(57)【要約】【課題】  生体でのペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを再現する系を構築する。【解決手段】  (a)ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを発生ないし増強させようとするターゲット細胞を用意し、次いで(b)前記細胞に２型又は３型リアノジン受容体遺伝子を機能発現可能な状態で導入することにより、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞を得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を備え、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞：
(a)イノシトール三リン酸受容体を発現している；及び
(b)人為的な操作の結果として２型又は３型リアノジン受容体を発現している。
【請求項２】
前記人為的な操作が２型又は３型リアノジン受容体遺伝子の導入である、請求項１に記載のペースメーカー細胞。
【請求項３】
HEK293、COS細胞、及びCHO細胞からなる群より選択される細胞に由来する、請求項１又は２に記載のペースメーカー細胞。
【請求項４】
ペースメーカー活動を行なう組織又は臓器から採取された細胞に由来する、請求項１又は２に記載のペースメーカー細胞。
【請求項５】
以下の各ステップを含む、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞の調製方法：
(a)ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを発生ないし増強させようとするターゲット細胞を用意するステップ；
(b)前記細胞に２型又は３型リアノジン受容体遺伝子を機能発現可能な状態で導入するステップ。
【請求項６】
以下の各ステップを含む、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞の調製方法：
(a)ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずる細胞を含むと予想される細胞集団を用意するステップ；
(b)前記細胞集団の中から２型又は３型リアノジン受容体を発現している、又は発現可能な細胞を選択するステップ。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のペースメーカー細胞を含む、移植用材料。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のペースメーカー細胞を含む、ペースメーカー装置。
【請求項９】
以下のステップを含む、ペースメーキングに作用する化合物のスクリーニング方法：
(a)請求項１〜４のいずれかのペースメーカー細胞を含む溶液に被験物質を添加するステップ；
(b)所定時間経過後にペースメーカー細胞のペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーション量を測定するステップ。
【請求項１０】
以下のステップを含む、ペースメーキングに作用する化合物のスクリーニング方法：
(a)請求項１〜４のいずれかのペースメーカー細胞を含む溶液に被験物質を添加するステップ；
(b1)所定時間経過後にペースメーカー細胞における２型又は３型リアノジン受容体の発現量を測定するステップ。
【請求項１１】
以下のステップを含む、細胞のペースメーカー活動を測定する方法：
(a)被験細胞において２型又は３型リアノジン受容体の発現量を測定するステップ；
(b)ステップ(a)で求めた測定量と基準発現量とを比較するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は胃・腸管等においてペースメーキングに関与するペースメーカー細胞及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃・腸管における自発性リズム形成のメカニズムは、その重要性にも拘らず、未だ解明されていない部分が多く、十分に理解されるには至っていない。心臓の鼓動と同じように、内容物を混ぜ、消化し、運ぶという、胃・腸管の自発性運動は腸管内腔の本質的な機能である。最近の研究から、このような機能を発揮するために、心臓と類似の特殊なペースメーカー細胞が胃・腸管壁に存在し、平滑筋細胞を駆動するものと考えられている（非特許文献３４）。胃・腸管壁に存在するペースメーカー細胞は、特殊なtyrosineキナーゼであるc-Kitを発現し、Cajal 間質細胞(ICCs)として組織学的に特徴付けられている。
L型Ca2+チャネルが平滑筋の興奮収縮連関の中心的な役割を演じる（非特許文献１、２４）。一方、スローウェーブ（緩徐波、即ち腸管における自発性電気活動波）の電気ペースメーカー活動はジヒドロピリジン（dihydropyridine：DHP）感受性 L型Ca2+チャネルブロッカーにほとんど影響されない。この事実は他のCa2+ソースが胃腸のペースメーカー活動に重要な役割を果たしていることを示唆する。いくつかの研究グループがICCsにおけるCa2+活性化Cl-チャネルが電気的ペースメーカー活動に関与することを示唆した（非特許文献３７、６、１０）。このことから、細胞内Ca2+ストアーからのCa2+放出による細胞質内のCa2+オシレーションがおそらく第一義のペースメーカー活動であると推論される。このような推定メカニズムは一方で、ペースメーカー活動（周波数）の低い電圧感受性を説明する。
細胞内のCa2+遊離チャネルは大きく２つのファミリー、即ちイノシトール三リン酸（inositol 1,4,5-trisphosphate：InsP3)受容体（１型ないし３型）及びリアノジン（ryanodine）受容体（１型ないし３型）に分類される。InsP3 受容体(以下、「IP3R」ともいう) に関しては既に、胃腸管のペースメーカー細胞の自発性電気活動に関係していることが実験的に示されているが（非特許文献３５、８、２０、３３）、リアノジン受容体(以下、「RyR」ともいう)ファミリーの関与については明らかではない。
【０００３】
【非特許文献１】Beech, D.J. and, D. McHugh. 1996. Regulation of opening ofvoltage-gated Ca channels in smooth muscle cells. In Smooth Muscle Excitation. Bolton, T.B. and Tomita, T. editors pp., AcademicPress/London, pp39-54.
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【非特許文献４５】Yang, D., Pan, Z.,Takeshima, H., Wi, C., Nagaraj, R.Y., Ma, J. and Cheng, H. 2001. RyR3 amplifiesRyR1-mediated Ca2+-induced Ca2+ release in neonatalmammalian skeletal muscle. J. Biol. Chem. 276, 40210-40214.
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は以上の背景の下なされたものであって、細胞内Ca2+オシレーションにおけるリアノジン受容体の関与を明らかにすることによって生体でのペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを再現する系を構築すること、及びそれを利用して胃・腸管等のペースメーカー異常等に対する薬剤のスクリーニング法や治療法等の確立を図ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために本発明者らはまずICCにおける細胞内Ca2+オシレーションについてその機構を解明することを試みた。その結果、マウス回腸から作製した細胞小塊を用いた実験によって、細胞内ストアからの周期的Ca2+放出が、ICCにおける細胞内Ca2+オシレーションを形成するということが実験的に示された。即ち、ICCのペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションは、平滑筋細胞のCa2+活動（L型Ca2+チャネル）を抑制するジヒドロピリジンCa2+拮抗薬存在下でも保存されるが、リアノジン受容体(RyR)またはIP3受容体(IP3R)へ影響する薬剤の添加によって、比較的低濃度の場合であってもICCのペースメーカー的Ca2+オシレーションが停止した。この結果を得た後、リアノジン受容体の発現状態を確認すべくICCを抗リアノジン受容体抗体で免疫染色したところ高い染色性が認められた。つまり、ICCではリアノジン受容体が大量に発現していることが確認された。一方でRT-PCRによる解析によって、ICCでは主に３型リアノジン受容体（RyR3）が発現していることが判明した。以上の結果を受け本発明者らは、RyR3がCa2+オシレーションに重要な役割を果たす分子であるとの仮説を立て、それを実証すべくさらに検討を重ねた。その結果、IP3Rを発現するHEK293細胞にRyR3遺伝子を導入することによって、HEK293細胞にペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションの発生をもたらすことが示された。注目すべきことに、その再構築されたHEK293細胞の細胞内Ca2+オシレーションは、ICCに見られるものと本質的に同等の薬学的性質を有していた。以上の結果は、ICCでのペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションにおけるRyR3の機能的役割を支持するものであり、つまりRyR3はIP3Rと協同してペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを発生ないし修飾する重要な分子（key molecule）であるとの知見が得られた。また、RyR3遺伝子の代わりに２型リアノジン受容体（RyR2）遺伝子をHEK293細胞内で機能発現させた場合にも同様のペースメーカー的細胞内Ca2＋オシレーションの発生が観察された。
