(57)【要約】      （修正有）【課題】  イグサの品種に特異的なオリゴヌクレオチド、およびそれを用いたイグサの品種を識別する方法を提供する。【解決手段】イグサの品種識別に有用なプライマーであって、該プライマーが、特定の塩基配列からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、プライマーに関する。本発明はさらに、上記プライマーを含むプライマー対に関する。本発明はまた、イグサの品種を識別する方法に関し、この方法は、上記プライマー対を用いてイグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程、および増幅産物を検出する工程、を包含する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イグサの品種識別に有用なプライマーであって、該プライマーが、配列番号１（ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ）および配列番号２（ＴＣＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴ）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、プライマー。
【請求項２】
前記プライマーが、以下からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のプライマー：
ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）。
【請求項３】
イグサの品種識別に有用なプライマー対であって、該プライマー対が、以下の組み合わせを含む、プライマー対：
配列番号１（ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ）に示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位にアニールして伸長可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチド、および、
配列番号２（ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）に示される配列を有するオリゴヌクレオチド、もしくは該オリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位にアニールして伸長可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記プライマー対が、以下の組み合わせを含む、請求項３に記載のプライマー対：
ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）。
【請求項５】
イグサの品種を識別する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）請求項３に記載のプライマー対を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【請求項６】
前記プライマー対が、以下の組み合わせを含む、請求項５に記載の識別方法：
ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）。
【請求項７】
イグサから試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
イグサの品種を識別するためのキットであって、請求項３に記載のプライマー対を備える、キット。
【請求項９】
前記プライマー対が、以下の組み合わせを含む、請求項８に記載のキット：
ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イグサ品種識別に関する。本発明は、より詳細には、イグサ主要栽培品種のうち、特定の品種（例えば、最も優良な品質を持ち産業価値の高い品種「ひのみどり」）と他の品種を識別するためのＤＮＡマーカーおよび該マーカーを標的としてイグサの品種を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イグサは主に栄養繁殖で増殖・栽培されており、これまで育成された品種は、栄養系品種である。
【０００３】
従来、イグサの品種特性は茎長（草丈）、茎の太さ、幹茎色（茎の色）、茎数（一株あたりの茎の数）花序着生率（着花の頻度）、先枯程度（先端部分の枯れの程度）など産業上の品質に関わる特徴で表されてきた。しかし、これらの特性は量的形質であって、生育環境の変化に応じてそれらの形質も変化するため、一定の栽培環境における品種の特徴を説明することはできても、確実に品種を識別するマーカーとしては利用できなかった。このため、いったん入手経路が不確実になるとどの品種であるのか断定することは困難であった。その結果、いくつかの品種が混ざって製品の均一性が失われたり、あるいは優良品種の盗難、不法栽培を防止・規制することができなかった。
【０００４】
イグサの品種開発は、近縁系統間交雑育種を始め、芽条変異や放射線照射による突然変異が主に育種に利用され、ＤＮＡレベルでの変異が極めて少ないと考えられる。
【０００５】
