(57)【要約】【課題】  MALDI-IT型、MALDI-IT-TOF型やMALDI-FTICR型の質量分析装置において、疎水性のペプチドを効率よくイオン化することができる方法を提供する。【解決手段】MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）イオン源を有する質量分析装置によって、ペプチドをα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸又は３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸を用いて測定する方法。好ましくは、MALDI-IT型、MALDI-IT-TOF型又はMALDI-FTICR型の質量分析装置によって、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドによって誘導体化されたペプチドを測定する。マトリックスとして３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸を用いる場合、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸と組み合わせた混合マトリックスとして用いることが好ましい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）イオン源を有する質量分析装置によって、ペプチドをα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸又は３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸をマトリックスとして用いて測定する方法。
【請求項２】
前記マトリックスとして３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸を用いる場合に、前記３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸とα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸とを組み合わせた混合マトリックスを用いて測定する、請求項１に記載のペプチドの測定方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、疎水性化合物により化学修飾されたペプチドである、請求項１又は２に記載のペプチドの測定方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、スルフェニル化合物によって修飾されたアミノ酸残基を含有するペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドの測定方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドによって誘導体化されたペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドの測定方法。
【請求項６】
MALDI-IT（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置による、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドの測定方法。
【請求項７】
MALDI-IT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置による、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドの測定方法。
【請求項８】
MALDI-FTICR（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置による、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドの測定方法。  
【請求項９】
前記マトリックスを、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドの測定方法。
【請求項１０】
前記α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いる、請求項２〜９のいずれか１項に記載のペプチドの測定方法。
【請求項１１】
前記３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸の溶液と、前記α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の溶液とを、１：１０〜１０：１の体積比で組み合わせて用いる、請求項１０に記載のペプチドの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析装置を用いたプロテオーム解析の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜定量解析＞
