(57)【要約】      （修正有）【課題】植物における器官形状の発生制御に対する核内倍加の寄与を明らかにするため、核内倍加を有し、且器官形状の表現型に変異を有する個体を作出する。また、花の形態に対するステロールの影響を明らかにするため、ステロールの組成の変化を有し、且花の形態にも変化を有する個体を作出すること。【解決手段】シロイヌナズナの種子に対して放射線を照射することにより変異を生じた個体の中に、花弁および／または萼片がフリル状に変化する表現型を有する個体を見出した。より具体的には、特定配列に記載のステロールメチルトランスフェラーゼ2（SMT2）遺伝子中に変異を有する、SMT2機能欠失植物を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 1に記載のステロールメチルトランスフェラーゼ2（SMT2）遺伝子中に、519番塩基gの欠失変異を有する、SMT2機能欠失植物。
【請求項２】
フリル状の花弁および／または萼片を表現型として有することを特徴とする、請求項1に記載のSMT2機能欠失植物。
【請求項３】
フリル状の花弁および／または萼片において核の膨大が生じることを特徴とする、請求項1または2に記載のSMT2機能欠失植物。
【請求項４】
核の膨大が，核の染色体が倍数化することにより生じる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のSMT2機能欠失植物。
【請求項５】
SMT2が媒介するステロール合成経路の下流におけるステロールが減少することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載のSMT2機能欠失植物。
【請求項６】
SMT2遺伝子の発現が抑制される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のSMT2機能欠失植物。
【請求項７】
植物がシロイヌナズナである、請求項1〜6のいずれか1項に記載のSMT2機能欠失植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、器官形状の発生制御に対する核内倍加の寄与を明らかにすることを目的とする。本発明はまた、花の形態に対するステロールの影響を明らかにすることもまた、目的とする。
【背景技術】
【０００２】
核内倍加、すなわち細胞分裂を伴わないゲノムの複製、は、植物において一般的な現象である。多くの植物細胞は、植物細胞の最終分化プロセスで、細胞分裂の停止の後、核内倍加をする（Larkins B.A., et al., (2001) J. Exp. Bot., 52, 183-192）。実際、シロイヌナズナ（Arabidopsis）におけるほとんどの体細胞組織は、多倍体細胞を含有し、そして核内倍加の程度は、齢および組織の種類に依存して制御される（Galbraith D.W., et al., (1991) Plant Physiol., 96, 985-989）。一般的に、核内倍加に伴って、細胞が大きくなり（Melaragno J.E., et al., (1993) Plant Cell, 5, 1661-1668）そして核内倍加は、器官サイズ調節に関与する重要な因子の一つであると考えられている（Mizukami Y. (2001) Curr. Opin. Plant Biol., 4, 533-539）。しかしながら、植物においては、器官形状の発生制御に対する核内倍加の寄与は、未だほとんどわかっていない。
【０００３】
ステロールは、膜構成物質であり、膜の流動性および透過性を制御する役割を果たすことが知られている（Hartmann M.A., (1998) Trends. Plant Sci., 3, 170-175）。それらはブラシノステロイド（BR）の前駆物質としても機能しており、ブラシノステロイド（BR）は生長を促進する植物のステロイドホルモンとして広範囲に研究されてきた（Bishop G.J. and Koncz C., (2003) Plant Cell 14 Suppl:S97-110）。高等植物におけるステロールの大部分は、炭素24位がアルキル化されている。このアルキル化は、2つのクラスのC-24ステロールメチルトランスフェラーゼ（C-24 SMT）により行われる（Bouvier Nave P., et al., (1998) Eur. J. Biochem., 256, 88-96）。現在まで、生合成経路の上流の過程を欠損するいくつかの変異体、例えばfk/hyd2、hyd1およびsmt1が、刊行物に記載された（Diener A. C., et al., (2000) Plant Cell 12, 853-870；Jang J.-C., et al., (2000) Genes. Dev., 14, 1485-1497；Schrick K., et al., (2000) Genes. Dev., 14, 1471-1484；Souter M., et al., (2002) Plant Cell 14, 1017-1031）。それらは全て、胚形成において深刻な表現型を示し、そして外来性にBR類を適用することによっても救済されない。したがって、BR類以外の植物ステロールもまた、植物発生において重要かつ特異的な役割を有していることが示唆される。
【０００４】
