(57)【要約】【課題】  細胞レベルでの環境変化の測定が可能で、さらに、酸化ストレスの局在や経時変化を測定でき、細胞内酸化ストレス等のリアルタイムでの測定が可能となるプローブおよびタンパク質、これらを用いた測定方法を提供する。【解決手段】  環境の変化を検出するための分子プローブであって、該分子プローブは少なくとも１つの色素が結合されており、酸化ストレスに応答してプローブの光学的性質が変化することを特徴とする生体に影響を及ぼしうる環境の変化を検出するための分子プローブ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境の変化を検出するための分子プローブであって、該分子プローブは少なくとも１つの色素が結合されており、酸化ストレスに応答してプローブの光学的性質が変化することを特徴とする生体に影響を及ぼしうる環境の変化を検出するための分子プローブ。
【請求項２】
環境の変化が酸化ストレスであることを特徴とする請求項２に記載の分子プローブ。
【請求項３】
分子プローブが、タンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の分子プローブ。
【請求項４】
タンパク質が、単一の分子から構成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の分子プローブ。
【請求項５】
タンパク質が、酸化ストレスに応答して立体構造を変化させる性質を持つことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分子プローブ。
【請求項６】
分子プローブが蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が結合されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の分子プローブ。
【請求項７】
光学的性質の変化が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によることを特徴とする請求項１〜６に記載の分子プローブ。
【請求項８】
タンパク質が、酸化ストレスに応答して立体構造を変化させ、２種以上の蛍光タンパク質あるいは蛍光色素の互いの距離が変化することで、２種以上の蛍光タンパク質あるいは蛍光色素間で蛍光共鳴エネルギー移動が発生または消滅することを特徴とする７に記載の分子プローブ。
【請求項９】
タンパク質が、転写因子あるいは転写因子を改変した変異タンパク質であることを特徴とする請求項３〜８に記載の分子プローブ。
【請求項１０】
転写因子が、酵母由来のYAP‐1タンパク質であることを特徴とする請求項９に記載の分子プローブ。
【請求項１１】
蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が、GFP、YFP、CFP、BFP、Venusなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、DsRed、HcRed、AsRed、ZsGreen、ZsYellow、AmCyan、AcGFP、Kaedeなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択される蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項６〜１０に記載の分子プローブ。
【請求項１２】
請求項３〜１１に記載の分子プローブのタンパク質をコードする遺伝子DNA。
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子DNAより転写反応によって生成されるｍRNA
【請求項１４】
環境の変化に応答して変化する光学的性質を測定することを特徴とする環境の変化の検出方法。
【請求項１５】
環境の変化が酸化ストレスであることを特徴とする請求項１４に記載の環境の変化の検出方法。
【請求項１６】
光学的性質がＦＲＥＴであることを特徴とする請求項１４または１５に記載の環境の変化の検出方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１に記載の分子プローブを用いて、環境の変化を検出する方法。
【請求項１８】
請項１〜１１に記載の分子プローブを用いて、細胞内での蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の環境の変化の検出方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１に記載の分子プローブを細胞内に導入し、細胞内での蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の環境の変化の検出方法。
【請求項２０】
請求項１２に記載の遺伝子DNAまたは請求項１３に記載のmRNAを細胞内に導入し、細胞内で翻訳反応によってタンパク質を生成し、そのタンパク質の蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することを特徴とする酸化ストレスの検出方法。
【請求項２１】
環境の変化に応答して構造が変化する部位、色素として機能する部位を含有することを特徴とするタンパク質
【請求項２２】
環境の変化が酸化ストレスであることを特徴とする請求項２１に記載のタンパク質。
【請求項２３】
色素として機能する部位が蛍光を発する部位であることを特徴とする請求項２１または２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
