(57)【要約】      （修正有）【課題】急性白血病細胞に対する新たな標的遺伝子に対する細胞死誘導体とその製造方法を提供する。【解決手段】エクソン塩基配列を補完するエクソン補完塩基配列と、イントロン塩基配列を補完するイントロン補完塩基配列と、のすべて又は一部を有する細胞死誘導体であって特定の塩基配列を補完する塩基配列を有する細胞死誘導体。Ａｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓの投与に伴って特定の塩基配列のメッセンジャーＲＮＡの発現が特異的に消失することを示され、上記特定塩基配列で示されるメッセンジャーRNAを標的として合成したｓｉＲＮＡにより前記メッセンジャーRNAの発現が特異的に消失した際に、白血病細胞の生存および増殖が著しく阻害されることを見出した。【選択図】図１
2005095084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクソン塩基配列を補完するエクソン補完塩基配列と、イントロン塩基配列を補完するイントロン補完塩基配列と、のすべて又は一部を有する細胞死誘導体であって配列表１に示す塩基配列を補完する塩基配列を有する細胞死誘導体。
【請求項２】
前記メッセンジャーＲＮＡは、哺乳類細胞の急性白血病細胞の生存および増殖に関わる請求項１に記載の細胞死誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性白血病細胞の生存および増殖に必須な超微量融合メッセンジャーＲＮＡの発現を阻止する細胞死誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病細胞の生存および増殖には多数の遺伝子が複雑に関与している。これらの遺伝子の中には塩基配列が同定されるに至ったものもあるが、今もって全ての遺伝子が同定されたわけではない。白血病細胞の生存や増殖に関わる遺伝子をあまねく同定していくことは、これらの遺伝子発現を特異的に抑制することを目的とした遺伝子療法、例えばアンチセンス療法（=目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を持つアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを投与することで、目的遺伝子の発現を特異的に抑制することを特徴とした治療法）などの開発において極めて重要である。
【０００３】
慢性白血病においてはその責任遺伝子とされる癌遺伝子ｂｃｒ−ａｂｌを標的としたアンチセンス療法の有効性が報告され臨床応用の可能性も検討されている。また白血病とは異なる造血器腫瘍であるリンパ腫においては、責任遺伝子とされる癌遺伝子ｂｃｌ−２を標的としたアンチセンス療法がすでに臨床試験の成果を挙げている。
【０００４】
これに対して急性白血病の治療における有効な遺伝子標的はいまだ確立されていない。請求者らのグループも、サイクリックＡＭＰ応答エレメント結合蛋白（ＣＲＥＢ）に対して相補的な配列を持つ合成アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓ）が、白血病細胞の増殖を特異的に抑制することを見出し、その塩基配列、およびこれを白血病治療に使用することを特徴とする白血病治療法に関して特許を出願した（特許平１１−１０３８６０）。しかしＡｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓの標的遺伝子がＣＲＥＢ自身ではないことは請求者らのグループがすでに明らかにしており（参考文献１）、顕著な生物学的効果にもかかわらずＡｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓの標的遺伝子は明らかにされていない。
【特許文献１】特許平１１−１０３８６０
【非特許文献１】Ｌｅｕｋｅｍｉａ  (２００１)１５，２３８―２４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は急性白血病細胞に対する新たな標的遺伝子に対する細胞死誘導体とその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本件発明は、エクソン塩基配列を補完するエクソン補完塩基配列および、イントロン塩基配列を補完するイントロン補完塩基配列、の全部もしくは一部を有する細胞死誘導体であって、配列表１に示す塩基配列を有する塩基配列の全部もしくは一部を補完する細胞死誘導体である。
【０００７】
本発明者らは、抗白血病効果を持つオリゴデオキシリボヌクレオチドとして特許を取得している「ＣＲＥＢに対する合成アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓ）」の標的が、配列表１のメッセンジャーＲＮＡにほかならないこと、即ちＡｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓの投与に伴って配列表１のメッセンジャーＲＮＡの発現が特異的に消失することを示すとともに、配列表１のメッセンジャーRNAを標的として合成したｓｉＲＮＡ（これは従来のＣＲＥＢメッセンジャーＲＮＡには存在せず、配列表１を部分に含むメッセンジャーＲＮＡにのみ存在する配列を標的として合成した）により前記メッセンジャーRNAの発現が特異的に消失した際に、白血病細胞の生存および増殖が著しく阻害されることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の請求項１または２に記載の細胞死誘導体によれば、有効な標的遺伝子が発見されていない急性白血病の治療における遺伝子の配列の一部を見つけることができ、また、急性白血病細胞の細胞レベルでの細胞の死に至らしめることを確認し、急性白血病治療における進展が見込まれる、という効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について、図を用いて説明する。なお、本発明は、これら実施様態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
