(57)【要約】      （修正有）【課題】内因性膀胱組織の再増殖を促進するために、外科的に切除した膀胱欠損部を置換するための方法の提供。【解決手段】損傷膀胱組織を、膀胱状形状に形成された温血脊椎動物の粘膜下組織からなる組織グラフト構成物で置換する。この粘膜下組織は、粘膜層の内腔部分と筋層とから剥離された粘膜下層を含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱の損傷または疾病部分の置換のための組織グラフト構成物であって、膀胱の２０％以上を置換するための膀胱状形状に形成された温血脊椎動物の粘膜下組織のシートからなる前記構成物。
【請求項２】
前記組織グラフト構成物が、尿管及び尿道との液体連絡及び外科的付着のための開口部を有する請求の範囲１に記載の組織グラフト構成物。
【請求項３】
前記組織グラフト構成物が、１温血脊椎動物の２つ以上の粘膜下組織片から形成され、前記グラフト構成物が、前記グラフト構成物の形成に用いた個々の片のどれよりも大きい表面積を有する請求の範囲１に記載の組織グラフト構成物。
【請求項４】
粘膜下組織が、粘膜層の内腔部分と筋層の両方から剥離された粘膜下層を含む腸粘膜下組織である請求の範囲１に記載の組織グラフト構成物。
【請求項５】
複数の粘膜下組織層を有することを特徴とする請求の範囲１に記載の組織グラフト構成物。
【請求項６】
２つ以上の粘膜下組織片から形成されることを特徴とする請求の範囲１に記載の組織グラフト構成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織グラフト、および損傷−および疾病膀胱の修復法に関するものである。より詳細に述べるならば、本発明は内因性膀胱組織の増殖を促進するために、外科的に切除した膀胱欠損部を置換するための方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
泌尿器科医は長い間膀胱置換グラフトとしての使用に適する異物的形成材料または生体内分解性材料を探してきた。膀胱再建術のために合成生体内分解性材料、例えばシリコンゴム、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリプロピレンを用いて多くの実験が行われてきた。このような材料は、概して異物型反応を誘起し、その結果グラフトの拒絶または無機質化をおこすことが判明した。
【０００３】
合成生体適合材料を用いる実験の失敗が報告された結果、研究者は天然−または合成生体内分解性材料、例えば胃腸−、胎盤−、洋膜−および心膜組織および合成再吸収性ポリマーを膀胱再生のために使用することを研究し始めた。これらの材料は内因性細胞増殖の足場として役立ち、異物型反応が始まる前に分解する。特に胃腸組織は膀胱再建術のための好適材料源である。しかし膀胱再建術のための胃腸組織の使用は、有害な副作用、例えば感染症、腸閉塞、粘液産生、電解質異常および発癌などと関連がある。
【０００４】
胎盤−、洋膜−および心膜組織グラフトは膀胱組織を置換するためのグラフト材料として有用であるが、このようなグラフト材料はグラフト縮化という欠点があり、それらは完全な膀胱壁再生を促進することはできない（（膀胱壁の）組織は尿不透過層および機能的筋細胞層を有する）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非免疫原性で、移植後著しい縮化を受けず、尿不透過性細胞層および機能的筋細胞層を有する内因性膀胱組織の増殖を促進する組織グラフトが所望されることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、膀胱の損傷−または疾病部分の内因性膀胱組織による置換を促進するために脊椎動物粘膜下基質を使用することに向けられる。