(57)【要約】【課題】  in vitroで目的の生物活性物質をクローン化およびスクリーニングする新規システムの提供。【解決手段】  核酸集団によりコードされる所望の活性の同定方法であって、  a)  核酸集団から１つ以上の遺伝子ライブラリーを作製し、  b)  a)で作製した１つ以上の遺伝子ライブラリーの抽出物を、代謝的にリッチな細胞から得られる標的細胞成分と組み合わせ、そして  c)  b)の組合せ物をスクリーニングして所望の活性を同定する、ことを含んでなる上記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸集団によりコードされる所望の活性の同定方法であって、
a)  核酸集団から１つ以上の遺伝子ライブラリーを作製し、
b)  a)で作製した１つ以上の遺伝子ライブラリーの抽出物を、代謝的にリッチな細胞から得られる標的細胞成分と組み合わせ、そして
c)  b)の組合せ物をスクリーニングして所望の活性を同定する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
宿主細胞を、核酸集団から得られる回収された遺伝子ライブラリーで形質転換して、複数のクローンの発現ライブラリーを作製することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標的細胞成分が代謝的にリッチな細胞から得られる粗抽出物中に含有される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
標的細胞成分が代謝的にリッチな細胞から得られる精製タンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
遺伝子ライブラリー抽出物と標的細胞成分が微小環境中に共カプセル化される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
微小環境がリポソーム、ゲルマイクロドロップ、ビーズ、アガロース、細胞、ゴースト赤血球、またはゴーストマクロファージである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
リポソームが１種以上のリン脂質、糖脂質、ステロイド、リン酸アルキル、または脂肪酸エステルから調製される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
リン脂質がレシチン、スフィンゴミエリンおよびジパルミトイルよりなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ステロイドがコレステロール、コレスタノールおよびラノステロールよりなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
核酸集団によりコードされる活性物質が酵素または小分子である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
酵素がリパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、モノ−およびジオキシゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エポジドヒドロラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼ、およびアシラーゼよりなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
原核生物から得られる核酸集団によりコードされる所望の活性の同定方法であって、
a)  １つ以上のライブラリーを核酸集団から作製し、
b)  a)で作製された１つ以上の遺伝子ライブラリーの抽出物を、代謝的にリッチな細胞から得られた標的細胞成分と組み合わせ、そして
c)  b)の組合せ物をスクリーニングして所望の活性を同定する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項１３】
宿主細胞を、核酸集団から得られる回収された遺伝子ライブラリーで形質転換して、複数のクローンの発現ライブラリーを作製することをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
生物が微生物である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
微生物が非培養微生物である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
非培養微生物が環境サンプルから得られる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
非培養微生物が土壌微生物もしくは海洋微生物もしくは空中微生物の混合物、または土壌微生物と海洋微生物と空中微生物の混合物を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
非培養微生物が好極限性細菌（extremophiles）を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
好極限性細菌が好熱菌（thermophiles）、超好熱菌（hyperthermophiles）、好冷菌（psychrophiles）、好圧菌（barophiles）、および低温栄養菌（psychrotrophs）よりなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
クローンがファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、ウイルスベクターおよび人工染色体よりなる群から選択される構築物を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
特定の酵素活性について発現ライブラリーをスクリーニングすることをさらに含んでなる、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
スクリーニングをFACS解析で行う、請求項１２記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞が細菌、真菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞よりなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子ライブラリー抽出物と標的細胞成分が微小環境中に共カプセル化される、請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
微小環境がリポソーム、ゲルマイクロドロップ、ビーズ、アガロース、細胞、ゴースト赤血球、またはゴーストマクロファージである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
リポソームが１つ以上のリン脂質、糖脂質、ステロイド、リン酸アルキル、または脂肪酸エステルから調製される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
リン脂質がレシチン、スフィンゴミエリンおよびジパルミトイルよりなる群から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ステロイドがコレステロール、コレスタノールおよびラノステロールよりなる群から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
微生物の集団が選択可能な微生物富化培地を支持する固相支持体を含む装置を使用して採集される、請求項１６記載の方法。
【請求項３０】
選択可能な微生物富化培地が微生物誘引物質を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
微生物誘引物質がグルコサミン、セルロース、ペンタン酸または他の酸、キシラン、リグニン、キチン、アルカン、芳香族化合物、クロロ有機物、スルホニル化合物および重金属よりなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
選択可能な微生物富化培地が真核生物の増殖インヒビターを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
真核生物に特異的な増殖インヒビターがナイスタチン、シクロヘキシミド、およびピマリシンよりなる群から選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
選択可能な微生物富化培地が原核生物の増殖インヒビターを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
原核生物に特異的な増殖インヒビターがポリミキシン、ペニシリン、およびリファンピンよりなる群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
固相支持体がガラスビーズ、シリカエアロゲル、アガロース、セファロース、セファデックス、ニトロセルロース、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、および微孔性ポリビニリデンジフルオリド膜よりなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新しい生物活性分子（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、および調節タンパク質）の探索に関する。さらに詳しくは、本発明は、原核生物系の関心のもてる新規生化学的経路をコードする可能性のある遺伝子を捕捉するシステム、およびハイスループットスクリーニングアッセイ法を使用してこれらの経路をスクリーニングするシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
過去10年間に、新規活性を有する生物活性化合物に対するニーズが劇的に増加した。この需要は主に、現在入手できる抗生物質に対して耐性の病原菌の数が明らかに上昇していることと相まって、世界的な人口動態の変化から来ている。例えば、若者の多い新興国では抗生物質に対する需要が上昇しているが、老人の多い国（例えば、米国）では、癌、糖尿病、関節炎、およびその他の衰弱性の症状に対する薬剤が増加している。感染症による死亡率は、1980年と1992年の間で58％増加し、抗生物質耐性微生物の出現により、米国のみで医療コストが毎年300億ドルの追加が必要になった（Adams et al., Chemical and Engineering News, 1995; Amann et al., Microbiological Reviews, 59, 1995）。この傾向に対して製薬会社は、ユニークな活性または特異性を有する化合物を求めて微生物の多様性のスクリーニングを大幅に増加させている。
【０００３】
ヌクレオチド、ペプチド、他の高分子のような、天然産物の収集物、合成化学品収集物、および合成コンビナトリアルケミストリーライブラリーを含めて、リード化合物（薬剤候補）のいくつかの共通の供給源がある。これらの各供給源は、利点と欠点がある。これらの候補をスクリーニングするプログラムが成功するか否かは、主にプログラムに入る化合物の数に依存し、そのため製薬会社は、リード化合物を探して、今日までに数十万の合成および天然の化合物をスクリーニングしてきた。残念ながら、すでに発見された化合物に対する新規化合物の比率は時とともに減少してきている。製薬会社の多大の努力にもかかわらず、新規のリード化合物の発見速度は需要に追いつかない。このように薬剤候補の新しい供給源を利用することに対して大きなニーズが存在する。
【０００４】
現在使用されている大半の生物活性化合物は、土壌微生物由来である。土壌や他の複合的生態環境に生息する多くの微生物は、生存および増殖する能力を増加させる多様な化合物を産生する。これらの化合物は一般的に、微生物の増殖に必須ではなく、中間代謝に関与する遺伝子の助けを借りて合成されると考えられており、従って「２次代謝産物」と呼ばれる。他の生物の増殖または生存に影響を与える２次代謝産物は、「生物活性」化合物として知られ、微生物および巨大生物の両方の化学防御手段の重要な成分として機能する。人類は、これらの化合物を広範な原核生物および真核生物病原体に対する活性を有する抗生物質、抗感染症剤および他の生物活性化合物として利用してきた。微生物起源の約6,000個の生物活性化合物が性状解析されており、その60％以上はストレプトミセス（Streptomyces）属のグラム陽性土壌微生物により産生される（Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1994）。これらのうち少なくとも70は現在、生物医学および農学分野で使用されている。最も大きなクラスの生物活性化合物であるポリケチドには、広範な抗生物質、免疫抑制剤、および抗癌剤があり、これらは全部で年間50億ドル以上の売り上げがある。
【０００５】
見かけ上非常に多くの利用可能な生物活性化合物があるが、現代の生物医学が直面している最も大きな問題の１つは、抗生物質耐性病原体の蔓延である。病原性微生物はその世代時間が短く容易に遺伝情報を交換できる能力のために、ほとんどすべてのクラスの抗生物質化合物に対する耐性機構を、急速に進化かつ蔓延させてきた。例えば、現在はたった１つの抗生物質（バンコマイシン）でのみ治療可能なヒトの病原体であるブドウ球菌（Staphylococcus）や連鎖球菌（Streptococcus）の悪性株があり、この化合物に対する耐性には、耐性の腸球菌（Enterococcus）種から単一の遺伝子（vanA）の移入を必要とするのみである（Bateson et al., System. Appl. Microbiol, 12, 1989）。新規抗菌化合物に対するこの重要なニーズを、酵素阻害剤、免疫抑制剤および抗癌剤に対する需要の増加と併せて考えると、製薬会社が、新規性質を有する生物活性化合物を求めて微生物的多様性のスクリーニングを増強してきた理由が、容易に明らかになる。
【０００６】
新しい生物活性化合物を求めて微生物をスクリーニングするのに現在使用されているアプローチは、この分野が始まって以来あまり変化していない。新しく単離した細菌、特に土壌環境からのグラム陽性菌株を集め、その代謝物の薬剤活性をスクリーニングする。より最近のアプローチでは、あらかじめ性状解析した経路からの遺伝子サブユニットを組み合わせて、ハイブリッド抗生物質経路を合成する組換え法を使用している。このアプローチは「コンビナトリアル生合成」と呼ばれ、主にポリケチド抗生物質に焦点を当て、これにより活性を示す多くの構造的にユニークな化合物が得られてきた（Betz et al., Cytometry, 5, 1984；Davey et al., Microbiological Reviews, 60, 1989）。しかし新規抗生物質活性を有する化合物はまだ報告されておらず、これは、経路サブユニットは、すでに性状解析された化合物をコードするものから得られるという事実による観察結果かも知れない。小分子合成により組換えアプローチを使用する劇的な成功が、好ましい抗生物質の生産を増加させるための生合成経路の工学的操作において、最近報告されている（Diaper et al., Appl. Bactreriol., 77, 1994；Enzyme Nomenclature, Academic Press；NY, 1992）。
【０００７】
いまだにリード化合物の供給源として、膨大な生物多様性が未開発である。しかし、リード化合物のスクリーニングや生産のために現在利用可能な方法は、これらの未開発の資源に効率的に応用できない。例えば、少なくとも99％の海洋細菌種は、実験室の培地では生存できず、市販の発酵装置は、これらの種が増殖する条件で使用するのに最適ではなく、従ってこれらの生物は、スクリーニングまたは再供給のために培養することが困難かまたは不可能である。薬剤を産生する生物の再収集、増殖、株の改良、培地の改良、およびスケールアップ生産は、しばしばリード化合物の合成および開発の問題を提起する。さらに、ある化合物は合成するのに特定の生物の相互作用を必要とするため、発見においてこれらを使用することは極めて困難になっている。薬剤発見で使用するためのこれらの未開発の化合物源の遺伝子資源および化学的多様性を利用する新しい方法は、非常に有用である。本発明は、この未開発の生物多様性を利用する方針と、組換えＤＮＡ技術を利用して、目的の活性について迅速にスクリーニングする方針とを提供する。本発明は、天然の化合物の迅速なスクリーニングに関連する利点と、生物の遺伝物質を扱うことにより得られる柔軟性と再現性を組合せている。
【０００８】
細菌や多くの真核生物は、遺伝子（関連プロセスにその産物が関与する）を制御するための統合された機構を有する。遺伝子は、「遺伝子クラスター」という構造になって１つの染色体の上に集まり、単一のプロモーター（これは完全なクラスターの転写を開始させる）を含む単一の制御配列の制御下で一緒に転写される。遺伝子クラスター、プロモーターおよび制御において一緒に機能する追加の配列は「オペロン」と呼ばれ、20以上までの遺伝子（通常は２〜６個の遺伝子）を含むことができる。すなわち遺伝子クラスターは、同一であるかまたはその機能に関して通常関連している隣接遺伝子の群である。遺伝子クラスターの産物は、例えば抗生物質、抗ウイルス剤、抗癌剤、および調節タンパク質を含むため、薬剤探索プロセスにおいて興味深い。
【０００９】
一部の遺伝子ファミリーは１つ以上の同一のメンバーから構成される。クラスター化した遺伝子は必ずしも同一ではないが、クラスタリングは、遺伝子間の同一性を維持するための必要条件である。遺伝子クラスターは、隣接する関連遺伝子が複製される極端な場合から、数百の同一の遺伝子がタンデムで並んでいる場合まで広範囲である。ある場合には、特定の遺伝子の繰り返しに重要性がまったく認められない。この主要な例は、ある生物種で発現される重複インスリン遺伝子であり、他の哺乳動物種では単一のインスリン遺伝子で充分である。
【００１０】
遺伝子クラスターは連続的な再組織化を受け、かくして、たとえば細菌または他の原核生物供給源からの遺伝子クラスターの不均一ライブラリーを作製できることは、新規生物活性物質（例えば、広範な有用な活性を有するポリケチドの合成に関与するポリケチドシンターゼのような酵素を含む）の供給源を決定するのに有用である。
【００１１】
ポリケチドは、生物活性物質のきわめてリッチな供給源であり、抗生物質（テトラサイクリンやエシスロマイシン）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（FK506お呼びラパマイシン）、および獣医学的産物（モネンシン）を含む。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼにより産生される）は治療薬として有用である。ポリケチドシンターゼ（PKSs）は、長さと機能および環状化のパターンが異なる莫大な種類の炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。この見かけの構造の多様性にもかかわらず、これらは共通の経路（酢酸またはプロピオン酸から得られる単位が、脂肪酸生合成に似たプロセスにより、伸長する鎖の上に縮合される）により合成される。この中間体は、鎖の伸長と各縮合で生成される  −ケトン基の（種々の程度の）還元の複数サイクルの間、ポリケチドシンターゼに結合したままである。天然に存在するポリケチド間の構造的変化は主に、各PKSが、付加される単位の数およびタイプを制御する方法から生じ、また、各サイクルでの還元の程度と立体化学から生じる。より大きな多様性は、PKSの産物に対する部位特異的グリコシラーゼ、メチルトランスフェラーゼおよび酸化酵素の作用により発生する。
【００１２】
ポリケチドシンターゼ遺伝子は遺伝子クラスターに入る。ポリケチドシンターゼの少なくとも１つのタイプ（タイプＩと呼ぶ）は、サイズの大きい遺伝子によりコードされた酵素を有し、遺伝子操作を複雑にし、これらの遺伝子／蛋白質のin vitro研究を困難にしている。タイプＩシステムの酵素学の理解は、これらのマルチ酵素のいずれかによるポリケチド鎖合成を研究するための無細胞系が欠如しているため進展していないが、ある経路のいくつかの部分的反応はin vitroでうまくアッセイされてきた。30年以上の精力的な努力にもかかわらず、複雑なポリケチドの無細胞酵素的合成はうまくいっておらず、これはおそらく、これらの大きくて天然に存在する生産生物から発現量の少ない多機能性タンパク質を完全に活性な型で単離することが困難なためであり、また、ポリケチド生合成の間に形成される中間体の相対的不安定性のためであろう。これらの欠点を克服するために、大腸菌（Escherichia coli）やストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）のような異種宿主でモジュラーPKSサブユニットが発現されている。大腸菌（E. coli）で発現されるタンパク質は完全に活性というわけではないが、エス・コエリカラー（S. coelicolor）中のいくつかのPKSの異種発現により、活性タンパク質が産生された。実質的に活性部位の少ないPKS（例えば、６−メチルサリチル酸シンターゼ、カルコンシンターゼ、テトラセノマイシンシンターゼ、およびシクロスポリンのポリケチド成分に関与するPKS）からの、ポリケチドの無細胞酵素的合成が報告されている。
【００１３】
従って、ポリケチドのin vitro合成が可能であることを研究は報告しているが、合成はいつも精製酵素を用いて行われた。PKSモジュラーサブユニットをコードする遺伝子の異種発現は、in vivoで機能性ポリケチドの合成を可能にしたが、このアプローチには克服すべきいくつかの課題がある。モジュラーPKS遺伝子クラスターの大きなサイズ（＞30kb）は、プラスミド上でのその操作を困難にしている。モジュラーPKSはまた、異種宿主には存在しない基質をしばしば利用する。最後に、非常に大きな外来ポリペプチドの正しい折り畳み、組立て、および翻訳後の修飾が保証されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
in vitroで目的の生物活性物質をクローン化およびスクリーニングする新規システムが好ましい。本発明の方法は、in vitroでの新規生物活性分子、特に非培養サンプルからの新規生物活性分子のクローニングと探索を可能にする。サイズの大きい遺伝子クラスターは、本発明の方法を使用してクローン化およびスクリーニングすることができる。従来の方法とは異なり、本発明の方法は、既知の遺伝子系を使用したクローン化および粗（純粋でない）調製物を用いたin vitroでのスクリーニングを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の概要）
本発明は、原核生物系の関心のもてる新規生化学的経路をコードする可能性のある遺伝子をクローン化し、新規プロセスを利用してこれらの経路についてスクリーニングすることを可能にする。遺伝子の供給源は単離された個々の生物（「分離株」）、規定培地中で増殖させた生物の収集物（「富化培養物」）、または最も好ましくは非培養生物（「環境サンプル」）でありうる。環境サンプルから新規生物活性物質をコードする遺伝子を直接クローン化する培養非依存性アプローチの使用は、生物多様性の未開発の資源を利用できるようになるため、特に好ましい。