【０００６】
本発明は以上の知見に基づくものであって、以下の各構成を提供する。
[１]  以下の特徴を備え、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞：
(a)イノシトール三リン酸受容体を発現している；及び
(b)人為的な操作の結果として２型又は３型リアノジン受容体を発現している。
[２]  前記人為的な操作が２型又は３型リアノジン受容体遺伝子の導入である、[１]に記載のペースメーカー細胞。
[３]  HEK293、COS細胞、及びCHO細胞からなる群より選択される細胞に由来する、[１]又は[２]に記載のペースメーカー細胞。
[４]  ペースメーカー活動を行なう組織又は臓器から採取された細胞に由来する、[１]又は[２]に記載のペースメーカー細胞。
[５]  以下の各ステップを含む、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞の調製方法：
(a)ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを発生ないし増強させようとするターゲット細胞を用意するステップ；
(b)前記細胞に２型又は３型リアノジン受容体遺伝子を機能発現可能な状態で導入するステップ。
[６]  以下の各ステップを含む、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞の調製方法：
(a)ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずる細胞を含むと予想される細胞集団を用意するステップ；
(b)前記細胞集団の中から２型又は３型リアノジン受容体を発現している、又は発現可能な細胞を選択するステップ。
[７]  [１]〜[４]のいずれかに記載のペースメーカー細胞を含む、移植用材料。
[８]  [１]〜[４]のいずれかに記載のペースメーカー細胞を含む、ペースメーカー装置。
[９]  以下のステップを含む、ペースメーキングに作用する化合物のスクリーニング方法：
(a)[１]〜[４]のいずれかのペースメーカー細胞を含む溶液に被験物質を添加するステップ；
(b)所定時間経過後にペースメーカー細胞のペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーション量を測定するステップ。
[１０]  以下のステップを含む、ペースメーキングに作用する化合物のスクリーニング方法：
(a)[１]〜[４]のいずれかのペースメーカー細胞を含む溶液に被験物質を添加するステップ；
(b1)所定時間経過後にペースメーカー細胞における２型又は３型リアノジン受容体の発現量を測定するステップ。
[１１]  以下のステップを含む、細胞のペースメーカー活動を測定する方法：
(a)被験細胞において２型又は３型リアノジン受容体の発現量を測定するステップ；
(b)ステップ(a)で求めた測定量と基準発現量とを比較するステップ。
尚、特に記載のない限り、以下における遺伝子工学的操作は、Molecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或いはCurrent protocols in
molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参考にして行うことができる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、生体におけるペースメーカー活動を再現する細胞（ペースメーカー細胞）が提供される。本発明のペースメーカー細胞は、ペースメーカー活動の機構を研究するツールとして有用であることは勿論のこと、ペースメーキングに作用する化合物のスクリーニング、ペースメーカー異常の治療法（予防的治療法を含む）の確立などへの利用も図られ、その有用性は高い。例えば本発明のペースメーカー細胞を用いたスクリーニング方法によれば、ペースメーキングに作用する物質（薬剤等）を細胞レベルでスクリーニングすることができる。したがって、多検体を短時間でスクリーニングすることができる。即ちハイスループットなスクリーニングが実現される。また、検出の妨げとなる他の細胞などが存在しない状態でのスクリーニングアッセイが可能となることから、高感度かつ再現性に優れたスクリーニングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の第１の局面は、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞に関する。本発明において「ペースメーカー的」とは、規則的ないし周期的であることを意味するが、生物内において通常認められる程度の不規則性や揺らぎ等はあってもよい。一方「細胞内Ca2+オシレーション」とは、細胞内におけるCa2+濃度の振動（変動）をいう。尚、以下において特に説明のない場合には、「ペースメーカー細胞」と言えば「ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞」を意味する。
本発明のペースメーカー細胞は第１に、(a)イノシトール三リン酸受容体（IP3R）を発現していることを特徴とする。IP3Rは、胃・腸管におけるペースメーカー細胞の自発性電気活動に関与していることが示されている（Suzuki et al. 2000; Hirst & Edwards, 2001; Malysz et al. 2001;
Sergeant et al. 2001）。一方で後述の実施例で示すように、本発明者らの検討によってIP3Rは３型リアノジン受容体（RyR3）と協同してペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを引き起こすことが示された。一方で、IP3Rは２型リアノジン受容体（RyR2）とも同様に協同してペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを引き起こすことが観察された。P3Rは必要な時点、即ち本発明のペースメーカー細胞を目的の用途に使用するときにおいて発現しておればよい。したがって、例えば本発明のペースメーカー細胞を生体移植用として使用する場合には、生体に移植された際にIP3Rが適切に発現されることが必要とされる。同様に、本発明のペースメーカー細胞を薬剤のスクリーニング法などに使用する場合には、アッセイの際にIP3Rが適切に発現されればよい。
尚、IP3Rが発現していることは、例えばIP3Rに特異的な抗体を用いた免疫学的手法やRT-PCRによって確認することができる。
【０００９】
本発明のペースメーカー細胞は第２に、(b)人為的な操作の結果として２型又は３型リアノジン受容体を発現していることを特徴とする。ここでの「人為的な操作」とは、典型的には、遺伝子工学的手法を用いた２型リアノジン受容体遺伝子或いは３型リアノジン受容体遺伝子の導入を意味するが、これに限定されるものではなく、例えば発生工学的手法によって２型又は３型リアノジン受容体を発現させるような操作（例えば、２型又は３型リアノジン受容体遺伝子の発現能を潜在的に備える細胞（ペースメーカー細胞の幹細胞や前駆細胞等）に対して、当該遺伝子の発現が誘導されることとなる操作）であってもよい。
尚、「２型又は３型リアノジン受容体を発現している」とは、少なくとも２型リアノジン受容体又は３型リアノジン受容体のいずれか片方を発現していることをいい、したがってこれら両者を共に発現していてもよい。
【００１０】
２型或いは３型リアノジン受容体遺伝子の導入は、例えばMolecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New Yorkに詳述されるような、ベクターを用いた常法によって行うことができる（詳しくは、後述するペースメーカー細胞の作製方法において説明される）。２型リアノジン受容体遺伝子及び３型リアノジン受容体遺伝子は既に同定及びクローニングされており、それら塩基配列はGenBank（NCBIのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）においてAccession No. NM_023868（２型リアノジン受容体）、Accession No. AF111166（３型リアノジン受容体）で提供されている。
【００１１】
本発明のペースメーカー細胞では、IP3Rと同様に、RyR3又はRyR3は必要な時点、即ち本発明のペースメーカー細胞を目的の用途に使用するときに発現しておればよい。RyR2又はRyR3の発現は一過的な発現であっても安定的な発現であってもよい。例えばペースメーカー異常の治療を目的としてペースメーカー細胞を作製する場合には、継続するペースメーキングが望まれることから、RyR2又はRyR3が安定発現していることが好ましい。
【００１２】
本発明のペースメーカー細胞は例えば、HEK293細胞、COS細胞、又はCHO細胞に対して上記の人為的操作を加えることによって作製される。換言すれば、本発明のペースメーカー細胞の由来としてこれらの細胞を例示することができる。一方、後述するように、生体より取得した細胞に対して人為的操作を加えて本発明のペースメーカー細胞とすることもできる。この場合の細胞供給源としては、典型的には、ペースメーカー活動を行なう組織又は臓器である。尚、本発明のペースメーカー細胞の調製方法の具体的一例を以下に記載する。
【００１３】
本発明の第２の局面はペースメーカー細胞の調製方法に関する。本発明の調製方法は、(a)ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを発生ないし増強させようとするターゲット細胞を用意するステップと、(b)前記細胞に２型又は３型リアノジン受容体遺伝子を機能発現可能な状態で導入するステップとを含むことを特徴とする。
