(57)【要約】【課題】  癌の処置に有用な、新規ナチュラルキラー細胞刺激因子を提供すること。【解決手段】  発現制御配列と共同的に機能する特定のＤＮＡ（明細書に開示された特定のアミノ酸配列または当該アミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入および／または置換したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ）で形質転換された哺乳類または細菌細胞を培養することによって、目的とするナチュラルキラー細胞刺激因子を産生させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血白血球でのガンマインターフェロンのインビトロ産生を誘導する能力があり、実質的に他の蛋白性物質が存在しないナチュラルキラー細胞刺激因子蛋白。
【請求項２】
見かけ上の分子量約４０ｋＤであり表１と同じまたは本質的に同じアミノ酸配列をもつサブユニットを含む請求項１記載の蛋白。
【請求項３】
見かけ上の分子量約３０−３５ｋＤであり表２と同じまたは本質的に同じアミノ酸配列をもつサブユニットを含む請求項１記載の蛋白。
【請求項４】
ガンマインターフェロン誘導測定で特異的活性が１×１０７希釈単位／mgより大であることにより生物学的に特徴付けられる請求項１記載の蛋白。
【請求項５】
以下の特徴を１個またはそれ以上持つ請求項１記載の蛋白：
（1）ＳＤＳＰＡＧＥで非還元条件下で見かけ上分子量が約７０−８０ｋＤ；
（2）サブユニットがＳＤＳＰＡＧＥで非還元条件下で見かけ上分子量が約４０ｋＤ；
（3）サブユニットがＳＤＳＰＡＧＥで非還元条件下で見かけ上分子量が約３０−３５ｋＤ；
（4）等電点電気泳動ゲルで等電点が４.３；
（5）等電点電気泳動ゲルで等電点が４.８；
（6）ヒドロキシルアパタイトカラムから単一ピークとして溶出；
（7）ヘパリン−セルロースカラムから単一ピークとして溶出；
（8）ＦＰＬＣ  Ｍono−Ｑカラムから単一ピークとして溶出；
（9）ＰＢＬsとのガンマＩＦＮ誘導分析で生物学的活性
（10）ＰＢＬsとのＧＭ−ＣＳＦ誘導分析で生物学的活性
（11）白血病および腫瘍誘導細胞を殺すＮＫ細胞の活性化で生物学的活性
（12）ＰＨＡ活性化Ｔリンパ球を使用した腫瘍壊死因子誘導測定で生物学的活性；
（13）末梢血Ｔリンパ球において共同マイトジェン作用。
【請求項６】
ＲＰＭＩ８８６６由来順化培地をＱＡＥゼータプレプカートリッジ、レンズ豆（ヒラマメ）レクチンカラム、ヒドロキシアパタイトカラム、ヘパリンセファロースカラムおよび高速蛋白液体クロマトグラフィーＭono−Ｑカラムにより連続精製に付することを含み、ＮＫＳＦは後者のカラムから単一ピークとして溶出する、均質ＮＫＳＦの製造方法。
【請求項７】
さらにＭono−Ｑカラム溶出物をゲル濾過クロマトグラフィーに付すことを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
所望により逆相ＨＰＬＣ精製を上記ゲル濾過クロマトグラフィー前に行ってもよい請求項６記載の方法。
【請求項９】
発現制御配列と機能的に結合するＮＫＳＦまたはそのサブユニット発現コード化ＤＮＡ配列で形質転換した細胞系を培養することを含むＮＫＳＦまたはそのサブユニットを製造する方法。
【請求項１０】
上記ＤＮＡ配列が表１と同じまたは実質的に同じ配列、またはその断片を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
上記ＤＮＡ配列が表２と同じまたは実質的に同じ配列、またはその断片を含む請求項９記載の方法。
【請求項１２】
配列が
（a）表１の配列；
（b）表２の配列；
（c）それらの断片；
（d）それらとハイブリダイズできる配列
からなる群から選択された配列と同じまたは実質的に同じヌクレオチド塩基の配列を含むＮＫＳＦまたはそのサブユニットをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１３】
発現制御配列と機能的に結合する請求項１２記載のＤＮＡ配列で形質転換した細胞。
【請求項１４】
哺乳類または細菌細胞を含む請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
ガンマインターフェロン誘導分析において蛋白１ｍｇ当たり１×１０７希釈単位より大な特異的活性を持つ均質ＮＫＳＦ。
【請求項１６】
薬理学的に有効な溶媒中にＮＫＳＦまたはそのユニットを治療上有効な量で含む医薬組成物。
【請求項１７】
さらに治療的に有効な量の付加的サイトカイン、ヘマトポエチン、または成長因子を含む請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
上記サイトカインがＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−６からなる群から選択される請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１２記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド。
【請求項２０】
ベクターがpＮＫ４０−４である、請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
ベクターがp３５nksf１４−1−１である、請求項１９記載のベクター。
【請求項２２】
患者に有効量のＮＫＳＤまたはそのサブユニットを投与することからなる癌の処置法。
【請求項２３】
更に同時にまたは連続して上記ＮＫＳＦに加えて、ヘマトポエチン、サイトカイン、成長因子またはＮＫ細胞のＦc領域に結合できる抗体の少なくとも１種を有効量投与することを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
上記ヘマトポエチンがＩＬ−１、ＩＬ−２またはＩＬ−６である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
患者に有効量のＮＫＳＤまたはそのサブユニットを投与することからなる感染処置法。
【請求項２６】
上記感染がウィルスまたは細菌感染である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
上記感染が無応答ウィルス感染である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
上記感染がＡＩＤＳである、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
見かけの分子量が約４０ｋＤであり表１記載のアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じ配列をもつ第１のサブユニットを、見かけの分子量が約３０ｋＤであり表２記載のアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じ配列をもつ第２のサブユニットと一緒に含む、実質的に他の蛋白性物質を随伴しないナチュラルキラー細胞刺激因子蛋白。
【請求項３０】
患者に有効量のＮＫＳＦまたはそのサブユニットとＩＬ−２を投与することを含み、ＮＫＳＦとＩＬ−２の間の相乗作用が見られる、感染処置法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
これは１９８８年１１月１０日出願の米国特許出願番号第０７／２６９９４５号の一部継続出願である、１９８９年２月７日出願の係属中の米国特許出願番号第０７／３０７８１７号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明はナチュラルキラー細胞および免疫系のその他の細胞の機能を刺激する新規なサイトカイン、並びに均質な形態での因子の獲得、および組み換え遺伝子工学の技法によるそれの産生に関する。
【０００３】
本発明の背景
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は免疫系において活性なリンパ球のサブセットであり、ヒト末梢血では単核細胞の平均１５％になる［Ｇ．トリンチエリおよびＢ．ペルシア、ラボラトリー・インベスティゲーション５０巻４８９頁（１９８４年)］。表面マーカーの中でヒトＮＫ細胞の同定に用いられるものの中には、低い親和性でＩgＧ抗体のＦc断片に結合する受容体、例えばＦc−ガンマー受容体IIIまたはＣＤ１６抗原がある［Ｂ．ペルシアら、ジャーナル・オブ・イムノロジー１３３巻１８０頁(１９８４年)］。ＮＫ細胞は、腫瘍防御、腫瘍転移、ウイルス感染に対するにおいてイン・ビトロで重要な役割を果たし、正常および悪性の造血を制御することが示されている。
【０００４】
免疫系の細胞間で信号を送る制御タンパクの増大しつつある群が同定されている。これらの制御分子はサイトカインとして知られている。多くのサイトカインは、造血および免疫系の細胞の成長、発展および生物学的活性を調節することが見出されている。これらの制御分子には、全てのコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびマルチＣＳＦまたはインターロイキン−３）、インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１１）、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマー）、腫瘍壊死因子（アルファおよびベータ）および白血病阻止因子（ＬＩＦ）がある。これらのサイトカインは、骨髄、末梢血、胎児肝臓、およびその他のリンパ様または造血器官の標的細胞と、広範な生物学的活性を呈する。Ｇ．ウォングおよびＳ．クラーク、イムノロジー・トゥディ９巻５号１３７頁（１９８８年）を参照されたい。
【０００５】
特定のサイトカインの生化学的および生物学的同定および特性化は、天然の供給源、例えば血液および尿から入り得る少量の天然発生の因子により妨害された。多くのサイトカインは最近、分子的にクローン化され、異種発現され、均質になるまで精製されている。［Ｄ．メットカルフ、「ザ・モレキュラー・バイオロジー・アンド・ファンクションズ・オブ・ザ・グラニュロサイト−マクロファージ・コロニー・スティミュレーティング・ファクターズ」ブラッド６７巻２号２５７−２６７頁(１９８６年)。］これらのサイトカインにはガンマー・インターフェロン、ヒトおよびネズミＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＣＳＦ−１並びにヒトおよびネズミＩＬ−３がある。これらの精製因子のなかには造血および免疫系にイン・ビボで制御効果を示すことが見出されているものもあり、これらにはＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−２がある。
【０００６】
当業界では、免疫応答を刺激または増強でき、医薬的用途に適した、天然の供給源から精製するか、そうでなければ均質な形態で産生したさらなるタンパクの必要性が残っている。
【０００７】
本発明の簡単な要約
本発明は１つの様相において、実質的にその他の哺乳動物タンパクを含まない、ＮＫＳＦと称する新規なヒトナチュラルキラー刺激因子を提供する。活性なＮＫＳＦの見かけの分子量は約７０〜８０キロダルトンである。ＮＫＳＦの純粋な調製物は約４０キロダルトンおよび３０キロダルトンのサブユニットである２つのポリペプチドが存在することを示し、これらが会合した場合に活性ＮＫＳＦを生じる。現在では、ＮＫＳＦは大きいサブユニットと小さいサブユニットの両方が１個またはそれ以上のジスルフィド結合を介して会合することにより形成されるヘテロダイマーであると推測される。この見かけのヘテロダイマー構造は、２個の別個のサブユニットの会合により生じることができる。
