(57)【要約】【課題】  抗原に対して高い特異性を有する抗体を取得する方法を提供すること。【解決手段】  抗体の作製が望まれる抗原を細胞の表面に局在化させ、この細胞を動物に投与することによって抗原による感作を実施し、抗体の産生を誘導する。抗原が細胞上で効率よく免疫系の細胞に提示されることから、従来の方法に比較して高い効率で抗体が誘導される。また、同種の細胞の表面上に抗原を提示させることにより、目的の抗原に対する抗体を特異的に誘導することが可能である。その表面上に抗原を提示させた細胞はワクチン組成物として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を動物に投与する工程を包含する抗体の製造方法であって、当該細胞が細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域に結合された抗原を有しており、抗原を細胞表面に提示しうるものであることを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項２】
細胞膜表面に局在するポリペプチドがムチンボックスを含有するポリペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗原がペプチドもしくはポリペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗原が細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域と抗原との融合ポリペプチドとして細胞表面に提示されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域と抗原との融合ポリペプチドをコードする遺伝子が細胞に導入されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
細胞が当該細胞を投与される動物と同種の動物由来の細胞である請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域に結合された抗原を有し、抗原をその表面に提示しうる細胞を有効成分として含有するワクチン組成物。
【請求項８】
細胞膜表面に局在するポリペプチドがムチンボックスを含有するポリペプチドである請求項７記載のワクチン組成物。
【請求項９】
抗原がペプチドもしくはポリペプチドである請求項７記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
抗原が細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域と抗原との融合ポリペプチドとして細胞表面に提示されていることを特徴とする請求項９記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域と抗原との融合ポリペプチドをコードする遺伝子が細胞に導入されていることを特徴とする請求項１０記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学、薬学分野で有用な、抗原に対する抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は極めて高い特異性と安定性をもって抗原と結合することができる。この性質を利用し、抗体は種々の物質の検出、定量システムにおいて広く利用されている。また、抗体を使用して物質を精製する技術も広く利用されている。
【０００３】
抗体（ポリクローナル抗体）の作製は、通常、抗原を動物に接種することにより開始される（この操作は感作と呼ばれている）。生体にとって異種の物質である抗原を接種された動物の体内では、抗体上の抗原決定基によって特異的に刺激されるリンパ球が抗原の刺激に反応して増殖分化を起こし、前期の抗原決定基に結合しうる抗体を産生する。
【０００４】
抗原による抗体産生の誘導の程度はその抗原の物理化学的性質に依存する。例えば、ペプチドやタンパクは分子量５０００以上であれば抗体産生を誘導するとされているが、多糖類の場合にはさらに大きな分子量が必要であると言われている。また、感作に使用された動物においてどの程度異物と認識されやすいかという点も重要である。しかしながら、この性質は抗原の物理学的性質から単純に予測できるものではなく、類似の物質であっても抗体産生の誘導活性はまったく異なる例は珍しくない。
タンパク質はほとんどの場合、ただそれだけを投与したのでは、免疫原性が弱いかほとんど無い。タンパク質などの抗原に対する強い適応免疫反応を引き起こし、抗体産生の効率を上げることは抗体作製の最大の課題である。この手段の一つとして、免疫反応を非特異的に誘導する物質であるアジュバントが知られている。代表的なものとして完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等が知られており、市販品として入手することもできる。ただし、その有効性は抗原の種類によって異なっている。また、完全フロイントアジュバントに含まれるような細菌成分によるアジュバント効果は抗原誘導に重要であることが知られているが、局所の炎症反応を引き起こすため、ヒトに対して投与するワクチンに使用することが出来ない。
