(57)【要約】  【課題】  例えば鮭の鼻軟骨からアルカリ抽出法や酵素法により抽出されたコンドロイチン硫酸ナトリウム抽出液のように、タンパク質等の夾雑物を含むムコ多糖含有組成物（原料組成物）から夾雑物を簡便且つ低コストで除去し、高純度のムコ多糖を得る方法を提供する。  【解決手段】  ムコ多糖並びにタンパク質及び／又はその分解物を含有してなる原料組成物、及び酢酸ナトリウム等の食塩塩を含み且つ該食塩の濃度が８〜６０重量％である水溶液を調製した後に、当該水溶液とエタノール等の水溶性有機溶媒とを混合して、ムコ多糖を選択的に析出させて高純度化されたムコ多糖を得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムコ多糖並びにタンパク質及び／又はその分解物を含有してなる原料組成物から、ムコ多糖を分離することにより、高純度化されたムコ多糖を製造する方法であって、前記原料組成物を用いて、該原料組成物及び食塩を含み且つ食塩濃度が８〜６０重量％である水溶液を調製する水溶液調製工程、及び該水溶液調製工程で得られた水溶液と水溶性有機溶媒とを混合して、ムコ多糖を選択的に析出させる析出工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記析出工程で析出したムコ多糖と、水溶性有機溶媒を含有する水溶液とを分離する分離工程、当該分離工程で分離されたムコ多糖を水に溶解させて水溶液を調製する第二水溶液調製工程、及び当該第二水溶液調製工程で得られた水溶液に限外ろ過処理、活性炭処理、イオン交換樹脂処理及びろ過処理から選ばれる少なくとも１つの処理を施す工程を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物、飼料等の分野において種々の用途が期待されるムコ多糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖とは、広義には動物から得られた多糖類を意味し、その原料としては、鮫、鮭等の魚類；鯨、エイ、ナマコ等のその他の水生動物；および牛、豚、鶏、馬等の陸上動物から取り出した骨、軟骨、皮、魚の鱗等が知られている。ムコ多糖の代表的な物質としては、グリコサミノグルカンを挙げることが出来る。グリコサミノグルカンは、一般にコアタンパク質に共有結合したプロテオグルカンとして存在する。グリコサミノグルカンは、繰り返し二糖で構成され、二糖の内のひとつはＤ−グルコサミンまたはＤ−ガラクトサミンのいずれかである。グルコサミノグルカンの例としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ケタラン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸及びデルマタン硫酸等が知られている。
【０００３】
これらのなかでコンドロイチン硫酸は、動物の粘質性分泌液、軟骨等から得られるムコ多糖の一種であり、動物、人体の保水をはかり、これによって新陳代謝を潤滑にし、細胞の賦活機能を果たしていると推定されており、医薬品、化粧品、健康食品として広く用いられている。コンドロイチン硫酸の生理作用としては、細胞外液の容量調節と水分代謝、細胞外液のイオン移動と調節、関節組織の円滑化、脂血清澄作用と血液凝固阻止作用、抗炎症作用、抗ガン作用、角膜透明度維持、感染防止等が知られている。食品、飲料、化粧品または医薬品の有効成分として、これらの生理機能を十分に発揮するために、簡便で安価な高純度コンドロイチン硫酸の製造方法の開発が求められている。
【０００４】
一般にムコ多糖は、骨、軟骨、皮等の原料に処理を施すことにより、これら原料に含まれる「ムコ多糖とムコ多糖が共有結合したコアタンパク質」の共有結合を切断し、切断されたムコ多糖を取り出す（抽出する）ことにより製造されている。コアタンパク質の共有結合を切断する処理方法としては、アルカリ液を用いるアルカリ処理法、プロテアーゼ、プロナーゼ等のタンパク質分解酵素を用いる酵素法等が知られている。しかしながら、これらの処理により取り出されたムコ多糖含有抽出物中には、タンパク質やその分解物が多量に含まれている。ムコ多糖へのタンパク質及び／又はその分解物の混在は、特に医薬品、化粧品分野での使用に支障をきたすことがある。例えば、注射薬用医薬剤として用いる場合には、これらタンパク質等が混在するとアレルギー反応を引き起こしやすくなり、化粧品用途では経時的な褐変を生じるなど安定性に問題を生じやすくなる。
【０００５】
そこで、これらの方法で得られた抽出物からタンパク質やその分解物等のコンタミネーションを除去し、ムコ多糖の高純度化を図る必要がある。そのための方法としては、エタノール分画処理、イオン交換クロマトグラフィー処理、エタノールによる沈殿回収とイオン交換樹脂処理との組合せ、限外ろ過処理等が知られている。
【０００６】
エタノール分画処理は、本来は広い分子量分布を有するムコ多糖組成物の中から特定の分子量範囲のムコ多糖を得るための方法であり、分子量によりエタノールに対する溶解性が異なることを利用した方法である。“タンパク質及び／又はその分解物”のエタノールに対する溶解度はムコ多糖のそれに比べて有意に高いため、結果としてこの方法によりこれら夾雑物を分離除去することができる（非特許文献１参照）。しかしながら、エタノール分画処理では、回収されるムコ多糖の総回収率の点で問題がある。また、エタノールによる沈殿回収とイオン交換樹脂処理との組合せ（特許文献１参照）においては、ムコ多糖抽出物水溶液にエタノールを添加して沈殿回収されるムコ多糖の純度は一般に低いため、更に高純度化を図るためにはイオン交換樹脂を用いた処理を行なうことが必須となっている。さらに限外ろ過処理（特許文献２参照）においては、高価な設備が必要であるという問題点があった。
【０００７】
【非特許文献１】日本生化学会編  新生化学実験講座３  「糖質ＩＩ」，東京化学同人，１９９１年，ｐ．２８
【特許文献１】特開２００１−２３１４９７号公報
【特許文献２】特開２０００−２７３１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、タンパク質やタンパク質の分解物等の夾雑物を含むムコ多糖含有抽出物から夾雑物を簡便且つ低コストで除去し、高純度のムコ多糖を得る方法はこれまで知られていない。そこで、本発明は、簡便且つ低コストでムコ多糖含有抽出物から夾雑物を除去する方法を提供し、高純度のムコ多糖を効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった。その結果、ムコ多糖並びにタンパク質及び／又はその分解物を含有してなる原料組成物の水溶液に特定量の食塩を添加してからエタノールと混合してムコ多糖を沈殿回収した場合には、従来のエタノール沈殿回収法による場合と比べて回収されたムコ多糖の純度が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、ムコ多糖並びにタンパク質及び／又はその分解物を含有してなる原料組成物から、ムコ多糖を分離することにより、高純度化されたムコ多糖を製造する方法であって、前記原料組成物を用いて、該原料組成物及び食塩を含み且つ食塩濃度が８〜６０重量％である水溶液を調製する水溶液調製工程、及び該水溶液調製工程で得られた水溶液と水溶性有機溶媒とを混合して、ムコ多糖を選択的に析出させる析出工程を含むことを特徴とする方法である。
