(57)【要約】【課題】アルツハイマー病（ＡＤ）の予防手段、改善手段または治療手段の開発に用い得る手段を提供し、それによりＡＤの予防、改善または治療を可能にすること。【解決手段】生後３０日までに脳内にＡβ沈着を生じる大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）マウスを用いることを特徴とする、ＡＤの予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法；Ａβ沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤またはニューロン脱落阻害剤のスクリーニング方法；該スクリーニング方法で得られた、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＶＥＧＦ等を含むＡＤの予防剤、改善剤または治療剤；Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＶＥＧＦ等を含むＡβ沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤またはニューロン脱落阻害剤；上記薬剤を用いることを特徴とするＡＤの予防方法、改善方法または治療方法；上記薬剤を用いることを特徴とするＡβ沈着阻害方法、繊維性斑形成阻害方法またはニューロン脱落阻害方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージコロニー刺激因子の欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
マクロファージコロニー刺激因子の欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物を用い、該動物に調べようとする物質を投与して、該動物におけるアミロイドβ蛋白質沈着、繊維性斑形成およびニューロン脱落から選ばれるいずれか１つ以上を指標にしてその変化を検出し、該物質が該指標を阻害するか否かを決定することを特徴とする、アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤が、アミロイドβ蛋白質沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤およびニューロン脱落阻害剤から選ばれるいずれか１である請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
マクロファージコロニー刺激因子の欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物が、大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）マウスである請求項１から３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法で得られたアルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤。
【請求項６】
請求項３または４に記載のスクリーニング方法で得られた、下記の群から選ばれるいずれか１の阻害剤：
ｉ）アミロイドβ蛋白質沈着阻害剤、
ｉｉ）繊維性斑形成阻害剤
および
ｉｉｉ）ニューロン脱落阻害剤。
【請求項７】
マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子および血管内皮増殖因子から選ばれる１つ以上を有効成分として含む、アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤。
【請求項８】
アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤が、下記の群から選ばれるいずれか１の阻害剤である請求項７に記載の予防剤、改善剤または治療剤：
ｉ）アミロイドβ蛋白質沈着阻害剤、
ｉｉ）繊維性斑形成阻害剤
および
ｉｉｉ）ニューロン脱落阻害剤。
【請求項９】
請求項７に記載のアルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤を用いることを特徴とするアルツハイマー病の予防方法、改善方法または治療方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の阻害剤を用いることを特徴とする、下記の群から選ばれるいずれか１の阻害方法：
ｉ）アミロイドβ蛋白質沈着阻害方法、
ｉｉ）繊維性斑形成阻害方法
および
ｉｉｉ）ニューロン脱落阻害方法。
【請求項１１】
アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法への大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）マウスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病モデル動物を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、マクロファージコロニー刺激因子の欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物、例えば大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）マウスを用いた当該薬剤のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、上記動物を用いたアミロイドβ蛋白質沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤またはニューロン脱落阻害剤のスクリーニング方法に関する。