本発明により使用するコラーゲン性粘膜下組織は高度に保存されたコラーゲン類、糖蛋白質類、プロテオグリカン類およびグリコサミノグリカン類をそれらの天然の形で、天然濃度で含む。粘膜下組織は、食肉生産のために飼育される動物、例えばブタ、ウシおよびヒツジまたはその他の温血脊椎動物の特に腸組織を含める種々のソースから得ることができる。この組織はその天然の形でもまたは細砕しまたは一部消化した液状形でも用いることができる。脊椎動物粘膜下組織は商売上の食肉生産処理の豊富な副産物であり、そのため粘膜下組織をその天然シート形で用いる場合は特に、低コスト組織グラフト材料である。
【０００７】
温血脊椎動物の腸の粘膜下層および粘膜層の基底部分がシート型の組織グラフト材料として用いられることは公知である。米国特許第４,９０２,５０８号を参照されたい。その特許に記載され、請求される組成物は、すぐれた機械的特性、例えば高コンプライアンス、高い破裂圧力点および、このような組成物を血管グラフト構成物に好都合に使用せしめるような有効多孔度指数などを特徴とする。その特許に開示されたグラフト材料は腱、靭帯およびその他の結合組織を置換する用途にも有用である。このような用途に用いるとき、その好適グラフト構成物は、グラフト構成物によって置換される組織の再増殖のための基質として役立つようにみえる。６００以上の cross-species 移植において腸粘膜下組織の大規模免疫学的試験が行われたが、明らかな拒否反応が示されることはなかった。
【０００８】
さらに、腸粘膜下組織は、明白な生物内向性を失うことなく、細砕および／またはプロテアーゼ消化によって液状にし、修復を必要とする宿主組織に比較的侵襲性の少ない投与法（例えば注射または局所投与）で使用することができる。米国特許第５,２７５,８２６号を参照されたい。粘膜下層を含む液状細砕腸組織はこれまで、例えば膀胱括約筋などを含める損傷組織を修復し、機能的に補強するために上首尾に用いられてきた。組織再形成にかかわる一般的できごとは、広範囲の速やかな血管新生、顆粒間葉性細胞の増殖、移植粘膜下組織の生体内分解、および免疫拒絶がないこと、などである。
【０００９】
本発明は脊椎動物由来粘膜下基質の、膀胱グラフトとしての使用に向けられる。粘膜下組織は宿主組織の増殖、および移植した膀胱組織の再形成ならびに再生を誘起する安価な非免疫原性物質である。本発明により、温血脊椎動物の粘膜下組織を含む組織グラフト構成物は尿不透過性細胞層および機能的筋細胞層を両方有する内因性膀胱組織の増殖を促進することが判明した。
【発明の効果】
【００１０】
こうして本発明により、疾病−または損傷膀胱を再建する方法が提供される。この方法は損傷または疾病部分を外科的に除去し、除去部分を温血脊椎動物の粘膜下組織からなる組織グラフト構成物で置換する諸段階を含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明により、損傷−または疾病膀胱組織を置換する方法および組成物が提供される。本発明の粘膜下組織グラフト組成物は、内因性組織のグラフト材料への侵入並びにグラフト材料の内因性膀胱組織による置換を誘起する生物内向性／生体内分解性足場としてはたらく。
【００１２】
この組織グラフト構成物の粘膜下組織は脊椎動物粘膜下組織から誘導され、天然に関連する細胞外基質蛋白質類、糖蛋白質類およびその他の因子を含む。１実施態様において、粘膜下組織は温血脊椎動物の腸粘膜下組織を含む。温血脊椎動物の小腸は本発明に利用するための好適粘膜下組織源である。
【００１３】