蛍光を発する部位が蛍光タンパク質あるいは蛍光色素であることを特徴とする請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が、GFP、YFP、CFP、BFP、Venusなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、DsRed、HcRed、AsRed、ZsGreen、ZsYellow、AmCyan、AcGFP、Kaedeなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択される蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
環境の変化に応答して構造が変化する部位が転写因子あるいは転写因子を改変した変異タンパク質であることを特徴とする請求項２１〜２５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２７】
転写因子が、酵母由来のYAP‐1タンパク質であることを特徴とする請求項２６に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体に影響を及ぼしうる環境の変化を検出するプローブに関し、さらには生体にかかるストレスを検出する分子プローブに関し、より詳細には、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いてストレスを検出する分子プローブに関する。また、該分子プローブを用いてストレスを検出する方法に関する。
さらには、環境の変化により構造が変化し、その構造変化を光学的手法により検出することが可能なタンパク質に関する。
加えてこのようなタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、ｍＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
35億年前に地球上に現れたとされる最初の生命体は、主に発酵と呼ばれる酸素を必要としないいわゆる嫌気的な化学反応を行うことによって、生存に必要なエネルギーを獲得していたと考えられている。このころの地球上には、酸素はほとんど存在せず、大気は主に窒素、二酸化炭素、水から構成されており、極めて還元的な環境において生命は生存していた。その後、太陽光を利用して、光合成を行うラン藻類が出現し、水分子を分解することにより酸素を多量に排出しはじめた。その後、酸素は徐々に濃度を増してゆき、約１５億年前には、酸素呼吸を行う最初の生命体が現れたといわれている。
【０００３】
酸化反応は、物質を燃焼させた場合に激しい熱や光を放出する反応などを見てもわかるように、高いエネルギーを生じさせることができる、極めて有用な化学反応である。生命体は、この有利な反応を自身の機能として獲得することで、効率良くエネルギーを得ることができるようになった。我々人間を含めた現存する高等生物の多くは、酸素呼吸を行うことでエネルギーを獲得している。
【０００４】
酸素は、通常の分子状態(O2)では、反応性は比較的弱く、安定である。しかしながら、一電子が還元され、いわゆる活性酸素とよばれる状態になると、一転して高い反応性を持つようになる。還元的な環境で生きていた古代生物の名残か、酸素呼吸を行う高等生物の体内は、依然として高い還元状態に保たれている。
【０００５】
したがって、その体内では、電子と酸素分子が反応し、活性酸素が常に生じるという状態になっている。活性酸素は、生細胞中で代謝産物として産生されるほか、化学物質、紫外線、放射線等の環境変異原などによっても生成される。スーパーオキサイドアニオン(O2.‐)、過酸化水素(H2O2)、ヒドロキシラジカル(HO.)、過酸化脂質(LOOH)などのような活性酸素種(ROS)は、前述したように強い反応性を持ち、核酸やタンパク質、脂質等の細胞を構成する全ての因子に損傷を与え得る。
【０００６】
活性酸素種はまた、体内へ侵入した異物の無毒化や、不要な細胞の処理、細胞情報伝達など有用な役割も果たしているが、大抵の場合は有害な作用を及ぼしている。しかしながら、活性酸素は前述のように生命体の代謝産物であり、その生成を原因から断つことは不可能である。それに対処するため、生命体には、活性酸素に対する防御機構が備えられている。即ち、生命体は、常に発生する活性酸素と、それに対する防御機構のバランスの上に成り立っているといえる。このバランスが崩れ、防御機構の能力を活性酸素種の量が上回った状態を酸化ストレスと呼び、その原因となる刺激要因は、酸化ストレス因子と呼ばれる。
【０００７】
前述したように、酸化ストレス因子は、核酸やタンパク質、脂質等の細胞中の様々な因子に障害を与え得る。このことは、酸化ストレスが遺伝子損傷による発癌、老化、高血圧、そのほかの様々な生活習慣病の原因となることを示している。近年は遺伝子解析も進み、癌や高血圧等の原因遺伝子も特定されつつあり、生活習慣病に罹りやすい体質、すなわち遺伝子素因の存在が知られるようになってきた。しかしながら、そのような遺伝子素因があっても、日ごろの生活習慣等を整えることにより酸化ストレス量を抑えることで、発症を防ぐのに大きな効果があることもわかって来た。したがって、疾病、老化の予防のためには、食品や運動、喫煙、飲酒、日ごろの生活習慣についての酸化ストレスの増大または減少への影響を測定・評価し、酸化ストレス量を十分に小さくするための生活習慣の最適化を行うことが重要であるといえる。
【０００８】
