(57)【要約】【課題】シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体の質量分析用プローブであって、標的化合物に対する選択性及び定量性が高いプローブを提供すること。【解決手段】【化１】2005061854.tif 000021（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、Ｘ１及びＸ２は互いに独立にハロゲン、ｎは１ないし４の整数を示す）で表される構造を有するシトシン又はその誘導体の質量分析用プローブ。【効果】本発明のプローブは、シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体に対して高い選択性を有し、これらを正確に質量分析することができるので、核酸試料の質量分析や、酸化ストレスマーカーの質量分析に有用である。【選択図】  図１
2005061854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2005061854.tif 000017
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、Ｘ１及びＸ２は互いに独立にハロゲン、ｎは１ないし４の整数を示す）で表される構造を有するシトシン又はその誘導体の質量分析用プローブ。
【請求項２】
式（ＩＩ）
【化２】
2005061854.tif 000018
で表される構造を有する請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2005061854.tif 000019
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、Ｘはハロゲン、ｍは１ないし４の整数を示す）で表される構造を有するグアニン又はその誘導体の質量分析用プローブ。
【請求項４】
式（ＩＶ）
【化４】
2005061854.tif 000020
で表される構造を有する請求項３記載のプローブ。
【請求項５】
８’−ヒドロキシデオキシグアニンの質量分析用である請求項３又は４記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体の質量分析用プローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、最も高感度、高精度に検体中の試料を定量することができる方法として質量分析測定法が挙げられる。質量分析法を用いて液状試料を測定するにあたり重要なことは、化合物の性質に合わせたイオン化法を選択することである。例えば化合物の不安定要因によって使い分ける場合、大きく分けてハードイオン化とソフトイオン化の２種類に分けられる。前者の方法としては、電子イオン化法、化学イオン化法及び大気圧イオン化法が挙げられ、後者の方法としてはエレクトロスプレーイオン化法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法及び高速原子衝撃イオン化法が挙げられる。
【０００３】
一方、最近では高速液体クロマトグラフィーで分離した試料をオンラインで質量分析を用いて同定を行う手法（ＬＣ／ＭＳ）が化学、生物学の分野で頻繁に利用されている。この場合、液体クロマトグラフィーと相性の良いイオン化法は、キャピラリー先端から流出する溶液試料を直接イオン化する方法であるため、先に記した方法のうち、後者の方法が該当する。中でもエレクトロスプレーイオン化質量分析装置と高速液体クロマトグラフィーをオンラインで接続した装置は現在最も汎用されており、タンパク質、糖質をはじめとした生体に不可欠な物質から、近年問題とされている環境ホルモン物質の同定にその威力を十分に発揮している。
エレクトロスプレーイオン化の場合、試料の分子イオンピークが検出されることは極めて低く、通常ナトリウムなどが加算された擬分子イオンピークとして観察されるか、あるいはＬＣ／ＭＳでは移動相に酢酸アンモニウム、ギ酸、酢酸などのプロトン性溶媒を混入することにより、試料のイオン化を助ける方法が採られている。
【０００４】
液状試料の質量分析の際のイオン化を助ける手段として、液体クロマトグラフィーの移動相にプロトン性溶媒を添加する手法がＬＣ／ＭＳでは一般的となっている。しかし、ｉ）酢酸アンモニウムは負イオンモードの場合、試料のイオンとアンモニウムイオンがペアとなって感度が低下する、ｉｉ）トリフルオロ酢酸は正イオンモードの場合、サンプルイオンとトリフルオロ酢酸イオンがペアとなって感度が低下し、負イオンモードの場合、一部例外を除きイオン化を妨害する、ｉｉｉ）アセトニトリルでは必ず酸を添加しなければならない、またこの際、酢酸アンモニウムでは溶解しないので用いることができない、等の欠点も指摘されている。
【０００５】
上記の問題を解決すべく、本願発明者のグループは、溶媒中でイオン化する基と、試料化合物中の官能基と反応して共有結合する官能基を１つの分子中に有する化合物をプローブとして用い、該プローブを試料化合物と共有結合させることにより、試料化合物を効率的にイオン化することができることに想到し、かつ、このようなプローブによりイオン化した試料化合物がエレクトロスプレー質量分析により高感度に定量できることを実験的に確認し、特許出願した（ＷＯ  ０２／０４９３６）。
