(57)【要約】【課題】細胞寿命の延長が可能な上皮細胞の培養方法を提供する。【解決手段】酸素濃度が１．０％未満のガス雰囲気下で上皮細胞を培養する培養工程を備えるようにする。こうすることで、上皮細胞の細胞寿命を、酸素濃度が１９％以上２１％以下のガス雰囲気を培養ガス雰囲気とする以外は前記培養工程と同じ条件で前記上皮細胞を培養した場合の細胞寿命よりも延長することができる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞の培養方法であって、
酸素濃度が１．０％未満のガス雰囲気下で上皮細胞を培養する培養工程を備える、方法。
【請求項２】
前記培養工程は、前記上皮細胞の細胞寿命を、酸素濃度が１９％以上２１％以下のガス雰囲気を培養ガス雰囲気とする以外は前記培養工程と同じ条件で前記上皮細胞を培養した場合の細胞寿命よりも延長する培養工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガス雰囲気は酸素濃度が０．２％未満である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ガス雰囲気は、窒素と二酸化炭素とから構成し実質的に酸素を含まない、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記上皮細胞はヒト表皮細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記培養工程は継代培養工程である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記培養工程後の前記上皮細胞を、酸素濃度が１．０％以上のガス雰囲気下で培養する他の培養工程を備える、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
上皮細胞の三次元構造体を作製する方法であって、
前記上皮細胞を酸素濃度１．０％未満のガス雰囲気下で培養する培養工程を備える方法。
【請求項９】
上皮細胞の三次元構造体を作製する方法であって、
前記上皮細胞を第１の酸素濃度のガス雰囲気下で培養する第１の培養工程と、
前記上皮細胞を前記第１の酸素濃度よりも高い第２の酸素濃度のガス雰囲気下で培養する第２の培養工程と、
を備える、方法。
【請求項１０】
前記第１の培養工程のガス雰囲気の酸素濃度は１．０％未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の培養工程のガス雰囲気の酸素濃度は０．２％未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の培養工程のガス雰囲気は、窒素と二酸化炭素とから構成し実質的に酸素を含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の培養工程のガス雰囲気の酸素濃度は、１９％以上２１％以下である、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の培養工程は継代培養工程であり、前記第２の培養工程は重層化培養工程である、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮細胞の培養方法及び上皮細胞の三次元構造体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト細胞をインビトロ（in vitro）で培養して増殖させた培養細胞や、該培養細胞から再構築させた培養組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。ヒト皮膚組織、例えばヒト表皮細胞（Keratinocyte）を用いた培養細胞シートの作製工程の一例を図２に示す。培養細胞シートを得るには、まず、患者の健康な部位から少量の皮膚組織片を採取し、酵素処理によって細胞分散させた後、表皮細胞を単離し（ステップＳ１）、次に、その表皮細胞を用いて初代培養を行い（ステップＳ２）、その後、初代培養で増殖させた細胞を別の複数の培養容器に分けて播種（接種）し（ステップＳ３）、必要に応じて培地交換等の操作を行いつつ培養すると、細胞が増殖して培養面における細胞の占める面積が徐々に増加する（ステップＳ４）。細胞増殖によって培養面における細胞占有面積が所定値に達したとき、必要数の製品（培養細胞シート）を作製するために必要となる十分な面積（細胞数）が総合的に確保されたか否かをチェックし（ステップＳ５）、確保されていなければ細胞をトリプシンなどのプロテアーゼによって培養容器から剥離・回収し（ステップＳ６）、必要な細胞数が確保できるまで継代培養を繰返し行うことで細胞数を増やす。一方、必要な細胞数が確保されたならば継続して培養を行い、シート化（組織構築）のために三次元培養（重層化）を施し（ステップＳ７）、これを移植用の培養細胞シートとして病院へ輸送し、移植を行う（ステップＳ８）。
【０００３】
しかしながら、細胞は寿命（分裂限界）を持っていて無制限に増殖できるわけではないため、必要な細胞数を確保する前に寿命が訪れて増殖しなくなるケースがある。殊に、年齢が高い患者から採取した細胞は、増殖能が低く、細胞余命も少ない（残存する分裂回数が少ない）ことが確認されている。このように一連の継代培養工程（ステップＳ３〜Ｓ６）中において細胞が寿命を迎えて増殖しなくなると、製品化（シート化）工程（ステップＳ７）に進めない場合が生じ、最終製品が得られなかったり、生産効率が低下したりするという問題があった。
【０００４】
