(57)【要約】【課題】  薬物伝送システムにおける新しい薬物担体として、この出願の発明は、新しい薬物担体として薬物の吸着もしくは内包特性と放出特性、特に徐放性の良好なカーボンナノホーン複合体とその製造方法を提供する。【解決手段】  酸化開孔されたのカーボンナノホーンにステロイド系薬物または金属含有の薬物が吸着もしくは内包されている薬物カーボンナノホーン複合体とする。【選択図】  図２
2005343885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化開孔されたカーボンナノホーンにステロイド系薬物または金属含有の薬物が吸着もしくは内包されていることを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体。
【請求項２】
リン酸緩衝食塩水中で前記薬物の徐放性を示すことを特徴とする請求項１の薬物カーボンナノホーン複合体。
【請求項３】
薬物が、融点３００℃以下の化合物であることを特徴とする請求項１または２の薬物カーボンナノホーン複合体。
【請求項４】
ステロイド系薬物が、デキソメタゾンまたはそのエステル誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかの薬物カーボンナノホーン複合体。
【請求項５】
金属含有の薬物がシスプラチンであることを特徴とする請求項１から３のいずれかの薬物カーボンナノホーン複合体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかの薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法であって、酸化開孔されたカーボンナノホーンと薬物とを、極性溶媒と水との混合溶媒中で混合することを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法。
【請求項７】
請求項６の薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法において、酸化開孔されたカーボンナノホーンを予め水素雰囲気下２００〜１８００℃の範囲で熱処理し、その後このカーボンナノホーンと薬物とを、極性溶媒と水との混合溶媒中で混合することを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、薬物伝送システム等に有用な、薬物カーボンナノホーン複合体とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な無機物が薬物伝送システムにおける薬物の担体として活用することが検討されてきている。このような担体として、特にナノ粒子が注目されており、これまでにも、たとえばヒドロキシアパタイト結晶やシリカをベースとしたナノ粒子等が報告されている。
【０００３】
このような状況において、機能性のナノ粒子としてのカーボンナノ粒子への関心が高まっている。フラーレンやカーボンナノチューブ、カーボンナノホーン等である。
【０００４】
このうちのカーボンナノホーン（CNH）は、カーボンナノチューブ生成の研究中に新しいタイプのカーボンナノ粒子としてこの出願の発明者らによって発見された（非特許文献１）。この粒子は、たとえばその直径が約80nmで、大半が円錐キャップ（ホーン）のついたチューブ状のナノ炭素材料が球状に凝集したものであることが拡大透過電子顕微鏡（TEM）像により明らかになっている。個々のホーンは単層のグラファイトシートでできており、完全に閉鎖しており、直径の平均値は2〜3mmと、一般的なカーボンナノチューブの1.4nmよりもはるかに大きい。
【０００５】
また、酸化処理の結果、ホーンの先端または側壁面には穴があき、各種分子が当該穴を通過しホーン内の空間に入り得ることが確認されている（非特許文献２）。これによって、ホーンの内壁をおよび内部空間を物質の捕捉サイトとして利用できるようになるため、酸化処理されていないカーボンナノホーンに比べて表面積が大幅に増大する。実際、N2ガスは酸化処理された単層カーボンナノホーン（SWNHox）の個々のホーンの隙間だけでなく、ホーンの空洞にも吸着もしくは内包される。ホーンの側面および先端の穴の直径は、SWNHoxのTEM像によりそれぞれ1.58nmおよび1.17nmと測定されている。そして、この酸化処理により、SWNHoxの穴の縁には、カルボキシル基やキニン基のような酸素官能基も付加される（非特許文献３−４）。
