(57)【要約】【課題】本発明の課題は、予後の悪い甲状腺濾胞癌と、甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを採取するための方法およびキットを提供することである。【解決手段】被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集する方法であって、(1)前記被験者から採取された甲状腺標本からRNAを調製し、(2)前記RNA中に含まれる、甲状腺癌の判別に役立つ100個の予測遺伝子群より選択される少なくとも20遺伝子の発現量を測定し、且つ、(3)前記遺伝子群の発現量から、甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを得る、上記過程を具備する方法が、本発明により提供された。【選択図】図１
2005168432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集する方法であって、
(1)前記被験者から採取された甲状腺標本からRNAを調製し、
(2)前記RNA中に含まれる以下のRefSeqのID番号、GenBankアクセッション番号または配列表の配列番号（SEQ.ID.No）記載の遺伝子群より選択される少なくとも20遺伝子の発現量を測定し、
gi|21629138|gb|AC046135.15|AC046135、NM_025113、NM_003226、NM_032413、NM_014851、NM_022664、NM_006595、gi|24635989|gb|AC021573.10|AC021573、NM_016322、NM_022845、L22214、NM_024591、NM_024045、SEQ.ID.No1、NM_016135、NM_033255、SEQ.ID.No2、NM_153649、NM_174881、M73554、NM_002107、NM_003016、NM_000268、NM_004591、NM_032327、gi|4731044|gb|AC005841.3|AC005841、NM_001268、NM_014220、NM_001273、NM_145690、NM_005566、NM_002999、NM_021134、NM_001833、NG_001019、NM_001312、U90441、NM_002467、NM_012198、NM_002773、X60708、gi|23396328|gb|AC116447.10|AC116447、NM_148416、NM_003186、NM_025382、NM_178148、NM_014873、NM_016339、NM_015922、NM_005952、NM_005517、NM_014365、NM_004999、SEQ.ID.No3、NM_0182931、NM_006516、NM_001642、Y00503、NM_177526、NM_024640、NM_003235、NM_006640、NM_033281、U65092、NM_006243、NM_004448、NG_002765、NM_181492、NM_004960、NM_006765、gi|7408084|gb|AC009948.3|AC009948、NM_000362、NM_006432、NM_176783、NM_016946、M15036、NM_032508、AY007685、D26070、NM_015455、NM_001551、NM_182471、NM_006565、NM_003878、NG_001019、gi|23621912|gb|AC008581.11|AC008581、NG_001019、NM_145792、NM_003040、NM_014757、NM_004896、NM_000302、NM_031298、NM_000982、NM_003190、NM_004926、NM_006330、NM_000396、NM_181642、NM_022778：且つ
(3)前記遺伝子群の発現量から、甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを得る、上記過程を具備する方法。
【請求項２】
前記遺伝子の発現量は、前記遺伝子群のうちの20遺伝子の発現量であり、該20遺伝子は、
gi|21629138|gb|AC046135.15|AC046135、NM_025113、NM_003226、NM_032413、NM_014851、NM_022664、NM_006595、gi|24635989|gb|AC021573.10|AC021573、NM_016322、NM_022845、L22214、NM_024591、NM_024045、SEQ.ID.No1、NM_016135、NM_033255、SEQ.ID.No2、NM_153649、NM_174881、M73554であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子の発現量をPCRに基づく方法によって定量することを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記甲状腺濾胞癌と前記甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータは、重み付け投票（Weighted Voting）アルゴリズムでの計算式を使用して予測されることを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項５】
