(57)【要約】【課題】  ２つ以上の標的核酸を同時に迅速且つ効率よく増幅及び検出するためにポリメラーゼ連鎖反応に使用できる、２つ以上の標的核酸の反対鎖に対するプライマーを含有する水性組成物を提供する。【解決手段】  各標的核酸に対するプライマーの長さは、ヌクレオチド数が５個以下しか異ならず、そしてそれらのプライマーは65〜74℃の範囲内のＴm を有すると同時に、Ｔm 'sは互いに約５℃の範囲内である。そのような組成物は、複数の捕捉プローブを用いる「多重的」な、診断試験キット並びに複数の核酸の増幅及び検出方法に有用である。すべての捕捉プローブが、50℃を越え、且つ互いに15℃の範囲内であるＴm 'sを有する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体の別個の領域に複数の捕捉試薬を配置せしめた水不溶性支持体を含む診断要素であって、
上記捕捉試薬の各々が、40〜55℃の温度で感染性物質と関連付けられる別個の標的ＤＮＡに対して特異的であり且つそれらとハイブリダイズしうる捕捉プローブを有し、上記捕捉プローブの各々が10〜40個のヌクレオチド及び50℃を越えるＴmを有し、そしてすべての捕捉プローブのＴmが15℃以下しか異ならないことを特徴とする前記診断要素。
【請求項２】
前記捕捉プローブが、以下のオリゴヌクレオチド：
配列番号：51  ５′-GGAACAACAT TAGAACAGCA ATACAACAAA CCG-３′、
配列番号：52  ５′-AATATTGTAA CCTTTTGTTG CAAGTGTGAC TC-３′、
配列番号：53  ５′-CCTATAGGTG GTTTGCAACC AATTAAACAC-３′、
配列番号：54  ５′-GAGGTATTTG AATTTGCATT TAAAGATTTA TTTGT-３′、
配列番号：55  ５′-GCAAGACAGT ATTGGAACTT ACAGAGG-３′、
配列番号：56  ５′-GTGTTGTAAG TGTGAAGCCA GATTTGA-３′、
配列番号：57  ５′-GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG-３′、及び
配列番号：65  ５′-AAAGACAGAA TAAAACGCAC GGGTGTTGGG TCG-３′
から成る群から選ばれる、請求項１に記載の診断要素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上の感染性物質と関連付けられる複数の核酸を増幅及び検出するための、診断用組成物、要素、方法並びに試験キットに関する。詳細には、それは、試験キット及び細菌もしくはウイルスＤＮＡの診断検出用の「似通った（matched）」プライマーを含有する緩衝組成物を用いたポリメラーゼ連鎖反応の改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の感染性物質（ウイルス類、細菌類、真菌類及び原生動物類を包含する）と関連付けられる極微量の核酸を検出するための技術はこの10年間で急速に進歩しており、それらには、増幅技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応においてプローブを用いる非常に精巧なハイブリダイゼーション・アッセイの発展が包含される。研究者らは、ヒトもしくは動物の試験被検体中の疾病及び遺伝的特徴を検出するためのそのような技術の価値を速やかに認識した。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応は、非常に低濃度の標的核酸の検出を可能にする、当該技術分野における著しい進歩である。ポリメラーゼ連鎖反応についての詳細は、例えば、米国特許第 4,683,195号、同第 4,683,202号及び同第 4,965,188号明細書並びにMullis et al, Methods of Enzymology, 155, pp.335-350 (1987) に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
種々の生物学的及び診断的分野においてポリメラーゼ連鎖反応が広範且つ急速に使用されているにもかかわらず、技術を首尾よく遂行するために解決しなければならない実際的な制限が依然として存在する。
ポリメラーゼ連鎖反応が「繰越し（carry-over) 」という課題を受けやすいために、或る反応により増幅された核酸が、「新たな」ポリメラーゼ連鎖反応の反応混合物を用いる次の反応に繰り越され、それによって後に被検体を試験する際に「偽」陽性を生ぜしめる可能性がある。
【０００５】
この課題に対するアプローチの一つは、どんな試薬もしくは副生成物も後の反応に繰越すことがないように、各ポリメラーゼ連鎖反応操作について試薬を完全に含有せしめることである。この理由のため、ポリメラーゼ連鎖反応操作手順を含む特別に設計された試験パックもしくは試験デバイスが設計されてきた。これらの試験デバイスは、米国特許第 A-5,089,660号及び同第 A-5,089,233号明細書に記載されるようなものを初めとする自動ポリメラーゼ連鎖反応処理装置と組み合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応に使用できる。この装置は、別個の試験デバイスで数種の試験被検体を同時に処理する能力により特徴付けられる。
【０００６】
単一試験デバイスで複数の標的核酸（もしくは同一核酸中の複数の核酸配列）を検出することは望ましい。これは、本明細書中では「多重化又は多重的（multiplexing) 」と称される。
ポリメラーゼ連鎖反応の或る態様では、プライマー及び捕捉プローブの特別なセット（３つのオリゴヌクレオチド全部）が、増幅及び検出しようとする各標的核酸について必要である。従って、３つのオリゴヌクレオチドはその標的核酸に対して相補的且つ特異的である。例えば、多重化するに際しては、３つの標的核酸を増幅及び検出しようとする場合、典型的には３セットのプライマー及びプローブが必要とされるが、各標的核酸に特異的な１セットのプライマー及びプローブが必要とされる。通常、複数の核酸の検出には複数の試験デバイス、恐らく各標的核酸を効率よく増幅するために、異なるセットのポリメラーゼ連鎖反応条件（即ち、温度及び時間条件）が必要とされる。
【０００７】
しかしながら、「万能（universal)」処理装置及び条件を用いて、複数の標的核酸を同一の試験デバイスで同時に増幅及び検出することが望まれるであろう。これは、一般的な供給源由来の各標的核酸に特異的なプライマー及びプローブのいずれかのセットを単に選択することによって実施できるものではない。処理装置を使用して幾つかの試験デバイスを同時に処理する場合、又は単一の試験デバイスが多重的に設計される場合には、各セットのプライマー及びプローブは恐らくすべて個別の最適増幅条件（例えば、変性温度）を有するであろうから、該装置が各セットのプライマー及びプローブに関して最適な加熱及び冷却時間並びに温度を提供するようになんとかして適応させねばならない。装置をランダムに選択されたプライマー及びプローブに対して多重的に適応させることは非常に経費がかかり、課題の解決は厄介であるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題は、ポリメラーゼ連鎖反応で、
ａ）それぞれ、第１標的ＤＮＡの反対鎖中の配列であり且つ互いに反対鎖に沿ってヌクレオチド数90から 400個分ほど離れている第１及び第２核酸配列に対して、特異的であり且つそれらとハイブリッド可能である第１及び第２プライマー、並びに
ｂ）それぞれ、第２標的ＤＮＡの反対鎖中の配列であって、第１及び第２核酸配列とは異なり且つ互いに反対鎖に沿ってヌクレオチド数90から 400個分ほど離れている第３及び第４核酸配列に対して、特異的であり且つそれらとハイブリッド可能である第３及び第４プライマー、
を含んでなる水性組成物であって、
第１、第２、第３及び第４プライマーが65℃〜74℃の範囲内のＴm を有し、すべてのプライマーのＴm 'sが互いに約５℃の範囲内であり、第１及び第２プライマーはヌクレオチド数が５個以下しか互いに異ならないヌクレオチド長さを有し、そして第３及び第４プライマーはヌクレオチド数が５個以下しか互いに異ならないヌクレオチド長さを有することを特徴とする水性組成物を用いることにより解決される。
【０００９】
また本発明は、上記水性組成物を含んでなる第１及び第２標的ＤＮＡの増幅に有用な診断試験キットを提供する。
本発明の、第１標的ＤＮＡ及び第２標的ＤＮＡの同時増幅及び検出方法は、