本発明に使用するための腸由来粘膜下組織は、粘膜層の少なくとも内腔部分と筋層の両方から剥離された粘膜下層を含んでなる。本発明の１実施態様では腸粘膜下組織は粘膜下層と粘膜層の基底部分とを含み、後者は、厚さも定義もソース脊椎動物種によって異なることが知られている粘膜筋板および緻密層を含むことができる。
【００１４】
本発明により使用するための粘膜下組織の製法は米国特許第４,９０２,５０８号に記載されている；この開示はここに引例によって明白に挿入される。脊椎動物、好適にはブタ、ヒツジまたはウシ―ただしこれらに制限されるものではない―から収穫した腸切片を縦方向のふきとり運動によってこすりとり、平滑筋組織を含む外側層と、最も内側の層、すなわち粘膜層の内腔部分とを取りはずす。粘膜下組織を生理食塩液ですすぎ、任意に滅菌する；それは水和−または脱水状態で保存できる。凍結乾燥または空気乾燥した粘膜下組織は、再水和し、任意に伸長し、その細胞増殖活性を著しく喪失することなしに本発明により使用することができる。
【００１５】
本発明による１実施態様において、粘膜下組織の数片を互いに接着して広い面積の粘膜下組織シートを作ることができる。広面積粘膜下組織シートの生成法は粘膜下組織を切り、各片の少なくとも１部を隣接片の１部と重ね合わせることを含む。重なった部分をその後、脱水条件下で圧縮し、大きい粘膜下組織シートを形成する。１実施態様において、粘膜下組織片を透過性面上に並べ、第２の任意に透過性の面を用いて重なり合った部分を２面間で圧縮する。
【００１６】
任意に、 広面積粘膜下組織シートを粘膜下組織片の複数層から形成することができる。１実施態様において、粘膜下組織片をメッシュ上で１方向に組織的に並べ、そのとき粘膜下組織の少なくとも１部が他の粘膜下組織片の少なくとも１部と重なるようにする。そのメッシュが１層の粘膜下組織で覆われたとき、第２層の粘膜下組織を第１層の最上部に、第１層に対して異なる角度で載せる。その他の粘膜下組織層を加えて、所望の強度および厚さをもったグラフト構成物を得ることができる。すべての粘膜下組織片をメッシュ上に置いた後、別のメッシュをそれらの粘膜下組織の最上部に置き、“メッシュ−粘膜下組織−メッシュ”サンドイッチを負荷をかけて圧縮し、乾燥する。この方法により、メッシュから剥ぎ取れる乾燥した広面積粘膜下組織シートが形成される。
【００１７】
１実施態様において、粘膜下組織構成物は２枚以上の粘膜下組織から、減圧バッグ法を使用してそれらを１つに圧縮し、乾燥するという方法で作られる。この方法では粘膜下組織を２枚の有孔性の、好適にはステンレス鋼のプレートの間に並べる。それらプレートは膀胱置換グラフトのための所望の形、例えばポーチ状構成物を輪郭づけるように形成される。その材料を任意に１面上におき、水分を吸い込むための吸い取り材料および空気を通過させる通気性被覆物で覆う。生成した圧縮プレートと粘膜下組織との“サンドイッチ”をそれから減圧口をもったナイロンバッグに入れて密封する。真空装置を用いて減圧バッグから空気を引き抜くと、生成した雰囲気圧の低下によりプレートは粘膜下組織に押し付けられ、同時にその粘膜下組織を少なくとも１部脱水する。４−２４時間真空にした後、生成したシートはまだ湿っており、非常に柔軟性である。粘膜下組織を重ね合わせることによる継ぎ目は見えず、原型の８シートの強度はボール破裂試験によって測定した場合約８０ポンドである。もしこのような単一層の粘膜下組織構成物の“形成（shaping）”が特殊の用途に必要または適切であると確認された場合には、この一般的方法を用いて複数粘膜下組織片からなる単一層を形造ることもできる。
【００１８】
或いは、広面積粘膜下組織シートをより小さい粘膜下組織切片から、縫合によって、および／または米国特許第３,５６２,８２０号に記載される結合剤ペーストを用いて形成することができる。この開示はここに引例によって明白に挿入される。
【００１９】
