により、適度な増殖反応、例えば媒体のみを投与した場合に比べて３倍程度の増殖反応を引き起こす濃度を選択することが好ましい。
【００２０】
次いで、調製した基準溶液又は被検溶液を、それぞれ対照用試験動物群又は被検用試験動物群の試験動物の耳介に、１日１〜数回程度（好ましくは１日１回）、１〜５日間（好ましくは３日間）塗布する。
【００２１】
試験動物に基準化学物質又は被検化学物質を投与し、所定期限が経過した後、試験動物の耳介リンパ節を採取して細胞増殖程度を示す指標を測定し、被検化学物質の感作性強度を評価する。投与後、耳介リンパ節を採取するまでの期間としては、通常１〜７日程度が好ましい。更に、試験動物群として基準化学物質及び被検化学物質を溶解する溶媒を塗布する動物群を用意することにより、より誤差の少ない評価を行うことができる。細胞増殖程度を示す指標としては公知のものを制限なく用いることができるが、例えば、耳介リンパ節に取り込まれた標識化合物量、耳介リンパ節質量、耳介リンパ節総細胞数、リンパ節内の特定の細胞集団の細胞数やその割合等を挙げることができる。
【００２２】
耳介リンパ節に取り込まれた標識化合物量を指標とする場合には、試験動物に予め標識化合物を投与し、標識化合物の投与から数時間〜数日経過した後、試験動物の耳介リンパ節を採取して標識化合物量を測定する。標識化合物の投与は、腹空内投与、静脈内投与とすることが可能で、浸透圧ポンプを使用してもよい。標識化合物としては、リンパ球数の増加とともに試験動物の耳介リンパ節に取り込まれる化合物であって、耳介リンパ節に取り込まれた量が測定可能なものであればいずれの化合物を用いることもできる。標識化合物としては、例えば、3Ｈ−チミジンや125Ｉ−ヨードデオキシウリジン等のＲＩ標識化合物等を挙げることができる。また、ＥＬＩＳＡ法により定量可能な５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）やフローサイトメーター等により検出可能なカルボキシフルオレセインスクシイミジルエステル（ＣＦＳＥ）等の蛍光基質も標識化合物として使用できる。更に、リンパ節内の特定の細胞集団を染色するＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体等の蛍光標識抗体も標識化合物として使用できる。
【００２３】
被検化学物質の感作性強度は、対照用試験動物群の細胞増殖程度を示す指標と、被検用試験動物群の細胞増殖程度を示す指標との相対比較により行う。相対比較は被検化学物質の感作性強度が、既知の基準化学物質のいずれかに相当することを示す表示で評価することができる。
【００２４】
また、細胞増殖程度を示す指標から増殖刺激指数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ、ＳＩ）を算出し、ＳＩ値の相対比較を行ってもよい。例えば、細胞増殖程度を示す指標としてＢｒｄＵ量の取り込み量を選択する場合、次式によりＳＩ値が算出できる。被検溶液と基準溶液のＳＩ値の相対比較から被検化学物質のヒトあるいは試験動物における感作性強度が推定できる。
【００２５】
ＳＩ＝ ｍ ／ ｍ0
ｍ：被検溶液又は基準溶液を投与した試験動物の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量
ｍ0：溶媒のみを投与した試験動物の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量
【実施例１】
【００２６】
基準化学物質としてヒトに対して軽度から中等度の感作性強度を有するα−ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）を溶媒（アセトン／オリーブ油混液（ｖ／ｖ＝４：１））に溶解して、２５質量％の濃度の基準溶液を調製した。更に、表１に示す被検化学物質を基準溶液と同じ溶媒に溶解して同濃度の被検溶液を調製した。
【００２７】
８週令の雌性マウス（ＣＢＡ／ＪＮ  Ｃｒｊ）を４匹／群に分け、各群のマウスの耳介に基準溶液、被検溶液、又は溶媒を塗布した。溶液の塗布は両耳介にそれぞれ１日１回２５μＬずつとし、３日間行った。試験開始から４日後、０．５ｍＬ／匹のＢｒｄＵ（１０ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内投与した。
【００２８】
ＢｒｄＵを投与して２４時間経過した後、各個体の耳介リンパ節を採取し脂肪組織を取り除いた後、耳介リンパ節を一匹分ずつ生理食塩液に入れてすりつぶし、セルストレーナ（ＦＡＬＣＯＮ  ２３５０，ＦＡＬＣＯＮ社製）で濾過した。その後、各個体の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量を市販の測定キットＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ（ベーリンガー・マンハイム社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。各群の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量の平均値を求め、溶媒のみを投与した溶媒対照試験動物群の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量に対する対照用試験動物群及び被検用試験動物群の耳介リンパ節に含まれるＢｒｄＵ量の比をとり、ＳＩ値を算出した。結果を表１に示す。
【００２９】
表  １
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物質名                 ＳＩ        標準誤差
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ＨＣＡ（基準化学物質）   ２．０８      ０．３８
アニリン                 １．３８      ０．０９
シナミックアルデヒド     ３．７６      ０．３２
シトラール               ３．３９      ０．４５
m−アミノフェノール      ２．９５      ０．２５
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表１の結果を基にＨＣＡと各被検化合物のＳＩ値の相対比較から、アニリンはＨＣＡより感作性強度が低く、ヒトに対して極軽度あるいは感作性を有しないものと推定される。他の３つの被検化学物質は、ＨＣＡと同等あるいはそれ以上の感作性強度、即ちヒトに対して軽度から中等度ないしはそれ以上の感作性強度を有すると推定される。