(57)【要約】【課題】  生体内に移植された細胞を非侵襲的にモニターする有効な方法として、磁気共鳴画像法が提案されているが、汎用性があり、簡便で、効率的で、標識を受ける細胞に対する影響が小さく、同時に生体内での該細胞の動態を長期間にわたりモニターすることを可能にするような技術が求められている。【解決手段】  本発明は、少なくとも1種の磁気共鳴造影剤が不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含まれる、生細胞を磁気標識するための組成物を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を、不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、及び
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物と標識されるべき生細胞とを接触させて、磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程を含む、生細胞を磁気標識する方法。
【請求項２】
前記ロの工程が、生体外で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも1種の磁気共鳴造影剤が不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含まれる、生細胞を磁気標識するための組成物。
【請求項４】
エンベロープがパラミクソウイルス亜科に属するウイルスのエンベロープである請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
磁気共鳴造影剤が常磁性体及び超常磁性体よりなる群から選択される請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
磁気共鳴造影剤が超常磁性体である請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
磁気共鳴造影剤が超常磁性酸化鉄である請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物と標識されるべき生細胞とを接触させて、磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程、及び
ハ．磁気共鳴画像化法により該細胞を画像化する工程を含む、磁気標識された生細胞を検出する方法。
【請求項９】
生体外の細胞を画像化する請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞を磁気標識するための組成物、該組成物により磁気標識された細胞、該細胞を磁気共鳴画像法（MRI：magnetic resonance imaging）により同定、識別する技術に関する。生細胞の処理方法を含む本発明は、疾患の診断、処置のため使用できる他、特に細胞治療、再生医療に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
今日では、いくつかの治療や診断において、外生の生きた細胞や組織が患者に導入されるようになっている。その目的は患者において欠損している細胞や組織の供給であるか、患者において欠乏していたり補給しなければならない自然物質を生産する細胞の供給である。輸血、器官や組織の移植、胎児や胚を由来とする細胞の輸注や組織の移植および幹細胞治療がその例である。更に、パーキンソン病の治療で見られるような胎児由来の細胞や組織を用いた治療の進展が見られ、また多種類の幹細胞や前駆細胞が発見されるに至り、このような細胞を用いた治療方法は、治療が充分できなかった病態の治療に広範に用いられるようになるものと考えられている。
【０００３】
細胞移植、細胞治療において、移植細胞の空間的な分布を明らかにするための技術は、移植後に、それらの細胞がどのように機能するかを理解する上で大変な助けとなる。例えば、移植細胞の生理学的な動態や分化過程およびそれらの再生能力についての情報などが得られることになる。特に、生体内に移植された細胞を継続的に且つ非侵襲的にモニターする技術は、非常に重要な役割を果たすと考えられている。これまで、組織学的手法で蛍光顕微鏡を用いた方法がいくつか報告されているが、これらの手法の利用は死亡した試料に限定されるので、生体中での情報と関連付けるため、補強証拠となるような画像的な実証を必要としている。そこで、生体に応用できる有望な技術の一つとして、磁気標識の利用が提案されている。即ち、磁気共鳴画像を得るための造影剤を対象となる細胞内に導入し、磁気共鳴画像によってその標識を追跡する手法である。
【０００４】
磁気共鳴画像法において、磁気標識として利用される造影剤としては、極めて低濃度で、周辺組織の信号強度に影響を与え、強度低下を引き起こす物質、例えば超常磁性体酸化鉄（SPIO；super paramagnetic iron oxide）が有望であると考えられているが、SPIOそれ自体は細胞内への取り込みの効率が低く、細胞標識には限界があった。モノクローナル抗体や外来タンパク質との結合、デンドリマー、リポソーム、リポフェクション試薬等の利用により、磁気共鳴造影剤の細胞への取り込みを容易にする必要があった。それらは以下の先行文献に記載されている。Carboxy-terminated dendrimer（非特許文献１）、フュ-ジーンFuGene（登録商標：非特許文献２）、Superfect、Polyfect PLUS/Lipofectamine、Effectene（以上全て登録商標）およびPoly-L-lysin（特許文献１、非特許文献３）などである。また、前記特許文献１には特定のウイルスのエンベロープ表面を、そのカプシドに対する抗体を媒体として用いて、磁気標識する方法に関する記載が見られるが、これらのウイルスは標識の対象であって、細胞移植や細胞治療のための細胞の処理に使用することは記載されていない。
【０００５】
一方、遺伝子等の核酸を細胞内へ導入するベクターとして不活性化されたウイルスのエンベロープが提案され、一部は実用化されている（特許文献２）。しかしながら、これらの不活性化ウイルスエンベロープを用いて磁気共鳴造影剤を細胞内に導入できるとした記載は見られない。
【０００６】
【特許文献１】WO00/71169、第19頁
【特許文献２】WO01/527204
【非特許文献１】Bulte IWM, Douglas T, Witwer B et al. Acad Radiol 9 (suppl 2) (suppl 2): S332-S335, 2002.
【非特許文献２】M Hoeh M, Kustermann E, Blunk J et al. Proc Natl Acad Sci USA 99: 16267-16272, 2002.
