(57)【要約】【課題】  組織損傷部、外傷部または組織移植部へのリンパ球の移動・侵入を妨げる。【解決手段】  ヒトリンパ球関連細胞表面タンパク質ＬＡＭ−１または当該タンパク質の活性を保持するように上記配列中の一つまたはいくつかのアミノ酸が置換、欠失または付加を有するタンパク質を発現する宿主細胞を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２（SEQ ID NO:2）のアミノ酸配列：
【化１】
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を有するヒトリンパ球関連細胞表面タンパク質ＬＡＭ−１または当該タンパク質の活性を保持するように上記配列中の一つまたはいくつかのアミノ酸が置換、欠失または付加を有するタンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項２】
配列番号：２（SEQ ID NO:2）のアミノ酸配列：
【化２】
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を有するヒトリンパ球関連細胞表面タンパク質ＬＡＭ−１または当該タンパク質の活性を保持するように上記配列中の一つまたはいくつかのアミノ酸が置換、欠失または付加有するタンパク質を発現する細胞を生産するための方法であって、請求項１記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明はヒトリンパ球関連細胞表面タンパク質に関する。
【従来の技術】
【０００２】
ある細胞系統によって選択的に発現されるが、他の系統によっては発現されない遺伝子は、往々にしてその細胞集団の機能を規定する。新たな機能をもつタンパク質をコードする新たな遺伝子が発生する場合には、機能的に独立したドメインが集まって遺伝子を形成することがしばしば起こる。誘導可能な内皮−白血球付着分子（ＥＬＡＭ−１）は、サイトカイン処理した内皮細胞の表面に発現される。この分子は血管内壁への細胞の付着を媒介することによって炎症部位に血液白血球を蓄積させると考えられる（Bevilacquaet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：9238（1987））。血小板や内皮細胞に存在する、ＧＭＰ−１４０と呼ばれる顆粒膜タンパク質はクローン化されており、ＥＬＡＭ−１と相同性がある（Johnston et al., Blood Suppl．1 72：327A（1988））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
組織損傷部、外傷部または組織移植部へのリンパ球の移動・侵入は病変を引き起こしたり、病状を進展させたりするので、これらの過程を妨げる薬剤に関する要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、一般に、動物レクチン、成長因子、およびＣ３／Ｃ４結合タンパク質の結合ドメインと相同なドメインを含むリンパ球関連細胞表面タンパク質ＬＡＭ−１をコードするヒトｃＤＮＡ配列（配列番号：１（SEQ ID NO:1））；および前記ｃＤＮＡ配列によってコードされるＬＡＭ−１タンパク質（配列番号：２（SEQ ID NO:2））またはＬＡＭ−１の免疫原性のある断片を提供する。
【発明の実施の形態】
【０００５】
好適な実施態様において、前記ｃＤＮＡ配列はヒト扁桃腺ｃＤＮＡライブラリーに由来するＢ細胞に特有なｃＤＮＡ集団から分離され、そして前記タンパク質のアミノ酸配列は図２−図４並びに配列番号：２（SEQ ID NO:2）に実質的に示す通りであり、より好ましくは図２−図４並びに配列番号：２（SEQ ID NO:2）に示す配列と８０％相同であり、最も好ましくは９０％相同である。（ここで“実質的に示す通りである”とは、同一機能をもつように図示した配列と十分近似した配列であることを意味する。）他の面において、本発明は、リンパ球関連細胞表面タンパク質ＬＡＭ−１またはその断片に対して、もしくはＬＡＭ−１またはその断片と特異的に会合して機能的な分子を生成する分子に対して誘導された抗体を提供する。
【０００６】
別の面において、本発明は、前記抗体と細胞集団を反応させ、前記抗体と結合する細胞を分離することを含む、ＬＡＭ−１を発現する細胞の同定方法を提供する。抗体の結合はＬＡＭ−１のレセプター活性を阻止するためにも使われる。
【０００７】
