(57)【要約】  【課題】  NBS試薬を用いた相対定量プロテオーム解析において、ラベル化ペプチド（トリプトファン含有ペプチド）に由来するピークと、非特異的吸着ペプチド（トリプトファンを含まないペプチド）に由来するピークとを容易に区別する方法を提供する  【解決手段】  比較したい2種類のサンプル（ここではサンプルA、サンプルBと表記）について、組み合わせとして（サンプルA＋サンプルA)、（サンプルB＋サンプルB)、（サンプルA＋サンプルB)の3組を考える。そして、それぞれの組み合わせについて一方を非標識の軽い試薬でラベル化し、他方を安定同位体標識された重い試薬でラベル化した後、両者を混合して質量分析計で分析する。【選択図】  図１
2005300430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定同位体標識を用いてペプチドを解析する方法において、
同一の生体試料を安定同位体標識されたラベル化試薬と、非標識のラベル化試薬によってラベル化した後、両者を混合し、質量分析装置で分析することによって、ラベル化されたペプチドとラベル化されていないペプチドとを識別することを特徴とするラベル化ペプチドの特異的検出法。
【請求項２】
安定同位体標識を用いて2種類の生体試料中のペプチドを相対的に定量する方法において、
a)上記2種類の生体試料の一方を安定同位体標識されたラベル化試薬でラベル化し、他方を非標識のラベル化試薬によってラベル化した後、両者を混合したものと、
b)両試料のそれぞれについて、同一の試料を安定同位体標識されたラベル化試薬と、非標識のラベル化試薬によってラベル化した後、両者を混合したものと、
をそれぞれ質量分析装置で分析することによって、片在ピークを検出することを特徴とする片在ピークの特異的検出法。
【請求項３】
上記ラベル化試薬がNBS試薬であり、上記安定同位体が13Cであることを特徴とする請求項１または２に記載のラベル化ペプチドの特異的検出法または片在ピークの特異的検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定同位体標識を用いたタンパク質またはペプチドの解析において、ラベル化試薬によってラベル化されたペプチドを特異的に検出する方法、および片在ピークの特異的検出法に関する。なお、本発明において片在ピークとは、2種類の生体試料のうち、片方の試料に存在し、他方の試料には存在しないペプチドおよびタンパク質に由来するマススペクトルピーク（いわゆるAll or None Peak）のことを指す。
【背景技術】
【０００２】
生体細胞中の発現タンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析分野においては、従来より、ペプチド・マス・フィンガープリンティング（Peptide Mass Fingerprinting:PMF）法による解析や、二次元電気泳動を用いたディファレンシャル・ディスプレイ法による相対定量解析などが広く行われてきた。しかし、これらの従来法には、多大な時間と労力が必要であると共に、定量性や再現性の点で問題があった。そこで、これらの問題を解決する方法として、安定同位体標識を用いたタンパク質の網羅的解析法が考案されている。
【０００３】
その一つに、NBS試薬(2-nitrobenzenesulfenyl chloride)を用いた相対定量プロテオーム解析法（以下、NBS法と表記する）がある（非特許文献１）。
NBS試薬は、酸性溶液下でトリプトファン残基を選択的に化学修飾する試薬であり、非標識の軽いNBS試薬（以下、単に「軽い試薬」と呼ぶ）と、その各炭素原子12Cを13Cで同位体標識した重いNBS試薬（以下、単に「重い試薬」と呼ぶ）の２種の試薬を作製することができる。両者は、6Daの質量差を有する。NBS法は、これら両NBS試薬を質量タグとして使用し、質量分析を用いて2種類の生体試料（例えば正常細胞と病態細胞から抽出された生体試料）におけるタンパク質発現量の相対的な差を明らかにする方法である。
【０００４】
図２にNBS法の概略を示す。まず、2種類の細胞や組織から別個にタンパク質を抽出することによって得られた生体試料に対し、一方には重い試薬を、他方には軽い試薬を用いて該生体試料中のタンパク質に含まれるトリプトファン残基をラベル化する。その後、これらの試料を混合してトリプシンなどで酵素消化したものから、NBS試薬によってラベル化されたペプチド（すなわちトリプトファン含有ペプチド）をクロマトグラフィーによって分離・濃縮し、質量分析装置による分析を行う。このとき、図３に示すように、重い試薬と軽い試薬の質量差に由来する6Daの質量差で検出されるピークの対（ペアピーク）を比較することにより、混合物内における種々のペプチドまたはタンパク質の相対定量解析を行うがことができる。さらに、MS/MS分析を行うことにより、目的とするペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の決定、および同定を行うこともできる。