さらに、本発明は、上記スクリーニング方法で得られたアルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤、アミロイドβ蛋白質沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤並びにニューロン脱落阻害剤に関する。また、本発明は、薬剤を用いることを特徴とするアルツハイマー病の予防方法、改善方法または治療方法、アミロイドβ蛋白質沈着阻害方法、繊維性斑形成阻害方法並びにニューロン脱落阻害方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；以下、ＡＤと略称することもある）は高齢者の痴呆の原因として最も頻度の高い神経変性疾患である。ＡＤの病理学的特徴は、大脳皮質における神経細胞脱落、神経細胞外に出現する老人斑、および神経細胞内に出現する神経原繊維変化である。これら特徴の中で、老人斑アミロイドの主要構成成分であるアミロイドβ蛋白質（以下、Ａβと略称することもある）の産生、凝集および蓄積がＡＤの発症に深く関与している可能性が示されている。Ａβは凝集して可溶性凝集体を形成し神経機能障害を起こす。この可溶性凝集体がさらに凝集して形成された不可溶性凝集体であるアミロイドは神経細胞死を起こす。アミロイドが沈着して生じる繊維性斑が老人斑である。
【０００３】
Ａβは、膜貫通型蛋白質であるβアミロイド前駆体蛋白質（以下、ＡＰＰと略称する）がセクレターゼと呼ばれる酵素により切断されて生じる。ＡＰＰは、まずβセクレターゼによって細胞外（ＡβのＮ末端側）で切断される。その結果生じた９９アミノ酸からなるＣ末端側断片（Ｃ９９）は、引き続きγセクレターゼにより膜内で切断を受け、Ａβが産生・分泌される。γセクレターゼにより生じるＡβのＣ末端には多様性がみられ、第４０番目のバリン残基で終わるＡβ１−４０と第４２番目のアラニン残基で終わるＡβ１−４２が知られている。Ａβ１−４２はＡβ１−４０より遥かに強い凝集性を示し、アミロイド形成能が高い。また、病理学的にも、明らかな老人斑が形成される前にＡβ１−４２が沈着し、それにさらにＡβ４０が沈着して神経変性が生じることが観察された。さらに、Ａβ１−４２が培養神経細胞に対して高い毒性を示したことが報告されている。
【０００４】
ＡＤの中で、家族性ＡＤ（以下、ＦＡＤと略称することもある）は常染色体優勢遺伝形式をとるＡＤであり、種々の、ＡＰＰ遺伝子に連鎖するＦＡＤ遺伝子変異が報告されている。そのうち、セクレターゼによる切断部位に近接したアミノ酸の点突然変異は、ＡＰＰの切断特異性を変化させ、Ａβ、特にＡβ１−４２産生を上昇させることが明らかにされている。さらに、これらＦＡＤ変異を持つヒトＡＰＰ遺伝子を過剰発現させたトランスジェニックマウスの脳においてＡβアミロイドの蓄積や記憶・学習障害が観察された。これらの結果から、Ａβ１−４２の産生亢進もしくは分解低下、それに続く凝集と蓄積などの過程がＡＤ発症に重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００５】
一方、大多数のＡＤを占める孤発性ＡＤではＦＡＤで観察されるようなＡβ合成の上昇が普遍的な現象として認められない。そのため、分解速度の低下が孤発性ＡＤにおけるＡβ蓄積の原因であると考えられるようになった。近年、脳内Ａβ分解メカニズムには、中性エンドペプチダーゼの一種であるネプリライシンが主要な働きを果たしていることが明らかになった。
【０００６】
このようにＡβは、一定の代謝バランス（合成速度と分解速度のバランス）によって正常脳に一定量存在しているが、加齢等に伴う代謝バランスの変化により脳内に蓄積し、その結果ＡＤの発症に深く係ると考えられる。
【０００７】
ＡＤの発症メカニズムの研究や、ＡＤの治療および予防を目的とする医薬の開発のために、種々のＡＤモデルマウスが作製されている。例えば、６９５アミノ酸からなるＡＰＰのアイソフォームを過剰発現させたトランスジェニックマウスが知られている。このマウスは、Ｙ迷路において試験したところ、学習・記憶能力障害を示した。また、このマウスではＡβが有意に増加し、行動欠陥がより顕著であった（非特許文献１）。同様に、ＡＰＰ２３トランスジェニックマウスでは、新皮質および海馬全体にわたって実質的なＳＰ沈着が認められた。このトランスジェニックマウスのＣＡ１錐体細胞の数は、対象と比較して有意に減少していた（非特許文献２）。
【０００８】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９６年、第２７４巻、ｐ．９９−１０２。
【非特許文献２】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９８年、第３９５巻、ｐ．７５５−７５６。
【非特許文献３】「ジャーナル  オブ  ニューロケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９８年、第７０巻、ｐ．７２１−７２６。
【非特許文献４】「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第２７２巻、ｐ．６６４１−６６４６。
【非特許文献５】「ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス  リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９６年、第４３巻、ｐ．１９０−２０２。