【００１４】
ステップ(a)におけるターゲット細胞としては、HEK293細胞、COS細胞、又はCHO細胞を用いることができる。生体より取得した細胞を用いることもできる。この場合における「生体より取得した細胞」としては、典型的には、本来有するペースメーキング作用が何らかの異常によって機能しなくなっている、又は機能が低下している細胞が用いられる。このような細胞に対して本発明の調製方法を適用すれば、ペースメーキング作用を回復した生体由来の細胞が得られ、かかる細胞はこれを移植することによるペースメーキング異常の治療に好適なものとなる。生体より細胞を取得する場合のソースとしては例えば胃、小腸、大腸、膀胱、尿管、輸精管、子宮、気管支、リンパ管、神経組織、門脈、尿道等の組織又は臓器を挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、目的とする細胞（即ち、ペースメーカー活動を行う細胞）が含まれる組織又は臓器であればこれを細胞供給源として利用することができる。また、細胞供給源となる動物種は特に限定されず、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、チンパンジー、ヒトなどをその例として挙げることができる。
ターゲット細胞として、イノシトール三リン酸受容体（IP3R）を発現する細胞を用いることが好ましい。但し、ステップ(a)で使用される時点においてIP3Rを発現していない、又は発現能を有していなくとも、後の操作によって最終的にIP3Rを発現するようになる限りにおいて、本発明のターゲット細胞として使用することができる。ここでの「後の操作」とは例えばIP3R遺伝子の導入操作をいう。かかる遺伝子導入操作は、ステップ(b)の遺伝子導入操作と同時に、或いは単独で実施することができる。
【００１５】
以上のような細胞供給源としての組織又は臓器の全部又は一部を必要に応じて採取し、ペースメーカー細胞を作製するための細胞集団として用いることができる。採取した組織は、それを構成する個々の細胞に分けた後又はそのままの状態で以降のステップに供される。個々の細胞に分けるためには、化学的手法（例えば界面活性剤による処理）、酵素学的手法（例えばタンパク分解酵素による処理）、及び物理学的手法（例えばピペッティング操作）などを利用できる。
【００１６】
ステップ(b)では、ステップ(a)で用意した細胞に２型又は３型リアノジン受容体遺伝子が機能発現可能な状態で導入される。２型アノジン受容体遺伝子と３型アノジン受容体遺伝子の両者をそれぞれ機能発現可能な状態で導入することもできる。遺伝子導入は、ベクター（遺伝子導入用プラスミド、ウイルスベクターなど）を用いた方法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、超音波マイクロバブル（Lawrie, A.,
et al. Gene Therapy 7, 2023-2027 (2000)）、リポフェクション(Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann,M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
73,366-370(1976))等の方法により行うことができる。
【００１７】
ベクターを用いた遺伝子導入を行う場合には、宿主細胞（即ち、ターゲット細胞）の種類を考慮して、それに保持させた２型又は３型リアノジン受容体遺伝子をターゲット細胞に導入でき、且つ導入後にターゲット細胞内で導入遺伝子を発現させることができるベクターが使用される。２型又は３型リアノジン受容体遺伝子のベクターへの組込みは、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法(Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York)により行うことができる。遺伝子導入用のベクターには、典型的には、２型又は３型リアノジン受容体遺伝子、プロモータ、及びターミネータが含有される。プロモータによる２型又は３型リアノジン受容体遺伝子の適切な転写が達成されるように、上流から下流に向かって順にプロモータ、２型又は３型リアノジン受容体遺伝子、及びターミネータが配置される。選択マーカーやエンハンサー機能を有する配列などをベクター内に含有させてもよい。
【００１８】
本発明の第１の局面において記載したように、２型リアノジン受容体遺伝子及び３型リアノジン受容体遺伝子は既に同定及びクローニングされており、各塩基配列情報をGenBank（NCBIのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から入手することができる（Accession No. NM_023868（２型リアノジン受容体）、Accession No. AF111166（３型リアノジン受容体））。２型リアノジン受容体遺伝子（又は３型リアノジン受容体遺伝子）は、それを保有するクローンより、当該配列情報を利用して調製することができる。勿論、生体材料からの核酸の抽出及び精製、並びに目的とする遺伝子のクローニング等の工程を経ることによって２型リアノジン受容体遺伝子（又は３型リアノジン受容体遺伝子）を調製することもできる。
【００１９】
ここで、一般に、あるタンパク質をコードするDNAの一部に改変を施した場合において、改変後のDNAがコードするタンパク質が、改変前のDNAがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち、DNA配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。このことを考慮して、上で示した２型リアノジン受容体遺伝子（又は３型リアノジン受容体遺伝子）の一部を改変した塩基配列を有するDNA（以下、「改変DNA」ともいう）であっても、それがコードするタンパク質が２型リアノジン受容体（又は３型リアノジン受容体）としての機能を有する限りにおいて２型リアノジン受容体遺伝子（又は３型リアノジン受容体遺伝子）の導入に利用することができる。このように、２型リアノジン受容体（又は３型リアノジン受容体）としての機能が維持される限りにおいて一部の配列の改変が許容される。
【００２０】
ここでの「一部の改変」とは、典型的には、改変前の塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加されることをいう。このような改変は複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは改変が行われる位置や改変の種類によっても異なるが例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜１０個である。以上のような改変DNAは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、２型リアノジン受容体遺伝子（又は３型リアノジン受容体遺伝子）を保有するクローンを紫外線で処理し、その後改変された遺伝子を単離することなど、公知の変異処理を利用した方法によっても取得することができる。
【００２１】
以上の作製方法では、用意したターゲット細胞に対して遺伝子導入を行うことによってペースメーカー細胞が作製されるが、例えば生体から取得した細胞集団が、十分なペースメーカー活動を行う細胞を含むと予想される場合には、上記のごとき遺伝子導入操作を経ることなく、２型又は３型リアノジン受容体の発現の有無を指標にペースメーカー細胞を取得（抽出）することができる。即ち、本発明の他の態様では、(a)ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずる細胞を含むと予想される細胞集団を用意するステップと、(b)前記細胞集団の中から２型又は３型リアノジン受容体を発現している、又は発現可能な細胞を選択するステップとを含む、ペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションを生ずるペースメーカー細胞の調製方法が提供される。尚、２型リアノジン受容体及び３型リアノジン受容体の両者を指標として上記選択ステップを実施してもよい。
ここでのステップ(b)の選択操作は例えば、２型リアノジン受容体（又は３型リアノジン受容体）に特異的な抗体を用いた免疫学的手法や、２型リアノジン受容体遺伝子（又は３型リアノジン受容体遺伝子）に特異的なプローブ及び／又はプライマーを用いた遺伝子工学的手法によって行うことができる。ここにおいて「２型又は３型リアノジン受容体遺伝子を発現可能な細胞」とは、本質的に２型又は３型リアノジン受容体遺伝子（両遺伝子であってもよい）の発現能を有するが、培養環境などによって一時的に当該遺伝子の発現が抑制されている細胞をいう。
【００２２】
