(57)【要約】【課題】  exo-およびendo-ヌクレアーゼ耐性が非常に高い修飾型核酸（DNA）をテンプレートとする新たなRNA転写法を提供すること。【解決手段】  少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または酸素原子が他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡであって、ＲＮＡの転写および／または増幅のテンプレートとして機能しうる前記修飾型ＤＮＡをテンプレートとして用いることを特徴とする、ＲＮＡの転写および／または増幅方法。【選択図】  図２ 
2005046073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または酸素原子が他
の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡであって、ＲＮＡの転
写および／または増幅のテンプレートとして機能しうる、または遺伝子の発現抑制として
機能しうる前記修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡをテンプレートとして用いることを特徴とす
る、ＲＮＡの転写および／または増幅方法。
【請求項２】
修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡが、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水
酸基がボラノ基に置換されているＤＮＡあるいはＲＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項３】
修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡが、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水
酸基が光学活性ボラノ基に置換されている完全化学合成されたＤＮＡあるいはＲＮＡであ
る請求項１記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または酸素原子が他
の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡであって、ＲＮＡの転写および／また
は増幅のテンプレートとして機能しうる前記修飾型ＤＮＡからなる、ＲＮＡ転写および／
または増幅のためのテンプレート。
【請求項５】
修飾型ＤＮＡが、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基がボラノ基
に置換されているＤＮＡである請求項４記載のテンプレート。
【請求項６】
糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基が他の原子または基に置換
された修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む、ＲＮＡ転写および／または増幅
ためのテンプレート作製用キット。
【請求項７】
修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、α−リン酸部分のリンに結合している水酸
基がボラノ基に置換されている2’-デオキシリボヌクレオシド三リン酸である請求項６記
載のキット。
【請求項８】
糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基が他の原子または基に置換
された修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む、ＲＮＡ転写および／または増幅
用キット。
【請求項９】
修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、α−リン酸部分のリンに結合している水酸
基がボラノ基に置換されている2’-デオキシリボヌクレオシド三リン酸である請求項８記
載のキット。
【請求項１０】
糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または酸素原子が
他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡであって、ＲＮＡの転写および／ま
たは増幅のテンプレートとして機能しうる前記修飾型ＤＮＡを含む、ＲＮＡ転写および／
または増幅用キット。
【請求項１１】
修飾型ＤＮＡが、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基がボラノ基
に置換されているＤＮＡである請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または酸素原子が他
の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡであって、ＲＮＡの転
写および／または増幅のテンプレートとして機能しうる、または遺伝子の発現抑制として
機能しうる前記修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡ。
【請求項１３】
細胞あるいは組織に導入し、機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現させることができる
請求項１２記載の修飾型ＤＮＡ。
【請求項１４】
発現する機能性核酸がsiRNAあるいはヘアピンRNAを含む二本鎖RNAである請求項１３記載
の修飾型DNA。
【請求項１５】
発現する機能性核酸がリボザイムである請求項１３記載の修飾型DNA。
【請求項１６】
発現する機能性核酸がアンチセンスRNAである請求項１３記載の修飾型DNA。
【請求項１７】
発現する機能性核酸の標的がウィルスあるいは癌に関連する遺伝子である請求項１３〜１
６のいずれかに記載の修飾型DNA。
【請求項１８】
ウイルスがHIV、HCV及びHBVからなる群より選択される請求項１７記載の修飾型DNA.
【請求項１９】
細胞あるいは組織に導入し、遺伝子の発現を抑制することができる請求項１２記載の修飾
型ＤＮＡあるいはＲＮＡ。
【請求項２０】
修飾型ＲＮＡがアンチセンスＲＮＡである請求項１９記載の修飾型ＲＮＡ。
【請求項２１】
修飾型ＲＮＡがsiRNAおよびヘアピンRNAを含む二本鎖ＲＮＡである請求項１９記載の修飾
型ＲＮＡ。
【請求項２２】
修飾型ＤＮＡがＤＮＡザイムである請求項１９記載の修飾型ＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項１２〜２２のいずれかに記載の修飾型DNAあるいはＲＮＡを含む組成物。
【請求項２４】
請求項１２〜２２のいずれかに記載の修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡを含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１９〜２１のいずれかに記載の修飾型ＲＮＡをin vitro転写によって作成する方法
。
【請求項２６】
請求項１２〜２２のいずれかに記載の修飾型DNAあるいはＲＮＡを光学活性なボラノ基を
含むヌクレオチドより合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾核酸を用いるＲＮＡの転写および／または増幅方法、ＲＮＡ転写および
／または増幅のためのテンプレート、ＲＮＡ転写および／または増幅ためのテンプレート
作製用キット、ならびにＲＮＡ転写および／または増幅用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な修飾を施した核酸（DNA）の開発ならびにそれらの生物学的研究への利用は従来
から盛んに行われてきた。これらの手法には大別して２種類が存在し、核酸塩基部分を化
学修飾するものとリン酸部のバックボーン骨格を修飾する手法とに分かれる。核酸塩基部
の修飾では主に酵素やタンパク質等の機能性生体物質に対する修飾型核酸の認識様や活性
発現様などに影響を与え、またリン酸骨格の修飾では主に核酸自身の安定性や血液および
細胞液に対する溶解性などに影響を与える。これまでに核酸リン酸部位の水酸基が部分的
に硫黄やメチル基で置換された修飾型核酸の合成が行われ、それらのDNAとしての性質や
挙動について研究が行われてきた。同様にリン酸部位の水酸基が一部ホウ素で置換された
ボラノホスフェート核酸の合成も達成されており、このボラノホスフェートDNAが従来の
天然型DNAと比較して、生体内に過量存在するexo-およびendo-ヌクレアーゼに対する耐性
が数百から数万倍高いことがin vitroの系で示された（非特許文献1, 2）。しかしこのボ
ラノホスフェートDNAが生物学的な研究において実際に使用された例は少ない。一つはSha
wらがボラノホスフェートを用いた放射性物質不使用のシーケンス法を報告している（非
特許文献2）。これは天然型DNAのリン酸部と比べてボラノホスフェートのexo-ヌクレアー
ゼ耐性が高いという特性を利用したものである。もう一つはShawらが報告したもので、α
-ボラノデオキシヌクレオシド三リン酸を化学合成的に調整し、それらの存在下PCR反応に
よってボラノホスフェートを含むDNAを生化学的手法によって作成した（非特許文献3）。
しかしこの場合、ボラノホスフェートDNAはDNAポリメラーゼに認識されDNA複製のための
テンプレートとして機能したが、これまで使用された他の例を含めてそれらは単にヌクレ
アーゼ耐性が高いDNA部位としてしか認識されず、発展利用はされてこなかった。
【０００３】
一方でわれわれを始めとする世界の多数の研究者は、siRNAを用いるRNAi研究を精力的
に行っている。現在非常に注目を集めている哺乳動物の細胞内でsiRNAを発現させる場合
、それらを発現する長い遺伝子を羅患部位に直接接種あるいは点滴等を用いて静注するこ
とが必須となる。ここで大きな問題となるのが導入する遺伝子（DNA）の生体内での安定
性である。生体外部から導入された遺伝子の生体内での寿命は一般的に極めて短く、それ
らは導入後まもなく何の機能をも果たさなくなるほどの長さに細かく切断される。それは
生体自身が持つ生体外物質に対する基本的防御機構によるものであり、その役割を直接的
に果たすのが前述のexo-およびendo-ヌクレアーゼである。
【０００４】
【非特許文献１】JACS (1998) 120,9417-9427
【非特許文献２】Nucleic Acid Research(1997) 25, 1611-1617.