Ａ）上記水性組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応により第１標的ＤＮＡ及び第２標的ＤＮＡを同時に増幅すること、そして
Ｂ）少なくとも１つの増幅した第１標的ＤＮＡ鎖及び少なくとも１つの増幅した第２標的ＤＮＡ鎖を同時に検出すること、
を含んでなる。
【００１０】
更に、診断要素は、支持体の別個の領域に複数の捕捉試薬を配置せしめた水不溶性支持体を含んでなり、
捕捉試薬の各々が、40〜55℃の温度で感染性病原体と関連付けられる別個の標的ＤＮＡについて特異的であり且つそれらとハイブリダイズ可能である捕捉プローブを有し、各捕捉プローブが10〜40個のヌクレオチド及び50℃を越えるＴm を有し、そしてすべての捕捉プローブのＴm 'sが15℃以下しか異ならないことを特徴とする。
【００１１】
本発明の新規オリゴヌクレオチドは、
配列番号：２６  ５′-GAGATGGGAA TCCATATGCT GTATGTGAT- ３′、
配列番号：２７  ５′-GGACACAGTG GCTTTTGACA GTTAATACA- ３′、
配列番号：２８  ５′-GATGGTCCAG CTGGACAAGC AGAAC- ３′、
配列番号：２９  ５′-CCTAGTGTGC CCATTAACAG GTCTTC-３′、
配列番号：３０  ５′-GACACAGAAA ATGCTAGTGC TTATGCAGC- ３′、
配列番号：３１  ５′-GGTGGACAAT CACCTGGATT TACTGCAAC- ３′、
配列番号：３２  ５′-CCTGATCTGT GCACGGAACT GAACACT- ３′、
配列番号：３３  ５′-CCCAGTGTTA GTTAGTTTTT CCAATGTGTC TG- ３′、
配列番号：３４  ５′-TGCCTGCGGT GCCAGAAACC GTTGAAT- ３′、
配列番号：３５  ５′-TGCTCGGTTG CAGCACGAAT GGCACT-３′、
配列番号：３６  ５′-GAGCCGAACC ACAACGTCAC ACAATGTT-３′、
配列番号：３７  ５′-GGACACACAA AGGACAGGGT GTTCAGAAA- ３′、
配列番号：３９  ５′-GCGACTCAGA GGAAGAAAAC GATG-３′、
配列番号：４０  ５′-GAGATCGAGC TGGAGGATCC GTACG- ３′、
配列番号：４１  ５′-AGCTGCAGCC CAAAGGTGTT GGACT- ３′、
配列番号：５１  ５′-GGAACAACAT TAGAACAGCA ATACAACAAA CCG-３′、
配列番号：５２  ５′-AATATTGTAA CCTTTTGTTG CAAGTGTGAC TC- ３′、
配列番号：５３  ５′-CCTATAGGTG GTTTGCAACC AATTAAACAC-３′、
配列番号：５４  ５′-GAGGTATTTG AATTTGCATT TAAAGATTTA TTTGT-３′、
配列番号：５５  ５′-GCAAGACAGT ATTGGAACTT ACAGAGG- ３′、
配列番号：５６  ５′-GTGTTGTAAG TGTGAAGCCA GATTTGA- ３′、
配列番号：５７  ５′-GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG-３′、
配列番号：６３  ５′-CCGGGAGATG GGGGAGGCTA ACTGA- ３′、
配列番号：６４  ５′-GGGGTGGGGA AAAGGAAGAA ACGCG- ３′、及び
配列番号：６５  ５′-AAAGACAGAA TAAAACGCAC GGGTGTTGGG TCG-３′
の配列を有する。
【００１２】
ポリメラーゼ連鎖反応による増幅及びポリメラーゼ連鎖反応を用いた核酸の検出についての一般的な原理及び条件は極めてよく知られている。
本発明は、試験被検体中の感染性病原体と関連付けられるＤＮＡ分子由来の２つ以上の特異的な核酸配列の増幅及び検出に向けられている。
【００１３】
検出できる細菌としては、ヒトの血液中に見いだされる細菌、サルモネラ種（Salmonella species）、ストレプトコッカス種（Streptococcus species ）、クラミジア種（Chlamydia species ）、ゴノコッカル種（Gonococcal species）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテイウム・フォルトウイタム（Mycobacterium fortuitum ）、トリ型結核菌複合体（Mycobacterium avium complex ）、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile ）、ボレリア・ブルグドルフェライ（Borrelia burgdorferei ）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、シゲラ種（Shigella species）及びリステリア種（Listeria species）が挙げられる。検出可能であるウイルスとしては、ヘルペス（herpes）を包含するサイトメガロウイルス（cytomegalovirus ）、ＥＢウイルス（Epstein Barr virus）、インフルエンザウイルス（influenza viruses ）、ヒトパピローマウイルス（human papilloma virus ）、肝炎ウイルス（hepatitis ）並びにレトロウイルス、例えば、HTLV-I、HTLV-II 、HIV-I 及びHIV-IIが挙げられる。原生動物寄生体、酵母及びかびも検出可能である。
【００１４】
本発明は、レトロウイルスのＤＮＡ（例えば、HTLV-I、HTLV-II 、HIV-I 及びHIV-IIのＤＮＡ）、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）のＤＮＡ、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ、結核菌のＤＮＡ、トリ型結核菌のＤＮＡ、肝炎ウイルスのＤＮＡ及びニューモシスチス・カリニのＤＮＡの１つ以上の核酸配列の同時増幅及び検出に関して特に有用である。
【００１５】
本明細書で用いられる「標的」ＤＮＡは、アッセイにおいて陽性対照を提供するために試験被検体に添加される核酸も包含する。
「ポリメラーゼ連鎖反応試薬」は、ポリメラーゼ連鎖反応に必須であると見なされるいずれかの試薬、即ち、標的核酸のプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクター及びデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸を称する。
【００１６】
一般的には、本発明で用いられるプライマーは、12〜60個のヌクレオチドを有する。好ましくは、１セット中の各プライマーが25〜35個のヌクレオチドを有する。各プライマー中のプライマーの長さは、互いにヌクレオチド数が５個以下しか異ならない、好ましくはヌクレオチド数が２個以下しか異ならない。最も好ましくは、セット中のプライマーが同じ長さを有する。
【００１７】
本発明の実施に際して用いられる１セットのプライマーは、それぞれ、第１標的ＤＮＡの反対鎖中の第１及び第２核酸配列に対して特異的である第１及び第２プライマーを包含する。第１及び第２核酸配列は、互いに反対鎖に沿ってヌクレオチド数90〜400 個分ほどの間隔があり、好ましくは反対鎖上でヌクレオチド数 100〜300 個分ほど離れている。従って、２つのプライマーは、反対鎖に沿って互いに比較的近くにある核酸配列とハイブリダイズする。
【００１８】
第２セットのプライマー（第３及び第４プライマーを包含する）は、同一標的ＤＮＡもしくは異なる供給源の別の標的ＤＮＡの反対鎖の第３及び第４配列を増幅及び検出するために使用される。更なるセットのプライマーを用いて更なる標的ＤＮＡ′ｓの増幅及び検出ができる。
本発明で用いられる全セットについて、セット中の各プライマーは、65〜74℃の範囲内のＴm を有し、好ましくは67〜74℃の範囲内のＴm を有する。更に、プライマーＴm ′ｓは互いに５℃以内であり、好ましくはそれらが２℃以下しか異ならない。更にまた、各追加セット中のプライマーのＴm ′ｓは、本方法に用いられる別のセットのプライマー中のすべての別のプライマーのＴm ′ｓとは５℃以下しか、好ましくは２℃以下しか異ならない。
【００１９】
すべてのプライマーの間のこれらの特徴及び関係は、同じポリメラーゼ連鎖反応処理装置及び条件を用いる有効且つ効率のよい多重性を可能にする。