以上のようにして調製される本発明のペースメーカー細胞は、生体におけるペースメーキングに作用する化合物のスクリーニング、ペースメーカー異常の治療（予防的治療を含む）などに利用され得る。従来では胃・腸管のペースメーキング活動を再現した培養細胞系が存在しないことから、胃・腸管のペースメーキングに作用する薬剤のスクリーニングを行おうとすれば、通常、生体より切除した胃・腸管組織がそのままの状態で使用されていた。このような従来の方法では効率的なスクリーニングは不可能であり、このため胃・腸管のペースメーキングに作用する化合物の探索は困難を極めていた。これに対して本発明のペースメーカー細胞を用いれば、培養細胞によるスクリーニング系が構築されることから、胃・腸管のペースメーキングに作用する化合物をハイスループットにスクリーニングすることができる。このように、本発明のペースメーカー細胞は、胃・腸管のペースメーキングに作用する化合物の探索を極めて容易にするという点において有用である。一方、上記のように生体由来の細胞を用いて本発明のペースメーカー細胞を作製した場合には、本発明のペースメーカー細胞をペースメーカー異常の治療に直接利用することもでき、その有用性は極めて高い。ペースメーカー異常の治療を目的とする場合、本発明のペースメーカー細胞を例えば、単独で若しくは組織体として、又は人工臓器として利用することができる。換言すれば、本発明のペースメーカー細胞を用いて移植用材料やペースメーカー装置等を作製することができる。ここでの「単独で」とは、本発明のペースメーカー細胞が他の成分と組織体を形成していない状態にあることを意味し、本発明のペースメーカー細胞に加えて他の成分が同時に使用されることを妨げるものではない。例えば、本発明のペースメーカー細胞を複数個、適当な溶媒に分散させた状態で使用する場合も、ここでいう「単独で」の使用に該当する。一方「組織体として」とは、本発明のペースメーカー細胞が組織体を形成した状態にあることを意味する。即ち、本発明のペースメーカー細胞が複数個、他の成分（例えば、細胞外マトリックス成分、合成高分子、他の細胞など）とともに組織として集合した状態をいう。このような組織体は、ペースメーカー細胞を含む組織（即ちペースメーキング活動を行う組織）の異常を治療するための移植材料として好適に利用することができる。また、このような組織体を用いれば、生体におけるペースメーキング活動を組織レベルで再現することができ、ペースメーキングに作用する化合物のスクリーニングやペースメーキング機構の解明などにとって有益なツールが提供されることとなる。一方、本発明のペースメーカー細胞を用いた「人工臓器」とは、本発明のペースメーカー細胞を少なくとも含み、人工的に構築された臓器を意味し、典型的には、本発明のペースメーカー細胞と他の成分とを組み合わせたハイブリッド型の人工臓器である。ここでの他の成分としては、細胞を保持するための担体（シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、PGA（ポリグルコール酸）、PLA（ポリ乳酸）、及びこれらの重合体、多糖類（キチン、アルギン酸など）、β−TCP等）や細胞外マトリックス成分（プロテオグリカン、フィブロネクチン、���ミニン、フィブロネクチンなど）、容器などを挙げることができる。本発明の人工臓器は例えば、適当な担体上において本発明のペースメーカー細胞を培養することによって（培養中に人為的な操作を加えることで、ペースメーカー細胞の作製を人工臓器の構築と並行して行う場合も含む）作製することができる。
【００２３】
尚、本発明のペースメーカー細胞の特徴である「IP3R及びRyR3が発現した状態」は、胃・腸管のペースメーカー細胞を用いた実験より得られた知見（即ちIP3R及びRyR3の協同によりペースメーキング活動が生ずるという知見）にその基礎を置くものであるが、これら両受容体の協同によるペースメーキング作用は胃・腸管のみに特異的なものではなく、他のペースメーキング活動を行う組織ないし臓器（例えば膀胱、尿管、尿道、輸精管、門脈、子宮、気管支、リンパ管、神経組織、神経分泌組織、及び呼吸中枢）においても共通する機構であると予想される。更に、IP3R及びRyR3の組み合わせに限るものではなく、IP3RとRyR2の組み合わせも含めた機構であると予想される。したがって、本発明のペースメーカー細胞は、胃・腸管に関連する用途に限らず、IP3RとRyR2との協同、又はIPR3とRyR3との協同によるペースメーキング作用が認められる組織に関連する用途に対して広く適用できるものである。
【００２４】
以下、本発明のペースメーカー細胞の利用方法の一例として、ペースメーキングに作用する化合物のスクリーニング方法について説明する。このスクリーニング方法ではまず、(a)上記のペースメーカー細胞を含む溶液に被験物質を添加するステップが実行される。被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等））又は無機化合物を用いることができる。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。
【００２５】
ステップ(a)に続いて、(b)所定時間経過後にペースメーカー細胞のペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーション量を測定するステップが実行される。Ca2+オシレーションの測定は、これに限定するものではないが、細胞内のカルシウム濃度を可視化できる試薬（例えばfluo-3やfura-2）を用いて行うことができる。得られた画像（イメージ）は、市販のCa2+イメージングシステムを利用して解析することができる。尚、ステップ(b)における「所定時間」とは、ステップ(a)において添加された被験物質がペースメーカー細胞に対してその作用を十分に及ぼすことができる時間をいう。この「所定時間」は、使用するペースメーカー細胞の種類、被験物質の種類、実験条件などによって一般に変動するが例えば５分〜２４時間（具体的には、５分、１０分、１時間、３時間、５時間等）の範囲内で設定することができる。
【００２６】
上記のステップ(b)の代わりに、(b1)所定時間経過後にペースメーカー細胞における２型又は３型リアノジン受容体の発現量を測定するステップを行うこともできる。ここでの発現量の測定は、２型リアノジン受容体又は３型リアノジン受容体に特異的な抗体を用いた免疫学的手法、或いは２型リアノジン受容体遺伝子又は３型リアノジン受容体遺伝子に特異的な核酸を用いた遺伝子工学的手法によって実施することができる。遺伝子工学的手法を用いて２型リアノジン受容体又は３型リアノジン受容体遺伝子の発現量を調べる方法については、後述の実施例に示すように、RT-PCRを好適に利用することができる。
【００２７】
以上のスクリーニング方法で取得される化合物はペースメーキングに作用（発生、増強、又は抑制）することから、これを生体に投与すればペースメーキング活動を正常化させることができると考えられる。従って、当該化合物を用いてペースメーキング異常を治療（予防的治療を含む）することが可能と考えられる。換言すれば、当該化合物を用いることによりペースメーキング異常に対する治療方法を構築できる。また、当該化合物を有効成分として含有するペースメーキング異常に対する薬剤、即ち治療薬を構成できる。製剤化する場合には製剤上許容される他の成分（例えば、生理食塩水、賦形剤、防腐剤、）を含有させることができる。また、種々の形態に製剤化できる。例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、顆粒剤などとして調製でき、経口投与、非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）により適用することができる。投与量については、症状、患者の年齢、体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択、設定することが可能である。
ペースメーキング異常に起因する疾病としては例えば、腸閉塞、老人性排尿障害（膀胱収縮障害）、尿失禁、頻尿、腸管不全、便秘などを挙げることができる。
【００２８】
本発明の更に他の局面は、被験細胞におけるペースメーカー活動を測定する方法であって、(a)被験細胞において２型又は３型リアノジン受容体の発現量を測定するステップと、(b)ステップ(a)で求めた測定量と基準発現量とを比較するステップと、を含むこと特徴とする方法に関する。ステップ(a)における２型リアノジン受容体又は３型リアノジン受容体の発現量の測定は、上述のスクリーニング方法の場合と同様に免疫学的手法や遺伝子工学的手法を利用して行うことができる。被験細胞は、典型的には、ペースメーカー活動が認められる組織から採取される。もっとも、例えば研究を目的とする場合などにおいては、予め調製された培養細胞（株化細胞など）を被験細胞として用いることもできる。ステップ(b)で使用される基準発現量は予め設定される。例えば、複数の正常検体を測定した結果を基に、組織毎に基準発現量（基準範囲）を設定することができる。
被験細胞におけるペースメーカー活動を測定した結果は、当該細胞を採取した組織におけるペースメーカー活動の異常の測定、治療、予防などに利用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下の各試験で使用した材料及び実験方法は次の通りである。
＜標本細胞の調製＞
既報の方法（Nakayama et al. 2002）に従って細胞小塊を作製した。BALB/cマウス（生後10〜20日）の小腸筋層を、消化酵素を含むCa2+フリーのHanks溶液で分離した（Nakayama et al. 2002）。得られた細胞小塊を、コラーゲンコートした培養皿に移し、培養に供した。2〜3日培養した後に培養細胞小塊をCa2+イメージングに使用した。
上記の酵素処理時間を調節することにより細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を、フィコエリトリン結合抗マウスCD117（c-Kit）抗体（PE-ACK2, eBioscience, San Diego, CA, USA）を含む溶液内でインキュベーションした。約5〜10個の単離された平滑筋細胞又はc-Kit陽性細胞を、先端の直径が10〜20μmのガラスピペットを用いて別々に集め、RT-PCRを実施するまで-80℃のフリーザー内に貯蔵した。
【００３０】
＜細胞培養と DNA導入＞
既報の方法(Imaizumi et al., 2002)に従ってHEK293細胞を培養・維持した。この細胞に２型リアノジン受容体（RyR2：GenBank Accession No. NM_023868）又は３型リアノジン受容体(RyR3：GenBank Accession No. AF111166)をコードするDNAベクターを導入した。DNA導入にはCaPO4共沈殿法（Sambrook et al. 1989）を使用した。DNA導入をしない細胞（その他の処理は同様に行なった）をコントロールとした。
【００３１】
＜細胞内Ca2+イメージング＞
8μMのfluo-3/AM及び界面活性剤（0.02% Pluronic F-127, Dojindo; 0.02% cremophor EL, Sigma）を含むfluo-3/AM標準溶液で培養細胞小塊を3〜4 時間インキュベートした。倒立顕微鏡（Axiovert