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ０２／０４９３６号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
特許文献１に記載されている質量分析用プローブのうち、シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体の質量分析用プローブであって、標的化合物に対する選択性及び定量性が高いプローブを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の構造を有する化合物を、シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体の質量分析用プローブとして用いると、標的化合物に対する選択性及び定量性が高くなることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）
【化５】
2005061854.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、Ｘ１及びＸ２は互いに独立にハロゲン、ｎは１ないし４の整数を示す）で表される構造を有するシトシン又はその誘導体の質量分析用プローブを提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、一般式（ＩＩＩ）
【化６】
2005061854.tif 000004
【００１２】
（式中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、Ｘはハロゲン、ｍは１ないし４の整数を示す）で表される構造を有するグアニン又はその誘導体の質量分析用プローブを提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明のシトシン又はその誘導体の質量分析用プローブは、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、特に好ましい化合物は、下記式（ＩＩ）で表される構造を有する（以下、式（ＩＩ）で表される構造を有する化合物を「ＫＡＰ−ＮＢ０１」と呼ぶことがある）。
【００１４】
【化７】
2005061854.tif 000005
【００１５】
シトシン又はその誘導体と、一般式（Ｉ）で示されるプローブ（以下、便宜的にプローブ（Ｉ）と呼ぶことがある）とは下記スキーム１に示すように反応し、結合する。
【００１６】
【化８】
2005061854.tif 000006
スキーム１
【００１７】
上記反応式中、式（Ｖ）で示される化合物はシトシン又はその誘導体である。式（Ｖ）中、Ｒは水素又は任意の基である。上記反応式から明らかなように、Ｒは上記結合反応に寄与しないので、水素原子又は任意の基であってよい。Ｒが水素原子の場合は、一般式（Ｖ）で表される化合物はシトシンである。Ｒがリボースの場合、一般式（Ｖ）で表される化合物はシチジンであり、Ｒがデオキシリボースである場合にはデオキシシチジンであり、シチジンのリボースにさらにリン酸エステルが１個結合したものがシチジル酸（シチジンモノホスフェート、ＣＭＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがシチジンジホスフェート（ＣＤＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがシチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、デオキシシチジンのデオキシリボースにさらにリン酸エステルが１個結合したものがデオキシシチジル酸（デオキシシチジンモノホスフェート、ｄＣＭＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがデオキシシチジンジホスフェート（ｄＣＤＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがデオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）であり、これらは全て、本発明で言うシトシンの誘導体に包含される。さらに、ＣＭＰを含むＲＮＡ、ｄＣＭＰを含むＤＮＡも本発明で言うシトシンの誘導体に包含される。以上のシトシン誘導体が、好ましいシトシン誘導体として挙げられる。これらに加え、さらに、一般式（Ｖ）中のＲに限らず、プローブ（Ｉ）との結合に関与しない、ピリミジン環上の他の炭素原子が任意の置換基で置換されているものも本発明で言う、シトシンの誘導体に包含される。
【００１８】
