(57)【要約】【課題】  定量的PCRによる微生物又は遺伝子の定量法において、DNAの回収率が低く且つ夾雑物が多く含まれるような試料に対しても定量精度を確保できる定量法等を提供する。【解決手段】  本発明は、被検試料から標核酸試料を回収し、該核酸試料を鋳型とする定量的PCRを行い、前記被検試料中に存在する標的微生物又は遺伝子を定量する方法であって、前記核酸試料の回収の工程と、前記定量的PCRの工程とで少なくとも２種以上の異なる標準物質を用いることを特徴とする方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料から核酸試料を回収し、該核酸試料を鋳型とする定量的PCRを行い、前記被検試料中に存在する標的微生物又は遺伝子を定量する方法であって、
前記核酸試料の回収の工程と前記定量的PCRの工程とで少なくとも２種以上の異なる標準物質を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記標的微生物又は遺伝子の指標となる標的核酸を増幅するためのプライマーを使用する定量的PCR法において、
前記PCR法の増幅率標準物質として、前記核酸試料中に、前記プライマーの標的部位とは異なる第三のプライマー標的部位が付加された核酸断片を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅率標準物質を異なる濃度で含む核酸試料を鋳型とし、それぞれに前記第三のプライマー標的部位に対する第三のプライマーを使用してPCRを行うことを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法に使用する増幅率標準物質の製造方法であって、
標的微生物又は遺伝子に由来する核酸試料を鋳型とし、それらの指標となる標的核酸を増幅するためのプライマーを使用してPCRを行い、さらに、該PCRの増幅産物を鋳型とし、前記プライマーにこれとは異なる第三のプライマーを連結させた連結プライマーを使用してPCR法を行うことを含む方法。
【請求項５】
前記回収工程の回収率標準物質として、前記被検試料中に、前記標的微生物又は遺伝子とは異なる第三の微生物又は遺伝子を添加し、これらの指標となる第三の標的核酸を増幅するためのプライマーを使用してPCRを行うことを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記第三の標的核酸を増幅するためのPCR法の増幅率標準物質として、前記第三の標的核酸を増幅するためのプライマーとは異なる第三のプライマー標的部位が付加された核酸断片を使用することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第三の標的核酸を増幅するためのPCR法において、前記増幅率標準物質を異なる濃度で含む核酸試料を鋳型とし、それぞれに前記第三のプライマー標的部位に対する第三のプライマーを使用してPCRを行うことを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法に使用する標準物質の製造方法であって、
前記第三の微生物又は遺伝子に由来する核酸試料を鋳型とし、それらの指標となる第三の標的核酸を増幅するためのプライマーを使用してPCRを行い、さらに、該PCRの増幅産物を鋳型とし、前記プライマーにこれとは異なる第三のプライマーを連結させた連結プライマーを使用してPCRを行うことを含む方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により求められる標的核酸の定量値に対し、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法により求められる第３の標的核酸についての回収率を適用し、試料における標的微生物又は遺伝子の存在量を決定する、標的微生物又は遺伝子の定量方法。
【請求項１０】
前記被検試料が、土壌、地下水、河川、湖沼、海水、排水、ヘドロ、汚泥又は活性汚泥に由来する試料である、請求項１〜３、５〜７、又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜３、５〜７、又は９のいずれか１項に記載の方法を実施するための定量評価用キットであって、前記増幅率標準物質、前記回収率標準物質又はそれら標準物質を作成するための試薬等、及び必要なプライマーを含むキット。
【請求項１２】
生物処理プロセスを制御するための生物処理制御装置であって、生物処理槽から試料を自動的にサンプリングするサンプリングユニット、サンプリングされた試料に請求項１〜３、５〜７、又は９のいずれか１項に記載の定量法を適用して標的微生物又は遺伝子を定量するDNA定量ユニット、生物処理槽内の条件をコントロールする条件制御ユニット、前記DNA定量ユニットで得られた定量値に基づいて条件制御ユニットを制御するコントロールユニットを具備する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、定量的PCR法による微生物または遺伝子の定量法、この手法を原理とする微生物または遺伝子の定量キット及び生物処理制御ユニット等に関し、より詳しくは、DNAの回収率が低く且つ夾雑物が多く含まれるような高精度な定量評価が困難な試料に対しても有効な定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
PCR法による微生物の定量評価において、外部標準または内部標準を用いた様々な手法が利用されている。外部標準法（Heid他：Genome Res.：6：986‐994(1996)：非特許文献１）では標的微生物の精製DNAまたは利用可能な標準DNAを単独で遺伝子増幅する事で検量線を作成し定量解析する手法が汎用されている。本手法ではDNA回収率が高い、又は一定であり、PCR反応に対する阻害物質が少ない試料では有効な手法であるが、土壌の様にDNAの吸着性が高く、夾雑物質を多く含む試料を対象とする場合にはDNAの回収率が評価されず、更に標準物質と標的遺伝子の増幅効率の違いを補正する事ができないため正確な定量評価は困難である。
