(57)【要約】【課題】  有機物、特には、生体物質を基材の表面に固定化する際、その有機物、特には、生体物質が有する生理的機能の発揮に適する配向で、基材の表面に安定に有機物の固定化が可能な新規な固定化手段を採用する有機物固定化構造体と、その新規な固定化手段を利用する作製方法の提供。【解決手段】  基体表面の少なくとも一部は、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成される面とした上で、基体表面への有機物の固定化は、該有機物に連結される、少なくとも一以上のアミノ酸からなる酸化珪素に親和性を有するペプチドを含んでなる結合ドメインを介して、基体表面に対して、該結合ドメインの少なくとも一部が結合することによってなされている有機物固定化構造体とする。【選択図】    図１
2005095154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体の表面に有機物が固定化された構造体であって、
前記基体の表面の少なくとも一部が、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成され、
前記有機物は、酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ含んでなる結合ドメインを介して、前記基体の表面に結合され、
前記ペプチドは、下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなるペプチドである
ことを特徴とする、有機物が固定化された構造体。
【請求項２】
前記有機物は、生体物質である
ことを特徴とする請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記生体物質と結合ドメインとの連結部において、前記結合ドメイン中の前記ペプチドと前記生体物質の間に、一以上のアミノ酸からなるリンカーが更に含まれる
ことを特徴とする請求項２に記載の構造体。
【請求項４】
前記基体の少なくとも一部が多孔質である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項５】
基体の表面上に有機物を固定化してなる構造体の製造方法であって、
酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ以上含んでなる結合ドメインと有機物とが連結してなる、有機物−結合ドメイン融合体を調製する工程と、
前記結合ドメインの少なくとも一部を、前記表面の少なくとも一部が酸化珪素を含む一以上の部材によって構成された基体に結合させることにより、前記結合ドメインを介して、前記基体の表面に前記有機物を固定化する工程とを有し、
前記ペプチドは、下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなるペプチドである
ことを特徴とする有機物固定化構造体の製造方法。
【請求項６】
下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる
ことを特徴とする酸化珪素に親和性のペプチド。
【請求項７】
下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる酸化珪素に親和性のペプチド鎖をコードする塩基配列を含む
ことを特徴とする酸化珪素親和性ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる酸化珪素に親和性のペプチド鎖をコードするＤＮＡを含むベクター。
【請求項９】
検体中の標的物質を検出するための装置であって、
請求項１に記載の基体の表面に有機物が固定化された構造体と検体とを接触させることにより、前記有機物と前記標的物質とを結合させるための手段と、
前記結合された標的物質を検出するための手段とを有する
ことを特徴とする検出装置。
【請求項１０】
検体中の標的物質を検出する方法であって、
請求項１に記載の基体の表面に有機物が固定化された構造体と検体とを接触させることにより、前記有機物と前記標的物質とを結合させる工程と、
前記結合された標的物質を検出する工程とを有する
ことを特徴とする検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一部に酸化珪素層を有する基体表面に有機物を固定化してなる有機物固定化基体、ならびにその製造方法、使用方法、更には、前記有機物の固定化に利用される、酸化珪素を含む層に親和性のあるペプチドと該ペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、基体上に固定した生体物質を利用する検出装置や反応装置、分離装置、回収装置への応用が可能な、生体物質固定化基体、ならびにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、ＲＮＡといった遺伝子を含む核酸分子、酵素や抗体といった生体物質の有する分子認識能、物質変換能を利用した、所謂バイオセンサー、バイオリアクタに関し、その広範な応用を目的として、多くの研究開発が行われてきた。
【０００３】
バイオセンサーに関しては、環境汚染物質の問題や社会的安全性、更には、健康に対する関心の高まりと共に、例えば、多様な検出対象への適用を目標とする、更なる技術開発の要求が高まっている。また、バイオリアクタに関しても、最近、環境にやさしいクリーンなプロセス技術として高い注目を集めており、例えば、種々なバイオプロセスを利用する産物の生産法開発等、一層の技術開発の要求が高まっている。
【０００４】
具体的には、バイオセンサーに関しては、上記のように、各生体物質分子が有する分子認識の選択性を利用する検出装置の開発が広く行われている。例えば、デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡと記す）鎖間における、塩基配列依存の相補的水素結合（相補鎖間のハイブリダイズ反応）を利用したＤＮＡセンサーチップ、あるいは、タンパク質分子と低分子間またはタンパク質分子同士などの特異的な結合能に由来する分子認識能、例えば、抗原抗体反応を利用して、血液中に溶出する疾病マーカー等を検出する抗体センサー、さらには、糖尿病患者のためのグルコースセンサーに代表される、酸化還元酵素や加水分解酵素を利用して、基質物質の濃度を検出する酵素センサー等のバイオセンサーを初めとする、各種の検出手法に基づく検出装置の開発が挙げられる。
【０００５】
現在は、これら生体物質を応用するバイオセンサーでは、利用されるＤＮＡなどの核酸分子や、抗体・酵素等のタンパク質などの生体物質を、基板または担体などの基体表面に固定化して、生体物質固定化基体の形態で使用する方式をとるものが一般的である。
【０００６】
また、昨今開発が進められているバイオセンサーに要求される性能品質の一つに、μ−ＴＡＳに代表される、「高感度且つ小型化」が挙げられる。この「高感度且つ小型化」の目標を達成するためには、如何にして、微小な反応場または検出場の空間を有効に利用するとともに、感度を上げるかが重要な技術課題となる。
【０００７】
例えば、基板上に生体物質を固定化している検出場において、目的とする被検出物の特異的な結合に加えて、被検出物以外の生体物質の非特異な吸着が多く生じる可能性、あるいは、被検出物自体が非特異的に基板上に吸着する可能性があり、これら非特異な吸着現象は、バイオセンサーのＳ／Ｎ比を低下させる要因の一つとなる。特に、検出場が微小になるほど、目的とする被検出物の特異的な結合の総量自体、少なくなるため、非特異な吸着に起因するノイズの影響を受けやすく、高感度な測定を難しくする。また、微量なサンプルを有効に活用する観点でも、被検出物の非特異的吸着が多いと、十分高い確度で測定を行うことが困難となり、非特異な吸着現象を低減、抑制することが、やはり大きな技術的な課題となってくる。
【０００８】
一方、バイオリアクタに関しては、目的産物の産生能を有する微生物自体を利用する手法に代えて、主にタンパク質の一種である酵素の位置選択的触媒機能を利用して、アミノ酸等の食品添加物、医薬候補物質や抗生物質を酵素反応により生産する手法、さらには、酵素反応を、化学品やポリマー材料の生産へと応用する検討もなされてきている。この様な酵素反応を利用するバイオリアクタの開発においても、少量多品種生産に適する装置の開発が主流となってきている点、例えば、コンビナトリアル・ケミストリー手法による候補物質のスクリーニング技術の普及に伴い、前記バイオセンサーと同様に反応に利用する酵素タンパク質を固定化した装置によって、小型化（すなわち少量生産）へのニーズが高まってきている。
【０００９】
また、このようなバイオセンサー及びバイオリアクタに利用される生体物質固定化基材用の基材、基板・担体の材料としては、一般的に、固定化する有機物、例えば、生体物質の種類・用途に応じて、有機ポリマー、ガラス、セラミクス、金属基板等、既知の材料から適宜選択して用いられている。
【００１０】
基材上に固定化する有機物が特異的な作用する対象物質が、生体物質、特にタンパク質である場合、基材として利用する基板表面が疎水的であると、かかる疎水的な表面上への対象物質タンパク質の非特異的な吸着が増加する。そのため、バイオセンサーでは、十分な検出感度を達成することができない、また、バイオリアクタでは、高い生産性をあげることができない恐れがある。
このような疎水的な表面上へ非特異的な吸着を低減する方法の一つとして、対象物質タンパク質を含む液と接触させる、有機物固定化基板の少なくとも流路や反応場等の部位に対しては、基板表面に親水化処理を施す手法がある。親水化処理を施されている基板表面では、表面に物理的に吸着される対象物質タンパク質は、所望の組成からなる洗浄用の水溶液を用いて、基板表面を置換し、洗浄する操作によって、比較的容易に除去することができる。基板表面に対する親水化処理方法としては、表面に酸化珪素に代表される酸化金属層を設ける方法や、シランカップリング剤に代表されるカップリング剤処理を行って、親水性に富むカップリング剤被覆層を設ける方法は、一般的に利用されている。
【００１１】
このような親水化処理を施した表面を具える基板に対して、その表面に、生体物質、特にタンパク質等の生体物質を固定化する方法としては、例えば、タンパク質溶液中に浸漬する、またはタンパク質溶液を塗布する手段を用いて、基板表面にタンパク質溶液の塗布層を形成した後、該塗布層に含有される溶媒を除去・乾燥することで、物理吸着によって、タンパク質を基板表面上に固定化する手法や、反応性官能基を導入する目的で、基板表面またはタンパク質分子に化学修飾を施した後に、導入される反応性官能基間の反応を利用して、化学結合を形成することによって、基板表面にタンパク質分子を化学結合的に固定化する手法等が、基板表面への生体物質の固定化手段として、現在まで知られている。
【００１２】
物理吸着による固定化法の一例として、特許文献１には、導電性基板の表面上に有機電荷移動錯体層を形成し、次いで、この有機電荷移動層上にタンパク質溶液を塗布した後乾燥させることで、有機電荷移動層を介して基板表面に酵素タンパク質を物理的吸着・固定化する手法を適用した酵素電極の作製方法が開示されている。
【００１３】
化学結合を用いた固定化法の一例として、非特許文献１には、白金蒸着したシリコン基板表面に、アミン系シランカップリング剤処理を施した後、グルタルアルデヒド等架橋剤を用いて、前記アミノ・シランカップリング由来のアミノ基と、ペプチド鎖との間を化学的結合により連結して、固定化する方法が開示されている。その他に、ガラス基板上に抗体を固定化してなるバイオセンサー等の検出装置を作製する際にも、ガラス基板の表面にシランカップリング剤処理によって反応性官能基を導入し、同様に架橋剤を用いて、化学的結合を介してペプチド鎖を固定化する方法が適用されている。
【００１４】
しかしながら、物理吸着や架橋反応による化学的結合を利用して、生体物質を固定化する方法では、特に、酵素や抗体等のタンパク質に適用する際、基板上への物理吸着に際して、タンパク質側の吸着に係わる部位は、任意で選択することができない、また、架橋剤に対する、タンパク質側の反応に係わる官能基の存在部位は任意に設定できず、さらには、反応可能な官能基が複数存在する際には、その間での選択性が極めて低い。つまり、物理吸着や架橋反応による化学的結合による基板への結合においては、タンパク質側の結合に関与する部位は、無作為に選択されるため、対象の化合物に対する該タンパク質の結合能や、該タンパク質の酵素活性等に、直接的に関与する部位、もしく間接的に関係している部位が、基板表面への結合にも関与する部位となると、基板上に結合した際、タンパク質が有する、対象との結合能や酵素活性が著しく低下することが懸念される。
【００１５】
従って、基板表面への結合に関与する、被固定化分子側の固定化部位を予め設定する手段、例えば、基板表面上に固定化される生体物質の配向性を予め制御することが可能な技術開発が重要となっている。
【００１６】
加えて、「高感度且つ小型化」を達成する際には、基材表面の微小な領域において、生体物質を高集積化して、固定化することが必要となる。
【００１７】
生体物質を高集積化して、固定化する方法の一例として、比表面積が大きい基材、例えば、ナノレベルの規則的な細孔構造を有する多孔体を基板として採用し、比表面積の大きな細孔構造を具える表面に生体物質を固定化する手法が、一般的に知られている。前記用途に利用可能なナノメートルオーダーのスケールで、規則性を有する細孔構造を形成する従来の方法として、ポリマー加工したメンブレン・フィルタ−や、ポーラス・ガラス、陽極酸化アルミ膜等がよく知られている。また、コーティング法によって、多孔性の被覆膜を金属やガラス等の基板表面上に形成する方法も知られている。多孔性膜の形成方法としては、非特許文献２に記載される手法では、先ず、非イオン性ブロックポリマーを鋳型として、その周りにアルコキシシランを出発物質として酸性条件下においてシリカを形成させた構造体を形成する。その後、加熱もしくは有機溶媒処理することにより、鋳型の非イオン性ブロックポリマーを消失させることにより、数ｎｍオーダーの孔径を有する多孔体構造のシリカ膜が得られることが開示されている。
このような数ｎｍオーダーの孔径が形成されている多孔体を基板とすることで、微小な領域においても、高感度の検出に十分な量の生体物質が固定化されている反応場を作製することができる。
【００１８】
この多孔性基材を利用する手法、特に、多孔質の酸化珪素材料に対して、タンパク質等の生体物質を固定化する方法の例として、下記する文献を挙げることができる。
【００１９】
特許文献２には、表面がアニオン性であるメソポーラス・シリカ多孔体の細孔内に、ペルオキシダーゼ、サチライシン、リパーゼといった酵素タンパク質を、ファンデルワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）力により固定化した超安定化酵素が開示されている。
【００２０】
特許文献３には、同じく、メソポーラス・シリカ多孔質材料の細孔にペルオキシダーゼを固定化した酵素固定構造体により、基質リグニンを分解する方法が開示されている。
【００２１】
更に、同様に酵素タンパク質を多孔性基材に固定する方法を適用して、特許文献４には、燃料の酵素的改質方法が、特許文献５には、酵素の固定化方法が、特許文献６には、脂質分解酵素であるリパーゼの特異性向上の方法がそれぞれ開示されている。
【００２２】
更に、非特許文献３は、酸化珪素のメソポーラス・モレキュラーシーブに、チトクロームｃ、パパイン、トリプシンといった酵素タンパク質を固定化すると、それら酵素タンパク質の性能が向上することを報告している。
【００２３】
非特許文献４は、ナノポーラス・ゾル−ゲルガラスの細孔に、末端にアルデヒド基を有するシラン化剤（トリメトキシシリルプロパナール）を利用して、酵素タンパク質（α−キモトリプシン）を共有結合により固定化することにより、該酵素タンパク質の安定性が向上することを報告している。
【特許文献１】特開平０６−００３３１７号公報
【特許文献２】特開２０００−１３９４５９号公報
【特許文献３】特開２００１−１２８６７２号公報
【特許文献４】特開２００１−４６１００号公報
【特許文献５】特開２００１−１７８４５７号公報
【特許文献６】特開２００２−９５４７１号公報
【非特許文献１】Ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  １５−１６  ｐ１２７  （１９９３）
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９,  ５４８  （１９９７）
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ．  Ｂ，  ２（２−３），  １１５−１２６  （１９９６）
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７４（３），  ２４９−２５５  （２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
上述する比表面積が大きい基材、例えば、ナノレベルの規則的な細孔構造を有する多孔体を基板として採用することで、基板表面により多くの生体物質を固定化することは可能であるが、基板上に固定化される生体物質が、例えば、検出する対象物質との結合に適する配向をとっていない場合、固定化されている生体物質の量に見合った検出感度を達成することができない。また、作用すべき基質物質に対して、適正な配向をとっていない場合、固定化されている生体物質の量に見合った、反応性を達成することができない。すなわち、基板上に固定化される生体物質は、その用途に適する配向性を制御した上で、固定化が達成されていないと、比表面積の大きい基材を利用して、基板表面により多くの生体物質を固定化することに伴う利点が発揮されないものとなる。
【００２５】
換言するならは、基板上に固定化される生体物質が、その用途に適する配向性を制御した上で、固定化が達成されていないと、所望の検出感度、あるいは、反応性を得るためには、基板上に固定化される生体物質の量を更に増すことが必要となり、基板の単位面積当たりに過剰な量の生体物質を固定化する、あるいは、生体物質を固定化する基板の面積を過度に広くするなどの対応を余儀なくされることになる。生体物質を固定化する基板の面積を過度に広くすると、装置自体の小型化を図る上で、大きな障害となる。あるいは、その作製に大きなコストを要する生体物質材料の使用量が増すと、装置全体として、コストアップの要因となり、工程当たりの必要コストを低減する上で、大きな障害となる。
【００２６】
したがって、基板上に固定化される生体物質を、その用途に適する配向性を制御しつつ、かつ、比表面積が大きい基板を利用して、該基板表面により多くの生体物質を固定化することを可能とする、配向性を制御した固定化手法の開発が望まれている。
【００２７】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、バイオセンサーやバイオリアクタなどで利用される、有機物、特には、生体物質を基材の表面に固定化する際、その有機物、特には、生体物質が有する生理的機能の発揮に適する配向で、基材の表面に安定に有機物の固定化が可能な新規な固定化手段を採用する有機物固定化構造体と、その新規な固定化手段を利用する作製方法を提供することにある。加えて、本発明は、前記新規な固定化手段として利用可能な酸化珪素を含む層に親和性のあるペプチドと該ペプチドをコードするＤＮＡの提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、基材の表面に対して、有機物、特には、生体物質を固定化する際、利用可能な新たな固定化手段を検討したところ、固定化した有機物、特には、生体物質が、その本来の生理的機能を十分に発揮する上では、固定化に利用される部位を有機物の本体部とは別に設け、加えて、該固定化に利用される部位における基材の表面との結合には、化学的試薬を利用する手法ではなく、かかる固定化に利用される部位に特異的な、物理的な相互作用を利用する手法を選択すると、有機物、特には、生体物質が有する生理的機能の発揮に適する配向で、基材の表面に安定に有機物の固定化が可能となることを見出した。さらに、前記固定化に利用される部位に特異的な、物理的な相互作用を利用する手法として、固定化すべき表面の材質として、酸化珪素を含む部材を利用すると、酸化珪素に対して親和性を有するペプチドを選別することが可能であり、この酸化珪素に対して親和性を有するペプチドを含む結合ドメインを、有機物、特には、生体物質からなる機能ドメインと連結した融合体の形態とすると、酸化珪素を含む部材で構成される表面を有する基材に対して、表面の酸化珪素と、酸化珪素に対して親和性を有するペプチドを含む結合ドメインとの間における物理的結合を介して、有機物、特には、生体物質を、それが有する生理的機能の発揮に適する配向で、高い再現性と安定性で固定化が可能であることを確認した。本発明は、これらの知見に基づき、完成されたものである。
【００２９】
すなわち、本発明にかかる有機物が固定化された構造体は、
基体の表面に有機物が固定化された構造体であって、
前記基体の表面の少なくとも一部が、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成され、
前記有機物は、酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ含んでなる結合ドメインを介して、前記基体の表面に結合され、
前記ペプチドは、下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなるペプチドである
ことを特徴とする、有機物が固定化された構造体である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明にかかる有機物固定化構造体、例えば、表面に生体物質を固定化した基板においては、固定がなされる基板表面として、酸化珪素層を設け、一方、固定する有機物は、生体物質自体を機能ドメインとして、前記酸化珪素層に対する結合能を有する結合ドメインを、この機能ドメインに連結した構成とすることにより、機能ドメインである生体物質部分は、基板表面と直接接触することなく、連結されている結合ドメインによって、その酸化珪素結合能による選択的な固定が可能となる。この独立に設けられている結合ドメインを介して、基板表面に固定化することで、生体物質は、その本来の機能に対する固定化の影響は及ばず、また、固定化に際して、なんらの試薬を利用していないため、その機能に影響を及ぼす化学反応を被ることもない。