S100TV, Zeiss, Germany）を備えたCCD カメラシステム (Argus HiSCA, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) を用いてfluo-3蛍光のデジタルイメージ（画像）を取得した。488nmの励起光を使用し、515〜565nmの発光を検出した。300msのインターバルでデジタルイメージを取得した。蛍光強度（F）の変化はFt/F0（但し、F0は実験開始時の蛍光強度）で表した。Ca2+イメージングの間、記録チャンバーの温度をマイクロウオームプレート（DC-MP10DM, Kitazato Supply, Fujinomiya, Japan）で35℃に維持した。[Ca2+]iオシレーション（細胞内Ca2+オシレーション）の振幅がコントロール値の10%以下に低下した場合、又はノイズ範囲となった場合をオシレーションの停止とした。
DNA導入したHEK293細胞、及びDNA導入しないHEK293細胞内における平均遊離細胞内[Ca2+] iをfura-2/AMを用いて測定した。DNA導入から約48時間に10μMのfura-2/AMを20分間負荷した。fura-2の500 nm の蛍光を、室温、一定流速のKRH溶液の条件下、Ca2+イメージングシステム（ARGUS-50/CA, HAMAMATSU, Japan）を用いて２波長(F340及びF380)励起で測定した。340nm及び380nmの蛍光量をGrynkiewicz et al. (1985)の方法を用いてCa2+濃度に変換した。
また、既報と同様の方法（Imaizumi et al. 1998）で、共焦点顕微鏡(RCM 8000, Nikon, Japan 及びRatio3ソフトウェア（Nikon）を用いて高速共焦点Ca2+イメージを取得した。この場合には細胞に10μMのfluo-4/AMを負荷し、得られたイメージの解析にはRatio3ソフトウェア及びGLOBAL LAB image（Data Translation, Marlboro, MA, USA）を使用した。
【００３２】
＜免疫組織化学、及び免疫細胞化学＞
平滑筋層(筋層間神経叢を含む)をマウス小腸から摘出し、4%パラホルムアルデヒドで固定した後、triton X-100を用いて細胞膜を透過性とした。この筋層を小断片化した後、抗リアノジン受容体(RyR)抗体(クローン34C、Sigma, St Louis, MO, USA)及び抗c-Kit(マウス CD117)抗体で二重染色した（1.5時間）。続いて２次抗体であるAlexa結合抗マウス又はラットIgG（Molecular Probes）とインキュベーションした（15μg/ml、1時間）。１次抗体による処理を省略したものをコントロールとした。以上の処理を行った染色断片をスライドガラス上に載置し、共焦点顕微鏡(MRC-1024: Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて走査した。
類似のプロトコルを使用して、遺伝子導入したHEK293細胞のRyRタンパク質発現レベルを分析した。[Ca2+]i測定後、スライドガラス上の標本を固定し、その後透過性とし、そして抗RyR2又は抗RyR3抗体で染色し、共焦点顕微鏡(RCM 8000; Nikon, Japan)による分析に供した。
【００３３】
＜全RNA 採取、及びRT-PCR＞
既報の方法(Ohya et al., 1997)に従って全RNAの抽出及び逆転写反応を行った。得られたcDNAサンプルを、遺伝子特異的プライマーを使用したPCRで増幅した（図１０の表）。増幅条件は95℃で15秒、及び60℃で60秒とした。組織内及び細胞ベースのRT-PCRをそれぞれ35及び45サイクルの増幅によって行った。RT-PCR産物を2%のアガロースゲルを使用した電気泳動によって分離し、その結果をFluorImager 595 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)に画像取り込みした。テンプレートを含まないコントロール（NTC：図５）は、サンプル RNA を含まない状態でRT-PCRを実施した結果として得られた産物であって、これを非特異性増幅のモニタに用いた。DSQ-1000L シーケンサー(Shimadzu, Kyoto, Japan) を使って各amplicons（増幅産物）のシーケンスを確認した。
【００３４】
＜溶液、及び薬物＞
細胞小塊の調製等に使用した標準溶液の組成は次の通りである(化合物、濃度（mM）の順)：NaCl、125；KCl、5.9；MgCl2、1.2；CaCl2、2.4；グルコース、11；Tris-HEPES (pH 7.4)、11.8。HEK293細胞の調製等に使用した標準溶液は以下を含有する(化合物、濃度（mM）の順)： NaCl 125；KCl、5；KH2PO4、1.2；グルコース、6 ；MgCl2、1.2；CaCl2、2；NaOH で調節したHEPES（pH 7.4）、25。Ca2+フリーKRH溶液は、標準KRH溶液においてCa2+を省略し、そして0.01 mM EGTAを加えることにより調製した。
使用した薬物の供給源は次の通りである：ニフェジピン（nifedipine）及びリアノジン（ryanodine）(Sigma, St Louis, MO, U.S.A.)；カフェイン(anhydrous, Kanto Kagaku, Tokyo, Japan)；ゼストスポンジン（xestospongin）C及び2-APB (2-aminoethoxydiphenyl
borate) (Calbiochem, San Diego, CA, U.S.A.)；fura-2/AM、fluo-4/AM、及びAlexa（登録商標）標識化２次抗体(Molecular Probes. Inc., Eugene, OR, USA)；fluo-3/AM (Dojindo, Kumamoto, Japan)。
【００３５】
＜統計処理＞
数字データは平均値±標準偏差として表した。ANOVA及びStudentのt検定を使用して統計学的有意性を検定した。記号＊及び＊＊はそれぞれ、p<0.05及びp<0.01（対コントロール）を表す。
【００３６】
[試験結果]
１．ICCsにおける細胞内Ca2+オシレーション
マウス小腸からの調製した培養細胞小塊にfluo3-AMを負荷し、CCDカメラシステムを用いて細胞内Ca2+濃度の指標としてのfluo-3蛍光をモニタした。2.4mMのCa2+を含有する標準溶液中35℃の条件で（Nakayama & Torihashi, 2002）、多くの細胞小塊は8〜20サイクル/分の自発性収縮を示した。DHPのL型Ca2+チャネルブロッカーは、胃・腸管平滑筋における収縮は抑制するが、スローウェーブ（緩徐波）へはほとんど影響しないことが知られている（Dickens et al. 1999; Huang et al. 1999）。このことを考慮して、本試験ではニフェジピンを、培養細胞小塊のペースメーカー細胞を見分けることに使用した。1〜2μMのニフェジピンの存在下では、ニフェジピンの非存在下において自発的収縮を示した細胞小塊の１以上の部位（図１Aa及びBa）でCa2+オシレーションが観察された。Ca2+オシレーションが複数の部位で観察された細胞小塊では、その周期的なCa2+イベントは同期して進行した。ニフェジピンの存在下でのCa2+オシレーションの平均周期は、18.4±5.1サイクル/分 (n=26)であった。
【００３７】
２．Ca2+オシレーションの発生におけるリアノジン受容体の関与
DHP Ca2+チャネルブロッカーの存在下の細胞小塊標本を使用して、Ca2+遊離チャネルに影響する薬剤の作用を調べた。図１に、単一の[Ca2+]iオシレーション（A）又は複数の部位での[Ca2+]iオシレーション(B)を発生する細胞小塊におけるリアノジンの影響を示す。図１Abは、パネルAaで四角に囲った部位で測定した蛍光強度（Ft/F0）の変化をトレースしたグラフである。Aa1〜Aa3のCa2+イメージはそれぞれ、Abにおいて線1〜3で示した各時間に測定した。2μMのニフェジピン存在下で測定した[Ca2+]iオシレーションは、1μMのリアノジンの添加によって添加5分後その振幅及び周期が顕著に減少した。リアノジンの添加量を10μMまで増加させたところ添加５分後の[Ca2+]iのオシレーションは完全に停止した。このように細胞内Ca2+オシレーションが消失した細胞小塊ではリアノジンを洗浄除去しても細胞内Ca2+オシレーションは回復しなかった。リアノジンの効果を検証した後、ACK2を使用して細胞小塊を染色した。図１Aaにおいて四角で囲った部位においてc-Kit免疫陽性反応が認められた。このことはICCsにおける[Ca2+]iオシレーションがリアノジンによって調節されたことを示唆する。本質的に同様のリアノジンの効果が他の三つの細胞小塊で観察された。
【００３８】
図１Baに示した細胞小塊標本は[Ca2+]iオシレーションを発生する複数の部位を含んでいた。Bbにおける[Ca2+]iの変化のタイムコースは、x（青色線）及びy（赤色線）で示した部位でモニタした結果である。前述した二つの部位での[Ca2+]iは良好に同期していた（ニフェジピンの存在下において）。10μMのリアノジン添加によって[Ca2+]iオシレーションの振幅及び周期が時間依存的に減少した。図1Bcに、x部位のFt/F0とy部位のFt/F0間の相関を示す（各グラフはそれぞれBbのトレースに対応する）。相互相関関数はt=0で最大（>0.9）となった（グラフ示さず）。[Ca2+]iの振幅が顕著に減少したときに周期も減少する傾向にあった。[Ca2+]iが停止するまでの時間は、10μMリアノジンを添加後、3〜18分の範囲であった（平均は6.6±4.9分）。オシレーション停止前に記録したFt/F0トレースにおいて振幅及び周期はそれぞれ、コントロールの54±32%及び71±21%であった。