【０００８】
活性で約７０〜８０キロダルトンのＮＫＳＦは、さらに、以下の表１および／または２のアミノ酸配列の全部または一部を含有するという特徴がある。さらに、９配列のアミノ酸の１個またはそれ以上が、大きいまたは小さいＮＫＳＦのサブユニットの一次配列に存在する。これらの９個のアミノ酸断片は以下に一覧表にして詳細に論じる。
【０００９】
ＮＫＳＦの大きいサブユニットポリペプチドは、見かけの分子量が４０キロダルトンであるという特徴がある。このサブユニットはさらに、表１に記載したアミノ酸配列と同じかまたは実質的に同じであるという特徴があり、Ｎ−末端配列：
Ｉle-Ｔrp-Ｇlu-Ｌeu-Ｌys-Ｌys-Ａsp-Ｖal-Ｔyr-Ｖal-Ｖal-Ｇlu-Ｌeu-Ａsp-Ｔrp-Ｔyr-Ｐro-Ａsp-Ａla-Ｐro-Ｇly-Ｇlu-Ｍet
を有する。このＮ末端アミノ酸配列は、表１のアミノ酸＃２３〜４５に相当する。このポリペプチドはさらに９個のアミノ酸の断片を６個含有するという特徴がある。
【００１０】
ＮＫＳＦの小さいポリペプチドサブユニットの見かけの分子量は約３０〜３５キロダルトンであるという特徴がある。２つのcＤＮＡ配列が小さい方のサブユニットについて同定された。２つの配列の短い方は、表２に示すプラスミドp３５nksf１４−１−１の長い配列内に実質的に含まれる。小さいサブユニットはさらに表２に記載するのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を有するという特徴があり、以下のＮ−末端配列を含有する：
Ａrg-Ａsn-Ｌeu-Ｐro-Ｖal-Ａla-Ｔhr-Ｐro-Ａsp-Ｐro-Ｇly-Ｍet-Ｐhe-Ｐro
この断片はp３５nksf１４−１−１クローンの下線を付したアミノ酸＃５７〜７０に相当する。
【００１１】
この小さいポリペプチドはさらに表２の下線を付して区別した９個のアミノ酸断片を３個含有するという特徴がある。
【００１２】
ＮＫＳＦはイン・ビトロでヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬs）のガンマーインターフェロンの産生を誘起する生物学的活性を示す。ＮＫＳＦは、等質な形態では、ガンマーインターフェロン誘導検定において、特異活性がミリグラムあたり１×１０７希釈単位以上であるという特徴があるが、詳細は以下に記載する。
【００１３】
ＰＢＬsにおけるガンマーインターフェロンの誘導に加えて、ＮＫＳＦは以下の生物学的活性を示す：
（１）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）誘導検定におけるＰＢＬsとの生物学的活性；
（２）白血病および腫瘍由来の細胞を殺すナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化における生物学的活性；
（３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）誘起検定におけるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−活性化Ｔリンパ球との生物学的活性；
（４）末梢血Ｔリンパ球との共ミトゲン活性；および
（５）ＰＢＬsでのγＩＦＮ誘導およびＰＢＬ増殖の維持におけるＩＬ−２との相乗作用。
【００１４】
本発明の別の様相には、ヒトＮＫＳＦポリペプチド、ヒトＮＫＳＦの大きいサブユニットポリペプチド、およびヒトＮＫＳＦの小さいサブユニットポリペプチドの発現をコードするcＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列がある。このような配列は上記のサブユニットおよびペプチド配列を１個またはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
本発明はまた発現調節配列と機能可能に結合したＮＫＳＦまたはＮＫＳＦサブユニットをコードするＤＮＡ配列を含有するベクターをも提供する。本発明はまた組み換えＮＫＳＦまたはそれの組み換えサブユニットの産生に使用されるこのようなベクターで形質転換した宿主細胞をも提供する。
【００１６】
本発明のさらなる様相として、組み換えＮＫＳＦタンパクを提供する。このタンパクはその他の哺乳動物のタンパク質性物質を含まず、上記物理学的、生化学的または生物学的活性または特性を１つまたはそれ以上含む上記サブユニットまたはペプチド断片を１個またはそれ以上をコードするＤＮＡ配列が存在するという特徴がある。
【００１７】
本発明の別の様相では、均質なもしくは組み換えＮＫＳＦを治療的に有効量、またはＮＫＳＦのサブユニットを１つまたは両方またはそれのペプチド断片を１つまたはそれ以上を有効量含有する医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は癌、ウイルス感染、例えばエイズ、細菌感染、およびガンマーインターフェロンの増加またはＧＭ−ＣＳＦ産生に反応するその他の疾病状態の処置方法において用いることができる。従って、一般的にこの因子は免疫機能を刺激するのが有益であろうと考えられる疾病の処置に用いることができる。
【００１８】
従って、本発明のさらなる様相は、患者にＮＫＳＦまたはそれのサブユニットを１つもしくは両方、またはそれのペプチド断片を治療的に有効量、適切な医薬用担体中で投与することにより、ナチュラルキラー細胞機能を増強すると有効である癌および／またはその他の病理学的状態を処置する方法である。これらの治療法にはＮＫＳＦまたはそれのサブユニットもしくはペプチド断片を１つもしくはそれ以上と共に、少なくとも１つのその他のサイトカイン、造血素、インターロイキン、成長因子または抗体の有効量を同時にまたは逐次的に投与することが含まれる。具体的には、ＮＫＳＦまたはそれのサブユニットの１つまたはそれ以上をＩＬ−２と共に投与すると相乗効果があることが示されている。イン・ビトロでＩＬ−２と相乗効果があるために、このインターロイキンはとりわけＮＫＳＦと組み合わせると効果的であると考えられる。
【００１９】
本発明のさらなる様相は、ＮＫＳＦまたはそのサブユニットをその他のタンパクおよびポリペプチドと混合して産生するヒトセルラインから、等質なＮＫＳＦまたはそれのサブユニットを産生する方法である。本発明が提供するこの産生方法には、ＮＫＳＦ、そのサブユニットまたはそれのペプチド断片の産生能力のある選別した細胞を培養してならし培地を得、５段階の１次精製段階を通してならし培地を精製することが含まれる。
【００２０】
本発明のベクターおよび形質転換細胞は、本発明の別の様相、すなわち、組み換えヒトＮＫＳＦタンパク、それのサブユニットまたはそれのペプチド断片を産生するための新規な方法に用いられる。この方法では、発現調節配列と機能可能に結合した、ＮＫＳＦタンパク、それのサブユニットまたはそれのペプチド断片の発現をコードするＤＮＡ配列で形質転換したセルラインを培養する。この特許請求した方法ではポリペプチドを発現させるための宿主細胞として多くの既知の細胞を用いることができる。現在のところ好ましいセルライは哺乳動物セルラインおよび細菌細胞である。
【００２１】
本発明のその他の様相および優越性は、それの好ましい態様に関する以下の詳細な説明を考慮すると明白になろう。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明が提供する新規なヒトナチュラルキラー細胞刺激因子、ＮＫＳＦは、実質的にその他の哺乳動物のタンパク質性物質が関与しない等質なタンパクまたはタンパク質性組成物である。
【００２３】
ナチュラルキラー刺激因子は、非還元条件下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約７０〜８０キロダルトンである。この７０〜８０キロダルトンのペプチドはガンマーインターフェロン誘導検定において活性である。
【００２４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０キロダルトンのバンドが、還元条件下見かけの分子量約４０キロダルトン（大きい方のサブユニット）および約３０〜３５キロダルトン（小さい方のサブユニット）の２つの小さなサブユニットを生じる。両方のサブユニットは別個に、同一のガンマーインターフェロン誘導検定において生物学的活性が、元来の７０〜８０キロダルトンの種と比較すると実質的に喪失されている。上記で同定されたアミノ末端配列はＮＫＳＦヘテロダイマーのサブユニットであると考えられている４０キロダルトンの還元種および３０〜３５キロダルトンの還元種から元来決定された。現在ＮＫＳＦは大きいおよび小さいサブユニットのジスルフィド−結合へテロダイマーであると考えられている。しかしながら、これらのサブユニットの１つまたは両方は、単独で存在する場合、生物学的活性を有することも可能である。
【００２５】
ＮＫＳＦは、少なくとも部分的に陰イオン糖タンパクである。等電点電気泳動では、ＮＫＳＦの２種は等電点が４.３および４.８であることが観察される。現在では、２種はグリコシル化パターンで異なることが推測されている。
【００２６】
ＮＫＳＦは、以下の実施例８で詳細に記載するガンマーインターフェロン誘導検定における生物学的活性により主に特性化される。ＮＫＳＦのその他の生物学的活性には、ヒト末梢血リンパ球によるＧＭ−ＣＳＦ産生を誘起する能力もある。［例えば、ＧＭ−ＣＳＦのさらなる情報に関する発行ＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９を参照されたい。］ＮＫＳＦはまた、末梢血Ｔリンパ球における種々ミトゲン、例えばレクチンおよびフォルボールジエステルのミトゲン活性に及ぼす増強効果をも有し、活性化ヒト扁桃腺Ｂセルに及ぼす成長促進効果をも有する。ＮＫＳＦはまたイン・ビトロで自然性細胞毒性検定および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）検定を用いると、白血病および腫瘍由来細胞を殺すＮＫ細胞機能を増強することも観察されている。
【００２７】
自発性細胞毒性検定では、ヒト末梢血リンパ球または精製ＮＫ細胞をＮＫＳＦの存在下、８〜１８時間恒温培養する。次いで標準５１Ｃr放出検定でリンパ球およびＮＫ細胞の、標的細胞、例えば白血病セルライン、腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線維芽細胞を融解する能力を検定する。ＮＫＳＦは、ＮＫ細胞の、このような標的細胞を融解する能力をインターフェロンアルファおよびＩＬ−２といった周知のＮＫ細胞細胞毒性活性の活性化剤に匹敵する水準で、劇的に高める［例えばＧ．トリンチエリら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン１４７巻１３１４頁（１９７８年）およびＧ．トリンチエリら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン１６０巻１１４６頁（１９８４年）を参照されたい］。
【００２８】
ＡＤＣＣ検定では、標的癌細胞はＮＫ細胞のＦＣ受容体に結合能力のある抗体例えばＩgＧ２ａ、ＩgＧ３等で被覆する。予備検定では、ＮＫＳＦの存在が、ＡＤＣＣにおける被覆腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺活性を増強するようである。［例えばＬ．Ｍ．ワイナーら、キャンサー・リサーチ４８巻２５６８〜２５７３頁（１９８８年）；Ｐ．ハーセイら、キャンサー・リサーチ４６巻６０８３〜６０９０頁（１９８８年）；およびＣ．Ｊ．ハンシクら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ８３巻７８９３〜７８９７頁（１９８６年）のＡＤＣＣに関するさらなる情報を参照されたい。］
