(57)【要約】  【課題】  安価で宿主に影響が少なく、容易な操作で目的蛋白質の転写が誘導できる組換え遺伝子発現調節方法及び同方法に有用な蛋白質、並びに遺伝子発現の誘導物質を提供する。  【解決手段】  ２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又は２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸の誘導体の濃度を調節することによって、ＤＮＡ結合性蛋白質のＤＮＡ結合能を調節し、ＤＮＡカセットが導入されたＤＮＡ又は組換え発現ベクターの転写調節を行う。【選択図】    図１
2005095163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リプレッサー作用を有するＤＮＡ結合性蛋白質であって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ結合性蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ結合性蛋白質又は同ＤＮＡ結合性蛋白質のＤＮＡ結合性を有する部分配列と、他の蛋白質のアミノ酸配列とを融合したアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ結合性蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ結合性蛋白質をコードする、組換え遺伝子。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列を有する単離された、組換え遺伝子。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡ結合性蛋白質が結合可能なＤＮＡ断片であって、
前記ＤＮＡ断片は、レフトインバーテッドリピートと、前記レフトインバーテッドリピートに対して略相補的に逆反復するライトインバーテッドリピートとが、介在配列を介して結合してなるインバーテッドリピートを含み、
前記レフトインバーテッドリピートは、配列番号１７、配列番号３７、若しくは配列番号３８の何れかに示される塩基配列、又は同塩基配列において１〜３の塩基が欠損、挿入置換若しくは付加された塩基配列からなる、ＤＮＡ断片。
【請求項６】
インパーテッドリピートが、約２１〜２３個の塩基配列からなることを特徴とする、請求項５記載のＤＮＡ断片。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡ結合性蛋白質が結合可能なＤＮＡ断片であって、
配列番号３９に示される塩基配列からなるインバーテッドリピートを含む、ＤＮＡ断片。
【請求項８】
プロモーター領域と、請求項５〜７のいずれか一に記載のＤＮＡ断片とを含む、ＤＮＡカセット。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか一に記載のＤＮＡ断片が挿入されてなる、組換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項３又は４に記載の組換え遺伝子が発現可能に挿入されてなる、組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換え発現ベクターに、更に請求項８に記載のＤＮＡカセットが導入されてなる、組換え発現ベクター。
【請求項１２】
宿主に、請求項９〜１１のいずれか一に記載の組換え発現ベクターを導入してなる、形質転換体。
【請求項１３】
宿主に、請求項９記載の組換え発現ベクターと、請求項１０記載の組換え発現ベクターとを導入してなる、形質転換体。
【請求項１４】
宿主が、細菌、真菌、植物細胞及び動物細胞からなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載した形質転換体。
【請求項１５】
蛋白質の発現媒質中において、請求項８に記載されるＤＮＡカセットを含むＤＮＡ、又は請求項９に記載した組換え発現ベクターを用い、請求項１記載のＤＮＡ結合性蛋白質の共存下にて遺伝子発現をさせるに際し、前記発現媒質中の２-アミノチアゾリン-４-カルボン酸又は該２-アミノチアゾリン-４-カルボン酸の誘導体の濃度を調節することによって転写調節を行うステップを含む、遺伝子発現調節方法。
【請求項１６】
請求項１記載のＤＮＡ結合性蛋白質を、請求項１０又は１１に記載される組換え発現ベクターにより発現させる、請求項１５に記載される遺伝子発現調節方法。
【請求項１７】
２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又は２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸の誘導体が、Ｄ体である、請求項１５又は１６に記載される遺伝子発現調節方法。
【請求項１８】
所望の蛋白質をコードする構造遺伝子の上流側の転写領域内に、請求項５〜７のいずれか一に記載のＤＮＡ断片を配置されてなる発現ＤＮＡを構築し、蛋白質の発現媒質中において同発現ＤＮＡを請求項１記載のＤＮＡ結合性蛋白質が共存し得る条件下で培養し、同発現媒質中の２-アミノチアゾリン-４-カルボン酸又は該２-アミノチアゾリン-４-カルボン酸の誘導体の濃度を調節して所望の蛋白質を発現せしめ、培養物から所望の蛋白質を採取するステップを含む、蛋白質の製造方法。
【請求項１９】
請求項１記載のＤＮＡ結合性蛋白質を、請求項１０又は１１に記載される組換え発現ベクターにより発現させる、請求項１８に記載される蛋白質の製造方法。
【請求項２０】
２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又は２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸の誘導体が、Ｄ体であることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載される蛋白質の製造方法。
【請求項２１】
遺伝子発現の転写調節を制御する誘導物質において、
Ｄ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又は、Ｄ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸の誘導体を含む、誘導物質。
【請求項２２】
誘導物質により遺伝子の転写調節を行う遺伝子発現誘導方法において、
Ｄ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又は、Ｄ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸の誘導体を含む遺伝子発現の誘導物質を用いる、遺伝子発現誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術の分野に属し、特には２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸（以下、ＡＴＣと云う。）及びその誘導体により、遺伝子の転写活性を制御し得る遺伝子発現システムの技術分野に属する。さらに云えば、前記ＡＴＣ若しくはその誘導体によりＤＮＡ結合能が制御される新規リプレッサー蛋白質ＡｔｃＲ、及び前記ＡＴＣ等の存在下で特異的オペレーターとの結合から開放され該オペレーターの下流に位置する遺伝子の転写を制御する当該リプレッサー蛋白質ＡｔｃＲの特性を利用して、前記オペレーターの下流に位置する目的遺伝子の転写を調節する方法、及び前記目的遺伝子がコードする蛋白質の発現を制御するシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、目的遺伝子のコードする蛋白質を効率的に発現させるには、目的遺伝子を保持する組換え発現ベクターを宿主に導入した組換え体を用いる方法が、一般的に用いられている。
【０００３】
この方法において、目的蛋白質を大量に発現させるために、より強力にＲＮＡ合成酵素と結合するプロモーター領域若しくは、該プロモーター領域と強力な転写能を持つｍＲＮＡ合成酵素（T7 RNA ポリメラーゼ等）とを組み合わせた発現用のＤＮＡカセットを組み込んだ発現ベクターが用いられている。前記プロモーター領域等により、当該プロモーターの下流に位置する目的遺伝子の転写能力を増強し、その結果大量に合成されるｍＲＮＡを翻訳することによって、目的蛋白質を大量に発現させる。
【０００４】
宿主には、大腸菌等のバクテリアから、酵母等の真菌類、動物細胞、植物細胞に至るまで、多種類の細胞及びそれらによって構成される個体が用いられている。
【０００５】
特に、大腸菌を宿主として用いた蛋白質発現システムは古くから開発され使用されている。その中でも、ラクトースオペロン若しくはその変異体を用いた発現系は、最もよく使用されている。このラクトースオペロンは、本来大腸菌がラクトースを炭素原として用いるために、ラクトース存在下でのみ発現が誘導される遺伝子群であり、ラクトースを誘導物質としてそのプロモーター下流に位置する遺伝子の転写が増強される発現系である。大腸菌の生育環境中にラクトースが存在しない状態では、リプレッサーとしてのLacI蛋白質が、ラクトースオペロンプロモーター直下のオペレーター領域に結合しており、該オペロンの転写を抑制している。ラクトースの存在下では、ラクトースそのものがこのLacI蛋白質のリプレッサー活性を不活性化し、該LacI蛋白質がオペレーター領域から離れることによって、RNAポリメラーゼによるｍＲＮＡの合成の開始が可能となる。
【０００６】
上記のようなラクトースオペロンにおける転写誘導の仕組みを利用し、ラクトースの代わりに菌体内で分解しないイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (以下、IPTGと云う。)を誘導物質として用いた発現系が一般的に使用されている。この発現系を用いると、培養液中にIPTGを添加するだけで、ラクトースオペロン下流に位置する遺伝子の発現を誘導することが可能となる。また、この発現系に使用されているプロモーターとしては、他のプロモーターとの融合や変異を加えることにより、より効率的なものに改良されたものも使用されている（非特許文献１を参照）。この他にIPTGを誘導物質として用いた発現系には、強力なRNA合成酵素であるT7 RNA ポリメラーゼを誘導物質IPTGにより発現誘導し、T7プロモーターの下流に位置する目的遺伝子を発現させる発現系があり、よく用いられている（非特許文献２を参照）。
【０００７】
また、IPTGを使用せずに遺伝子の転写を発現を誘導する発現系も存在し、古くから利用されている。代表的な発現系として、λファージのPLプロモーターとその変異リプレッサーであるcI857を利用する発現系がある。このcI857リプレッサーは４２℃で完全に不活性化されるので、培養液の温度を上昇させることにより、PLプロモーターの下流に導入された目的遺伝子の転写を誘導することができる（非特許文献３を参照）。
【０００８】
上記した大腸菌以外を宿主として目的蛋白質の発現を制御する発現系としては、ほ乳類細胞においてテトラサイクリンを誘導物質として利用する発現系がよく知られている。この発現系では、テトラサイクリンとの結合によってそのコンフォメーションを変化させるＤＮＡ結合蛋白質TetRと、転写因子であるVP16とを融合させることによって、培養液中のテトラサイクリン濃度に依存した目的遺伝子の高い発現が可能となる。テトラサイクリン濃度が低いと発現が誘導される“Tet-Off”の発現系と、逆に濃度が高くなると発現が誘導される“Tet- On”の発現系（BDバイオサイエンス・クロンテック社）が開発されており、いずれの場合もテトラサイクリンの濃度調節が発現の誘導効率に大きく影響する（非特許文献４を参照）。
【０００９】
【非特許文献１】ジェイ.ディ.ワトソン他（J.D. Watson et al.）著, 「遺伝子の分子生物学  」（Molecular Biology of the Gene），第4版（4th edition）,ベンジャミン/カミング  パブリッシング  カンパニー  インク.（The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.）, 1987年, pp.465-482.
