(57)【要約】【課題】異常プリオンたんぱく質を簡単な操作で安全に高感度に検出する。【解決手段】図は検査機本体に装着可能な検査キットを示し、この検査キットは試料の導入手段２１と、異常プリオンたんぱく質を濃縮する濃縮手段２２、検出する検出手段２３と、廃液を保存する保存手段２４を持ち、試料から異常プリオンたんぱく質が検出された場合は、検査機本体から外して検査キットごと廃却し、試料を外気に露出させることなく無害化処理を行う。【選択図】        図２
2005061833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常プリオンたんぱく質の検出のための測定手段を含む検査機本体と、検査機本体に着脱可能な検査キットとから成り、該検査キットは、検査すべき液体状試料の導入手段と、試料中の異常プリオンたんぱく質を選択的に濃縮する凝縮手段と、濃縮した異常プリオンたんぱく質を検出する検出手段と、濃縮手段又は検出手段で発生した廃液を保存する保存手段とから成り、前記導入手段と前記濃縮手段、前記検出手段、前記保存手段間を結ぶ管路を有し、前記検査キットは試料を密封したまま着脱可能とし、導入した試料中に異常プリオンたんぱく質が検出された場合は、前記検査キットを外気に試料を露出させることなく無害化処理を可能とすることを特徴とする異常プリオンたんぱく質の検査装置。
【請求項２】
前記検出手段は前記検査キットから分離可能とした請求項１に記載の異常プリオンたんぱく質の検査装置。
【請求項３】
前記濃縮手段は異常プリオンたんぱく質に特異的な吸着、濃縮機能を有する特異抗体又はその一部分を用いた請求項１に記載の異常プリオンたんぱく質の検査装置。
【請求項４】
前記濃縮手段で用いる抗体は、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含むアミノ酸配列から構成したエピトープの免疫原性を増強した人工たんぱく質を抗原として用いて作製した請求項３に記載の異常プリオンたんぱく質の検査装置。
【請求項５】
前記検出手段は異常プリオンたんぱく質に特異性を有する抗体を使用して抗原抗体反応を利用した請求項１〜４の何れか１つの請求項に記載の異常プリオンたんぱく質の検査装置。
【請求項６】
前記検出手段は表面に異常プリオンたんぱく質と親和力のある特異抗体を固定したファイバ形状のプローブを用いる蛍光免疫法を検査方法として用いる請求項５に記載の異常プリオンたんぱく質の検査装置。
【請求項７】
前記検出手段は前記異常プリオンたんぱく質を選択的に濃縮する手段と、試料を封印したまま分離可能であり、前記検出手段だけを廃却可能とした請求項１〜６の何れか１つの請求項に記載の異常プリオンたんぱく質の検査装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物に由来する異常プリオンたんぱく質を簡単な操作で安全に高感度に検出する異常プリオンたんぱく質の検査装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
伝播性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、羊では古くからスクレーピーとして知られ、研究されていた。この病気にかかると、動物の脳はスポンジ状に変質して、空洞ができ、神経中枢が機能しなくなり死に至る。スクレーピーの原因は、当初はウイルスによるものと考えられていたが、１９８０年代に感染性のたんぱく質が病原体と分かり、米国のプルシナーによってこのたんぱく質はプリオンと名付けられた。このプリオンは従来の細菌、ウイルスに比べ、その生物活性は異常に安定で、３０分煮沸しても、ホルマリン等の強力な薬剤で処理しても死滅することはない。更に、たんぱく質分解酵素に対しても、非常な耐性を有していることが知られている。
【０００３】
１９８６年に英国で牛の海綿状脳症（ＢＳＥ）が初めて発見され、狂牛病と呼ばれるようになった。狂牛病の症状は、２年以上の潜伏期間の後に、行動異常、運動失調などの神経症状を呈し、発病後２週間〜６ヶ月の経過で死に至るものである。感染した牛は、羊の場合と同様に脳の神経細胞が死滅して空洞ができ、脳組織がスポンジ状になることが確認されている。
