(57)【要約】    【課題】  発酵法により、アミノ酸の副生を減少させて、非アミノ有機酸を効率よく製造する。    【解決手段】  グルタメートシンターゼ及びグルタミンシンセターゼのいずれか一方又は両方の活性、並びにグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸などの非アミノ有機酸を生成させる。より好ましくは、グルタメートシンターゼ及びグルタミンシンセターゼのいずれか一方又は両方の活性、並びにグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化するように改変され、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強され、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸などの非アミノ有機酸を生成させる。    【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタメートシンターゼ及びグルタミンシンセターゼのいずれか一方又は両方の活性、並びにグルタメートデヒドロゲナーゼ活性がそれぞれ非改変株に比べて３０％以下に低減化するように改変された細菌またはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、該反応液中に非アミノ有機酸を生成蓄積させ、該反応液から非アミノ有機酸を採取することを特徴とする非アミノ有機酸の製造方法。
【請求項２】
前記細菌が、グルタメートシンターゼ活性及びグルタメートデヒドロゲナーゼ活性がそれぞれ非改変株に比べて３０％以下に低減化するように改変された細菌である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、エシェリヒア属細菌、ラクトバチルス属細菌、およびアクチノバチルス属細菌よりなる群から選ばれるいずれかの細菌である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が、該酵素の非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記有機原料が、グルコースまたはシュークロースである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
非アミノ有機酸がコハク酸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び前記工程で得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネ型細菌等の細菌を用いた非アミノ有機酸の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum（アナエロビオスピリラム）属、Actinobacillus（アクチノバチルス）属等の嫌気性細菌が用いられている（例えば、特許文献１又は２、非特許文献１参照）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。
【０００３】
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（例えば、特許文献３又は４参照）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、好気性細菌を用いた場合に、目的の非アミノ有機酸以外にアミノ酸が副生するということも、非アミノ有機酸の収量をさらに向上させる上での改善すべき点であった。また、非アミノ有機酸の製造に用いる微生物については、遺伝子改変微生物（特許文献4又は5参照）も報告されていたが、非アミノ有機酸の収量などのさらなる改善のために、新たな微生物の創出が求められていた。
【０００４】
一般に、微生物は、アンモニアを同化してグルタミン酸を生成するために少なくとも以下の２種類の生合成経路を持つことが知られている。前者はグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）によりアンモニアとα−ケトグルタル酸からグルタミン酸を生成する経路（GDH経路）で、後者は、先ずグルタミンシンセターゼ（GS）によりアンモニアとグルタミン酸からグルタミンを生成し、生じたグルタミンとα−ケトグルタル酸からグルタメートシンターゼ（GOGAT）によって２分子のグルタミン酸を生成する経路（GS-GOGAT経路）である（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
コリネ型細菌において、GDH遺伝子単独の欠損株（例えば、非特許文献３参照）、又はGOGAT遺伝子単独の欠損株（例えば、非特許文献４参照）が報告されているが、これらの株はいずれも、グルタミン酸要求性を示さず、非欠損株と比較してもグルタミン酸生成においても大きな変化はなかった。その理由として、上記２種類の生合成経路のうちのもう一方の生合成経路によってグルタミン酸が生成した可能性、または、他のアンモニア同化酵素およびアミノ基転移酵素、例えばアラニンデヒドロゲナーゼなどによってグルタミン酸が生成した可能性などが考えられるが、実際は明らかになっていない（例えば、非特許文献５参照）。従って、これらの知見のみからは、上記２種類のアンモニア同化経路の両方を破壊した場合に、グルタミン酸生産が実際に低減されるか否かは予測困難であった。したがって、グルタミン酸生合成経路を効率的に破壊する方法は知られていなかった。
【０００６】
グルタミン酸生合成系はコハク酸の前駆体の一つであるα‐ケトグルタル酸を基質としてグルタミン酸を合成するものの、コハク酸生合成系は複雑であって、コハク酸はα‐ケトグルタル酸以外にもフマル酸やイソクエン酸などを前駆体として合成されるため、コハク酸生合成系とグルタミン酸生合成系との関係は十分に検討されてこなかった。したがっ
て、上記のようなグルタミン酸生合成系遺伝子の破壊株がコハク酸などの非アミノ有機酸の製造に用いられることはなかった。
【特許文献１】米国特許第５，１４２，８３４号公報
【特許文献２】米国特許第５，５０４，００４号公報
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号公報
【特許文献４】特開平１１−１９６８８８号公報
【特許文献５】特開平１１−２０６３８５号公報
【非特許文献１】International Journal of Systematic Bacteriology, vol. 49, p207-216、 1999年
【非特許文献２】Gottschalk G.著、Spriner-Verlag 2nd ed., New York, N.Y.、1986年
【非特許文献３】Bormann-El Kholy E.R., E.R., Eikmanns B.J., Gutmann M., Sahm H.著、Appl.Environ.Microbiol.、vol. 59、p2329-2331、1993年
【非特許文献４】Beckers G., Nolden L., Burkovski A.著、 Microbiology、 vol. 147、p2961-2970、2001年
【非特許文献５】M. Tesch, A.A. de Graaf, and H. Sahm.著、 Applied and Environmental Microbiology vol. 65、p1099-1109、1999年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、アミノ酸の副生を減少させてより生産効率の高い非アミノ有機酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、グルタメートシンターゼ（GOGAT）活性及びグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化するようにに改変された細菌あるいはその処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、副生アミノ酸が減少するとともに、非アミノ有機酸の生成量が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  グルタメートシンターゼ及びグルタミンシンセターゼのいずれか一方又は両方の活性、並びにグルタメートデヒドロゲナーゼ活性がそれぞれ非改変株に比べて３０％以下に低減化するように改変された細菌またはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、該反応液中に非アミノ有機酸を生成蓄積させ、該反応液から非アミノ有機酸を採取することを特徴とする非アミノ有機酸の製造方法。
