(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中に含まれる被験物の分光学的測定のための装置および方法を提供する。【解決手段】この装置は、光路を形成する電磁放射線（EMR）の線源、光路内にあり、EMR線源と試料スロットとの間に位置する絞り、および光検出器からなる。装置はまた、分光学的装置と操作上連携する主キャリブレーションアルゴリズムを備えている。この装置を使用して測定できる被験物の例には、総ヘモグロビン、メトヘモグロビン、ヘモグロビンをベースとする血液代替物、およびメトヘモグロビン同等物などがあるが、これらに限定されない。メトヘモグロビンの測定は、全血中の総ヘモグロビン、または溶血指標として用いられるときのヘモグロビンの正確な測定に利用できる。メトヘモグロビンの測定も、ヘモグロビンをベースとする血液代替物の劣化または劣化の好転の監視手段、またはヘモグロビンのメトヘモグロビンへの酸化または酸化還元の監視手段として利用できる。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分光学的装置において、
ａ）電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）前記EMR線源と試料スロットとの間の光路を形成するためこの２つの間に位置する第１絞り、
ｃ）前記光路内に置かれる試料容器を受け止める、前記装置内の試料スロット、
ｄ）前記試料スロットと１つまたは２つ以上の光検出器の間にあって、光路内に位置する第２絞り、前記１つまたは２つ以上の光検出器は前記分光学的装置と操作上連携する、および
ｅ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型
からなる分光学的装置。
【請求項２】
前記試料容器が、キュベット、試料タブ、ピペット・チップ、チュービング、ラベルを貼ったテストチューブ、ラベルを貼っていないテストチューブ、血液バッグチュービング、透明試料容器、半透明試料容器およびフロースルーキュベットからなる群から選択される、請求項１に記載の分光学的装置。
【請求項３】
前記試料タブが、蓋板と基板との間に置かれた試料を含み、前記蓋板の少なくとも一部が透明または半透明であり、前記基板の少なくとも一部が透明または半透明であり、前記蓋板が前記基板にちょうつがいで接続される、請求項２に記載の分光学的装置。
【請求項４】
前記EMRの線源が、１つのタングステンランプ、１つまたは２つ以上の発光ダイオード（LED）および１つまたは２つ以上のレーザからなる群から選択される、請求項１に記載の分光学的装置。
【請求項５】
前記１つまたは２つ以上の光検出器が、光ダイオードまたは電荷結合素子（CCD）からなる群から選択される、請求項１に記載の分光学的装置。
【請求項６】
前記１つまたは２つ以上の光検出器が、前記分光学的装置内の分光器に内蔵された、列に並んだ、単一の検出器からなり、前記分光器はさらに回折格子からなる、請求項１に記載の分光学的装置。
【請求項７】
前記１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムが、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長におけるキャリブレーション試料の吸光度の次導関数、および単純線形回帰、重線形回帰および多変量解析からなる群から選択される統計技法を使用して開発された、請求項１に記載の分光学的装置。
【請求項８】
前記多変量解析が、部分最小二乗、主成分分析、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムからなる群から選択される、請求項７に記載の分光学的装置。
【請求項９】
前記試料が、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、髄液および非生体試料からなる群から選択される、請求項１に記載の分光学的装置。
【請求項１０】
前記１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムが、ヘモグロビンをベースとする血液代替物、総ヘモグロビン（Total-Hb）、オキシヘモグロビン（Oxy-Hb）、「総ヘモグロビン  マイナス  メトヘモグロビン（Total-Hb minus Met-Hb)」、メトヘモグロビン（Met-Hb）、ビリルビン、ビリベルジン、メチレンブルー、およびこれらの組合せからなる群から選択される被験物についての用途のものである、請求項１に記載の分光学的装置。
【請求項１１】
分光学的装置において、
ａ）光路を形成するための電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）前記EMRの線源と試料スロットとの間の光路に位置する絞り、
ｃ）前記光路内に置かれ、試料容器を受け止める試料スロットであって、前記試料スロットは、第１サイドおよび第２サイドからなり、前記第１サイドはEMRの線源に面している、
ｄ）第２サイドにあるまたはその近傍にある反射部材であり、前記反射部材は、反射光路を形成するため試料スロットを通過するEMRを反射するためにある、
ｅ）反射光路内に置かれた１つまたは２つ以上の光検出器であって、前記１つまたは２つ以上の光検出器は、前記分光学的装置と操作上連携する、
ｆ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる分光学的装置。
【請求項１２】
前記試料容器が、キュベット、試料タブ、ピペット・チップ、チュービング、ラベルを貼ったテストチューブ、ラベルを貼っていないテストチューブ、血液バッグチュービング、透明試料容器、半透明試料容器およびフロースルーキュベットからなる群から選択される、請求項１１に記載の分光学的装置。
【請求項１３】
前記試料タブが、蓋板と基板との間に置かれた試料を含み、前記蓋板の少なくとも一部が反射性、透明または半透明であり、前記基板の少なくとも一部が反射性、透明または半透明であり、前記蓋板が前記基板にちょうつがいで接続される、請求項１２に記載の分光学的装置。
【請求項１４】
前記EMRの線源が、１つのタングステンランプ、１つまたは２つ以上の発光ダイオード（LED）および１つまたは２つ以上のレーザからなる群から選択される、請求項１１に記載の分光学的装置。
【請求項１５】
前記１つまたは２つ以上の光検出器が、光ダイオードまたは電荷結合素子（CCD）からなる群から選択される、請求項１１に記載の分光学的装置。
【請求項１６】
前記１つまたは２つ以上の光検出器が、前記分光学的装置内の分光器に内蔵された、列に並んだ、単一の検出器からなり、前記分光器がさらに回折格子からなる、請求項１１に記載の分光学的装置。
【請求項１７】
前記１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムが、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長におけるキャリブレーション試料の吸光度の次導関数、および単純線形回帰、重線形回帰および多変量解析からなる群から選択される統計技法を使用して開発された、請求項１１に記載の分光学的装置。
【請求項１８】
前記多変量解析が、部分最小二乗、主成分分析、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムからなる群から選択される、請求項１７に記載の分光学的装置。
【請求項１９】
前記試料が、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、髄液および非生体試料からなる群から選択される、請求項１１に記載の分光学的装置。
【請求項２０】
前記１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムが、ヘモグロビンをベースとする血液代替物、総ヘモグロビン（Total-Hb）、オキシヘモグロビン（Oxy-Hb）、「総ヘモグロビン  マイナス  メトヘモグロビン（Total-Hb minus Met-Hb)」、メトヘモグロビン（Met-Hb）、ビリルビン、ビリベルジン、メチレンブルー、およびこれらの組合せからなる群から選択される被験物についての用途のものである、請求項１１に記載の分光学的装置。
【請求項２１】
分光学的装置において、
ａ）光路を生成するための電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）前記EMRの線源と試料スロットとの間の光路内に位置する絞り、
ｃ）前記光路内に置かれ、試料容器を受け止める試料スロット、
ｄ）前記試料スロットの、EMRの線源と同じ側に位置する１つまたは２つ以上の光検出器であって、前記１つまたは２つ以上の光検出器は、分光学的装置と操作上連携する、
ｅ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる分光学的装置。
【請求項２２】
前記試料容器が、キュベット、試料タブ、ピペット・チップ、チュービング、ラベルを貼ったテストチューブ、ラベルを貼っていないテストチューブ、血液バッグチュービング、透明試料容器、半透明試料容器およびフロースルーキュベットからなる群から選択される、請求項２１に記載の分光学的装置。
【請求項２３】
前記試料タブが、蓋板と基板との間に置かれた試料を含み、前記蓋板の少なくとも一部が反射性、透明または半透明であり、前記基板の少なくとも一部が反射性、透明または半透明であり、前記蓋板が前記基板にちょうつがいで接続される、請求項２２に記載の分光学的装置。
【請求項２４】
前記EMRの線源が、１つのタングステンランプ、１つまたは２つ以上の発光ダイオード（LED）および１つまたは２つ以上のレーザからなる群から選択される、請求項２１に記載の分光学的装置。
【請求項２５】
前記１つまたは２つ以上の光検出器が、光ダイオードまたは電荷結合素子（CCD）からなる群から選択される、請求項２１に記載の分光学的装置。
【請求項２６】
前記１つまたは２つ以上の光検出器が、前記分光学的装置内の分光器に内蔵された、列に並んだ、単一の検出器からなり、前記分光器がさらに回折格子からなる、請求項２１に記載の分光学的装置。
【請求項２７】
前記１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムが、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長におけるキャリブレーション試料の吸光度の次導関数、および単純線形回帰、重線形回帰および多変量解析からなる群から選択される統計技法を使用して開発された、請求項２１に記載の分光学的装置。
【請求項２８】
前記多変量解析が、部分最小二乗、主成分分析、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムからなる群から選択される、請求項２７に記載の分光学的装置。
【請求項２９】
前記試料が、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、髄液および非生体試料からなる群から選択される、請求項２１に記載の分光学的装置。
【請求項３０】
前記１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムが、ヘモグロビンをベースとする血液代替物、総ヘモグロビン（Total-Hb）、オキシヘモグロビン（Oxy-Hb）、「総ヘモグロビン  マイナス  メトヘモグロビン（Total-Hb minus Met-Hb)」、メトヘモグロビン（Met-Hb）、ビリルビン、ビリベルジン、メチレンブルー、およびこれらの組合せからなる群から選択される被験物についての用途のものである、請求項２１に記載の分光学的装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中に含まれる被験物の分光学的測定の分野に関する。さらに詳しくは、ヘモグロビン（Hb）測定に使用される方法および装置、ならびにヘモグロビンに関連する物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
全血に含まれる血清や血漿の臨床検査が日常的に行われている。通常の検査では、赤血球（RBC）は、遠心分離により血漿から分離され、また赤血球や各種血漿のタンパクは、遠心分離前に凝固させて血清から分離される。ヘモグロビン、光散乱物質（脂質粒子など）、また胆汁色素であるビリルビン（BR）やビリベルジン（BV）は、血液中の被験物の分光学的測定あるいはその他の血液分析測定を阻害し、影響を与える代表的な血液中成分である。このような成分を阻害物質と呼び、分光学的方法で測定できる。このような阻害物質が血液中に存在すると、血清や血漿の検査精度に影響を与えことになり、試料の完全性を損なうことになると言える。
【０００３】
試料中の総ヘモグロビン量（Tot-Hb）の測定に現在用いられている方法では、試薬を使用するのが好ましく、したがってオキシヘモグロビン（Oxy-Hb）、デオキシヘモグロビン（Deoxy-Hb）、カルボキシヘモグロビン（Carboxy-Hb）、メトヘモグロビン（Met-Hb）など種々のHb種が一種に変換され、この変換された種を分光法により１つの波長で測定し、時にはもう一つの波長が使用されることもある。使用される試薬は、通常、シアン化カリウムやアジドなどの有毒物質であるため、体液中ヘモグロビンの測定には試薬を使用しない方法が必要である。Harboe（Harboe, M.,1959、A method of determination of hemoglobin in plasma by near ultraviolet spectrophtometry、 Scand. J. Clin. Lab. Invest、 pp.66-70）およびTietz（Tietz Textbook of Clinical Chemistry、3rd Ed、1999、pp 1674-1676；本明細書で参考文献として引用）が、試薬を使用しない分光学的ヘモグロビン測定の例を提供している。ヘモグロビンには非常に大きい吸光信号を出すが、Hb種の吸光スペクトルは、種によって大きな違いを示す。試薬を使用しない分光学的測定は、おもにOxy-HbおよびDeoxy-Hbを含んでいる試料に限られている。試料が大気の酸素に短時間曝露されると、Deoxy-Hbは、通常Oxy-Hbに変化する。上記の２つの方法（Harboe とTietz）で誤差を生じる最大の原因は、Met-Hbが存在することである。米国特許6,689,612（Samsoondar）において、総ヘモグロビン量（Total-Hb）、オキシヘモグロビン（Oxy-Hb）、および「Total-Hbマイナスメトヘモグロビン（Met-Hb）」を溶血指標として使用すると説明されている。Met-Hbの吸収スペクトルはその他のHb種のスペクトルと非常に異なるので、Hb用に開発されたキャリブレーションアルゴリズムは、「Total-HbマイナスMet-Hb」をよりうまく予測できる可能性がある。
【０００４】
Met-HbはHbの酸化生成物であり、ヘモグロビンをベースとする血液代替物のMet-Hb形もヘモグロビンをベースとする血液代替物の酸化生成物である。自然の血液のMet-Hbあるいはヘモグロビンをベースとする血液代替物のMet-Hbは、酸素を運搬できず、従って有用なHbではない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、生体試料中に含まれる被験物の分光学的測定の分野に関する。さらに詳しくは、ヘモグロビン（Hb）測定に使用する方法および装置、ならびにヘモグロビンに関連する物質に関する。
【０００６】
本発明の目的は、改良した被験物測定用の方法および装置を提供することにある。
【０００７】
本発明によって、試料中の補正総ヘモグロビン（Corr-Total-Hb）量を測定する方法（Ａ）が提供され、前記方法（Ａ）は、
i)  試料中の総Hb（Total-Hb）、オキシヘモグロビン（Oxy-Hb）および「総ヘモグロビンマイナスメトヘモグロビン」（Total-HbマイナスMet-Hb）の１つまたは２つ以上の濃度を予測するためのTotal-Hb、Oxy-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上についての一次主キャリブレーションアルゴリズムを開発し、かつ一次値を導く工程、
ii)  試料中のMet-Hbの濃度を予測して、二次値を導くためMet-Hbの二次主キャリブレーションアルゴリズムを得る工程、
iii)  一次値および二次値を得るため、分光学的装置を使用して試料を測定する工程、および
iv）補正総ヘモグロビン量を得るため、二次値を一次値に加えるか、
または
補正総ヘモグロビン量を測定する一次主キャリブレーションアルゴリズムの１組の条件を形成するため、Total-Hb、Oxy-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上の中の１つについての一次主キャリブレーションアルゴリズムの条件を、二次主キャリブレーションアルゴリズムの条件に加える工程、
からなる。
【０００８】
Total-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」またはCorr-Total-Hbのそれぞれが、溶血の指標として使用できる。
【０００９】
本発明はまた、試料中の補正総ヘモグロビン（Corr-Total-Hb）量を測定する方法（Ｂ）に関するものであり、前記方法（Ｂ）は、
i)   １つまたは２つ以上の一次主キャリブレーションアルゴリズムおよび二次主キャリブレーションアルゴリズムからなる分光学的装置を準備する工程、前記一次主キャリブレーションアルゴリズムは、試料中のTotal-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上の濃度を予測し、それにより一次値を導くためTotal-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上のために開発され、前記二次主キャリブレーションアルゴリズムは、試料中のMet-Hbの濃度を予測し、それにより二次値を導くために開発される
ii)  一次値および二次値を得るため、分光学的装置を使用して試料を測定する工程、および
iii)  補正総ヘモグロビン量を導くため、一次値を二次値に加えるか、
または
補正総ヘモグロビン量を測定する単一キャリブレーションアルゴリズムの１組の条件を導くため、Total-Hb、Oxy-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上の中の１つについての一次主キャリブレーションアルゴリズムの条件を、二次主キャリブレーションアルゴリズムの条件に加える工程、
からなる。
【００１０】
上記の方法（Ｂ）において、Total-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」またはCorr-Total-Hbのそれぞれが、溶血の指標として使用できる。
【００１１】
本発明は、上記の方法（Ａ）または方法（Ｂ）のいずれかに関するものであり、開発、演繹または提供の工程はそれぞれ、
ａ）主キャリブレーションセットの各キャリブレーション試料について、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長で、吸光度の測定値を収集する工程であって、前記各キャリブレーション試料は、Total-Hb、Oxy-Hb、Met-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上について既知の標準値を持っている、および
