(57)【要約】【課題】核酸の回収量は十分に保ちながら、回収した核酸収容液に、ヘモグロビン等の血球成分が混入し、純度が低下することなく、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する。【解決手段】(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、更に、上記洗浄液が、水溶性有機溶媒を４０質量％〜６０質量％の濃度で含有し、かつカオトロピック塩を含有しない水溶液であることを特徴とする核酸の分離精製方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、更に、上記洗浄液が、水溶性有機溶媒を４０質量％〜６０質量％の濃度で含有し、かつカオトロピック塩を含有しない水溶液であることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項２】
上記洗浄液中の水溶性有機溶媒の濃度が４５質量％〜５５質量％である、請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３】
上記水溶性有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体並びにブチルアルコール及びその異性体から選択される少なくとも１種のアルコールである、請求項１または２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項４】
上記アルコールがエタノールである、請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項５】
上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項６】
上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させることを特徴とする請求項５記載の核酸の分離精製方法。
【請求項７】
上記核酸を含む試料溶液が、全血を処理したことで得られる試料溶液である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項８】
上記核酸がＤＮＡである、請求項１から７のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項９】
上記多孔性膜が再生セルロースの多孔性膜である、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１０】
多孔性膜が、表裏非対称性の多孔性膜である、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ。
【請求項１２】
圧力発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱加納に結合されるポンプである請求項６に記載の核酸分離精製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸を分離精製するために、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法に関する。さらに詳しくは、得られた核酸を含む試料溶液を用いて、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む試料から核酸を分離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。
【０００３】
診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
【０００４】
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
【０００５】
広く知られた分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって分離精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化および小型化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。
【０００６】
また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が記載されている（特許文献２）。
【０００７】
一方、従来の核酸分離精製法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、多孔性膜を用いるものなどがある。例えば、多孔性膜を用いた核酸分離性装置としては、多孔性膜を収容した多孔性膜をラックに多数セットし、これに核酸を含む試料液を分注し、上記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全多孔性膜チューブを同時に排出側より吸引し試料液を通過させて核酸を多孔性膜に吸着し、その後、洗浄液および回収液を分注して、同様に減圧吸引して洗浄・脱着するようにした機構が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【特許文献１】特公平７−５１０６５号公報
【特許文献２】特開２００３−１２８６９１号公報
【特許文献３】特許第２８３２５８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の核酸分離方法では、収率や純度の点で未だ充分ではなく、更なる改良が求められる。特に、多孔性膜を用いた核酸分離方法では、従来使用している洗浄液の処方では、全血を試料とした場合に、回収した核酸溶液中にヘモグロビン等の血球成分が混入してしまい、純度が低下するという問題があった。
【０００９】
従って、本発明の目的は、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において、核酸の回収量は十分に保ちながら、回収した核酸収容液に、ヘモグロビン等の血球成分が混入し、純度が低下することのない方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔性膜に吸着及び脱着させる過程を含む核酸の分離精製方法において、該多孔性膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用い、且つ、洗浄工程で使用する洗浄液として、水溶性有機溶媒濃度が４０〜６０質量％でカオトロピック塩を含有しない水溶液を用いることによって、核酸を含む検体から核酸を高純度で、かつ高収量で分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明は、下記の構成よりなるものである。
【００１１】
１．(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(2)洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗
浄する工程、及び
(3)回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工
程
を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、更に、上記洗浄液が、水溶性有機溶媒を４０質量％〜６０質量％の濃度で含有し、かつカオトロピック塩を含有しない水溶液であることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【００１２】
２．上記洗浄液中の水溶性有機溶媒の濃度が４５質量％〜５５質量％である、上記第１項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１３】
３．上記水溶性有機溶媒が、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体並びにブチルアルコール及びその異性体のうちの少なくとも１種のアルコールである、上記第２項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１４】
４．上記アルコールがエタノールである、上記第３項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１５】
５．上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする上記第１項〜第４項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【００１６】
６．上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させることを特徴とする上記第５項に記載の核酸の分離精製方法。
【００１７】
７．上記核酸を含む試料溶液が、全血を処理したことで得られる試料溶液である、上記第１項〜第６項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
８．上記核酸が、ＤＮＡである、上記第１項〜第７項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【００１８】
９．上記多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である、上記第１項〜第８項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【００１９】
１０．アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上である、上記第１８項に記載の核酸の分離精製方法。
１１．アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、１０％以上である、上記第９項に記載の核酸の分離精製方法。
【００２０】
１２．アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、上記第９項〜第１１項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【００２１】
１３．トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）が、９９：１〜５０：５０である、上記第１２項に記載の核酸の分離精製方法。
【００２２】
１４．上記多孔性膜が再生セルロースの多孔性膜である、上記第１項〜第８項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【００２３】
１５．上記多孔性膜が、表裏非対称性の多孔性膜である、上記第１項〜第１４項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
