(57)【要約】【課題】画像歪みが低減され、性能が高い２次元表面プラズモン共鳴装置。【解決手段】チップ上の２５ｍｍ2以上の正方形領域からの反射像の歪みが４％以下である２次元表面プラズモン共鳴装置。受光手段の中に、歪みを低減する光学レンズを使用するのが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チップ上の金属薄膜面からの反射光を２次元で測定する受光手段を有している、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置において、反射像の歪みが４％以下となる領域を、少なくとも、チップ上で連続して２５ｍｍ2以上有することを特徴とする２次元表面プラズモン共鳴装置。
【請求項２】
縦方向のディストーションと横方向のディストーションの絶対値がどちらも０．５％以下である請求項１記載の装置。
【請求項３】
チップ上の同時測定可能なサンプル数が２５以上である請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の２次元表面プラズモン共鳴装置を用いて、チップ上の２５点以上のスポットを同時に測定することを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歪みおよびディストーションの低減され、マスク操作の容易な２次元表面プラズモン共鳴装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性物質間の相互作用を評価する試みが数多くなされている。その多くは一方の分子を固相に固定化し、その分子と分析対象物質（アナライト）に蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質を結合させ、ラベル物質を検出することで生体分子あるいは分子集合体間の相互作用を評価する方法が取られている。一般的なＤＮＡチップは蛍光などのラベル物質を用いて相互作用をスクリーニングする。しかし、ラベル操作は非常に煩雑であるとともに定量性に欠ける。また、相互作用をリアルタイムで観察するのは非常に困難である。
【０００３】
そこで、ラベルが不要でかつ定量性があり、リアルタイムで評価可能な分析方法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーが注目を集めている。ＳＰＲは分析体を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモーターし、サンプルとの相互作用を、共鳴角もしくは反射光強度の変化で測定する方法である。
【０００４】
一般的なＳＰＲセンサーにおいては、特許文献ｌにみられるように単一波長であるレーザー光を光源として用いる。レーザー光は直進性に優れており、光学研究には非常に使い易い光源である。しかし、光は一点に集中したビームであり、光の当たる部分の面積は非常に小さい。よって、相互作用を評価できる物質は基本的に一つであり、ＤＮＡチップのように複数の物質をスクリーニングすることは非常に難しい。
【０００５】
この問題を解決する手段として、ＮｅｌｓｏｎらはＳＰＲの光源としてハロゲンランプを採用し、その光源を凸レンズやピンホールを組み合わせた空間フィルタで平行光にして、偏光板を通したのち、ＳＰＲに適当な角度で入射させて、１８×１８ｍｍの金蒸着スライドに照射し、さらにその反射光を波長フィルタに通してからＣＣＤカメラで撮影した、いわゆる２次元表面プラズモン共鳴装置で複数の物質の同時測定を実現した（非特許文献１）。
【０００６】
しかし従来技術では、使用されているカメラ用レンズは、一般のＣＣＴＶレンズや凸レンズ１枚の単レンズ構成であるため、２次元撮影自体は可能であるが、レンズ収差に伴う球面収差、ディストーション、像面湾曲などによる歪みやピントずれ、さらには金属薄膜面を斜めから撮影していることも相まっての、いわゆる遠近効果による画像の台形上歪みやピントずれが発生するなど、目的の２次元ＳＰＲ画像は歪みが大きく、不鮮明である。
【０００７】
また、このような２次元表面プラズモン共鳴装置では、アナライトと相互作用をする物質をそれぞれ金薄膜上の予め決められた領域に固定化してスポットが形成されているので、各ＳＰＲシグナルを測定する場合は測定前に撮影した画像を基に、被測定物質ごとに観察したい領域を指定する、いわゆるマスク操作を行う必要がある。通常各スポットは同一形状、同一面積で、等間隔で配置されることが多いが、前記のように従来の技術では撮影された画像は歪みが大きく、原型を忠実に再現できていない。そのためマスク操作は等間隔処理による一括指定ができず、すべての領域をひとつひとつ指定していく必要があり、スポット数が多い場合は非常に煩雑であった。
【特許文献１】ＥＰ０３４１９２７Ａｌ
【特許文献２】ＷＯ９３／１４３９３
