(57)【要約】【課題】            遺伝子組換え動物を作出するための新規な核移植未受精卵の活性化方法を提供する。【解決手段】        本発明は、核移植された未受精卵の活性化方法において、精子を用いて受精させることにより核移植未受精卵の成熟分裂を開始させることを特徴とする核移植未受精卵の活性化方法に関する。また、本発明は、当該活性化方法により得られる核移植受精卵、さらに当該核移植受精卵を用いることを特徴とする遺伝子組換え動物の作出方法に関する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核移植された未受精卵の活性化方法において、受精により核移植未受精卵の成熟分裂を開始させることを特徴とする核移植未受精卵の活性化方法。
【請求項２】
核移植未受精卵が、未受精卵から除核後、所望とする遺伝子組換え操作が行われた細胞由来の核が当該除核部位に移入されることにより得られるものである請求項１に記載の活性化方法。
【請求項３】
受精が精子、精原細胞または精母細胞のいずれか一つを用いることにより行われることを特徴とする請求項１または２に記載の活性化方法。
【請求項４】
受精が精子を用いることにより行われることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の活性化方法。
【請求項５】
受精が、精子、精原細胞または精母細胞のいずれか一つに、人工的な単為発生処理を組み合わせて行うことを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の活性化方法。
【請求項６】
人工的な単為発生処理が薬剤処理または電気刺激により行われる請求項５に記載の活性化方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の活性化方法により活性化されることを特徴とする核移植受精卵。
【請求項８】
請求項７に記載の核移植受精卵を用いることを特徴とする遺伝子組換え動物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入動物を得る効率的な方法に関するものである。詳細には、核移植された未受精卵を受精により核移植未受精卵の成熟分裂を開始させることを特徴とする核移植未受精卵の活性化方法、当該活性化方法により得られる核移植受精卵、さらに当該核移植受精卵を用いることを特徴とする遺伝子組換え動物の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え動物は、生物学的な研究のみならず医薬品等の有用タンパク質生産や再生医療への応用が進められている。遺伝子組換え動物の作出は、1980年にGordonらによってマウスでその成功が報告され、その後、他の動物でも相次いで成功が報告された（例えば、非特許文献１参照）。Gordonらの方法は、外来DNAを受精卵の前核内に直接注入する方法で、最も一般的に遺伝子組換え動物の作出方法として利用されている。しかしこの方法では、遺伝子相同組換えなどの高度な遺伝子組換えを行うことは難しい。マウスでは、遺伝子相同組換えを実施するための培養も可能でかつ個体への分化能をもつ胚性幹細胞が確立されているが（例えば、非特許文献２参照）、その他の動物では、このような細胞は確立されていない。
【０００３】
このような背景の中、近年、体細胞を用いた核移植によりクローン動物が得られることが報告された（例えば、非特許文献３参照）。この技術は体細胞核移植と呼ばれ、胚性幹細胞と同様に培養可能な体細胞で遺伝子組換え操作が行えることから遺伝子相同組換え等の高度な操作を行った遺伝子組換え動物の作出も可能とした（例えば、非特許文献４参照）。しかしながら、この技術は十分に確立されておらず、その手技や効率はマウスにおけるＥＳ細胞を使った遺伝子組換え動物の作製技術のレベルまで達しておらず、技術確立および効率アップのための更なる改良が切望されている。
【非特許文献１】Gordon, J.W., Scangos, G.A., Plotkin, D.J., Barbosa, J.A. & Ruddle, F.H. : Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science of U.S.A., 77: 7380-7384, 1980
【非特許文献２】Thompson, S., Clarke, A.R., Pow, A.M., Hooper, M.L. & Melton, D.W. : Germ line transmission and expression of a corrected HPRT gene produced by gene targeting in embryonic stem cells. Cell, 56: 313-321, 1989