【非特許文献３】Frank JA, Zywicke H, Jordan EK et al. Acad Radiol 9 (suppl 2): S484-S487, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
生体内に移植された細胞を非侵襲的にモニターする有効な方法として、磁気共鳴画像法が重要な方法と考えられており、前記のように移植細胞の磁気標識のための方法がいくつか提案されている。しかしながら、限られた種類の細胞にのみ適用される方法であったり、モノクローナル抗体のような特殊なタンパク質等を必要としたり、煩雑な工程を必要するという問題が存在する。それゆえ依然として、汎用性があり、簡便で、効率的で、標識を受ける細胞に対する影響が小さく、同時に生体内での該細胞の動態を長期間にわたりモニターすることを可能にするような技術が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
鋭意検討の結果、不活性化されたウイルスのエンベロープを磁気共鳴造影剤の細胞への導入系として用いたところ、驚くべきことに、従来の方法に比し、高効率で磁気共鳴造影剤を導入でき、対象となる細胞への影響がより小さいことを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明により、以下に記載の生細胞を磁気標識する方法が提供される。
（１）  イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を、不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、及び
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物と標識されるべき生細胞とを接触させて、磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程を含む、生細胞を磁気標識する方法。
（２）  前記ロの工程が、生体外で行われる（１）に記載の方法。
【０００９】
また、本発明の別の局面では、以下に記載の生細胞を磁気標識するための組成物が提供される。
（３）  少なくとも1種の磁気共鳴造影剤が不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含まれる、生細胞を磁気標識するための組成物。
（４）  エンベロープがパラミクソウイルス亜科に属するウイルスのエンベロープである（３）に記載の組成物。
（５）  磁気共鳴造影剤が常磁性体及び超常磁性体よりなる群から選択される（３）に記載の組成物。
（６）  磁気共鳴造影剤が超常磁性体である（３）に記載の組成物。
（７）  磁気共鳴造影剤が超常磁性酸化鉄である（３）に記載の組成物。
さらに、本発明の別の局面では、以下に記載の磁気標識された生細胞を検出する方法が提供される。
（８）  イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物と標識されるべき生細胞とを接触させて、磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程、及び
ハ．磁気共鳴画像化法により該細胞を画像化する工程を含む、磁気標識された生細胞を検出する方法。
（９）  生体外の細胞を画像化する（８）に記載の方法。
【００１０】
本発明の別の態様として以下のものも挙げられる。
（１０）  イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物と標識されるべき生細胞とを接触させて、磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程、
ハ．該細胞を宿主に移植する工程、及び
ニ．磁気共鳴画像化法により該宿主を画像化する工程を含む、磁気標識された生細胞を検出する方法。
（１１）  磁気共鳴造影剤が不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含まれる組成物と、標識されるべき細胞とを接触させる工程を硫酸プロタミンの存在下で行う、前記（１）、（８）及び（１０）に記載の方法。
【００１１】
また、本発明の更なる別の態様として以下のものが挙げられる。
（１２）  イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を、不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、及び
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物を宿主内の特定の部位に導入し、磁気共鳴造影剤を同部位に位置する細胞に内在化する工程を含む、生細胞を磁気標識する方法。
（１３）  磁気標識された細胞を検出する方法であって、（１２）に記載の方法に、磁気共鳴画像法により該宿主を画像化する工程を更に含む方法。
（１４）  イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を、不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物を標識されるべき細胞と接触させて、磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程、及び
ハ．磁気共鳴画像化法により該宿主を画像化する工程を含む、哺乳類の疾患を処置する方法。
（１５）  イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を、不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物を標識されるべき細胞と接触させて、磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程、及び
ハ．磁気共鳴画像化法により宿主を画像化する工程を含む、哺乳類の細胞治療のための方法。
（１６）  イ．少なくとも1種の磁気共鳴造影剤を、不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含ませる工程、
ロ．磁気共鳴造影剤が該エンベロープ中に含まれる組成物を標識されるべき細胞と接触させて、磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程、及び
ハ．磁気共鳴画像化法により宿主を画像化する工程を含む、哺乳類の再生医療のための方法。
（１７）  前記ロの工程を硫酸プロタミンの存在下で行う、（１４）から（１６）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、生細胞を磁気標識するために使用できるが、特定の細胞への親和性を高めるための、抗体やタンパク質等を特に必要としないため、広範囲の細胞が磁気標識の対象とすることを可能にする。本発明は、不活性化したウイルスのエンベロープを使用するため、煩雑な工程を必要とせず、磁気標識を効率的に行うことを可能にする。さらに、本発明は、標識を受ける細胞に対する影響が小さく、生体内での該細胞の動態を長期間にわたりモニターすることを可能にする。現在、臨床用途で通常使用される磁気共鳴装置によって、標識された細胞を明瞭に観測することを可能にする。即ち、磁気標識後に宿主へ移植された細胞の動態追跡を一般的に利用可能なものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明において特に使用される用語を説明する。
