(57)【要約】      （修正有）【課題】果汁入り飲食品をはじめとする各種飲食品やその原材料についてのアリサイクロバチルス・アシドテレストリスによる汚染の有無を迅速かつ簡便に検査する方法を提供すること。【解決手段】検査対象から細菌のＤＮＡを調製し、調製されたＤＮＡを鋳型として、３種類の特定の配列のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーに、他の２種類の特定の配列のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーに用いた核酸増幅を行い、用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより定まる所定の断片長を有する増幅産物の有無に基づいて、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス混入の有無を鑑別することにより行うことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
飲食品またはその原材料がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスにより汚染されているか否かを検査する方法であって、検査対象から細菌のＤＮＡを調製し、調製されたＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ１，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ３，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ４から選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーに、配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ１，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ２から選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーに用いた核酸増幅を行い、用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより定まる以下の断片長を有する増幅産物の有無に基づいて、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス混入の有無を鑑別することにより行うことを特徴とする方法。
ＰＦ１とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が５９３ｂｐの増幅産物
ＰＦ１とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が５３３ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が４４４ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が３８４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が２９４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が２３４ｂｐの増幅産物
【請求項２】
検査対象が酸性飲食品またはその原材料であることを特徴とする請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
検査対象が果汁入り飲食品またはその原材料であることを特徴とする請求項２記載の検査方法。
【請求項４】
同定対象となる細菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスであるか否かを同定する方法であって、細菌のＤＮＡを調製し、調製されたＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ１，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ３，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ４から選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーに、配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ１，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ２から選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーに用いた核酸増幅を行い、用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより定まる以下の断片長を有する増幅産物の有無を検査することにより行うことを特徴とする方法。
ＰＦ１とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が５９３ｂｐの増幅産物
ＰＦ１とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が５３３ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が４４４ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が３８４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が２９４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が２３４ｂｐの増幅産物
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載されてなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列表の配列番号２に記載されてなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列表の配列番号３に記載されてなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列表の配列番号４に記載されてなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列表の配列番号５に記載されてなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーとして、配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーとして少なくとも含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスの検出用キット。
【請求項１１】
配列表の配列番号１４に記載の塩基配列またはこの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子。
【請求項１２】
配列表の配列番号２４に記載の塩基配列またはこの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子。
【請求項１３】
配列表の配列番号２６に記載の塩基配列またはこの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子。
【請求項１４】
