(57)【要約】【課題】標的遺伝子の発現を抑制し得る新規なＲＮＡ分子発現システム、および該システムを用いたノックダウン細胞の作製方法の提供を課題とする。【解決手段】本発明者らは、ステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡから、ｔＲＮＡプロモーターを利用して該ＲＮＡ分子を産生させることにより、該ＲＮＡ分子を効率的に細胞質へ移行させ、ＲＮＡｉ効果を発揮させることが可能であることを見出した。また、ステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡへ細胞質移行シグナル配列を導入することによっても、ＲＮＡｉ効果を効率的に発揮させることが可能である。このステムループ形ＲＮＡ分子発現システムを用いることにより、簡便に所望の遺伝子がノックアウトした細胞を作製することが可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡと細胞質移行シグナル配列を有するＤＮＡであって、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
前記スペーサー領域中に細胞質移行シグナル配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
プロモーターが、ｔＲＮＡプロモーター、ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーター、ｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーター、またはテトラサイクリン誘導型プロモーターである、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
テトラサイクリン誘導型プロモーターがテトラサイクリン誘導型ｔＲＮＡプロモーターである請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
プロモーターが、ＮＭＴ１プロモーターまたはＧＡＬ１プロモーターである請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであって、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをｔＲＮＡプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡ。
【請求項７】
ｔＲＮＡプロモーターがｔＲＮＡＶａｌプロモーターである、請求項３、４または６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
センスコードＤＮＡの長さが１０〜３５ｂｐである、請求項１〜４、６または７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項９】
センスコードＤＮＡの長さが２６〜３０ｂｐである、請求項１〜４、６または７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
センスコードＤＮＡの長さが３１〜３５ｂｐである、請求項１〜４、６または７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
センスコードＤＮＡの長さが１０〜５０００ｂｐである、請求項５に記載のＤＮＡ
【請求項１２】
スペーサー領域の長さが１〜１００００ベースである請求項１〜１１のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
スペーサー領域の長さが１〜１００ベースである請求項１〜１１のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが１０〜３５ｂｐである、請求項１〜４、６〜１０、１２または１３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが２６〜３０ｂｐである、請求項１〜４、６〜１０、１２または１３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが３１〜３５ｂｐである、請求項１〜４、６〜１０、１２または１３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中にミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、請求項１〜１６のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
センス鎖に２０塩基対あたり１〜６塩基のＧ・Ｕペアを組むようなミスマッチを含むように構築されたものである、請求項１７に記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中に２０塩基対あたり１〜１０塩基のミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、請求項１〜１８のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
ミスマッチがセンス鎖に２０塩基対あたり１〜６塩基のＧ・Ｕペアを組むようなミスマッチである、請求項１９に記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中に３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、請求項５または１１に記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、請求項１〜２１のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物である、細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれかに記載のＤＮＡ、または請求項２４に記載のベクターを保持する細胞。
【請求項２６】
細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれかに記載のＤＮＡ、または請求項２４に記載のベクターを含む組成物。
【請求項２８】
標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載のＤＮＡ、または請求項２４に記載のベクターを細胞に導入する工程、および前記ＤＮＡもしくはベクターが導入された細胞を選択する工程、を含む生産方法。
【請求項２９】
細胞内でステムループ形ランダムＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであって、ランダムな配列からなるＲＮＡをコードするＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをｔＲＮＡプロモーターと機能的に接続させた構造を有するＤＮＡを含むベクター。
【請求項３０】
請求項１〜２２のいずれかに記載のＤＮＡ、または請求項２４もしくは２９に記載のベクターを保持した生物個体。
【請求項３１】
標的遺伝子ノックアウト非ヒト動物である、請求項３０に記載の生物個体。
【請求項３２】
生物がマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、およびチンパンジーからなる群より選択される、請求項３０または３１に記載の生物個体。
【請求項３３】
発現するステムループ形ランダムＲＮＡ分子のステム領域の長さが１０〜３５ｂｐである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３４】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、機能遺伝子探索方法。
（ａ）請求項２９または３３に記載のベクターを細胞へ導入する工程
（ｂ）前記ベクターが導入された細胞を選択する工程
（ｃ）選択された細胞の表現型を解析する工程
【請求項３５】
表現型解析により表現型が変化していた細胞中のベクター配列中のランダムな配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項３４に記載の機能遺伝子探索方法。
【請求項３６】
（ａ）細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであって、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡと、
（ｂ）Ｄｉｃｅｒタンパク質におけるＤｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド領域をコードするＤＮＡとプロモーターとを機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡ、とを含むｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項３７】
（ａ）に記載のプロモーターがｔＲＮＡ  プロモーターまたはＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターである、請求項３６に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項３８】
（ａ）に記載のプロモーターがＮＭＴ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターまたはＰｏｌ  ＩＩ系プロモーターである、請求項３６に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項３９】
発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中に、３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含む、請求項３８に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項４０】
（ｂ）に記載のプロモーターがＰｏｌＩＩ系プロモーターである、請求項３６に記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項４１】
細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、請求項３６〜４０のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項４２】
標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが、少なくとも３０塩基対以上である、請求項３６〜４１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項４３】
標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ中、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中のセンス鎖に、３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含む、請求項３６〜４１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム。
【請求項４４】
請求項３６の（ａ）および（ｂ）の両方のＤＮＡを含むｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項４５】
請求項３６〜４３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、または請求項４４に記載の発現ベクターを用いて、ステムループ形ＲＮＡ分子とＤｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドの両方を発現させることを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項４６】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
（ａ）標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子を、Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドで処理する工程、
（ｂ）上記工程（ａ）で生成したｄｓＲＮＡを、標的遺伝子を含む細胞へ導入する工程、
【請求項４７】
Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが、Ｄｉｃｅｒタンパク質の１０６６位〜１９２４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが、Ｄｉｃｅｒタンパク質の１２６８位〜１９２４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが、Ｄｉｃｅｒタンパク質の１２９６位〜１９２４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが全長Ｄｉｃｅｒタンパク質である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、請求項４５〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが大腸菌で発現させた請求項４７〜５０のいずれかに記載のポリペプチドである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが昆虫細胞で発現させた請求項４７〜５０のいずれかに記載のポリペプチドである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが、少なくとも３０塩基対以上である、請求項４５〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ中、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中のセンス鎖に、３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含む、請求項４５〜５３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的遺伝子の発現を抑制し得るＲＮＡ分子発現システムおよび、これを用いたノックダウン細胞の生産方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列からなるセンスＲＮＡとこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目を集めている。上記ＲＮＡｉは、当初、線虫において発見されたが（非特許文献１参照）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（非特許文献２〜５参照）。これら生物では、実際に外来よりｄｓＲＮＡを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。
【０００３】
インビトロにおいて、ｄｓＲＮＡは、ショウジョウバエの初期胚の溶解物または培養ショウジョウバエＳ２細胞の抽出物における切断に関してｍＲＮＡを標的とすることが知られている（非特許文献６〜８参照）。インビトロでのＲＮＡｉの反応はＡＴＰ（非特許文献７および８参照）を必要とする。
【０００４】
合成ＲＮＡ二本鎖による最近の研究により、それぞれのｓｉＲＮＡ二本鎖が標的ＲＮＡを切断することが証明された（非特許文献９参照）。ｓｉＲＮＡ二本鎖内の２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの突出３’末端が、効率的な標的切断にとって必要であることが明らかになった（非特許文献９参照）。そのような３’突出末端は、ＲＮアーゼＩＩＩ切断反応の産物に特徴的であり、培養ショウジョウバエＳ２細胞において、ｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡへの切断は、ダイサーとして知られる多数のドメインＲＮアーゼＩＩＩ酵素を必要とする（非特許文献１０参照）。その後、ｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエにおいて同定され、ＲＩＳＣと呼ばれる多成分ヌクレアーゼと会合し、ｍＲＮＡの配列特異的分解に関してこの酵素を誘導するものと考えられる（非特許文献７、１０および１１参照）。
【０００５】
ＲＮＡｉは標的遺伝子を不活化する方法を提供し、このように、Ｃ．  エレガンス（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエおよび植物における遺伝子機能を研究するための強力なツールを提供する。遺伝子発現の特異的阻害はまた、動物および植物におけるｄｓＲＮＡの安定な発現および誘導型発現によって得ることができる（非特許文献４、１２および１３参照）。マウス胚癌ＥＣ細胞および胚幹（ＥＳ）細胞では、ｄｓＲＮＡによる遺伝子の不活化は成功したが（非特許文献１４および１５参照）、培養哺乳類細胞における長いｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉの誘発は一般的にあまり成功していない。これらの失敗は、長いｄｓＲＮＡ（＞３０塩基対）（非特許文献１６参照）によって活性化されるインターフェロン（ＩＦＮ）防御経路の一部を形成する２つの潜在型酵素の作用によって、容易に説明される。その一つは、２’−５’−オリゴアデニレート（２−５Ａ）シンターゼであり、これはｄｓＲＮＡによって活性化されて、ＲＮアーゼＬと呼ばれる配列非特異的ＲＮアーゼの活性化にとって必要である２−５Ａの合成を増加させる（非特許文献１７参照）。もう一つは、蛋白質キナーゼＰＫＲであり、その活性型は翻訳因子真核細胞開始因子（ｅＩＦ２）をリン酸化して、蛋白質合成の全般的な阻害と細胞死に至る（非特許文献１８参照）。
【０００６】
最近、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖がいくつかの哺乳類細胞において内因性遺伝子の発現を特異的に抑制することが報告された（非特許文献１９参照）。この場合、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖は、ＩＦＮ防御システムから逃れることができる。この知見は、ＲＮＡｉまたはＲＮＡｉ関連システムが哺乳類に存在することを示唆した。実際に、ｒｄｅ−１、ｍｕｔ−７およびダイサーのようなＲＮＡｉ関連蛋白質の哺乳類相同体がいくつか同定されている（非特許文献１０、２０および２１参照）。しかし、哺乳類体細胞におけるＲＮＡｉの特徴およびメカニズムはあまり詳しくは分かっていない。
【０００７】
また、ＲＮＡｉを利用して遺伝子発現抑制による機能解析や遺伝子治療を行うことが期待されている。遺伝子の一次配列がほぼ明らかにされた現在、遺伝子の機能を迅速に解明するために、系統的かつ効率的な機能遺伝子探索方法の開発が進められている。ＲＮＡｉを利用して任意の遺伝子の発現を抑制し、その細胞あるいは個体の表現型の変化から系統的に機能遺伝子の探索を行うことができれば、新規な機能遺伝子の解明をより一層加速させることができる。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｆｉｒｅ，  Ａ．  ら著、「Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．  ３９１、ｐ．８０６−８１１、１９９８年
【０００９】
【非特許文献２】
Ｆｉｒｅ，  Ａ．著、「ＲＮＡ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．  １５、ｐ．３５８−３６３、１９９９年
【００１０】
【非特許文献３】
Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．  Ａ．著、「ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ２００１．」、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、Ｖｏｌ．１５、ｐ．４８５−４９０、２００１年
【００１１】
【非特許文献４】
Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｃａｕｄｙ，  Ａ．  Ａ．  および  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．  Ｊ．著、「Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ．」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．  ２、ｐ．１１０−１１９、  ２００１年
【００１２】
【非特許文献５】
Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．  Ｄ．著、「ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  ｌｉｓｔｅｎｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｏｕｎｄ  ｏｆ  ｓｉｌｅｎｃｅ．」、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．  ８、ｐ．７４６−７５０、２００１年
【００１３】
【非特許文献６】
Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．ら著、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．」、Ｖｏｌ．  １３、ｐ．３１９１−３１９７、１９９９年
【００１４】
【非特許文献７】
Ｈａｍｍｏｎｄ  Ｓ．  Ｍ．ら著、「Ｎａｔｕｒｅ」、Ｖｏｌ．  ４０４、ｐ．２９３−２９６、２０００年
【００１５】
【非特許文献８】
Ｚａｍｏｒｅ  Ｐ．ら著、「Ｃｅｌｌ」、Ｖｏｌ．  １０１、ｐ．２５−３３、  ２０００年
【００１６】
【非特許文献９】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．  Ｍ．ら著、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．」、Ｖｏｌ．  １５、ｐ．１８８−２００、２００１年
【００１７】
【非特許文献１０】
Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ．  ら著、「Ｎａｔｕｒｅ」、Ｖｏｌ．  ４０９、ｐ．３６３−３６６、２００１年
【００１８】
【非特許文献１１】
Ｈａｍｍｏｎｄ  Ｓ．  Ｍ．ら著、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｖｏｌ．  ２９３、ｐ．１１４６−１１５０、  ２００１年
【００１９】
【非特許文献１２】
Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  および  Ｃａｒｔｈｅｗ著、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、Ｖｏｌ．  １８、ｐ．８９６−８９８、２０００年
【００２０】
【非特許文献１３】
Ｔａｖｅｒｎａｒａｋｉｓ  Ｎ．ら著、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｖｏｌ．  ２４、ｐ．１８０−１８３、２０００年
【００２１】
【非特許文献１４】
Ｂｉｌｌｙ  Ｅ．ら著、「ＰＮＡＳ」、Ｖｏｌ．  ９８、ｐ．１４４２８−１４４３３、２００１年
【００２２】
【非特許文献１５】
Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ．  Ｊ．  ら著、「ＰＮＡＳ」、Ｖｏｌ．  ９９、ｐ．１４４３−１４４８、２００２年
【００２３】
【非特許文献１６】
Ｓｔａｒｋ  Ｇ．  Ｒ．ら著、「Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、Ｖｏｌ．  ６７、ｐ．２２７−２６４、１９９８年
【００２４】
【非特許文献１７】
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  Ｒ．  Ｈ．  ｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，  ｅｄｓ．  Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｒｉｏｒｄａｎ  Ｊ．  Ｆ．  （Ａｃａｄｅｍｉｃ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）  ｐｐ．５１５−５５１
【００２５】
【非特許文献１８】
Ｃｌｅｍｅｎｓ  Ｍ．  Ｊ．  および  Ｅｌｉａ  Ａ．，  Ｊ．著、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．」、Ｖｏｌ．  １７、ｐ．５０３−５２４、１９９７年
【００２６】
【非特許文献１９】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．  Ｍ．  ら著、「Ｎａｔｕｒｅ」、Ｖｏｌ．  ４１１、ｐ．４９４−４９８、２００１年
【００２７】
【非特許文献２０】
Ｔａｂａｒａ  Ｈ．  ら著、「Ｃｅｌｌ」、Ｖｏｌ．  ９９、ｐ．１２３−１３２、１９９９年
【００２８】
【非特許文献２１】
Ｋｅｔｔｉｎｇ  Ｒ．  Ｆ．ら著、「Ｃｅｌｌ」、Ｖｏｌ．  ９９、ｐ．１３３−１４１、１９９９年
【００２９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、標的遺伝子の発現を抑制し得る新規なＲＮＡ分子発現システム、および該システムを用いたノックダウン細胞の作製方法を提供することにある。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、哺乳類細胞においてＲＮＡｉ効果が生じる細胞中の部位を検討した。まず、ｔＲＮＡＶａｌまたはＵ６プロモーターによって制御される２種類のｄｓＲＮＡ発現ベクターを構築した（それぞれ、「ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ」、「Ｕ６−ｄｓＲＮＡ」）。ｔＲＮＡＶａｌプロモーターからの転写産物は、核から細胞質へ効率的に移行するのに対し、Ｕ６プロモーターからの転写産物は、核内に留まることが知られている。
【００３１】
実験の結果、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡの転写物は細胞質に存在し、リボヌクレアーゼＩＩＩ複合体によって効率よく処理された。さらに、変異体ｋ−ｒａｓ指向ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡは、ターゲッティングされたｍＲＮＡをインビトロおよびインビボで効率よく切断した。即ち、ＲＮＡｉ効果が生じたことが示された。対照的に、Ｕ６−ｄｓＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞において正常なｋ−ｒａｓの発現に影響を及ぼさなかった。従って、これらの結果は、哺乳類細胞においてＲＮＡｉが細胞質において起こることを示すものである。さらに本発明者らは、酵母においてもＲＮＡｉ効果によって効率的に遺伝子の発現を抑制できることを見出した。
【００３２】
また上記実験に使用したｄｓＲＮＡは、細胞においてステムループ構造を形成するものと考えられた。従って、上記実験結果は、ステムループ構造を有するＲＮＡ分子（ステムループ形ＲＮＡ分子）が、細胞質へ移行することにより、ＲＮＡｉ効果をもたらすことを示すものでもある。
【００３３】
また、ステムループ構造を形成するＲＮＡ分子は、１つの産物としてＤＮＡから転写させることが可能である特長を有する。
【００３４】
