(57)【要約】【課題】浴槽水のレジオネラ属菌の検査方法であって、従来の培養法に比べ、同等の精度を有し、特に偽陰性率が極めて低く、検査対象水からの遺伝子抽出にも手間が掛からず、かつ、極めて迅速に行うことを可能とする浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法を提供する。【解決手段】下記（ａ）〜（ｄ）の工程を有することを特徴とする浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法。（ａ）検査対象水を濃縮する工程、（ｂ）濃縮した検査対象水をアルカリ性条件下で熱処理する工程、（ｃ）熱処理した試料中のレジオネラ属菌遺伝子を、ＬＡＭＰ法を用いて増幅する工程、（ｄ）増幅した遣伝子を検出する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）の工程を有することを特徴とする浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法。
（ａ）検査対象水を濃縮する工程、
（ｂ）濃縮した検査対象水をアルカリ性条件下で熱処理する工程、
（ｃ）熱処理した試料中のレジオネラ属菌遺伝子を、ＬＡＭＰ法を用いて増幅する工程、
（ｄ）増幅した遣伝子を検出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は浴槽水中のレジオネラ属菌検査方法であって、培養法に比べ極めて短時間で、かつ、同等の結果を得ることができるレジオネラ属菌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌はレジオネラ症の原因微生物として知られており、自然界や人工の水環境に広く生息しているグラム陰性の細菌である。レジオネラ属菌に汚染された冷却塔水や温泉水、循環風呂水などのエアロゾルを吸い込むことによって、レジオネラ属菌に感染し、レジオネラ症を引き起こす場合がある。そのため、「新版  レジオネラ症防止指針」（非特許文献１）が定められ、これらの環境水中のレジオネラ属菌のコントロールを行うことが求められている。
【０００３】
特に浴槽水に関しては、「公衆浴場における水質基準等に関する指針」（２００３年２月１４日厚生労働省健康局長通知第０２１４００４号、非特許文献２）により、レジオネラ属菌は検出されないこと（１０ＣＦＵ／１００ｍＬ未満）が求められ、一定の頻度でこれら基準を満たしているかどうかについての検査が求められている。
【０００４】
しかしながら、レジオネラ属菌の検査は、たとえば図１に「新版  レジオネラ症防止指針」に記載された冷却遠心濃縮法を用いた平板培養法のフローチャート（抜粋）を示すように、培養法で行われ、かつ、その培養には５日間〜７日間は要する。
【０００５】
しかしながら、浴槽水は人体に直接接触する水であり、その中にレジオネラ属菌がいる場合には確実に検出する必要があると同時に、その結果を迅速に知る必要があるケースが想定される。
【非特許文献１】「新版レジオネラ症防止指針」  監修  厚生省生活衛生局企画課、発行者：（財団法人）ビル管理教育センター  平成１１年１１月  初版発行
【非特許文献２】「公衆浴場における水質基準等に関する指針」（２００３年２月１４日厚生労働省健康局長通知第０２１４００４号、非特許文献２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等は、上記レジオネラ属菌の検査へ遺伝子検査法の応用を試みた。ここで、遺伝子検査法は２〜１０時間程度で細菌類の検出／非検出が判定できるため、大幅な時間短縮が可能となると予想される。
【０００７】
遺伝子検査法としては一般にＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法及びＰＡＬＳＡＲ法等の核酸増幅、検知法が知られているが、その中でも、核酸の増幅効率が高く、最も迅速な増幅が可能となる核酸増幅法であり、目的遺伝子が極少量であっても、多少の反応阻害物質が存在しても目的とする遺伝子を増幅することができるので、ＬＡＭＰ法を採用することとして検討を行った。
【０００８】
一般に、遺伝子検査法では、検査対象水から遺伝子を抽出する必要がある。このような遺伝子抽出法としては、（１）細胞の溶解、（２）除蛋白と脱炭水化物、（３）分離濃縮、（４）洗浄精製、等を組み合わせた一連の操作を行うのが一般的である。
【０００９】
細胞の溶解にはリゾチーム、アクロモペプチダーゼなどの細胞壁溶解酵素やプロテインナーゼＫ等の蛋白分解酵素を用いたり、アルカリやＳＤＳ等の界面活性剤を用いて細胞を破壊する。また、ビーズや超音波を用いて物理的に破壊する場合もある。
【００１０】
除蛋白と脱炭水化物については、従来よりフェノール・クロロホルム法による抽出が最も多く使用されている。分離濃縮操作においては、核酸を含む水性液体からイソプロピルアルコールまたはエタノール等で核酸を沈殿させて分離濃縮する。洗浄精製においては、通常、エタノールを用いて、分離濃縮された核酸から不純物を取り除き精製する。
【００１１】