近年の分子生物学的技術の適用に関しては、九州農業試験場、熊本県農業研究センター及び農業生物資源研究所が平成９〜１０年に「ＲＡＰＤ法によるイグサ品種識別」について共同研究を行った。しかし、ＤＮＡ多型率が極めて低い結果となり、実用的な品種識別マーカーは全く得られなかった。
【０００６】
ＩＳＳＲは、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子をコードしていない非コード領域に主に見られる単純反復配列（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ：ＳＳＲ）を利用し、ＳＳＲの反復回数が種系統間で異なる性質に基づいて品種系統を識別する方法である。このＳＳＲ部位をアンカープライマー（（ＡＧ）×８Ｔ、（ＣＡ）×８ＲＧなどのランダムな繰り返し配列から構成される１７〜２０マー程度のプライマー)を用いて、染色体上の広い領域に散在するＳＳＲ領域の末端にプライミングさせ、ＳＳＲに挟まれた領域を特異的にＰＣＲ増幅させる方法であり、ＩＳＳＲ−ＰＣＲ法は、一度の操作で多くのＤＮＡマーカーを得ることができる（非特許文献１）。
【０００７】
広範なゲノム領域の検索を行うための一手法として、様々な植物においてその有効性が示されているＩＳＳＲ（Ｉｎｔｅｒ−Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ：単純反復配列間）−ＰＣＲ法を利用し、イグサの品種識別への適用が検討されている（非特許文献１および２）。マイクロサテライト（ＳＳＲ：Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ）は、染色体上に多数散在しており、変異性が極めて高く、この領域は高頻度に多型を示すことから、種、系統などの識別のための有効なマーカーとして利用することができる。
【非特許文献１】「ＤＮＡ多型」Ｖｏｌ．１１（２００３）５７−６０「ＩＳＳＲ−ＰＣＲ法を用いたイグサ品種識別」（矢野博・池田達哉著）（日本ＤＮＡ多型学会［編］）
【非特許文献２】育種学研究、第５巻、別冊２号、８００頁、２００３年９月発行、「ＩＳＳＲ−ＰＣＲによるイグサ品種識別」（矢野博・池田達哉著）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、加工品のイグサの品種識別に利用しうるＤＮＡマーカーを同定し、イグサ産業における品種識別の判断材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を行った結果、イグサ主要栽培品種１６品種をＩＳＳＲ法に供することにより、これら品種のゲノムＤＮＡ断片の中から、優良イグサ品種「ひのみどり」に特異的なＤＮＡ断片を同定することに成功した。本発明者らにより同定された、このようなＤＮＡ断片に含まれる特異的な塩基配列は、イグサ品種を識別するための（特に、種々のイグサ品種からから品種「ひのみどり」を識別するための）重要なＤＮＡマーカーとなる。本発明は、イグサ品種の識別に成功しうる実用的なＤＮＡマーカーとして同定されたものである。
【００１０】
即ち、本発明は、イグサ主要栽培品種のうち、最も優良な品質を持ち産業価値の高い品種「ひのみどり」と他の品種を識別するための方法に関し、より詳しくは、下記（１）から（９）に記載の発明を提供するものである。
【００１１】
（１）イグサの品種識別に有用なプライマーであって、該プライマーが、配列番号１（ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ）および配列番号２（ＴＣＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴ）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、プライマー。
【００１２】
（２）前記プライマーが、以下からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである、項１に記載のプライマー：
ＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）。
【００１３】
（３）イグサの品種識別に有用なプライマー対であって、該プライマー対が、以下の組み合わせを含む、プライマー対：
配列番号１（ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ）に示される配列を有するオリゴヌクレオチドもしくは該オリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位にアニールして伸長可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチド、および、
配列番号２（ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）に示される配列を有するオリゴヌクレオチド、もしくは該オリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位にアニールして伸長可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するそれらの断片である、オリゴヌクレオチド。
【００１４】
（４）前記プライマー対が、以下の組み合わせを含む、項３に記載のプライマー対：
ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）。
