(57)【要約】【課題】  生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、十分に活性を備えた生体組織補填体を出荷することを可能にする。【解決手段】  培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量および細胞数を測定するステップＳ１，Ｓ２と、測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断するステップＳ３と、測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断するステップＳ４と、アルカリフォスタファーゼが所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップＳ５とを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量および細胞数を測定するステップと、
測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断するステップと、
測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断するステップと、
アルカリフォスタファーゼが所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法。
【請求項２】
培養された生体組織補填体に含まれるオステオカルシンの量を測定するステップと、
測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値より少ないと判断されたときに、測定されたオステオカルシンの量が所定値以上であるか否かを判断するステップと、
オステオカルシンの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える請求項１に記載の生体組織補填体の検査方法。
【請求項３】
細胞数の測定を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）の検出により行う請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の検査方法。
【請求項４】
培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量を測定するアルカリフォスタファーゼ量測定手段と、
前記生体組織補填体に含まれる細胞数を測定する細胞数測定手段と、
測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断する第１判断手段と、
測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断する第２判断手段と、
アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断する最終判断手段とを備える生体組織補填体の検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体組織補填体の検査方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
培養されている生体組織、例えば、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化しているか否かを示す指標として、従来より、骨芽細胞が分泌するアルカリフォスタファーゼおよびオステオカルシンが用いられている（例えば、非特許文献１参照。）。
アルカリフォスタファーゼの量は、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化する過程において経時的に上昇していくが、ある時点でピークを迎え、その後減少していくことが知られている。一方、オステオカルシンは、骨芽細胞が産生すると考えられており、その量は、アルカリフォスタファーゼに遅れて増加する。
【非特許文献１】吉川隆章、生体材料、vol.19、27-33、2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
その発生の時期の相違から、アルカリフォスタファーゼの量が減少しても、オステオカルシンの量が増加していることがあり、一概にアルカリフォスタファーゼの量のみによって骨芽細胞への十分な分化を判断することは困難である。また、オステオカルシンの量が十分に多い場合においても、細胞のいくつかが大量のオステオカルシンを産生しているに過ぎない場合もあり、生体組織補填体として十分な活性を備えているか否かを判断することが困難であった。
【０００４】
アルカリフォスタファーゼの量およびオステオカルシンの量の変化を経時的に測定していき、その変化の推移から、十分に活性を備えた生体組織補填体として最適な状態となる時点を推定して出荷することも考えられる。しかし、検査に要する時間、サンプル作製などの検査に要する費用を考慮すると現実的な手段ではない。
【０００５】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、十分に活性を備えた生体組織補填体を出荷することを可能にする生体組織補填体の検査方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量および細胞数を測定するステップと、測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断するステップと、測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断するステップと、アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。