【００１４】
本発明において「ウイルス」とは、DNAまたはRNAのいずれかをゲノムとして有し、感染細胞内のみで増殖する感染性の微小構造体をいう。本発明の不活性化ウイルスエンベロープとしては、エンベロープを有するウイルスのものであれば種々のウイルス由来のエンベロープが使用できる。例えば、そのようなウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科及びヘパドナウイルス科に属するウイルスが挙げられる。好ましくはパラミクソウイルス科またはオルトミクソウイルス科に属するウイルスであり、より好ましくはパラミクソウイルス科に属するウイルスである。さらにより好ましくはパラミクソウイルス亜科に属するウイルスである。パラミクソウイルス亜科に属するウイルスとしてはレスピロウイルス属、ルブラウイルス属、モービリウイルス属がある。これらの中ではレスピロウイルス属のウイルスが好ましく、センダイウイルスがより好ましい。
本明細書において「センダイウイルス」または「HVJ」（Hemagglutinating virus of Japan）とは、互換的に用いられ、細胞融合作用を有するウイルスである。種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のヘテロカリオン形成、雑種細胞の作出などの細胞融合に広く利用されている。
【００１５】
本発明において「不活性化」とは、ウイルスについて言及されるとき、ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製欠損である。不活性化は例えばUV処理またはアルキル化剤による処理によってなされる。
【００１６】
本発明において「エンベロープ」とは、特定のウイルスに存在するヌクレオカプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。
【００１７】
本発明において「エンベロープ中に含まれる」とは上記脂質二重層を基本とする膜構造で囲まれた内部を満たす水性層の中及び/または膜構造の脂質中に存在することを意味し、磁気共鳴造影剤の表面の性質、例えば、親水性または疎水性等に依存すると考えられる。磁気共鳴造影剤が不活性化ウイルスのエンベロープ内部を満たす水性層に主に存在することが望ましい。また、本発明において「エンベロープ中に含ませる」とは磁気共鳴造影剤が前記「エンベロープ中に含まれる」状態にすることを意味する。
【００１８】
本発明において使用される磁気共鳴造影剤は、常磁性体、超常磁性体、強磁性体のいずれも含まれる。好ましくは、常磁性体または超常磁性体であり、より好ましくは超常磁性体である。上記の磁性体の材質としては金属、金属酸化物、非金属-金属複合体、セラミック複合体が挙げられる。最も望ましい態様としては、金属酸化物の超常磁性体が挙げられる。
【００１９】
前記常磁性体の造影剤としては、例えば、生理学的に許容される常磁性金属塩もしくはキレートであることができ、または遊離基、好ましくはニトロキシド型の遊離基を含むことができる。常磁性剤が遊離金属イオンである場合、マンガン（２＋）塩が好ましい。キレートは好ましくはマンガン（２＋）、ガドリニウム（３＋）、ジスプロシウム（３＋）または鉄（３＋）を基礎にしており、文献（例えばWO91/10645）中に記載されたようなキレート化剤、例えばNTA、EDTA、HEDTA、DTPA、DTPA-BMA、BOPTA、TTHA、NOTA、DOTA、DO3A、HP-D03A、EOB-DTPA、TETA、HAM、DPDP、ポルフィリンおよびそれらの誘導体を含むことができる。
【００２０】
前記超常磁性体の造影剤としては、例えば当業界で公知のものも含むことができる。この型の好ましい剤としては、磁鉄鉱、Fe３O４、Fe２O３、混合フェライト、および有機強磁性材料を包含する磁性を有する他の鉄含有化合物が挙げられる。超常磁性とは、強磁性体の微粒子の集合体が示す磁性を指し、超常磁性体とは好ましくは強磁性体の微粒子である。超常磁性体は、低い磁界で飽和を示すにもかかわらず、ヒステリシスを示さず、残留磁化もないが、個々の磁性微粒子の磁気モーメントは強磁性の磁化であるため、常磁性体の原子磁気モーメントに比し、100から100000倍もの大きな値を示す。
【００２１】
これらの磁気共鳴造影剤は、遊離であるかまたは例えばデキストラン、脂肪酸もしくは磁性材料を安定化することが知られている化合物のうち他の生体に無害な化合物でコーティングされていても良い。該コーティング皮膜は生体内で分解されるものが好ましい。
磁気共鳴造影剤の磁性粒子の平均粒径は1〜600nmであり、好ましくは4〜300nm、より好ましくは10〜150nmである。また、磁気共鳴造影剤は、前記の磁性粒子の水性懸濁液の形であるのが好都合である。
【００２２】
本発明の磁気標識のための組成物の使用量は、磁気標識の対象となる細胞により異なり適宜選択することができる。磁気共鳴造影剤を該細胞に内在化する工程において、細胞懸濁液に該組成物を添加する場合、細胞懸濁液中の磁性体の濃度としては、0.02μMから200mMであり、好ましくは0.2μM〜20mM、より好ましくは20〜200μMである。
【００２３】
本発明の磁気標識のための組成物の調製は、好ましくは以下の工程、
イ．磁気共鳴造影剤と不活性化されたウイルスのエンベロープとを混合する工程、
ロ．界面活性剤を前記工程イで得られた混合物に添加する工程、
ハ．得られた混合物から界面活性剤の濃度を低下させる工程、
を含む工程により調製されるが、このうち、イの工程は硫酸プロタミンの存在下に行われても良い。この硫酸プロタミンの使用濃度は10〜10000μg/mLであり、好ましくは100〜2000μg/mLである。
【００２４】
前記工程ロで使用する界面活性剤としては、オクチルグルコシド、Triton-X100、CHAPS、またはNP-40などが使用できるが、好ましくはTriton-X100である。界面活性剤の使用濃度は0.01〜10％であり、好ましくは0.1〜1％である。前記ハの工程、界面活性剤の濃度を低下させる工程としては、希釈や遠心分離による除去が望ましいが、より好ましくは遠心分離による除去である。
【００２５】
本発明の生細胞を磁気標識する方法において、使用する不活性化ウイルスエンベロープの粒子数は磁気標識の対象となる細胞により異なるが、対象細胞当り100〜100000粒子使用するのが望ましく、対象細胞当り1000〜10000粒子を使用するのがより望ましい。
【００２６】
また、本発明において、磁気共鳴造影剤が不活性化されたウイルスのエンベロープ中に含まれる組成物を、標識されるべき細胞と接触させる工程では、対象となる細胞により異なるが、硫酸プロタミンの存在下にこの工程を行うこともできる。硫酸プロタミンの存在下でこの工程を行う場合、その使用濃度は0.1〜2000μg/mLであり、好ましくは1〜1000μg/mLであり、より好ましくは5〜500μg/mLである。