広面積粘膜下組織シートの機械的特性はシートの層数の調節、隣接層相互の角度の変更、および複数の粘膜下組織片を１つの広面積粘膜下組織シートに圧縮するためにかける負荷の変更によって変えることができる。
【００２０】
本発明の粘膜下組織グラフトは、米国特許第５,２７５,８２６号に記載のように材料を縦方向または横方向に伸長することによってあらかじめ条件づけることができる。この開示はここに引例によって明白に挿入される。粘膜下組織はグラフト構成物の形成前に、またはその構成物の形成中に伸長することができ、またはその粘膜下組織をシート形成後に伸長してもよい。
【００２１】
本発明のグラフト組成物は一般的滅菌法、例えばグルタールアルデヒド  タンニン処理、酸性ｐＨにおけるホルムアルデヒド  タンニン処理、エチレンオキシド処理、プロピレンオキシド処理、ガス プラズマ滅菌、ガンマ線照射、電子ビームおよび過酢酸滅菌法などを用いて滅菌できる。逆に粘膜下組織の機械的強度、構造および生物内向性に悪影響を与えない滅菌法が好ましい。例えば強いガンマ線照射は粘膜下組織シートの強度低下をおこすかも知れない。好適滅菌法としては、グラフトを過酢酸、１−４Ｍｒａｄガンマ線照射（より好適には１−２.５Ｍｒａｄガンマ線照射）またはガス プラズマ滅菌にさらすことなどがある；過酢酸滅菌が最も好ましい滅菌法である。粘膜下組織を２種類以上の滅菌法にかけるのが一般的である。粘膜下組織を例えば化学処理などにより滅菌した後、その組織をプラスチックまたはホイルラップに包み、電子ビームまたはガンマ線照射滅菌法により再度滅菌する。
【００２２】
本発明により、粘膜下組織は損傷−または疾病尿路上皮（urothelial）組織を置換／再建するための組織グラフトとして使用される。“尿路上皮”は、ここでは尿管、尿道および腎臓集合系の細胞および組織を含むものと定義する。粘膜下組織構成物は宿主生体に移植したとき、内因性尿路上皮組織の増殖を促進する。これらのグラフト構成物を用いて尿管、尿道および膀胱の広い部分を置換することができる。
【００２３】
１実施態様において、粘膜下組織グラフト構成物は外科的に移植され、尿不透過性細胞層および機能的筋細胞層を有する内因性膀胱組織の増殖を促進する。その組織グラフト材料は足場として役立ち、グラフト面積の縮化または“瘢痕”組織を生成することなく組織グラフトに置換する機能的膀胱組織構造の増殖を促進する。
【００２４】
上記のように、組織グラフト構成物はポーチの形に形成され、膀胱の広い部分（すなわち２０％以上）を置換するために役立つ。この構成物は１つ以上の粘膜下組織片から外科的に構成することにより、または上記のもののように圧縮成形法によって作ることができる。さらに、組織グラフト構成物を処理してその組織グラフトに外科的付着のための、 および尿管および尿道との液体連絡のための口を形成することができる。
【００２５】
本発明の組織グラフト構成物を宿主脊椎動物種に移植し、損傷−、疾病−またはその他の機能的に侵害された膀胱を修復することができる。１実施態様において膀胱の欠損部分を外科的に除去し、温血脊椎動物の粘膜下組織を含む組織グラフト構成物で置換する。その粘膜下組織が腸由来のものである場合は、腸粘膜下組織の内腔側を膀胱の内腔に向けるのが好ましい。膀胱の広い部分を切除し、本発明の組織グラフトで置換することができる。移植後、その構成物は結局は宿主によって、正常膀胱壁に見いだされるような層状の細胞層を有する機能的膀胱組織で再形成される。膀胱全体を本発明のグラフト構成物で置換し、機能的膀胱を再生することも期待される。
【００２６】