プローブ（Ｉ）とシトシン又はその誘導体との結合反応は、好ましくは、例えば、０．１〜５．０  μｇの試料を、５０μＬのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解後、２００μＬの１ｍｇ／ｍＬのプローブ／リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加え、室温で５分間撹拌し、溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とすることにより行うことができるし、下記実施例に具体的に記載されている条件においても好ましく行うことができる。
【００１９】
また、上記の通り、本発明のグアニン又はその誘導体の質量分析用プローブは、上記一般式（ＩＩＩ）で表される構造を有する。一般式（ＩＩＩ）で表される化合物のうち、特に好ましい化合物は、下記式（ＩＶ）で表される構造を有する（以下、式（ＩＶ）で表される構造を有する化合物を「ＫＡＰ−ＮＢ０２」と呼ぶことがある）。
【００２０】
【化９】
2005061854.tif 000007
【００２１】
グアニン又はその誘導体と、一般式（ＩＩＩ）で示されるプローブ（以下、便宜的にプローブ（ＩＩＩ）と呼ぶことがある）とは下記スキーム２に示すように反応し、結合する。
【００２２】
【化１０】
2005061854.tif 000008
スキーム２
【００２３】
上記反応式中、式（ＶＩ）で示される化合物はグアニン又はその誘導体である。式（ＶＩ）中、Ｒは水素又は任意の基である。上記反応式から明らかなように、Ｒは上記結合反応に寄与しないので、水素原子又は任意の基であってよい。Ｒが水素原子の場合は、一般式（Ｖ）で表される化合物はグアニンである。Ｒがリボースの場合、一般式（Ｖ）で表される化合物はグアノシンであり、Ｒがデオキシリボースである場合にはデオキシグアノシンであり、グアノシンのリボースにさらにリン酸エステルが１個結合したものがグアニル酸（グアノシンモノホスフェート、ＧＭＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがグアノシンジホスフェート（ＧＤＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、デオキシグアノシンのデオキシリボースにさらにリン酸エステルが１個結合したものがデオキシグアニル酸（デオキシグアノシンモノホスフェート、ｄＧＭＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがデオキシグアノシンジホスフェート（ｄＧＤＰ）、さらにそのリン酸部分にリン酸エステルが１個結合したものがデオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）であり、これらは全て、本発明で言うグアニンの誘導体に包含される。さらに、ＧＭＰを含むＲＮＡ、ｄＧＭＰを含むＤＮＡも本発明で言うグアニンの誘導体に包含される。以上のグアニン誘導体が、好ましいグアニン誘導体として挙げられる。さらに、一般式（ＶＩ）中のＲに限らず、プローブ（ＩＩＩ）との結合に関与しない、プリン環上の他の炭素原子が任意の置換基で置換されているものも本発明で言う、グアニンの誘導体に包含される。例えば、酸化ストレスマーカーとして知られている８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）がこの例であり、８−ＯＨｄＧもグアニン誘導体の好ましい例として挙げられる。
【００２４】
プローブ（ＩＩＩ）とグアニン又はその誘導体との結合反応は、好ましくは、例えば、０．１〜５．０μｇの試料を、５０μＬのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解後、２００μＬの１ｍｇ／ｍＬのプローブ／リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を加え、室温で５分間撹拌し、溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とすることにより行うことができるし、下記実施例に具体的に記載されている条件においても好ましく行うことができる。
【００２５】
プローブ（Ｉ）及びプローブ（ＩＩＩ）は、当業者が、公知の方法に基づいて容易に合成することができる。下記実施例にも、これらのプローブの製造方法が具体的に記載されている。
【００２６】
本発明のプローブを用いた質量分析は、試料化合物と本発明のプローブを反応、結合させた後、通常の液状試料の質量分析と全く同様にして行うことができる。本発明のプローブは、試料のイオン化を伴う、あらゆる液状試料の質量分析方法に適用可能である。好ましい液状試料の質量分析方法の例として、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、大気圧化学イオン化質量分析、サーモスプレーイオン化質量分析、パーティクルビーム質量分析、フリット高速原子衝撃質量分析等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、通常の質量分析のみならず、反応槽と一体化された分析装置中で行われる質量分析に適用することも可能である。例えば、ポストカラム反応方式の高速液体クロマトグラフィ装置や、フローインジェクション分析装置のように、分析装置に反応槽又は反応コイルが組み込まれた分析装置において、反応槽又は反応コイルの下流で行われる質量分析に本発明のプローブを適用することができる。この場合、プローブは、反応槽又は反応コイルの上流で試料と混合し、結合反応を反応槽又は反応コイル中で行うことができる。なお、質量分析自体は、市販の装置を用い、装置に添付された指示書に従って容易に行うことができる。
