(57)【要約】      （修正有）【課題】所定のサブセットの細胞においてトランススプライシングされた分子をin vivo作製するための手段を提供する。【解決手段】プレトランススプライシング分子と、特定の標的細胞で特異に発現されるプレmRNAとの間のin vivoトランススプライシング反応は、mRNAとして機能するか、または標的細胞で発現されるタンパク質をコードする新規なmRNAを提供する。このmRNAの発現産物は細胞または宿主生物に治療上有用なタンパク質、特定の細胞を死滅させる毒素、またはこのような細胞には通常存在しない新規なタンパク質である。さらに、エキソンタグ付け法を用いてプレmRNA分子のエキソン／イントロン境界を同定するために遺伝子操作されたPTMを提供する。PTMはまた、特定の細胞型で発現されたタンパク質の精製および同定に使用できるペプチドアフィニティー精製タグをコードするキメラRNAの産生をもたらすようにデザインすることもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。
【請求項２】
核酸分子を含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 該3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。
【請求項３】
核酸分子を含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。
【請求項４】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
3’スプライス領域がピリミジントラクトをさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記核酸分子が5’スプライス部位の片側または両側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記核酸分子が3’スプライス領域の片側または両側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
前記核酸分子の標的プレmRNAへの結合が相補性、三重らせん形成またはタンパク質-核酸相互作用により媒介される、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列が、イヌ非ヒト因子VIIIタンパク質のエキソン23〜26またはマウス非ヒト因子VIIIタンパク質のエキソン16〜26をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
核酸分子を発現する組換えベクターを含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。
【請求項１１】
核酸分子を発現する組換えベクターを含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 該3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。
【請求項１２】
核酸分子を発現する組換えベクターを含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。
【請求項１３】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１４】
3’スプライス領域がピリミジントラクトをさらに含む、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１５】
前記核酸分子が3’スプライス領域の片側または両側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１６】
細胞においてキメラRNA分子を作製する方法であって、
細胞内で発現された標的非ヒト因子VIIIプレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
細胞においてキメラRNA分子を作製する方法であって、
細胞内で発現された標的非ヒト因子VIIIプレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 該3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなる、上記方法。
【請求項１８】
細胞においてキメラRNA分子を作製する方法であって、
細胞内で発現された標的非ヒト因子VIIIプレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記方法。
【請求項１９】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
3’スプライス領域がピリミジントラクトをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子が3’スプライス領域の片側または両側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。
【請求項２３】
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 該3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。
【請求項２４】
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。
【請求項２５】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２６】
3’スプライス領域がピリミジントラクトをさらに含む、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２７】
前記核酸分子が3’スプライス領域の片側または両側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２８】
前記核酸分子の標的プレmRNAへの結合が相補性、三重らせん形成またはタンパク質-核酸相互作用により媒介される、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２９】
核酸分子を発現する真核生物発現ベクターであって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記発現ベクター。
【請求項３０】
核酸分子を発現する真核生物発現ベクターであって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 該3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記発現ベクター。
【請求項３１】
核酸分子を発現する真核生物発現ベクターであって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記発現ベクター。
【請求項３２】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３３】
前記核酸分子がピリミジントラクトをさらに含んでなる、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３４】
前記核酸分子が3’スプライス領域の片側または両側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３５】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３６】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
生理学上許容される担体および請求項２９〜３６のいずれか1項に記載のベクターを含んでなる組成物。
【請求項３８】
被験者に核酸分子を投与することを含んでなる、被験者の非ヒト因子VIII遺伝的欠損を修復するための方法であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された非ヒト因子VIIIプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン、ただし、該プレmRNAは非ヒト因子VIII遺伝的欠損を含む遺伝子によりコードされるものであること；および
b) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、非ヒト因子VIIIポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内で核スプライシング成分により認識されるものである、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  緒論
本発明は、標的スプライセオソームトランススプライシングによって新規な核酸分子を作製する方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、天然の標的前駆体メッセンジャーRNA分子(標的プレmRNA)と相互作用し、新規なキメラRNA分子(キメラRNA)の形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようデザインされたプレトランススプライシング分子(PTM)を含む。本発明のPTMは、それ自体、RNA翻訳の阻害のようなある機能を遂行しうるか、または細胞において欠陥があるもしくは不活性なタンパク質を補足するタンパク質をコードするか、または特定の細胞を死滅させる毒素をコードする新規なキメラRNAの産生をもたらすように遺伝子操作される。一般に、標的プレmRNAは、特定の細胞型内で発現され、従って、新規なキメラRNAの発現を選択された細胞型にターゲットする手段となることから、標的として選択される。本発明はさらに、エキソンのタグ付け法を用いてプレmRNA分子のエキソン／イントロン境界を同定するために遺伝子操作されたPTMに関する。またPTMは、特定の細胞型で発現するタンパク質を精製および同定するのに使用できるペプチドアフィニティー精製タグをコードするキメラRNAの生成をもたらすようデザインすることもできる。本発明の方法は、本発明のPTMと標的プレmRNAを、PTMの一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて新規なキメラRNA分子を形成するような条件下で接触させることを含む。本発明の方法および組成物は、癌などの増殖性疾患の治療、または遺伝疾患、自己免疫疾患もしくは感染性疾患の治療のための細胞遺伝子調節、遺伝子修復および自殺遺伝子治療に使用できる。また、本発明の方法および組成物は、標的スプライセオソームトランススプライシングにより、植物において新規な核酸分子を生成するためにも使用できる。例えば、標的トランススプライシングは植物の病害の処置、病害耐性植物の遺伝子操作、または植物での所望の遺伝子の発現のために植物において遺伝子発現を調節するために使用できる。本発明の方法および組成物はまた、イントロン／エキソン境界をマッピングするため、また、いずれかの細胞で発現した新規なタンパク質を同定するためにも使用できる。
【背景技術】
【０００２】
2.  発明の背景
染色体のDNA配列はコード領域(エキソン)を含み、通常、介在する非コード領域(イントロン)も含んだプレmRNAへと転写される。イントロンはスプライシングと呼ばれる精密なプロセスでプレmRNAから除かれる(Chowら, 1977, Cell 12: 1-8;およびBerget, S.M.ら, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 3171-3175)。スプライシングは、いくつかの小さなリボヌクレオタンパク質(snRNP)と、集合してスプライセオソームとして知られる酵素複合体を形成する多くのタンパク質因子との協調した相互作用として起こる(Mooreら, 1993, The RNA World, R.F. GestlandおよびJ.F. Atkins編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Kramer, 1996, Annu. Rev. Biochem., 65:367-404; StaleyおよびGuthrie, 1998, Cell 92: 315-326)。
【０００３】
プレmRNAのスプライシングは2ステップ機構で進行する。第1のステップでは、5’スプライス部位が切断されて「遊離の」5'エキソンと輪縄状の中間体が生じる(Moore, M.J.およびP.A. Sharp, 1993, Nature 365: 364-368)。第2のステップでは、この5’エキソンが3’エキソンと連結し、それに伴って輪縄状の産物としてのイントロンが遊離する。これらのステップは小さな核リボヌクレオタンパク質とスプライセオソームと呼ばれるタンパク質の複合体で触媒される。これらのスプライシング反応部位は5'および3’スプライス部位の周辺の共通配列によって規定される。5’スプライス部位共通配列はAG/GURAGU(ここでA=アデノシン、U=ウラシル、G=グアニン、C=シトシン、R=プリン、/=スプライス部位)である。3’スプライス領域は、分岐点または分枝部位、ポリピリミジントラクトおよび3’スプライス共通配列(YAG)の3つの個別の配列エレメントからなる。これらのエレメントは3’スプライス領域を大まかに規定し、3’スプライス領域は3’スプライス部位の上流に100ヌクレオチドのイントロンを含みうる。哺乳類の分岐点共通配列はYNYURAC(ここでN=任意のヌクレオチド、Y=ピリミジン)である。下線のAは分岐形成部位である(BPA=分岐点アデノシン)。3'スプライス共通配列はYAG/Gである。分岐点とスプライス部位の間には通常ポリピリミジントラクトが見られるが、これは哺乳類系では効果的な分岐点の利用と3’スプライス部位の認識に重要なものである(Roscigno, R. F.ら, 1993, J. Biol. Chem.. 268:11222-11229)。分岐点およびポリピリミジントラクトの下流にある最初のYAGのトリヌクレオチドは最もよく用いられる3’スプライス部位である(Smith, C.W.ら, 1989, Nature 342:243-247)。
【０００４】
ほとんどの場合、スプライシング反応は同じプレmRNA分子内で起こり、これはシススプライシングと呼ばれる。独立して転写された2つのプレmRNAの間のスプライシングをトランススプライシングと呼ぶ。トランススプライシングはトリパノソーマで初めて発見され(Sutton & Boothroyd, 1986, Cell 47: 527; Murphyら, 1986, Cell 47:517)、続いて線虫(Krause & Hirsh, 1987, Cell 49:753);扁虫(Rajkovicら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8879; Davisら, 1995, J. Biol. Chem. 270: 21813)および植物のミトコンドリア(Malekら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:553)で発見された。寄生虫Trypanosoma bruceiでは、全てのmRNAがトランススプライシングによりその5’末端にスプライスリーダー(SL)RNAを獲得する。Caenorhabditis elegansでも、いくつかの遺伝子で5’リーダー配列がトランススプライシングされる。この機構は多くの異なる転写物に単一の共通配列を付加するのに好適である。
【０００５】
トランススプライシング機構は従来のシススプライシング機構とほとんど同じであり、2つのホスホリル転移反応によって起こる。まず、2’-5’ホスホジエステル結合が形成され、シススプライシングの場合の輪縄状の中間体に等しい「Y」型の分岐を持つ中間体が生じる。第2の反応であるエキソン連結は従来のシススプライシングと同様に起こる。また、3’スプライス部位の配列およびトランススプライシング反応を触媒するsnRNPのいくつかは、シススプライシングに関与するそれらの対応物とよく似ている。
【０００６】
またトランススプライシングは、あるプレmRNAのイントロンが別のプレmRNAのイントロンと相互作用して、2つの通常のプレmRNA間のスプライス部位の組換えを促進するという、また違ったプロセスについてもいう場合がある。このタイプのトランススプライシングは、トランスジェニックマウスにおいて内因性の不変領域に連結されたヒト免疫グロブリン可変領域配列をコードする転写産物を説明するために仮定されたものである(Shimizuら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8020)。さらにまた、c-myb pre-RNAのトランススプライシングが実証され(Vellard, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci., 1992 89:2511-2515)、もっと最近では、培養細胞および核抽出物中に、互いにトランススプライシングされたクローン化SV40由来のRNA転写物が検出された(Eulら, 1995, EMBO. J. 14:3226)。しかし、哺乳類プレmRNAの天然に存在するトランススプライシングは極めてまれであると考えられる。
【０００７】
数グループにより、スプライシング機構を調べるモデル系としてin vitroトランススプライシングが用いられている(Konarska & Sharp, 1985, Cell 46:165-171; Solnick, 1985, Cell 42:157; Chiara & Reed, 1995, Nature 375:510; PasmanおよびGarcia-Blanco, 1996, Nucleic Acids Res. 24:1638)。かなり効率的なトランススプライシング(シススプライシングされた類似体の30%)は互いに塩基対合可能なRNA間で達成されたが、塩基対合によって結びつかないRNAのスプライシングはさらに10倍低くなった。基質間で明確なRNA-RNA相互作用を必要としない他のin vitroトランススプライシング反応が、Chiara & Reed (1995, Nature 375: 510), Bruzik J.P. & Maniatis, T. (1992, Nature 360:692)ならびにBruzik J.P.およびManiatis, T. (1995, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92: 7056-7059)によって観測されている。これらの反応は比較的低い頻度でしか起こらず、下流5’スプライス部位またはエキソンスプライシングエンハンサーなどの特殊なエレメントを要する。
【０００８】
RNAを正しく切断して連結する働きをする複数のタンパク質の前駆体mRNAへの結合を含むスプライシング機構に加えて、第3の機構としてはイントロン自身によるRNAの切断および連結を含み、これは触媒RNA分子またはリボザイムと呼ばれる。このリボザイムの切断活性は、リボザイムに別の「ハイブリダイゼーション」領域を組み込むことにより特定のRNAにターゲッティングされている。標的RNAとハイブリダイズすると、このリボザイム切断触媒領域は標的を切断する。このようなリボザイム活性は、外来のまたは異常なRNAの産生を特徴とするヒト疾患の治療など、in vivoにおける標的RNAの不活性化または切断に有用であることが示唆されている。また、特定のRNAのターゲッティングおよび破壊のためのもう1つの機構として、アンチセンスRNAの使用も提案されている。このような例では、小RNA分子を標的RNAとハイブリダイズさせ、標的RNAに結合することによって標的RNAの翻訳を妨げるか、あるいはヌクレアーゼの活性化によりRNAの破壊を起こすようにデザインする。
【０００９】
最近まで、特定の標的遺伝子を改変するための標的トランススプライシングの実用上の適用例は第1群リボザイムに基づく機構に限られていた。テトラヒメナ(Tetrahymena)第1群リボザイムを用いた標的トランススプライシングは、大腸菌(E. coli)(Sullenger B.A.およびCech. T.R., 1994, Nature 341: 619-622)、マウス繊維芽細胞(Jones, J.T.ら, 1996, Nature Medicine 2:643-648)、ヒト繊維芽細胞(Phylacton, L.A.ら,  Nature Genetics 18:378-381)およびヒト赤血球前駆体(Lapら, 1998, Science 280: 1593-1596)で実証されている。改変型第1群リボザイムによって起こる標的RNAトランススプライシングの多くの用途が検討されてきたが、天然の哺乳類スプライシング機構、すなわちスプライセオソームによって媒介される標的トランススプライシングはこれまでに報告されていない。
【発明の開示】
【００１０】
3.  発明の概要
本発明は、スプライセオソームにより媒介される標的トランススプライシングを介して新規な核酸分子を作製するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、天然の標的プレmRNA分子(以下、「プレmRNA」という)と相互作用しかつ新規なキメラRNA分子(以下、「キメラRNA」という)の形成をもたらすスプライセオソームトランススプライシング反応を媒介するようにデザインされた、プレトランススプライシング分子(以下、「PTM」という)を含む。本発明の方法は、本発明のPTMと天然標的プレmRNAとを、PTMの一部が天然プレmRNAにスプライシングされて新規なキメラRNAを形成するような条件下で接触させることを含む。本発明のPTMは、トランススプライシング反応から生じた新規なキメラRNAそれ自体がRNAの翻訳を阻害するといったある機能を遂行するか、あるいはまた、キメラRNAが細胞内で欠陥のあるまたは不活性なタンパク質を補足するタンパク質をコードするか、または特定の細胞を死滅させる毒素をコードするように遺伝子操作される。一般に、標的プレmRNAは、それが特定の細胞型で発現され、それにより新規なキメラRNAの発現を選択された細胞型にターゲットするための手段を提供するという理由で選択される。標的細胞としては、限定されるものではないが、ウイルスその他の感染性病原体に感染した細胞、良性または悪性新生物、あるいは自己免疫疾患または組織拒絶に関わる免疫系の成分が挙げられる。また本発明のPTMは、遺伝病に関与することが分かっている遺伝子変異を修正するためにも使用できる。特に、内部エキソンを置換するために二重トランススプライシング反応を用いることができる。本発明のPTMはまた、標的プレmRNAにおいてイントロン／エキソン境界を同定する方法としてmRNA分子のエキソン配列にタグを付けるために遺伝子操作することもできる。本発明はさらに、特定の細胞型で発現されるタンパク質を精製および同定する際に用いるペプチドアフィニティー精製タグをコードするよう遺伝子操作されるPTM分子の使用に関する。本発明の方法および組成物は遺伝子調節、遺伝子修復および標的化された細胞死に使用することができる。このような方法および組成物は限定されるものではないが、遺伝病、感染性疾患または自己免疫疾患、および癌などの増殖性疾患の治療
ならびに植物における遺伝子発現の調節に使用できる。
【００１１】
5.  発明の詳細な説明
本発明はプレトランススプライシング分子(PTM)を含んでなる組成物、および新規な核酸分子を作製するためのかかる分子の使用に関する。本発明のPTMは、プレmRNAに特異的に結合するようにデザインされた1以上の標的結合ドメイン；分岐点、ピリミジントラクト、ならびに3’スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域；ならびにそのRNAスプライス部位を標的結合ドメインから離す1以上のスペーサー領域を含んでなる。また、本発明のPTMは翻訳可能なタンパク質産物をコードするもののようないずれかのヌクレオチド配列を含むように操作することもできる。
【００１２】
本発明の方法は、本発明のPTMと天然プレmRNAを、PTMの一部が天然プレmRNAの一部へとトランススプライシングされて新規なキメラRNAを生じるような条件下で接触させることを含む。標的プレmRNAは、それが特定の細胞型で発現し、従って、新規なRNAの発現を選択された細胞型へターゲッティングする機構をもたらすことから、標的として選択される。得られるキメラRNAは特定の細胞型で所望の機能をもたらすか、または遺伝子産物を産生しうる。特定の細胞としては、限定されるものではないが、ウイルスその他の感染性病原体に感染したもの、良性または悪性新生物、あるいは自己免疫疾患または組織拒絶に関わる免疫系の成分が挙げられる。特異性はPTMの結合ドメインを標的内因性プレmRNAに結合するように改変することで達成される。キメラRNAによりコードされる遺伝子産物は、例えば治療遺伝子またはマーカー遺伝子ならびに毒素をコードする遺伝子など、臨床的に有用な遺伝子をはじめとするいずれの遺伝子であってもよい。
【００１３】
5.1.  プレトランススプライシング分子の構造
本発明は標的トランススプライシングにより新規なキメラ核酸分子を作出するのに用いる組成物を提供する。本発明のPTMは(i)PTMの結合をプレmRNAへターゲッティングする1以上の標的結合ドメイン、(ii)分岐点、ピリミジントラクト、ならびに3’スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域；ならびに(iii)そのRNAスプライス部位を標的結合ドメインから離す1以上のスペーサー領域を含んでなる。また、このPTMは翻訳可能なタンパク質産物をコードするいずれかのヌクレオチド配列を含むように操作することもできる。本発明のさらにもう1つの実施形態では、PTMはキメラRNA分子の翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含むように操作することができる。例えば、このヌクレオチド配列は、翻訳停止コドンまたは二次構造を形成することにより翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、キメラRNAはアンチセンス分子として働き、それによりそれが結合するRNAの翻訳を阻害するものであってもよい。
【００１４】