配列表の配列番号２８に記載の塩基配列またはこの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子。
【請求項１５】
配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニット。
【請求項１６】
配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニット。
【請求項１７】
配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニット。
【請求項１８】
配列表の配列番号２９に記載のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とするアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、果汁入り飲食品をはじめとする各種飲食品やその原材料についてのアリサイクロバチルス・アシドテレストリスによる汚染の有無を迅速かつ簡便に検査する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８２年に、無菌充填された透明リンゴ果汁飲料が製品の保存・流通時に異臭と濁りを伴って変敗するといった事故が西ドイツで起こった。これは、現在、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（以下、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓとも記載する）として知られている細菌が市販の飲料で引き起こした初めての変敗事例である（Ｃｅｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）。その後、アメリカ、オーストラリア、ブラジルなど、様々な国でこの細菌に関する報告がされてきている。日本では１９９１年に丹羽らによって報告された輸入透明リンゴ果汁から分離された耐熱性好酸性菌（後に新種Ａ．  ｍａｌｉとして報告されている）を皮切りに（丹羽ら、１９９１）、アリサイクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌による変敗、分離、制御、検出などに関する報告が幾つかされてきている。１９９０年代後半までは、それほどＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が問題視されることは多くなかったが、近年、特に日本を中心としてＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌による汚染の問題がクローズアップされてきている。その理由としては諸説有るが、少なくとも検査法や分析技術の向上によりＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の汚染が表面化してきたこと、およびこれまで以上に安全な製品を提供したいといった意識の高まりによるものであることは間違いのないことである。このような背景のもと、食品、特に飲料メーカーを中心としてＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌対策に着手してきており、各社の汚染事故防止に効果を挙げてきている。しかしながら、業界としてみれば相変わらずＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に悩まされており、一刻も早い汚染防止策の確立が待ち望まれている。また、ここ数年の内にＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に関する情報が多数蓄積され、変敗の主原因である異臭（グアイアコール）を産生する菌種がアリサイクロバチルス・アシドフィルス（Ａ．  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓおよびアリサイクロバチルス・ハーバリウス（Ａ．  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ）であることが分かってきている。しかしながら、Ａ．  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓやＡ．  ｈｅｒｂａｒｉｕｓが分離されることは極めて稀で、従って食品業界に於けるターゲット菌種はＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓであるとされている。
Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌は温度域２０〜７０℃（至適生育温度：４０〜６０℃）、ｐＨ域２〜６（至適生育ｐＨ３．５〜４．５）で生育することができ、また微量の酸素でも生育することができる（絶対好気性）。しかしながら、これら以外の性状に関しては、非常に菌種レベルあるいは菌株レベルで性状が異なり、種レベルでの共通性状を見いだすことは難しく（多くのバラエティーが存在する）、それぞれの菌種を同定するためには遺伝子レベルの解析が不可欠である。このようなバラエティーの多さは本属細菌を同定することが難しいことを如実に物語っている。
他方、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌は土壌を主な生息域としているが、二次汚染的に果実、液糖、ハーブなどから分離されてきている。分離される頻度としてはＡ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓとアリサイクロバチルス・ゲノミック・スピーシーズ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が最も多く、次いでＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓで、その他は極めて低い頻度である。しかしながら、上記三種をはじめとしてＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の生息域は基本的に同じと考えられており、従ってターゲット菌種であるＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓをその他のＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌と見分ける方法が不可欠である。
このような背景のもと、下記の特許文献１には、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の部分領域を用いてＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌を同定する手法が記載されている。本手法では、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の部分１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を決定し、データベースとの相同性検索によって菌種を決定する。しかしながら、本手法は幅広い細菌に応用することを目的としているため、結果を得るために数日要し、また高額かつ特殊な機械を必要とするため、迅速性が求められる品質管理の現場では活用が難しいのが現状である。
【０００３】