【００２７】
本発明のプローブを用いた場合には、試料化合物がプローブと結合することによって確実にイオン化されており、結合後のプローブ由来部分の質量も既知であるから、通常の質量分析により高感度、高精度に定量することができる。なお、観察されたピーク値（ｍ／ｚ値）からプローブの分子量を差し引くことにより試料化合物の分子量を算出することができる。
【００２８】
質量分析用プローブはヌクレオチドのみでなくポリマー状態の核酸にも有効に用いることができる。例えば数残基の核酸があれば、ｃｔｔａというような配列があれば、ｃまたはａ特異的に質量分析用プローブを付加することにより一価の正電荷を持ったＤＮＡ鎖を作製することができ、効果的に分子量を測定することが可能である。複数の塩基に対するプローブで反応を行なうことも可能であるが、その際は例えばｃｔｔａという配列にｔ特異的プローブを付加した場合は２価の正電荷をもつこととなり、質量を２で除した価が質量分析の結果として得られる。
【００２９】
さらにこれと同様にＰＣＲの際にプライマーに質量分析用プローブをあらかじめ付加しておくことができる。これを用いてＰＣＲを行なえば必ずＰＣＲ産物にはプライマー配列が１つ含まれるため、効果的に１価の正電荷をもつものを作製することができる。シークエンシング解析に主に用いられるダイデオキシＰＣＲ法に関しても同様に用いられると考えられる。分子量レベルで産物の差が観察されれば、一塩基多型の確認にも用いられる（補足：通常の電気泳動法では塩基数のレベルでの分離しかなされないため、同じ塩基数であればその配列中の塩基の構成が異なっても見分けることは困難である。しかし質量分析を用いれば分子量レベルでの差を見分けられるため、構成塩基の違いまで検出できる）。
【００３０】
またヌクレアーゼなどの酵素を用いて末端から一塩基ずつ核酸を切断し、それぞれ切出されてくる断片に質量分析用プローブを付加し順に質量分析により塩基を確認するような方法に基づいたＤＮＡのシークエンス解析も可能であると期待される。
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１    ＫＡＰ−ＮＢ０１の合成
【化１１】
2005061854.tif 000009
【００３３】
２−アミノ−エチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル  （化合物（２））の合成
【００３４】
【化１２】
2005061854.tif 000010
【００３５】
反応容器を窒素置換し、エタノール２１  ｍｌ  を加えてから氷浴につけた。エチレンジアミン（１）  ２２．５  ｇ  （３７４．４  ｍｍｏｌ，  ２３．４  ｅｑ）  を反応容器にゆっくりと加え、その後トリエチルアミン１．６２  ｇ  （１６．０  ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）  を加えて撹拌した。エタノール１０  ｍｌ  に溶かしたジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート  ３．４９  ｇ  （１６．０ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）  を滴下して加えていき、氷浴中で３０  分間撹拌し、その後室温で２時間反応を行った。反応後エタノールを減圧留去し、残渣を塩化メチレンに溶かした。１Ｎ  酢酸水溶液２００  ｍｌ  を伴って３回抽出を行った。得られた水層に１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を加えｐＨを１０とした。得られた水層を塩化メチレンで再度３回抽出を行った。炭酸カリウムで乾燥後、塩化メチレンを減圧留去し、薄く黄色い透明液体状物質（１．８９  ｇ，  ｙｉｅｌｄ  ：  ７３．８５  ％）  を得た。
【００３６】
ＴＬＣ  （ＳｉＯ２，  クロロホルム：メタノール  ＝  １０  ：  １  ｖ／ｖ）    Ｒｆ  ＝  ０．１４