【００１５】
（５）イグサの品種を識別する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）項３に記載のプライマー対を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００１６】
（６）前記プライマー対が、以下の組み合わせを含む、項５に記載の識別方法：
ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）。
【００１７】
（７）イグサから試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、項５または６に記載の方法。
【００１８】
（８）イグサの品種を識別するためのキットであって、項３に記載のプライマー対を備える、キット。
【００１９】
（９）前記プライマー対が、以下の組み合わせを含む、項８に記載のキット：
ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ（配列番号１）および
ＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＧ（配列番号２）。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、イグサの主要品種を識別するための実用的なＤＮＡマーカーが提供された。また、該ＤＮＡマーカーを指標としたイグサ品種の識別方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２２】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２３】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。必要に応じて、プライマーは、デオキシイノシン残基で置換された塩基を含む。
【００２４】
用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００２５】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本件明細書においてヌクレオチドを１文字表記する場合、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを示す。
【００２７】
本明細書において、「断片」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。断片の長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上（例えば、５００〜１０００もの長さのヌクレオチド長も含まれ得る）のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「プライマー」とは、適切な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメライゼーション剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）の存在下）で、適切な緩衝液中で、そして適切な温度において、鋳型指向性のＤＮＡ合成を開始する点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存する。本発明のプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチドである。プライマーは、代表的には、４０ヌクレオチド未満であり得、好ましくは、３０ヌクレオチド未満であり得る。さらに好ましくは、本発明のプライマーは、長さが２０〜２７ヌクレオチドの範囲であり得る。短いプライマー分子は、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、一般により低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列に完全にマッチする必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であるべきである。用語「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的である鋳型核酸の配列をいう。用語「プライマー対」とは、増幅される核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一組のプライマーをいう。
【００２９】
本明細書において、「プライマー」の３’末端から塩基を数える場合、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」とは、３’末端の塩基をいう。従って、例えば、配列番号１の配列（５’−ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ−３’）を有するプライマーにおいて、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」は「Ｃ」であり、「プライマーの３’末端から３番目の塩基」は「Ｔ」である。
【００３０】
