(57)【要約】【課題】  メチル化部位を予め解析することなく、任意の領域を標的配列とすることができ、しかも、簡便且つ正確にＤＮＡのシトシンのメチル化率を測定することのできる、ＤＮＡメチル化率の測定方法を提供する。また、細胞の状態の評価方法を提供する。【解決手段】  前記測定方法は、（１）測定対象塩基配列を含むＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程、（２）得られたＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含む鎖を鋳型とし、標識化ｄＣＴＰの存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程、（３）増幅したＤＮＡから、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖を分離する工程、及び（４）分離したＤＮＡ鎖中の標識化シトシンの量を測定する工程を含む。前記評価方法では、細胞の染色体標本と抗メチル化シトシン抗体との接触を、２価結合条件下において実施する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖、又は得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化デオキシシチジン５’−三リン酸又は標識化デオキシグアノシン５’−三リン酸の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシン又は標識化グアニンの量を測定する工程
を含むことを特徴とする、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率を測定する方法。
【請求項２】
（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖、又は得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化デオキシシチジン５’−三リン酸の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡの、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシンの量を測定する工程
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖、又は得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化デオキシグアノシン５’−三リン酸の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡの、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化グアニンの量を測定する工程
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖を鋳型とし、標識化デオキシシチジン５’−三リン酸の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡの、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシンの量を測定する工程
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項５】
（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖を鋳型とし、標識化デオキシグアノシン５’−三リン酸の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡの、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化グアニンの量を測定する工程
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法により、シトシンのメチル化率を測定した細胞又は組織。
【請求項７】
（１）細胞の染色体標本と抗メチル化シトシン抗体との接触を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下において実施する工程、及び
（２）前記染色体標本に結合した抗メチル化シトシン抗体を検出する工程
を含む、細胞の状態を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡメチル化率の測定方法に関する。ＤＮＡメチル化率を測定することにより、例えば、癌細胞の悪性度を評価したり、あるいは、各種細胞の分化状態を評価することができる。また、本発明は、細胞の状態を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物が持つ遺伝情報は、ＤＮＡの中に集約されている。一般的にはこのＤＮＡの塩基配列で全てが規定されるように理解されているがそれだけではなく、高等動物において、体内のゲノムＤＮＡは老化する。実際にはＤＮＡ中のシトシン塩基のメチル化が老化と共に変化し、これが原因で起こる疾患が数多くある。
ゲノムＤＮＡを卵の中に移植すると脱メチル化され、再び若返ることは、クローン動物の実験で立証されており、この場合、テロメア長も元に戻るということが、現在、マウスで立証されている。
体内のゲノムが老化すると、働くべき遺伝子が働かなかったり、働いてはいけない遺伝子が働いてしまったりする。多くの癌細胞では、遺伝子発現を制御するプロモーター領域のメチル化の亢進が起きており、これにより癌を抑制する遺伝子群は、その多くが不活性化されている。
【０００３】
このように、ＤＮＡ鎖のメチル化は、癌をはじめとする様々な疾患の重要な指標であり、また遺伝子発現の制御に関係することから、例えば、細胞の分化の程度を把握するための指標ともなり、これまでにその測定方法が様々に検討されている。
一方、例えば、医療の現場においてＤＮＡメチル化を測定する場合には、迅速かつ正確に判定結果が得られることが求められている。しかしながら、このような観点からは従来の各方法は、必ずしも好ましい方法ではなかった。
【０００４】
現在までに行われてきたＤＮＡのメチル化分析法、特に５−メチルシトシンの分析法には、例えば、
（１）試料ＤＮＡを酵素処理により単塩基にまで分解し、これをクロマトグラフィーやＥＬＩＳＡ法を応用して定量する方法、
（２）試料ＤＮＡ中のシトシン塩基を、亜硫酸水素イオン（bisulfite）などの薬剤処理によりウラシルに変化させ、メチル化ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする、あるいはメチル化していないＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＰＣＲ用プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物の出現のあるなしにより、プライマーがハイブリダイズする領域のメチル化を分析する方法、
（３）前記（２）の方法と同様にして亜硫酸水素イオン処理したＤＮＡを用いて、そのＤＮＡ配列を直接シーケンシングする方法、又は
（４）亜硫酸水素イオン−ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single strand conformational polymorphism）法（非特許文献１）
が知られている。
【０００５】
前記方法（１）では、分析対象とする遺伝子の特定領域を制限酵素で切り出して精製する必要があり、ＤＮＡ断片の量として５〜５０μｇもの多量のＤＮＡを必要とする。この方法（１）を用いて、ヒトの血液からＤＮＡを採取して、特定のＤＮＡ断片のメチル化解析をする場合には、その分析対象とする断片の分子サイズにもよるが、数リットルから数十リットルの血液が必要となり、臨床応用するには本方法の検出感度を飛躍的に上げるしかなく、現在のところ、実現されていない。
【０００６】
前記方法（２）では、方法（１）のように、多量のＤＮＡ試料は必要ではなく、ＰＣＲによって増幅してそのメチル化を分析することが可能である。しかし、分析対象であるＤＮＡのメチル化部位は予め詳細に分析されていることが前提で、その結果を基に、ＰＣＲ用のオリゴＤＮＡプライマーを設計する。また、本方法ではプライマーがハイブリダイズする領域に存在する数個のシトシンのメチル化のみが分析対象であり、２つのＰＣＲプライマーに挟まれる領域の全体的なメチル化率は分析することができないという欠点がある。
【０００７】
前記方法（３）では、個々の試料に対するメチル化解析がＤＮＡ配列分析（シーケンシング）により分析する必要があり、操作が煩雑で分析に多大な時間と労力がかかり、実施コストが高いという欠点があり、遺伝子の網羅的なメチル化解析には向いていない。
【０００８】
前記方法（４）では、亜硫酸水素イオン処理を行ったＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、その産物であるＤＮＡをＳＳＣＰ電気泳動法により分析する。しかし、ＳＳＣＰ電気泳動法における１本鎖ＤＮＡの挙動は予測することが難しく、２試料間のおおよそのメチル化率の違いを判別することができるが、正確に定量することは困難である。また、本方法ではポリアクリルアミドゲル中のＤＮＡを銀染色やアイソトープ標識で可視化するため、その操作は煩雑であり、分析までに時間を要する。
【０００９】
【非特許文献１】エム・前川（Ｍ．Ｍａｅｋａｗａ）ら，「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，（オランダ），１９９９年，２６２巻，ｐ．６７１−６７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の課題は、従来技術のこれらの欠点を解消し、メチル化部位を予め解析することなく、任意の領域を標的配列とすることができ、しかも、簡便且つ正確にＤＮＡのシトシンのメチル化率を測定することのできる、ＤＮＡメチル化率の測定方法を提供することにある。また、本発明の別の課題は、メチル化の状態、更には細胞の状態を、視覚的に把握することのできる、細胞の状態の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題は、本発明による、（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程（以下、変換工程と称する）、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖、又は得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化デオキシシチジン５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）又は標識化デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程（以下、増幅工程と称する）、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシン又は標識化グアニンの量を測定する工程（以下、分析工程と称する）
を含むことを特徴とする、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率を測定する方法により解決することができる。
【００１２】
また、本発明は、（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程（変換工程）、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）、又は得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化デオキシシチジン５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程（増幅工程）、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡの、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシンの量を測定する工程（分析工程）
を含むことを特徴とする、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率を測定する方法（以下、本発明のセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法と称する）に関する。
【００１３】
また、本発明は、（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程（変換工程）、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）、又は得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程（増幅工程）、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡの、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化グアニンの量を測定する工程（分析工程）
を含むことを特徴とする、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率を測定する方法（以下、本発明のセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法と称する）に関する。
【００１４】
また、本発明は、（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程（変換工程）、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）を鋳型とし、標識化デオキシシチジン５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程（増幅工程）、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡの、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシンの量を測定する工程（分析工程）
を含むことを特徴とする、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率を測定する方法（以下、本発明のアンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法と称する）に関する。
【００１５】
また、本発明は、（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程（変換工程）、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡの、前記測定対象塩基配列に由来する変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）を鋳型とし、標識化デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）の存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程（増幅工程）、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡの、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化グアニンの量を測定する工程（分析工程）
を含むことを特徴とする、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率を測定する方法（以下、本発明のアンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法と称する）に関する。
【００１６】
更に、本発明は、前記測定方法により、シトシンのメチル化率を測定した細胞又は組織に関する。
【００１７】
更に、本発明は、（１）細胞の染色体標本と抗メチル化シトシン抗体との接触を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下において実施する工程、及び
（２）前記染色体標本に結合した抗メチル化シトシン抗体を検出する工程
を含む、細胞の状態を評価する方法に関する。
【００１８】
本明細書において、「シトシン」とは、メチル化されていないシトシン、すなわち、非メチル化シトシンを意味する。また、「メチル化されたシトシン」とは、５−メチルシトシンを意味する。
【００１９】
また、本明細書において「測定対象塩基配列」とは、本発明方法によりＤＮＡメチル化率を測定する対象となる塩基配列を意味する。本発明方法においては、一本鎖ＤＮＡ上の任意の塩基配列、あるいは、二本鎖ＤＮＡにおける任意のＤＮＡ鎖上の任意の塩基配列を、測定対象塩基配列とすることができる。
より具体的には、図３に示すように、ＤＮＡゲノムでは、プラス（＋）鎖及びマイナス（−）鎖の両方に構造遺伝子（例えば、図３の構造遺伝子Ａ及び構造遺伝子Ｂ）がコードされている。例えば、図３に示す二本鎖ＤＮＡを被検試料として用いる場合には、例えば、＋鎖上の構造遺伝子Ａの塩基配列若しくはその部分塩基配列、前記構造遺伝子Ａの５’側上流領域ａ（プロモーター領域を含む）の塩基配列若しくはその部分塩基配列Ｂの塩基配列若しくはその部分塩基配列、前記構造遺伝子Ｂの５’側上流領域ｂ（プロモーター領域を含む）の塩基配列若しくはその部分塩基配列、又は前記領域ｂの相補領域ｂ’の塩基配列若しくはその部分塩基配列などを測定対象塩基配列とすることができる。
【００２０】
また、本明細書において「変換後塩基配列」とは、前記測定対象塩基配列を、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤（以下、単に、シトシン修飾剤と称する）で処理することにより得られる塩基配列を意味する［図１における二本鎖ＤＮＡ（ｂ）のセンス鎖、あるいは、図２における二本鎖ＤＮＡ（ｆ）のセンス鎖参照］。
【００２１】
更に、本明細書において「増幅後塩基配列」とは、前記変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖又はその相補鎖を鋳型とするＤＮＡ増幅操作により得られる二本鎖ＤＮＡにおける、前記変換後塩基配列に対応する配列を意味する。例えば、図１に示すように、変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖［図１における二本鎖ＤＮＡ（ｂ）のセンス鎖］を鋳型としてＤＮＡ増幅操作を実施する場合には、二本鎖ＤＮＡ（ｃ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄ）のセンス鎖上の配列を意味する。一方、図２に示すように、変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖［図２における二本鎖ＤＮＡ（ｆ）のアンチセンス鎖］を鋳型としてＤＮＡ増幅操作を実施する場合には、二本鎖ＤＮＡ（ｇ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｈ）のセンス鎖上の配列を意味する。
【００２２】
なお、本明細書においては、二本鎖ＤＮＡの内、測定対象塩基配列、変換後塩基配列、又は増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖を「センス鎖」と称し、その相補鎖を「アンチセンス鎖」と称する。一般的に、生物学的に意味のある塩基配列（例えば、タンパク質をコードする塩基配列）を含むＤＮＡ鎖をセンス鎖と称し、その相補鎖をアンチセンス鎖と称するが、本明細書では、前記規定のとおり、生物学的に意味のある塩基配列を含むか否かにかかわらず、測定対象塩基配列、変換後塩基配列、又は増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖をセンス鎖と称し、その相補鎖をアンチセンス鎖と称する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の測定方法によれば、メチル化部位を予め解析することなく、任意の領域を標的配列とすることができる。また、簡便且つ正確にＤＮＡメチル化率を測定することができる。
【００２４】
より具体的には、本発明の測定方法では、メチル化分析を行いたい領域を増幅するＰＣＲプライマーがハイブリダイズする領域に、シトシンのメチル化部位が入っていても入らなくても構わない。このことは、すなわち、分析対象とする個々の遺伝子のメチル化部位をあらかじめ解析しておく必要がなく、ゲノム情報からＣｐＧアイランドとプロモーター領域をコンピューター解析により割りだし、その解析結果をもとにＰＣＲプライマーをデザインすることが可能であることを意味している。
【００２５】
更に、本発明の測定方法によれば、ＰＣＲプライマーで挟まれる任意の領域のメチル化率を測定することができる。これにより、従来法のようにＰＣＲプライマーがハイブリダイズする領域のみのメチル化だけではなく、ＰＣＲプライマーに挟まれる領域全体のメチル化率を定量的に分析することができる。また、本発明の測定方法では、ＤＮＡ増幅法（特にはＰＣＲ増幅法）を応用していることから、微量のサンプルを分析対象とすることもできる。
