(57)【要約】【課題】短時間で高い合成量のタンパク質を、安価に得ることができる簡便な無細胞タンパク質合成方法を提供する。【解決手段】リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に供給する操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。好ましくは、合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に添加する操作と、半透性膜を通過しうる成分を除去する操作を行うか、又は、リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む反応溶液の層の上にＡＴＰ及びクレアチンリン酸を含む基質溶液の層を重層して、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に供給する重層操作を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、
合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に供給する操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。
【請求項２】
リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、
合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に添加することにより供給する添加操作と、半透性膜を通過しうる成分を除去する除去操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、請求項１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項３】
前記添加操作及び前記除去操作を、前記半透性膜を介して行う、請求項１又は２に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項４】
リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、
合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、前記リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む反応溶液の層の上にＡＴＰ及びクレアチンリン酸を含む基質溶液の層を重層して、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に供給する重層操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、請求項１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項５】
前記反応溶液と前記基質溶液とを、半透性膜を介して重層し、前記半透性膜を通過しうる成分を除去する除去操作をさらに行う、請求項４に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項６】
前記合成系にさらに基質のアミノ酸を供給する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項７】
前記半透性膜を通過しうる成分には、合成中に形成された減成生成物が含まれる、請求項２、３、５及び６のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項８】
前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、化学的又は生物学的に目的物質を捕捉することができるものから選ばれる、請求項２、３及び５〜７のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質合成方法として、無細胞タンパク質合成系が知られている。無細胞タンパク質合成系では、生細胞を用いる場合のような細胞培養の必要がなく、利便性に優れる。また、生細胞を用いる場合には、生細胞が自己の細胞機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向が強いため、発現が困難なタンパク質も多いが、無細胞タンパク質合成系では、このような生態維持機構の制約を受けにくく、この観点からも優れている。
【０００３】
しかしながら、バッチ法による無細胞タンパク質合成系においては、生細胞を用いた場合に比べ合成量が少なく、１〜２時間で反応が停止してしまう。このため、バッチ法では所望の量のタンパク質を合成するために多大な手間と時間とを要するという欠点があった。
【０００４】
A.S.Spirin et al., Science, 242, 1162-1164(1988) や特公平７−１１０２３６号公報に記載されているフロー法では、タンパク質の連続合成を可能にした。しかしながら、装置が大掛かりとなり、コストの点で不利である。
【０００５】
【特許文献１】特公平７−１１０２３６号公報
【非特許文献１】Ａ．Ｓ．スピリン（A.S.Spirin）ら著、「サイエンス（Science）」、（米国）、第２４２巻、１９８８年、ｐ．１１６２−１１６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明の目的は、短時間で高い合成量のタンパク質を、安価に得ることができる簡便な無細胞タンパク質合成方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明には以下の発明が含まれる。
（１）リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、
合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に供給する操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。
【０００８】
（２）リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、
合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に添加することにより供給する添加操作と、半透性膜を通過しうる成分を除去する除去操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、（１）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
（３）前記添加操作及び前記除去操作を、前記半透性膜を介して行う、（１）又は（２）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【０００９】
（４）リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む無細胞タンパク質合成系にてタンパク質を合成する方法であって、
合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、前記リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む反応溶液の層の上にＡＴＰ及びクレアチンリン酸を含む基質溶液の層を重層して、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に供給する重層操作を行うことによってタンパク質の連続合成を行う、（１）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
