(57)【要約】【課題】高純度のイヌフォリスタチンを効率良く生産する。【解決手段】イヌの下垂体に作用して卵胞刺激ホルモンの基礎分泌を特異的に抑制し、黄体形成ホルモンの基礎分泌を抑制せず、アクチビンとの結合能を有しそのアンタゴニストとしての能力を有するイヌフォリスタチン、該イヌフォリスタチンをコードするDNA配列、該DNA配列を含む組換えベクター、該組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体、および該形質転換体を培養または飼育しイヌフォリスタチンを採取することを特徴とするイヌフォリスタチンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌの下垂体に作用して卵胞刺激ホルモンの基礎分泌を特異的に抑制し、黄体形成ホルモンの基礎分泌を抑制せず、アクチビンとの結合能を有しそのアンタゴニストとしての能力を有するイヌフォリスタチン。
【請求項２】
配列番号１もしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる請求項１に記載のイヌフォリスタチン。
【請求項３】
請求項１または２に記載のイヌフォリスタチンをコードするＤＮＡ配列。
【請求項４】
配列番号３、４もしくは５で表されるＤＮＡ配列、または該ＤＮＡ配列とハイブリダイズする請求項３記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
請求項３または４記載のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養または飼育し、イヌフォリスタチンを採取することを特徴とする、イヌフォリスタチンの製造方法。
【請求項８】
請求項６記載の形質転換体を培養した培養液中に含まれるイヌフォリスタチンを、陽イオン交換担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出させることを特徴とするイヌフォリスタチンの高純度製造方法。
【請求項９】
請求項８記載の溶出されたイヌフォリスタチンを含む溶液を、ヘパリン担体に接触させ、該担体への吸着物を溶出剤で溶出させることを特徴とするイヌフォリスタチンの高純度製造方法。
【請求項１０】
溶出剤が塩化ナトリウム溶液である請求項８または９に記載のイヌフォリスタチンの高純度製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の一次構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌフォリスタチンを遺伝子操作技術により量産し、以て動物用医薬品（肝疾患治療薬、腎疾患治療薬）とすることを目的とした、ＤＮＡ配列、組換えベクター、形質転換体、イヌフォリスタチン及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フォリスタチンは、分子量が約35,000〜32,000の糖蛋白質である。アミノ酸数が３１５個および２８８個のどちらのフォリスタチンもアクチビンとの結合能を有し、下垂体培養細胞の卵胞刺激ホルモン（FSH）産生を抑制する作用を有している。
【０００３】
尿細管由来のメーディン−ダーバイキャナインキドニー（Madin-Darby Canine kidney）(MDCK)細胞をＩ型コラーゲン内で培養すると嚢胞を形成するが、そこに肝細胞増殖因子(HGF)を添加すると管腔形成が見られる（非特許文献１）。しかし、本効果をアクチビンは濃度依存的に阻害した。またアクチビンのアンタゴニストとされるフォリスタチンはHGF非存在下でも管腔形成を誘導した。
【０００４】
遺伝子操作技術によりこれまで多くの種のフォリスタチン遺伝子が単離されており（非特許文献２）、例えばヒト（Homo sapiens）とマウス（Mus musculus）間で91%のホモロジーを有する。イヌのフォリスタチンcDNAクローニングの報告は未だない。
【０００５】
イヌの疾患には、急性肝炎様の肝疾患が知られ、多くの場合肝臓の機能障害が見られることが知られている。イヌの肝疾患では、ステロイド製剤や健康食品などが使用されているが、根本的な治療法は確立していない。
【０００６】
また、フォリスタチンの精製法としては、フォリスタチンと結合能を有するアクチビンAを適当な担体に架橋して作製したカラムによる精製法（非特許文献３）や電気泳動したゲルから直接タンパク質を調製する方法（非特許文献４）などがあるが、これらの方法は医薬品等の開発手段としては好ましくなく、より汎用で大量に精製可能な方法を確立する必要がある。
【非特許文献１】マエシマら：サイトカイングロースファクターレビュー（Cytokine Growth Factor Rev）.2001 12(4)289-98
【非特許文献２】シマサキら：プロセジャーナショナルアカデミーサイエンスオブアメリカ（Proc Natl Acad SciUSA.）1988. 85(12)4218-22
【非特許文献３】デ  ウィンター  ジェーピー（De Winter JP）ら：モレキュラー、セル・エンドクライノロジー（Mol Cell Endocrinol） 1996.116(1).105-114
【非特許文献４】ヨコヤマ（０．Yokoyama Y）ら：ジャーナル・クリニカル  エンドクライノロジー  メタボライズ（J Clin Endocrinol Metab） 1995.80(3).915-921
