(57)【要約】【課題】目的配列を複数回有する核酸を合成できる方法を提供する。【解決手段】目的配列を有する環状一本鎖DNAを鋳型として、このDNAとアニールしない第１非アニール配列及びこのDNAの一部とアニールする第１アニール配列を有するプライマーAを用いてローリングサークル型複製を行い；ローリングサークル型複製で得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列及びローリングサークル型複製で得られた一本鎖核酸の第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールする第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖DNAの相補鎖を合成し；プライマーAの第１非アニール配列にアニールする配列のプライマーC及びプライマーBの第２非アニール配列にアニールする配列のプライマーDを用いてPCRを行う方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状一本鎖DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含む目的配列を複数有する核酸の製造方法。
【請求項２】
さらに、所望の長さの核酸を分離する工程(5)を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(5)において、所望の長さの核酸を一本鎖状態で分離する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、得られた核酸をポリメラーゼチェーン反応により増幅する工程(6)を含む請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、得られた二本鎖DNAを変性させて一本鎖にする工程(6)を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程(2)において、ファージM2由来DNAポリメラーゼを用いる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程(3)及び工程(4)において、校正機能を有するDNAポリメラーゼを用いる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
特定長さの配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含む核酸ラダーマーカーの製造方法。
【請求項９】
目的タンパク質をコードする塩基配列又はその相補的配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と、
を含む目的タンパク質をコードする核酸の製造方法。
【請求項１０】
目的タンパク質がメタロチオネイン、イソニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼである請求項９に記載の目的タンパク質をコードする核酸の製造方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法により得られた核酸をベクターに挿入して発現ベクターを得る工程(8)と、
この発現ベクターで宿主を形質転換する工程(9)と、
この形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)と
を含む目的タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法により得られた核酸を相同組み換えにより宿主のゲノムに挿入する工程(11)と、
この宿主を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)と
を含む目的タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
目的タンパク質がメタロチオネイン、イソニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼである請求項11又は12に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
目的タンパク質をコードする塩基配列と相補的な配列であってスタートコドン及びストップコドンを除いた目的配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAの目的配列とはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの目的配列の一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖DNAとはアニールしない第２非アニール配列、及び、この一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含むマルチマータンパク質をコードする核酸の製造方法。
【請求項１５】
目的タンパク質がメタロチオネイン、イソニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼである請求項14に記載のマルチマータンパク質をコードする核酸の製造方法。
【請求項１６】
請求項14に記載の方法により得られた核酸をベクターに挿入して発現ベクターを得る工程(8)と、
この発現ベクターで宿主を形質転換する工程(9)と、
この形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)と
を含むマルチマータンパク質の製造方法。
【請求項１７】
請求項14に記載の方法により得られた核酸を相同組み換えにより宿主のゲノムに挿入する工程(11)と、
この宿主を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)と
を含むマルチマータンパク質の製造方法。
【請求項１８】
目的タンパク質がメタロチオネイン、イソニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼである請求項16又は17に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項１９】
アプタマー配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含むアプタマー配列を複数有する核酸の製造方法。
【請求項２０】
請求項19に記載の方法により得られたアプタマー配列を繰り返し有する核酸をセンサーチップ表面に固定又は吸着させるセンサーチップの製造方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法により得られるセンサーチップを検出装置と接続することにより、アプタマーの結合対象を検出できるセンサーを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的配列を複数有する核酸を合成する方法に関する。また本発明は、アプタマー配列を複数回有する核酸を用いた高感度センサーの製造方法に関する。さらに本発明は、タンパク質の効率的な生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼチェーン反応(PCR)は、現在、分子生物学の分野で欠くことのできない重要な技術である。PCRにより、微量の遺伝子試料からでも目的とする遺伝子を簡単に増幅することができ、さらには人為的な遺伝子配列を新たに作り出すこともできる。
【０００３】
しかし、PCRは目的配列の一部に相補的なプライマーを用いて当該配列を増幅することから、目的配列が相同配列を多く含む場合は、使用するプライマーが鋳型DNAに対してミスアニーリングを起こし易いため、種々の長さの配列が増幅されてしまい、目的配列の全体を効率的に増幅することが困難である。ましてや同一配列を複数回有する配列の全体の増幅はほとんど報告されていない。
【０００４】
唯一報告されている方法としては、プライマーをビーズに固定化し、固相上でPCRを行う手法がある（非特許文献１）。しかしながら、この方法は、操作が煩雑であることに加え、通常のPCRのプロトコールと異なる操作を行う必要があることから、殆ど利用されていない。また、この手法を用いた場合でも、目的配列が高頻度又は高密度に繰り返された核酸を増幅したことは現在までに報告されていない。
【０００５】
なお、φ２９DNAポリメラーゼを利用して、環状核酸分子を鋳型として鋳型と相補的な配列が繰り返し並んだ核酸を合成することが可能であることが既に知られている（非特許文献２）。しかし、この方法では、繰り返し配列を有する核酸を短時間で実用上十分な量得ることはできない。
【非特許文献１】Nucleic Acid Research, Vol.20, 6743-6744, 1992
【非特許文献２】J. Biol. Chem., Vol.264, 8935, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、同一又は略同一の配列を複数有する核酸を効率的に合成できる方法を提供することを第１の課題とする。また本発明は、この方法を利用して高感度センサーを製造できる方法を提供することを第２の課題とする。また本発明は、この方法を利用してタンパク質を効率的に製造できる方法を提供することを第３の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ね、以下の知見を得た。
【０００８】
目的とする塩基配列を有する環状DNAを鋳型としてローリングサークル型複製を行うと目的配列の相補的配列を繰り返し有する一本鎖核酸が得られる。この一本鎖核酸の相補鎖を合成すると、目的配列を繰り返し有する二本鎖核酸であって種々の長さのものが得られる。
【０００９】
