(57)【要約】【課題】分析物の確実な定量的同定を短い反応時間で可能にし、かつ簡単に製造できる試験エレメントを提供すること。【解決手段】本発明は、試料中の分析物の光学的検出用の試験エレメントに関するものであって、（ａ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、（ｂ）厚さ＜１０μｍ（乾燥）を有する分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｂ）厚さ＜１０μｍ（乾燥）を有する分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む分析物の光学的検出用の試験エレメント。
【請求項２】
担体がプラスチック箔であることを特徴とする請求項１記載の試験エレメント。
【請求項３】
試験試薬が、少なくとも１つの酵素と、酵素反応によって直接的または間接的に検出可能の少なくとも１つの酵素基質とを含むことを特徴とする請求項１または２記載の試験エレメント。
【請求項４】
反応膜の厚さが２〜１０μｍ（乾燥）の範囲であることを特徴とする請求項１、２または３記載の試験エレメント。
【請求項５】
単層反応膜中の試験試薬の濃度が測定信号の強度の最適化によって調節されることを特徴とする請求項１、２、３または４記載の試験エレメント。
【請求項６】
本質的に均一な分析物との反応が試験エレメントの全厚にわたって生じる、単層反応膜中の試験試薬の濃度であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５記載の試験エレメント。
【請求項７】
単層反応膜が多孔性構造を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６記載の試験エレメント。
【請求項８】
孔径が測定信号の強度の最適化によって調節されることを特徴とする請求項７記載の試験エレメント。
【請求項９】
薄膜内への赤血球の浸透が本質的に除外される孔径であることを特徴とする請求項７または８記載の試験エレメント。
【請求項１０】
単層反応膜が微粒の顔料粒子、たとえばＴｉＯ2または／およびＺｒＯ2を基材とする顔料粒子を含有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の試験エレメント。
【請求項１１】
微粒の顔料粒子の平均的直径が＜０．５μｍ、特に０．１μｍおよび０．３μｍのあいだであることを特徴とする請求項１０記載の試験エレメント。
【請求項１２】
単層反応膜が、
（ｉ）中粒または／および粗粒の顔料粒子、たとえばＴｉＯ2、ＢａＴｉＯ3、ＺｒＯ2、ＺｒＳｉＯ3または／およびＢａＳＯ4を基材とする顔料粒子、または／および
（ｉｉ）非反射填料、たとえばＳｉＯ2または／およびケイ酸塩または／および水溶性樹脂の中粒または／および粗粒の粒子を含有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１記載の試験エレメント。
【請求項１３】
中粒の粒子の平均的直径が、０．７および＜４μｍのあいだ、特に１および３μｍのあいだの範囲にあることを特徴とする請求項１２記載の試験エレメント。
【請求項１４】
粗粒の粒子の平均的直径が＞４μｍ、特に４および８μｍのあいだの範囲にあることを特徴とする請求項１２または１３記載の試験エレメント。
【請求項１５】
微粒の顔料粒子と、粗粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）とからなる混合物を、特に１：０．２〜１の重量比で含有することを特徴とする請求項１２、１３または１４記載の試験エレメント。
【請求項１６】
微粒の顔料粒子と、中粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）とからなる混合物を、特に１：０．２〜１の重量比で含有することを特徴とする請求項１２、１３または１４記載の試験エレメント。
【請求項１７】
微粒の顔料粒子と、粗粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）および中粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）とからなる混合物を、特に１：０．１〜０．９：０．１〜０．９の重量比で含有することを特徴とする請求項１２、１３または１４記載の試験エレメント。
【請求項１８】
試験試薬がポリマーマトリックス中に存在することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７記載の試験エレメント。
【請求項１９】
反射測光法により分析物を検出するための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８記載の試験エレメント。
【請求項２０】
蛍光測定法により分析物を検出するための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８記載の試験エレメント。
【請求項２１】
