(57)【要約】    【課題】  IPPによるPPiの加水分解経路、PGMの関与する糖代謝経路、又はサイクロフィリンとカルシニューリンが伝達するカルシウムシグナルに対して、直接かつ特異的に作用する新規タンパク質、該新規タンパク質をコードする遺伝子、並びに前記新規タンパク質を有効成分とする薬剤及び標的物質を提供すること。    【解決手段】  新規タンパク質カルフォグリン、これをコードする遺伝子、並びに前記カルフォグリンを有効成分とする薬剤及び標的物質。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a）若しくは（b）のタンパク質、下記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であって、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するその断片、又はスクリーニングよって得られる（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する類似体。
（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトカルフォグリン
（b）配列番号１のアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する組み換えタンパク質
【請求項２】
下記（a）若しくは（b）のタンパク質、下記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であって、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する断片、又はスクリーニングよって得られる（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する類似体をコードするポリヌクレオチド。
（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトカルフォグリン
（b）配列番号１のアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する組み換えタンパク質
【請求項３】
ヒトカルフォグリンをコードする配列番号２の塩基配列を有する遺伝子。
【請求項４】
請求項１記載の（a）若しくは（b）のタンパク質、断片、又は類似体を有効成分とすることを特徴とする薬剤。
【請求項５】
請求項１記載の（a）若しくは（b）のタンパク質、断片、又は類似体を有効成分とすることを特徴とする標的物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質カルフォグリン、これをコードする遺伝子、並びにこれを有効成分とする薬剤及び標的物質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの血糖変化を生じさせる治療薬には、糖尿病などの疾患に対する治療薬をはじめ多数の治療薬があるが、血糖抑制作用を持つ糖尿病薬インスリンなどの治療薬の薬理作用は糖代謝経路以外に作用して血糖抑制を行う間接的機序によるものであり、糖尿病ではその大部分において間接的機序による治療薬への感受性が低下している。そのため、現在の血糖調節薬の有用性は限られている。
【０００３】
無機ピロホスファターゼ（以下、IPPとも述べる）による無機ピロリン酸（以下、PPiとも述べる）のリン酸（２Pi）への加水分解は、細胞の核酸、蛋白、多糖合成等のPPiを放出する多くの生合成反応を進行させるために必須である。また、ホスホグルコムターゼ（以下、PGMとも述べる）は、グルコース―１―リン酸とグルコース―６―リン酸を相互転換する作用をもち細胞における糖新生系と解糖系に切り替える中心酵素であり、細菌の細胞膜の主成分である多糖の代謝酵素である。
【０００４】
それゆえ、これら酵素の阻害剤は、細菌破壊効果をもつ抗菌剤、抗生物質として用いることが可能である考えられる。また、PGMの関与する糖代謝経路に対して、直接かつ特異的に作用する物質が開発されれば、糖尿病治療薬などの血糖調節薬に加えダイエット食品など多様な応用が考えられる。加えて、IPPとPGMとを直接活性化する物質が開発されれば、該物質は、その中核的役割から多くの代謝、生合成、細胞分裂を制御する薬物開発の標的物質となり得る。
【０００５】
一方、サイクロフィリンとカルシニューリンが伝達するカルシウムシグナルはTリンパ球増殖と神経可塑変化を生じさせる細胞の中枢情報経路であり、ここを標的とした薬物に免疫抑制剤FK506とサイクロスポリンがあるが、この免疫抑制剤がもつ副作用として腎・神経への毒性と糖尿病発症作用があり、新規なカルシウムシグナル調節薬が必要とされている。          