子葉での脈のパターン形成を欠損するcvp1変異体は、最近、SMT2の変異により引き起こされることが見いだされた（Carland F.M., et al., (2002) Plant Cell 14, 2045-2058）。すなわち、frl1遺伝子は、cvp1の対立遺伝子である。cvp1の子葉における維管束は不連続なものであり、そして野生型子葉における維管束よりも肥厚（thick）している。同様の欠陥が、frl1変異体の子葉において見いだされた。cvp1変異体についての研究から、脈のパターン形成におけるステロールの重要な役割が示唆されるが、しかしながら、花の形態とステロール生合成との関係については記載されていない。
【０００５】
【非特許文献１】Larkins B.A., et al., (2001) J. Exp. Bot., 52, 183-192
【非特許文献２】Galbraith D.W., et al., (1991) Plant Physiol., 96, 985-989
【非特許文献３】Melaragno J.E., et al., (1993) Plant Cell, 5, 1661-1668
【非特許文献４】Mizukami Y. (2001) Curr. Opin. Plant Biol., 4, 533-539
【非特許文献５】Hartmann M.A., (1998) Trends. Plant Sci., 3, 170-175
【非特許文献６】Bishop G.J. and Koncz C., (2003) Plant Cell 14 Suppl:S97-110
【非特許文献７】Bouvier Nave P., et al., (1998) Eur. J. Biochem., 256, 88-96
【非特許文献８】Diener A. C., et al., (2000) Plant Cell 12, 853-870
【非特許文献９】Jang J.-C., et al., (2000) Genes. Dev., 14, 1485-1497
【非特許文献１０】Schrick K., et al., (2000) Genes. Dev., 14, 1471-1484
【非特許文献１１】Souter M., et al., (2002) Plant Cell 14, 1017-1031
【非特許文献１２】Carland F.M., et al., (2002) Plant Cell 14, 2045-2058
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、器官形状の発生制御に対する核内倍加の寄与を明らかにするため、核内倍加を有し、かつ器官形状の表現型に変異を有する個体を作出することを課題とする。本発明はまた、花の形態に対するステロールの影響を明らかにするため、ステロールの組成の変化を有し、かつ花の形態にも変化を有する個体を作出することもまた、課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは、シロイヌナズナの種子に対して放射線を照射することにより変異を生じた個体の中に、花弁および／または萼片がフリル状に変化する表現型を有する個体を見出し、上記課題を解決できることを示し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、SEQ ID NO: 1に記載のステロールメチルトランスフェラーゼ2（SMT2）遺伝子中に変異を有する、SMT2機能欠失植物を提供する。本発明において、SMT2遺伝子中の変異という場合、野生型のSMT2タンパク質の機能が欠失される変異であれば、どのような変異であってもよく、例えば1または数個の塩基の欠失、置換、または付加などが挙げられる。シロイヌナズナ（Arabidopsis）の場合には、3種のSMT遺伝子（SMT1、SMT2およびSMT3）を有する。SMT1は、ステロール生合成経路のうち1回目のメチル化過程を触媒し、そしてSMT2およびSMT3は、協働してステロール生合成経路のうち2回目のメチル基付加過程において機能することが知られている。したがって、上述した野生型のSMT2タンパク質の機能は、ステロール生合成経路のうち2回目のメチル基付加過程についての機能である。本明細書中では、シロイヌナズナにおける野生型SMT2遺伝子の塩基配列をSEQ ID NO: 1として、そしてそのSEQ ID NO: 1を有するSMT2遺伝子によりコードされる野生型SMT2のアミノ酸配列をSEQ ID NO: 2として、それぞれ示す。
【０００９】
本発明においては、SEQ ID NO: 1に記載のSMT2遺伝子中の変異として、SEQ ID NO: 1に記載のステロールメチルトランスフェラーゼ2（SMT2）遺伝子中に、ナンセンスコドンを生じる変異を有するSMT2機能欠失植物を提供することが好ましく、より好ましくは519番塩基gの欠失変異を有するSMT2機能欠失植物を提供する。
【００１０】
本発明において、上述したようなSEQ ID NO: 1に記載のSMT2遺伝子の変異（例えば519番塩基gの欠失変異）を有するSMT2機能欠失植物は、表現型としてフリル状の花弁および／または萼片を有することを特徴とする。ここで「フリル状」という場合、例えば花弁および萼片の場合、花弁および萼片の周縁部がギザギザの状態になることをいう。このような形態的な変化は、野生型の植物における形態と、肉眼的に識別することができる。
【００１１】
これらのフリル状の変化を起こした花弁および萼片は、これらの花弁および萼片のうちフリル状の変化を起こした部分のみにおいて、核の膨大が生じることを特徴とする。しかしながら、フリル状の変化を起こしていない部分、例えば、これらの花弁先端部および萼片のうちの周縁部、以外の部分や他の組織（葉、根、子葉など）においては、野生型に比べて、さらなる核の膨大が生じていないこともまた特徴とする。
【００１２】