【００２９】
ビーズに結合したヤギ抗ヒトＩgＭ抗体（アンチ−μ）で刺激した正常ヒトＢセルを用いるＢセル成長因子検定でのＮＫＳＦの予備分析により、ＮＫＳＦがＢセル成長因子活性によっても特性化できるとことが示される。この検定ではＢセル表面上のＩgＭイムノグロブリンに抗する抗体がＢセルを活性化し、Ｂセル成長因子に反応するようにさせる。［Ｃ−ＴＫ．ツェングら、ジャーナル・オブ・イムノロジー１４０巻２３０５−２３１１頁(１９８８年）を参照されたい］。このような抗体は市販で入手できる。
【００３０】
ＮＫＳＦは元来、リンフォカインの混合物を産生する市販で入手可能なセルライン［ユニバーシティー・オブ・ペンシルバニア・セル・センター］であるヒトセルライン、ＲＰＭＩ８８６６のならし培地で検出された。この因子はその他のエプスタイン・バール・ウイルス形質転換リンフォブラストイドセルラインにより、またはその他のヒトセルラインからも産生できる。ＲＰＭＩ８８６６セルラインは自発的に因子を産生するが、産生レベルはセルラインをフォルボールエステル類、例えばフォルボール・ジブチレートで処理することにより増強できる。血清を除去した細胞は、４８時間でも依然、ＮＫＳＦをその他のリンフォカインと共に産生する。ＲＰＭＩ８８６６または別のＮＫＳＦの供給源の細胞の培養方法（実施例１参照）は、当業者には周知である。
【００３１】
天然にＮＫＳＦを産生する細胞からＮＫＳＦを得る場合に用いる精製技術では以下の段階を用いる。これらの段階には、イオン交換カラム例えばＱＡＥゼータ予備カートリッジ［ＬＫＢファルマシア］を通す精製、があり、これはＮＫＳＦタンパクが陰イオン性であることを示している。２番めの精製段階はレンチル・レクチン・カラムであり、これはＮＫＳＦが少なくとも部分的に糖タンパクであることを示している。レンチル・レクチン・カラムからの溶出液はヒドロキシルアパタイトカラムを通してさらに精製し、続いてヘパリンセファロースカラムおよび高速タンパク液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）モノ−Ｑカラムを通して精製する。ＲＰＭＩ８８６６からのＮＫＳＦは、後者の３個のカラムの各々で単一のピークとして溶出された。残存する約３７キロダルトンのタンパク夾雑物を、ゲル濾過クロマトグラフィー単独で、または逆相ＨＰＬＣおよびゲル濾過クロマトグラフィーで除去する。結果的に得られた精製した等質ＮＫＳＦは実施例８のガンマーインターフェロン誘導検定で生物学的活性を検定し、ミリグラムあたり１×１０７希釈単位以上の特異活性が示された。
【００３２】
従って、均質なＮＫＳＦは上記の精製法に適用して得ることができ、このことは実施例２でＲＰＭＩ８８６６またはその他のヒトＮＫＳＦ供給源のならし培地に関して詳細に記載する。
【００３３】
ＮＫＳＦ、そのサブユニットの１つもしくは両方、またはそれのペプチド断片もまたは組み換え技術により、例えば適当な条件下、それを発現させることができる制御調節配列を有効に関与させた、大きいおよび／または小さいサブユニットをコードするＤＮＡ配列で形質転換した宿主細胞を培養することにより産生できる。
【００３４】
クローン化ＮＫＳＦおよびそのサブユニットのＤＮＡ配列は、等質なポリペプチドをトリプシン消化させることにより本来単離された。例えば、本来ＮＫＳＦに見出される９個のトリプシン処理断片は以下のように同定される：
【表１】
2005046158.tif 000002
断片４，５および６は小さい方、すなわち３０キロダルトンのサブユニット内に位置することが確認されている。これらの配列は表２に説明するp３５nksf１４−１−１クローンの下線を付したアミノ酸＃１７９−１８４、２４６−２５２および８１−８６の各々に相当する。断片１−３および７−９は、大きい方の４０キロダルトンのＮＫＳＦサブユニット内に位置することが確認されている。断片１（アミノ酸＃７５−７９）；断片２（アミノ酸＃２１９−２２４）；断片３（アミノ酸＃２３−２７）；断片７（アミノ酸＃３０３−３０８）；断片８（アミノ酸＃１２７−１３０）；および断片９（アミノ酸＃２３１−２３９）に相当するアミノ酸配列は、表１で下線を付してある。さらに、ＮＫＳＦの大きいおよび小さいサブユニットのアミノ末端配列は以下の実施例５に記載するように同定し、各々表１（＃２３−４５）および表２（＃５７−７０）で下線を付してある。
【００３５】
オリゴヌクレオチドプローブは、ＮＫＳＦのこれらのトリプシン消化産生物のアミノ酸配列をコードする全ての可能な配列を予想するための遺伝子コードを用いて合成した。同一の方法を行って、上記で同定されたＮＫＳＦの２つのサブユニットのアミノ末端配列からプローブを構築することができる。ＮＫＳＦサブユニット遺伝子はこれらのプローブを用いて同定でき、ヒトゲノムライブラリーをふるい分けできる。また別に、ＲＰＭＩ８８６６または別のＮＫＳＦの細胞供給源からのmＲＮＡを用いてＮＫＳＦの大きいおよび小さいサブユニットのポリペプチドをコードするcＤＮＡを同定するプローブでふるい分けできるcＤＮＡライブラリを作ることができる。一度cＤＮＡを同定すると、これらを発現ベクターに導入し、ＮＫＳＦ、またはそれのサブユニットの１つもしくは両方の発現系を作った。
【００３６】
このように組み換え技術を用いることにより、ＮＫＳＦの大きいおよび小さいサブユニットのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を得たが、これはトリプシン処理断片または上記で同定されたアミノ末端配列をコードするＤＮＡ配列を含有する。
【００３７】
pＮＫ４０−４と称する１つのＮＫＳＦクローンは以下の表１に示すＤＮＡおよびアミノ酸配列を有し、大きいＮＫＳＦサブユニットの全てまたは一部をコードする：
表１
pＮＫ４０−４
cＤＮＡヌクレオチドおよびアミノ酸配列、
４０キロダルトンのＮＫＳＦのサブユニット
【表２】
2005046158.tif 000003
【表３】
2005046158.tif 000004
【表４】
2005046158.tif 000005
【表５】
2005046158.tif 000006
【００３８】
プラスミドpＮＫ４０−４のこのクローン化配列はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランドに１９９０年７月３１日に受け入れ番号４０８５４で寄託した。おおよそヌクレオチド＃８８８までを含有する配列を通ってＮ末端非コード化部域を含有する、この大きい断片の先の部分的クローンをpＮＫ−６と称し、１９８９年２月３日にＡＴＣＣＮo．４０５４５でＡＴＣＣに寄託した。大きいサブユニットの別の部分的クローンであるpＮＫ１６２を配列決定すると、表１のヌクレオチド＃６４３〜２３６２の配列を含有する。このクローンはジェネティックス・インスティテュート有限会社の研究室で保存されている。
【００３９】
ＮＫＳＦの小さい（３０〜３５キロダルトン）サブユニットの配列をコードする２個の別個のcＤＮＡクローンを同定した。長いクローン（p３５nksf１４−１−１と称する）を表２に示す。短いクローン（p３５nksf９−１−１と称する）は表２および寄託配列のヌクレオチド＃１３３（＊で示す）で始まり、ヌクレオチド＃１３３５（＊で示す）で終わる。これらの２つのヌクレオチドの間では、小さいクローンは、３’非コード化部域での５ヌクレオチドの変化以外は表２の配列と同一である。従ってこの短いクローンは表２のＭet（アミノ酸＃３５）で始まるコード化配列を有する。p３５nksf１４−１−１の５’末端における付加的な配列は、p３５nksf９−１−１での有効な開始コドンのフレーム内開始コドン（ＡＴＧ）３４残基５’をコードする。
【表６】
2005046158.tif 000007
【表７】
2005046158.tif 000008
【００４０】
これらのクローンの両方は、精製ＮＫＳＦのトリプシン消化で同定されたペプチド配列の全ておよび精製３０キロダルトンサブユニットのアミノ末端配列をコードするが、これらは４０キロダルトンのサブユニットタンパクでは見出されなかった。これらの配列は表２で下線を付している。クローンは翻訳が表２のＭet＃１またはＭet＃３５で開始されるかどうかに依って、ＮＫＳＦの３０〜３５キロダルトンのサブユニットの２つの可能な翻訳物をコードする配列を含有する。しかしながら、ＮＫＳＦの３０〜３５キロダルトンのタンパクサブユニットはＡla（アミノ酸＃５６）に続く開裂により生じると考えられるので、両方の配列は同じ成熟タンパクを産生するはずである。p３５nksf１４−１−１の配列は、１９９０年９月１１日に受け入れ番号４０８８６でＡＴＣＣに寄託した。
【００４１】
【表８】
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【００４２】
表２
３０キロダルトンのサブユニットのヌクレオチドおよびアミノ酸配列
長いクローン、p３５nksf１４−１−１および短いクローン、p３５nksf９−１−１
【表９】
2005046158.tif 000010
【表１０】
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【表１１】
2005046158.tif 000012
【００４３】
p３５nksf９−１−１の配列（表２で下線を付したＰstＩ部位からブルースクリプト・ポリリンカー配列のＰstＩ部位まで）は、発現ベクターpＥＭＣ３（１）中４０キロダルトンのサブユニットを発現するプラスミドと共にＣos細胞に導入した場合、生物学的に活性なＮＫＳＦを産生した。この物質は以下で論じる天然のＮＫＳＦを試験するのに用いたのと同じ生物検定で活性であった。この配列はp３５nksf１４−１−１よりＰstＩで消化して得ることができる。また別に、短い３０〜３５キロダルトンのサブユニット配列を含有するプラスミドp３５nksf９−１−１のクローン化配列は、ジェネティックス・インスティテュート、ケンブリッジパーク、メリーランド州の研究室で保存されており、特許が賦与されたとき、公けに入手可能になるであろう。
【００４４】
より長い３０〜３５キロダルトンのサブユニット発現に適したcＤＮＡは、ＳalＩおよびＮotＩでの消化によりp３５nksf１４−１−１寄託クローンから得ることができる。長い３０〜３５キロダルトンのサブユニットには先のＭet（アミノ酸＃１）コドン、付加的な５’コード化および非コード化配列、並びに３’非コード化配列を含有する。成熟タンパク（両方のcＤＮＡによりコードされる）のＭet（アミノ酸＃３５）からＮ末端までの配列は、信号ペプチドに似た配列をコードし、サブユニットの適切な折りたたみおよび／または分泌を指示できる。従って、長い３０〜３５キロダルトンのサブユニットの配列が、短いものよりも効果的にＣos細胞により発現および分泌されることが可能である。これはまた異なって折りたたまれ、それによりＮＫＳＦの活性が４０キロダルトンのサブユニットの存在とは独立して付与される。
【００４５】
表２は寄託クローンのポリリンカー配列、並びにこのサブユニットの大きいおよび小さい翻訳物の最初と最後のヌクレオチドの配置を示す。また発現した小さいサブユニットの配列および下線を付したトリプシン処理断片の配列を得るための５’ＰstＩ部位をも示す。
【００４６】
ペプチド配列および上記の大きいおよび小さいサブユニットをコードするＤＮＡ配列のアレル化したものおよびそれのアナログまたは誘導体もまた本発明に含まれる。
