(57)【要約】  【課題】  本発明が解決しようとする課題は、迅速かつ正確に、ポリヌクレオチド中の一塩基多型あるいは変異の有無を判定する方法を提供することにある。  【解決手段】ポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無を判定する方法であって、前記ポリヌクレオチド中の判定しようとする位置の塩基が特定の塩基（α）である場合には伸長反応が進行し、かつ該塩基が特定の塩基（α）以外である場合には伸長反応が進行しないプライマー（ａ）を使用した核酸増幅反応をマイクロ流体デバイス上で行い、増幅の有無をもって該塩基が特定の塩基（α）であるか否かを判別するポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無を判定する方法であって、
ポリヌクレオチド中の判定しようとする位置の塩基が特定の塩基（α）である場合には伸長反応が進行し、かつ該塩基が特定の塩基（α）以外である場合には伸長反応が進行しないプライマー（ａ）を使用した核酸増幅反応をマイクロ流体デバイス上で行い、増幅の有無をもって該塩基が（α）であるか否かを判別するポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法。
【請求項２】
前記プライマー（ａ）が、その３’末端に前記ポリヌクレオチドの塩基（α）と相補的な塩基を有するオリゴヌクレオチドである請求項1に記載のポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法。
【請求項３】
前記プライマー（ａ）が、その３’末端から５塩基以内に、前記ポリヌクレオチドと非相補的な塩基であって、該ポリヌクレオチドへのアニーリングを実質的に阻害しない塩基を少なくとも１つ有するオリゴヌクレオチドである請求項２に記載のポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法。
【請求項４】
前記マイクロ流体デバイスが、プラスチックからなる請求項１に記載のポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法。
【請求項５】
前記マイクロ流体デバイスが、流路により連結された、核酸増幅反応部分と、ハイブリダイゼーション部分とを有する請求項１〜４のいずれかの請求項に記載のポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーション部分が、核酸増幅反応部分で増幅されたポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチドを有する請求項５に記載のポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、マイクロ流体デバイス内に設けた多孔質層上に固定されている請求項６に記載のポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物学、医学、医療分野において、ポリヌクレオチドの特定位置の塩基における塩基置換、すなわち、一塩基多型（ＳＮＰｓ）が注目を浴びており、疾患や、薬物代謝、薬物反応性などとの相関が徐々に解明されている。そのため、ポリヌクレオチドの特定位置の塩基における塩基置換を検出することによる遺伝子診断など、医療分野に活用しようとする動きが活発化している。
【０００３】
ポリヌクレオチドの特定位置の塩基における塩基置換の有無を判定する方法としては、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などによる核酸増幅反応によってポリヌクレオチドが増幅するか否かを、電気泳動法で検出する方法が一般的に挙げられる。
【０００４】
ＰＣＲ法は、判定の対象であるポリヌクレオチドが微量である場合でも、指数関数的に増幅できる方法として、有用であることが知られている。しかし本方法は、アニーリング、伸長、変性の一連の設定温度の異なる工程を数十回繰り返すため、温度上昇、下降に伴う時間的ロスを生じる。このため増幅には、３０〜１２０分の時間を要し、これを迅速化することが求められていた。また、増幅産物の検出を電気泳動法で行う場合、増幅産物を泳動層に移動させ、ゲル上に展開するといった、煩雑な操作を必要とし、より簡便に検出する方法が求められていた。
【０００５】
これらの欠点を補う方法として、担体上で増幅及びハイブリダイゼーションを行うことによって、標的とするポリヌクレオチドを検出する方法が開示されている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。この方法は、同一の担体上で増幅及び検出を行うため、増幅産物の移動などの煩雑な操作を必要としないが、ＰＣＲ法を利用することから、より迅速な方法が求められていた。
【０００６】
また、ＰＣＲ法を細管内で行うことによって昇温、降温に要する時間を省略し、標的とするポリヌクレオチドを効率よく増幅する方法（例えば、特許文献３参照）や、ミクロな細管を用いたＤＮＡマイクロアレイを利用することによって、ポリヌクレオチドの迅速な増幅及び増幅産物のハイブリダイズを同一のＤＮＡマイクロアレイで行う方法（例えば、特許文献４参照）などが開示されているが、ＳＮＰｓの検出に関する記述はなく、ＳＮＰｓの簡便で、迅速、かつ、正確な検出法は確立されていないのが現状である。
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−５０５４９２号公報
【特許文献２】特開２００３−６１６５６号公報
【特許文献３】特開平６−３０７７６号公報
【特許文献４】特開２００２−３００８７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、迅速かつ正確にポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無を判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、一塩基多型あるいは変異の有無を核酸増幅の有無によって判定できるように工夫されたプライマーを用いた核酸増幅反応をマイクロ流体デバイス上で行うことにより、上記課題を解決しうることを見いだした。
すなわち、本発明はポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無を判定する方法であって、前記ポリヌクレオチド中の判定しようとする位置の塩基が特定の塩基（α）である場合には伸長反応が進行し、かつ該塩基が特定の塩基（α）以外である場合には伸長反応が進行しないプライマー（ａ）を使用した核酸増幅反応をマイクロ流体デバイス上で行い、増幅の有無をもって該塩基が（α）であるか否かを判別するポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無の判定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無を判定する方法は、ポリヌクレオチドが、その特定位置に塩基（α）を有する場合は、伸長反応が進行し、特定位置が（α）以外の塩基に置換されている場合は、伸長反応が進行しないプライマー（ａ）を使用して、該ポリヌクレオチド、ポリメラーゼおよびプライマー（ａ）を用いた核酸増幅反応を温度制御等が迅速かつ正確に行えるマイクロ流体デバイス上で行い、その増幅の有無を検出することから、迅速かつ正確にポリヌクレオチドの一塩基多型あるいは変異の有無を判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法では、ポリヌクレオチドの特定位置の塩基置換が未知であるポリヌクレオチドに対して、特定位置の塩基が（α）であるポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（Ａ）と言う場合がある。）に対しては伸長反応が進行し、特定位置の塩基が（α）以外であるポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（Ｂ）と言う場合がある。）に対しては伸長反応が進行しないように設計されたプライマー（ａ）と、ポリメラーゼとともに、該ポリヌクレオチドの核酸増幅反応をマイクロ流体デバイス上で行う。該ポリヌクレオチドが、特定位置の塩基として（α）を有する場合、核酸増幅反応によってポリヌクレオチドが増幅する。一方、特定位置の塩基として（α）以外の塩基を有する場合、核酸増幅反応が起こらない。この増幅の有無を検出することによって、ポリヌクレオチドの特定位置の塩基における塩基置換の有無を判定することができる。
