(57)【要約】【課題】  安定に非水溶性薬物を封入できる薬物送達用の高分子ドラッグキャリヤーシステムの提供。【解決手段】ＡＢ型のブロックコポリマーであって、カルボキシル基を側鎖に担持するポリマー鎖セグメントの、カルボキシル基のエステル化によって、効率よく高分子ドラッグキャリヤーシステムに使用できる、ブロックコポリマーの製造、及び該ポリマーの有効な使用が提供される。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
Ｘ−＜H.philic＞−block−＜Carbo-E＞−Ｚ            （１）
式中、＜H.philic＞  はポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)及びポリ（ビニルピロリドン）からなる群より選ばれるポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントを表し、＜Carbo-E＞  はポリ(αアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型，βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型−グルタミン酸)及びポリ(γアミド型−グルタミン酸)から選ばれるポリマーのアミノ酸ポリマー鎖セグメントであって、総カルボキシル基の少なくとも４０％が式
【化１】
2005336402.tif 000018
（ここで、Ｒ１は水素原子もしくはフェニル基を表し、Ｒ２はＣ３−Ｃ１７アルキル、フェニル、p-,m-もしくはo-ビフェニル、または１もしくは２−ナフチルを表し、フェニル及びナフチルのベンゼン環はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、フッ素、塩素、ジアゾ、カルバモイル、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、アミノ及びモノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノからなる群より選ばれる置換基１乃至４個まで置換されていてもよく、ａは０乃至４の整数を表す）のエステル結合を形成しているアミノ酸ポリマー鎖セグメントを表し、
Ｘは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アセタールもしくはケタール化ホルミル、アセタールもしくはケタール化ホルミル−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アミノ、アミノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジル基を表し、そして
Ｚは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルフェニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル、またはフェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノカルボニル基を表す、
のブロックコポリマーの製造方法であって、
一般式（１Ｐ）
Ｘ−＜H.philic−Ｐre＞−block−＜Carbo＞−Ｚ    （１Ｐ）
式中、＜H.philic−Ｐre＞  はポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)もしくはポリ(酢酸ビニル)及びポリ（ビニルピロリドン）からなる群より選ばれるポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントまたはその前駆セグメントを表し、＜Carbo＞  はポリ(αアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型及びβアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型−グルタミン酸)及びポリ(γアミド型−グルタミン酸)から選ばれるポリマーのアミノ酸ポリマー鎖セグメントを表し、そしてＸ及びＺは一般式(１)について定義したのと同義である、
のブロックコポリマーを、溶液中、有機強塩基の存在下で、一般式（２）
【化２】
2005336402.tif 000019
式中、haloは塩素、臭素またはヨウ素を表し、Ｒ１，Ｒ２及びａは一般式（１）について定義したのと同義である、
のハロゲン化物と反応させることを特徴とする一般式(１)で表されるブロックコポリマーの製造方法。
【請求項２】
一般式（１）の＜Carbo-E＞−Ｚが、式（Ａ−１）、式（Ａ−２）、式（Ｂ−１）、式（Ｂ−2）、式（Ｃ−１）、式（Ｃ−2）、式（Ｄ−１）及び式（Ｄ−２）： 
【化３】
2005336402.tif 000020
【化４】
2005336402.tif 000021
上記各式中、Ｒは水素原子または式（３）：
【化５】
2005336402.tif 000022
の基を表し（ここで、Ｒ１、Ｒ２及びａは、請求項１の一般式（１）について定義したのと同義である）、式（３）の基は総Ｒの少なくとも４０％を占め、ｐ及びｑは相互に独立して1乃至300の整数であるが、ｐ＋ｑは３５０までであり、そしてＺは一般式（１）について定義したのと同義である、で表されるポリアミノ酸ブロックからなる群より選ばれる請求項1記載のブロックコポリマーの製造方法。
【請求項３】
一般式（１）のＸ−＜H.philic＞  が、式（Ｅ）：
Ｘ―(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎ―(ＣＨ２)ｓ−            （Ｅ）
式中、Ｘは、ヒドロキシ、アセタールもしくはケタール化ホルミル及びアミノが除かれること以外、一般式（１）について定義したのと同義であり、ｎは１０乃至１０，０００の整数を表し、そしてｓは０乃至６の整数を表す、の親水性ポリマーブロックである、請求項１または２に記載のブロックコポリマーの製造方法。
【請求項４】
一般式(１)のブロックコポリマーが、式（１Ａ−１）、（１Ａ−２）、（１Ｂ−１）、（１Ｂ−２）、（１Ｃ−１）、（１Ｃ−２）、（１Ｄ−１）及び（１Ｄ−２）：
【化６】
2005336402.tif 000023
【化７】
2005336402.tif 000024
上記各式中、Ｒ、ｐ、ｑ及びＺは式（Ａ−１）、式（Ａ−２）、式（Ｂ−１）、式（Ｂ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｄ−１）及び式（Ｄ−２）について定義したのと同義であり、Ｘは、ヒドロキシ、アセタールもしくはケタール化ホルミル及びアミノが除かれること以外、一般式（１）について定義したのと同義であり、そしてｎ及びｓは式（Ｅ）について定義したのと同義であり、Ｙ１は−ＮＨ−または−Ｒａ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｂ−を表し、ＲａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｂはＮＨまたはＯを表し、Ｙ２はＣＯまたは−Ｒｃ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｄ−を表し、ＲｃはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｄはＣＯを表し、そしてｒは１乃至６の整数を表す、請求項１記載のブロックコポリマーの製造方法。
【請求項５】
一般式（１）
Ｘ−＜H.philic＞−block−＜Carbo-E＞−Ｚ                （１）