（２）  前記細菌が、グルタメートシンターゼ活性及びグルタメートデヒドロゲナーゼ活性がそれぞれ非改変株に比べて３０％以下に低減化するように改変された細菌である、（1）の製造方法。
（３）  前記細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、エシェリヒア属細菌、ラクトバチルス属細菌、およびアクチノバチルス属細菌よりなる群から選ばれるいずれかの細菌である（１）または（２）の製造方法。
（４）  前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が、該酵素の非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）〜（３）のいずれかの製造方法。
（５）  前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌である、（１）〜（４）のいずれかの製造方法。
（６）  有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する、（１）〜（５）のいずれかの製造方法。
（７）  前記有機原料が、グルコースまたはシュークロースである、（１）〜（６）のいずれかの製造方法。
（８）  非アミノ有機酸がコハク酸である、（１）〜（７）のいずれかの製造方法。
（９）  （１）〜（８）のいずれかの方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び前記工程で得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
グルタメートシンターゼ及びグルタミンシンセターゼのいずれか一方又は両方の活性、並びにグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化するように改変された細菌あるいはその処理物を用いて非アミノ有機酸を製造することにより、副生アミノ酸を減少させ、非アミノ有機酸の生成量を増大させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１２】
１．本発明に使用する細菌
本発明の製造方法に用いることのできる細菌は、グルタメートシンターゼ（GOGAT）及びグルタミンシンセターゼ（GS）のいずれか一方又は両方の活性、並びにグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化するように改変された細菌であり、非アミノ有機酸生産能を有する細菌である。このような細菌は、本来的に非アミノ有機酸生産能を有する細菌又は育種により非アミノ有機酸生産能を付与された細菌において、上記のような改変を行ったものでもよいし、上記のような改変を行うことにより非アミノ有機酸生産能を有するようになったものでもよい。ここで、「非アミノ有機酸生産能を有する」とは、該細菌を培地中で培養したときに該培地中に非アミノ有機酸を生成蓄積することができることをいう。非アミノ有機酸はアミノ酸以外の有機酸を意味するが、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸又はピルビン酸が好ましく、コハク酸がより好ましい。
【００１３】
この細菌は、以下に示すような細菌を親株として用い、該親株を改変することによって得ることができる。親株の種類は特に限定されないが、コリネ型細菌（Coryneform Bacterium）、バチルス（Bacillus）属細菌、リゾビウム（Rhizobium）属細菌、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌又はアクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌が好ましく、コリネ型細菌がより好ましい。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium  glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium  flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium  ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium  lactofermentum）に属する微生物が挙げられる。
【００１４】
本発明に用いる細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of
Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそ
れぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
【００１５】
また、親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【００１６】
本発明に用いる細菌は、上記のような親株を、グルタメートシンターゼ（GOGAT）及びグルタミンシンセターゼ（GS）のいずれか一方又は両方の活性、並びにグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化するように改変することによって得ることができる。すなわち、本発明に用いる細菌としては、GOGAT及びGDHの活性が低減化するように改変された菌株、GS及びGDHの活性が低減化するように改変された菌株、並びに、GOGAT、GS及びGDHの活性が低減化するように改変された菌株を挙げることができる。
【００１７】
なお、「グルタメートシンターゼ活性」とは、グルタミンをα−ケトグルタル酸とグルタミン酸に変換する反応を触媒する活性、「グルタミンシンセターゼ活性」とは、グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを生成する反応を触媒する活性、「グルタメートデヒドロゲナーゼ活性」とは、α−ケトグルタル酸とアンモニアからグルタミン酸を生成する反応を触媒する活性をそれぞれ言う。
【００１８】
「グルタメートシンターゼ活性が低減化する」、「グルタミンシンセターゼ活性が低減化する」、「グルタメートデヒドロゲナーゼ活性が低減化する」とは、これらの酵素の非改変株と比較してこれらの酵素の活性が低減化されていることをいう。これらの酵素の活性は、それぞれ非改変株の３０％以下に低減化されていることが好ましく、１０％以下に低減化されていることがより好ましい。これらの酵素活性は完全に消失していてもよい。なお、グルタメートシンターゼ及びグルタメートデヒドロゲナーゼの活性は、それぞれ後述の実施例3又は4に示すようなNADHの減少に基く方法によって測定することができる。また、グルタミンシンセターゼ活性はJournal of Fermentation and Bioengineering vol 70, p182-184（1990年）に記載の方法によって測定することができる。なお、本明細書において、「非改変株」とは、改変株の元になった株そのものである必要はなく、同種の野生株や上述したような親株であってもよい。
【００１９】
グルタメートシンターゼ（GOGAT）活性及び／又はグルタミンシンセターゼ（GS）活性、及びグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化された株の作製は、公知の相同組み換え法、例えば、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、ＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）により該遺伝子を破壊することによって行うことができる。具体的な製造方法としては、GOGATについては本明細書実施例３に、GDHについては実施例４に、それぞれ記載されたような方法が挙げられる。一方、GS遺伝子の破壊についても、ＧＳ遺伝子の配列は公知であるため（GenBank  Accession No.AP005281の塩基番号11680〜13113又は25666〜27006）、この遺伝子を用いてGOGATやGDHと同様にして行うことができる。
【００２０】
また、上記酵素活性の低減化は、PCR法や変異剤処理などの公知の変異導入法によっても行うことができる。具体的には、PCR法によって酵素の活性部位をコードする領域に変異を導入し、得られた変異遺伝子を親株に導入することによって得ることができる。また、親株を、紫外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン(NTG)もしくはＥＭＳ（エチルメタンスルフォネート）などで変異処理し、得られた変異株から上記酵素の活性が低減化した細菌を選択することによっても得ることができる。なお、GOGAT、GS、及びGDH遺伝子の破壊又は変異導入はいずれの遺伝子を先に行ってもよい。