【００２７】
本発明において磁気標識の対象となる細胞とは哺乳類の細胞を意味し、ヒト、サル、マウス、ラット等に由来する細胞が含まれる。それらの細胞としては、分化した細胞である体細胞、それらに分化する前駆細胞、更には、前駆細胞を生み出す、より未分化な幹細胞が含まれる。好ましくは分化の程度が体細胞より低い細胞であり、前駆細胞や幹細胞がより好ましい。分化の程度が体細胞より低い細胞には、癌細胞に由来する培養細胞も含まれる。更に好ましくは、中枢神経においてニューロンに分化する能力を有する細胞である。
【００２８】
本発明において磁気標識の対象となる細胞は、宿主において欠損または不足している細胞、欠損または不足している組織や器官を再生する細胞、欠損または不足している物質を供給する細胞が含まれるが、それらの細胞に宿主内で分化することができる細胞であっても良い。磁気標識されたこれらの細胞は宿主の処置や診断にも利用され得る。
【００２９】
従って、本発明において磁気標識の対象となる細胞には、胚性幹細胞（embryonic stem cell）、この胚性幹細胞から人工的に分化させた幹細胞や体細胞、多能性幹細胞（生殖性幹細胞体や体性幹細胞由来の多能性幹細胞）、組織幹細胞、この組織幹細胞または体性幹細胞から人工的に分化させた体細胞、または各種体細胞なども含まれが、さらに前記胚性幹細胞と体細胞の融合細胞である、多能性融合細胞も含まれる。磁気標識された細胞は宿主内で損傷した細胞や病気の細胞と入れ替わることができる。
【００３０】
前記多能性幹細胞には体性幹細胞由来の多能性幹細胞が含まれるが、組織を越えて色々な組織の細胞に分化する能力を持つ幹細胞であって、たとえば間葉系幹細胞、中胚葉系前駆細胞が分離されており、この中胚葉系前駆細胞は多能性体性幹細胞（multipotent adult progenitor cell）と呼ばれることもある。また前記組織幹細胞は各組織に存在する幹細胞であり、それぞれの組織の構成細胞に分化する能力を有し、骨髄、中枢神経、網膜、骨格筋、脂肪組織、皮下組織、肝臓などでその存在が確認されている。神経幹細胞、神経堤細胞、角膜幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、上皮幹細胞、色素幹細胞、腸管上皮幹細胞、網膜幹細胞などがその例である。
【００３１】
磁気標識の対象となる分化程度が体細胞より低い細胞から分化する細胞には、ドーパミン産生ニューロン、アセチルコリン産生ニューロン、運動ニューロン、グリア細胞、心筋細胞、インスリン分泌細胞、肝細胞、骨細胞、破骨細胞、筋芽細胞、造血幹細胞、血液血管芽細胞、血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞、腸管上皮細胞、表皮細胞、網膜色素上皮細胞、視細胞、歯槽骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、末梢神経系ニューロン、末梢神経系グリア細胞、メラノサイト、内耳感覚細胞、角膜細胞、膵前駆細胞、腺管上皮細胞、内毛幹鞘細胞、外毛幹鞘細胞、皮膚基底細胞、色素細胞、虹彩由来視細胞などが含まれる。
【００３２】
従って、本発明おいて磁気標識された細胞を用いて細胞治療や再生医療が有効な疾患や症状等には、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄損傷、運動ニューロン疾患、脱髄疾患、心筋梗塞、心筋症、糖尿病、肝代謝障害、肝硬変、骨腫瘍、外傷による骨欠損、骨粗しょう症、筋ジストロフィー症、白血病、再生不良貧血、先天性免疫不全、代謝疾患、短腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、熱傷などによる皮膚欠損、網膜色素変性、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、歯周病、骨形成不全症、脳虚血、リウマチによる関節炎や変形関節症、末梢神経障害、脳卒中後遺症、海馬硬化、多発性硬化症、高度感音性難聴、脱毛抑制、発毛促進、シミ抑制、網膜再生などが含まれる。
【００３３】
本発明によれば、これらの対象となる疾患や損傷の処置において、造影剤で標識された細胞の位置や移動を磁気共鳴画像法により、確認することができる。長期間にわたり、必要に応じて、または好ましい時期に何回でも宿主を磁気共鳴画像法により撮像することが可能である。
【００３４】
本発明において磁気標識の対象となる細胞は、これらの疾患や損傷の処置のために、物質生産用の遺伝子ベクターを伴って導入されることが可能で、それらの細胞について、その移動、生存や処置のためのタンパク質の生産能力を確認するために必要に応じてモニターあるいは追跡することができる。
【００３５】
本発明において磁気標識された細胞を生体の処置や診断または実験に応用する手段としては、磁気標識の対象となる細胞は、分散されたものであっても良いし、組織や器官の一部であっても良い。また、磁気標識した後で細胞が組織や器官に導入されても良い。あるいは、細胞は手術によって、または血管、宿主の何らかの構造物、器官や体腔への注入などによって宿主の適切な部位に導入されても良い。さらには、生体外で組織や器官に標識された細胞が組込まれた後、それらの組織や器官が手術により宿主体内へ移植されても良い。特に、生体外での培養が困難または不可能な細胞を磁気標識の対象とする場合は、細胞はインサイチュ（in situ）で磁気標識されても良い。それらの細胞が増殖可能な生体に移植し、移植された生体上または組織中で、対象となる細胞を磁気標識しても良い。
好ましくは、磁気標識された細胞が生体の構造物、組織、器官に対して直接導入される。より好ましくは、磁気標識された細胞は、中枢神経系に導入される。
【００３６】
宿主には、磁気標識された細胞が移植される対象が含まれ、実験の対象となる動物、処置の対象となる動物、処置の対象となる人、治療試験の対象となる人及びそれらの組織、器官などが含まれる。好ましくは実験の対象となる動物、処置の対象となる動物、処置の対象となる人または治療試験の対象となる人の組織、器官である。それらの組織、器官としては、骨髄、中枢神経、心臓、網膜、骨格筋、脂肪組織、皮下組織、肝臓、膵臓、腸などが挙げられる。
【実施例】
【００３７】
実施例１．不活性化HVJエンベロープの調製
以下の実施例で用いられる不活性化HVJエンベロープは、WO03/014338の実施例１、実施例７（第38頁から第46頁に開示）に記載の方法と同様な方法により調製される。手短には、受精卵で増殖されたHVJをβ-プロピオラクトンにより不活性化した後、フィルター濾過、限外濾過による濃縮、カラムクロマトグラフィーによる精製を経て、限外濾過による濃縮を行うことにより、不活性化HVJエンベロープが得られる。
【００３８】
実施例２．アストロサイトへの鉄粒子の導入（磁気標識）