式中、＜H.philic＞  はポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)及びポリ（ビニルピロリドン）からなる群より選ばれるポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントを表し、＜Carbo-E＞  はポリ(αアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型，βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型−グルタミン酸)及びポリ(γアミド型−グルタミン酸)から選ばれるポリマーのアミノ酸ポリマー鎖セグメントであって、総カルボキシル基の少なくとも４０％が式
【化８】
2005336402.tif 000025
（ここで、Ｒ１は水素原子もしくはフェニル基を表し、Ｒ２はＣ３−Ｃ１７アルキル、フェニル、p-,m-もしくはo-ビフェニル、または１もしくは２−ナフチルを表し、フェニル及びナフチルのベンゼン環はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、フッ素、塩素、ジアゾ、カルバモイル、ヒドロキシ及びアミノからなる群より選ばれる置換基１乃至４個まで置換されていてもよく、ａは０乃至４の整数を表す）のエステル結合を形成しているポリマーのアミノ酸ポリマー鎖セグメントを表し、
Ｘは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アセタールもしくはケタール化ホルミル、アセタールもしくはケタール化ホルミル−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アミノ、アミノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジル基を表し、そして
Ｚは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルフェニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル、またはフェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノカルボニル基を表す、
のブロックコポリマーを含んでなる薬物担持用キャリヤー。
【請求項６】
ブロックコポリマーが、一般式（１）における＜Carbo-E＞−Ｚが、式（Ａ−１）、式（Ａ−２）、式（Ｂ−１）、式（Ｂ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｄ−１）及び式（Ｄ−２）： 
【化９】
2005336402.tif 000026
【化１０】
2005336402.tif 000027
上記各式中、Ｒは水素原子または式（３）：
【化１１】
2005336402.tif 000028
の基を表し（ここで、Ｒ１、Ｒ２及びａは、請求項１の一般式（１）について定義したのと同義である）、式（３）の基は総Ｒの少なくとも４０％を占め、ｐ及びｑは相互に独立して1乃至300の整数であるが、ｐ＋ｑは３５０までであり、そしてＺは一般式（１）について定義したのと同義である、で表されるポリアミノ酸ブロックからなる群より選ばれる、請求項５に記載の薬物担持用キャリヤー。
【請求項７】
ブロックコポリマーが、一般式（１）におけるＸ−＜H.philic＞  が、式（Ｅ）：
Ｘ―(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎ―(ＣＨ２)ｓ−            （Ｅ）
式中、Ｘは、ヒドロキシ、アセタールもしくはケタール化ホルミル及びアミノが除かれること以外、一般式（１）について定義したのと同義であり、ｎは１０乃至１０，０００の整数を表し、そしてｓは０乃至６の整数を表す、の親水性ポリマーブロックである、請求項５に記載の薬物担持用キャリヤー。
【請求項８】
ブロックコポリマーが、式（１Ａ−１）、（１Ａ−２）、（１Ｂ−１）、（１Ｂ−２）、（１Ｃ−１）、（１Ｃ−２）、（１Ｄ−１）及び（１Ｄ−２）：
【化１２】
2005336402.tif 000029
【化１３】
2005336402.tif 000030
上記各式中、Ｒ、ｐ、ｑ及びＺは式（Ａ−１）、式（Ａ−２）、式（Ｂ−１）、式（Ｂ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｄ−１）及び式（Ｄ−２）について定義したのと同義であり、Ｘ、ｎ及びｓは式（Ｅ）について定義したのと同義であり、Ｙ１は−ＮＨ−または−Ｒａ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｂ−を表し、ＲａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｂはＮＨまたはＯを表し、Ｙ２はＣＯまたは−Ｒｃ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｄ−を表し、ＲｃはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｄはＣＯを表し、そしてｒは１乃至６の整数を表す、のブロックコポリマーからなる群より選ばれる請求項５に記載の薬物担持用キャリヤー。
【請求項９】
ブロックコポリマーが、式（１Ａ−１）及び（１Ａ−２）：
【化１４】
2005336402.tif 000031
上記各式中、Ｒ、ｐ、ｑ及びＺは式（Ａ−１）及び式（Ａ−２）について定義したのと同義であり、Ｘ、ｎ及びｓは式（Ｅ）について定義したのと同義であり、Ｙ１は−ＮＨ−または−Ｒａ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｂ−を表し、ＲａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｂはＮＨまたはＯを表し、Ｙ２はＣＯまたは−Ｒｃ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｄ−を表し、ＲｃはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｄはＣＯを表し、そしてｒは１乃至６の整数を表す、のブロックコポリマーからなる群より選ばれる請求項５に記載の薬物担持用キャリヤー。
【請求項１０】
薬物が、カンプトテシン及びその誘導体、ビンクリスチン、ビンプラスチン、ビンデシン、タキソール及びその誘導体、エトポシド、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、メソオレキセート、６−メルカプトプリン、インドメタシンを初めとする難水溶性の抗炎症剤、テトラサイクリン系抗生物質、バンコマイシンを初めとするペプチド系抗生物質、及びキノロン系抗菌剤からなる群より選ばれる請求項５に記載の薬物担持用キャリヤー。
【請求項１１】
薬物が高分子ミセルの内核領域に担持される形態になる請求項１０に記載の薬物担持用キャリヤー。
【請求項１２】
式（１Ａ−１）及び（１Ａ−２）：
【化１５】
2005336402.tif 000032
上記各式中、Ｘは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アセタールもしくはケタール化ホルミル−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アミノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジル基を表し、そして  