【非特許文献６】「ジーンターゲティング：ア  プラクティカル  アプローチ（プラクティカル  アプローチ  シリーズ  ２１２）〔Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２１２）〕」、第２版、２０００年、ジョイヤー、アレクサンドラ（Ｊｏｙｅｒ，Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｌ．）編、出版：オックスフォードユニバーシティープリント（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒ）。
【非特許文献７】「アメリカン  ジャーナル  オブ  パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、１９９１年、第１３９巻、ｐ．６５７−６６７。
【非特許文献８】「ブレイン  リサーチ（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９８年、第８０４巻、ｐ．１３５−１３９。
【非特許文献９】「ジャーナル  オブ  セル  サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９３年、第１０４巻、ｐ．１０２１−１０２９。
【非特許文献１０】「ブレイン  リサーチ（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９９年、第８２６巻、ｐ．１４８−１５３。
【非特許文献１１】「リサーチメソッズ  イン  ニューロアナトミー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ）」、ナウタ（Ｗ．Ｊ．Ｈ．Ｎａｕｔａ）およびエベッソン（Ｓ．Ｏ．Ｅ．Ｅｂｂｅｓｓｏｎ）校訂版、１９７０年、スプリンガー−フェアラーク、ベルリン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＡＤの予防および治療には、沈着が起こる前にＡβ産生を抑制する、Ａβの分解を促進する、または沈着したＡβの除去を行うなどの手段が有効と考えられる。例えば、Ａβの産生や蓄積の阻害をターゲットとして、ＡＤの予防手段および治療手段の開発が進められている。しかしながら、未だに、ＡＤの根本的な予防手段および治療手段の開発には至っていない。
【００１０】
ＡＤの予防および治療を目的とする医薬の開発のために、種々のＡＤモデルマウスが作製されている。しかしながら、従来用いられているＡＤモデルマウスはいずれも、脳内にアミロイドの沈着が観察されるまでに３ヶ月から６ヶ月を要する。このように、Ａβ沈着を生じるまでに要する期間が長いことが、これらモデルマウスを薬剤評価に用いる上での問題点であった。
【００１１】
本発明においては、ＡＤの予防手段、改善手段または治療手段の開発に用い得る有用な手段の提供を課題とする。また、ＡＤの予防手段、改善手段または治療手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）無歯顎マウスにおいて、３０日齢で既にその脳にＡＤの特徴的症状、例えばＡβ沈着、繊維性斑出現およびニューロン脱落等が認められることを見出した。ｏｐ／ｏｐマウスにおいては、マクロファージコロニー刺激因子（以下、Ｍ−ＣＳＦと略称する）の欠失によりミクログリアが減少している。ｏｐ／ｏｐマウスにＭ−ＣＳＦを投与することにより、Ａβ沈着を伴う繊維性斑形成およびニューロン脱落が抑制されることをさらに見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、
１．マクロファージコロニー刺激因子の欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法、
２．マクロファージコロニー刺激因子の欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物を用い、該動物に調べようとする物質を投与して、該動物におけるアミロイドβ蛋白質沈着、繊維性斑形成およびニューロン脱落から選ばれるいずれか１つ以上を指標にしてその変化を検出し、該物質が該指標を阻害するか否かを決定することを特徴とする、アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法、
３．アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤が、アミロイドβ蛋白質沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤およびニューロン脱落阻害剤から選ばれるいずれか１である前記１．または２．のスクリーニング方法、
４．マクロファージコロニー刺激因子の欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物が、大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）マウスである前記１．から３．のいずれかのスクリーニング方法、
５．前記１．から４．のいずれかのスクリーニング方法で得られたアルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤、
６．前記３．または４．のスクリーニング方法で得られた、下記の群から選ばれるいずれか１の阻害剤：
ｉ）アミロイドβ蛋白質沈着阻害剤、
ｉｉ）繊維性斑形成阻害剤