【非特許文献３】Nucleic Acid Research(1999) 27, 1788-1794.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、exo-およびendo-ヌクレアーゼ耐性が非常に高い修飾型核酸（DNA）をテンプ
レートとする新たなRNA転写法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、まず天然型dATP、dCTP、dGTPおよびα-ボラノチミジン三リン酸存在下
、PCR法を用いてcircular DNAから任意の部位をdsDNAとして複製した。このdsDNA中に存
在するすべてのチミジンの5’-側リン酸部位では、リン酸部位の水酸基が完全にホウ素に
置換されている。また複製されたdsDNAの塩基配列はシーケンス解析によって確認した。
得られたdsDNAにはT7RNAポリメラーゼのプロモーターが存在するため、T7RNAポリメラー
ゼを用いて転写試験を行ったところ、ボラノホスフェートDNAから初めてRNAが転写された
ことが確認された。さらにプロモータ部位に存在するチミジンの5’-側リン酸部位は天然
型リン酸型でもボラノホスフェート型でもいずれの場合でも問題なく転写は進行した。本
発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
［１］  少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または酸素
原子が他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡであって、Ｒ
ＮＡの転写および／または増幅のテンプレートとして機能しうる、または遺伝子の発現抑
制として機能しうる前記修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡをテンプレートとして用いることを
特徴とする、ＲＮＡの転写および／または増幅方法。
［２］  修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡが、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合し
ている水酸基がボラノ基に置換されているＤＮＡあるいはＲＮＡである［１］記載の方法
。
［３］  修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡが、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合し
ている水酸基が光学活性ボラノ基に置換されている完全化学合成されたＤＮＡあるいはＲ
ＮＡである［１］記載の方法。
［４］  少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または酸素
原子が他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡであって、ＲＮＡの転写およ
び／または増幅のテンプレートとして機能しうる前記修飾型ＤＮＡからなる、ＲＮＡ転写
および／または増幅のためのテンプレート。
［５］  修飾型ＤＮＡが、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基が
ボラノ基に置換されているＤＮＡである［４］記載のテンプレート。
［６］  糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基が他の原子または
基に置換された修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む、ＲＮＡ転写および／ま
たは増幅ためのテンプレート作製用キット。
［７］  修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、α−リン酸部分のリンに結合して
いる水酸基がボラノ基に置換されている2’-デオキシリボヌクレオシド三リン酸である［
６］記載のキット。
［８］  糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基が他の原子または
基に置換された修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む、ＲＮＡ転写および／ま
たは増幅用キット。
［９］  修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、α−リン酸部分のリンに結合して
いる水酸基がボラノ基に置換されている2’-デオキシリボヌクレオシド三リン酸である［
８］記載のキット。
［１０］  糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または
酸素原子が他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡであって、ＲＮＡの転写
および／または増幅のテンプレートとして機能しうる前記修飾型ＤＮＡを含む、ＲＮＡ転
写および／または増幅用キット。
［１１］  修飾型ＤＮＡが、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基
がボラノ基に置換されているＤＮＡである［１０］記載のキット。
［１２］  少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または酸
素原子が他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡであって、
ＲＮＡの転写および／または増幅のテンプレートとして機能しうる、または遺伝子の発現
抑制として機能しうる前記修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡ。
［１３］  細胞あるいは組織に導入し、機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現させるこ
とができる［１２］記載の修飾型ＤＮＡ。
［１４］  発現する機能性核酸がsiRNAあるいはヘアピンRNAを含む二本鎖RNAである［１
３］記載の修飾型DNA。
［１５］  発現する機能性核酸がリボザイムである［１３］記載の修飾型DNA。
［１６］  発現する機能性核酸がアンチセンスRNAである［１３］記載の修飾型DNA。
［１７］  発現する機能性核酸の標的がウィルスあるいは癌に関連する遺伝子である［１
３］〜［１６］のいずれかに記載の修飾型DNA。
［１８］  ウイルスがHIV、HCV及びHBVからなる群より選択される［１７］記載の修飾型D
NA.
［１９］  細胞あるいは組織に導入し、遺伝子の発現を抑制することができる［１２］記
載の修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡ。
［２０］  修飾型ＲＮＡがアンチセンスＲＮＡである［１９］記載の修飾型ＲＮＡ。
［２１］  修飾型ＲＮＡがsiRNAおよびヘアピンRNAを含む二本鎖ＲＮＡである［１９］記
載の修飾型ＲＮＡ。
［２２］  修飾型ＤＮＡがＤＮＡザイムである［１９］記載の修飾型ＤＮＡ。
［２３］  ［１２］〜［２２］のいずれかに記載の修飾型DNAあるいはＲＮＡを含む組成
物。
［２４］  ［１２］〜［２２］のいずれかに記載の修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡを含む医
薬組成物。
［２５］  ［１９］〜［２１］のいずれかに記載の修飾型ＲＮＡをin vitro転写によって
作成する方法。
［２６］  ［１２］〜［２２］のいずれかに記載の修飾型DNAあるいはＲＮＡを光学活性
なボラノ基を含むヌクレオチドより合成する方法。
【０００８】
本発明の技術は、修飾型DNAをテンプレートとして用いるsiRNA発現法の開発、修飾siRN
A、修飾型DNAのRNAi研究への応用などに利用可能である。さらには、ヘアピンRNA、リボ
ザイム、アンチセンスRNAなどの機能的核酸の発現への応用、アンチセンスRNA、siRNA、
ヘアピンRNA、DNAザイムなどの遺伝子発現抑制作用を有する核酸への応用が可能である。
【０００９】
本明細書において、「修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡ」とは、天然型ＤＮＡあるいはＲＮ
Ａと比較して、リン酸骨格における少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している
水酸基および／または酸素原子が他の原子および／または基に置換されているという修飾
がなされているＤＮＡあるいはＲＮＡを意味する。
【００１０】
「テンプレート」とは、ＲＮＡ転写および／または増幅において、二本鎖ＤＮＡが鋳型
となり、センスＲＮＡの合成を行う際の鋳型ＤＮＡのことをいう。
【００１１】
「修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸」とは、天然型デオキシリボヌクレオシド
三リン酸と比較して、糖に直接結合しているリン酸（α−リン酸）部分のリン（α位のリ
ン）に結合している水酸基が他の原子または基に置換されているという修飾がなされてい
るデオキシリボヌクレオシド三リン酸を意味する。
【００１２】
「機能性核酸」とは、細胞、組織、および器官において、特定の働きを持つ核酸をいい
、遺伝子発現抑制などの生理活性、RNAの切断などの酵素活性、タンパク質や、RNA、低分
子化合物などへの結合能、などを有する核酸が含まれる。
【００１３】
「ヘアピンＲＮＡ」とは、直鎖状2本鎖RNAの5’末端および3’末端の両末端同士が、1
本鎖の構造を持つRNAループでつながったRNAをいい、ステム構造とそれをつなぐループ構
造を持つステム、ループRNAが含まれる。ステム構造は、完全にマッチしていなくてもよ
い。
【００１４】
「リボザイム」とは、RNAを化学的実体とする生体触媒の総称である。
【００１５】
「アンチセンスＲＮＡ」とは、あるRNAと相補的な配列を持つRNA分子をいい、あるター
ゲットRNAと相補的に結合し、その発現を抑制するRNA分子を含む。
【００１６】
「ＤＮＡザイム」とは、DNAを化学的実体とする生体触媒の総称である。
【００１７】
「光学活性なボラノ基を含むヌクレオチド」とは、ボラノ基が5’のα-リン原子に共有
結合しているために生じる不斉中心を有するヌクレオチドをいう。
【００１８】
なお、本明細書において、「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値および
最大値として含む範囲を示す。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、exo-およびendo-ヌクレアーゼ耐性が非常に高い修飾型核酸（DNA）をテ
ンプレートとする新たなRNA転写法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／または
酸素原子が他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡであって
、ＲＮＡの転写および／または増幅のテンプレートとして機能しうる、または遺伝子の発
現抑制として機能しうる前記修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡをテンプレートとして用いるこ
とを特徴とする、ＲＮＡの転写および／または増幅方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、少なくとも１箇所のリン酸部分のリンに結合している水酸基および／
または酸素原子が他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡであって、ＲＮＡ
の転写および／または増幅のテンプレートとして機能しうる前記修飾型ＤＮＡからなる、
ＲＮＡ転写および／または増幅のためのテンプレートを提供する。
【００２２】
本発明において、テンプレートとして用いるＤＮＡは、少なくとも１箇所のリン酸部分
のリンに結合している水酸基および／または酸素原子が他の原子および／または基に置換
されている。この置換は、exo-およびendo-ヌクレアーゼ耐性の向上を目的とする。置換
の例を以下に挙げるが、これらに限定されることはない。
【００２３】
天然ＤＮＡの構造を以下に示す。
【００２４】
【化１】
2005046073.tif 000003
（１）リン酸部分のリンに結合している水酸基(-OH)（上式におけるX）が、ボラノ基(-BH
3-)、ホスホロ基(-S-)、アミノ基(-NH2)、低級アルキル基(-R)（Rは、例えば、メチル基
、エチル基など）およびアルコキシ基(-OR) （Rは、例えば、メチル基、エチル基など）
からなる群より選択される基に置換されている（Biochemistry (1979) 18, 5134.; Tetra
hedron Lett.
