(57)【要約】【課題】ヒト外陰腟炎の予防および治療方法の研究開発に際して、臨床症状を発現する利用価値の高い病態モデル動物を提供する【解決手段】用具により動物が外陰部を舐めることを妨げ、それによって臨床症状を発現する外陰腟炎の病態モデル動物を作成する【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
用具により動物が外陰部を舐めることを妨げ、それによって作成した臨床症状を発現することを特徴とする外陰腟炎モデル動物
【請求項２】
請求項１における動物がマウスであることを特徴とする外陰腟炎モデル動物
【請求項３】
請求項１における用具がコルセットタイプの用具であることを特徴とする外陰腟炎モデル動物
【請求項４】
請求項１における外陰腟炎が微生物に因るものであることを特徴とする外陰腟炎モデル動物
【請求項５】
請求項４における微生物がカンジダ菌であることを特徴とする外陰腟炎モデル動物
【請求項６】
請求項１における外陰腟炎がアレルギーに因るものであることを特徴とする外陰腟炎モデル動物
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は女性の外陰腟炎の予防および治療方法を研究開発する際に必要とされる外陰腟炎モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】  外陰腟炎は女性にしばしばみられる炎症であり、外陰部や腟の強い掻痒感、発赤、腫脹などを主要な臨床症状とする。原因としては感染性と非感染性要因（代謝・内分泌疾患、アレルギー、妊娠など）に分けられ、感染性はさらに特異な病原菌（カンジダ、トリコモナス、淋菌、ウイルスなど）の感染による特異的炎症と非特異的な病原菌（ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、嫌気性菌など）の感染による非特異的炎症とに分類される。病原菌の中ではカンジダ菌に因るものが最も多く、欧米では女性が一生に一度は罹るといわれているほど普通の疾患であり、日本においても同様である。外陰腟炎を引き起こすカンジダ菌は病原性カンジダと総称されて数種類が知られ、そのうちカンジダ・アルビカンスに因るものが最も多い。しかしながら近年、従来の薬剤による治療では完治し難いカンジダ・アルビカンス以外のカンジダ菌による外陰腟炎、またカンジダ・アルビカンスを起因菌としながらも再発を繰り返す反復性患者の増加が問題となっている。とくに女性用ナプキンの普及に伴ってカンジダ性外陰腟炎はますます増加し、その予防や治療法の開発が急務となっている。また真菌類以外の病原菌による外陰腟炎についても増加傾向にある。非感染性の外陰腟炎としては、糖尿病や肝炎などの全身性疾患に続発するもの、皮膚アレルギーなどの局所疾患に伴うもの、妊娠に伴うものなどが知られており、感染性に比較して頻度は低いものの決して少ない患者数ではない。以上の状況から外陰腟炎の新しい治療法の開発が強く求められている。【０００３】  実用に結び付く治療法の開発を精度よく効率的に進めるためにはヒトの病態をよく反映したモデル動物の利用が不可欠である。感染性の腟炎に関しては、例えば腟カンジダ症モデル動物の作成について、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、第１７３巻、第４２５乃至４３１頁、１９９６年、に掲載されたフィデル、カットライト、ソーベル（Ｆｉｄｅｌ  ＰＬ  Ｊｒ，Ｃｕｔｒｉｇｈｔ  ＪＬ，Ｓｏｂｅｌ  ＪＤ）らのマウスを用いたモデルの報告などがある。しかしながらこれら方法では接種したカンジダ菌は増殖するものの、ヒト患者にみられる外陰部の炎症は発現しない。ヒトでは腟からカンジダ菌が検出されても炎症が認められない場合も多く、その場合は疾病とは診断せず、とくに治療を加えることはしない。すなわち今までの腟カンジダ症モデルは、接種した菌の増殖は認められるもののヒトの病態を十分反映したものではなかった。原虫や細菌による外陰腟炎についても症状が発現する動物モデルについての報告は無い。また非感染性の外陰腟炎についても炎症が発現する動物モデルについての報告は無い。すなわち予防法や治療法の開発に必要な臨床症状を発現した外陰腟炎のモデル動物はこれまで開発されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明の課題はヒトの病態に近似した臨床症状を伴う外陰腟炎モデル動物の作成にある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  感染性の外陰腟炎モデルの作成において、従来の技術である動物への女性ホルモン投与と腟への起因菌接種に加えて、用具を用いて動物が外陰部を舐めることを妨げ、それによって確実に起因菌が増殖し、起因菌がカンジダ菌の場合はヒト外陰腟炎にしばしばみられる白帯下を伴った分泌物が滲みでることを見出した。