被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するためのキットであって、以下のRefSeqのID番号、GenBankアクセッション番号または配列表の配列番号（SEQ.ID.No）の遺伝子群から選択される少なくとも20遺伝子を増幅可能であり、かつ定量可能なプライマーを含むことを特徴とするキット。
gi|21629138|gb|AC046135.15|AC046135、NM_025113、NM_003226、NM_032413、NM_014851、NM_022664、NM_006595、gi|24635989|gb|AC021573.10|AC021573、NM_016322、NM_022845、L22214、NM_024591、NM_024045、SEQ.ID.No1、NM_016135、NM_033255、SEQ.ID.No2、NM_153649、NM_174881、M73554、NM_002107、NM_003016、NM_000268、NM_004591、NM_032327、gi|4731044|gb|AC005841.3|AC005841、NM_001268、NM_014220、NM_001273、NM_145690、NM_005566、NM_002999、NM_021134、NM_001833、NG_001019、NM_001312、U90441、NM_002467、NM_012198、NM_002773、X60708、gi|23396328|gb|AC116447.10|AC116447、NM_148416、NM_003186、NM_025382、NM_178148、NM_014873、NM_016339、NM_015922、NM_005952、NM_005517、NM_014365、NM_004999、SEQ.ID.No3、NM_0182931、NM_006516、NM_001642、Y00503、NM_177526、NM_024640、NM_003235、NM_006640、NM_033281、U65092、NM_006243、NM_004448、NG_002765、NM_181492、NM_004960、NM_006765、gi|7408084|gb|AC009948.3|AC009948、NM_000362、NM_006432、NM_176783、NM_016946、M15036、NM_032508、AY007685、D26070、NM_015455、NM_001551、NM_182471、NM_006565、NM_003878、NG_001019、gi|23621912|gb|AC008581.11|AC008581、NG_001019、NM_145792、NM_003040、NM_014757、NM_004896、NM_000302、NM_031298、NM_000982、NM_003190、NM_004926、NM_006330、NM_000396、NM_181642、NM_022778
【請求項６】
被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するためのキットであって、以下のRefSeqのID番号、GenBankアクセッション番号または配列表の配列番号（SEQ.ID.No）の遺伝子群から選択される少なくとも20遺伝子を検出可能なプローブが固定化されたアレイを含むことを特徴とするキット。
gi|21629138|gb|AC046135.15|AC046135、NM_025113、NM_003226、NM_032413、NM_014851、NM_022664、NM_006595、gi|24635989|gb|AC021573.10|AC021573、NM_016322、NM_022845、L22214、NM_024591、NM_024045、SEQ.ID.No1、NM_016135、NM_033255、SEQ.ID.No2、NM_153649、NM_174881、M73554、NM_002107、NM_003016、NM_000268、NM_004591、NM_032327、gi|4731044|gb|AC005841.3|AC005841、NM_001268、NM_014220、NM_001273、NM_145690、NM_005566、NM_002999、NM_021134、NM_001833、NG_001019、NM_001312、U90441、NM_002467、NM_012198、NM_002773、X60708、gi|23396328|gb|AC116447.10|AC116447、NM_148416、NM_003186、NM_025382、NM_178148、NM_014873、NM_016339、NM_015922、NM_005952、NM_005517、NM_014365、NM_004999、SEQ.ID.No3、NM_0182931、NM_006516、NM_001642、Y00503、NM_177526、NM_024640、NM_003235、NM_006640、NM_033281、U65092、NM_006243、NM_004448、NG_002765、NM_181492、NM_004960、NM_006765、gi|7408084|gb|AC009948.3|AC009948、NM_000362、NM_006432、NM_176783、NM_016946、M15036、NM_032508、AY007685、D26070、NM_015455、NM_001551、NM_182471、NM_006565、NM_003878、NG_001019、gi|23621912|gb|AC008581.11|AC008581、NG_001019、NM_145792、NM_003040、NM_014757、NM_004896、NM_000302、NM_031298、NM_000982、NM_003190、NM_004926、NM_006330、NM_000396、NM_181642、NM_022778
