(57)【要約】【課題】  活性酸素やフリーラジカル消去能が高く、かつ人体に対して安全であって、各種用途に有用な天然物由来の活性酸素消去剤およびその用途を提供する。【解決手段】  （Ａ）プロポリス原塊粉砕物を、水と有機溶剤と乳化剤を含む混合溶媒を用いて抽出処理したのち、抽出液と抽出残渣とに固液分離する工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で分離された抽出残渣に水を加えて攪拌後、有機溶剤水溶液と固形物とに固液分離する工程、および（Ｃ）前記（Ｂ）工程で分離された有機溶剤水溶液を濃縮する工程、または（Ｄ）前記（Ｂ）工程で分離された固形物を乾燥・粉砕処理する工程を含み、前記（Ｃ）工程で得られた濃縮液または（Ｄ）工程で得られた粉末を製品とする、活性酸素消去剤の製造方法、並びにこの方法で得られた活性酸素消去剤を含む食品、化粧料である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）プロポリス原塊粉砕物を、水と有機溶剤と乳化剤を含む混合溶媒を用いて抽出処理したのち、抽出液と抽出残渣とに固液分離する工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で分離された抽出残渣に水を加えて攪拌後、有機溶剤水溶液と固形物とに固液分離する工程、および（Ｃ）前記（Ｂ）工程で分離された有機溶剤水溶液を濃縮する工程を含み、該（Ｃ）工程で得られた濃縮液を製品とすることを特徴とする活性酸素消去剤の製造方法。
【請求項２】
（Ａ）プロポリス原塊粉砕物を、水と有機溶剤と乳化剤を含む混合溶媒を用いて抽出処理したのち、抽出液と抽出残渣とに固液分離する工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で分離された抽出残渣に水を加えて攪拌後、有機溶剤水溶液と固形物とに固液分離する工程、および（Ｄ）前記（Ｂ）工程で分離された固形物を乾燥・粉砕処理する工程を含み、該（Ｄ）工程で得られた粉末を製品とすることを特徴とする活性酸素消去剤の製造方法。
【請求項３】
（Ａ）工程で用いる混合溶媒中の有機溶剤が、分子中に水酸基２個以上を有する多価アルコール系化合物である請求項１または２に記載の活性酸素消去剤の製造方法。
【請求項４】
（Ａ）工程で用いる混合溶媒中の乳化剤が、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン類およびサポニン類の中から選ばれる少なくとも１種である請求項１、２または３に記載の活性酸素消去剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法で得られた活性酸素消去剤を含むことを特徴とする食品。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法で得られた活性酸素消去剤を含むことを特徴とする化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素消去剤の製造方法および用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、プロポリス原塊粉砕物の抽出残渣から、食品用や化粧料用などとして有用な活性酸素消去剤を製造する方法、およびこの方法で得られた活性酸素消去剤を含む食品および化粧料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酸素は生体にとって代謝によるエネルギーの産生など、生命の維持には必須な物質であるが、生体内外での諸反応系、すなわち一部の免疫反応や紫外線・放射線照射等により反応性に富んだ活性酸素種（スーパーオキサイドアニオン：Ｏ2- 、過酸化水素：Ｈ2Ｏ2、ヒドロキシルラジカル：ＯＨ・、一重項酸素：1Ｏ2 等）やフリーラジカルを産生する。これらの活性酸素種やフリーラジカルは、例えばある免疫反応においては侵入した細菌等の異物を不活性化することには役に立つ一方で、生体成分と反応して脂質の過酸化、蛋白質や核酸の変性を引き起こし、種々の疾病や老化の促進の原因となることが知られている。特に皮膚は、身体の最外層にあるために、紫外線や放射線等の外部要因により発生する活性酸素種やフリーラジカルの影響を受け易く、これらが皮膚で過剰に産生すると、ラジカル反応による過酸化脂質の生成やシミ、ソバカス等の皮膚の異常な色素の産生が増強されることが知られている。
【０００３】
