(57)【要約】【課題】  特定の診断設備や測定装置を必要とせずにＨＩＶ感染をできるだけ感染初期に検出し、短時間に測定結果が得られる試薬や器具であって、ＨＩＶの抗原及び抗体を１回の操作で簡便に測定する装置を提供する。【解決手段】  毛細管作用により輸液可能な帯状のマトリクスに、少なくとも１種類の抗ＨＩＶ抗体を不動化したＨＩＶ抗原検出部と、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類の合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換え抗原を不動化したＨＩＶ抗体検出部とからなる検出ゾーンを有するＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定装置により測定を行う。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛細管作用により輸液可能な帯状のマトリクスを備え、該マトリクスに、
少なくとも１種類の抗ＨＩＶ抗体を不動化したＨＩＶ抗原検出部と、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類の合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換え抗原を不動化したＨＩＶ抗体検出部とを有する検出ゾーンと、
酵素標識試薬ゾーンと、
検体点着ゾーンと、
前記マトリクスの一方の長手方向の端部近傍に基質試薬ゾーンを有する展開液パッドを付設した展開液供給ゾーンと、
前記マトリクスの他の長手方向の端部に設けた展開液吸収ゾーンとを有する
ＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具。
【請求項２】
前記マトリクスが展開液供給ゾーンから展開液吸収ゾーンへ向けて展開液を輸液するマトリクスであって、検出ゾーンの上流側に酵素標識試薬ゾーン及び前記酵素標識試薬ゾーンの上流側に基質試薬ゾーンとを有し、酵素標識試薬ゾーンの上に検体点着ゾーンを設けてなる請求項１記載の免疫測定器具。
【請求項３】
酵素標識試薬ゾーンがマトリクス上に積層された酵素標識試薬を含有するパッドである請求項１又は２記載の免疫測定器具。
【請求項４】
酵素標識試薬を含むパッドをマトリクス上に積層した酵素標識試薬ゾーンと、該パッドの積層部位と密着するマトリクス部分の一部又は全部に前記酵素標識試薬と同一又は異なった酵素標識試薬を含む酵素標識ゾーンとを設けた請求項１ないし３のいづれか１項に記載の免疫測定器具。
【請求項５】
ＨＩＶ抗原検出部に不動化された抗ＨＩＶ抗体が、ＨＩＶ−１ｇａｇ抗原のｐ２４に対する１種類又は２種類のモノクローナル抗体である請求項１ないし４のいづれか１項に記載の免疫測定器具。
【請求項６】
酵素標識試薬が、酵素標識されたＨＩＶ−１ｇａｇ抗原のｐ２４に対するポリクローナル抗体である請求項５記載の免疫測定器具。
【請求項７】
ＨＩＶ抗体検出部のＨＩＶ抗原が、ＨＩＶ−１ｅｎｖ抗原のｇｐ４１の遺伝子組換え抗原と、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類のＨＩＶ−２ｅｎｖ抗原のｇｐ３６中の合成ＨＩＶペプチド抗原からなる請求項１ないし４のいづれか１項に記載の免疫測定器具。
【請求項８】
酵素標識試薬が、酵素標識された遺伝子組換えＨＩＶ−１ｅｎｖ抗原のｇｐ４１と、酵素標識された合成ＨＩＶ−２ｇｐ３６とからなる請求項７記載の免疫測定器具。
【請求項９】
ポリアミノ酸担体がポリリジンである請求項７記載の免疫測定器具。
【請求項１０】
請求項１ないし９記載の免疫測定器具の検体点着ゾーンに検体を点着し、展開液供給ゾーンに展開液を供給し、マトリクスに展開液を展開した後、検出ゾーンのシグナルを検出することからなるＨＩＶ抗原抗体免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛細管作用により輸液可能な帯状のマトリクスに、少なくとも１種類の抗ＨＩＶ抗体を不動化したＨＩＶ抗原検出部と、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類の合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換え抗原を不動化したＨＩＶ抗体検出部とを有する検出ゾーンを有するＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具、及び該免疫測定器具を用いるＨＩＶ抗原抗体免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）の感染の有無、ＨＩＶ感染時期の特定や治療効果の確認する方法として、検体中の抗ＨＩＶ抗体やＨＩＶ抗原を免疫測定することが行われている。近年、世界的にＨＩＶ感染による後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者の増加に伴い、感染初期の感染者においても漏れなく感染者を検出できる試薬として、ＨＩＶの抗原と抗体を同時に測定するいわゆる第４世代のＨＩＶ診断試薬が開発されている。この試薬は、ＨＩＶ抗原または抗ＨＩＶ抗体を固相に結合させた試薬、若しくはＨＩＶ抗原を結合させた固相と抗ＨＩＶ抗体を結合させた固相とを混合した試薬を用い、検体中の抗体及び抗原を同時に測定することができる（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４等参照）。また、これらの試薬は、１回で抗体及び抗原の測定が行え、感染直後の検査で検出できない空白期間を短縮することができるため近年広く用いられるようになった。これらの抗体及び抗原同時測定試薬は、抗原又は抗体の少なくとも一方をＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ等で検出することはできるが、抗原と抗体とを別々に測定するためには、従来の抗原測定用の試薬と抗体測定用の試薬を用意し、少なくとも２回の測定を実施する必要があった。
【０００３】
更に、抗ＨＩＶ抗体の測定には、ＨＩＶ−１又は２の培養抗原、組換え抗原、合成抗原等を用いて検体中の抗ＨＩＶ抗体を検出することが行われている。タンパク質の合成技術の向上に伴い、ＨＩＶ構成タンパク質の抗原決定基部位のアミノ酸配列を合成したＨＩＶ合成抗原を用いた抗ＨＩＶ抗体の測定試薬が開発されている。この試薬は、非特異反応を引き起こす抗原決定基以外の構造を含まないため、特異的な測定を実施することができる等の特徴を有している。ところが、固相に合成抗原を結合させると検体中の抗体との反応性が十分でなく、微量の抗体の検出ができず、要求される感度が得られないという問題点があった。
【０００４】
一方、輸液可能な帯状のマトリックスを用いる免疫測定器具（以下「イムノクロマト器具」という）が開発され、所定の箇所に検体を点着するだけで、特別な検出装置、熟練した測定技術を必要とせず短時間に簡便に検体中の抗原又は抗体の測定ができるようになった。イムノクロマト器具には、その測定対象物質によって、例えば検出ゾーンに複数の梅毒トレポネマ抗原（ＴＰ抗原）を結合し、検体中の複数の抗ＴＰ抗体を別々の検出ゾーンで検出することのできるイムノクロマト器具が開発されている（特許文献５参照）。この器具の検出ゾーンには、異なったＴＰ抗原を結合させた複数のゾーンを有し、異なる抗ＴＰ抗体を別々の検出して感染時期を特定し、治療薬の選択等に利用されている。この試薬は、検体中の抗原と抗体とを同時に測定しようとするものではない。