【００１０】
【非特許文献２】エフ.ダブリュー.  ステューディアー他（F.W. Studier et al.）著, 「メッソド  イン  エンザイモロジイ  185巻」（Methods in Enzymol. Vol.185）, 1990年, pp.60-89.
【００１１】
【非特許文献３】エー.アール.シャッツマン,  エム.ローゼンバーグ（A.R. Shatzman and M. Rosenberg）著, 「メッソド  イン  エンザイモロジイ  152巻」（Methods in Enzymol. Vol.152）, 1987年, pp.661-673.
【００１２】
【非特許文献４】BDバイオサイエンス・クロンテック社ホームページ（http://www.clonetech.co.jp）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記のように誘導物質にIPTGを使用するラクトースオペロン等を利用した目的蛋白質の発現系は、種々の問題を有する。
例えば、誘導物質にIPTGを使用する発現系では、IPTG自体が大変高価であり、工業レベルでの物質生産には不向きであるとの問題がある。
【００１４】
一方、形質転換体の培養温度によって目的蛋白質の発現を調節する“λファージのPLプロモーターとその変異リプレッサーであるcI857を利用する発現系”を利用した蛋白質発現システムは、IPTGのような高価な誘導物質を使用しないので、安価に目的の遺伝子産物を生産できる利点がある。そのため、工業レベルでも利用可能である。
【００１５】
しかしながら、この蛋白質発現システムは、比較的高い温度で蛋白質を高発現させるため、目的蛋白質が不溶性になりやすい欠点がある。また、低い温度においても完全に発現が抑制されるわけではないので、非誘導時に転写の漏れがあるといった欠点がある。さらに、温度変化による発現誘導は、IPTG等の薬物添加による発現誘導と比較して、条件設定が非常に難しく簡便ではない。
【００１６】
また、誘導物質としてテトラサイクリンを使用し、ほ乳類細胞を宿主とする目的蛋白質の発現制御系では、誘導物質のテトラサイクリンが抗生物質であるため、該テトラサイクリンが宿主細胞の生理活性になんらかの影響を与える可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、安価であるＡＴＣ若しくはその誘導体を新しい誘導物質として使用し、目的遺伝子の転写制御を可能にする蛋白質発現系を提供するものである。本発明の蛋白質発現系は、上記のように高価なIPTGを用いる発現系に比べてコストを抑えた目的蛋白質の製造を実現し、延いては前記目的蛋白質の触媒作用等による他の有用な物質生産を実現するものである。また、ＡＴＣは菌体や培養細胞に対する毒性も極めて低く、真核細胞を用いた培養細胞の生理機能に大きな影響を与える可能性も低い。従って、本発明により、安価で宿主に影響が少なく、容易な操作で目的蛋白質の転写が誘導できる発現誘導系が提供される。
【００１８】
発明者らは、誘導物質としてのＡＴＣ若しくはその誘導体の濃度変化に依存して塩基配列特異的にＤＮＡへ結合・解離するＤＮＡ結合蛋白質（AtcR）を見出した。そして、このAtcRが特異的に結合する塩基配列を決定することにより、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち本発明は、以下のＤＮＡ結合性蛋白質、同蛋白質をコードする組換えＤＮＡ、組換え発現ベクター、形質転換体、及びそのＤＮＡ結合活性を利用した遺伝子発現調節方法並びに蛋白質の製造方法等を提供する。
【００２０】
第一の態様において、本発明は、リプレッサー作用を有するＤＮＡ結合性蛋白質であって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ結合性蛋白質を提供する。
【００２１】
また、上記ＤＮＡ結合性蛋白質又は同ＤＮＡ結合性蛋白質のＤＮＡ結合性を有する部分配列と、他の蛋白質のアミノ酸配列とを融合したアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ結合性蛋白質をも提供し得る。
【００２２】
別の態様において、本発明は、上記ＤＮＡ結合性蛋白質をコードする組換え遺伝子を提供する。この組換え遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を有する、単離された組換え遺伝子としても提供される。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、上記ＤＮＡ結合性蛋白質が結合可能なＤＮＡ断片を提供する。前記ＤＮＡ断片は、レフトインバーテッドリピートと、前記レフトインバーテッドリピートに対して略相補的に逆反復するライトインバーテッドリピートとが、介在配列を介して結合してなるインバーテッドリピートを含み、前記レフトインバーテッドリピートは、配列番号配列番号１７、配列番号３７、若しくは配列番号３８の何れかに示される塩基配列、又は同塩基配列において１〜３の塩基が欠損、挿入置換若しくは付加された塩基配列からなる。なお、このＤＮＡ断片におけるインパーテッドリピートは、約２１〜２３個の塩基配列からなるＤＮＡ断片としても提供され得る。また、このＤＮＡ断片は、配列番号３９に示される塩基配列からなるインバーテッドリピートを含む、ＤＮＡ断片としても提供される。
【００２４】
他の態様において、本発明は、プロモーター領域と、上記ＤＮＡ結合性蛋白質が結合可能なＤＮＡ断片とを含む、ＤＮＡカセットを提供する。また、本発明は、前記ＤＮＡ断片が挿入された組換え発現ベクターをも提供する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、上記ＤＮＡ結合性蛋白質をコードする組換え遺伝子が発現可能に挿入された組換え発現ベクターを提供する。この組換え発現ベクターは、当該発現ベクターに、更に上記ＤＮＡカセットを導入した組換え発現ベクターとしても提供される。
【００２６】
他の態様において、本発明は、宿主に上記に記載した組換え発現ベクターを導入した形質転換体を提供する。また、宿主に上記ＤＮＡ結合性蛋白質が結合可能なＤＮＡ断片を挿入した組換え発現ベクターと、上記ＤＮＡ結合性蛋白質をコードする組換え遺伝子を挿入した組換え発現ベクターとを導入した形質転換体が提供される。この形質転換体の宿主には、細菌、真菌、植物細胞及び動物細胞が選択され得る。
【００２７】
他の態様において、本発明は、蛋白質の発現媒質中に、上記ＤＮＡカセットを含むＤＮＡ、又は上記ＤＮＡ結合性蛋白質が結合可能なＤＮＡ断片が挿入された組換え発現ベクターを用い、上記ＤＮＡ結合性蛋白質の共存下にて遺伝子発現をさせるに際し、前記発現媒質中の２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又はその誘導体の濃度を調節することによって転写調節を行うステップを含む、遺伝子発現調節方法を提供する。
【００２８】
この遺伝子発現調節方法は、上記ＤＮＡ結合性蛋白質を、前記蛋白質をコードする組換え発現ベクターにより発現させる遺伝子発現調節方法としても提供され得る。更に、当該方法に用いる２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又はその誘導体が、Ｄ体である遺伝子発現調節方法としても提供され得る。
【００２９】
他の態様において、本発明は、所望の蛋白質をコードする構造遺伝子の上流側の転写領域内に、上記ＤＮＡ結合性蛋白質が結合可能なＤＮＡ断片を配置されてなる発現ＤＮＡを構築し、蛋白質の発現媒質中において同発現ＤＮＡを上記ＤＮＡ結合性蛋白質が共存し得る条件下で培養し、同発現媒質中の２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又はその誘導体の濃度を調節して所望の蛋白質を発現せしめ、培養物から所望の蛋白質を採取するステップを含む蛋白質の製造方法を提供する。
【００３０】
この蛋白質の製造方法は、上記ＤＮＡ結合性蛋白質を、前記蛋白質をコードする組換え発現ベクターにより発現させる蛋白質の製造方法としても提供され得る。更に、当該方法において、２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又はその誘導体が、Ｄ体である蛋白質の製造方法としても提供され得る。
【００３１】
他の態様において、本発明は、遺伝子発現の転写調節を制御する誘導物質として、Ｄ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又はその誘導体を含む誘導物質を提供する。
【００３２】
他の態様において、本発明は、誘導物質により遺伝子の転写調節を行う遺伝子発現誘導方法として、Ｄ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸、又はその誘導体を含む遺伝子発現の誘導物質を用いる遺伝子発現誘導方法を提供される。
【発明の効果】
【００３３】