ｂ）吸光度の次導関数、各キャリブレーション試料についての既知の標準値、および統計技法を使って、Total-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」およびMet-Hbの１つまたは２つ以上についての主キャリブレーションアルゴリズムを形成する工程。前記統計技法は、単純線形回帰、重線形回帰および多変量解析からなる群から選択されることが好ましい。さらに前記多変量解析は、部分最小二乗、主成分分析、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムからなる群から選択される。また、１つまたは２つ以上の波長は、約300nmから約2500nmまでの波長範囲から選択される波長、もしくはその間の値、または約450nmから約1100nmまでの波長範囲から選択される波長、もしくはその間の値からなる、
工程からなる。
【００１２】
本発明は、上記の方法（Ａ）または方法（Ｂ）のいずれかを含み、収集の工程（工程(a)）において、Total-HbまたはOxy-Hbのいずれかについての既知の標準値が、キャリブレーション試料中にOxy-Hb、Deoxy-Hb、Carboxy-Hb、Met-Hbのうちの１つまたは２つ以上が存在する中で、Total-HbまたはOxy-Hbの測定値から得られる。Oxy-Hbが、試料中のTotal-Hbの約95%を占めれば、または試料中のTotal-Hbが約95%のOxy-Hbからなれば、Total-Hbの値およびOxy-Hbの値は、概算として同じとみなされる。
【００１３】
本発明は、上記の方法（Ａ）または方法（Ｂ）のいずれかを含み、前記方法において、試料は全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、髄液からなる群から選択される。
【００１４】
好ましくは、上記の方法（Ａ）または方法（Ｂ）のいずれかに使用される分光学的装置は、
ａ）光路を形成する１つまたは２つ以上の電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）光路と一直線上にある１つまたは２つ以上の光検出器、
ｃ）光路内に置かれる試料容器を受け止めるスロット、および
ｄ）分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム（前記１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムは、１つまたは２つ以上のその他の装置を使用して開発される）、または分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる。
【００１５】
さらに、前記試料容器は、キュベット、試料タブ、ピペット・チップ、チュービング、ラベルを貼ったテストチューブ、ラベルを貼っていないテストチューブ、血液バッグチュービング、透明試料容器、半透明試料容器およびフロースルー・キュベットからなる群から選択される。
【００１６】
本発明は、Met-Hbが存在するかどうかを、試料中の溶血指標の予測値または試料中のTotal-Hbの予測値で知らせる方法（Ｃ）も提供し、前記方法（Ｃ）は、
i)  試料中のTotal-Hb、 Oxy-Hb、または「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上の一次値を予測するためのTotal-Hb、 Oxy-Hb、または「Total-HbマイナスMet-Hb」のうちの１つまたは２つ以上についての一次主キャリブレーションアルゴリズム（Total-Hb、 Oxy-Hb、または「Total-HbマイナスMet-Hb」のそれぞれが、試料中の溶血指標として使用される）と、試料中のMet-Hbの二次値を予測するためのMet-Hbについての二次主キャリブレーションアルゴリズムからなる分光学的装置を提供する工程、および
ii)  二次値が所定の値を超えたときに、一次値で知らせる工程、
からなる。
【００１７】
試料は全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、髄液からなる群から選択されるのが、好ましい。
【００１８】
本発明は、上記の方法（Ｃ）を含み、１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムおよび二次主キャリブレーションアルゴリズムのそれそれを提供する工程（工程ｉ））は、
ａ）主キャリブレーションセットの各キャリブレーション試料について波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長における吸光度測定値を収集する工程であって、前記各キャリブレーション試料は、Total-Hb、Oxy-Hb、Met-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたはそれ以上についての既知の標準値を持っている、および
ｂ）吸光度の次導関数、各キャリブレーション試料についての既知の標準値、および統計技法を使って、Total-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」およびMet-Hbの１つまたは２つ以上についての主キャリブレーションアルゴリズムを生成する工程、
を含んで開発される。
【００１９】
本発明は、上記の方法（Ｃ）にも関するものであり、収集の工程（工程(a)）において、Total-HbまたはOxy-Hbのいずれかについての標準値が、キャリブレーション試料中にOxy-Hb、Deoxy-Hb、Carboxy-Hb、Met-Hbのうちの１つまたは２つ以上が存在する中で、Total-HbまたはOxy-Hbの測定値から得られる。Oxy-Hbが、試料中のTotal-Hbの約95%を占めれば、または試料中のTotal-Hbが約95%のOxy-Hbからなれば、Total-Hbの値およびOxy-Hbの値は、概算として同じとみなされる。
【００２０】
本発明は、上記の方法（Ｃ）にも関するものであり、生成の工程（工程ｂ））において、統計技法は、単純線形回帰、重線形回帰および多変量解析からなる群から選択される。多変量解析は、部分最小二乗、主成分分析、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムからなる群から選択されることが好ましい。また、１つまたは２つ以上の波長は、約300nmから約2500nmまでの波長範囲から選択される波長、もしくはその間の値、または約450nmから約1100nmまでの波長範囲から選択される波長、もしくはその間の値からなる。
【００２１】
本発明は、上記の方法（Ｃ）も提供し、当該方法に用いる分光学的装置は、
ａ）光路を形成する１つまたは２つ以上の電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）光路と一直線上にある１つまたは２つ以上の光検出器、
ｃ）光路内に置かれる試料容器を受け止めるスロット、および
ｄ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる。
【００２２】
試料容器は、キュベット、試料タブ、ピペット・チップ、チュービング、ラベルを貼ったテストチューブ、ラベルを貼っていないテストチューブ、血液バッグチュービング、透明試料容器、半透明試料容器およびフロースルーキュベットからなる群から選択されることが、好ましい。さらに、EMRを供給する線源は、約300nmから約2500nmまでの１つまたは２つ以上の波長、もしくはその間のいずれかの波長をもつことを特徴とする。波長は、約450nmから約1100nmまで、またはその間の値が好ましい。
【００２３】
本発明は、分光学的装置も提供し、前記装置は、
ａ）電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）EMR線源と試料スロットとの間の光路を形成するためこの２つの間に位置する第１絞り、
ｃ）光路内に置かれる試料容器を受け止める、装置内の試料スロット、
ｄ）試料スロットと１つまたは２つ以上の光検出器の間にあって、光路内に位置する第２絞り、前記１つまたは２つ以上の光検出器は分光学的装置と操作上連携する、および
ｅ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる。
【００２４】
本発明は、
ａ）光路を形成するための電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）EMRの線源と試料スロットとの間の光路に位置する絞り、
ｃ）光路内に置かれ、試料容器を受け止める試料スロットであって、前記試料スロットは、第１サイドおよび第２サイドからなり、前記第１サイドはEMRの線源に面している、
ｄ）第２サイドにあるまたはその近傍にある反射部材であり、前記反射部材は、反射光路を形成するため試料スロットを通過するEMRを反射するためにある、
ｅ）反射光路内に位置する１つまたは２つ以上の光検出器であって、前記１つまたは２つ以上の光検出器は、分光学的装置と操作上連携する、
ｆ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる分光学的装置も含む。
【００２５】
さらに、本発明は、
ａ）光路を形成するための電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）EMRの線源と試料スロットとの間の光路内に位置する絞り、
ｃ）光路内に置かれ、試料容器を受け止める試料スロット、
ｄ）試料スロットの、EMR線源と同じ側に位置する１つまたは２つ以上の光検出器であって、前記１つまたは２つ以上の光検出器は、分光学的装置と操作上連携する、
ｅ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる分光学的装置も含む。
上記に説明した分光学的装置のそれぞれにおいて、試料容器は、キュベット、試料タブ、ピペット・チップ、チュービング、ラベルを貼ったテストチューブ、ラベルを貼っていないテストチューブ、血液バッグチュービング、透明試料容器、半透明試料容器およびフロースルーキュベットからなる群から選択されることが、好ましい。さらに、前記試料タブは、蓋板と基板との間に置かれた試料を含み、蓋板の少なくとも一部が反射性、透明または半透明であり、基板の少なくとも一部が反射性、透明または半透明であり、蓋板が基板にちょうつがいで接続される。
【００２６】
本発明は、上記の装置のいずれかも含んでおり、EMRの線源は、１つのタングステンランプ、１つまたは２つ以上の発光ダイオード（LED）および１つまたは２つ以上のレーザからなる群から選択される。EMRの線源は、約300nmから約2500nmまでの１つまたは２つ以上の波長、またはその間のいずれかの波長をもつ特徴がある。波長は、約450nmから約1100nmまで、またはその間の値が好ましい。さらに、前記１つまたは２つ以上の光検出器は、光ダイオードまたは電荷結合素子（CCD）からなる群から選択される。
【００２７】
さらに、１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムは、単純線形回帰、重線形回帰および多変量解析からなる群から選択される統計技法を使用して開発され、前記多変量解析は、部分最小二乗、主成分分析、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムからなる群から選択される。前記１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムは、Hbをベースとする血液代替物、Total-Hb、 Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」、Met-Hb、ビリルビン、ビリベルジン、メチレンブルー、およびその組合せからなる群から選択される被験物についてのものである。
【００２８】
本発明は、試料中の１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の劣化または劣化の好転を監視する方法（Ｄ）も提供し、前記方法（Ｄ）は、
i)  吸光度を得るため、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長においてMet-Hbについてのキャリブレーションアルゴリズムからなる分光学的装置を使って、試料の吸光度を測定する工程、
ii)  キャリブレーションアルゴリズムを吸光度の次導関数に適用することにより、吸光度からMet-Hbの一次濃度を決定する工程、
iii)  ２回目に試料中のMet-Hbの二次濃度を決定する工程
からなる。
ここにおいて、一次濃度と比較して二次濃度が増加していれば、１つまたは２つ以上の血液代替物の劣化を示し、一次濃度と比較して二次濃度が減少していれば、１つまたは２つ以上の血液代替物の劣化の好転を示す。たとえば、Met-Hbの濃度が、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の３％と等しいか、またはそれより高いと、これは、１つまたは２つ以上の血液代替物が劣化している指標となる。
【００２９】
本発明は、上記に説明した方法（Ｄ）を含んでおり、試料は、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物を注入した被験者から採取した全血試料、１つまたは２つ以上のHbをベースとした血液代替物を注入した被験者から採取した血清試料、１つまたは２つ以上のHbをベースとした血液代替物を注入した被験者から採取した血漿試料、及びHbをベースとする貯蔵血液代替物からなる群から選択される。
【００３０】
本発明は、上記に説明した方法（Ｄ）を含んでおり、測定段階（段階 (i)）において、キャリブレーションアルゴリズムは、単純線形回帰、重線形回帰および多変量解析からなる群から選択される統計技法を使用して得られる。さらに、多変量解析は、部分最小二乗、主成分分析、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムからなる群から選択される。また、前記１つまたは２つ以上の波長は、約300nmから約2500nmまでの波長範囲から選択される波長、もしくはその間の値、または約450nmから約1100nmまでの波長範囲から選択される波長、もしくはその間の値からなる。
【００３１】
本発明は、試料中の１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の劣化または劣化の好転を監視する方法（E）も提供し、前記方法は
i)  Met-Hbについての一次キャリブレーションアルゴリズム、および１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物についての二次キャリブレーションアルゴリズムを、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長における試料の吸光度の次導関数に適用することにより、Met-Hbの一次濃度、および試料中の１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の一次濃度を決定する工程、
ii)  Met-Hbについての一次キャリブレーションアルゴリズム、および１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物についての二次キャリブレーションアルゴリズムを、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長における試料の吸光度の次導関数に適用することにより、２回目にMet-Hbの二次濃度および試料中の１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の二次濃度を決定する工程、
iii)  １つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の一次濃度を使って、Met-Hbの形である、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の一次比率を計算し、かつ１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の二次濃度を使って、Met-Hbの形である、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の二次比率を計算する工程、
からなる。
ここにおいて、一次比率と比較して二次比率が増加していれば、１つまたは２つ以上の血液代替物の劣化を示し、一次比率と比較して二次比率が減少していれば、１つまたは２つ以上の血液代替物の劣化の好転を示すことになり、これにより１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の劣化または劣化の好転を監視する。
【００３２】
本発明は、試料中の１つまたは２つ以上の血液代替物の劣化を確かめる方法（Ｆ）も提供し、前記方法（Ｆ）は、
i)  Met-Hbについてのキャリブレーションアルゴリズム、および１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物についての１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムからなる分光学的装置を使って、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長で試料の吸光度を測定する工程
ii)  Met-Hbについてのキャリブレーションアルゴリズムを吸光度の次導関数に適用することにより、吸光度からMet-Hbの一次濃度を決定し、またMet-Hbをベースとする血液代替物についての１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムを吸光度の次導関数に適用することにより、吸光度から１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の二次濃度を計算する工程、
からなる。
ここにおいて、Met-Hbの濃度が、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の二次濃度の３％と等しいか、またはそれより高いと、それは、１つまたは２つ以上の血液代替物が劣化していることを示す。
【００３３】
試料は、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物を注入した被験者から採取した全血試料、１つまたは２つ以上のHbをベースとした血液代替物を注入した被験者から採取した血清試料、１つまたは２つ以上のHbをベースとした血液代替物を注入した被験者から採取した血漿試料、およびHbをベースとする貯蔵血液代替物からなる群から選択されることが、好ましい。
【００３４】
本発明は、上記の方法（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）のいずれかに関しており、測定または決定の段階（段階i））において、分光学的装置は
ａ）光路を形成する１つまたは２つ以上の電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）光路と一直線上にある１つまたは２つ以上の光検出器、
ｃ）光路内に置かれる試料容器を受け止める試料スロット、および
ｄ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる。
【００３５】
さらに、試料容器は、キュベット、試料タブ、ピペット・チップ、チュービング、ラベルを貼ったテストチューブ、ラベルを貼っていないテストチューブ、血液バッグチュービング、透明試料容器、半透明試料容器およびフロースルーキュベットからなる群から選択される。
【００３６】
本発明は、被験物、たとえばより詳しく言えばTotal-Hbを分光学的方法で測定し、同時に、自然のHbまたはHbをベースとする血液代替物のMet-Hbを測定する方法を説明している。被験物の分析に使用する装置についても説明している。