この中から電気泳動などの手段で所望の長さの二本鎖DNAを分離するためには、各長さの核酸が比較的多量に必要である。各長さの核酸を増幅するためには、各長さの二本鎖核酸の末端にのみアニールできるプライマーを用いたPCRを行えばよい。
【００１０】
しかし、これらの二本鎖DNAはローリングサークル型複製の結果得られたものであるため、同一配列を繰り返し有し、二本鎖核酸の末端にのみアニールできるセンスプライマーSP及びアンチセンスプライマーAPは設計し難い。
【００１１】
そこで、ローリングサークル型複製を行うためのプライマーの上流側に、センスプライマーSPがハイブリダイズできる配列を連結しておき、ローリングサークル型複製の結果得られた一本鎖核酸の相補鎖合成時に使用するプライマーの上流側にアンチセンスプライマーAPがハイブリダイズできる配列を連結しておけば、ローリングサークル型複製及びその相補鎖合成により得られる二本鎖核酸を鋳型として、このプライマーセットSP及びAPを用いたPCRを行うことにより、各長さの二本鎖核酸の全体を増幅させることができる。
【００１２】
本発明は前記知見に基づき、さらに研究を重ねて完成されたものであり、以下の核酸の製造方法などを提供する。
【００１３】
項１．  対象配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状一本鎖DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含む目的配列を複数有する核酸の製造方法。
【００１４】
項２．  さらに、所望の長さの核酸を分離する工程(5)を含む項１に記載の方法。
【００１５】
項３．  工程(5)において、所望の長さの核酸を一本鎖状態で分離する項２に記載の方法。
【００１６】
項４．  さらに、得られた核酸をポリメラーゼチェーン反応により増幅する工程(6)を含む項１、２又は３に記載の方法。
【００１７】
項５．  さらに、得られた二本鎖DNAを変性させて一本鎖にする工程(6)を含む項４に記載の方法。
【００１８】
項６．  工程(2)において、ファージM2由来DNAポリメラーゼを用いる項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００１９】
項７．  工程(3)及び工程(4)において、校正機能を有するDNAポリメラーゼを用いる項１〜６のいずれかに記載の方法。
【００２０】
項８．  特定長さの配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含む核酸ラダーマーカーの製造方法。
【００２１】
項９．  目的タンパク質をコードする塩基配列又はその相補的配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と、
を含む目的タンパク質をコードする核酸の製造方法。
【００２２】
項10．  目的タンパク質がメタロチオネイン、イソニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼである項９に記載の目的タンパク質をコードする核酸の製造方法。
【００２３】
項11．  項９に記載の方法により得られた核酸をベクターに挿入して発現ベクターを得る工程(8)と、
この発現ベクターで宿主を形質転換する工程(9)と、
この形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)と
を含む目的タンパク質の製造方法。
【００２４】
項12．  項９に記載の方法により得られた核酸を相同組み換えにより宿主のゲノムに挿入する工程(11)と、
この宿主を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)と
を含む目的タンパク質の製造方法。
【００２５】
項13．  目的タンパク質がメタロチオネイン、イソニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼである項11又は12に記載の目的タンパク質の製造方法。
【００２６】
項14．  目的タンパク質をコードする塩基配列と相補的な配列であってスタートコドン及びストップコドンを除いた目的配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAの目的配列とはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの目的配列の一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖DNAとはアニールしない第２非アニール配列、及び、この一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含むマルチマータンパク質をコードする核酸の製造方法。
【００２７】
項15．  目的タンパク質がメタロチオネイン、イソニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼである項14に記載のマルチマータンパク質をコードする核酸の製造方法。
【００２８】
項16．  項14に記載の方法により得られた核酸をベクターに挿入して発現ベクターを得る工程(8)と、
この発現ベクターで宿主を形質転換する工程(9)と、
この形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)と
を含むマルチマータンパク質の製造方法。
【００２９】
項17．  項14に記載の方法により得られた核酸を相同組み換えにより宿主のゲノムに挿入する工程(11)と、
この宿主を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)と
を含むマルチマータンパク質の製造方法。
【００３０】
項18．  目的タンパク質がメタロチオネイン、イソニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼである項16又は17に記載の目的タンパク質の製造方法。
【００３１】
項19．  アプタマー配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含むアプタマー配列を複数有する核酸の製造方法。
【００３２】
項20．  項19に記載の方法により得られたアプタマー配列を繰り返し有する核酸をセンサーチップ表面に固定又は吸着させるセンサーチップの製造方法。
【００３３】
項21．  項20に記載の方法により得られるセンサーチップを検出装置と接続することにより、アプタマーの結合対象を検出できるセンサーを製造する方法。
【００３４】
本発明方法によれば、特殊なプライマーを用いたことにより、従来困難であった同一又は略同一配列を繰り返し有する核酸を、既存の技術であるPCR及びローリングサークル型複製を利用して大量かつ簡単に得ることが出来る。
【００３５】
例えば、その配列がアプタマー配列である場合は、アプタマー配列を繰り返し有する核酸が得られるため、この核酸をセンサーチップに固定又は付着させたセンサーでは、センサーチップの単位面積当たりのアプタマー数が多いため、その分検出感度が向上する。また、この配列がタンパク質をコードする配列である場合は、一つのプロモーターの下で繰り返し配列を一度に転写させて効率よく製造することができる。
【００３６】
また、本発明方法によれば、目的配列を種々の個数含む核酸の混合物を大量かつ簡単に得ることが出来る。この混合物は、互いに、長さが目的配列の長さ分異なる核酸の混合物であるため、核酸の分子量マーカーの１種であるラダーマーカーとして使用できる。
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。
(I)目的配列を複数有する核酸の製造方法
本発明の目的配列を複数有する核酸の製造方法は、
対象配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状一本鎖DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含む方法である。
工程(1)
工程(1)では、目的配列を有する環状DNAを用意する。
【００３８】
目的配列の長さは特に限定されない。例えばタンパク質をコードする塩基配列である場合は通常数千塩基程度、特に3000塩基程度までであり、アプタマーをコードする塩基配列である場合は通常200塩基程度、特に100塩基程度までである。また、核酸ラダーマーカーの単位配列である場合は通常1000塩基程度、特に200塩基程度までである。どのような目的配列であっても、二つのプライマーとアニールできるだけの長さは必要であるため、最低50塩基程度の長さは必要である。
【００３９】
目的配列を有する核酸は、線状又は環状のいずれであってもよく、DNA又はRNAのいずれであってもよい。環状DNA以外を対象にする場合は、それを工程(1)において環状DNAにすればよい。また対象配列を有する核酸は二本鎖又は一本鎖のいずれであってもよいが、後に行うローリングサークル型複製が起こり易い点で一本鎖核酸であることが好ましい。
【００４０】
目的配列を有する核酸がRNAである場合は、逆転写酵素を用いてDNAに変換すればよい。
【００４１】
対象配列を有する核酸が二本鎖線状DNAである場合はDNAリガーゼを用いて環状二本鎖DNAにすればよい。
【００４２】
また、対象配列を有する核酸が一本鎖線状DNAである場合は、その線状DNAの両末端配列を有する補助的な一本鎖線状核酸とハイブリッド形成させた状態で、DNAリガーゼを用いて線状DNAの両末端を連結することにより、部分的に補助的な一本鎖核酸とハイブリッド形成した環状DNAにすればよい。ハイブリッド形成と目的配列を有する一本鎖DNAのセルフライゲーションによる環状化とは、順次行ってもよく、同時に行ってもよい。
【００４３】
補助的な一本鎖線状核酸は、目的配列を有するDNAの5'末端領域にハイブリダイズできる配列及び3'末端領域にハイブリダイズできる配列を有するものを用いることができる。5'末端領域にハイブリダイズできる配列及び3'末端領域にハイブリダイズできる配列は隣接していてもよく、その間に任意配列が挟まれていてもよい。