酸化ストレス量を測定・評価する手段としては、酸化ストレス検出マーカを用いた測定方法が一般的に用いられている。酸化ストレス検出マーカには、主に用いられるものとして、抗酸化物質ビリルビンの活性酸素との反応分解物であるバイオピリン、DNAの酸化損傷物8-ヒドロキシ-2’-デオキシグアノシン(8-OHｄG)、酸化還元制御を担うチオレドキシンなどがある。いずれもヒトの体液中のそれらの成分を定量し、生体内の酸化ストレスの総量を定量することができる。この方法では、個体レベルでの酸化ストレス量を検出することができ、主に医療分野などで用いられることが多い。
【０００９】
一方、酸化ストレス因子が細胞レベルでどのような影響を与え得るかを評価することは、酸化ストレスの生体に及ぼす作用を解明するために必要不可欠である。しかしながら、前述の酸化ストレス検出マーカを用いた方法は、あくまで個体レベルでの酸化ストレス総量の測定を目的としており、細胞レベルでの酸化ストレス検出には不向きである。これは、前述の酸化ストレス検出マーカは、主に化学的反応や免疫学的反応による方法でしか検出できず、細胞内での総量や局在を測定することは、技術的に非常に困難であるという問題があった。
【００１０】
細胞レベルでの酸化ストレス量を測定するためには、さまざまな酸化ストレス因子を個別に追跡するという方法もある。しかしながら、前述したように、酸化ストレスをもたらしうる因子にはさまざまな種類があり、それらを全て追跡できないことには、細胞内の酸化ストレスの総量を計測することはできず、実際問題として全ての酸化ストレス因子を追跡するということは非常に困難であるという問題があった。
【００１１】
一方で、細胞レベルでの酸化ストレスに関する研究は、別のアプローチによっても行われてきた。特に、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeは真核細胞の酸化ストレス応答研究に適したモデルである。S. cerevisiaeにおける酸化ストレス耐性の重要な因子の一つは、Yap-1とよばれる転写因子の一種である。Yap-1は当初、細胞質において発見された。しかし、細胞が酸化ストレス因子にさらされると、Yap-1は核に移行する。Yap-1はそのN末側に核内移行シグナル(NLS)を、C末側に核外輸送シグナル（NES）を持つ。Yap-1のシステインリッチ領域はNESに存在する。
【００１２】
Yap-1はNLSおよびNESを介して、インポーチンと呼ばれる核内輸送受容体と、エクスポーチンと呼ばれる核外輸送受容体によって、構成的に核の内外へ輸送される。酸化ストレスがかかっていない状態では、Yap-1は不活性状態であり、核内への局在レベルも低い。
ところが、細胞が酸化ストレスに晒されると、Yap-1のシステインリッチドメインのシステイン残基が酸化され、ジスルフィド結合を形成し、Yap-1は構造的変化を起こす。この構造的変化により、Yap-1とエクスポーチンとの結合が阻害され、一方でインポーチンとの結合は阻害されないため、Yap-1の核内外への輸送に偏りが起こり、結果としてYap-1は核内へ蓄積される。Yap-1は核内で、チオレドキシン、グルタチオン等のさまざまな抗酸化因子をコードする遺伝子の転写を活性化する。
【００１３】
一方最近、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた細胞内でのタンパク質間相互作用を追跡する分子プローブが開発された。FRETは分子間の相互作用を観察する技術である。供与側の蛍光分子の蛍光波長が、受容側の蛍光分子の励起波長と重なり、さらに二つの蛍光分子が互いに近接した場合に、FRETのシグナルを検出することができる。シアン色蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）との組み合わせでは、CFPが短波長の光により励起されただけでは、CFPの蛍光波長が観察されるだけであるが、CFPのエネルギーがYFPへ移動したときには、FRETのシグナルが観察される。FRETを利用した最初の細胞内分子プローブは、カメレオンと呼ばれ、カルシウム結合性タンパク質であるカルモジュリンを基にした、細胞内のカルシウム検出プローブであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上に述べたような理由から、細胞レベルでの酸化ストレスの局在や経時変化を測定できる方法が求められていた。すなわち、本発明の目的は、細胞レベルでの酸化ストレス総量を測定することができる細胞内酸化ストレス追跡用の分子プローブを提供することにある。また本発明の目的は、細胞内酸化ストレス追跡用の分子プローブを用いて、細胞レベルまたは試験管内での酸化ストレスの局在や経時変化を測定する方法を提供することにある。
さらには、本発明者らは広い課題としてとらえ、環境の変化、特には生体における環境の半価を容易にかつリアルタイムで測定できる、分子プローブ、測定方法、新規なタンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前述の目的を達成するために、本発明者らは鋭意検討重ね、光学的性質を用いた分子プローブにより環境変化特に酸化ストレスの局在や経時変化を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
即ち、本発明は。環境の変化を検出するための分子プローブであって、該分子プローブは少なくとも１つの色素が結合されており、酸化ストレスに応答してプローブの光学的性質が変化することを特徴とする生体に影響を及ぼしうる環境の変化を検出するための分子プローブである。
【００１７】
上記において、環境の変化が酸化ストレスであることができる。
【００１８】
上記において、分子プローブが、タンパク質であることができる。
【００１９】