【００１６】
「環境ライブラリー」は、環境サンプルから作製され、適当な原核細胞宿主中で増殖することができるクローニングベクター中に収容されている天然に存在する生物の集合ゲノムである。クローン化DNAは、まず環境サンプルから直接抽出されるため、ライブラリーは、純粋培養で増殖することができるわずかの原核生物に限定されない。さらに、これらのサンプル中に存在する環境DNAの標準化は、元々のサンプル中に存在するすべての種からのDNAの同等の提示を可能にする。これは、優性の種と比較して数桁少なく提示されうるサンプルのマイナー成分から、興味ある遺伝子を見つける効率を劇的に上昇させる。
【００１７】
複雑な環境発現ライブラリーの評価において、律速段階は生物活性物質の探索レベルで起こる。本発明は、例えば数千の異なる生物を含有する複雑な環境発現ライブラリーの迅速なスクリーニングを可能にする。
【００１８】
本発明においては、例えば１つまたはそれ以上の培養していない微生物から作製される遺伝子ライブラリーが、目的の活性についてスクリーニングされる。関心のある生物活性分子をコードする可能性のある経路は、まず遺伝子発現ライブラリーの形で原核生物細胞中で捕捉される。代謝的にリッチな細胞系からの粗抽出物または部分精製抽出物または純粋なタンパク質を、遺伝子発現ライブラリーと組み合わせて活性候補分子を作製し、この組合せ物を目的の活性についてスクリーニングする。薬剤探索の一般的なアプローチは、疾患標的（疾患を引き起こすと考えられる巨大分子）を、潜在的薬剤候補に暴露させ、治療活性について試験するスクリーニングアッセイを必要とする。他のアプローチでは、疾患の原因物質である全細胞または生物（例えば、細菌または腫瘍細胞系）を、スクリーニング目的で潜在的候補に暴露する。本発明では、これらの任意のアプローチを使用することができる。
【００１９】
本発明はまた、前記で簡単に説明した種々のスクリーニングアプローチを使用して、目的の生物活性化合物の異種発現と下流スクリーニングのために、非培養サンプルから得られるクローン化経路の、代謝的にリッチな宿主中への導入も可能にする。
【００２０】
従ってある態様において本発明は、関心のある特定の活性をコードするクローンの同定方法であって、(i) 環境から直接単離された核酸から得られる１つ以上の発現ライブラリーを作製し、(ii)この発現ライブラリーを、代謝的にリッチな細胞系からの粗抽出物または部分的に精製した抽出物、または純粋なタンパク質と組み合わせ、そして(iii) 種々のスクリーニングアッセイ法のいずれかを使用して該ライブラリーをスクリーニングして該クローンを同定する、ことを含んでなる方法を提供する。
【００２１】
別の態様において本発明は、関心のある特定の活性をコードするクローンの同定方法であって、(i) 環境から直接単離された核酸から得られる１つ以上の発現ライブラリーを作製し、(ii)該クローンを代謝的にリッチな細胞系に移し、そして(iii) 種々のスクリーニングアッセイ法のいずれかを使用して該細胞系をスクリーニングして該クローンを同定する、ことを含んでなる方法を提供する。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、DNA（主に環境から直接単離されるDNA）から得られる発現ライブラリーは、蛍光活性化セルソーター解析を利用して、目的の生物活性物質について非常に迅速にスクリーニングすることができる。これらのライブラリーは、10８を超えるメンバーを含有することができ、単一の生物でも、または100を超える異なる微生物、種または亜種のゲノムを提示してもよい。
【００２３】
従って１つの態様において本発明は、関心のある特定の活性を有するクローンの同定方法であって、(i) 環境から直接単離された核酸から得られる１つまたはそれ以上の発現ライブラリーを作製し、そして(ii)該発現ライブラリーを、ハイスループット細胞アナライザー（好ましくは蛍光活性化セルソーター）を使用してスクリーニングしてクローンを同定する、ことを含んでなる方法を提供する。
【００２４】
さらに詳しくは、本発明は、関心のある特定の活性を有するクローンの同定方法であって、(i) 環境から直接または間接に単離された核酸を含有するように作製される１つ以上の発現ライブラリーを作製し、(ii)該発現ライブラリーを、１種以上の特定の基質に暴露させ、そして(iii) ハイスループット細胞アナライザー（好ましくは蛍光活性化セルソーター）を使用して該暴露されたライブラリーをスクリーニングして、１種以上の基質と反応するクローンを同定する、ことを含んでなる方法を提供する。
【００２５】
別の態様において本発明はまた、関心のある特定の活性を有するクローンの同定方法であって、(i) 環境から直接または間接に単離された核酸から得られる１つ以上の発現ライブラリーを作製し、そして(ii)標的の結合イベントまたは共有結合修飾を必要とするアッセイ法を使用しかつハイスループット細胞アナライザー（好ましくは蛍光活性化セルソーター）を使用して該暴露されたライブラリーをスクリーニングして、陽性クローンを同定する、ことを含んでなる方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、微小環境中に作用物質と、標的および検出マーカーを発現する組換え細胞とを共カプセル化し、標的細胞成分の活性に及ぼす作用物質の作用を検出することにより、標的タンパク質または他の細胞成分（例えば、核酸）（ここで、標的と選択マーカーは組換え細胞により発現される）の活性を調節する作用物質のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
別の態様において本発明は、生物の混合物から得られる標的DNAの混合物と、DNAプローブの混合物（検出マーカーと、特定の酵素活性を有する少なくとも１つの酵素をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部とを含む）とを共カプセル化し、共カプセル化混合物を、相補的な配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件下かつそのような時間にわたりインキュベートし、そして標的DNAについてスクリーニングすることにより、DNAサンプル中の少なくとも１つの特定の活性の少なくとも部分的なコード領域を含有する標的DNA配列を富化する方法を提供する。場合により本方法は、回収された標的DNAで宿主細胞を形質転換して、複数のクローンの発現ライブラリーを作製することをさらに含む。例えば、核酸集団から得られる回収された遺伝子ライブラリーで宿主細胞を形質転換して、複数のクローンの発現ライブラリーを作製する。
【００２８】
本発明はさらに、作用物質を、第１の試験タンパク質および第２の試験タンパク質と共に適当な微小環境中に共カプセル化し、DNA結合成分に連結した第１の試験タンパク質と、転写活性化成分に共有結合連結した第２の試験タンパク質との相互作用を調節する作用物質の能力を測定することによる、DNA結合成分に連結した第１の試験タンパク質と、転写活性化成分に連結した第２の試験タンパク質との相互作用を調節する作用物質（ここで該物質は、検出可能なタンパク質の発現を増強または阻害する）のスクリーニング方法を提供する。好ましくはスクリーニングはFACS解析により行われる。
【００２９】
別の態様において本発明は、固相表面に化学的に結合した特異的基質に、微生物を選択的に誘引する手段を提供する。本発明はさらに、これらの微生物の富化を提供する。このアプローチは、水性または土壌環境中の複雑なまたは希薄な微生物集団から、特異的酵素または小分子経路をコードする遺伝子を有する微生物の富化および採集を可能にする。誘引と以後の富化の基礎は、化学走化性的誘引を特定の基質に向ける特異的受容体を、微生物が有することである。表面に基質を結合させ、次に基質−表面結合体を混合微生物集団の存在下でインキュベートすることにより、その集団の特異的メンバーを集めることができる。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、周囲の環境マトリックスから特定の微生物を選択的に富化する手段を提供することである。これらおよび他の目的を達成するのに、本発明の１つの態様において、選択可能な微生物富化培地を付着させるための表面を有する固相支持体を含む、環境サンプルから微生物の集団を採集する装置が提供される。
【００３１】
本発明の１つの態様において、微生物誘引物質を含有する微生物富化培地は、環境群集のメンバーを装置に選択的に引きつけるために使用される。本発明の別の態様において、好ましくない生物の増殖を阻害する生物活性化合物が、好ましい微生物の選択をさらに増強するために、微生物富化培地中に加えられる。
【００３２】
本発明のさらに別の態様において、固相支持体と選択可能な微生物富化培地を付着するための表面とを有する装置に、サンプルを接触させ、該装置から集団を単離することを含んでなる、環境サンプルから微生物を単離する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（好適な実施形態の詳細な説明）
サンプル供給源／採集
本発明の方法は、適当な原核生物宿主中で増殖することができるクローニングベクター中に収容されている天然に存在する生物の集合ゲノムを提示する遺伝子ライブラリーの作製から開始する。
【００３４】
ライブラリーを作製しうる微生物には、原核微生物（例えば、真正細菌（Eubacteria）と古細菌（Archaebacteria））、および下等真核微生物（例えば、真菌、一部の藻類、および原生動物）が含まれる。ライブラリーは、環境サンプルから作製され、この場合DNAは生物を培養することなく回収されるか、またはDNAは１以上の培養生物から回収される。このような微生物は、好極限性細菌（extremophiles）、例えば超好熱菌（hyperthermophiles）、好冷菌（psychrophiles）、低温栄養菌（psychrotrophs）、好塩菌（halophiles）、好圧菌（barophiles）、好酸菌（acidophiles）などでありうる。
【００３５】
ライブラリーを作製しうる微生物は、当該分野で公知の種々の方法を使用して採集される。サンプルはまた、以下の実施例に詳述された方法を使用して採集される。簡単に説明すると、以下の実施例は、細菌および始原細菌種の選択的in situ富化法と、同時に集団の真核生物メンバーの増殖を抑制する方法を提供する。in situ富化を行うと、微生物集団の稀少種および以前に培養されたことのないメンバーが回収される可能性が上昇する。細菌および始原細菌種を得たくても、環境サンプル中の真核生物からの核酸は、DNAライブラリー作製を非常に複雑にし、グレイジング(grazing)により好ましい細菌種の数を低下させる。下記の方法は、選択的物質（例えば抗真菌剤）を使用して、真核生物種の増殖を抑制する。
【００３６】
in situ富化は、増殖基質と栄養改善剤（周囲の環境マトリックスのメンバーを選択的に誘引するため）からなる微生物封じ込め装置を使用して達成される。基質（炭素源）と栄養改善剤（すなわち、窒素、リンなど）の選択はは、富化したい集団のメンバーに依存する。真核生物メンバーに対する選択的物質も、トラップに加えられる。この場合も、正確な組成は富化したいおよび抑制したい集団のメンバーに依存する。集団の特定のメンバーを引き出すのに有用な富化「培地」の一部を、本明細書に提供した実施例に記載する。
【００３７】
標的DNAが得られる出発物質ライブラリーとしての微生物DNAの供給源は、特に環境サンプル（例えば、北極または南極の氷、水、永久凍土層、火山性の物質、熱帯地域の土壌または植物からの物質から得られる微生物サンプル）を含むことが意図される。かくして、例えば、ゲノムDNAは、培養可能なまたは培養不可能な生物から回収され、その後の生物活性の測定のために適当な組換え発現ライブラリーを作製するのに使用される。２つ以上の種のDNAを含むそのような出発物質から作製された原核生物発現ライブラリーは、本明細書において多特異的ライブラリーとして定義される。
【００３８】
DNA単離
サンプルからのDNAの調製は、非培養生物を含む環境サンプルからのDNAライブラリーの作製、または培養生物からのライブラリーの作製において重要な工程である。DNAは、当該分野で公知の種々の技術を使用してサンプルから単離することができる（Nucleic Acids in the Environment Methods & Applications, J.T. Trevors, D.D. van Elsas, Springer Laboratory, 1995）。好ましくは、得られるDNAはサイズが大きく、酵素阻害剤または他の汚染物質を含まない。DNAは環境サンプルから直接単離（直接溶解）されるか、または、DNA回収の前にサンプルから細胞を採集してもよい（細胞分離）。直接溶解法は、細胞分離に基づくプロトコールに対していくつかの利点を提供する。直接溶解法は、微生物集団を一般により高く提示する多くのDNAを提供するが、これは時に、細胞分離法を使用して回収されるDNAよりサイズが小さく、酵素阻害剤を含有する可能性が高い。高分子量と高純度を有するDNAを提供する非常に有用な直接溶解法が記載されている（Barns, 1994; Holben, 1994）。阻害剤が存在する場合は、使用可能な細胞分離を利用するプロトコールがいくつか存在する（Holben, 1994）。さらに分画法、例えば、本明細書に記載のビス−ベンズイミド分離（塩化セシウム単離）を使用して、DNAの純度を上げることができる。
【００３９】
極端な環境サンプルからの全ゲノムDNAの単離は、物質の供給源と量に依存して変化する。本発明の代表的ライブラリーの作製には、汚染されていない良質の（＞20kbp）DNAが必要である。成功している一般的DNA単離プロトコールは、標準的なセチル−トリメチル−アンモニウム−ブロミド（CTAB）沈殿法である。バイオマスペレットを溶解し、タンパク質を非特異的プロテアーゼ、プロテイナーゼＫにより、界面活性剤SDSの存在下で消化する。高温と高塩濃度で、CTABは変性タンパク質、多糖類および細胞破片を含む不溶性複合体を形成する。CTAB複合体を含有する白色界面が大幅に減少するまで、クロロホルム抽出を行う。上清中の核酸をイソプロパノールで沈殿させ、TEバッファー中に再懸濁させる。
【００４０】
溶解に抵抗性の細胞については、化学的および機械的方法と種々の細胞溶解酵素のカクテルを併用することができる。その後、単離された核酸を小セシウム勾配を使用してさらに精製してもよい。
【００４１】
単離方法のさらなる例を以下に説明する。このタイプの単離方法は、クローニングのための良質でサイズの大きいDNAを得るのに最適である。
【００４２】
標準化
本発明はさらに、種々の供給源（微生物の組合せ、１次富化物、および環境の「非培養」サンプルを含む）からの、関心のある活性物質の単離法を最適化することができる。元々のサンプル中のゲノム集団のそれらの提示において「標準化」されているライブラリーは、本発明と共に使用可能である。次にこれらのライブラリーは、本発明の方法を使用して、目的の酵素および他の生物活性物質についてスクリーニングすることができる。
【００４３】
自然集団中の存在量が大きく異なる微生物からのゲノムの同等の提示を有するゲノムを有するライブラリーを作製し、スクリーニングする。この「標準化」アプローチは、豊富に存在する種からのクローンの重複を減少させ、稀少種からのクローンの提示を上昇させる。これらの標準化されたライブラリーは、より効率的なスクリーニングを可能にし、新規な生物学的触媒をコードする細胞の同定をもたらす。
【００４４】
ある実施形態において、環境から単離される生存細胞または非生存細胞は、発現遺伝子ライブラリー作製のための核酸の単離に先だって、FACSで選別して、例えば細胞のDNAまたはAT/GC含量に基づいて、サンプルから細胞を分離する。当該分野で公知の種々の色素または染色液（例えば、"Practical Flow Cytometry", 1995 Wiley-Liss, Inc. Howard M. Shapiro, M.D.に記載されるもの）を使用して、細胞の核酸の間にインターカレートするか核酸と結合させ、細胞中の相対的DNA含量またはAT/GC DNA含量に基づいてFACSで細胞を分離する。他の基準を使用しても、サンプルから細胞を分離することができる。次に細胞からDNAを単離し、発現遺伝子ライブラリーの作製に使用し、次にこれを目的の活性物質についてスクリーニングする。
【００４５】
あるいは、核酸を環境から直接単離し、遺伝子ライブラリーの作製の前に、DNAまたはAT/GC含量に基づいて選別する。環境から直接単離されたDNAをそのまま使用し、ランダム剪断または消化して断片化したDNAを得る。次にDNAを前述のインターカレート剤に結合させ、相対的塩基含量に基づいてアナライザーで分離して目的のDNAを単離する。次に、選別したDNAを使用して遺伝子ライブラリーを作製し、次にこれを目的の活性物質についてスクリーニングする。
【００４６】
前記したように、環境サンプルから標準化したライブラリーを形成するための実施形態は、サンプルからの核酸の単離で始まる。次にこの核酸を標準化の前に分画して、採集した生物のプールからのマイナー種からのDNAをクローニングする機会を増加させる。密度遠心分離法（例えば、塩化セシウム勾配）を使用してDNAを分画することができる。インタカレート剤（例えば、ビス−ベンズイミド）を用いて核酸の浮遊密度を変えると、勾配により、相対的塩基含量に基づいてDNAが分画される。複数の生物からの核酸をこの方法で分離し、この方法を使用して、ゲノムの複雑な混合物を分画することができる。これは、複雑な環境サンプルを扱っている場合は、特に有用である。あるいはまた、標準化に先だってDNAを分画する必要がない。分画したDNAからサンプルを回収し、核酸の鎖を次に融解し、一定の条件（Cotに指令されるハイブリダイゼーション）下で選択的にアニーリングさせる。核酸断片の混合物を融解し、ストリンジェント条件下で再アニーリングすると、普通の配列は稀少配列より速く相補鎖を見つける。場合により１本鎖核酸単離工程を行った後に、稀少配列の富化を示す１本鎖核酸を、当該分野で公知の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Barnes, 1994））を使用して増幅し、遺伝子ライブラリーの作製に使用する。この手順により、稀なまたは少量しか存在しない核酸分子が増殖され、次にこれを使用して遺伝子ライブラリーを作製すると、これを所望の生物活性についてスクリーニングすることができる。DNAは回収されるが、元々そのDNAを含有していた生物の同定は失われるかもしれない。この方法は、「クローン化不可能な」供給源からのDNAの回収を可能にする。この方法を、以下の実施例でさらに詳述する。
【００４７】
かくして、環境サンプルから標準化したライブラリーを生成する１つの実施形態は、(a)環境サンプルから核酸を単離し；(b)場合により核酸を分画し、所望の画分を回収し；(c)集団内でのDNAの提示を標準化し、こうして環境サンプルのDNAから標準化した発現ライブラリーを形成することによる。標準化法は、同時係属中の、共通に譲渡された米国特許出願第08/665,565号（1996年６月18日出願）中に記載されており、詳細に例示されている。
【００４８】
遺伝子ライブラリー
遺伝子ライブラリーは、サンプルから由来した、もしくは単離した標準化した、もしくはしていないDNAをベクターもしくはプラスミドに挿入することによって作製することができる。そのようなベクターもしくはプラスミドは、プロモーター、エンハンサーなどの発現調節配列を含んでいるものが好ましい。そのようなポリヌクレオチドはベクターおよび/または組成物の一部であってもよく、さらにはそのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないという意味で単離されていてもよい。特に好ましいファージもしくはプラスミド、ならびにそれらに導入しパッケージ する方法をここに述べる。
【００４９】
下記の実施例は培養生物および非培養生物からのライブラリーの作製法を詳述する。
【００５０】
標的DNAのランダムな切断によって調製したDNA断片のクローニングは代表的なライブラリーの作製にも用いることができる。TEバッファーに溶解したDNAを、切断された断片が所望のサイズの範囲となるまで25ゲージの二重ハブの針に勢いよく通す。DNA末端はヤエナリ（Mung Bean）ヌクレアアーゼで「研磨」すなわち平滑化し、標的DNA内のEcoRI切断部位はEcoRIメチラーゼで保護する。EcoRIリンカー(GGAATTCC)を、標的DNAに対してリンカーのモル濃度比を非常に高くして、平滑化/保護されたDNAと連結する。このことにより、2個のDNA分子がお互いに連結してキメラクローンを作る可能性が低減する。そのリンカーをEcoRI制限ヌクレアーゼで切り出し、DNAをサイズ分画する。最適なものより小さいDNA断片および小さなリンカーの除去は重要である。何故ならば、それらのベクターへの連結により、パッケージングし得ない組換え分子が生じるか、もしくはリンカーのみを挿入物として含むライブラリーが構築されてしまうからである。ショ糖勾配による分画が非常に容易で迅速であり、信頼性が高いために用いられる。ショ糖勾配はアガロースゲルによる単離ほどの分解能をもたらさないが、この方法は阻害性の夾雑物がかなり少ないDNAを生じる。調製された標的DNAをλベクターへ連結し、in vitroパッケージング抽出物を用いてパッケージングし、適切な大腸菌(E.coli)で増殖させる。
【００５１】
用いうる発現ベクターの代表的な例としては、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌性人工染色体、ウイルスDNA(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽性狂犬病、およびSV40の誘導物など)、P1をベースとした人工染色体、酵母のプラスミド、酵母の人工染色体、およびその他の特定の対象とする宿主［例えば、バシルス（棹菌）(Bacillus)、アスペルギルス(aspergillus)、酵母など］に対して特異的なその他のいかなるベクターも挙げることができる。したがって、例えばポリペプチドを発現させるためにそのDNAを各種の発現ベクターのいずれかに含ませることができる。そのようなベクターとしては染色体性のもの、非染色体性のもの、および合成のDNA配列がある。当業者には適切なベクターは多数知られており、市販されている。下記のベクターを例として挙げる；細菌性：pQE ベクター(Qiagen)、pBluescriptプラスミド、pNH ベクター、λ-ZAPベクター(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核細胞性：PXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。しかし、その他のいかなるプラスミドもしくはベクターも、それらが宿主中で複製可能で生存しうるものである限りは用いることができる。
【００５２】
本発明用での使用に好ましいベクターの種類はF因子を起点とする複製を含むものである。大腸菌(E.coli)中のF因子(もしくは稔性因子)は、接合の際にそれ自体の高頻度の伝達(transfer)をもたらすが、細菌の染色体自体の伝達の頻度はより低くなるようなプラスミドである。特に好ましい実施形態は「フォスミド」もしくは細菌性人工染色体(BAC)ベクターと呼ばれるクローニングベクターを用いることである。このベクターは、大腸菌(E.coli)F因子由来であり、ゲノムDNAの大きなセグメントを組み込むことができる。混合された非培養の環境サンプルから得たDNAを組み込んだ場合には、このベクターは大きなゲノム断片を安定な「環境DNAライブラリー」の形にすることができる。