プロテオーム解析（タンパク質の網羅的解析）分野において、これまでは二次元電気泳動と質量分析装置とを組み合わせたPMF（ペプチドマスフィンガープリンティング）解析法が主流であったが、これに代わる次世代のプロテオーム解析法として、安定同位体を用いた手法が考案されている。例えば、Curr. Opinion Chem. Biol., 2003, 7, 70-77には、ICAT(Isotope-Coded Affinity Tag)試薬を用いた、マススペクトロメトリーを用いた定量的プロテオミクスが記載されている。さらに、Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 17, 1642-1650及び国際公報第２００４／００２９５０号パンフレットには、本発明者らによって開発された、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド(NBSCl)の安定同位体標識体と非標識体とをラベル化試薬として用い、タンパク質又はペプチドのトリプトファン残基を修飾し、これらをトリプシンで酵素消化して得られるペプチド混合物中から疎水クロマトグラフィーカラムを用いてニトロベンゼンスルフェニル (NBS)ラベル化トリプトファンを含有するペプチドを濃縮し、定量解析を行う方法（以下、NBS法と表記する。）が記載されている。
【０００３】
＜MS/MS解析による配列同定＞
PMF法においては、１つのタンパク質を酵素消化して得られる複数のペプチド断片のマス値を質量分析装置によって検出し、これらをデータベース上の理論断片のマス値と比較することでタンパク質の同定を行う。一方、NBS法ではラベル化・濃縮されたペプチドをMS/MS解析して配列を決定し、データベース上でそのような配列を含むタンパク質の検索を行うことで、元のタンパク質の同定を行う。従って、NBS法においては、通常の質量分析による定量解析と同時に、MS/MS解析による配列決定がタンパク質同定のための必須の工程となる。
【０００４】
MS/MS解析は、１）プレカーサーイオンと呼ばれる、配列を決定したいペプチドの選択、２）選択したプレカーサーイオンのフラグメント化、及び、３）生じたフラグメントイオンのマス値の検出、の三段階を経て行われる。このようなMS/MS解析を行うことができる質量分析装置としては、プレカーサーイオン選択・フラグメントイオン検出のための二台の質量分離部が連結されたタンデム型、イオン自身の持つ内部エネルギーによる分解（PSD; post-source decay）を利用するもの、イオンを補足することによって複数回のMS解析（MSn解析）を行うことができるイオントラップ型、及び、イオンサイクロトロン共鳴（ICR; Ion Cyclotron Resonance）技術を用いて得られたデータをフーリエ変換（FT; Fourier Transform）してマススペクトルの信号とするFTICR型が挙げられる。
【０００５】
MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)） 型質量分析装置では、試料に混ぜられたマトリックスと呼ばれる分子（一般的に有機化合物）がレーザー光のエネルギーを吸収することで加熱され、気化するとともにイオン化される。試料分子を取り囲んでいたマトリックスが瞬時に気化することで、結果として試料分子もほぼ同時に気相に放出されることになる。この時、試料分子とマトリックスとの間で電子やプロトンの受け渡しが行われ、試料分子のイオン化が達成される。また、これと同時にエネルギーの一部が内部エネルギーとして試料分子に受け渡される。
【０００６】
このように、マトリックスは試料分子の気化・イオン化を補助するだけでなく、試料分子の分散剤としても働いているので、試料分子の効率良いイオン化にはマトリックスと試料分子との親和性が重要であると考えられている。そのため、測定する試料ごとに最適とされる有機化合物が検索され、用いられてきた。例えば、ペプチドを測定する際には、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）が広く一般的に用いられている。
【０００７】
一方、MALDI-IT（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型、MALDI-IT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型（例えばAXIMA-QIT（島津製作所製））やMALDI-FTICR（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型の質量分析装置では、MALDI法によってイオン化した試料分子を一度セル内に閉じ込めてから、イオンの検出や選択、或いはMS/MS解析を行っていく。このため、一度生成したイオンが検出器に到達して測定されるまでの時間が、通常のMALDI-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）型装置に比べ、２〜３桁以上長くなる。イオン化された試料分子は余剰の内部エネルギーを持っているため、徐々に自己崩壊が起こることが知られている。実際に、MALDI-TOF型質量分析装置のPSD測定においては、この原理を利用して擬似MS/MS解析を行っている。
【０００８】
従って、MALDI-IT型、MALDI-IT-TOF型やMALDI-FTICR型の質量分析装置においては、イオン化の際に大きな内部エネルギーを受け取ると、測定時に望まないフラグメントイオンがたくさん検出されてしまい不都合である。この点から、4-CHCAをマトリックスとして用いることは、イオン化の際に試料に過剰の内部エネルギーを与えることとなるため、MALDI-IT型、MALDI-IT-TOF型やMALDI-FTICR型の質量分析装置において好ましくない。そのため、AXIMA-QIT装置で実際にデフォルトとして設定されているマトリックスは、イオン化の際に試料分子に与えるエネルギーが比較的小さいとされている２，５−ジヒドロキシ安息香酸 (DHB)である。
【０００９】
