(57)【要約】【課題】増殖性糸球体腎炎の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】増殖性糸球体腎炎の予防又は治療用薬をスクリーニングする方法であって、増殖性糸球体腎炎の予防・治療用薬をスクリーニングする方法であって、Ｅｄｇ-５の活性化を抑制する作用に基くことを特徴とする方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性糸球体腎炎の予防・治療用薬をスクリーニングする方法であって、Ｅｄｇ-５の活性化を抑制する作用に基くことを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｅｄｇ-５のリガンドと、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドとの結合を阻害する作用に基くことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｅｄｇ−５又はそれと同等のポリペプチドが以下の群から選択される、請求項２に記載の方法：
▲１▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、
▲２▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、
▲３▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入を有するアミノ酸で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、及び
▲４▼ 前記▲１▼〜▲３▼のいずれかに記載のポリペプチドを含有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のポリペプチドを含有する細胞、該細胞由来の細胞膜画分若しくは単離された蛋白質を用いる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、請求項２又は３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入され、該ポリヌクレオチドを発現している細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが以下の群から選択される、請求項５に記載の方法：
▲１▼ 配列表の配列番号１、３若しくは５に記載の塩基配列で示されるポリヌクレオチド；
▲２▼ 配列表の配列番号１、３若しくは５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド；
▲３▼配列表の配列番号１、３若しくは５に記載の塩基配列と縮重を介して異なる塩基配列で示されるポリヌクレオチド；及び
▲４▼ 上記▲１▼〜▲３▼に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるポリヌクレオチド。
【請求項７】
Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドとリガンドとを接触させた場合と、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチド、リガンドおよび試験物質とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
比較を、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドを含有する細胞に対するリガンドの刺激活性（シグナル伝達作用）の変化、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドに対するリガンドの結合量の変化、または細胞内でのＥｄｇ-５の発現・産生量の変化に基づいて行なうことを特徴とする、請求項２〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
Ｅｄｇ−５を発現しうる細胞におけるＥｄｇ−５の産生量又はｍＲＮＡの量を定量することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２、４若しくは６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いてＥｄｇ-５のｍＲＮＡを定量することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法又は請求項１１に記載のキットを用いて得られる増殖性糸球体腎炎の予防・治療薬。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法又は請求項１１に記載のキットを用いて、Ｅｄｇ-５のリガンドと、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドとの結合を阻害するか、Ｅｄｇ−５の発現・産生を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする工程、前記物質の増殖性糸球体腎炎に対する予防又は治療効果を確認する工程、及び前記工程で増殖性糸球体腎炎に対する予防又は治療効果が確認された物質を有効成分として含有する増殖性糸球体腎炎の予防・治療薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、増殖性糸球体腎炎特にメサンギウム増殖性糸球体腎炎の予防・治療用医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
増殖性糸球体腎炎は糸球体内に細胞増殖を伴う糸球体腎炎であって、急性から慢性まで、様々な腎炎が含まれる。慢性腎炎に属するものにメサンギウム増殖性腎炎と膜性増殖性糸球体腎炎があり、メサンギウム増殖性腎炎はイムノグロブリンＡ腎症ともいわれ、世界的に最も一般的な腎疾患の一つである。その病理学的な特徴としては、血尿、循環するＩｇＡレベルの上昇、ＩｇＡや補体Ｃ３、フィブロネクチン、コラーゲン等の糸球体への異常な沈着、メサンギウム細胞の増殖等が挙げられる。この疾患の患者のほとんどが透析を必要とする末期の腎不全へと進行することから、早期に適切な治療を施す必要がある。以下、主として本発明をメサンギウム増殖性腎炎との関係で説明するが、広く増殖性糸球体腎炎に適用されることは明らかである。また、「メサンギウム増殖性腎炎」を、「イムノグロブリンＡ腎症（ＩｇＡ腎症又はＩＧＡＮ）と同意義に用いる。