【００１１】
原料組成物において“ムコ多糖”と“タンパク質及び／又はその分解物”とは分子の絡み合い等の物理的な相互作用により分離され難い状態となっていると考えられ、単に水溶液化しただけではこの相互作用は弱められないのに対し、本発明の製造方法では水溶液中に適量存在する食塩によりその相互作用が弱まり（例えば分子の絡み合いが解きほぐされて）、析出工程においてムコ多糖のみが選択的に析出されると推測される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造法によれば、例えば鮭の鼻軟骨からアルカリ処理法や酵素法により得られるタンパク質等の夾雑物を含むムコ多糖含有抽出物から夾雑物を簡便且つ低コストで除去することができ、高純度のムコ多糖を効率的に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で使用する原料組成物は、ムコ多糖並びにタンパク質及び／又はその分解物を含有してなる組成物であれば特に限定されず、例えば各種原料動物由来の原料物質をアルカリ或いは酵素で処理してムコ多糖とムコ多糖が共有結合したコアタンパク質とを切断して得られる組成物（所謂、ムコ多糖含有抽出物）が使用できる。
【００１４】
ここで、上記原料動物としては、鮫、鮭等の魚類；鯨、エイ、ナマコ等のその他の水生動物；又は牛、豚、鶏、馬等の陸上動物等が使用できるが得られる原料組成物の純度が比較的高く、臭気を少なくすることができることから、水生動物、特に鮭を使用するのが好適である。また、原料物資としては骨、軟骨、皮、魚の鱗等、ムコ多糖成分を含む組織であれば特に制限されないが、取り扱いが容易で、ムコ多糖の含量が高いことから特に鼻軟骨等の軟骨を使用するのが好適である。なお、用いる原料物質は、あらかじめ水洗、有機溶媒洗浄等により肉、脂肪等の夾雑物を除去することが好ましい。これら原料を、処理前に切断、粉砕、水を添加し加圧する等の処置により、処理の効率を高めることが通常行われる。
【００１５】
また、原料物質から原料組成物を得る方法としては、従来採用されている方法、即ち、原料物質をアルカリ液で分解し、ムコ多糖を抽出するアルカリ処理法、原料物質からムコ多糖を中性塩液で抽出する中性塩処理法、原料物質にプロテアーゼ、プロナーゼ等のタンパク質分解酵素を作用させて分解し、ムコ多糖を抽出する酵素法、又はこれらの方法の組み合わせが制限なく使用できるが、ムコ多糖の回収率が高いという理由からこれらの方法の中で、アルカリ処理法及び酵素法による処理が好ましく、特に酵素処理が好ましい。これらの処理により、ムコ多糖とムコ多糖が共有結合したコアタンパク質とを切断し、ムコ多糖類含む水溶液成分を得ることが出来る。このとき切断されたタンパクやその分解物（タンパクの分解物）も不可避的に上記水溶液に含まれることになる。このような処理によって得られた水溶液は、そのまま原料組成物として使用することができるが、遠心分離、ろ過等によって不溶物の除去を行い、さらに必要に応じて、ろ過助剤を用いてもよいろ過、活性炭処理等を行うことにより、濁り成分の除去、脱臭、脱色、脱脂等を行うのが好適である。さらに、取扱いの容易性からスプレードライ（噴霧乾燥）、蒸発乾燥、凍結乾燥等の方法で固化・粉末化するのが好適である。
【００１６】
原料組成物に含まれるムコ多糖としては、グリコサミノグルカン、キチン、キトサン等を挙げることが出来る。グリコサミノグルカンは、一般にコアタンパク質に共有結合したプロテオグルカンとして存在する。グリコサミノグルカンは、繰り返し二糖で構成され、二糖の内のひとつはＤ−グルコサミンまたはＤ−ガラクトサミンのいずれかで構成される。グルコサミノグルカンの例としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ケタラン硫酸Ｉ及びＩＩ、ヘパリン、ヘパリン硫酸及びデルマタン硫酸等が挙げられる。これらの中で、精製の効率が高いことから、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケタラン硫酸、デルマタン硫酸が好ましく、特にコンドロイチン硫酸が好ましい。ムコ多糖が、硫酸エステル基を有している場合には、中性構造（−OSO3H）または、Na塩（−OSO3Na）、K塩（−OSO3K）、Ca塩（−OSO3Ca）等のイオン性構造またはこれらの混合物であってもよい。またムコ多糖が、カルボシキル基構造を有している場合には、中性構造（−CO2H）または、Na塩（−CO2Na）、K塩（−CO2K）、Ca塩（−CO2Ca）等のイオン性構造またはこれらの混合物であってもよい。
【００１７】
本発明で使用する原料組成物におけるムコ多糖並びにタンパク質及び／又はその分解物の含有量は特に限定されないが、上記したような方法で得られるムコ多糖含有抽出物におけるムコ多糖の含有率は、“ムコ多糖”と“タンパク質及び／又はその分解物”との合計重量を基準とした“ムコ多糖”の重量％で表して、通常１０〜９０重量％の範囲である。本発明においてはこのような範囲のムコ多糖含有率の原料組成物が何ら問題なく使用できる。また、原料組成物にはその他の成分として塩類、灰分、無機物等が含まれていてもよい。これらその他の成分は上記合計重量を基準として０〜５００重量％であるのが好適ある。なお、原料組成物が水溶液である場合には、水溶液中のムコ多糖の濃度は０．１〜９０重量％であるのが好適である。
【００１８】
本発明の製造方法では、前記原料組成物及び食塩を含み且つ該食塩濃度が８〜６０重量％である水溶液を調製する水溶液調製工程、及び該工程で得られた水溶液と水溶性有機溶媒とを混合して、ムコ多糖を選択的に析出させる析出工程を含むことにより前記原料組成物から高純度化されたムコ多糖を製造する。水溶液状態の原料組成物にエタノール等の水溶性有機溶媒を添加してムコ多糖を析出させるという点では、従来のエタノール分画処理法及びエタノールによる沈殿回収法と同じであるが、ムコ多糖の析出を特定濃度の食塩の共存下で行なうことにより、これら従来法では実現できない効果を得ることが可能となっている。以下、これら工程について説明する。
【００１９】
本発明の製造方法では、先ず水溶液調製工程として、前記原料組成物及び食塩を含み且つ該食塩濃度が８〜６０重量％である水溶液を調製する。水溶液中の食塩濃度が８重量％未満の場合には後段の析出工程で析出するムコ多糖の純度が高くならない。また、食塩濃度が６０重量％を超えるときには溶解度の問題や攪拌動力に対する負荷、経済性等の観点から効果が低い。経済性、精製効果の観点から水溶液調製工程で調製される水溶液中の食塩の濃度は、９〜５０重量％、特に１０〜４０重量％であるのが好適である。なお、該水溶液調製工で調製する水溶液中におけるムコ多糖の濃度は特に限定されるものではないが、精製効率の高さの観点から０．２〜６０重量％、特に０．５〜３０重量％であるのが好適である。また、水溶液のｐHは特に制限はないが、精製効率および腐敗防止の観点から、１〜５の範囲（酸性）であるか又は８〜１４（アルカリ性）であるのが好ましい。
