(57)【要約】【課題】  本発明の目的は簡便に簡単な構造で剥離時の細胞への損傷を防ぎ、栄養物の運搬，老廃物排出を促進する細胞培養容器を提供することである。【解決手段】  上記課題を解決するために、本発明は細胞培養容器の表面に相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である突起群が形成されていることを特徴とする。これにより、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進するとともに細胞と容器の接触を点接触にすることにより細胞の剥離時に生じる細胞の損傷を防ぐことのできる細胞培養容器を提供できる。【選択図】図１
2005168494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器において、該細胞培養容器の底面に形成された、相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である突起群を有することを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養容器において、該細胞培養容器の底面に形成された突起群の相当直径が、該細胞培養容器内で培養する細胞の直径よりも小さいことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養容器において、該細胞培養容器の底面に形成された突起群の相当直径が、該細胞培養容器内で培養する細胞の直径の５分の１以下であることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養容器において、該細胞培養容器の底面に形成された突起群の中に、その間隔が該細胞培養容器内で培養する細胞の直径よりも小さいものを含むことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞培養容器において、細胞培養容器と突起群が同一材料であり、一体化されていることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養容器において、細胞培養容器の全体、若しくはその一部に、親水処理，疎水化処理，金属層の形成、又は、有機物質の被覆のいずれか１つ以上の処理が施されていることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞培養容器において、特定の領域に選択的に親水処理，疎水化処理，金属層の形成、又は、有機物質の被覆のいずれかの１つ以上の処理が施されていることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞培養容器において、突起群を構成する個々の突起物に対して選択的に親水処理，疎水化処理，金属層の形成、又は有機物質の被覆のいずれか１つ以上の処理が施されていることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞培養容器において、突起群の先端部のみに親水処理，疎水化処理，金属層の形成、または有機物質の被覆が施されていることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞培養容器において、突起群が細胞培養容器表面に液体を通すことの出来る列状に空いた領域を有することを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１１】
培養液を入れるための容器と、該容器の底面に形成された突起群とを有し、該容器と該突起群とが同一材料であることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１２】
請求項１１の細胞培養容器において、該細胞培養容器の底面に形成された突起群の相当直径が、該細胞培養容器内で培養する細胞の直径よりも小さいことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１３】
請求項１１の細胞培養容器において、該細胞培養容器の底面に形成された突起群の相当直径が、該細胞培養容器内で培養する細胞の直径の５分の１以下であることを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１４】