可視領域または／およびＵＶ領域において検出するための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載の試験エレメント。
【請求項２２】
ＮＡＤＨを検出するための請求項２１記載の試験エレメント。
【請求項２３】
試験エレメントが５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内での分析物の同定を企図していることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２記載の試験エレメント。
【請求項２４】
（ｃ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｄ）分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む、分析物の光学的検出用の試験エレメントにおいて、
前記試験エレメントが５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内での分析物の同定を企図していることを特徴とする試験エレメント。
【請求項２５】
（ｃ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｄ）分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む、分析物の光学的検出用の試験エレメントにおいて、
反応膜の厚さおよび有孔率と、試験試薬の濃度とが、５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内での分析物の同定が定量的同定に充分である信号強度で生じることを特徴とする試験エレメント。
【請求項２６】
グルコース、乳酸塩、ケトン体および尿素から選ばれる分析物の同定のための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５記載の試験エレメント。
【請求項２７】
血中グルコースの同定のための請求項２６記載の試験エレメント。
【請求項２８】
試験試薬が
（ｉ）グルコース色素酸化還元酵素、または
（ｉｉ）グルコース脱水素酵素から選ばれる酵素系を含むことを特徴とする請求項２７記載の試験エレメント。
【請求項２９】
試料中の分析物の検出方法であって、
（ｃ）請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８記載の試験エレメントと試料の接触工程と、
（ｄ）試料中の分析物濃度の定量的同定工程と、を含む方法。
【請求項３０】
定量的同定が光学的方法によって、特に反射測光法または蛍光測定法による検出によって行われることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
定量的同定が５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内で行われることを特徴とする請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
グルコースの検出のための請求項２９、３０または３１記載の方法。
【請求項３３】
試料中の分析物の光学的検出用の試験装置であって、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８記載の試験エレメントを含むことを特徴とする試験装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の分析物の光学的検出用の試験エレメントおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料液中の分析物の定性的または定量的同定は、しばしば担体結合式試験方法を使用して実施される。この試験方法において分析物の同定に必須の試薬は、試料が接触させられる固体の試験エレメントの反応層の上またはその中に存在する。試料液中に含有される分析物と試薬とのあいだの反応は、検出可能な信号、特に視覚的または装置を利用して評価できる光学的に検出可能の信号を生じる。
【０００３】
試験エレメントは、しばしば少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、その上に塗布された検出層とから構成されるストリップとして形成されている。しかしながら、たとえば方形または四角形の小板として形成される別の形状をもつ試験エレメントも知られている。以下、呼称「試験エレメント」は任意の形状を含むものとする。
【０００４】
特許文献１に、担体と、検出試薬を含有する少なくとも１つの検出層とから構成される診断用試験エレメントが記載されており、担体上にない前記試験エレメントの表面は被覆層を備えている。この被覆層は、織物体、編物体またはフリースの形態におけるファインメッシュ網状構造から構成できる。プラスチック織物体は、試料液による検出層の迅速な湿潤を達成し、妨害となるクロマトグラフィ効果を避ける（クロマトグラフィ効果の妨害を避ける）ために有利な網状構造物として記載されている。分析物の検出のために試験エレメントが試料液中に浸漬される。検出層は、このようにして試験エレメントが吸収できない非常に多量の液体過剰分と接触する。試料液と検出層の各接触時間に応じて様々な強度をもつ信号を観察することができ、そのため定量的評価は制限付きでのみ可能となる。