【００４４】
5'末端領域にハイブリダイズできる配列及び3'末端領域にハイブリダイズできる配列は、それぞれ通常５〜50bp程度、特に10〜40bp程度の長さであることが好ましい。余りに長いとアニール特異性が低下し、余りに短いとアニールが不安定になって目的配列を有するDNAのライゲーションが行われ難くなる。また、これらの間に挟まれることのある任意配列は、1000bp以下程度、特に10bp以下程度の長さであることが好ましい。余りに長いと目的配列を有するDNAのライゲーションが行われ難くなるからである。
【００４５】
補助的な一本鎖線状核酸を目的配列を有する線状一本鎖の両端にアニールさせるときの温度は、目的配列を有する線状一本鎖DNAに対するアニール選択性が最も高くなるように選択すればよい。アニール選択性が最も高くなる温度とは、補助的一本鎖核酸と目的配列を有する線状一本鎖DNAとが特異的に結合し且つミスマッチによる非特異的結合が最小になる温度であり、一本鎖核酸の組み合わせ毎に徐々に昇温させて見出せばよい。通常は、０〜80℃程度とすればよい。
【００４６】
一本鎖線状DNAを環状にした後は、補助的な一本鎖核酸を変性させることにより除去してもよいが、後に行うローリングサークル型複製は核酸二重鎖を剥がしながらプライマー伸長物の合成を進めることができるため、補助的な一本鎖核酸は必ずしも除去しなくてもよい。
【００４７】
目的配列を有する二本鎖DNAの両末端を連結する場合、及び、目的配列を有する一本鎖DNAの両末端を連結する場合に用いるDNAリガーゼは、特に限定されない。例えば、Ｔ４DNAリガーゼ、Ｔ７DNAリガーゼ、大腸菌（E.coli）DNAリガーゼ又は耐熱性DNAリガーゼ（TaqリガーゼやPfuリガーゼ、Ampリガーゼ、Thermus thermophilus DNAリガーゼなど）を用いることができる。上記説明した補助的一本鎖核酸を用いたDNAの環状化を行う場合は、アニール選択性を向上させるために比較的高温でDNA連結反応を行う場合があるため、耐熱性DNAリガーゼを用いることが好ましい。ＤＮＡリガーゼを用いたDNA連結反応は常法に従い行えばよく、例えば特開昭63-22197号公報又は WO90/01069に記載の方法を用いることができる。
【００４８】
目的配列を有する線状一本鎖DNA又は線状二本鎖DNAの各鎖の５'末端にはリン酸基を付加しておくことが好ましい。これによりセルフライゲーションが行われ易くなる。リン酸基の付加は、例えばＡＴＰの存在下で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを作用させることにより行うことができる。或いは、核酸合成の際に修飾することもできる。
【００４９】
工程(1)において用意する環状DNAは、目的配列を有していればよく、通常は、その間に任意配列を有していてもよい。この任意配列の長さは、1000塩基以下程度、特に100塩基以下程度であることが好ましい。
工程(2）
＜プライマーA＞
プライマーAは、上流（5'末端側）から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール部分とこの環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有する。
【００５０】
環状DNAが二本鎖である場合は、通常、いずれの鎖を鋳型にしてもよい。但し、たとえばマルチマータンパク質をコードするDNAを製造する場合は、目的配列を有する鎖とはアニールしない第１非アニール部分とこの鎖の一部とアニールできる第１アニール配列を有していればよい。
【００５１】
ここで、第１アニール部分は、何らかの条件下で環状DNAの一部とアニールできればよい。また第１非アニール部分は、第１アニール部分を環状DNAにアニールさせる条件下で環状DNAとはアニールしないものであればよい。
【００５２】
第１アニール部分の長さは、環状DNAの一部に特異的に結合できるだけの長さで有ればよく、通常PCRプライマーとして使用できる15〜100塩基程度、特に20〜50塩基程度であればよい。
【００５３】
第１非アニール部分は、工程(4)においてPCRプライマーとして用いるものであるため、通常PCRプライマーとして使用できる15〜100程度程度、特に20〜50塩基程度であればよい。
【００５４】
また第１アニール配列の下流側(3'末端側）に、長い任意配列が付加されているとDNAポリメラーゼによるDNA複製反応を阻害するため、このような任意配列は存在しない方がよい。
【００５５】
プライマーは公知の方法で合成すればよい。このような公知の方法として、例えばABI社（Applied Biosystems Inc.）のDNAシンセサイザーを用いたホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、H-ホスホネート法、チオホスファイト法等が挙げられる。また、生物学的起源、例えば細菌のDNAを制限エンドヌクレアーゼで消化することにより得られる消化物から単離してもよい。
＜ローリングサークル型複製反応＞
ローリングサークル型複製反応で使用するDNAポリメラーゼは、ディスプレイスメント活性を有するものであればよい。例えば、φ２９DNAポリメラーゼ又はＭ２DNAポリメラーゼのようなファージ由来のディスプレイスメント活性を持つDNAポリメラーゼを用いることができる。特に、反応効率が高い点で、Ｍ２DNAポリメラーゼが好ましい。
【００５６】
ローリングサークル型複製反応は、例えばdNTP（(dATP、dCTP、dGTP、dTTP）の４種のデオキシリボヌクレオチド）の存在下でDNAポリメラーゼを鋳型である上記環状一本鎖DNAに作用させてDNA鎖伸長反応を行わせることにより進行させることができる。詳しくは、例えば特許第２９０７２３号又はジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology, Vol.56, 341-361, 1971）に記載の方法により行える。
【００５７】
また、プライマーAにプロモーター配列が含まれている場合は、ローリングサークル型複製反応で得られた一本鎖DNAを鋳型として、NTP（ATP、CTP、GTP、TTP）の４種のリボヌクレオチドの存在下でRNAポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなど）を用いてRNA合成反応を行わせることにより、環状DNAの一方の鎖に相補的な配列を繰り返し有する一本鎖ＲＮＡを得ることができる。さらに、このRNAを鋳型として逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡに再度RNAポリメラーゼを作用させることを繰り返すことにより、工程(2)において、大量にRNAを合成することもできる。目的配列が、リボザイム、アンチセンス等をコードするものであれば、この操作により、リボザイム、アンチセンス等を大量に得ることができる。この操作は、DNAポリメラーゼによるローリングサークル型複製と別途行ってもよく、同時に行ってもよい。
工程(3)
＜プライマーB＞
プライマーBは、上流（5'末端側）から順に、ローリングサークル型複製により得られた繰り返し一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール部分、及び、繰り返し一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有する。
ここで、第２アニール配列は、何らかの条件下で繰り返し一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできればよい。また第２非アニール部分は、第２アニール部分を繰り返し一本鎖核酸にアニールさせる条件下で繰り返し一本鎖核酸とはアニールしないものであればよい。
【００５８】
第２アニール部分の長さは、繰り返し一本鎖核酸の一部に特異的に結合できるだけの長さで有ればよく、通常PCRプライマーとして使用できる15〜100塩基程度、特に20〜50塩基程度であればよい。
【００５９】
第２非アニール部分は、工程(4)においてPCRプライマーとして用いるものであるため、通常PCRプライマーとして使用できる15〜100塩基程度、特に20〜50塩基程度であればよい。
【００６０】
第２アニール配列の下流側(3'末端側）に、長い任意配列が付加されているとDNAポリメラーゼによるDNA合成反応を阻害するため、このような任意配列は存在しない方がよい。
＜相補鎖合成＞
相補鎖合成にあたり、プライマーBを繰り返し配列を有する一本鎖核酸にアニールさせる。アニール条件は、最大のアニール選択性が得られる温度、溶液条件とすればよく、具体的には繰り返し一本鎖DNAとプライマーBとが特異的に結合し、且つ、ミスマッチによる非特異的結合が最小になる温度を昇温させることにより選択すればよい。
＜相補鎖合成反応＞
工程(3)で使用するDNAポリメラーゼの種類は特に限定されない。例えばE.coliポリメラーゼＩ、クレナウフラグメント（Klenow Fragment）、各種
耐熱性DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、QβレプリカーゼのようなRNAポリメラーゼ等の公知の酵素を使用できる。
【００６１】
但し、本発明方法により得られるDNAをタンパク質の製造又はアプタマーの繰り返し配列の製造などに用いる場合は、例えばラダーマーカー等の製造に用いる場合と異なり塩基配列自体が重要であるため、校正機能を有するDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。校正機能を有するDNAポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドの取り込みミスを修正することができ、結果として合成されたDNAの変異出現率を極めて小さく抑えらることができる。校正機能を有するDNAポリメラーゼとしては、例えばKOD DNAポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼ、PfuTurboポリメラーゼ、PfuUltraポリメラーゼ、Deep Ventポリメラーゼ、Pfxポリメラーゼなどが挙げられる。特に校正機能の高さの点からKOD DNAポリメラーゼが好ましい。