【０００３】
ＩＧＡＮにおけるメサンギウム細胞の増殖反応には、多くの成長因子やサイトカインが関与しているとの報告があり（Floegeら，Kidney Int. 43：S47−S54，1993）、中でもメサンギウム細胞に対し強い増殖作用を示す血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：Platelet-Derived Growth Factor）が、重要な役割を担っているとの報告（Floege ら，Clin. Exp. Immunol. 86：334−341，1991）がある。また、メサンギウム増殖性糸球体腎炎患者において、メサンギウム細胞の増殖にＰＤＧＦ受容体が強く関与するとの報告もある（Gesualdo ら，J. Clin. Invest 94：50−58，1994）。このような状況下、ＰＤＧＦ刺激下でのメサンギウム細胞の増殖を抑制する物質（ＰＤＧＦ受容体拮抗物質）が、ＩＧＡＮの治療又は予防剤として有効と提供された（特開平１０−１２０５６８号公報）。一方、メサンギウム細胞の増殖とＢ細胞刺激因子としてクローニングされたインターロイキン６（ＩＬ−６）との関係も知られており、実際、糸球体腎炎ではＩＬ−６トランスジェニックマウスで高度の蛋白尿を伴うメサンギウム増殖性腎炎が認められ、抗ＩＬ−６抗体を投与すると症状の改善が認められたという報告がある（日本臨床、第50巻、2840-2841頁（1992年）。このような観点から、ＩＧＡＮの治療、予防剤として、ＩＬ−６活性阻害物質が提供されている（特開平１０−３３８６８０、特開平１０−３３８６７８等）。
【０００４】
しかしながら、ＩＬ-６活性阻害物質の場合、ＩＬ−６受容体は多くの細胞（Ｔリンパ球やＢリンパ球、単球、繊維芽細胞、皮膚ケラチノサイト、血管内皮細胞、腎メサンギウム細胞、脳アストロサイト、骨芽細胞）で産生されており、その生理活性は免疫系、造血系、脳神経系、炎症系、内分泌系など多義にわたることから（ザ・サイトカイン・ハンドブック第２版（The Cytokine Handbook）、アカデミック・プレス社、USA、145-168頁（1994年））、目的とする組織以外の組織に対しても何らかの影響が及ぶ恐れがあり、適用が困難と考えられる。
また、ＰＤＧＦアンタゴニストの場合も、それが多くの組織で発現されているいことから、ＩＬ−６受容体と同様に目的以外の作用を及ぼす可能性が危惧される。
【０００５】
従って、増殖性糸球体腎炎、特にメサンギウム細胞の増殖を伴うＩＧＡＮ等の腎炎に特異的に効果のある医薬の開発が強く求められている。そのためには、多くの化合物（物質）の中から、目的に適う候補化合物を効率よく選択する手段を確立する必要がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、増殖性糸球体腎炎、特にメサンギウム細胞の増殖を伴うＩＧＡＮ等に対して特異的で安全性の高い予防又は治療用医薬の開発を目指して鋭意研究を重ねてきたが、その過程で、Ｅｄｇ（endothelial differentiation gene）ファミリー受容体がメサンギウム細胞の活性化に重要な役割を担っていることを見出した。
【０００７】
Ｅｄｇ受容体ファミリーは、Ｇ蛋白質共役型受容体スーパーファミリーに属する膜結合型受容体蛋白質をコードする遺伝子として既知である。この受容体ファミリーは、７つの膜貫通領域を有しており、薬物のターゲット分子として好適であると考えられる。
【０００８】
Ｅｄｇファミリーには高い配列ホモロジーを持つ８つのサブタイプ（Ｅｄｇ−１〜Ｅｄｇ−８）が存在するが、本発明者らは、予想外にも、メサンギウム細胞の増殖が観察されない段階でＥｄｇ-５が顕著に上方制御されているとの知見を得た。Ｅｄｇ-５は細胞増殖や細胞の遊走・アポトーシスに関与すると示唆されている（J Biol Chem 2000 Jan 7;275(1):288-96, Sphingosine 1-phosphate-induced cell proliferation, survival, and related signaling events mediated by G protein-coupled receptors Edg3 and Edg5. An S, Zheng Y, Bleu T）が、Ｅｄｇ−５とメサンギウム細胞の増殖との関係は、本発明以前には知られていなかった。
【０００９】
ヒト、マウス及びラットのＥｄｇ-５のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列は既知であり、Genbankに登録されている（WO99/54351、WO00/60056、Genbankのアクセッション番号：Human AF034780; mouse AF108020; Rat U10699）。しかし、この公報には、Ｅｄｇ-５の生体内での機能に関し、上記Ｇ−タンパク結合受容体として一般的に知られている活性が列挙されているにすぎない。
【００１０】
ヒト、マウス、及びラットのＥｄｇ−５をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１、３及び５に示す。また、これらのヌクレオチド配列のCDS領域によりコードされているアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号２、４、及び６に示す。
【００１１】
