(57)【要約】【課題】神経分野の薬理試験、毒性試験に用いられるミクログリア細胞を安定した培養と信頼性の高い試験が可能な形で輸送し提供すること。【解決手段】混合グリア細胞培養系を形成した培養容器を作成し、該培養容器を混合グリア細胞培養系を維持した状態で輸送することを特徴とする混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法であり、好ましくは混合グリア細胞培養系は、神経組織を分散培養することによって形成されたもの、又は胎児ないしは新生児の脳を４〜10日間培養して形成されたものであり、輸送された培養容器を用いて培養を行い、増殖し浮遊してくるミクログリア細胞を採取するミクログリア細胞の採取方法。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合グリア細胞培養系を形成した培養容器を作成し、該培養容器を混合グリア細胞培養系を維持した状態で輸送することを特徴とする混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法。
【請求項２】
混合グリア細胞培養系は、神経組織を分散培養することによって形成されたものである請求項１記載の混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法。
【請求項３】
混合グリア細胞培養系は、胎児ないしは新生児の脳を４〜10日間培養して形成されたものである請求項１記載の混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか記載の混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法によって輸送された培養容器を用いて培養を行い、増殖し浮遊してくるミクログリア細胞を採取するミクログリア細胞の採取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経組織において免疫機能を担うミクログリア細胞の提供方法に関するものである。ミクログリア細胞は、神経組織に存在し、特に中枢神経系に於いては、主要な生体防御機能を担う細胞である。この防御機能が過剰に、また適切性を欠いて働くことにより、アルツハイマー病などの中枢性神経疾患を悪化させることが知られている。この他にも多くの疾患に関与していることが示されており、神経系疾患の病因解明、その治療薬の開発などに於いて重要な細胞となっている。
【背景技術】
【０００２】
細胞の提供方法としては、大きく分けて３つの方法が用いられている。細胞ないしは細胞を含む組織を凍結して提供する方法、細胞ないしは細胞を含む組織を冷蔵して提供する方法、細胞ないしは細胞を含む組織を室温〜37℃程度までの常温で提供する方法である。冷蔵又は常温で提供する場合、細胞は培養容器の培養表面上で接着し培養されている状態のもの、培養液中に浮遊している状態のもの、浮遊ないしは接着しているが、球状凝集状態（スフェロイド状）をとっているものなど、細胞の特性に応じて種々の形状をとる。凍結の場合は、細胞ないしは細胞を含む組織は、通常培養液や保存液とともに凍結されて提供される。
【０００３】
初代細胞（正常細胞）と株化細胞でも、提供方法に違いが見られる場合が多い。株化細胞の場合は均一な細胞集団であること、凍結に対しても耐性が高いこと、などから凍結状態で提供される場合が多い。被提供者はこれを解凍し分散、定められた培養液で培養する。これにより容易に均一な細胞培養系を得ることが出来る。また、一定の培養容器に予め培養し、これを常温で提供する方法も用いられている。これは、解凍時のトラブルを防ぐとともに、被提供者は凍結ダメージから回復した細胞を受けとることが出来るというメリットがある。
【０００４】
初代細胞の場合は、凍結に対して耐性が低いものが多い。そのため、常温や冷蔵での提供方法も多く行われている。形状は分散培養状態、凝集球状状態、浮遊状態、組織の状態など、様々である。冷蔵状態での提供は、移植医療で頻繁に行われる。これは凍結によるダメージを受けた組織や細胞は使用できないことが、その主因である。しかし凍結に比べ冷蔵では、組織や細胞の機能を正常に維持するには限度があり、迅速な輸送手段が必要とされている。
【０００５】