【００１０】
実施形態１は主に請求項１に関する。
【００１１】
実施形態２は主に請求項２に関する。
【００１２】
≪実施形態１≫
【００１３】
<実施形態１の構成>
【００１４】
実施形態１は、エクソン補完塩基配列と、イントロン補完塩基配列と、のすべて又は一部を有する細胞死誘導体であって、配列表１に示す塩基配列を補完する塩基配列を有する細胞死誘導体。
【００１５】
<実施形態１の構成の説明>
【００１６】
「エクソン補完塩基配列」は、エクソン塩基配列を補完する。すなわち、エクソン塩基配列に相補的である配列である。
【００１７】
「イントロン補完塩基配列」は、ＤＮＡ上の前記エクソン塩基配列以外の塩基部分であるイントロン塩基配列を補完する。すなわち、イントロン塩基配列に相補的である配列である。また、エクソンと、イントロンという呼び名は、本特許出願時点でのＤＮＡ配列に与えられている呼称とする。
【００１８】
本実施形態の「細胞死誘導体」は、「エクソン補完塩基配列」と、「イントロン補完塩基配列」からなり、スプライシング機序を介さずにメッセンジャーＲＮＡが、シス（=同一遺伝子内）またはトランス（=異なる遺伝子間）にエクソン塩基配列とイントロン塩基配列が融合（または接合）することで新たに生成されたメッセンジャーＲＮＡを標的遺伝子とする。また、この細胞死誘導体の塩基配列は、前記新たに生成されたメッセンジャーＲＮＡの接合部を含む全部又は部分であってもよい。また、細胞死誘導体は、前記メッセンジャーＲＮＡの接合部が複数ある場合には、その全部又は部分であってもよく、部分である場合には、その接合部を一又は二以上を含み、さらに、複数個からなってよい。
【００１９】
「細胞死誘導体」は、核酸類似体、ｓｉＲＮＡ、合成アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよく、前記新たに精製されたメッセンジャーＲＮＡの接合部を含む全部又は部分であってもよい。
【００２０】
前記細胞死誘導体は、（１）合成アンチセンスオリゴヌクレオチドと、（２）ｓｉＲＮＡと、（３）アンチセンスメッセージ発現ベクターと、などが含まれる。また、前記（１）の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドには、（ａ）ホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドと、（ｂ）ＰＮＡ（＝Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）と、（ｃ）モリフォリオリゴヌクレオチド、などが含まれる。
【００２１】
前記細胞死誘導体が標的とする「標的遺伝子」は、一例をあげれば、ヒトゲノムのイントロンに多数含まれるＡｌｕ  ｅｌｅｍｅｎｔを含む融合メッセージである。
【００２２】
「配列表１に示す塩基配列」は、cAMP response element-binding protein(ＣＲＥＢ)と、Ａｌｕ  ｅｌｅｍｅｎｔの融合メッセージである。ＣＲＥＢとは、ｃＡＭＰを介するシグナルに依存して転写を活性化する因子である。血液細胞の機能発現においても重要であり、さまざまな細胞の増殖と死の制御に関わっている。また、Ａｌｕ  ｅｌｅｍｅｎｔは、ヒトゲノムに繰り返し現れる３００ｂｐ程度の特徴的配列である。
【００２３】
前記「配列表１に示す塩基配列」は、ＣＲＥＢのｅｘｏｎ３の途中からｉｎｔｒｏｎ４のＡｌｕ  ｅｌｅｍｅｎｔに接合する融合メッセージである。
【００２４】
（（アンチセンスオリゴヌクレオチド））
【００２５】
この細胞死誘導体のひとつである合成アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド(Ａｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓ)による配列表１のメッセンジャーＲＮＡの特異的な発現消失をもたらす。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗白血病効果を有するものである。
【００２６】
（試験例１）
【００２７】
以下、試験例を通じて、細胞死誘導体の一であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果について詳述する。
【００２８】
ＨＬ−６０細胞（組織学的にはＦＡＢ分類のＭ２型である分化傾向を伴う腫瘍細胞で、急性白血病の中では比較的高頻度に見られる）は１０％牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。継代は３日ごとに７．５ｘ１０4／ｍｌの密度に細胞を希釈して調製した。
【００２９】
対数増殖期にある細胞を遠心濃縮し、１ｘ１０6／ｍｌの密度で５ｍｌの血清添加培地に浮遊させ、ここにＣＲＥＢに対する合成アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド(Ａｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓ)またはＣＲＥＢの合成センスオリゴデオキシリボヌクレオチドを各８０μｇ／ｍｌ、およびコントロールとしてバッファー１００μｌを添加し、３７度の５％炭酸ガス培養装置で５時間培養した。その後５ｍｌの血清非添加培地を添加し、さらに１５時間培養した後に細胞からメッセンジャーＲＮＡを調製した。