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するための方法に関する。更に本発明は、甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺癌は発見が比較的容易な癌であり、術後治癒率は90％以上であって予後は極めて良好である。その組織型には乳頭癌、濾胞腺癌、濾胞腺腫があり、その中で甲状腺濾胞癌は悪性であるために手術により摘出する必要がある。一方濾胞腺腫は良性であって摘出する必要性に乏しい。なお甲状腺癌に関する一般的知見は、例えばShermanらによって総説（非特許文献１）としてまとめられている。
【０００３】
上記のような予後の差から、甲状腺濾胞癌と良性の濾胞腺腫とを術前に区別することは非常に重要である。しかし、穿刺吸引細胞診や超音波を用いた診断技術は近年向上しているにもかかわらず、両者を術前に区別することはいまだに困難である。よって濾胞癌を正確に診断する目的に資する新たな技術が提供されたら不必要な外科手術を避けることが可能となるために、その臨床上の有用性は高いと考えられる。
【０００４】
これまでの知見としては、抗体染色を利用した免疫学的な方法により甲状腺癌の診断を試みたという報告（非特許文献２）、gelectin-3の遺伝子発現を指標として甲状腺癌の診断を試みたという報告（非特許文献３）、甲状腺癌においてマイクロアレイを用いて遺伝子発現のプロファイリングを行った報告（非特許文献４）、肝細胞増殖因子受容体、メタロプロテイナーゼやフィブロネクチンなどが甲状腺癌においてアプレギュレートされていることをマイクロアレイで解析した報告（非特許文献５）などがある。しかし、いずれの技術もまだ一般化されるには至っていない。
【０００５】
【非特許文献１】Sherman SI, Lancet (2003) Vol.361, pp501-511
【非特許文献２】Bartolazzi A.et al., Lancet (2001) Vol.357, pp1644-1650
【非特許文献３】Takano T et al., Cancer Lett. (2003) Vol.199, pp69-73
【非特許文献４】Barden CB et al., Clin. Cancer Res. (2003) Vol.9, pp1792-1800
【非特許文献５】Wasenius VM et al., Clin. Cancer Res. (2003) Vol.9, pp68-75
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情を鑑み、本発明の課題は、甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するための方法および測定キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、高い定量性をもつ競合PCR法の手法を用いたPCR-アレイ(ATAC-PCR)による遺伝子発現プロファイリング解析の手段を用いて、甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫の遺伝子診断に利用できる遺伝子群を同定することにより、本発明を完成するに至った。
【０００８】
よって本発明は、被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集する方法であって、
(1)前記被験者から採取された甲状腺標本からRNAを調製し、
(2)前記RNA中に含まれる以下の被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するためのキットであって、以下のRefSeqのID番号、GenBankアクセッション番号または配列表の配列番号（SEQ.ID.No）の遺伝子群より選択される少なくとも20遺伝子の発現量を測定し、gi|21629138|gb|AC046135.15|AC046135、NM_025113、NM_003226、NM_032413、NM_014851、NM_022664、NM_006595、gi|24635989|gb|AC021573.10|AC021573、NM_016322、NM_022845、L22214、NM_024591、NM_024045、SEQ.ID.No1、NM_016135、NM_033255、SEQ.ID.No2、NM_153649、NM_174881、M73554、NM_002107、NM_003016、NM_000268、NM_004591、NM_032327、gi|4731044|gb|AC005841.3|AC005841、NM_001268、NM_014220、NM_001273、NM_145690、NM_005566、NM_002999、NM_021134、NM_001833、NG_001019、NM_001312、U90441、NM_002467、NM_012198、NM_002773、X60708、gi|23396328|gb|AC116447.10|AC116447、NM_148416、NM_003186、NM_025382、NM_178148、NM_014873、NM_