【００３７】
本発明の要約は、必ずしも本発明のすべての特徴を説明しているのではない。
【発明の詳細な説明】
【００３８】
本発明の以上の特徴およびその他の特徴は、本明細書の付属図面を参照している以下の説明によりさらに明らかとなる。
【００３９】
本発明は、被験物の分光学的測定の分野に関する。さらに詳しくは、ヘモグロビン測定に使用する方法および装置、ならびにヘモグロビンに関連する物質に関する。
【００４０】
以下の説明は、好適な実施例の説明である。
【００４１】
本発明は、分光学的装置を提供する。この装置は、試料中に所望の被験物が存在するかの判定、またはその濃度の測定に使用され、
ａ）たとえば約300nmから約2500nmまでの波長またはその間の波長を生成する機能をもつ電磁放射線（EMR）の線源、
ｂ）EMRの線源と試料スロットとの間の光路を形成するためこの２つの間に位置する第１絞り、
ｃ）光路内に置かれる試料容器を受け止める、装置内の試料スロット、
ｄ）試料スロットと１つまたは２つ以上の光検出器の間にあって、光路内に位置する第２絞り、前記１つまたは２つ以上の光検出器は、分光学的装置と操作上連携する、および
ｅ）前記分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して開発された１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム、または前記分光学的装置と操作上連携する１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの改良型、
からなる。
【００４２】
本発明は、試料中の補正総ヘモグロビン（Corr-Total-Hb）量を測定する方法も提供する。前記方法は、
i)  試料中のTotal-Hb、オキシヘモグロビン（Oxy-Hb）および「総ヘモグロビン  マイナス  メトヘモグロビン」（Total-HbマイナスMet-Hb）の１つまたは２つ以上の濃度を予測し、一次値を生成するためのTotal-Hb、Oxy-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上についての一次主キャリブレーションアルゴリズムを開発する工程、
ii)  試料中のMet-Hbの濃度を予測し、二次値を生成するためのMet-Hbの二次キャリブレーションアルゴリズムを得る工程、
iii)  一次値および二次値を得るため、分光学的装置を使用して試料を測定する工程、および
iv）補正総ヘモグロビン量を得るため、二次値を一次値に加えるか、
または
補正総ヘモグロビン量を測定する単一キャリブレーションアルゴリズムの１組の条件を形成するため、Total-Hb、Oxy-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上の中の１つについての一次主キャリブレーションアルゴリズムの条件を、二次主キャリブレーションアルゴリズムの条件に加える工程、
からなる。
【００４３】
また、本発明は、試料中の補正総ヘモグロビン（Corr-Total-Hb）量を測定する別の方法も提供する。前記別の方法は、
i)  １つまたは２つ以上の一次主キャリブレーションアルゴリズムおよび１つの二次主キャリブレーションアルゴリズムからなる分光学的装置を準備する工程であって、前記一次主キャリブレーションアルゴリズムは、試料中のTotal-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上の濃度を予測し、それにより一次値を得るための、Total-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上用に開発され、また前記二次主キャリブレーションアルゴリズムは、試料中のMet-Hbの濃度を予測し、それにより二次値を得るための、Met-Hb用に開発された、
ii)  一次値および二次値を得るため、分光学的装置を使用して試料を測定する工程、および
iii)  補正総ヘモグロビン量を得るため、二次値を一次値に加えるか、
または
補正総ヘモグロビン量を測定する単一キャリブレーションアルゴリズムの１組の条件を形成するため、Total-Hb、Oxy-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」の１つまたは２つ以上の中の１つについての一次主キャリブレーションアルゴリズムの条件を、二次主キャリブレーションアルゴリズムの条件に加える工程、
からなる。
【００４４】
本発明は、Met-Hbが存在するかどうかを、試料中の溶血指標の予測値または試料中のTotal-Hbの予測値で知らせる方法も提供する。前記方法は、
i)  試料中のTotal-Hb、 Oxy-Hb、または「Total-HbマイナスMet-Hb」のうちの１つまたは２つ以上についての一次値（Total-Hb、 Oxy-Hb、または「Total-HbマイナスMet-Hb」のそれぞれが試料中の溶血指標として使用される）を予測するため、Total-Hb、 Oxy-Hb、または「Total-HbマイナスMet-Hb」のうちの１つまたは２つ以上についての一次主キャリブレーションアルゴリズムを、分光学的装置を使って、開発する工程、
ii)   試料中のMet-Hbの二次値を予測するためMet-Hbの二次キャリブレーションアルゴリズムを得る工程、
iii)   二次値が所定の値を超えたときに、一次値を知らせる工程、
からなる。
【００４５】
本発明では、試料中の１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の劣化または劣化の好転を監視する方法も開示されている。前記方法は、
i)   波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長において、Met-Hbについてのキャリブレーションアルゴリズムからなる分光学的装置を使用して、試料を測定する工程、
ii)  キャリブレーションアルゴリズムを吸光度の次導関数に適用して、吸光度からMet-Hbの一次濃度を決定する工程、
iii)  ２回目に試料中のMet-Hbの二次濃度を決定する工程、
からなる。
ここにおいて、一次濃度と比較して二次濃度が増加していれば、１つまたは２つ以上の血液代替物の劣化を示し、一次濃度と比較して二次濃度が減少していれば、１つまたは２つ以上の血液代替物の劣化の好転を示すことになる。
【００４６】
本発明は、試料中の１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の劣化を監視する別の方法も提供し、前記別の方法は、
i)  Met-Hbについての一次キャリブレーションアルゴリズム、および１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物についての二次キャリブレーションアルゴリズムを、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長で、試料の吸光度の次導関数に適用することにより、Met-Hbの一次濃度、および試料中の１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の二次濃度を決定する工程、
ii)  Met-Hb型である１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の比率を計算する工程、
iii)  １つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の劣化を監視するため、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物の劣化の測定値としてMet-Hbの比率を用いる工程。たとえばMet-Hbの一次濃度が、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物二次濃度の３％と等しいか、またはそれより高いと、それは、１つまたは２つ以上の血液代替物が劣化していることを示す、
からなる。
【００４７】
本明細書の技術用語は、説明の目的で下記の通り定義される。
【００４８】
「被験物」とは、試料中に存在し、測定の対象となる物質を意味する。測定される被験物が存在する試料の例としては、例えば全血、血清、血漿、尿、滑液、髄液、唾液、リンパ液、精液、糞便、などの生物学的試料、またはミルク、チーズ、コテッジ・チーズ、ヨーグルト、アイスクリーム、ワイン、その他飲料、半固体食物、柔らかい固形食物からなる群から選択される非生物学的試料などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
「吸光度」とは、試料が引き起こす光度の低下を意味する。ベールの法則によると、吸光度 = Log（１／透過光）となり、これは光を散乱しない試料に適用される。測定された変数は、試料を透過した光の量であり、この透過した光（透過光、transmittanceまたはtransmission）が、吸光度単位に変換される。試料が光を散乱する場合にベールの法則を適用すると、光の散乱による影響により「真の吸光度」と光のロスを装置で区別することができないので、この場合は「見かけ上の吸光度」という表現を使うべきである。「吸光度」という言葉を使う場合は、試料が光を散乱するか、散乱しないかが必ずしも明らかでないので、「真の吸光度」と「見かけ上の吸光度」のどちらかを意味することになり、また両方を意味することもあり得ることを理解すべきである。吸光度についての例が挙げられているが、透過光に代わり反射光（reflectanceまたはreflection）を測定した場合には、吸光度はLog（１／反射光）と置き換えられ、反射光測定が本発明の範囲に含まれる。なお、transmittanceとtransmissionは、時として相互交換的に使用されることがあり、またreflectanceとreflectionも時として相互交換的に使用されることがある。
【００５０】
「実吸光度」または「測定吸光度」とは、装置の波長キャリブレーション表の１つまたは２つ以上の所定の波長でその装置により提供される、試料またはキャリブレータ物質の吸光度値もしくは吸光度測定値、または簡単にいえば吸光度を意味する。
【００５１】
「調整済補間吸光度」とは、光度補正を特に補間吸光度に適用した後の、補間吸光度の値を意味する。
【００５２】
「血液バッグチュービング」とは、全血が入っている、適切なポリマーまたはプラスチック製一次バッグと、一次バックから得られる血漿が入っていることがある、適切なポリマーまたはプラスチック製二次バッグとを接続するチュービングを意味する。前記チュービングおよびバッグは、透明または半透明の柔軟性のあるポリマーまたはプラスチックからできている。
【００５３】
「血液代替物」とは、全血または赤血球（RBC）に代わり輸血用に使用できる物質を意味する。血液または赤血球に代わり血液代替物を使用する利点は、次の通りである。血液代替物はどの血液型にも例外なく適合することが期待でき、したがって輸血前の適合性確認試験が不要であること；血液の最大保存期間が４２日であるのに対して、血液代替物はさらに長期間保存可能なこと；および血液代替物の精製過程に熱処理も含むことができ、ウイルス感染の恐れを抑える可能性があること。
【００５４】
適切な界面活性剤の中にペルフルオロカーボンのごく小さいビーズを含んだ乳白色の乳剤の特徴をもつ別の種類の血液代替物も、報告されている。このような「乳白色」の血液代替物は、「ペルフルオロカーボン様」の血液代替物とよべる。「ペルフルオロカーボン様」血液代替物は、乳白色の乳剤の特徴をもつすべての血液代替物に当てはまる。このような血液代替物にはビーズが含まれているので、「ペルフルオロカーボン様」血液代替物は光を散乱する物質を含むという特徴を持っている。
【００５５】
「阻害物」とは、血清や血漿などの試料中にある被験物が存在することにより、試料中のほかの被験物の存在もしくは定量化、またはその両方の測定を阻害する当該被験物を意味する。
【００５６】
「キャリブレーションアルゴリズムトランスファー」とは、キャリブレーションアルゴリズムを第１装置から第２装置へ転送する工程を意味する。キャリブレーションアルゴリズムを第１装置から第２装置へうまく転送するために、波長標準セットを使用することが望ましい。キャリブレーションアルゴリズムトランスファーの過程が、米国特許6,651,015（Samsoondar、参照として援用する）で開示されている。第１装置（少なくとも１つの被験物の濃度を測定するのに使用できる）をキャリブレーションするために使用される方法を、主キャリブレーションという。主キャリブレーションは複雑な過程であり、本明細書では「主キャリブレーション」という名称で説明している。このように複雑である故に、すべての装置について主キャリブレーションを実施することは実際的でないし、望ましくもない。
【００５７】
本発明は、ある装置、たとえば第２装置をあたかも主キャリブレーション過程によりキャリブレーションされたように機能させる簡易な別案を提供する。第２装置を使用する主キャリブレーションを行う必要がないので、第２装置は、第１装置と同じような方法でキャリブレーションする必要はない。第１装置と第２装置は類似していることが好ましいが、第２装置を使用することにより必要となる測定の精度または種類によっては、必ずしも類似している必要はない。
【００５８】
本発明の発明者は、特定の被験物について、１つまたは２つ以上の「第１装置」を使用して開発された「主キャリブレーションアルゴリズム」が「第２装置」に転送され、第２装置は、キャリブレーションアルゴリズムトランスファーの後、直ちに使用できることを見出した。さらに、主キャリブレーションセットと異なる独自のキャリブレータ物質の小セットを使用して、第２装置上の転送された主キャリブレーションを、必要があれば、アップグレードしてもよい。当該独自のキャリブレータ物質の小セットは、主キャリブレーションセットと明確に区別できる。
【００５９】
「データ前処理」とは、装置（第１装置、第２装置、または両方の装置を含む）で被験物の測定を容易にするために使用できる、分光データの数理的操作を意味する。データ前処理の例としては、次のものがあるが、限定を加えるとみなされてはならない。
−  試料を透過した、または試料から反射した電磁放射線（EMR）の吸光度の測定；
−  補間吸光度の計算；
−  吸光度の平滑化；吸光度の一次導関数および高次導関数の計算；
−  乗法散乱補正；
−  データ変換；および
−  測光補正
キャリブレーションアルゴリズムの開発以前に、１つまたは２つ以上の形式のデータ前処理が使用可能であり、また被験物の濃度の計算にキャリブレーションアルゴリズムを適用する以前に、１つまたは２つ以上の形式のデータ前処理が、第２装置から得たデータ上で使用できる。平滑化の例にデータの平均化も含まれるが、それに限定されない。
【００６０】
「データ変換」とは、分光データまたは被験物濃度データに適用できる数理的技法を意味する。データ変換の例には、分光学的データのフーリエ変換、被験物濃度の対数または逆対数の計算などがあるが、これらは決して限定を加えるとみなされてはならない。平滑化もデータ変換とみなすことができ、たとえばSavitzky-Golay法（SavitzkyとGolay、1964、Anal. Chem.、36：1627-1638）が使用される。
【００６１】
「吸光度の導関数」とは、吸光度の次導関数を意味する。吸光度のゼロ次導関数は測定された吸光度である。ある特定波長における吸光度の一次導関数は、その波長の吸光スペクトルの勾配であり、ある特定波長における吸光度の二次導関数は、その波長の一次導関数吸光スペクトルの勾配である。吸光度の高次（三次、四次など）導関数は、そのすぐ下の次（二次、三次など）の導関数吸収スペクトルの勾配により得られる。特定波長における吸光度の導関数を計算する方法は、当業者に広く知られている。
【００６２】
ある特定波長における吸光度の一次導関数の計算は、重要な波長も含めた２つの波長における吸光度の相違をとらえることにある。吸光度の導関数を計算する他の方法としては、いくつかの異なる波長における吸光度の使用することがあり得るが、この場合には平滑化が導関数過程の重要な部分である。平滑化の程度を大きくすれば、吸光スペクトルまたは吸光スペクトルの次導関数における信号細部のロスが大きくなる。吸光度の導関数の計算に使用できる最小波長数は、２波長である。平滑化、データ変換、および吸光度の次導関数の計算は、データ前処理の例であるが、これらに限定されるものではない。上に説明したように、その他の形式のデータ前処理（たとえば乗法散乱補正が含まれるが、それに限定されない）は、吸光度の次導関数の計算の前後で実行することができる。
【００６３】
「第１装置」とは、１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムの開発に使用される装置を意味する。１つまたは２つ以上の第１装置を、主キャリブレーションアルゴリズムの開発に使用することができる。
【００６４】
「INTRALIPIDTM（IL）」とは、血液中に自然に見出されるキロミクロンを真似た脂肪乳剤を意味する。ILはこのような乳剤の一例である。血清や血漿中の混濁の主な原因は、キロミクロンなどの脂肪粒子にあり、したがってILまたはその他の脂肪乳剤を使用して、本物そっくりに血液中に混濁を起こすことができる。「混濁のシミュレータ」という表現は、混濁の定量に使用される「被験物」をいう場合に使用される。
【００６５】
「溶血指標」とは、赤血球（RBC）内に存在するが、RBCを取り囲む血漿の中には存在しない物質をいう。溶血指標の例としてTotal-Hb、Oxy-Hb、「Total-HbマイナスMet-Hb」などが含まれるが、これらに限定されない。Oxy-Hb部分がTotal-Hbの約95パーセントである既知Oxy-Hb濃度の試料は、Oxy-Hb濃度と同じ値のTotal-Hbを持つと考えられる。同様に、約95%を占める既知Total-Hb濃度の試料は、Total-Hb濃度と同じ値のOxy-Hbを持つと考えられる。Total-Hb濃度またはOxy-Hb濃度の近似値の許容性は、Total-HbまたはOxy-Hbの予測値の必要精度によって決まる。
【００６６】
「マッピング」とは、補間吸光度を標準波長と関連づける過程を意味する。
【００６７】
「乗法散乱補正」（乗法信号補正ともいう）とは、試料セットから得られる分光データの光散乱効果の少なくとも一部の除去に使用できる数理的技法を意味する。この技法で、各吸光スペクトルをできるだけ中間スペクトルに近づくように回転させる。この技法は、Martens、H and Nacs、T （Multivariate Calibration、1993、John Wiley & Sons発行）と Osborne、B.G.、Fearn、T & Hindle、 P.H. （Practical NIR Spectroscopy with Applications in Food and Beverage Analysis、1993、Longman Scientific & Technical発行）に詳しく説明されており、本明細書においてこの２つとも参照として援用する。試料セットの中間スペクトルは、１つまたは２つ以上の装置から得られる１つまたは２つ以上の試料吸光測定値を結合した後に得られる。
【００６８】
「測光補正」または「吸光度調整」とは、１つの装置で測定した試料の吸光度に対して、試料が他の装置で測定された如くその吸光度を見せるために、調整を加えることを意味する。測光補正の値は、キャリブレーションアルゴリズムトランスファーの過程において第１装置と第２装置の両装置で１セットのキャリブレータから得られる吸光度から得られる線形回帰方程式「y=mx+c」の勾配（「m」）およびｙ切片（「c」）により決まる。測光補正により得られる吸光度は、調整済吸光度または補正済吸光度と言われる。
【００６９】