ところで、下記の特許文献２には、細菌に普遍的に存在するＤＮＡジャイレースのβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ遺伝子）の一部をＰＣＲによって増幅し、その増幅断片の塩基配列を指標として細菌の同定を行う方法が記載されている。しかしながら、本方法は、ｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅することが可能なＰＣＲプライマーの設計に成功したことに基づき、ｇｙｒＢ遺伝子塩基配列のほぼ全長を決定することができるというものであるが、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌についての検討はなされていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１１−１３７２５９号公報
【特許文献２】
特開平１１−１６９１７５号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、果汁入り飲食品をはじめとする各種飲食品やその原材料についてのアリサイクロバチルス・アシドテレストリスによる汚染の有無を迅速かつ簡便に検査する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の点に鑑み、本発明者らはＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌基準株のｇｙｒＢ遺伝子の部分領域の塩基配列を決定し、相同性解析を実施した。その結果、ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列は基準株特異的であることが分かった。更に食品有害菌であるＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに関して、３株の食品分離株のｇｙｒＢ遺伝子の配列を決定し、ｇｙｒＢ遺伝子のＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓにおける塩基配列の保存性を確認したところ、極めて高い相同値（９９％以上）で保存されていた。そこで、決定した塩基配列全てを用いてＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに特異的なプライマーを設計し（３個のフォワードプライマー：ＰＦ１，ＰＦ３，ＰＦ４および２個のリバースプライマー：ＰＲ１，ＰＲ２）、これらのプライマーを組み合わせ、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ由来のＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を実施したところ、全ての組み合わせで正確に目的の長さの断片が増幅されていることが確認された。次に、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ以外の細菌について同様の試験を行ったところ、一部の組み合わせでマイナーなバンドが増幅されるものの、今回設計したプライマーは極めて種特異性が高いことが示された。以上のことから、今回設計したプライマーはＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに特異的に反応し、このプライマーを用いれば迅速かつ正確にＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓを同定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子に関する報告はこれが始めてである。
【０００７】
以上の経緯によって完成された本発明の飲食品またはその原材料がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスにより汚染されているか否かを検査する方法は、請求項１記載の通り、検査対象から細菌のＤＮＡを調製し、調製されたＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ１，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ３，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ４から選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーに、配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ１，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ２から選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーに用いた核酸増幅を行い、用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより定まる以下の断片長を有する増幅産物の有無に基づいて、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス混入の有無を鑑別することにより行うことを特徴とする。
ＰＦ１とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が５９３ｂｐの増幅産物
ＰＦ１とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が５３３ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が４４４ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が３８４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が２９４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が２３４ｂｐの増幅産物
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の検査方法において、検査対象が酸性飲食品またはその原材料であることを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項２記載の検査方法において、検査対象が果汁入り飲食品またはその原材料であることを特徴とする。
また、本発明の同定対象となる細菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスであるか否かを同定する方法は、請求項４記載の通り、細菌のＤＮＡを調製し、調製されたＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ１，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ３，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ４から選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーに、配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ１，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ２から選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーに用いた核酸増幅を行い、用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより定まる以下の断片長を有する増幅産物の有無を検査することにより行うことを特徴とする。
ＰＦ１とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が５９３ｂｐの増幅産物