【００６２】
プライマーBの繰り返し配列を有する一本鎖核酸へのアニール及び相補鎖合成は、順次行ってもよく、実質的に同時に行ってもよい。
【００６３】
ローリングサークル型複製により得られる一本鎖核酸は目的配列を種々の個数含む複数種類の一本鎖核酸の混合物である。また、個々の一本鎖核酸はプライマーBの第２アニール配列とアニールできる配列を複数有するため、工程(3)により生じる二本鎖核酸は、目的配列を種々の個数含む種々の長さの二本鎖核酸の混合物である。
工程(4)
種々の長さの二本鎖核酸の中から所望の長さの二本鎖核酸を分離するにあたっては、各長さの二本鎖核酸を比較的多量に必要とする。しかし、工程(2)のローリングサークル型複製及び工程(3)の相補鎖合成により必要量の二本鎖核酸を得ようとすると長時間を要し非効率的である。このため、本発明方法は、プライマーAに第１非アニール部分を設け、プライマーBに第２非アニール部分を設けることにより、工程(3)により生じる二本鎖核酸混合物の各々をPCRで増幅できることが最大の特徴となっている。
＜プライマーC＞
プライマーCは、プライマーAの第１非アニール配列に何らかのPCR条件下でアニールできるものであればよく、好ましくはプライマーAの第１非アニール配列と相補的な配列であればよい。
【００６４】
プライマーCのアニール部分の5'末端側には任意の配列が付加されていてもよいが、3'末端側に長い任意配列を有するとDNA鎖の伸長反応が阻害されるため、有している場合でも２塩基以下程度であることが好ましい。なお、プライマーCにおいて、プライマーAの第１非アニール部分とアニールする部分の下流側には、プライマーAの第１アニール部分とアニールできる配列が付加されていることは構わない。
＜プライマーD＞
プライマーDは、プライマーBの第２非アニール部分に何らかのPCR条件下でアニールできるものであればよい。プライマーDのアニール部分の5'末端側には任意の配列が付加されていてもよいが、3'末端側に長い任意配列を有するとDNA鎖の伸長反応が阻害されるため、有している場合でも２塩基以下程度であることが好ましい。なお、プライマーDにおいて、プライマーBの第２非アニール部分とアニールする部分の下流側には、プライマーBの第２アニール部分とアニールできる配列が付加されていることは構わない。
【００６５】
プライマーC及びプライマーDの長さは、それぞれプライマーAの第１アニール部分及びプライマーBの第２アニール部分とアニールできる程度の長さを有するとともに、余りに長すぎてアニール特異性が低下したりDNA伸長反応が阻害されたりすることがない程度の長さとすればよい。具体的には、15塩基以上程度、特に20塩基以上程度、100塩基以下程度、特に50塩基以下程度であることが好ましい。
＜PCR＞
二本鎖核酸混合物を鋳型として、プライマーC及びプライマーDをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて、dNTPの存在下でDNAポリメラーゼを作用させることによりポリメラーゼチェーン反応(PCR)を行う。
【００６６】
プライマーC及びプライマーDのアニール条件は、最大のアニール特異性が得られる温度、溶液条件とすればよい。
【００６７】
また、DNAポリメラーゼは、一般にPCRに用いられる耐熱性DNAポリメラーゼを制限なく使用できる。このような酵素として、例えばTaq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ等が挙げられる。但し、本発明方法によりタンパク質製造のためのDNAを合成する場合又はアプタマーを繰り返し有するDNAを製造する場合は、配列自体が重要であるため、校正機能を有する耐熱性DNAポリメラーゼ（例えばKOD DNAポリメラーゼ等）を用いることが好ましい。
【００６８】
以上の工程により、目的配列を繰り返し有する二本鎖DNAの混合物が得られる。
工程(5)
本発明において、必要に応じて、工程(5)を行い、例えば二本鎖DNA混合物を電気泳動、HPLCなどのクロマトグラフィー等に供することにより長さ別に分離し、目的長さのDNAを分離すればよい。電気泳動は常法やクロマトグラフィーに従い行えばよい
例えば、アプタマーを製造する場合は、アプタマー配列を種々の個数有する核酸の混合物であってもよいが、アプタマー配列を同じ個数有する核酸の集合物としておくことにより、センサーチップに固定又は付着させる場合に、単位面積あたりのアプタマー数を揃えることができ、その結果感度ムラのないセンサーチップが得られる。
【００６９】
また、目的配列として特定長さの配列を用い、ラダーマーカーを製造する場合は、電気泳動又はクロマトグラフィーなどにより、特定長さの配列の繰り返し数が一定範囲の核酸を選択してもよい。
【００７０】
本工程において、目的長さの核酸は上記のような条件下で２本鎖状態で分離してもよいが、本発明者らは、１本鎖状態で分離する方がより効率良く分離を行い得ることを見い出した。例えば、２本鎖核酸混合物をアルカリアガロースゲル電気泳動に供することにより、目的長さの１本鎖核酸を分離することができる。アルカリアガロースゲル電気泳動は、例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Joseph Sambrook & David W. Russell, Cold spring Harbor Laboratory Pressに記載されている方法を採用できる。
工程(6)
また、アプタマーやアンチセンスなどを製造する場合のように、得られた二本鎖DNAを一本鎖DNAにする必要がある場合は、二本鎖DNAを熱、アルカリ、酸、尿素、ホルムアミド、DNAヘリカーゼのような酵素等で処理することにより変性させて一本鎖DNAにすればよい。アルカリ処理は、例えば0.2〜1規定程度のNaOHで1〜30分間処理した後、等量のHClで中和することにより行える。酸処理は、例えば0.01〜1規定程度のＨＣｌで1〜30分処理した後、NaOHで中和することにより行える。
【００７１】
DNA変性処理は、所望の長さの二本鎖DNAの分離と同時に行ってもよく、所望の長さの二本鎖DNAの分離の後に行ってもよいが同時に行う方が簡単で好ましい。例えば、二本鎖DNA混合物をアルカリアガロースゲル電気泳動に供することにより、目的長さの一本鎖DNAを分離することができる。アルカリアガロースゲル電気泳動は、例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Joseph Sambrook & David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている方法を採用できる。
工程(7)
工程(5)又は工程(6)により得られた所望長さのDNAは、必要に応じてPCRにより増幅すればよい。プライマーは、対象DNAの末端部分の配列に基づき適宜設計すればよい。例えば目的配列を５回有する直鎖状一本鎖DNAを分離回収し、それを鋳型としてPCR反応を行えば、目的配列を５回有する直鎖状二本鎖DNAを大量に得ることができる。
【００７２】
目的配列が例えばアプタマー配列である場合は、最終的に、目的配列を２〜20個程度有する一本鎖核酸を得ればよい。また、目的配列がタンパク質をコードする配列である場合は、全体としてベクターに挿入できる程度の個数であればよく、タンパク質の種類によって異なるが、目的配列を通常２〜10個程度有する二本鎖DNAを得ればよい。また、目的配列が核酸ラダーマーカーの単位である場合は、通常１〜20個程度の繰り返し数を有する核酸の混合物とすればよい。
【００７３】
また最終的に得られる核酸は、目的配列がタンパク質をコードする配列である場合は二本鎖DNAとし、目的配列がアプタマー配列である場合は、一本鎖DNA又はRNAとし、目的配列がラダーマーカーの単位配列である場合は、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNAとすればよい。
【００７４】
また本発明により目的配列を複数有する核酸が得られるが、この核酸は、全く同一の配列が複数繰り返されたもの、及び、ポリメラーゼによる塩基の読み間違いによって一部異なるが略同一の配列が複数繰り返されたものの双方を含む。
(II)タンパク質の製造方法
本発明のタンパク質の製造方法は、上記本発明の同一配列を複数有するDNAの合成方法において、工程(1)の環状DNAとして、目的タンパク質をコードする塩基配列又はそれに相補的な配列を有する環状DNAを用意し、他は上記方法の工程(4)までを同様にして行うことにより、目的タンパク質をコードする配列を複数有する二本鎖DNAの混合物を得た後、
この二本鎖DNAをベクターに挿入して発現ベクターを得る工程(8)と、
この発現ベクターで宿主を形質転換する工程(9)と、
この形質転換体を培養し培養物から目的タンパク質を回収する工程(10)とを含む方法である。
【００７５】
本発明において、タンパク質をコードする配列には、タンパク質の全長をコードする配列及びタンパク質の一部をコードする配列が含まれる。
【００７６】
目的タンパク質の種類は特に限定されず、例えば酵素、抗体、ペプチド抗原、レセプターなどのどのようなタンパク質であってもよい。
＜ベクター＞
ベクターは、公知のベクターを宿主に応じて広い範囲から選択して用いることができる。例えば大腸菌を宿主とする場合にはpBR322、pUC18、pUC19、pUC119、pBluescript等、バチルス属細菌を宿主とする場合にはpUB110、pC194等が挙げられる。酵母を宿主とする場合にはYIp5、YEp24等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合にはAcNPV等が挙げられる。動物細胞を宿主とする場合にはpERV3、pEGSH等が挙げられる。
【００７７】