【００５３】
本発明に用いるための別のベクターとして好ましい形のものとしてはコスミドベクターがある。コスミドベクターはもともとゲノムDNAの大きなセグメントをクローニングし増殖するために設計されたものである。コスミドベクターへのクローニングはSambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に詳細に述べられている。
【００５４】
発現ベクター中のDNA配列は、RNA合成を指令するために、適切な発現制御配列(プロモーター)に機能しうる形で連結されている。細菌性のプロモーターの名前を特に挙げると、lacI, lacZ, T3, T7, gpt, λPR, PLおよびtrpである。真核細胞性のプロモーターとしてはCMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルス由来のLTR、マウスのメタロチオネイン-Iプロモーターが挙げられる。適切なベクターとプロモーターの選択は当業者に知られている範囲内のものである。発現ベクターには翻訳の開始と転写の終結のためのリボソーム結合部位も含む。ベクターは発現増幅のための適切な配列を含むことができる。プロモーター領域はCAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターもしくはその他の選択可能なマーカーを有するベクターを用いて所望のいかなる遺伝子からも選択することができる。
【００５５】
さらに、真核細胞培養物ではジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性など、大腸菌(E.coli)ではテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの形質転換された宿主細胞を選別するための表現型特性を提供するために、発現ベクターには1つ以上の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【００５６】
通常は組換え発現ベクターは宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点と選択マーカーを含むが、それは例えば、大腸菌(E.coli)のアンピシリン耐性遺伝子およびS. cerevisiae のTRP1 遺伝子、ならびに下流構造配列の転写を指令する高度発現遺伝子に由来するプロモーターである。そのようなプロモーターは、とりわけ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)などの解糖系の酵素、a-因子、酸性ホスファターゼ、もしくは熱ショックタンパク質をコードするオペロンから由来し得る。異種の構造配列は、翻訳開始および終結配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞質外のスペースもしくは細胞外の培地への分泌を指令することのできるリーダー配列と適切に読み枠を合せてアセンブリされる。
【００５７】
このようなクローニング戦略によって、ベクターによるものおよび内在性プロモーターの双方によって発現がなされる；ベクターによる促進は、遺伝子の内在性プロモーターが大腸菌(E.coli)中では機能しないような遺伝子の発現の場合に重要である。
【００５８】
微生物由来のDNAをベクター中に種々の方法で挿入することができる。通常は、DNA配列は当業界では既知の方法によって適切な制限酵素切断部位へ挿入される。そのような手法は当業者の理解の範囲内であるとみなされる。
【００５９】
上述のように選択され、単離されたDNAは適当な宿主に挿入されてライブラリーが調製され、それを所望の活性についてスクリーニングする。選択されたDNAは、好ましくは、所望の活性の検出のために既にベクター内にあるものであり、そのベクターには、それによって生物活性を有するものをコードする選択されたDNAが発現されるような適切な制御配列が含まれる。宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞である。特に好ましい宿主細胞は大腸菌(E.coli)である。構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、もしくはエレクトロポレーションによって行うことができる(Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986))。適切な宿主の選択はここに示した教示から当業者の考えうる範囲のものとみなされる。
【００６０】
宿主細胞はベクターを用いて遺伝子操作される(形質導入、形質転換、もしくはトランスフェクトされる)。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、もしくは遺伝子を増幅するために従来の培地を適切に改変した栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞の場合に以前に用いられた条件であり、当業者であれば明らかである。
【００６１】
細菌を起源とする多数の生物学的に活性な化合物は、15〜100kbpの間の連続する多重遺伝子経路内にコードされており、新規の経路を微生物の天然のアセンブル（assemblages）から発現させるためには大きなゲノム断片のクローニングが本発明では好ましい。大腸菌(E.coli)、バチルス(Bacillus)、ストレプトコッカス（連鎖球菌）(Streptococcus)などの代理の宿主中での40〜100kbpの断片の捕捉および複製は、それぞれの断片が典型的な真正細菌ゲノムの2〜5%に該当する大きなDNA断片の形態であるにもかかわらず、培養していない微生物を"増殖"させることである。
【００６２】
大きなゲノム断片を天然の微生物から首尾よく捕捉し、それ以降のクローンから多重遺伝子経路を発現させるために克服しなければならない障害は2つあり、その2つとは、1)環境DNAのクローニング効率が低いこと、および2)大きなクローンはそもそも不安定性であること、である。これらの障害を克服するために、土壌から高品質の大分子量DNAが直接的に抽出され、F因子などのベクターをベースとした細菌性人工染色体(BAC)ベクターが、大きなゲノム断片を効率的にクローン化および増殖させるために用いられる。環境ライブラリーを作製するというアプローチ(図1)では、そのようなサンプルを、混合微生物アセンブル中の収集ゲノムを高い忠実度で分類保存し複製する目的で処理するものである。このアプローチの基礎となっていることは改変された細菌性人工染色体(BAC)ベクターを100〜200kbpのゲノム断片を安定的に増殖させるために応用することである。BACベクターおよびその誘導体フォスミド(F因子をベースとしたコスミド)は、コピー数を細胞1個あたり1ないし2個に維持するために複製のF-起点を用いる。この特徴は大きなクローン化された断片の安定性を維持するためには極めて重要な因子である。高忠実度の複製は、そこからクローンが再アレンジメントしやすく複製配列の欠失が起こりやすい連鎖球菌(Streptococcus)などの高GC生物体からなるライブラリーを増殖させる際に特に重要である。
【００６３】
フォスミドベクターは高効率のλパッケージング系を用いるので、包括的なライブラリーは最小限の開始DNA量でアセンブリできる。本発明の4 x 10７個のクローンの環境フォスミドライブラリーは、各々が約40kbpのクローン化されたDNAを含有しているが、それは例えばここに述べる微生物封じ込め器具からのものを含むサンプルから回収した100ngの精製DNAから作製することができる。
【００６４】
大腸菌(E.coli)内での生物活性化合物の発現のためのライブラリーの構築において問題となる可能性のあることは、このグラム陰性菌がその化合物の活性型を発現するための適切な遺伝的背景を有していないかもしれないという点である。本発明の１つの態様では、大腸菌(E.coli)中での断片の効率的なクローニングおよびそれに引き続く発現およびスクリーニングのための異なる適切な宿主への移送が可能となる。シャトルベクターは2種類の異なるタイプの宿主中での増殖を可能にするが、本発明ではそのシャトルベクターを大腸菌(E.coli)などの細菌性の宿主中でのクローン化と増殖、および活性分子の発現のための別の宿主への移送に用いることができる。そのような別の宿主としては、例えば連鎖球菌(Streptococcus)もしくは桿菌(Bacillus)、もしくはその他のシアノバクテリア(Cyanobacteria)、粘液細菌(Myxobacteria)などの代謝的にリッチな宿主が挙げられるがそれらに限定されない。例えばStreptomyces lividansは、クローン化された経路の発現宿主として用いることができる。この株は異種の抗生物質経路の組換え発現においてルーチンに用いられる。その理由は、その株が多数のプロモーターを認識し、しかも制限系を欠いていると考えられるためである(Gusdck, T.W. とKinsella, J.E., (1992) Crit. Rev. Microbiol. 18, 247-260)。
【００６５】
本発明においては、下記の実施例では、用いることのできるシャトルベクターについて述べる。そのベクターは大腸菌(E.coli)-連鎖球菌(Streptococcus)シャトルベクターである。このシステムは大きなインサート(40kbpゲノム断片)を安定的にクローン化し発現させることができる。染色体中に組み込まれた組換え体は、陽性のクローンの配列の特徴決定および以後の取り扱いが容易となるようにもとのフォスミドとして回収することができる。宿主中でクローンのコピー数の制御を可能にするレプリコンを用いることができる。例えば、32kb 稔性プラスミドであり、かつStreptomyces coeliocolor中で細胞1個あたり1コピーで存在するSPC2 レプリコンを用いることができる。このレプリコンは末端切断によってStreptomycesの宿主中で様々なコピー数で複製するように"調節(tune)"することができる。例えば、組込み型シャトルベクターの複製型は、Streptomyces宿主中のクローンのコピー数を1細胞あたり1〜10個に調節しうるような完全長および末端切断型のSCP2レプリコンを含むように設計することができる。
【００６６】
推定上のポリケチドもしくはその他のクラスターされた遺伝子を含んでいるクローンの生物活性が常在性遺伝子（resident gene）のクラスターの活性化によるものではないことを確実にするために、遺伝子置換もしくは削除によって宿主株から常在性遺伝子配列を除去することができる。
【００６７】
バイオパニング
発現ライブラリーを作製した後、発現スクリーニングのために第2の宿主に移送するために、そのライブラリーを「バイオパニング」する工程を追加することができる。「バイオパニング」手法とは、特定の生物活性を有するクローンを、クローンのライブラリー中の配列の相同性についてスクリーニングすることによって同定する操作法をいい、そのライブラリーは(i)少なくとも1つの微生物から由来するDNAから、その特定の生物活性を有する生物学的物質をコードするDNA配列の少なくとも1部分からなる少なくとも1つのプローブDNAを用いることにより標的DNAを選択的に単離し、(ii)単離された標的DNAで宿主を形質転換してクローンのライブラリーを作製し、それはさらに該特定の生物活性についてスクリーニングするために加工される。
【００６８】
関心のある標的DNAを、少なくとも1つの微生物に由来するDNAから選択的に単離するために用いるプローブDNAは、既知の生物活性のためのDNAの完全長のコード領域配列もしくは部分的コード領域配列とすることができる。オリジナルのDNAライブラリーは好ましくは少なくとも、所望の活性を有する既知の生物活性物をコードするDNA配列の少なくとも1部分からなるプローブの混合物を用いてプローブすることができる。これらのプローブもしくはプローブライブラリーは好ましくは一本鎖であって、プローブされた微生物DNAが一本鎖の形に転換されたものが好ましい。特に好ましいプローブはスクリーニングしようとする特定の生物活性と類似もしくは同一の活性を有する生物活性物をコードするDNAから由来したものである。
【００６９】
プローブDNAは少なくとも10個の塩基、好ましくは少なくとも15個の塩基を持つものでなければならない。ある実施形態においては、経路の一部の全コード領域をプローブとして用いうる。標的DNAが少なくとも１つのDNAプローブの使用により選択的に単離されるようなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが少なくとも約50%の配列同一性、より特定すればストリンジェンシーが少なくとも約70%の配列同一性となるように設計される。
【００７０】
潜在的に関心のある標的DNAを単離するために微生物DNAライブラリーをプローブするためのハイブリダイゼーション法は当業界ではよく知られており、文献に記載されているいかなる方法もここに用いることができるが、特に固相と直接的にもしくは間接的に結合させたプローブDNAを用いることにより、微生物由来の標的のもの以外のDNAからの分離を容易にする方法が挙げられる。
【００７１】
プローブDNAは特異的な結合対の片方のパートナー(すなわちリガンド)で「標識された」ものであって、他方のパートナーが固相のマトリクスに結合して供給源からの標的物の分離が容易となるようなものが好ましい。リガンドおよび特異的結合パートナーは次のものから、その方向はいずれでもよいが、選択することができる：(1)抗原もしくはハプテンと抗体もしくはそれの特異的結合フラグメント；(2)ビオチンもしくはイミノビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン；(3)糖とそれに特異的なレクチン；(4)酵素とそれに対する阻害剤；(5)アポ酵素とその補因子；(6)相補的なホモ重合性オリゴヌクレオチド；および(7)ホルモンとそれに対する受容体。固相としては次のものから選択されたものが好ましい：(1)ガラスもしくは重合体性の表面；(2)重合体性ビーズの充填カラム；(3)磁性もしくは常磁性粒子。
【００７２】
さらに、単離された標的DNAを増幅することは任意ではあるが望ましい。この実施形態においては、標的DNAは単離後プローブDNAから分離される。次いで宿主の形質転換に用いる前にその標的DNAは増幅される。Long PCR(Barnes, WM, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1994) Mar.15)を用いて、大きいDNA断片(例えば35kb)を増幅することができる。あらかじめ定められたDNA配列の少なくとも一部分を含むように選択された二本鎖DNAは一本鎖としてから増幅し、再アニーリングして増幅された数の選択された二本鎖DNAを得ることができる。当業界では非常に多数の増幅法がよく知られている。
【００７３】
選択されたDNAは、適切な生物体を形質転換することによって、それ以降の処理およびスクリーニングのためのライブラリーを調製するために用いられる。宿主、特にここで好ましいものとして特に述べたものは、標的DNAを含有するベクターを、そのような形質転換を行いうる条件下で接種することによる人工的に導入することによって、形質転換される。
【００７４】
結果として得られた形質転換されたクローンのライブラリーは、対象とする活性を示すクローンについてスクリーニングするために処理される。クローンは活性化合物の発現のために互いの宿主に折り返して送り込まれるか、もしくは本明細書に記載の方法でスクリーニングされる。
【００７５】
in vivoのバイオパニングをFACSベースの装置を用いて行いうる。複合遺伝子ライブラリーは、転写されたRNAを安定化するエレメントを含有するベクターを用いて構築される。例えば、RNAの転写された領域に隣接するように設計されたヘアピン構造などの二次構造をもたらす配列を含めると、それは転写された配列の安定性を高め、したがってそれらの配列の細胞内での半減期を延長する。バイオパニング処理で用いられるプローブ分子は、プローブが標的分子と結合したときのみ蛍光を発するレポーター分子で標識されたオリゴヌクレオチドからなる。これらのプローブは、数種の形質転換法のうちの1つを用いてライブラリーから組換え細胞中へ導入される。プローブ分子は転写された標的RNAと結合しDNA/RNAヘテロ二本鎖分子ができる。プローブの標的への結合によって、蛍光シグナルを生じ、それはスクリーニング処理中にFACS機で検出およびソートがなされる。
【００７６】
ある生物体から選択的に単離されたDNAから多数のクローンを調製して、そのようなクローンを特定の活性についてスクリーニングし、特定の特徴を有するクローンを同定する。
【００７７】
活性についてのスクリーニングは、発現クローンの個々について行われるか、もしくは発現クローンの混合物に対してその混合物が1種以上の特定の活性を有するか否かを確認するためにまず最初にその混合物に対して行うことができる。混合物に特定の活性があった場合には、個々のクローンをその活性もしくはより特異的な活性について再スクリーニングする。また別に、クローンの群の中で陽性を示す発現クローンをFACS機でスクリーニングするため複数のクローンを1個所に局在させるために、ゲルミクロドロプレット法などの被包化技法を行うことができ、それらのクローンの群は各個別のクローンに分けられ、陽性を示す個々のクローンを同定するためにFACS機で再度スクリーニングされる。FACS機を用いたこの方法でのスクリーニングは米国特許出願番号08/876,276（1997年6月16日出願）中に詳細に述べられている。したがって例えば、あるクローンの混合物が所望の活性を有している場合は、個々のクローンを回収しFACS機を用いて再スクリーニングしてそれらのクローンのうちのどれが特定の所望の活性を有しているのかを決定する。
【００７８】
上述の態様のうちの1つに関連して述べたとおり、本発明は、微生物由来の選択されたDNAを含むクローンの活性をスクリーニングする方法を提供し、その方法は次の工程を含む：特定の生物活性についてライブラリーをスクリーニングし、該ライブラリーは複数のクローンを含み、該クローンは微生物の選択されたDNA中のゲノムDNAから回収することによって調製されたものであり、DNAは、所望の活性を有する生物活性物をコードするDNA配列の全てもしくは一部であるDNA配列の少なくとも1つの配列とハイブリダイゼーションさせることによって選択されたものであり；および、その選択されたDNAで宿主を形質転換させてクローンを産生させ、そのクローンがさらに処理され特定の生物活性についてスクリーニングされる。
【００７９】
ある実施形態においては、微生物由来のDNAライブラリーは、そこから所望の活性を有する活性物をコードするDNA配列の全てもしくは部分である1つ以上のプローブDNA配列とハイブリダイズするDNAを選別するための選別操作にかけられ、その操作は以下によって行う：
(a)  二本鎖ゲノムDNAの集団を一本鎖DNAの集団とし；
(b)  (a)の一本鎖DNAの集団をハイブリダイゼーションを行いうる条件下で、リガンドと結合したDNAプローブを接触させて、プローブとそれにハイブリダイズするゲノムDNAの集団のメンバーとの二本鎖の複合体を作製し；
(c)  (b)の二本鎖複合体を該リガンドのための固相特異的結合パートナーと接触させて固相複合体を作製し；
(d)  (b)の一本鎖DNAの集団から固相複合体を分離し；
(e)  固相結合プローブに結合したゲノム集団のメンバーをプローブから遊離させ；
(f)  (e)のゲノム集団のメンバーから二本鎖DNAを形成し；
(g)  (f)の二本鎖DNAを適切な宿主に導入し、選択されたDNAを含む複数のクローンを含有するライブラリーを形成し；
(h)  所望の活性についてそのライブラリーをスクリーニングする。
【００８０】
別の態様においては、方法にはシグナル配列もしくは分泌配列を含むDNAを回収するための前選択を含む。この方法においてはゲノムDNAの集団もしくは核酸の集団から上述のようなハイブリダイゼーションによって、シグナル配列もしくは分泌配列を含むDNAのみを選択することができる。下記のパラグラフでは本発明のこの実施形態のプロトコール、分泌シグナル配列の性質と機能についての概説、およびそのような配列のアッセイもしくは選択過程への応用の具体的な例について述べる。
【００８１】
この態様の特に好ましい実施形態はさらに、上記の(a)の後で(b)の前に次の工程を含む：
(ai)  (a)の一本鎖DNAの集団を特定のクラスのタンパク質のみに特有な分泌シグナル配列に相補的な、リガンドと結合したオリゴヌクレオチドプローブと、二本鎖複合体を形成するハイブリダイゼーションを行いうる条件下で接触させ；
(aii)  (ai)の二本鎖複合体を該リガンド用の固相特異的結合パートナーと接触させ固相複合体を作製し；
(aiii)  (a)の一本鎖DNAの集団から固相複合体を分離し；
(aiv)  該固相結合プローブに結合したゲノムの集団のメンバーを遊離させ；
(av)  固相結合プローブを、そこに結合しているゲノムの集団のメンバーから分離する。
【００８２】
シグナル配列を含むように選択され単離されたDNAは、次いで、所望の生物活性を有する生物活性物をコードするDNAに由来する1個以上のプローブDNA配列と結合するDNAを選択および単離するために上述の選択操作にかける。
【００８３】
この"バイオパニング"操作は米国特許申請  第08/692,002号（1996年8月2日出願）に述べられ、例示されている。
【００８４】
さらに、標準化ステップが発現ライブラリーの作製の前に行なわれ、発現ライブラリーが次いで作製され、そのように作製された発現ライブラリーが次いでバイオパニングされ、バイオパニングされた発現ライブラリーがハイスループットの細胞ソーティングおよびスクリーニング装置を用いてスクリーニングされるように上述の実施形態の全てを組み合わせることが可能である。したがって、種々のオプションがある：すなわち(i)ライブラリーだけを作製し、次いでそれをスクリーニングしてもよいし；(ii)標的DNAを標準化し、発現ライブラリーを作製しそれをスクリーニングしてもよいし；(3)標準化し、ライブラリーを作製し、バイオパニングおよびスクリーニングしてもよいし；または(iv)ライブラリーを作製し、バイオパンニングしスクリーニングしてもよい。
【００８５】
また別のやり方としてはライブラリーをより特定的な酵素活性についてスクリーニングすることができる。例えば、加水分解酵素活性を加水分解酵素全般としてスクリーニングする替わりに、ライブラリーをより特異的な活性、すなわちその加水分解酵素が働く結合の種類などでスクリーニングすることができる。例えば、1種以上の特定の化学的官能価に作用する加水分解酵素、例えば：(a)アミド(ペプチド結合)、すなわちプロテアーゼ；(b)エステル結合、すなわちエステラーゼおよびリパーゼ；(c)アセタール、すなわちグリコシダーゼなどを調べるためにライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００８６】
