(57)【要約】【課題】抗体エフェクター機能におけるIgG糖化の役割を支持する証拠はたくさんあるが、これまでの研究はin vitroの細胞培養系で行ったものであった。本発明は、生体内(in vivo)でのIgG1機能において多糖類の役割を明らかにして、アナフィラキシー症状の改善を図るものである。【解決手段】本発明は、IgG1-Fcの多糖類がIgG1により惹起されたアナフィラキシーに不可欠であることを発見し、脱糖鎖化されたIgG1をIgG抗原特有なアナフィラキシーの治療法に応用する技術である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgG抗原特有なアナフィラキシーの治療薬としての脱糖鎖化されたIgG1
【請求項２】
脱糖鎖化されたIgG1をIgG抗原特有なアナフィラキシーの治療法に応用する技術
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
即時型アレルギーに対する治療開発分野。
【背景技術】
【０００２】
アナフィラキシーは、循環系に肥満細胞と好塩基球から突然放出された伝達物質が引き起こすことによる急性の、生命を危うくする症候群である。IgEは、古くからこの即時型の過敏反応を引き出す際に中心的な役割を持つと考えられる。マスト細胞や好塩基球の表面に存在するレセプター（Fc RI）にIgEが結合しクロスリンクすると即時性過敏症が惹起される。
【０００３】
しかし、IgEはマウスの場合抗原によって誘発されるアナフィラキシーにはかならずしも必要でない証拠がでてきた。Oettgenらは,IgE欠損マウスを用いた能動的なアナフィラキシーの実験結果からIgE以外の刺激がin vivoでは重要な役割を演じていると報告した。このようなIgEに依存しない発症機構において、IgGの役割はますます注目を集めている。
【０００４】
IgGは、そのレセプターFc RIIIを介して結合することによって、動物において受動的な皮下アナフィラキシー反応と受動的な全身性のアナフィラキシー反応を惹起する。
【０００５】
IgGは糖タンパク質で、Fc領域中の非常に保存されたAsn297でN連結された糖化部位はCH2領域の間に埋没しており、そして、Fcのタンパク質表面で特異的なタンパク質-糖相互作用を形成している。IgGのFcに存在する糖鎖部分は、細胞のFcレセプターや補体と結合すること、抗体依存性の細胞性傷害(ADCC)を誘導すること、抗原-抗体複合体を循環系から迅速に除去することなどの抗体エフェクターとして必須である、しかし、IgGを介するアナフィラキシーにおいてIgGの糖鎖の果たす役割はまだ明らかにされていない。
【特許文献１】特開平９−２９５９
【特許文献２】特開平９−２２７４０９
【特許文献３】特開２００２−２８８０９３
【非特許文献１】Biomedical Research 24, 291-297 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗体エフェクター機能におけるIgG糖化の役割を支持する証拠はたくさんあるが、これまでの研究はin vitroの細胞培養系で行ったものであった。本発明は、生体内(in vivo)でのIgG1機能において多糖類の役割を明らかにして、アナフィラキシー症状の改善を図るものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、IgG1-Fcの多糖類がIgG1により惹起されたアナフィラキシーに不可欠であることを発見し、脱糖鎖化されたIgG1をIgG抗原特有なアナフィラキシーの治療法に応用する技術である。
【発明の効果】
【０００８】
抗体IgGの脱糖鎖がマウスにおいてアレルギー反応を抑制できることを発見した。この発見はIgG抗体を介するアナフィラキシーを制御することに非常に役立つと思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において、我々はIgG1から糖鎖を酵素的に除去した脱糖鎖化IgGがIgG抗体の介するアナフィラキシーを抑制するかどうかを解析し、本アナフィラキシーにおける抑制技術を開発した。
【実施例１】
【００１０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００１１】