血清中や尿中には遊離のＤＮＡ断片が数ｎｇ／ｍＬから数百ｎｇ／ｍＬ含まれているが、それらの量的変化は癌の診断、特に胆癌の診断には有効な手段であることが報告されている。本発明の測定方法は、このような特定組織由来の微量な血中遊離ＤＮＡ断片又は尿中遊離ＤＮＡ断片をも分析対象とすることが可能であることから、この遊離ＤＮＡに含まれる複数遺伝子のメチル化パターンのプロフィールを解析することにより、どの組織由来のＤＮＡであるかも判定することができる可能性をもっている。
【００２６】
また、本発明の評価方法によれば、細胞の状態、例えば、腫瘍細胞の悪性度、細胞の分化状態、生体移植用細胞の安全性、又は細胞の加齢などを判定することができ、正常細胞と異常細胞とを判別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
［１］本発明の測定方法
本発明の測定方法（センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法、センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法、アンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法、及びアンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法を含む）は、
（１）測定対象塩基配列を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを、シトシンを別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理する工程（変換工程）、
（２）得られた二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖、又は得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰの存在下で、ＤＮＡ増幅操作を実施する工程（増幅工程）、及び
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖、又は増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシン又は標識化グアニンの量を測定する工程（分析工程）
を含む。
【００２８】
本発明の測定方法では、前記分析工程において、（Ａ）前記増幅工程で増幅した二本鎖ＤＮＡからセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方を分離した後、そのＤＮＡ鎖中の標識化シトシン又は標識化グアニンの量を測定することもできる（以下、二本鎖分離型測定方法と称する）し、あるいは、（Ｂ）前記増幅工程で増幅した二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシン又は標識化グアニンの量を、分離することなく二本鎖の状態のまま、測定することもできる（以下、二本鎖非分離型測定方法と称する）。
【００２９】
例えば、二本鎖分離−センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法は、
（１）変換工程、
（２）増幅工程、
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡから、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖（センス鎖）を分離する工程（以下、分離工程と称する）、及び
（４）分離したＤＮＡ鎖中の標識化シトシンの量を測定する工程（以下、分離後分析工程と称する）
を含む。
【００３０】
また、二本鎖分離−センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法は、
（１）変換工程、
（２）増幅工程、
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡから、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）を分離する工程（分離工程）、及び
（４）分離したＤＮＡ鎖中の標識化グアニンの量を測定する工程（分離後分析工程）
を含む。
【００３１】
また、二本鎖分離−アンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法は、
（１）変換工程、
（２）増幅工程、
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡから、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）を分離する工程（分離工程）、及び
（４）分離したＤＮＡ鎖中の標識化シトシンの量を測定する工程（分離後分析工程）
を含む。
【００３２】
更に、二本鎖分離−アンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法は、
（１）変換工程、
（２）増幅工程、
（３）増幅した二本鎖ＤＮＡから、前記変換後塩基配列に対応する増幅後塩基配列を含むＤＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）を分離する工程（分離工程）、及び
（４）分離したＤＮＡ鎖中の標識化グアニンの量を測定する工程（分離後分析工程）
を含む。
【００３３】
高等動物におけるゲノムＤＮＡのメチル化はＣＧの連続配列中シトシンがメチル化される場合が多いので、ＣＧ配列のみにターゲットをおいてメチル化率を測定する場合、あるいは、おおよそのメチル化率を測定する場合であれば、アンチセンス鎖のＣＧ配列をターゲットとして増幅することもできる。すなわち、センス鎖におけるＣＧ配列のシトシンがメチル化されている場合、そのアンチセンス鎖における対応ＣＧ配列のシトシンも細胞内で直ちにメチル化される。従って、ＣＧ配列のみにターゲットをおいてメチル化率を測定する場合、センス鎖におけるメチル化シトシンの数と、アンチセンス鎖におけるメチル化シトシンの数とが概ね一致するため、アンチセンス鎖におけるメチル化シトシンの数を測定することにより、センス鎖におけるメチル化シトシンの数を決定することができる。本発明のアンチセンス鎖鋳型測定方法（アンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法及びアンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法を含む）は、このような原理に基づくものである。
【００３４】
なお、ＣＧ配列以外のＤＮＡ中のシトシンのメチル化も含めて分析する場合には、そのメチル化パターンがセンス鎖とアンチセンス鎖で同様にメチル化されていない場合があるので（例えば、センス鎖のＣＡ配列のシトシンがメチル化される場合、それに相補的に対応する塩基配列はＴＧであり、アンチセンス鎖にシトシンがない）、この場合には、本発明のセンス鎖鋳型測定方法（センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法及びセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法を含む）を用いる必要がある。
【００３５】
以下、本発明のセンス鎖鋳型測定方法（特にはセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法）に基づいて本発明の測定方法を説明し、必要に応じて、本発明のアンチセンス鎖鋳型測定方法についても説明する。
本発明のセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法、センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法、アンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法、及びアンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法の概要について、表１にまとめた。表１において、「Ｓ鎖鋳型」及び「Ａ鎖鋳型」は、それぞれ、「センス鎖鋳型」及び「アンチセンス鎖鋳型」を意味する。また、「標識化ｄＮＴＰ」欄に記載の「ｄＣＴＰ」又は「ｄＧＴＰ」は、各方法において少なくとも使用する標識化デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を意味しており、後述するように、これ以外の標識化デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を一緒に用いることも可能である。「操作例」欄には、各方法と、図１及び図２に示す各操作との対応関係を記載した。
【００３６】
なお、図１及び図２は、本発明のセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法、センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法、アンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法、及びアンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法の各々に関して、二本鎖を分離した後、標識に由来する信号を分析する態様を模式的に示す説明図である。
図１及び図２において、二本鎖ＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）並びに二本鎖ＤＮＡ（ｅ）及び（ｆ）における記号「ｍ」は、シトシン（Ｃ）がメチル化されていることを示す。また、二本鎖ＤＮＡ（ｃ）及び（ｄ）並びに二本鎖ＤＮＡ（ｇ）及び（ｈ）における記号「＊」は、シトシン（Ｃ）又はグアニンが標識化されていることを示す。更に、塩基を示す記号として小文字（ａ，ｃ，ｇ，ｔ，ｕ）を使用した塩基は、各工程において変化した塩基で
あることを示す。
また、図１における配列（ａ）、配列（ｂ）、配列（ｃ）、及び配列（ｄ）は、それぞれ、配列番号１６〜１９で表される塩基配列であり、図２における配列（ｅ）、配列（ｆ）、配列（ｇ）、及び配列（ｈ）は、それぞれ、配列番号２０〜２３で表される塩基配列である。
【００３７】
《表１》
Ｓ鎖鋳型／Ｃ型  Ｓ鎖鋳型／Ｇ型  Ａ鎖鋳型／Ｃ型  Ａ鎖鋳型／Ｇ型  
増幅工程の鋳型      センス鎖        センス鎖    アンチセンス鎖  アンチセンス鎖
標識化ｄＮＴＰ      ｄＣＴＰ        ｄＧＴＰ        ｄＣＴＰ        ｄＧＴＰ
分析工程の分析対象  センス鎖    アンチセンス鎖  アンチセンス鎖      センス鎖
操作例            図１(A),(B)     図１(A),(C)     図２(D),(E)     図２(D),(F)   
【００３８】
本発明の測定方法における変換工程では、測定対象塩基配列を含むＤＮＡ（試料ＤＮＡ）を、シトシン（すなわち、非メチル化シトシン）を別の塩基に変換可能なシトシン修飾剤で処理することにより、前記試料ＤＮＡ中の全てのシトシンを別の塩基に化学変換させる［図１における工程（Ａ）又は図２における工程（Ｄ）参照］。
【００３９】
本発明の測定方法を適用することのできる試料ＤＮＡは、測定対象塩基配列を含むＤＮＡであって、しかも、メチル化されたシトシン（５−メチルシトシン）を含む可能性のあるＤＮＡである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ゲノムＤＮＡ若しくはその断片若しくはそれらを含むＤＮＡ構築物、ｃＤＮＡ若しくはその断片若しくはそれらを含むＤＮＡ構築物、又は化学的若しくは酵素的手法により人工的に合成したＤＮＡ等を挙げることができる。また、試料ＤＮＡは、測定対象塩基配列を含む限り、一本鎖ＤＮＡであることもできるし、二本鎖ＤＮＡであることもできる。
【００４０】
変換工程で用いるシトシン修飾剤は、試料ＤＮＡ中に含まれる全てのシトシン（すなわち、非メチル化シトシン）を、シトシン以外の別の核酸構成塩基（例えば、ウラシル、アデニン、チミン、又はグアニン）に変換（例えば、化学的変換又は酵素学的変換）することができ、しかも、メチル化シトシンの構造に影響を与えない限り、特に限定されるものではない。例えば、シトシンをウラシルに変換することのできるシトシン修飾剤としては、例えば、亜硫酸水素イオン（例えば、C. Grunau et al., Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 13, e65）を挙げることができる。
【００４１】
試料ＤＮＡを亜硫酸水素イオンで処理すると、例えば、図１の二本鎖ＤＮＡ（ｂ）又は図２の二本鎖ＤＮＡ（ｆ）に示すように、前記試料ＤＮＡ中の全塩基の内、シトシンは全てウラシルに変換されるが、それ以外の塩基（アデニン、グアニン、チミン、及びメチル化シトシン）は変換されることなく、元の塩基のままである。当然のことながら、試料ＤＮＡ中の測定対象塩基配列においても、シトシンからウラシルへの変換が起こる。全てのシトシンがウラシルへ変換された場合、変換後塩基配列中には、シトシン（すなわち、非メチル化シトシン）は存在せず、存在する可能性のある塩基は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、及びメチル化シトシンである。
【００４２】
本発明のセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法における増幅工程では、試料ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである場合には、前記変換工程で得られたＤＮＡのセンス鎖（すなわち、前記変換後塩基配列を含む鎖）を鋳型とし、標識化ｄＣＴＰの存在下で、前記センス鎖及びその相補鎖を増幅する［図１における工程（Ｂ）参照］。また、試料ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである場合には、前記変換工程で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化ｄＣＴＰの存在下で、前記一本鎖ＤＮＡ及びその相補鎖を増幅する。増幅された二本鎖ＤＮＡでは、例えば、図１の二本鎖ＤＮＡ（ｃ）に示すように、変換後塩基配列におけるメチル化シトシンは標識化シトシンに置換され、ウラシルはチミンに置換され、アデニン、グアニン、及びチミンは元の塩基のままである。
【００４３】
本発明のセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法において、シトシン修飾剤として、シトシンをウラシルに変換することのできるシトシン修飾剤（例えば、亜硫酸水素イオン）を用いた場合の、測定対象塩基配列、変換後塩基配列、及び増幅後塩基配列における各塩基の対応関係を、表２に示す。なお、表２における記号（＊）は、標識化されたシトシンであることを示す。
【００４４】
《表２》
測定対象塩基配列    変換後塩基配列    増幅後塩基配列  
メチル化シトシン    メチル化シトシン      シトシン（*）
シトシン            ウラシル          チミン
アデニン            アデニン          アデニン
グアニン            グアニン          グアニン
チミン              チミン            チミン      
【００４５】
本発明のセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法における増幅工程は、標識化ｄＣＴＰの代わりに標識化ｄＧＴＰを使用すること以外は、本発明のセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法における増幅工程と同様にして実施することができる［図１における工程（Ｃ）参照］。増幅された二本鎖ＤＮＡでは、例えば、図１の二本鎖ＤＮＡ（ｄ）に示すように、変換後塩基配列におけるメチル化シトシンはシトシンに置換され、グアニンは標識化グアニンに置換され、ウラシルはチミンに置換され、アデニン及びチミンは元の塩基のままである。
増幅工程で増幅された二本鎖ＤＮＡでは、メチル化シトシンに由来するセンス鎖におけるシトシン数は、アンチセンス鎖におけるグアニン数と一致するため、アンチセンス鎖におけるグアニン数を測定することにより、センス鎖におけるシトシン数（すなわち、その由来であるメチル化シトシン数）を決定することができる。本発明のセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法は、このような原理に基づくものである。
【００４６】
なお、試料ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合、前記変換工程で得られたＤＮＡも二本鎖ＤＮＡであるが、シトシンがウラシルに変換されているため、変換工程で得られたＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、もはや完全には相補的でない［例えば、図１の二本鎖ＤＮＡ（ｂ）又は図２の二本鎖ＤＮＡ（ｆ）参照］。本発明のセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程では、センス鎖のみを増幅することにより、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率を正確に測定することができる。
【００４７】
本発明のセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程で用いることのできるＤＮＡ増幅法としては、標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰを取り込ませることができ、しかも、センス鎖のみを増幅可能な方法である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、あるいは、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ増幅法などを挙げることができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ増幅法としては、例えば、バクテリオファージ由来のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ増幅法（Amersham Biosciences；Dean, F. et al., Genome Research, 11, 1095-1099, 2001；及びLizardi, P. et al., Nat. Genet., 19, 225-232, 1998）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（タカラバイオ；特許第3433929号明細書）、又はＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法（栄研化学；特許第3313358号明細書）等を挙げることができる。
【００４８】
本発明のセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程で使用するプライマーは、例えば、用いるＤＮＡ増幅法の種類や、後述する分離工程で用いる一本鎖ＤＮＡの調製法に応じて、適宜設計することが可能である。
例えば、ＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法を使用する場合には、変換工程で得られたＤＮＡセンス鎖（すなわち、変換後塩基配列を含む鎖）の前記変換後塩基配列からなるＤＮＡ領域を、二本鎖ＤＮＡとして増幅可能なプライマーセットを設計して用いることができる。具体的には、変換工程で得られたＤＮＡセンス鎖の変換後塩基配列の直後に続く３’側下流の塩基配列（通常、１８〜４０塩基）に相補的な塩基配列からなるリバースプライマーと、前記変換後塩基配列の５’側上流の塩基配列（通常、１８〜４０塩基）からなるフォワードプライマーとの組み合わせを用いることができる。
【００４９】
センス鎖鋳型測定方法における増幅工程で使用する前記プライマーセットは、変換工程で得られたＤＮＡアンチセンス鎖を増幅しないプライマーセットであることが必要である。例えば、前記フォワードプライマーが、変換工程で得られたＤＮＡアンチセンス鎖と、ＰＣＲ反応条件下においてアニールしないプライマーである場合には、変換工程で得られたＤＮＡアンチセンス鎖を増幅することなく、変換工程で得られたＤＮＡセンス鎖のみを増幅することができる。
【００５０】
増幅工程で使用するフォワードプライマー又はリバースプライマーとしては、通常、それぞれ１種類のプライマーを使用するが、プライマーがハイブリダイズする標的塩基配列中にシトシンを含み、かつそのシトシンがメチル化されているか否かが明らかでない場合には、フォワードプライマー（又はリバースプライマー）として、２種類以上のプライマーの混合物を使用することが好ましい。あるいは、２種類以上のプライマーの混合物を使用する代わりに、メチル化の有無が不明なシトシンに対応する塩基として、複数の塩基と結合可能なユニバーサル塩基を含むプライマーを使用することが好ましい。
【００５１】