【０００６】
一方、発明者らは、液体相のフラーレン（C60）が、先端および側壁の開口を通じ
て酸化処理された単層カーボンナノチューブに取り込まれることも報告している（非特許文献５）。
【非特許文献１】Chem. Phys. Lett., 309, 165-170(1999)
【非特許文献２】Langmuir, 18, 4138-4141(2002)
【非特許文献３】J. Phys. Chem., 107, 4479-4484(2003)
【非特許文献４】Chem. Phys. Lett., 321, 292-296(2000)
【非特許文献５】Chem. Phys. Lett., 380,42(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この出願の発明者は、カーボンナノホーン（CNH）とその酸化開孔体（CNHox）についてのこれまでの知見を踏まえ、薬物伝送システムにおける新しい薬物担体としてこれらを活用することを課題とし、検討を進めてきた。すなわち、この出願の発明は、新しい薬物担体として薬物の吸着もしくは内包の特性と放出特性、特に徐放性の良好なカーボンナノホーン複合体とその製造方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この出願は、上記の課題を解決するものとして以下の発明を提供する。
〔１〕酸化開孔されたカーボンナノホーンにステロイド系薬物または金属含有の薬物が吸着もしくは内包されていることを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体。
〔２〕リン酸緩衝食塩水中で前記薬物の徐放性を示すことを特徴とする上記の薬物カーボンナノホーン複合体。
〔３〕薬物が、融点３００℃以下の化合物であることを特徴とする上記の薬物カーボンナノホーン複合体。
〔４〕ステロイド系薬物が、デキソメタゾンまたはそのエステル誘導体であることを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体。
〔５〕金属含有の薬物がシスプラチンであることを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体。
〔６〕上記のいずれかの薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法であって、酸化開孔されたカーボンナノホーンと薬物とを、極性溶媒と水との混合溶媒中で混合することを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法。
〔７〕上記の薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法において、酸化開孔されたカーボンナノホーンを予め水素雰囲気下２００〜１８００℃の範囲で熱処理し、その後このカーボンナノホーンと薬物とを、極性溶媒と水との混合溶媒中で混合することを特徴とする薬物カーボンナノホーン複合体の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
この出願の発明によれば、薬物伝送システムにおける薬物の担体として活用することができる、薬物の吸着もしくは内包特性と放出特性、特に徐放性の良好な、新しいカーボンナノホーン複合体とその簡便な製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１１】
この出願の発明の薬物カーボンナノホーン複合体においては、「薬物」とは、医薬もしくは動物薬等を指す。そして、これらは、いわゆるステロイド系の薬物であるか、あるいは金属含有の薬物である。このような薬物は、この出願の発明では、酸化開孔されたカーボンナノホーンに吸着もしくは内包されている。
【００１２】
ここで酸化開孔されたカーボンナノホーンとは、この出願の発明者らが開発してきた方法に従って、凝集体としてのカーボンナノホーンを酸化処理することで開孔されたものを意味している。