【００２０】
食塩としては、工業塩、並塩、岩塩、塩田塩、各種塩化ナトリウムを使用することができる。また、水溶液中で水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムを塩酸あるいは塩化水素と反応させて塩化ナトリウムを使用することもできる。さらに、海水を使用することも可能である。
【００２１】
また水溶液調製工程で調製される水溶液には、必要に応じて、酸、アルカリ、他の塩類、防腐剤を加えることにより、精製効率の向上、菌・カビ等の発生（腐敗）防止を図ることが出来る。例えば、ｐＨを１〜５、好適には２〜５に調製するためには酸を添加するが、このときに使用する酸としては酢酸、クエン酸、酒石酸等の有機カルボン酸、リン酸、塩酸、硫酸等の無機酸を用いることが出来る。これらの中でも特に酢酸が好ましい。
【００２２】
また、ｐＨを８〜１４、好適には８〜１３に調製するためには塩基を添加するが、このときに使用する塩基としてはアルカリを使用するのが好適である。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カルシウム等の炭酸塩、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド等の有機水酸化物等を用いることが出来る。アルカリは単にｐＨを調整する機能だけではなくムコ多糖の精製効率を高める効果もあることから、水溶液はアルカリを含有するのが好適である。
【００２３】
防腐剤としては、一般に腐敗防止に用いられているもののなかで、ムコ多糖及び／又はタンパク質を分解・変性しないものであれば制限なく用いることが出来る。例えば、エタノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、ポリヘキサメチレン等のグアニジン類、塩化ベンザルコニウム等の逆性石鹸、アルキルポリアミノエチルグリシン等の表面活性剤、次亜塩素酸ナトリウム等のハロゲン系殺菌剤、過酸化水素、過酢酸等の過酸化物等を用いることが出来る。これら防腐剤の使用量は、用いるムコ多糖の種類、処理温度等によって適宜調整すればよい。
【００２４】
水溶液調製工程において水溶液を調製する際の各種成分の添加順序は特に制限されず、一度に添加しても数回に分けて添加してもよい。たとえば、粉末状の原料組成物および水を入れた反応釜を攪拌しながら、食塩を固体状態で又は水に溶かした状態で添加すると共にその他添加物を同様にして添加して水に溶解させることにより好適に調製できる。得られた水溶液は、精製効率を高めるために４℃〜１００℃、好ましくは２０〜９０℃、特に好ましくは３０〜７０℃で１０分〜１００時間、好ましくは３０分〜５０時間、特に好ましくは３０分〜２４時間攪拌処理し、必要に応じて放冷・放置するのが好適である。またこの段階でろ過等を行い、不溶物、濁りを除去することは、精製の観点から有用である。なお、水としては、上水またはイオン交換水を使用するのが好適である。
【００２５】
本発明の製造方法では、析出工程において前記水溶液調製工程で得られた水溶液と水溶性有機溶媒とを混合して、ムコ多糖を選択的に析出させる。ここで、水溶性有機溶媒とは、２５℃における水への溶解度が水１００ｇ当たり５０ｇ以上の有機溶媒を意味する。ムコ多糖の回収率を高くすることができるという理由から水溶性有機溶媒としては水と混和する有機溶媒を使用するのが好ましい。好適に使用できる水溶性有機溶媒を例示すれば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール等低級アルコール；エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ジオキサン、ジメチルスルホキシド等を挙げることが出来る。これら溶媒の中で精製するムコ多糖類に応じて適宜選択すればよいが、一般に精製効率の点から、メタノール、エタノールが好ましく、エタノールが特に好ましい。なお、水溶性有機溶媒は、無水のものであっても水を含むものであってもよいが、ムコ多糖類を効率的に析出させる点から、混合する水溶性有機溶媒における水溶性有機溶媒の含有量は８０重量％以上、特に９０重量％以上であるのが好ましい。水溶性有機溶媒がエタノールである場合には、溶媒回収効率と精製効率の点から８５〜９９重量％が好ましく、９２〜９７重量％であることが特に好ましい。
【００２６】
当該析出工程で析出したムコ多糖と水溶性有機溶媒を含有する水溶液とを分離した後に分離された水溶液から前記水溶性有機溶媒を回収し、これを再利用することはプロセス上勿論可能であり、こうすることにより製造コストを低減することができる。この場合において、水を含有してもよい水溶性有機溶媒を使用することは、水溶性有機溶媒の回収・精製コストの点でメリットがある。
【００２７】
析出工程で使用する水溶性有機溶媒の量は、ムコ多糖の析出効率の点から、水溶液調製工程で調製した水溶液及び水溶性有機溶媒（水を含んでいてもよい）の合計重量を基準とした水溶性有機溶媒（水を含まない）の重量％で表して、２０〜８０重量％、特に２５〜７５重量％であるのが好適であり、最も好ましくは３０〜７０重量％である。
【００２８】
水溶液調製工程で得られた水溶液と水溶性有機溶媒との混合する方法には特に制限はなく、例えばバッチ式処理にて該水溶液中に水溶性有機溶媒を添加する方法、逆に水溶性有機溶媒中に水溶液を添加する方法、フロー式処理にて、該水溶液と水溶性有機溶媒を別々のラインから流し、反応槽又はライン中で混合する方法等が好適に採用できる。これらの中でも、処理工程の容易さの点からバッチ式処理が好ましく、主な不純物であるタンパク質及び／又はその分解物の除去効率が高い点から、水溶液中に水溶性有機溶媒を添加する方法が特に好ましい。
【００２９】
水溶液調製工程で得られた水溶液中に水溶性有機溶媒を添加する場合には、反応槽に該水溶液を入れ、温度調整を行いながら攪拌し、水溶性有機溶媒を添加し、さらに攪拌を継続し析出を完了させる。本方法において、混合液の温度、攪拌条件および水溶性有機溶媒の添加速度は析出物の純度、取り扱い性に大きな影響を与える。高純度でろ過性の良い析出物を得るためには、攪拌および水溶性有機溶媒を添加する際の温度は、４℃〜６０℃、特に２０〜４０℃とするのが好適である。また攪拌は、剪断速度が０．５〜１００（ｍ／秒）であることが好ましく、０．７〜５０（ｍ／秒）であることが特に好ましい。水溶性有機溶媒の添加速度に関しては、０．００００１〜５００（ｌ／分）、特に０．０００１〜４００（ｌ／分）であるのが好ましい。また水溶性有機溶媒を添加し終わった後の攪拌時間は、液温によっても変わってくるが通常３０分から１２時間であり、腐敗防止の観点から３時間以内であることが好ましい。このような条件を採用して析出を行うことにより原料組成物中に含まれる９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上のムコ多糖を一度に析出させることができる。
【００３０】