「ピクセル分散」とは、通常１ピクセルあたりのnmで測定される、線形ダイオードアレイの２つの近傍ピクセルにより包囲される波長を意味する。たとえば、波長キャリブレーションに600nmと900nmの２つのレーザが使用され、それぞれピクセル20とピクセル220に照射されるとすると、300nm（すなわち900 - 600nm）が200ピクセル（すなわち220 - 20ピクセル）で包囲されることをになる。したがって、ピクセル分散は、1.5 nm per pixel（すなわち300nm÷200ピクセル）と計算される。そのほかに、予め定められたピクセル分散も使用できる。この場合、ピクセルにある波長を割り付けるために既知波長のレーザ１個、またはEMRに既知波長を提供する狭帯域フィルターが必要となる。
【００７０】
「主キャリブレーション」とは、被験物用第１装置または任意に２つ以上の第１装置についての主キャリブレーションアルゴリズムの開発に使用される過程を意味する。典型的には、主キャリブレーションに使用される試料セットは、比較的大きく、試料は天然のものか、あるいは天然の試料に非常に近い。堅牢なキャリブレーションアルゴリズムを開発するには、主キャリブレーションセットは、試料中に予測されるすべてのばらつきを含んでいるべきである。さらに、装置内のばらつきも含むより堅牢なキャリブレーションアルゴリズムを開発するには、主キャリブレーションセットの１つまたは２つ以上の試料は、１つまたは２つ以上の第１装置で測定され、統合される。このようなキャリブレーションアルゴリズムは、１つまたは２つ以上の類似の装置から得られる測定値を結合することにより開発される。
【００７１】
被験物予測にどのような精度が必要とされるかにもよるが、いかなる形式の統計データ解析も、また任意にいかなる形式のデータ前処理（たとえば、平滑化、吸光度の一次および高次導関数、測光補正、データ変換、吸光度補間、乗法散乱補正があるが、これらに限定されない）も使用できる。たとえば、２つ以上の第１装置から得られるデータを含むことにより、多くの第２装置で、精度がより低くなる、したがって正確さがより低くなる（精度が低いことは正確さが低いと言い換えられる）可能性がある。しかし、試料中に被験物が存在するか否かについての単純なイエスまたはノーの回答だけが求めれらるのであれば、このような主キャリブレーションでも適しているといえ、本発明の範囲に含まれる。
【００７２】
必要であれば、主キャリブレーションの一部ではない、小セットの弁別的な試料を、第２装置で測定し、そのデータを主キャリブレーションセットから得られる元データの一部またはすべてと統合させて、１つまたは２つ以上の「主キャリブレーションアルゴリズムの改良型」を開発することができる。小セットの弁別的な試料は、主キャリブレーションセットと類似しているのが好ましい。吸光度のゼロ次導関数（基礎吸光度という）または吸光度の何次の導関数も、キャリブレーション過程では使用できるが、吸光度の二次導関数が好ましく、吸光度の一次導関数がより好ましい。
【００７３】
「主キャリブレーションアルゴリズム」とは、たとえばY=A(x)+Bx1+・・・+Cの一次結合（これに限定されない）などの方程式を意味する。ここにおいてYは所定の被験物の濃度、Ａ、Ｂ、およびＣは定数、ｘ、ｘ１・・・は特定の波長（この方程式の右辺は、方程式の「項」の合計からなる）における吸光度の次導関数である。しかし、非線形方程式は、本発明の範囲に含まれる（たとえば、例５の方程式１６および１７）。この方程式は、試料セットの重線形回帰により得ることが好ましいが、たとえば単純線形回帰、PLS（部分最小二乗）およびPCA（主成分分析）（これらに限定されない）などのその他の統計技法も利用でき、本発明の範囲に含まれる。主キャリブレーションに使用される試料セットは、比較的大きく（上記参照）、試料は天然のものか、または天然の試料に非常に近い。堅牢なキャリブレーションアルゴリズムを開発するためには、主キャリブレーションセットが、試料中に予測されるすべてのばらつきを含んでいるべきである。「キャリブレーションアルゴリズム」とは、使用されるとき、別段の説明がない限り、主キャリブレーションアルゴリズム、または主キャリブレーションアルゴリズムを補正したもの（たとえば、主キャリブレーションアルゴリズムの改良型）を意味し、したがって改良とは被験物の予測値の精度を改善するためのもの、または第１装置としてキャリブレーションされなかった別の装置で主キャリブレーションアルゴリズムの使用を促進するためのものをいう。
【００７４】
主キャリブレーションアルゴリズムが、試料中の被験物の濃度を測定する目的に使用する分光学的装置に組み込まれるとき、主キャリブレーションアルゴリズムは、それが組み込まれる分光学的装置と操作上連携する。上に説明したように、主キャリブレーションアルゴリズムは、一般的には第１装置を使用して開発され、かつ第２装置で使用するため第２装置に転送される。さらに、分光学的装置と操作上連携する主キャリブレーションアルゴリズムは、第１装置で開発され、第２装置に転送され、転送後に、たとえば一次キャリブレーションセットの一部ではなかった小セットの弁別的なキャリブレータを使用して改良された主キャリブレーションアルゴリズム改良型でもよい。しかし、主キャリブレーションアルゴリズムは、第２装置で使用するため第１装置から転送されて、この主キャリブレーションアルゴリズムをさらに改造または改良せずに、そのまま使用可能である。分光学的装置と操作上連携する主キャリブレーションアルゴリズムは、分光学的装置のROM、EPROM、EEPROM、マイクロコントローラ、マイクロプロセッサー、内部または外部メモリーディバイス（たとえばディスク、CD、メモリースティック、フラッシュメモリーカードまたは類似のディバイスがあるが、これらに限定されない）にインストールできる。
【００７５】
「キャリブレーションアルゴリズム」とは、使用されるとき、別段の説明がない限り、主キャリブレーションアルゴリズム、または主キャリブレーションアルゴリズムの改良型を意味し、したがって改良とは被験物の予測値の精度を改善するためのもの、または第１装置でキャリブレーションできなかった別の装置（すなわち第２装置）で主キャリブレーションアルゴリズムの使用を促進するためのものをいう。
【００７６】
「主キャリブレーションセット」とは、主キャリブレーションに使用される試料を意味する。
【００７７】
「主キャリブレーション波長」とは、主キャリブレーションアルゴリズムで使用される波長を意味する。
【００７８】
「主要キャリブレーション波長」とは、吸光度の次導関数と被験物濃度との間で高相関関係を示す主キャリブレーションアルゴリズムの波長を意味する。主要キャリブレーション波長は、組成が異なると同じ被験物についても異なる。主キャリブレーションアルゴリズムは、任意に、吸光度の次導関数と被験物濃度との間の低相関関係を示す１つまたは２つ以上の他の波長を含んでもよい。このような他の波長は、二次キャリブレーション波長といわれる。二次キャリブレーション波長は、特に、主要キャリブレーション波長の吸光バンドと重複する吸光バンドを持ち、したがって主要キャリブレーション波長における吸光度と被験物濃度との間の相関関係に影響を与える可能性のある阻害物質が存在すると、主キャリブレーションアルゴリズムに堅牢性を付加する。
【００７９】
少なくとも１つの主キャリブレーション波長を含む、約5〜約400nm、もしくはその間の値の、または約5〜約200nm、もしくはその間の値の負の勾配を持つ連続スペクトル領域は、「主キャリブレーションセクション」と呼ばれる。主キャリブレーションアルゴリズムの開発には、どのような統計技法も使用できる。たとえば単純線形回帰、重線形回帰、多変量解析などがあるが、これらに限定されるとみなされてはならない。多変量解析の例には、主成分分析（PCA）、主成分回帰（PCR）、部分最小二乗(PLS)、ニューラル・ネットワークなどがあるが、これらに限定されるとみなされてはならない。多変量解析が主キャリブレーションアルゴリズムの開発に使用されるときは、主キャリブレーションアルゴリズムは、それぞれの波長における吸光度の次導関数と被験物濃度との間に高相関関係が観察される多くの波長を含んでいる。
【００８０】
「予測値」とは、被験物についての主キャリブレーションアルゴリズムを試料の吸光度の次導関数に適用したときに得られる被験物の値を意味する。以前に説明したように、主キャリブレーションアルゴリズムは、たとえば、依存変数としての被験物の予測値、ならびに定数および１つまたは２つ以上のその他の条件の合計からなる方程式である。その他の条件とは、定数と独立変数の積である（例１〜７を参照）。独立変数とは、ある特定の波長における試料の吸光度の次導関数である。予測値は、必ずしも離散濃度値として報告される必要はなく、半定量値または定性値（たとえばイエス／ノー）も含んでいる。
【００８１】
ある被験物の「標準値」とは、ある試料に与えられた被験物の値を意味する。一般的に、標準値は、適切な精度水準にある、技術範囲内で知られた方法によって推定された値である。例であって、決して制限を加えるとみなされてはならないが、たとえば試料に加えられた被験物の既知の量が、標準値として用いられ、加えられたのが溶血指標物であれば、溶血指標物が測定できる。なお溶血指標物の場合、Total-Hb、Oxy-Hbおよび「Total-HbマイナスMet-Hb」が、好ましい指標物である。
【００８２】
シアンメトヘモグロビン（cyanMet-Hb）法は、当業者にはよく知られた方法であり、存在するすべてのHb種、すなわちOxy-Hb、Deoxy-Hb、Carboxy-HbおよびMet-Hbを測定する方法である。Oxy-Hbは、試薬を使用しない既知の分光学的方法、たとえばHarboe またはTietzの方法（Harboe、 M.、1959、A method of determination of hemoglobin in plasma by near ultraviolet spectrophotometry Scand. J. Clin.Lab.Invest., pp.66-70；Tietz Textbook of Clinical Chemistry、 3rd Ed、 1999、pp 1674-1676；本書にて参考文献として引用する）で測定できる。Hb種が試薬を使用しない分光学的方法で測定できるかどうかは、被験物の測定に使用される標準法および主キャリブレーションセットの試料に含まれる物質の２つによって決まる。
【００８３】
Oxy-Hb部分がTotal-Hbの約95％である既知Oxy-Hb濃度の試料は、Oxy-Hb濃度と同じ値のTotal-Hb濃度を持っていると考えることができる。同様に、約95％のOxy-Hbからなる既知Total-Hb濃度の試料は、Total-Hb濃度と同じ値のOxy-Hb濃度を持っていると考えることができる。
【００８４】
「試料」とは、分光学的に測定できる１つまたは２つ以上の性質を示す、生体液もしくは非生体液、生体半固体もしくは非生体半固体、または生体固体もしくは非生体固体を意味する。試料は、一般的には１つまたは２つ以上の被験物からなる。被験物の例としては、キャリブレータ、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、乳製品、飲料、身体部分（指、腕、耳たぶなどがあるが、これらに限定されない）、または錠剤などがあるが、これらに限定されない。
【００８５】
「試料容器」とは、試料から出るEMRの吸光度、反射率、または吸光度と反射率の両方の測定が行えるように試料を保持できる透明または半透明の容器を意味する。試料容器の例としては、試料タブ、ピペット・チップ、チュービング、キュベット、ラベルを貼ったテストチューブ、ラベルを貼っていないテストチューブ、血液バッグチュービング、透明試料容器、半透明試料容器などがあるが、これらに限定されない。試料容器は、分光学的装置の試料スロット内に挿入できる。
【００８６】
キュベットの場合、キュベットが、試料を再利用可能なキュベットに注入する必要のあるフロースルーキュベットとして設計できる。フロースルーキュベットは、洗浄システムが必要となるため、好ましくはないが、本発明の範囲に含まれると考えられる。試料容器は、任意に１つまたは２つ以上の試薬を含むことができる。身体部分の場合は、試料容器に代わり、レセプターが必要となる。
【００８７】
本発明は、試薬を使用しないシステムに限定される必要はなく、試料容器で１つまたは２つ以上の試薬を使用することは、試薬を使用しないシステムの機能強化になると考えられる。米国特許4,088,448においてLiljaらは、空洞に試薬を含み、試料が毛管力により空洞に任意に引き込まれることを特徴とする、お互いに所定の距離に設置された２つの平面で規定される空洞を持つサンプリング用キュベットについて説明している。このようなキュベットまたはこれに類似したキュベットを使用することも本発明の範囲に含まれるとみなされる。
【００８８】
「試料タブ」とは、たとえば、図７ａおよび図７ｂに示すように、上面と下面を持ち、基板の少なくとも一部をEMRが透過できるようになっている基板からなる試料容器（720）を意味する。ウェル（714）は、試料、たとえば液体試料を保持するため基板（718）の上面に配置されており、ウェルは基板上面から上に伸びる閉鎖壁（706）および蓋板（702）に囲まれる。蓋板（702）は、基板に取り付けて（たとえば基板にちょうつがいで取り付ける（たとえば710））、開放位置と閉鎖位置との間で可動できることが好ましい。試料タブの閉鎖壁（706）は、１つまたは２つ以上のオバーフロー孔（716）を有していてもよく、オーバーフローリングが閉鎖壁と格納壁の間にくるように格納壁（712）により取り囲まれていてもよい。
【００８９】
蓋板の少なくとも一部は、EMRがその蓋板の中を透過できるようになっており、したがって、蓋板が閉鎖位置にあっても、光学経路が、EMRを透過させる基板部分、ウェル、EMRを透過させる蓋板部分を通過するように形成されている。あるいは、EMRが試料タブの反対側で反射して、試料タブ内にある試料を通過する直接光路を２倍にするように、試料タブを設定することもできる。
【００９０】
蓋板は基板に取り付けても、分離してもよい。さらに、試料タブは、対応する合わせ部材とつながり、それによって蓋板が基板に取り付けられるようになった固定部材からなってもよい。固定部材は、格納壁の外側に摩擦して接合することができる１つの円形リング、または蓋板に摩擦して接合し、蓋板を基板に取り付けることができるクリップからなることもできるが、これらに限定されない。円形のウェルおよびオバーフロー・リングが図に示されているが、ウェルおよびオバーフロー・リングはどのような形でもよい。固定部材は、基板、蓋板、または基板および蓋板の両方に取り付けることができる。同様に、固定部材を受ける関連合わせ部材も、基板、蓋板、または基板および蓋板の両方に取り付けることができる。
【００９１】
格納壁は、その上面（708）にシーリング部材を含んでもよい。シーリング部材は、Ｏリング、または格納壁と一体に成形しやすい材料でもよい。本発明の好適な実施例において、蓋板を閉じると余分な試料が溢れ出るので、試料ウェルは、１つまたは２つ以上の孔または溝、および溢れた試料を集めるオーバーフロー・リングを含んでいる。蓋板は、蓋板ちょうつがいのすぐ前にある試料がまず蓋板と接し、蓋板が閉じると余分な試料が２つの溝を通って、オーバーフロー・リングへ溢れ出るように、タブに取り付けるのが好ましい。本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明により明らかとなる。しかし、詳細な説明および具体的な例は、試料タブの好適な実施例を示し、例示にすぎない。試料タブの各種の設計が、米国特許出願10/042,258（公開番号2002-0110496 A1、Samsoondar；その内容は参照として援用する）に説明されている。
【００９２】
曲線、たとえば吸光度スペクトルの「平滑化」とは、「連続スペクトル」を形成して、スペクトル中の「ノイズ」を減らすために、数理関数をデジタルデータに適用することを意味する。多様な程度の平滑化が曲線に適用できるが、平滑化の結果、被験物信号のロスが生ずる場合がある。
【００９３】
「第２装置」とは、第１装置と同様に機能し、したがってキャリブレーションをする必要がないか、または第１装置と同様な方法（すなわち主キャリブレーションを行う）でキャリブレーションする必要はない装置を意味する。主キャリブレーションセットと異なる弁別的な試料セットは、希望すれば、主キャリブレーションアルゴリズム改良型を開発するため第２装置で測定できる。
【００９４】
「波長標準セット」とは、装置特有の波長キャリブレーション表とともにすべての装置で使用され、また測定された吸光度または実際の吸光度から補間吸光度を生成するために使用される波長セットを意味する。装置で検査された試料の実際の吸光度は、波長キャリブレーション表の波長において測定される。主キャリブレーションアルゴリズムは、マッピングされた吸光度に適用されるのが好ましいが、特に波長キャリブレーション表と波長標準セットが同じであるときは、実際の吸光度にも適用できる。波長標準セットの例は、決して制限することは望まないが、2nm単位で450nmから約300nmを含み、好ましくは約450mから1100nmである。しかし、その他の波長範囲および単位も必要により使用でき、また当業者には知られているだろう。波長標準セットの範囲は、波長キャリブレーション表から導くことができ、単位は、試行錯誤により得ることができる。波長標準セットも、第１装置および第２装置の波長キャリブレーション表に共通の波長セットを確立することにより得ることができる。また、波長標準セットは、第１装置および第２装置の波長キャリブレーション表の波長に近い波長セットを確立することにより得られる。
【００９５】
「標準波長」とは、波長標準セットの中の波長を意味する。
【００９６】
「Hbをベースとする貯蔵血液代替物」とは、製造されたHbをベースとする血液代替物であって、すぐに使用できる、例を挙げれば（その例に限定されない）、被験者に注入できる用意ができているものを意味する。Hbをベースとする血液代替物は、品質管理材料として使用できる。
【００９７】
「主キャリブレーションアルゴリズム改良型」とは、主キャリブレーションと異なる試料の弁別的なセットから得られたキャリブレーションアルゴリズムを意味する。前記試料は第２装置で試験され、データは、１つまたは２つ以上の「主キャリブレーションアルゴリズム改良型」を開発するために、主キャリブレーションセットから得られる元データの一部またはすべてと統合される。
【００９８】
「波長キャリブレーション」とは、分光計の線形ダイオードアレイ検出器、荷電結合検出器、またはその他の類似ディバイスのキャリブレーションを意味し、波長が、線形ダイオードアレイ検出器または荷電結合検出器の各ピクセルに割り当てられる。
【００９９】
「波長キャリブレーション表」とは、各ピクセルに対応する、または各ピクセルに割り当てられる実際の波長を提供する表であって、波長キャリブレーションの結果得られるものを意味する。
【０１００】
（装置）
本発明の装置は、次の要素からなることが好ましい：
−試料に照射するための１つまたは２つ以上の電磁放射線（EMR）の線源。前記線源は、約300nmから約2500nmまでの１つまたは２つ以上の波長、またはその間の波長を持つEMRを提供する。波長は、約450nmから約1100nmまで、またはその間の値が好ましい
−試料を透過する、または試料で反射するEMRの量を測定するための１つまたは２つ以上の光検出器、
−１つまたは２つ以上の光検出器で受けた情報を処理するために、任意に、１つまたは２つ以上の増幅器、アナログ・デジタル変換器、およびマイクロコントローラを含む電子基板、
−試料容器を設置するための、装置内の試料スロット、および
−分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムであって、前記１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムは、１つまたは２つ以上の他の装置を使用して完全に開発される。分光学的装置と操作上連携する、１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム改良型（下記の「キャリブレーションアルゴリズム変換」を参照）も本発明の装置内で使用できる。