【非特許文献１】Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ．ａ１．Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，３９２８−３９３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、２次元表面プラズモン共鳴装置において、画像歪みを低減することで、マスク操作の等分割一括指定による簡便化、ＳＰＲシグナルのバラツキ低減、高密度なＳＰＲ同時測定などを可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．チップ上の金属薄膜面からの反射光を２次元で測定する受光手段を有している、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置において、反射像の歪みが４％以下となる領域を、少なくとも、チップ上で連続して２５ｍｍ2以上有することを特徴とする２次元表面プラズモン共鳴装置。
２．縦方向のディストーションと横方向のディストーションの絶対値がどちらも０．５％以下である１記載の装置。
３．チップ上の同時測定可能なサンプル数が２５以上である１．または２．に記載の装置。
４．  １．又は２．に記載の２次元表面プラズモン共鳴装置を用いて、チップ上の２５点以上のスポットを同時に測定することを特徴とする測定方法。
【００１０】
本発明の対象となるアレイは、多数のスポットからなるアレイである。スポット数は、少なくとも一方の辺が５個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは７個以上である。また、スポットの少ない辺であってもスポット数は４個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは６個以上である。
【００１１】
本発明のアレイは、通常測定領域において２５ｍｍ2程度以上の面積を有する。２５ｍｍ2程度とは、例えば約５ｍｍ×約５ｍｍの大きさを想定している。アレイ上の１つのスポットの大きさを０．３〜０．５ｍｍと仮定し、その間隔も０．３〜０．５ｍｍとすると、２５ｍｍ2程度の測定領域上に２５個（５個×５個；スポット０．５ｍｍ、間隔０．５ｍｍ）〜５０個程度以上（７個×７個〜８個×８個；スポット０．５ｍｍ、間隔０．５ｍｍ）のスポットにおいて測定が可能になる。このように多くのスポットを同時測定する場合、反射像の歪みが４％以下であれば、等間隔のマスク化及びそれによる処理の容易化を実現することができる。
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態を図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
図３に示すように、２次元プラズモン共鳴装置を構成するものとして、まずｐ波変調した平行光束を入射する手段であるが、この平行光の平行精度および光束内照度の均一性はＳＰＲの性能において重要である。そのためハロゲンランプを光源として、途中に凸レンズとピンホールを使用した、いわゆる空間フィルタを使用して生成する方式が好ましい。
【００１４】
次に金属薄膜面と被測定物質を２次元で接触させる手段であるが、光学プリズムと、金属薄膜がコートされた前記光学プリズムと同一の屈折率を有する光学スライドガラスを、それらと同一の屈折率を有するマッチングオイルを介して、金薄膜面とは反対側と接合し、さらに２次元の液空間が金属薄膜面との間に設けられるような凹部を有し、かつその液空間に接続された入出力ポートを有しているフローセルと、光学スライドガラスを接合する方式（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置）が好ましい。ただし、回折格子を金属表面に有しプリズムやマッチングオイルを必要としない方式（Ｗｏｏｄ配置）、プリズム底面と金属表面との間に空隙を設ける方式（Ｏｔｔｏ配置）も可能である。
【００１５】
本発明で使用する２次元の反射光強度を測定する手段としては、テレビカメラが好ましく、さらにはカメラの種類としては、単色を２次元に撮影できるものであれば、撮像管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳカメラのいずれでもよいが、経済性と性能の両面からＣＣＤカメラがより好ましい。カメラサイズや画素数は、レンズを含めた解像力が目的の金属薄膜面の解像度以上になるようにすれば、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明における、二次元の反射光すなわち反射像の歪みは４％以下であることが好ましく、さらには３％以下、特には２％以下が好ましい。歪みが少ない方がマスク操作は容易となるためである。歪みはチップ上の２５ｍｍ2以上の正方形領域からの反射像を図５に示す場所の距離を測定することで計算される。
歪み（％）＝（｜Ｌb−Ｌu｜／Ｌb）×１００          式（１）
Ｌu：最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌb：最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