本明細書において、「プライマーの３’末端からＸ番目の塩基に対応する塩基」とは、プライマーが鋳型核酸とハイブリダイズした場合に、そのプライマーの３’末端から数えてＸ番目の位置の塩基がハイブリダイズする位置に存在する塩基をいう。また、プライマーの設計において、「（ある）塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列」とは、前者の（ある）塩基配列にアニールする（例えば、相補的な）塩基配列をいい、前者の（ある）塩基配列が、ＧＧである場合、「（ある）塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列」とはＣＣであり得る。
【００３１】
また、本明細書においては、核酸増幅反応として、例示的に用語「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いているが、本発明の実施のためにＰＣＲ以外の核酸増幅反応も使用可能である。従って、本発明のプライマーが使用されるのは、ＰＣＲに限定されない。
【００３２】
本発明のプライマーを用いるＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡの調製は、周知の種々の方法（例えば、ＣＴＢＡ法、ボイル法など）によって、細胞および組織などからＤＮＡ（好ましくは、ゲノムＤＮＡ）を調製することによって、行われ得る。
【００３３】
鋳型核酸としてＤＮＡ断片を使用する場合、鋳型核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを消化することによって、あるいはＰＣＲの使用によって、調製され得る。プライマーまたはプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの化学合成の分野において公知の方法（非限定的例として、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９〜１８６２（１９８１））によって記載されるホスホロアミダイト法、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１））によって提供されるトリエステル法（両方を本明細書において参考として援用する）によって化学的に合成される。これらの合成は、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）において記載されるような自動合成機を使用し得る。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．およびＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ、２５５：１３７〜１４９（１９８３））に記載されるように、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって行われ得る。次に、所望される場合、二本鎖断片は、適切な相補的な一本鎖の対を適切な条件下でアニールすることによってか、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することによって、得られ得る。核酸プローブのための特定の配列が与えられる場合、相補的鎖もまた同定され、そして含まれることが理解される。その相補的鎖は、標的が二本鎖核酸である場合、同等に良く作用する。
【００３４】
合成オリゴヌクレオチドの配列または任意の核酸断片の配列は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはマクサム−ギルバート法のいずれかを使用して得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８９）、本明細書において参考として援用する）。このマニュアルを、本明細書において、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」という；「Ｚｙｓｋｉｎｄら（１９８８）」。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）。
【００３５】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ」とは、オルソロガス遺伝子ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。
【００３６】
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｗｉｌｅｙ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
【００３７】
本発明は、イグサ品種に特異的なオリゴヌクレオチドを提供する。本オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される配列（ＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣ）を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される配列（ＴＣＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴ）を有するオリゴヌクレオチド、またはそれらの断片であり得る。
【００３８】