【非特許文献３】Wilmut, I., Schnieke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J. & Campbell, K.H. : Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385: 810-813, 1997
【非特許文献４】Polejaeva, I.A. & Campbell, K.H. : New advances in somatic cell nuclear transfer: application in transgenesis. Theriogenology, 53: 117-126, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
胚由来細胞核移植および体細胞核移植技術は、大きく分けると未受精卵の核を目的の細胞の核と入れ換える工程（この工程を「初期化」と呼ぶ）、そして作製した核移植卵（または核移植胚）を個体形成のために成熟分裂（個体発生）させる工程（この工程を「活性化」と呼ぶ）からなる。一般には胚由来細胞核移植と体細胞核移植は、移植に用いる細胞の種類によって厳密には区別されているが、本発明においては、特に細胞の種類は関係なく、胚性の細胞、生殖系の細胞および体細胞のいずれであってもよいので、以下、胚由来細胞核移植及び体細胞核移植を総括して「核移植」と呼ぶ。
【０００５】
核移植技術の前半の工程では、移植した核を未分化の状態に戻し、個体発生可能な状態にすることが重要なポイントとなる。この移植核を未分化の状態に戻す因子は「初期化因子」と呼ばれ、未受精卵子の細胞質に存在することが知られているが、その本体は未だ同定されていない。
【０００６】
核移植技術の後半の工程である「活性化」は、核移植によって再構築した卵子（胚）の成熟分裂を開始させる刺激を与える工程であり、一般には人工的に単為発生を誘起する手法で行われている。こちらもまた、成熟分裂開始のメカニズムは未解明な部分が多く、既知の知識をもとに人工的な単為発生処理を実施している。
【０００７】
このように核移植技術は、移植核の「初期化」および再構築卵の「活性化」によって成り立っているが、そのメカニズムの詳細について解明されていないことが、上述の如くこの技術が未確立で未だ十分な作製効率が得られない理由である。
【０００８】
更に動物種ごと、または系統、核移植に用いる細胞によって手法、条件および作製効率が異なることが本手法の課題の一つでもある。
【０００９】
本発明は核移植技術の改良方法であるが、特には後者の工程である「活性化」を改善する方法に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
我々は核移植技術によって作出した再構築卵を用いて、未受精卵子と同様に精子を受精させるシステムを開発し、遺伝子相同組換え等の高度な操作を行った遺伝子組換え動物を作出する新たなシステムを完成するに至った。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、医薬品等の有用物質を遺伝子組換え動物より生産させる場合に、遺伝子相同組換え等の高度な遺伝子組換えを必要とする場合の作出方法として提供される。また、物質生産に限らず、従来の前核内注入法では得られない遺伝子組換え動物の作出方法としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、第２減数分裂中期未受精卵の除核、遺伝子組換え細胞由来核の移植、核移植卵子への受精、核移植卵由来受精卵の胚発生操作の工程により構成される。
【００１３】
本発明は、核移植の技術を用いて作出した再構築卵に精子を受精させるシステムを用いて遺伝子組換え動物を作出に関するものである。一般の核移植技術は移植した細胞のクローン動物を得ることを目的とするが、本発明では遺伝子組換えよって得られた遺伝的特性を保持した動物を得ることを目的とし、その他の形質に関するクローン性については特に問題としない。つまり本発明は、受精による遺伝形質の混入、欠如は問題としないことが、これまでのクローン作製と大きく異なる点である。
【００１４】