Ｔm （融解温度）は、本明細書では二本鎖ＤＮＡ分子の１／２が変性される温度として定義される。Ｔm の測定は、紫外線淡色効果に基づいて、数種の標準方法を用いて、例えば、Biochemistry, The Molecular Basis of Cell Structure and Function, 2nd Edition, Lehninger, Worth Publishers, Inc., 1970, pp.876-7に記載されるように260nm でスペクトルをモニターすることにより達成できる。種々のＴm 値測定方法は、同一のＤＮＡ分子についてわずかに異なる値を提供するかもしれないが、それらの値は互いに２又は３℃以上変動すべきではない。
【００２０】
好ましくは、プライマー及びプローブに関して本明細書中に記載されるＴm 値は、式（Ｉ）を用いて計算される。
（Ｉ）  Ｔm （℃）＝67.5＋0.34（％Ｇ＋Ｃ）− 395／Ｎ
上式中、「Ｇ」及び「Ｃ」は、それぞれ、グアニン及びシトシンヌクレオチドの数を表し、そして「Ｎ」は、オリゴヌクレオチド（即ち、プライマーもしくはプローブ）中のヌクレオチドの総数を表す。この計算により得られたＴm 値は、１つ以上の無機もしくは有機塩、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム及び塩化ナトリウムにより提供される少なくとも60μモルのイオン強度を有する10μモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（pH8.5 ）中にオリゴヌクレオチド（プライマーもしくはプローブ）を含む溶液について、従来のＵＶ淡色効果及び従来のヒューレット−パッカード・ダイオード・アレイ・分光光度計（Hewlett-Packard diode array spectrophotometer ）（走査速度＋１℃／min.）を用いて室温で経験的に決定された値と非常に良く相関する。前記式を決定するために用いられた溶液中のオリゴヌクレオチド及びその相補体の量は、光学濃度 0.5〜1.0 OD単位を提供するには十分であった。
【００２１】
HIV-I ＤＮＡの増幅及び検出に有用なプライマーとしては、Ｔm 値と共に以下に示される７つのプライマー・セットの配列を有するものが挙げられる。
プライマー・セット１：
配列番号：１    ５′-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-３′
（72.8℃）
配列番号：２    ５′-TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTC-３′
（70.4℃）、
プライマー・セット２：
配列番号：３    ５′-TAGCACCCAC CAGGGCAAAG AGAAGAGT-３′
（71.6℃）
配列番号：４    ５′-AGATGCTGTT GCGCCTCAAT AGCCCTCA-３′
（72.1℃）、
プライマー・セット３：
配列番号：１    ５′-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-３′
（72.8℃）
配列番号：５    ５′-CTTGGTTCTC TCATCTGGCC TGGTGC-３′
（71.6℃）、
プライマー・セット４：
配列番号：１    ５′-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-３′
（72.8℃）
配列番号：１３  ５′-CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC-３′
（72.5℃）、
プライマー・セット５：
配列番号：２０  ５′-CGTCGTCGTA TAATCCACCT ATCCCAGTAG GAGAAAT-３′
（71.3℃）
配列番号：２１  ５′-CGTCGTCGTT TTGGTCCTTG TCTTATGTCC AGAATGC-３′
（73.4℃）、
プライマー・セット６：
配列番号：２２  ５′-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-３′
（66.8℃）
配列番号：２３  ５′-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-３′
（68.0℃）、及び
プライマー・セット７：
配列番号：２４  ５′-GATGGATGAC AAATAATCCA CCTATCCCAG TAGGAGAAAT- ３′
（71.2℃）
配列番号：２５  ５′-CTAAAGGGTT CCTTTGGTCC TTGTCTTATG TCCAGAATGC- ３′
（72.9℃）。
【００２２】
セット１及びセット３〜７のプライマーは、HIV-I ＤＮＡの「gag 」領域中の核酸配列に相補的であり、セット２のプライマーは、HIV-I ＤＮＡの「env 」領域中の核酸配列に相補的である。
HIV-II  ＤＮＡの反対鎖中の核酸配列の増幅に有用な２つのプライマー・セットは、以下の配列（及びＴm ′ｓ）を有する。
プライマー・セット８：
配列番号：１４  ５′-AAGTAGACCA ACAGCACCAC CTAGCGG- ３′
（71.8℃）
配列番号：１５  ５′-GCAGCCTTCT GAGAGTGCCT GAAATCCTG- ３′
（72.6℃）、及び
プライマー・セット９：
配列番号：１６  ５′-GGGATAGTGC AGCAACAGCA ACAGCTGT-３′
（71.6℃）
配列番号：１７  ５′-GTGGCAGACT TGTCTAAACG CACATCCCC- ３′
（72.6℃）。
【００２３】
hCMV  ＤＮＡの増幅及び検出に特に有用なプライマーとしては、Ｔm 値と共に以下に示される３つのプライマー・セットの配列を有するものが挙げられる。
プライマー・セット１０：
配列番号：４６  ５′-GAGGCTATTG TAGCCTACAC TTTGG- ３′
（68.0℃）
配列番号：４７  ５′-CAGCACCATC CTCCTCTTCC TCTGG- ３′
（72.1℃）、
プライマー・セット１１：
配列番号：３８  ５′-CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT- ３′
（70.5℃）
配列番号：４８  ５′-TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT-３′
（69.4℃）、
プライマー・セット１２：
配列番号：１０  ５′-TGCACTGCCA GGTGCTTCGG CTCAT- ３′
（72.1℃）
配列番号：１１  ５′-CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT- ３′
（72.1℃）、
【００２４】
セット１０のプライマーは、hCMV  ＤＮＡの「主要即時型初期（major immediate early ）」領域中の核酸配列に相補的であり、セット１１のプライマーは、hCMV  ＤＮＡの「主要キャプシド・タンパク質（major capsid protein）」領域中の核酸配列に相補的であり、そしてセット１2 のプライマーは、hCMV  ＤＮＡの「後期抗原（late antigen）」領域中の核酸配列に相補的である。
【００２５】
ヒトパピローマウイルス（hPV ）ＤＮＡの増幅に有用な似通ったプライマーとしては、以下のものが挙げられる。
プライマー・セット１３：
配列番号：２６  ５′-GAGATGGGAA TCCATATGCT GTATGTGAT- ３′
（68℃）
配列番号：２７  ５′-GGACACAGTG GCTTTTGACA GTTAATACA- ３′
（68℃）、
プライマー・セット１４：
配列番号：２８  ５′-GATGGTCCAG CTGGACAAGC AGAAC- ３′
（70.7℃）
配列番号：２９  ５′-CCTAGTGTGC CCATTAACAG GTCTTC-３′
（69.3℃）、
プライマー・セット１５：
配列番号：３０  ５′-GACACAGAAA ATGCTAGTGC TTATGCAGC- ３′
（69.1℃）
配列番号：３１  ５′-GGTGGACAAT CACCTGGATT TACTGCAAC- ３′
（70.3℃）、
プライマー・セット１６：
配列番号：３２  ５′-CCTGATCTGT GCACGGAACT GAACACT- ３′
（70.5℃）
配列番号：３３  ５′-CCCAGTGTTA GTTAGTTTTT CCAATGTGTC TG- ３′
（69℃）、
プライマー・セット１７：
配列番号：３４  ５′-TGCCTGCGGT GCCAGAAACC GTTGAAT- ３′