さらに、Ｕ６プロモーターで発現されたステムループ形ＲＮＡ分子は、通常核に局在するが、本発明者らによるマイクロＲＮＡのループ配列を含むステムループ形分子は、細胞質へと輸送され、効率良くＲＮＡｉ効果を示した。しかし、マイクロＲＮＡの細胞質への輸送は細胞の維持に必須であり、マイクロＲＮＡのループ配列を含むＵ６−ステムループ形ＲＮＡ分子は、ドミナントネガティブに働き、細胞毒性を示す可能性もある。そこで、本発明者らが開発したｔＲＮＡプロモーターで発現されたステムループ形ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡの輸送システムを使用せずに、細胞質へと輸送されるため、細胞毒性が無いと考えられる。
【００３５】
上記の如く本発明者らは、ステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡから、ｔＲＮＡプロモーターを利用して該ＲＮＡ分子を産生させることにより、該ＲＮＡ分子を効率的に細胞質へ移行させ、ＲＮＡｉ効果を発揮させることに成功し、本発明を完成させた。
【００３６】
また本発明者らは、上記のＲＮＡ分子が細胞質へ移行することによりＲＮＡｉ効果をもたらすという本発明者らによって今回見出された知見に基づいて、以下の実験を行った。即ち、組換えヒトＤｉｃｅｒ（ｈＤｉｃｅｒ）を作製し、この組換えｈＤｉｃｅｒを用いて、長鎖ｄｓＲＮＡをプロセシングすることにより２０〜２５ｎｔのｓｉＲＮＡを生成させ、このｓｉＲＮＡを直接細胞質へ導入し、ＲＮＡｉ効果の検討を行った。その結果、長鎖ｄｓＲＮＡを基質として上記ｈＤｉｃｅｒで処理されたｓｉＲＮＡ（ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡ）は、細胞質へ直接導入することにより、効率的な標的遺伝子の抑制効果が見られた。組換えｈＤｉｃｅｒで処理されたＲＮＡを直接細胞へ導入することによりＲＮＡｉ効果を発揮させることは、本発明者らによって初めて達成されたことである。また、ｓｉＲＮＡを生成し得る活性を持つｈＤｉｃｅｒについての組換えタンパク質の製造も、本発明者らによって初めて成し遂げられたことである。
【００３７】
本発明者らによって開発されたステムループ形ＲＮＡ分子発現システムを用いることにより、簡便に所望の遺伝子がノックアウトした細胞を作製することが可能である。また本発明は、哺乳類細胞におけるＲＮＡｉのメカニズムおよび他の遺伝子機能を研究するための強力なツールとなり、さらには、治療用途として潜在的有用性を持つものと大いに期待される。
【００３８】
本発明は、標的遺伝子の発現を抑制し得る新規ＲＮＡ分子発現システム、および該システムを用いたノックダウン細胞の作製方法に関し、より具体的には、
〔１〕  細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡと細胞質移行シグナル配列を有するＤＮＡであって、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡ、
〔２〕  前記スペーサー領域中に細胞質移行シグナル配列を有する、〔１〕に記載のＤＮＡ、
〔３〕  プロモーターが、ｔＲＮＡプロモーター、ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター、またはテトラサイクリン誘導型プロモーターである、〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡ、
〔４〕  テトラサイクリン誘導型プロモーターがテトラサイクリン誘導型ｔＲＮＡプロモーターである〔３〕に記載のＤＮＡ、
〔５〕  プロモーターが、ＮＭＴ１プロモーターまたはＧＡＬ１プロモーターである〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡ、
〔６〕  細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであって、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをｔＲＮＡプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡ、
〔７〕  ｔＲＮＡプロモーターがｔＲＮＡＶＡＬプロモーターである、〔３〕、〔４〕または〔６〕に記載のＤＮＡ、
〔８〕  センスコードＤＮＡの長さが１０〜３５ｂｐである、〔１〕〜〔４〕、〔６〕または〔７〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔９〕  センスコードＤＮＡの長さが２６〜３０ｂｐである、〔１〕〜〔４〕、〔６〕または〔７〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔１０〕  センスコードＤＮＡの長さが３１〜３５ｂｐである、〔１〕〜〔４〕、〔６〕または〔７〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔１１〕  センスコードＤＮＡの長さが１０〜５０００ｂｐである、〔５〕に記載のＤＮＡ、
〔１２〕  スペーサー領域の長さが１〜１００００ベースである〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔１３〕  スペーサー領域の長さが１〜１００ベースである〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔１４〕  発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが１０〜３５ｂｐである、〔１〕〜〔４〕、〔６〕〜〔１０〕、〔１２〕または〔１３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔１５〕  発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが２６〜３０ｂｐである、〔１〕〜〔４〕、〔６〕〜〔１０〕、〔１２〕または〔１３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔１６〕  発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが３１〜３５ｂｐである、〔１〕〜〔４〕、〔６〕〜〔１０〕、〔１２〕または〔１３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔１７〕  発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中にミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔１８〕  センス鎖に２０塩基対あたり１〜６塩基のＧ・Ｕペアを組むようなミスマッチを含むように構築されたものである、〔１７〕に記載のＤＮＡ、
〔１９〕  発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中に２０塩基対あたり１〜１０塩基のミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔２０〕  ミスマッチがセンス鎖に２０塩基対あたり１〜６塩基のＧ・Ｕペアを組むようなミスマッチである、〔１９〕に記載のＤＮＡ、
〔２１〕  発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中に３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含むように構築されたものである、〔５〕または〔１１〕に記載のＤＮＡ、
〔２２〕  細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、〔１〕〜〔２１〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔２３〕  〔１〕〜〔２２〕のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物である、細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子、
〔２４〕  〔１〕〜〔２２〕のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
〔２５〕  〔１〕〜〔２２〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔２４〕に記載のベクターを保持する細胞、
〔２６〕  細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、〔２５〕に記載の細胞、
〔２７〕  〔１〕〜〔２２〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔２４〕に記載のベクターを含む組成物、
〔２８〕  標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、〔１〕〜〔２２〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔２４〕に記載のベクターを細胞に導入する工程、および前記ＤＮＡもしくはベクターが導入された細胞を選択する工程、を含む生産方法、
〔２９〕  細胞内でステムループ形ランダムＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであって、ランダムな配列からなるＲＮＡをコードするＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをｔＲＮＡプロモーターと機能的に接続させた構造を有するＤＮＡを含むベクター、
〔３０〕  〔１〕〜〔２２〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔２４〕もしくは〔２９〕に記載のベクターを保持した生物個体、
〔３１〕  標的遺伝子ノックアウト非ヒト動物である、〔３０〕に記載の生物個体、
〔３２〕  生物がマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、およびチンパンジーからなる群より選択される、〔３０〕または〔３１〕に記載の生物個体、
〔３３〕  発現するステムループ形ランダムＲＮＡ分子のステム領域の長さが１０〜３５ｂｐである、〔２９〕に記載のベクター、
〔３４〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、機能遺伝子探索方法、
（ａ）〔２９〕または〔３３〕に記載のベクターを細胞へ導入する工程
（ｂ）前記ベクターが導入された細胞を選択する工程
（ｃ）選択された細胞の表現型を解析する工程
〔３５〕  表現型解析により表現型が変化していた細胞中のベクター配列中のランダムな配列に基づいて機能遺伝子をスクリーニングする工程をさらに含む、〔３４〕に記載の機能遺伝子探索方法、
〔３６〕  （ａ）細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであって、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡと、
（ｂ）Ｄｉｃｅｒタンパク質におけるＤｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド領域をコードするＤＮＡとプロモーターとを機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡ、とを含むｓｉＲＮＡ発現システム、
〔３７〕  （ａ）に記載のプロモーターがｔＲＮＡ  プロモーターまたはＰｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターである、〔３６〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔３８〕  （ａ）に記載のプロモーターがＮＭＴ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターまたはＰｏｌ  ＩＩ系プロモーターである、〔３６〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔３９〕  発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中に、３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含む、〔３８〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔４０〕  （ｂ）に記載のプロモーターがＰｏｌＩＩ系プロモーターである、〔３６〕に記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔４１〕  細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、〔３６〕〜〔４０〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔４２〕  標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが、少なくとも３０塩基対以上である、〔３６〕〜〔４１〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔４３〕  標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ中、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中のセンス鎖に、３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含む、〔３６〕〜〔４１〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、
〔４４〕  〔３６〕の（ａ）および（ｂ）の両方のＤＮＡを含むｓｉＲＮＡ発現ベクター、
〔４５〕  〔３６〕〜〔４３〕のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現システム、または〔４４〕に記載の発現ベクターを用いて、ステムループ形ＲＮＡ分子とＤｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドの両方を発現させることを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制する方法、
〔４６〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、標的遺伝子の発現を抑制する方法、
（ａ）標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子を、Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドで処理する工程、
（ｂ）上記工程（ａ）で生成したｄｓＲＮＡを、標的遺伝子を含む細胞へ導入する工程、
〔４７〕  Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが、Ｄｉｃｅｒタンパク質の１０６６位〜１９２４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔４６〕に記載の方法、
〔４８〕  Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが、Ｄｉｃｅｒタンパク質の１２６８位〜１９２４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔４６〕に記載の方法、
〔４９〕  Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが、Ｄｉｃｅｒタンパク質の１２９６位〜１９２４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔４６〕に記載の方法、
〔５０〕  Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが全長Ｄｉｃｅｒタンパク質である、〔４６〕に記載の方法、
〔５１〕  細胞が哺乳動物細胞もしくは酵母細胞である、〔４５〕〜〔５０〕のいずれかに記載の方法、
〔５２〕  Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが大腸菌で発現させた〔４７〕〜〔５０〕のいずれかに記載のポリペプチドである、〔４６〕に記載の方法、
〔５３〕  Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドが昆虫細胞で発現させた〔４７〕〜〔５０〕のいずれかに記載のポリペプチドである、〔４６〕に記載の方法、
〔５４〕  標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域の長さが、少なくとも３０塩基対以上である、〔４５〕〜〔５３〕のいずれかに記載の方法、
〔５５〕  標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ中、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中のセンス鎖に、３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含む、請求項〔４５〕〜〔５３〕のいずれかに記載の方法、を提供するものである。
【００３９】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ステムループ形ＲＮＡ分子が細胞質へ移行すると、ＲＮＡｉ効果を有することを見出した。そして本発明者らは、ステムループ形ＲＮＡをコードするＤＮＡをｔＲＮＡプロモーターと連結させることにより、該プロモーターによる転写産物は、核から細胞質へ効率的に移行し、該転写産物は、ＲＮＡｉ効果を有することを明らかにした。「ステムループ」とは、一本鎖ＲＮＡ上に存在する逆方向反復配列間で水素結合によって生じる二本鎖の部分（ステム；  ｓｔｅｍ）とそれに挟まれるループの部分から成る構造を言い、ヘアピンループとも呼ばれる。ステムループ形ＲＮＡ分子は、ステム領域が二本鎖ＲＮＡ構造をしており、細胞質において、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）を含むリボヌクレアーゼＩＩＩ複合体（ＲＩＳＣ）によって処理され、ＲＮＡｉ効果を有するｓｉ（短鎖干渉；  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡが生成されるものと考えられる。ｓｉＲＮＡは、通常２０ｂｐ程度の二本鎖ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡｉ効果を有することが知られている。ダイサーおよびＲＩＳＣは、細胞質に局在しているものと考えられており、従って、ステムループ形ＲＮＡ分子を細胞質へ移行させることは、ＲＮＡｉ効果を発揮させるために重要である。
【００４０】
本発明は、細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを提供する。即ち本発明は、発現産物が効率的に細胞質へ移行することを特徴とする、細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡに関する。
【００４１】
本発明の上記ＤＮＡの好ましい態様においては、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンス（もしくはアンチセンス）ＲＮＡをコードするセンス（もしくはアンチセンス）コードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡである。
【００４２】
本発明において標的遺伝子とは、その遺伝子の発現が本発明のステムループ形ＲＮＡ分子のＲＮＡｉ効果により抑制される遺伝子であり、任意に選択することができる。この標的遺伝子として例えば、配列は判明しているがどのような機能を有するかを解明したい遺伝子や、その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを好適に選択することができる。標的遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列の一部、少なくとも１５塩基以上が判明しているものであれば、ゲノム配列まで判明していない遺伝子であっても選択することができる。したがって、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）などのｍＲＮＡの一部は判明しているが、全長が判明していない遺伝子なども本発明における標的遺伝子として選択することができる。
【００４３】
上記「対向する」とは、２つの配列が互いに逆方向となるように配置することを指す。本発明の上記ＤＮＡは、センスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、スペーサー領域を挟んで、逆方向反復配列を形成した構造を有する、と換言することができる。具体的に説明すると、例えば、センスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（二本鎖）が、
ＡＧＴＣ  （センス鎖）
：：：：
ＴＣＡＧ  （アンチセンス鎖）
である場合には、上記のセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、スペーサー領域を挟んで、逆方向反復配列を形成した構造は、
ＡＧＴＣ−ＳＳＳ−ＧＡＣＴ
：：：：          ：：：：
ＴＣＡＧ−ＳＳＳ−ＣＴＧＡ
と表わすことができる。（上記の「Ｓ」はスペーサー領域の任意の塩基であり、「：」は水素結合を表す。）
【００４４】
本発明のＤＮＡは、上記のように標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させた構造を有するが、この「相補的な配列」は、即ち、上記の「標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域」に対するアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡである、と表わすこともできる。従って本発明のＤＮＡは換言すると、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードするアンチセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させた構造を有する、と表現することもできる。
【００４５】
本発明の上記ＤＮＡを細胞質へ効率的に移行させるためには、例えば、上記ＤＮＡ上へ細胞質移行シグナル配列を含ませることによって、達成させることができる。即ち、本発明のＤＮＡの好ましい態様のおいては、細胞質移行シグナル配列を有する前記ＤＮＡである。細胞質移行シグナル配列は、必ずしも限定されないが、スペーサー領域中へ存在することが好ましい。本発明の細胞質移行シグナル配列としては、公知の細胞質移行シグナルの他、例えば、細胞質移行タンパク質が特異的に結合し得るＤＮＡ配列を好適に用いることができる。細胞質移行シグナル配列の一例として、ｍｉＲ２３のループモチーフ（配列：５’−ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ−３’）を示すことができる（Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｈ．，  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  Ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｄｓＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔＲＮＡ（Ｖａｌ）  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３１，  ７００−７０７  （２００３））。
【００４６】
また本発明の上記ＤＮＡにおける「プロモーター」としては、後述のｔＲＮＡプロモーター、あるいは、ｐｏｌＩＩ系、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用することができる。また、テトラサイクリン誘導型プロモーターを好適に使用することができる。このような誘導可能なプロモーターを用いることにより、所望のタイミングで本発明のＤＮＡを発現させることも可能となる。テトラサイクリン誘導型プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリンで誘導可能なＵ６プロモータ（Ｏｈｋａｗａ，  Ｊ．  ＆  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｓｎＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１，  ５７７−５８５  （２０００））等が挙げられる。例えば、テトラサイクリン誘導型プロモーターの例として、ＴｅｔＯ７を含むプロモーターを挙げることができる。また、テトラサイクリン誘導型プロモーターを利用した場合の一例として、後述の実施例を参照することができる。また、本発明のプロモーターとして、テトラサイクリン誘導型ｔＲＮＡプロモーターを好適に使用することができる。さらに本発明の好適に使用可能なプロモーターとして、例えば、ＮＭＴ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターを挙げることができる。
【００４７】
また、本発明の別の好ましい態様においては、上記の標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンス（もしくはアンチセンス）ＲＮＡをコードするセンス（もしくはアンチセンス）コードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させたＤＮＡを、ｔＲＮＡプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡである。
【００４８】
ｔＲＮＡプロモーターは、原核生物の場合は遺伝子の上流に存在するのに対し、真核生物の場合は、ｔＲＮＡのＤループ、Ｔループに対応するＤＮＡ領域がｔＲＮＡプロモーターとして機能することが知られている。従って本発明のｔＲＮＡプロモーターとは、通常、ｔＲＮＡのＤループまたはＴループに対応するＤＮＡ領域を言う。ｔＲＮＡは各アミノ酸に対して、通常複数個のｔＲＮＡが存在する。本発明のｔＲＮＡプロモーターとしては、バリン（Ｖａｌ）に対応したｔＲＮＡ  （ｔＲＮＡＶａｌ）のプロモーターを好適に使用することができる。
【００４９】
本発明に使用することができるｔＲＮＡプロモーターとしては、具体的には、以下の塩基配列をコードするプロモーターを挙げることができる。
５’−  ＡＣＣＧＵＵＧＧＵＵＵＣＣＧＵＡＧＵＧＵＡＧＵＧＧＵＵＡＵＣＡＣＧＵＵＣＧＣＣＵＡＡＣＡＣＧＣＧＡＡＡＧＧＵＣＣＣＣＧＧＵＵＣＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＣＵＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣ  −３’（配列番号：１）
【００５０】
本発明において上記「機能的に連結した」とは、ｔＲＮＡプロモーターからの転写を受けて、上記の「標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させたＤＮＡ」の転写産物が生成するように、該ＤＮＡとｔＲＮＡプロモーターとが結合していることを言う。従って、該ＤＮＡに対するｔＲＮＡプロモーターの位置は、その上流、下流を問わないが、通常上流に位置する。また、該ＤＮＡとｔＲＮＡプロモーターとの間には、該ＤＮＡの転写が起こり得る限り、任意のＤＮＡ配列を有していても良い。
【００５１】
本発明においては、上記のようにｔＲＮＡプロモーターからの転写を受けることによって、細胞質への移行シグナルとしてそのｔＲＮＡ自体も上記ステムループ形ＲＮＡ分子と結合している。
【００５２】