【００３１】
加えて、本発明を適用することで得られる、生体物質固定化基体では、固定化されている生体物質は、予め、この生体物質自体を機能ドメインとし、この機能ドメインとは全く独立して設ける、酸化珪素層に対する結合能を有する結合ドメインを、この機能ドメインに連結した構成を有する融合体として作製し、結合ドメインによる物理的な結合を介して、酸化珪素層を設ける基体表面上に固定されるので、機能ドメインとする生体物質の種類、その機能に依存することなく、結合ドメインに含まれるペプチドとして、酸化珪素層に対する結合能を有する様々のアミノ酸配列の内から、適宜選択されるアミノ酸配列を用いることが可能となる。換言するならば、本発明にかかる有機物固定化構造体では、結合ドメインに含まれるペプチドのアミノ酸配列を適宜選択して、固定対象の有機物、特には、生体物質が有する機能は、本来の機能水準と全く遜色のない融合体とすることができ、多様な固定対象の有機物への利用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明では、上述する有機物固定化構造体の発明、すなわち、
基体の表面に有機物が固定化された構造体であって、
前記基体の表面の少なくとも一部が、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成され、
前記有機物は、酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ含んでなる結合ドメインを介して、前記基体の表面に結合され、
前記ペプチドは、下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなるペプチドである
ことを特徴とする、有機物が固定化された構造体における、好ましい態様の一例として、下記の態様を挙げることができる。
【００３３】
先ず、前記有機物は、生体物質であることが好ましい。具体的には、ここで用いる「生体物質」とは、結合ドメインと連結した形態などに調製するため、天然に存在する生体物質と実質的に同じ構成を有するが、その機能自体は保持される範囲で、非本質部分に対して人為的改変が施されている、「生体由来の物質」をも包含している。その際、前記生体物質と結合ドメインとの連結部において、前記結合ドメイン中の前記ペプチドと前記生体物質の間に、一以上のアミノ酸からなるリンカーが更に含まれる形状とすることが可能である。
【００３４】
一方、本発明にかかる有機物が固定化された構造体において、
前記基体の少なくとも一部が多孔質であることが、一般に好ましい。
【００３５】
また、本発明は、上記する本発明にかかる有機物が固定化された構造体の発明に関連して、下記する形態の発明をも提供している。
【００３６】
すなわち、本発明にかかる有機物固定化構造体の製造方法は、
基体の表面上に有機物を固定化してなる構造体の製造方法であって、
酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも一つ以上含んでなる結合ドメインと有機物とが連結してなる、有機物−結合ドメイン融合体を調製する工程と、
前記結合ドメインの少なくとも一部を、前記表面の少なくとも一部が酸化珪素を含む一以上の部材によって構成された基体に結合させることにより、前記結合ドメインを介して、前記基体の表面に前記有機物を固定化する工程とを有し、
前記ペプチドは、下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなるペプチドである
ことを特徴とする製造方法である。
【００３７】
さらには、本発明にかかる有機物が固定化された構造体において、発明の本質的な構成要素の一つである、上記結合ドメインとしての利用可能な、酸化珪素親和性ペプチドの発明も提供されている。すなわち、本発明にかかる酸化珪素親和性ペプチドは、
下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる
ことを特徴とする酸化珪素に親和性のペプチドである。
【００３８】
対応して、かかる酸化珪素親和性ペプチドのコード遺伝子に相当する、本発明にかかる酸化珪素親和性ペプチドをコードするＤＮＡは、
下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる酸化珪素に親和性のペプチド鎖をコードする塩基配列を含む
ことを特徴とする酸化珪素親和性ペプチドをコードするＤＮＡである。
【００３９】
なお、前記本発明にかかる酸化珪素親和性ペプチドをコードするＤＮＡは、通常、ベクター中に挿入された形態で使用されることが多い。従って、かかるベクター中に挿入された形態に相当する、本発明にかかる酸化珪素に親和性のペプチド鎖をコードするＤＮＡを含むベクターは、
下記配列番号：１または配列番号：２
（配列番号：１）Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val
（配列番号：２）Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列、
前記アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列、
あるいは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造または複合体を含んでなる酸化珪素に親和性のペプチド鎖をコードするＤＮＡを含むベクターである。
【００４０】
更には、本発明にかかる有機物が固定化された構造体の用途発明も提供されており、その一つの形態に相当する、本発明にかかる検出装置は、
検体中の標的物質を検出するための装置であって、
上述の構成を有する本発明にかかる、基体の表面に有機物が固定化された構造体と検体とを接触させることにより、前記有機物と前記標的物質とを結合させるための手段と、
前記結合された標的物質を検出するための手段とを有する
ことを特徴とする検出装置である。
【００４１】
また、本発明にかかる有機物が固定化された構造体の用途発明における、他の形態に相当する、本発明にかかる検出方法は、
検体中の標的物質を検出する方法であって、
上述の構成を有する本発明にかかる、基体の表面に有機物が固定化された構造体と検体とを接触させることにより、前記有機物と前記標的物質とを結合させる工程と、
前記結合された標的物質を検出する工程とを有する
ことを特徴とする検出方法である。
【００４２】
以下に、本発明に関して、より詳しく説明する。
【００４３】
まず、本発明にかかる有機物固定化構造体は、
基体の表面上に有機物を固定化してなる構造体であって、
前記基体表面の少なくとも一部は、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成される面であり、
前記基体表面への有機物の固定化は、該有機物に連結される、少なくとも一以上のアミノ酸からなるペプチドを含んでなる結合ドメインを介して、基体表面に対して、該結合ドメインの少なくとも一部が結合することによってなされている
ことを特徴とする、有機物固定化構造体の形態とすることができる。
【００４４】
その際、本発明にかかる有機物固定化構造体において、
前記結合ドメインに含まれるペプチドは、
前記酸化珪素を含む一以上の部材中の酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列を含んでなるペプチドであることが好ましい。
【００４５】
その際、前記酸化珪素に対する結合能を有するアミノ酸配列を含んでなるペプチドは、
下記配列番号：１、配列番号：２
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val （配列番号：１）
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val （配列番号：２）
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸配列の全部、またはその一部を含むアミノ酸配列を含んでなるペプチドであることがより好ましい。
【００４６】
一方、前記有機物は、生体物質であることが望ましい。
【００４７】
その際、前記生体物質と結合ドメインとの連結部において、
前記結合ドメイン中の前記酸化珪素に対して結合能を有するアミノ酸配列を含んでなるペプチドと前記生体物質の間には、一以上のアミノ酸からなるリンカーが含まれていてもよい。
【００４８】
また、対応して、本発明にかかる有機物固定化構造体の製造方法は、
基体の表面上に有機物を固定化してなる構造体であって、
前記基体表面の少なくとも一部は、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成される面であり、
前記基体表面への有機物の固定化は、該有機物に連結される、少なくとも一以上のアミノ酸からなるペプチドを含んでなる結合ドメインを介して、基体表面に対して、該結合ドメインの少なくとも一部が結合することによってなされている、有機物固定化構造体を製造する方法であって、
（１）前記結合ドメインを該有機物に連結してなる構成の有機物−結合ドメイン融合体を作製する工程、及び
（２）前記有機物−結合ドメイン融合体を前記基体の表面に接触させ、該有機物−結合ドメイン融合体中に含まれる結合ドメインの少なくとも一部を、前記基体表面に結合させて、前記結合ドメインを介して、基体の表面に前記有機物の固定化を行う工程を含む
ことを特徴とする、有機物固定化構造体の製造方法の形態とすることができる。
【００４９】
その際、本発明にかかる有機物固定化構造体の製造方法では、例えば、
前記有機物が、タンパク質を含んでなる生体物質である場合、
前記（１）有機物−結合ドメイン融合体を作製する工程は、
（１−１）前記生体物質に含まれるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、
前記結合ドメインに含まれるペプチド部分のアミノ酸配列をコードする塩基配列とが、前記二つのアミノ酸配列を連結してコードするように、連結されてなる塩基配列を有する連結遺伝子に基づき、前記結合ドメインに含まれるペプチド部分を前記生体物質に含まれるタンパク質に連結してなる融合体型タンパク質を発現させる工程、及び
（１−２）前記融合体型タンパク質によって、前記生体物質に含まれるタンパク質と前記結合ドメインに含まれるペプチドとの間において連結がなされる前記有機物−結合ドメイン融合体を作製する工程
を含むことが好ましい。
【００５０】
加えて、本発明は、上述する形態において、本発明にかかる有機物固定化構造体の構成に利用される結合ドメインに含まれるペプチドが有する、特定のアミノ酸配列の発明をも適用しており、
すなわち、かかる形態の本発明にかかる酸化珪素親和性ペプチドは、
下記配列番号：１、配列番号：２
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val （配列番号：１）
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val （配列番号：２）
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする酸化珪素親和性ペプチドである。さらには、かかる形態に対応する、本発明にかかるＤＮＡ分子は、下記配列番号：１、配列番号：２
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val （配列番号：１）
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val （配列番号：２）
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸配列の全部、またはその一部を含むアミノ酸配列、
もしくは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造を含んでなる酸化珪素親和性ペプチド鎖をコードするＤＮＡを含む
ことを特徴とするＤＮＡ分子である。あるいは、かかる形態に対応する、本発明にかかるベクターは、
下記配列番号：１、配列番号：２
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val （配列番号：１）
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val （配列番号：２）
に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸配列の全部、またはその一部を含むアミノ酸配列、
もしくは、それらアミノ酸配列の繰り返し構造を含んでなる酸化珪素親和性ペプチド鎖をコードするＤＮＡを含むベクターである。
【００５１】
まお、本発明にかかるベクターは、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミドといった、遺伝子導入、形質転換、タンパク質発現等の分子生物学的操作に用いられる各種ベクター中に、上記のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入してなるベクターとすることができる。
【００５２】
本発明にかかる有機物固定化構造体では、表面の少なくとも一部が、酸化珪素を含む一以上の部材によって構成されている基体の表面上に、有機物を固定化する際、従来利用されている、物理吸着法や、化学的手法を利用して、酸化珪素を含む部材に共有結合を介して生体物質を固定する手法に代えて、例えば、用いる表面部材中の酸化珪素に対する結合能について、ランダム・ペプチド・ライブラリーをスクリーニングすることで簡便に取得することができ、所望の酸化珪素に対する結合能を有するペプチド断片のアミノ酸配列に基づき、前記酸化珪素に対し結合能を示すアミノ酸配列を有するペプチド含む結合ドメインを設計し、有機物に対して、該結合ドメインを予め結合してなる有機物−結合ドメイン融合体とすることで、この酸化珪素に対する結合能を有する結合ドメイン部を介して、酸化珪素を含む部材の表面に対して、特異的に有機物−結合ドメイン融合体を固定化する手法を用いている。
【００５３】
従って、前記結合ドメインを予め結合してなる有機物−結合ドメイン融合体において、前記有機物が生体物質の場合は、該生体物質の本来の機能（分子認識能や触媒能）が発揮されていることを、前もって確認しておくことができ、その後、生体物質−結合ドメイン融合体を、酸化珪素を含む部材表面に固定化する際、生体物質の機能に対して、影響を及ぼす試薬等を利用する化学的な反応を利用していないので、生体物質−結合ドメイン融合体を、酸化珪素を含む部材表面に固定化した際にも、固定化される生体物質は、その機能を十分発揮できる状態に保持されたものとなる。加えて、基材表面に利用する酸化珪素部材に応じて、スクリーニングによって、予め所望の結合能を有するアミノ酸配列を選別することができ、また、対象とする生体物質に応じて、生体物質と予め結合させる結合ドメインの結合形態と、結合ドメイン中に含まれる酸化珪素に対する結合能を示すアミノ酸配列とを設計できるので、本発明にかかる有機物固定化構造体は、利用する酸化珪素、対象とする有機物、特に生体物質の双方ともに、広範囲に適用することが可能である。
【００５４】
以下に、本発明における好適な実施態様について、更に詳しく説明する。
【００５５】
本発明にかかる有機物固定化構造体では、有機物を固定化する基材表面には、その表面の少なくとも一部に、酸化珪素を含む一以上の部材で構成される領域を設け、この酸化珪素を含む部材からなる領域において、有機物を固定化している。その酸化珪素を含む部材からなる領域への固定化は、該有機物に連結される、少なくとも一以上のアミノ酸からなるペプチドを含んでなる結合ドメインを介して、基体表面に対して、該結合ドメインの少なくとも一部が結合することによってなされている。従って、該結合ドメインが、酸化珪素を含む部材からなる領域と選択的に結合する結果、この結合ドメインと連結されている有機物自体の基体表面への物理吸着は回避され、有機物自体の機能は、物理吸着に付随した影響を被ることがないものとされている。
【００５６】
図１に、本発明にかかる有機物固定化構造体の実施形態の一例を模式的に示す。図１に示す形態では、基材本体は、平板状の基板１１であり、その表面に酸化珪素を含む部材で構成される被覆層として、酸化珪素層１２を設けている。有機物の固定化は、この酸化珪素層１２の表面において、結合ドメイン１５と選択的になされる。一方、この結合ドメイン１５と連結されている機能ドメイン１４に相当する有機物自体は、酸化珪素層１２に対して、非選択的な、弱い物理吸着が可能であっても、結合ドメイン１５部分がより優先的に結合する結果、かかる競争過程によって、機能ドメイン１４に相当する有機物自体が物理吸着を起こす頻度は低く、また非特異的な弱い物理吸着は固定化条件を選択することにより低減させることも可能である。
【００５７】
従って、基材本体、例えば、基板は、その表面に酸化珪素を含む部材で構成される被覆層を設けることが可能であれば、従来公知の種々の材料からなる基板を、使用目的に応じて、適宜選択して用いることができる。具体的には、鉄、アルミ、金等の金属材料、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ＰＣに代表される合成樹脂材料、シリコンなどの半導体材料、アルミナ、サファイアなどの酸化物やセラミックス材料、あるいは、これら材料の二種以上を組み合わせた複合材料を用いて形成される基板から、適宜選択して用いることができる。
【００５８】
一方、基材本体の表面に設ける、酸化珪素を含む部材で構成される被覆層は、少なくとも、その最表面には、酸化珪素の表層が露呈する形態とすることが好ましい。酸化珪素層１２は、例えば、アルコキシシラン等の原料と、必要に応じて、重合開始剤、金属触媒等を適量含む溶液を用いて、かかる溶液を、例えば、基板表面に従来既知の方法により、塗布コートし、溶媒の蒸散、乾燥と、加熱処理して、重合による酸化珪素層とする方法で作製することができる。
【００５９】
あるいは、基板表面に設ける酸化珪素層１２は、ＣＶＤ法を適用して、形成することもできる。ＣＶＤ法を適用する場合、堆積過程において、相当の高温加熱がなされるため、基板材料は、この高温加熱において、熱損傷等を受けることのない材料を選択する必要がある。加えて、堆積される酸化珪素層の熱膨張率と、基板の熱膨張率に大きな差異があると、堆積後、冷却する際、酸化珪素層に機械的歪みが誘起され、剥落や反りを生じることもあり、この点をも考慮して、基板材料を選択することが好ましい。
【００６０】
なお、酸化珪素層１２は、多孔体被膜構造とすると、多孔体は細孔を有し、比表面積が大きくなり、固定化に利用可能な延べ表面積を増すことができ、一般に好ましい。本発明では、この多孔体中の細孔内に固定化を行う際にも、機能ドメイン１４に相当する有機物自体の物理吸着ではなく、結合ドメインによる選択的な結合を介する固定化が起こるように、細孔の内径を固定化する有機物の形状に応じて、適正化することが好ましい。また、多孔体被膜構造とする際には、酸化珪素層１２の厚さも、前記細孔の内径、ならびに、固定化する有機物の形状に応じて、適正化することが好ましい。
【００６１】
例えば、酸化珪素層１２の厚さを、ナノメートルオーダーに選択する際には、極薄い酸化珪素膜形成により適している、ＣＶＤ法などの気相堆積法を適用することが好ましい。
【００６２】
一方、酸化珪素層を多孔体被膜構造とする際には、ＣＶＤ法などの気相堆積法ではなく、例えば、酸性条件下で、界面活性剤を添加したアルコキシシラン溶液を用いて、塗布層を形成し、３５℃にて２０時間反応させ、その後、８０℃で４８時間加熱することにより、界面活性剤相が網目状に混在する酸化珪素層を形成させる。次に、層内に混在している界面活性剤相を取り除く（例えば、加熱による場合、５００℃にて６時間）ことにより、かかる界面活性剤相が占めていた領域が、孔径１ｎｍ〜１０００ｎｍの細孔構造として残される多孔質材料層を得る手法を利用することができる。上記の工程により作製した酸化珪素−界面活性剤複合体から界面活性剤を取り除く方法としては、前記の加熱方法以外に、有機溶媒処理して、界面活性剤を溶出除去する手法等が挙げられる。いずれの手法を採用するかは、使用する基板の物性、例えば、耐熱性、溶剤耐性等に応じて、適宜選択して用いることが好ましい。
【００６３】
酸化珪素層を多孔体被膜構造とすると、比表面積を大幅に増加することができ、単位面積あたりの固定化される生体物質数を多くすることができる利点がある。また、生体物質が固定化された細孔内部は、この分子認識反応場に侵入する分子を、その細孔径の大きさにより選択する機能を付加する利点もある。更には、平面上に生体物質を固定化した場合に比べ、細孔内部一つ一つの反応場の体積は、限定されており、縮小されたものとなる。そのため、限られた空間を有する細孔内部の反応場では、対象化合物が生体物質と結合する際、必要な平均移動距離を大幅に短縮でき、分子認識反応効率を向上する効果を示すことも期待できる。従って、細孔径は、対象化合物の大きさ、試料溶液の粘性を考慮して、目的とする対象化合物の選択的な細孔内へ侵入が可能な範囲に選択することも可能である。例えば、細孔径を、１ｎｍ〜５００ｎｍの範囲、好ましくは、１０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲に選択することが好ましい。
【００６４】
上述するように、酸化珪素層は、基板表面に直接、気相から蒸着する方法、もしくは塗布膜を処理して形成する方法を利用して作製することができる。また、基板に有機材料を採用する際には、酸化珪素層の形成工程で選択する温度、使用できる溶剤等は、基板材料の種類に応じて、適宜選択されるものである。場合によっては、予め酸化珪素材料粒子を形成し、基板材料の性質を鑑みて選択された溶媒に懸濁し、酸化珪素材料粒子の懸濁液を塗布し、必要に応じて加熱して溶媒を除去することにより、粒子状酸化珪素を含む層を形成することも可能である。
【００６５】
更には、基体自体を、透光性材料とすることにより、その表面に固定化した生体物質の挙動を、光学的な手法により測定することが可能な構造してもよい。
【００６６】