【非特許文献１】サルバトーレ・セチ（Salvatore Sechi）及びヨシヤ・オダ（Yoshiya Oda）著、マススペクトロメトリーを用いた定量的プロテオミクス（Quantitative proteomics using mass spectrometry ）、「カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー（Current Opinion in Chemical Biology）」、（英国）、２００３年、第７巻、ｐ．７０−７７
【非特許文献２】九山浩樹（Hiroki Kuyama）、渡辺真（Makoto Watanabe）、戸田千香子（Chikako Toda）、安藤英治（Eiji Ando）、田中耕一（Koichi Tanaka）及び西村紀（Osamu Nishimura）著、トリプトファン残基のラベル化による定量的プロテオーム解析法（An Approach to Quantitative Proteome Analysis by Labeling Tryptophan Residues）「ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Rapid Communications in Mass Spectrometry）」、２００３年、第１７巻、ｐ．１６４２−１６５０
【特許文献１】国際公報第２００４／００２９５０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、MALDI-IT型、MALDI-IT-TOF型やMALDI-FTICR型の質量分析装置においてはマトリックスとして主にDHBを用いている。しかし、疎水性のペプチドを含む試料の測定を行う場合は、DHBを用いても疎水性ペプチドを効率よくイオン化することができない。
【００１１】
そこで本発明の目的は、MALDI型質量分析装置、特にMALDI-IT型、MALDI-IT-TOF型やMALDI-FTICR型の質量分析装置において、疎水性のペプチドを効率よくイオン化することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討した結果、マトリックスとしてα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸又は３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸を用いることによって上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）イオン源を有する質量分析装置によって、ペプチドをα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸又は３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸をマトリックスとして用いて測定する方法。
（２）前記マトリックスとして３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸を用いる場合に、前記３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸とα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸とを組み合わせた混合マトリックスを用いて測定する、（１）に記載のペプチドの測定方法。
【００１４】
（３）前記ペプチドが、疎水性化合物により化学修飾されたペプチドである、（１）又は（２）に記載のペプチドの測定方法。
（４）前記ペプチドが、スルフェニル化合物によって修飾されたアミノ酸残基を含有するペプチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドの測定方法。
（５）前記ペプチドが、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドによって誘導体化されたペプチドである、（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドの測定方法。
【００１５】
ここで、本明細書においてペプチドとは、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む意味で用いる。
【００１６】
（６）MALDI-IT（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置による、（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドの測定方法。
（７）MALDI-IT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置による、（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドの測定方法。
（８）MALDI-FTICR（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置による、（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドの測定方法。  
【００１７】
（９）前記マトリックスを、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いる、（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドの測定方法。
（１０）前記α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いる、（２）〜（９）のいずれかに記載のペプチドの測定方法。
