(57)【要約】【課題】積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層構造の積層状態で存在する積層細胞層を簡単に、かつ効率的に作製することができる培養容器、該容器を使用した培養物と培養方法、ならびに前記培養物を使用した生体組織の再生方法の提供。【解決手段】増殖用細胞が播種される複数の培養棚が上下方向に設置され、かつ前記培養棚の少なくとも１個が培養中で分解可能な材料で形成されたことを特徴とする培養容器、該培養容器の各培養棚に増殖用細胞を播種した培養容器、この増殖用細胞を播種した培養容器を培養した培養物、および該培養物を利用した細胞組織再生方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の容器状の培養室が液密に積み重ねられた培養容器であって、前記培養室が該培養室に必要とされる培養液を供給可能な供給口とガス供給口を有し、該培養室の少なくとも一個が培養中に分解可能な材料（以下、この材料を生分解性材料ともいう）で形成された底面部を有するものであることを特徴とする培養容器。
【請求項２】
複数の容器状の培養室が上下方向に液密に積み重ねられた培養容器であって、前記培養室が該培養室に必要とされる培養液を供給可能な培養液供給口とガス供給口を有し、該培養室の少なくとも一個が上下の両面部が存在しない容器状物と該容器状物の上下の両面部を液密に被覆することが可能な生分解性材料で形成されたスペーサーで構成されたものであることを特徴とする培養容器。
【請求項３】
培養室間が液密にリング状シール材でシールされていることを特徴とする請求項１または２に記載の培養容器。
【請求項４】
最下位に存在する培養室の底面部の分解速度が、他の底面部の分解速度より低いことを特徴とする請求項１または３に記載の培養容器。
【請求項５】
最下位に存在するスペーサーの分解速度が、他のスペーサーの分解速度より低いことを特徴とする請求項２または３に記載の培養容器。
【請求項６】
最下位に存在する培養室の底面部、あるいは最下位に存在するスペーサーの強度が、増殖用細胞層の培養が完了した時点で該培養棚上の載持物を保持するに十分なものであることを特徴とする請求項４または５に記載の培養容器。
【請求項７】
最下位に存在する培養室の底面部、あるいは最下位に存在するスペーサーが、生体組織の再生誘導のための足場になるものであることを特徴とする請求項５〜６のいずれかに記載の培養容器。
【請求項８】
培養室の底面部、あるいはスペーサーが、増殖用細胞層との接着性を向上するための表面改質が施されたものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の培養容器。
【請求項９】
増殖用細胞を各培養室に播種した請求項１〜８のいずれかに記載の培養容器。
【請求項１０】
請求項９に記載の培養容器の増殖用細胞を培養した培養物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の培養容器の培養室中に増殖用細胞を播種後、前記培養室の培養液の供給口より各増殖用細胞の培養に適した培養液の供給を行い、増殖用細胞の培養と最下位に存在する培養室の底面部あるいは最下位に存在するスペーサーを除く培養室の底面部あるいはスペーサーの分解を行い、この結果、分解除去された培養室の底面部あるいはスペーサーに載持された増殖用細胞層を下層の増殖用細胞層に重力落下させるとともに、これら増殖用細胞層を接着させることを特徴とする培養物の作製方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の培養容器の培養物を生体に移植して細胞増殖させることを特徴とする生体組織の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞層が多層の形で積層された積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層の形で積層された積層細胞層を作製するために使用される培養容器、増殖用細胞が播種された前記の培養容器、増殖用細胞が播種された前記の培養容器の培養物とその培養方法、および前記培養物を使用した生体組織の再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、組織欠損部位への移植用材料として、代表的なものに人工皮膚が挙げられる。これら細胞膜の多くはコラーゲンに代表される生体由来の吸収性材料を細胞増殖の基材として細胞を三次元で培養することにより作製されている。しかしながら、このようにして作製した細胞膜は単層構造であり、増殖された細胞層が積層された形で存在する積層細胞層、特に多種類の増殖され、かつこれら細胞層が接着された積層細胞層を作製することは困難であった。