本発明はまた、イグサ品種を識別するためのオリゴヌクレオチドのセットを提供する。本セットは、配列番号１に示される配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される配列を有するオリゴヌクレオチド、およびそれらの断片からなる群から選択される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。本発明の１つの実施形態では、当該セットは、上記少なくとも２つのオリゴヌクレオチドとして、配列番号１に示される配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００３９】
上記オリゴヌクレオチドは、下記に示すように、プライマーとして働き得るのに十分な長さを有し得る。
【００４０】
イグサ品種の識別は、イグサから抽出した試料ＤＮＡを上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅し、この増幅産物を検出することにより行われ得る。例えば、下記に示した実施例１では、配列番号１に示される配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示される配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーとして用いて増幅反応を行って、他のイグサ品種では、３００ｂｐと５５０ｂｐの２つの増幅産物が検出され、品種「ひのみどり」では、３００ｂｐの１つの増幅産物のみが検出されているが、イグサ識別にて使用される手法、材料などはこれに限定されず、プライマーを用いて試料ＤＮＡを増幅させて得られた増幅産物に関して、特定の品種（例えば、「ひのみどり」）においてのみ識別可能な結果が得られれば十分である。特定の品種（例えば、「ひのみどり」）においてのみ識別可能な結果が得られるに十分な増幅反応を生じさせ得るオリゴヌクレオチドが、本発明においてプライマーとして使用され得る。
【００４１】
本発明は、イグサの品種を識別するためのプライマーを提供する。上述したように、プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、本発明のプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチドである。プライマーは、代表的には、４０ヌクレオチド未満であり得、好ましくは、３０ヌクレオチド未満であり得る。さらに好ましくは、本発明のプライマーは、長さが２０〜２９ヌクレオチドの範囲であり得る。
【００４２】
本発明のプライマーは、下記の実施例１に示される結果と実質的に同等の結果を示し得る限り、プライマー各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドに加えて、これら各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位にアニールして伸長可能なオリゴヌクレオチド、およびそれらの断片もまた、本発明のプライマーとして使用され得る。実施例１に示される結果と「実質的に同等の結果である」とは、実施例１と実質的に同等の条件下で増幅反応を行ったとき、他のイグサ品種では、３００ｂｐと５５０ｂｐの２つの増幅産物が検出され、品種「ひのみどり」では、３００ｂｐの１つの増幅産物のみが示されることであるが、「ひのみどり」特異的な結果が示される限り、この増幅産物の大きさは必ずしも正確に一致し得なくてもよいことを意味する。各配列番号に示される配列を有するオリゴヌクレオチドがアニールするプライマー部位の配列は、各配列番号に示される配列の記載に基づいて当業者に認識され得、このようにして得られたプライマー部位の配列に基づいて、当該プライマー部位にアニールして伸長可能であるように設計されたプライマーもまた、本発明の範囲内である。プライマーは、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であれば、鋳型の正確な配列に完全にマッチする必要はない。
【００４３】
本発明のプライマーは、鋳型のプライマー部位にアニールして伸長し得ることが重要であり、そのようなプライマーの設計は、本明細書の記載に基づいて当業者の技術範囲内にて行われ得る。プライマー設計上の注意事項は当業者には周知である。プライマーの長さについては上述したとおりであり、プライマーのＧＣ含量は、極端になることを避けるべきである（例えば、このＧＣ含量は４０〜６０％であり得る）。また、プライマー対によるプライマーダイマーの形成、プライマーの分子内高次構造の形成、プライマー対の5'末端配列の相補性などを、プライマー設計の際に考慮に入れるべきであることは、当業者には周知である。プライマーにより伸長する方向の３’末端領域が、該プライマーがアニールする鋳型と相補的であれば、プライマーを構成する他の塩基は必ずしも、該プライマーがアニールする鋳型とマッチしていなくてもよい。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドのプライマーのＴｍは、３４℃〜８０℃であり得る。好ましくは５０℃以上、なお好ましくは、５５℃以上、より好ましくは、６０℃以上であり、そして、６５℃以上、７０℃以上のＴｍを有するプライマーも使用可能である。
【００４５】
本発明は、イグサの品種を識別する方法を提供する。本方法は、（ａ）上記プライマー対を用いて、イグサのＤＮＡ試料を増幅させる工程；および（ｂ）該増幅産物を検出する工程を包含する。好ましい実施形態では、本発明の方法によって、イグサ品種間で品種「ひのみどり」を識別することができる。