プライマーがハイブリダイズする標的塩基配列中にシトシンを含み、かつそのシトシンがメチル化されているか否かが明らかでない場合には、このシトシン（以下、未知シトシンと称する）をシトシン修飾剤処理すると、ウラシルに変化する場合（未知シトシンが非メチル化シトシンである場合）と、メチル化シトシンのままである場合（未知シトシンがメチル化シトシンである場合）とがある［例えば、図１における二本鎖ＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）参照］。従って、例えば、リバースプライマーを設計する場合には、前記未知シトシンに対応する塩基が、アデニンであるプライマーと、グアニンであるプライマーとを設計し、その混合物を用いることにより、いずれの場合でもＤＮＡ増幅を実施することが可能となる。一方、フォワードプライマーを設計する場合には、未知シトシンに対応する塩基が、チミンであるプライマーと、シトシンであるプライマーとを設計し、その混合物を用いることにより、いずれの場合でもＤＮＡ増幅を実施することが可能となる。
【００５２】
なお、２種類以上のプライマーの混合物を用いる場合、少なくとも１箇所以上に異なる塩基を含むため、プライマーの塩基長が等しい場合には各プライマーのＴｍに違いが生じることがある。異なるＴｍのプライマーを同時に用いる場合、鋳型ＤＮＡに対する結合力が異なるため、或る特定のプライマーに由来するＤＮＡが優先的に増幅される傾向がある。従って、このようなバイアスを回避するために、プライマーの塩基長を調整することによって、Ｔｍを一致させることが好ましい。
【００５３】
一方、２種類以上のプライマーの混合物の代わりに、複数の塩基と結合可能なユニバーサル塩基を含むプライマーを使用する場合には、対象となる塩基に応じて適当なユニバーサル塩基を選択することができる。例えば、先述したように、未知シトシンを含む標的塩基配列に対するリバースプライマーを設計する場合には、前記未知シトシンに対応する塩基が、アデニンであるプライマーと、グアニンであるプライマーとを設計する代わりに、前記未知シトシンに対応する塩基が、チミン及びシトシンの両方と結合可能なユニバーサル塩基［例えば、２−アミノ−６−メトキシアミノプリン（2-amino-6-methoxyaminopurine）］であるプライマーを設計すればよい。
【００５４】
このようなユニバーサル塩基としては種々の塩基が公知である［P.K. Lin and D.M. Brown, Nucleic Acids Research, vol. 20, No. 19, pp5149-5152, 1992］。アデニン及びグアニンの両方と結合可能なユニバーサル塩基としては、例えば、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（6H,8H-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one）を用いることができる。また、対応する塩基を選ばない化合物としてデオキシイノシン（deoxyinosine）も広く使用されている［E. Ohtsuka et al., J. Biological Chemistry, vol. 260, No. 5, pp2605-2608, 1985］。
増幅工程で用いるプライマーの更なる好適態様については、分離工程における一本鎖ＤＮＡ調製法の説明の際に、更に詳述する。
【００５５】
本発明のセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程で用いる標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰの標識化に用いる標識物質は、増幅工程におけるＤＮＡ増幅反応を抑制又は阻害することがないか、あるいは、抑制又は阻害することが少なく、しかも、標識物質それ自体が信号（例えば、蛍光、発光、又はアイソトープ）を発するか、あるいは、標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）、Ｃｙ３（Cyanine 3）、Ｃｙ５（Cyanine 5）、ローダミン、テキサスレッド（Texas Red）、ＨＥＸ（Hexachloro-6-carboxyfluorescein）、ＦＡＭ（6-Carboxyfluorescein）、ＴＥＴ（Tetrachloro-6-carboxyfluorescein）、ＴＡＭＲＡ（6-Carboxytetramethylrhodamine）、ＴＲＩＴＣ（Tetramethylrhodamin）、ＲＯＸ（Carboxy-X-rhodamine）、又はＤＮＰ（Dinitrophenol）、ジゴキシゲニン、ビオチン、又はアレクサ・フルーオー（Alexa Fluor；Molecular Probes社）等を挙げることができる。また、標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰとして、例えば、５−メチルｄＣＴＰ、６−メトキシｄＧＴＰ、又は７−メチルｄＧＴＰ等を用いることもできる。
【００５６】
本発明のセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程におけるＤＮＡ増幅は、変換工程で得られた二本鎖ＤＮＡのセンス鎖又は一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰの存在下で実施すること以外は、使用するＤＮＡ増幅法に従って実施することができる。
例えば、センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法においてＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法を用いる場合には、標識化ｄＣＴＰに加え、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰと、所望によりｄＣＴＰ（すなわち、未標識のｄＣＴＰ）とを加えて、ＰＣＲを実施する。本発明の測定方法においては、ｄＣＴＰとして、標識化ｄＣＴＰのみを用いることもできるし、あるいは、標識化ｄＣＴＰ及び未標識ｄＣＴＰの混合物を用いることもできる。標識化ｄＣＴＰ及び未標識ｄＣＴＰの混合物を用いる場合には、例えば、５−メチルｄＣＴＰを任意の量で取り込ませたメチル化標準ＤＮＡを用いて検量線を描くことにより、たとえ標識化ヌクレオチドがＰＣＲ反応液中に微量しか添加しなくても、検量線からメチル化率を分析する試料ＤＮＡの実際のメチル化率を算出することができる。例えば、実際に蛍光標識ヌクレオチドの量は、未標識：標識の比率が５００：１以下の量で測定可能であることを確認している。
なお、センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法においてＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法を用いる場合には、標識化ｄＧＴＰに加え、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰと、所望によりｄＧＴＰ（すなわち、未標識のｄＧＴＰ）とを加えて、ＰＣＲを実施する。
【００５７】
また、ＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法を用いる場合には、非対称（asymmetric）ＰＣＲ法を用いることもできる。非対称ＰＣＲ法では、例えば、リバースプライマーとフォワードプライマーとを約１：５０の量比で使用して、ＰＣＲを実施することにより、センス鎖を優先的に増幅することができる。
【００５８】
センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法における増幅工程では、標識化ｄＣＴＰに加えて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、又はｄＴＴＰの少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸に代えて（又は加えて）、標識化ｄＣＴＰの標識化に用いた標識物質とは別の標識物質で標識化したデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（例えば、標識化ｄＡＴＰ、標識化ｄＧＴＰ、又は標識化ｄＴＴＰ）を用いることができる。試料ＤＮＡが同一遺伝子であれば、各試料ＤＮＡ中のセンス鎖におけるアデニン及びグアニン並びにアンチセンス鎖におけるシトシン及びチミンの数は変わらない。従って、アデニン、グアニン、又はチミンを内部標準としてメチル化シトシンを定量することにより、正確にメチル化率を定量することができる。
なお、センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法における増幅工程では、標識化ｄＧＴＰに加えて、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、又はｄＴＴＰの少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸に代えて（又は加えて）、標識化ｄＧＴＰの標識化に用いた標識物質とは別の標識物質で標識化したデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（例えば、標識化ｄＡＴＰ、標識化ｄＣＴＰ、又は標識化ｄＴＴＰ）を用いることができる。
【００５９】
また、増幅工程で用いるフォワードプライマーとして、標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰの標識化に用いた標識物質とは別の標識物質で標識化したフォワードプライマーを用いることもできる。例えば、標識化フォワードプライマーの標識化に第１の蛍光物質（蛍光物質Ａ）を使用し、標識化ｄＣＴＰの標識化に第２の蛍光物質（蛍光物質Ｂ）を使用した場合、後述の分析工程において、センス鎖ＤＮＡの蛍光強度を、蛍光物質Ａ及びＢのそれぞれの測定波長で測定し、（蛍光物質Ｂの蛍光強度）／（蛍光物質Ａの蛍光強度）の値から、センス鎖ＤＮＡ中に含まれるシトシンの割合を算出することができる。
【００６０】
以上、本発明の測定方法における増幅工程について、本発明のセンス鎖鋳型測定方法に基づいて説明したが、本発明のアンチセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程も、前記変換工程で得られたＤＮＡのアンチセンス鎖（すなわち、前記変換後塩基配列を含むＤＮＡ鎖の相補鎖）を鋳型とすること以外は、本発明のセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程と同様に実施することができる［図２における工程（Ｅ）又は（Ｆ）参照］。
【００６１】
具体的には、本発明のアンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法における増幅工程では、前記変換工程で得られたＤＮＡのアンチセンス鎖を鋳型とし、標識化ｄＣＴＰの存在下で、前記アンチセンス鎖及びその相補鎖を増幅する［図２における工程（Ｅ）］。増幅された二本鎖ＤＮＡでは、例えば、図２の二本鎖ＤＮＡ（ｇ）に示すようにメチル化シトシンは標識化シトシンに置換され、ウラシルはチミンに置換され、アデニン、グアニン、及びチミンは元の塩基のままである。
【００６２】
また、本発明のアンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法における増幅工程では、前記変換工程で得られたＤＮＡのアンチセンス鎖を鋳型とし、標識化ｄＧＴＰの存在下で、前記アンチセンス鎖及びその相補鎖を増幅する［図２における工程（Ｆ）参照］。増幅された二本鎖ＤＮＡでは、例えば、図２の二本鎖ＤＮＡ（ｈ）に示すように、変換後塩基配列におけるメチル化シトシンはシトシンに置換され、グアニンは標識化グアニンに置換され、ウラシルはチミンに置換され、アデニン及びチミンは元の塩基のままである。
本発明のアンチセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程で用いる標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰの標識化に用いる標識物質としては、例えば、本発明のＣ型測定方法における増幅工程で例示した標識物質を用いることができる。
【００６３】
本発明のアンチセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程で用いることのできるＤＮＡ増幅法としては、標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰを取り込ませることができ、しかも、アンチセンス鎖（すなわち、変換後塩基配列を含む鎖の相補鎖）のみを増幅可能な方法である限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のセンス鎖鋳型測定方法における増幅工程で例示したＤＮＡ増幅法を用いることができる。
本発明のアンチセンス鎖鋳型測定方法におけるＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法を使用する場合には、変換工程で得られたＤＮＡアンチセンス鎖（すなわち、変換後塩基配列を含む鎖の相補鎖）の前記変換後塩基配列に対応するＤＮＡ領域を、二本鎖ＤＮＡとして増幅可能なプライマーセットを設計して用いることができる。この場合、前記プライマーセットは、変換工程で得られたＤＮＡセンス鎖を増幅しないプライマーセットであることが必要である。例えば、リバースプライマーが、変換工程で得られたＤＮＡセンス鎖と、ＰＣＲ反応条件下においてアニールしないプライマーである場合には、変換工程で得られたＤＮＡセンス鎖を増幅することなく、変換工程で得られたＤＮＡアンチセンス鎖のみを増幅することができる。
【００６４】
本発明のアンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法におけるＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法を用いる場合には、標識化ｄＣＴＰに加え、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰと、所望によりｄＣＴＰ（すなわち、未標識のｄＣＴＰ）とを加えて、ＰＣＲを実施することができる。また、本発明のアンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法におけるＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法を用いる場合には、標識化ｄＧＴＰに加え、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰと、所望によりｄＧＴＰ（すなわち、未標識のｄＧＴＰ）とを加えて、ＰＣＲを実施することができる。
また、本発明のアンチセンス鎖鋳型測定方法におけるＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ法を用いる場合には、非対称（asymmetric）ＰＣＲ法を用いることもできる。非対称ＰＣＲ法では、例えば、フォワードプライマーとリバースプライマーとを約１：５０の量比で使用して、ＰＣＲを実施することにより、アンチセンス鎖を優先的に増幅することができる。
【００６５】
本発明のアンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法における増幅工程では、標識化ｄＣＴＰに加えて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、又はｄＴＴＰの少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸に代えて（又は加えて）、標識化ｄＣＴＰの標識化に用いた標識物質とは別の標識物質で標識化したデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（例えば、標識化ｄＡＴＰ、標識化ｄＧＴＰ、又は標識化ｄＴＴＰ）を用いることができる。また、本発明のアンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法における増幅工程では、標識化ｄＧＴＰに加えて、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、又はｄＴＴＰの少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸に代えて（又は加えて）、標識化ｄＧＴＰの標識化に用いた標識物質とは別の標識物質で標識化したデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（例えば、標識化ｄＡＴＰ、標識化ｄＣＴＰ、又は標識化ｄＴＴＰ）を用いることができる。
【００６６】
また、増幅工程で用いる１つのプライマーとして、標識化ｄＣＴＰ又は標識化ｄＧＴＰの標識化に用いた標識物質とは別の標識物質で標識化したリバースプライマーを用いることもできる。例えば、標識化リバースプライマーの標識化に第１の蛍光物質（蛍光物質Ａ）を使用し、標識化ｄＣＴＰの標識化に第２の蛍光物質（蛍光物質Ｂ）を使用した場合、後述の分析工程において、アンチセンス鎖ＤＮＡの蛍光強度を、蛍光物質Ａ及びＢのそれぞれの測定波長で測定し、（蛍光物質Ｂの蛍光強度）／（蛍光物質Ａの蛍光強度）の値から、アンチセンス鎖ＤＮＡ中に含まれるシトシンの割合を算出することができる。
【００６７】
本発明の二本鎖分離型測定方法における分離工程では、前記増幅工程において増幅した二本鎖ＤＮＡから、センス鎖（二本鎖分離−センス鎖鋳型測定方法の場合）又はアンチセンス鎖（二本鎖分離−アンチセンス鎖鋳型測定方法の場合）を分離する。
前記増幅工程で得られたＤＮＡは、通常、二本鎖ＤＮＡであり、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方に、標識化ｄＣＴＰ（二本鎖分離−Ｃ型測定方法の場合）又は標識化ｄＧＴＰ（二本鎖分離−Ｇ型測定方法の場合）、あるいは、標識化ｄＣＴＰ及び標識化ｄＧＴＰ（二種類の標識化デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いる場合）が導入されている。本発明の二本鎖分離型測定方法では、二本鎖ＤＮＡをセンス鎖及びアンチセンス鎖に分離するため、一方のＤＮＡ鎖の標識物質の量を測定する際に、他方のＤＮＡ鎖の標識物質の影響を受けることがない。以下、センス鎖を分離する場合を例にとり、本発明の二本鎖分離型測定方法における分離工程を説明するが、当業者であれば必要に応じて自明な変更を適宜加えることにより、同様にしてアンチセンス鎖を分離することができる。
【００６８】
センス鎖のみを分離するための一本鎖ＤＮＡ調製法としては、例えば、
（１）二本鎖ＤＮＡの状態で、センス鎖のみを固定化用担体に固定化した後、二本鎖ＤＮＡを変性させることにより、固定化用担体に固定化されていないアンチセンス鎖のみを解離させ、除去する方法（以下、固定化法と称する）、
（２）アンチセンス鎖のみを酵素で分解する方法（以下、酵素分解法と称する）、
（３）分子ふるい効果を用いた分離方法（例えば、電気泳動）により分離する方法（以下、分子ふるい法と称する）、又は
（４）アフィニティーを利用して分離する方法（以下、アフィニティー法と称する）
等を挙げることができる。
【００６９】
前記固定化法（１）は、例えば、増幅工程で実施するＰＣＲに用いるフォワードプライマー（センス鎖の５’末端を形成）として、適当な反応性官能基を導入したフォワードプライマーを用いることにより、実施することができる［なお、アンチセンス鎖のみを分離する場合には、増幅工程で実施するＰＣＲに用いるリバースプライマー（アンチセンス鎖の５’末端を形成）として、適当な反応性官能基を導入したリバースプライマーを用いる］。前記反応性官能基は、固定化用担体側の反応性官能基と反応することによって、二本鎖ＤＮＡの固定化用担体への固定化が可能であって、増幅工程におけるＰＣＲを抑制又は阻害することなく、しかも、二本鎖ＤＮＡの変性処理（例えば、酸処理又はアルカリ処理）に対して耐性である限り、特に限定されるものではない。前記反応性官能基としては、例えば、アミノ基、マレイミド基、アルデヒド基、カルボキシル基、メルカプト基、ビニルスルホン基、又はメタンスルホニル基などを挙げることができる。また、前記反応性官能基に代えて、特異的結合反応により相互に結合可能な結合パートナーの組み合わせを用いることができ、このような組み合わせとしては、例えば、ビオチン／アビジンの組み合わせを挙げることができる。
【００７０】
前記固定化法では、例えば、フォワードプライマーに導入された反応性官能基又は結合パートナーを介して、二本鎖ＤＮＡを固定化用担体に固定化する。この場合、二本鎖ＤＮＡの内、センス鎖は固定化用担体に固定化されているが、アンチセンス鎖は、センス鎖と水素結合しているものの、固定化用担体には共有結合により固定化していない。この状態で、二本鎖ＤＮＡの変性処理［例えば、酸処理、アルカリ処理、熱処理、又はＤＮＡ変性剤（例えば、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、又はジメチルスルホキサイド等）処理など］を実施すると、センス鎖とアンチセンス鎖とが解離するため、固定化用担体に固定化されていないアンチセンス鎖のみが固定化担体から外れる。外れたアンチセンス鎖を、例えば、洗浄によって除去することにより、一本鎖ＤＮＡを調製することができる。
【００７１】