このような公知のベクターのプロモーターの下流の発現可能な位置に二本鎖DNAを挿入することにより発現ベクターが得られる。
＜形質転換＞
宿主も公知のものを制限なく使用できる。例えば大腸菌（例えばJM109、HB101、C600、DH5、DH5α、W3110）、バチルス属細菌（例えばMI114）のような細菌、酵母（例えばAH22）、昆虫細胞（例えばSf細胞）、動物細胞（例えばCOS-7細胞、Vero細胞、CHO細胞等）が挙げられる。
【００７８】
宿主の形質転換方法も、公知の方法から、宿主に応じて適した方法を選択すればよい。公知の導入方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法等が挙げられる。また市販のコンピテントセル（例えば、東洋紡績社製Competent high JM109）を用いて添付された実験手順に従って形質転換すれば便利である。また、トンプソン等の方法 (Journal of Bacteriology, Vol.151, 668-677, 1982) などがある。
＜形質転換体の培養＞
形質転換体が微生物である場合は、微生物の培養に通常使用される液体培地又は平板培地を用いて培養すればよい。通常は、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて硝酸塩、リン酸塩等を含有する培地を用いればよい。炭素源としては、澱粉又は澱粉加水分解物、糖密、ペプトン類等が好適に用いられる。窒素源としては、ポリペプトン、トリプトン、肉エキス、酵母エキス等を使用できる。培養温度は微生物の生育可能温度内であればよく、例えば15〜40℃程度が挙げられる。培地のpHも微生物の生育可能範囲であればよく、例えば6〜8程度が挙げられる。培養時間は、培養物中の目的タンパク質の量が最大になる時間とすればよく、その他の培養条件により異なるが、通常１〜５日間程度、特に１〜２日間程度とすればよい。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型の発現ベクターを用いる場合には、誘導時間は１日間以内、特に数時間程度とすればよい。
【００７９】
形質転換体が哺乳動物細胞である場合にも、当該細胞に応じて適した条件で培養すればよい。例えばFBSを添加したDMEM培地（ニッスイ社製等）を用い、５％CO2存在下に36〜38℃程度の温度で、数日ごとに新しい培地に交換しながら培養することができる。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えばトリプシンPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、得られた細胞の懸濁液を数倍に希釈して新しいシャーレに播種し継代を続ければよい。培養日数は、通常２〜５日間程度、特に２〜３日間程度とすることが好ましい。
【００８０】
形質転換体が昆虫細胞の場合も、細胞の種類に応じて適した培養条件とすればよい。例えばFBS及びYeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地を用いて、25〜35℃程度で培養することができる。培養時間は１〜５日間程度、特に２〜３日間程度とすることが好ましい。また、ベクターとしてBaculovirus等のウィルスを含む形質転換体の場合は、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前まで（例えば３〜７日間程度、特に４〜６日間程度）とするのが好ましい。
【００８１】
培養終了後、目的タンパク質が宿主内に生産されるものである場合は、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、必要に応じて、細胞を適当なバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ホモジナイザー、フレンチプレス等の機械的方法で破砕すればよい。宿主が細菌である場合は、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の細胞壁溶解酵素で処理してもよい。
【００８２】
得られた破砕液を2000〜15000ｇ程度で５〜10分間程度遠心分離することにより、上清に目的タンパク質が回収される。また、目的タンパク質が宿主外に分泌させるものである場合は、培養上清に目的タンパク質が回収される。
＜目的タンパク質の精製＞
必要に応じて、得られた粗タンパク質液を、公知のタンパク質精製方法、例えば塩析、透析による脱塩、イオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、目的タンパク質を精製すればよい。
(III)マルチマータンパク質の製造方法
マルチマータンパク質をコードするDNAの製造
マルチマータンパク質を製造するに当たっては、先ず、本発明の同一配列を複数有するDNAの合成方法に従い、マルチマータンパク質をコードするDNAを製造する。
【００８３】
即ち、目的タンパク質をコードする塩基配列と相補的な配列であってスタートコドン及びストップコドンを除いた目的配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAの目的配列とはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの目的配列の一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖DNAとはアニールしない第２非アニール配列、及び、この一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含む方法によりマルチマータンパク質をコードするDNAを製造する。
【００８４】
工程(1)において、目的配列とは、環状DNAが環状一本鎖DNAであればその一本鎖が目的配列であり、環状DNAが環状二本鎖DNAであれば、マルチマータンパク質をコードする塩基配列及び該塩基配列に相補的な配列が目的配列である。
スタートコドン及びストップコドンを除いた配列とするのは、一セットのスタートコドンとストップコドンとの間に同じタンパク質をコードする配列を複数並べることにより、同じアミノ酸配列が複数配置されたマルチマータンパク質が得られるからである。
【００８５】
マルチマータンパク質を発現するためには、新たなスタートコドンとストップコドンとを付加する必要がある。これらはプライマーA及びプライマーBの非アニール部分に含ませることができ、又は、後述するベクターに予め含ませておくこともできる。例えば、プライマーAの第１非アニール部分にスタートコドンを含ませ、プライマーBの第２非アニール部分にストップコドンの相補的配列を含ませればよい。または、プライマーAの第１非アニール部分にストップコドンの相補的配列を含ませ、プライマーBの第２非アニール部分にスタートコドンを含ませてもよい。これにより、工程(4)において、一方の鎖にスタートコドンとストップコドンとが存在し、その間にタンパク質をコードする塩基配列が並列した（タンデムに並んだ）二本鎖DNAが増幅される。
＜マルチマータンパク質の製造＞
得られた二本鎖DNAを前述したようにして、ベクターに挿入して発現ベクターを得て、この発現ベクターで宿主を形質転換し、形質転換体を培養し、培養産物からマルチマータンパク質を回収すればよい。
(IV)センサーの製造方法
本発明のセンサーの製造方法は、アプタマー配列を複数有する一本鎖核酸を製造し、このDNAをセンサーチップ基体の表面に固定又は吸着させてセンサーチップを製造し、さらにこのセンサーチップと検出装置とを接続する方法である。
【００８６】
アプタマー配列を複数有するDNAは、アプタマー配列を有する環状DNAを用意する工程(1)と、
上流側から順に、この環状DNAとはアニールしない第１非アニール配列、及び、この環状DNAの一部とアニールできる第１アニール配列を有するプライマーAを用いて、この環状DNAを鋳型としたローリングサークル型複製反応を行う工程(2)と、
上流側から順に、ローリングサークル型複製反応により得られた一本鎖核酸とはアニールしない第２非アニール配列、及び、ローリングサークル型複製により得られた一本鎖核酸の一部であって第１アニール配列部分とは異なる部分とアニールできる第２アニール配列を有するプライマーBを用いて、この一本鎖核酸の相補鎖合成反応を行う工程(3)と、
プライマーAにおける第１非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーC及びプライマーBにおける第２非アニール配列にアニールできる配列を有するプライマーDを用いて、工程(3)において得られた二本鎖核酸を鋳型としたポリメラーゼチェーン反応を行う工程(4)と
を含む方法により製造できる。
【００８７】
アプタマーの種類は特に限定されない。例えば酵素、レセプターなどのタンパク質、糖類、脂質、それらの複合体等と特異的に結合できる核酸が対象になる。核酸はDNA及びRNAのいずれであってもよい。RNAの場合は、工程(4)のPCRの後にRNAを合成すればよい。
【００８８】
またPCRにより得られる核酸は、二本鎖DNAであるが、アプタマーとして利用する際には、変性により一本鎖にすればよい。例えば95〜100℃程度で２〜５分間程度熱処理することにより、アプタマーとして利用できる核酸を得ることができる。
【００８９】
また、得られたDNAは、アプタマー配列の繰り返し数の異なる種々の長さの二本鎖DNAの混合物であるため、長さを揃えたい場合は、変性アガロースゲル電気泳動等により同一長さを有する一本鎖DNAを分離すればよい。これにより、得られたアプタマーをセンサーチップ基体表面に塗布し固定又は吸着させて得られるセンサーチップの全体にわたり、単位面積当たりのアプタマー数を揃えることができ、センサーチップの感度ムラを低減することができる。
【００９０】
