(57)【要約】【課題】  遺伝的改変によって転写されたｍＲＮＡの安定化及び蛋白質折りたたみ効率が高められた組換え蛋白質生産用バクテリア宿主を提供し、またこのバクテリア宿主を用いた組換え蛋白質の製造方法を提供すること。【解決手段】  ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつ分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子が補充されていることを特徴とするバクテリア。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつ分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子が補充されていることを特徴とするバクテリア。
【請求項２】
ｍＲＮＡ分解の抑制が、ヌクレアーゼ活性の抑制により行われる請求項１記載のバクテリア。
【請求項３】
ｍＲＮＡ分解の抑制が、産生されるＲＮａｓｅＥのＣ末端ドメイン（４７７アミノ酸）の一部又は全部の欠損又はアミノ酸置換により行われる請求項１又は２記載のバクテリア。
【請求項４】
分子シャペロン又はその部分ペプチドの補充が、該分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子の導入により行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバクテリア。
【請求項５】
少なくとも１つの分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを有し、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするバクテリア。
【請求項６】
プラスミドがゲノム当たり１５コピー以上複製され得るものである請求項５記載のバクテリア。
【請求項７】
分子シャペロンが、シャペロニン、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ２５、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロティンディスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１〜６のいずれか１項に記載のバクテリア。
【請求項８】
バクテリアが大腸菌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバクテリア。
【請求項９】
以下の工程：
（ａ）バクテリアにおいてｍＲＮＡ分解を抑制させる工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいて分子シャペロン又はその部分ペプチドを補充する工程；
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバクテリアを製造する方法。
【請求項１０】
以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドをバクテリアに導入する工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
を含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載のバクテリアを製造する方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のバクテリアに目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】
目的蛋白質又はペプチドが膜蛋白質である、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のバクテリアの粗抽出物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１１又は１２記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的蛋白質又はペ
プチドを回収することを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドの製造方法。
【請求項１５】
目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子を、少なくとも１つの分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子と共発現することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
目的蛋白質又はペプチドを、少なくとも１つの分子シャペロン又はその部分ペプチドとの融合蛋白質として発現することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
目的蛋白質又はペプチドが分子シャペロン又はその部分ペプチドのＣ末端側に融合する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において、請求項１３記載の組成物を用いて目的蛋白質又はペ
プチドを産生することを特徴とする、目的蛋白質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が、真核生物由来ｃＤＮＡの全長配列、又は６残基以上のアミノ酸配列をコードするその部分配列である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法により製造された目的蛋白質若しくはペプチド、請求項１１若しくは１２記載の形質転換体若しくはその膜画分成分、又は請求項１３記載の組成物のいずれかを動物に免疫する工程を含むことを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドに対する抗体の作製方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法によって得られる抗体。
【請求項２２】
請求項２０に記載される免疫動物より抗体遺伝子を分離する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質又はペプチドに対する抗体をコードする遺伝子の調製方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって得られる抗体遺伝子、及び抗体の抗原認識領域の６残基以上のペプチドをコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え蛋白質生産に利用できる、新規な遺伝的改変が施された宿主バクテリア、及び該バクテリアを用いた蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主微生物、特に大腸菌などのバクテリアにおける組換え蛋白質の発現効率を向上させるため、これまでに転写・翻訳・ポリペプチドの折りたたみといった成熟蛋白質に到達するまでの様々の過程を改善する目的で、遺伝子工学的な手法による改善が試みられている（Ｂａｎｅｙｘ，Ｆ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９９  １０，４１１−４２１）。
【０００３】
例えば、分子量サイズの大きいポリペプチドを生産しようとする場合には、発現されたｍＲＮＡが分解されることがあるが、組換え蛋白質の生産においてこのｍＲＮＡの分解を抑制することは有効な手段である。これに関して、バクテリアでのｍＲＮＡの分解に関与する特定因子のリボヌクレアーゼ活性を低下させる技術が報告されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