１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３，  ＴＭＳ，  ｒ．ｔ．，  δ／ｐｐｍ）    １．３３（ｓ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２ＮＨ２）  ，  １．４５（ｓ，  ９Ｈ，  ｔ−Ｂｕｔｙｌ）  ，  ２．８０（ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０Ｈｚ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）  ，  ３．１８（ｑ，  Ｊ  ＝  ５．７Ｈｚ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）  ，  ４．９１（ｂｒ，  １Ｈ，  −ＣＯＮＨＣＨ２−）ＥＳＩ−ＴＯＦ  （＋）  ：  ［  Ｍ  ＋  Ｈ  ］＋  ＝  １６１．２３，  ［  Ｍ  ＋  Ｎａ  ］＋  ＝  １８３．２４
【００３７】
［２−（４−アセチル−ベンゾイルアミノ）−エチル］−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル  （化合物（３））の合成
【００３８】
【化１３】
2005061854.tif 000011
【００３９】
反応容器を窒素置換し、ＤＭＦ  ３０  ｍｌ、及び化合物（２）  １．５０  ｇ  （９．３６  ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）を加えて氷浴においた。ｐ−アセチル安息香酸１．５４  ｇ  （９．３６  ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）、ＨＯＢｔ  １．４３  ｇ  （９．３６  ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）、トリエチルアミン０．９９  ｇ  （９．８３  ｍｍｏｌ，  １．０５  ｅｑ）  を加え攪拌した。ＤＭＦ  １０  ｍｌで懸濁したＥＤＣ  １．８８  ｇ  （９．８３  ｍｍｏｌ，  １．０５  ｅｑ）  をゆっくり加えた。もう一度ＤＭＦ  １０  ｍｌを用いてＥＤＣの残りを加えた。氷浴で３０分、その後室温で３時間反応を行った。反応終了後、反応液に水を加え、ジエチルエーテルを用いて抽出を行った。得られたエーテル層を飽和食塩水で洗い、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２，  クロロホルム：メタノール  ＝  １０  ：  １  ｖ／ｖ）で単離精製し、白色の固体状物質（２．０２  ｇ，  ｙｉｅｌｄ  ：  ７０．４０  ％）  を得た。
【００４０】
ＴＬＣ  （ＳｉＯ２，  クロロホルム：メタノール  ＝  １０  ：  １  ｖ／ｖ）    Ｒｆ  ＝  ０．５３
１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ，  ＴＭＳ，  ｒ．ｔ．，  δ／ｐｐｍ）    １．４１（ｓ，  ９Ｈ，  ｔ−Ｂｕｔｙｌ）  ，  ２．６３（ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３ＣＯ−  ）  ，  ３．２９（ｔ，  Ｊ  ＝  １．８Ｈｚ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）  ，  ３．４６（ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０Ｈｚ，  ２Ｈ，  −ＣＯＮＨＣＨ２−）  ，  ７．９２（ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＮＨＣＯＡｒＨ  ）  ，  ８．０６（ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＣＨ３ＣＯＡｒＨ）
ＥＳＩ−ＴＯＦ  （＋）  ：  ［  Ｍ  ＋  Ｎａ  ］＋  ＝  ３２９．４４
【００４１】
４−アセチル−Ｎ−（２−アミノ−エチル）−ベンズアミド  （化合物（４））の合成
【００４２】
【化１４】
2005061854.tif 000012
【００４３】
反応容器に乾燥塩化メチレン５０  ｍｌ、化合物（３）  ４１１．４  ｍｇ  （１．３４  ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）を加えて氷浴においた。ＴＦＡ  ６．１２  ｇ  （５３．７  ｍｍｏｌ，  ４０．０  ｅｑ）  を加え、氷浴中で１０分、その後室温で１時間反応した。原料の消失確認後、溶媒、ＴＦＡを減圧中で攪拌して取り除き、黄白色の油状物質（２．３３  ｇ，  収率測定不可能）を得た。単離精製は行わずに次の反応に用いた。
【００４４】
ＴＬＣ  （ＳｉＯ２，  クロロホルム：メタノール  ＝  １０  ：  １  ｖ／ｖ）    Ｒｆ  ＝  ０．０８
ＥＳＩ−ＴＯＦ  （＋）  ：  ［  Ｍ  ＋  Ｈ  ］＋  ＝  ２０７．２８
【００４５】
ヨウ化  ［２−（４−アセチル−ベンゾイルアミノ）−エチル］−トリエチルアンモニウム  （化合物（５））の合成
【００４６】
【化１５】
2005061854.tif 000013
【００４７】