これらのフリル状の変化を起こした花弁先端部および萼片の周縁部細胞における核の膨大は、核の染色体が倍数化（すなわち、核内倍加）することにより生ずる。本発明において、「核の染色体が倍数化する」もしくは「核内倍加する」という場合、通常は二倍体である核内のDNA含量が2倍（四倍体）、4倍（八倍体）等に増加することをいう。この現象は、核内で染色体が複製されるものの、核の分裂以降の細胞分裂の過程が進行しないために、核内のDNA含量が倍数化することにより生じる。このような核内倍加は、植物において一般的な現象であり、花弁および萼片でもその中心部細胞においてはしばしば核内倍加が生じていることが知られている。しかしながら、花弁の先端部および萼片の周縁部細胞においては、もともとほとんど核内倍加が生じていないことがこれまでにも知られていた。本発明においては、本来は核内倍加を生じない組織において核内倍加が生じた場合に、顕著な形態的変化が発生することをはじめて見出した。
【００１３】
本発明におけるSMT2機能欠失植物は、SMT2が触媒するステロール生合成経路の下流におけるステロールが減少することを特徴とする。ステロール生合成経路において、SMT2は、SMT3と協働して、2回目のメチル基付加過程において機能することが知られている（図1）。ステロール生合成経路は、この2回目のメチル基付加過程の工程から、二種類の合成経路に分岐している。本発明において、SMT2遺伝子に変異が生じ、SMT2タンパク質の機能が欠失することにより、2つめのメチル基が付加したステロール含量のみが、細胞内で有意に減少する。本発明の植物体中で特異的に減少する2つめのメチル基が付加されたステロールとしては、24-エチリジンロフェノール、イソフコステロール、シトステロール、スチグマステロールなどが含まれるが、これらには限定されない。
【００１４】
ステロールは、前述したとおり、膜構成物質であり、膜の流動性および透過性を制御する役割を果たすことが知られている。理論により束縛を受けるわけではないが、天然のステロールの性質から判断して、本発明のSMT2機能欠失植物においては、細胞膜中に存在するステロールの組成が野生型植物におけるステロール組成とは異なることにより生じる細胞膜の特性の変化、または、ある種のステロール自身もしくはそれに由来する物質の不足によって、細胞間でのシグナル伝達に変化が生じ、その結果として最終的に形態形成の異常を引き起こす可能性が考えられる。
【００１５】
SMT2タンパク質の機能を欠失した植物は、いずれかの方法により、野生型SMT2タンパク質の機能を欠失させることにより作出することができる。本発明においては、例えば、野生型SMT2タンパク質の機能を欠失させる方法としては、SMT2遺伝子のmRNAへの転写を抑制すること、転写されたmRNAを不安定化させること、野生型SMT2タンパク質の機能を失わせるようにSMT2遺伝子を変異させること、などが含まれる。
【００１６】
例えばSMT2遺伝子の発現を抑制するためには、アンチセンス法、コサプレッション法、RNAi法など、本発明の技術分野において既知の様々な方法を用いることができる。
また、野生型SMT2タンパク質機能を失わせるようにSMT2遺伝子を変異させるためには、遺伝子工学的に目的とするSEQ ID NO: 1に記載する遺伝子を変異させ、その遺伝子を発現する発現ベクターを用いて形質転換する方法（トランスジェニック法）、植物の種子に対して放射線を照射して変異を生じさせた後、目的とする変異を有する個体を選抜する方法などが存在するが、いずれの方法を使用してもよい。
【００１７】
本発明において「放射線」という場合、イオンビーム、α線、β線、中性子線、陽子、重陽子、負π中間子、X線、γ線、電子線、などを含むことができるが、これらに限定されない。本発明においては、「放射線」として、イオンビームを使用することが好ましい。
【００１８】
「イオンビーム」は、大型加速器（サイクロトロン）を用いて、原子核（イオン）を光に近い高速度で加速し、正に荷電したビームを取り出すことにより得られる。イオンビームを発生する大型加速器としては、日本原子力研究所がもつイオン照射研究施設（TIARA）の大型加速器（AVFサイクロトロン）、タンデム加速器などを使用することができる。
【００１９】
イオンビームを作成するためのイオンとしては、Heイオン、Cイオン、アルゴンイオン、ネオンイオン、Nイオン、Oイオン、などを使用することができる。本発明においては、Cイオンを使用することが好ましい。しかしながら、イオンビームのイオンの種類、速度、線量などの特徴は、変異を誘発する対象、目的、選抜方法にしたがって、当業者が容易に選択することができる。本発明において例えば、変異体植物を作出することを目的としてシロイヌナズナの種子を照射する場合、例えば12.1 MeV/nのエネルギーを有するHeイオンを照射する際には500〜1100 Gy、または17. 4 MeV/n のエネルギーを有するCイオンを照射する際には100〜300 Gyの線量のイオンビームを使用する。最も好ましくは、17. 4 MeV/nのエネルギーを有するCイオンを用いて、線量150 Gyを照射する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、器官形状の発生制御に対する核内倍加の寄与を明らかにすることができる。本発明によりまた、花の形態に対するステロールの影響を明らかにすることもまたできる。本発明により、さらに、フリル状の花弁および萼片を有する植物個体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明を実施するための最良の形態を以下に記載するが、これらの記載は、本発明の範囲を限定することを目的としたものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ規定されるものである。