（１１）前記３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸の溶液と、前記α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の溶液とを、１：１０〜１０：１の体積比で組み合わせて用いる、（１０）に記載のペプチドの測定方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、MALDI型質量分析装置、特にMALDI-IT型、MALDI-IT-TOF型やMALDI-FTICR型の質量分析装置において、疎水性のペプチドを効率よくイオン化することができる方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の方法は、MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）イオン源を有する質量分析装置を用いて、疎水性のペプチド試料を測定する方法である。なお、現在に至るまで、MALDI法のイオン化機構については完全に解明されているとはいえない。本明細書の記載は、現在最も多く受け入れられている解釈に基づく。
【００２０】
本発明において疎水性ペプチド・疎水性タンパク質とは、ペプチド・タンパク質の組成アミノ酸残基のうち、疎水性のアミノ酸、特に疎水性の高いアミノ酸の含量が比較的高いもの、下記の基を有するもの、及び下記の化学修飾を受けたものをいう。疎水性の高いアミノ酸としては、例えば、トリプトファン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、メチオニンなどを挙げることができる。さらに、アラニン、グリシン、プロリンなども疎水性のアミノ酸とみなすこともある。
【００２１】
特に本発明は、ニトロベンゼンスルフェニル基（NBS基：NO2PhS基(Ph：フェニレン基) ）やニトロフェニル基などを有している疎水性ペプチドを測定する場合に有用に用いられる。このような疎水性ペプチドとしては、ニトロチロシン残基、ニトロフェニルアラニン残基、NBS基を置換基として有するトリプトファン残基、NBS基を置換基として有するシステイン残基などを含むペプチドが挙げられる。
【００２２】
疎水性ペプチドは、対応するペプチドを疎水性化合物によって化学修飾することによって得たものでもよい。ここで、対応するペプチドとしては、それ自体が疎水性である場合も含まれる。すなわち、疎水性ペプチドが、疎水性化合物を用いた化学修飾によって、より疎水性の高いペプチドに誘導体化される場合も含まれる。疎水性化合物は、スルフェニル化合物であることが好ましい。なお、スルフェニル化合物は、ペプチド又はタンパク質中のトリプトファン残基及びシステイン残基を特異的に修飾する化合物である。スルフェニル化合物の特に好ましい例として、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（NBS試薬）が挙げられる。すなわち、本発明において好ましい疎水性ペプチドの一例としては、トリプトファン残基やシステイン残基を有するペプチドをNBS試薬を用いて化学修飾することによって得たものが挙げられる。
【００２３】
本発明の方法は、MALDIイオン源と組み合わされる質量分析計として、生成したイオンが検出器に到達して測定されるまでの時間が通常のMALDI-TOF型のものに比べて長いものに特に有用に用いることができる。このような質量分析装置としては、MALDI-IT（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、MALDI-IT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置MALDI-FTICR（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などが挙げられる。
【００２４】
本発明においては、マトリックスとして、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（3-CHCA; 下記式I）又は３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（3H4NBA; 下記式II）を用いる。
【００２５】
【化１】
2005326391.tif 000003
【００２６】
【化２】
2005326391.tif 000004
【００２７】
これらの化合物は、質量分析用マトリックスとして用いるという目的において、当業者が適宜その使用形態を決定することができる。たとえば、これら化合物は、溶液として用いることが好ましい。溶液の濃度としては特に限定されないが、例えば、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いることができる。
【００２８】
このような溶液の調製に用いられる溶媒としては、アセトニトリル水溶液、トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液、又はアセトニトリル−トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液を用いることが好ましい。アセトニトリル水溶液又はアセトニトリル−TFA水溶液を用いる場合、アセトニトリルの濃度は特に限定されないが、９０％以下、好ましくは５０％程度用いることができる。TFA水溶液又はアセトニトリル−TFA水溶液を用いる場合、TFAの濃度も特に限定されないが、１％以下、好ましくは０．１％程度用いることができる。
【００２９】