(1982) 23, 4289.)。
（２）リン酸部分のリンに結合しているオキソ基(=O)
（上式における=O1）が、チオキソ基(=S)に置換されている（Tetrahedron
Lett. (1980) 21, 1121.; Biochemistry (1987) 26, 8237.）。
（３）リン酸部分のリンと糖の5’位の炭素に結合しているオキシ基(-O-)（上式における
-O2-）が、メチレン基(-CH2-)、チオキシ基(-S-)およびアミノ基(-NH-)からなる群より選
択される基に置換されている（Nucleic Acids Res. (1997) 25, 830）。
（４）リン酸部分のリンと糖の3’位の炭素に結合しているオキシ基(-O-)（上式における
-O3-）が、メチレン基(-CH2-)、チオキシ基(-S-)およびアミノ基(-NH-)からなる群より選
択される基に置換されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 5798）。
（５）（１）と（２）の組合せ（例えば、リン酸部分がホスホロジチオエート化されてい
る（上式において、XがS-に置換し、=O1が=Sに置換されている））など（Tetrahedron
Lett. (1988) 29, 2911.; JACS (1989) 111, 2321.）。
【００２５】
また、テンプレートとして用いるＤＮＡのリン酸部分におけるリンに結合している水酸
基および／または酸素原子の他の原子および／または基への置換（以下、この置換を「修
飾」と記す）は、少なくとも１箇所のリン酸部分でなされていればよい。例えば、特定の
種類の塩基（すなわち、アデニン(Aと略記される)、グアニン(Gと略記される)、シトシン
(Cと略記される)またはチミン(Tと略記される)のいずれかの塩基）が糖（D-フラノース）
に結合しているデオキシリボヌクレオシド部分に結合（エステル結合）しているリン酸部
分の全部または一部で修飾がなされていてもよいし、すべてのリン酸部分で修飾がなされ
ていてもよい。あるいはまた、複数のリン酸部分でランダムに修飾がなされていてもよい
。
【００２６】
修飾型ＤＮＡは、いかなるＤＮＡであってもよく、例えば、siRNAやリボザイムやアプ
タマーを発現するＤＮＡ、p53などアポトーシス関連遺伝子、デコイDNAなどの医薬として
有用なＤＮＡ、研究対象として興味のあるＤＮＡを挙げることができるが、これらに限定
されるわけではない。
【００２７】
また、修飾型ＤＮＡは、リン酸部分以外の部位に修飾がなされていてもよい。リン酸部
分以外の部位の修飾としては、塩基部分の修飾、糖部分の修飾、5’末端の修飾、3’末端
の修飾などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００２８】
修飾塩基の例としては、2-アミノプリン、2’-アミノ-ブチリルピレン-ウリジン、2’-
アミノウリジン、2’-デオキシウリジン、2’-フルオロ-シチジン、2’-フルオロ-ウリジ
ン、2,6-ジアミノプリン、4-チオ-ウリジン、5-ブロモ-ウリジン、5-フルオロ-シチジン
、5-フルオロ-ウリジン、5-インド-ウリジン、5-メチル-シチジン、イノシン、N3-メチル
-ウリジン、7-デアザ-グアニン、8-アミノヘキシル-アミノ-アデニン、6-チオ-グアニン
、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、5-ヨード-ウリジン、5-ヨード-シチジン、8-ブロモ-
グアニン、8-ブロモ-アデニン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-グアニン、8-オキソ-グア
ニン、5,6-ジヒドロ-ウリジン、5-ヒドロキシメチル-ウリジンなどを挙げることができる
が、これらに限定されることはない。これらの合成ユニットは市販されており（例えば、
Glen Research社から購入できる）、DNAへの導入は化学合成により可能である。
【００２９】
糖部分の修飾の例としては、3’-デオキシ化、2’-フルオロ化、アラバノシド化などを
挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらについてもDNAへの導入
は化学合成により可能である。
【００３０】
5’末端の修飾の例としては、5’-アミノ化、5’-ビオチン化、5’-フルオレセイン化
、5’-テトラフルオロ-フルオレセイン化、5’-チオ化、5’-ダブシル化などを挙げるこ
とができるが、これらに限定されることはない。
【００３１】
3’末端の修飾の例としては、3’-アミノ化、3’-ビオチン化、2,3-ジデオキシ化、3’
-チオール化、3’-ダブシル化、3’-カルボキシレート化、3’-コレストリル化などを挙
げることができるが、これらに限定されることはない。
【００３２】
修飾型ＤＮＡは、公知のいかなる方法で製造してもよい。製造方法の一例を簡単に説明
する。
【００３３】
上述の（１）の置換がなされた修飾型ＤＮＡを合成するには、生物学的方法と化学合成
が可能である。
【００３４】
生物学的方法においては、まず、糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合してい
る水酸基が他の原子または基に置換された修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を合
成する。修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸はラセミ体でも、所望の立体配置のも
のでもよい。ラセミ体の修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸の合成法は、Biochemi
stry (1979) 18, 5134.; Tetrahedron Lett.
(1982) 23, 4289.に記載されている。Ｒ配置の修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸
の合成法は、後述の実施例８に記載されている。また、所望の立体配置の修飾型デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸は、ラセミ体から光学分割により得ることもできる。得られた
修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて、公知の核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ
）により、鋳型となるＤＮＡから目的の修飾型ＤＮＡを合成する（Nucleic Acid Researc
h (1997) 25, 1611-1617.）を参照のこと）。核酸増幅法においては、ラセミ体の修飾型
デオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として用いても、酵素によりＳ配置の修飾型デ
オキシリボヌクレオシド三リン酸のみが消費されて、Ｒ配置の修飾ＤＮＡが構築される。
この手法を用いる場合、基質となる修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を光学活性
体として合成あるいは分離調製す必要がなく、しかも導入された修飾型デオキシリボヌク
レオシド三リン酸の光学純度は１００％となる。
【００３５】
化学的合成法においては、反応点であるリン酸のリン原子に結合生成の方向を規制する
キラル補助基を結合させ、この効果によって任意の立体化学を有するリン酸を合成する。
このキラル補助基自身については裏表いずれの立体配置も合成可能なため、これにより天
然対の立体化学と反対の結合様式を持つ非天然型DNAの合成も可能となる。化学的合成法
の一例については、後述の実施例６及び７に記載されている。
【００３６】
上述の（２）〜（５）の置換がなされた修飾型ＤＮＡを合成するには、ヌクレオシドを
２ユニット連結させてからリン酸部を修飾し、その後、３ユニット目のヌクレオシドを２
ユニット目と同様に導入後、再びリン酸部を修飾する。この操作を必要数繰り返し行い、
望む塩基配列を持つDNAを合成することができる（Tetrahedron Lett. (1980) 21, 1121.;
Biochemistry (1987) 26,
8237.; Nucleic Acids Res. (1997) 25, 830; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92,
5798; Tetrahedron Lett. (1988) 29, 2911.; JACS (1989) 111, 2321.を参照のこと）。
【００３７】
修飾型ＤＮＡが、ＲＮＡの転写および／または増幅のテンプレートとして機能しうるか
否かについては、後述のＲＮＡの転写および／または増幅を行う方法を実施することによ
り、確認することができる。
【００３８】
修飾型ＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＲＮＡの転写および／または増幅を行う方
法の一例を以下に記載する。バッファー(11〜12μl)中に溶解した修飾型DNAテンプレート
（3〜4μg）存在下、10〜11μLの各種塩基のリボヌクレオシド三リン酸（以下、「rNTPs
」と記す。各25〜27mM, Promega社）、T7 Transcription 5x Buffer（5〜6μL, Promega
社）、Enzyme Mix（2〜2.5μL, Promega社）を用いて36.5〜37.5℃で4〜5時間転写反応を
行う。望む大きさを示すRNAが得られたことは市販のアクリルアミドゲルによって確認す
ることができる。得られたRNAの塩基配列は逆転写酵素を用いてDNAを逆転写後、得られた
DNAをPCRで増幅してから市販のシーケンス装置によって確認することができる。
【００３９】
ＲＮＡについても、同様の方法で同様の修飾が可能である。
【００４０】
本発明の修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡを用いて、siRNAあるいはヘアピンRNAを含む二本
鎖RNA、リボザイム、アンチセンスRNAなどの機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現させ
たり、遺伝子の発現を抑制することができる。機能性核酸の標的は、HIV、HCV、HBVなど
のウイルス、癌遺伝子などであるとよい。本発明の修飾型ＤＮＡを細胞あるいは組織内に
導入したときに、遺伝子の発現を抑制するための一つの方法として、この修飾型ＤＮＡは
ＤＮＡザイムとして利用することができる。
【００４１】
本発明の修飾型ＤＮＡあるいはＲＮＡを含む組成物は、医薬品、化粧品、試薬、食品な
どの種々の用途に利用することができる。
【００４２】
さらに、本発明は、糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基が他
の原子または基に置換された修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む、ＲＮＡ転
写および／または増幅ためのテンプレート作製用キットを提供する。
【００４３】
修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、糖に直接結合しているリン酸部分のリン
に結合している水酸基が他の原子または基に置換されている。この置換は、exo-およびen
do-ヌクレアーゼ耐性が向上した修飾型ＤＮＡを作製できるようにすることを目的とする
。置換の例としては、α−リン酸部分のリンに結合している水酸基(-OH)が、ボラノ基(-B
H3-)に置換されたものを挙げることができる。他のホスホロ基(-S-)、アミノ基(-NH2)、
低級アルキル基(-R)（Rは、例えば、メチル基、エチル基など）およびアルコキシ基(-OR)
（Rは、例えば、メチル基、エチル基など）からなる群より選択される基に置換されてい
るものもＲＮＡポリメラーゼに認識される限り転写の鋳型として使用可能である（Bioche
mistry (1979) 18, 5134.; Tetrahedron Lett.