本発明においては、基材表面に固定化される有機物は、作製される有機物固定化構造体の使用用途に応じて、適宜選択すべきものである。少なくとも、一以上のアミノ酸からなるペプチドを含んでなる結合ドメインと連結することが可能であれば、機能ドメインとして利用される有機物の種類は、特に制限はない。一以上のアミノ酸からなるペプチドを含んでなる結合ドメインと連結することが可能な、種々の生体物質を、基材表面に固定化される有機物として選択することができる。本発明を適用可能な有機物として、選択可能な生体物質の例として、具体的には、核酸分子、一以上のアミノ酸からなるペプチドまたはタンパク質、糖鎖および糖鎖−タンパク質複合体を挙げることができる。
【００６７】
例えば、核酸分子の例としては、デオキシリボ核酸分子、リボ核酸分子等が挙げられる。例えば、ＤＮＡチップなどでは、固定化されるＤＮＡ分子の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子を、ハイブリダイズ反応によって認識する機構を利用するため、該ＤＮＡ分子は、所定の塩基配列を有する一本鎖のＤＮＡ分子とされる。加えて、核酸分子の一部は、特定の立体構造を形成し、かかる立体構造に由来する分子認識能を有することも判明している。この種の立体構造に由来する分子認識能を有する核酸分子は、アプタマーと総称され、例えば、ＳＥＬＥＸ法に代表される分子進化工学的手法により、多様な塩基配列のうちから、高い分子認識能を有する塩基配列を選別取得することも可能である。されには、ＤＮＡ結合性タンパク質において、そのターゲートとなる二重鎖ＤＮＡの塩基配列も特定されており、この種の二重鎖ＤＮＡ分子も、本発明を適用可能な有機物として、選択可能である。
【００６８】
また、本発明を適用可能な有機物の選択可能なタンパク質分子の例として、酵素、抗体、レセプタ−分子、または足場タンパク質分子が挙げられる。
【００６９】
本発明を適用可能な抗体分子としては、抗原物質を被検体動物に導入し、その免疫反応の結果産出される免疫抗体分子、さらには、前記免疫抗体の構造を部分的もしくは全体的に遺伝工学的に改変された組換え抗体分子など、種々の方法で採取される免疫グロブリン分子が挙げられる。これら抗体は、モノクロ−ナル抗体、またはポリクロ−ナル抗体であってもよい。これら抗体分子は、任意の免疫グロブリン・クラスに含まれ、例えば、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択できる。これらのクラスのなかでも、ＩｇＧクラスの抗体分子は、より好適に利用できる。
【００７０】
免疫グロブリン分子に加えて、抗体断片分子を利用することもでき、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2等が挙げられる。例えば、Ｆａｂ断片分子は、抗体グロブリンのパパイン消化によって得られる抗体断片分子と、ほぼ同じ断片分子である。Ｆ（ａｂ’）2は、抗体グロブリンのペプシン消化によって得られる抗体断片分子と、ほぼ同じ断片分子である。これら抗体断片分子の調製は、抗体グロブリンを酵素的または化学的分解して作製する方法もあるが、多くは、遺伝子工学的に組み換え生産する方法も適用可能である。さらには、免疫グロブリン分子中の抗原認識部位である、可変領域部（Ｆｖ）を構成する重鎖部（ＶＨ）と軽鎖部（ＶＬ）とを、ペプチド・リンカーで連結して、抗原認識能を具える、遺伝子工学的に組み換え生産された分子とされている、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）を利用することもできる。
【００７１】
例えば、機能ドメイン１４とする生体物質が、組み換え生産可能なタンパク質である場合、それと連結される、一以上のアミノ酸からなるペプチドを含んでなる結合ドメイン１５とは、両者のペプチド鎖が一連に連結された融合タンパク質の形態とすることができる。その際、機能ドメイン１４部と、結合ドメイン１５部との間に、適当なアミノ酸長のリンカー配列を挿入することもできる。
【００７２】
一方、本発明を適用する生体物質が、その配列が未知なタンパク質や核酸分子、糖鎖の場合には、この生体物質、ペプチド構造を含む結合ドメイン、あるいは、双方に対して、その機能に重大な影響を及ぼさない範囲で、両者の連結に利用される反応性官能基の導入等の化学的修飾・変換を予め施した上で、両者間を化学結合によって連結した複合体を作製することができる。具体的には、両者の連結に利用される反応性官能基として、マレイミド基とスルファニル基（−ＳＨ）、スクシイミド基とアミノ基、イソシアネート基とアミノ基、ハロゲンとヒドロキシ基、ハロゲンとスルファニル基（−ＳＨ）、エポキシ基とアミノ基、エポキシ基とスルファニル基（−ＳＨ）の組み合わせになるように、生体物質、ペプチド構造を含む結合ドメイン、あるいは、双方に、予め化学的修飾・変換を施した後に、前記の官能基間で化学的な結合を形成させることで、生体物質−ペプチド構造含む結合ドメイン融合体を形成することができる。
【００７３】
さらには、本発明を適用する生体物質が脂質の場合には、酸化珪素結合性ペプチド構造に加えて、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンなどの遊離の疎水性基を有するアミノ酸を複数含む「疎水ペプチド構造」をも具えている「結合ドメイン」を作製し、脂質分子の「疎水ペプチド構造」に対する疎水結合により、脂質−ペプチド構造含む結合ドメインの複合体を作製し、融合体に代えて利用することも可能である。
【００７４】
本発明にかかる有機物固定化構造体において、基体表面に設ける酸化珪素層表面に固定化する際に利用する結合ドメイン１５は、該酸化珪素層１２に対して特異的な結合能を有する一以上のアミノ酸からなるペプチド鎖を含む分子、あるいは、該ペプチド鎖のアミノ酸配列を含むタンパク質を利用することができる。
【００７５】
本発明に利用される結合ドメイン１５は、好ましい一形態において、酸化珪素層１２に親和性を有する一以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有している。
【００７６】
結合ドメインが有する、酸化珪素層に親和性を有するアミノ配列の好ましい例は、
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val （配列番号：１）、
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val （配列番号：２）、
からなる群より選ばれた少なくとも一つの全部または一部を含むものがより好ましいが、
Val−Ser−Pro−Met−Arg−Ser−Ala−Thr−Thr−His−Thr−Val（配列番号：１）の全部または一部を含むペプチドであっても、もしくは
Ile−Pro−Met−His−Val−His−His−Lys−His−Pro−His−Val（配列番号：２）の全部または一部を含むペプチドであってもよい。
【００７７】
また、前記アミノ酸配列の全部または一部の繰り返し構造を有していてもよい。
【００７８】
また、これらアミノ酸配列複数種を含んでなる複合体であってもよい。
【００７９】
なお、前述する配列番号：１または配列番号：２に示すアミノ酸配列の一部を含むペプチドとは、該アミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がなされた改変アミノ酸配列を有するペプチドであり、改変の基礎とするアミノ酸配列と同様の酸化珪素層に対する親和性を具えるものであれば何ら問題はない。なお、アミノ酸の付加は、通常、かかるアミノ酸配列のＮ末、Ｃ末に更なるアミノ酸配列を付加する形態とすることが望ましい。また、アミノ酸の欠失は、通常、かかるアミノ酸配列のＮ末、Ｃ末から、合計１または数個のアミノ酸を除去してなる、末端短縮型のアミノ酸配列とする形態が望ましい。一方、アミノ酸の置換は、通常、置換を受けるアミノ酸に対して、所謂、相同的な置換と称されるアミノ酸置換を施す形態が望ましい。改変を受けるアミノ酸数の総和が、数個を超えない範囲で、複数種の変異を施すことも可能である。その際、改変アミノ酸配列において、元となるアミノ酸配列と一致するアミノ酸数は、少なくとも７個以上、より好ましくは８個以上であることが好ましい。
【００８０】
さらには、前記結合ドメインが有する、酸化珪素層に親和性を有する、一以上のアミノ酸からなるアミノ配列は、酸化珪素層に対する親和性に関して、ランダム・ペプチド・ライブラリーのスクリーニングによって決定されたアミノ酸配列、もしくは酸化珪素層の化学的性質により合理的に設計されたアミノ酸配列であってもよい。
【００８１】
以下に、酸化珪素層に親和性を有するアミノ酸配列を取得するための、ランダム・ペプチド・ライブラリーのスクリーニング法について記載する。
【００８２】
スクリーニングに利用可能なランダム・ペプチド・ライブラリーとしては、ランダム・ペプチドを可溶性の形で化学的に合成したランダム合成ペプチド・ライブラリーや、樹脂ビーズ上で合成した固相固定化ペプチド・ライブラリー、化学合成されたランダム配列のＤＮＡをリボソ−ム無細胞系で生合成したペプチド・ライブラリー、例えば、Ｍ１３系ファージの表面蛋白質（例えば、ｇｅｎｅIII蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージ・ディスプレイ・ペプチドライブラリー、同様の手法で細菌の層タンパク質、Ｏｍｐ  Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ら，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  １０４４４−１０４４８あるいはＰｉｓｔｏｒ  と  Ｈｏｂｏｒｎ，  １９８９，  Ｋｌｉｎ．  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．，  ６６，  １１０−１１６）、ＰＡＬ（Ｆｕｃｈｓ  ら，  １９９１，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９，  １３６９−１３７２）、Ｌａｍｂ（Ｃｈａｒｂｉｔ  ら，  １９８８，  Ｇｅｎｅ，  ７０，  １８１−１８９及び  Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ら，  １９９３，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １５６５−１５６８）、フィンブリン（Ｈｅｄｅｇ  ＡａｒｄとＫｌｅｍ  Ｍ．，  １９８９，  Ｇｅｎｅ，  ８５，  １１５−１２４及び  Ｈｏｆｎｕｎｇ，  １９９１，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、  ３４，  ７７−１０５）、およびＩｇＡプロテア−ゼβ領域（Ｋｌａｕｓｅｒ  ら，  １９９０，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ９，  １９９１−１９９９）に融合して提示したランダム・ペプチド・ライブラリーなどを挙げることができる。
【００８３】
これらのランダム・ペプチド・ライブラリーを用いて、酸化珪素層に対して親和性を有するアミノ酸配列をスクリ−ニング手法としては、化学合成ペプチド・ライブラリーを用いる場合には、ペプチド・ライブラリーと酸化珪素層２と同じ材料からなるカラム担体やプレート等担体または基板とを接触させ結合（吸着）させた後、酸化珪素層に対して親和性を有しないペプチドを洗浄工程により除き、しかる後に酸化珪素層に結合しているペプチドを回収しエドマン分解等を用いてそのアミノ酸配列を決定する。
【００８４】
一方、ファージ・ディスプレイ・ペプチドライブラリーを用いる場合には、前記担体や前記酸化珪素被覆基板表面に、上記のライブラリーを添加することによって接触させ、結合ファージを残し、非結合ファージは洗浄で洗い流す。洗浄後残ったファージを酸などにより溶出し緩衝液で中和した後、大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別（パンニング操作）を複数回繰り返すと、目的の酸化珪素層に親和性のある複数のクローンが濃縮される。ここで単一のクローンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコ−ル等で沈澱精製し、その塩基配列を解析すれば、目的とするペプチドのアミノ酸配列を知ることができる。
【００８５】
ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーを用いた酸化珪素層に対して親和性を有するペプチドのスクリ−ニングは、酸化珪素層に対してより強く結合するファージを濃縮する、いわゆるパンニング操作を含んでいるために、より信頼性のあるペプチド候補を選別できるので、本発明の目的に好適に用いることができる。ファージ・ディスプレイ・ランダム・ペプチド・ライブラリーを構築する方法としては、例えば、Ｍ１３  系ファージの表面蛋白質（例えば、ｇｅｎｅIII蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結し作製すれば良い。その方法としては、Ｓｃｏｔｔ、  Ｊ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、  Ｇ．Ｐ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２４９，  ３８６  （１９９０）やＣｗｉｒｌａ、  Ｓ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８７、  ６３７８、  （１９９０）等の報告がある。挿入する遺伝子の大きさは、ペプチドが安定に発現できれば、特に制限はないが、作製したライブラリーがすべてのランダム配列を網羅し、しかも親和性を有するためには６から４０アミノ酸に相当する長さ（分子量約６００から４０００に相当）が適当で、中でも７から１８アミノ酸が好ましい。
【００８６】
ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーのスクリ−ニングによって得られた酸化珪素層に対して親和性を有するアミノ酸配列を直列繋ぎ繰り返し構造を構成してもよい。また、二種類以上得られた場合には、これらのアミノ酸配列からなる群より選ばれた少なくとも一つのアミノ酸配列の、全部または一部分のアミノ酸配列を適当な組合せで直列に繋いだ配列を、酸化珪素層に対して親和性を有するアミノ酸配列として用いても良い。この際、二種類のアミノ酸配列の間には適当なスペーサー配列を設けることが望ましい。スペーサー配列としては、約３〜約４００アミノ酸の範囲で、連結する酸化珪素層に対して親和性を有するアミノ酸配列が有する、酸化珪素層に対する親和性に悪影響を及ぼさないものとすることが可能である。なお、二種類のアミノ酸配列を含む結合ドメインと機能ドメインとからなる融合タンパク質の発現性、および安定性を考慮する場合、スペーサー配列は、３〜１５アミノ酸の範囲に選択することがより好ましい。また、連結する酸化珪素層に対して親和性を有するアミノ酸配列が有する、酸化珪素層に対する親和性に悪影響を及ぼさない範囲であれば、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、前記機能ドメインの機能を妨害せず、また、生体物質が酸化珪素層に結合するのを妨害しないものである。
【００８７】
本発明で利用される、酸化珪素層に対する親和性を有するアミノ酸配列は、ランダム・ペプチド・ライブラリーのスクリ−ニングによって決定されたアミノ酸配列の他、酸化珪素層の化学的性質により合理的に設計し、アミノ酸配列とすることもできる。それらでライブラリーを構成し、上記のようなスクリーニング方法により、更に親和性の高いアミノ酸配列を選択することもできる。
【００８８】
このような一以上のアミノ酸からなる、酸化珪素層に対する親和性を有するアミノ酸配列を含む結合ドメインと、機能ドメインとする、所望の特性を有するタンパク質とを連結してなる融合タンパク質は、前記機能ドメインをコードする遺伝子の上流もしくは下流に、本発明にかかる酸化珪素を含む層に親和性を有する少なくとも一以上のアミノ酸からなるペプチドをコードする遺伝子を、読み枠を一致させて挿入した発現ベクターを構築することにより、安定に前記融合タンパク質を作製することができる。該発現ベクターに使用するプロモーター配列や、形質転換確認用の抗生物質耐性遺伝子配列等は、従来既知のものから選択して使用することができる。
【００８９】
酸化珪素層に対する融合タンパク質の固定化は、前記機能ドメイン１４に融合され、翻訳される前記結合ドメイン１５中の前記スクリーニング操作により得られた酸化珪素層に対する親和性を有するアミノ酸配列（以下、酸化珪素層親和性部位１５ａ）を介して成される。
【００９０】
表面が親水性である酸化珪素層２では、前記機能ドメイン１４に融合され、翻訳される前記酸化珪素層親和性部位１５ａとして、親水性基、特には、カチオン性を有する残基やヒドロキシ基を有するアミノ酸を多く含んだ配列を選ぶことによって、前記結合ドメイン１５を介する酸化珪素層２への固定化をより強固なものとすることができる。
【００９１】
上記方法により取得さられた前記酸化珪素層親和性部位１５ａは、通常の遺伝子工学的手法を用いて、前記機能ドメイン１４とされるタンパク質に融合して利用される。前記酸化珪素層親和性部位は、前記機能ドメイン１４とされるタンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に連結して発現することができる。また、適当なリンカー配列を挿入して、結合ドメインとして、発現することもできる。
【００９２】
リンカー配列としては、約３〜約４００アミノ酸の範囲で、結合ドメインと機能ドメインともに所望の機能が発揮するように選択できる。さらに、結合ドメインと機能ドメインを連結した融合タンパク質の発現性、ならびに安定性を考慮する場合、前記のアミノ酸からなるリンカー配列の利用が好ましく、また、リンカー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、リンカー配列の配列長は、３〜１５アミノ酸の範囲に選択する。すなわち、リンカー配列は、前記機能ドメイン１４とするタンパク質の機能発揮を妨害せず、また、前記結合ドメイン１５が酸化珪素層１２に結合するのを妨害しないものである。加えて、場合によっては、リンカー配列の配列長を調節することにより、結合ドメインを介して基板上に結合される、機能ドメインとされるタンパク質の基板上での配向性を調整することも可能である。
【００９３】
本発明にかかる有機物固定化構造体では、前記ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーのスクリ−ニングなどの操作によって、酸化珪素層に対して親和性を有するアミノ酸配列が、二種類以上決定された場合には、これらのアミノ酸配列をそれぞれ個別に含む結合ドメインを、前記機能ドメインとするタンパク質に融合した、複数種類の融合体タンパク質を、混合物として、同一の基体表面に固定化した形態とすることもできる。
【００９４】
前記機能ドメイン１４とするタンパク質と前記酸化珪素層親和性部位１５ａを含む結合ドメインとを連結してなる融合タンパク質の分離・精製方法は、前記機能ドメインとするタンパク質の活性が、保持される方法であれば、いかなる方法をも用いることができる。
【００９５】
酸化珪素層１２に、有機物を、酸化珪素層親和性部位１５ａを含む結合ドメインを介して固定化する工程は、有機物と結合ドメインとで構成される融合体を、水性媒体中で酸化珪素層１２と接触させることにより達成される。
【００９６】
本発明において、結合ドメインを介して固定化を行う工程に用いる水性媒体の組成は、固定化される有機物、例えば、生体物質が行う目的化合物の結合または変換反応を妨げないものであればよいが、後の工程の省略化を図るために、生体物質が示す結合または変換反応活性を発揮させ得る組成としておくこともできる。ここで、活性を発揮させ得る組成として、例えば、緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、生化学的反応に用いられる一般的な緩衝液、例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー、トリス塩酸バッファー、グリシンバッファー、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファーなどが好適に用いられる。例えば、生体物質が後述するＰＨＡ合成酵素タンパク質である際、その酵素活性を発揮させ得る緩衝液の濃度は、一般的な濃度、即ち５ｍＭから１０Ｍの範囲で使用することができるが、望ましくは１０〜２００ｍＭで行うことが好ましい。また、ｐＨは５．５〜９．０、好ましくは７．０〜８．５となるように調製する。
【００９７】
有機物と結合ドメインとで構成される融合体を、結合ドメイン１５を介して、基板表面の酸化珪素層１２への固定化は、酸化珪素層１２を設ける基板が浸漬される液を、有機物と結合ドメインとで構成される融合体が所定の濃度となるように上記水性媒体中に溶解する溶液とすることによって達成される。このとき、有機物と結合ドメインとで構成される融合体に含まれる、酸化珪素層親和性部位１５ａを含む結合ドメイン部分が、酸化珪素層の表面に均等に結合されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【００９８】
上記固定化処理において、利用される水性媒体の組成としては、水性媒体のｐＨや塩濃度によって、酸化珪素層および結合ドメインに含まれる酸化珪素層親和性部位１５ａの表面電荷の電荷量、疎水性が変化するので、それを考慮した組成とするのが望ましい。例えば、塩濃度を上げることによって両者の疎水性を増やすことができる。
【００９９】
また、基板表面に設ける酸化珪素層１２に対する、溶媒のぬれ角等を予め測定し、酸化珪素層１２の親水性、疎水性を調べることで、結合ドメインの結合に適した溶液組成を設定することもできる。さらに、酸化珪素層２表面に対する、酸化珪素層親和性部位１５ａの結合量を直接測定して、溶液組成を求めることもできる。結合量の測定は、例えば、ある一定面積の酸化珪素層に、濃度既知の有機物と結合ドメインとで構成される融合体溶液を添加し、固定化処理を行った後、溶液中に残余している有機物と結合ドメインとで構成される融合体の濃度を測定し、差し引き法により結合量を求める等の方法を用いればよい。
【０１００】
上記方法により作製された、有機物固定化構造体、例えば、生体物質固定化基板は、そのままでも用いることができる。さらに、凍結乾燥等を施した上で使用してもよい。生体物質の固定化処理を行う時間は、１分間から４８時間が望ましく、より望ましくは、１０分間から３時間である。過剰な静置あるいは放置は、固定化された生体物質の所望の機能活性低下を招くことも少なくなく、一般に好ましくない。