本発明は、安価なＡＴＣ若しくはその誘導体を新しい誘導物質として使用し、目的遺伝子の転写制御を可能にする蛋白質発現系の構築に関するものであり、上記のように高価なIPTGを用いる系に比べてコストを抑えた目的蛋白質の製造を実現するものであり、延いては前記目的蛋白質の触媒作用を利用したその他有用な物質生産を実現するものである。また、ＡＴＣは菌体や培養細胞に対する毒性も極めて低く、真核細胞を用いた培養細胞の生理機能に大きな影響を与える可能性も低い。従って、本発明により、安価で宿主に影響が少なく、容易な操作で目的蛋白質の発現を誘導可能な蛋白質発現の誘導系が実現する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、図面等を参照し、請求項１〜２２に記載した本発明の最良の実施形態を説明する。  
なお、本発明の最良の実施形態について詳述するあたり、以下に本願明細書において使用される主な用語について簡単に解説する。
【００３５】
本願明細書において「リプレッサー」とは、特定の遺伝子発現を抑制する蛋白質を意味する。ＤＮＡ上の特定領域（オペレーター）に特異的に結合し、オペレーターの制御下にある遺伝子(群)からｍＲＮＡが転写されるのを抑える機能を有する。
【００３６】
「ＤＮＡ結合性蛋白質」とは、少なくとも特異的な塩基配列に対して結合可能なＤＮＡ配列認識部位を形成するペプチド領域を有する蛋白質を意味する。
【００３７】
「インバーテッドリピート（ＩＲ配列：Inverted Repeat）」とは、本願明細書において、遺伝子の両端に逆方向に略相補的な塩基配列の繰り返し構造をもった塩基配列を意味する。即ち、ＩＲ配列とは、このＩＲ配列の５’末端側に位置するレフト・インバーテッドリピート（ＬＩＲ：Left Inverted Repeat）と、当該ＬＩＲと略相補的な塩基配列でＩＲ配列の３’末端側に位置するライト・インバーテッドリピート（ＲＩＲ：Right Inverted Repeat）と、前記ＬＩＲと前記ＲＩＲとの間に介在する塩基配列（介在配列）とから構成される塩基配列を意味する。
【００３８】
「ＤＮＡカセット」とは、発現ベクター又はＤＮＡの特定部位に組み込んで意図する変異を導入することを可能とする、相補する２本鎖からなるＤＮＡ断片又はベクターを意味する。
「誘導物質」とは、インディーサー（Inducer）ともいい、本願明細書では、特にIPGT等の非代謝性誘導物質を意味する。
【００３９】
次に本発明は、以下述べるように組換え遺伝子技術を使用することによって実施するこ  とができる。  
１．ＤＮＡ結合性蛋白質の調製
本発明のＤＮＡ結合蛋白質は、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質である。
【００４０】
このＤＮＡ結合性蛋白質は、下記の構造式を示すＡＴＣ、
【化１】
2005095163.tif 000003
又は下記の一般式を示す前記ＡＴＣの誘導体
【化２】
2005095163.tif 000004
（式中のＲ１、Ｒ２はそれぞれ水素、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基を示す。但し、Ｒ１とＲ２とが同時に水素であるものを除く。）
の濃度に依存して、特定の塩基配列を有するＤＮＡに結合若しくはＤＮＡから解離する特性を有する。即ち、ｍＲＮＡの転写制御に関与するリプレッサー活性を持つ蛋白質である。従って、該ＤＮＡ結合性蛋白質は、少なくともＡＴＣ及びその誘導体に対する結合部位を形成するペプチド領域と、特異的な塩基配列に対して結合可能なＤＮＡ配列認識部位（以下、ＤＮＡ結合部位と云う。）を形成するペプチド領域とから構成される。因みに、該ＤＮＡ結合性蛋白質は、前記ＡＴＣの濃度が増大するのに従ってＤＮＡから解離し、一方、同濃度が減少するのに従って前記ＤＮＡと結合する性質を有する。
【００４１】
また、当該ＤＮＡ結合性蛋白質は、Ｄ−２-アミノチアゾリン-４-カルボン酸（以下、Ｄ−ＡＴＣと云う。）が結合し、ＤＮＡ解離活性が誘導される（実施例１０、図８参照）。因みに、Ｄ−ＡＴＣとＬ−２-アミノチアゾリン-４-カルボン酸（以下、Ｌ−ＡＴＣと云う。）の混合物（ラセミ体など）を、誘導物質として使用することができる（実施例３及び１０並びに図８参照）。前記ＡＴＣ誘導体としては、前記［化２］に示したチアゾリン環を持つ光学異性体のＤ体が好適に用いられる。
【００４２】
Ｄ−ＡＴＣは、例えばＤ−シスチンを合成出発物質として、公知の方法基づいてシアノ基と共に閉環反応に付すことにより合成することができる。（Rambacher P. (1968) Further simple cystine syntheses from alpha-acetamino-acyrylic acid or serine and thiourea. Chem. Ber. Vol. 101, pp. 3433-3437参照）。また、後述のとおり、ＡＴＣのラセミ体を光学分離しＤ−ＡＴＣを得ることもできる。
【００４３】
Ｌ−ＡＴＣは、Ｌ−シスチンを合成出発物質として、上記Ｄ−ＡＴＣの合成方法と同様の方法により合成することができる。
また、Ｄ体とＬ体との双方を含むＡＴＣの混合物（ラセミ体など）は、Ｌ−シスチンとＤ−シスチンとの混合物をやはりＤ−ＡＴＣの合成方法と同様の方法にて合成することができる。勿論、上述した方法によりそれぞれ作製されたＤ−ＡＴＣとＬ−ＡＴＣとを単に混合してもよい。
【００４４】
前記ＤＮＡ結合性蛋白質のＤＮＡ結合部位が結合可能な塩基配列としては、配列番号１８、１９及び３９等に示す塩基配列が例示される。  
これらの塩基配列は、配列番号１７に示される９塩基からなるＬＩＲと当該ＬＩＲと略相補的に結合可能な塩基配列ＲＩＲとを各要素として、これら要素間、即ちＬＩＲとＲＩＲとの間に任意の５塩基が挿入されたインバーテッドリピート（ＩＲ配列：inverted repeat）を有したオペレーター配列である。
【００４５】
本発明に係るＩＲ配列は、後述する実施例からも明らかなように配列番号１７に示す塩基配列について若干の塩基が欠失、挿入若しくは置換された塩基配列をＬＩＲとしても、本発明のＤＮＡ結合性蛋白質との特異的結合能が維持される。
例えば、塩基の欠失例としては配列番号３７又は３８に示される８塩基からなる配列をＬＩＲするＩＲ配列が挙げられ、ＤＮＡ結合性蛋白質との有意な相互作用も確認されている。
塩基の置換例としては、配列番号１９に相補する塩基配列である配列番号４９に示されるように、配列番号１７に示す塩基配列に対して７番目のＣ（シトシン）がＴ（チミン）に置換された当該配列番号４９に示す塩基配列をＬＩＲとするＩＲ配列が挙げられ、やはりＤＮＡ結合性蛋白質との有意な相互作用も確認されている。
≪配列番号１９に相補する塩基配列≫
ATT CAT TGC GCC TGG CGA TGA AT（配列番号４９）
【００４６】
また、ＩＲ配列は、５’末端側の配列ＬＩＲと、完全に相補性を保った３’末端側の配列ＲＩＲを有する必要はなく、このことは、配列番号１８及び１９に示されるＩＲ配列が本発明のＤＮＡ結合性蛋白質と特異的な結合を生じることからも理解される。かかるＩＲ配列は、リプレッサーである本発明のＤＮＡ結合性蛋白質を使用する組換え蛋白発現系の要素として使用することができ、その調製には慣用のＤＮＡ合成技術が適用されうる。
【００４７】
このようなＩＲ配列は、８乃至９個の塩基からなる略相補的な２つの要素（ＬＩＲ、ＲＩＲ）が、介在配列を介して結合され、略２１塩基乃至２３塩基の長さを有する塩基配列からなり、様々なＤＮＡ断片と組み合わせて、多種多様のＤＮＡカセットや発現ベクターの一要素として使用されうる。特に、配列番号３９に示した塩基配列は、上記ＤＮＡ結合性蛋白質との特異的な結合能が高く、当該ＤＮＡ結合性蛋白質に対するCis因子として好適に使用されうる。なお、前記ＩＲ配列としては、５〜７塩基の介在配列を持つものがより好適に使用される。
【００４８】
また、上記したＤＮＡ結合性蛋白質又は同蛋白質のＤＮＡ結合部位を含むアミノ酸配列と、転写活性化因子とを融合したＤＮＡ結合性蛋白質（以下、融合蛋白質と云う。）を作製することにより、前記ＤＮＡ結合性蛋白質が認識・結合する塩基配列の下流に位置する遺伝子の転写を促進することが可能となる。例えば、当該ＤＮＡ結合性蛋白質に上記した[非特許文献４]記載の既存のTet-On, Tet-Offシステム（BDバイオサイエンス・クロンテック社）を応用して、前記ＤＮＡ結合性蛋白質のＤＮＡ結合部位と転写活性化因子であるVP16を融合させることにより、テトラサイクリンの代わりにＡＴＣを用いて転写調節を行う組換え蛋白発現制御系が構築可能である。ここで前記ＤＮＡ結合性蛋白質と融合させる蛋白質はVP16に限定されるものではない。その他にも、VP16以外の転写活性化因子や、RNAポリメラーゼも好適に用いることができる。
【００４９】
また、該融合蛋白質は、単に組換え蛋白質の発現系に利用されるだけでなく、GFP等の蛍光蛋白質、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシタ−ゼ等の標識酵素と融合させることにより、ＤＮＡ結合性蛋白質の認識する塩基配列をタグとして含む特定のＤＮＡを検出、若しくは抽出する分子（ツール）として用いることができる。また、ヌクレアーゼと融合させることにより、ＤＮＡ結合性蛋白質の認識する塩基配列近辺のＤＮＡを特異的に切断することもできる。この他にも、イミュノグロブリンと融合させることにより、特定の抗原蛋白質とＤＮＡ結合性蛋白質の認識する塩基配列をタグとして含むＤＮＡを特異的に結合させることも可能となる。
【００５０】
以上に説明したＤＮＡ結合性蛋白質又は融合蛋白質は、後述するような遺伝子組換え技術や、既知のアミノ酸配列に基づく化学合成法などを用いて製造することができる。