（71.8℃）
配列番号：３５  ５′-TGCTCGGTTG CAGCACGAAT GGCACT-３′
（71.9℃）、
プライマー・セット１８：
配列番号：３６  ５′-GAGCCGAACC ACAACGTCAC ACAATGTT-３′
（70.4℃）
配列番号：３７  ５′-GGACACACAA AGGACAGGGT GTTCAGAAA- ３′
（70.3℃）、及び
プライマー・セット１９：
配列番号：３７  ５′-GGACACACAA AGGACAGGGT GTTCAGAAA- ３′
（70.3℃）
配列番号：３９  ５′-GCGACTCAGA GGAAGAAAAC GATG-３′
（68℃）。
【００２６】
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（Mtb ）ＤＮＡの増幅に有用な似通ったプライマーとしては、以下のものが挙げられる。
プライマー・セット２０：
配列番号：４０  ５′-GAGATCGAGC TGGAGGATCC GTACG- ３′
（72.1℃）
配列番号：４１  ５′-AGCTGCAGCC CAAAGGTGTT GGACT- ３′
（70.7℃）、及び
プライマー・セット２１：
配列番号：４２  ５′-TCAGCCGCGT CCACGCCGCG A- ３′
（75℃）
配列番号：４３  ５′-CCTGCGAGCG TAGGCGTCGG- ３′
（73.3℃）。
配列番号：４２は、似通ったプライマーについて特許請求した範囲からわずかに外れており、効率よく「多重性」であるとはいえないけれども、ポリメラーゼ連鎖反応はそれを用いても可能である。
【００２７】
トリ型結核菌（Mycobacterium avium ）（Mav ）ＤＮＡの増幅に有用な似通ったプライマーとしては、以下のものが挙げられる。
プライマー・セット２２：
配列番号：４４  ５′-GAGATCGCCA CCTTCGGCAA- ３′
（68.2℃）
配列番号：４５  ５′-GAGCAGTTCG GTGGCGTTCA- ３′
（68.2℃）。
【００２８】
ヘルペス・シンプレックス．ウイルス１（Herpes simplex virus 1）（HSV-1 ）のＤＮＡのチミジンキナーゼ遺伝子の増幅に有用な似通ったプライマーとしては、以下のものが挙げられる。
プライマー・セット２３：
配列番号：６３  ５′-CCGGGAGATG GGGGAGGCTA ACTGA- ３′
（73.5℃）
配列番号：６４  ５′-GGGGTGGGGA AAAGGAAGAA ACGCG- ３′
（72.1℃）。
【００２９】
更なる標的核酸の増幅及び検出に有用なプライマーは、この分野における多数の文献を参考にして標的核酸の適当な核酸配列を決定することにより、当業者らにより容易に決定可能であるだろう。次いでこれらの配列は、既知技術を用いてプライマーを調製するためのパターンとして使用できる。これらのプライマーは、それらが必要なＴm 及び別の上記要件を有するかどうか（上記の適当な方法を用いて）測定することにより、容易にスクリーニングできる。
【００３０】
本明細書中で用いられる「プローブ」とは、標的核酸（例えば、HIV-I ＤＮＡもしくはいずれかの更なる標的核酸）の核酸配列に実質的に相補的であり、そして増幅された標的核酸の検出又は捕捉に使用されるオリゴヌクレオチドである。一般的には、プローブは10〜40個のヌクレオチドを有し、そして50℃を越えるＴm を有する。更に、プローブは、40〜55℃の範囲内（好ましくは45〜53℃の範囲内）の温度で、特定の標的核酸の核酸配列とハイブリダイゼーション可能である。本発明の実施に際して複数の増幅された標的核酸を同時に捕捉するために複数のプローブを使用する場合には、すべての捕捉プローブが15℃以下しか異ならないＴm 'sを有する。好ましくは、同時に使用される捕捉プローブのＴm 'sが５℃以下しか異ならない。
【００３１】
HIV-I ＤＮＡに対する代表的な捕捉プローブとしては、括弧内にＴm 'sを記載した以下のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
配列番号：６    ５′-GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-３′
（69.2℃）、及び
配列番号：７    ５′-GTGCAGCAGC AGAACAATTT GCTGAGGG-３′
（71.6℃）。
最初に列挙したプローブは、HIV-I ＤＮＡの「gag 」領域中の核酸配列に相補的であり、二番目に列挙したプローブは、HIV-I ＤＮＡの「env 」領域中の核酸配列に相補的である。
【００３２】
HIV-II  ＤＮＡの増幅された核酸の検出に有用な代表的な捕捉プローブとしては、以下のもの（Ｔm ）が挙げられる。
配列番号：１８  ５′-GAGGAAAAGA AGTTCGGGGC AGAAGT-３′
（69.3℃）、及び
配列番号：１９  ５′-CAACAAGAAA TGTTGCGACT GACCGTCT-３′
（69.2℃）。
【００３３】
hCMV  ＤＮＡに有用な代表的な捕捉プローブとしては、括弧内にＴm を示した以下のオリゴヌクレオチド類が挙げられる。
配列番号：８    ５′-GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC-３′
（78.1℃）、
配列番号：４９  ５′-GACACAGTGT CCTCCCGCTC CTCCTGAGCA-３′
（75.9℃）、
配列番号：５０  ５′-GTGGAAGGCG GCTCGCTGGA AGCCGGTCGT-３′
（78.1℃）、
配列番号：１２  ５′-GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG-３′  
（75.9℃）、及び
配列番号：６２  ５′-GGTCATCGCC GTAGTAGATG CGTAAGGCCT-３′
（73.6℃）。
【００３４】
列挙したプローブの最初の２つは、hCMV  ＤＮＡの「主要即時型初期（major immediate early ）」領域中の核酸配列に相補的であり、列挙したプローブの次の２つは、hCMV  ＤＮＡの「後期抗原（late antigen）」領域中の核酸配列に相補的であり、そして最後のプローブは、hCMV  ＤＮＡの「主要キャプシド・タンパク質（major capsid proyrin）」領域中の核酸配列に相補的である。
【００３５】
ヒトパピローマウイルス（hPV ）ＤＮＡの検出に有用な代表的なプローブとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号：５１  ５′-GGAACAACAT TAGAACAGCA ATACAACAAA CCG-３′
（68.9℃）、
配列番号：５２  ５′-AATATTGTAA CCTTTTGTTG CAAGTGTGAC TC- ３′
（66.8℃）、
配列番号：５３  ５′-CCTATAGGTG GTTTGCAACC AATTAAACAC-３′
（67.9℃）、
配列番号：５４  ５′-GAGGTATTTG AATTTGCATT TAAAGATTTA TTTGT-３′
（63.8℃）、
配列番号：５５  ５′-GCAAGACAGT ATTGGAACTT ACAGAGG- ３′
（68℃）、及び
配列番号：５６  ５′-GTGTTGTAAG TGTGAAGCCA GATTTGA- ３′
（66.7℃）。
【００３６】
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（Mtb ）ＤＮＡの検出に有用な捕捉プローブとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号：５７  ５′-GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG-３′
（75.9℃）及び
配列番号：５８  ５′-CTCGTCCAGC GCCGCTTCGG- ３′
（73.3℃）。
【００３７】
トリ型結核菌（Mycobacterium avium ）（Mav ）ＤＮＡの検出に有用な捕捉プローブとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号：５９  ５′-TGGATCTCGT TGTTCGGGTC- ３′
（66.5℃）及び
配列番号：６０  ５′-GACCAGATCG CTGCCACCGC GGCCATCTCC-３′
（78.1℃）。
【００３８】