【０００４】
この病気は英国を始めとして、瞬く間に世界中の牛に広がった。英国では、１９９２年の３６，９０６頭を筆頭に、現在まで１８万頭以上の牛に発生している。このように牛に狂牛病が発生したのは、英国でスクレーピーに感染した羊を未加熱のまま動物性飼料として牛に与えたためと考えられている。日本でも、２００１年８月に千葉県で発見されてから現在までに、北海道、群馬県などで５頭の発生が確認されている。
【０００５】
また、１９９６年に狂牛病に感染した牛肉を食べた結果、人にも変異型のクロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）が発症する可能性が高いことが報告された。このｖＣＪＤは１９９５年から現在までに、１００名以上の患者が確認されている。しかし、ｖＣＪＤは現在のところ有効な治療法がないことが、事態を深刻なものとしている。
【０００６】
このｖＣＪＤは感染経路が不明であり治療法もないことから、食肉の安全を確保するためには、食肉処理される牛に対してＢＳＥに感染しているか否かの検査を実施して、感染している牛は焼却処分にせざるを得ない状況である。
【０００７】
日本では、２００１年１０月１８日から厚生労働省の「牛海綿状脳症検査要領」に基づき、と畜場に搬入される全ての牛について検査が実施されるようになった。
【０００８】
この要領に拠れば、スクリーニング検査として、と畜場に搬入された全ての牛の延髄を牛海綿状脳症用検査キット「プラテリアＢＳＥ」を使用して、所謂ＥＬＩＳＡ法により検査を行うこととなっている。更に、スクリーニング検査で陽性と判断された検体については、確定検査を実施することをなっている。
【０００９】
確定検査では、ウエスタンブロット法と組織切片免疫組織学的な検査により、比較的擬陽性の出易いスクリーニング検査に対して、特異性の高い確定診断を行っている。
【００１０】
しかし、現在では何れの検査方法も感度に限界があるため、異常プリオンたんぱく質が高濃度に蓄積する脳を検体として用いざるを得ない。また、スクリーニング検査にしても確定検査にしても、これらの異常プリオンたんぱく質が高濃度に蓄積した検体を、開放系で非常に煩雑な操作で処理することが必要とされている。
【００１１】
異常プリオンたんぱく質が高濃度に蓄積する脳の試料の取り扱いは、非常に危険な作業である。これら危険を踏まえて、「牛海綿状脳症検査要領」では、「実験室内でのプリオン材料の取り扱いについて」として安全キャビネットの使用、手袋、マスクなどの安全保護具の着用、汚染物の処理などが記述されている。しかし、異常プリオンたんぱく質が、従来の細菌、ウイルスなどに比べて桁違いにその生物活性を保存し、通常のバイオセーフティの手法では、その感染性危険はなくならないことを考えると、作業者や直接検査に携わる検査官を始めその周辺の人々に対して、十分な安全性の確保は困難と云わざるを得ない状況にある。
【００１２】
また、これらの検査は死亡した牛にだけ有効であるので、生きた牛の異常を知るためには、外観の観察だけしか手段がないため、潜伏期間中の牛の感染については知ることができず、生産者の不安は何時までもなくなることがない。
【００１３】
更に、牛は食肉以外にも、牛乳、ゼラチン、コラーゲン等などが様々な用途に用いられている。これらの原材料及びそれを原料として作られた製品の安全性を確実に確認するために、これらの低濃度部位でも異常プリオンたんぱく質の蓄積を検査できることが望まれている。
【００１４】
日本国内で、と畜場に搬入される牛は年間約１００万頭である。これらの牛の全数を確実に処理するためには、高い安全性と、高感度は勿論のこと、迅速で個人差の無い簡便な検査装置が望まれている。
【００１５】
従来技術として、微量の異常プリオンたんぱく質の検査方法が幾つか提案されている。イムノＰＣＲにより、例えば特許文献１に異常プリオンたんぱく質を高感度に検出する技術が開示されている。
【００１６】
更に、低濃度の病原性プリオンたんぱく質の検出方法として、濃縮の工程を含む検出方法が例えば特許文献２に開示されているが、濃縮はプロテイナーゼＫ処理後に遠心分離等で分離、濃縮するものであって、異常プリオンたんぱく質の特異的な濃縮を提案しているものではない。