【００４７】
従って、本発明はまたその他の霊長類タンパクをコードするＤＮＡ配列を随伴せず、それの大きいおよび小さいサブユニットを含むＮＫＳＦポリペプチドの発現をコードするこれらの新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列には上記で同定したＤＮＡおよびペプチド配列、並びにストリンジェントハイブリダイゼーション条件下〔Ｔ．マニアティスら、モレキュラー・クローニング（アラボラトリー・マニュアル）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(１９８２年)３８７〜３８９頁を参照されたい〕でＤＮＡ配列にハイブリダイズするこれらの配列の１つまたはそれ以上を含有するものを含む。このようなストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件の例としては、６５℃で４×ＳＳＣでハイブリダイゼーションし、続いて６５℃で０.１×ＳＳＣで１時間洗浄する。また別に、典型的なストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件は５０％ホルムアミド中４２℃で４×ＳＳＣである。
【００４８】
緩和なハイブリダイゼーション条件下、ＮＫＳＦまたはそのサブユニットの配列にハイブリダイズし、ＮＫＳＦ生物学的特性を有するＮＫＳＦペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列もまた新規なＮＫＳＦポリペプチドをコードする。このような非ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件の例としては、５０℃で４×ＳＳＣかまたは、４２℃で３０〜４０％ホルムアミドでのハイブリダイズがある。例えば、グリコシル化またはジスルフィド架橋といった重要な等質性の部域をＮＫＳＦ配列と共有し、ＮＫＳＦの生物学的特性を１つまたはそれ以上有するタンパクをコードするＤＮＡ配列は、このようなＤＮＡ配列がたとえストリンジェント的にＮＫＳＦ配列にハイブリダイズしなくても、明らかにＮＫＳＦポリペプチドをコードする。
【００４９】
同様に、ＮＫＳＦの配列によりコードされるＮＫＳＦポリペプチドをコードするが、遺伝子コードが縮重またはアレル変化する（種の集合体において天然に発生する塩基の変化で、結果的にアミノ酸変化をもたらす場合ももたらさない場合もある）ためにコドン配列が異なるＤＮＡ配列もまた、本発明に包含する。点突然変異により、または活性、半減期またはそれによりコードされるポリペプチドの産生を増強するように改変させることにより引き起こされるＮＫＳＦのＤＮＡ配列の変化もまた本発明に包含される。
【００５０】
ＮＫＳＦポリペプチドはまた、既知の通常の化学合成によっても産生できる。本発明のポリペプチドを合成手段により構築する方法は当業者に周知である。１次、２次または３次構造および配置特性をＮＫＳＦポリペプチドと共有することにより、合成的に構築したＮＫＳＦポリペプチド配列は、それと共通したＮＫＳＦ生物学的特性を有することができる。従って、これらは治療的および免疫学的方法において天然精製ＮＫＳＦポリペプチドの、生物学的活性また免疫学的代替物として用いることができる。
【００５１】
本明細書で提供するＮＫＳＦポリペプチドはまた、精製した等質な組み換えＮＫＳＦタンパクまたはサブユニットポリペプチドであるが、改変が自然に行われるか、故意に操作されたものの配列に類似した配列でコードされる因子をも含むペプチドまたはＤＮＡ配列における改変は、当業者間で周知の技術を用いて行うことができる。ＮＫＳＦ配列中の重要な改変には、コード化配列中の選別されたアミノ酸残基の置換、挿入または削除がある。このような置換、挿入または削除のための突然変異誘発技術は当業者に周知である〔例えば米国特許第４５１８５８４号を参照されたい。〕
【００５２】
本明細書に記載したＮＫＳＦポリペプチドまたはサブユニットポリペプチドの配列のその他の特異的な突然変異には、グリコシル化部位の改変がある。任意のアスパラギン連結グリコシル化認識部位で、または０−連結炭水化物の添加により改変される分子の任意の部位でのアミノ酸置換または削除の結果、グリコシル化しなかったり、部分的にしかグリコシル化しなかったりする。アスパラギン連結グリコシル化認識部位には、適当な細胞性グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンかまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここでＸは通常任意のアミノ酸である）のどちらかである。グリコシル化認識部位の１番めのまたは３番めのアミノ酸の位置の１つかまたは両方での、種々のアミノ酸置換または削除（および／または２番めの位置でのアミノ酸の削除）の結果、改変されたトリペプチド配列で非グリコシル化される。
【００５３】
このように変化したヌクレオチド配列の発現により、その部位でグリコシル化されない変種が産生される。
【００５４】
ＮＫＳＦ活性が全体的にまたは部分的に保持されているであろうと考えられるＮＫＳＦまたはそのサブユニットの配列のその他のアナログおよび誘導体もまた、本明細書に示された当業者により容易に作ることができる。そのような改変の１つは、ポリエチレングリコールの存在するリジン残基への付着または通常の技法による付着を可能にするためのリジン残基の配列への挿入である。このような改変は本発明に包含されると考えられる。
【００５５】
本発明はまたＮＫＳＦポリペプチドを産生する方法をも提供する。本発明の方法には、既知の制御配列の調節を受けながら、ＮＫＳＦポリペプチドまたはサブユニットの発現をコードするＤＮＡ配列で形質転換した適当な細胞またはセルラインを培養することを含む。両方のサブユニットの好ましいＤＮＡ配列は宿主細胞に形質転換する。
【００５６】
適当な細胞またはセルラインは、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または３Ｔ３細胞である。適当な哺乳動物宿主細胞の選別および形質転換、培養、増幅、ふるい分け並びに産生物の産生および精製の方法は当業界で周知である。例えばゲティングおよびサンブルーク、ネイチャー２９３巻６２０〜６２５頁(１９８１年)、別法としてカウマンら、モル．セル．ビオール．５巻７号１７５０〜１７５９頁(１９８５年)もしくはハウレイら、米国特許第４４１９４４６号を参照されたい。ＣＨＯ細胞における２種の異なるＤＮＡの同時発現については、例えば発行ＰＣＴ国際出願ＷＯ８８／０８０３５に記載されている。その他の適当な哺乳動物セルラインはサルＣＯＳ−１セルラインおよび元来ウィスター・インスティテュート、フィラデルヒィア、ペンシルベニア州で開発されたＣＶ−１セルラインである。
【００５７】
同様に本発明に適した宿主細胞として有用であるのは、細菌細胞である。例えば、エシェリキア・コリ（例えばＨＢ１０１、ＭＣ１０６１および以下の実施例で用いた菌株）の種々の菌株は、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞として周知である。Ｂ．サブチリス、プセウドモナス、その他の桿菌等の種々の菌株をもこの方法に用いることができる。
【００５８】
当業者に周知の酵母細胞の多くの株もまた本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用できる。さらに、望まれる場合、昆虫細胞を本発明の方法において宿主細胞として利用できる。例えばミラーら、ジェネティック・エンジニアリング８巻２７７〜２９８頁（プレナム・プレス１９８６年）およびそこで引用されている参考文献を参照されたい。
【００５９】
本発明はまた新規ＮＫＳＦポリペプチドの発現方法において使用されるベクターをも提供する。これらのベクターは本発明のサブユニットポリペプチドを含むＮＫＳＦポリペプチドをコードする新規ＮＫＳＦＤＮＡ配列を含有する。また別に、上記で記載したような改変した配列を組み込んだベクターもまた本発明の態様であり、ＮＫＳＦポリペプチド産生に有用である。この方法で用いるベクターもまた本発明のＤＮＡコード化配列と有効に関与し、選択した宿主細胞中でそれの複製および発現を指示できる選択された制御配列を含有する。
【００６０】
従って、細胞供給源から等質になるまで精製した、または組み換えもしくは合成により産生したＮＫＳＦは、医薬組成物すなわち増強されたＮＫ細胞活性またはイン・ビボでのガンマーインターフェロンもしくはＧＭ−ＣＳＦの産生増加に反応する癌またはその他の疾病状態を処置するための製剤に用いることができる。このような病理学的状態は、疾病、放射線または薬物の暴露、例えば白血病、細菌およびウイルス感染、貧血、骨髄移植後の免疫細胞または造血細胞不全を含むＢセルまたはＴセル不全の結果起こる。これらのＮＫＳＦポリペプチド組成物での癌またはその他の疾病の治療的処置によると、現在使用できる薬物での処置により引き起こされる望ましくない副作用を避けることができる。本発明によるＮＫＳＦポリペプチド組成物は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびその他のウイルス感染、とりわけ非反応性ウイルス感染および細菌感染の処置にも用いることができる。
【００６１】
このような医薬用製剤において、ＮＫＳＦのサブユニットポリペプチドもしくはそれのペプチド断片の１つまたは両方を用いることも可能である。
【００６２】
本発明のポリペプチドはまた、単独でまたはその他のサイトカイン、造血素、インターロイキン、成長因子もしくは抗体と組み合わせて、癌またはその他の疾病状態の処置に用いることもできる。例えばＮＫＳＦポリペプチドをＩＬ−２と連結させて投与した場合、相乗効果があることが示されている。これは感染、とりわけウイルス感染および癌の処置に有用であると考えられる。これらの新規ポリペプチドのその他の用途は、標準方法により診断または治療用に発生させたモノクローナルおよびポリクローナル抗体の開発である。
【００６３】
従って、本発明のまた別の様相は、上記で言及した状態の処置のための方法および治療用組成物である。このような組成物には、本発明のＮＫＳＦタンパクもしくはサブユニットポリペプチドまたは治療的に有効なそれの断片の治療的に有効量を医薬的に許容されうる担体と混合したものを含む。この組成物は非経口的に全身的に投与できる。また別に、この組成物は静脈内投与できる。望まれる場合は、この組成物は静脈内投与できる。全身的に投与する場合、本発明で用いられる治療用組成物は、発熱物質不含の非経口的に許容され得る水性溶液の形態である。このような医薬的に許容され得るタンパク溶液の調製物は、pＨ、等調性、安定性等を十分に考慮して、当業界の技術の範疇である。
【００６４】
上記の状態を処置する方法において用いられる投与計画は、薬物の作用を変化させる種々の因子、例えば患者の病状、体重、性別および食事、感染の重篤度、投与回数並びにその他の臨床因子を考慮して担当の内科医により決定されるであろう。一般に、１日の投与計画はＮＫＳＦタンパクもしくはそれのサブユニット１〜１０００μgまたは体重１kgあたりタンパク５０〜５０００単位（すなわち、１単位／mlはガンマーインターフェロン誘導検定において最大刺激の半分まで刺激するタンパク濃度である）の範囲内にすべきである。
【００６５】