さらに本発明においては、上記ＤＮＡにターミネーターを適宜備えることができる。ターミネーターは、プロモーターの転写を終結し得る配列であれば、特に制限されず、例えば、Ａ（アデニン）塩基が４つ以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列等の公知のターミネーターを用いることができる。なお、本発明のＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡが含まれる。
【００５３】
本発明の上記ＤＮＡがｔＲＮＡプロモーターからの転写を受けることにより、一続きの転写産物（ＲＮＡ分子）が生成される。本発明のＤＮＡには、スペーサー領域を間にして逆方向反復配列を有することから、本発明のＤＮＡの転写産物もまた、スペーサー領域を間にする逆方向反復配列を含む構造をしている。このような構造を有するＲＮＡ分子は、通常、該反復配列間で水素結合を形成し、該反復配列をステムとし、スペーサー領域をループとするステムループを形成する。本明細書においては、このステムループを形成するＲＮＡ分子を「ステムループ形ＲＮＡ分子」と記載する。本発明は、本発明の上記ＤＮＡから転写されるステムループ形ＲＮＡ分子もまた、本発明に含まれる。なお、本発明において「ＲＮＡｉ効果を有する」とは、本発明のステムループ形ＲＮＡ分子の代謝産物等（例えば、ＲＮＡ鎖に切断等の代謝を受けて生成される産物）がＲＮＡｉ効果を有する場合も含まれる。
【００５４】
本発明のスペーサー領域を構成するＤＮＡは、それに隣接する反復配列が水素結合をし得る限り、その長さは特に制限されないが、通常１〜１００００ベースであり、好ましくは１〜１００ベース、より好ましくは、３〜３０ベースであり、さらに好ましくは５〜２０ベースである。スペーサー領域を構成するＤＮＡの塩基配列は、特に規定されず、任意の配列とすることができる。また、上記のように逆方向反復配列間で水素結合を形成し得るものであれば、特にスペーサー領域は必要とせず、スペーサー領域を有しない場合であっても、本発明のＤＮＡに含まれる。本発明のＤＮＡは、例えば、図１Ａの上段のような構造を模式的に示すことができる。
【００５５】
哺乳動物細胞へ、通常約３０ｂｐ以上の長さの二本鎖ＲＮＡを導入すると、インターフェロン（ＩＦＮ）防御経路によって、該二本鎖ＲＮＡが消化されることが知られている。従って、本発明のステムループ形ＲＮＡ分子は、ステム領域の二本鎖ＲＮＡの長さが、通常、３５ｂｐ以内であり、好ましくは１０〜３５ｂｐであり、より好ましくは１５〜３０ｂｐであり、さらに好ましくは１８〜３０ｂｐであり、最も好ましくは２６〜３０ｂｐもしくは３１〜３５ｂｐである。また、本発明のＤＮＡにおける「センスコードＤＮＡ」あるいは、上記の２つの逆方向反復配列のそれぞれの長さもまた、通常、３５ｂｐ以内であり、好ましくは１０〜３５ｂｐであり、より好ましくは１５〜３０ｂｐであり、さらに好ましくは１８〜３０ｂｐであり、最も好ましくは２６〜３０ｂｐもしくは３１〜３５ｂｐである。ただし、本発明のプロモーターとして、ＮＭＴ１プロモーターまたはＧＡＬ１プロモーターを用いる場合には、特に制限されるものではないが、センスコードＤＮＡの長さは１０〜５０００ｂｐであることが好ましい。
【００５６】
また本発明において、ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分（ステムループ形ＲＮＡ分子のステム部分）は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。不対合部分はｓｉＲＮＡ形成に支障がない範囲で設けることができる。その際、本発明のＤＮＡから発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中に存在するミスマッチまたはバルジの数は、特に制限されないが、通常、２０塩基対あたり１〜１０塩基である。また、本発明のＤＮＡが有するプロモーターがＮＭＴ１プロモーターあるいはＧＡＬ１プロモーターである場合には、本発明のＤＮＡから発現するステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中に、特に制限されないが、３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含んでいてもよい。また、上記ミスマッチとしては例えば、センス鎖に２０塩基対あたり１〜６塩基のＧ・Ｕペアを組むようなミスマッチを挙げることができる。
【００５７】
本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により作製することができる。ｔＲＮＡプロモーターを含む本発明のＤＮＡは、例えば、周知のオリゴヌクレオチド合成法によって任意の配列を合成して作製することができる。本発明の二本鎖ＤＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ個別に合成し、それぞれの鎖をアニーリングさせることにより取得することができる。
【００５８】
本発明のＤＮＡは、そのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内で発現させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記ＤＮＡをベクターに保持させることが好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターもまた、本発明に含まれる。ここで用いることができる「ベクター」は、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Ｎｉｉｔｓｕ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５：  １３８５−１３９５  （１９９８））、これらに限定されるものではない。
【００５９】
ベクターには、必要に応じて、ベクターが導入された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいは、ＧＦＰなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。また、ＥＧＦレセプター、Ｂ７−２などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなども用いてもよい。このように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち、本発明のベクターが導入された細胞のみを選択することが可能となる。また、ベクターを用いることにより、細胞内での保持時間を高め、またベクターによってはレトロウイルスベクターなどのように染色体へのインテグレーションを誘導するため、本発明のＤＮＡからの細胞内での安定的なステムループ形ＲＮＡ分子の供給を行うことが可能となる。
【００６０】
本発明の好ましい態様においては、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを、細胞へ導入することにより、該細胞における遺伝子の発現を抑制することができる。従って本発明は、標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを細胞に導入する工程、および前記ベクターが導入された細胞を選択する工程、を含む生産方法を提供する。さらに本発明は、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを保持する細胞を提供する。本発明の上記細胞は、特に限定されず、遺伝子の発現を抑制したい所望の細胞を使用することができる。従来ＲＮＡｉの誘導が困難であった哺乳動物細胞においても、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターにより、ＲＮＡｉを誘導することが可能であることから、本発明の細胞としては、特に制限されず、例えば、哺乳動物細胞（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、またはチンパンジー等の細胞）、酵母等を挙げることができる。また、植物細胞などの長鎖のｄｓＲＮＡでは、長期の安定な発現保持が難しい細胞も、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを導入される細胞として好適である。
【００６１】
また、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターの上記細胞への導入方法は、当業者においては、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．５２，  ｐ．４５６  （１９７３））、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．１５，  ｐ．１３１１  （１９８７））  、リポフェクション法（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｎｕｔｒ．，  Ｖｏｌ．７，  ｐ．１７５  （１９８９））、ウィルスにより感染導入方法（Ｓｃｉ．Ａｍ．，  ｐ．３４，  Ｍａｒｃｈ  （１９  ９４））  、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３１９，  ｐ．７９１  （１９８６））  、ポリエチレングリコール法（ＥＭＢＯ  Ｊ．，  Ｖｏｌ．３，  ｐ．２７１７  （１９８４））  、パーティクルガン法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏ  ｌ．８５，  ｐ．８５０２  （１９８８））  、アグロバクテリュウムを介した方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．１２，  ｐ．８７１１  （１９８４））  等により行うことができる。
【００６２】
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターが導入された細胞を選択する方法としては、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターに特異的なＤＮＡ配列をプローブあるいはプライマーとしてハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法等の公知の手法により選択することもできるが、選択マーカーを備えたベクターに本発明のＤＮＡが保持されている場合には、その選択マーカーによる表現型を指標に選択することができる。
【００６３】
上記のように本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターが導入された細胞は、標的遺伝子の発現が抑制されたノックダウン細胞となる。ここで「ノックダウン細胞」には、標的遺伝子の発現が完全に抑制された細胞と、標的遺伝子の発現が完全には抑制されていないが低減されている細胞とが含まれる。従来、このような細胞は、標的遺伝子をあるいはその制御領域を欠損・改変させることにより創生されていたが、本発明を用いることにより、染色体上の標的遺伝子を改変することなく、単に本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを導入し、導入された細胞を選択するという簡易な方法により標的遺伝子の発現が抑制された細胞を作ることができる。このように創生されたノックダウン細胞は、標的遺伝子の機能解析のための研究材料として、また疾患原因遺伝子を標的遺伝子として発現が抑制されている細胞では疾患モデル細胞などとして利用することが可能となる。また、生殖細胞に本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを導入し、この本システムを保持した生殖細胞より生物個体を発生させることにより、標的遺伝子ノックダウン動物、疾患モデル動物などを創生することも可能となる。本発明には、本発明によって生産される上記ノックダウン細胞も含まれ、さらに上記本発明のＤＮＡもしくはベクターを保持する生物個体（例えば、標的遺伝子ノックアウト非ヒト動物等）も本発明に含まれる。本発明における上記生物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、またはチンパンジー等を挙げることができる。
【００６４】
また本発明は、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを含有する組成物に関する。本発明により所望の標的遺伝子の発現を抑制し得るため、本発明により疾患の原因となる遺伝子発現を抑制することにより、該疾患の治療または予防効果が期待できる。さらに上記組成物は、所望の遺伝子の機能を検討するための試薬としても有用である。本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを医薬品として用いる場合には、適切な賦形剤等を添加した組成物とすることもできる。
【００６５】
本発明の別の態様においては、ステムループ形ランダムＲＮＡ分子を発現するベクターに関する。該ベクターは、ランダムな配列からなるＲＮＡをコードするＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをｔＲＮＡプロモーターと機能的に接続させた構造を有するＤＮＡを含む。該ＤＮＡから発現するランダムな配列を有する転写産物を、本発明においては「ステムループ形ランダムＲＮＡ分子」と呼ぶ。このステムループ形ランダムＲＮＡ分子を細胞へ導入することにより、機能遺伝子の探索が可能である。つまり、上述までの本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターは特定の標的遺伝子の発現を抑制し得るものであるが、上記態様においては、ステムループ形ランダムＲＮＡを発現して、任意の遺伝子、例えば機能未知の遺伝子配列未知の遺伝子を抑制し、新規な機能遺伝子を探索するために用いることができる。上記ステムループ形ランダムＲＮＡ分子もまた、好ましくは、ステム領域の長さが、通常３０ｂｐ以内であり、好ましくは１５〜３０ｂｐであり、より好ましくは１８〜３０ｂｐである。
【００６６】
本発明は、上記ステムループ形ランダムＲＮＡ分子発現ベクターを細胞へ導入する工程、前記ベクターが導入された細胞を選択する工程、および、選択された細胞の表現型を解析する工程、を含む機能遺伝子探索方法を提供する。
【００６７】
本発明においては、異なるランダム配列を有するステムループ形ランダムＲＮＡ分子を発現し得るベクターを集めてライブラリーとして構築することもできる。該ライブラリーを用いることにより、機能遺伝子の探索を一層効率的に行うことが可能となる。
【００６８】
上記方法における、ステムループ形ランダムＲＮＡ分子発現ベクターの細胞への導入は前述のように行うことができる。
【００６９】
上記方法においては、次いで、ステムループ形ランダムＲＮＡ分子発現ベクターまたはライブラリーが導入された細胞が選択された後に、その細胞の表現型を解析する。この表現型の解析は、例えば、コントロールとしてステムループ形ランダムＲＮＡ分子発現ベクターが導入されていない細胞の表現型と比較することにより行うことができる。この表現型は、細胞表面に生じるものだけではなく、例えば、細胞内の変化なども含まれる。
【００７０】
上記解析の結果、表現型が変化した細胞には、何らかの機能遺伝子の発現を抑制し得るステムループ形ランダムＲＮＡ分子が含まれている可能性が高い。そのため、機能遺伝子をスクリーニングするために、例えば、この細胞に含まれるステムループ形ランダムＲＮＡ分子発現ベクターのステムループ形ランダムＲＮＡをコードするＤＮＡの配列に基づき、プローブ、プライマーを構築する。そして、このプローブ、プライマーを用いて、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲを行うことにより、機能遺伝子のクローニングを行うことができる。また、ステムループ形ランダムＲＮＡをコードするＤＮＡの配列に基づいて、データベースから機能遺伝子を検索することもできる。
【００７１】
また本発明は、細胞内でＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡ分子が発現可能な構造を有するＤＮＡ、およびＤｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｄｉｃｅｒタンパク質）の発現が可能な構造を有するＤＮＡを含む、ｓｉＲＮＡ発現システムに関する。本発明のｓｉＲＮＡ発現システムの好ましい態様においては、以下の（ａ）および（ｂ）のＤＮＡを含む、ｓｉＲＮＡ発現システムである。Ｄｉｃｅｒ活性により長鎖ｄｓＲＮＡによる細胞毒性を軽減させることが可能である。
（ａ）細胞内でＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであって、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡと、該ＤＮＡと相補的な配列とを、スペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターと機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡ
（ｂ）Ｄｉｃｅｒタンパク質におけるＤｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド領域をコードするＤＮＡとプロモーターとを機能的に接続させた構造を特徴とするＤＮＡ
【００７２】
本発明において「Ｄｉｃｅｒタンパク質におけるＤｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド」とは、Ｄｉｃｅｒタンパク質において、少なくとも、Ｄｉｃｅｒ活性を有する部分ポリペプチド断片、あるいは該ポリペプチドを含むタンパク質（例えば、全長Ｄｉｃｅｒタンパク質）を言う。このＤｉｃｅｒ活性とは、通常、長い二本鎖ＲＮＡを２１〜２５塩基の二本鎖ＲＮＡに切断する活性を言う。一般的にＤｉｃｅｒ活性は、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性を測定することにより評価することができる。当業者においては公知の方法、例えば、インビトロ・プロセシング・アッセイ等によって該活性について評価（測定）することができる。例えば、インビトロ・プロセシング・アッセイは、後述の実施例に記載の方法によって実施することができる。
【００７３】
また、本発明において使用されるＤｉｃｅｒタンパク質は、特にその由来は制限されず、例えば、ヒトＤｉｃｅｒタンパク質を好適に用いることができる。例えば、Ｄｉｃｅｒタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：５５に、Ｄｉｃｅｒタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５６に示すことができる。
【００７４】
本発明における上記Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチドの具体例としては、通常Ｄｉｃｅｒタンパク質において好ましくは１０６６位〜１９２４位、より好ましくは１２６８位〜１９２４位、さらに好ましくは１２９６位〜１９２４位のアミノ酸配列からなるポリペプチド（例えば、配列番号：５６に記載のアミノ酸配列において、好ましくは１０６６位〜１９２４位、より好ましくは１２６８位〜１９２４位、さらに好ましくは１２９６位〜１９２４位のアミノ酸配列からなるポリペプチド）である。
【００７５】
上記（ａ）および（ｂ）のＤＮＡを有するｓｉＲＮＡ発現ベクターもまた本発明に含まれる。上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡは、当業者においては、公知の遺伝子工学技術を用いて、容易に作製することができる。
【００７６】
さらに本発明は、標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。本発明の標的遺伝子抑制方法の好ましい態様においては、本発明のｓｉＲＮＡ発現システム、または本発明の発現ベクターを用いて、ステムループ形ＲＮＡ分子とＤｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｄｉｃｅｒタンパク質）の両方を細胞において発現させることを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制方法である。該方法におけるＤｉｃｅｒとしては、組換えタンパク質が好適に使用される。
【００７７】
また本発明の標的遺伝子抑制方法の他の好ましい態様においては、まず、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡを、Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド（例えば、組換えｈＤｉｃｅｒタンパク質）で処理し、次いで、生成したｄｓＲＮＡを、標的遺伝子を含む細胞へ導入する。
【００７８】
上記方法における組換えｈＤｉｃｅｒの製造方法は、例えば、後述の実施例で示す方法により、実施することができるが、必ずしもこの方法のみに制限されるものではない。当業者においては、実施例に示される方法を適宜改変して組換えｈＤｉｃｅｒの製造を行うことが可能である。
【００７９】
また、上記方法における「Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド」としては、例えば、全長Ｄｉｃｅｒタンパク質、またはＤｉｃｅｒタンパク質における上述の部分ポリペプチド領域を含むタンパク質を、好適に使用することができる。また、「Ｄｉｃｅｒ活性を有するポリペプチド」は、例えば、大腸菌もしくは昆虫細胞等で発現させたものを好適に利用することができる。当業者においては一般的な遺伝子工学技術を用いて、大腸菌もしくは昆虫細胞において所望のタンパク質を発現させ、さらに該タンパク質を回収・精製することが可能である。
【００８０】
また上記方法においてｄｓＲＮＡの細胞への導入は、当業者においては公知の方法、例えば、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法等により、容易に実施することができる。
【００８１】
上記方法における「標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ」の長さは、特に制限されるものではないが、好ましくは、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域は少なくとも３０塩基対以上である。また、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域におけるセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが対合したｄｓＲＮＡ中、または該ｄｓＲＮＡをステムとするステムループ形ＲＮＡ分子のステム領域中のセンス鎖に、３００塩基対あたり１〜１００塩基のミスマッチまたはバルジを含んでいてもよい。
【００８２】
また、生殖細胞に本発明のＤＮＡもしくはベクターを導入し、該ＤＮＡもしくはベクターを保持した生殖細胞より生物個体を発生させることによって、標的遺伝子ノックダウン非ヒト動物（例えば、マウス等）、疾患モデル非ヒト動物などを創生することも可能となる。
【００８３】
本発明のＤＮＡもしくはベクターを用いた標的遺伝子ノックダウン動物は、当業者においては、一般的なノックアウト動物作製技術によって作製することができる。一例を示せば、ｓｉＲＮＡ発現ベクターをＦ１のメスとオスとを交配して得られた受精卵に注入する。受精卵から発生させたマウスの尾部から末梢血ＤＮＡを得て、発現ベクターの一部をプローブとして用いたゲノミックサザンブロットを行い、染色体にｓｉＲＮＡ発現ベクターが組み込まれた陽性の創始動物を同定する。Ｆ１ハイブリッドマウスのいずれかとの戻し交配を繰り返して後代マウスを得る。そして、ゲノミックサザンブロット解析およびＰＣＲ解析により、遺伝子組換え陽性の子孫を同定する。
【００８４】
また、上記では主に哺乳動物にｓｉＲＮＡ発現システムを用いる場合を説明したが、本発明のｓｉＲＮＡ発現システムは植物に用いてもよい。特に、従来の二重鎖ＲＮＡを直接植物細胞に導入してＲＮＡｉを誘導していたが、細胞を継代している過程でｄｓＲＮＡが欠落しＲＮＡｉの効果を維持することが困難であった。そのため、本発明のＤＮＡもしくはベクターを植物細胞中の染色体にインテグレーションさせることにより、ＲＮＡｉの効果を維持することが可能となる。また、こうした細胞よりトランスジェニック植物を創生することにより、ＲＮＡｉ効果を安定的に保持した植物を創生することもできる。なお、植物の創生は、当業者においては、周知の方法により実施することが可能である。
【００８５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
本実施例における実験材料、および実験方法は下記の通りである。
【００８６】
（１）細胞培養とトランスフェクション
ＳＷ４８０ヒト結腸癌細胞株を、１０％ＦＢＳを加えたＬ−１５培地（ＩＣＮバイオメディカルズインク、オハイオ、アメリカ）において培養した。ＨｅＬａ細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。トランスフェクションは、イフェクチンＴＭ試薬（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）によって製造元のプロトコールに従って実施した。ｄｓＲＮＡ発現ＳＷ４８０およびｄｓＲＮＡ発現ＨｅＬａ細胞は、ピューロマイシンと共に２週間インキュベートすることによって選択した。
【００８７】
（２）ｄｓＲＮＡ発現プラスミドの構築
ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現するベクターを構築するために、本発明者らは、ｐＰＵＲ（クロンテック社、カリフォルニア州、アメリカ）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位とのあいだに、ｔＲＮＡＶａｌ（Ｋｏｓｅｋｉ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７３，  １８６８−１８７７．）に関するヒト遺伝子の化学合成されたプロモーターを含むｐＰＵＲ−ｔＲＮＡプラスミドを用いた。ループ１（５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＣＣ−３’／配列番号：２）を含む変異体ｋ−ｒａｓ指向ｄｓＲＮＡをコードする化学合成されたオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲによって二本鎖配列に増幅した。ＳａｃＩおよびＫｐｎＩによる消化後、断片をｐＰＵＲ−ｔＲＮＡのｔＲＮＡプロモーターの下流にクローニングした。マウスＵ６プロモーターからｄｓＲＮＡを発現させるためのベクターの構築について、ｄｓＲＮＡ配列の挿入工程以外は他の文献で述べられている（Ｐｌｅｈｎ−Ｄｕｊｏｗｉｃｈ，  Ｄ．  ＆  Ａｌｔｍａｎ，  Ｓ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５，  ７３２７−７３３２．、Ｋａｔｏ，  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  １５３７８−１５３８５．）。ループ１（５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ−３’／配列番号：３）またはループ２（５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＵＵＣ  ＣＵＧ  ＵＣＡ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＣＴＡ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧ−３’／配列番号：４）を含む、ｋ−ｒａｓ指向ｄｓＲＮＡをコードする化学合成オリゴヌクレオチドを、特異的アッププライマーおよびダウンプライマー（それぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩリンカー配列を含む）を用いて、二本鎖配列としてＰＣＲで増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化後、断片をマウスＵ６遺伝子プロモーターの下流にクローニングした。ヒトＵ６プロモーターの場合、本発明者らはｐＴＺ  Ｕ６＋１（Ｂｅｒｔｒａｎｄ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  ＲＮＡ，  ３，  ７５−８８．）を使用した。ループ１（５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ−３’／配列番号：５）またはループ２（５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＵＵＣ  ＣＵＧ  ＵＣＡ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＣＴＡ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡ−３’／配列番号：６）を含む、ｋ−ｒａｓ指向性ｄｓＲＮＡをコードする化学合成オリゴヌクレオチドを、特異的アッププライマーおよびダウンプライマー（それぞれ、ＳａｌＩおよびＸｂａＩリンカー配列を含む）を用いて、二本鎖配列としてＰＣＲで増幅した。ＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化した後、断片をｐＴＺ  Ｕ６＋１のヒトＵ６遺伝子プロモーターの下流にクローニングした。