本発明者らは、ＩＧＡＮに関連する様々な因子の分子メカニズムを検討するために、ｃＤＮＡマイクロアレイを用い、ＩＧＡＮのモデルマウス（以下、「ＨＩＧＡマウス」と称する）の腎臓における遺伝子発現の変化について解析を行った。該マウスの受精卵は通商産業省生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１５０）。このゲノミックなアプローチによって、一つ一つの遺伝子というよりはむしろＩＧＡＮに関与する遺伝子のファミリーを同定し、複雑な疾患の進行においてどのような分子レベルの現象が重要であるかを明らかにすることができた。即ち、ＨＩＧＡマウスの腎臓では、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ受容体、ＳＰＰ（sphingosine 1-phosphate）受容体であるＥｄｇ-５（endothelial differentiation gene-5）など、細胞周期や細胞増殖の制御に関与している幾つかの遺伝子の発現が上昇していた。また、培養ラットメサンギウム細胞を用いる実験で、ＰＤＧＦはＥｄｇ-５のアップレギュレーション（又は上方制御）を伴うメサンギウム細胞の増殖を誘導した。これらの結果は、ＳＰＰ合成の増加と連結するＰＤＧＦ−Ｅｄｇ-５シグナルの増強が、ＩＧＡＮにおける腎臓のメサンギウム細胞の増殖において重要な役割を果たしていることを示唆している。しかも、Ｅｄｇ-５の上方制御は、ＩＧＡＮを発症する前、メサンギウム細胞の増殖が顕著でない時点で認められることから、該受容体の上方制御がメサンギウム細胞の増殖、延いてはＩＧＡＮの発症、進行に重要な役割を担っていることを強く示唆している。
【００１２】
ＰＤＧＦ−刺激によって起るメサンギウム細胞の増殖シグナル伝達機序を模式的に図１に示した。即ち、ＰＤＧＦで刺激された細胞はＰＤＧＦを生産・放出し、オートクライン及びパラクラインの機構によって細胞表面のＰＤＧＦ受容体の発現が増加する。ＰＤＧＦはメサンギウム細胞のスフィンゴミエリナーゼとセラミダーゼを活性化し、ＳＰＰの合成が増加し、ＳＰＰはまた、活性化した、若しくは凝集性の血小板からも放出される。ＳＰＰは、オートクラインでまたは分子内のセカンドメッセンジャーとして働くことにより、メサンギウム細胞の増殖を引き起こすと考えられる。リガンドであるＳＰＰとその受容体Ｅｄｇ-１、Ｅｄｇ-３、Ｅｄｇ-５（特にＥｄｇ-５）の合成量の増加は相乗的なものと考えられる。ＨＩＧＡマウス腎臓でＰＤＧＦ/ＰＤＧＦ受容体とＥｄｇ-５の発現が増大したという結果は、細胞増殖活性につながる成長因子シグナルとリンクするカスケードの増幅のために、ＰＤＧＦ-ＳＰＰ-1−Ｅｄｇパスウェイが正のフィードバックループ中で作用している可能性を示唆している。さらに、メサンギウム細胞からのＳＰＰはＥｄｇ-6の発現上昇を通して血小板を活性化し、血小板からのＳＰＰの分泌も促進するというように、ＩＧＡＮの進行中正のフィードバックループ内で次々に作用が起こる。これらの悪循環のすべてがＨＩＧＡマウス腎臓において作動していると考えられる。ＨＩＧＡマウスにおける糸球体腎炎の所見は、ヒトの糸球体腎炎に酷似していることから、ヒトの糸球体腎炎においても同様のメカニズムが想定され、こういった観点から、上記の一連のメカニズムとＩＧＡＮが難治性疾患であることとの関連性が指摘できる。
【００１３】
本発明者らは、Ｅｄｇ-５がメサンギウム細胞の増殖を引き起こし、またＥｄｇ−５の上方制御がその増殖を増強することから、Ｅｄｇ-５の活性化を抑制する物質が、ＩＧＡＮの特異的な予防・治療薬となりうるとの見解に達した。
【００１４】
即ち、本発明は、
（１）増殖性糸球体腎炎の予防・治療用薬をスクリーニングする方法であって、Ｅｄｇ-５の活性化を抑制する作用に基くことを特徴とする方法、
（２）Ｅｄｇ-５のリガンドと、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドとの結合を阻害する作用に基くことを特徴とする、上記（１）に記載の方法、
（３）Ｅｄｇ−５又はそれと同等のポリペプチドが以下の群から選択される上記（２）に記載の方法：
▲１▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、
▲２▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、
▲３▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入を有するアミノ酸で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、及び
▲４▼ 前記▲１▼〜▲３▼のいずれかに記載のポリペプチドを含有するポリペプチド、
（４）上記（２）又は（３）に記載のポリペプチドを含有する細胞、該細胞由来の細胞膜画分若しくは単離された蛋白質を用いる、上記（２）又は（３）に記載の方法、
（５）前記細胞が、上記（２）又は（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入され、該ポリヌクレオチドを発現している細胞である、上記（４）に記載の方法、
（６）前記ポリヌクレオチドが以下の群から選択される、上記（５）に記載の方法：
▲１▼ 配列表の配列番号１、３若しくは５に記載の塩基配列で示されるポリヌクレオチド；
▲２▼ 配列表の配列番号１、３若しくは５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド；
▲３▼配列表の配列番号１、３若しくは５に記載の塩基配列と縮重を介して異なる塩基配列で示されるポリヌクレオチド；及び
▲４▼ 上記▲１▼〜▲３▼に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるポリヌクレオチド、
（７）Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドとリガンドとを接触させた場合と、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチド、リガンドおよび試験物質とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、上記（２）〜（６）のいずれかに記載の方法、
（８）比較を、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドを含有する細胞に対するリガンドの刺激活性（シグナル伝達作用）の変化、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドに対するリガンドの結合量の変化、または細胞内でのＥｄｇ-５の発現・産生量の変化に基づいて行なうことを特徴とする、上記（２）〜（７）のいずれかに記載の方法、