本発明の治療方法および組成物には、その他のヒト因子との併用投与も含まれる。このような用途のための典型的なサイトカインまたは造血素には、既知の因子、とりわけＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−６がある。〔例えばＰＣＴ公開ＷＯ８５／０５１２４、およびＷＯ８８／００２０６；並びにヨーロッパ特許出願第０１８８８６４号を参照されたい。〕その他のＮＫＳＦ治療への参入の強力な候補には、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−１１またはエリトロポエチンも含まれ得る。Ｂ細胞成長因子のような成長因子、Ｂセル分化因子または好エオシン分化因子もまたＮＫＳＦと併用投与するのが有用であることが解明できている。
【００６６】
同様に、ＮＫＳＦもしくはサブユニットまたはそれの断片を、ＮＫ細胞のＦc受容体に結合する能力のある抗体と一緒に、またはこれに先んじて投与すると、腫瘍に抗することを目的としたＡＤＣＣ治療を増強できる。上記で列挙した投与量は、治療用組成物中のこのような付加的な成分のために補整されよう。処置した患者の改善は、通常の方法で監視する。
【００６７】
以下の実施例は、本発明の均質なヒトＮＫＳＦの精製および特性並びにその他の方法および産生物を説明するために記載する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６８】
実施例１．血漿無含有ＲＰＭＩ８８６６細胞順化培地の製造
ヒトＢ−類リンパ球芽細胞系（lymphoblastoid cell line）ＲＰＭＩ８８６６を５％熱不活化胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。血漿無含有順化培地の製造のために、細胞を洗浄し、１０−７Ｍフォルボール−１２−１３−ジブチラート（ＰdＢＵ）を含む血漿無含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁（１０６セル／ml）し、４８時間３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞無含有上清を０.２μmフィルター［ドラポア（商標）親水性カートリッジフィルター、ミリポア、ベッドフォード、ＭＡ］を通して濾過により採取し、トゥィーン−２０およびフェニルメチルスルホニル−フルオリド（ＰＭＳＦ）を０.０２％および０.１mＭにそれぞれ加えた。ついで、細胞順化培地を、限外濾過カートリッジ［スパイラル−ウンド、Ｓ１、アミコン、ダンバース、ＭＡ］を使用して加圧下５０倍に濃縮した。
【００６９】
実施例２．順化培地からＮＫＳＦの精製
下記の製造法は、現在、上記の実施例１と同様に、ＲＰＭＩ８８６６順化培地から相同ＮＫＳＦタンパク質を得るために使用されている。
【００７０】
ａ．アニオン交換カートリッジクロマトグラフィー
粗濃縮順化培地の２リットルを、６m Ｏs／cmの伝導度まで蒸留水で希釈し、１Ｍトリス−ＨＣl緩衝液（pＨ８）でpＨ８に調整した。ついで、濃縮物を、流速１５０ml／分で平行に連結されている、および０.１Ｍトリス−ＨＣl緩衝液（pＨ８）で前以て平衡化した５個のＱＡＥゼタプレップ２５０カートリッジ［ファルマシア］に適用した。特に断らない限り、精製に使用した緩衝液すべては０.０２％トゥィーン−２０および０.１mＭ ＰＭＳＦを含有した。カートリッジを０.１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液３リットルで洗浄し、ついで０.１トリス−ＨＣl緩衝液（pＨ６.８）中０.５Ｍ ＮaＣl １.５リットルで洗浄し、画分３００mlを捕集した。ＮＫＳＦ活性を０.５Ｍ ＮaＣl含有洗浄液で溶出した。
【００７１】
ｂ．レンチル−レクチンセファロースクロマトグラフィー
２種の別個のＱＡＥゼタプレップ溶出液から溜めたＮＫＳＦ−含有画分を集め、２０mＭ トリス−ＨＣl緩衝液（pＨ７.２）で平衡化されているレンチル−レクチンセファロース４Ｂ［ファルマシア］のカラム（２.５×１５cm）に直接適用した。カラムの５倍容量の平衡化緩衝液で洗浄後、カラムをカラムの３倍容量の０.２Ｍ α−メチル−Ｄ−マンノピラノシド［シグマ］および０.５Ｍ ＮaＣl含有２０mＭトリス−ＨＣl緩衝液（pＨ７.２）で溶出した。ＮＫＳＦの約半分の活性がカラムにより結合し、α−メチルＤ−マンノピラノシドで溶出した画分中に回収した。
【００７２】
ｃ．ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
レンチル−レクチンセファロースカラムに結合したＮＫＳＦ活性のプールから濃縮した試料を０.１ｍＭＣaＣl２および０.１５Ｍ ＮaＣlを含む１mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ６.８）で透析し、０.１mＭＣaＣl２を含む１mＭリン酸カリウム緩衝液で前以て平衡化したバイオゲルＨＴ［バイオラッド］カラム（２×５cm）に適用した。カラムを平衡化したカラムの５倍容量の緩衝液で洗浄し、０.１５Ｍ ＮaＣlを含む１mＭ〜４００mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ６.８)の直線勾配１００mlで溶出した。画分４mlを捕集し、ＮＫＳＦ活性を試験した。活性の単一ピークが約２００mＭ〜３００mＭリン酸カリウム間でカラムから現れた。
【００７３】
ｄ．ヘパリンセファロースクロマトグラフィー
バイオゲルＨＴカラムから溶出したＮＫＳＦ−含有画分を溜め、２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７.２）で透析し、ヘパリンセファロース［ピアース、ロックファード、ＩＬ］カラム（１×１０cm）に適用した。カラムを２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７.２）の５倍容量で洗浄し、１Ｍ ＮaＣlを含む同じ緩衝液で溶出した。画分３mlを捕集し、ＮＫＳＦ活性を測定した。本質上活性すべてをヘパリンカラムにより結合し、１Ｍ ＮaＣl洗浄液中に回収した。
【００７４】
ｅ．モノＱクロマトグラフィー
ヘパリンセファロールカラムから溜めた画分を１％エチレングリコールおよび０.１mＭ ＰＭＳＦを含み、トゥィーン２０を含まない２０mＭトリス−ＨＣl（緩衝液Ａ）で透析し、ＹＭ１０膜で撹拌した細胞［アミコン］を使用して２mlに濃縮した。試料をモノＱ（５／５）カラム［ファルマシア−ＦＰＬＣ装置］に適用し、緩衝液Ａ（pＨ６.８）中直線勾配０Ｍ〜１Ｍ ＮaＣlで溶出した。画分０.５ｍｌを捕集し、ＮＫＳＦ活性を試験した。活性は約２２０mＭ〜２７０mＭ ＮaＣlの単一ピークとしてカラムから現れた。
【００７５】
ｆ．ゲル濾過クロマトグラフィー
モノＱカラムからＮＫＳＦ活性を含む溜めた画分をスピードバック濃縮機［サバント、ファルミングデール、ＮＹ］により１００マイクロリットルに濃縮し、ＦＰＬＣスパローズ１２カラムに適用した。クロマトグラフィーを０.１５Ｍ ＮaＣl、１％エチレングリコールおよび０.１mＭ ＰＭＳＦを含む５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ７.２)で行った。流速は０.６ml／分であり、画分０.５mlを捕集した。ＮＫＳＦタンパク質を約３７ｋＤタンパク質混合物から分離した。
別法として、溜めたモノ−Ｑ画分を上記の工程（ｆ）より前に逆相ＨＰＬＣ（Ｃ８カラム）に入れ、活性７０ｋＤタンパク質からタンパク質を分離することができる。
【００７６】
実施例３．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを１０％アクリルアミドスラッブゲル（厚さ０.７５mm）でラエミリの方法［ラエミリ、Ｕ．Ｋ．ネイチャー、第２２７巻、６８０〜６８５頁(１９７０年)］により行った。電気泳動後、ゲルを銀染色剤［バイオラッド］を使用して硝酸銀法で染色するか、２mm薄片にし、４時間２４℃で０.５mlのＲＰＭＩ培地で溶出し、ＮＫＳＦ活性を分析した。見掛け分子量をタンパク質標準、ホスホリパーゼｂ（９４ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤ）、オバルビン（４３ｋＤ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０ｋＤ）、大豆トリプシン阻害剤（２０ｋＤ）、およびラクトアルブミン（１４.４ｋＤ）で測定した。
【００７７】
ＮＫＳＦ活性前に溶出する数種の画分で始め、ついで活性画分を通して適当に行い、ＮＫＳＦ活性ピーク後に溶出する画分で終わるモノＱカラム画分（実施例２、工程（ｅ））ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元状態）は、２種のタンパク質（７０ｋＤおよび３７ｋＤ）の存在が種々のモノＱ画分中ＮＫＳＦ活性の存在と関係することを示した。活性画分を第２の非還元ゲルに再度移し、タンパク質を７０ｋＤおよび３７ｋＤバンドに対応する領域から溶出し、ＮＫＳＦ活性を試験した。活性すべては、７０ｋＤ種と関連し、このタンパク質がＮＫＳＦであることを示した。
【００７８】
７０ｋＤ種をゲルから溶出し、クロラミンＴ［シグマ、セント・ルイス、ＭＯ］を使用してヨウ素化し、還元剤β−メルカプトエタノール（１０％）の存在下２分間煮沸後、第２ＳＤＳゲル上で再度行った。
それらの条件下、７０ｋＤ種を分子量４０ｋＤおよび３０ｋＤの２種の別のサブユニットに分解し、未変性ＮＫＳＦはそれらサブユニットポリペプチドのジスルフィド結合ヘテロダイマーであり得ることを示している。あるいは、ＮＫＳＦはより大きいまたはより小さいサブユニットの多重化により生成したダイマーであり得る。未変性７０ｋＤ ＮＫＳＦの還元はその活性のすべてを破壊し、ガンマインターフェロンの末梢血リンパ球製造を誘発すると思われた。
【００７９】
実施例４．タンパク質の回収
ＲＰＭＩ８８６６細胞無含有順化培地の５００リットルで開始し、モノＱカラムから最後に溜めた活性画分は、同じゲルで同時に分析した対照タンパク質で銀染色の強さにより評価したところタンパク質約１０μgを含んでいた。これの約６μgは７０ｋＤ ＮＫＳＦタンパク質に相当した。７０ｋＤ ＮＫＳＦの推定特異的活性は１×１０７ｕ／mgである。生成物におけるＮＫＳＦ活性の全回収率は２％であった。
【００８０】
実施例５．ＮＫＳＦタンパク質組成物
相同ＮＫＳＦを上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施例と同様に還元し、トリプシンで分解した。別法として、非還元ＮＫＳＦを逆相ＨＰＬＣカラムから得、トリプシンで消化し得る。以下のアミノ酸配列を含む９種のトリプシン断片を分離する：
【表１２】
2005046158.tif 000013
【００８１】
更に、ＮＫＳＦの各ユニットのアミノ酸末端のアミノ酸配列を、実施例３に記載と同様に、還元後、ＮＫＳＦの分離した４０ｋＤおよび３０ｋＤ種から決定した。４０ｋＤサブユニットからのアミノ酸末端配列は、以下のとおりであった：
【表１３】
2005046158.tif 000014
上記アミノ酸末端配列および断片１〜３および７〜９が、上記の第１表に示したより大きいサブユニットのクローンのアミノ酸配列から由来することが判明した。  ３０ｋＤより小さいサブユニットからのアミノ酸末端配列は以下のとおりであった：
【表１４】
2005046158.tif 000015
断片４、５および６は上記の第２表に記したより低いサブユニットのクローンのアミノ酸配列から由来することが判明した。
【００８２】
オリゴヌクリオチドのプールまたは独特のオリゴヌクリオチドからなるプローブは、Ｒ．ラス、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１８３（１）巻：１〜１２（１９８５年）の方法で設計する。オリゴヌクレオチドプローブを自動ＤＮＡ合成機で合成する。
【００８３】
