(57)【要約】【課題】  基材表面にＤＮＡ断片を、ＤＮＡ末端に導入されたアミノ基とイソシアナート基との迅速な反応によって結合させることが可能で、且つ、反応生成物が従来のイオン結合によるものと比べて安定に結合を維持することが可能なＤＮＡチップ及びＤＮＡチップの製造方法を提供する。【解決手段】  少なくとも基材上に下記式（化１）で表される構造単位を有する高分子を含有する結合剤含有層が形成されていることを特徴とする。  【化１】2005055285.tif 000014  〔上記式（化１）において、Ｒ，Ｒ’は、同一又は異なって、脂肪族、芳香族から選ばれる基で構成される高分子の主鎖を表す。〕【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも基材上に下記式（化１）で表される構造単位を有する高分子を含有する結合剤含有層が形成されていることを特徴とするＤＮＡチップ。
【化１】
2005055285.tif 000011
〔上記式（化１）において、Ｒ，Ｒ’は、同一又は異なって、脂肪族、芳香族から選ばれる基で構成される高分子の主鎖を表す。〕
【請求項２】
前記結合剤含有層は、蒸着重合法により形成されたものであることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡチップ。
【請求項３】
マスキングにより前記結合剤含有層がパターン形成されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡチップ。
【請求項４】
マスキングを介して予め形成された前記結合剤含有層に紫外線を照射することにより、前記結合剤含有層がパターン形成されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡチップ。
【請求項５】
前記結合剤含有層に、プローブＤＮＡを結合したことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡチップの製造方法であって、下記構造式（化２、化３）で表される二種類以上の原料を蒸発させ、基材上に蒸着重合させて高分子の結合剤含有層を形成するようにしたことを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【化２】
2005055285.tif 000012
〔上記式（化２）において、Ｒは、脂肪族又は芳香族で構成されるモノマーの骨格を表す。〕
【化３】
2005055285.tif 000013
〔上記式（化３）において、Ｒ’は、脂肪族又は芳香族で構成されるモノマーの骨格を表す。〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の発現、遺伝子の変異、遺伝子の多型等の同時解析に有用なＤＮＡチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞や組織における種々の遺伝子発現の解析は、これまでは細胞や組織からＲＮＡを調製し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の遺伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うノーザンプロット（若しくは、ドットプロット）法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。
一方、遺伝子の研究の進展により解析を必要とする遺伝子の数が急速に増加し、更に、ゲノムプロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴って、遺伝子の発現変動を大量迅速に解析処理する必要性が高まっている。
【０００３】
このような要望に応えるための技術開発が進んでおり、その解析手段としてＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップの特徴は、ガラス製の基材上に、互いに異なる数千種類のＤＮＡ断片を高密度に整列固定し、この固定ＤＮＡ断片と極少量の標識されたターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、高感度でターゲットＤＮＡ断片を検出することにある。
【０００４】
形成されたハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予め結合させた蛍光標識若しくは放射性標識を利用する方法や、ハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基若しくは導電性基を持つインターカレータを利用する方法などが知られている。
このようなＤＮＡチップを用いることによって、ヒト等のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を迅速に解析処理することができ、標識ＲＮＡによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行うこともできる。また、ゲノムＤＮＡを標識することによって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
【０００５】
前記ＤＮＡチップの作製方法としては、基材表面において直接ＤＮＡ断片を合成する方法（オン・チップ法）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を基材表面に固定する方法とが知られている。
オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術とを組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法が代表的である。
この方法の使用はオリゴヌクレオチドに限られるため、ひとつのｍＲＮＡを検出するのに複数個のオリゴヌクレオチドプローブを用いなければならない。
【０００６】
一方、予め調製したＤＮＡ断片を基材表面に固定する方法としては、まず、複数種類のプローブＤＮＡが入っているマイクロプレートを用意する。また、ガラス板を用意しておき、その表面にpoly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤をコーティングする。この後、マイクロプレートに入っているプローブＤＮＡをピンに付着させ、表面にＤＮＡとガラスの結合剤（poly-l-Lysine）がコーティングしてあるガラス基材の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットする。マイクロプレートに入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、ＤＮＡチップを製造する。