細胞の特性は細胞種によって大きく異なる。実験室内では問題ない細胞でも、これを他の研究室に提供するとなると困難が発生する場合も多い。最も安全な提供方法は凍結することであるが、前記したように凍結ダメージは細胞種により異なり、軽微なものから大きな影響を受けるものまである。株細胞の場合は増殖力が大きく、生き残った細胞を増殖させることにより、この問題は解決できるが初代細胞では増殖しない、あるいは増殖力が弱いため、大きな問題となる。この場合、常温での提供方法が必要となる。
【０００６】
常温での提供も、すべての細胞で可能とはいえない。例えば神経細胞を培養し、これを常温で輸送した場合、接着力が弱い神経細胞は培養表面から遊離してしまい、披提供者は最初の培養系を再現することは出来ない。この他にも接着力の弱い細胞は多い。また、通常細胞は炭酸ガスインキュベーター内で培養されるが、この温度、環境ガス濃度、湿度、それぞれ一定に設定された環境から、輸送によって必然的に生じてしまう温度変化、振動、環境ガス濃度の変化などに耐えられない細胞も多く、いかに安全な輸送方法を取るかも重要である。
【０００７】
生体外で培養する場合、株細胞あるいは癌細胞のように機能が異常化している細胞は基本的な培養方法で、いつでも培養が可能であるが初代細胞は由来する生物の生物年齢や培養系に取り出してからの経過時間が決定的な影響を与える。すなわち、これらの要因が初代培養系を構成する際に重要な限定要因となり、適切な条件で細胞を提供しなければ被提供者にとっては意味を成さないことになる。
【０００８】
生体外に取り出し培養系に移してからの経過時間が、細胞の機能、生存維持などに影響を与える初代細胞は、神経細胞、ミクログリア細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵島細胞など多くの細胞が該当し、影響しない細胞の方が数少ないといえる。特にミクログリア細胞は混合グリア細胞培養系で経時的に細胞数を増すという特性があり、この細胞増加期に於いて細胞を採取し試験に用いなければならない。
【非特許文献１】Brain Research、324巻、379-383ページ、(1984年)
【非特許文献２】The Journal of Pharmaceutical and Experimental Therapeutics、304巻、1-7ページ、(2003年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、神経分野の薬理試験、毒性試験に用いられるミクログリア細胞を安定した培養と信頼性の高い試験が可能な形で輸送し提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ミクログリア細胞を生体外に取り出した後の分化・増殖、安定性の検討を行った。ミクログリア細胞を分離した条件では、細胞数の少なさ、低増殖率などに問題を認めたが、混合グリア細胞培養系では良好な状態であることに着目、安定した提供方法の検討を行った結果、本発明に至ったものである。
即ち本発明は、
（１）混合グリア細胞培養系を形成した培養容器を作成し、該培養容器を混合グリア細胞培養系を維持した状態で輸送することを特徴とする混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法、
（２）混合グリア細胞培養系は、神経組織を分散培養することによって形成されたものである（１）記載の混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法、
（３）混合グリア細胞培養系は、胎児ないしは新生児の脳を４〜10日間培養して形成されたものである（１）記載の混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法、
（４）（１）〜（３）いずれか記載の混合ミクログリア細胞培養容器の輸送方法によって輸送された培養容器を用いて培養を行い、増殖し浮遊してくるミクログリア細胞を採取するミクログリア細胞の採取方法、