遺伝子コードが縮重しているため（１個以上のコドンは同じアミノ酸をコードし得る）、トリプシン断片のアミノ酸配列をコード化するすべての可能なヌクレトチド配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を合成しなければならない。幾つかのコドンが真核性遺伝子にほとんど使用されないために、および真核性コード化配列におけるジヌクレオチドＣpＧが相対的にまれである［Ｊ．トール等、ネーチャー、第３１２巻、３４２〜３４７頁（１９８４年）］ために、コドン使用を基礎とするプローブ混合物におけるオリゴヌクレオチドの数を減少することは可能であり得る。プローブ設計に使用したアミノ酸配列の領域をもし可能なら高度に縮重したコドンを避けて選択する。オリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成機で合成し、ついでプローブをポリヌクレオチドキナーゼおよび３２Ｐ−ＡＴＰで放射能標識化する。
【００８４】
ＮＫＳＦの小さいサブユニットをコード化するcＤＮＡを、定着している技術（上記で引用のトール等参照）を使用してＰdＢu誘発８８６６細胞（ユニバーシティ・ペンシルバニア・セル・センター）からのポリアデニル化ＲＮＡから作ったｃＤＮＡラリブラリー（ラムダＺapで製造；ストラタジークローニングシステム、ラ・ジオラ、ＣＡ）をスクリーニングして同定した。スクリーニングを、プローブとして４０ｋＤタンパク質をコード化する以前クローン化されたｃＤＮＡ中に含まれないそれらトリプシンペプチドにより予測された配列を有するオリゴヌクレオチドを使用して行った。このライブラリーからの組換え型をプレートに置き、プレートでつくられたニトロセルロースを複製する。オリゴヌクレオチドを３２ＰガンマＡＴＰで切断し、複製をハイブリダイズする。
【００８５】
特に、オリゴヌクレオチドの２種のプールをペプチドＶａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａに基づいて合成した。１７量体の１種のプールの配列はペプチドＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａから、第２のものはＶａｌ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎから誘導した。オリゴヌクレオチドの第１のプールにハイブリッドしたクローンを第２プールでハイブリッドした。３Ｍ ＴＭＡＣを含む緩衝液中４８℃でハイブッリドした。フィルターを連続して３Ｍ ＴＭＡＣ、５０mＭトリスpＨ８、５０℃で洗浄した。［Ｋ．Ａ．ジャコブ等、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ、第１６巻：４６３７〜４６５０頁（１９８８年）、参照］複製共に陽性のものをプラーク精製した。両方のプール、上記のp３５nksf９−１−１およびp３５nksf１４−１−１にハイブリダイズした２種のクローンを同定した。
【００８６】
配列およびコンピューターによる翻訳を第２表に示す。４０ｋＤサブユニットタンパク質中に発見されなかった精製ＮＫＳＦのトリプシン消化物において同定したすべてのペプチド配列（下線部）および精製３０ｋＤサブユニットのアミノ酸末端配列（下線部）を含む。
【００８７】
ＮＫＳＦ４０ｋＤサブユニットの完全な長さのｃＤＮＡを得るために、８８６６ポリアデニル化ＲＮＡから先に製造したｃＤＮＡを上記と同様にλＺＡＰへクローン化した。このライブラリーから２０００００個の組み換え型をプレートし、複製ニトロセルロースフィルターを製造し、pＮＫ−６内に存在する配列であるランダムにプライムされた３２Ｐ標識化ＤＮＡ断片をスクリーニングした。プローブ実験を標準的ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用しておこなった。プラークを再プレートし、上記のプローブおよび条件を使用して再プローブし、プラークをクローン分離した。ついで３種の分離物を３２Ｐ末端標識化オリゴdＴプローブ（pd（Ｔ）１２−１８、ファルマシア）でプローブ化した。このハイブリダイゼーションを６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルズ溶液、およびキャリヤーＤＮＡプラス標識プローブ中室温で行った。３種の分離物中の１種のpＮＫ１６２はオリゴdＴプローブにハイブリダイズし、配列決定した。
【００８８】
標準制限消化およびサブクローン化技術を使用して、ＮＫＳＦクローンpＮＫ−６およびpＫＮ１６２を転写および翻訳のフレーム内で共にサブクローン化し、ＣＯＳ発現のpＸＭ発現ベクターへ結合した。生じたクローンであるpＮＫ４０−４（第１表）は、４０ｋＤ ＮＫＳＦサブユニットの完全な長さのcＤＮＡを含むと思われる。
【００８９】
実施例６．組み換え型ヒトＮＫＳＦの発現
ＮＫＳＦを製造するために、そのサブユニットをコード化するＤＮＡを、標準分子生物学技術により、多くのタイプが哺乳類、昆虫、酵母、真菌、および細菌の発現について公知である適当な発現ベクターに移送する。哺乳類細胞のそのようなベクターの１種は、ｐＸＭ［Ｙ．Ｃ．ヤン等、セル、４７：３ー１０頁（１９８６年）］である。このベクターは、哺乳類の細胞中で所望のｃＤＮＡの高濃度発現をもたらすに適当な関係で、ＳＮ４０複製開始点およびエンハンサー、アデノウイルス主遅滞プロモーター、アデノウイルストリパルタイトリーダー配列のｃＤＮＡコピー、小ハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウイルスＶＡＩ遺伝子を含む［参照、例えば、コフマン、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユエスエー、８２巻：６８９〜６９３頁（１９８５年）］。pＸＭベクターをエンドヌクレアーゼ酵素ＸhoＩで直線化し、ついでＮＫＳＦの各サブユニットの発現用構築物を生成すためにＸhoＩ相補的末端を生成する合成オリゴヌクレオチド［コラボラティブ・リサーチ、レキシントン、ＭＡ］を加えて前もって修飾したＮＫＳＦサブユニットをコード化するｃＤＮＡに別々に当量を結合する。
【００９０】
哺乳類発現用のもう１つのベクターpＥＭＣ３（１）を下記のようにpＥＭＣ２ＢＩベクターの単純な修飾により生成し得る。pＥＭＣ３（１）は、ポリリンカー領域中の３種の制限部位ＳmaＩ、ＳalＩ、ＸbaＩによりpＥＭＣ２ＢＩと異なる。pＥＭＣ３（１）を生成するために、これら３種の制限部位を常法によりpＥＭＣ２Ｂ１のＰstＩとＥcoＲＩ制限部位の間に挿入した。
【００９１】
pＥＭＣ２Ｂ１は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーランド（アメリカ合衆国）に、受託番号ＡＴＣＣ４０３４８で寄託されているpＭＣＴ２pcから誘導し得る。ＤＮＡはＰstＩによる消化により、直線化される。ＤＮＡはそれからＴ４ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて鈍端にする。オリゴヌクレオチド
【表１５】
2005046158.tif 000016
を、次にＤＮＡ中にライゲートして、５’末端にＰstＩ部位を再生し、ＥcoＲＩ部位およびＸholＩ部位をＤＨＦＲcＤＮＡのＡＴＧの前に加える。このプラスミドはpＭＴ２１と呼ばれる。pＭＴ２１は、ＥcoＲＩおよびＸholＩで切断し、これはプラスミドを２カ所の隣接クローニング部位で開裂する。５０８塩基対のＥＭＣＶ断片が制限酵素ＥcoＲＩおよびＴaqαＩによりpＭＴ２ＥＣＡＴ１から切断された（エス・ケー・ジョングら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、６３巻、１６５１−１６６０頁（１９８９年））。６８ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド一対はＥＭＣＶ配列をＡＴＧまで複製することにより合成される。ＡＴＧはＡＴＴへ変え、Ｃを加え、３’末端にＸhoＩ部位を作る。ＴaqαＩ部位は５’末端に位置させる。このオリゴヌクレオチドの配列は：
【表１６】
2005046158.tif 000017
およびその相補鎖である。
【００９２】
pＭＴ２１  ＥcoＲＩからＸhoＩ断片の、ＥＭＣＶ  ＥcoＲＩからＴaqαＩ断片へおよびＴaqαＩ／ＸhoＩオリゴヌクレオチドへのライゲーションはベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を生成する。このベクターはＳＶ４０の複製開始点およびエンハンサー、アデノウィルス主要遅延プロモーター、アデノウィルス３分節リーダー配列の大部分のcＤＮＡコピー、小ハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化信号およびアデノウィルスＶＡ  Ｉ遺伝子、ＤＨＦＲおよびβ−ラクタマーゼマーカー類およびＥＭＣ配列を哺乳類細胞の目的cＤＮＡの高レベルの発現の指令に適当な関係で含む。
これら２つの異なったｃＤＮＡ類は同時に同じ宿主に、または独立して別の宿主に発現する。後者の場合、サブユニットが別々に精製され、最終活性ＮＫＳＦは個々のサブユニットの再生により組立てられる。
【００９３】
ａ．哺乳類細胞発現
下記の測定に使用するためのＮＫＳＦ蛋白の発現を得るために、４０ｋＤおよび３０ｋＤ（小形種）サブユニット類のためのcＤＮＡ類を含む構築物を哺乳類発現ベクターpＥＭＣ３（１）に別々にクローニングし、ＣＯＳ細胞にリン酸カルシウム共沈および形質導入により一緒に挿入する。約８０ｋＤ（非還元）および４０ｋＤおよび３０ｋＤ（還元）３５Ｓメチオニン標識蛋白（４時間パルス、形質導入後２日）がＣＯＳ共同形質導入物順化培地のＰＡＧＥゲルに存在するが、陰性対照形質導入物には存在しない。ＣＯＳ同時形質導入物から形質導入後４８時間で回収した調整培地は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）分析測定で活性である（実施例７ａ参照）。
【００９４】
活性が８８６６調整培地から精製されたものと全く同一であるという更なる証拠は、ＩＦＮγ導入分析においてＩＬ２と相乗作用すること、ＮＫＳＦ重鎖に対するポリクローナルウサギ抗血清（１：１００希釈）が共同形質導入体中およびＲＰＭＩ８８６１調整培地での活性を阻害することの観察からきている。抗血清はＮＫＳＦ重鎖ｃＤＮＡで形質導入（ｐＥＭＣ  ３（１）中にクローニング）したＣＯＳ細胞からの調整培地から精製されたＮＫＳＦ重鎖で免疫したウサギで産生する。
【００９５】
pＮＫ４０−４プラスミドを別々にＣＯＳ細胞に形質導入した場合、上清を回収し測定し、それから細胞を３５Ｓシステインで短時間標識した。標識蛋白は標準還元および非還元条件下１１％アクリルアミドゲル上を流した。pＮＫ４０−４でのこの形質転換からの非標識上清は、実施例８記載の通り行ったガンマインターフェロン導入分析および殺細胞活性分析に対して不活性であった。
【００９６】