雌のddYマウス（8-12週齢）はSLC社（東京（日本）から購入し、免疫実験と受動的な全身性のアナフィラキシー・テストのために使用した。雌のSprague-Dawley（SD）ラット（10-12週齢）はチャールズリバー日本（大阪））から購入し、皮内アナフィラキシ-反応(PCA)のために使用した。全ての実験は、秋田大学医学部の動物のガイドラインに基づいて実施された。
【００１２】
ddYマウス群は、コンプリートアジュバント（Nacalai Tesque社、京都、日本）に50μgの卵白アルブミン（OVA、Grade V、Sigma、USA）を添加したものを、腹膜内に注射し（i.p.）、第２週目と第3週目に再度同様に免疫した。第4週目にマウスから採血し、得られた免疫血清は使用まで−80°Cで保存した。
【００１３】
マウスIgEe鎖に対するラットモノクロナール抗体（IgG）（South Biotechnology 社、バーミンガム、AL、USA）をリガンドとしたアフィニティーカラムで、免疫血清からIgEを除去した。カラムに結合せずに通過した分画をラットの抗マウスg1鎖抗体（Bethyl Lab. Inc., Montgomery, TX, USA）をリガンドとしたアフィニティーカラムにかけた後、4Mグアニジン塩酸溶液で溶出し、一晩4°Cで25mMEDTA（pH 7.2）を含んだ0.1mMのリン酸ナトリウム・バッファに対して透析した。精製されたIgG1は2つに分けて、一方は脱糖鎖化を行い、残りの半分は無処理の天然の抗体で、コントロールとして用いた。
【００１４】
無傷の脱糖鎖されたIgG1を得るために、どんな界面活性剤も還元剤も加えない非変性条件でペプチド-N-グリコシダーゼF(PNGase F, Roche, Mannheim, Germany)を用いて 天然のIgG1を消化した。手短に言うと、IgG1溶液に125mMEDTA、0.1Mリン酸ナトリウム・バッファ（pH 7.2）中に溶解したPNGase F（IgG150μg/単位）を加えて、37°Cで48時間反応させた。コントロールは、同じ方法で酵素を加えないで反応させた。
【００１５】
脱糖化の程度は、DIG-Glycan Detection Kit（Roche, Mannheim, Germany)を使って分析した。手短に言うと、タンパク質の多糖類を穏やかな過ヨウ素酸塩で処置することによって酸化した。そして、digoxigenin-3-0-succinyl-aminocaproic acidヒドラジドでラベルした。試料は100°Cで2分間熱変させ、それから試料3μgを12%SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。その後、試料はイモビロン膜（ミリポア、MA、USA）に転写し、その後タンパク質をPonceau S溶液で染色した。一方、タンパク質の多糖類は同じ膜を用いてアルカリホスファターゼ結合抗digoxingenin抗体で検出した。糖化タンパク質のコントロールとしてトランスフェリンを用いた。脱糖化されたことを確認後、抗原OVAをリガンドとしたアフィニティーカラムに脱糖鎖化された抗体を吸着させ、4Mguanidinium塩酸で溶出した。溶出画分を一晩4°CでPBSに対して透析した。
【００１６】
ELISAを用いてIgG1のProtein G 結合能を測定した。段階的に濃度を変えた（34μg/ml、17μg/ml、8.5μg/ml、4.3μg/ml）100μlの天然のIgG1または脱糖鎖されたIgG1をMaxisorb 96穴平底のマイクロタイタープレート(Nunc, Denmark)に加えて、１晩4°Cで反応させた。プレートは、洗浄バッファー（WS; 50mMTris、0.14MNaCl-0.05% Tween20、pH 8.0）で洗浄し、ブロックキング溶液（BS; TBS-1% BSA、pH 8.0）にて室温で1時間ブロックした。その後２回WSで洗浄し、100μlのHRP結合protein G (1:1000, ZYMED, CA, USA)を加えて、1時間反応させた。4回洗浄して、1,3,3',5,5'-tetramethylbenzidine（TMB、Sigma、USA）100μlを添加して１０分間発色させてから、0.5MH2SO4を50μl添加して反応を停止し、450nmの波長で吸光度を測定した。全ての測定は３回行った。
【００１７】