Ｉn vivo 実験をブタ、イヌおよびラットで行い、膀胱形成増強（augmentation）グラフトとしての粘膜下組織の効果を研究した（例２、３、４参照）。これらの実験は、本発明のグラフト構成物の膀胱再建のための効果を確認するものである。これらの実験における膀胱の形態学的検査から、周囲腹部構造への癒着はほとんど、 または全くなく、 明らかな組織再生があったことが示された。その上、内腔面には平らな移行上皮細胞層が形成され、尿を保持する尿不透過層が生成していた。
【００２７】
この実験は、元の膀胱組織の最低７０％を除去し、本発明の粘膜下組織グラフトを用いて再建することができることを示している。このように元の膀胱組織のほんの小部分が残されていれば再生は起きる。膀胱の平滑筋細胞を形成する細胞ソースは確認されていないが、多分残っている膀胱の周囲平滑筋からの細胞の動員、並びに血流を介してその部位に到達して平滑筋細胞に分化する循環単核細胞である。
【００２８】
ラット膀胱置換研究から得られた組織学的データは、手術後２週間までに移行上皮が粘膜下組織パッチグラフトを完全に覆うことを明らかにした。顕著な急性炎症性反応は宿主再形成中のいかなる時にも起きなかった。宿主再形成は主として、周辺からの単核球および線維芽細胞侵入から始まり（２週間）、それらはグラフトの中心に向かって移動し（４週間）、結局移植後３カ月目には天然宿主組織によって完全に置換された。平滑筋細胞は、まばらではあったが４週間目には存在し、１１カ月目には完全に組織化され、正常膀胱平滑筋線維と区別できなくなった。組織学的観察によるこれらの研究結果は、この細胞反応が線維血管治癒型反応（fibrovascular healing type reaction）であり、単核細胞浸潤が、粘膜下組織コラーゲンの消化と、それが天然コラーゲンによって置換されることのあらわれであったことを示唆する。
【００２９】
尿路に異種材料を使用したために起きる一合併症は結石生成（無機物質塊、すなわち鉱質塩または“腎臓結石”の形成）である。結石は３カ月後に採取した動物の大部分に存在するとはいえ、それらは自由に浮遊しており、グラフトに固着してはいない。石の分析からヒドロキシアパタイトであり、スツルバイトではないことがわかったため、その結石の感染性原因は減少する。これまでに発表されたラット長期増強（augmentation）研究を調査すると、それらの対照群、胃膀胱形成群、回腸膀胱形成群および結腸膀胱形成群にも膀胱結石が存在することが明らかになった。膀胱結石の生成は autoaugmentation を受けたラット群にも報告された。そのため、ラットのいかなる種類の膀胱手術も結石形成に導く素因を作るようにみえる。これらの知見を仮定すれば、結石生成は膀胱手術によるものであって、粘膜下組織グラフト材料そのものに直接関係はないようにみえる。
【００３０】
［実施例１］  粘膜下組織の作成
小腸粘膜下組織を米国特許第４,９０２,５０８号に記載されている方法によって作った。つまり、ブタ空腸の切片を安楽死後１０分以内に採取し、直ちに０.９％生理食塩液中に入れた。これらの切片を１０ないし２０ｃｍ長さに切り、その小腸切片から腸間膜組織を取り外した。小腸を裏返し（inside out）、粘膜を機械的に取りはずす。小腸切片を再び返して（すなわち元の配置の内腔側の緻密層）漿膜および筋層を外側表面から取り外した。組織を生理食塩液ですすぎ、グラフト材料として使用するまで１０％硫酸ネオマイシン溶液に入れた。グラフト材料のの保存時間は２週間ないし３カ月であった。粘膜下組織の作成はソーセージ注入成形法に似た機械的プロセスであり、酵素反応段階は含まない。
【００３１】
［実施例２］  ブタ膀胱の外科的修復
イヌ腸粘膜下組織を異種移植材料としてブタに用いた。グラフトのための腸粘膜下組織を採取後１ないし５日以内に用いた。注入用腸粘膜下組織は、１８ゲージ針によって懸濁液を注入できるように組織を機械的に乳化することによって調製した。
【００３２】