一般の核移植の手法では、再構築卵の活性化は人工的な単為発生の方法によって行われている。なお、現時点での受精機構は以下のように理解されている。排卵未受精卵子は、卵細胞質中に含まれる分裂中期促進因子（MPF）と細胞分裂抑制因子（CSF）の作用により受精が行われるまで第２減数分裂中期の状態で停止している。これらは除核卵子および核移植卵子においても同様である。成熟分裂は、受精の刺激により、卵細胞質内の小胞体から一過性にカルシウムイオンが反復して放出され、その結果MPFが変性し、CSFが破壊されることによって開始される。すなわち、人工的な単為発生の方法はこれらの現象を物理的、化学的に模倣することによって行われており、薬剤処理による方法（アルコール、イオノマイシン、イノシトール酸リン酸、DMAPなどの薬剤）、電気刺激による方法などが広く用いられている。
【００１５】
本発明者らは活性化の方法として一般的に実施されている単為発生の方法によるものではなく、精子を受精させることによる核移植卵を活性化する方法を開発した。さらに活性化効率が向上する場合は、精子の受精に単為発生による方法を組み合わせることも可能である。
【００１６】
本方法に用いられる核移植卵の移植細胞はいずれでもよいが、核相を２ｎまたは１ｎの細胞に限定する。本発明においては、例えば核相が４ｎに相当するＭ期の細胞は核移植卵作製のための移植細胞として用いることはできない。核移植卵の作製方法は一般に行われている方法でよい。
【００１７】
精子を受精させることによる核移植卵の活性化のタイミングは、核移植後いずれの時期でもよいが、少なくとも移植した核が染色体として凝集したのちが好ましく、厳密には核移植後から８時間の間が好ましい。
【００１８】
受精の方法は、核移植胚を、レシピエント動物に移植し、体内で受精させる方法（交配によって受精させる方法、経膣または経卵管による人工授精などを含む）、体外受精による方法、顕微授精による方法のいずれかの方法に用って実施する。受精すなわち活性化のタイミングを調整するには、体外受精および顕微授精による方法が好ましく、更に多受精を防止するためには顕微授精による方法が好ましい。
【００１９】
人工授精に用いる精子は、新鮮精子、凍結精子または凍結乾燥精子のいずれでもよい。また精原細胞、精母細胞でも実施可能である。ただし本発明において精子（又はそれに匹敵する細胞）は核相が１ｎの細胞しかもちいることはできず、好ましくは新鮮または凍結精子かつ成熟精子が好ましい。精子の採取方法は、動物種ごとに適切な方法で実施すれば、特に限定はない。
【００２０】
本発明の第１のポイントは、前述の如く精子を用いることでより自然に近い成熟分裂を行わせることである。そして本発明の第２のポイントは、核相を調整することにある。すなわち従来の核移植の手法が一般に核移植時の染色体数を維持させるのに対して、本手法は核相が２ｎの核移植卵子を作製し、受精によって移植細胞由来の染色体の核相を１ｎにすることが重要なポイントであり、本発明においてはじめてこれらが実施可能なことが明らかにされた。すなわち核移植卵子は、通常の卵子と同様に受精によって、第２極体を放出することで卵子の核相は１ｎとなり、前核（雌性前核）を形成し、精子由来の前核（雄性前核）と融合し核相２ｎの融合核を形成し、成熟分裂を開始する（図１参照）。
【００２１】
本発明においては、核移植に用いる細胞は基本的に雌雄どちらでもよいが、どちらかというと雌由来が好ましい。雌由来の細胞を用いることで核移植卵の個体発生の異常や発生停止の一因として考えられている「遺伝子の刷り込み」の影響を回避できる可能性が期待される。「遺伝子の刷り込み」とは、雄由来、雌由来の遺伝子の発現に偏りがある現象のことで、哺乳類の単為発生卵子が個体まで発生できない一因として挙げられる。本発明においては、雌細胞由来の核移植卵子を用いることで、雌雄の遺伝子が揃うことになる。従って本発明を利用することで“遺伝子の刷り込み“に起因した障害を回避可能となる。
【００２２】
本発明においては、核移植に用いる細胞が遺伝子組換え細胞である場合、得られた核移植受精卵子を代理妊娠ウサギに胚移植することで遺伝子組換えウサギ個体を得ることができる。
【００２３】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
《実施例１．核移植卵由来受精卵の作製》
核移植胚作製の動物種は、日本白色種ウサギを用いた。核移植胚の作製は松田ら（Cloning Stem Cells, 4:9-19,2002）の方法に従って実施した。
（１）未受精卵の採卵
未受精卵は日本白色種メスウサギに採卵３日前よりFSHを0.5単位/１匹で皮下に12時間間隔で６回投与し、採卵前日の夕方にhCGを100単位/１匹で静脈内投与することで過排卵させ、hCG投与後１５〜１６時間目に採卵した。採卵後、ヒアルロニダーゼ処理及びピペッティングにより卵丘細胞を卵子より除去した。卵子は核移植の操作中は、Ｍ２液（シグマ社）内で保持した。