請求項１１の細胞培養容器において、該細胞培養容器の底面に形成された突起群の中に、その間隔が該細胞培養容器内で培養する細胞の直径よりも小さいものを含むことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１５】
請求項１に記載の培養容器によって培養されたことを特徴とする培養細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養容器とその容器で培養した培養細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療目的に使われる細胞培養の技術が進歩し、実際に皮膚の移植などに用いられている。また、少量の細胞から皮膚などの組織にとどまらず角膜，歯，骨，臓器など複雑な器官へと自家移植や他家移植に向けた培養技術の進歩が見られる。
【０００３】
細胞の培養にはガラス製や樹脂製のペトリシャーレなどの容器が用いられる。例えば、以下のようなペトリシャーレが開示されている。所定の濃度のコラーゲン溶液を、培養容器に、ピペットで表面が一様になるよう分注して塗布した後、１５分〜７２時間乾燥する。あるいは、所定の濃度のコラーゲン溶液を、シリコン膜等の伸縮性を有する培養基材上に塗布し、１５〜４２℃のインキュベーター内で２０〜１２０分間重合させた後、このシリコーン膜等の伸縮性を有する培養基材をＵＶ灯下で１５分〜７２時間放置し、コラーゲンが乾燥した後、リン酸緩衝液で再び湿らせ、その後、１０〜４０％伸展させて固定するなどの手法により細胞培養用シャーレを作成する方法がある（特許文献１参照）。
【０００４】
また、別の細胞培養容器として以下のような培養容器が開示されている。培養容器の底面に温度によって親水性，疎水性の入れ替わるポリマーを塗布し、紫外線照射などで定着させることにより培養後の細胞の剥離に適した培養容器を作ることが出来る（特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１４２７５１号公報（実施例Ａ）
【特許文献２】特開平５−２４４９３８号公報（実施例１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記第一の方法によれば、細胞をその細胞と親和性のあるコラーゲンの上において培養することが出来るが、反面、細胞と培養容器の密着力が強い為に細胞の剥離が困難であった。この密着力に対して、機械的に細胞を剥がすと細胞に物理的な損傷を与え、トリプシンなどの酵素によって化学的な処理を行うと細胞表面の膜タンパク質が破壊されて移植後の細胞の組織への定着率が低下するという問題があった。
【０００７】
上記第２の方法は剥離の問題を培養容器表面の親水性を調整することにより細胞表面の密着力を減少させることで解決することが出来る。しかし、細胞培養容器表面の状態が特定の物質に限定され、そのほかに、例えば様々な細胞に対応した任意の表面状態を作る、培養容器を作るのにかかる時間の短縮，シート状の細胞の中央部への栄養物の運搬と老廃物排出の促進、等の課題が残っていた。
【０００８】
本発明の目的は簡便に簡単な構造で剥離時の細胞への損傷を防ぎ、栄養物の運搬，老廃物排出を促進する細胞培養容器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明の第１は細胞培養容器の底面に相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である突起群が形成された細胞培養容器を特徴とする。これにより、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進するとともに細胞と容器の接触を点接触にすることにより細胞の剥離時に生じる細胞の損傷を防ぐことのできる細胞培養容器を提供するものである。また、栄養物の運搬，老廃物排出をより促進するために、突起群が培養液の流れる隙間を有していることが好ましい。なお、相当直径という語を用いたのは、突起の断面が必ずしも円形ではなく、楕円，多角形，非対称形などの場合があるためで、本発明ではこれらを全て包含するために相当直径を用いている。本発明で相当直径は、突起物底面の断面の直径とする。