【０００３】
また、内部標準法（Gilliland他：Proc.Natl.Acad.Sci.USA：87：2725‐2729(1990)：非特許文献２）では、PCR後の増副産物が標的DNAの増副産物との区別が可能な鋳型DNAを標準物質として試料DNAに加え、両DNAを同時に増幅させる事で試料に由来する夾雑物質の影響を回避できる定量評価が可能となった。さらに本手法では、標準物質をDNA抽出前の試料に直接添加する事で、DNA回収率を補正した定量評価も実施可能となった。
【０００４】
【非特許文献１】Heid他：Genome Res.：6：986‐994(1996)
【非特許文献２】Gilliland他：Proc.Natl.Acad.Sci.USA：87：2725‐2729(1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、標準物質をDNA抽出前の試料に添加する方法では、未知濃度の試料を定量評価に供するための検量線の作成に、多くのチューブからDNA抽出を行う必要がある。例えば、標的微生物が103〜10８程度存在すると予想される場合、オーダーレベルの検量線を作成する場合でも１検体あたり7本のチューブからDNA抽出する必要がある。PCR法によるDNAの定量評価の工程において、試料からのDNAの抽出・精製は操作が最も煩雑となり、長時間を要する工程であるため、1検体の定量評価に多数のDNA抽出を伴う手法は、汎用性に乏しい手法であった。この様に試料からのDNA回収率を決定し、PCR反応による定量評価において夾雑物質の影響を受けずに定量性を確保し、且つ操作が煩雑なDNA抽出工程の作業負荷が少ない定量手法の確立が望まれていた。
【０００６】
上記のような事情に鑑み、本発明は、PCR反応による微生物または遺伝子の定量評価において、DNAの回収率が低く且つ夾雑物が多く含まれるような通常高精度な定量評価が困難な試料に対しても定量精度を確保でき、特に1試料あたりのDNA抽出処理検体数が１検体でも評価が可能である定量法を提供すること、さらには、当該手法を原理とする微生物または遺伝子の定量キット及び生物処理制御ユニット等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、PCR法による標的微生物または核酸の定量評価において、最も汎用性の高い外部標準法および内部標準法による定量評価手法の改良研究を行い、その結果、DNAの抽出・精製におけるDNAの回収率を求める工程と、PCRによる標的遺伝子の定量評価を行う工程で異なる複数の標準物質を使用することにより夾雑物質の影響を受けずに定量性を確保でき且つDNA抽出工程の作業負荷が少ない手法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、被検試料から核酸試料を回収し、該核酸試料を鋳型とする定量的PCRを行い、前記被検試料中に存在する標的微生物又は遺伝子を定量する方法であって、
前記核酸試料の回収の工程と前記定量的PCRの工程とで少なくとも２種以上の異なる標準物質を用いることを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法の一態様は、前記標的微生物又は遺伝子の指標となる標的核酸を増幅するためのプライマーを使用する定量的PCR法において、
前記PCR法の増幅率標準物質として、前記核酸試料中に、前記プライマーの標的部位とは異なる第三のプライマー標的部位が付加された核酸断片を用いることを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の方法の他の一態様は、前記増幅率標準物質を異なる濃度で含む核酸試料を鋳型とし、それぞれに前記第三のプライマー標的部位に対する第三のプライマーを使用してPCRを行うことを含む。
【００１１】
また本発明は、上記の方法に使用する増幅率標準物質の製造方法であって、
標的微生物又は遺伝子に由来する核酸試料を鋳型とし、それらの指標となる標的核酸を増幅するためのプライマーを使用してPCRを行い、さらに、該PCRの増幅産物を鋳型とし、前記プライマーにこれとは異なる第三のプライマーを連結させた連結プライマーを使用してPCR法を行うことを含む方法を提供する。
【００１２】
本法の他の一態様は、前記回収工程の回収率標準物質として、前記被検試料中に、前記標的微生物又は遺伝子とは異なる第三の微生物又は遺伝子を添加し、これらの指標となる第三の標的核酸を増幅するためのプライマーを使用してPCRを行うことを含む。
【００１３】
上記の本法の態様は、さらに、前記第三の標的核酸を増幅するためのPCR法の増幅率標準物質として、前記第三の標的核酸を増幅するためのプライマーとは異なる第三のプライマー標的部位が付加された核酸断片を使用することを含んでもよい。
【００１４】
また上記の本法の態様は、前記第三の標的核酸を増幅するためのPCR法において、前記増幅率標準物質を異なる濃度で含む核酸試料を鋳型とし、それぞれに前記第三のプライマー標的部位に対する第三のプライマーを使用してPCRを行うことを含んでもよい。
【００１５】
また本発明は、上記方法に使用する第三の微生物又は遺伝子のための増幅率標準物質の製造方法であって、
前記第三の微生物又は遺伝子に由来する核酸試料を鋳型とし、それらの指標となる第三の標的核酸を増幅するためのプライマーを使用してPCRを行い、さらに、該PCRの増幅産物を鋳型とし、前記プライマーにこれとは異なる第三のプライマーを連結させた連結プライマーを使用してPCRを行うことを含む方法を提供する。
【００１６】