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、IPPによるPPiの加水分解経路、PGMの関与する糖代謝経路、又はサイクロフィリンとカルシニューリンが伝達するカルシウムシグナルに対して、直接かつ特異的に作用する新規タンパク質、該新規タンパク質をコードする遺伝子、並びに前記新規タンパク質を有効成分とする薬剤及び標的物質を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる実情において、本発明者は鋭意検討を行なった結果、ヒトゲノムから予測された規定蛋白である新規タンパク質ヒトカルフォグリンが存在すること、並びに、ヒトカルフォグリンがIPPの活性化作用、PGMの活性化作用、及びカルシウムシグナルへの連動（ラット筋肉組織から調製されたミクロソームのカルシウム取り込みの促進）を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明（１）は、下記（a）若しくは（b）のタンパク質、下記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であって、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するその断片、又はスクリーニングよって得られる（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する類似体を提供するものである。
（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトカルフォグリン
（b）配列番号１のアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する組み換えタンパク質
【０００９】
また、本発明（２）は、下記（a）若しくは（b）のタンパク質、下記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であって、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する断片、又はスクリーニングよって得られる（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する類似体をコードするポリヌクレオチドを提供するものである。
（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトカルフォグリン
（b）配列番号１のアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する組み換えタンパク質
【００１０】
また、本発明（３）は、ヒトカルフォグリンをコードする配列番号２の塩基配列を有する遺伝子を提供するものである。
【００１１】
また、本発明（４）は、本発明（１）記載の（a）若しくは（b）のタンパク質、断片、又は類似体を有効成分とする薬剤を提供するものである。
【００１２】
また、本発明（５）は、本発明（１）記載の（a）若しくは（b）のタンパク質、断片、又は類似体を有効成分とする標的物質を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、IPPによるPPiの加水分解経路、PGMの関与する糖代謝経路、又はサイクロフィリンとカルシニューリンが伝達するカルシウムシグナルに対して、直接かつ特異的に作用する新規タンパク質、該新規タンパク質をコードする遺伝子、並びに前記新規タンパク質を有効成分とする薬剤及び標的物質を提供することができる。
【００１４】
本発明に係るヒトカルフォグリンは、Nagaseら（文献名; DNA Res. 7(2): 143-150, 2000）においてcDNAが解読されているように、ヒトゲノムとcDNAから予測される規定タンパク質である。カルフォグリンタンパク質は、かかる文献に記載される方法でcDNAを得て、配列番号２で表わされる塩基配列を有するそのcDNA全長を、大腸菌発現ベクターを用いて、大腸菌において発現させ、公知の方法で精製することによって所得することができる。また、組み換えタンパク質は配列番号２で表わされる塩基配列を有するそのcDNAを遺伝子組み換えすることによって得られるものであり、配列番号４で表わされる塩基配列の遺伝子を発現して得られる配列番号３のアミノ酸配列を有するマウスカルフォグリン、及び配列番号６で表わされる塩基配列の遺伝子を発現して得られる配列番号５のアミノ酸配列を有するラットカルフォグリンを例示することができる。また、類似体としては、ラット、ウサギ、牛、サルなどの哺乳動物からスクリーニングによって得られるタンパク質のみではなく、爬虫類、両性類、鳥類、植物、菌類、細菌など幅広い生物からスクリーニングによって得られるカルフォグリンに類似するタンパク質を示し、例えば、配列番号８で表わされる塩基配列の遺伝子を発現して得られる配列番号７のアミノ酸配列を有する酵母Ede1pタンパク質、配列番号１０で表わされる塩基配列の遺伝子を発現して得られる配列番号９のアミノ酸配列を有する大腸菌MukBタンパク質を挙げることができる。ここでカルフォグリンタンパク質の生物学的活性の１つとは、以下の実施例で示されるIPPの活性化、PGMの活性化、及びカルシウムシグナルへの連動の内いずれか１つを示すものである。
【００１５】
本発明に係る（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトカルフォグリン、（b）配列番号１のアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する組み換えタンパク質、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するその断片、又はスクリーニングよって得られる（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する類似体は、糖尿病治療薬などの血糖調節薬に加え、細胞代謝促進剤、抗菌剤、抗生物質、血糖調節薬、ダイエット食品用薬剤、免疫抑制剤、細胞分裂阻害剤、抗癌剤など多様な応用が考えられる。また、ヒトカルフォグリンがカルシウムシグナルと連動するため、本発明に係る前記（a）のヒトカルフォグリン、前記（b）の組み換えタンパク質、前記断片、又は前記類似体は、リン・糖代謝制御を行う薬剤開発の標的物質となることに加えて、カルシウムシグナル領域の多くの薬剤開発を促進させる標的物質として用いることができる可能性を有する。かかる標的物質は、リン代謝、糖代謝、カルシウムシグナルを作用部位とする、細胞代謝促進剤、抗菌剤、抗生物質、血糖調節薬、ダイエット食品用薬剤、免疫抑制剤、細胞分裂阻害剤、抗癌剤等の薬剤を開発するのに有効な原理を提供すると考えられる。
