(57)【要約】【目的】  甘果オウトウ栽培種の植物体の組織を培養して、不定芽を高効率に誘導する。【解決手段】  甘果オウトウ栽培種の組織の切片を、２８℃から５０℃の範囲で温度条件下にて、培養溶液または培地中に一定時間浸して前処理をした後、少なくともサイトカイニン系植物ホルモンが含まれる培養溶液または培地で本培養する。【選択図】      なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘果オウトウ栽培種の組織の切片を、２８℃から５０℃の範囲の温度条件下にて、培養溶液または培地中に浸して前処理した後に、少なくともサイトカイニン系植物ホルモン含有の培養溶液または培地で本培養をすることを特徴とする高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法。
【請求項２】
前処理の温度条件が、２９℃から４５℃の範囲であることを特徴とする請求項１の高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法。
【請求項３】
前処理の温度条件が、３０℃から４０℃の範囲であることを特徴とする請求項１の高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法。
【請求項４】
前処理において用いる培養溶液、または、培地中に、オーキシン系植物ホルモンが含まれていることを特徴とする請求項１から３のいずれかの高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法。
【請求項５】
オーキシン系植物ホルモンが、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸であることを特徴とする請求項４の高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法。
【請求項６】
甘果オウトウ栽培種の組織として、冬芽中の小葉または茎頂培養系の小植物体の小葉を用いることを特徴とする請求項１から５のいずれかの高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、植物組織培養の技術によって、甘果オウトウ栽培種の植物体の組織から不定芽を高効率に誘導するための改善された新しい方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
甘果オウトウが属するバラ科植物の核果類において、組織培養によって再分化系を確立した報告がいくつかなされている。たとえば、モモの未熟胚を培養してカルスを誘導し、そのカルスから不定芽を形成させた報告がある（非特許文献１）。また、スモモの成熟胚の子葉を培養して不定芽形成に成功した例とともに、酸果オウトウの未熟胚の子葉を培養して不定芽を誘導したことが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、これらの報告において対象としている植物種は、甘果オウトウとは異なるものであり、これらの方法を甘果オウトウの栽培種から不定芽を誘導するのに適用することは困難であると考えられる。
【０００３】
甘果オウトウ（Prunus avium L.）においては、その次世代の組織を培養して再分化系を確立した報告として、未熟胚を培養して不定芽を誘導した例（非特許文献３）や、未熟胚の子葉を培養して不定胚を誘導した例（非特許文献４）が知られている。ただ、これらは次世代の組織である受精胚を利用しているため、親の品種とは遺伝的に異なるという点で育種的利用が限られる。
【０００４】
また、甘果オウトウの野生種において、その植物体の組織を培養して再分化させた報告としては、葉片を培養して不定芽を形成させた例（非特許文献５）と、根の切片を培養して不定芽を形成させた例（非特許文献６）が知られている。だが、これら報告は、あくまでも野生種の場合に限られた例である。
【０００５】
一方、甘果オウトウの栽培種において、その植物体の組織を培養して再分化させた報告としては、葉片からの不定芽誘導の例（非特許文献７）があるが、これはごく一部の品種に限られており、その誘導率は極めて低いものであり、いまだ甘果オウトウの再分化培養系の確立は、報告されていない。
【０００６】
そこで、上記のとおりの係る問題を解決するため、最近、この出願の発明者らによって、「佐藤錦」や「ナポレオン」等の日本における、主要な甘果オウトウ栽培種において、甘果オウトウの系統を問わずに組織培養による不定芽を経由した再分化系培養方法の確立が提案されている（特許文献１）。この提案では、茎頂培養系または冬芽中の小葉をオーキシン系植物ホルモン（たとえば、２,４-ジクロロフェノキシ酢酸）が含まれる培地に一定時間浸漬することによって、不定芽を誘導させる方法である。また、２,４-ジクロロフェノキシ酢酸を含まない場合においても、４℃に冷却した培地にそれら小葉を一定時間浸漬した後、サイトカイニン系植物ホルモン（たとえば、チジアズロン）が含まれる培地で本培養することによって、不定芽が誘導されることが見出されている。