【００２２】
本発明においては、植物のモデルとして、シロイヌナズナのコロンビア株の種子に対して、日本原子力研究所がもつイオン照射研究施設（TIARA）の大型加速器（AVFサイクロトロン）で発生させたCイオンビームを150 Gy照射することができる。その後、イオンビーム照射種子を播種して植物体を育成し、それらの自家受粉により得られた次代の植物体の中から、花弁および／または萼片にフリル状の形態変化を有する変異体植物を選抜することができる。
【００２３】
このような変異を有する変異体植物は、花弁および萼片の先端部分にフリル状の形態変化を有する以外には、他の組織、例えば根、葉などだけでなく、花弁および萼片の先端部分以外についても、顕著な形態的変異を有さなかった。また、稔性は若干低下するものの維持していた。
【００２４】
これらの変異体植物に関して、遺伝子変異部位を調べるために、まず染色体歩行法によりゲノム上の変異遺伝子の位置を特定し、その後、ゲノムシークエンシングを行うことにより、遺伝子中の変異を特定することができる。これらの方法は全て当該技術分野において既知のものであり、例えば「モデル植物の実験プロトコール：イネ・シロイヌナズナ編、秀潤社 (1996)」などを参照することにより当業者であれば容易に実験を行うことができる。
【００２５】
この変異体植物中での当該変異遺伝子の発現は、RT-PCRを行うことにより定量することができる。すなわち、形態的な変異を生じている組織を採取し、その組織よりRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）などの市販のキットを用いて総RNAを抽出し、これを鋳型として当業者に既知の通常の手順に従って、RT-PCRを行うことができる。
【００２６】
このようにして得られ、そして具体的な変異部位を明らかにした変異体植物について、遺伝子の変異が形態的な変異を生じる原因となっているかについて、相補テストを行って調べることができる。相補テストは、野生型SMT2遺伝子領域を含むゲノム領域を発現ベクター中に挿入し、この発現ベクターを用いて変異植物体を形質転換することにより、変異体の表現型が野生型に回復するかどうかを確認することにより行うことができる。
【００２７】
この変異体植物について、植物の種々の組織における変異遺伝子の発現と形態との関係、核の形態学的特徴、核DNAの倍数性の特徴を調べることができる。これらの方法もまた、当該技術分野において既知のものであり、当業者であればこれらの実験を容易に実施することができる。例えば、植物の種々の組織における変異遺伝子の発現と形態との関係は、例えばレポーター遺伝子として一般的な大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を所望の遺伝子と結合させることにより作製した融合遺伝子を用いてトランスジェニック植物を作出し、このトランスジェニック植物におけるGUS染色の部位および濃度に基づいて所望の遺伝子のin situでの発現を調べる。また核の形態学的特徴は、変異を起こし肉眼的に形状が変化した部分の組織片を、DAPI溶液で処理することにより核を染色する。この組織片を紫外線ランプを装備した蛍光顕微鏡（Axioskop, ZEISS, Germany）を用いて観察する。また、核DNAの倍数性に関しては、変異を起こし肉眼的に形状が変化した部分について組織から、市販のキット（Cystain UV Precise P, Partec, Germany）を用いて、細胞から溶出させた核をDAPIで染色した後、市販のフローサイトメーター（PAS flow cytometer, Partec, Germany）を用いて、DAPIの発光強度の分布を測定する。
【００２８】
本発明においてはさらに、この遺伝子の機能が変異によりこれらの変異体植物においてどのように変化したかを調べることもできる。機能の変化は、変異したタンパク質の機能に基づいて、その機能が野生型植物と比較してどのように変化しているかを調べることにより行う。すなわち、本発明においては、本件発明のタンパク質のアミノ酸配列からこのタンパク質がSMT2であることが明らかになったため、SMT2の機能、すなわちステロール生合成経路における2個目のメチル基付加反応が生じているかどうかを、Noguchiら（Noguchi, T. et al., (2000) Plant Physiol. 124, 201-209）により記載されたように解析する。
【００２９】
以下の実施例において、ここまでに上述した態様に関してさらに詳細な説明を行う。しかしながら、この実施例の記載は本発明を単に説明することを目的として記載するものである。
【実施例】
【００３０】
実施例1：変異体植物の作出
本実施例においては、炭素イオンビームを変異原として使用して、シロイヌナズナ（Arabidopsis）の変異体を作出した。
【００３１】
イオン照射研究施設（TIARA；日本原子力研究所）の大型加速器（AVFサイクロトロン）で発生させた、17.4 MeV/nの炭素イオンビームを使用して、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のColumbia（Col）株の種子に対して、150 Gyの線量を曝露した。イオンビームを照射した全ての植物は、市販の培養土（Metro-Mix 350, Scotts-Sierra Horticultural Products, Marysville, OH）を入れたポットに植え、3000〜4000 luxの白色蛍光灯で16時間明期・8時間暗期の条件の下、温室内で23℃にて育成した。