【００１２】
本発明で言うポリヌクレオチドとは複数のヌクレオチドが重合したものでありその数は特に限定されないが、好ましくは２０個以上、より好ましくは３０個以上、更に好ましくは５０個以上のヌクレオチドが重合したものを称する。また、本発明で判定の対象とするポリヌクレオチドは、全血、血清、糞便由来物、尿等の生体由来物、または、動物、植物、ウイルス由来の細胞組織、細胞培養物、さらには、飲料物、缶詰等の加工食品を含む食品一般等が含有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、これらのポリヌクレオチドを鋳型として予め増幅させたものを、判定対象のポリヌクレオチドとすることもできる。
【００１３】
また、本発明で言う、塩基（α）とは、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシルの５つの塩基のうちのいずれかを称し、特定位置の塩基（α）とは、一塩基多型（ＳＮＰｓ）など、特定位置の塩基を指し、特定位置の塩基が（α）以外であるとは、先に挙げた５つの塩基のうち、（α）以外のいずれかの塩基を称する。
【００１４】
次に、本発明で用いられるプライマー（ａ）について説明する。通常、核酸増幅反応には一対のプライマーが用いられるが、このうち本発明で用いられるプライマー（ａ）は置換の有無を調べようとする特定位置の塩基を含む側のプライマーとして使用する。また、プライマー（ａ）は該特定位置の塩基が（α）であるポリヌクレオチド（Ａ）に対しては核酸増幅反応を進行させ、一方、該特定位置の塩基が（α）以外であるポリヌクレオチド（Ｂ）に対しては核酸増幅反応を進行させない。このような性質を有している限りプライマー（ａ）はその塩基数について特に限定を受けないが、反応進行の効率が高いことから１０〜５０塩基であることが好ましく、１５〜４０塩基であることがより好ましい。
【００１５】
より具体的には、例えば、プライマー（ａ）は、判別対象とするポリヌクレオチドと実質的に相補的で、かつ３’末端が該ポリヌクレオチドの特定位置の塩基（α）と相補的な塩基を有するオリゴヌクレオチド（ａ１）であればよい。この場合、プライマー（ａ）は、ポリヌクレオチドにアニーリングし、該ポリヌクレオチドがポリヌクレオチド（Ａ）の場合は、３’末端が相補的であることから伸長反応が進行するのに対して、該ポリヌクレオチドがポリヌクレオチド（Ｂ）である場合にはアニーリングするが、３’末端が非相補的であることから伸長反応は進行しない。
【００１６】
あるいは、プライマー（ａ）は、３’末端から５塩基以内に、３’末端以外の少なくとも１つの塩基をポリヌクレオチド（Ａ）と非相補的な塩基としたオリゴヌクレオチド（ａ２）であってもよい。但し、前記非相補的な塩基は、前記プライマー（a）がポリヌクレオチド（Ａ）へのアニーリングを実質的に阻害しない塩基である必要がある。この場合、プライマー（ａ２）は、ポリヌクレオチド（Ａ）にアニーリングし、３’末端が相補的であることから伸長反応が進行するのに対して、ポリヌクレオチド（Ｂ）にはアニーリングするが、３’末端、および、３’末端から５塩基以内の少なくとも１塩基、の少なくとも２箇所が非相補的であることから伸長反応はより進行しにくく、その判別が正確かつ明確になる。
【００１７】
あるいはまた、プライマー（ａ）は、
１）ポリヌクレオチド（Ａ）と実質的に相補的であって、
２）３’末端から５塩基以内にポリヌクレオチド（Ａ）の特定位置の塩基（α）と相補的な塩基（β）を有し、
３）３’末端から５塩基以内（但し、３’末端、及び前記塩基（β）以外の位置）に少なくとも１つのポリヌクレオチド（Ａ）と非相補的な塩基を有する
オリゴヌクレオチド（ａ３）であってもよい。
この場合、プライマー（ａ３）は、ポリヌクレオチド（Ａ）にアニーリングし、３’末端が相補的であることから伸長反応が進行するのに対して、ポリヌクレオチド（Ｂ）にはアニーリングするが、３’末端から５塩基以内の少なくとも２つの塩基が非相補的であることから伸長反応は進行しない。
【００１８】
通常、プライマー（ａ）として、オリゴヌクレオチド（ａ１）が好ましく用いられるが、想定外の核酸増幅反応を抑制するために、プライマー（ａ）として、オリゴヌクレオチド（ａ２）、または（ａ３）を好ましく用いることができる。いずれにせよ、特定位置の塩基が（α）であるポリヌクレオチド（Ａ）に対しては、伸長反応が進行し、特定位置の塩基が（α）以外の塩基に置換されているポリヌクレオチド（Ｂ）に対しては伸長反応が進行しないプライマー（ａ）であれば、本発明のプライマーとして使用できる。
【００１９】
また、通常、核酸増幅反応時に使用する一対のプライマーは、等量で用いられるが、そのうちの片方の割合を上げる、いわゆる非対称ＰＣＲを行うこともでき、この場合、増幅産物として一本鎖ポリヌクレオチドが多く得られ、後に述べる検出の際、ハイブリダイゼーションが効率的に行われることから好ましい。
【００２０】
プライマーは、必要に応じて標識物質で修飾されたものを用いることができる。標識部位は、核酸増幅反応に影響がなければ任意の部位でよく、核酸増幅反応に影響が少ない５’末端が好ましい。この場合、標識されたプライマーは、標識されたプライマーが検出用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによるノイズを防ぐために、検出用オリゴヌクレオチドに対して実質的に相補的な配列を含まない方が好ましい。本発明で使用できる標識物質としては、蛍光物質、放射性同位体、ビオチン、酵素、発光団、抗原および抗体などが挙げられる。より具体的には、蛍光物質として、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＥＴ，テキサスレッドなどが、放射性同位体としては、32Ｐ、35Ｓ，14Ｃ等が、また、酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが、発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
【００２１】
本発明で使用されるポリメラーゼは、逆転写酵素や核酸増幅能をもつ酵素であれば任意のものが使用でき、熱安定性のポリメラーゼであることが好ましい。
【００２２】
本発明のマイクロ流体デバイスとは、マイクロ・フルイディック・デバイス、マイクロ・ファブリケイテッド・デバイス、ラボ・オン・チップ、又はマイクロ・トータル・アナリティカル・システム（μ−ＴＡＳ）とも呼ばれるものを指し、流路内で、必要に応じて、流体が温度変化をうける機構、濃度調整される機構、化学反応をうける機構、流動の流速、流動の分岐、混合若しくは分離などの制御をうける機構、又は電気的、光学的な測定をうける機構等を設けた毛細管状の流路を有するデバイスである。
【００２３】