Ｚは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルフェニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル、またはフェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノカルボニル基を表す、
Ｒは水素原子または式（３）：
【化１６】
2005336402.tif 000033
（ここで、Ｒ１は水素原子もしくはフェニル基を表し、Ｒ２はＣ３−Ｃ１７アルキル、フェニル、p-,m-もしくはo-ビフェニル、または１もしくは２−ナフチルを表し、フェニル及びナフチルのベンゼン環はＣ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、フッ素、塩素、ジアゾ、カルバモイル、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、アミノ及びモノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノからなる群より選ばれる置換基１乃至４個まで置換されていてもよく、ａは０乃至４の整数を表す）の基を表し、式（３）の基は総Ｒの少なくとも４０％を占め、ｐ及びｑは相互に独立して1乃至300の整数であるが、ｐ＋ｑは３５０までであり、Ｙ１は−ＮＨ−または−Ｒａ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｂ−を表し、ＲａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｂはＮＨまたはＯを表し、Ｙ２はＣＯまたは−Ｒｃ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｄ−を表し、ＲｃはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｄはＣＯを表し、そしてｒは１乃至６の整数を表し、そしてｓは０乃至６の整数を表す、のブロックコポリマー。
【請求項１３】
式（３）の基が、総Ｒの少なくとも５０％を占める請求項１２に記載のブロックコポリマー。
【請求項１４】
式（３）の基が、ベンジルまたは２−ナフチルメチルであり、総Ｒの少なくとも５５％を占める請求項１２に記載のブロックコポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達用のキャリヤーとして有用な高分子、特に、親水性ポリマー鎖セグメントとポリアミノ酸誘導体セグメントを含むブロックコポリマー、及びその使用、並びにそのブロックコポリマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物送達もしくはターゲティングとは、「薬物治療が必要な部位に選択的に薬物を送りこみ働かせること」と定義され、該ターゲティングによって、薬物治療が必要な部位での薬物濃度が高められるために、目的とする薬理作用が増強される一方、他の部位への送達量を少なくすることで副作用を著しく軽減することが可能となる。特に、副作用が大きいことが治療上の重大な問題になっている、抗がん剤などにおいて薬物ターゲティングの必要性が認識されている。薬物ターゲティングは薬物を標的に運搬するキャリヤーを用いて薬物を治療が必要な部位に送達して働かせることによって達成される。このようなキャリヤーの中で、高分子ミセルは数々の優れた特長を有していることで注目を集めている。高分子ミセルとは、主としてＡＢ型のブロックコポリマーなどが多数会合して形成されるもので、内核（またはコア）と外殻（シェル）の２相構造となっていて、通常、水性媒質中でサブミクロンの直径を有する球状の構造体である。
【０００３】
高分子ミセルドラッグキャリヤーシステムの数々の特長の中でも、医学での応用に際して重要なことには、疎水性もしくは非水溶性薬物への適用性があり、疎水性または非水溶性もしくは難水溶性薬物を含量高く、システムの水溶性を失うことなく封入できることである。封入方法には、内核構成高分子鎖に薬物分子を化学的に結合する方法と、疎水性内核に薬物を封入する方法がある。疎水性や非水溶性もしくは難水溶性薬物のミセル内核への物理的な封入は、内核構成高分子鎖と薬物の相互作用により達成される。この相互作用は疎水性相互作用が主たるものと考えられるが、これに加えて水素結合やπーπ相互作用なども封入に寄与することが考えられている。
【０００４】
このような高分子ミセルを形成する典型的なＡＢ型のブロックコポリマーとしては、親水性ポリマー鎖セグメントがポリ（エチレンオキシド）からなり、疎水性ポリマー鎖セグメントが疎水性ポリアミノ酸からなるもが挙げられる(例えば、特許文献１及び２参照)。これらでは、高分子ミセルの内核を構成するポリマー鎖の疎水性の強さが薬物封入についての重要な因子として認識されている。特に、特許文献２では、特許文献１における疎水性セグメントを構成するポリ(ベンジルアスパラギン酸)のベンジル基を酸触媒の存在下に高級アルコールで部分的にエステル交換して高分子ミセルの内核の疎水性を高め、タキソールやカンプトテシン等の難水溶性薬物の高分子ミセル内核への物理的な封入を行っている。他方、特許文献２とは異なり、カンプトテシン誘導体であるN,N−ジメチルアミノメチル基を導入して水溶性を高めたトポテカンを高分子ミセル内核へ物理的に封入するのに、ポリ(ベンジルアスパラギン酸)セグメント(αアミド型)のベンジル基を酸部分加水分解して一部のカルボキシル基を遊離型にしたものを使用することも提案されている(例えば、特許文献３参照)。
【特許文献１】特許第２７７７５３０号公報(第４頁、式〔III〕)
【特許文献２】特開平１１−３３５２６７号公報(第８頁)
【特許文献３】特開２００３−３４２１６７号(第７頁)
【発明の開示】
【０００５】
以上に述べた特許文献２及び３からは、ポリマー側鎖のカルボキシル基のエステルの形態及びカルボキシル基の割合により薬物の高分子ミセル内核への封入特性が変動しうることが示唆される。しかし、例えば、特許文献２及び３に記載のポリ(ベンジルアスパラギン酸)セグメントのベンジル基の部分加水分解では、必ずしも、所望のエステル部分加水分解率を達成することが困難なことがよくある。また、こうような部分加水分解により得られるポリマー組成物は、ポリマーの分子レベルで考慮すると、例えば、１００％のエステルが加水分解したものと未分解のままの分子の混合物として、見かけ上一定の加水分解率を示すこともあるようである。
【０００６】
他方、従来、一般的にポリマーの側鎖のカルボキシル基にエステル形成するためには、カルボジイミド類のカップリング剤によって、ポリマー側鎖のカルボキシル基を反応性の高い活性状態にしておき、それに対して水酸基を持った化合物を反応させていた。しかし、この従来法では、２つのカルボキシル基がカップリング剤によって反応して酸無水物となる過程が含まれるが、高分子であることでポリマー側鎖の全て或いは大多数のカルボキシル基が酸無水物を経てエステルとなることは困難である。なぜなら、エステル化反応が進行してポリマー上に未反応のカルボキシル基が少なくなってくると、一つのポリマー分子上の反応すべき二つのカルボキシル基の距離が大きくなり、その二つが近づいて反応する確率が小さくなる。また、異なる２本のポリマー中のカルボキシル基が近づいて反応することは、ポリマー鎖の拡散が低分子に比べて著しく遅いことから、困難である。
【０００７】
ところが、ここに、有機強塩基を触媒に用いてハロゲン化合物の置換反応を行うことにより高エステル化率のポリマーを製造しうることを見出した。
【０００８】
また、こうして得られた一定のエステル化率を有するポリマーは、遊離のカルボキシル基が存在していても、非水溶性もしくは難水溶性薬物のミセル内核への物理的な封入を効率よく達成することができ、しかも生理学的条件下で安定に維持できる薬物内包ミセルを提供できることも見出した。