センサーチップ基体表面の材質は特に限定されず、公知のものを制限なく使用できる。例えば表面に金属層を有するセンサーチップ基体が挙げられる。基体表面に核酸を固定又は吸着させる方法は既に周知であり、例えばJ. Am. Chem. Soc., Vol.121, 8044-8051(1999);Anal. Chem., Vol.71, 3928-3934( 1999);Annu. Rev. Phys. Chem., Vol.51, 41-63( 2000);Anal. Chem., Vol.73, 1-7( 2001);J. Am. Chem. Soc., Vol.124, 6810-6811(2002)に記載の方法を採用できる。
【００９１】
このようにして得られたセンサーチップを検出装置と組み合わせることによりセンサーが得られる。検出器の種類も特に限定されず公知のものを使用できる。本センサーチップを接続する検出装置としては、表面プラズモン共鳴を利用した装置や水晶マイクロバランス法を利用した装置が挙げられる。具体的には、MultiSPRinter（東洋紡績社）、Biacore（ビアコア社）、AffinixQ（イニシアム社）などが挙げられる。
【００９２】
このようにして得られたセンサーに試料を接触させると、試料中にアプタマーの結合対象物質が存在すれば、それがアプタマーに結合により補足されて検出装置により検出される。
【発明の効果】
【００９３】
本発明方法によれば、従来製造が困難であった同一配列を複数有するDNAを確実に得ることができる。また、特別な装置、器具および試薬を必要とせず、汎用されている装置、器具および試薬のみを用いて所望の同一配列を複数回有する核酸を合成することができる。
【００９４】
特に、この配列がタンパク質をコードする配列である場合は、これをベクターにクローニングして得られる発現ベクターで宿主を形質転換し、この形質転換体を培養して培養物から目的タンパク質を回収することより、所望のタンパク質を効率的に製造することができる。
【００９５】
また、この配列がアプタマー配列である場合は、アプタマー配列を複数回有する一本鎖DNAを合成し、これをセンサーチップに固定化してセンサーを製造すれば、センサーチップの単位面積当たりのアプタマー数が増えるため、その分検出感度が向上する。
【００９６】
また本発明方法によれば、単位配列の長さだけ異なる長さを有する核酸の混合物を簡単に得ることができ、ラダーマーカーとして好適に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９７】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
材料の購入先
なお、以下の実施例において、DNA（一本鎖オリゴヌクレオチド）は北海道システム・サイエンス株式会社あるいは株式会社アイ・シー・エムより購入した。その他の試薬類はナカライテスク株式会社、和光純薬工業株式会社又は中山商事株式会社より購入した。
ローリングサークル増幅反応用DNAポリメラーゼの調製
実施例で使用したローリングサークル増幅反応用のＭ２DNAポリメラーゼは、J. Gen. Appl. Microbiol., Vol.39, 467-478, 1993に記載の発現ベクターを使用し、J. Gen. Appl. Microbiol., Vol.39, 467-478, 1993に記載の方法にて調製した。その際、培養スケールは８Ｌとし、37℃で培養し、120Klett単位の時に２mM IPTGの誘導条件でさらに２時間培養することで菌体を調製した。精製は、菌体破砕液より硫安塩析により粗酵素液を調製後、Phosphocellulose、Heparin Sepharose CL-6B、Heparin Sepharose CL-6B、DEAE-Toyopearlのカラムクロマトグラフィーにて実施し、最終的に単一なＭ２DNAポリメラーゼを得た。
【実施例１】
【００９８】
同一配列を複数回有する二本鎖DNAの作成
(1)環状一本鎖DNAの合成
(1-1)以下の試薬組成物を調製した。
直鎖状一本鎖DNA（配列番号１：RCA100-2）       250pmol
直鎖状一本鎖DNA（配列番号２：lig-temp)        500pmol
Ampligase（epicentre社）                      ３μｌ
（15U、酵素濃度は5U/μｌ）
10X  Ampligase  buffer                        7.5 μl           
合計                                          75 μｌ
(1-2)  (1-1)の試薬組成物に対し、以下の反応条件で直鎖状一本鎖DNA（RCA100-2）の末端を連結し、環状一本鎖DNAを合成した。
【００９９】
９４℃           ３０秒
６０℃           １５分
サイクル数       ４０回
(2)環状一本鎖DNAへのアニーリング
(2-1)以下の試薬組成物を調製した。
(1)で合成した環状一本鎖DNA                   約15pmol
プライマーA（配列番号３：RCA）               300pmol
Tris-HCl（ｐＨ８．２）                       17mM
MgCl2                                        17mM      
合計                                         20μｌ
(2-2) (2-1)の試薬組成物を85℃で10分間処理後、20分間かけて20℃まで下げることにより、環状一本鎖DNAにプライマーAをアニールした。
(3)ローリングサークル増幅反応
(3-1)以下の試薬組成物を調製した。
(2)で調製したアニーリング産物      20μｌ
Tris-HCl（ｐＨ８．５）             50ｍＭ
dNTP                               250μＭ
MgCl2                              20ｍＭ
Ｍ２DNAポリメラーゼ                0.8μｇ
合計                               ３０μｌ
(3-2)  (3-1)の試薬組成物を３０℃で約３０分間反応後、９４℃で３分間加熱し、反応を止めた。
(4)相補鎖合成
(4-1)以下の試薬組成物を調製した。
(3)で調製したローリングサークル増幅産物           15μｌ
プライマーB（配列番号４：R-pol）                  300pmol
dNTP                                              200μM
MgSO4                                             1ｍM 
KOD-Plus DNAポリメラーゼ（東洋紡績）              １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                             5μl       
合計                                              50μl
(4-2)  (4-1)の試薬組成物を９４℃で２分間処理後、６０秒間かけて６８℃まで下げ、６８℃で２分間反応させた。
(5)PCR反応
(5-1)以下の試薬組成物を調製した。
(4)で調製したDNA産物                               5μｌ
プライマーC（配列番号５：PCR-S）                   0.2μM
プライマーD（配列番号６：PCR-AS）                  0.2μＭ
dNTP                                               200μＭ
MgSO4                                              1ｍＭ
KOD-Plus DNAポリメラーゼ                          １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                              5μｌ      
合計                                               50μｌ
(5-2)  (5-1)の試薬組成物に対し、まず９４℃で２分間処理後、以下の反応条件でPCR反応を実施し、直鎖状一本鎖DNA（配列番号１：RCA100-2）の配列に由来する同一配列を複数回有する二本鎖DNAを合成した。
【０１００】
９４℃           １５秒
６８℃           １５秒
サイクル数       ３５回
(6)アルカリアガロースゲル電気泳動による検出
(5)で合成した同一配列を複数回有する二本鎖DNAを試料とし、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Joseph Sambrook & David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press）記載の方法にて２％アガロースゲルを用いてアルカリアガロースゲル電気泳動を実施した。電気泳動後にゲルを中和し、さらにSYBR  Gold（Molecular Probes社）にて染色することにより一本鎖DNAを検出した。
【０１０１】
ゲルの外観を図１に示す。直鎖状一本鎖DNA（配列番号１：RCA100-2）の配列に由来する同一配列を複数回有する一本鎖DNAに相当するDNAが検出されており、本発明の方法によって同一配列を複数回有する一本鎖DNAを作成し得ることが確認された。
【実施例２】
【０１０２】
メタロチオネインのマルチマーDNAの作成
(1)直鎖状一本鎖DNAの調製
(1-1)以下の試薬組成物を調製した。
直鎖状一本鎖DNA（配列番号７：PCR189-part1）        １ｎＭ
直鎖状一本鎖DNA（配列番号８：PCR189-part2）        １ｎＭ
直鎖状一本鎖DNA（配列番号９：PCR189-part3）        １ｎＭ