【０００５】
他方、試験エレメントにとって少なすぎる試料体積は、糖尿病モニタリングにおいて、すなわち糖尿病患者の血液のグルコース濃度に対する定期検査において、しばしば誤った測定値を生じる原因となっている。そのため、試料体積の必要量が可能な限り少ない試験エレメントが現今の開発目的である。しかしながらこのような試験担体は、非常に小さな、たとえば３μｌの試料体積で正確な測定値を与える必要があるだけでなく、該試験担体は、より大きな、たとえば１５〜２０μｌの試料体積でも確実に働き、試料液の保留を可能にしなければならない。
【０００６】
分析物の光学的同定に使用される現今の試験ストリップは、通常、１つの担体上に重ねて塗布される少なくとも２つの反応もしくは検出層を含む。この場合、第１層は試薬層であり、第２層は遮断層とおよび特に反射測光法検出に必要な反射層である。検出反応が現れる試薬層の中に、通常、試薬のほかには填料のみが含有されており、他方、測定光を反射させる遮断もしくは反射層は顔料を含有するものである。これら２層を塗布することによって、約２０〜４０μｍの乾燥層厚が生じる。このような２層構造の例は、特許文献２、特許文献３および特許文献４に記載されている。また種々の市販の試験システムは、このような多層構造、たとえば富士社のシステムＤｒｉｃｈｅｍ１０００が使用されている（ゾンターク、ドライケミカル、１８頁以下、ティエーメ１９８８）。
【０００７】
コダック社の検出システムＥｋｔａｃｈｅｍの場合は、検出試薬が埋設されたゼラチンまたはアガロースからなる薄層中の試料液から分析物の同定が行われる（ゾンターク、ドライケミカル、２３頁以下、ティエーメ１９８８）。
【０００８】
上記先行技術の方法に共通していることは、範囲が１５秒以上になる比較的長い測定時間である。遮断もしくは反応層を約１０μｍ（乾燥）に減少することによって、前記測定時間を約５秒に短縮することができた（特許文献４）。しかしながら、層厚の減少によるさらなる反応時間の短縮は達成できなかった。多層構造をもつ試験エレメントのその他の欠点は、担体上へ層を塗布するための被覆および乾燥工程が何度も実施される必要があり、これが相当な作業コストとなる。
【０００９】
さらにＥｋｔａｃｈｅｍ検出方法の場合は、非常に長いプレインキュベーション時間、すなわち試料塗布と測定とのあいだで３７℃の場合約５分の時間が必要になる。
【００１０】
【特許文献１】ドイツ連邦共和国特許出願公開第２１１８４５５号明細書
【特許文献２】ドイツ連邦共和国特許出願公開第３０４２８５７号明細書
【特許文献３】ヨーロッパ特許出願公開第０８２１２３３号明細書
【特許文献４】ヨーロッパ特許出願公開第０９９５９９４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の基礎におく課題は、分析物の確実な定量的同定を短い反応時間で可能にし、かつ簡単に製造できる試験エレメントを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この課題は、
（ａ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｂ）厚さ＜１０μｍ（乾燥）をもつ分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む、分析物の光学的検出用の試験エレメントによって解決される。
【００１３】
本発明のもう１つの観点は、
（ａ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｂ）分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む、分析物の光学的検出用の試験エレメントにおいて、
前記試験エレメントが５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内での分析物の同定を企図していることを特徴とする試験エレメントに関する。
【００１４】
本発明のもう一つの観点は、
（ａ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｂ）分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む、分析物の光学的検出用の試験エレメントにおいて、
反応膜の厚さおよび有孔率と、試験試薬の濃度とが、５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内での分析物の同定が定量的同定に充分である信号強度で行われるものであることを特徴とする試験エレメントに関する。
【００１５】
さらに、本発明は、
（ａ）本発明に係る試験エレメントと試料の接触工程と、
（ｂ）試料中の分析物濃度の定量的同定工程とを含む試料中の分析物の検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