【０００３】
多種類の細胞が多層構造の積層状態で存在する積層細胞層を作製する方法としては、例えば単層の細胞層を積層する方法が用いられているが（非特許文献１）、この方法では単層の細胞層を連続的に積層する必要があり、多くの手間がかかり効率的でない。
【０００４】
【非特許文献１】バイオマテリアルス２４（２００３）２３０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
解決しようとする課題は、積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層構造の積層状態で存在する積層細胞層を簡単に、かつ効率的に作製することができる培養容器、該容器を使用した培養物と培養方法、ならびに前記培養物を使用した生体組織の再生方法の提供することにある。
なお、本発明でいう多種類の細胞層が多層構造の積層状態で存在する積層細胞層とは、複数の細胞層が積層状態で存在するものは全て含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１は、複数の容器状の培養室が液密に積み重ねられた培養容器であって、前記培養室が該培養室に必要とされる培養液を供給可能な供給口とガス供給口を有し、該培養室の少なくとも一個が培養中に分解可能な材料（以下、この材料を生分解性材料ともいう）で形成された底面部を有するものであることを特徴とする培養容器にある。
【０００７】
本発明の第２は、複数の容器状の培養室が上下方向に液密に積み重ねられた培養容器であって、前記培養室が該培養室に必要とされる培養液を供給可能な培養液供給口とガス供給口を有し、該培養室の少なくとも一個が上下の両面部が存在しない容器状物と該容器状物の上下の両面部を液密に被覆することが可能な生分解性材料で形成されたスペーサーで構成されたものであることを特徴とする培養容器にある。
【０００８】
以下、本発明の培養容器を図面に基づいて具体的に説明する。
１．培養容器の実施態様１
図１の培養容器は、図２に示す６個の容器状の培養室３〜８が上下方向に液密に積み重ねられて構成されている。各培養室３〜８は、そこに播種される増殖用細胞を培養するに適した培養液および酸素あるいは必要に応じてその他のガス、例えば一酸化炭素、不活性ガス等を供給する供給口２を有する。前記供給口２を介して個々の培養室に他の培養室に供給される培養液と混合されることなく供給可能となる。また、前記供給口２を介して酸素も供給することができる。
培養液と酸素あるいはその他のガスを供給する場合、前記供給口２は同一形状のものであってもよいし、あるいは培養液と酸素を供給する場合は別の異なる形状のものとしてもよい。したがって、一つの培養室に設けられる供給口２は１個でも良いが、好ましくは２個以上の複数個である。また、酸素を供給する前記供給口２には除菌フィルターを設けてもよく、かつ前記供給口２にはその開口部を外界と遮断可能な栓部材を装着可能なものであってもよい。また、図１および２に示す培養室３〜８の形状は円筒状のものであるが、該形状は任意の形状のものが採用できる。前記のように、本発明の培養容器は、各培養室に播種された細胞毎に好ましい培養液が他の培養液と混合されることなく供給でき、かつ各培養室は好ましい培養条件、例えば酸素供給量、酸素供給速度、培養温度等を独立してコントロールできるので、本発明の培養容器は多種類の増殖された積層細胞層を作製するのに特に好都合である。
【０００９】
前記培養室３〜８は、その底面部３１〜８１は培養中に分解可能な生分解性材料で形成され、さらに好ましくは底面部８１を構成する生分解性材料が、他の底面部３１〜７１を構成する生分解性材料に比較して分解速度が低いことが好ましい。培養室３〜８の底面部３１〜８１の分解特性を前記のようなものとし、さらにはその厚さを調節することにより、増殖用細胞層の所定の培養が完了した時点で、最下層の培養室以外の増殖用細胞層を載持する底面部を少なくとも部分的、好ましくは完全に破壊するものであるので、前記培養容器は所定の培養が完了した時点では、図４に示すように最下層の培養室以外の培養室で増殖された増殖細胞層は最下位の培養室８の底面部８１上に重積あるいは積層されたものとなる。また、前記増殖細胞層の重積物あるいは積層物は、前記底面部８１がそこに載持されている載持物を保持するに十分に強度等の維持しているから、作製された積層あるいは積層細胞層の取扱い、例えば生体へ移植する等に際しての取扱い、あるいは移植の作業が簡単となる。