(1982) 23, 4289.)。
【００４４】
修飾型デオキシヌクレオチド三リン酸の塩基部分の塩基は、A、G、C、Tのいずれであっ
てもよい。
【００４５】
また、修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、糖に直接結合しているリン酸（α
−リン酸）部分以外の部位に修飾がなされていても、いなくてもよい。糖に直接結合して
いるリン酸部分以外の部位での修飾としては、塩基部分の修飾、糖部分の修飾などを挙げ
ることができるが、これらに限定されることはない。塩基部分の修飾、糖部分の修飾など
の例としては、修飾型ＤＮＡの塩基部分の修飾、糖部分の修飾などについて上述した例と
同じものを挙げることができるが、これらに限定されることはない。また、糖部分の他の
修飾の例として、修飾型ＤＮＡの3’末端の修飾について上述した例と同じものを挙げる
ことができる。また、糖に直接結合していないリン酸（β、γ-リン酸）部分の修飾はな
されていなくて良い。
【００４６】
修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、2’-デオキシリボヌクレオシド三リン酸
であるとよい。
【００４７】
修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸はラセミ体でも、所望の立体配置のものでも
よい。
【００４８】
一方、修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、公知のいかなる方法で製造しても
よい。修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法を記載している文献は上述し
た通りである。
【００４９】
本発明のＲＮＡ転写および／または増幅ためのテンプレート作製用キットは、さらに、
ＲＮＡの転写および／または増幅のためのテンプレートとなるＤＮＡの合成を促進する誘
導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、他のデオキシリボヌクレオシド
三リン酸（例えば、修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸の構成要素である特定の塩
基とは異なる種類の塩基を構成要素として含むデオキシリボヌクレオシド三リン酸（糖に
直接結合しているリン酸部分が修飾されたものであっても、修飾されていないものであっ
てもよい）など）、バッファー（例えば、Hepes, TRIS, グリセロール、DTTなど）、金属
イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなど）、キットの使用方法を記載
した説明書などを含んでもよい。さらに、本発明の上記キットは、ＲＮＡを転写および／
または増幅するためのテンプレートとなるＤＮＡを合成するためのプライマー対、鋳型と
なるＤＮＡなどを含んでいてもよい
本発明のＲＮＡ転写および／または増幅ためのテンプレート作製用キットの使用方法の
一例を以下に説明する。修飾型デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および修飾型デオキ
シリボヌクレオチド三リン酸の構成要素である特定の塩基（例えば、T）とは異なる各種
塩基を構成要素とする天然型デオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、dATP、dGTPお
よびdCTP)の存在下、鋳型となるDNA、１組のプライマーおよびDNAポリメラーゼを用いて
、目的とするDNA（ＲＮＡ転写および／または増幅ためのテンプレート）を合成する。合
成したDNAの分子量は市販のアクリルアミドゲルで確認することができる。合成したDNAの
塩基配列は市販のシーケンス装置で確認することができる。
【００５０】
さらにまた、本発明は、糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基
が他の原子または基に置換された修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む、ＲＮ
Ａ転写および／または増幅用キット（以下、「本発明の第１の態様のＲＮＡ転写および／
または増幅用キット」と記す。）を提供する。
【００５１】
本発明の第１の態様のＲＮＡ転写および／または増幅用キットは、（Ａ）ＲＮＡ転写お
よび／または増幅ためのテンプレートとなるＤＮＡを作製するための要素と（Ｂ）ＲＮＡ
を転写および／または増幅するための要素から構成されるとよい。
【００５２】
（Ａ）の要素としては、糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基
が他の原子または基に置換された修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＲＮＡの転
写および／または増幅のためのテンプレートとなるＤＮＡの合成を促進する誘導剤（例え
ば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（
例えば、修飾型デオキシリボヌクレオシド三リン酸の構成要素である特定の塩基とは異な
る種類の塩基を構成要素として含むデオキシリボヌクレオシド三リン酸（糖に直接結合し
ているリン酸部分が修飾されたものであっても、修飾されていないものであってもよい）
など）、バッファー（例えば、Hepes, TRIS, グリセロール、DTTなど）、金属イオン（例
えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなど）などを挙げることができる。
【００５３】
（Ｂ）の要素としては、ＲＮＡの転写および／または増幅を促進する誘導剤（例えば、
RNAポリメラーゼなど）、リボヌクレオシド三リン酸（塩基部分の塩基が、それぞれ、A、
G、CおよびUであるもの）、バッファー（例えば、Hepes, TRIS, グリセロールなど）、金
属イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなど）などを挙げることができ
る。
【００５４】
さらに、本発明の第１の態様のＲＮＡ転写および／または増幅用キットは、キットの使
用方法を記載した説明書を含むとよい。
【００５５】
本発明の第１の態様のＲＮＡ転写および／または増幅用キットの使用方法の一例を以下
に説明する。まず、（Ａ）の要素を用いて、ＲＮＡ転写および／または増幅のためのテン
プレートとなるＤＮＡを作製する。その方法については、本発明のＲＮＡ転写および／ま
たは増幅のためのテンプレート作製用キットの使用方法と同様である。次に、作製したテ
ンプレート（DNA）と（Ｂ）の要素を用いて、ＲＮＡの転写および／または増幅を行う。
その方法の一例を以下に記載する。DNAテンプレートの存在下、各種塩基のrNTP、バッフ
ァー、RNAポリメラーゼを用いて転写反応を行う。得られたRNAの分子量は市販のアクリル
アミドゲルによって確認することができる。得られたRNAの塩基配列は逆転写酵素を用い
てDNAを逆転写後、得られたDNAをPCRで増幅してから市販のシーケンス装置によって確認
することができる。
【００５６】
また、本発明は、糖に直接結合しているリン酸部分のリンに結合している水酸基および
／または酸素原子が他の原子および／または基に置換された修飾型ＤＮＡであって、ＲＮ
Ａの転写および／または増幅のテンプレートとして機能しうる前記修飾型ＤＮＡを含む、
ＲＮＡ転写および／または増幅用キット（以下、「本発明の第２の態様のＲＮＡ転写およ
び／または増幅用キット」と記す。）を提供する。
【００５７】
修飾型ＤＮＡは上述の通りである。この修飾型ＤＮＡは、ＲＮＡ転写および／または増
幅のためのテンプレートとなる。
【００５８】
本発明の第２の態様のＲＮＡ転写および／または増幅用キットは、さらに、ＲＮＡの転
写および／または増幅を促進する誘導剤（例えば、RNAポリメラーゼなど）、リボヌクレ
オシド三リン酸（塩基部分の塩基が、それぞれ、A、G、CおよびUであるもの）、バッファ
ー（例えば、Hepes, TRIS, グリセロールなど）、金属イオン（例えば、ナトリウム、カ
リウム、マグネシウムなど）、キットの使用方法を記載した説明書などを含んでもよい。
この際のテンプレートは、光学活性なヌクレオシドを用いた化学合成によっても合成でき
る。
【００５９】
本発明の第２の態様のＲＮＡ転写および／または増幅用キットの使用方法の一例を以下
に説明する。DNAテンプレート（修飾型DNA）の存在下、各種塩基のrNTP、バッファー、RN
Aポリメラーゼを用いて転写反応を行う。得られたRNAの分子量は市販のアクリルアミドゲ
ルによって確認することができる。得られたRNAの塩基配列は逆転写酵素を用いてDNAを逆
転写後、得られたDNAをPCRで増幅してから市販のシーケンス装置によって確認することが
できる。また、RNA転写反応において光学活性なボラノ修飾rNTPを用いるとボラノ修飾RNA
が調製される。さらに、光学活性なボラノ修飾ＲＮＡ合成ユニットを用いることによって
化学合成による供給が可能である。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を