【０００５】
【特許文献１】特開平２−５０３９５０号
【特許文献２】特開平６−２６５５４８号
【特許文献３】特開２００１−５０４５７２号
【特許文献４】特開２００１−５１４７４９号
【特許文献５】特開平９−２２９９３８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このようにＨＩＶ感染の拡大を防止するため、感染をできるだけ感染初期に感染者を検出することのできる測定試薬や測定器具が求められていた。また、特定の診断設備や測定装置を必要とせず、短時間に測定結果が得られる試薬や器具であって、感染時期を確認して治療薬を選択し、治療経過をモニターするため、ＨＩＶの抗原及び抗体を１回の操作で簡便に測定する方法が求められていた。更に、ＡＩＤＳの診断に用いる試薬にあっては、測定感度の向上と非特異的な反応による擬陽性の割合を低下させることが広く求められていた。本発明は、これらの要求をすべて満足するＨＩＶ感染の測定器具を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、毛細管作用により輸液可能な帯状のマトリクスを備え、該マトリクスに、少なくとも１種類の抗ＨＩＶ抗体を不動化したＨＩＶ抗原検出部と、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類の合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換え抗原を不動化したＨＩＶ抗体検出部とを有する検出ゾーンと、酵素標識試薬ゾーンと、検体点着ゾーンと、前記マトリクスの一方の長手方向の端部近傍に基質試薬ゾーンを有する展開液パッドを付設した展開液供給ゾーンと、前記マトリクスの他の長手方向の端部に設けた展開液吸収ゾーンとを有するＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具を見出し本発明を完成した。
【０００８】
また、本発明は、該免疫測定器具の検体点着ゾーンに検体を点着し、展開液供給ゾーンに展開液を供給し、マトリクスに展開液を展開した後、検出ゾーンのシグナルを検出することからなるＨＩＶ抗原と抗体の同時免疫測定方法を提供する。
【０００９】
以下本発明の免疫測定器具を更に詳細に説明する。本発明の免疫測定器具において、帯状のマトリクスは毛細管作用によって液体を輸液可能な吸収性の材料で構成される。この吸収性材料としては、例えばセルロース、ニトロセルロース等のセルロース又はその誘導体、ガラス繊維等を単独又は混合して製造したろ紙、膜、多孔性材料である。このマトリックスの大きさに制限はないが、幅３ｍｍ〜１０ｍｍ程度、長さ３０ｍｍ〜１００ｍｍ程度のストリップ状のものが取り扱いが容易で好ましい。更に、マトリックスの厚さは１００μｍ〜１ｍｍのものを用いることが好ましい。またマトリックスは、その一部又は全体を測定時に検体由来のタンパク質のマトリックスへの非特異反応による吸着を防止するために、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物血清、カゼイン、シュークロース等でブロッキングして用いることができる。
【００１０】
（検出ゾーン）
検出ゾーンには、前記マトリクス上に少なくとも１種類の抗ＨＩＶ抗体を不動化したＨＩＶ抗原検出部と、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類の合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換え抗原を不動化したＨＩＶ抗体検出部との少なくとも２箇所の検出部を設けることができる。この検出部は、マトリクス上にあり、マトリクスを展開する液体の輸液方向（マトリクスの長手方向）に直交する方向にライン状に設け、更に少なくとも２本の検出部は近傍に設けることが判定を容易に行う上で好ましい。この２本の検出部は液体の輸液方向の上流側又は下流側のいづれであってもよい。前記ＨＩＶ抗原検出部には、抗ＨＩＶ抗体を、またＨＩＶ抗体検出部には、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類の合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換えＨＩＶ抗原を不動化することにより作成することができる。
【００１１】
このＨＩＶ抗原検出部に不動化された抗ＨＩＶ抗体は、ＨＩＶ−１又は２に対する抗体を単独又は混合して使用することができ、公知の方法により製造された抗体、市販される各種抗体から選択して使用することができる。抗ＨＩＶ抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用することができ、例えばＨＩＶを構成する遺伝子構造のｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ等に対するＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、更にこれらの抗体のフラグメントであるＦａｂ、Ｆ（ａｂ‘）２  等であってもよい。ＨＩＶ−１のｇａｇに対する抗体としては例えばｐ−２４抗体、ｐ−１７等、ｅｎｖに対する抗体としては例えばｇｐ１２０ｇｐ４１、ｐｏｌに対する抗体としてはｐ６６、ｐ５１ 、ｐ３２、ｐ１０等              等をそれぞれ挙げることができ、目的によって選択して用いることができる。またＨＩＶ−２のｇａｇに対する抗体としては、ｐ２６、ｐ１６等、ｅｎｖに対する抗体としては            ｇｐ１０５、ｇｐ３６等、ｐｏｌに対する抗体としてはｐ６１、ｐ３４、ｐ１０等をそれぞれ挙げることができ、目的によって選択して用いることができる。
【００１２】
抗ＨＩＶ抗体検出部は、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類の合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換え抗原をマトリクスに不動化することによって構成される。合成ＨＩＶペプチド抗原としては、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２を構成するペプチドを化学的に合成した種々の抗原を用いることができ、例えばＨＩＶ−２ｅｎｖペプチドｇｐ３６由来のアミノ酸配列を有する１１〜１７ｍｅｒのアミノ酸残基からなるＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチド抗原を用いることができる。合成ＨＩＶペプチド抗原は周知の固相法、液相法等を利用し、合成装置によって容易に製造することができる。また、ＨＩＶの遺伝子組換え抗原についても、周知の方法に従い製造することができる。また、合成ＨＩＶペプチド抗原及び遺伝子組換え抗原は、市販されている抗原を用いることもできる。