【０００９】
こうして、本発明によれば、一般式（１）
Ｘ−＜H.philic＞−block−＜Carbo-E＞−Ｚ                （１）
式中、＜H.philic＞  はポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)及びポリ（ビニルピロリドン）からなる群より選ばれるポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントを表し、＜Carbo-E＞  はポリ(αアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型，βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型−グルタミン酸)及びポリ(γアミド型−グルタミン酸)から選ばれるポリマーのアミノ酸ポリマー鎖セグメントであって、総カルボキシル基の少なくとも４０％が式
【００１０】
【化１】
2005336402.tif 000002
【００１１】
（ここで、Ｒ１は水素原子もしくはフェニル基を表し、Ｒ２はＣ３−Ｃ１７アルキル、フェニル、p-,m-もしくはo-ビフェニル、または１もしくは２−ナフチルを表し、フェニル及びナフチルのベンゼン環はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、フッ素、塩素、ジアゾ、カルバモイル、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、アミノ及びモノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノからなる群より選ばれる置換基１乃至４個まで置換されていてもよく、ａは０乃至４の整数を表す）のエステル結合を形成しているアミノ酸ポリマー鎖セグメントを表し、
Ｘは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アセタールもしくはケタール化ホルミル、アセタールもしくはケタール化ホルミル−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アミノ、アミノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジル基を表し、そして
Ｚは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルフェニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル、またはフェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノカルボニル基を表す、
のブロックコポリマーの製造方法であって、
一般式（１Ｐ）
Ｘ−＜H.philic−Ｐre＞−block−＜Carbo＞−Ｚ    （１Ｐ）
式中、＜H.philic−Ｐre＞  はポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)もしくはポリ(酢酸ビニル)及びポリ（ビニルピロリドン）からなる群より選ばれるポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントまたはその前駆セグメントを表し、＜Carbo＞  はポリ(αアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型及びβアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型−グルタミン酸)及びポリ(γアミド型−グルタミン酸)から選ばれるポリマーのアミノ酸ポリマー鎖セグメントを表し、そしてＸ及びＺは一般式(１)について定義したのと同義である、
のブロックコポリマーを、溶液中、有機強塩基の存在下で、一般式（２）
【００１２】
【化２】
2005336402.tif 000003
【００１３】
式中、haloは塩素、臭素またはヨウ素を表し、Ｒ１，Ｒ２及びａは一般式（１）について定義したのと同義である、
のハロゲン化物と反応させることを特徴とする一般式(１)で表されるブロックコポリマーの製造方法が提供される。
【００１４】
また、別の態様の本発明として、都合よくは前記の方法で製造される、上記の一般式（１）で表されるブロックコポリマーを含んでなる薬物担持用キャリヤーも提供される。
【００１５】
さらなる別の態様の本発明として、  式（１Ａ−１）及び（１Ａ−２）：
【００１６】
【化３】
2005336402.tif 000004
【００１７】
上記各式中、Ｘは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アセタールもしくはケタール化ホルミル−Ｃ１−Ｃ６アルキル、アミノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジル基を表し、そして
Ｚは水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルフェニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル、またはフェニル−Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノカルボニル基を表す、
Ｒは水素原子または式（３）：
【００１８】
【化４】
2005336402.tif 000005
【００１９】
（ここで、Ｒ１は水素原子もしくはフェニル基を表し、Ｒ２はＣ３−Ｃ１７アルキル、フェニル、p-,m-もしくはo-ビフェニル、または１もしくは２−ナフチルを表し、フェニル及びナフチルのベンゼン環はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、フッ素、塩素、ジアゾ、カルバモイル、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、アミノ及びモノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノからなる群より選ばれる置換基１乃至４個まで置換されていてもよく、ａは０乃至４の整数を表す）の基を表し、式（３）の基は総Ｒの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましく少なくとも５５％を占め、ｐ及びｑは相互に独立して1乃至300の整数であるが、ｐ＋ｑは３５０までであり、Ｙ１は−ＮＨ−または−Ｒａ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｂ−を表し、ＲａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｂはＮＨまたはＯを表し、Ｙ２はＣＯまたは−Ｒｃ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｄ−を表し、ＲｃはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＯまたはＣＯＮＨを表し、ＲｄはＣＯを表し、そしてｒは１乃至６の整数を表し、そしてｓは０乃至６の整数を表す、のブロックコポリマーも提供される。
［発明の効果］
【００２０】