【００５１】
遺伝子組換え技術を用いて、前記ＤＮＡ結合蛋白質又は融合蛋白質を製造する場合、先ず該ＤＮＡ結合性蛋白質又は融合蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、発現制御因子の制御下に挿入した組換え発現ベクターを作成し、該組換え発現ベクタ−を適当な宿主に導入する。その後、該宿主を培養し、細胞内又は細胞外に産生された種々の当該ＤＮＡ結合性蛋白を採取する。
【００５２】
ＤＮＡ結合性蛋白質の遺伝子をコードするＤＮＡ断片を採取するドナーとしては、該ＤＮＡ結合性蛋白質を生産するものであればいずれの微生物でもよいが、例えば、ＡＴＣを窒素源若しくは炭素源として代謝可能である細菌であるシュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）BS株が挙げられる。因みに、発明者らは、このシュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）BS株（FERM P-16965）から、当該ＤＮＡ結合性蛋白質AtcRをコードする遺伝子をクローニングした（実施例２を参照）。
【００５３】
前記クローニングした遺伝子の塩基配列を、配列番号１に示す。勿論、前記ＤＮＡ結合性蛋白質をコードする遺伝子は、コドンの縮重から明らかなように配列番号１に示す塩基配列に限定されることは無い。更に、そのＤＮＡ結合特性が維持される限りにおいて前記配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は同アミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列であればよい。
【００５４】
融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片は、ＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法を用いて、上述の方法で取得したＤＮＡ結合性蛋白質をコードする遺伝子に所望の他の蛋白質をコードする遺伝子をリーディング・フレームに合せて連結して得る。勿論、融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片の作成方法は、当該方法に限定されることは無く、公知の遺伝子組換え技術を用いることで他の手法により作成することができる。例えば、融合蛋白質を構成するＤＮＡ結合性蛋白質と他の蛋白質とをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列が予め分かっていた場合、その情報に基づいてホスホアミダイト法などの化学合成法により合成しても良い。
【００５５】
ＤＮＡ結合性蛋白質又は融合蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を挿入する組換えベクターには、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、植物細胞若しくは動物細胞のうちから選択される細胞内で遺伝子発現が可能なものが使用される。例えば、大腸菌においてはpBR322誘導体に代表されるcolE1系プラスミド、pACYC系プラスミド、pSC系プラスミド、Bac等のF因子由来ミニFプラスミドが挙げられ、酵母においてはセントロメアを複製のオリジンとするYcpベクター、ARS配列を複製オリジンとするベクター、２−μｍ配列をもつベクターが挙げられる。また、植物細胞においてはpTi(Tiプラスミド)又はその誘導体が挙げられ、動物細胞においてはSV40ウイルス、ワクシニアウイルス、パピローマウイルス、エプスタイン-バー ウイルス、レトロウイルス等を利用したウイルスベクターが一般的に用いられる。
【００５６】
更に、蛋白質の分泌発現に使用される組換えベクターを用いても良い。この蛋白質の分泌発現に使用される組換えベクターは、一般的に分泌のためのシグナル配列を目的タンパク質と融合させて発現させる組換えベクターが挙げられる。大腸菌において、このシグナル配列にはヘモリシン発現に機能しているHlyAのＮ末端は配列、エンテロトキシンの発現に関与しているＡサブユニットとＢサブユニットのＮ末端配列、OmpFシグナル配列、OmpAシグナル配列、PhoAシグナル配列等が挙げられ、colE1オリジンをもつpBR322誘導体等の一般的に用いられるプラスミドに特定のシグナル配列と目的蛋白質とを融合した蛋白質を発現させることによって分泌発現させることが可能となる。酵母を宿主とする場合においても、大腸菌の場合のシグナル配列に相当する種々のリーダー配列を目的蛋白質に付加することによって分泌発現が可能となる。この場合に使用される組換えベクターも、通常の発現に利用される組換えベクターと同等である。
【００５７】
上記した組換えベクターを導入する宿主には、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、植物細胞若しくは動物細胞が使用される。
宿主への組換え発現ベクターの導入は、種々の公知の方法により実施される。例えば、宿主がバクテリアであれば、カルシウムで処理した菌体を用いるコンピテント細胞法や、宿主が真菌類であれば、酢酸リチウムを用いたコンピテント細胞法、プロトプラストポリエチレン融合法、植物細胞であればアグロバクテリウムの植物細胞への感染に伴う形質転換法、動物細胞であれば、細胞のエンドサイトーシスを利用したリン酸カルシウム法やDEAEデキストラン法、リポフェクション法、キャピラリーを用いてＤＮＡを細胞内に直接インジェクションするマイクロインジェクション法、金コロイド等の微粒子にＤＮＡを吸着させて細胞内に直接打ち込む方法などによって実施される。また電気刺激によってＤＮＡを導入するエレクトロポレーション法は複数の宿主に一般的に適応可能である。
【００５８】
宿主に組換え発現ベクターが導入された形質転換体は適当な条件で培養し、その後、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生された当該ＤＮＡ結合性蛋白質を公知の方法で抽出、精製する。抽出、精製方法としては、例えば、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、ゲル電気泳  動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの手法を組み合わせて分離精製することができる。
【００５９】
因みに、分泌発現系により産生させた目的蛋白質の抽出、精製は、培養液中に分泌された目的タンパク質を精製させる手段として、一般的にはまず培養液を限外濾過することによって目的タンパク質を濃縮し、その濃縮液から通常の塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法により行われる。
【００６０】
２．ＤＮＡ結合性蛋白質を利用した遺伝子発現調節方法、及び蛋白質の製造方法
【００６１】
上述したＤＮＡ結合性蛋白質は、発明者らにより、少なくともシュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）BS株において、ＡＴＣ及びその誘導体から L-システインを合成する一連の酵素群をコードするオペロンのうち、特にL-ATC ハイドロラーゼをコードするatcB、N-カルバモイル-L-システインアミドロハイドロラーゼをコードするatcCが形成するatcBCオペロンの上流域に存在する塩基配列と特異的に結合し、その転写を制御する転写制御因子（リプレッサー）であることが分かった（実施例３、実施例５〜８参照）。
【００６２】
前記塩基配列として、前記シュードモナス・オバリスＢＳ株から単離されたものは配列番号１８及び１９に示す塩基配列を有していた。
【００６３】
本発明は、例えば図１に示すように、ＤＮＡ結合性蛋白質１が特異的に結合可能な塩基配列７をプロモーター領域３の下流に連結し、更に前記プロモーター３の制御下に所望の蛋白質をコードする構造遺伝子４を連結し、以ってＡＴＣ及びその誘導体（以下、ＡＴＣ等という場合もある。）１０を誘導物質として使用して上述したＤＮＡ結合性蛋白質１のＤＮＡ結合能を調整し、前記構造遺伝子４の転写調節を行う遺伝子発現調節方法を提供する。即ち、従来のラクトースオペロン等の系を用いた目的蛋白質の発現制御系に換わるＡＴＣ等１０を誘導物質とする新たな発現制御系を提供するものである。
【００６４】
この遺伝子発現調節方法は、例えば、前記塩基配列７を含むＤＮＡカセットを、既存の組換え発現ベクターのプロモーター領域と目的蛋白質をコードする構造遺伝子との間に組込み、上述したＤＮＡ結合性蛋白質又は前記融合蛋白質の存在下で、ＡＴＣ等を誘導物質として用いて転写調節を行うことにより、蛋白質発現制御を可能とする。因みに、前記ＤＮＡカセットを、カセット変異導入法等により、ゲノムＤＮＡ等の遺伝子ＤＮＡの特定部位に直接組み込んで、前記蛋白質発現制御系を構築することもできる。なお、宿主が天然で本質的にＤＮＡ結合性蛋白質の合成能を有さない場合には、当該ＤＮＡ結合性蛋白質又は前記融合蛋白質をコードする遺伝子カセットが組み込まれた組換え遺伝子ベクターを前記宿主に導入し、前記ＤＮＡ結合性蛋白質又は前記融合蛋白質を産生・供給する。
【００６５】