マイクロ流体デバイスは、毛細管状の流路内を流れる流体の精密な温度制御が可能であり、精密な温度制御を必要とする核酸増幅反応、特にＰＣＲをマイクロ流体デバイス上で行うことによって、想定外の増幅を抑制し、目的とするポリヌクレオチドのみを正確に増幅することができる。また、昇温、降温を速やかに行うことができ、目的とするポリヌクレオチドを迅速に増幅することができる。また従来、ＰＣＲ後の増幅産物は、電気泳動装置等を用いて検出しており、煩雑な操作を必要としたり、夾雑物の混入等が起こり得たりしたが、核酸増幅反応と検出とを同一のマイクロ流体デバイス上で行うことによって、迅速、正確、かつ簡便にポリヌクレオチドの特定位置の塩基における塩基置換の有無を判定することができる。
【００２４】
本発明におけるマイクロ流体デバイスの外形は任意であって、核酸増幅反応を行う部分、および増幅の有無を検出する部分を有する。
【００２５】
マイクロ流体デバイス上で核酸増幅反応を行う部分（以下、部分（１）と言う場合がある。）にて核酸増幅反応を行う方法は任意であり、例えばＰＣＲ法を用いることが出来る。部分（１）にてＰＣＲ法を行う方法は任意であり、例えば、ＰＣＲ法のアニーリング・伸長・変性に対応した温度領域を部分（１）に持つ態様が挙げられる。より具体的には、部分（１）全体の温度を、ＰＣＲに必要とされるアニーリング・伸長・変性温度にコントロールすることを繰り返す方法や、部分（１）にアニーリング・伸長・変性温度の３つの温度帯を設け、その温度帯に溶液を通過させる方法が挙げられる。前者の場合、目的の温度に到達するために一定の時間が必要であり、さらに、一定の温度に安定化させるためにも時間が必要であるのに対して、後者の場合、予め温度を設定するために、昇温、降温に要する時間が不要であり、ＰＣＲに要する時間が大きく短縮されることから、より好ましい形態である。
【００２６】
部分（１）を加熱する方法として、部分（１）に１つ以上のヒーターを組み込んで、部分（１）の温度を制御しても、また、部分（１）に１つ以上の外部ヒーターを接触させて部分（１）の温度を制御しても、あるいは、ヒーター以外の方法、例えば、部分（１）に放射線等を放射して加熱して温度を制御しても良い。
【００２７】
部分（１）の形状は任意であるが、部分（１）を外部ヒーターで加熱する場合、部分（１）が外部ヒーター面に対して水平な面を多く持つと、ヒーターからの熱が効率よく部分（１）に伝わるため、好ましい。さらに、判定を行うポリヌクレオチド、ポリメラーゼおよびプライマー（ａ）を含む溶液を部分（１）に導入した際に、該溶液と部分（１）の外部ヒーター面に対して水平な面との距離が小さくなるほうが、さらに効率よくヒーターの熱を該溶液に伝えることが可能となり、好ましい。このような部分（１）としては、例えば上面と底面の大きさが側面に対して非常に大きい面積を持つ空間や、一本の毛細管状の流路を同一平面上で複数回折り曲げたデザインとすればよい。後者の場合、大きな外部ヒーターを用意することが可能であれば、複数回折り曲げなくともよいが、同一平面内で複数回折り曲げるデザインの方が省スペースの観点から好ましい。
【００２８】
また、部分（１）にアニーリング・伸長・変性温度の３つの温度帯を設ける方法として、例えば３つの空間を二つの流路によって連結したものを部分（１）とし中心に位置する空間をアニーリング温度帯として用いるか、３つの異なる温度を持つ３つの外部ヒーターを平行に置き、該外部ヒーターによって構成される平面と平行となるような同一平面上に、一本の毛細管状の流路を該ヒーター上を往復するように複数回折り曲げたものを部分（１）とする方法などが挙げられる。
【００２９】
核酸増幅反応による核酸増幅の有無を判定するために、マイクロ流体デバイス上の流路内に検出部分を有することが好ましい。核酸増幅反応及び特異的増幅の有無の検出を同一のマイクロ流体デバイス上で行えば夾雑物の混入が少なく、また、該検出がハイブリダイゼーションを利用した方法である場合、想定外の誤った増幅が起きてしまっても正確な判定が可能である。更に、ハイブリダイゼーション用のプローブを表面積の大きい多孔質層に固定した場合には検出効率が高まるため、低感度の検出装置でも正確に判定できる。
増幅の有無をマイクロ流体デバイス上で検出する方法は任意であるが、ハイブリダイゼーションで行う場合、マイクロ流体デバイス上にハイブリダイゼーション部分（以下、部分（２）と言う場合がある。）を有することが好ましい。部分（２）には、流路内壁面の少なくとも一部にプローブとしてのオリゴヌクレオチド（Ｃ）が固定されていることが好ましい。オリゴヌクレオチドとは複数のヌクレオチドが重合したものでありその数は特に限定されないが、好ましくは２〜１００個、より好ましくは２〜６０個のヌクレオチドが重合したものである。本発明で使用するオリゴヌクレオチド（Ｃ）は、ポリヌクレオチド（Ａ）からの特異的増幅産物とハイブリダイズ可能であればよく、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチド（Ｃ）は、流路内壁面に物理的、あるいは化学的に固定して用いられる。固定には、公知慣用の任意の方法が使用できるが、例えば、オリゴヌクレオチド（Ｃ）の末端をアミノ基等で修飾し、流路内壁面に設けたアルデヒド基等の官能基と公知の方法で化学的に結合させると、オリゴヌクレオチド（Ｃ）が流路内壁面とより強固に結合し、多孔質層から脱離し難くなることから、より好ましい。
【００３１】
オリゴヌクレオチド（C）の固定量は多い方が検出感度が向上するため好ましい。部分（２）に固定されるオリゴヌクレオチド（C）の量を増加させる方法としては、固定面積を大きくする方法と固定密度を大きくする方法とがある。
【００３２】
固定面積を大きくする方法としては、例えば流路の表面を多孔質層とする方法がある。多孔質層とは、層内に、表面まで連絡し、表面に開口している多数の細孔、即ち、連通細孔を有するものをいう。細孔の形状は任意であり、例えば三次元網目状（スポンジ状）、凝集粒子状、井戸状、不織布や編織布の繊維間状等であり得る。多孔質層は、流路断面全面に形成されていても、また、一部に形成されていてもよく、特に、流路断面が方形である場合、一面のみに多孔質層を有する構造は作製が容易であるため、一面のみの多孔質層で充分な量のオリゴヌクレオチド（Ｃ）が固定できる場合には、一面のみに多孔質層を有する流路が好ましい。
【００３３】
多孔質層の厚みは、０．５μｍ〜３０μｍが好ましく、１μｍ〜２０μｍがさらに好ましく、２μｍ〜１０μｍが最も好ましい。この下限以上とすることで、充分な量のオリゴヌクレオチド（Ｃ）を流路内面に固定可能であり、この上限以下とすることで、分離や分析の時間短縮が図れる。
【００３４】
上記多孔質層の細孔の孔径も任意であるが、０．０５μｍ〜３μｍが好ましく、０．１μｍ〜１μｍがさらに好ましい。この下限以上とすることで、充分な量のオリゴヌクレオチド（Ｃ）が固定可能となる。なお、前記細孔径は、多量に存在する細孔の孔径であり、必ずしも平均径とは限らない。
【００３５】
部分（２）において、オリゴヌクレオチド（Ｃ）と対向する内壁までの平均距離が１〜１００μｍの範囲にあることにより、部分（２）を移動するポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチド（Ｃ）との間に有効にアフィニティーが生じるため、正確なハイブリダイゼーションが可能となる。
【００３６】
核酸増幅反応を行う部分（１）と、ハイブリダイゼーションを行う部分（２）とは流路によって連結されていればよい。核酸増幅反応を行う部分（１）と、部分（２）の数の比率は任意であり、例えば部分（１）に対して部分（２）が複数個連結されていても良い。この場合、部分（１）にすべての部分（２）が直列に連結されていても良いし、並列に連結されていても良い。また、直列と並列とを組み合わせて連結しても良い。流路の断面形状も任意であり、円形状、方形形状等であって構わない。
