(57)【要約】【課題】酵母エキスやモルトエキス、肉エキスなどのエキス類やペプトンなど蛋白質分解物を原料とする天然培地を用いなくとも、合成培地を用いてアスタキサンチンなどのカロテノイドを生産する方法を提供する。【解決手段】ニコチン酸０．０１μＭ〜０．１ｍＭ、及び／又はチアミン０．０１μＭ〜０．１ｍＭを含有する合成培地を用いて、カロテノイド生産性細菌（例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌のアグロバクテリウム・アウランティアカス  ｓｐ．ｎｏｖ．  Ｎ−８１１０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）又はその変異体）を培養し、菌体又は培養液からアスタキサンチンなどのカロテノイドを回収することを特徴とする、カロテノイドの製造法。【選択図】    選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチン酸及び／又はチアミンを含有する合成培地を用いてカロテノイド生産性細菌を培養し、菌体又は培養液からカロテノイドを回収することを特徴とする、カロテノイドの製造法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造法において、カロテノイド生産性細菌がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の製造法において、アグロバクテリウム属細菌が、アグロバクテリウム・アウランティアカス  ｓｐ．ｎｏｖ．  Ｎ−８１１０６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）又はその変異体であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の製造法において、培地１リットルあたり、ニコチン酸０．０１μＭ〜０．１ｍＭ、及び／又はチアミン０．０１μＭ〜０．１ｍＭを含有することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載の製造法において、カロテノイドがアスタキサンチンであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂溶性色素であるカロテノイド、例えばアスタキサンチンなどを合成培地で製造する方法に関するものである。アスタキサンチンは養殖サケ・マス・マダイや鶏卵の色調改善剤、健康補助食品、医薬品として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
カロテノイド系色素としては、例えばアスタキサンチン、β‐カロチン、リコペンなどがあげられるが、例えばアスタキサンチンは、オキアミ、カニ、エビなどの甲殻類やマダイ、サケ、マスなどの魚類、フラミンゴなどの鳥類、藻類や微生物等に広く分布する天然の化合物である。近年、アスタキサンチンはサケやマス、マダイ等の養殖魚や鶏卵の色調改善剤として需要が増加している他、抗酸化活性や抗癌活性などの様々な生理的作用が確認され、医薬品や健康補助食品としての利用も注目されている。
【０００３】
カロテノイドの製造方法としては、化学合成品、天然物からの抽出品、微生物による発酵生産品などがあるが、現在は主に価格等の要因から化学合成品が使われている。しかし、化学合成品は原料に臭素および塩素を含むハロゲン系化合物や重金属類を使用するため安全性に懸念があり（例えば特許文献１参照）、消費者の自然、天然志向にともない天然物由来のカロテノイドが注目されている。天然物からの抽出品としては、例えばアスタキサンチンはオキアミ等からの抽出品があるが、これらは含量が低く、採取、抽出、精製などに多大な労力を要し、コスト的に問題があった。
【０００４】
微生物を利用した製法としては、酵母ではファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（例えば非特許文献１参照）、藻類ではヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（例えば非特許文献２参照）、細菌ではアグロバクテリウム・アルランティアカス（例えば非特許文献３参照）の報告がある。
【０００５】
ファフィア酵母は増殖速度が遅いため培養日数が長く、細胞壁の破壊が困難なために抽出効率が低く、含量が少ないためコスト高である。ヘマトコッカス藻類は増殖速度が非常に遅いために非常に培養日数が長く、光を必要とするため立地条件や設備などに制約がある他、クロロフィルなどの夾雑物の除去が必要になりコスト高である。細菌による方法は増殖速度が早いため培養時間が短く、細胞壁が破壊し易いため抽出が容易で、カロテノイドの工業的生産に適している。
【０００６】