非感染性のアレルギー性外陰腟炎モデルについては、従来の技術である動物の外陰部皮膚への薬剤塗布による感作とその後の薬剤再塗布による炎症発現に加え、用具を用いて動物が外陰部を舐めることを妨げ、それによって局所の腫脹が進展し、炎症の判別が容易になることを見出した。以上の新たな知見を基に本発明を完成するに至った。【０００６】  従来の技術で外陰腟炎モデル動物の作成を試み、マウスの腟にカンジダ菌を接種したところ、菌が腟内に継続して存在することは確認できるものの、外陰部は健常マウスと変わらずきれいな状態に保たれていた。すなわち従来技術で作成したモデル動物はヒトの外陰腟炎モデルとしては著しく不充分な段階に留まっていた。【０００７】  そこでマウスをつぶさに観察したところ、カンジダ菌接種後に外陰部をしばしば舐める行為が認められた。唾液には抗菌物質の存在も知られており、舐める行為により外陰部や腟が洗浄され、接種されたカンジダ菌の増殖が妨げられて症状が発現しなかった可能性が示唆された。そこで市販の動物実験用首輪（マウス用ネックレス；夏目製作所）に工夫を加えてマウスに装着し、再度同様の実験を試みた。市販の首輪は、マウスが脚で耳などを擦らないようにするための用具で、そのまま装着しても外陰部を舐めてしまう。そこでさらに首輪の周囲に整形した薄いプラスチック板を張り付け、マウスが外陰部を舐めることを妨げた。その結果、外陰部は汚れて白帯を含んだ分泌液が滲み出る個体が観察され、腟内のカンジダ菌についても増殖が認められた。すなわち用具の使用によって利用価値の高い病態モデルの作成可能性が認められた。しかしながら市販の首輪はマウスが外してしまう場合がしばしばあり、安定した病態の発現に問題があった。そこで外れる心配のないコルセットタイプの用具を新たに工夫して完成度の高い病態モデルの作成に結びつけた。【０００８】  また非感染性のアレルギー性外陰腟炎については以下の手順によりモデル動物の作成を試みた。すなわち塩化ピクリルをマウスの外陰部に塗布して感作させ、そこに再度薬剤を塗布するとアレルギー性炎症が惹起される。以上は従来技術の応用である。しかしながらコルセットタイプの用具をマウスに装着して同様の実験を行うと、局所の腫脹が一層進展し炎症の判別が容易になることが認められた。すなわち非感染性の外陰腟炎モデルについてもコルセット装着の効果は明らかであり、その使用によって完成度の高い病態モデルの作成に結びつけることができた。
【発明の効果】
【０００９】  本発明は、用具により動物が外陰部を舐めることを妨げ、それによって作成した臨床症状を発現する外陰腟炎モデル動物に関するものである。本モデル動物は従来技術によるモデル動物に比較して、はるかにヒトの病態に近似しており、外陰腟炎の予防や治療方法の研究開発を進める上で利用価値が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明の特徴は、用具により動物が外陰部を舐めることを妨げ、それによって作成したより利用価値の高い感染性または非感染性の外陰腟炎のモデル動物の作成にある。すなわち用具の使用により、感染性の場合は起因微生物を増殖させ、白帯下状の臨床症状を伴う外陰腟炎のモデル動物を作成することができる。非感染性のアレルギーの場合は炎症を促進させ、それによって強い腫脹を伴う外陰腟炎のモデル動物を作成することができる。本モデル動物は、従来技術により作成したモデル動物に比較してはるかにヒトの病態に近似しており、外陰腟炎の予防や治療方法を研究開発する上で利用価値が高い。【００１１】  本発明に用いることのできる動物としてはマウスに限定されず、ラット、モルモットなども使用可能である。【００１２】  本発明に用いることのできる用具としては首輪やコルセットに限定されず、動物が外陰部を舐める行動を妨げるものであれば使用可能である。またコルセットの動物への装着法についても、実施例に記載したコンベックスやビニールテープによる方法に限定されず、コルセットが動物に外されることなく継続して装着され、かつ動物の行動を過度に妨げない方法であれば使用可能である。【００１３】  本発明に用いることのできる微生物としてはカンジダ菌や細菌に限定されず、外陰腟炎を起こす原虫などの微生物さらにはウイルスなども使用可能である。
【実施例】