【００１７】
従来技術として、異常プリオンたんぱく質による感染の有無を迅速に決定するために、例えば特許文献３に非ヒト動物の濾胞樹状細胞における異常プリオンたんぱく質の沈着を指標とする技術が開示されている。
【００１８】
また、従来技術として、例えば特許文献４に異常プリオンと反応する標識された抗体により伝播性海綿状脳障害の推定因子を検出する方法が開示されている。
【００１９】
従来技術では、例えば特許文献５に異常蛋白のプロテアーゼＫ抵抗性ドメインからのペプチド配列に対して誘導した抗体を使用して、異常たんぱくを検出するプリオン病の検出方法が開示されている。
【００２０】
また、ＨＩＶの抗体の作製方法として、例えば特許文献６に特異抗体を効率良く作製するために抗原として用いるペプチド性エピトープのアミノ酸配列を含みエピトープの免疫原性が増強された人工たんぱく質について開示されている。
【００２１】
従来の免疫法の検査手段として、例えば特許文献７にファイバ部を有する分析装置が開示されている。
【００２２】
【特許文献１】
特開平１０−２６７９２８号公報
【特許文献２】
特開平１１−３２７９５号公報
【特許文献３】
特開２００２−２２８６６５号公報
【特許文献４】
特開２０００−２３０９２８号公報
【特許文献５】
特許第３３３３２１３号
【特許文献６】
特開２００２−１１９２８６号公報
【特許文献７】
特許第３０５４１６１号
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら上述の従来例においては、食品の安全を確保するために行われる異常プリオンたんぱく質の検査は、試料そのものが危険である。即ち、異常プリオンたんぱく質が体内に入ると、変異型のクロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）が発症する可能性があるため、試料の慎重な取り扱いが要求される。
【００２４】
本発明の目的は、上述の課題を解決し、このような危険な検体を扱う検査の全工程で安全性を保証する異常プリオンたんぱく質の検査装置を提供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明に係る異常プリオンたんぱく質の検査装置は、異常プリオンたんぱく質の検出のための測定手段を含む検査機本体と、検査機本体に着脱可能な検査キットとから成り、該検査キットは、検査すべき液体状試料の導入手段と、試料中の異常プリオンたんぱく質を選択的に濃縮する凝縮手段と、濃縮した異常プリオンたんぱく質を検出する検出手段と、濃縮手段又は検出手段で発生した廃液を保存する保存手段とから成り、前記導入手段と前記濃縮手段、前記検出手段、前記保存手段間を結ぶ管路を有し、前記検査キットは試料を密封したまま着脱可能とし、導入した試料中に異常プリオンたんぱく質が検出された場合は、前記検査キットを外気に試料を露出させることなく無害化処理を可能とすることを特徴とする。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明を図示の実施の形態に基づいて詳細に説明する。
図１は本発明の検査装置を模式的に表した構成図であり、検査装置は検査機本体１と、検査機本体１に着脱可能な検査キット２とから成っている。検査キット２は試料を密封したまま検査機本体１に着脱可能であり、導入した試料中に異常プリオンたんぱく質が検出された際は、検査キット２は試料を外気に露出させることなく、検査機本体１から外して無害化処理が可能な構成とされている。
【００２７】
検査機本体１は、異常プリオンたんぱく質の検出のための測定手段１１、必要に応じて信号処理手段１２、動作制御手段１３、液晶ディスプレイから成る表示手段１４を備えている。
【００２８】
図２は検査キット２の構成図を示し、検査すべき液体状の試料の導入手段２１と、試料中の異常プリオンたんぱく質を選択的に濃縮する濃縮手段２２と、濃縮した異常プリオンたんぱく質を検出する検出手段２３と、濃縮手段２２又は検出手段２３で発生した廃液を保存する廃液保存手段２４とを備えている。
【００２９】