上記において、タンパク質が単一の分子から構成されることができる。
【００２０】
上記において、タンパク質が、酸化ストレスに応答して立体構造を変化させる性質であることができる。
【００２１】
上記において、分子プローブが蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が結合されていることができる。
【００２２】
上記において、光学的性質の変化が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によるものであることができる。
【００２３】
上記において、タンパク質が酸化ストレスに応答して立体構造を変化させ、２種以上の蛍光タンパク質あるいは蛍光色素の互いの距離が変化することで、２種以上の蛍光タンパク質あるいは蛍光色素間で蛍光共鳴エネルギー移動が発生または消滅するものであることができる。
【００２４】
上記において、タンパク質が転写因子あるいは転写因子を改変した変異タンパク質であることができる。
【００２５】
上記において、転写因子が、酵母由来のYAP‐1タンパク質であることをができる。
【００２６】
蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が、GFP、YFP、CFP、BFP、Venusなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、DsRed、HcRed、AsRed、ZsGreen、ZsYellow、AmCyan、AcGFP、Kaedeなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択される蛍光タンパク質であることができる。
【００２７】
また、本発明は上記の分子プローブのタンパク質をコードする遺伝子DNAまたは該遺伝子DNAより転写反応によって生成されるｍRNAである。
【００２８】
本発明は、環境の変化に応答して変化する光学的性質を測定することを特徴とする環境の変化の検出方法である。
【００２９】
上記の検出方法において環境の変化が酸化ストレスであることができる。
【００３０】
上記の検出方法において光学的性質がＦＲＥＴであることができる。
【００３１】
上記の検出方法において、前述の分子プローブを用いて環境の変化を検出することができる。
【００３２】
上記の検出方法において、前述の分子プローブを用いて細胞内での蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することができる。
【００３３】
上記の検出方法において、前述の分子プローブを細胞内に導入し、細胞内での蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することができる。
【００３４】
本発明は、上記の遺伝子DNAまたは遺伝子DNAより転写反応によって生成されるmRNAを細胞内に導入し、細胞内で翻訳反応によってタンパク質を生成し、そのタンパク質の蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することを特徴とする酸化ストレスの検出方法である。
【００３５】
本発明は、環境の変化に応答して構造が変化する部位、色素として機能する部位を含有することを特徴とするタンパク質である。
【００３６】
上記において環境の変化が酸化ストレスであることができる。
【００３７】
上記において色素として機能する部位が蛍光を発する部位であることができる。
【００３８】
上記において、蛍光を発する部位が蛍光タンパク質あるいは蛍光色素であることができる。
【００３９】
上記において、蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が、GFP、YFP、CFP、BFP、Venusなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、DsRed、HcRed、AsRed、ZsGreen、ZsYellow、AmCyan、AcGFP、Kaedeなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択される蛍光タンパク質であることができる。
【００４０】
上記において、環境の変化に応答して構造が変化する部位が転写因子あるいは転写因子を改変した変異タンパク質であることができる。
上記において、転写因子が、酵母由来のYAP‐1タンパク質であることができる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明により、細胞レベルでの環境変化の測定が可能となり、特に酸化ストレスの局在や経時変化を測定でき、細胞内酸化ストレス等が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明において、生体に影響を及ぼしうる環境の変化とは、具体的には、温度、ｐＨ等の変化、各種の薬品類、天然および合成の毒物の有無や、これらの濃度の濃度変化等で、生体の機能等に影響を及ぼすものが挙げられ、特には酸化ストレスである。
【００４３】
ここでいう酸化ストレスとは、細胞になんらかの障害を生じさせ得る活性酸素種を指し、より具体的にはスーパーオキサイドアニオン(O2.‐)、過酸化水素(H2O2)、ヒドロキシラジカル(HO.)、過酸化脂質(LOOH)などを指す。
【００４４】
また、ここでいう分子プローブとは、一分子または数個の分子の集合体で、何らかの対象を検出する機能を持つ分子を指し、その構造は特に限定されないが、タンパク質や核酸などの高分子が好ましく、特に一分子のタンパク質であることが好ましい。