【００１３】
酸化処理時の条件の選択によって、開孔の度合、たとえばその数や大きさ、表面性状を変化させ、薬物の吸着もしくは内包の特性や放出能を制御することが可能になる。
【００１４】
また、薬物の放出能の制御は、酸化開孔されたカーボンナノホーンに薬物を吸着もしくは内包させる前に、予めこのカーボンナノホーンを水素雰囲気下２００℃以上の温度で熱処理することによっても可能である。２００℃未満の場合にはその効果が十分でないことがあるため好ましくない。この熱処理温度の上限としては、放出能の制御ができれば特に限定されるものではないが、実際上１８００℃程度が考慮される。
【００１５】
薬物の吸着もしくは内包のための手段としては、酸化開孔されたカーボンナノホーンと薬物とを液相において混合することにより実現される。この場合の液相溶媒としては適宜選択することができ、アルコールや、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトニトリル等の極性溶媒と水との混合溶媒がより好適なものとして考慮される。特にアルコール、なかでもエタノールと水との２０〜８０／８０〜２０（体積比）の混合溶媒を用いて、たとえば５℃〜３０℃程度の温度において混合することが考慮される。
【００１６】
たとえば、この出願の発明においては、酸化開孔されたカーボンナノホーン：CNHoxは、抗炎症薬であるデキサメタゾン（DEX）を吸着もしくは内包し、エタノールとH2Oの1：1の混合物中で193mg/gの最大結合能をもつ。DEX-CNHox複合体は、37℃で、リン酸緩衝食塩水（PBS）中でDEXの徐放性を示す。マウス骨芽MCT3T-E1細胞をDEX-CNHoxで処理すると、MC3T3-E1細胞のアルカリホスファターゼの発現が加速されたが、これはDEXが細胞に及ぼす本質的な作用であり、複合体化したことによって毒性を生じることはなかった。これらの知見より、CNHoxが生体適合性薬物担体として有用であることが初めて示唆される。
【００１７】
酸化開孔されたカーボンナノホーンに薬物が吸着もしくは内包されたこの出願の発明の複合体においては、薬物は、その融点として３００℃以下のものがより好適である。またステロイド系薬物としては、デキソメタゾンまたはそのエステル誘導体が、金属含有薬物としては、抗ガン剤として知られているシスプラチンが代表的な具体例として例示される。
【００１８】
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん以下の例によって発明が限定されることはない。
【実施例】
【００１９】
＜実施例１＞
＜材料および方法＞
１）材料
CNH凝集体（CNH）および酸化多孔性生成物（CNHox）は、前記の報告（非特許文献１−２）に従って生成させた。簡単に述べると、CNHの酸化は、純酸素を流しながら（760Torr）石英チューブ中、580℃、10分間で行った。
【００２０】
デキサメタゾン（DEX）、β-グリセロリン酸、アスコルビン酸、およびSIGMA FAST（登録商標）p-ニトロフェニルリン酸錠セットは、Sigma社より入手した。エタノールはWakoより入手した。［1,2,4-3H］デキサメタゾンは、Amersham Bioscience社より購入した。
遺伝子組み換えヒト骨形態形成蛋白-4（rhBMP-4）は、Genzyme/TECHNE社より入手した。
蛋白質量定量キット（Dc Protein Assay Kit）はBio-Rad社より入手した。ウシ胎児血清（FBS）は、JRH Bioscience社より購入した。α-最少必須培地（α-MEM）、Dulbeccoのリン酸緩衝食塩水（PBS）、およびトリプシン-EDTA（0.05％トリプシン、0.53mM EDTA-4Na）は、Invitrogen社より入手した。ペニシリンおよびストレプトマイシンは、それぞれ萬有製薬および明治製菓より購入した。正常細胞培養皿はIWAKI社より購入した。
２）DEXのCNHoxへの吸着もしくは内包