このような問題を解決するものとして、個々の細胞から得られるパラメータに基づいて細胞の寿命、殊に細胞集団の継代培養限界を予測する方法が案出されている（特許文献１）。一方、表皮細胞を低酸素濃度の環境下で培養することで細胞寿命が延びることも報告されている（非特許文献１）。この報告者らの実験は、酸素濃度１％では、３％、１０％、２０％に対して、わずかに１継代分ではあるが、細胞寿命が延びることを示している。一方、ヒト胎児細胞を酸素濃度２％と０．５％の環境下で培養した場合、酸素濃度２％では細胞寿命が延びるが、酸素濃度０．５％では酸素不足により細胞寿命の延長は認められなかったことも報告されている（非特許文献２）。これらの報告には、酸素濃度１．０％未満での上皮細胞の培養については記載も示唆もなく、また、酸素濃度が１．０％未満での上皮細胞の増殖程度についての何らの記載も示唆もない。
【特許文献１】特開２００３−１１６５３０号
【非特許文献１】The effect of low oxygen tension on the in vitro life span of mouse epidermal keratinocyte，Enzyme and Microbial Technology，Anli Ouyang. et.al.，Vol.30，p.817-p.821，2002
【非特許文献２】ヒト細胞の分裂寿命に対する酸素ストレスの影響，科学技術振興事業団報告書「『動植物細胞におけるストレス応答機構』に関する共同研究」，Vol.1，2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上述の問題点を鑑み、細胞寿命の延長が可能な上皮細胞の培養方法を提供することを一つの目的とする。また、別の一つの目的は、確実に上皮細胞が三次元化された三次元構造体を得ることができる上皮細胞の三次元構造体の作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、従来試みられていた低酸素雰囲気（１．０％）よりもさらに酸素濃度が低いガス雰囲気によれば、上皮細胞に対して予想外の細胞寿命延長作用があることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明によれば、
上皮細胞の培養方法であって、
酸素濃度が１．０％未満のガス雰囲気下で上皮細胞を培養する工程を備える、方法が提供される。
この培養工程は、前記上皮細胞の細胞寿命を、酸素濃度が１９％以上２１％以下のガス雰囲気を培養ガス雰囲気とする以外は前記培養工程と同じ条件で前記上皮細胞を培養した場合の細胞寿命よりも延長する培養工程であることが好ましい。また、この上皮細胞の培養方法においては、前記ガス雰囲気は酸素濃度が０．２％未満であることが好ましく、また、前記ガス雰囲気は、酸素が含まれているときには酸素以外は二酸化炭素と窒素とから構成されていることが好ましく、実質的に酸素を含まないことがより好ましい。さらに、前記上皮細胞は表皮細胞であることが好ましく、より好ましくはヒト表皮細胞である。さらにまた、前記培養工程は継代培養工程であることが好ましい。また、前記培養工程後に、酸素濃度が１．０％以上のガス雰囲気下で培養する他の培養工程を備えることができる。この『他の培養工程』としては、酸素濃度が１９％以上２１％以下のガス雰囲気下であることが好ましい。
【０００８】
また、本発明によれば、
上皮細胞の三次元構造体の作製方法であって、
前記上皮細胞を酸素濃度１．０％未満のガス雰囲気下で培養する培養工程を備える方法が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、
上皮細胞の三次元構造体の作製方法であって、
前記上皮細胞を第１の酸素濃度のガス雰囲気下で培養する第１の培養工程と、
前記上皮細胞を前記第１の酸素濃度よりも高い第２の酸素濃度のガス雰囲気下で培養する第２の培養工程と、を備える、方法が提供される。この方法において、第１の培養工程のガス雰囲気の酸素濃度は１．０％未満であることが好ましく、０．２％未満であることがより好ましい。また、前記ガス雰囲気は、該ガス雰囲気に酸素が含まれるときには、酸素以外は二酸化炭素と窒素とから構成されていることが好ましく、実質的に酸素を含まないことがより好ましい。さらにまた、第２の培養工程のガス雰囲気の酸素濃度は、１９％以上２１％以下であることが好ましい。また、この方法における第１の培養工程は、継代培養工程であることが好ましく、第２の培養工程は重層化培養工程であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の上皮細胞の培養方法によれば、上皮細胞の細胞寿命を延長させることができる。また、本発明の上皮細胞の三次元構造体の作製方法によれば、重層化するための上皮細胞の余命を確保して確実に上皮細胞の三次元構造体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（上皮細胞の培養方法）
本発明の上皮細胞の培養方法（以下、単に本培養方法ともいう。）は、上皮細胞を酸素濃度が１．０％未満のガス雰囲気下で培養する工程（以下、単に低酸素培養工程ともいう。）を備えている。上皮細胞をかかる低酸素雰囲気下で培養することにより、上皮細胞の細胞寿命を延長させることができる。より具体的には、前記上皮細胞の細胞寿命を、酸素濃度が１９％以上２１％以下のガス雰囲気を培養ガス雰囲気とする以外は前記培養工程と同じ条件で前記上皮細胞を培養した場合の細胞寿命よりも延長することができるのである。また、本培養方法によれば、上皮細胞の細胞分裂回数を増加させて、その細胞余命（残り細胞分裂回数）を増加させることができる。この結果、従来法では細胞の余命が短いことが予測される加齢あるいは高齢の細胞であっても、増殖に必要な余命を確保でき、容易にまた十分に増殖させることができ、上皮細胞の大量培養を容易にする。
【００１２】