【０１０１】
本発明にかかる検出方法では、本発明にかかる有機物固定化構造体において、該有機物として、標的物質に対する結合能を有するものを選択した上で、検体中に含有されている標的物質を該有機物と結合させることで、構造体上に間接的に固定する手法を利用している。その際、本発明にかかる有機物固定化構造体では、種々な有機物について、その標的物質に対する結合能を保持した状態で簡便に固定化が可能である。従って、種々な有機物から、検出対象の標的物質に対する結合能を有するものを適宜選択することで、多様な標的物質の検出に適用可能である。
【０１０２】
なお、本発明にかかる検出方法が対象とする標的物質は、非生体物質と生体物質に大別される。
【０１０３】
本発明にかかる検出方法が適用可能な非生体物質であり、また、かかる非生体物質に対する検出方法は、産業上利用価値の大きいものなるものとしては、例えば、各種動物や植物に対して、好ましくない作用を及ぼす種々の環境汚染物質が挙げられる。具体的には、環境汚染物質としての塩素置換数／位置の異なるＰＣＢ類、同じく塩素置換数／位置の異なるダイオキシン類、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質（例：ヘキサクロロベンゼン、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、アミトロール、アトラジン、アラクロール、ヘキサクロロシクロヘキサン、エチルパラチオン、クロルデン、オキシクロルデン、ノナクロル、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン、ＤＤＴ、ケルセン、アルドリン、エンドリン、ディルドリン、エンドスルファン（ベンゾエピン）、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキサイド、マラチオン、メソミル、メトキシクロル、マイレックス、ニトロフェン、トキサフェン、トリフルラリン、アルキルフェノール（炭素数５〜９）、ノニルフェノール、オクチノニルフェノール、４−オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジ−ｎ−ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジエチル、ベンゾ（ａ）ピレン、２，４−ジクロロフェノール、アジピン酸ジ−２−エチルヘキシル、ベンゾフェノン、４−ニトロトルエン、オクタクロロスチレン、アルディカーブ、ベノミル、キーポン（クロルデコン）、マンゼブ（マンコゼブ）、マンネブ、メチラム、メトリブジン、シペルメトリン、エスフェンバレレート、フェンバレレート、ペルメトリン、ビンクロゾリン、ジネブ、ジラム、フタル酸ジペンチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジプロピル）等が挙げられる。
【０１０４】
なお、これら生体内で好ましくない作用を発揮する汚染物質は、生体内細胞が産生する受容体タンパク質など、当該汚染物質に対する結合能を示すタンパク質、あるいは、複合体形成能を有する核酸分子を介して、様々な臓器、組織、細胞へ取り込まれる。従って、これら汚染物質の検出には、当該汚染物質に対する結合能を示すタンパク質、あるいは、複合体形成能を有する核酸分子を、本発明にかかる有機物固定化構造体における、有機物として利用することが好適である。
【０１０５】
検出対象の生体物質としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される生体物質が含まれ、更に詳しくは、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質から選択される生体分子を含んでなるものである。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質の何れかから選択された物質を含むものであれば、如何なる生体物質の検出に、本発明にかかる検出方法を適用することができる。更には、前記の「生体物質」を産生する細菌や細胞そのものも、細菌や細胞に由来する「生体物質」の検出に本発明にかかる検出方法を適用することで、広義の「標的物質」とすることが可能である。
【０１０６】
本発明にかかる検出方法が好適に適用可能な、具体的なタンパク質として、所謂、疾病マーカーが挙げられる。かかる疾病マーカー・タンパク質の一例として、
胎児期に肝細胞で産生され胎児血中に存在する酸性糖蛋白であり、肝細胞癌（原発性肝癌）、肝芽腫、転移性肝癌、ヨークサック腫瘍のマーカーとなるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、
肝実質障害時に出現する異常プロトロンビンであり、肝細胞癌で特異的に出現することが確認されるＰＩＶＫＡ−ＩＩ、
免疫組織化学的に乳癌特異抗原である糖蛋白で、原発性進行乳癌、再発・転移乳癌のマーカーとなるＢＣＡ２２５、
ヒト胎児の血清、腸および脳組織抽出液に発見された塩基性胎児蛋白であり、卵巣癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、膵癌、胆道癌、肝細胞癌、腎臓癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌のマーカーである塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、
進行乳癌、再発乳癌、原発性乳癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１５−３、
膵癌、胆道癌、胃癌、肝癌、大腸癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１９−９、
卵巣癌、乳癌、結腸・直腸癌、胃癌、膵癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ７２−４、
卵巣癌（特に漿液性嚢胞腺癌）、子宮体部腺癌、卵管癌、子宮頸部腺癌、膵癌、肺癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１２５、
上皮性卵巣癌、卵管癌、肺癌、肝細胞癌、膵癌マーカーとなる糖蛋白であるＣＡ１３０、
卵巣癌（特に漿液性嚢胞腺癌）、子宮体部腺癌、子宮頸部腺癌のマーカーとなるコア蛋白抗原であるＣＡ６０２、
卵巣癌（特に粘液性嚢胞腺癌）、子宮頸部腺癌、子宮体部腺癌のマーカーとなる母核糖鎖関連抗原であるＣＡ５４／６１（ＣＡ５４６）、
大腸癌、胃癌、直腸癌、胆道癌、膵癌、肺癌、乳癌、子宮癌、尿路系癌等の腫瘍関連のマーカー抗原として現在、癌診断の補助に最も広く利用されている癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、
膵癌、胆道癌、肝細胞癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＤＵＰＡＮ−２、
膵臓に存在し、結合組織の弾性線維エラスチン（動脈壁や腱などを構成する）を特異的に加水分解する膵外分泌蛋白分解酵素であり、膵癌、膵嚢癌、胆道癌のマーカーとなるエラスターゼ１、
ヒト癌患者の腹水や血清中に高濃度に存在する糖蛋白であり、肺癌、白血病、食道癌、膵癌、卵巣癌、腎癌、胆管癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫のマーカーとなる免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）、
膵癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、肝細胞癌、肺腺癌、胃癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＮＣＣ−ＳＴ−４３９、
前立腺癌のマーカーとなる糖蛋白質であるγ−セミノプロテイン（γ−Ｓｍ）、
ヒト前立腺組織から抽出された糖蛋白であり、前立腺組織のみに存在し、それゆえ前立腺癌のマーカーとなる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、
前立腺から分泌される酸性ｐＨ下でリン酸エステルを水解する酵素であり、前立腺癌の腫瘍マーカーとして用いられる前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、
神経組織及び神経内分泌細胞に特異的に存在する解糖系酵素であり、肺癌（特に肺小細胞癌）、神経芽細胞腫、神経系腫瘍、膵小島癌、食道小細胞癌、胃癌、腎臓癌、乳癌のマーカーとなる神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、
子宮頸部扁平上皮癌の肝転移巣から抽出・精製された蛋白質であり、子宮癌（頸部扁平上皮癌）、肺癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌のマーカーとなる扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ抗原）、
肺腺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるシアリルＬｅX−ｉ抗原（ＳＬＸ）、
膵癌、胆道癌、肝癌、胃癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＳＰａｎ−１、
食道癌、胃癌、直腸・結腸癌、乳癌、肝細胞癌、胆道癌、膵癌、肺癌、子宮癌のマーカーであり、特に他の腫瘍マーカーと組み合わせて進行癌を推測し、再発予知・治療経過観察として有用である単鎖ポリペプチドである組織ポリペプタイド抗原（ＴＰＡ）、
卵巣癌、転移性卵巣癌、胃癌、大腸癌、胆道系癌、膵癌、肺癌のマーカーとなる母核糖鎖抗原であるシアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）、
肺の非小細胞癌、特に肺の扁平上皮癌の検出に有効な腫瘍マーカーであるシフラ（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ；ＣＹＦＲＡ）、
胃液中に分泌される蛋白消化酵素であるペプシンの２種（ＰＧ  Ｉ・ＰＧ  II）の不活性型前駆体であり、胃潰瘍（特に低位胃潰瘍）、十二指腸潰瘍（特に再発、難治例）、ブルンネル腺腫、ゾーリンガーエリソン症候群、急性胃炎のマーカーとなるペプシノゲン（ＰＧ）、
組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白であり、急性心筋梗塞等により心筋に壊死が起こると、高値を示すＣ−反応性蛋白（ＣＲＰ）、
組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白である血清アミロイドＡ蛋白（ＳＡＡ）、
主に心筋や骨格筋に存在する分子量約１７５００のヘム蛋白であり、急性心筋梗塞、筋ジストロフィー、多発性筋炎、皮膚筋炎のマーカーとなるミオグロビン、骨格筋，心筋の可溶性分画を中心に存在し、細胞の損傷によって血液中に遊出する酵素であって、急性心筋梗塞、甲状腺機能低下症、進行性筋ジストロフィー症、多発性筋炎のマーカーとなるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）（骨格筋由来のＣＫ−ＭＭ型，脳、平滑筋由来のＣＫ−ＢＢ型，心筋由来のＣＫ−ＭＢ型の、三種のアイソザイム、ならびに、ミトコンドリア・アイソザイムや免疫グロブリンとの結合型ＣＫ（マクロＣＫ））、
横紋筋の薄いフィラメント上でトロポニンＩ，Ｃとともにトロポニン複合体を形成し，筋収縮の調節に関与している分子量３９，０００の蛋白であり、横紋筋融解症、心筋炎、心筋梗塞、腎不全のマーカーとなるトロポニンＴ、
骨格筋・心筋いずれの細胞にも含まれる蛋白であり、測定結果の上昇は骨格筋、心筋の障害や壊死を意味するため、急性心筋梗塞症、筋ジストロフィー、腎不全のマーカーとなる心室筋ミオシン軽鎖Ｉ、
また、近年、ストレス・マーカーとして注目されてきているクロモグラニンＡ、チオレドキシン、８−ＯｈｄＧ、等が挙げられる。
【０１０７】
上述する核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される生体物質の多くは、当該生物が産生する内因性物質であるが、異種の生物においては、免疫原性物質として機能する。従って、当該生物が産生する内因性物質を、異種生物に対して、免疫原性物質として免疫感作することで、特異的な反応性を示す抗体を創製することが可能である。例えば、タンパク質、あるいは、タンパク質成分を含む複合体を免疫原とすると、一般に、立体構造を有するタンパク質分子上には、複数のエピトープ部位が存在し、対応して、各エピトープ部位と選択的に反応する抗体複数種、抗体複数種を含む坑血清、あるいはポリクローナル抗体を創製することが可能である。従って、標識物質である生体物質を免疫原として、特異的な抗体複数種を創製することが可能である際には、特異的な抗体の一つを、本発明にかかる有機物固定化構造体における、有機物として利用することが好適である。
【０１０８】
一方、立体構造を有していない核酸分子は、免疫原性物質として機能を示さない場合があるが、特定の塩基配列を有する核酸分子に関しては、その塩基配列の相補性を利用して、プローブ・ハイブリダイゼーション法を適用して、ＤＮＡプローブと選択的に結合させることができる。すなわち、標識物質である核酸分子に対して、良好なハイブリダイゼーションが可能なＤＮＡプローブを、本発明にかかる有機物固定化構造体における有機物として、好適に利用することができる。
【０１０９】
また、糖鎖、脂質も多くの場合、免疫原として機能し、特異的な反応性を示す抗体を創製することが可能である。従って、標識物質である糖鎖、脂質を免疫原として、特異的な抗体複数種を創製することが可能である際には、特異的な抗体の一つを、本発明にかかる有機物固定化構造体における、有機物として好適に利用することができる。加えて、糖鎖、脂質に対して、当該生物自体がそらに対する受容体タンパク質を有していることもある。そのような内因性の受容体タンパク質が存在している、標識物質である糖鎖、脂質については、その内因性の受容体タンパク質を、本発明にかかる有機物固定化構造体における、有機物として好適に利用することができる。特に、糖鎖自体が、糖鎖間の相互作用が可能な構成を有する場合、この糖鎖間の相互作用を利用するプローブとして、本発明に利用することも可能である。
【０１１０】
なお、本発明にかかる検出方法では、本発明にかかる有機物固定化構造体において、該有機物が示す、標的物質に対する結合能を利用して、標的物質を選択的に結合、固定化した上で、構造体上に固定、濃縮される標的物質の有無、あるいはその量を検出する。具体的には、検体中に低濃度で含有されている標的物質は、本発明にかかる有機物固定化構造体の表面に存在する、有機物によって選択的に結合、固定化され、その後、有機物固定化構造体を分離、回収することで、結果的に、濃縮がなされる。
【０１１１】
この構造体上に固定、濃縮される標的物質を検出する手法は、従来既知の方法から適宜選択して用いることが可能である。例えば、標的物質を特異的に認識・結合する物質、例えば、抗体（所謂、二次抗体）などを利用し、この二次抗体を予め標識化しておき、構造体上に固定、濃縮される標的物質と反応した二次抗体の標識により、検出または定量が可能である。なお、前記標的物質を特異的に認識・結合する物質、特には、二次抗体は、対象とする標的物質と選択的に結合するものであって、本発明の有機物固定化構造体において、該有機物によって標的物質が結合された状態でも、対象とする標的物質と反応可能なものが利用される。すなわち、該有機物によって標的物質が結合される際に利用される、標的物質上の結合部位と、かかる抗体に対するエピトープ部位とが相違しているモノクロナル抗体、もしくは、そのような抗体を含む抗体群（ポリクローナル抗体）が利用可能である。場合によっては、該有機物によって標的物質が結合された状態では、標的物質自体には存在していないエピトープの発現が起こる場合もある。この有機物と標的物質との複合体に特有のエピトープ部位に特異的な反応性を有する抗体は、より選択性の高い二次抗体として好適に利用できる。
【０１１２】
例えば、二次抗体など、標的物質を特異的に認識・結合する物質に対する標識化に利用される標識化合物としては、例えば、金等の金属またはラテックス等の有機材料から微粒子、特定波長域の励起光により蛍光を発する蛍光物質やその蛍光物質を反応生成物とする酵素、例えばＨＲＰ等を挙げることができる。二次抗体等のタンパク質を標識する方法としては、物理吸着による方法、あるいは、反応活性のある官能基を標識物質／或いは被標識物質に導入し、それを架橋点として化学結合を形成する化学結合法が挙げられる。
【０１１３】
前記標的物質を特異的に認識・結合する物質に付されている標識を検出する方法としては、従来既知の検出方法を用いることができる。例えば、二次抗体に付す標識物質として、従来既知の標識物質、例えば、蛍光物質、発光物質、金属及び金属酸化物微粒子等を用いると、これら標識物質に対応する定量性の高い検出手段は従来から多く報告されている。
【０１１４】
標識化に利用可能な、蛍光物質としては、従来既知の蛍光色素である、４−メチルウンベリフェロン，７−ヒドロキシ−４−ビフェニル−ウンベリフェロン，３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸２−フェニルアニリド，３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸２，４−ジメチルアニリド，６−ブロモ−２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸２−メチルアニリド，３−ヒドロキシ−２−アントラノイック酸２−メチルアニリド，ピレン，フルオレセイン，ペリレン，ローダミン，テキサスレッド等が挙げられる。
【０１１５】
標識化に利用可能な、発光物質として、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが広く用いられている。
【０１１６】
標識化に利用可能な、金属としては、金や銀、銅、白金、亜鉛、アルミニウム、リチウム、カリウムなどのアルカリ金属元素、ベリリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属元素、鉄、コバルト、ニッケルなどの磁性を帯びる金属など、任意の金属元素を含む金属元素含有微粒子が従来から利用されている。これら微粒子状の標識の検出には、例えば、プラズモン共鳴法が高い感度の点から好適に利用される。従って、プラズモン共鳴が起こりやすい金や銀、銅、アルミニウム、亜鉛、カリウムなどが、好適な例として挙げられるが、これらの金属元素に限定されるものではない。
【０１１７】
また、標識化に利用可能な、半導体微粒子としては、ＺｎＳ，ＺｎＳｅ，ＺｎＴｅ，ＣｄＳ，ＣｄＳｅ，ＣｄＴｅ，ＩｎＧａＡｓ，ＩｎＰの半導体ナノ微粒子が挙げられる。また、一種類の半導体種から形成される微粒子のみでなく、より幅の広いバンドギャップを持つ半導体材料により被覆した半導体微粒子も含まれる。これら半導体微粒子の粒子径は、好ましくは、１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲、より好ましくは、２ｎｍ〜２０ｎｍの範囲に選択することが望ましい。
【０１１８】
標識化に利用可能な、強磁性材料微粒子としては、例えば、Ｆｅ3Ｏ4、γ−Ｆｅ2Ｏ3、Ｃｏ−γ−Ｆｅ2Ｏ3、（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ2Ｏ3、（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ2Ｏ3、（Ｍｎ・Ｚｎ）Ｏ・Ｆｅ2Ｏ3、（ＮｉＺｎ）Ｏ・Ｆｅ2Ｏ3、ＳｒＯ・６Ｆｅ2Ｏ3、ＢａＯ・６Ｆｅ2Ｏ3、ＳｉＯ2で被覆したＦｅ3Ｏ4、（粒子径  約２０ｎｍ）［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２，  ｐ．２〜１０（１９８０）参照］、更には、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミドタンパク質等）とフェライトとの複合微粒子等を挙げることができる。
【０１１９】
また、本発明にかかる検出装置は、検体中の標的物質を検出する用途に適合する検出装置であり、その検出方式には、専ら、上述の本発明にかかる検出方法を適用するものである。従って、上述の本発明にかかる検出方法において、好適とされる態様は、本発明にかかる検出装置においても、好適な態様となる。
【実施例】
【０１２０】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。なお、これら実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はかかる実施例に示す形態に限定されるものではない。
【０１２１】
下記する実施例では、本発明にかかる有機体固定化構造体、特には、生体物質固定化基体の構成について、機能ドメインに相当する生体物質として、ポリヒドロキシアルカネ−ト（ＰＨＡ）合成酵素タンパク質、また、結合ドメインとして、酸化珪素層親和性ペプチドを採用し、ＰＨＡ合成酵素タンパク質のＮ末に、前記酸化珪素層親和性ペプチドを、リンカー配列を介して連結してなる、融合体型ＰＨＡ合成酵素タンパク質を、表面に酸化珪素層を被覆した基板上に固定化してなる生体物質固定基板を例に採り、かかる生体物質固定基板の構成と、その製造方法に関して、具体的に説明する。
【０１２２】
また、前記結合ドメインとして利用される、酸化珪素層親和性ペプチドのアミノ酸配列の取得方法に関しても、具体的に説明する。
【０１２３】
これら実施例に先立ち、参照例１において、前記生体物質固定基板において利用される、酸化珪素層、具体的には、メソポーラス・シリカ（ＳＢＡ−１５）層の形成方法を、加えて、参照例２において、融合体型ＰＨＡ合成酵素タンパク質を構成する、機能ドメインに相当する生体物質である、ＰＨＡ合成酵素タンパク質の遺伝子組換え生産方法、ならびに、該組換え型ＰＨＡ合成酵素タンパク質の酵素活性、その測定方法について、予め説明を加える。
【０１２４】