【０００５】
抗体の作製において留意すべきもう１つの事項が抗原の純度である。抗原として使用された物質が不純物を含んでいる場合、感作された動物の体内ではその不純物に対する抗体の産生も同時に誘導される。不純物の抗原性が著しく高い場合には、得られたポリクローナル抗体中の目的の抗原を認識する抗体の割合が低くなる。精製が困難な生体物質について抗体を作製する場合には、まず抗原物質の精製手段を至適化しなければならない。
タンパク質の精製に比較して、当該タンパク質をコードする遺伝子の純化のほうが容易である場合も少なくない。これは遺伝子については１種の遺伝子のクローニング手法が確立しているからである。このことから、純化された遺伝子を動物に導入し、動物の体内でこの遺伝子にコードされるタンパク質を発現させて抗体産生を誘導する方法が開発されている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。また、ＩＩ型膜タンパク質由来の膜貫通ドメインと抗原との融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを動物に投与する工程を包含する抗体の作製方法が開発されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、生体への遺伝子を直接投与する手法は一般的に細胞内に遺伝子が送達される効率は低い。細胞内への遺伝子導入効率を向上させるために、前記特許文献２記載の方法では、遺伝子銃が使用されているが、生体に対して使用することは煩雑である。また、生体に投与された遺伝子が実際に細胞内で発現された場合であっても、抗体の誘導に十分なタンパク質が発現されないことも多い。
【０００６】
以上のように、抗体の作製、製造、あるいはワクチン開発においては今なお解決すべき課題が残されている。
【０００７】
細胞表面にタンパク質を局在させる方法について、ＩＩ型膜タンパク質由来の膜貫通ドメイン以外にもいくつかの方法が開発されている；チロシンキナーゼ・レセプターのシグナルペプチドを利用する方法（例えば、非特許文献２参照）、ＧＰＩアンカーシグナル配列を使用する方法（例えば、非特許文献３参照）、セリン、スレオニンに富んだムチンボックスを使用する方法（例えば、非特許文献４参照）。
しかしながら、上記の膜貫通ドメイン以外のものは抗体の製造において利用可能なものであるかどうかは知られていない。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６２１４８０４号
【特許文献２】国際公開第０２／００８４１６号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５９巻、第１７４５〜１７４８頁（１９９３）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、第１３７３〜１３７７頁（１９９７）
【非特許文献３】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４５８巻、第２９９〜３０３頁（１９９９）
【非特許文献４】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２７８巻、第１０５２３〜１０５３０頁（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、抗体の作製が望まれる抗原を細胞の表面に局在化させ、この細胞を動物に投与することによって抗原による感作を実施し、抗体の産生を誘導することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、本発明の第１の発明は、細胞を動物に投与する工程を包含する抗体の製造方法であって、当該細胞が細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域に結合された抗原を有しており、抗原を細胞表面に提示しうるものであることを特徴とする。
【００１１】
第１の発明の方法に使用される、細胞膜表面に局在するポリペプチドとしてはムチンボックスを含有するポリペプチドが例示される。
【００１２】
第１の発明の方法には、抗原としてペプチドもしくはポリペプチドを使用することができ、この場合には抗原を細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域と抗原との融合ポリペプチドとして細胞表面に提示させることができる。前記融合ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードする遺伝子として細胞に導入されてもよい。
【００１３】
第１の発明の方法に使用される細胞は、当該細胞を投与される動物と同種の動物由来の細胞が公的である。
【００１４】
本発明の第２の発明は、細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域に結合された抗原を有し、抗原をその表面に提示しうる細胞を有効成分として含有するワクチン組成物に関する。
【００１５】
第２の発明の組成物に使用される、細胞膜表面に局在するポリペプチドとしてはムチンボックスを含有するポリペプチドが例示される。