別の面において、本発明は、リンパ球動員疾患をもつヒト患者に、無毒性の製剤用担体物質と組み合わせたＬＡＭ−１に対する拮抗物質の治療量を投与することから成る、前記疾患の治療方法を提供する。この方法の好適な実施態様において、患者は組織の損傷、自己免疫疾患、またはがんを患っているか、あるいは器官もしくは組織移植を受けた者である。
【０００８】
別の面において、本発明は、交差ハイブリダイズするヒトＤＮＡを単離するための前記ｃＤＮＡ配列の使用を提供する。
別の面において、本発明は、ＬＡＭ−１に結合するリガンド、またはＬＡＭ−１と特異的に会合して機能的な分子を生成する分子に結合するリガンドを同定するためのＬＡＭ−１の使用を提供する。
【０００９】
ここで用いる“拮抗物質（antagonist）”なる用語は、ＬＡＭ−１と相互作用してその機能を妨害する物質、例えばＬＡＭ−１と反応する抗体またはＬＡＭ−１に結合するリガンドを含むものである。
【００１０】
リンパ球関連細胞表面タンパク質ＬＡＭ−１は、以前に同定されたことのない特異なレセプタータンパク質である。ＬＡＭ−１は数種類の異なるレセプターに存在するドメインと相同なドメインを含み、細胞付着に関与していることが知られているタンパク質ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０を含む遺伝子ファミリーの新しい一員である。ＬＡＭ−１は同様の機能を果すと思われるが、リンパ球によって特異的に発現される。ＬＡＭ−１をコードするｃＤＮＡの単離によりこの分子の構造が決定され、またこの遺伝子を発現しない細胞にＬＡＭ−１の発現を移すために前記ｃＤＮＡが使われた。
【００１１】
ＬＡＭ−１と反応する抗体を使用することにより、このレセプターを発現する細胞を同定すること、およびレセプターの機能を阻止することができる。さらに、ｃＤＮＡタンパク質産物を使用することにより、リンパ球の付着および機能を妨げうる拮抗物質リガンドを開発することができ、それにより組織の損傷、がん細胞の転移のような症状を治療するのに使用されうる。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の好適な実施態様の説明並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【実施例】
【００１３】
Ｂ細胞に特有のｃＤＮＡは、ヒト扁桃腺ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣ ＃３７５４６）から、Ｂ細胞（ＲＡＪＩ）ＲＮＡまたはＴ細胞（ＨＳＢ−２）ＲＮＡより誘導された標識ｃＤＮＡを使った鑑別ハイブリダイゼーションにより分離した（Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA85：208-212（1988））。陽性プラークを単離してクローン化し、このｃＤＮＡ挿入物をプラスミドｐＳＰ６５（Promega社、Madison，WI）にサブクローン化した。ヌクレオチド配列はマクサム−ギルバート法（Meth．Enzymol. 65：499（1980））を使って解析した。ギャップまたは欠失が存在する配列では、各ヌクレオチドまたはアミノ酸の相同性の分析において−１のギャップペナルティを課した。単離した２６１個のＲＡＪＩ＋ＨＳＢ２−ｃＤＮＡクローンのうちの１つ、Ｂ１２５は数種のＢ細胞系列に存在する２．４ｋｂ ＲＮＡ種とハイブリダイズする１．９０ｋｂ ｃＤＮＡ挿入物を含んでいた（Tedder et al., 同上）。しかしながら、Ｂ１２５は他のＲＡＪＩ＋ＨＳＢ２−クローンのどれともハイブリダイズせず、また数種のＴ細胞系列由来のｍＲＮＡともハイブリダイズしなかった。Ｂ１２５ｃＤＮＡクローンは制限マッピングおよびヌクレオチド配列解析によりその性状を決定した。Ｂ１２５とハイブリダイズするほぼ全長の２．３ｋｂ ｃＤＮＡが単離され、その塩基配列が決定され、そしてｐＬＡＭ−１と命名された。
【００１４】
図１のＡに示すように、制限地図はｐＬＡＭ−１の標準的なシングル、ダブル、またはトリプル消化により作成した。推定コード領域は黒い線で示す。矢印はヌクレオチド配列解析の方向および範囲を示し、白の円は５′末端標識を示す。第１Ｂ図には、ＬＡＭ−１ ｍＲＮＡの構造の模式図を示す。細い線は５′および３′非翻訳配列（ＵＴ）を示し、太い線は翻訳領域を示す。ボックスはレクチン様および上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、並びに２つのショート・コンセンサス・リピート（ＳＣＲ）単位を表す。白のボックスは推定上のトランスメンブラン（ＴＭ）領域を示す。