【０００７】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の検査方法において、培養された生体組織補填体に含まれるオステオカルシンの量を測定するステップと、測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値より少ないと判断されたときに、測定されたオステオカルシンの量が所定値以上であるか否かを判断するステップと、オステオカルシンの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。
【０００８】
請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の検査方法において、細胞数の測定を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）の検出により行う生体組織補填体の検査方法を提供する。
【０００９】
請求項４に係る発明は、培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量を測定するアルカリフォスタファーゼ量測定手段と、前記生体組織補填体に含まれる細胞数を測定する細胞数測定手段と、測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断する第１判断手段と、測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断する第２判断手段と、アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断する最終判断手段とを備える生体組織補填体の検査装置を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
請求項１に係る発明によれば、アルカリフォスタファーゼの量に加えて細胞数が測定され、両者がそれぞれ所定値を超えたことを条件として培養を終了することが判断される。その結果、少ない数の細胞が大量のアルカリフォスタファーゼを分泌しているような場合を除外して、補填後に十分な骨形成作用を生じ得る生体組織補填体を出荷することが可能となる。
また、経時的な測定を行うことなく、出荷時等に短時間に判断することができるので、検査のコストや手間を省くことが可能となる。
【００１１】
請求項２に係る発明によれば、アルカリフォスタファーゼの量が少ない場合であっても、オステオカルシンの量が十分に多い場合には、細胞の活性が十分であると判断することができ、しかも、十分な数の細胞が存在しているために、補填後に十分な生体組織形成作用を生じ得る生体組織補填体を出荷することが可能となる。
請求項３に係る発明によれば、細胞数を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）の検出により簡易に測定することができる。
【００１２】
請求項４に係る発明によれば、アルカリフォスタファーゼ量測定手段の作動により、生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量が測定され、細胞数測定手段の作動により、生体組織補填体に含まれる細胞数が測定される。その後、第１判断手段により、アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かが判断されるとともに、第２判断手段の作動により、細胞数が所定値以上であるか否かが判断される。そして、最終判断手段により、アルカリフォスタファーゼの量のみならず、細胞数によって培養の終了が判断されるので、十分に活性を有し、補填された後にも生体組織形成作用を十分に発揮し得る生体組織補填体を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の検査方法および装置について図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法は、例えば、骨髄間葉系幹細胞をリン酸カルシウム多孔体のような生体組織補填材に付着させて所定期間培養した培養骨の検査方法である。この検査方法は、図１に示されるように、第１ステップＳ１から第６ステップＳ６までの６個のステップを備えている。第１ステップＳ１は、提供された培養骨に含まれるアルカリフォスタファーゼの量を測定する。第２ステップＳ２は、培養骨に含まれる細胞数を測定する。第３ステップＳ３は、アルカリフォスタファーゼの量が所定のしきい値Ａ１より大きいか否かを判断する。第４ステップＳ４は、アルカリフォスタファーゼの量が所定のしきい値Ａ１より大きいと判断された場合に、細胞数が所定のしきい値Ａ２より多いか否かを判断する。第５ステップＳ５は、細胞数が所定のしきい値Ａ２より多い場合に、出荷を許可するステップである。第６ステップＳ６は、アルカリフォスタファーゼの量がしきい値Ａ１より少ない場合および細胞数がしきい値Ａ２より少ない場合に出荷を禁止するステップである。
【００１４】
アルカリフォスタファーゼの量は、Ｐ−ニトロフェニルリン酸法（和光純薬）でＰ−ニトロフェノールの生成速度を測定することにより測定される。
細胞数は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）を検出することにより測定される。
しきい値Ａ１，Ａ２は、細胞の種類、適用条件等に応じて適宜設定されている。例えば、しきい値Ａ１は、２０ＩＵ／Ｌ／３７℃であり、しきい値Ａ２は、１０５個である。
【００１５】