また、バクテリア宿主で特に真核生物由来の蛋白質を大量発現した場合には、この蛋白質は可溶化が困難な封入体（不溶性凝集体）として発現してしまう傾向がある。この解決手段として、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（非特許文献２）やチオレドキシン（非特許文献３）、マルトース結合蛋白質（非特許文献４）等との融合蛋白質として発現したり、目的蛋白質を蛋白質の折り畳み反応を支援する蛋白質群である分子シャペロンと共発現させる（非特許文献５）ことで、目的蛋白質を可溶性画分に発現させることに成功している。また近年、分子シャペロンの代表的蛋白質であり、７−９の回転対称性リング構造を形成するシャペロニンのサブユニットの数回連結体と目的蛋白質を融合蛋白質として発現させると、シャペロニンサブユニットの会合によって、目的蛋白質はシャペロニンが有するキャビティ内部に格納された状態で発現し、細胞質環境から隔離されることで、宿主生物への毒性、封入体の形成及び宿主プロテアーゼによる分解といった殆ど全ての問題を解消することができることが報告されている（特許文献１）。
【０００５】
以上のように、バクテリア宿主での蛋白質大量発現の問題点を解消する目的で、ｍＲＮＡ分解抑制あるいは蛋白質折り畳みといった側面から個々に改変された例はあるが、両方の遺伝子工学的改変を施した大腸菌で目的蛋白質を大量発現させる技術はこれまでになかった。従って、当該技術分野においては、蛋白質を高効率に生産するための方法及びツールが望まれていた。
【特許文献１】ＷＯ００／０８１８３号パンフレット
【非特許文献１】Ｂａｃａ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｈｏｌ， Ｗ．Ｇ．Ｊ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ３０， １１３−１１８ （２０００）
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６７，  ３１−４０（１９８８）
【非特許文献３】Ｌａｖａｌｌｉｅ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，１８７−１９３（１９９３）
【非特許文献４】Ｇｕａｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６７，２１−３０（１９８８）
【非特許文献５】Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｙ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１６９４−１６９９（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遺伝的改変によって転写されたｍＲＮＡの安定化及び蛋白質折りたたみ効率が高められた組換え蛋白質生産用バクテリア宿主を提供し、またこのバクテリア宿主を用いた組換え蛋白質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バクテリアにおけるｍＲＮＡの分解を抑制する遺伝的改変をバクテリアに施し、さらに分子シャペロンの共存下にて目的とする蛋白質を発現させることによって、その蛋白質生産効率が改善され、かつ正確な折りたたみを有する蛋白質が可溶性画分に産生されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）を提供する。
（１）ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつ分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子が補充されていることを特徴とするバクテリア。
上記バクテリアにおいて、ｍＲＮＡ分解の抑制は、例えば、ヌクレアーゼ活性の抑制により、具体的には、産生されるＲＮａｓｅＥのＣ末端ドメイン（４７７アミノ酸）の一部又は全部の欠損又はアミノ酸置換により行うことができる。
また、分子シャペロン又はその部分ペプチドの補充は、例えば、該分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子の導入により行うことができる。
【０００９】
（２）少なくとも１つの分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを有し、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするバクテリア。
上記バクテリアにおいて、プラスミドはゲノム当たり１５コピー以上複製され得るものであることが好ましい。
また、分子シャペロンは、シャペロニン、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ２５、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロティンジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンからなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
上記（１）〜（２）のバクテリアとしては、例えば大腸菌が挙げられる。
【００１０】
（３）以下の工程を含む、上記（１）又は（２）のバクテリアを製造する方法。
（ａ）バクテリアにおいてｍＲＮＡ分解を抑制させる工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいて分子シャペロン又はその部分ペプチドを補充する工程
【００１１】
（４）以下の工程を含む、上記（２）のバクテリアを製造する方法。
（ａ）少なくとも１つの分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドをバクテリアに導入する工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程
【００１２】
（５）上記（１）又は（２）のバクテリアに目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
上記形質転換体において、目的蛋白質又はペプチドとしては、例えば膜蛋白質などが挙げられる。
（６）上記（１）又は（２）のバクテリアの粗抽出物を含むことを特徴とする組成物。
【００１３】
（７）上記（５）の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的蛋白質又はペプチドを回収することを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドの製造方法。
上記方法においては、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子を、少なくとも１つの分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子と共発現してもよいし、あるいは目的蛋白質又はペプチドを、少なくとも１つの分子シャペロン又はその部分ペプチドとの融合蛋白質として発現してもよい。融合蛋白質として発現させる場合には、例えば目的蛋白質又はペプチドを分子シャペロン又はその部分ペプチドのＣ末端側に融合させることができる。
（８）ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において、上記（６）の組成物を用いて目的蛋白質又はペ
プチドを産生することを特徴とする、目的蛋白質又はポリペプチドの製造方法。
