(57)【要約】【課題】  ゲラニルゲラニルグリセロールリン酸合成酵素の結晶を提供する。【解決手段】サーモプラズマ・アシドフィラム由来ゲラニルゲラニルグリセロールリン酸合成酵素の結晶。本発明の結晶の単位格子は64±1Å、64±1Å及び145±1Åであり、正方晶系(tetragonal)を有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニルゲラニルグリセロールリン酸合成酵素の結晶。
【請求項２】
ゲラニルゲラニルグリセロールリン酸合成酵素が古細菌由来のものである請求項１記載の結晶。
【請求項３】
古細菌がサーモプラズマ・アシドフィラムである請求項２記載の結晶。
【請求項４】
ゲラニルゲラニルグリセロールリン酸合成酵素が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものである請求項１記載の結晶。
【請求項５】
結晶の単位格子が64±1Å、64±1Å及び145±1Åである請求項１記載の結晶。
【請求項６】
結晶が正方晶系を有するものである請求項１記載の結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲラニルゲラニルグリセロールリン酸合成酵素（GGGPs）の結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
古細菌は、特有な構造の細胞膜脂質を持つことが知られている。なぜ古細菌だけが上記特有な細胞膜脂質を持つかは未だ謎である。また、古細菌に対する遺伝子操作はまだ確立しておらず、扱いやすいモデル生物にするためには開発途上の状態である。特に、古細菌に特有の生化学はまだ十分に理解されていないことが多い。細胞膜脂質合成もその一つであり、酵素、遺伝子が単離されて解析されている例はほとんど見当たらない。
ゲラニルゲラニルグリセロールリン酸合成酵素（Geranylgeranylglycerol phosphate synthase: GGGPs) は、古細菌特有の脂質合成の最初のステップを担う酵素であり、ゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)とグリセロール１リン酸(G-1-P)との間のエーテル結合を触媒する。この反応は、古細菌に特有であるため、古細菌以外の生物では報告例はない。また、古細菌の中でも、本酵素が詳細に調べられている例は、サーモプラズマ・アシドフィラムの他には、メタン生成古細菌だけである (非特許文献1)。サーモプラズマ・アシドフィラムは、６０度付近の温泉に生育する好酸好熱性古細菌である (非特許文献2)。このような好熱菌からは、熱に対して安定な酵素が得られることが知られており、実際に産業での利用例も多く見られる。また、古細菌の細胞膜脂質は、他の生物の細胞膜脂質と比べて、丈夫であるという報告があり、その点を利用して生体内の目的の器官に特異的に薬剤を輸送する、ドラッグ・デリバリー・システムの材料として期待されている (非特許文献3)。すなわち、古細菌の脂質合成酵素を利用することによって、自在に古細菌特有の細胞膜脂質をデザインすることが可能になれば、医学の面でも利用が広がると期待できる。
【非特許文献１】Soderberg, T., Chen, A. & Poulter, C. D. (2001) Geranylgeranylglyceryl phosphate synthase. Characterization of the recombinant enzyme from Methanobacterium thermoautotrophicum. Biochemistry. 40, 14847-14854.
【非特許文献２】Yasuda, M., Oyaizu, H., Yamagishi, A. & Oshima, T. (1995) Morphological variation of new Thermoplasma acidophilum isolates from Japanese hot springs. Appl. Environ. Microbiol. 61, 3482-3485.