前記酵素分解法（２）としては、例えば、二本鎖ＤＮＡの末端から、５’から３’の方向に向かって分解するエキソヌクレアーゼ（例えば、λエキソヌクレアーゼ）を用いる方法を挙げることができる。
この方法は、例えば、増幅工程で実施するＰＣＲに用いるプライマーセットとして、前記エキソヌクレアーゼに消化されやすいリバースプライマー（アンチセンス鎖の５’末端を形成）と、前記エキソヌクレアーゼに消化されにくいセンスプライマー（センス鎖の５’末端を形成）との組み合わせを用いることにより、実施することができる［なお、アンチセンス鎖のみを分離する場合には、増幅工程で実施するＰＣＲに用いるプライマーセットとして、前記エキソヌクレアーゼに消化されやすいフォワードプライマー（センス鎖の５’末端を形成）と、前記エキソヌクレアーゼに消化されにくいリバースプライマー（アンチセンス鎖の５’末端を形成）との組み合わせを用いる］。プライマーをエキソヌクレアーゼ易消化性にする方法としては、例えば、プライマーの５’末端をリン酸化する方法を挙げることができる。また、プライマーをエキソヌクレアーゼ難消化性にする方法としては、例えば、プライマーの５’末端を水酸基（−ＯＨ）のままにしておく方法、あるいは、少なくとも１つ（好ましくは全て）のインターヌクレオチド結合をホスホロチオエート型結合とする方法を挙げることができ、それらを組み合わせることにより、エキソヌクレアーゼ難消化性を更に向上させることもできる。
また、前記のエキソヌクレアーゼ難消化性フォワードプライマーには、前記固定化法で説明した反応性官能基又は結合パートナーを更に導入することもできる。
【００７２】
前記エキソヌクレアーゼを用いる酵素分解法では、例えば、（ａ）二本鎖ＤＮＡを固定化用担体に予め固定化し、前記二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで処理した後、消化産物を洗浄により除去することにより、一本鎖ＤＮＡを調製することもできるし、あるいは、（ｂ）二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで処理した後、通常のＤＮＡ精製法により、一本鎖ＤＮＡと消化産物とを分離することにより、一本鎖ＤＮＡを精製することもできる。
前記方法（ａ）では、反応性官能基又は結合パートナーを更に導入したエキソヌクレアーゼ難消化性フォワードプライマーを使用する。
また、前記方法（ｂ）では、前記ＤＮＡ精製法として、例えば、エタノール沈殿法、限外濾過法、又はシリカ吸着法などを挙げることができる。
【００７３】
前記分子ふるい法（３）では、分子ふるい効果を利用した各種分離法、例えば、電気泳動法（例えば、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法）、ゲル濾過法、限外濾過法、又は遠心分離法などを用いることができる。前記分子ふるい法（３）又はアフィニティー法（４）は、例えば、増幅工程で非対称ＰＣＲ法を用いた場合に利用することができる。電気泳動法（特にはＳＳＣＰ電気泳動法）では、例えば、増幅工程で得られたＰＣＲ反応液を、常法により電気泳動用ゲル（例えば、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル）で電気泳動することにより、ゲル中で泳動度が遅い一本鎖ＤＮＡとして分離することができる。あるいは、通常のＤＮＡ増幅法（すなわち、非対称でない）を実施した後、２本鎖ＤＮＡを変性した直後に電気泳動することにより、それぞれ塩基配列や組成が異なるそれぞれの１本鎖ＤＮＡをゲル中で分離することができる。また、ゲル中に変性剤を混入したり、ゲル中で変性剤の濃度勾配を形成させても、同様にそれぞれの１本鎖ＤＮＡを分離することができる。
【００７４】
分子ふるい法では、蛍光物質標識により、各ＤＮＡ鎖の物理的又は化学的性質を変えることにより、各ＤＮＡ鎖の物性の違いにより分離することも可能である。例えば、蛍光物質標識により、一方のＤＮＡ鎖の疎水性を増加させたり、あるいはまた、一方のＤＮＡ鎖のイオン性を高めたりすることにより、二本鎖ＤＮＡを分離することができる。
【００７５】
本発明の測定方法における分析工程では、二本鎖分離型測定方法の場合には、前記分離工程で得られた一方のＤＮＡ鎖中の標識化デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の量を測定することによって、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率［あるいは、シトシン（すなわち、非メチル化シトシン）とメチル化シトシンの比率］を決定する。各態様における、分析対象となるＤＮＡ鎖及び標識化デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸は、前記表１に示したとおりである。
すなわち、二本鎖分離−センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法ではセンス鎖中の標識化シトシンの量を［図１の二本鎖ＤＮＡ（ｃ）参照］、二本鎖分離−センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法ではアンチセンス鎖中の標識化グアニンの量を［図１の二本鎖ＤＮＡ（ｄ）参照］、二本鎖分離−アンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法ではアンチセンス鎖中の標識化シトシンの量を［図２の二本鎖ＤＮＡ（ｇ）参照］、二本鎖分離−アンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法ではセンス鎖中の標識化グアニンの量を［図２の二本鎖ＤＮＡ（ｈ）参照］、それぞれ測定する。
【００７６】
例えば、センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法では、先の表２にも示したとおり、増幅後塩基配列中のシトシンは、測定対象塩基配列におけるメチル化シトシンに対応する。従って、センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法では、増幅後塩基配列中のシトシン（すなわち、標識化シトシン）の量を測定することにより、測定対象塩基配列中のメチル化シトシンの量を算出することができる。
【００７７】
一方、二本鎖非分離型測定方法の場合には、前記増幅工程で得られた二本鎖ＤＮＡ中の標識化デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸の量を測定することによって、測定対象塩基配列におけるシトシンのメチル化率［あるいは、シトシン（すなわち、非メチル化シトシン）とメチル化シトシンの比率］を決定する。
すなわち、二本鎖非分離−センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法又は二本鎖非分離−アンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法では二本鎖ＤＮＡ中の標識化シトシンの量を、二本鎖非分離−センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法又は二本鎖非分離−アンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法では二本鎖ＤＮＡ中の標識化グアニンの量を測定する。
【００７８】
標識化シトシン量又は標識化グアニンの測定は、標識化に用いた標識物質の種類に応じて、常法により測定することができる。以下、標識化シトシンを用いた場合の態様に基づいて分析工程を説明するが、標識化グアニンを用いた場合にも同様に実施することができる。
例えば、標識物質それ自体が信号（例えば、蛍光、発光、又はアイソトープ）を発したり、同位元素を用いて特異的に識別したりする場合には、例えば、その信号に応じた測定器を用いることにより、標識物質の量（すなわち、標識化シトシンの量）を測定することができる。
また、標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する場合には、例えば、前記パートナーを別の標識物質（例えば、蛍光物質、発光物質、同位元素、又は酵素）で標識化し、この標識化パートナーを標識化シトシンに結合させた後、前記標識化パートナーの信号を測定することにより、標識化シトシンの量を決定することができる。あるいは、前記パートナーを標識化しなくても、極小さい質量変化を測定可能な方法［例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する測定法又は水晶発振子マイクロバランス（ＣＭ）を利用する測定法］を用いることにより、前記パートナーの標識物質への結合量を直接測定し、標識化シトシンの量を決定することができる。更には、前記パートナーを標識化しなくても、前記パートナー結合後の分子量を測定（例えば、電気泳動における泳動度により、あるいは、質量分析器により、分子量を決定）することにより、前記パートナーの標識物質への結合量を算出し、標識化シトシンの量を決定することができる。
【００７９】
本発明の測定方法では、測定対象ＤＮＡのみを用いて、変換工程、増幅工程、及び分析工程を実施し、前記測定対象ＤＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡ又はその一方のＤＮＡ鎖中の標識化ヌクレオチドの取り込み量を直接測定することにより、測定対象ＤＮＡの測定対象塩基配列におけるメチル化率を決定することもできるが、測定対象ＤＮＡに対応するメチル化標準ＤＮＡを予め調製しておき、前記測定対象ＤＮＡ及び前記メチル化標準ＤＮＡを用いて、同じ条件下にて変換工程、増幅工程、及び分析工程を実施した後、前記メチル化標準ＤＮＡの分析結果から検量線を作成することにより、測定対象ＤＮＡの測定対象塩基配列におけるメチル化率を決定することもできる。
【００８０】
メチル化標準ＤＮＡを用いる本発明の測定方法は、例えば、以下の手順で実施することができる。すなわち、測定対象ＤＮＡを鋳型とし、増幅工程で用いるプライマーセットを用いて、５−メチルｄＣＴＰ単独、あるいは、５−メチルｄＣＴＰとｄＣＴＰとの共存下で、ＰＣＲを実施することにより、メチル化標準ＤＮＡを調製する。この場合、５−メチルｄＣＴＰ及びｄＣＴＰの混合比を変化させることにより、メチル化率の異なる複数のメチル化標準ＤＮＡを調製する。例えば、５−メチルｄＣＴＰ及びｄＣＴＰの混合比（５−メチルｄＣＴＰ：ｄＣＴＰ）を、０：１０、２：８、４：６、６：４、８：２、及び１０：０の６段階に設定してＰＣＲを実施することにより、シトシンのメチル化率が概ね０％、２０％、４０％、６０％、８０％、及び１００％の６種類のメチル化標準ＤＮＡを調製することができる（なお、前記混合比は、適宜変更することができる）。なお、各メチル化標準ＤＮＡにおける正確なメチル化率を決定する場合には、例えば、各メチル化標準ＤＮＡに関して、亜硫酸水素イオンの処理前及び処理後の塩基配列を必要な数だけ直接シークエンスし、統計的処理を行うことにより、決定することができる。
【００８１】
得られた複数のメチル化標準ＤＮＡと、測定対象ＤＮＡとを用いて、同じ条件下にて変換工程、増幅工程、及び分析工程を実施する。各メチル化標準ＤＮＡに関して得られた標識化ヌクレオチドの各取り込み量と、各メチル化標準ＤＮＡの各メチル化率とから検量線を作成した後、測定対象ＤＮＡに関して得られた標識化ヌクレオチドの取り込み量を、前記検量線に当てはめることにより、測定対象ＤＮＡの測定対象塩基配列におけるメチル化率を決定することができる。
【００８２】
以上、本発明の測定方法について説明したが、より具体的な操作手順に基づいて本発明の測定方法について更に説明する。
（１）電気泳動による分子ふるいを用いる測定方法
本測定方法では、変換工程後の分析を、分子ふるいによって定量する。
試料ＤＮＡを亜硫酸水素イオンで処理した後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びビオチン標識ｄＣＴＰを用いてＰＣＲを実施し、ＤＮＡ産物中にビオチン標識ｄＣＴＰを取り込ませる。なお、前記ＰＣＲに用いる２種類のオリゴＤＮＡプライマーは以下のように設計する。一方のオリゴＤＮＡプライマーの５’末端をリン酸化してλエキソヌクレアーゼに対して易消化性とする。もう一方のオリゴＤＮＡプライマーは、λエキソヌクレアーゼに対して難消化性にするために、５’末端を水酸基（−ＯＨ）にしておくか、あるいは、難消化性を更に増強するために、各ヌクレオチド間の全てのリン酸結合、あるいは、一部のリン酸結合をチオール結合に変換したＳ−オリゴ化ＤＮＡプライマーとする。
得られたＰＣＲ産物をλエキソヌクレアーゼで消化し、一本鎖にする。λエキソヌクレアーゼ消化操作後の溶液中にアビジン溶液を混和し、電気泳動用試料とし、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供する。電気泳動後のゲルをＤＮＡ染色剤又はタンパク質染色剤で染色し、泳動物の分子量を測定する。この場合、ビオチンアビジン結合が離れないことが重要である。通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥではビオチンアビジン結合が離れてしまうことがあるため、例えば、非還元条件下で、試料用バッファー中のＳＤＳ濃度を０．１％程度まで下げることが好ましく、ゲル中のＳＤＳ濃度も０．１％以下であることが好ましい。
【００８３】
前記ＰＣＲ反応で得られた一本鎖ＤＮＡ中にビオチン化シトシンが含まれている場合、前記一本鎖ＤＮＡ上のビオチン数に応じた数のアビジン分子が結合し、前記一本鎖ＤＮＡの分子量を増加させる。これにより、前記一本鎖ＤＮＡ上のビオチン化シトシンの数を定量することができる。アビジンは、ビオチン結合部位を１分子中当たり４箇所有することから、不充分な濃度のアビジン溶液を用いた場合、１つの一本鎖ＤＮＡ上の２〜４分子のビオチンに対して１分子のアビジンが結合し、一本鎖ＤＮＡ上のビオチン分子の数を正確に定量することができなくなる。従って、充分な量のアビジンを添加する必要がある。
【００８４】
（２）蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンを用いた測定方法
２つのオリゴＤＮＡプライマーの内、いずれか一方に基質に固定化するための側鎖、例えば、アミノ基を導入したものを使用してＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡを無水マレイン酸活性化ポリスチレンプレート［Reacti-Bind(TM) Maleic Anhydride Activated Polystyrene Plates；PIERCE社製，Cat#15100］のウェルに製品マニュアルに従って固定化する。固定化後、ブロッキング液［１ｍｏｌ／Ｌグリシン／１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）］２００μＬをウェルに入れて室温で１時間以上放置する。次に、ウェルに０．３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液１００μＬを入れて２０分間放置し、ＤＮＡの一本鎖化を行う。次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでウェルを数回洗浄し、５μｇ／ｍＬアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン含有０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳをウェルに入れ、室温で１時間放置する。次に、ウェル内の液を除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄する。次に、アルカリホスファターゼ基質液（SIGMA社製，Cat#N-1891）を製品マニュアルに従って作製し、ウェルに入れ、室温で数分〜１時間放置し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００８５】
前記方法では、ウェル中でＤＮＡを一本鎖化するが、λエキソヌクレアーゼにより、測定対象としないＤＮＡ鎖のみを酵素分解して一本鎖化したＤＮＡを、前記と同じ方法でウェルに固定化しても同様の効果が得られる。この場合に用いるＰＣＲ用オリゴＤＮＡプライマーは前記の方法に従って設計し、分析対象としない一本鎖ＤＮＡのみを分解除去することができるもので、かつ、分析対象とする一本鎖ＤＮＡはλエキソヌクレアーゼに対して耐性を有する構造のもので、なおかつ基質上に固定化することができる構造でなければならない。
【００８６】
（３）非対称ＰＣＲ法による測定方法
２つのオリゴＤＮＡプライマーの内、蛍光物質Ａで標識したフォワードプライマーを用い、更に蛍光物質Ｂで標識したｄＣＴＰを混入させてＰＣＲ反応を行う。前記ＰＣＲ反応において、リバースプライマーは、フォワードプライマーの約１／５０の量を反応液中に入れる。ＰＣＲ反応液は、常法に従ってアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行う。前記方法により、蛍光標識されたフォワードプライマーの塩基配列を有するＰＣＲ産物は、電気泳動ゲル中で移動度が遅い一本鎖ＤＮＡとして現れる。蛍光イメージアナライザー（タカラバイオ社製；FMBIO）を用い、前記一本鎖ＤＮＡバンドの蛍光強度を、蛍光物質Ａ及びＢのそれぞれの測定波長で計測する。一本鎖ＤＮＡにおける（蛍光物質Ｂの蛍光強度）／（蛍光物質Ａの蛍光強度）の値から、一本鎖ＤＮＡ中に含まれるシトシンの割合を算出することができる。
【００８７】
（４）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は水晶発振子マイクロバランス（ＣＭ）による測定方法
標記の２つの方法は、基本的にはセンサーチップ上の極小さい質量変化を測定する方法である。例えば、センサーチップ上に結合させた物質Ａに対して、親和性がある物質Ｂが結合すると、その結合によってセンサー上の質量が増加するので、その変化を検知することができる。ＳＰＲを利用する測定器としては、例えば、ビアコアシステム（Biacore 2000；ビアコア社）を挙げることができ、ＣＭを利用する測定器としては、例えば、水晶発振子バイオセンサー（AFFINIX Q4；イニシアム社）を挙げることができる。
【００８８】
前記のいずれかの方法で作製した一本鎖ＤＮＡを基質に固定化するが、このときの一本鎖ＤＮＡ中のシトシンをハプテン標識しておく。また、ＰＣＲ反応において増幅されるDNAのセンス鎖の５’上流に取り込まれるオリゴＤＮＡプライマーには、予めアミノ基を導入しておく。例えば、ハプテンとしてビオチンで標識したｄＣＴＰをＰＣＲ産物中に取り込ませておき、その一本鎖ＤＮＡをセンサー上に固定化する。センサーチップ上への一本鎖ＤＮＡの固定化は、ＤＮＡ中に予め導入しておいたアミノ基を介して行う。以上のようにして分析対象とする一本鎖ＤＮＡが固定化されたセンサーチップに対してアビジン溶液を接触させることにより、前記アビジンは、前記センサーチップ上に固定化された前記一本鎖ＤＮＡ中に取り込まれたビオチン量に比例した量の分子数が結合する。この質量変化を測定することにより、前記一本鎖ＤＮＡにいくつのシトシンが含まれるかを分析することができる。また、試料間のメチル化率の比較を行ったり、メチル化標準ＤＮＡを作製して試料と同様に作業を行った場合には、検量線を作成してメチル化率を定量することができる。
【００８９】
（５）ヒトＥ−カドヘリンの転写開始点近傍のメチル化率の解析
以下、具体的配列を例にとり、本発明の測定方法を説明する。
実際にヒトゲノムのメチル化は−ＣＧ−の連続配列中のシトシンがメチル化されており、通常、そのメチル化されているシトシンはセンス鎖とアンチセンス鎖の両鎖ともメチル化されている。例えば、以下に示す２本鎖ＤＮＡ（配列番号１）を例にして解説する。なお、ボックスで囲まれたシトシンはメチル化されたシトシンを表す。
【化１】
2005168486.tif 000002
【００９０】
上記配列には５’−ＣＧ−３’配列がセンス鎖及びアンチセンス鎖にそれぞれ２箇所存在するが、ここではそのうちの１箇所の５’−ＣＧ−３’配列がそれぞれのＤＮＡ鎖でメチル化されていると仮定する。通常、高等動物ではセンス鎖のある特定の５’−ＣＧ−３’配列中のシトシンがメチル化されている場合には、その領域に相補的にハイブリダイズしているアンチセンス鎖の５’−ＣＧ−３’配列中のシトシンも同様にメチル化されている。従って、ある特定領域のＤＮＡのメチル化率を測定する場合には、センス鎖を分析対象としても良く、また同様にアンチセンス鎖を分析対象としても、ある特定領域中のＤＮＡのメチル化率は同じ結果となる。また、センス鎖とアンチセンス鎖ではシトシンの塩基数が異なるが、本発明におけるメチル化率の分析において高等動物のゲノムＤＮＡにおいては、どちらのＤＮＡ鎖を分析対象としても分析対象とする領域のメチル化率と言う意味では同じ分析結果となる。高等動物では多くの場合、５’−ＣＧ−３’の連続配列中に存在するシトシンがメチル化の標的となるため、ある任意の領域のＤＮＡのメチル化率を分析するのであれば、センス鎖をＰＣＲで増幅しても、アンチセンス鎖を同様に増幅してメチル化率を分析しても同じ結果が得られることとなる。但し、高等動物では、ＣＧの連続配列中のシトシン以外のシトシンも少なからずメチル化を受けているので、そのようなシトシンのメチル化も含めて分析対象とする場合には、センス鎖（遺伝子の転写の方向を基準とした場合のセンス鎖）を分析対象として選択する必要がある。具体的には、センス鎖の５’−ＣＡ−３’連続配列中のシトシンがメチル化されている場合には、それに対応するアンチセンス鎖の配列は５’−ＴＧ−３’となっており、シトシンは含まれない。