【００４５】
また、光学的特性とは光の吸収、放出の強度の変化であり、好ましくは４００ｎｍ〜７００ｎｍの可視光内の変化であることが好ましい。
光学的性質が変化する機構としては、環境の変化による色素自体の構造及び化学的変化であっても良いが、特には２つの蛍光色素間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の状態の変化であることが好ましい。
【００４６】
色素としては、光の吸収、放出をになうものであり、ＦＲＥＴを用いることが好ましいことから、蛍光分子であることが好ましい。
【００４７】
本発明におけるタンパク質は特に環境の変化に応答して立体構造を変化させる性質のものであることが好ましい。このようなタンパク質はどのようなものを用いてもよいが、FRETを用いて検出するという特性上、何らかの物質との相互作用によりその立体構造を変化させる性質をもつものが好ましい。より具体的には、酸化ストレス因子との相互作用によりその立体構造を変化させる性質をもつものであり、立体構想を変化させる部位にアミノ酸としてシステインを２個以上、さらには３個以上、特には４個以上持つものであることが好ましい。また、天然タンパク質であることが好ましく、さらに具体的にはYap-1等の酸化ストレス応答に関与する転写因子等の構造を任意に改変したものが好適に用いられる。
【００４８】
また、ＦＲＥＴを利用するという点でタンパク質には２種以上の蛍光分子が結合していることが好ましい。
【００４９】
本発明における蛍光分子は、天然および合成の各種蛍光色素や、各種蛍光タンパク質が好ましいが、細胞内で発現させるという目的においては、蛍光タンパク質を用いることが好ましい。具体的には、GFP、YFP、CFP、BFP、Venusなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、DsRed、HcRed、AsRed、ZsGreen、ZsYellow、AmCyan、AcGFP、Kaedeなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体等の各種蛍光タンパク質を用いることが好ましい。
【００５０】
また、ＦＲＥＴ以外では蛍光タンパクが環境の変化によって、蛍光を失う、蛍光波長がシフトする等、その蛍光特性が変化するものであっても良い。また、吸収スペクトル特性が変化するようなものであっても良い。
【００５１】
本発明はまた、前述の分子プローブのタンパク質をコードする遺伝子DNAおよび該遺伝子DNAより転写反応によって生成されるｍRNAである。
【００５２】
さらに本発明は、環境の変化に応答して変化する光学的性質を測定することを特徴とする環境の変化の検出方法である。
【００５３】
検出対象については特に限定されないが、細胞レベルでの検出対象としては、すべての生細胞もしくは各種タンパク質等の機能が保持された状態で固定化された細胞、部分的に細胞膜に穿孔したセミインタクトセルなどが用いられ、あるいは試験管レベルでの検出対象としては、生体から抽出した試料、あるいは細胞培養液もしくはその抽出液などが好適に用いられる。
【００５４】
本発明における細胞への遺伝子DNAあるいはRNAの導入法は、いかなる方法を用いてもよいが、一般的に多用されるエレクトロポレーション法や、陽イオンリポソーム法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、ウィルス感染法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、活性型デンドリマー法、非リポソーム系脂質法などが好適に使用される。また本発明における遺伝子DNAあるいはRNAを導入した細胞については、一過性にDNAあるいはRNAが導入された細胞（トランジエントトランスフォーマント）であってもよいし、安定的にDNAが導入された細胞（ステーブルトランスフォーマント）であってもよい。
【００５５】
また、本発明のタンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡをプラスミドに組み込み、これを酵母や大腸菌等の菌類等に形質転換して発現させることが好ましい。
【実施例】
【００５６】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５７】
実施例１
酸化ストレス分子プローブの大腸菌発現系の構築
酵母由来のｙａｐ１遺伝子を元に、酸化ストレス分子プローブタンパク質の発現系を構築した。具体的には、酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３Ｂ株由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてセンスプライマーＣＲＤ１（６０１）−Ｓｐｈ−Ｆｗ（配列番号１）とアンチセンスプライマーＣＲＤ１−Ｇｌｙ２−Ｃｌａ−Ｒｖ（配列番号２）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＣＲＤ１（６０１）−Ｓｐｈ−ＦｗにはＳｐｈ  Ｉ切断部位、ＣＲＤ１−Ｇｌｙ２−Ｃｌａ−ＲｖにはＣｌａ  Ｉ切断部位が含まれている。ＰＣＲ反応には、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を使用し、各プライマー５０ｐｍｏｌ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−専用ＰＣＲバッファーを１ｘ濃度、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、最終液量５０μｌの反応系で、９４℃２分、｛９４℃１５秒、６０℃２０秒、６８℃２分｝ｘ２５サイクル、６８℃７分の温度で反応を行った。ＰＣＲ産物の両端を、制限酵素Ｓｐｈ ＩおよびＣｌａ  Ｉを使用して切断し、その処理後のＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  （プロメガ社製）のＳｐｈ  ＩおよびＣｌａ Ｉの位置にサブクローニングを行い、プラスミドＣＲＤ１（６０１−６５０）／ｐＧＥＭを構築した。