チップ上の反射像の歪みが４％以下となる領域が２５ｍｍ2未満であると、アレイとしてスポットを並べる領域が狭くなり、一度に多くのサンプルを測定することができるという２次元表面プラズモン共鳴測定のメリットが生かしきれない場合がある。光学系においてはＳＰＲ現象を起こす入射角が必要であるため、反射像の撮影はチップの正面ではなく、斜め方向から行われる。その結果、像は長方形に近い形状となるが、そのアスペクト比は本発明では限定されない。
【００１７】
４％以下の歪みの意味を、計算を容易にするため、１０ｍｍ×１０ｍｍの領域の場合を例として以下に説明する。
【００１８】
歪みが４％以上ある場合は、１０ｍｍと１０ｍｍの領域（100mm2）を想定すると、上辺が１０ｍｍ、下辺が９．６ｍｍ（またはその逆）となる。この場合０．４ｍｍのずれが生じることになる。
【００１９】
チップ上のスポット１つの大きさを直径０．５ｍｍまたは１辺０．５ｍｍであると仮定すると（これ以上スポットが大きい場合、チップ上に十分な測定可能なスポット数が得られにくい）、歪みによりスポットの中心が０．２ｍｍずれると、スポットのオーバーラップする部分は０．３ｍｍになり、測定可能な限界であり、非常に小さいマスクを使用して初めて測定可能になる。
【００２０】
チップ上の１つのスポットの大きさ、スポットの間隔、歪みの対称性などにより、許容される歪みの割合が代わるが、反射像の歪みは４％以下であれば、多数のスポットを同時に測定可能であり、歪みが３％以下、さらに２％以下であれば、スポットの大きさ、スポット間隔、スポットの数などの種々の条件にかかわらず高精度に２次元表面プラズモン共鳴測定を行うことが可能である。一般にチップ上のスポットの大きさ、スポット間の間隔が小さくなればなるほど、歪みを小さくする必要がある。
【００２１】
反射像の歪みが４％以下となる領域は、好ましくは少なくとも４５ｍｍ2以上、さらに好ましくは７０ｍｍ2以上、特に好ましくは１００ｍｍ2以上である。
【００２２】
また、当該領域はチップ上で長方形または正方形であることが好ましく、アスペクト比が０．５以上、さらには０．６以上、特には０．７以上が好ましい。
【００２３】
さらに、該領域の面積の上限は特に定めるものではないが、１００００ｍｍ2（100mm×100mm）、さらには２５００ｍｍ2（50mm×50mm）である。
【００２４】
本発明において、縦方向のディストーションと横方向のディストーションの絶対値はどちらも０．５％以下である。これらのディストーションは図３に示したパラメータから計算される。
縦方向ディストーション（％）
＝（(Ｈm−（Ｈl＋Ｈr）／２)／Ｈm）×１００    式（２）
Ｈl：最左列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ
Ｈr：最右列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ
Ｈm：中央列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ（中央列がない場合は、中央に最も近い左右二つの列を選択し、平均を中央列とする）
横方向ディストーション（％）
＝（（Ｌm−（Ｌu＋Ｌb）／２）／Ｌm）×１００    式（３）
Ｌu：最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌb：最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌm：中央段の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ（中央段がない場合は、中央に最も近い上下２つの段を選択し、平均を中央段とする）
ディストーションが０．５％より大きい場合、歪みが少なくても、スポットの一部がマスクからずれ、正確な測定ができなくなるか、別途、手作業でマスク操作をする手間が必要になり好ましくない。
【００２５】
従来、２次元ＳＰＲでアレイの測定を行う場合、せいぜい数個のサンプル処理を同時に行う程度であったので、歪みないしディストーションが本発明の範囲外であっても、測定に問題がなく、単に見栄えの問題で歪みがない方がよいといった認識であった。一方、本発明のように多サンプル（多スポット）の系で２次元ＳＰＲによる同時測定を行う場合、歪み、ディストーションなどの数値が所定の範囲内にあることが決定的に重要である。
【００２６】
本発明を実現する手段として、カメラ用レンズに焦点距離の長いレンズを用い、遠くから撮像する場合、あおりレンズを用いる場合、等も挙げられるが、振動に対する影響の少なさ、光軸ずれなどに対する安定性、レンズのコンパクトさ、画像の明るさ、被写界深度の深さ等から、カメラ用レンズにテレセントリックレンズを用いる方法が最も好ましい。ここでいうテレセントリックレンズとは、焦点位置に絞りを設けることで、主光線が光軸と平行になるようなレンズをいい、その中でも物体側テレセントリック性能を有するものである。像側テレセントリック性能を有するレンズもあるが、本発明ではその効果は無関係であるため、その有無は問わない。また通常のカメラレンズであるＣＣＴＶレンズであっても、物体側テレセントリック性能を有するものは、これに該当する。