また本発明は、上記いずれかの標的微生物又は遺伝子の定量方法により求められる標的核酸の定量値に対し、上記いずれかの第三の標的微生物又は遺伝子の定量方法により求められる第３の標的核酸についての回収率を適用し、試料における標的微生物又は遺伝子の存在量を決定する、標的微生物又は遺伝子の定量方法を提供する。
【００１７】
上記の被検試料は、土壌、地下水、河川、湖沼、海水、排水、ヘドロ、汚泥又は活性汚泥に由来する試料であることができる。
さらに本発明は、上記いずれかの方法を実施するための定量評価用キットであって、前記増幅率標準物質、前記回収率標準物質、又はそれら標準物質を作成するための試薬等、及び必要なプライマー等を含むキットを提供する。
【００１８】
さらに本発明は、生物処理プロセスを制御するための生物処理制御装置であって、生物処理槽から試料を自動的にサンプリングするサンプリングユニット、サンプリングされた試料に、上記いずれかの定量法を適用して標的微生物又は遺伝子を定量するDNA定量ユニット、生物処理槽内の条件をコントロールする条件制御ユニット、前記DNA定量ユニットで得られた定量値に基づいて条件制御ユニットを制御するコントロールユニットを具備する装置を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
図１は、本発明の定量法の好ましい態様を示す工程図である。この方法は、先ず標的菌体を含む被検試料からDNA抽出工程及びDNA精製工程を経て精製DNAを取得し、次いで、精製DNAを鋳型にして定量的PCR法を行い、その結果から標的菌体数に関する定量評価を行う方法であって、DNAの回収率を求めるための標準物質として標的以外の微生物（第三の微生物）を利用し、PCRによる定量評価のための標準物質として標的核酸以外の合成DNA（検出用プライマーとは異なる第三のプライマーにより増幅される核酸）を利用する。
【００２０】
標準試料とすべき第三の微生物は、標的微生物に類縁であるが、PCRで特異的に検出できる微生物を使用するが、被検試料中にもともと存在しない微生物から選択するのが好ましい。また、定量評価用合成DNA（以下増幅率標準物質とも称する）としては、好ましくは標的核酸と同じ配列を有するが、標的核酸とは別個に特異的に検出できるプライマー標的配列を有する核酸断片を使用する。
【００２１】
具体的な定量評価法は、標的核酸についてのPCR定量値から標的菌体数（濃度）を逆算的に求めるものである。すなわち、PCRにより増幅した標的核酸量に当該PCRでの増幅率をかけて、増幅前の量、つまり鋳型核酸中の標的核酸量を求める。次いで、この標的核酸量に回収率をかけて初期試料中の標的核酸量を求め、この標的核酸の数を１菌体あたりの当該標的核酸のコピー数で割って得た値を、試料中の菌体数とすることができる。
【００２２】
PCRの増幅率の評価は下記のように行われる。
先ず、標的微生物の指標となる検出対象領域（標的核酸）を選定する。これは当該PCRによって選択的に増幅される領域であり、好ましくは当該標的微生物に特異的な部分配列を標的としたプライマー対の選定により決定される。プライマーの標的とすべき配列は、当該技術分野の常法に従って16SrRNAや23SrRNA等の核酸配列から選定することができ、好ましくは、被検試料に存在する他の微生物群集内にあっても特異的な検出を可能にする部位である。
【００２３】
他方、増幅率標準物質としては、上記検出対象領域を含み、その両端に上記検出用プライマー標的部位とは異なる第三のプライマー標的部位を有する核酸断片を使用する。
上記のように標的核酸領域を含むが、第三のプライマー標的部位を有する増幅率標準物質は、上記検出用プライマーに第三のプライマーを連結した連結プライマーを使用して容易に製造することができる(図２参照)。すなわち、先ず標的微生物に由来する精製DNAを鋳型とし、検出用プライマー対を使用してPCR(I)を行い、標的核酸の増幅核酸断片を取得し、さらにこの増幅核酸断片を鋳型とし、前記検出用プライマー対の非対向末端（通常は各５′末端側）に、第三のプライマーを付加した構成の連結プライマーを使用してPCR(II)を行う。こうして、標的核酸と同じ配列を有し、各端部に第三のプライマー標的部位を有する核酸断片が増幅される。第三のプライマーは、試料中の生物群由来の核酸にはハイブリダイズしない合成DNAでよい。第三のプライマー標的部位を有する前記標準物質は、第三のプライマーを用いたPCR(III)により選択的に増幅され、このPCR反応を利用して検量線を作成することができる。
【００２４】
前記増幅率標準物質による評価は、１つの精製DNA試料を用いて次のように行うことができる。試料から抽出された精製DNA試料を分けて、それぞれに増幅率標準物質を種々の濃度で添加し、複数の鋳型試料を用意する。それぞれの鋳型試料について第三のプライマーを使用した定量的PCRを行い、それらの結果から濃度に対する増幅率の検量線を作成する。実際には鋳型試料に含まれる標的核酸の濃度は未知であるから、被検試料についてのPCRでの増幅結果を前記検量線に当てはめることで適正な増幅率を適用し、増幅前の正確な標的核酸量（濃度）を求めることができる。本法によれば、標的核酸の増幅率を同じ配列構成を有する標準物質を用いて内部評価することにより定量精度を確保でき、しかも１つの精製DNA試料から検量線を得ることができるので、未知濃度の標的微生物に対して必要最小限の精製作業で定量評価を行うことができる。
【００２５】
次に、DNA回収率による評価について説明する。
本法では、回収率を調べるために、被検試料中に回収率標準物質として、標的微生物とは異なる第三の微生物を特定濃度で添加し、定量的PCRを行う。つまり、第三の微生物について同様の試料からの同様の工程による回収率を求め、この回収率を標準微生物の回収率として適用し、初期試料中の標的微生物数を正確に決定することができる。
【００２６】