実施例１で調製された不活性化HVJエンベロープを使用して、超常磁性酸化鉄コロイド溶液Feridex（登録商標、Ferumoxides,Advanced Magnetics, Inc. Cambridge, MA：以下単に鉄粒子と記載するものもFeridexのことである）をエンベロープ内に封入し細胞に処理することにより、アストロサイトを磁気標識した。
【００３９】
不活性化HVJエンベロープ懸濁液40μLを1.5mLマイクロテストチューブに採取し、4℃、10,000×g、5分間遠心した。遠心上清を除去後、不活性化HVJエンベロープペレットをPBS(-) 10μLに懸濁し、Feridex溶液（原液のFe濃度；11.2mg/mL）10μLを添加・混合した。同混合液に2% Triton X-100 2μLを添加・混合し、再度4℃、10,000×g、5分間遠心した。遠心上清を除去後、鉄粒子が封入された不活性化HVJエンベロープペレットをPBS(-) 30μLに懸濁し、10mg/mL 硫酸プロタミン 5μLを添加・混合した。上記操作は氷上〜4℃で実施した。
【００４０】
マウス由来アストロサイト細胞株（CRL-2541：American Type Culture Collectionから購入）は定法に従って培養された。培地2mL当たり2×105細胞を直径35mmプレート（6-well plate）に播種し、一晩培養した後、鉄粒子の導入に供した。鉄粒子が封入された不活性化HVJエンベロープ懸濁液35μLをアストロサイト（2mL culture）に添加し、同プレートを37℃、5% CO2下、20時間インキュベートした。ネガティブコントロールとして、不活性化HVJエンベロープを含まないFeridex溶液が直接細胞に処理された。
【００４１】
鉄粒子の細胞内導入の確認は、Prussian blue staining法に準じた。細胞はPBS(-)で洗浄され、4％パラホルムアルデヒド液を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）で10分間固定処理された。再度PBS(-)で洗浄後、細胞は1% フェロシアンカリウム 1% HCl溶液で30分間インキュベートされた。上記操作はすべて室温で実施した。
【００４２】
アストロサイトのPrussian blue staining法による鉄染色像を図１（a, c）に示した。不活性化HVJエンベロープの使用（a）により、アストロサイト細胞内に効率的に鉄粒子が導入されることが示された。導入された鉄粒子は細胞質内に均一に分布しており、その導入量は封入に使用したFeridex溶液のFe濃度に依存した（データの開示はない）。いずれの濃度溶液の使用においても細胞毒性は認められなかった。Fe濃度11.2mg/mL溶液の使用が最も高い導入量を示したため、以降の導入では同濃度溶液を使用した。
【００４３】
鉄粒子導入後の長期培養における細胞毒性の出現について検討するため、導入処理後1週間培養を継続した。その期間中、細胞毒性は観察されなかった。1週間後、鉄染色される細胞数は増殖に伴い減少するものの、維持されていた。
【００４４】
実施例３．PC-12細胞への鉄粒子の導入（磁気標識；第1法）
実施例１で調製された不活性化HVJエンベロープを使用して、Feridexをエンベロープ内に封入し細胞に処理することにより、PC-12細胞を磁気標識した。
【００４５】
不活性化HVJエンベロープ懸濁液40μLを1.5mLマイクロテストチューブに採取し、1mg/mL 硫酸プロタミン10μLを添加・混合した。氷上で5分間静置後、Feridex溶液10μLを添加・混合した。同混合液に2% Triton X-100 6μLを添加・混合し、4℃、10,000×g、5分間遠心した。遠心上清を除去後、鉄粒子が封入された不活性化HVJエンベロープペレットをPBS(-) 30μLに懸濁し、10mg/mL 硫酸プロタミン 5μLを添加・混合した。上記操作は氷上〜4℃で実施した。
【００４６】
ラット副腎褐色細胞腫由来細胞株PC-12（CRL-1721：American Type Culture Collectionから購入）は定法に従って培養された。培地2mL当たり2×105細胞を直径35mmプレート（6-well plate）に播種し、一晩培養した後、鉄粒子の導入に供した。
【００４７】
鉄粒子が封入された不活性化HVJエンベロープ懸濁液35μLをPC-12細胞（2mL culture）に添加し、同プレートを35℃、1,600×g、10分間遠心した。遠心後、培地交換し、プレートを37℃、5% CO2下、20時間インキュベートした。ネガティブコントロールとして、不活性化HVJエンベロープを含まないFeridex溶液が直接細胞に処理された。
【００４８】
鉄粒子の細胞内導入の確認は、Prussian blue staining法に準じた。PC-12細胞のPrussian blue staining法による鉄染色像を図１（b, d）に示した。不活性化HVJエンベロープの使用（b）により、PC-12細胞内に効率的に鉄粒子が導入されることが示された。その導入量は封入に使用したFeridex溶液のFe濃度に依存した。いずれの濃度溶液の使用においても細胞毒性はほとんど認められなかった。
【００４９】
実施例４．PC-12細胞への鉄粒子の導入（磁気標識；第2法）
実施例１で調製された不活性化HVJエンベロープを使用して、実施例２に従ってFeridexをエンベロープ内に封入し、同封入体を細胞に処理することにより、PC-12細胞を磁気標識した。
【００５０】
不活性化HVJエンベロープ懸濁液40μLを1.5mLマイクロテストチューブに採取し、4℃、10,000×g、5分間遠心した。遠心上清を除去後、不活性化HVJエンベロープペレットをPBS(-) 10μLに懸濁し、Feridex溶液10μLを添加・混合した。同混合液に2% Triton X-100 2μLを添加・混合し、再度4℃、10,000×g、5分間遠心した。遠心上清を除去後、鉄粒子が封入された不活性化HVJエンベロープペレットをPBS(-) 30μLに懸濁し、10mg/mL 硫酸プロタミン 5μLを添加・混合した。上記操作は氷上〜4℃で実施した。
【００５１】
以下、鉄粒子が封入された不活性化HVJエンベロープによるPC-12細胞への鉄粒子の導入処理は、実施例３に従った。
【００５２】
比較例５．トランスフェクション試薬による磁気標識
比較対照としてトランスフェクションキットSuperfect（登録商標：Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用い、同キット添付のプロトコールに従って、アストロサイトおよびPC-12細胞を磁気標識した。
【００５３】
1.5mLマイクロテストチューブにFeridex溶液2μLを採取し、Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM, Sigma, USA）100μLを添加・混合し、Superfect試薬8μLを添加・混合した後、室温で10分間反応した。反応後、10%胎児牛血清（FBS, BioWhittaker, Maryland）を含むDMEM 400μLを添加・混合した。
【００５４】