ＰＦ１とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が５３３ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が４４４ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が３８４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が２９４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が２３４ｂｐの増幅産物
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、請求項５記載の通り、配列表の配列番号１に記載されてなることを特徴とする。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、請求項６記載の通り、配列表の配列番号２に記載されてなることを特徴とする。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、請求項７記載の通り、配列表の配列番号３に記載されてなることを特徴とする。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、請求項８記載の通り、配列表の配列番号４に記載されてなることを特徴とする。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、請求項９記載の通り、配列表の配列番号５に記載されてなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスの検出用キットは、請求項１０記載の通り、配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーとして、配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーとして少なくとも含んでなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子は、請求項１１記載の通り、配列表の配列番号１４に記載の塩基配列またはこの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含んでなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子は、請求項１２記載の通り、配列表の配列番号２４に記載の塩基配列またはこの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含んでなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子は、請求項１３記載の通り、配列表の配列番号２６に記載の塩基配列またはこの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含んでなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子は、請求項１４記載の通り、配列表の配列番号２８に記載の塩基配列またはこの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含んでなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットは、請求項１５記載の通り、配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットは、請求項１６記載の通り、配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットは、請求項１７記載の通り、配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする。
また、本発明のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスのＤＮＡジャイレースβサブユニットは、請求項１８記載の通り、配列表の配列番号２９に記載のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の飲食品またはその原材料がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスにより汚染されているか否かを検査する方法は、検査対象から細菌のＤＮＡを調製し、調製されたＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ１，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ３，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドＰＦ４から選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーに、配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ１，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドＰＲ２から選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーに用いた核酸増幅を行い、用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより定まる以下の断片長を有する増幅産物の有無に基づいて、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス混入の有無を鑑別することにより行うことを特徴とするものである。
ＰＦ１とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が５９３ｂｐの増幅産物
ＰＦ１とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が５３３ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が４４４ｂｐの増幅産物
ＰＦ３とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が３８４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ１の組み合わせ・・・断片長が２９４ｂｐの増幅産物
ＰＦ４とＰＲ２の組み合わせ・・・断片長が２３４ｂｐの増幅産物
即ち、本発明の飲食品またはその原材料がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスにより汚染されているか否かを検査する方法は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスに特異的に反応するプライマーを用い、同定対象となる細菌から調製されたＤＮＡを鋳型として核酸増幅を行った際、用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより定まる所定の断片長を有する増幅産物が得られるか否かを検査し、増幅産物が得られれば同定対象となる細菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスであると同定する方法を利用したものである。本発明によれば、同定対象となる細菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスであるか否かを短時間で精度よく同定することができるので、飲食品またはその原材料がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスにより汚染されているか否かも短時間で精度よく検査することができる。フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせは６種類存在するので、核酸増幅はそのうちのいずれかの組み合わせにて行えばよいが、より精度の高い結果を得るためには、核酸増幅は複数のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにて行うことが望ましい。また、複数のフォワードプライマーおよび／または複数のリバースプライマーを１度に組み合わせて核酸増幅を行ってもよい。