僅かな厚さをもつ単層反応膜を、特に前記厚さに調整された、反応膜を形成する材料の粒径または／および反応膜中の試薬濃度と組合せて使用することによって、特に約１〜２秒の非常に短い反応時間内での確実な定量的検出を可能にする試験エレメントを得ることができることが明らかになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係る試験エレメントは光学的検出方法、特に反射測光法または蛍光測定法による検出法に好適である。光学的検出は４００〜８００ｎｍの可視領域または／およびＵＶ領域で行うことができる。好ましくは、単層反応膜は特に反射測光法を適用するために多孔性構造を有する。試験試薬は、必要な場合はポリマーマトリックス中に存在していてよい。
【００１８】
本発明に係る試験エレメントの構成要素（ａ）は、少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体である。この担体は、好ましくは液体透過性の担体、たとえばポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステルまたはポリアミドのようなプラスチック箔である。その他の担体材料としては、たとえばガラスが好適である。担体の厚さは一般的に重要でなく、好ましくは１０μｍ〜１ｍｍの範囲にある。
【００１９】
担体は、少なくとも部分的に、すなわち少なくとも分析物の同定に利用する範囲（検出ゾーン）で、光学的に本質的に透明であり、それによって担体を通しての分析物の光学的検出を行うことができる。
【００２０】
試験エレメントの構成要素（ｂ）は、分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜である。試験試薬は、分析物の定性的検出または定量的同定に必要な物質、ただし少なくともその一部、ならびに必要な場合は助剤または／および添加剤を含む。単層反応膜はただ１つの機能層から構成される。単層反応膜の厚さは、好ましくは＜１０μｍである。試験試薬は、好ましくは少なくとも１種の酵素と、酵素反応によって直接的または間接的に検出可能の少なくとも１種の酵素基質、たとえば色原体または蛍光性酵素基質を含有する。
【００２１】
酵素の有利な例は、グルコース検出に使用する酵素、グルコース脱水素酵素、たとえばジアフォラーゼまたはＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素、またはＧｌｕｃ−ＤＯＲ（グルコース色素酸化還元酵素）およびそれらの突然変異体と組合せたグルコース脱水素酵素である。これらの酵素は、必要な場合は組換形態で使用してよい。このような試験試薬は、体液中のグルコース同定、特に血中のグルコース同定に好適である。その他の好ましい分析物はラクテート（乳酸）、３−ヒドロキシ酪酸（ケトン体）または尿酸である。
【００２２】
試験試薬もしくはこれらの成分は、乾燥形態で単層反応膜の中もしくはその表面に存在する。反応膜表面への試験試薬の塗布は、公知の方法にしたがって、たとえば含浸法によって行うことができる。この試験エレメントは、必要な場合はポリマーマトリックス中に存在していてもよく、ポリマーは天然または合成の薄膜形成ポリマー、たとえばポリビニルエステル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸、ポリアクリルエステル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸、ポリメタクリルエステル、ポリビニルアミド、ポリアミド、ポリスチレン、または、たとえばブタジエン、スチレンおよびマレイン酸エステルのコポリマーまたは混合ポリマーである。ポリマーは仕上げ状態で担体に塗布し、または原位置の重合によって、好ましくは試験試薬の存在下に担体上に生成させることができる。さらに反応膜は、１種または複数種の湿潤剤、たとえば特許文献４に記載されているような２種の湿潤剤、顔料または／および膨潤剤、たとえばキサンタンガムまたはメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマーを含有してよい。
【００２３】
単層反応膜中の試験試薬の濃度は、本質的に均一な分析物との反応が本質的に反応膜の全厚にわたって生じることができるように好適に調節される。たとえば試験試薬の高い濃度が高い信号強度も引き起こす、という当業者の仮定に反して、本発明による最適な反応濃度は最大反応濃度と等しくないことが確認された。
【００２４】
高すぎる反応濃度を使用する場合、まず第一に片側のみ（試料供給側）で加速された分析物の変換が行われる。それに対し、他方の側（すなわち担体対向側）では、下層部からの光学的検出において弱い信号強度のみを生じる弱い変換のみが現れる。不適切な反応濃度は、全体的に分析物の弱い変換と共に同様に弱い信号強度を生じる。所定の試験エレメントに対して好適な試薬濃度は、信号強度を試験試薬の濃度の関数として同定することにより簡単な方法で算出することができる。
【００２５】