説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］α-ボラノチミジン三リン酸（dTTP-αB）、α-ボラノアデノシン三リン酸（
dATP-αB）、α-ボラノグアノシン三リン酸（dGTP-αB）及びα-ボラノシチジン三リン酸
（dCTP-αB）の合成
【００６１】
【化２】
2005046073.tif 000004
（１）α-ボラノチミジン三リン酸（dTTP-αB）の合成（上式のB=チミン）
乾燥させた市販の3’-O-アセチルチミジン（Sigma-Aldrich社）（0.25 mmol）をアルゴ
ン雰囲気下、無水ピリジン（0.1
mL）と無水DMF（0.75 mL）に溶かした。そこへ1Mの2-クロロ-4H-1,3,2-ベンゾジオキサホ
スフォリン-4-オン（Aldrich社）（0.75 mL）を加え攪拌した。15分後に0.5Mのビス（ト
リ-n-ブチルアンモニウム）ピロリン酸（Sigma-Aldrich社）（0.75 mL）と無水n-トリブ
チルアミン（東京化成）（0.125
mL）を加えてさらに10分間攪拌後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン-ボラン錯体（Aldri
ch社）（1 mL）を加えて室温で9時間攪拌した。反応液を水（25 mL）で希釈して1.5時間
攪拌後、ロータリーエバポレーターで濃縮して固体を得た。アンモニア水-メタノール/2:
1（40 mL）を加えて室温で68時間攪拌後、ロータリーエバポレーターで濃縮して固体を得
た。残査を水（25 mL）に溶解し、ジクロロメタン（10
mLx2）で洗浄後、水溶液を凍結乾燥して固体を得た。粗生成物はイオン交換クロマトグラ
フィー（UNO-Q12、BIORAD社）によって炭酸水素アンモニウム（溶出濃度0.45M-0.5M）を
用いて精製した。溶出液の凍結乾燥を３度繰り返して生成物（dTTP-αB）を得た。収率36
％。dTTP-αBの質量分析スペクトルを図５に示す。dTTP-αBの質量分析値(M)は479.0364
であった。
（２）α-ボラノアデノシン三リン酸（dATP-αB）の合成（上式のB=アデニン）
2’,3’-O-ジアセチル-5’-O-[(2R,5R)-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジ
ン-2-イル]アデノシンの合成
3’-O-ジアセチルアデノシン（1.5mmol）をTHF（7.5mL）とトリエチルアミン（7.5mmol
）に溶解して-78℃に冷却した。0.22M溶液の(5R)-1（7.5mL, 1.65mmol）を滴下し、室温
まで上昇させて30分間攪拌した。飽和重曹水（75mL）とクロロホルム（75mL）を加えて有
機層を分離後、有機層を飽和重曹水で洗浄した。水層をクロロホルムで逆抽出して混合後
、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去後、粗生成物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフを用いて精製した（ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン=50:50:2）。溶
出物を飽和重曹水で洗浄して無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して純粋な生成物（2
’,3’-O-ジアセチル-5’-O-[(2R,5R)-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジ
ン-2-イル] アデノシン）（1.2 mmol）を得た。
アデノシン 5’-[α-(Rp)-ボラノ]三リン酸の合成
0.2Mアセトニトリル溶液のN-シアノメチルピロリジニウムトリフラート（500μL, 100
μmol）と2,6-ジニトロフェノール（50μmol）に2’,3’-O-ジアセチル-5’-O-[(2R,5R)-
3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル] アデノシン（39.6mg, 60μm
ol）を加えた。５分後にボラン-ジメチルスルフィド錯体（60μmol）を加え、８分後に無
水ピリジン（500μmol）と無水酢酸（100μmol）を加えた。さらに３分後にテトラ（トリ
-n-ブチルアンモニウム）ピロリン酸（60μmol）を加えて１時間攪拌した。反応溶液をク
ロロホルム（3mL）で希釈し、0.2Mのリン酸緩衝液（pH7.0,
3mL）で洗浄し、水層をクロロホルムで逆抽出した。有機層を混合後、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥させた。残査を25%アンモニア水-ピリジン（9:1）中55℃で30分反応させてキラ
ル補助基と保護基を除去し、冷却後に濃縮した。残査を水に溶解してエーテルで洗浄し、
水を減圧留去後、粗生成物をイオン交換クロマトグラフHPLCを用いて精製して純粋な生成
物(アデノシン 5’-[α-(Rp)-ボラノ]三リン酸)（35.4 μmol）を得た。
（３）α-ボラノグアノシン三リン酸（dGTP-αB）の合成（上式のB=グアニン）
上記の最初の原料にジアセチルグアノシンを使用して、上記の方法により、α-ボラノ
グアノシン三リン酸を得た。
（４）α-ボラノシチジン三リン酸（dCTP-αB）の合成（上式のB=シトシン）
上記の最初の原料にジアセチルシチジンを使用して、上記の方法により、α-ボラノシ
チジン三リン酸を得た。
【００６２】
［実施例２］PCRによる含ホウ素オリゴDNAの調整
市販の天然型2’-デオキシアデノシン三リン酸（タカラバイオ社）、2’-デオキシシチ
ジン三リン酸（タカラバイオ社）、2’-デオキシグアノシン三リン酸（タカラバイオ社）
（各0.25 mM）、および実施例１で合成したα-ボラノチミジン三リン酸（0.25 mM）存在
下、２種のプライマー（TTAATACGACTCACTATAGAAGGAGACATATGGATGTTCAGCTGCAGG（配列番号
１）とGCTCTAGATTAGTGGTGGTGGTGGTGG（配列番号２））（各0.5 μM）、テンプレート（塩
基配列を配列番号３に示す。）（0.5 pM）、ならびにExTaqポリメラーゼ（タカラバイオ
社）（1 μL）を用いてPCRを行った（35 cycle（94℃-1分、55℃-1分、72℃-1分。））。
生成物は2%アガロース（タカラバイオ社）を用いて精製し、目的とするdsDNAを得た（図1
）。得られたdsDNAの塩基配列はシーケンス装置（Applied Biosystems、ABI-PRISM377）
を用いてその配列を確認した。
天然型dATP+dCTP+dGTPおよびdTTP-αBの代わりに、天然型dATP+dCTP+dGTPおよびdTTP-
αB、天然型dCTP+dGTPおよびdATP-aB+dTTP-αB、天然型dTTPおよびdATP-aB+ dGTP-aB+dCT
P-αB、天然型dCTPおよびdATP-aB+ dGTP-aB+dTTP-αB、天然型dGTPおよびdATP-aB+ dCTP-
aB+dTTP-αB、天然型dATPおよびdGTP-aB+ dCTP-aB+dTTP-αB、または dATP-aB+ dGTP-aB+
dCTP-aB+dTTP-αBを用いて、上記の操作を繰り返した。結果を図１に示す。得られたdsD
NAの塩基配列はシーケンス装置（Applied Biosystems、ABI-PRISM377）を用いてその配列
を確認した。
【００６３】
［実施例３］
ヒトH1プロモーターおよびヒトU6プロモーターを含む配列を染色体上のDNAをもとにし
て、PCR法によって増幅させた。PCRに用いたプライマー配列は、それぞれに対して以下の
通りである。
U6(90bp)
5'-TGCACTAGTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATCTTACCGTAACTTGAA-3'（配列番号４）
および
5'-GTGGGGCCCTTCGAACGCGAATTCCTTTCCACAGATA-3'（配列番号５）。
H1(100bp)
5'-TGCACTAGTATTTGCATGTCGCTA-3'（配列番号６）
および
5'-GTGGGGCCCTTCGAACGCGAATTCGTC-3'（配列番号７）。
【００６４】
PCRによって増幅されたDNAをプラスミドpPUR(CLONTECH 社/CLONTECH Laboratories, In
c. カルフォルニア、米国)に組み込み、それぞれ、pRU6(90)、pRH1(100)、と名付けた。
【００６５】
これらの構築したプラスミドDNAに、機能性RNA（二本鎖RNA）の配列を組み込んだ。そ
の配列は、以下の通りである。
5'-AATTAACACCGCAGAAGCTATGAAACGATTTGCTTCCTGTCACAAATCGTTTCATAGCTTCTGCTTTTT-3'（配
列番号８）
および
5'-AATTAAAAAGCAGAAGCTATGAAACGATTTGTGACAGGAAGCAAATCGTTTCATAGCTTCTGCGGTGTT-3'（配
列番号９）。
【００６６】
上記の配列を持つ二種類のDNAを混和し、加熱後、徐々に室温まで冷却させた。生じたD
NAを上記4種類のプラスミドに組み込み、それぞれ、pRU6(90)-L23、pRH1(100)-L23と命名