【００１３】
前記合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換えＨＩＶ抗原は、ポリアミノ酸担体に結合させて抗ＨＩＶ抗体検出部を構成することが好ましい。このポリアミノ酸担体は、側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくは水酸基から選択される基を有する、単一の若しくは複数のアミノ酸残基の繰り返し構造を含み、前記反応基の全部又は一部が、架橋構造を介して又は介さずにジオール構造若しくはアミノアルコール構造と結合する構造を有する。ポリアミノ酸担体は、酸化処理によって前記ジオール構造若しくはアミノアルコール構造からアルデヒド基を生成させ、前記合成ＨＩＶペプチド抗原又は遺伝子組換え抗原のアミノ基と反応させることによって、抗原をポリアミノ酸担体に担持させることができる。ポリアミノ酸は、例えばグリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェルアラニン、チロシン、トリプトファン等の中性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸を挙げることができる。ポリアミノ酸担体を構成するアミノ酸は、その側鎖に反応基例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基又は水酸基を有することが好ましい。より好ましくは、本発明のポリアミノ酸担体に使用するアミノ酸は、リジン、グルタミン酸である。また、ポリアミノ酸担体に使用されるアミノ酸は、その側鎖の反応基を適当な保護基で保護されたアミノ酸誘導体であってもよい。ポリアミノ酸担体に使用されるポリアミノ酸は、典型的には前記アミノ酸残基又はアミノ酸誘導体から選択される単一のアミノ酸残基の繰り返し構造、又は複数のアミノ酸残基の繰り返し構造からなる。ポリアミノ酸の製造方法については、一般的な合成方法、例えば前記アミノ酸のＮ−炭酸無水物を乳化重合又は不均一重合する方法（特開平９−１５１２５０）が挙げられるが、これに限定されない。また、本発明のおいては、例えばシグマ社から市販されているアミノ酸ホモポリマー、又はランダムコポリマーをポリアミノ酸として使用することができる。ポリアミノ酸としては、例えばポリリジン、ポリグルタミン酸等のホモポリマー、リジン−グルタミン酸、リジン−リジン−グルタミン酸等の複数のアミノ酸残基の繰り返し構造を有する市販されているポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン  分子量３０，０００−７０，０００又は分子量１５０，０００−３００，０００等（シグマ社））を使用することも可能である。
【００１４】
また、本発明のポリアミノ酸担体は、構成するアミノ酸の側鎖にある反応基と架橋構造、及び／又は、架橋構造とジオール構造若しくはアミノアルコール構造がアミド結合によって結合していることが好ましい。あるいは、前記反応基とジオール構造若しくはアミノアルコール構造が、架橋構造を介さずに、直接、アミド結合によって結合していてもよい。
【００１５】
本願明細書において、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」には、酸化によってアルデヒド基を生成できる化学構造を有する化合物が含まれる。ここで、「ジオール構造」とは、２個の水酸基が２個の相異なる炭素原子に結合している構造をいう。また、「アミノアルコール構造」とは、同一分子内にアミノ基とアルコール性の水酸基を有する構造であり、隣り合う２個の炭素原子の一方にアミノ基を有し、他方にアルコール性の水酸基を有する構造が好ましい。本発明のペプチド結合用ポリアミノ酸担体は、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」の酸化処理によってアルデヒド基を生成し、当該アルデヒド基部分にペプチドを結合させることが可能である。
【００１６】
本発明において使用する「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物は、さらに、架橋構造と、あるいはポリアミノ酸担体を構成するアミノ酸の側鎖にある反応基と直接、結合できるような基を有することが望ましい。例えば、架橋構造又は反応基（以下、「架橋構造等」という場合がある。）がアミノ基を有する場合、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物はカルボキシル基を有し、架橋構造等とアミド結合を形成することが好ましい。架橋構造等がカルボキシル基を有する場合には、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物はアミノ基を有し、架橋構造等とアミド結合を形成できることが好ましい。「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物は、好ましくはヒドロキシアミノ酸、最も好ましくは、セリン残基、スレオニン残基である。
【００１７】
本願明細書において、「架橋構造」とは、本発明のポリアミノ酸を構成するアミノ酸又はアミノ酸誘導体の側鎖にある反応基と、アルデヒド基を生成させるためのジオール構造若しくはアミノアルコール構造とを連結するための架橋剤の構造である。
【００１８】
本発明において使用される架橋剤は、前記反応基とジオール構造若しくはアミノアルコール構造とを結合させ得る化合物である。好ましくは、架橋構造の一方の末端がカルボキシル基及び他の末端がアミノ基からなる化合物、又は架橋構造の両端がアミノ基である化合物（ジアミノ化合物）である。例えば、架橋構造の一方の末端がカルボキシル基及び他の末端がアミノ基からなる化合物で、かつ、前記反応基がアミノ基の場合、架橋構造中のカルボキシル基は前記反応基とアミド結合を形成し、そして架橋構造中のアミノ基は、好ましくはカルボキシル基を有するジオール構造若しくはアミノアルコール構造とアミド結合をする。あるいは、架橋構造の両端がアミノ基である化合物（ジアミノ化合物）で、かつ、前記反応基がカルボキシル基の場合、架橋構造中のもう一方のアミノ基は、好ましくはカルボキシル基を有するジオール構造若しくはアミノアルコール構造とアミド結合を形成する。好ましい架橋構造は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）又はエチレンジアミンである。
【００１９】
また、架橋構造は、１又はそれより多くの、及び同種又は異種の前記化合物を直鎖状又は分枝鎖状に結合した架橋剤からなっていてもよい。一方、本発明の目的であるように、担体に結合された場合の低分子抗原の活性が損なわなければ、上述した架橋構造はなくてもよく、ポリアミノ酸担体の反応基にジオール構造若しくはアミノアルコール構造が結合してもよい。
【００２０】