さらには、実施例においては、融合体型ＰＨＡ合成酵素タンパク質を、表面に酸化珪素層を被覆した基板上に固定化してなる生体物質固定基板において、固定化されている融合体型ＰＨＡ合成酵素タンパク質が保持する酵素活性は、前記組換え型ＰＨＡ合成酵素タンパク質の酵素活性を基準とした評価によって、検証がなされている。
【０１２５】
（参照例１）
メソポーラス・シリカ（ＳＢＡ−１５）の作製
ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）−ポリ（エチレンオキサイド）；＜エチレンオキサイド２０単位、プロピレンオキサイド７０単位、エチレンオキサイド２０単位からなるブロック共重合体、以下、ＥＯ20−ＰＯ70−ＥＯ20＞４ｇ、０．０４１ｍｏｌ  テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）／０．２４ｍｏｌ  ＨＣｌ、６．６７ｍｏｌ  Ｈ2Ｏからなるシリカ反応液を調製した。
【０１２６】
このシリカ反応液を、３５℃にて２０時間反応させ、更に８０℃にて４８時間反応させた。続いて、５００℃にて６時間加熱して、含まれるブロック共重合体樹脂ＥＯ20−ＰＯ70−ＥＯ20を燃焼させることにより、多孔性シリカを得た。
【０１２７】
得られた多孔性シリカにおいて、平均孔径は、７．９ｎｍで、孔間のシリカ壁面の平均的な厚さは、３ｎｍであった。
【０１２８】
（参照例２）
ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製、及びＰＨＡ合成酵素の生産
ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体を以下の方法で作製した。
【０１２９】
先ず、ＰＨＡ合成酵素生産能を有するＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  ＹＮ２，  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７５）を１００  ｍｌのＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で３０℃、一晩培養後、マーマーらの方法により、該ＹＮ２株の染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで完全分解した。クローニング・ベクターには、ｐＵＣ１８を使用し、制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  １，  ５７２  （１９８９）；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）の後、ＤＮＡライゲーション・キット  Ｖｅｒ．II（宝酒造）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）に、染色体ＤＮＡのＨｉｎｄIII完全分解断片を連結・挿入した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド・ベクターを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１３０】
次に、ＹＮ２株由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプロ−ブ調製を行った。配列番号：１１ならびに配列番号：１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）、このオリゴヌクレオチド二種をプライマー対に用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ断片を単離し、コロニー・ハイブリダイゼーション用のプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販のアルカリフォスパターゼ標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を利用して行った。得られた酵素標識化プロ−ブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニー・ハイブリダイゼーション法によって、目的とするＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＹＮ２株由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１３１】
（配列番号：１１）フォワード・プライマーの塩基配列
5'−TGCTGGAACT GATCCAGTAC−3'
（配列番号：１２）リバース・プライマーの塩基配列
5'−GGGTTGAGGA TGCTCTGGAT GTG−3'
ここで取得したＰＨＡ合成酵素遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グル−プであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない、広宿主域複製領域を含むベクター  ｐＢＢＲ１２２（Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドを、シュードモナス・チコリアイ  ＹＮ２ｍｌ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、形質転換したＹＮ２ｍｌ株では、ＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、少なくとも、シュードモナス・チコリアイ  ＹＮ２ｍｌ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０１３２】
このＹＮ２株由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコ−ドする、配列番号：７ならびに配列番号：８で示される二種の塩基配列が存在することが確認された。下で述べるように、この二種の塩基配列でコードされる、二種のペプチド鎖からなるタンパク質は、ともに、ＰＨＡ合成酵素活性を有しており、配列番号：７と配列番号：８で示される塩基配列は、それぞれＰＨＡ合成酵素遺伝子であることを確認することができた。すなわち、配列番号：９に示すアミノ酸配列が、配列番号：７の塩基配列によりコードされており、配列番号：１０に示すアミノ酸配列は、配列番号：８の塩基配列によってコードされており、この二種のアミノ酸配列を有するタンパク質の何れか一方のみでも、ＰＨＡ合成能が発揮されることを確認した。
【０１３３】
配列番号：７で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に関して、染色体ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行って、完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子を再調製した。
【０１３４】
配列番号：８で示される塩基配列に対して、上流側プライマーとなる、その開始コドンよりも上流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：１５）、ならびに下流側プライマーとなる、終止コドンよりも下流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）をそれぞれ設計・合成した（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）。この二種のオリゴヌクレオチドをプライマー対として、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行って、完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１３５】
（配列番号：１５）  上流側プライマーの塩基配列
5'−GGACCAAGCT TCTCGTCTCA GGGCAATGG−3'
（配列番号：１３）  下流側プライマーの塩基配列
5'−CGAGCAAGCT TGCTCCTACA GGTGAAGGC−3'
同様に、配列番号：８で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子についても、染色体ＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行い、完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子を再調製した。配列番号：８で示される塩基配列に対して、上流側プライマーとなる、その開始コドンよりも上流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）および下流側プライマーとなる、終止コドンよりも下流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：１６）をそれぞれ設計・合成した（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１３６】
（配列番号：１４）  上流側プライマーの塩基配列
5'−GTATTAAGCT TGAAGACGAA GGAGTGTTG−3'
（配列番号：１６）  下流側プライマーの塩基配列
5'−CATCCAAGCT TCTTATGATC GGGTCATGCC−3'
次に、上述する二種の得られた完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＰＣＲ増幅断片を、それぞれ、制限酵素ＨｉｎｄIIIを用いて完全分解した。また、発現ベクター  ｐＴｒｃ９９Ａも制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、  １巻、  ５７２頁、  １９８９年；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）した。この発現ベクター  ｐＴｒｃ９９ＡのＨｉｎｄIII切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いた、完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を、それぞれ、ＤＮＡライゲ−ション・キット  Ｖｅｒ．II（宝酒造）を用いて連結して、二種の組換えプラスミドを作製した。
【０１３７】
得られた組換えプラスミドにより、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号：７の塩基配列を含む完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドを、ｐＹＮ２−Ｃ１（配列番号：１１由来）、配列番号：８の塩基配列を含む完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドを、ｐＹＮ２−Ｃ２（配列番号：１２由来）とした。
【０１３８】
組換えプラスミドｐＹＮ２−Ｃ１、ｐＹＮ２−Ｃ２をそれぞれ用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１ｆＢ  ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、各組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株を得た。
【０１３９】
ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株を、それぞれを酵母エキス０．５％、オクタン酸０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌに植菌して、３７℃、１２５ストロ−ク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、常法によりプラスミドＤＮＡを回収した。
【０１４０】
ｐＹＮ２−Ｃ１に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１７）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１８）をそれぞれ設計・合成した（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）。この二種のオリゴヌクレオチドをプライマー対に用いて、ｐＹＮ２−Ｃ１をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、上流にＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ制限部位、下流にＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有する、完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを増幅産物として得た（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１４１】
上流側プライマー（配列番号：１７）：
5'−AGTGGATCCT CCGAGCTCAG TAACAAGAGT AACGATGAGT TGAAG−3'
下流側プライマー（配列番号：１８）：
5'−ATACTCGAGA CTACTAGTCC GTTCGTGCAC GTACGTGCCT GGCGC−3'
同様に、ｐＹＮ２−Ｃ２に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１９）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：２０）をそれぞれ設計・合成した（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）。この二種のオリゴヌクレオチドをプライマー対に用いて、ｐＹＮ２−Ｃ２をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有する、完全長のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを増幅産物として得た（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１４２】
上流側プライマー（配列番号：１９）：
5'−ATACTCGAGA CTACTAGTGC GCACGCGCAC GTAAGTCCCG GGCGC−3'
下流側プライマー（配列番号：２０）：
5'−AGTGGATCCT CCGAGCTCCG CGATAAACCT GCGAGGGAGT CACTA−3'
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）の対応する部位に挿入した。これらの二種のベクター（ｐＧＥＸ−Ｃ１およびｐＧＥＸ−Ｃ２）を用いて、大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。各菌株における発現ベクター導入の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片の分子量確認によって行った。得られた発現用菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍｌで一晩プレ・カルチャ−した後、その培養物０．１ｍｌを、１０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後、ＩＰＴＧ（終濃度  １ｍＭ）を添加し、３７℃で４〜１２時間培養を続けた。
【０１４３】
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を遠心（８０００×ｇ、  ２分、４℃）して、集菌し、１／１０量の４℃  ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（８０００×ｇ、  １０分、４℃）して、固形夾雑物を取り除いた。発現された目的タンパク質（ＧＳＴ融合タンパク質）が上清に存在することを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導・発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロ−ス４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  ＳｅＰＨＡｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｂｅａｄｓ：アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０１４４】
使用したグルタチオン・セファロ−スは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオン・セファロ−スを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後、同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオン・セファロ−ス  ４０μＬを、無細胞抽出液１ｍｌに添加し、４℃で静かに攪拌した。この攪拌処理により、ＧＳＴ融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１およびＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ２を、融合パートナーＧＳＴの結合能を利用して、グルタチオン・セファロ−ス上に吸着させた。
【０１４５】
吸着後、遠心（８０００×ｇ、  １分、４℃）して、グルタチオン・セファロ−スを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０  ｍＭ  グルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着したＧＳＴ融合タンパク質を溶出した。遠心（８０００×ｇ、２分、４℃）して、ＧＳＴ融合タンパク質を含む上清を回収した。その後、ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０１４６】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇを、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテア−ゼ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化して、Ｎ末の融合パートナーＧＳＴ部とＣ末側のＰＨＡ合成酵素タンパク質とを分離した後、グルタチオン・セファロ−ス・カラムに通して、プロテアーゼとＧＳＴを除去した。グルタチオン・セファロ−ス・カラムのフロー・スルー分画を、さらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１およびＹＮ２−Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、最終精製済みの発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１およびＹＮ２−Ｃ２は、それぞれ６０．８ｋＤａ、および６１．５ｋＤａのシングルバンドを示すことを確認した。
各精製酵素タンパク質の活性は以下の方法で測定した。
【０１４７】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、基質の３−ヒドロキシアシルＣｏＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣｏＡの量を、５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）で発色させて測定する、評価方法に基づき、以下の手順で測定した。
【０１４８】
試薬１：ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を、０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０  ｍｇ／ｍｌ溶解、
試薬２：３’−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを、０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０  ｍＭ溶解、
試薬３：トリクロロ酢酸を、０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に１０  ｍｇ／ｍｌ溶解、
試薬４：５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を、０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に２．０  ｍＭ溶解。
【０１４９】
第１反応（ＰＨＡ合成反応）：試料（酵素）溶液１００μｌに、試薬１を１００μｌ添加・混合し、３０℃で１分間プレインキュベートする。次いで、この液に、試薬２を１００μｌ添加・混合し、３０℃で１〜３０分間インキュベートした後、試薬３を添加して、酵素反応を停止させる。
【０１５０】
第２反応（遊離ＣｏＡの発色反応）：反応停止した第１反応液を、遠心分離（１５，０００×ｇ、１０分間）し、上清を採取する。この上清５００μｌに、試薬４を５００μｌ添加し、３０℃で１０分間インキュベ−トした後、４１２  ｎｍの吸光度を測定して、含有されていたＣｏＡの濃度を決定する。
【０１５１】
酵素活性の算出：１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【０１５２】
また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。表１に、各精製酵素の活性測定の結果を示す。
【０１５３】
【表１】
2005095154.tif 000003
【０１５４】