バッチ式処理の別法として、水溶性有機溶媒中に水溶液調製工程で得られた水溶液を添加する場合には、反応槽にあらかじめ水溶性有機溶媒を入れ、温度調整を行いながら攪拌し、該水溶液を添加し、さらに攪拌を継続し析出を完了させればよい。このときの条件は添加する液が水溶性有機溶媒から水溶液調製工程で得られた水溶液に変わるだけで上記の場合と同様である。
【００３１】
析出工程で析出したムコ多糖は、遠心分離ろ過、過圧ろ過、減圧濾過、デカンテーション、フィルタープレス等の通常の分離方法によって、液成分と分離し、回収することが出来る。このようにして回収されたムコ多糖の純度は高いものであるが、より高純度のムコ多糖を得る場合には、分離されたムコ多糖を再度水に溶解させて水溶液（以下、二次水溶液ともいう）を調製した後（第二水溶液調整工程）、得られた二次水溶液と水溶性有機溶媒とを混合して更に高純度化されたムコ多糖を析出させればよい（第二析出工程）。二次水溶液の調製は前記水溶液調製工程と同様にして行えばよい。なお、二次水溶液中にはムコ多糖の析出を促進する目的で酢酸ナトリウム等の有機カルボン酸塩をその濃度が０．１〜５重量％となるように添加するのが好適である。また、調製された二次水溶液は、水溶性有機溶媒と混合せずに、限外ろ過処理、活性炭処理、イオン交換樹脂処理及びろ過処理から選ばれる少なくとも１つの処理を施してもよい。以下これら処理について説明する。
【００３２】
（１）限外ろ過処理
限外ろ過に用いる処理液（二次水溶液）としては、ムコ多糖類を０．１〜３０重量％、好ましくは２〜１０重量％含む水溶液を用いるのが好適である。二次水溶液には腐敗を防止の目的で、防腐剤、酸、アルカリを加えてもよい。二次水溶液のｐＨは、特に制限はないが、腐敗防止の観点からｐＨ８〜１４又はｐＨ１〜５であることが好ましい。限外ろ過に用いる膜は、ムコ多糖類の分子量に応じて適宜選択すればよい。ムコ多糖がコンドロイチン硫酸の場合には、分画分子量が６０００以上の膜であれば有効であるが、特に鮭由来のコンドロイチン硫酸の場合には、分画分子量が３万〜１０万の膜が好ましく、５万の膜を用いることが精製効率の点で特に好適である。
【００３３】
操作手順としては、二次水溶液を加圧下、分画膜に接触させることにより、ムコ多糖類以外の含有物を水と共に溶出させることにより、二次水溶液中のムコ多糖類の純度を上げることが出来る。この際の圧力は、通常１ＭＰａ以下で行われる。この操作により、有機カルボン酸塩を除去することが出来、さらに混在する少量のタンパク質及び／又はその分解物も除去することが可能である。
【００３４】
限外ろ過を行う際の運転様式としては、通常の限外ろ過処理に用いられる運転様式を制限なく用いることが出来る。例示すると、回分式システム、連続式システム、カスケード方式などが挙げられる。回分式システムとしては、通常の回分式運転フローの他にフェッドバッチ式フロー、供給ポンプ付フェッドバッチ式フローも用いられる。
【００３５】
回分式システムでは、二次水溶液は原液タンクに一度導入され、一定時間内に濃縮処理される。本システムの場合には、限外ろ過により濃縮された原液に、必要に応じて水を添加し、繰り返し濃縮処理を行うことにより、ムコ多糖類を精製することが出来る。また、連続式システムを用いることにより、限外ろ過原液を連続的に処理し、連続して処理液を得ることが出来る。
【００３６】
（２）活性炭処理
活性炭処理に使用される活性炭は入手可能なものが何ら制限なく使用される。例えば日本ノーリット社のＰＫ、ＰＫＤＡ  ＭＥＳＹ／ＭＲＸ、ＥＬＯＲＩＴ、ＡＺ０、ＤＡＲＣＯ、ＨＹＤＲＯＤＡＲＣＯ  ３０００／４０００、ＤＡＲＣＯ  １２Ｘ２０ＬＩ、ＤＡＲＣＯ１２Ｘ２０ＤＣ、ＰＥＴＲＯＤＡＲＣＯ、ＤＡＲＣＯ  ＭＲＸ、ＧＡＣ、ＧＡＣ  ＰＬＵＳ、ＤＡＲＣＯ  ＶＡＰＵＲＥ、ＧＣＮ、Ｃ−ＧＲＡＮＵＬＡＲ等の破砕活性炭類、ＣＡ、ＣＮ、ＣＧ、ＤＡＲＣＯ  ＫＢ／ＫＢＢ、Ｓ−５１、Ｓ−５１−ＨＦ、Ｓ−５１−ＦＦ、ＰＲＥＭＩＵＭ  ＤＡＲＣＯ、ＤＡＲＣＯ  ＧＦＰ、ＨＤＣ／ＨＤＲ／ＨＤＨ、ＧＲＯ  ＳＡＦＥ、ＦＭ−１、ＤＡＲＣＯ  ＴＲＳ、ＤＡＲＣＯ  ＦＧＤ、ＳＸ、ＳＸ  ＵＬＴＲＡ、ＳＡ、Ｄ−１０、ＰＮ、ＺＮ、ＳＡ−ＳＷ、Ｗ、ＧＬ、ＨＢ  ＰＬＵＳ等の粉末活性炭類、ＲＯＷ、ＲＯ、ＲＯＸ、ＲＢ、Ｒ、Ｒ．ＥＸＴＲＡ、ＳＯＲＢＯＮＯＲＩＴ、ＧＦ  ４０／５０、ＣＮＲ、ＲＯＺ、ＲＢＡＡ、ＲＢＨＧ、ＲＺＮ、ＲＧＭ等の成型活性炭・添着活性炭類、ＰＩＣＡ社の粒状活性炭類、球状活性炭類、粉末活性炭類、日本エンバイロケミカル社のモルシーボン、ＷＨＡ、粒状白鷺（Ｘ２Ｍ、ＧＭ２Ｘ、ＧＨ２Ｘ、ＧＨＸＵＧ、ＧＳ１Ｘ、ＧＳ３Ｘ、ＧＴＸ、ＧＴＳＸ、Ｇ２Ｘ、ＧＳ２Ｘ、ＧＡＡＸ、ＭＡＣ−Ｗ、ＧＯＣ、ＧＯＸ、ＧＯＨＸ、ＡＰＲＣ、ＴＡＣ、ＭＡＣ、ＸＲＣ、ＮＣＣ、ＳＲＣＸ）等の機能性活性炭類、粒状白鷺（Ｇ２Ｃ、Ｃ２Ｃ、ＷＨ２Ｃ、Ｗ２Ｃ、ＷＨ５Ｃ、Ｗ５Ｃ、ＬＧＫ−４００、ＬＧＫ−１００、ＬＨ２Ｃ、ＫＬ、Ｇ２Ｘ、ＧＨ２Ｘ、ＷＨ２Ｘ、Ｓ２Ｘ、Ｃ２Ｘ、Ｘ７０００Ｈ、Ｘ７１００Ｈ、Ｘ７００Ｈ−３、Ｘ７１００Ｈ−３、ＬＧＫ−７００、ＤＸ７−３）、Ｘ−７０００、Ｘ−７１００、Ｘ−７０００−３、Ｘ−７１００−３、等の粒状活性炭類、白鷺（Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ＰＨＣ、ＦＡＣ−１０）、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、精製白鷺２、特製白鷺、白鷺ＤＯ−２、白鷺ＤＯ−５、白鷺ＤＯ−１１等の粉末活性炭類、ハニカムカーボ白鷺、モールドカーボン、カーボンペーパー、白鷺Ｃ−ＤＣ、カルボラフィンＤＣ、粒状白鷺ＤＣ、アルデナイト、アルデナイトＳＰ等の活性炭加工品類二村化学工業社のＳＧ、ＳＧＰ等の顆粒活性炭類、ＴＡ、ＴＳ、ＴＧ、ＴＭ等の造粒活性炭類、Ｓ、ＦＣ、ＳＡ１０００、Ｋ、Ａ、ＫＡ、ＡＣ、Ｍ、Ｐ、ＩＣ、ＩＰ、ＣＢ、ＧＢ、ＧＬＰ、ＣＬＰ、Ｗ等の粉末活性炭類、ＣＧ４８Ｂ、ＣＧ４８ＢＲ、ＣＷ１３０Ｂ、ＣＷ１３０Ａ、ＣＷ１３０ＢＲ、ＣＷ１３０ＡＲ、ＣＷ４８０ＳＺ、ＣＷ６１００ＳＺ、ＧＬ１３０Ａ、ＧＬ２４０Ａ、ＧＭ１３０Ａ、ＧＭ２４０Ａ、ＧＭＣ等の破砕活性炭類があげられる。使用する活性炭はムコ多糖原料組成物の種類によっても異なるため、適宜選択すればよい。また、二種類以上組み合わせて使用してもよい。これらの活性炭の中で、より高純度のムコ多糖類を得やすいことから、特に粉末活性炭類が好ましく、市販品としては精製白鷺、精製白鷺２、ＳＸ  ＵＬＴＲＡ等を挙げることが出来る。
【００３７】
活性炭の使用量はあまり少ないと効果が激減し、多すぎるとムコ多糖類が吸着され収率が低下すること、および、経済性の観点から二次水溶液中に含有されるムコ多糖に対して、０．００１〜５００重量％、好ましくは０．０１〜４００重量％、さらに好ましくは０．１〜１００重量％の中から適宜選択すればよい。
【００３８】