また、本発明のポリアミノ酸担体は、架橋構造を介して又は介さずに、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造と結合している反応基が、好ましくは、側鎖の反応基のうち３％ないし３０％であり、より好ましくは、５％ないし２０％である。本発明のペプチド結合担体の製造方法に従えば、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造からアルデヒド基を生成させるための酸化処理は特に限定されないが、例えば、過ヨウ素酸酸化法を用いることができる。ポリアミノ酸担体に生成されたアルデヒド基と、前記HIV合成抗原中のアミノ基を結合させることを特徴とする。この結合には、該ポリアミノ酸担体へペプチドの結合効率、HIV合成ペプチド抗原の活性を損なわないこと、及びHIV合成ペプチド抗原への抗体の反応性等を考慮して、HIV合成ペプチド抗原中の側鎖ではなくＮ末端のアミノ基を使用することが好ましい。または、アミノ基を有するアミノ酸をペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に結合し、該アミノ酸を使用することが好ましい。より好ましくは、ポリアミノ酸担体のアルデヒド基とHIV合成ペプチド抗原のアミノ基の選択的結合性を高めるため、HIV合成ペプチド抗原の末端にあらかじめヒドラジノ基を導入したHIV合成ペプチド抗原を調製し、使用する。ヒドラジノ基の導入のために使用される試薬として、ε−アミノ基にヒドラジノ基を有するヒドラジノベンゾイルリジンを用いる。遺伝子組換えHIV抗原についても、合成HIVペプチド抗原の場合に従い製造をすることができる。
【００２１】
前記した如くマトリクス上の検出ゾーンには、少なくとも１種類の抗ＨＩＶ抗体を不動化したＨＩＶ抗原検出部と、ポリアミノ酸担体に担持された少なくとも１種類の合成ＨＩＶペプチド抗原及び／又は遺伝子組換えＨＩＶ抗原を不動化したＨＩＶ抗体検出部との少なくとも２箇所の検出部を設けることができる。これらの検出部は、マトリクスの輸液方向において、酵素標識試薬ゾーン、検体点着ゾーン及び展開液供給ゾーンの下流側であって、添加液吸収ゾーンの上流側であり、少なくとも２箇所の検出部の順序はいずれであってもよい。検出部は、マトリクスに巾０．５ｍｍから２ｍｍ程度、好ましくは１ｍｍ程度のライン状に、近接して複数のラインを設けることができる。巾５ｍｍ程度のマトリクスであれば、前記抗体又は抗原を通常それぞれ約０．１μｇから１０μｇ点着し、乾燥させることにより検出部を作成することができる。
【００２２】
（酵素標識試薬ゾーン）
酵素標識試薬ゾーンは、マトリックス上に設けられたゾーンに標識ＨＩＶ抗原、標識抗ＨＩＶ抗体等の酵素標識試薬を展開液によって移動可能に点着して設けることができる。このゾーンは展開液供給ゾーンからの展開液の輸液方向で前記検出ゾーンの上流側に設けられる。このゾーンは、マトリックスに酵素標識試薬を点着する方法、酵素標識試薬を含む吸水性のパッドをマトリックス上に積層する方法、又はパッドと密着するマトリクス部分の一部又は全部にパッドとともに酵素標識試薬を含有させることにより構成される。マトリクス及びパッドの両方に酵素標識試薬を添加する場合には、標識ＨＩＶ抗原及び標識抗ＨＩＶ抗体を個別又は混合して点着することができる
【００２３】
酵素標識ＨＩＶ抗原を構成する抗原としては前記したＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の抗原から１種又は２種以上の抗原を選択して周知の方法に従い製造することができる。このＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗原としては、例えばＨＩＶの感染株から得られた培養抗原、遺伝子組換え抗原、化学合成された抗原等であり、前記検出ゾーンで例示したＨＩＶ抗原と同じ抗原から選択して使用することができる。
【００２４】
また、標識抗ＨＩＶ抗体としては、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体である。これらの抗体としては、前記検出ゾーンで例示した抗ＨＩＶ抗体と同じ抗体から選択して使用することができる。
【００２５】
前記酵素標識ＨＩＶ抗原又は酵素標識抗ＨＩＶ抗体は、前記抗原又は抗体と酵素とを結合させて酵素標識を製造することができる。酵素としては周知の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に用いられる各種酵素を挙げることができ、その酵素としては例えばアルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。
【００２６】
また酵素とＨＩＶ抗原又はＨＩＶ抗体との結合方法は、公知の共有結合又は非共有結合を作る方法を利用して製造することができる。結合の方法には、例えばグタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、各種架橋剤を用いる方法等を挙げることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８５）参照）。架橋剤を用いる結合方法では、架橋剤としては例えばＮ−スクシンイミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等を用いることができる。共有結合による方法では、抗原又は抗体に存在する官能基を用いることができる他、例えばチオール基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を常法により導入したのち、前記結合法により酵素標識ＨＩＶ抗原又は酵素標識抗ＨＩＶ抗体を製造することができる。また非共有結合による方法としては物理吸着法等を挙げることができる。
【００２７】
酵素標識試薬ゾーンに含有される酵素標識ＨＩＶ抗原及び酵素標識抗ＨＩＶ抗体は、マトリクス又は吸水性パッドのどちらか一方に含有させる方法、若しくはマトリクスと吸水性のパッドの両方に酵素標識ＨＩＶ抗原又は酵素標識抗ＨＩＶ抗体を含有させることができる。ＨＩＶ抗原抗体を同時に測定を行う場合には、標識試薬を多く用いるため、マトリクスとパッドの両方に酵素標識試薬を単独又は混合して含有させることが高感度測定を行う上で有利である。酵素標識ＨＩＶ抗原及び酵素標識抗ＨＩＶ抗体量は、通常検査対象物の予測される量に応じて適宜変更することができるが、前記マトリックスに用いる場合には通常乾燥重量で１ｎｇ〜１００ｎｇ程度である。酵素標識ＨＩＶ抗原及び酵素標識抗ＨＩＶ抗体は、酵素標識ゾーンに含有させる場合に動物血清、糖等の安定化剤、溶解調節剤等とともに塗布することができる。
【００２８】
（検体点着ゾーン）
検体点着ゾーンは、展開液供給ゾーンの展開液の輸液方向の下流側で検出ゾーンの上流側のマトリクス上に設けることができる。この検体点着ゾーンは、１）展開液ゾーンの展開液輸液方向の下流側で酵素標識試薬ゾーンの上流側の所定箇所、２）標識試薬ゾーンの下流側で検出ゾーンの上流側の所定箇所、３）標識試薬ゾーン上の所定箇所等に設けることが好ましい。また、前記酵素標識試薬ゾーンに検体点着ゾーンを設けた装置では、前記した如く酵素標識を含有する吸水性パッドを付設することが効率よく分析を行う上で好ましい。このパッドを付加する装置では、多量の検体液を点着することができるため、検体中の微量成分を検出感度よく測定を行うことができる。この吸水性のパッドとしては、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、不織布、セルロース等の多孔質の合成又は天然の高分子化合物からなる材料を単独又は組み合わせて構成することができる。このパッドの大きさ、厚さ、密度等は限定されないが、通常縦と横が３ｍｍ〜１２ｍｍ程度で厚さが０．５ｍｍ〜４ｍｍ程度のパッドを用いることが効率よく測定を行うためには好ましい。