【００８８】
（３）Ｄｉｃｅｒ指向リボザイム発現プラスミドおよびＤｉｃｅｒ  ｃＤＮＡ発現プラスミドの構築
ｐｏｌＩＩＩ終結配列（ＴＴＴＴＴＴ）を有する、Ｄｉｃｅｒ指向性リボザイム配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−３’／配列番号：７）を、ＰＣＲによって二本鎖ＤＮＡに変換した。Ｃｓｐ４５ＩおよびＰｓｔＩで消化後、断片を、ｐＵＣ−ｄｔ（Ｋｏｓｅｋｉ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７３，  １８６８−１８７７．、Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９３，  ２８４−２８９．、Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｈ．，  ＆  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  （２００２）  ＥＭＢＯ  ｒｅｐ．，  ３，  ４４３−４５０．）のｔＲＮＡプロモーターの下流にクローニングした。ポリ（Ａ）連結リボザイムを作成するために、本発明者らは、リボザイムとｐｏｌＩＩＩ終結配列との間に１００ヌクレオチドのポリ（Ａ）配列を挿入した（Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｈ．，  ＆  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  （２００２）  ＥＭＢＯ  ｒｅｐ．，  ３，  ４４３−４５０．、Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０，  ３７６−３８０．、Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｈ．，  ＆  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  （２００２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３０，  ３６０９−３６１４．、Ｗａｒａｓｈｉｎａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９８，  ５５７２−５５７７）。
【００８９】
（４）細胞の核分画と細胞質分画の調製
ＳＷ４８０細胞またはＨｅＬａ細胞を細胞約５×１０６個に増殖させ、イフェクチン（登録商標）試薬（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）によってｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡまたはＵ６−ｄｓＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞を回収した。細胞質分画を調製するため、回収した細胞をＰＢＳによって２回洗浄し、ジギトニン溶解緩衝液（５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ  ７．５、５０  ｍＭ酢酸カリウム、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、および５０μｇ／ｍｌジギトニン）中に氷中で１０分間再浮遊させた。溶解物を１，０００×ｇで遠心し、上清を細胞質分画として回収した。ペレットをＮＰ−４０溶解緩衝液（２０  ｍＭトリス塩酸、ｐＨ  ７．５、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５％ＮＰ−４０）中に再浮遊し、氷中で１０分間維持し、得られた溶解物を核分画として用いた。
【００９０】
（５）ノーザンブロット分析
細胞質ＲＮＡおよび核ＲＮＡを抽出して、ＩＳＯＧＥＮ試薬（和光、大阪、日本）によって細胞質分画および核分画からそれぞれ精製した。１レーンあたりｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ３０μｇを１５％ポリアクリルアミドゲルにローディングした。電気泳動後、ＲＮＡのバンドをハイボンド−Ｎ（登録商標）ナイロンメンブレン（アマシャム社、バッキンガムシャー、イギリス）に転写した。ｋ−ｒａｓ遺伝子の配列と相補的な合成オリゴヌクレオチドによってメンブレンをプロービングした。合成プローブをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造、京都、日本）によって３２Ｐ標識した。
【００９１】
（６）ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）とｄｉｃｅｒ上流（ｎｔ．１−２４）プライマーおよび下流（ｎｔ．４３５−４５９）プライマー、または対照としてＧＡＤＰＨ上流（ｎｔ．２３０−２５４）プライマーおよび下流（ｎｔ．４４２−４４６）プライマーを用いて行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。
【００９２】
（７）ウェスタンブロット分析
個々のｄｓＲＮＡ−発現ベクターをトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞またはＨｅＬａ細胞を回収した。蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）によって分解し、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦメンブレン（フナコシ社、東京、日本）に転写した。免疫複合体は、Ｋ−Ｒａｓ（ＵＢＩ、カリフォルニア、アメリカ）およびアクチン（サンタクルーズ、カリフォルニア、アメリカ）を用いて特異的ポリクローナル抗体ＥＣＬキット（アマシャム社、バッキンガムシャー、イギリス）によって可視化した。
【００９３】
（８）インビトロＲＮＡｉアッセイ
標的ＲＮＡ切断に関して、本発明者らは変異体ｋ−ｒａｓ鋳型ＤＮＡ（７０ｎｔ）および正常ｋ−ｒａｓ鋳型ＤＮＡ（７０ｎｔ）をＤＮＡシンセサイザーによって合成した。ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ基質を調製するため、鋳型ＤＮＡを、Ｔ７プロモーター配列を含むｋ−ｒａｓ特異的アッププライマーおよびｋ−ｒａｓ特異的ダウンプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。これらの増幅されたｋ−ｒａｓ  ＤＮＡ鋳型をＴ７ポリメラーゼによって転写した。転写された正常および変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ基質を、ＰＡＧＥを用いて抽出した。これらｍＲＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって３２Ｐ標識した。標的ＲＮＡ切断を検出するために、５〜１０  ｎＭ標的ＲＮＡを、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡまたはＵ６−ｄｓＲＮＡを発現する各ＳＷ４８０細胞溶解物と共に、標準的な条件下で（Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ，  １０１，  ２５−３３．）２５℃で２時間インキュベートした。ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡにターゲッティングされるｓｉＲＮＡの場合、１００  ｎＭ  ｓｉＲＮＡをＳＷ４８０細胞溶解物において５〜１０  ｎＭ標的ＲＮＡと共に標準的な条件下で（Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ，  １０１，  ２５−３３．）２５℃で２時間インキュベートした。
【００９４】
（９）細胞増殖速度の検出
各細胞系の増殖速度は、細胞増殖キットＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．，スイス）を用いて製造業者の説明書に従って測定した。
【００９５】
［実施例１］  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターによって制御される２種類のｄｓＲＮＡ発現プラスミドの構築
長いｄｓＲＮＡが核または細胞質でＤｉｃｅｒにより、どのように作用するかは不明であるため、本発明者らは、哺乳類細胞におけるｄｓＲＮＡの発現のために２種類のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（ヒトｔＲＮＡＶａｌに関する遺伝子のプロモーター、およびマウスＵ６プロモーターあるいはヒトＵ６プロモーター）を用いた。適切にデザインされれば、ｔＲＮＡＶａｌに関するヒト遺伝子のプロモーターで生成される転写物を、細胞質から効率よく輸送することができると考えられる。対照的に、Ｕ６プロモータの制御下での転写された小さいＲＮＡｓは、核に存在する（Ｋｏｓｅｋｉ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７３，  １８６８−１８７７．）。次に、本発明者らは、伸長したステムループＲＮＡ（図１Ａ）としてｄｓＲＮＡをｔＲＮＡＶａｌプロモーター（ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ）、マウスＵ６プロモータ（ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ）またはヒトＵ６プロモーター（ｈＵ６−ｄｓＲＮＡ）の３’末端に結合させた。
【００９６】
本発明者らは、ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２において点突然変異を有するＫ−Ｒａｓ変異体のｍＲＮＡを標的としたｄｓＲＮＡ発現プラスミドを構築した（図１Ｂ）。長いｄｓＲＮＡ（＞３０ｍｅｒ）はｍＲＮＡの非特異的縮小を誘導するため（Ｍａｎｃｈｅ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２，  ５２３８−５２４８．、Ｍｉｎｋｓ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５４，  １０１８０−１０１８３．）、ｄｓＲＮＡ内の二本鎖領域の長さは２９ｂｐとした。Ｕ６に基づく構築物の場合、本発明者らは、ステムループＲＮＡの２種類のループモチーフを使用した。一方は、５ヌクレオチド（５’−ＧＡＡＡＡ−３’）からなるループモチーフ、すなわちループ１である（図１Ａ）。他方は、マイクロＲＮＡ（ヒトｍｉｒ−２３；４８）  ループモチーフ、すなわちループ２である（図１Ａ）。前駆体マイクロＲＮＡは輸送され、処理されたマイクロＲＮＡは、転写後遺伝子サイレンシングを務めると考えられる（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９４，  ８５３−８５８．、Ｌｅｅ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＥＭＢＯ  Ｊ，  ２１，  ４６６３−４６７０．、Ｇｒｉｓｈｏｋ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｅｌｌ，  １０６，  ２３−２４．、Ｒｅｉｎｈａｒｔ，  Ｂ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０３，  ９０１−９０６．、Ｌａｕ，  Ｎ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９４，  ８５８−８６２．、Ｌｅｅ，  Ｒ．Ｃ．  ＆  Ａｍｂｒｏｓ，  Ｖ．  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９４，  ８６２−８６４．、Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １６，，  ７２０−７２８．）。
【００９７】
［実施例２］  ｔＲＮＡＶａｌプロモーター制御下のｄｓＲＮＡの細胞質におけるＤｉｃｅｒ複合体による処理
ＲＮＡｉにおいて、長いｄｓＲＮＡは、長さが約２１および２２ヌクレオチドで、ＲＮアーゼＩＩＩ様反応に従ってねじれた３’末端を有する短いＲＮＡ二本鎖に処理される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０９，  ３６３−３６６．）。ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡおよびＵ６−ｄｓＲＮＡが哺乳類細胞においてＲＮアーゼＩＩＩ複合体によって処理されるか否かを調べるため、本発明者らは、ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ特異的プローブを用いてノーザンブロット分析を行った。ｔＲＮＡＶａｌまたはＵ６プロモーターの制御下で、ＳＷ４８０細胞にｄｓＲＮＡ発現プラスミドをトランスフェクトさせた。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収して、細胞質と核分画に分離した。各分画のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離し、１５％ポリアクリルアミドゲルで分画した。図２に示すように、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現する細胞において、処理されたｓｉＲＮＡが細胞質分画において検出されたが、核分画では検出されなかった。更に、処理されたｓｉＲＮＡｓの配列は、ｓｉＲＮＡクローニングおよびシークエンシングによって確認された（データは示していない）。
【００９８】
対照的に、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡまたはｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）を発現する細胞では、大部分が処理されていない前駆体ｄｓＲＮＡが核に検出された。ｍＵ６−ｄｓＲＮＡまたはｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）を発現する細胞の核画分はｓｉＲＮＡをほとんど含まなかった。しかし、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）およびｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）は細胞質へ輸送され、効率的に処理された（図２）。
【００９９】
哺乳動物のＤｉｃｅｒの大部分が、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける免疫染色によって細胞質に検出されている（Ｂｉｌｌｙ，  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９８，  １４４２８−１４４３３．）。そのため、細胞質へ輸送されたｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）、およびｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）は、Ｄｉｃｅｒ様ＲＮａｓｅＩＩＩ複合体によって処理されたと考えられる。
【０１００】
ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒによって処理されるかどうかを確認するために、本発明者らは、ポリ（Ａ）連結Ｄｉｃｅｒ指向リボザイム（Ｄｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００）発現プラスミドを構築した。次いで、このプラスミドをＨｅＬａ細胞に安定に導入した。安定な細胞系はネオマイシンによる選抜によって得られた。次に、Ｄｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００によるｄｉｃｅｒ遺伝子の発現抑制を調べるために、ｄｉｃｅｒ  ｍＲＮＡ特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。図３Ａに示すように、Ｄｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００発現細胞におけるｄｉｃｅｒ  ｍＲＮＡレベルは、ＷＴ−ＨｅＬａ細胞におけるｄｉｃｅｒ  ｍＲＮＡレベルと比較して減少した。対照であるＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡレベルは両細胞系において変化がなかった。これらの結果から、Ｄｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００はｄｉｃｅｒ  ｍＲＮＡを特異的に切断することが分かった。
【０１０１】
Ｄｉｃｅｒの減少がｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡの処理に影響しているかどうかを調べるために、本発明者らは、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ発現細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてノーザンブロット分析を行った。図３Ｂに示すように、Ｄｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００発現細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの場合、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡから生じたｓｉＲＮＡは、核および細胞質の両方において観察されなかった。従ってこれらの結果から、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡが細胞質においてＤｉｃｅｒにより処理されることが示唆される。対照的に、Ｄｉｃｅｒの減少は、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）の処理に影響しなかった。従って、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）の処理は、別のＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素により行われている可能性がある。
【０１０２】
［実施例３］  ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ、Ｕ６−ｄｓＲＮＡあるいは合成ｓｉＲＮＡを含む細胞抽出物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ標的ｍＲＮＡ分解
ｄｓＲＮＡ−媒介遺伝子サイレンシングによる標的ｍＲＮＡ分解がどの区画において起こるかを調べるために、本発明者らは、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡの転写物を含む細胞抽出物を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡｉアッセイを行った。これらアッセイにおいて、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ７ポリメラーゼによって基質として転写される変異体および正常ｋ−ｒａｓ部分的ｍＲＮＡを用いた。標的ｍＲＮＡを切断するために、各基質を、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞抽出物と共に２５℃で２時間インキュベートした。５’切断産物をシークエンシングゲル上で分解した。図４Ａに示すように、変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ基質は、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを含む細胞抽出物の細胞質分画において切断された（レーン４）。対照的に、細胞抽出物の核分画では、基質は切断されなかった（レーン３）。ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ；  ＲＩＳＣ）はリボソーム分画に含まれることが以前に報告されている（Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ，  １０１，  ２５−３３．、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０９，  ３６３−３６６．、Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９３，  １１４６−１１５０．）が、これらの結果はそれを支持するものである。
【０１０３】
これらの結果とは対照的に、正常ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ基質の場合、基質の５’切断産物は、有意により少ない量が検出され、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡの転写物を含む細胞抽出物の細胞質分画のみに見られた（図４Ａ、レーン２）。これらの結果は、ｓｉＲＮＡの中心部にミスマッチ塩基対１個を有する合成ｓｉＲＮＡでは、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の溶解物とｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡｉアッセイを用いる標的ＲＮＡの抑制効率が減少したという報告と一致した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０，  ６８７７−６８８８．）。本発明者らは、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡから生成したｓｉＲＮＡが、シークエンシング分析によってｓｉＲＮＡの中央の位置において正常なｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡに対するミスマッチ塩基対を有することを確認した（データなし）。変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡにターゲッティングされる合成ｓｉＲＮＡｓを用いて類似の結果を得た（図４Ｂ；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，  Ｇ．  ＆  Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．Ｄ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９７，  ２０５６−２０６０．）。このように、本発明者らの結果により、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる標的ｍＲＮＡ分解も同様に細胞質で起こり、ｓｉＲＮＡが中央の位置における一つのミスマッチ塩基対を区別できることが示唆された。
【０１０４】
［実施例４］  結腸癌細胞におけるｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉの有効性と特異性
ヒト結腸癌ＳＷ４８０細胞におけるｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉの特異性と有効性を調べるために、本発明者らは、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡおよび４種類のＵ６−ｄｓＲＮＡ発現プラスミドをＳＷ４８０細胞およびＨｅＬａ細胞に導入した。変異体ｋ−ｒａｓ遺伝子はＳＷ４８０細胞に限り発現した（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｃ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２２４，  １４８−１５３．）。本発明者らは、対照として正常なｋ−ｒａｓ遺伝子を発現するＨｅＬａ細胞を用いた。次に、本発明者らは、ピューロマイシン選抜により、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡまたは各Ｕ６−ｄｓＲＮＡを発現する安定な細胞株を得た。
【０１０５】
次に、本発明者らは、Ｋ−Ｒａｓ特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析により、ｔＲＮＡ−または各Ｕ６−ｄｓＲＮＡを発現する細胞におけるＫ−Ｒａｓ蛋白質レベルをチェックした。定量のため、バンド強度をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｙｓを用いてデンシトメトリーにより分析した。図５に示すように、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）あるいはｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）を発現するＳＷ４８０細胞のＫ−Ｒａｓ蛋白質レベルは、野生型（ＷＴ）ＳＷ４８０細胞と比較して有意に減少したが、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）あるいはｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）を発現するＳＷ４８０細胞におけるＫ−Ｒａｓ蛋白質レベルは、野生型ＳＷ４８０細胞と比較してほとんど変化しなかった。内部対照としてのアクチン蛋白質レベルは、これらの細胞株において一定のままであった。その上、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現するＨｅＬａ細胞において、Ｋ−Ｒａｓ蛋白質レベルは、野生型細胞および各Ｕ６−ｄｓＲＮＡを発現する細胞と比較して変化しなかった。これらの結果は、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡのヒト癌細胞における効率性および特異性の双方を明確に示した。
【０１０６】
次に、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現する細胞の表現型を調べるために、本発明者らは、これらの細胞株の増殖速度を分析した。図６に示すように、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現するＳＷ４８０細胞における増殖速度は、野生型ＳＷ４８０細胞より有意に遅かった。対照的に、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現するＨｅＬａ細胞における増殖速度は、野生型ＳＷ４８０細胞と比較して変化なかった。これらの結果は、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現するＳＷ４８０細胞における増殖速度の減少が、細胞におけるＫ−Ｒａｓ蛋白質レベルの減少と相関することを示した。本発明者らのｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを変異体ｋ−ｒａｓにターゲッティングすることは、治療物質としての潜在的有用性を有するであろう。