前記ＤＮＡカセットとしては、目的に応じて、上記した塩基配列７のみからなるもの、前記塩基配列７の上流にプロモーター領域を備えたもの、又は前記塩基配列７の上流にプロモーター領域を備え更に下流に所望の蛋白質をコードする構造遺伝子が発現可能に含むものが、それぞれ好適に使用される。
【００６６】
前記ＤＮＡカセットを組み込む組換え遺伝子ベクターとしては、上記“１．ＤＮＡ結合性蛋白質の調製”の項で記載したものが使用できる。従って、このＤＮＡカセットを組み込んだ組換え遺伝子ベクターを導入した形質転換体を作成する場合、宿主としては、上記“１．ＤＮＡ結合性蛋白質の調製”の項で記載したものを使用することができる。
【００６７】
また、本発明に係る遺伝子発現調節方法において、誘導物質として使用するＡＴＣ及びその誘導体は、従来のラクトースオペロンを用いた遺伝子発現系で誘導物質に用いられているIPTGに比べ、安価に入手することができる。更に前記ＡＴＣ及びその誘導体は、菌体や培養細胞に対する毒性も極めて低く、真核細胞を用いた培養細胞の生理機能に大きな影響を与える可能性も低いとの利点を有する。
【００６８】
次に、以上に説明した遺伝子発現調節方法を利用した蛋白質の製造方法について説明する。
この蛋白質の製造方法は、所望の蛋白質をコードする構造遺伝子４の上流側の転写領域内に、上記ＩＲ配列を構成する塩基配列７を含むＤＮＡ断片を配置された発現ＤＮＡを構築し、蛋白質の発現媒質中において、同発現ＤＮＡを上記ＤＮＡ結合性蛋白質又は融合蛋白質２が共存し得る条件下で培養し、同発現媒質中のＡＴＣ等１０の濃度を調節して所望の蛋白質５を発現させ、培養物から所望の蛋白質５を採取する方法である。
【００６９】
更に詳述すると、本発明に係る蛋白質の製造方法は、一態様として例えば図１に模式図を示すように、宿主細胞内へ、上記したＤＮＡ結合性蛋白質１をコードする遺伝子９を発現制御因子の制御下に挿入した組換え発現ベクター６と、プロモーター３の下流に上記塩基配列７を含むＤＮＡカセットが挿入され、且つ該ＤＮＡカセットの下流に更に所望の蛋白質５をコードする外来遺伝子４が導入されてなる組換え発現ベクター８とを導入した形質転換体２０を作成し、当該形質転換体２０をＡＴＣ等１０の存在下で培養し、外来遺伝子４にコードされる所望の蛋白質５を発現させ、当該蛋白質を採取することにより実施され得る。
【００７０】
また、本発明の別の態様としては、ＤＮＡ結合性蛋白質にかかる前記組換え発現ベクター６と蛋白発現系を構成する組換え発現ベクター８とを導入した形質転換体に代えて、ＤＮＡ結合性蛋白質１の発現系と前記ＩＲ配列を含む所望の蛋白質５の発現系との両者を同時に保持する組換え発現ベクターを導入した形質転換体を使用してもよい。
因みに、産生された目的蛋白質は、上記“１．ＤＮＡ結合性蛋白質の調製”の項で記載した方法により抽出・精製される。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７２】
〔実施例１〕
ａ)Ｌ-２‐アミノチアゾリン‐４‐カルボン酸の調製
L-シスチン４．８１ｇとシアン化カリウム３．９ｇとを蒸留水２０ｍｌで溶解後、当該溶解液の温度を２０〜２５℃に保ちながら１５％過酸化水素水６．４ｇを室温で約３時間かけて滴下し、一晩放置する。この一晩放置した溶解液を、酢酸を添加してpH5.0に調整後、ロータリーエバボレーターを用いて減圧濃縮を行い、粗晶を得た。
続いて、粗晶を蒸留水に加え、６０℃で完全に融解し、脱色の為に活性炭を適量０．２ｇ加え漏斗に濾紙をセットして溶液が熱いうちに濾過して前記活性炭を濾し取って、濾液を回収する。その後、回収した濾液を１０℃に冷却して、１時間晶析する。
前記晶析により得た粗晶３．５ｇを蒸留水２５ｍｌに再溶解し、再晶析を行って精製結晶（ｍｐ２１９．０℃）２．０３ｇを得た（合成参考文献；Rambacher P. (1968) Further simple cystine syntheses from alpha-acetamino-acyrylic acid or serine and thiourea. Chem. Ber. Vol. 101, pp. 3433-3437）。なお、精製結晶の測定データを以下〔表１〕に示す。
【表１】
2005095163.tif 000005
【００７３】
ｂ）Ｄ‐２‐アミノチアゾリン‐４‐カルボン酸の調製
Ｄ-シスチン５．２ｇとシアン化カリウム４．２ｇとを蒸留水２０ｍｌで溶解後、上記ａ)Ｌ-２‐アミノチアゾリン‐４‐カルボンの調製の欄で述べた手法と同様の手法により、Ｄ‐ＡＴＣの精製結晶（ｍｐ２２４．５℃）１．９ｇを得た。以下に、精製結晶の測定データを示す。
【表２】
2005095163.tif 000006
【００７４】
ｃ）ＤＬ−２‐アミノチアゾリン‐４‐カルボン酸の調製
Ｌ−シスチンとＤ−シスチンとのラセミ体を蒸留水に溶解後、上記ａ)Ｌ-２‐アミノチアゾリン‐４‐カルボンの調製の欄で述べた手法と同様の手法により、ＤＬ‐ＡＴＣの精製結晶を得た。
【００７５】
〔実施例２〕  ａｔｃＲ遺伝子のクローニング及び配列決定
Pseudomonas ovalis BS株（FERM P-16965）の染色体ＤＮＡを調製し、そのゲノムＤＮＡを制限酵素Sau3AIにより部分分解した。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素BamHIで切断してフォスファターゼ処理したプラスミドベクターpBluescript SK+（Stratagene）にライゲーションした。この組換え体ＤＮＡを用いて、大腸菌DH5αを形質転換した。この形質転換体の中から、ＡＴＣを唯一の窒素源として生育できるコロニーをスクリーニングしたところ、該コロニーは約10 kbのＤＮＡ 断片を含むプラスミド(pTK42)を有しており、このプラスミド上にＡＴＣの代謝に関連する遺伝子群が存在すると予想された。該プラスミド上には複数のORFが存在したが、その中で未同定のものとして、283個のアミノ酸をコードする849塩基で構成されるORF1の存在が確認され、atcR遺伝子と命名した。この遺伝子にコードされるポリペプチドのアミノ酸一次配列は、LysRファミリーの転写制御因子であるdgdR遺伝子産物 (Burkholderia cepaciaの2,2-ジアルキルグリシンデカルボキシラーゼリプレッサー)（GenBankアクセッション番号J05282）のアミノ酸一次配列と約30%の同一性を示した。なお、塩基配列の決定は、種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ）及びＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ）を用いて、常法に従って行った。
【００７６】
得られたPseudomonas sp. BSのatcR遺伝子の塩基配列を配列番号１に、また塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号２にそれぞれ示した。また、塩基配列を決定した隣接領域（Shiba et al. (2002) Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68, pp. 2179-2187）も含めた制限酵素地図と各遺伝子の位置関係を図２に示した。atcB遺伝子はL-ATCをN-カルバモイル-L-システインに変換するL-ATC加水分解酵素をコードし、atcC遺伝子はN-カルバモイル-L-システインをL-システインに変換するN-カルバモイル-L-システイン加水分解酵素をコードする。
【００７７】
〔実施例３〕  ＡｔｃＲ蛋白質とＤＬ−ＡＴＣによる発現制御
atcB遺伝子及びatcC遺伝子を完全に含む約2.6kbのEcoRI断片（図２参照）をEcoRIで開裂したクローニングベクターpBluescript SK+ (Stratagene)に挿入し、pTK10を得た。一方、atcR遺伝子を完全に含む約1.3kbのPstI断片（図２参照）をPstIで開裂したクローニングベクターpSTV28（タカラバイオ）に挿入し、pTK20を得た。これらのプラスミドにおいては、何れの遺伝子も本来クローニングベクターに備わっているlacプロモーターと順方向に位置させた。
【００７８】
pTK10とpTK20の組合せ（atcBCR）または、pTK10とpSTV28の組合せ（atcBC）で大腸菌DH5α株を形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコールに対する耐性を指標にして形質転換体を得た。それぞれの形質転換体を5mlのLB液体培地（100μg/mlアンピシリン、20μg/mlクロラムフェニコールを含む）で一晩培養し、5mlの新鮮なLB液体培地（100μg/mlアンピシリン、20μg/mlクロラムフェニコールを含む）で100倍希釈し、30℃で更に培養した。菌体濃度がOD600= 0.5の時、インデューサーとして最終濃度0.05%のDL-ATC（ＡＴＣのラセミ体）を添加し、更に3時間培養した。対照群にはDL-ATCを加えなかった。集菌後、200μlの20mM Tris-HCl (pH8.0)、1mMジチオスレイトール混合液に懸濁した。超音波処理にて菌体を破砕した後、10,000 rpm、3分間、4℃で遠心して上清を得た。50μlの30mM Tris-HCl (pH8.0)、2.5mMヒドロキシアミン、2.5mM DL-ATC混合液に10μlの遠心上清を加えた。30℃で1時間反応させた後、4μlの濃塩酸を加えて反応を停止した。15,000 rpm、5分間、4℃で遠心後、上清1μlを2回ずつ薄層にスポットして展開した（展開液；1-ブタノール：酢酸：水 = 2：1：1）。発色反応はニンヒドリンスプレー（和光純薬）を噴射し、ドライヤーで加熱して行った。