【００１６】
第２の発明の組成物においては、抗原としてペプチドもしくはポリペプチドを提示する細胞を使用することができる。前記細胞は、細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域と抗原との融合ポリペプチドとして抗原を細胞表面に提示するものであってもよく、さらに、前記融合ポリペプチドをコードする遺伝子が導入された細胞であってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法によれば、抗原が標的細胞上で効率よく免疫系の細胞に提示されることから、通常の方法に比較して高い効率で抗体が誘導される。また、同種の細胞の表面上に抗原を提示させることにより、提示される抗原のみを異物として免疫細胞に認識させ、目的の抗原に対する抗体を特異的に誘導することが可能である。さらに、抗原の発現量が少ない場合でも、目的の抗原に対する免疫応答を特異的に誘導することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域に結合された抗原を細胞に導入し、該細胞を生体に投与して抗体の産生を始めとする免疫応答を誘導することを特徴とする。
【００１９】
本発明に使用される、細胞膜表面に局在するポリペプチドには特に限定はない。例えば、セリン、スレオニン、プロリンに富むムチンボックスと呼ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド［セラミダーゼ；スクラーゼイソマルターゼ〔Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２７５巻、第６５６６〜６５７２頁（２０００）〕；ジペプチヂルペプチダーゼＩＶ〔Ｅｘｐｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、第２５８巻、第１８４〜１９４頁（２０００）〕；ニューロトロフィンレセプター〔Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２７３巻、第３０２６３〜３０２７０頁（１９９８）〕；ラット膵臓胆汁塩依存性リパーゼ〔Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２７２巻、第２７３５３〜２７３６１頁（１９９７）〕；ヒトＭＵＣ２〔Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２６９巻、第２４４０〜２４４６頁（１９９４）〕等］、膜貫通ドメインを有するポリペプチド［サイトカインレセプター類（ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター等）、各種ホルモンレセプター類］、ＧＰＩアンカーポリペプチド［アルカリホスファターゼ、トリパノソーマ原虫のＶＳＧ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２１６巻、第６９６頁（１９８２）〕、赤血球膜のＣＤ５５あるいはＣＤ５９〔Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１０４巻、第６３３頁（１９８８）〕、Ｔｈｙ−１〔Ｎａｔｕｒｅ、第３３３巻、第２６９〜２７２頁（１９８８）〕等］などが例示される。本発明においては、特に限定するものではないが、これらのポリペプチドのうちの細胞膜への局在化に関与する領域（ムチンボックス、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、ＧＰＩアンカーシグナル）を使用することが可能である。
以下、当該領域を「膜局在化領域」と記載することがある。さらに、細胞膜に局在化させる能力を失わない範囲で、これらのポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列に１以上アミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加のいずれか１以上が導入されたポリペプチドも本発明に使用することができる。
【００２０】
例えば、前記のムチンボックスを含有するポリペプチドよりムチンボックスを含む領域を取り出し、本発明に使用することができる。
【００２１】
配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配列は、ラット腎臓由来セラミダーゼ［Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２７６巻、第２６２４９〜２６２５９頁（２００１）］のＮ末端部分より見出されたムチンボックスである。
【００２２】