【００５８】
次に、酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３Ｂ株由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてセンスプライマーＣＲＤ２（２８１）−Ｃｌａ−Ｆｗ（配列番号３）とアンチセンスプライマーＣＲＤ２−Ｓａｃ−Ｒｖ（配列番号４）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＣＲＤ２（２８１）−Ｃｌａ−ＦｗにはＣｌａ  Ｉ切断部位、ＣＲＤ２−Ｓａｃ−ＲｖにはＳａｃ  Ｉ切断部位が含まれている。ＰＣＲ産物の両端を、制限酵素Ｃｌａ  ＩおよびＳａｃ  Ｉを使用して切断し、その処理後のＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＶｅｃｔｏｒのＣｌａ  ＩおよびＳａｃ  Ｉの位置にサブクローニングを行い、プラスミドＣＲＤ２（６０１−６５０）／ｐＧＥＭを構築した。
【００５９】
次に、プラスミドＣＲＤ１（６０１−６５０）／ｐＧＥＭから、制限酵素Ｓｐｈ  ＩとＣｌａ  ＩによってＣＲＤ（６０１−６５０）の断片を切り出し、プラスミドＣＲＤ２（６０１−６５０）／ｐＧＥＭのＳｐｈ  ＩおよびＣｌａ  Ｉの位置にサブクローニングして、プラスミドＣＲＤ１／２（６０１−６５０）／ｐＧＥＭを構築した。
【００６０】
また、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１（ＢＤバイオサイエンス社製）を鋳型としてセンスプライマーＣＦＰ−Ｂａｍ−Ｆｗ（配列番号５）とアンチセンスプライマーＣＦＰ−Ｓｐｈ−Ｒｖ（配列番号６）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＣＦＰ−Ｂａｍ−ＦｗにはＢａｍ  Ｈ  Ｉ切断部位が、ＣＦＰ−Ｓｐｈ−ＲｖにはＳｐｈ  Ｉ切断部位が含まれている。ＰＣＲ産物の両端を、制限酵素Ｂａｍ  Ｈ  ＩおよびＳｐｈ  Ｉを使用して切断し、その処理後のＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＶｅｃｔｏｒのＢａｍ  Ｈ  ＩおよびＳｐｈ  Ｉの位置にサブクローニングを行い、プラスミドＣＦＰ−Ｎ／ｐＧＥＭを構築した。このプラスミドから制限酵素Ｂａｍ  Ｈ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉを用いてＣＦＰ−Ｎ断片を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン社製）のＢａｍ  Ｈ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ部位にサブクローニングし、プラスミドＣＦＰ−Ｎ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを構築した。さらにこのプラスミドから制限酵素Ｂａｍ  Ｈ  ＩおよびＳａｃ  Ｉを用いてＣＦＰ−Ｎ断片を切り出し、ｐＲＳＥＴ  Ａ（インビトロジェン社製）のＢａｍ  Ｈ  ＩおよびＳａｃ  Ｉの位置にサブクローニングし、プラスミドＣＦＰ−Ｎ／ｐＲＳＥＴを構築した。このプラスミドに、前述のプラスミドＣＲＤ１／２（６０１−６５０）／ｐＧＥＭから、制限酵素Ｓｐｈ  ＩおよびＳａｃ  Ｉを用いてＣＲＤ１／２（６０１−６５０）断片を切り出し、プラスミドＣＦＰ−Ｎ／ｐＲＳＥＴのＳｐｈ  ＩおよびＳａｃ  Ｉ部位にサブクローニングし、プラスミドＣＦＰ−ＣＲＤ１／２（６０１−６５０）／ｐＲＳＥＴを構築した。
【００６１】
次に、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１（ＢＤバイオサイエンス社製）を鋳型としてセンスプライマーＹＦＰ−Ｓａｃ−Ｆｗ（配列番号７）とアンチセンスプライマーＹＦＰ−Ｅｃｏ−Ｒｖ（配列番号８）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＹＦＰ−Ｓａｃ−ＦｗにはＳａｃ  Ｉ切断部位、ＹＦＰ−Ｅｃｏ−ＲｖにはＥｃｏ  ＲＩ切断部位が含まれている。ＰＣＲ産物の両端を制限酵素Ｓａｃ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩで切断し、プラスミドＣＦＰ−ＣＲＤ１／２（６０１−６５０）／ｐＲＳＥＴのＳａｃ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＣＹ２（６０１−６５０）を構築した。
【００６２】
実施例２
酸化ストレス分子プローブの大腸菌における発現
プラスミドｐＣＹ２（６０１−６５０）を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換した。形質転換菌をアンピシリンナトリウム入りのＬＢ培地プレートにまき、３７℃で１６時間インキュベートし、シングルコロニーをピックアップした。ピックアップした株をアンピシリンナトリウム入りのＬＢ液体培地１００ｍｌに植菌し、２３℃で約５時間、ＯＤ６１０が０．５になるまで培養した。組換タンパク質はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭになるように加えてタンパク質発現誘導をかけ、更に３時間培養し、その後に０．４ｍＭのＩＰＴＧを更に添加して１２時間培養することによって発現させた。