（９）Ｅｄｇ−５を発現しうる細胞におけるＥｄｇ−５の産生量又はｍＲＮＡの量を定量することを特徴とする、上記（１）に記載の方法、
（１０）配列番号２、４若しくは６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いてＥｄｇ-５のｍＲＮＡを定量することを特徴とする、上記（９）に記載の方法、
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法を実施するためのキット、
（１２）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法又は上記（１１）に記載のキットを用いて得られる増殖性糸球体腎炎の予防・治療薬、
（１３）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法又は上記（１１）に記載のキットを用いて、Ｅｄｇ-５のリガンドと、Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドとの結合を阻害するか、Ｅｄｇ−５の発現・産生を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする工程、前記物質の増殖性糸球体腎炎に対する予防又は治療効果を確認する工程、及び前記工程で増殖性糸球体腎炎に対する予防又は治療効果が確認された物質を有効成分として含有する増殖性糸球体腎炎の予防・治療薬の製造方法、
などに関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のスクリーニング方法はＥｄｇ-５の活性化がメサンギウム細胞増殖を刺激し、もってＩＧＡＮの発症、進行をもたらすとの知見に基いており、生体内でのＥｄｇ−５の活性化を抑制する物質、とりわけＥｄｇ-５−リガンド結合を阻害する任意の物質を標的としている。
【００１６】
本明細書中、「Ｅｄｇ−５の活性化」とは、Ｅｄｇ−５にリガンドが結合することによりその生理活性（生物活性）が発揮されること、又は、Ｅｄｇ−５の上方制御によりその生理活性が増強されること、その他Ｅｄｇ−５の生理活性が発揮されることをいう。なお、Ｅｄｇ−５の生理活性としては、メサンギウム細胞表面に発現しているＥｄｇ−５がリガンドと結合することにより、細胞内にシグナルを伝達し、図１に記載の一連の増殖シグナルの伝達を刺激し、メサンギウム細胞を増殖させるという活性が例示される。
【００１７】
また、本明細書中、Ｅｄｇ−５の「上方制御（アップレギュレーション）」とは、当該技術分野で用いられる通常の意味を有し、Ｅｄｇ−５遺伝子の発現が増加することを意味する。Ｅｄｇ−５遺伝子の上方制御は、例えば、図１に模式的に示した一連のメサンギウム細胞の増殖シグナル伝達機序のいずれかの段階で作用し、正のフィードバック機構を介するＥｄｇ−５遺伝子の発現増大などの形で起ると考えられる。
【００１８】
従って、Ｅｄｇ−５の活性化を抑制する物質は、Ｅｄｇ−５の上方制御を抑制する物質を包含し、そのような物質としては、リガンド−Ｅｄｇ−５結合反応の阻害物質のみならず、図１のシグナル伝達機構の任意の部位をブロックする物質が例示されるが、それらに限定されない。
【００１９】
「Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチド」とは、リガンドと結合して、図１に記載の細胞活性化シグナルを伝達し得るＥｄｇ-５蛋白質、Ｅｄｇ−蛋白質と同質の活性を有するポリペプチド、リガンドとの結合に必須の部分を有するそれらの断片、であり、以下のポリペプチド類が例示される。
「実質的に同質の活性」とは、Ｅｄｇ−５に特徴的なリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用と、同質の活性を指す。従って、実質的に同質の活性を有するポリペプチドは、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性においてＥｄｇ−５と同等（例、約0.01〜100倍、好ましくは0.03〜30倍、より好ましくは0.１〜10倍）の活性を有する。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
【００２０】
Ｅｄｇ−５又はそれと同等のポリペプチドの例として、配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列を含有する蛋白質及び、これら配列番号２、４若しくは６のいずれかと約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する配列を含有し、かつ、配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有するポリペプチド；配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列に対して、１個以上（好ましくは、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数個のアミノ酸の欠失、置換又は挿入がなされたアミノ酸配列を含有し、かつ、配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、Ｅｄｇ−５又はそれと同等のポリペプチドとして、
▲１▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、
▲２▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、
▲３▼ 配列表の配列番号２、４若しくは６に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入を有するアミノ酸で示されるポリペプチド又はその断片であって、Ｅｄｇ−５のリガンドとの結合活性を有するポリペプチド、及び
▲４▼ 前記▲１▼〜▲３▼のいずれかに記載のポリペプチドを含有するポリペプチド。
が挙げられる。
本明細書中、上記の「Ｅｄｇ-５又はそれと同等の活性を有するポリペプチド」を、総称してＥｄｇ-５蛋白質等という。
【００２２】