微生物による発酵生産を行なう場合、原料に用いる培地は安価で品質が安定したものが好ましい。一般に発酵生産培地には酵母エキスやモルトエキス、肉エキスなどのエキス類や、カゼイン、大豆、とうもろこしなどの蛋白質を加水分解したペプトンなどを原料に用いる天然培地がよく使われる。これらはアミノ酸やペプチド、核酸、無機塩、ビタミン、金属等の様々な成分を含み、多くの微生物の栄養要求性に対応できる優れた培地であるが、高価なため培地コストの上昇を招く他、生育に必須な栄養成分が早く枯渇しやすいため途中で増殖が止まったり、更に成長阻害物質を分泌して増殖が停止するなどの欠点を有している。また、多種の成分からなるため一定な品質を安定供給することに問題があり、そのため化学的に単一な成分を用いた合成培地の方が好ましいものである。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第４２８３５５９号明細書
【非特許文献１】
Ａｎｄｒｅｗｅｓ，Ａ．Ｇ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５，１００３，１９７６
【非特許文献２】
Ｒｅｎｓｔｒｏｍ，Ｂら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２５６１，１９８１
【非特許文献３】
Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，１８４２，１９９４
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵母エキスやモルトエキス、肉エキスなどのエキス類やペプトンなど蛋白質分解物を原料とする天然培地を用いなくとも、化学的に単一な物質を原料とし、それを組合わせて得られた合成培地を用いてアスタキサンチンなどのカロテノイドを生産する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、炭素源にグルコースなどの糖類や有機酸などを、窒素源に硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩やアミノ酸などを、無機塩にリン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄などを用いた合成培地に、ニコチン酸とチアミンの一方もしくは双方を加えることによって、細菌がカロテノイド特にアスタキサンチンを顕著に生産すること見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、ニコチン酸及び／又はチアミンを含有する合成培地を用いてカロテノイド生産性細菌を培養し、菌体又は培養液からカロテノイドを回収することを特徴とする、カロテノイドの製造法である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１１】
本発明の合成培地の成分は炭素源、窒素源、無機塩、ニコチン酸およびチアミンの一方又は双方などから成るが、化学的に単一な物質を原料とし、それによってカロテノイドを生産し得るものであればいずれを使用してもよい。例えば炭素源にはグルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロールなどの糖類や、酢酸、オレイン酸などの有機酸が、窒素源には酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・２水和物、硫酸カルシウムなどが使用できる。またニコチン酸やチアミンは各種の塩の形で使用してもよく、またフリーの形で使用してもよい。
【００１２】
合成培地中の各成分の濃度は、菌株が増殖しカロテノイドを生産し得るものであればいずれの濃度でもよいが、好ましくは炭素源の糖類が０．１％から１０％、窒素源の無機アンモニウム塩やアミノ酸が０．０１％から３％、無機塩類のリン酸カリウム塩やリン酸ナトリウム塩が０．０１から１％、硫酸マグネシウムなどのマグネシウムイオンが０．１から１０ｍＭ、塩化カルシウムなどのカルシウムイオンが０．０１から５ｍＭ、硫酸鉄などの鉄イオンが０．０１から５ｍＭである。ニコチン酸及び／又はチアミンの濃度には特に限定はないが、ニコチン酸の濃度は０．０１μＭから０．１ｍＭが好ましく、チアミンの濃度は０．０１μＭから０．１ｍＭが好ましい。また必要に応じて更に亜鉛、ニッケル、マンガン、銅、モリブデン酸などの金属イオンやビオチン、パンテトン酸、ピリドキシン、ｐ−アミノ安息香酸、リボフラビン、葉酸、アスコルビン酸などのビタミンを添加してもよい。
【００１３】
本発明で用いられる細菌としてはカロテノイド生産性のものであれば特に限定はないが、例えばアグロバクテリウム属細菌を用いることができ、中でもアグロバクテリウム・アウランティアカス  ｓｐ．ｎｏｖ．  Ｎ−８１１０６（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３として寄託されている）や、その変異株が好ましい。そのような変異株としては、例えばカロテノイドの生産性を改良された菌株をあげることができ、例えばアグロバクテリウム属細菌の菌株ＴＳＵＧ１Ｃ１１（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６として寄託されている）をあげることができる。
【００１４】