および
ｉｉｉ）ニューロン脱落阻害剤、
７．マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子および血管内皮増殖因子から選ばれる１つ以上を有効成分として含む、アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤、
８．アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤が、下記の群から選ばれるいずれか１の阻害剤である前記７．の予防剤、改善剤または治療剤：
ｉ）アミロイドβ蛋白質沈着阻害剤、
ｉｉ）繊維性斑形成阻害剤
および
ｉｉｉ）ニューロン脱落阻害剤、
９．前記７．のアルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤を用いることを特徴とするアルツハイマー病の予防方法、改善方法または治療方法、
１０．前記８．の阻害剤を用いることを特徴とする、下記の群から選ばれるいずれか１の阻害方法：
ｉ）アミロイドβ蛋白質沈着阻害方法、
ｉｉ）繊維性斑形成阻害方法
および
ｉｉｉ）ニューロン脱落阻害方法、
１１．アルツハイマー病の予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法への大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）マウスの使用、
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生後３０日までに脳内にＡＤの特徴的な症状、例えばＡβ沈着、繊維性斑形成およびニューロン脱落を生じるＡＤモデルマウスを用いる、ＡＤの予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法を提供できる。上記ＡＤモデルマウスは、従前用いられていたモデルマウスと比較して、Ａβ沈着を生じるまでに要する期間が短い。そのため、薬剤評価期間の短縮および経費の削減が可能になる。
【００１５】
上記スクリーニング方法を用いて、Ａβ沈着阻害剤、繊維性形成阻害剤またはニューロン脱落阻害剤の同定もまた可能である。
【００１６】
本発明においてはさらに、上記スクリーニング方法により得られたＡβ沈着阻害剤、繊維性形成阻害剤またはニューロン脱落阻害剤、並びにＡＤの予防剤、改善剤または治療剤を提供できる。具体的には、Ｍ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと略称する）および血管内皮増殖因子（以下、ＶＥＧＦと略称する）から選ばれる１つ以上を有効成分とする薬剤を提供できる。これらの薬剤の使用により、ＡＤの予防、改善または治療を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本発明は、Ｍ−ＣＳＦの欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物を用いることを特徴とする、ＡＤの予防剤、改善剤または治療剤のスクリーニング方法に関する。
【００１８】
「Ｍ−ＣＳＦの欠損」とは、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子の発現あるいはＭ−ＣＳＦの生合成の異常等の理由により、Ｍ−ＣＳＦが生体内において産生されないか、極わずかに産生されてもその機能の効果が得られない状態をいう。「Ｍ−ＣＳＦの機能不全」とは、Ｍ−ＣＳＦの変異あるいはＭ−ＣＳＦの機能促進に関与する蛋白質の異常等の理由により、Ｍ−ＣＳＦの機能が全く認められないか、極わずかに認められても正常マウスにおいて得られる効果より遥かに低い効果しか得られない状態をいう。ここで、Ｍ−ＣＳＦの機能とは、単球・マクロファージの前駆細胞に特異的に作用し、その増殖と分化を促進する機能をいう。
【００１９】
「ミクログリア」は、脳組織において単球から分化した細胞であり、単球・マクロファージ系統に属する。ミクログリアの増殖・分化を促進する物質としては、Ｍ−ＣＳＦが知られている。その他、単球・マクロファージ系統の細胞の増殖・分化を促進する物質として知られているＧ−ＣＳＦやＶＥＧＦも、ミクログリアの増殖・分化を促進すると考えられる。また、ミクログリアが、メタロプロテアーゼの放出（非特許文献３および４）または貪食作用（非特許文献５）によりＡβ形成を減少させることが報告されている。
【００２０】
「非ヒト動物」とは、ヒトを含まない哺乳動物を意味し、好ましくはげっ歯類、例えばマウスやラットを例示できる。Ｍ−ＣＳＦの欠損および／または機能不全を有しミクログリアの減少または消失を伴う非ヒト動物を、以下モデル動物と呼称する。このようなモデル動物は、自体公知の遺伝子工学的手法により、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子のノックアウトマウス等を作製することにより得ることができる。ノックアウトマウスの作製方法として、ジーンターゲティング法を例示できる。具体的なジーンターゲティング法は、既に公開されている種々の成書を参照して実施できる（非特許文献６等）。
【００２１】
上記モデル動物として具体的には、ｏｐ／ｏｐマウスを挙げることができる。ｏｐ／ｏｐマウスにおいては、３０日齢で既にその脳にＡＤの特徴的症状、例えばＡβ沈着、繊維性斑出現およびニューロン脱落等が認められた。このことは、本発明において初めて見出した。
【００２２】