PTMの標的結合ドメインは、選択されたプレmRNAのターゲッティング領域に対して相補的、かつ、アンチセンス配向である複数の結合ドメインを含んでもよい。本明細書において標的結合ドメインは、結合の特異性を与え、核のスプライセオソームプロセッシング機構がPTMの一部をプレmRNAの一部へとトランススプライシングできるように近接してプレmRNAをつなぎ止めるいずれかの配列として定義される。これらの標的結合ドメインは数千までのヌクレオチドを含みうる。本発明の好ましい実施形態では、これらの結合ドメインは少なくとも10ないし30、数百までのヌクレオチドを含みうる。本明細書に示されるように、PTMの特異性は標的結合ドメインの長さを増加させることによって著しく高めることができる。例えば標的結合ドメインは数百またはそれより多いヌクレオチドを含んでもよい。さらにまた、標的結合ドメインは「直鎖状」であってもよいが、このRNAは、複合体を安定化させて、それによりスプライシング効率を高めうる二次構造を形成するように折りたたまれていてもよいと考えられる。第2の標的結合領域は分子の3’末端に位置してもよく、本発明のPTMに組み込むことができる。絶対的な相補性が好ましいが、必ずしも必要ではない。本明細書に関してRNAの一部に「相補的な」配列とは、そのRNAとハイブリダイズして安定な二重らせんを形成しうるのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズ能は相補性の程度および核酸の長さの両方に依存しうる(例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照)。一般にハイブリダイズする核酸が長いほど、RNAと誤対合する塩基をより多く含んでなお安定した二重らせんを形成する。当業者ならば、標準的な方法を用いてハイブリダイズした複合体の安定性を調べることにより、二重らせんの誤対合または長さの許容度を確かめることができる。
【００１５】
PTMをイントロン-エキソンタグ付けまたはペプチドアフィニティータグ付けに用いるようデザインする場合、PTMライブラリーを、標的結合ドメインにランダムなヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作する。あるいは、 イントロン-エキソンタグ付けには、標的結合ドメインを欠くようにPTMを遺伝子操作してもよい。かかるPTM分子ライブラリーを作製する上での到達目標は、ライブラリーが、細胞で発現する各RNA分子に結合しうるPTM分子の集団を含むということである。組換え発現ベクターは、ランダムなDNA断片をPTMに挿入してランダムな標的結合ドメインを形成させるのに使用できる制限エンドヌクレアーゼ部位を含むPTMのコード領域を含むように遺伝子操作することができる。標的結合ドメインとしてPTMに含めるべきランダムヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、制限酵素によるDNA部分消化、またはDNAのランダム断片を作出するDNA物理的剪断をはじめ、当業者に周知の様々な異なる方法を用いて作出することができる。ランダム結合ドメイン領域はまた、縮重オリゴヌクレオチド合成によって作出することもできる。これらの縮重オリゴヌクレオチドは、縮重結合ドメインを有するPTM分子ライブラリーの作出のため、各末端に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、PTM分子へのクローニングを容易にするために操作することができる。
【００１６】
また、結合はその他の機構、例えば三重らせんの形成、またはPTMが特定のRNA結合タンパク質、すなわち特定の標的プレmRNAと結合したタンパク質を認識するように操作されているものなど、タンパク質／核酸相互作用によって達成することもできる。あるいは、本発明のPTMは、例えばRNA分子内のヌクレオチド間の分子内塩基対合によって生じるヘアピン構造などの二次構造を認識するようにデザインしてもよい。
【００１７】
また、PTM分子は分岐点、ピリミジントラクトおよび3' スプライス受容AG部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域を含む。RNA スプライシングに用いる5’スプライス供与部位および3’スプライス領域の共通配列は当技術分野で周知のものである(Mooreら, 1993, The RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 303-358参照)。さらにまた、本発明の実施において、5'供与スプライス部位および3’スプライス領域として機能する能力を維持する改変共通配列を用いてもよい。要するに、5’スプライス部位共通配列はAG/GURAGU(ここで、A=アデノシン、U=ウラシル、G=グアニン、C=シトシン、R=プリンおよび/=スプライス部位)である。3’スプライス部位は分岐点または分岐部位、ポリピリミジントラクトおよび3'共通配列(YAG)の3つの異なる配列エレメントからなる。哺乳類の分岐点共通配列は YNYURAC(Y=ピリミジン)である。下線を引いたAは分岐形成部位である。ポリピリミジントラクトは、分岐点とスプライス部位アクセプターとの間に位置し、様々な分岐点利用および3’スプライス部位認識に重要なものである。
【００１８】
さらに、3'受容部位(AG)を含んでなるPTMを遺伝子操作することができる。このようなPTMはピリミジントラクトおよび／または分岐点配列をさらに含んでもよい。
【００１９】
最近、ジヌクレオチドAUで始まり、ジヌクレオチドACで終わるプレメッセンジャーRNAイントロンが確認され、U12イントロンと呼ばれている。U12イントロン配列ならびにスプライス受容／供与配列として機能するいずれかの配列をPTMで用いてもよい。
【００２０】
また、標的結合ドメインからRNAスプライス部位を離すスペーサー領域もPTMに含めてよい。このスペーサー領域は非スプライスPTMの翻訳を遮断する停止コドン、および／または標的プレmRNAへのトランススプライシングを促進する配列などの特徴を有しうる。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、スペーサー、結合ドメイン、またはPTMの他のいずれかの場所に「セーフティー」を組み込んで非特異的トランススプライシングを妨げる。これは比較的弱い相補性によってPTMの3'および／または5’スプライス部位のエレメントをカバーして非特異的トランススプライシングを妨げるPTMの１領域である。PTMは、PTMの結合／ターゲッティング部分のハイブリダイゼーションの際に 3'および／または5'スプライス部位はカバーされず、完全活性型となるようにデザインされる。
【００２２】
「セーフティー」は、PTM分岐点、ピリミジントラクト、3’スプライス部位および／または5’スプライス部位(スプライシングエレメント)の片側または両側に弱く結合する1以上のシス配列の相補的ストレッチからなる(または、第2の個別の核酸ストランドでありうる)か、あるいは、スプライシングエレメントそれ自体の一部と結合しうる。この「セーフティー」結合はスプライシングエレメントが活性となるのを防ぐ(すなわちU2 snRNPその他のスプライシング因子がPTMスプライス部位認識エレメントと結合するのを妨げる)。この「セーフティー」の結合はPTMの標的結合領域が標的プレmRNAに結合して露出し、PTMスプライシングエレメントを活性化する(それらを標的プレmRNAへとトランススプライシングされやすくする)ことで阻害されうる。
【００２３】
本発明のPTMには、細胞死などの作用をもたらしうる翻訳可能なタンパク質、あるいはマーカーとしての欠損した機能または作用を回復するものをコードするヌクレオチド配列が含まれる。例えば、ヌクレオチド配列は公知の遺伝病で欠損または変異している遺伝子産物をコードする配列を含みうる。あるいは、ヌクレオチド配列は、細胞の同定または画像化に用いうるマーカータンパク質またはペプチドをコードすることができる。本発明のさらに別の実施形態では、アフィニティー精製に用いるPTM分子には、HISタグ(6つの連続するヒスチジン残基)(Janknechtら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)のC末端(SmithおよびJohnson, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8703-8707)(Pharmacia)またはFLAG(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys)(Eastman Kodak/IBI, Rochester, NY)などのアフィニティータグをコードするヌクレオチド配列を含めてもよい。このようなヌクレオチド配列を含むPTMを使用すると、ペプチドアフィニティータグと結合させた細胞で通常発現されるペプチド配列を含む融合タンパク質をコードするキメラRNAが産生される。このアフィニティータグは細胞で発現されるペプチド配列の迅速な精製と同定のための方法を提供する。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、放射線照射または化学療法などの続いて行う治療に対する細胞の感受性を高める何らかの機能を提供する毒素その他のタンパク質をコードしてもよい。
【００２４】
本発明の極めて好ましい実施形態では、PTM分子はジフテリア毒素サブユニットAをコードするヌクレオチド配列を含むようにデザインする(Greenfield, L.ら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6853-6857)。ジフテリア毒素サブユニットAは酵素毒素活性を含み、ヒト細胞で発現または送達された場合に細胞死をもたらす働きをする。さらに本発明では、限定されるものではないが、シュードモナス毒素、志賀毒素および外毒素Aをはじめ、その他種々の公知のペプチド毒素を用いてもよい。
【００２５】
PTM分子の前後いずれかにさらなる特徴（例えば、スプライシングを促進するためのポリアデニル化シグナルもしくは5’スプライス配列、さらなる結合領域、「セーフティー」自己相補領域、さらなるスプライス部位、または分子の安定性を調節し、分解を防ぐための保護基など）を有する翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を付加することができる。
【００２６】
本発明のPTMへ組み込みうるさらなる特徴としては、非スプライシングプレmRNAの発現を防ぐための、結合ドメインとスプライス部位の間の領域における停止コドンまたはその他のエレメントが挙げられる。本発明の別の実施形態では、PTMは、3’標的イントロンまたはエキソンへの結合を促進するために、また、固定された原型のシス5’スプライス部位(U5および／またはU1結合部位)を遮断するために、翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列から下流にある第2のアンチセンス結合ドメインを伴って作出することができる。
【００２７】
また、キメラトランススプライシング産物の作出に二重トランススプライシング反応を必要とするPTMも作出することができる。このようなPTMはRNAの修復に使用できる内部エキソンを置換するのに使用できる。2つのトランススプライシング反応を促進するようにデザインされたPTMは上記のように作製されるが、それらは5’供与部位と3’スプライス受容部位の双方を含む。さらに、PTMは2以上の結合ドメインおよびスプライサー領域を含んでもよい。これらのスプライサー領域は複数の結合ドメインとスプライス部位との間、あるいはまた複数の結合ドメイン間で置換してもよい。
【００２８】
核局在化およびスプライセオソームの組み込み、ならびに細胞内安定性を促進または補助するため、PTMに3’ヘアピン構造、環化RNA、ヌクレオチド塩基修飾または合成類似体などのさらなるエレメントを組み込むことができる。
【００２９】
さらにまた、植物細胞で用いるPTMを設計する際には、植物でのイントロンのプロセッシングに必ずしも不可欠な配列ではないため、保存された分岐点配列またはポリピリミジントラクトを含む必要はない。しかし、脊椎動物および酵母のスプライシングに必要なものなど、3’スプライス受容部位および／または5’スプライス供与部位は含まれる。さらに、植物でのスプライシング効率はUA豊富なイントロン配列も含めることによって増大させることができる。当業者ならば、植物におけるトランススプライシング反応を媒介しうるいずれの配列を用いてもよいことが分かるであろう。
【００３０】
本発明のPTMは、標的細胞において新規なキメラRNAを産生するようにデザインした方法で用いることができる。本発明の方法は、例えば、RNA分子、またはRNA分子へ転写されるDNAベクターなど、当業者が用いるいずれの形態であってもよいが、PTMを標的細胞へ送達することを含んでなり、そのPTMがプレmRNAに結合し、プレmRNAの一部へスプライシングされるPTM分子の一部を含んでなるキメラRNAの形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介する。
【００３１】
5.2.  トランススプライシング分子の合成
本発明の核酸分子は、RNAもしくはDNAまたはその誘導体もしくは改変型、一本鎖もしくは二本鎖でありうる。核酸とは、デオキシリボヌクレオチドからなる場合であれ、リボヌクレオシドからなる場合であれ、また、ホスホジエステル結合からなる場合であれ、改変型の結合からなる場合であれ、PTM分子、またはPTM分子をコードする核酸分子を意味する。また、核酸という用語には、生物学的にみられる5つの塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基からなる核酸も特に含まれる。
【００３２】
本発明のRNAおよびDNA分子は、DNAおよびRNA分子の合成に関して当技術分野で公知のいずれの方法によっても調製することができる。例えば、核酸は当業者に周知の方法により市販の試薬およびシンセサイザーを用いて化学的に合成してもよい(例えば、Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England)。あるいはRNA分子は、RNA分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin vivo転写によって作製することもできる。このようなDNA配列はT7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込んだ様々なベクターへ組み込むことができる。RNAはSPS65(Promega Corporation, Madison, WI)などのプラスミドを用いるin vitro転写を介して高収率で産生することができる。さらにまた、Q-β増幅などのRNA増幅法を利用してRNAを産生することもできる。
【００３３】
核酸分子は例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、細胞への輸送などを向上させるために塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変することができる。例えば全体としての電荷を小さくするようPTMを改変すると、分子の細胞への取り込みを向上させることができる。さらにまた、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を低減する改変を行うこともできる。核酸分子はペプチド(例えば、in vivoで宿主細胞受容体をターゲッティングするため)、または細胞膜(例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; 1988年12月15日公開のPCT公開W088/09810参照)または血液脳関門(例えば、1988年4月25日公開のPCT公開W089/10134)を通過する輸送を補助する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤(例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6:958-976参照)またはインターカレート剤(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549)などのその他の付属基を含んでもよい。この目的で核酸分子は、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などにコンジュゲートしてもよい。核酸分子への種々のその他周知の改変が細胞内安定性および半減期を上昇させる手段として導入できる。可能な改変としては、限定されるものではないが、分子の5’および／または3’末端へのリボまたはデオキシヌクレオチドのフランキング配列の付加が挙げられる。安定性の上昇が望まれるいくつかの環境では、2’-O-メチル化などの改変型のヌクレオシド内結合を有する核酸が好ましいものでありうる。改変型のヌクレオシド内結合を含む核酸は当業者に周知の試薬および方法を用いて合成することができる(Uhlmannら, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneiderら, 1990, Tetrahedron Lett. 31:335およびその中に挙げられている参照文献参照)。
【００３４】
核酸は当技術分野において周知であるような好適な手段のいずれかによって精製しうる。例えば、核酸は逆相クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によって精製することができる。もちろん当業者ならば、精製方法が精製する核酸の大きさによってある程度異なることが分かるであろう。
【００３５】
PTMをコードする核酸分子を用いる場合、核酸分子の発現ベクターへのクローニングには当技術分野で公知のクローニング技術を用いることができる。使用できる当技術分野で一般に知られている組換えDNA技術の方法は、Ausubelら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
【００３６】
目的のPTMをコードするDNAは、DNAの大スケール複製も提供し、かつ、PTMの転写を指令する必須エレメントも含む様々な宿主ベクター系に組換え操作することができる。患者の標的細胞をトランスフェクトすることを目的にこのような構築物を用いると、内因的に発現したプレmRNA標的と相補的塩基対を形成し、それにより複合化した核酸分子間のトランススプライシング反応を促進するのに十分な量のPTMの転写が起こる。例えば、ベクターは、細胞に取り込ませ、PTM分子の転写を命令することができるようにin vivoで導入することができる。このようなベクターは、転写されて目的のRNAを産生する限り、エピソームとして維持されるものであっても染色体に組み込まれるものであってもよい。このようなベクターは当技術分野で標準的な組換えDNA技術によって構築することができる。
【００３７】
目的のPTMをコードするベクターは、プラスミド、ウイルス、または哺乳類細胞で複製および発現させるのに用いる当技術分野で公知のその他のものであってもよい。PTMをコードする配列の発現は、哺乳類、好ましくはヒトの細胞で機能させるために当技術分野で公知のいずれかのプロモーターによって調節することができる。このようなプロモーターは誘導性のものであっても構成的なものであってもよい。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(Benoist, C.およびChambon, P. 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長い末端リピートに含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22: 787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42)、CMVウイルスプロモーター、ヒト漿膜ゴナドトロピン-βプロモーター(Hollenbergら, 1994, Mol. Cell.  Endocrinology 106:111-119)などが挙げられる。いずれの種類のプラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベクターを用いて、直接組織部位へ導入できる組換えDNA構築物を作製することができる。あるいは、所望の標的細胞へ選択的に感染するウイルスベクターを用いることもできる。
【００３８】
ペプチドアフィニティー精製タグをコードするPTMの使用に関しては、ランダムな標的結合部位を含むヌクレオチド配列をPTMに挿入し、それらを選択可能な哺乳類発現ベクター系にクローニングするのが望ましい。限定されるものではないが、それぞれtk欠損、hgprt欠損またはaprt欠損細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の発現についての選択をはじめ、いくつかの選択系を使用することができる。また、メトトレキサート耐性を付与するジヒドロ葉酸トランスフェラーゼ(dhfr)、ミコフェノール酸耐性を付与するキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)、アミノグリコシドG-418耐性を付与するネオマイシン(neo)、およびハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hygro)に関する選択に基づく代謝拮抗物質耐性を使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、いずれの細胞にも1個のベクターまたは限られた数のベクターしか存在しないように、培養細胞を細胞に対して低率のベクターで形質転換する。本発明の実施に用いるベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス種に由来するものなどウイルス発現ベクターをはじめとするいずれかの真核発現ベクターが挙げられる。
【００３９】
5.3.  トランススプライシング分子の使用および投与
5.3.1  遺伝子調節、遺伝子修復および標的化細胞死のためのPTM分子の使用
本発明の組成物および方法は遺伝子調節、遺伝子修復、および標的化細胞死をはじめとする種々の異なる用途を有する。例えば、トランススプライシングは毒性を有するタンパク質を細胞に導入するために使用できる。さらにPTMは、ウイルスmRNAと結合してウイルスmRNAの機能を破壊するか、あるいは、ウイルスmRNAを発現するいずれの細胞も破壊しうるように操作することができる。本発明のさらに別の実施形態では、PTMは、有害なmRNA転写物に停止コドンを配置し、それにより転写物の発現を低下させるように操作することができる。
【００４０】
本発明のある実施形態では、PTM分子はパピローマウイルスRNAと結合してウイルスRNAの機能を阻害するようにデザインした。具体的には、HPVプレmRNAを特異的にターゲッティングし、HPV感染した癌細胞においてのみ阻害的または毒性であるタンパク質の発現をもたらすように抗HPV PTMをデザインした。このように本発明は、パピローマウイルスRNAの機能を阻害するようにデザインしたPTM分子を提供する。このようなパピローマウイルスとしては、限定されるものではないが、ヒトパピローマウイルスを含む哺乳類パピローマウイルスが挙げられる。
【００４１】
パピローマウイルスは、ヒトをはじめ種々の脊椎動物に乳頭腫(いぼ)を作る小型DNAウイルスの一群である。さらに、ヒトパピローマウイルスはわが国で性的伝染病の最も一般的な原因の一つであり、大部分の子宮頚癌は発癌性ヒトパピローマウイルスに関連し、E6およびE7発癌タンパク質をコードするウイルスmRNAを発現する。このように、本発明のPTM分子は感染した宿主内でパピローマウイルスの増殖を阻害するのに使用できる。
【００４２】
二重トランススプライシング反応、3'エキソン置換および／または5’エキソン置換をはじめとする標的トランススプライシングを用い、末端切断型または点突然変異を含む転写物を修復または修正することができる。本発明のPTMは特定の突然変異の上流もしくは下流、または未成熟3’の上流で標的転写物を切断し、突然変異を含む転写物の部分を機能的配列で置換するトランススプライシング反応を介して変異転写物を修正するようにデザインされている。
【００４３】
さらにまた、腫瘍細胞での毒素の選択的発現のために二重トランススプライシング反応を用いてもよい。例えば、PTMは、ヒトβ-漿膜ゴナドトロピン-6(βhCG6)遺伝子転写物の第2のエキソンを置換し、ジフテリア毒素サブユニットA(DT-A)をコードするエキソンを送達するようにデザインすることができる。サブユニットBの不在下でのDT-Aの発現はDT-A遺伝子を発現する細胞でのみ毒性となるはずである。βhCG6はトランススプライシングによる遺伝子改変の原型的な標的である。βhCG6遺伝子の配列および構造は完全に知られており、スプライシングのパターンが決定されている。βhCG6遺伝子は多くの非生殖細胞系の腫瘍をはじめとする多種の固形癌で発現が高いが、このβhCG6遺伝子は正常な成体の大部分の細胞ではサイレントである。従って、βhCG6プレmRNAは腫瘍特異的毒性をもたらすようにデザインされたトランススプライシング反応の望ましい標的となる。
【００４４】
βhCG6プレmRNAの第1のエキソンは、トランススプライシングmRNAの効率的な翻訳に必要なシグナルを提供するとともに、DT-A毒素の適切な折りたたみにより最小の妨害しか引き起こさないように、開始コドンAUGを含む5つのアミノ酸だけをコードするのが理想的である。キメラタンパク質の形成を妨げる停止コドンを含むようにデザインされたDT-Aエキソンは、βhCG6遺伝子の最後のエキソンへとトランススプライシングされるように操作する。βhCG6遺伝子の最後のエキソンは、mRNAをポリアデニル化して確実に翻訳されるようにする適当なシグナルを有する構築物を提供する。
【００４５】
嚢胞性繊維症(CF)はヒトにおいて最も一般的な致死性の遺伝子病の1つである。遺伝子解析および分子解析の双方に基づき、嚢胞性繊維症に関連する遺伝子が単離され、そのタンパク質産物が推定されている(Kerem, B.S.ら, 1989, Science 245:1073-1080; Riordanら, 1989, Science 245: 1066-1073; Rommansら, 1989, Science 245:1059-1065)。CF関連遺伝子のタンパク質産物は嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質(CFTR)と呼ばれる。本発明の特定の実施形態では、トランススプライシング反応は嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質(CFTR)をコードするDNA配列における遺伝子欠損を修正するために用い、それによって嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質をコードするDNA配列が発現され、患者の気道上皮細胞に機能的塩素イオンチャネルが形成される。
【００４６】
集団研究によって、最も多い嚢胞性繊維症突然変異はCFTRアミノ酸配列の508番のフェニルアラニンをコードするエキソン10における3つのヌクレオチドの欠失であることが示された。図15に示されているように、トランススプライシング反応はCFTRのアミノ酸配列の508番の欠失を修正することができた。遺伝子欠損の修正に用いるPTMは、CFTR BDイントロン9配列、スペーサー配列、分岐点、ポリピリミジントラクト、3’スプライス部位および野生型CFTR BDエキソン10配列を含んでいた(図13)。トランススプライシング反応を用いてCFTRをコードする変異DNAが首尾よく修正できるということは、遺伝子欠損の修正のためのPTMの全般的な適用を支持するものである。
【００４７】