【００１０】
細胞培養容器の表面は培養液を行き渡らせるために親水性に処理する必要がある。しかし、培養する細胞の種類によっては容器表面を疎水性に処理をすることや、容器表面を金属やタンパク質などで覆うことが必要となることがある。このため、本発明は細胞培養容器に形成された突起群が細胞と接する先端部のみに細胞培養に必要な疎水化処理，金属によるコート，タンパク質によるコートなど細胞培養に必要な処理を施した細胞培養容器を提供するものである。
【００１１】
また、培養する細胞に配向性など、特定の形状を求める場合には培養する細胞の形状に応じて疎水処理などの特定の処理を細胞培養容器の底面に部分的に処理することがある。本発明は細胞培養容器表面の突起群の先端部に対して施す疎水性，金属によるコート，タンパク質によるコートなど細胞培養に必要な処理を容器表面に選択的に施した細胞培養容器を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明を適用することにより、簡便に簡単な構造で剥離時の細胞への損傷を防ぎ、栄養物の運搬，老廃物排出を促進する細胞培養容器を提供できる。突起群を用いた形状効果で上記の効果を出しているため、形成プロセスを簡便にすることができ、従来に比べて新たな薬品や処理装置の導入も無いことから新しく廃棄方法を考慮する必要がないという効果を得ることもできた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照しながら本発明の細胞培養容器について詳細に説明する。
【００１４】
図１は本発明における細胞培養容器１００を示す鳥瞰図である。細胞、及びその培養液を入れる容器１００の底面に相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０
ｎｍ以上１mm以下である突起物集合体１０１が形成されている。また、突起物集合体101の中には培養液を流れやすくするための隙間１０３が形成されている。
【００１５】
図１の突起物集合体１０１の相当直径は、細胞との接触面積を減らすために細胞の直径よりも十分に小さく、例えば細胞の直径の５分の１以下に設定される。また、突起物の下部に十分に培養液を浸透させる必要があるためこれらの突起物の高さは十分に、例えば相当直径以上、より好ましくは相当直径の５倍以上であることが好まれる。しかし、構造強度的な観点からは１００倍以下が好まれる。
【００１６】
図２は本発明における細胞培養容器１００に対して突起群の先端への表面処理を行った後の状態を示す鳥瞰図である。細胞、及びその培養液を入れる容器１００の底面に相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である突起物集合体１０１が形成されており、その突起物の先端部のみに疎水化処理，金属によるコート，タンパク質によるコートなど細胞培養に必要な処理１０２が施されている。
【００１７】
図３は本発明における細胞培養容器１００に対して突起物の先端部の一部への表面処理を行った後の状態を示す鳥瞰図である。細胞、及びその培養液を入れる容器１００の底面に相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である突起物集合体１０１が形成されており、その突起物の一部の先端部に細胞培養に必要な疎水化処理，金属によるコート，タンパク質によるコートなど細胞培養に必要な処理１０２を施されている。
【００１８】
本発明における細胞培養容器１００の材質は特に限定されないが、所望する加工精度，表面特性，光学特性，強度などに応じて、選択される。具体的には、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリビニルアルコール，ポリ塩化ビニリデン，ポリエチレンテレフタレート，ポリ塩化ビニール，ポリスチレン，ＡＢＳ樹脂，ＡＳ樹脂，アクリル樹脂，ポリアミド，ポリアセタール，ポリブチレンテレフタレート，ガラス強化ポリエチレンテレフタレート，ポリカーボネート，変性ポリフェニレンエーテル，ポリフェニレンスルフィド，ポリエーテルエーテルケトン，液晶性ポリマー，フッ素樹脂，ポリアレート，ポリスルホン，ポリエーテルスルホン，ポリアミドイミド，ポリエーテルイミド，熱可塑性ポリイミド等の熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂，メラミン樹脂，ユリア樹脂，エポキシ樹脂，不飽和ポリエステル樹脂，アルキド樹脂，シリコーン樹脂，ジアリルフタレート樹脂，ポリアミドビスマレイミド，ポリビスアミドトリアゾール等の熱硬化性樹脂、及びこれらを２種以上ブレンドした材料を用いることが可能である。また、この他に石英，ガラス類などの無機物も使用することが可能である。