【０００９】
同定対象となる細菌から調製されたＤＮＡを鋳型として核酸増幅を行うに際し、フォワードプライマーとして用いる配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドや、リバースプライマーとして用いる配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドは、自体公知の方法で化学合成してもよいし、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの遺伝子から制限酵素などを利用して直接切り出すことも可能であり、また、それらの遣伝子をＥ．  ｃｏｌｉなどのプラスミドにクローニングし、細菌の増殖の後にプラスミドを回収し、切り出して利用することも可能である。
【００１０】
核酸増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼや反応条件は特段制限されるものでない。本発明においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、自体公知の種々の核酸増幅方法を利用するのに十分な長さを有するので、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの同定を短時間で精度よく行うことができる。例えば、核酸増幅を変性・アニーリング・伸長の三工程で行う場合、温度サイクル条件は９０℃〜９６℃で１秒〜６０秒→５０℃〜７０℃で１秒〜１２０秒→６５℃〜７５℃で１秒〜１２０秒とすればよい。
【００１１】
所定の断片長を有する増幅産物の有無は、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた電気泳動により行えばよいが、この方法に限定されるものではない。
【００１２】
本発明が適用される飲食品やその原材料は、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに汚染される可能性のあるものであれば特に制限されるものではない。飲食品としては、例えば、酸性飲食品が挙げられる。ここで酸性飲食品とはｐＨ５．５以下の食品および飲料を意味する。酸性飲食品の代表例としては、果汁入り飲食品が挙げられる。ここで果汁入り飲食品とは果汁が最終濃度として０．０１重量％以上含まれる食品および飲料を意味し、１００％果汁飲料を含む果汁入り清涼飲料、果汁入りのゼリーやヨーグルトやガムや飴などが例示される。果汁入り飲食品の原材料としては、原果汁が挙げられるが、これは、例えば、果実から搾取した果汁またはその水分を除去して濃縮したものであり、濃縮果汁還元して使用されたりするものである。代表的に例示される果汁としては、オレンジ果汁、アップル果汁、グレープフルーツ果汁、グレープ果汁、パイン果汁、レモン果汁、ピーチ果汁、ベリー果汁、マンゴ果汁などが挙げられる。酸性飲食品としては、果汁入り飲食品の他にも、炭酸飲料、果実飲料、酸性紅茶飲料、スポーツ飲料、トマトジュースや人参ジュースなどの各種野菜ジュース、栄養ドリンク、乳性飲料、ヨーグルト、果肉入りゼリー、リキュール、ジャム、マーマレード、ドレッシングなどが挙げられる。酸性飲食品の原材料としては、果実や野菜の他にも、糖類（ブドウ糖や果糖などの単糖類、砂糖や麦芽糖などの二糖類、果糖・ブドウ糖液糖、デキストリン、各種オリゴ糖、蜂蜜、糖アルコールなど）、酸味料、着色料、香料、増粘多糖類、ゲル化剤、脱脂粉乳、加糖乳糖、乳酸菌飲料、発酵乳、ビタミン類などが挙げられる。また、穀類、いも及びでんぷん類、豆類、種実類、茶類、きのこ類、藻類、魚介類、肉類、卵類、乳類、油脂類、菓子類、し好飲料類、調味料及び香辛料類、調味加工食品などの飲食品や、これら飲食品の中で原材料を使用して製造されるものにおける当該原材料が検査対象となることができる。
【００１３】
検査対象から同定対象となる細菌のＤＮＡを調製する方法は特段制限されるものではなく、自体公知の方法で調製することができる。もちろん市販のＤＮＡ抽出キットを用いて調製してもよい。
【００１４】
本発明はまた、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの検出用キットを提供する。このキットは、配列表の配列番号１に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つをフォワードプライマーとして、配列表の配列番号４に記載のオリゴヌクレオチド，配列表の配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１つをリバースプライマーとして少なくとも含んでなるものであるが、その他に、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰの各溶液、バッファーなどを含んでいてもよい。
【００１５】
本発明において提供されるＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓのＤＮＡジャイレースβサブユニットとこれをコードする遺伝子は、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの研究材料として産業上の利用可能性を有する。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の記載の限定して解釈されるものではない。
【００１７】
実験例１：
１．実験方法
（１）菌株
表１に示す１３種類の菌株について行った。また、プライマーの検証には、表１の菌株に加え、次の３３菌株を用いた：Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＤＳＭ３９２３，  Ｈ１，  ＡＬＢ６５，  ＡＬＢ６６，  ＡＬＢ６７，  ＡＬＢＲ１，  ＡＬＢＲ２２１，  ＡＬＢＲ２５３，  ＡＬＢＲ３４６，  ＡＬＢＲ３５９、Ａ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ３Ｗ，  ＯＪ５，  ＳＯ６，  ＤＳＭ４５１，  ＤＳＭ４４８，  ＤＳＭ４５２，  ＭＩＨ３２１，  ３Ｂ，  ＤＳＭ４４９，  ＨＰ２、Ａ．  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ  ＤＳＭ４００５，  ＤＳＭ４００７、Ａ．  ｈｅｓｐｒｒｉｄｕｍ  ＤＳＭ１２７６６、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  １  ＤＳＭ４５３，  ＤＳＭ４５４，  ＭＩＨ２，  ＵＺ１，  ＫＨＡ３１，  ＤＳＭ１２４９０，  Ｐ２，  ＫＨＣ３  ＤＳＭ６４８１，  ＤＳＭ１１９８３。
【００１８】
【表１】
2005046035.tif 000002
【００１９】
（２）培養条件
菌株は全てＹＳＧ寒天培地あるいはＹＳＧ液体培地を用いて培養した。培養期間は２〜５日、培養温度は４５〜６０℃である。ＹＳＧ培地の詳細は次の通りである。