本明細書に記載の哺乳類細胞発現ベクターは当分野の技術者に既知の技術で合成し得る。ベクターの要素、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、およびその他は既知の方法で天然源または合成により得られる。カウフマンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１５９巻、５１１−５２１頁（１９８２年）、およびカウフマン、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー、８２巻、６８９−６９３頁（１９８５年）参照。代表的な哺乳類宿主細胞は、特に形質転換細胞系を含む霊長類細胞系および齧歯類細胞系である。通常のディプロイド細胞、初期組織のイン・ビトロ培養由来の細胞株および初期体外移植片もまた適当である。候補細胞は、分泌遺伝子が優性に作用する限り分泌遺伝子の遺伝子型的欠損を必要としない。両方とも既知の方法によるベクターＤＮＡ類安定な統合、および統合ベクターＤＮＡ類のその後の増幅のためにＣＨＯ細胞が用いられ得る。あるいは、ベクターＤＮＡはウシ乳頭腫ウィルスゲノムの全部または一部を含み得（ルスキーら、セル、３６巻、３９１−４０１頁(１９８４年)）、安定エピゾーム因子としてＣ１２７マウス細胞のような細胞系に導入される。他の適当な哺乳類細胞系はＨeＬa、ＣＯＳ−１サル細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス人由来３Ｔ３系、Ｂalb−cまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨaＫハムスター細胞系が含まれるが限定はされない。
【００９７】
２個のサブユニットが哺乳類での同時発現を必要とする場合、２種のcＤＮＡを異なった選択遺伝子またはマーカーを用いて細胞内へ導入し得る。下の実施例７に記載のように、これはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を１つのマーカーとして、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を他のマーカーとして使用してＣＨＯ細胞中へ容易に行われる。独立して哺乳類細胞系に選択される２つの遺伝子のいかなる組み合わせも本方法に使用できる。例えば、ＣＨＯ細胞系を独立してＡＤＡ選択下１つのサブユニットの発現のために開発し、異なった細胞系をＤＨＦＲ選択下他のサブユニット発現のために開発する。細胞系は２種の選択下ポリエチレングリコール中で融合し、両方のサブユニットを発現する安定系を産生する。あるいは、ＤＮＡ類を同時にまたは連続的に同じ細胞へ導入し、それにより活性ＮＫＳＦを発現する系を産生する。
【００９８】
単一の選択可能マーカーで両方のサブユニットをコードする多シストロンベクターが、両方のサブユニットが１個の選択薬で同時増幅される細胞を産生し得ることもまた可能である。加えて、この効果は細胞への別個のベクターの同時の単純なコトランスフェクションによりなしとげ得る。
【００９９】
安定な形質導入体は、次に標準免疫学的、生物学的または酵素分析により発現産物についてスクリーニングする。ＮＫＳＦポリポプチドをコードするＤＮＡおよびmＲＮＡの存在は、サザン・ブロット法およびＲＮＡブロット法などの標準的な方法で検出し得る。ポリペプチフドをコードするＤＮＡのＣＯＳ−１サル細胞のような適当な宿主細胞への発現ベクターＤＮＡの導入後数日間の一過性の発現は培養培地中の蛋白の活性または免疫学的測定の選択なしに測定し得る。
【０１００】
当分野の技術者はpＥＭＣ３（１）ベクターに相当する他の哺乳類発現ベクター類を、例えばそれぞれのプラスミドからのＮＫＳＦサブユニットＤＮＡ配列を適当な酵素で挿入して、および周知の組み替え遺伝子工学技術、および他のpＸＭ、pＪＬ３およびpＪＬ４（ゴーホら、エンボ・ジャーナル、４巻、６４５−６５３頁(１９８５年)）およびpＭＴ２（pＭＴ２−ＶＷＦで開始し、ＡＴＣＣ＃６７１２２；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０００３３号参照）のような既知ベクターを用いて構築し得る。両方のＮＫＳＦサブユニット（別々のベクターまたは同一のベクターいずれも）をもつこれらのベクターの適当な宿主細胞への形質導入は、ＮＫＳＦポリペプチド発現をもたらす。
【０１０１】
ｂ．細菌発現系
同様に、当分野の技術者はＮＫＳＦサブユニットをコードする配列を、コード配列に隣接する哺乳類調節配列がある場合これを除去しおよび細菌調節配列を挿入して、本発明のＮＫＳＦサブユニットの細菌細胞による細胞内または細胞外発現のための細菌ベクターを作ることにより操作できる。ＮＫＳＦ蛋白をコードするＤＮＡは当分野で既知のように、さらに細菌の発現を能率よくするために異なったコドンを含むように修飾し得る。好ましくは、成熟ＮＫＳＦサブユニットをコードする配列はまた当分野で既知の方法で、成熟ＮＫＳＦポリペプチドの細菌発現、分泌および加工を可能にする分泌性リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能可能に枠内で連結する。このような分泌系を用いたエシェリキア・コリでの両方のＮＫＳＦサブユニットの同時発現は活性ヘテロダイマーの分泌をもたらす。この方法は活性キメラ抗体断片を産生する（例えばビターら、サイエンス、２４０巻、１０４１−１０４３頁(１９８８年)参照）。
あるいは、既知の方法で細胞内発現の為のベクターを使用して個々のサブユニットをエシェリキア・コリの２つの異なったcＤＮＡから別々に成熟形として発現させ、サブユニットを別々に単離し、混合し、再び折りたたむ。例えば米国特許第４５１２９２２号参照。いずれの経路で細菌宿主細胞内に発現された組成物も次に、すべて既知の方法で、回収し、精製しおよび／または物理学的、生物学的および／または臨床パラメーターにより確認される。
【０１０２】
ｃ．昆虫または酵母細胞発現
昆虫細胞でＮＫＳＦポリペプチドを発現する昆虫ベクターの構築物についても同様の操作が可能である（例えばヨーロッパ特許出願第１５５４７６号公報に記載の方法参照）。もしＮＫＳＦサブユニットが１個のcＤＮＡ由来であれば、このcＤＮＡは昆虫細胞で発現するであろう。あるいは、もしＮＫＳＦサブユニットが２個の異なったcＤＮＡ類由来の場合、それぞれのサブユニットを別々に昆虫細胞ベクターに挿入し、得られた２個のベクターを生物学的に活性なＮＫＳＦを発現するために昆虫細胞へ挿入する。
【０１０３】
同様に酵母ベクターは酵母調整配列を用いてそれぞれ個々のＮＫＳＦを同時に、またはもし蛋白が１個の前駆体由来であれば、その前駆体をコードするcＤＮＡを、酵母細胞中で発現するように構築して細胞外分泌活性ＮＫＳＦヘテロダイマーを産生する。あるいは個々のサブユニットを酵母において細胞内発現し、個々のポリペプチドを単離し、最後に折りたたみ活性ＮＫＳＤを産生させ得る。（例えばＰＣＴ出願第ＷＯ８６／００６３９号およびヨーロッパ特許出願第ＥＰ１２３２８９号参照。）
【０１０４】
実施例７．ＮＫＳＦを高レベルで産生するＣＨＯ細胞系の構築
哺乳類細胞から高レベルの本発明のＮＫＳＦ蛋白を産生する１つの方法は個々のＮＫＳＦサブユニットをコードする２個のcＤＮＡの多くのコピーを含む細胞の構築に関する。
【０１０５】
２つのＮＫＳＦポリペプチドがそれぞれ別のmＲＮＡ類に由来するため、それぞれの対応するcＤＮＡは同時にＣＨＯ細胞に発現しなければならない。２つの異なった選択マーカー、例えばＤＨＦＲおよびＡＤＡが用いられ得る。cＤＮＡのうち一方は例えばベクターpＥＭＣ３（１）を用いてＤＨＦＲ系を使用して発現し（カウフマンおよびシャープ、シャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、(１９８２年)前掲）、第１のＮＫＳＦサブユニットおよびＤＨＦＲを発現する。第２のサブユニットは第２のベクター、例えばpＭＴ３ＳＶ２ＡＤＡ（アール・ジェー・カウルマン、メソッズ・オブ・エンザイムノロジー、１８５巻、５３７−５６６頁(１９９０年)）を用いて発現する。プラスミドｐＭＴ３ＳＶ２ＡＤＡはまた哺乳類細胞でＡＤＡの発現を司る。１つのサブユニットを含む第１のベクター構築物はＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯＤＵＫＸ−ＢＩＩ細胞に形質転換する。第２のサブユニットを含む第２のベクター構築物は第２のＣＨＯ細胞系に形質転換する。形質転換細胞はＤＨＦＲマーカーとして約５nＭで開始し適当な段階で１００μＭまでメトトレキセートの濃度を増加させるか、または２’−デオキシコフォマイシン（dＣＦ）をＡＤＡマーカーとして１００nＭから適当な段階で１０μＭまで増加させたときの成育で選択する。個々のcＤＮＡの発現（第１の細胞系でＤＨＦＲ選択下第１のサブユニットおよび第２目の細胞系でＡＤＡ選択下第２のサブユニット）は転写の試験のためにmＲＮＡブロットおよび蛋白産生の試験のために免疫測定を組み合わせて測定する。ＡＤＡ選択下のサブユニットを発現する細胞およびＤＨＦＲ選択下の他方サブユニットを発現する細胞は、当分野で確立された方法によりポリエチレングリコール中で、dＣＦおよびＭＴＸの両方に耐性で、両方のサブユニットを産生して生物学的に活性なＮＫＳＦを産生する１つの細胞系を産生するために融合する。
【０１０６】
他の存在する好ましい発現の方法は両方のサブユニットを発現する１つの細胞系の開発を基礎とする。例えば上記の最初のベクターの様な１つのサブユニットを含む最初のベクターは選択ＣＨＯ細胞系に形質導入され、サブユニットの発現は上記の薬選択下に増幅する。その後、他のサブユニットを含む第２のベクターを既に増幅された第１のベクターを含む細胞系に形質導入する。他のサブユニットを発現するcＤＮＡ、例えば上記の第２のベクターは第２の薬選択下で導入し得る。第２のベクターは次に同様の方法で増幅し、両方のサブユニットを同時に発現する細胞系が得られる。（例えば、ＤＨＦＲ遺伝子に結合した第１の遺伝子およびＡＤＡ遺伝子に結合した第２の遺伝子を個々に増幅する代表的記載例はＰＣＴ国際出願第ＷＯ８８／０８０３５号参照。）
【０１０７】
他の方法では、２つのベクター構築物、例えば第１のサブユニットおよびＤＨＦＲ遺伝子を含む第１のpＥＭＣ３（１）および第２のサブユニットおよびＤＨＦＲ遺伝子を含む第２のpＥＭＣ３（１）構築物を設計し得る。両方のＮＫＳＦサブユニットを発現する２つのpＥＭＣ３（１）構築物を混合しそして混合物をＣＨＯ細胞へ形質導入し得る。細胞は次にＭＴＸ中で上記のように増幅し、両方のサブユニットを産生する細胞系を得る。あるいは、２つの薬選択マーカーがこの方法で用いられ、両方の薬の結合選択分泌が使用され得、形質転換体のＮＫＳＦ活性が直接試験され、ヘテロダイマーを発現する細胞系が得られる。
【０１０８】
更に別の方法では、両サブユニットおよび１つの薬選択マーカーをコードする他のシストロンベクターの開発である。このベクターの形質導入およびその増幅がさらに急速に高発現細胞系を作る可能性がある。
【０１０９】
上記のいずれの発現系も、得られた細胞系は更に適当な薬選択により増幅でき、得られた細胞系は再びクローニングし得、発現の評価は本明細書で述べたガンマインターフェロン分析により行うことができる。
【０１１０】
実施例８．ヒトＮＫＳＦの生物学的活性
以下の測定は実施例２記載の均質ＮＫＳＦまたは部分精製変形ＮＫＳＦのいずれかを使用して行った。分子の組み合え変形はＮＫＳＦ生物学的特性を、これらの同じ測定または別の測定で示すと予期される。
【０１１１】
新鮮ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−誘導芽細胞をＮＫＳＦと共に培養した場合、上清に有意なガンマインターフェロンの量を検出する。更に、ＮＫＳＦはＩＬ−２、ジブタン酸フォルボール（ＰdＢu）およびＰＨＡと、ガンマインターフェロン誘導において相乗作用がある。ノーザンブッロト測定は、ＮＫＳＦ単独または他の因子との組合せでガンマインターフェロンmＲＮＡの蓄積を増加させることを示す。ガンマインターフェロンメッセージは精製ＴおよびＮＫ集団の両方で発見された。蛋白合成阻害剤、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）との予備インキュベーションはＮＫＳＦによる刺激の後ガンマインターフェロンmＲＮＡの超誘導を導く。ＨＬＡ−ＤＲ（＋）補助細胞はＴおよびＮＫ細胞がガンマインターフェロンを産生するのに必要である。ガンマインターフェロンmＲＮＡの誘導はＰＨＡ芽細胞のＮＫＳＦで処理後１時間の早さですでに検出できる。測定の詳細は以下に述べる。