【０１０７】
［実施例５］  ヒトＤｉｃｅｒ遺伝子のクローニングおよび組換えヒトＤｉｃｅｒ（ｒｅ−ｈＤｉｃｅｒ）の精製
特定の標的ｍＲＮＡの中のさまざまな部位をターゲットできる不均一なｓｉＲＮＡを調製するために、ヒト細胞におけるＲＮＡｉに関与するヒトＤｉｃｅｒを用いた。まず、本発明者らは、細菌発現系を使用して、組換えヒトＤｉｃｅｒ／ＨＥＲＮＡ（ｈＤｉｃｅｒ）を作製した。
【０１０８】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン社、カリフォルニア、米国）に組み込まれた部分長ヒトｄｉｃｅｒ／ＨＥＲＮＡ遺伝子（ｎｔ  ３７９〜１６５７およびｎｔ  １３９０〜７０３７）を、Ｄｒ．Ｍａｔｓｕｄａ（名古屋大学；  Ｍａｔｓｕｄａ，  Ｓ．，  Ｉｃｈｉｇｏｔａｎｉ，  Ｙ．，  Ｏｋｕｄａ，  Ｔ．，  Ｉｒｉｍｕｒａ，  Ｔ．，  Ｎａｋａｔｓｕｇａｗａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｍ．  （２０００）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  （ＨＥＲＮＡ）  ｗｈｉｃｈ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＲＮＡ−ｈｅｌｉｃａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １４９０，  １６３−１６９．）より譲り受けた。本発明者らは、特異的プライマー（フォワードプライマー：５’−ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＣＡＡ  ＣＣＣ  ＣＴ−３’／配列番号：８；リバースプライマー：５’−ＡＧＴ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＣＴＴ−３’／配列番号：９）を用いて、ＨｅＬａ  ｃＤＮＡライブラリーからｄｉｃｅｒの５’末端側コード領域（１８３〜９０２位の塩基）をＰＣＲによって増幅し、増幅されたＤＮＡをＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社、カリフォルニア、米国）にクローニングした。そして、前記部分長ヒトｄｉｃｅｒ（ｈＤｉｃｅｒ）ｃＤＮＡから全長ヒトｄｉｃｅｒ遺伝子をクローニングした。次いで、ｈＤｉｃｅｒの全長ｃＤＮＡを切断し、それらの平滑末端断片を、組換えタンパク質の精製のためのビオチンタグを含有しているＰｉｎＰｏｉｎｔ（登録商標）−Ｘａベクター（プロメガ社、ウィスコンシン、米国）へＥｃｏＲＶ部位を用いてサブクローニングした。次に、ｈＤｉｃｅｒ発現プラスミド（ｐｈＤｉｃｅｒ）を２μＭのビオチンとともに大腸菌へ導入し、１００μＭ  ＩＰＴＧにより発現を誘導した。その後、細胞を回収し、５，０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿させ、細胞溶解用緩衝液［１００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １ｍＭ  ＤＴＴ，  ２  ｍＭ  ＰＭＳＦ，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）］に再懸濁した。
【０１０９】
次に、製造業者のプロトコールに従い、ストレプトアビジンを結合させたＳｏｆｔＬｉｎｋ（登録商標）樹脂（プロメガ）を用いた「プルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）」法によってｒｅ−ｈＤｉｃｅｒの調製液（０．５μｇ）の等量液を精製し、Ｘａ因子プロテアーゼを使用してビオチンタグから単離した。このｈＤｉｃｅｒを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）で分画し、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜（フナコシ社、東京、日本）に転写した。そして、ＥＣＬキット（アマシャム社、バッキンガムシャー、イギリス）とストレプトアビジン・アルカリホスファターゼを使用して可視化するウェスタンブロッティングにより検出した。
【０１１０】
その結果、図７Ａに示したように、ビオチンタグを有する組換えｈＤｉｃｅｒが、ウェスタンブロッティングにより検出された。ｒｅ−ｈＤｉｃｅｒの推定分子量は、およそ２２０ｋＤａである。対照的に、ｈＤｉｃｅｒ遺伝子をコードしていないモックベクターでは、同タンパク質を得られなかった。従って、組換えｈＤｉｃｅｒは、この発現系を使用して作製されうることが分かった。
【０１１１】
［実施例６］  インビトロ・プロセシング・アッセイ
次に、組換えｈＤｉｃｅｒがＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有することを確認するため、インビトロ転写により作製した長鎖ｄｓＲＮＡを使用してインビトロ・プロセシング・アッセイを実施した。
【０１１２】
まず、基質として用いる長鎖ｄｓＲＮＡを作製するため、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｎｔ  １〜３００）、Ｈ−ｒａｓ遺伝子（ｎｔ  ３７０〜５７０）、ｃ−ｊｕｎ遺伝子（ｎｔ  １〜２００）、およびｃ−ｆｏｓ遺伝子（ｎｔ  １〜２００）を、Ｔ７プロモーターを含む特異的フォワードプライマーと、ＳＰ６プロモーターを含む特異的リバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。次いで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりセンス鎖ＲＮＡを生成させ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによりアンチセンス鎖ＲＮＡを生成させた。ピューロマイシン耐性ｍＲＮＡおよびＨ−ｒａｓ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、全てＪａｐａｎ  Ｂｉｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＪＢｉｏＳ）Ｃｏ  Ｌｔｄ．（埼玉、日本）により合成した。次いで、これらのＲＮＡを標準的な方法を使用してアニーリングさせた（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  （２００１）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ２１−  ａｎｄ  ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  １８８−２００．）。
【０１１３】
ｈＤｉｃｅｒの活性を調べるため、１０μｇのｄｓＲＮＡと１μｇのｒｅ−ｈＤｉｃｅｒを２００μｌの反応用緩衝液［１００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  １  ｍＭ  ＡＴＰ，  ５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．０）］の中で混合した。上記ＭｇＣｌ２は添加あるいは添加せずに使用した。この混合液を３７℃で３０分間インキュベートした後、２０μｌの反応混合液を、非変性１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して分画した。Ｓｙｂｅｒ（登録商標）グリーンＩＩ試薬（ニッポンジーン社、富山、日本）を用いて、ＲＮＡバンドを検出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ヌクレオチド除去用キット（ＱＩＡＧＥＮ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて、この反応混合液から２１〜２３塩基長のｓｉＲＮＡを回収した。ｓｉＲＮＡは、エタノールで沈殿させてから、ＴＥ緩衝液に溶解した。２６０  ｎｍにおける吸光度を測定して、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの濃度を算定した。
【０１１４】
結果、図７Ｂに示したように、組換えｈＤｉｃｅｒ  の存在下では、２０〜２５ｎｔのｓｉＲＮＡが生成した。対照的に、組換えｈＤｉｃｅｒまたはＭｇ２＋イオンの非存在下では、これらのｓｉＲＮＡは検出されなかった（レーン１および３）。従って、組換えｈＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡプロセシング活性を有意に示し、またｒｅ−ｈＤｉｃｅｒは、Ｍｇ２＋に依存したｄｓＲＮＡプロセッシング活性を示した。昆虫細胞においても組換えｈＤｉｃｅｒがリボヌクレアーゼＩＩＩ活性を示すことが最近報告された（Ｈａｒｂｏｒｔｈ，  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１４，  ４５５７−４５６５，  （２００１）、Ｐｒｏｖｏｓｔ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｄｉｃｅｒ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２１，  ５８６４−５８７４，  （２００２））。
【０１１５】
［実施例７］  ピューロマイシン耐性遺伝子を標的としたｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの効果
哺乳動物細胞において、合成２１ｎｔ  ｓｉＲＮＡが、レポーター遺伝子および内因性遺伝子の両方の発現を有意に抑制することが知られている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｒｔｈ，  Ｊ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．，  Ｙａｌｃｉｎ，  Ａ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  （２００１）  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１，  ４９４−４９８．；  Ｈａｒｂｏｒｔｈ，  Ｊ．，  Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｂｅｃｈｅｒｔ，  Ｋ．，  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ，  Ｋ．  （２００１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１４，  ４５５７−４５６５．；  Ｈｏｌｅｎ，  Ｔ．，  Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，  Ｍ．，  Ｗｉｉｇｅｒ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｂａｂａｉｅ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｒｙｄｚ，  Ｈ．  （２００２）．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３０，  １７５７−１７６６．）。長鎖ｄｓＲＮＡ（＞３０ｎｔ）は、ＩＦＮにより媒介される防御経路に関与しているＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素を活性化するが、これらの比較的短いｓｉＲＮＡは、これらの酵素の活性化を回避するとともに、ＲＮＡｉ経路を活性化することができる。従って、これらのｓｉＲＮＡは、遺伝子発現における配列特異的遺伝子サイレンシングに有用である。しかしながら、ｓｉＲＮＡは標的部位依存性を有することが報告されており（Ｈｏｌｅｎ，  Ｔ．，  Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，  Ｍ．，  Ｗｉｉｇｅｒ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｂａｂａｉｅ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｒｙｄｚ，  Ｈ．  （２００２）．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３０，  １７５７−１７６６．）、最高の（効率的な）標的部位を予測することは極めて困難である。ｓｉＲＮＡの標的部位依存性は、ヒト組織因子（ｈＴＦ）遺伝子でしか調査されていないため（Ｈｏｌｅｎ，  Ｔ．，  Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，  Ｍ．，  Ｗｉｉｇｅｒ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｂａｂａｉｅ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｒｙｄｚ，  Ｈ．  （２００２）．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３０，  １７５７−１７６６．）、本発明者らは、さらに、ピューロマイシン耐性遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの標的部位依存性を、この遺伝子内の以下に示す１０個の標的部位（部位１〜１０）を選択することにより検討した（図８Ａおよび８Ｂ）。
【０１１６】
部位１：５’−  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  Ａ  −３’／配列番号：１０；
部位２：５’−  ＣＴＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  Ｇ  −３’／配列番号：１１；
部位３：５’−  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＣＣＧ  Ｃ  −３’／配列番号：１２；
部位４：５’−  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＡＣＧ  ＣＧＣ  Ｇ  −３’／配列番号：１３；
部位５：５’−  ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  Ｃ  −３’／配列番号：１４；
部位６：５’−  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  Ｇ  −３’／配列番号：１５；
部位７：５’−  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  Ｇ  −３’／配列番号：１６；
部位８：５’−  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  Ｃ  −３’／配列番号：１７；
部位９：５’−  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  Ｇ  −３’／配列番号：１８；
部位１０：５’−  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＣＣＣ  Ｇ  −３’／配列番号：１９
【０１１７】
ＧＬ３−ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを、対照として使用した。ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡ構築のため、ピューロマイシン耐性遺伝子の部分長ｍＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖（１〜３００ｎｔ）の両方を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロで転写し、次いで組換えｈＤｉｃｅｒにより処理した。ｄｓＲＮＡをインビトロで断片化してから、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ヌクレオチド除去用キットを用いてゲル抽出法によりｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡを精製した。次に、各ｓｉＲＮＡ（２０  ｎＭ）およびピューロマイシン耐性遺伝子発現プラスミドを、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）（インビトロジェン社）試薬を使用して製造業者の指示に従い、ＨｅＬａ細胞へ導入した。ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。３６時間後、ＨｅＬａ細胞をピューロマイシンで処理し、細胞生存率をトリパンブルー染色を使用して測定した。各ｓｉＲＮＡの形質転換効率は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を用いて測定した。
【０１１８】
図８Ｂに示すように、ＧＬ３ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡの存在下では、細胞生存率は、野生型ＨｅＬａ細胞と比較して変化がなかった。部位２、部位３、部位４、部位５、および部位１０に対し特異的なｓｉＲＮＡで処理した細胞の生存率は、野生型細胞と比較して有意に減少していた。対照的に、部位１、部位６、部位７、部位８、および部位９に対するｓｉＲＮＡは、比較的低い阻害活性を示した。
【０１１９】
これらの結果は、ピューロマイシン耐性遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡの効率は、標的ｍＲＮＡ内の標的部位に依存していることを示している。予想通り、特定のｍＲＮＡに対し制限を設けないターゲッティング部位からなるｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡは、何れの特異的なｓｉＲＮＡよりも、または、部位１、部位２、部位３、部位４、および部位５のｓｉＲＮＡを混合したものよりも効率的であった。
【０１２０】
さらに、標的部位のＧＣ含量および標的遺伝子の二次構造を解析したところ、ｍｆｏｌｄプログラムの予想によれば（図８Ｂ；Ｚｕｋｅｒ，  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ．  ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ，  Ｊ．，  ＆  Ｃｌａｒｋ，  Ｂ．Ｆ．Ｃ．  （ｅｄｓ），  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｈｉｎｇｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ．  （１９９９））二次構造またはＧＣ含量（表１）のいずれも、標的部位の有効性の高さに明確に相関関係があるとは認められなかった。
【０１２１】
【表１】
2005046003.tif 000002
【０１２２】
標的遺伝子の場合には、標的遺伝子の２０〜２８０  ｎｔ領域、および３’末端近傍領域を標的とするｓｉＲＮＡが、試験した限りでは他のものと比べても、かなり効率的であった。
【０１２３】
［実施例８］  Ｈ−ｒａｓ遺伝子を標的としたｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの効果
さらに、内因性遺伝子発現に対するｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの効果を確認するため、標的としてＨ−ｒａｓ遺伝子を選択した。Ｈ−ｒａｓ遺伝子は、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓも含むｒａｓ遺伝子ファミリーのメンバーである（Ａｄｊｅｉ，  Ａ．Ａ．  （２００１）．  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｒａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ．Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  ９３，  １０６２−１０７４．）。また、ｓｉＲＮＡの標的部位依存性を確認するため、Ｈ−ｒａｓ遺伝子内の以下に示す１０個の標的部位（部位１〜１０）を選択した（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１２４】
部位１：５’−  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＧＡＡ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  Ｇ  −３’／配列番号：２０；
部位２：５’−  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＴＧ  Ｇ  −３’／配列番号：２１；
部位３：５’−  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＡＧ  Ｇ  −３’／配列番号：２２；
部位４：５’−  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  Ｔ  −３’／配列番号：２３；
部位５：５’−  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  Ｇ  −３’／配列番号：２４；
部位６：５’−  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＧＣＣ  Ｃ  −３’／配列番号：２５；
部位７：５’−  ＴＣＴ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  Ｃ  −３’／配列番号：２６；
部位８：５’−  ＧＡＣ  ＣＣＧ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  Ｇ  −３’／配列番号：２７；
部位９：５’−  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  Ｔ  −３’／配列番号：２８；
部位１０：５’−  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  Ａ  −３’／配列番号：２９
【０１２５】
ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡを構築するため、まずＨ−ｒａｓ遺伝子における他ｒａｓファミリーメンバーとの相同性が低い領域を探索した。Ｈ−ｒａｓ遺伝子の３’領域に相当する領域（３００〜５００ｎｔ）を長鎖ｄｓＲＮＡ基質として選択し、組換えｈＤｉｃｅｒにより処理した。Ｈ−ｒａｓ遺伝子を標的とするｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡを、実施例６と同様の方法により作製した。各ｓｉＲＮＡ（２０  ｎＭ）を、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）試薬（インビトロジェン社）を使用して製造業者の指示に従い、ＨｅＬａ細胞へ導入した。３６時間後、各ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を収集し、各細胞から全タンパク質を抽出した。Ｈ−Ｒａｓタンパク質のレベルを、Ｈ−ｒａｓ特異的抗体を用いてウェスタンブロッティングにより検出した。内部対照としてアクチンを使用した。詳しくは、Ｈ−Ｒａｓタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）により分画してから、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜（フナコシ社、東京、日本）へと転写した。Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、および、内部対照としてのアクチンに対する特異的ポリクローナル抗体（抗Ｈ−Ｒａｓポリクローナル抗体：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、カリフォルニア、米国；抗Ｎ−Ｒａｓポリクローナル抗体：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製；抗Ｋ−Ｒａｓポリクローナル抗体：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、抗ｃ−Ｊｕｎポリクローナル抗体：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、サンタクルーズ、カリフォルニア、米国；抗ｃ−Ｆｏｓポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）；および抗アクチンポリクローナル抗体：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用い、ＥＣＬ（登録商標）キットによって、免疫複合体を可視化した。デンシトメトリーおよびＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓによって定量化を行った。
【０１２６】
結果、図９Ｃに示したように、部位２、部位３、部位４、部位５および部位９に対するｓｉＲＮＡで処理された細胞においては、Ｈ−Ｒａｓのレベルが、野生型ＨｅＬａ細胞と比較して有意に減少していた。対照的に、部位１、部位６、部位７、および部位８に対するｓｉＲＮＡは、比較的低い阻害活性を示した。
【０１２７】
アクチンのレベルを参照して結果を標準化したところ、ｓｉＲＮＡの効率は、内因性Ｈ−ｒａｓ遺伝子における標的部位に依存することを示している。ピューロマイシン耐性遺伝子の場合も、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の場合にも、これらの遺伝子の中央の領域を標的とした合成ｓｉＲＮＡの効率は低かった。ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡについては、調べた限りでは、他のｓｉＲＮＡのいずれよりも有効であり、また、Ｈ−ｒａｓ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを混合したもの（部位７、部位８、部位９および部位１０のｓｉＲＮＡ）よりも有効であった。
【０１２８】
さらに、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡ処理細胞における、関連タンパク質Ｋ−ＲａｓおよびＮ−Ｒａｓのレベルは、野生型ＨｅＬａ細胞と比較して変化がなかった（図９Ｄ）。従って、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現にもＮ−ｒａｓ遺伝子の発現にも影響を与えなかった。
【０１２９】