なお、上皮細胞の細胞寿命の延長程度、換言すれば残り細胞分裂回数の増加程度は、酸素濃度が１９％以上２１％以下のガス雰囲気における細胞寿命（残り細胞分裂回数）を１００とした場合に、低酸素下で培養した上皮細胞の寿命が、１３０以上であることが好ましい。より好ましくは１５０以上、さらに好ましくは２００以上である。なお、酸素濃度が１９％以上２１％以下のガス雰囲気とは、典型的には、大気あるいは大気の窒素分の一部（５％程度）を二酸化炭素に置換したガス雰囲気あるいはこれと同等のガス雰囲気（例えば、窒素７４％、酸素２１％、二酸化炭素５％の組成のガス）（以下、このようなガス雰囲気を「常法のガス雰囲気」という。）を用いることができる。
【００１３】
（上皮細胞）
本培養方法の対象となる上皮細胞としては、その由来は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞とすることができる。好ましくはヒト由来である。また、上皮細胞としては、これらの温血動物において上皮を形成する種々の細胞であり、例えば、皮膚、粘膜、羊膜、角膜など各種の上皮細胞を挙げることができ、具体的には、皮膚表皮あるいは口蓋表皮の角化細胞（ケラチノサイト）、表皮細胞、角膜上皮細胞が挙げられる。また、インビトロでの培養操作によって、これら細胞の前駆細胞や間葉系幹細胞（MSCs）から分化されたものであってもよい。これらの細胞に、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。
【００１４】
（本培養方法におけるガス雰囲気）
本培養方法が備える低酸素培養工程で用いるガス雰囲気は、酸素濃度が１．０％未満であることが好ましい。酸素濃度が１．０％以上であると、１．０％未満であるときに比較して細胞寿命の延長効果が低下するからである。酸素濃度が１．０％未満のガス雰囲気下でかかる細胞寿命の延長効果があるのは予想を超えるものであるが、より好ましくは、０．５％以下であり、さらに好ましくは、０．２％未満である。本明細書において、酸素濃度の測定方法は特に限定されず、ガスクロマトグラフィーやジルコニアを用いた固体電解質型の酸素濃度測定装置、ガルバニ型電極などの、公知の酸素濃度測定方法を採用することができる。いずれの方法においても、少なくとも、各種酸素濃度の標準溶液を用いて標準曲線を用いることにより酸素濃度を正確に測定することができる。
【００１５】
もっとも好ましいガス雰囲気は、実質的に酸素を含まないものである。「実質的に酸素を含まないガス雰囲気」とは、酸素を積極的に用いていないガス雰囲気という意味を有している。したがって、「実質的に酸素を含まないガス雰囲気」とは、不純物としての酸素が含まれている場合も包含している。なお、不純物としての酸素は、ガス供給源に含まれる不純物としての酸素ガスのほか、ガス供給源や培地に存在する水蒸気や装置内で発生した水蒸気に由来する酸素ガスである場合がある。このように、「実質的に酸素を含まない」とは、不純物としての酸素を含む場合も包含するが、該酸素を含んでいたとしても酸素濃度は０．１％未満であることが好ましく、より好ましくは０．０５％未満であり、さらに好ましくは０．０１％未満であり、一層好ましくは０．００５％以下である。「実質的に酸素を含有しないガス雰囲気」は、例えば、雰囲気ガスを、窒素及び二酸化炭素のみで構成して酸素を用いないで構成する場合のほか、このようなガス供給構成とともに窒素や二酸化炭素の供給源、供給経路、培養空間内に公知の酸素消去剤などを配置することによっても形成することができる。
【００１６】
低酸素培養工程においては、常法のガス雰囲気よりも低い酸素濃度であるため、常法のガス雰囲気において減少されるべき酸素体積分が窒素ガスで置換されたガス雰囲気を用いることが好ましい。したがって、低酸素培養工程における低酸素ガス雰囲気は、窒素および二酸化炭素を主体とすることが好ましく、より好ましくは、二酸化炭素濃度が５％以上１０％以下、窒素濃度が８９％以上９５％以下である。
【００１７】
低酸素培養工程は、ガス雰囲気以外は、培養対象である上皮細胞に用いられている公知の細胞培養条件等を採用して実施することができる。したがって、本培養方法の低酸素培養工程は、初代培養工程、継代培養工程、及び三次元化培養工程のいずれにもあるいはこれらのうち２種以上に適用することができるが、継代培養工程の少なくとも一部に適用することが好ましい。継代培養工程において低酸素培養工程を採用することで細胞寿命が延長されると、大量培養が容易になるとともに、細胞余命や残り細胞分裂回数などをコントロールすることが容易になるからである。また、継代培養工程にて低酸素培養工程を採用することで、その後に上皮細胞を使用するのに適した細胞余命を容易に確保することもできる。なお、低酸素培養工程では、条件によっては、常法におけるガス雰囲気下での細胞形態とは異なる細胞形態を有する培養細胞も現出するなど細胞の生理状態が変化しているため、該形態を保持することが最終的な細胞供給形態として好ましくない場合等には、低酸素培養工程を最終培養工程でない工程に採用することが好ましいといえる。なお、三次元化培養工程としては、上皮細胞の三次元構造体を構築できるものであればよく、スキャフォールド等に対して単層あるいは重層化した上皮細胞で構成される三次元構造体の他、重層化した上皮細胞単体による三次元構造体を得る培養方法の双方を含んでいる。低酸素培養工程を三次元化工程に適用する場合には、適当なスキャフォールドを用い、該スキャフォールドに対して上皮細胞を単層状に培養する三次元化培養工程に適用することが好ましい。三次元化構造体については後述する。
【００１８】
なお、低酸素培養工程を用いた継代培養工程とは、継代培養の全ての継代を通して低酸素培養工程を用いる場合の他、その一部においてのみ低酸素培養工程を用いる場合を含んでいる。例えば、継代培養の当初においては常法のガス雰囲気下など他の酸素濃度のガス雰囲気下で培養し、その後の継代では低酸素培養工程により培養することができるし、この逆であってもよい。また、常法のガス雰囲気などの他のガス雰囲気下での継代培養を主体とする継代培養の間に低酸素培養工程による継代培養を１回又は２回以上行うこともできる。あるいは、低酸素培養工程による継代培養を主体とする継代培養の間に他のガス雰囲気下での継代培養を１回又は２回以上行うこともできる。