血友病Aは凝固カスケードの重要な成分である因子VIIIの活性の欠損を特徴とするX染色体連関出血障害である。血友病Aの罹患率は男性5,000ないし10,000人におよそ1人である。罹患者は関節および筋肉出血に苦しみ、打撲しやすく、傷からの出血が長引く。血友病Aは因子VIII遺伝子における種々の突然変異から起こる。この遺伝子は26個のエキソンからなり、186kbにわたる。突然変異が同定されている血友病A患者の約95%は遺伝子に点突然変異を有する。本発明の特定の実施形態では、因子VIIIをコードするDNA配列における遺伝子欠損を修正するためにトランススプライシング反応を用い、それにより因子VIIIタンパク質をコードするDNA配列が発現し、患者の血漿で機能的凝固因子が形成される。本発明のPTMは因子VIII遺伝子のコード領域における欠損を修正することを目的として対象とするいずれのエキソンまたはエキソンの組合せも修復するように遺伝子操作することができる。
【００４８】
遺伝的研究では、最も一般的な因子VIII突然変異が生じることが示されている。図46に示されるように、トランススプライシング反応は因子VIIIアミノ酸配列における突然変異を修正することができた。突然変異はマウス遺伝子のエキソン16とイントロン16の間にネオマイシン遺伝子を挿入し、エキソン16のオープンリーディングフレームに割り込ませ、イントロン16の3'スプライス供与部位を除去することにより作出した。遺伝子欠損を修正するのに用いたPTMは因子VIIIエキソン16〜24コード配列、スペーサー配列、分岐点、ポリピリミジントラクト、および3'受容スプライスを含んでいた(図44A)。トランススプライシング反応を用いて因子VIIIをコードする変異型DNAが首尾よく修正できるということは、遺伝子欠損の修正のためのPTMの全般的な適用をさらに支持するものである。
【００４９】
本発明の方法および組成物はまた、植物での遺伝子発現を調節するためにも使用できる。例えば、いずれかの操作された遺伝子の発現を選択された標的植物遺伝子の本来の調節下に置くためにトランススプライシングを用いてもよく、それにより操作された遺伝子の発現が調節される。トラススプライシングはまた、非宿主植物において操作された遺伝子の発現を妨げたり、あるいは内因性の遺伝子産物をさらに望ましい産物へと変換するためにも使用できる。
【００５０】
本発明の特定の実施形態では、トランススプライシングはBt毒素(Bacillus thuringiensis)を産生する殺虫遺伝子の発現を調節するためにも使用できる。例えば、昆虫が植物を食害した後にはじめて発現する傷害応答遺伝子(プレmRNA)へとトランススプライシングされるようにPTMをデザインすることができる。このようにして、植物の全細胞がPTM中にBt遺伝子を有するようになるが、これらの細胞は昆虫が植物を傷害した際に傷害した場所でしかBtは産生されない。植物の残りの部分は、ほとんどあるいはまったくBtを作らない。PTMは、所望の発現パターンで、Bt遺伝子を選択されたいずれかの遺伝子へとトランススプライシングすることができる。さらに、PTMをターゲッティングして植物の食用部分ではBtを産生しないようにすることができるはずである。
【００５１】
PTMの使用に関する1つの利点は、PTMが標的遺伝子の本来の遺伝子制御エレメントを獲得していることから、操作した遺伝子の上流にある適当な調節配列を同定・再構成するのに費やす時間や労力が軽減される。このようにPTMによって調節される遺伝子の発現は、標的プレmRNAを含む植物細胞でしか起こらないはずである。消費者は組換え遺伝子から作られたタンパク質を食べたがらないので、植物の食用部分または花粉で発現しない遺伝子をターゲッティングすることで、トランススプライシングは遺伝子組換え植物に対する抵抗を緩和することができる。かかる作物の食用部分は、遺伝子組換えタンパク質が含まれていないことを試験する必要がある。
【００５２】
また、PTMは他の植物には存在しない宿主細胞特有の配列へターゲッティングすることができる。従って、PTMをコードする遺伝子(DNA)がたとえ他の植物種にジャンプしたとしても、そのPTM遺伝子にはトランススプライシングの適当な標的がないことになる。このようにトランススプライシングは他の植物種へ遺伝子が「ジャンプ」することを防ぐ「フェイルセーフ(fail-safe)」様式を与え、PTM遺伝子は、適当な標的プレmRNAを含む操作された植物宿主でしか発現しない。操作されていない植物での発現は不可能なのである。
【００５３】
トランススプライシングはまた、ある遺伝子産物を別のものへと変換するより効率的な経路を提供する。例えば、トランススプライシングリボザイムおよびキメラオリゴをトウモロコシゲノムに組み込んで飽和油と不飽和油の比率を改変することができる。トランススプライシングはまた、ある遺伝子産物を別のものへと変換するのに用いることができる。
【００５４】
例えば、リポソームへの封入、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、組成物を発現しうる組換え細胞、受容体により媒介されるエンドサイトーシス(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照)、レトロウイルスその他のベクターの一部としての核酸の構築、DNA注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムにより媒介されるトランスフェクションなど、種々の送達系が知られており、本発明の組成物を細胞へ導入するのに用いることができる。
【００５５】
これらの組成物および方法は癌およびその他の重篤なウイルス感染、自己免疫疾患、ならびに特定の細胞型の改変または除去が有益なその他の病状を治療するために使用できる。また、これらの組成物および方法は、欠損または変異遺伝子産物の発現が正常な表現型をもたらす遺伝性の遺伝子疾患を有する患者の細胞に、機能的生物活性分子をコードする遺伝子を提供するために使用することもできる。
【００５６】
好ましい実施形態では、PTM機能を促進するために、遺伝子送達および宿主細胞での発現という方法で、PTMをコードする配列を含んでなる核酸を投与する。本発明のこの実施形態では、核酸はPTM産生を促進することにより作用を媒介する。当技術分野で利用できる宿主細胞に対する遺伝子送達の方法はいずれも本発明に従って使用できる。遺伝子送達法の総説としては、Strauss, M.およびBarranger, J.A., 1997, Concepts in Gene Therapy, by Walter de Gruyter & Co., Berlin; Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932;ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照。方法例を以下に記載する。
【００５７】
宿主細胞への核酸の送達は直接的(すなわち、宿主がその核酸または核酸を運ぶベクターに直接曝される場合)であっても、間接的(すなわち、まず、in vitroにて宿主細胞をその核酸で形質転換した後、宿主へ移植する場合)であってもよい。これらの2つのアプローチはそれぞれin vivoまたはex vivo遺伝子送達として知られている。
【００５８】
特定の実施形態では、核酸は直接in vivo投与し、そこで発現させてPTMを産生させる。これは例えばそれを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内のものとなるように投与することにより、あるいは例えば欠陥または弱毒レトロウイルスその他のウイルスベクターを用いた感染(米国特許第4,980,286号参照)により、あるいは裸のDNAのの直接注入により、あるいはマイクロパーティクル衝撃(例えば、遺伝子ガン; Biolistic, Dupont)の使用により、あるいは脂質もしくは細胞表面受容体またはトランスフェクション剤によるコーティング、あるいはリポソーム、マイクロパーティクルまたはマイクロカプセルへの封入により、あるいは核へ入ることが知られているペプチドに結合させて投与することにより、あるいは受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを受けるリガンドへ結合させて投与する(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)ことによるなど、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって達成することができる。
【００５９】
特定の実施形態では、PTMを含むウイルスベクターを使用することができる。例えば、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組み込みに必要でないレトロウイルス配列を削除するように改変されたレトロウイルスベクターを用いることができる(Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599参照)。あるいは、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターを細胞または組織への遺伝子送達に使用することができる(アデノウイルスを基にした遺伝子送達の総説としてはKozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503参照)。
【００６０】
細胞への遺伝子送達に対する別のアプローチとしては、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを媒介とするトランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により組織培養細胞へ遺伝子を導入することを含む。通常、導入方法は細胞への選択マーカーの導入を含む。次にこれらの細胞を、導入遺伝子を取り込み、それを発現している細胞を単離する選択下に置く。得られた組換え細胞は当技術分野で公知の種々の方法により宿主へ送達することができる。好ましい実施形態では、遺伝子送達に用いる細胞は宿主細胞自身のものである。
【００６１】
本発明はまた、有効量のPTMまたはPTMをコードする核酸および製薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物も提供する。特定の実施形態では、「製薬上許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって認可されているか、または米国薬局方またはその他動物用、より好ましくはヒト用として汎用されている薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」とは、それとともに治療薬を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルをさす。好適な医薬担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
【００６２】
特定の実施形態では、医薬組成物は、(1)例えばそのタンパク質を欠いた、遺伝的に欠陥がある、生物学的に不活性もしくは活性が不十分な、または発現が十分でない宿主で内因性タンパク質または機能が存在しないか、そのレベルが低い(正常または望ましいものに比べて)疾病または疾患、あるいは(2)in vitroまたはin vivoアッセイによって特定のタンパク質の機能を阻害するPTMの利便性が示される疾病または疾患、において投与する。PTMにより媒介されるトランススプライシング反応から生じたキメラmRNAによってコードされるタンパク質の活性は、例えば宿主組織サンプル(例えば、生検組織から)を得、in vitroでmRNAまたはタンパク質レベル、発現したキメラmRNAの構造および／または活性に関してアッセイすることで容易に検出することができる。このように、限定されるものではないが、キメラmRNAによりコードされるタンパク質を検出および／または可視化する免疫アッセイ (例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降とその後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫組織化学など)、および／またはキメラmRNAの存在を検出および／または可視化することによるキメラmRNAの発現の形成を検出するハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーションおよび逆転写PCRなど)などをはじめとする、当技術分野で標準的な多くの方法を利用することができる。
【００６３】
本発明はまた、有効量のPTMまたはPTMをコードする核酸、および製薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物も提供する。特定の実施形態では、「製薬上許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって認可されているか、または米国薬局方またはその他動物用、より好ましくはヒト用として汎用されている薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」とは、それとともに治療薬を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルをさす。好適な医薬担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は治療を必要とする領域に局所投与するのが望ましい。これは限定されるものではないが例えば、手術中の局部注入(local infusion)、例えば術後の外傷用医薬材料と組み合わせた局所適用、注射、カテーテル、坐剤、あるいはインプラント(インプラントはシアラスティック(sialastic)メンブランまたはファイバーなどの膜をはじめとする多孔質、非多孔質、またはゼラチン素材のものである)によって達成できる。ナノ粒子、徐放性ポリマー、ヒドロゲルなどの母材など、その他の放出制御性薬物送達系もある。
【００６４】
PTMはターゲッティングされる細胞で所望の作用をもたらすのに有効な量で投与する。PTMの有効用量は生物学的半減期、バイオアベラビリティーおよび毒性などのパラメーターに着目する当業者に周知の手法によって決定することができる。有効である本発明の組成物の量は治療する疾病または疾患の性質によって異なり、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらにまた、最適用量範囲を確定する助けとして所望によりin vitroアッセイを用いてもよい。
【００６５】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の1以上の成分を、所望により容器を伴い、充填させた1以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットも提供し、このような容器は医薬または生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態で認知でき、なお、この認知はヒトにおける投与を目的とする製造、使用または販売の政府機関による認可を反映している。
【００６６】
5.3.2  エキソンのタグ付けのためのPTM分子の使用
ヒトその他の生物のゲノムを配列決定し、特性解析する現在の努力を鑑みれば、このような特性解析を容易にする方法が必要である。ゲノムマッピングおよびシーケンシングによって現在得られる情報の大部分はmRNAのcDNAへの逆転写によって作出される相補的DNA(cDNA)ライブラリーから得られるものである。残念なことに、このプロセスはイントロン配列およびエキソン／イントロン境界の位置に関する情報を欠落させる。
【００６７】
本発明は、(i)プレトランススプライシング分子とプレmRNA分子を、そのプレトランススプライシング分子の一部が標的プレmRNAへとトランススプライシングされてキメラmRNAを形成するような条件下で接触させ、(ii)そのキメラmRNA分子を増幅し、(iii)増幅した分子を選択的に精製し、さらに(iv)増幅した分子のヌクレオチド配列を決定し、それによりイントロン-エキソン境界を決定することを含んでなる、プレmRNA分子のエキソン-イントロン境界をマッピングする方法を包含する。
【００６８】
本発明のある実施形態では、プレmRNA分子のエキソン-イントロン境界を位置決定するためのトランススプライシング反応でPTMを用いることができる。イントロン-エキソン境界のマッピングに用いるPTMは上記第5.1節のものと類似した構造を有する。具体的にはPTMは多くのプレmRNAと結合するようにデザインされた標的結合ドメイン、(ii)分岐点、ピリミジントラクトおよび3’スプライス受容部位、または5’スプライス供与部位を含む3’スプライス領域、(iii)そのmRNAスプライス部位を標的結合ドメインから離すスペーサー領域、および(iv)プレmRNAへとトランススプライシングされるタグ領域を含む。あるいは、エキソン-イントロン境界を位置決定するのに用いるPTMは標的結合ドメインを含まないように操作することもできる。
【００６９】
イントロン-エキソンマッピングのためには、ランダムヌクレオチド配列を含む標的結合ドメインを含むようにPTMを遺伝子操作する。このランダムヌクレオチド配列は、プレmRNAと結合してそれをつなぎ止めることができる少なくとも15〜30で数百までのヌクレオチド配列を含み、これにより核のスプライセオソームプロセッシング機構がPTMの一部(タグまたはマーカー領域)をプレmRNAの一部へとトランススプライシングすることができる。短い標的結合ドメインを含有する、またはイノシンを含有するPTMはストリンジェントでない条件下でプレmRNA分子と結合する。さらに、強い分岐点配列およびピリミジントラクトはPTMトランススプライシングの非特異性を増強する働きをする。
【００７０】
PTM分子において標的結合ドメインとして用いるランダムヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、制限エンドヌクレアーゼによるDNAの部分消化、またはDNAの物理的剪断をはじめとする様々に異なる方法を用いて作出することができる。このようなランダムヌクレオチド配列の使用は、細胞内で発現した各標的プレmRNAに関して種々の結合活性を有するPTM分子の膨大なアレイを作出するようにデザインされる。オリゴヌクレオチドのランダムライブラリーは、遺伝子操作されたPTM分子をプラスミドベクターへクローニングするための各末端にある適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて合成することができる。ランダムオリゴヌクレオチドを連結して発現させると、ランダムなPTMの結合ライブラリーが得られる。
【００７１】
本発明の特定の実施形態では、ランダムヌクレオチド配列を含んでなる標的結合ドメインを含むPTM分子をコードする発現ライブラリーは当業者に周知の種々の方法を用いて作出することができる。理想的には、このライブラリーは細胞内で発現した各標的プレmRNAと相互作用しうるPTM分子を含むのに十分複雑なものである。
【００７２】
例を挙げれば、図9はイントロン-エキソン境界のマッピングに利用できる2形態のPTMの模式図である。左のPTMはプレmRNA3’スプライス部位へと非特異的にトランススプライシングされうるが、右のPTMはプレmRNA5’スプライス部位へとトランススプライシングされうる。PTMと標的プレmRNAとの間のトランススプライシングの結果、原型エキソンの3’または5’いずれかの末端に特定のヌクレオチド配列「タグ」を有するキメラmRNA分子が産生される。
【００７３】
選択的精製の後、PTMのタグヌクレオチド配列内で始まり、タグ付けされたエキソン配列へと進行するプライマーを用いてDNAシーケンシング反応を行う。このタグヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドのすぐ後の配列がエキソン境界を表す。イントロン-エキソンタグの同定のためには、当業者に周知の方法を用いてin vitroまたはin vivoのいずれかで本発明のトランススプライシング反応を行うことができる。
【００７４】
5.3.3.  細胞内で発現したタンパク質の同定のためのPTM分子の使用
本発明のさらにもう1つの実施形態では、PTMにより媒介されるトランススプライシング反応は細胞内で発現する、これまでには検出されなかった未知のタンパク質を同定するために使用できる。この方法は、とりわけタンパク質サイズが小さい、あるいはタンパク質が低濃度であるために二次元電気泳動または他の方法では検出できない、あるいは二次元電気泳動では他のタンパク質と同様の移動パターンを示すためにタンパク質を検出できないタンパク質の同定に特に有用である。
【００７５】
本発明は、(i)ランダムな標的結合ドメインおよびペプチドタグをコードするヌクレオチド配列を含有するプレトランススプライシング分子とプレmRNA分子を、そのプレトランススプライシング分子の一部が標的プレmRNAの一部へとトランススプライシングされて融合ポリペプチドをコードするキメラmRNAを形成するような条件下で接触させるか、あるいはゲル電気泳動によってそれを分離し、(ii)融合ポリペプチドをアフィニティー精製する、さらに(iii)融合タンパク質のアミノ酸配列を決定することを含んでなる、細胞内で発現したタンパク質を同定する方法に関する。
【００７６】
細胞内で発現したタンパク質を同定するためには、本発明のPTMを、(i)ランダム化ヌクレオチド配列を含んでなる標的結合ドメイン、(ii)分岐点、ピリミジントラクトおよび3'スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3'スプライス領域、(iii)そのPTMスプライス部位を標的結合ドメインから離すスペーサー領域、および(iv)マーカーまたはペプチドアフィニティー精製タグをコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作する。このようなペプチドタグとしては、限定されるものではないが、HISタグ(6ヒスチジン連続残基)(Janknechtら, 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)(Smith, D.B.およびJohnson, K.S., 1988, Gene 67:31)(Pharmacia)またはFLAG(Kodak/IBI)タグ(Nisson, J.ら, J. Mol. Recognit., 1996, 5:585-594)が挙げられる。
【００７７】
このようなPTMを用いたトランススプライシング反応の結果、マーカーまたはペプチドアフィニティー精製タグに結合した細胞内で通常発現されるタンパク質配列を含んでなる融合タンパク質をコードするキメラmRNA分子が形成される。このような方法の望ましい到達点は細胞内で合成された全てのタンパク質がマーカーまたはペプチドアフィニティータグを受け取り、それにより細胞内で発現した各タンパク質を同定する方法を提供することである。
【００７８】
本発明の特定の実施形態では、ランダムヌクレオチド配列を含んでなる種々の標的結合ドメインを有するPTMをコードするPTM発現ライブラリーを作製する。望ましい到達点は細胞内で発現した各プレmRNAに結合しうるPTMを産生するに十分複雑なPTM発現ライブラリーを作り出すことである。好ましい実施形態では、このライブラリーを哺乳類発現ベクターにクローニングし、1個の細胞につき1つ、またはせいぜい数個のベクターが存在するようにする。
【００７９】
キメラタンパク質の発現を同定するには、宿主細胞をこのPTMライブラリーで形質転換し、1個のPTMベクターを含有する個々のコロニーが増殖および精製可能なようにプレーティングする。単一のコロニーを選択、単離し、適当な培地で増殖させ、例えばアフィニティー精製タグを用い、標識されたキメラタンパク質エキソン断片を他の細胞タンパク質から分離する。例えば、アフィニティークロマトグラフィーはFLAGタグなどのペプチドタグに特異的に結合する抗体の使用を含みうる。あるいは、HISタグを用いる場合には融合タンパク質は、イミダゾールを含有するバッファーで溶出した結合ペプチドを選択的に溶出させるNi2+ ニトリロ酢酸アガロースカラムを用いて精製される。GSTタグを用いる場合には融合タンパク質はグルタチオン-S-トランスフェラーゼアガロースビーズを用いて精製する。次にこれらの融合タンパク質は遊離グルタチオンの存在下で溶出させることができる。
【００８０】
キメラタンパク質の精製後、分析を行って融合タンパク質のアミノ酸配列を決定する。融合タンパク質のアミノ酸配列はエドマン分解とその後のHPLC、質量分析またはアミノ酸分析を用いたアミノ酸解析など、当業者に周知の技術を用いて決定する。同定したところで、そのペプチド配列をGenBankなどのタンパク質データベースで入手できる配列と比較する。部分的なペプチド配列が既知であれば、さらなる分析は行わない。部分的なタンパク質配列が未知であれば、そのタンパク質のより完全な配列決定を行って全タンパク質配列を決定することができる。融合タンパク質は全長タンパク質の一部のみを含む場合には、全長タンパク質をコードする核酸は通常の方法を用いて単離することができる。例えば、cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブまたはPCRプライマーとして用いるには、部分タンパク質配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを生成することができる。
【００８１】
6.  実施例：  トランススプライシング分子の作製
以下の節はPTMの作製およびこのような分子がトランススプライシング反応を媒介してキメラmRNA分子を産生しうる証明について記載する。
【００８２】
6.1.  材料および方法
6.1.1.  プレmRNA分子の構築