マイコバクテイウム・フォルトウイタム（Mycobacterium fortuitum ）ＤＮＡの検出に有用な捕捉プローブとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号：６１  ５′-GAGCAGATCG CTGCCACCGC CGGTATCTCC-３′
（77℃）。
ヘルペス・シンプレックス．ウイルス１（Herpes simplex virus 1）（HSV-1 ）ＤＮＡのチミジンキナーゼ遺伝子の検出に有用な捕捉プローブとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号：６５  ５′-AAAGACAGAA TAAAACGCAC GGGTGTTGGG TCG-３′
（70.2℃）。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応に必要な更なるポリメラーゼ連鎖反応試薬は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクター及び適当なｄＮＴＰ類を包含する。これらの試薬は、別個に提供されるか、試験キットの一部として提供されるか、試験デバイスの試薬室中に配置されるか、又は本発明の組成物中に組み入れることができる。
【００４０】
数多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、当該技術分野において報告されており、それらとしては、米国特許第 4,965,188号及び同第 4,889,818号明細書に詳細に記載されるものが挙げられる。特に有用なポリメラーゼは、種々のサーマス属細菌種、例えば、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus ）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）もしくはサーマス・スラバス（Thermus flavus）が挙げられる。別の有用な熱安定性ポリメラーゼが、WO-A-89/06691 に記載されている。
【００４１】
ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターとは、酵素が活性に関して依存している非タンパク質性化合物を意味する。数多くのそのような物質は、２価カチオンが水性溶液中に放出されるような状態のマンガンもしくはマグネシウムを包含する既知コファクターである。有用なコファクターとしては、マンガン塩及びマグネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩（例えば、酪酸塩、カプロン酸塩、カプリル酸塩、カプリン酸塩及びラウリン酸塩）が挙げられる。
【００４２】
更にポリメラーゼ連鎖反応に必要とされるものは、２つ以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰもしくはｄＵＴＰである。ｄＩＴＰ及び７−ジアザ−ｄＧＴＰのような類似体も有用である。好ましい物質、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰは、一緒にアッセイに使用される。
【００４３】
本明細書に記載されたポリメラーゼ連鎖反応試薬は、所定の処理に適するいずれかの濃度で提供され使用される。所定の酵素の特別な活性に依存して、好ましくは、反応混合物 100μＬ当たり熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ 0.1〜50単位がポリメラーゼ連鎖反応に使用される。「単位」は、74℃で30分間に伸長核酸鎖中に総ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）量10ナノモルを導入するために必要とされる酵素活性の量として、本明細書では定義される。より詳細には、ＤＮＡポリメラーゼ10〜40単位／溶液 100μＬが使用される。プライマーの量は、少なくとも 0.075μモルであり、 0.1〜２μモルが好ましい。好ましくは、各プライマーが同じ量で存在する。一般的には、コファクターは、２〜15μモルの量で存在する。各ｄＮＴＰは、0.25〜3.5 μモルで存在する（４種の常用のｄＮＴＰの総量は、１〜14マイロモルである）。
【００４４】
本発明の水性組成物は、１つ以上の適当な緩衝液を用いてpH７〜９に緩衝化される。
本発明の特に有用な組成物は、本明細書に記載したプライマー、前記マグネシウム・コファクター、前記ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ、ゼラチンもしくは同様の親水性コロイド物質（少なくとも５重量％の量で）、並びに10〜100 μモルの量で存在するアルカリ金属塩（例えば、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム）の緩衝化混合物である。
【００４５】
本発明の一態様では、２つ以上の標的ＤＮＡについてのポリメラーゼ連鎖反応用の反応混合物の調製方法は、
Ａ）各々異なる標的ＤＮＡに対するプライマーのセットを選択すること、
〔ここで、
各セットのプライマーは、異なる標的ＤＮＡの反対鎖中の配列であり且つ互いに異なる標的ＤＮＡの反対鎖に沿ってヌクレオチド数90から 400個分ほど離れている核酸配列に対して特異的であり且つそれらとハイブリッド可能であるように選択され、
各プライマー・セット中の各プライマーは65℃〜74℃の範囲内のＴm を有し、すべてのプライマーのＴm 'sは互いに５℃の範囲内であり、そして各セット中のプライマーはヌクレオチド数が５個以下しか互いに異ならないヌクレオチド長さを有し、
Ｔm 'sは、次式を用いて計算される
Ｔm （℃）＝67.5＋0.34（％Ｇ＋Ｃ）− 395／Ｎ
（上式中、Ｇ及びＣは、それぞれ、グアニン及びシトシンヌクレオチドの数を表し、そしてＮは、ヌクレオチドの総数を表す）〕、そして
Ｂ）段階Ａ）で選択されたプライマーのセットを、
0.1〜50単位／溶液 100μＬの量の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、
２〜15μモルの量のＤＮＡポリメラーゼ・コファクター、及び
0.25〜3.5 μモルの量で存在するｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、
と混合すること、
（ここで、各プライマーが、少なくとも 0.075μモルの濃度で混合物中に存在する）
を含んでなる。
【００４６】
標的核酸は種々供給源、例えば、全血試料のいずれかより得ることができる。一般的には、それは、何らかの手段で抽出されて、プライマー及び別のポリメラーゼ連鎖反応試薬と接触可能にせしめられる。
増幅及び検出しようとする核酸は通常二本鎖型であるので、プライミングを行う前に２つの鎖を分離（即ち、変性）せねばならない。変性は、熱処理のみを用いて、又は従来技術文献に記載されているようないずれかの適当な別の物理的、化学的もしくは酵素的手段と組み合わせて用いて達成される。一般的には、初期変性処理は、85〜100 ℃の第１温度で適当な時間、例えば、１秒間〜３分間、標的核酸を含有すると予測される被検体を加熱することにより実施される。
【００４７】
次いで変性した鎖は、通常、鎖をプライミングするために55〜70℃の範囲内の温度まで冷却される。変性した鎖を冷却するのに要する時間は、ポリメラーゼ連鎖反応処理に用いられる装置のタイプに依存して変化するであろう。
一旦、変性した鎖が第２温度に冷却されると、ポリメラーゼ連鎖反応試薬を含有する反応混合物はプライマー伸長生成物の形成を行うのに適する温度でインキュベーションされる。一般的には、この温度は、少なくとも50℃であり、好ましくは62〜75℃の範囲内である。インキュベーション時間は、インキュベーション温度及び所望の伸長生成物の長さに依存して広範に変化できるが、好ましい態様では、１〜120 秒間である。即ち、幾つかのポリメラーゼ連鎖反応処理工程は、プライミング用の第２温度及びプライマー伸長用の第３温度を利用する。好ましくは、本発明の実施に際して、プライミング及びプライマー伸長用の両方について同じ温度が用いられる。
【００４８】
次いでハイブリダイズされたプライマー伸長生成物を変性する場合には、更に所望の回数のプライミング、伸長及び変性・サイクルにてポリメラーゼ連鎖反応を実施できる。一般的には、少なくとも20回実施されるだろう。