【特許文献１】特開２００２−２４７９２８号公報
【非特許文献１】Hammerschlagら, Theor. Appl. Genet., vol.70, p248-251, 1985
【非特許文献２】Manteら, Plant Cell Tissue Organ Cult., vol.19, p1-11, 1989
【非特許文献３】Lane and Cossio, Can. J. Plant Sci., vol.66, p953-959, 1986
【非特許文献４】De Marcら、Plant Cell Tissue Organ Cult., vol.34, p209-215, 1993
【非特許文献５】Hammatt and Grant, Plant Cell Rep., vol.17, p526-530, 1998
【非特許文献６】Pedrotti and Cornu, Acta Hortic., vol.289, p141-142, 1991
【非特許文献７】Yang and Schmidt, Gartenbauwissenschaft, vol.57, p7-10, 1992
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１の方法の場合においては、甘果オウトウの栽培種からの再分化率（すなわち、不定芽誘導率）は、約３％〜１０％前後であり、最大でも約３０％程度という低い誘導率であった。このため、甘果オウトウ栽培種の植物体の組織を培養して、高効率に再分化させることのできる植物組織培養技術は、いまだに報告された例はない。
【０００８】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの背景技術から、従来では困難であった植物組織培養の技術によって、甘果オウトウ栽培種の植物体の組織から不定芽をより高効率に誘導する不定芽誘導方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この出願の発明は、前記の課題を解決するための第１の発明として、甘果オウトウ栽培種の組織の切片を、２８℃から５０℃の範囲の温度条件下にて、培養溶液または培地中に浸して前処理した後に、少なくともサイトカイニン系植物ホルモン含有の培養溶液または培地で本培養をすることを特徴とする高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法を提供する。
【００１０】
第２には、前処理の温度条件が、２９℃から４５℃の範囲であることを特徴とする高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法を、第３には、前処理の温度条件が、３０℃から４０℃の範囲であることを特徴とする高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法を提供する。
【００１１】
また、この出願の発明は、第４には、前処理において用いる培養溶液、または、培地中に、オーキシン系植物ホルモンが含まれていることを特徴とする高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法を、第５には、オーキシン系植物ホルモンが、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸であることを特徴とする高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法を提供し、そして、第６には、甘果オウトウ栽培種の組織として、冬芽中の小葉または茎頂培養系の小植物体の小葉を用いることを特徴とする高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
上記のとおりのこの出願の発明の第１の発明の高温処理による甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法によれば、従来に比べてはるかに高い効率で甘果オウトウ栽培種の植物体の組織から不定芽を誘導することが可能となる。
【００１３】
また、第２、第３の発明によれば、前処理の温度条件をさらに特定することによって、より高効率に不定芽を誘導することができる。
【００１４】
そして、第４および第５の発明によれば、オーキシン系植物ホルモン、特に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を前処理において加えることにより、さらなる不定芽の誘導効率の向上を実現することができる。
【００１５】
さらに、上記第６の発明により、冬芽中または茎頂培養系の小葉を用いることによって、継続的に不定芽を誘導することができ、品質の優れた品種を安定、かつ、簡便に取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１７】