活性炭処理の溶媒は基本的に水溶液であるが、水溶性有機溶媒との混合溶液でも良い。該水溶性有機溶媒を具体的に示すと、メタノール、エタノール、１−プロピルアルコール、２−プロピルアルコール、１−ブチルアルコール、２−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、アセトニトリル等のニトリル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類が挙げられる。該水溶性有機溶媒と水との比は、あまり水溶性有機溶媒が多いとムコ多糖類が析出するため、通常、水溶性有機溶媒が５０重量％以下で使用する。二次水溶液のムコ多糖の濃度は特に制限はないが、一般に０．１〜３０重量％の範囲から適宜選択する。二次水溶液のｐＨは、３〜１１、特に４〜１０に調整して、活性炭と接触することが好ましい。
【００３９】
活性炭処理は活性炭と二次水溶液を接触させることにより行われるが、このときの接触は大気圧下、過圧下、減圧下のいずれで行ってもよく、さらに、窒素、ヘリウム、アルゴン等の不活性ガス化、大気下のいずれの雰囲気下で処理しても良い。上記接触は通常バッチ式で行われ、添加順序は特に制限されない。接触の際の液度は、あまり低いと水溶液が凝固し、高いとムコ多糖類が変性するため、通常−２０〜１００℃、好ましくは−１０〜９０℃、さらに好ましくは−５〜８０℃である。接触時間はあまり短すぎると効果が発現せず、あまり長いとムコ多糖類の変性を伴うため、通常、０．１〜２４時間である。
【００４０】
活性炭処理後の処理液からの活性炭の除去は通常の分離方法が制限なく使用される。例えば、遠心分離ろ過、過圧ろ過、減圧濾過、デカンテーション、フィルタープレス等が挙げられる。一般的にはろ過助剤としてケイソウ土等のろ過助剤を使用し、加圧ろ過、減圧濾過、フィルタープレスでろ過する。該ろ過助剤は水溶液中に添加してもよく、ろ過器に添加してもよく、両方組み合わせてもよい。さらに、ろ過後の水溶液を０．１〜１．０μｍの精密ろ過（メンブランフィルター、ポールフィルター）をすることがより好ましい。
【００４１】
（３）イオン交換樹脂処理
イオン交換処理を行う場合には、腐敗防止の観点から腐敗防止剤を添加した二次水溶液を使用するのが好適である。二次水溶液中のムコ多糖濃度は０．１〜３０重量％、特に０．５〜２５重量％とするのが好適である。カチオン交換樹脂での処理により、タンパク質及び／又はその分解物の除去、塩、必要であるならば重金属の除去を行うことが出来る。金属イオンおよびタンパク質及び／又はその分解物は、プロトン型の交換体樹脂に結合し、遊離のムコ多糖はろ液又は溶離液中に存在する。処理温度は、一般に０〜５０℃で行われるが、精製効率、樹脂再生、腐敗防止等の観点から、１０〜２５℃が好ましい。処理方式としては、イオン交換樹脂中での攪拌によるバッチ方式、あるいは連続式又は不連続式カラム法で行うことが出来る。カチオン交換樹脂としては、強酸性樹脂が好ましく、例えばダウエックスX５０，アンバーライトIR１２０、ＰＫ２１６等が挙げられる。イオン交換樹脂の使用量は二次水溶液中のムコ多糖１重量部に対して、１〜５０重量％、好ましくは５〜４０重量％を用いて行う。
【００４２】
（４）ろ過処理
前記（１）〜（３）の処理の前後で、ムコ多糖原料組成物を含有する水溶液に濁りが観測される場合は、該処理の効果をさらに向上させるため、濁り成分を除去するため、ろ過処理を行うことが好ましい。該ろ過処理として通常の処理方法が何ら制限なく使用される。例えば、遠心分離ろ過、過圧ろ過、減圧濾過、デカンテーション、フィルタープレス等が挙げられる。一般的にはろ過助剤としてケイソウ土等のろ過助剤を使用し、加圧ろ過、減圧濾過、フィルタープレスでろ過する。該ろ過助剤は水溶液中に添加してもよく、ろ過器に添加してもよく、両方組み合わせてもよい。さらに、ろ過後の水溶液を０．１〜１．０μｍの精密ろ過（メンブランフィルター、ポールフィルター）をすると尚良い。
【００４３】
必要に応じてこのような二次処理を行なった後、析出したムコ多糖を分離する或いは処理後の液から溶媒を除去する等の方法により更に高純度化されたムコ多糖を得ることができる。
【００４４】
前記析出工程（第一析出工程及び第二析出工程）後にろ過等の方法で分離回収されたムコ多糖、或いは上記（１）〜（３）の処理を経た後に分離されたムコ多糖は、水および水溶性有機溶媒を含有しているため、乾燥処理を行うことが好ましい。該乾燥処理は通常の処理が何ら制限なく使用される。例えば、減圧乾燥、温風乾燥、調湿乾燥、風乾、棚段乾燥が挙げられ、棚式で乾燥してもよく、コニカルドライヤーのように回転させて乾燥させても良い。得られるムコ多糖類の種類によって適宜選択すればよい。乾燥操作の温度は、あまり低いと乾燥時間が長期化し、高すぎるとムコ多糖類が変性するため、通常−１０〜１２０℃、好ましくは０〜１１０℃、さらに好ましくは１０〜１００℃の範囲から適宜選択する。
【００４５】
また、上記の乾燥処理をせず直接ムコ多糖類の固体を得る方法として、凍結乾燥および噴霧乾燥が何ら制限なく使用される。凍結乾燥時の水溶液の濃度としては、ムコ多糖類の濃度が５０重量％以下、凍結温度を−５℃以下、減圧度を７００ｍｍHｇ以下で行うと良い。一方、噴霧乾燥時の水溶液の濃度としては１〜４０重量％の範囲で行い、乾燥温度は５０〜２００℃の範囲で適宜選択すればよい。上述の操作により、ムコ多糖類の固体を得ることが可能となる。
【００４６】
乾燥処理により得られたムコ多糖類の固体は必要に応じて、固体を粉砕し分級される。この粉砕・分級処理は公知のものが何ら制限なく使用される。粉砕方法としてはジョークラッシャー、ジャイレトリー・クラッシャー、コーンクラッシャー、ハンマークラッシャー、シュレッダー、ロールクラッシャー、ハンマーミル、ディスインテグレーター、カッターミル、円盤ミル、ピンミル、スタンプミル、フレットミル、ロッドミル、ローラーミル、テーブルミル、リングロールミル、リングロールミル、エロフォールミル、ターボ系粉砕機、スクリーンミル、遠心分級ミル、縦型ジェット粉砕機、マイクロナイザージェット粉砕機、衝突式ジェット粉砕機、ポットミル、チューブミル、コニカルミル、ラジアルミル、塔式粉砕機、円形振動ミル、らせん系振動ミル、遊星型粉砕機、サンドミル、コロイドミル、乳鉢、石臼、薬研等が挙げられる。
【００４７】
一方、分級方法としては、公知のふるい分け法が何ら制限なく使用される。例示すると、重力流動式、機械的強制流動式、振動流動式、気流同伴流動式等のふるい分けが挙げられる。使用するふるいのメッシュのサイズは３．５〜６３５メッシュの範囲から、適宜選択すればよい。
【００４８】
また本発明の方法により高純度化されたムコ多糖の純度、不純物として含まれる各種物質の分析は以下の方法によって行うことが出来る。
【００４９】
１）ムコ多糖
ムコ多糖の構造に応じた方法により分析する。例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸等のグルコサミノグルカンの場合には、構成ユニットのひとつであるウロン酸分析により分析できる。ウロン酸分析法としては、一般にカルバゾール法を用いることが出来る。またコンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸等の硫酸基を有するムコ多糖の場合には、硫酸バリウム比濁法、ロジゾン酸法等の硫酸基定量法を用いることが出来る。混在する不純物の特性ピークが明確であり、目的のムコ多糖のシグナルと分離可能な場合には、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1H-NMR）においても純度分析をすることが可能である。またゲルパーミエイションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって、純度分析が可能である。