【０００５】
上記NBS法では、タンパク質中の含有量の少ないトリプトファン残基を特異的にラベル化するため、チオール標識用ビオチン型ラベル化試薬を用いてシステイン残基を特異的にラベル化するICAT法などに比べて、マススペクトルが簡略化され、解析が容易となる、また、NBS試薬は低分子構造であるため、ラベル化がMS/MSによる配列解析に悪影響を与えないといった利点もある。さらに、NBS試薬で修飾されたトリプトファン含有ペプチドの濃縮・分離が、C18（ODS)カラムを用いた逆相分離、もしくはセファデックス系のカラムやフェニルカラムを用いたアフィニティ分離によって比較的簡便に行える。
【０００６】
しかし、どの分離濃縮法を用いても、NBS試薬によってラベル化されたペプチド以外のペプチドのカラムへの非特異的な吸着が多少存在する。このような非特異的吸着に由来するペプチドピークは、図３に示すようにペアピークではなく１本のピーク（シングルピーク）３１として現れる。一方、片方の試料に存在し、他方の試料には存在しないペプチドおよびタンパク質がある場合にも、そのペプチドピーク（片在ピーク）はシングルピーク３２として現れる。そのため、非特異的吸着によるペプチドピーク３１は、片在ピーク３２との識別が困難であり、片在ピーク検出の障壁となる。
【０００７】
【非特許文献１】九山浩樹（Hiroki Kuyama）、渡辺真（Makoto Watanabe）、 戸田千香子（Chikako Toda）、 安藤英治（Eiji Ando）、田中耕一（Koichi Tanaka）、及び西村紀（Osamu Nishimura）著、ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（ Rapid Communications in  Mass Spectrometry） 、2003年、第17巻、pp.1642-1650
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、NBS試薬でラベル化されたペプチド（トリプトファン含有ペプチド）に由来するピークと、非特異的吸着によるペプチド（トリプトファンを含まないペプチド）に由来するピークとを容易に区別する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために成された本発明に係るラベル化ペプチドの特異的検出法は、安定同位体標識を用いてペプチドを解析する方法において、同一の生体試料を安定同位体標識されたラベル化試薬と、非標識のラベル化試薬によってラベル化した後、両者を混合し、質量分析装置で分析することによって、ラベル化されたペプチドとラベル化されていないペプチドとを識別することを特徴とするものである。
【００１０】
上記の方法により、重い試薬でラベル化されたペプチドと軽い試薬でラベル化されたペプチドは、両試薬間の質量差に基づく質量だけ離れたペアピークとして現れる、一方、ラベル化されていないペプチドの非特異的吸着に由来するピークは、シングルピークとして現れる。そのため、上記ラベル化ペプチド由来のピークと非特異的吸着によるピークとを容易に区別することができる。
【００１１】
また、本発明の第2の態様である片在ペプチドの特異的検出法は、安定同位体標識を用いて2種類の生体試料中のペプチドを相対的に定量する方法において、a)上記2種類の生体試料の一方を安定同位体標識されたラベル化試薬でラベル化し、他方を非標識のラベル化試薬によってラベル化した後、両者を混合したものと、b)両試料のそれぞれについて、同一の試料を安定同位体標識されたラベル化試薬と、非標識のラベル化試薬によってラベル化した後、両者を混合したものと、をそれぞれ質量分析装置で分析することによって、片在ピークを検出することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のラベル化ペプチドの特異的検出法および片在ピークの特異的検出法を用いることにより、NBS試薬でラベル化されたペプチドに由来するピークと、非特異的吸着に由来するピークとの識別が可能となり、トリプトファン含有ペプチドを特異的に検出できるようになる。また、従来の方法では不可能であった、片在ピークの特異的な検出が可能となり、質量分析計を用いたペプチドまたはタンパク質の相対定量をより正確に行うことができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のペプチド検出法では、2種類の生体試料（ここではサンプルA、サンプルBとする）中のペプチドまたはタンパク質の相対定量解析において、従来のNBS法における（サンプルA＋サンプルB）の組み合わせに加えて、（サンプルA＋サンプルA)、（サンプルB＋サンプルB）の組み合わせを考え、各組についてそれぞれ、NBS試薬によるラベル化、酵素消化、ラベル化ペプチドの分離・濃縮および質量分析を行う。
【００１４】
以下、上記のラベル化、酵素消化、ラベル化ペプチドの分離・濃縮および質量分析の具体的手順を述べる。ただし、これはあくまで一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１５】