生体内で種々の原因により生じたスーパーオキサイドアニオンＯ2-は、酵素スーパーオキサイドディスムターゼ（以下ＳＯＤと略記する）によりＨ2Ｏ2に変換され、さらにＨ2Ｏ2は酵素カタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼの作用によって水と酸素とに分解される。これらの酵素に加えて生体内にはビタミンＣやビタミンＥ等の食品由来の抗酸化物質が存在し、これらが生体内のラジカル反応や酸化反応を抑制するネットワークを形成して活性酸素やフリーラジカルによる諸障害の防御にあたると考えられている。しかし、周囲ならびに生体内の環境の変化、例えば細菌やウイルス等による感染、食物の摂取状態や栄養状態の変化、紫外線の過剰な照射、周囲から受ける種々のストレスおよび加齢・老化等により上記のネットワークのバランスが崩れると、生体内で産生される活性酸素やフリーラジカルの代謝バランスが崩れ、結果として過酸化脂質量の増加、皮膚炎、シミ、シワ、湿疹、ソバカス等の美容上の障害となる諸症状が現れ、さらには関節リウマチ、動脈硬化、糖尿病、肝炎、腎炎や癌等の疾病が引き起こされることが知られている。
【０００４】
また、人が摂取する食品や食品添加物についても、紫外線や放射線の作用により発生する活性酸素やフリーラジカルによる酸化や通常の酸化によって、それらに含まれている脂質その他の成分の過酸化や変性が起こり、それら酸化、変性物の摂取は健康上好ましくないことは周知のことである。さらに、化粧品、皮膚外用剤に配合されることがある不飽和脂質を含む天然油脂や界面活性剤の中には、紫外線等の作用によって酸化を受け易いものがあることが知られており、結果として変色や異臭の発生等の好ましくない現象が起こることが多い。このような酸化を受け易い化粧品基剤の使用によって、前述の諸原因によって皮膚に生ずる脂質過酸化物の量が増大し、上記の美容上の障害となる諸症状が増幅されることは容易に推測されることである。
【０００５】
従来、化粧品、食品、食品添加物および飼料に添加されている抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、エトキシキン等の合成抗酸化剤の他、アスコルビン酸やビタミンＥ等の天然抗酸化剤がある。上記の合成抗酸化剤は、抗酸化効果は優れているが、発癌性等の安全性に問題があるものがあり、その使用については制限されているものもある。一方、上記の天然由来の抗酸化剤は、安全性については評価されるものの、抗酸化効果は合成抗酸化剤よりもかなり劣るという欠点がある。
【０００６】
近年、このような状況下で活性酸素・フリーラジカル消去効果や抗酸化効果を有する物質もしくは組成物の香粧品科学的、食品科学的また薬学的見地からの探索が活発に行われ、その結果、かなりの数の活性酸素・フリーラジカル消去剤や抗酸化剤が知られるようになった。例えば、オウゴンに含まれるフラボノイド成分であるバイカレインを含有する活性酸素消去剤（例えば、特許文献１参照）、クローブ油またはその成分であるデハイドロジオイゲノールからなる活性酸素消去・除去剤（例えば、特許文献２参照）、クルミ殻抽出物を有効成分とする活性酸素消去剤（例えば、特許文献３参照）などが提案されている。
【０００７】
一方、従来より、天然の抗菌性物質や健康増進物質としてプロポリスが知られている。このプロポリスは、ミツバチが巣の保全のために作る濃緑色〜茶褐色の粘着性物質であり、ミツバチが樹木より採取したガム質・樹液・植物色素系物質・香油等の集合体に、自身の分泌物・蜜蝋等を混合して作られる。該プロポリスについては、抗腫瘍活性、抗酸化活性、抗炎症活性、抗菌活性など様々な生物活性が報告されている。生理活性を有する化合物群としてはケイ皮酸誘導体、フラボノイド類、エステル類や、その他のフェノール性化合物群等があげられ、亜熱帯産のプロポリスにおいては加えてテルペン類の存在が報告されている。
そして、このようなプロポリスを、水とアルコール系有機溶剤と界面活性剤を含む混合溶媒を用いて抽出処理して得られた抽出液を含むプロポリス食品組成物が開示されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００８】
【特許文献１】特公平４−３４９６９号公報
【特許文献２】特開平３−２２７９３８号公報
【特許文献３】特開平７−６９９１２号公報
【特許文献４】特公平４−６６５４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、活性酸素やフリーラジカル消去能が高く、かつ人体に対して安全であって、各種用途に有用な天然物由来の活性酸素消去剤の製造方法および用途を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、プロポリス原塊粉砕物を抽出処理し、有効成分を取り出した抽出残渣に、活性酸素消去性物質がまだ残存していることに着目し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）プロポリス原塊粉砕物を、水と有機溶剤と乳化剤を含む混合溶媒を用いて抽出処理したのち、抽出液と抽出残渣とに固液分離する工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で分離された抽出残渣に水を加えて攪拌後、有機溶剤水溶液と固形物とに固液分離する工程、および（Ｃ）前記（Ｂ）工程で分離された有機溶剤水溶液を濃縮する工程を含み、該（Ｃ）工程で得られた濃縮液を製品とすることを特徴とする活性酸素消去剤の製造方法（以下、製造方法Ｉと称す。）、