【００１６】
本発明に係る前記（a）のヒトカルフォグリン、前記（b）の組み換えタンパク質、前記断片、又は前記類似体を薬剤として用いる際には、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収により非経口的に、あるいは経口的に投与し得る。非経口投与のための製薬上許容可能な担体調製物としては、滅菌あるいは水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、注射可能有機エステル、例えばエチルオレエートである。閉塞用包帯用の担体は、皮膚透過性を増大し、吸収を増強するために用い得る。経口投与のための液体投薬形態は一般に、液体投薬形態を包含するリポソーム溶液を包含し得る。リポソームを懸濁するための適切な形態としては、当業界で一般に用いられている不活性希釈剤、例えば精製水を含有する乳濁液、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。不活性希釈剤の他に、このような組成物は、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、ならびに甘味剤、風味剤および香料も含有し得る。
【００１７】
本発明の薬剤がアジュバントを含有することも可能である。アジュバントは、それらの組成に基づいて、大まかにいくつかの群に分けられる。
【００１８】
これらの群としては、油アジュバント（例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント）、無機塩（例えば、AlK(SO4)2、AlNH4(SO4)、シリカ、ミョウバン、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、カオリンおよび炭素）、ポリヌクレオチド（例えばポリICおよびポリAU酸）、ならびにある種の天然物質（例えば、結核菌Mycobacterium tuberculosisからのロウD、ならびにCorynebacterium parvum、百日咳菌Bordetella pertussisおよびブルセラ族の成員に見出される物質）が挙げられる。
【００１９】
本発明の薬剤は、ヒトの他、家畜やペットなどの動物にも用いることができる。
【００２０】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００２１】
＜タンパク質の発現、大腸菌溶解液の調製、及びリン酸化反応実験＞
ヒトカルフォグリンタンパク質の全長cDNAと大腸菌PGMのcDNAとを大腸菌発現ベクターであるpDEST14ベクター、pDEST17ベクター、pET-DEST42ベクター（全てインビトロゲン社製）につないでクローンを得た。また、大腸菌IPPの全長cDNAをpCA24N ベクター(遺伝子登録番号AB052891)につないでクローンを得た。大腸菌株BL21-AI及びBL21-SI（Invitrogen社製）をこれらのクローンで形質転換し、対応する抗生物質であるアンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するLB培地とLBON培地とで選択した。これらの細胞を、中間対数増殖期に到達するまで、5mlのLB及びLBON培地中で、３７℃で激しく攪拌して増殖させた。０．２％アラビノース及び０．３ＭNaClを得られた培地に添加して、各々タンパク質の発現を誘導した。ヒトカルフォグリンcDNAを導入した大腸菌の発現誘導を２時間行った後、細胞を遠心分離によって集め、集めた細胞を再懸濁し、マイクロプローブを使用して１分間氷浴上で音波処理した。５０ｍＭのトリス塩酸、１０mM MgCl2、２０μCiの[32P]ATP、及び３０μｇの溶菌用タンパク質を含有するpH７．５のリン酸化反応用の混合物２５μｌを添加して、リン酸化反応を開始した。２５℃で６０分間インキュベーションを行った後、５μｌの6XSDSローディングバッファーによってリン酸化反応を停止し、１０μｇのリン酸化したタンパク質を１２％のゲルを用いたSDS-PAGEによって分離し、PVDFに移し、オートラジオグラフィーによって検出した。ヒトカルフォグリンcDNAを発現した大腸菌と遺伝子を組み込まれていない空のベクターを導入された大腸菌（陰性対照）の溶解液のリン酸化反応のオートラジオグラフィーの結果を図１（Ａ）に示す。さらに、ヒトカルフォグリン遺伝子を組み込まれたpBluescriptベクター（ストラタジーン社製）及び遺伝子を組み込まれていない空のベクターを導入された大腸菌を、別々にアンピシリンを含有するLB培地で培養した。培養の結果を図１（Ｃ）に示す。図2（B）と図3（B）で用いられたPGMプラスミド並びにIPPプラスミドによる二重形質転換体の大腸菌は、アンピシリンとクロラムフェニコールを含む培地で選択した。
【００２２】