酵素結合免疫吸着分析法（ELISA）を用いて、抗原OVAに対する脱糖鎖されたIgG1の結合能を測定した。以下の全ての実験は室温で行った。0.05Mの炭酸ナトリウム（pH 9.6）に溶解したOVA（100μg/ml）100μlづつMaxisorb 96穴プレートの各穴に注入し、2時間温置した。プレートを次にWSで二回洗浄して、1時間BSでブロックして、その後２回洗浄し、希釈したIgG1試料（TBS-1% BSA-0.05% Tween20で1:5に希釈）100μlをプレートに加え、2時間温置した。コントロールとして,希釈したバッファと普通のマウスIgGを用いた。さらに、プレートを４回洗浄し、HRP結合抗マウスIgG1抗体(1:80,000, Bethyl Lab. Inc., Montgomer）100μlを加えて、1時間温置した。そして、先に述べたような方法で発色した。全ての測定は、３回行った。
【００１８】
天然のIgG1と脱糖鎖されたIgGの受動的な皮内アナフィラキシー能（PCA）を測定するために、10 -12週齢のSDラットの背中を注意深く剃り、精製した天然（50μg）,脱糖鎖されたIgG（50μg,100μg）あるいはPBS100μlを皮内に注射した。1時間後に、滅菌した生理食塩水に溶解した1 mg OVAと0.5% エバンス青色素をラットの静脈内に注射した。注入部位に着色した エバンス青色素の管外溢出を視覚的に数値化した。  
【００１９】
天然と脱糖鎖されたIgG1の受動的な全身性アナフィラキシーを誘導する能力を測定するために、精製した天然あるいは脱糖鎖された抗OVA IgG1抗体300μg（病原体フリーのPBS200μl中に溶解）をddYマウスの静脈内に注射した。コントロールのマウスには、同量のPBSを注射した。注射24時間後、OVA500μgと0.5%エバンス青色素の溶液100μlをマウスの静脈内に注射した。
【００２０】
受動的な全身性アナフィラキシーの評価の一つに直腸温度を測定した。ネズミ直腸温度は、抗原/染料注射直前および10、20、30、40、50、60分後に、デジタル温度計（MC-106B、オムロン、東京、日本）で測定した。マウのス死亡や足甲の青色を観察した。
【００２１】
マウスにおいてアナフィラキシーショック過程で脱糖鎖されたアレルギゲン特異的なIgGの治療的な効果を調べるために、ddYマウス（雌、8週齢）にアジュバントImject Alum（Pierce、IL、USA）50μlと50μgOVAを腹腔内に注射して免疫した。10日後に、マウスにアジュバントなしでOVA50μgを腹腔内に注射した。ブースター７日後、OVA 100μgをマウスに腹腔内に注射してアナフィラキシーショックを誘発させた。注射24時間前に、脱糖鎖された抗OVA IgG抗体 150μg/PBS100μlをマウスに静脈注射した。偽のマウスにはPBSを同量注射した。そして、マウスの死亡を観察した。
【００２２】
天然および脱糖鎖されたIgG1のOVAへの結合の統計的な有意差検定は、Student-tテストを用いた。直腸の温度の時間経過についてマウス群間の統計的な有意差検定は、ANOVAとStudent-tテストを用いた。実験群間の死亡率の統計的な有意差検定は、フィッシャーテストによって行った。統計的有為差のP値は、0.05または0.01に決めた。各測定値は、mean±S.E.Mとして表した。
【００２３】
天然のIgG1を非変性条件下でPNGase F処置したところ、重鎖の移動位置が移動した（図1A）。分子量マーカーと比較して12%SDS-PAGE上の移動度から計算して、脱糖鎖された重鎖の分子量は天然のそれよりおよそ1.9kDa小さかった、この結果は、哺乳類のIgGは2-3%の糖を含むという以前の他者らの発表と一致した。糖染色により脱糖化後はオリゴ糖類が検出されないことを示した（図1B）。それは、PNGase Fが非変性条件下で完全にIgG1のN結合の多糖類を削除したことを示している。
【００２４】
脱糖化によって引き起こされたIgG1の全体構造の破壊によるのではということを除外するために、IgGのCH2-CH3結合領域を認識するProtein Gへの天然および脱糖鎖されたIgGの結合能をELISAによって測定した。脱糖鎖されたIgG1は以前としてProtein Gと結合できたので、多糖類の除去では全体構造の破壊は起こらなかったことを示している。しかし、その能力は天然のIgG1のそれより低かった（図2）。
【００２５】
IgG1の抗原結合能に対する脱糖化の効果を調べるために、天然および脱糖鎖されたIgG1が抗原OVAを結合する能力をOVAでコートしたプレートを使ってELISAによって測定した。天然のIgG1または脱糖鎖されたIgG1を1.6ng/mlから1000ng/mlまでの濃度になるように連続的に希釈した。抗原への脱糖鎖されたIgG1の結合能は天然のIgG1のそれと同じものであった。この結果は、酵素による多糖類の除去がIgG1の抗原結合能に影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【００２６】