（２）（Ａ）プロポリス原塊粉砕物を、水と有機溶剤と乳化剤を含む混合溶媒を用いて抽出処理したのち、抽出液と抽出残渣とに固液分離する工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で分離された抽出残渣に水を加えて攪拌後、有機溶剤水溶液と固形物とに固液分離する工程、および（Ｄ）前記（Ｂ）工程で分離された固形物を乾燥・粉砕処理する工程を含み、該（Ｄ）工程で得られた粉末を製品とすることを特徴とする活性酸素消去剤の製造方法（以下、製造方法IIと称す。）、
（３）（Ａ）工程で用いる混合溶媒中の有機溶剤が、分子中に水酸基２個以上を有する多価アルコール系化合物である上記（１）または（２）項に記載の活性酸素消去剤の製造方法、
（４）（Ａ）工程で用いる混合溶媒中の乳化剤が、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン類およびサポニン類の中から選ばれる少なくとも１種である上記（１）、（２）または（３）項に記載の活性酸素消去剤の製造方法、
（５）上記（１）ないし（４）項のいずれか１項に記載の方法で得られた活性酸素消去剤を含むことを特徴とする食品、および
（６）上記（１）ないし（４）項のいずれか１項に記載の方法で得られた活性酸素消去剤を含むことを特徴とする化粧料、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、プロポリス原塊抽出残渣から、活性酸素やフリーラジカル消去能が高く、かつ人体に対して安全であって、各種用途に有用な活性酸素消去剤を製造する方法、並びにこの方法で得られた活性酸素消去剤を含む食品および化粧料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の活性酸素消去剤の製造方法においては、製造方法Ｉおよび製造方法IIの２つの態様がある。
製造方法Ｉは、（Ａ）プロポリス原塊粉砕物を、水と有機溶剤と乳化剤を含む混合溶媒を用いて抽出処理したのち、抽出液と抽出残渣とに固液分離する工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で分離された抽出残渣に水を加えて攪拌後、有機溶剤水溶液と固形物とに固液分離する工程、および（Ｃ）前記（Ｂ）工程で分離された有機溶剤水溶液を濃縮する工程を含み、該（Ｃ）工程で得られた濃縮液を製品とする活性酸素消去剤の製造方法である。
一方、製造方法IIは、前記の（Ａ）工程、（Ｂ）工程、および（Ｄ）前記（Ｂ）工程で分離された固形物を乾燥・粉砕処理する工程を含み、該（Ｄ）工程で得られた粉末を製品とする活性酸素消去剤の製造方法である。
【００１４】
本発明の製造方法Ｉおよび製造方法IIにおいて、前記（Ａ）工程で用いられるプロポリス原塊粉砕物は、原料のプロポリス原塊を粉砕機により粉砕処理することにより得ることができる。該原料のプロポリス原塊は、粉砕および抽出処理を効率的に行うために、通常１５℃以下、好ましくは０〜１０℃程度の温度に保存したものを用いることが望ましい。前記粉砕機に装着するスクリーンの孔径は、通常１〜５ｍｍ径、好ましくは２〜３ｍｍ径である。
【００１５】
また、抽出処理に用いる混合溶媒における有機溶剤としては、分子中に水酸基２個以上を有する多価アルコール系化合物が好ましく、具体的には、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリンのアルキレンオキサイド付加物、エチレングリコールのアルキレンオキサイド付加物、プロピレングリコールのアルキレンオキサイド付加物、グルコノデルタラクトン、さらにはキシリトール、ヘキシトール、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール等を挙げることができる。これらは１種用いてもよく、２種以上混合して用いてもよいが、得られる活性酸素消去剤を食品用途に用いる場合には、特にグリセリンおよび各種の糖アルコールが好適である。
【００１６】
一方、乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン類およびサポニン類などを例示することができる。
【００１７】
前記グリセリン脂肪酸エステルとしては、例えばグリセリン＝モノラウレート、グリセリン＝モノパルミテート、グリセリン＝モノステアレート、グリセリン＝モノオレエート、グリセリン＝モノリノレート、グリセリン＝モノリシノレートなどを挙げることができる。
【００１８】