【００３７】
判別の対象のポリヌクレオチド、ポリメラーゼおよびプライマー（ａ）による増幅の有無をマイクロ流体デバイス上で検出する方法は任意であるが、マイクロ流体デバイス上の部分（２）に固定されているオリゴヌクレオチドへのハイブリダイズの有無を検出する方法が好ましい。ハイブリダイズの有無を検出する方法として、標識されたプライマーを用いた場合は、部分（２）を直接測定し、標識に応じて、例えば、蛍光物質で修飾されたプライマーを用いた場合は、部分（２）の蛍光強度を測定することによって、また、放射性同位体で修飾されたプライマーを用いた場合は、部分（２）の放射線量を測定することによって、それぞれハイブリダイズの有無を検出することができる。この場合、標識されたプライマー自身が蛍光、放射線等を有することから、判別を行うポリヌクレオチド、プライマー（ａ）、ポリメラーゼを含む溶液を部材に必要量流した後、緩衝液等の標識物質を含まない溶液を流し、ハイブリダイズしない標識されたプライマーによるシグナルを拾わないような工程を経ることが好ましい。
【００３８】
また、ハイブリダイズの有無を、部分（２）の放射線量や蛍光強度などを直接測定せずに、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを加熱して解離させ、解離したポリヌクレオチドの放射線量や蛍光強度などを測定することによっても、検出できる。
【００３９】
また、標識されないプライマーを用いる場合は、例えば、部材に導入する溶液中に、サイバーグリーンなどのインターカレーション能力をもつ蛍光物質を予め加えておき、増幅したポリヌクレオチドと、流路内に固定したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる二本鎖ヌクレオチドにインターカレートさせ、部分（２）の蛍光強度を測定することによってハイブリダイズの有無を検出できる。
【００４０】
本発明で用いられる検出装置は、公知慣用の任意のものが使用でき、例えば、標識として蛍光物質、インターカレート剤などを利用する場合は、蛍光物質を励起させ、蛍光強度を測定できる蛍光顕微鏡、マイクロプレートリーダー、蛍光分光光度計などが使用できる。また、標識として放射性物質を利用する場合は、電離箱、ＧM計数管に代表される電離作用を利用したもの、シンチレーション検出器の様な励起作用を利用するものなどが使用できる。
【００４１】
次に、ポリヌクレオチドの特定位置の塩基における塩基置換の有無を判定する方法について説明する。
【００４２】
まず、ハイブリダイゼーションである部分（２）に、ポリヌクレオチド（Ａ）からの特異的増幅産物とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド（Ｃ）が固定されたマイクロ流体デバイスを用意する。該マイクロ流体デバイスの部分（２）に固定されたオリゴヌクレオチド（Ｃ）が一本鎖のオリゴヌクレオチドの場合は、そのまま使用することができる。また、オリゴヌクレオチド（Ｃ）が二本鎖オリゴヌクレオチドの場合は、そのまま使用することもできるが、部分（１）で増幅されたポリヌクレオチドがハイブリダイズする前に解離させて、一本鎖オリゴヌクレオチドとする方が、増幅されたポリヌクレオチドが効果的にハイブリダイズされることから好ましい。次に、判定を行うポリヌクレオチド、プライマー（ａ）、ポリメラーゼを必須とし、必要に応じて、対を成すプライマー、ポリメラーゼ反応の基質となる４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、塩化マグネシウムや塩化カリウムに代表される塩類、トリス（Tris）等の緩衝剤を含む溶液を調製し、該溶液をマイクロ流体デバイスの流路に導入、部分（１）、部分（２）の順に送液する。
【００４３】
該溶液の送液は、送液可能な方法であれば任意であり、例えば、インジェクターを備えたマイクロポンプ、シリンジポンプ等が使用できる。送液速度は、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーションに適した送液速度であれば任意であるが、例えば、ポリヌクレオチドを含む溶液の導入から検出までの一連の操作を、概ね15〜60分で完結させるような速度が好ましい。
【００４４】
部分（１）におけるポリヌクレオチドの増幅は、任意の方法が使用でき、例えば、ＰＣＲ法によって増幅する場合、プライマーの種類、例えばプライマーの長さやＧC含量などによって変動しうるが、通常、90〜95℃で二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを変性し、40〜60℃でプライマーと鋳型ポリヌクレオチドのアニーリングを行い、続いて70〜75℃でポリヌクレオチドの伸長反応を行うというサイクルを20〜50回程度繰り返すと有効である。
【００４５】
部分（２）では、増幅されたポリヌクレオチドが熱により変性し、一本鎖のポリヌクレオチドとなり、多孔質層上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。また、プライマーや副産物等がハイブリダイズされないことが望ましい。このような条件として、例えば、オリゴヌクレオチドの長さやＧC含量などによって変動しうるが、30〜60℃の範囲で最適な温度に設定するのが好ましい。
【００４６】
判定を行うポリヌクレオチドの、特定位置の塩基が（α）である場合、部分（１）で核酸増幅反応が進行し、特定位置の塩基が（α）以外の塩基である場合、部分（１）で核酸増幅反応が進行しない。よって、部分（２）を連続的、もしくは、断続的に検出したとき、増幅が検出された場合は、ポリヌクレオチドの特定位置の塩基が（α）であり、一方、増幅が検出されない場合は、ポリヌクレオチドの特定位置の塩基が（α）以外であるというように、塩基置換の有無が判定できる。
【００４７】
部分（１）、及び部分（２）の温度制御、判定を行うポリヌクレオチド、プライマー（ａ）、ポリメラーゼを含む溶液のマイクロ流体デバイスへの導入、該溶液の送液、検出は、全て自動化することができ、煩雑な操作を必要とせず、正確、かつ迅速に、ポリヌクレオチドの特定位置の塩基における塩基置換の有無を判定することができる。
【００４８】
次に、本発明のマイクロ流体デバイスの作製方法について説明する。本発明のマイクロ流体デバイスの素材は任意であり、例えば、ガラス、水晶等の結晶、シリコンなどの半導体、セラミック、炭素、有機重合体（ポリジメチルシロキサンのように、無機元素を含有するものであってもよい。以下、「プラスチック」と称する。）、又はこれらの発泡体などであることが好ましい。特に、プラスチックは安価で大量に製造できるため使い捨てとすることが可能で、他の検体ポリヌクレオチドが混入する心配がなく、信頼性が高い。また、プラスチックは容易に焼却処分できるため、使用済み部材に由来する検体・ポリヌクレオチド等による汚染・感染の危険度が低く、安全性が高い。これらの理由から、本発明のマイクロ流体デバイス、特に臨床検査やＢＳＥ検査等の多検体を扱うマイクロ流体デバイスの素材としてはプラスチックが好ましい。
【００４９】
プラスチックとしては、ポリヌクレオチドの増幅やハイブリダイズ時の加温に耐える樹脂の使用が好ましい。また、核酸増幅反応の有無を蛍光強度を測定して検出する場合は、該プラスチックは透明で、かつ、蛍光強度が低いプラスチックの使用が好ましい。このようなプラスチックとして、例えば、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリメチルメ  タクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン等の樹脂を用いることができる。また、活性エネルギー線を照射することによって重合体となる、いわゆるフォトリソグラフィー材料も本発明のプラスチックとして好適に用いることができる。