そのようなポリメラーゼ連鎖反応に有用な装置の１つが、米国特許第 4,965,188号明細書及びEP-A-0 236 069に記載されている。一般的には、この装置は、反応混合物を含有する多数の反応管を保持するための熱伝導性容器、加熱、冷却及び温度維持手段、並びに増幅処理、温度変化及びタイミングを調節するためのシグナルを発生させる計算手段（computing means)を含む。使い捨て化学試験パック中で増幅反応を行う際の好ましい装置は、米国特許第 5,089,233号明細書に幾らか詳細に記載されている。
【００４９】
また、適当な容器で実施することは、本発明方法に有用である。ほとんどの粗製容器は試験管、キュベット、フラスコもしくはビーカーであろうが、該方法を実施するための自動化操作を促進するためにより精巧な容器が形成されている（例えば、WO-A-91/12342 を参照されたい）。例えば、該方法の実施中に所定の温度特性を提供するように作られたキュベット及び化学試験パック（パウチとしても既知である）が、米国特許第 4,902,624号、同第 5,173,260号及び同第 5,229,297号明細書に記載されている。
【００５０】
増幅された標的ＤＮＡの検出は、数多くの既知方法、例えば、米国特許第 4,965,188号明細書に記載のもので達成できる。例えば、サザン・ブロッティングもしくはドット・ブロット法を用いて検出できる。あるいは、適当に標識された（例えば、放射線同位体で標識された）プライマーを用いて増幅を実施することができ、そして放射線同位体の発光を検出するための方法及び装置を用いて、増幅されたプライマー伸長生成物は検出される。
【００５１】
或る態様では、検出のために標識された、そして直接的又は間接的にプライマー伸長生成物の１つとハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブを用いて、増幅された標的核酸が検出される。有用な標識としては、放射線同位体、電子密度試薬、色原体、発蛍光団、リン光体部分、フェリチン及び別の磁気粒子、化学ルミネセンス部分並びに酵素が挙げられる。有用な酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及び当該技術分野で既知である別のものが挙げられ、そしてそれらはオリゴヌクレオチドに付着できる。
【００５２】
好ましい態様では、標的核酸の検出に用いられる各プライマーセットの１つもしくは両方のプライマーが、特異的バインディング部分で標識されている。特異的バインディング部分は各セットのプライマーと同一であるか又は異なることができる。そのような標識は、特異的バインディング部分と特異的に反応するレセプター分子が存在するいずれかの分子を包含する。特異的バインディング・ペア（その１つが標識できる）の具体例としては、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、糖／レクチン、抗体／ハプテン及び抗体／抗原が挙げられる。次いでレセプターは、既知技術を用いて検出可能な標識部分、例えば、酵素と接合せしめられる。
検出しようとする増幅された標的核酸については、反応媒体中の別の物質からそれを分離することが有用であることが多い。これは、水不溶性支持体に共有結合される捕捉プローブを有する捕捉試薬を用いることを包含する多数の方法のいずれかにより行われる。
【００５３】
マイクロタイタープレート、試験管、ビーカー、ビーズ、フィルム、薄膜フィルター、濾紙、ゲル、磁気粒子及びガラスウールを包含するいずれかの有用な固形支持体が、検出用水不溶性生成物の分離に使用できる。それは、ガラス、セラッミク、金属、天然型もしくは合成ポリマー、セルロース系材料、フィルター材料及び当業者に容易に明らかである別のものから成る。特に有用な固形支持体材料は、一般的には 0.001〜10μメートルの平均粒子径を有するポリマー粒子もしくは磁気粒子である。
捕捉プローブもしくは捕捉試薬を、平らな支持体、例えば、上記微孔質濾過膜上に、又は薄いポリマーフィルム、非コーティング紙もしくはポリマー・コーティング紙（それらの多くは当該技術分野で既知である）の上に固定化することによっても検出が実施できる。
【００５４】
捕捉試薬の特に有用な配置が、例えば、WO 92/16659 及び米国特許第 5,173,260号明細書に記載されている。捕捉プローブは同じ型のポリマー粒子に（直接又は化学連結基を介して）共有結合せしめられ、そして得られた捕捉試薬はヒートシール可能な又は超音波シール可能な支持体（例えば、シート、膜、繊維マット、フィルム）の上に固定化される。或る特に有用なヒートシール可能な又は超音波シール可能な支持体は、ポリエチレン及びポリエステルの積層体である。捕捉試薬は、適当な試験デバイス（上記）の一部である水不溶性支持体の上の異なる領域に置くことができる。そのような試験デバイスは診断要素としても規定されうる。例えば、支持体は、種々の捕捉試薬の複数のストリップもしくはスポットをその上に配置できる。そのような支持体上の異なる領域に配置された複数の捕捉プローブすべてが、上記Ｔm 値、即ち、わずかに15℃ほどしか違わないＴm 値を有する。
【００５５】
本発明は、本発明の組成物、更なるポリメラーゼ連鎖反応試薬、並びに本発明方法を実施するのに必要な別の材料、装置及び指令を包含できる診断試験キットを含む。該キットは、１つ以上の検出もしくは捕捉プローブ、複数のプライマー・セット、及びアッセイ用試験デバイスを包含できる。幾つかの態様では、キット成分が、適当な容器もしくは試験デバイス中用途に応じて別個に包装されている。別の態様では、キットが、アッセイに必要とされる幾つかの又は全ての試薬及び成分を個別の部屋の中に有する試験デバイスを含む。そのような態様では、個別に包装されたキット成分が単一試験デバイスの中に存在できる。
【００５６】
実施例についての材料及び方法：
サーマス・アクアティクス由来の組換えＤＮＡポリメラーゼは、EP-A-0 482 714に記載された方法のような既知方法を用いて調製したものであり、 250,000単位／タンパク質１mgの活性を有した。
【００５７】
プライマー及びプローブは、標準ホスホルアミダイト化学及びABI １μモル・スケール、第１サイクル・プロトコールを用いてApplied Biosystems Model 380B ，スリー・カラムＤＮＡ合成器（three column DNA synthesizer）を使用して、既知出発物質及び方法を用いて調製した。制御された孔質ガラス支持体（controlled pore glass supports）に導入されたヌクレオシド−３′−ホスホルアミダイト及びヌクレオシドは、Applied Biosystemsより入手した。プライマーは先に同定した配列を有した。それらを、５′末端を２つのテトラエチレングリコール・スペーサーで機能化し、続いて１つのDuPont市販のビオチンホスホルアミダイトで機能化した。プローブは、米国特許第 4,914,210号明細書に従って、３′末端を２つのテトラエチレングリコール・スペーサーで機能化し、続いて１つのアミノジオール連結基で機能化した。核酸精製カラム、続いて逆相ＨＰＬＣ技法を用いて、すべての精製を実施した。
【００５８】
記載したＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体は、宿主動物の抗体分泌細胞をリンパ様組織（例えば、脾臓）から単離し、そしてポリエチレングリコールの存在下SP2/0-Ag14ネズミ・ミエローマ細胞と融合せしめ、選択培地で希釈し、そして複数のウェルを有する組織培養皿で培養することによって、ハイブリドーマ・セルライン（ATCC由来のHB 11126もしくは 11127のどちらか）を用いて免疫したＤＮＡポリメラーゼ免疫化マウスの免疫細胞より調製した。約７〜14日後、抗体を含有するハイブリドーマ細胞を収穫し、そして従来の技法を用いて精製した。
【００５９】
アビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液は、市販（Zymed Laboratories, Inc.) のアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体（ 126μＬ／Ｌ）、カゼイン（ 0.5％）及びメルチオレート（ 0.5％）を含むものであった。
洗浄溶液（pH 7.4）は、リン酸ナトリウム，一塩基性一水和物（25μモル）、塩化ナトリウム（ 373μモル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（ 2.5μモル）、エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム塩（25μモル）及びデシル硫酸ナトリウム（38μモル）を含有するものであった。
【００６０】