CNHox（100μg/ml）およびDEX（1000μg/ml）は、エタノール/H2O（50/50）に混合し、この混合物を室温で一夜インキュベートした。混合物を15,000rpｍで5分間遠心分離し、上清を捨てて、デキサメタゾン-CNHox複合体（DEX-CNHox）を残渣として得た。DEX-CNHoxをさらに真空中で一夜乾燥させ、以下のバイオアッセイに供した。3H-標識DEXを、DEXがCNHoxに最大限吸着もしくは内包されるのに必要な浸漬時間、CNHoxおよびCNHのDEXへの最大結合能および親和性を求めるために、また以下に述べるin vitro放出実験用に3H-標識DEX-CNHoxを調製するために用いた。
３）熱重量分析（TGA）
逐次熱重量分析（sequential thermogravimetric analysis）を、Hi-Res TGA 2950 Thermogravimetric analyzer（TA Instruments）を用いて、10℃/分の速度で室温から1000℃まで、100cm3/分の純酸素ガス流量下で実施した。
４）DEXが結合したCNHoxのin vitroでの放出
3H標識DEX-CNHoxは、PBS（0.005wt％）に分散させ、37℃でインキュベートした。適当な時間に、この懸濁液を15,000rpmで5分間遠心分離し、LS6500シンチレーションカウンター（Beckman）を用いて放出された3H-DEX量を測定するために、上清分画を入れた。累積放出実験の場合は、上清の残りを新鮮なPBSで置換して0.005wt％懸濁液とした。3H標識DEX-CNHoxを撹拌装置で速やかに混合して再度分散させ、次の測定まで37℃でインキュベートした。
５）細胞培養
マウス骨芽細胞株（MC3T3-E1）は、T. Imamura博士（癌研究所、財団法人癌研究会）から提供されたものであり、このMC3T3-E1細胞は、α-MEMにおいて、10％FBS、100μg/mlペニシリンおよび100 U/mlストレプトマイシンを用いて維持し、5％CO2および95％空気の加湿した大気中で37℃で連続的に培養し、3〜4日毎に継代した。
６）ALP活性
MC3T3-E1細胞を26,000細胞/cm2で、24穴プレートに入れ、増殖させてコンフルエントな状態にした。次に、培地をα-MEM、5％FBS、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、50μMアスコルビン酸、10mM β-グリセロリン酸、および20ng/ml rhBMP-4からなる分化誘導培地に代え、CNHoxまたはDEX-CNHox（0.2、1、2、10、20μg/ｍl）と組み合わせた。培養物を、さらに10日間インキュベートし、分化誘導培地で培地を3〜4日毎に新しくしたが、細胞に付着したCNHoxまたはDEX-CNHoxを吸引しないように注意を払った。
【００２１】
ALP活性の測定には、培地を除去して、細胞を3回TBS（20mM Tris pH7.4、150mM NaCl）で洗浄した。その後、細胞をかきおとして0.2％ Triton X-100を含有するTBS 250μlに氷上で収集し、氷上で5分間超音波処理をした。細胞溶解産物を15,000rpm、4℃で10分間遠心分離し、上清のアリコートをALPおよび蛋白分析用に取り出した。この上清（50μl）を製造業者の方法にしたがってp-ニトロリン酸と混合し、10分間で放出されたp-ニトロフェノールの量を、モデル550マイクロプレートリーダー（Bio-Rad）を用いて分光光度法（405nm）により測定した。上清の蛋白濃度は、蛋白質量定量キット（Dc Protein Assay Kit）を用いてローリー法により測定した。ALP活性は、p-ニトロフェノール量と総蛋白濃度の比として算出した。
＜結果＞
＜１＞デキサメタゾン（DEX）の酸化単層カーボンナノホーンへの吸着もしくは内包（CNHox）
CNHox上清とDEX溶液を、エタノール/H2O（50/50）に混合し、この混合物を室温で一夜インキュベートした。得られた固体分画を、熱重量質量分析（TGA）に入れた。図１にDEXで処理したCNHox（DEX-CNHox）のTGAプロフィールを示したが、これは100μg/ml CNHoxと1000μg/ml DEXの初期濃度下で調製したものと、CNHoxの場合のものである。5段階のDEX-CNHoxの重量減少が、210、290、330、470および610℃付近でみられた。210および610℃付近の重量減少は、それぞれ溶媒の蒸発およびCNHoxの分解が原因であった。290、330および470℃付近の重量減少は、DEX-CNHoxに特有で、対応する吸熱ピークは純粋なDEXのものとほぼ等しかったことから、DEXがCNHoxに吸着もしくは内包されたことが明確に立証された。CNHoxに吸着もしくは内包されたDEXの総量は、CNHox  1gにつき約150mgであった。