即時性アレルギーの反応を誘発する能力を測定するために、PCAのモデルで生体内での局所性の管外溢出試験を用いた。天然あるいは脱糖鎖された抗-OA IgG1をSDラットの背中に注射した。1時間後に、全ての動物に0.5% エバンス青色素と1mgOVAを投与した。5分後に、染料の管外溢出は天然のIgG150μgを注射されたラットでは見られ、注射後10分でピークに達した。対照的にPBSや50μgの脱糖鎖されたIgG1を投与した 60分後でも染料漏洩は観察されなかった（図３）。従って、天然のIgG1はPCAを誘導することができたが脱糖鎖されたIgG1は誘導できなかった。
【００２７】
生体内でアレルギー反応をテストするもう一つの測定法は、受動的な全身性のアナフィラキシーを誘発することである。マウスに天然あるいは脱糖鎖された抗-OVA IgG1300μgを注射した。24時間後に、全てのマウスに0.5% エバンス青色素とOVA500μgを投与した。脱糖鎖されたIgG1、PBSまたは天然のIgG1で感作されたマウスとそれぞれ比較した結果、天然のIgG1で感作されたマウスは抗原投与後10ー20分に直腸温度が有為に減少した（図4A）。
【００２８】
天然のIgG1で感作されたマウスのおよそ40%は、投与後10-20分の間に死亡した。投与30分後から、天然のIgG1で感作されたマウスの直腸温度は検知されなくなった。脱糖鎖されたIgG1で感作されたマウスは、PBSで感作されたマウスと同様に直腸温度は有為な減少を示さなかった。天然のIgG1で感作されたマウスは静脈からの抗原投与後50分以内に全て死亡したのに対し、脱糖鎖されたIgG1またはPBSを投与されたマウスは死亡しなかった。
【００２９】
抗原投与30分後に、マウス足甲が青色に着色することによってプラスマ漏出効果を測定した。有為な青い着色はPBS（図4B1）または脱糖鎖されたIgG1（図4B3）で感作されたマウスにおいては観察されなかった、しかし、天然のIgG1で感作されたマウス（図4B2）は感作後、足甲に顕著な青い着色が観察された。
【００３０】
抗原によって誘発された能動的全身性アナフィラキシーのモデルを用いて、脱糖鎖されたIgGの効果を調べた。このために、最初にアルミニウムのアジュバントとOVAでマウスを免疫し、10日後にもう一度免役した。次に、これらのOVAで感作されたマウスにアナフィラキシーショックを誘発するために抗原を再投与した。12匹のコントロールマウスのうちの10匹（83.3%）は、アナフィラキシーを呈し60分以内に死亡し、脱糖鎖されたIgG1で処置したマウスの死亡率（10匹中３匹、30%、p<0.05）より有為に高かった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、アレルギーの予防および治療に有効な、脱糖鎖化IgG抗体に関するものである。脱糖鎖化されたIgG1をIgG抗原特有なアナフィラキシーの治療法に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】脱糖化の脱糖鎖されたIgG1の性質。図1AはPonceau S染色で、図1Bは抗digoxigenin抗体で染色されたタンパク質上の糖を示す。レーン1：分子量まーかー;レーン2：天然のIgG1（レーン3：脱糖鎖されたIgG1;レーン4：transferrin（糖タンパク質のコントロール）。
【図２】ELISAを用いた脱糖鎖されたIgG1の Protein G結合能
【図３】SDネズミにおいてPCAを誘導できない脱糖鎖化IgG1。NIgG1：天然のIgG1; DIgG1：脱糖鎖されたIgG1.
【図４】ddYマウスにおける受動的な全身性のアナフィラキシーを誘発けるできない脱糖鎖化IgG1。A.OVA投与後の直腸温度、B.全身性のアナフィラキシー過程での血清漏出。抗原投与の30分後の足甲の写真。1. PBS処理のマウス、2.天然のIgG1処理のマウス；３脱糖鎖されたIgG1処理のマウス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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