膀胱壁、膀胱頸部または尿管周囲へ腸粘膜下組織を注入するために４匹の雌ブタを無作為に選択した。液状腸粘膜下組織（１０−２０ｍｌ）を１８ゲージ針によって粘膜下または漿膜下部位に注入し、分離した結節を作った。注入部位を膀胱鏡および腹腔鏡によって同時に観察し、腸粘膜下組織が膀胱壁または粘膜下組織に漏れなく注入されることを確認した。生成した結節の各々は、ビデオテープで証明された。第１の動物で２週間目に膀胱鏡検査を行い、注入部位に丘斑が持続的に存在することを確認した。８、１０、１８、２５およ３４週目に膀胱試料を取り、病理検査を行った。
【００３３】
第２の動物では１０週目に膀胱円蓋部注入部位の試料を採取した。部分的膀胱切除術後、腸粘膜下組織パッチグラフトを用いて膀胱増強が行われた。無管状（detubularized）パッチをグラフトの内腔面を膀胱内腔に向けて置き、 膀胱に縫合し水密的に閉鎖した。 フォレー カテーテルで３週間膀胱から排液し、その時に膀胱鏡検査、腹腔鏡検査および膀胱造影法で増強を検査した。パッチグラフトは上皮化するようにみえた。膀胱能力は保存されていた。フォレー カテーテルを除去した。増強後８週間目に膀胱を採取し、組織学的検査を行った。
【００３４】
液状腸粘膜下組織の注入部位の組織学的検査では炎症性反応または肉芽形成は全く検出されなかった。宿主上皮、結合組織、および平滑筋組織がグラフト材料内へ徐々に伸びていることが示された。結合組織、平滑筋および毛細管の内生（ingrowth）が注入後早くも８週間目に認められた。
【００３５】
３週間目の粘膜下組織パッチグラフトの膀胱造影法およびその後の腹腔鏡による検査は、膀胱に瘢痕組織または拘縮の証拠はなく、膀胱が完全に能力を保持することを示した。内腔面は完全に上皮化していた。膀胱増強形成術後８週間目の肉眼的検査では、グラフト部位が厚くなり、本来の膀胱能力が維持されていることが証明された。パッチグラフトの内腔面の完全な上皮化が組織学的に確認された。紡錘細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞の緻密な内生（ingrowth）が上皮下に認められた。α平滑筋アクチン特異的染色法により、平滑筋がグラフト材料内に伸びていることが確認された。そのパッチグラフトで毛細管の内生も確認できた。
【００３６】
［実施例３］  ラット膀胱の外科的修復
体重２５０ないし３００ｍｇの Sprague Dawley ラット ２２匹をネンブタール（１５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、腹部正中線切開を行い膀胱を露出させた。膀胱頸部を露出させ、薄い付着物である膀胱周囲の脂肪を注意深く取り除いた。膀胱を取り扱いやすくするために、５−０絹の懸濁縫合糸４本を膀胱の４comers に置いた。マイクロ鋏を用いて膀胱の全背側表面（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を切開し（膀胱表面積の約１／３）、微小焼灼器で止血した。１片の粘膜下組織グラフトを欠損部（膀胱内腔に面する緻密層表面）よりわずかに大きく形づくり、連続 non-interlocking 縫合を用いて７−１０マイルド クロミックで正しい位置に縫い付けた。コンピテント（応答性）閉鎖を確実にするために、希メチレンブルー溶液を３０ゲージ針で膀胱の腹側面に注射した。色素が溢出した縫合縁を断続７−０マイルド クロミック縫合でかがり縫いした。それから今後グラフトの正確な位置を比較するために、粘膜下組織グラフトのへりに４本の永久標識縫合糸（プロリン）で印しをつけた。その後腹部傷を筋肉および皮膚の両方共を連続５−０デキソン（Dexon）で２層に閉鎖した。手術直後の期間に尿路変更もドレーンも行わずにすんだ。 研究期間中に抗生物質を投与した動物もいなかった。