【００２４】
１６．上記第１項〜第１５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ。
【００２５】
１７．上記圧力発生装置が、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱加納に結合されるポンプである上記第６項に記載の核酸分離精製方法。
【００２６】
１８．上記第１項〜第１７項のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための、核酸分離精製カートリッジと試薬のキット。
【００２７】
１９．上記第１請〜第１８項のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うための装置。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、効率良く、高純度で、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製することができる。更には、本発明の核酸分離精製方法は、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である。
更に、本発明によれば、核酸の回収量は十分に保ちながら、回収したら核酸溶液に、ヘモグロビンのような血球成分が混入して純度が低くならないように処理でき、かつ、小型化が可能な、核酸分離精製装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の核酸分離精製方法は、(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、及び(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を少なくとも含むものである。
【００３０】
好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。
【００３１】
上記の核酸分離精製の工程では、最初の核酸を含む試料液を注入から核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。また、上記の核酸分精製の工程では核酸を検体中に含まれる全量に対して５０質量％以上、好適な状況では９０質量％以上の収率で得る事が可能である。
【００３２】
また、上記の核酸分精製の工程では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法（キアゲン社）に比べて、長鎖の核酸を回収できる。
【００３３】
また、上記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計での測定値(２６０nm/２８０nm)が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値(２６０nm/２８０nm)がＤＮＡの場合は１．８付近なる純度を持つ核酸を回収することができる。
【００３４】
また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。  また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。
【００３５】
本発明において使用できる検体に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。特に、全血から調整された溶液が対象になる。
【００３６】
最初にこれらの検体について細胞膜および核膜等を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。
【００３７】
細胞膜および核膜を溶解して、核酸を可溶化するためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、赤血球の除去、（2）各種タンパク質の除去、及び（3）白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。赤血球の除去および（2）各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程により核酸を可溶化することが必要である。
【００３８】
核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。検体の数は一つでも複数（複数の容器を用いての複数の検体の並列処理）であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。
本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ、更に好ましくは１００ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることができる。撹拌及びピペッティングを穏やかにすることが、より長いＤＮＡを回収する点で好ましい。
【００３９】
以下に、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程について説明する。本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。
【００４０】
細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法としては、(Ｉ)細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、(II)上記容器に、カオトロピック塩と界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、(III)上記で得られた混合液をインキュベートする工程、(IV)インキュベートされた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む方法を挙げることができる。
【００４１】
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体をホモジナイズ処理することで、自動化処理適正が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。
【００４２】
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となる。
【００４３】
タンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼなどから、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。
金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。
【００４４】
また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。  タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度で含有することが好ましい。
【００４５】
タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの試薬として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
【００４６】
核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。上記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。
上記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
【００４７】
検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。
混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
【００４８】
検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベートすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１〜９０分、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。
【００４９】
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、界面活性剤とカオトロピック塩を含む核酸可溶化試薬溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８のものが用いられる。
【００５０】
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５Ｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５Ｍ〜４Ｍ、さらに好ましくは、１Ｍ〜３Ｍである。上記カオトロピック塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のカオトロピック塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン）を使用することもできる。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
【００５１】
また、上記の核酸可溶化試薬溶液は水溶性有機溶媒を含んでいても良い。この水溶性有機溶媒としてはアルコールが好ましい。アルコールは、1級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。アルコールがメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。
【００５２】
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体にカオトロピック塩およびタンパク質分解酵素とともに混合する界面活性剤は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤である。
本発明においてはノニオン界面活性剤を好ましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。
【００５３】
また、カチオン界面活性剤も好ましく用いることができる。さらに好ましくは、カチオン界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドから選択されるカチオン界面活性剤である。これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００５４】
ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ  Ｈ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、通常用いられる濃度で用いることが出来る。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時に行うことが好ましい。
【００５５】
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、インキュベートされた混合液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコールを好ましく用いることができる。アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。
【００５６】
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸を含む試料溶液には、消泡剤を含有させることも好ましい。上記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。
【００５７】
消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。
【００５８】
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は５０ｄｙｎｅ／ｃｍ以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。
【００５９】
以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
【００６０】
また、本発明の核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、酢酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。ここで、親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が、親水性基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。
【００６１】
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版（株）発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
【００６２】
親水基を有する多孔性膜としては、水酸基を有する有機材料の多孔性膜を挙げることができる。水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、鹸化率（表面鹸化率）が約５〜１００％であることが好ましく、１０〜１００％であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理することが好ましい。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００６３】
鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分に、再生セルロースとなり水酸基が導入される。
鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
【００６４】
水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００６５】
特に、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を好ましく使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。
特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜５０：５０である事が好ましい。
【００６６】
また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜を好ましく用いることができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料としては、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物も好ましく使用する事ができる。特に、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物を好ましく使用することができる。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜５０：５０である事が好ましい。
【００６７】
また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。セルロースの多孔性膜としては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。再生セルロースとは、アセチルセルロースの固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもので、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。
【００６８】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
【００６９】
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
【００７０】
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
【００７１】
多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
【００７２】
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
【００７３】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
【００７４】
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
【００７５】
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
【００７６】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
【００７７】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。
【００７８】
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
【００７９】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
【００８０】
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。
【００８１】
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。
【００８２】
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。
【００８３】
上記に記載した、各々の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。
すなわち、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程が挙げることができる。
【００８４】
また、別の態様としては、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を減圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、又は核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程をおこなうことができる。
【００８５】
また、別の核酸分離精製工程としては、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を行うこともできる。
【００８６】
以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。
【００８７】
本発明においては、洗浄工程における洗浄液が、水溶性有機溶媒を４０〜６０質量％、好ましくは４５〜５５質量％の濃度で含有する水溶液であることを特徴とする。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であると共に、核酸の回収量は十分に保ちながら、回収した核酸溶液に、ヘモグロビンのような血球成分が混入して純度が低くならないように処理することが重要である。かかる要請の下、核酸が難溶性である水溶性有機溶媒を洗浄液中に特定量含有させることにより、核酸を保持したまま核酸以外の成分、特に血球成分を有効に脱着させることができることを見出した。洗浄液（水溶液）中に含まれる水溶性有機溶媒の量が、６０質量％より多いと、血球成分が凝集してしまい、多孔膜から除くのが困難になり、４０質量％未満であると、目的の核酸が多孔膜から脱着してしまい、回収量が大幅に減少してしまう。
【００８８】
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、1級アルコール、２級アルコール、３級アルコール等のアルコールをいずれでも好ましく用いることができる。メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体、ブチルアルコール及びその異性体を用いることが好ましく、中でもエタノールを用いることが好ましい。
【００８９】
洗浄液は、更に必要に応じて水溶性塩を含んでいることが好ましい。水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不要成分の選択的除去作用が向上する。洗浄液に含有させることのできる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましくナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍＭ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１Ｍ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１Ｍ／Ｌ以下であることがより好ましい。