【００２９】
（展開液供給ゾーン）
展開液供給ゾーンは、マトリクスの長手方向の一端に設けられ展開液が供給されるゾーンである。測定を開始するには、少なくとも展開液吸収ゾーンに達する量の展開液の入った容器に展開液供給ゾーンを浸し行うとができる。さらに展開液の供給には展開液ゾーンに展開液の入った液槽を付加し、この液槽のカバーを破り展開液とマトリクスを接触させることにより測定を開始することもできる。展開液には、界面活性剤、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤等を適宜含有することができる。緩衝剤を含む緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液等を挙げることができる。また展開液供給ゾーンには展開液のマトリクスへの供給を安定して連続的に実施するため展開液パッドを付設することが好ましい。
【００３０】
（展開液吸収ゾーン）
展開液吸収ゾーンは、マトリクスの一端に設けられた前記展開液供給ゾーンに対して他端に設置される。このゾーンはマトリクスに供給される展開液を吸収し分析を円滑に行うために設けられる。展開液吸収ゾーンはマトリクスを長く形成してこのゾーンを確保するともできる。また、マトリクスに吸水性材料を付設し展開を促進することもできる。この吸水性材料には、天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができる。展開液吸収ゾーンは、展開液を全て吸収する容積をもったパッド状の吸収性材料あるが、吸収性材料をマトリクスの上又は下に積層することにより、小型化した免疫測定器具を製造できるため好ましい。
【００３１】
（基質試薬ゾーン）
基質試薬ゾーンはマトリクスの一方の端部近傍に設けることができる。基質試薬ゾーンは、マトリクス上に設けてもよいが、展開液供給ゾーンに付設した前記展開液パッドに含有させ設けることが基質量を多く含有させるためには好ましい。基質ゾーンは、用いる基質によって、１箇所又は２箇所以上設けることもできる。
【００３２】
基質試薬ゾーンには酵素標識試薬の酵素に対応して以下に示す各種発色基質、蛍光基質、発光基質等を用いることができる。
【００３３】
（ａ）発色基質パーオキシダーゼ用：過酸化水素と組合せた２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）
アルカリホスファターゼ用：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）
【００３４】
（ｂ）蛍光基質アルカリホスファターゼ用：４−メチルウムベリフェニル−ホスフェート（４ＭＵＰ）
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用：４−メチルウムベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（４ＭＵＧ）
【００３５】
（ｃ）発光基質アルカリホスファターゼ用：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスフォリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）
パーオキシダーゼ用：過酸化水素と組み合わせたルミノール、イソルミノール
【００３６】
前記基質は、通常基質を水溶液に溶解して展開液パッドにライン状に塗布した後、乾燥させることにより形成することができ、所望により基質のシグナル増強剤、安定化剤、溶解調節剤等を添加することもできる。基質ゾーンは、マトリクスの端部に付設した展開液パッド内であれば、特に限定されない。展開液パッドに添加する基質量は、測定条件により決定することができるが、１個の器具当たり通常１００ｍｇ〜４００ｍｇ程度を用いることができる。基質は、展開液に含まれてマトリクスに供給できればよく、基質ゾーンを設ける以外に展開液に基質の一部又は全部を含有させることもできる。
【００３７】
（測定器具の使用方法）
本発明の測定器具により各種検体試料中のＨＩＶ抗原及び／又は抗ＨＩＶ抗体の測定を行うことができる。測定は、まず約５μｌ〜５０μｌの検体を本発明の測定器具の検体点着ゾーンに供給した後、展開液をマトリクスに展開して行う。展開液は毛細管作用によりマトリクスを移動し、展開液吸収ゾーンに達し、検出ゾーンに結合されなかった検体中の成分、酵素標識試薬等が吸収され展開が完了する。所定時間（通常１０分から２０分）経過後、ＨＩＶ抗原検出部とＨＩＶ抗体検出部を有する検出ゾーンを観察し、検体液中のＨＩＶ抗原又は抗ＨＩＶ抗体に依存存する量の前記ＨＩＶ抗原検出部及びＨＩＶ抗体検出部に固定化された酵素標識物と基質との反応によって生ずるシグナルを検出することによりＨＩＶ抗原及び抗ＨＩＶ抗体の測定を行うことできる。この検出は本発明の測定器具に用いる基質により目視による測定の他、比色計、蛍光光度計、フォトンカウンター、感光フィルム等の測定装置を用いて実施することができる。測定は、例えば発色基質により生成する色素の有無を定性的に目視で測定する方法が簡便である。また、この方法では検体中に含まれるＨＩＶ抗原又は抗ＨＩＶ抗体の量に対応した色票（カラーチャート）を用いることにより半定量的な分析が可能となる。更に、比色計等により検出ゾーンの発色を数値化して、定量を行うこともできる。
【００３８】
更に、検出ゾーンと展開液吸収ゾーンの間のマトリクス上には、展開液が展開して測定が正常に行われた否かを確認するための展開液確認部を設けることが好ましい。展開液確認部には、展開液又は展開液に含まれる試薬と反応して発色する指示薬、展開液と反応して着色が消える指示薬の他、標識試薬の試薬の一部と反応する抗体又は抗原等を不動化させることができる。標識試薬と反応する抗体又は抗原を結合させる場合には、展開液確認部では展開液中に含まれる前記基質との反応による発色により確認をすることができる。
【００３９】
また、前記マトリクスはプラスチック、金属、紙等の支持部材上に積層し固定して用いることもできる。前記マトリクスは、プラスチック等のケースに固定し、展開液を含む液槽を展開液供給ゾーンに付設し前記各ゾーン部分に穴の開いたケースでカバーをすることにより取扱の容易な装置を構成することができる。本発明の測定器具で測定される検体としては、例えば血清、血漿、全血、唾液、尿等の体液が挙げられる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明のＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具を用いると検体中のＨＩＶ抗原及び／又は抗ＨＩＶ抗体を同時に測定ができるため、簡便にしかも容易にＨＩＶ感染を測定することができる。また、本発明の器具では、従来の抗体検査に比べ感染初期において早期に感染が検出でき、極めて擬陽性の割合が少ないため、高感度且つ正確な診断を行うことができる。更に、本発明の器具では検査開始後１５分程度で判定ができ、判定に特別な測定装置を必要としないために、ＨＩＶ感染を簡便に判定でき、ＨＩＶ感染拡大の防止に有用である。また、更に同時に得られるＨＩＶ抗原と抗ＨＩＶ抗体の測定結果から、感染時期の特定や、治療薬の選択にも有用である。