【００３２】
前述した条件下で、およそ1,500個の照射当代（M1）種子を生育させ、そして自家受粉させた。得られた照射次代（M2）種子を、およそ12,000個生育させ、植物体の各器官の形態変化を指標として変異体を選抜した。この結果、フリル状の花弁および萼片を有することを特徴とするシロイヌナズナ変異体を1個体得ることができた。本発明においては、この変異体をfrl1変異体と命名した。このようにして得られたシロイヌナズナfrl1変異体の花序の概観を、図2Aに示す。frl1変異体は、全体的な形態および植物体のサイズは、野生型のものと同様である。しかしながら、図2Aに示すように、花弁および萼片の周縁は、ギザギザ（フリル状）になっている。萼片は、生長が十分でないため、しばしば花芽を完全に包み込むことができない。
【００３３】
このfrl1変異体の形態学的な特徴を調べた結果を図2C〜Fに示す。ここでは、核のサイズを観察するため、成熟した花から採取した花弁先端領域および萼片の周縁領域から組織を採取し、これらの組織を70％エタノール中で透明化し、1μg/mlのDAPI溶液によって染色することにより、組織中の核のサイズを比較した。核の観察には、蛍光顕微鏡（Axioskop, ZEISS, Germany）を用いた。図2Cはfrl1変異体の花弁組織における核；図2Dは野生型花弁組織における核；図2Eはfrl1変異体萼片組織における核；図2Fは野生型萼片組織における核；をそれぞれ示す。全てのバーは、50μmを示す。
【００３４】
野生型花弁の先端部分が均一なサイズの核を有すること（図2D）と比較して、frl1変異体花弁の先端部分における核は、より大型でありそして様々なサイズを有することを見いだした（図2C）。同様な相違は、萼片の周縁においても観察された（図2E：frl1変異体；および図2F：野生型）。したがって、異常に生じた核内倍加が、周縁部のフリル状化を引き起こすことが示唆された。
【００３５】
frl1変異体の稔性を調べた結果、稔性は、3番目から5番目の花での受精した胚珠の数に基づくと、野生型の稔性の40％にまで低下した（n＝30個の長角果）。
【００３６】
実施例2：frl1変異体原因遺伝子のマッピングおよびシークエンシング
ついで、得られたfrl1変異体において、どのような遺伝子変異が生じているかを明らかにするため、本実施例においては、原因遺伝子のマッピングおよびシークエンシングを試みた。
【００３７】
CAPSマーカーを使用して、当技術分野において標準的な方法によってfrl1遺伝子をマッピングした（Konieczny A. and Ausubel F.M. (1993) Plant J. 4,403-410）。具体的には、frl1変異体をシロイヌナズナのLandsberg erecta (Ler)株と交配させて得られたF2植物の中から、フリル状の花弁および萼片を有する約400個体を選抜し、これらの植物体のそれぞれから採取した1枚の葉よりDNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型とし、それぞれのCAPSマーカーに特異的なプライマー対を用いたPCRによって、マーカーのヌクレオチド配列を増幅した後、それぞれのマーカーに対して個別に指定された制限酵素で切断した。ついで、アガロースゲル電気泳動でのバンドパターンを確認することにより、それぞれのCAPSマーカーにおけるCol型とLer型との比率を調査し、Col株由来染色体と強く連鎖しているCAPSマーカーを探索した。CAPSマーカーの配列は、TAIRデータベース（http://www.arabidopsis .org）に列挙されている既知のものであり、インターネット上で入手可能である。
【００３８】
その結果、frl1変異体の原因遺伝子を第一染色体の105-kb領域にマッピングした。
ついで、frl1変異体から抽出したゲノムDNAにおいて、この領域の約1/3をシークエンシングしたところ、frl1変異体では、植物ステロール生合成経路における2回目のアルキル化過程を触媒する、ステロールメチルトランスフェラーゼ2（SMT2）遺伝子において、1塩基欠失の変異を有することが示された。
【００３９】
野生型SMT2遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれSEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2として示す。SMT2遺伝子は、単一のオープンリーディングフレーム（1086 bp）を有し、イントロンを有さない。そしてfrl1遺伝子は、コード領域の中ほどで、一塩基欠失を有することが示された（図3）。1塩基欠失（矢頭、519番目のg）の結果、44アミノ酸の異常な翻訳と218番目のアミノ酸における新規な停止コドンとを生じた。枠で囲んだ部分は、C-24 SMTの間で保存されたモチーフ（SMT IおよびSMT II）およびS-アデノシルメチオニン-依存性-メチルトランスフェラーゼの間で保存されたモチーフ（SAM I、SAM IIおよびSAM III）である。保存されたモチーフについてのデータは、Dienerら（Diener A.C., et al., (2000) Plant Cell 12, 853-870）から得た。SMT2遺伝子中の1塩基欠失の結果、SMT遺伝子において保存されている3つのモチーフが、変異により失われていた。
【００４０】
実施例3：SMT2フラグメントを用いたfrl1変異体の相補性テスト
この遺伝子における一塩基欠失がfrl1変異体を生じた原因であるかどうかを確認するため、ゲノム由来のSMT2フラグメントを用いた相補性テストを行った。