016339、NM_015922、NM_005952、NM_005517、NM_014365、NM_004999、SEQ.ID.No3、NM_0182931、NM_006516、NM_001642、Y00503、NM_177526、NM_024640、NM_003235、NM_006640、NM_033281、U65092、NM_006243、NM_004448、NG_002765、NM_181492、NM_004960、NM_006765、gi|7408084|gb|AC009948.3|AC009948、NM_000362、NM_006432、NM_176783、NM_016946、M15036、NM_032508、AY007685、D26070、NM_015455、NM_001551、NM_182471、NM_006565、NM_003878、NG_001019、gi|23621912|gb|AC008581.11|AC008581、NG_001019、NM_145792、NM_003040、NM_014757、NM_004896、NM_000302、NM_031298、NM_000982、NM_003190、NM_004926、NM_006330、NM_000396、NM_181642、NM_022778：且つ
(3)前記遺伝子群の発現量から、甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを得る、上記過程を具備する方法を提供するものである。なお上記においてSEQ.ID.No1、SEQ.ID.No2、SEQ.ID.No3は配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３を意味し、その塩基配列は後述の配列表において示す。
【０００９】
上記方法において、前記遺伝子群のうちで発現量を測定する少なくとも20遺子は、gi|21629138|gb|AC046135.15|AC046135、NM_025113、NM_003226、NM_032413、NM_014851、NM_022664、NM_006595、gi|24635989|gb|AC021573.10|AC021573、NM_016322、NM_022845、L22214、NM_024591、NM_024045、SEQ.ID.No1、NM_016135、NM_033255、SEQ.ID.No2、NM_153649、NM_174881、M73554であることが好ましい。
【００１０】
更に本発明は、上記の方法であって、前記遺伝子の発現量をPCRに基づく方法によって定量されることを特徴とする方法を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、上記の方法であって、前記甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータは、重み付け投票（Weighted Voting）アルゴリズムでの計算式を使用して予測される方法を提供するものである。
【００１２】
更に本発明は、被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するためのキットであって、上記の遺伝子群から選択される少なくとも20遺伝子を増幅可能であり、かつ定量可能なプライマーを含みことを特徴とするキットを提供するものである。
【００１３】
更に本発明は、被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するためのキットであって、上記の遺伝子群から選択される少なくとも20遺伝子を検出可能なプローブが固定化されたアレイを含むことを特徴とするキットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって得られたデータを利用することにより、今後臨床の現場においては、例えば生検サンプルの採取時に採取した甲状腺標本の一部よりRNAを抽出し、PCRアレイ等による発現量の定量を少なくとも20個の遺伝子に対して行うことにより、甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫の判別を高い確率において判別することができる。ここで、予後の悪い甲状腺濾胞癌であると判別された症例に対してはすぐに切除手術を行うが、予後が良好である濾胞腺腫については不必要な手術を行わないといったようなテーラーメード医療の実現が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
そこで本発明者らは、甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫の遺伝子診断のための遺伝子群の同定を目的として、高い定量性をもつ競合PCR法の手法を用いたPCR-array(ATAC-PCR)による遺伝子発現プロファイリング解析を行った。
【００１６】
より具体的には、2516の遺伝子について、濾胞癌28症例と濾胞腺腫58症例の合計86症例のトランスクリプトーム解析から、t統計量類似の指標であるシグナル対ノイズ比より、濾胞癌と濾胞腺腫で発現に差がある遺伝子100個を選択し、重み付け投票（Weighted Voting：以下WVと称する）アルゴリズムを用いた診断システムを構築することにより本発明は完成に至った。これら100個の遺伝子群は、濾胞癌と濾胞腺腫を区別するのに役立つことにより被験者の予後の予測に有用であるので、以下において予測遺伝子群と称する。
【００１７】