試料はバルブ２５を介して管路２６を通って導入手段２１に導入されるようになっており、導入手段２１と濃縮手段２２間は管路２７で結ばれ、濃縮手段２２と検出手段２３間はバルブ２８を介して管路２９に結ばれている。また、濃縮手段２２と廃液保存手段２４間はバルブ３０、３１を介して管路３２により結ばれ、検出手段２３と保存手段２４間は管路３３、バルブ３１を介して結ばれている。
【００３０】
検査機本体１内の動作制御手段１３は、動作信号Ｓを発して検査機本体１内の各手段の動作を制御すると同時に、バルブ２５等の開閉制御、検査キット２内の各手段の動作の制御も行うようにされている。
【００３１】
異常プリオンたんぱく質を蛍光により検出する場合に、検査機本体１の測定手段１１は、検査キット２の検出手段２３内の検体を励起する励起光源と、検体から発生した蛍光の光学的な測定機構を有している。蛍光の励起光源としては、レーザー、ＬＥＤ、蛍光灯、キセノンランプ、ハロゲンランプ、重水素ランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などが有効であるが、特に半導体レーザーが装置の小型化、単色性などから最適である。蛍光の検出手段としては、フォトダイオード、フォトマル、ＣＣＤなどが有効であるが、特にフォトダイオードが最適である。
【００３２】
本発明で望ましい濃縮手段２２は、アフィニティクロマトグラフィの利用であり、このアフィニティクロマトグラフィでは先ずカラム内のマトリックスに異常プリオンたんぱく質と親和力のあるリガンドをカップリングする。望ましいリガンドは、正常なプリオンたんぱく質に対して異常プリオンたんぱく質に優位な親和力を有することである。通常の検体では、正常プリオンたんぱく質と異常プリオンたんぱく質の両方が、試料の中に見い出されるので、両者を識別する必要がある。正常プリオンたんぱく質と異常プリオンたんぱく質は、そのペプチド配列は同等であるが、立体構造が異なるので、リガンドは立体構造を識別できることが必要である。
【００３３】
本実施の形態で望ましいリガンドは、正常プリオンたんぱく質と異常プリオンたんぱく質の立体構造を識別し得る抗体である。特に、抗体はペプチド性エピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含むアミノ酸配列から構成されているエピトープの免疫原性を増強した人工たんぱく質を抗原として用いて作製したものであることが望ましく、特にモノクローナル抗体であることが好ましい。更に、異常プリオンたんぱく質に反応するエピトープの異なる複数の抗体を用いることが望ましい。
【００３４】
マトリックスはリガンドと効率良くカップリングできること、焼却等の無害化処理で環境に悪影響の少ないものであることが必要である。本実施の形態において、マトリックスの材質としては、アクリルアミド樹脂などの樹脂、又はガラス、シリカ、ハイドロキシアパタイトなどの無機物が好ましい。特に、ヒドラジド、琥珀酸イミド等の官能基を表面に持つ樹脂が好適で、マトリックスの形状としてはビーズ形状が望ましい。
【００３５】
次に、上記の方法で作製したカラム内に濃縮すべき試料を導入すると、リガンドに親和力がある異常プリオンたんぱく質は、マトリックス上のリガンドに吸着するが、親和力のない他の分子は吸着されることなく通過する。
【００３６】
吸着されることなく通過した液体中にも、微量であるが吸着されなかった異常プリオンたんぱく質を含んでいるので、これらの廃液は濃縮手段２２から管路３２を経て保存手段２４に導入され、陰性、陽性の判別がなされるまで保存される。バルブ２８、３０、３１により、管路２９、３２、３３を切換え、廃液が検出手段２３を通過することなく廃液保存手段２４に導けることは、信頼性を高めるために有効である。廃液保存手段２４に保存された溶液は、試料が陽性と判断された場合には、検査キット２に密封されたまま検査キット２ごと焼却等の方法で無害化処理される。
【００３７】
濃縮手段２２でリガンドに吸着された異常プリオンたんぱく質は、ｐＨを変化させる等の方法で溶出させる。溶出した異常プリオンたんぱく質を高濃度に含んだ溶液は、必要に応じてｐＨを調整するなどの操作後に、管路２９を経て検出手段２３に導入される。
【００３８】