【０１０１】
装置は、例で説明されるように、透過モードまたは反射モードで動作できる。
【０１０２】
図４ａおよび図４ｂに、分光学的装置の試料インターフェース（444）が示されている。明瞭化のために、分光学的装置の全体は図に示されていない。双方向性の光ファイバー束430が、EMRを適切な保持具内の試料のある場所、たとえば試料スロット（440）に挿入された試料タブ（442）（これに限定されない）に導くために、使用できる。束430内の一部のファイバーが、反射部材450に反射して試料から戻ってきたEMRの一部を受ける。反射後集められたEMRは、分光器（透過モードについては、下記図６ａおよび図６ｂで詳細に説明する）に導かれる。反射後のEMRの処理（反射モード）は、透過後のEMRの処理（透過モード）と同じである。透過モードについては、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂに示してある。試料インターフェース（444）は、分光学的装置と切り離すことができ、その場合、照射光ファイバーと集光ファイバーは、EMR信号を外部装置との間で交信する。しかし、図６ａおよび図６ｂに示すように、試料インターフェースは分光学的装置と一体化することもできる。
【０１０３】
図５ａおよび図５ｂは、透過モードで使用できる分光学的装置の試料インターフェース（544）を示す。明瞭化のために、分光学的装置の全体は図に表示されていない。EMR線源は、照射光ファイバー（548）を経由して試料（たとえば542）に送られ、試料を透過したEMRは、集光ファイバー（546）により集光される。試料は、適切な試料保持器、たとえば試料タブ（542、542b）を使用して試料スロット（440）内に置かれる。照射光ファイバーが546で、集光ファイバーが548であってもよい。反射モードについて上に示したように、試料インターフェース（544）は、分光装置と切り離すことができ、その場合、照射光ファイバーと集光ファイバーは、EMR信号を外部装置との間で交信する。しかし試料インターフェースは分光装置と一体化することもできる（たとえば図６ａおよび図６ｂ）。
【０１０４】
図６ａおよび図６ｂには、所望するEMR線源（600）、たとえばタングステンランプからなる分光学的装置（620）が示してある。分光器内にある検出器の飽和を避けるために、EMR線源の減衰が必要になることもあり（614；検出器86が、図８の分光器に示されている）、したがって減衰ディバイスをEMR線源と試料または検出器の間に設置できる。本発明の例において、減衰器は、しかるべき直径の絞りまたはチャンネル（602）であるが、チャンネルも、適当な長さまたは直径の光ファイバー、またはその他の減衰ディバイス、たとえばフィルターまたは、試料スロット（608）に届いた照射EMRの量を制御する、当業者に知られたその他のディバイスであってもよい。
【０１０５】
標準測定は、試料測定の前後に行うことができる。あるいは標準測定は保存して、何度も再利用することができる。不透明な部材を試料スロット（608）に挿入することにより、暗電流の測定ができる。「暗電流」とは、EMRが検出器に照射しないときの検出器の反応を意味する。暗電流測定値の減算は任意であり、暗電流測定は必須ではない。
【０１０６】
試料スロット（608）から出てきたEMRは、チャンネル（612）を経て、分光器（614）に入る。チャンネル（612）は、試料タブと分光器の間の絞りとして示されているが、図４（430）、図５（546または548）、または図８（612）に示すように、チャンネルは、いかなる長さの光ファイバーでもよい。
【０１０７】
分光器は、たとえば図８に示すように、回折格子（80）からなるものでもよい。透過格子または反射格子のどちらでも使用できる。図８に示す例では、回折格子（80）は反射格子である。格子は、分散素子であり、EMR成分を波長によって分離する。好適な実施例において、分光器（614）の検出器は、一列に並んだ光ダイオード（たとえば図８の86；簡単に表現するため、図にはダイオード２個のみが示されている）であるが、列に並んだ検出器に代わり、検出器１個を使用することもできる。EMR源としてLEDを使用することもでき、LEDを使用すると、回折格子が不要となる。例であって、決して制限するとみなされてはならないが、たとえば、EMRの線源（600）が１つまたは２つ以上のLEDであれば、単一の検出器を使用してもよい。
【０１０８】
電源は、適切な電源であればよく、例であって、決して制限するとみなされてはならないが、たとえば図６の電源は、電池２個（616）からなるものとして示されている。しかし装置は、外部電源、たとえば壁コンセントの交流電流から電力供給することもできる。
【０１０９】
分光器から受けとる電気信号は、検出器が光信号を積分する時間に比例する。電気信号は、アナログ電気増幅器（図には示されていない）により増幅され、アナログ・デジタル変換器またはADC（図には示されていない）によりデジタル信号に変換できる。
【０１１０】
図８には、本発明によって使用できる分光器の一例が示してある。試料から出たEMR（84）は、反射格子（80）に衝突し、その成分波長に分散される。分散したEMRは、ダイオードの列（たとえば86）に衝突する。したがって各ダイオードが１つのピクセルを意味する。このダイオードアレイは既知のピクセル分散を持っており、各ピクセルに波長が配置されている。ピクセル配列が波長範囲を意味しており、たとえば波長範囲が約450ナノメータから約800ナノメータであってよく、この場合１ピクセル当り約３ナノメータのピクセル分散となる。適切な分光器の一例が、MicroParts（ドイツ）によって製造されており、その分光器は256個のダイオードを含んでいる。簡単にするため、図８にはダイオード２個（86）のみが示してある。いかなる数のピクセルであっても、本発明の範囲に含まれる。分光器の波長キャリブレーション（および波長標準セット）は、米国特許6,651,015（Samsoondar、参照として援用する）で詳細に説明されている。いかなる分光器を使用することも、本発明の範囲に含まれる。
【０１１１】
図８に示すように、ダイオードアレイ（88）からの出力は、電子基板（図６ａおよび図６ｂに示す618）に連結される。前記電子基板（618）は、増幅器、アナログ・デジタル変換器およびマイクロコントローラを含んでいてもよい。なおこれらの要素は、図６ａおよび図６ｂには示されていない。
【０１１２】
図６ａおよび図６ｂに示すように、試料タブ（610）は、試料スロット（608）に挿入できる。命令がキーボードまたはキーパッド（606）から実行され、データ、例であって、決して制限するとみなされてはならないが、たとえば結果が、モニターまたは画面（604）に表示される。携帯型装置にとって、１つまたは２つ以上のスイッチ、ボタンまたはキーの使用がキーボードまたはキーパッドには好ましく、これらはすべて、本発明の範囲に含まれていると考えられる。ホストコンピュータの使用も本発明の範囲に含まれていると考えられる。交信ポートは図に示されておらず、任意である。
【０１１３】
試料スロットおよび検出器を室内照明から適切に遮蔽することが望ましいが、その遮蔽の程度は、測定される被験物またはパラメータ、および暗電流測定値の使用の有無による。装置はどの方向にも向けることができ、特に上下を入れ替える、すなわち図６ａおよび図６ｂのようにEMR線源を試料の上側に設置するのではなく、試料の下側に設置することもできる。
【０１１４】
吸光度は、電子基板（618）上に設置したマイクロコントローラ（図には示されていない）により下記の式に従い計算される：
Absorbancei = log {(RLi - RDi) / (SLi - SDi)} + log(ITS / ITR)
この式において
Ab sorbancei  ＝ピクセルｉにおける吸光度
RLiは標準光ｉ＝標準ピクセルｉリーディング；
RDiは標準暗ｉ＝標準ピクセルｉリーディング；
Sliは試料光ｉ＝試料ピクセルｉリーディング；
Sdiは試料暗ｉ＝試料ピクセルｉリーディング；
ITS＝試料測定積分時間（Integration time for sample measurement）；
ITR＝標準測定積分時間（integration time for reference measurement）；
i＝検出器列の特定のピクセル（波長）
【０１１５】
本発明の方法は、１つまたは２つ以上の被験物についての１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムが、分光学的装置に組み込まれることを要求する。例であって、決して制限を加えるとみなされてはならないが、たとえば、前記１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムは、電子基板（618）に組み込まれたマイクロコントローラ内にインストールすることができる。しかし、１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムは、どのような形式の不揮発性メモリー、例であって、決して制限を加えるとみなされてはならないが、たとえば、ROM、EPROM、EEPROM（electronically erasable programmable read only memory）、CD、ディスケット、またはメモリーカードにもインストールできる。
【０１１６】
装置は、試験用試料容器（たとえば図５の542）を受ける試料スロット（たとえば図５の540）を含むことがある。「試料スロット」とは、試料容器が位置付けられる開口部、または試料が適合する溝、チャンネルまたはスリットを意味する。前記スロットは、図５および図６にはEMRが垂直方法に進む水平スロットとして示されているが、どの方向にも向けることができる。他の配置には、試料容器（たとえばキュベット）を受ける垂直試料スロットからなる分光学的装置も含まれる。この組合せにおいて、EMRは水平方向に試料を通過する。
【０１１７】
図５および図６に示すように、試料スロットは、EMRが試料容器を収容するスロットの上面に入り、透過したEMRがスロットの底面で収集されるか、またはその逆（この場合、照射EMRはスロットの底面から入り、上面から抜け出る）になるように設定できる。スロットは、EMRが、試料容器を収容するスロットの上面に入り、そこで透過したEMRがスロットの底面に設置された反射表面または反射部材（すなわち図４ａおよび図４ｂの450）から反射するようにも設定できる。この場合、透過したEMRは、スロットの裏面またはその近傍の試料容器の側面に設置された反射表面で反射し、その反射したEMRがスロットの上面で集光される。
【０１１８】
試料容器は、任意に１つまたは２つ以上の試薬を含むことができ、また試料容器は、任意に１つまたは２つ以上の試薬を含むことができる適切な容器（キュベットまたは試料タブを含む）であってもよい。
【０１１９】
（試料タブ）
試料容器の非制限的な１つの例が、試薬を使用しない試料タブである。試料スロットは、試料タブを適切な方向、たとえば水平方向に受入れるように設計される。試料が全血の場合であって、沈殿しやすい赤血球が沈降することを許容する場合には、水平方向が好ましい。この場合、赤血球がEMRの経路に残るようにするには、EMRは垂直方向に当たるべきである。しかし、試料スロットのいかなる配置も、本発明の範囲に含まれると考えられる。試料容器は、毛管現象により試料を吸引するように設計されたキュベットであってもよく、任意に１つまたは２つ以上の試薬を含むこともできる。
【０１２０】
試料タブは、試料ウェル付基板および蓋を含み、前記基板の少なくとも一部および前記蓋の少なくとも一部が、EMRをその中を透過させるよう適合されている。もう一つの方法として、試料タブは、試料ウェル付基板および蓋を含み、前記基板の少なくとも一部が、EMRを試料の中を通過させるよう適合され、前記蓋の少なくとも一部が、試料から出てくるEMRを反射するように適合され、反射したEMRが前記基板の試料タブを離れる前に試料を横切るように適合されるか、または前記蓋の少なくとも一部が、EMRを試料の中を透過させるよう適合され、前記基板の少なくとも一部が試料から出てくるEMRを反射するように適合され、反射したEMRが前記蓋の試料タブを離れる前に試料を横切るように適合されている。本発明の１つの態様によれば、試験用試料を保持する試料タブが提供される。前記試料タブは、試料容器の１つの例として使用され、限定を加えるとみなされてはならない。
【０１２１】
使用に際しては、試料は、電磁放射線が基板を透過し、ウェル中の試料を透過し、そして蓋板を透過できるように、試料タブの基板と蓋板との間にあるウェルの中に保持される。しかし、放射光線が試料を透過して、基板または蓋板のいずれかに反射し、それにより放射光線の経路長が２倍になることも、本発明の範囲に含まれる。経路長が２倍になることにより、試料の量が減少しても分析に使用できる。基板または蓋板は、反射表面を持ってもよいし、あるいは反射材で製造されてもよい。別の方法として、試料タブを透明材または半透明材でつくることもでき、図４ａおよび図４ｂに示すように、この場合であっても反射モードで使用することもできる。この場合、試料スロット（440）の下に置かれた反射部材（450）は、たとえばセラミックコーティング、硫酸バリウム、SPECTRALONTM、SPECTRAFLECTTM、またはDURAFLECTTM（これらに限定されない）からなることができる。
【０１２２】
図７ａ、図７ｂに、試料タブの実施例の態様を示すが、決して制限を加えるものとはみなされるべきではない。試料タブ（720）は、基板（718）、蓋板（702）、および閉鎖壁（706）を持つ試料ウェル（714）からなる。試料ウェル（714）は、必要に応じいかなる容量でもよく、たとえば、少量の血液がウェルに満ちるに十分な大きさであって、好ましくは多少余裕があればよい（これに限定されない）。例であって、決して制限を加えるとみなされてはならないが、たとえば、ウェルは、図７ａ、図７ｂに示すように、寸法が直径4mm、深さ2mmの円形であってよい。
【０１２３】
蓋板（702）が閉じて、試料ウェル（714）および基板（718）の上にくると、閉鎖壁（706）のオーバーフロー孔または溝（716）により、過剰の試料が試料ウェル（714）から流れ出る。試料ウェル（714）から溢れる試料を、試料タブから漏出しないように、オーバーフローリング（壁706と壁712との間の円形の溝）に保持し、他方、十分な量の試料がウェルを満たすために、格納壁（712）（これに限定されない）などの二次壁が利用できる。このため、格納壁（712）の鉛直高さは、試料ウェル（714）の閉鎖壁（706）の高さと同じか、それ以下である。より好ましくは、試料ウェル（714）の閉鎖壁（706）と同じ高さである。蓋板（702）は、ちょうつがい（710）、または技術的に既知の適切な取り付け方法で、基板（718）に取り付けるのが好ましい。しかし、蓋板が基板にパタンと閉じるような、ちょうつがいを使用しない蓋板も使用可能である。
【０１２４】
試料タブは、技術的に既知の適切な材料、たとえばガラス、プラスチック、もしくはその組合せの透明材、半透明材、または部分的には反射材など（これらに限定されない）で製造できる。基板および蓋板を透明または半透明とする場合には、基板および蓋板は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスチレンなど（これらに限定されない）の透明または半透明なプラスチックからなることが好ましい。しかし、ガラス板も使用できる。基板または蓋板のいずれかを反射性のものにする場合は、セラミックコーティング、硫酸バリウム、SPECTRALONTM、SPECTRAFLECTTM、DURAFLECTTMなど（これらに限定されない）の反射材が、基板または蓋板の１つとして使用できる。
【０１２５】
蓋板（702）を基板（718）に固定するため、試料タブは、任意に、固定部材を含んでもよい。固定部材は、蓋板、基板またはその両方の一部からなることができる。さらに固定部材は、可逆的にまたは不可逆的に蓋を基板に固定してもよい。米国特許出願10/042,258（公開番号2002-0110496 A1；Samsoondar；その内容は参照として援用する）に説明されているもの（これらに限定されない）などの技術的に既知の固定部材が、本発明の試料タブと共に使用できる。格納壁を使用すれば、試料が試料タブ内に保持され、試料間の汚染を削減できる。さらに、試料タブの蓋板を閉鎖位置に固定することにより、試料タブは、試料の漏出なしに使用後に、容易に処分でき、あるいは試料タブを、たとえば分光学的装置内での使用のために改造されたキュベット保持具内で、垂直方向に使用できる。
【０１２６】
蓋板（702）を基板（718）に固定できる固定部材（704）も示されている。この例において、固定部材（704）は、格納壁（712）と摩擦的に係合でき、これにより蓋板（702）を基板（718）に逆に取り付けて、試料が試料タブから流出するのを防ぐことができる円形リングからなる。
【０１２７】
蓋板がウェル上に閉じて、基板と接する場合、格納壁（712）の上面が蓋スリップの下面と密着するのが好ましい。しかし、万一格納壁を越えて漏出が生じる恐れのある場合、固定部材も、試料を試料タブ内に密閉するために使用できる。
【０１２８】
試料タブの別の態様によれば、吸光度は、EMRの透過ではなく、反射で計算することができる。反射の場合、基板または蓋板のいずれかが反射表面を持つか、または反射部材で作られる。かかる反射表面または反射材には、適切な反射コーティング、たとえばセラミックコーティング、硫酸バリウム、SPECTRALONTM、SPECTRAFLECTTM、またはDURAFLECTTM（これらに限定されない）などが含まれる。
【０１２９】
（波長キャリブレーション）
ピクセル数に代わり、波長がキャリブレーションアルゴリズムで使用される場合、分光器をキャリブレーションしなければならない。キャリブレーションアルゴリズムトランスファーを容易にするには、分光器の波長キャリブレーションを行う必要がある。波長キャリブレーションの方法の例をいくつか次に示すが、これらは例示であって、制限を加えるとみなされてはならない：
【０１３０】
（方法１）
波長の分かっているレーザ、または波長の分かっているバンドパスフィルターを透過してきたEMRが、線形ダイオードアレイのピクセルに照射される。EMRは、レーザまたはバンドパスフィルターに限定されず、他の単色EMRの線源も使用できる。EMRが２つ以上のピクセルに衝突し、そのEMRのピーク強度の相対的位置が、当業者に既知のプロセスで数理的に決定される。さらに、ピーク強度は、２つのピクセルの間にあることもある。対象となるピクセルは、スペクトルの一方の端近傍にあるのが好ましい。スペクトルのもう一方の端近傍に好ましく照射された、波長の分かっている第２レーザ、または波長の分かっている第２バンドパスフィルターを透過してきたEMRが、使用でき、また光線が照射されたピクセルが特定される。ピクセル数が判明しているので、ピクセル分散を決定できる。２つの既知の波長とそれに対応するピクセル、およびピクセル分散により、波長キャリブレーション表、すなわち線形ダイオードアレイの各ピクセルに対応する離散波長を提供する表を、生成できる。
【０１３１】
１つまたは２つ以上の装置から得た波長キャリブレーション表の波長における吸光度は、そのあと補間され、波長標準セット上でマッピングできる。標準波長の両端にある２つの実際の波長における吸光度が、補間され、標準波長における吸光度が得られる。このプロセスを各標準波長について繰り返す。これは、異なる装置により得られた波長を同じように見せる好ましい方法である。測光精度は、部分的には波長精度によって決まり、被験物濃度の予測精度は、装置の測光精度によって決まる。この点において、求められるのがイエス／ノーだけであるような被験物の定性測定には、同じ被験物の定量測定と同じ水準の波長精度は必要ではない。さらに、キャリブレーションアルゴリズムは、第１装置および１つまたは２つ以上の類似装置で測定された、１つまたは２つ以上の一次キャリブレータからのデータを含むことにより、より堅牢に開発できる。