本発明により、上記予測遺伝子群の発現量のみをPCR-arrayによって測定し、その値をWVアルゴリズムでの計算式に当てはめるだけで、甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫を判別するためのデータを即座に得ることができる。
【００１８】
上記100個の予測遺伝子を用いて、甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫を判別し、予後の予測に用いるための手順は以下の通りである。
【００１９】
披検患者から採取された甲状腺標本からRNAを調整する。具体的には、予め採取された甲状腺組織の一部（例えば術前の生検により採取されたもの）から、通常のプロトコールにてRNAを抽出する。たとえば、市販のRNA抽出用キット等を使用すればよい。
【００２０】
そして上記抽出したRNAに含まれる上記遺伝子群のRNA発現量を定量する。ここで、抽出したRNAは、RNAを一旦cDNAに変換してから以下の工程を行えばよい。RNAの抽出からcDNAの取得までは、市販のキット等を使用して行うことができる。
【００２１】
上記予測遺伝子群の発現量は、たとえばPCRアレイ、DNAマイクロアレイ、リアルタイムPCR（Light Cycler）などの各種遺伝子発現定量法などを用いて定量することができる。
【００２２】
PCRアレイとしては、たとえばATAC-PCRを使用することができる（Kato K: Adaptor-tagged competitive PCR: a novel method for measuring relative gene expression. Nucleic Acids Res 25:4694-4696,1997を参照）。ATAC-PCRは、一度に多種の標的核酸を定量することが可能な競合的PCRに基づく方法であり、本発明のように100遺伝子という多数の遺伝子の発現を解析するために有用である。
【００２３】
たとえばPCRアレイを使用して発現量を定量する場合、上記予測遺伝子群を増幅可能なプライマーを使用して、以下の実施例において示したような手順で行うことができる。この時、プライマーには標識（蛍光標識など）を行っておけば、蛍光に基づいて容易に定量することができる。特に、ATAC-PCRによって定量する場合は、さらにピオチン標識およびアダプターが付加されたcDNAサンプルを使用しなくてはならない。また、上記遺伝子群のそれぞれの遺伝子配列は既に明らかにされており、該遺伝子を増幅可能なプライマーは、当業者であれば容易に作成することができる。
【００２４】
DNAマイクロアレイを使用する場合は、上記予測遺伝子群を検出可能なプローブが固定化されたアレイを使用して、通常のプロトコールに従って各遺伝子の発現量を定量することができる。
【００２５】
リアルタイムPCRを使用する場合は、上記予測遺伝子群を検出可能なプライマーを使用して、通常のプロトコールに従って各遺伝子の発現量を定量することができる。
【００２６】
また、上記発現量の定量において、定量のための対照（標準）サンプルとしては、甲状腺濾胞癌、濾胞腺腫、および正常甲状腺あるいはその混合物より得たサンプルを使用すればよい。
【００２７】
上記遺伝子群の発現量から甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫を判別するが、両者を判別するためのデータは、各種判別関数に測定した発現量を代入することにより、即座に得ることが出来る。判別関数は、たとえば、重み付け投票（Weighted Voting:WV)法、(Gulub TR, Slonim DK, Tamayo P.et al: Molecular classification of cancer : class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286:531-537,1999を参照)、k nearest neighbor (k-NN)法、support vector machine (SVN)、Artificial Neural Network (ANN)、Fisher linear classifier、階層的クラスタリング、主成分分析（PCA）などを使用して導き出すことができるが、好ましくはWV法である。
【００２８】
上記判別関数は、上記判別方法を使用して、実施例に示した86症例および57症例（これらの症例は甲状腺濾胞癌群と濾胞腺腫群を含んでいる）から得られる上記遺伝子群の各遺伝子の発現量と、これらの症例の甲状腺濾胞癌群または濾胞腺腫群であるという診断結果から導き出すことができるであろう。
【００２９】
また、100個すべての潰伝子を使用せずに、このうちの幾つかの遺伝子を選択して判定することによっても、高い予測が期待できる。たとえば、判別関数としてWV法を用いた場合、予測に使用する遺伝子数をシグナル対ノイズ比の絶対値によるランキングの上位から変動させた上で、それぞれの予測的中率をleave-one-out法により算出すると、最低限上位20個の遺伝子を使用した場合において、下記の実施例に示すように、ほぼ満足するべき予測精度を示した。したがって、本発明の好ましい態様において、予測に使用する最少遺伝子数は20個であり、この場合には該20遺伝子の発現量を定量するだけで甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫を判別できるデータが得られる。
【００３０】