前記のようにして得られた重積あるいは積層増殖細胞層は、底面部８１と一緒に培養室８１から取り外すことにより生体内に移植することができる。また、前記培養室３〜８は底面部を除いて再使用が可能なように培養段階で分解しないものが好ましく、例えばポリスチレンで構成されたものが挙げられる。ただし、培養室８１全体をその底面部８１を含めて所定の培養が完了した時点で未分解であるが、生体内では分解可能な材料で作製すれば、所定の培養が完了した時点で底面部８１を培養室８１から取り外すことなく、前記培養物をそのまま生体内に移植することができる。
【００１０】
前記培養室３〜８の底面部３１〜８１は、各培養室に供給される培養液および増殖細胞が混合しないように、液透過性が低いものを用いることが好ましい。より好ましくは無孔のもの、例えば無孔のフィルムを使用することが好ましい。さらに、前記底面部３１〜８１は、そこに載持される前記増殖用細胞層の該フィルムへの接着性が向上するように、プラズマ照射、コロナ放電等により表面改質したものが好ましく、また、このフィルムの厚さのコントロール及び／又は底面部３１〜８１を構成する材料を適宜選択することにより、前記底面部３１〜８１の培養段階での分解速度を任意にコントロールすることができる。ただし、前記底面部３１〜８１を構成する部材はフィルム形状のものに限られるものではなく、前記のような培養室に要求される要件を満足するものであれば、前記増殖用細胞層を載持可能なもの、例えば平面状スポンジあるいは繊維束等のようなものであっても良い。また、前記培養室８の底面部８１は未分解で生体組織内に移植された場合、再生誘導のための足場としての機能を奏することができる。すなわち、通常、培養物を生体組織に移植して組織の再生誘導を行う場合、血液細胞を除いて欠損部位組織の再生誘導のために足場を必要とするが、前記最下層の培養棚が前記のような生体組織の再生誘導における足場の機能を奏することにより、別途生体組織の再生誘導に際して別途前記のような足場の機能を奏する材料を使用する必要がなく、生体組織の再生誘導を簡単に行うことができるという効果を奏することができる。
本発明の培養容器における培養室の数および培養室に播種される増殖用細胞の種類は、作製される積層細胞層の使用分野あるいは用途に応じて適宜決定される。
【００１１】
２．培養容器の実施態様２
図３に基づいて説明する。
本実施の態様の培養容器は、前記図２に示す培養室３〜８の底面部を有しないものに相当する容器状部材３２〜８２を各容器状部材間にスペーサー１０〜１４を挟んで積み重ね、最上位の容器状部材３２の上部開口部を蓋部材９で閉鎖し、また最下位の容器状部材８２の下部開口部を生分解性材料で形成された蓋部材１５で閉鎖して構成されるものである。蓋部材１５を使用する代わりに最下位の容器状部材８２のみを前記実施の態様１で使用する有底の培養室８と同様のものを使用してもよく、また、前記蓋部材９は非生分解性材料である必要はなく、任意の材料で形成されたものでよい。
本実施の態様の培養容器を構成するスペーサーの材料としては、前記実施態様１の培養室の底面部３１〜８１を構成するものと同様のものが用いられ、また、本実施の態様の培養容器を構成する容器状部材３２〜８２の材料としては、前記実施態様１の底面部３１〜８１を除く培養室３〜８を構成するものと同様の材料が用いられる。
本実施態様の培養容器は、スペーサーを用いることにより、実施態様１と同様の機能を奏することができるだけでなく、使用するスペーサーの種類を簡単に変更することができるので、各培養室に合わせて所望の分解速度のものを容易に得ることが可能である。
【００１２】
前記実施態様１および２の培養容器においては、培養室間がリング状シール部材で液密にシールされていることが好ましい。前記リング状シール部材としては、弾性を有するリング状物、例えば例えば図に示すようなシリコーンゴムのリング状物が挙げられるが、本発明で使用される前記リング状シール部材はシリコーンゴムのリング状物に限定されるものではなく、前記培養室間を液密にシールできるリング状シール部材であれば特に制限なく使用が可能である。また、前記シールは他の任意のシール手段、あるいはシール材を使用できる。このようなシール手段、あるいはシール材としては、例えば培養後には各培養室を簡単に分離できるように培養室の外面から簡単に剥離可能な感圧性粘着テープのようなテープ部材、あるいは接着剤などを挙げることができる。このようなシール手段は、本発明の培養容器の断面形状は円形状のものに限定されるものではなく任意の断面形状、例えば四角形のもののようなものも採用可能であるが、このような形状の培養容器の場合においても、培養室間をシールする際に有効である。