【００１９】
（他の培養工程）
本培養方法は、低酸素培養工程のほか、酸素濃度が１．０％以上２１％以下のガス雰囲気下で培養する他の培養工程を備えることができる。かかる他の培養工程を備えることで、低すぎる酸素濃度による細胞へのストレスを緩和したり、細胞の形態等を調整したりすることができる。他の培養工程における酸素濃度は１．０%以上２１%以下であれば特に限定しないが、好ましくは、酸素濃度が１０％以上であり、より好ましくは酸素濃度が１９％以上２１％以下である。酸素濃度が１９％以上２１％以下の雰囲気ガスを用いることにより、効果的に低酸素ストレスを緩和できる。酸素濃度が１９％以上２１％以下のガス雰囲気は、常法のガス雰囲気とすることができる。
【００２０】
このような他の培養工程は、低酸素培養工程に先立って行うこともできるが、低酸素培養工程後に実施することが好ましい。他の培養工程は、細胞形態等の上皮細胞の生理状態の復元及び低酸素ストレスの緩和の観点からは、低酸素培養工程を用いた継代培養工程の途中の適当な時期若しくは末期に適用されることが好ましい。当該継代培養工程の途中若しくは末期に実施するときは、継代培養工程中の該実施時期において低酸素ストレスを緩和することができると同時に、継代培養工程で細胞寿命や残り細胞分裂回数をコントロールすることもできる。他の培養工程を継代培養の末期などの最終培養工程として実施するときは、供給する製品形態において低酸素ストレスを除去しかつ常法のガス雰囲気での保存や搬送に適合しやすくすることができる。なお、このような他の培養工程は、初代培養工程としても実施することもできる。
【００２１】
（上皮細胞の三次元構造体の作製方法）
上皮細胞の三次元構造体の作製方法における一つの形態は、本培養方法を用いる形態である。すわなち、この一形態は、低酸素培養工程を備えている。かかる低酸素培養工程を備えることで、上皮細胞の細胞寿命を延長させることができ、結果として、三次元化培養工程のための余命を確保して確実に上皮細胞の三次元構造体を得ることができる。既に説明したように、低酸素培養工程は、少なくとも継代培養工程の一部に適用することが好ましく、継代培養工程の全工程に適用することもできる。低酸素培養工程で継代培養工程の少なくとも一部を実施し、その後、常法のガス雰囲気で三次元化培養工程を実施することもできる。
【００２２】
また、もう一方の上皮細胞の三次元構造体の作製方法は、上皮細胞を第１の酸素濃度のガス雰囲気下で培養する第１の培養工程と、前記第１の酸素濃度よりも高い第２の酸素濃度のガス雰囲気下で培養する第２の培養工程とを備えている。上皮細胞を異なる酸素濃度で培養する工程を備えることで、上皮細胞の培養寿命をコントロールして確実に上皮細胞の三次元構造体を得ることができるようになる。したがって従来法では細胞余命が短いことが予測される細胞であっても確実に所望の三次元構造体を得ることができる。特に、上皮細胞を重層化して三次元構造体を得る場合において、細胞余命（残り細胞分裂回数）が確保されることの意義が大きい。また、上皮細胞を異なる酸素濃度で培養する工程を備えることで、上皮細胞の生理状態を必要に応じてコントロールすることができる。以下、これらの上皮細胞の三次元構造体の作製方法を、一括して、単に本作製方法ともいう。なお、本作製方法においては、本培養方法の対象となる上皮細胞を同様に培養対象とすることができる。本発明における『三次元構造体』とは最終製品形態である『培養組織』を示すものであり、例えば、シート状等の重層化された培養上皮細胞に限定されるものではなく、フィブリンやコラーゲンなどの細胞外マトリクス（ＥＣＭ：Extra Cellular Matrix）、あるいは生体親和性材料などで構成されたスキャフォールド（Scaffold）に細胞を保持させたものであってもよい。具体的には、シート状のスキャフォールド上に単層あるいは重層化した上皮細胞層を形成させたものや、スポンジ状のスキャフォールドに上皮細胞を保持させたものであってもよい。さらには、培養容器の培養面上で形成された単層あるいは重層化した培養上皮細胞シートも含むものである。なお、かかるスキャフォールドとしては、接着や包埋などによってスキャフォールドに細胞が保持されている限り、いずれの形態であってもよく、ゲル状、スポンジ状、フィルム状、メッシュ状、不織布状、編織布状など、種々の形態とすることができる。またスキャフォールドは、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール重合体（ＰＬＧＡ）、ポリロタキサンなど、周知の材質の生体親和性材料で構成されていることが好ましい。また、上皮細胞の三次元構造体は、各種の平面形態を備えるシート状、各種の曲面状、各種断面の筒状、各種の外形形状のビーズ状等各種の形態を採ることができる。
【００２３】
（第１の培養工程）
第１の培養工程は、上皮細胞を第１の酸素濃度のガス雰囲気下で培養する工程である。第１の酸素濃度のガス雰囲気とは、好ましくは酸素濃度が３．０%以下のガス雰囲気であり、さらに好ましくは既に説明した本培養方法の低酸素培養工程におけるガス雰囲気における酸素濃度の好ましい上限酸素濃度未満である。第１の培養工程によれば、上皮細胞を少なくとも酸素濃度が３．０％以下のガス雰囲気下で培養することにより、上皮細胞の細胞寿命を延長させることができ、これにより、従来法では細胞の余命が短いことが予測される加齢あるいは高齢の細胞であっても、容易に、また十分に増殖させることができる。第１の酸素濃度は、１．０％未満であることが好ましく、より好ましくは、０．５％以下であり、さらに好ましくは、０．２％未満である。もっとも好ましいガス雰囲気は、既に定義されたとおりの「実質的に酸素を含まない」ものである。また、既に述べたように、このような酸素濃度のガス雰囲気は、公知の方法にて構成することができる。