本発明のブロックコポリマーの製造方法は、ポリマー側鎖のカルボキシル基のエステル化を効果的に行うことが出来、また、当該ブロックコポリマー、特に、ポリマーそれ自体の提供を意図するブロックコポリマー、を含んでなる薬物担持用キャリヤーでは、未だ、遊離のカルボキシル基が残存していても、非水溶性もしくは難水溶性薬物、特に、ベンゼン環に富んだ構造を有する薬物を効率よく封入でき、しかも薬物内包高分子ミセルの生理学的条件下での安定性を有意に高めることができる。
【００２１】
このことは、理論により本発明を限定するものではないが、次のように理解できる。上記したとおり、薬物を高分子ミセルの内核に封入する際には、ポリマー鎖と薬物の疎水性相互作用、水素結合またはπ−π相互作用の寄与が考えられてきた。しかし、ミセル内核構成ポリマー鎖の、疎水性以外の物性（例えばポリマー鎖の流動性など）や、疎水基の配置や薬物分子との形状とのかみ合せなどの立体的要因も重要である可能性がある。本発明によれば、高分子ミセルの内核を形成するポリマー鎖の化学構造を系統的に変化させることで、疎水性薬物の物理的封入に寄与する要因のうち、疎水性の強さ以外の要因にもよる物理的封入がより好ましいブロックコポリマー構造が提供される。具体的には、例えば、ベンゼン環に富んだ構造を有するカンプトテシンを封入する場合に、ベンゼン環を疎水基として有するブロックコポリマーのベンゼン環の配置を調整することによりカンプトテシンの封入安定性が高い高分子ミセルが得られる。また、ミセル内核構成高分子鎖の疎水基の立体配置については、β−アミド型のアスパラギン酸残基に富むブロックコポリマーを用いることで、疎水基のベンジル基の高分子鎖上の間隔をαーアミド型の場合よりも大きくすることで安定にカンプトテシンを封入することができたものと理解できる。
＜発明の具体的な説明＞
本発明の説明に関して使用するＣ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルコキシ等の基中のアルキル部分は、炭素原子数が１乃至６のアルキルであり、メチル、エチル、n−プロピル、iso−プロピル、n−ブチル、tert−ブチル、n−ヘキシル等を意味する。また、本明細書で用いる結合または連結基は、示されている方向性を以って各基またはセグメントもしくはブロックを結合または連結しているものと理解されている。また、前記のＲ２について定義に関してとることのできるＣ１８までのアルキル基の例は、上記のものに加えて、分岐していてもよいオクタデカン、ヘプタデカン、テトラデカン、ウンデカン、ノナン等を挙げることができる。
【００２２】
本明細書で用いる結合または連結基は、示されている方向性を以って各基またはセグメントもしくはブロックが結合もしくは連結されているものと理解される。例えば、式（１A −1）を参照すれば、（ＣＨ２）ｓ−Ｙ１−（ＣＯ  におけるＹ１が−Ｒａ−(ＣＨ２)ｒ−Ｒｂ−を表す場合、Ｒａが（ＣＨ２）ｓに結合することを意味する。
【００２３】
一般式（１）で表されるブロックコポリマーを製造するのに使用できる一般式（１Ｐ）で表されるブロックコポリマーは、Ｘ−＜H.philic−Ｐre＞に相当する、場合により片末端がＸに対応するように修飾されたポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(酢酸ビニル)またはポリ（ビニルピロリドン）を用意し、他方、＜Carbo＞−Ｚに相当する、場合により片末端がＺに対応するように修飾されたポリ(αアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(βアミド型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型及びβ型−アスパラギン酸)、ポリ(αアミド型−グルタミン酸)またはポリ(γアミド型−グルタミン酸)を用意し、両者をそれ自体公知の結合反応に供して取得できる。他方、親水性ポリマー鎖セグメントに対応するポリマーを用意し、必要により適当な官能基をω−末端に導入した後、その末端官能基を利用して、それ自体公知の、逐次的な鎖長の伸長反応を実施して、所期のポリマミノ酸が導入された一般式（１Ｐ）で表されるブロックコポリマーを取得できる。例えば、特許文献１に記載の方法で取得した各アミノ酸の対応するベンジルエステル化物を、アルカリまたは酸化水分解に供して実質的に全てのベンジル基を脱離させて遊離のカルボン酸とすることにより一般式（１Ｐ）で表されるブロックコポリマーを提供することができる。なお、ポリ（γアミド型−グルタミン酸）は、バチルス属（Bacillus）の細菌が生産するものを、利用してもよい。
【００２４】
ポリ(β―ベンジル  アスパラギン酸)のポリマー鎖は、ベンジルエステル結合をアルカリ化水分解すると、通常、主鎖の約７５％がβ−アミド化し、例えば、式（１A −1）のＲが水素原子を表すような、αアミド型−アスパラギン酸単位とβアミド型−アスパラギン酸単位とがランダムに混在するポリマー鎖になる。他方、上記のアルカリ加水分解に代え、酸加水分解すると、αアミド型−アスパラギン酸単位のみからなる一般式（１Ｐ）で表されるブロックコポリマーを提供することができる。
【００２５】
また、ポリ(ビニルアルコール)は公知方法で製造したポリ(酢酸ビニル)からの加水分解により得たものを利用するか、場合によっては、ポリ(酢酸ビニル)のポリマー鎖のまま、もう一方のアミノ酸のポリマー鎖のエステル化を行った後にポリ(ビニルアルコール)化してもよい。また、ポリ（ビニルピロリドン）もそれ自体公知のラジカル重合により得たものを利用できる。これらのポリマーの片末端に各種のＸ基を担持させるには、例えば、アセタールもしくはケタール化ホルミル等は、ＷＯ９６／３３２３３に記載の方法を参考にすることができる。
【００２６】
こうして用意されるブロックコポリマーを、溶液中、有機強塩基の存在下で、一般式（２）
【００２７】
【化５】
2005336402.tif 000006
【００２８】
式中、haloは塩素、臭素またはヨウ素を表し、Ｒ１，Ｒ２及びａは一般式（１）について定義したのと同義である、
のハロゲン化物と適当な条件下で反応させることにより、総カルボキシル基の少なくとも４０％をエステル化することができる。このような条件は、限定されるものでないが、好ましくは、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、等の双極性非プロトン性溶媒（場合により、クロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素を混合してもよい）を用い、溶媒の沸点以下の温度で、上記の所望のエステル化が進行するまで反応させる。
【００２９】
本反応で、必須であるのは、触媒として、有機強塩基を使用することである。有機強塩基としては、１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]  ７−ウンデセン（ＤＢＵ）、１，５−ジアザビシクロ[４．３．０]ノン―５−エン（ＤＢＮ）、１，５，７−トリアザビシクロ[４．４．０]デカ−５−エン（ＴＢＤ）、７−メチル−１，5，７−トリアザビシクロ[４．４．０]デカ−5−エン（ＭＴＢＤ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン（ＴＭＰ）等を挙げることができる。
【００３０】
一般式（２）で表されるハロゲン化物の典型的なものとしては、限定されるものでないが、臭化ベンジル、臭化ｎ−ブチル、ヨウ化ｎ−ブチル、臭化ラウリル、（２−ブロモメチル）ナフタレン、（２−ブロモエチル）ベンゼン、１−ブロモ−３−フェニルプロパン、４−フェニルベンジルクロリド、４−ブロモビフェニル、ブロモジフェニルメタン、２−フェニルベンジルブロミドを挙げることができる。
【００３１】
こうして得られる一般式（１）のブロックコポリマーは、具体的には、＜Carbo-E＞−Ｚが、式（Ａ−１）、式（Ａ−２）、式（Ｂ−１）、式（Ｂ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｄ−１）及び式（Ｄ−２）： 