【００３０】
こうして調製されたメッセンジャーＲＮＡを鋳型として逆転写酵素反応を行いｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡを調製し、これを鋳型としてｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒｓ（配列２と配列３、および配列４と配列５）を用いて入れ子型ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応産物はアガロースゲル電気泳動法で検出した。結果は図１に示すように、約３００塩基対のＰＣＲ産物が検出され(ｌａｎｅ  ４)、その発現はセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの投与では変化はなかたが(ｌａｎｅ  ６)、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの投与により消失した(ｌａｎｅ  ５)。またこの産物をアガロースゲルより抽出して塩基配列をDNAシークエンサーで決定したところ、配列表１に示したごとく塩基配列が決定された。
【００３１】
以上より、配列表１のメッセンジャーＲＮＡがＡｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓの真の標的であることが証明された。
【００３２】
さらに配列表１のメッセンジャーＲＮＡの塩基配列をヒトゲノムの塩基配列情報を照合した結果、このメッセンジャーＲＮＡはＣＲＥＢ遺伝子の第２番目のエキソン（=遺伝子領域内でメッセンジャーＲＮＡのコードに寄与する領域）と第４番目のイントロン（=遺伝子領域内でメッセンジャーＲＮＡの前駆体のコードに寄与するがメッセンジャーＲＮＡの成熟過程で除去される領域）とが融合（接合）したものであることが判明した。しかもこの融合は、従来のＲＮＡ接合に関わる機序であるスプライシング（=メッセンジャーＲＮＡ前駆体からイントロンを除去してエキソン同志を接合していく過程）では説明のできないものであることも判明した。
【００３３】
また配列表１のメッセンジャーＲＮＡの発現量は、一般の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡに比して超微量であり（例えば従来のＣＲＥＢのメッセンジャーのＲＮＡは１回の単純なPCR反応で検出されるが、配列表１のメッセンジャーＲＮＡは入れ子型の２段階ＰＣＲ反応により始めて検出される）、このことがＣＲＥＢメッセンジャーの発現が影響を受けない状況においても配列表１のメッセンジャーＲＮＡの発現が消失した原因であると考えられた。
以上より、抗白血病効果を持つ合成アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド(Ａｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓ)の真の標的であるメッセンジャーＲＮＡの同定および白血病細胞における発現の確認、Ａｓ−ＣＲＥＢ−ＯＤＮｓによる発現抑制、このメッセンジャーＲＮＡの発現量（=超微量）および生成機序（=従来の機序では説明ができない）における特徴的な点が確認された。
【００３４】
（（ｓｉＲＮＡ））
【００３５】
また、細胞死誘導体はｓｉＲＮＡであってよく、ｓｉＲＮＡの添加により、抗白血病効果を示す。
【００３６】
以下、ｓｉＲＮＡの添加による白血病細胞の生存および増殖の阻害の試験例について詳述する。
【００３７】
（試験例２）
【００３８】
ＨＬ−６０細胞を１０％牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。継代は３日ごとに７．５ｘ１０4／ｍｌの密度に細胞を希釈して調製した。
【００３９】
対数増殖期にある細胞を４ｘ１０4／ｍｌの密度に希釈し、ここから１ｍｌをとって２４穴細胞培養皿に移し、ｓｉＲＮＡ(配列６)、またはその変異体の２本鎖ＲＮＡ（配列７）を８０μｇ／ｍｌずつ添加し、３７度の５％炭酸ガス培養装置で培養し、３日後に生存細胞の数をカウントした。実験は独立して３回施行し、それらのデータを統計的解析した。結果は図２に示すように、ｓｉＲＮＡの添加に依存して細胞死が誘導され、細胞増殖も有意に低下した。
【００４０】
なお、図４における変異ｓｉＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡの塩基配列の一部を変異させたものでありｓｉＲＮＡとの比較のために作成した。
【００４１】
また、図３には、エクソンとイントロンの接合部の配列を用いてｓｉＲＮＡを作成していることを模式的に示している。
【００４２】
（（アンチセンス発現ベクター））
また、細胞死誘導体は、アンチセンス発現ベクターの導入による白血病細胞の生存および増殖の阻害により、その効果を確認されている。以下、試験例を詳述する。
【００４３】
（試験例３）
【００４４】
まず配列表１のメッセンジャーＲＮＡに対して相補的な塩基配列を持つアンチセンスメッセージの発現ベクターを構築する。具体的には、配列表１のメッセンジャーＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により相補的ＤＮＡ(＝ｃＤＮＡ)を合成し、これを哺乳類細胞用発現ベクターのマルチクローニング部位に逆向きに挿入する。こうして構築されたアンチセンス発現ベクターをＨＬ−６０細胞に電気穿孔法やリポソーム法などの遺伝子導入技術を用いて導入し、ベクターに共存する薬剤耐性マーカー遺伝子に応じて薬剤選択を行うことで、安定にアンチセンスメッセージを発現する細胞株を取得した。