【００４１】
相補性テストは、次のように行った：
SMT2のコード領域（1.1 kb）、3.7-kbの上流領域、および1.5-kbの下流領域を含む6.3-kbのゲノムDNA断片を、BACクローンF14O10から、制限酵素BamHIおよびEcoRIを用いて切り出した。なお、BACクローンF14O10は、ABRCストックセンター（http://www.biosci.ohio-state.edu/~plantbio/Facilities/abrc/abrchome.htm）より入手可能である。得られたゲノムDNA断片を、バイナリーベクターpBI101（Jefferson R. A. et al., (1987) EMBO J. 6, 3901-3907）中にサブクローニングした。得られたバイナリーベクターをエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム（Agrobacterium）GV3101株に形質転換した。バイナリーベクターを持つアグロバクテリウムを、減圧浸潤法（Bechtold N. and Pelletier G. (1998) Methods. Mol. Biol. 82, 259-266）によりfrl1植物体に形質転換した。得られたT1種子を、1×MS塩、1×B5ビタミン、2.5％スクロース、50 mg/lカナマイシン（Sigma）、および166 mg/lのクラフォラン（Aventis Pharma）を含有し、KOHによりpH 5.7に調整した、2 g/lのジェランガムで固化した培地上に播種し、形質転換体を選抜した。
【００４２】
その結果、10個体のカナマイシン耐性T1植物の全てにおいて、ゲノム由来のSMT2フラグメントを形質転換することにより、frl1変異体の表現型が完全に野生型に回復することを確認した（図2B）。
【００４３】
実施例4：SMT2遺伝子の変異の影響の検討
本実施例においては、frl1変異体でのSMT2遺伝子の変異がどのようにしてフリル状の花弁や萼片を引き起こすかを形態学的に検討した。
【００４４】
まず、SMT2遺伝子の発現パターンを調べるため、SMT2をコードする配列の2.7-kbの5'領域と最初の33塩基を含む断片を、バイナリーベクターpBI101中のβ-グルクロニダーゼをコードする配列の上流に挿入することにより、SMT2とGUSとの融合タンパク質（SMT2::GUS）を発現させられるトランスフォームベクターを調製した。次いで、このトランスフォームベクターにより野生型のシロイヌナズナのコロンビア株を形質転換して、SMT2::GUSを発現する形質転換体（SMT2::GUS植物）T1植物を作出した。
【００４５】
次いで、カナマイシン耐性を有するT1植物由来のT2植物を、氷冷90％アセトン中に1時間、その後NaPO4バッファー（PH 7.0）中2 mM X-Gluc、0.5 mM K3Fe（CN）6、0.5 mM K4Fe（CN）6および0.5％Triton X-100を含有するGUS染色溶液中に浸漬した。それらを減圧下にて30分間浸潤させ、そしてその後1〜2日間、暗条件下にて37℃でインキュベートした。染色した組織は、GUS染色が明瞭に可視化されるまで、70％エタノール中で透明化した。
【００４６】
SMT2の発現について、SMT2::GUS植物のGUS染色パターンを図4A〜Cに示す。図4AはSMT2::GUS植物の概観；図4BはSMT2::GUS植物の根系；および図4CはSMT2::GUS植物の花序をそれぞれ示す。2個体の独立したT1植物の系統において同様の染色パターンが観察された。
【００４７】
図4Dはトルイジンブルーにより染色した、frl1の根端の長軸方向切片を示す（バーは50μmを示す）。この切片の作製にあたっては、寒天プレート上で育成した3日齢の根を、4％パラホルムアルデヒドで固定し、エタノールシリーズを通して脱水し、そしてTechnovit 7100樹脂（Heraeus Kulzer GmbH & Co. KG, Wehrheim, Germany）中に包埋した。4μm厚の切片をロータリーミクロトームを用いて作製し、そしてトルイジンブルーで染色した。
【００４８】
GUS染色は広範囲であったが、しかし、脈組織、根および新しく形成された側根の先端領域が最も濃く染色された（図4A、B）。しかしながら、根端の長軸方向切片は、正常な形態を示した（図4D）。一方、花弁の染色レベルは、その他の花器官における染色レベルと比較すると、相対的に低かった（図4C）。
【００４９】
実施例5：SMT遺伝子のRT-PCR解析
本実施例においては、frl1変異体でのSMT2遺伝子の変異がどのようにしてフリル状の花弁や萼片を引き起こすかを遺伝子発現の観点から半定量的RT-PCR解析により検討した。
【００５０】
frl1変異体の、およそ20個体の14-日齢の幼苗および、およそ200個の花より採取した花弁先端部から、総RNAをRNeasy PlantMini Kit（QIAGEN）を使用して単離した。製造者によるマニュアルにしたがって、RNAをDNase Iで処理した。逆転写を、BD PowerScript逆転写酵素（BD Biosciences Clontech）により行った。
【００５１】
PCRプライマーの配列は、以下の通りである：
SMT1については、SMT1-F、5'-TGTTTTTGGT TATGAATCGT-3'（SEQ ID NO: 3）およびSMT1-R、5'-CCGAACATCA GAAAATAAAG-3'（SEQ ID NO: 4）；
SMT2については、SMT2-F、5'-ACTGGTTCCT CTGCGTTCTC-3'（SEQ ID NO: 5）およびSMT2-R、5'-TGATGGTGAG AAGTGGAAGG-3'（SEQ ID NO: 6）；