野生型ジフテリア毒素サブユニットA(DT-A, 野生型受託番号#K01722)およびDT-A突然変異体(CRM 197, 酵素活性無し)を含有するプラスミドはDr. Virginia Johnson, Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland (Uchidaら, 1973 J. Biol. Chem 248:3838)から入手した。in vitro実験では、DT-Aをプライマー：DT-1F (5'-GGCGCTGCAGGGCGCTGATGATGTTGTTG)、およびDT-2R (5'-GGCGAAGCTTGGATCCGACACGATTTCCTGCACAGG)を用いて増幅し、PstIおよびHindIIIで切断し、PstIおよびHindIIIで消化したpBS(-)ベクター(Stratagene, La Jolla, CA)へクローニングした。得られたクローンpDTAを用いて個々のPTMを構築した。(1) pPTM+：ターゲッティング構築物。EcoRIおよびPstlで消化したpDTAへIN3-1(5'AATTCTCTAGATGCTTCACCCGGGCCTGACTCGAGTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTCCTGCA)およびIN2-4(5'-GGAAAAAAAAGAAGAGGTACCAGTTAGTACTCGAGTCAGGCCCGGGTGAAGCATCTAGAG)プライマーを挿入することにより作製した。(2) pPTM+Sp：BDとBPの間に30bpのスペーサー配列を有すること以外はpPTM+に同じ。pPTM+をXhoIで消化し、オリゴヌクレオチド内でスペーサーS(5'-TCGAGCAACGTTATAATAATGTTC)およびスペーサーAS(5'-TCGAGAACATTATT ATAACGTTGC)を連結することにより作製した。in vivo研究では、pcPTM+SpのEcoRIおよびHindIII断片を哺乳類発現ベクターpcDNA3.1(Invitrogen) のCMVプロモーターの制御下にクローニングした。また、コドン14のメチオニンをイソロイシンに変え、翻訳の開始を妨げた。得られたプラスミドをpcPTM+Spと命名した。(3)pPTM+CRM：野生型DT-AをCRM突然変異体DT-A(T. Uchidaら, 1973, J. Biol. Chem. 248:3838)で置換したこと以外はpPTM+Spに同じ。これはプライマーDT-1FおよびDT-2Rを用いてDT-A突然変異体(G52Eにおける突然変異)のPCR増幅により作製した。in vivo研究では、PTM+CRMのEcoRI HindIII断片をpc3.1DNAにクローニングし、pcPTM+ARMを得た。(4)PTM-：非ターゲッティング構築物。PTM+をEcoRIおよびPst Iで消化し、ゲル精製して結合ドメインを除去した後、オリゴヌクレオチドIN-5(5'-ATCTCTAGATCAGGCCCGGGTGAAGCCCGAG)およびIN-6(5'-TGCTTCACCC GGGCCTGATCTAGAG)を連結することにより作製した。(5)PTM-SpはPstI部位に30bpのスペーサー配列を有すること以外はPTM-と同一のバージョンである。同様に、特定の配列を挿入または欠失させることでスプライス突然変異体[Py(-)AG(-)およびBP(-)Py(-)AG(-)]およびセーフティー変異体[PTM+SF-Pyl, PTM+SF-Py2, PTM+SFBP3およびPTM+SFBP3-Pyl]を構築した(1参照)。
【表１】
2005168509.tif 000002
太字のヌクレオチドは、正常なBP、PPTおよび3'スプライス部位に対する突然変異を示す。分岐部位Aは下線で示す。イタリックのヌクレオチドはPTMのBP配列をマスクするためにセーフティーBDに導入された誤対合を示す。
【００８３】
また、二重トランススプライシングPTM構築物(DS-PTM)も、PTM+SFの毒素コード配列の3'末端へ、5'スプライス部位とβHCGプレmRNAの第2のイントロンに相補的な第2の標的結合ドメインとを付加して作製した(図A)。
【００８４】
6.1.2.  βHCG6標的プレmRNA
in vitro標的プレmRNAを産生するため、βHCG遺伝子6(受託番号#X00266)のSacI断片をpBS(-)にクローニングした。これによりヌクレオチド460〜1265に由来し、5'非翻訳領域、開始コドン、エキソン1、イントロン1、エキソン2およびイントロン2の大部分を含む805bpのインサートが産生された。in vivo研究では、EcoRIおよびBamHI断片を哺乳類発現ベクター(pc3.1DNA)へクローニングし、βHCG6を産生した。
【００８５】
6.1.3.  mRNAの調製
in vitroスプライシング実験では、T7 mRNAポリメラーゼ(Pasman & Garcia-Blanco, 1996, Nucleic Acids Res. 24:1638)を用い、それぞれBamHIおよびHindIIIで消化したプラスミドDNAをin vitro翻訳することにより、βHCG6、β-グロビンプレmRNAおよび種々のPTM mRNAを合成した。合成したmRNAを変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により精製し、産物を切り出し、溶出した。
【００８６】
6.1.4.  in vitroスプライシング
PTMおよび標的プレmRNAを、98℃で加熱した後に30〜34℃までゆっくり冷却することによりアニーリングした。各反応物には最終量12.5μlに、アニーリングしたmRNA複合体4μl(標的100ngおよびPTM200ng)、1Xスプライスバッファー(2mM MgCl2、1mM ATP、5mMリン酸クレアチニン、および40mM KCl)およびHeLaスプライス核抽出物(Promega)4μlを含んだ。反応物を30℃で示された時間の間インキュベートし、同量の高塩バッファー(7M尿素、5% SDS、100mM LiCl、10mM EDTAおよび10mM TrisHCl, pH7.5)を添加することで反応を停止させた。核酸はフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(50:49:1)で抽出した後、エタノール沈殿させることにより精製した。
【００８７】
6.1.5.  逆転写-PCR反応
RT-PCR解析はEZ-RT PCRキット(Perkin-Elmer, Foster City, CA)を用いて行った。各反応物には、反応量50μl中に、シスまたはトランススプライシングmRNA 10ng、または全mRNA 1〜2μg、3'および5'特異的プライマー各0.1μl、各dNTP 0.3mM、1X EZバッファー(50mMビシン、115mM酢酸カリウム、4%グリセロール, pH8.2)、2.5mM酢酸マグネシウムおよび5UのrTth DNAポリメラーゼを含んだ。60℃で45分間逆転写を行った後、得られたcDNAのPCR増幅を以下のようにして行った：初期変性94℃30秒1サイクル、変性94℃18秒、60℃40秒でアニーリングおよび伸張の25サイクル、その後70℃で7分最終伸張。反応産物はアガロースゲルでの電気泳動によって分離した。
【００８８】
本研究で用いたプライマーは以下の通りだった：
DT-1F:  GGCGCTGCAGGGCGCTGATGATGTTGTTG
DT-2R:  GGCGAAGCTTGGATCCGACACGATTTCCTGCACAGG
DT-3R:  CATCGTCATAATTTCCTTGTG
DT-4R:  ATGGAATCTACATAACCAGG
DT-5R:  GAAGGCTGAGCACTACACGC
HCG-R2:  CGGCACCGTGGCCGAAGTGG
Bio-HCG-F:  ACCGGAATTCATGAAGCCAGGTACACCAGG
β-グロブリン-F:  GGGCAAGGTGAACGTGGATG
β-グロブリン-R:  ATCAGGAGTGGACAGATCC
【００８９】
6.1.6.  細胞増殖、トランスフェクションおよびmRNAの単離
ヒト肺癌細胞系H1299(ATCC受託番号#CRL-5803)を37℃、5 % C02環境下、10%ウシ胎児血清を補足したRPMI培地で増殖させた。リポフェクタミン試薬(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を用い、細胞をpcSp+CRM(CRMは非機能的毒素である)、PTMを発現するベクター、またはベクター単独(pcDNA3.1)でトランスフェクトした。アッセイとしてはトランスフェクション2週間後にネオマイシン耐性(neor)コロニー形成に関してスコアした。4つのneorコロニーが選択され、neo選択の継続下で拡張した。RNAエキソール(BioChain Institute, Inc., San Leandro, CA)を用いて全細胞mRNAを単離し、RT-PCRに用いた。
【００９０】
6.1.7.  ヌードマウスの腫瘍におけるトランススプライシング
11個体のヌードマウスの背側側腹皮下部に1x107個のH1299ヒト肺腫瘍細胞を左右に注射した(B10、B11およびB12以外は1腫瘍を持っていた)(1日目)。14日目、マウスに適量の麻酔を施し、数方向のエレクトロポレーション(T820, BTX Inc., San Diego, CA)をかけながら、またはかけずに、pcβHCG6またはpcPTM+Spを含む、または含まないpcSp+CRM 100μgを含有する全量100μlの生理食塩水を注射した。右側の腫瘍に注射した溶液には針の軌跡をマークするために墨も加えた。48時間後に動物を屠殺し、腫瘍を摘出し、すぐに-80℃で凍結した。分析に関しては、各腫瘍10mgをホモジナイズし、製造業者の説明書に従ってダイナビーズmRNAディレクトキット(Dynabeads mRNA direct kit)(Dynal)を用いてmRNAを単離した。精製したmRNA(総量10μlのうち2μl)を、はじめに記載したようなβHCG-FおよびDT-5Rプライマーを用いてRT-PCRに供した。全てのサンプルをDT-3R、ネスティッドDT-Aプライマーおよびビオチン化βHCG-Fを用いて再増幅し、これらの産物を2%アガロースゲルでの電気泳動により分析した。バンドを生じたサンプルをM280ストレプトアビジンダイナビーズを用い処理して一本鎖DNAとし、毒素特異的プライマー(DT-3R)を用いて配列決定した。
【００９１】
6.2.  結果
6.2.1.  PTMの合成
18ntの標的結合ドメイン(βHCG6イントロン1に相補的)、30ヌクレオチドのスペーサー領域、分岐点(BP)配列、ポリピリミジントラクト(PPT)、およびジフテリア毒素サブユニットA(DT-A)をコードするエキソンのすぐ上流の3'スプライス部位にAGジヌクレオチドを含む原型トランススプライシングmRNA分子pcPTM+Sp(図1A)を構築した(Uchidaら, 1973, J. Biol. Chem. 248:3838)。その後、DT-Aエキソンをコドン14の翻訳開始部位を除去するように改変した。トランススプライシングを証明するためにPTM構築物は最大活性となるようデザインされていることから、それらは効力のある3'スプライスエレメント(酵母BPおよび哺乳類PPT)(Mooreら, 1993, In The mRNA World, R.F. GestelandおよびJ.F. Atkins編(Cold Spring Harbor, New York:  Cold Spring Harbor Laboratory Press)を含んでいた。βHCG6プレmRNA(Talmadgeら, 1984, Nucleic Acids Res. 12:8415)を、この遺伝子が大部分の腫瘍細胞で発現されることから、モデル標的として選んだ。これは脳下垂体および性腺などいくつかの例外があるが、正常な成体細胞では発現しない(Acevedoら, 1992, Cancer 76:1467; Hoonら, 1996, Int J. Cancer 69:369; Belletら, 1997, Cancer Res. 57:516)。図1Cに示されているように、pcPTM+Spは、βHCG6イントロン1の3'末端を有するその結合ドメインにより、通常のワトソン・クリック塩基対を形成して標的のイントロン3'スプライスシグナルをマスクする。この特徴は標的とPTMの間のトランススプライシングを促進するようにデザインされている。
【００９２】
HeLa核抽出物を確立されたスプライシング手順(Pasman & Garcia-Blanco, 1996, Nucleic Acids Res. 24:1638)とともに用い、PTM構築物がβHCG6プレmRNA標的に侵入することができるかどうかを調べた。in vitroトランススプライシング産物はキメラmRNA分子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRにより検出した。トランススプライシング反応が成功したと推定される産物は、βHCG6の最初のエキソンのすぐ後にDT-AをコードするpcPTM+Spに由来するエキソンを含んでなるキメラmRNAである(図1C)。このようなキメラmRNAはプライマーβHCG-F(βHCG6エキソン1特異的)およびDT-3R(DT-A特異的, 図2Aレーン1〜2)を用い、RT-PCRにより容易に検出された。0時間またはATPの不在下では466bpの産物は見られず、このことはこの反応がATPと時間双方に依存的であったことを示す。
【００９３】
pcPTM+Spの標的結合ドメインはβHCG6イントロン1プレmRNAに相補的な18個のヌクレオチドを含み、効率的なトランススプライシングを示した(図2Aレーン1〜2)。相補的でない18個のヌクレオチドの「非結合ドメイン」を含む非ターゲッティングPTM-Spを用いた場合には、トランススプライシング効率は少なくとも8倍低下した(図2レーン3〜4)。結合ドメインとBPの間にスペーサーを含む、または含まないPTM mRNAのトランススプライシング効率も比較した。この実験から、スペーサーの付加によりトランススプライシング効率が有意に上昇することが証明された(図2Bレーン2+5)。効率的なトランススプライシングに必要なスプライシング因子の補充を容易にするためには、3'スプライス部位と、結合ドメイン／標的相互作用によって生じた二本鎖二次構造の間にスペースがいくらか必要であると思われる。
【００９４】
トランススプライシング特異性におけるPTM長の影響を検討するため、AccIで切断したPTMプラスミドからより短いPTMを合成した(図1参照)。これによりDT-Aコード配列の3'末端から479個のヌクレオチドが除去された。図2Bは非ターゲッティングの短いPTM(-)(レーン14〜17)に比較した場合のターゲッティングの短いPTM(+)(レーン10〜12)のトランススプライシング能力を示している。短いPTM+は他方、非ターゲッティングの短いPTM(図2Bレーン17)よりも実質的により多くのトランススプライシング産物(図2Bレーン12)を産生した。これらの実験から、より長いPTMほどトランススプライシングを非特異的に媒介する能力が高い可能性があることを示す。
【００９５】
6.2.2.  PTMスプライセオソームにより媒介されるトランススプライシングの精度
pcPTM+SpとβHCG6標的との間のトランススプライシングが正確かどうかを確認するため、5' ビオチン化βHCG-Fおよび非ビオチン化DT-3Rプライマーを用いてRT-PCR増幅産物を産生した。この産物を一本鎖DNAに変換し、MitchellおよびMerril(1989, Anal. Biochem. 178:239)の方法を用い、プライマーDT-3R(DT-A特異的リバースプライマー)で直接配列決定した。トランススプライシングは推定されるスプライス部位の間で正確に起こっており(図3)、スプライシングの際、従来のプレmRNAが操作されたPTM構築物の侵入を受けることができ、さらにこの反応が正確なものであることが確認された。
【００９６】
さらに、二重スプライシング PTM(DS-PTM)の選択的トランススプライシングが見られた(図8B)。DS-PTMは3'または5'いずれかのスプライス部位に寄与することでトランススプライシングをもたらしうる。また、3'および5'の両部位で同時に二重トランススプライシングしてエキソン置換を可能とするであろうDS-PTMも構築することができる。図8Bはこの構築物で5'スプライス部位が標的βHCGプレmRNA:DS-PTMが1:1の濃度の際に最も活性があることを示している。 1: 6の比率では3'スプライス部位がより活性がある。
【００９７】
6.2.3.  3'スプライス部位はPTMのトランススプライシングに不可欠である
一般に3'スプライス部位は1)受容部位の5'側に位置するBP配列、2)ピリミジン残基の短い連なりからなるPPT、および3)イントロン-エキソン境界のYAGトリヌクレオチドスプライス部位アクセプターの3つのエレメントを含む(Senapathyら, 1990, Cell 91:875; Mooreら, 1993)。これらの配列エレメントのうちの1つが欠失または変更されるとスプライシングが低下または起こらないことが知られている(Aebiら, 1986; Reed & Maniatis 1988, Genes Dev. 2:1268; Reed, 1989, Genes Dev. 3:2113; Roscignoら, 1993, J. Biol. Chem. 268:11222; Coolidgeら, 1997, Nucleic Acids Res. 25:888)。これらの保存されたエレメントの標的トランススプライシングにおける役割に実験的に取り組んだ。1つの場合[(BP(-)Py(-)AG(-)]は、3つのシスエレメントを全て(BP、PPTおよびAGジヌクレオチド)をランダムな配列で置換した。PPTおよび3'スプライス部位アクセプターが突然変異され、ランダム配列で置換されたもう1つのスプライシング突然変異体[(Py(-)AG(-)]を構築した。in vitroトランススプライシングを支持しうる構築物はなく(図2Aレーン5〜8)、このことは通常のシススプライシングの場合と同様、PTMトランススプライシングプロセスも3'スプライス部位に機能的BP、PPTおよびAGアクセプターを必要とすることを示唆するものである。
【００９８】
6.2.4.  特異性を高めるための「セーフティー」スプライス部位の開発
結合ドメインの包摂またはPTMの短縮によって達成される標的特異性のレベルを改善するため、いくつかのPTM構築物の標的結合ドメインを、3'スプライス部位をマスクする分子内ステムを作り出すよう改変した(「セーフティーPTM」と呼ぶ)。PTM 3'スプライス部位領域またはそれらに隣接する配列と部分的に塩基対合し、それにより標的捕捉の前にPTM 3'スプライス部位に対するスプライセオソーム成分の接近を遮断する結合ドメインの一部によってセーフティーステムが形成される(図4A, PTM+SF)。PTM結合ドメインとβHCG6標的領域の自由な部分間の塩基対合はセーフティーステムを解除し、U2AFなどのスプライシング因子をPTM 3'スプライス部位へ結合させ、トランススプライシングを開始する(図4B)。
【００９９】
この概念をPTM+SF(セーフティー)またはpcPTM+Sp(線状)のいずれか、および標的(βHCG6)および非標的(β-グロビン)プレmRNAの両者を含有するスプライシング反応において試験した。これらのスプライシング産物は次にRT-PCRおよびゲル電気泳動により解析した。βHCG-FおよびDT-3Rプライマーを用いたところ、βHCG標的および線状PTM(pcPTM+Sp, 図5レーン2)またはセーフティーPTM(PTM+SF, 図5レーン8)のいずれかを含む反応において特異的196bpトランススプライシングバンドが示された。線状PTM(図5レーン2)とセーフティーPTM(図5レーン8)の間の標的トランススプライシングの比較により、セーフティーPTMの方が線状PTMよりもトランススプライシングが効率的でなかったことが示された。
【０１００】
非ターゲッティング反応物はβ-グロビン-F(β-グロビンのエキソン1に特異的)および DT-3Rプライマーを用いて増幅した。β-グロビンプレmRNAによる非特異的PTMトランススプライシングによって産生された推定産物は189bpである。非特異的トランススプライシングは線状PTMとβ-グロビンプレmRNAの間のものであることが明らかであった(図5レーン5)。これに対し、非特異的トランススプライシングはセーフティーPTMを用いることで事実上なくなった(図5レーン11)。線状PTMはスプライセオソームにより媒介されるトランススプライシングの概念を証明するために最大活性となるようにデザインされていることから、このことは予期されないことではなった。その効力のある3'スプライス部位と組み合わせた線状PTMの開環構造はスプライシング因子の結合を強く促進する。一度結合すれば、これらのスプライシング因子は、トリパノソーマにおけるトランススプライシングと同様のプロセスでいずれかの5'スプライス部位でトランススプライシングを潜在的に開始することができる。セーフティーステムはU2AFなどのスプライシング因子が標的捕捉の前にPTMに結合するのを防ぐようにデザインされた。この結果は結合ドメインの自由な部分とβHCG6標的の間の塩基対合がセーフティーステムを解除し(mRNA-mRNA相互作用による)、3'スプライス部位のカバーが除かれ、スプライシング因子の補充およびトランススプライシングの開始を可能とするというモデルと一致する。β-グロビンとβHCG6プレmRNAの間ではトランススプライシングは検出されなかった(図5レーン3、6、9および12)。
【０１０１】
6.2.5.  セーフティーPTMおよび変異体のin vitroトランススプライシング
トランススプライシングにおける3'スプライス部位でのシスエレメントの役割をよりよく理解するために、プリンで置換することによりPPTを弱め、かつ／または塩基置換によりBPを改変した一連のセーフティーPTM変異体を構築した(表I参照)。セーフティー(PTM+SF)のin vitroトランススプライシング効率を3つのセーフティー変異体と比較したところ、トランススプライシング能の低下が示された。最も大きな作用は変異体2 (PTM+SFPy2)で見られ、トランススプライシング不能であった(4Cレーン5〜6)。このトランススプライシングの阻害はPPTを弱めたこと、かつ／またはセーフティーステムのTmがより高いことによるものと思われる。これに対し、BP配列中の変異(PTM+SFBP3)はトランススプライシングに著しい作用はなかった(図4Cレーン7〜8)。導入された改変は哺乳類分岐点共通領域YNYURAC(ここでY=ピリミジン、R=プリン、およびN=任意のヌクレオチド)(Mooreら, 1993)内であったことから、このことは驚くことではなかった。この知見は、分岐点配列がスプライシング効率に影響を及ぼすことなく除去できることを示す。PPTの変更(PTM+SF-Pyl)はトランススプライシングレベルを低下させた(レーン3〜4)。同様に、BPとPPTの両者を変更した場合(PTM+SFBP3-Pyl)、トランススプライシングにさらなる低下を引き起こした(図4Cレーン9〜10)。これらのセーフティー変異体のトランススプライシング効率の順は、 PTM+SF>PTM+SFBP3>PTM+SFPy1>PTM+SFBP3-Pyl>PTM+SFPy2である。これらの結果から、PPTおよびBPの双方がin vitroトランススプライシングの効率に重要なものである(Roscignoら, 1993, J. Biol. Chem. 268:11222)ことが確認される。
【０１０２】
6.2.6.  シスおよびトランススプライシング間の競合
PTMの濃度を引き上げることによりプレmRNAシススプライシングが遮断できるかどうかを調べるために、反応をトランススプライシングへ向ける実験を行った。スプライシング反応は一定量のβHCG6プレmRNA標的および種々の濃度のトランススプライシングPTMを用いて行った。シススプライシングは、βHCG-F(エキソン1)およびβHCG-R2(エキソン2)に対するプライマーを用いるRT-PCRによりモニタリングした。これにより、予測された125bpのシススプライシング産物と478bpの非スプライシング産物が増幅された(図6A)。プライマーβHCG-FおよびDT-3Rを用いてトランススプライシング産物を検出した(図6B)。より低いPTM濃度では、シススプライシング(図6Aレーン1〜4)はトランススプライシング(図6Bレーン1〜4)よりも優勢であった。シススプライシングは標的よりも1.5倍高いPTM濃度でおよそ50%低下した。標的濃度3倍までPTM mRNA濃度を高めると、シススプライシングが90%を超えて阻害され(図6Aレーン7〜9)、これに伴いトランススプライシング産物が上昇した(図6Bレーン6〜10)。1回の反応で3つのプライマー(βHCG-F、HCG-R2およびDT-3R)全てを含むことでシスおよびトランス双方のスプライシング産物を同時に増幅させるために競合的RT-PCRを行った。この実験は図6で見られる同様の結果を示し、in vitro条件下でPTMは標的プレmRNAのシススプライシングを効率的に遮断し、それを操作されたトランススプライシングキメラmRNAの産生に置き換えることを示している。
【０１０３】
6.2.7.  組織培養におけるトランススプライシング
細胞培養モデルにおいてトランススプライシング機構を証明するために、ヒト肺癌系H1299(βHCG6陽性)をSP+CRM (非機能的ジフテリア毒素)を発現するベクターまたはベクター単独(pcDNA3.1)でトランスフェクトし、ネオマイシンの存在下で増殖させた。14日後に4つのネオマイシン耐性コロニーを個別に回収し、引き続きネオマイシンの存在下で拡張した。各クローンから全mRNAを単離し、プライマーβHCG-FおよびDT-3Rを用いRT-PCRにより分析した。これにより、選択された4クローンのうち3クローンで推定される196bpのトランススプライシング産物が得られた(図7Aレーン2、3および4)。クローン＃2由来の増幅産物を直接配列決定したところ、PTMにより駆動されるトランススプライシングがヒト細胞において内因的に発現したβHCG6標的エキソン1 とDT-Aの最初のヌクレオチドの推定スプライス部位で正確に起こったことが確認された(図7B)。
【０１０４】
6.2.8.  in vivoモデルにおけるトランススプライシング
トランススプライシングのin vivo機構を証明するために、以下の実験を無胸腺(ヌード)マウスで行った。腫瘍は背側側腹皮下部位に107個のH1299細胞を注射することにより確立した。14日目、PTM発現プラスミドを腫瘍に注射した。次に大部分の腫瘍をエレクトロポレーションに供し、プラスミドの送達を促進した(以下の表2参照)。48時間後、腫瘍を摘出し、ポリ-A mRNAを単離し、RT-PCRにより増幅した。19のPTM処理腫瘍のうち8つでトランススプライシングが検出された。1回目のRT-PCRの後、2サンプルでmRNAから推定されるトランススプライシング産物(466bp)が生じた。続いてネスティッドプライマーセットを用いた2回目のPCR増幅によりさらに6つの腫瘍がトランススプライシング陽性となり、これらは推定196bpの産物を生じた(表2)。各陽性サンプルを配列決定したところ、βHCG6エキソン1は推定スプライス部位でDT-A(野生型またはCRM突然変異体)のコード配列へと正確にトランススプライシングされたことが示された。6つの陽性サンプルは、同時トランスフェクションプラスミドpcPTM+CRMおよびpcHCG6を受容した処理群に由来し、標的プレmRNA濃度を高めた。これはトランススプライシング事象を検出できる確率を高めるために行った。他の2つの陽性腫瘍は、pcPTM+Sp(野生型DT-A)のみを受容した群に由来するものであった。これらの腫瘍はβHCG6発現プラスミドでトランスフェクトされたものではなく、ここで再び、第6.2.7節に記載された組織培養モデルと同様に、PTMと腫瘍細胞によって産生された内因性βHCG6プレmRNAの間でトランススプライシングが起こったことが示された。
【表２】
2005168509.tif 000003
a:  99μsの3パルスセットを6パルス直交印加
b:  10msの4パルスセットを8パルス直交印加
c:  50msの4パルスセットを8パルス直交印加
+:  RT-PCRトランススプライシング産物陽性
1:  エレクトロポレーションを受けず
【０１０５】
7.  実施例：  lacZトランススプライシングモデル
特異的プレmRNA標的とPTMの間の、スプライセオソームにより媒介される標的トランススプライシングの機構の普遍性を証明および評価するために、β-ガラクトシダーゼ酵素の発現に基づく簡単なモデル系を開発した。以下の節では特異的標的とPTMの間の、スプライセオソームにより媒介される標的トランススプライシングの成功を示す結果について記載する。
【０１０６】
7.1.  材料および方法
7.1.1.  プライマー配列
以下のプライマーをlacZモデル系の試験に用いた：
5'Lac-1F
GCATGAATTCGGTACCATGGGGGGGTTCTCATCATCATC
5'Lac-1R