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、イヌのフォリスタチンを製造することにより、従来とは異なる作用によるイヌの肝疾患治療薬を提供することを目的とする。
【０００８】
すなわち、重度の肝疾患でその発現が高進していると予想されるアクチビンと結合し、アクチビンが誘導する細胞外マトリックスの産生や組織の線維化を阻害することにより、肝臓の再生および組織障害の遅延化を可能にしようとするものである。
また、培養液等から有用タンパク質を医薬品とする場合、目的の成分を精製で分離・分画することが重要な課題である。
【０００９】
従って、培養液中の不純物を含むイヌフォリスタチンを高純度で容易に分離・分画する方法を確立することができれば、医薬品等としての開発の途が開かれると期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するため、イヌフォリスタチンcDNAクローニングおよびそれを用いた大量生産を目的とし、創意工夫をなし、イヌのcDNAからネコフォリスタチンをコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、更にこれらを発現ベクターに連結したプラスミドを用いてイヌフォリスタチンを生産する細胞の作製に成功し、以って簡単に大量にイヌフォリスタチンを製造する方法を確立し、さらに２種のカラムクロマト担体を用いて高純度製造を可能にし、かくして本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、イヌの下垂体に作用して卵胞刺激ホルモンの基礎分泌を特異的に抑制し、黄体形成ホルモンの基礎分泌を抑制せず、アクチビンとの結合能を有しそのアンタゴニストとしての能力を有するイヌフォリスタチン、該イヌフォリスタチンをコードするDNA配列、該DNA配列を含む組換えベクター、該組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体、および該形質転換体を培養または飼育し、カラムクロマト精製により高純度なイヌフォリスタチンを採取することを特徴とするイヌフォリスタチンの製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
イヌフォリスタチンを高純度で容易に分離・分画する方法を確立することができれば、医薬品等としての開発の途が開かれると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のイヌフォリスタチンは、天然型および遺伝子組換え型のいずれをも包含するものであって、以下の(1)〜(3)の機能を有するものである。
(1)イヌの下垂体に作用して卵胞刺激ホルモンの基礎分泌を特異的に抑制する。
(2)黄体形成ホルモンの基礎分泌を抑制しない。
(3)アクチビンとの結合能を有しそのアンタゴニストとしての能力を有する。
【００１４】
ここで、アクチビンとの結合能を有するか否かは、アクチビンをラベルしたアクチビンのバインディング・アッセイによって確認することができる。なお、アクチビンはイヌ肝疾患において過剰発現するものと予想される。
【００１５】
イヌフォリスタチンのアミノ酸配列は常法により決定することができ、配列番号１および配列番号２の配列はその一例である。配列番号２の配列のＣ末端の２７アミノ酸残基を削除したものが配列番号１の配列となっている。上記の(1)〜(3)の機能が実質的に保持される限り、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失しても、他のアミノ酸に置換されても、あるいは１もしくは数個のアミノ酸が付加されてもよい。
【００１６】
本発明のイヌフォリスタチンをコードするDNA配列のうち好ましいものは、上記配列番号１または配列番号２をコードするものであり、特に配列番号３、４もしくは５で表されるDNA配列、またはこれらとハイブリダイズするDNA配列である。
【００１７】
本発明のイヌフォリスタチン蛋白質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（A）RNAを抽出した後、cDNAを合成し、マウスやヒトのフォリスタチンをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下PCRと略す）を行うことによって、イヌフォリスタチン活性を示す遺伝子をクローニングすることができる。また合成したcDNA組換え体よりファージライブラリーを作製し、PCRにより得られた２つの遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、イヌフォリスタチンをクローニングすることができる。
【００１８】
イヌの臓器や細胞、イヌの腎細胞由来のMDCKなどよりRNAを得る方法としては、通常の方法、例えばポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法があげられる。イヌ細胞からRNAを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後CsCl密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（シャーウイン（Chirgwin）ら：バイオケミストリー（Biochemistry）1979. 18. 5294-5304）、バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理した後フェノール抽出を行う方法（バーガー（Berger）ら：バイオケミストリー（Biochemistry） 1979. 18. 5143-49）、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理した後、塩化リチウムで処理してRNAを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選択して行うことができる。