【００２７】
テレセントリックレンズの作動距離（ＷＤ）は、長ければ画像の歪み率は小さく、また被写界深度が大きい、良質な画像が得られるが、反面装置の寸法が大きくなるデメリットがある。そのためＷＤは特に限定するものではないが、５０〜２００ｍｍの範囲が好ましい。
【００２８】
また、被写界深度は、金属薄膜面の傾斜による距離差よりも大きいことが特に好ましいが、ＷＤが大きくなるデメリットもあるため、最低でも前記距離差の半分以上であることが好ましい。
【００２９】
ＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００３０】
本発明における表面プラズモン共鳴装置は、画像歪みが４％以下と少なく、ディストーションの絶対値は０．５％以下であり、かつ鮮明な画像が得られる、非常に性能の高い装置である。
【００３１】
本発明は、スポットの大きさ０．５ｍｍ、スポット間距離０．５ｍｍの条件下において歪み、ディストーションに要求される範囲を明らかにした。これにより、さらに小さいスポットの大きさ、スポット間距離を有するアレイの解析を行うことも可能になる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の効果により、画像歪みが低減され、性能が高い２次元表面プラズモン共鳴装置を実現した。今後、生体分子の相互作用のスクリーニングに広く用いられていくと期待する。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
光源にはハロゲンランプ（細渕電球社製）を用いた。光源から５０ｍｍの位置に直径３０ｍｍφ、焦点距離５０ｍｍの球面平凸レンズ（シグマ光機社製ＳＬＳＱ３０−５０Ｐ）をレンズの平面側をランプに向けて設置し、光源からの光を平行光とした。前記球面平凸レンズからさらに３５ｍｍ離して、さらにもう一つ直径３０ｍｍφ、焦点距離５０ｍｍの球面平凸レンズ（シグマ光機社製ＳＬＳＱ３０−５０Ｐ）の球面側を光源に向けて設置した。この球面平凸レンズによってレンズから５０ｍｍの位置に集光され、その位置に直径２００μｍのピンホール(シグマ光機社製ＰＡ−２００)を置いて光束をピンホールに通し、球面アロマティックレンズ（シグマ光機製ＤＬＢ−３０−５０ＰＭ）によって平行光とした後、有効径２４ｍｍφの近赤外偏光フィルタ（シグマ光機社製ＳＰＦＮ−３０Ｃ−２６）によって２４ｍｍφの偏光平行光束を得た。この偏光平行光束は広範囲の領域を照射可能である。
【００３４】
１８ｍｍ四方で厚さ２ｍｍのＬａｋ１０スライド（ｎD＝１．７２０、松浪硝子工業社製）に３ｎｍクロムと４５ｎｍの金を蒸着した。末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた溶液を調製し、金蒸着スライドを３時間浸漬し、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００３５】
４ａｒｍＰＥＧの分子量は１０，０００であり、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基となっており、金に対する金属結合'性を示す。
【００３６】
このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは透明な水晶上にクロムがパターン化されており、直径０．５ｍｍのクロムの貫通孔が１００個あいており、穴があいている部分でＵＶ光が透過してスライドに照射される。
【００３７】
次に、７−カルボキシヘプタンチオール（７−ＣＨＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭエタノール溶液を調製し、前記金蒸着スライドを浸漬し、ＵＶ照射部に７−ＣＨＴを吸着させ、パターン化チップを得た。このパターン化チップをテスト用チップ１として以下に用いた。
【００３８】
テスト用チップ１のガラス面にマッチングオイル（カーギル社製Ｍシリーズ、ｎD＝１．７２０）をつけ、一辺２５ｍｍの６０°分散プリズム（Ｏｒｉｅｌ社製４６１０６）と接触させ、本発明のＳＰＲ装置の偏光平行光束を導入した。テスト用チップの金蒸着面には水を接触させた。
【００３９】
金からの反射光束を８３０ｎｍの光干渉フィルタ（シグマ光機社製ＶＰＦ−２５Ｃ−１０−４５−８３０００）によって８３０ｎｍ近傍の波長光を取り出し、テレセントリック系ＣＣＴＶレンズ（モリテックス社製ＭＴＥ−５５）により、完全な平行光のみを取り出してから、白黒ＣＣＤカメラ（東京電子工業社製ＣＳ８３３０Ｂ）で撮影した。装置の概要は図２に示す。
【００４０】
観察した２次元表面プラズモン共鳴画像を図４に示す。カメラを９０°回転して設置しているため、画像も９０°回転して撮影されており、画像上が金薄膜面では遠方側に相当する。そこで画面の上部のスポット間隔と画面下部のスポット間隔を比較すると、遠近効果による像の歪みを計算でき、その値は０．００％となり、前記遠近効果では歪みの生じない像が得られ、歪みは４％以下であった。