測定された活性に基づき、前記酵素溶液を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくん  ＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０  Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０１５５】
以下に示す、実施例では、比活性の高いＰＨＡ合成酵素タンパク質ＹＮ−Ｃ１を用いる。
【０１５６】
（実施例１）
メソポーラス・シリカ（ＳＢＡ−１５）に対する親和性を有するアミノ酸配列の取得
（ステップ１）
前記参照例１に記載するメソポーラス・シリカＳＢＡ−１５を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）＜以下、ＴＢＳＴバッファー＞に５  ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１０μｌをエッペンドルフチューブに加え、９９０μｌ  ＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて希釈した。
【０１５７】
（ステップ２）
ＰｈＤ．−１２ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリー（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢ社製）の４×１０10ｐｆｕ相当を、前記チューブに添加し、２５℃で３０分間静置した。
【０１５８】
（ステップ３）
前記チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱画分としてＳＢＡ−１５を回収した。回収した沈澱を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し、遠心分離し、沈澱画分を回収する操作を繰り返すことによって、ＳＢＡ−１５をＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
【０１５９】
（ステップ４）
洗浄済みのＳＢＡ−１５に１００μｌの溶出バッファー（０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を加えて、１０分間緩やかに振盪させた後、遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）し、上清を別のエッペンドルフチューブに移した。分取された上清に、１５μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、ＳＢＡ−１５上から溶出されたファージを得た。
【０１６０】
（ステップ５）
溶出されたファージを、対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢ社製）に感染させ、下記の手順に従って増幅した。
【０１６１】
感染後、大腸菌を３７℃で４．５時間培養した。次に、遠心分離により、ファージを大腸菌から分離し、上清からポリエチレングリコールにより沈澱させて、精製した。増幅、精製されたファージは、ＴＢＳバッファーに懸濁し、該ファージ懸濁液について、適当な希釈系列で大腸菌に感染させることによって、その力価（Ｔｉｔｅｒ）を測定した。
【０１６２】
（ステップ６）
上記のファージの提示するペプチドについて、メソポーラス・シリカＳＢＡ−１５に対する親和性に関する、一次スクリーニングされた該懸濁液に含まれるファージについて、前記ステップ１〜ステップ５のスクリーニング操作を更に４回繰り返した。但し、二次スクリーニング以降、洗浄に用いる、ＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０濃度を０．５％に上げることによって、ステップ３における洗浄条件を厳しくし、メソポーラス・シリカＳＢＡ−１５に対して、より高い親和性を示すファージを選別した。また、三次スクリーニング（２回目）以降では、前記ステップ３における洗浄によって、ＳＢＡ−１５から離脱したファージに関しても、同様の操作を行い、その力価（Ｔｉｔｅｒ）を測定し、コントロールとした。
【０１６３】
以上、１次スクリーニング〜５次スクリーニングの各回において、ＳＢＡ−１５上から溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表２に示す。
【０１６４】
【表２】
2005095154.tif 000004
【０１６５】
上記のスクリーニング操作において選別された、最終スクリーニング・ステップで溶出されたファージを、大過剰の大腸菌に感染させることによってクロ−ン化した。
【０１６６】
分離される各クロ−ンを、大腸菌に感染させ、増幅した後、各クローンのファージからｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読することによって、ＳＢＡ−１５に対して高い親和性を有する１５クローンのファージを取得した。
【０１６７】
取得された１５クローンのファージに対して、ファージＥＬＩＳＡによって酸化珪素に対する親和性評価を行い、また、各ファージの提示ペプチド部をコードするＤＮＡ配列を解析して、酸化珪素に対する結合能を示すペプチドのアミノ酸配列を決定した。
１）ファージＥＬＩＳＡによる酸化珪素親和性評価
（ステップ１）
ＳＢＡ−１５を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）＜以下、ＴＢＳＴ＞に５  ｍｇ／ｍｌの濃度になるように懸濁した。この懸濁液１０μｌをエッペンドルフチューブに加え、９９０μｌ  ＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて希釈した。
【０１６８】
（ステップ２）
ＰｈＤ．−１２ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリー（ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢ）から選別された上記１５クローンの各クローンのファージ懸濁液について、該懸濁液の４×１０10ｐｆｕ相当を前記チューブに添加し、２５℃で３０分間静置した。
【０１６９】
（ステップ３）
前記チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱画分としてＳＢＡ−１５を回収した。回収した沈澱を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し、遠心分離し、沈澱画分を回収する操作を繰り返すことによって、ＳＢＡ−１５をＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
【０１７０】
（ステップ４）
上記チューブ中の洗浄済みＳＢＡ−１５に、１００μｌのＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体溶液（抗Ｍ１３抗体（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢ社製）１μＬをＴＢＳＴ１０ｍＬに懸濁）を加えて、６０分間緩やかに振盪させた。次に、チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱画分としてＳＢＡ−１５を回収した。回収した沈澱を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し、遠心分離し、沈澱画分を回収する操作を繰り返すことによって、ＳＢＡ−１５をＴＢＳＴバッファーで５回洗浄した。
【０１７１】
（ステップ５）
ＳＢＡ−１５上に結合しているファージに前記ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体を反応させる処理を施した、ＳＢＡ−１５の沈澱を、５０μＬのＤｅｔｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＃ＲＰＮ２２０９）で懸濁し、９６穴タイタープレートの各ウェルに移す。
【０１７２】
さらに、５０μＬのＤｅｔｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＃ＲＰＮ２２０９）を加えて、３分後、ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体中の標識酵素ＨＲＰの作用により得られる、４２８ｎｍにおけるルミノール発光強度を測定した。
【０１７３】
表３に、各クローンに対する評価結果を示す。なお、Ｉ420は４２０ｎｍでの発光強度を示す。
【０１７４】
【表３】
2005095154.tif 000005
【０１７５】
なお、上記ファージＥＬＩＳＡ測定系において、ステップ２において、ＳＢＡ−１５と接触させる液にファージを混合していない場合（コントロール）に観測される、発光強度は、０．０００９であった。
【０１７６】
以上の評価によって、得られた１５のファージ・クローンが提示するペプチドは、いずれも酸化珪素親和性を有することが確認された。
２）酸化珪素との結合能を示すアミノ酸配列
選別された１５のファージ・クローンについて、該ファージのＤＮＡ配列解析結果から、各ファージのランダム・ペプチド提示領域のアミノ酸配列を対比して、酸化珪素に対する親和性に関与すると推定されるアミノ酸配列を特定した。表４に、特定された酸化珪素に対する親和性を示すアミノ酸配列と、その出現頻度を示す。
【０１７７】
【表４】
2005095154.tif 000006
【０１７８】
（実施例２）
前記ＳＢＡ−１５に対する親和性を示すアミノ酸配列を含むペプチドを付加したＰＨＡ合成酵素を、以下の手順により調製した。
【０１７９】
実施例１において取得された、ＳＢＡ−１５に対する親和性を示すアミノ酸配列（配列番号：１と配列番号：２）を、リンカー配列ＧＧＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合してなる、ＰＨＡ合成酵素融合体を発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。これらのアミノ酸配列をコ−ドするＤＮＡ断片を、二本鎖ＤＮＡとして作製するために、下記の表５に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドのセットを用意した。
【０１８０】
【表５】
2005095154.tif 000007
【０１８１】
表５に挙げた、各アミノ酸配列に対する二種の合成ＤＮＡは、それぞれ製造業者の説明に従い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ−ゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて、末端をリン酸化した。続いて、二種の合成ＤＮＡを等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後、室温までゆっくり冷却させることによって、二本鎖ＤＮＡ断片を形成した。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクロ−ニングに直接用いた。
【０１８２】
参照例２で作製したプラスミドｐＧＥＸ−Ｃ１を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて、大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。各菌株における発現ベクター導入の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとして、ｐＧＥＸ  ５’  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いたシークエンシングによって、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部位間にインサートされている塩基配列を決定することによって行った。得られた発現用菌株を、ＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その培養物０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後、ＩＰＴＧ（終濃度  １ｍＭ）を添加し、３７℃で４〜１２時間培養を続けた。
【０１８３】
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（８０００×ｇ、２分、４℃）し、１／１０量の４℃  ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（８０００×ｇ、１０分、４℃）して、固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が、上清に存在することを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。その後、上清から、誘導・発現されたＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオン・セファロ−ス４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｂｅａｄｓ：アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で精製した。なお、誘導・発現されるＧＳＴ融合タンパク質は、融合パートナーのＧＳＴタンパク質のＣ末と、ＰＨＡ合成酵素タンパク質ＹＮ２−Ｃ１のＮ末との間に、上記配列番号：１のアミノ酸配列とリンカー配列ＧＧＧＳとが連結されるペプチド鎖が挿入されている融合タンパク質ＧＳＴ−０１−ＹＮ２−Ｃ１、または、融合パートナーのＧＳＴタンパク質のＣ末と、ＰＨＡ合成酵素タンパク質ＹＮ２−Ｃ１のＮ末との間に、上記配列番号：２のアミノ酸配列とリンカー配列ＧＧＧＳとが連結されるペプチド鎖が挿入されている融合タンパク質ＧＳＴ−０２−ＹＮ２−Ｃ１である。
【０１８４】
使用したグルタチオン・セファロ−スは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオン・セファロ−スを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後、同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオン・セファロ−ス  ４０μＬを、無細胞抽出液（上清）１ｍＬに添加し、４℃で静かに攪拌した。この攪拌により、融合タンパク質ＧＳＴ−０１−ＹＮ２−Ｃ１、あるいは、ＧＳＴ−０２−ＹＮ２−Ｃ１をグルタチオン・セファロ−スに吸着させた。
【０１８５】
吸着後、遠心（８０００×ｇ、１分、４℃）して、グルタチオン・セファロ−スを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０  ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心（８０００×ｇ、２分、４℃）して、融合タンパク質を含む上清を回収した後、ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０１８６】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇを、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテア−ゼ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化して、Ｎ末の融合パートナーＧＳＴ部を切断分離した。この液をグルタチオン・セファロ−ス・カラムに通して、プロテアーゼとＧＳＴを除去した。グルタチオン・セファロ−ス・カラムのフロー・スルー分画を、さらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、ペプチド融合タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１、あるいは、０２−ＹＮ２−Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、最終精製済みの発現タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１および０２−ＹＮ２−Ｃ２は、それぞれシングルバンドを示すことを確認した。
【０１８７】
得られる最終精製済みの発現タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１および０２−ＹＮ２−Ｃ２について、それぞれ酵素活性は、上記参照例２に記載の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。試料の酵素活性は、１．９  Ｕ／ｍｌ、また比活性は、４．０  Ｕ／ｍｇタンパク質であった。最終精製済み酵素溶液を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくん  ＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０  Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０１８８】
（実施例３）
ペプチド融合タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１、０２−ＹＮ２−Ｃ２のＳＢＡ−１５に対する親和性評価
ＳＢＡ−１５を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この懸濁液１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例２で調製した、ペプチド融合ＰＨＡ合成酵素０１−ＹＮ２−Ｃ１、０２−ＹＮ２−Ｃ１、あるいは、参照例２で調製したＰＨＡ合成酵素ＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当量を加え、室温で３０分間振とうした。遠心分離操作（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）によって、ＳＢＡ−１５粒子を沈澱として回収し、ＳＢＡ−１５に結合しなかった酵素タンパク質を含む上清と分離した。沈澱画分として、回収されるＳＢＡ−１５を再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心分離して、沈澱画分を回収する操作を繰り返すことによって、ＳＢＡ−１５を洗浄した。表６に、洗浄したＳＢＡ−１５の懸濁液について、上記参照例２に記載する測定方法で、酵素活性を測定した結果を示す。
【０１８９】
【表６】
2005095154.tif 000008
【０１９０】
コントロ−ルの酵素タンパク質ＹＮ２−Ｃ１と比較して、Ｎ末にＳＢＡ−１５に対する結合能を有するアミノ酸配列のペプチド鎖を融合している酵素タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１ならびに０２−ＹＮ２−Ｃ１において、観測される酵素活性は高く、Ｎ末に融合されているＳＢＡ−１５に対する結合能を有するアミノ酸配列のペプチド鎖を介して、酵素タンパク質が有効に酸化珪素からなる基材表面に固定化できることが確認された。
【０１９１】
（実施例４）
ＳＢＡ−１５に対する親和性を有する二種類のアミノ酸配列、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号：１）およびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号：２）の全部を、スペーサー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して、この順番に直列に繋いだ配列  Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号：２１）を、さらにリンカー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合した融合タンパク質を発現する、大腸菌用発現ベクターを次のようにして構築した。
【０１９２】
この配列番号：２１のアミノ酸配列とリンカー配列ＧＳをコ−ドするＤＮＡは、二種類の合成オリゴヌクレオチド：
５’−ＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＧＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴ−３’（配列番号：２２）および
５’−ＡＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧＣＡＣＧＴＧＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：２３）を
それぞれＴ４ポリヌクレオチドキナ−ゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて、末端をリン酸化した後、等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後、室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片として形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、実施例２と同様にして、プラスミドｐＧＥＸ−Ｃ１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに挿入し、このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。実施例２と同様にして、配列番号：２１のアミノ酸配列とリンカー配列ＧＳからなるペプチドをＮ末端に融合した発現タンパク質２１−ＹＮ２−Ｃ１を精製し、１０  Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。実施例３と同様にして、ＳＢＡ−１５上に結合されている酵素タンパク質に起因する酵素活性を測定して、この精製酵素タンパク質のＳＢＡ−１５に対する親和性を評価した。表７に、測定結果を示す。