【０１３２】
この波長キャリブレーション方法において、第１波長は、各装置の線形ダイオードアレイの同じピクセルに照射される必要はない。なぜなら、吸光度は補間され、波長標準セットでマッピングできるからである。第２レーザまたは第２バンドパスフィルターの波長は、EMR光線が線形ダイオードアレイの他の端近傍に照射されるように選択されるのが好ましい。端ピクセルで得られた吸光度にノイズがある場合は、レーザまたはバンドパスフィルターは、EMR光線が線形ダイオードアレイの端ピクセルに近すぎないように照射されるのが好ましい。さらに、バンドパスフィルターは狭い波長を透過するバンドパスフィルターであることが好ましい。
【０１３３】
（方法２）
波長キャリブレーション表を生成するもう一つの方法は、各線形ダイオードアレイの同じピクセルに一次光線を照射する方法である。この方法を波長キャリブレーション表の生成に使用する場合は、上に説明したように異なる波長の２つの光線を使用してピクセル分散をあらかじめ測定する。ピクセル分散は、１つの分光器により測定できるが、２つ以上の類似分光器から平均値を得るのが好ましい。同じピクセル分散が各装置において使用され、一次光線が各類似線形ダイオードアレイの同じピクセルに照射されれば、各装置についての波長キャリブレーション表は同じになるはずであり、したがってこの波長キャリブレーション表は、波長標準セットとして使用できる。その結果、吸光度の補間および波長標準セットへのマッピングは、自動的に排除できる。第２光線は、波長精度の検証に使用できる。
【０１３４】
（方法３）
波長キャリブレーション表を生成する第３の方法は、第１光線を線形ダイオードアレイ中の任意のピクセルに照射すること以外は、第２の方法と類似している。もし、異なる装置について第１の光線が照射されるピクセル番号が異なれば、異なる装置における波長キャリブレーション表中で、特定の波長が割り当てられるピクセル数が異なることになる。この場合、標準波長セットを生成するために、以下のようなソフトウェアが使用されることがある。
（i）異なる装置の波長キャリブレーション表に共通の波長セットを確立する。
（ii）波長標準セットの波長範囲を選択する。前記波長範囲は、標準波長セットに属する波長を持つ。
【０１３５】
上記の第３の方法で説明した異なる装置から得られる波長キャリブレーション表は、異なる装置のピクセル番号に同じ波長が割り当てられないことがある。当初のピクセルは、ピクセル番号の近似値の場合があり、異なる装置における当初のピクセル（群）は、近似的に同一の場合がある。そして、許容近似値は主キャリブレーションアルゴリズムに必要な予測精度によって決まる。すなわち、当初のピクセルの特定は不正確である可能性がある。特定が不正確なピクセルが、約+/-Nピクセルと同じまたはそれ以下（Nは波長範囲を含むピクセルの数）であれば、不正確な特定も許容できる。たとえば、ピクセル分散が２nmであり、かつ許容できる誤差が+/-10nmであれば、その特定が不正確なピクセルは、光線が衝突した実際のピクセルの一方側で５ピクセル以下でなければならない。誤差レベルは、一般的には+/-2nmから +/-20nmまで（これに限定されない）であれば許容でき、より好ましくは+/-2nmから +/-10nmまでである。波長キャリブレーション方法の選択は、主キャリブレーションアルゴリズムの必要とされる予測精度によって決まる。
【０１３６】
（キャリブレーションアルゴリズムトランスファー）
本発明の別の態様は、キャリブレーションアルゴリズムトランスファーである。たとえば図６ａおよび図６ｂに示す電子基板（618）のマイクロコントローラに組み込まれた、操作上分光学的装置と連携する１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムは、試料中の１つまたは２つ以上の被験物の存在の有無またはその濃度の決定に使用される。前記１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムは、いかなる形式の不揮発性メモリー、例であって、決して制限を加えるとみなされてはならないが、たとえば、ROM、EPROM、EEPROM（electronically erasable programmable read only memory）、CD、ディスケットまたはメモリーカードにもインストールできる。前記１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムは、一次キャリブレーション過程によって１つまたは２つ以上の第１装置で前もって開発され、また前記１つまたは２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムは、第２装置という別の装置に転送された。キャリブレーションアルゴリズムトランスファーについては、米国特許6,651,015（Samsoondar、参照として援用する）に説明されている。
【０１３７】
好適な実施例において、主キャリブレーションアルゴリズムは、１つまたは２つ以上の装置で完全に開発され、本発明の装置に簡単にインストールされる。好適な実施例では、主キャリブレーションアルゴリズムの定数および係数の調整は行われない。しかし、キャリブレーションアルゴリズムは、第２装置で試験される一次キャリブレーションセットにおいて使用される試料とは異なる弁別的な試料セットを使用して、得られることがあり、データは、１つまたは２つ以上の「主キャリブレーションアルゴリズム改良型」を開発するために、主キャリブレーションセットから得られる元データの一部または全体と統合される。１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズム改良型の使用も、本発明の範囲に含まれると考えられる。主キャリブレーションアルゴリズム改良型については、米国特許6,651,015（Samsoondar、参照として援用する）に説明されている。
【０１３８】
被験物濃度の予測値がより正確であるためには、第２装置の実際の波長で測定される吸光度が、標準波長を含む実際の波長で吸光度を補間することにより、波長標準セットの標準波長にマッピングできなければならない。吸光度のマッピングおよび吸光度の補間についても、米国特許6,651,015（Samsoondar、参照として援用する）に説明されている。
【０１３９】
キャリブレーションアルゴリズムトランスファーの後、「測光補正」または吸光度補正も行えるが、検査対象の被験物が必要とする精度による。測光補正または吸光度補正についても、米国特許6,651,015（Samsoondar、参照として援用する）に説明されている。
【０１４０】
分光器および分光光度計という用語は、時として同義的に用いられることがあり、本発明の発明者は、この２つの用語を区別していない。
【０１４１】
（体液中のヘモグロビン）
溶血指標としてのHbの測定精度は、いくつかの要素によって決まる。たとえば、次の要素が挙げられるが、これらは例であって、制限を加えるとみなされてはならない。
１）溶血指標として選択されるHb種；
２）主キャリブレーションアルゴリズムの開発に使用される主キャリブレーションセット中の各試料の構成物質；および
３）溶血指標の標準値に含まれるHb種。
米国特許6,268,910 B1、米国特許5,846,492、WO-98/39634、およびWO-97/47972が、Hb用キャリブレーションアルゴリズムについて説明しており、その中でHbが溶血指標として使用される。しかし、前記明細書のいずれも、溶血指標として使用されるHb種については指摘していないし、Total-Hbが溶血指標として使用されることについての示唆もない。
【０１４２】
被験物についての標準値の正確な推定値を用いて、特定の被験物について主キャリブレーションアルゴリズムが開発されるが、試料中に存在する他の被験物または物質が被験物の予測値の誤差を引き起こす可能性があることが、当業者に理解されなければならない。このことは、特に、HbがいくつかのHb種として存在し、これらのHb種が主キャリブレーションアルゴリズムにおいて評価されなければならない溶血指標の予測値に当てはまる。たとえば、溶血指標がTotal-Hbでもよく、標準測定は、標準的な方法、たとえばTotal-Hb測定のシアンメトヘモグロビン（cyanMet-Hb）標準法（（TietzTextbook of Clinical Chemistry 3rd Ed、1999、pp 1674-1676）（これに限定されない））を使用して、行われる。主キャリブレーション試料中に存在するTotal-Hbが、適度のばらつきのあるHb種から成っていない場合、Met-Hbの比率が高い試料についてのTotal-Hb予測値は、著しく低く見積もられる可能性がある。
【０１４３】
溶血指標の測定に必要とされる精度は、溶血指標の応用によって決まる。溶血は、赤血球に含まれる物質を血清または血漿中に遊離させるので、赤血球（RBC）内に存在するが、RBCのまわりの血漿には存在しない物質が、溶血指標として使用できる。Hbは赤血球に含まれる物質の一例であり、溶血が起こると血清または血漿に現れる。
【０１４４】
溶血は、生体外でも生体内でも起こる。生体外の例は、試料が乱暴に取り扱われた場合、生体内の例は、赤血球の膜が脆弱な患者、人工心臓弁を持つ患者の場合である。したがって、溶血指標を正確に測定するには、次の項目を確定することが望ましい。
１）生体内、生体外溶血の複合の程度；
２）溶血の真のレベル。たとえば、カリウムのような物質の濃度が、生体外溶血により、血清または血漿内でどれだけ人工的に上昇するかを把握するため（カリウムは、溶血した赤血球から離れる物質のもうひとつの例。赤血球中のカリウム濃度は、血漿中における濃度の約25倍である。）；および
３）ヘモグロビンの流出による血清または血漿の吸光度の上昇。Hbにより人工的に増加した吸光度が、他の被験物の分光学的アッセイにどのような影響を与えるかを把握するためである。
【０１４５】
Total-Hbは、重要な溶血指標であり、溶血の程度の正確な推定値を提供する。動脈血中の正常なHbの構成は、CO酸素濃度計により動脈血で測定すると、Oxy-Hbが約95％、Met-Hbが約１％、carboxy-Hbが約２％、deoxy-Hbが約２％である。CO酸素濃度計の技術は、よく知られており、全血中のヘモグロビン種（Oxy-Hb、Deoxy-Hb（またはreduced-Hb）、Met-Hb、Carboxy-Hb）を測定する。血清および血漿は、通常静脈血から採取されるが、その場合も、溶血が生じている血清および血漿中のHb種の割合は、動脈血について説明されている割合と類似している。Total-Hb中のOxy-Hb比率（Hb酸素飽和度という）は、静脈血試料と比較して、動脈血試料においてはるかに高い（静脈血中のDeoxy-Hbが増加するため）が、静脈血（血清および血漿）中のOxy-Hbレベルが上昇するのは、試料が、酸素を20パーセント含む空気（760Hgの20％、すなわち152mmの酸素分圧）に曝露するためである。したがって、Oxy-Hbは、特に正常なHb種の血液試料では、もう一つの重要な溶血指標である。
【０１４６】
図３は、試料中のMet-Hbの増加を示しているが、Met-Hb 形であるTotal-Hb部分が不明である。図３のMet-Hbは、Hbの自然酸化により生成されたものである。図３に示す吸光度スペクトルの溶血血液の供血者は同じであり、新しい溶血血液の吸光度スペクトルを別の日にも測定したが、区別ができなかった。ここでは血清および血漿の溶血について説明したが、全血も含め、体液にも同じことがあてはまる。
【０１４７】
Oxy-Hb、Deoxy-HbおよびCarboxy-Hbの吸光度スペクトルは、約576nmから700nmまでの領域（特に、図２に示すように、約590nmから約610nmまでの領域）で、同じ波長領域のMet-Hbの吸光度（はるかに低い）と比べ、非常に類似している。Met-Hbはまた、約632nmで特徴的な吸光度ピークを示す。したがって、Total-Hbのキャリブレーションアルゴリズムが、たとえば約95％のOxy-Hb からなる、Total-Hbの予測値である標準値を使用して開発されると、試料中の大量のDeoxy-HbおよびCarboxy-HbがTotal-Hbの測定値に含まれてしまう可能性がある。しかし、Met-Hbの吸光度が、576nmから700nmの領域で低く、その結果Total-Hb の標準測定値と比較してTotal-Hbが著しく過小評価される可能性がある。この場合、溶血指標としてTotal-Hbについてのキャリブレーションから得られる予測値は、「Total-HbマイナスMet-Hb」の量をより反映した値である。この例では、溶血指標は「Total-HbマイナスMet-Hb」であるといってもよいだろう。
【０１４８】
Oxy-Hbが全Hb種の約95％である例では、Oxy-Hbの標準値はTotal-Hbの予測値として使用できる。Oxy-Hb部分がTotal-Hbの約95％であるOxy-Hbの既知標準値の試料は、Oxy-Hbと同じ値のTotal-Hb濃度を持つと考えられる。同様に、約95％のOxy-Hbからなる既知Total-Hb濃度の試料は、Total-Hb濃度と同じ値のOxy-Hb濃度を持つと考えられる。Oxy-Hbの予測値は、Met-Hbの影響を受けたとしてもそれほど大きく影響は受けないだろう。しかし、Met-Hb の大半が測定されないので、Oxy-Hbの予測値は、信頼できる溶血指標とはならないだろう。
【０１４９】
上に説明したHb測定方法は、Hbの体液への混入、または血漿および血清中の溶血に関するものであるが、全血中のHb測定は、本発明の範囲に含まれる。全血中のHbと血清または血漿中のHbとの唯一の相違は、Hb濃度と赤血球の光散乱効果である。赤血球により引き起こされる光散乱効果を増加させるため、INTRALIPID粒子を血清または血漿中のHbについての主キャリブレーションセットのいくつかの試料に加えることができる。
【０１５０】
したがって、本発明の方法の１つの態様は、大量のMet-Hbが存在する中、Total-Hbの過小評価を次のように克服することである。
・方法１：Met-Hbを主キャリブレーションセットに加え、前記Met-Hbをキャリブレーションアルゴリズムの開発のためのTotal-Hbの標準値に含めること；または
・方法２：Met-Hbを主キャリブレーションセットに加えること。しかし、キャリブレーションアルゴリズムの開発中に前記Met-HbをHbの標準値に含めない。
【０１５１】
方法１においては、Total-Hbについてのキャリブレーションアルゴリズムは、Met-Hbを予測されたTotal-Hb結果にある程度は含める。
【０１５２】
方法２においては、キャリブレーションアルゴリズムは、「Total-HbマイナスMet-Hb」を予測し、試料中のMet-Hbは無視される。
【０１５３】
再度方法２を参照して、方法２では、Met-Hbが所定の値を上回る試料中のMet-Hb測定のため、別の主キャリブレーションアルゴリズムが、Met-Hbについて開発される。または、予測Met-Hbが、Total-Hbの決定のため、上に説明した「Total-HbマイナスMet-Hb」に加えられる。上記に定める方法２は、Met-Hbが存在する中でTotal-Hbを得る正確な方法である。
【０１５４】
「Total-HbマイナスMet-Hb」についての主キャリブレーションアルゴリズムは、各量のOxy-Hb、Deoxy-Hb、Carboxy-HbおよびMet-Hbを含む主キャリブレーションセット中の試料を使用して開発できる。Oxy-Hb、Deoxy-HbおよびCarboxy-Hbの量を合計して、標準値内のTotal-Hbの濃度（実際には「Total-HbマイナスMet-Hb」）とすることが好ましい。溶血指標として使用される物質の名称は、通常は標準値に含まれる物質と同じである。しかし、標準値に含まれる実際の物質は、主キャリブレータの構成によって決まる。
【０１５５】
方法１を使用して得られる予測Total-Hbの精度が、特定のアプリケーションに受け入れられるのであれば、方法１は使用できる。
【０１５６】
本発明の１つの態様において、「Total-HbマイナスMet-Hb」についての主キャリブレーションアルゴリズムの条件およびMet-Hbについての主キャリブレーションアルゴリズムの条件が合計されて、補正総ヘモグロビン（Corr-Total-Hb）量を予測する単一キャリブレーションアルゴリズムについての条件セットが形成される。
【０１５７】
本発明の他の態様において、溶血指標はOxy-Hbであり、Corr-Total-Hb値は、Oxy-HbおよびMet-Hbについての予測値を加算することにより得られる。Deoxy-Hbおよび／またはCarboxy-Hbのほぼ大部分は、もし試料中に存在すれば、Oxy-Hbとして測定されることが、当業者により理解されるであろう。
【０１５８】
上に説明したように、供血者が供血直前に一酸化炭素に曝露していないか、またはヘモグロビン血症に罹患していなければ、溶血試料または全血試料中のHbのほぼ95％は、通常はOxy-Hb状態にある。一酸化炭素に曝露（主に煙草の吸煙による）すると、Carboxy-Hbの上昇を引き起すし、またメトヘモグロビン血症になるとMet-Hbが上昇する。Hb分子のヘム部分にある鉄の酸化は、生体内で起きる正常な作用である。酵素が常にこの過程を逆転する働きをしており、したがってMet-Hbの蓄積を防いでいる（たとえば、NADHメトヘモグロビン還元酵素およびメトヘモグロビン還元システム）。メトヘモグロビン血症は、この酸化の逆転に必要な酵素が欠損している状態である。この酸化を逆転する酵素が欠損すると、溶血後時間が経過した血清または血漿中で、同様にHbがMet-Hbに自然に酸化して、試料が暗赤褐色化する。
【０１５９】
図３は、溶血した試料の吸光度スペクトルが時間の経過とともにどのように変化するかを示している。暗赤褐色化を伴う約632nmにおける吸光度ピークは、HbがMet-Hbに変化することを示している。Met-Hbの蓄積は、Hbをベースとする血液代替物を輸血された患者の血清または血漿でも起こる。溶血した血清または血漿の試料中のMet-Hb、またはHbをベースとする血液代替物を輸血された患者の血清または血漿中のMet-Hbについてのキャリブレーションアルゴリズムは、好ましくは約630nmにおいて最大吸光度のピークの負吸光度勾配を使用して、開発できる。例６（方程式22）は、主キャリブレーション波長として645nmを使用する、Met-Hbについての主キャリブレーションアルゴリズムの一例である。
【０１６０】
本明細書で説明するMet-Hbの測定は、Hbが酸化してMet-Hbに変化する状況、またHbをベースとする血液代替物が酸化してMet-Hb形に変化する状況を測定するために、血清、血漿、尿、髄液、リンパ液および滑液中の溶血指標の測定に利用される。さらに、本明細書で説明するMet-Hbの測定は、Hbをベースとする血液代替物を輸血された患者または輸血されていない患者の全血中のHbの測定にも利用される。
【０１６１】
（ヘモグロビンの酸化）
Hb分子のヘム部分にある鉄の酸化は、生体内で起きる正常な作用である。酵素がこの酸化作用を逆転する働きをしており、したがってMet-Hbの蓄積を防いでいる。メトヘモグロビン血症は、この酸化作用の逆転に必要な酵素、たとえばNADHメトヘモグロビン還元酵素が欠損している状態である。メトヘモグロビン還元システムが未発達な幼児では、ヘモグロビン血症が大人より多く見られる。幼児や新生児にメトヘモグロビン血症が多いもう一つの理由は、一部の幼児で消化系器官が未発達なためである。消化系器官が未発達だと、胃液の分泌が少ないため細菌が増殖しやすくなる。消化系器官の細菌が硝酸を亜硝酸に変化させ、その亜硝酸がHbと反応して、Met-Hbを生成する。
【０１６２】