【００４６】
上述したように、本明細書においては、核酸増幅反応として、例示的に用語「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いているが、本発明の実施のためにＰＣＲ以外の核酸増幅反応も使用可能である。本発明の識別方法において、好ましくは、増幅工程は、ＰＣＲによって行われ得る。
【００４７】
本発明におけるＰＣＲ反応において使用される鋳型としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用される鋳型は、天然から単離された状態であっても、単離された後に酵素などによって処理されたものあってもよい。鋳型を処理する酵素としては、逆転写酵素、制限酵素、ポリメラーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
本発明において使用されるプライマーは、例えば、放射性物質、蛍光物質などによって標識されていてもよい。
【００４９】
ＰＣＲ産物を検出する方法としては、電気泳動、リアルタイムＰＣＲ検出装置が挙げられるがこれに限定されない。
【００５０】
ＰＣＲ反応のためには、周知または市販の種々の酵素を使用しうる。また、ＰＣＲ反応の条件は周知である。
【００５１】
本発明のプライマー対を使用して、イグサ品種を検出できることが当業者に容易に理解され得る。本発明のプライマー対は、ＰＣＲによって増幅するＤＮＡ断片長の組み合わせによって、一回のＰＣＲ反応に付き４〜５種類のＳＳＲマーカーで遺伝子型を比較するマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）法におけるプライマー対としても使用され得る。
【００５２】
本発明の識別方法は、イグサから試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含し得る。本発明の識別方法にて品種を識別するための供試材料としては、イグサの植物体（例えば、茎）および加工されたイグサ製品（例えば、畳）のいずれもが用いられ得る。このような材料から当業者に周知の方法（例えば、上述したＣＴＢＡ法、ボイル法など）によってＤＮＡが抽出され得る。例えば、畳表製品からのサンプルの採取は、「裏毛」からとることになり得るが、イグサ植物体の株基と先端部とを見分けて、先端部から抽出することが望ましい。株基は原草を乾燥させる際に熱源に近い位置にあるため、ＤＮＡの分解が進んでいることが多い。しかし、本明細書中のいずれの方法も２００〜３００塩基対程度の短い配列を標的としたＰＣＲ法に基づき得るので、株基のようなＤＮＡの断片化したサンプルにも適用可能である。また、一つの畳表製品が単一の品種である保証は無いため、一つの製品について１６〜３２点程度のサンプリングを行うことが望ましい。
【００５３】
本発明はまた、イグサの品種を識別するためのキットを提供する。本キットは、本発明のプライマー対を備える。好ましくは、本発明のキットは、プライマー対として、配列番号１に示されるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドを備える。本キットはさらに、イグサ品種を識別するための手順を記載した説明書もまた備え得る。本キットはさらに、上述したようなイグサ品種の識別方法において好適に使用するために用いられ得る他の任意の成分もまた備え得る。
【００５４】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。
【００５６】
＜プライマーの設計＞
ＵＢＣ（カナダ、ブリティッシュコロンビア大学）より購入したマイクロサテライトプライマーセットの内、３つの塩基から成る配列（ＡＴＧ）が６回反復した配列をもつ８６４（ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ）について、新たに３’末端にＴを付加したプライマー８６４ｔ（ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  Ｔ）を合成した。このプライマー８６４ｔを、ＩＳＳＲ−ＰＣＲのプライマーとして使用した。
【００５７】
生育中期のイグサ茎約５ｇを液体窒素下で粉砕した後、ＣＴＡＢ法により全ＤＮＡを抽出し、このイグサＤＮＡをＩＳＳＲの多型検索のためのサンプルとした。ここで、イグサは、熊本県農業研究センターい業研究所から分譲された、国内で生産される主要栽培品種と在来種の１６品種（千丁在来、あさなぎ、ふくなみ、せとなみ、ひのみどり、下増田在来、きよなみ、文政在来、いそなみ、筑後みどり、岡山３号、くまがわ、さざなみ、しらぬい、岡山Ｆ系、岡山みどり）を用いた。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、下記の実施例１中の「２．ＰＣＲ反応」の節に示すのと同様にして行った。ＰＣＲ増幅産物は１．５％アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色でＤＮＡバンドを検出した。この反応により、約３００塩基対のＰＣＲ産物が「ひのみどり」に特異的に得られた。この「ひのみどり」特異的に得られた約３００塩基対のＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターを用いてクローニングし、塩基配列を決定した。その配列をもとにして、プライマー設計ソフトウエアＯｌｉｇｏを用いて、新たにプライマー８６４ｔ４を設計した。