【００１４】  本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００１５】実施例１．カンジダ性外陰腟炎モデルマウスの作成【００１６】１．動物
ＩＣＲマウス（雌、６週齢）を日本チャールスリバー（株）（神奈川）より購入し、実験に供した。【００１７】２．女性ホルモン
エストラジオール（シグマ化学株式社）を用い、投与量はマウス１匹当たり０．５ｍｇに設定した。すなわちエストラジオール２５ｍｇを１０ｍｌのオリーブ油（シグマ化学株式会社）に溶解し、マウス１匹当たり０．２ｍｌを皮下に注射した。【００１８】３．カンジダ菌
帝京大学医真菌研究センターに保存されている臨床分離株であるカンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ２６４０株を用いた。同菌株を０．５％イーストエキス（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を含むサブロー・グルコース培地（ベクトン・ディッキンソン株式会社）で培養後、１０％量のグリセリンを加えて−８０℃で凍結し、そのまま使用時まで保存したものを種菌とした。種菌をカンジダＧＳ培地平板（栄研化学株式会社）に接種し（培地平板１枚当たり５０μｌ）、３７℃、２４時間培養して増殖したカンジダ菌を回収し、生理食塩水に懸濁して菌数を１×１０７個／ｍｌに調整した。本菌液１０μｌをマウス腟内に接種した（マウス１匹当たり１×１０５個）。なお、菌数測定はセルタック（日本電子株式会社）により行った。【００１９】４．コルセット
試験に用いたコルセットを図１に示す。アクリル製の筒の上に先端に輪を形成した針金をビニールテープで固定し、さらにその輪にコンベックスを通してコルセットを作製した。マウスをエーテルで麻酔し、その胴を筒に納め、コンベックスを腰の上で締めて装着した。【００２０】５．抗真菌剤
市販フルコナゾール（ファイザー製薬株式会社）５０ｍｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解し、それを飲水として自由摂取させて供与した。【００２１】６．マウス腟洗浄液中のカンジダ菌数の測定
マウスの腟を生理食塩水１００μｌで洗浄した。その洗浄液を１０倍づつ連続して希釈し、それぞれの希釈液５０μｌをカンジダＧＳ培地平板（栄研化学株式会社）に接種して、３７℃、２０時間培養した。形成されたカンジダ菌のコロニー数（ＣＦＵ）を計測し、その数から元の洗浄液の菌数を計算した。【２２】７．    マウスに対する感染実験
マウス１９匹を３群に分け、第１群（６匹）はコルセットを装着せず（従来法）、第２群（８匹）および第３群（５匹）にはコルセットを装着させ、第３群にはさらにフルコナゾールを投与した。女性ホルモン投与およびカンジダ菌接種はすべてのマウスに実施した。接種前４日目にコルセットを装着させ、翌日エストラジオールを投与した。カンジダ菌の接種は、菌液１０μｌを細いゴムチューブでマウス腟内へ挿入することにより行った。接種後４日目に再度エストラジオールを投与した。カンジダ菌接種後７日目に評価を行った。すなわち外陰部・腟周辺の臨床症状を観察し、その後生理食塩水により腟洗浄を行った。洗浄液は回収してその中のカンジダ菌数の計測に供した。なお飼育環境の明暗周期はそれぞれ１日１２時間とし、温度は２１℃に設定した。また飼料および飲水の摂取は自由とした。【００２３】８．結果
外陰部・腟周辺の状態については、第１群（コルセットなし）および第３群（コルセットあり、フルコナゾール投与）においては健常なマウスのそれと変わらなかったが、第２群（コルセットあり）においてはその部位は汚れ、個体によっては白帯を含んだ分泌液が滲み出ていた。また腟洗浄液中のカンジダ菌数については、第１群においては１例のみ高い菌数を検出したが、それ以外は菌数が低く、個体によっては菌が検出されなかった。第２群においては全例に高い菌数を認めた。第３群においては全例に菌が検出されなかった。腟洗浄液中のカンジダ菌数についての結果を図２に示す。また本実施例は、本発明のモデルマウスを用いて市販抗真菌剤フルコナゾールの治療効果を評価したものともいえる。その結果、外陰部・腟周辺の状態、腟内のカンジダ菌数、いずれの項目についてもフルコナゾールの治療効果が確認された。【００２４】  実施例２．細菌性外陰腟炎モデルマウスの作成【００２５】１．動物
実施例１と同様。【００２６】２．女性ホルモン
実施例１と同様。【００２７】３．ステロイドホルモン