そして、マトリックスとして3-CHCAを用いる場合は、上述の溶媒に溶解させることにより、特に限定されないが例えば１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは１０ｍｇ/ｍｌのマトリックス溶液として用いることができる。また、マトリックスとして3H4NBAを用いる場合は、このような溶媒に溶解させることにより、特に限定されないが例えば１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度のマトリックス溶液として、好ましくは、飽和濃度のマトリックス溶液として用いることができる。
【００３０】
なお、本明細書における、％で表された量の基準に関しては、特に断りのない限りv/v％とする。
【００３１】
上記のマトリックスを用いることにより、以下のような利点がある。
まず、先に述べたように、MALDI-IT型質量分析装置、MALDI-IT-TOF型質量分析装置MALDI-FTICR型質量分析装置などは、生成したイオンが検出器に到達して測定されるまでの時間が通常のMALDI-TOF型のものに比べて長い。また、マトリックスは、受け取ったレーザーのエネルギーにより加熱され気化・イオン化するが、そのエネルギーの一部は試料分子の内部エネルギーとなり、徐々にイオンの自己崩壊をもたらす。すなわち、生成したイオンが検出器に到達して測定されるまでの時間が長いほど自己崩壊が進み、結果として望まないフラグメントイオンがたくさん検出されることとなる。本発明において用いられるマトリックスは、従来法（例えば4-CHCAが単独でマトリックスとして用いられる方法）におけるマトリックスに比べ、イオン化の際に測定分子に対して与える内部エネルギーが小さいと考えられる。そのため、上述のように、生成したイオンが検出器に到達して測定されるまでの時間が長い質量分析装置において用いられても、生成したイオンの自己崩壊の進行を抑えることができる。
【００３２】
このような理由で、本発明は、イオントラップ型質量分析装置のようにイオン化からイオンの検出までの時間が比較的長い質量分析装置において特に有用に用いられる。従って、イオントラップを持たない質量分析装置においても有用に用いられることはいうまでもない。
【００３３】
さらに、先に述べたように、マトリックスと試料分子との親和性は、イオン化の際の重要なファクターである。従って、疎水性度の高い試料には疎水性度の高いマトリックスが、親水性度の高い試料には親水性度の高いマトリックスが合うと考えられる。本発明において用いられるマトリックス3-CHCAや3H4NBAは、従来のマトリックス（例えばDHB）に比べ、疎水性度が高いと考えられる。一方、本発明において測定されるペプチド試料分子も疎水性度が高いため、マトリックスとしての3-CHCAや3H4NBAとの親和性が高いと考えられる。その結果、ペプチド試料とマトリックスとが均一な微小結晶を作りやすく、効率良いイオン化を達成することができると考えられる。
【００３４】
本発明においては、マトリックスとして３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（3H4NBA）を用いる場合に、3H4NBAをα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA; 下記式III）と組み合わせた混合マトリックスとして用いることが好ましい。4-CHCAは、ペプチドを質量分析測定する際に広く一般的にマトリックスとして用いられている化合物である。（以下本明細書において、4-CHCAを組み合わせて用いずに単独で使用するマトリックスと、4-CHCAを組み合わせて用いる混合マトリックスとを、単にマトリックスと記載することがある。）
【００３５】
【化３】
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【００３６】
3H4NBAと4-CHCAとの組み合わせの比率は、特に制限はないが、例えば以下のような量的関係で組み合わせることができる。
例えば、3H4NBAは、すでに述べたような濃度で調製することができる。すなわち、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として、例えばアセトニトリル水溶液、TFA水溶液又はアセトニトリル−TFA水溶液を溶媒とした場合、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは飽和濃度の3H4NBA溶液として調製することができる。
一方、4-CHCAは、従来から用いられてきた濃度で調製することができる。例えば、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として調製することができる。上記3H4NBAを用いる場合と同様の、アセトニトリル水溶液、TFA水溶液又はアセトニトリル−TFA水溶液を溶媒として用いる場合は、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは１０ｍｇ/ｍｌの4-CHCA溶液として調製することができる。
以上のように調製された双方の溶液を、好ましくは１：１０〜１０：１、より好ましくは１：３〜３：１、例えば１：１の体積比で混合して用いる。
【００３７】
従来のマトリックス4-CHCAは、MALDI-IT、MALDI-IT-TOF、MALDI-FTICR装置など、イオン化からイオンの検出までの時間が長いMALDI装置での測定において、測定試料の自己崩壊を生ぜしめるという欠点はあるが、測定の感度には優れており、また、質量分析試料においてレーザーを当てる最適スポットを探すのが容易であるという利点を有する。
【００３８】