また上位80個の遺伝子を使用した場合には予測精度は最高に達し、それ以上の数の遺伝子を使用した場合と比較しても予測精度はプラトーに達している。よって本発明のより好ましい態様において、予測に使用する遺伝子数は、80個である。
【００３１】
重み付け投票（WV）アルゴリズムにおいて、以下の式に従って濾胞癌であるか否かの判別を行う。該方法において、ある遺伝子(g)のWeighted Voteは、以下の式によって計算される。
Weighted Vote（Vg）＝Sg×｜Xg−（μ1g＋μ2g）／２｜
ここで、Sgは遺伝子gのシグナル対ノイズ比であり、Xgは遺伝子gの発現レベルであり、μ1gは濾胞癌群における遺伝子gの平均またはメディアンであり、μ2gは腺腫群における遺伝子gの発現量の平均またはメディアンである。またσ1gは癌における遺伝子の発現量の標準偏差であり、σ2gは腺腫における遺伝子の発現量の標準偏差である。なおシグナル対ノイズ比（Sg）は下記の式で計算される値である。
シグナル対ノイズ比（Sg）＝μ1g−μ2g／σ1g＋σ2g
【００３２】
そして濾胞癌群におけるvoteの合計（V1＝ΣVi, Vi>0）と、腺腫群におけるvoteの合計（V2＝ΣVi, Vi<0）より、以下の式で表されるPrediction strength（PS）の値が得られる。そして、PSが０以上である場合に濾胞癌であると判別され、PSが０未満の場合に濾胞癌でないと判別される。
Prediction strength（PS）＝（V1−｜V2｜）／（V1＋｜V2｜）
【００３３】
予測に使用する遺伝子数をシグナル対ノイズ比の絶対値によるランキングの上位から順次変動させた上で、それぞれの予測的中率をleave-one-out法により算出した。なお本願明細書においてleave-one-out法とは、n個からなる検体を評価するにあたり、一つの検体を除いたn-1個に関して選択した遺伝子群の発現量から予測アルゴリズムに従って判定する、という過程を全検体について（即ちn回）繰り返し、結局は検体（n個）の各々について除いた場合について評価するという手法を意味するものである。
【００３４】
ここで甲状腺濾胞癌と判別された症例に対しては外科的な摘出手術を行うが、甲状腺濾胞癌でないと判別された症例は良性の濾胞腺腫である可能性が高く摘出手術は必要ないといった判定が可能になると想定される。
【００３５】
判別関数は、上記記載のもの以外にも、種々の関数を使用することができる。上記のように甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫との間の判別と、遺伝子の発現量との関係から、当業者であれば容易にこのような関数を適用することができるであろう。
【００３６】
次に、本発明のキットについて説明する。本発明のキットは、被験者において甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するためのキットであり、上記遺伝子群から選択される少なくとも20遺伝子を増幅可能かつ定量可能なプライマーを含むことを特徴とする。増幅可能なプライマーは、通常、増幅したい遺伝子に相補的な配列を有する。このような配列は当業者であれは容易に得ることができるであろう。また、各遺伝子の発現量を定量可能とするために、そのプライマーには、たとえば種々の標識がなされていてもよい。たとえば、ATAC-PCRに使用するためのキットとして、プライマーは、上記遺伝子を増幅するための配列の他にアダプター配列などを有し、蛍光標織がなされていてもよい。このようなプライマーの作製は、定法に従って合成して作製することができる。
【００３７】
その他、本発明のキットには、PCRのための酵素、溶液、反応容器、対照として使用するための遺伝子などが含まれていてもよい。また、甲状腺標本からRNAを調整するための試薬や、cDNAを得るための試薬が含まれていてもよい。
【００３８】
本発明のキットを使用することにより、上記の甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を判別するためのデータを収集するための方法を容易に実施することができる。すなわち、被験者から生検時に採取された甲状腺標本からRNAを調整し、本キットを使用して甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫を判別するために有用な遺伝子の少なくとも20個について増幅および定量し、得られた発現量から甲状腺濾胞癌と濾胞腺腫を判別するためのデータを容易に得ることができる。
【００３９】
また本発明のキットは、上記遺伝子群から選択される少なくとも20遺伝子を検出可能なプロープが固定化されたアレイを含むことを特徴とするキットであってもよい。この場合、アレイによって予測のための20遺伝子の発現量を定量し、その値を各種関数に代入することによってデータを得ることができる。
【実施例】
【００４０】
以下、甲状腺濾胞癌群と甲状腺濾胞腺腫群の間で、発現量の有意な相違を認めた100遺伝子を抽出した過程を説明する。しかし下記の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４１】
（検索遺伝子の設定）
甲状腺腫瘍及び正常甲状腺のtotal RNAを用いて3’cDNAライブラリーを作成し、約9000クローンのランダムシーケンスを行い、甲状腺特異的な遺伝子発現情報を得た。甲状腺で発現が確認された2383遺伝子及び、文献で発現が確認されている133遺伝子、計2516遺伝子を候補遺伝子とした。これらのプライマーを用いて、外科切除後の甲状腺濾胞癌の28症例、濾胞腺腫の58症例を対象に発現情報の収集を行った。