さらに、図８Ｂに示したものと同様の構造解析を行ったが（図９Ｂ）、ＧＣ含量（表１）とｓｉＲＮＡによる阻害程度とが相関することを示せなかった。以前の研究で得られた結果は、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびリボザイムの効果には共通の特徴があることを示唆していたため（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．（２００３））、このような推定上の関係をより正確に調べるためには、（例えば、図９Ｂに示したコンピュータ予測による二次構造よりも）インビトロおよびインビボにおける標的ｍＲＮＡとの接触可能性に関する実験データがさらに必要になる可能性が高いと考えられる。ここでも、Ｈ−ｒａｓの場合には、標的遺伝子の一定の領域（２０〜２８０  ｎｔ、および３’末端近傍）を標的とするｓｉＲＮＡが、他の領域を標的とするｓｉＲＮＡよりも有効であり、また、ここでも、断片化したｓｉＲＮＡの方が、各ｓｉＲＮＡや混合ｓｉＲＮＡよりもずっと有効であった（図９Ｃ）。これらの結果は、ピューロマイシン耐性遺伝子で得られた結果と同様であった。ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの方が各ｓｉＲＮＡより活性が高いのは、単に、メッセンジャーＲＮＡ上の多数の部位を標的とすることの相加効果によるとも考えられる。しかし、ｓｉＲＮＡを混合したもの（部位７、部位８、部位９および部位１０のｓｉＲＮＡ）による結果は、この解釈を裏付けられなかった。それよりも、ｓｉＲＮＡの効果は、標的部位の僅かな違いによっても（ほんの数塩基異なるだけでも）変化するという可能性の方が高く、そのため、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡは、各ｓｉＲＮＡの組み合わせよりも、更に有効性の高いｓｉＲＮＡ集団をいくつか含んでいると考えられる。これらの結果は、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡが、個々の合成ｓｉＲＮＡよりも明らかに有益であることを示唆するものである。
【０１３０】
［実施例９］  ｃ−ｊｕｎ  ｍＲＮＡ又はｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡを標的としたｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの効果
さらに、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの効果を確認するため、本発明者らはｃ−ｊｕｎ  ｍＲＮＡ又はｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡそれぞれに対するｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡを構築した。まず、ｃ−ｊｕｎ遺伝子（１〜２００ｎｔ）、又はｃ−ｆｏｓ遺伝子（１〜２００ｎｔ）の５’領域に相当する長鎖ｄｓＲＮＡを作製し、次いで組換えｈＤｉｃｅｒにより処理した。ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡは、実施例６と同様の方法を使用して作製した。次いで、これらのｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞へ導入した。３６時間後、これらの細胞を収集し、各細胞から全タンパク質を抽出した。ｃ−Ｊｕｎタンパク質又はｃ−Ｆｏｓタンパク質のレベルを、各特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングを使用して検出した。
【０１３１】
その結果、図１０に示すように、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡで形質転換した細胞においては、ｃ−Ｊｕｎのレベルが、野生型ＨｅＬａ細胞と比較して有意に減少していた。形質転換細胞でも野生型細胞でも、アクチンの発現レベルは変化しなかった。同様の結果が、ｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡに対するｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの場合にも得られた。
【０１３２】
これらの結果より、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡが、ヒト細胞において特定の遺伝子をサイレンシング状態にするのに極めて有用である可能性が示された。
【０１３３】
［実施例１０］  種々のｓｈＲＮＡをコードするプラスミドの構築
本発明者らは、ｓｈＲＮＡ、すなわち、ｔＲＮＡＶａｌプロモーターに基づくｓｈＲＮＡ（ｔＲＮＡｉ）、ヒトＵ６プロモーターに基づくｓｈＲＮＡ（ｈＵ６ｉ）、およびマウスＵ６プロモーターに基づくｓｈＲＮＡ（ｍＵ６ｉ）の３種類のｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現用のベクターを構築した。ｐＰＵＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に、ヒトｔＲＮＡＶａｌ遺伝子の化学合成プロモーターを含むｐＰＵＲ−ｔＲＮＡプラスミドを使用した。これら構築物は、各々ヒトｅｒｂＢ２遺伝子の転写物を標的としたものである（図１１Ａ）。
【０１３４】
本発明者らは、ｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡ内に５つの標的部位（部位１：５’−ＡＡＧ  ＵＧＵ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＵＧＡ  ＡＧＣ  ＵＧ−３’／配列番号：３１、部位２：５’−ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＣＵＧ  ＧＡＣ  ＡＵＧ  ＣＵＣ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＵＣ  ＵＡ−３’  ／配列番号：３２、部位３：５’−ＵＧＣ  ＵＣＡ  ＵＣＧ  ＣＵＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＵＧＡ  ＧＧＣ  ＡＧ−３’  ／配列番号：３３、部位４：５’−ＡＡＧ  ＡＵＣ  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＡＣＧ  ＡＵＧ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＵ−３’  ／配列番号：３４、部位５：５’−ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＧＣＵ  ＵＡＵ  ＧＣＣ  ＣＵＡ  ＵＧＧ  ＣＵＧ  ＣＣＵ  ＣＵ−３’  ／配列番号：３５）、およびＧＦＰ  ｍＲＮＡ内に１つの部位（５’−ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＣＵＧ  ＡＣＣ  ＣＵＧ  ＡＡＧ  ＵＵＣ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＣ−３’  ／配列番号：３６）を選択した（図１１Ｂ）。ループ配列（５’−ＧＡＡＡＡ−３’）で連結された、センス鎖（２９ｎｔ）およびアンチセンス鎖（２９ｎｔ）ｅｒｂＢ２遺伝子をコードする化学合成オリゴヌクレオチドを、特異的アッププライマーおよびダウンプライマーを用いて二本鎖配列としてＰＣＲで増幅した。ＳａｃＩおよびＫｐｎＩで消化した後、断片を、ｐＰＵＲ−ｔＲＮＡのｔＲＮＡ遺伝子プロモーター下流にクローニングした。ｍＵ６およびｈＵ６プロモーターからのｄｓＲＮＡ発現用のベクターの構築は文献（Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０，  ４４６−４４８  （２００２）．，  Ｋａｔｏ，  Ｙ．，  Ｋｕｗａｂａｒａ，  Ｔ．，  Ｗａｒａｓｈｉｎａ，  Ｍ．，  Ｔｏｄａ，  Ｈ．，  ＆  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｋｉｎｄｓ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  １５３７８−１５３８５  （２００１）．，  Ｏｈｋａｗａ，  Ｊ．，  ＆  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｓｎＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１，  ５７７−５８５  （２０００）．）に記載されている。
【０１３５】
［実施例１１］  細胞の培養およびトランスフェクション
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞は、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸溶液、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したＭＥＭ（アイシーエヌバイオメディカルズ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．），ＵＳＡ）中で培養した。ＭＣＦ−７細胞を約５×１０６細胞／１０ｃｍディッシュまで増殖させ、次いで、Ｅｆｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬（キアゲン）を用いてｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ、ｈＵ６−ｄｓＲＮＡ、またはｍＵ６−ｄｓＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした。ピューロマイシンと２週間インキュベーションし、安定してｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡまたはＵ６−ｓｈＲＮＡを発現する形質転換ＭＣＦ−７細胞を選択した。
【０１３６】
［実施例１２］  細胞の核画分および細胞質画分の調製
トランスフェクションの３６時間後に、細胞を採取した。細胞質画分を調製するために、収集した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ジギトニン溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ酢酸カリウム、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、および５０μＭ／ｍｌジギトニン）に氷上で１０分間、再懸濁した。溶解産物を１，０００×ｇで遠心分離し、上清を細胞質画分として収集した。
【０１３７】
また、ペレットを、ＮＰ−４０溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５％ＮＰ−４０）に再懸濁し、氷上で１０分間、保持した。結果として得られた溶解産物を核画分として使用した。
【０１３８】
［実施例１３］  ＭＣＦ−７細胞におけるｓｈＲＮＡの発現確認
さらに実施例１１で得られた形質転換ＭＣＦ−７細胞において、様々なｓｈＲＮＡの発現を確認した。細胞質ＲＮＡおよび核ＲＮＡを抽出し、ＩＳＯＧＥＮ（商標）試薬（和光純薬工業（Ｗａｋｏ）、大阪、日本）を用いて、それぞれ細胞質画分および核画分を精製した。レーン１つにつき３０マイクログラムの総ＲＮＡを電気泳動のために１２％ポリアクリルアミドゲルにロードし、この後、ＲＮＡのバンドを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（商標）ナイロン膜（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏ．），Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に転写した。膜を、ｅｒｂＢ２遺伝子内の配列に相補的な合成オリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＧ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧ−３’  ／配列番号：３７）でプローブした。それぞれの合成プローブは、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム（アマシャム）を用いて標識した。
【０１３９】
結果、図１１Ｃに示すように、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現細胞の細胞質において、前駆体ｓｈＲＮＡおよびプロセシングされたｓｉＲＮＡを検出した（レーン２）。対照的に、ｈＵ６−ｓｈＲＮＡまたはｍＵ６−ｓｈＲＮＡ発現細胞の核において、前駆体ｓｈＲＮＡおよび少量のｓｉＲＮＡを検出したが（レーン３および５）、細胞質では検出しなかった（レーン４および６）。
【０１４０】
これらの結果から、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡが細胞質に効率的に輸送されたことが分かり、ｓｉＲＮＡがＤｉｃｅｒによって前駆体ｓｈＲＮＡから生成された可能性があることが示唆された。
【０１４１】
［実施例１４］  ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの発現調節のためのテトラサイクリン依存誘導系の構築
テトラサイクリン依存誘導系を構築するために、７コピーのテトラサイクリンオペレーター配列（５’−ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＧ−３’  ／配列番号：３８）を、ｐＰＵＲ−ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡのｔＲＮＡプロモーター下流に挿入した。ＭＣＦ−７−ＴＲ細胞系を構築するために、テトラサイクリンリプレッサー遺伝子をコードするｐＴｅｔ−Ｔｔｓ（クロンテック）を、ネオマイシン耐性遺伝子をコードするｐｃＤＮＡ３．１−ｎｅｏ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＣＡ，ＵＳＡ）と共にＭＣＦ−７細胞に導入した。ＭＣＦ−７−ＴＲ細胞系はネオマイシンによる選択によって得た。ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの発現調節のために、本発明者らは、ｓｈＲＮＡ転写の誘導物質として様々な濃度のドキシサイクリン（クロンテック）を使用した。
【０１４２】
［実施例１５］  ｅｒｂＢ２遺伝子発現に対するｓｈＲＮＡの影響
ＭＣＦ−７細胞でｅｒｂＢ２遺伝子発現に対するｓｈＲＮＡの影響、すなわち、ｔＲＮＡｉ−ＥｒＢ２、ｈＵ６ｉ−ＥｒＢ２、およびｍＵ６ｉ−ＥｒＢ２の影響を調べるために、ＥｒＢ２特異的抗体を用いてウェスタンブロッティング分析を行った。
【０１４３】
個々のｓｈＲＮＡをコードするベクターでトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞を収集した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）によって分離し、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜（フナコシ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｃｏ．）、東京、日本）に転写した。ＥＣＬ検出キット（アマシャム）ならびにＥｒｂＢ２に対するポリクローナル抗体（オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ），ＣＡ，ＵＳＡ）および内因性対照としてアクチンに対するポリクローナル抗体（オンコジーン）を用いて、免疫複合体を視覚化した。定量のために、バンドの強度を、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムを用いてデンシトメトリーによって分析した。ＥｒｂＢ２タンパク質レベルはアクチンレベルを用いて標準化した。
【０１４４】
結果、図１１Ｄに示すように、ｔＲＮＡｉ−ＥｒＢ２（部位２および３に向けられる）、ｈＵ６ｉ−ＥｒＢ２（部位２）、およびｍＵ６ｉ−ＥｒＢ２（部位２）を発現するＭＣＦ−７細胞におけるＥｒＢ２タンパク質レベルは、野生型ＭＣＦ−７細胞より有意に少なかった。さらに、その効果は標的部位の選択によって左右されたが、ｔＲＮＡｉ−ＥｒＢ２の影響は少なくともｈＵ６ｉ−ＥｒＢ２の影響と同程度、あるいはそれ以上だった。内因性対照として選択されたアクチンのレベルは、全ての細胞系において一定のままであった。これらの結果から、ｅｒｂＢ２転写物に対するＲＮＡｉにおいて細胞質ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの有用性がはっきりと証明された。
【０１４５】
［実施例１６］  ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現トランスジェニックマウス
さらに、本発明者らは、本発明のｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡがマウスにおいて機能し得るかどうかを、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスを作製して調べた。
【０１４６】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｏｋａｂｅ  Ｍ，，  Ｉｋａｗａ  Ｍ．  Ｋｏｍｉｎａｍｉ  Ｋ．  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｔ．，  ＆  Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ  Ｙ．  ’Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｅ’  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｇｒｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４０７，  ３１３−３１９  （１９９７）．）の遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用し、この遺伝子を、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ（ｔＲＮＡｉ−Ｅ１２６）、ｈＵ６−ｓｈＲＮＡ（ｈＵ６−Ｅ１２６）、およびｍＵ６−ｓｈＲＮＡ（ｍＵ６−Ｅ１２６）の標的として使用した（図１２Ａ；Ｅ１２６はＧＦＰ遺伝子配列の一部である）。ｔＲＮＡｉ−Ｅ１２６、ｍＵ６−Ｅ１２６、およびｍＵ６−Ｅ１２６をそれぞれコードする発現プラスミドの精製ＳａｌＩ断片を、ＧＦＰ発現雄マウス（Ｂａｅｒ，  Ｍ．，  Ｎｉｌｓｅｎ，  Ｔ．Ｗ．，  Ｃｏｓｔｉｇａｎ，  Ｃ．，  ＆  Ａｌｔｍａｎ，  Ｓ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｈ１  ＲＮＡ，  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＲＮａｓｅ  Ｐ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８，  ９７−１０３  （１９９０））からの精子と受精させた野生型卵に注入した。次いで、１００個のＤＮＡ注入卵を偽妊娠マウスに移植した。トランスジーンが組み込まれたことはサザンブロッティング分析で調べた。注入卵から、ｔＲＮＡｉ−Ｅ１２６、ｍＵ６−Ｅ１２６、およびｍＵ６−Ｅ１２６をそれぞれ発現するトランスジェニック８細胞桑実胚および胚盤胞を発生させた。これらの細胞におけるＧＦＰ発現を調べるために、緑色蛍光の検出を紫外線（２５４ｎｍ）照射によって行った。さらに、生まれて３日後のｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡトランスジェニックマウスに紫外線（２５４ｎｍ）を照射した。紫外線下、デジタルカードカメラ（ＤＳ−５０５；Ｆｕｊｉｘ，Ｊａｐａｎ）（フィルターなし）を用いて写真を撮影した。
【０１４７】
結果、図１２Ｂに示すように、ｔＲＮＡｉ−Ｅ１２６を発現する桑実胚に紫外線を照射した時、桑実胚は緑色蛍光を発した。対照的に、ｍＵ６−Ｅ１２６またはｍＵ６−Ｅ１２６を発現する桑実胚は緑色蛍光を発した。同様の結果が胚盤胞期で得られたことから（図１３Ａ）、ｔＲＮＡｉ−Ｅ１２６の効力が保持されていることが分かった。さらに、ｔＲＮＡｉ−Ｅ１２６トランスジェニックマウス新生仔が発する緑色蛍光は、ＷＴ（ＧＦＰ発現）マウスより有意に少なかった（図１３Ｂ）。これらの結果から、ｔＲＮＡｉ−Ｅ１２６は、８細胞桑実胚および胚盤胞だけでなくマウス新生仔においても配列特異的ジーンサイレンシングを誘導することが分かった。
【０１４８】
［実施例１７］  ＲＮＡｉ誘導発現系の開発
次に、本発明者らは、ｔＲＮＡｉの潜在的な有用性を考慮し、将来ハウスキーピング遺伝子の機能分析を目標として、ＲＮＡｉの誘導発現系の開発を試みた。詳細に述べると、本発明者らは、ｔＲＮＡＶａｌプロモーターに取り付けたＴｅｔＯ７を用いてｔＲＮＡｉ発現の制御を試みた（図１４および１５）。ＴｅｔＯ７系は、遺伝子発現の「オン／オフ」スイッチとして機能する。
【０１４９】
まず、本発明者らは、ＴｅｔＯ７をｔＲＮＡＶａｌプロモーターに取り付けたベクター、およびテトラサイクリン応答リプレッサー（ｔＴＳ；クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を発現する安定なＭＣＦ−７細胞系（ＭＣＦ−７−ＴＲ）を構築した。次いで、テトラサイクリンに関連した試薬であるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下および非存在下でｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２の発現を調べた。図１４Ｂに示すように、Ｄｏｘ非存在下のＭＣＦ−７−ＴＲ細胞では、ｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２の発現はごくわずかであった（レーン３）。対照的に、Ｄｏｘ存在下の細胞では、かなりのレベルの前駆体ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡが検出された（レーン４）。これらの結果から、本発明のテトラサイクリン誘導系はｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２の発現調節が可能であることが分かった。
【０１５０】
本発明者らはまた、Ｄｏｘに対する用量反応を調べた（図１５Ａ）。ｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２を発現する細胞を、様々な濃度のＤｏｘと共に７２時間培養し、次いで、転写物のレベルをＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２は、培地中に１ｎｇ／ｍｌというわずかなＤｏｘにより、誘導が検出された。Ｄｏｘ濃度が増加するにつれて、転写物のレベルは急速に増加し、１００ｎｇ／ｍｌで完全に活性化した。この用量は、ＴｅｔＯ７非存在系におけるＤｏｘ活性化レベルの８０％と等しかった。さらに、この飽和濃度のＤｏｘでは、培養細胞の増殖挙動および形態に明らかな変化はなかった。
【０１５１】
ＴｅｔＯ７−ｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２の影響を確かめるために、本発明者らはウェスタンブロッティング分析を行った。図１５Ｂに示すように、Ｄｏｘ非存在下では、ＴｅｔＯ７−ｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２構築物を含む細胞におけるＥｒｂＢ２タンパク質レベルはＷＴ  ＭＣＦ−７−ＴＲ細胞と同様であった。対照的に、Ｄｏｘ存在下では、ＥｒｂＢ２タンパク質レベルはＷＴ  ＭＣＦ−７−ＴＲ細胞より有意に少なかった。これらの結果から、本発明者らのテトラサイクリン誘導系はｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２の機能調節を可能にしたことが分かった。ｔＲＮＡｉ−ＥｒｂＢ２の影響は、予想されるように、Ｄｏｘと無関係である。
【０１５２】
本発明において、本発明者らは、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡが細胞質に局在する、ｔＲＮＡに基づくＲＮＡｉ発現系を構築した。
【０１５３】
〔実施例１８〕  酵母株および培養
本発明では、Ｓ．ポンベＴＣＰ１株（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＣＡ，ＵＳＡ）およびＳ．セレビシエＥＧＹ４８株（インビトロゲン，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。
ｙｄｃｒ１−およびｙｒｄｐ１−欠失株はｕｒａ４遺伝子の相同組換えによって作成した。これらの欠失株を、それぞれｙｄｃｒ１、ｙｒｄｐ１、およびｕｒａ４遺伝子の特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認した。
ＬａｃＺ遺伝子を発現するＳ．ポンベは、ＬａｃＺ遺伝子およびｎｍｔプロモーターを含むｐＮＭＴ−ＬａｃＺベクターを用いて調製した。
ＬａｃＺ遺伝子を発現するＳ．セレビシエは、ｐＹｅｓ２−ＬａｃＺプラスミド（インビトロゲン）を細胞に導入した。これらの酵母株は、酵母エキス／ペプトン／デキストロース（ＹＰＤ）培地にて増殖させた。様々なｄｓＲＮＡまたは外因性遺伝子を発現する株の選択には、−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、または−Ｕｒａ  Ｄｏ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ＣＡ，ＵＳＡ）を含む合成デキストロース（ＳＤ）培地を使用した。ゼオシン耐性遺伝子を発現する株は、５０μｇ／ｍｌゼオシン（インビトロゲン）を含むＹＰＤ培地において選択した。
【０１５４】
〔実施例１９〕  ｄｓＲＮＡ発現プラスミドの構築
外因的に発現された長いｄｓＲＮＡが、Ｓ．ポンベおよびＳ．セレビシエにおいてＲＮＡｉを介する遺伝子サイレンシングを誘導するかどうかを確かめるために、本発明者らは、Ｓ．ポンベおよびＳ．セレビシエにおけるｄｓＲＮＡ発現ベクターをそれぞれ構築した。（図１６Ａ）。本発明者らは、これらのｄｓＲＮＡの標的として外因性ＬＥＵ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、および内因性ＰＣＮＡ遺伝子を選択した。Ｓ．ポンベ（ｐＳＰｉ）において、ＬＥＵ２−ｄｓＲＮＡ、ＰＣＮＡ−ｄｓＲＮＡ、およびＬａｃＺ−ｄｓＲＮＡ（３００ｎｔ）の発現は、ｎｍｔ１プロモーターによって制御される。Ｓ．セレビシエ（ｐＳＣｉ）において、ＬａｃＺ−ｄｓＲＮＡ（３００ｎｔ）の発現は、ＧＡＬ１プロモーターによって制御される。
【０１５５】