上記（７）又は（８）の方法において、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子は、真核生物由来ｃＤＮＡの全長配列、又は６残基以上のアミノ酸配列をコードするその部分配列とすることができる。
【００１４】
（９）上記（７）又は（８）の方法により製造された目的蛋白質若しくはペプチド、上記（５）の形質転換体若しくはその膜画分成分、又は上記（６）の組成物のいずれかを動物に免疫する工程を含むことを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドに対する抗体の作製方法。
【００１５】
（１０）上記（９）の方法によって得られる抗体。
（１１）上記（９）に記載される免疫動物より抗体遺伝子を分離する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質又はペプチドに対する抗体をコードする遺伝子の調製方法。
（１２）上記（１１）の方法によって得られる抗体遺伝子、及び抗体の抗原認識領域の６残基以上のペプチドをコードする遺伝子。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつ分子シャペロンを含むバクテリアが提供される。このバクテリアは、所望の蛋白質又はペプチドを、正確な配列及び折りたたみを保ち、かつ高効率に生産するために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の新規なバクテリアは、ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつ分子シャペロン又はその部分ペプチドをコードする遺伝子が補充されていることを特徴とするものであり、これを目的蛋白質又はペプチドの遺伝子組換え手法による製造に用いた場合には、該目的蛋白質又はペプチドを高効率に製造することができる。
【００１８】
１．バクテリア及びその製造
（１）バクテリア
本発明において使用するバクテリアとしては、蛋白質生産に利用されている一般的なバクテリアであれば特に限定されるものではなく、例えば、大腸菌、枯草菌等が含まれる。本発明においては、簡便性の点から大腸菌を使用することが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。
【００１９】
（２）ｍＲＮＡ安定化
組換え蛋白質の生産においてｍＲＮＡの分解を抑制し、ｍＲＮＡを安定化させることは組換えポリペプチドの生産性を向上させるための有効な手段である。ｍＲＮＡの分解を抑制するには、例えばｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質の活性を抑制することが挙げられる。例えばそのような活性としてはヌクレアーゼ活性があり、このヌクレアーゼ活性を抑制することによってｍＲＮＡを安定化させることができる。
【００２０】
バクテリアにおけるｍＲＮＡの分解には、デグラダゾームと呼ばれるヌクレアーゼ活性を有する蛋白質複合体が主に関与していると考えられている（Ｍａｒｉａｎｎｅ  Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ，Ａｎｎｕ. Ｒｅｖ.Ｇｅｎｅｔ. １９９９，３３， １９３−２２７）。従って、このデグラダゾームのｍＲＮＡ分解活性を抑制（欠損又は低下）させることによって、ｍＲＮＡを安定化させることが可能である。デクラダゾームは、主にＲＮａｓｅＥ、ＰＮＰａｓｅ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓ
ｅ）、ヘリカーゼ活性を有するＲｈｌＢ、及びエノラーゼなどの蛋白質により構成されている。ＲＮａｓｅＥ（１０６１アミノ酸）のＣ末端ドメイン（４７７アミノ酸）は、デグラダゾームの他の蛋白質の集合の足場となっており、またＮ末端ドメイン（５８４アミノ酸）は、単独でエンドヌクレアーゼ活性を有し、ｍＲＮＡのプロセッシンングに関与し、またバクテリアの生育に必要である。以上のことから、バクテリアのｍＲＮＡの分解活性を抑制するには、例えば、以下に示すＬｏｐｅｔｚらの知見を利用することが挙げられる。Ｌｏｐｅｔｚらは、ＲＮａｓｅＥのＣ末端側４７７アミノ酸が欠損した大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株（ｒｎｅ１３１変異株）では、ｍＲＮＡの分解が抑制されたことを報告し
ている（Ｌｏｐｅｔｚ Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９９， ３３（１）， １８８−１９９）。すなわち、ＲＮａｓｅＥのＣ末端ドメインの全部又は一部を欠損又はアミノ酸置換することにより、このＲＮａｓｅのｍＲＮＡ分解活性を抑制することができる。このような蛋白質の全部又は一部の欠損及びアミノ酸置換手法は当技術分野で周知である。例えば、ＲＮａｓｅＥ以外のｍＲＮＡ分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させることにより、蛋白質の全部又は一部を欠損させたり、アミノ酸を置換させたりすることができる。このような遺伝子の欠損及び変異手法もまた当技術分野では周知である。
以上のようにｍＲＮＡ分解が抑制されたバクテリアは、発現されたｍＲＮＡの分解が低減し、例えば分子量の大きい蛋白質又はペプチドであっても高効率で生産することができる。
【００２１】
（３）分子シャペロン様活性を有する蛋白質の存在
本発明は、上述したように、ｍＲＮＡの分解が抑制されているバクテリア宿主を提供し、該バクテリアを用いることにより、蛋白質又はペプチドの高効率生産を達成することができる（蛋白質製造に関しては、「４．目的蛋白質及びペプチドの製造」の項を参照されたい）。
【００２２】
しかしながら、一般的に特に真核生物由来の蛋白質又はペプチドをバクテリアにて大量発現しようとした場合には、その蛋白質又はペプチドが不活性な不溶性凝集体となってしまうことが多い。一度形成された不溶性凝集体を可溶化させて活性体を高効率で回収するための手段は現在はあまり有効ではなく、また非効率でもある。そのため本発明が提供するバクテリアを宿主として用いた場合でも、不溶性凝集体形成の問題は解消できない場合があると考えられる。従って、本発明は、そのような蛋白質又はペプチドを生産させる場合に可溶性画分への蛋白質又はペプチドの生産効率を向上させる目的で、さらに、バクテリア宿主内で、目的蛋白質又はペプチドを、蛋白質の折りたたみに関与する蛋白質因子と共発現させたり、該蛋白質因子との融合蛋白質として発現させる技術をも包含する。
【００２３】
生体内には、新生ポリペプチドが正常に折りたたまれて成熟蛋白質に至るまでの過程を支援している蛋白質群が存在し、これらは、分子シャペロン（Ｈａｒｔｌ，ＦＵ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，１８５２；Ｔｈｏｍａｓ，ＪＤ  ｅｔ  ａ
ｌ．，１９９７，Ａｐｐｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６，１９７）、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（以下、ＰＰＩａｓｅとも称する）、ジスルフィドイソメラーゼ（以下、Ｄｓｂとも称する）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（以下、ＰＤＩとも称する）及びチオレドキシンである。分子シャペロンは、ＡＴＰ