【００２４】
第１の培養工程のガス雰囲気は、常法のガス雰囲気の酸素濃度より低い酸素濃度であるため、常法のガス雰囲気から減少されるべき酸素体積分が窒素ガスで置換されたガス雰囲気を用いることが好ましい。したがって、第１の培養工程におけるガス雰囲気は、窒素および二酸化炭素を主体とすることが好ましく、より好ましくは、二酸化炭素濃度が５％以上１０％以下、窒素濃度が８７％以上９５％以下である。
【００２５】
第１の培養工程は、ガス雰囲気以外は、培養対象細胞に用いられている公知の細胞培養条件等を採用して実施することができる。また、第１の培養工程は、初代培養工程、継代培養工程及び三次元化培養工程のいずれにも適用することができ、継代培養工程の少なくとも一部に適用することが好ましい。継代培養工程で細胞寿命が延長されると、大量培養が容易になるとともに、細胞寿命や残り細胞分裂回数などをコントロールすることが容易になるからである。また、三次元構造体を得るための三次元化培養工程を実施可能な細胞寿命（残り細胞分裂回数）を残すように継代培養し、確実にかつ適切なタイミングで三次元化培養を開始することができる。なお、第１の培養工程は、継代培養工程の全工程に用いることもでき、また、その一部においてのみ用いることもできる。
【００２６】
（第２の培養工程）
本作製方法は、第２の培養工程を備えることもできる。第２の工程は、第１の酸素濃度よりも高い第２の酸素濃度のガス雰囲気下で第１の培養工程後の上皮細胞を培養する工程である。第２の培養工程を備えることで、第１の培養工程で被った、あるいは被る可能性のある低すぎる酸素濃度による上皮細胞へのストレスを緩和したり、細胞形態を含む細胞状態を適正にコントロールしたりできる。
【００２７】
第２の酸素濃度は、第１の酸素濃度よりも高濃度であればよいが、好ましくは酸素濃度１０％以上であり、より好ましくは、１９％以上である。また、上限は２１％以下であることが好ましい。最も好ましくは１９％以上２１％以下である。酸素濃度が１９％以上２１%以下のガス雰囲気として、例えば、常法のガス雰囲気を用いることができる。常法のガス雰囲気を用いることで、常法のガス雰囲気下において得られている細胞形態等常法のガス雰囲気下の生理状態を維持あるいは付与することができる。
【００２８】
第２の培養工程は、第１の培養工程との関係においては、第１の培養工程後に行うことが好ましい。すわなち、第１の培養工程で培養された上皮細胞を第２の培養工程で培養することが好ましい。こうすることで、第１の培養工程において上皮細胞が被った低酸素ストレスを第２の培養工程で緩和することができるからである。なお、かかる第２の培養工程後に、さらに第１の培養工程を実施することもできるが、一連の培養工程は第２の培養工程で終了するようにすることが好ましい。こうすることで最終の包装や輸送において一般的な常法のガス雰囲気に順応させやすく、また、細胞形態等の細胞状態を常法のガス雰囲気下での状態に戻すことができるからである。なお、第１の培養工程後、第２の培養工程を実施するのに先だって、培養した上皮細胞を適宜洗浄し、必要に応じてトリプシン及び／又はＥＤＴＡなどを用いた剥離処理を行うことができる。
【００２９】
第２の培養工程は、ガス雰囲気以外は、培養対象細胞に用いられている公知の細胞培養条件等を採用して実施することができ、初代培養工程、継代培養工程、三次元化培養工程のいずれにも適用できるが、好ましくは、継代培養工程の一部及び三次元化培養工程に適用することが好ましい。継代培養工程を第１の培養工程と第２の培養工程とで実施するときには、継代培養工程で第1の培養工程による低酸素ストレスを効果的に緩和でき、細胞寿命のコントロールも容易となる。継代培養工程を第１の培養工程と第２の培養工程とを組み合わせて実施する形態としては、第２の培養工程は、第１の培養工程を主体とする継代培養工程中、１回あるいは２回以上実施してもよいし、あるいは、第２の培養工程を主体とする継代培養工程中、１回あるいは２回以上の第１の培養工程を実施するようにしてもよい。また、第１の培養工程で所定数継代培養した後に、第２の培養工程で継代培養し、第２の培養工程で継代培養工程を終了することもできる。
【００３０】
また、第２の培養工程のみで三次元化培養工程を実施することが好ましい。こうすることで、三次元化培養工程では低酸素ストレスを被ることなく上皮細胞を培養できる。また、三次元化培養工程により最終製品形態を得るときには、最終製品における細胞形態等の細胞状態を常法のガス雰囲気下の状態とすることができるとともに、保存あるいは輸送工程における常法のガス雰囲気に馴化させることができる。
【００３１】
以上のことから、本作製方法においては、第１の培養工程と第２の培養工程とを組み合わせてあるいは第１の培養工程のみで継代培養工程を実施することが好ましく、細胞寿命の延長化及び常法のガス雰囲気での細胞生理状態を得る観点においては、第１の培養工程のみで継代培養工程を実施し、その後、第２の培養工程のみで三次元化培養工程を実施することが好ましい。
【００３２】
三次元化培養工程としては、単層の培養細胞を２層以上に積層した状態の培養細胞を得るための公知の重層化培養工程を含んでいる。本作製方法においては、三次元化培養工程は、重層化培養工程とすることが適している。重層化培養工程を実施するには、十分な細胞余命が確保されないと重層化途中で細胞寿命が尽き、目的とする三次元構造体を得られなくなりがちであるからである。かかる重層化培養工程としては、例えば、不活性化したマウス線維芽細胞等のフィーダー細胞と上皮細胞とを、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）などの血清含有培地を用いて行うフィーダー・レイヤー培養法による培養工程や、無血清培地のＣａ２＋イオン濃度の増大等の刺激によって重層化する方法による培養工程などを挙げることができる。フィーダー・レイヤー培養法を採用することで、効率よく細胞を増殖させ重層化を容易に行うことができる。