【非特許文献３】B.Patel and GD Sprott (1999) Critical Rev. Biotechnol. 19, 31-357
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、GGGPsの結晶を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、古細菌であるサーモプラズマ・アシドフィラム由来のGGGPsを結晶化することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、GGGPsの結晶である。GGGPsは、古細菌（例えばサーモプラズマ・アシドフィラム）由来のものである。GGGPsとしては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【０００６】
本発明の結晶は、その単位格子が64±1Å、64±1Å及び145±1を有するものである。また、本発明の結晶は、正方晶系(tetragonal)を有するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の結晶は、使用時に溶媒に溶解する要時調製が可能であり、生化学的試薬、エーテル合成のための試薬、有用化合物合成のための触媒として有用である。すなわち、基質グリセロールとGGPPからエーテル脂質を得ることが出来る。この脂質は、その構造のエーテル結合をおそらく生体内で分解できないため、生体内で不活性な脂質としての利用可能性が考えられる。
【０００８】
また、この脂質を有する微生物（メタン生成古細菌）は、ヒトの体内に存在しているため、人体への害はあまりないものと考えられる。とりわけ、エーテル脂質よりなるリポソームが安定かつ生体不活性な事を利用して、ドラッグデリバリー等への応用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ゲラニルゲラニルグリセロールリン酸合成酵素（Geranylgeranylglycerol phosphate synthase: GGGPs)の結晶に関するものである。GGGPsは、古細菌特有の脂質合成の最初のステップを担う酵素であり、ゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)とグリセロール１リン酸(G-1-P)との間のエーテル結合を触媒する（図１）。
【００１０】
本発明の結晶は、GGGPsの精製及び結晶化を経て作製することができる。
１．GGGPsの精製
本発明において使用するGGGPsの採取源は、古細菌であれば特に限定されず、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidphilum)、スルフォロバス・トコダイ（Sulfolobus tokodaii）を用いることができる。上記採取源を大量培養し、精製することにより、目的酵素であるGGGPsを採取する。
【００１１】
また、遺伝子工学的手法を用いて、GGGPsをコードする遺伝子(例えば配列番号１に示されるもの）を細菌や動物細胞等により発現させて大量生産することも可能である。例えば、GGGPs遺伝子が組み込まれた組換えDNAを、GGGPs遺伝子が発現し得るように大腸菌、酵母、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞などの宿主中に導入して形質転換体を得、その形質転換体を培養することによりGGGPsを得ることができる。
【００１２】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、GGGPs遺伝子が組み込まれた組換えDNAが細胞中で自律複製できるようにする。また、組換えDNAには転写プロモーター（例えばtrp、lac、PL、PRなどの各プロモーター）、リボゾームRNA結合領域としてのSD配列等が連結されていてもよく、転写ターミネーターなどを適宜挿入することもできる。このようにして得られた組換えベクターの宿主への導入は、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を利用した市販のキットを使用することにより、容易に行なうことができる。
【００１３】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1、MFα1、PHO5、PGK、GAP、ADHなどの各プロモーターが使用される。酵母への組換えベクターの導入は、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を利用することができる。
【００１４】
動物細胞を宿主とする場合は、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）などが用いられる。プロモーターとしては、SRα、SV40、LTR、CMVなどの各プロモーター等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法は、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用することができる。
【００１５】