回収率は、第三の微生物を添加した試料から得られた核酸試料を鋳型とし、第三の微生物の指標となる第三の標的核酸を選択的に増幅できるプライマーを使用して定量的PCRを行い、第三の標的核酸についての計算上の菌数定量値と実際の添加量とを比較することにより求められる。第三の標的核酸領域は、当該PCRによって選択的に増幅される領域であり、好ましくは第三の微生物に特異的な部分配列を標的としたプライマー対の選定により決定される。プライマーの標的とすべき配列は、当該技術分野の常法に従って、16SrRNAや23SrRNA等の核酸配列から選定することができ、好ましくは、被検試料に存在する他の微生物群集内で特異的な検出を可能にする部位である。
【００２７】
さらに、上記第三の微生物の回収率を求めるに際し、上記定量的PCR法に対して標的微生物と同じように増幅率の検量線を求めるとよい。この場合、増幅率標準物質として、前記第三の標的核酸を含み、その両端に当該検出用プライマー標的部位とは異なる第三のプライマー標的部位を有する核酸断片を使用する。
【００２８】
第三の標的核酸のための増幅率標準物質も、上述の標的微生物と同様の方法で製造でき、当該第三の標的核酸の検出用プライマーに第三のプライマーを連結した連結プライマーを使用して製造する(図２参照)。すなわち、第三の微生物に由来する精製DNAを鋳型とし、先ず検出用プライマー対を使用してPCR(I)を行い、第三の標的核酸の増幅核酸断片を取得し、次いでこの増幅核酸断片を鋳型とし、前記検出用プライマー対の非対向末端（通常は各５′末端側）に、第三のプライマーを付加した構成の連結プライマーを使用してPCR(II)を行う。こうして増幅した核酸断片は、第三の標的核酸と同じ配列を有し、各端部に第三のプライマー標的部位を有する。第三のプライマーは、試料中の生物群由来の核酸にハイブリダイズしない合成DNAがよい。なお、ここで利用する第三のプライマーは、上述標的微生物の場合と同じ配列のものを使用しても構わない。第三のプライマー標的部位を有する当該標準物質は、第三のプライマーを用いたPCR(III)により選択的に増幅され、このPCR反応を利用して検量線を作成することができる。
【００２９】
前記第三の微生物についての定量評価に際しても、１つの精製DNA試料を用いて増幅率を求めることができる。すなわち、精製DNAを分けて、それぞれに上記増幅率標準物質を種々の濃度で添加して複数の鋳型試料を用意し、それぞれの鋳型試料について上記第三のプライマーを使用した定量的PCR法を行い、それらの結果から、当該PCRでの第三の標的核酸について増幅率の検量線を作成できる。こうして増幅前の当該第三の標的核酸の量を簡易かつ正確に決定し、回収率の正確な算定を行うことができる。
【００３０】
以下では、増幅率評価及び回収率評価の双方が適用された本法の一態様を示す。
先ず、被検試料に特定濃度の第三の微生物を添加し、DNAの抽出及び精製工程を行い、精製DNAを鋳型試料として第三の標的核酸を標的とするプライマーを使用してPCRを行う。平行して同じ鋳型試料に種々の濃度で増幅率標準物質（当該第三の標的核酸に第三のプライマー標的部位を有する核酸断片）を添加した系を用意し、それぞれに同じ条件のPCRを行う。その結果得られた検量線に基づいて増幅前（当該精製DNA試料中）の第三の標的核酸の量を決定する。この核酸定量値から推定される計算上の菌数と実際の添加菌体数とを比較し、ここで必要であれば当該核酸のコピー数等を考慮に入れ、その比率を第三の微生物についてのDNA回収率とする。
【００３１】
別個に、標的微生物について特異的な定量的PCRを行う。ここで平行して、精製DNA試料に種々の濃度で増幅率標準物質（当該標的核酸に第三のプライマー標的部位を有する核酸断片）を添加した系を用意し、それぞれに同じ条件のPCRを行い、その結果得られた検量線に基づいて増幅前（当該精製DNA試料中）の標的核酸の量を求める。この核酸定量値に対し上記で得られた回収率を当てはめ、必要ならば当該核酸のコピー数等を考慮に入れ、当該標的微生物の初期試料中の菌体数を算定することができる。
【００３２】
以上の説明においては特定微生物の定量法を例示したが、微生物に代えて遺伝子を標的にすれば、上記と同様にして特定遺伝子の定量を行うことができる。
また上記定量法を容易に実施できるように、必要とされる各検出用プライマー、各標準物質若しくは標準物質の調製用試薬類、及び対応する第三のプライマー等をセットにして、微生物又は遺伝子の定量評価用キットを提供することができる。
【００３３】
次に、本発明の定量法を実施するための装置の一態様を説明する。
本発明の装置の好ましい一態様は、汚泥発酵槽等の生物処理プロセスの監視ないし制御に向けられている。そのような生物処理制御装置は、生物処理槽から試料を自動的にサンプリングするサンプリングユニット、サンプリングされた試料に本発明の定量法を適用して標的微生物又は遺伝子を定量するDNA定量ユニット、DNA定量ユニットにより得られた定量値に基づいて前記生物処理の運転パラメータについての変更を行う条件制御ユニット、前記各ユニットを制御するコントロールユニットなどにより構成される（図４参照）。この種の装置は、当該技術分野において市販されている各種自動分析手段を汎用のコンピュータ制御手段と組み合わせることで構築でき、コンピュータ制御によってDNA抽出、PCR、データの記憶、定量のための演算及びその出力などを自動的に処理することができる。
【００３４】
上記生物処理制御装置では、コントロールユニットは、DNA定量ユニットを介して生物処理槽内の環境的条件、例えば特定微生物の菌体数等をモニタリングし、そのモニタリング結果に基づいて条件制御ユニットを作動させて、運転パラメータを最適化するための処理、例えば微生物の添加等を実行する。また本発明の装置は、菌体数以外の環境要因を検出する他の分析手段と組み合わせてもよく、生物処理プロセスに対するあらゆる制御、診断に有効である。
【実施例】
【００３５】
下記の実施例では、外部標準法による事例を示すが、本発明はこれに限定されるものではなく、内部標準法による評価法にも適用可能である。
【００３６】
実施例１
［被検体］