反応容器を窒素置換したのち、アセトン３０  ｍｌ、化合物（４）  １．０  ｇ  （４．９０  ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）、Ｋ２ＣＯ３  ２．７  ｇ  （１９．６  ｍｍｏｌ，  ４．０  ｅｑ）、ヨウ化エチル１１．５  ｇ  （７３．５  ｍｍｏｌ，  １５．０  ｅｑ）を順次加えた。オイルバスで還流し、二日間反応を行った。原料の消失を確認後、反応溶液をろ過し、余分なＫ２ＣＯ３を取り除いた。残渣をメタノールで洗浄した後溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２，  クロロホルム：メタノール  ＝  ７  ：  １  →  ３  ：  １  ｖ／ｖ）  で単離精製し、粘りのある白色の固体状物質（１．５１  ｇ，  ｙｉｅｌｄ  ：  ７３．４５  ％）を得た。
【００４８】
ＴＬＣ  （ＳｉＯ２，  クロロホルム：メタノール  ＝  ７：  １  ｖ／ｖ）    Ｒｆ  ＝  ０．２０
１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ，  ＴＭＳ，  ｒ．ｔ．，  δ／ｐｐｍ）  １．３８（ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２Ｈｚ，  ９Ｈ，  −ＣＨ２ＣＨ３  ）  ，  ２．６４（ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３ＣＯ−  ）  ，  ３．４６（ｑ，  Ｊ  ＝  ７．２Ｈｚ，  ６Ｈ，  −ＣＨ２ＣＨ３）  ，  ３．８０（ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９Ｈｚ，  ２Ｈ，  −ＣＯＮＨＣＨ２−）  ，  ７．９９（ｄ，  Ｊ  ＝  １．５Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＮＨＣＯＡｒＨ  ）  ，  ８．０７（ｄ，  Ｊ  ＝  １．５Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＣＨ３ＣＯＡｒＨ）
ＥＳＩ−ＴＯＦ  （＋）  ：  ［  Ｍ  −  Ｉ  ］＋  ＝  ２９１．４４
【００４９】
｛２−［４−（２−ブロモ−アセチル）−ベンゾイルアミノ］−エチル｝−トリエチルアンモニウムブロミド  （化合物（６）（ＫＡＰ−ＮＢ０１））の合成
【００５０】
【化１６】
2005061854.tif 000014
【００５１】
反応容器に化合物（５）  １００  ｍｇ  （０．２３９  ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）  と脱水メタノール  ２８４．０  μｌ加え高速で攪拌した。Ｂｒ２をゆっくりと滴下し、室温で１時間反応を行った後５０  ℃で３０分反応を行った。反応物の生成をＭＳで確認後、α−ブロモジエチルケタール体の生成を抑えるために水を１４２．０  μｌ加え，ついで同量のメタノールも加えた。さらにＢｒ２を２．４  μｌ加えてから５０  ℃で３０分反応を行った。その後、フラスコを０  ℃〜−５  ℃まで冷やし、上澄み液を取り除いた。ＭｅＯＨ  ：  Ｈ２Ｏ  ＝  ２  ：  １の溶液を少量加えてから更に冷やし、上澄み液を取り除いた。高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ，  アセトン）で単離精製し、赤色の油状物質（６９．０  ｍｇ，  収率：  ６４．１０  ％）を得た。
【００５２】
ＴＬＣ  （ＳｉＯ２，  クロロホルム：メタノール  ＝  ７  ：  １  ｖ／ｖ）    Ｒｆ  ＝  ０．２１
１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ，  ＴＭＳ，  ｒ．ｔ．，  δ／ｐｐｍ）    １．３９（ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１Ｈｚ，  ９Ｈ，  −ＣＨ２ＣＨ３  ）  ，  ３．４５（ｑ，  Ｊ  ＝  ７．１Ｈｚ，  ６Ｈ，  −ＣＨ２ＣＨ３）  ，  ３．８０（ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３Ｈｚ，  ２Ｈ，  −ＣＯＮＨＣＨ２−）  ，  ４．７０（ｓ，  ２Ｈ，  ＢｒＣＨ２ＣＯ−）  ，  ７．９９（ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＮＨＣＯＡｒＨ  ）  ，  ８．１２（ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＢｒＣＨ２ＣＯＡｒＨ）
ＥＳＩ−ＴＯＦ  （＋）  ：  ［  Ｍ  −  Ｂｒ  ］＋  ＝  ３６９．５５，  ３７１．５５
【００５３】
実施例２    ＫＡＰ−ＮＢ０２の合成
【化１７】
2005061854.tif 000015
【００５４】