【００３３】
また、重層化培養工程は、上皮細胞単体で重層化培養する他、上皮細胞を保持し、補強し、あるいは上皮細胞に適切な三次元形状を付与するスキャフォールド（Scaffold：担体ともいう。）を用いて行うこともできる。したがって、上皮細胞の三次元構造体は、上皮細胞単体で構築された培養組織の他、スキャフォールドを伴った培養組織も含んでいる。かかるスキャフォールドとしては、「三次元構造体」の説明時において説明したものを用いることができ、また、重層化培養工程で得られる上皮細胞の三次元構造体も、既に説明したとおり、各種の平面形態を備えるシート状、各種の曲面状、各種断面の筒状、各種の外形形状のビーズ状等各種の形態を採ることができる。
【００３４】
また、上皮細胞の三次元構造体は、単一の細胞種によって構成されるものだけでなく、複数の細胞種によって構成される複合型のものであってもよい。上皮細胞以外の細胞種としては、例えば、表皮細胞を表層とする培養皮膚を三次元構造体として取得するときにおける線維芽細胞を挙げることができる。上皮細胞の三次元構造体としては、例えば、培養皮膚、培養表皮、培養粘膜上皮、培養角膜上皮等である。これらは、熱傷、創傷、褥瘡、擦過傷、皮膚潰瘍又は母斑等の痣、瘢痕除去後のレーザーアブレーションの欠損創面に適用され、あるいは皮膚等の刺激性や化合物の毒性などの試験研究用に適用される。
【００３５】
本作製方法においては、第１の培養工程において上皮細胞の細胞寿命が延長されて余命が増大し、十分な増殖が可能となっている。第１の培養工程を備えることで、三次元構造体の構築に必要な量の細胞を容易かつ確実に得ることができるとともに、三次元構造体の構築に必要な細胞余命を保持した上皮細胞を得ることができる。この結果、細胞余命が短いことが予測される加齢あるいは高齢の上皮細胞であっても、確実に三次元構造体を得ることができる。さらに、第２の培養工程を備える場合には、第１の培養工程で上皮細胞が被ることのある低酸素ストレスが緩和され、安定した生理状態の三次元構造体を得ることができる。したがって、本作製方法によって得られる上皮細胞の三次元構造体は、各種上皮の代替材料等の用途に好ましいものとなっている。
【００３６】
なお、上記した本培養方法における低酸素ガス雰囲気培養工程及び他の培養工程、ならびに本作製方法における第１の培養工程及び第２の培養工程の各工程は、各工程における酸素濃度として許容される範囲内において、単独の酸素濃度を用いることもできるが、２種類以上の酸素濃度のガス雰囲気を組み合わせて用いることもできる。例えば、許容される酸素濃度範囲内で、低濃度から高濃度へ、あるいは高濃度から低濃度へと酸素濃度を連続的あるいは不連続的な濃度勾配で変化させてもよいし、高濃度と低濃度のガス雰囲気を適宜組み合わせてもよい。
【００３７】
（細胞余命あるいは残り細胞分裂回数のコントロール）
本培養方法及び本作製方法においては、継代培養工程中において細胞余命あるいは残り細胞分裂回数を判定することができる。このような判定には、例えば、特開２００３−１１６５３０号に記載される方法を用いることができる。この方法は、所定の継代培養条件下で繰り返し継代培養した細胞が培養容器の底面に接着したときの接着面積、倍加時間及び比増殖速度のうちのいずれかあるいは２以上の指標値と該指標値の測定時点での残りの細胞分裂回数とを求め、前記指標値と残り細胞分裂回数との相関関係を取得しておき、新たに求めた前記指標値をこの相関関係に照らすことにより該指標値の測定時点での残り細胞分裂回数、すわなち、細胞余命を判定することができる。
【００３８】
接着面積は、培養底面における細胞１個あたりの接着面積であって、例えば、細胞による培養容器底面の被覆割合を示す表面被覆率及び培養底面の単位面積あたりの細胞数である接着細胞濃度とから求めることができる。また、この接着面積は、培養底面を撮像した画像に基づいて算出した前記表面被覆率と前記接着細胞濃度とから求めることもできる。
【００３９】
以下に、表面被覆率と接着細胞濃度から接着面積を算出する一例を示す。測定時における細胞１個当たりのみかけの接着面積（みかけの細胞接着面積）をＡｃ、培養容器底面に占める細胞の表面被覆率をＣｄ、接着細胞濃度をＸａとすると、Ａｃは下記数１式で表される。なお、本明細書では、ある特定の細胞のパラメータ値ではなく複数の細胞の平均のパラメータ値であることを表す場合には、パラメータの先頭に「みかけの」を付すものとする。
【００４０】
【数１】
2005168398.tif 000003
【００４１】
なお、Ｘａは単位面積当たりの接着細胞数を表すパラメータであるが、撮像手段によって撮像された培養容器底面の画像全体の面積をＳ、画像全体に占める接着細胞数をｎａとすると、Ｘａは下記数２式で表される。このＸａは培養容器底面の複数箇所で撮像した画像を用いて算出し、その平均値を採用することが好ましい。
【００４２】
【数２】
2005168398.tif 000004
【００４３】
また、表面被覆率Ｃｄは、単位面積当たりの細胞接着面積の割合を表すパラメータであり、下記数３式で示されるように、撮像手段によって撮像された培養容器底面の画像において、画像全体の面積Ｓに対する個々の細胞の接着面積Ｓａの総和（ΣＳａ）が占める割合で示される。
【００４４】
【数３】
2005168398.tif 000005
【００４５】