砂質土壌、シルト質土壌および粘土の3種類の土壌にそれぞれ大腸菌B株の培養菌体を土壌湿重量あたり５×１０6個添加し、これを被検体とした。
【００３７】
［DNA抽出］
氷上にて、2.0ml容マイクロテストチューブに検体0.5 gを入れ、DNA回収率評価用標準物質としてBachillus subtilis IAM 12118株の培養菌体を１×１０6個添加し、DNA抽出を行った。100 mMリン酸バッファー（pH8.0）を0.5 ml、直径0.1 mmのzirconia /silica beadsを0.5 g、TNSE buffer（0.5 M Tris-HCl pH 8.0、0.1 M NaCl、10 % SDS、2 mM EDTA）を250μl添加後、3 min間のミニビーズビーター（BIOSPEC PRODUCTS）処理を行った。15,000 rpm×3 minの遠心処理後、上清を新しいチューブに移し、40 ％量の7.5 M酢酸アンモニウムと混合後、4℃にて10 min間放置した。遠心処理後の上清を新しいチューブに回収し、2倍量のイソプロパノールを混合後10 min間放置した。室温にて15,000 rpm×10 minの遠心処理後、上清を取り除き、沈殿物を80 ％エタノールにて2回洗浄した。沈殿物を遠心濃縮機で乾燥後、1 mg/ml濃度のRNaseを添加したTE buffer 50μlに懸濁した試料を40℃にて1時間処理したものを抽出DNAとした。
【００３８】
［DNAの精製］
アガロース濃度1.2 ％にて抽出DNAの電気泳動を行った。電気泳動槽はMupid（コスモバイオ）を使用し、抽出DNAの全量を泳動に供した。100 Vにて20 min間の通電後、DNAの蛍光象を観察しながら染色体DNAの先端部分（約4 kbのサイズに相当）にRECOCHIP（タカラ）を挿入し、再び40 min間の通電を行った。泳動後RECO CHIPを付属のテストチューブに移し、10秒間の遠心処理によりDNAを回収し、滅菌水で50μlに調製した。PCR反応にはこの精製DNA溶液を1／10希釈したものを使用した。
【００３９】
［PCRプライマ］
PCR反応に以下の配列のプライマを使用した。
【００４０】
【化１】
2005168408.tif 000002
【００４１】
［標準物質の調製］
図２に標準物質の調製方法等を示す。大腸菌の染色体DNA50ngを含むPCR反応液50μl（プライマEcl62fおよびEcl238r）を調製し、DNA  Thermal  Cycler（パーキンエルマ‐シータス社製）により95℃２分間の熱変性の後、94℃‐15秒、59℃‐30秒、72℃‐60秒のサイクルを30回行った。さらに、増副産物の10万倍希釈液を５μl含むPCR反応液50μl（プライマST-Ecl62fおよびST-Ecl238r）を調製し、前記と同様のPCRサイクルを30回行った。PCR増副産物にWizard SV Gel and PCR Clean-up System（プロメガ）を用いた簡易精製を施したものを大腸菌定量評価用の標準物質Ｅとした。標準物質の濃度は260nmの吸光度から求めた。
【００４２】
Bachillus subtilisの染色体DNAから標準微生物定量評価用の標準物質Ｂを前記の大腸菌と同様の手順で作成した。但し、1回目のPCRプライマとして Bsb79fおよびBsb230r、2回目のプライマとしてST-Bsb79fおよびST-Bsb230rを用いた。
【００４３】
［DNA回収率の評価］
PCR反応は酵素キットとしてFastStart DNA Mster SYBR Green I（ロッシュ）を用い、増幅装置としてLightCyclerTM（ロッシュ）を使用した。反応容器のガラスキャピラリーにキット添付のマスターミックス液を2μl、鋳型DNAとして被検DNAを5μl、最終濃度で3.5mMのMgCl2、0.5μMのプライマBsb79fおよびBsb230rを添加後キットに付属の滅菌水で20μlの液量に調製し、95℃10分間の熱変性の後、95℃‐15秒、59℃‐10秒、72℃‐20秒、84℃‐0秒のサイクルを45回行った。また、前記のPCR条件にBachillus subtilisの染色体DNAのPCR産物より調製した標準微生物定量評価用の標準物質ＢをPCR反応あたり１×１０1、１×１０2、１×１０3、１×１０4、１×１０5、１×１０６コピー添加した系を調製し、検量線を作成した。この場合、プライマとしてST-fおよびST-rを用いた。
【００４４】
LightCyclerTMによる解析結果より、砂質土壌、シルト質土壌および粘土におけるBachillus subtilisの標的遺伝子コピー数はそれぞれ１．４×１０７、５．０×１０６、４．４×１０５コピー／g‐soilとなった。Bachillus subtilis の標的遺伝子のコピー数は10個であることから、DNA抽出、精製工程における砂質土壌、シルト質土壌および粘土でのDNA回収率はそれぞれ68％、25％および2.2％であった。
【００４５】
［標的微生物の定量評価］
PCR反応は酵素キットとしてFastStart DNA Mster SYBR Green Iを用い、増幅装置としてLightCyclerTMを使用した。MgCl2の最終濃度を3.8mM、プライマとしてEcl62fおよびEcl238rを使用した以外は全て上記のPCR手順と同様に実施した。また、大腸菌の染色体DNAのPCR産物より調製した大腸菌定量評価用の標準物質ＥをPCR反応あたり１×１０1、１×１０2、１×１０3、１×１０4、１×１０5、１×１０6コピー添加した系を調製し、検量線を作成した。この場合、プライマーとしてST-fおよびST-rを用いた。
【００４６】