の存在下及び非存在下で不安定な折りたたみ中間体に結合し、蛋白質の凝集形成を抑制する作用がある。分子シャペロンには、シャペロニン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥ、並びにその他の熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）群が含まれる。一方、蛋白質又はペプチドにおけるプロリンのＮ末端側のペプチド結合は、トランス異性体よりも安定なシス異性体をとる場合があり、シス異性体の形成は蛋白質の立体構造形成で重要な役割を果たす。プロリン残基の立体異性化反応は蛋白質折りたたみ過程の律速段階であるが、これを触媒する酵素がＰＰＩａｓｅである。また蛋白質の構造形成過程でシステインを介したジスルフィド結合の形成・交換反応も重要であり、ＰＤＩ、Ｄｓｂ及びチオレドキシンがこれを触媒することが知られている。また、興味深いことに、一部のＰＰＩａｓｅ及びＰＤＩは本来の機能とは独立して、蛋白質の折りたたみ中間体に結合することにより、分子シャペロンのように、蛋白質の凝集形成を抑制することが知られている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，４５３；Ｓｏｎｇ，ＪＬ．，
１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１，３１２）。近年では、ＰＰＩａｓｅ、Ｄｓｂ、ＰＤＩ及びチオレドキシンも分子シャペロンの１種とみなされている（本発明では、分子シャペロン、ＰＰＩａｓｅ、Ｄｓｂ、ＰＤＩ及びチオレドキシンを一括して「分子シャペロン」と称する）。
【００２４】
すなわち、本発明では、バクテリア宿主としてｍＲＮＡ分解を抑制するだけではなく、分子シャペロンに属する蛋白質又はシャペロン活性を保持したこれらの部分ペプチドと、目的蛋白質又はペプチドとを共発現させる、又はこれらを融合蛋白質として発現させることをも含む。本発明においては、上記共発現又は融合蛋白質としての発現のいずれでもよい。例えば、目的蛋白質又はペプチドを分子シャペロンとの融合蛋白質として発現させることにより、それらを時空間的に接近させることができることから、不溶性凝集体形成の抑制効果が高いと考えられ、その点からは融合蛋白質としての発現が好ましい。一方、融合蛋白質として発現させる場合は、分子シャペロンと目的蛋白質又はペプチドを、これらの間に介在する配列を特異的に切断するプロテアーゼによって切断する工程を必要とするため、共発現法で不溶性凝集体形成を抑制できる場合には、融合蛋白質として発現させる必要はない。従って、目的蛋白質又はペプチドの性質に応じて共発現と融合蛋白質としての発現を使い分ければよい。
【００２５】
共発現法を行う場合、目的蛋白質若しくはペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミド（「２．形質転換体」の項を参照）に分子シャペロン蛋白質をコードする遺伝子の発現ユニットを含有させることで、本発明の意図する効果を達成することが可能である。また、互いに複製部位の異なる２種のプラスミドを用いることも可能である。例えば、目的蛋白質又はペプチドの発現は、複製部位がＣｏｌＥ１由来であるプラスミド、そして分子シャペロンの発現は複製部位がＰ１５Ａ由来であるプラスミドを使用することができる。これらのプラスミドに互いに異なる薬剤耐性遺伝子を含ませることで２種のプラスミドをバクテリア内部で安定的に複製させることが可能である。
【００２６】
本発明で使用できる分子シャペロンは、これに定義されるもの全てを含むが、その分子種の多様性は高い。例えばシャペロニンの場合、グループ１型と２型に分類されており、前者にはバクテリア、ミトコンドリア若しくは葉緑体のものが属し、後者には古細菌及び真核生物細胞質由来のものが属するが、いずれのグループのものでも蛋白質の折りたたみを改善する効果が期待でき、本発明において使用可能である。
【００２７】
シャペロニンのサブユニットは、頂上ドメイン（ａｐｉｃａｌ  ｄｏｍａｉｎ）、中間ドメイン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｄｏｍａｉｎ）、及び赤道ドメイン（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  ｄｏｍａｉｎ）の３つのドメインから構成されており、頂上ドメインは不安定な蛋白質の折りたたみ中間体を特異的に捉えて結合する活性を有し、シャペロニンの蛋白質折りたたみ機能において特に重要な役割を果たしている。従って、本発明のバクテリ
アにおいて、目的蛋白質又はペプチドを、シャペロニンの全長又はその頂上ドメインのペプチドと共発現させたり、融合蛋白質として発現させることは有効である。本発明においては、分子シャペロンの部分ペプチド、例えばシャペロニンの場合には頂上ドメインを含む部分ペプチドを、目的蛋白質又はペプチドと共発現又は融合蛋白質として発現させることを含む。
【００２８】
ＰＰＩａｓｅは、シクロフィリン（サイクロスポリン結合性蛋白質）、ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びパーブリンの３種に分類されるが、これらは全て蛋白質中のプロリン残基の立体異性化反応を触媒する。中でも古細菌由来ＦＫＢＰは、ＰＰＩａｓｅ活性以外に蛋白質の折りたたみ中間体の凝集形成を抑制する分子シャペロン様の活性を持つ（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９，４５３；Ｉｄｅｎｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００１）３５７，４６５）。古細菌のＦＫＢＰの中には、ＰＰＩａｓｅ活性自体は殆ど無いが、強い分子シャペロン様活性を有するものも存在する（Ｉｄｅｎｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２６７，３１３９）。従って、不溶性凝集体の形成抑制を効果的に行うには、ＰＰＩａｓｅの中でも古細菌由来のＦＫＢＰと、目的蛋白質又はペプチドとを共発現したり、あるいはこれらを融合蛋白質として発現させることが好ましい。
【００２９】
目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとを融合蛋白質として発現させる場合には、使用する分子シャペロンの種類及び由来に応じて、融合蛋白質における目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドの数の比を選択することが好ましい。例えば、分子シャペロン：目的蛋白質の比がｎ：１（ｎ＝約１．０〜９．０）となることが好ましい。
【００３０】
融合蛋白質における目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとの連結パターンとしては、分子シャペロン又はその部分ペプチドのＣ末端若しくはＮ末端、又は分子シャペロンが連結しているその連結部に目的蛋白質又はペプチドを配置することが好ましい。また、目的蛋白質又はペプチドの細胞膜に対する親和性が極めて高い場合には、分子シャペロン又はその部分ペプチドの複数の部分に配置することによって毒性蛋白質の発現を抑制することが可能となる。また、目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとの連結は、限定するものではないがペプチド結合が挙げられる。さらに、目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとの間に、トロンビンやエンテロキナーゼなどのプロテアーゼの切断配列を配置させ、発現された融合蛋白質においてその両者を切断しやすくしてもよい。
【００３１】
融合蛋白質として発現させるには、制限酵素を用いる方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる方法などの通常の遺伝子工学手法を利用して、融合蛋白質をコードする遺伝子を構築し、これを挿入した発現ベクター又はプラスミドを宿主バクテリアに導入し、該宿主において融合蛋白質として発現させることができる。
【００３２】