Ｓ．ポンベにおけるｄｓＲＮＡ発現用ベクター構築には、ｎｍｔプロモーターを含むｐＮＭＴ−ＴＯＰＯクローニングキット（インビトロゲン）を使用した。ＬＥＵ２（ｎｔ．１−３００）、ＰＣＮＡ（ｎｔ．１０５０−１３５０）、またはＬａｃＺ（部位Ａ（ｎｔ．１−３００）；部位Ｂ［ｎｔ．１０００−１３００）；部位Ｃ（ｎｔ．２０００−２３００）］をコードするセンス鎖ＤＮＡを、特異的アッププライマー［ＬＥＵ２（５’−ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＴ−３’  ／配列番号：３９）；ＰＣＮＡ（５’−ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＡ−３’  ／配列番号：４０）；ＬａｃＺ−部位Ａ（５’−ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＡ−３’  ／配列番号：４１）；ＬａｃＺ−部位Ｂ（５’−ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＣ−３’  ／配列番号：４２）；ＬａｃＺ−部位Ｃ（５’−ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ−３’  ／配列番号：４３）］、およびＸｈｏＩ部位を有するダウンプライマー［ＬＥＵ２（５’−ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＡＧ  ＴＡＡ  ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＡＧＧ−３’  ／配列番号：４４）；ＰＣＮＡ（５’−ＴＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＴＧＴ−３’  ／配列番号：４５）；ＬａｃＺ−部位Ａ（５’−ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＣＧＣ−３’  ／配列番号：４６）；ＬａｃＺ−部位Ｂ（５’−ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＧＣＧ−３’  ／配列番号：４７）；ＬａｃＺ−部位Ｃ（５’−ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ−３’  ／配列番号：４８）］によって増幅した。ＰＣＲ産物をｐＮＭＴ−ＴＯＰＯにクローニングした。次いで、アンチセンス鎖ＤＮＡを、ＸｈｏＩ部位を有するアッププライマー［ＬＥＵ２（５’−ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＡＧ  ＴＡＡ  ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＡＧＧ−３’  ／配列番号：４４）；ＰＣＮＡ（５’−ＴＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＴＧＴ−３’  ／配列番号：４５）；ＬａｃＺ−部位Ａ（５’−ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＣＧＣ−３’  ／配列番号：４６）；ＬａｃＺ−部位Ｂ（５’−ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＧＣＧ−３’  ／配列番号：４７）；ＬａｃＺ−部位Ｃ（５’−ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ−３’  ／配列番号：４８）］、およびＳａｌＩ部位を有するダウンプライマー［ＬＥＵ２（５’−ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＴ−３’  ／配列番号：３９）；ＰＣＮＡ（５’−ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＡ−３’  ／配列番号：４０）；ＬａｃＺ−部位Ａ（５’−ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＡ−３’  ／配列番号：４１）；ＬａｃＺ−部位Ｂ（５’−ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＣ−３’  ／配列番号：４２）；ＬａｃＺ−部位Ｃ（５’−ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ−３’  ／配列番号：４３）］を用いてＰ���Ｒで増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＸｈｏＩで消化した。断片を、センス鎖遺伝子を含むｐＮＭＴ−ＴＯＰＯのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。
【０１５６】
Ｓ．セレビシエ用のＬａｃＺ［部位Ａ（ｎｔ．１−３００）；部位Ｂ［ｎｔ．１０００−１３００）；部位Ｃ（ｎｔ．２０００−２３００）］−ｄｓＲＮＡ発現プラスミドを構築する場合、本発明者らはｐＹｅｓ３ＣＴプラスミド（インビトロゲン）を使用した。ＬａｃＺ［部位Ａ（ｎｔ．１−３００）；部位Ｂ［ｎｔ．１０００−１３００）；部位Ｃ（ｎｔ．２０００−２３００）］をコードするセンス鎖ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する特異的アッププライマー［ＬａｃＺ−部位Ａ（５’−ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＡ−３’  ／配列番号：４１）；ＬａｃＺ−部位Ｂ（５’−ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＣ−３’  ／配列番号：４２）；ＬａｃＺ−部位Ｃ（５’−ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ−３’  ／配列番号：４３］およびＫｐｎＩ部位を有するダウンプライマー［ＬａｃＺ−部位Ａ（５’−ＧＧ  ＴＴＡ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  Ｃ／配列番号：４９）；ＬａｃＺ−部位Ｂ（５’−ＣＧ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  Ｇ−３’  ／配列番号：５０）；ＬａｃＺ−部位Ｃ（５’−ＣＣ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  Ｇ−３’  ／配列番号：５１）］を用いてＰＣＲで増幅した。次いで、これらの増幅ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化した。断片をｐＹｅｓ３ＣＴのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ部位にクローニングした。ＬａｃＺ（部位Ａ、部位Ｂ、および部位Ｃ）のアンチセンス鎖ＤＮＡを、ＮｏｔＩ部位を有するアッププライマー［ＬａｃＺ−部位Ａ（５’−ＧＧ  ＴＴＡ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  Ｃ−３’  ／配列番号：４６）；ＬａｃＺ−部位Ｂ（５’−ＣＧ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  Ｇ−３’  ／配列番号：４７）；ＬａｃＺ−部位Ｃ（５’−ＣＣ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  Ｇ／配列番号：４８）］およびＸｈｏＩ部位を有するダウンプライマー［ＬａｃＺ−部位Ａ（５’−ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＡ−３’  ／配列番号：４１）；ＬａｃＺ−部位Ｂ（５’−ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＣ−３’  ／配列番号：４２）；ＬａｃＺ−部位Ｃ（５’−ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ−３’  ／配列番号：４３）］を用いてＰＣＲで増幅した。次いで、これらの増幅ＤＮＡをＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化した。断片を、センス鎖遺伝子を含むｐＹｅｓ３ＣＴのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングした。
【０１５７】
〔実施例２０〕  ｄｓＲＮＡの発現およびｓｉＲＮＡの作成
本発明者らは、Ｓ．ポンベ細胞およびＳ．セレビシエ細胞における前駆体ｄｓＲＮＡの発現およびこれらのｄｓＲＮＡのプロセシングについて、各ｄｓＲＮＡ特異的プローブを用いてノーザンブロット分析を行い確認した。
【０１５８】
総ＲＮＡは、ＹｅａＳｔａｒ  ＲＮＡキット（ザイモリサーチ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて得た。レーン１つにつき３０マイクログラムの総ＲＮＡを２．５％アガロースゲルにロードした。電気泳動後、ＲＮＡのバンドを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（商標）ナイロン膜（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏ．）、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）に転写した。膜を、ｄｓＲＮＡ−ＬＥＵ２（ｎｔ．１−３００）およびｄｓＲＮＡ−ＬａｃＺ（ｎｔ．１−３００）遺伝子の配列に相補的な特異的オリゴヌクレオチドでプローブした。これらのプローブは、ＥＣＬ標識キット（アマシャム、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて標識した。
【０１５９】
結果、図１６Ｂに示すように、ｄｓＲＮＡを発現するＳ．セレビシエ細胞においては、ＬａｃＺ  ｍＲＮＡにターゲッティングされたプロセシングを受けていない前駆体ｄｓＲＮＡが検出されたが、ｓｉＲＮＡはほとんど検出されなかった（図１６Ｂ、レーン５）。対照的に、ｄｓＲＮＡ発現Ｓ．ポンベ細胞においては、前駆体ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方とも検出された（レーン２）。また、ｄｓＲＮＡ−ＬａｃＺ発現Ｓ．ポンベ細胞では、前駆体ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方が検出された（図１６Ｂ、レーン７）。結果を裏付けるように、Ｓ．セレビシエのゲノム配列中にＲＮａｓｅＩＩＩ  Ｄｉｃｅｒ様タンパク質は見出されなかった。これらの結果から、ｓｉＲＮＡはＳ．ポンベにおいて前駆体ｄｓＲＮＡから生成されるが、Ｓ．セレビシエでは生成されないことが示唆された。
【０１６０】
また、Ｓ．ポンベ細胞でのｄｓＲＮＡプロセシングにおけるｙＤｃｒ１の役割を調べるために、本発明者らはｙｄｃｒ１欠失株を構築した。ｙｄｃｒ１欠失株構築は実施例１８に記載のように行った。
【０１６１】
本発明者らが予想したように、ｄｓＲＮＡ発現ｙｄｃｒ１欠失株では、ｓｉＲＮＡは前駆体ｄｓＲＮＡから生成されなかった（図１６Ｂ、レーン３）。従って、Ｓ．ポンベＤｉｃｅｒホモログｙＤｃｒ１は、Ｓ．ポンベ細胞におけるｓｉＲＮＡの生成に必要であることがわかった。
【０１６２】
〔実施例２１〕  Ｓ．ポンベおよびＳ．セレビシエにおける外因性ＬａｃＺ遺伝子の発現に及ぼすｄｓＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響
ｄｓＲＮＡがＳ．セレビシエにおいて配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導できるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＬａｃＺにターゲッティングされたｄｓＲＮＡ発現ベクター（ｐＳＣｉ−ＬａｃＺ）を構築した。
【０１６３】
本発明者らは、ＬａｃＺ  ｍＲＮＡ内にｄｓＲＮＡの３つの標的部位を選択した。次いで、これらのｄｓＲＮＡ発現プラスミドを、ＬａｃＺ遺伝子を発現するＳ．セレビシエ細胞に導入した。各細胞抽出物のβガラクトシダーゼ活性は、Ｙｅａｓｔ  β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙキット（ピアス、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて製造業者のプロトコールに従って測定した。値は、それぞれの場合で３回の反復実験を行い、その結果の平均とＳ．Ｄ．である。
【０１６４】
結果、図１７に示すように、ｄｓＲＮＡ−ＬａｃＺを発現するＳ．ポンベ細胞のＬａｃＺ活性レベルは、野生型Ｓ．ポンベ細胞と比較して減少した。対照的に、ｄｓＲＮＡ−ＬａｃＺを発現するＳ．セレビシエ細胞におけるＬａｃＺ活性レベルは、野生型Ｓ．セレビシエ細胞と比較して十分に減少しなかった。これらの結果から、外因性のｄｓＲＮＡは、Ｓ．セレビシエでは配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導しない可能性があることが示唆された。Ｓ．セレビシエ細胞では、内因性遺伝子にターゲッティングされたｄｓＲＮＡについても、同様の結果が得られた（データ示さず）。
【０１６５】
［実施例２２］  Ｓ．ポンベにおける外因性ＬＥＵ２遺伝子の発現に及ぼすｄｓＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響
ｓｉＲＮＡが、ｄｓＲＮＡ−ＬＥＵ２を発現するＳ．ポンベ細胞において検出されたので、本発明者らは、ロイシン欠損培地（Ｌｅｕ−）にて、Ｓ．ポンベ細胞の増殖を調べた。ＬＥＵ２  ｍＲＮＡにターゲッティングされたｄｓＲＮＡ発現プラスミド（ｐＳＰｉ−ＬＥＵ２）、ＬａｃＺ  ｍＲＮＡにターゲッティングされたｄｓＲＮＡ発現プラスミド（ｐＳＰｉ−ＬａｃＺ）それぞれを、Ｓ．ポンベ細胞に導入した。
【０１６６】
結果、図１８Ａに示すように、ＬＥＵ２遺伝子を発現する野生型（ＷＴ）細胞は、Ｌｅｕ−培地において正常に増殖した。しかしながら、ｄｓＲＮＡ−ＬＥＵ２発現細胞は、この培地では増殖しなかった。
【０１６７】
ｙｄｃｒ１欠失株の場合、ｄｓＲＮＡ−ＬＥＵ２は遺伝子サイレンシングを誘導せず、結果、これらの細胞はＬｅｕ−培地でも増殖した。さらに、ｄｓＲＮＡ−ＬＥＵ２発現細胞におけるＬＥＵ２  ｍＲＮＡレベルは、ＷＴ細胞と比較して有意に減少した（データ示さず）。従って、外因性ｄｓＲＮＡは、Ｓ．ポンベ細胞ではＲＮＡｉを介する遺伝子サイレンシングを誘導することができ、ｙＤｃｒ１が、ｄｓＲＮＡを介する遺伝子サイレンシングに必要であることがわかった。
【０１６８】
〔実施例２３〕  Ｓ．ポンベにおける内因性ＰＣＮＡ遺伝子の発現に及ぼすｄｓＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響
外因性ｄｓＲＮＡが、Ｓ．ポンベ細胞における内因性遺伝子の発現を抑制するかどうかを調べるために、ＰＣＮＡ  ｍＲＮＡにターゲティングされたｄｓＲＮＡ発現プラスミド（ｐＳＰｉ−ＰＣＮＡ）をＳ．ポンベ細胞に導入した。次いで、本発明者らは、ＰＣＮＡタンパク質レベルおよび内因性対照としてＲａｄ１７タンパク質レベルを、それぞれマウスＰＣＮＡモノクローナル抗体（Ｗａｓｅｅｍ，  Ｎ．Ｈ．，  ＆  Ｌａｎｅ，  Ｄ．Ｐ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＣＮＡ）：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｆｏｒｍ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ９６  １２１−１２９  （１９９０）．）およびマウスＲａｄ１７モノクローナル抗体（Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｃ．Ａ．，  Ｋａｎｔｅｒ−Ｓｍｏｌｅｒ，  Ｇ．，  Ｗｅｉ，  Ｙ．Ｆ．，  Ｒａｍａｇｌｉ，  Ｌ．Ｓ．，  Ｓｕｎｎｅｒｈａｇｅｎ，  Ｐ．，  Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ，  Ｍ．Ｊ．，  ＆  Ｌｅｇｅｒｓｋｉ，  Ｒ．Ｊ．  ｈＲＡＤ１７，  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＲＡＤ１７  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｇｅｎｅ，  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐ５３  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８，  １６８９−  １６９９  （１９９９）．）を用いたウェスタンブロット分析によって調べた。
【０１６９】
ウェスタンブロット分析は、Ｙ−ＰＥＲ酵母タンパク質抽出試薬（ピアス）を用いて製造業者のプロトコールに従って、細胞抽出物を各形質転換体から調製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）によって分離し、他に記載（Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｈ．，  Ｅｃｋｎｅｒ，  Ｒ．，  Ｙａｏ，  Ｔ．  Ｐ．，  Ｔａｉｒａ，，  Ｋ．，  Ｃｈｉｕ，  Ｒ．，  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  ＆  Ｋ．  Ｋ．  Ｙｏｋｏｙａｍａ．，  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｐ３ＯＯ  ａｎｄ  ＣＢＰ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ−ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆ９−ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９３，  ２８４−２８９  （１９９８）．，Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｓｃｈｉｌｔｚ  Ｌ，  Ｃｈｉｕ  Ｒ，  Ｉｔａｋｕｒａ  Ｋ，  Ｔａｉｒａ  Ｋ，  Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｙ，  Ｙｏｋｏｙａｍａ  ＫＫ，  ＡＴＦ−２  ｈａｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０５，  １９５−２００  （２０００）．）のようにエレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜（フナコシ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｃｏ．）、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に転写した。マウスＰＣＮＡに対する特異的ポリクローナル抗体（ザイメッドラボラトリーズ（ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）、ＣＡ、ＵＳＡ）およびマウスＲａｄ１７に対する特異的ポリクローナル抗体（ザイメッドラボラトリーズ）を用いたＥＣＬキット（アマシャム）によって、免疫複合体を視覚化した。これらの抗体はそれぞれ、Ｓ．ポンベのＰＣＮＡおよびＲａｄ１７と反応する（Ｗａｓｅｅｍ，  Ｎ．Ｈ．，  ＆  Ｌａｎｅ，  Ｄ．Ｐ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＣＮＡ）：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｆｏｒｍ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ９６  １２１−１２９  （１９９０）．，  Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｃ．Ａ．，  Ｋａｎｔｅｒ−Ｓｍｏｌｅｒ，  Ｇ．，  Ｗｅｉ，  Ｙ．Ｆ．，  Ｒａｍａｇｌｉ，  Ｌ．Ｓ．，  Ｓｕｎｎｅｒｈａｇｅｎ，  Ｐ．，  Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ，  Ｍ．Ｊ．，  ＆  Ｌｅｇｅｒｓｋｉ，  Ｒ．Ｊ．  ｈＲＡＤ１７，  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＲＡＤ１７  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｇｅｎｅ，  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐ５３  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８，  １６８９−  １６９９  （１９９９）．）。
【０１７０】
結果、図１８Ｂに示すように、ｄｓＲＮＡ−ＰＣＮＡ発現細胞におけるＰＣＮＡタンパク質レベルは、野生型（ＷＴ）細胞と比較して有意に減少した。対照として使用したＲａｄ１７タンパク質レベルは両細胞とも変化しなかった。これらの結果から、外因性ｄｓＲＮＡは、Ｓ．ポンベ細胞におけるＲＮＡｉシステムを介して外因性ＬＥＵ２遺伝子の発現だけでなく内因性ＰＣＮＡ遺伝子の発現も抑制することが分かった。
【０１７１】
〔実施例２４〕  Ｓ．ポンベにおけるｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響およびＲｄＲＰ活性
次に、合成ｓｉＲＮＡもＳ．ポンベ細胞では配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導できるかどうかを試験するために、本発明者らは、ゼオシン（商標）耐性（Ｚｅｏｒ）遺伝子にターゲッティングされたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒ）を合成した。
【０１７２】
ゼオシン指向性ｓｉＲＮＡ（センス鎖：５’−ＣＵＧ  ＣＧＵ  ＧＣＡ  ＣＵＵ  ＣＧＵ  ＧＧＣ  ＣＧＡ−３’  ／配列番号：４９；アンチセンス鎖：５’−ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＧＡＡ  ＧＵＧ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＧＵＵ−３’  ／配列番号：５０）は、日本バイオサービス（Ｊａｐａｎ  Ｂｉｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＪＢｉｏＳ）Ｃｏ  Ｌｔｄ）によって合成された。これらのＲＮＡを、標準的な方法（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．，  ＆  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．，  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ２１−  ａｎｄ  ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ．  Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，  １５，  １８８−２００  （２００１）．）を用いてアニールさせた。次いで、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（ザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて製造業者のプロトコールに従って、５〜２０ｎＭのゼオシン指向性ｓｉＲＮＡを、ゼオシンを含むＳ．ポンベ細胞にトランスフェクトした。
【０１７３】
次に、本発明者らは、５０μｇ／ｍｌゼオシン（インビトロゲン）を含むＹＰＤ培地において、ゼオシン耐性遺伝子を発現する株を選択し、ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒ処理細胞の増殖を調べた。図１９Ａに示すように、Ｚｅｏｒ遺伝子を発現するＷＴ細胞がゼオシン含有培地において増殖した。しかしながら、ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒ（２０ｎＭ）で処理した細胞の増殖レベルは、Ｚｅｏｒ遺伝子を発現するＷＴ細胞と比較して有意に減少した。
【０１７４】
さらに、Ｓ．ポンベのＲｄＲＰホモログ（ｙｒｄｐ１）がＤＮＡデータベース検索によって同定されたので、本発明者らは、ＲＮＡｉを介する遺伝子サイレンシングにおけるｙＲｄｐ１の役割について調べるためにｙｒｄｐ１欠失株を構築した。ｙｒｄｐ１欠失株の構築は、実施例１８に記載のようにして行った。
【０１７５】
結果、ｙｒｄｐ１欠失株では、ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒは遺伝子サイレンシングを効率的に誘導しなかった（図１９Ａ：右下４分の１の増殖レベルと左下４分の１の増殖レベルを比較のこと）。従って、これらの結果から、合成ｓｉＲＮＡも、Ｓ．ポンベにおいてＲＮＡｉを介する遺伝子サイレンシングを誘導することができ、ｙＲｄｐ１がＲＮＡｉを介する遺伝子サイレンシングに少なくとも部分的に関与することが分かった。
【０１７６】
〔実施例２５〕  ５’ビオチン標識アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ「プルダウン」および逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ分析
伸長アンチセンス鎖ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ−ＲｄＲＰ複合体によって生成されるかどうかを確かめるために、本発明者らはビオチンプルダウンＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。
【０１７７】
最初に、本発明者らは、Ｚｅｏｒ遺伝子にターゲッティングされた５’ビオチン結合ｓｉＲＮＡを合成した。５’ビオチン標識ゼオシン耐性遺伝子（Ｚｅｏｒ）−ｓｉＲＮＡは、日本バイオサービスによって合成された。これらのＲＮＡを、標準的な方法（Ｆｉｒｅ  Ａ．，  Ｘｕ  Ｓ．，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｋｏｓｔａｓ，  Ｓ．Ａ．，  Ｄｒｉｖｅｒ，  Ｓ．Ｅ．，  ＆  Ｍｅｌｌｏ，  Ｃ．Ｃ．，  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ８０６−８１１  （１９９８）．）を用いてアニールさせた。Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（ザイモリサーチ）を用いて製造業者のプロトコールに従って、５’ビオチン標識Ｚｅｏｒ−ｓｉＲＮＡをＳ．ポンベ細胞またはｙｒｄｐ１欠失株にトランスフェクトした。４８時間後、細胞を収集し、総ＲＮＡを各細胞から、ＹｅａＳｔａｒ  ＲＮＡキット（ザイモリサーチ）を用いて得た。ストレプトアビジン樹脂を含むＳｏｆｔＬｉｎｋ（商標）樹脂（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），ＵＳＡ）を用いて製造業者のプロトコールに従って、ビオチン標識アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡを精製した。
【０１７８】
ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラ（ＴａＫａＲａ），Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）とＺｅｏｒ上流プライマー（５’−ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＧＴＴ−３’  ／配列番号：５１）および下流プライマー（５’−ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ−３’  ／配列番号：５２）または対照としてＲａｄ１７上流プライマー（５’−ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＡ−３’  ／配列番号：５３）および下流プライマー（５’−ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＴＡＧ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  Ｇ−３’  ／配列番号：５４）を用いて伸長アンチセンス鎖ＲＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。
【０１７９】
結果、図１９Ｂに示すように、ｓｉＲＮＡから生じた伸長アンチセンス鎖ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む細胞（Ｚｅｏｒ）でしか検出されなかった（レーン４）。対照的に、ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒを含むＷＴ細胞は伸長アンチセンス鎖ＲＮＡを含まなかった（レーン２）。これらの結果から、ｓｉＲＮＡはターゲッティングｍＲＮＡの非存在下では増幅されないことが示唆された。
【０１８０】
さらに、これらの伸長ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒを含むｙｒｄｐ１ｓ欠失株では生成されなかった（レーン３）。これらの結果から、ｓｉＲＮＡが、Ｓ．ポンベ細胞においてＲＮＡｉ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）のガイドとしてだけでなく、ｓｉＲＮＡ増幅のためのプライマーとしても働くことが示唆された。