色素提供性組成物（pH 6.8）は、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾール（ 250μモル）、ポリ（ビニルピロリドン）（ 112μモル）、アガロース（ 0.5％）、ジエチレントリアミン五酢酸（ 100μモル）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５μモル）及びリン酸ナトリウム，一塩基性，一水和物（10μモル）を含有するものであった。
【００６１】
HIV-I ＤＮＡは、従来の方法を用いてHUT/AAV 78セルラインより抽出し、続いて細胞溶解そしてタンパク質消化を行い、フェノール／クロロホルム抽出により精製した（トリス飽和フェノール（ 750μＬ）を細胞懸濁液に添加し、そしてフェノール／リゼイト溶液を混合して遠心分離により分離した）。次いで水性相を新しい２mL管に移した。この方法をクロロホルム・イソアミルアルコールを用いて繰り返した。水性相を 0.3モル  酢酸ナトリウムに入れた。95％冷エタノールを添加し、そして−70℃で１時間保存することにより核酸を沈殿させた。次いでHIV-I ＤＮＡの濃縮液をＡ260 で検出し、そしていろいろなコピー数の連続希釈液を、実験用にＴＥ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１μモル）及び（エチレンジニトリロ）四酢酸（ 0.1μモル）〕を用いて調製した。希釈溶液の試料（10μＬ）を各ポリメラーゼ連鎖反応の反応混合物（ 300μＬ）に添加した。
【００６２】
従来のショ糖密度勾配及びフェノール／クロロホルム抽出方法を用いて市販の粗hCMV  ＤＮＡ（Advanced Biotech's strain AD169 ）を精製することにより、純粋なhCMV  ＤＮＡが得られた。次いでhCMV  ＤＮＡの濃縮液をＡ260 で検出し、そしていろいろな計算コピー数の標的希釈液を実験用にＴＥ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１μモル）及びエチレンジアミン四酢酸（ 0.1μモル）〕を用いて調製した。希釈溶液の試料（10μＬ）をポリメラーゼ連鎖反応の反応混合物（ 300μＬ）に添加した。
【００６３】
以下の配列を有する２つのプローブを、HIV-I ＤＮＡを増幅及び検出するためのアッセイの際に対照試薬として使用した。
配列番号：８    ５′-GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC-３′
配列番号：９    ５′-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C- ３′
また、hCMV  ＤＮＡのアッセイの際にも対照として同じプローブを使用した。
【００６４】
上記捕捉プローブを、以下の方法で、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕の粒子（モル比  95:5，平均直径１μｍ）に付着せしめることにより捕捉試薬を調製した。水への粒子の懸濁液を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ 0.1モル，pH６）で２回懸濁し、そして約10％固体になるように懸濁せしめた。洗浄した粒子の試料（ 3.3mL）を緩衝液（ 0.1モル）で3.33％固体となるように希釈し、それを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（84mg/mL の水溶液   2.1mL）及び適当なプローブ（ 44.44 OD/mLのナノポア水の溶液   983μＬ）と混合した。得られた懸濁液を断続的に混合しながら水浴中50℃で約２時間加熱し、そして遠心分離した。（エチレンジニトリロ）四酢酸ナトリウム塩（0.0001モル）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（0.01モル，pH８）で粒子を３回洗浄し、そして４％固体となるようにそれに再懸濁した。
【００６５】
増幅されたHIV-I ＤＮＡの検出に用いられる捕捉プローブは、配列番号：６及び配列番号：７であり、最初のものはHIV-I ＤＮＡの「gag 」領域に対するものであり、そして２番目のものはHIV-I ＤＮＡの「env 」領域に対するものであった。
対照捕捉試薬は、上記プローブを用いて同時に調製した。
アッセイ流体及び試薬がすべての捕捉試薬とほぼ同時に接触するように、すべての捕捉試薬を、WO-A-92/16659 に記載のように製造した試験デバイス中のヒートシール可能なポリエチレン／ポリエステルの積層体（コロナ放電処理した）の上に置いた。米国特許第 5,089,233号明細書に詳細に記載されている自動化コダック（Kodak)ポリメラーゼ連鎖反応処理装置を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施した。
【００６６】
hCMV  ＤＮＡの増幅及び検出に用いたプライマー（及びＴm ）は、以下のものであった。
配列番号：１０  ５′-TGCACTGCCA GGTGCTTCGG CTCAT- ３′  
（72.1℃）、及び
配列番号：１１  ５′-CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT- ３′  
（72.1℃）。
hCMV  ＤＮＡについての捕捉試薬は、以下の捕捉プローブ（Ｔm ）を用いて上記のように調製した。
配列番号：１２  ５′-GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG-３′  
（75.8℃）。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例では、特に断らない限りすべてのパーセンテージは重量パーセントである。
実施例１  HIV-I ＤＮＡのプライマーを含有する緩衝化組成物
プライマーと更なるポリメラーゼ連鎖反応試薬とを混合させることにより、本発明の組成物の１つを調製した。この組成物は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（10μモル，pH８）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（6.86μモル）、塩化カリウム（50μモル）、エチレンジアミン四酢酸（ 686μモル）、塩化マグネシウム（10μモル）、ゼラチン（ 100μg/mL）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々 1.5μモル）、グリセロール（ 9.5％）、プライマー（各々 0.4μモル）、上記ＤＮＡポリメラーゼ（48単位／ 300μＬ）、並びに上記ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体（ＤＮＡポリメラーゼに対するモル比  50:1）を含有するものであった。包含されるプライマーは、HIV-I ＤＮＡの「gag 」領域中の核酸配列に特異的である配列番号：１及び配列番号：５と同定されるもの、並びにHIV-I ＤＮＡの「env 」領域中の核酸配列に特異的である配列番号：３及び配列番号：４と同定されるものであった。また組成物には、ヒトの血液試料を模倣するためにフェノール／クロロホルム精製ＣＥＭ細胞（正常非感染リンパ球、2.75又は６μｇ／ 300μＬ）も含有させた。
【００６８】
実施例２  HIV-I ＤＮＡ及びhCMV  ＤＮＡの同時増幅及び検出
この実施例は、組成物が更に配列番号：１０及び配列番号：１１と先に同定したプライマーを各々 0.4μモル含むことを除いて、HIV-I ＤＮＡと共にhCMV  ＤＮＡを同時に検出するために実施例１に記載の組成物を用いた本発明の実施を具体的に示すものである。
【００６９】
２種の異なる量のＣＥＭ細胞を有する試験試料中の、以下のさまざまな濃度の標的核酸を検出するために、24通りのアッセイを実施した。
試料ａ）hCMV  ＤＮＡ  20,000コピー及びHIV-I ＤＮＡ  20,000コピー、
試料ｂ）hCMV  ＤＮＡ 500コピー及びHIV-I ＤＮＡ 500コピー、
試料ｃ）hCMV  ＤＮＡ 100コピー及びHIV-I ＤＮＡ 100コピー、
試料ｄ）hCMV  ＤＮＡ 100コピー及びHIV-I ＤＮＡ 20,000 コピー、
試料ｅ）hCMV  ＤＮＡ  20,000コピー及びHIV-I ＤＮＡ 100コピー、及び
試料ｆ）hCMV  ＤＮＡ 100コピー及びHIV-I ＤＮＡ 500コピー。
【００７０】