【０００７】
このように、従来はガラス基材上に予めＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてＤＮＡチップを製造していた。
【０００８】
また、ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合剤でガラス基材上にスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl,trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。  このとき、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でなければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残留するか、そのごく一部はガラス基材上にコーティングされている結合剤と結合し残る場合もある。
その後、ガラス基材上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗浄すると、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡは排除される。その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行う。
【０００９】
しかしながら、この方法では、poly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスとは、イオン結合をしているために結合力が十分でなく、上記洗浄工程の際、基材とＤＮＡの結合が外れ、ハイブリダイズした試料まで洗い流されてしまう場合があった。このような不十分な結合により、プローブＤＮＡ及びサンプルＤＮＡが多大に損失されてしまうという問題があった。
更に、プローブＤＮＡと結合しなかったサンプルＤＮＡが必要以外の部分、即ち、プローブＤＮＡがスポットされていない結合剤部分に非特異的に結合しているサンプルＤＮＡは洗浄によってもガラス基材上から除去されない。それが検出時ノイズとなって現われ、測定精度を低くしてしまっていた。
このため、サンプルＤＮＡの一部がプローブＤＮＡとの特異結合ではなく単に結合剤に張り付いた状態でＤＮＡチップ上に残り、そのサンプルＤＮＡに標識されている蛍光物質も励起されて発光し、ノイズとして検出されてしまうという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明の目的は、上記のような問題を解消すべく、基材表面に充分な量で安定にＤＮＡ断片を固定する材料及び技術の開発にある。
つまり、基材表面にＤＮＡ断片を、ＤＮＡ末端に導入されたアミノ基とイソシアナート基との迅速な反応によって結合させることが可能で、且つ、反応生成物が従来のイオン結合によるものと比べて安定に結合を維持することが可能なＤＮＡチップ及びＤＮＡチップの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討の結果、次のような解決手段を見出した。
即ち、本発明のＤＮＡチップは、請求項１に記載の通り、少なくとも基材上に下記式（化１）で表される構造単位を有する高分子を含有する結合剤含有層が形成されていることを特徴とする。
【化１】
2005055285.tif 000002
〔上記式（化１）において、Ｒ，Ｒ’は、同一又は異なって、脂肪族、芳香族から選ばれる基で構成される高分子の主鎖を表す。〕
また、請求項２に記載のＤＮＡチップは、請求項１に記載のＤＮＡチップにおいて、前記結合剤含有層は、蒸着重合法により形成されたものであることを特徴とする。
また、請求項３に記載のＤＮＡチップは、請求項１又は２に記載のＤＮＡチップにおいて、マスキングにより前記結合剤含有層がパターン形成されたものであることを特徴とする。
また、請求項４に記載のＤＮＡチップは、請求項１又は２に記載のＤＮＡチップにおいて、マスキングを介して予め形成された前記結合剤含有層に紫外線を照射することにより、前記結合剤含有層がパターン形成されたものであることを特徴とする。
また、請求項５に記載のＤＮＡチップは、請求項１乃至４のいずれかに記載のＤＮＡチップにおいて、前記結合剤含有層に、プローブＤＮＡを結合したことを特徴とする。
本発明のＤＮＡチップの製造方法は、請求項６に記載の通り、請求項１に記載のＤＮＡチップの製造方法であって、下記構造式（化２、化３）で表される二種類以上の原料を蒸発させ、基材上に蒸着重合させて高分子の結合剤含有層を形成するようにしたことを特徴とする。
【化２】
2005055285.tif 000003
〔上記式（化２）において、Ｒは、脂肪族又は芳香族で構成されるモノマーの骨格を表す。〕
【化３】
2005055285.tif 000004
〔上記式（化３）において、Ｒ’は、脂肪族又は芳香族で構成されるモノマーの骨格を表す。〕
【発明の効果】
【００１２】
以上のように、本発明によれば、その基材表面の反応基とＤＮＡ末端に導入した反応基を共有結合させることにより、ＤＮＡを効率よく、安定して固定することができる。
また、本発明によれば、基材表面の反応基部分にプローブＤＮＡを結合することにより、プローブＤＮＡとハイブリタイズした試料は、強固に結合されることになり、精度の高い測定が可能となる。更に、必要なプローブＤＮＡや試料を測定の際に失うことがないため、測定のためのコストを抑えることができる。
また、本発明によれば、基材表面への結合剤含有層を蒸着重合法により形成することにより、イソシアナート基を基材表面に均一に分布させることができる。
また、本発明によれば、紫外線照射によりパターン形成することが可能となるためＤＮＡを固定する箇所を特定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
上記の通り、本発明のＤＮＡチップは、少なくとも基材上に下記式（化１）で表される構造単位を有する高分子を含有する結合剤含有層が形成されたものである。
これにより、基材とプローブＤＮＡとをより確実に結合させることができ、水洗い工程等において、プローブＤＮＡ、サンプルＤＮＡが基材から流れ落ちることなく、プローブＤＮＡ、サンプルＤＮＡを有効に活用することができるようにしたものである。
【００１４】
【化１】
2005055285.tif 000005
【００１５】