以上のように本発明では、転写系が強化されたバクテリアを提供するとともに、このバクテリア宿主内で遺伝子工学的に目的蛋白質又はペプチドを分子シャペロン又はその部分ペプチドと共発現又は融合蛋白質として発現させることによって、特に真核生物のｃＤＮＡにコードされるポリペプチドを活性型蛋白質（正確に折りたたまれた蛋白質）として、不溶性凝集体の形成を抑制して高効率で生産するものである。
【００３３】
（４）その他の改変
以上の改変に加えて、さらに目的に応じてその他の様々な遺伝的改変と組み合わせてもよい。例えば、生産される蛋白質又はペプチドの宿主プロテアーゼによる分解を抑制する
には、ｌｏｎ，ＯｍｐＴのようなプロテアーゼをコードする構造遺伝子を欠損又は変異させればよい（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｔ  ａｌ．１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，２８３−２８７）。生産しようとする蛋白質又はペプチドが構造形成にＳ−Ｓ（ジスルフィド）結合の形成を必要する場合は、バクテリアの細胞質内を酸化的に保つために、チオレドキシン還元酵素遺伝子及びグルタチオン還元酵素をコードする遺伝子を欠損又は変異させればよい（Ｐｒｉｎｚ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１５６６１−１５６６７）。また、宿主バクテリアに導入されたプラスミド内に繰り返し配列が存在する場合は、プラスミドの安定化を計るために、特定のリコンビナーゼ遺伝子を欠損又は変異させればよい。本発明が提供する宿主バクテリアの改良はこれらに限られるものではない。
【００３４】
２．形質転換体
本発明の形質転換体は、上記「１．バクテリア及びその製造」の項に記載のバクテリアを宿主とし、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする。
本発明において、目的蛋白質としては、特に限定されないが、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウィルス等の病原性ウィルスゲノムにコードされる蛋白質（外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等）；ｓｃＦＶ（一本鎖抗体）、Ｆａｂ（Ｆａｂ）2、及び完全抗体（ＩｇＧ）型である治療・診断用抗体；Ｇ蛋白質共役型受容体等の膜
受容体；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長・栄養因子（ＮＧＦ又はＮＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等の成長因子に属するもの；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、アルブミン、ヒト成長ホルモン等に属するもの、が挙げられる。その他、ヒト、マウス及び線虫等の高等生物由来の疾病関連遺伝子産物の全てが、本発明に従って発現させる対象の目的蛋白質となり得る。
【００３５】
本発明においては、宿主として使用するバクテリアの性質から、可溶性蛋白質又は膜蛋白質をも目的蛋白質として発現対象とすることができる。そのような可溶性蛋白質としては、核内受容体、病原性ウイルスゲノムにコードされる蛋白質（外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等）、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、Ｆａｂ（Ｆａｂ）2、及び完全ＩｇＧ型である治療・診断用抗体、血小板増殖因子、血液幹細胞成長
因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因等の成長因子に属するもの、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等が好ましく、また膜蛋白質としては、チロシンカイネース型受容体、Ｇ蛋白質共役型受容体、イオンチャンネル構成蛋白質及びイオンチャンネル共役型膜貫通型受容体等が好ましい。
【００３６】
また本発明においては、宿主として使用するバクテリアの性質から、分子量が大きい蛋白質、例えば分子量が１５〜８００キロダルトン、好ましくは１００〜５００キロダルトンの蛋白質をも目的蛋白質として生産することができる。
【００３７】
さらに本発明においては、上記目的蛋白質の部分ペプチドをコードする遺伝子をバクテリアに導入し、本発明の形質転換体を作製してもよい。その場合、部分ペプチドは、蛋白質の全長アミノ酸配列のうち６残基以上のアミノ酸からなるものとすることができる。従って、本発明の形質転換体は、目的蛋白質をコードするｃＤＮＡのうち、６残基以上のアミノ酸配列をコードする部分配列が導入されたものであってもよい。
【００３８】
形質転換体は、適当なプラスミド又はベクターに所望の目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子、並びにこれらの遺伝子を発現させるのに必要な配列を連結（挿入）することによりプラスミド又はベクターを構築し、該プラスミド又はベクターを宿主バクテリアに導入することにより得ることができる。
【００３９】
本発明で使用するプラスミド又はベクターとしては、宿主バクテリア中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
【００４０】
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４，ｐＲＫ４０１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０，λＺＡＰ等）が挙げられる。
【００４１】
プラスミド又はベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、それを適当なプラスミド又はベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してプラスミド又はベクターに連結する方法などが採用される。
【００４２】
目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにプラスミド又はベクターに組み込まれることが必要である。そこで、プラスミド又はベクターには、プロモーター、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４３】
宿主がバクテリアであるため、プラスミド又はベクターＤＮＡは、該バクテリア中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等のバクテリア中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００４４】
また、本発明においては、上記「１．バクテリア及びその製造」の項に記載したバクテリアの改変を行うための蛋白質又はその部分ペプチドと、所望の目的蛋白質又はペプチドとを共発現させることもある。本明細書中、「共発現」とは、２つ以上の異なる蛋白質をコードする遺伝子が、同じか又は異なるプロモーターに作動可能に結合されており、同時期に発現されることを意味する。したがって、共発現が可能であるならば、上記のそれぞれの遺伝子を同一のベクター若しくはプラスミドに組み込んでもよいし、又は、異なるベクター若しくはプラスミドに組み込んでバイナリーベクターとして使用してもよい。
【００４５】
プラスミド又はベクターＤＮＡを宿主バクテリアに導入する手法は、バクテリアにＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４６】
３．バクテリア抽出物を含む組成物