組成Ａ：酵母エキス（ＤＩＦＣＯまたはＭＥＲＣＫ）０．２ｇ、可溶性デンプン（ＤＩＦＣＯまたはＭＥＲＣＫ）０．２ｇおよびグルコース（和光特級）０．１ｇを水５０ｍｌに溶解し２Ｎ硫酸（和光）または１／１０Ｎ硫酸（和光）でｐＨ３．７±０．１に調整する（ｐＨが下がりすぎた場合４％ＮａＯＨで調整する。）。その後、高圧滅菌する（１２１℃  １５ｍｉｎ）。
組成Ｂ：寒天（ＤＩＦＣＯまたはＭＥＲＣＫ）１．５ｇを水５０ｍｌに溶解し高圧滅菌する（１２１℃で１５ｍｉｎ間）。
組成Ａと組成Ｂを混合し、９０ｍｍ径プレートに約２０ｍｌ流し込み固化させて寒天培地とする。液体培地の場合には組成Ａを更に水で２倍に希釈し、高圧滅菌する。
【００２０】
（３）ＤＮＡ調製方法
Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。方法はキット添付の方法に準じた。
【００２１】
（４）部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列の決定および解析
部分ｇｙｒＢ遺伝子の増幅は山本＆原山の方法で行った（Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ＆  Ｈａｒａｙａｍａ，  Ｓ．  （１９９５）．  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｇｙｒＢ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１，  １１０４−１１０９．）。増幅用プライマーはＵＰ−１Ｇ  （ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＹ  ＧＣＮ  ＧＧＮ  ＧＧＮ  ＡＡＲ  ＴＴＹ  ＧＧ−３’）とＵＰ−２ｒ  （ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＣＣＲ  ＴＣＮ  ＡＣＲ  ＴＣＮ  ＧＣＲ  ＴＣＮ  ＧＴＣ  ＡＴ−３’）を用いた。増幅した目的の断片は０．８％  ｌｏｗ−ｍｅｌｔｉｎｇ−ｐｏｉｎｔ  ａｇａｒｏｓｅ  （ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧ；  ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて電気泳動し、目的のバンド部分をナイフで切り取った。このアガロースゲル片からＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的の増幅産物を回収した。回収したＰＣＲ産物を鋳型とし、ＵＰ−１Ｓ  （ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡ−３’；  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ２７４−２９６）、ｇｙｒＳ−２Ｆ  （ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＣＳ  ＴＴＴ  ＴＴＲ  ＡＡＴ  ＫＣＣ  ＧＧ−３’；  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ５７７−５９９）、ｇｙｒ−Ｉｎｔ−Ｒ  （ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ＣＣＧ  ＣＧＶ  ＡＣＹ  ＴＣＲ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＣ−３’；  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １０２１−１０４０）、ｇｙｒＳ−４Ｒ  （ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ＧＡＴ  ＴＣＣ  ＡＧＹ  ＡＣＲ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＣ  ＣＧ−３’；  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １１７７−１１９９）およびＵＰ−２ｒＳ  （ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＣＣ−３’；  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １５０７−１５２９）のシークエンスプライマーとＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてシークエンス反応を行った（ナンバリングはＥ．  ｃｏｌｉのｇｙｒＢ遺伝子の番号に準ずる）。反応産物の精製はＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。精製反応産物の塩基配列はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。決定した塩基配列の解析およびＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ特異プライマーの構築はＧｅｎｅ  Ｗｏｒｋｓ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０，  ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）およびＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８  （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．  Ｇ．  ＆  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｔ．  Ｊ．  （１９９４）．  ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ���  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ７６，  ４３５０−４３５４．）を用いて行った。
【００２２】
（５）ＰＣＲ反応条件
Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ特異プライマーの検定のために、各種菌株由来ＤＮＡとＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ特異プライマーを用い、ＰＣＲを行った（９５℃×３０秒→［９５℃×３０秒→６２．５℃×３０秒→７２．０℃×１２０秒］×３３サイクル→４．０℃）。ＰＣＲ産物の電気泳動はＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。
【００２３】
２．実験結果
（１）部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列と対応するアミノ酸配列