検出手段２３は外気に触れることなく密封系で検出できること、高感度に検出できること、異常プリオンたんぱく質を特異的に検出できることなどの条件が必要であるが、抗体による免疫法が望ましい。特に、ファイバ表面に異常プリオンたんぱく質と親和力を持つ抗体を固定したプローブ形状から成る蛍光免疫法による検査方法が最適である。
【００３９】
ファイバ表面に異常プリオンたんぱく質と親和力のある抗体を固定したプローブ形状から成る蛍光免疫法を検査方法として用いる場合に、ファイバは光学的に良好な性質を示すガラス又は樹脂が望ましい。特に、アクリル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂又はそれらの樹脂を含む樹脂が最適である。
【００４０】
ファイバの形状は、十分な光学的特性を出すために細長い形状が好ましい。ファイバ部の長さとしては、５ｍｍ〜５００ｍｍ、望ましくは１０ｍｍ〜２００ｍｍ、最適には２０ｍｍ〜１００ｍｍである。断面の形状は、円形、楕円形、三角形、四角形又は多角形が好ましい。断面積としては、０．１ｍｍ２〜１０ｍｍ２、望ましくは０．２ｍｍ２〜５ｍｍ２、更には０．３ｍｍ２〜２ｍｍ２が最適である。また、ファイバの端部に光を導入するためのレンズ形状を持つことが望ましい。
【００４１】
ファイバの表面には、異常プリオンたんぱく質の捕捉のために、リガンドを付着させてあることが必要である。リガンドとしては、異常プリオンたんぱく質に親和性のある抗体が望ましい。サンドイッチ法で検出する場合に、標識抗体には酵素、色素、蛍光色素、アイソトープなどが結合されていることが必要である。本実施の形態では、特に蛍光色素を用いることが好適であり、蛍光色素としてはフルオレッセイン、ローダミン系、Ｃｙ５などが有効である。
【００４２】
また検査キット２では、濃縮手段２２と検出手段２３とを分離可能であることが好ましい。試料が陰性であった場合に、検出手段２３だけを交換することによって、検査コストを押さえ、更に検出感度を安定させることが可能となる。
【００４３】
以下に、本発明を更に実施例により具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるわけではない。
【００４４】
実施例１：光学的な測定手段１１を持つ検査機本体１に、濃縮手段２２と検出手段２３と廃液保存手段２４から成る検査キット２を装着した。検査キット２内の濃縮手段２２は、直径５ｍｍ、長さ１００ｍｍのチューブ内に、異常プリオンたんぱく質に反応するエピトープの異なる３種類のモノクローナル抗体をアクリルアミド樹脂から成るビーズに固定したビーズを充填したカラムから成っている。先のモノクローナル抗体は、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列の一部を含むアミノ酸配列から構成され、異常プリオンたんぱく質と同一の立体構造を部分的に持つ人工たんぱく質Ａを抗原として用いて作製した。
【００４５】
実施例１の検出手段２３は、端部にレンズを持ち、表面に異常プリオンたんぱく質と親和力のあるモノクローナル抗体が固定してあるファイバ状のプローブを用いて行った。ファイバの太さは０．７ｍｍ、長さは１０ｃｍとし、ポリスチレン樹脂を射出成形により作製した。
【００４６】
ファイバ表面に固定した抗体は、濃縮手段２２のリガント同様に、ペプチド性エピトープのアミノ酸配列の一部を含むアミノ酸配列から構成され、人工たんぱく質を抗原として用いて作製したモノクローナル抗体を使用した。標識抗体としては、抗原のエピトープを変えた以外は、ファイバに固定した抗体と同様の方法で作製したモノクローナル抗体に、蛍光色素（Ｃｙ５）を結合したものを用いた。
【００４７】
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の中に、以下の表１に示すような組み合わせで、正常プリオンたんぱく質、及び異常プリオンたんぱく質と同一の立体構造を部分的に有する人工たんぱく質Ａを、異常プリオンたんぱく質に代えて加えた試料を各１００ｍｌ用意し検査キット２に導入した。
【００４８】
2005061833.tif 000003
【００４９】
各試料は導入手段２１を経て濃縮手段２２のカラムに導入され、試料内の人工たんぱく質Ａは、抗体に補足された。カラムを通過した廃液は管路３２を経て廃液保存手段２４に導入し、結果が判定するまで保存した。