LightCyclerTMによる解析結果に標的遺伝子と標準物質の増幅効率の比、試料の希釈倍率等の係数を乗じた結果、砂質土壌、シルト質土壌および粘土における大腸菌の標的遺伝子コピー数はそれぞれ２．５×１０７、８．２×１０６、および７．４×１０５コピー／g‐soilとなった。大腸菌の標的遺伝子のコピー数は７個であり、初期検体中の大腸菌数はそれぞれ３．５×１０６、１．２×１０６、および１．１×１０５細胞／g‐soilとなる。このように土質により標的遺伝子または微生物の定量値は大きく異なるが、先に求めたDNA回収率で補正すると５．１×１０６、４．７×１０６、および４．８×１０６細胞／g‐soilとなった。このように本発明による標的微生物の定量法では、1つの試料につき1検体のDNA抽出処理で、試料中における初期濃度５．０×１０６細胞／g‐soilに対して精度の高い結果を得る事ができた。
【００４７】
比較例１（従来法１）
［被検体］
砂質土壌、シルト質土壌および粘土の3種類の土壌にそれぞれ大腸菌B株の培養菌体を土壌湿重量あたり５×１０6個添加し、これを被検体とした。
【００４８】
［DNA抽出］
氷上にて、2.0ml容マイクロテストチューブに検体0.5 gを入れDNA抽出を行った。100 mMリン酸バッファー（pH8.0）を0.5 ml、直径0.1 mmのzirconia /silica beadsを0.5 g、TNSE buffer（0.5 M Tris-HCl pH 8.0、0.1 M NaCl、10 % SDS、2 mM EDTA）を250μl添加後、3 min間のミニビーズビーター（BIOSPEC PRODUCTS）処理を行った。15,000 rpm×3 minの遠心処理後、上清を新しいチューブに移し、40 ％量の7.5 M酢酸アンモニウムと混合後、4℃にて10 min間放置した。遠心処理後の上清を新しいチューブに回収し、2倍量のイソプロパノールを混合後10 min間放置した。室温にて15,000 rpm×10 minの遠心処理後、上清を取り除き、沈殿物を80 ％エタノールにて2回洗浄した。沈殿物を遠心濃縮機で乾燥後、1 mg/ml濃度のRNaseを添加したTE buffer 50μlに懸濁した試料を40℃にて1時間処理したものを抽出DNAとした。
【００４９】
［DNAの精製］
アガロース濃度1.2 ％にて抽出DNAの電気泳動を行った。電気泳動槽はMupid（コスモバイオ）を使用し、抽出DNAの全量を泳動に供した。100 Vにて20 min間の通電後、DNAの蛍光象を観察しながら染色体DNAの先端部分（約4 kbのサイズに相当）にRECOCHIP（タカラ）を挿入し、再び40 min間の通電を行った。泳動後RECO CHIPを付属のテストチューブに移し、10秒間の遠心処理によりDNAを回収し、滅菌水で50μlに調製した。PCR反応にはこの精製DNA溶液を1／10希釈したものを使用した。
【００５０】
［PCRプライマ］
PCR反応に以下の配列のプライマを使用した。
【００５１】
【化２】
2005168408.tif 000003
【００５２】
［標準物質の調製］
Bachillus subtilis IAM 12118株の染色体DNAを定法（モルキュラクローニングに記載の方法）に従って抽出・精製し、そのDNAを鋳型DNAとした。PCR反応は酵素キットとしてEX‐Taq  HotStart  Ver.（宝酒造）を用いた。0.2ml容のマイクロテストチューブにキット添付のマスターミックス液を5μl、鋳型DNAを50ng、0.5μMのプライマBsb79fおよびBsb230rを添加後キットに付属の滅菌水で50μlの液量に調製し、DNA  Thermal  Cycler（パーキンエルマ‐シータス社製）により95℃２分間の熱変性の後、94℃‐15秒、59℃‐30秒、72℃‐60秒のサイクルを30回行った。PCR増副産物は直ちにWizard SV Gel and PCR Clean-up System（プロメガ）を用いた簡易精製を施し、定量評価用の標準物質とした。標準物質の濃度は260nmの吸光度から求めた。
【００５３】
［標的微生物の定量評価］
PCR反応は酵素キットとしてFastStart DNA Mster SYBR Green I（ロッシュ）を用い、増幅装置としてLightCyclerTM（ロッシュ）を使用した。反応容器のガラスキャピラリーにキット添付のマスターミックス液を2μl、鋳型DNAとして被検DNAを5μl、最終濃度で3.8mMのMgCl2、0.5μMのプライマEcl62fおよびEcl238rを添加後キットに付属の滅菌水で20μlの液量に調製し、95℃10分間の熱変性の後、95℃‐15秒、59℃‐10秒、72℃‐20秒、84℃‐0秒のサイクルを45回行った。また、前記のPCR条件にBachillus subtilisの染色体DNAのPCR産物より調製した標準物質をPCR反応あたり１×１０1、１×１０2、１×１０3、１×１０4、１×１０5、１×１０６、１×１０７コピー添加した系を調製し、検量線を作成した。この場合、プライマーとしてBsb79fおよびBsb230rを用い、MgCl2の最終濃度を3.8mMとした。
【００５４】
LightCyclerTMによる解析結果に試料の希釈倍率等の係数を乗じた結果、砂質土壌、シルト質土壌および粘土における大腸菌の標的遺伝子コピー数はそれぞれ２．９×１０７、７．３×１０６、および６．７×１０５コピー／g‐soilとなった。大腸菌の標的遺伝子のコピー数は７個であり、初期検体中の大腸菌数はそれぞれ４．１×１０６、１．０×１０６、および９．６×１０４細胞／g‐soilと評価された。本実施例では、試料中における標的微生物の初期濃度５．０×１０６細胞／g‐soilと比較すると、試料の性状によって大きな誤差を生じた。
【００５５】
比較例２（従来法２）
［被検体］
砂質土壌、シルト質土壌および粘土の3種類の土壌にそれぞれ大腸菌B株の培養菌体を土壌湿重量あたり５×１０6個添加し、これを被検体とした。
【００５６】
［DNA抽出］