【０１９３】
【表７】
2005095154.tif 000009
【０１９４】
コントロ−ルの酵素タンパク質ＹＮ２−Ｃ１と比較して、Ｎ末にＳＢＡ−１５に対する結合能を有する二つのアミノ酸配列を含むペプチド鎖を融合している酵素タンパク質２１−ＹＮ２−Ｃ１において、観測される酵素活性は高く、Ｎ末に融合されているＳＢＡ−１５に対する結合能を有する二つのアミノ酸配列を含むペプチド鎖を介して、酵素タンパク質がより有効に酸化珪素からなる基材表面に固定化できることが確認された。
【０１９５】
（実施例５）
本実施例５は、酸化珪素層被覆したシリコン基板上に酸化珪素層親和性ペプチドを融合したポリヒドロキシアルカネ−ト（ＰＨＡ）合成酵素を固定して得られる有機物固定化構造体及びその製造方法の一例である。図１は、本実施例５の有機物固定化構造体の構成を模式的に示す断面図である。
【０１９６】
（１）多孔性シリカ被覆層を有する基板の作製
本実施例５の有機物固定化構造体における基板１１として、シリコン基板を用いる。
【０１９７】
先ず、シリコン基板上に、参照例１と同様にして調製したＳＢＡ−１５反応液をスピンコーターにより塗布する。メソポーラス・シリカ（ＳＢＡ−１５）被膜層形成のための、加熱処理の温度条件は参照例１に記載の条件と同じとする。この手法により、シリコン基板１１上に、平均厚さ１００ｎｍのメソポーラス・シリカ膜を被覆形成した。
【０１９８】
シリコン基板１１上に形成されたメソポーラス・シリカ（ＳＢＡ−１５）膜は、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄しても、基板表面から脱離しないことの確認を行った。以上の工程によって、シリコン基板１１の表面を、多孔性シリカ：ＳＢＡ―１５からなる酸化珪素層１２が被覆している、ＳＢＡ−１５被覆シリコン基板（以下、実施例５では、シリカ被覆基板と称する）が作製された。
【０１９９】
（２）シリカ被覆基板に対する親和性の評価
実施例２に記載の方法により得られた、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドがＮ末端に連結されてなるＰＨＡ合成酵素タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１を用いて、以下の評価を行った。
【０２００】
（１）で作製したシリカ被覆基板を３０ｍｌ  ＴＢＳバッファーが入ったシャーレに浸漬しする。次に、上記実施例２で調製されるＰＨＡ合成酵素タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１、または参照例２で調製されるＰＨＡ合成酵素タンパク質ＹＮ２−Ｃ１  ２．５Ｕ相当量を加え、室温でゆっくりと１時間間振とうする。シリカ被覆基板をシャーレから取り出した後、基板表面をＴＢＳバッファーにより１０回洗浄した。洗浄したシリカ被覆基板を、再びＴＢＳバッファー中に浸漬し、ＰＨＡ合成酵素活性を上記参照例２に記載の評価方法に準じて測定した。表８に、ＰＨＡ合成酵素活性の測定結果を示す。
【０２０１】
【表８】
2005095154.tif 000010
【０２０２】
コントロ−ルの酵素タンパク質ＹＮ２−Ｃ１と比較して、Ｎ末にＳＢＡ−１５に対する結合能を有するアミノ酸配列を含むペプチド鎖を融合している酵素タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１において、観測される酵素活性は高く、Ｎ末に融合されているＳＢＡ−１５に対する結合能を有するアミノ酸配列を含むペプチド鎖を介して、酵素タンパク質がより有効にシリカ被覆基板の表面に固定化できることが確認された。また、この酸化珪素に対する親和性を有するアミノ酸配列を含むペプチド鎖を、結合ドメイン１５として、ＰＨＡ合成酵素タンパク質のＮ末に融合している融合体は、該結合ドメイン１５を介して、酸化珪素からなる表面被覆層１４上に安定に固定化されており、この構成を有する構造体は、表面に固定化されている機能ドメイン１４に相当するＰＨＡ合成酵素タンパク質部は、本来の酵素活性を保持しており、バイオリアクタとして利用できることが示唆される。
【０２０３】
さらに、ＰＨＡ合成酵素に対する基質濃度を、
試薬２：３’−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ／０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）溶液、基質を３．０ｍＭ溶解、に加えて、
試薬２−１；３’−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ／０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）溶液、基質を１．５ｍＭ溶解、
試薬２−２；３’−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ／０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）溶液、基質を６．０ｍＭ溶解
を用いた系においても、それぞれ、シリカ被覆基板上に固定化された酵素タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１によるＰＨＡ合成酵素活性を測定した。表９に、異なる基質濃度に対する、シリカ被覆基板上に固定化された酵素タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１の酵素活性の評価結果を示す。
【０２０４】
【表９】
2005095154.tif 000011
【０２０５】
反応系内に添加される基質３’−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡの濃度依存的に反応量が変化しており、酸化珪素に対する親和性を有するアミノ酸配列を含むペプチド鎖を介して、シリカ被覆基板上に固定化された酵素タンパク質０１−ＹＮ２−Ｃ１は、本来の酵素活性を保持しており、バイオリアクタとして利用できることが示唆される。
【０２０６】
（実施例６）
ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖ／ＳＢＡ−１５親和性ペプチド融合タンパク質の作製
ＳＢＡ−１５親和性ペプチドＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＨＶ（配列番号：２）をＨＥＬ結合性ｓｃＦｖのＣ末端に融合したタンパク質を以下の工程により作製する。
【０２０７】
（１）発現ベクター作製
予め、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖの構成要素となるＶＬ（クローン名：ＶＬ＿ＨＥＬ、配列番号：２４にそのアミノ酸配列、ならびに配列番号：２５に前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す）、ＶＨ（クローン名：ＶＨ＿ＨＥＬ、配列番号：２６にそのアミノ酸配列、ならびに配列番号：２７に前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す）のコード遺伝子断片を、それぞれ、ｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のマルチ・クローニングサイトを部分的に変更したべクター中に挿入する。図２に示すように、ＶＬコード遺伝子が挿入されているベクター：ｐＵＴ−ＶＬ＿ＨＥＬ、ＶＨコード遺伝子が挿入されているベクター：ｐＵＴ−ＶＨ＿ＨＥＬとする。
【０２０８】
次に、ＶＬのアミノ酸配列（配列番号：２４）、ｓｃＦｖ分子内リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３、ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：２６）、ＧＳリンカー（融合ドメイン間リンカー）、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：２：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＨＶ）、Ｈｉｓ×６（以下、Ｈｉｓタグ）の順で連続したポリペプチド鎖の翻訳が可能な、発現ベクター  ｐＵＴ−ｓｃＦｖ（ＨＥＬ）を以下のように作製する。
【０２０９】
ＶＨコード遺伝子が挿入されているベクター：ｐＵＴ−ＶＨ＿ＨＥＬをテンプレートして、下記のプライマーを用いて、ＰＣＲ産物を調製する。
ＳｉｓｃＦｖ−Ｂ（配列番号：２８）
5'- NNNNNACGGC CGGCGGGGGC GGTAGCGGCG GTGGCGGGTC GGGCGGTGGC GGATCGGATA TCCAGCTGCA GGAGT -3'
ＳｉｓｃＦｖ−Ｆ（配列番号：２９）
5'- NNNNNCCGCG GGTGGGGGTG CTTGTGGTGC ACGTGCATGG GGATGCTACC CGCGGAGACG GTGACGAGGG T -3'
前記フォワード側プライマー：ＳｉｓｃＦｖ−Ｂは、５’末端部にリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３をコードする塩基配列を含み、一方、リバース側プライマー：ＳｉｓｃＦｖ−Ｆは、５’末端部にスペーサー配列ＧＳ、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：２：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＨＶ）をコードする塩基配列に対して、相補的な塩基配列を含んでいる。従って、得られるＰＣＲ産物は、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３、ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：２６）、ＧＳリンカー、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：２：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＨＶ）からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を包含している。なお、ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲキット（タカラバイオ  ＬＡ−Ｔａｑキット）を使用し、業者推奨のプロトコールに従って行う。
【０２１０】
ＰＣＲ反応後、得られるＰＣＲ産物は、２％アガロース電気泳動を行って、目的とする塩基長のＤＮＡ断片のバンドとして回収する。次に、ゲル抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ゲルから粗精製を行い、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を得る。シークエンスを行い、目的の塩基配列を有することを確認する。
【０２１１】
ＶＬコード遺伝子が挿入されているベクター：ｐＵＴ−ＶＬ＿ＨＥＬ、ならびに、上記ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を、それぞれ、制限酵素Ｅｃｏ５２１／ＳａｃIIを用いて、消化する。次いで、それぞれ、アガロース電気泳動を行い、ｐＵＴ−ＶＬ＿ＨＥＬ由来のＶｅｃｔｏｒ側ＤＮＡ断片、ならびにＰＣＲ産物由来のＩｎｓｅｒｔ側ＤＮＡ断片を単離、精製する。
【０２１２】
精製された、二種のＤＮＡ断片を、Ｖｅｃｔｏｒ：Ｉｎｓｅｒｔ＝１：５のモル比率で混合し、実施例１と同様にしてライゲーション反応を行う。得られる発現ベクター：ｐＵＴ−ｓｃＦｖＳｐ２は、ｐＵＴ−ＶＬ＿ＨＥＬ由来のＶｅｃｔｏｒ側ＤＮＡ断片に由来する、ＶＬコード遺伝子（配列番号：２５）とＨｉｓ×６（以下、Ｈｉｓタグ）のコード配列との間に、ＰＣＲ産物由来のＩｎｓｅｒｔ側ＤＮＡ断片に由来する、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３をコードする塩基配列、ＶＨコード遺伝子（配列番号：２７）、ＧＳリンカーとＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：２：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＨＶ）をコードする塩基配列が挿入されたものとなる。
【０２１３】
上記ライゲーション反応液を用いて、４０μＬのＢＬ２１溶液中において、ＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換する。形質転換は、ヒートショック法により、氷中→４２℃×９０ｓｅｃ→氷中の条件で行う。ヒートショックにより、形質転換された菌株を含むＢＬ２１溶液に、ＬＢ培地７５０μＬを加え、３７℃で、一時間振盪培養を行う。その後、６０００ｒｐｍ×５分間遠心を行い、培養上清６５０μＬを廃棄する。残った培養上清と沈澱となった細胞画分を攪拌し、ＬＢ／ａｍｐ．プレート上に撒き、３７℃で、一晩静置する。
【０２１４】
前記プレートから無作為にコロニーを選択し、各コロニーをＬＢ／ａｍｐ.液体培地３ｍＬにて振盪培養を行う。培養液から、集菌した後、市販のＭｉｎｉＰｒｅｐキット（プロメガ社製）を用いて、業者推奨の方法により、組換え菌株からプラスミドを抽出する。抽出されるプラスミドを、制限酵素ＮｏｔI／ＳａｃIIを用いて、消化する。次いで、アガロース電気泳動を行い、目的の塩基長を有するＤＮＡ断片が挿入されていることを確認する。
【０２１５】
前記のプラスミド増殖、挿入ＤＮＡ断片の確認作業を終え、精製されたプラスミドｐＵＴ−ｓｃＦｖＳｐ２を用いて、４０μＬのＢＬ２１（ＤＥ３）溶液中のコンピテントセルを形質転換する。形質転換は、ヒートショック法により、氷中→４２℃×９０ｓｅｃ→氷中の条件で行う。ヒートショックにより、形質転換された菌株を含むＢＬ２１溶液に、ＬＢ培地７５０μＬを加え、３７℃で、一時間振盪培養を行う。その後、６０００ｒｐｍ×５分間遠心を行い、培養上清６５０μＬを廃棄する。残った培養上清と沈澱となった細胞画分を攪拌し、ＬＢ／ａｍｐ．プレート上に撒き、３７℃で、一晩静置する。
【０２１６】
（２）予備培養
プレート上のコロニーを無作為に選択し、３．０ｍＬ  ＬＢ／ａｍｐ．培地にて、２８℃で、一晩振盪培養を行う。
【０２１７】
（３）本培養
上記予備培養溶液を２×ＹＴ培地  ７５０ｍＬに植え継ぎ、更に、２８℃で培養を継続する。培養液のＯＤ600が０．８を超えた時点で、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、更に、２８℃で、終夜培養を行う。
【０２１８】
（４）精製
形質転換菌株中において、発現ベクターｐＵＴ−ｓｃＦｖＳｐ２から翻訳されるポリペプチド鎖は、不溶性顆粒を形成している。下記の工程に従って、不溶性顆粒画分から、目的のポリペプチド鎖の単離、精製を行う。
【０２１９】
（ｉ）不溶性顆粒画分の回収
上記本培養で得られる菌体培養液７５０ｍＬを６０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎにて遠心し、菌体を沈澱（不溶性画分）として分離する。分離された菌体を、氷中にて、トリス溶液（２０ｍＭ  トリス／５００ｍＭ  ＮａＣｌ）１５ｍＬに懸濁する。この懸濁液中の菌体をフレンチプレスによって破砕する。破菌後、菌破砕液を１２，０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎで遠心を行い、上清を除き、不溶性顆粒を含む沈澱（不溶性画分）を回収する。
【０２２０】
（ii）不溶性顆粒画分の可溶化
回収される不溶性顆粒を含む沈澱（不溶性画分）に、６Ｍ  塩酸グアニジン／トリス溶液  １０ｍＬを加えて、一晩浸漬する。前記変性処理により、不溶性顆粒を形成するポリペプチドの可溶化がなされる。次に、１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心し、可溶化されたポリペプチドを含む上清を、可溶化成分溶液として分取する。
【０２２１】
（iii）Ｈｉｓタグを有するポリペプチドの金属キレートカラム精製
Ｈｉｓタグを利用するカラム精製に用いる、金属キレートカラム担体として、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いている。カラム調製、サンプル負荷、ならびに、カラム洗浄工程、条件は、業者の推奨方法に準拠し、室温（２０℃）にて行う。サンプル負荷、カラム洗浄工程後、該金属キレートカラムに吸着されている、Ｈｉｓタグ融合のポリペプチドの溶出は、６０ｍＭ  イミダゾール／Ｔｒｉｓ溶液を用いて行う。溶出液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド１５％）上での泳動によって分析し、単一バンドが観測されることを確認する。観測される、単一バンドの見掛けの分子量は目的のポリペプチド鎖に相当することから、精製されていることが確認される。
【０２２２】
（iv）透析
前記溶出液中に含まれるイミダゾールを透析により除去する。６Ｍ  塩酸グアニンジン／Ｔｒｉｓ溶液を外液として、４℃で透析を行い、該ポリペプチド鎖の塩酸グアニンジン／Ｔｒｉｓ溶液を得る。
【０２２３】
（v）リフォールディング処理
前記塩酸グアニンジン／Ｔｒｉｓ溶液中では、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖのＣ末にＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：２：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＨＶ）が連結された、上記ｓｃＦｖ−Ｓｐ２のポリペプチド鎖は変性されている。この変性されている、ポリペプチド鎖を、下記する工程に従って、透析（４℃）によって、段階的に脱塩酸グアニンジンを行いつつ、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質部分のリフォールディングを行う。
【０２２４】
（イ）該ポリペプチド鎖の塩酸グアニンジン／Ｔｒｉｓ溶液について、希釈溶媒として、６Ｍ  塩酸グアニジン／Ｔｒｉｓ溶液を用いて、タンパク質濃度を調整する。ポリペプチド鎖のモル吸光係数に基づき、ΔＯ．Ｄ．（２８０ｎｍ−３２０ｎｍ）値を測定しつつ、希釈して、タンパク質濃度を７．５μＭに調整する（希釈後体積１０ｍＬ）。
【０２２５】
次に、タンパク質濃度７．５μＭのポリペプチド鎖溶液に、β−メルカプトエタノール（還元剤）を終濃度３７５μＭ（タンパク質濃度の５０倍）になるよう添加する。室温、暗所に、４時間静置して、還元処理を行う。このポリペプチド鎖溶液を透析バック（ＭＷＣＯ：１４，０００）に入れ、透析サンプルとする。
【０２２６】
（ロ）６Ｍ塩酸グアニンジン／トリス溶液を透析外液として、透析サンプルを浸漬し、緩やかに攪拌しながら６時間透析する。
【０２２７】
（ハ）外液中の塩酸グアニジン濃度を、６Ｍから、３Ｍ、２Ｍと段階的に下げる。前記外液濃度において、それぞれ、６時間透析する。
【０２２８】
（二）酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を終濃度３７５μＭ、Ｌ−Ａｒｇを終濃度０．４Ｍ）となるようにトリス溶液に加え、更に、等量の２Ｍ  塩酸グアニジン／Ｔｒｉｓ溶液を混合して、塩酸グアニジン濃度が１Ｍの混合液とする。更に、濃ＮａＯＨ液を用いて、該混合液のｐＨを８．０（４℃）に調整し、透析外液として用いる。この透析外液に対して、１２時間緩やかに攪拌しながら透析する。
【０２２９】
（ホ）前記（二）の同様の手順で、塩酸グアニジン濃度０．５Ｍの含Ｌ−Ａｒｇ  トリス溶液を調製し、この透析外液に対して、１２時間緩やかに攪拌しながら透析する。
【０２３０】
（ヘ）最後に、トリス溶液を透析外液として、１２時間透析する。
【０２３１】
（ト）一連の透析終了後、１００００ｒｐｍで約２０分遠心分離し、凝集体と上清を分離する。リフォールディング処理された、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とＣ末のＳＢＡ−１５親和性ペプチドからなる融合タンパク質は、可溶性タンパク質として、上清に回収される。
【０２３２】
回収された可溶性タンパク質溶液に対して、更に外液をリン酸バッファー（以下、ＰＢＳ）に替え、透析を行い、緩衝液の変換を行う。この可溶性タンパク質ＰＢＳ溶液を用いて、ＨＥＬ固定化セファロースによるアフィニティ精製を行う。前記アフィニティ精製によって、正しくリフォールディング処理がなされた、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とＣ末のＳＢＡ−１５親和性ペプチドからなる融合タンパク質のＰＢＳ溶液が得られる。
【０２３３】
（実施例７）
構造体の作製
（ステップ１）  参照例１に記載の作製法より作製した多孔体（ＳＢＡ−１５）  ２００ｍｇを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／リン酸バッファー：ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）中に一晩浸漬する。
【０２３４】
（ステップ２）  前記浸漬処理済みの多孔体（ＳＢＡ−１５）に、タンパク質濃度  １．５μＭの、実施例６で調製したＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とシリカ親和性ペプチドとの融合タンパク質／ＰＢＳＴ溶液を混合して、２４時間攪拌する。
【０２３５】
（ステップ３）  その後、１２，０００ｒｐｍ×５ｍｉｎにて遠心を行い、上清を取り除き、沈澱物を採取する。この沈澱物を真空乾燥して、多孔体（ＳＢＡ−１５）の表面にＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とシリカ親和性ペプチドとの融合タンパク質が結合してなる構造体を得る。
【０２３６】
（実施例８）
ＨＥＬ検出用検査キット
（ステップ１）  終濃度がそれぞれ０.１、０.５、１μＭとなるように、ＰＢＳＴ中にＨＥＬ（生化学工業）を溶解した溶液を、３本のエッペンドルフチューブ内で調製する。
【０２３７】