SMT3については、SMT3-F、5'-GATCTTTGTT CGTGTCCTAC-3'（SEQ ID NO: 7）およびSMT3-R、5'-TTTCTCCTTC ACTACCTCAA-3'（SEQ ID NO: 8）；そして
アクチンについては、アクチン-F、5'-CTACGTCTTG ATCTTGCTGG TCGTG-3'（SEQ ID NO: 9）およびアクチン-R、5'-CCACCACTGA GCACAATGTT ACCG-3'（SEQ ID NO: 10）。
【００５２】
PCRは、以下のプログラム：94℃・5分間の後、94℃・30秒間、55℃または60℃・30秒間、および72℃・1分間を1サイクルとして所定のサイクル数；に従って行った。アニーリング温度は、SMT1およびSMT3については55℃、そしてSMT2およびアクチンについては60℃とした。
【００５３】
PCR産物を、20サイクル、25サイクル、30サイクル、35サイクル、40サイクルそして45サイクル後に2％アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロマイド染色後、UV-励起により可視化した。画像は、IS8000デジタルイメージングシステム（Alpha Innotech, San Leandro, CA）に装着されたフィルターを通して取り込んだ。
【００５４】
それぞれの増幅からは、予想された長さの特異的なバンドが得られた。バンド強度の解析は、ソフトウェアAlphaEase FC（Alpha Innotech）を用いて行った。測定は、PCRによる増幅が飽和に到達する前のサイクル数で行った。全てのRT発現解析を、3回の別個の実験のそれぞれにおいて、2回ずつ行った。
【００５５】
結果を図4Eに示す。ここで左側の列は14日齢の幼苗に由来する総RNAを用いた半定量的RT-PCRの結果得られたSMT遺伝子の発現レベルを、そして右側の列は花弁先端部に由来する総RNAを用いた半定量的RT-PCRの結果得られたSMT遺伝子の発現レベルをそれぞれ示す。値は、野生型における発現値を1.0とし、それに対するfrl1変異体における相対発現強度（平均±標準偏差）として示す。
【００５６】
RT-PCR解析により、SMT2の転写レベルが花弁先端部においてだけでなく、frl1植物全体において減少したことが示された。この減少は、SMT1およびSMT3の転写に影響を与えなかった。これらの結果から、frl1の表現型の器官特異性は、変異遺伝子の発現パターンによっては説明できないことが示された。
【００５７】
実施例6：内生ステロールの解析
本実施例においては、SMT2遺伝子に変異が存在することに起因するステロール組成の変化を調べるため、内生ステロールの解析を行った。
【００５８】
開花初期の花序（400〜600 mg新鮮重量）を、frl1植物および野生型植物からそれぞれ採取した。内生ステロールの解析は、Noguchiら（Noguchi, T. et al., (2000) Plant Physiol. 124, 201-209）により記載されたように、日本電子製JMS-AM150型Automass mass spectrometerおよびHewlett-Packard製5890A-II型ガスクロマトグラフからなる装置を用い、ガスクロマトグラフ質量分析法で行った。
【００５９】
図1は、提案された植物ステロール生合成経路、およびfrl1と野生型における内生ステロールの定量の結果を示している。図1の各ステロールの下に記載された数値において、上段および下段の値はそれぞれ、frl1変異体と野生型の花序における各ステロールの含有量を、全ステロールに対する％で示すものである。全ステロール含量は、野生型においては187.7μg/g新鮮重量であり、そしてfrl1変異体においては240.0μg/g新鮮重量であった。点線矢印は、複数の過程を有する反応を示す。SMT2は四角く囲んだ。他の変異体から同定された酵素もまた示している。
【００６０】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）において提案された植物ステロール合成経路は、SMT2の場所で2つの分岐に別れる。一方の分岐では、主要な最終生成物としてカンペステロールなどのC24-メチルステロールが生成される。もう一方の分岐では、シトステロールまたはスチグマステロールなどのC24-エチルステロールが生成される。シトステロールは、植物において最も豊富に存在するステロールであり、そして膜の特性を制御する重要な構造分子である。frl1変異体において、シトステロールやイソフコステロールなどのC24-エチルステロールの量は、野生型におけるその量の1/5〜1/3であり、一方カンペステロールや24-メチレンコレステロールなどのC24-メチルステロールの量は、野生型におけるその量の4倍以上高かった。カンペステロールは、frl1変異体において最も豊富に存在するステロールであり、全ステロール含量の43.3％にものぼる。これらの結果から、生合成の流れの方向が、SMT2の変異により変化したことが示される。ステロールの構成成分における同様の変化が、frl1変異体植物の茎およびロゼット葉において観察され（データは示していない）、このことから、frl1変異体植物の全体を通じて同様の変化が生じていることが示唆される。合成中間体を添加することにより変異体を元に戻すという本発明者らの試み（2μlの10-5 Mの22α-ヒドロキシシトステロールまたは10-7 Mのブラシノライドを花序に対して1週間のあいだ毎日滴下した）は、ブラシノライド処理によりfrl1および野生型の両方で小花柄（pedicel）の伸長が誘導されたものの（データは示していない）、有効なものではなかった。