【００５０】
ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン等の樹脂を用いて本発明のマイクロ流体デバイスを製造するには、例えば、まず前記重合体を射出成型して核酸増幅反応を行う部分（１）と検出部分とが凹部で連結されている部材を得、次に別の部材を用意し、前記凹部が空洞状の流路となるようにこれらを固着すればよい。検出にハイブリダイゼーションを利用する場合は、固着前に前記いずれかの部材の一部表面にオリゴヌクレオチド（Ｃ）を固定しておき、その箇所がハイブリダイゼーションを行う部分（２）となるように固着すればよい。
【００５１】
あるいは別の製造法としては、まず板状の前記重合体を前述のデザインのように公知の方法で切削することによって、核酸増幅反応を行う部分（１）と検出部分とが凹部で連結されている部材を得、次に別の部材を用意し、前記凹部が空洞状の流路となるようにこれらを固着すればよい。検出にハイブリダイゼーションを利用する場合は、固着前に前記いずれかの部材の一部表面にオリゴヌクレオチド（Ｃ）を固定しておき、その箇所がハイブリダイゼーションを行う部分（２）となるように固着すればよい。
【００５２】
前述の別の部材としては、凹部が流路となるように蓋ができ、形成された流路に流す液体に侵されないシート、板状等の任意のものを使用できる。また、該部材上に、公知の方法で多孔質層を形成してもよく、多孔質層の細孔表面に公知慣用の方法でオリゴヌクレオチド（Ｃ）を固定するとより多くのオリゴヌクレオチド（Ｃ）が固定でき、好ましい。この場合、予め多孔質層の細孔表面に反応性を有する官能基（例えばカルボキシ基、エポキシ基、アルデヒド基等）を導入し、次いで、直接または他の官能基を介して、該オリゴヌクレオチド（Ｃ）中のアミノ基や水酸基、リン酸基、カルボキシ基を反応させることにより、共有結合で多孔質層の細孔表面に固定することができる。
【００５３】
支持体上に多孔質層を形成する方法としては、多孔質層が形成できれば任意であり、公知の方法を使用すればよい。一般に、多孔質層を形成する第一の方法として、支持体上に活性エネルギー線重合性化合物と、該重合性化合物とは相溶するが、該重合性化合物の重合物とは相溶しない貧溶剤とを含有する活性エネルギー線硬化性の製膜液を塗布した後、活性エネルギー線を照射し、該重合性化合物を重合させると共に相分離を生じさせることにより、多孔質層を形成する方法（以下、反応誘発型相分離法と言う。）、支持体と、該支持体を溶解あるいは膨潤できる溶剤とを接触させた後、該支持体を溶解あるいは膨潤させないが溶剤とは相溶する別の溶剤を用いて溶解あるいは膨潤できる溶剤を洗浄除去し、多孔質層を形成する方法（以下、表面膨潤法と称する。）、鎖状重合体を溶剤に溶解してなる製膜溶液を支持体に塗布し、該支持体と、該鎖状重合体を溶解または膨潤させず、かつ溶剤とは相溶する別の溶剤とを接触させることにより、鎖状重合体を多孔質層上に凝集させ、支持体表面に多孔質層を形成する方法（以下、湿式法と言う。）などが挙げられる。反応誘発型層分離法は、多孔質層表面に、オリゴヌクレオチドを固定できる官能基の導入が容易であることから、最も好ましく用いられる。
【００５４】
多孔質層を支持体に形成するためには、前記製膜液を支持体に必要な部分塗工すればよく、この方法として、任意の塗工方法を用いることができ、例えば、スピンコート法、ローラーコート法、流延法、ディッピング法、スプレー法、バーコーター法、Ｘ−Ｙアプリケータ法、スクリーン印刷法、凸版印刷法、グラビア印刷法、ノズルからの押し出しや注型などの方法が挙げられる。また、前記製膜液が高粘度である場合や特に薄く塗工する場合には、前記製膜液に溶剤を含有させて塗工した後、溶剤を揮発させる方法により塗工することもできる。
【００５５】
蓋部材と凹部を有する部材を貼り合わせる際は、必要に応じて接着剤を用いることもでき、例えば、エポキシ樹脂系接着剤、スチレンブタジエン樹脂系接着剤、（メタ）アクリル系接着剤などが使用できる。
【００５６】
また、フォトリソグラフィー材料を用いて本発明のマイクロ流体デバイスを製造するには、例えば、支持体の表面に活性エネルギー線硬化性の組成物を塗工して該組成物の未硬化塗膜を形成、流路と成すべき部分以外の箇所に活性エネルギー線を照射して前記組成物の硬化又は半硬化塗膜を形成し、非照射部分の未硬化の前記組成物を除去して、核酸増幅反応を行う部分（１）と検出部分とが凹部で連結されている部材を得る。検出に、ハイブリダイゼーションを利用する場合は、検出部分にオリゴヌクレオチド（Ｃ）を固定後、別の部材を固着して前記凹部を空洞状の流路と成すことによって、目的とする核酸増幅反応を行う部分（１）と、ハイブリダイゼーションを行う部分（２）とが流路で連結されているマイクロ流体デバイスが得られる。
【００５７】
また、支持体の表面に前述の方法で多孔質層を形成し、該多孔質層の上に活性エネルギー線硬化性の組成物を塗工して該組成物の未硬化塗膜を形成、流路と成すべき部分以外の箇所に活性エネルギー線を照射して前記組成物の硬化又は半硬化塗膜を形成し、非照射部分の未硬化の前記組成物を除去して、核酸増幅反応を行う部分（１）と多孔質層が底面に露出した凹部である部分（２）とが凹部で連結されている部材を得る。次に、多孔質層の表面に公知慣用の方法でオリゴヌクレオチド（Ｃ）を固定後、別の部材を固着して前記凹部を空洞状の流路と成すことによって、核酸増幅反応を行う部分（１）と、多孔質層の表面にオリゴヌクレオチドが固定されたハイブリダイゼーションを行う部分（２）とが流路で連結されているマイクロ流体デバイスが得られる。この方法は、多孔質層の細孔表面により多くのオリゴヌクレオチド（Ｃ）が固定でき、好ましい。この場合、予め多孔質層の細孔表面に反応性を有する官能基（例えばカルボキシ基、エポキシ基、アルデヒド基等）を導入し、次いで、直接または他の官能基を介して、該オリゴヌクレオチド（Ｃ）中のアミノ基や水酸基、リン酸基、カルボキシ基を反応させることにより、共有結合で多孔質層の細孔表面に固定することができる。
【００５８】
支持体の形状は特に限定されず、使用目的に応じて任意の形状のものを使用できる。例えば、シート状（フィルム状、リボン状、ベルト状を含む）、板状、ロール状、球状などの形状が挙げられるが、塗工し易く、また、活性エネルギー線を照射し易いという観点から、塗工面が平面状または２次曲面状の形状であることが好ましい。また、支持体は、その表面に形成された流路（マイクロ流体デバイス）と一体化されたものであっても良いし、必要に応じて、流路形成後、支持体を取り除く一時的なものであっても良い。
【００５９】
活性エネルギー線硬化性の組成物は、重合開始剤の存在下、あるいは非存在下で活性エネルギー線により重合し得る組成物であり、付加重合性の化合物や、活性エネルギー線重合性官能基として重合性の炭素−炭素二重結合を有する重合性化合物を含む組成物が好ましく用いられる。重合性化合物は、反応性の高い（メタ）アクリル系化合物やビニルエーテル類や、光重合開始剤の不存在下でも硬化するマレイミド系化合物などが好ましい。また、重合性化合物が多官能の化合物であると、重合して架橋構造となるため、硬化後の強度も高くなる。重合性化合物は単独で、あるいは二種以上を混合して使用することができる。
【００６０】
活性エネルギー線硬化性の組成物には、光重合開始剤、重合遅延剤、重合禁止剤などを添加してもよい。該組成物の粘度は、多孔質層の孔径に応じて変わりうるものであるが、多孔質層の上に塗工した際に、該組成物が速く多孔質層内へ浸透すること、および活性エネルギー線照射後に、後述する非照射部分の未硬化の該組成物を除去する際に、該組成物が完全に多孔質層から除去される観点から、該組成物の粘度が２５℃において３０〜３０００ｍＰａ・ｓの範囲であることが好ましく、１００〜１０００ｍＰａ・ｓの範囲であることが更に好ましい。粘度が３０ｍＰａ・ｓ未満であると、凹部の深さ制御が困難になり、一方、粘度が３０００ｍＰａ・ｓより大きいと、該組成物の多孔質層内部への浸透が困難になり、また、非照射部分の未硬化の組成物の除去も困難になる。