この出願の発明の各方法において、甘果オウトウ栽培種としては、日本および海外で栽培されている甘果オウトウの全ての品種を対象とすることができる。特に、現在の日本において利用価値が高い「佐藤錦」、「ナポレオン」、「紅秀峰」および「紅てまり」の各品種を対象とすることが考慮される。
【００１８】
上記のとおり、この出願の発明では、これらの「佐藤錦」や「ナポレオン」等の甘果オウトウ栽培種の組織切片を、培養溶液、または培地に一定時間浸漬する前処理をした後に、少なくともサイトカイニン系植物ホルモンを含有する溶液、あるいは、培地で培養することによって、甘果オウトウの不定芽を誘導するが、この場合の前処理は、２８℃から５０℃の範囲の温度で行なうことを特徴としている。そして、この温度範囲については、２９℃から４５℃の範囲の温度であることが、好ましく、さらにまた、温度条件が、３０℃から４０℃の範囲であることが、不定芽の誘導効率をさらに向上することができるため、より好ましい。
【００１９】
また、上記の前処理として用いる培養溶液または培地中には、オーキシン系植物ホルモンを含有させることが有効でもある。オーキシン系植物ホルモンとしては、２,４-ジクロロフェノキシ酢酸やナフタレン酢酸等を使用することができるが、これらに限定されることはなく、その他のオーキシン活性を示す成長調節物質等を使用することができる。このオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、たとえば、通常は５〜２０ｍｇ／Ｌ程度等とすることが考慮される。
【００２０】
さらに、前処理の時間については、たとえば一般的には、２〜４８時間、好ましくは４〜１２時間、最も好ましくは６時間とすることが考慮される。
【００２１】
この出願の発明の方法においては、以上のような前処理後の組織切片を、サイトカイニン系植物ホルモンを含む培地で培養する。培養培地に含ませるサイトカイニン系植物ホルモンとしては、天然のカイネチン、trans-ゼアチン、イソペンテニルアデニン、合成サイトカイニンであるベンジルアデニン、４-ベンジルアミノベンゾイミダゾール、N,N'-ジフェニル尿素系のもの（たとえば、N-(２-クロロ-４ピリジル)-N'-フェニル尿素等）等を特段の制限なく使用することができるが、特に、チジアズロンを使用することが好ましい。培地中のサイトカイニン類の濃度は、たとえば一般的には、２〜２０ｍｇ／Ｌ程度とすることが考慮される。また、この培地には、たとえば、不定芽の誘導効率を向上させるために、たとえば、０〜０．５ｍｇ／Ｌ程度のオーキシン系植物ホルモンをさらに含有させてもよい。
【００２２】
前処理後における、不定芽誘導のための本培養は、３０日間以上行なう。このような培養によって、組織切片の切り口に現れたカルスから、不定芽が誘導される。また、この時、光条件として、明期および暗期を適度に組み合わせることにより、より高効率に不定芽が誘導される。
【００２３】
培養する甘果オウトウ栽培種の組織切片としては、通常の不定芽誘導に用いられる小葉等を用いることができるが、特には、甘果オウトウの冬芽中の小葉切片、または甘果オウトウの茎頂培養系の小植物体の小葉切片を用いることにより、より確実に不定芽の誘導率が向上するため好ましい。茎頂培養系の小葉を使用する場合、葉を分割することなく、たとえば、その中央脈に垂直方向に２〜３の切れ目を形成することが、不定芽誘導率の向上のために好ましい。なお、組織切片は、事前に滅菌処理（たとえば、エタノール等のアルコール滅菌や漂白剤の使用等）を行うようにすることが好ましい。
【００２４】
また、この出願の発明は、上記のとおりの甘果オウトウ栽培種の不定芽誘導方法により得られた不定芽を継代培養して形成された植物体から組織切片を採取し、さらに同様の不定芽誘導方法を複数回繰り返すことによって、再び不定芽を誘導することが可能としている。これにより、味や色艶、香り等の品質の良い甘果オウトウの品種を安定、かつ、簡便に取得することができる。
【００２５】
以下の実施例により、この出願の発明をさらに詳細に説明するが、この出願の発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
（実施例１）
「紅てまり」および「マザード」の果樹体から冬芽の付いた枝を採取し、それを水に挿して２５℃、１６時間明期／８時間暗期の光条件下で数日間それぞれ育成させ冬芽をほころばせた。次に、枝の長さが１２〜１５ｍｍに１つの冬芽が付くように切り出した。それらを７０％エタノールに３０秒間浸して処理した後、６倍に希釈した漂白剤中に２０分間浸して滅菌した。滅菌蒸留水でそれらを３回濯ぎ、付着した水分を取り除いた。そして、冬芽から外皮を除き、６〜７枚の小葉を取り出した。それらを、「紅てまり」においては、２５℃、３０℃または３５℃または４０℃の各温度条件下で、一方「マザード」においては、２５℃、３０℃または３５℃の温度条件下で、それぞれ３％ショ糖を含む液体Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ（ＷＰ）培地中にそれぞれ６時間浸した。次に、１０ｍｇ／Ｌのチジアズロン、０．１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、３％ショ糖および０．６％寒天を含むＷＰ培地を、５０ｍＬづつ滅菌済みのプラスチックシャーレに入れて準備した。このＷＰ培地上に６時間浸された小葉を置き、２５℃にて１６時間明期／８時間暗期の光条件下で４０日間以上培養した。