【００１９】
得られたRNAから塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴdTセルロースカラム法等によりmRNAを単離し、得られたmRNAから逆転写酵素やプライマーによるDNAポリメラーゼを用いてcDNAを合成する。
【００２０】
このcDNAを鋳型として、マウスやヒトの塩基配列を基にしたプライマーを用いてPCRを行うことによりイヌフォリスタチン遺伝子をクローニングできる。また合成したcDNAをλファージベクターに連結した後、in vitroでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。λファージが感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークを適当なフィルターに転写し、予め標識したオリゴマーもしくはPCRで得られた遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションによりイヌフォリスタチン遺伝子をクローニングすることができる。
【００２１】
宿主としては原核生物もしくは真核生物を用いることができる。原核生物の例としては大腸菌を用いることができる。真核生物としては例えば、動物細胞や昆虫細胞などを使用することができる。
【００２２】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、ファージ、レトロウイルス等を使用できる。発現ベクター中のプロモーター及び薬剤選択マーカーは宿主細胞に依存して選択される。例えば細菌ではlacプロモーター、昆虫細胞ではバキュロウイルスプロモーター、動物細胞ではSV40プロモーター等である。また形質転換体の培養は常法に従って行うことができる。
【００２３】
産生されたイヌフォリスタチンは、還元条件下、SDS-PAGEを行うことにより、その分子量は約35,000〜32,000である。
【００２４】
本発明では、イヌフォリスタチンの精製に際し陽イオン交換担体を用いることが、より好ましくはさらに引き続いてヘパリン担体を用いることが重要である。両カラム担体を使用することで、より高純度のイヌフォリスタチンを得ることができる。
【００２５】
イヌフォリスタチンの分離・分画に使用される陽イオン交換担体ととしては、アガロース、セルロース、セファロース、合成ポリマーゲルなどに、親水性のスペーサーを介して、化学的に安定なエーテル結合によって陰イオン官能基を導入したものが挙げられる。好ましくは、SPセファロース（Sepharose）（Amersham-Pharmacia製）などが用いられる。また、ヘパリン担体としては、アガロース、セルロース、セファロース、合成ポリマーゲルなどに、親水性のスペーサーを介して、化学的に安定なエーテル結合によってヘパリン基を導入したものが挙げられる。好ましくは、ヘパリン  セファロース（Heparin Sepharose）（Amersham-Pharmacia製）などが用いられる。
【００２６】
本発明における精製工程では、イヌフォリスタチンを含む溶液を陽イオン交換担体、およびヘパリン担体に接触させ、担体への吸着物を溶出剤で溶出させる方法が好ましく採用される。
【００２７】
陽イオン交換担体からの溶出は、塩濃度を徐々に上昇させリガンドである陽イオン交換基とのイオン的相互作用を打ち消し、かつ吸着したタンパクのイオン強度の違いによって分離・分画することができる。また、ヘパリン担体からの溶出は、塩濃度を徐々に上昇させリガンドであるヘパリン基との特異的相互作用を打ち消し、分離・分画することができる。一般にフォリスタチンに限らずタンパク質を各種生産系で生産した場合、培養液中の培養液組成物や血清中のタンパク質など、不純物が混在する。これら成分からイヌフォリスタチンのみを分離することは容易でないと考えられる。本発明で使用される陽イオン交換担体およびヘパリン担体は、溶出剤の濃度の差により、培養液中の不純物からイヌフォリスタチンを分離・分画できる。
【００２８】
なお、陽イオン交換担体およびヘパリン担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、有用タンパク質各成分の量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００３０】
実施例１
イヌフォリスタチン遺伝子のクローニング
（１）イヌcDNAライブラリー調製
イヌ腎由来細胞MDCKを150cm２フラスコで３〜４日培養し、5×10７cellsの細胞沈殿物を調製した。メッセンジャーRNAアイソレーションキット（mRNA isolation kit）（Strtagene社）によりmRNAを調製した。すなわち、MDCKの沈殿物にグアニジン・チオシアネートを含む変性溶液（denaturing solution）を加え、21Gニードルで混入したDNAをせん断した。次に溶出液（elution buffer）を加え遠心を行い、その上清を得た。得られた上清をオリゴdTセルロースカラムにアプライし、カラムの洗浄を行った後、予め68℃に加温しておいた溶出液によりポリ（A）RNAを溶出した。次に得られたポリ(A)RNAを用いて、cDNA合成キット（cDNA Synthesis kit）（TOYOBO社）によりcDNAライブラリーを合成した。すなわちkitのマニュアルに従い、２本鎖cDNAを合成した。