一方、本発明のマトリックス3H4NBAは、すでに述べたように、測定試料の自己崩壊の進行を抑えることができるとともに、疎水性の試料の効率的なイオン化を達成することができるという利点を有する。そして、本発明のマトリックス3H4NBAが、4-CHCAと組み合わされることによって、双方のマトリックスが有する利点の相乗効果が奏される。すなわち、3H4NBAが単独で有する測定試料の自己崩壊の抑制と疎水性試料のイオン化達成という利点を確保したまま、4-CHCAが有する高感度検出能がさらに伴い、より解析効率に優れた質量分析を行うことが可能になる。
【００３９】
本発明によると、疎水性ペプチド（例えばNBSラベル化ペプチド）の配列同定を行うことが可能な方法の範囲が大幅に広まった。従来の技術では、ESI（エレクトロスプレーイオン化法）を利用した質量分析装置によるMS/MS解析、MALDI型質量分析装置のPSD解析が用いられていたが、本発明により、CID（衝突誘起解離）を起こすことができる、MALDI-IT型質量分析装置、MALDI-IT-TOF型質量分析装置MALDI-FTICR型質量分析装置などによるMS/MS解析が新たに可能となった。さらに、PSDよりもCIDのほうが効率的にフラグメント化を起こすことができるため、ペプチドの同定率を向上させることが可能となった。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。すでに述べたように、％で表された量の基準に関しては、特に断りのない限りv/v％とする。なお、実施例においては、NBS試薬によるラベル化を修飾又はNBS修飾と表記することがある。
【００４１】
［実施例１］
本実施例においては、NBSラベル化ペプチド（安定同位体元素13C６つで標識されたNBS(heavy)試薬によって修飾されたペプチドと非標識のNBS(light)試薬によって修飾されたペプチドとの混合物）を測定サンプルに用い、本発明のマトリックス3-CHCA（α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸、式I）及び3H4NBA（３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸、式II）と、比較用の従来のマトリックスDHB（２，５−ジヒドロキシ安息香酸、式IV）とを用いて、質量分析装置にて測定を行った。
【００４２】
【化４】
2005326391.tif 000006
【００４３】
【化５】
2005326391.tif 000007
【００４４】
【化６】
2005326391.tif 000008
【００４５】
測定サンプルは、以下のように調製した。
精製タンパク質４種類（オボアルブミン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、リゾチーム、α−ラクトアルブミン；全てSIGMA社製）を25μgずつ混合し合計100μgとしたものを２つ用意した。変性剤として終濃度8Mの尿素を用いて、それぞれの混合物についての可溶化及びNBS修飾試料混合物の再可溶化を行ったこと以外は、「13CNBS Isotope Labeling キット」（島津製作所製）のプロトコルに従って測定サンプルを調製した。すなわち、２つの混合物のうち一方をNBS Reagent (heavy)（２−ニトロ［13C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）で、他方をNBS Reagent (light)（２−ニトロ［12C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）で修飾し、両修飾試料の混合、脱塩、尿素による再可溶化、還元・アルキル化、及びトリプシン消化を行った。
【００４６】
その後、試料を凍結乾燥し、500μlの0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液に懸濁し、0.1％のTFA水溶液で平衡化したHiTrap Phenyl FF (high sub) column（アマシャムバイオサイエンス社製）にロードした。このカラムを3mlの0.1％TFA水溶液で洗浄し、その後、10％のアセトニトリルを含む0.1％のTFA水溶液1mlを用いて溶出した。続いて、溶出に用いるTFA水溶液のアセトニトリル濃度を順に15、20、25、30、35、40％と変え、同様に溶出を行った。溶出後、10％のアセトニトリルを含む0.1％TFA水溶液で溶出した画分を、凍結乾燥し、50μlの0.1％TFA水溶液に再懸濁し、ZipTip(μC18)で脱塩処理した。このようにして、測定サンプルを得た。
【００４７】
マトリックスとしては、本発明の3-CHCA（α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸、式I）及び3H4NBA（３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸、式II）、及び比較のために従来のマトリックスDHB（２，５−ジヒドロキシ安息香酸、式IV）の３種を用意した。
【００４８】
マトリックスとしては、以下のように調製したものを用いた。0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液を溶媒とし、3-CHCA、3H4NBA及びDHBをそれぞれ溶解させた。DHBと3-CHCAとはそれぞれ10mg/mlの溶液、3H4NBAは飽和溶液とした
【００４９】
上述のようにして得られた測定サンプルの溶液とマトリックスの溶液とを、それぞれ0.5μlずつとって混合し、マスプレート上に滴下した。溶液を乾燥させた後、AXIMA-QIT装置（MALDI-IT-TOF型質量分析装置、島津製作所製）にて測定した。