【００５０】
２）タンパク質及び／又はその分解物
タンパク質を水中で分解し、生成したアミノ酸をニンヒドリン反応により呈色することを利用するニンヒドリン法を用いることが出来る。また、硫酸と強熱して窒素をすべてアンモニウムイオンとして定量する方法であるケルダール法、２つ以上のペプチド結合が近接して存在する場合に、強アルカリ性側で２価の銅と錯塩を形成する反応を利用するビュレット法、フェノール試薬とタンパク質中の芳香族アミノ酸に由来する呈色反応であるローリー法、芳香族アミノ酸含量を指標とするＵＶ法、過剰の酸（又は塩基性）色素を添加して、タンパク質との間に不溶性の塩を形成させ、沈殿させて、未反応の色素量を分光光度計で測定し、算出した結合色素量からタンパク量を求める色素結合法等、一般にタンパク質を分析する方法を用いることが出来る。これらのなかから、製造するムコ多糖類に応じた分析方法を採用すればよいが、一般に妨害物質の影響を受けにくいこと、検出感度が高いことから好適にはニンヒドリン法を用いることが出来る。またタンパク質及び／又はその分解物の特性ピークが明確であり、目的のムコ多糖のシグナルと分離可能な場合には、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1H-NMR）においても混在量を分析することが可能である。
【００５１】
３）食塩
イオン交換クロマトグラフィー法にてクロルイオン、ナトリウムイオン量を分析することが出来る。硝酸銀滴定によりその濁度から濃度を定量することができる。また、原子吸光やＩＣＰ−ＭＡＳによりナトリウムイオンからの定量が可能である。
【００５２】
４）硫黄含量
日本薬局方一般試験法に基づき、酸素フラスコ燃焼法により分析することが出来る。
【００５３】
５）微生物分析法
公知方法によって可能であるが、例えば日本薬局方一般試験法に基づく、微生物限度試験法生菌数試験（メンブランフィルター法）を用いることができる。
【００５４】
６）水溶性有機溶媒含量
ガスクロマトグラフィー法（ＧＣ）で測定することが可能である。また、プロトン核磁気共鳴スペクトル（1H-NMR）によっても水溶性有機溶媒由来の特性シグナルに基づいて、定量することも可能である。
【００５５】
本発明の製造法により得られるムコ多糖の用途としては、医薬品、化粧品、食品、飲料、調味料、飼料等が挙げられる。以下これら用途のうち、医薬品及び化粧品について詳しく説明する。
【００５６】
本発明の高純度化されたムコ多糖類を有効成分として含有する医薬（以下、本発明の医薬と呼ぶ）としては、生理機能、例えばコンドロイチン硫酸の有する生理機能としては関節組織の円滑化、脂血清澄作用、血液凝固阻止作用、抗炎症作用、抗ガン作用を利用した医薬が挙げられる。
【００５７】
本発明方法により高純度化されたムコ多糖類を有効成分とする医薬品を製造する場合には、例えば該ムコ多糖を公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればよい。製剤の製造は一般的には、本発明の高純度化されたムコ多糖類を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液料となし得る乾燥品とすることが出来る。
【００５８】
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
【００５９】
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の高純度化されたムコ多糖類を、希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、タイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができる。
【００６０】
このようにして得られる医薬は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与する事が出来、外用剤には座剤等も包含される。また、そまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００６１】
また本発明製法により得られる高純度化されたムコ多糖類の他の用途そして化粧品が挙げられる。なお、ここで言う化粧品は例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ケン又は浴用洗剤等を包含するものである。ムコ多糖を有効成分として含有する化粧品は、ムコ多糖が有する化粧品素材としての公知の生理作用、例えば皮膚の保湿性や弾力性の向上効果、皮膚の老化防止効果等の効果を有する。ムコ多糖を化粧品として利用する場合は、常法に従って製造することができる。
【００６２】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６３】
製造例１  ムコ多糖原料組成物の調製
鮭頭部より鼻軟骨を採取し、粉砕した。次いで固形分に対して、２倍量のイオン交換水を加えｐＨを９に調製し、０．２重量％のタンパク質分解酵素（アルカリ性プロテアーゼ）を加えて、５０℃前後で１〜２時間処理した後、９０℃に加熱し酵素を失活させた。冷却後、遠心分離して、活性炭を０．２重量％添加し、攪拌した。次いでろ過助剤（ケイソウ土、ラヂオライト３００）を入れてろ過した後、ろ液をスプレードライヤを用いて乾燥させ、微黄色粉末を得た。得られたムコ多糖類を含む組成物を分析したところ、コンドロイチン硫酸純度は、約４３％、タンパク質及び／又はその分解物は、ケルダール分析法にて約５５％であることが判った。
【００６４】
実施例１
１０００ｍｌの四つ口フラスコに、スリーワンモーター（３５Ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着した。これに、イオン交換水２００ｍｌ、ムコ多糖原料組成物５０．０ｇ｛ムコ多糖類（コンドロイチン硫酸ナトリウム）４３重量％（２１．５ｇ）、タンパク質５５重量％（２７．５ｇ）、食塩２重量％（１．０ｇ）、ＮＭＲ純度４３％｝を加え、４０℃で攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら溶解させた。さらに、食塩２３．４ｇを加え、５０℃で溶解させた（この時点での食塩の濃度は８．６重量％）。その後、４重量％水酸化ナトリウム水溶液２２．０ｇ（水酸化ナトリウム０．０８ｇ、イオン交換水２１．９２ｇ）を加え、５０℃で２時間攪拌した。次に、２２℃まで冷却し、酢酸１．３２ｇを加え、さらに食塩２８．５ｇを加え、２２℃で溶解させた（この時点での食塩の濃度は１６．０重量％）。溶解後、９５重量％エタノール５１３．５ｇ（エタノール４８７．