【００６１】
多孔質層の上に活性エネルギー線硬化性の組成物を塗工する方法としては任意の塗工方法を用いることができ、例えば、スピンコート法、ローラーコート法、流延法、ディッピング法、スプレー法、バーコーター法、Ｘ−Ｙアプリケータ法、スクリーン印刷法、凸版印刷法、グラビア印刷法、ノズルからの押し出しや注型などの方法が挙げられる。また、活性エネルギー線硬化性の組成物が高粘度である場合や特に薄く塗工する場合には、活性エネルギー線硬化性の組成物に溶剤を含有させて塗工した後、溶剤を揮発させる方法により塗工することもできる。
【００６２】
照射する活性エネルギー線としては、紫外線、可視光線、赤外線、レーザー光線、放射光などの光線；エックス線、ガンマ線、放射光などの電離放射線；電子線、イオンビーム、ベータ線、重粒子線などの粒子線が挙げられる。これらの中でも、取り扱い性や硬化速度の面から紫外線及び可視光が好ましく、紫外線が特に好ましい。硬化速度を速め、硬化を完全に行う目的で、活性エネルギー線の照射を低酸素濃度雰囲気で行うことが好ましい。低酸素濃度雰囲気としては、窒素気流中、二酸化炭素気流中、アルゴン気流中、真空又は減圧雰囲気中が好ましい。
【００６３】
多孔質層を底面全体または底面の一部に形成された凹部を形成するために、上記活性エネルギー線を照射する際に、活性エネルギー線をパターニング照射する。パターニング照射の方法は任意であり、例えば、活性エネルギー線を照射しない部分をマスキングして照射する、あるいはレーザーなどの活性エネルギー線のビームをパターン走査するなどのフォトリソグラフィーの手法が利用できる。
【００６４】
パターニング照射の際、充分なエネルギー量の活性エネルギー線を照射して硬化させてもよいが、照射量を調整して表面に僅かにタックが残る程度に硬化させた半硬化塗膜とすることもできる。半硬化塗膜と蓋となる他の部材とを接着剤を介して貼り合わせることによって、接着強度を向上させることができる。
【００６５】
多孔質層の細孔表面にオリゴヌクレオチド（Ｃ）を固定する方法は公知慣用の方法を使用することが可能である。予め多孔質層の細孔表面に反応性を有する官能基（例えばカルボキシ基、エポキシ基、アルデヒド基等）を導入し、次いで、直接または他の官能基を介して、該オリゴヌクレオチド（Ｃ）中のアミノ基や水酸基、リン酸基、カルボキシ基を反応させることにより、共有結合で多孔質層の細孔表面に固定することができる。
【００６６】
凹部を有する部材と蓋部材とを貼り合わせる際の接着剤としては、例えば、エポキシ樹脂系接着剤、スチレンブタジエン樹脂系接着剤、（メタ）アクリル系接着剤などが使用できる。また、活性エネルギー線硬化性組成物を接着剤として使用することもできる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例及び比較例を用いて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例の範囲に限定されるものではない。
【００６８】
（作製例１）
［紫外線ランプ１照射条件］
３０００Ｗメタルハライドランプを光源とするアイグラフィックス株式会社製のＵＥ０３１−３５３ＣＨＣ型ＵＶ照射装置を用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００６９】
［紫外線ランプ２照射条件］
２５０Ｗ高圧水銀ランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２５０Ｗシリーズ露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が５０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を、特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００７０】
［蛍光強度測定方法］
ライカ株式会社製の共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴを用いて測定した。測定条件はＰＭＴ感度５２０Ｖ、ピンホール１．００であった。
【００７１】
［エネルギー線硬化性組成物（i）の調製］
平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー（大日本インキ化学工業株式会社製の「ユニディックＶ−４２６３」）７２質量部、ジシクロペンタニルジアクリレート（日本化薬株式会社製の「Ｒ−６８４」）１８質量部、メタクリル酸グリシジル（和光純薬工業株式会社製）１０質量部、デカン酸メチル（和光純薬工業株式会社製）を１５０質量部、揮発性の良溶剤としてアセトンを１０質量部、紫外線重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン（チバガイギー社製の「イルガキュア１８４」）３質量部を均一に混合して組成物（ｉ）を調製した。
【００７２】
［エネルギー線硬化性組成物（ii）の調製］
活性エネルギー線架橋重合性化合物として、「ユニディックＶ−４２６３」を８０質量部、及び１，６−ヘキサンジオールジアクリレート（第一工業製薬株式会社製の「ニューフロンティアＨＤＤＡ」）を２０質量部、光重合開始剤として「イルガキュア１８４」５質量部を均一に混合して組成物（ii）を調製した。
【００７３】
［エネルギー線硬化性組成物（iii）の調製］
活性エネルギー線架橋重合性化合物として、「ユニディックＶ−４２６３」を６０質量部、「ニューフロンティアＨＤＤＡ」４０質量部、光重合開始剤として「イルガキュア１８４」５質量部、及び重合遅延剤として２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン（関東化学株式会社製）０．５質量部を均一に混合して組成物（iii）を調製した。
【００７４】
［塗膜（２）の形成］
下基材（１）を支持体としてポリアクリレート（三菱レイヨン社製の「アクリライトL 000番」）製の板を用い、これに２０００ｒｐｍ、５０秒間条件のスピンコーターを用いて組成物（ii）を塗布し、紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射してこれを半硬化させ、塗膜（２）を形成した。
【００７５】
［多孔質塗膜（３）の形成］
この半硬化状態の塗膜（２）の上に、５００ｒｐｍ、３０秒間条件のスピンコーターを用いて組成物（i）を塗布し、該組成物（i）に紫外線ランプ１により紫外線を４０秒間照射して組成物（i）を硬化させ、ｎ−ヘキサンでデカン酸メチルを洗浄除去して多孔質塗膜（３）を形成した。
【００７６】
［多孔質塗膜を底面に持つ凹部（流路）の形成１］
上記多孔質塗膜（３）に、２０００ｒｐｍ、３０秒間条件のスピンコーターを用いて組成物（iii）を染みこませ、該組成物（iii）の未硬化塗膜を形成し、フォトマスク（Ａ）を通して紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒間行って前記組成物（iii）の半硬化塗膜を形成し、非照射部分の未硬化の前記組成物（iii）をエタノールで除去して、多孔質塗膜（３）が一部分に露出した塗膜（４）を形成した。
【００７７】
［多孔質塗膜を底面に持つ凹部（流路）の形成２］