前記ムチンボックスには、配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号：１０、１４、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２６、２７、２９に示される「Ｏ−結合型糖鎖が付加されうる部位」が存在する。また、上記部位のアミノ酸残基は、Ｏ−結合型糖鎖が付加できるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、スレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）が好適である。本発明に膜局在化領域として使用できるムチンボックスとしては、配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも６０％、さらに好ましくは、少なくとも７０％の配列同一性を有するものが挙げられる。
【００２３】
配列表の配列番号：１に示されるムチンボックスは３６アミノ酸残基からなるポリペプチドであり、異種タンパクを細胞膜表面に局在化させるために非常に有用である。当該ムチンボックスは、例えばシグナルペプチドと連結して本発明に使用することができる。
【００２４】
本発明に抗原として使用される物質には特に限定はないが、前記の膜局在化領域との融合ポリペプチドとすることが可能である点からはペプチドもしくはポリペプチドが好適である。なお、ペプチドもしくはポリペプチド以外の物質であっても、公知の方法により細胞膜表面に局在するポリペプチドに結合させることが可能なものであれば本発明に使用することができる。
【００２５】
細胞膜表面に局在するポリペプチドの膜の局在化に寄与する領域と結合された抗原は、適切な方法により標的細胞に導入される。本発明を特に限定するものではないが、前記細胞は抗体の産生を誘導する動物と同一種由来の細胞であることが望ましい。導入方法としては、例えばリポソーム法や穿孔法など、公知の方法を使用することができる。
【００２６】
本発明のひとつの態様において、膜局在化領域と抗原ペプチドもしくはポリペプチドとの融合ポリペプチドをコードする遺伝子を構築し、これを標的細胞に導入して前記融合ポリペプチドを発現させることにより、標的細胞の表面に抗原を局在化させることができる。前記の融合ポリペプチドにおける膜局在化領域と抗原の位置関係には特に限定はなく、使用する膜局在化領域や抗原の種類等に応じて、適当な順序で融合したポリペプチドとすればよい。例えば、上記のムチンボックスは、通常、抗原ペプチドもしくはポリペプチドのＮ末端側に付加されるが、ＧＰＩアンカーシグナルの場合はＣ末端側に付加される。
さらに、前記融合ポリペプチドは、その機能、すなわち細胞表面への局在化と抗原性が損なわれない範囲で、これらの要素以外のペプチド、例えば分泌シグナル等を有していてもよい。また、膜局在化領域と抗原の間にリンカーポリペプチドが挿入された融合ポリペプチドも本願発明に使用することができる。
【００２７】
前記融合ポリペプチドをコードする遺伝子の導入方法には特に限定はないが、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、リポソーム法のような非ウイルスベクターを使用する方法、ならびにレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターを用いる方法が使用できる。標的細胞において継続的に前記融合ポリペプチドを発現させることが望まれる場合には、レトロウイルスベクターの使用が好適である。
【００２８】
上記の標的細胞として使用される細胞は前期の機能性物質をその表面に発現する能力を有するものであれば特に限定はない。前記の機能性物質が細胞表面に発現されているかどうかは、例えば膜局在化領域に対する抗体を使用して確認することができる。また、マクロファージや樹状細胞等の抗限提示細胞を本発明に使用することもできる。
なお、感作される動物にとって異種の細胞を本発明の方法に使用した場合には、細胞自体やその成分を抗原として認識し、これらに対応する抗体の産生が誘導される可能性があることから、通常、前記動物と同種の動物に由来する細胞が使用される。さらに好ましくは同系の動物由来の細胞が使用されるが、例えば、感作される動物自身より採取された細胞を使用してもよい。
【００２９】
さらに、目的の抗原を提示する標的細胞は、好ましくはタンパク質や血清を含有しない培地で培養された後に動物に投与される。この場合には、培地中に含有されるタンパク質に対する抗体の産生が起こらず、目的の抗原に高い特異性を有する抗体を得ることができる。無タンパク質培地では生育困難な細胞であっても、適切な操作により無タンパク質培地に馴化させたものは本発明の方法への使用に好適である。なお、投与する動物と同種の動物由来のタンパク質や血清を含む培地を使用することにより、無タンパク質培地と同等の効果を得ることができる。
【００３０】
本発明の方法により、標的細胞上に抗原が提示される。この細胞を投与されることによって感作された動物（例えば非ヒト動物）においては、免疫系の細胞が標的細胞表面の抗原を認識し、この抗原に結合可能な抗体の産生を始めとする体液性免疫や細胞障害性Ｔ細胞の産生を始めとする細胞性免疫が誘導される。この場合、投与された細胞において提示されている抗原の量が微量であった場合にも、本発明の方法では十分な免疫の誘導が起こる。本発明の方法では抗原を提示する細胞が投与された生体内で生存しうるため、高い誘導効果が期待される。
【００３１】