【００１９】
本発明における突起物集合体１０１の材質は特に限定されないが、やはり所望する加工精度，表面特性，光学特性，強度などに応じて前述の樹脂組成物、若しくは石英，ガラス類など無機物よりなる。突起群の強度が問題となる場合はこれらの突起群が細胞培養容器と同じ材料でできており、一体化されていることが好まれる。
【００２０】
本発明における細胞培養容器の底面に突起群を形成する手法を図４に示す。容器４０１を加熱して軟化し、その容器４０１に微細な凹凸パターンが形成された金型４０２を押し付けることにより、金型４０２の微細形状４０３を容器４０１に転写し、突起群を形成した細胞培養容器１００を得ることができる。
【００２１】
金型４０２上の微細形状４０３は細胞培養容器４００上の突起群を前述の効果を与えるのに必要な大きさ，相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下であることが求められる。このため、金型は金属，カーボンやシリコンなどの無機物、及び樹脂組成物の少なくとも１つを含み、その表面形状は光リソグラフィ法，電子線直接描画法，粒子線ビーム加工法，走査プローブ加工法などの微細加工法や微粒子の自己組織化、又はこれらの手法により形成されたマスタよりナノプリント法，射出成型法，無電解めっき法などにより形状転写することにより形成される。また、図４では突起群を形成する手法として軟化した容器に金型を押し付けるいわゆるナノプリント法を用いたが、これ以外の射出成型法を代表とする樹脂の成型法や、金型を用いずレーザ加工法などで直接加工することも可能であるのは明らかである。
【００２２】
本発明において、細胞培養容器は必要に応じて過酸化水素やオゾンなどの酸化剤を含む溶媒を用いた溶媒への浸漬や紫外線照射，プラズマ処理などの気相処理などによる親水化処理や、溶液への浸漬などによるタンパクによるコート、若しくはめっき，気相蒸着法による金属コート，光や電子線，粒子線などによる表面改質が行われ、細胞培養に必要な表面処理が施される。
【００２３】
続いて本発明における突起群の先端のみへの表面修飾法を図５を用いて説明する。突起群を形成し、全面に必要な表面処理が施された細胞培養容器１００に対し、処理剤５０３を表面に付着したスタンプ５０２を密着させ、必要なら加熱，光照射などを施すことにより、スタンプ５０２と接触した突起物集合体１０１の先端部のみに所望の表面処理５０１を施すことができる。
【００２４】
スタンプ５０２は細胞培養容器１００表面の多くの突起物集合体１０１に均等に密着する必要がある。そのため、スタンプ５０２は必要な弾性を有するシリコーンゴム，樹脂フィルム，金属薄膜などの弾性体よりなることが望ましい。また、ここで図６に示すようにスタンプ５０２に凹凸６０１を形成しておくことにより、突起群先端部への処理の分布を形成することができる。
【００２５】
処理剤５０３としては樹脂ペースト，シリコーングリス，フッ素系コート剤などの疎水化剤やタンパクを含有する溶媒が挙げられる。処理剤５０３をスタンプ５０２に塗布する際に処理剤の有無，濃度などで面内分布をつけることによっても突起群先端部への処理の分布を形成することができる。また、加熱などにより直接突起物集合体１０１の先端部を変化させる場合は処理剤５０３を省くことができる。
【００２６】
図７に本発明における細胞培養容器１００の使用法を示す。細胞培養容器１００内部を培養液７０１で満たし、突起物集合体１０１の上に細胞７０２を配置する。この後、常法により細胞７０２を培養する。本発明の細胞培養容器１００では、細胞７０２と容器との接触が点接触となるため、細胞７０２の剥離時に生じる損傷を防ぐことができる。また、突起物集合体１０１の形状や突起物集合体１０１の表面処理を、培養する細胞７０２によって変化させることにより、品質の良い培養細胞を剥離時の損傷なしに形成できる。なお、培養細胞とは、培養組織，器官に代表される組織化された培養細胞をも含む概念である。