【００２１】
さらに、本発明に使用する細菌は、グルタメートシンターゼ（GOGAT）活性及び／又はグルタミンシンセターゼ（GS）活性、及びグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性の低減化に加えて、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された細菌であってもよい。このような細菌は、非アミノ有機酸がコハク酸である場合に特に有効である。このような細菌は、例えば、後述の実施例２のようにしてLDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、さらに該細菌のGOGAT遺伝子及び／又はGS遺伝子、及びGDH遺伝子を上述の方法により破壊することにより得ることができる。ただし、LDH活性低減化のための改変操作と、グルタメートシンターゼ（GOGAT）活性及び／又はグルタミンシンセターゼ（GS）活性、及びグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性低減化のための改変操作はいずれを先に行ってもよい。
【００２２】
「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化された」とは、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に消失していてもよい。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化した変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、本明細書実施例２に記載のＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et
al. Gene 145 (1994) 69-73）等が挙げられる。
【００２３】
また、本発明に用いる細菌は、グルタメートシンターゼ（GOGAT）活性及び／又はグルタミンシンセターゼ（GS）活性、及びグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化に加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌であってもよい。「ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強される」とは、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して好ましくは１００％以上、より好ましくは３００％以上増加していることをいう。ピルビン酸カルボキシラーゼの活性は例えば、後述の実施例６のようなNADHの減少を測定する方法により測定することができる。このような細菌は、例えば、GOGAT遺伝子及び／又はGS遺伝子、およびGDH遺伝子を破壊されたコリネ型細菌に、ＰＣ遺伝子を導入することにより得ることができる。なお、ＰＣ遺伝子の導入とこれらの遺伝子を相同組み換えにより破壊する改変操作はいずれの操作を先に行ってもよい。
【００２４】
PC遺伝子の導入は、例えば、特開平１１−１９６８８８号公報に記載の方法と同様にして、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）遺伝子をコリネ型細菌中で高発現させることにより行うことができる。具体的なＰＣ遺伝子遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株由来のPC遺伝子（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927、GenBank  Database  Accession  No.AP005276（配列番号２２）などを用いることができる。ＰＣ遺伝子を包含するＤＮＡ断片は、コリネバクテリウム・グルタミカム染色体ＤＮＡから単離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。また、前記の如くコリネ型細菌染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、配列番号１５の塩基配列において、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる
。さらに、配列番号１５の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または配列番号１５の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAであって、PC活性を有するタンパク質をコードするDNAも好適に用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２５】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト  ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
【００２６】
上述したようなＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。例えば、後述の実施例３に記載するようなＴＺ４プロモーターが挙げられる。
【００２７】
ＰＣ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
【００２８】
このようなプラスミドベクターの適当な部位にＰＣ遺伝子を挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、ＰＣ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、PC活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でPC遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。
【００２９】
本発明に用いる細菌は、グルタメートシンターゼ（GOGAT）活性及び／又はグルタミンシンセターゼ（GS）活性、及びグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化するように改変され、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強され、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された細菌が特に好ましい。このような細菌は、例えば、LDH遺伝子、GOGAT遺伝子及び／又はGS遺伝子、及びGDH遺伝子を破壊されたコリネ型細菌を、ＰＣ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。なお、これらの改変操作はいずれの操作を先に行ってもよい。
【００３０】
２．本発明の製造方法
本発明の製造方法は、上記細菌またはその処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、非アミノ有機酸を生成させる事を特徴とする非アミノ有機酸の製造方法である。製造する非アミノ有機酸はコハク酸、フマル酸、リンゴ酸又はピルビン酸が好ましく、コハク酸がより好ましい。
【００３１】
非アミノ有機酸の製造に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。種培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収した後に、非アミノ有機酸の製造反応に用いることが好ましい。なお、種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによって非アミノ有機酸を製造してもよいし、予め増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによっても非アミノ有機酸を製造してもよい。
【００３２】
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
【００３３】
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース又はシュークロースが好ましく、特にグルコースが好ましい。
【００３４】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。ま
た、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