ｏｐ／ｏｐマウスについては、機能的Ｍ−ＣＳＦの欠失によりミクログリアの数密度が減少していることが報告されている（非特許文献７−９）。ミクログリアは、メタロプロテアーゼの放出または貪食作用により、産生されたＡβの除去に関与している。ミクログリアが減少しているｏｐ／ｏｐマウスでは、ミクログリアによるＡβの除去、さらにはＡβの沈着を伴う繊維性斑の除去が行われないため、ＡＤの特徴的症状が現れると考えた。したがって、ｏｐ／ｏｐマウス以外の非ヒト動物においても、Ｍ−ＣＳＦの欠損および／または機能不全によりミクログリアが消失または低減した場合、ｏｐ／ｏｐマウスと同様、早期にＡＤの特徴的な症状が現れると考える。
【００２３】
ｏｐ／ｏｐマウスは、その他、破骨細胞不全により歯牙萌出が妨げられているため歯が消失しているという特徴を有する。また、歯の消失が脳の十分な発達に影響を及ぼすため、学習・記憶能力が障害されていると報告されている（非特許文献１０）。
【００２４】
ｏｐ／ｏｐマウスの取得は、例えば市販のＢ６Ｃ３Ｆｅ−ａ／ａ−ｏｐ／＋マウスのメスおよびオスを育種用のつがいとして用いて交配させることにより可能である。産出したマウスの中で、ｏｐ／ｏｐ遺伝子型を有するマウスと＋／＋または＋／ｏｐ遺伝子型を有するマウスとの区別は、切歯萌出の有無により判定できる。ｏｐ／ｏｐマウスは、切歯萌出が認められない。切歯萌出の有無の判定は、出生後約１０日目前後に実施できる。ｏｐ／ｏｐマウスは歯が消失しているため、飼育は顆粒状飼料を用いて行う。マウスの交配および飼育は、一般的に知られた実験用動物の飼育方法に従って実施できる。
【００２５】
本発明に係るスクリーニング方法は、上記モデル動物に、調べようとする物質（以下、被検物質と呼称する）を投与し、ＡＤの特徴的症状であるＡβ沈着、繊維性斑形成およびニューロン脱落から選ばれるいずれか１以上を指標にしてその変化を検出することにより実施できる。被検物質の投与時期は、上記モデル動物においてＡＤの特徴的症状が発生する前であってよく、該症状が発生した後であってもよい。モデル動物においてＡＤの特徴的症状が認められる時期は、該動物の作製または出生後、脳に発生する該症状を、経日的に調べることにより決定できる。ＡＤの特徴的症状が認められる前に被検物質を投与することにより、該症状の発生を予防する薬剤をスクリーニングできる。また、ＡＤの特徴的症状が生じた後に被検物質を投与することにより、該症状を改善または治療する薬剤をスクリーニングできる。このような薬剤として、Ａβの生成や凝集の阻害、あるいはＡβの分解や除去の促進といった機能により、Ａβ沈着、繊維性斑形成またはニューロン脱落を阻害する薬剤が挙げられる。本スクリーニング方法によれば、Ａβ沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤またはニューロン脱落阻害剤のスクリーニングも可能である。被検物質の投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択可能である。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与または動脈内投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。好ましくは、脳に注射等により直接的に投与することが好ましい。被検物質としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物等が挙げられる
【００２６】
上記スクリーニング方法において、ＡＤの特徴的症状であるＡβ沈着、繊維性斑形成およびニューロン脱落から選ばれるいずれか１以上を指標にしてその変化を検出する際には、被検物質を投与しなかったモデル動物を対照として用い、被検物質を投与したモデル動物との間でこれら症状を比較することが好ましい。ＡＤの特徴的症状であるＡβ沈着、繊維性斑形成またはニューロン脱落が、被検物質を投与したモデル動物において、対照動物と比較して減少または消失した場合、該被検物質は、ＡＤの予防剤、改善剤または治療剤の有効成分として使用できると判定する。
【００２７】
ＡＤの特徴的症状であるＡβ沈着、繊維性斑形成またはニューロン脱落の検出は、自体公知の方法を利用して実施できる。例えば、Ａβ沈着の検出は、上記モデル動物から取り出した脳から作製した組織切片について、抗Ａβ抗体、好ましくは抗Ａβ１−４２抗体を用いて免疫組織化学的染色を行うことにより実施できる。これらの抗体はＡβあるいはＡβ１−４２を抗原として自体公知の抗体製造法により取得できる。あるいは市販されている抗体も使用可能である。繊維性斑形成の検出は、例えば、上記組織切片についてコンゴーレッド染色を行い、斑を計数することにより実施できる。ニューロン脱落は、例えば、上記組織切片についてニッスル染色を行い、ニューロン数を計数することにより実施できる。ＡＤのこれら特徴的症状の検出方法は、より具体的には後述する実施例に従って実施できる。検出方法はこれら方法に限定されず、Ａβ沈着、繊維性斑形成またはニューロン脱落を検出できる方法であればいずれを用いることも可能である。
【００２８】
上記スクリーニング方法により得られたＡＤの予防剤、改善剤または治療剤、あるいはＡβ沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤またはニューロン脱落阻害剤は、ＡＤの発症機序の解明、並びにＡＤの予防、改善または治療に有用である。これら薬剤は、単独で使用することもできるし、複数を組合せて使用することも可能である。このような薬剤を用いて、ＡＤの予防方法、改善方法または治療方法、あるいはＡβ沈着阻害方法、繊維性斑形成阻害方法またはニューロン脱落阻害方法を実施することができる。
【００２９】