まず、タンパク質100μgを含む各生体試料を個別に15μLの0.1%SDS溶液（5mM EDTAを含む）に溶かし、5分間沸騰水中で加熱することにより変性させる。室温まで放冷後、上記各組の生体試料のうち、一方の試料には重い試薬、他方の試料には軽い試薬（いずれも酢酸35μLに溶解した20倍当量のNBS試薬）を加え、遮光下室温で終夜反応させることによってラベル化する。反応後、両試料を混合し、セファデックス LH-20のカラム（移動相は30%アセトニトリル）によって過剰のラベル化試薬を除去する。その後、該試料を遠心濃縮し、50μLの50mM Tris buffer（pH8.6、0.01% SDS含有）を加えて溶解した後、ジスルフィド結合の還元（5μLの40mM トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）：37℃、30分）、およびスルフヒドリル基のアルキル化を行う（1μLの500mM iodoacetamide：遮光下室温で45分）。反応後の溶液に450μLのTrypsin溶液（5mM CaCl2を含む50mM Tris-HCl buffer pH7.8）を酵素：基質＝1：10の割合で加え、37℃で16時間消化する。目的とするラベル化ペプチドをセファデックス LH-20のカラム（bed volume：2.0mL、移動層は30%アセトニトリル）で分離・濃縮し、得られたラベル化ペプチドをMALDI-TOFMSあるいはESI-MSによって解析する。
【００１６】
以上のような一連の工程により、i)軽い試薬でラベル化したサンプルA＋重い試薬でラベル化したサンプルA、ii)軽い試薬でラベル化したサンプルB＋重い試薬でラベル化したサンプルB、iii)軽い試薬でラベル化したサンプルA＋重い試薬でラベル化したサンプルB、の３つの組み合わせについてのマススペクトルが得られる。これらのマススペクトルの概略図を図１に示す。
【００１７】
（サンプルA＋サンプルA)、（サンプルB＋サンプルB）について得られたマススペクトル１１、１２上では、各サンプルに含まれるラベル化ペプチドは、軽い試薬でラベル化されたペプチドに由来するピーク１４、１６、１９と、重い試薬でラベル化されたペプチドに由来するピーク１５、１７、２０から成る、質量差6Da、ピークの強度比が1:1のペアピークとして検出される。また、非特異的吸着によるペプチドについてはペアピークではなくシングルピーク１８として検出される。したがって、上記（サンプルA＋サンプルA)または（サンプルB＋サンプルB）について得られたマススペクトル１１、１２上のペプチドピークのパターンにより、非特異的吸着ペプチドとラベル化ペプチドとを容易に区別することができる。
【００１８】
さらに、（サンプルA＋サンプルA)、（サンプルB＋サンプルB)のマススペクトル１１、１２を比較することにより（サンプルA＋サンプルB)の解析のみでは検出できなかった片在ピークの特異的検出を行うことができる。このとき、片在ピークは（サンプルA＋サンプルB)について得られたマススペクトル１３上ではシングルピーク１９として現れており、これだけでは非特異的吸着ペプチドに由来するピーク１８と区別することができないが、上記（サンプルB＋サンプルB)のマススペクトル１２には対応するピークが見られず、上記（サンプルA＋サンプルA)のマススペクトル１１上では、ペアピーク１９、２０として現れていることから、非特異的吸着に由来するピーク１８と区別することができる。
【００１９】
なお、上記（サンプルA＋サンプルB)について得られたマススペクトル１３上の各々のペアピークの強度比は、発現タンパク質の相対量比（この場合はいずれも１：１）を示している。したがって、（サンプルA＋サンプルB)のデータに、上記（サンプルA＋サンプルA)、（サンプルB＋サンプルB)のデータを加味することによって、サンプルAとサンプルBにおける発現タンパク質の正確な相対定量を行うことができる。
【００２０】
なお、本発明のラベル化ペプチドの検出法および片在ピークの特異的検出法は、上記NBS法に限らず、他の安定同位体標識を用いたプロテオーム解析、例えば、2Hで標識したラベル化試薬を使用するICAT法などにも適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明において得られるマススペクトルを示す概略図。
【図２】NBS法の手順を示す説明図。
【図３】NBS法において得られるマススペクトルを示す概略図。
【符号の説明】
【００２２】
１１、１２、１３…マススペクトル
１４、１６、１９…軽い試薬でラベル化されたペプチドピーク
１５、１７、２０…重い試薬でラベル化されたペプチドピーク
１８、３１…非特異的吸着に由来するペプチドピーク
１９、３２…片在ピーク
【図１】
2005300430.tif 000003
【図２】
2005300430.tif 000004
【図３】
2005300430.tif 000005