１３株のＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌について部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を決定した。また、決定した塩基配列に基づいて対応するアミノ酸配列を決定した。Ａ．  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ  ＣＰ−１Ｔの部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号６にアミノ酸配列を配列表の配列番号７に記載する。Ａ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７００９Ｔの部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号８にアミノ酸配列を配列表の配列番号９に記載する。Ａ．  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ  ＤＳＭ  １２４８９Ｔの部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１０にアミノ酸配列を配列表の配列番号１１に記載する。Ａ．  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ  ＴＡ−６７Ｔの部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１２にアミノ酸配列を配列表の配列番号１３に記載する。Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＡＴＣＣ  ４９０２５Ｔの部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１４にアミノ酸配列を配列表の配列番号１５に記載する。Ａ．  ｐｏｍｏｒｕｍ  ３ＡＴの部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１６にアミノ酸配列を配列表の配列番号１７に記載する。Ａ．  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ４００６Ｔの部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１８にアミノ酸配列を配列表の配列番号１９に記載する。Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  １  ＤＳＭ  １１９８４の部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２０にアミノ酸配列を配列表の配列番号２１に記載する。Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ２  ＭＩＨ  ３３２の部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２２にアミノ酸配列を配列表の配列番号２３に記載する。Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＤＳＭ  ３９２４の部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２４にアミノ酸配列を配列表の配列番号２５に記載する。Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＤＳＭ  ２４９８の部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２６にアミノ酸配列を配列表の配列番号２７に記載する。Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＯＲ３の部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２８にアミノ酸配列を配列表の配列番号２９に記載する。Ａ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｒｉｔｔｍａｎｎｉｉ  ＤＳＭ  １１２９７Ｔの部分ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号３０にアミノ酸配列を配列表の配列番号３１に記載する。
【００２４】
（２）多重配列比較およびプライマーの設計
（１）で決定した塩基配列を用いて多重配列比較解析を行った。その結果を図１〜１０に示した。図から明らかなように、それぞれの塩基配列は種間で異なり、塩基配列の違いによってそれぞれの種を識別することが可能であることが示唆された。またアミノ酸配列を用いた場合でも、それぞれ配列は種間で異なり、塩基配列の場合と同様に種の識別が可能であることが示唆された（アミノ酸配列解析のデータは省略）。
次に、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ検出のための特異プライマー設計するため、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの菌株に共通し、かつその他の菌種とは高度に異なる領域を検索したところ、５箇所の領域が見いだされた（図３，４，５〜６，７〜８参照）。そこで、これらの領域がＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに特徴的な領域であることが示されれば、煩雑なシークエンス反応無しにＰＣＲ反応だけでＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓを鑑別することが可能となるため、この領域の塩基配列を基にプライマーを設計した。フォワードプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドＰＦ１を配列表の配列番号１に、オリゴヌクレオチドＰＦ３を配列表の配列番号２に、オリゴヌクレオチドＰＦ４を配列表の配列番号３に記載する。また、リバースプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドＰＲ１を配列表の配列番号４に、オリゴヌクレオチドＰＲ２を配列表の配列番号５に記載する。
【００２５】
（３）設計したプライマーのＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ特異性の検証設計したプライマーが正確に目的の部分ｇｙｒＢ遺伝子断片のみを増幅するかを確認するため、まず１４株のＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ株のＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を電気泳動したところ、全ての菌株に於いて、また全てのプライマーの組み合わせ、ＰＦ１＆ＰＲ１（予想断片長５９３ｂｐ），ＰＦ１＆ＰＲ２（予想断片長５３３ｂｐ），ＰＦ３＆ＰＲ１（予想断片長４４４ｂｐ），ＰＦ３＆ＰＲ２（予想断片長３８４ｂｐ），ＰＦ４＆ＰＲ１（予想断片長２９４ｂｐ），ＰＦ４＆ＰＲ２（予想断片長２３４ｂｐ）に於いて（総計６の組み合わせ）、目的とする長さの断片のみが増幅されていることが明らかになった（図１１〜１３参照）。図上、増幅産物の断片長が予想される断片長とは異なるように見える場合があるが、これは同時に電気泳動していないものを羅列したためであり、オリジナルのマーカーを用いて断片長を計測した場合、予想される断片長が確認された。