【００２２】
吸着もしくは内包をさらに詳細に評価するために、3H-標識DEXを用いた。浸漬時間の関数としてのCNHoxに吸着もしくは内包されたDEXの量は、インキュベーションの数分以内に飽和した。このように速やかな飽和は、シスプラチンのヒドロキシアパタイト結晶への吸着もしくは内包でもみられた。浸漬時間を減らし、不完全な吸着もしくは内包を避けるために、CNHoxをこの後DEX溶液で最低1時間含浸した。
【００２３】
溶液中に残っている濃度の関数としての吸着もしくは内包されたDEXの量を、エタノール/H2O（50/50）において検討した。図２は、CNHoxまたはCNH（0.1mg/ml）と種々の濃度の3H-標識DEXを含有するDEXをエタノール/H2O（50/50）中で混合した後、一夜インキュベートし、この混合物を遠心分離してDEXを吸着もしくは内包したカーボンナノホーンを残渣として得た後に、CNHoxまたはCNHへのDEXの吸着もしくは内包を、液体シンチレーションカウンターを用いて定量した結果を示したものである。
【００２４】
図中の黒四角はCNHoxを、黒丸はCNHの場合を示している。
【００２５】
この図２に示すように、CNHoxに吸着もしくは内包されるDEXの量は、平衡状態にある溶液中のDEX濃度が増すにつれて増加し、その後上昇がゆるやかになりプラトーとなる。DEXの取り込みは、Langmuirの吸着等温モデルにより表すことができ、以下の関係により定義される：A＝m［S］/（κ+［S］）。A項は吸着量（mg/g）、［S］は平衡濃度（mol/L）、κおよびｍは吸着の親和性および吸着能を反映する定数である。エタノール/H2O（50/50）中のCNHoxのDEXに対する解離定数および最大結合能は、それぞれ2.50×10-4M-1および193mg/gと算出されたのに対して、CNHは2.76×10-3M-1および160mg/gであった。CNHoxのDEXに対する親和性はCNHよりもはるかに強く、CNHoxの最大結合能はCNHと比較して増加が小さいことが分かった。CNHoxのホーンの内側がカーブしていること、およびグラファイトシートの外側が酸化されていることが、以下に示すように、CNHと比較して、CNHoxのDEXに対する親和性が高い原因であると予想される。すなわち、カーボンナノチューブの場合のカーブした内側表面に非常に近い分子で予想されるように、SWNTの内側表面は、開放された先端から侵入した吸着もしくは内包分子に対して、平らなグラファイトのシートよりも強い結合エネルギーを示した。この特性は、CNHoxの内側表面に応用でき、おそらくCNHoxのDEXに対する親和性を増すことになると思われる。一方、CNHは、吸着もしくは内包に利用できる内側表面そのものはもっていない。
【００２６】
CNHおよびSWNTの穴が開くための酸化過程の間に、グラファイトシートの外側表面は種々の酸素官能基、たとえばカルボキシル基、カルボニル基、およびヒドロキシル基などで修飾される（非特許文献３−４）ことが報告されており、また、Arakiらは、ビスフェノールA（2つのヒドロキシル基をもつ疎水性内分泌攪乱物質）が吸着もしくは内包した酸化活性炭（同じように酸化したグラファイトシート）は、酸素官能基をもたない還元した活性炭よりも親和性が高いことを観察している(J.Sur.Sci.Jpn.,23,437-442)。結合は基本的にビスフェノールAと酸化活性炭のグラファイトシートの間の疎水性相互作用により制御されるが、ビスフェノールAのヒドロキシル基と酸化活性炭の外側表面の酸素官能基との間に、H-結合の親和性に及ぼす相互作用があることが示唆されている。そしてDEXのむ場合には疎水性で、CNHoxの酸素官能基とH-結合を形成するヒドロキシル基、カルボニル基およびフッ化物基を含有し、CNHoxの外側表面を酸化することによっても、DEXの親和性を高めることができている。してみると、CNHoxのDEXに対する親和性に影響を及ぼすことができるこれらの2つの要因を考慮することで、CNHoxは適切に修飾することにより薬物に対する親和性を制御できることが留意される。