リアノジン受容体の開口特性にカフェインが影響することが知られている（Endo, 1977; Karaki & Weiss, 1988; Ogawa et al. 2002）。そこで、カフェインを用いてICCsにおけるCa2+オシレーションへのリアノジン受容体の関与について更に検討した（図２）。[Ca2+]iオシレーションの休止時及びピーク時におけるCa2+イメージがA1及びA2に示される（Baにおける線1及び2によって示される）。ニフェジピン(2μM)の存在下で10mMのカフェインを添加することによって[Ca2+]iオシレーションが顕著に抑制された。検討したすべての細胞小塊において(n=5)5分以内に[Ca2+]iオシレーションが停止した。５個の内４個の細胞小塊においてオシレーションの振幅が減少するのに伴いその周期も減少した。オシレーション停止前に記録したトレースにおいて、[Ca2+]iオシレーションの振幅及び周期はそれぞれ、コントロールの42±23%及び40±24%であった(n=4)。図２Bbに示すとおり、カフェインは[Ca2+]iオシレーションの周期を顕著に減少させ、一方でペースメーカー部位の[Ca2+]i周期は良好に同期した（青色線はx部位、赤色線は部位y）。Bcのトレースは10mMのカフェイン添加3分後に記録したものであり、A3のCa2+イメージはBcにおいて線3で示した時間に得られたものである。図2Bdに示すように、[Ca2+]iオシレーションへのカフェインによる抑制効果は可逆的であった。より低い濃度のカフェインによっても同様の抑制効果が得られたが、5分以内に[Ca2+]iオシレーションが停止したのは5個の内2個の細胞小塊標本のみであった。
【００３９】
３．InsP3 受容体ブロッカの作用
自発性電気活動、即ちスローウェーブは、1型IP3R欠損マウスの胃腔平滑筋では不規則的なインターバルで観察されるか、又は全く観察されない（Suzuki et al. 2000）。このことは、スローウェーブの発生に関してIP3Rがおそらく重要な役割を果たしていることを示唆する。そこで、小腸のICCsにおける[Ca2+]iオシレーションに対するIP3R Ca2+遊離チャネルの役割について、2APB及びゼストスポンジンCの効果を調べることによって検討した。尚、これら二つの薬剤については、細胞膜を透過してInsP3受容体をブロックすることが報告されている（Murayama et al. 1997; Gafni et al. 1997）。図３Aはニフェジピン抵抗性[Ca2+]iオシレーション（ペースメーカー[Ca2+]iオシレーション）に対する2APBの効果の一例を示す。赤色線（x）及び青色線（y）は、およそ50μmはなれた二つのペースメーカー部位における[Ca2+]iの変化を示す。10μMの2-APBの添加によって、添加5分後に[Ca2+]iオシレーションは完全に停止した（A-c）。10μMの2-APBを添加する実験に使用した4個の細胞小塊全てにおいて添加5分以内に[Ca2+]iオシレーションが停止した。一方、1μMの2APBの添加によって6個の内2個の細胞小塊で5分以内に[Ca2+]iオシレーションが消失した。2APBの添加では、周期に大きな変化が生ずることなく[Ca2+]iオシレーションの振幅が減少する傾向にあった。オシレーション停止前に記録したFt/F0トレースにおいて、[Ca2+]iオシレーションの平均振幅及び平均周期はそれぞれ、コントロールの61±32%及び98±11%であった(n=5)。図３Bにおける各トレースはゼストスポンジンCの効果の一例を示す。10μMのゼストスポンジンCによって添加後2分以内に[Ca2+]iオシレーションが完全に停止した(n=3)。以上の結果より、ICCsの[Ca2+]iオシレーションへのInsP3受容体の関与が示された。尚、以上で使用した二つの薬剤については、これを添加後に洗浄除去したとしても5分以内に[Ca2+]iオシレーションは容易には回復しなかった。
【００４０】
４．免疫組織化学とメッセンジャーRNA発現
マウス小腸の ICC におけるリアノジン受容体(RyR)の存在を確認するために、抗c-Kit抗体(ACK2)と同時に抗リアノジン受容体抗体(クローン34C) で、摘出した平滑筋組織(筋層間神経叢を含む)を染色した（図４）。図４パネルA（赤）では筋層間神経叢におけるネットワーク様構造内にc-Kit免疫陽性細胞が分布していることがわかる。抗リアノジン受容体抗体の蛍光がc-Kit免疫陽性細胞（ネットワーク様）及び平滑筋細胞（垂直方向に縦走する）に検出された（同図パネルB（緑））。合成イメージ(図４パネルC)において明確に、c-Kit陽性細胞のほとんどが抗リアノジン受容体抗体に反応したことが示される（黄色）。
【００４１】
単離された ICCs と平滑筋細胞において、リアノジン受容体アイソフォームのmRNA発現をRT-PCRで調べた。図５Aに、脳(brain)、心臓(heart)、骨格筋(skeletal m.)から調製したGAPDHcDNAとともに、1型〜3型リアノジン受容体（RyR1〜RyR3）の増幅産物をコントロールとして示す。同図Bに示すように、単離したICC（c-Kit陽性細胞）では主にRyR3 が発現していた。一方、平滑筋細胞では主にRyR2 が発現していた。c-Kitに対応するDNAバンドはICC細胞にのみ認められた。更にPCRを5サイクル実行しても、ICCs及び平滑筋細胞の両者においてさらに他のDNAバンドが観察されることはなかった。次に、InsP3受容体の発現を調べるためにRT-PCRを実行した。その結果、3型及び2型アイソフォームがそれぞれ、平滑筋及びICCsの主なInsP3受容体であった（データ示さず）。
【００４２】
５．HEK293細胞において再構成された細胞内Ca2+オシレーション
ICCsにおけるペースメーカー[Ca2+]iオシレーションに対するRyR3の寄与を確認するため、HEK293細胞において機能的RyR3の再構成を試みた。尚、HEK293細胞はIP3Rを発現する。RT-PCRの結果、ネイティブHEK293細胞は全ての型のIP3RのmRNAを、発現量としてIP3R3>IP3R2>IP3R1の順で発現する。その一方で、RyRサブタイプのmRNAは45サイクルの増幅反応によっても検出されなかった（データ示さず）。
【００４３】
RyR3遺伝子導入の2日後に、蛍光Ca2+の指標となるfura-2を用いて[Ca2+]iを測定した。HEK293細胞のおよそ10%が自発性[Ca2+]iオシレーションを示した。図６Aaに、[Ca2+]iの自発性オシレーション、及び1mMのカフェイン添加に反応した自発性オシレーションの増大を示す。カフェイン添加量の増加に対する明確な反応性は認められなかった。HEK293細胞のおよそ30% が 1mMのカフェインに反応した。このことはRyR3の機能的発現の効率が約30%であることを示唆する。図６Aaにおける赤色線（x）で示すように、残りのHEK293細胞（約70%）は1mM〜10mMのカフェインに対して反応しなかった。一方で、1μMのAChに対して反応性を示した。休止時(resting)、並びに1mMカフェイン(caffeine)又は1mMカフェインと1μM ACh(ACh)が存在する条件下で取得したCa2+イメージを図6Abに示す。1mMのカフェイン添加によって二つの細胞で[Ca2+]iが増大した。例外なく、カフェインに反応性の細胞においてRyR3タンパク質の実質的な発現が認められた(n>200)。このことは形質転換細胞においてカフェインに対する高反応性とRyR3タンパク質の発現との間に直接的な相関が存在することを示唆する。
【００４４】
図６Bは、RyR3でトランスフェクトしたHEK293細胞内の典型的な自発性Ca2+オシレーションを示す。二つの細胞（1及び2）は共焦点イメージにおいてCa2+オシレーションを示した。Ca2+波は、細胞1において白抜きの矢じりで示した特定の開始点で発生した。Ca2+オシレーションの周期は1.3±0.6 min-1であった(n=39、トランスフェクションにおいて独立した8グループから選択)。[Ca2+]iのピークの平均値は1.6±1.4μM(n=24)であった。いくつかの実験においてRyR3タンパク質の発現とCa2+オシレーションの発生との関係を、BODIPY FL-Xリアノジンを使用して調べた(図６C)。19細胞の内4細胞においてCa2+オシレーションが記録され、Ca2+オシレーションを示す4細胞を含む12細胞についてはBODIPY FL-Xリアノジンによる良好な染色性が認められた。
【００４５】
図7に、RyR3を遺伝子導入したHEK293細胞の自発性[Ca2+]iオシレーションの薬理学的抑制試験の結果を示す。リアノジン(10μM, A)の添加によって3分以内に[Ca2+]iオシレーションが停止した(n=3、グラフA)。他のRyRブロッカであるテトラカイン(tetracaine)の添加によっても[Ca2+]iオシレーションが停止した(n=3、データ示さず)。一方、IP3Rブロッカである2APB(100μM、n=3、パネルB)又はゼストスポンジンC(20μM、n=3、データ示さず)の添加によって[Ca2+]iオシレーションが停止したが、この効果はより短時間内に認められた。これらの結果はICCにおける自発性[Ca2+]iオシレーションの発生にRyR3及びIP3Rの両者が必須であるとの仮説を支持する。パネルC及びDでは、Ca2+フリー溶液、又は原形質膜のTRP(transient receptor potential)ファミリーチャネルを介したCa2+の流入をブロックすることで知られる既知の一般的チャネルブロッカーであるSK&F96365（Zhu et al. 1998; Roe et al. 1998）によって、[Ca2+]iオシレーションを示すHEK293細胞を処理した結果が示される。これらいずれの処理によっても[Ca2+]iオシレーションが停止した。このことはペースメーキングにとって細胞外空間からのCa2+の流入が必要であることを示唆する（Torihashi et al. 2002）。Ni2+又はCd2+、或いは天然Ca2+ブロッカの添加によってもまた[Ca2+]iオシレーションは抑制された（データ示さず）。
【００４６】
６．RyR2を発現するHEK293細胞において再構成された細胞内Ca2+オシレーション
ペースメーカー[Ca2+]iオシレーションに対するRyR2の寄与を確認するため、HEK293細胞において機能的RyR2の再構成を試みた。