＜タンパク質の精製、ウエスタンブロット、及び抗体の生産＞
４００ｍｌの培地に対してタンパク発現を誘導した後、細胞を遠心分離によって集め、ペレット状物を氷と同程度の温度の、２０mMNa2HPO4-NaH2PO4、０．５M NaCl、及び１０mMのイミダゾールを含有するpH７．４の溶液１０ｍｌに再懸濁した。細胞の懸濁液は、氷浴上でマイクロプローブを用いて４０分間超音波処理した。細胞の溶解液は、４℃で１５分間１２０００Xgで遠心分離した。上清を集め、０．４５μｍフィルターで濾過し、細胞の破片を除去した。濾過した上清からえられた発現された(His)6で標識されたタンパク質（ヒトカルフォグリン、PGM、PGM及びIPP）を固定化ニッケルカラム（アマーシャム社製、製造番号１７−１８８０−０１）、及びPD-10脱塩カラム（アマーシャム社製）を用いて、製造者の示した精製方法に従って、アフィニティクロマトグラフィー法で精製した。精製したタンパク質３μｇを電気泳動によって泳動し、該タンパク質をCBB染色して検出した。結果を図２（Ａ）、図２（Ｂ）に示す。抗V5抗体（インビトロゲン社製）及び抗カルフォグリンタンパク質抗体（精製したヒトカルフォグリンタンパク質を用いて作成したもの）を用いたウエスタンブロット法による抗原の検出は、インビトロゲン社の示した抗原の検出方法に従って以下の条件で行われた。V5エピトープを有する組み換えヒトカルフォグリン及びヒト小脳のヒトカルフォグリンを用いて、抗V5抗体は１：７０００の希釈物を用いて、抗カルフォグリンタンパク質抗体（全長の組み換えタンパク質に対する抗カルフォグリンウサギポリクローナル抗血清から作成）は、１：４０００の希釈物として用いて行った。ウエスタンブロット法の結果を図２（Ａ）に示す。さらに、V5エピトープを有する組み換えカルフォグリンタンパク質３０μｇを、３００μCi [32P]ATP及びラット小脳の破砕均一溶液３００μｇを含む溶液２５０μｌによってリン酸化し、リン酸化した溶液２００μｌをニッケルカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法で精製した。精製前の反応液並びに精製したカルフォグリンタンパク質を、前記リン酸化反応実験と同様にオートラジオグラフィーを行うか、あるいは前記ウエスタンブロット法実験を同様に行って検出した。結果を図１（Ｂ）に示す。
【００２３】
＜PGM活性測定＞
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びNADP+の還元と共役させた活性測定を行った。２０mM Tris-HCl、１０mM MgCl2、１mM グルコース−１−リン酸、０．２５mM NADP+、及び０．１mM グルコース−１，６−ジリン酸を含有しpH７．５である反応混合物を調製した。反応は、所定の量（例えば５μｇ）の細胞溶解液又は所定の量（例えば０．１５μｇ）の精製したPGMに、１ユニットのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを添加して開始した。NADP+の還元反応は、分光光度計で３４０ｎｍの吸光度を計ることにより３０秒毎に２０分間測定した。独立した実験を３回行って平均値を採用した。ヒトカルフォグリンを発現した大腸菌溶解液のPGM活性上昇の測定結果を、図３（Ａ）に示す。さらに、PGM を単独で発現させた大腸菌、又はIPP及びPGMをともに発現させた大腸菌によって所得される精製されたPGM 又はIPP及びPGM を用いて、PPiの存在下及び不存在下で同様にPGM活性測定を行った。結果を図３（Ｂ）に示す。
【００２４】
＜IPP活性測定及び細胞性リン酸の総量＞
２０mM Tris-HCl、１０mM MgSO4、６０mM KCl、２mM PPi、及び所定の量のIPP又は細胞溶解液を含有するpH８．０である反応混合物０．１mlを調製した。５０mM PPi４μｌを添加して反応を開始した。３０℃で３０分間温置した後、１Mクエン酸４μｌを添加して反応を停止した。PPiの加水分解速度を決定するために、Heinonenらの方法（Anal Biochem 113(2), 313-317）によりPiの放出速度を比色法によって測定した。PPiを加える前にクエン酸を加えた反応混合物をブランクテストに用いた。ヒトカルフォグリンによるIPPの活性化実験は、酵母及び大腸菌（共にSigma社製）からそれぞれ精製されたIPPタンパク質３０ngを、アフィニティークロマトグラフィー法によって精製されたヒトカルフォグリン３００ngとともに２５℃で１０分間温置して、その後、IPP活性測定を３０分間行った。４回の独立した実験を行って平均値を採用した。このIPP活性測定の結果を図４（Ａ）に示す。また、ヒトカルフォグリンのcDNAを導入した大腸菌細胞の溶解液を用いて、３回の独立した実験を行って平均値を採用した。このIPP活性測定の結果を図４（Ｂ）に示す。Ca2+によるIPPの阻害実験では、１０mM MgSO4の代わりに２mM MgSO4を含有する反応混合物を用いた。４回の独立した実験を行って平均値を採用した。カルシウムイオンCa2+のよるIPPの阻害実験の結果を、図５（Ａ）に示す。細胞性リン酸を全て抽出するために、マイクロ遠心チューブにおいてヒトカルフォグリンを発現させた大腸菌を培養した培地のペレット状の乾燥物に１．２mlの１M HCl溶液を添加し、該チューブを回転装置によって回転させながら温置した。２４時間後におのおのの試料を短時間遠心分離し、それから、上清のリン酸の濃度を測定して、リン酸の総量を求めた。細胞性リン酸の総量を図６（Ａ）に示す。