「Ｅｄｇ-５のリガンド」とは、天然に存在するＥｄｇ-５のリガンドであるＳＰＰ、ＳＰＰと同様にＥｄｇ-５に結合して図１に記載の細胞増殖シグナルを伝達させる活性を有するＳＰＰ類似化合物を指す。そのようなリガンドは、Ｅｄｇ−５溶液を用いた結合実験によって得ることができる。ＳＰＰはＥｄｇ-５の天然のリガンドであり、Ｅｄｇ-５を発現する細胞の増殖を刺激することが明らかであることから本発明方法にとって好ましいリガンドである。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法で得られる物質は増殖性糸球体腎炎の予防・治療薬として有用でありうることから、本明細書中では抗ＩＧＡＮ薬（anti-IGAN drug）と称する。なお、本発明の抗ＩＧＡＮ薬の内、リガンドとＥｄｇ-５との結合を阻害する物質を「Ｅｄｇ-５アンタゴニスト」と呼称することもある。本発明の抗ＩＧＡＮ薬はＥｄｇ−５とリガンドとの結合反応を阻害し、又は、一連のシグナル伝達機構の抑制を介してＥｄｇ−５遺伝子の上方制御を抑制することにより、メサンギウム細胞の増殖を阻止しＩＧＡＮの治療・予防効果を発揮する。
【００２４】
本発明方法の対象である抗ＩＧＡＮ薬、Ｅｄｇ-５とリガンドとの結合を阻害するＥｄｇ−５アンタゴニスト、アンタゴニストの候補となる物質には特に限定がなく、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが含まれる。これらの物質は新規物質であってもよいし、公知物質であってもよい。一例として、ＷＯ９９／５４３５１、ＷＯ００／６００５６に記載のＥｄｇ-５に対するモノクローナル抗体が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法で得られるＥｄｇ-５の活性化の抑制作用を有する化合物は増殖性糸球体腎炎以外のＥｄｇ-５による他の細胞シグナル伝達機構にも有効である。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法で得られた抗ＩＧＡＮ薬は、次いで、医薬としての有用性（バイオアベイラビリティー、製剤設計上の条件など）に関して必要とされる種々の試験に供し、最終的に増殖性糸球体腎炎の予防又は治療のための医薬として用いることができる。そのような試験の種類及び方法は、使用目的に応じて、当該技術分野で既知のものから、適宜選択することができる。例えば、急性毒性、投与形態に応じた特性（溶解性）等が含まれる。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法には、Ｅｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞、該細胞由来の細胞膜画分若しくは単離された蛋白質を用いることができる。Ｅｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞は、上記の定義に従い、Ｅｄｇ-５蛋白質等を産生している細胞であり、天然のＥｄｇ-５産生細胞及びＤＮＡ組換え技術で得られた組換え体を含む。前者の例として、メサンギウム細胞、例えば、ＨＩＧＡマウスの腎臓由来のメサンギウム細胞を挙げることができる。後者は、Ｅｄｇ-５蛋白質等をコードするポリヌクレオチド（ＲＮＡ及びＤＮＡを包含する）が導入され、それを発現して活性なＥｄｇ-５蛋白質等を産生している形質転換体を指す。
【００２７】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、修飾された、または修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡを含む任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより通常的には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物等の、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。
【００２８】
形質転換細胞は、後述の実施例にも記載したように、Ｅｄｇ-５蛋白質等をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換することにより得られる。そのような方法は当該技術分野で既知であり、例えば、Davisら、BasicMethods in Molecular Biology（1986）；Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）などに記載の方法を参照して行うことができる。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、Ｅｄｇ−５蛋白質等をコードする限り、任意のヌクレオチド配列を有するものであって良いが、好ましくは配列表の配列番号２、４又は６に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又はこれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡである。ここに、ストリンジェントな条件とは上記のモレキュラークローニング：ア  ラボラトリー・マニュアル第２版などに記載の条件が挙げられる。例えば、ハイブリダイズの条件は、５０％ホルムアミドを含む6XSSC中で４２℃、２４時間等であり、洗浄の条件は、０．１ＸSSC、６８℃、３０分等である。
【００３０】
宿主細胞も任意であり、大腸菌等の細菌細胞、酵母細胞等の真菌細胞、ショウジョウバエＳ２（Drosophila S2）等の昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（CHO）、ヒト胎児性腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３）、ＣＯＳ、ＨｅＬａ等の動物細胞が挙げられ、中でもＣＨＯおよびＨＥＫ２９３が好ましい。
【００３１】
それぞれの宿主に適したベクターも上記の教科書に記載されており、また当業者にとって既知であるが、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、pＣＩ−ＮＥＯ（Gene Bank Accession No. U47120)、pＣＤＮＡ３.１(Invitrogen)などが用いられる。宿主が哺乳動物細胞の場合、ベクターはｐＣＩ−ＮＥＯまたはｐＣＤＮＡ３.１が好ましい。