また、これらの方法を組み合わせて、簡易に遺伝子抽出を可能にしたキットも多数市販されているが、いずれにしても煩雑で、手間のかかる処理が必要であり、また、遺伝子抽出法での前処理において、工程が多いほど検出目的遺伝子の収率が低くなり、偽陰性（実際に菌が存在するのに陰性と判定すること）となる可能性が高くなるので問題となっている。また、遺伝子の抽出操作を簡略化すると、検出目的遺伝子の収率は高くなるものの、遺伝子増幅反応を阻害する不純物を分離できず、この不純物がやはり偽陰性の原因となるとされている。
【００１２】
本発明は、このような問題点を改善する、すなわち、浴槽水のレジオネラ属菌の検査方法であって、従来の培養法に比べ、同等の精度を有し、特に偽陰性率が極めて低く、検査対象水からの遺伝子抽出にも手間が掛からず、かつ、極めて迅速に行うことを可能とする浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は上記目的を達成するために、請求項１に記載の通り、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を有する浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法である。
（ａ）検査対象水を濃縮する工程、
（ｂ）濃縮した検査対象水をアルカリ性条件下で熱処理する工程（以下「アルカリ熱抽出工程」とも云う）、
（ｃ）熱処理した試料中のレジオネラ属菌遺伝子を、ＬＡＭＰ法を用いて増幅する工程、
（ｄ）増幅した遣伝子を検出する工程
【発明の効果】
【００１４】
本発明の浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法は上記構成により、浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法であって、従来の培養法に比べ、同等の精度で、特に偽陰性率が極めて低く、検査対象水からの遺伝子抽出にも手間が掛からず、かつ、極めて迅速に行える浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法であって、その検査対象水は浴槽水であり、冷却塔水等の夾雑物が多く併存するような水では培養法との充分な相関が得られない。ただし、プール水等比校的清浄な水に関しては、本検査法により培養法との相関が得られやすく、そのような清浄な水系への応用は可能である。
【００１６】
本発明において、検査対象水を濃縮する工程（（ａ）工程）は、具体的には検査対象水中の細菌類を濃縮して回収する工程であり、検査対象水の濃縮に用いられる通常の濃縮方法を用いることができる。すなわち、ろ過濃縮法、遠心濃縮法、磁気ビーズ法、多孔質材やフェライトを用いた吸着濃縮法などが挙げられるが、操作が容易であり、冷却遠心装置等の大型の装置が不要であるのでろ過濃縮法を用いることが好ましい。
【００１７】
ここで、浴槽水の場合には一般にレジオネラ属菌の生菌数が少ないため、検査対象水に対して少なくとも１００倍以上、より好ましくは１０００倍以上に濃縮することが好ましい。
【００１８】
本発明における、（ａ）工程で濃縮した検査対象水をアルカリ性条件下で熱処理する工程（（ｂ）工程）では、菌体を破壊して内部の遺伝子の抽出を行う。このとき、アルカリ性条件下で熱処理を行う方法以外では、操作が煩雑になり、目的とする遺伝子の収率が落ちるため、培養法と同等の検査結果が得られにくくなる。
【００１９】
（ｂ）工程では、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの苛性アルカリを添加してｐＨ１１以上として加熱するが、このときの温度は９０℃以上であることが好ましい。また、熱処理時間としては、菌体が壊れて遺伝子が溶液中に溶出するのに充分な時間であればよいが、通常、１０分以上とすることが好ましい。なお、（ｂ）工程終了後、必要に応じて次工程であるＬＡＭＰ法を用いる遺伝子増幅に適したｐＨに調製する。
【００２０】
本発明における（ｃ）工程である、（ｂ）工程で熱処理した試料中のレジオネラ属菌遺伝子を、ＬＡＭＰ法を用いて増幅する工程では、ＬＡＭＰ法を用いる必要がある。ＬＡＭＰ法以外の遺伝子増幅法では偽陰性率を低く抑えることが困難であり、培養法による結果との一致率が極めて低く、そのため、充分な信頼性を有する検査結果を得ることができない。
【００２１】
本発明において、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法とは、特再ＷＯ００−２８０８２公報、特再ＷＯ０１−０３４８３８公報、特開２００１−２４２１６９公報、特開２００２−２７２４７５公報、及び特開２００２−３４５４９９公報等で提案ないし記載されている方法であり、伸長鎖上の配列と相補的な配列を５’側に持つ少なくとも２種類のインナープライマー、開始物質合成のために必要な少なくとも２種類のアウタープライマー、及び、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いて目的とする遺伝子を増幅させる遺伝子増幅法である。なお、ＬＡＭＰ法では増幅処理を一定温度（６５℃付近）で行うため、温度の上昇下降の繰り返しを伴うＰＣＲ法などと異なり、極めて迅速な遺伝子増幅が可能であるとされている。