【実施例】
【００４１】
以下実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、発明を本実施例に限定するものではない。
【００４２】
参考例１  ＨＩＶ−１ｇｐ４１ 組換抗原の作製
ＨＩＶ−１ｇｐ４１のアミノ酸５４０番から６８３番目までの遺伝子を発現ベクターに組み込んだプラスミドを導入した大腸菌株を用いた。
リコンビナントＨＩＶ−１抗原（ｇｐ４１）の調製
培養は産生培地を用いて３７℃で通気攪拌培養し、組み換え体の増殖を濁度モニターしながらＩＰＴＧ（イソプロピル-チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で誘導した。培養終了後組み換え体の回収は膜濃縮法で行い、濃縮液に緩衝液を加えさらに濃縮操作を行うことで菌体の洗浄を行った。抗原の精製は菌体を破砕後遠心分離し、その沈殿を回収する。回収した沈殿は緩衝液に懸濁させた後界面活性剤を加え、沈殿の洗浄処理を行った。得られた沈殿を可溶化し、さらにクロマトグラフィーに供し精製を行い最終的にゲル濾過で脱塩し精製組み換え体を得た。
【００４３】
参考例２  アルカリホスファターゼ標識ＨＩＶ−１ｇｐ４１組換抗原の作製
ジスルフィド結合を含む精製リコンビナント抗原液に０．２ＭＤＴＴ（（±）−ジチオトレイトール、和光）を添加し、37℃、2時間インキュベートした。ゲル濾過精製を行い、フリーのチオール基（−ＳＨ）に対して、Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）を導入した、アルカリホスファターゼとカップリングした。最終的にゲル濾過で精製し、アルカリホスファターゼ標識ＨＩＶ−１ ｇｐ４１組換抗原を得た。
【００４４】
参考例３  ＨＩＶ−２ｇｐ３６１７merペプチド結合担体の作製
（I）セリン化ポリリジンの合成１
（ａ）Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリル−γ−アミノ酪酸（１）の合成
アミノアルコール構造を有するセリンと架橋剤としてγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を用いて、標記の架橋構造を有するセリンを合成した（スキーム１）。市販されているセリンのアミノ基及び水酸基があらかじめ保護されているセリンを使用した。Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン２．６１ｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１．２７ｇをＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド（以下、ＤＭＦという。）に溶解し、氷冷下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２．１１ｇを加え、室温で終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、よく攪拌して分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせて、５％クエン酸水溶液、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。酢酸エチルを溜去し、残渣をＤＭＦに溶解し、ＧＡＢＡ１．０３ｇと炭酸水素ナトリウム０．８４ｇを水に溶解して加え、終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、６Ｎ塩酸でｐＨを約３として分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を合わせて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを溜去すると結晶化した。ｎ−ヘキサンを加えて結晶を濾取した。収量２．７７ｇ（８０％）。
【００４５】
（ｂ）Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリル−γ−アミノ酪酸  Ｎ−コハク酸イミドエステル（２）
上記で調製した化合物（１）のカルボキシル基をスクシンイミドエステルで活性化した（スキーム１）。
【００４６】
化合物（１）１．０４ｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．３８ｇをＤＭＦに溶解し、氷冷下１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．６３ｇを加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水と酢酸エチルを加え、よく攪拌して分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を合わせて５％クエン酸水溶液、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した。酢酸エチルを溜去すると結晶化した。ｎ−ヘキサンを加えて結晶を濾取した。収量１．２１ｇ（９１％）
スキーム１
【００４７】
【化１】
2005061910.tif 000003
【００４８】
（ｃ）ポリリジン｛Ｂｏｃ−セリン（ｔ−ブチル）−γ−アミノ酪酸｝（３）
上記で製造した化合物（２）とポリリジンとをペプチド結合させて、標記化合物（３）を得た（スキーム２）。
【００４９】
ポリリジン（シグマ社製Ｎｏ．Ｐ２６３６、ＭＷ（粘度）３０，３００）２０ ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、化合物（２）８．９ｍｇをＤＭＦ２００μｌに溶解して加え、室温で３時間攪拌した。反応液に酢酸１００μlを加えて透析チューブに移し、水に対して室温３時間透析した後、凍結乾燥した。収量２２．０ｍｇ
スキーム２
【００５０】
【化２】
2005061910.tif 000004
【００５１】
（ｄ）ポリリジン｛Ｂｏｃ−セリン（ｔ−ブチル）−γ−アミノ酪酸、スクシニル｝（４）
上記で製造した化合物（３）におけるポリリジンの未反応のアミノ基に無水コハク酸を反応させ、修飾した（スキーム３）。上記の化合物（３）１０ｍｇを１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、無水コハク酸２５ｍｇをＤＭＦ２５０μｌに溶解して加え、室温で２時間攪拌した。反応液を透析チューブに移し、水に対し４℃で一夜透析した後、凍結乾燥した。収量１３．７ｍｇ
【００５２】
（ｅ）ポリリジン｛セリン−γ−アミノ酪酸、スクシニル｝（５）