したがって、有利な一実施形態において、試験エレメントは測定信号の強度の最適化によって調節される試験試薬の濃度を含有する。好ましくは、試験エレメントの所定の有孔率または／および層厚で試験試薬の最適な濃度調節が行われる。
【００２６】
単層反応膜の構造にとり重要なもう１つの特徴は、試料液の透過性である。この透過性は、反応膜を形成する材料の有孔率もしくは粒径の調節によって最適化することができる。好ましくは、その際に赤血球が試験エレメントの上側に保持され、他方、溶解した分析物のような試料成分が反応膜の中に浸入できるように反応膜が形成されている。試験エレメントの中で分析物が試験試薬と反応し、たとえばグルコース同定ＮＡＤＨの例で光学的に検出可能の反応生成物が形成される。その際に上方で試験エレメントに保持される血液と反応膜の内部とのあいだの拡散平衡が調節され、分析物たとえばグルコースが反応膜の内部へ拡散し、検出可能の反応生成物を反応膜から試料の中へ戻して拡散される。拡散平衡を調節する際に初めて分析物の濃度を時間と関係なく測定することができる。したがって、分析物の有孔率は、拡散平衡が可能な限り速く達成されるように選ばれる。またこの場合も最適な有孔率が信号強度の簡単な同定によって算出することができる。
【００２７】
別の有利な一実施態様において単層反応膜の孔径は、測定信号の強度を最適化することによって調節されている。この最適化は、たとえば試験試薬の所定の濃度または／および所定の層厚が使用される条件下で行うことができる。
【００２８】
全体的に、試薬濃度、孔径および層厚は、先行技術で通常行われる仮定とは逆に最適化されることが明らかである。係数相互の整合性は、単層試験エレメントで充分な信号強度を可能にする。
【００２９】
驚くべきことに、そのため突出する測定信号強度は、厚さ＜１０μｍ（乾燥）をもつ単層反応膜の使用下に、好ましくは２〜１０μｍ（乾燥）の範囲および特に有利には５〜８μｍ（乾燥）の範囲で達成することができる。これは、分析物の定量的同定を非常に短い、５秒未満、特に１〜４秒、特に有利には１〜２秒の反応時間内で行うことができるようにする。
【００３０】
有利な一実施態様において本発明に係る試験エレメントは、分析物の反射測光法による検出のために企図されている。この実施態様において単層反応膜は、微粒の顔料粒子、たとえばＴｉＯ2または／およびＺｒＯ2を基材とする顔料粒子を含有する。検出器の方向への測定信号の光学的反射し、それによって信号強度の増大を生じる微粒の顔料粒子の平均的直径は、好ましくは＜０．５μｍ、特に０．１μｍおよび０．３μｍのあいだである。良好な結果は、典型的に市販の二酸化チタン顔料、たとえばクロノス社（レバークーゼン、ドイツ）のＲＮ５６型またはＥ１７１型で存在するように、たとえば約０．２μｍの平均粒径で得られた。
【００３１】
さらに単層反応膜は、好適に中粒または／および粗粒の粒子を含有する。この粒子がなければ、全グルコース測定範囲０〜６００ｍｇ／ｄｌのレミッションのずれは約５％になるだけであり、臨床的に必須である４％以上の精度では場合により充分ではない。この粒子は、好ましくは次の粒子である：（ｉ）中粒または／および粗粒の顔料粒子、たとえばＴｉＯ2または／およびＢａＳＯ4を基材とする顔料粒子、または／および（ｉｉ）非反射填料、たとえばＳｉＯ2または／およびケイ酸塩または／および水溶性樹脂の中粒または／および粗粒の粒子を含有する。
【００３２】
中粒または／および粗粒の顔料粒子は、たとえばＴｉＯ2、ＢａＴｉＯ3、ＺｒＯ2、ＺｒＳｉＯ3または／およびＢａＳＯ4から選択される。非反射填料の中粒または／および粗粒の粒子は、たとえばＳｉＯ2（たとえばデグッサ社の沈殿ケイ酸ＦＫ３２０）、ケイ酸塩（たとえばデグッサ社のトランスパフィル）または不溶性有機樹脂（たとえばＢＡＳＦ社、ルードヴィッヒスハーフェンのコリドンＣＬ−Ｍのような架橋結合ポリビニルピロリドン）から選択される。中粒径の粒子の平均的直径は、好ましくは０．７および＜４μｍのあいだ、特に１および３μｍのあいだの範囲にある。粗粒の粒子の平均的直径は、好ましくは＞４μｍ、特に４および８μｍのあいだの範囲にある。
【００３３】
有利な一実施形態において、試験エレメントは微粒の顔料粒子と、粗粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）とからなる混合物を、特に１（微粒の顔料粒子）：０．２〜１（粗粒の粒子）の重量比で含有する。
【００３４】
別の有利な一実施態様において、試験エレメントの単層反応膜は、微粒の顔料粒子と、中粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）とからなる混合物を、特に１（微粒の粒子）：０．２〜１（中粒粒径の粒子）の重量比で含有する。
【００３５】
別の有利な一実施態様において、試験エレメントは微粒の顔料粒子と、粗粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）および中粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）とからなる混合物を、特に１（微粒の粒子）：０．１〜０．９（粗粒の粒子）：０．１〜０．９（中粒粒径の粒子）の重量比で含有する。