ここで歪み計算は以下の計算式を使用した。各パラメータの計測地点は図３に示す。
歪み（％）＝（｜Ｌb−Ｌu｜／Ｌb）×１００      式（１）
Ｌu：最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌb：最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
さらにレンズ収差によるディストーション（歪曲）を計算するため、画面縦方向、および画面横方向それぞれについて、端部の間隔の平均と、中心部の間隔を比較すると、縦方向は−０．１２％、横方向は＋０．２５％と、中心部分の変形が±０．５％以内に収まり、ほとんど歪んでいない像が得られた。ここで歪みの計算は以下の計算式を使用した。
縦方向ディストーション（％）
＝（(Ｈm−（Ｈl＋Ｈr）／２)／Ｈm）×１００      式（２）
Ｈl：最左列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ
Ｈr：最右列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ
Ｈm：中央列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ（中央列がない場合は、中央に最も近い左右二つの列を選択し、平均を中央列とする）
横方向ディストーション（％）
＝（（Ｌm−（Ｌu＋Ｌb）／２）／Ｌm）×１００      式（３）
Ｌu：最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌb：最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌm：中央段の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ（中央段がない場合は、中央に最も近い上下２つの段を選択し、平均を中央段とする）
得られた画像の左上端スポットと、左下端スポットと、右上端スポットの３箇所を指定して、その間は縦および横を９等分に分割するように、マスク設定した画像を図５に示す。これにより、１０×１０の１００点スポットにおいても、わずか３点の位置指定で、１００点すべてのマスクが位置ずれ無く指定することができた。これらを総合すると、画像の歪みがほとんど生じない、そのためマスク指定も非常に簡便な２次元表面プラズモン共鳴装置を実現できた。
［比較例］
従来の方法の１例として、投光手段および接液手段は実施例と同様の構成で、受光手段のカメラレンズをテレセントリックレンズの代わりに、球面アロマティック凸レンズ（ダブレット凸レンズ）の単レンズ構成のレンズを使用したときの結果を示す。
【００４１】
前記実施例１と同様に、テストチップ１を観察した２次元表面プラズモン共鳴画像を図６に示す。同様に画面の上部のスポット間隔と画面下部のスポット間隔を比較すると、遠近効果による像の歪みを計算でき、その値は４．８％となり、画面上つまり遠方側が小さくなっている台形上の大きな歪みが生じていることが判る。
【００４２】
さらに実施例１と同様に、レンズ収差によるディストーション（歪曲）を計算するため、画面縦方向、および画面横方向それぞれについて、端部の間隔の平均と、中心部の間隔を比較すると、縦方向は１．４２％、横方向は０．７６％と、±０．５％以上になり、大きく歪んでいることが判る。ここで横方向のディストーション計算時には、一旦前記遠近効果による歪み４．８％を考慮して、長さＢ（中央段の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ）は、＋２．４％、長さＡ(最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ）は＋４．８％の補正を実施してから計算した。
【００４３】
また、得られた画像の左上端スポットと、左下端スポットと、右下端スポットの３箇所を指定して、その間は縦および横を９等分に分割するように、マスク設定した画像を図７に示す。これにより、等間隔による簡易の３箇所スポット設定では大きくマスクがずれ、実用できないことが判る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例・比較例で用いた１００穴フォトマスク
【図２】２次元表面ブラズモン共鳴装置の概観図
【図３】歪みおよびディストーションを計算する際の計測場所
【図４】実施例における観察画像１
【図５】実施例における等間隔マスク処理
【図６】比較例における観察画像１
【図７】比較例における等間隔マスク処理
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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