【００２５】
＜ラットの可溶性タンパク画分の所得＞
可溶性タンパク画分を調製するために、ラットの骨格筋５ｇを切刻み、次いで２５mM Tris-HCl、１３７mM NaCl、２．７mM KClを含有し、pH7.5である溶液５０mlを冷却した。切刻まれた筋肉は、５分間ホモジェナイザーによる均一化する操作を３回行った。得られた均一化物を５０００Xgで１０分間４℃で遠心分離した。上清を取り出し、さらに１２０００Xgで１０分間遠心分離し、上清から得られたタンパク質２５μｇ及び８５μｇをそれぞれPGM及びIPPの活性測定に用いた。いずれも３回の独立した実験を行い平均値を採用した。ヒトカルフォグリンの添加量は共に０．３μｇとした。PGM及びIPPの活性測定の結果を図６（Ｂ）及び図５（Ｂ）に示す。
【００２６】
＜RT-PCR＞
配列番号１１及び１２のプライマーを用いてマウスカルフォグリンのmRNAを用いたRT-PCR法を行い、配列番号１３及び１４のプライマーを用いてPGMのmRNAを用いたRT-PCR法を行った。各々の臓器のcDNA５ngを鋳型として用いた。増幅は、以下の条件で行った。変性は９４℃で１分間行い、変性を９４℃で４５秒行い、アニーリングを６８℃で１分間行い、７２℃で１分間のプライマーによる相補鎖合成を３０サイクル行い、最終相補鎖合成を７２℃で５分間行った。増幅した後、反応混合物に対して１．２％アガロース／エチジウムブロミドゲルによる電気泳動を行った。マウスカルフォグリン及びPGMのRT-PCR法による産物は７３８ｂｐ及び８８６ｂｐであった。結果を図７に示す。
【００２７】
＜インシトゥハイブリダイゼーション＞
インシトゥハイブリダイゼーションの実験は、Ingiら（Eur J Neurosci 15(5), 929-936, 2002）の方法に従って行った。新たに切断されたマウスの脳組織をドライアイス／エタノール上に配置したプラスチック容器内にて冷凍した。冷凍した厚さ１０μｍのスライス断片を、ゲラチンで被覆したガラス製スライド上に貼り付けた。ハイブリダイゼーションを行う前に、前記断片を、新たに調製された、４％の解重合されたパラフォルムアルデヒドで固定し、次にpH８．０に調製された０．９％塩化ナトリウム水溶液に溶解した０．１Mトリエタノールアミン中で０．５％無水酢酸によってアセチル化し、脱脂した。ハイブリダイゼーションは、密閉された飽和湿度の小箱内に置かれた各々の組織スライド上に、５０％ホルムアルデヒド、１０mMヂチオトレイトール、６００mM NaCl、１X Denhards、１mM EDTA、０．２mg/mlの酵母tRNA、及び１０％デキストランを含有するハイブリダイゼーションバッファー１００μｌ中に１×１０６cpmのプローブを入れて載せ、カバーガラスを被せた状態で５６℃で行った。一晩インキュベーションを行った後、スライドを２XSSC（１XSSCは、１５０mM NaCl、１５mM クエン酸ナトリウムを含有し、pH ７．０に調整されている）で３７℃にて洗浄し、１０μｇ／ｍｌのRNase A含有する２XSSCで処理し、さらに２XSSCで三回洗浄した。洗浄後、断片を３０％エタノール、７０％エタノール、９５％エタノールに逐次浸漬し、空気乾燥して、Bio Max MR フィルム（コダック社製）に室温で７〜１４日間暴露した。35Sで標識したRNAプローブは、pBluescriptベクターに組み込まれたカルフォグリンcDNAからMAXIscript（Ambion社製）の方法に従って、[35S]UTP及びT7 RNA ポリメラーゼ又はT3 RNA ポリメラーゼを用いて合成されたアンチセンスcRNA転写物として調製された。合成されたRNAプローブは、Sephadex G50 カラム（アマーシャム社製）を用いて精製した。インシトゥハイブリダイゼーション実験は、非特異的染色を見分ける目的から１００倍量の標識されていないRNAプローブの存在下及び非存在下で行われた。結果を図８に示す。
【００２８】
＜トゥーハイブリッド法の実験＞
トゥーハイブリッド法の実験は、Cagneyら（Methods Enzymol 328,3-14, 2000）の方法をいくらか修正した方法により行った。DNA-結合ドメインベクターpOBD2、及びGal4活性化ドメインベクターpOADを実験に用いた。Gal4活性化ドメインに結合した28個の酵母遺伝子を含有しそれぞれの融合蛋白を発現する酵母株PJ69-4aが、相互作用するタンパク質を選別するために用いられた。各々の酵母遺伝子を含む28個のPJ69-4aへpOBD2-ヒトカルフォグリン（又はpOBD2-大腸菌PGM）を導入する方法は、S.c.EasyComp 形質転換キット（Invitrogen社製）に示された指示に従って行われた。酵母の懸濁液は、トリプトファンとロイシンを含まない合成のプレート上に播かれ、３０℃で７日間温置した。コロニーが生育した後、コロニーを取り出し、次いで３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含み、トリプトファン、ロイシン、及びヒスチジンを含まない合成のプレート上に播き直しトゥーハイブリッド活性を検出した。それぞれ１００mM及び３mMの３−アミノ−１，２，４−トリアゾール濃度をカルフォグリン及びPGMを選別するために用いた。プレートは、選別するための条件の下で３０℃で７〜２１日経た後、形質転換体の生育能力を記録した。遺伝子の組み込まれていない空のpOBD2ベクターを含む形質転換体、あるいはpOBD2-calphoglin（又は大腸菌pgm）のみを持ち酵母遺伝子を含まない形質転換体を各々のトゥーハイブリッド測定実験において陰性対照として用いた。