【００２７】
以下、実施例により本発明をさらに詳述する。
【実施例１】
【００２８】
以下、本発明の一実施例を説明する。図８は本実施例で作製した突起物集合体１０１の走査型電子顕微鏡写真の模式図である。突起物集合体１０１は複数の柱状微小突起物801から成る。柱状微小突起物８０１の材質はポリスチレンで分子量は２０００から６０万であり、更に分子量の上限は６００万まで拡張することができる。
【００２９】
図９は突起物集合体１０１を拡大した走査型電子顕微鏡写真の模式図である。柱状微小突起物８０１の高さは３μｍ、一辺の長さは根元で３００ｎｍである。柱状微小突起物
８０１は上部約１μｍの部分は平滑な表面状態であり、根元から約２μｍの部分の表面は縞模様である。
【００３０】
また、柱状微小突起物８０１は底面の一辺が３００ｎｍで高さが３μｍなので高さと一辺の比は１０となり、１より大きいことが分かる。
【００３１】
また、柱状微小突起物８０１は先端部が底面部より小さくなっており、末広がり状であることが分かる。本実施例では、柱状微小突起物８０１の形状は根本から先端にかけて細くなっていく形状であるが、例えば、根本から先端にかけて細くなり先端部に太い部分を有するきのこのような形状でもよい。本発明の柱状微小突起物８０１は、根本から先端部にかけて細くなる部分を有することを特徴の一つとしている。
【００３２】
また、柱状微小突起物８０１は下地８０２と同じポリスチレンでできている。
【００３３】
また、柱状微小突起物８０１は下地８０２に接続されており、一体化していることが分かる。
【００３４】
また、突起物の先端部が突起物の底面部より小さく末広がり状であるため、突起物が基板から取れにくい効果を得られる。また、突起物が下地の材料と同じであるため突起物が下地から取れにくい効果を得られる。また、突起物が基板と一体化しているため基板から取れにくい効果を得られる。
【００３５】
なお、本実施例では、柱状微小突起物８０１と底面８０２の材料はポリスチレンを用いたが、細胞培養容器の材質として先に例示した材料を用いてもよい。
【００３６】
上述の柱状微小突起物８０１は以下に述べる方法で作製した。図１０は柱状微小突起物８０１の製造工程である。容器４０１を１００℃に加熱し、表面に直径０.５μｍ ，深さ１.０μｍの微細孔が１.０μｍピッチで全面に形成された金型４０２をプレス圧力４MPaで３００ｓ間プレスした。プレス装置内にて７０℃に冷却後に金型４０２と容器４０１をプレス装置より取り出し、金型４０２を容器４０１から垂直に引き上げることで剥離し、柱状微小突起物８０１を有する細胞培養容器１００を作製した。金型４０２は結晶方位
(１００)，直径２５mmのシリコンウエハであり、成型時における容器４０１との接着を防止する為にフッ素系の離型剤により離型処理を施した柱状微小突起物８０１のアスペクト比は金型４０２の凹凸のアスペクト比の約３倍である。このような高アスペクト比の構造はアスペクト比の大きい凹凸を金型４０２に形成することによっても細胞培養容器１００上に形成できるが、本実施例の手法を用いれば高いアスペクト比の柱状微小突起物８０１を比較的作成が容易である低アスペクト比の金型４０２から形成できる効果を得られる。
【００３７】
なお、本実施例では、ポリスチレンを容器４０１に用いたが、容器４０１はポリスチレンに限らず例えばポリカーボネートなどの有機物，ガラスなどの無機物、あるいはこれらの積層構造体でもよい。
【００３８】
また、本実施例では、金型４０２に結晶方位（１００），直径２５ミリメートルのシリコンウエハを用いたが、特に結晶方位が（１００）であったり、材質が単結晶シリコンである必要はなく、ニッケルなどの金属薄膜やＰＤＭＳ（polydimethylsiloxane）などの有機物でもよい。また、加熱した容器４０１より金型４０２を離型する際の容器４０１や柱状微小突起物８０１への損傷を防ぐため金型４０２にはフッ素系、若しくはシリコーン系などの離型剤によりコートされていることが望ましい。
【００３９】
また、金型４０２の凹部の深さや容器４０１の材質を調整することで柱状微小突起物
８０１の直径や高さを制御できる。
【００４０】
また、金型４０２の凹部の開口面積を大きくすることで柱状微小突起物８０１の底部の大きさを制御できる。
【００４１】