【００３５】
上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００３６】
反応液には、例えば上記した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガス（二酸化炭素ガス）を含有させる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させる。
【００３７】
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜10、好ましくはｐＨ６〜9.5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
【００３８】
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
【００３９】
細菌の種培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。
【００４０】
以上のような微生物反応により、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸又はピルビン酸などの非アミノ有機酸が反応液中に生成蓄積する。反応液（培養液）中に蓄積した非アミノ有機酸は、常法に従って、反応液より採取することができる。具体的には、例えば、遠心分離
、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより精製するなどして、非アミノ有機酸を採取することができる。
【００４１】
さらに本発明においては、上記した本発明の方法により非アミノ有機酸を製造した後に、得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行うことにより非アミノ有機酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造される非アミノ有機酸、特にコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。また、本発明の製造法により得られる非アミノ有機酸または該非アミノ有機酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
【００４２】
［実施例］
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムDNAの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
【００４４】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００４５】
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
【００４６】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭGSＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００４７】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
【００４８】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００４９】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝バイオ社製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００５０】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
【００５１】
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝バイオ社：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝バイオ社製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝バイオ社）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
【００５２】
一方、上記（B）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝バイオ社）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
【００５３】
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝バイオ社：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。
【００５４】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝バイオ社）
０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００５５】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【００５６】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝バイオ社製）により５'末端をリン酸化した。
【００５７】
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００５８】
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄIII消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図１に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
【実施例２】
【００５９】
＜ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭGSＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【００６０】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝バイオ社） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００６１】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【００６２】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００６３】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００６４】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
【００６５】
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
【００６６】
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断した実施例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨ（図２）と命名した。
【００６７】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
【００６８】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株（FERM BP-1497）を、常法（Wolf H et al., J. Bacteriol. 1983, Vol. 156 (3), p1165-1170, Kurusu Y et al., Agric. Biol.
Chem. 1990, vol. 54 (2), p443-447）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、得られたプラスミドキュアリング株、すなわち、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株を以後の形質転換に用いた。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【００６９】
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
【００７０】