トゥーハイブリッド測定実験の結果を図９に示す。図９において、A行１列及びa行１列はcmd１タンパク質を、A行２列及びa行２列はcmk２タンパク質を、A行３列及びa行３列はcmp２タンパク質を、A行４列及びa行４列はcph１タンパク質を、A行５列及びa行５列はcof１タンパク質を、A行６列及びa行６列はnuf１タンパク質を、B行１列及びb行１列はmyo２タンパク質を、B行２列及びb行２列はmyo３タンパク質を、B行３列及びb行３列はmyo４タンパク質を、B行４列及びb行４列はmyo５タンパク質を、B行５列及びb行５列はpgm２タンパク質を、B行６列及びb行６列はils１タンパク質を、C行１列及びc行１列はvas１タンパク質を、C行２列及びc行２列はhyp２タンパク質を、C行３列及びc行３列はipp１タンパク質を、C行４列及びc行４列はynk１タンパク質を、C行５列及びc行５列はpst２タンパク質を、C行６列及びc行６列はsod１タンパク質を、D行１列及びd行１列はuba１タンパク質を、D行２列及びd行２列はvps１３タンパク質を、D行３列及びd行３列はshe４タンパク質を、D行４列及びd行４列はhch１タンパク質を、D行５列及びd行５列はhul５タンパク質を、D行６列及びd行６列はmlc１タンパク質を、E行１列及びe行１列はuso１タンパク質を、E行２列及びe行２列はmyo１タンパク質を、E行３列及びe行３列はrad５０タンパク質を、E行４列及びe行４列はpgm１タンパク質を、それぞれGal4活性化ドメインに融合した酵母タンパク質として発現される場合のトゥーハイブリッド測定の結果を示すものである。
【００２９】
＜45Ca2+結合実験＞
ヒトカルフォグリン、大腸菌IPP（シグマ社製）、酵母IPP（シグマ社製）、及びウサギPGMの精製タンパクを用いて、Maruyamaら（J. Biochem(Tokyo) 95(2),511-519, 1984）の方法に従って、45Ca2+結合実験を行った。これらのタンパク質３０μｇは１２％ゲルを用いたSDS-PAGEによって分離し、Protran  ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell社製)に移した。その後、１０mMイミダゾール-塩酸、６０mM KCl、5mM MgCl2を含みpH６．８の溶液に膜を浸した。その後、膜を45Ca2+を１μCi/ml含む前記溶液と同じ組成の緩衝液に２５℃で１０分間温置した。蒸留水で５分間膜をすすぎ、その後空気乾燥し、X-OMATフィルム（コダック社製）に室温で１〜５日間暴露して現像した。45Ca2+結合実験の結果を図１０（Ａ）に示す。
【００３０】
＜45Ca2+取込実験＞
ミクロソームの画分を、Eletrら（Biochim Biophys Acta 282(1),174-179, 1972）の方法に従って、ラット筋肉組織から調製した。２５μｇマイクロソーム、３μｇのヒトカルフォグリン、及び０．３μｇの酵母IPPを、２０mM MOPS、１００mM KCl、２０mM NaCl、５mM MgCl2、３mM ATP、５mM NaN3、２mM PPi ２０μM CaCl2、１．２μCi 45CaCl2 を含みpH７．２の溶液１ml中で３７℃で温置した。所定の時間後に、マイクロソームによって蓄積された45Ca2+量をFulceriら（Biochem J 289(Pt 1), 299-306, 1993）の方法による迅速濾過法により測定し、45Ca2+取込量を求めた。３回の独立した実験を行って平均値を採用した。45Ca2+取込実験の結果を図１０（Ｂ）に示す。
【００３１】
図２（Ａ）の左段及び中段において検出された、大腸菌でcDNAから発現された組み換えカルフォグリンの分子量８０kdと同じ８０kdの位置に、図２（Ａ）の右段においてヒト小脳に存在するヒトカルフォグリンが検出された。図１（Ｃ）に示すように、カルフォグリンには、大腸菌の生育を阻害する作用があり、抗菌剤、抗生物質として利用できる可能性があることがわかった。
【００３２】
図９におけるトゥーハイブリッド法の結果から、ヒトカルフォグリンと酵母IPPとが相互作用すること、及び大腸菌PGMと酵母IPPとが相互作用することが示されており、ヒトカルフォグリンと酵母のIPPと大腸菌PGMとが複合体を形成することが示唆された。かかる３つの異なる生物蛋白の会合は、この情報伝達経路が、生物進化過程で驚くべき保存性を有したことを示すと同時に、広範な現存種の細胞に普遍的に備わる機能であることを示唆している。
【００３３】
図４（Ａ）の結果から、精製したヒトカルフォグリンの添加によりIPPの活性が、酵母及び大腸菌でそれぞれ２．８倍及び２．３倍に向上しており、ヒトカルフォグリンが、酵母IPP及び大腸菌IPPを活性化することがわかった。また、図４（Ｂ）の結果から、ヒトカルフォグリン遺伝子を発現させた大腸菌の溶解液を用いた場合において、カルフォグリンを発現していない大腸菌に比べIPPの活性が２．５倍に向上しており、ヒトカルフォグリンが、酵母／大腸菌IPPを活性化することがわかった。図６（Ａ）において、図４（Ｂ）の結果を与えたヒトカルフォグリン遺伝子を発現させた大腸菌の溶解液において、細胞内Pi濃度が１．７倍になっており、ヒトカルフォグリンによる酵母／大腸菌IPPの活性化と整合する結果が得られた。また、図５（Ｂ）の結果から、ラット骨格筋の可溶蛋白分画へ精製ヒトカルフォグリンを加えた生理的哺乳動物蛋白群を用いた場合においてIPPの活性が２．０倍に向上しており、ヒトカルフォグリンが、酵母／大腸菌IPPを活性化することがわかった。