溶血の後時間が経過した血清中でMet-Hb還元酵素が欠損すると、HbがMet-Hbに自然に酸化して、試料が暗赤褐色化してしまう。図３において、暗赤褐色化を伴い、HbがMet-Hbに変化していることを示す約632nmにおける吸光度ピークが観察される。メトヘモグロビン還元酵素が欠損していない患者にもMet-Hbの蓄積が起こる。このような患者では、Met-Hbの蓄積が、ある種の治療薬およびその他の化学物質、例であって制限を加えるとみなされてはならないが、たとえばダプソーン、クロロチン、フェナゾピリジン、フェナセチン、硝酸、亜硝酸、フェノール、アニリンなどを摂取すると誘発される。Met-Hbレベルが高い患者については、その原因の如何を問わず、Met-Hb量の増加、または治療後のMet-Hb量の減少、またはその両方を監視しなければならない。
【０１６３】
正常な人の場合、動脈血中のHbの組成（Tot-Hbに対する％）は、CO酸素測定による測定では、Oxy-Hbが約95％、Deoxy-Hbが約２％、Carboxy-Hbが約２％、Met-Hbが約１％である。ヘビースモーカの場合、このCarboxy-Hbが約10％になることもある。Hbの組成は、Hb種の％の測定に使用されるCO酸素濃度計の影響を受ける。最近のCO酸素濃度計では測定数字が異なることがよくあるが、これは従来よりも多くの波長を使って測定が行われるからであって、測定数字に対する信頼性はおそらく以前より高いだろう。波長が多くなれば、ビリルビン、混濁、スルヘモグロビン、胎児性ヘモグロビンなどの阻害物質を補正することができるはずである。CO酸素濃度計は、Hb種の％を測定するための標準装置と一部では考えられているが、CO酸素濃度計を使用する方法は、血液試料中のHb種の％を測定する真の標準方法とはいえないことを理解すべきである。
【０１６４】
Tot-Hb およびMet-Hbは、ピン刺で採決した血液試料で測定でき、その％Met-Hbが計算できる。％Met-Hb測定のキャリブレーションアルゴリズムも、２つの異なる波長、たとえば約630nmと約560nmで試料の吸光度比率を得ることにより、実験的に開発することができる。図２において、約630nmにおけるMet-Hbの吸光度は、その他の種のそれぞれの値よりも大きいのが分かる。約560nmにおいては逆にMet-Hbの吸光度が低い。この２つの波長は、例として挙げてあるのであり、限定するものとみなされてはならない。
【０１６５】
さらに、560nmと940nmにおける吸光度の比率は、％Met-Hbについてのキャリブレーションアルゴリズムにおける２つ以上の比率条件の１つである。１つの条件として吸光度比率を使用するか、または１つのキャリブレーションアルゴリズムにおける２つ以上の類似した条件の合計を使用するのが好ましい。しかし、キャリブレーションアルゴリズムの開発に使用されるいかなる統計技法も、本発明の範囲に含まれている。Met-Hbの存在を確認するためTotal-Hb（血清および血漿中の溶血指標として用いられる）の測定を補正する方法が、米国特許6,689,612（Samsoondar、参照として援用する）で開示されている。Met-Hbのキャブリブレーションで説明した方法、すなわちMet-Hbの存在下でTotal-Hbを補正することと、Met-Hbが存在するときにTotal-Hbに標識することは、全血試料に対しても使用できる。
【０１６６】
（ヘモグロビンをベースとする血液代替物の劣化および劣化の改善）
輸血は、外傷により、または手術により大量失血が起こったとき取られる救命処置の１つである。全血（「全血」とは、血液の細胞成分および非細胞成分を組み合わせた血液をいう）または赤血球に代わり、血液代替物を使用する利点は、
ａ）血液代替物は、どの血液型にも例外なく適合することが期待でき、したがって輸血前の適合性確認試験が不要であること、
ｂ）血液の最大保存期間が42日であるのに対して、血液代替物はさらに長期間保存可能なこと、および
ｃ）血液代替物の精製過程に熱処理も含まれており、これによりウイルス感染の可能性が低下すること、
である。
【０１６７】
現在開発中のほとんどの血液代替物が、ヒトのHbもしくはウシのHbから、または遺伝子組み換え技術（遺伝子組み換えHb）によって生成されている。ヘモグロビンは、２対の同じポリペプチド鎖である４つのたんぱく質サブユニットからなる。各サブユニットの分子量は約16,000であり、酸素結合サイトであるヘム（鉄ポリフィリン）グループを含む裂け目がある。サブユニットは共有結合しておらず、サブユニットを維持するには赤血球膜が必要である。ヘモグロビン分子は大きすぎて腎臓組織に入れないが、サブユニットは小さくて腎臓内にとどまるため、腎障害を引き起こす。
【０１６８】
Hbをベースとする血液代替物では、Hbのサブユニットが化学的に、お互いに、あるいは大きなポリマーと架橋結合しているか、またはHb分子が他のHb分子と結合して、poly-Hbを形成し、安定している。Hbサブユニットは、分子内または分子間で架橋結合することもできる。ヘムグループの周りに存在するたんぱく質またはポリマーにかかわらず、Hbをベースとする血液代替物の吸光度スペクトルは、正常Hbとほとんど同じであるが、特定の波長では若干の相違を示す。Hbは、通常赤血球膜内でMet-Hb還元酵素と接触するが、Hbをベースとする血液代替物は、その赤血球膜内に入らないので、コントロール不能の自然な酸化によるMet-Hbへの変化は避けられない。血液代替物に関しては、「Blood Substitutes: Principles, Methods, Products and Clinical Trials」（1998年、T.M.S. Chang著、Karger Landes Systems出版）に詳しく説明されている。Hbをベースとする、どのような形の代替血液も、本発明の範囲に含まれると考えられる。
【０１６９】
Met-Hb還元酵素が欠損しているために、Met-Hbが、Hbをベースとする血液代替物を輸血された患者の血漿に蓄積する可能性がある。Total-Hbに対するMet-Hbの比率の測定または計算は、Hbをベースとする血液代替物の劣化によるMet-Hb生成のモニタリング、または１つまたは２つ以上の治療薬の投与後などにおける劣化（すなわち酸化による劣化）の還元プロセスのモニタリング、またはHbをベースとする血液代替物をNADHメトヘモグロビン還元酵素のような酵素もしくはその他の還元剤で封入することによる自然酸化プロセスの遅延のモニタリングに有用である。この例では、Hbをベースとする血液代替物およびHbをベースとする血液代替物のMet-Hb型が、２つの血液被験物である。１つまたは２つ以上の型のHbをベースとする血液代替物を輸血された患者では、Total-Hbが、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物および内生Hbを含んでいる可能性があり、またMet-Hbが、１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物のMet-Hb型および内生Met-Hbの両方を含んでいる可能性がある。
【０１７０】
Hbをベースとする血液代替物の劣化（すなわち酸化）をモニタリングする方法では、Met-HbおよびHbをベースとする血液代替物についてのキャリブレーションアルゴリズムを開発することが必要である。このキャリブレーションアルゴリズムは、１つまたは２つ以上の波長において試料が吸収したEMRを処理する統計技法を任意に使用することにより開発することができる。１つまたは２つ以上のHbをベースとする血液代替物およびMet-Hbの濃度は、それぞれのキャリブレーションアルゴリズムを１つまたは２つ以上の波長における試料の吸光度に適用することにより決定できる。Met-HbについてのキャリブレーションアルゴリズムおよびHbをベースとする血液代替物についての別のキャリブレーションアルゴリズムを使用することにより、Met-Hbが、Total-Hbをベースとする血液代替物の比率、部分またはパーセントとして報告される。あるいは、キャリブレーションアルゴリズムが、Met-Hbの形をとるTotal-Hbをベースとする血液代替物の比率、部分またはパーセントについて開発できる。
【０１７１】
米国特許出願10/136,329（公開番号2003-0138960 Ai；Samsoondar；参照として援用する）は、Hbをベースとする血液代替物のMet-Hb派生物の生成を監視することにより、Hbをベースとする血液代替物の劣化を監視する方法について説明している。この出願では、試料は、血液代替物を輸血された患者の全血、血清、血漿、または生体の一部であることを教示している。同じ方法が、Hbをベースとする保存血液代替物の劣化の監視にも使用できる。「Hbをベースとする保存血液代替物」とは、たとえば患者への輸血などに使用するなど（例であって、決して制限を加えるとみなされてはならない）、すぐに使用できる状態にある、製造されたHbをベースとする血液代替物を意味する。Met-Hbの存在下で、Total-Hb（血清および血漿中の溶血指標として用いられる）の測定を補正する方法が、米国特許6,689,612（Samsoondar、参照として援用する）に開示されている。
【０１７２】
上記の説明は、請求範囲の発明になんらかの制限を加えることを意図したものではない。本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。
【０１７３】
（例：主キャリブレーション）
装置の主キャリブレーションは、比較的数の多い試料セット（主キャリブレーションセットという）の吸光度を測定する必要があるため、面倒かつ時間集約的な作業である。主キャリブレーションセットの試料は、実際の試料か、または実際の試料に非常に近くなければならない。試料が１つの試料で考えられる吸光度のばらつきをすべて含み、それにより試料のばらつきが主キャリブレーションアルゴリズムに組み込まれることが好ましい。容器もばらつきに影響するので、２つ以上の容器の組み合わせを使用（それにより容器のばらつきが主キャリブレーションアルゴリズムに組み込まれる）して、１つまたは２つ以上の主キャリブレーションアルゴリズムを開発することも可能である。しかし、ある特定の形の容器に固有の主キャリブレーションアルゴリズムを開発するのが、好ましい。主キャリブレーションが行われる装置は、「第１装置」と呼ぶ。第２装置自体では主キャリブレーションの工程を行わず、主キャリブレーションアルゴリズムまたは主キャリブレーションアルゴリズム変形型を使用する別の装置は、「第２装置」と呼ぶ。
【０１７４】
主キャリブレーションアルゴリズムは、以下のようにして得ることができる。主キャリブレーションアルゴリズム開発の対象となる所定の被験物の濃度範囲を含むいくつかの試料について吸光度スペクトルを得る。その試料には被験物に含まれるであろう吸光度のばらつきをすべて含み、それにより試料のばらつきが主キャリブレーションアルゴリズムに組み込まれることが好ましい。特定波長における吸光度の次導関数を独立変数として、被験物の濃度を従属変数として持つ線形組合せを開発するため重線形回帰を行う。１つの波長のみを使用する単純線形回帰、部分最小二乗（PLS）および主成分分析（PCA）などの別の統計方法も使用できる。こうして得られた方程式が、主キャリブレーションアルゴリズムである。
【０１７５】
吸光度のゼロ次導関数（生吸光度という）も、吸光度の何次の導関数も、キャリブレーション過程で使用できるが、吸光度の二次導関数が好ましく、吸光度の一次導関数がより好ましい。一つの例外が、濁度（たとえばIL）のシミュレータであり、ここでは吸光度のゼロ次関数および吸光度の一次導関数が、好ましい。ILなどの液体乳剤に関しては、たとえば再現可能な方法で光を減衰する容器の中の試料に対しては、吸光度のゼロ次導関数が、吸光度の一次導関数より好ましい。これは、得られる主キャリブレーションアルゴリズムが、より広い分析範囲、すなわちILなどの液体乳剤の予測値と実際の濃度との関係が直線的である、より広い範囲を含むからである。たとえば、米国特許6,268,910 B1で説明されている、血液バッグチュービング（光路に黒い文字を含んでいるかもしれないし、含んでいないかもしれない）の中の試料については、吸光度の一次導関数が好ましい。
【０１７６】
主キャリブレーションアルゴリズムの開発に使用されるソフトウエアツールは次のものからなるが、それらに限定されない。
−吸光度を平滑化して、吸光度の導関数を得るのに使用されるMatlabTM、
−MS ExcelTMも吸光度の導関数を計算するマクロの開発に使用できる、
−「段階的重線形回帰」と呼ばれるプロセスによりアルゴリズムを生成するのに使用されるStatViewTM。段階的重線形回帰においては、すべての波長の吸光度の次導関数が、StatViewTMプログラムに送られる；吸光度の次導関数が所定量の重要性でキャリブレーションに寄与する波長だけが、アルゴリズム用として選択される、
−PirouetteTMが、すべての波長の測定値、または吸光度スペクトルの選択部分を使用して、PLSまたはPCAによりキャリブレーションアルゴリズムを生成するのに使用できる。
しかし、その他のソフトウエアツールも使用できる。また、各種の統計技法がキャリブレーションアルゴリズムの作成に使用でき、その統計技法には、例であって、決して制限を加えるとみなされてはならないが、たとえば、単純線形回帰、重線形回帰および多変量データ分析などがある。
【０１７７】
例であって決して制限を加えるとみなされてはならないが、多変量データ分析の例には、主成分分析（PCA）、主成分回帰（PCR）、部分最小二乗(PLS)、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムがある。主キャリブレーションアルゴリズムの開発に使用されるソフトウエアツールは次のものからなるが、それらに限定されない。
−吸光度を平滑化して、吸光度の導関数を得るのに使用されるMatlabTM、
−MS ExcelTMも吸光度の導関数を計算するマクロの開発に使用できる、
−「段階的重線形回帰」と呼ばれるプロセスによりアルゴリズムを生成するのに使用されるStatViewTM。段階的重線形回帰においては、すべての波長の吸光度の次関数が、StatViewTMプログラムに送られる；吸光度の次導関数が所定量の重要性でキャリブレーションに寄与する波長だけが、アルゴリズム用として選択される、
−PirouetteTMが、すべての波長、または吸光度スペクトルの選択部分の測定値を使用して、PLSまたはPCAによりキャリブレーションアルゴリズムを生成するのに使用されてもよい、
―いかなる統計技法も本発明の範囲に含まれるけれども、キャリブレーションアルゴリズムはニューラル・ネットワークおよび遺伝アルゴリズムの技術を含んでいてもよい。
しかし、その他のソフトウエアツールも使用できる。血液被験物に関して、主キャリブレーション手順の例が、本明細書に引用されている文献に説明されている。主キャリブレーションアルゴリズムは、最も単純なケースは単一波長条件から、多くの波長を使用する多重条件まで含んでいる。主キャリブレーションアルゴリズムは、単純線形回帰、重線形回帰、多変量解析、またはその組合せのプロセスにより得られる。多変量解析のいくつかの例が、PLS、PCA、遺伝アルゴリズム、およびニューラル・ネットワークである。
【０１７８】
吸光度の何次の導関数も使用できる。また主キャリブレーションアルゴリズムの堅牢性は、一次キャリブレーションセットに、実際の試料で直面すると考えられる阻害物質を含むかどうかによって決まる。言及されているケモメトリクスは、限定的なものとみなされるべきではなく、いかなる形式のケモメトリクスもデータ処理も、本発明の範囲に含まれる。
【０１７９】
第２装置における試料中の被験物濃度の決定は、平滑化、吸光度の一次および高次導関数の計算、吸光度の補間、乗法散乱補正、またはデータ変換などのデータ前処理を伴っていてもよい。同様なデータ前処理が、主キャリブレーションアルゴリズムの開発前に用いられてもよい。測光補正も、被験物濃度の予測値に必要とされる精度によっては、第２装置に使用されてもよい。
【０１８０】
主キャリブレーションアルゴリズム開発の他のいかなる方法も、またどのような形式のデータ変換フォームも、本発明の範囲内にある。例であって、決して制限を加えるとみなされてはならないが、データ変換には、被験物濃度の対数または逆対数の計算、フーリエ変換などが含まれる。これらについては、当業者にはよく知られている（本書にて参考文献として引用しているOsborne、B.G.、Fea rn、T & Hindle、 P.H.、Practical NIR Spectroscopy with Applications in Food and Beverage Analysis、1993年、Longman Scientific & Technical発行を参照）。
【０１８１】
主キャリブレーションアルゴリズムの堅牢性は、主キャリブレータの構成に依存して異なる。主キャリブレーションアルゴリズムがある特定の被験物について得られると、試料中の被験物の濃度（すなわち予測値）が、その試料の吸光度スペクトルを得て、被験物の主キャリブレーションアルゴリズムを適用することにより、決定できる。いかなる数の被験物についても主キャリブレーションアルゴリズムを装置にインストールでき、その主キャリブレーションアルゴリズムが、被験物の濃度を得るために、同じ吸光度データに適用されてもよい。さらに、２つ以上のキャリブレーションアルゴリズムを１つの被験物についてインストールできる。多重主キャリブレーションアルゴリズムを使用して、高被験物濃度あるいは低被験物濃度でも分光学的装置の分析範囲を拡大できる。
【０１８２】
本明細書で開示される被験物は、例示のためのみであって、本発明の装置の使用を制限するものではない。
【０１８３】
（主キャリブレーションアルゴリズムの開発）
以下の例は、ほとんど血漿中の被験物について説明する。しかし、例であって、決して制限を加えるとみなされてはならないが、たとえばキャリブレータ、全血、血清、血漿、尿、滑液、リンパ液、唾液、糞便、乳製品、飲料、身体部分（指、腕、耳たぶなどがあるが、これらに限定されない）、薬品の錠剤など、その他の種類の試料中に含まれる被験物についてのキャリブレーションアルゴリズム開発の同様な方法も、本発明の範囲に含まれる。
【０１８４】
ヘモグロビンについての主キャリブレーションアルゴリズムを作成するために、目に見えるような阻害物質を含まない60個の血清試料を、使用するまで冷蔵保存または冷凍保存した。堅牢なアルゴリズムを得るに十分な数が使用される限り、より多数のまたはより少数の試料が使用できる。ヘモグロビン（Hb）、INTRALIPID（IL）、ビリルビン（BR）およびビリベルジン（BV）を正常な血清に加え、最終濃度をそれぞれ0-6.1g/L、0-5.1g/L、0-42.7mg/dL、0-4.4mg/dLとした。血液試料から血漿（阻害物はまったく含まれない）を取り出し、その２倍の水を加え、細胞を３サイクルの凍結融解で溶解させて、貯蔵Hbを得た。各サイクルについて、血液は45〜60分間冷凍庫に置いたままにして、その後取り出して30〜45分間室温のロッカーに置いた。
【０１８５】
RBC破片および溶解しなかったRBCを10,000xgで10分間遠心分離して除去した後、溶解物のHb量を、Tietz（Tietz Textbook of Clinical Chemistry、 3rd Ed、 1999、 pp1674-1676）が説明するoxy-Hb測定の分光学的方法で測定した。Hb量を確実に測定できる方法であれば、いかなる方法でも使用できる。通常、溶血血液は、約100g/Lの Hbを含んでいる。CO酸素濃度計で測定すると、Hbの95％以上が、oxy-Hb状態である。ビリベルジンジヒドロクロライド（Sigmaから入手）をまずメタノール50％水50％の溶液で溶解し、さらにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈して、貯蔵ビリベルジン（BV）を生成した。TRAVAMULSIONTM（Clintec-Nestle & Baxterから入手するのが好ましい）として知られている貯蔵ILの濃度は、10％である。Ditauro-Bilirubin （Porphyrin Products, Logan, Utah, USAから購入）を、阻害物のない血清中で分解して、濃度500mg/dLとして、貯蔵ビリルビン（BR）を生成した。異なるポリプロピレン製分注チップを使用して、前記60個の試料のスペクトル吸光度データを得た。前記60個の試料のうち、奇数番号の試料がキャリブレーションセットとして使用され、偶数番号の試料が検証セットとして使用された。この主キャリブレーションセットには、Met-HbまたはMBは含まれていない。したがってこれらの物質は、Hb測定の不正確さの原因となる可能性がある。より堅牢な前記主キャリブレーションアルゴリズムを得るために、Met-HbおよびMBを、主キャリブレーションセットの吸光度のばらつきとして含んでもよい。