本発明のバクテリアの抽出物は無細胞翻訳反応にも利用可能であり、これも発明の対象となる。該抽出物を得るためには、バクテリアの細胞は比較的穏和な条件で破砕することが好ましく、例えば、ガラスビーズによる破砕、リゾチーム処理と浸透圧ショックを組み合わせた方法による破砕が挙げられる。このとき使用する緩衝液は転写、翻訳に関わる蛋白質、酵素等の活性を低下させないものが好ましく、例えばｐＨ６．０〜７．８、１０〜５０ｍＭのリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液等が挙げられる。また必要に応じて５〜２００ｍＭのＮａＣｌ等の塩類を添加してもよい。細胞抽出液は３０００−５０００ｇで遠心分離を行うことで、沈殿物と分離して回収されうる。無細胞翻訳反応に供するためには、得られた細胞抽出液にアミノ酸、ＡＴＰ等のエネルギー物質、及びヌクレオチド等を添加して使用する。本発明のバクテリアの抽出物のＲＮＡ分解活性は抑制されているので、効率的に翻訳反応が進行する。
【００４７】
４．目的蛋白質及びペプチドの製造
本発明のバクテリアは、上述したように、ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつ分子シャペロンを含むものであるため、所望の蛋白質又はペプチドを、正確な配列及び折りたたみを保ち、かつ高効率に、不溶性凝集体の形成を抑制して生産するために有用である。従って、本発明は、さらに本発明のバクテリアを用いることを特徴とする目的蛋白質又はペプチドの製造方法を提供する。
【００４８】
本発明において、目的蛋白質又はペプチドは、上記「２．形質転換体」の項に記載の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、バクテリアの培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４９】
バクテリアを培養する培地としては、バクテリアが資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、バクテリアの培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５０】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類、そしてジベンゾフラン、ゲンチジン酸、サリチル酸等の芳香族炭化水素が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００５１】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２５〜３７℃で１０〜５０時間行う。培養期間中、ｐＨは約７．４（５．０〜７．９）に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いたプラスミド又はベクターで形質転換したバクテリアを培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換したバクテリアを培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いたプラスミド又はベクターで形質転換したバクテリアを培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００５３】
培養後、目的蛋白質又はペプチドが菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより当該目的蛋白質又はペプチドを抽出する。また、目的蛋白質又はペプチドが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。その後、蛋白質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の蛋白質又はペプチドを単離精製することができる。
【００５４】
また、目的蛋白質又はペプチドが、分子シャペロン又はその部分ペプチドとの融合蛋白質として生産される場合には、この融合蛋白質をそのまま精製して使用してもよいし、あるいは融合蛋白質から目的の蛋白質又はペプチドのみを分離してもよい。この分離は、培養物をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理し、マグネシウム及びＡＴＰを含有しない緩衝液に対して透析を行い、マグネシウム及びＡＴＰを取り除く。これによって分子シャペロン又はその部分ペプチドの立体構造が破壊され、目的蛋白質又はペプチドが露出することになる。また、透析内液にトロンビンなどのプロテアーゼを作用させ、目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとの切断を行ってもよい。
【００５５】
目的蛋白質又はペプチドが不溶性凝集体を形成した場合には、この不溶性凝集物を回収し、リポソーム、界面活性剤、蛋白質変性剤（グアニジウム塩酸、尿素）又は適当な担体の存在下にて可溶化させ、分子シャペロン又はその部分ペプチドの存在下にて再構成（再折りたたみ）してもよい。この工程により、正しい折りたたみを有する目的蛋白質又はペプチドを再生することができる。
【００５６】
あるいは、当業者には周知のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を利用して目的蛋白質又
はペプチドを製造することも可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系とは、ｍＲＮＡ転写及
び／又は蛋白質翻訳に必要な成分が含まれ、所望の蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを添加することにより、それらの成分が細胞内と同様に機能して、蛋白質が生産される系を指し、このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系は当業者に周知である。本発明においては、
このｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系は、上記「３．バクテリア抽出物を含む組成物」の項に記載
の組成物を利用して行うことができる。簡単に説明すると、本発明のバクテリアの抽出物を含む組成物中に、目的蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを添加し、該目的蛋白質又はペプチドを発現させ、その組成物から目的蛋白質又はペプチドを回収する。
【００５７】
５．抗体及び抗体をコードする遺伝子
人工的に調製される組換えマウス・ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が、今後、蛋白医薬の中でも最も成長する素材の一つであると予測されている。従って本発明は、哺乳動物由来のｃＤＮＡから上述したように生産された目的蛋白質又はペプチドを動物に免疫することを含む、目的蛋白質又はペプチドに対する抗体の作製方法、及びその抗体をコードする遺伝子の単離方法をも包含する。
【００５８】
現在では、抗原（目的蛋白質又はペプチド）を動物に免疫して免疫応答を誘発することができる。動物の免疫手法は当該技術分野で周知であり、また抗体の単離も慣例的な手法に従って行うことができる。また抗体をコードする遺伝子を単離する場合には、免疫した動物の抗体産生組織からｍＲＮＡを回収し、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって抗体可変領域に相当する遺伝子を増幅し、例えば大腸菌を用いたファージディスプレイ法（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３）等によって抗体可変領域遺伝子をクローニングすることができる。クローン化された可変領域遺伝子とヒト抗体遺伝子と融合させることで、キメラ又はヒト化抗体が作製可能である。また免疫動物としてヒト抗体産生マウス（Ｂｒｕｇｇｅ
ｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７，３９１；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，７２２）を用いることにより、直接ヒト抗体及びその遺伝子を得ることも
可能である。目的蛋白質が膜蛋白質である場合、バクテリア宿主の膜画分に蓄積する場合が多いため、バクテリア宿主自体を動物に免疫しても膜蛋白質に対する抗体及びその遺伝子は取得できる。このような膜蛋白質又はそのペプチドに対する抗体は、膜蛋白質に対するアゴニスト（作動薬）又はアンタゴニスト（拮抗薬）の作用を示すものと考えられ、医薬として多大な可能性を有する。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ｔＲＮＡの含有量が増加され、かつシャペロニン遺伝子が増強された大腸菌の作製
配列番号１に示された大腸菌ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳオペロン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ
Ｎｏ．Ｘ０７８５０）をｐＥＴ２１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入した後、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ遺伝子のＴ７系発現ユニットをＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩを用いた制限酵素反応によって切り出した。これをｐＡＣＹＣの誘導体（複製領域：Ｐ１５Ａ；日本ジーン製）に導入し、ｐＴＣＰＮを構築した。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をｐＴＣＰＮで形質転換し、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地にてコロニーを選抜することによってｍＲＮＡの分解が抑制され、かつシャペロニンＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ遺伝子が増強された大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＮ株を得た。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株は、ＲＮａｓｅＥのＣ末端ドメイン（４７７アミノ酸）が削除されており、これによって本株ではＤｅｇｒａｄａｓｏｍｅと呼ばれるｍＲＮＡ分解に関与する蛋白質複合体の活性が失われている（Ｌｏｐｅｔｚ  Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，３３（１），１８８−１９９）。
【００６０】
〔実施例２〕大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＮ株でのアクチン蛋白質の発現
配列番号２に示されたヒト由来アクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ００３５１）をｐＥＴ２１に挿入し、発現ベクターｐＡＣＴを得た。ｐＡＣＴを用いて実施例１で得られた大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＮを形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地にて培養し、生育した１０コロニーを同様の薬剤を含有したＬＢ液体培地２００ｍｌに接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が１．５に到達した時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養した。コントロール実験としてＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株、あるいはＢＬ２１（ＤＥ３）株でのアクチン蛋白質の発現も行った。
【００６１】
各発現実験の菌体を回収した後、超音波破砕し、遠心分離によって上清と沈殿を得た。これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドの面積を数値化して発現レベルを定量し、各サンプルにおける発現した組換えアクチン蛋白質の細胞質可溶性全蛋白質に対する含有量（％）を算出した。またアクチン蛋白質の発現は、抗アクチンポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによって確認した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株ではアクチン蛋白質はほとんど発現しなかった。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株では上清にはほとんど発現していないが、沈殿画分には発現していることがわかった。しかし、ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＮ株では細胞質可溶性全蛋白質の約１１％までアクチン蛋白質が発現していることがわかった。ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳとの共発現によってアクチンの凝集形成が抑制されたと考えられる。
【００６２】
〔実施例３〕大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ  （ＤＥ３）／ｐＴＣＰＮ株でのチューブリン蛋白質の発現
配列番号３に示されたヒト由来チューブリン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｋ００５５８）をｐＥＴ２１に挿入し、発現ベクターｐＴＵＢを得た。ｐＴＵＢを用いて実施例１で得られた大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＮを形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地にて培養し、生育した１０コロニーを同様の薬剤を含有したＬＢ液体培地２００ｍｌに接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が１．５に到達した時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養した。コントロール実験としてＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株、あるいはＢＬ２１（ＤＥ３）株でのアクチン蛋白質の発現も行った。
【００６３】
各発現実験の菌体を回収した後、超音波破砕し、遠心分離によって上清と沈殿を得た。これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドの面積を数値化して発現レベルを定量し、各サンプルにおける発現した組換えチューブリン蛋白質の細胞質可溶性全蛋白質に対する含有量（％）を算出した。またチューブリン蛋白質の発現は抗チューブリンポリクロナル抗体を用いるウエスターンブロッティングによって確認した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株ではチューブリン蛋白質は全く発現しなかった。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株では上清にはほとんど発現していないが、沈殿画分には発現していることがわかった。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＮ株では細胞質可溶性全蛋白質の約９％までチューブリン蛋白質が発現していることがわかった。ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳとの共発現によってチューブリンの凝集形成が抑制されたと考えられる。