【００３４】
図３（Ｂ）の結果から、大腸菌でPGMを単独発現させた場合のPGM酵素活性と、IPPとPGMを共に発現させて精製したタンパク質を用いた場合のPGM酵素活性を、比較すると、IPPとPGMを共に発現させて精製したタンパク質を用いた場合の方が、PPiの濃度が向上していくにつれて、PGMの活性が向上していくことがわかった。このことは、PPiの濃度が向上してIPP が活性化されることにより、PGMの活性が向上していくことを示しており、ヒトカルフォグリンによるIPP の活性化を通じて、PGMの活性化が起こることを示している。なお、図２（Ｂ）は、PGM を単独で発現させた大腸菌、並びにIPP及びPGMをともに発現させた大腸菌において、それぞれ、PGM並びにIPP及びPGMが発現していることをCBBにより確認したものである。
【００３５】
ヒトカルフォグリンが最終的にPGMを活性化することを２つの所見から示した。（１）図１（Ａ）から、ヒトカルフォグリン遺伝子又は組み換えヒトカルフォグリン遺伝子を大腸菌細胞で発現させることにより、PGM に由来する５５ｋｄのシグナル強度が増大することから、ヒトカルフォグリンが、PGMのリン酸化を促進することがわかった。図３（Ａ）に示すように、ヒトカルフォグリン遺伝子を大腸菌細胞で発現させることにより大腸菌におけるPGMの酵素活性が増大することから、ヒトカルフォグリンが、PGMのリン酸化を促進することを通じて、PGMを活性化すると考えられる。
（２）図６（Ｂ）から、ラット骨格筋の可溶蛋白分画へ精製ヒトカルフォグリンを加えた生理的哺乳動物蛋白群系においてPGMの活性が増大することから、ヒトカルフォグリンが、PGMを活性化することがわかった。
【００３６】
ヒトカルフォグリンとカルシウムシグナルの連動が以下の４つの所見から示唆された。
（１）下表１に記載される酵母の全細胞内蛋白質複合体の解析データから抽出した１つのカルシウムシグナル蛋白群（以下の２６蛋白質から構成）がカルフォグリン類似体を含んでいたことが判明した。なお、表１は、全ての酵母タンパク質を網羅した酵母タンパク質複合体のデータベースとしてGavinら（Nature 415(6868)，p141-147）及びHoら（Nature 415(6868)，p180-183）のデータベースを用い、プローブとしてはPGMを用いて、PGMを含む酵母蛋白群１４群を抽出して、これらのなかから、カルフォグリン類似体を含有する酵母蛋白群１群を抽出した結果である。
（２）図１０（Ａ）の結果から、３５ｋｄの分子量を有するヒトカルフォグリンC末端部分蛋白（約１μｇ）、並びに大腸菌IPP及び酵母IPPの精製蛋白が45Ca2+と結合することがわかった。
（３）図５（Ａ）の結果から、大腸菌IPP及び酵母IPPの活性を、Ca2+が抑制すること、ヒトカルフォグリンによって大腸菌IPP及び酵母IPPの活性が向上することがわかった。なお、図１（Ｂ）に示すように、右段に示す抗V5抗体を用いたウエスタンブロット法による検出結果と同様に、３５ｋｄのヒトカルフォグリンC末端部分タンパク質がヒト小脳蛋白によってリン酸化されて強いシグナルを示すことから、図１０（Ａ）の結果と併せて、かかるヒトカルフォグリンC末端部分タンパク質が、Ca2+存在下のカルフォグリンとIPPの活性を制御する可能性があることが示唆された。
（４）図１０（Ｂ）の結果から、ヒトカルフォグリンが、ラット骨格筋小胞体のCa2+取り込みを促進することがわかった。
【００３７】
【表１】
2005168338.tif 000002
【００３８】
図７に示すように、なお、マウスカルフォグリンのmRNAを用いたRT-PCR法及びPGMのmRNAを用いたRT-PCR法により、マウスの脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、骨格筋、精巣、卵巣、小腸、胚にマウスカルフォグリン及びPGMが存在していることがわかった。図８に示すように、マウスカルフォグリンは、マウスの脳において、特に海馬のニューロン及び小脳顆粒細胞に高濃度で存在することがわかった。非標識プローブが高濃度だと全体の染色が消失するため、マウスカルフォグリンｍＲＮＡはマウスの脳に満遍なく存在していると考えられる。
【００３９】
ヒトカルフォグリンが直接にIPPを活性化する機構は、PPi分解を介して多くの生合成反応を亢進させて細胞全体の代謝を活性化する方法を示しており、ヒトカルフォグリンを標的物質とすることにより、細胞の中核となる代謝機能に直接作用するため特効性を有した薬物の開発につながる可能性がある。ヒトカルフォグリンが複合体を介してPGM活性を増加させる機構は細胞のリン・糖代謝を支配する作用部位とその薬物モデルを提供する。このヒトカルフォグリンによるPGM活性化の機構は、細胞に普遍的に存在するリン・糖代謝の制御中枢機構であり、核酸、蛋白、多糖等の広範囲な合成を支配する薬剤又は薬剤を開発するための標的物質となり得るものである。ヒトカルフォグリンは細胞内でIPPとPGMというリン代謝、糖代謝を支配する２つの中核酵素と次のように機能複合体を形成していると考えられる。まず、ヒトカルフォグリンがIPPと複合体を形成し、次にヒトカルフォグリンとIPPとの複合体がPGMとの複合体を形成する。このような複合体形成、及びIPPとPGMとの活性化の機構を図１１に示す。このヒトカルフォグリン−IPP−PGM複合体は、生体におけるリン・糖代謝の制御と細胞活性化に直接的かつ最も効果的な原理を示すものと言える。さらに、実施例から、ヒトカルフォグリンがカルシウムシグナルと連動する機構が、細胞内におけるカルシウムシグナル蛋白群との局在（表１）、Ca2+結合とそれによる調節（図１０（Ａ）と図５（Ａ））、小胞体のCa2+取り込み促進（図１０（Ｂ））、の３点から示された。ヒトカルフォグリンはリン・糖代謝制御と連動してカルシウムシグナル領域の多くの薬物開発を促進させる可能性を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１（Ａ）】ヒトカルフォグリンの全長cDNAを発現した大腸菌の溶解液のリン酸化反応のオートラジオグラフィーの結果を示す図である。