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。
【００７１】
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
【００７２】
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
【００７３】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【００７４】
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964
)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
【実施例３】
【００７５】
＜GOGAT遺伝子破壊株の作製＞
(Ａ)  GOGAT遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株GOGAT遺伝子の取得は、実施例２（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
【００７６】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭGSＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００７７】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【００７８】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００７９】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝バイオ社製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて大腸菌ベクターｐＨＳＧ３９６（宝バイオ社製）のＨｉｎｃＩＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより、約１．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐGOGAT／３９６と命名した。
【００８０】
（Ｂ）GOGAT遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐGOGAT／３９６を制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより０．４３ｋｂからなるGOGAT遺伝子のコーディング領域を切り出した。残った約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより、約１．２ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐGOGAT／３９６−ｐｓｔと命名した。
【００８１】
次に、上記ｐGOGAT／３９６−ｐｓｔを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩにて切断して生じる約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むGOGAT遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩにて切断した実施例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００８２】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより、約１．２ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔGOGAT（図３）と命名した。
【００８３】
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来GOGAT遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔGOGATを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
【００８４】
GOGAT遺伝子破壊の供試菌株は、実施例２で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株とした。形質転換およびＳａｃＢ遺伝子を利用した選抜方法は、実施例２に記載の方法に従って行った。
【００８５】
この様にして得られた２回目の相同組み換え株の中には、そのGOGAT遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔGOGATに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。GOGAT遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、GOGAT遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号９および配列番号１０）を用いて分析すると、野生型では１６５９ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では１２２９ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＧＯＧＡＴΔＬＤＨ株と命名した。
【００８６】
（Ｄ）ＧＯＧＡＴ活性の測定
上記（Ｃ）で得られたＧＯＧＡＴ遺伝子破壊株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＧＯＧＡＴΔＬＤＨを、グルコース２％を含むA培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液にをＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いＧＯＧＡＴ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液（pH7.5）、1mM ジチオスレイトール、5mM  ２−オキソグルタル酸ナトリウム、5mM Ｌ−グルタミン、0.32 mM NADH、及び無細胞抽出液を含む反応液中において２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。その結果、ＧＯＧＡＴ遺伝子破壊株におけるＧＯＧＡＴ活性は、検出限界の0.001 U/mgタンパク質以下であった。なおＧＯＧＡＴ遺伝子破壊されていないマーカーフリー株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を、Ａ培地を用いて同様に培養した菌体でのＧＯＧＡＴ活性の比活性は、0.017 U/mgタンパク質であった。
【実施例４】
【００８７】
＜グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、実施例２（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム
ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）を用いたＰＣＲによって行った。
【００８８】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭGSＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００８９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【００９０】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【００９１】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝バイオ社製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて大腸菌ベクターｐＨＳＧ３９６（宝バイオ社製）のＨｉｎｃＩＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断することにより、約１．２ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐGDH／３９６と命名した。
【００９２】
（Ｂ）クロラムフェニコール耐性遺伝子の取得