【００９１】
上記配列中に示したシトシンのみがメチル化されている場合、これを亜硫酸水素イオン処理すると以下の塩基配列（配列番号２）となり、センス鎖とアンチセンス鎖は、もはや相補的に結合することができなくなっている。
【化２】
2005168486.tif 000003
【００９２】
例えば、ここでセンス鎖をＰＣＲ増幅の対象とする場合には、センス鎖に先ず最初に相補的にハイブリダイズするオリゴＤＮＡプライマー１と、前記オリゴＤＮＡプライマーによって最初に合成された１本鎖に相補的に結合するオリゴＤＮＡプライマー２を設計する必要がある。一般的に行われているＰＣＲ法では、第１サイクルから２つのオリゴＤＮＡプライマーともにハイブリダイズする鋳型ＤＮＡ鎖が存在しているが、亜硫酸水素イオン処理をしたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合には、ＰＣＲ反応の第１サイクルでは一方のオリゴＤＮＡプライマーしかハイブリダイズしていない。
このような原理であるから、亜硫酸水素イオン処理をしたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合には、先ず最初に、亜硫酸水素イオン処理で塩基配列が変化したどちらのＤＮＡ鎖を増幅するのかを選択し、注意深くＰＣＲ反応用のオリゴＤＮＡプライマーを設計しなくてはならない。
【００９３】
例えば、ここで、以下に示す領域のヒトＥ−カドヘリンのゲノムＤＮＡ（配列番号３）のメチル化率を測定すると仮定する。
亜硫酸水素イオン処理前の塩基配列（配列番号３）：
【化３】
2005168486.tif 000004
【００９４】
亜硫酸水素イオン処理した前記ヒトゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ増幅する実験条件の一例を以下に示す：
鋳型DNA：亜硫酸水素イオン処理したヒトゲノムDNA  1μg
フォワードプライマー：5’tttAGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT-3’（配列番号６）50pmole
［５’側の「ｔ」はＳ−オリゴ化していることを示す］
リバースプライマー：5’-AAACTCACAAATACTTTACAATTCC-3’（配列番号７）50pmole
［５’末端はリン酸化している］
Taq DNAポリメラーゼ：TaKaRa Taq Hot Start Version（タカラバイオ社製），2.5ユニット
ヌクレオチド：dATP，dGTP，dTTPをそれぞれ2.5μmole
シトシン：dCTPとTexas Red標識 dCTPの添加量合計が2.5μmoleになるように添加
PCR反応系総量を50μＬとする。
PCR反応条件：
（95℃，2分）  ｘ  1サイクル
（95℃，30秒／59℃，30秒／72℃，30秒）ｘ  30サイクル
（72℃，8分）  ｘ  １サイクル
【００９５】
亜硫酸水素イオン処理後の塩基配列（処理前のＤＮＡが全くメチル化されていない場合：配列番号４）：
【化４】
2005168486.tif 000005
ＰＣＲ反応に使用する２種類のオリゴＤＮＡプライマーは、上記配列（配列番号４）中の四角で囲んだ部分の塩基配列を標的とし、前記ＰＣＲ反応によって増幅されるＤＮＡ産物の塩基配列は下記配列（配列番号５）のようになる。なお、四角で囲んだ塩基は、ＰＣＲ反応で使用したオリゴＤＮＡプライマーの塩基配列を反映した領域である。
ＰＣＲ増幅後の塩基配列（配列番号５）：
【化５】
2005168486.tif 000006
【００９６】
（６）メチル化標準ＤＮＡの作製方法
ゲノムＤＮＡのメチル化の定量には、任意のある特定のメチル化率をもったＤＮＡ（メチル化標準ＤＮＡ）を作製し、これをメチル化率の基準ＤＮＡとして用いて検量線を描き、それをもとに試料ＤＮＡのメチル化率を算定することができる。ＰＣＲ反応では５−メチルｄＣＴＰを反応液中に添加することにより、任意のメチル化率をもったＤＮＡ産物を得ることができる。以下にＰＣＲ法によるメチル化標準ＤＮＡの作製方法について述べる。
【００９７】
ＰＣＲ法において、任意のある特定の量の５−メチルｄＣＴＰをＰＣＲ反応液中に混入しておけば、ＰＣＲ産物であるＤＮＡのシトシン塩基の部分が５−メチルシトシンになったＤＮＡが得られる。ＰＣＲ反応では、この５−メチルシトシンの取り込まれるＤＮＡ鎖上の位置を指定することはできず、シトシンか５−メチルシトシンがランダムに入ることになる。すなわち、前記ＰＣＲ反応においては鋳型ＤＮＡ上の−ＣＧ−連続配列にこだわらず、任意の位置のシトシンが５−メチルシトシンになる。勿論、ＰＣＲ反応中にｄＣＴＰを入れずに５メチルｄＣＴＰのみにしてしまえば、前記ＰＣＲにより得られるＤＮＡ産物中のシトシンは全て５−メチルシトシンになったＤＮＡが得られることになる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応では、ｄＣＴＰと５−メチルｄＣＴＰの取り込み効率は殆ど変わらない。従って、ｄＣＴＰと５−メチルｄＣＴＰを１対１の割合でＰＣＲ反応を行うと、前記ＰＣＲによって得られたＤＮＡ産物中のシトシンと５−メチルシトシンの取り込みの割合は、最適な条件でＰＣＲ反応を行えば１対１から２対１程度にすることが可能である。他の蛍光標識ヌクレオチドと比較して、５−メチルｄＣＴＰはその分子構造がｄＣＴＰと近似しているため、取り込み効率が良く、ＰＣＲ産物中の全てのシトシンを５−メチルシトシンに置換することが可能である。ＰＣＲ反応中のシトシンの全てを５−メチルシトシンに置換するＰＣＲ反応では、ＰＣＲ反応におけるアニーリング温度や時間などの設定を若干変更する必要がある。実際にはアニーリング温度を２℃〜５℃低く設定して増幅する必要がある。しかし、本発明において分析対象とするＤＮＡ中のシトシンのメチル化率は通常０％〜５０％で、特に動物から得られたＤＮＡの場合にはＤＮＡのメチル化率が通常０％〜１０％であることから、この時使用するメチル化標準ＤＮＡは多く見積もっても５０％のシトシンが５−メチルシトシンに置き換わったＤＮＡが必要となる程度である。ＰＣＲ反応液中にｄＣＴＰと５−メチルｄＣＴＰを１対１〜１対２の割合で添加してＰＣＲ産物であるＤＮＡ中のシトシンのメチル化率を５０％とする場合、ＰＣＲ反応の温度及び時間の設定条件は５−メチルｄＣＴＰを混和しない場合のＰＣＲ反応とほぼ同じ条件でＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡを得ることができる。但し、この場合、ＤＮＡ収量は３０％〜７０％程度となる。
【００９８】
例えば、ここで、ヒトＥ−カドヘリンのゲノムＤＮＡ配列の転写開始点近傍のメチル化分析を行うためのメチル化ＤＮＡ標準品の作製方法の一例を述べる。
鋳型DNA：ヒトゲノムDNA  1μg
フォワードプライマー：5’-ATAACCCACCTAGACCCTAGCAAC-3’（配列番号８）50pmole
リバースプライマー：5’-GAGTCTGAACTGACTTCCGCA-3’（配列番号９）50pmole
Taq DNAポリメラーゼ：TaKaRa Taq Hot Start Version（タカラバイオ社製），2.5ユニット
ヌクレオチド：dATP，dGTP，dTTPをそれぞれ2.5μmole
シトシン：dCTPと5-methyl dCTPの添加量合計が2.5μmoleになるように添加
PCR反応系総量を50μＬとする。
PCR反応条件：
（95℃，2分）  ｘ  1サイクル
（95℃，30秒／59℃，30秒／72℃，30秒）ｘ  30サイクル
（72℃，8分）  ｘ  １サイクル
【００９９】
以上の条件により増幅されたＤＮＡは、以下の塩基配列（配列番号１０）：
【化６】
2005168486.tif 000007
を有する。前記配列は、ＰＣＲ産物である２本鎖ＤＮＡのうちのセンス鎖のみを記している。このセンス鎖のうち、四角で囲まれたオリゴＤＮＡプライマー部分を除く領域の塩基配列中のシトシンの位置に、任意に設定した割合の５−メチルｄＣＴＰがランダムの位置に取り込まれる。アンチセンス鎖も同様に、プライマー部分を除く領域に５−メチルｄＣＴＰがセンス鎖と同様の割合で取り込まれることとなる。
例えば、ＰＣＲ反応液中にｄＣＴＰと５−メチルｄＣＴＰとを９対１の割合で添加した場合には、上記塩基配列中の全シトシンのうちのおよそ１０％が５−メチルシトシンに転換される。このときの５−メチルシトシンの取り込まれる位置はランダムである。
【０１００】
以上のようにして作製したメチル化標準ＤＮＡを作製し、メチル化率の分析対象とするゲノムＤＮＡと同様に亜硫酸水素イオン処理を行う。分析対象とするＤＮＡのシトシンのメチル化を定量するためには、様々な割合のメチル化率を有するメチル化標準ＤＮＡを作製しておく。次に、前記メチル化標準ＤＮＡと、メチル化率分析対象のＤＮＡの両方に対して同一の条件で亜硫酸水素イオン処理を行い、以下、ＤＮＡ増幅、一本鎖ＤＮＡの調製、及び標識分析の各操作を実施する。
【０１０１】
（７）二本鎖非分離型測定方法
本発明の測定方法では、増幅工程で得られた二本鎖ＤＮＡをセンス鎖及びアンチセンス鎖に分離することなく、二本鎖ＤＮＡの状態のままでも、標識化シトシン又は標識化グアニンの量を測定することができる。
【０１０２】
以下、ＰＣＲプライマーで挟まれる部分の塩基配列が以下の場合（プライマー部分は省略して表記）を想定して説明する。四角で囲んだ部分のシトシンがメチル化され得るシトシンを示す。下記ＤＮＡは亜硫酸水素イオン処理する前の標的ＤＮＡ配列である。
【化７】
2005168486.tif 000008
標的配列がメチル化されていない場合、亜硫酸水素イオン処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅したＤＮＡ産物の内のセンス鎖にはシトシンは含まれないが、アンチセンス鎖にはセンス鎖のグアニン数と等しい数のシトシンが存在し、ＰＣＲで得られたＤＮＡ産物中のアンチセンス鎖のシトシン数は、亜硫酸水素イオン処理前の標的ＤＮＡのシトシンのメチル化率に係わらず、常に一定である。ＰＣＲで得られたＤＮＡ産物中のアンチセンス鎖のシトシンは標的配列のメチル化に係わらず常に５個で一定である（下記参照）。これに対してセンス鎖中に存在するシトシンは標的ＤＮＡのメチル化率に応じて変化する。
【０１０３】
（７−ｉ）０カ所のシトシンがメチル化されている場合
亜硫酸水素イオン処理及びＰＣＲ処理後の二本鎖ＤＮＡ産物の塩基配列は下記のとおりである：
【化８】
2005168486.tif 000009
センス鎖で四角で囲んだＴは、標的ＤＮＡ配列のセンス鎖においてメチル化されていないシトシンが、Ｔに変換された箇所を示す。センス鎖のシトシンは０個であり、アンチセンス鎖のシトシンは５個である。従って、亜硫酸水素イオン処理及びＰＣＲ処理の後では、標的二本鎖ＤＮＡ中のシトシンの数は合計５個である。
【０１０４】
（７−ii）３カ所のシトシンがメチル化されている場合
亜硫酸水素イオン処理及びＰＣＲ処理後の二本鎖ＤＮＡ産物の塩基配列は下記のとおりである：
【化９】
2005168486.tif 000010
センス鎖で四角で囲んだＣは、標的ＤＮＡ配列のセンス鎖においてメチル化されていたシトシンの箇所を示す。センス鎖のシトシンは３個であり、アンチセンス鎖のシトシンは５個である。従って、亜硫酸水素イオン処理及びＰＣＲ処理の後では、標的二本鎖ＤＮＡ中のシトシンの数は合計８個である。
【０１０５】
以上の関係から、ＰＣＲで増幅しようとする試料ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列のセンス鎖に含まれるメチル化シトシンの数をｍｃとすると、次式で表される：
ａ＝（Ｓｇ−Ｐｇ）＋（ｃ＋ｍｃ−Ｐｃ）
Ｐｃ：フォワードプライマーに含まれるシトシンの数。
Ｐｇ：リバースプライマーに含まれるシトシンの数。
ｃ  ：ＰＣＲで増幅しようとする試料ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列のセンス鎖に含まれる非メチル化シトシンの数。
ｍｃ：ＰＣＲで増幅しようとする試料ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列のセンス鎖に含まれるメチル化シトシンの数。
Ｓｇ：ＰＣＲで増幅しようとする試料ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列のセンス鎖に含まれるグアニンの数。
ａ  ：ＰＣＲで得られた２本鎖ＤＮＡ産物中において、蛍光標識ｄＣＴＰを取り込むことのできるシトシンの数（センス鎖とアンチセンス鎖の両鎖の合計数）。
【０１０６】
前記式において、ｍｃ＝０の時のａをａ０として表すと、
ａ＝ｍｃ＋ａ０
となり、標的ＤＮＡのセンス鎖上のメチル化されたシトシンの数だけ変数ａが増加する（なお、ＰＣＲプライマー中にＧが含まれている場合には相補鎖ＤＮＡ領域にＣが取り込まれる）。従って、二本鎖ＤＮＡの状態のまま、センス鎖及びアンチセンス鎖の両鎖に含まれる標識シトシンの合計数を測定しても、標的ＤＮＡのセンス鎖上のメチル化シトシンの数を算出することできる。
より具体的には、標識された２本鎖ＤＮＡ又は１本鎖ＤＮＡをヌクレアーゼＰ１によりヌクレオチドレベルにまで分解し、その酵素消化物に含まれる蛍光標識ヌクレオチド分子の数を、前記酵素で分解する前の蛍光個数カウントと１分子蛍光の個数カウントとを、例えば、オリンパス社製ＭＦ２０を使用して分析することができる。
【０１０７】
（８）ＳＳＣＰ（single strand conformational polymorphism）電気泳動法を用いる測定方法
本発明の測定方法は、１種類又は２種類の蛍光標識ヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅を行うことができるため、増幅して得られた二本鎖ＤＮＡをＳＳＣＰ電気泳動により分離し、ＤＮＡ産物の分析は電気泳動後にゲルがガラス板内に入ったままの状態で蛍光スキャナーで読み取ることが可能である。ＳＳＣＰ電気泳動法を用いた場合、ＤＮＡ増幅からメチル化分析までの時間を大幅に短縮することができる。
【０１０８】
また、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰをそれぞれ種類が異なる蛍光物質で標識したヌクレオチドを用い、亜硫酸水素イオン処理したＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行って得られたＤＮＡ産物は、センス鎖とアンチセンス鎖にそれぞれ偏って前記ヌクレオチドが取り込まれる。
具体的には、高等動物では多くの場合、−ＣＧ−の連続配列のうちのシトシンがメチル化されることから、それ以外のシトシンは亜硫酸水素イオン処理によってウラシルに変換され、それに続くＰＣＲ増幅では亜硫酸水素イオン処理した前記ＤＮＡが鋳型となり、ＰＣＲ産物ではチミンに変換される。従って、ＰＣＲ産物のセンス鎖にシトシンが残存する場合、前記シトシンはメチル化されていたことを意味している。例えば、ここでＰＣＲ産物中のセンス鎖にシトシンが３個残存する場合には、アンチセンス鎖にはシトシンに相補的なグアニンが３個存在することとなる。
【０１０９】
一方、センス鎖のグアニン及びアンチセンス鎖のシトシンは、鋳型ＤＮＡのメチル化の度合いに係わらず一定である。従って、「センス鎖におけるグアニンのモル数に対するシトシンのモル数の比率」と、「アンチセンス鎖におけるシトシンのモル数に対するグアニンのモル数の比率」は等しく、分析対象とするＤＮＡ試料のメチル化率は、前記の比率を求めることにより、正確に算出することができる。本発明におけるＳＳＣＰを用いた方法では、メチル化率をゲル中の１本鎖ＤＮＡの移動度をもって予想するのではなく、２本鎖ＤＮＡをゲル中で分離し（strand separation）、そのそれぞれのバンドごとの２種類の蛍光の比率を求めることにより、正確に定量することが可能となった。
【０１１０】
また前記のように２種類の蛍光標識ヌクレオチドを用いなくても、１種類の蛍光標識ヌクレオチド、例えば、蛍光標識ｄＣＴＰ又は蛍光標識ｄＧＴＰを用いてＤＮＡ増幅法（特にはＰＣＲ増幅法）を行い、異なる試料を鋳型として得られた増幅産物であるＤＮＡを電気泳動ゲルに供し、異なる試料の各１本鎖ＤＮＡのバンド間の蛍光を比較することによりメチル化率の定量を行うことも可能である。例えば、標識ｄＣＴＰを用いる場合には、アンチセンス鎖のシトシンの数は一定であるため、アンチセンス鎖のシトシン量を基準とし、センス鎖のシトシン量を測定することにより、メチル化率の定量が可能である。あるいは、標識ｄＧＴＰを用いる場合には、センス鎖のグアニンの数は一定であるため、センス鎖のグアニン量を基準とし、アンチセンス鎖のグアニン量を測定することにより、メチル化率の定量が可能である。
【０１１１】
（９）質量分析器を用いる測定方法
分析工程に関して先述したとおり、本発明の測定方法における分析工程では、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを標識化しなくても、前記パートナー結合後の分子量を、例えば、質量分析器により測定することにより、前記パートナーの標識物質への結合量を算出し、標識化シトシンの量を決定することができる。しかし、質量分析器は現時点では低分子量ＤＮＡ（例えば、１００ｂｐ〜３００ｂｐ程度）の分子量しか読むことができないといった測定限界がある。従って、ＰＣＲ産物が高分子量である場合には、高分子量のＰＣＲ産物を制限酵素で分解して質量分析器に供すれば、分子量の測定が可能である。この場合、分析対象試料間で制限酵素によるＤＮＡの消化断片のサイズが異なるより、できるだけ近似した分子量であるほうが容易に解析することができる。
【０１１２】
亜硫酸水素イオン処理後にＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ法など）で得られたＤＮＡ産物を断片化する制限酵素としては、出発材料であるＤＮＡのメチル化によって、制限酵素による前記ＤＮＡの消化（断片化）が左右されない制限酵素を使用することが好ましく、例えば、シトシンを認識部位に含まない制限酵素がより好ましい。このような制限酵素としては、例えば、ＰｓｈＢＩ（ＡＴＴＡＡＴ）、ＳｓｐＩ（ＡＡＴＡＴＴ）、若しくはＳｗａＩ（ＡＴＴＴＡＡＡＴ）（以上、タカラ社）、ＡｓｎＩ（ＡＴＴＡＡＴ）、ＤｒａＩ（ＴＴＴＡＡＡ）、若しくはＴｒｕ９Ｉ（ＴＴＡＡ）（以上、Stratagene社）、又はＴｓｐ５０９Ｉ（ＡＡＴＴ）若しくはＭｓｅＩ（ＴＴＡＡ）（以上、NEB社）を挙げることができる。
【０１１３】
なお、異なる試料ＤＮＡ間の塩基配列上で共通にメチル化を受けないシトシンや、共通にメチル化を受けるシトシンが予め判明していれば、前記制限酵素に限定されず、その領域の塩基配列を標的領域として制限酵素を選択することができる。制限酵素消化後のＤＮＡ断片のサイズが複数の分析試料間で同一か近似している方が分析が簡易である。
また、試料のメチル化の相違によって制限酵素処理で得られるＤＮＡ断片のサイズが分析対象試料間で異なっている場合は、質量分析器で得られる各質量を表すピークを、そのＤＮＡ断片の既知の塩基配列情報を基に、詳細に解析することにより、分析対象試料のメチル化率を求めることが可能である。
【０１１４】
例えば、ここで、ヒトＥ−カドヘリンのプロモーター領域の以下の配列（配列番号１４）：
【化１０】
2005168486.tif 000011
（四角で囲んだ領域はＰＣＲ用プライマーに由来する配列で、この部分はメチル化されていない）
をメチル化率分析対象ＤＮＡとする場合、この配列のうちの５’−ＣＧ−３配列に含まれるシトシン以外は亜硫酸水素イオン処理とそれに続くＤＮＡ増幅工程によりチミンに置換されるので、５’−ＣＧ−３配列に含まれるシトシン以外は分析対象試料間で共通にチミンとして現れる。
【０１１５】
分析対象ＤＮＡが全くメチル化されていない場合、亜硫酸水素イオン処理とそれに続くＤＮＡ増幅過程で得られるＤＮＡのセンス鎖の塩基配列は以下のようになる（配列番号１５）。
【化１１】
2005168486.tif 000012
例えば、制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉの認識配列である−ＡＡＴＴ−に注目すると、前記配列における−ＡＡＴＴ−配列はすべてＤＮＡのメチル化に左右されない認識部位となっている。すなわち、高等動物では−ＣＧ−の連続配列のうちのシトシンがメチル化される可能性があるが、前記条件に当てはまる−ＣＧ−配列を起源とするＡＡＴＴ配列は存在しない。このような酵素を選択してＤＮＡの制限酵素による断片化を行えば、分析対象ＤＮＡのメチル化率の如何によらず、前記制限酵素によって得られる各ＤＮＡ断片の分子量は異なる試料ＤＮＡ間においても近似している。従って、前記ＤＮＡ断片をそれぞれ詳しく質量分析することができ、各断片のメチル化率を正確に求めることが可能となる。もちろん、複数種類の制限酵素を組み合わせて行うことも可能である。
【０１１６】
従って、ＰＣＲ産物が高分子量である場合に用いる制限酵素としては、制限酵素の認識配列にシトシンを含まない制限酵素であるか、あるいは、亜硫酸水素イオン処理に続くＤＮＡ増幅反応（ＰＣＲ法など）を行って得られたＤＮＡ産物の塩基配列中に、試料ＤＮＡ（亜硫酸水素イオン処理を施す前）の塩基配列の−ＣＧ−の連続配列中のシトシンに由来するチミン（Ｔ）が含まれない塩基配列を認識する制限酵素が好ましい。
【０１１７】
［２］本発明の細胞又は組織
ＤＮＡのメチル化は転写を抑制状態に維持するありふれた方法であり、哺乳類の遺伝子制御に重要な役割を担う後成的な機構である（ヒトの分子遺伝学  第２版，ｐ１８５，発行元：メディカル・サイエンス・インターナショナル）。ヒト遺伝子のうちのおよそ半数はＣｐＧアイランドを有しており［Ioshikhes IP and Zhang MQ, Nature Genetics, vol.26(1), pp61-63, 2000］、前記ＣｐＧアイランドは細胞内においてシトシンをメチル化から防護する塩基配列として知られている。