【００３７】
組織学的評価のために、 増強後２、４、８、１２、２４、および４８週間目に動物を殺し、切除した膀胱を緩衝１０％ホルマリン溶液に最低２４時間固定した。固定後、各試料を膀胱三角および膀胱円蓋の移植部分を通る矢状面で二分した。１／２づつをパラフィンに埋封した。切片を５ミクロンに切り、マッソンのヘマトキシリンおよびエオシン、過ヨウ素酸−シッフ、およびマッソンの三色染料で染色した。
【００３８】
［結果］
肉眼で見て、膨張した膀胱試料は均一に拡張しており、グラフト領域に憩室形成の兆候はなかった。グラフトは周囲の本来の膀胱と比較してわずかに白っぽい領域で、ほとんど見分けがつかなった。取り巻く膀胱周囲脂肪、 またはその他の腹部内構造への癒着はごくわずかであった。グラフトに固着していない、自由に浮遊する黄褐色の結石が１２週間目に採取した４匹動物のうちの３匹の膀胱に認められ、２４週目に採取した２匹のうちの１匹の膀胱に、 および４８週目に採取した４匹の動物中３匹の動物の膀胱に認められた。その他の動物では膀胱結石の証拠は見つからなかった。日常的結石分析で１００％ヒドロキシアパタイトであることが明らかにされた。水尿管腎盂症のはっきりした兆候はどの動物にもなかった。２匹の動物が術後の早い時期に縫合線漏れによって死亡した。これらに代わる動物によって、動物の総数を２２匹に維持した。その他の動物は研究期間中死ぬことはなかった。
【００３９】
組織学的には粘膜下組織グラフトは２週間目には移行上皮によって完全に覆われた。グラフトはそれらの末端部の著しい血管増加（血管新生）とそれら全表面への線維芽細胞および新しい毛細管の侵入を示した。周辺には中程度の単核炎症細胞反応があった。中心では炎症はあまり強くなく、線維芽細胞および小毛細管が粘膜下組織のコラーゲン線維に侵入していた。
【００４０】
４週間までに十分形成された小血管および線維芽細胞がグラフトに侵入した。単核炎症細胞の侵潤は末端部ではごくわずかであったが、中心領域では中程度の強さであった。平滑筋と一致する形態学的特性および染色特性をもった筋線維が周辺全体に分散されていた。
【００４１】
３カ月目にはグラフト全体の炎症活性はおさまり、小さいが十分形成された血管が存続した。コラーゲンは良く組織化され、まき散らされた線維芽細胞が個々のコラーゲン線維間に散在していた。平滑筋と一致する形態学的および染色特性をもった小筋線維が全体的に散らばっていた。その上、今度は十分形成された平滑筋の明らかな束がグラフトの小部分にはっきり認められた。
【００４２】
最後に、増強後２４および４８週間目には正常ラット膀胱の３層（尿路上皮、平滑筋および漿膜）すべてが存在し、肉眼的にも顕微鏡的にも正常ラット膀胱とは区別できなかった。粘膜下組織グラフトの縁を輪郭づける永久標識縫合糸が、粘膜下組織グラフトが外科的に移植されたことを示す唯一の目印であった。グラフト縮化の兆候はなかった。膀胱結石のある動物では再生した粘膜下組織および残っている正常膀胱両方に広範な尿路上皮の炎症があった。 結石のない動物は炎症の兆候を示さなかった。
【００４３】
［実施形４］  イヌ膀胱の外科的修復
１４匹のイヌで、 膀胱の３０−７０％を過酢酸滅菌粘膜下組織材料で置換する研究を行った。動物を手術の１週間、２週間、４週間、８週間、１２週間、 ６カ月および１４カ月後に殺した。概要を述べると、 すべての動物は術後２日以内に尿保有能力および正常な排尿能力を示した。膀胱は非常に短期間（１−２週）に再生し（グラフト組織は内因性膀胱組織で置換された）、正常な移行上皮、基底膜、粘膜下組織、および比較的薄くて正常な、だが明白に組織化された平滑筋細胞層を含んでいた。感染したり、発熱したり、異種材料拒否の兆候を示す動物は１匹もいなかった。