８ｇ、イオン交換水２５．７ｇ）を２時間かけ、３０℃以下で激しく攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら滴下した。滴下後、１時間さらに攪拌して、減圧ろ過により、沈殿を分離した。得られた湿体は１０５．３ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体４８．７ｇが得られた。ＧＰＣ、ＩＥＣ（イオンクロマト）、アミノ酸自動分析（ニンヒドリン法）の結果、コンドロイチン硫酸ナトリウムの含有量は２１．５ｇであり、不純物としてタンパク質／タンパク質分解物７．２ｇ、食塩２０．０ｇが含まれていた。さらに得られたコンドロイチン硫酸について核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）測定、日本薬局方一般試験法に基づく、微生物限度試験法生菌数試験（メンブランフィルター法）、酸素フラスコ燃焼法（イオウ）を行った。結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2005336330.tif 000002
【００６６】
比較例１
１０００ｍｌ四つ口フラスコに、スリーワンモーター（３５Ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着した。これに、イオン交換水２００ｍｌ、ムコ多糖原料組成物５０．０ｇ｛ムコ多糖類（コンドロイチン硫酸ナトリウム）４３重量％（２１．５ｇ）、タンパク質５５重量％（２７．５ｇ）、食塩２重量％（１．０ｇ）、ＮＭＲ純度４３％｝を加え、４０℃で攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら溶解させた。さらに、食塩８．２ｇを加え、５０℃で溶解させた（この時点での食塩の濃度は３．２重量％）。その後、４重量％水酸化ナトリウム水溶液２２．０ｇ（水酸化ナトリウム０．０８ｇ、イオン交換水２１．９２ｇ）を加え、５０℃で２時間攪拌した。次に、２２℃まで冷却し、酢酸１．３２ｇを加え、さらに食塩６．０ｇを加え、２２℃で溶解させた（この時点での食塩の濃度は６．２重量％）。溶解後、９５重量％エタノール５１３．５ｇ（エタノール４８７．８ｇ、イオン交換水２５．７ｇ）を２時間かけ、３０℃以下で激しく攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら滴下した。滴下後、１時間さらに攪拌して、減圧ろ過により、沈殿を分離した。得られた湿体は８５．３ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体３４．７ｇが得られた。ＧＰＣ、ＩＥＣ、アミノ酸自動分析（ニンヒドリン法）の結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム２１．３ｇ、タンパク質／タンパク質分解物２１．３ｇ、食塩１０．０ｇであった。さらに核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）測定、日本薬局方一般試験法に基づく、微生物限度試験法生菌数試験（メンブランフィルター法）、酸素フラスコ燃焼法（イオウ）を行った。結果を表２に示す。
【００６７】
【表２】
2005336330.tif 000003
【００６８】
実施例２
実施例１と同様にして得られた湿体２３．３ｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム４．７６ｇ）をイオン交換水３５０ｇに溶解させ、０．４５μｍのメンブランフィルターで精密ろ過した。アドバンテック製ポリサルホン限外ろ過膜（分画分子量５万）を装着した同社製限外ろ過装置（ＵＨＰ−７６Ｋ）を用い、得られた濾液を、窒素圧力０．２ＭＰａ、液温２０℃の条件で２０時間限外ろ過を行った。このとき、装置内の水溶液が３０ｇになったところで、全量が３５０ｇとなるようにイオン交換水を継ぎ足し、これを繰り返した。継ぎ足したイオン交換水はトータルで１５００ｇであった。限外ろ過終了時の装置内の水溶液量は、１２５ｇであり、これを４つ口５００ｍｌフラスコに移液した。このフラスコにスリーワンモーター（３５Ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着し、攪拌しながら酢酸ナトリウム２ｇを添加し溶解させた。溶解後、温度を５℃に冷却し、せん断速度を１０ｍ／秒とした後、９５重量％エタノール２３８ｇ（エタノール２２６ｇ、イオン交換水１２ｇ）を２時間かけて滴下した。滴下終了後、さらに１時間熟成後、減圧濾過により沈殿を分離した。さらに、９５重量％エタノール５０ｇ（エタノール４７．５ｇ、イオン交換水２．５ｇ）で２回洗浄した。
【００６９】
得られた湿体は１０ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体４．７ｇを得た。ＧＰＣ、ＩＥＣ、アミノ酸自動分析（ニンヒドリン法）の結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム４．６ｇ、タンパク質／タンパク質分解物０．０６ｇ、酢酸ナトリウム未検出であった。また、このときのＮＭＲ純度は１００％であった。さらに、日本薬局方一般試験法に基づく、酸素フラスコ燃焼法（イオウ）を行ったところ、イオウ５．９重量％であった。
【００７０】
実施例３
実施例１と同様にして得られた湿体２３．３ｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム４．７６ｇ）をイオン交換水１２５ｇに溶解させ、０．４５μｍのメンブランフィルターで精密ろ過した。三菱化学社製カチオン交換樹脂ＰＫ２１６を充填した１．５ｃｍＸ２０ｃｍのカラムに前記精密ろ過により得られた濾液を添加し１時間かけてカラム処理した。さらに、イオン交換水２０ｍｌで樹脂を洗浄した。カチオン交換樹脂処理後に得られた水溶液は洗浄液とあわせて１５０ｇであり、これを４つ口５００ｍｌフラスコに移液した。その後、水酸化ナトリウム０．３８ｇを加えて中和した。このフラスコにスリーワンモーター（３５Ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着し、攪拌しながら酢酸０．５ｇでｐＨ＝５．５に調整した。その後、さらに酢酸ナトリウム２ｇを添加し溶解させた。溶解後、温度を５℃に冷却し、せん断速度を０．７ｍ／秒とした後、９５重量％エタノール２８５ｇ（エタノール２７１ｇ、イオン交換水１４ｇ）を２時間かけて滴下した。滴下終了後、さらに１時間熟成後、減圧濾過により沈殿を分離した。さらに、９５重量％エタノール５０ｇ（エタノール４７．５ｇ、イオン交換水２．５ｇ）で２回洗浄した。
【００７１】
得られた湿体は１０ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体４．７ｇを得た。ＧＰＣ、ＩＥＣ、アミノ酸自動分析（ニンヒドリン法）の結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム４．６ｇ、タンパク質／タンパク質分解物０．０４ｇ、酢酸ナトリウム未検出であった。また、このときのＮＭＲ純度は１００％であった。さらに、日本薬局方一般試験法に基づく、酸素フラスコ燃焼法（イオウ）を行ったところ、イオウ５．９重量％であった。