【００６１】
実施例7：核DNA量の倍数性
本実施例においては、frl1変異体において核の膨大が見られたことから、核DNA量の倍数性について調べた。
【００６２】
花弁先端部および全萼片を、数個の完全に開花した花から採取した。ロゼット葉を、成熟した植物から1枚採取した。子葉および根を、寒天プレート上で育成した1週齢の幼苗、およそ10個体から採取した。採取した組織は、約0.5 mlの核抽出バッファー（Cystain UV Precise PキットのA液；Partec, Germany）中で、カミソリの刃を用いて裁断した。次いで、30-μmメッシュナイロンシーブを介してろ過した後、DAPIを含有する約2.0 mlの染色溶液（キットの溶液B）を添加した。倍数性を、PASフローサイトメーター（Partec）を用いて測定した。
【００６３】
倍数性レベルを、野生型およびfrl1変異体の花弁先端、萼片、ロゼット葉、子葉および根において比較した結果を示す（図5）。データは、片対数目盛り上に示し、このグラフ上ではピークが横座標に沿って等間隔に現れる。蛍光強度の最も低いピークを、2Cの核であるとみなした（Cは、半数体のDNA含量）。
【００６４】
ほとんど全ての核が、野生型花弁においては2Cレベルであった（図5A）のに対して、frl1変異体花弁においては、明瞭な4Cピークが存在した（図5B）。さらに、frl1変異体花弁は、少数ではあるが4Cレベル以上の核を有したが、一方で野生型花弁ではそのような核はほとんど存在しない。核内倍加の程度は、それぞれの器官において本来異なっているが、調べたその他の組織においては、野生型とfrl1変異体の間で明瞭な相違は見られなかった（図5C〜J）。frl1変異体の萼片の周縁において見いだされた巨大な核は、この解析では認識されなかった。これはおそらく、周縁部分の組織量が少ないからであると考えられた。
【００６５】
cvp1変異体の子葉と同様に、frl1変異体花弁における脈のパターンは異常であった。frl1変異体花弁の葉脈（vein）は、概して野生型のものよりも肥厚（thick）していた。ほとんどのfrl1変異体花弁では、野生型花弁においては見ることができる“脈（vein）のループ”が見られなかった（データは示していない）。しかしながら、ギザギザの凹凸の位置が概して脈（vein）の位置とは別個独立のものであるので、異常な脈（vein）形成はおそらく周縁のフリル状化の直接的な原因ではないだろう。この予測は、非常に不連続な二次および高次の脈（vein）を有するが、花弁および萼片の全体的な形態においてはほんのわずかな変化しか有さない、scarface変異体の特徴によって支持される（Dayholos M. K. et al., (2000) Development 127, 3205-3213）。さらに、フローサイトメトリー解析から、frl1変異体子葉および野生型子葉の間で、倍数性レベルの明瞭な相違は存在しないことが示された（図5G、H）。これらの事実から、脈形成および倍数性レベルの調節は独立して制御され、そしてfrl1変異体における花弁および萼片の周縁のフリル状化は、異常な核内倍加が生じているためであって、異常な脈（vein）形成のためではないことが示唆される。
【００６６】
SMT2が幅広く発現される遺伝子であることから、花弁および萼片は、frl1変異体中で見られるステロール組成の変化に対して、最も感受性の高い器官であると考えられる。フローサイトメトリー解析により、通常は核内倍加を生じない花弁の先端部分において異常な倍加が起こっていることが示された（図5A、B）。frl1萼片の周縁部において膨大した核が明らかに観察されているにも関わらず（図2E）、萼片全体を解析に使用した場合には、萼片において明瞭な変化は何も見いだされなかった（図5C、D）。野生型萼片の周縁は均一なサイズの核を含有していたが、そのサイズは野生型花弁の末端部分における核のサイズと同様であった（図2D、F）。したがって、野生型萼片の周縁は、2Cレベルで維持されているようである。これらの事実から、frl1変異体では、分化した組織の内、通常は核内倍加（endoreduplicate）をしない組織においてのみ、異常な核内倍加が生じたことが示唆される。このことは、核内倍加の抑制が花弁形態形成に重要であることもまた示唆している。メカニズムは未知であるが、花弁の末端部分および萼片の周縁において核内倍加を抑制するいくつかの因子が存在する可能性がある。frl1変異体は、核内倍加の分子メカニズムを研究するために有用な組織を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図1は、提案された植物ステロール生合成経路、およびfrl1と野生型における内生ステロールの定量を示す。
【図２】図2は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）frl1変異体のフリル状の花弁および萼片は、膨大した核を有する巨大細胞を含有することを示す。
【図３】図3は、frl1変異体のSMT2座位で見いだされた変異を示す。
【図４】図4は、種々の組織におけるSMT2の発現を示す。
【図５】図5は、frl1および野生型の様々な組織（花弁先端、全萼片、ロゼット葉、子葉、根）における倍数性レベルの比較を示す図である。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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