【００７９】
pTK10及びpTK20を導入した形質転換体（atcBC遺伝子に加えてatcRリプレッサー遺伝子を持つ）は、培養中にDL-ATCを添加することにより、DL-ATCからL-システインを合成するようになった。DL-ATCを添加しない場合には、L-システインの合成は認められなかった。一方、pTK10及びpSTV28を導入した形質転換体（atcBC遺伝子を持つがatcR遺伝子は持たない）は、DL-ATCの添加の有無に関わらずL-システインを合成した。以上の結果は、L-システインの合成に関与する加水分解酵素をコードするatcBC遺伝子は、AtcRタンパクとDL-ATCに依存した発現制御下にあることを強く示唆する。
【００８０】
〔実施例４〕  ＡｔｃＲタンパク
atcR遺伝子を完全に含む約1.3kbのNcoI-PstI断片（図２参照）をNcoI及びPstIで開裂したpT7-7(BgXNc)に挿入し、pTA4011を得た。pT7-7(BgXNc)は、T7発現ベクターpT7-7（Current Protocols in Molecular Biology, Unit 16.2）のNdeI認識配列をNcoI認識配列に改変したものである。
【００８１】
大腸菌BL21 Star (DE3)株（インビトロジェン）にAtcR産生用プラスミドpTA4011を導入し、LB寒天培地 (20μg/mlアンピシリン)に植菌後、37℃で一晩培養して多数のコロニーを得た。これらのコロニーを掻き集め、600mlのLB液体培地 (20μg/mlアンピシリン)に植菌し、30℃で増殖させた。菌体濃度がOD600=0.55の時、最終濃度1mMのIPTGで誘導し、更に30℃で5時間培養した。培養液を4,500rpm、10分間遠心して集菌し、60mlの20mM Tris-HCl (pH7.5)に懸濁した後、超音波処理にて菌体を破砕した。これを再度遠心（30,000 X g、30分間）し、得られた上清（可溶性画分）を硫酸アンモニウム沈殿法にて分画した。その結果、可溶性画分に含まれる大部分のAtcRタンパクが、30-40%飽和硫酸アンモニウム画分に回収された。次に、沈殿を20mlの20mM Tris-HCl (pH7.5)、0.1% Triton X-100混合液に溶解し、HiTrapQ HPカラム（アマシャム社製）に吸着させ、KCl濃度勾配にて分画した。AtcRタンパクは、KCl濃度200-300mMの溶出画分（約4ml）に得られた。このピーク画分ではAtcRタンパクが95%以上の純度に精製されており、タンパク濃度は約5mg/mlであった。AtcRタンパクをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析したところ、分子量約30,000ダルトンの位置に認められた。アミノ酸配列を基に算出される分子量は31,463ダルトンであり、電気泳動の結果とほぼ一致した。
【００８２】
〔実施例５〕  ａｔｃＢ転写調節領域とＡｔｃＲタンパクとのゲルシフトアッセイ
上記〔実施例３〕でatcB遺伝子の発現が、AtcRタンパクによって抑制されていることが示唆された。そこで、AtcRタンパクがatcB遺伝子の転写調節領域に存在する特定の塩基配列に対する結合能を有することを確かめるため、ゲルシフトアッセイを試みた。atcB及びatcR遺伝子の転写調節領域を含むと考えられる部分の塩基配列とatcB遺伝子にコードされるアミノ酸配列の一部を配列番号２４及び配列番号２５に示す。また、atcRは同領域５’側の相補鎖にコードされ、そのアミノ酸配列の一部（アミノ末端側）が図３に示されている（atcRの全配列は配列番号２参照）。ここに示した範囲に含まれる部分的領域に相当するＤＮＡ断片をPCRで増幅した。ポリメラーゼはKOD-Plus-（東洋紡）、鋳型としてpTK20（〔実施例３〕）、プライマーとして下記のものを用いた。PCR反応は、T gradient（バイオメトラ）にて94℃15秒、54〜60℃30秒、68℃20〜40秒で35サイクルおこなった。増幅したＤＮＡ断片の名称、使用したプライマーの名称及び塩基配列（配列番号３〜配列番号８）を以下に示す。
【００８３】
≪増幅したＤＮＡ断片及び合成したプライマー≫
ＤＮＡ断片
B283（配列番号２４のヌクレオチド番号11から283）
プライマー
B11-30F: TCA ATC CGG TCA ATC ACC TG（配列番号３）
B264-283R: GCG CTA CTT GGT TCA GTC CT（配列番号４）
【００８４】
ＤＮＡ断片
B312（配列番号２４のヌクレオチド番号11から312）
プライマー
B11-30F（配列番号３）
B290-312R: TGA TAG GTT GAT CGC AAA ACG CG（配列番号５）
【００８５】
ＤＮＡ断片
B13（配列番号２４のヌクレオチド番号11から378）
プライマー
B11-30F（配列番号３）
B354-378R：GTC TTT TAT TGG TTA TCG CAT CGG C（配列番号６）
【００８６】
ＤＮＡ断片
B7（配列番号２４のヌクレオチド番号307から600）
プライマー
B307-337F: CTA TCA GAT AAA TCC GTT TCT ATT CAA TAA G（配列番号７）
B581-600R: TTC GCG GCG AAG GTT TGC CC（配列番号８）
【００８７】
ゲルシフトアッセイは、以下のように行った。増幅したＤＮＡ断片0.4ngとAtcRタンパク20ngを10μlの系（20mM Tris-HCl (pH7.5), 0.01% Triton X-100, 5%(w/v) グリセロール）で室温10分間反応させ、
6%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動は1X TBEバッファー中で、10 mA、4℃で行った。ゲル中のＤＮＡの染色にはSYBR green I nucleic acid gel stain（モレキュラープローブ）を用い、FRA-3000（フジフィルム）でスキャンした。尚、各々のＤＮＡ断片に関して、対照として反応系にAtcRタンパクを加えていないものを同時に電気泳動した。ＤＮＡ断片B312とB13に関しては、AtcRタンパクの存在により有意なバンドのシフトがみられた。一方、ＤＮＡ断片B283とB7に関してはシフトが認められなかった（図５参照）。また、ネガティブ対照群として、pUC18（タカラバイオ）のlacプロモーター及びマルチクローニング部位を含む500bpのＤＮＡ断片L3を用いて同様のアッセイを行ったが、ＤＮＡバンドのシフトは認められなかった（図６参照）。このL3断片をPCRで増幅する際に使用したプライマーの名称及び塩基配列（配列番号９及び配列番号１０）を以下に示す。
【００８８】
≪合成したプライマー≫
PUC18( 1-20): GCG CCC AAT ACG CAA ACC GC（配列番号９）
PUC18c(500-481): TAT GCG GTG TGA AAT ACC GC（配列番号１０）
【００８９】
〔実施例６〕  ａｔｃＡ転写調節領域とＡｔｃＲタンパクとのゲルシフトアッセイ 
以前から、Pseudomonas ovalis BS株をDL-ATC存在下で培養するとATCラセミ化酵素活性が上昇するという結果が得られており、ATCラセミ化酵素をコードするatcA遺伝子もAtcRタンパクの関与する発現制御下にあることが予想されている。そこで、AtcRタンパクがatcA遺伝子の転写調節領域に存在する特定の塩基配列に対する結合能を有することを確かめるため、ゲルシフトアッセイを試みた。配列番号２６及び配列番号２７にatcA遺伝子の転写調節領域を含むと考えられる部分の塩基配列とatcA遺伝子にコードされるアミノ酸配列とをそれぞれ示した（図４参照）。ここに示した範囲に含まれる部分的領域に相当するＤＮＡ断片をPCRで増幅した。鋳型としてpTK42（〔実施例２〕）、プライマーとして下記のものを用いた。PCR反応は、〔実施例５〕と同様に行った。増幅したＤＮＡ断片の名称、使用したプライマーの名称及び塩基配列（配列番号１１〜配列番号１６）を以下に示す。
【００９０】
≪増幅したＤＮＡ断片及び合成したプライマー≫
ＤＮＡ断片
A13（配列番号２６のヌクレオチド番号1から306）
プライマー
R1-20F: TCG CCA GAT CCT CGA CGA GC（配列番号１１）
R285-306R: GCT TCA TCG TAC TGA GCC CGT C（配列番号１２）
【００９１】
ＤＮＡ断片
A16（配列番号２６のヌクレオチド番号1から341）
プライマー
R1-20F（配列番号１１）
R322-341R: CTC GCT GGA TTC ATT GCG CC（配列番号１３）
【００９２】
ＤＮＡ断片
R21（配列番号２６のヌクレオチド番号307から600）
プライマー
R307-326F: AAC AAT TCA TCG CCA GGC GC（配列番号１４）
R581-600R: TGC GGG GTC AGC GGC ATG GA（配列番号１５）
【００９３】
ＤＮＡ断片