該塗膜（４）の上に、更に５００ｒｐｍ、３０秒間条件のスピンコーターを用いて組成物（iii）を塗工し、該組成物（iii）の未硬化塗膜を形成し、フォトマスク（Ｂ）を通して紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒間行い前記組成物（iii）の半硬化塗膜（５）を形成し、非照射部分の未硬化の前記組成物（iii）をエタノールで除去して、上記多孔質塗膜（３）が部分的に底面に露出した（マスク（Ａ）とマスク（Ｂ）の重なり部分）凹部を有する塗膜（５）を形成した。
【００７８】
［オリゴヌクレオチド（Ｃ）固定用多孔質部前処理１］
上記工程で作製した凹部を有する支持体を、日東紡製１０％ポリアリルアミン溶液ＰＡＡ−１０Ｃを純水にて希釈して得た５質量％ポリアリルアミン水溶液と接触させ、５０℃にて２時間反応させた（ポリアリルアミン分子内の一部のアミノ基を、露出した多孔質塗膜部のエポキシ基と反応させた）後、流水で３０分間洗浄した。これにより、露出した多孔質塗膜部、即ちオリゴヌクレオチド（Ｃ）固定用多孔質部へのアミノ基の導入を行った。
【００７９】
［オリゴヌクレオチド（Ｃ）固定用多孔質部前処理２］
上記工程にてアミノ基を導入した凹部を有する支持体を、和光純薬工業製２５％グルタルアルデヒド溶液をリン酸緩衝液（和光純薬工業製の「りん酸緩衝剤粉末」を１リットルの滅菌水に溶解したもの）にて５倍希釈して作製した５質量％グルタルアルデヒド水溶液中に入れ、５０℃、２時間反応させた（上記前処理１にて該多孔質部に導入されたほぼ全てのアミノ基を、該グルタルアルデヒド中の片方のアルデヒド基と反応させた）後、流水で５分洗浄して、該オリゴヌクレオチド（Ｃ）固定用多孔質部へのアルデヒド基の導入を行った。
【００８０】
［プライマーの設計］
一対のプライマーのうちの一方として、鋳型ポリヌクレオチドであるｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ  ６１のＧｌｎタイプ野生型（タカラバイオ株式会社製；配列番号１）、及びｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ  ６１のＬｙｓタイプ変異型（タカラバイオ株式会社製；配列番号２）の両方に相補的なプライマー（ｂ）（５’−ｔｔｇａｔｇｇａｇａａａｃｃｔｇｔｃｔｃ−３’；配列番号３）を設計した。もう一方としては、野生型の鋳型に実質的に相補的で、３’末端の位置がｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ  ６１変異部位に相当し（塩基が相補的という意味ではない）、但し３’末端から３塩基目がミスマッチとなるようにチミン（Ｔ）からシトシン（C）に変更したプライマー（ａ）（５’−ａｔｔｇｃａｃｔｇｔａｃｔｃｃｔｃｃｔｇ−３’；配列番号４）を設計した。また、プライマー（ａ）は、その５’末端をＦＩＴＣにて標識した。
【００８１】
［固定用オリゴヌクレオチド（Ｃ）の設計］
ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ  ６１のＧｌｎタイプ野生型塩基配列（配列番号１）のうち、４６塩基目から６９塩基目に相当する部分（５’−ｔｔｇｇａｔａｔｔｃｔｃｇａｃａｃａｇｃａｇｇｔ−３’；配列番号５） を固定用オリゴヌクレオチド（Ｃ）とした。
【００８２】
［オリゴヌクレオチド（Ｃ’）の調製］
５’末端をアミノ基修飾した５００μＭのオリゴヌクレオチド（Ｃ）を１μＬ、該オリゴヌクレオチド（Ｃ）に相補的な５００μＭのオリゴヌクレオチド（Ｄ）（５’−ａｃｃｔｇｃｔｇｔｇｔｃｇａｇａａｔａｔｃｃａａ−３’；配列番号６）を１μＬ、ＰＣＲ用１０×緩衝液（宝酒造株式会社製の１０× Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ）を１μＬ、滅菌水を７μＬ加え１０μＬとし、ＰＣＲ用反応チューブ内に反応溶液を調製した。この反応溶液に、ＰＣＲ用サーマルサイクラーを用いて９５℃２分、８０℃２分、７０℃２分、６０℃２分、５０℃２分、４０℃２分、３０℃２分、４℃２分の温度変化を与えることにより、５’末端にアミノ基を修飾したオリゴヌクレオチド（Ｃ）に対してオリゴヌクレオチド（Ｄ）をハイブリダイゼーションさせて二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｃ’）を形成させた。これにより、オリゴヌクレオチド（Ｃ）に含まれる各塩基中のアミノ基をマスクしてその反応性を抑え、次工程におけるオリゴヌクレオチドの固定が優先的に５’末端修飾アミノ基を介して行われるようにした。
【００８３】
［オリゴヌクレオチド（Ｃ’）の固定］
前述の前処理を施したオリゴヌクレオチド（Ｃ）固定用多孔質部に、上記方法にて調製したオリゴヌクレオチド（Ｃ’）溶液を１μＬ滴下して、湿度１００％、５０℃にて１５時間反応（オリゴヌクレオチドの５’末端アミノ基を多孔質層のアルデヒド基と反応）させた後、０．２質量％のテトラヒドロ硼酸ナトリウム水溶液中に入れ、５分間還元反応させ、次いで、０．２×ＳＳＣ／０．１質量％ＳＤＳ溶液でリンスし、更に０．２×ＳＳＣでリンスした。これにより該多孔質部への二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｃ’）の固定を行った。
【００８４】
［オリゴヌクレオチド（Ｃ）の固定］
上記工程にてオリゴヌクレオチド（Ｃ’）を固定した凹部を有する支持体を０．１×ＴＢＥ緩衝液（和光純薬工業製の「１０×ＴＢＥ粉末」から調製）中に入れ、９５℃にて５分間煮沸し、多孔質部に固定されたオリゴヌクレオチド（Ｃ’）からオリゴヌクレオチド（Ｄ）を解離させ、オリゴヌクレオチド（Ｃ）のみが固定された凹部を有する支持体を得た。
【００８５】
［蓋の固着］
組成物（ii）を、一時的な支持体である１２ｃｍ×５ｃｍ×３０μｍのポリプロピレンフィルム（二村化学工業社製の「二軸延伸ポリプロピレンフィルム「太閤」FOR 30番」）のコロナ放電処理された面上に、１２７μｍのバーコーターを用いて塗工した。該組成物（ii）の未硬化塗膜に、紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射し、前記組成物の半硬化塗膜（６）を形成し、上記工程で作製した凹部を有する支持体に貼り合わせ、紫外線ランプ１により、紫外線を４０秒間照射して完全に硬化させた。その後、ポリプロピレンフィルムを剥離し、多孔質部が部分的に底面に露出した流路（１０）を形成した。
【００８６】
［開口部の形成］
この後、前記工程において凹部上に張り合わせ完全に硬化した塗膜（６）上に組成物（i）を塗布して塗膜（７）を形成し、さらにその上に上基材（８）として、下基材（１）と同じポリアクリレート製（三菱レイヨン社製の「アクリライトＬ 000番」）の１２ｃｍ×３ｃｍ×１ｍｍの板を重ね合わせ、５０ｍＷ／ｃｍ2の紫外線を窒素雰囲気中にて塗膜全面に４０秒間照射し、塗膜（７）を硬化させた。これにより塗膜（６）上に塗膜（７）および上基板（８）が接着一体化された。
次いで、上基板（８）、塗膜（７）および塗膜（６）を通過し流路（１０）に通じる直径１ｍｍの孔を、ドリルを使用して流路の両末端に形成し、さらにこれら２つの孔にそれぞれ内径３ｍｍ、高さ５ｍｍのポリ塩化ビニル管を接着して開口部（１１）、（１２）とし、ポリヌクレオチドマイクロ流体デバイス（２０）を製造した。
【００８７】
得られたポリヌクレオチドマイクロ流体デバイス（２０）を使用し、ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ６１二本鎖ポリヌクレオチドの野生型／変異型判定を行った。  
（実施例１）
［ＰＣＲ用サンプル溶液調製］