ポリグリセリン脂肪酸エステルとしては、例えばジグリセリン＝モノラウレート、ジグリセリン＝モノパルミテート、ジグリセリン＝モノステアレート、ジグリセリン＝モノオレエート、ジグリセリン＝モノリノレート、ジグリセリン＝モノリシノレート、テトラグリセリン＝モノラウレート、テトラグリセリン＝ジラウレート、テトラグリセリン＝モノパルミテート、テトラグリセリン＝ジパルミテート、テトラグリセリン＝モノステアレート、テトラグリセリン＝ジステアレート、テトラグリセリン＝モノオレエート、テトラグリセリン＝ジオレエート、テトラグリセリン＝モノリノレート、テトラグリセリン＝ジリノレート、テトラグリセリン＝モノリシノレート、テトラグリセリン＝ジリシノレート、テトラグリセリン＝モノベヘネート、テトラグリセリン＝ジベヘネート、ペンタグリセリン＝モノラウレート、ペンタグリセリン＝ジラウレート、ペンタグリセリン＝モノパルミテート、ペンタグリセリン＝ジパルミテート、ペンタグリセリン＝モノステアレート、ペンタグリセリン＝ジステアレート、ペンタグリセリン＝モノオレエート、ペンタグリセリン＝ジオレエート、ペンタグリセリン＝モノリノレート、ペンタグリセリン＝ジリノレート、ペンタグリセリン＝モノリシノレート、ペンタグリセリン＝ジリシノレート、ペンタグリセリン＝モノベヘネート、ペンタグリセリン＝ジベヘネート、デカグリセリン＝モノラウレート、デカグリセリン＝ジラウレート、デカグリセリン＝トリラウレート、デカグリセリン＝モノパルミテート、デカグリセリン＝ジパルミテート、デカグリセリン＝トリパルミテート、デカグリセリン＝モノステアレート、デカグリセリン＝ジステアレート、デカグリセリン＝トリステアレート、デカグリセリン＝モノオレエート、デカグリセリン＝ジオレエート、デカグリセリン＝トリオレエート、デカグリセリン＝モノリノレート、デカグリセリン＝ジリノレート、デカグリセリン＝トリリノレート、デカグリセリン＝モノリシノレート、デカグリセリン＝ジリシノレート、デカグリセリン＝トリリシノレート、デカグリセリン＝モノベヘネート、デカグリセリン＝ジベヘネート、デカグリセリン＝トリベヘネート、デカグリセリン＝モノイソステアレート、デカグリセリン＝セスキイソステアレート、デカグリセリン＝ジイソステアレート、デカグリセリン＝トリイソステアレート、デカグリセリン＝モノ（１２−ヒドロキシ）ステアレート、デカグリセリン＝ジ（１２−ヒドロキシ）ステアレート、デカグリセリン＝トリ（１２−ヒドロキシ）ステアレート等を挙げることができる。
【００１９】
プロピレングリコール脂肪酸エステルとしては、例えばプロピレングリコール＝モノラウレート、プロピレングリコール＝モノパルミテート、プロピレングリコール＝モノステアレート、プロピレングリコール＝モノオレエート、プロピレングリコール＝モノリノレート、プロピレングリコール＝モノリシノレート、プロピレングリコール＝モノイソステアレート、プロピレングリコール＝モノ（１２−ヒドロキシ）ステアレートなどを挙げることができる。
【００２０】
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えばソルビタン＝モノラウレート、ソルビタン＝ジラウレート、ソルビタン＝モノパルミテート、ソルビタン＝ジパルミテート、ソルビタン＝モノステアレート、ソルビタン＝ジステアレート、ソルビタン＝モノオレエート、ソルビタン＝ジオレエート、ソルビタン＝モノリノレート、ソルビタン＝ジリノレート、ソルビタン＝モノリシノレート、ソルビタン＝ジリシノレート、ソルビタン＝モノベヘネート、ソルビタン＝ジベヘネート、ソルビタン＝モノイソステアレート、ソルビタン＝ジイソステアレート、ソルビタン＝モノ（１２−ヒドロキシ）ステアレート、ソルビタン＝ジ（１２−ヒドロキシ）ステアレート等が挙げられる。
【００２１】
ショ糖脂肪酸エステルとしては、例えばショ糖＝モノラウレート、ショ糖＝ジラウレート、ショ糖＝モノパルミテート、ショ糖＝ジパルミテート、ショ糖＝モノステアレート、ショ糖＝ジステアレート、ショ糖＝モノオレエート、ショ糖＝ジオレエート、ショ糖＝モノリノレート、ショ糖＝ジリノレート、ショ糖＝モノリシノレート、ショ糖＝ジリシノレート、ショ糖＝モノイソステアレート、ショ糖＝ジイソステアレート、ショ糖＝モノ（１２−ヒドロキシ）ステアレート、ショ糖＝ジ（１２−ヒドロキシ）ステアレート等を挙げることができる。
【００２２】
また、レシチン類としては、例えば大豆レシチンや他の植物レシチンなどを、サポニン類としては、例えばキラヤ抽出物やダイズサポニンなどを挙げることができる。
【００２３】
これらの乳化剤は、１種用いてもよく、２種以上混合して用いてもよい。なお、前記乳化剤は、食品用として使用可能であるので、得られる活性酸素消去剤を食品用途に用いる場合、含まれていてもかまわない。
【００２４】
混合溶媒における水と前記有機溶剤と前記乳化剤の含有割合は、それらの合計量を１００質量％とすると、通常水：５〜５０質量％、有機溶剤：４５〜９４．９質量％および乳化剤：０．１〜１０質量％であり、好ましくは、水：５〜３０質量％、有機溶剤：６５〜９４．５質量％および乳化剤：０．１〜５質量％の範囲である。
