(57)【要約】【課題】本発明は、癌末期患者の体液中、特に循環血液中に存在する悪液質惹起物質を検出する方法を提供する。【解決手段】白血球細胞、特にマクロファージに、末期の担癌ラットの血清を作用させたとき、悪液質惹起物質の毒性によって低下する細胞活性を、細胞の接着能を測定することによって検出可能であることを見出した。当該方法は、混合物である癌悪液質惹起物質を分離することなく、総括的に捉えることができ、癌悪液質惹起物質を簡便かつ迅速に検出することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内の癌悪液質惹起物質を検出する方法であって、
１）被験者から採取した体液を白血球細胞に作用させる、および
２）当該細胞の接着能を測定する、
工程からなる上記方法。
【請求項２】
細胞がマクロファージまたは好中球である請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞がヒト、ブタ、マウスまたはラット由来である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
体液が血液または腹水である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
接着能の測定を、
（ｉ）工程１）処理後の細胞を試験溶液中で培養し、
（ｉｉ）当該細胞を試験溶液が接する面に接着させ、
（ｉｉｉ）接着した細胞に洗浄液を作用させ、および
（ｉｖ）面に残存する細胞の量を測定する、
ことによって行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
培養時間が１５〜２０分である請求項５記載の方法。
【請求項７】
培養温度が１５〜２５℃である請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
洗浄液は水圧約０．０１〜０．１ＭＰａで細胞に噴射する請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ｉｉｉ）の処理を振盪により行う請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
残存する細胞の量を顕微鏡観察により測定する請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
残存する細胞の量を比色法を用いて測定する請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌末期患者の体液中、特に循環血液中に存在する悪液質惹起物質を検出する方法に関する。
本発明はまた、癌悪液質惹起物質を除去するための吸着剤を選定するための、簡便かつ優れた癌悪液質惹起物質の検出法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
癌患者、特に終末期における患者は、悪液質の状態に陥っており、患者は死亡するまで極度の二日酔いに似た状態や痛みなどを伴って苦しむのが一般的である。その原因としては、血液中の免疫抑制物質の体内での増加が考えられ、血液交換療法で患者の血液を廃棄して健常人の血液を輸血し、それらを除去することにより免疫機能の回復を図ることを目的として実施されてきた。この考えは、１９７６年にＩｓｒａｅｌらにより実施され、癌の部分的な縮小があったと発表している（例えば、非特許文献１〜３参照。）。
【０００３】
免疫抑制物質を含む癌悪液質惹起物質として抗腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン、αフェトプロテインやＣ反応性タンパク質（Ｃ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＰ）などが見出され、これらを特異的に吸着する方法が考案されてきた。しかしながら、現在認められているだけでも２５〜３０種類の癌悪液質惹起物質が存在し、癌の種類によってもそれらの物質が量的に偏りがあることが知られている。そのため、患者の病態と患者体内の癌悪液質惹起物質との関連性を調べたり、癌悪液質惹起物質を除去するための吸着剤を選定する際、個々の癌悪液質惹起物質についてそれぞれ測定しなければならなかった。
【０００４】
癌末期患者の体内の悪液質惹起物質が徐々に増加することによって、その患者の全身状態が悪化し、やがて食欲なども低下して死に至るものと考えられる。従って、悪疫質惹起物質を鋭敏に検出できる方法があれば、患者が重篤な状態に陥る前に悪液質惹起物質を早期に発見し、体外に取り除いてやることが可能となる。しかしながら、今までは技術的にごく限られた一部の物質しか検出することができず、他の残りの物質が存在していても検出することができなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
イスラエル、エル．ら（Ｉｓｒａｅｌ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、血漿瀉血と癌の免疫学的制御（Ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、ｉ：６４２、１９７６