ＰＣＲ酵素（ポリメラーゼ）としてはジーンタック（株式会社ニッポンジーン製）を使用し、緩衝液、基質溶液は該酵素商品に添付のものを使用した。１０μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ増幅用緩衝液、８μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）混合液、５’末端をＦＩＴＣにて修飾した５μｌの１０μＭ  プライマー（ａ）（配列番号４）、５μｌの１０μＭ  プライマー（ｂ）（配列番号３）、０．５μｌの５ユニット/μｌジーンタック、鋳型ポリヌクレオチドとして０．１nｇのｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ  ６１のＧｌｎタイプ野生型（タカラバイオ株式会社製；配列番号１）を加え、さらに滅菌水にて１００μｌとし、ＰＣＲサンプル溶液を調製した。
【００８８】
［ＰＣＲ］
ポリヌクレオチドマイクロ流体デバイス（２０）を４つの金属ブロックから成るヒーター（図５）上に固定した。金属ブロック（Ａ）を９０℃、金属ブロック（Ｂ）を７２℃、金属ブロック（Ｃ）を５５℃、金属ブロック（Ｄ）を５０℃に設定した。上記ＰＣＲ用サンプル溶液２０μlをポリヌクレオチドマイクロ流体デバイス（２０）の開口部（１１）に注入し、さらに開口部（１１）にマイクロシリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  ＩＣ３２００）を接続して５μｌ/分にて開口部（１２）に向けて送液した。次いで、０．２×ＳＳＣ（０．３  ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ，  ０．０３  ｍｏｌ／ｌ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ）溶液を検出が終了するまで送液した。該ＰＣＲ用サンプル溶液は金属ブロック上を（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｂ）、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）・・・という順序で通過し、その過程において、溶液中に増幅可能な組み合わせの鋳型ポリヌクレオチドとプライマーとが存在している際には、ポリヌクレオチドの増幅が起こる。
【００８９】
［ハイブリダイゼーション］
該ＰＣＲ用サンプル溶液は金属ブロック（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）上を繰り返して移動した後、金属ブロック（Ｄ）上を通過し開口部（１２）から排出される。金属ブロック（Ｄ）直前の金属ブロック（Ａ）では、増幅された二本鎖ポリヌクレオチドが変性して一本鎖となり、引き続く金属ブロック（Ｄ）上では一本鎖となったポリヌクレオチドの内、ＦＩＴＣが結合している方の鎖が多孔質塗部上に固定された前記ポリヌクレオチド（Ｃ）とハイブリダイズする。
【００９０】
［ポリヌクレオチドの検出］
多孔質部表面をライカ株式会社製の共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴにて観察することによって、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの検出を行った。該ＰＣＲ用サンプル溶液を注入してから約２０分後（サンプル溶液が多孔質部を通過した頃）に該多孔質部表面の蛍光強度が大きく増加した。
【００９１】
（実施例２）
［ＰＣＲ用サンプル溶液調製］
実施例１の［ＰＣＲ用サンプル溶液調製］と同様の操作を行った。但し、鋳型ポリヌクレオチドとして０．１nｇのｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ  ６１のＬｙｓタイプ変異型（タカラバイオ株式会社製；配列番号２）を使用した。
【００９２】
［ＰＣＲ］
実施例１と同様にＰＣＲを行った。
【００９３】
［ハイブリダイゼーション］
実施例１と同様にハイブリダイズ操作を行った。
【００９４】
［ポリヌクレオチドの検出］
多孔質部表面をライカ株式会社製の共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴにて観察することによって、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの検出を行った。ＰＣＲ用サンプル溶液を注入後、約２０分経過して（サンプル溶液が多孔質部を通過した頃）も該多孔質部表面の蛍光強度に大きな変化は見られず、さらに約１０分経過しても、同様の結果であった。
【００９５】
実施例１及び２の結果から、鋳型ポリヌクレオチド中の一塩基置換（変異）の有無を本発明の方法により、迅速（約２０分間）かつ正確に判定可能であることが示された。
【００９６】
（比較例）
実施例１及び実施例２と同様の試薬及びサンプル溶液を用いてサーマルサイクラーでＰＣＲを行い、続いて電気泳動にてポリヌクレオチドの検出を行った。
【００９７】
［ＰＣＲ用サンプル溶液］
実施例１及び実施例２と同じサンプル溶液をそれぞれ用いた。
【００９８】
［ＰＣＲ］
各サンプル溶液５０μｌが入った５００μｌ容ＰＣＲチューブを、それぞれサーマルサイクラー（エムジェイジャパン株式会社製ＰＴＣ−１００）のヒートブロックにセットした。９０℃３分間に続いて、「９０℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒」のサイクルを３０回繰り返してＰＣＲを行った。このＰＣＲ増幅工程に約１００分要した。
【００９９】
［ポリヌクレオチドの検出（電気泳動）］
サーマルサイクラーにてＰＣＲを行ったサンプル溶液１０μlに１μlの１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社製）を添加し、これをアガロースゲル（３質量％）電気泳動にて展開した。展開後、エチジウムブロマイド染色し、ＵＶトランスイルミネーターにて泳動パターンを観察した。その結果、鋳型ポリヌクレオチドとしてＧｌｎタイプ野生型を用いた場合のみならず、Ｌｙｓタイプ変異型を用いた場合においても（前者よりは少ないながら）６４ｂｐのバンドが確認された。この電気泳動の工程に約３０分、検出の工程に約２０分を要した。
【０１００】
即ち、該ノイズの発生により野生型と変異型の正確な判定が困難であることが示された。更に、ＰＣＲからポリヌクレオチドの検出が終了するまでにおよそ１５０分間という長時間を要した。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】実施例に使用した本発明のマイクロ流体デバイスの模式図（平面図）である。
【図２】実施例に使用した本発明のマイクロ流体デバイスの模式図（側面図）である。
【図３】図１中のI−I線に沿う断面図である。
【図４】図１に示すマイクロ流体デバイスを製造する際に用いるフォトマスク（Ａ）を示した平面図である。
【図５】図１に示すマイクロ流体デバイスを製造する際に用いるフォトマスク（Ｂ）を示した平面図である。
【図６】実施例に使用した本発明のマイクロ流体デバイスを加熱するヒーターの模式図の平面図である。
【符号の説明】
【０１０２】
１…下基材、２…塗膜、３多孔質塗膜、４塗膜、
５…塗膜、６…半硬化塗膜、７…塗膜、８…上基材
１０…流路（欠損部）、１１…開口部、１２…開口部
２０…マイクロ流体デバイス、３１…金属ブロック（Ａ）
３２…金属ブロック（Ｂ）、３３…金属ブロック（Ｃ）
３４…金属ブロック（Ｄ）、３５…マイクロ流体デバイス設置位置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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