【００２５】
（Ａ）工程におけるプロポリス原塊粉砕物の抽出処理は、以下のようにして行うことができる。
プロポリス原塊粉砕物１質量部に対し、水と前記有機溶剤と前記乳化剤を前記の割合で含有する混合溶媒からなる抽出溶媒を３〜７質量部程度加える。抽出溶媒の使用量が３質量部未満ではプロポリス原塊粉砕物と抽出溶媒の粘性により、抽出作業効率が低下する原因となり、また７質量部を超えると抽出液中の有効成分の含有量が低下するおそれがある。
【００２６】
次に、５０〜９０℃程度、好ましくは６５〜８０℃の温度に加熱して３０〜１２０分間程度抽出処理を行う。抽出処理後、ろ過、遠心分離、圧搾などの手段により、抽出液と抽出残渣とに固液分離する。
【００２７】
このようにして得られた抽出液には、本発明者らの研究によると（特願２００４−００８８６２号明細書）、ｐ−クマリン酸（ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシ−３−プレニルケイ皮酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｐｒｅｎｙｌｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）および４’−メトキシ−３，５，７−トリヒドロキシフラバノール（４’−ｍｅｔｈｏｘｙ−３，５，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｌ）が主要有効成分として含まれており、さらに３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシケイ皮酸（アーテピリンＣ）［３，５−ｄｉｐｒｅｎｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ａｒｔｅｐｉｌｌｉｎＣ）］、カエムフェライド（ｋａｅｍｐｈｅｒｉｄｅ）、ベツレトール（ｂｅｔｕｒｅｔｏｌ）、クロロゲン酸（ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、エルマニン（ｅｒｍａｎｉｎ）、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）、カフェー酸（ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ）、カエムフェロール（ｋａｅｍｐｈｅｒｏｌ）およびバニリン（ｖａｎｉｌｌｉｎ）などの有効成分が含まれている。なお、カエムフェライドは、４’−メトキシ−３，５，７−トリヒドロキシフラボン、ベツレトールは、４’，６−ジメトキシ−３，５，７−トリヒドロキシフラボン、エルマニンは、３，４’−ジメトキシ−５，７−ジヒドロキシフラボン、クリシンは、５，７−ジヒドロキシフラボン、カエムフェロールは、３，４’，５，７−テトラヒドロキシフラボンのことである。
【００２８】
一方抽出残渣には、前記抽出液が４０〜6０質量％程度含有していることから、当然該抽出液中に存在する前記の各有効成分が含まれており、また、未抽出の前記各有効成分及びその他の有効成分が残存しているものと思われる。
【００２９】
抽出残渣に含まれる有効成分を利用するために、抽出残渣を温風乾燥、スプレー乾燥、凍結乾燥などの方法で乾燥処理して、粉末化しようとしても、有機溶剤が揮発しにくいことから、除かれるのは水分が大部分であり、残渣の粉末化は困難である。
【００３０】
したがって、本発明の製造方法ＩおよびIIにおいてはまず、（Ｂ）工程として、前記（Ａ）工程で分離された抽出残渣に水を加えて攪拌後、有機溶剤水溶液と固形物とに固液分離を行う。この際、抽出残渣より、効率的に脱有機溶剤操作を行うために、抽出残渣を必要に応じて粉砕機により粉砕処理する。粉砕処理を効率的に行うために、好ましくは１５℃以下、より好ましくは０〜１０℃程度の温度に保存した残渣を用いることが望ましい。この際、粉砕機に装着するスクリーン孔径は、通常２〜２０ｍｍ径、好ましくは５〜１０ｍｍ径である。
【００３１】
このプロポリス原塊抽出残渣１質量部に対し、水を３〜７質量部程度加え、攪拌する。水は、イオン交換水、蒸留水等を用いるのが望ましく、残渣中の有効成分の流出を押さえる目的で、水温は、好ましくは常温以下、より好ましくは１５℃以下で用いるのがよい。水の使用量が３質量部未満では、十分な脱有機溶剤が行われず、また、７質量部を超えると、残渣中の有効成分が過度に流出するおそれがある。次いで、公知の手段により、有機溶剤水溶液と固形物とに固液分離する。
【００３２】
製造方法Ｉにおいては、（Ｃ）工程において、前記（Ｂ）工程で分離された有機溶剤水溶液を適度に濃縮し、液状製品の活性酸素消去剤を得る。