【００１５】
リンパ球および非リンパ球様細胞由来の細胞系列によるＬＡＭ−１ ｍＲＮＡの発現を調べた。ノザンブロット分析は、ＬＡＭ−１がＢ細胞系列Ｒａｊｉ、ＳＢ、Ｌａｚ−５０９、およびＧＫ−５から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ中の２．６ｋｂ ＲＮＡ種と強くハイブリダイズし、１．７ｋｂ ＲＮＡ種とは弱くハイブリダイズすることを明らかにした。しかしながら、２つのプレＢ細胞系列（Ｎａｌｍ−６、ＰＢ−６９７）、３つのＢ細胞系列（Ｎａｍａｌｗａ、Ｄａｕｄｉ、ＢＪＡＢ）、５つのＴ細胞系列（ＣＥＭ、Ｈｕｔ−７８、ＨＳＢ−２、Ｍｏｌｔ−１５、Ｍｏｌｔ−３）、骨髄性単球系列（Ｕ９３７、およびＬＰＳと共に培養したＵ９３７）、並びに赤白血病（Ｋ−５６２）細胞系列から単離したＲＮＡはＬＡＭ−１とハイブリダイズせず、この遺伝子の発現がＢリンパ球と特別な関係にあることを示唆した。
【００１６】
Ｂ１２５ ｃＤＮＡクローンは、図２−図４に示すように、３７２個のアミノ酸から成るタンパク質をコードしうる１１８１ｂｐのオープン・リーディング・フレームを含んでいた。アミノ酸配列の上に示す数字はアミノ酸残基の位置を表す。右側に示す数字はヌクレオチド残基の位置を表す。アミノ酸は一文字表記で表され、＊は終結コドンを示す。四角で囲った配列は起こりうるＮ結合グリコシル化部位である。シグナルおよびトランスメンブランペプチドであると考えられる疎水性領域にはアンダーラインが引いてある。成熟タンパク質のアミノ末端でありうる位置には垂直の矢印が付けてある（von Heijne, Nucleic Acids Res. 14：4683（1986）を参照）。
【００１７】
ＬＡＭ−１のアミノ酸配列は膜糖タンパク質に特徴的な構造を予告した。２つの可能な翻訳開始部位がヌクレオチド位置５３および９２に存在していた。２番目の開始部位は最適開始のためのコンセンサス配列（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧに最もよく合致しており、その後にシグナルペプチドでありうる２７アミノ酸の疎水性領域が続いている。von Heijneのアルゴリズムは、成熟タンパク質のアミノ末端がアミノ酸位置５２のＴｒｐである可能性が最も高いことを予告した。ＬＡＭ−１配列はトランスメンブラン領域でありうるアミノ酸３４６−３６８の第二疎水性領域を含んでいた。推定上の成熟ＬＡＭ−１タンパク質は７つの起こりうるＮ結合グリコシル化部位を含む約２９４個のアミノ酸から成る細胞外領域をもつであろう。ＬＡＭ−１は８個の塩基性残基と１個の酸性残基を含む１７個のアミノ酸から成る細胞質尾部をもつであろう。２個の細胞質Ｓｅｒ残基は、プロテインキナーゼＣが数個の塩基性残基のカルボキシル末端側にあるＳｅｒ残基をリン酸化するので、リン酸化のための基質として役立つ。これらの結果は、プロセッシングを受けたＬＡＭ−１タンパク質のＭｒが少なくとも５０，０００であることを示唆している。ＬＡＭ−１タンパク質は、抗体またはリガンドを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーのような慣用技法により、このレセプターを通常発現する細胞系列から、またはトランスフェクションされた細胞系列から単離することができる。あるいは、このタンパク質はＬＡＭ−１ ｃＤＮＡのinvitro翻訳により合成することができる。
【００１８】
ＬＡＭ−１は３種類の異なる分子ファミリー：動物レクチン、成長因子、およびＣ３／Ｃ４結合タンパク質に見られる以前には無関係であったドメインの組み合わせを含んでいた。ＬＡＭ−１の提案された細胞外領域は、図１のＢに示す一般構造と共に、多くのＣｙｓ残基（７％）を含んでいた。図５−図７には、相同タンパク質のセグメントが示されており、それぞれの端にアミノ酸残基の番号が付けてある。相同なアミノ酸は四角で囲ってある。相同性を最大限にするために、配列中にギャップ（−）を挿入した。このタンパク質の最初の１５７個のアミノ酸（図５−図７）はＩｇＥの低アフィニティーレセプター（Kikutani et al.,Cell 47：657（1986））、アシアログリコプロテインレセプター（Spiess et al., Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82：6465（1985)）、および他の数種の炭水化物結合タンパク質（Drickamer et al., J．Biol．Chem. 256：5827（1981）；Ezekowitz et al., J．Exp．Med．167：1034（1988）；Krusius et al., J．Biol．Chem．262：13120-13125（1987）；およびTakahashi et al., J．Biol．Chem．260：12228（1985））と相同であった。すべての動物レクチン炭水化物認識ドメイン間で保存されていたアミノ酸には（＊）を付けてある。配列相同性は３０％以下であったが、動物レクチン炭水化物認識ドメインに存在する不変残基はすべて保存されていた（Drickamer, J．Biol．Chem．263：9557（1988））。