【００３２】
プロモーターは、Ｅｄｇ-５遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。
形質転換の方法も当該技術分野で既知であり、例えば動物細胞を形質転換するには、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、Ｅｄｇ-５蛋白をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。該形質転換体はそれを適当な培地で培養するとＥｄｇ-５を細胞表面に発現する。
【００３３】
形質転換体の培地、培養条件は当該技術分野で既知であり、当業者が適宜選択することができる。例えば、宿主が動物細胞である形質転換体の場合、MEMダルベッコ培地、RPMI1640培地、ハムF-12培地を用いることができ、MEMダルベッコ培地が好ましい。またｐHは、約７.４付近が好ましい。培養は通常、約２０℃〜４２℃で約２時間から２日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞膜にＥｄｇ-５受容体蛋白を生成させることができる。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法には、上記のＥｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞そのものを用いるのみならず、該蛋白質等を含有する細胞膜画分、及び組換えＥｄｇ-５蛋白質等を用いることができる。
【００３５】
また、Ｅｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のＥｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞としては、該蛋白質等を発現している宿主細胞を指し、上記のメサンギウム細胞や形質転換体が挙げられる。
【００３６】
本発明方法に用いる細胞は、細胞表面にＥｄｇ‐５又はＥｄｇ-５と同等の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質を発現しており、該リガンド結合領域にリガンドが結合することによって増殖を刺激される細胞であり、細胞膜画分はそのような細胞から常法に従って得ることができる。
【００３７】
細胞膜画分は、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＥｄｇ-５蛋白質等と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
組換えＥｄｇ-５蛋白質等は、大腸菌等で発現させたＥｄｇ-５ＤＮＡの発現産物を常法通り単離精製することにより得ることができる。
【００３８】
一つの態様では、本発明のスクリーニング方法は、Ｅｄｇ-５蛋白質等とリガンドとを接触させた場合と、Ｅｄｇ-５蛋白質等、リガンドおよび試験物質とを接触させた場合との比較を行なうことによって実施することができる。
試験物質の存在下で、リガンドのＥｄｇ-５活性化作用が阻害されていれば、その物質は抗ＩＧＡＮ薬の候補である。
試験物質の存在又は不在下で、リガンドとＥｄｇ-５蛋白質等を接触させる方法は、Ｅｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞、又は該細胞から調製されるＥｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞膜画分又はＥｄｇ−蛋白質等を用いて行うことができる。
比較は、▲１▼Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドを含有する細胞に対するリガンドの刺激活性（シグナル伝達作用）の変化、▲２▼Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドに対するリガンドの結合量の変化、さらには、▲３▼細胞内でのＥｄｇ-５の発現・産生量の変化の等に基づいて行うことができる。
【００３９】
▲１▼Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドを含有する細胞に対するリガンドの刺激活性（シグナル伝達作用）の変化に基く方法
より具体的には、本発明は、Ｅｄｇ-５のリガンド（例えばＳＰＰ）をＥｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合と、Ｅｄｇ-５のリガンドと試験化合物をＥｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合におけるＥｄｇ-５を介する細胞へのシグナル伝達阻害作用を測定して比較することを含むＥｄｇ-５アンタゴニストをスクリーニングする方法を提供する。
【００４０】
シグナル伝達は、例えば、細胞の増殖（細胞数の変化）や、Ｅｄｇ-５を介する細胞刺激活性（例えば、細胞内Ｃａ遊離、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨ低下をもたらす物質の産生を抑制する活性などを公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することにより実施できる。Ｅｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞は、メサンギウム細胞等のそれ自身がＥｄｇ-５を産生する細胞、上記の形質転換体等を含む。
【００４１】
上記の方法を実施するには、まず、本発明のＥｄｇ-５蛋白質等を細胞膜表面に発現する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、倍養後の細胞数を計数するか、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、カルシウムイオン、ｐＨ低下物質）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００４２】