【００１３】
前記実施態様１および２の培養容器培養室の底面部、あるいはスペーサーを構成する生分解性材料としては、大きく分けて合成高分子材料、天然高分子材料および無機材料がある。
高分子材料としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酪−カプロラクトン共重合体等が挙げられ、特に前記共重合体はその共重合成分の共重合比を変えることにより、その特性、例えば前記生分解性の速度を変更することができる。
天然高分子材料としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸等が挙げられる。また、これら天然高分子材料、コラーゲン、ゼラチン等は架橋処理することにより、その生分解性を任意に変更することができる。その他、生分解性無機材料としては、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウムが挙げられる。
【００１４】
本発明の培養容器を使用した増殖用細胞の培養は、例えば以下のようにして行うことができる。
本発明の前記培養容器の培養室に、作製した細胞層自体の使用分野あるいは用途に応じて適当な増殖用細胞を播種した後、培養液（例えば血清を含有した培養液）を供給して培養を開始し増殖用細胞層を培養し、培養養開始後、最下層の底面部あるいは最下層のスペーサーを除いた底面部あるいはスペーサーが分解消失させ、この分解除去された底面部あるいはスペーサーに載持された増殖用細胞層を下層の増殖用細胞層に重力落下させ、前記殖用細胞層が接着された積層細胞層を形成させる。前記のようにして作成した培養物は、それを生体に移植して細胞増殖させることにより生体組織の再生を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
多種類の細胞層が層状構造に積層した培養容器および該培養容器を使用した細胞膜の作製方法
【実施例１】
【００１６】
生分解性材料で形成された底面部を有する培養室の複数個が積み重ねられて構成された培養容器
図１および２に基づいて説明する。
分子量１０万のポリグリコール酸を用いて押し出し成形により厚みが２００μｍのフィルム、および同様にして乳酸−カプロラクトン共重合体のフィルムを得た。得られた前記両フィルムは放電処理により親水化処理して増殖用細胞層に対する接着性を改善し、前記ポリグリコール酸フィルムを上下両面部が無く、かつ、その側壁面部に培養液および酸素を供給する開口部２を有するポリスチレン製容器状物の一方開口部面に貼り付けて５個の培養室３〜７を作製し、また、前記前記ポリグリコール酸フィルムに比較して生分解速度の遅い乳酸−カプロラクトン共重合体のフィルムを上下両面部が無いポリスチレン製容器状物の一方開口部面に貼り付けて１個の培養室８を作製した。前記培養室８を最下位として、前記培養室３〜８を積み重ね６層の培養室よりなる培養容器を作製し、γ線滅菌した。
【実施例２】
【００１７】
生分解性材料で形成されたスペーサーを用いて構成された培養容器
図３に基づいて説明する。
分子量１０万のポリグリコール酸を用いて押し出し成形にて厚みが２００μｍのフィルム、および同様にして乳酸−カプロラクトン共重合体のフィルムを得た。前記両フィルムは放電処理により親水化処理して増殖用細胞層に対する接着性を改善した。上下両面部が無く、かつその側壁面部に培養液および酸素を供給する開口部２を有するポリスチレン製容器状物３２〜８２の６個を、各容器状物間に前記ポリグリコール酸フィルムを挟んで積み重ねるとともに、前記ポリスチレン製容器状物８２の下部開口部面を前記前記ポリグリコール酸フィルムに比較して生分解速度の遅い乳酸−カプロラクトン共重合体のフィルムで液密にシールして培養容器を作製し、γ線滅菌した。
なお、前記実施例１および２の培養容器においては、各培養室間は帯状のシリコーンゴムのリング状物、あるいは感圧接着テープのようなテープ等によって液密にシールされている。