【０１１２】
ａ．ガンマインターフェロン誘導測定
ＮＫＳＦ活性はヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬs）のガンマインターフェロン（ガンマ−ＩＦＮ）発現の誘導により測定された。測定では、１０％熱不活性ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培養培地に懸濁した１００μlのヒトＰＢＬs（１０７細胞／ml）を１００μlの試験をするサンプルにマイクロタイタープレート（Ｕ底、９８−ウェル、コスター、ケンブリッジ、エムエー）中で加え、１８時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションする。試験するサンプルは純粋ＮＫＳＦ、フォルボールジエステル４８時間刺激ＲＰＭＩ８８６６細胞の透析した細胞非存在上清および組換えＩＬ−２（ジェネティクス・インスティテュート・インコーポレイテッド、ＰＣＴ出願第ＷＯ８５／０５１２４号）を含む。インキュベーションの後、１００μlの細胞非存在上清をそれぞれのウェルから回収し、ガンマ−ＩＦＮ産生レベルを放射免疫測定で測定した（デントコール・ガンマ・インターフェロン・ラジオイムノアッセイ、セントコール、マルベルン、ピーエー）。１ml当たりのＮＫＳＦの単位は、ＮＫＳＦの最適濃度の存在下の最大ガンマ−ＩＦＮ産生の半分を産生するのに必要な濃度である。
【０１１３】
それぞれのウェルのガンマ−ＩＦＮ産生量と培養液のＮＫＳＦ量の間には明確な直線関係がある。
【０１１４】
ガンマ−ＩＦＮに加えて、ＮＫＳＦはＴおよびＮＫ細胞をＧＭ−ＣＳＦおよび腫瘍壊死因子を産生するために誘導する。これらのサイトカイン類の測定は、上記のように行い、上清は特異的生物学的測定または放射免疫測定によりサイトカイン類の存在を測定する（クツリら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン、１６５巻、１５８１−１５９４頁(１９８７年)）。あるいはサイトカイン遺伝子の誘導はＮＫＳＦで処理したリンパ球中の３種のサイトカイン類のmＲＮＡ転写の蓄積の評価により測定する。リンパ球はＮＫＳＦと共に４から１８時間培養し、ＲＮＡは確立した方法で抽出し、アガロースゲル電気泳動により画分化し、ニトロセルロースで吸着し、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、または腫瘍壊死因子遺伝子用３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズする（ノーザン・ブロッティング）。ハイブリッド形成の程度はオートラジオグラフィーおよびデンシトメトリー測定する。
【０１１５】
ＮＫＳＦは精製ヒトＮＫ細胞由来のＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦの産生を誘導する。上記工程（ａ）のガンマインターフェロン誘導下に記載のように測定した場合、ＮＫ細胞は種々の標的細胞を２つの機構で融解することができる。１つの機構は特異的刺激不存在下の、リンパ血病および固形癌由来細胞系、ウィルス感染細胞、および、ある場合には、正常細胞系を含む種々の標的細胞の自然融解である。第２の機構はＡＤＣＣである。予備的証拠は、ＮＫＳＦが、ＮＫ細胞のＦc受容体に結合可能なＦc部分をもつＩgＧ抗体で覆われた標的細胞を更に効果的に融解するＮＫ細胞の能力を増加させ得ることを示す。
【０１１６】
ｂ．ＮＫ分析
ＮＫ細胞のＮＫＳＦによる自然殺細胞活性の増加を測定するために、ＰＢＬsまたは精製ＮＫ細胞（５×１０６細胞／ml）を１８時間ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活性ＦＣＳ中で、種々の希釈ＮＫＳＦの存在下インキュベーションする。ＰＢＬsは次に洗浄し、ＰＢＬ−標的細胞比１：１から１００：１で、１０４
５１Ｃr−標識標的細胞にＵ底マイクロタイタープレート中で加える（最終量２００μl）。４時間後、プレートを遠心し、細胞非存在上清を回収し、標的細胞の融解は細胞からの５１Ｃr標識遊離により評価する。ＮＫＳＦは以下の標的細胞に対して測定した場合、ＮＫ細胞の細胞毒性を数倍上昇させた：悪性造血細胞系（即ち、Ｋ５６２、ダウジ、Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＭＬ３、モルト４、ジューカット、ＴＨＰ−１）、固型腫瘍由来細胞系（横紋筋肉腫、メラノーマ）および正常包皮由来繊維芽細胞系。ＮＫＳＦによるＮＫ細胞媒介細胞毒性の増加はＮＫＳＦで処理したＰＢＬにより産生されるＩＮＦ−ガンマ、腫瘍壊死因子、またはＩＬ−２産生による２時的なものではない。細胞毒性測定、ＮＫ細胞精製およびサイトカイン類によるＮＫ細胞媒介促進の上昇の定量的評価の方法はジー・トリンシェリら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン、１４７巻、１３１４頁（１９７８年）；ジー・トリンシェリら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン、１６０巻、１１４７頁（１９８４年）；およびビー・ペルシャら、ナチュラル・イムニティー・アンド・セル・グロース・レギュレーション、６巻、１７１−１８８頁（１９８７年）に詳細に記載されている。
【０１１７】
ｃ．ＡＤＣＣ測定
標準抗体依存細胞媒介細胞毒性測定において、予備的結果は、本発明の部分精製ＮＫＳＦがＮＫ細胞の抗体で包まれた腫瘍標的細胞の殺傷を用量依存的に増加させることを示す。ＮＫ細胞のＦc受容体に結合する抗体の能力のため、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ反応はＮＫＳＦを添加することにより増加した。
【０１１８】
ｄ．ＮＫＳＦの共同マイトジェン効果
ＰＢＬs（０.５×１０６／ml）を２００μlの１０％熱不活性ヒトＡＢ血清を加えたＲＰＭＩ１６４０培地で培養する。３および６日後、ＰＢＬｓは３Ｈ−チミジンでパルスし、ＤＮＡ合成（増殖）はスカルトロン細胞回収機を使用して細胞をグラスフィルター上に回収し、細胞関連３Ｈ−チミジンをパッカード・トリカーブ・ベータ測定器を使用した液体シンチレーションで測定し、細胞内の３Ｈ−チミジン取込みにより評価する。ＮＫＳＦはＰＢＬ増殖にはそれ自身殆ど影響しないが、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｍ  ウェルカム、１：１００）と一緒に培養６日で、およびフォルボールジエステル（ＴＰＡまたはＰＤＢu、それぞれ１０−８または１０−７）と一緒に３日および６日で強い共同マイトジェン効果を示す。細胞周期分析はフローサイトメトリー（サイトフルオログラフ  ５０Ｈ、オルトダイアゴニスティクス）でロンドンら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３７巻、３８４５頁（１９８６年）に従ってＤＮＡ染色と免疫蛍光染色を組み合わせて行った。この分析はＮＫＳＦの共同マイトジェン効果に影響を受けるＰＢＬsがＣＤ４またはＣＤ８のいずれかが陽性のＴ細胞であることを示す。
【０１１９】
ｅ．ＧＭ−ＣＳＦ誘導測定
ヒトＰＢＬsの培養液中でのＧＭ−ＣＳＦ発現誘導を測定した。この測定では、１０％熱不活性ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培養培地に懸濁した１００μlのヒトＰＢＬs（１０７細胞／ml）をマイクロプレート（Ｕ−底、９６ウェル、コスター、ケンブリッジ、エムエー）中の試験サンプル１００μlに添加し、１８時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。インキュベーションの後、１００μlの細胞非存在上清をそれぞれのウェルから回収し、ＧＭ−ＣＳＦ産生のレベルを酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）で、異なるエピトープを認識するヒトＧＭ−ＣＳＦに対する２種のマウスモノクローナル抗体（３／８．２０．５および２／３．１、ジェネティクス・インスティテュート・インコーポレイテッド販売）を使用して行った。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ジェネティクス・インスティテュート・インコーポレイテッド）を標準として用いた場合、本測定の測定限界は５０pg／mlであった。
【０１２０】
本発明の実行に際し多数の修飾および変形がこの分野の技術者によって行われることが期待される。
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月1日(2004.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）におけるガンマインターフェロンのインビトロ産生を誘導する能力がある次のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質：
（ａ）次表ＡおよびＢに示したアミノ酸配列：
表Ａ
【表１】
2005046158.tif 000018
表Ｂ
【表２】
2005046158.tif 000019
および
（ｂ）（ａ）に示したアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が欠失、挿入および／または置換したアミノ酸配列。
【請求項２】
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）におけるガンマインターフェロンのインビトロ産生を誘導する能力があり、次のいずれかのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質：
（ａ）次表ＣおよびＤに示したヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列：
表Ｃ
【表３】
2005046158.tif 000020
【表４】
2005046158.tif 000021
表Ｄ
【表５】
2005046158.tif 000022
および
（ｂ）（ａ）に示したＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列。
【請求項３】
請求項１または２記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、プラスミド。
【請求項４】
プラスミドがＡＴＣＣ受託番号４０８５４として寄託されている、請求項３記載のプラスミド。
【請求項５】
プラスミドがＡＴＣＣ受託番号４０８８６として寄託されている、請求項３記載のプラスミド。
【請求項６】
発現制御配列と共同的に機能する請求項１または２記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列で形質転換された、細胞。
【請求項７】
細胞が哺乳類細胞または細菌細胞である、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
請求項６または７の細胞を培養することを含む過程により産生される、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）蛋白質。