【００５８】
ここで得られたプライマー８６４ｔ４を以下に示す：
８６４ｔ４−５’  ｃａｔｔｔｃａｔｇｇａｇｇｇｔｔｔｔｔｃ（配列番号１）
８６４ｔ４−３’  ｔｃｇａｇｇａｇａｔｔｇａｇｇａｔｇａｔ（配列番号２）。
【００５９】
＜イグサ品種の識別について＞
イグサ品種の識別について、以下に概要を示すが、これらと同等の技術および条件もまた使用され得る。
【００６０】
１．イグサからのＤＮＡの抽出
ＤＮＡ抽出は、ＣＴＡＢ法を用いて行った。要約すれば、抽出緩衝液中に試料を溶解し、夾雑物およびタンパク質の除去、ＲＮａｓｅ処理を行い、ＤＮＡを抽出した。ＣＴＡＢを溶出液とすることで、多糖類等が抽出されるのを避けた。
【００６１】
２．ＤＮＡ抽出の確認およびＤＮＡ抽出量の計算
抽出後のＤＮＡ溶液は、０．５〜１０μｌ容のマイクロピペットを用いて、５μｌを採り、ＴＥ緩衝液を加えて５０μｌにし２００〜３００ｎｍの範囲で紫外吸光スペクトルを測定し、２３０、２６０および２８０ｎｍの吸光度を測定した。ここで、１Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍを５０ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液として濃度を算出した。滅菌水によりＰＣＲ用のＤＮＡ溶液（１０ｎｇ／μｌ）を調製した。濃度が薄い場合は再度抽出を行った。抽出されるＤＮＡの純度は、Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍ／Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ比が１．８〜２．０程度となった。
【００６２】
３．ＰＣＲ増幅およびゲル電気泳動
３．１．試験の概要
抽出ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡポリメラーゼ、イグサ品種「ひのみどり」に特異的なプライマー対を用い、ＰＣＲを行った。その後、電気泳動、紫外線照射下での可視化を行い、予想される長さのＰＣＲ産物が得られるか否かにより判定した。
【００６３】
３．２．ＰＣＲ
サーマルサイクラー：Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用い、常法に従って行った。しかし、この機器を用いて行った結果と同等であるものも用い得る。
【００６４】
ＰＣＲ用の試薬としては以下を用いた：
ＤＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡ  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）（これの同等品もまた用い得る）。デオキシヌクレオシド三リン酸溶液：ｄＮＴＰ（２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｅａｃｈ）Ａｍｐｌｉ  ＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄ添付品。塩化マグネシウム溶液：ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）Ａｍｐｌｉ  ＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄ。ＰＣＲ用緩衝液：１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ。
【００６５】
３．３．ゲル電気泳動
ゲル電気泳動装置：ミューピッド電気泳動装置（株式会社アドバンス製）を用い、常法に従って行った。ＤＮＡ分子量マーカー：１００ｂｐラダーマーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ社）を用いたが、ＰＣＲ産物の増幅長に適したマーカーが用いられ得る。
【００６６】
４．  結果の判定
４．１．ＰＣＲの成否
４．２  特異性および検知感度
ＣＴＡＢを用いて抽出したＤＮＡ溶液を鋳型として、ＰＣＲを行った場合、「ひのみどり」以外の１５品種には、３００ｂｐと５５０ｂｐの位置にのみＰＣＲ増幅バンドがみられたが、「ひのみどり」においては、５５０ｂｐのＰＣＲ増幅バンドはみられず、３００ｂｐの位置にのみＰＣＲ増幅バンドがみられた。
【００６７】
［実施例１：  ＩＳＳＲ法に由来する識別マーカーによるイグサ品種「ひのみどり」の識別］
本実施例では、イグサ１６品種のうち、主要栽培品種を含む１１品種間の識別を行った。
【００６８】
１．ＤＮＡ抽出方法