氷上にて、2.0ml容マイクロテストチューブに検体0.5 gを分取したものを1検体あたり合計７本準備し、定量評価用標準物質としてBachillus subtilis IAM 12118株の培養菌体を１×１０３個〜１×１０８個まで10倍濃度ずつ段階的に添加したものおよび無添加のものを調製し、DNA抽出を行った。それぞれのテストチューブに、100 mMリン酸バッファー（pH8.0）を0.5 ml、直径0.1 mmのzirconia /silica beadsを0.5 g、TNSE buffer（0.5 M Tris-HCl pH 8.0、0.1 M NaCl、10 % SDS、2 mM EDTA）を250μl添加後、3 min間のミニビーズビーター（BIOSPEC PRODUCTS）処理を行った。15,000 rpm×3 minの遠心処理後、上清を新しいチューブに移し、40 ％量の7.5 M酢酸アンモニウムと混合後、4℃にて10 min間放置した。遠心処理後の上清を新しいチューブに回収し、2倍量のイソプロパノールを混合後10 min間放置した。室温にて15,000 rpm×10 minの遠心処理後、上清を取り除き、沈殿物を80 ％エタノールにて2回洗浄した。沈殿物を遠心濃縮機で乾燥後、1 mg/ml濃度のRNaseを添加したTE buffer 50μlに懸濁した試料を40℃にて1時間処理したものを抽出DNAとした。
【００５７】
［DNAの精製］
アガロース濃度1.2 ％にて抽出DNAの電気泳動を行った。電気泳動槽はMupid（コスモバイオ）を使用し、抽出DNAの全量を泳動に供した。100 Vにて20 min間の通電後、DNAの蛍光象を観察しながら染色体DNAの先端部分（約4 kbのサイズに相当）にRECOCHIP（タカラ）を挿入し、再び40 min間の通電を行った。泳動後RECO CHIPを付属のテストチューブに移し、10秒間の遠心処理によりDNAを回収し、滅菌水で50μlに調製した。PCR反応にはこの精製DNA溶液を1／10希釈したものを使用した。
【００５８】
［PCRプライマ］
PCR反応に以下の配列のプライマを使用した。
【００５９】
【化３】
2005168408.tif 000004
【００６０】
［標的微生物の定量評価］
PCR反応は酵素キットとしてFastStart DNA Mster SYBR Green I（ロッシュ）を用い、増幅装置としてLightCyclerTM（ロッシュ）を使用した。検量線作成用の微生物を添加せずにDNA抽出を行った試料では、反応容器のガラスキャピラリーにキット添付のマスターミックス液を2μl、鋳型DNAとして被検DNAを5μl、最終濃度で3.8mMのMgCl2、0.5μMのプライマEcl62fおよびEcl238rを添加後キットに付属の滅菌水で20μlの液量に調製し、95℃10分間の熱変性の後、95℃‐15秒、59℃‐10秒、72℃‐20秒、84℃‐0秒のサイクルを45回行った。また、検量線作成用の微生物を添加した試料の場合、プライマとしてBsb79fおよびBsb230rを用い、MgCl2の最終濃度を3.5mMに変更した条件でPCR反応を行い、検量線を作成した。LightCyclerTMによる解析結果に試料の希釈倍率を乗じた結果、砂質土壌、シルト質土壌および粘土における大腸菌数はそれぞれ３．３×１０６、３．７×１０６、および３．１×１０６細胞／g‐soilとなった。検量線作成に用いたBachillus subtilis IAM 12118株の標的遺伝子のコピー数は10個、また大腸菌の標的遺伝子のコピー数は7個であることから、初期検体中の大腸菌数はそれぞれ４．７×１０６、５．３×１０６、および４．４×１０６細胞／g‐soilと評価された。このように初期試料に標準物質を加える定量評価法では正確な評価が可能であるが、一連の工程の中でもっとも操作が煩雑なDNA抽出・精製に多量の検体処理を行う必要があった。
【００６１】
下記表１と図３に実施例１、比較例１及び２の特徴と結果をまとめた。これらの結果から明らかなように、実施例１の方法によれば、１本の抽出サンプルから簡便且つ正確に被検微生物を定量することができる。
【００６２】
【表１】
2005168408.tif 000005
【００６３】
実施例２（遺伝子組換体を用いた排水のリン除去試験）
［生物処理制御装置の構成］
図４は、本実施例の生物処理制御装置の概略構成を模式的に示す。本装置は、生物処理プロセスを構成するリン除去槽から活性汚泥の一定量を自動的に採取するサンプリングユニット（１）、DNA回収率補正用の標準微生物を活性汚泥に添加してDNA抽出及び精製を行い、次いで精製DNAに定量評価用の後記標準物質（合成DNA）を添加して定量的PCRを行う自動定量ユニット（２）、処理条件の最適化を実行するための処理条件制御ユニット（３）、及び、前記各ユニット（１）〜（３）を自動制御するためのコントロールユニット（４）からなる。
【００６４】
［試験］
供試微生物：リン蓄積能を増強した遺伝子組換体、E.coli MV1184(pBC29＋pEP02.2)（Hardoyo他、(1994)Appl Environ Microbiol 60，3485‐3490）をリン除去微生物として使用した。
原水：グルコースを最終濃度0.1％の濃度で添加した人工排水を使用した。表２に人工排水の組成を示す。
【００６５】
【表２】
2005168408.tif 000006
【００６６】
排水処理装置：図５にリン除去処理プロセス装置の構成を示す。0.5Lのリン除去槽（組換え体脱リン槽）には原水が100mL/hの速度で供給された。リン除去槽の後段に汚泥濃縮槽を設け、中空糸膜による固液分離を行った。汚泥返送率は25%に設定した。
【００６７】
本実施例では、前記リン除去槽に対しサンプリングユニット（図示せず）を設置し、該槽内のリン除去微生物であるE.coli MV1184(組換え体微生物；pBC29＋pEP02.2)の濃度を自動モニタリングし、条件制御ユニットとして、培養菌体保存槽からリン除去槽内へポンプにより前記リン除去微生物を自動供給する装置を設置した。コントロールユニット（図示せず）は、前記サンプリングユニットから得られる前記リン除去微生物の濃度を自動モニタリングし、当該微生物の濃度のモニタリング結果に基づいて、必要で有れば前記自動供給装置を作動させ、前記微生物をリン除去槽に自動供給するようになっている。