細胞数の測定には、市販のXTT細胞増殖アッセイキット(ロシュ  ダイアグノスティクス社)を用いて行う。このキットを用いて得られる結果は、増殖細胞数と強く相関している。
酸性化物質の酸性に対する阻害活性は、市販のマイクロフィジオメーターを用いて行うことができる。これは、酸性化物質は、シグナル応答に対応して細胞内シグナリングプロセスを活性化するために必要な代謝活性が増大し、微少の酸性物質が排出されることによる。よって、細胞のシグナル応答（代謝の活性化、増殖）を細胞外液の酸性化率（ｐＨ変化）に基いて検出することができる。そのようなｐＨ変化は市販の装置、例えば、シリコンセンサーチップを用いるサイトセンサー（モレキュラー デバイス社）で検出することができる。
【００４３】
また、細胞外刺激を受けると細胞内カルシウム濃度が一時的に上昇するので、Ｃａ＋２イオンも、細胞刺激伝達の指標となる。Ｃａ２＋イオンも市販の装置で測定することができ、たとえばＦＬＩＰＲシステム（Fluorometric Imaging Plate Reader、モレキュラー・デバイス社）が使用可能である。
【００４４】
▲２▼Ｅｄｇ-５又はそれと同等のポリペプチドに対するリガンドの結合量の変化に基づく方法
より具体的には、本発明は、標識したリガンドを、Ｅｄｇ-５蛋白質等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＥｄｇ-５蛋白質等に接触させた場合における、標識したリガンドの該Ｅｄｇ-５蛋白質等に対する結合量を測定し、比較すること；標識したリガンドを、Ｅｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＥｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較すること；標識したリガンドを、Ｅｄｇ-５をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＥｄｇ-５蛋白質等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本Ｅｄｇ-５をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＥｄｇ-５蛋白質等に接触させた場合における、標識したリガンドの該Ｅｄｇ-５蛋白質等に対する結合量を測定し、比較すること、を含むスクリーニング方法を提供する。
【００４５】
上記方法には既述の動物由来の細胞、形質転換体、細胞膜画分、組換えＥｄｇ-５蛋白質等を用いることができる。細胞は固定化されていても良い。
標識したリガンドとしては、当該技術分野で既知の方法で標識されたリガンドを用いることができ、例えば、3Ｈ、125Ｉ、14Ｃ、35Ｓなどで標識されたリガンドが挙げられる。具体的には、Ｅｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞または細胞膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりＥｄｇ-５標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとＥｄｇ-５との結合を阻害しないバッファーを用いる。非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜２ｍｌのＥｄｇ-５溶液に、一定量の標識したリガンドを添加し、同時に１０ｎＭの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えて同様に反応させる。反応は約０℃から３７℃で、約１０分から４時間、好ましくは約３０分から２時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。試験物質がない場合のカウント(Ｂ0)から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択する。
【００４６】
▲３▼細胞内でのＥｄｇ-５の発現・産生量の変化に基づく方法
▲３▼−１  ｍＲＮＡ量の変化
より具体的には、本発明は、例えば、ヒト以外の哺乳動物の血液、特定の臓器、該臓器から単離した組織若しくは細胞、または（ii）形質転換体等に含まれるＥｄｇ-５蛋白質等のｍＲＮＡ量を測定することを含むＥｄｇ-５アンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
Ｅｄｇ-５蛋白質等のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なうことができる。正常あるいは疾患モデル動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より好ましくはＩＧＡＮのモデルマウスであるＨＩＧＡマウス）に対して、試験物質を投与し、一定時間（例えば、数時間〜数週間、好ましくは４時間）経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（腎臓）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた細胞に含まれるＥｄｇ-５蛋白質等のｍＲＮＡを、TaqManＰＣＲなどの手法を用いることにより、あるいは自体既知のノザンブロットを行って解析する。
あるいは、Ｅｄｇ-５蛋白質等を発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、培養する際に試験物質を培地中に混合させ、一定時間培養後（数時間〜数日、好ましくは４時間）、該形質転換体に含まれるＥｄｇ-５蛋白質等のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
【００４７】
▲３▼−２  Ｅｄｇ-５蛋白質等の量の変化