【００５０】
次に、カラム内に脱離液として塩酸溶液（ｐＨ２．０）を１ｍｌ導入して人工たんぱく質Ａを溶出させた。この人工たんぱく質Ａを高濃度に含んだ塩酸溶液は濃縮手段２２内のｐＨ調整部分で中和し、人工たんぱく質Ａを高濃度に含んだ中和溶液は、バルブ２８、３０を切換え、濃縮手段２２から管路２９を経て検出手段２３に導入した。
【００５１】
次に、検出手段２３のファイバプローブを挿入した検査容器に中和した溶液を導入した。溶液中の人工たんぱく質Ａはファイバ表面の抗体に補足された。残った液は管路３３を通過して廃液保存手段２４に排出した。
【００５２】
次に、標識抗体をファイバプローブ表面に導入した。人工たんぱく質Ａがファイバ表面に存在するときは、人工たんぱく質Ａに標識抗体が付着して所謂抗原抗体のサンドイッチ構造を構成した。続いて、ファイバプローブの一端にあるレンズから、検査機本体１の測定手段１１に設けた半導体レーザー光源から検出手段２３に波長６３５ｎｍの照射光Ｌを照射する。この照射光Ｌはファイバ表面で複数全反射する。全反射した表面近傍にはエバネッセント光が漏れ出し、試料中に人工たんぱく質Ａがあった場合は、表面近傍のサンドイッチ構造の蛍光色素を励起して蛍光を発生させる。
【００５３】
蛍光は励起光と反対の経路を通りファイバ内を進み、ファイバ端部のレンズから出射して、測定手段１１に設けたフォトダイオードに照射される。導入された蛍光の強度から、予め設定したプログラムに従って、信号処理手段１２によって陽性、陰性の判断を行い、表示手段１４に結果を表示した。
【００５４】
結果を以下の表２に示し、本実施の形態の検査装置は異常プリオンたんぱく質の検出が可能であることが明らかとなった。
【００５５】
2005061833.tif 000004
【００５６】
導入した試料が陽性であった場合は、入口のバルブ２５を閉じ、汚染された試料を密封したまま検査キット２を取り外して焼却処理を行った。この結果、従来の方法と比べて作業者が試料に触れることなく、高い安全性が確認された。
【００５７】
実施例２：実施例１と同様の装置を用い、リン酸緩衝溶液の代りに牛の血液を用いた以外は実施例１と同等の実験を行ったところ、同等の結果が得られた。
【００５８】
実施例３：検査キット２の濃縮手段２２と検出手段２３が試料を密封したまま分離可能である以外は、実施例１と同等の装置を用い、実施例１と同等の実験を行ったところ、実施例１と同等の検査結果が得られた。
【００５９】
本実施例３では、試料が陽性であった場合は、実施例１と同様にバルブ２５を閉じ、汚染された溶液を密封した検査キット２全体を取り外して焼却処理を行った。
【００６０】
一方、試料が陰性であった場合は、濃縮手段２２と検出手段２３とを結ぶ管路２９のバルブ２８を閉じ、検出手段２３だけを取り外して廃却し、新たに未使用の検出手段２３を装着して、別の試料の検査を行ったところ、実施例１と同等の結果を得ることができた。
【００６１】
本実施例により、試料が陰性であった場合には、濃縮手段２２を繰り返し使用が可能であることが分かり、廃棄物の削減に大きな効果があることが確認された。
【００６２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明に係る異常プリオンたんぱく質の検査装置は、異常プリオンたんぱく質を高感度に検出でき、更に異常プリオンたんぱく質が検出された場合も、全試料を外気に試料を露出させることなく、無害化処理が可能という優れた効果があり、その産業的利用価値は大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】検査装置の模式図である。
【図２】検査キットの模式図である。
【符号の説明】
１  検査機本体
２  検査キット
１１  測定手段
１２  信号処理手段
１３  動作制御手段
１４  表示手段  ２１  導入手段
２２  濃縮手段
２３  検出手段
２４  廃液保存手段
２５、２８、３０、３１  バルブ
２６、２７、２９、３２、３３  管路
【図１】
2005061833.tif 000005
【図２】
2005061833.tif 000006