R22（配列番号２６のヌクレオチド番号322から600）
プライマー
R322-341F: GGC GCA ATG AAT CCA GCG AG（配列番号１６）
R581-600R（配列番号１５）
【００９４】
ゲルシフトアッセイは、〔実施例５〕と同様におこなった。ＤＮＡ断片A16とR21に関しては、AtcRタンパクの存在により有意なバンドのシフトがみられた。一方、ＤＮＡ断片A13とR22に関してはシフトが認められなかった。
【００９５】
〔実施例７〕  ａｔｃＢ遺伝子とａｔｃＡ遺伝子上流領域とのホモロジー解析
上記〔実施例５〕及び〔実施例６〕の結果から、AtcRタンパクがatcB遺伝子及びatcA遺伝子の上流領域に存在する特定の塩基配列に結合することが示唆された。atcB遺伝子及びatcA遺伝子の上流領域間で塩基配列のホモロジーを調べると、完全に一致する9塩基からなる配列が見つかった。その塩基配列を以下に示す。
【００９６】
≪atcB遺伝子及びatcA遺伝子の上流領域に共通の塩基配列≫
ATT CAT CGC（配列番号１７）
【００９７】
この配列の近傍を更に解析すると、配列番号１７に示した9塩基をＬＩＲとする不完全なＩＲ配列が、atcB遺伝子及びatcA遺伝子の上流領域に存在することが明らかになった。その塩基配列を以下に示す。
【００９８】
≪atcB遺伝子上流領域に存在するＩＲ配列≫
ATT CAT CGC GTT TTG CGA TCA AC（配列番号１８）（図３のヌクレオチド番号284から306）
【００９９】
≪atcA遺伝子上流領域に存在するＩＲ配列≫
ATT CAT CGC CAG GCG CAA TGA AT（配列番号１９）（図４のヌクレオチド番号311から333）
【０１００】
従って、〔実施例５〕のゲルシフトアッセイの結果は、配列番号１８に示した23塩基を全て含むＤＮＡ断片はシフトし、含まないものはシフトしなかったことを示している。また、〔実施例６〕のゲルシフトアッセイの結果は、配列番号１９に示した23塩基を全て含むＤＮＡ断片はシフトし、部分的に含むもの及び全く含まないものはシフトしなかったことを示している。AtcRタンパクが、これらのＩＲ配列をCis因子として特異的に認識し、結合することが強く示唆された。
【０１０１】
〔実施例８〕  配列番号２８−３０のゲルシフトアッセイ
次に、AtcRタンパクが、これらのＩＲ配列に特異的に結合することを確かめるためのゲルシフトアッセイを試みた。先ず、atcB遺伝子またはatcA遺伝子の周辺配列とはその塩基配列が無関係と考えられるpUC18のマルチクローニング部位に、配列番号１８及び配列番号１９に示したＩＲ配列を挿入した。具体的には、配列番号２０及び配列番号２１に示す2種のオリゴヌクレオチドをアニールさせ、生成した短い2本鎖のＤＮＡ断片をEcoRIとPstIで開裂させたpUC18にクローニングし、プラスミドpLB23を得た。また、配列番号２２及び配列番号２３に示す2種のオリゴヌクレオチドをアニールさせ、生成した短い2本鎖のＤＮＡ断片をEcoRIとPstIで開裂させたpUC18にクローニングし、プラスミドpLA23を得た。
【０１０２】
≪合成したオリゴヌクレオチド≫
B23-T (34): AAT TAT TCA TCG CGT TTT GCG ATC AAC ACC TGC A（配列番号２０）
B23-B (26): GGT GTT GAT CGC AAA ACG CGA TGA AT（配列番号２１）
A23-T (34): AAT TAT TCA TCG CCA GGC GCA ATG AAT ACC TGC A（配列番号２２）
A23-B (26): GGT ATT CAT TGC GCC TGG CGA TGA AT（配列番号２３）
【０１０３】
pLB23は、pUC18のEcoRI-PstI部位間に配列番号１８に示したＩＲ配列を挿入したプラスミドであり、pLA23は、同じくpUC18のEcoRI-PstI部位間に配列番号１９に示したＩＲ配列を挿入したプラスミドである。
【０１０４】
また同様に、配列番号１８に示す塩基配列の両端から1塩基ずつを除いた配列番号２８に示す塩基配列、配列番号１９に示す塩基配列の両端から1塩基ずつを除いた配列番号２９に示す塩基配列及び配列番号１９に示す塩基配列のうちヌクレオチド番号16のC（シトシン）を除いた配列番号３０に示す塩基配列をpUC18のマルチクローニング部位に挿入した。配列番号２８から配列番号３０を以下に示す。
【０１０５】
TTC ATC GCG TTT TGC GAT CAA（配列番号２８）（図３のヌクレオチド番号285から305）
TTC ATC GCC AGG CGC AAT GAA（配列番号２９）（図４のヌクレオチド番号312から332）
ATT CAT CGC CAG GCG AAT GAA T（配列番号３０）
【０１０６】
具体的には、配列番号３１及び配列番号３２に示す2種のオリゴヌクレオチドをアニールさせ、生成した短い2本鎖のＤＮＡ断片をEcoRIとPstIで開裂させたpUC18にクローニングし、プラスミドpLB21を得た。また、配列番号３３及び配列番号３４に示す2種のオリゴヌクレオチドをアニールさせ、生成した短い2本鎖のＤＮＡ断片をEcoRIとPstIで開裂させたpUC18にクローニングし、プラスミドpLA21を得た。更に、配列番号３５及び配列番号３６にに示す2種のオリゴヌクレオチドをアニールさせ、生成した短い2本鎖のＤＮＡ断片をEcoRIとPstIで開裂させたpUC18にクローニングし、プラスミドpLA23-2を得た。
【０１０７】
≪合成したオリゴヌクレオチド≫
B21-T (32): AAT TTT CAT CGC GTT TTG CGA TCA AAC CTG CA（配列番号３１）
B21-B (24): GGT TTG ATC GCA AAA CGC GAT GAA（配列番号３２）
A21-T (32): AAT TTT CAT CGC CAG GCG CAA TGA AAC CTG CA（配列番号３３）
A21-B (24): GGT TTC ATT GCG CCT GGC GAT GAA（配列番号３４）
A22-T (33): AAT TAT TCA TCG CCA GGC GAA TGA ATA CCT GCA（配列番号３５）
A22-B (25): GGT ATT CAT TCG CCT GGC GAT GAA T（配列番号３６）
【０１０８】
pLB21は、pUC18のEcoRI-PstI部位間に配列番号２８に示したＩＲ配列を挿入したプラスミドである。pLA21はpUC18のEcoRI-PstI部位間に配列番号２９に示したＩＲ配列を挿入したプラスミドであり、pLA23-2はpUC18のEcoRI-PstI部位間に配列番号３０に示したＩＲ配列を挿入したプラスミドである。
【０１０９】
〔実施例５〕と同様に、ゲルシフトアッセイに用いるＤＮＡ断片はPCRで増幅した。pLB23、pLA23、pLB21、pLA21またはpLA23-2を鋳型とし、PUC18( 1-20) （配列番号９）及びPUC18c(500-481) （配列番号１０）をプライマーとして用いた。pLB23由来のＤＮＡ断片b23は、配列番号１８に示したＩＲ配列とその両端それぞれ234bpのpUC18由来配列とからなる。pLA23由来のＤＮＡ断片a23は、配列番号１９に示したＩＲ配列とその両端それぞれ234bpのpUC18由来配列とからなる。pLB21由来のＤＮＡ断片b21は、配列番号２８に示したＩＲ配列とその両端それぞれ234bpのpUC18由来配列とからなる。pLA21由来のＤＮＡ断片a21は、配列番号２９に示したＩＲ配列とその両端それぞれ234bpのpUC18由来配列とからなる。pLA23-2由来のＤＮＡ断片a22は、配列番号３０に示したＩＲ配列とその両端それぞれ234bpのpUC18由来配列とからなる。
【０１１０】
ＤＮＡ断片L3〔実施例５〕、b23、b21、a23、a21及びa22を用いて〔実施例５〕と同様にゲルシフトアッセイを行った（図６）。ＤＮＡ断片b23、b21及びa23に関しては、AtcRタンパクの存在下で特異的にバンドのシフトが認められた。一方、L3、a21及びa22に関しては、バンドのシフトは認められなかった。この結果は、配列番号１８、配列番号２８及び配列番号１９に示したＩＲ配列にAtcRタンパクが特異的に結合することを証明するものである。更に、b21がAtcRタンパクと結合することより、以下に示す８塩基からなる配列（配列番号３７及び配列番号３８）が、AtcRタンパクと結合するＩＲ配列の最小の構成要素の１つであることが示唆された。なお、配列番号３８に示す塩基配列は、配列番号２８に示すＩＲ配列のＲＩＲに対して完全に相補するものである。
【０１１１】
TTC ATC GC（配列番号３７）
TTG ATC GC（配列番号３８）
【０１１２】
〔実施例９〕  配列番号３９及び４０のゲルシフトアッセイ
次に、上記した配列番号１８および配列番号２８のＩＲ配列について、そのＬＩＲとＲＩＲとが完全に相補する塩基配列に改変し（配列番号３９、配列番号４０）、当該改変したＩＲ配列に対するAtcRタンパクの結合能をゲルシフトアッセイで確かめた。
因みに、配列番号３９に示したＩＲ配列は、配列番号１８に示した塩基配列の３’末端から４番目のシトシン（Ｃ）をグアニン（Ｇ）へ、３’末端のシトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）へ、それぞれ改変した塩基配列である。他方、配列番号４０に示したＩＲ配列は、配列番号２８に示した塩基配列の３’末端から３番目のシトシン（Ｃ）をグアニン（Ｇ）へ改変した塩基配列である。