（１）試料粉砕器（ヒスコトロン  ＮＳ−５６、マクロテック・ニチオン社製）を台上にセットした。（２）プラスチックビーカーを準備した。（３）−８０℃の冷凍庫に保存したイグサ茎（約５ｇ）を発砲スチロールに移した。このときにイグサ茎が溶けないように液体窒素を箱に入れておいた。イグサ茎はその日に行うもの全てを入れた。（４）ビーカーに液体窒素を約１００ｍｌ入れ、イグサ茎を加えた。（５）粉砕器にイグサ茎をかけ、完全な粉状になるまですりつぶした。（６）ビーカーを−２０℃の冷凍庫に移し、液体窒素がなくなるまで保管した。（７）試料粉砕器を水で完全に洗浄した。（８）ウォーターバスを６５℃にセットした。（冷え切っている場合はお湯を足す）。（９）２×ＣＴＡＢをビーカーに３００ｍｌ入れ、沸騰寸前まで加熱した。（１０）１０ｍｌピペットを準備し、冷凍庫からサンプルの入ったビーカーを取り出した。（１１）温めたＣＴＡＢを１０ｍｌずつビーカーに加え、完全な液状になるまで、薬さじでかき混ぜた。（１２）どろどろのサンプルを５０ｍｌチューブに移し、ウォーターバスに入れた。（１３）１０ｍｌピペットとクロロホルムを準備し、チューブに１０ｍｌずつ加えた。（１４）チューブを良く攪拌し、シェーカーの上に並べてゆっくりと２０分間攪拌した。（１５）遠心分離器にチューブをかけ、３０００ｒｐｍで１５分間回した。（１６）遠心分離をしている間に新しい５０ｍｌチューブを準備しておいた。（１７）遠心機からチューブを出し、チップを使って上清液を新しいチューブに移した。（１８）１０％ＣＴＡＢを１ｍｌ加え、混ぜた。（１９）ＣＴＡＢ沈殿バッファーを１５ｍｌ加え、かげろうが消えるまでゆっくりと攪拌した。このとき、ＤＮＡは、白い綿状になった。（２０）ＤＮＡを流さないようにゆっくりと上澄みを捨てた。（２１）１ＭＮａＣｌ−ＴＥを１ｍｌ加え攪拌した。（２２）ＲＮａｓｅを５μｌ加え攪拌。（２３）ＤＮＡが完全に溶けるまで５６℃のウォーターバスに入れ、時々攪拌した。（２４）エタノールを２ｍｌ加え、ゆっくりとＤＮＡが見えるまで攪拌した。（２５）ＤＮＡをチューブに残して上澄みは捨てた。（２６）７０％エタノールを３ｍｌ加え、ＤＮＡとチューブの内壁を洗い、エタノールのみを捨てた。（２７）エタノールがなくなるまで乾かし、ＴＥをＤＮＡ量に応じて２００〜５００μｌ加え、溶けるまでゆっくりと攪拌した。（２８）ＤＮＡが完全に溶けたら溶液を１．５ｍｌチューブに移し、−２０℃の冷凍庫で保管した。
【００６９】
２．ＰＣＲ反応
（１）抽出したＤＮＡ溶液１０ｎｇをＰＣＲ用の作業液として用いた。遺伝子型識別には、サーマルサイクラー：Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を使用した。
【００７０】
（２）１．５ｍｌサンプルチューブに以下の組成のＰＣＲ反応溶液を調製した：
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２：１４μｌ
０．１ｍＭの各ｄＮＴＰ：２３μｌ
５ｐｍｏｌの各プライマー：１８μｌ
０．５Ｕ、Ａｍｐｌｉ  ＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１μｌ
×１０ＰＣＲ  Ｇｏｌｄ  ｂｕｆｆｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：２３μｌ
ｄＨ２Ｏ：１４０μｌ。
ここで、用いたプライマーの配列は、以下に示すとおりである：
８６４ｔ４−５’  ｃａｔｔｔｃａｔｇｇａｇｇｇｔｔｔｔｔｃ（配列番号１）
８６４ｔ４−３’  ｔｃｇａｇｇａｇａｔｔｇａｇｇａｔｇａｔ（配列番号２）。
８６４ｔ４−５’プライマーを上流の順方向プライマーとして、そして８６４ｔ４−３’プライマーを下流の逆方向プライマーとして使用した。
【００７１】
（３）チューブミキサーでよく撹拌し、スピンダウンした。（４）２０μｌずつＰＣＲチューブに分注した。（５）約１０ｎｇのイグサＤＮＡ溶液１μｌを各ＰＣＲチューブに加えた。ＰＣＲ反応条件は以下で行った：
（１）９４℃、５分
（２）９４℃、３０秒
（３）５０℃、３０秒
（４）７２℃、９０秒
（５）７２℃、７分。
【００７２】
３．結果
イグサ１１品種の電気泳動の結果を図１に示した。図１に示される電気泳動のレーンの番号は、それぞれ以下の品種を示す：１．あさなぎ、２．ふくなみ、３．せとなみ、４．ひのみどり、５．下増田在来、６．きよなみ、７．いそなみ、８．筑後みどり、９．岡山３号、１０．くまがわ、および１１．しらぬい。なお、Ｍは、分子量マーカー（１００ｂｐ  ＰＣＲ  Ｒｕｌｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ）を示す。図１に見られるように、「ひのみどり」では、約５５０ｂｐの位置に１本（レーン４）、それ以外の品種（レーン１〜３、５〜１１）では、３００ｂｐと５５０ｂｐの位置に２本のバンドが検出された。従って、「ひのみどり」においてのみ特異的な結果が見られ、本プライマー対を使用したＰＣＲによって、品種「ひのみどり」が識別されたことが示される。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明により、イグサの主要品種を識別するための実用的なＤＮＡマーカーが提供された。また、該ＤＮＡマーカーを指標としたイグサ品種の識別方法が提供された。本発明のイグサ品種の識別方法は、ＤＮＡ情報の品種間での違いを反映しているため、従来のような量的形質で識別する方法とは異なり、イグサの生育環境に影響されることはない。また、簡単に再現性の高い結果が得られるので、品種識別の誤認の可能性は低く、正確な品種判定を簡便・高速に実施できる。従って、本発明は、イグサの品種識別に多大な貢献をしうるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明による、イグサの品種の識別結果を示す図であって、各品種から得られたＤＮＡの電気泳動の結果を示す写真である。
【図１】
2005168310.tif 000002
【配列表】
2005168310000001.app