(57)【要約】【課題】  MRSAは黄色ブドウ球菌の治療薬であるβラクタム系抗菌剤に耐性を獲得したもので、国内では1980年代に報告され、また近年は多剤耐性MRSAが主流となり、院内感染は多くの病院において大きな問題となっている。  抗MRSA活性を有し、既存薬と異なる骨格や作用機序を有する化合物は新たな抗菌薬として有用である。  従来、MRSAに対する薬剤としてはバンコマイシンが使われているが、最近ではバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）も報告されるなど耐性菌が発生していることから、他の薬剤が望まれていた。  本発明の目的は、MRSAおよびＶＲＥに対する阻害活性を有する新規な生理活性物質を提供することにある。【解決手段】式【化１】2005336088.tif 000011[式中、Ｒは式【化２】2005336088.tif 000012で示される基、またはアミノ基を示す。]で示されるチアゾール系化合物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2005336088.tif 000009
[式中、Ｒは式
【化２】
2005336088.tif 000010
で示される基、またはアミノ基を示す。]で示されるチアゾール系化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下MRSA）活性および抗バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）活性を有する新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
MRSAは黄色ブドウ球菌の治療薬であるβラクタム系抗菌剤に耐性を獲得したもので、国内では1980年代に報告されている。近年では多剤耐性MRSAが主流となり、院内感染は多くの病院において大きな問題となっている。
【０００３】
抗MRSA活性を有し、既存薬と異なる骨格や作用機序を有する化合物は新たな抗菌薬として有用である。
【０００４】
従来、MRSAに対する薬剤としてはバンコマイシンが使われているが、最近ではバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）も報告されるなど耐性菌が発生していることから、他の薬剤が望まれていた。
【０００５】
従来、抗菌作用を有するチアゾール系化合物としてはノシヘプチド(Nosiheptide)が知られている（非特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】K. Umemuraら  Bull. Chem. Soc. Jpn., 71, 1391-1396 (1998).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、MRSAおよびＶＲＥに対する阻害活性を有する新規な生理活性物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的達成のために多数の菌株を土壌および植物より分離し、その菌株の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株の産生する化合物がMRSAおよびＶＲＥに対して強い阻害活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、式
【００１０】
【化１】
2005336088.tif 000002
【００１１】
[式中、Ｒは式
【００１２】
【化２】
2005336088.tif 000003
【００１３】
で示される基、またはアミノ基を示す。]で示される、チアゾール系化合物である。
【００１４】
以下、Ｒが式
【００１５】
【化３】
2005336088.tif 000004
【００１６】
で示される基の化合物をWSS2258、Ｒがアミノ基の化合物をWSS2260とする。
【００１７】
WSS2258及びWSS2260を産生する菌株は、本発明者らが中国、雲南省の土壌より分離した放線菌であり、本菌株は受領番号FERM AP-20003として独立行政法人産業技術総合研究所に受託されている。
【００１８】
以下に菌学的性状を示す。
Ａ．形態的性質
基生菌糸はよく生育し分岐しているが、分断は見られない。気菌糸は形成せず、基生菌糸より短い菌糸が立ち上がり、その先端に胞子嚢を形成する。胞子嚢は球状および亜球状で、その表面はしわ状、大きさは４〜１０μｍ程度である。また、成熟した胞子嚢から放出された胞子の大きさは、１〜１．５μｍ程度である。
【００１９】
Ｂ．培養的性質
各種培地上で、２８℃、３週間培養した場合の肉眼的観察結果を次の表１に示す。なお色の表示は日本規格協会、ＪＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引用した。
【００２０】
【表１】
2005336088.tif 000005
【００２１】
Ｃ．生理学的性質
(1)  生育温度範囲
・生育温度範囲    ：１８〜３２℃
・最適生育温度範囲：２５〜２８℃
(2)メラニン様色素産生：無し
(3)炭素源の利用能
プリドハム・ゴトリーブ培地上で３０℃、２週間培養した場合の肉眼的観察結果を表２に示す。なお、表中「＋」は生育、「ｗ」は弱く生育を示す。
【００２２】
【表２】
2005336088.tif 000006
【００２３】
Ｄ．化学分類学的性質
菌体成分細胞壁からは、meso-ジアミノピメリン酸およびグリシンが検出され、細胞壁タイプはII型である。全菌体糖成分はアラビノースが検出され、糖パターンはＤ型である。主要メナキノンとしてＭＫ９（Ｈ４）を有している。リン脂質パターンは、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のみを有するＰII型である。