例えば、ライブラリーを特定の酵素活性についてスクリーニングすることができる。例えばスクリーニングされる酵素活性は6つのIUBクラス；オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼ、のうちの1つ以上のものとすることができる。1つ以上のIUBクラスに陽性であることが示された組換え酵素は、さらにより特定の酵素活性について再スクリーニングすることができる。
【００８７】
本発明は、例えば、新たな酵素、例えば下記の用途に用いうる下記の活性を有するもの、を同定することができる：
リパーゼ/エステラーゼ    エステル(脂質)/チオエステルの鏡像異性選択的な加水分解、ラセミ混合物の分離、光学活性の酸もしくはアルコールのメゾ-ジエステルからの合成、選択的合成、領域特異的な炭水化物エステルの加水分解、環状第2アルコールの選択的加水分解、光学活性エステル、ラクトン、酸、アルコールの合成、活性化/非活性化エステルのエステル転移反応、エステル交換、ヒドロキシエステルからの光学活性ラクトン、領域および鏡像異性選択的な無水物の環の開裂、界面活性剤、脂肪/油脂変換、およびチーズの熟成。
【００８８】
プロテアーゼ    エステル/アミド合成、ペプチド合成、アミノ酸エステルのラセミ混合物の分離、非天然型アミノ酸の合成、および界面活性剤/タンパク質加水分解。
【００８９】
グリコシダーゼ/グリコシルトランスフェラーゼ    糖/重合体合成、グリコシド結合の開裂によるモノ,ジ,およびオリゴサッカライドの形成、複合オリゴサッカライドの合成、UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼを用いたグリコシド合成、ジサッカライド,グリコシルフルオリド,アリルガラクトシドのグリコシル基転移、オリゴサッカライド合成におけるグリコシル基の転移、ジアステレオ選択的なα-グルコシルスルホキシドの開裂、非対称グリコシル化、食物加工、および製紙。
【００９０】
ホスファターゼ/キナーゼ    リン酸エステルの合成/加水分解、領域および鏡像異性選択的リン酸化、リン酸エステルの導入、リン脂質前駆体の合成、制御されたポリヌクレオチドの合成、生物学的分子の活性化、保護基なしでの選択的リン酸結合形成。
【００９１】
モノ/ジオキシゲナーゼ    活性化されていない有機物質の直接的酸素機能化、アルカン,芳香族,ステロイドの水酸化、アルケンのエポキシ化、鏡像異性選択的なスルホキシド化、領域および立体異性選択的Bayer-Villiger酸化。
【００９２】
ハロペルオキシダーゼ    ハライドイオンの親核性部位への酸化的付加、オレフィン結合への次亜ハロゲン酸（hypohalous acid）の付加、シクロプロパンの環の開裂、活性化芳香族基質のオルトおよびパラ1,3誘導体への変換、ジケトンの2-ハロ-誘導体への変換、イオウおよび窒素含有基質のヘテロ原子酸化、エノールアセテート, アルキン,および活性化芳香環の酸化。
【００９３】
リグニンペルオキシダーゼ/ジアリルプロパンペルオキシダーゼ    C-C結合の酸化的開裂、ベンジルアルコールのアルデヒドへの酸化、ベンジルカーボンの水酸化、フェノールの2量体化、二重結合の水酸化によるジオール形成、リグニンアルデヒドの開裂。
【００９４】
エポキシドヒドロラーゼ    鏡像異性体として純粋な生物活性化合物の合成、エポキシドの、領域および鏡像異性選択的加水分解、モノオキシゲナーゼによる芳香族およびオレフィンのエポキシド化でのエポキシドの形成、ラセミエポキシドの分離、ステロイドエポキシドの加水分解。
【００９５】
ニトリルヒドラターゼ/ニトリラーゼ    脂肪族ニトリルのカルボキサミドへの加水分解、芳香族,ヘテロ環,不飽和脂肪族ニトリルの対応する酸への加水分解、アクリロニトリルの加水分解、芳香族性カルボキサミド,カルボン酸(ニコチンアミド,ピコリンアミド,イソニコチンアミド)の産生、アクリルジニトリルの領域選択性の加水分解、ヒドロキシニトリルからのアミノ酸の生成。
【００９６】
トランスアミナーゼ    アミノ基のオキソ酸への転移。
【００９７】
アミダーゼ/アシラーゼ    アミド,アミジンおよびその他のC-N結合の加水分解、非天然アミノ酸の分離および合成。
【００９８】
特定の活性を有するものとして同定されたクローンは、その特定の活性を有する生物活性物をコードするDNA配列を同定するために配列決定できる。本発明に従って次のものを単離および同定することができる：(i)特定の活性を有する生物活性物をコードするDNA、(ii)そのような活性を有する生物活性物(そのアミノ酸配列を含む)、および(iii)そのような活性を有する組換え分子の産生。
【００９９】
スクリーニング
本発明は多数のタイプの生物活性物をスクリーニングする能力を提供する。例えば、ポリケチドおよびポストポリケチド生合成遺伝子のライブラリーから新規のポリケチドを研究用に作製するための所望の成分を選択し組み合わせる能力は魅力的である。大きなインサート(特に大きなインサートを受け容れることのできる、F因子ベースのベクターなどのベクターを用いる場合)を含有するクローンを用いて遺伝子バンクを作ることができ、それは遺伝子クラスターのクローニングを容易にするものであるので、本発明の方法は、新規のポリケチドシンターゼ、およびその他の関連の経路もしくは商業上関連する2次的代謝物をコードする遺伝子のクローニングを可能に、および容易にする。
【０１００】
好ましくは、遺伝子クラスターもしくは経路のDNAをベクターに、特に、さらに検出可能なタンパク質もしくはタンパク質関連の一連の活性の、連結された遺伝子クラスターからの産生を制御しうる発現制御配列からなるベクターに連結することが好ましい。外来性DNAの導入能が非常に大きいベクターの使用は、そのような遺伝子クラスターに用いるためには特に適切であり、そのようなベクターの使用はここに例示として大腸菌(E.coli)のF因子(稔性因子)が挙げられる。前述のとおり、この大腸菌(E.coli)のF因子はそれ自体の接合の際の高頻度の伝達に影響を及ぼし、かつ混合微生物サンプルからの遺伝子クラスターなどの大きなDNA断片を作り安定に増殖させるためには理想的なプラスミドである。その他のベクターの例としてはコスミド、細菌性人工染色体ベクター(BACベクター)、およびP1ベクターが挙げられる。λベクターも比較的大きなDNA分子を保持でき、高いクローニングおよびパッケージング効率を有し、プラスミドベクターと比べると取り扱いおよび貯蔵が容易である。λ-ZAPベクター(Stratagene Cloning Systems, Inc.)は、ベクター中のクローンがヘルパーファージで切除されてpBluescriptファージミドに導入されるので、サブクローニングにかかる時間をなくせる、という都合のよいサブクローニングの特徴を有している。これらのベクターのクローニング部位はlacプロモーターの下流にある。この特徴によって、内在性プロモーターが大腸菌(E.coli)中では機能しないような遺伝子の発現が可能になる。
【０１０１】
対象とする生物活性分子をコードしている可能性のある経路を捕捉している本発明の遺伝子発現ライブラリーは、まず原核細胞中に誘導されて所望の前駆体(例えば改変可能なバックボーン分子)を発現させ、次いでその前駆体は活性分子を発現しうるような別の宿主系中でスクリーニングされる。特に好ましい原核細胞は大腸菌(E.coli)細胞である。あるいはまた、代謝的にリッチな細胞系から得た粗製もしくは部分精製抽出物、または純粋なタンパク質を元の遺伝子発現ライブラリーと組み合わせて活性を有する可能性のある分子を作り出し、その分子に対象とする活性があるかスクリーニングすることができる。
【０１０２】
例えば、遺伝子ライブラリーは大腸菌(E.coli)を宿主とし、シャトルベクターをベクターとし、ここに提供する実施例に従って作製することができる。その後ライブラリーを"ハイブリダイゼーションスクリーニング"を用いてスクリーニングすることができる。"ハイブリダイゼーションスクリーニング"は、以前に特徴を検討済みの小分子に関連する化合物をコードする経路を検出するために用いられるアプローチであり、それは経路内の保存されている遺伝子に対するプローブのハイブリダイゼーションによって行われる。このアプローチは、経路中のポリケチド合成酵素遺伝子内に高度に保存された領域のあるポリケチドクラスの分子には効果的であると考えられる。これらの遺伝子は性質が高度に保存されているので、複雑性の低いライブラリーからのクローンの高密度フィルターアレイとプローブとのハイブリダイゼーションは、可能性のある完全長の経路を持つクローンを同定するための効果的なアプローチであると考えられる。あるいはまた、保存された経路遺伝子に対して設計されたプライマーを用いた多重PCRを、マイクロタイターディッシュフォーマット中にアレイされたクローンからのDNAプールについて用いることができる。
【０１０３】
複雑なコミュニティーから作られたライブラリーは、相同の配列を持つ任意のクローンをハイブリダイゼーションによって同定する可能性を高めるために富化操作が必要である。例えば、図3に示すフィルター上に固定化された約1億塩基対のDNAは、3つの典型的なStreptomycesゲノムを約5回カバーできることになる。しかし、1グラムの土壌は10４種以上に相当する約10６個の細菌細胞を含む。そのようなサンプルから作られたライブラリーのスクリーニングには3000枚以上のフィルターが必要となるであろう。
【０１０４】
このような核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質によって異なる。例えば、その核酸のハイブリダイズされる領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成(例えばGC 対 AT含量)、および核酸の種類(例えばRNAかDNAか)をハイブリダイゼーション条件の選択にあたって考慮することができる。さらに考慮すべき点は核酸の１つが例えばフィルター上に固定化されているかどうかである。進行性のより高いストリンジェンシー条件の例としては下記のとおりである：2 x SSC/0.1% SDSで室温近辺(ハイブリダイゼーション条件)；0.2 x SSC/0.1% SDSで室温付近(低ストリンジェンシー条件)；0.2 x SSC/0.1% SDSで42℃(中程度ストリンジェンシー条件)；および0.1 x SSCで68℃(高ストリンジェンシー条件)。洗浄は、これらの条件の１つのみ、例えば高ストリンジェンシー条件のみ、もしくはこれらの各条件を例えばそれぞれ10〜15分間、上述の順番で、記載のステップのいずれかもしくは全てを繰り返して用いて行うことができる。しかし、上述のとおり、最適な条件は特定のハイブリダイゼーション反応毎に異なり、経験的に定めることができる。
【０１０５】
上述のバイオパニングのアプローチは、所与のプローブ配列と相同な配列を持つクローンに富むライブラリーを作るために用いることができる。このアプローチを用いて40kbpまでのインサートを有するクローンを含有するライブラリーをパニングの各ラウンド後に約1000倍富化させることができる。このことによって1ラウンドのバイオパニング富化で上述の3000枚のフォスミドライブラリーから3枚のフィルターに減らすことができる。このアプローチはポリケチド配列を有するクローンに富むライブラリーを作り出すために応用することができる。
【０１０６】
高密度フィルターもしくはバイオパニングを用いたハイブリダイゼーションスクリーニングは、保存された遺伝子を含む経路の相同体を検出するための有効なアプローチであることが判明している。しかし既知の対応物がないと考えられる新規の生物活性分子を発見するためには、その他のアプローチが必要である。本発明の別のアプローチは、大腸菌(E.coli)中で小分子の環状構造もしくは「バックボーン」の発現についてスクリーニングすることである。これらのポリサイクリック（多環式）構造をコードする遺伝子は大腸菌(E.coli)中で発現されうる場合が多いので、小分子バックボーンは、不活性型ではあるが作製することができる。生物活性は、その分子もしくは経路を、その構造を活性型へ改変もしくは「修飾」するのに必須のグリコシル化およびメチル化遺伝子を発現する適切な宿主へ移入させることによって得られる。つまり、組換えによって大腸菌(E.coli)中で発現させた不活性な環状化合物がクローンの同定のために検出され、次いでそのクローンは代謝的にリッチなStreptomycesなどの宿主に折り返して導入され、それに引き続いて生物活性分子の産生が起こる。ハイスループットのロボット化システムの使用によって、多重アレイ中の何十万ものクローンのスクリーニングがマイクロタイタープレートで行えるようになる。
【０１０７】
これらの構造物を有するクローンの検出と富化のための１つのアプローチはFACSスクリーニング法を用いることであり、このFACSスクリーニング法は米国特許申請第08/876,276号（1997年6月16日出願）に述べられ、例示されている方法である。ポリサイクリック環状化合物は典型的には紫外光で励起すると特徴的な蛍光スペクトルを示す。このようにこれらの構造物を発現しているクローンは十分な感度の検出法を用いてバックグラウンドから区別することができる。ハイスループットのFACSスクリーニング法は大腸菌(E.coli)ライブラリー中の小分子のバックボーンをスクリーニングするために用いることができる。市販されているFACS装置はUV活性分子について1秒あたり100,000個までのクローンをスクリーニングすることができる。これらのクローンは更なるFACSスクリーニングのためにソートされるか、もしくは常在プラスミドを活性スクリーニングのために抽出しStreptomycesへ折り返し導入できる。
【０１０８】
別のスクリーニングアプローチにおいては、Streptomyces宿主への折り返し導入の後、候補のクローンからの有機抽出物は、Staphylococcus aureus、大腸菌(E.coli)、もしくはSaccharomyces cervisiaeなどの試験生物に対する感受性スクリーニングによってその生物活性を調べることができる。FACSスクリーニング法はクローンを試験生物とともに被包（encapsulate）することによってこのアプローチにも用いることができる(図5)。
【０１０９】
上述のスクリーニング法に替わる別の方法として本発明で提供される方法は"混合抽出"スクリーニングと名付けられたアプローチである。"混合抽出"スクリーニングアプローチは、ポリサイクリックバックボーンへ活性を与えるのに必須な、アクセサリー遺伝子はStreptomycesなどの代謝的にリッチな宿主中で発現されること、ならびに、酵素は抽出され大腸菌(E.coli)クローンから抽出されたバックボーンと組み合わせてin vitroで生物活性化合物を生じること、という事実を利用している。様々な増殖段階でのStreptomyces株などの代謝的にリッチな宿主からの酵素抽出調製物は大腸菌(E.coli)ライブラリーからの有機抽出物のプールと組み合わせ、次いで生物活性を評価する。この方法の説明は下記の実施例に示す。
【０１１０】
大腸菌(E.coli)クローンにおける活性を検出する別の方法は、生物活性化合物を異なる形に変換することのできる遺伝子をスクリーニングすることである。例えば、低値（low value）のダウノマイシンをより高値（higher value）のドキソルビシンに変換することのできる組換え酵素が最近発見された。ペニシリンをセファロスポリンに変換する同様な酵素経路が探索されている。
【０１１１】
比色アッセイに比べると蛍光を基礎とするアッセイは非常に感度がよく、これは単一細胞アッセイのための主たる選択基準である。単一細胞中での組換え酵素のスクリーニングを左右する2つの主要な因子がある：i)遺伝子発現レベル、およびii)酵素アッセイの感度である。遺伝子発現のレベルを推定するために、ベクターを与えられた宿主細胞によって遺伝子産物のコピーが何個産生されるかを求めることができる。例えば、pBluescriptファージミド(Stratagene Cloning Systems, Inc.)で感染させた大腸菌(E.coli)細胞の各々がインサートからの遺伝子産物のコピーを〜10３個産生するものと仮定することができる。FACS装置は細胞1個あたり約500ないし1000個の蛍光分子を検出することができる。酵素1分子が少なくとも1個の蛍光を発しうる基質分子を変えることができると仮定するならば、細胞1個は蛍光励起細胞ソーター(FACS)の光学系で検出するのに十分な量の蛍光を示すこととなろう。
【０１１２】
基質は細胞ソーティング分析のプロセスの前もしくは途中に細胞に加えることができる。どちらの場合でも、基質溶液を作り細胞をそれと接触させる。細胞ソーティング分析の前にこれを行う場合には、溶液を作り、それを細胞が培養プレートもしくはその他の容器に入っている状態のときに添加することができる。基質溶液の濃度範囲は用いる基質によって異なる。市販の基質は通常は例えば細胞染色の目的で用いるための濃度範囲が指示されている。これらの濃度範囲を本発明において用いるべき最適濃度もしくは濃度範囲の決定において用いることができる。基質溶液を細胞と接触した状態で、基質が細胞膜を透過するために必要なだけの時間と適切な温度で保持する。ここでもこのことは基質によって異なる。例えばポペット弁など、それは流路中の開口部を試薬(例えば基質)の流路中への導入指示があるまでは封じておくものであり、その流路中では細胞が分析機を通過して動いているが、その弁などによって流れの中に試薬を送り込む器具を、基質の送り込みに用いることができる。
【０１１３】
基質は細胞に入り込むことができ、細胞内で分析しうることが起こるために十分な時間存在し続けることの出来るものである。細胞膜を通過する基質の細胞内への導入が困難を伴わずに起こることは通常観察されることである。また、基質がいったん細胞内に入った後は、探索している生体分子と反応して検出可能な応答が生ずるのに十分な程度反応するより以前には、外に"漏れ"出ないことが好ましい。基質の細胞内への保持は各種の方法で増強することができる。その一つとしては、基質化合物は疎水性の尾部を付加することにより構造的に改変される。別の好ましい溶剤、例えばDMSOもしくはグリセロールなどを細胞の外部をコートするために用いることができる。また、基質を細胞へより低い温度で持ち込むことができ、それは細胞内部からの基質の漏出を遅らせることが観察されている。
【０１１４】
広範囲の基質を用いることができ、それらは探索しようとする生物活性のタイプに基づいて選ばれる。さらに、探索しようとする生物活性が他の生体分子の生物活性と同じクラスであってそれに対する多数の基質が既知の場合には、探索しようとする生物活性は既知の生体分子に関連する既知の基質のカクテルを用いて調べることができる。例えば、約20種の市販のエステラーゼに対する基質が知られており、これらの既知の基質の組み合わせによって、最適ではないかもしれないが、検出可能なシグナルが産生される。グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、およびモノオキシゲナーゼに対する基質も既知であり入手可能である。
【０１１５】
基質は標的の生体分子と相互作用して検出可能な応答を生ずる。そのような応答には色素産生もしくは蛍光性の応答および類似のものを含む。検出可能な分子種は基質の開裂の結果得られるもの、もしくは開裂によって影響を受ける2次分子、もしくはその他の基質/生体分子相互作用によって検出可能な変化が起こったものである。診断薬業界では既知の、検出可能なアッセイフォーマットの多数の例があり、それらはイムノアッセイ、色素産生アッセイ、および標識プローブ法を用いるものである。
【０１１６】
また、FACSスクリーニングはStreptomycesなどの代謝性に富む宿主中でのUV蛍光分子の発現を検出するためにも用いることができる。組換えオキシテトラサイクリンは異種的にS.lividans TK24中で産生させた場合でも判別可能な赤い蛍光を保持している(図6)。経路クローンはFACSによってソートしうるが、ポリサイクリック分子について高いスループットでスクリーニングすることができる。
【０１１７】
文献に記載されている数種の酵素アッセイでは、フェノリックヒドロキシル(もしくはアニリノアミン)が酵素作用によって脱アシル(もしくは脱アルキル)となるときに蛍光の変化をまねくことを利用している。図7はこのタイプの脱アシルの酵素アッセイの基礎原理を示している。生物学的プロセスの結果としての蛍光波長の何らかの消失もしくは活性化は生物活性の蛍光とここでは定義される。
【０１１８】
本発明では各種のハイスループットの細胞ソーティング装置を用いることができる。第1に非常に高いスループットおよび個々の細胞の分析が行える利点のあるFACS細胞ソーティング装置がある。用いうるその他のタイプの装置としてはロボット化装置、および時間分解蛍光装置があり、それらの蛍光装置は実際に単一の分子からの蛍光を長時間測定することができる。それらの方法は単一の分子を測定するものであるので、それらは単一分子の分子量を同時に測定できるが、それらのスループットはFACS細胞ソーティング装置ほど高くはない。
【０１１９】
FACS装置でスクリーニングする際には、トリガーパラメーターは対数前方側方散乱にセットする。フルオレセインもしくはその他の蛍光基質によって放出される陽性クローンの蛍光シグナルは2波長ミラーで区別され、対数モードで捕捉される。例えば、"活性"クローンはソートされマイクロタイタープレートへ置かれる。単一の生物体または小規模の微生物の集合(consortia)から構築されたライブラリーからのクローンのソーティングの場合には、マイクロタイタープレートの個々のウエルに約50のクローンがソートされて移される。環境から得た複雑な大規模ライブラリー(すなわち＞100の生物体を代表する〜10８個のクローンを持つライブラリー)の場合には、約500の発現クローンが集められるはずである。
【０１２０】
次いでプラスミドDNAを、Autogen社から発売されているような市販の自動ミニプレプ機のいずれかを用いて、ソートされたクローンから単離することができる。次いでプラスミドを適切な発現宿主中へ再形質転換し、色素産生性寒天プレートをベースとした、もしくは自動液体フォーマットアッセイを用いて活性をアッセイする。次いで発現クローンであると確認されたものの配列を調べる前にRFLP分析にかけ、ユニークなクローンを求める。ユニークなエステラーゼクローンを含んでいるインサートの配列を調べ、同定されたオープンリーディングフレーム(ORF)、過剰発現のために遺伝子をPCRでサブクローン化した。また別に、発現しているクローンを"粗くソート"して単一の管に入れ、プラスミドインサートは増幅された産物として回収され、そのインサートはサブクローン化され、適切なベクター宿主系に再スクリーニングのために形質転換した。
【０１２１】
被包技法はシグナルを局在化させるために行われ、細胞がもはや生存していないような場合でも行いうる。ゲルミクロドロップ(GMD)は生体適合性のマトリクスで作られた小さな粒子(直径25ないし50nm)である。生きた細胞ではこれらのミクロドロップは細胞の後代がお互いの隣にとどまるのでミニアチュア化したペトリ皿として働き、クローンの成長に基づいて細胞を分離することができる。基本的方法は高度に自動化されハイスループットである；コロニーの大きさのシグナルの境界値を確立した後、1時間当たり約10６GMDが自動的にプロセスされる。細胞は基質とともに被包され、陽性のクローンを含んだ粒子がソートされる。蛍光性基質で標識されたガラスビーズもGMDの内部にロードすることができる。生存していない細胞の場合には、GMDはシグナルの局在を確認するために用いることができる。
【０１２２】