このように構成された本実施形態に係る検査方法によれば、最終的な出荷の許可が、アルカリフォスタファーゼの量のみによって判断されるのではなく、細胞数が所定値以上含まれていることをも条件として判断されるので、より正確に培養骨の機能を評価することができる。すなわち、アルカリフォスタファーゼの量がしきい値Ａ１より多いことにより、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化していることが推測できるとともに、細胞数がしきい値Ａ２より多いことにより、補填後に十分な骨形成作用が発生することが推測できる。そして、アルカリフォスタファーゼの量の変化を経時的に測定するのではなく、比較的短時間の内にこのような判断を行うことができるので、検査に要するコストや手間を省くことができるという効果を奏する。
【００１６】
また、細胞数の測定にＭＴＴを使用しているので、ＣＣＫ（Cell Counting Kit）による場合のように、培養骨の分化過程において培養液中に使用されるアスコルビン酸等の影響を受けることが比較的少なく、精度よく測定することができる。
【００１７】
次に、本発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法は、図２に示されるように、提供された培養骨に含まれるオステオカルシンの量を測定する第７ステップＳ７と、オステオカルシンの量が所定のしきい値Ａ３より多いか否かを判断する第８ステップＳ８とをさらに備えている点で、第１の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法と相違している。
【００１８】
本実施形態に係る検査方法によれば、第３ステップＳ３において、アルカリフォスタファーゼの量がしきい値Ａ１より少ない場合には、第８ステップＳ８において、オステオカルシンの量がしきい値Ａ３より多いか否かが判断される。オステオカルシンの量がしきい値Ａ３より多いと判断された場合には、たとえ、アルカリフォスタファーゼの量が少ない場合であっても、骨芽細胞の活性が十分に高いと考えられるので、第４ステップＳ４に進んで細胞数がしきい値Ａ２より多いか否かが判断される。その結果、細胞数がしきい値Ａ２より多い場合には、ステップＳ５において出荷が許可され、オステオカルシンの量がしきい値Ａ３以下の場合、および細胞数がしきい値Ａ２以下の場合には、ステップＳ６において出荷が禁止されることになる。
【００１９】
オステオカルシンの量は、ＥＩＡ法によるオステオカルシン測定キット（タカラ・バイオ）により測定される。
しきい値Ａ３は、細胞の種類、適用条件等に応じて適宜設定されている。例えば、しきい値Ａ３は、１０ng/mlである。
【００２０】
したがって、最終的な出荷の許可が、アルカリフォスタファーゼの量による判断に加えて、オステオカルシンの量により判断されるとともに、細胞数が所定値以上含まれていることをも条件として判断されるので、より正確に培養骨の機能を評価することができる。
その結果、骨欠損部に補填された後に、十分な骨形成作用を生じ得る培養骨のみに対して出荷の許可が出されるので、高い性能の培養骨を提供することが可能となる。
【００２１】
図３に本実施形態に係る生体組織補填体の検査装置１を例示する。
この検査装置１は、培養された所定量の培養骨を投入されることにより、当該培養骨に対して、アルカリフォスタファーゼの量を測定するアルカリフォスタファーゼ量測定部２と、オステオカルシンの量を測定するオステオカルシン量測定部３と、細胞数を測定する細胞数測定部４と、これらの測定部２〜４から出力された測定結果に基づいて、上述した図１または図２の処理を施す判断部５とを備えている。判断部からの出力が検査装置から出力され、符号６に示すディスプレイのような表示部に表示されることになる。
その結果、迅速に出荷の可否が判断でき、出荷を禁止された培養骨に対しては、再度の培養等の処理が施されることになる。
【００２２】
なお、上記実施形態においては、生体組織補填体として、リン酸カルシウム多孔体に骨髄間葉系幹細胞を付着させた培養骨を採用したが、細胞を付着させる生体組織補填材としては、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウムの他、ハイドロキシアパタイトなどの他のリン酸カルシウム、コラーゲンやキチンなどの天然高分子材料、ポリ乳酸やε−カプロラクタンのような合成高分子材料、チタン合金やステンレス鋼３１６およびタンタル合金のような金属材料や金属繊維およびこれらの材料の少なくとも２種類以上の複合材などを採用してもよい。また、生体組織補填材に生着させる細胞としては骨髄細胞に含まれる間葉系幹細胞の他、末梢血、臍帯血から分離した間葉系幹細胞を用いて生体組織補填体を製造することにしてもよい。また、間葉系幹細胞に代えて、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞あるいは神経細胞等を採用してもよい。
また、自家細胞に限らず他家細胞でもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の検査方法を示すフローチャートである。
【図２】この発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法を示すフローチャートである。
【図３】この発明の検査方法を実施するための検査装置を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００２４】
Ｓ１  第１ステップ（アルカリフォスタファーゼの量を測定するステップ）
Ｓ２  第２ステップ（細胞数を測定するステップ）
Ｓ３  第３ステップ（アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断するステップ）
Ｓ４  第４ステップ（細胞数が所定値以上か否かを判断するステップ）
Ｓ５  第５ステップ（培養終了を判断するステップ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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