上記で製造した化合物（４）を脱保護し、標記化合物（５）を得た（スキーム３）。化合物（４）の全量を水２５μｌとトリフルオロ酢酸５００μｌに溶解して、室温で１時間攪拌した。反応液に水を加えて凍結乾燥した。１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、水に対して室温で３時間透析した後、凍結乾燥した。収量１０．７ｍｇ
スキーム３
【００５３】
【化３】
2005061910.tif 000005
【００５４】
加水分解後のアミノ酸分析により、ポリリジンの反応基の中で、アミノアルコール構造が結合している反応基の割合を調べた。化合物（２）とポリリジンの反応基をモル比１：５で混合した場合には、ポリリジンの反応基４．６に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応していた。
【００５５】
（ｆ）さらに、アミノアルコール構造と結合している反応基の割合が異なるポリリジン担体を調製するため、上記の化合物（２）とポリリジンの混合比を変化させて、同様の方法でセリン化ポリリジンを調製した。上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：１０で混合した場合には、ポリリジンの反応基９．６に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。また、上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：２０で混合した場合には、ポリリジンの反応基１９．２に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。
【００５６】
参考例４  ヒドラジノペプチドの合成
（１）４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸の合成
４−ヒドラジノ安息香酸１５．２ｇをアルゴン気流下、水５０ｍｌに縣濁し、水酸化ナトリウム４．８ｇを加えて溶解した。二炭酸ジ−ｔ−ブチル２６．２ｇを１，４−ジオキサン５０ｍｌに溶解して加えて、一夜攪拌した。減圧下に溶媒を約半分溜去し、水を加えて酢酸エチルで２回洗った。水相に酢酸エチルを加え、６Ｎ塩酸で中和し、分液した。もう一度酢酸エチルを加え、６Ｎ塩酸でｐＨを３に調整し、分液した。酢酸エチル相を合わせて、水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去すると結晶が析出した。結晶を濾取し、酢酸エチルで洗った。収量１６．９ｇ（６７％）
母液を濃縮すると結晶が析出した。濾取し酢酸エチルで洗浄した。収量４．８ｇ。合わせて２１．７ｇ（８６％）。
【００５７】
（２）４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸Ｎ−スクシンイミドエステルの合成
４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸５．０５ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．５３ｇをＤＭＦに溶解し、氷冷下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４．２２ｇを加え終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルを加え、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗った。結晶が析出した。濾取し、五酸化二燐上で乾燥した。母液を濃縮し、析出した結晶を濾取し、五酸化二燐上で乾燥した。初めに析出した結晶と合わせて６．１５ｇ（８８％）の表題化合物を得た。
【００５８】
（３）Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−（４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）ベンゾイル）−Ｌ−リジンの合成
Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リジン３．０ｇと炭酸水素ナトリウム０．６５ｇを水とＤＭＦに縣濁し、氷冷下、４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸Ｎ−スクシンイミドエステル２．７ｇをＤＭＦに溶解して加えた。室温で終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、６Ｎ塩酸で酸性にし、分液した。水相を酢酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル相を合わせて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去し、得られた油状の残渣を、減圧下に乾燥すると固化した。収量３．５０ｇ（７５％）。
【００５９】
（４）ヒドラジノ基を有するＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチドの合成
ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６より誘導される抗体を検出するための抗原ペプチドとして、ＨＩＶ−２ｇｐ３６のアミノ酸配列から１７残基を選択し、ペプチドの合成をおこなった。公知のＦｍｏｃ法に従い、ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８（島津製作所）を用いて、１７残基のアミノ酸を結合させ、最後にＮα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−（４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）ベンゾイル）−Ｌ−リジンを加えることにより、Ｎ末端のリジンにヒドラジノ基を有するＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチドを作成した。
【００６０】
ヒドラジノペプチドの構造
１８残基の配列
Lys（HBz）−Gln−Asp−Gln−Ala−Arg−Leu−Asn−Ser−Trp−Gly−Cys−Ala−Phe−Arg−Gln−Val− Cys（配列番号１）
HBz ＝ヒドラジノベンゾイル
【００６１】
参考例５  セリン化ポリリジンとヒドラジノペプチドとの複合体の作製
上記実施例２で製造した、ポリリジンの反応基２０．２に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した化合物（５）を過ヨウ素酸酸化し、上記実施例３で製造したヒドラジノペプチドを結合したペプチド結合ポリリジン担体を調製した（スキーム４）。
【００６２】