CTGAGGATCCTCTTACCTGTAAACGCCCATACTGAC
3'Lac-1F
GCATGGTAACCCTGCAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGG
3'Lac-1R
CTGAAAGCTTGTTAACTTATTATTTTTGACACCAGACC
3'Lac-Stop
GCATGGTAACCCTGCAGGGCGGCTTCGTCTAATAATGGGACTGGGTG
HCG-In1F
GCATGGATCCTCCGGAGGGCCCCTGGGCACCTTCCAC
HCG-In1R
CTGACTGCAGGGTAACCGGACAAGGACACTGCTTCACC
HCG-Ex2F
GCATGGTAACCCTGCAGGGGCTGCTGCTGTTGCTG
HCG-Ex2R
CTGAAAGCTTGTTAACCAGCTCACCATGGTGGGGCAG
Lac-TR1(ビオチン): 7-GGCTTTCGCTACCTGGAGAGAC
Lac-TR2 GCTGGATGCGGCGTGCGGTCG
HCG-R2: CGGCACCGTGGCCGAAGTGG
【０１０７】
7.1.2.  lacZプレmRNA標的分子の構築
lacZ標的1プレmRNA(pc3.l lacT1)は以下3つのPCR産物：(i)lacZの5'断片、その後(ii)βHCG6イントロン1、および(iii)lacZの3'断片をクローニングすることにより構築した。lacZ遺伝子の5'および3'断片を、以下のプライマー：5'Lac-1Fおよび5'Lac-1R(5'断片用)と3'Lac-1Fおよび3'Lac-1R(3'断片用)を用い、鋳型pcDNA3.1/His/lacZ(Invitrogen, San Diego, CA)からPCR増幅した。増幅されたlacZ 5'断片は1788bpの長さであり、開始コドンを含み、増幅された3'断片は1385bpの長さであり、分岐点、ポリピリミジントラクトおよびβHCG6イントロン1の他、天然型の5'および3'スプライス部位を有する。βHCG6イントロン1は以下のプライマー：HCG-In1FおよびHCG-In1Rを用いてPCR増幅した。
【０１０８】
lacZ標的2は、フレーム内の3'スプライス部位の4コドン後に2つの停止コドン(TAA TAA)を含むこと以外はlacZ標的1と同じバージョンである。これは、以下のプライマー：3'Lac-Stopおよび3'Lac 1Rを用いて3'断片(lacZ)をPCR増幅し、lacZ標的1の機能的3'断片を置き換えることによって作製した。
【０１０９】
7.1.3.  pc3.1 PTM1およびpc3.1 PTM2の構築
プレトランススプライシング分子pc3.1 PTM1は、pPTM+SpをPstIおよびHindIIIで消化し、DT-A毒素をコードするDNA断片をlacZの機能的3'末端をコードするDNA断片で置き換えることによって作製した。この断片は以下のプライマー：3'Lac-1Fおよび3'Lac-1Rを用いてPCR増幅により生成した。細胞培養実験については、HCGイントロン1に対する結合ドメイン、30bpのスペーサー、酵母分岐点(TACTAAC)、および強力なポリピリミジントラクトの後にクローニングされたlacZを含むpc3.1 PTM2のEcoRIおよびHindIII断片をpcDNA3.1へクローニングした。
【０１１０】
プレトランススプライシング分子pc3.1 PTM2は、pPTM+SpをPstIおよびHindIIIで消化し、DT-A毒素をコードするDNA断片をβHCG6エキソン2で置き換えることによって作製した。βHCG6エキソン2は以下のプライマー：HCG-Ex2FおよびHCG-Ex2Rを用いるPCR増幅により生成した。細胞培養実験については、HCGイントロン1に対する結合ドメイン、30bpのスペーサー、酵母分岐点(TACTAAC)、および強力なポリピリミジントラクトの後にクローニングされたβHCG6エキソン2を含むpc3.1 PTM2のEcoRIおよびHindIII断片を用いた。
【０１１１】
7.1.4.  293T細胞へのlacZスプライス標的プレmRNAとPTMの同時トランスフェクション
ヒト胚性腎細胞(293T)を37℃、5%CO2下、10%FBSを補足したDMEM培地で増殖させた。製造業者の説明書に従い、リポフェクタミンプラス(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を用い、pc3.1 LacT1とpc3.1 PTM2、またはpc3.1 LacT2とpc3.1 PTM1で細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、標的およびPTM分子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行った。また、β-gal染色キット(Invitrogen, San Diego. CA)を用いて細胞を染色することによりβ-ガラクトシダーゼ活性をモニタリングした。
【０１１２】
7.2.  結果
7.2.1.  lacZスプライス標的は機能的β-ガラクトシダーゼを産生するために効率的にシススプライシングする
スプライス標的プレmRNAの効率的シススプライス能を調べるため、リポフェクタミンプラス(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を用い、pc3.1 lacT1を293T細胞へトランスフェクトした後、全RNAのRT-PCR解析を行った。シススプライシングRT-PCR産物の配列解析により、スプライシングが正確であり、かつ、推定されるスプライス部位で正確に起こったことが示された(図12B)。さらに、標的プレmRNA分子の正確なシススプライシングの結果、β-ガラクトシダーゼの加水分解を触媒する活性型β-ガラクトシダーゼ、すなわち、X-galをコードしうるmRNAが形成され、顕微鏡下で視認できる青色を呈する。標的プレmRNAの正確なシススプライシングはβ-ガラクトシダーゼの酵素活性が検出できることでさらに確認された。
【０１１３】
機能的3'lacZ断片(PTM1)のトランススプライシングによる欠陥型lacZ標的2プレmRNAの修復は、β-ガラクトシダーゼの酵素活性を染色することで測定した。この目的で、293T細胞をlacZ 標的2プレmRNA(欠陥型3'断片を含む)およびPTM1(正常3'lacZ配列を含む)で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後にβ-ガラクトシダーゼ酵素活性に関して細胞をアッセイした。PTM1の、lacZ標的2プレmRNAへの効率的なトランススプライシングの結果、機能的β-ガラクトシダーゼ活性が生じるだろう。図11B〜Eで示されているように、PTM1のlacZ標的2へのトランススプライシングの結果、β-ガラクトシダーゼ酵素活性が対照の5%〜10%まで回復する。
【０１１４】
7.2.2.  lacZ標的プレmRNAとPTM2の間の標的トランススプライシング
トランススプライシングをアッセイするため、lacZ標的プレmRNAとPTM2を293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、全RNAをRT-PCRを用いて分析した。以下のプライマーをPCR反応に用いた：lacZ-TR1(lacZ 5'エキソン特異的)およびHCGR2(βHCGRエキソン2特異的)。このRT PCR反応は推定される195bpのトランススプライシング産物を産生したが(図11レーン2および3)、これはlacZ標的プレmRNAとPTM2の間の効率的なトランススプライシングを示すものである。レーン1はPTM2を含まない対照を示す。
【０１１５】
また、トランススプライシングの効率はβ-ガラクトシダーゼ酵素活性を染色することにより測定した。トランススプライシングをアッセイするため、293T細胞をlacZ標的プレmRNAおよびPTM2で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に細胞をβ-ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。標的プレmRNAとPTMの間に効率的なトランススプライシングが存在すれば、lacZ標的プレmRNAの5'断片からなるキメラmRNAが生じ、活性型のβ-ガラクトシダーゼをコードすることができないβHCG6エキソン2が形成される。これらの同時トランスフェクション実験の結果から、PTM2の、lacZ標的1へのトランススプライシングの結果、対照に比べてβ-ガラクトシダーゼ活性が低下したことが示された。
【０１１６】
lacZ標的プレmRNAとPTM2の間のトランススプライシングが正確であることをさらに確認するために、5'ビオチン化lacZ-TR1および非ビオチン化HCGR2プライマーを用いてRT-PCRを行った。一本鎖DNAを単離し、HCGR2プライマー(HCGエキソン2特異的プライマー)を用いて直接配列決定を行った。スプライシング部位の配列によって明らかなように、トランススプライシングは推定されるスプライス部位の間で正確に起こっており(図12Aおよび12B)、スプライシングの際に通常のプレmRNAに操作されたPTMが侵入でき、さらにこの反応が正確であることが確認された。
【０１１７】
8.  実施例：  嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質遺伝子のコレクション
嚢胞性繊維症(CF)は世界でも最も一般的な遺伝病の1つである。CFに関連する遺伝子が単離され、そのタンパク質産物が推定されている(Kerem, B.S.ら, 1989, Science 245:1073-1080; Riordanら, 1989, Science 245:1066-1073; Rommansら, 1989, Science 245:1059-1065)。CF関連遺伝子のタンパク質産物は嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節タンパク質(CFTR)と呼ばれている。全ての突然変異体対立遺伝子の約70%を占める最も一般的な病因突然変異は508番のフェニルアラニンをコードするエキソン10の3つのヌクレオチドの欠失である(ΔF508)。以下の節ではスプライセオソームにより媒介されるトランススプライシングを用いた嚢胞性繊維症遺伝子の修復の成功について記載し、モデル系でCFTR修復の実現可能性を示す。
【０１１８】
8.1.  材料および方法
8.1.1.  プレトランススプライシング分子
CFTRプレトランススプライシング分子(PTM)はCFTRイントロン9(3'末端、-13〜-31)に相補的な23個のヌクレオチドの結合ドメイン、30個のヌクレオチドのスペーサー領域(スプライセオソーム成分の効率的な結合を可能とする)、分岐点(BP)配列、ポリピリミジントラクト(PPT)およびCFTRエキソン10(F508を含む野生型配列)をコードする配列のすぐ上流にある3'スプライス部位のAGジヌクレオチドからなる。この最初のPTMはトランススプライシングを証明するために最大活性となるようにデザインされていることから、従ってPTMはUACUAAC酵母共通BP配列と延長PPTを含んでいた。内因性CFTRではなくトランススプライシング産物の特異的増幅および単離を可能とするため、野生型エキソン10コード配列の後に18個のヌクレオチドのHISタグ(6ヒスタミンコドン)を含んだ。この2つの断片の生成に用いたオリゴヌクレオチドは、増幅されたDNAの哺乳類発現ベクターpcDNA3.1への指向性クローニングを容易にする特有の制限部位を含んでいた(それぞれApalとPstI、およびPstIとNotI)。
【０１１９】
8.1.2.  標的CFTRプレmRNAミニ遺伝子
CFTRミニ遺伝子標的は図13に示され、CFTRエキソン9、イントロン9の機能的5'および3'領域(それぞれ各末端から260および265ヌクレオチド)、エキソン10[ΔF508]、およびイントロン10の5'領域(96ヌクレオチド)からなる。さらに図16に示されているように、CFTRエキソン1〜9および10〜24を含むミニ標的遺伝子を用いて嚢胞性繊維症突然変異のコレクションに対するスプライセオソームにより媒介されるトランススプライシングの使用を試験できる。図 17は嚢胞性繊維症突然変異のコレクションに対しても用いることができる二重スプライシングPTMを示す。示されているように、二重スプライシングPTMはCFTR BDイントロン9、スペーサー、分岐点、ポリピリミジントラクト、3'スプライス部位、CFTRエキソン10、スペーサー、分岐点、ポリピリミジントラクト、5'スプライス部位およびCFTR BDエキソン10を含む。
【０１２０】
8.1.3.  オリゴヌクレオチド
以下のオリゴヌクレオチドを用いてCFTR PTMを作製した：
2005168509.tif 000004
【０１２１】
以下のヌクレオチドを用いてCFTR標的プレmRNAミニ遺伝子(エキソン9 +ミニイントロン9+エキソン10+5'末端イントロン10)を作製した：
2005168509.tif 000005
【０１２２】
以下のオリゴヌクレオチドを用いてトランススプライシング産物を検出した：
2005168509.tif 000006
【０１２３】
8.2.  結果
PTMおよび標的プレmRNAをリポフェクタミン(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を用いて293胚性腎細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収し、RNAを単離した。RT-PCR反応でPTMおよび標的特異的プライマーを用い、標的プレmRNAの突然変異体エキソン10がPTMの野生型エキソン10で置換されたトランススプライシング産物を検出した(図14)。トランススプライシング産物の配列解析から、3つのヌクレオチド欠失が回復し、そのスプライシングが正確であり、推定されるスプライス部位で起こっている(図15)ことが確認され、嚢胞性繊維症遺伝子CFTRのはじめてのRNA修復が示された(Mansfieldら, 2000, Gene Therapy 7:  1885-1895)。
【０１２４】
9.  実施例：  二重トランススプライシング
以下の実施例は標的プレmRNAと、3'および5'両スプライス部位を含むPTM RNAの間の二重トランススプライシングにより内部エキソンが正確に置換され、機能上活性な全長タンパク質の産生が導かれることを示すものである。
【０１２５】
本明細書に記載のように、いずれのプレmRNAでも、3'-スプライス部位、5'-スプライス部位の一方または双方を含むトランス反応RNA分子を提供することで再プログラムすることができる。以下の実施例では、5'および3'両スプライス部位を含むプレトランススプライシング分子(PTM)を用いた単一の内部エキソンのターゲッティングおよび置換の成功を記載する。このようなPTMはスプライセオソームにより媒介される意図した標的遺伝子との2つのトランススプライシング反応を促進することができる。この機構を試験するため、 lacZ 5'「エキソン」-CFTR ミニイントロン9-CFTRエキソン10(ΔF508)-CFTRミニイントロン10、続いてlacZ 3'「エキソン」からなるスプライシングlacZモデル標的遺伝子を作製した。この標的転写物では、β-ガラクトシダーゼORFの124bp中央部がCFTRのエキソン10(ΔF508)に置換されていたことから、従ってそれは非機能的タンパク質を産生する。124bp lacZ「ミニエキソン」の欠失、ならびに標的イントロンおよびエキソンに相補的な結合ドメイン(BD)を含む5'および3'トランススプライシングドメインからなるPTMを作製した。HEK 293T細胞を標的単独またはPTM単独のいずれかでトランスフェクトしたところ、検出可能なレベルのβ-gal活性は見られなかった。これに対し、標的+PTMでトランスフェクトした293T細胞は実質的レベルのβ-gal活性を生じ、タンパク質機能の回復を示した。標的とPTMの間のトランススプライシングの精度は、推定内部エキソン置換が明らかとなった適当なRT-PCR産物を配列決定することで確認した。疾病モデルでこのアプローチの実現可能性を、嚢胞性繊維症において CFTR ΔF508エキソン10を、F508を含む正常なエキソン10で置換することにより調べた。これらの結果は、トランススプライシング技術が、それらが遺伝子の5'エキソンまたは3'エキソンに関するものであれ、またはいずれかの内部エキソンに関するものであれ、遺伝子欠陥の多くを修正するよう容易に適合させることができることを示す。
【０１２６】
図18はlacZ 5'エキソン-CFTRミニイントロン9-CFTRエキソン10(Δ508)-CFTRミニイントロン10、続いてlacZ 3'エキソンからなるモデルlacZ標的の模式図である。この標的では、lacZ遺伝子の124bp中央部分を、508番に突然変異を有する(Δ508)CFTRエキソン10で置換されている。このプレmRNA標的は通常のシススプライシングを受けて、lacZ 5'エキソン-CFTRエキソン10(Δ508)、続いてlacZ 3'エキソンかならるmRNAを産生する。β-ガラクトシダーゼORFが破壊されているため、これは機能のない末端切断型タンパク質を産生する。
【０１２７】
二重トランススプライシングによりβ-gal機能を回復させるため、図19に示されるように、124bp lacZ「ミニエキソン」の欠失、ならびに標的イントロンおよびエキソンに相補的な結合ドメインを含む5'および3'トランススプライシングドメインからなる3つのPTMを作製した。これらのPTMは、3'エキソン置換で用いるPTM24(下記参照)由来の120bpの3'結合ドメイン(イントロン9に相補的)、スペーサー配列、酵母分岐点、ポリピリミジントラクト、3'アクセプターAGジヌクレオチド、lacZ「ミニエキソン」、5'スプライス部位、スペーサー配列、続いて5'結合ドメインを有する。これらのPTMは5'結合ドメイン配列のみが異なる。DSPTM5はイントロン10に相補的で、標的の5'スプライス部位だけを遮断する27bpのBDを有する。DSPTM6は120bpの5'BDを有し、標的の5'および3'両スプライス部位にわたり、一方DSPTM7は両スプライス部位(5'および3')をマスクし、また標的のエキソン全体にわたる260bpのBDを有する。
【０１２８】
DSPTM7とDSCFT1.6標的プレmRNAとの結合を示す二重トランススプライシング反応の模式図は図20に示されている。3'BDはミニイントロン9に相補的な120bpの結合ドメイン；5'BD(260bp)はミニイントロン10およびエキソン10に相補的な第2の結合ドメイン；ssはスプライス部位；BPは分岐点；およびPPTはポリピリミジントラクト。
【０１２９】
DSPTM7の重要な構造要素(図21)は以下の通りである：
2005168509.tif 000007
【０１３０】
β-gal機能の回復がRNAトランススプライシング媒介性のものかどうかを決定するため、突然変異体を図22に示す。DSPTM8は、BPなどの3'スプライスエレメント、ポリピリミジントラクトおよび3'アクセプターAGジヌクレオチドが欠失され、ランダムな配列に置き換えられた3'スプライス突然変異体である。このPTMはなお3'および5'結合ドメインならびに機能的5'スプライス部位を有している。PTM29は第2の結合ドメインおよび5'ssを欠くが、なお 3'結合ドメイン3'スプライス部位を有し、一方、PTM30は第1の結合ドメインおよび3'スプライス部位を欠くが、機能的5'スプライス部位および第2の結合ドメインを有している。
【０１３１】
二重トランススプライシングにより媒介されるβ-gal機能の回復を調べるため、リポフェクタミンプラス試薬を用い、293T細胞を2μgの標的またはPTM単独でトランスフェクトするか、あるいは2μgの標的および1.5μgのPTMで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、全RNAを単離し、K1-1FおよびLac-6Rプライマーを用いRT-PCRにより解析した。これらのプライマーは一回の反応でシスおよびトランスの両スプライシング産物を増幅し、これらは大きさに基づいて同定した。シススプライシング産物の大きさは295bpであり、一方トランススプライシング産物の大きさは230bpである。DSPTM7とDSCFT1.6プレmRNAの間のトランススプライシングが正確であることを確認するため、RT-PCR増幅産物を切り出し、K1-2FおよびLac-6Rプライマーを用いて再増幅し、K1-2FまたはLac-6Rプライマーを用いて直接配列決定した。図23に示されているように、トランススプライシングは推定スプライス部位で正確に起こっており、2つのトランススプライシング事象による正確な内部エキソン置換が確認された。
【０１３２】
欠陥型lacZプレmRNAの二重トランススプライシング事象による修復とそれに続く全長β-galタンパク質の産生は同時トランスフェクションアッセイで検討した。293T細胞をDSCFT1.6標的およびDSPTM7発現プラスミドで同時トランスフェクトすると同時に対照としてDSCFT1.6標的またはDSPTM7単独でトランスフェクトした。ポリクローナル抗β-ガラクトシダーゼ抗血清を用いた全細胞溶解物のウエスタンブロット解析はDSCFT1.6標的+DSPTM7プラスミドで同時トランスフェクトした細胞でのみ約120kDaのタンパク質を特異的に認識したが(図24レーン3および4)、DSCFT1.6標的(レーン1)またはDSPTM7プラスミド単独(レーン2)でトラスフェクトした細胞では認識しなかった。同様に、DSCFT1.6標的+3'スプライス突然変異体(レーン5および6)、または3'トランススプライシングドメインもしくは5'トランススプライシングドメインが欠失されたPTM29もしくは30(レーン7)で同時トランスフェクトした細胞では全長タンパク質は検出されなかった。さらに、120kDaのタンパク質バンドはlacZ-T1プラスミドを用いて産生された機能的全長β-galと同時に移動した(陽性対照、データは示されていない)。これらの結果は標的とPTMの間の二重トランススプライシングによる全長タンパク質の産生を確認するだけでなく、このプロセスには3'スプライス部位および5'スプライス部位の双方が不可欠であることを示した。
【０１３３】
標的プレmRNAとDSPTM7 RNAの間の二重トランススプライシングにより産生された全長タンパク質が機能的に活性であるかどうかを決定するため、293T細胞をDSCFT1.6ターゲッティング+二重スプライシングPTM5、6または7発現プラスミドの1つで同時トランスフェクトするか、またはDSCFT1.6標的もしくはDSPTM7単独でトランスフェクトした。全細胞抽出液を調製し、ONPGアッセイ(Invitrogen)を用いてβ-gal活性に関してアッセイした。DSCFT1.6標的またはDSPTM7のいずれか単独でトランスフェクトした細胞から調製した抽出液におけるβ-gal活性はモック(mock)トランスフェクションで検出されたバックグラウンドレベルとほぼ同じであった(図25)。これに対し、DSCFT1.6標的およびDSPTM7で同時トランスフェクトした293T細胞はバックグラウンドの約21倍高いレベルのβ-gal活性を生じた(図25)。これらの結果により、標的プレmRNAとPTM RNAの間の正確な二重トランススプライシングと機能的全長タンパク質の産生が確認された。
【０１３４】
二重トランススプライシング反応によるβ-gal活性の回復がPTMの3'および5'両スプライス部位の存在に絶対的に依存するものであることを確認するため、本発明者らはいくつかの突然変異体を構築した：(a)DSPTMBは機能的3'スプライスエレメント(分岐点、ポリピリミジントラクトおよび3'アクセプターAGジヌクレオチド)が欠失され、ランダムな配列で置換されていたこと以外はDSPTM7に同じである(詳細は図22を参照)；(b)PTM29は5'スプライス部位ならびに5'結合ドメインを欠くが、3'結合ドメインおよび3'スプライス部位を有する；および(c)PTM30は3'結合ドメインおよび3'スプライス部位を欠くが、5'スプライス部位および5'結合ドメインを有する。DSCFT1.6標的またはDSPTM7のいずれか単独でトランスフェクトした細胞から調製した抽出液におけるβ-gal活性はモックトランスフェクションで検出されたバックグラウンドレベルとほとんど同じあった(図26)。同様に、DSPTM8単独(3'スプライス部位突然変異体)でトランスフェクトした細胞またはDSCFT1.6標的+上記突然変異体PTMの1つでの同時トランスフェクションではβ-gal活性の有意な上昇は検出されなかった。他方、機能的3'および5'スプライス部位を有するDSCFT1.6標的およびDSPTM7で同時トランスフェクトした細胞はバックグラウンドを超える実質的なレベルのβ-gal活性を生じた(図26)。これらの結果によって二重スプライシングPTMには両スプライス部位が必要であることが確認され、また、β-gal活性の回復が末端切断型タンパク質間の相補性によるものであったという可能性が排除された(図26)。
【０１３５】
種々の濃度の標的およびPTMを同時トランスフェクトしβ-gal活性の回復に関してアッセイした。予測されたように、DSCFT1.6標的+DSPTM7で同時トランスフェクトした293T細胞は対照を超える実質的なレベルのβ-gal活性(約30倍)を示した。PTM濃度を2および3倍引き上げると、 β-gal活性レベルは上昇するが、有意なものではなかった(図27)。これらの結果によって、二重トランススプライシングにより媒介されるβ-gal酵素機能の回復がさらに確認された。
【０１３６】
二重トランススプライシング反応の特異性は、特異的標的(DSCFT1.6)に類似するが、CFTRミニイントロン9-CFTRエキソン10(Δ508)およびCFTRミニイントロン10の代わりにβHCGイントロン1-βHCGエキソン2およびβHCGイントロン2を有する非特異的標的(DSHCGT1.1)を構築することにより調べた(図28)。DSHCGT1.1(非特異的標的)単独またはDSPTM7(DSCFT1.6標的にターゲッティングされている)と組み合わせてトランスフェクトした細胞から単離した全RNAの RT-PCR解析では、予測された314bpの二重トランススプライシング産物を生じなかった。他方、特異的標的+PTMで同時トランスフェクトした細胞から調製した全RNAのRT-PCR解析では予測された314bpの産物が生じた。このことはさらに全細胞抽出液のβ-gal活性アッセイによっても確認された。非特異的標的単独またはDSCFT1.6標的にターゲッティングされたDSPTM7と組み合わせてトランスフェクトした細胞で検出されるβ-gal活性レベルはバックグラウンドレベルとほとんど同じであった。これに対し、特異的標的(DSCFT1.6)+DSPTM7で同時トランスフェクトした細胞では実質的なレベルのβ-gal活性が検出された(図27)。これらの結果によって、二重トランススプライシングが高度に特異的であることが確認された。
【０１３７】