上記スクリーニング方法により得られた物質として具体的には、Ｍ−ＣＳＦを例示できる。Ｍ−ＣＳＦをｏｐ／ｏｐマウスに投与して３〜５日後に観察したところ、Ｍ−ＣＳＦを投与しなかったｏｐ／ｏｐマウスと比較して、老人斑が約２０％減少した。投与は、３０日齢のｏｐ／ｏｐマウスに、５μｇのＭ−ＣＳＦを脳に直接的に単回注射することにより行った。Ｍ−ＣＳＦの投与によるこの効果は、Ｍ−ＣＳＦによりミクログリアの分化・増殖が促進された結果であると考える。すなわち、ｏｐ／ｏｐマウスにおいてミクログリアの機能が回復したことにより、Ａβが除去され、その結果、不溶性Ａβ凝集体の形成が抑制されてＡβの沈着が減少したと考える。
【００３０】
Ｍ−ＣＳＦと同様に、ミクログリアの分化・増殖を促進する作用を有すると考えられるＧ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦも、ｏｐ／ｏｐマウスにおいて老人斑の減少に効果を示すと考える。
【００３１】
本発明においては、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦから選択される１つ以上の物質を含むＡＤの予防剤、改善剤または治療剤を提供可能である。また、該物質を含むＡβ沈着阻害剤、繊維性斑形成阻害剤またはニューロン脱落阻害剤も提供可能である。これら薬剤を用いて、ＡＤの予防方法、改善方法または治療方法、あるいはＡβ沈着阻害方法、繊維性斑形成阻害方法またはニューロン脱落阻害方法の実施が可能である。
【００３２】
本発明に係る薬剤は、通常は、１種または２種以上の医薬上許容される担体（医薬用担体）を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
【００３３】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００３４】
医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。
【００３５】
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、所望の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
【００３６】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤等を適宜使用して調製することもできる。
【００３７】
安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは表面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。
【００３８】
表面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性表面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
【００３９】
緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。
【００４０】
等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
【００４１】
キレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
【００４２】
本発明に係る薬剤および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【００４３】
本発明に係る薬剤または医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験によりこれら用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００４４】
本発明に係る薬剤または医薬組成物を投与するときには、該薬剤または該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいはＡＤの予防、改善または治療に必要な他の物質または医薬と併用してもよい。例えば、本発明に係る薬剤または医薬組成物をＡＤの予防方法、改善方法または治療方法に用いるときに、該薬剤または該医薬組成物とは別のＡＤの予防剤、改善剤または治療剤を併用することが可能である。
【００４５】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。また、脳に注射等により直接投与することもできる。
【００４６】
投与形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４８】
＜材料および方法＞
Ｂ６Ｃ３Ｆｅ−ａ／ａ−ｏｐ／＋マウスのメスおよびオスをジャクソンラボラトリー（米国メイン州バーハーバー）より購入して育種用のつがいとし、＋／＋、＋／＋ｏｐ、またはｏｐ／ｏｐの各遺伝子型を有するマウスを産出した。ｏｐ／ｏｐマウスは、出生後約１０日目に切歯萌出が無いことを指標にして判定し、顆粒状飼料（ＣＥ−２、クレア  ジャパン社）を与えた。対照として用いる正常マウスには固形飼料を与えた。正常マウスおよびｏｐ／ｏｐマウスは、いずれも３０日齢（各群５匹）で実験に用いた。全ての動物は、広島大学倫理委員会により定義された通りの倫理的規定の下で処置した。
【００４９】