した。発現された二本鎖RNAはルシフェラーゼ酵素の遺伝子に相同性を持つ。
【００６７】
配列番号３に示す塩基配列を有するテンプレートDNAの代わりに、U6プロモーターを有
するプラスミド(pRU6(90)-L23)を用いて、実施例２の操作を繰り返した。結果を図２に示
す。U6プロモータを有するプラスミドをテンプレートとした場合でも含ホウ素PCR生成物
が得られた。
【００６８】
さらに、酵素をExTaqからFermentas社のTaqに変更したところ、すべての塩基の組合せ
においてホウ素が導入されたPCR生成物が得られた（図３）。
【００６９】
［実施例４］T7 RNA転写反応
実施例２で調整したDNAテンプレート（3 μg/12 μL）存在下、10 μLのrNTPs（Promeg
a社）（各25 mM）、T7
Transcription 5x Buffer（6 μL, Promega社）、Enzyme Mix（2 μL, Promega社）を用
いて37℃で4時間転写反応を行った。望む大きさを示すRNAが得られたことは5%アクリルア
ミドゲルによって確認された（図４）。
【００７０】
［実施例５］RNAi実験
U6プロモーターまたはH1プロモーターを有するプラスミド(pRU6(90)-L23、pRH1(100)-L
23)を用いて、実施例２の操作を繰り返し、各種ボラノホスフェートＤＮＡを調整した。
これらの各種ボラノホスフェートＤＮＡをテンプレートとするRNAi実験を行った。実験操
作はNature Biotechnology (2002) 20, 497-500.に従って行った。トランスフェクション
はLipofectamine2000（ライフテクノロジー社）を用いて試薬の操作書に従って行った。
ルシフェラーゼアッセイは、HeLa S3細胞に20ngのRenillaルシフェラーゼ発現ベクター、
50ngのfireflyルシフェラーゼ発現ベクター、66ngのsiRNA発現ベクターを用いて行った。
24時間後にdual
luciferase system（プロメガ社）をもちいて、同キットの操作書に従って行った。Remil
laの発現量（測定値）からfirefly発現量を換算変換して比較した。結果を図６に示す。
一種類の塩基についてホウ素が導入されたPCR産物についても、すべての塩基に組合せに
ついてホウ素が導入されたPCR産物についても、RNAi効果が見られた。
【００７１】
［実施例６］オリゴヌクレオシドホスホロチオエートの立体配置を制御する合成
N-(シアノメチル)ピロリジニウムトリフルオロメタンスルホネート(1f)の合成
【００７２】
【化３】
2005046073.tif 000005
N-(シアノメチル)ピロリジン（2.2g, 20mmol）溶液（ジクロロメタン20mL）にトリフルオ
ロメタンスルホン酸（1.77mL,
20mmol）を0℃で加えた。反応液を室温まで上昇させてエーテル（40mL）で希釈後、不溶
物を濾過してエーテルで洗浄した。濾取物を減圧乾燥して純粋な生成物1f（5.2g, 20mmol
）を得た。
融点67.0-67.5℃. IR (KBr) vmax 2996, 2841, 2651,2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 14
37, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761,641 cm-1. 1H NMR (300 MHz, CD3CN)
δ 8.14 (br,1H), 4.28 (s, 2H), 3.48 (br, 4H), 2.09 (m, 4H). 13C NMR (75 MHz, CD
3CN)δ 121.5 (q, 1JCF = 320 Hz), 112.6, 56.2, 42.3, 23.9.Anal. Calcd for C7H11F3
N2O3S:C, 32.31; H, 4.26; N, 10.76. Found: C, 32.31; H, 4.22; N, 10.81.
1a-e,g-nは同様の方法で合成した。
(5R)-2-クロロ-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン[(5R)-3a]の合成
【００７３】
【化４】
2005046073.tif 000006
N-メチルモルホリン（1.1mL, 10mmol）を(R)-2a（756mg, 5mmol）のトルエン溶液（2.5mL
）に溶かし、三塩化リン（435μL, 5mmol）溶液（トルエン2.5mL）を0°Cで加えた。反応
液を室温まで上昇させて30分攪拌後、不溶物を-78°Cで濾過して濾液を濃縮して(5R)-3a
の粗生成物（1.07g, 5mmol）を得た。粗生成物は精製せずに次の反応に用いた。13C NMR 
(75 MHz, CDCl3) δ 138.1, 128.5, 128.5,126.5, 85.4 (br), 56.3 (d, 2JPC = 6.6 Hz)
, 31.0 (d, 2JPC= 13.0 Hz).
(5S)-3a, 3b-fは同様の方法で合成した。(5S)-3a, 3b-fの精製法およびスペクトルデート
を以下に示す。(5S)-3aは蒸留によって精製した。20mmolから2.1g, 9.7mmol。
(5S)-2-クロロ-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン[(5S)-3a]の合成
(S)-2aから(5S)-3aの粗生成物を得、蒸留によって精製した。20mmolから2.22g, 12mmol。
(4S,5R)-2-クロロ-3,4-ジメチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン(3b)の合成
出発物質として(1R,2S)-エフェドリン(2b)（496 mg, 3.0 mmol）を用い、得られた粗生成
物をクーゲロール蒸留によって精製して、3bを得た。3mmolから356mg, 1.6mmol。
1H NMR (300 MHz, CDCl3).δ 7.40-7.23(m, 5H), 5.85 (d, 3JHH = 6.3 Hz, 1H), 3.72-3
.61 (m, 1H),2.72 (d, 3JPH = 15.6 Hz, 3H), 0.72 (d, 3JHH= 4.2 Hz, 3H). 13C NMR (7
5 MHz, CDCl3) δ 136.4 (d, 3JPC= 2.6 Hz), 128.3, 128.3, 126.9, 87.7 (d, 2JPC = 8
.9 Hz),57.7 (br), 29.0 (d, 2JPC = 13.8 Hz), 14.4. 31PNMR (121 MHz, CDCl3).δ 171
.5.
(4S,5R)-2-クロロ-3-メチル-4,5-ジフェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン(3c)の合成
(1R,2S)-2-メチル-1,2-ジフェニルエタノール(2c)(2.27 g, 10 mmol)から3cの粗生成物を
得た。10mmolから3.17g, 10mmol。
1H NMR (300 MHz, CDCl3). δ 7.08-7.05(m, 6H), 6.91-6.81 (m, 4H), 6.15 (d, 3JHH =
8.3 Hz, 1H),4.64 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 3JPH = 4.2Hz, 1H), 2.64 (d, 3JPH = 15.3 Hz
, 3H). 13C NMR(75 MHz, CDCl3) δ 135.8 (d, 3JPC = 3.2 Hz),134.5 (d, 3JPC = 5.4 H
z), 128.2, 127.9, 127.7, 127.6,127.5, 126.5, 88.0 (d, 2JPC = 8.6 Hz), 68.1 (d, 2
JPC= 6.3 Hz), 29.6 (d, 2JPC = 14.1 Hz). 31P NMR(121 MHz, CDCl3). δ 171.7.
(5R)-2-クロロ-3-イソプロピル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン(3d)の合成
(R)-2-イソプロピル-1-フェニルエタノール(2d)(896 mg, 5.0 mmol)から3dの粗生成物を
得た。5mmolから1.22g, 5mmol。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.45-7.34(m, 5H), 5.94-5.24 (br, 1H), 3.62-3.47 (m, 1
H), 3.18 (dd, 2JHH= 18.3 Hz, 3JHH = 9.3 Hz, 1H), 1.35 (d, 3JHH= 6.6 Hz, 6H). 13C
NMR (75 MHz, CDCl3) δ 138.5 (br),128.6, 128.5, 126.5 (br), 84.7 (br), 51.3 (br
), 47.3 (d, 2JPC= 10.6 Hz), 22.0 (d, 3JPC = 8.9 Hz), 21.8 (d, 3JPC= 9.5 Hz). 31P
NMR (121 MHz, CDCl3) δ 170.6 (br).