クロラムフェニコール耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝バイオ社製）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３および配列番号１４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。
【００９３】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝バイオ社）
０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【００９４】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【００９５】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）
を用いて行った。回収したクロラムフェニコール耐性遺伝子断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝バイオ社製）により５'末端をリン酸化した。
【００９６】
（Ｃ）グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ａ）で構築したｐGDH／３９６を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断して切り出された約０．９ｋｂのグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を、ｐＨＳＧ２９９（宝バイオ社製）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩ部位に、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて結合させ、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００９７】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで切断することにより、約０．９ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐGDH／２９９と命名した。
【００９８】
次に、ｐGDH／２９９を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断することにより直鎖状化したＤＮＡ断片と上記（Ｂ）で調製したクロラムフェニコール耐性遺伝子断片をライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて結合させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００９９】
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで切断することにより、約１．８ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐGDH８１（図４）と命名した。
【０１００】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐGDH８１を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
【０１０１】
グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊の供試菌株は、実施例４で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔGOGATΔＬＤＨ株とした。形質転換方法は、実施例２に記載の方法に従って行い、カナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地上に生育する株を得た。この様にして得られた株は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔGOGATΔＬＤＨのゲノム上のグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子とｐGDH８１の該遺伝子との間で相同組み換えを一度起こしたと考えられた。
【０１０２】
次に、上記株を、５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールのみを含むLBG液体培地にて一昼夜培養したのち、５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールのみを含むLBG寒天培地に塗抹した。得られた約２０００のコロニーを、常法に従い２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地にレプリカし、３０℃で一昼夜培養した。この結果、クロラムフェニコール耐性の中から、カナマイシンに感受性を示す株を選抜した。
【０１０３】
この様にして得られた株は、2回目の相同組み換えが起こった結果、グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された変異型遺伝子を残し
、カナマイシン耐性遺伝子およびｐＨＳＧ２９９に由来する配列を欠失したものであると考えられる。
【０１０４】
グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの直接的な確認は、グルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号１２および配列番号１５）を用いて分析するとによって行うことができ、野生型からは４０２ｂｐ、クロラムフェニコール耐性遺伝子挿入領域を持つ変異型からは１２９２ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られるはずである。
【０１０５】
上記方法にてクロラムフェニコールに耐性を示し、カナマイシン非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨと命名した。
【０１０６】
（Ｅ）グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）活性の測定
上記（Ｄ）で得られたＧＤＨ遺伝子破壊株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨをグルコース２％、クロラムフェニコール１０μg/ｍＬを含むA培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液にをＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いＧＯＧＡＴ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液（pH8.0）、20mM 塩化アンモニウム、5mM  ２−オキソグルタル酸ナトリウム、0.32 mM NADH、及び無細胞抽出液を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。その結果、ＧＤＨ遺伝子破壊株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨにおけるGDHの比活性は0.012 U/mgタンパク質であった。なお遺伝子破壊されていない親株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔGOGATΔＬＤＨををA培地を用いて同様に培養した菌体でのGDHの比活性は0.795 U/mgタンパク質であった
【実施例５】
【０１０７】
＜コリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、実施例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１６および配列番号１７）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１０８】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭGSＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１０９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
【０１１０】
増幅産物の確認は、２．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片