【００２４】
Ｅ．１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に基づく系統解析
本菌の１６ＳｒＤＮＡ領域の部分塩基配列を決定し、データベース検索（ＤＤＢＪ；DNA Database bank of Japan）の結果、９８％以上の相同性が確認されたのはアクチノプラネス（Actinoplanes）属のみであった。
【００２５】
以上の結果をもとに、放線菌の分離と同定（日本放線菌学会編、２００１年）に従い同定を行った結果、本菌株はアクチノプラネス属に属する放線菌に分類することが妥当であり、本菌株をアクチノプラネス・エスピーＴＡ０４５５(Actinoplanes sp.TA0455)と命名した。
【００２６】
WSS2258及びWSS2260の生産は大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地でTA0455株を好気的条件下で培養することにより行う。
【００２７】
培地は主として液体培地を用い、炭素源、窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先駆物質および消泡剤を加えることができ、pHは7前後に調製する。炭素源としては、例えばグルコース、シュウクロース、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまたは混合して用いる。窒素源としては、例えば肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コーン・スティープ・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独または混合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを、単独または混合して用いる。消泡剤としてはアデカノール、シリコン化合物などを用いることができる。
【００２８】
培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気的培養が適しており、pH 4〜10、25〜35℃で2〜5日間、望ましくはpH 6〜7、25〜28℃で4日間培養する。
【００２９】
本発明の化合物は、発酵生産物について一般的な方法で精製を行うことにより得られる。すなわち、培養終了後、遠心分離または濾過により培養濾液を得、ダイヤイオンHP-20（商品名、三菱化学社製）などのポリスチレン樹脂に吸着させた後、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。菌体は低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出する。次いでこの菌体抽出液および吸着樹脂からの溶出液を合わせて減圧濃縮し、有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ブタノールなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび逆層分配用ODSを充填したカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーに伏すことにより本発明化合物を精製単離することができる。
【００３０】
以上の方法によって得られたWSS2258及びWSS2260は、その分子量、紫外線吸収スペクトル、1H-NMRスペクトル、13C-NMRスペクトル等の解析により、上記構造が決定された。
【００３１】
WSS2258の理化学的性状は以下の通りである。
(a). 外観：黄色粉末
(b). 分子量：1206
(c). 分子式：C51H43N13O11S6
(d). HR-TOFマススペクトル
実測値：1206.1625
理論値：1206.1608 (C51H43N13O11S6として計算)
(e). 1H-NMRスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、500 MHzで測定した結果を図１に示す。
(f). 13C-NMRスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、125 MHzで測定した結果を図２に示す。
(g). 溶剤に対する溶解性：
ジメチルスルホキシド、クロロホルムに可溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
(h). 塩基性、酸性、中性の区別：中性
【００３２】
WSS2260の理化学的性状は以下の通りである。
(a). 外観：黄色粉末
(b). 分子量：1137
(c). 分子式：C48H40N12O10S6
(d). HR-TOFマススペクトル
実測値：1137.1375
理論値：1137.1393 (C48H41N12O10S6として計算)
(e). 比旋光度：[α]D25 : 80.91(c 0.26, CHCl3)
(f). 1H-NMRスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、500 MHzで測定した結果を図１に示す。
(g). 13C-NMRスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、125 MHzで測定した結果を図２に示す。
(h). 溶剤に対する溶解性：
ジメチルスルホキシド、クロロホルムに可溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
(i). 塩基性、酸性、中性の区別：中性
【発明の効果】
【００３３】