さらに、金型４０２の凹部の位置を制御することで柱状微小突起物８０１を形成する位置を制御できる。
【００４２】
また、柱状微小突起物８０１の材料を熱可塑性にすることで、柱状微小突起物８０１の形成時の温度を調整することで柱状微小突起物８０１の形状を容易に制御できる効果を得られることは明らかである。
【００４３】
また、柱状微小突起物８０１の材料を光硬化性にすることで、柱状微小突起物８０１の形成時に光を入射させることで柱状微小突起物８０１の形状を容易に制御できる効果を得られることは明らかである。
【実施例２】
【００４４】
以下、本発明の他の実施例を説明する。図１は本実施例で作製した細胞培養容器１００を示した鳥瞰図である。細胞培養容器１００は、厚さ２mmのポリスチレンを主成分とした直径３５mmのシャーレ状の形状を有している。細胞培養容器１００の底面には、実施例１で示した手法を用いて直径３０mmの領域に突起物集合体１０１を形成している。また、突起物集合体１０１の形成後に親水化処理として酸素プラズマ処理（１００Ｗ，３０ｓ）を施した。この突起物集合体１０１の先端部に、５０μｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液
（Cultrex Bovine Collagen I（登録商標）、溶媒：０.０２Ｍ酢酸水溶液）を突起物集合体１０１の高さよりも薄くコートさせた表面親水化ＰＤＭＳ製の平滑スタンプを密着させ、突起物集合体１０１の先端部のみコラーゲンＩ溶液を付着させた。平滑スタンプを除いた後に室温にて１時間保持してＰＢＳ（リン酸緩衝液）で洗浄することで、突起物集合体１０１の先端部のみにコラーゲンによる修飾を加え、細胞培養に適した表面処理を行った。
【００４５】
本実施例では、ポリスチレンを細胞培養容器１００に用いたが、ポリスチレンに限らず、施される表面処理との親和性があれば例えばポリカーボネートなどの有機物，ガラスなどの無機物、あるいはこれらの積層構造体でもよい。また、細胞培養容器１００の大きさを直径３５mm，突起物集合体１０１の形成領域を直径３０mmとしたが、これは培養する細胞の大きさに応じて変えられる。また、突起物集合体１０１は隙間１０３を設けて配置することが好ましく、本実施例では図１に示したよう十字形状に隙間１０３を設けている。このように隙間１０３を形成することで培養液が流れやすくなり細胞に対して効率良く栄養素を供給することができる。また、細胞培養時の細胞の老廃物を効率良く排出することができる。
【００４６】
また、本実施例では突起物集合体１０１の形成後にタンパクの一種であるコラーゲンによる修飾を行ったが、この手法に限られず、培養を行う細胞の種類、及び細胞培養容器
１００、及び突起物集合体１０１の材質に応じて酸素プラズマ処理（例えば１００Ｗ，
３０ｓ），紫外線照射，過酸化水素水，オゾン水への浸漬などによる親水化処理，アミノ基，カルボキシル基，メチル基，ＣＦ3 基などに代表される官能基の導入など適宜異なる表面処理を施すこともできる。また、この表面処理を図５，図６に示す方法で突起物集合体１０１の一部にのみ施すことによって培養する細胞の形状を制御することができる。
【実施例３】
【００４７】
以下、本発明の細胞培養容器１００を用いて細胞を培養した例を示す。図７は本実施例２で作製した細胞培養容器１００を用いて細胞を培養している様子を表す模式図である。
【００４８】
細胞培養容器１００に培養液を浸した状態で入れ、細胞培養容器１００内にて、常法により正常ヒト表皮角化細胞を培養した（使用培地：HuMedia−ＫＢ２（クラボウ(株) 製。３７℃，５％ＣＯ2 下）。その結果、細胞培養容器１００上において表皮角化細胞は正常に付着し、シート形状に増殖した。
【００４９】
培養開始の１４日後、培養した細胞の上に直径２cmのポリビニリデンジフルオライド
（ＰＶＤＦ）膜をかぶせて、培地を吸引することによって、細胞培養容器１００上に成長したシート状の表皮角化細胞を、ＰＶＤＦ膜と共に細胞培養容器１００から剥離した。このシート状の表皮角化細胞はかぶせたＰＶＤＦ膜から容易に剥がすことができた。細胞培養容器１００からの剥離によるこのシート状の表皮角化細胞への損傷は通常のガラスシャーレなどを使用した場合に比べて大幅に軽減することができた。
【実施例４】
【００５０】
以下、本発明の細胞培養容器１００を用いて細胞を培養し、細胞の剥離性が向上した例を示す。