【００３２】
【化６】
2005336402.tif 000007
【００３３】
【化７】
2005336402.tif 000008
【００３４】
〔上記各式中、Ｒは水素原子または式（３）：
【００３５】
【化８】
2005336402.tif 000009
【００３６】
の基を表し（ここで、Ｒ１、Ｒ２及びａは、上記の一般式（１）について定義したのと同義である）、式（３）の基は総Ｒの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも５５％、最も好ましくは少なくとも６０％を占め、ｐ及びｑは相互に独立して1乃至300の整数であるが、ｐ＋ｑは３５０までであり、そしてＺは一般式（１）について定義したのと同義である〕で表されるポリアミノ酸ブロックからなる群より選ばれるものである（＜Carbo-E＞−Ｚに対応する＜Carbo＞−Ｚを有する一般式（１Ｐ）の出発原料を用いる）。
【００３７】
さらに具体的には、一般式（１）のＸ−＜H.philic＞  が、式（Ｅ）：
Ｘ―(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎ―(ＣＨ２)ｓ−            （Ｅ）
〔式中、Ｘは上記で一般式（１）について定義したのと同義であり、ｎは１０乃至１０，０００の整数を表し、そしてｓは０乃至６の整数を表す〕の親水性ポリマーブロックである、上記のブロックコポリマーが得られる（Ｘ−＜H.philic＞に対応するＸ−＜H.philic−Ｐre＞を有する一般式（１Ｐ）の出発原料を用いる）。
【００３８】
より具体的には、上記の式（Ａ−１）、式（Ａ−２）、式（Ｂ−１）、式（Ｂ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｃ−１）、式（Ｄ−１）及び式（Ｄ−２）と、式（Ｅ）との組み合わせからなり、上記のＹ１またはＹ２で表される連結基を有する下記の式（１Ａ−１）、（１Ａ−２）、（１Ｂ−１）、（１Ｂ−２）、（１Ｃ−１）、（１Ｃ−２）、（１Ｄ−１）及び（１Ｄ−２）からなる群より選ばれる下記の式で表されるブロックコポリマーが上記の方法により得られる。
【００３９】
【化９】
2005336402.tif 000010
【００４０】
【化１０】
2005336402.tif 000011
【００４１】
上記各式中、Ｘ、Ｚ、Ｒ、Ｙ１、  Ｙ２、ｎ、ｐ、ｑ、ｓは上記のとおりである。
【００４２】
こうして都合よく取得できる、ブロックコポリマーは、薬物担持用キャリヤーとして有用である。
【００４３】
かような薬物としては、カンプトテシン及びその誘導体、ビンクリスチン、ビンプラスチン、ビンデシン、タキソール及びタキソレート等のその誘導体、エトポシド、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、メソオレキセート、６−メルカプトプリン、インドメタシンを初めとする難水溶性の抗炎症剤、テトラサイクリン系抗生物質、バンコマイシンを初めとするペプチド系抗生物質、及びキノロン系抗菌剤からなる群より選ばれる薬物を挙げることができる。
【００４４】
したがって、本発明によれば、好ましくは、該ブロックコポリマーと該薬物を含んでなり、かかる薬物が高分子ミセルの内核に封入乃至は内包された薬物内包高分子ミセルを含んでなる組成物も提供される。薬物として、都合よく使用できるのは、ベンゼン環を含むカンプトテシン及びその誘導体(例えば、カンプトテシンの１９位のエチル基が、メチル、２−ヒドロキシエチル、２−ブロモエチル基に置き換わったもの、またはカンポトテシンの９位、１０位、１１位、１２位のいずれかの水素原子がアミノ、ヒドロキシまたはニトロに置換されたもの、１０位と１２位の水素原子が一緒になってメチレンジオキシによって置換されたもの、その他、特許文献３に記載のもの等)、タキソール及びタキソレート等のその誘導体を挙げることができる。
【００４５】
本発明によれば、具体的には後述する具体例に示すとおり、生理学的条件下で安定に保持することができ、薬物の封入率を高めた薬物内包高分子ミセルを提供できる。
【００４６】
該ブロックコポリマーの形成する高分子ミセルに該薬物を封入する方法はそれ自体公知の方法、例えば、具体的には後述する、（ｉ）透析法、（ｉｉ）エマルション法、（ｉｉｉ）エバポレータ法、が使用できる。
【００４７】
また、式（１Ａ−１）及び（１Ａ−２）で表されるブロックコポリマーは、上記の薬物の封入に特に好ましく使用でき、また、新規な物質でもある。したがって、本発明によれば、式（１Ａ−１）及び（１Ａ−２）で表されるブロックコポリマーそれ自体も提供される。
【００４８】
こうして提供される薬物内包高分子ミセルの作用効果について、カンプトテシンを参照にさらなる説明を行う。カンプトテシンは、通常、Ｅ環と称されている位置にラクトン環を有し、ラクトン体とそれが加水分解したオープン体の両方で存在し、この２つの形態はｐＨに依存した平衡関係にあり、ｐＨ７．４では大部分がオープン体で存在する。この２つの形態のうちラクトン体のみに抗がん活性があり、もう一つのオープン体には抗がん活性が存在しない。本発明によれば、高分子ミセル内にカンプトテシンを封入することにより非水溶性のカンプトテシンを水溶性、つまり血液内に容易に注射できるものとし、さらにがんにターゲティングして抗がん効果を飛躍的に増大させることができる。加えて、体内に投与した後にカンプトテシンの血液中での加水分解を抑制し、その抗がん作用をもたらす活性体であるラクトン体を安定に保ことによっても抗がん効果を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、本発明の具体例を挙げながらより具体的に説明するが、本発明をこれらの具体的な態様に限定することを意図するものでない。
例１：ベンジルエステルの加水分解
（１）−１アルカリ加水分解
ポリエチレングリコールーポリ（β−ベンジル  L−アスパルテート）ブロックコポリマー（以下、ＰＥＧ−ＰＢＬＡと略記する）のポリエチレングリコールの分子量が５，０００でβ−ベンジル  L−アスパルテートの重合度が２７のもの３.００gを取り、０.５Nの水酸化ナトリウム水溶液をβ−ベンジル  L−アスパルテートユニットに対し１.５倍モル等量加えて１５分撹拌した。１５分程で溶液が透明になったところで、６N塩酸をβ−ベンジル  L−アスパルテートユニットに対し１０倍モル等量加えた。その後、この混合液を０.１N塩酸、ついで蒸留水中で透析した。最後に凍結乾燥して、ポリエチレングリコールーポリ（アスパラギン酸）ブロックコポリマー（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ））を得た。このアルカリ加水分解によって、ポリエチレングリコールーポリ（アスパラギン酸）のポリ（アスパラギン酸）部分の主鎖の約７５％がβ−アミド化することが当該技術分野で確認されている。
（１）−２  酸加水分解
ポリエチレングリコールーポリ（β−ベンジル  L−アスパルテート）ブロックコポリマー（以下、ＰＥＧ−ＰＢＬＡと略記する）のポリエチレングリコールの分子量が５，０００でβ−ベンジル  L−アスパルテートの重合度が２７のもの０．５０gを取り、５mLのトリフルオロ酢酸に溶解させた。これに、β−ベンジル  L−アスパルテートユニットに対し１０倍モル等量のトリフルオロメタスルホン酸、チオアニソール、m−クレゾールを加えて０℃で４時間撹拌した。反応液をその１０倍容量のジエチルエーテルに滴下し、再沈した高分子を回収して、水に対して透析した。最後に凍結乾燥して、ポリエチレングリコールーポリ（アスパラギン酸）ブロックコポリマー（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ））を得た。この酸加水分解によって得られたＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）の、ポリアスパラギン酸部分のアミドの構造はほぼ１００％（９５％以上）α−アミドであることが１Ｈ−ＮＭＲ測定によって確認された。