上記の、抗原を表面に提示する細胞を動物に投与する経路には特に限定はなく、抗体産生などの免疫応答の誘導に適した部位、例えば皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内等に投与すればよい。前記細胞の投与にあたっては、必要に応じて公知のアジュバント（例えば完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等）を併用してもよいが、これらの添加は本発明には必須ではない。
【００３２】
本発明の方法により動物において誘導された抗体は、常法により当該動物より採取された血液より抗血清として調製することができる。必要に応じて、適切な精製操作により抗体分子の精製を行ってもよい。さらに、前記動物より得られる抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、次いで目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、モノクローナル抗体を作製することも可能である。
【００３３】
本発明の１つの態様として、細胞表面に抗原を提示する細胞を含有するワクチン組成物が挙げられる。
本発明によって得られる細胞表面に抗原を提示する細胞は、生体内において効率よく抗原に対する免疫応答を誘導することができることから、ワクチン組成物として使用することができる。特に、接種される動物由来の細胞の表面に抗原を提示する前記ワクチン組成物は、抗原部分のみが当該動物に対して異物であるために安全性が高く、疾患の予防、治療に有用である。ヒト由来の細胞の表面に所望の抗原を提示させた場合には、当該細胞を医薬としてヒトの疾患の予防、治療に使用することもできる。
【００３４】
前記ワクチン組成物は、細胞が提示している抗原の抗原性が失われない範囲で任意の剤形とすることができる。例えば、細胞の保存に適した培地や生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水に前記細胞を懸濁したワクチン組成物が例示される。さらに該組成物には安定化の目的でアルブミン等を添加してもよく、また、適当なアジュバントを添加してもよい。本発明の性格上、添加物は投与されるヒト、動物に対して抗原性を有さないものであることが好ましい。なお、本発明のワクチンは、アジュバントを用いない場合であっても抗原に対する特異的な免疫応答を効率よく引き起こすことができると言う点で、予防、治療薬として有利である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により、本発明を具体的に示すが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１  細胞膜表面局在ＧＦＰ発現ベクターの構築
（１）細胞膜表面局在発現ベクターｐＣＡ−ＳＭの構築
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）に含まれるベクターであるアンフォトロピックエンベロープ発現ベクター、ｐＥ−ａｍｐｈｏを制限酵素ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、アンフォトロピックエンベロープ遺伝子を除いたベクター断片を調製した。
一方、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２７６巻、第２６２４９〜２６２５９頁（２００１）に記載のラット中性セラミダーゼ発現ベクター、ｐｃＤＮＡｋＣＤを鋳型とし、配列表の配列番号２に塩基配列を示す、制限酵素ＫｐｎＩ認識部位を有する５’側プライマーと、配列表の配列番号３に塩基配列を示す、ＥｃｏＲＩ認識部位を有する３’側プライマーを用いたＰＣＲにより、ｆｌａｇ−ｔａｇが付加されたラット中性セラミダーゼ由来のシグナル配列−ムチンボックス部分をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、先のアンフォトロピックエンベロープ遺伝子を除いたｐＥ−ａｍｐｈｏベクター断片とライゲーションした。得られたプラスミドについて塩基配列を確認し、ｐＣＡ−ＳＭとした。
ｐＣＡ−ＳＭはサイトメガロウイルスプロモーターの下流にｆｌａｇ−ｔａｇが付加されたラット中性セラミダーゼ遺伝子由来のシグナル配列−ムチンボックスをコードする領域があり、その下流にはクローニングサイトとしてＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＡｐａＩの認識配列がある。目的遺伝子のフレームを合わせて挿入することによって、目的遺伝子の産物をｆｌａｇ−ｔａｇ−シグナル配列−ムチンボックスとの融合タンパクとして発現させることができる。
【００３７】
（２）細胞膜表面局在ＧＦＰ発現ベクターｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰの構築
プラスミドｐＱＢＩ２５（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）に挿入されているｒｅｄ  ｓｈｉｆｔｅｄ−ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ｒｓＧＦＰと称す）をコードする遺伝子領域を、配列表の配列番号４に塩基配列を示す、制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を有する５’側プライマー、配列表の配列番号５に塩基配列を示す、制限酵素ＸｂａＩ認識部位を有する３’側プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。