（ステップ２）  前ステップで調製したＨＥＬ溶液三種に、それぞれ、実施例７で得られた構造体を混合し、室温で、１時間静置する。この混合液中では、抗原のＨＥＬと、構造体の表面に固定化されている、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とシリカ親和性ペプチドとの融合タンパク質との間で、抗原−抗体反応が進行する。
【０２３８】
（ステップ３）  前記抗原−抗体反応液を遠心（１２０００ｒｐｍ×５分間）して、構造体を含む沈澱部と上清とを分離させ、上清を廃棄する。更に、前記沈澱部に、ＰＢＳＴ  ５００μＬを加え、５分間攪拌する。再び、遠心（１２０００ｒｐｍ×５分間）した後に、上清を廃棄する。この洗浄作業を５回繰り返した。
【０２３９】
（ステップ４）  次に、洗浄済の構造体に、濃度１００ｎＭのＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体溶液５００μＬを混合し、室温にてインキュベートする。すなわち、構造体の表面に固定化されている、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とシリカ親和性ペプチドとの融合タンパク質との反応によって、固定化された抗原のＨＥＬに対して、ＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体を更に反応させる。
【０２４０】
（ステップ５）  前記抗体反応を終えた後、該反応液を遠心（１２０００ｒｐｍ×５分間）して、構造体を含む沈澱部と上清とを分離させ、上清を廃棄する。更に、前記沈澱部にＰＢＳＴ  ５００μＬを加え、５分間攪拌する。再び、遠心（１２０００ｒｐｍ×５分間）した後に、上清を廃棄する。この洗浄作業を５回繰り返した。
【０２４１】
（ステップ６）  上記洗浄を終えた沈澱をＰＢＳに再懸濁する。この懸濁液について、蛍光光度計により、ＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体中のＦＩＴＣ標識に由来する、５２０ｎｍの蛍光強度を測定する。
【０２４２】
（比較例１）
（ステップ１）  参照例１に記載の作製法より作製した多孔体（ＳＢＡ−１５）と、濃度１００ｎＭのＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体溶液５００μＬとを混合し、室温にてインキュベートする。
【０２４３】
（ステップ２）  上記混合液を遠心（１２０００ｒｐｍ×５分間）により、構造体からなる沈澱部と上清を分離させ、上清を廃棄する。
【０２４４】
（ステップ３）  次に、分離した沈澱部にＰＢＳＴ  ５００μＬ加え、５分間攪拌する。再び、遠心（１２０００ｒｐｍ×５分間）した後に、上清を廃棄する。この洗浄作業を５回繰り返した。
【０２４５】
（ステップ４）  前記洗浄を終えた後、採取される沈澱をＰＢＳに再懸濁する。この懸濁液について、蛍光光度計により、ＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体中のＦＩＴＣ標識に由来する、５２０ｎｍの蛍光強度を測定する。
【０２４６】
この比較例１で測定される蛍光は、基体の多孔体（ＳＢＡ−１５）の表面に付着しているＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体に起因している。従って、この比較例１において測定される蛍光強度の測定値は、基体の多孔体（ＳＢＡ−１５）の表面に直接付着しているＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体量を反映する。
【０２４７】
一方、上記実施例８において、測定される蛍光強度は、構造体の表面に固定化されている、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とシリカ親和性ペプチドとの融合タンパク質と反応した、抗原のＨＥＬに対して、更に反応させたＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体に起因する蛍光が主体である。なお、基体の多孔体（ＳＢＡ−１５）の表面に直接付着しているＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体に由来する蛍光成分も含まれている。従って、上記実施例８において、測定される蛍光強度から、比較例１で測定される蛍光強度をバックグランド値として差し引き、この差分を、固定化されている抗原のＨＥＬに対して、更に反応させたＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体に起因する蛍光強度と見なす。
【０２４８】
実施例８において、終濃度がそれぞれ０.１、０.５、１μＭのＨＥＬ溶液を用いて、それぞれ求まった、前記のバックグランド値補正後の「差分蛍光強度」を、ＨＥＬ濃度に対してプロットする。前記ＨＥＬ濃度範囲において、プロット結果は、優れた直線性を示し、上記条件で測定される、バックグランド値補正後の「差分蛍光強度」は、構造体の表面に固定化されている、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とシリカ親和性ペプチドとの融合タンパク質との反応に伴う、ＨＥＬ結合量の定量的な指標となっている。
【０２４９】
換言するならば、構造体の表面に固定化されている、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とシリカ親和性ペプチドとの融合タンパク質を、標的物質のＨＥＬと結合、固定化を図る一次抗体とし、ＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体を検出用の二次抗体とする組み合わせは、標的物質ＨＥＬの定量的な検査キットに適用可能であることが検証される。
【０２５０】
（実施例９）
ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖ／ＳＢＡ−１５親和性ペプチド融合タンパクの作製
ＳＢＡ−１５親和性ペプチド：ＩＰＨＶＨＨＫＨＰＲをＨＥＬ結合性ｓｃＦｖのＣ末端に融合したタンパク質を、以下の工程に従って作製する。
【０２５１】
（１）発現ベクターの構築
発現ベクターの構築は、上述の実施例６と同様の手順で行う。
【０２５２】
予め、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖの構成要素となるＶＬ（クローン名：ＶＬ＿ＨＥＬ、配列番号：２４にそのアミノ酸配列、ならびに配列番号：２５に前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す）、ＶＨ（クローン名：ＶＨ＿ＨＥＬ、配列番号：２６にそのアミノ酸配列、ならびに配列番号：２７に前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す）のコード遺伝子断片を、それぞれ、ｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のマルチ・クローニングサイトを部分的に変更したべクター中に挿入する。図２に示すように、ＶＬコード遺伝子が挿入されているベクター：ｐＵＴ−ＶＬ＿ＨＥＬ、ＶＨコード遺伝子が挿入されているベクター：ｐＵＴ−ＶＨ＿ＨＥＬとする。
【０２５３】
次に、ＶＬのアミノ酸配列（配列番号：２４）、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３、ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：２６）、ＧＳリンカー、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３０：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＲ）、Ｈｉｓ×６（以下、Ｈｉｓタグ）の順で連続したポリペプチド鎖の翻訳が可能な、発現ベクター  ｐＵＴ−ｓｃＦｖ（ＨＥＬ）を以下のように作製する。
先ず、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３、ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：２６）、ＧＳリンカー、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３０：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＲ）からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を包含している二本鎖ＤＮＡを下記する方法で調製する。
【０２５４】
ＶＨコード遺伝子が挿入されているベクター：ｐＵＴ−ＶＨ＿ＨＥＬをテンプレートして、下記のプライマーを用いて、ＰＣＲ産物を調製する。
ＳｉｓｃＦｖ−Ｂ  （配列番号：３１）
5'- NNNNNACGGC CGGCGGGGGC GGTAGCGGCG GTGGCGGGTC GGGCGGTGGC GGATCGGATA TCCAGCTGCA GGAGT -3'
ＳｉｓｃＦｖ−Ｆ  （配列番号：３２）
5’- NNNNNCCGCG GGTGGTGCTT GTGGTGCACG TGCATGGGGA TGCTACCCGC GGAGACGGTG ACGAGGGT -3’
前記フォワード側プライマー：ＳｉｓｃＦｖ−Ｂは、５’末端部にリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３をコードする塩基配列を含み、一方、リバース側プライマー：ＳｉｓｃＦｖ−Ｆは、５’末端部にスペーサー配列ＧＳ、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３０：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＲ）をコードする塩基配列に対して、相補的な塩基配列を含んでいる。従って、得られるＰＣＲ産物は、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３、ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：２６）、ＧＳリンカー、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３０：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＲ）からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を包含している。なお、ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲキット（タカラバイオ  ＬＡ−Ｔａｑキット）を使用し、業者推奨のプロトコールに従って行う。
【０２５５】
以降の工程は、上記実施例６に記載の工程と同様にして、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質のＣ末にＳＢＡ−１５親和性ペプチド（ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＲ）が連結された融合タンパク質のＰＢＳ溶液が得られる。
【０２５６】
（実施例１０）
ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖ／ＳＢＡ−１５親和性ペプチド融合タンパクの作製（２）
ＳＢＡ−１５親和性ペプチドとして、配列番号２のアミノ酸配列に基づき、改変を施した配列番号３３：ＩＰＭＨＶＨＨＲＨＰＨＶを選択し、かかるＳＢＡ−１５親和性ペプチドをＨＥＬ結合性ｓｃＦｖのＣ末端に融合したタンパク質を、以下に記した工程以外は、実施例６に記載の工程に従って作製する。
【０２５７】
（１）発現ベクターの構築
ＳＢＡ−１５親和性ペプチドとして用いる、配列番号３３：ＩＰＭＨＶＨＨＲＨＰＨＶのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する合成ＤＮＡを用い、それ以外は実施例６に記載と同様の手順で発現べクターを作製する。この発現ベクターから、実施例６に開示する手法に準じて、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質のＣ末にＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３３：ＩＰＭＨＶＨＨＲＨＰＨＶ）が連結された融合タンパク質のＰＢＳ溶液を得る。
【０２５８】
リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３、ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：２６）、ＧＳリンカー、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３３：ＩＰＭＨＶＨＨＲＨＰＨＶ）からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を包含している二本鎖ＤＮＡを調整するため、ＰＣＲ産物の調製工程では、下記する塩基配列を有するプライマー用いる。
ＳｉｓｃＦｖ−Ｂ２  （配列番号：３１）
5'- NNNNNACGGC CGGCGGGGGC GGTAGCGGCG GTGGCGGGTC GGGCGGTGGC GGATCGGATA TCCAGCTGCA GGAGT 3'
ＳｉｓｃＦｖ−Ｆ３  （配列番号：３４）
5'- NNNNNGACGT GGGGGTGCCT GTGGTGCACG TGCATGGGGA TGCTACCCGC GGAGACGGTG ACGAGGGT 3'
前記フォワード側プライマー：ＳｉｓｃＦｖ−Ｂ２は、５’末端部にリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３をコードする塩基配列を含み、一方、リバース側プライマー：ＳｉｓｃＦｖ−Ｆ３は、５’末端部にスペーサー配列ＧＳ、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３３：ＩＰＭＨＶＨＨＲＨＰＲ）をコードする塩基配列に対して、相補的な塩基配列を含んでいる。
【０２５９】
（実施例１１）
ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖ／ＳＢＡ−１５親和性ペプチド融合タンパクの作製（２）
ＳＢＡ−１５親和性ペプチドとして、配列番号２のアミノ酸配列に基づき、改変を施した配列番号３５：ＩＰＭＲＶＨＨＫＨＰＨＶを選択し、かかるＳＢＡ−１５親和性ペプチドをＨＥＬ結合性ｓｃＦｖのＣ末端に融合したタンパク質を、以下に記した工程以外は、実施例６に記載の工程に従って作製する。
【０２６０】
（１）発現ベクターの構築
ＳＢＡ−１５親和性ペプチドとして用いる、配列番号３５：ＩＰＭＲＶＨＨＫＨＰＨＶのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する合成ＤＮＡを用い、それ以外は実施例６に記載と同様の手順で発現べクターを作製する。この発現ベクターから、実施例６に開示する手法に準じて、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質のＣ末にＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３５：ＩＰＭＲＶＨＨＫＨＰＨＶ）が連結された融合タンパク質のＰＢＳ溶液を得る。
【０２６１】
リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３、ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：２６）、ＧＳリンカー、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３５：ＩＰＭＲＶＨＨＫＨＰＨＶ）からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を包含している二本鎖ＤＮＡを調整するため、ＰＣＲ産物の調製工程では、下記する塩基配列を有するプライマー用いる。
ＳｉｓｃＦｖ−Ｂ２  （配列番号：３１）
5'- NNNNNACGGC CGGCGGGGGC GGTAGCGGCG GTGGCGGGTC GGGCGGTGGC GGATCGGATA TCCAGCTGCA GGAGT -3'
ＳｉｓｃＦｖ−Ｆ４  （配列番号：３６）
5'- NNNNNGACGT GGGGGTGCTT GTGGTGCACT CTCATGGGGA TGCTACCCGC GGAGACGGTG ACGAGGGT -3'
前記フォワード側プライマー：ＳｉｓｃＦｖ−Ｂ２は、５’末端部にリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）×３をコードする塩基配列を含み、一方、リバース側プライマー：ＳｉｓｃＦｖ−Ｆ３は、５’末端部にスペーサー配列ＧＳ、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３５：ＩＰＭＲＶＨＨＫＨＰＲ）をコードする塩基配列に対して、相補的な塩基配列を含んでいる。
【０２６２】
（実施例１２）
ＨＥＬ検出用検査キット
前記実施例９、１０、１１の調製法によって得られる、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質のＣ末にＳＢＡ−１５親和性ペプチドとして、配列番号：３０：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＲ、配列番号：３３：ＩＰＭＨＶＨＨＲＨＰＨＶ、または配列番号：３５：ＩＰＭＲＶＨＨＫＨＰＨＶのアミノ酸配列のペプチドが連結された融合タンパク質三種を用いて、上記実施例７に記載の手順に準じて、該融合タンパク質を多孔体（ＳＢＡ−１５）の表面に結合してなる構造体を作製する。
【０２６３】
上記実施例８に記載の手順に準じて、作製された構造体の表面に固定化されている、該ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質とシリカ親和性ペプチドとの融合タンパク質を、標的物質のＨＥＬと結合、固定化を図る一次抗体とし、ＦＩＴＣ標識したＨＥＬポリクローナル抗体を検出用の二次抗体とする組み合わせは、標的物質ＨＥＬの定量的な検査キットに適用可能であることを検証する。
【０２６４】
また、作製された構造体の表面に固定化されている、融合タンパク質の密度は、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖタンパク質のＣ末にＳＢＡ−１５親和性ペプチドとして、配列番号：３０：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＲ、配列番号：３３：ＩＰＭＨＶＨＨＲＨＰＨＶ、または配列番号：３５：ＩＰＭＲＶＨＨＫＨＰＨＶのアミノ酸配列のペプチドが連結された融合タンパク質三種を用いた場合と、上述する実施例７のＨＥＬ結合性ｓｃＦｖのＣ末にＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：２：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＨＶ）が連結された融合タンパク質を用いた場合との間で、検出可能な差違は見出されていない。すなわち、かかる融合タンパク質中において、ＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：２：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＨＶ）と、それに基づき改変が施されている三種のＳＢＡ−１５親和性ペプチド（配列番号：３０：ＩＰＭＨＶＨＨＫＨＰＲ）、（配列番号：３３：ＩＰＭＨＶＨＨＲＨＰＨＶ）ならびに（配列番号：３５：ＩＰＭＲＶＨＨＫＨＰＨＶ）との間で、基体ＳＢＡ−１５の表面に対する結合能には、検出可能な差違は見出されていない。
【産業上の利用可能性】
【０２６５】
本発明は、有機物固定化構造体、例えば、表面に生体物質を固定化した基板において、固定がなされる基板表面として、酸化珪素層を設け、一方、固定する有機物は、生体物質自体を機能ドメインとして、前記酸化珪素層に対する結合能を有する結合ドメインを、この機能ドメインに連結した構成とすることにより、機能ドメインである生体物質部分は、基板表面と直接接触することなく、連結されている結合ドメインによって、その酸化珪素結合能による選択的な固定を可能としている。この独立に設けられている結合ドメインを介して、基板表面に固定化されている生体物質は、その本来の機能に対する固定化の影響は及ばず、また、固定化に際して、なんらの試薬を利用していないため、その機能に影響を及ぼす化学反応を被ることもない。従って、本発明を適用することで得られる、生体物質固定化基体では、固定化されている生体物質は、その機能に対する影響を最小限に抑え、効率的かつ高配向に基板表面上に固定されたものとなる。
【０２６６】
つまり、本発明は、生体物質などの有機物を基体表面に固定化して、該有機物の有する種々の生理的機能を利用する、バイオセンサーやバイオリアクタを初めとする、各種の生体物質の機能を応用する製品の高性能化に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】実施例５に示す、本発明にかかる有機物固定化構造体の一例における、構造体の構成を模式的に示す断面図である。
【図２】実施例７に示す、ＨＥＬ結合性ｓｃＦｖ／ＳＢＡ−１５親和性ペプチド融合タンパク質の組換え発現用プラスミドｐＵＴ−ｓｃＦｖＳｐ２の構築手順を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【０２６８】
１１    基板
１２    酸化珪素層
１４    機能ドメイン（酵素タンパク質）
１５    結合ドメイン（酸化珪素親和性ペプチド）
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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