アストロサイトおよびPC-12細胞は、培地2mL当たり2×105細胞を直径35mmプレート（6-well plate）に播種され、一晩培養された後、導入処理直前に0.5mLの培地が除去され、鉄粒子の導入に供された。鉄粒子が包埋されたSuperfect反応液500μLを各細胞（1.5mL culture）に添加し、同プレートを37℃、5% CO2下、20時間インキュベートした。
【００５５】
実施例６．磁気標識された細胞懸濁液の磁気共鳴画像法による評価
（方法）実施例２〜５に従ってそれぞれ鉄粒子が導入されたアストロサイトおよびPC-12細胞が、トリプシン処理によりプレートから剥がされ、培地0.2mLに懸濁された（約1×106細胞／mL）。
【００５６】
NMR試料管（直径5mm×長さ3cm）に細胞懸濁液0.2mLを採取し、磁気共鳴計測を行った。信号の検出には、自作した直径50mm、長さ50mmの円筒状体積コイル（送受信兼用）を用いた。磁気共鳴画像装置には2テスラ動物実験用CSI（ブルーカー、カールスルエー、ドイツ）を用いた。撮像方法にはスピン・エコー法を用い、関心領域（FOV）35mm×35mm、スライス厚4mm、マトリックス256×128に設定して、T1-強調画像とT2-強調画像を観察した。T1-強調画像の撮像条件は、繰り返し時間（TR）500ms、エコー時間（TE）18ms、フリップ角90°、2回スキャンで、約2分の計測時間を要した。また、T2-強調画像の撮像条件は、繰り返し時間2000ms、エコー時間80〜120ms、フリップ角90°、4回スキャンで、約17分の計測時間を要した。それぞれの元データにはゼロ・フィルを加えて画像化し、最終的にマトリックス256×256の画像データを得た。
【００５７】
（結果１）各種条件で磁気標識されたアストロサイト細胞懸濁液のT2-強調画像および同信号の相対強度をグラフ化し図2に示した。図中の番号はそれぞれ対応し、次のように、
懸濁液１（suspension number１）：無処理、
懸濁液２（同２）：不活性化ＨＶＪエンベロープを用いFeridex（11.2mg/mL）で標識処理、
懸濁液３（同３）：Feridex（11.2mg/mL）で直接処理、
懸濁液４（同４）：Superfectを用いFeridex（11.2mg/mL）で標識処理、
懸濁液５（同５）：Superfectを用いFeridex（5.6mg/mL）で標識処理、
懸濁液６（同６）：Superfectを用いFeridex（2.8mg/mL）で標識処理
したものを示す。
【００５８】
Feridexで標識していない細胞が最も高い信号強度を呈するが、これを100としたときのそれぞれの処理区の信号強度の割合を相対強度（relative image intensity）として示した。直接処理（懸濁液3）では信号強度がほとんど減少しないのに対し、不活性化ＨＶＪエンベロープおよびSuperfectを用いることにより信号強度が有意に減少することが示された。Superfectによる標識（懸濁液4〜6）が30〜40％の減少に留まったのに対し、不活性化ＨＶＪエンベロープによる標識（懸濁液2）では80％の顕著な減少が示された。
【００５９】
（結果２）PC-12細胞懸濁液のT2-強調画像および同信号の相対強度（前記に同じ）は図 3に示した。PC-12細胞では、アストロサイトに比べて信号強度の減少程度は小さいものの同様な傾向が観察された。図中の番号はそれぞれ対応し、次のように、
懸濁液1（suspension number１）：無処理
懸濁液2（同２）：不活性化ＨＶＪエンベロープ（第2法）を用いFeridex（11.2mg/mL）で標識処理、
懸濁液3（同３）：不活性化ＨＶＪエンベロープ（第2法）を用いFeridex（5.6mg/mL）で標識処理、
懸濁液4（同４）：Feridex（11.2mg/mL）で直接処理、
懸濁液5（同５）：不活性化ＨＶＪエンベロープ（第1法）を用いFeridex（5.6mg/mL）で標識処理、
懸濁液6（同６）：Superfectを用いFeridex（11.2mg/mL）で標識処理、
懸濁液7（同７）：Superfectを用いFeridex（5.6mg/mL）で標識処理
したものを示す。Superfectで20％、不活性化HVJエンベロープで40％の減少がそれぞれ示された。
【００６０】
これらの結果より、鉄粒子の細胞内導入において不活性化HVJエンベロープの使用が効果的であることが判明し、生細胞の磁気標識における不活性化HVJエンベロープの有用性が示された。
【００６１】
実施例７．磁気標識アストロサイトが移植されたラット脳の磁気共鳴画像観察
実施例２に従って鉄粒子が導入されたアストロサイトがトリプシン処理によりプレートから剥がされ、生理食塩水にて1回洗浄後、5×106細胞／mLの細胞濃度になるよう適当量の生理食塩水に懸濁された。ラット脳に移植する細胞の磁気標識では、Feridexを含む不活性化HVJエンベロープの調製において、5倍量の不活性化HVJエンベロープ（200μL）が使用され、培地2mL当たり2×105細胞の播種により準備された直径35mmプレート（6-well plate）5枚に対し、1プレート当たり1倍量相当の不活性化HVJエンベロープ懸濁液が処理された。
【００６２】
体重250〜400gの雄性ウィスターラット（日本クレア、東京）がペントバルビタール（50mg/kg）麻酔下、脳固定装置に設置された。頭皮の切開により頭蓋が暴露され、ブレグマから前方0.5mm、左方2.5mmの線条体（深さ5mm）に、ハミルトン型マイクロシリンジを用いて、磁気標識された細胞懸濁液0.5μL（約2,500細胞）が1μL/minの速度で注入された。注入後、逆流を防ぐため、マイクロシリンジが2分間静置された。
【００６３】
ラット脳の磁気共鳴計測には、実施例６で細胞の磁気共鳴計測に用いた自作コイルと動物実験用磁気共鳴画像装置を用いた。磁気標識細胞の脳移植後の観察のため、移植ラットを随時MR計測に供した。ラットはイソフルラン（1.5% in O2）麻酔下、MR画像装置に設置され、MR計測中温水保温マットを用いて37℃の体温を維持された。
【００６４】
撮像方法にはグラジエント・エコー法を用い、関心領域（FOV）35mm×35mm、スライス厚2mm、マトリックス256×128に設定して、Ｔ2＊-強調画像（Ｔ2スター：磁場の不均一性によるＴ2短縮効果を反映させた画像）を観察した。撮像条件は、繰り返し時間（TR）200ms、エコー時間（TE）30〜40ms、フリップ角45°、8回スキャンで、1回の画像計測に約3分24秒の計測時間を要した。細胞のMRIと同様に、それぞれの元データにはゼロ・フィルを加えて画像化し、最終的にマトリックス256×256の画像データを得た。
【００６５】
磁気標識アストロサイトのラット脳への移植後1日（a）、3日（b）、9日（c）および41日（d）のＴ2＊-強調画像を図４に示した。1日後の細胞移植部位で強い信号強度の減少（コントラスト）が観察された。3日後にはコントラストが手術創に分散する様子がみられ、その後徐々にコントラストが弱くなるのが観察された。41日後においても同位置にコントラストが観測された。
【００６６】
実施例８．磁気標識PC-12細胞が移植されたラット脳の磁気共鳴観察および移植細胞の組織染色による確認