【００４４】
殺したときに切り取った組織の in vitro 研究では、新たに再生した膀胱が収縮性、機能性紡錘細胞（平滑筋細胞）を含み、神経受容体を有することが示された。これらの細胞はカルバコルおよびニコチンに反応した。カルバコル反応はアトロピンによってブロックされた。
【００４５】
さらに、平滑筋細胞は電気刺激に対し、正常膀胱平滑筋収縮力の約７５％で応答した。手術前の膀胱の容積は約５１ｍｌで、殺したときの膀胱容積は約５５ｍｌであった。こうして膀胱の大きさは粘膜下組織グラフト材料の使用によって保持され、“瘢痕化”で予想されるような縮化の兆候はなかった。再建された膀胱の持続的圧力保持能力は維持された。尿容量を生ずる圧力は手術前は５２ｃｍ水で、殺したときには４５ｃｍ水であった。
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月7日(2005.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿路の尿路上皮組織の損傷または疾病部分の修復または置換のための組織グラフト構成物であって、前記構成物は温血脊椎動物の粘膜下組織のシートを備え、前記尿路上皮組織は尿道組織または尿管組織を備えることを特徴とする
組織グラフト構成物。
【請求項２】
前記組織グラフト構成物は温血脊椎動物の２つ以上の粘膜下組織片から形成され、前記グラフト構成物は前記グラフト構成物を形成するために用いられる個々の片のどれよりも大きい表面積を有することを特徴とする
請求項１に記載の組織グラフト構成物。
【請求項３】
前記粘膜下組織は粘膜層の内腔部分と筋層の両方から剥離された粘膜下層を備える腸粘膜下組織であることを特徴とする
請求項１に記載の組織グラフト構成物。
【請求項４】
前記組織グラフト構成物が複数の粘膜下組織層を有することを特徴とする
請求項１に記載の組織グラフト構成物。
【請求項５】
前記組織グラフト構成物は２つ以上の粘膜下組織片から形成されることを特徴とする
請求項１に記載の組織グラフト構成物。
【請求項６】
尿路の尿路上皮組織の損傷または疾病部分の修復または置換のための組織グラフト構成物であって、前記構成物は温血脊椎動物の粘膜下組織のシートを備え、前記修復および置換された尿路上皮組織は７０％以上の膀胱を形成することを特徴とする
組織グラフト構成物。
【請求項７】
前記組織グラフト構成物はポーチとして形成されることを特徴とする
請求項６に記載の組織グラフト構成物。
【請求項８】
前記組織グラフト構成物は膀胱全体を置換するために用いられることを特徴とする
請求項６に記載の組織グラフト構成物。
【請求項９】
前記組織グラフト構成物は膀胱形状に形成されることを特徴とする
請求項６に記載の組織グラフト構成物。
【請求項１０】
前記組織グラフト構成物は尿管および尿道に外科的に結合されるための口および液体で連絡するための口を有することを特徴とする
請求項６に記載の組織グラフト構成物。
【請求項１１】
前記組織グラフト構成物は温血脊椎動物の２つ以上の粘膜下組織片から形成され、前記グラフト構成物は前記グラフト構成物を形成するために用いられる個々の片のどれよりも大きい表面積を有することを特徴とする
請求項６に記載の組織グラフト構成物。
【請求項１２】
前記粘膜下組織は粘膜層の内腔部分と筋層の両方から剥離された粘膜下層を備える腸粘膜下組織であることを特徴とする
請求項６に記載の組織グラフト構成物。
【請求項１３】
前記組織グラフト構成物が複数の粘膜下組織層を有することを特徴とする
請求項６に記載の組織グラフト構成物。
【請求項１４】
前記組織グラフト構成物は２つ以上の粘膜下組織片から形成されることを特徴とする
請求項６に記載の組織グラフト構成物。