【００３６】
特に顔料としてのＺｒＯ2と、上記の中粒または／および粗粒の粒子を使用する場合、ＵＶ領域における測光法による検出、たとえば反射測光法および蛍光測定法による３４０〜３７０ｎｍでのＮＡＤＨ検出に好適である本発明に係る試験エレメントが得られる。
【００３７】
蛍光測定法により分析物を検出する場合は、顔料を含有する反応膜を使用する必要がない。しかしながらこの場合にも、測定時間および信号強度の最適化を薄膜の層厚、試薬濃度および有孔率によって同定できることは明らかである。
【００３８】
単層反応膜は公知の方法にしたがって担体上に塗布してよい。最も簡単な実施態様において、単層反応膜に必要な被覆物質は所望の層厚で、たとえば注入、ブラシまたはスプレッドナイフによる塗布、ローラ塗布または前記方法の組合せによって担体上に付与され、乾燥される。担体上の反応膜の固定は、同様に公知の方法にしたがって、たとえば粘着箔もしくは接着テープによって行うことができる。
【００３９】
担体および単層反応膜のほかに試験エレメントは、さらに別の要素を含有してもよい。このように試料液を均一かつ可能な限り迅速に反応膜に供給し、もしくは必要な場合は複数の、並列に担体上に存在する該試料液を反応膜上に均一に分布する開張台を反応膜上に設けることができる。この開張台には、必要な場合さらに分析物試料の過剰分を試験エレメントから導出する課題が付与される。
【００４０】
試験エレメントは、さらに試料材料用の塗布領域、たとえば試験エレメントの試料塗布領域から単層反応膜上の検出ゾーンへの試験エレメントの液体輸送に利用される毛管間隙もしくは毛管通路を入れてもよい。そのほかに、保護キャップ、スペーサ、粘着層ならびに観察−および測定開口部を設けてもよい。好適な試験エレメントの構造に関しては、ヨーロッパ特許出願公開第０９９５９９４号明細書および国際特許出願公開第９９／２９４２９号を参照できる。
【００４１】
本発明に係る分析物の検出方法は、本発明に係る試験エレメントと試料の接触させ、試料中の分析物濃度の定性的検出または定量的同定を含む。定量的同定は、好ましくは光学的方法によって、特に反射測光法および蛍光測定法による検出によって行われる。さらに、定量的同定は５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内に行うことが好ましい。
【００４２】
この方法を実施するために、試料液が試験エレメントに、たとえば反応膜から離間している開張台側に塗布され、好適には、開張台を通して到来する液体が反応膜を完全に満たす量の試料液が塗布される。試料液として、特に血液、血漿、血清、尿、唾液等の体液が対象となる。血液または血液から誘導される血漿または血清ならびに尿のような液体は、特に好ましい試料液である。
【００４３】
反応膜中に現れる試験試薬と分析物とのあいだの反応によって試料液中の分析物の濃度と相関関係にある測定信号が生じる。この測定信号は、好ましくは色の変化である。色の変化とは、色の形成、色の損失または色の変化である。この色の変化は視覚的にまたは反射側光法において使用される適当な検出器による装置を用いて、定量的に評価される。また、分析物含有量の直接的表示を測定装置のソフトウエアを介して実行してもよい。別の有利な一実施態様において、この信号は、励起波長をもつ光の試験エレメントの照射と、試料から照射される放射波長をもつ光の検出とによって生じる蛍光発光である。
【００４４】
さらに本出願は、以下の例によってより詳しく説明する。
【実施例】
【００４５】
例１：ＰＱＱ依存性のグルコース脱水素酵素によるグルコースの反射測光法による同定用試験エレメント
被覆物質は、以下の成分から−純物質としてまたは原液の形態で−ビーカーの中で攪拌して混合される；
【００４６】
水                                                            ８０．５０ｇ
メチルビニルエーテル−マレイン酸−コポリマー                    １．３６ｇ
水酸化ナトリウム                                                ０．４９ｇ
テトラエチルアンモニウムクロリド                                ０．６８ｇ
Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−グルカミド                        ０．３４ｇ
ナトリウム−Ｎ−メチル−Ｎ−オレオイル−タウラート              ０．０３ｇ
沈殿ケイ酸ＦＫ３２０ＤＳ（デグッサ社、平均的直径５μｍ）        ６．０３ｇ
二酸化チタンＥ１７１（クロノス社、平均的直径０．２μｍ）      １４．４４ｇ
ポリビニルプロピオナート分散液（水中で５０重量％）              ５．７７ｇ
Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）                          ０．３０ｇ
−４−ニトロソ−アニリン−ヒドロクロリド