【０１８１】
【発明の効果】
本発明により、ＲＮＡｉ効果を有するステムループ形ＲＮＡをコードするＤＮＡ、および該ＤＮＡを含むベクターが提供された。これらを用いることにより、簡便に所望の遺伝子がノックアウトした細胞を作製することが可能である。また本発明は、哺乳類細胞におけるＲＮＡｉのメカニズムおよび他の遺伝子機能を研究するための強力なツールとなり、さらには、治療用途として潜在的有用性を持つものと大いに期待される。
【０１８２】
ステムループ形ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡへ細胞質移行シグナル配列を導入することによっても、ＲＮＡｉ効果を効率的に発揮させることが可能である。また、ｐｏｌ  ＩＩ系のプロモーターを利用しても、転写産物を細胞質に移行させ、ＲＮＡｉ効果を効率的に発揮させることが可能である。この際にＤｉｃｅｒ遺伝子を同時発現させることにより、細胞毒性を軽減することが可能である。さらにｄｓＲＮＡまたはステムループ形ＲＮＡ分子をＤｉｃｅｒタンパク質で処理することにより、効果的なｄｓＲＮＡを作製することができる。
【０１８３】
【配列表】
2005046003.tif 000003
2005046003.tif 000004
2005046003.tif 000005
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2005046003.tif 000047
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｄｓＲＮＡ発現プラスミドの構築を示す図である。
（Ａ）ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ発現用プラスミドは、ヒトｔＲＮＡＶａｌプロモーター配列およびターミネーター配列を有する。マウスＵ６−ｄｓＲＮＡまたはヒトＵ６−ｄｓＲＮＡ発現用プラスミドは、それぞれ、マウスＵ６プロモーターまたはヒトＵ６プロモーターを有する。ループ１配列（５’−ＧＡＡＡＡ−３’）またはループ２配列（ｍｉｒ２３ループ配列（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９４，  ８５３−８５８．）：５’−ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ−３’／配列番号：３０）を、ｋ−ｒａｓセンス鎖配列（２９ｂｐ）とアンチセンス鎖配列（２９ｂｐ）との間に挿入した。Ｕ６−ｄｓＲＮＡにおけるｄｓＲＮＡおよびループ配列は、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡと同じである。
（Ｂ）ｄｓＲＮＡによってターゲッティングされる変異体および正常ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの配列。変異体ｋ−ｒａｓ遺伝子は点突然変異を有する（コドン１２ＧＧＴ−＞ＧＴＴ）。
【図２】図２は、前駆体ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの検出を示す写真である。前駆体ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの検出はノーザンブロット分析によって分析した。ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡをコードするプラスミドあるいはＵ６−ｄｓＲＮＡをコードするプラスミドを、ＳＷ４８０細胞に導入した。４８時間後、これらの細胞を回収して、細胞質（Ｃ）と核分画（Ｎ）に分離した。各分画のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離して１５％ポリアクリルアミドゲルを用いて分画した。ノーザンブロット分析は、本文記載のように行った（レーン１、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現する細胞の核画分；レーン２、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現する細胞の細胞質画分；レーン３、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）を発現する細胞の核画分；レーン４、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）を発現する細胞の細胞質画分；レーン５、ｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）を発現する細胞の核画分；  レーン６、ｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ１）発現する細胞の細胞質画分；レーン７、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）を発現する細胞の核画分；  レーン８、ｍＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）を発現する細胞の細胞質画分；  レーン９、ｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）を発現する細胞の核画分；  レーン１０、ｈＵ６−ｄｓＲＮＡ（ループ２）を発現する細胞の細胞質画分）。
【図３】図３は、ｄｓＲＮＡ処理に及ぼすＤｉｃｅｒリボザイムの影響を表わす写真である。
（Ａ）  ポリ（Ａ）連結Ｄｉｃｅｒリボザイム（Ｄｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００）発現細胞におけるｄｉｃｅｒ遺伝子の発現レベルを示す。ｄｉｃｅｒ  ｍＲＮＡは、ｄｉｃｅｒ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによって検出した（実施例３参照）。ＧＡＤＰＨは内因性対照である。
（Ｂ）  Ｄｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００発現細胞における前駆体ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの検出。（レーン１、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡおよびＤｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００を発現する細胞の核画分；レーン２、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡおよびＤｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００を発現する細胞の細胞質画分；レーン３、Ｕ６−ｄｓＲＮＡおよびＤｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００を発現する細胞の核画分；  レーン４、Ｕ６−ｄｓＲＮＡおよびＤｉｃｅｒ−ＲｚＡ１００を発現する細胞の細胞質画分）。
【図４】図４は、ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ−媒介分解による変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの切断を示す写真である。
（Ａ）  ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを含む細胞抽出物による変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの切断。インビトロＲＮＡｉアッセイを実験技法として記述した。（レーン１：ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡと正常ｋ−ｒａｓ  ＲＮＡとを発現する細胞の核分画（Ｎ）、レーン２：ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡと正常ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡとを発現する細胞の細胞質分画（Ｃ）、レーン３：ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡと変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡとを発現する細胞の核分画、レーン４：ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡと変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡとを発現する細胞の細胞質分画）。
（Ｂ）  ｋ−ｒａｓ指向ｓｉＲＮＡおよびＳＷ４８０細胞抽出物による変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの切断（レーン１：ＳＷ４８０細胞の核分画と正常ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ、レーン２：ＳＷ４８０細胞の細胞質分画と正常ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ、レーン３：ＳＷ４８０細胞の核分画と変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ、レーン４：ＳＷ４８０細胞の細胞質分画と変異体ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ）。
【図５】図５は、インビボでｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉの効率と特異性を示す図である。ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡまたはＵ６−ｄｓＲＮＡを発現する細胞におけるＫ−ｒａｓ蛋白質レベルを、特異的ｋ−Ｒａｓ抗体を用いてウェスタンブロット分析によって分析した。変異体ｋ−ｒａｓ遺伝子はＳＷ４８０細胞において発現させた。対照的に、正常ｋ−ｒａｓ遺伝子はＨｅＬａ細胞において発現させた。定量のために、バンドの強度を、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓを用いてデンシトメトリーによって分析した。
【図６】図６は、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡによる細胞増殖の影響を示す図である。実施例に記載のように増殖速度を測定した。値は、それぞれの場合での３回の反復実験からの結果の平均±Ｓ．Ｄ．である。ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ発現ＳＷ４８０細胞は、野生型ＳＷ４８０細胞よりかなり緩やかに増殖した。対照的に、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡ発現ＨｅＬａ細胞における増殖速度は、野生型ＳＷ４８０細胞の増殖速度と同じであった。
【図７】図７は、（Ａ）ｈＤｉｃｅｒによって生成されたｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの検出を示す写真である。実施例中に記載した通り、組換えｈＤｉｃｅｒを大腸菌の中で合成し、ウェスタンブロット解析によって検出を行った。ｒｅ−ｈＤｉｃｅｒ（０．５μｇ）の調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）によって分画し、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写した。次に、ＥＣＬキットとストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼによって、ｒｅ−ｈＤｉｃｅｒを可視化した。Ｍｏｃｋ：空のプラスミドで形質転換した細胞からの調製物；ｐｈＤｉｃｅｒ：ｈＤｉｃｅｒをコードする発現プラスミドを感染させた細胞からの調製物。
（Ｂ）ｒｅ−ＤｉｃｅｒによるｓｉＲＮＡの生成を示す写真である。２００μｌの反応用緩衝液の中、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加あるいは添加せずに、長鎖ｄｓＲＮＡ（１０μｇ）と１μｇのｒｅ−ｈＤｉｃｅｒを混合した。反応混合液を３７℃で３０分間インキュベートした。そして、２０μｌの各反応混合液を１２％非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して分画した。２０〜２５塩基長のｓｉＲＮＡをＳｙｂｅｒ（登録商標）グリーンＩＩで検出した。
【図８】図８は、外来性ピューロマイシン耐性遺伝子の発現抑制を示す図である。
（Ａ）実施例にて説明したとおり、合成ｓｉＲＮＡの標的として１０個の部位（部位１〜１０）を選択した。ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡを調製するため、ピューロマイシン耐性遺伝子の５’末端側領域（１−３００位の塩基）に対応する長鎖ｄｓＲＮＡを作製し、組換えｈＤｉｃｅｒで処理した。
（Ｂ）ｍｆｏｌｄプログラム（Ｐｒｏｖｏｓｔ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｄｉｃｅｒ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２１，  ５８６４−５８７４，  （２００２））によって推定されたピューロマイシン耐性ｍＲＮＡの二次構造を表わす図である。
（Ｃ）ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡが、外来性ピューロマイシン耐性遺伝子の発現に対する最も有効なサプレッサーであった（棒グラフの一番右側のバー）。レニラ由来のルシフェラーゼのレポーター遺伝子によって、ｓｉＲＮＡによる形質転換効率を観察した。
【図９】図９は、内因性Ｈ−ｒａｓ遺伝子の発現抑制を示す図である。
（Ａ）実施例にて説明した通り、合成ｓｉＲＮＡの標的として１０個の部位（部位１〜１０）を選択した。ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡを調製するため、関連ｒａｓ遺伝子の配列と相同性が低いＨ−ｒａｓ遺伝子（３７０〜５７０  ｎｔ）の３’領域に対応する長鎖ｄｓＲＮＡを作製し、組換えｈＤｉｃｅｒで処理した。
（Ｂ）ｍｆｏｌｄプログラムによって推定されたＨ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの二次構造を表わす図である。
（Ｃ）ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡが、内因性Ｈ−ｒａｓ遺伝子の発現に対する最も有効なサプレッサーであった（棒グラフの一番右側のバー）。アクチンレベル（対照）を参照として結果を標準化した。
（Ｄ）Ｈ−ｒａｓ遺伝子を標的とするｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの関連遺伝子Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓの発現に対する効果を示すグラフである。Ｋ−ＲａｓおよびＮ−Ｒａｓは、特異的抗体を用いてウェスタンブロッティングにより検出した。発現レベルはデンシトメトリーおよびＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓにより定量した。
【図１０】図１０は、ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡによる内因性遺伝子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの発現の抑制を示す図である。ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡの調製のために、ｃ−ｊｕｎ遺伝子（１〜２００  ｎｔ）およびｃ−ｆｏｓ遺伝子（１〜２００  ｎｔ）の５’領域に関連する長鎖ｄｓＲＮＡを生成し、組換えｈＤｉｃｅｒで処理した。ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓ双方ともに特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出した。アクチンを内因性対照として利用した。ＷＴ−Ｈｅｌａ；野生型ＨｅＬａ細胞、ｃ−Ｊｕｎ（ｃ−Ｆｏｓ）ｄｉｃｅｄ−ｓｉＲＮＡ；ｃ−ｊｕｎ特異的（ｃ−ｆｏｓ特異的）ｄｓＲＮＡより生成されるｓｉＲＮＡ。
【図１１】図１１は、ｓｈＲＮＡおよびその標的ｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡのｐｏｌＩＩＩ依存発現用のプラスミドの構築を示す図である。
（Ａ）  ｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下でｓｈＲＮＡを発現するｓｈＲＮＡ発現プラスミドの構築図である。ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ、ｈＵ６−ｓｈＲＮＡ、およびｍＵ６−ｓｈＲＮＡ発現用プラスミドは、それぞれ、ヒトｔＲＮＡＶａｌ遺伝子からのプロモーター配列、ヒトＵ６プロモーター配列、マウスＵ６プロモーター配列と共にターミネーター配列を含む。ループ配列（５’−ＧＡＡＡＡ−３’）を、ｅｒｂＢ２ターゲットのセンス鎖配列（２９ｎｔ）とアンチセンス鎖配列（２９ｎｔ）との間に挿入した。
（Ｂ）  ｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡにおけるＲＮＡｉのターゲッティング部位を示す図である。本発明者らは、ｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡ内にｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの５つのターゲッティング部位を選択した。
（Ｃ）  前駆体ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの検出を示す写真である。前駆体ｄｓＲＮＡ（プレｄｓＲＮＡ）およびｓｉＲＮＡの存在をノザンブロッティングによって分析した。ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ、ｍＵ６−ｓｈＲＮＡ、およびｈＵ６−ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドをＭＣＦ−７細胞に導入した。４８時間後、細胞を収集し、細胞質（Ｃ）画分および核（Ｎ）画分を調製した。各画分の総ＲＮＡを単離し、１２％ポリアクリルアミドゲルで分画した。ノザンブロッティング分析は他に記載のように行った。レーン１はｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現する細胞の核画分、レーン２はｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現する細胞の細胞質画分、レーン３はｈＵ６−ｓｈＲＮＡを発現する細胞の核画分、レーン４はｈＵ６−ｓｈＲＮＡを発現する細胞の細胞質画分、レーン５はｍＵ６−ｓｈＲＮＡを発現する細胞の核画分、レーン６はｍＵ６−ｓｈＲＮＡを発現する細胞の細胞質画分である。
（Ｄ）  ＭＣＦ−７細胞におけるｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ（ｔＲＮＡｉ）、ｍＵ６−ｓｈＲＮＡ（ｍＵ６ｉ）、およびｈＵ６−ｓｈＲＮＡ（ｈＵ６ｉ）によるＲＮＡｉの効果について示す図である。ＥｒｂＢ２タンパク質レベルは、ウェスタンブロッティング分析およびデンシトメトリーによる定量によって調べた。ＥｒｂＢ２タンパク質レベルはアクチンレベルを用いて標準化した。
【図１２】図１２は、マウスにおけるｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ、ｍＵ６−ｓｈＲＮＡ、およびｈＵ６−ｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉの効果を示す図である。
（Ａ）  ＧＦＰ  ｍＲＮＡ内のＥ１２６配列にターゲッティングされたｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ、ｍＵ６−ｓｈＲＮＡ、およびｈＵ６−ｓｈＲＮＡ発現プラスミドの構築を示す図である。
（Ｂ）  ８細胞桑実胚におけるｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ、ｍＵ６−ｓｈＲＮＡ、およびｈＵ６−ｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉの効果を示す写真である。細胞に紫外線を照射した。ＧＦＰ発光は蛍光顕微鏡によって検出された（右パネル）。左パネルは位相差顕微鏡写真を示す。
【図１３】図１３は、マウスにおけるｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ、ｍＵ６−ｓｈＲＮＡ、およびｈＵ６−ｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉの効果を示す図である。
（Ａ）  胚盤胞におけるｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ、ｍＵ６−ｓｈＲＮＡ、およびｈＵ６−ｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉの効果を示す写真である。詳細については（Ｂ）を参照のこと。
（Ｂ）  マウス新生仔におけるｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉの効果を示す写真である。ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡトランスジェニックマウスに紫外線を照射した。緑色蛍光ＧＦＰ発光は、デジタルカードカメラ（フィルターなし）を用いて撮影した。
【図１４】図１４は、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡのテトラサイクリン誘導（Ｔｅｔ誘導）発現を示す図である。
（Ａ）  ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡのＴｅｔ依存発現の模式図である。Ｄｏｘはドキシサイクリン、Ｔｅｔ−ｔＴＳはテトラサイクリンリプレッサー、ＴｅｔＯ７は７コピーのテトラサイクリンオペレーター系。
（Ｂ）  Ｔｅｔ依存ｓｈＲＮＡ発現系における前駆体ｄｓＲＮＡ（プレｄｓＲＮＡ）およびｓｉＲＮＡの検出結果を示す写真である。１００ｎｇ／ｍｌ  Ｄｏｘの存在下または非存在下での前駆体ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの存在を、ノザンブロッティングによって分析した。
【図１５】図１５は、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡのテトラサイクリン誘導（Ｔｅｔ誘導）発現を示す図である。
（Ａ）  ＴｅｔＯ７−ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）用量依存性について示す図である。Ｄｏｘ濃度を上げるにつれて、転写物レベルが急速に増加し、最大活性化は１００ｎｇ／ｍｌであった。
（Ｂ）  ｅｒｂＢ２遺伝子発現に及ぼすＴｅｔＯ７−ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの影響を示す図である。１００ｎｇ／ｍｌ  Ｄｏｘの存在下または非存在下でのＥｒｂＢ２タンパク質レベルは、ウェスタンブロッティングおよびデンシトメトリーで定量し分析した。ＥｒｂＢ２タンパク質レベルはアクチンレベルを用いて標準化した。
【図１６】図１６Ａは、酵母におけるｄｓＲＮＡ発現ベクターの構築を模式的に表した図である。
Ｂは、ｄｓＲＮＡの発現およびｓｉＲＮＡの作成を示す写真である。ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのレベルはノーザンブロット分析によって検出した（レーン１は野生型（ＷＴ）Ｓ．ポンベ株におけるモックベクター、レーン２はＷＴ  Ｓ．ポンベ株におけるｐＳＰｉ−ＬＥＵ２、レーン３はｙｄｃｒ１−Ｓ．ポンベ株におけるｐＳＰｉ−ＬＥＵ２、レーン４はＷＴ  Ｓ．セレビシエ株におけるモックベクター、レーン５はＷＴ  Ｓ．セレビシエ株におけるｐＳＣｉ−ＬａｃＺ、レーン６はＷＴ  Ｓ．ポンベ株におけるモックベクター、レーン７はＷＴ  Ｓ．ポンベ株におけるｐＳＣｉ−ＬａｃＺ）。ｓｉＲＮＡは、ｐＳＰｉ−ＬＥＵ２およびｐＳＰｉ−ＬａｃＺを発現するＷＴ  Ｓ．ポンベ株において検出された。しかしながら、ｓｉＲＮＡは、ｐＳＰｉ−ＬＥＵ２を発現するｙＤｃｒｌ−Ｓ．ポンベ株およびｐＳＣｉ−ＬａｃＺを発現するＷＴ  Ｓ．セレビシエ株においてほとんど検出されなかった。
【図１７】図１７は、Ｓ．ポンベおよびＳ．セレビシエにおける外因性ＬａｃＺ遺伝子の発現に及ぼすｄｓＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響を示す図である。
【図１８】図１８は、Ｓ．ポンベにおけるｄｓＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響を示す写真である。
Ａは、Ｓ．ポンベにおける外因性ＬＥＵ２遺伝子の発現に及ぼすｄｓＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響を示す写真である。ｄｓＲＮＡ−ＬＥＵ２を発現するＳ．ポンベ細胞の増殖を、ロイシン欠損培地（Ｌｅｕ−）において調べた。
Ｂは、Ｓ．ポンベにおける内因性ＰＣＮＡ遺伝子の発現に及ぼすｄｓＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響を示す写真である。ＰＣＮＡタンパク質レベルはウェスタンブロット分析によって検出された。Ｒａｄ１７は内因性対照である。
【図１９】図１９は、Ｓ．ポンベにおけるｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響およびＲｄＲＰ活性の検出を示す写真である。
Ａは、Ｓ．ポンベにおける外因性Ｚｅｏｒ遺伝子の発現に及ぼすｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡｉの影響を示す写真である。
Ｂは、ビオチンプルダウンＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた、Ｓ．ポンベにおけるｙＲｄｐ１複合体による伸長アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡの検出を示す図および写真である。（レーン１はＺｅｏｒ遺伝子を発現するＷＴ株、レーン２は２０ｍＭ  ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒで処理されたＷＴ株、レーン３はＺｅｏｒ遺伝子を発現するｙｒｄｐ−株における２０ｍＭ  ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒ、レーン４は２０ｍＭ  ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒで処理されたＺｅｏｒ発現Ｓ．ポンベ株）。伸長アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡは、２０ｍＭ  ｓｉＲＮＡ−Ｚｅｏｒで処理されたＺｅｏｒ発現Ｓ．ポンベ株でしか検出されなかった。Ｒａｄ１７は内因性対照である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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