得られた増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで切断後、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで切断したｐＣＡ−ＳＭに挿入してプラスミドｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰを構築した。
このプラスミドは配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列のポリペプチドをコードしている。該配列中、２〜９番目のアミノ酸がｆｌａｇ−ｔａｇ、１０〜９２番目のアミノ酸がラット中性セラミダーゼ由来のシグナル配列−ムチンボックス領域（５１〜８６番目のアミノ酸が配列番号１のムチンボックス）、それ以降の配列がｒｓＧＦＰに相当する。
【００３８】
実施例２  マウス細胞への遺伝子の導入
（１）細胞の無タンパク質培地への馴化
マウス神経芽腫由来の株化細胞であるＮｅｕｒｏ−２ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）を、無タンパク質培地であるＵｌｔｒａＤＯＭＡ−ＰＦＴＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  社製）で継代培養し、無タンパク質培地への馴化を行った。この操作により、無タンパク質培地に馴化された細胞株を取得し、Ｎｅｕｒｏ２Ａとして以下の実験に用いた。このＮｅｕｒｏ２Ａはシャーレへの接着力が低下しており、分散用酵素（トリプシン等）を使用せずに剥離させることができた。
【００３９】
（２）ｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰ導入細胞の調製
以下の操作に従い、Ｎｅｕｒｏ２Ａにリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を使用して上記のｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰを導入した。
ＵｌｔｒａＤＯＭＡ−ＰＦ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）  ２０ｍｌを含む１０ｃｍシャーレ（初代培養用のシャーレＰＲＩＭＡＲＩＡ；Ｆａｌｃｏｎ社製）中、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で前日より培養しておいたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称す；Ｃａｍｂｒｅｘ社製）  １０ｍｌで２回洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）  １０ｍｌを加えた。一方、エッペンドルフチューブに１．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え、そこにリポフェクトアミン２０００試薬  ６０μｌを加えたものを用意した。更に、別のチューブに１．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地とｐＣＭ−ＳＭ−ＧＦＰ  ２４μｇを加えたものを準備し、それぞれ室温に５分間放置した。５分後、この２つを充分に混和してＤＮＡ−Ｌｉｐｉｄ混合液を調製し、室温に２０分放置した。この混合液の全量を上記のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に培地上から滴下した後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。２４時間後、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ−ＰＦ培地を１５ｍｌ添加し、さらに３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。
比較対照実験のため、上記のｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰを細胞内でｒｓＧＦＰを発現するｐＱＢＩ２５にかえて、上記と同条件で、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞に導入し、ｐＱＢＩ２５導入Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を調製した。
以上の遺伝子導入は、ｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰは６枚のシャーレの細胞に対して、ｐＱＢＩ２５は４枚のシャーレの細胞に対して実施した。
【００４０】