【００６８】
［試験条件］
試験系１：リン除去槽内の初期リン除去微生物濃度を５×１０８細胞/mLとし、連続処理試験を行った。1日１回の微生物自動モニタリングを行い、リン除去微生物濃度の記録を行った。リン除去微生物の供給は行わなかった。
【００６９】
試験系２：リン除去槽内の初期リン除去微生物濃度を５×１０８細胞/mLとし、連続処理試験を行った。1日１回の微生物自動モニタリングを行い、リン除去微生物の濃度が１×１０８細胞/mL以下になったとき、乾燥重量で25g相当のリン除去微生物を自動供給するように制御した。
【００７０】
［モニタリング条件］
［被検体］
自動サンプリングした汚泥0.5mLを被検体とした。
【００７１】
［DNA抽出と精製］
DNA自動抽出装置により、被検体からDNAを抽出、精製した。
【００７２】
［PCRプライマ］
PCR反応に以下の配列のプライマを使用した。
【００７３】
【化４】
2005168408.tif 000007
【００７４】
［標準物質の調製］
リン除去微生物のプラスミドDNA0.1ngを含むPCR反応液50μl（プライマｐBC29‐Lf1およびｐBC29‐Lr3）を調製し、DNA  Thermal  Cycler（パーキンエルマ‐シータス社製）により95℃2分間の熱変性の後、94℃‐15秒、59℃‐30秒、72℃‐60秒のサイクルを30回行った。さらに、増副産物の10万倍希釈液を5μl含むPCR反応液50μl（プライマST-ｐBCLf1およびST-ｐBCLr3）を調製し、前記と同様のPCRサイクルを30回行った。PCR増副産物にWizard SV Gel and PCR Clean-up System（プロメガ）を用いた簡易精製を施したものをリン除去微生物定量評価用の標準物質Ｅとした。標準物質の濃度は260nmの吸光度から求めた。
【００７５】
Bachillus subtilisの染色体DNA50ngから定量評価用標準物質Ｂを前記のリン除去微生物と同様の手順で作成した（図２参照）。但し、1回目のPCRプライマとして Bsb79fおよびBsb230r、2回目のプライマとしてST-Bsb79fおよびST-Bsb230rを用いた。
【００７６】
［試験結果］
図６及び図７に自動モニタリング結果を示す。
試験系１：図６に示されるようにリン除去微生物の自動モニタリング結果は、試験開始時では５．４×１０８細胞/mLとなり、当該微生物濃度の理論値５×１０８細胞/mLに対して良好な結果が得られた。その後リン除去微生物の濃度は徐々に低下し、試験開始後6日目には１×１０８細胞/mLとなり、15日目のモニタリングでは１×１０７細胞/mLまで低下する様子が観察された。また図７に示されるように本試験における原水のオルトリン酸濃度は約6.0 mg/Lであったが、試験開始後1日目から処理水のオルトリン酸濃度は0.1 mg/Lとなり、その後7日目まで安定した水質が得られた。リン除去微生物濃度が８．５×１０７細胞/mL 以下となった8日目以降、処理水質は徐々に悪化し、15日目の処理水オルトリン酸濃度は3.0 mg/Lとなり、以後同様の水質が維持された。
【００７７】
試験系２：リン除去微生物の自動モニタリング結果は、試験開始時では５．２×１０８細胞/mLとなり、当該微生物濃度の理論値５×１０８細胞/mLに対して良好な結果が得られた（図６）。その後リン除去微生物の濃度は徐々に低下し、試験開始後6日目には１×１０８細胞/mLとなった。ここでリン除去微生物の自動供給が行なわれた結果、7日目のモニタリングでは４．６×１０８細胞/mL となった。その後リン除去微生物の濃度は徐々に低下し、14日目には再び１×１０８細胞/mLとなった。その後20日目までリン除去微生物の濃度は１×１０８細胞/mL 以上を維持した。本試験における原水のオルトリン酸濃度は約6.0 mg/Lであったが、試験開始後1日目から処理水のオルトリン酸濃度は0.1 mg/Lとなり、以後試験を終了する20日目まで安定した水質が維持された（図７）。
【００７８】
上記実施例で示されたように、本法による定量法を利用した微生物自動定量装置では、通常定量評価が困難な環境中の試料でも正確な評価が可能であり、その結果として、生物処理法におけるプロセス管理において、無駄のない最適な条件の維持が可能となる。
【００７９】
なお上で示した廃水処理への適用事例は、本法の適用範囲を限定するものではなく、汚染土壌処理など、生物反応の関与するプロセスであればあらゆる処理プロセスに対して適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、本発明の定量法の一態様を示す工程図である。
【図２】図２は、増幅率標準物質の調製工程を示す図である。
【図３】図３は、実施例１、比較例１及び２で使用されたサンプル数等をまとめた図である。
【図４】図４は、実施例２の生物処理制御装置の概略構成を示す模式図である。
【図５】図５は、実施例２のリン除去処理プロセス装置の構成を示す図である。
【図６】図６は、微生物濃度についてのモニタリング結果を示す線図である。
【図７】図７は、リン酸濃度についてのモニタリング結果を示す線図である。
【符号の説明】
【００８１】
１  サンプリングユニット
２  DNA定量ユニット
３  条件制御ユニット
４  コントロールユニット
【図１】
2005168408.tif 000008
【図２】
2005168408.tif 000009
【図３】
2005168408.tif 000010
【図４】
2005168408.tif 000011
【図５】
2005168408.tif 000012
【図６】
2005168408.tif 000013
【図７】
2005168408.tif 000014
【配列表】
2005168408000001.app