【００３１】
（２）イヌフォリスタチン遺伝子のクローニング
ヒトフォリスタチンのN末端およびC末端の塩基配列（ウエノ（Ueno）ら：プロセジャーナショナルアカデミーサイエンスオブアメリカ（Proc Natl Acad SciUSA）.1984. 84. 8282-86）をもとに、配列番号６と配列番号７の２種類のプライマーをDNAシンセサイザーにて合成した。上記（１）のMDCKcDNAを0.5mLのマイクロチューブに１μLを入れ、各プライマー20pmol、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgSO４、25mM KCl、50μM各ｄＮＴＰ、KODを添加し、全量50μLとした。DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を60℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でBio-RAD社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約900bpのDNA断片を常法(モレキュラークローニングコールドスプリングハーバーラボラトリーズ（Molecular Cloning .Cold Spring Harbor Laboratory）.New York.1982)に従って調製した。
【００３２】
このDNA断片をpUC108（アマシャムファルマシア社）にDNA Ligation kit Ver.2を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同条件のPCRおよびEcoRＩおよびHindIIIによる制限酵素処理により確認し、ABI PRISM 377XL(Applied Biosystems)により、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンス法（BigDye Terminator Cycle Sequencing法）（モレキュラークローニングコールドスプリングハーバーラボラトリーズ（Molecular Cloning .Cold Spring Harbor Laboratory）.New York.1982）でイヌフォリスタチンと思われるDNAの塩基配列を決定した。この配列を配列番号３に示す。
【００３３】
（３）５’RACE法によるイヌフォリスタチン遺伝子５’末端のクローニング
（２）で得られたイヌフォリスタチンの部分塩基配列をもとに、配列番号８と配列番号９と配列番号１０の3種類のプライマーをDNAシンセサイザーにて合成した。上記（１）のMDCKmRNAを0.5mLのマイクロチューブに２μLを入れ、５’RACE kit(GIBCO社製)を用いてイヌフォリスタチンの５’側末端を含むDNAを調製した。すなわち、MDCKmRNAおよびRNaseを不活化するためのDEPC水、プライマー25pmol（配列番号８）を加え、70℃10分間処理した。次に氷上で１分間おき、10×PCR Buffer、25mM MgCl２、10mM dNTP、0.1M DTTをそれぞれ添加し42℃で１分加温した。次にスーパースクリプトII RT（SuperScriptIIRT）を添加し、さらに42℃で30分処理し続けて70℃15分処理して、cDNAへの逆転写を行った。最後にRNaseMixを加え37℃で20分処理を行ってRNAを分解した。こうして得られたサンプルを用いて、スピンカートッリッジ（Spin Cartridge）により逆転写されたcDNAの精製を行った。すなわち、結合溶液（Binding solution）(6M NaI)をサンプルに添加し、Spin cartridgeにセットした後13,000G、20秒遠心を行った。400μL wash bufferで洗浄を繰り返し、さらに70%エタノールで洗浄を加えた後、予め65℃に熱しておいた滅菌水を加えて13,000G、20秒遠心を加えた。溶出したサンプル10μL、DEPC処理水6.5μL、tailing Buffer5μL、2mMdCTP2.5μLを混合し、94℃、3分処理した後、氷上で1分静置した。次に５’RACE kit(GIBCO社製)のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase）1μLを加え、３７℃10分処理し、さらに65℃、10分処理して、後述のアダプタープライマーと塩基配列が相補的な塩基配列を前記ｃDNA５’末端に付加させた。得られたサンプルを用いて、プライマー20pmol（配列番号９）およびアダプタープライマー20pmol、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgSO４、25mM KCl、50μM各ｄＮＴＰ、KODを添加し、全量50μLとした。DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を62〜50℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でBio-RAD社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。