一方、製造方法IIにおいては、（Ｄ）工程において、前記（Ｂ）工程で分離された固形物に、公知の方法、例えば温風乾燥、スプレー乾燥および凍結乾燥などの乾燥処理を施し、粉砕処理して、粉末製品の活性酸素消去剤を得る。この際、該固形物に糖類などを添加して濃度調整を行うことができる。
【００３３】
このようにして得られた液状又は粉末状の活性酸素消去剤は、フラボノイド類、ヒドロキシケイ皮酸誘導体、その他フェノール性化合物など、親水性から疎水性まで幅広い成分を含んでおり、高い活性酸素・フリーラジカル消去能および抗酸化能を有し、例えば食品用途、化粧料用途、さらには飼料用途などに用いることができる。
【００３４】
前記活性酸素消去剤は、そのまま液状品として食品や化粧料などの組成物に配合するか、または粉末として食品や飼料などの組成物に配合し、あるいは予め該有効成分を製剤化したものを前記組成物に配合して、活性酸素消去効果および抗酸化効果を賦与して前記組成物の商品価値を高めることが可能である。
【００３５】
製剤化の例としては、錠剤、カプセル剤、散剤、または顆粒剤の場合は、上記有効成分を澱粉、乳糖やマニトール等の賦型剤、カルボキシメチルセルロースやヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、結晶セルロースやカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、タルクやステアリン酸マグネシウム等の潤沢剤、その他必要に応じて湿潤剤、着色剤や香料等を適宜組み合わせて処方することにより製剤化することができる。また、液剤としては、水性もしくは油性の乳濁剤やシロップ剤にすればよく、単シロップ、ソルビトール、メチルセルロースやカルボキシメチルセルロースナトリウム等の懸濁化剤、卵黄レシチン、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ラウロマクロゴールやヒマシ油等の乳化剤、その他必要に応じて防腐剤、保存剤や安定化剤等を適宜配合して製剤化することができる。軟膏の場合は、ワセリン、パラフィン、シリコン、プラスチベース、植物油やロウ類等の疎水性基剤、精製ラノリン、カルボキシビニルポリマー、プロピレングリコールや１，３−ブタンジオール等の親水性基剤、ポリエタノールアミン等の乳化剤等を適宜配合して製剤化することができる。
【００３６】
本発明はまた、前記活性酸素消去剤を含む食品および化粧料を提供する。
前記食品の形態としては、当該活性酸素消去剤をそのまま飲用する形態、あるいは味噌、醤油、マヨネーズ等の調味料、サラダオイル等の食用油に添加・混合する他、各種調理食品；デザート類、氷菓、飴、チューインガムや果汁等の菓子・飲料等を挙げることができる。これらの食品には、使用目的に応じた任意の成分を用いることができる。例えば氷菓や飲料の場合は、果汁、甘味料、酸味料、着色料や香料等を適宜配合することができる。本発明の有効成分の食品への添加量は、その形態により適宜変えればよい。
【００３７】
一方、化粧品の形態としては種々のものを挙げることができ、例えばローション、乳液、クリームをはじめとして洗顔料、パック料、メーキャップ化粧料、頭髪化粧料、口唇化粧料、爪用化粧料、浴剤や制汗剤等が挙げられる。これらの化粧品には、使用目的に応じた任意の成分を用いることができ、例えばクリームの場合は、ワセリン、パラフィン、スクワランなどの疎水性基剤、ラノリン、プロピレングリコール、１，３−ブタジオール等の親水性基剤、脂肪酸モノグリセライド類、ソルビタン脂肪酸エステル類等の乳化剤、防腐剤、顔料、香料、その他必要に応じて栄養剤、保湿剤、美白剤及び紫外線吸収剤等を常法に従って適宜配合することができる。同様に、その他の製品についても、その種類に応じた必要成分を適宜配合することができる。本発明の有効成分の化粧品への添加量は、その形態により適宜変えればよい。
【００３８】
また、本発明の活性酸素消去剤は、飼料に配合することもできる。飼料の形態としては、種々のものを挙げることができ、例えば家畜・家禽・魚類用の粉状、練り製品状またはペレット状の配合飼料を挙げることができる。これらの飼料には、使用目的に応じた任意の成分を用いることができ、例えば練り製品状の飼料の場合は、着色料や香料等を適宜配合することができる。本発明の有効成分の飼料への添加量は、その形態により適宜変えればよい。
【実施例】
【００３９】
次に、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例１
（１）プロポリス原塊粉砕物の抽出
プロポリス原塊（ブラジル産Ｂａｃｃｈａｒｉｓ  ｄｒａｃｕｎｃｕｌｉｆｏｌｉａ基源タイプ）の粉砕物２５質量部に、水１０質量％とグリセリン８９質量％と乳化剤（グリセリン＝モノオレート）１質量％の混合液２００質量部を加え、攪拌しながら７０℃で１時間抽出したのち、ろ過することにより、抽出液およびプロポリス原塊抽出残渣を得た。