次に、設計したプライマーがＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに特異的であることを確かめるため、その他のＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌を用いて同様の試験を行った。その結果を図１４〜１６に示した。図から明らかなように、Ａ．  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ、Ａ．  ｐｏｍｏｒｕｍ、Ａ．  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ、Ａ．  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ２ではいずれのプライマーの組み合わせでもＰＣＲ産物は確認されなかった。一方、Ａ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ａ．  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍおよびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  １の幾つかの株に於いて、ＰＦ１とＰＲ２の組み合わせでマイナーなＰＣＲ産物（約５３０〜１４００ｂｐ）が１〜２本確認された。５３０ｂｐ付近は本来ＰＦ１とＰＲ２の組み合わせで増幅される断片長に近いため、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓとの判別に支障を来すが、それよりも長い断片は、本来生じる断片ではないので、判別に支障はないと考えられた。他方、ＰＦ１とＰＦ２以外の組み合わせでは、予想されうるバンド長の断片は増幅されず、従って、ＰＦ１とＰＲ２の組み合わせを用いる場合は、その他の組み合わせも併用して用いることにより、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓを他のＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌と容易に判別することが可能であった。
以上の結果から、これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、Ａ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓとその他のＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌を５時間（一般的な装置を使用した場合の概算値：ＤＮＡ調製：１時間、ＰＣＲ反応：３時間、電気泳動：１時間）で鑑別することが可能となった。従来はこの鑑別に約１日を費やしていたため、本技術開発により所要時間が１／４以下に短縮された。
一般的にＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の検査には、ＹＳＧ培地で４５℃培養の条件が使用されており、この条件で生育するものはほぼＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌であることが分かっている。従って、検査の結果得られたコロニーを少量用い、本技術と組み合わせることによって、短時間かつ簡便にターゲット菌か否かを確認することができるため、品質管理への応用が期待される。
【００２６】
実施例１：消費者異臭クレームオレンジジュースの汚染検査例
検体１０ｍｌをはかり取り、ＹＳＧ液体培地９０ｍｌに懸濁した。これを４５℃で３日間前培養した。前培養液の１ｍｌを約２０ｍｌのＹＳＧ寒天培地とよく混ぜ、固化後、３０℃で５日間培養した。生じたコロニーがＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓであるかどうかを確かめるため、次の検査を行った。即ち、生じたコロニーを、ＹＳＧ寒天培地を用いて純化した。純化したコロニーの一白金耳を取り、実験例１と同様にして染色体ＤＮＡを調製し、得られたＤＮＡを鋳型とし、設計した５本のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、反応産物を電気泳動で確認した。その結果、予測されるバンド長に目的の増幅断片が確認された（図１７参照）。以上のことから、今回分離された菌株はＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓであることが判明し、異臭産生の原因菌は製品中に混入していたＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓであることが分かった。なお、この菌株については、１６Ｓ  ｒＤＮＡのＨＶ領域の解析によりＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓであることを確かめた。
【００２７】
実施例２：果糖ブドウ糖液糖を使用した清涼飲料の出荷前異臭不合格品の汚染検査例
原料（果糖ブドウ糖液糖）１０ｇをはかり取り、滅菌水９０ｍｌに懸濁した。この糖液を０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過し、そのメンブレンフィルターをＹＳＧ寒天培地上に載せ、４５℃で５日間培養した。生じた３コロニーがＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓであるかどうかを確かめるため、次の検査を行った。即ち、生じた３コロニーを、ＹＳＧ寒天培地を用いてそれぞれ純化した。純化したコロニーの一白金耳を取り、実験例１と同様にして染色体ＤＮＡを調製し、得られたＤＮＡを鋳型とし、設計した５本のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、反応産物を電気泳動で確認した。その結果、１コロニーについては予測されるバンド長に目的の増幅断片が確認された。残りの２コロニーについてはいずれの組み合わせに於いても予測されるバンド長に目的の増幅断片が確認できなかった（図１８参照）。以上のことから、今回分離された３菌株は、１株がＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓで、２株がＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ以外の細菌株であることが分かった。従って、異臭不合格品の原因は果糖ブドウ糖液糖中に混在していたＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓが原因であることが判明した。なお、これらの株については、１６Ｓ  ｒＤＮＡのＨＶ領域の解析により、増幅断片が確認された株はＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓで、されなかった株はＡ．  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓであることを確かめた。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、果汁入り飲食品をはじめとする各種飲食品やその原材料についてのアリサイクロバチルス・アシドテレストリスによる汚染の有無を迅速かつ簡便に検査する方法が提供される。
【００２９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実験例１における多重配列比較解析の結果を示す表。
【図２】同、続き
【図３】同、続き
【図４】同、続き
【図５】同、続き
【図６】同、続き
【図７】同、続き
【図８】同、続き
【図９】同、続き
【図１０】同、続き
【図１１】実験例１におけるＡ．  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ株に基づく増幅産物の電気泳動像。
【図１２】〃
【図１３】〃
【図１４】実験例１におけるその他のＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌株に基づく増幅産物の電気泳動像。
【図１５】〃
【図１６】〃
【図１７】実施例１における増幅産物の電気泳動像。
【図１８】実施例２における増幅産物の電気泳動像。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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