＜２＞in vitroにおけるDEX-CNHox複合体からのDEXの放出
臨床的有用性を得る際に、薬物担体に薬物の制御放出は不可欠である。37℃でPBS（pH7.4）中におけるDEX-CNHoxからDEXの放出率を図３に示した。すなわち、図３は、37℃でのPBS中DEX-CNHoxからのDEXの累積放出率を示した図であり、3H-標識DEXを用いて調製したDEX-CNHoxは、PBS中に5wt％で分散させた後、37℃でインキュベートし、放出されたPBS中DEXを、液体シンチレーションカウンターを用いて各表示時刻に交換したPBSとともに測定した結果である。各表示時刻までに放出されたDEXの総量は、DEX-CNHox中の総DEXの割合（％）で表した。この図３においては、DEXはPBS中の複合体からゆっくりと放出されることに留意することができる。最初に放出された量は、ほぼインキュベーション時間に比例しており、徐々に放出量が低下してプラトーに達した。DEX-CNHox複合体の最初の量の合計52％が、2週間の終わりまでに放出された。ユニークなCNHoxの表面特性が、DEX-CNHoxからのDEXの制御放出に寄与していると考えられる。
【００２７】
また、37℃でPBS中でDEX-CNHoxを3日間PBSを交換せずにインキュベートしたとき、DEX-CNHoxに結合していたDEXの14％が放出された。この値は、最初の3日間に5回 PBSを交換した累積放出実験でみられた24％よりも低かった（図３）ことから、PBS中のDEX-CNHoxからのDEXの放出の動態は、PBS中のDEXの溶解度（25℃で10mg/100ml H2O）にも影響を受けている可能性がある。
＜３＞in vitroにおけるDEX-CNHox複合体の生物学的活性
次に、DEX-CNHoxのin vitroでの生物学的活性を骨芽MC3T3-E1細胞を用いて検討した。DEXはアルカリホスファターゼ（ALP）（骨形成中の分化マーカーのひとつ）の発現を誘導することが知られている合成糖質コルチコイドである。MC3T3-E1細胞は、骨芽分化および骨形成の強力なプロモータである（20〜22）骨形態形成蛋白（BMP）-2存在下でDEXで処理することによりALPの発現を増大させることが報告されている。図４は、DEX-CNHoxおよびCNHoxがアルカリホスファターゼ（ALP）活性に及ぼす影響を示した図である。
【００２８】
細胞は、5％FBS、50μg/mlアスコルビン酸、10mM β-グリセロリン酸、および20ng/ml rhBMP-4に、DEX（0.01、0.05、0.1、0.5、1μM）、CNHoxまたはDEX-CNHox（0.2、1、2、10、20μg/ml）のいずれかを組み合わせたものを含有するα-MEM中で10日間培養した。培地はCNHoxおよびDEX-CNHoxを追加せずに3〜4日毎に交換した。ALP活性は、p-ニトロフェニルリン酸を用いて測定し、蛋白濃度について正規化し、相対ALP活性を−倍誘導として示した。この図４に示すように、0.05μM以上のDEXを加えてALP活性を上昇させることにより、我々の培養条件でのMC3T3-E1細胞に対するDEXの生物学的活性を確認した。
【００２９】
2μg/mlを超えるDEX-CNHoxで処理することにより、ALP活性が明らかに増大した（図４）。これとは対照的に、CNHoxには、ALP活性に及ぼす有意な影響はなかった。これらの結果から、DEX-CNHoxはDEXの本質的な生物学的活性を示したのに対して、CNHox自体はMC3T3-E1細胞のALP発現に及ぼす作用を阻害しなかったことが明確に立証された。さらに、CNHoxの最大用量（20μg/ml）でさえ細胞毒性はみられなかった。
＜実施例２＞
単層カーボンナノホーン凝集体(CNH)を、酸素ガスを用いて、760Torr、570〜580℃の
温度において15分間加熱した。
【００３０】