遺伝子導入３日後、蛍光顕微鏡下で観察したところ、いずれの細胞もｒｓＧＦＰ由来の蛍光を発しており、遺伝子の導入とタンパク質の発現を肉眼で確認できた。さらに、フローサイトメトリー法を使用して蛍光保持細胞群が未導入細胞群と比べて有意にシフトしたことを確認した。
【００４１】
実施例３  遺伝子導入細胞を用いたマウスの免疫
【００４２】
上記実施例２で調製した遺伝子導入細胞を使用し、下記の要領でマウスの免疫を行った。上記の細胞を使用する免疫の場合、１匹のマウスの１回投与量として、直径９ｃｍシャーレ１枚分の培養細胞（平均４〜６×１０６細胞）を使用することを目安にした。
【００４３】
免疫は下記の６群について、いずれもＢａｌｂｃ雌性マウス  ２匹の腹腔に投与して行った。
Ａ群：回収したｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰ導入細胞を滅菌ＰＢＳ  ０．９ｍｌに懸濁し、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｃｏｒｉｘａ社製）  ０．１ｍｌを添加して投与試料とした。
Ｂ群：回収したｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰ導入細胞を滅菌ＰＢＳ  １．０ｍｌに懸濁液して投与試料とした。
Ｃ群：回収したｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰ導入細胞細胞を１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を含むＰＢＳ（以下、ＮＰ４０／ＰＢＳと称す）  ０．１ｍｌで充分にほぐすように可溶化し、そのあとに０．９ｍｌの滅菌ＰＢＳを追加してよく混合し、投与試料とした。
Ｄ群：回収したｐＱＢＩ２５導入細胞を滅菌ＰＢＳ  ０．９ｍｌに懸濁し、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｃｏｒｉｘａ社製）  ０．１ｍｌを添加して投与試料とした。
Ｅ群：回収したｐＱＢＩ２５導入細胞をＮＰ４０／ＰＢＳ  ０．１ｍｌで充分にほぐすように可溶化し、そのあとに０．８ｍｌの滅菌ＰＢＳを追加してよく混合した。さらにＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｃｏｒｉｘａ社製）  ０．１ｍｌを添加して投与試料とした。
Ｆ群：精製ＧＦＰタンパク質（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）  １５μｇ（２０μｌ相当）を滅菌ＰＢＳ  ０．９８ｍｌで溶解して調製した１．０ｍｌのタンパク質溶液を投与試料とした。
【００４４】
上記の各投与試料０．５ｍｌを１４週齢のＢａｌｂｃ雌性マウス２匹の腹腔に投与し、免疫を実施した。免疫は２週間隔で３回実施し、３回免疫後、１週目に全採血を行い、血清を調製した。この血清を用いて最終的な抗体価測定を行った。
【００４５】
実施例４  抗体価の測定
以下に記載の操作により、抗対価の測定を行った。
（１）  精製ＧＦＰタンパク質を２μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、これをイムノアッセイ用のマイクロプレート（ナルジェヌンク社製）に５０μｌ／ウェルずつ入れた。プレートをラップに包み、４℃で一晩放置して精製ＧＦＰタンパク質を固定化した。
（２）  マイクロプレートからＧＦＰ溶液を除き、ブロックエース原液（大日本製薬社製）を２００μｌ／ウェルずつ入れて室温で１時間ブロッキングした後、ブロックエース原液を除去し、ＧＦＰ固定化マイクロプレートを作製した。
（３）  上記実施例３で調製したマウス血清  １０μｌを使用し、１０１〜１０７倍の系列希釈を行った。調製した希釈液をそれぞれ５０μｌ／ウェルずつＧＦＰ固定化マイクロプレートに加え、ラップに包んで室温で１時間反応させた。
（４）  反応終了後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識二次抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）をブロックエースで１０００倍希釈したものを５０μｌ／ウェルずつ加え、ラップに包んで室温で１時間反応させた。
（５）  反応終了後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、次いで自家調製した発色基質ＡＢＴＳを５０μｌ／ウェルずつ加えて発色反応させた。１０分間の反応後、５０μｌ／ウェルの１５０ｍＭ  シュウ酸溶液を添加して反応を停止させた。
（６）  反応停止より５分以内にマイクロプレートリーダー（波長４０５ｎｍ）で吸光度を測定し、同時に写真撮影した。
上記の測定の結果を表１に示す。なお、表中の数値は４０５ｎｍにおける吸光度である。
【００４６】
【表１】
2005168437.tif 000002
【００４７】
表１に示すように、細胞内でｒｓＧＦＰを発現するｐＱＢＩ２５が導入された細胞を使用したＤ、Ｅ群では抗体価の上昇が確認できなかった。一方、細胞表面にｒｓＧＦＰを提示する細胞を使用したＡ〜Ｃ群では充分な抗体価の上昇が確認できた。
