(57)【要約】【課題】  本発明は、ＤＮＡポリメラーゼαを選択的に阻害し得る化合物を提供することを課題とする。【解決手段】  ステロール骨格の３位水酸基を構造式［Ｘ］に変換したステロール及    びスタノールカルボン酸誘導体がＤＮＡポリメラーゼαに対する阻害活性があること    を見出し、本発明を完成した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式［Ｘ］で表されるＤＮＡポリメラーゼα阻害剤。
【化１】
2005035923.tif 000013
（式中Ｒはスチグマステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β‐シトステロール、コレステロール、コレスタノールあるいはこれらの誘導体のいずれかの側鎖部分を示す。）
【請求項２】
Ｒがスチグマステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β‐シトステロールあるいはこれらの誘導体の混合物であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼαの機能を阻害する新規な阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは4種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として鋳型ＤＮＡの塩基配列に従ってＤＮＡ鎖の重合を触媒する酵素であり、生体に広く存在している。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは核を持たない原核生物にも核を持つ真核生物にも存在する。真核生物が有するＤＮＡポリメラーゼは、分子量や生化学的な特徴及びＤＮＡ合成における機能の違いから哺乳類にはα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、λ、κ、μ、σと命名された１３種類のＤＮＡポリメラーゼの存在が確認されている。これらの分子種の具体的な機能としてＤＮＡポリメラーゼα、δ及びεは核のＤＮＡ複製用、γはミトコンドリアDNAの複製用、そしてその他の分子種は核ＤＮＡの修復に関与して、さらにβはＤＮＡ組み換え機構にも関与していることが示唆されている。しかしＤＮＡ複製・修復・組み換え反応反応におけるＤＮＡポリメラーゼの具体的な役割分担や生化学的な役割については未だ不明な点が多い。
【０００４】
一般に酵素の役割を研究するためには酵素の阻害剤を用いる方法が有用である。酵素の阻害剤が特定の酵素のみを選択的に阻害するものであれば、その生物学的機能をよりよく解明することが可能である。
【０００５】
ＤＮＡポリメラーゼαは核のＤＮＡ複製の中心に位置する非常に重要な酵素であり、世界的な要求として様々な生物種のＤＮＡポリメラーゼαのみを選択的に阻害する化合物の開発が望まれている。
【０００６】
特にＤＮＡポリメラーゼは細胞増殖に本質的に関与している酵素であるから、ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤の中から優れた特徴を有する制癌剤が開発される可能性は極めて大きい。
【０００７】
従来、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤については、特開平７−４１４９３号公報(特許文献１)、特開平８−１６５２１７号公報(特許文献２)、特開平９−２０６５７号公報(特許文献３)、特開平９−１２４６９０号公報(特許文献３)、特開２００１−１３９４７０号公報(特許文献４)及び特開２００２−２２３７５０号公報(特許文献５)等の先行文献がある。
【０００８】
しかしながら、いずれの技術も複雑な工程を経たり、高価な材料を使用したりしているため、実用に供するには難点があった。
従って、ＤＮＡポリメラーゼα阻害剤を実用的に提供する技術開発が求められている。
【０００９】
【特許文献１】特開平７−４１４９３号公報
【特許文献２】特開平８−１６５２１７号公報
【特許文献３】特開平９−２０６５７号公報
【特許文献４】特開２００１−１３９４７０号公報
【特許文献５】特開２００２−２２３７５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼαを選択的に阻害し得る化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ステロール骨格の３位水酸基を構造式［Ｘ］に変換したステロール及びスタノールカルボン酸誘導体がＤＮＡポリメラーゼαに対する阻害活性があることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
(１)構造式［Ｘ］で表されるＤＮＡポリメラーゼα阻害剤、
【００１３】
【化１】
2005035923.tif 000002
（式中Ｒはスチグマステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β‐シトステロール、コレステロール、コレスタノールあるいはこれらの誘導体のいずれかの側鎖部分を示す。）
【００１４】
(２)Ｒがスチグマステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β‐シトステロールあるいはこれらの誘導体の混合物であることを特徴とする(１)記載のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤
である。
【００１５】
本発明における化合物はステロール骨格の３位水酸基を構造式［Ｘ］に変換した化合物であり、ステロールの種類としては植物性のステロールであるスチグマステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、β−シトステロール及びこれらの混合物あるいは動物性のステロールであるコレステロール、また構造式［Ｘ］のステロール骨格５位の二重結合が飽和されたコレスタノールも本発明の化合物に含まれる。
【００１６】
本発明の請求項に示した構造の化合物の合成法は、ステロールエチレングリコール誘導体の酸化反応により誘導することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、細胞増殖に本質的に関与しているＤＮＡポリメラーゼαの役割を解明することに資する。これによって、制癌剤の開発に有用な情報を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明のＤＮＡポリメラーゼα阻害剤について詳細に説明する。はじめに本発明の特許請求の範囲に記載された化合物の合成例を示す。
【実施例１】
【００１９】
【化２】
2005035923.tif 000003
【００２０】
ｉ-Stigmasteryl  methyl  eter  [I]〔J．A．Steele，E．Mosettig，Journal  of  Organic  Chemistry，28，571（1963）〕1.00ｇをアセトニトリル20mlに溶解し、エチレングリコール10mlとカンファースルホン酸100mgを加え2時間還流攪拌する。薄層クロマトグラフィーで原料が消失したことを確認し、反応混合物を室温まで冷却する。トルエン100mlを加え、飽和食塩水100mlで3回洗浄する。有機相を濃縮し、粗生成物1.50gを得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（100ｇ、展開溶媒：トルエン/酢酸エチル＝３：１）で精製し、スチグマステロールエチレングリコール誘導体[II] 0.91gを白色粉末として得た。本化合物［II］の機器分析結果は以下の通りである。
【００２１】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.73（トルエン/酢酸エチル＝１：５）
1Ｈ-ＮＭＲ（400ＭＨｚ）：0.69（ｓ，３Ｈ），0.79（ｄ，Ｊ＝7.0，6Ｈ），0.80（ｔ，Ｊ＝7.0，1Ｈ），0.84（ｄ，Ｊ＝7.0，3Ｈ），1.00（ｓ，3Ｈ），1.02（d，Ｊ＝7.0，3H），3.15‐3.24（ｍ，1Ｈ），3.57（ｔ with fine coupling，Ｊ＝4.5，2Ｈ），3.72（ｔ with fine coupling，Ｊ＝4.5，2Ｈ）5.01（dd，Ｊ＝14.0，8.5，1Ｈ），5.15（dd，Ｊ＝14.0，8.5，1Ｈ）and 5.33‐5.37（ｍ，1Ｈ）
13C-ＮＭＲ（100ＭＨｚ）：12.03，12.23，18.96，19.35，21.04，21.06，21.20，24.34，25.39，28.42，28.90，31.87（2C），31.91，36.87，37.17，39.10，39.67，40.47，42.21，50.19，51.22，55.95，56.86，62.10，68.92，79.44，121.74，129.27，138.30，and140.71
Mass（ｍ/ｚ，％）：456（Ｍ+，9），394（100），379（8），351（12），255（33）and 159（13）
ＩＲ（cm-1）：3465，2935，1635，1460，1380，1365，1105  and  970
m.p.（℃）：153〜154
上記化合物［II］から本発明の化合物［III］が生成される。
【００２２】
【化３】
2005035923.tif 000004
【００２３】
構造式［II］に示したスチグマステロールエチレングリコール誘導体500mgをアセトン
50mlに溶解し、氷冷下Jones試薬（酸化クロム0.2ｇ、硫酸0.2ｇ、水1mL）を15分かけて滴下し、氷冷化1.5時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料が消失したことを確認し、イソプロピルアルコール1mLを加え、過剰の試薬を失活させた。酢酸エチル100mLを加え、ｐHが中性になるまで飽和食塩水で洗浄を行った。得られた有機層を濃縮し、粗生成物800mgを得た。トルエン30mLを加え、60℃に加温溶解後氷冷し結晶を析出させる。得られた結晶を濾過し、目的物である構造式［III］に示したスチグマステロールカルボン酸誘導体500mgを得た。本化合物［III］の機器分析結果は以下の通りである。
【００２４】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.33（トルエン/メタノール＝５：１）
1Ｈ-ＮＭＲ（400ＭＨｚ）：0.69（ｓ，３Ｈ），0.79（ｄ，Ｊ＝0.70，6Ｈ），0.80（ｔ，Ｊ＝0.70，1Ｈ），0.84（ｄ，Ｊ＝0.70，3Ｈ），1.00（ｓ，3Ｈ），1.02（d，Ｊ＝0.70，3H），3.26‐3.35（ｍ，1Ｈ），4.14（ｓ，2Ｈ），5.01（dd，Ｊ＝14.0，8.5，1Ｈ），5.15（dd，Ｊ＝14.0，8.5，1Ｈ）and  5.34‐5.39（ｍ，1Ｈ）