【００２２】
本発明における（ｄ）工程、すなわち、（ｃ）工程で増幅した遣伝子を検出する工程での、増幅産物の検出法としては、一般的なアガロースゲル電気泳動法による検出法の他、ＬＡＭＰ法特有の検出方法として、遺伝子増幅反応の副生成物である難溶性のピロリン酸塩による濁度の上昇を検知する方法、ＬＡＭＰ反応によって得られる遺伝子増幅産物の一本鎖ループ部分にハイブリダイズする蛍光標識プライマーを添加して、反応液の蛍光偏光度を測定する方法等を採ることができる。
【００２３】
本発明は、アルカリ熱抽出法とＬＡＭＰ法とを組み合わせることにより、偽陰性を殆ど出すことがなく、培養法との一致率が高く、短時問で結果が得られる優れたレジオネラ属菌の検査方法である。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明の実施例について説明する。サンプルは、公衆浴場、温泉等５０箇所から集めた実際の浴槽水を検査対象水として使用した。
【００２５】
（実施例）
＜（ａ）工程：検査対象水の濃縮＞
試料水各５００ｍＬをメンブレンフィルター（孔径：０．４５μｍ）を用いてろ過したのち続けて、５０ｍＬの滅菌脱イオン水をろ過してメンブレンフィルターを濯いだ。
【００２６】
ろ過捕捉物の付着した上記メンブレンフィルターを、滅菌済みの５０ｍＬ容のスクリューキャップ付き遠心沈殿管に入れ、滅菌脱イオン水を５ｍｌ加えてボルテックスタイプミキサーで５分間攪拌して捕捉物を再懸濁させた。
【００２７】
＜（ｂ）工程：アルカリ性条件下で熱処理する工程（アルカリ熱抽出工程）＞
まず、上記で得た再懸濁液２ｍＬを２ｍＬ容のマイクロチューブに移し、４℃、１４０００×ｇで１０分間遠心処理を行った
【００２８】
その上清１９６０μＬを取り除き、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を５０μＬ加え、沸騰水中（１００℃）にこのマイクロチューブを浸漬し、１５分間加熱して遺伝子を菌体外に抽出した。次いで、マイクロチューブを氷冷した後、１Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を８μＬ添加して中和し、４℃の温度下で、１４０００×ｇで１０分問遠心処理し、その上清を遺伝子増幅用の試料として用いた。
【００２９】
＜（ｃ）工程：レジオネラ属菌遺伝子を、ＬＡＭＰ法を用いて増幅する工程＞
表１にその組成を示す反応用混合液２０μＬに上記で調製した遣伝子増幅用の試料５μＬを添加し、６５℃で６０分間反応させた。
【００３０】
このとき用いたプライマーはレジオネラ属菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとする６箇所の領域を含む、表１に示す８種類のプライマーである。
【００３１】
【表１】
2005265680.tif 000002
【００３２】
＜（ｄ）工程：増幅した遣伝子を検出する工程＞
上記ＬＡＭＰ法によって増幅反応開始後６０分後に、ＬＡＭＰ反応の副生成物であるピロリン酸マグネシウムにより反応液に濁りが生じた試料をレジオネラ陽性と判定した。
【００３３】
（比較例１：遺伝子抽出キットを使用してのＬＡＭＰ法による検討）
上記実施例と同様にして、ただし、アルカリ熱抽出ではなく市販の遺伝子抽出キットによる遺伝子抽出で検討を行った。すなわち、（ａ）工程を行った後の再懸濁液１００μＬに対して、東ソー株式会社製の遺伝子抽出キットＥＸＴＲＡＧＥＮを用い、その高感度プロトコールに従って遺伝子の抽出を行い（このときの操作は１３工程に亘る繁雑なものである）、最終的にＴＥ緩衝液２５μＬに溶解して遣伝子増幅用の試料とし、次いで上記実施例の（ｃ）工程及び（ｄ）工程を行った。
【００３４】
（比較例２：ＰＣＲ法による検討）
ＬＡＭＰ法同様に遺伝子増幅検査法に属する、他の方法であるＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）での検討を行った。すなわち、上記実施例と同様にして（ａ）工程及び（ｂ）工程を行った後、次のようにＰＣＲ法を行った。
【００３５】
ＰＣＲに用いるプライマーはＹａｍａｍｏｔｏら（「環境水中のレジオネラ属菌の検出方法としての、培養法、蛍光抗体染色法、ＰＣＲ法の比較」(Yamamoto, H., Y. Hashimoto and T. Ezaki (1993) Comparison of detection methods  for Legionella species in environmental water by colony isolation, fluorescent antibody staining, and polymerase chain reaction. Microbiol. Immunol., 37, 617-622)が報告している、レジオネラ属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをターゲットとするＬＥＧ４４８−Ａ（５’−GAG GGT TGA TAG GTT AAG AGC−３’）（配列番号９）およびＬＥＧ８５４−Ｂ（５’−CGG TCA ACT TAT CGC GTT TGC T−３’）（配列番号１０）を用いた。