図１に発現させたＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の分子構造を示す。
【００６３】
実施例３
大腸菌で発現させた酸化ストレス分子プローブの精製
培養終了後の菌体は６０００ｘｇで１０分間の遠心分離を行って回収し、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、３μｇ／ｍｌ ロイペプチン、３μｇ／ｍｌ ペプスタチンを含有するＰＢＳバッファに再懸濁した。４倍量の同バッファを更に加え、フレンチプレス細胞破砕機（サーモスペクトロニック社製）を用いて細胞を破砕した。破砕液を４００００ｘｇで一時間遠心分離し、可溶化したタンパク質を含有する上清を回収した。得られたタンパク質溶液から、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡績製）を用いて、酸化ストレス分子プローブタンパク質を精製した。
【００６４】
図２に精製したＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す。ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質は、単一のバンドとなって表れ、純度の高い状態で精製されたことが示された。
【００６５】
実施例４
精製した酸化ストレス分子プローブのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける過酸化水素濃度変化による蛍光特性の変化の測定
得られた精製ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいての、酸化ストレス因子として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加していった場合の蛍光特性の変化を、分光蛍光光度計ＲＦ５３００−ＰＣ（島津製作所製）を用いて、ＣＦＰの励起光（４３４ｎｍ）下での蛍光スペクトル分析を行うことで測定した。
【００６６】
その結果を図３に示す。過酸化水素を添加しない条件（０ｍＭ）では、ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質にそれぞれ融合されたＣＦＰおよびＹＦＰとが蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こし、ＣＦＰの励起光下で強いＹＦＰの蛍光シグナルが検出されたが、過酸化水素濃度を段階的に上げていくことにより、ＹＦＰのシグナルが減少し、ＣＦＰのシグナルが増加するのが確認され、ＣＹ２（６０１−６５０）が過酸化水素濃度依存的に構造変化を引き起こし、徐々にＦＲＥＴが解除されていることが示唆された。
【００６７】
実施例５
精製した酸化ストレス分子プローブのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける酸化ストレス因子添加時の蛍光特性の経時変化の測定
【００６８】
ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質に加え、ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の４箇所のシステイン残基をすべてアラニンに置き換えたＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質を合成し精製した。ＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡの分子構造を図４に示す。
【００６９】
ＣＹ２（６０１−６５０）およびＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡについて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、酸化ストレス因子として過酸化水素、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジアミドをそれぞれ添加したときの、ＣＦＰの励起光下でのＣＦＰとＹＦＰのそれぞれの蛍光シグナルの強度の比率（ＦＲＥＴ比率)を、分光蛍光光度計ＲＦ５３００−ＰＣ（島津製作所製）を用いて検討した。
【００７０】
それぞれの結果を図５、６、７に示す。ＣＹ２（６０１−６５０）は、酸化ストレス因子添加時には時間経過とともにＦＲＥＴ比率が低下しているが、ＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡでは、ほとんど変化が起こらないことが示された。
【００７１】
実施例６
酵母細胞内での酸化ストレス分子プローブの発現とＦＲＥＴ解析
ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の遺伝子を、ＧＡＰプロモータ下流に組み込んだ発現プラスミドを構築し、酵母細胞へ導入して、ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の酵母細胞内での発現を行った。酵母細胞へのプラスミド導入による形質転換は、改変酢酸リチウム法（Ｓａｋａｉ,  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：  ３５５６−６２）によって行った。具体的には、プラスミドを用いて酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３Ｂ株を形質転換した。得られた４５８ｎｍの励起光下での蛍光スペクトル分析を行った。