【００５１】
図１１は実施例１の手法を用いて本実施例で作製した細胞培養容器１００の形状例である。図１２は細胞培養容器１００上の突起物集合体１０１を構成する柱状微小突起物801の拡大図である。本実施例では培養した細胞の剥離性と突起物集合体１０１を構成する柱状微小突起物８０１の形状の関係を調べるために、柱状微小突起物８０１の直径Ｒを180ｎｍ，２４０ｎｍ，５００ｎｍ，２μｍの４通りとした４つの細胞培養容器１００を形成した。形成した柱状微小突起物８０１の高さＨは４つの細胞培養容器１００において全て３μｍである。柱状微小突起物８０１の配列は図１１，図１２に示すように２次元正方格子状であり、隣り合う柱状微小突起物８０１の間隔Ｄは直径Ｒの２倍である。
【００５２】
剥離性の評価のために、それぞれの細胞培養容器１００上でヒト間葉系幹細胞(CAMBREX社、Cyro hMSC  No.2051) を培地（CAMBREX社、ブレットキットMSCGM（間葉系幹細胞増殖用培地））中に播種し、３７℃・５％ＣＯ2 下のインキュータ内で５日間培養した。比較のために一般的に用いられる動物細胞培養用ディッシュ（Corning社）においても同様の条件でヒト間葉系幹細胞を培養した。
【００５３】
剥離性は、５日間培養後の細胞培養容器１００上のヒト間葉系幹細胞を培地中に発生させた水流によって剥離することで評価した。水流は２５０μｌ用電動ピペット（EDP plusEP-250）に容量２００μｌのピペットチップを装着して、細胞培養容器１００の底面近傍から底面に対して７０度の角度で培養に用いている培地を吐出することによって発生させた。
【００５４】
顕微鏡観察下で、培地を１回吐出して細胞培養容器１００上の細胞の剥がれを観察した結果を表１に示す。本発明で形成したいずれの細胞培養容器１００においても、比較例として用いた動物細胞培養用ディッシュと比較してヒト間葉系幹細胞の剥離性が増すことが確認された。細胞培養容器１００からのヒト間葉系幹細胞の剥離性は柱状微小突起物801の直径Ｒに依存し、直径が大きいＲ＝２μｍの時に剥離能は最も大きくなることが示された。このことから、接着性細胞であるヒト間葉系幹細胞の接着力は柱状微小突起物８０１上では小さくなり、剥離性に優れることが示された。
【００５５】
【表１】
2005168494.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明による細胞培養容器の一例を示す模式図。
【図２】本発明による細胞培養容器の別の一例を示す模式図。
【図３】本発明による細胞培養容器の第３の例を示す模式図。
【図４】細胞培養容器表面に突起群を形成する手法を示す模式図。
【図５】突起群の先端のみへの表面修飾法を示す模式図。
【図６】突起群先端部への処理の分布を形成する修飾法を示す模式図。
【図７】本発明における細胞培養容器の使用法を示す模式図。
【図８】第１の実施例において作製した突起物集合体の走査型電子顕微鏡写真の模式図。
【図９】突起物集合体を拡大した走査型電子顕微鏡写真を示す模式図。
【図１０】柱状微小突起物の製造工程を示す模式図。
【図１１】第４の実施例において作製した細胞培養容器の一例を示す模式図。
【図１２】第４の実施例において作製した細胞培養容器上の柱状微小突起物の拡大図を示す模式図。
【符号の説明】
【００５７】
１００…細胞培養容器、１０１…突起物集合体、１０２，５０１…表面処理、４０１…容器、４０２…金型、４０３…金型の形状、５０２…スタンプ、５０３…表面処理剤、
７０１…培養液、７０２…細胞、８０１…柱状微小突起物、８０２…下地。
【図１】
2005168494.tif 000004
【図２】
2005168494.tif 000005
【図３】
2005168494.tif 000006
【図４】
2005168494.tif 000007
【図５】
2005168494.tif 000008
【図６】
2005168494.tif 000009
【図７】
2005168494.tif 000010
【図８】
2005168494.tif 000011
【図９】
2005168494.tif 000012
【図１０】
2005168494.tif 000013
【図１１】
2005168494.tif 000014
【図１２】
2005168494.tif 000015