図30の修復モデルは、エキソン1〜9、ミニイントロン9、Δ508突然変異を含むエキソン10、ミニイントロン10およびエキソン11〜24からなる標的CFTRプレmRNAの部分を示す(図30)。図で示されるPTMはエキソン10コード配列(コドン508を含む)、および各々その固有のスプライシングエレメント(受容部位および供与部位、分岐点およびピリミジントラクト)およびイントロン9スプライス部位に相補的な結合ドメインを有する2つのトランススプライシングドメイン、エキソン10の部分(5'および3'末端)およびイントロン10 5'スプライス部位からなる(図31(DS-CF1))。PTMのエキソン10も、PTMのエキソン10と、その固有の、またエキソン配列に相補的な結合ドメインを有するPTMのためでもある結合ドメインとの間のアンチセンス作用を軽減するに至る改変されたコドン利用も有する(図31)。PTMと標的の間の二重トランススプライシング事象は修復された全長mRNAを生じるはずである。
【０１３８】
図32はPTM20エキソン10へと正確にスプライシングされた標的エキソン9(改変コドンを有する)(上のパネル)、PTMのエキソン10のコドン508(中央のパネル)、および標的エキソン11へと正確にスプライシングされたPTMエキソン10(下のパネル)を示す単一のPCR産物の配列を示す。修復された標的の配列はRT-PCRの後にPCRを行うことで生成した。
【０１３９】
10.  実施例：  5'エキソン置換を遂行しうるPTMを用いた嚢胞性繊維症遺伝子のトランススプライシング修復
遺伝子修復に5'エキソン置換を用いる重要な利点は、
(a)遺伝子の5'部分の置換が可能となること、
(b)その構築物が全長遺伝子構築物よりも小さな配列およびスペースしか必要としないこと、
(c)PTM翻訳を妨げると考えられるポリAシグナルを欠いたPTMが産生できること、および
(d)翻訳を増強するために5'末端を改変できること
である。
【０１４０】
10.1.  材料および方法
10.1.1.  プラスミドの構築
PTM30のCFTRコード配列(エキソン1〜10)は、部分cDNAプラスミド鋳型(61160; American Type Culture Collection, Manassas, VA)を用いてPCRにより生成した。トランススプライシングドメイン(TSD)[結合ドメイン、スペーサー配列、ポリピリミジントラクト(PPT)、分岐点(BP)および3'スプライス部位を含む] は、PCR産物(既存のプラスミド鋳型を使用)からオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより生成した。次に種々の断片(TSDおよびコード配列)を適当な制限部位を用いてpcDNA3.1(-)へクローニングした。オリゴデオキシヌクレオチドプライマーはSigma Genosys (The Woodlands, TX)から入手した。PCR産物は全てREDTaq (Sigma, St. Louis, MO)またはクローニングPfu(Stratagene, La Jolla, CA)DNAポリメラーゼのいずれかを用いて生成した。増幅のためのPCRプライマーは指向性クローニングのための制限部位を含んだ。PCR産物を適当な制限酵素で消化し、哺乳類発現プラスミドpc3.1DNA(-)(Invitrogen, Carlsbad, CA)へクローニングした。
【０１４１】
10.2.  細胞培養およびトランスフェクション
リポフェクタミンプラス(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を用い、構築物をヒト胚性腎(HEK)293Tまたは293細胞(1.25 x 106細胞／60mmポリ-d-リジンコーティングディッシュ)に同時トランスフェクトし、トランスフェクションの開始から48時間後に細胞を回収した。製造業者の説明書(Epicenter Technologies, Inc.)に記載のようにして全RNAを単離した。HEK 293T細胞を10%v/vウシ胎児血清(Hyclone, Inc., Logan, UT)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(Life Technologies)で増殖させた。細胞は全て37℃、5% CO2下の加湿インキュベーターで維持した。
【０１４２】
10.1.3.  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(TR-PCR)
RT-PCRはEZ-RT-PCRキット(Perkin-Elmer, Foster, CA)を用いて行った。各反応物には反応量40μl中に0.03〜1.0μgの全RNAおよび80ngの5'および3'特異的プライマーを含んだ。RT-PCR産物は2% Seakenアガロースゲルで電気泳動に付した。トランススプライシング産物を生成するのに用いたPTM特異的および標的特異的オリゴヌクレオチドはそれぞれ、5'-CGCTGGAAAAACGAGCTTGTTG-3' (プライマーCF93)および5'-ACTCAGTGTGATTCCACCTTCTC-3' (プライマーCF111)である。シススプライシング産物を生成するのに用いたPTM特異的および標的特異的オリゴヌクレオチドはCF1およびCF93であった。オリゴヌクレオチドCF1の配列は、5'-GACCTCTGCAGACTTCACTTCTAATGATGATTATGG-3'である。
【０１４３】
図33の修復モデルは、エキソン1〜9、ミニイントロン9、Δ508突然変異を含むエキソン10、ミニイントロン10およびエキソン11〜24からなる標的CFTR プレmRNA部分を示す(図33)。図に示されているPTMはエキソン1〜10コード配列(コドン508を含む)、ならびにその固有のスプライシングエレメント(供与部位、分岐点およびピリミジントラクト)および結合ドメインを有するトランススプライシングドメインからなる。種々の結合ドメインを有するいくつかのPTMを構築した。3つの例を図34に示している。図34Aでは、結合ドメインはイントロン9のスプライス部位およびエキソン10の一部に相補的である(3'末端; CF-PTM11)。図34Bでは、PTMはエキソン10の5'末端およびイントロン9の3'スプライス部位にもわたる延長結合ドメインを有する(CF-PTM20)。最後の例(図34C)では、結合ドメインは、結合ドメインがエキソン10の全長に及んでいること以外はパネルBで示されたものと同じである(CF-PTM30)。最後の場合では、PTMエキソン10は、その固有の結合ドメインによるアンチセンス作用を軽減するために改変されたコドン利用を有する(図34)。結合ドメインのさらなる例は図35に示されている。
【０１４４】
図36はシスおよびトランススプライシング産物の配列を示している。図36Aの上のパネルはその3つのヌクレオチド(CTT)が欠失した標的エキソン10を示し、一方下のパネルはともに正確にスプライシングされた標的のエキソン10および11を示す。図36Bは1つのPCR産物の部分配列であり、PTMのエキソン10における改変コドン(上のパネル)、PTMのエキソン10のコドン508(中央のパネル)、および標的エキソン11へと正確にスプライシングされたPTMエキソン10(下のパネル)を示し、これはトランススプライシングが正確であることを示す。修復された標的の配列はRT-PCR、その後にPCRを行うことにより生成した。
【０１４５】
11.  実施例:  長い結合ドメイン(不連続であってもよい)を有するPTMはトランススプライシング効率および特異性を増大させる
11.1.  材料および方法
11.1.1.  細胞培養
ヒト胚性腎細胞(293または293T)はthe University of North Carolina tissue culture facility at Chapel Hill (Chapel Hill, NC)に由来した。細胞は37℃、5% CO2の加湿インキュベーターにて、10%v/vウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(Life Technologies, Bethesda, MD)に維持した。0.5%トリプシンを用いて2〜3日毎に細胞を継代し、所望の密度で再プレーティングした。内因性の突然変異体lacZプレmRNA(lacZCF9)を発現する安定した細胞を0.5mg/ml G418(Calbiochem, San Diego, CA)の存在下で維持した。
【０１４６】
11.1.2.  組換えプラスミド
標的：  pc3.1lacZCF9、pc3.1lacZCF9m、およびpc3.1lacZHCG1m。pc3.1lacZCF9は通常のlacZプレmRNAをコードしており、5'エキソンとしてlacZコード配列であるヌクレオチド1〜1788、CFTRミニイントロン9、それに続くlacZコード配列であるヌクレオチド1789〜3174を3'エキソンとして用いて構築された。これは、lacZ 3'エキソンにおける停止コドンを含まず、βHCG6イントロン1の代わりにCFTRミニイントロン9を有すること以外はpc3.1lacZ-T2と同様のものである(図37A)。CFTRミニイントロン9は鋳型としてのプラスミドT5およびプライマーCFIN-9F(5'-CTAGGATCCCGTTCTTTTGTTCTTCACT ATTAA)とCFIN-9R(5'-CTAGGGTTACCGAAGTAAAACCATACTTATTAG、下線は制限部位)を用いてPCR増幅し、BamHIおよびBstEIIで消化し、pc3.1lacZ-T2プラスミドのBHCG6イントロン1の代わりにクローニングした。pc3.1lacZCF9mは欠陥型のlacZプレmRNAを発現するが、3'エキソン内に2つのナンセンスコドンをイン・フレームで含むこと以外はpc3.1lacZCF9と同一である(図37A)。pc3.1lacZHCG1mはキメラ標的であり、lacZ 5'エキソン、それに続くβHCG6のイントロン1およびエキソン2を含む。これは変異型lacZ 3'エキソンの代わりにβHCG6のエキソン2を含むこと以外はpc3.1lacZCF9mと同様のものである。βHCG6エキソン2は、鋳型DNAとしてのβHCG6プラスミド(アクセッション番号X00266)およびプライマーHCGEx-2F(5'-GCATGGTTACCCTGCAGGGGCTGCTGCTGTTGCTG)とHCGEx-2R(5'-CTGAAAGCTTGTTAACCAGCTCACCATGGTGGGGCAG、下線は制限部位)を用いてPCR増幅し、BstEIIおよびHindIIIで消化し、pc3.1lacZCF9mのlacZ 3'エキソンに代えるようにクローニングした。プラスミドpcDNA3.l/HisB/lacZ(Invitrogen, Carlsbad, CA)をDNA鋳型として用いて5'および3' lacZエキソンを作製した。lacZ 5'エキソンは1788bpの長さであり、ATG開始コドンを有し、lacZ 3'エキソン(停止コドンを含まない)は1385bpの長さであり、3'エキソンの末端に転写終結シグナルを有する。CFTRミニイントロン9およびβHCG6イントロン1はそれぞれ548bpおよび352bpの大きさであり、両者とも5'および3'スプライスシグナルを有する。βHCG6のエキソン2は162bpの長さであり、エキソンの末端に転写終結シグナルを有する。
【０１４７】
プレトランススプライシング分子(PTM)：  PTM-CF14はトランススプライシングドメインのマイナーな改変を有する、pcPTM1と同様の形態のものである(図37B)。PTM-CF14は線状形態であり、CFTRミニイントロン9に相補的な23bpのアンチセンス結合ドメイン(BD)(5'-ACCCATCATTATTAGGTCATTAT)、18bpのスペーサー、標準的な分岐点配列(UACUAAC; BP)および延長されたポリピリミジントラクト(PPT)、それに続き通常のlacZ 3'エキソンを含む。PTM-CF22、PTM-CF24、PTM-CF26およびPTM-CF27はBDの長さが異なること以外はPTM-CF14と同一である(図37B)。sPTM-CF18は32bpのBDを有し、またsPTM-CF22およびsPTM-CF24はそれぞれPTM-CF22およびPTM-CF24と同じBDを含む。これらのPTMでは、PTMの3’スプライス部位をマスクするために分子内ステムループ構造(「セーフティー」)を作り出すように結合ドメインを改変した。種々の結合ドメインは、特異的プライマー(唯一のNheIおよびSacII部位を含む)および鋳型としてCFTRミニイントロン9を含むプラスミドを用いるPCR増幅によって作製した。PCR産物はNhe IおよびSac IIで消化し、そしてそれを、スペーサー配列、3'スプライスエレメント(BP、PPTおよびアクセプターAGジヌクレオチド)、それに続く通常のlacZ 3'エキソンからなるPTMプラスミド中へクローニングした。
【０１４８】
11.1.3.  プラスミドDNAの293T細胞へのトランスフェクション
トランスフェクション前日に1 x 106 個の293T細胞を、細胞の接着を高めるためにポリ-D-リジンでコーティングした60mmプレート(Sigma, St. Louis, MO)にプレーティングし、37℃で24時間増殖させた。標準的なプロトコールに従い、リポフェクタミンプラス試薬(Life Technologies, Bethesda, MD)を用い、細胞を発現プラスミドでトランスフェクトした。典型的な同時トランスフェクションでは、2μgのpc3.1lacZCF9m標的および1.5μg のPTM発現プラスミドを細胞中にトランスフェクトし、また対照(標的およびPTM単独トランスフェクション)としてはpcDNA3.1ベクターを用い、全DNA濃度を3.5μgに標準化した。
【０１４９】
トランスフェクションの48時間後、プレートをPBSですすぎ、細胞を回収し、マスターピュア(Master Pure) RNA/DNA精製キット(Epicenter Technologies, Madison, WI)を用いて全RNAまたは全DNAを単離した。RNA調製物中の夾雑DNAはDNアーゼIで処理することによって除去し、一方、DNA調製物中の夾雑RNAは37℃で30〜45分間RNアーゼAで消化することによって除去した。
【０１５０】
11.1.4.  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)
EZrTth RNA PCRキット(Perkins-Elmer, Foster City, CA)を用い、製造業者が示したようにしてRT-PCRを行った。典型的な反応(50μl)には25〜500ngの全RNA、100ngの5'標的特異的プライマー(シスおよびトランススプライシング産物に共通)(Las-9F, 5'-GATCAAATCTGTCGATCCTTCC)および100ngの3'プライマー(Las-3R, 5'-CTGATCCACCCAGTCCCATTA、シススプライシングのための標的特異的プライマー；およびLac-5R、5'-GACTGATCCACCCAGTCCCAGA、トランススプライシングのためのPTM特異的プライマー)、1×逆転写バッファー(100mM Tris-HCl, pH8.3, 1 mM MnC12を含む900mM KCL)、200μM dNTPsおよび10単位のrTth DNAポリメラーゼを含めた。RT反応では、60℃にて45分の後、94℃にて30秒の予熱、次いで94℃にて18秒と60℃にて1分のアニーリングおよび伸長とのPCR増幅25〜35サイクル、その後70℃にて7分の最終伸長を行った。反応生成物はアガロースゲル電気泳動によって解析した。
【０１５１】
11.1.5.  タンパク質の調製およびβgalアッセイ
発現プラスミドでトランスフェクトした細胞から、凍結解凍法にて全細胞タンパク質を単離し、β-galアッセイキット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてβ-ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイ試薬(BIO-RAD, Hercules, CA)を用いた色素結合アッセイによって測定した。
【０１５２】
11.1.6.  ウエスタンブロット
約5〜25μgの全タンパク質を7.5% SDS-PAGEゲル上で電気泳動に付し、さらにPVDF-P膜(Millipore)へエレクトロブロッティングした。室温で1時間ブロッキングした後(ブロッキングバッファー：1×PBS中、5%のドライミルクおよび0.1%のTween-20)、そのブロットを室温で1時間、ポリクローナルウサギ抗β-ガラクトシダーゼ抗体(Research Diagnostics Inc., NJ)の1:2500希釈液とともにインキュベートし、ブロッキングバッファーで３回洗浄し、次に、1:5000希釈の抗ウサギHRPコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした。室温で1時間インキュベートした後、ブロッキングバッファー中で３回洗浄し、ECL PLusウェスタンブロッティング試薬(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用いて呈色させた。
【０１５３】
11.1.7.  in situ β-gal染色
β-gal染色キット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用い、細胞の機能的β-ガラクトシダーゼの発現をモニタリングした。β-gal陽性細胞のパーセンテージは、無作為に選択した５〜１０個の視野で染色細胞 対 非染色細胞を算出することによって求めた。
【０１５４】
11.1.8.  内因性欠陥型lacZプレmRNA標的を発現するネオマイシン耐性クローンの選択
1日目に1 x 106個の293細胞を60mmプレートにプレーティングして37℃で24時間増殖させた。2日目、上記のようにリポフェクタミンプラス・トランスフェクション試薬を用い、2μgのpc3.1lacZCF9mで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、0.5mg/mlのG418を含有する培地中に細胞を希釈し(1:20の比率)、増殖させた。2週間終了時、ネオマイシン耐性コロニーを選択し、プールして増殖させて、常にG418の存在下で維持した。
【０１５５】
11.2.  結果
細胞におけるスプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングについての容易で用途の広い解析を可能とするモデル系を開発した。細菌lacZ遺伝子を嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節タンパク質(CFTR)遺伝子由来の末端切断型イントロン9で分断した(図37A)。この分断lacZ遺伝子は、それをヒト293T細胞へ導入したところ、適切なスプライシングが可能なlacZプレmRNAの合成を誘導した。このlacZ遺伝子のオープンリーディングフレームを、第2のエキソンの5’末端付近に2つのナンセンスコドンをイン・フレームで挿入することにより変異させた(図37A)。このlacZ遺伝子はlacZCF9mと呼ぶ。293T細胞においてlacZCF9mは、酵素活性を持たない末端切断型β-ガラクトシダーゼ(β-gal)タンパク質をコードするlacZCF9mプレmRNAの合成を誘導した。lacZCF9m遺伝子を有する細胞は、機能喪失型突然変異によって引き起こされる遺伝病のモデル系となる。
【０１５６】
プレトランススプライシング分子(PTM)は、lacZCF9mプレmRNAとのトランススプライシングを起こして、2つのナンセンスコドンによって引き起こされる突然変異を修復するように、デザインした。23、91および153個のヌクレオチド(nt)にわたる結合ドメインを有するPTMを構築し、これらをPTM-CF14、PTM-CF22およびPTM-CF24と呼称した(図37B)。PTM-CF24結合ドメインは、標的CFTR遺伝子イントロン9の153個の連続するヌクレオチドとは結合せず、むしろ27および126個のヌクレオチドの相補領域間に存在する標的において47個のヌクレオチドのループを作る(図37B)。これらのPTMはlacZCF9mによって作り出された欠陥を修復するものと推定された(図37C)。
【０１５７】
半定量的RT-PCR解析を用い、長い標的結合ドメインを有するPTMによって媒介されるトランススプライシングの効率を調べた。トランススプライシングによるlacZCF9m転写物の修復は、PTMと標的(lacZCF9m)プラスミドとの同時トランスフェクション、または内因性プレmRNAとして標的を発現するよう改変された細胞のトランスフェクションという、2つの異なる方法で調べた。PTMをコードするプラスミドをlacZCF9mプラスミドと同時トランスフェクトすることは、前者をその効率についてスクリーニングするための容易な方法であった。半定量的RT-PCRアッセイにおいてPTM-CF22およびPTM-CF24はPTM-CF14よりもおよそ3倍および10倍効率がよく、このことはmRNA修復の著しい向上を示している(図38)。RT-PCR産物の配列決定を行ったところ、トランススプライシングは正確であり、その結果として標的およびPTMに由来するエキソンが適切に連結されることが示された。さらに、PTMの3’スプライス部位における重要なシス作用エレメントの突然変異は、トランススプライシングを妨げた。これらのアッセイおよび本明細書に記載のその他の全てのアッセイでは、DNAレベルの組換えを除外するために対照実験を行った。このように、lacZCF9m転写物の修復は、標的RNAトランススプライシングの結果であった。
【０１５８】
PTM-CF14、PTM-CF22またはPTM-CF24の、内因性lacZCF9m遺伝子を有する293細胞へのトランスフェクションにより、標的結合ドメインが長いほど効率の高いPTMとなることが確認された(図38B)。同等レベルのRT-PCRトランススプライシング特異的産物が、PTM-CF24およびPTM-CF14のそれぞれについて30サイクルおよび35サイクルのPCRの後に得られた。従ってこのデータは、長い結合ドメインを有するPTMが、これまでに報告されたPTMよりも少なくとも１桁は高いレベルでlacZCF9m転写物を修復したことを示している。
【０１５９】
10個のlacZCF9mのうち1を超えるものがトランススプライシングによって修復されうる。定量的リアルタイムPCRを用いて、長い結合ドメインを有するPTMによって修復されたlacZCF9m転写物の割合を測定した。これらの実験において上記の同時トランスフェクションアッセイを用いた。23ヌクレオチドの結合ドメインを含むPTM-CF14は、293T細胞では1.2〜1.6%、H1299ヒト肺癌細胞では2.1%のlacZCF9m RNAを修復することが示された。153ヌクレオチドの長い結合ドメインを有するPTM-CF24は、著しく効率が高く、293T細胞では12.1〜15.2%、H1299 細胞では19.7%のlacZCF9m RNAを修正した。結果としてこれはlacZCF9m mRNAのレベルにおける測定可能な低下をもたらした。また、これらのデータから、このRT-PCRアッセイの、シススプライシング産物であるlacZCF9m mRNAと、トランススプライシング産物である修復されたlacZCF9m mRNAとを識別することができる顕著な能力も確認された。これは、トランススプライシングにより媒介されるmRNA修復効率のRNAレベルでのはじめての真の定量である。これらのデータから、上記に示された半定量的RT-PCR解析の示唆が確認される。同様の実験を内因性lacZCF9mプレmRNA標的を発現する293細胞を用いて行った。上記で示されたデータと一致するように、PTM-CF24はPTM-CF14よりも10倍効率がよく、このPTM-CF24は内因性lacZCF9m転写物の1.3〜4.1%を修正する。これらのデータから、PTMの長さを増大させるとトランススプライシング効率に著しい増加がもたらされることが確認される。
【０１６０】
トランススプライシングにより媒介されるmRNAの修復は活性β-ガラクトシダーゼの合成をもたらす。細胞レベルでのmRNAの修復の成功の最終的な基準は活性タンパク質の産生である。ウェスタンアッセイを用い、トランススプライシングの結果として全長β-galが産生されたことを確認した。lacZCF9mまたはPTM-CF24をコードするプラスミドで293T細胞をトランスフェクトした後には、全長β-galは認められなかった。しかし、両プラスミドの同時トランスフェクションの結果、全長β-galタンパク質が活発に産生され、このことは抗β-gal抗血清を用いて容易に検出された(図39)。この結果は酵素活性データを補完するものであり、その酵素活性データが末端切断型β-galタンパク質の補充によるものではなかったことを示唆している。ウェスタンブロット解析では、293T細胞において全長β-galタンパク質はトランススプライシングによって生成されたものであることが明らかになり、さらに、長い結合ドメインを有するPTMが効率的にスプライシングされたことも確認された。
【０１６１】
β-gal mRNAの適切な修復および全長β-galタンパク質の合成は活性酵素の産生をもたらすはずである。実際、lacZCF9mおよびPTM-CF24で同時トランスフェクトされた293T細胞はin situ(図40A)または抽出物(図40B)のいずれかで測定した場合にβ-gal活性を有することが示された。この活性は標的プレmRNAおよびPTMの間のトランススプライシングによるものであることが示された。さらに定量的液相アッセイでは、上記に示されたデータがさらに確認され、すなわち、PTM-CF22およびPTM-CF24はPTM-CF14よりもそれぞれ2.9倍および9.3倍効率が高かった。しかし、最も顕著であったのは、安定な内因性遺伝子としてlacZCF9mを有する293T細胞を用いた場合の結果であった。これらの細胞をPTM-CF14でトランスフェクトした際、得られたβ-gal活性のレベルはかろうじてバックグラウンドを超えるものであった。しかし、PTM-CF24でのトランスフェクションは相当なレベルのβ-gal活性をもたらした(図40C)。これは全長β-galタンパク質の出現と並行して行った。これらのデータは、突然変異したプレmRNAを修復するトランススプライシング効率の大幅な上昇を示す。実際、グループIリボザイムまたはトランススプライシングのいずれかによる哺乳動物細胞における内因性RNAの修復についての先行する報告は全て、RT-PCRを用いて低レベルの修復の徴候を記載しているに過ぎない。
【０１６２】
極めて長い結合ドメインを有するPTMは特異性が高い。結合ドメイン内の二次構造はHeLa核抽出物においてPTMの特異性を高めうることが示された。トランススプライシング反応の特異性をin vivoにて確認するため、非特異的反応のリポーターとして機能しうる第2の標的遺伝子を調製した。この遺伝子はlacZHCG1mと呼ばれ、lacZCF9mと第1エキソンを共有している。lacZHCG1mのイントロンはヒト絨毛性ゴナドトロピン遺伝子6(βhCG6)のβ-サブユニットのイントロン１であり、第2エキソンは同じ遺伝子のエキソン2である。lacZHCG1mは、正確にスプライシングされることにより全長β-galをコードしないキメラmRNAを生じるプレmRNAの合成を駆動する(下記参照)。PTM-CF14、PTM-CF22およびPTM-CF24は、これらのPTMおよび標的遺伝子中の結合ドメイン間に相補性が認められないため、lacZHCG1mプレmRNAへはターゲッティングされない。ゆえに、これらのPTMとlacZHCG1mプレmRNAとの間のトランススプライシングはいずれも非特異的である(図41A)。
【０１６３】