免疫組織化学的染色用の脳は、正常マウスおよびｏｐ／ｏｐマウスから、深い麻酔をかけて摘出した。脳は４％  パラホルムアルデヒドで固定し、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水ですすいだ。検体は、次いでパラフィンに包埋し、１０μｍ厚の前頭断切片に切り分けた。切片は、ベクタステインエリートＡＢＣキット（ベクターラボラトリーズ社）を使用し、Ａβ１−４２に対する１次抗体〔ウサギ抗Ａβ１−４２（ケミコンインターナショナル社）〕を用いて４℃で１２時間かけて免疫組織化学的に染色した。さらに、Ａβの沈着を確認するため、連続的な切片をコンゴーレッド染色により分析した。コンゴーレッドはシグマ社より購入した。大脳皮質、海馬、扁桃体および視床下部中の繊維性斑の平均数は、パキシノスおよびワトソンのアトラスを使用してブレグマ  −３．１４ｍｍ周辺の３つの切片から、算出した。
【００５０】
海馬ニューロンの消失もまた、正常マウスおよびｏｐ／ｏｐマウスで検討した。上記実験に用いた同じ検体にニッスル染色を施した。試料は、ラット脳アトラスを使用してブレグマ  −２．３ｍｍから−３．８ｍｍまでの海馬２００μｍごとに選択した。ＣＡ１（Ｎ１）およびＣＡ３（Ｎ３）の左側海馬中の全錐体細胞を、各切片について、×２０倍の対物顕微鏡を使用して先に報告された方法により計数した（非特許文献１１）。正常マウスとｏｐ／ｏｐマウス間の錐体細胞数の差異を解析するために、スチューデントｔ−テストを行い、有意水準をｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５に設定した。
【００５１】
＜結果＞
Ａβ沈着を伴う繊維性斑は正常マウスでは全く検出されなかった。しかしながら、多くのＡβ陽性斑がｏｐ／ｏｐマウスで観察された。さらに、これらＡβ陽性斑がコンゴーレッドに対しても陽性であることが明らかになった。
【００５２】
繊維性斑の組織特異的スコアを、５匹の正常マウスおよびｏｐ／ｏｐマウスのそれぞれについて、表１に示した。繊維性斑は、大脳皮質で最も頻度高く観察され、ｏｐ／ｏｐマウスにおいては１００から２００を超える繊維性斑が認められた。扁桃体および視床下部では、およそ２０から６０の繊維性斑が検出された。海馬領域においては、ほんの少数の繊維性斑が検出されたのみであった。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
ＣＡ１およびＣＡ３領域における錐体細胞密度をそれぞれ、表２に示した。ＣＡ１およびＣＡ３領域における海馬ニューロンの消失が、ｏｐ／ｏｐマウスにおいて正常マウスと比較して明瞭に認められた。ＣＡ１領域において、ｏｐ／ｏｐマウスの錐体細胞密度は、正常マウスの約８４％であった。ＣＡ３領域においては、錐体細胞のほぼ３０％が正常細胞に比べて減少していた。このように、ｏｐ／ｏｐマウスと正常マウスの２つの群間で、これら領域における錐体細胞密度に有意差が認められた。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
上記結果から、ｏｐ／ｏｐマウスにおいては３０日齢で既に、Ａβの沈着、繊維性斑の出現およびニューロン脱落が認められることが判明した。
【実施例２】
【００５７】
３０日齢のｏｐ／ｏｐマウスを、一群５匹とし、Ｍ−ＣＳＦを投与した。投与群は、Ｍ−ＣＳＦ５μｇ／マウスを脳内に注射により単回投与した。対照として、Ｍ−ＣＳＦ非投与群を用いた。Ｍ−ＣＳＦは、０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩水に溶解して５℃で保存し、用時、適宜、生理食塩水で希釈して用いた。
【００５８】
Ｍ−ＣＳＦ投与３〜５日後に、各群のマウスから脳を採取して前頭断切片を作製し、免疫化学的染色を行い、大脳皮質、海馬、扁桃体および視床下部中の老人斑の形成を観察した。脳の採取、切片の作製、免疫化学的染色は、いずれも実施例１に記載の方法に準じて行った。
【００５９】
Ｍ−ＣＳＦを脳内に直接投与したｏｐ／ｏｐマウスでは、Ｍ−ＣＳＦ非投与群と比較して、老人斑が約２０％減少した（表３）。
【００６０】
【表３】
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【実施例３】
【００６１】
（サイトカインの注入）
最初に３０日齢のマウスを３つの群に分けた。第１群は正常マウスのコントロールとした（ｎ＝５）。第２群はｏｐ／ｏｐマウスのＭ−ＣＳＦ非投与群とした（ｎ＝５）。第３群はｏｐ／ｏｐマウスのＭ−ＣＳＦ投与群とした（ｎ＝５）。５μｇのＭ−ＣＳＦを３０日齢のｏｐ／ｏｐマウスの脳に注入し、そのマウスを投与して３または７日後に屠殺した。Ｍ−ＣＳＦを注入した領域は、ペキシノスとワトソンのアトラスを用いたブレグマ−  ３．１４ｍｍであった。
【００６２】
（免疫組織化学的染色）
免疫組織化学的染色のために、ペントバルビタールナトリウムの腹膜内投与（０．５ｍｇ／ｇ体重）で麻酔をかけた後に全てのマウスを屠殺し、３つの群から脳を摘出した。４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすいだ。検体は、次いでパラフィンに包埋し、１０μｍ厚の前頭断切片に切り分けた。この切片を、ＰＢＳで１：１０００に希釈したＦ４/８０抗血清（セクロテック社、オックスフォード、イギリス）と共に1時間インキュベートした。
【００６３】
単球および成熟クロファージに特異的なマウスマクロファージ抗原から精製されたＦ４/８０糖蛋白質に対して、ウサギポリクローナル抗血清を作製した。ＰＢＳ-トライトン中で洗浄した後、ＰＢＳで１：２００に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ血清（ベクターラボラトリーズ、ピーターバラ、イギリス）を４５分間作用させた。その切片を洗浄し、アルコール性の０．３％過酸化水素中で２０分間インキュベートして内在性のペルオキシダーゼ活性を消去し、再び洗浄した。最終的に、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体（ビクタステインエライトＡＢＣ、ベクター）と４５分間インキュベートした。Ｆ４/８０抗血清が同じ希釈率の正常ウサギ血清に置き換えられた対照切片を、興味の対象である切片と平行してルーチンに進行させた。