である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を用いることにより安定したミクログリア細胞の提供を図ることが出来る。これにより、従来本細胞による評価実験が行えなかった研究者も、容易に入手が可能となることから、神経系疾患の病因解明やその治療薬開発の加速化が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において混合グリア細胞培養系を形成するには、ラット、マウスなどの動物の胎児ないしは新生児の脳を用いることが好ましいが、ヒト由来とすることも可能である。これを細切、トリプシンなどにより、結合組織を切断し細胞を分離する。これを血清添加培養液で培養することにより、アストロサイトを主要な細胞とする混合グリア細胞培養系が形成される。この状態で培養を継続すると、ミクログリア細胞が顕微鏡観察下、容易に認めることが出来る状態で出現してくる。この期間は使用する脳の量、由来が胎児、新生児、成熟動物などにより異なる。使用する培養液は、血清添加培養液が適するが、さらにミクログリア細胞増殖作用を持つM-CSF、GM-CSFなどの増殖誘導因子を添加してもよい。
【００１３】
増殖してきたミクログリア細胞を採取することにより、評価試験系などの実験系を構成することが出来るが、この混合グリア細胞培養系では浮遊している状態のものと接着しているものが認められる。後者は培養器を振とうすることにより浮遊状態へ変わり、より多くの細胞を採取することが出来る。混在してくる非ミクログリア細胞を除くために、疎水性表面の培養器で、１〜２時間ほど培養、非接着細胞を除去することにより均一な細胞集団が得られる。
【００１４】
本発明において混合グリア細胞培養系を形成する培養容器（混合ミクログリア細胞培養容器）は、特に制限されるものではないが多くのミクログリアを得ようとする場合には培養面積の大きなものを用いる必要がある。また、振とう操作を行い、より多くの細胞を得ようとする場合は容器を密閉状態にする必要がある。輸送する場合にも容器を密閉状態にする必要があり、この点から容易に密閉状態に出来る培養フラスコなどが好適である。培養表面は通常の接着性細胞を培養するための表面状態であればよく、ミクロキャリアーやファイバー状のものなど各種の培養器材が使用できる。このタイプの培養基材も輸送時には密閉できる容器に入れて輸送すればよい。また、ポリリジンなどをコートし接着性を高めた培養容器、培養基材も使用することが出来る。
【００１５】
上述のように形成した混合グリア細胞培養系は一定期間の培養後ミクログリア細胞が顕微鏡下明瞭に観察されてくるが、この状態で提供することも可能である。しかし、ミクログリア細胞は継続的な増殖状態にあるため、この状態になる前に提供する方がより好適である。すなわち、多くのミクログリア細胞が存在する状態で輸送によるダメージを与えるより、その前に輸送し被提供者の実験室でダメージを回復し、その後ミクログリア細胞の増殖を図るほうが、より安定して均一な細胞を得ることができる。混合グリア細胞培養系からは、一定期間培養後ミクログリア細胞を採取することが出来るが、この後も複数回の採取が可能である。
【００１６】
混合ミクログリア細胞培養容器を提供するための輸送方法としては、通常の輸送方法である航空機、列車、自動車などによる輸送が可能である。培養容器を温度変化からまもるため、充分な断熱あるいは加温して迅速な輸送方法を取ればよい。被提供者は受領後直ちに培養インキュベーターの中に戻し、ダメージから回復させることにより良好な培養系を得ることが出来る。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例にもとづき説明する。
（実施例・比較例）
混合グリア細胞培養系：ラット新生児1個体の大脳を定法により切り出し細切。トリプシン0.25%液(SIGMA製)中で15分間酵素処理した。トリプシンを除き、DME/F-12液に牛胎児血清(10%量)を加えた培養液（いずれもインビトロジェン製）で分散、40μmのメッシュに通した後、遠心分離した。分離した細胞を、再度同じ培養液20mLで分散し、75cm2の培養フラスコ（住友ベークライト製）2個に分け、炭酸ガスインキュベーター内で培養した。
混合ミクログリア細胞培養容器の輸送と採取：5日間培養した後、作製した2個の混合グリア細胞培養系培養フラスコの内1個は同じ実験室内で培養を継続した。別の1個の培養フラスコは培養液を300mLほど加え密閉し、断熱材で梱包し、別の実験室に航空機、自動車を用いて輸送した。輸送時の気温の変化は15〜25℃であった。翌日、到着した培養フラスコは培養液量を元に戻し、炭酸ガスインキュベーター内で同様に培養した。
ミクログリア細胞の採取：両フラスコとも、その後4日間培養し、顕微鏡観察したところ、両フラスコとも浮遊状態、接着状態にあるミクログリア細胞が多数観察された。また容器を10分間振とうし、浮遊した細胞を採取したところ、両フラスコとも多数のミクログリア細胞が採取された。