【００３６】
ＰＣＲの反応液はＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いて調整した。反応液の組成は１４．３７５μＬの滅菌蒸留水に２．５μＬの１０×  Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）、２μＬのｄ−ＮＴＰ  ｍｉｘ、０．５μＬのＬＥＧ４４８−Ａプライマー溶液（１０μＭ）、０．５μＬのＬＥＧ８５４−Ｂプライマー溶液（１０μＭ）および０．１２５μＬのＥｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを混合し、最後に５μＬの核酸抽出液を添加して全量を２５μＬとした。
【００３７】
サーマルサイクラーの設定は、最初の熱変性として９４℃で９０秒、続けて９４℃で３０秒、６５℃で６０秒及び７２℃で６０秒の操作を１サイクルとして５サイクル行った。その後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒及び７２℃で６０秒の操作を１サイクルとして３５サイクル行い、最後に７２℃で４分の反応を行った。
【００３８】
増幅産物の検出はアガロースゲル（１．５重量％）電気泳動で行った。泳動後のゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ＢＭＰ）を用いて染色し、２５４ｎｍのトランスイルミネーター上で、レジオネラ属由来である４３０ｂｐの増幅産物の有無を観察し、増幅産物が観察された場合を「陽性」と判断した。
【００３９】
（比較例３：培養法による検討）
上記実施例と同様にして（ａ）工程を行った後の再懸濁液１ｍＬを用いて培養法による検討を行った。
【００４０】
培養法は、「新版  レジオネラ症防止指針」に記載された冷却遠心濃縮法を用いた平板培養法のフローチャート（図１）に沿って定めた、図２に示すフローチャートに従ってＧＶＰＣα培地を用いて行った。このときの培養日数は６日であった。
【００４１】
これら、実施例の方法、比較例の方法でそれぞれ公衆浴場、温泉等５０箇所から集めた実際の浴槽水を検査対象水として検査した結果を表２に示す。なお、表２中「培養法との一致率」は、個々の検査対象水に対する結果が培養法による結果とそれぞれの方法による結果とが一致した割合を示し、「偽陰性率」は培養法による結果が「陽性」であった検査対象水でそれぞれの方法による結果が「陰性」と判断された割合を、また、「偽陽性率」は培養法による結果が「陰性」であった検査対象水でそれぞれの方法による結果が「陽性」と判断された割合を、それぞれ示す。
【００４２】
また、５０箇所から集めた冷却塔の冷却水について、実施例及び比較例３と同様な方法で調べた結果を参考データとして表２に併せて記載する。
【００４３】
【表２】
2005265680.tif 000003
【００４４】
表２により、本発明に係るレジオネラ属菌の検査方法が、浴槽水の検査において、アルカリ熱抽出工程とＬＡＭＰ法による遺伝子増幅との組み合わせが培養法との一致率が最も高く、しかも、実際はレジオネラ属菌がいるにもかかわらず偽陰性となってレジオネラ属菌に関して「安全」と判断されてしまう偽陰性率が０％である。
【００４５】
一方、市販のキットによる遺伝子抽出とＬＡＭＰ法との組合せでは、培養法との一致率は低く、さらに、遺伝子の抽出に非常に繁雑な手間が掛かるにもかかわらず、偽陰性となる確率が１８％と非常に高く、全く信頼性に欠けることが判る。
【００４６】
また、アルカリ熱抽出工程とＰＣＲ法との組合せでは偽陰性率が４％と、やはり、レジオネラ属菌の検査方法として、最も忌避すべき偽陰性率が高く、信頼性に欠ける。
【００４７】
一方、夾雑物が多く併存するような冷却塔の冷却水を検査対象とした検査では、アルカリ熱抽出工程とＬＡＭＰ法による遺伝子増幅との組み合わせを有する検査方法であっても、培養法との一致率が半分以下であり、本検査方法の冷却塔の冷却水への応用は適当ではないと判断される。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、浴槽水のレジオネラ属菌の検査方法であって、従来の培養法に比べ、同等の精度を有し、特に偽陰性率が極めて低く、検査対象水からの遺伝子抽出にも手間が掛からず、かつ、極めて迅速に行うことを可能とする浴槽水中のレジオネラ属菌の検査方法であり、公衆浴場などの浴槽水の安全管理のためのレジオネラ属菌の検査方法として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】「新版  レジオネラ症防止指針」に記載された冷却遠心濃縮法を用いた平板培養法のフローチャート（抜粋）である。
【図２】比較例３の培養法による検討で行った検査方法でのフローチャートである。
【図１】
2005265680.tif 000004
【図２】
2005265680.tif 000005
【配列表】
2005265680000001.app