【０１１８】
すなわち、−ＣＧ−配列が密集したＣｐＧアイランド中のシトシンは他の部位のシトシンに比較してメチル化を受け難い。従って、プロモーター領域にＣｐＧアイランドを持つ遺伝子は通常シトシンのメチル化修飾が起こりにくいことから、前記遺伝子にはハウスキーピン遺伝子や広範囲に発現する遺伝子などが多い。しかし、最近の研究から、ある種の癌細胞や老化した細胞ではＣｐＧアイランド中のシトシンの異常なメチル化が起きていることが報告されている［Cancer Research, vol. 63, pp1114-1121, 2003; Melki J.R. et al., Blood, vol. 15, No. 10, pp3208-3213, 2000; Leopoldo Alves Ribeiro-Filho et al., Molecular Carcinogenesis, vol. 34, pp187-198, 2002; Maria F. Paz et al., Cancer Research (USA), vol.63, pp1114-1121, 2003; Toyota M. et al., Cancer Research, vol. 59, No. 1, pp5438-5442, 1999］。遺伝子の転写開始点付近のコアプロモーター領域にＣｐＧアイランドを有する遺伝子は、前記領域のシトシンの異常なメチル化によって下流の遺伝子発現は抑制傾向に陥る。認識配列中のシトシンのメチル化によって前記転写因子の標的ＤＮＡへの結合が阻害されるものの例として、例えば、Ｅ２Ｆ、ＣＲＥＢ、ＡＰ２、ｃＭｙｃ、Ｍｙｎ、ＮＦ−κＢ、ｃＭｙｂ、ＥＴＳ、又はＳｐ１等が挙げられるが、これ以外の転写因子であっても標的結合塩基配列にシトシンを含む転写因子であれば、認識配列中のシトシンのメチル化によって前記転写因子との結合親和性に何らかの変化が生じることは容易に推察される。すなわち、遺伝子のプロモーター領域のシトシンの異常なメチル化は生体恒常性（ホメオスタシス）のバランスに影響を与えてしまう。細胞が癌化するとＣｐＧアイランドの異常なメチル化亢進が高頻度に観察されるが［Maria F. Paz et al., Cancer Research (USA), vol.63, pp1114-1121, 2003］、ＣｐＧアイランドを持つ遺伝子はヒトの場合は１万種類以上にも及ぶことから、癌細胞における遺伝子欠損と同様に、メチル化異常によっても細胞の恒常性が破壊されると考えられている［Jones PA and Laird PW, Nature Genetics, vol.21(2), pp163-167, 1999］。たとえコアプロモーターにＣｐＧアイランドが存在しない場合でも、エンハンサーやサイレンサー等の遺伝子発現調節領域のシトシンのメチル化に異常が起きれば、前記領域は転写因子が結合する領域であることから、プロモーター領域にＣｐＧアイランドを有する遺伝子と同様に生体恒常性の破壊が起きると容易に推察される。また、シトシンのメチル化亢進はクロマチンの構造変化、すなわち、クロマチンの構成成分であるヒストンの脱アセチル化を誘導し、前記クロマチンに結合している遺伝子の転写を抑制することも明らかになっている。すなわち、遺伝子に含まれるシトシンの高度メチル化は転写因子の結合を妨げる機構とクロマチンの凝集という前記２つの転写制御機構によって、シトシンが高度にメチル化された遺伝子の発現が抑制される。
【０１１９】
本発明のＤＮＡのメチル化分析法を用いて、細胞の恒常性の維持にかかわる遺伝子の発現調節にかかわる特定領域のメチル化率を、正常細胞の遺伝子のメチル化率と比較することにより、検査対象とする細胞が正常細胞であるか、あるいは、癌化のプロセスに入り込むなど異常な細胞であるかなど、前記細胞を生体に移植して治療を行う場合などにおける、前記細胞の安全性を推測することが可能である。このように、ヒトなどの生体内に有用な細胞を移植する際には、前記細胞を生体に移植する前に前記細胞のゲノムＤＮＡのメチル化率を正常細胞のそれと比較することが極めて重要である。ヒトの場合、遺伝子の総数はおよそ３万２千種類あると言われているが、その全ての遺伝子のメチル化を分析する必要はなく、数千個以下、好ましくは１０００個以下、より好ましくは５００個以下、更に好ましくは１００個以下、更に好ましくは１０個以下、更に好ましくは数個以下の遺伝子のシトシンのメチル化を分析すれば充分である。これは、細胞は癌化や老化によって数少ない特定の遺伝子のみのシトシンのメチル化異常が観察されるのではなく、前記のメチル化異常は遺伝子の広範囲に観察されるという根拠に基づいている［Jones PA and Laird PW, Nature Genetics, vol.21(2), pp163-167, 1999; Maria F. Paz et al., Cancer Research (USA), vol.63, pp1114-1121, 2003］。従って、ゲノムＤＮＡの検査対象とする細胞の安全性を評価するには全遺伝子についてシトシンのメチル化分析をする必要はなく、特定の一部の遺伝子のメチル化分析をすることによって全体の遺伝子のメチル化を推測することができ、前記細胞が正常細胞であるか否かを統計的に推測することが可能である。
【０１２０】
例えば、癌抑制遺伝子を例にあげると、前記遺伝子のうち、プロモーター領域にＣｐＧアイランドを持つ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化率を正常細胞と比較することにより、前記細胞が正常であるか否かを判定することができる。
【０１２１】
例えば、胎児性幹細胞（ＥＳ細胞）や組織幹細胞を細胞培養し、試験管内で人為的に神経細胞に分化させて、更に前記神経細胞を生体内に移植する場合の前記細胞の安全性評価基準について説明する。幹細胞を人為的に目的の神経細胞にまで分化させて、更に前記細胞を生体内に移植する場合には、数千個以下、好ましくは１０００個以下、より好ましくは５００個以下、更に好ましくは１００個以下、更に好ましくは１０個以下、更に好ましくは１個の遺伝子のシトシンのメチル化を分析し、前記遺伝子群のＤＮＡメチル化率を正常な神経細胞の遺伝子群のＤＮＡメチル化と人為的に分化させた前記神経細胞との間で比較することにより、本発明の細胞を取得することができる。
【０１２２】
正常細胞では、通常ではシトシンのメチル化率が低い領域や、また逆に、通常ではシトシンが高度にメチル化されている領域があり、これは細胞の種類によっても異なる。前者の代表としてはＣｐＧアイランドなどが挙げられるが、一般的には前記領域のメチル化率は低いとされている。また、後者の代表としてはゲノムＤＮＡ内に組み込まれた微生物に由来するパラサイト遺伝子や、レトロトランスポゾン等が挙げられ、前記遺伝子の発現は宿主に害を及ぼすため、通常、ゲノム中では高度にメチル化され、不活性化されている。検査対象とする細胞が正常であるか否かを判断するには、前記細胞のゲノムＤＮＡのメチル化が正常細胞と近似しているかどうかを分析すれば良く、前記ＤＮＡのメチル化率が正常範囲内であれば前記検査対象細胞は正常であると判断し、前記細胞が安全であるということから前記細胞を安全に生体に移植することができる。以下の検査対象細胞の安全性をゲノムＤＮＡのメチル化から判断する為の判定基準とその設定の根拠を述べる。
【０１２３】
検査対象とする細胞の分析対象遺伝子のメチル化分析対象領域に存在するシトシン、特にＣｐＧアイランド中のシトシンのメチル化率が５０％以上であり、なお且つ検査対象とする遺伝子のうちの半数以上が前記のメチル化率を超過している場合には、分析対象とした前記細胞は癌細胞の特徴と類似しており、前記細胞の恒常性が保たれていないと判断することができ、生体への移植に適していない危険な細胞であると判断することができる［Maria F. Paz et al., Cancer Research (USA), vol.63, pp1114-1121, 2003］。従って、前記のメチル化率検査で恒常性が保たれておらず、危険であると判断された細胞以外は、生体への移植可能な細胞の候補として利用することができる。
【０１２４】
一方、ゲノムＤＮＡの中でシトシンのメチル化などにより通常不活性化されている遺伝子として、ゲノムＤＮＡ内に組み込まれた微生物に由来するパラサイト遺伝子や、レトロトランスポゾン等がある。また、神経系の細胞における細胞増殖関連遺伝子などのプロモーター領域も高度にメチル化されており、細胞増殖が抑制されている。このように正常細胞でその遺伝子が高度にメチル化されて不活性化されている遺伝子群は、正常細胞では働かないように制御されているのであるから、その高度メチル化を維持している細胞は恒常性が保たれていると考え、前記細胞は生体へ移植する細胞として安全な細胞であると判断することができる。具体的には、正常細胞において通常、或る特定のメチル化分析対象のＤＮＡ領域のメチル化率が正常細胞のメチル化率の５０％以下である細胞は、恒常性が保たれていないと判断することができ、前記細胞は生体への移植には適していない危険な細胞であると判断することができる。
【０１２５】
クローン動物作成においては、エピジェネティックな異常から起こる胎児の成長異常においても、ＤＮＡのメチル化異常が報告されている。従って、クローン動物を作成する場合には、母体や胎児の血液を採取し、特定の遺伝子のメチル化を正常の場合と比較することにより、個体の出生前に胎児が正常であるか否かを判断することも可能である。
【０１２６】
分析対象細胞又は組織の分析対象遺伝子のメチル化分析対象領域は、前記遺伝子の任意の領域の５０〜２０００ｂｐ、より好ましくは４０〜１００ｂｐをメチル化分析対象領域として設定することが前記細胞の安全性を判断するのに好ましい。また、特に分析対象領域は、遺伝子の転写開始点の上流５ｋｂｐ（−５ｋｂｐ）から転写開始点の下流１００ｂｐ（＋１００ｂｐ）を挟む領域を分析対象とすることが好ましい。
前記遺伝子の前記領域を本発明のメチル化分析法で分析することにより、前記遺伝子が細胞内で正常に機能するのか、あるいは正常に不活性化されているかを判断することできる。
【０１２７】
より具体的には、正常細胞で転写される遺伝子の場合は以下を危険域とする。すなわち、検査対象細胞の種類に相当する正常細胞の検査対象ＤＮＡのシトシンのメチル化率が０％〜５０％未満の場合、メチル化率の危険域は８０％以上とする。また、検査対象細胞の種類に相当する正常細胞の検査対象ＤＮＡのシトシンのメチル化率が５０％以上の場合、メチル化率の危険域は９０％以上とする。
更に、微生物に由来するパラサイト遺伝子や、レトロトランスポゾンのように、正常細胞では通常転写されないか、あるいは、転写されると細胞や生体に毒性や危害を及ぼす遺伝子であって、通常高度にメチル化されている領域をメチル化分析の対象とする場合には、前記検査対象領域のシトシンのメチル化率が２０％以下である場合を危険域とする。
【０１２８】
本発明の細胞は、その安全性を検査対象の細胞が有する全遺伝子数にまで拡張して分析することができるが、好ましくは２〜１０００種類の遺伝子についてメチル化を分析して前記細胞の安全性を評価することができる。特にこの場合、メチル化分析対象とする複数種類の遺伝子の内、前記の危険性判定基準において５０％以上の遺伝子について危険と判断された場合には前記検査対象細胞は危険であると判断し、それ以外の細胞は安全性が高いと判断し、生体へ移植可能な細胞の候補とすることができる。
【０１２９】
［３］本発明の評価方法
本発明の評価方法によれば、細胞の状態を判定することができる。本発明の評価方法で判定可能な細胞の状態としては、例えば、腫瘍細胞の悪性度、細胞の分化状態、生体移植用細胞の安全性、又は細胞の加齢などを挙げることができ、正常細胞と異常細胞とを判別することができる。
【０１３０】
本発明の評価方法は、抗体として抗メチル化シトシン抗体を使用することと、細胞の染色体標本と抗メチル化シトシン抗体との接触を、抗原抗体反応における１価結合を解離させ、且つ２価結合を維持することのできる条件下（以下、２価結合条件下と称する）において実施すること以外は、通常の免疫染色法に従って実施することができる。
【０１３１】
抗原抗体反応においては、抗体の２価結合は、１価結合に比べて約１０３（Ｍ−１）倍も強い親和性を示すことが公知である［例えば、Ivan Roitt, Jonathan Brostoff, and David Male著、多田富雄監訳、免疫学イラストレイテッド（原書第５版）、２０００年２月１０日発行、南江堂、第１１０頁（原著名：IMMUNOLOGY, FIFTH EDITION）］。ここで、２価結合とは、一分子の抗体、あるいは、１つの担体に固定されている二分子の抗体が、２箇所の抗原結合部位で抗原に結合することを意味し、１価結合とは、一分子の抗体が１箇所の抗原結合部位で抗原に結合することを意味する。
【０１３２】
この点について、図７〜図１０に沿って更に説明する。図７〜図１０は、両端に突出末端を有する一分子の二本鎖ＤＮＡ（１）と、一分子の抗メチル化シトシン抗体（２）との結合の状態を示す模式図である。二本鎖ＤＮＡ（１）の突出末端に記載の黒丸（図７〜図１０）はメチル化シトシンを意味し、白丸（図７）はシトシンを意味する。
図７〜図１０に示すように、一分子の抗体（２）には２箇所の抗原結合部位が存在している。１価結合では、その内の一方の抗原結合部位で、抗原である二本鎖ＤＮＡ（１）と結合する（図７）。それに対して、２価結合では、一分子の抗体（２）がその２箇所の抗原結合部位を利用して一分子の抗原（１）に結合する（図８）か、あるいは、担体（３）に固定されている２分子の抗体（２）がそれぞれ１箇所の抗原結合部位を利用して一分子の抗原（１）に結合する（図９）。なお、図１０では、二分子の抗体（２）がそれぞれの抗原結合部位１箇所を利用して一分子の抗原（１）に結合しているが、この場合の親和性は１価結合と同じであることが公知である。
【０１３３】
前述のように、２価結合と１価結合とでは親和性に差があるため、抗原抗体反応系における種々の条件を変化させることにより、１価結合を解離させると共に、２価結合を維持させることが可能である。抗原抗体間の結合は、例えば、静電気力による結合、水素結合、又は疎水結合などに基づくものであり、静電気力による結合は、例えば、塩濃度又はｐＨにより、水素結合は、例えば、尿素又はグアニジン塩酸濃度により、疎水結合は、例えば、ポリエチレングリコール濃度により、影響を受けることが知られている。
【０１３４】
例えば、抗原抗体反応系における塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度に関して、２価結合は維持されるが、１価結合は排除される（なお、２価結合及び１価結合が混在し、その割合において１価結合よりも２価結合の方が優位である場合も含む）条件は、用いる抗体又は塩の種類により変化することがあるが、例えば、参考実施例１に記載の方法に従って、使用抗体毎に塩濃度範囲を容易に決定することができる。
また、塩濃度以外にも親和性に影響を与えることのできる条件、例えば、尿素、グアニジン塩酸、若しくはポリエチレングリコール濃度、又はｐＨについても、同様にして、２価結合は維持されるが、１価結合は排除される条件を、使用抗体毎に容易に決定することができる。
【０１３５】
細胞の染色体標本と抗メチル化シトシン抗体との接触を２価結合条件下において実施する場合には、例えば、最初から２価結合条件下にて、細胞の染色体標本と抗メチル化シトシン抗体とを接触させることにより実施することもできるし、あるいは、通常の抗原抗体反応条件下にて、細胞の染色体標本と抗メチル化シトシン抗体との接触を実施した後、２価結合条件下で前記染色体標本を洗浄することにより実施することもできる。
【０１３６】
本発明の評価方法に用いる細胞の染色体標本は、抗メチル化シトシン抗体が、染色体を構成するＤＮＡに含まれるメチル化シトシンに特異的に反応可能である限り、特に限定されるものではないが、例えば、通常の染色体標本の作製方法に従って、調製することができ、例えば、実施例３に記載の手順に従って、細胞の染色体標本を作製することができる。
【０１３７】
本発明の評価方法においては、通常の免疫染色法で使用する細胞標本をそのまま使用することもできるが、その細胞標本をプロテアーゼ処理してから、次の抗体反応を実施することが好ましく、前記プロテアーゼ処理の後に更に酸処理及び／又はアルカリ処理を実施してから、次の抗体反応を実施することがより好ましい。
【０１３８】
プロテアーゼ処理に使用する前記プロテアーゼとしては、例えば、トリプシン又はペプシンを挙げることができる。プロテアーゼ（例えば、トリプシン）濃度は、例えば、処理温度又は処理時間などに応じて適宜決定することができるが、例えば、０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．１％で実施することができる。また、処理温度は、例えば、０℃（例えば、氷上）〜室温、好ましくは０〜１０℃で実施することができる。処理時間は、例えば、５秒〜３０分間、好ましくは１５秒〜１０分間、より好ましくは３０秒〜５分間であることができる。本発明は以下の推論に限定されるものではないが、プロテアーゼ処理を実施することにより、染色体上のタンパク質が除去され、次の抗体反応における抗メチル化シトシン抗体とＤＮＡとの反応が促進されるものと考えられる。
【０１３９】
前記酸処理は、例えば、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、又は硝酸）又は有機酸を用いて実施することができる。その濃度は、例えば、処理温度（通常、室温）又は処理時間などに応じて適宜決定することができるが、例えば、０．１〜５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５〜３ｍｏｌ／Ｌで実施することができる。処理時間は、例えば、１分〜１時間、好ましくは５〜１５分であることができる。本発明は以下の推論に限定されるものではないが、酸処理を行うことにより、ＤＮＡの脱プリン（脱アデニン又は脱グアニン）が起こり、次の抗体反応における抗メチル化シトシン抗体とＤＮＡとの反応が促進されるものと考えられる。
【０１４０】
前記アルカリ処理は、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）の水酸化物の水溶液を用いて実施することができる。アルカリ金属の水酸化物を用いる場合には、その濃度は、例えば、処理温度（通常、室温）又は処理時間などに応じて適宜決定することができるが、例えば、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌで実施することができる。処理時間は、例えば、１分〜１時間、好ましくは５〜１５分であることができる。
前記酸処理及びアルカリ処理は、いずれか一方のみを実施することもできるし、あるいは、任意の順序で順次実施することもできる。
【０１４１】
本発明の評価方法は、以下に示す手順に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により実施することができる。
細胞の染色体標本を、適当なブロッキング剤（例えば、１％ウシ血清アルブミン）によりブロッキング処理（例えば、室温にて３０分間）する。染色体標本を洗浄してブロッキング剤を除去した後、１次抗体として抗メチル化シトシン抗体を通常の抗原抗体反応条件下（例えば、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ存在下）にて反応させる（例えば、室温にて１時間）。染色体標本を洗浄して未反応の１次抗体を除去した後、更に、２価結合条件下（例えば、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ存在下）で染色体標本を洗浄し、１価結合で染色体標本に結合していた１次抗体を除去する。続いて、標識（例えば、蛍光標識）した２次抗体を反応させた（例えば、室温にて３０分間）後、洗浄により、未反応の標識化２次抗体を除去する。染色体標本を、前記標識に応じた検出手段（例えば、蛍光顕微鏡）にかけ、染色像を観察する。
【０１４２】
２次抗体の標識物質としては、免疫染色法に通常使用可能な物質、例えば、蛍光物質、発光物質、又はアイソトープ等を用いることができる。また、標識化２次抗体を用いる代わりに、１次抗体を直接、標識することができる。あるいは、２次抗体を直接、標識する代わりに、特異的に結合可能なパートナーの一方（例えば、ビオチン−アビジンにおけるビオチン）で２次抗体を修飾し、もう一方のパートナー（例えば、アビジン）を標識することもできる。
【０１４３】
本発明の評価方法では、得られた染色像により、細胞の状態を判定する。通常の生理的条件下（例えば、ＮａＣｌ濃度＝１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）で抗原抗体反応を実施した免疫染色では、正常細胞及び癌細胞を含むほとんどの細胞において、染色体が全体にわたって染色され、正常細胞と癌細胞との差はほとんど認められない（例えば、実施例３における図１２、図１３）。
一方、２価結合条件下で抗原抗体反応を実施した免疫染色では、染色陽性箇所が、染色体上に微小な点（スポット）として表われる。癌細胞では、正常細胞と比較して、その微小なスポットが小さく（例えば、実施例３における図１４、図１５）、正常細胞ではスポットが大きい（例えば、実施例３における図１６、図１７）。また、スポットの数は、癌細胞では多く（例えば、実施例３における図１４、図１５）、正常細胞では少ない（例えば、実施例３における図１６、図１７）。従って、染色体上のスポットの大きさと数を比較することにより、被検細胞が、正常細胞であるか、癌細胞であるかを簡単に判別することができる。