GGGPsは、上記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養容器中に含まれる培養液又は宿主細胞成分を意味し、(a)培養上清、(b)培養細胞自体、(c)培養菌体自体、又は(d)細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。培養方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば大腸菌を宿主とした場合、細菌細胞に使用される通常の培地（例えばLuria-Bertani medium）中で、5% CO2条件下、37℃で培養する。
【００１６】
培養後、GGGPsが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりGGGPs粗酵素液を採取する。その後、粗酵素液から各種クロマトグラフィ装置等を用いてGGGPsを単離精製し調製試料とする。
【００１７】
このようにして得られるGGGPsのアミノ酸配列として、配列番号２に示されるものが挙げられる。
２．結晶の作製
GGGPsを結晶化する方法としては、蒸気拡散法、バッチ法、透析法などの一般的なタンパク質結晶化手法を用いることができる（新生化学実験講座１、タンパク質I、日本生化学会編、406〜415頁、東京化学同人）。
【００１８】
「蒸気拡散法」とは、沈澱剤を含むタンパク質溶液の液滴を、より高濃度の沈澱剤を含む緩衝液（外液）の入った容器中に置き、密封後静置する方法である。液滴の置き方によって、ハンギングドロップ法及びシッティングドロップ法がある。ハンギングドロップ法は、タンパク質溶液の小さな液滴をカバーグラス上に配置し、カバーグラスを溶液溜め（リザーバー）上で反転させ、密封する方法である。シッティングドロップ法は、リザーバー内部に適切な液滴台を設置し、タンパク質溶液の小滴を液滴台上に配置し、カバーグラス等でリザーバーを密封する方法である。リザーバー中の溶液には沈澱剤を含有させ、また沈澱剤はタンパク質小滴中にも少量含有させる。
【００１９】
蒸気拡散法において使用する沈澱剤溶液は、当業者であれば任意に調製することができる。例えば以下の(a)-(c)の成分を含有するように調製する。
【００２０】
(a)分子量400〜20000、2〜30重量％の濃度のポリエチレングリコール（PEG）
(b)添加塩として0.01〜1Mの濃度の塩化ナトリウム、塩化リチウム又は塩化マグネシウム
(c)pHを1〜11に調整するための緩衝剤（酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Tris-HCl、CAPSなど）。
【００２１】
「バッチ法」とは、タンパク質溶液に沈澱剤溶液を少しずつ加え、わずかに濁ったところで不溶物を遠心分離して除去し、上清を小さな試験管に入れて密封した後に静置する方法である。
【００２２】
「透析法」とは、タンパク質溶液を沈澱剤の入った緩衝液（外液）に対して、半透膜を用いて透析する方法である。
【００２３】
GGGPsの結晶化においては、例えば蒸気拡散法を用い、pH=4.8- 5.0、タンパク質濃度10〜20mg/ml、温度5〜20℃の条件下で、沈殿剤として6-12 %(v/v)PEG 4000を用いた場合に、良好な結晶を得ることができる。このようにして得られた結晶は、Ｘ線解析に適している。
【００２４】
ここで、タンパク質の結晶化においては、タンパク質濃度、塩濃度、pH、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子の決定が重要であり、これらの因子の決定については当業者に一般的に知られている。例えば、複数のパラメーター（例えば沈殿剤、pH及び濃度）を能率よく調べるために、フェーズダイアグラムを作成しておくことが好ましい。一旦結晶が析出した後は、さらにパラメーターを細かく変えて最良の結晶が出現する条件を精密化する。
３．結晶のＸ線結晶解析
タンパク質の３次元構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているものは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線を当て、得られたＸ線の回折像をもとに、タンパク質の３次元構造を明らかにしていくものである。
【００２５】
タンパク質結晶はＸ線照射により損傷を受け、回折能が劣化する場合が多いため、低温測定により高分解能のＸ線回折を行うことが好ましい。低温測定とは、結晶を急激に-173℃程度に冷却凍結して、その状態で回折データを収集する方法である。凍結による結晶の崩壊を防ぐため、グリセロールなどの保護剤を含む溶液に浸漬した結晶を、液体窒素に直接浸漬して瞬時に凍結させることにより、凍結結晶を調製することができる。
【００２６】
本発明では、結晶を、適切なX線源を用いてX線解析する。
【００２７】
X線回折データは、非常に詳細に複合体の３次元構造を解析できるように、約3.5Åより高い分解能、好ましくは2.5Åより高い、より好ましくは2.0Åより高い分解能で回折する結晶で収集する。
【００２８】
上述のようにして、GGGPs結晶の構造を、Ｘ線による結晶構造解析技術を用いて解析した。配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するGGGPsの結晶は、正方晶系   (tetragonal) に属するものであり、単位格子としてａ軸、ｂ軸及びｃ軸の方向にそれぞれ64±1Å、64±1Å及び145±1Åの大きさを有する。更に、GGGPs結晶を用いたＸ線回折による結晶構造解析の手法により、GGGPsの３次元構造座標を得ることができる。