２，１８−ホスホルモリブデン酸−ヘキサナトリウム塩              ２．２２ｇ
ピロロキノリンキノン                                            ０．００３２ｇ
カルシウムクロリド−２−ヒドラート                              ０．０５ｇ
アシネトバクター属カルコアセティクス                            ０．２６ｇ
（Acinetobacter calcoaceticus）                                 （＝１８０ｋＵ）
ＥＣ  １．１．９９．１７由来グルコース脱水素酵素ｒｅｃ
１−ヘキサノール                                                ０．１６ｇ
１−メトキシ−２−プロパノール                                  ４．２６ｇ
カリウムヘキサシアノフェラート（ＩＩＩ）                        ０．０１ｇ
【００４７】
全物質がＮａＯＨでｐＨ値６．８に調節され、次に高さ３０μｍの間隙でポリカーボネート箔厚さ１２５μｍまで塗布し、乾燥する。
【００４８】
このように製造した幅５ｍｍの反応膜のストリップを箔側で担体層上に穿孔した両面接着テープに寸法正確に接着する。直接反応膜に接して両側で両面接着テープをスペーサとして担体に接着する。その後、両方の両面接着テープの保護箔を引き離す。この複合体上に、ヨーロッパ特許出願公開第０９９５９９４号により製造した幅２０ｍｍの開張フリースのストリップを載せ、押圧して接着する。スペーサを覆うことができ、少なくとももう１つの反応膜との多少の重なりが生じるように２枚の片面接着テープを被覆体として開張フリース上に接着する。この方法で仕上げるテープ製品を幅６ｍｍの試験エレメントに切断し、それによって試験エレメント中の測定孔が中心に位置する。
【００４９】
試験エレメントは、種々のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）静脈血中のグルコース濃度でＰＣ制御式Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ（登録商標）活性装置で測定される。得た色発生の時間的経過は図１に再現している。使用したソフトウエアのため、最初の０．５秒間隔の３測定サイクルはこの図に含まれていない。
【００５０】
ＴｉＯ2を顔料とする厚さ約７μｍ（乾燥）の単層膜は、１０〜６００ｍｇ／ｄｌの測定範囲に対してレミッション約４５％（絶対値）の測定信号を有することが分かる。この反応時間は約１〜２秒である。
【００５１】
例２：ＧｌｕｃＤＯＲによるグルコースの反射測光法による同定用試験エレメント
例１に記載した方法にしたがって試験エレメントを製造し、グルコース脱水素酵素の代わりにＧｌｕｃＤＯＲ（野生型）を使用する。微粒顔料（二酸化チタン、平均的直径０．２μｍ）は中粒または粗粒の粒子で以下のように希釈する：
（ａ）顔料と、粗粒填料たとえばＴｉＯ2１４ｇ（粒径０．２μｍ、狭い分布）＋ＳｉＯ2６ｇ（５μｍ、広い分布）の混合。
（ｂ）顔料と、粗粒填料たとえばＴｉＯ2１４ｇ（粒径０．２μｍ）＋ＴｉＯ2６ｇ（２〜３μｍ、平均的分布）またはＢａＳＯ4（１μｍ、平均的分布）の混合。
（ｃ）顔料と、中粒粒径の填料たとえばＴｉＯ2９ｇ（粒径０．２μｍ）＋ＢａＳＯ4４．５（１μｍ）＋ＳｉＯ2４．５ｇ（５μｍ）の混合。
【００５２】
被覆物質の固形物含量はこの場合ほぼ一定に維持される。
【００５３】
ＥＤＴＡ静脈血中のグルコース同定の測定結果は、付加物（ａ）は図２に、付加物（ｂ）は図３に、そして付加物（ｃ）は図４に示している。
【００５４】
例３：グルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ）によるグルコースの蛍光測定法による検出用試験エレメント
以下の成分からなる重合および含浸溶液を調製する：
【００５５】
重合溶液
ＧｌｕｃＤＨ（５０％ＮａＣｌ）              ２７Ｕ／ｍｇ  ５．８ｇ
緩衝液ｐＨ７．０、ＦＬＵＫＡ                            ２０．３ｇ
β−ＮＡＤ+、遊離酸                                       ０．９ｇ
緩衝液（ＦＬＵＫＡ）ｐＨ７                              １０．０４ｇ
エタノール                                                ８．３ｇ
Ｎ−アクリロイル−トリスヒドロキシメチル−アミノメタン    ２．１ｇ
ポリ−（ビニルスルホン酸）ナトリウム塩                    ２．１ｇ
阻害剤                                                    ２．１ｇ
ｐＨ値                                                    ８．３０ｇ
ｐＨ、ＨＣｌで調整                                        ６．０２ｇ