詳細に見ると、アジュバントを添加したＡ群に比べて生細胞のみで免疫したＢ群のほうが良好な結果を得たことは、投与された細胞がアジュバントの毒性の影響を受けず、マウス腹腔内でしばらくの間生存できたことに起因するのではないかと考えられた。また、Ｃ群の抗体価がＢ群よりも低いことは、可溶化のために細胞膜表面への提示効果が損なわれたことが原因とも考えられる。
【００４８】
実施例５  ｒｓＧＦＰ遺伝子導入細胞中のｒｓＧＦＰタンパク質発現量の測定
上記実施例４において、Ｄ、Ｅ群の抗体価上昇が見られなかったため、遺伝子導入細胞可溶化物を使用してウエスタンブロット法による発現タンパク質量の確認を行った。
ｐＣＡ−ＳＭ−ＧＦＰ、ｐＱＢＩがそれぞれ導入されたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を６ｃｍ径シャーレで３日間培養した。さらに、回収した細胞に５００μｌのＮＰ４０／ＰＢＳ溶液を加えて可溶化し、その１５μｌ相当ずつを１０％アクリルアミドゲル電気泳動に供した。陽性コントロールとしては、上記実施例３の免疫に使用した精製ＧＦＰタンパク質溶液  ２μｌ（３μｇ相当）を使用した。前記の試料にはすべて還元・加熱処理を施した。泳動終了後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写した。
上記のＰＤＶＦ膜について、上記実施例３のＢ群より作製された抗血清（Ｎｏ．１）、Ｆ群より作製された抗血清（Ｎｏ．１）の２種をそれぞれブロックエースで５００倍希釈したもの、上記実施例４で使用された抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識二次抗体を使用し、ｒｓＧＦＰタンパク質の検出を行った。
【００４９】
ウエスタンブロット法での解析では、Ｂ群、Ｆ群由来のどちらの抗血清を使用した場合も遺伝子導入細胞由来の試料についてｒｓＧＦＰタンパク質を検出できなかった。これらの抗血清は精製ＧＦＰタンパク質を検出できていることから、遺伝子導入細胞でのｒｓＧＦＰタンパク質の発現量はごく微量であったものと考えられた。すなわち、微量ではあっても細胞膜表面に有効に抗原を提示したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞は、感作において極めて効率的に働いたと考えられる。
また、精製タンパク質での免疫により作製されたＦ群由来の抗血清を使用した場合、精製ＧＦＰタンパク質が泳動されたレーンにおいて複数（少なくとも５本）の、極めて明瞭なバンドが示された。これに対し、Ｂ群由来の抗血清ではＧＦＰの分子量に相当する１本のメインバンドのみが示された。さらに、遺伝子導入細胞由来の試料が泳動されたレーンにおいて、Ｆ群由来の抗血清ではＢ群由来の抗血清では確認できないマイナーバンドが検出された。
これらのことは、細胞表面に提示された抗原を使用して作製された抗血清の特異性は極めて厳格であり、不純物を含む抗原の中であっても目的の抗原のみを検出可能であることを示している。さらに、Ｆ群の抗血清について測定された抗体価は、実際には抗不純物抗体を含んだ力価であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の方法を使用することにより、目的の抗原を特異的に認識する抗体を効率よく作製することが可能となる。また本発明の方法によりその表面上に抗原を提示させた細胞はワクチン組成物として使用することができ、人を含む動物の疾患の治療剤、予防剤として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
SEQ ID NO. 2:  Designed oligonucleotide PCR to amplify a portion of neutral ceramidase gene from Rattus norvegicus with flag-tag.  "nucleotide 5 to 10 is KpnI restriction site."
SEQ ID NO. 3:  Designed oligonucleotide PCR to amplify a portion of neutral ceramidase gene from Rattus norvegicus with flag-tag.  "nucleotide 2 to 7 is EcoRI restriction site."
SEQ ID NO. 4:  Designed oligonucleotide PCR to amplify a portion of rsGFP gene.  "nucleotide 7 to 13 is EcoRI restriction site."
SEQ ID NO. 5:  Designed oligonucleotide PCR to amplify a portion of rsGFP gene.  "nucleotide 6 to 11 is XbaI restriction site."
SEQ ID NO. 6:  Artificial protein comprising flag-tag, signal sequence and mutin box from Rattus norvegicus, and rsGFP.
【配列表】
2005168437000001.app