遺伝子ライブラリーからのそれぞれ異なる発現クローンを含んでいる生細胞もしくは非生存細胞をFACS機上でスクリーニングした後、陽性クローンを回収し、DNAを陽性クローンから単離する。得られたDNAをin vivoもしくはin vitroのいずれかで当業界では既知の各種の増幅技法のいずれかを用いて増幅することができる。in vivoの増幅操作は得られたクローンのクローンそのものもしくはサブクローンを生きた宿主中へ形質転換させることを含み、その後、宿主を増殖させる。in vitroでの増幅はポリメラーゼ連鎖反応法などの技法を用いて行うことができる。
【０１２３】
上述の参照文献の全てはここに参照により取り込むこととする。これらの各技法については参照文献中に詳細に述べられている。
【０１２４】
DNAはこれらの技法のいずれか1つ以上を用いて変異原化、もしくは"進化"させ、より好ましいクローンを同定するためにFACS機で再スクリーニングすることができる。ここで用いられている"蛍光スクリーニング"という用語は対象とする活性のいかなるものについてでも蛍光を検出する蛍光分析機を用いてスクリーニングすることを意味する。緑色蛍光タンパク質をコードするものなどの蛍光分子を発現しているか、もしくはβ-ガラクトシダーゼなどの蛍光性分子に転換しうるタンパク質をコードするかのいずれかの内部制御基準遺伝子を用いることができる。この内部制御遺伝子はその分子の進化した形のものを検出するために用いる波長とは異なる波長で最適の蛍光を発するものとするべきである。DNAを進化させ、これらのタンパク質もしくは分子を共発現するベクター中に再クローン化し、適切な宿主生物に形質転換させ、より好ましいクローンを同定するためにFACS機を用いて再スクリーニングする。
【０１２５】
本発明の重要な態様として、細胞が個別に分析されるというものがある。しかしながら、その他の実施形態では細胞のプールを作ることと多数回のスクリーニングを経ることが含まれていることを意図している。このことは、より一般的な活性のカテゴリー、すなわち酵素のカテゴリーから、特定の基質分子に対して特異的なカテゴリーの酵素などの主たる対象としている特定の活性に至る、生物活性の階段状の分析法を提供する。
【０１２６】
これらのライブラリーのメンバーはゲルミクロドロップレット中に被包され、対象とする基質、例えば遷移状態の類似体などに暴露され、対象とする活性についてFACSソーティングを経由しての結合に基づいてスクリーニングされる。
【０１２７】
本発明から、基質の混合物を用いて対象とする多数の活性を同時にあるいは順次検出することできるということが期待される。FACS装置は異なる波長で蛍光を発する分子を検出することができ、異なる波長で蛍光を発し、異なる活性を示す基質を用いることができる。
【０１２８】
本発明の蛍光励起細胞ソーティングスクリーニング法は所望の生物活性について1時間当たり数百万個のクローンをアッセイすることができる。この技法は、生物学的に非常に多様な環境ライブラリーのスクリーニングに必要な非常に高いスループットのスクリーニング法を提供する。
【０１２９】
好ましい実施形態においては、本発明は新規の活性スクリーニング法を提供し、その活性はここに"作用物質"と定義されそれは例えばGタンパク質などの変換タンパク質の作用に影響を及ぼすものである。本発明においては、機能を有する変換タンパク質(膜結合Gタンパク質など)を含む細胞は、ここでは"標的細胞"もしくは"標的"と定義されるものであるが、作用物質分子となる可能性のあるものとともに被包され、その作用物質分子が変換タンパク質の作用に影響を及ぼすかをスクリーニングする。作用物質分子となる可能性のあるものは、ここに述べたように、環境もしくはその他のサンプルから作製された遺伝子ライブラリーから元々は由来するものである。
【０１３０】
とりわけ、作用物質は経路もしくは遺伝子クラスターによってコードされる分子であるかまたは該経路もしくはクラスターの発現によって作製される分子である。作用物質を発現する核酸を含んでいる細胞、もしくは細胞内に働いて作用物質分子を生じさせるような活性を発現する核酸を含む細胞をスクリーニングに用いることができる。また別に、作用物質分子をスクリーニングの前に発現させる、もしくは作製することができ、その後に用いることができる。作用物質分子を発現している細胞、もしくは作用物質分子は被包され、ここに述べたような方法などの各種の方法を用いてスクリーニングされる。
【０１３１】
作用物質分子は各種の方法で被包粒子中に存在させるかあるいは導入することができる。作用物質分子(例えば小分子)を作製するために働くようなタンパク質をコードする遺伝子を発現している細胞は被包粒子中へ、例えばここに提供する実施例を用いて導入することができる。該細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。原核細胞は大腸菌(E.coli)などの細菌を用いうる。既に示したとおり、遺伝子を被包粒子の外部で発現させ、発現産物もしくは発現産物の作用によって作製された分子(小分子もしくは作用物質分子)を宿主から精製し、該作用物質を機能を有する変換タンパク質とともに被包粒子中へ下記の実施例に述べる方法を用いて導入することもできる。
【０１３２】
被包はビーズ、高温アガロース、ゲルミクロドロップレット、ゴースト赤血球細胞もしくはマクロファージなどの細胞、リポゾーム、またはその他のいかなる方法による被包および局在化分子を用いうる。
【０１３３】
例えば、リポゾームの調製法は既に述べられており(すなわち米国特許第5,653,996号、第5,393,530号および第5,651,981号)、リポゾームを各種の分子の被包に用いることも述べられている(米国特許第5,595,756号、第5,606,703号、第5,627,159号、第5,652,225号、第5,567,433号、第4,235,871号、第5,227,170号)。エンドサイトージスの際に赤血球中にタンパク質、ウイルス、細菌、およびDNAを包み込むことも述べられている(journal of Applied Biochemistry 4, 418-435(1982))。in vitroもしくはin vivoで低張状態での融解もしくは双極性の膜の崩壊の際に包み込まれる物質のための担体として用いる赤血球についても述べられている(Ihler, G.M.(1983) J.Pharm.Ther.に総説されている)。これらの技法は本発明においてスクリーニングのためのサンプルの被包に有用である。
【０１３４】
ここで用いられている"微小環境"という用語は、本発明の方法に必要な相互作用を容易にするための適切な環境を提供するいかなる分子構造をも意味する。分子間の相互作用を容易にするために適した環境としては例えばリポゾームが挙げられる。リポゾームは、リン脂質、糖脂質、ステロイド、例えばリン酸化アルキルなどの長鎖アルキルエステル、レシチンなどの脂肪酸エステル、脂肪族アミンおよび類似のものなどの各種の脂質から調製することができる。中性ステロイド、電荷両親媒性、およびリン脂質の組み合わせに脂肪物質の混合物を用いうる。リン脂質の具体的な例としてはレシチン、スフィンゴミエリン、およびジパルミトイルフォスファチジルコリンがある。ステロイドの代表例としてはコレステロール、コレスタノール、およびラノステロールがある。電荷両親媒性の化合物の代表的なものは通常は12-30個の炭素原子を含んでいる。モノ-もしくはジアルキルリン酸エステル、もしくはアルキルアミン例えばジセチルリン酸、ステアリルアミン、ヘキサデシルアミン、ジラウリルリン酸、および類似のもの。
【０１３５】
さらに、リガンド/受容体相互作用を増強するもしくは阻害する可能性のある作用物質をスクリーニングして同定することができる。本発明はこのように、タンパク質-タンパク質相互作用などの分子間相互作用をブロックもしくは増強する薬剤を産生する組換え体をスクリーニングする方法を提供する。G-タンパク質相互作用に影響を及ぼす化合物のスクリーニングの場合、組換えクローンを発現しているスクリーニングされる宿主細胞を、膜に結合しているG-タンパク質およびリガンドとともに被包する。化合物(小分子など)は宿主細胞外へ拡散してゆき、G-タンパク質相互作用による増強もしくは阻害は各種の方法で評価できる。スクリーニング法であって、リガンド/受容体相互作用、G-タンパク質相互作用などの変換剤、もしくは細胞内で起こるカスケードイベントの増強もしくは阻害からもたらされる活性の増減もしくは細胞内の化合物もしくは分子、それは核酸およびタンパク質を含むが、その存在を検出しうるスクリーニング法であれば本発明においては有用である。
【０１３６】
例えば、上述のアデニルシクラーゼ法を本発明に用いることができる。その他のアッセイ法でエフェクターによって改変を受けるような効果もしくは変化を検出するものは本発明に有用である。その変化、もしくはシグナルは、バックグラウンド、もしくは変化を起こす可能性のある小分子もしくは薬剤が存在しないときのそのエフェクターの基礎的活性に対して検出可能なものでなければならない。そのシグナルとは細胞の増殖速度の変化、もしくは色調の変化もしくは発光などのその他の表現型の変化である。機能を有する遺伝子産物の産生もその効力によって影響を受ける可能性がある。例えば、普通はその遺伝子の下流、もしくは変換剤又はエフェクターによって作り出される直接的な効果によって、制御されている、機能を有する遺伝子産物の産生が変化を受け検出することができるようになる。機能を有する該遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質もしくは赤色蛍光タンパク質などのレポーター分子(Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995 Oct; 59(10):1817-1824)、またはその他の検出可能な分子がある。これらの"機能を有する遺伝子"はマーカー遺伝子として用いられる。"マーカー遺伝子"は所望により宿主細胞中へ組み込ませることができる。それらの発現レベルが変わると表現型もしくはその他のスクリーニング可能なもしくは選択可能な変化をもたらす。その変化が選択可能なものの場合は、表現型での変化はマーカー遺伝子を発現している細胞とそうでない細胞との間に増殖の相異もしくは生存率の相異を引き起こすか、または細胞内もしくは細胞周囲でのレポーター分子の発現レベルの検出可能な変化をもたらす。その変化がスクリーニング可能なものの場合は、表現型での変化は細胞の検出可能な特徴の相異、それによってマーカーを発現している細胞とそうでないものとを区別しうるような相異をもたらす。選択はスクリーニングよりも好ましい。
【０１３７】
転写活性の直接的な読み出しを測定するような迅速なアッセイ法は本発明に有用である。例えば、lacZをコードする細菌性遺伝子をFUS1プロモーターの制御下に置くと、酵母のフェロモン応答経路の活性化は、透過化処理された酵母が発色物質から発色させる能力をモニターすることにより1時間未満で検出することができる。その他の応答経路の活性化も同様な方策でアッセイすることができる。検出可能な分子をコードする遺伝子、もしくは別の分子の改変を経由して検出可能なシグナルを作りだす遺伝子は、応答の活性化もしくは応答の抑制を分析するために用いることができる。
【０１３８】
蛍光タンパク質および/または蛍光基ならびに消光基をお互いに近接させて、酵素もしくは核酸配列の存在をアッセイするために用いることが報告されている(WO 97/28261およびWO 95/13399)。これらの反応の最初は、適切な発光と励起スペクトルを有する蛍光タンパク質を、蛍光エネルギーの移転を示すために物理的に近接した位置に置かれる。酵素活性の基質はそれら2種のタンパク質の間に置かれ、酵素活性の存在による基質の開裂が2種のタンパク質を、発光のスペクトルが変わる程度まで引き離すようにする。別のグループでは、蛍光タンパク質および消光分子を近接させて"衝突消光"性を示すようにし、それによって蛍光タンパク質の蛍光は近傍の消光基によって簡単に低減させられる。プローブ核酸配列が2つの基の間になるように操作し、そのプローブ配列とサンプル中の標的とがハイブリダイゼーションを起こすとタンパク質を消光剤から引き離し、それによって蛍光シグナルが生ずる。また別のグループとして報告されているものは、上記の方策の組み合わせであって、酵素基質をその1端では蛍光タンパク質、別の末端では消光剤を側方につないだものを用いた分子を作製するものである(EP 0428000)。これらのタイプのアッセイを、リガンドと受容体などの相互作用をする分子の会合が阻害もしくは改善された結果としての、または生物活性化合物の作用が直接的に特定の分子の転写におよんだ結果としての、核酸産生(転写活性化もしくは抑制)および/または酵素もしくはその他のタンパク質の産生(翻訳の修飾)の修飾を検出するために本発明の方法に用いることができるものと理解される。
【０１３９】
宿主細胞を形質転換するために用いることのできる遺伝子によってコードされ、対象とする化合物を同定するためのスクリーニングに用いられる蛍光タンパク質は本発明に特に有用である。基質は種々の方法によって被包中に局在させられ、それらの方法としてはここに下記の実施例で述べる方法が挙げられるがそれに限定されない。また細胞は蛍光分子をコードする遺伝子を含むように操作して作ることもできる。例えば、転写を調節された遺伝子をレポーター分子の遺伝子に結合させてレポーター分子の発現(もしくは発現の欠如)を起こさせ、転写調節されている遺伝子の発現の検出を容易にすることができる。例えば、リガンドの受容体への結合を増強もしくは阻害するために、または経路のいずれかの分子の効果を増強もしくは阻害するために、相互作用するアゴニストもしくはアンタゴニストの究極の効果が、細胞内の対象とする遺伝子の転写活性化もしくは抑制にあるとするならば、発現の検出を容易にするために活性化された遺伝子をレポーター遺伝子と結合させることができることは有用である。
【０１４０】
細胞は種々の方法で操作して化合物が細胞性の"イベント"に与える影響をアッセイできるようにすることができる。ここで用いている"イベント"とは、サンプルから由来しここに述べる方法に従って作製された遺伝子ライブラリーのメンバーもしくはその発現によって最終的に(究極には)得られる、もしくは発現される
分子に対しての細胞もしくは細胞成分の暴露への応答として修飾される何らかの細胞性の機能、もしくは応答として起こるイベントを意味する。例えば、市販の製品で検出しうる細胞性のイベントとしては、膜貫通pHの変化(すなわちBCECF pH 指示薬で、それはBioRad Laboratories, Inc., Hercules, 米国カリフォルニア州から販売されている)、細胞増殖などの細胞サイクル−イベント、細胞毒性、および細胞死(ヨウ化プロピジウム、5-ブロモ-2'-デオキシ  ウリジン(BrdU)、アネキシン-V-Fluos、およびBoehringer-Mannheim Research Biochemicalsから市販されているTunel(方法))、または酵素などのタンパク質の産生が挙げられる。多くの場合、膜タンパク質が他の分子と相互作用することによって開始されたイベントのカスケードには、細胞内での分子のリン酸化もしくは脱リン酸化などの修飾を伴う。これらのイベントの検出を容易にする蛍光性の基質などの分子は本発明において対象とする活性を発現しているライブラリーのスクリーニングに有用である。ELISA又は比色アッセイも、本発明に従ってライブラリーをスクリーニングするために用いられる単一細胞スクリーニングに適用することができる。
【０１４１】
上述の方法に従ってデザインされたプローブ核酸配列は、本発明において所望のクローンを"集積"させるためにも用いることができる。ここで用いている"集積"という用語は分子のもとの集合の数および/または複雑性を低減させることを意味している。例えば、プローブは特定のポリケチド配列を同定するためにデザインされ、ポリケチド経路をコードするクローンを集積するために用いることができる。図Xは被包化されたフォスミドクローンを、特定の対象とするプローブでin situハイブリダイゼーションした結果を示しており、この場合にはポリケチドシンターゼ遺伝子プローブである。ここの実施例中で述べている方法にしたがって大腸菌(E.coli)中にフォスミドライブラリーを作製する。クローンを被包し、被包化されたクローンの集合を得られるように増殖させる。細胞を融解させ、中和し、対象のプローブに暴露させる。ハイブリダイゼーションによって陽性の蛍光シグナルが生じ、そのシグナルは蛍光細胞ソーター上でソートすることができる。陽性のものはさらに発現スクリーニングによってスクリーニングされるかもしくは活性スクリーニングによってスクリーニングされる。本発明のこの態様はもとの集合の複雑性の低減を容易にし、所望の経路のクローンを集積する。これらのクローンはさらに以降のスクリーニングに用いることができる。例えば、これらのクローンを発現させてバックボーン構造物(ここに定義されている)を生じさせることができ、その構造物は代謝性に富む宿主中で修飾され、最後に対象とする活性についてスクリーニングされる。また別に、クローンを発現させて直接的に小分子を生じさせ、その小分子は対象とする活性についてスクリーニングされる。さらにまた、多重のプローブをデザインして"多重"スクリーニングおよび/または集積を可能とすることができる。ここで用いられている"多重"スクリーニングおよび/または集積という用語は、スクリーニングおよび/または集積を所望の成果以上に同時に行うことである。
【０１４２】
検出可能な分子をスクリーニングアッセイに用いるための基質として加えることができ、または検出可能な分子をコードする遺伝子を本発明の方法で用いることができる。
【０１４３】
本発明はここに記載したハイスループットのスクリーニングメカニズムを、分子の集合から所望の活性を集積することができるように用いるための方策を提供する。本発明の1つの態様においては、細胞をチオエステラーゼ活性などの遍在分子の存在についてスクリーニングし、例えばポリケチド経路によってコードされている生物活性などの所望の生物活性を産生している細胞を集積させることができる。種々のスクリーニングメカニズムを用いることができる。例えば、チオエステラーゼ活性を有する細胞を同定し回収することによって、ポリケチド活性を含んでいる可能性のある細胞を集積することができるようになる。例えば、芳香族のポリケチドに対しては、ポリケチドシンターゼは1つの酵素活性のセットからなっており、単一のポリペプチド鎖(タイプＩ)もしくは別々のポリペプチド（タイプII）のどちらかに収められており、全てのサイクルで働く。これに対して、複合ポリケチドは、連鎖合成における各触媒ステップのための固有の活性部位を含む多機能性PKS上で合成される。タイプIポリケチドの主枝は、チオエステラーゼ−シクラーゼ活性(チオエステル結合が開裂する)によって最終反応においてアシル担体タンパク質から作製され開裂される。あるグループはチオエステル結合をポリケチド経路に沿って位置を動かすと、ポリケチド主枝が担体タンパク質から離れてクリップされる場所をクローンは指令する(Cortes J.ら, Science, Vol.258, 9, June 1995)。ハイブリダイゼーション(相同性)スクリーニングを、チオエステラーゼ活性を含む細胞を同定するために行うことができる。ハイブリダイゼーションスクリーニングを用いる場合には既知のチオエステラーゼをコードする遺伝子の配列(部分もしくは完全な配列)を同定用プローブとして用いることができる。また別に、既知のチオエステラーゼ活性遺伝子から由来するプロービング配列を含むプローブで、例えば上述のものなどの蛍光分子および/または消光分子が側方にあるようなプローブを用いることができる。標識基質もスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。
【０１４４】
本発明の別の態様では、蛍光分析機、それは単一の細胞の検出を要求し、例えばFACS機などであるが、それを用いたスクリーニングを、ActinomycesもしくはStreptomycesなどの、菌糸体を形成する真菌および糸状細菌の特定のタイプをスクリーニングするためのハイスループットな方法として用いられる。とりわけ、スクリーニングは糸状真菌及び細菌でその生活環のあるステージで単細胞となるものについて行われる(多核封入体細胞が断片となって単細胞を産生する)。典型的には、菌糸体生物の胞子は発芽して基質菌糸体を作り(この相の期間に抗生物質が産生される可能性がある)、その後それは気中菌糸を形成する。気中菌糸はやがて断片化しより多数の胞子を作る。糸状細菌もしくは真菌でその生活環のステージの1つで単細胞を形成するものは対象とする活性のスクリーニングに用いることができる。以前にはこの方法は行われていなかった。なぜならば多核封入体(真菌様の)細胞の分枝ネットワークはある種を形成するからである。好ましい実施形態においては、本発明は特別な種、Streptomyces venezuelaeを、単一細胞の検出を要求する蛍光分析機を用いるスクリーニングのために提示する。本発明の方法によって、例えば新規の小分子および生物活性物の産生のための、菌糸体のハイスループットのスクリーニングが可能となる。これらの細胞は組換え、および非組換えのものである。
【０１４５】
Streptomyces venezuelaeは他のStreptomycesの種の大多数とは異なり、液体培地中で芽胞形成を行う。いくつかの培地中ではこれは培養が栄養生長の終わりに達したときに断片化して単一細胞になる。生物活性の小分子を含む大部分の2次的代謝産物の産生は対数増殖期の終わりで起こるので、生物活性を産生しているStreptomyces venezuela断片化細胞についてFACS機などの蛍光分析機で小分子の何らかの天然の蛍光を与えればスクリーニングすることができる。
【０１４６】
本発明の1つの態様においては、単一の細胞もしくは断片化された菌糸体を産生するために操作されるStreptomycesもしくはActinomycesのいかなる種も、対象とする特徴についてスクリーニングすることができる。細胞のスクリーニングはその生活環において本発明のための小分子を産生しているステージにあるときに行うことが好ましい。
【０１４７】
組換えプラスミドの選択のための蛍光をベースとした方法は既に述べられている(Bio Techniques 19:760-764, November 1995)。ウロポルフィリノーゲン III メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を過剰に発現させるためのプラスミドを含んでいる大腸菌(E.coli)株は、蛍光性のポルフィリノイド化合物を蓄積し、それに紫外光を照射されたときには組換え細胞が明赤色の蛍光を発するようになる。その遺伝子の他のDNA断片との置換もしくは崩壊が起こると、酵素活性を失い蛍光を発しない細胞となる。
【０１４８】
ウロポルフィリノーゲン III メチルトランスフェラーゼはS-アデノシル-l-メチオニン(SAM)依存性の2つのメチル基のウロポルフィリノーゲン IIIメチルトランスフェラーゼへの付加を触媒して、シロヘム、F430因子、およびビタミンB12の合成に必要なジヒドロシロヒドロクロリンを生じさせる酵素である。この酵素の基質であるウロポルフィリノーゲン III(  -アミノレブリン酸に由来する)はこれらの合成経路のみならずその他のいわゆる"生命色素"と呼ばれるヘムおよびクロロフィルの合成経路にも遍く認められる化合物である。ジヒドロシロヒドロクロリンは細胞内で酸化されて蛍光性の化合物であるシロヒドロクロリン(第II因子)を生ずるかもしくは、再度ウロポルフィリノーゲン III メチルトランスフェラーゼによる修飾を受けて別の蛍光化合物であるトリメチルピロコルフィンを生ずる。これらの蛍光化合物は紫外光(300nm)を照射したとき明赤色ないし赤橙色の蛍光を発する。