化合物（５）の調製までは実施例１と同じ方法で行った。
【００５５】
トリエチル−｛２−［４−（２−オキソ−アセチル）−ベンゾイルアミノ］−エチル｝−アンモニウムブロミド（化合物７）（ＫＡＰ−ＮＢ０２））の合成
【００５６】
【化１８】
2005061854.tif 000016
【００５７】
反応容器にＤＭＳＯ  ０．４  ｍｌ、Ｈ２Ｏ  ４３．３  μｌ、化合物（５）  １００  ｍｇ  （０．２３９  ｍｍｏｌ，  １．０  ｅｑ）  を加えて反応容器内をアスピレーターで減圧状態にしながら高速で攪拌した。そこに４８  ％  ＨＢｒ  １２２．０  μｌ  （１．０８  ｍｍｏｌ，  ４．５  ｅｑ）を滴下し、４５  ℃で３時間反応させた。原料の消失を確認後、反応溶液を氷の中に注ぎ込んで反応を停止させた。そこにアセトンを加えて溶かした後、トルエンを加えて共沸させるなどしてＨ２Ｏを減圧留去した。高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ，  アセトニトリル：Ｈ２Ｏ  ＝  ９  ：  １  ｖ／ｖ）で単離精製し、粘りのある黄色状物質（７１．３  ｍｇ，  収率：  ７４．０６  ％）を得た。
【００５８】
ＴＬＣ  （ＳｉＯ２，  クロロホルム：メタノール  ＝  １０  ：  １  ｖ／ｖ）    Ｒｆ  ＝  ０．１４
１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  ＴＭＳ，  ｒ．ｔ．，  δ／ｐｐｍ）  １．２３（ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９Ｈｚ，  ９Ｈ，  −ＣＨ２ＣＨ３  ）  ，  ３．６２（ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６Ｈｚ，  ２Ｈ，  −ＣＯＮＨＣＨ２−）  ，  ５．６８（ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９Ｈｚ，  １Ｈ，  −ＣＯＮＨＣＨ２−）  ，  ６．９１（ｄ，  Ｊ  ＝  ７．２Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＣＨ（ＯＨ）２  ）  ，  ７．９７（ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＮＨＣＯＡｒＨ）  ，  ８．１７（ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４Ｈｚ，  ２Ｈ，  ＣＨ（ＯＨ）２ＣＯＡｒＨ）  ，  ９．０３（ｔ，  Ｊ  ＝  ５．４Ｈｚ，  １Ｈ，  −ＣＨ（ＯＨ）２）
ＥＳＩ−ＴＯＦ  （＋）  ：  ［  Ｍ  ＋  ＣＨ３ＯＨ  −  Ｂｒ  ］＋  ＝  ３３７．１４，  ［  Ｍ  ＋  Ｈ２Ｏ  −  Ｂｒ］＋  ＝  ３２３．１５
【００５９】
実施例３    ＫＡＰ−ＮＢ０１を用いたシトシンの質量分析
試料としてシトシンを用い、ＫＡＰ−ＮＢ０１との反応性の評価を行なった。詳しい反応条件を以下に示す。シトシンの６６．６７ｍＭ水溶液３０μｌ  （０．２２ｍｇ，  ２．０μｍｏｌ）  、ＫＡＰ−ＮＢ０１の２８．５７ｍＭアセトニトリル溶液１７．５μｌ  （２．２５ｍｇ，  ０．５μｍｏｌ）  とアセトニトリル５２．５μｌを豆試験管に加え、８０℃、１３５分間、湯浴で反応させた。反応終了後、２０μｌの反応溶液を取り、５００倍にメタノールで希釈してＥＳＩ−ＭＳ試料とした（１．０×１０−５Ｍ）。
【００６０】
ＥＳＩ−ＭＳに用いた装置及び条件は以下の通りであった。
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＭａｒｉｎｅｒを用いて測定した。条件は以下のとおりであった。
スプレーチップポテンシャル：  ３１７４．６１〔Ｖ〕
ノズルポテンシャル：  ６０．０６〔Ｖ〕
Ｑｕａｄ  ＲＦ電圧：  ９００．１５〔Ｖ〕      （シトシンのみ７００〔Ｖ〕）
検出器電圧：  ２１９９．７１〔Ｖ〕
ネブライザー：Ｎ２  Ｇａｓ流速：  ０．３９０  ｌ／分
溶媒：  メタノール
流速：  １１．５μｌ／分
【００６１】
結果を図１に示す。図１に示されるように、分子量である３８２のピークがメインピークとして観察された。これにより、本発明のプローブ（Ｉ）で、シトシンを質量分析できることが明らかになった。
【００６２】
実施例４    ＫＡＰ−ＮＢ０１を用いたシチジンの質量分析
シチジンとプローブを反応させ、その反応性を評価した。反応の詳細は次のとおりである。シチジンの６６．６７ｍＭ水溶液もしくはＤＭＦ溶液３０μｌ  （０．４９ｍｇ，  ２．０μｍｏｌ）  、ＫＡＰ−ＮＢ０１の２８．５７ｍＭアセトニトリル溶液１７．５μｌ  （２．２５ｍｇ，  ０．５μｍｏｌ）  とアセトニトリル５２．５μｌが豆試験管に加え、８０℃、１３５分間、湯浴中で反応させた。
シチジンのＤＭＦ溶液を用いた場合には、８０℃、９０分間反応させた。反応終了後、２０μｌの反応溶液を取り、５００倍にメタノールで希釈してＥＳＩ−ＭＳ試料とした（１．０×１０−５Ｍ）。ＥＳＩ−ＭＳは実施例３と同様にして行った。