【００４５】
こうして得られたアンチセンスメッセージを安定に発現した細胞における増殖能をコントロール細胞（=空ベクターだけを導入した細胞）と比較して追跡したところ、前者において有意な増殖性の低下が観察された。ここではとくに、培地へ亜鉛イオンを添加することでアンチセンスメッセージの発現が促進される様に工夫されたベクターシステムを用いているため、亜鉛イオン濃度に依存した細胞増殖性の低下が確認された。（図6）
【００４６】
<実施形態１の効果>
【００４７】
実施形態１によって、これまで、エクソンからなる遺伝子に対する細胞死誘導体以外に、エクソンとイントロンからなる新しいメッセンジャーＲＮＡを補完する細胞死誘導体により、メッセンジャーＲＮＡの発現制御をより幅広く行うことが可能になった。とくに、本実施形態にかかげるメッセンジャーＲＮＡを標的遺伝子とする細胞死誘導体は、基礎医学から臨床医学にいたる幅広い分野において新しい治療方法を生み出すことができる。
【００４８】
≪実施形態２≫
【００４９】
<実施形態２の構成>
【００５０】
実施形態２は、実施形態1を基本として、特徴点は、前記メッセンジャーＲＮＡは、哺乳類細胞の急性白血病細胞の生存および増殖に関わる点にある。
【００５１】
<実施形態２の構成の説明>
【００５２】
実施形態２のメッセンジャーＲＮＡは、哺乳類の急性白血病細胞の生存および増殖に関わる。なお、哺乳類には、ヒト、サルなどの霊長類も含むものとする。また、急性白血病の生存および増殖に関わるとは、シグナル伝達、遺伝子転写、その他、生存および増殖のメカニズムに関わるという意である。また、急性白血病細胞とは、株として樹立された細胞と、人体の中にある細胞、その他すべてを含む。
（配列表）
<１１０>  Michio Sasaki； International Medical Center of Japan
<１２０>  急性白血病細胞死誘導体
<１６０>  ７
<２１０>  １
<２１１>  ４５６
<２１２>  ＲＮＡ
<２１３>  mammalian
<４００>  １
tggccccggg  cggctgggag  aagcggagtg  ttggtgagtg  acgcggcgga  ggtgtagttt    60
gacgcggtgt  gttacgtggg  ggagagaata  aaactccagc  gagatccggg  ccgtgaacga    120
aagcagtgac  ggaggagctt  gtaccaccgg  taactaaatg  accatggaat  ctggagccga    180
gaaccagcag  agtggagatg  cagctgtaac  agaagctgaa  aaccaacaat  tgacagttca    240
agaccagcct  gggcaacata  gcaagaccct  gtctctacaa  aaaaattaaa  aattagctgg    300
gagtggtagt  gcatgcctgc  aatcccagct  aactcaggag  gttgagtcgt  gaggatccct    360
tgagcccatg  agtttgaggc  tgcagtgggc  tgtgatcgca  ccactgcact  ccagcctcgg      420
tgagtgagtg  agatcctgtc  tctcaaaaaa  aaaaaa                              457
<２１０>  ２
<４００>  ２
ggagagaata  aaactccag          19
<２１０>  ３
<４００>
gagagacagg  atctcactca  c       21
<２１０>  ４
<４００>
ccgggccgtg  aacgaaagc          19
<２１０>  ５
<４００>
gaggctggag  tgcagtggtg          20
<２１０>  ６
<４００>
aaugacaguu  caagaccagc  c      21
<２１０>  ７
<４００>
aaugacaguu  gaacaggacc  c      21
【産業上の利用可能性】
【００５３】
造血器腫瘍ほかさまざまな腫瘍の遺伝子治療技術分野への適用が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】非スプライシング機序によるCREB/Alu融合メッセージの発現とアンチセンスCREBによる発現の消失を示す図
【図２】融合メッセージＲＮＡの模式図
【図３】ｓｉＲＮＡの模式図
【図４】siRNAによるCREB/Alu融合メッセージのノックダウンの効果を示す図
【図５】導入したアンチセンスメッセージ発現ベクターを示す図
【図６】アンチセンスメッセージの導入よる CREB/Alu融合メッセージのノックダウンの効果を示す図
【図１】
2005095084.tif 000003
【図２】
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【図３】
2005095084.tif 000005
【図４】
2005095084.tif 000006
【図５】
2005095084.tif 000007
【図６】
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