含浸溶液
ベンゾフェノン（５％）                                    ２．００ｇ
アセトン                                                  ４．００ｇ
エタノール                                                ４．００ｇ
１０．００ｇ
【００５６】
ポカロンフォイル（１４０μｍ）を含浸溶液を入れた装置を用いて被覆し（湿潤層１０μｍ）、それに続き乾燥炉中５０℃で１５〜２０分間乾燥する。
【００５７】
それに続き、この重合溶液を樹脂台の中に入れ、含浸前の箔を置く。この箔を通して、ランプ（蛍光試験フォルテ、水銀蒸気灯、フィルタなし、波長２８０ｎｍ〜３６０ｎｍ）を用いて前記混合物を箔上に重合する。上清を水で洗出し、それに続き重合したフィルムを乾燥箱中５０℃で１５分間乾燥する。
【００５８】
図５は付属の血液測定を示す。初期値は試験エレメントの乾燥値であり、湿潤は約２秒以内に行う。安定水準状態には約５秒で達し、そのため測定時間は約３秒で充分である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】色発生の時間的経過を示すグラフである。
【図２】ＥＤＴＡ静脈血中のグルコース同定の測定結果を示すグラフである。
【図３】ＥＤＴＡ静脈血中のグルコース同定の測定結果を示すグラフである。
【図４】ＥＤＴＡ静脈血中のグルコース同定の測定結果を示すグラフである。
【図５】血液の測定結果を示すグラフである。
【図１】
2005230009.tif 000002
【図２】
2005230009.tif 000003
【図３】
2005230009.tif 000004
【図４】
2005230009.tif 000005
【図５】
2005230009.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月6日(2005.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｂ）厚さ＜１０μｍ（乾燥）を有する分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む分析物の光学的検出用の試験エレメント。 
【請求項２】
反応膜の厚さが２〜１０μｍ（乾燥）の範囲であることを特徴とする請求項１記載の試験エレメント。 
【請求項３】
単層反応膜が微粒の顔料粒子、たとえばＴｉＯ2または／およびＺｒＯ2を基材とする顔料粒子を含有することを特徴とする請求項１または２記載の試験エレメント。 
【請求項４】
単層反応膜が、
（ｉ）中粒または／および粗粒の顔料粒子、たとえばＴｉＯ2、ＢａＴｉＯ3、ＺｒＯ2、ＺｒＳｉＯ3または／およびＢａＳＯ4を基材とする顔料粒子、または／および
（ｉｉ）非反射填料、たとえばＳｉＯ2または／およびケイ酸塩または／および水溶性樹脂の中粒または／および粗粒の粒子を含有することを特徴とする請求項１、２または３記載の試験エレメント。 
【請求項５】
微粒の顔料粒子と、粗粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）とからなる混合物を、特に１：０．２〜１の重量比で含有することを特徴とする請求項４記載の試験エレメント。
【請求項６】
微粒の顔料粒子と、中粒の粒子（ｉ）または／および（ｉｉ）とからなる混合物を、特に１：０．２〜１の重量比で含有することを特徴とする請求項４記載の試験エレメント。 
【請求項７】
試験エレメントが５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内での分析物の同定を企図していることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６記載の試験エレメント。
【請求項８】
（ｃ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｄ）分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む、分析物の光学的検出用の試験エレメントにおいて、
前記試験エレメントが５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内での分析物の同定を企図していることを特徴とする試験エレメント。
【請求項９】
（ｃ）少なくとも部分的に光学的に本質的に透明の担体と、
（ｄ）分析物を同定するための試験試薬を含有する単層反応膜とを含む、分析物の光学的検出用の試験エレメントにおいて、
反応膜の厚さおよび有孔率と、試験試薬の濃度とが、５秒未満、特に１〜４秒の反応時間内での分析物の同定が定量的同定に充分である信号強度で生じることを特徴とする試験エレメント。 
【請求項１０】
試料中の分析物の光学的検出用の試験装置であって、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の試験エレメントを含むことを特徴とする試験装置。