【００５０】
以下の例においては、断りのない限り、アルカリ加水分解で得られたポリエチレングリコールーポリ（アスパラギン酸）をエステル形成反応、カンプトテシン封入に用いている。
例２．エステル形成反応
ポリエチレングリコールーポリ（アスパラギン酸）ブロックコポリマー（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ））のポリエチレングリコールの分子量が５，０００でアスパラギン酸の重合度が２７のもの200.0mgを取り、N,N,-ジメチルホルムアミド2.7mLに溶かした。この溶液に、臭化ベンジル116.9mgと1,8-ジアザビシクロ［5,4,0］7-ウンデセン（DBU）103.9mgを加え、５０℃で一晩反応させた。反応液をその約１０倍の容積量のジエチルエーテルに滴下して、再沈した高分子をろ過によって回収した。この回収ポリマーを少量のジメチルスルホキシドに溶かし、アスパラギン酸残基に対し１０倍量の６N  HClを加えてから、水に対して透析し、凍結乾燥した。収量144.0mg。これと同様の手順で表１に示す様々なエステル化を行なった。
【００５１】
【表１】
2005336402.tif 000012
【００５２】
表１に示すように、各種鎖長のブロックコポリマーに対し、様々な疎水性の基をエステル形成で導入することができた。特に、ベンジル基の場合に７５％のエステル形成率が達成されたように、ブロックコポリマー側のアスパラギン酸残基に対して極めて高いエステル形成率が得られた。
例３．下記の３種の高分子ミセルの形成方法によるカンプトテシンの高分子ミセルへの封入効率の比較
（１）透析法
ブロックコポリマー5.0mgとカンプトテシン0.5 mgを1.0 mLのジメチルホルムスルホキシドに溶かし、蒸留水に対して１晩透析した。透析膜内に残った溶液をろ紙でろ過してミセル溶液を得た。
（２）エマルション法
ブロックコポリマー5.0mgとカンプトテシン0.5 mgを0.5 mLの塩化メチレンに溶かし、2.0 mLの蒸留水中に撹拌しながら加えた。塩化メチレンが蒸発させた後、水溶液をろ紙でろ過してミセル溶液を得た。
（３）エバポレーション法
ブロックコポリマー5.0mgとカンプトテシン0.5 mgを0.5 mLのクロロホルムに溶かして、ガラス容器に入れた。これに撹拌しながら、乾燥窒素ガスを吹き付けた。クロロホルムを蒸発させた後、蒸留水3.0mLを入れて、超音波照射を２分間行なった（Sonics&Materials社製model VC100）。この水溶液をろ紙でろ過してミセル溶液を得た。
【００５３】
以上の３方法で得られた高分子ミセル溶液中のカンプテテシン量を370nmの光の吸光度から600nmの光の吸光度を引いた値から求めた（モル吸光係数としては19,900を用いた）。表２にカンプトテシンの収量を示す。透析法、エマルション法の両方法では、カンプトテシンの収量は様々なブロックコポリマーを用いても低く、最高で３６％であった。これに対してエバポレーション法では高い６０％という値が得られた。なお、ブロックコポリマーの立て欄に記載の、例えば、「ベンジル−２５」は、アスパラギン酸単位の約２５％がベンジルエステルの形態にあることを意味する。以下、同様。
【００５４】
【表２】
2005336402.tif 000013
【００５５】
例４．エバポレーション法によるカンプトテシン封入の最適化
例３で、エバポレーション法で高いカンプトテシン収率が得られたので、エバポレーション法に絞って封入効率、封入安定性を測定した。
【００５６】
ブロックコポリマー7.5 mgとカンプトテシン0.75 mgを0.75 mLのクロロホルムまたは0.75 mLのクロロホルムと0.5mLのアセトニトリルの混合溶媒に溶かして、ガラス容器に入れた。これに撹拌しながら、乾燥窒素ガスを吹きつけた。クロロホルムを蒸発させた後、蒸留水3.0mLを入れて、超音波照射を２分間行なった（S onics&Materials社製model VC100）。この水溶液を遠心分離し（3,000rpm,１０分間）、沈んだ凝集物を除いて上澄みのみをディスク型ろ過装置（Puradisc 25NYL, Whatman社製）を通して、高分子ミセル溶液を得た。高分子ミセル溶液中のカンプテテシン量は、ＤＭＳＯ：蒸留水＝９：１（体積割合）中で、365nmの光の吸光度から600nmの光の吸光度を引いた値から求めた。（モル吸光係数としては20,860を用いた）また、カンプトテシン封入の安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによって評価した。
【００５７】
すなわち、高分子ミセル溶液を、Tosoh TSKgel G3000PWXLのカラムを装着した高速液体クロマトグラフ装置に注入し、その３５１ｎｍの吸収で検出した3.3 mL〜4.0 mLに流出する高分子ミセルピークの大きさを求め、カンプトテシン濃度で割った値（ピーク面積／カンプトテシン濃度）の大きさで評価した。この値が大きい程封入安定性が高いことになる。
【００５８】
表３に示すように、用いるブロックコポリマーによってカンプトテシン収率，ピーク面積／カンプトテシン濃度の値は大きく異なった。その中でベンジル−６１，ベンジル−６９，（２−メチル）ナフチル−６４が封入安定性が高かった（ピーク面積／カンプトテシン濃度の値が大きかった）。またこれらのポリマーではカンプトテシン収率も３７％以上と良好であった。さらに、Run11とRun12で有機溶媒をクロロホルムのみと（クロロホルム＋アセトニトリル）混合物の結果を比べてみると、アセトニトリルを添加したRun12の方が、カンプトテシン封入効率と封入安定性の両者で高い値が得られた。よって、以後の封入はクロロホルムとアセトニトリルの混合溶媒で行なった。
【００５９】
【表３】
2005336402.tif 000014
【００６０】
表３に示すように、用いるブロックコポリマーによってカンプトテシン収率，ピーク面積／カンプトテシン濃度の値は大きく異なった。その中でベンジル−６１，ベンジル−６９，（２−メチル）ナフチル−６４を用いた場合に封入安定性が高かった（ピーク面積／カンプトテシン濃度の値が大きかった）。またこれらのポリマーではカンプトテシン収率も３７％以上と良好であった。さらに、Run11とRun12で有機溶媒をクロロホルムのみと（クロロホルム＋アセトニトリル）混合物の結果を比べてみると、アセトニトリルを添加したRun12の方が、カンプトテシン封入効率と封入安定性の両者で高い値が得られた。よって、以後の封入はクロロホルムとアセトニトリルの混合溶媒で行なった。
【００６１】
次に、ベンジル−６１，ベンジル−６９，（２−メチル）ナフチル−６４で得られた高い封入安定性が、ポリアスパラギン酸残基に含まれるβーアミドの効果であることを確かめる実験を行なった。有機溶媒の条件は表３Run12と同じ条件を用いた。結果を表４に示す。
【００６２】
【表４】
2005336402.tif 000015
【００６３】