これらのアッセイでは、hCMV  ＤＮＡの「後期抗原（late antigen) 」領域中の核酸配列を検出し、そしてHIV-I ＤＮＡの「gag 」及び「env 」領域中の核酸配列を検出した。各アッセイについて２回反復実験を行った。
アッセイについての増幅及び検出方法は以下のとおりであった。
増幅：
95℃で60秒間加熱することにより変性し、
68℃で30秒間プライミング及び伸長し、そして94℃で15秒間加熱するサイクルを40回行った。
検出：
増幅した鎖を97℃で 120秒間変性し、
増幅した生成物を50℃で５分間捕捉試薬で捕捉し、
捕捉した生成物を40℃で１分間アビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液と接触及びインキュベーションし、
捕捉生成物を40℃で１分間洗浄溶液を用いて洗浄し、
色素提供性組成物を添加し、そして40℃で２分間インキュベーションし、そして
色素シグナルを読み取った。
【００７１】
試料ａ）〜ｆ）のアッセイの結果（各アッセイにつき２回の反復実験結果）を、それぞれ図１〜６の棒グラフに示す。図中、色素シグナルをｙ軸に示す（ここで、「０」は色素シグナルがないことを表し、そして「10」は最高色素濃度を表す）。各図面において、第１セットの棒グラフはＣＥＭ細胞2.75μｇを存在せしめたことによるアッセイであり、そして第２セットの棒グラフはＣＥＭ細胞６μｇを存在せしめたことによるアッセイである。また、すべての図面において、各セットの棒の最初の棒（「１」と示す）はhCMV  ＤＮＡ（「後期抗原（late antigen) 」領域）由来のシグナルを表し、第２の棒（「２」と示す）はHIV-I ＤＮＡ（「gag 」領域）由来のシグナルを表し、そして第３の棒（「３」と示す）はHIV-I ＤＮＡ（「env 」領域）由来のシグナルを表す。両方の対照捕捉試薬の色素シグナルは実質的にゼロであったので、それらは棒グラフには図示しない。
【００７２】
実施例３  HIV-I ＤＮＡ単独の増幅及び検出
本例は、実施例１の組成物（ＣＥＭ細胞６μｇのみ）を用いて試料ａ）〜ｆ）中のHIV-I ＤＮＡの２つの核酸配列（「gag 」及び「env 」領域）のみの増幅及び検出について、実施例２と同様に実施した。
図７は、試料ａ）〜ｃ）の各々についての２回の反復実験のポリメラーゼ連鎖反応プロセスの色素シグナル結果を示し、そして図８は、試料ｄ）〜ｆ）の各々についての反復実験のポリメラーゼ連鎖反応プロセスの色素シグナル結果を示す。HIV-I ＤＮＡの存在に関する明瞭なシグナルが得られた（「２」及び「３」と示される棒）。わずかなバックグラウンド・シグナルも認められた（各セットの棒グラフ中「１」と示される）。
【００７３】
実施例４  hCMV  ＤＮＡのプライマーを含有する緩衝化組成物
プライマーと更なるポリメラーゼ連鎖反応試薬とを混合させることにより、本発明の別の組成物を調製した。この組成物は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（10μモル，pH８）、塩化カリウム（50μモル）、塩化マグネシウム（10μモル）、ゼラチン（ 100μg/mL）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々 1.5μモル）、グリセロール（ 7.5％）、プライマー（各々 0.4μモル）、上記ＤＮＡポリメラーゼ（48単位／ 300μＬ）、並びに上記ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体（ＤＮＡポリメラーゼに対するモル比  50:1）を含有するものであった。包含されるプライマーは、hCMV  ＤＮＡの核酸配列に特異的である配列番号：１０及び配列番号：１１と同定されるものであった。また組成物には、ヒトの血液試料を模倣するためにフェノール／クロロホルム精製ＣＥＭ細胞（正常非感染リンパ球、2.75又は６μｇ／ 300μＬ）も含有させた。
【００７４】
実施例５  hCMV  ＤＮＡ単独の増幅及び検出
本例は、実施例４の組成物（ＣＥＭ細胞  2.75μｇのみ）を用いて試料ａ）〜ｆ）中のhCMV  ＤＮＡ（「後期抗原（late antigen) 」領域のみ）の増幅及び検出について、実施例２と同様に実施した。
図９は、試料ａ）〜ｃ）の各々についての２回の反復実験のポリメラーゼ連鎖反応プロセスの色素シグナル結果を示し、そして図１０は、試料ｄ）〜ｆ）の各々についての反復実験のポリメラーゼ連鎖反応プロセスの色素シグナル結果を示す。hCMV  ＤＮＡの存在に関する明瞭なシグナルが得られた（「１」と示される棒）。HIV-I ＤＮＡ（「gag 」及び「env 」領域）の存在に由来するわずかなバックグラウンド・シグナルも認められた（各セットの棒グラフ中、それぞれ「２」及び「３」と示される）。
【００７５】
本発明は、多重的な、又は同じ試験デバイス、そして所望であれば、同じ処理装置（１つ以上の試験デバイスを同時に処理する）を用いて複数の標的核酸配列を増幅及び検出するための有効的且つ効率の良い手段を提供する。感染性病原体と関連付けられる第１標的ＤＮＡの１つ以上の核酸配列並びに感染性病原体と関連付けられる第２標的ＤＮＡの１つ以上の核酸配列の検出に特に有用である。同一又は異なるＤＮＡ分子の多数の核酸配列のいずれについても、適当なプライマー・セットを組み合わせて用いて同時に増幅及び検出できる。
これらの利点は、各標的核酸についてのポリメラーゼ連鎖反応に「似通った」プライマーのセットを用いることにより達成される。「似通った」プライマーとは、実質的に同じである融解温度（Ｔm 's）、即ち、それらが５℃以下しか異ならない融解温度を有する各セット中のプライマーを意味する。更に、各セットの２つのプライマーのＴm 'sは、65〜74℃の範囲内であり、そして各プライマーセットの２つのプライマーは、ヌクレオチド数が５個以下しか互いに異ならないヌクレオチド長さを有する。更に、増幅方法に使用されるすべてのプライマーセットのすべてのプライマーも、「似通った」ものである、即ち、それらがすべて５℃以下しか異ならないＴm 'sを有し、そしてすべて65〜74℃の範囲内である。好ましい態様では、捕捉プローブもＴm 値が似通っており、15℃以下しか異ならない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、上記実施例２に記載された、hCMV  ＤＮＡ及びHIV-I ＤＮＡの両方のポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図２】図２は、上記実施例２に記載された、hCMV  ＤＮＡ及びHIV-I ＤＮＡの両方のポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図３】図３は、上記実施例２に記載された、hCMV  ＤＮＡ及びHIV-I ＤＮＡの両方のポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図４】図４は、上記実施例２に記載された、hCMV  ＤＮＡ及びHIV-I ＤＮＡの両方のポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図５】図５は、上記実施例２に記載された、hCMV  ＤＮＡ及びHIV-I ＤＮＡの両方のポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図６】図６は、上記実施例２に記載された、hCMV  ＤＮＡ及びHIV-I ＤＮＡの両方のポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図７】図７は、上記実施例３に記載された、さまざまな濃度のHIV-I ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図８】図８は、上記実施例３に記載された、さまざまな濃度のHIV-I ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図９】図９は、上記実施例５に記載された、さまざまな濃度のhCMV  ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、上記実施例５に記載された、さまざまな濃度のhCMV  ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応アッセイの反復実験における色素シグナルを示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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