【０１４９】
細菌のウロポルフィリノーゲン III メチラーゼは大腸菌(E.coli)(1), 緑膿菌(Pseudomonas)(2), 桿菌(Bacillus)(3), およびMethanobacterium(4)から精製されている。Bacillus stearothermophilusのウロポルフィリノーゲン III メチラーゼはクローン化され、配列を調べられ、大腸菌(E.coli)中での発現がなされている(Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995 Oct; 59(10):1817-1824)。
【０１５０】
本発明の方法においては、この化合物およびその他の類似の化合物の蛍光発光性は対象とする化合物のスクリーニングに上述したように用いることができるか、もしくは対象とする化合物の存在を集積させるために用いることができる。遺伝子経路をコードしている可能性のある組換えクローンを発現している宿主細胞は蛍光性でスクリーニングされる。このように、蛍光タンパク質もしくは代謝物を産生する細胞を同定することができる。大腸菌(E.coli)中もしくはその他の宿主細胞中で発現された経路クローンは生物活性を持つ化合物もしくは生物活性を持つ化合物の"バックボーン構造"(それはこの後他の宿主細胞、例えば代謝性に富む生物体中で"修飾"される)を生じさせる。"バックボーン構造"は小分子の特定のクラスで定義される基礎的構造である。例えばポリケチドバックボーンはラクトン、グリコシド、もしくはペプチド抗生物質のバックボーンとは異なる。各クラスの中で、変異体は側鎖の付加もしくは除去、又は環状構造の再配置によって("修飾"もしくは"修飾された")産生される。芳香族生物活性化合物に存在する環状構造が、ある場合には蛍光シグナルを生ずることが知られており、そのことはそれらの細胞を集合から区別するために用いることができる。これらの構造のあるものは、また非組換え宿主細胞の示すバックグラウンドの吸光度とは異なる吸光度の特徴を提供することができ、それによっても集合からそれらの細胞を区別することができる。生物活性化合物もしくは"バックボーン構造"を産生している可能性のある組換え細胞は同定され、細胞の集合から分離されて所望の細胞の集合が集積される。このように、本発明の方法はまた、遺伝子経路によってコードされる新規の芳香族化合物、例えばポリケチド遺伝子によってコードされるものを、環境もしくはその他のサンプルから直接的に発見することを可能にする。
【０１５１】
また、化合物は宿主のポルフィリン様分子をこれらのサンプルから由来する遺伝子産物で改変することによっても作製することができる。このように、宿主のポルフィリン様化合物を改変してそれを蛍光性のものとするような組換えクローン遺伝子産物をスクリーニングすることができる。
【０１５２】
本発明の別の態様においては、対象とする分子を発現している細胞は、特にさらに以降の取り扱いおよび組換えクローンのスクリーニングのために、96ウエルもしくは384ウエルのプレート中にソートされる。本発明のこの態様においては、FACS機などの蛍光分析機は集合中のメンバーを区別したり、集合を評価する、もしくは既に開示されているようなスクリーニングに用いるためではなく、選択されたサンプルについて陽性を示すものをスクリーニングして回収し、さらにスクリーニングを行うことを可能とするために行われる。例えば、計数に用いられる典型的な株は細胞の生存に影響を及ぼすので、これらのタイプの株は細胞のさらに以降の取り扱い、特に例えば対象とする活性をコードする核酸の回収のためのスクリーニングおよび選択には用いられない。特に、組換えクローンを含んでいる細胞はさらに以降の取り扱いのために同定され多数のウエルを持つプレートにソートされる。細胞内の組換えクローンの存在をスクリーニングするためには種々の方法がある。緑色蛍光タンパク質(Biotechiniques 19(4):650-655, 1995)などの蛍光タンパク質をコードする遺伝子、もしくはウロポルフィリノーゲン III メチルトランスフェラーゼ(Bio Techniques 19:760-764, November 1995)をコードする遺伝子を、本発明の方法において組換えクローンの検出ができるようにするためのレポーターとして用いることができる。組換えクローンはさらにそれ以降の対象とする活性のスクリーニングのためにソートされる。スクリーニングは、例えば酵素について、もしくは小分子について行うことができ、ここに記載した、もしくは参照したものを含む種々の方法を用いて行うことができる。
【０１５３】
本発明の別の態様においては、望ましい既存化合物を改変し、評価してより望ましい化合物を得る。既存の化合物もしくは化合物ライブラリーは、ここに記載した方法に従って作製した小もしくは大インサートライブラリーの発現によって製した分子に暴露される。これらの分子による既存化合物の望ましい改変は検出され、FACS機などの蛍光分析機を用いてより良いリード化合物がスクリーニングされる。例えば小分子を生ずるクローンを発現している大腸菌(E.coli)細胞を1種以上の既存の化合物に暴露し、それはさらに望ましい改変が行われているものについてスクリーニングされる。また別に、細胞を1種以上の既存化合物とともに被包化し、同時にスクリーニングしてその化合物への望ましい改変を同定する。改変の例としては、共有結合性もしくは非共有結合性の改変がある。共有結合性の改変としては、メチル基もしくはリン酸基の化合物への付加もしくは転移、ペプチド結合もしくはその他の結合の開裂などの取り込み、転移、および開裂による改変で活性化合物を生じさせることが挙げられる。非共有結合性の改変としては、例えば水素結合、イオン結合、および/またはファンデルワールス力の付加もしくは除去によるコンホメーション変化を分子に作り出すことが挙げられる。改変された化合物はここに述べたものを含む種々の方法でスクリーニングされる。
【０１５４】
また別に、既存の化合物は、大もしくは小インサートクローンの発現によって作製された分子の改変に用いることができ、分子の望ましい改変は、ここに述べたものを含む種々の方法を用いて、蛍光スクリーニング法でスクリーニングすることができる。
【０１５５】
本発明の別の態様では、発現したクローンから由来する分子を、増殖阻害もしくは細胞死を引き起こす可能性のある化合物を集積するために生物体に暴露させる。例えば、Staphylococcus aureusの培養物をクローンの発現によって作製された化合物とともに、もしくはクローンを発現している細胞とともに被包化し、選択的培地に暴露させてある期間増殖させる。共被包化された産物はついて染色され蛍光スクリーニング法によってスクリーニングされる。生細胞の検出のできる染色法を用いることができ、陽性のもの、この場合にはそれは蛍光を発しないものであるが、それを回収する。また別に、前方および側方散乱の特徴が、陽性のものを集積するために用いられる。評価しようとするStaphylococcusもしくはその他の生物体が増殖しない、もしくは低下すると、被包物の前方および/または側方への散乱が低下してカプセルを生ずる。
【０１５６】
本発明の別の態様においては、有用な生物活性物を発現するクローンがin vivoでスクリーニングされる。この態様においては、宿主細胞は組換え細胞を内部化するような刺激を受け、これらの組換え細胞によって作製される生物活性物、その生物活性物は宿主細胞の死または宿主中にある内部分子もしくは化合物を改変することができるものであるが、その生物活性物についてスクリーニングするために用いられる。
【０１５７】
多くの細菌性病原体がマクロファージなどの大食細胞中で協同して広範囲の遺伝子の発現を調節することによって生存する。大食細胞による殺滅から微生物が生き延びるための能力はその微生物が持つ病気を引き起こす能力と相関している。従って、宿主の細胞内環境において好んで転写される遺伝子を同定することは病原生物がどのように首尾よく感染を起こさせるかということの理解に極めて重要である。
【０１５８】
ValdiviaとFalkowは、宿主細胞もしくは組織と出会った際に誘導される病原生物からの遺伝子を同定するための選択法を報告している。彼らは、少なくとも4つの独立した調節サーキットの制御下にある14個のネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)遺伝子が宿主マクロファージ中で選択的に誘導されることを示した。この方法は、薬剤耐性及び栄養要求性とは独立に働く、宿主細胞と出会って誘導される細菌遺伝子の迅速な同定のための差次蛍光誘導(DFI)に基づくものである。
【０１５９】
差次蛍光誘導は本発明の1つの態様においては、レポーター分子へ融合させた病原性遺伝子を持つ細菌性のクローンおよび推定上の生物活性経路のクローンを宿しているマクロファージのスクリーニングの用いられる。マクロファージ細胞は本発明の方法において、有用な生物活性物をコードしている可能性のある経路のクローンならびに病原性因子をコードしているプラスミドもしくはその他のベクターとともに共感染させる。このように、本発明の1つの態様で組換え生物活性分子、この生物活性分子はマクロファージもしくは他の大食細胞中の転写的に活性なレポーター遺伝子融合体を抑制しているが、その生物活性分子のスクリーニングが可能となる。in vivoで病原性因子を阻害する生物活性分子は、例えば赤色もしくは緑色蛍光タンパク質などのレポーター分子の発現の欠如によって同定される。この方法によって、病原性因子もしくはその他の遺伝子産物を特異的に阻害する生物活性化合物をコードする経路についての迅速なスクリーニングが可能となる。そのスクリーニング法によって哺乳類細胞中で活性を有する生物学的関連分子を同定することが可能となる。
【０１６０】
また組換え生物活性化合物はin vivoで"2-ハイブリッド"システムを用いてもスクリーニングでき、それは転写因子とその活性化剤との間、もしくは受容体とその同種の標的との間などの様なタンパク質-タンパク質もしくはその他の相互作用のエンハンサーおよびインヒビターを検出することができる。図7は転写因子の転写開始を増強もしくは阻害する小分子についてスクリーニングするためのアプローチを示している。小分子経路およびGFPレポーター構築物は共発現される。GFP発現を変えるクローンはFACSによってソートされ経路クローンはその特徴を調べるために単離される。
【０１６１】
示してきたとおり、薬剤発見のための共通のアプローチには、スクリーニングアッセイが含まれ、そのアッセイにおいて疾病標的(疾病の原因となるとされる巨大分子)は薬剤の候補となる可能性のあるもの、それは治療活性を試験されるものであるが、それに暴露される。他のアプローチにおいては、疾病の原因物質を代表する、細菌もしくは腫瘍細胞系などの細胞の全体もしくは生物体が、スクリーニングの目的で候補となる可能性のあるものに暴露される。これらのアプローチのいずれもが本発明で行いうる。
【０１６２】
また本発明は、未培養サンプルから由来したクローン化された経路の、代謝性に富む宿主への移転を可能にし、その移転は異種での発現及びそれ以降での対象とする生物活性化合物の、ここに簡潔に記載した種々のスクリーニングアプローチを用いてのスクリーニングのためのものである。
【０１６３】
所望の生物活性物の回収 
生細胞もしくは生存していない細胞、それぞれ遺伝子ライブラリーからの異なる発現クローンを含んでいるが、それらがスクリーニングされ、陽性のクローンが回収された後、陽性クローンから当業界では良く知られた技法を用いてDNAが単離される。そのDNAは次いでin vivoもしくはin vitroで当業界では既知の種々の増幅技法のうちのいずれかを用いて増幅される。in vivoでの増幅は、クローンもしくはそのクローンのサブクローンの生きた宿主への形質転換、およびそれに引き続く宿主の増殖を含むものである。in vitroでの増殖はポリメラーゼ連鎖反応法などの技法を用いて行うことができる。
【０１６４】
進化
組換えアプローチによって新規な生物活性化合物を発見することの１つの利点は、改変された特異性を有する変異体を産生し選択するための経路（pathway）サブユニットを操作することができることである。経路サブユニットは置換することができ、又は個々のサブユニットを下記の方法を用いて進化させ、得られた異なる活性を有する生物活性分子を選択することができる。
【０１６５】
スクリーニングを行って生物活性を有することが見出されたクローンは、位置指定突然変異誘発（directed mutagenesis）を行って所望の特性を有する新たな生物活性を発現させる（develop）か、又は熱もしくは有機溶媒に対する安定性などの、野生型活性には存在しないかまたはほとんど報告されていない特に望ましい特性を有する改変された生物活性を発現させることができる。既知の位置指定突然変異誘発の技術は、いずれも本発明に適用できる。例えば、本発明に従って使用される特に好ましい突然変異誘発技術は、下記のものを含む。
【０１６６】
用語「エラー・プローン（error-prone）PCR」とは、DNAポリメラーゼの複写忠実性が低い条件下でPCRを行い、点突然変異がPCR産物の全長に沿って高い割合で得られる方法をいう。Leung, D. W.ら、Technique, 1:11-15 (1989)及びCaldwell, R. C.及びJoyce G. F., PCR Methods Applic., 2:28-33 (1992)。
【０１６７】
用語「オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発」とは、目的の任意のクローン化されたDNAセグメントの部位特異的突然変異誘発の発生を可能にする方法をいう。Reidhaar-Olson, J. F.及びSauer, R. T.ら、Science, 241:53-57 (1988)。
【０１６８】
用語「アセンブリーPCR(assembly PCR)」とは、小さなDNA断片の混合物からのPCR産物の構築(assembly)を含む方法をいう。多数の異なるPCR反応が同じバイアル中で平行して起こり、１つの反応の産物によって別の反応の産物が開始される。
【０１６９】
用語「性的PCR突然変異誘発(sexual PCR mutagenesis)」（「DNAシャッフリング」としても知られている）とは、密接に関連するDNA配列であるが異なるDNA分子の間でのin vitroにおける強制的な相同的組換えをいい、配列の相同性に基づくDNA分子のランダムなフラグメント化とPCR反応におけるプライマー伸長による乗換えの固定化によって引き起こされるものである。Stemmer, W. P., PNAS, USA, 91:10747-10751 (1994)。
【０１７０】
用語「in vivo突然変異誘発」とは、目的の任意のクローン化DNAにおいてランダム突然変異を生成する方法をいい、１つ以上のDNA修復経路で突然変異を担う大腸菌株におけるDNAの増殖を伴うものである。これらの「ミューテーター（mutator）」株は、野生型の親よりも高いランダム突然変異率を有する。これらの株の１つにおいてDNAを増殖することは、結局はそのDNA内のランダム突然変異を生成するであろう。
【０１７１】
用語「カセット突然変異誘発」とは、本来の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」を有する二本鎖DNA分子の小さな領域を置換する任意の方法をいう。オリゴヌクレオチドは、しばしば完全に及び／又は部分的にランダム化された本来の配列を含む。
【０１７２】
用語「循環アンサンブル突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis）」とは、各々アミノ酸配列は異なるが表現型が関連する突然変異体の多様な集団を作り出すために開発されたタンパク質工学（タンパク質突然変異誘発）のアルゴリズムをいう。この方法は、フィードバック機構を使用してコンビナトリアル・カセット突然変異誘発の連続ラウンドを制御する。Arkin, A. P.及びYouvan, D. C., PNAS, USA, 89:7811-7815 (1992)。
【０１７３】
用語「指数的アンサンブル突然変異誘発（exponential ensemble mutagenesis）」とは、高いパーセンテージの特有かつ機能的な突然変異体を有するコンビナトリアル・ライブラリーを作製する方法であって、残基の小さなグループを平行してランダム化し、各々の改変位置で、機能性タンパク質を構成するアミノ酸を同定する方法、Dlegrave, S.及びYouvan, D. C., Biotechnology Research, 11:1548-1552 (1993)；並びにランダムおよび位置指定突然変異誘発、Arnold, F. H., Current Opinion in Biotechnology, 4:450-455 (1993)をいう。
【０１７４】
環境サンプル由来の新規な酵素をコードする遺伝子を直接クローニングする培養非依存性（culture-independent）アプローチを使用することにより、生物多様性の未開発供給源の利用が可能になる。このアプローチは、好適な原核生物宿主中で増殖され得るクローニングベクターに保有させた（archived）天然の生物の集合的なゲノムに相当する「環境ライブラリー」の構築に基づく。クローン化DNAは、最初は環境サンプルから直接抽出されるため、そのライブラリーは、純粋培養で増殖し得る原核生物の小さな画分に限られない。さらに、これらのサンプル中に存在する環境DNAを標準化(normalization)することにより、元のサンプル中に存在する全ての種に由来するDNAにより一層匹敵するようになる。これにより、優性種に比べて数桁も少ないサンプルの微量成分から目的遺伝子を見出す効率が劇的に増加する。
【０１７５】
複合的な環境発現ライブラリーの評価では、生物活性を発見するレベルで既に律速段階が生じている。本発明は、例えば、何千もの異なる生物を含む複合的な環境発現ライブラリーの迅速なスクリーニングを可能にするものである。このサイズの複合サンプルの分析には、数百万のクローンをスクリーニングして、ゲノムの生物多様性をカバーすることが必要である。本発明は、莫大な数のクローンの利用を可能にする、高ハイスループットスクリーニング法に相当する。本明細書に開示する方法によって、所望の生物学的活性について時間当たり約3,000万〜約2億個のクローンのスクリーニングが可能となる。これにより、新規な生物分子を発現するクローンの環境ライブラリーの完全なスクリーニングが可能である。
【０１７６】
本発明は、環境サンプル由来の新規な生物活性をコードする遺伝子を直接クローニングする培養非依存性アプローチと、新規な生物分子の迅速な発見のために設計された高ハイスループットスクリーニングシステムとを組み合わせるものである。
【０１７７】
この方法は、大腸菌又は他の好適な原核生物宿主中で増殖し得るクローニングベクターに保有させた微生物ゲノムを代表とする遺伝子ライブラリーの構築から始める。好ましくは、天然の微生物の集合的なゲノムに相当する「環境ライブラリー」を作製する。この場合、クローン化されたDNAは環境サンプルから直接抽出されるため、ライブラリーは、純粋培養で増殖し得る原核生物の小さな画分に限定されない。「標準化」は、元のサンプル中に存在する全ての種に由来するDNAへ匹敵させる１つのアプローチとして、環境核酸へ実施することができる。標準化技術によって、環境サンプルの微量成分に相当するゲノムからの発見効率を劇的に増加できる。標準化を行うことは、少なくとも１つの研究によって目的の生物が優性種と比べて5桁も少ないことが証明されたため、好ましいものである。
【０１７８】
もう１つの実施態様では、本発明は、微生物の単離及び収容（containment）のための装置、並びに未培養微生物のin situ富化を行う方法を提供する。富化プロセスは、希少種及び未培養の微生物集団のメンバーの回収の可能性を増加することができる。
【０１７９】
in situ富化は、本発明では、周囲環境マトリックスのメンバーを選択的に誘引(lure)することを目的とした増殖用基質(substrate)と栄養改善剤（nutritional amendments）からなる微生物収容装置を使用することによって達成できる。基質（炭素供給源）及び栄養改善剤（すなわち、窒素、リンなど）の選択は、富化したい集団のメンバーに依存する。抽出組成は、集団のどのメンバーを富化し、集団のどのメンバーを富化しないかに依存する。次いでこれらの収容装置を、望ましい微生物を誘引（attraction）して増殖させる期間、所望のバイオトープ下に置く。
【０１８０】
本発明の基質は、モノマーとポリマーを含んでいてもよい。グルコサミン、セルロース、ペンタン酸又は他の酸、キシラン、キチンなどの、基質モノマーは、ある種の微生物の誘引に利用できる。モノマーを利用することで、細胞上の基質受容体の有無よりも、回収のための誘引の影響を大きくすることができる。これにより、さらに多くの生物多様性が得られるという利点が追加される。ポリマーもまた、該ポリマーを分解できる微生物を誘引するために使用できる。
【０１８１】
目的の特定の微生物は、水性環境中の希釈集団から取得かつ富化されるため、大容量の水から微生物を富化する必要がなくなる。これらの装置はまた、土壌環境に埋め込むことで陸生の生息環境から微生物を富化することもできる。セルロースやキチンなどの基質は、表面材料に結合して放線菌などの特定クラスの微生物を誘引でき、2次代謝産物に富む供給源となる。
【０１８２】
本発明を利用すれば、in situ富化は容易に達成できる。図２は、本発明で詳述する異なる生息環境からの微生物の取得を示す。これらの写真は、２つの異なる種類の基質（セルロース及びキシラン）を利用した場合の土壌環境から回収された微生物の種類の違いを示す。これらの写真はまた、ビーズのみを採用した場合と基質（キチン）を結合させたビーズを使用した場合の相違を示す。
【０１８３】
好ましい実施態様では、本発明は、微生物富化用選択培地を結合するための表面を有する固相支持体を含む環境サンプルから微生物集団を回収するための微生物収容装置に関する。
【０１８４】
本発明のもう１つの好ましい実施態様では、サンプルを、固相支持体及び微生物富化用選択培地を結合するための表面を有する装置と接触させ、装置からその集団を単離することを含む、環境サンプルから微生物を単離する方法を提供する。
【０１８５】
本明細書中で用いる「微生物富化用選択培地」は、ある生物の増殖を増強し、かつ／又は周囲環境に存在する他の生物の増殖を阻害する要素を含む任意の培地である。本発明の培地は、富化の標的である生物が周囲マトリックス中で増殖する他の微生物に比べて比較的少数で存在する場合に有用である。例えば、抗生物質コリスチン及びナリジクス酸を含む微生物富化用選択培地は、グラム陰性細菌の増殖を阻害するが、グラム陽性細菌の増殖は阻害しないであろう。微生物富化用培地の選択性は、例えばセルロースなどの特定の基質を、コリスチン及びナリジクス酸含有培地に添加することによってさらに強化できる。従って、前述の微生物富化用培地を組み込んだ微生物収容装置は、エネルギー源としてセルロースを利用できるグラム陽性生物に対して選択的である。
【０１８６】