表４では、トリフルオロ酢酸を用いて全ポリアスパラギン酸残基の９５％以上をαーアミドで占めているブロックコポリマーにベンジルエステルを６６％導入したブロックコポリマーとカンプトテシンの封入挙動を比較した。封入時のカンプトテシン／ブロックコポリマーの重量比を５％、１０％、２０％、４０％と変えたすべての場合において、封入安定性を示す値（ピーク面積／カンプトテシン濃度）はβ−アミドを約７５％含むブロックコポリマー（Ａ）の方が高かった。このブロックコポリマー（Ａ）のベンジルエステル導入率は６９％なので、β−アミドのアスパラギン酸残基は必ずベンジルエステル化している。（ベンジルエステル化しているβ−アミドアスパラギン酸残基の割合は全アスパラギン酸残基の４４％〜６９％の範囲である）一方，ブロックコポリマー（Ａ）ではその９５％以上がα−アミドである。以上より、βーアミド体であるベンジルエステル化アスパラギン酸残基がカンプトテシンの封入安定化に大きく寄与していることがわかる。
【００６４】
次に、カンプトテシン収率と封入安定性が比較的よかったベンジルエステル導入ブロックコポリマーを用いて、薬物とブロックコポリマーの比を５％〜４０％に変えて、カンプトテシン収率を評価した。結果を表５に示す。ブロックコポリマーはすべて5.0 mgを使用。溶媒はCHCl3  0.5 mLとCH3CN 0.33 mLの混合溶媒を用いた。ベンジルエステルの含量が増えると、カンプトテシン収率が顕著に上昇し、ベンジル−６９では非常に高い値が得られ、仕込みのカンプトテシン量がブロックコポリマーの５〜２０％の範囲では９５％以上であった。また、仕込み量が４０％でも８４％という高い収率が得られた。このｒｕｎ１２の場合、ブロックコポリマーが１００％回収されたと仮定したときに、得られた高分子ミセルでのカンプトテシン／ブロックコポリマーの比は３４％にも及ぶ。よって得られたカンプトテシン封入高分子ミセルは、３４％以上という大変に大きな量のカンプトテシンを封入しながらも、良好な水溶性を有していたことは、非水溶性の薬物を安全に投与できる観点からたいへん有益な結果である。
【００６５】
【表５】
2005336402.tif 000016
【００６６】
例５．in vitro薬物放出試験
いずれもポリエチレングリコールの分子量が５，０００でアスパラギン酸の重合度が２７のもののベンジル−４４、ベンジル−５７、ベンジル−６９、ベンジル−７５（以上３つのブロックコポリマーは表４に示したもの）、ＰＥＧ−ＰＢＬＡの５種類のブロックコポリマーを用い、表４で行なった条件のうちカンプトテシン／ブロックコポリマーの比が４０％でカンプトテシンを封入したものを用いて薬物放出実験を行なった。カンプトテシン封入高分子ミセル溶液1.0mLを透析チューブ（Spectrapor 4）に入れ、pH7.4のリン酸生理緩衝液１００mLに対して透析する。チューブ外の液を適時サンプリングし、その液内のカンプトテシン量は、ＤＭＳＯ：蒸留水＝９：１（体積割合）中で、365nmの光の吸光度から600nmの光の吸光度を引いた値から求めた（モル吸光係数としては20,860を用いた）。このサンプル液内カンプトテシン量を薬物が高分子ミセルから放出した量とした。結果を図１にしめす。
【００６７】
ＰＥＧ−ＰＢＬＡでは薬物放出は非常に早く、封入しているカンプトテシン換算で７と７０μg/mLの濃度で１２時間以内に８０％以上の薬物が放出する。一番高い４００μg/mLでも２４時間以内に８０％以上の薬物が放出する。ベンジル−４４ではＰＥＧ−ＰＢＬＡよりも放出は遅く、ベンジル−５７になるとさらに遅くなる。ベンジル−５７で特徴的なのは薬物の放出速度が高分子ミセルの初期濃度に依存することである。初期濃度がカンプトテシン７μg/mLに比べて、５５３μg/mLの高濃度では顕著に放出が遅い。しかし、ベンジル−７５では初期濃度に関わらず放出速度はほぼ一定であり、２４時間で約５０％の放出量となっている。このようなゆっくりとした放出速度は、体内で長時間血液中を循環しながらがん組織に運搬される高分子ミセルキャリヤーシステムには好適の性質と考えられる。
例６．カンプトテシンの活性体の保持効果
上述したとおり、カンプトテシンはラクトン体に抗がん活性があり、もう一つのオープン体には抗がん活性がない。これらラクトン体とオープン体の間はpHに依存した平行関係が成り立っており、pH7.4では大部分がオープン体で存在する。図２に示す様に、カンプトテシン単独ではpH7.4リン酸緩衝液中、50%牛胎児血清を含むpH7.4リン酸緩衝液中の両方で、急速にオープン体に変化してゆく。それに対して、ベンジル−６９からなる高分子ミセルに封入したカンプトテシンはその活性体であるラクトン体がpH7.4リン酸緩衝液中、50%牛胎児血清を含むpH7.4リン酸緩衝液中の両方で長時間にわたって保持される。以上のことより、高分子ミセルに封入することで抗がん活性を示すラクトン体が非活性のオープン体に変換することを大幅に抑制することができることがわかった。
例７．マウスでの血液循環性測定
体重２５g程度のｄｄｙ雄性マウスの尾静脈にカンプトテシン５０μgに相当する量を投与し、４時間後に血液を採取し、そこから血清を作成した。血清にpH1.6のリン酸を加えて酸性にして、クロロホルム：メタノール＝４：１（体積）でカンプトテシンを抽出し、その量をTSK-gel ODS-80Tsカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフで測定した。
【００６８】
表６に示すように、カンプトテシンをそのまま投与した場合（非水溶性のカンプトテシンを均一溶液として投与するために脂質でエマルションにする．これは(polyethylene glycol 400 : propylene glycol : Tween80=40:58:2 , volume ratio)  にCPT濃度0.26mg/mLで溶かし，超音波をかけて調製した）は、４時間後には血中には、投与量のわずか0.099％という量が血液中を循環しているにすぎない。これに対し、高分子ミセルのベンジル−５７（ポリエチレングリコールの分子量が５，０００でアスパラギン酸の重合度が２７のもの）に封入したものでは、封入仕込み量が５、１０、２０％いずれの量でも3.1％から5.0％と圧倒的に多い量が血液中を循環していた。これは、高分子ミセルに内封することで、血液循環性を飛躍的に増大させた。このことは、固形がんへのターゲティングに充分な性質を有するもの考えられる。
【００６９】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明に従い、提供されるブロックコポリマーの製造方法は、所望の含有率のカルボン酸エステルを担持させることができ、また、こうして得られるブロックコポリマーは、薬物送達用高分子ドラッグキャリヤーとして有用な特有の特長を示す。したがって、本発明は、医薬の製造産業において、好ましく、利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明に従う、または比較の薬物内包高分子ミセルからのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物放出挙動を示す図である。図中、×印は７μg/mLの、白抜き丸印は７０μg/mLの、黒塗り丸印は、それぞれ５００μg/mL（ベンジル―４４）、５５３μg/mL（ベンジル―５７）、５１２μg/mL（ベンジル―７５）及び４００μg/mL(PEG-PBLA)の初期薬物濃度に関するデータによる。
【図２】本発明に従う、または比較の薬物(カンプトテシン)内包高分子ミセルを用いる活性体の保持効果を示す図である。図中、黒塗り丸印はPBS中の高分子ミセル封入カンプトテシンについての、黒塗り四角印は５０％牛胎児血清中の高分子ミセル封入カンプトテシンについての、白抜き丸印はPBS中のカンプトテシン単独についての、そして白抜き四角印は５０％牛胎児血清中のカンプトテシン単独についてのデータによる。
【図１】
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【図２】
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