得られたPCR産物を用いてプライマー20pmol（配列番号10）およびアダプタープライマー20pmol、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgSO４、25mM KCl、50μM各ｄＮＴＰ、KODを添加し、全量50μLとした。DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を62〜50℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でBio-RAD社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約400bpのDNA断片を常法に従って調製した。
【００３４】
このDNA断片をpUC108（アマシャムファルマシア社）にDNA Ligation kit Ver.2を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ABI PRISM 377XL(Applied Biosystems)により、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法で５’末端を含むイヌフォリスタチンのDNAの一部と推定される塩基配列を決定した。
【００３５】
（４）３’RACE法によるイヌフォリスタチン遺伝子３’末端のクローニング
（２）で得られたイヌフォリスタチンの部分塩基配列をもとに、配列番号１１と配列番号１２の２種類のプライマーをDNAシンセサイザーにて合成した。上記（１）のMDCKmRNAを0.5mLのマイクロチューブに２μLを入れ、３’RACE kit(GIBCO社製)を用いてイヌフォリスタチンの３’側末端を含むDNAを調製した。すなわち、MDCKmRNAおよびRNaseを不活化するためのDEPC水、プライマー25pmol（配列番号１１）を加え、70℃10分間処理した。次に氷上で１分間おき、25mM MgCl２、10mM dNTP、0.1M DTTをそれぞれ添加し42℃で１分加温した。次にスーパースクリプトIIRT（SuperScriptIIRT）を添加し、さらに42℃で30分処理し続けて70℃15分処理して、cDNAへの逆転写を行った。最後にRNaseMixを加え37℃で20分処理を行ってRNAを分解した。こうして得られたサンプルを用いて、スピンカートリッジ（Spin Cartridge）により逆転写されたcDNAの精製を行った。すなわち、結合溶液（Binding solution）(6M NaI)をサンプルに添加し、スピンカートリッジ（Spin cartridge）にセットした後13,000G、20秒遠心を行った。400μL 洗浄緩衝液（wash buffer）で洗浄を繰り返し、さらに70%エタノールで洗浄を加えた後、予め65℃に熱しておいた滅菌水を加えて13,000G、20秒遠心を加えた。溶出したサンプル50μL、DEPC処理水6.5μL、tailing Buffer5μL、2mMdCTP2.5μLを混合し、94℃、3分処理した後、氷上で1分静置した。次に３’RACE kit(GIBCO社製)のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase）1μLを加え、３７℃10分処理し、さらに65℃、10分処理して、後述のアダプタープライマーと塩基配列が相補的な塩基配列を前記ｃDNA３’末端に付加させた。得られたサンプルを用いて、プライマー20pmol（配列番号１２）およびアダプタープライマー20pmol、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgSO４、25mM KCl、50μM各ｄＮＴＰ、KODを添加し、全量50μLとした。DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を62〜50℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でBio-RAD社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約400bpのDNA断片を常法に従って調製した。
【００３６】
このDNA断片をpUC108（アマシャムファルマシア社）にDNA Ligation kit Ver.2を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ABI PRISM 377XL(Applied Biosystems)により、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法で３’末端を含むイヌフォリスタチンのDNAの一部と推定される塩基配列を決定した。
【００３７】
（５）イヌフォリスタチンのcDNA配列
上記の（２）、（３）および（４）により、決定された塩基配列をつき合わせて、イヌフォリスタチンのcDNA完全配列が明らかになった（配列番号５）。
【００３８】
得られた得られたイヌフォリスタチン遺伝子のホモロジー検索の結果、ウマ（Equus caballus）：95%、ヒツジ（O aries）：94%、ブタ（Porcine）：92%、ヒト（Homo sapiens）：93%、ラット（Rattus norvegicus）：92%、マウス（Mus musculus）：92%であった。
【００３９】
実施例２
イヌフォリスタチンの生産