本明細書中で用いる、用語「固相支持体」は、微生物富化用選択培地を結合させるための支持表面を提供する任意の構造体である。本発明のスクリーニングアッセイに用いることができる周知の固相支持体としては、限定するものではないが、ガラスビーズ、シリカエアロゲル、アガロース、Sepharose、Sephadex、ニトロセルロース、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然及び改質セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、並びに微孔性ニフッ化ポリビニリデン膜が挙げられる。選択培地の結合及び支持を可能にする任意の材料が本発明に含まれると理解すべきである。例えば、ガラスビーズ又はシリカエアロゲルなどの、表面積が大きい材料を使用することにより、基質-表面コンジュゲートの集団を多数保持する比較的小さな装置中に高濃度の微生物を回収できる。
【０１８７】
本発明の１つの態様では、基質を、選択用の環境に置く前に固相表面にコンジュゲートさせる。このようなコンジュゲーションは、好ましくは化学的なコンジュゲーションである。ガラスビーズ又はシリカエアロゲルなどの表面積の大きい材料を、好ましくは本発明の表面として利用する。本発明で有効に利用できる表面積を有する材料には、様々なものがある。基質の表面材料へのコンジュゲーション又は固定化は、当業者に明らかな様々な方法によって行うことができる。ガラスビーズの誘導体化（derivitization）の一例を下記実施例中に記載する。多様なコンジュゲーション又は固定化方法のうち任意のものを使用して、基質を本発明の表面へ固定化させることができる。
【０１８８】
ガラスビーズ又はシリカエアロゲルなどの、本発明の誘導体化（derivitized）された表面積材料は、目的の環境中に置かれるまで別々の装置中に収容される。好ましくは、そのような収容装置は、誘導体化材料の収容と同時に微生物の移住を可能にするタイプである。例えば、特に好ましい容器（containers）は、メッシュフィルターであり(例えば、Houston, TexasのSpectrum社から入手可能なもの)、誘導体化材料を収容するように処理されている。例えば、フィルターを四角に切断し、誘導体化材料をその中央に配置し、該フィルターを半分に折り畳み、3つの側面（sides）を接着して閉じて収容装置とすることができる。次いで、メッシュフィルター等を、環境中に配置する固相支持体として使用される任意の装置中に設置すればよい。特に好ましい装置は、プレキシガラス（plexiglass）などの、不活性材料からなる。
【０１８９】
あるいは、材料の収容と同時に微生物の移住を可能にする装置であれば、任意のものを本発明に採用することができる。例えば、Falconチューブ（VWR、Fisher Scientific）などを採用して誘導体化材料を直接収容してもよい。該チューブは、尖った器具を利用して穴を開けることができ、装置の中又は外への微生物の移住を可能にする装置を提供することができる。
【０１９０】
富化用選択培地の定着要素は、非共有結合又は共有結合によって固定化できる。非共有結合は、固相表面を、例えば、標的微生物の細胞膜上に展示される受容体によって特異的に認識されるタンパク質の溶液で被覆することによって達成できる。あるいは、固定すべきタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、固相表面にタンパク質を定着させることもできる。該表面は、前以て製造して貯蔵しておくことができる。
【０１９１】
もう１つの態様では、本発明は、固相表面に結合された微生物誘引物質（attractant）を利用する細菌及び原始（archaeal）微生物の選択的in situ富化方法に関する。本明細書中で用いる「微生物誘引物質」は、微生物を選択的に沈殿させるか、又は微生物富化用培地を含む装置へ微生物の移住を誘導する任意の組成物として定義される。微生物誘引物質は、さらに、本発明の装置に含まれる微生物富化用培地と接触する微生物の生き残りを選択的に増加する任意の組成物として定義される。例えば、微生物は、炭素源などのエネルギー供給源として認識される環境刺激に対して走化性（chemotactic）応答を機械的に（routinely）示す。特定の炭素源はいずれも、集団のあるメンバーによって利用できるが、他のメンバーには利用できない。このように、炭素源選択は、富化したい集団のメンバーに依存する。例えば、Streptomycetalesのメンバーは、セルロース、キチン及びリグニンなどの複合重合性基質を利用する傾向がある。これらの複合基質は、他の属（genera）には利用されるけれども、殆どの細菌には利用できない。
【０１９２】
もう１つの態様では、炭素源の選択に応じて、さらに窒素源を用いることが必要である。例えば、キチンはそのC：N比が釣り合っているが、セルロースは釣り合っていない。セルロース（又は他の炭素に富む基質）の利用を高めるためには、硝酸塩又はアンモニアなどの窒素源を添加することがしばしば有用である。さらに、微量要素の添加によっても、集団のあるメンバーの増殖を高める一方で他のメンバーの増殖を阻害することができる。本発明のもう１つの態様では、真核生物の増殖インヒビターとして有用な化合物を、本発明の装置中に含ませることができる。真核生物の増殖インヒビターには、真核生物の増殖を選択的に妨げる任意の化合物が含まれる。そのようなインヒビターとしては、例えば、ナイスタチン、シクロヘキシミド、及び／又はピマリシン若しくは他の抗真菌性化合物などの1種以上の市販化合物が挙げられる。これらの化合物は、微生物富化用選択培地中に粉末として振りかけるか、又は液体として混和することができる。他の選択剤は望ましくない種の増殖を阻害するため、又は所望の種の増殖を促進するために使用できると予想される。例えば、細菌種及び原始種の取得は、利用可能な基質にとって望ましい細菌種を抑えて競合（out-compete）できる真核生物の有無によって複雑になる場合がある。従って、本発明の装置中に抗真菌剤又は他の真核生物増殖インヒビターなどの選択剤を含ませることで、標的微生物の増殖が促進される。
【０１９３】
またもう１つの態様では、ある細菌種の増殖を阻害するが、他の細菌は阻害しない化合物を、富化用培地中に含ませてもよい。原核生物の増殖インヒビターには、原核細胞の増殖を防ぐ任意の化合物が含まれる。そのような化合物としては、限定するものではないが、ポリミキシン、ペニシリン及びリファンピンが挙げられる。このような化合物の使用は、細菌集団のどのメンバーを富化したいかに依存する。例えば、Streptomycesの大半はポリミキシン、ペニシリン及びリファンピンに感受性であるが、これらは、耐性を有するファミリーの「希少」メンバーの富化に使用できる。選択剤はまた、集団の原始メンバーの富化に使用することもできる。
【０１９４】
本発明では、微生物富化用培地を含む収容装置は、例えば、誘引物質としての複合炭素源、真核生物のインヒビターとしてのナイスタチン及び選択された原核生物のインヒビターとしてのリファンピンを内包することができる。誘引物質、真核生物インヒビター及び原核生物インヒビターは、本発明の微生物富化用選択培地の成分として、個別に又は任意に組み合わせて使用できると理解すべきである。さらに、本発明の装置は、任意の適切な固相支持体を、環境マトリックス又は目的の微生物の単離に好適な任意の微生物富化用培地と組み合わせて含むことができると理解すべきである。環境マトリックスは、海洋環境、陸生環境又は海洋及び陸生環境の組み合わせを含むことができる。さらに、環境マトリックスは、空中浮遊し続ける生物などの、固体でも液体でもない環境に存在する生物を含むことができる。本発明の装置は、大気又は他の気体環境からそのような生物を濾過するのに使用できる。さらに、本発明の収容装置は、地球以外の惑星上に存在するような、非陸生環境からの微生物の単離に使用できることが意図されている。例えば、火星に存在する可能性のある微生物を誘引するために設計される微生物富化用培地を含む収容装置は、本発明に含まれる。そのような装置は、地球上で現在遭遇するものと実質的に違わない環境マトリックス中に存在し得る微生物を誘引するために設計される特徴を含むであろう。さらに、地球以外の惑星の環境条件に関するデータは利用するに十分であり、本発明の収容装置はそれらの環境に特異的な要素を含むように設計できる。
【０１９５】
もう１つの態様では、本発明は、生物治療（bioremediation）に有用な微生物を単離・同定するのに利用できる。生物治療は、微生物を利用して、環境由来の毒性を有する不要な化学物質を除去又は解毒する方法である。本発明の装置は、毒性を有する不要な化学物質に結合し得るか又は解毒し得る生物を選択的に富化する培地を含むように修飾できる。例えば、ハロゲン化有機化合物は、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、殺藻剤、可塑剤、溶媒、作動液、冷却剤及び化学合成の中間体として広く使用されてきた。結果としてこれらの化合物は、環境汚染物質の最大のグループの１つを構成している。塩化有機化合物は、これらの物質の最大の割合を占めており、過去数十年にわたって大規模プロセスによって合成されてきたものである。我々の生態系の至る所に使用および散布されてきたため、公衆衛生及び環境への潜在的な影響に対する関心が高まっている。従って、これらの化学物質や他の化学物質を環境から除去し得る微生物を同定することが必要とされている。例えば、本発明の富化用選択培地中に塩素化有機化合物を含有させることによって、そのような化合物に誘引される生物の単離を促進することが可能である。他のそのような化合物としては、アルカン類、芳香族類、スルホニル類及び重金属類が挙げられる。一旦同定されれば、その生物は、そのような汚染物質を含むことが知られている環境を解毒する、自然の安価な手段として使用できる。
【０１９６】
上記の全ての文献は、その全内容を引用によって本明細書に含めるものとする。これらの技術のそれぞれは、上記の文献中に詳細に記載されている。DNAは、これらの技術の任意の1種以上を利用して突然変異させるか、又は「進化させる」ことができ、より望ましいクローンを同定するために再スクリーニングすることができる。以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでは決してない。
【実施例】
【０１９７】
実施例1
微生物収容装置を利用するサンプルの回収
ライブラリーを作製するため、下流の核酸を単離するのに利用されるサンプルは、以下の実施例に従って回収することができる。
【０１９８】
以下に、細菌及び原始種をin situで選択的に富化し、同時に集団中の真核生物メンバーの増殖を阻害する方法を示す。
【０１９９】
in situ富化は、表面上に被覆された周囲環境マトリックスのメンバーを選択的に誘引する目的で、増殖基質及び栄養改善剤からなる「トラップ（trap）」を使用することによって達成する。基質（炭素源）及び栄養改善剤（すなわち、窒素、リンなど）の選択は、富化したい集団のメンバーに依存する。真核生物メンバーに対する選択剤もトラップに添加する。さらに、その正確な組成は、集団のどのメンバーを富化し、集団のどのメンバーを阻害したいかに依存するだろう。基質にはモノマー及びポリマーが含まれる。グルコサミン、セルロース、ペンタン酸又は他の酸、キシラン、キチンなどの基質モノマーは、ある種の微生物の誘引に利用できる。ポリマーもまた、該ポリマーを分解できる微生物を誘引するのに使用できる。集団の特定メンバーを引き抜くのに有用な富化用「培地」のうち幾つかを以下に記載する。
【０２００】
１．真菌及び微小真核生物に対する生物活性化合物の添加：
集団の真核生物メンバーの増殖は、ナイスタチン、シクロヘキシミド、及び／又はピマリシンなどの市販化合物を1種以上用いることで阻害が可能である。これらの化合物は、富化用選択培地中に粉末として振りかけるか、液体として混和することができる。
【０２０１】
２．他の細菌種に対する生物活性化合物の添加：
ある細菌種の増殖は阻害するが、他の細菌の増殖を阻害しない化合物（すなわち、ポリミキシン、ペニシリン、及びリファンピン）を、富化用培地中に混和することができる。これらの化合物の使用は、細菌集団のどのメンバーを富化したいかに依存する。例えば、Streptomycesの大半は、ポリミキシン、ペニシリン、及びリファンピンに感受性のため、これらの化合物は耐性を有するファミリーの「希少」メンバーを富化するのに使用できる。選択剤もまた、集団の原始メンバーの富化に使用してもよい。
【０２０２】
３．選択剤としての炭素源の使用：
特定の炭素源はいずれも、集団のあるメンバーには利用できるが他のメンバーには利用できない。従って炭素源の選択は、富化したい集団のメンバーに依存する。例えば、Streptomycetalesのメンバーは、セルロース、キチン、及びリグニンなどの複合重合性基質を利用する傾向がある。これらの複合基質は、他の属には利用されるものの殆どの細菌には利用できない。これらの複合基質は真菌にも利用され、その場合には上記の抗真菌剤の使用が必要である。
【０２０３】
４．窒素源の添加：
追加的な窒素源の使用は、炭素源の選択に応じて必要となる場合がある。例えば、キチンはそのC：N比が釣り合っているが、セルロースは釣り合っていない。セルロース（又は他の炭素に富む基質）の利用を高めるには、硝酸塩又はアンモニアなどの窒素源の添加がしばしば有用である。
【０２０４】
５．微量要素の添加：
一般に、環境マトリックスは、微量要素の良好な供給源になる傾向があるが、ある環境では、その要素は制限され得る。微量要素の添加は、集団のあるメンバーの増殖を高めるが、他のメンバーの増殖は阻害する。
【０２０５】
ガラスビーズ又はシリカエアロゲルなどの表面積が大きい材料を使用することにより、基質-表面コンジュゲートの集団を多数保持する比較的小さな装置中に高濃度の微生物を回収できる。
【０２０６】
ガラスビーズは、以下のようにN−アセチルB−D−グルコサミン−フェニルイソチオシアネートによって誘導体化(derivitized)できる：
ビーズの調製：
30 mlのガラスビーズ（Biospec Products社製, Bartlesville, OK）を、50 mlのAPS/トルエン（10% APS）（Sigma Chemical Co.社製）と混合する。
【０２０７】
一晩還流
デカンテーションし、トルエンで3回洗浄
エタノールで3回洗浄し、乾燥器中で乾燥
N−アセチルB−D−グルコサミン−フェニルイソチオシアネートによる誘導体化：
Falconチューブ中での化合：
上記のように調製されたガラスビーズ25 ml
15 mlの0.1M NaHCO3＋25 mgのN−アセチル−B−D−グルコサミン−PITC（Sigma Chemical Co.社製）＋1 ml DMSO
10 ml NaHCO3＋1 ml DMSOを添加
ガラスビーズ上に注ぐ
Falconチューブ中で一晩振盪
20 ml 0.1M NaHCO3で洗浄
50 ml ddH2Oで洗浄
55℃で1時間乾燥
次いで、ビーズの収容と同時に微生物の移住を可能にするよう作製されたメッシュフィルター「バッグ（bags）」（Spectrum社製、Houston, Texas）中にビーズを設置し、次いで、バッグを収容する固相支持体として使用される任意の装置中に設置する。特に好ましい装置は、プレキシガラスなどの、不活性な材料からなる。あるいは、針を使用して穴を開けたFalconチューブ（VWR、Fisher Scientific社製）中にビーズを直接設置することもできる。これらの「収容」装置を、次いで、所望のバイオトープに、望ましい微生物の誘引及び増殖が可能な期間配置する。
【０２０８】
以下のプロトコールは、簡単な「微生物収容装置」の製造方法の一つを詳述するものである：
加熱された針又は他の尖った先端を有する器具を使用して、15 mlのFlaconチューブ（VWR, Fisher Scientific社製）に穴を開ける。
【０２０９】
誘導体化されたビーズのおよそ1-5 mlを、70 mのメッシュ孔（opening）、43%の開口領域、及び70 mの厚さを有するSpectra／メッシュ・ナイロンフィルター（例えば、Spectrum社（Houston, Texas）から入手可能）中に設置する。ナイロンフィルターを密閉し、例えば、Goop, Houshold Adhesive & Sealant社製を使用してビーズを含む「バッグ」を作製する。
【０２１０】
ビーズ含有フィルターを、通風(ventilated)Falconチューブ中に設置し、該チューブを所望のバイオトープに一定期間（典型的には数日）置く。
【０２１１】
実施例2
培養された生物からのDNA単離及びライブラリー構築
以下に、単離されたストレプトミセス・リモサス（Streptomyces rimosus）から遺伝子ライブラリーを産生するために使用される手順を概説する。
【０２１２】
DNAの単離
１．250 mlの調節装置付きのエーレンマイヤー（erlenmeyer）フラスコ中の25 mlのTrypticase Soy Broth（BBL Microbiology Systems社製）をストレプトミセス・リモサスの胞子と共に植え付ける。30℃、250 rpmで48時間インキュベートする。
【０２１３】
２．遠心分離によって菌体を集める。50 mlの円錐チューブを使用し、25℃、4000 rpmで10分間遠心分離する。
【０２１４】
３．上清をデカントし、ペレット2Xを10 mlの10.3%ショ糖で洗浄する（洗浄と洗浄との間に上記の遠心分離を行う）。
【０２１５】
４．将来の使用のためにペレットを−20℃で貯蔵する。
【０２１６】
５．ペレットを、リゾチーム（1 mg/ml；Sigma Chemical Co.社製）を含む40 mlのTE（10 mMトリス、1 mM EDTA；pH 7.5）中に再懸濁し、37℃で45分間インキュベートする。
【０２１７】
６．サルコシル（N−ラウロイルサルコシン、ナトリウム塩、Sigma Chemical Co.社製）を最終濃度1%で添加し、穏やかに転倒させて数分間混合する。
【０２１８】
７．20 mlの調製物を清潔なチューブに移し、プロテイナーゼK（Stratagene Cloning System社製）を添加し、最終濃度1 mg/mlとする。50℃で一晩インキュベートする。
【０２１９】
８．（TEで飽和された）フェノールで2Xを抽出する。
【０２２０】
９．フェノール：CH3Clで1Xを抽出する。
【０２２１】
10．CH3Cl：イソアミルアルコールで1Xを抽出する。
【０２２２】
11．2倍容量のエタノールでDNAを沈殿させる。
【０２２３】
12．密封されたパスツールピペットにDNAを巻き取る。
【０２２４】
13．70%エタノールですすぐ。
【０２２５】
14．空気中で乾燥する。
【０２２６】
15．1 mlのTE中にDNAを再懸濁し、4℃で貯蔵してゆっくりと再水和化させる。
【０２２７】
16．DNAの品質チェック：
製造業者のプロトコールに従って、EcoRI制限酵素（Stratagene Cloning System社製）で10 mlのDNAを消化し、DNA消化物を0.5%アガロースによって、20V一晩；1 g/ml EtBrの着色ゲルで電気泳動する。
【０２２８】
17．DNA濃度を測定する（A260−A280）。
【０２２９】
DNAの制限消化
１．以下のものを37℃で3時間インキュベートする。
【０２３０】
8 mlのDNA（〜10 mg）
35 mlの水
5 mlの10x制限酵素バッファー
2 mlのEcoRI制限酵素（200単位）
ショ糖勾配
１．小さなショ糖勾配（Sambrook, Fritsch and Maniatus、1989）を調製し、DNAを25℃で4時間45,000 rpmにかける。
【０２３１】
２．各画分の5 mlを0.8%アガロースゲル上で試験する。
【０２３２】
３．適切な画分をプールし、2.5倍容量のエタノールによって−70℃1時間でDNAを沈殿させる。
【０２３３】
４．13,200 rpm、15分間の遠心分離によってDNAを集める。
【０２３４】
５．デカントし、1 mlの70%エタノールで洗浄する。
【０２３５】
６．乾燥し、15 mlのTE中に再懸濁する。
【０２３６】
７．4℃で貯蔵する。
【０２３７】
DNAの脱リン酸化
１．製造業者のプロトコール（US Biochemicals）に従って、小エビアルカリ性ホスファターゼによってDNAを脱リン酸化する。
【０２３８】
アダプターの連結
１．製造業者のプロトコールに従って、アダプターを連結する。
【０２３９】
２．EcoRI I-BamH Iアダプター（Stratagene Cloning Systems社製）中に、簡単に穏やかにDNAを再懸濁させ；10X連結バッファー、10 mM rATP、及びT4 DNAリガーゼを添加し、室温で4〜6時間インキュベートする。
【０２４０】
フォスミドアーム（Fosmid Arms）の調製
１．フォスミドアームは、（Kimら、Nucl. Acids Res., 20:10832-10835, 1992）に記載されているように調製できる。プラスミドDNAは、製造業者のプロトコールに従って、PmeI制限酵素（New England Biolabs社製）によって消化、脱リン酸化され（Sambrook, Fritsch及びManiatus, 1989）、次いで、製造業者のプロトコールに従って、BamH I制限酵素（New England Biolabs社製）によって消化され、そして別の脱リン酸化工程が、それぞれが35〜45 kbpの間の連結DNAのクローニング及びパッケージングにとって適切な方向にcos部位を含む2つのアームを産生させることができる。
【０２４１】
フォスミドアームへの連結
１．連結反応物の調製：
製造業者の説明書により、挿入物及びベクターDNAの各〜50 ngを、1U（単位）のT4 DNAリガーゼ（Boehringer Mannheim社製）及び10Xリガーゼバッファーに添加し、必要ならば、H2Oを添加し、全容量を10 mlとする。
【０２４２】
２．16℃で一晩インキュベートする。
【０２４３】
パッケージング及びプレーティング
１．製造業者のプロトコールに従うギガパック（Gigapack）XLパッケージングシステム（Stratagene Cloning Systems, Inc.社製）を使用して連結反応物をパッケージングする。
【０２４４】
２．製造業者のプロトコールに従って、大腸菌株DH10B（Bethesda Research Laboratories, Inc.社製）をトランスフェクションし、LB／クロラムフェニコールプレート（Sambrook, Fritsch及びManiatus, 1989）上に塗る。
【０２４５】
実施例３
培養されていない原核DNAライブラリーの調製
図1は、混合されたピコプランクトン（picoplankton）サンプルから環境ライブラリーを構築するために使用される手順の概観を示す。目標は、ピコプランクトンゲノムDNAを代表する安定で大きな挿入DNAライブラリーを構築することであった。
【０２４６】
細胞の収集及びDNAの調製
濃縮されたピコプランクトン細胞を含むアガロースプラグを、オレゴン州ニューポートからハワイ州ホノルルの海洋巡航で収集されたサンプルから調製された。海水（30リットル）をニスキン（Niskin）瓶に集め、10 mmナイテックス（Nitex）によってスクリーニングし、分子量30,000カットオフポリスルホンフィルターによる中空ファイバー濾過（Amicon  DC10）によって濃縮した。濃縮されたバクテリオプランクトンを0.22 mm、47 mmデュラポア（Durapore）フィルター上に集め、1 mlの2x STEバッファー（1 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mMトリス、pH 8.0）中に再懸濁して、最終密度をおよそ１×1010個の細胞／mlとした。この細胞懸濁液を、40℃に冷却された、1容量の1%の溶解したシープラーク（Seaplaque）LMPアガロース（FMC）と混合し、次いで、直ちに1 ml注射器中に吸い上げた。注射器をパラフィルムで密封し、氷上に10分間置いた。細胞含有アガロースプラグを、10 mlの溶菌バッファー（10 mMトリス、pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 M EDTA, 1%サルコシル、0.2%デオキシコリン酸ナトリウム）、a mg/mlリゾチーム）中に押し出し、37℃で1時間インキュベートした。アガロースプラグを、次いで、40 mlのESPバッファー（0.5 M EDTA中、1%サルコシル、1 mg/mlプロテイナーゼ−K）に移し、55℃で16時間インキュベートした。この溶液をデカントし、新しいESPバッファーで置換し、55℃でさらに1時間インキュベートした。次いで、アガロースプラグを50 mM EDTA中に入れ、海洋巡航の間、船上で4℃で貯蔵した。