プライマー（配列番号１０：189-s-p）                0.2μＭ
プライマー（配列番号１１：189-as-b）               0.2μＭ
dNTP                                               200μＭ
MgSO4                                              １ｍＭ
KOD-Plus DNAポリメラーゼ                           １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                               5μｌ      
合計                                                50μｌ
(1-2)  (1-1)の試薬組成物に対し、まず９４℃で２分間処理後、以下の反応条件でPCR反応を実施し、直鎖状二本鎖DNAを合成した。
【０１０３】
９４℃           １５秒
５５℃           １５秒
６８℃           ５秒
サイクル数       ４０回
(1-3)  (1-2)の増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、MagExtractor  -PCR&Gel  Clean up-（東洋紡）にてゲルから増幅断片を二本鎖DNAとして抽出した。その後、アルカリバッファー(0.1M NaOH, 0.1M NaCl)中において二本鎖DNA を解離させ、MAGNOTEX-SA（TAKARA社）を用いて5'-末端をビオチン化した方のDNA 鎖をビーズに捕捉し、目的の5'-リン酸化一本鎖DNA のみを回収した。回収した DNA 鎖はエタノール沈澱をして精製した。
(2)環状一本鎖DNAの合成と精製
(2-1)以下の試薬組成物を調製した。
(1)で調製した直鎖状一本鎖DNA                       約500pmol
直鎖状一本鎖DNA（配列番号２：lig-temp）            1000pmol
Ampligase                                          １μｌ（５U）
10X  Ampligase  buffer                             ２μｌ            
合計                                               20μｌ
(2-2)  (2-1)の試薬組成物に対し、以下の反応条件で直鎖状一本鎖DNAの末端を連結し、環状一本鎖DNAを合成した。
【０１０４】
９４℃           ３０秒
６０℃           １０分
サイクル数       ４０回
(1-3)  (1-2)の反応物を試料として、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、１１００ｂａｓｅ付近の位置に現れる環状一本鎖DNAのバンドを切出す。切出したゲルを細かく砕き、溶出バッファー(0.5M 酢酸アンモニウム、10mM 酢酸マグネシウム、1mM EDTA(pH8.0) )を加えて37℃で3時間程度インキュベートし、遠心分離でゲルを沈澱させて除去した上清をエタノール沈澱した。
(3)環状一本鎖DNAへのアニーリング
(3-1)以下の試薬組成物を調製した。
(2)で調製した環状一本鎖DNA                       約15pmol
プライマーA（配列番号１２：RCA3）                300pmol
Tris-HCl（ｐＨ８．２）                           17ｍＭ
MgCl2                                            17ｍM       
合計                                             20μｌ
(3-2)  (3-1)の試薬組成物を８５℃で１０分間処理後、２０分かけて２０℃まで下げることにより、環状一本鎖DNAにプライマーAをアニールした。
(4)ローリングサークル増幅反応
(4-1)以下の試薬組成物を調製した。
(3)で調製したアニーリング産物                    20μｌ
Tris-HCl（ｐＨ８．５）                           50ｍＭ
dNTP                                             250μＭ
MgCl2                                            20ｍＭ
Ｍ２DNAポリメラーゼ                              0.8μｇ      
合計                                             30μｌ
(4-2)の試薬組成物を３０℃で約３０分間反応後、９４℃で３分間加熱し、反応を止めた。
(5)相補鎖合成
(5-1)以下の試薬組成物を調製した。
(4)で調製したローリングサークル増幅産物          15μｌ
プライマーB（配列番号１３：R-Pol3）              300pmol
dNTP                                             200μＭ
MgSO4                                            １ｍＭ
KOD-Plus DNAポリメラーゼ                         １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                            ５μｌ      
合計                                             50μｌ
(5-2)  (5-1)の試薬組成物を９４℃で２分間処理後、６０秒間かけて６８℃まで下げ、６８℃で２分間反応させた。
(6)PCR反応
(6-1)以下の試薬組成物を調製した。
(5)で調製したDNA産物                            ５μｌ
プライマーC（配列番号１４：PCR-S3）              0.2μＭ
プライマーD（配列番号１５：PCR-AS3）             0.2μＭ
dNTP                                             200μＭ
MgSO4                                            １ｍＭ
KOD-Plus DNAポリメラーゼ                         １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                            ５μｌ      
合計                                             50μｌ
(6-2)  (6-1)の試薬組成物に対し、まず９４℃で２分間処理後、以下の反応条件でPCR反応を実施し、メタロチオネインの配列に由来する同一配列を複数回有する二本鎖DNAを合成した。
【０１０５】
９４℃           １５秒
５５℃           １０秒
６８℃           ４０秒
サイクル数       ３０回
(7)アルカリアガロースゲル電気泳動と増幅DNAの抽出
(6)で合成した同一メタロチオネイン遺伝子配列を複数回有する二本鎖DNAを試料とし、モレキュラー・クローニング記載の方法にて２％アガロースゲルを用いてアルカリアガロースゲル電気泳動を実施した。電気泳動後にゲルを中和し、さらにSYBR  Goldにて染色することにより一本鎖DNAを検出した。
【０１０６】
ゲルの外観を図２に示す。メタロチオネインの配列に由来する同一配列を複数回有する一本鎖DNAに相当するDNAが検出されており、本発明の方法によって同一酵素遺伝子配列を複数回有する核酸を作成し得ることが確認された。
(8)アルカリアガロースゲルからのゲル抽出
(7)の電気泳動ゲルより所望の一本鎖DNAを切出し、細かく砕き、等量の飽和フェノールを加えて-80℃で凍結させて一本鎖DNAを回収した（バイオ実験イラストレイテッド２−遺伝子解析の基礎−（秀潤社））。
(9)目的断片のPCR
以下の試薬組成物を調製した。
(8)で調製したDNA                                       ５μｌ
プライマーC（配列表の配列番号１４記載：PCR-S3）        ０．６μＭ
プライマーD（配列表の配列番号１５記載：PCR-AS3）       ０．６μＭ
ｄＮＴＰ                                               ２００μＭ
MgSO4                                                  １ｍＭ
KOD-Plus DNAポリメラーゼ                               １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                                  ５μｌ      
合計                                               ５０μｌ
この試薬組成物に対し、まず９４℃で２分間処理後、以下の反応条件でPCR反応を実施し、メタロチオネインの配列に由来する同一配列を複数回有する二本鎖DNAを合成した。
【０１０７】
９４℃           １５秒
５５℃           １０秒
６８℃           １０秒（繰り返し回数に応じて時間を調節した）
５０℃           ５秒
サイクル数       １５回
なお、このPCRはサイクル数を多くするとスメアになる傾向が強くなるため、十分な増幅産物が得られる最低のサイクル数に設定した。