【００２７】
「紅てまり」の結果は、２５℃、３０℃または３５℃または４０℃の各温度条件にそれぞれ対応して、０％、６７％、６３％または５０％の誘導率で、小葉の基部の切り口に出現したカルスから不定芽が誘導された。
【００２８】
「マザード」の結果は、２５℃、３０℃または３５℃の温度条件にそれぞれ対応して、０％、１５％または３４％の誘導率で不定芽が誘導された。
（実施例２）
実施例１と同様に準備された「紅てまり」及び「マザード」の冬芽中の小葉を、２５℃、３０℃、３５℃または４０℃の各温度条件下で、１０ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及び３％ショ糖を含む液体WP培地中にそれぞれ６時間浸した。次に、実施例１と同様に、それらの小葉を１０mg／Ｌのチジアズロン、０．１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、３％ショ糖及び０．６％寒天を含むＷＰ培地上で、２５℃で１６時間明期／８時間暗期の光条件下で４０日間以上培養した。「紅てまり」の結果は、上記各温度条件にそれぞれ対応して、３１％、８８％、８３％、または６６％の誘導率で、小葉の基部の切り口に出現したカルスから不定芽が誘導された。「マザード」の結果は、上記各温度条件にそれぞれ対応して、５８％、６７％、７８％、または５５％と、いずれの温度条件においても高い誘導率で不定芽が誘導された。
（実施例３）
（１）「紅てまり」の果樹体から新梢を採取し、枝の各節にある葉芽を以下の茎頂培養系の確立に用いた。葉芽を７０％エタノールに３０秒間浸した後、２０％アンチホルミンに１５〜２０分間浸して滅菌した。滅菌蒸留水でそれらをよく濯ぎ、茎頂を実体顕微鏡下で摘出した。摘出した茎頂部は、０．１mg／Ｌベンジルアミノプリン、３％ショ糖および０．６％寒天を含む１／４に希釈したＭｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地で約３０日間培養した。次に、これらを、１．０ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．１ｍｇ／Ｌのインドール酪酸、０．１ｍｇ／Ｌのジベレリン酸、１ｍＭ フロログルシン、３％ショ糖及び０．７％寒天を含むＦｅＮａＥＤＴＡを使用した修正ＭＳ培地（シュート増殖培地）で培養して増殖させた。このシュート増殖培地上で継代培養している茎頂培養系において、新しいシュート増殖培地に植え込んで２８日後の小植物体が形成させることができ、さらにこの小植物体から上位展開葉（小葉）を切り出して、さらに上記と同様の不定芽誘導方法を行なった。
【００２９】
（２）すなわち、上記（１）から得られた茎頂培養系の上位展開葉（小葉）の中央脈に、１枚の小葉が分離されないようにして、垂直方向に切れ目を２〜４箇所つけたものを用意した。
【００３０】
（３）上記（２）にて用意された小葉を、２５℃、３０℃、３５℃または４０℃の各温度条件下で、３％ショ糖を含む液体ＷＰ培地中に６時間浸した。次に、実施例１と同様に、これら小葉を１０ｍｇ／Ｌのチジアズロン、０．１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、３％ショ糖及び０．６％寒天を含むＷＰ培地上で、２５℃、１６時間明期／８時間暗期の光条件下で６０日間以上培養した。培養し始めて２１日後から、中央脈の切れ目に形成されたカルスから不定芽が誘導された。最終的に、その不定芽誘導率は、上記各温度条件にそれぞれ対応して、０％、３６％、３４％、または２７％であった。
【００３１】
結果は、上記のとおり、この出願の発明の不定芽誘導方法によって誘導された不定芽を継代培養することによって、形成された植物体から、組織切片を採取し、この組織切片を用いて再び同様の不定芽誘導方法を実施した場合においても、不定芽が誘導されることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、植物組織培養の技術によって、甘果オウトウ栽培種の植物体の組織から不定芽を高効率に誘導することが可能となった。すなわち、この出願の発明によって、甘果オウトウのある栽培品種の植物体組織に有用な遺伝子を導入した後、その組織から不定芽を高効率に誘導し、その不定芽を成長させてその植物体を数多く得ることができ、また、遺伝子を組換えたその栽培品種を容易に得ることができて、産業上においても有効に活用することができる。