なお、前記スポットの大きさは、例えば、用いた標識の種類又はその可視化のための処理条件（例えば、露光時間）などに応じて変化するため、必ずしも絶対的な数値で規定することができるものではない。従って、好ましくは、予め細胞状態が既知である細胞（正常細胞及び癌細胞の両方を使用することがより好ましい）を標準用細胞として使用し、評価対象細胞で観察されるスポットの大きさを、前記標準用細胞で観察されるスポットの大きさと比較することにより、評価対象細胞のスポットの大きさを相対的に決定することができ、その結果に基づいて細胞状態を評価することができる。なお、標準用細胞としては、評価対象細胞と同じか、あるいは、類似の細胞を使用することが好ましい。例えば、或る組織（例えば、肝臓）から採取した細胞又はその株化若しくは分化細胞の細胞状態を評価する場合には、同一組織から採取した細胞又はその株化若しくは分化細胞、又は前記組織由来の癌細胞などを所望により適宜組み合わせて標準用細胞として使用することができる。
【実施例】
【０１４４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ヒト・カドヘリンのプロモーター領域のメチル化解析》
（１）メチル化ＤＮＡ標準品の調製
本実施例では、ヒト・カドヘリンのプロモーター領域を標的とし、ＦＩＴＣ標識ｄＣＴＰとテキサスレッド標識ｄＧＴＰとを使用し、ＳＳＣＰによる２本鎖分離型メチル化解析を実施した。
前記メチル化解析に先立って、メチル化解析用の試料として、以下の手順に従って、シトシンのメチル化率が０％、１０％、及び２５％の３種類のメチル化ＤＮＡ標準品を調製した。
【０１４５】
３種類のメチル化ＤＮＡ標準品を得るためのＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（１μｇ）を使用し、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号８及び配列番号９で表される各塩基配列からなる各オリゴヌクレオチド（各５０ｐｍｏｌｅ）を使用し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとして市販のポリメラーゼ（TaKaRa Taq Hot Start Version；タカラバイオ社製）２．５ユニットを使用し、ヌクレオチドとして、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（各２．５μｍｏｌｅ）、並びにｄＣＴＰ及び５−メチルｄＣＴＰ（合計量として２．５μｍｏｌｅ）を使用し、ＰＣＲ反応系総量を５０μＬとして実施した。ＰＣＲ反応条件は、９５℃にて２分間の反応の後、９５℃にて３０秒／５９℃にて３０秒／７２℃にて３０秒からなるサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃にて８分間の反応を行った。ｄＣＴＰ及び５−メチルｄＣＴＰ（合計量として２．５μｍｏｌｅ）の量比（ｄＣＴＰ：５−メチルｄＣＴＰ）は、メチル化率が２５％の場合に３：１とし、メチル化率が１０％の場合に９：１とし、メチル化率が０％の場合にｄＣＴＰのみとした。
前記ＰＣＲ反応により、配列番号１０で表される塩基配列からなる３種類のメチル化ＤＮＡ標準品が得られた。
【０１４６】
（２）メチル化ＤＮＡ標準品のメチル化解析
前記実施例１（１）で得られた３種類のメチル化ＤＮＡ標準品について、以下の手順に従って、亜硫酸水素イオン処理を実施した。
各メチル化ＤＮＡ標準品２μｇを滅菌蒸留水５０μＬに溶解し、３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液５．５μＬを添加し、４２℃で２０分間保温した。更に、前記ＤＮＡ溶液に亜硫酸水素ナトリウム溶液５００μＬを添加し、５５℃で６時間反応させた。なお、前記亜硫酸水素ナトリウム溶液（用時調製）は、１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを５．０に調整した飽和亜硫酸水素ナトリウム溶液８ｍＬと、１０ｍＬの蒸留水に０．２２ｇのヒドロキノンを蒸留水に溶解した溶液０．５ｍＬとを混和して作製した。
【０１４７】
その後、市販の試薬（Wizard Plus Minipreps, DNA Purification System；Promega社, USA）を用いて前記反応液中の変換後ＤＮＡを製品マニュアルに従って精製した。前記精製操作によって得られたＤＮＡ液５０μＬに３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液５．５μＬを添加し、３７℃で保温した。３０分間反応させた後、５ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム溶液６６μＬ及びエタチンメート（ニッポンジーン社製）０．５μＬを加えて混和した後、更に９５％エタノール３００μＬを添加し、−３０℃で２０分間冷却した。前記溶液を４℃にて１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離した後、上精を捨て、ＤＮＡが含まれる沈殿を−３０℃に予め冷却した８０％エタノールで軽くリンスし、沈殿を減圧乾燥させた。得られたＤＮＡは１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス/１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）３０μＬに溶解した。
【０１４８】
続いて、鋳型として亜硫酸水素イオン処理したメチル化標準ＤＮＡ２０ｎｇを使用し、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号６及び配列番号７で表される各塩基配列からなる各オリゴヌクレオチド（各５０ｐｍｏｌｅ）を使用し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとして市販のポリメラーゼ（TaKaRa Taq Hot Start Version；タカラバイオ社製）２．５ユニットを使用し、ヌクレオチドとして、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ（各２．５μｍｏｌｅ）、並びにｄＣＴＰ及びＦＩＴＣ標識ｄＣＴＰ（合計量として２．５μｍｏｌｅ）並びにｄＧＴＰ及びテキサスレッド標識ｄＧＴＰ（合計量として２．５μｍｏｌｅ）を使用し、ＰＣＲ反応系総量を５０μＬとして実施した。ＰＣＲ反応条件は、９５℃にて２分間の反応の後、９５℃にて３０秒／５９℃にて３０秒／７２℃にて３０秒からなるサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃にて８分間の反応を行った。ｄＣＴＰ及びＦＩＴＣ標識ｄＣＴＰ（合計量として２．５μｍｏｌｅ）の量比（ｄＣＴＰ：ＦＩＴＣ標識ｄＣＴＰ）は、１０：１とし、ｄＧＴＰ及びテキサスレッド標識ｄＧＴＰ（合計量として２．５μｍｏｌｅ）の量比（ｄＧＴＰ：テキサスレッド標識ｄＧＴＰ）は、１０：１とした。
【０１４９】
得られた３種類のＰＣＲ産物（各２０μＬ）を、等量のジメチルホルムアミドと混和し、９８℃で５分処理し、直後に氷令した後、８％アクリルアミド［アクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド＝４９：１（重量比）］及び１ｘＴＢＥ［Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ（１０９ｇ）、ホウ酸（５７ｇ）、及びＥＤＴＡ−２Ｎａ（９．３ｇ）］を含むゲルで電気泳動を行った。
【０１５０】
得られた電気泳動の結果の内、メチル化率が２５％のメチル化ＤＮＡ標準品を用いた場合の結果を、図４に示す。図４において、左のレーンは、ＦＩＴＣ由来の蛍光（緑色）に基づいてバンドを検出した結果であり、中央のレーンは、テキサスレッド由来の蛍光（赤色）に基づいてバンドを検出した結果であり、右のレーンは、ＦＩＴＣ及びテキサスレッド由来の蛍光に基づいてバンドを検出した結果である。
【０１５１】
図４において、四角で囲んだバンドＡの領域には、ＦＩＴＣ標識ｄＣＴＰとテキサスレッド標識ｄＧＴＰの両方を取り込んだセンス鎖ＤＮＡが含まれる。すなわち、前記バンドＡに含まれるＦＩＴＣの蛍光量はセンス鎖に含まれるシトシン含有率を反映している。また、バンドＡに含まれるテキサスレッドの蛍光量は、センス鎖中のグアニン含有率を反映している。前記分析操作において得られたＰＣＲ産物である前記の蛍光標識ＤＮＡのセンス鎖中のグアニン蛍光量はＤＮＡのメチル化分析対象試料が変わっても変化しないのであるから、テキサスレッドの蛍光量を内部標準として、前記センス鎖中のＦＩＴＣ蛍光量を測定することにより、容易にバンドＡ中のシトシン含有率を算出することが可能となる。
【０１５２】
一方、バンドＢのアンチセンス鎖におけるテキサスレッドの蛍光量、すなわち、グアニン含有量はセンス鎖のシトシン含有量を直接反映している。また同様にして、バンドＢにおけるＦＩＴＣの蛍光量、すなわち、シトシン含有量はセンス鎖のグアニン含有量を直接反映している。従って、バンドＢのアンチセンス鎖においては、バンドＡのセンス鎖の場合と同様にして、シトシンのＦＩＴＣの蛍光量を内部標準として、前記アンチセンス鎖のテキサスレッドの蛍光量を測定することにより、センス鎖の場合と同様にして容易にバンドＢのグアニン含有率を算出し、これによりセンス鎖のシトシン含有率を求めることも可能である。
【０１５３】
前記の方法は、バンドＡ又はバンドＢに含まれる２種類の異なる蛍光を測定することにより、センス鎖のシトシン含有率を求める方法であるが、バンドＡ及びバンドＢに含まれる１種類の蛍光を測定することによっても、前記と同様にして、センス鎖のシトシン含有率を算出することができる。以下にその詳細を述べる。
図４において、バンドＡとバンドＢの領域に存在するＦＩＴＣの量には大きな差が見られる。これは、前記測定において測定対象ＤＮＡに含まれる全シトシン数のおよそ２５％がメチル化された５−メチルシトシンに置換されたものを用いているためであり、その結果、バンドＢとバンドＡにおけるＦＩＴＣの蛍光量には大きな差が見られる。また一方、アンチセンス鎖におけるシトシン数は、増幅後塩基配列におけるグアニン数に対応するものであるから、これはシトシンのメチル化率が異なる試料を用いた場合であっても、異なる検査対象試料間であっても、塩基配列が同一であれば、前記のアンチセンス鎖のシトシン数は常に一定である。このような原理に基づいていることから、前記のメチル化分析実験において、アンチセンス鎖のＦＩＴＣの蛍光量を内部標準として前記センス鎖のＦＩＴＣの蛍光量を算出すれば、たとえ、電気泳動における各サンプル間のＰＣＲ増幅後のＤＮＡ量にばらつきがあったとしても、前記したように内部標準を基準として測定対象塩基配列中のシトシンのメチル化率を算出することができる。
また、前記した原理であるから、増幅後塩基配列のセンス鎖中のグアニンの蛍光量を内部標準とし、センス鎖のグアニンの蛍光量を測定すれば、たとえ、電気泳動における各サンプル間のＰＣＲ増幅後のＤＮＡ量にばらつきがあったとしても、前記したように内部標準を基準として測定対象塩基配列中のシトシンのメチル化率を算出することができる。
【０１５４】
図４に示す各バンドの蛍光強度を測定した結果と、メチル化率が０％及び１０％の各メチル化ＤＮＡ標準品を用いた場合の電気泳動により得られた各バンドの蛍光強度を測定した結果とを以下に示す。なお、測定はＦＭ−ＢＩＯ（タカラバイオ社製）を用いて行った。以下に示す各表中の蛍光強度は、前記測定機で得られた各バンドの蛍光強度の実測値の一例である。
【０１５５】
シトシンが全くメチル化されていない「０％メチル化標準ＤＮＡ」の場合の測定結果を、表３に示す。
《表３》
蛍光強度                蛍光強度
ＦＩＴＣ（シトシン）    テキサスレッド（グアニン）
センス鎖          １．９３ｘ１０６        ５２．７  ｘ１０６
アンチセンス鎖  ４２．２  ｘ１０６          ２．０５ｘ１０６ 
表３のデータより、ＦＩＴＣにおけるアンチセンス鎖蛍光量に対するセンス鎖蛍光量の比率は
１．９３／４２．２  ＝  ０．０４５７  −−−（１）
であり、テキサスレッドにおけるセンス鎖蛍光量に対するアンチセンス鎖蛍光量の比率は
２．０５／５２．７  ＝  ０．０３８９  −−−（２）
であった。
【０１５６】
シトシンのうちの１０％がメチル化されている「１０％メチル化標準ＤＮＡ」の場合の測定結果を、表４に示す。
《表４》
蛍光強度                蛍光強度
ＦＩＴＣ（シトシン）    テキサスレッド（グアニン）
センス鎖          ５．２１ｘ１０６        ４８．２  ｘ１０６
アンチセンス鎖  ４１．２  ｘ１０６          ６．４２ｘ１０６ 
表４のデータより、ＦＩＴＣにおけるアンチセンス鎖蛍光量に対するセンス鎖蛍光量の比率は
５．２１／４１．２  ＝  ０．１２６  −−−（３）
であり、テキサスレッドにおけるセンス鎖蛍光量に対するアンチセンス鎖蛍光量の比率は
６．４２／４８．２  ＝  ０．１３３  −−−（４）
であった。
【０１５７】
シトシンのうちの２５％がメチル化されている「２５％メチル化標準ＤＮＡ」の場合の測定結果を、表５に示す。
《表５》
蛍光強度                蛍光強度
ＦＩＴＣ（シトシン）    テキサスレッド（グアニン）
センス鎖        １０．８  ｘ１０６        ５０．７  ｘ１０６
アンチセンス鎖  ４０．８  ｘ１０６        １４．２  ｘ１０６ 
表５のデータより、ＦＩＴＣにおけるアンチセンス鎖蛍光量に対するセンス鎖蛍光量の比率は
１０．８／４０．８  ＝  ０．２６５  −−−（５）
であり、テキサスレッドにおけるセンス鎖蛍光量に対するアンチセンス鎖蛍光量の比率は
１４．２／５０．７  ＝  ０．２８０  −−−（６）
であった。
【０１５８】
前記の測定結果においてＦＩＴＣのみに注目して前記の（１）、（３）、及び（５）で算出した値を使用して検量線（図５）を描き、メチル化率が未知である測定対象ＤＮＡのメチル化率を求めることができる。また同様にして、前記の測定結果においてテキサスレッドのみに注目して前記の（２）、（４）、及び（６）で算出した値を使用して検量線（図６）を描き、メチル化率が未知である測定対象ＤＮＡのメチル化率を求めることもできる。（１）〜（６）の計算では、測定対象ＤＮＡのメチル化率に依存して変化する蛍光量を式の分子に、また、測定対象ＤＮＡのメチル化率に依存しない基準となる蛍光量を式の分母において計算する。
【０１５９】
前記の表３〜表５に示すように、シトシンのメチル化率に伴い、アンチセンス鎖のＦＩＴＣ蛍光強度に対するセンス鎖のＦＩＴＣ蛍光強度の割合と、センス鎖のテキサスレッド蛍光強度に対するアンチセンス鎖のテキサスレッド蛍光強度の割合とが増加し、この増加率はＤＮＡのメチル化率に比例した。
【０１６０】
電気泳動に供した増幅後ＤＮＡの実質的量は、アンチセンス鎖のシトシンの量、すなわち、この場合にはアンチセンス鎖のＦＩＴＣの蛍光量で示され、また同様に、テキサスレッドの場合はセンス鎖のグアニン量、すなわち、この場合にはセンス鎖のテキサスレッドの蛍光量で示される。
この原理は、増幅後ＤＮＡのアンチセンス鎖のシトシン量が測定対象ＤＮＡのメチル化率に依存しないこと、また同様に、センス鎖のグアニン量が測定対象ＤＮＡのメチル化率に依存しないことによるものである。
前記のような原理であるから、たとえ、電気泳動に供する各サンプル間の実質的量にばらつきがあったとしても、測定対象ＤＮＡのメチル化率に依存しないヌクレオチドに注目してそれを内部標準としてメチル化率で変動するヌクレオチドの蛍光量を補正することができる。
【０１６１】
この測定法においては、ＤＮＡの増幅工程において任意の一定の割合で蛍光標識ヌクレオチドを混合しているので、センス鎖又はアンチセンス鎖における前記の２つの蛍光標識ヌクレオチドの蛍光強度の比率をもとに、測定対象ＤＮＡのメチル化率を求めることも前記と同様にして行える。
【０１６２】
具体的には、以下のようにセンス鎖又はアンチセンス鎖における前記２つの蛍光強度の比率を計算し、測定対象ＤＮＡのメチル化率を算出する。この場合、測定対象ＤＮＡのメチル化率に依存して変化する蛍光標識ヌクレオチドの蛍光量の実測値を式の分母に、また、測定対象ＤＮＡのメチル化率に依存しない蛍光標識ヌクレオチドの蛍光量の実測値を式の分母におくことにより、測定対象ＤＮＡのメチル化に依存した値（式の右辺）を算出することができる。
【０１６３】
０％メチル化標準ＤＮＡの場合には、
センス鎖          １．９３／５２．７  ＝  ０．０３６６    −−−（７）
アンチセンス鎖    ２．０５／４２．２  ＝  ０．０４８６    −−−（８）
である。
１０％メチル化標準ＤＮＡの場合には、
センス鎖          ５．２１／４８．２  ＝  ０．１０８      −−−（９）
アンチセンス鎖    ６．４２／４１．２  ＝  ０．１５６      −−−（１０）
である。
２５％メチル化標準ＤＮＡの場合には、
センス鎖          １０．８／５０．７  ＝  ０．２１３      −−−（１１）
アンチセンス鎖    １４．２／４０．８  ＝  ０．３４８      −−−（１２）
である。
【０１６４】
以上の式で示したように、（７）、（９）、及び（１１）の値を使用して検量線を書くこともできるし、また同様にして、（８）、（１０）、及び（１２）の値を使用して検量線を描き、未知のメチル化率である測定対象ＤＮＡのメチル化率を求めることができる。すなわち、前記の電気泳動におけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のどちらか一方のＤＮＡ鎖において、前記の２つの蛍光量に同時に注目することによって測定対象ＤＮＡのメチル化率を求めることが可能である。
【０１６５】
しかし、電気泳動に供する増幅後ＤＮＡサンプルの実質的ＤＮＡ量をあらかじめ正確に定量すれば、２本鎖ＤＮＡの各ＤＮＡ鎖を分離する必要はなく、この場合には２本鎖ＤＮＡが発するＦＩＴＣの蛍光量とテキサスレッドの蛍光量の比を求めることで、測定対象ＤＮＡのメチル化率を定量することができる。この場合、２本鎖ＤＮＡは電気泳動すらする必要がなく、前記ＤＮＡの前記２種類の蛍光を測定することにより、任意の測定対象ＤＮＡのメチル化率を検量線から求めることができる。この原理については、先に、（７）二本鎖非分離型メチル化測定方法において、その原理を説明している。
【０１６６】
《実施例２：ヒト・インテグリンα２のプロモーター領域のＥＬＩＳＡ法によるメチル化解析》
ヒト血液を採取し、ヒト白血球からゲノムＤＮＡ精製カラム（キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡを精製し、常法に従って制限酵素ＥｃｏＲＩで断片化した。次に前記ＤＮＡ断片を、市販のキット（CpGenome Modification Kit, Cat#S7820；Intergen Company社製) を用いて亜硫酸水素イオン処理し、メチル化されていないシトシンのウラシルへの化学変換を行った。前記変換処理で得られた塩基置換ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、また、５’末端にビオチン化を施したＰＣＲ用上流プライマーと、ＰＣＲ用下流プライマーとを用い、更にシトシン８０％に対して２０％の５−メチルシトシンを含有するヌクレオチド混合液（5-メチルdCTP, dCTP, dATP, dGTP, dTTPを含む）を用いてＰＣＲ増幅を行った。これにより、ＰＣＲ産物のＤＮＡ中のシトシンの約２０％がメチル化されたシトシン、すなわち、５−メチルシトシンにランダムの位置で置換される。
【０１６７】
具体的なＰＣＲ条件を以下に示す。
ＰＣＲの標的DNA配列（配列番号２４）：
【化１２】
2005168486.tif 000013
ＰＣＲ用フォワードプライマー（配列番号２５）：
５’− TTATTTAGGAAAAATAGAGAAAGGGA −３’ （５’末端はビオチン化してある）
ＰＣＲ用リバースプライマー（配列番号２６）：
５’− CCTAACAAACTTTCCTACCCTAAAC −３’
鋳型ＤＮＡ：ヒトゲノムＤＮＡ  １μｇ
ヌクレオチド：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰをそれぞれ２．５μｍｏｌｅとし、更に、２．５μｍｏｌｅのｄＣＴＰと０．５μｍｏｌｅの５−メチルｄＣＴＰ（ｄＣＴＰと５−メチルｄＣＴＰの添加量合計が２．５μｍｏｌｅ）を使用。
ＰＣＲ反応系総量：５０μＬ
ＰＣＲ反応条件：
（９５℃，２分）ｘ１サイクル
（９５℃，３０秒／５９℃，３０秒／７２℃，３０秒）ｘ３０サイクル
（７２℃，８分）ｘ１サイクル
【０１６８】
ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ産物は、そのうちの５μＬを１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（以下、ＴＥ緩衝液と称する）で希釈して１００μＬとし、このＤＮＡ希釈液の全量を、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに加え、室温で１時間反応させた。なお、前記ＥＬＩＳＡ用プレートとしては、各ウェルを予めアビジン・コートし、更に１０％ウシ血清アルブミンでブロッキング処理したものを使用した。反応後、各ウェルをＴＥ緩衝液で数回洗浄し、ピコ・グリーン（Cat# P7581；Molecular Probes社製，USA）を用い、マニュアルに従ってウェルにコートされたＤＮＡ量を蛍光光度法により定量した。