RyR2遺伝子導入の2日後に、蛍光Ca2+の指標となるfura-2を用いて[Ca2+]iを測定した。測定結果を図８（下段）に示す。図８（下段）に示すように、RyR2を発現させたHEK293細胞において自発性[Ca2+]iオシレーションの発生が認められた。1mMのカフェイン添加によって細胞内Ca2+ストアからのCa2+の遊離が生じ、その結果Ca2+ストアのCa2+がほぼ枯渇することによって、より高濃度のカフェインには反応しない。このようなCa2+の遊離現象が生ずることから、続けて作用させた1μMのアセチルコリン（ACh）によってもCa2+の変化は生じない。点線はRyR2を発現していないHEK293細胞でのCa2+濃度の変化を表している。この場合には、10mMまでのカフェイン添加によってCa2+濃度は変化しない。このため貯蔵Ca2+は減少せず、1μMのアセチルコリン添加によって顕著なCa2+遊離が生ずる。
尚、比較のために図８の上段には、RyR3を発現するHEK293細胞を使用し、同一条件下で測定した結果を示した。
【００４７】
７．[Ca2+]iオシレーションを誘発（開始）するCa2+スパーク
局所的Ca2+移動がどのようにして自発性Ca2+オシレーションを引き起すかを分析するために、高速共焦点Ca2+イメージングを実施した。RyR3でトランスフェクトし、そしてカフェインに対して高反応性を示すHEK293細胞を使用して33ms毎に共焦点Ca2+イメージを得た。細胞にはFluo-4を負荷した。比較的短周期の自発性[Ca2+]iオシレーション(Ca2+波)を示すこと、及びその結果としてCa2+波間のインターバルにおいてCa2+スパークを測定し易いことから、図９に示す細胞は選択された。図９Aaは、細胞における自発性Ca2+波の開始及び伝搬の様子を示す。図９Abにおける垂直な点線で示す各時間においてイメージを連続的に取得した。図中のαで示す細胞下部でCa2+波が発生し、上方へと伝搬した。図９Aaにおけるα、β、及びγで示した小円内で平均蛍光強度を測定した。Ca2+波の発生後の蛍光強度(Ft/F0)変化を図９Abに示す。α領域での[Ca2+]i上昇が明らかに、β領域及びγ領域での局所的[Ca2+]i上昇に先行することが示された。
【００４８】
Ca2+波間のインターバルにおけるα領域、β領域、及びγ領域についてのFt/F0の時間変化を図９Baに示す。また、図９Baにおいて点線で示す時間に取得したCa2+イメージを図９Bbに示す。α領域においてCa2+波の発生後に急激な[Ca2+]iの上昇が観察された。RyR3でトランスフェクトしたこのHEK293細胞で観察されたCa2+波の伝搬は、cardiac myocyte及びcardiac trabeculaeで報告されている（Cheng et al., 1996, Wier et al., 1997）ものと同様に、開始部位（α）におけるCa2+スパークが引き金となって生じたものと推測される。分析した全てのHEK293細胞(n=5)において本質的に同様の結果が得られた。Ca2+スパークは20ms以内にピークに達した(ピークまでの時間は17.3±5.3 ms、n=12)。最大F/F0の50%での継続時間は38.3±7.6 ms(n=11)であった。本試験によって、独立した9回のトランスフェクションで得られた29細胞において合計32のCa2+スパークが観察された。また、全てのCa2+スパーク部位が、RyR3免疫蛍光染色で染色性を示した部位に一致した(n=20)。ピーク振幅でのスパークサイズは、RyR3タンパク質の染色パターンのドットサイズと類似したものであった(2.1±0.3μm対1.9±0.3μm、n=13)。細胞内の同一空間位置においてCa2+スパークが発生し、その平均周期は2.9±1.2 sec-1(n=18)であった。一つの細胞において二つ以上のCa2+スパーク部位が観察されるものはまれであった(29細胞中に2細胞)。ほんの少数のCa2+スパーク部位でのみ自発性Ca2+波／オシレーションが開始した。これらの結果は、これらのスパークサイトが、RyR3がクラスター様に発現している領域に対応していることを強く示唆する。
【００４９】
本発明者らが最近開発した培養細胞小塊標本は、平滑筋、腸ニューロン及びc-Kit免疫陽性細胞(ICCs)を含んでいる。この中でc-Kit免疫陽性細胞は胃・腸管における仮説ペースメーカーであり、これが神経伝達によって調節される。したがって、この細胞小塊標本は、胃腸運動とペースメーカー機能の根底にあるメカニズムを研究する上で必要不可欠かつ最小限の細胞メンバーたちから成りたつと考えられる。
【００５０】
以上の試験によって、十分低い濃度 (10μM)のリアノジンがICCsの[Ca2+]iオシレーションを抑制し、最終的にこれを停止することが確認された。これはおそらく、細胞小塊標本の小さなサイズ（表面―体積比）が十分量のリアノジン分子を比較的急速にICCsへ取り入れることを可能にするためであると推測される。このことは、細胞膜透過性IP3Rブロッカである2APB及びゼストスポンジンCを用いた実験によって支持された。即ち、図３に示されたように、これらいずれかの薬剤の添加によって低濃度の場合であっても[Ca2+]iオシレーションが完全に停止した。このように、リアノジンを含む多くの薬剤がオシレーションの抑制に有効であるという事実は、この標本がCa2+オシレーションの薬理学検査において有効な材料となることを示唆する。
【００５１】
Ca2+依存的イオン透過性、即ちCa2+活性化Cl-チャネルによってICCsの自発性電気興奮が発生するという仮説が提唱されている（Tokutomi et al. 1995; Edwards et al. 1999; Huizinga et al. 2002）。このことから、細胞内Ca2+ストアからの周期的なCa放出がICC細胞のペースメーキングにおける基礎的イベントであると考えられる。以上の試験によって、RyR及びIP3Rの両者がICCsに存在することが示される。
【００５２】
以上のRT-PCRの結果から、マウス小腸のICCsが主としてRyR3を発現し、その一方で平滑筋で発現する主なRyRアイソフォームはRyR2であることが明らかとなった。RyR3はその特性から脳型アイソフォームとして知られており、いくつかの脳領域、即ち線条体、海馬、及び視床において発現している（Ogawa et al 2000; 2002）。RyR3は、マイナーな要素であるが、骨格筋及び平滑筋においても発現している。骨格筋におけるRyR3は、RyR1の活性化によって誘発されるCa2+の放出を増幅するのかもしれない（Ogawa et al., 1999; Yang et al., 2001）。多くの組織及び臓器においてRyR3の存在が確認されているものの、これがRyR1又はRyR2よりも優勢に発現しているのは未妊娠子宮に限られ、そこではRyR3はSRにCa2+が過剰に負荷されたときのみCa2+のシグナリングに関与するのであろう（Mironneau et al., 2002）。動脈平滑筋細胞においてRyR1及びRyR2と同様にRyR3がCa2+スパークの発生に関与するということが、RyR3欠損マウスを使用した実験の結果によって示されている（Lohn et al., 2001）。培養ラット門脈平滑筋細胞にCa2+を過剰負荷した系を使用した実験によって、Ca2+シグナリングへのRyR3の同様の関与が示唆されている（Mironneau et al., 2001）。しかしながら、平滑筋細胞において優勢に発現するRyR3のスプライスバリアントは機能的Ca2+放出チャネルではなく、ドミナントネガティブとして機能し得るということが判明している（Jiang et al., 2003）。現在までのところ、RyR3サブタイプが[Ca2+]iオシレーションの発生に関与していることの証拠はない。
【００５３】
ICCsにおけるRyR3の優勢的な発現がペースメーカー機能に関与することが示された。RyR3は、末梢システムにおいて自発的リズム性を有する組織及び臓器におけるペースメーカー細胞同定のための新しい分子マーカーとなるであろう。実際、抗リアノジン抗体及び抗c-Kit抗体によるマウス小腸の二重染色の場合と同様に（上記試験を参照）、c-Kit免疫陽性細胞におけるRyRの明らかな発現が他の胃・腸管組織（例えば、モルモットの胃及び小腸、データ示さず）で観察された。一方、再構成実験では培養細胞においてRyR3を選択的に発現させることによってCa2+スパークが発生することが示されている（Ward et al. 2000; Rossi et al., 2002）。
【００５４】
RyR3を導入したHEK293細胞のおよそ10%において自発性[Ca2+]iオシレーションが記録された。カフェインに対する反応性から判断すると、一時的な RyR3発現効率は 30%と考えられる。特に注目に値するのは、そのHEK293細胞と腸管ペースメーカー細胞であるICCsにおける[Ca2+]iオシレーションが以下の特性を共有することである：1)RyR (カフェイン、リアノジン(ryanodine))或いはIP3R (2APB、ゼストスポンジン(xestospongin))に影響を与える薬剤によってCa2+オシレーションが抑制される；2)細胞内CaストアからのCa2+放出が、自発性Ca2+オシレーションの基礎的イベントであるが、細胞外からのCa2+流入もCa2+オシレーション維持に不可欠である、即ち細胞内Ca2+オシレーションは、細胞外Ca2+の除去やSK&F96365投与によって抑圧される（Torihashi et al. 2002）。さらに、無機Ca2+ブロッカの投与も Ca2+オシレーションと同期する自発性電気活動を停止させる（Nakayama & Torihashi, 2002）。
一方、RyR2を導入したHEK293細胞においても、RyR3を導入した場合と同様に自発性[Ca2+]iオシレーションの発生が認められた。このことは、RyR3と同様にRyR2もペースメーカー的細胞内Ca2+オシレーションに関与していることを意味する。
【００５５】
Ca2+スパークはRyRの存在を示すランドマークイベントある（Cheng et al., 1993; Bootman et al. 1995;