【０１８６】
表１に、本明細書で説明される方法を使った典型的な主キャリブレーションアルゴリズムの要約を示す。これは例であって、決して制限を加えるとみなされてはならない。また異なる物質または試料容器などを使用し、本明細書に説明する方法を使用して、他の主キャリブレーションアルゴリズムを容易に得ることもできる。
【０１８７】
【表１】
2005300547.tif 000003
【０１８８】
また、表１に示す波長で、最も短い波長が504nm、最も長い波長が1038nmである。しかし約300nmから約2500nmまでの波長範囲、またはその間の波長範囲のキャリブレーション波長は、本発明の範囲内である。
【０１８９】
（例１：Hbのキャリブレーションアルゴリズム）
本出願で説明した方法を使用するHbの主キャリブレーションアルゴリズムの例を下に示す。アルゴリズムは、それが得られる条件が異なると違うこともあり得る。下の例では、「g/L Hb」を従属変数として示しているが、この従属変数はHbに関連するいかなる溶血指標、たとえばTotal-Hb、Oxy-Hb、および「Total-HbマイナスMet-Hb」であってもよい。真の溶血指標は、溶血指標測定に使用される標準方法、および主キャリブレーションセットに含まれる物質によって決まる。本発明のほかの態様として、溶血指標の補正方法が説明されており、補正が溶血指標の値についてされるかどうか、溶血指標の値が誤差を含む可能性があることだけが示されるかは、溶血指標について必要とされる精度によって決まる。全血中のHbの測定は、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１９０】
方程式１（使い捨てポリプロピレン製分注チップを使用して得られた）
g/L Hb = - 16.81(1st D A584) + 79.47(1st D A 599) - 60.95(1st D A617) + 0.24
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０１９１】
方程式２（ポリプロピレン製12mm使い捨てチューブを使用して得られた）
g/L Hb = 113.27(1st D A600) - 182.94(1st D A 618) - 0.13
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０１９２】
以下に示す、 Hbの主キャリブレーションアルゴリズムの示すその他の例は、米国特許6,268,910 B1、5,846,492、WO 98/39634およびWO 97/47972に説明されている。
【０１９３】
方程式３（血液バッグチュービングを使用して得られた）
g/L Hb = 45.68(1st D A591) - 47.48(1st D A 653) - 0.42
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０１９４】
方程式４（プラスチック製使い捨て分注チップを使用して得られた）
g/L Hb = 15.89(1st D A600) - 15.88(1st D A 663) - 0.21
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０１９５】
方程式５（プラスチック製使い捨て分注チップを使用して得られた）
g/L Hb = 30.72(1st D A558) - 17.40(1st D A 570) + 171.14(1st D A730) - 072
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０１９６】
方程式６（半透明ピペットチップを使用して得られた）
(g/L) Hb = 30.14(1st D A591) - 27.98(610) 
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０１９７】
（例２：Hbをベースとする血液代替物のキャリブレーションアルゴリズム）
下記は、WO 98/39634に説明されているHbをベースとする血液代替物の主キャリブレーションアルゴリズムの例である。
【０１９８】
方程式７（ポリプロピレン製使い捨て分注チップを使用して得られた）
g/L Hbをベースとする血液代替物 = 23.97(1st D A541) - 76.01(1st D A 558) + 130.84(1st D A600) - 113.61(1st D A616) + 0.30
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０１９９】
（例３：ビリベルジンのキャリブレーションアルゴリズム）
ビリベルジンの主キャリブレーションアルゴリズムの下記の例は、米国特許6,268,910 B1、5,846,492、およびWO 97/47972に説明されている。
【０２００】
方程式８（血液バッグチュービングを使用して得られた）
mg/L BV = - 45.40(1st D A649) + 323.15(1st D A 731) - 493.79(1st D A907) - 1.14
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２０１】
方程式９（プラスチック製使い捨て分注チップを使用して得られた）
mg/L BV = 98.07(1st D A724nm) - 122.73(1st D A803nm) + 0.07
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２０２】
方程式10（半透明ピペットチップを使用して得られた）
mg/L BV = 160.29(1st D A718) - 206.15(1st D A781) + 1.42
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２０３】
（例４：ビリルビンのキャリブレーションアルゴリズム）
Hbキャリブレーションに使用される試料セットは、通常、BRキャリブレーションに使用されることはない。これは、Hb>4g/LまたはIL>4g/Lのいずれかであるために吸光度が、BRキャリブレーションに使用される主波長である524nm近傍領域で装置の限界に近づくからである。それに代わり、60個の別の試料セットが作製されて、使用された。当業者には容易に理解できるはずだが、主キャリブレーションに使用される試料セットは、実際の患者の試料（血清または血漿など）でよく起こるばらつきの大半を含めるだけの十分な大きさでなければならない。当該試料は、前記と同様にHb、IL、BRおよびBVを正常な血清に加え、最終濃度をそれぞれ0-2.6g/L、0-3.6g/l、0-37mg/dL、0-4.4mg/dLとした。前記60個について、異なるポリプロピレン製分注チップを使用して、スペクトル吸光度を記録した。前記60個の試料のうち、奇数番号の試料をキャリブレーションセットとして使用し、偶数番号の試料を検証セットとして使用した。貯蔵阻害物質は、Hb用について上に説明したように用意され、BR濃度は係数1.23で調整された。この1.23係数は、黄疸に罹患した血清および血漿の試料を使用して、検証セットから得られた回帰直線の勾配から前もって導き出された。Met-HbおよびMBは、BRの予測を阻害するとは考えれられず、主キャリブレーションセットの吸光度ばらつきに含まれれば、より堅牢なキャリブレーションアルゴリズムの形成に役立つことができる。
【０２０４】
方程式11（ポリプロピレン製使い捨て分注チップを使用して得られた）
mg/dL BR = 293.1(1st D A524) + 327.8(1st D A587) - 451.7(1st D A602) - 7.5
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２０５】
方程式12（ポリプロピレン製12mm使い捨てチューブを使用して得られた）
mg/dL BR = 406.04(1st D A534) + 183.94(1st D A586) - 2.27
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２０６】
以下の、ビリルビンのキャリブレーションアルゴリズムの例は、米国特許6,268,910 B1、米国特許5,846,492、およびWO 97/47972に説明されている。
【０２０７】
方程式13（血液バッグチュービングを使用して得られた）
mg/dL BR = -43.03(1st D A504) + 252.11(1st D A518) + 240.03(1st D A577) - 2.89
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２０８】
方程式14（プラスチック製使い捨て分注チップを使用して得られた）
mg/dL BR = -24.88(1st D A495) + 201.61(1st D A512) + 44.98(1st D A578mm) -6.48
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２０９】
方程式15（半透明ピペットチップを使用して得られた）
mg/dL BR = 142.09(1st D A511) + 89.9(1st D A554) - 4.47
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２１０】
（例５：混濁のキャリブレーションアルゴリズム）
血清および血漿中の混濁は、主に脂肪粒子、特にキロミクロンが存在することにより引き起こされる。INTRALIPIDTM（IL）は、脂肪乳剤であり、自然に存在するキロミクロンに似た作用をするので、血清または血漿の混濁をシミュレーションするのに好ましく使用できる。
【０２１１】
HbおよびBRのキャリブレーションに使用される試料は、ILのキャリブレーションに使用するのは好ましくない。これは、RBCおよびRBC小片が溶解しないために、Hb貯蔵溶液が、（脂質粒子のように）著しい光散乱を引き起こすからである。溶血血液の遠心分離では、溶解していないRBCおよびRBC小片を除去することはできなかった。
【０２１２】
PBS（リン酸緩衝生理食塩水）の試料40個に10％IntralipidTMを微小量添加することにより、0-20g/Lの濃度にした。異なるポリプロピレン製分注チップを使用して、前記40試料のスペクトル吸光度を記録した。前記40個の試料のうち、奇数番号の試料をキャリブレーションセットとして使用し、偶数番号の試料を検証セットとして使用した。ILキャリブレーションに使用した適切な波長は、約700nmから約1100nmまでである。
【０２１３】
混濁を同等のIL濃度に換算して、測定した。
【０２１４】
方程式16（ポリプロピレン製使い捨て分注チップを使用して得られた）
In(g/L IL) = 1.867(A700) - 0.447(A700)2 + 0.041(A700)3 - 1.33
この式において、（A）は、ナノメータ単位で表示した波長における生の吸光度測定値である。
【０２１５】
方程式17（ポリプロピレン製12mm使い捨てチューブを使用して得られた）
g/L IL = 2.72(A872) - 3.88(A872)2 + 1.70(A872)3 + 0.19
この式において、（A）は、ナノメータ単位で表示した波長における生の吸光度測定値である。
【０２１６】
以下の、ILの主キャリブレーションアルゴリズムの例は、米国特許6,268,910 B1、米国特許5,846,492、およびWO 97/47972に説明されている。
【０２１７】
方程式18（血液バッグチュービングを使用して得られた）
g/L IL = 432.42(1st D A988) + 40.40(1st D A1038) + 0.04
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２１８】
方程式19（血液バッグチュービングを使用して得られた）
g/L IL = 305.78(1st D A874) + 1.12
この式において、(1st D A)は、ナノメータ単位で表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２１９】
方程式20（プラスチック製使い捨て分注チップを使用して得られた）
g/L IL = 252.16(1st D A874nm) + 0.24
この式において、(1st D A)は、表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２２０】
方程式21（半透明ピペットチップを使用して得られた）
g/L IL = 296.01(A900) - 0.04
この式において、（A）は、ナノメータ単位で表示した波長における生の吸光度測定値である。
【０２２１】
（例６：メトヘモグロビンについてのキャリブレーションアルゴリズム）
約95％Oxy-Hb、Met-Hb、MB、BVおよびILを含んだ新鮮な溶血血液からなる29個の試料を使用して、TEFLONTM 試料保持具を使用した装置をキャリブレーションした。BRは、Met-HbまたはMBのいずれかのキャリブレーションに使用される波長で光を吸収しないので、試料に加えなかった。このMet-Hbは、Sigmaから凍結乾燥した形で入手し、リン酸緩衝生理食塩水でもとに戻した。上記のように、本明細書で説明する主キャリブレーションは、主キャリブレーションアルゴリズムの開発に関する典型的な作業である。
【０２２２】
方程式22（TEFLONTM 試料保持具を使用して得られた）
g/L Met-Hb = 69.88(1st D A645) + 53.15(1st D A669) - 1.17
この式において、(1st D A)は、表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２２３】
（例７：メチレンブルーについてのキャリブレーションアルゴリズム）
方程式23 （TEFLONTM 試料保持具を使用して得られた）
mg/L MB = 162.53(1st D A702) - 112.58(1st D A759) - 1.17
この式において、(1st D A)は、表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２２４】
以下の、MBの主キャリブレーションアルゴリズムの例は、米国特許6,268,910 B1に説明されている。
【０２２５】
方程式24（血液バッグチュービングを使用して得られた）
mg/L MB = 56.04(1st D A677) + 267.21(1st D A953) + 4.49
この式において、(1st D A)は、表示した波長における吸光度測定値の一次導関数である。
【０２２６】
本明細書で言及した主キャリブレーションアルゴリズムは、段階的重線形回帰のプロセスにより得られる例であって、その例は限定的ではない。主キャリブレーションアルゴリズムは、波長標準セットの１つまたは２つ以上の波長においてキャリブレーション試料の吸光度の次導関数、および単純線形回帰、重線形回帰および多変量解析（前記多変量解析は、部分最小二乗、主成分分析、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムからなる群から選択される）からなる群から選択される統計技法を使用して、開発できる。吸光度の何次の導関数も、たとえばILについて示されているように（例５の方程式18〜20）、使用できる。主キャリブレーションアルゴリズムの堅牢性は、主要キャリブレーション波長近傍の光を吸収または分散する阻害物質を主キャリブレーションセットに含むかどうかによって決まる。さらに、全血中のTotal-HbおよびMet-Hbについての類似キャリブレーションアルゴリズムは、血漿のキャリブレーションアルゴリズムの開発用として上に説明したものと類似する方法を使用して、全血中のTotal-HbおよびMet-Hb用として開発できる。
【０２２７】
主キャリブレーションアルゴリズムは、以下のようにしても得られる。主キャリブレーションアルゴリズムが開発される対象となる所定の被験物の濃度範囲を含むいくつかの試料について、吸光度スペクトルを得る。その試料には１つの試料で考えられる吸光度のばらつきをすべて含み、それにより試料のばらつきが主キャリブレーションアルゴリズムに組み込まれることが好ましい。特定波長における吸光度の次導関数を独立変数として、また被験物の濃度を従属変数として持つ線形組合せを開発するため、重線形回帰を行う。別の統計方法、たとえば単純線形回帰（１つの波長のみを使用する回帰）、部分最小二乗（PLS）、主成分分析（PCA）、ニューラル・ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムなども使用できる。こうして得られた方程式が、主キャリブレーションアルゴリズムである。
【０２２８】
すべての引用文献は、援用文献である。
【０２２９】
本発明は、１つまたは２つ以上の実施例に関して説明されている。しかし、多くの変更例および変形例が、特許請求の範囲に説明されている発明の範囲から逸脱することなく行えることが、当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】X軸に600〜1000nmの波長範囲を、Y軸に吸光係数対数をとり、４つの異なるヘモグロビン種の吸光度スペクトルを表すグラフを示している。
【図２】X軸に500〜700nmの波長範囲を、Y軸に各ヘモグロビン種の同じ濃度の吸光度（吸光係数と同じ）をとり、４つの異なるヘモグロビン種の吸光度スペクトルを表すグラフを示している。
【図３】同じプールの３つの異なる濃度のTotal-Hbの吸光スペクトルを表すグラフを示している。Total-Hbは、部分的に酸化してMet-Hbを生成しており、これも表に示されている。
【図４】本発明にしたがって使用可能な試料タブの種々の態様を示している。反射板は試料タブの下に位置し、反射モードで使用される。図４ａは、分光学的装置における試料タブおよび試料スロットの斜視図である。図４ｂは、スロット内に挿入された試料タブの側面図を示している。
【０２３１】
【図５】本発明にしたがって使用される試料タブの種々の態様を示している。図の試料タブは、トランスミッションモードで使用されている。図５ａは、試料タブおよび試料スロットの斜視図である。図５ｂは、スロット内に挿入された試料タブの側面図を示している。
【図６】図５に図示されている本発明の装置をさらに詳細に示している。図６ａは、試料スロット内に挿入された試料タブの側面図を示している。図６ｂは、試料スロット内に挿入された試料タブの正面図を示している。
【図７】本発明に使用される試料タブの別の実施例の種々の態様を示している。図７ａは、試料タブの斜視図を示している。図７ｂは、試料タブの側面図を示している。
【図８】好適な実施例に使用される分光器614（一部切り抜き図）を示している。単純化するため、光ダイオードは２個だけ示してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
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