(5R)-2-クロロ-3-メチル-5-イソプロピル-1,3,2-オキサザホスホリジン(3e)の合成
出発物質として(R)-1-メチルアミノ-3-メチル-2-ブタノール(2e)(1.17
g, 10 mmol)を用い、得られた粗生成物を蒸留によって精製して、3eを得た。10mmolから1
.09g, 6mmol。
1H NMR (300 MHz, CDCl3). δ 4.68, 4.18(br, br, 1H), 3.16, 2.95 (m, m, 2H), 2.72 
(d, 3JPH = 15.0Hz, 3H), 2.01, 1.90 (br, br, 1H), 1.06-0.99 (m, 3H), 0.94 (d, 3JH
H= 6.6 Hz, 3H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 90.7, 88.7 (br,br), 53.0, 51.8 (br, b
r), 32.9 (br), 31.1 (d, 2JPC = 14.3Hz), 18.3, 18.2 (br, br). 31P NMR (121 MHz, C
DCl3). δ 173.7,172.5 (br, br).
(4S)-2-クロロ-3-メチル-4-イソプロピル-1,3,2-オキサザホスホリジン(3f)の合成
出発物質として(S)-2-メチルアミノ-3-メチル-1-ブタノール(2f)(1.17
g, 10 mmol)を用い、得られた粗生成物を蒸留によって精製して、3fを得た。10mmolから1
.09g, 6mmol。
1H NMR (300 MHz, CDCl3). δ 4.57 (d, 2JHH= 8.7 Hz, 3JHH = 8.7 Hz, 1H), 4.21 (m, 
1H), 3.25 (m, 1H),2.68 (d, 3JPH = 16.2 Hz, 3H), 2.03 (m, 1H), 0.92 (d, 3JHH= 7.2
Hz, 3H), 0.84 (d, 3JHH = 6.6 Hz, 3H). 13CNMR (75 MHz, CDCl3) δ 71.5 (d, 2JPC =
9.2 Hz),63.5 (br), 29.1 (d, 2JPC = 14.1 Hz), 26.7 (d, 3JPC= 4.9 Hz), 19.3, 14.5
. 31P NMR (121 MHz, CDCl3) δ 176.8.
5’-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-3’-O-[(2R,5R)-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキ
サザホスホリジン-2-イル]チミジン [(Rp)-5a]の合成.
【００７４】
【化５】
2005046073.tif 000007
5’-O-(tert-ブチルジメチルシリル)チミジン（721mg, 1.5mmol）をTHF（7.5mL）とトリ
エチルアミン（7.5mmol）に溶解して-78℃に冷却する。0.22MTHF溶液の(5R)-3a（7.5mL, 
1.65mmol）を滴下し、室温まで上昇させて30分間攪拌した。飽和重曹水（75mL）とクロロ
ホルム（75mL）を加えて有機層を分離後、有機層を飽和重曹水で洗浄した。水層をクロロ
ホルムで逆抽出して混合後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去後、粗生
成物をシリカゲルカラムクロマトグラフを用いて精製した（ヘキサン-酢酸エチル-トリエ
チルアミン=50:50:2）。溶出物を飽和重曹水で洗浄して無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、
濃縮して純粋な生成物5b（765mg, 1.2mmol）を得た。31P NMR(121 MHz, CDCl3) δ 144.6
. FAB-HRMS: calcd for C35H43N3O6PBi+(M + H+) 660.2659, found 660.2658.
5’-O-(tert-ブチルジフェニルシリル)-3’-O-[(2R,4S,5R)-3-メチル-4,5-ジフェニル-1,
3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]チミジン [5c]の合成.
5’-O-(tert-ブチルジメチルシリル)チミジン（721mg, 1.5mmol）をTHF（7.5mL）とトリ
エチルアミン（7.5mmol）に溶解して-78℃に冷却した。0.22MTHF溶液の3c（7.5mL, 1.65m
mol）を滴下し、室温まで上昇させて30分間攪拌した。飽和重曹水（75mL）とクロロホル
ム（75mL）を加えて有機層を分離後、有機層を飽和重曹水で洗浄した。水層をクロロホル
ムで逆抽出して混合後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去後、粗生成物
をシリカゲルカラムクロマトグラフを用いて精製した（ヘキサン-酢酸エチル-トリエチル
アミン=67:33:2から0:100:2）。溶出物を飽和重曹水で洗浄して無水硫酸ナトリウムで乾
燥させ、濃縮して純粋な生成物5c（1.41g, 1.9mmol）を得た。31P NMR(121 MHz, CDCl3) 
δ 142.3. FAB-HRMS: calcd for C41H47N3O6PBi+(M + H+) 736.2972, found 736.2975.
(Sp)-1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エニウム 5’-O-(tert-ブチルジフェニルシ
リル)チミジン-3’-イル3’-O-(tert-ブチルジメチルシリル)チミジン-5’-イル ホスホ
ロチオエート [(Sp)-11]
の合成.
【００７５】
【化６】
2005046073.tif 000008
0.22Mアセトニトリル溶液の1f（500μL, 100μmol）に(Rp)-5a（39.6mg, 60μmol）を加
えた。５分後に無水ピリジン（500μmol）と無水酢酸（100μmol）を加え、さらに３０秒
後に3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシド（12mg,60μmol）を加えた。さら
に３分後、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン（74.6μL,500μmol）を加えて50
℃で３０分攪拌した。反応溶液を冷却後クロロホルム（3mL）で希釈し、0.2Mのリン酸緩
衝液（pH7.0,3mL）で洗浄し、水層をクロロホルムで逆抽出した。有機層を混合後、無水
硫酸ナトリウムで乾燥させる。残査をPTLCによって精製後、残査をクロロホルム（3mL）
に溶解して0.2M炭酸水素1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エニウム溶液で洗浄し、
濃縮して生成物11（50.4mg, 47μmol）を得た。
(Rp)-1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エニウム 5’-O-(tert-ブチルジフェニルシ
リル)チミジン-3’-イル3’-O-(tert-ブチルジメチルシリル)チミジン-5’-イル ホスホ
ロチオエート [(Rp)-11]の合成.
出発物質として(Sp)-5aを用い、上記と同様に合成した。60μmolから39.6mg, 60μmol。
1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エニウム 5’-O-(tert-ブチルジフェニルシリル)
チミジン-3’-イル3’-O-(tert-ブチルジメチルシリル)チミジン-5’-イル ホスホロチオ
エート (11)の合成
常用のH-ホスホネート法（Kers, A.; Kers, I.;Kraszewski, A.; Sobkowski, M.; Szabo
´, T.; Thelin, M.; Zain,R.;Stawinski,J.Nucleosides Nucleotides 1996,15(1-3),361
-378.）に従い、ジアステレオマーの混合物[(Rp)-11:(Sp)-11=46:54]の混合物として11を
合成した。
(Sp)-アンモニウム チミジン-3’-イル チミジン-5’-イル ホスホロチオエート （（Sp)
-12a）の合成
(Sp)-11（50.4mg, 47μmol）をトリエチルアミントリヒドロフルオライド（500μL）に溶
かし室温で１５時間攪拌した。0.1Mの酢酸アンモニウム緩衝液（3mL）を加えてエーテル
で洗浄し、有機層を濃縮した。残査を逆送クロマトで精製し、（Sp)-12aの精製物（20.5m
g, 35.4μmol）を得た。
(Rp)-アンモニウム チミジン-3’-イル チミジン-5’-イル ホスホロチオエート （(Rp)-
12a）の合成
(Rp)-11(52.9 mg, 49μmol)を出発物質として用いて、(Rp)-12aを得た。49μmolから20.6
mg, 36μmol。
アンモニウムチミジン-3’-イルチミジン-5’-イル ホスホロチオエート (12a)の合成
常用のH-ホスホネート法（Kers, A.; Kers, I.;Kraszewski, A.; Sobkowski, M.; Szabo
´, T.; Thelin, M.; Zain,R.;Stawinski,J.Nucleosides Nucleotides 1996,15(1-3),361
-378.）に従い、ジアステレオマーの混合物[(Rp)-12a:(Sp)-12a=41:59]の混合物として12
aを得た。
マニュアル固相合成
【００７６】
【化７】
2005046073.tif 000009
上記反応式の13a-dにおいて、B1は、それぞれ、Th(チミン)、Ad（アデニン）、Cy（シト
シン）及びGu（グアニン）残基である。
3%TCAによる脱トリチル、ジクロロメタンおよびアセトニトリルによる洗浄、カップリン
グ（0.2M モノマー13a-d及び1.0M 1fのアセトニトリル溶液、９秒）、アセトニトリルに
よる洗浄、キャッピング[Ac2O-N-メチルイミダゾール-THF(1:2:7, v/v/v)、３０秒]、ア
セトニトリルによる洗浄、硫化（ボカージ試薬）、アセトニトリルによる洗浄を繰り返し
た。各ステップの平均収率は97-98%であった。固相坦体をアンモニア水-ピリジン（9:1）
で５５℃、３０分処理してキラル補助基と核酸塩基の保護基を除去し、生成物を逆相クロ
マトによって分析、精製した。
【００７７】
以下、「T」はチミジンホスフェート、「TPS」はチミジンホスホロチオエートを表す。
All-(Rp)-[TPS]3T (15)の合成.