【００６３】
結果を図２に示す。図２の（Ａ）は、溶媒がアセトニトリル／水の場合、（Ｂ）は溶媒がアセトニトリル／ＤＭＦの場合の結果を示す。図２に示されるように、いずれの場合も反応物のピークである、５１４のピークがメインピークとして観察された。
これにより、本発明のプローブ（ＩＩ）で、シチジンを質量分析できることが明らかになった。
【００６４】
実施例５    ＫＡＰ−ＮＢ０１を用いたシチジンの濃度定量測定
シチジンの濃度を種々変化させたことを除き、実施例４と同様にしてシチジンの質量分析を行った。
【００６５】
結果を図３に示す。なお、図３の縦軸は強度比（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）である。図３の（Ｂ）は、図３の（Ａ）の５ｍＭから０．１  ｍＭの範囲を拡大して示すものである。図３に示されるように、いずれの溶媒を用いた場合も、濃度に比例した非常に直線性の高い検量線が得られた。このことから、本発明のプローブ（Ｉ）を用いることにより、正確にシチジンの質量分析を行うことができることが明らかになった。
【００６６】
実施例６    ＫＡＰ−ＮＢ０１のシトシン又はシチジンへの選択性
反応時間を種々変えたことを除き、実施例３（シトシンの場合）又は実施例４（シチジン、アデノシン、グアノシン及びチミジンの場合）と同様にして、ＫＡＰ−ＮＢ０１と各試料との結合反応を行い（ただし、溶媒はアセトニトリル／水）、質量分析を行った。
【００６７】
結果を図４に示す。なお、図４の縦軸は強度比である。図４に示されるように、ＫＡＰ−ＮＢ０１は、シトシン及びシチジンのみと結合し、これらの質量分析を行うことができたが、他の３種類のヌクレオシドであるアデノシン、グアノシン及びチミジンとは全く反応しなかった。このことから、本発明のプローブ（Ｉ）が、シトシン及びその誘導体に対して極めて高い選択性を有していることが確認された。
【００６８】
実施例７    ＫＡＰ−ＮＢ０２を用いたデオキシグアノシン及び８−ＯＨｄＧの質量分析
２’−デオキシグアノシンと酸化ストレスの指標としても用いられている８−ＯＨｄＧを用いてＫＡＰ−ＮＢ０２と反応させ、それらの反応性を評価しピークを比較した。その反応の詳細は次のとおりである。２’−デオキシグアノシン１．１３  ｍｇ  もしくは、８−ＯＨｄＧ  １．１３  ｍｇ（両４．０  μｍｏｌ）  とＫＡＰ−ＮＢ０２  １．６１  ｍｇ  （４．０  μｍｏｌ）をサンプル管に加え、そこにアセトニトリル６６．３μｌ、水１３２．５μｌ、５０ｍＭ、ｐＨ６．０に調整したリン酸バッファを６６．３μｌをさらにそれぞれ加えた。攪拌槽を使い湯浴中で４５  ℃で６０分間反応させた。反応液を１５００倍にメスアップして１．０×１０−５Ｍのメタノール試料溶液とし、実施例３と同様にＥＳＩ−ＭＳ測定を行なった。なお、この二つの試料は、グアニンの８’位が水素かヒドロキシル基かの違いのみである。
【００６９】
結果を図５に示す。図５の左側の図が２’−デオキシグアノシンについての結果、右側の図が８−ＯＨｄＧについての結果を示す。図５の２つの図を比べると分かるとおり、反応物のピークは試料の分子量の差である１６の差でピークが検出されていることが分かる。このことから、本発明のプローブ（ＩＩＩ）により、デオキシグアノシン及びその誘導体を非常に正確に質量分析できることが確認された。
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体を、高い選択性を持って正確に質量分析することができる質量分析用プローブが提供された。本発明のプローブは、シトシン若しくはその誘導体又はグアニン若しくはその誘導体に対して高い選択性を有し、これらを正確に質量分析することができるので、核酸試料の質量分析や、酸化ストレスマーカーの質量分析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例のプローブを用い、シトシンを質量分析した結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例のプローブを用い、シチジンを質量分析した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例のプローブを用い、シチジンの濃度定量測定を行った結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例のプローブを用い、シトシン及び各種ヌクレオシドの質量分析を、結合反応の時間を変えて行った結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例のプローブを用い、デオキシグアノシン及び８−ＯＨｄＧの質量分析を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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