13C-ＮＭＲ（100ＭＨｚ）：12.02，12.23，18.96，19.30，21.03，21.06，21.19，24.33，25.38，28.09，28.88，31.85（2C），36.76，36.94，38.67，39.61，40.46，42.19，50.10，51.22，55.93，56.81，65.17，80.49，122.44，129.29，138.26，139.86  and  172.99
Mass（ｍ/ｚ，％）：470（Ｍ+，4），394（100），379（8），351（16），255（32）and 159 （16）
ＨＲＭＳ：ｍ/z  470.3779，calcd  for C31H50O3 470.3760
ＩＲ（cm-1）：3500〜2500，2935，1730，1460，1380，1270，1145  and  970
m.p.（℃）：191〜192
【００２５】
実施例１は請求項１におけるスチグマステロールの場合であるが、ブラシカステロール、カンペステロール、β‐シトステロール及びこれらの混合物も同様に合成に供することができ、更にコレステロールについても同様である。また以上のステロール化合物のステロール骨格５位の二重結合が飽和されたスタノール化合物も同様に合成に供することができる。勿論、これらの誘導体についても同様である。
【００２６】
DNA複製に関するDNAポリメラーゼとしては、α、δ及びεがあるが、そのうち、本発明のDNAポリメラーゼ阻害剤は、δ及びεに対してほとんど阻害活性を有しないのに対して、αのみに極めて高い阻害活性を有するという特徴がある。
【００２７】
また、本発明のDNAポリメラーゼα阻害剤は、哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ウシ）のDNAポリメラーゼαに対して高い阻害活性を有し、さらに昆虫（例えば、キイロショウジョウバエ）のDNAポリメラーゼαに対しても高い阻害活性を有する。キイロショウジョウバエのDNAポリメラーゼδ及びεについては哺乳動物と同様に阻害活性を有しない。
【実施例２】
【００２８】
阻害活性の比較
以下の例において、DNAポリメラーゼ活性は、鋳型-プライマーDNAとしてpoly(dA)/oligo(dT)12-18（アマシャム社）を、ヌクレオチド基質として[3H]-TTP（アマシャム社）を用いて実施した。
【００２９】
下記の3種類の純物質（化合物１、２及び３）及びA、B、C及びDの２：２９：１４：５３の割合での混合物について具体的にDNAポリメラーゼαに対する阻害効果の検討を行った。
【００３０】
【化４】
2005035923.tif 000005
【００３１】
【化５】
2005035923.tif 000006
【００３２】
【化６】
2005035923.tif 000007
【００３３】
【化７】
2005035923.tif 000008
【００３４】
【化８】
2005035923.tif 000009
【００３５】
【化９】
2005035923.tif 000010
【００３６】
【化１０】
2005035923.tif 000011
【００３７】
ヒト白血病培養細胞Molt4から抽出精製したDNAポリメラーゼα、δ及びε、及びE.coli BL21 （DE3）から精製した組み換えラットDNAポリメラーゼβ及びマウスDNAポリメラーゼλに対する化合物１、２、３及びABCD混合物の阻害活性の測定をした。
【００３８】
化合物１、２、３及びABCD混合物を各濃度にジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を準備し、30秒間超音波処理をした。得られた処理試料に上記各酵素用の反応液、各種酵素と混合し、10分間0℃に維持し、その後、37℃で60分間インキュベートした。化合物１、２及び３各々が非存在下の活性を100%として、各濃度における残存阻害活性を求めた。
【００３９】
DNAポリメラーゼαに対する阻害曲線を図１に示す。（化合物１、２、３及びABCD混合物）
各々の酵素に対する阻害活性（IC50）を示す。
【００４０】
【表１】
2005035923.tif 000012
【００４１】
上記の表１及び図１から、カルボキシル基を有するステロール化合物は、哺乳動物DNAポリメラーゼα対して化合物１は28μM, 化合物2は20μM, 化合物3は8μM、ABCD混合物は17μMの濃度で50%阻害活性を示し、全ての化合物は50μMでほぼ完全に阻害することがわかる。
【００４２】
また、表１からDNAポリメラーゼα、β、δ、ε及びλのうちαのみに阻害活性があることがわかる。
【実施例３】
【００４３】
阻害機序の検討
化合物１、２、３及びABCD混合物のDNAポリメラーゼαに対する阻害機序を調べた。
１）DNA鋳型-プライマーDNA及びdTTP基質について、それぞれLineweaver-Burkのプロットを求めた結果、化合物１、２、３及びABCD混合物はすべてDNA鋳型に対して拮抗的に作用し、基質に対して非拮抗的に作用することを確認した。
２）ヒトDNAポリメラーゼαのサブユニットのうちDNA合成能を有するサブユニットp180と一本鎖DNA（M13 DNA (TAKARA)）を用いて、化合物１、２、３及びABCD混合物との相互作用をゲルシフト分析により調べた。
【００４４】
その結果、化合物１、２、３及びABCD混合物は１分子の一本鎖DNAと拮抗すること、及びDNAポリメラーゼαにあるDNA結合部位に直接結合することにより酵素阻害することが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】DNAポリメラーゼαに対する阻害曲線を示す図である。
【図１】
2005035923.tif 000014