【００７２】
その結果を図８に示す。実施例４に示した結果とは、励起光の波長が異なるため波形が異なっているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける場合と同様のＦＲＥＴの波形が確認された。
【００７３】
実施例７
酵母細胞内での酸化ストレス分子プローブの酸化ストレス因子添加時の蛍光特性の経時変化の測定
形質転換株ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質を発現している酵母細胞に、酸化ストレス因子として、１ｍＭのジアミドを添加し、スライドガラス上に載せ、共焦点レーザ顕微鏡ＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡ（カールツァイス社製）を用い、蛍光の１０分間の経時変化について、蛍光顕微鏡観察を行った。
【００７４】
その結果を図９に示す。測定した結果、ＦＲＥＴが時間の経過とともに徐々に解除されていく様子が観察され、ＣＹ２（６０１−６５０）はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける場合と同様の酸化ストレスに対する反応性を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明により、細胞レベルでの環境変化の測定が可能となり、さらに、酸化ストレスの局在や経時変化を測定でき、細胞内酸化ストレスの追跡等が可能となり、産業界に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】酸化ストレス分子プローブＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の分子構造を示す図。
【図２】精製したＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す図。
【図３】ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質に過酸化水素を添加した際の蛍光スペクトル変化を測定した結果を示す図。
【図４】ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質と、４箇所のシステイン残基をアラニンに置換したＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質の分子構造を示す図。
【図５】ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質と、４箇所のシステイン残基をアラニンに置換したＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質に、過酸化水素を添加した際のＦＲＥＴ比率の経時変化を測定した結果を示す図。赤線がＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質、青線がＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質をそれぞれ示す。
【図６】ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質と、４箇所のシステイン残基をアラニンに置換したＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質に、ジチオスレイトールを添加した際のＦＲＥＴ比率の経時変化を測定した結果を示す図。赤線がＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質、青線がＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質をそれぞれ示す。
【図７】ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質と、４箇所のシステイン残基をアラニンに置換したＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質に、ジアミドを添加した際のＦＲＥＴ比率の経時変化を測定した結果を示す図。赤線がＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質、青線がＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質をそれぞれ示す。
【図８】酵母細胞内で発現したＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の蛍光スペクトルを測定した結果を示す図。
【図９】酵母細胞内で発現したＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質にジアミドを添加した際の蛍光スペクトルの経時変化を観察した結果を示す図。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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