【００６４】
〔実施例４〕ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子が増強された大腸菌の作製
配列番号４に示された古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１株由来ＦＫＢＰ型ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（ＴｃＦＫ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ
Ｎｏ．ＡＢ０１２２０９）をｐＥＴ２１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入した後、ＴｃＦＫ遺伝子のＴ７系発現ユニットをＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩを用いる制限酵素反応によって切り出した。これをｐＡＣＹＣの誘導体（複製領域：Ｐ１５Ａ）に導入し、ｐＡＴｃＦＫを構築した。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をｐＡＴｃＦＫで形質転換し、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地にてコロニーを選抜することによってｍＲＮＡの分解が抑制され、かつＴｃＦＫ遺伝子が補充された大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＴｃＦＫを得た。
【００６５】
〔実施例５〕大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＴｃＦＫ株でのアクチン蛋白質の発現
配列番号２に示されたヒト由来アクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ００３５１）をｐＥＴ２１に導入し、発現ベクターｐＡＣＴを得た。ｐＡＣＴを用いて実施例１で得られた大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＴｃＦＫを形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地にて培養し、生育した１０コロニーを同様の薬剤を含有したＬＢ液体培地２００ｍｌに接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が１．５に到達した時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養した。コントロール実験としてＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株、あるいはＢＬ２１（ＤＥ３）株でのアクチン蛋白質の発現も行った。
【００６６】
各発現実験の菌体を回収した後、超音波破砕し、遠心分離によって上清と沈殿を得た。これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドの面積を数値化して
発現レベルを定量し、各サンプルにおける発現した組換えアクチン蛋白質の細胞質可溶性全蛋白質に対する含有量（％）を算出した。またアクチン蛋白質の発現は抗アクチンポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによって確認した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株ではアクチン蛋白質はほとんど発現しなかった。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株では上清にはほとんど発現していないが、沈殿画分には発現していることがわかった。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＴｃＦＫ株では細胞質可溶性全蛋白質の約８％までアクチン蛋白質が発現していることがわかった。ＴｃＦＫとの共発現によってアクチンの凝集形成が抑制されたと考えられる。
【００６７】
〔実施例６〕大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＴｃＦＫ株でのチューブリン蛋白質の発現
配列番号３に示されたヒト由来チューブリン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  Ｋ００５５８）をｐＥＴ２１に挿入し、発現ベクターｐＴＵＢを得た。ｐＴＵＢを用いて実施例１で得られた大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＴｃＦＫ株を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地にて培養し、生育した１０コロニーを同様の薬剤を含有したＬＢ液体培地２００ｍｌに接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６００が１．５に到達した時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養した。コントロール実験としてＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）株、あるいはＢＬ２１（ＤＥ３）株でのチューブリン蛋白質の発現も行った。
【００６８】
各発現実験の菌体を回収した後、超音波破砕し、遠心分離によって上清と沈殿を得た。これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドの面積を数値化して発現レベルを定量し、各サンプルにおける発現した組換えチューブリン蛋白質の細胞質可溶性全蛋白質に対する含有量（％）を算出した。またチューブリン蛋白質の発現は抗チューブリンポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによって確認した。その結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）株ではチューブリン蛋白質は全く発現しなかった。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＴｃＦＫ株では可溶性画分にはほとんど発現しなかったが、沈殿画分には発現していることがわかった。ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＴｃＦＫ株では細胞質可溶性全蛋白質の約９％までチューブリン蛋白質が発現していることがわかった。ＴｃＦＫとの共発現によってチューブリンの凝集形成が抑制されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明により、ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつ分子シャペロンを含むバクテリアが提供される。このバクテリアは、所望の蛋白質又はペプチドを、正確な配列及び折りたたみを保ち、かつ高効率に生産するために有用である。
【配列表】
2005046067000001.app