（２）分離液の濃縮
上記（１）で得たプロポリス原塊抽出残渣１質量部に対し、イオン交換水４質量部を加え、３０分間攪拌後、遠心分離を行い、固形分と分離した有機溶剤水溶液を得た。次いで、この水溶液を濃縮し、濃度が異なる４種の濃縮液試料（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を得た。また、前記（１）で得た抽出液を対照（ｅ）として用意した。
（３）プロポリス成分の含有量
上記（２）で得た４種の濃縮液試料（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および対照（ｅ）について、財団法人日本健康・栄養食品協会プロポリス食品規格基準（平成７年改定）を適用し、吸光光度法（λ＝４１５ｎｍ）を用い総フラボノイド量（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ当量）を測定した。その結果を表１に示す。
また、財団法人日本健康・栄養食品協会プロポリス食品規格基準（平成１３年改定）により、総フェノール酸量（ｐ−クマル酸当量）を測定した。その結果を表１に示す。
（４）ＤＰＰＨラジカル消去活性
上記（２）で得た４種の濃縮液試料（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および対照（ｅ）について、抗酸化活性を評価するためにこれらの様々な濃度のエタノール溶液を作製し、同量の６０マイクロモル／Ｌ濃度のＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）（和光純薬工業）エタノール溶液と混合し、３０分後の吸光度（λ＝５２０ｎｍ）を測定し、それぞれの試料のＤＰＰＨラジカル消去のＩＣ50値を求めた。その結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
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表１から４種の試料（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は総フラボノイド量および総フェノール酸量に依存してＤＰＰＨラジカル消去活性を示すことがわかる。
また、試料（ｄ）においては対照（ｅ）に相当する測定値が得られることがわかる。
【００４１】
実施例２
（１）プロポリス原塊抽出残渣からの脱有機溶剤
実施例１（１）で得たプロポリス原塊抽出残渣１質量部に対し、イオン交換水５質量部を加え、３０分間攪拌後遠心分離を行って、固形部分を分離し、その後、凍結乾燥し固形分を得た。
（２）プロポリス成分の含有量
上記（１）で得た凍結乾燥品（ｆ）およびプロポリス原塊３種（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）について、財団法人日本健康・栄養食品協会プロポリス食品規格基準（平成７年改定）を適用し、吸光光度法（λ＝４１５ｎｍ）を用い総フラボノイド量（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ当量）を測定した。その結果を表２に示す。
また、財団法人日本健康・栄養食品協会プロポリス食品規格基準（平成１３年改定）により、総フェノール酸量（ｐ−クマル酸当量）を測定した。その結果を表２に示す。
（３）ＤＰＰＨラジカル消去活性
上記（１）で得た凍結乾燥品（ｆ）およびプロポリス原塊３種（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）について、抗酸化活性を評価するためにこれらの様々な濃度のエタノール溶液を作製し、同量の６０マイクロモル／Ｌ濃度のＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）（和光純薬工業）エタノール溶液と混合し、３０分後の吸光度（λ＝５２０ｎｍ）を測定し、それぞれの試料のＤＰＰＨラジカル消去のＩＣ50値を求めた。その結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
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表２から、凍結乾燥品（ｆ）とプロポリス原塊３種（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）を比較すると、総フラボノイド量（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ当量）においてはプロポリス原塊の測定値に対し、６８〜６８６％の値を示した。
総フェノール酸量（ｐ−クマル酸当量）においてはプロポリス原塊の測定値に対し、７９〜２１１％の値を示した。
【００４３】
〈試料の分析〉