本発明において細菌の培養条件については特に制限はないが、アグロバクテリウム属細菌の場合は振とう培養や通気攪拌培養等の好気的な条件が好ましく、培養時間としては２４時間〜１６８時間程度、培養温度としては１５〜３５℃付近が好ましく、ｐＨとしては６〜９が好ましい。なお培養液中の菌体濃度は、乾燥重量法、濁度法、菌数計算法などで測定できるが、操作が簡便な濁度法が適している。このようにして培養した菌体または培養液よりカロテノイドを回収する。回収の方法には特に限定はなく、カロテノイドが安定に効率良く回収されればいずれの方法でもよい。例えばカロテノイドを菌体から抽出する場合、抽出溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等を用いればよい。抽出されたカロテノイドの定量は、各種カロテノイドが分離され定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
カロテノイドの定量法
カロテノイドの定量は逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにて行い、操作手順は以下のように行なった。培養液１．０ｍｌを１４，０００回転、５分間遠心分離により菌体を回収し、２０μｌの純水を加えチューブミキサーにて１０分間懸濁させた。次いで純水に対して４５０μｌのアセトンを加え、更に３０分間チューブミキサーにて攪拌した後、１４，０００回転、５分間遠心分離を行ない上清を回収し、一部を高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソー（株）製を使用）にて生成したカロテノイドを定量した。
【００１７】
比較例１
以下の組成の培地（バクトペプトン０．５％、バクトイーストエキストラクト０．１％、酢酸ナトリウム０．１％、リン酸鉄４０ｍｇ／Ｌ、グルコース１％）７５ｍｌが入った２００ｍｌ容の三角フラスコにアグロバクテリウム・アウランティアカス  ｓｐ．ｎｏｖ．  Ｎ−８１１０６を植菌し、２０℃で１日間、毎分１００回転で振とう速度にて培養した。得られた培養液３ｍｌを以下に示す組成の培地（リン酸２カリウム０．３６％、リン酸１カリウム０．１２％、グルコース０．５％、硫酸アンモニウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物３ｍＭ、塩化カルシウム２水和物０．６ｍＭ、硫酸第１鉄７水和物０．１ｍＭ）３００ｍｌが入ったひだ付きの５００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２０℃で５日間、毎分１００回転で振とう培養した。培養終了後、６６０ｎｍの吸光度を測定したところ０．８２だった。培養液の色調はカロテノイド類特有の黄色から赤色を示さず、カロテノイドは得られなかった。
【００１８】
実施例１
比較例１に示した本培養の培地に対して、ニコチン酸をそれぞれ０．２μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、又は１０μＭの濃度になるように加えたこと以外は、比較例１と同様な条件にて培養を行った。各ニコチン酸濃度における培養の培養液の６６０ｎｍの吸光度、総カロテノイド濃度、アスタキサンチン濃度を表１に示した。ニコチン酸の添加によりカロテノイド、アスタキサンチンとも良好に生産された。
【００１９】
【表１】
2005046027.tif 000002
実施例２
比較例１に示した本培養の培地に対して、塩酸チアミンをそれぞれ０．１μＭ、１．０μＭ、３．３μＭ、又は１０μＭの濃度になるように加えたこと以外は、比較例１と同様な条件にて培養を行った。各濃度における培養の培養液の６６０ｎｍの吸光度、総カロテノイド濃度、アスタキサンチン濃度を表２に示した。チアミンの添加によりカロテノイド、アスタキサンチンとも良好に生産された。
【００２０】
【表２】
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実施例３
比較例１に示した本培養の培地に対して、ニコチン酸を２μＭおよび塩酸チアミンを１μＭの濃度になるように加えたこと以外は、比較例１と同様な条件にて培養を行った。培養終了後の培養液の６６０ｎｍの吸光度は４．８８を示し、総カロテノイド濃度２．０７ｍｇ／Ｌ、アスタキサンチン濃度０．９７ｍｇ／Ｌの生産量が得られた。ニコチン酸およびチアミンの双方の添加により、総カロテノイド濃度およびアスタキサンチン濃度とも一方のみを添加したときより増加するという相乗効果がみられ、後述の比較例２に示した酵母エキスと同等以上のカロテノイド及びアスタキサンチンの生産効率を示した。
【００２１】
比較例２
比較例１に示した本培養の培地に対して、酵母エキスを０．１％の濃度になるように加えたこと以外は、比較例１と同様な条件にて培養を行った。培養終了後、培養液の６６０ｎｍの吸光度は５．３０を示し、総カロテノイド濃度１．８９ｍｇ／Ｌ、アスタキサンチン濃度０．６４ｍｇ／Ｌの生産量を示した。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によって、高価な酵母エキスなどのエキス類やペプトンなどの蛋白質分解物を使用しなくても、合成培地によってアスタキサンチンなどのカロテノイドの生産が可能となった。