【００１９】
３６個のアミノ酸から成る次のドメイン（図５−図７）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Gregory, Nature 257：325（1975））、第ＩＸ因子に存在するＥＧＦ様リピート単位（Yoshitake et al., Biochem. 25：3736（1985））、および線維芽細胞プロテオグリカンのコアタンパク質（Krusius et al., 同上）と相同（３６−３９％）であった。
【００２０】
これらのドメインのすぐ後に、ＩＬ−２レセプター（Leonard et al., Nature311：626（1984））、第XIII因子（Ichinose et al.,Biochem. 25：4633（1986））、および多くのＣ３／Ｃ４結合タンパク質（Klickstein et al., J．Exp．Med．165：1095（1987）；および Morleyet al., EMBO J. 3：153（1984））を構成するショート・コンセンサス・リピート単位（ＳＣＲ）と相同である、それぞれ６２個のアミノ酸から成る２つの直列ドメイン（図５−図７）が続いている。保存されたＣｙｓ残基を４個含む従来のすべてのＳＣＲと対照的に、これらの２つのＳＣＲは６個のＣｙｓ残基を保有していた。すべてのＳＣＲに見られる４個の保存Ｃｙｓ残基には図７図において（＊）が付けてあり、ＬＡＭ−１に見られる追加の保存Ｃｙｓ残基には（＋）が付けてある。これらのタンパク質のそれぞれに存在するＳＣＲのうちで、ＬＡＭ−１と最も相同性の高いＳＣＲが図面に示されている。１５個のアミノ酸から成るスペイサーが推定上のトランスメンブランドメインの上流に存在していた。
【００２１】
ＬＡＭ−１の推定アミノ酸配列はＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０の配列と相同である。従って、これらの２つのタンパク質およびＬＡＭ−１は、異なる細胞系統によって発現されかつ細胞の相互作用においてレセプターとして機能しうる相同な構造の新しいファミリーを構成するものである。
【００２２】
［発明の効果］
組織損傷部、外傷部または組織移植部へのリンパ球の移動・侵入は病変を引き起こしたり、病状を進展させたりするので、これらの過程を妨げる薬剤は治療に使用することができる。ＬＡＭ−１を抗原として使用することにより、このタンパク質に対する抗体を生産すること、およびリンパ球の付着および機能を妨害しうる拮抗物質リガンドを開発することができる。これらの試薬類を使って研究することにより、ＬＡＭ−１の三次元構造を解析したり、リンパ球機能におけるその役割を明らかにすることが可能になる。これらの薬剤の患者への投与は病変を阻止または軽減しうる。一例として、この抗原を発現する悪性細胞のサブ集団は、レセプターに腫瘍細胞を転移させるように機能させるであろう。このレセプター機能を阻止する薬剤は悪性細胞の転移・帰還を妨げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１のＡおよびＢは、ＬＡＭ−１  ｃＤＮＡクローンの構造を示す制限地図である。
【図２】図２は、ＬＡＭ−１のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す配列図である。
【図３】図３は、図２の続きの配列図である。
【図４】図４は、図３の続きの配列図である。
【図５】図５は、ＬＡＭ−１と他のタンパク質との相同関係を示す配列図である。
【図６】図６は、ＬＡＭ−１と他のタンパク質との相同関係を示す配列図である。
【図７】図７は、ＬＡＭ−１と他のタンパク質との相同関係を示す配列図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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