【００５０】
AXIMA-QIT装置によるMSスペクトルを、図１に示す。図１中、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)、縦軸はイオンの相対強度を表す。また、(a)は、DHBをマトリックスに用いたときのNBS修飾ペプチドのスペクトル、(b)は、3-CHCAをマトリックスに用いたときのNBS修飾ペプチドのスペクトル、(c)は、3H4NBAをマトリックスに用いたときのNBS修飾ペプチドのスペクトルである。図中、(i)、(ii)及び(iii)は、NBSで修飾されたペプチドのペアピークを示す。それぞれのペアピークは、２つのラベル化試薬NBS Reagent (heavy)（２−ニトロ［13C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）とNBS Reagent (light)（２−ニトロ［12C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）との質量差に相当する、m/z=6 の差を有するピークの組として検出された。それぞれのペアピークに相当する理論マス値、配列、及び由来するタンパク質は次のとおりである。
【００５１】
(i)1198.53, 1204.55 (m/z)、GTDVQAWIR（配列番号１）、リゾチーム
(ii)1244.51, 1250.53 (m/z)、LDQWLCEK（配列番号２）、α−ラクトアルブミン
(iii)2011.95, 2017.97 (m/z)、ELINSWVESQTNGIIR（配列番号３）、オボアルブミン
【００５２】
図２は、図１中のペアピーク(i)の1198.53 m/zに相当するイオン(GTDVQAWIR)を選択的にトラップした後、MS/MS解析したときのフラグメントスペクトルである。図２中、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)、縦軸はイオンの相対強度を表す。
【００５３】
［実施例２］
（ａ）イオントラップを持つ質量分析装置とイオントラップを持たない質量分析装置とによる質量分析測定  
【００５４】
NBS試薬によって修飾されたペプチドと非修飾ペプチドとの混合物を測定サンプルに用い、本発明の混合マトリックス、すなわち3H4NBA（３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸、式II）と従来のマトリックス4-CHCA（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、式III）との混合物を用い、質量分析装置にて測定を行った。
【００５５】
【化７】
2005326391.tif 000009
【００５６】
【化８】
2005326391.tif 000010
【００５７】
測定サンプルは、以下のように調製した。
精製タンパク質４種類（オボアルブミン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、リゾチーム、α−ラクトアルブミン；全てSIGMA社製）を25μgずつ混合し合計100μgとしたものを２つ用意した。変性剤として終濃度8Mの尿素を用いてそれぞれの混合物について変性を行った以外は、「13CNBS Isotope Labeling キット」（島津製作所製）のプロトコルに従った。すなわち、一方をNBS Reagent (heavy)（２−ニトロ［13C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）で標識修飾し、他方をNBS Reagent (light)（２−ニトロ［12C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）で非標識修飾し、両修飾試料の混合、脱塩、尿素による再可溶化、還元、アルキル化、及びトリプシン消化を行った。消化後のサンプルをZipTipμ-C18で脱塩処理し、0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液4μlにより溶出したものを、測定サンプルとした。このうち、0.5μlをマスプレート上に塗布した。
【００５８】
マトリックスとしては、以下のように調製したものを用いた。0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液を溶媒とし、3H4NBA及び4-CHCAをそれぞれ溶解させた。3H4NBAは飽和溶液、4-CHCAは10mg/mlの溶液とした。このように調製した溶液を、１：１の体積比で混合し、マトリックス混合溶液を得た。あらかじめ用意しておいた測定サンプル塗布を行ったマスプレート上に、マトリックス混合溶液0.5μlを添加し、乾燥した後、イオントラップを持つMALDI-IT-TOF型質量分析装置（AXIMA-QIT、島津製作所製）及びイオントラップを持たないMALDI-TOF型質量分析装置（AXIMA-CFR plus、島津製作所製）にて測定を行った。
【００５９】
このとき得られたMSスペクトルを、図３(a-1)及び図３(a-2)に示す。これらの図において、横軸は質量／電荷(m/z)、縦軸はイオンの相対強度(%Int.)を表す。また、(a-1)は、イオントラップを持つAXIMA-QITで測定することによって得られたスペクトル、(a-2)は、イオントラップを持たないAXIMA-CFR plusで測定することによって得られたスペクトルである。さらにこれらの図において、矢印でマークされたピーク対は、NBS修飾されたペプチドのものであることを示している。それぞれのペアピークは、２つの修飾試薬NBS Reagent (heavy)（２−ニトロ［13C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）とNBS Reagent (light)（２−ニトロ［12C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）との質量差に相当する、m/z=6の差を有する。