（１）イヌフォリスタチン組換えウイルスの調製
発現ベクターpVL1392を制限酵素BglII及びEcoRＩで切断し、ウシ由来アルカリフォスファターゼで末端を脱リン酸化し、調製した。一方、イヌフォリスタチンDNA断片は配列番号８と配列番号９の２種類の切断部位(BglII及びEcoRＩ)を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したイヌフォリスタチンDNAを鋳型として、DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を60℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でBio-RAD社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。エタノール沈殿後、制限酵素で切断し、１％アガロースゲル電気泳動にて約１kbpのDNA断片を調製した。
【００４０】
このDNA断片をT4 ポリヌクレオチドキナーゼ（polynucleotide kinase）によりリン酸化した後、pVL1392にDNA Ligation kit Ver.2を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌に形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドとAcNPVと共に昆虫細胞Sf9に常法に従いコトランスフェクション（co-transfection）を行い、イヌフォリスタチンを発現する組換えウイルスを得た。
【００４１】
さらに、作製した発現プラスミド中のイヌフォリスタチンDNAの塩基配列を確認した。
【００４２】
（２）昆虫細胞Ｓｆ９でのイヌフォリスタチンの発現
上記（１）で得られた組換えウイルスを27℃下培養したSf9に感染させた。27℃下５日間培養し、培養上清を回収した後2,000G,10分遠心しその上清を回収した。
【００４３】
（３）イヌフォリスタチンの活性測定
上記（２）で生産されたイヌフォリスタチンの活性測定は以下のようにして行った。K562細胞を用いてアクチビンAによるヘモグロビン放出作用の抑制を確認した(モレキュラークローニングコールドスプリングハーバーラボラトリーズ（Molecular Cloning .Cold Spring Harbor Laboratory）.New York.1982)。
【００４４】
96穴プレートにK562細胞（2×10５cells/mL）を、10%FBSを含むRPMI-1640培地により、アクチビンA非存在下または存在(20ng/mL)下、イヌフォリスタチン非存在下または存在下４日間培養を行った。次に細胞をPBSにより２回洗浄し、滅菌した水50uLに懸濁し、遠心操作により上清画分40μLを得た。得られた上清に0.5mg/mL O-フェニレンジアミン と0.03%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液200μLを加え、暗下15分処理した。その後2.5M硫酸を50μL加え、490nmの吸光度の測定を行った。その結果、イヌフォリスタチン存在下有意にヘモグロビン産生の抑制が見られた（図１）。
【００４５】
実施例３
イヌフォリスタチンの精製法
（１）陽イオン交換担体によるイヌフォリスタチンの精製
実施例２（２）で得られた培養上清を、予め20mMリン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換担体であるSP Sepharoseに導入し、再度20mMリン酸緩衝液を用いて洗浄を行った。次に０〜１Ｍ塩化ナトリウムを含有する20mMリン酸緩衝液を用いてステップワイズ法による溶出を行い得られた溶出液を用いてイムノブロッティング並びに実施例２（３）による方法で活性測定を行ったところ、0.5M塩化ナトリウムを含む画分でイヌフォリスタチンを検出した。
【００４６】
（２）ヘパリン担体によるイヌフォリスタチンの精製
上記で得られた溶出液を、予め0.2M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液で平衡化したヘパリン担体に導入し、再度0.2M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液を用いて洗浄を行った。次に0.2M〜１Ｍ塩化ナトリウムを含有する20mMリン酸緩衝液を用いてステップワイズ法による溶出を行い得られた溶出液を用いてイムノブロッティング並びに実施例２（３）による方法で活性測定を行ったところ、0.８M塩化ナトリウムを含む画分でイヌフォリスタチンを検出した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、イヌのフォリスタチンを製造することにより、従来とは異なる作用によるイヌの肝疾患治療薬を提供することを目的とする。
【００４８】
イヌフォリスタチンを高純度で容易に分離・分画する方法を確立することができれば、医薬品等としての開発の途が開かれると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、イヌフォリスタチンを用いたアクチビンAによるヘモグロビン放出作用の抑制を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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