これらは、例えば、紀ノ岡らの論文（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７，ｐ２３４−２３９（２０００））の画像解析手法を撮像画像に施すことにより得られる。この場合、原画像に対して背景分離処理、ルックアップテーブル変換処理、平滑化処理、二値化抽出処理、孤立点除去処理、クロージング処理、穴埋め処理、エリア抽出処理、画素数計測処理の順に画像解析を行い、画像全体の画素数（面積Ｓ）に対する細胞接着部分の画素数（接着面積の総和ΣＳａ）の割合を表面被覆率Ｃｄとして算出する。なお、原画像に対する接着部分の抽出処理としては、これらの画像処理方法に限定されず、種々の画像解析処理を行うことが可能である。このＣｄは継代タイミングの指標として用いることができ、例えばＣｄが所定値以上になった時点又は所定値を越えた時点を継代タイミングとし、培養容器から細胞を剥離して次の継代培養を行うようにしてもよい。なお、撮像は、ＣＣＤカメラ等によって行うことができる。
【００４６】
次に、細胞分裂回数を算出する一例を示す。継代回数Ｎｐにおけるみかけの細胞分裂回数をＮd,Np、初期の細胞濃度をＸ０とすると、Ｎd,Npは下記数４式で表される。そして、一連の継代培養（継代培養１回目から最終回まで）における累積細胞分裂回数Ｎｄは、各継代培養における総和として表される。なお、初期の細胞濃度は、培養条件により、接種時濃度（Ｘ０）でなく、所定時間（例えば２４時間）経過後の濃度（Ｘ１）とすることもできる。培養系によっては、接種後の初期において細胞が多数死滅することもあるからである。
【００４７】
【数４】
2005168398.tif 000006
【００４８】
継代培養工程を、継代毎の接着面積と細胞分裂回数とを算出しつつ培養細胞がほとんど分裂しなくなって細胞数が一定となったとき（当該時点が寿命満了時とする。なお、寿命満了時は、累積細胞分裂回数Ｎｄが一定になったときとすることもできる。）まで行う。寿命満了時での累積細胞分裂回数Ｎｄを限界細胞分裂回数ＮｄＦとし、該ＮｄＦから継代毎のみかけの細胞分裂回数Ｎｄ，ＮＰを差し引くことで、継代毎の残り細胞分裂回数ＮｄＲを算出し、これにより、接着面積と残り細胞分裂回数との相関関係を求めることができる。一旦、所定の培養条件下においての相関関係を求めれば、同一培養条件下において測定した指標値から残り細胞分裂回数ＮｄＲを知ることができる。
【００４９】
本明細書における細胞寿命とは、上記の寿命満了時の培養時間とすることができる。すなわち、培養細胞がほとんど分裂しなくなって細胞数が一定になったときの培養時間の他、みかけの細胞分裂回数をＮd,Npがこのようにして求めた限界細胞分裂回数ＮｄＦに到達したときの培養時間を含めることができる。細胞寿命を比較するときには、これらの培養時間を比較することができる。また、これらの培養時間に替えて培養細胞の限界細胞分裂回数ＮｄＦを用いて比較しても、細胞寿命を比較することができる。
【００５０】
なお、みかけの倍加時間ｔｄは下記数５式及びみかけの比増殖速度μは下記数６式により求めることができ、みかけの接着面積を用いた場合と同様にして残り細胞分裂回数との相関関係を求めることができる。
【００５１】
【数５】
2005168398.tif 000007
ただし、ｔは測定時、Δｔは微小時間（例えば２４時間）を表す。
【００５２】
【数６】
2005168398.tif 000008
ただし、ｔは測定時、Δｔは微小時間（例えば２４時間）を表す。
【００５３】
このようにして継代毎に測定した指標値を所定の相関関係に照らして得られる細胞余命、すなわち、残り細胞分裂回数ＮｄＲ（＝ＮｄＦ−Ｎｄ）を知ることができると、例えば、継代培養工程から三次元化（重層化）培養工程へ移行するのにあたり、好ましい移行タイミング（残り細胞分裂回数）に対応する指標値をあらかじめ定めておき、該指標値をモニタリングすることで、移行すべきか否かを容易に判定し、確実に好ましいタイミングで三次元化（重層化）培養工程を実施できる。なお、特に、重層化工程に移行させる場合、好ましい移行タイミングとは、残り細胞分裂回数ＮｄＲが３回以上であり、より好ましくは５回以上あり、さらに好ましくは７回以上である。殊に、播種密度にもよるが、８層以上重層化させる場合には、ＮｄＲが５回以上であることが好ましく、７回以上であることがさらに好ましい。
【００５４】
既に述べたように、上記低酸素培養工程あるいは第１の培養工程によれば、細胞寿命を延長し、細胞余命を増加させることができる。したがって、これらの培養工程のみあるいはこれらの培養工程に対してそれぞれ上記他の培養工程や第２の培養工程を組み合わせて継代培養して上記した所定の相関関係を得ることで、所望の培養時間で所望の残り細胞分裂回数を保有する細胞を継代培養工程終了時点で得られるように継代培養工程を構成できるようになる。継代培養工程において培養時間と残り細胞分裂回数とをコントロールすることは、継代培養工程の自動化、特に三次元構造体の構築までを含んだ一連の細胞培養工程の自動化に有効である。
【実施例１】
【００５５】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
【００５６】
（無酸素環境下でのヒト表皮角化細胞継代培養）
以下、ヒト表皮角化細胞を無酸素環境下で継代培養した例について説明する。なお、実施例１は、上皮細胞を酸素濃度が１．０％未満のガス雰囲気で培養する本発明の細胞培養方法の実施例であるとともに、本発明の培養細胞の三次元構造体の作製方法における第１の培養工程の実施例でもある。
【００５７】