293T細胞をPTM-CF14、PTM-CF22またはPTM-CF24でトランスフェクトし、非特異的トランススプライシングのレベルをRT-PCRおよび液相β-galアッセイにより測定した。半定量的RT-PCRにより、PTM-CF24は、lacZHCG1mプレmRNAとのトランススプライシングを、PTM-CF14と比べて非常に起こしにくいことが示唆された。β-gal活性の測定から確認されることであるが、lacZHCG1mとPTM-CF24とで同時トランスフェクトされた細胞は、lacZHCG1mとPTM-CF14で同時トランスフェクトされたものよりも3.7倍低減されたβ-galしか生じなかった(図41C)。これらのデータを基に、PTM-CF24は非特異的標的よりもその標的に対してトランススプライシングを起こす頻度が50倍高いと見積もられた。PTM-CF24の「セーフティー」形態であるsPTM-CF24はそれ以上の特異性をもたらさなかった(図41C)。しかしやはり、より短い結合ドメインを有するPTMに関しては、結合ドメインを含む「セーフティー」ステムはin vivoにおける特異性を高めることが分かった(図41C)。これらのデータから、長い結合ドメインは効率が高いだけでなく特異性も高いPTMをもたらすものと結論された。
【０１６４】
長い結合ドメインがPTMの特異性を高めたという観察結果は、極めて長い結合ドメイン(>200nt)が識別能もさらに高めうることを示唆した。それぞれ200ヌクレオチドおよび411ヌクレオチドにわたる結合ドメインを有するPTM-CF26および-CF27をコードするプラスミドを構築し、lacZHCG1mプラスミドとともに同時トランスフェクトした。これら2つのPTMの非特異的トランススプライシングは、RT-PCRでかろうじて検出される程度のものであった(図41B)。β-galアッセイによって測定した場合、PTM-CF26およびPTM-CF27は非特異的トランススプライシング活性を最小限しか有していなかった(図41C)。液相β-galアッセイによって測定した場合のlacZCF9mとの特異的トランススプライシング反応では、PTM-CF26はPTM-CF14と同等の活性であった(図41B)。PTM-CF26は非特異的標的(lacZHCG1m)に対するよりも特異的標的(lacZCF9m)に対してトランススプライシングを起こす頻度が80倍高いと見積もられた。ゆえに、極めて長い結合ドメインを含むことにより、これらのPTMには極めて高い特異性が付与される。
【０１６５】
12.  実施例：  3’エキソン置換を用いた因子VIII遺伝子の修復
血友病は血液凝固因子の1つが欠損することによって起こる出血性疾患である。血友病Aは全症例の約80%を占め、凝固因子VIIIの欠損である。以下の節ではスプライセオソームにより媒介されるトランススプライシングを用いた凝固因子VIII遺伝子の修復の成功について記載し、遺伝子治療を用いた因子VIIIの修復の実現可能性を示す。
【０１６６】
マウス因子VIII PTMのコード領域(エキソン16〜24)を、指向性クローニングのための唯一の制限部位を含むプライマーを用いてcDNAプラスミド鋳型からPCR増幅した。PCR産物は全て、クローン化Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて作製した。EcoRVおよびPmeI制限部位を用いてコード配列をpc3.1DNA(-)へクローニングした。結合ドメイン(BD)は、鋳型としてゲノムDNAを用い、PCRにより作製した。プライマーは指向性クローニングのための唯一の制限部位を含んでいた。このPCR産物を、NheIおよびSacII制限部位を用いて既存のPTMプラスミド(PTM-CF24、pc3.1DNA)へクローニングした。このプラスミドはすでに、スペーサー配列、ポリピリミジントラクト(PPT)、分岐点(BP)および3'受容部位を含む残りのTSDエレメントを含んでいた。次にこのTSD全体を因子VIII PTMコード配列を含有するベクター(上記のもの)へサブクローニングした。最後に、別個のプラスミドクローンに由来するウシ成長ホルモン3’非翻訳配列を、PmeIおよびBamHI制限部位を用いて上記PTMへサブクローニングした。
【０１６７】
この構築物全体を配列決定した後、ありうる多義的スプライシングをRT-PCRによってアッセイし、次に、XhoIおよびBamHI制限部位を用いてAAVプラスミドpDLZ20-M2へサブクローニングした(Chaoら, 2000, Gene Therapy 95:1594-1599; FlotteおよびCarter, 1998, Methods Enzymol., 292:717-32)。いくつかのウイルス(および非ウイルス)送達系では、治療薬のサイズが重要となる。アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターは、(i)広範な宿主範囲を有する非病原性ウイルスであること、(ii)アデノウイルスベクターに比べて炎症性応答が低いこと、および(iii)分裂中の細胞にも非分裂細胞にも感染可能であることから好ましい。しかし、rAAVのパッケージング能は野生型ゲノムの大きさのおよそ110%、すなわち約4.9kBに限られていることから、プロモーターおよびエンハンサーなどの大きな調節エレメントの余地が小さい。B-ドメイン欠失ヒト因子VIIIがAAVのパッケージングサイズに近いことから、トランススプライシングはより小さな導入遺伝子を送達する可能性を付与するとともに調節エレメントの付加を可能とする。
【０１６８】
XhoI PTMクローニング部位の上流にあるプレmRNAの多義的供与部位を除去するため、エキソン1の一部およびイントロン1配列の全体を含むオリジナルAAV構築物からおよそ170bpの配列を除去した(図44C参照)。
【０１６９】
図44Dの修復モデルはエキソン1〜14、イントロン14、エキソン15、イントロン16、およびネオマイシン遺伝子インサートを含むエキソン16〜24からなるマウス因子VIIIプレmRNA標的(内因性遺伝子)の単純化モデルを示す。図に示されているPTMは、エキソン16〜24コード配列、ならびにそれ自身のスプライシングエレメント(供与部位、分岐点およびピリミジントラクト)および結合ドメインを有するトランススプライシングドメインからなる。結合ドメインの詳細は図44Aおよび44Bに示されている。この結合ドメインはイントロン15のスプライス部位およびエキソン16の一部(5'末端)に相補的である。
【０１７０】
遺伝子修復に3’エキソン置換を用いることの重要な利点は、(i)構築物が全長遺伝子構築物より小さな配列およびスペースしか必要とせず、それにより調節エレメントのためのスペースがより大きく残ること、(ii)SMaRTの修復が標的遺伝子を発現する細胞でしか起こらないことから、修復されたRNAの異所発現に関連する潜在的な問題がなくなるということである。
【０１７１】
因子VIII欠損マウスはノースカロライナ大学チャペルヒル校（University of North Carolina at Chapel Hil）の動物施設で維持した。プラスミドの注入に関しては、各マウスに鎮静剤を投与し、解剖顕微鏡下に置き、1cm垂直正中線腹部切開を行った。およそ100マイクログラムのPTMプラスミドDNAを含むリン酸緩衝生理食塩水を、肝臓門脈へ注入した。注入後1、2、3および20日の間隔で眼窩後方叢から採血し、コアテストアッセイ(Coatest assay)を用いて因子VIII活性をアッセイした。
【０１７２】
マウスから採取した血液サンプルにおける因子VIIIの活性をコアテストアッセイと呼ばれる標準的な試験を用いてアッセイした。アッセイは製造業者の説明書に従って行った(Chromgenix AB, Milan, Italy)。因子VIIIノックアウトマウスにおける因子VIIIの修復を示すデータは図46に示されている。
【０１７３】
ヒトにおける血友病Aの欠陥は、DNA全体の再配列、単一のDNA塩基の置換、欠失および挿入を含むいくつかのカテゴリーに大まかに分類される。エキソン1〜22(イントロンを含む)の逆位およびエキソン23〜26から離れた転座を伴うDNAの再配列は重篤な血友病Aの全症例の約40%の原因であることが確認されている。イヌ血友病Aモデルもまた、全体の再配列が非常に似ている。この突然変異は本発明者らのヒトおよびイヌ因子VIII PTMデザインの基礎として用いられる。
【０１７４】
ヒト因子VIII PTMの構築方法は、異なるコード領域(エキソン23〜26)がヒトcDNAから増幅され、結合ドメインがヒトゲノム配列鋳型(全ゲノムDNAまたはゲノムクローン)から増幅され、さらに、修復された因子VIIIタンパク質を検出するのに用いるPTMではC末端FLAGタグが遺伝子工学的に操作されること以外は、マウスPTMに関して上記したものとよく似ている。スペーサー配列、ポリピリミジントラクト(PPT)、分岐点(BP)および3'受容部位を含むトランススプライシングドメインの残りのエレメントは既存のプラスミドから得る。必要があれば、PTM内の多義的スプライシングを排除するために結合ドメイン配列に変化を加える。最終的なPTMを同じマウスAAVプラスミドベクターpDLZ20-M2へサブクローニングし、このプラスミドからウイルスを調製した。イヌ因子VIII PTMはイヌcDNAおよびゲノムプラスミドを用いる以外は同様にして作製した。 
13.  実施例：  パピローマウイルスRNAの標的トランススプライシング
大多数の子宮頚癌は発癌性ヒトパピローマウイルス(HPV)に関連し、E6およびE7発癌タンパク質をコードするウイルスmRNAを発現する。下記のように、PTMはHPV-16のE6領域へターゲッティングされ、226番のヌクレオチドに位置する5’スプライス部位を用いて、TMエキソンをE6 ORFの5'末端へとスプライスする。
【０１７５】
13.1  材料および方法
PTM効率を調べるため標的DNA(p1059)を用いたが、これはSV40初期プロモーターおよび複製起点の後ろにクローニングされた全HPV-16初期領域(nt79〜4468)を含む。特異性は標的として異種発現ベクターlacZCF9mを用いて評価した(Puttarajuら, 2001. Mol Ther 4:105-14)。プラスミドはQuiagen maxi prepキットを用いて調製した。
【０１７６】
293細胞がほぼ集密的な6cmプレートを、リポフェクタミン2000(Life Technologies)を用い、2μgの標的DNAおよび2μgのPTM DNAでトランスフェクトした。トランスフェクション2日後、プレート上の細胞をPBSで洗浄し、300μlの溶解バッファーを用いてプレート上で溶解した。Ambion RNAqueousキットを用いて全細胞RNAを調製した。トランスフェクトしたDNAを、LiCl沈殿と、その後のAmboin DNA-freeTM DNAse処理を用いたDNアーゼI処理および除去試薬によって、RNAから除去した。
【０１７７】
High Capacity cDNA Archive Kit (PE Applied Biosystems)からのRTを製造業者の指示に従って用い(ただし、以下のような改変を伴った：ランダムプライマーの量は半分にし、反応物100μl当たり5μlの50μMオリゴ(dTl6)原液および5μlの20単位/μlのRNアーゼ阻害剤原液を加えた)、RNAをcDNAへ変換した。リアルタイム定量的PCR(QPCR)解析のため、RT反応物を50ng/μlおよび5ng/μl(もとのRNA含量に対して)まで希釈した。特異的シスおよびトランススプライスmRNAの量をリアルタイム定量的PCRを用いて定量した。これらのアッセイはリアルタイムQRT-PCRと呼ばれる。これらの反応は本質的にこれまで記載されているように(Puttarajuら, 2001 Mol Ther 4:105-14)、PE Applied Biosystems製のSYBRグリーンキットを用い、Bio-Rad iCycler iQ Real Time PCR装置にて行った。
【０１７８】
全HPV-16 RNAレベル(シスおよびトランススプライシングされたもの)をE6エキソン1(HPV-16 nt152〜204; 53bp)中の共通のアンプリコンを用いて評価した。このアッセイはHPV-16プライマーoJMD-15(ACAGAGCTGCAAACAACTAT)およびoJMD-16(TTGCAGTACACATTCTAA)を用いる。各PCR反応に用いるRT反応物の量は5ngとした。HPV-16の nt226 5'スプライス部位からのPTM lacZエキソンへのトランススプライシングは53bpのキメラアンプリコンを用いて評価した。このアッセイはHPV-16センスプライマーoCCB-348(GCAAGCAACAGTTACTGCGA; HPV-16 nt201〜220)およびlacZアンチセンスプライマーoCCB-322(ATCCACCCAGTCCCAGA)を用いる。各PCR反応に用いるRT反応物の量は50ngとした。両アッセイとも、定量のための標準曲線を作成するために同じプラスミド(p3671)を用いた。HPV-16の nt880 5'スプライス部位からPTM lacZエキソンへのトランススプライシングは50bpのキメラアンプリコンを用いて評価した。このアッセイはHPV-16センスプライマーoCCB-366(ATCTACCATGGCTGATCCTG; HPV-16 nt858〜877)およびlacZアンチセンスプライマーoCCB-322を用いる。各PCR反応に用いるRT反応物の量は50ngとした。このアッセイの標準曲線を作成するため、プラスミドp3672を用いた。
【０１７９】
リアルタイムQPCRの標準として用いるプラスミドは以下のようにしてクローニングした。293T細胞におけるp1059およびHPV-PTM1の同時トランスフェクションからのRT反応をPCR反応の鋳型として用いた。プライマーoCCB-257(HPV-16 nt127〜147; ACCCAGAAAGTTACCACAGTT)およびoCCB-322は127bpのバンドを示し、これをpCRII-TOPO(Invitrogen)中にTOPOクローニングして、p3671を得た。配列決定から、このDNAはHPV-16 nt226からPTMの3’スプライス部位へのトランススプライシングに相当することが示された。プライマーoJMD-17(HPV-16 nt689〜708; GACAAGCAGAACCGGACAGA)およびoCCB-322は219bpのバンドを示し、これをpCRII-TOPOにTOPOクローニングしてp3672を得た。配列決定から、このDNAはHPV-16 nt880からPTMの3’スプライス部位へのトランススプライシングに相当することが示された。プラスミド原液(1ng/μl)については、標準曲線のために用いる前にPicoGreen(Molecular Probes)を用いて定量した。
【０１８０】
PTMおよび標的lacZCF9mでの同時トランスフェクションに関するシスおよびトランススプライシングの定量はまさにこれまでに記載のように行った(Puttarajuら, 2001. Mol. Ther. 4:105-14)。各PCR反応に用いるRT反応物の量は5ngとした。
【０１８１】
13.2  結果
HPVおよびCF PTMを、トランススプライシング効率を評価するためにHPV-16発現ベクターp1059とともに、またはトランススプライシングの特異性を評価するためにlacZCF9m(CFイントロンを含む)とともに、293細胞へ同時トランスフェクトした。上記のようにリアルタイムQRT-PCRアッセイを行い、各標的のシススプライシングに対するトランススプライシングのレベルを評価した。結果は表1に示されている。全RNAレベルをDNA標準のfgとして表す。標準 p3671およびp3672は同じサイズに近く、従ってこれらの値を用い、各アッセイにつき相対RNAレベルで表すことができる。HPV-PTM1、2、5および6はHPV-16の nt226 5'スプライス部位へと効率的にトランススプライシングされた。HPV-PTM1では最大70%のトランススプライシングが見られた。予測されたように、HPV-PTM5トランススプライシングはPTMの分岐点およびポリピリミジントラクトにおける突然変異によって無効になった。これらのPTMはnt 880 5’スプライス部位へのトランススプライシングを1%未満で示した。このデータは、ヌクレオチド409および526 3’スプライス部位に相補的な結合ドメインを有するこれらのPTMのデザインと一致する。880 5’スプライス部位の下流のHPV-PTM-8およびHPV-PTM-9トランス結合ドメインは5’スプライス部位に対する効率的なトランススプライシング(HPV-PTM8では37%、HPV-PTM9では22%)を示し、nt226 5’スプライス部位に対するトランススプライシング効率はいく分低い。HPV-PTM9は、nt880 5’スプライス部位へのスプライシング因子の結合を立体障害により妨害する。また、 HPV-PTM1、2、5および6の特異性も、CFイントロンを有する標的プレmRNAに対するトランススプライシング能によって評価した。特異性は274から606倍の範囲であった。
【表３】
2005168509.tif 000008
【０１８２】
14.  実施例：  標的パピローマウイルスPTMのデザイン
最初の治療薬前駆体RNA分子(「PTM」)はHPV mRNAの存在量およびスプライシングパターンを基にして開発する。良性感染におけるHPV-16の転写マップが図48に示されている。この最初のPTMについてシスおよびトランススプライシングアッセイを行い、それらのアッセイから得られたデータを用いてスプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシング反応において至適効率を有する特定のPTMを作出する。
【０１８３】
最も効率的なPTMは、感染した細胞を死滅させる毒性産物をコードするPTMによりHPV標的転写物をトランススプライシングするものである。最もよく用いられるHPV標的スプライス部位のターゲッティングにおいては、2つの活性のある5'スプライス部位標的および2つの活性のある3'スプライス部位標的が使用できる。より高い頻度で用いられる部位を遮断するようにPTMをデザインする場合には、低い頻度で用いられるスプライス部位も十分な標的となりうる。多くの子宮頚癌ではHPV-16の組み込みがこれらの癌においてE6およびE7領域の発現しかもたらさないことから、標的スプライス部位の選択はその強度が癌治療を目的とするかどうかでさらに制限される。
【０１８４】
毒性産物の発現をもたらす最初のPTMの開発に以下の標的スプライス部位を用いる。
【０１８５】
i) 5’スプライス部位標的：
nt226：このスプライス部位は全E6*種の合成に用いられる。大部分の腫瘍および細胞株では、P97プロモーター転写物の大多数はこの5’スプライス部位を用いてスプライシングされる。
【０１８６】
nt880：このスプライス部位は全E6US(非スプライシング)、およびE6*IIIを除くE6*種の合成に用いられ、両スプライス部位とも増殖性感染および癌の双方で好適な標的となる。
【０１８７】
ii) 3’スプライス部位標的：
nt409：この 3’スプライス部位は、一般にE6*II種よりも存在量の多いE6*I種のスプライシングに用いられる。このスプライス部位は癌および増殖性HPV感染に用いられる。
【０１８８】
nt3358：この標的はウイルスDNAが染色体外にある場合に限り、ほとんどのmRNAのスプライシングに用いられる。このスプライス部位は大部分の癌の治療にとっては良好な標的というわけではない。
【０１８９】
さらに、増殖性感染組織または癌において内部エキソンnt409〜880またはnt526〜880を置換するように二重トランススプライシングPTMが開発される。
【０１９０】
あるいは、最初のPTMは、トランススプライシングが、PTMによりコードされる部分ウイルスおよび部分外来ペプチドである融合タンパク質をコードするmRNAを生じるようにデザインされる。この融合タンパク質は必須のウイルス機能を阻害するようウイルスタンパク質の機能を変化させる。上記のスプライス部位は次の3つのウイルス融合タンパク質を生じるようターゲッティングされる：
(i)標的として226 5’スプライス部位を用いるE6のN末端
(ii)標的としてnt409(最良)またはnt526 3’スプライス部位を用いるE6のC末端
(iii)標的としてnt3358 3’スプライス部位を用いるE2のC末端。
【０１９１】
この融合タンパク質は染色体外ウイルスDNAを含む増殖性感染および癌で産生される。E2のC末端ドメインはDNA結合・二量化ドメインであり、融合タンパク質をP97プロモーターへターゲッティングし、転写を遮断するのに使用できる。高濃度ではE2ウイルスタンパク質はP97プロモーターのすぐ上流に結合し、結合をめぐって転写因子 SP1およびTFIIDと競合することで転写を阻害する。しかし、これらのE2結合部位は長い制御領域(LCR)の上流のものよりも弱く、ウイルスE2タンパク質が高濃度の場合にのみ飽和する。E2が低濃度の場合は、このタンパク質は上流LCRのE2結合部位に結合し、転写を活性化する。このように、融合タンパク質に「リプレッサー」ドメインを付加すると、いずれかのE2結合部位と結合することにより転写を遮断することができる。この融合タンパク質はまた、E1/E2複合体が複製起点と結合することから、ウイルスDNAの複製を遮断するのにも有用である。しかし、E2 DNA結合ドメインとE1の複合体はこの起点には結合しないことが示されている。E2は二量体であるので、E2融合タンパク質と全長E2タンパク質とのヘテロ二量体化によりおそらくDNA複製におけるE2の機能が失われるであろう。
【０１９２】
上記で挙げた図48に示されるHPV標的スプライス部位に対するターゲッティングおよびトランススプライス能に基づいたPTMを構築し、スプライシングによって、感染細胞を死滅させるか、または容易に検出できるマーカー遺伝子を発現するジフテリア毒素サブユニットA(DT-A)産物の発現がもたらされるようにスクリーニングする。他のペプチドまたはタンパク質毒素をもコードしてもよい。典型的な原型PTM(3'トランススプライシング)はHPV配列に相補的なアンチセンス標的結合ドメイン(25以上)、スペーサー配列、標準的な分岐点配列(UACUAAC)、延長ポリピリミジントラクト(12〜15U)、3'スプライス部位のAGジヌクレオチド、それに続く送達される遺伝子からなる。PTMはまた、HPV 3'スプライス部位を用いてPTMにより媒介されるトランススプライシングが起こるよう構築する(図66B)。PTMのトランススプライシングドメイン(TSD)はモジュール方式で構築する。各PTMエレメントの間に個々のエレメントの置換を容易にする唯一の制限部位を組み込む。3'エキソン置換および5'エキソン置換モデルの模式図がそれぞれ示されている(図66A〜B)。トランススプライシングの効率および特異性の双方は、結合ドメインの長さ、スペーサー配列、PPTの強度をはじめとするTSDにおけるいくつかの配列の変更により実質的に調節することができるということがこれまでに実証されている。
【０１９３】
「線状」PTMはトランススプライシング効率を最大にし、それにより、非常に高いトランススプライシング効率を与えるPTM配列を同定するように、最初にデザインされる。線状PTMは一本鎖形態としてのPTMの結合ドメインをさす。高度のターゲッティング特異性を達成するには、「セーフティーステム」と呼ばれるもう1つに形態のTSDを構築することができる。これらのPTMでは、PTMのスプライス部位は折りたたみ構造において、自身と結合することにより他のプレmRNA標的との反応から保護される。特異的標的との接触により、セーフティーステムの解除、スプライセオソーム形成のためのPTMの3’スプライス部位の露出および活性化が促進される。
【０１９４】
また、トランススプライシングの特異性をさらに高めるために、予測される治療効果を得るのに2つのトランススプライシング事象を必要とするPTMも構築される(図65)。このPTMはHPV 5’スプライス部位へとトランススプライシングする上流3’スプライス部位を有し、それにより単独のトランススプライシング産物を生じる。この産物は必要なポリアデニル化シグナルを含まず、核細胞質輸送およびmRNAの翻訳ができないことから不活性であろう。HPV 3’スプライス部位を用いる第2のスプライシング事象はポリアデニル化に必要なシグナルを伴うPTMを提供する必要がある(図65)。ポリアデニル化は、3'および5'両結合ドメインが線状である線状結合ドメインを有するPTM、あるいは、3'セーフティー+5'線状結合ドメインを有するPTMに必要であり、ウイルス発現の阻害のためにもデザインされる。さらに、PTMは、3'および5'両セーフティースプライス部位、または3'線状もしくは5'セーフティー部位を有する「二重セーフティー」PTMとしてもデザインされる。
【０１９５】
これらPTMの試験はin vitroスプライシングアッセイおよび細胞培養に基づくアッセイを用いて行われる。PTMのトランススプライシング能を調べるためにはHPV-16含有細胞系を用いる。W12細胞(80263細胞)は染色体外HPV-16 DNAを含み、全HPV-16初期領域を発現しており、PTMターゲッティングを試験するのに用いることができる。SiHaおよびCaSki細胞系は組み込まれたHPV-16を含み、ウイルスのE6/E7/5'E1領域のみを発現する。これらの細胞系は、子宮頚癌で発現されるものに特徴的なウイルスプレmRNAを発現するので、有用である。しかし、それらは3358 3'スプライス部位をターゲッティングするPTMを試験するために有用な細胞系とはいえない。CaSki細胞は試験した他のいずれの細胞系よりも著しく高いレベルのHPV-16 mRNAを発現することから、他のPTMをアッセイする上で最良の細胞となる。
【０１９６】
細胞培養に基づく、PTM発現ベクターとHPV-16初期領域発現ベクターでの同時トランスフェクション実験では、PTMの発現に関してアッセイする。HPV-16の発現を駆動するいくつかのプラスミドを構築した。例えば、同時トランフェクション実験で使用できる2つのプラスミドとしては、SV40初期プロモーター(p1059)またはK14プロモーター(p2571; pK14-1203)のいずれかの指令下でHPV-16を発現するものが挙げられる。
【０１９７】
イソ型特異的(すなわち、スプライス特異的)プライマーと定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(QRT/PCR)を併用して選択的スプライシングについてアッセイする。このアッセイは極めてイソ型特異的であり、RNA分解に対しては比較的感度が低く、一分子のcDNAに対しては感度がよく、広いダイナミックレンジを有し(少なくとも7O桁の規模)、かつ、各イソ型の絶対量が得られる。各PTM/標的プレmRNAの組合せに特異的なプライマー対を用いる。このアッセイの配列特異性により、トランススプライシング反応の特異性をモニタリングすることができる。アッセイの感度および定量性ならびにアッセイを開発・実施する上での迅速性はパピローマウイルスプレmRNAへターゲッティングされるPTMの至適化に有用である。
【０１９８】