【図１（Ｂ）】V5エピトープを有する組み換えヒトカルフォグリンをヒト小脳蛋白の作用によりリン酸化して得られたリン酸化反応液を用いたオートラジオグラフィー及びウエスタンブロット法による検出結果を示す図である。
【図１（Ｃ）】遺伝子を組み込まれていない空のベクターを導入した大腸菌と、ヒトカルフォグリン遺伝子を組み込まれたpBluescriptベクターを導入した大腸菌とを、別々に培養した結果を示す図である。
【図２（Ａ）】V5エピトープを有するヒトカルフォグリンをCBB染色とウエスタンブロット法によって検出した結果及びヒト小脳のカルフォグリンのウエスタンブロット法による検出結果を示す図である。
【図２（Ｂ）】精製したPGMあるいは精製したPGMとIPPを電気泳動によって泳動し、CBB染色して検出した結果を示す図である。
【図３（Ａ）】ヒトカルフォグリンを発現した大腸菌と発現していない大腸菌の溶解液を用いてPGM活性測定を行った結果を示す図である。
【図３（Ｂ）】PGM を単独で発現させた大腸菌、又はIPP及びPGMをともに発現させた大腸菌によって所得される精製されたPGM 又はIPP及びPGM を用いて、PPiの存在下及び不存在下でPGM活性測定を行った結果を示す図である。
【図４（Ａ）】酵母IPP及び大腸菌IPPと、精製されたヒトカルフォグリン３００ngとを用いてIPP活性測定を行った結果を示す図である。
【図４（Ｂ）】ヒトカルフォグリンのcDNAを導入した大腸菌の溶解液を用いたIPP活性測定の結果を示す図である。
【図５（Ａ）】Ca2+によるIPPの阻害実験の結果を示す図である。
【図５（Ｂ）】ラットの可溶性タンパク画分を用いたIPP活性測定の結果を示す図である。
【図６（Ａ）】ヒトカルフォグリンを発現させた大腸菌における細胞内リン酸の総量を示す図である。
【図６（Ｂ）】ラットの可溶性タンパク画分を用いたPGM活性測定の結果を示す図である。
【図７】マウスの各々の臓器のｍＲＮＡを用いたRT-PCR法の産物を電気泳動で分離した結果を示す図である。
【図８】ラットの脳組織を用いたインシトゥハイブリダイゼーション実験の結果を示す図である。
【図９】ベイト蛋白としてヒトカルフォグリンと大腸菌PGMを、プレイ蛋白としてIPPを含む酵母カルシウムシグナル蛋白群を用いたトゥーハイブリッド測定実験の結果を示す図である。
【図１０（Ａ）】ヒトカルフォグリン、大腸菌IPP、酵母IPP、及びウサギPGMを用いた45Ca2+結合実験の結果を示す図である。
【図１０（Ｂ）】ヒトカルフォグリン及び酵母IPPを用いたラット筋肉組織から調製されたミクロソームの45Ca2+取り込み実験の結果を示す図である。
【図１１】ヒトカルフォグリンがIPPを活性化し、次にヒトカルフォグリンによるIPP活性化がPGMを活性化する機構を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
配列番号１及び２は、ヒトカルフォグリンのアミノ酸配列及びcDNAの塩基配列を示し、配列番号３及び４は、マウスカルフォグリンのアミノ酸配列及びcDNAの塩基配列を示し、配列番号５及び６は、ラットカルフォグリンのアミノ酸配列及びcDNAの塩基配列を示し、配列番号７及び８は、酵母Ede1pタンパク質のアミノ酸配列及びcDNAの塩基配列を示し、配列番号９及び１０は、大腸菌MukBタンパク質のアミノ酸配列及びcDNAの塩基配列を示し、配列番号１１〜１４はプライマーの塩基配列を示す。
【図１（Ａ）】
2005168338.tif 000003
【図１（Ｂ）】
2005168338.tif 000004
【図２（Ａ）】
2005168338.tif 000005
【図２（Ｂ）】
2005168338.tif 000006
【図８】
2005168338.tif 000007
【図９】
2005168338.tif 000008
【図１（Ｃ）】
2005168338.tif 000009
【図３（Ａ）】
2005168338.tif 000010
【図３（Ｂ）】
2005168338.tif 000011
【図４（Ａ）】
2005168338.tif 000012
【図４（Ｂ）】
2005168338.tif 000013
【図５（Ａ）】
2005168338.tif 000014
【図５（Ｂ）】
2005168338.tif 000015
【図６（Ａ）】
2005168338.tif 000016
【図６（Ｂ）】
2005168338.tif 000017
【図７】
2005168338.tif 000018
【図１０（Ａ）】
2005168338.tif 000019
【図１０（Ｂ）】
2005168338.tif 000020
【図１１】
2005168338.tif 000021
【配列表】
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