（５）前記反応溶液と前記基質溶液とを、半透性膜を介して重層し、前記半透性膜を通過しうる成分を除去する除去操作をさらに行う、（４）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００１０】
（６）前記合成系にさらに基質のアミノ酸を供給する、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
（７）前記半透性膜を通過しうる成分には、合成中に形成された減成生成物が含まれる、（２）、（３）、（５）及び（６）のいずれか１つに記載の無細胞タンパク質合成方法。
（８）前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、化学的又は生物学的に目的物質を捕捉することができるものから選ばれる、（２）、（３）及び（５）〜（７）のいずれか１つに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、短時間で高い合成量のタンパク質を、安価に得ることができる無細胞タンパク質合成方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書においてタンパク質は、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む意味で用いる。
本発明の無細胞タンパク質合成系には、リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝溶液中に含む系を、特に限定することなく用いることができる。例えば、胚芽、大腸菌、家兎網状赤血球等の既知の無細胞タンパク質合成系を用いることができる。好ましくは、小麦、大麦、イネ、コーン、ホウレンソウの胚芽、大腸菌を用いることができる。これらは公知の方法によって、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物として調製することができる。
【００１３】
本発明において、まず、リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを含む無細胞合成系にて合成反応を開始させる。次に、この無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を合成反応液中に供給する。すなわち、クレアチンリン酸−クレアチンキナーゼの系によってエネルギー源であるＡＴＰを再生して用いる。このことにより、無細胞合成系中のＡＴＰの濃度を常に高い状態に保つことができる。また、ＡＴＰの減成生成物が合成系中に蓄積する量を抑えることができるため、ＡＴＰの減成生成物の除去操作を行わなくとも持続して合成を行うことができ、操作を簡略化することができる。本発明においては、このようにＡＴＰ及びクレアチンリン酸を供給すれば反応を維持することができるため、合成のコストを安価にすることができる。なお、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸供給のタイミングは、当業者が適宜決定することができる。
【００１４】
本発明の無細胞タンパク質合成方法としては、例えば透析法や重層法等を用いることができる。
【００１５】
透析法としては、合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に添加することにより供給する添加操作と、半透性膜を通過しうる成分を除去する除去操作とを行うことができる。
【００１６】
半透性膜を通過しうる成分には、合成中に形成された減成生成物、すなわちＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ、リン酸塩、ピロリン酸塩等が含まれる。これらの成分はタンパク質合成の阻害物質であり、透析法においては、無細胞合成系を維持する間に合成反応液から半透性膜を介して除去される。このように除去操作を行うことによって、無細胞タンパク質合成をさらに効率よく長時間連続して行うことができる。また、半透膜を通過しうる成分には、合成された比較的小さな目的タンパク質が含まれることもある。
【００１７】
上記透析法を用いる方法においては、前記添加操作も半透膜を介して行うことができる。また、前記合成系にさらに基質のアミノ酸が供給されてもよい。すなわち、上記添加操作において、さらに基質のアミノ酸が加えられても良い。これらのことによって、無細胞タンパク質合成をさらに効率よく長時間連続して行うことができる。
【００１８】
半透膜としては、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、化学的又は生物学的に目的物質を捕捉することができる膜から選ばれる。それぞれ、孔の大きさが異なるので、膜を通過させる物質の種類に応じて適宜選択することができる。
【００１９】
また、重層法としては、合成反応の開始後無細胞合成系を維持する間に、リボゾーム、ｍＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを水性緩衝液中に含む反応溶液の層の上にＡＴＰ及びクレアチンリン酸を含む基質溶液の層を重層して、ＡＴＰ及びクレアチンリン酸を前記合成系に供給する重層操作を行うことができる。本発明においては、反応溶液と基質溶液とで粘性が異なるものを用いて重層し、溶液の粘性及び拡散の特性を利用して供給することができる。
【００２０】
また、反応溶液と基質溶液とを半透性膜を介して重層し、半透性膜の特性を利用して供給の操作を行うと共に半透膜を通過しうる成分を除去する操作を行うこともできる。半透性膜を通過しうる成分には、合成中に形成された減成生成物、すなわちＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ、リン酸塩、ピロリン酸塩等が含まれる。これらの成分はタンパク質合成の阻害物質であり、透析法においては、無細胞合成系を維持する間に合成反応液から半透性膜を介して除去される。このように除去操作を行うことによって、無細胞タンパク質合成をさらに効率よく長時間連続して行うことができる。また、半透膜を通過しうる成分には、合成された比較的小さな目的タンパク質が含まれることもある。
【００２１】
また重層法においては、前記合成系に、さらに基質のアミノ酸が供給されても良い。例えば、上記重層操作において供給溶液にさらに基質のアミノ酸を含ませることができる。また例えば、上記重層操作の後に、上層の供給溶液にさらに基質のアミノ酸を添加することができる。このことによって、無細胞タンパク質合成をさらに効率よく連続して長時間行うことができる。
【００２２】
半透膜としては、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、化学的又は生物学的に目的物質を捕捉することができる膜から選ばれる。それぞれ、孔の大きさが異なるので、膜を通過させる物質の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
本発明においては、前記供給の操作及び前記除去操作が、自動制御されていても良い。本発明の無細胞タンパク質合成方法は簡便であるため、自動制御のための装置も簡略化することができる。自動制御を行うことは、合成反応操作を確実にすると共にさらなる簡略化を図ることができる点で好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明によると、短時間で高い合成量のタンパク質を、安価に得ることができる簡便な無細胞タンパク質合成方法を提供することができる。