【０２４７】
オレゴン沿岸沖で収集したサンプルから調製されたアガロースプラグ（72 ml）の1片を、2 mlのミクロ遠心分離用チューブ中の1 mlのバッファーA（100 mM NaCl, 10 mM ビストリスプロパン(Bis Tris Propane)−HCl, 100 g/mlのアセチル化BSA; pH 7.0, 25℃）に対して4℃で一晩透析した。この溶液を、10 mM MgCl2及び1 mM DTTを含む新たなバッファーA 250 lで置換し、室温で1時間ロッキングプラットフォーム（rocking platform）上でインキュベートした。この溶液を、次いで、水浴中37℃で平衡化された、4U（単位）のSau3A1（NEB）を含む同じバッファーA 250 mlに交換し、次いで、37℃のインキュベーター中で45分間、ロッキングプラットフォーム上でインキュベートした。このプラグを、1.5 mlのミクロ遠心分離用チューブに移し、68℃で30分間インキュベートしてタンパク質、例えば、酵素を不活化し、アガロースを溶解した。このアガロースを、消化し、DNAを、製造業者の推奨する方法に従って、それぞれゲラーゼ（Gelase）及びHK−ホスファターゼ（Epicentre社製）を使用して脱リン酸化した。タンパク質を、緩和なフェノール／クロロホルム抽出によって除去し、DNAをエタノール沈殿させ、ペレット化し、次いで70%エタノールで洗浄した。この部分的に消化されたDNAを滅菌H2O中に再懸濁させて、pFOS1ベクターへの連結のために濃度2.5 ng/lとした。
【０２４８】
幾つかのアガロースプラグから得られたPCR増幅物（データは示されていない）は、かなりの量の始原DNAの存在を示した。オレゴン沿岸沖深さ200メートルで収集された、１つのサンプルから抽出されたrRNAを使用した定量的なハイブリダイゼーション実験は、この集合体中のプランクトン性始原種（archaea）が総ピコプランクトンバイオマスのおよそ4.7%からなることを示した（このサンプルは、DeLongら、high abundance of Archaea in Antarctic marine picoplankton, Nature, 371:695-698, 1994の表I中の「PACI」-200 mに相当する。）。アガロースプラグ分解物に関する始原種でバイアスした（archaeal-biased）rDNA PCR増幅から得られた結果から、このサンプル中の比較的大量の始原DNAの存在が確認された。このピコプランクトンサンプルから調製されたアガロースプラグは、続くフォスミドライブラリー調製のために選択された。およそ7.5×105個の細胞を含むこの部位からのアガロースプラグの各1 ml、従っておよそ5.4×105個の細胞が、部分的に消化されたDNAの調製に使用された70 ml片中に存在した。
【０２４９】
ベクターアームは、（Kimら、Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector, Nucl. Acids Res., 20:10832-10835, 1992）に記載されているpFOS1から調製する。簡単に言えば、プラスミドをAstIIで完全に消化し、HKホスファターゼで脱リン酸化し、次いでBamHIで消化し、それぞれが35〜45 kbpの間の連結されたDNAをクローニング及びパッケージングするのに適切な方向にcos部位を含む、２つのアームを産生させる。部分的に消化されたピコプランクトンDNAを各25 ngのベクター及び挿入物並びに1U（単位）のT4 DNAリガーゼ（Boehringer-Mannheim社製）を含む連結反応物15 ml中で、pFOS1に一晩連結させる。この反応物の4μl中の連結されたDNAは、ギガパックXLパッケージングシステム（Stratagene社製）を使用してin vitroでパッケージングされ、フォスミド粒子を大腸菌株DH10B（BRL社製）に感染させ、その細胞をＬBcm15プレートに塗る。得られたフォスミドクローンを、7%グリセロールを添加したＬBcm15を含む96−ウエルマイクロタイターディッシュ中に選び取る。組換えフォスミドはそれぞれ40 kbのピコプランクトンDNA挿入物を含んでおり、およそ1.4×108個の塩基対のクローン化されたDNAを含む、3,552個のフォスミドクローンのライブラリーを生成した。試験された全クローンが、38〜42 kbpの範囲の挿入物を含んでいた。このライブラリーを、後の分析のために−80℃で凍結貯蔵した。
【０２５０】
実施例4
環境サンプル由来のDNAの標準化
ライブラリー作製に先立ち、環境サンプル由来の精製されたDNAを標準化できる。DNAを最初に以下のプロトコールに従って分割する：
ゲノムDNAからなるサンプルを塩化セシウム勾配で精製する。この塩化セシウム（Rf=1.3980）溶液を0.2 mmフィルターで濾過し、15 mlを35 mlのオプティシール（OptiSeal）チューブ（Beckman社製）に入れる。DNAを添加し十分に混合する。10ミクログラムのビス−ベンズイミド（Sigma社製；ヘキスト（Hoechst）33258）を添加し、十分に混合する。このチューブを濾過された塩化セシウム溶液で満たし、ベックマン（Beckman）L8-70超遠心分離器中、33,000 rpmで72時間、VTi50ローターで回転させる。遠心分離に続き、注射器ポンプ及び分画装置（ブランデルモデル（Brandel Model）186）を使用して280 nmに設定されたISCO UA-5 UV吸収検出器によって勾配をかける。環境サンプル中に存在する生物由来のDNAを提示するピークを得る。
【０２５１】
次に、標準化を以下のように達成する：
１．２本鎖DNAをハイブリダイゼーションバッファー（0.12 M NaH2PO4, pH 6.8／0.82 M NaCl／1 mM EDTA／0.1% SDS）中に再懸濁させる。
【０２５２】
２．サンプルを鉱物油で被い、10分間煮沸することによって変性させる。
【０２５３】
３．サンプルを68℃で12〜36時間インキュベートする。
【０２５４】
４．60℃のヒドロキシアパタイト上で標準プロトコール（Sambrook, 1989）に従って、１本鎖DNAから２本鎖DNAを分離する。
【０２５５】
５．１本鎖DNA画分を脱塩し、PCRで増幅する。
【０２５６】
このプロセスをさらに数ラウンド（5回以上まで）繰り返す。
【０２５７】
実施例５
真核生物中で生産されたライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング及び代謝的にリッチな宿主中での発現スクリーニング
ハイブリダイゼーションスクリーニングは、任意のフォスミドベクターでの上記実施例3で記載したプロトコールに従って生成したライブラリー由来のフォスミドクローンに関して行うことができる。例えば、pMF3ベクターは、大腸菌中での効率的でかつ安定なクローニングに使用でき、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）又はストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）中で統合され、安定に維持され得るフォスミド系ベクターである。上記プロトコールに従って生成されたpMF3ライブラリーは、先ず大腸菌DH10B細胞中に形質転換される。tcm又はoxyを含むクロラムフェニコール耐性形質転換体を、oxy及びtcm遺伝子の以前に公表された配列からデザインされた配列を使用したコロニーハイブリダイゼーションによってライブラリーをスクリーニングすることによって同定する｝（27）、（28）。コロニーハイブリダイゼーションスクリーニングは、「Molecular Cloning」、A Laboratory Manual, Sambrookら（1989） I.90-1.104に詳細に記載されている。ハイブリダイゼーションによって陽性とされたコロニーは、精製でき、それらのフォスミドクローンは制限消化によって分析でき、PCRはそれらが完全な生合成経路を含むことを確認できる。
【０２５８】
あるいは、上記フォスミドクローン由来のDNAは、全経路陽性のクローンを同定するためにデザインされた増殖反応で使用できる。たとえば、以下の配列は、１つのフォスミドクローン上にコードされていると考えられる34 kbpのDNA断片上に在る、抗生物質グラミシジンをコードする経路（グラミシジンオペロン）を増幅するための増幅反応に利用できる：
プライマー：
配列番号1
2005095192.tif 000002
【０２５９】
配列番号2
2005095192.tif 000003
【０２６０】
増幅反応：
1 ml      フォスミド／挿入DNA
5 ml      各プライマー（50 ng/ml）
1 ml       Boehringer Mannheim社製エクスパンド（EXPAND）キットのエクスパンドポリメラーゼ
1 ml      dNTP
5 ml      Boehringer Mannheim社製エクスパンド（EXPAND）キットの10Xバッファー#3
30 ml    ddH2O
PCR反応プログラム：
94℃      60秒
以下の工程の20サイクル：
94℃    10秒
65℃    30秒
68℃    15分
以下の工程の1サイクル：
68℃    7分
4℃で貯蔵
オキシテトラサイクリン又はテトラセノマイシンポリケタイド（tetracenomycin polyketide）をコードするDNA配列を含むことが示されているクローン由来のフォスミドDNAは、次いで、実施例6からのストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）TK24ダクト（Dact）プロトプラストを形質転換するために使用される。形質転換体は、ハイグロマイシン（hygromycin）（pMF5）で再生プレートを覆うことによって選択される。耐性形質転換体は、試験生物大腸菌（Escherichia coli）又は枯草菌（Bacillus subtilis）の細胞を含む2 mlの栄養ソフト寒天によるオーバーレイ形質転換プレートによる生物活性でスクリーニングされる。大腸菌は、pMF3クローンのオーバーレイで使用されるチオストレプトン濃度（50 mg/ml）には耐性であるが、5 mg/mlの濃度のオキシテトラサイクリンには感受性である｝（29）。枯草菌試験株は、pHT315に担われているチオストレプトンマーカーでの形質転換によるスクリーニングの前に、チオストレプトン耐性にされる｝（30）。生物活性は、ストレプトミセス・リビダンスコロニー周辺の特定の試験株の増殖阻害によって証明される。生物活性を確認するために、推定に基づく活性コロニーを単離し、培養物を適度に極性の溶媒メタノールを使用して抽出する。抽出物を、メタノールの添加によって、クローン発酵ブロスで1：1の割合に調製し、4℃で一晩攪拌する。水層中の細胞残渣及び培地固体を、次いで遠心分離によって分離する。組換えによって発現された化合物を、溶媒層中に回収し、必要に応じて濃縮又は希釈できる。クローンの抽出物を、0.25インチのフィルターディスク上に少量づつ注ぎ、溶媒を蒸発させ、そしてアッセイ用生物を含む上層の表面に置く。適切な温度でのインキュベーションに続き、透明になった領域の直径を測定し記録する。標準として真正なオキシテトラサイクリン及びテトラセノマイシンを使用した、ダイオードアレイHPLCは、組換えクローン由来のこれらの抗生物質の発現を確認するのに使用できる。
【０２６１】
染色体に統合された経路のレスキュー
スクリーニングによって同定された染色体に統合された経路の配列分析は、生物活性分子の確認のために行うことができる。試験生物に対する生物活性を示すストレプトミセス・リビダンスクローン由来のフォスミドDNAをレスキューするために採用できる１つのアプローチは、pMF3などの、IS117を含むプラスミドベクターは、10〜30個の染色体当たり1個の頻度で循環中間体として存在するという観察に基づく。推定に基づく陽性クローンは、25 mlのブロス培地中で増殖でき、プラスミドDNAは、標準アルカリ性分解手順によって単離できる。プラスミドDNA調製物は、次いで大腸菌を形質転換するのに使用され、形質転換体は、クロラムフェニコール（15 mg/ml）を含むLB上にプレーティングすることによって、Cmrで選択される。大腸菌Cmr形質転換体由来のフォスミドDNAは単離され、制限消化分析、PCR及びDNA配列決定によって分析される。
【０２６２】
実施例6
宿主株構築
以下の実施例では、ストレプトミセス・リビダンス株を、実施例5による大腸菌で初めに同定された生物活性クローンをスクリーニングに有用にするために行うことができる修飾方法を記載する。
【０２６３】
ストレプトミセス・リビダンスは、多数のプロモーターを認識し、制限システムを欠いているように見えるので、異種の抗生物質経路の組換え発現において日常的に使用される株である。ストレプトミセス・リビダンスは、ポリケタイド抗生物質アクチノロージン（actinorhodin）を通常は産生しないが、必須遺伝子配列を含み、ストレプトミセス・リビダンス中でのその産生を活性化する幾つかの遺伝子が同定されている。ストレプトミセス・リビダンスのTK24株は、生物活性クローンのスクリーニングのための宿主として利用できる。この株は、ストレプトマイシンへの耐性を与え、アクチノロージンの産生を活性化する、リボソームタンパク質S12をコードする、rpsL遺伝子中に突然変異を含む。推定のポリケタイド又は他の抗生物質遺伝子を含むストレプトミセス・リビダンスクローンの生物活性が、内在するact遺伝子クラスターの活性化によらないことを確認するために、これらの配列は、遺伝子置換によって宿主株から除去すべきである。遺伝子置換計画の概要を図8に示す。actクラスターの境界線を定義する、actVI及びactVB内の遺伝子断片をPCRによって増幅する。増幅に使用されるプライマーは、それらの中にデザインされた認識配列を有しているので、それぞれ互いに、及びactクラスターに適切な方向にクローン化される。actVB及びactVI遺伝子断片は、pLL25中にクローン化されて、スペクチノマイシン（spectinomycin）をコードする遺伝子と隣り合い、pRBSV2を生産する。ストレプトミセス・リビダンスTK24のプロトプラストは、確立された形質転換プロトコールを使用してpRBSV2によって形質転換され、形質転換体は、スペクチノマイシン耐性によって選択される。図9に示すように、Spcｒ形質転換体は、幾つかの組換えイベントの結果として生じる。actVI又はactVB内での単一の組換えイベント（イベント1及び2）は、actクラスター内のプラスミド構築物の挿入をもたらす。actVI及びactVB内の二重交叉（組換えイベント3）は、actクラスターのSpcｒをコードする遺伝子による置換をもたらす。両タイプの組換えも、Act−株を生産できるが、この実施例は、遺伝子置換体を含む株の構築に焦点を当てている。これは、２つの理由で都合がよい：第1に、それが、繰り返し配列の間の組換えによってAct+への逆戻りができない安定なAct−株を生産し、第2に、クローン化された配列と染色体との間の潜在的な相同体の量を減少させ、部分経路のクローニングの可能性を減少させる。アクチノロージン抗生物質は染色されるので、Spcｒ形質転換体によって産生される色素に基づき異なるクラスの組換え体を識別できる。二重組換えによって生産されるSpcｒ形質転換体のみが、染色されない。spcによって置換されたactクラスターを有するストレプトミセス・リビダンスTK24クローンは、サザンハイブリダイゼーション及び通常の技術を使用するPCR分析によって確認される。
【０２６４】
実施例7
目的の化合物に対する大規模挿入物ライブラリーのスクリーニング
実施例1及び3に従って生成された大規模挿入物ライブラリーは、以下の方法を使用して目的の臨床的に潜在的な価値のある化合物のスクリーニングができる：
フォスミドライブラリークローン（水性）の有機抽出：
同量のメチル−エチル−ケトン（MEK）（Sigma Chemical Co.社製）を実施例３のマイクロタイタープレートの各ウエルに添加する。MEK層を新たなプレートに移す。プレートを回転させて乾燥する。サンプルをTNバッファー（50 mMトリス−7、10 mM NaCl）中に再懸濁する。
【０２６５】
ストレプトマイシンのタンパク質抽出
１．250 mlの制御装置付きのエーレンマイヤーフラスコ中の25 mlのトリプチカーゼソイブロス（BBL Microbiology Systems社製）に、ストレプトミセス・リビダンスTK24の胞子を植え付ける。30℃、225 rpmで48時間インキュベートする。
【０２６６】
２．50 mlの円錐容器中で4000 rpmで回転し、細胞をペレット化する（15分）。
【０２６７】
３．上清を捨て、保存する。
【０２６８】
４．ペレット及び上清を電子顕微鏡でチェックする。
【０２６９】
５．ペレットを超音波処理する。
【０２７０】
６．細胞残渣を4000 rpm／15分でペレット化する（保存する）。
【０２７１】
７．上清を除去する。
【０２７２】
８．製造業者の説明書（Pierce社製、スライド−A−ライザーＴＭ（Slide-A-Lyzer）透析装置）に従って80%飽和硫酸アンモニウム溶液に対して透析する。
【０２７３】
９．調製物を2500 rpmで15分間回転させる。
【０２７４】
10．調製物を3500 rpmでさらに15分間再度回転させる。
【０２７５】
11．上清を捨て、保存する。
【０２７６】
12．1 mlのＴＮバッファー（50 mMトリス pH 7；100 mM NaCl）を添加する。
【０２７７】
1.5 mlのねじぶた容器中で、フォスミドクローンからの50 l水性抽出物と、アッセイウエル中のストレプトマイシン（1：1比）の50 lタンパク質抽出物とを合せる。
【０２７８】
所望のように、水性抽出物：タンパク質抽出物の異なる比率（上記のように1：1、3：1など）を使用する。
【０２７９】
30分で4時間インキュベートする。
【０２８０】
バイオアッセイ
１．20 mlのサンプルをフィルターディスク上にスポットする。
【０２８１】
２．前もって生成したアッセイプレート（ソフト寒天中に固められた試験生物の細胞〜1 OD 600個のオーバーレイによる、目的の生物を増殖させるための適切な培地を含む増殖プレート）上にフィルターディスクをかぶせる。試験生物が増殖するのに適切なインキュベーション温度で一晩細胞を増殖させる。陽性結果（増殖阻害）の透明な領域を同定する。
【図面の簡単な説明】
【０２８２】
【図１】図１は、自然環境からの非培養微生物由来の大きいゲノム断片を捕捉、クローン化および収容するスキームを示す。この方法で使用されるクローニングベクターは、40 kbp（フォスミド）から100 kbp（BACs）以上までを保持することができる。
【図２】図２は、種々のストレプトミセス（Streptomyces）種からのポリケチド経路のケトシンターゼＩ遺伝子のある領域のヌクレオチドをアライメントしたものである。これらの領域は、大腸菌（E. coli）の脂肪酸シンターゼをコードする相同領域とアライメントされる。観察された配列の差異を使用して、クローン化したポリケチド配列にはハイブリダイズするが、大腸菌（E. coli）宿主株が担う脂肪酸配列にはハイブリダイズしないプローブを作製した。
【図３】図３は、標識オリゴヌクレオチドプローブでプローブされた環境フォスミドクローンの高密度フィルターアレイの例を示す。2400のアレイ化クローンは、天然に存在する微生物集団からのクローン化された約9600万塩基対のDNAを含有する。
【図４】図４は、大腸菌（E. coli）中で異種的に発現された組換えバックボーンへの、生物活性の付与を測定する混合抽出物実験の結果を示す。Ａ．３つのオキシテトラサイクリンクローン（１〜３）と３つのグラミシジンクローン（４〜６）からの有機抽出物を、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）TK24株からのタンパク質抽出物とインキュベートした。インキュベーション後、混合物をメチルエチルケトンで再抽出し、フィルターディスク上にスポットし、乾燥させ、次に大腸菌（E. coli）試験株のローン（lawn）上に置いた。ディスク２、３、および５の周りに鮮明な透明ゾーンが見られる。次に２と３からの抽出物を薄層クロマトグラフィーで分離すると、真正のオキシテトラサイクリンと同様のRfと外観を有するUV蛍光スポットが現れた。Ｂ．Ａにおけるフィルターに対応するが、ストレプトミセス（Streptomyces）からのタンパク質抽出物とインキュベートしないフィルター。ストレプトミセス（Streptomyces）抽出物単独でも，生物活性はなかった。
【図５】図５は，ストレプトミセス・ベネズエラ（Streptomyces venezuelae）中の組換え生物活性分子のFACSスクリーニングの方法を示す。
【図６】図６は、S.リビダンス（S. lividans）Tk24株中で発現されるpMF4オキシテトラサイクリンクローンの顕微鏡写真である。菌糸体の末端近くの赤色蛍光は、オキシテトラサイクリンの組換え発現が、内因性アクチノロジン（actinorhodin）経路の活性と同様に、胞子形成開始時に誘導されることを示唆する。
【図７】図７は、転写因子開始を増強または抑制する小分子をスクリーニングするアプローチを示す。小分子経路とGFPレポーター構築物の両方を同時発現させる。次に、GFP発現が改変されたクローンを、FACSにより選別し、経路クローンを単離して性状解析する。
【図８】図８は、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）TK24株中のアクチノロジン経路を不活性化するように設計された遺伝子置換ベクターpLL25を示す。
【図９】図９は、可能な組換えイベントと、pLL25上に存在するスペクチノマイシン遺伝子によるS.リビダンス（S. lividans）中のアクチノロジン遺伝子クラスターの置換から予測される表現型を示す。
【図１０】図10は、S.リビダンス（S. lividans）染色体へのpMF3クローンのタンデム重複を示す。重複クローンは、ラムダパッケージングのために適当な間隔でcos部位を含有する。
【図１】
2005095192.tif 000004
【図２】
2005095192.tif 000005
【図３】
2005095192.tif 000006
【図４】
2005095192.tif 000007
【図５】
2005095192.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８】
2005095192.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2005095192.tif 000013