【０１１３】
≪完全なＩＲ配列≫
ATT CAT CGC GTT TTG CGA TGA AT（配列番号３９）
TTC ATC GCG TTT TGC GAT GAA（配列番号４０）
【０１１４】
先ず、pUC18のマルチクローニング部位に、配列番号３９および配列番号４０に示したＩＲ配列を挿入した。具体的には、配列番号４１および配列番号４２に示す２種のオリゴヌクレオチドをアニールさせ、生成した短い2本鎖のDNA断片をEcoRIとPstIで開裂させたpUC18にクローニングし、プラスミドpLB23cを得た。また、配列番号４３および配列番号４４に示す２種のオリゴヌクレオチドをアニールさせ、生成した短い２本鎖のDNA断片をEcoRIとPstIで開裂させたpUC18にクローニングし、プラスミドpLB21cを得た。
【０１１５】
≪合成したオリゴヌクレオチド≫
B23c-T (34): AAT TAT TCA TCG CGT TTT GCG ATG AAT ACC TGC A（配列番号４１）
B23c-B (26): GGT ATT CAT CGC AAA ACG CGA TGA AT（配列番号４２）
B21c-T (32): AAT TTT CAT CGC GTT TTG CGA TGA AAC CTG CA（配列番号４３）
B21c-B (24): GGT TTC ATC GCA AAA CGC GAT GAA（配列番号４４）
【０１１６】
pLB23cは、pUC18のEcoRI-PstI部位間に配列番号３９に示したＩＲ配列を挿入したプラスミドであり、pLB21cは、同じくpUC18のEcoRI-PstI部位間に配列番号４０に示したＩＲ配列を挿入したプラスミドである。
【０１１７】
〔実施例５〕と同様に、ゲルシフトアッセイに用いるDNA断片はPCRで増幅した。pLB23cまたはpLB21cを鋳型とし、PUC18(1-20)（配列番号９）およびPUC18c(500-481)（配列番号１０）をプライマーとして用いた。pLB23c由来のDNA断片b23cは、配列番号３９に示したＩＲ配列とその両端それぞれ234bpのpUC18由来配列とからなる。pLB21c由来のDNA断片b21cは、配列番号４０に示したＩＲ配列とその両端それぞれ234bpのpUC18由来配列とからなる。
【０１１８】
b23cおよびb21cを用いて〔実施例８〕と同様にゲルシフトアッセイを行った（図７）。b21cに関しては、b21（〔実施例８〕および図６）と同程度のバンドシフトがみられた。一方、b23cに関しては、シフトしたバンドがはっきりと確認でき、これまでに調べた他の何れのDNA断片よりAtcRタンパクとの結合が強いことが分かった。以上の結果は、配列番号１７に示す９塩基を構成要素とする全長２３塩基からなる完全なＩＲ配列がAtcRタンパクの理想的な認識配列であることを示している。
【０１１９】
〔実施例１０〕
atcB遺伝子およびatcR遺伝子の転写調節領域（atcB遺伝子のCis因子とatcR遺伝子のCis因子とがオーバーラップしている領域）とatcR遺伝子の一部とを含む0.4kb DNA断片をPCRで増幅するため、プライマーB1-25Eco(27)およびB397-378Bg(28)を合成した。更に、残るatcR遺伝子領域を含む0.7kb DNA断片をPCRで増幅するため、プライマー5492-5512E(30)および6159-6180E(25)を合成した。〔実施例５〕と同様の方法でpTK42（〔実施例２〕）を鋳型とし、それぞれのDNA断片を増幅した。
【０１２０】
≪合成したプライマー≫
B1-25Eco(27): CGG AAT TCC TCT TCA ATC CGG TCA ATC（配列番号４５）
B397-378Bg(28): GAA GAT CTG CTG CTC CTC CTT GCT GGA G（配列番号４６）
5492-5512E(30): CCG GAA TTC CTG CAG TTG ATG GGG CGG ACC（配列番号４７）
6159-6180E(25): CCG GAA TTC TGC CCC GCA CGG ATG G（配列番号４８）
【０１２１】
大腸菌のlacZ遺伝子をレポーターとして含むクローニングベクターpRS551（Simons et al. (1987) Gene, Vol. 53, pp. 85-96）のマルチクローニング部位にあるSmaI認識配列をBglII認識配列に改変したpRSBglIIを作成した。上記の0.4kb PCR断片をEcoRIとBglIIで切断し、EcoRIとBglIIで開裂させたpRSBglIIにクローニングし、プラスミドpBU1001を得た。更に、上記の0.7kb PCR断片をEcoR Iで切断し、EcoRIで開裂させたpBU1001にクローニングし、プラスミドpBU2021を得た。このプラスミドは、atcR遺伝子全領域と、重複するatcR/atcB転写調節領域を含み、lacZレポーター遺伝子は、atcB転写調節領域の支配下にある。pRSBglIIおよびpBU2021をSalIで切断し、SalIで開裂させた広範囲宿主ベクターpMT45（Okazaki et al. (1991) FEMS Microbiology Letters, Vol. 79, pp. 31-36）にクローニングし、それぞれプラスミドpMR678とpMR4023を得た。
【０１２２】
pMR678とpMR4023とを塩化カルシウム法によってPseudomonas aeruginosa PAO1株に導入し、得られた形質転換体を3mlのLB液体培地（200μg/mlカルベニシリン）に植菌し、30℃で一晩培養した。このカルチャー60μlを3mlの新たなLB液体培地（200μg/mlカルベニシリン）に植え継ぎ30℃で培養した。菌体濃度がOD600=0.4に達した時、DL-ATC、D-ATC、L-ATC、N-カルバモイル-L-システイン（L-NCC）、L-システイン（L-Cys）を最終濃度が1mMとなるように添加し、更に90分間培養した。次に40μlのカルチャーを分取し、Millerの方法（Miller (1992) A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press）でβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した（図８）。尚、N-カルバモイル-L-システインとL-システインは、ATCの代謝産物である。pMR4023を導入した株においては、DL-ATCおよびD-ATCを添加した場合のみ顕著なβ-ガラクトシダーゼ活性の上昇（誘導）がみられ、L-ATC、N-カルバモイル-L-システイン、L-システインを添加した場合は有意な誘導は起こらなかった。また、pMR678を導入した株では、何れの場合も基底レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性が僅かに認められるのみであった。以上の結果は、D-ATCがatcRの関与する転写調節系の誘導物質（インデューサー）であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】本発明にかかる組換え蛋白発現系を模式的に示す概念図である。
【図２】Ａはatc遺伝子座の制限酵素地図と各遺伝子の配置を示す図である。ＢはatcR遺伝子の塩基配列を示し、ＣはatcR蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】atcB遺伝子及びatcR遺伝子の転写調節領域周辺の塩基配列と該遺伝子のコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図４】atcA遺伝子の転写調節領域周辺の塩基配列と該遺伝子のコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図５】AtcR蛋白質とatcB遺伝子上流領域との特異的結合を確かめたゲルシフトアッセイの結果を示す図である。
【図６】AtcR蛋白質とＩＲ配列との特異的結合を確かめたゲルシフトアッセイの結果を示す図である。
【図７】AtcR蛋白質と完全なＩＲ配列との結合能を調べたゲルシフトアッセイの結果を示す図である。
【図８】AtcR蛋白質の関与する転写調節系におけるD-ATCのインデューサー（遺伝子発現誘導）効果を示す図である。
【符号の説明】
【０１２４】
１      ＤＮＡ結合性蛋白質及び／又は融合蛋白質
３      プロモーター領域
５      目的蛋白質（所望の蛋白質）
６，８  組換え発現ベクター
１０    ２-アミノチアゾリン-４-カルボン酸及び／又はその誘導体
【配列表フリーテキスト】
【０１２５】
【図１】
2005095163.tif 000007
【図２】
2005095163.tif 000008
【図３】
2005095163.tif 000009
【図４】
2005095163.tif 000010
【図５】
2005095163.tif 000011
【図６】
2005095163.tif 000012
【図８】
2005095163.tif 000013
【図７】
2005095163.tif 000014
【配列表】
2005095163000001.app