【実施例】
【００２９】
１．GGGPsの精製
T. acidophilum 由来 GGGPs遺伝子（配列番号１：NP 394455）を、pCRT7-CT-TOPOからプライマーを用いて増幅することにより入手し、これをプラスミドpET21cにサブクローニングした。
【００３０】
PCRは、以下の反応組成液を用い、（94℃で1分の変性、55℃で0.5分のアニーリング、72℃で1分の伸長）のサイクルを25サイクル行なった。
【００３１】
プライマー：
Forward: 5'--ttacatatgatgaccgtcctcgaagaca（配列番号３）
Reverse: 5'--tgtcgactcatcattgtatttttgatattcctacc（配列番号４）
【００３２】
2005046057.tif 000002
そして、PCR産物を一度 pCR-4TOPOベクターにクローニングしたのち、制限酵素Nde I, Sal Iで処理したpET21c ベクターとpCR-4TOPOベクターから切り出したPCR産物部分をライゲーションすることにより、組換えベクターを得た。
【００３３】
得られた組換えベクターをミニプレップ法で大量調製したのち、大腸菌（E.coli  BL21  Codon plus(RIL)）に導入して形質転換体を得た。得られた形質転換体をIPTGの存在下で一晩培養し、9.2 g/4Lを集菌した。
【００３４】
目的酵素の精製は、１０分間（５分ｘ２回）の超音波破砕、５５度、２０分間の熱処理、DE52を用いた 0-500 mM NaClによる溶出、30-80 % 硫安沈殿、Phenyl 650S を用いた30 - 0 % 硫安による溶出、Resourse Qを用いた0 - 500 mM NaClによる溶出により行なった。
【００３５】
その結果、56.8 mgのGGGPsを回収した。
【００３６】
回収したGGGPsが精製されたことの確認は、SDS-PAGEにより行なった。
２．結晶化
目的蛋白を精製後、蛋白濃度を20mg/mLに調製し、25 mM Tris pH8.3, 100mM NaCl, 0.01% Triton X-100, 0.5 mM EDTA の外液を1/100希釈した（1/10希釈を２回）。
【００３７】
Hampton Research社製の結晶化スクリーニングキットであるCrystal Screenを用い、１次スクリーニングを行なった。24ウェルのプレートに、50種のReagentを1mLずつ入れ、蛋白溶液（20mg/mL) 2μLに対して、Reagent ２μLを混合して、ハンギングドロップ蒸気拡散法で、20度にて結晶化を行なった。
【００３８】
結晶化開始後１週間で、Reagent No.37（0.1M 酢酸ナトリウム pH 4.6, 8 % PEG4000)の条件で長軸長10μmのダイヤ型の結晶を確認した（図２、左パネル）また、Reagent No.50（0.5 M硫酸リチウム, 15 % PEG 8000)の条件で長軸長50-200μmのRod Cluster型の結晶を確認した（図２、右パネル）。
【００３９】
さらに最適条件を検討するために、２次スクリーニングを行なった。まず、0.1M 酢酸ナトリウムのpHを4.6-5.2まで0.2刻みで、そしてPEG4000濃度を4-14％まで2％刻みで、それぞれ変えたReagentを0.5mLずつ24ウェルのプレートに入れた。次に、蛋白溶液(濃度20mg/mL又は10mg/mL）2μLに対してReagent 2μLを混合して、シッティングドロップ蒸気拡散法により、20度又は4度で結晶化を行なった。
【００４０】
なお、２次スクリーニングのReagentは、40％PEG4000と、１M酢酸ナトリウムが0.1pH刻みで調製されたStock Option（Hampton Research社製）を混ぜることによって作製した。
【００４１】
その結果、１週間で、蛋白濃度10mg/mL、20度静置のプレートのうち、0.1M 酢酸ナトリウム pH4.8-5.0、6-12 % (6, 8, 10, 12% 各ウェル）PEG4000の条件において長軸長200-300μmのダイヤ型の結晶が得られた（図３）。図３において、右パネルは左パネルの強拡大図である。
【００４２】
上述のようにして得たGGGPs結晶の構造を、Ｘ線による結晶構造解析技術を用いて解析した。配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するGGGPsの結晶は、正方晶系に属するものであり、単位格子としてａ軸、ｂ軸及びｃ軸の方向にそれぞれ64±1Å、64±1Å及び145±1Åの大きさを有していた。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号３：合成DNA
配列番号３：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】GGGPsの作用を示す図である。
【図２】１次スクリーニングにおけるGGGPsの結晶を示す写真である。
【図３】２次スクリーニングにおけるGGGPsの結晶を示す写真である。
【図１】
2005046057.tif 000003
【図２】
2005046057.tif 000004
【図３】
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【配列表】
2005046057000001.app