【実施例３】
【００１８】
前記実施例１の培養容器を使用した重積あるいは積層細胞層の作製方法
図１に基づいて説明する
図１の培養容器において、培養室が３層のものを使用した。最上位の底面部がポリグリコール酸フィルムで構成される培養室（第１の培養室）に表皮細胞、中間の底面部がポリグリコール酸フィルムで構成される培養室（第２の培養室）に真皮細胞、最下位の底面部が乳酸−カプロラクトン共重合体フィルムで構成される培養室（第３の培養室）に血管内皮前駆細胞を、別々に１．０×１０4個を播種した。各培養室に供給口２を介して増殖対象の前記表皮細胞、真皮細胞および血管内皮前駆細胞の培養に適した培養液を入れた後、前記供給口２を介して酸素を供給して培養することで細胞を増殖させ、培養開始から２０日後、第１と第２の培養室の底面部を構成するポリグリコール酸フィルムが完全に消失して、かつ前記第１と第２の培養室で増殖された増殖細胞層は、最下位の培養室（第３の培養室）の乳酸−カプロラクトン共重合体のフィルムで構成される底面部上に落下して前記各増殖細胞層問が接着した多層構造の積層あるいは重責した細胞層を得た。
本実施例の積層細胞層の作製方法によると、各培養室の増殖細胞の培養を各培養細胞の培養に適した培養液をそれぞれ別個に供給して培養を行うことができ、かつ各培養室の培養条件をコントロールすることが可能であるので、多層に重積あるいは積層した細胞層層を製造する方法として非常に有効である。
なお、前記表皮細胞、真皮細胞および血管内皮前駆細胞の培養に適した培養液としては、それぞれ従来用いられているものを使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明の培養容器を利用して、例えば皮膚再生用の積層細胞層層を製造することができる。すなわち、皮膚は角化細胞、色素細胞やメルケル細胞等で構成される表皮層、線維芽細胞と呼ばれる細胞でつくられた線維と基質で構成される真皮層および真皮の下にあり、脂肪細胞を含み、血管や神経幹も走っている下皮を基本構成とするものであるが、皮膚細胞は他の生体組織、またこれに代わる物質に付着して増殖し，平面上に層を作る性質があり、従来、細胞培養床としてポリスチレンや合成高分子物質に天然高分子物質をコーティングしたもの等を利用して細胞増殖が行われている。
本発明の培養容器を利用すると、皮膚再生用の積層細胞層の他、血管再生用の積層細胞層、内臓臓器再生用の積層細胞層等を容易に作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１の培養容器の構成を示した説明図である。
【図２】実施例１の培養容器の培養室の構成を示した説明図である。
【図３】実施例２の培養容器の構成部材を示した説明図である。
【図４】実施例３の培養が終了した時点における、培養容器の状態を示した説明図である。
【符号の説明】
【００２１】
１    培養容器の蓋
２    培養液あるいは酸素ガス供給口
３    生分解性材料の底部を有する円筒容器
４    生分解性材料の底部を有する円筒容器
５    生分解性材料の底部を有する円筒容器
６    生分解性材料の底部を有する円筒容器
７    生分解性材料の底部を有する円筒容器
８    生分解性材料の底部を有する円筒容器
３１  生分解性材料の底部
４１  生分解性材料の底部
５１  生分解性材料の底部
６１  生分解性材料の底部
７１  生分解性材料の底部
８１  生分解性材料の底部
３２  上下両面部の無い円筒状部材
４２  上下両面部の無い円筒状部材
５２  上下両面部の無い円筒状部材
６２  上下両面部の無い円筒状部材
７２  上下両面部の無い円筒状部材
８２  上下両面部の無い円筒状部材
９    培養容器の蓋
１０  生分解性材料で形成された円盤状スペーサー
１１  生分解性材料で形成された円盤状スペーサー
１２  生分解性材料で形成された円盤状スペーサー
１３  生分解性材料で形成された円盤状スペーサー
１４  生分解性材料で形成された円盤状スペーサー
１５  生分解性材料で形成された蓋
Ａ    増殖した表皮細胞層
Ｂ    増殖した真皮細胞層
Ｃ    増殖した血管内皮前駆細胞層
【図１】
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【図２】
2005095015.tif 000004
【図３】
2005095015.tif 000005
【図４】
2005095015.tif 000006