上記の方法に従い、HCPに結合した5’-O-(DMTr)チミジン3’-O-サクシネートから、15の
粗生成物を得た。各ステップ平均収率は98%であった。生成物はMALDI-TOF-MSによって確
認した（m/z 1201(M-H+)-）。生成物を逆相クロマトで精製した。収率80%。
All-(Sp)-[TPS]3T (16)の合成.
上記の方法に従い、HCPに結合した5’-O-(DMTr)チミジン3’-O-サクシネートから、16の
粗生成物を得た。各ステップ平均収率は98%であった。収率78%。
all-(Rp)-d[CPSAPSGPS]T
(17)の合成.
上記の方法に従い、HCPに結合した5’-O-(DMTr)チミジン3’-O-サクシネートから、17の
粗生成物を得た。各ステップ平均収率は98%であった。生成物はMALDI-TOF-MSによって確
認した（m/z 1220(M-H+)-）。収率75%。
All-(Rp)-[TPS]9T (18)の合成.
上記の方法に従い、HCPに結合した5’-O-(DMTr)チミジン3’-O-サクシネートから、18の
粗生成物を得た。各ステップ平均収率は98%であった。生成物はMALDI-TOF-MSによって確
認した（m/z 3121(M-H+)-）。収率75%。
【００７８】
［実施例７］オリゴヌクレオシドボラノホスフェートの立体配置を制御する合成
(Sp)-11を合成する工程において、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドの
代わりにBH3・SMe2を用い、マニュアル固相合成におけるボカージ試薬による硫化の代わ
りにBH3・SMe2によるホウ素化を行う他は、実施例６の手順に従い、オリゴヌクレオシド
ボラノホスフェートを合成する。
［実施例８］2’-デオキシチミジン 5’-[α-(Rp)-ボラノ]三リン酸の製造
【００７９】
【化８】
2005046073.tif 000010
3’-O-アセチル-5’-O-[(2R,5R)-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-
イル]チミジン[(Rp)-2]の合成
3’-O-アセチルチミジン（1.5mmol）をTHF（7.5mL）とトリエチルアミン（7.5mmol）に溶
解して-78℃に冷却する。0.22M溶液の(5R)-1（7.5mL, 1.65mmol）を滴下し、室温まで上
昇させて30分間攪拌する。飽和重曹水（75mL）とクロロホルム（75mL）を加えて有機層を
分離後、有機層を飽和重曹水で洗浄する。水層をクロロホルムで逆抽出して混合後、無水
硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒を減圧留去後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマト
グラフを用いて精製した（ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン=50:50:2）。溶出物を
飽和重曹水で洗浄して無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して純粋な生成物(Rp)-2（1.
2 mmol）を得る。
2’-デオキシチミジン 5’-[α-(Rp)-ボラノ]三リン酸の合成
0.2Mアセトニトリル溶液のN-シアノメチルピロリジニウムトリフラート（500μL, 100μm
ol）と2,6-ジニトロフェノール（50μmol）に(Rp)-2（39.6mg, 60μmol）を加える。５分
後にボラン-ジメチルスルフィド錯体（60μmol）を加え、８分後に無水ピリジン（500μm
ol）と無水酢酸（100μmol）を加える。さらに３分後にテトラ（トリ-n-ブチルアンモニ
ウム）ピロリン酸（60μmol）を加えて１時間攪拌する。反応溶液をクロロホルム（3mL）
で希釈し、0.2Mのリン酸緩衝液（pH7.0,
3mL）で洗浄し、水層をクロロホルムで逆抽出する。有機層を混合後、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥させる。残査を25%アンモニア水-ピリジン（9:1）中55℃で30分反応させてキラ
ル補助基と保護基を除去し、冷却後に濃縮する。残査を水に溶解してエーテルで洗浄し、
水を減圧留去後、粗生成物をイオン交換クロマトグラフHPLCを用いて精製して純粋な生成
物(Rp)-7（35.4 μmol）を得る。
【００８０】
また上記の手法を改良し、つまり、市販の２’保護リボヌクレオシドを用いることによ
り光学活性なボラノ修飾ＲＮＡの合成が可能である。
【００８１】
ボラノ修飾リボヌクレオシド三リン酸の構造を以下に示す。以下の構造において、Base
は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルなどである。
【００８２】
【化９】
2005046073.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】実施例１で作製したdsDNAの電気泳動写真である。1および10は天然型DNAのレーン、２は天然型dATP+dCTP+dGTPおよびdTTP-αB（NH4HCO3の添加あり）のレーン、3は天然型dATP+dCTP+dGTPおよびdTTP-αBのレーン、MはDNAマーカー、４は 天然型dCTP+dGTPおよびdATP-aB+dTTP-αBのレーン、５は天然型dTTPおよびdATP-aB+ dGTP-aB+dCTP-αBのレーン、６は 天然型dCTPおよびdATP-aB+ dGTP-aB+dTTP-αBのレーン、７は 天然型dGTPおよびdATP-aB+ dCTP-aB+dTTP-αBのレーン、８は 天然型dATPおよびdGTP-aB+ dCTP-aB+dTTP-αBのレーン、９は dATP-aB+ dGTP-aB+ dCTP-aB+dTTP-αBのレーンである。
【００８４】
【図２】同様にU6プロモータを有するプラズミドでも含ホウ素PCR生成物が得られた。1A, 2G, 3C, 4T, 5AG, 6AC, 7AT, 8GC, 9GT, 10CT, 11AGC,12AGT, 13ACT, 14GCT, 15AGCT, 16natural
【００８５】
【図３】若干の条件検討の結果、すべての塩基の組み合わせにおいてホウ素が導入されたPCR生成物が得られた。1AT,2AGT, 3ACT, 4GCT, 5AGCT,
【００８６】
【図４】#1はSYBRGold染色の結果、#2はホスホロ造影剤(RI)による結果を示す。AはRNAマーカー（500ntおよび200nt）のレーン、Bは対照RNA（1800nt）のレーン、Cは天然型dNTPのレーン、Dは天然型dATP+dCTP+dGTPおよびdTTP-αBのレーンである。
【００８７】
【図５】dTTP-αBの質量分析スペクトルである。
【００８８】
【図６】RNAi実験の結果細胞内の効果に関して、含ホウ素DNAも天然体と同程度の優れた活性を有する。HeLaS3細胞を培養後、OPTI-MEM（50mL）、Lipofectamine2000（1mg）、pRL-RSV（20ng）、pGL3（50ng）存在下、PCR生成物（100ng）を作用させる。３７℃で２４時間後作用させた後、Dual Luciferase Reporter Assay System（Promega社）を用いて発現量を測定した。1: H1 promoter control2: H1 promoterPCR-natural3: H1 promoter PCR-CTaB4: H1 promoter PCR-fullaB6: pU6-90 promotercontrol7: pU6-90 promoterPCR-natural8: pU6-90 promoterPCR-CTaB9: pU6-90 promoterPCR-fullaB
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号１は、実施例２で用いたプライマー１の塩基配列を示す。
【００９０】
配列番号２は、実施例２で用いたプライマー２の塩基配列を示す。
【００９１】
配列番号３は、実施例２で用いたテンプレートの塩基配列を示す。
【００９２】
配列番号４は、PCRに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００９３】
配列番号５は、PCRに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００９４】
配列番号６は、PCRに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００９５】
配列番号７は、PCRに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００９６】
配列番号８は、機能性RNAの塩基配列を示す。
【００９７】
配列番号９は、機能性RNAの塩基配列を示す。
【図１】
2005046073.tif 000012
【図２】
2005046073.tif 000013
【図３】
2005046073.tif 000014
【図４】
2005046073.tif 000015
【図５】
2005046073.tif 000016
【図６】
2005046073.tif 000017
【配列表】
2005046073000001.app