得られた酸化開孔されたカーボンナノホーン(CNHox)を水（１mg／ml）中に分散した。一方、シスプラチン（CDDP）粉末（シグマ社）をDMSO、DMFの各々に20mg／mlで溶解した。得られた溶液を、上記のCNHox-H2O分散液に30℃〜100℃の温度において滴下した。
【００３１】
CDDPとCNHoxとの複合体が得られた。この複合体は、濾別した後に130℃の温度で３時間乾燥した。
【００３２】
図５は、この複合体についてのHR-TEM像であり、図６は、その高解像度像である。黒色の粒はCDDPを示しており、CDDPがカーボンナノホーンに内包吸着もしくは内包されていることがわかる。図７はＸ線解析の結果を示したものであって、下がCDDPを、上がCDDP-CNHoxの場合を示し、ｄ＝6.3オングストロームにCDDPの検出ピークが示されている。
＜実施例３＞
単層カーボンナノホーン凝集体(CNH)を、酸素ガスを用いて、760Torr、570〜580℃の
温度において15分間加熱した。
【００３３】
得られた酸化開孔されたカーボンナノホーン(CNHox)1mgをCDDP/DMF溶液（１mg/10mL）に混合した後、DMFを完全に蒸発させてCDDPとCNHoxとの複合体を得た。得られたCDDP-CNHox複合体は、約0.24 mg/mgであった。
＜１＞CDDPのCNHoxへの吸着もしくは内包
図８は、この複合体についてのHR-TEM像であり、図９は、その高解像度像である。黒色の粒はCDDPを示しており、CDDPがカーボンナノホーンに内包吸着もしくは内包されていることがわかる。
【００３４】
上記のCDDP-CNHox複合体を生理食塩水に１０時間浸漬すると、内包されたCDDPクラスターが生理食塩水中に放出された。図１０は、CDDP-CNHox複合体からCDDPクラスターが放出したカーボンナノホーンについてのHR-TEM像であり、図１１は、その高解像度像である。図８、９で観察された黒色の粒（CDDP）がカーボンナノホーン内に観察されなかった。
【００３５】
CDDPが内包されずにCNHの外側にある場合、Ｘ線回折で確認することができる。酸化開孔されていないCNHを用いたときや過剰のCDDPを用いたときには、CNHあるいはCNHoxの外側でCDDPが結晶をつくるためである。図１２はそのＸ線回折結果を示したもので、図中のａはDMFから析出したCDDPを示し、ｂはCNHを用いたときを、ｃは過剰のCDDPを用いたときを示す。これらは、図中の矢印で表されるCDDP特有のピーク強度が大きい。一方、適量のCDDPを用いたとき（ｄ、ｅ）は効率よくCDDPが内包され、矢印で示したCDDPに特徴的なピークの強度は弱くピーク幅も狭い。これは、内包されたCDDPクラスターサイズが小さいためと推測される。
【００３６】
図１３は、CDDP-CNHox複合体からCDDPが生理食塩水中に放出された量を測定した結果である。生理食塩水に浸漬する時間が長くなるにしたがって放出される量が増加していくのがわかる。CNHoxを１２００℃で１時間水素中で処理してからCDDPを内包させたものでは、放出が比較的早いのに対して、CNHoxをそのまま用いた場合には放出速度が著しく遅くなり徐放効果が顕著であった。内包CDDPがすべて放出されると1350ppb（点線）に達する。
＜２＞がん細胞の生存率のin  vitro試験
CNHoxから放出されるCDDPの効果を、WST-1アッセイによって検討した。CDDP-CNHox粉末を、ヒト由来肺ガン細胞NCI-H460に加えた。CDDPは、ヒトの肺ガンに対して効果を発揮する薬物である。この細胞は、5%ウシ胎児血清(FBS)含有のRPMI-1640培養液で、CO2および湿気を含み温度37℃の環境下での培養し、これにCDDP-CNHoxを加えた場合、CDDPを加えた場合、およびCNHoxを加えた場合について、それぞれ検討した。NCI-H460細胞は、4000細胞／ウエルになるように播種して、43時間培養した。また、2500細胞／ウエルになるように播種した場合は、67時間の培養をした（CDDP-CNHox、CDDPの薬物添加は無し）。そして、薬物添加によってH460細胞が死滅することを確認した。H460細胞の死滅した量は、H460細胞の生存を示すformazan（青色色素）の吸光度からその発光強度の減少を観察することで推定した。また、光学顕微鏡を用いてNH460細胞を直接観察した。
【００３７】