【００４２】
（アダプター付加競合PCR）
遺伝子の発現量を評価するために、具体的には、以下の手順に従って、アダプター付加競合PCRにより2516遺伝子を測定した。
【００４３】
１．1.5μgのtotal RNAと15pmolの５’ビオチン化oligo dT primerを混合し、全体で11μlの溶液とする。
【００４４】
２．70℃で5分間熱変性させ、氷上で急冷する。
【００４５】
３．以下の試薬を加えて全体で20μlとし、42℃で1時間反応させる。
【００４６】
5×1st Strand Buffer、4μl
O.1M DTT、2μl
10mM dNTP、1μl
RNase inhibitor、1μl(26U)
Superscript II、1μl(200U)
【００４７】
４．以下の試薬を加えて全体で123μlとし、16℃で2時間反応させる。
10×E、coli ligase Buffer、10μl
10mM dNTP、4μl
0.1M DTT、2μl
E.coli Ligase、2μl(20U)
E.coli Polymerase、4μl(40U)
E.coli RNase H、1μl(2U)
DW、80μl
【００４８】
５．70℃で20分間反応させ、酵素を失活させる。
【００４９】
６．以下の試薬を加えて全体で350μlとし、37℃で1時間反応させる。
10×K Buffer、35μl
MboI、5μl(50U)
DW、187μ1
【００５０】
７．フェノールクロロホルム処理およびエタノール沈後、ペレットを0.1×TE Buffer600μlにて溶解する。
【００５１】
８．以下の７種類のアダプタープライマーを用意し、それぞれを以下の比率にて混合し、16℃で一晩反応させる。
【００５２】
MB-1     5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCG-3’（配列番号４）
5’-GATCCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3’（配列番号５）
MB-2     5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGACT-3’（配列番号６）
5’-GATCAGTCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3’（配列番号７）
MB-3     5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGCATACT-3’（配列番号８）
5’-GATCAGTATGCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3’（配列番号９）
MB-4     5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGATCCATACT-3’（配列番号１０）
5’-GATCAGTATGGATCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3’（配列番号１１）
MB-5     5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTCAATCCATACT-3’（配列番号１２）
5’-GATCAGTATGGATTGACGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3’（配列番号１３）
MB-6     5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTACTCAATCCATACT-3’（配列番号１４）
5’-GATCAGTATGGATTGAGTACGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3’（配列番号１５）
MB-7   5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGCTATACTCAATCCATACT-3’（配列番号１６）
5’-GATCAGTATGGATTGAGTATAGCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3’（配列番号１７）
MB-1、MB-2、MB-3-7
MboI cDNA                     80μl、20μl、40μl
10xT4 ligation buffer         12μl、3μl、6μl
adaptor primer (5pmol/μl)    24μl、6μl、12μl
T4 ligase (3U/μl)            4μl、1μl、2μl
【００５３】
９．5M NaClをMB-1サンプルに48μl、MB-2サンプルに12μl、MB-3〜7サンプルにはそれぞれ24μlずつ加え、よく混合する。
【００５４】
１０.以下の組成で各サンプルを混合する。
MB-1、160μl
MB-2、32μl
MB-3〜7、80μl×5
【００５５】
１１.ストレプトアピジンでコートされた磁気ビーズを148μl加えてよく混合したのち、20分間氷上に静置する。
【００５６】
１２.マグネットを用いて混合液中の磁気ビーズを回収し、600μlのDWで２回洗浄する。
【００５７】
１３．回収したビーズにDW840μlを加えて混合する。
【００５８】
１４．以下の試薬を加え、混合する。