【非特許文献２】
ブラウン、オー．ら（Ｂｒｏｗｎｅ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．）、血漿瀉血と免疫賦活薬（Ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、ｉｉ：９６、１９７６
【非特許文献３】
ハーセイ、ピー．ら（Ｈｅｒｓｅｙ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．）、血漿瀉血によって誘導された、メラノーマ細胞に対する、抗体依存性の細胞媒介性細胞毒性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ）ｉ：８２５、１９７６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
癌の末期患者の体内における悪液質惹起物質は徐々に増加し、また、種々の癌悪液質惹起物質の内、どの物質が増加するかは患者の病態によって異なるため、従来の検出法では早期に癌悪液質惹起物質を検出することは困難であって、検出可能となった時期においては既に患者にとって重篤な状態に至る場合が多かった。
【０００７】
また、癌悪液質惹起物質は多種類であって未同定の物質も多いため、それら全てを検出する方法はなく、従って、癌悪液質惹起物質除去用の吸着剤などを選定するためには、生体内の癌悪液質惹起物質を総合的にかつ簡便に検出する方法が必要であった。
白血球のうち、特にマクロファージは生体の免疫機構に深く関りをもっており、また、好中球は直接癌細胞と戦っており、死んだ細胞を貪食もして生体に悪影響を及ぼさないように働くなど、これらの細胞は癌患者にとって極めて重要な働きを持っており、これらの細胞の正常な活動が妨げられる状況は、病死と密接な関係があると考えられている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明において、白血球細胞、特にマクロファージに、末期の担癌ラットの血清をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作用させると、当該マクロファージの、例えば試験管底面への接着能が低下することを初めて見出した。この現象は、種々の腫瘍によって作成した担癌モデルラットの血清においても同様に観察され、癌悪液質惹起物質の種類とは無関係に、生体内の癌悪液質惹起物質の存在を示す指標として有用なものである。
【０００９】
従って、本発明によって、癌患者の悪液質状態を早期にかつ簡便に検出することが可能となる。また、本発明は、生体毒としての癌悪液質惹起物質のかなりの部分を取り除くことができる吸着剤の効率的な選定を可能とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明では、マクロファージを使用してその細胞が存在する培養液の中に癌悪液質惹起物質が存在していればマクロファージの性質である
１）変形する、
２）一定以下の大きさの粒子を貪食（捕食）する、および
３）壁面に付着する、
という行動などに対して影響を与えるという現象を利用することにより、その毒性物質の存在を確認する。
【００１１】
本発明は、方法が簡便かつ定量性にも優れた、マクロファージの接着性を指標として、癌悪液質惹起物質の存在の有無を測定するものである。
【００１２】
白血球細胞には、単球細胞、リンパ球細胞、および好中球、好酸球、好塩基球である顆粒球細胞が含まれ、生体の免疫系の維持に機能している。単球から変化したものとしてマクロファージがあり、食作用などの特徴的な機能を有する細胞である。マクロファージを代表として、白血球細胞の一部は、血管内外の移動のため、接着性に富むものである。
そして、細胞の活動が癌悪液質惹起物質などの細胞毒性物質によって低下した場合、細胞の接着能の低下として具現化することを初めて見出した。
【００１３】
本発明の方法においては、マクロファージの接着性を利用するものであり、白血球細胞であれば本発明の方法に適用することができる。好中球を用いた場合も、同様な現象が認められた。
【００１４】
本発明の癌悪液質惹起物質の測定方法は、以下の工程からなる。
１）末期担癌ラットから血液などの体液を採取し、血液の場合は血清を分離するなど、当該体液から固形分や沈殿物を除去しておく。
２）あらかじめ処理しておいた健康なラットの腹腔内からマクロファージを採取する。
ヒト癌患者の場合は、
１）ヒト癌患者から血液などの体液を採取する、および
２）血液型などが適合した健康なヒトの、または、それに似た反応を示すヒト以外の動物のマクロファージを採取する、ことによって、本発明の方法を適用することができる。
【００１５】
工程１）において調製したサンプルを試験管内において工程２）において調製したマクロファージに加える。この処理は、市販のマイクロプレートを使用して行うこともできる。最終的に顕微鏡観察によってマクロファージの接着を観察する場合には、平底のものが望ましい。一回の処理数が多く、サンプルの希釈列を作成する上で、９６ウェルのマイクロプレートが望ましい。