実施例４に従って鉄粒子が導入されたPC-12細胞がトリプシン処理によりプレートから剥がされ、生理食塩水にて1回洗浄後、5×106細胞／mLの細胞濃度になるよう適当量の生理食塩水に懸濁された。ラット脳に移植する細胞の磁気標識では、Feridexを含む不活性化HVJエンベロープの調製において、5倍量の不活性化HVJエンベロープ（200μL）が使用され、培地2mL当たり2×105細胞の播種により準備された直径35mmプレート（6-well plate）5枚に対し、1プレート当たり1倍量相当の不活性化HVJエンベロープ懸濁液が処理された。
【００６７】
磁気標識PC-12細胞のラット脳への移植およびその後の磁気共鳴画像観察は、実施例７のアストロサイトの方法に従った。
【００６８】
MRI観察後のPC-12細胞移植ラットをペントバルビタール（80mg/kg）深麻酔下、10mM リン酸緩衝液でpH7.4に調整された生理食塩水を心臓から全身に流して脱血後、4％パラホルムアルデヒド液を含む固定液で灌流固定し、速やかに脳を摘出した。摘出脳は4％パラホルムアルデヒド液を含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）に24時間浸された後、15% Sucroseと0.1%アジ化ナトリウムを含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）中に置かれた。切片標本（厚さ20μm）はドライアイス凍結後、クリオスタットにて作製され、0.3% Triton X-100を含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）（PBST）中に回収された。
内因性ペルオキシダーゼ活性を除去するため、切片が0.5% H2O2を含むPBSTで室温、30分間処理された。PBSTで数回洗浄後、同切片は一次抗体で4℃、一晩処理された。一次抗体として、マウス抗チロシン水酸化酵素モノクローナル抗体（ケミコンインターナショナル、アメリカ）が使用された。続いて二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（ニチレイ、東京）が室温で、1時間処理された。各処理後、切片はPBSTで数回洗浄された。切片標本はDAB発色液（0.02% Diaminobenzidine、0.0045% H2O2を含む）との10分間の反応により着色された。また、同切片標本は、さらにPrussian blue staining法に準じて鉄染色（カウンター染色）された。
【００６９】
図５には、磁気標識PC-12細胞が移植されたラット脳のＴ2＊-強調画像（a, b）と移植部位の組織標本の染色像（c, d）を示した。
【００７０】
移植後4日（a）、11日（b）のＴ2＊-強調画像では、アストロサイトと同様、細胞移植部位にコントラストが観察された。
【００７１】
移植後11日に作製された移植部位周辺の切片標本の抗チロシン水酸化酵素（TH）抗体による免疫染色およびPrussian blue staining法（実施例と同様）による鉄染色の結果、低倍率像（c）で、鉄染色（青色）された組織像が観察された（矢印）。また、同部位の高倍率像（d）では、鉄染色と免疫染色（茶色）により二重に染色された細胞が観察された。ラット脳内の細胞と異なり、移植されたPC-12細胞はTH陽性のため免疫染色されるので、二重に染色された細胞は移植した磁気標識PC-12細胞であると想定され、これより磁気標識後移植された細胞の脳内での生着が確認された。
【００７２】
以上より、MRIで確認された部位によく一致して磁気標識された移植細胞が確認された。このことは、不活性化HVJエンベロープで磁気標識後移植された細胞は2テスラのMRI装置で確認できることを示している。
【００７３】
不活性化HVJエンベロープを使用した高効率のFeridexによる磁気標識は、現在のところ臨床用途で通常使用される2テスラの磁気共鳴装置によって、標識された細胞を明瞭に観測することを可能とした。即ち、磁気標識後に宿主へ移植された細胞の動態追跡を一般的なものとした。
【００７４】
実施例９．神経幹細胞への鉄粒子の導入（磁気標識）
実施例１に記載の方法と同様にして調製された不活性化HVJエンベロープを使用して、超常磁性酸化鉄コロイド溶液Feridex（登録商標、Ferumoxides,Advanced Magnetics, Inc. Cambridge, MA：以下単に鉄粒子と記載するものもFeridexのことである）をエンベロープ内に封入し細胞に処理することにより、神経幹細胞を磁気標識した。
【００７５】
鉄粒子が封入された不活性化HVJエンベロープの調製は実施例２に記載の方法と同様に行った。
【００７６】
神経幹細胞の調製
磁気標識の対象となる神経幹細胞は、マウス胚性幹細胞から胚様体を調製した後、神経幹細胞を誘導することにより得られる。マウス胚性幹細胞の樹立は、徳永智之、ジーンターゲッティングの最新技術、p.208-214、羊土社、2000年に記載の方法により行うことができる。手短には、予め調製したマウス胎仔繊維芽細胞をフィーダー細胞として用いて、交配3.5日目のマウス胚盤胞から胚性幹細胞を分離する。
【００７７】
上述の方法で得られるマウス胚性幹細胞から、岡部ら、Mechanisms of development, vol.59, p.89-102 、1996年のp.99に記載の方法や三寳千秋、ジーンターゲッティングの最新技術、p.20-28、羊土社、2000年に記載の方法に準じて神経幹細胞を調製できる。即ち、マイトマイシンC（Mitomycin C）で処理したマウス胎仔繊維芽細胞の初代培養細胞と、LIF（白血病抑制因子、leukemia  inhibitory  factor、ESGROアムラッド社）の存在下に、共培養することにより維持されたマウス胚性幹細胞を、ITSFｎ培地（インシュリン、トランスフェリン、塩化セレニウム、フィブロネクチンが添加された無血清培地）で培養することにより神経幹細胞を誘導する。上述のように共培養されたマウス胚性幹細胞を回収し、洗浄後、ゼラチンコートしたディシュに播種する。15〜30分後に胚性幹細胞だけを含む上清を分離回収し、浮遊培養する（LIFなし、血清あり）。数日間浮遊培養した後、形成された胚様体を単離し、接着培養する（LIFなし、血清あり）。培養1日後に無血清培地（インシュリン、トランスフェリン、塩化セレニウム、フィブロネクチンが添加された）に置換し、6〜10日間培養する。この培養によりネスチン陽性細胞（マウス抗ネスチンモノクローナル抗体を用いた染色により確認される）が誘導される。
【００７８】
鉄粒子の導入
上述の方法で得られるネスチン陽性細胞（神経幹細胞）を以下の工程で使用した。直径35mmプレート（6-well plate）に調製された神経幹細胞（約80％ confluency）を鉄粒子の導入に供した。神経幹細胞（2mL culture）に対して、実施例２に記載の方法と同様にして得られた、鉄粒子が封入された不活性化HVJエンベロープ懸濁液35μLを添加し、同プレートを37℃、5% CO2下、20時間インキュベートした。
【００７９】