化合物（５）２ｍｇを１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液４０μｌを加えて、室温で２０分間攪拌した。反応液を１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけて、同溶液で溶出した。最初の溶出液２．５ｍｌは採取せず、続く２．０ｍｌを回収した。この溶液にヒドラジノペプチドを１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解して（１ｍｇ／ｍｌ）加え、室温で３時間攪拌した。４００ｍＭヒドロキシアミン塩酸塩／１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１０μｌを加え、３０分間撹拌した。酢酸２０μｌを加え、３０分間撹拌した。酢酸２０μｌを加えて溶液のｐＨを約５として透析チューブに移し、水に対して４℃、一夜透析した後、凍結乾燥した。
【００６３】
加水分解後のアミノ酸分析によりペプチドの導入率を調べたところ、ポリリジンの反応基２０に対してペプチドを１の割合（ポリリジン担体上のアミノアルコール構造１に対して、ペプチドを約１の割合）で混合した場合には、ポリリジンの反応基４５．５に対してペプチドが１の割合で反応した。また、ポリリジンの反応基４０に対してペプチドを１の割合（ポリリジン担体上のアミノアルコール構造１に対して、ペプチドを約０．５の割合）で混合した場合には、ポリリジンの反応基６２．５に対してペプチドが１の割合で反応した。
【００６４】
スキーム４
【００６５】
【化４】
2005061910.tif 000006
【００６６】
参考例６  アルカリホスファターゼ標識  抗ＨＩＶ−１ｐ２４ ポリクローナル抗体の作製
抗ＨＩＶ-1ｇａｇＰ２４ ポリクローナル抗体をペプシンを用いてＦｃ領域を切断しＦ（ａｂ‘）２を得、次に２ＭＥ(２−メルカプトエタノール、ナカライテスク社製)を用いて、ジスルフィド結合を切断し、フリーのチオール基を露出させたＦ（ａｂ‘）２を得た。次に、マレイミド基を導入した、アルカリホスファターゼとカップリングし、最終的にゲル濾過で精製アルカリホスファターゼ標識抗ＨＩＶ-1ｇａｇＰ２４ポリクローナル抗体を得た。
【００６７】
実施例１  ＨＩＶ−１，２抗原抗体同時測定器具
図１に示すように、巾５ｍｍ、長さ５０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）のマトリクス２において、展開液吸収ゾーン５側の末端から１６ｍｍの位置に参考例３で製造したＨＩＶ−２ ｇｐ３６  １８merペプチド結合担体及びＨＩＶ−１ｇｐ４１合成抗原を含む水溶液０．７μｌを点着してＨＩＶ抗体検出部６ａを作成し、展開液吸収ゾーン５側の末端から１３．５ｍｍの位置に周知の方法に従い製造されたＨＩＶ−１  ｐ−２４に対するモノクローナル抗体を含む水溶液０．７μｌをニトロセルロース膜に点着し乾燥させ、ＨＩＶ抗原検出部６ｂを作成した。更に、マトリクス２の展開液吸収ゾーン５側の末端から１１ｍｍの位置に抗アルカリホスファターゼ抗体（ダコ社製）を点着して不動化して展開液確認部１０を作成した。次いで、マトリクス２の展開液吸収ゾーン５側の末端から２３ｍｍの位置に参考例６で製造したアルカリホスファターゼ標識抗ＨＩＶ−１ ｐ２４ポリクローナル抗体水溶液（１００μｇ／ｍｌ）２．５μｌを点着し乾燥させ、酵素標識試薬部４ｂを作成した。更に１０ｍｍ×６ｍｍのＰＶＡからなるパッドに、参考例２で製造したアルカリホスファターゼ標識ＨＩＶ−１ ｇｐ４１組換抗原(１μｇ／ｍｌ)と、参考例３で製造したアルカリホスファターゼ標識抗ＨＩＶ−２ｇｐ３６ペプチド(５μｇ／ｍｌ)を混和し、５μｌ点着し乾燥させて酵素標識試薬パッド４ａを作成した。図１に示すとおり、前記酵素標識試薬パッド４ａをマトリクス２の酵素標識試薬部４ｂ上に重ね、酵素標識試薬ゾーン４を作成した。
【００６８】
マトリクス２、展開液パッド３、酵素標識試薬パッド４a及び展開液吸収パッド５を展開液槽１１を有するプラスチックケースに固定して、図２及び３に示すＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具１を製造した。
【００６９】
実施例２  ＨＩＶ抗原と抗ＨＩＶ抗体の測定
前記実施例１で製造したＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具１（図２又は３）の検体点着ゾーン８に抗ＨＩＶ−１セロコンバージョンパネル検体（Panel BI (PRB959)；ＢＢＩ社製）を２５μｌ滴下した後、変形部材に設けた押し込み部１２を下方に加圧して変形させて、変形部材に付設された突起部１３によって展開液パッド３を展開液槽１１に挿入して展開液を展開液パッド３に供給することにより測定を開始した。測定開始１５分後、対象試薬ゾーン１０の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーン６ａ（抗体検出部）及び６ｂ（抗原検出部）の発色を目視で測定した。その結果を表１に示す。
【００７０】
対照としてボストンバイオメディカ社（Boston Biomedica, Inc.） のデータシートから得られたＨＩＶ−１／２Ａｂ（アボット社製）、ＨＩＶ−１Ａｇmonoclonal−１検出キット（アボット社製）、Genscreen ＨＩＶAg/Ab（バイオラッド社製）、Integral ＨＩＶAg/Ab（デイドベーリング社製）及びUni-Form ＨＩＶAg/Ab（オルガノンテクニカ社製）の結果を表１に併せて記載する。
従来のＨＩＶ−１／２抗体検出キット比べ本発明の測定器具では２日間早く検出することができた。また、従来のＨＩＶ−１Ａｇ検出キット、ＨＩＶ−Ａｇ／Ａｂ同時測定キットとは同時期で検出が可能であった。
【００７１】
【表１】
2005061910.tif 000007
【００７２】
実施例３  
前記実施例１で製造したＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具１（図２又は３）の検体点着ゾーン８に抗ＨＩＶ−２抗体陽性検体（ＰＲＦ２０２−０９；ＢＢＩ社製）を表２に示す通り８００倍〜１２，８００倍に希釈し、その検体２５μｌを検体点着ゾーンに滴下し、実施例２と同様に測定を行った。その結果を表２に示す。本願のＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具は、既存のＨＩＶ−１／２抗体検出試薬と比べ、ＨＩＶ−２抗体陽性希釈検体に対して高い反応性を示した。
【００７３】
【表２】
2005061910.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の測定器具態様の一例を模式的に示す断面図である。
【図２】本発明の測定器具をカセットにセットしたときの一例を示す平面図である。
【図３】図２のＡ−Ａ‘の断面図である。
【符号の説明】
【００７５】
１  ＨＩＶ抗原抗体測定用免疫測定器具
２  マトリクス
３  展開液パッド
４  酵素標識試薬ゾーン
４a  酵素標識試薬パッド
４b  酵素標識試薬部
５  展開液吸収ゾーン
６  検出ゾーン
６a  ＨＩＶ抗体検出部
６b  ＨＩＶ抗原検出部
７  基質試薬ゾーン
８  検体点着ゾーン
９  検体
１０  展開液確認部
１１  展開液槽
１２  押し込み部
１３  突起部
【図１】
2005061910.tif 000009
【図２】
2005061910.tif 000010
【図３】
2005061910.tif 000011
【配列表】
2005061910000001.app