10×PCR Buffer               216μl
20mM dNTP                     24μl
FAM-CIS primer(100pmol/μl )  24μl
Amplitaq Gold                 40μl
DW                           776μl
【００５９】
１５．384ウェルPCRプレートに、サンプルを4.5μlずつ分注する。
【００６０】
１６．遺伝子特異的primerを各ウェルに0.5μlずつ加えてよく混合し、以下の条件でPCRを行う。
【００６１】
１７．95℃、10分→（94℃、30秒→50℃、30秒→72℃、1分）×40サイクルー72℃、20PCR産物2μlを新しいPCRプレートに移し、DW58μlを加えて30倍希釈する。
【００６２】
１８．さらにサイズ標準マーカーである500-Roxを加えて8倍希釈する。
【００６３】
１９．95℃で7分間反応させる。
【００６４】
２０．DNAアナライザ3100を用いて、発現量の測定を行う。
【００６５】
（結果）
測定した遺伝子について、腺腫と癌で発現量に差のある遺伝子を100個選択した。具体的には、腺腫と癌で発現量について統計学的な処理を行い、有意水準を示すシグナル対ノイズ比の絶対値が高い順番から100個の遺伝子を選択した。それらの遺伝子は、甲状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫を区別するのに有用な遺伝子であると考えられる。表１において、選択された遺伝子をシグナル対ノイズ比の絶対値が高い順番から示し、RefSeqのID番号、GenBankアクセッション番号または配列表の配列番号（SEQ.ID.No）と遺伝子名を併記する。
【００６６】
【表１】
2005168432.tif 000003
2005168432.tif 000004
2005168432.tif 000005
【００６７】
上記の症例（濾胞癌28症例、濾胞腺腫58症例の計86症例）における遺伝子発現量を使用してWeighted Voting方式によって判別関数を導き出した。そして、予測に使用する遺伝子数をシグナル対ノイズ比の絶対値によるランキングの上位から順次変動させた上で、それぞれの予測的中率をleave-one-out法により算出した（図１）。この検討において、甲状腺濾胞癌28症例、濾胞腺腫58症例の計86症例を検討対象とした。  
【００６８】
まず、これら全サンプル（計86症例）を使用して学習検体による評価（Leave-one-out cross validation : LOO）を行った（図１:2100_LOO_86）。更に、それらのサンプルの中から甲状腺濾胞癌19症例、濾胞腺腫38症例をトレーニングデータセット（図１:2100_LOO_57）とし、残りの症例である甲状腺濾胞癌9症例、濾胞腺腫20症例をバリデーションセットとしてテスト検体による評価を行った（図１:test_LOO）。
【００６９】
図１の結果より、86症例について検討した2100_LOO_86においては、使用する遺伝子数が20個程度で90％近い精度を有し、それ以上の数の遺伝子を使用した場合も90％かそれ以上ではほぼプラトーに達していた。また57症例について検討した2100_LOO_57においては、使用する遺伝子数が20個程度で80％近い精度を有し、使用する遺伝子数が70個程度で精度は90％程度となり、それ以上の遺伝子数ではほぼプラトーに達していた。更にテスト検体によるバリデーション評価（図１:test_LOO）においては、使用する遺伝子数が20個程度での精度は65％程度であり、使用する遺伝子数が80個程度で精度は80％程度となり、それ以上の遺伝子数ではほぼプラトーに達していた。
【００７０】
また80個の遺伝子を用いて学種検体による評価を行った実例を示す。甲状腺濾胞癌28症例、濾胞腺腫58症例の計86症例について、全症例を用いた診断システムをleave-one-out cross validationで評価したところ、予測精度は91.9％であった。具体的には、腺腫の症例について腺腫であると正しく予測されたものは57症例、癌あると誤って予測されたものは2症例であった。また癌の症例について癌であると正しく予測されたものは22症例、腺腫であると誤って予測されたものは6症例であった。
【００７１】
更に、80個の遺伝子を用いてテスト検体による評価を行った実例を示す。甲状腺濾胞癌19症例、濾胞腺腫38症例をトレーニングデータセットとし、甲状腺濾胞癌9症例、濾胞腺腫20症例をバリデーションセットとして、テスト検体の評価したところ、予測精度は82.8％であった。具体的には、腺腫の症例について腺腫であると正しく予測されたものは17症例、癌あると誤って予測されたものは3症例であった。また癌の症例について癌であると正しく予測されたものは7症例、腺腫であると誤って予測されたものは2症例であった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、患者個々の分子生物学的個性を用いた甲状腺濾胞癌の新しい遺伝子診断により、濾胞腺腫と判別することが可能となった。従来の病理組織珍断法に組み合わせることで、より効果的なテーラーメード医療の実現が可能となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、判別に使用した遺伝子の数による予測精度の変化を示す図である。
【図１】
2005168432.tif 000006
【配列表】
2005168432000001.xml