また、PTMにより誘導されるトランススプライシングの特異性(すなわち、HPV標的プレmRNAへの標的トランススプライシングの特異性を調べるためのもの)も、標準的な手法に従い、cDNA末端の5'および／または3'迅速増幅(RACE)によって評価する。この方法は従来のcDNAライブラリーの構築に比べて比較的迅速であり、5'および／または3' cDNA末端の完全配列を与えることから、特異的および非特異的スプライシング事象の数を求めることができる。まず、(i)線状PTM+HPVミニ遺伝子標的、および(ii)セーフティーPTM+HPVミニ遺伝子標的で同時トランスフェクトされた細胞から単離したRNAからなる2つのcDNAライブラリーを構築する。例えば、トランススプライシングされたRNAの5’末端(3'エキソン置換)を同定するために、PTMアンチセンスプライマーを用いて5’RACEアッセイを行う。同様に、トランススプライシングされたRNAの3’末端(5’エキソン置換)を同定するために、PTMセンスプライマーを用いて3' RACEアッセイを行う。このcDNAをPCRにより増幅し、制限酵素で消化し、プラスミドベクターへクローニングする。これらのcDNAクローンをまず、PTM特異的プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングする。各cDNAライブラリーから陽性クローンを選択して配列決定し、その配列情報を用いて線状PTMとセーフティーPTMの特異性を比較する。これにより高頻度でトランススプライシングする非特異的標的の同定が可能となる。これらの標的を解析すると、非特異的トランススプライシングを引き起こす配列についての有用な情報が得られ、特異的PTMの構築に役立つ。
【０１９９】
トランススプライシングアッセイにおける最初の候補PTMの解析から得られたトランススプライシング効率および特異性のデータを用い、最適なトランススプライシング能を有するPTMを考案・開発する。これらの最適なPTMは上記のトランススプライシングアッセイを用いて解析する。
【０２００】
器官典型的な「ラフト/異種移植片」技術を用いたパピローマウイルス感染のマウスモデル。パピローマウイルスは一般に種および細胞型特異的である。増殖性感染はウシケラチノサイトとウシパピローマウイルスを用いてヌードマウスで確立したものである。この系では、まず、ケラチノサイトを、繊維芽細胞を含むコラーゲン「ラフト」上にプレーティングし、組織培養にて集密的になるまで増殖させる。次に、ケラチノサイトにパピローマウイルスを感染させるか、またはケラチノサイトをウイルスゲノムDNAでトランスフェクトし、数日間培養して増殖させる。次に、これらのラフトをヌードマウスの背に移植し、そこでそのラフトは増殖的に感染したウシ組織へと発達する。ヒトパピローマウイルス感染はヒトパピローマウイルスとケラチノサイトを組み合わせて用いる同じ技術を用いても確立することができる。この系は抗パピローマウイルスPTMのin vivo効率を調べるのに有用である。さらに、子宮頚癌組織または子宮頚癌細胞系のヌードマウスへの移植も用いられる。また、ウシパピローマウイルス(BPV-1)、イヌ口腔パピローマウイルス(COPV)、およびワタオウサギパピローマウイルス(CRPV)を含むいくつかの動物モデルを用いて試験を行うこともできる。COPVは特にワクチンの開発の良好なモデルとして役立つ。
【０２０１】
本発明は本明細書に記載の特定の実施形態に範囲を限定されるものではない。実際、当業者には以上の記載および添付の図面から、本明細書に記載されているものの他にも本発明の様々な改変が明らかになろう。このような改変も添付の特許請求の範囲内に入るものとする。本明細書には種々の参照文献が挙げられているが、それらの開示の全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１Ａ】プレトランススプライシングRNAのモデル。
【図１Ｂ】モデルPTM構築物および標的トランススプライシング戦略。第一世代PTMの模式図(PTM+SpおよびPTM-Sp)。BD，結合ドメイン；NBD，非結合ドメイン；BP，分岐点；PPT，ピリミジントラクト；ss，スプライス部位；およびDT-A，ジフテリア毒素サブユニットA。PTMS内のユニーク制限部位は一文字で示されている：E, EcoRI; X, Xhol; K, Kpnl; P, Pstl; A, Accl; B, BamHIおよびH, HindIII。
【図１Ｃ】従来のワトソンクリック塩基対合によるPTM+SpとβHCG6標的プレmRNAとの結合、ならびに提案されるシスおよびトランススプライシング機構を示した模式図。
【図２Ａ】βHCG6標的に対する種々のPTM構築物のin vitroトランススプライシング効率。標的とされた結合ドメインおよび活性スプライス部位はPTMトランススプライシング活性と相関する。全長標的(pcPTM+Sp)、非標的(PTM-Sp)およびスプライス変異体[Py(-)AG(-)およびBP(-)Py(-)AG(-)]PTM RNAを、βHCG6 標的プレmRNAを含有するスプライシング反応物に加えた。これらの産物をプライマーβHCG-F(標的βHCG6エキソン1に特異的)およびDT-5R(DT-Aに相補的)を用いてRT-PCR増幅し、1.5%アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。
【図２Ｂ】種々のPTM構築物のin vitroトランススプライシング効率。結合ドメインとスプライス部位の間にスペーサーを有する全長PTM(PTM+Sp)、スペーサー領域を持たないPTM(PTM+)および標的結合ドメイン(short PTM+)または非標的結合領域(PTM-)を含むshort PTMを、βHCG標的プレmRNAを含有するスプライシング反応物に加えた。これらの産物をプライマーβHCG-FおよびDT-3を用いてRT-PCR増幅した。short PTMを含有する反応物については、DT-3の結合部位がPTAから除かれていることから、リバースPCRプライマーをDT-4とした。
【図３】PTMと標的プレmRNAの間でin vitroトランススプライシングされた産物を示すヌクレオチド配列。図2(レーン2)から466bpのトランススプライシングRT-PCR産物を、5’ビオチン標識したフォワードプライマー(βHCG-F)およびネステッド非標識リバースプライマー(DT-3R)を用いて再増幅した。一本鎖DNAを精製し、毒素特異的DT-3Rプライマーを用いて直接配列決定した。矢印は標的βHCG6エキソン1の最後のヌクレオチドとDT-Aをコードする最初のヌクレオチドの間にあるスプライス部位を示す。
【図４Ａ】スプライシング因子からBPおよびPPTをマスクすることを意図した、PTM分子内塩基対合ステムを示す「セーフティー」PTMおよび変異体の模式図。下線の配列はβHCG6イントロン1相補的標的結合ドメインを表し、イタリックの配列はBPと相同な標的誤対合を示す。
【図４Ｂ】標的に結合した際のオープン配置のセーフティーPTMの模式図。
【図４Ｃ】in vitroトランススプライシング反応を、セーフティーPTMまたはセーフティーPTM変異体をβHCG6標的とともにインキュベートすることで行った。スプライシング反応物を、βHCG-FおよびDT-3Rプライマーを用いたRT-PCRによって増幅し、産物を2.0%アガロースゲルで分析した。
【図５】標的トランススプライシングの特異性は、PTMにセーフティー配列を含めることで増強される。βHCG6プレmRNA(250ng)とβ-グロビンプレmRNA(250ng)を、PTM+SF(セーフティー)またはpcPTM+Sp(線状)RNA(500ng)のいずれかとともにアニーリングした。in vitroトランススプライシング反応およびRT-PCR解析は実験手順に記載したように行い、産物を2.0%アガロースゲルで分離した。RT-PCRに用いたプライマーは示したとおりである。
【図６】漸増するPTM濃度の存在下において、シススプライシングはトランススプライシングにより阻害され、置き換わる。一定量のβHCG6標的プレmRNA(100ng)の存在下、PTM (pcPTM+Sp)RNAの濃度を上昇させつつ(52〜300ng)、in vitroスプライシング反応を行った。シススプライシング産物および非スプライシング産物のRT-PCRにはプライマーβHCG-F(エキソン1特異的)およびβHCG-R2(エキソン2特異的-パネルA)を用い、RT-PCRトランススプライシング産物に対してはプライマーβHCG-FおよびDT-3Rを用いた(パネルB)。反応産物をそれぞれ1.5%および2.0%アガロースゲルで分析した。パネルAでレーン9は300ngのPTMの存在下での60分時点を表し、これはパネルBのレーン10に相当する。
【図７Ａ】PTMは培養したヒト癌細胞においてトランススプライシングが可能である。pcSp+CRMでトランスフェクトした4つのネオマイシン耐性H1299肺癌腫コロニー(無毒なDT-Aを発現する)各々から全RNAを単離し、全RNA 1μgおよび5’ビオチン化βHCG-Fおよび非ビオチン化DT-3Rプライマーを用いてRT-PCRを行った。一本鎖DNAを精製し、配列決定した。
【図７Ｂ】内因性βHCG6標的とCRM197変異体毒素の間でトランススプライシングされた産物のヌクレオチド配列(センス鎖)を示す。2つの矢印はスプライス部位の位置を示している。
【図８Ａ】二重スプライシングプレ治療mRNAの模式図。
【図８Ｂ】二重スプライシングPTMの選択的トランススプライシング。PTM濃度を変えることで、PTMを標的の5’スプライス部位か3’スプライス部位のいずれかにトランススプライシングすることができる。
【図９】エキソンのタグ付けのためのPTM分子の使用を示した図。2例のPTMを示す。左側のPTMは標的プレmRNAの3’スプライス部位へ非特異的にトランススプライシングする能力がある。他方、右側のPTMは標的プレmRNAの5’スプライス部位へ非特異的にトランススプライシングするようにデザインされている。PTMにより媒介されるトランススプライシング反応の結果、エキソンの5’または3’側のいずれかに特定のタグを含んでなるキメラRNAが得られる。
【図１０Ａ】lacZノックアウトモデルで用いる構築物の模式図。標的lacZプレmRNAはlacZの5’断片を含み、次にβHCG6イントロン1とlacZの3’断片(標的1)が続く。このモデル系で用いるPTM分子は、pPTM+SPをPstIおよびHindIIIで消化し、DT-A毒素をβHCG6エキソン2で置き換えることにより作製した(pc3.1PTM2)。
【図１０Ｂ】スプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングによるβ-Gal活性の回復を示した模式図。lacZノックインモデル(pc.3.1 lacZ T2)で用いる構築物の模式図。このlacZ標的プレmRNAは、3’スプライス部位の4コドン後に2つの停止コドン(TAA TAA)をインフレームで含むこと以外は、ノックアウト実験に用いる標的プレmRNAと同じである。このモデル系で用いるPTM分子は、pPTM+SPをPstIおよびHindIIIで消化し、DT-A毒素をlacZの機能性3’断片で置き換えることにより作製した。
【図１１Ａ】lacZノックアウトモデルを用いた場合のシスおよびトランススプライシングを示したもの。LacZスプライス標的1プレmRNAおよびPTM2を293T細胞へ同時トランスフェクトした。次に全RNAを単離し、適当な特異的プライマーを用いてシススプライシング産物およびトランススプライシング産物に関してPCRにより分析した。増幅したPCR産物を2%アガロースゲルで分離した。
【図１１Ｂ】β-ガラクトシダーゼ活性の分析。293細胞をlacZ標的2 DNA単独でトランスフェクトした。
【図１１Ｃ】β-ガラクトシダーゼ活性の分析。293細胞をlacZ標的2 DNAとPTM1でトランスフェクトした。
【図１２Ａ】正確なトランススプライシングを示すトランススプライシングされた分子のヌクレオチド配列。
【図１２Ｂ】シススプライシング産物およびトランススプライシング産物のヌクレオチド配列。これらのヌクレオチド配列は異なるスプライシング反応の各々について期待される配列であった。
【図１３】嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質(CFTR)遺伝子の修復に関する遺伝子修復モデル。
【図１４】外因的に加えられたCFTRミニ遺伝子標的とPTMの間のトランススプライシングのRT-PCRを示したもの。プラスミドを293胚性腎細胞へ同時トランスフェクトした。RT-PCR反応に用いたプライマー対は各レーンの上に示されている。各レーンの下方のバンド(471bp)はトランススプライシング産物を示す。レーン1の下方のバンド(471bp)を2% Seakemアガロースゲルから精製し、そのバンドのDNA配列を決定した。
【図１５Ａ】トランススプライシング産物 (図14に示されているレーン1の下方のバンド)のDNA配列。このDNA配列はF508コドン(CTT)の存在を示し、エキソン9配列はエキソン10配列およびHisタグ配列と連続している。
【図１５Ｂ】図15Aに示されるトランススプライシング産物のDNA配列の続き。
【図１６】エキソン10にF508の欠失を有する外因的に加えられたCFTR標的分子の修復に関する模式図。
【図１７】二重スプライシングPTMを用いたエキソン10置換による内因性CFTR転写物の修復。二重スプライシングPTMを用いることで、極めて短いPTM分子によるΔ508変異の修復が可能となる。
【図１８】lacZ 5’エキソン-CFTRミニイントロン9-CFTRエキソン10(Δ508)-CFTRミニイントロン10、続いてlacZ 3'エキソンからなるモデルlacZ標的。PTMの結合ドメインを括弧でくくってある。
【図１９】β-gal機能を回復するようにデザインされた二重トランススプライシングPTMの模式図。
【図２０】DSPTM7とDSCFT1.6標的プレmRNAの結合を示す二重トランススプライシング反応の模式図。
【図２１】DSPTM7の重要な構造エレメント。二重スプライシングPTMは3’および5’双方の機能的スプライス部位ならびに結合ドメインを有する。
【図２２】変異型二重スプライシングPTMの模式図。
【図２３】二重トランススプライシング反応の精度。
【図２４】標的プレmRNAとDSPTM7の間の二重トランススプライシングは全長タンパク質をもたらす。ポリクローナル抗β-ガラクトシダーゼ抗血清を用いた全細胞溶解物のウエスタンブロット分析。
【図２５】二重トランススプライシングによるDSCFT1.6標的プレmRNAとDSPTM7 RNAの間の正確な内部エキソン置換は、機能的に活性なβ-galタンパク質をもたらす。全細胞抽出物を調製し、ONPGアッセイによりβ-gal活性を調べた。
【図２６】3’および5’スプライス部位は二重トランススプライシング反応によるβ-gal機能の回復に不可欠である。
【図２７】二重トランススプライシング：標的およびPTMのタイトレーション。種々の濃度の標的およびPTMを同時トランスフェクトし、β-gal活性の回復を分析した。
【図２８】二重トランススプライシング反応の特異性を調べるためにデザインされた構築物。
【図２９】二重トランススプライシング反応の特異性。
【図３０】二重トランススプライシング事象を媒介するPTMを用いる嚢胞性繊維症遺伝子のトランススプライシング修復。
【図３１】ミニ遺伝子標的の2つのスプライス部位およびエキソン10の一部をマスクする長い結合ドメインを有するPTM。
【図３２】PTMエキソン10(コドンの改変を伴う)へと正確にスプライシングされた標的エキソン9(上のパネル)、PTMのエキソン10中のコドン508(中央のパネル)、および標的エキソン11へと正確にスプライシングされたPTMエキソン10(下のパネル)、を示す単一のPCR産物の配列。修復された標的の配列はRT-PCR、続いてPCRにより作製した。
【図３３】5’エキソン置換を行いうるPTMを用いた嚢胞性繊維症のトランススプライシング修復。
【図３４】異なる結合ドメインを有する3つの異なるPTM分子の模式図。
【図３５】それ自体の結合ドメインによるアンチセンス効果を軽減するように改変されたコドン利用頻度を有するPTMエキソン10の模式図。
【図３６】シスおよびトランススプライシングされた産物の配列。
【図３７Ａ】トランススプライシングによるメッセンジャーRNA修復のモデル系。本研究で用いた欠陥型lacZCF9mスプライス標的の模式図(詳細については「材料および方法」を参照)。BP，分岐点；PPT，ポリピリミジントラクト；ss，スプライス部位およびpA，ポリアデニル化シグナル。
【図３７Ｂ】トランススプライシングドメインの重要な成分を示すプロトタイプPTM、ならびに結合ドメインの長さおよびそれらが標的プレmRNAに結合するおよその位置を示す種々のPTMの図。トランススプライシングドメイン内のユニーク制限部位はN，Nhe I；S，Sac II；K，Kpn IおよびE，EcoR Vである。
【図３７Ｃ】アンチセンス結合によるPTMの結合および標的RNAトランススプライシングによる欠陥型lacZプレmRNAの修復を示す模式図。予測されるシスおよびトランススプライシングされた産物、ならびにLac-9F、Lac-3RおよびLac-5Rのプライマー結合部位が示されている。
【図３８Ａ】lacZメッセンジャーRNAの効率的修復。標的特異的プライマーLac-9F(5’エキソン)およびLac-3R(3'エキソン)を用いてシススプライシング産物を増幅し、一方、標的およびPTM特異的プライマーLac-9F(5’エキソン)およびLac-5R(3'エキソン)を用いてトランススプライシング産物を増幅した(レーン7〜15)。全RNA 25〜50ngを用いて標的シススプライシングを測定し(レーン1〜6)、全RNA 50〜200ngを用いてPTMにより誘導されたRNAトランススプライシングを測定した(レーン7〜12)。レーン13〜15は、トランススプライシングに対する対照lacZCF9でトランスフェクトした細胞に由来する全RNA25〜50ng。
【図３８Ｂ】トランススプライシングによる内因性mRNAの修復。レーン1〜3はPTM-CF14、レーン4〜6はPTM-CF22、レーン7〜9はPTM-CF24、でそれぞれトランスフェクトした細胞由来のRNA。レーン10はモックトランスフェクト細胞由来のRNAであり、レーン11は逆転写反応を省いた対照である。
【図３９】メッセンジャーRNAの修復は全長β-ガラクトシダーゼの合成をもたらす。レーン1はlacZCF9(陽性対照、5μg)、レーン2はlacZCF9m標的単独(25μg)、レーン3はPTM-CF24単独(25μg)、およびレーン4はlacZCF9m標的+PTM-CF24(25μg)。
【図４０Ａ】SMaRTによるメッセンジャーRNAの修復は機能的β-ガラクトシダーゼをもたらす。トランススプライシングにより作製された機能的β-ガラクトシダーゼのin situ検出。上記のように、293T細胞を、lacZCF9m標的単独(パネルA)でトランスフェクトするか(一過性アッセイ)、またはlacZCF9m標的+PTM-CF24(パネルB)発現プラスミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に細胞をPBSですすぎ、β-gal活性についてin situ染色した。
【図４０Ｂ】欠陥型lacZ mRNAの修復は機能的β-ガラクトシダーゼをもたらす。標的およびPTM、lacZCF9m標的またはPTM-CF24プラスミド単独のいずれかでトランスフェクトした細胞由来の抽出物、残りはlacZCF9m標的および示したPTMの1つで同時トランスフェクトした細胞由来のものであった。
【図４０Ｃ】トランススプライシングによる内因性mRNAの修復は機能的β-ガラクトシダーゼをもたらす。内因性lacZCF9mプレmRNA標的を発現する安定した細胞を、上記した「線状」PTM (PTM-CF14、PTM-CF22またはPTM-CF24)でトランスフェクトした。トランスフェクション後、全細胞溶解物を調製し、β-gal活性をアッセイした。示されている結果は2回の独立したトランスフェクションの平均値である。
【図４１Ａ】メッセンジャーRNAの修復は特異的である。lacZHCG1mプレmRNAと「線状」PTMの間の非特異的トランススプライシングを評価するための実験的戦略。
【図４１Ｂ】結合ドメインの延長はトランススプライシングの特異性を増強する。レーン1〜3はPTM-CF14、4〜6はPTM-CF22、7〜9はPTM-CF24、10〜12はPTM-CF26および13〜15はPTM-CF27。
【図４１Ｃ】極めて長い結合ドメインを有するPTMが特異性を増強しうる。全細胞抽出物(5μl)を液相でβ-gal活性に関してアッセイし、比活性を算出した。β-gal活性をモックに対して正規化した。なお、示された結果は2回の独立したトランスフェクションの平均値である。対照、lacZHCG1m標的単独でトランスフェクトした細胞由来の抽出物、他はlacZHCG1m標的および線状PTMの1つで同時トランスフェクトしたものであった。
【図４２】トランススプライシングドメイン(下線)およびCFTR遺伝子のエキソン1〜10のコード配列を示すCFTR PTM30(5’エキソン置換PTM)の全配列。エキソン10で改変されたコドンは下線を引き、太字で示されている。
【図４３Ａ】153塩基対のPTM24結合ドメイン。
【図４３Ｂ】トランススプライシングドメイン(下線)およびCFTR cDNAのエキソン10〜24のコード配列を示すCFTR PTM24(3'エキソン置換PTM)の全配列。コード配列の末尾にヒスチジンタグと翻訳停止コドンがある。
【図４４Ａ】エキソン16〜26の正常マウス配列を含むマウス因子VIII PTMの詳細な構造。BGH=ウシ成長ホルモン3'UTR(非翻訳配列)；結合ドメイン=125bp；クリプティック部位を除去するための塩基の変更を円で囲んである：F5、F6、F7、F8=プライマー部位。
【図４４Ｂ】マウス因子VIII遺伝子における結合ドメインの範囲を示す模式図。
【図４４Ｃ】PTM結合ドメインの上流の配列でクリプティックドナー部位を除去するためのAAVベクターpDLZ20およびpDLZ20-M2のプロモーターの変更。
【図４４Ｄ】因子VIII修復モデル。マウス因子VIII遺伝子のイントロン15の3’スプライス部位に結合するPTMの模式図。
【図４５】トランススプライシングドメインが除去されたF8 PTMの模式図。これは修復がトランススプライシングの結果であるかどうかを調べるための対照PTMに相当する。
【図４６】因子VIIIノックアウトマウスにおける因子VIIIの修復を示すデータ。コアテストアッセイを用いて、血液を因子VIII活性に関して調べた。
【図４７Ａ】エキソン16〜26の正常配列およびC末端FLAGタグを含むマウス因子VIII PTMの詳細な構造。BGH=ウシ成長ホルモン3"UTR；結合ドメイン=125bp。
【図４７Ｂ】エキソン23〜26の正常配列を含むヒトまたはイヌ因子VIII PTMの詳細な構造。
【図４８】HPV-16の転写マップ。
【図４９】PTMによる16型ヒトパピローマウイルス発現の破壊。16型HPV標的プレmRNAの3’スプライス部位に結合するHPV-PTM2の模式図。
【図５０】複数のPTMがHPV E7にターゲットされる、E7ターゲッティング戦略。
【図５１】結合ドメイン、分岐点およびポリピリミジントラクトを示すPTMデザイン。
【図５２】(A) 409位の3’ssにターゲッティングされる80bp結合ドメインを有するHPV-PTM1。(B) 409位の3’ssにターゲッティングされる149bp結合ドメインを有するHPV-PTM2。
【図５３】HPV-PTM3および4の結合ドメイン。
【図５４】HPV-PTM5および6の結合ドメイン。太字のヌクレオチドはPTMのクリプティックスプライシングを避けるために改変されている。
【図５５】HPV-PTMターゲッティングドメインの位置。
【図５６】293T細胞におけるHPV-PTMのトランススプライシング効率。293T細胞を、2μgのp1059標的および1.5μgのPTM発現プラスミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、全RNAを単離し、RT-PCRによって分析した。標的特異的プライマーoJMD15およびJMD16を用いてシススプライシング産物を増幅し(上のパネルのレーン1〜11)、一方、標的およびPTM特異的プライマーoJMD15およびLac-6Rを用いてトランススプライシング産物を増幅した(下のパネルのレーン1〜12)。従って、レーン13〜14(上のパネル)で、lacZCF9ならびにHPV-PTM1および2でそれぞれトランスフェクトした細胞から単離されたRNAは、HPV-PTMの特異性を評価するための対照として利用できる。
【図５７】HPV標的プレmRNAとPTMの間のトランススプライス部位を示すヌクレオチド配列。RT-PCR産物を精製し、プライマーLac5R(PTMの3'エキソンに結合する)を用いて直接配列決定した。矢印はHPVプレmRNA標的のE6とPTMのlacZ 3'エキソンの間のトランススプライス部位を示す。
【図５８】293細胞におけるトランススプライシング(同時トランスフェクション)。トランススプライシング効率はリアルタイムQRT-PCRを用いて定量した。
【図５９】内因性プレmRNA標的へのHPV-PTMのトランススプライシング効率。SiHaおよびCaSki細胞を、1.5μgのHPV-PTM1、2またはCFTR標的PTM14または27発現プラスミドでトランスフェクトした。トランススプライシングの48時間後、全RNAを単離し、RT-PCRにより分析した。内因性HPV標的とPTMの間のトランススプライシングを、標的およびPTM特異的プライマーoJMD15およびLac-16Rを用いて検出した。HPV-PTMでトランスフェクトした細胞では、予測されるトランススプライシング産物(418bp)が明らかに見られるが(レーン2〜3および5〜7)、対照では見られない(レーン1および4)。さらに、レーン8でも非特異的トランススプライシングのためトランススプライシングが検出される。
【図６０】SiHa細胞におけるHPV-PTM1の正確なトランススプライシング。標的プレmRNAは内因性mRNAであった。トランススプライシングされたキメラRNAの配列解析は、トランススプライシングが正確であることを示している。
【図６１】リアルタイムQRT-PCRを用いたSiHa細胞におけるトランススプライシング効率の定量。
【図６２】SiHa細胞におけるHPV-PTM1、HPV-PTM5、およびHPV-PTM6のトランススプライシング効率。全RNAの分析をRT-PCRにより行った。
【図６３】ポリピリミジントラクトの欠失はトランススプライシングを無効にする。レーン1および2は変異型HPV-PPTでトランスフェクトした細胞由来のRNAを示す。レーン3および4はHPV-PTM5プラスミドでトランスフェクトした細胞由来のRNAを示す。トランススプライシングから得られた269bpの産物が検出される。
【図６４】HPVミニ遺伝子標的の5’スプライス部位に結合するPTMおよび得られるトランススプライシングされたキメラRNAの模式図。
【図６５】二重トランススプライシング。HPVミニ遺伝子標的の3’および5’スプライス部位に結合する二重トランススプライシングPTMの模式図。得られるトランススプライシングされたmRNAを示す。
【図６６】(A) 3’エキソン置換によるトランススプライシング。HPVミニ遺伝子標的の3’スプライス部位に結合するPTMの模式図。(B) 5’エキソン置換によるトランススプライシング。HPVミニ遺伝子標的の5’スプライス部位に結合するPTMの模式図。
【図６７】内部エキソン置換のためにデザインされた二重スプライシングHPV-PTMの模式図。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６６】
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【図６７】
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