【００１６】
サンプルとマクロファージを含む試験溶液の容量は、用いる試験管の形状によって変化することになるが、マクロファージを試験管の底面に均一に接着させる必要から、市販の平底の９６ウェルマイクロプレートの場合、数１０μＬ以上が望ましく、操作性の点から３００μＬが望ましい。
【００１７】
末期癌血清とマクロファージ含有液とを時間をおかないでウェル内に注入された試験溶液は、温度１０〜３７℃、好ましくは１５〜２５℃、特に好ましくは２０℃で、室温でよく、０〜６０分間、好ましくは５〜３０分間、特に好ましくは１５分間静置することによって、マクロファージを試験管の底面に接着させる。
【００１８】
マクロファージを接着させた後、マクロファージの接着性の強度を調べるため、接着したマクロファージ層に物理的または化学的な処理を加える。
【００１９】
物理的な処理は、試験溶液にノズルなどを挿入し、緩衝液などの洗浄液を一定圧力で噴出することによって行うことができる。また、マイクロピペッターなどによる一定回数、一定圧のピペッティングによって行うこともできる。また、一定の振盪や超音波処理によって行うこともできる。
【００２０】
洗浄液処理後、試験溶液に残存するマクロファージの量を測定する。顕微鏡観察による場合は、対照との比較による目視で癌悪液質惹起物質の有無を認識することができる。また、顕微鏡写真を利用するなどして画像処理によって残存するマクロファージの量を数値化し、よって、癌悪液質惹起物質の量を数値化することができる。さらに、マクロファージを染色後、比色法を用いてマクロファージの量を数値化することも可能である。
【００２１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、当該実施例により本発明は制限されるものではない。
【００２２】
【実施例】
（例１）
実験動物は、雄のＤｏｎｒｙｕラット（Ｃｒｊ−Ｄｏｎｒｙｕ；日本チャールズリバー製、体重１５０〜３５０ｇ）を用いた。
また、腫瘍細胞として、ラット肉腫ＬＹ−８０を使用した。
【００２３】
腫瘍モデルラットの作成
細胞数約２ｘ１０６個のＬＹ−８０をラット腹腔内に生着させた。
【００２４】
作成した腫瘍モデルラットについて、移植７、８、９日後に、エーテル麻酔下での心臓穿刺、または断頭によって血液を採取した。採取した血液は、８００ｇ、５〜２０分間の遠心分離によってその上清を血清成分として分取した。
対照は、腫瘍細胞の生着処理を行っていない健康なラットから上記の方法によって採取した血清を用いた。
【００２５】
マクロファージの採取
正常ラットの腹腔内に滅菌済みの５％グリコーゲン溶液を１０ｍｌ〜２０ｍｌ注入し、４日または５日経過後に屠殺し、腹腔内洗浄した洗浄液中からマクロファージを採取した。
【００２６】
マクロファージの接着性試験
９６ウェルプレート（ファルコン社製、型番３０７２）に、１０５〜１０７個／ｍｌに調整したマクロファージ含有液１５０μｌ、およびラット血清１５０μｌ、計３００μｌを注入した。
１）培養時間および操作温度の検討
最適条件を調べる実験として、操作時のプレートの温度を１０℃、２０℃および３０℃とし、各温度において培養時間を５分、１０分、１５分、２０分、２５分および３０分として、腫瘍ラット血清を加えた場合と健康ラットの血清を加えた場合でのウェル底面における着床したマクロファージ細胞の残存率を図１に示した。
培養時間１５〜２０分、培養温度１５〜２５℃において着床細胞残存率の顕著な差が認められ、当該培養時間および培養温度が、マクロファージの接着性試験に適した条件であることが明らかとなった。
２）培養温度を２４℃（室温）、培養時間を１５分として、マクロファージを培養後、一定圧（約０．０１〜０．１ＭＰａ）で水を着床面に向けて噴出し、その噴出の前後の着床面の顕微鏡写真（拡大倍率：ｘ２００）を撮影し、図２として示した。
図２の結果から明らかなように、腫瘍ラット血清を加えた場合に、健康ラット血清を加えた場合に比べて、マクロファージの着床残存率が顕著に低下した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の方法は、癌悪液質惹起物質による、細胞を死に至らしめるほどではない程度の毒性をも検出可能なものであり、種々の物質の混合物である癌悪液質惹起物質を総括的に検出する簡便方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種培養温度および培養時間における着床細胞残存率を示す。
【図２】培養温度２４℃（室温）、培養時間１５分の条件下における健康ラット血清添加および腫瘍ラット血清添加それぞれの場合の洗浄液（水）噴射前後におけるマクロファージ接着面の顕微鏡写真（拡大倍率：ｘ２００）を示す。
【図１】
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【図２】
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