図１４は、薬物添加によるNCI-H460細胞の生存率の結果を示した図である（（ａ）は培養時間が46時間、（ｂ）は培養時間が72時間）。図中のA群はCDDPを加えた場合の結果を示しており、加えた量が増えるに従いNCI-H460細胞の生存率が低下した。つまり、加えた量に従いNCI-H460細胞がアポトーシスにより死ぬ効率が高かった。図中のB群はCNHoxを加えた場合の結果で、C群はCDDP-CNHoxを加えた場合の結果を示している。この結果によれば、B群ではその加えた量が増えるに従いNCI-H460細胞の生存率の低下は認められなかったが、C群ではA群と同様にNCI-H460細胞の生存率の低下がみられた。
【００３８】
以上の結果を光学顕微鏡で確認した。この結果を図１５、図１６に示す。
【００３９】
図１５は46時間細胞培養後の結果であり、（ａ）は薬物添加なしの場合、（ｂ）はCNHoxを加えた場合、（ｃ）はCDDP-CNHox（CDDP3.8μM含有）を加えた場合の結果を示す。（ｃ）は（ａ）（ｂ）に比べてNCI-H460細胞が少ないことが確認された。図１６は72時間細胞培養後の結果であり、（ａ）は薬物添加なしの場合、（ｂ）はCNHoxを加えた場合、（ｃ）はCDDP-CNHox（CDDP3.8μM含有）を加えた場合の結果を示す。（ｃ）は（ａ）（ｂ）の結果に比べてNCI-H460細胞の数が著しく少ないことが確認された。これはNCI-H460細胞の増殖が抑えられたことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】10℃/分でCO2気流下のDEX-CNHoxの熱重量分析（TGA）の結果を例示した図である。
【図２】1：1比のエタノールとH2O混合物中のCNHoxおよびCNHによるDEXのLangmuirの吸着もしくは内包等温：吸着もしくは内包されたDEXの量対薬物平衡濃度を示した図である。
【図３】37℃でのPBS中DEX-CNHoxからのDEXの累積放出率を例示した図である。
【図４】DEX-CNHoxおよびCNHoxがアルカリホスファターゼ（ALP）活性に及ぼす影響を例示した図である。
【図５】実施例２におけるCDDP-CNHox複合体のHR-TEM像である。
【図６】実施例２における高解像度のCDDP-CNHox複合体のHR-TEM像である。
【図７】実施例２におけるCDDP-CNHox複合体のＸ線解析の結果を示した図である。
【図８】実施例３におけるCDDP-CNHox複合体のHR-TEM像である。
【図９】実施例３における高解像度のCDDP-CNHox複合体のHR-TEM像である。
【図１０】実施例３において、CDDP-CNHox複合体からCDDPクラスターが放出したカーボンナノホーンのHR-TEM像である。
【図１１】実施例３において、CDDP-CNHox複合体からCDDPクラスターが放出したカーボンナノホーンの高解像度のHR-TEM像である。
【図１２】実施例３におけるＸ線回折の結果を示した図である。
【図１３】CDDP-CNHox複合体からCDDPが生理食塩水中に放出された量を測定した結果である。
【図１４】薬物添加によるNCI-H460細胞の生存率の結果を示した図である（（ａ）は培養時間が46時間、（ｂ）は培養時間が72時間）。
【図１５】46時間細胞培養後のNCI-H460細胞の生存を光学顕微鏡で観察した結果である（（ａ）は薬物添加なしの場合、（ｂ）はCNHoxを加えた場合、（ｃ）はCDDP-CNHox（CDDP3.8μM含有）を加えた場合）。
【図１６】72時間細胞培養後のNCI-H460細胞の生存を光学顕微鏡で観察した結果である（（ａ）は薬物添加なしの場合、（ｂ）はCNHoxを加えた場合、（ｃ）はCDDP-CNHox（CDDP3.8μM含有）を加えた場合）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１２】
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【図１３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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