実施例１（２）で得た濃縮液試料（ｄ）、実施例２（１）で得た凍結乾燥品（ｆ）およびプロポリス原塊（ｉ）について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を行った。
ＨＰＬＣの測定条件は、下記のとおりである。
カラムＣＬＣ−ＯＤＳ（１５０×６．０ｍｍ，ｉ．ｄ．）、カラム温度４０℃、移動相はリニアグラジエント条件で開始時０．５％酢酸（和光純薬工業）−メタノール（和光純薬工業）（７０：３０ｖ／ｖ）から３０分後０．５％酢酸−メタノール（２０：８０ｖ／ｖ）３０分以降保持、分析時間５０分、流量１．０ｍＬ／分、測定波長λ＝２７５ｎｍである。試料（ｄ：試料量０．６ｇ）（ｆ：０．１ｇ）（ｉ：０．１ｇ）は、財団法人日本健康・栄養食品協会プロポリス食品規格基準（平成１３年改訂）により作製し、ザルトリウスミニザルト（０．４５μｍ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にてろ過後、ろ液１０μＬをＨＰＬＣ分析に用いた。
濃縮液試料（ｄ）と凍結乾燥商品（ｆ）およびプロポリス原塊（ｇ）のクロマトグラムをそれぞれ図１、図２および図３に示すと共にクロマトグラムの保持時間と対応する化合物名を表３に示す。
【００４４】
【表３】
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化合物名は、ａ：クロロゲン酸（ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ｃ：カフェー酸（ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ｄ：バニリン（ｖａｎｉｌｌｉｎ）、ｅ：ｐ−クマリン酸（ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ｆ：３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ｈ：３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ｏ：３，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシフラボノール（３，５，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−４’−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｏｌ）、ｐ：カエムフェロール（ｋａｅｍｐｈｅｒｏｌ）、ｑ：４−ヒドロキシ−３−プレニルケイ皮酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｐｒｅｎｙｌｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ｓ：クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）、ｕ：カエムフェライド（ｋａｅｍｐｈｅｒｉｄｅ）、ｚ：３，５−ジプレニル−４−ヒドロキシケイ皮酸（アーテピリンＣ）［３，５−ｄｉｐｒｅｎｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ａｒｔｅｐｉｌｌｉｎＣ）］である。
図１〜３のクロマトグラムより検出されるピークの保持時間は一致し、これらに対応するフラボノイド類やヒドロキシケイ皮酸誘導体類により抗酸化活性が発現するものと考えられる。
有機溶剤水溶液の濃縮液は、多種の抗酸化化合物を含むことが確認され、適当な濃度に調整することにより、例えば、食品用、化粧料用、飼料用などとして好適に用いることができる。
さらに、抽出残渣凍結乾燥粉末は、プロポリス原塊に匹敵する活性酸素消去能を有し、食品用、化粧料用、飼料用などとして好適に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の方法は、プロポリス原塊から有効成分を抽出した残渣を有効に利用するものであり、本発明の方法で得られた活性酸素消去剤は、人体に対する安全性が高く、かつ高い活性酸素・フリーラジカル消去能および抗酸化能を有し、例えば食品用、化粧料用、飼料用などとして好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】プロポリス原塊抽出残渣の加水処理により得られた有機溶剤水溶液の濃縮液試料の１例のクロマトグラムである。
【図２】プロポリス原塊抽出残渣の加水処理により得られた固形物の凍結乾燥品の１例のクロマトグラムである。
【図３】プロポリス原塊の１例のクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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