本発明の化合物はMRSA、ＶＲＥに対して阻害活性を有することがわかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、実施例および試験例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【００３５】
WSS2258及びWSS2260の製造
（１）可溶性澱粉2.5%、グルコース1%、フィッシュミール0.5%、ファーマメディア0.3%、NZケース0.3%、酵母エキス0.2%、炭酸カルシウム0.2%を含む液体培地60 mlを300 mlの三角フラスコに入れ、120℃、2気圧で20分滅菌した。次いで、この無菌培地にActinoplanes sp.TA0455株を接種し、28℃、200 rpmで3日間回転振とう培養し、種培養とした。
【００３６】
次に、オートミール2%、グルコース1%、デキストリン2.5%、ファーマメディア1%、フィッシュミール0.5%、糖みつ0.5%からなる無菌液体培地100 mlを500 mlの三角フラスコに入れ、これに前記種培養液2 mlを加え28℃、200 rpmで3日間回転振とう培養し、前培養とした。
【００３７】
次に、50L容培養タンク2基を用いて、前培養と同じ組成の無菌培地各30Lに前記前培養液600 mlを加え28℃、200 rpmで5日間回転振とう培養した。
【００３８】
培養終了後、得られた培養液60 Lに30Lのn-ブタノールを加えて撹拌し、遠心分離により菌体とn-ブタノール抽出画分に分けた。n-ブタノール画分を減圧濃縮して、褐色の油状物質120.27gを得た。
【００３９】
（２）前項の油状物質120.27gを水―メタノール（10：90）混合溶液750mlに溶かし、ヘキサン750mlを加え攪拌した後に遠心分離し、水―メタノール層を減圧下濃縮乾固した。得られた褐色物質65.35gをクロロホルム−メタノール混合溶媒に溶かし、200mlのシリカゲル［Silica Gel 60（Merck社製）］を添加し減圧濃縮して吸着させた。これをクロロホルムで調製したシリカゲル800mlの上層にのせ、クロロホルム1000 mlで洗浄した後、クロロホルム−メタノール（99：1〜80:20）の混合溶媒で順に溶出した。このうち混合溶媒比（96:4）で溶出した画分を合わせ減圧濃縮乾固して、2.014gの褐色物質を得た。この褐色物質にメタノール20mlを加え、濾過して得られた沈殿部分323.1mgをクロロホルムに溶解し、クロロホルム−メタノール（8：1）の混合溶媒を展開溶媒とした分取TLC［薄層板シリカゲルメルクF254（Merck社製）］を用いて分画を行った。Rf.0.62〜Rf.0.56の部分をかきとり、得られたシリカゲルをクロロホルム−メタノール（1：1）の混合溶媒で抽出し、減圧濃縮乾固して69.3mgのWSS2258を得た。同様にRf.0.06〜0.37の部分をかきとり、得られたシリカゲルをクロロホルム−メタノール（１：１）の混合溶媒で抽出し、減圧濃縮乾固して36.3mgのWSS2260を得た。
【００４０】
試験例１  MRSAに対するMIC測定
（検体）
WSS2258、WSS2260及びポジティブコントロールとしてバンコマイシンをそれぞれ10 mg/mlとなるようにDMSOに溶解し、滅菌水で目的濃度となるように希釈したものを用いた。
（試験菌種）
Staphylococcus aureus (MRSA)   SA-9（臨床分離株）
（試験方法）
MIC測定は下記に示した微量液体希釈法により行った。
【００４１】
一晩培養したハートインフージョン寒天培地からコロニーを掻き取り、濁度をMcFarland0.5に合わせた。最終接種菌量が5×10５CFU/mlとなるように薬剤含有培地に摂取した。35℃にて17時間培養後、判定は肉眼的に菌の発育が認められない最も低い濃度を以ってMIC（μg/ml）として表２に示した。
【００４２】
【表３】
2005336088.tif 000007
【００４３】
試験例２  ＶＲＥに対するMIC測定
（検体）
WSS2258、WSS2260及びポジティブコントロールとしてリネゾリドをそれぞれ10 mg/mlとなるようにDMSOに溶解し、滅菌水で目的濃度となるように希釈したものを用いた。
（試験菌種）
VRE（van(A)保有，臨床分離株）
（試験方法）
MIC測定は下記に示した微量液体希釈法により行った。
【００４４】
一晩培養したハートインフージョン寒天培地からコロニーを掻き取り、濁度をMcFarland0.5に合わせた。最終接種菌量が5×10５CFU/mlとなるように薬剤含有培地に摂取した。35℃にて17時間培養後，判定は肉眼的に菌の発育が認められない最も低い濃度を以ってMIC（μg/ml）として表３に示した。
【００４５】
【表４】
2005336088.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の化合物はＭＲＳＡ、ＶＲＥに対して強い抗菌活性を有するので、医薬品として利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】重ジメチルスルホキシド中、500 MHzで測定したWSS2258の1H-NMRスペクトルを示した。
【図２】重ジメチルスルホキシド中、125 MHzで測定したWSS2258の13C-NMRスペクトルを示した。
【図３】重ジメチルスルホキシド中、500 MHzで測定したWSS2260の1H-NMRスペクトルを示した。
【図４】重ジメチルスルホキシド中、125 MHzで測定したWSS2260の13C-NMRスペクトルを示した。
【図１】
2005336088.tif 000013
【図２】
2005336088.tif 000014
【図３】
2005336088.tif 000015
【図４】
2005336088.tif 000016