の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【０１１１】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝バイオ社製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝バイオ社）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１１２】
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
【０１１３】
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１８および配列番号１９）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。
【０１１４】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
【０１１５】
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの組み立て
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２―９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝バイオ社）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。
【０１１６】
ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１１７】
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図５に構築手順を示した）。
【実施例６】
【０１１８】
＜ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、＜実施例２＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（GenBank  Database  Accession  No.AP005276）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号２０および配列番号２１）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭGSＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１１９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝バイオ社）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
【０１２０】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
【０１２１】
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ X-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１２２】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
【０１２３】
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号２２に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であること断定した。
【０１２４】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した＜実施例３＞にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１２５】
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した
。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１（図６）と命名した。
【０１２６】
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨおよびブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨ株およびブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０１２７】
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨ株およびブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【０１２８】
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液にをＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM  Tris/HCl緩衝液（pH7.5）、0.1mg/10ｍＬビオチン、5mM  塩化マグネシウム、50 mM 炭酸水素ナトリウム、5mM ピルビン酸ナトリウム 、5mM アデノシン３リン酸ナトリウム、0. 32 mM NADH、20units/1.5ｍＬリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨ株の無細胞抽出液における比活性は  0.2 U/mgタンパク質であった。なお親株であるブレビバクテリウム・フラバムMJ233/ΔGDHΔGOGATΔＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は、検出限界の0.001 U/mgタンパク質以下であった。
【実施例７】
【０１２９】
＜菌体反応（炭酸アンモニウム中和、嫌気反応）＞
上記実施例７と同様にブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／△ＧＤＨ△ＧＯＧＡＴΔＬＤＨ株を培養し、反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、通気は行わず、毎分２００回転で攪拌しながら反応を行った。この時の糖消費速度は２．０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．２ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７９％であった。アミノ酸生産量は、グルタミン酸０ｇ／Ｌ、アラニン１．３ｇ／Ｌ、バリン０．７３ｇ／Ｌ、ロイシン０ｇ／Ｌであった。
【０１３０】
一方、実施例６で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は１．８ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸
生産速度は０．９３ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７３％であった。アミノ酸生産量は、グルタミン酸０ｇ／Ｌ、アラニン２．０ｇ／Ｌ、バリン１．２ｇ／Ｌ、ロイシン０．１４ｇ／Ｌであった。
【０１３１】
これらの結果より、グルタメートシンターゼ（GOGAT）活性、及びグルタメートデヒドロゲナーゼ（GDH）活性が低減化するように改変されたコリネ型細菌を用いることにより、アラニン、バリン、ロイシン等のアミノ酸の副生を減少させ、コハク酸の生産速度および収率を効率よく生産することができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率で非アミノ有機酸を製造することができる。得られた非アミノ有機酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行うことにより非アミノ有機酸含有ポリマーを製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】プラスミドｐＫＭＢ１の構築手順と制限酵素地図を示す図。
【図２】プラスミドｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨの構築手順を示す図。
【図３】プラスミドｐＫＭＢ１／ΔGOGATの構築手順を示す図。
【図４】プラスミドpGDH８１の構築手順を示す図。
【図５】プラスミドｐＴＺ４の構築手順を示す図。
【図６】プラスミドｐＭＪＰＣ１の構築手順を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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