上記式（化１）において、Ｒ，Ｒ’は、同一又は異なって、脂肪族、芳香族から選ばれる基で構成される高分子の主鎖を表すものであれば特に制限されるものではないが、好ましくは、前記脂肪族及び芳香族に反応基のないものが好ましい。
【００１６】
また、前記基材の材質は、透明なガラス、シリコン又はポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡ等のポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好ましい。その中でも、ガラス又はシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャニング装置による解析の容易さによるものである。シリカ表面層を有するガラスも好ましく用いられる。基材の厚さとしては、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の結合剤含有層は、好ましくは、原料物質を、蒸着重合法、特にＣＶＤ法により、蒸発、分解させて、これを基材上に重合・堆積させることで、ガラス等の基材と良好に接着すると共に、構造式中に存在するアミノ基（ＮＨ2）がプローブとなるＤＮＡ断片のリン酸基（ＰＯ4）と結合して、プローブＤＮＡを基材上に良好に固定することができる。
また、成膜時に所定パターンのマスクを用い、マスク蒸着を行ってもよい。このように、マスク蒸着を行うことにより、精度良く結合剤含有層パターンを形成することができ、不必要な部分にＤＮＡが付着してガーベージとして残り、Ｓ／Ｎの悪化を防止することができる。
また、前記パターンの形成は、前記成膜後において、紫外線照射をすることにより行うことが好ましい。紫外線を照射することにより、イソシアナート基が架橋して存在しなくなるため、紫外線照射部はＤＮＡが固定されなくなる。紫外線を用いるため分子がマスクを回り込んでしまう可能性のあるマスク蒸着よりも、更に、精度良くパターンを形成することができる。
【００１８】
本発明の結合剤含有層は、以下の方法により製造することができる。
【００１９】
真空槽内で、下記化２、化３の二種類の材料を加熱し、同時に蒸発させ、基板上での重合反応により高分子膜を得る。
【００２０】
【化２】
2005055285.tif 000006
【００２１】
【化３】
2005055285.tif 000007
【００２２】
その際、化２、化３の蒸気圧が同じになるようにそれぞれの加熱温度を設定すると、モノマー組成比が１：１の高分子膜ができる。化２の加熱温度を上記温度より高くすることにより化２が過剰になり、末端が−Ｎ＝Ｃ＝Ｏである化１ができる。
【００２３】
成膜された、高分子膜は、その膜厚が１分子分でもよいが、通常０．３〜１０μｍ程度である。
【００２４】
前記結合剤含有層に、プローブＤＮＡを結合することが好ましい。
これにより、水洗い工程等においてもプローブＤＮＡが剥がれ落ちることもなく、原料を有効に活用することができる。
尚、プローブとなるＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することができる。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリー又は全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下「ＰＣＲ産物」という。）。或いは、ＰＣＲ法によって増幅しないものも使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。更に、塩基配列分析の場合には、４ｎ（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、既知であることが好ましい。
【００２５】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解又は分散した水性液を、９６穴又は３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注された水性液をスポッター装置を用いて基材上に滴下すること等により行われる。
【００２６】
また、点着されるＤＮＡ断片は、基材表面に対して、１０2〜１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、基材表面にドットの形状で固定されるが、そのドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、特に１００〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐｌ〜１μｌの範囲にあることが好ましく、特に１〜１００ｎｌの範囲にあることが好ましい。
【００２７】
また、点着後は、必要に応じてインキュベーションを行うことが好ましい。インキュベート後、点着されなかったＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００２８】
前記基材表面上のドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。
【００２９】
上記のようにして作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤＮＡチップでは、更に、長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸とのハイブリダーゼーションである。
【００３０】
サンプルである標的核酸としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料又はＲＮＡ断片試料等が用いられる。
【００３１】
標的核酸は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、標的核酸は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００３２】
標的核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマー又は標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ることが好ましい。
【００３３】
標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法とがあるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、９６又は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した標的核酸が溶解、或いは、分散してなる水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによって実施することが好ましい。点着の量は、１〜１００ｎｌの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００３５】
ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないことである。そのため、基材に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【実施例１】
【００３６】
以下に、本発明の一実施例について図面を参照して説明する。
（結合剤含有層の形成）
【００３７】
図１は、本発明のＤＮＡチップの製造方法に使用される装置１０の構成図を示すものである。
図１に示すように真空排気系１に接続された真空槽２内には、結合剤含有層を形成させるための基材３が基材ホルダー４により下向きに保持される。また、真空槽２の下部には基体３の中心点直下に原料モノマーを蒸発させるための蒸発源噴き出し口５を、その横にもう一方の蒸発源噴き出し口６が設けられ、蒸発源容器７及び８はヒーター（図示せず）と熱電対（図示せず）とによって原料モノマーａ，ｂの蒸発量が一定となる所定温度に制御されている。蒸発源噴き出し口５、６と基体３との間にはシャッター９が形成され、このシャッター９により結合剤含有層の膜厚が調整される。
【００３８】
次に、上記装置１０を使用して本発明のＤＮＡチップを製造する方法について説明する。
１０ｃｍ角のガラス板を基材３とし、蒸発源容器７に４０℃における蒸気圧が１×１０-5Ｐａである４，４'メチレン・ジアニリン（以下、ＭＤＡと略す。）（化４）を、蒸発源容器８には４０℃における蒸気圧が５×１０-3Ｐａである４，４'ジフェニル・メタン・ジイソシアナート（以下、ＭＤＩと略す。）（化５）を充填し、シャッター９を閉じた状態で真空槽２内の雰囲気ガスの全圧が５×１０-5Ｔｏｒｒ以下になるまで、真空排気系１により排気する。尚、基材３の中心点から蒸発源噴き出し口５，６の内径は２ｃｍ、蒸発源噴き出し口５，６との間隔は８ｃｍに設定した。次いで、蒸発源容器７及び８のヒーターを制御して、ＭＤＡを７７℃に、ＭＤＩを８２℃に加熱した。この時の真空槽２内雰囲気ガスの全圧は４×１０-5Ｔｏｒｒであった。この状態でシャッター９を３０分間開放して基材３上に両原量モノマーの蒸気を差し向けて、厚さ約１μｍの結合剤含有層を得た。
【００３９】
導入された原料ガスがガラス基材界面で重合し、下記構造式化６で表される高分子膜が形成された。得られたＤＮＡチップの結合剤含有層の赤外吸収スペクトルを図２に示す。
【００４０】
【化４】
2005055285.tif 000008
【００４１】
【化５】
2005055285.tif 000009
【００４２】
【化６】
2005055285.tif 000010
【００４３】
図２からも分かるように、イソシアナート（周波数：２２７０ｃｍ-1）の吸収が大きく、イソシアナート基が表面に過剰に存在していることが分かった。
【００４４】
この後、マイクロプレートに入っているプローブＤＮＡをピンに付着させ、前記高分子膜が形成されたガラスプレート上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットした。マイクロプレートに入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返して、ＤＮＡチップを製造した。
このようにして、プローブＤＮＡ末端に導入されたアミノ基は、本実施例のＤＮＡチップの高分子を含有する結合剤含有層におけるイソシアナート基と共有結合することになる。
【００４５】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodiumdodecylsulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraaceticacid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００４６】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流し、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡを排出した。
【００４７】
このとき、基材上に結合しているプローブＤＮＡはほとんど剥がれ落ちることなく残留し、水洗工程でＤＮＡが剥がれ落ちないことが確認できた。
【００４８】
その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行った。
【００４９】
その結果、目的とするハイブリダイゼーションが的確に行われ、Ｓ／Ｎ比も良好であることが確認できた。
【実施例２】
【００５０】
実施例１において、結合剤含有層を形成した後に、スポット部となる位置に開口部を設けたパターンを前記結合剤含有層に被せ、紫外線を１０分間照射してＤＮＡチップを作成した。
前記ＤＮＡチップの紫外線照射部の赤外線吸収スペクトルを図３に示す。図３を見ると、図２に比べてイソシアナートの吸収（２２７０ｃｍ-1）がなくなり、結合剤含有層においてイソシアナート基が存在しないことが分かる。
上記の結果から、マスキングにより、紫外線照射部と未照射部をパターニングすることによりＤＮＡ固定部と非固定部を作製することが可能となった。
【００５１】
その後、マイクロプレート内のプローブＤＮＡをスポットすることなく、塗布し、その後蒸留水で洗い流した後、乾燥してＤＮＡチップを作製した。その他は実施例１と同様にしてＤＮＡチップを作製した。
【００５２】
得られた、ＤＮＡチップを実施例１と同様に評価したところ、ガーベージもなくＳ／Ｎが向上していることが解った。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の一実施例のＤＮＡチップの製造方法に使用される装置の構成図
【図２】本発明の一実施例の赤外吸収スペクトルを示すグラフ
【図３】本発明の他の実施例の赤外吸収スペクトルを示すグラフ
【符号の説明】
【００５４】
１    真空排気系
２    真空槽
３    基材
４    基材ホルダー
５    蒸発源噴き出し口
６    蒸発源噴き出し口
７    蒸発源容器
８    蒸発源容器
９    シャッター
１０    ＤＮＡチップの製造方法に使用される装置
【図１】
2005055285.tif 000015
【図２】
2005055285.tif 000016
【図３】
2005055285.tif 000017