細胞として新生児由来のヒト表皮角化細胞（Ｓｔ．ｎｏ．Ｏｃｏ２１５，クラボウ（株））、培地としてヒト表皮角化細胞用無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２）、培養容器としてＴ型フラスコをそれぞれ用い、細胞接種濃度は１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２として培養した。具体的には、培地を液深さ４ｍｍになるように注入し、培養温度３７℃、ガス雰囲気は、ＣＯ２（炭酸ガス）とＮ２（窒素ガス）とのみから構成し、ＣＯ２濃度５％、Ｎ２濃度９５％とした。このようなガス雰囲気は、炭酸ガス・ボンベ及び窒素ガス・ボンベのみをガス供給源として用い、これらのガス供給源から培養装置内の培養空間にそれぞれの分圧を調整してガスを供給することで構成した。なお、常法のＣＯ２濃度５％の加湿空気環境下、すなわち、ガス雰囲気をＣＯ２濃度５％、Ｎ２濃度７４％、Ｏ２濃度を２１％とする以外は、実施例１と同様に操作を行い、比較例とした。培養空間の雰囲気中の酸素濃度を、ジルコニア固体電解質方式の排ガス分析装置（エイブル株式会社製）で測定したところ、酸素は検出されなかった（検出限界は０．２％）。
【００５８】
培養工程中は適宜培地交換を行った。また、継代培養操作は、角化細胞がサブコンフルエント状態となったときに培養容器中の培地を除去し、ＰＢＳにて２回洗浄後、角化細胞をトリプシン処理により剥離、回収し、新たな培養容器に接種するものとした。継代培養を繰り返して後述する累積細胞分裂回数がほぼ一定となったときを細胞寿命に達したものと判定した。
【００５９】
培養中、培養容器の下部からＣＣＤカメラによって、培養容器底面に接着する細胞の画像（投影像）を撮影し、撮像画像から得られる投影像の面積である培養面積Ｓ、ＰＢＳ洗浄により未接着細胞を除去して接着細胞のみとしたときの投影面積Ｐａの最小値である閾値Ｔ、面積Ｓ内の細胞面積のうち投影面積Ｐａが閾値Ｔを超えるものの細胞数ｎａをそれぞれ測定した。培養状態がサブコンフルエント状態となったか否かは、培養容器の培養面積に対する撮影された培養細胞面積Ｓの割合が培養面の面積の７０％〜８０％となったときとした。
【００６０】
また、これらのデータから一連の継代培養における累積細胞分裂回数Ｎｄを求めた。すわなち、Ｎｄは、各継代培養における細胞分裂回数Ｎｄ，Ｎｐの総和として表される。
Ｎｄ＝ΣＮｄ，Ｎｐ…（１）
ただし、Ｎｄ，Ｎｐは、継代回数Ｎｐにおける細胞分裂回数であって、以下の式（２）で表され、
Ｎｄ，Ｎｐ＝ｌｏｇ２（Ｘａ／Ｘ１）…（２）
ここで、Ｘ１は、培養開始２４時間経過後に培養容器の底面に接着している細胞の単位面積あたりの細胞数（細胞濃度）であり、Ｘａは、継代時に培養容器の底面に接着している細胞の単位面積あたりの細胞数（細胞濃度）であって、以下の式（３）で表される。
Ｘａ＝ｎａ／Ｓ…（３）
ただし、Ｓは、継代時にＣＣＤカメラによって撮影された培養細胞面積であり、ｎａは、面積Ｓを構成する細胞のうち投影面積Ｐａが閾値Ｔを超えるものの細胞数である。閾値Ｔは、ＰＢＳ洗浄により未接着細胞を除去して接着細胞のみとしたときの投影面積Ｐａの最小値であって、培養容器底部に接着する細胞の最小面積に相当している。
【００６１】
さらに、上記データに基づいて細胞寿命に達したと判定されたときの累積細胞分裂回数Ｎｄを寿命満了時の限界細胞分裂回数ＮｄＦとした。図１に、培養時間と累積分裂回数Ｎｄとの関係を示すグラフ図を示す。
【００６２】
図１に示すように、図中の黒丸が本発明による実施例１（無酸素環境下における継代培養）を示し、白抜き丸が比較例（常法における培養）を示す。また、残り細胞分裂回数ＮｄＲ（＝ＮｄＦ−Ｎｄ）を細胞の寿命パラメータとした。なお、図１のデータからは、Ｏ２濃度２１％の比較例では培養時間が４００ｈを超えた時点（４０４ｈ）で細胞寿命を迎えているが、Ｏ２濃度０．０２％未満の実施例では培養時間が１１００ｈを超えても増殖を続け、１１３５ｈで寿命に至った。結果として、実施例の細胞寿命は比較例の２５０％以上となっていた。
【００６３】
一方、実施例１における細胞形態が、通常の表皮細胞とは異なる形態（やや細長い形態）を示すものがあったため、培養時間６３４ｈの継代培養操作時において、一部の培養フラスコを高酸素濃度環境となるＯ２濃度２１％の雰囲気下に静置して培養を行った（図中の白抜き四角）。すると、細胞形態は通常の表皮細胞の形態を示すようになり、培養時間が約８５０ｈを超えた時点で細胞寿命を迎えた。以上のことから、無酸素環境下での培養においても、表皮角化細胞は正常な状態を維持しており、脱分化や不死化などの形態変化は起していないことが確認できた。また、低酸素濃度環境で培養しても高酸素濃度環境へと切り替えることで、細胞の形態など生理状態を復元できることも確認できた。
【実施例２】
【００６４】
（ヒト表皮角化細胞を用いた培養細胞シートの作製）
次に、実施例１で継代培養したヒト表皮角化細胞を重層化して三次元構造体としての培養細胞シートを作製した例について説明する。なお、本例は、実施例１を本発明の培養細胞の三次元構造体の作製方法における第１の培養工程とした場合には、該方法における第２の培養工程に相当する。
【００６５】
実施例１における培養時間が６３４ｈの培養細胞を採取し、この細胞を、実施例１の継代培養操作と同様にして培養容器に播種し、ガス雰囲気を高酸素濃度環境（ＣＯ２濃度５％、Ｎ２濃度７４％、Ｏ２濃度２１％）とする以外は、実施例１と同様の条件で培養した。コンフルエント状態まで培養した後、それまでの培地（Ｃａ２＋濃度：０．１５ｍｏｌ／ｍ３）から高カルシウム濃度培地（Ｃａ２＋濃度：１．２ｍｏｌ／ｍ３）に切り換え、重層化を促した。高カルシウム濃度培地に切り換えて培養することで、表皮細胞の重層化が進み、２４０ｈ後には培養表皮細胞シートが作製された。
【００６６】
以上のことから、無酸素雰囲気下で上皮細胞を培養することで明らかに細胞寿命が延長され、しかも、かかる培養細胞であっても正常な細胞状態を維持しており、常法のガス雰囲気下での三次元構造体の構築が可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例１及び実施例２における培養時間と累積細胞分裂回数Ｎｄの関係を示すグラフである。
【図２】培養細胞シートの作製方法のフローの一例を示す図である。
【図１】
2005168398.tif 000009
【図２】
2005168398.tif 000010