【００６４】
０．０５％の塩酸ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、０．０８％イミダゾールと０．０５％過酸化水素を用いてペルオキシダーゼを可視化した。形態学的研究における対比を増加させるために、０．０１％の四酸化オスミウムを用いてＤＡＢ反応産物を増大させた。このようにして染色された細胞をＦ４/８０＋と称する。メチルグリーンで細胞核を対比染色した。隣接する切片をクレシルバイオレットアセテートで染色し、試験した構造の境界を同定した。
【００６５】
切片をＡβ１−４２に対する１次抗体によって４℃で１２時間、ビクタステインエライトＡＢＣキットを用いて免疫組織化学的に染色した。加えてＡβ沈着を確認するために、一連の切片をコンゴーレッド染色によって解析した。
【００６６】
ペキシノスとワトソンのアトラスを用いたブレグマ  −３．１４ｍｍ付近の３つの切片から、大脳皮質、海馬、小脳扁桃および視床下部における繊維性斑とマイクログリアの平均数を計測した。
【００６７】
正常マウス、非投与ｏｐ／ｏｐマウス、および投与を行ったｏｐ／ｏｐマウスの間における錐体細胞の数の差を検討するために、スタットビュー（登録商標：アバカスコンセプツ）を用いて、偏差（ＡＮＯＶＡ）とフィッシャーの解析を行った。
【００６８】
（大脳皮質におけるマイクログリア細胞）
図１において、生理食塩水を投与した+/?マウス（Ａ，Ｂ）、生理食塩水を投与したｏｐ／ｏｐマウス（Ｃ，Ｄ）、Ｍ−ＣＳＦを投与したｏｐ／ｏｐマウス（Ｅ，Ｆ）の前頭部分につき、マイクログリア細胞の免疫組織化学的染色を行った。なおｏｐ／ｏｐマウスは劣勢遺伝なので+/?マウスは正常な表現型を示す。矢印はＦ４/８０＋陽性細胞を示す。図１を定量化した結果を表４に示す。対照と比較してｏｐ／ｏｐマウスにおけるマイクログリア細胞の数は、前頭皮質および頭頂皮質のみならず、脳梁においても低下した（図１ＡとＣ、表４）。Ｍ−ＣＳＦを投与したｏｐ／ｏｐマウスのマイクログリア細胞は、対照の６０から７０％に低下した（図１ＡとＥ、表４）。これらの全ての場所におけるマイクログリアの大きさは部分的にＭ−ＣＳＦに依存するか、あるいはマイクログリア細胞のマイナーな小集団は完全にＭ−ＣＳＦに依存し、ｏｐ／ｏｐマウスの脳内には存在していなかった（図１）。
【００６９】
【表４】
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ｏｐ／ｏｐマウスの大脳皮質内において多くの繊維性斑が検出された。しかし+/?マウスにおいてＡβ沈着は決して観察されなかった。更にＭ−ＣＳＦを投与したｏｐ／ｏｐマウスにおいて、Ｆ４/８０＋の斑が有意に増加した（平均±Ｓ.Ｄ）。＊：投与しない側に対するＰ＜０．０５
【００７０】
（大脳皮質におけるＡβ蛋白質）
図２において、生理食塩水を投与した+/?マウス（Ａ，Ｂ）、生理食塩水を投与したｏｐ／ｏｐマウス（Ｃ，Ｄ）、Ｍ−ＣＳＦを投与したｏｐ／ｏｐマウス（Ｅ，Ｆ）の前頭部分につき、Ａβの免疫組織化学的染色を行った。矢印はＡβ陽性細胞を示す。図２を定量化した結果を表５に示す。正常マウスにおいてはＡβが沈着した繊維性斑は絶対に検出されなかった（図２ＡとＢ、表５）。しかし、多くのＡβ陽性斑がｏｐ／ｏｐマウスの脳において観察された（図２ＣとＤ）。これらの斑もコンゴーレッド陽性であることが確認された（図２Ｄ）。一方、Ｍ−ＣＳＦを投与したｏｐ／ｏｐマウスの脳において検出されたＡβ沈着は少なかった。（図２ＣとＥ、表５）
【００７１】
【表５】
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ｏｐ／ｏｐマウスの大脳皮質内において多くの繊維性斑が検出された。しかし+/?マウスにおいてＡβ沈着は決して観察されなかった。更にＭ−ＣＳＦを投与したｏｐ／ｏｐマウスにおいて、Ａβ陽性の斑が有意に増加した（平均±Ｓ.Ｄ）。＊：投与しない側に対するＰ＜０．０５
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、Ａβ沈着、繊維性斑形成またはニューロン脱落防止の阻害剤あるいは阻害方法の開発、並びにＡＤの防止剤、改善剤または治療剤、あるいは防止方法、改善方法または治療方法の開発等のために利用可能である。また、ＡＤの発症機序の解明等に関する研究にも利用可能である。このように本発明は、医薬分野において非常に有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、生理食塩水を投与した+/?マウス、生理食塩水を投与したｏｐ／ｏｐマウス、Ｍ−ＣＳＦを投与したｏｐ／ｏｐマウスの前頭部分につき、マイクログリア細胞の免疫組織化学的染色を行った写真である。
【図２】図２は、生理食塩水を投与した+/?マウス、生理食塩水を投与したｏｐ／ｏｐマウス、Ｍ−ＣＳＦを投与したｏｐ／ｏｐマウスの前頭部分につき、Ａβの免疫組織化学的染色を行った写真である。
【図１】
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【図２】
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