プレドニゾロン注射液「ミタカ」（三鷹製薬株式会社）をそのまま用いた。投与量はマウス体重１ｋｇ当たり１０ｍｌに設定し、皮下に注射した。【００２８】４．起因細菌
飼育期間３カ月のマウス（ＩＣＲ、雌、購入時６週齢）より糞便を採取し、約４倍の生理食塩水を加えて均質化し接種用の菌液とした。この菌液５０μｌをクロモアガー平板に接種し、３７℃、２４時間および４８時間培養した。クロモアガーはカンジダ菌などの真菌類が選択的に生育する培地であるが、いずれの時間においてもコロニーは観察されなかった。この結果は使用した菌液にはカンジダなどの真菌類は存在せず、菌液による感染は専ら常在細菌または非特異的な細菌によるものであることを意味している。【００２９】５．コルセット
マウスをエーテルにより麻酔してコルセットに上半身を通した後、ビニールテープをコルセットに巻き付け腹部に固定した。その際、ビニールテープの幅の約半分をコルセットの外に出してテープを伸ばしながら強く巻き付けてゆく。するとコルセットの外のビニールテープの外周が絞られ、それによってコルセットはマウス腹部に固定される。【００３０】６．マウスに対する感染実験
マウス６匹を２群に分け、対照群（３匹）はコルセットを装着せず、試験群（３匹）にはコルセットを装着させた。菌液接種前４日目にコルセットを装着し、翌日エストラジオールおよびプレドニゾロンを投与した。菌液の接種は、１０μｌを濾紙片（５×２ｍｍ）に吸収させピンセットで腟内に挿入しておこなった。菌液接種、エストラジオールおよびプレドニゾロンの投与は全てのマウスに実施した。飼育条件は実施例１と同様にした。【００３１】７．結果
菌液接種３日目に観察すると試験群のマウスはいずれも外陰部は汚れ、腟からは浸出液が滲み出ていた。一方対照群のマウスはいずれも外陰部はきれいに保たれており、とくに異常は認められなかった。【００３２】実施例３．アレルギー性外陰腟炎モデルマウスの作成【００３３】１．動物
実施例１と同様。【００３４】２．コルセット
実施例２と同様。【００３５】３．塩化ピクリル
市販塩化ピクリル（２，４，６−トリニトロクロロベンゼン、東京化成工業株式会社）をアセトンまたはオリーブ油に１％濃度に溶解し供試した。後者の場合、予め１０％アセトン溶液を調製し、それに所定濃度になるようオリーブ油を加えてよく撹拌し、アセトンを蒸発させてから供試した。【００３６】４．塩化ピクリル塗布
マウス６匹を塗布前日に全匹コルセットを装着し、翌日最初の塩化ピクリル塗布を実施した。まず除毛クリーム（マイケア除毛クリーム、カネボウ株式会社）をマウス下腹部と大腿部内側に塗ってよく擦り込み、５分後、温水でクリームと抜け毛を洗い落とした。数時間後、最初の塩化ピクリル塗布を実施した。すなわちマウス１匹当たり１％アセトン溶液１００μｌを下腹部中心に塗布した。１週間後、２回目の塩化ピクリル塗布を実施した。すなわち１％オリーブ油溶液を市販綿棒を用いて外陰部を中心に塗布した。１匹当たりの平均塗布重量は約１４ｍｇであった。塗布直後、対照群（３匹）はコルセットを外し、試験群（３匹）は着用を継続した。２４時間および４８時間後に各マウスの外陰部を観察した。飼育条件は実施例１と同様とした。【００３７】５．結果
両群ともに外陰部の腫脹は認められたが、対照群が外陰部の形状が見分けられる程度に留まったのに対し、試験群は外陰部から肛門に至るまで一様に強く腫脹し、器官の形状が見分けられなかった。この結果は、コルセットの使用により外陰部の炎症が重症化したことを意味しており、アレルギー性外陰腟炎モデルの作成においても本発明の有用性が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】  実施例１において用いたコルセットの図である。アクリル製の筒（内径２ｍｍ、長さ２５ｍｍ、厚さ２ｍｍ）の上に先端に輪を形成した針金をビニールテープで固定し、さらにその輪にコンベックスを通してコルセットを作製した。エーテル麻酔の後、マウスの胴を筒に納め、コンベックスを腰の上で締めて装着した。
【００３９】
【図２】  実施例１におけるマウス腟洗浄液中のカンジダ菌数についてのグラフである。カンジダ菌数（ＣＦＵ）は培地平板上のコロニー数より計算した。第１群（コルセットなし）においては１例のみ高い菌数を検出したが、それ以外は菌数が低く、個体によっては菌が検出されなかった。第２群（コルセットあり）においては全例に高い菌数を認めた。第３群（コルセットあり、フルコナゾール投与）においては全例において菌が検出されなかった。
【図１】
2005095125.tif 000002
【図２】
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