(10)アガロースゲル電気泳動でゲル抽出
(9)のPCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、MagExtaractor（東洋紡績製）で抽出した。MagExtractorで抽出したPCR増幅産物を、制限酵素HincIIで切断したpUC18にサブクローニングし、増幅した配列に変異が入っていないことを確認した。
(11)発現ベクターの構築
pUC18にサブクローニングした断片を制限酵素NdeIとSalIで切断し、同じ酵素で切断したpET-21a(+) (Novagen社製)に挿入し発現ベクターとした。
【実施例３】
【０１０８】
TaqアプタマーのマルチマーDNAの作成
(1)環状一本鎖DNAの合成
(1-1)以下の試薬組成物を調製した。
直鎖状一本鎖DNA（配列番号１６：aptq25）          50ｐｍｏｌ
直鎖状一本鎖DNA（配列番号１７：aptq-lig）        300ｐｍｏｌ
Ampligase                                        １μｌ（5U）
10X  Ampligase  buffer                           ２μｌ      
合計                                             20μｌ
(1-1)  (1-2)の試薬組成物に対し、以下の反応条件で直鎖状一本鎖DNA（aptq25）の末端を連結し、環状一本鎖DNAを合成した。
【０１０９】
９４℃           １０分
６０℃           １０分
サイクル数       ２０回
(2)環状一本鎖DNAへのアニーリング
(2-1)以下の試薬組成物を調製した。
(1)で合成した環状一本鎖DNA                ８μｌ
プライマーA（配列番号１７：aptq-lig）     100ｐｍｏｌ
Tris-HCl（ｐＨ８．２）                    17ｍＭ
MgCl2                                     17ｍＭ          
合計                                      20μｌ
(2-2)  (2-1)の試薬組成物を８５℃で１０分間処理後、１５分かけて２０℃まで下げることにより、環状一本鎖DNAにプライマーAをアニールした。
(3)ローリングサークル増幅反応
(3-1)以下の試薬組成物を調製した。
(2)で調製したアニーリング産物               20μｌ
Tris-HCl（ｐＨ８．５）                      50ｍＭ
dNTP                                        400μＭ
MgCl2                                       20ｍＭ
Ｍ２DNAポリメラーゼ                         0.8μg     
合計                                        30μｌ
(3-2)  (3-1)の試薬組成物を３０℃で約１５分間反応後、９４℃で３分間加熱し、反応を止めた。
(4)相補鎖合成
(4-1)以下の試薬組成物を調製した。
(3)で調製したローリングサークル増幅産物         14μｌ
プライマーB（配列番号１８：aptq-comp）          300pmol
dNTP                                            200μＭ
MgSO4                                           １ｍＭ
KOD-Plus DNAポリメラーゼ                        １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                           ５μｌ  
合計                                             ５０μｌ
(4-2)  (4-1)の試薬組成物を９４℃で２分間処理後、６０秒間かけて６８℃まで下げ、６８℃で２分間反応させた。
(5)PCR反応
(5-1)以下の試薬組成物を調製した。
(4)で調製したDNA産物                        ５μｌ
プライマーC（配列番号１９：aptq-s-b）       0.2μＭ
プライマーD（配列番号２０：aptq-as）        0.2μＭ
dNTP                                        200μＭ
MgSO4                                       １ｍＭ
KOD-Plus DNAポリメラーゼ                    １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                       ５μｌ      
合計                                        ５０μｌ
(5-2)  (5-1)の試薬組成物に対し、まず９４℃で２分間処理後、以下の反応条件でPCR反応を実施し、直鎖状一本鎖DNA（配列表の配列番号１６記載：aptq25）のTaqアプタマー配列に由来する同一アプタマー遺伝子配列を複数回有する二本鎖DNAを合成した。
【０１１０】
９４℃           １５秒
６８℃           ２０秒
サイクル数       ３０回
(6)アルカリアガロースゲル電気泳動による検出
(5)で合成した同一アプタマー遺伝子配列を複数回有する二本鎖DNAを試料とし、モレキュラー・クローニング記載の方法にて２％アガロースゲルを用いてアルカリアガロースゲル電気泳動を実施した。電気泳動後にゲルを中和し、さらにSYBR  Goldにて染色することにより一本鎖DNAを検出した。
【０１１１】
ゲルの外観を図３に示す。Taqアプタマーの配列に由来する同一配列を複数回有する一本鎖DNAに相当するDNAが検出されており、本発明の方法によって同一アプタマー遺伝子配列を複数回有する核酸を作成し得ることが確認された。
(7)アルカリアガロースゲル電気泳動からのゲル抽出
(6)の電気泳動ゲルより所望の一本鎖DNAを切出し、細かく砕き、等量の飽和フェノールを加えて-80℃で凍結させて一本鎖DNAを回収した（バイオ実験イラストレイテッド２−遺伝子解析の基礎−（秀潤社））。
(8)目的断片のPCR
以下の試薬組成物を調製した。
(7)で調製したDNA産物                                      ５μｌ
プライマーC（配列表の配列番号１９記載：aptq-s-b）         ０．６μＭ
プライマーD（配列表の配列番号２０記載：aptq-as）          ０．６μＭ
ｄＮＴＰ                                                  ２００μＭ
MgSO4                                                     １ｍＭ
KOD-Plus DNAポリメラーゼ                                  １ユニット
10X  KOD-Plus  buffer                                     ５μｌ      
合計                                                     ５０μｌ
この試薬組成物に対し、まず９４℃で２分間処理後、以下の反応条件でPCR反応を実施し、直鎖状一本鎖DNA（配列表の配列番号１６記載：aptq25）のTaqアプタマー配列に由来する同一アプタマー遺伝子配列を複数回有する二本鎖DNAを合成した。
【０１１２】
９４℃           １５秒
５５℃           １０秒
６８℃           １〜３秒（繰り返し回数に応じて時間を調節した）
５０℃           ５秒
サイクル数       １５回
なお、このPCRはサイクル数を多くするとスメアになる傾向が強くなるので、十分な増幅産物が得られる最低のサイクル数に設定した。
(10)アルカリアガロースゲル電気泳動
(9)で合成した同一アプタマー遺伝子配列を複数回有する二本鎖DNAを試料とし、２％アガロースゲルを用いてアルカリアガロースゲル電気泳動を実施した。電気泳動後にゲルを中和し、さらにSYBR  Goldにて染色することにより一本鎖DNAを検出した。
(11)アルカリアガロースゲル電気泳動からのゲル抽出
(10)の電気泳動ゲルより所望の一本鎖DNAを切出し、細かく砕き、等量の飽和フェノールを加えて-80℃で凍結させて一本鎖DNAを回収した。
【０１１３】
なお、得られた一本鎖DNAを応用するビアコア（Biacore）はサンプルに高純度が求められるため、最終精製をアルカリアガロースゲル電気泳動で行うのが良いと考えられた。サンプルの一部をアガロースゲル電気泳動に供し、純度を十分に確かめてからビアコア社製のチップ表面にストレプトアビジン−ビオチン結合方法で固定し、ビアコア（Biacore）のセンサーチップとして用いた。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明方法は、アプタマー製造、それを利用したセンサー製造、タンパク質製造、核酸ラダーマーカー製造などの分野に好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】実施例１における電気泳動分析結果を示す。
【図２】実施例２における電気泳動分析結果を示す。
【図３】実施例３における電気泳動分析結果を示す。
【図１】
2005095009.tif 000002
【図２】
2005095009.tif 000003
【図３】
2005095009.tif 000004
【配列表】
2005095009000001.app