Imaizumi et al. 1998）。それぞれRyR2、RyR1及びRyR2/3が高発現する心臓、骨格及び平滑筋細胞において（Ogawa et al. 1999）Ca2+スパークが発生することが知られている（Bootman et al., 1995）。オリゴデンドロサイト前駆細胞において、Ca2+スパーク（RyR3に起因すると考えられる）とpuff(一吹：IP3R2に起因すると考えられる)の両者が記録され、そしてこの両者はクロストークしているのではないかと考えられた（Haak et al., 2001）。ここに発現するIP3R2 が誘発性Ca2+puffとCa2+波に不可欠であり、一方RyR3 がCa2+波を誘起するCa2+スパークを作り出すことが提案された。非筋肉細胞にRyR3を発現させることでCa2+スパークが再構成され、IP3Rとの連関によってCa2+波を引き起こすことは注目に値する。既に述べたように、ICCsとHEK293細胞において再構成された[Ca2+]iオシレーションはいくつかの特性を共有する。このことを考え合わせると、以上の試験で得られた結果は、腸のペースメーカー、即ちおそらくRyR3及びIP3Rの協同によって発生した自発的律動性Ca2+オシレーションの再構築の可能性を示唆する。
結論として、RyR3はICCsのペースメーカー細胞内Ca2+オシレーションの発生に、あるいは少なくともその調節に寄与する。これは、RyR3が果たす必須の役割についての初めての証拠であって、このことはHEK293細胞においてCa2+オシレーションが再構成されたという事実によってさらに支持される。
【００５６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のペースメーカー細胞は例えば、ペースメーカー活動の機構を研究するツールとして使用され得る。また、ペースメーキングに作用する化合物のスクリーニングやペースメーカー異常の治療法（予防的治療法を含む）へも利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１はニフェジピンの存在下における[Ca2+]iオシレーションへのリアノジン(ryanodine)の効果を示す。A及びBにおいてそれぞれ、単一及び複数の[Ca2+]iオシレーション部位が認められる。Aa1〜Aa3は、2μMニフェジピン存在下、培養細胞小塊標本から得られた、線1〜3で示した時点で記録したfluo-3蛍光強度の擬似色比率イメージを示す。[Ca2+]i活動の指標としてfluo-3蛍光を使用した。初期イメージ(Abの第１トレース又は第３トレースにおけるt=0で取得)の蛍光強度を用いて各イメージを標準化した。パネルAa4及びAa5はそれぞれ、同一細胞小塊より得られたc-Kit免疫染色イメージ及び発光イメージを示す。垂直バーは100μmを表す。Aa1における四角で囲った部位は[Ca2+]iオシレーションを示し、c-Kit免疫陽性でもある。Abのトレースは四角で囲った部位（Aa）における[Ca2+]i(fluo-3強度：Ft/F0)の変化を示す。2μMニフェジピンの存在下でコントロール[Ca2+]iオシレーション(第１(左)トレース)を観察した後、1μMリアノジンを添加した。[Ca2+]iオシレーションの第２(真中)トレースは、1μMリアノジン添加5分後に得られた。続いて、リアノジン濃度を10μMまで上昇させた。Abにおける第３(右)トレースは、リアノジン濃度上昇後5分経過した時点で得られた。Baの三つのパネルは、複数のオシレーション部位を示した細胞小塊標本から得られた、[Ca2+]i活動の擬似色比率イメージである。イメージBa1〜Ba3は、Bbにおける線1〜3の時点で取得した。Bｂにおいて青（x）及び赤（y）のトレースはそれぞれ、パネルBa1における四角で囲ったx部位及びy部位での[Ca2+]iの変化を示す。ニフェジピン(2μM)存在下でのコントロール[Ca2+]iオシレーション(Bbの第１(左)トレース)を観察した後、10μMのリアノジンを細胞外溶液に添加した。第２(真中)及び第３(右)トレースはそれぞれ、リアノジン添加2分後及び8分後に得られた。Bcの各グラフはBaで示したx部位及びy部位間のFt/F0の相関を表す。
【図２】図２はICCsにおいてカフェインが[Ca2+]iオシレーションを可逆的に抑制することを示す。パネルA1〜A3はそれぞれ、Bにおける線1〜3の時点で記録した[Ca2+]iイメージを示す。垂直バーは100μmを表す。Bのトレースは、A(1)において四角で囲って各部位における[Ca2+]iの変化(Ft/F0)のタイムコースを示す：青色線はx部位、赤色線はy部位。2μMのニフェジピン存在下でのコントロール[Ca2+]iオシレーション(Ba)を観察した後、10mMのカフェインを添加した。Bb及びBcはそれぞれ、3分後及び5分後に記録された。Bdは、ニフェジピン存在下でカフェインを洗浄除去した後5分経過した時点での[Ca2+]iオシレーションの回復を示す。
【図３】図３はInsP3受容体ブロッカの効果の例を示す。A及びBのトレースは、異なる細胞小塊標本において、[Ca2+]iオシレーションを示す部位から得られた。Aでは2μMのニフェジピン存在下でのコントロール[Ca2+]iオシレーション(Aa)を観察した後、10μMの２APBを添加した。トレースAbは10μMの2APB添加3分後に記録された。青線（x）及び赤線（y）は約50μm離れた二つの部位において測定した[Ca2+]iの変化を示す。この距離は、図１Ba1及び図２A1に示したx部位及びy部位間の距離に相当する。Bではニフェジピンの存在下でコントロールを観察した後(Ba)、10μMのゼストスポンジンCを添加した。トレースBbは、ゼストスポンジン添加2分後に取得した。
【図４】図４はc-Kit及びリアノジン受容体の免疫組織化学特性を示す。マウス小腸平滑筋(筋層間神経叢を含む)を抗c-Kit抗体(A:Alexa488標識ACK2、赤色)及び抗リアノジン受容体抗体(B:Alexa594、緑色)で二重染色した。Cは合成イメージである。ほとんどのネットワーク様細胞は黄色に染色されていることに注目されたい。これはICCsがリアノジン受容体を含むことを示す。
【図５】図５はRyR1〜RyR3についてのRT-PCRの結果を示す。Aでは、RyR1〜RyR3及びGAPDHについてのコントロール増幅産物を脳、心臓、及び骨格筋から抽出した。増幅は35サイクルとした。Bは、NTC(テンプレートなしのコントロール)及びc-Kit免疫陽性細胞及び平滑筋細胞から調製したRNAサンプルを使用したRT-PCR実験の結果を示す。増幅は45サイクルとした。Bでは、c-Kitの発現についても検討した。各ゲルの右に示した数字は分子量マーカー(bp)である。
【図６】図６は、RyR3でトランスフェクトしたHEK293細胞において検出した自発性Ca2+オシレーションを示す。(A)はfura-2AMを負荷した細胞内のCa2+イメージを休止条件下、及び1mMのカフェイン又は1μMのAch存在下で取得した。Abの下部右パネルはRyRの免疫蛍光染色を示す。尚、1mMのカフェインに反応性を示した細胞を抗RyR3抗体の免疫蛍光で染色した。Abのスケールバーは20μmを表す。(Aa)は、RyR3を発現するHEK293細胞(黒色線、y)及びRyR3非発現細胞(赤色線、x)における[Ca2+]i変化のタイムコースである。細胞をその後、1,2,4,10mMのカフェイン及び1μMのAChで処理した。(B)では、一連の共焦点イメージ(b)で示した細胞１及び２より得られた自発性[Ca2+]iオシレーション(a)のタイムコースが示される。Ca2+イメージを3s毎に得た。細胞にfluo-4を15分間負荷した。(C)は、RyR3でトランスフェクトしたHEK293細胞における、fluo-4負荷後の共焦点イメージ(a)及びBODIPY FL-Xリアノジンで染色後の共焦点イメージ(b)である。(a)では細胞にfluo-4を負荷した。19細胞中4細胞(1〜4)でCa2+オシレーションを記録した。(b)では、[Ca2+]iオシレーションを記録後、細胞をBODIPY FL-Xリアノジンで5分間染色し、その後洗浄した。19細胞中12細胞([Ca2+]iオシレーションを示した4細胞全てを含む)はBODIPY FL-Xリアノジンで良好に染色された。(c)はこれら4細胞における[Ca2+]iオシレーションのタイムコースである。
【図７】図７は、RyR3でトランスフェクトしたHEK293細胞における自発性Ca2+オシレーションの薬理学的特性を示す。10μMのリアノジン(A)又は100μMの2APB(B)の添加、細胞外Ca2+の除去(C)、或いは40μMのSK&F96365(D)の添加によって自発性Ca2+オシレーションが停止した。
【図８】図８は、RyR2を発現するHEK293細胞において測定した自発性Ca2+オシレーションを示す（下段）。上段には、RyR3を発現するHEK293細胞を使用して測定した結果が示される。点線は、RyR2（又はRyR3）を発現していないHEK293細胞を使用して測定した結果である。縦軸は細胞内Ca2+濃度、横軸は秒単位の時間である。
【図９】図９は、RyR3を発現するHEL293細胞における自発性Ca2+放出のイメージを示す。(A)：(a)はRyR3を発現するHEK293細胞におけるfluo-4の7連続共焦点Ca2+イメージである。bにおける点線によって示した各時間において得たイメージを示す。(b)においてF及びF0はそれぞれ、特定の時間及び休止条件における蛍光強度である。α、β及びγで示した位置の円形のスポット(直径2μm)におけるF/F0を測定し、対時間でプロットした。黒色線（whole）は細胞の全領域におけるF/F0の変化を示す。パネルAaのスケールは10μmに相当する。(B)：同一細胞のα、β及びγ領域におけるCa2+スパークのイメージ及びF/F0を示す。
【図１０】図１０は、RyR1、RyR2、及びRyR3、並びにIP3R1、IP3R2、及びIP3R3、更に内部標準としてのGAPDHについてそれぞれ設計されたPCR用プライマーの塩基配列を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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