とりわけ、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが２０ｍＭ／Ｌ以上含まれていることが特に好ましい。
【００９０】
本発明では、更に、洗浄液がカオトロッピク物質を含んでいないことを特徴とする。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減少させることができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等の点からも、洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記したように尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。
【００９１】
また、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、本発明では、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収することができる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収することができる。
【００９２】
更に、従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を３５ｄｙｎｅ/ｃｍ未満にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。
逆に、洗浄工程における洗浄液のカートリッジへの残留を減少させる目的で、洗浄液の表面張力を３５ｄｙｎｅ／ｃｍ以上にして、カートリッジとの撥水性を高めて液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑えることもできる。核酸を吸着した多孔性膜、回収液、洗浄液の組合せなどによっていずれかの表面張力が選択される。洗浄液の表面張力は、界面活性剤を適宜添加することにより、容易に調整することができる。
【００９３】
洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給することができる。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が洗浄効率が優れてより好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２〜２００μｌ/ｍｍ2以上が好ましい。洗浄効果の向上と、試料の流出を抑止のために、より好ましくは、１０〜５０μｌ/ｍｍ2以下が好ましい。
【００９４】
洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので上記した範囲が選択される。
【００９５】
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。
【００９６】
本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。(1)洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回でよい、(2)洗浄工程を室温でできる。(3)洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。(4)前記(1)、(2)、(3）のいずれか1つもしくは２つ以上のも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。
【００９７】
従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。
【００９８】
以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が回収効率が優れてより好ましい。
【００９９】
検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。
【０１００】
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等が使用できる。また、回収した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液  (例えば、ＫＣｌ  ５０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  １０ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ  2  １．５ｍｍｏｌ／ｌを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。
【０１０１】
回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。
【０１０２】
回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。
【０１０３】
また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。
【０１０４】
また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からの核酸の脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。
【０１０５】
また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができる。
【０１０６】
また別の方法としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
【０１０７】
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入する事がある。
【０１０８】
回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラーゼチェインリアクション)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。
【０１０９】
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
【０１１０】
また、回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがそれに限定されるものではない。
【０１１１】
上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことが好ましい。それにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得ることが可能になる。
【実施例】
【０１１２】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例１]
（１）核酸精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作成する。アセチル化の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比が６：４の多孔性膜を鹸化処理した多孔膜（膜厚＝７０μｍ、平均孔径＝２．５μｍ）を、上記の、核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔膜を収容する部分に収容し、核酸分離精製カートリッジとする。
【０１１３】
（２）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
表１に示す処方の核酸可溶化試薬溶液及びエタノール濃度の異なる洗浄液（NaＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌの濃度は一定）を調製する。
【０１１４】
【表１】
2005168355.tif 000002
【０１１５】
（３）ＤＮＡ分離精製操作
人全血検体２００μｌに、実施例１で作製した核酸可溶化試薬２００μlと、プロテアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、"Protease“  Type  XXIV  Bacterial）溶液２０μlを添加して、６０℃で１０分間インキュベ−トする。インキュベ−ト後、エタノ−ル２００μｌを加え攪拌することで、核酸を含む試料溶液を作製する。該核酸を含む試料溶液を、上記（１）で作製した、アセチル化の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化物の核酸吸着性多孔膜を備えた、核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させることで、上記核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、実施例１で作製した洗浄液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出する。この操作を３回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収する。
【０１１６】
（３）ＤＮＡの回収量と純度の確認
回収液を用いてＵＶ測定を行い、２６０nmの吸光度（ＯＤ）から回収液中に含まれるＤＮＡの量を、４００nmの吸光度（ＯＤ）から血球成分（ヘモグロビン）の混入量を求める。
【０１１７】
[比較例１]
実施例１において、表２に示したエタノール濃度の洗浄液（NaＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣlの濃度は一定）を用いる以外は、実施例１と同じ操作を行い、回収液中のＤＮＡ量と血球成分（ヘモグロビン）混入量を求める。
【０１１８】
【表２】
2005168355.tif 000003
【０１１９】
[比較例２]
実施例１において、表３に示したエタノール濃度の洗浄液（NaＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣlの濃度は一定）を用いる以外は、実施例１と同じ操作を行い、回収液中のＤＮＡ量と血球成分（ヘモグロビン）混入量を求める。
【０１２０】
【表３】
2005168355.tif 000004
【０１２１】
表４に、実施例１、比較例１および比較例２で測定した値を示す。
【０１２２】
【表４】
2005168355.tif 000005
【０１２３】
表４から、本発明の実施例１では、十分量のＤＮＡが回収でき、かつ血球成分(ヘモグロビン)の混入量が少ないことがわかる。
一方、比較例１では、血球成分(ヘモグロビン)の混入量は少ないが、ＤＮＡの回収量が十分でない。また、比較例２では、ＤＮＡの回収量は十分だが、血球成分(ヘモグロビン)の混入量が多い。