【００７２】
実施例４
４つ口５００ｍｌフラスコにスリーワンモーター（３５Ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着し、イオン交換水１２５ｇを注入した。さらに、実施例１と同様にして得られた湿体２３．３ｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム４．７６ｇ）を室温で攪拌しながら溶解させ、さらに、日本エンバイロケミカル社製の活性炭／精製白鷺２を４ｇ添加後、室温で２時間攪拌した。攪拌後、減圧ろ過器に、ケイソウ土１０ｇをプレフィードしてろ過し、イオン交換水２０ｇで洗浄した。次いで、ろ液を０．４５μｍのメンブランフィル−ターで精密ろ過した。さらに、４つ口５００ｍｌフラスコにスリーワンモーター（３５ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着し、そのろ液１２５ｇを移液した。その水溶液に酢酸ナトリウム２ｇを溶解させた。溶解後、温度を５℃に冷却し、せん断速度を１ｍ／秒とした後、９５重量％エタノール（エタノール２２６ｇ、イオン交換水１２ｇ）を２時間かけて滴下した。滴下終了後、さらに１時間熟成後、減圧濾過により沈殿を分離した。さらに、９５重量％エタノール５０ｇ（エタノール４７．５ｇ、イオン交換水２．５ｇ）で２回洗浄した。
【００７３】
得られた湿体は１０ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体４．７ｇを得た。ＧＰＣ、ＩＥＣ、アミノ酸自動分析（ニンヒドリン法）の結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム４．６ｇ、タンパク質／タンパク質分解物０．０５ｇ、酢酸ナトリウム未検出であった。また、このときのＮＭＲ純度は１００％であった。さらに、日本薬局方一般試験法に基づく、酸素フラスコ燃焼法（イオウ）を行ったところ、イオウ５．９重量％であった。
【００７４】
実施例５
実施例１と同様にして得られた湿体２３．３ｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム４．７６ｇ）をイオン交換水３５０ｇに溶解させ、０．４５μｍのメンブランフィルターで精密ろ過した。アドバンテック製ポリサルホン限外ろ過膜（分画分子量５万）を装着した同社製限外ろ過装置（ＵＨＰ−７６Ｋ）を用いて濾液を窒素圧力０．２ＭＰａ、２０℃の条件で２０時間限外ろ過を行った。このとき、装置内の水溶液が３０ｇになったところで、全量が３５０ｇとなるようにイオン交換水を継ぎ足し、これを繰り返した。継ぎ足したイオン交換水はトータルで１５００ｇであった。限外ろ過終了時の装置内の水溶液量は、１２５ｇであった。
【００７５】
その水溶液を、４つ口５００ｍｌフラスコにスリーワンモーター（３５ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着し移液し、日本エンバイロケミカル社製の活性炭／精製白鷺２を４ｇ添加後、室温で２時間攪拌した。攪拌後、減圧ろ過器に、ケイソウ土１０ｇをプレフィードしてろ過し、イオン交換水２０ｇで洗浄した。次いで、ろ液を０．４５μｍのメンブランフィル−ターで精密ろ過した。さらに、４つ口５００ｍｌフラスコにスリーワンモーター（３５ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着し、そのろ液１２５ｇを移液した。その水溶液に酢酸ナトリウム２ｇを溶解させた。溶解後、温度を５℃に冷却し、せん断速度を１ｍ／秒とした後、９５重量％エタノール（エタノール２２６ｇ、イオン交換水１２ｇ）を２時間かけて滴下した。滴下終了後、さらに１時間熟成後、減圧濾過により沈殿を分離した。さらに、９５重量％エタノール５０ｇ（エタノール４７．５ｇ、イオン交換水２．５ｇ）で２回洗浄した。
【００７６】
得られた湿体は１０ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体４．７ｇを得た。ＧＰＣ、ＩＥＣ、アミノ酸自動分析（ニンヒドリン法）の結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム４．６ｇ、タンパク質／タンパク質分解物０．０１ｇ、酢酸ナトリウム未検出であった。また、このときのＮＭＲ純度は１００％であった。さらに、日本薬局方一般試験法に基づく、酸素フラスコ燃焼法（イオウ）を行ったところ、イオウ５．９重量％であった。
【００７７】
実施例６
１０００ｍｌ四つ口フラスコに、スリーワンモーター（３５Ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着した。これに、イオン交換水２００ｍｌ、日本バリアフリー社製のマリンコンドロイチン−４０（ＭＣ−４０）１２．８ｇ｛コンドロイチン硫酸ナトリウム４２重量％（５．４ｇ）、タンパク質４６重量％（５．９ｇ）、その他１１．３重量％（１．５ｇ）、ＮＭＲ純度４４｝を加え、４０℃で攪拌しながら溶解させた。さらに、食塩３２．８ｇを加え、５０℃で溶解させた（この時点での食塩の濃度は１３．４重量％）。その後、４重量％水酸化ナトリウム水溶液２２．０ｇ（水酸化ナトリウム０．０８ｇ、イオン交換水２１．９２ｇ）を加え、５０℃で２時間攪拌した。次に、２２℃まで冷却し、酢酸１．３２ｇを加え、さらに食塩４０．０ｇを加え、２２℃で溶解させた（この時点での食塩の濃度は２３．６重量％）。溶解後、９５重量％エタノール５１３．５ｇ（エタノール４８７．８ｇ、イオン交換水２５．７ｇ）を２時間かけ、３０℃以下で激しく攪拌（せん断速度５ｍ／秒）しながら滴下した。滴下後、１時間さらに攪拌して、減圧ろ過により、沈殿を分離した。得られた湿体は５０ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体５．４ｇを得た。ＧＰＣ、ＩＥＣ、アミノ酸自動分析（ニンヒドリン法）の結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム５．２ｇ、タンパク質／タンパク質分解物１．３ｇ、酢酸ナトリウム０．１ｇであった。さらに核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）測定、日本薬局方一般試験法に基づく、微生物限度試験法生菌数試験（メンブランフィルター法）、酸素フラスコ燃焼法（イオウ）を行った。結果を表３に示す。
【００７８】
【表３】
2005336330.tif 000004
【００７９】
実施例７
エタノールをメタノールに変更した以外は、実施例１と同様に処理した。結果を表４に示す。
【００８０】
【表４】
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