【００６０】
図３(a-1)及び図３(a-2)のスペクトルを互いに比較してわかるように、両者でほとんど同じスペクトルが得られた。イオントラップを持つ質量分析装置とイオントラップを持たない質量分析装置とで、ほとんど同じスペクトルが得られるということは、イオントラップを持つ質量分析装置の測定において測定試料の自己崩壊が抑制されていることを示す。すなわち、本発明のマトリックス混合物を用いると、従来4-CHCAを単体でマトリックスとして用いたイオントラップ型質量分析装置（すなわちイオン化からイオンの検出までの時間が比較的長い質量分析装置）での測定において起こっていた、測定試料の自己崩壊が抑制されていることがわかった。
【００６１】
（ｂ）3H4NBA単独使用のマトリックスと、3H4NBA及び4-CHCAの混合マトリックスとによる質量分析測定
【００６２】
上記（ａ）と同じ測定サンプルを用い、本発明のマトリックスである3H4NBA単独使用のマトリックス、及び3H4NBAと4-CHCAとの混合マトリックスを用いて、質量分析装置にて測定を行った。
【００６３】
上記（ａ）と同じ測定サンプルを、0.1％TFA水溶液により1000倍希釈し、そのうちの0.5μlをマスプレート上に塗布した。
【００６４】
マトリックスとしては、3H4NBA単独使用のマトリックス、及び3H4NBAと4-CHCAとの混合マトリックスを用いた。
3H4NBA単独使用のマトリックスについては、3H4NBAを、0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液に溶解し、飽和溶液とした。
3H4NBAと4-CHCAとの混合マトリックスについては、上記（ａ）と同様の方法によって調製した。
【００６５】
あらかじめ用意しておいた測定サンプル塗布を行ったマスプレート上に、3H4NBA溶液及び3H4NBAと4-CHCAとの混合溶液をそれぞれ添加し、乾燥させた後、MALDI-TOF型質量分析装置（AXIMA-CFR plus、島津製作所製）にて測定を行った。
【００６６】
このとき得られたMSスペクトルを、図３(b-1)及び図３(b-2)に示す。これらの図において、横軸は質量／電荷(m/z)、縦軸はイオンの相対強度(%)を表す。また、(b-1)は、マトリックスとして3H4NBAと4-CHCAとを混合して用いることによって得られたスペクトル、(b-2)は、マトリックスとして3H4NBAを用いることによって得られたスペクトルである。さらにこれらの図において矢印でマークされたピーク対は、NBS修飾されたペプチドのものであることを示している。それぞれのペアピークは、２つのラベル化試薬NBS Reagent (heavy)（２−ニトロ［13C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）とNBS Reagent (light)（２−ニトロ［12C6］ベンゼンスルフェニルクロリド）との質量差に相当する、m/z=6の差を有する。
【００６７】
図３の(b-1)及び(b-2)のスペクトルを互いに比較してわかるように、NBS修飾ペプチドのペアピークが、(b-1)において、(b-2)よりも感度良く検出されている。このことは、マトリックスとして3H4NBA に4-CHCAをさらに混合することによって、より感度良く検出することができるということを示す。すなわち、3H4NBAの、「質量分析において疎水性試料の検出ができる」という特長はそのままに、さらに、4-CHCAの、「レーザーを当てる最適スポットを容易に探すことができる」状態で、「感度の良い測定をおこなうことができる」という特長が付加されたことが確認できた。すなわち、3H4NBAの特長である、「イオン化からイオンの検出までの時間が比較的長いイオントラップ型MALDI質量分析装置で測定してもサンプルの自己崩壊を抑制することができる」ことと、4-CHCAの特長である、「レーザーを当てる最適スポットを容易に探すことができる」状態で、「感度の良い測定をおこなうことができる」こととが同時に達成されたことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例１において、従来の方法によって得られた比較用のMSスペクトル(a)と、本発明の方法によって得られたMSスペクトル(b)及び(c)である。
【図２】実施例１において得られたMS/MSスペクトルである。
【図３】実施例２（ａ）において、イオントラップを持つAXIMA-QITで測定することによって得られたMSスペクトル(a-1)、及びイオントラップを持たないAXIMA-CFR plusで測定することによって得られたMSスペクトル(a-2)、及び、実施例２（ｂ）において、マトリックスとして3H4NBAと4-CHCAとを混合して用いることによって得られたMSスペクトル(b-1)、及びマトリックスとして3H4NBAを用いることによって得られたMSスペクトル(b-2)である。
【図１】
2005326391.tif 000011
【図２】
2005326391.tif 000012
【図３】
2005326391.tif 000013
【配列表】
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