鉄粒子の細胞内導入の確認は、実施例２に記載の方法と同様に、Prussian blue staining法に準じて行った。Prussian blue staining法による鉄染色の結果、不活性化HVJエンベロープの使用により、神経幹細胞内に効率的に鉄粒子が導入されることが示された。鉄粒子による磁気標識は神経幹細胞に対して毒性を示さなかった。また、該細胞は神経細胞やグリア細胞への分化能を維持していることが、それぞれの分化誘導培地を用いて確認された。
【００８０】
実施例１０．磁気標識された細胞懸濁液の磁気共鳴画像法による評価
実施例９に記載の方法で得られた、鉄粒子が導入された神経幹細胞が、Dissociation buffer処理によりプレートから剥がされ、培地0.2mLに懸濁された。この細胞懸濁液0.2mLをNMR試料管（直径5mm×長さ3cm）に採取し、磁気共鳴計測を行った。磁気共鳴測定は実施例６に記載の方法と同様にして行った。
【００８１】
不活性化HVJエンベロープを用いてFeridexにより磁気標識された神経幹細胞のT2-強調画像の信号強度は、非標識細胞に比べ著しく減少した。これより、神経幹細胞の磁気標識における不活性化HVJエンベロープの有用性が示された。
【００８２】
実施例１１．磁気標識神経幹細胞が移植されたラット脳の磁気共鳴画像観察および移植細胞の組織染色による確認
実施例９に記載の方法で得られた、鉄粒子が導入された神経幹細胞がDissociation buffer処理によりプレートから剥がされ、PBS(-)にて1回洗浄後、7×106細胞／mLの細胞濃度になるよう適当量の生理食塩水に懸濁された。ラット脳に移植する細胞の磁気標識では、Feridexを含む不活性化HVJエンベロープの調製において、2倍量の不活性化HVJエンベロープ（80μL）が使用され、2mL cultureにより調製された直径35mmプレート（6-well plate）2枚に対し、1プレート当たり1倍量相当の不活性化HVJエンベロープ懸濁液が処理された。
【００８３】
体重250〜400gの雄性ウィスターラット（日本クレア、東京）がペントバルビタール（50mg/kg）麻酔下、脳固定装置に設置された。頭皮の切開により頭蓋が暴露され、ブレグマから前方0.5mm、左方2.5mmの線条体（深さ5mm）に、ハミルトン型マイクロシリンジを用いて、磁気標識された細胞懸濁液0.5μL（約3,500細胞）が1μL/minの速度で注入された。注入後、逆流を防ぐため、マイクロシリンジが2分間静置された。
【００８４】
ラット脳の磁気共鳴計測、MR画像の撮影方法は実施例7に記載の方法と同様にして行った。細胞のMRIと同様に、それぞれの元データにはゼロ・フィルを加えて画像化し、最終的にマトリックス256×256の画像データを得た。
【００８５】
MRI観察後の神経幹細胞移植ラットをペントバルビタール（80mg/kg）深麻酔下、10mM リン酸緩衝液でpH7.4に調整された生理食塩水を心臓から全身に流して脱血後、4％パラホルムアルデヒド液を含む固定液で灌流固定し、速やかに脳を摘出した。摘出脳は4％パラホルムアルデヒド液を含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）に24時間浸された後、15% Sucroseと0.1%アジ化ナトリウムを含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）中に置かれた。切片標本（厚さ20μm）はドライアイス凍結後、クリオスタットにて作製され、0.3% Triton X-100を含む100mMリン酸緩衝液（pH7.4）（PBST）中に回収された。
内因性ペルオキシダーゼ活性を除去するため、切片が0.5% H2O2を含むPBSTで室温、30分間処理された。PBSTで数回洗浄後、同切片は一次抗体で4℃、一晩処理された。一次抗体として、マウス抗ネスチンモノクローナル抗体（ケミコンインターナショナル、アメリカ）が使用された。続いて二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（ニチレイ、東京）が室温で、1時間処理された。各処理後、切片はPBSTで数回洗浄された。切片標本はDAB発色液（0.02% Diaminobenzidine、0.0045% H2O2を含む）との10分間の反応により着色された。また、同切片標本は、さらにPrussian blue staining法に準じて鉄染色（カウンター染色）された。
【００８６】
ラット脳に移植された標識神経幹細胞は、T2*-強調画像により、細胞移植部位に信号強度の減少（コントラスト）として観察された。これらは、移植直後から4週間継続して観察できた。また、移植の際に脳表に比較的大きな手術創が生じると、コントラストが創へ移動する所見が観察された。
【００８７】
MRI観察後作製された移植部位周辺の脳組織標本では、抗ネスチン抗体による免疫染色とPrussian blue staining法（実施例と同様）による鉄染色の結果、ネスチン染色像と鉄染色像が一致しているのが観察された。これらネスチン陽性細胞は神経幹細胞であると想定され、両染色像の一致は磁気標識後移植された神経幹細胞の脳内での生着を示している。
【００８８】
以上より、MRIで確認された部位によく一致して磁気標識された移植細胞が確認された。このことは、不活性化HVJエンベロープで磁気標識後移植された神経幹細胞は2テスラのMRI装置で確認できることを示している。
【００８９】
不活性化HVJエンベロープによる常磁性標識剤の神経幹細胞への導入は効率が良く、導入後細胞毒性もみられない。この磁気的標識法により、生体組織内の移植細胞をMRI法にて無侵襲で追跡でき、神経幹細胞の生体内における動態を連続して観察することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の組成物は、種々の疾患の処置のために宿主、組織または器官に移植される生細胞を磁気標識することに利用される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】アストロサイトおよびPC-12細胞の鉄染色像。Prussian blue staining法によるアストロサイトの鉄染色像（a, c）、PC-12細胞の鉄染色像（b, d）。
【図２】アストロサイト細胞懸濁液のT2-強調画像とその相対強度。  各種条件で磁気標識されたアストロサイト細胞懸濁液のT2-強調画像（a）およびその相対強度の比較（b）。
【図３】PC-12細胞懸濁液のT2-強調画像とその相対強度。各種条件で磁気標識されたPC-12細胞懸濁液のT2-強調画像（a）、およびその相対強度の比較（b）。
【図４】ラット脳のＴ2＊-強調画像（磁気標識アストロサイトを移植したラット脳）。磁気標識アストロサイトを移植したラット脳の移植後1日（a）、3日（b）、9日（c）および41日（d）のＴ2＊-強調画像。
【図５】ラット脳のＴ2＊-強調画像と組織染色像（磁気標識PC-12細胞を移植したラット脳）。磁気標識PC-12細胞を移植したラット脳のＴ2＊-強調画像（a, b）と移植部位の組織標本の染色像（c, d）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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