【０１６９】
次に、各ウェルを０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で５分間処理し、ウェルに固定化されたＤＮＡを変性させて１本鎖化し、その後０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ｐＨ７．５）／１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（以下、Ｔ−ＥＰＢＳと称する）で数回洗浄した。この操作により、ビオチン化されたセンス鎖ＤＮＡのみがウェル上に残存し、ビオチン化されていないアンチセンス鎖は洗浄除去された。
以上の操作を実施すると、検査対象ゲノムＤＮＡ中のセンス鎖のシトシンのうち、５位がメチル化されたシトシンの約２０％の個所にランダムに５−メチルｄＣＴＰが取り込まれたＤＮＡ産物が、ＰＣＲ増幅によって作成されることとなり、人工的に５−メチルｄＣＴＰを取り込ませた前記ＤＮＡのセンス鎖のみがアビジンコートしたＥＬＩＳＡプレートに残存して結合した状態になっている。
【０１７０】
次に、Ｔ−ＥＰＢＳを用いて２〜５μｇ／ｍＬの濃度に調整した抗５−メチルシトシン抗体（マウスモノクローナル抗体）を前記の各ウェルに入れ、１時間インキュベートした。反応後、各ウェルをＴ−ＥＰＢＳで４〜５回洗浄し、Ｔ−ＥＰＢＳで２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを前記の各ウェルに入れ、１時間インキュベートした。反応後、各ウェルをＴ−ＥＰＢＳで５〜６回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質１００μＬ（Cat.# T-0440；SIGMA社, USA）を加えて３０分間室温でインキュベートし、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸２０μＬを加えて反応停止した後、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１７１】
なお、メチル化標準ＤＮＡの作成及び測定は、測定対象ＤＮＡと近似した鎖長のＤＮＡであって、ＤＮＡ中に５−メチルシトシンを含まないＰＣＲ産物を０％メチル化標準ＤＮＡとして、また、ＰＣＲ増幅時にシトシン：５−メチルシトシンの比率を９５：５の割合で混合して得られたＤＮＡ産物を５％メチル化標準ＤＮＡとし、検査対象のヒトゲノムＤＮＡ試料と同様にしてＥＬＩＳＡプレートへのコーティングを行い、以下同様に操作を行った。
吸光度は、モレキュラー・デバイス社製のE-maxを用いて実施した。また、蛍光光度計は、モレキュラー・デバイス社製のSPECTRAmax GEMINI XSを使用し、励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで蛍光強度を測定した。結果を表６に示す。なお、表６における「ヒトゲノムＤＮＡ試料１」及び「ヒトゲノムＤＮＡ試料２」は、同一ＤＮＡ試料であるが、希釈率のみが異なる。
【０１７２】
《表６》
相対的蛍光強度    吸光度（Ａｂ）      Ａｂ／Ｆｒ
（Ｆｒ）        （４５０ｎｍ）                  
０％メチル化標準ＤＮＡ    １．０００        ０．０８５        ０．０８５
５％メチル化標準ＤＮＡ    ０．８２４        ０．３０６        ０．３７１
ヒトゲノムＤＮＡ試料１    ０．２９１        ０．１０６        ０．３６４
ヒトゲノムＤＮＡ試料２    １．２０５        ０．３７４        ０．３１０  
【０１７３】
亜硫酸水素イオン処理の反応効率が高い場合には、前記方法で検査対象ＤＮＡのメチル化率の近似値を求めることができる。一方、亜硫酸水素イオン処理の反応効率が低いＤＮＡ試料の場合には、検査対象ＤＮＡ中のシトシンが完全にウラシルに変化しないのであるため、検査対象ＤＮＡ中のメチル化されていないシトシンがそのままＰＣＲ増幅でシトシンとして増幅されることから、検査対象ＤＮＡが全くメチル化されていない場合であっても、見かけ上メチル化されているように測定される。従って、亜硫酸水素イオン処理の反応効率が低い場合には、検査対象ＤＮＡに任意の割合で５−メチルシトシンを取り込ませたＤＮＡを出発原料として、亜硫酸水素イオン処理し、これを検査対象ＤＮＡのメチル化率と比較することによって正確にメチル化率を定量することができる。
ここでは、メチル化標準ＤＮＡを作成し、それをそのままメチル化標準ＤＮＡとなる標準物質として、サンプルのメチル化を算出しているが、更に正確にサンプルＤＮＡのメチル化率を測定するには、前記ＰＣＲ法により、人為的にＤＮＡに５−メチルシトシンを取り込ませたものを亜硫酸水素イオン処理し、そのメチル化率を測定対象ＤＮＡのメチル化率と比較すれば、更に好ましい定量法となる。
【０１７４】
《実施例３：細胞分裂中期染色体標本の染色》
本実施例では、正常細胞として、肺の繊維芽細胞（fibroblast）由来のＴＩＧ−１細胞［国立医薬品食品衛生研究所、ＪＣＲＢ（Japanese Collection of Research Bioresources）細胞バンク］を使用し、癌細胞として、バーキットリンパ腫（Burkitt lymphoma）由来のＲａｊｉ細胞［東北大学加齢医学研究所、医用細胞資源センター；カタログ番号ＴＫＧ０３７１］と、繊維肉腫（fibrosarcoma）由来のＨＴ１０８０細胞［東北大学加齢医学研究所、医用細胞資源センター；カタログ番号ＴＫＧ０２０２］とを使用した。
【０１７５】
培養皿で培養されている細胞に、培地における最終濃度が０．０２μｇ／ｍＬになるようにデメコルシンを添加し、更に３０分間培養した。
浮遊細胞であるＲａｊｉ細胞については、培養細胞を培地と共に培養皿から取り出し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を捨てて細胞を回収した。
一方、接着細胞であるＨＴ１０８０細胞及びＴＩＧ−１細胞については、培養皿上の細胞をハンクス液（マグネシウム及びカルシウム不含）で軽くすすぎ、０．２５％トリプシンを含む前記ハンクス液を７５ｃｍ２の培養皿に対して２ｍＬ添加し、細胞全体に行き渡らせた後に捨て、３７℃で２分間保温し、剥がれた細胞を５ｍＬの培地で回収し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を捨てることにより、細胞を回収した。
【０１７６】
ペレット状になった細胞に７５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム溶液５ｍＬを加えて細胞を充分に懸濁し、室温に２０分間放置した。次に、前記細胞懸濁液を氷令した後、よく混ぜながらカルノア液（メタノール：酢酸＝３：１）１ｍＬを１５分間かけて加え、次に前記カルノア液４ｍＬを５分間かけて加えた。次に前記細胞懸濁液を４℃にて１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。沈殿した細胞を前記カルノア液に懸濁し、使用するまでー２０℃で保存した。
９９．５％エタノールで充分に洗浄したスライドグラスを、６０℃に保温した水浴の水面から３ｃｍの位置に設置し、スライドグラスが充分に暖まった後、スライド上の２０ｃｍの位置から前記のカルノア液に懸濁した細胞懸濁液を１滴滴下し、およそ３０秒後に取り出してスライド上の余分な水分を濾紙で除去し、室温で２〜１０日間放置し、以下の染色体染色を行った。
【０１７７】
氷冷した１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）（以下、ＰＢと称する）で染色体標本（スライドグラス）を２分間処理した後、前記標本を氷上に設置し、同じく氷冷した０．０５％トリプシン／１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で１分間処理した。次に、氷冷した７０％エタノール及び９９．５％エタノールで順次２分間処理し、完全に風乾させた後、２Ｎ  ＨＣｌにより室温で１０分間処理した。その後、０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で室温にて１０分間処理した。これを、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含むＰＢ（以下、ＰＢＳと称する）で軽くすすぎ、再び７０％エタノール及び９９．５％エタノールで順次２分間処理した。その後、室温にて標本を乾燥させた。
【０１７８】
完全に乾燥させた後、１％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと称する）／ＰＢＳに、アビジンブロッキング溶液（Avidin-Biotin blocking kit, Cat.#SP-2001；Vector社）を加えてブロッキング液とし、これを標本上にのせて室温で３０分間反応させた。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Ｔと称する）で前記標本を洗浄し、更に以下に示す１次抗体反応を行った。抗体希釈液（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ）で終濃度２０μｇ／ｍＬとした抗５−メチルシトシンモノクローナル抗体（１次抗体）に、ビオチンブロッキング溶液（Avidin-Biotin blocking Kit, Cat.#SP-2001；Vector社）を加え、１次抗体液とした。これを前記標本上にのせ、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔにより洗浄した。染色体標本の内の半数（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）については、そのまま、以下の２次抗体反応を実施し、残る半数（５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）については、高塩濃度ＰＢＳ−Ｔ［１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）／０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０］で更に５分間洗浄した後、２次抗体反応を実施した。２次抗体液は、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで抗マウスビオチン化２次抗体（Cat.#E0354；Cappel社）を８００倍に希釈したものを使用した。これを標本上にのせ、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔでよく洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで１０，０００倍に希釈したアビジン−ＦＩＴＣ液（Cat.#A-2001；Vector社）を標本上にのせ、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで充分に洗浄した後、洗浄液を吸水紙で吸い取り、封入剤（Cat.#H-1000；Vector社）を用いて封入した。染色した標本を蛍光顕微鏡（Cat.#TE2000-U；Nikon社）で観察し、デジタルカメラによる撮影を行った。
【０１７９】
結果を図１１〜図１７に示す。図１１〜図１３は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群であり、図１４〜図１７は、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群である。図１１及び図１４は、癌細胞であるＲａｊｉ細胞であり、図１２及び図１５は、癌細胞であるＨＴ１０８０細胞であり、図１３、図１６、図１７は、正常細胞であるＴＩＧ−１細胞である。
一般に通常に行われている免疫染色では、ＰＢＳ（Ｎａｃｌ濃度＝０．１５ｍｏｌ／Ｌ）などを用いた生理的条件下で抗体を反応させ、洗浄操作を行っている。このような一般的免疫染色条件では、癌細胞であるＨＴ１０８０細胞（図１２）と正常細胞であるＴＩＧ−１細胞（図１３）の染色体染色像には差は認められなかった。癌細胞であるＲａｊｉ細胞（図１１）については、このような生理的条件下での染色においては、個々の染色体中に強染色のスポットが観察された。従って、一般的に行われている免疫染色条件においては、Ｒａｊｉ細胞の染色体のメチル化異常が、ＴＩＧ−１細胞の染色体のメチル化との差は微小ではあるが、観察された。しかし、ＨＴ１０８０細胞については、一般的に行われている免疫染色条件では染色体のメチル化は正常細胞との差が見られなかった。
【０１８０】
一方、１次抗体反応後に、生理的条件下より高塩濃度の緩衝液（ＮａＣｌ濃度＝５００ｍｍｏｌ／Ｌ）で洗浄すると、図１４〜図１７に示すように、生理的染色条件下では観察することができなかった正常細胞（ＴＩＧ−１細胞）と癌細胞（ＨＴ１０８０、Ｒａｊｉ細胞）との染色体のメチル化の差異を観察することができた。前記洗浄により、染色体標本に弱く結合した抗体（１価結合抗体）を除去し、強固に結合した抗体（２価結合抗体）を残存させたものと考えられる。高塩濃度処理を行った染色体の染色結果は、癌細胞（図１４、図１５）では染色陽性箇所である微小な点（スポット）がきめ細かく、正常細胞（図１６、図１７）ではそのスポットが大きく観察された。また、癌細胞（図１４、図１５）ではこのスポットの数は、正常細胞（図１６、図１７）のスポットの数より多く、正常細胞と癌細胞とを簡単に見分けることが可能であることが判明した。
【０１８１】
《参考実施例１：２価結合条件の決定》
本参考実施例では、実施例３で一次抗体として使用した抗５−メチルシトシンモノクローナル抗体の２価結合条件を決定した。
まず、抗５−メチルシトシンモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ，κ）から、常法に従って、Ｆａｂフラグメントを調製し、このＦａｂフラグメント（１価）とＩｇＧ全体分子（２価）とを用いて、各種ＮａＣｌ濃度における結合能をＥＬＩＳＡにより評価した。ＥＬＩＳＡプレートに固定化する抗原としては、リバースプライマーとビオチン化フォワードプライマーとを用いるＰＣＲにより、５−メチルシトシンをランダムに取り込ませた２本鎖ＤＮＡを使用し、アビジンコートした各ウェルにビオチンを介して２本鎖ＤＮＡを固定化した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸処理により、一本鎖化した状態で使用した。２次抗体としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用し、発色基質としてはパラニトロフェニルリン酸を使用し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１８２】
結果を図１８に示す。図１８に示すように、Ｆａｂフラグメント（１価）は、ＮａＣｌ濃度が高くなるにつれ、急激に結合能が低下し、例えば、濃度０．３ｍｏｌ／Ｌでは最大結合能（濃度０．０５ｍｏｌ／Ｌでの結合能）の約２５％、濃度０．５ｍｏｌ／Ｌでは最大結合能の１０％以下まで低下した。一方、ＩｇＧ全体分子（２価）は、Ｆａｂフラグメントと比較して、結合能の低下が緩やかであり、例えば、濃度０．５ｍｏｌ／Ｌで最大結合能の約５０％、濃度０．８ｍｏｌ／Ｌで約２５％の結合能を維持していた。図１８に示すグラフから、この抗５−メチルシトシンモノクローナル抗体の２価結合条件は、０．３〜１．０ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．４〜０．８ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５〜０．６ｍｏｌ／Ｌと決定することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１８３】
本発明の測定方法及び評価方法は、例えば、癌細胞の悪性度の評価、又は各種細胞の分化状態の評価等の用途に適用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８４】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。具体的には、配列番号２及び４で表される各塩基配列は、亜硫酸水素イオン処理後の配列であり、配列番号５及び１０で表される各塩基配列は、ＰＣＲ増幅後の配列であり、配列番号６及び８で表される各塩基配列は、フォワードプライマーであり、配列番号７及び９で表される各塩基配列は、リバースプライマーであり、配列番号１１で表される塩基配列は、亜硫酸水素イオン処理前の配列であり、配列番号１２、１３、及び１５で表される各塩基配列は、亜硫酸水素イオン処理及びＰＣＲ増幅後の配列であり、配列番号１６で表される塩基配列は、図１における配列（ａ）であり、配列番号１７で表される塩基配列は、図１における配列（ｂ）であり、配列番号１８で表される塩基配列は、図１における配列（ｃ）であり、配列番号１９で表される塩基配列は、図１における配列（ｄ）であり、配列番号２０で表される塩基配列は、図２における配列（ｅ）であり、配列番号２１で表される塩基配列は、図２における配列（ｆ）であり、配列番号２２で表される塩基配列は、図２における配列（ｇ）であり、配列番号２３で表される塩基配列は、図２における配列（ｈ）であり、配列番号２５で表される塩基配列は、フォワードプライマーであり、配列番号２６で表される塩基配列は、リバースプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】本発明の二本鎖分離−センス鎖鋳型−Ｃ型測定方法、及び二本鎖分離−センス鎖鋳型−Ｇ型測定方法の各工程を模式的に示す説明図である。
【図２】本発明の二本鎖分離−アンチセンス鎖鋳型−Ｃ型測定方法、及び二本鎖分離−アンチセンス鎖鋳型−Ｇ型測定方法の各工程を模式的に示す説明図である。
【図３】本発明方法において測定対象塩基配列とすることができる領域を、模式的に示す説明図である。
【図４】メチル化率が２５％のメチル化ＤＮＡ標準品を用いて本発明方法を実施して得られた電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図５】ＦＩＴＣ標識ｄＣＴＰを用いた場合の、シトシンのメチル化率と、蛍光比（センス鎖／アンチセンス鎖）との関係を示すグラフである。
【図６】テキサスレッド標識ｄＧＴＰを用いた場合の、シトシンのメチル化率と、蛍光比（アンチセンス鎖／センス鎖）との関係を示すグラフである。
【図７】一分子の抗体が一方の抗原結合部位で二本鎖ＤＮＡと結合する１価結合の状態を示す模式図である。
【図８】一分子の抗体が２箇所の抗原結合部位で二本鎖ＤＮＡと結合する２価結合の状態を示す模式図である。
【図９】担体に固定された二分子の抗体がそれぞれ１箇所の抗原結合部位で二本鎖ＤＮＡと結合する２価結合の状態を示す模式図である。
【図１０】二分子の抗体がそれぞれ１箇所の抗原結合部位で二本鎖ＤＮＡと結合している状態を示す模式図である。
【図１１】癌細胞であるＲａｊｉ細胞（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）の染色体染色像を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１２】癌細胞であるＨＴ１０８０細胞（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）の染色体染色像を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１３】正常細胞であるＴＩＧ−１細胞（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）の染色体染色像を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１４】癌細胞であるＲａｊｉ細胞（５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）の染色体染色像を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１５】癌細胞であるＨＴ１０８０細胞（５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）の染色体染色像を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１６】正常細胞であるＴＩＧ−１細胞（５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）の染色体染色像を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１７】正常細胞であるＴＩＧ−１細胞（５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ処理群）の染色体染色像を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１８】各種濃度のＮａＣｌ条件化における、抗５−メチルシトシンモノクローナル抗体（ＩｇＧ）及びそのＦａｂフラグメントの結合能を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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