（２）除核
上記（１）で採卵した未受精卵子をサイトカラシンＤが最終濃度10μg/ml入ったＭ２液に15分さらした後、マイクロマニュピレータにセットし、ピペットにより極体直下の細胞質を吸引除去した。操作後、吸引した細胞質をアクリジンオレンジ(５μg/ml)にて染色し、除核の確認を行った。
（３）遺伝子組換え細胞の除核未受精卵子囲卵腔内への注入
遺伝子組換え細胞は、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子を導入したウサギ胎児由来線維芽細胞を用いた。遺伝子組換え細胞は数世代培養後、血清飢餓（0.5％ウシ胎児血清含有D-MEM）または、コンフルエントの状態で長期培養にて細胞周期をG1/G0期に同調した。0.1％トリプシン液にて細胞を分散し集め、マイクロマニュピレータ下で、上記（２）の除核未受精卵の囲卵腔内にドナー細胞を注入した。
（４）融合
除核未受精卵と遺伝子組換え細胞の融合は、0.3M マンニトール, 0.05mM 塩化カルシウム, 0.01mM 塩化マグネシウム（FM液）中で１mm間隔のチャンバーを用いて、300V（3kV/cm）、100μsのパルスを１回（LF101,BEX）与えることによって行った。
（５）精子の採取
人工膣を用いて、精子を採取した。膠様物を除去後、生理食塩水で２倍から５倍に希釈し、800rpm、室温で５分間遠心、上清を捨てる操作を２回繰り返すことで精漿を除き、生理食塩水中に再浮遊（約５×１０６個／ｍｌの濃度）させ、体外受精に用いた。
（６）体外受精
体外受精はピエゾマニュピレーター（PMAS-CT150，プライムテック社）を用い、卵細胞質内精子注入（ICSI）法により実施した。12%PVP（Polyvinylpyrrolidone，Irvine Scientific社）中に浮遊させた精子を内径約20μｍのピペットで吸引し、卵子の細胞質内に注入した。
なお、媒精のタイミングは融合後３０分から３時間の間に実施した。
（７）培養
体外受精を行った卵子は、10％ KNOCKOUT Serum Replacement（Gibco BRL）を添加したCELGROSSER-H（住友製薬）中で、38.5度、5%炭酸ガス培養器内で培養した。
以上のようにして、核移植卵由来受精卵を作製した。
【００２５】
《試験例１．体外受精卵の作製》
前記実施例１（１）「未受精卵の採取」、（５）「精子の採取」、（６）「体外受精」、及び（７）「培養」記載の方法に従い、体外受精卵を作製した。
【実施例２】
【００２６】
《実施例２：体外受精卵及び核移植卵由来受精卵の初期発生》
ウサギの体外受精卵は約９２％が前核を形成し、さらに２細胞期へ９２％の成熟分裂が観察された。また除核未受精卵子にＧＦＰ遺伝子導入ウサギ胎児由来線維芽細胞を融合後、受精させることで作製した核移植卵由来受精卵では、約８３％が前核を形成し、さらに２細胞期へ８３％の成熟分裂が観察された（表１参照）。
【００２７】
【表１】
2005168420.tif 000002
【００２８】
さらに、本発明の核移植卵由来受精卵は授精後約４時間目に第２極体の放出と雌雄前核形成が認められた（図２−ａ参照）。また授精後約１日目で２から４細胞期への成熟分裂が観察され（図２−ｂ参照）、さらに核移植卵の移植細胞に起因するＧＦＰの蛍光が認められた（図２−ｃ参照）。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
このように我々は鋭意努力の結果、核移植卵へ精子が受精可能なことを初めて証明し、その方法を確立したことで発明の完成に至った。これは従来の方法にはない新たな核移植細胞由来の遺伝子組換え動物を作製する方法であり、遺伝子組換え動物作製技術の進歩にも貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】核移植移植卵由来受精卵を用いた遺伝子組換え動物作製方法の概略図。
【図２】核移植移植卵由来受精卵の初期発生を示す図面代用写真。ａ：授精後４時間目の卵子（矢印：第２極体，＊：雌雄前核，＊＊：融合直前の雌雄前核）、ｂ：２細胞期（授精後約１日目）、ｃ：４細胞期（授精後約１日目，左図：明視野観察、右図：ＧＦＰの蛍光観察）
【図１】
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【図２】
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