より具体的には、本発明は、例えば、（i）ヒト以外の哺乳動物の臓器、該臓器から単離した組織若しくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＥｄｇ-５蛋白質等を定量することを含む、Ｅｄｇ-５アンタゴニストのスクリーニング方法、（ii）Ｅｄｇ-５蛋白質等を発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＥｄｇ-５蛋白質等を定量することを含む、Ｅｄｇ-５アンタゴニストのスクリーニング方法、（iii）ヒト以外の哺乳動物の臓器、該臓器から単離した組織若しくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層でのＥｄｇ-５蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することを含む、Ｅｄｇ-５アンタゴニストのスクリーニング方法、（iv）Ｅｄｇ-５蛋白質等を発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することを含むＥｄｇ-５アンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
【００４８】
細胞膜画分に含まれるＥｄｇ-５蛋白質等の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル動物（正常あるいは疾患モデル動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より好ましくはＩＧＡＮのモデルマウスであるＨＩＧＡマウス）に対して、試験物質を投与し、一定時間（例えば、数時間〜数週間、好ましくは４時間）経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば腎臓）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００TM、ツイーン２０TMなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
【００４９】
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕は上記した方法と同様にして行う。最終的に得られた該膜画分中には、発現したＥｄｇ-５蛋白質等と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。細胞膜画分に含まれるＥｄｇ-５蛋白質は、例えば、Ｅｄｇ-５に対する抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。かかるサンドイッチ免疫測定法は自体既知の方法で行うことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。抗体の取得及び該抗体の使用方法は既知である（例えば、WO99/54351、WO00/60056参照）。
【００５０】
（ii）Ｅｄｇ-５蛋白質等を発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれるＥｄｇ-５蛋白質等を定量することができる。即ち、Ｅｄｇ-５蛋白質等を発現する形質転換体を前述の方法に従い作製し、培養する際に試験物質を培地中に混合させ、一定時間培養後（数時間〜数日、好ましくは４時間）、細胞膜におけるＥｄｇ-５蛋白質等を上記と同様に定量することにより行なうことができる。
また、別の態様として、本発明のスクリーニング方法は、Ｅｄｇ−５を発現しうる細胞におけるＥｄｇ−５の産生量又はｍＲＮＡ量を定量することによって実施することができる。この方法は、上記「▲３▼細胞内でのＥｄｇ-５の発現・産生量の変化に基づく方法」の欄に記載の方法に順じて行うことができる。
【００５１】
本発明はまた、上記スクリーニング方法を実施するためのキットを提供する。そのようなキットは、スクリーニング方法により異なるが、例えば以下のものからなる。
【００５２】
本発明の抗ＩＧＡＮ薬がＥｄｇ-５アンタゴニストである場合、スクリーニング用キットには、Ｅｄｇ-５のリガンドと、Ｅｄｇ-５蛋白質等、Ｅｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞、またはＥｄｇ-５蛋白質等を含有する細胞の膜画分を含有するものが含まれる。さらに、使用するスクリーニング方法に応じて、阻害作用の効果を測定するための適当な試薬、装置、キットなども含まれる。
本発明のＥｄｇ−５アンタゴニストのスクリーニング用キットの例として、以下のものが挙げられる。
１．Ｅｄｇ-５蛋白質等を発現させた細胞を９６穴プレートに５×１０４個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％airで１日間培養したもの。
２．標識リガンド：市販の3Ｈ、125Ｉ、14Ｃ、35Ｓなどで標識したＳＰＰ。水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１０ｎＭに希釈する。
３．リガンド標準液：ＳＰＰを０.１％ＦＡＦウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
４．リガンドのＥｄｇ-５蛋白質等に対する活性化作用又は結合を測定するためのキット又は試薬
【００５３】
本発明のキットには、具体的なスクリーニングの方法に応じて、上記の、または上記以外の既知の構成であってよい。後述の実施例では、被検物質存在下での実験と、被検化合物の非存在下での実験を行っているが、予め決定した条件下で、リガンド及びＥｄｇ-５発現細胞を用いて測定したＥｄｇ-５発現量の変化に基く標準曲線を作成しておき、被検物質の存在下での測定量を該標準曲線と比較することで、阻害作用を判定するのが好都合である。
Ｅｄｇ−５アンタゴニスト以外の抗ＩＧＡＮ薬である場合、キットには適当な標準物質と被検物質とを用いてＥｄｇ−５ｍＲＮＡ又はＥｄｇ−５の量を測定するための装置が含まれる。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物（Ｅｄｇ-５アンタゴニスト等の抗ＩＧＡＮ薬）は例えばリガンドとＥｄｇ-５との結合を阻害することにより、図１で模式的に示したメサンギウム細胞の増殖にいたる一連のシグナル伝達機構の活性化を抑制するので、ＩＧＡＮの予防及び治療に有用である。得られた物質は、通常の薬理試験に供され、適当な剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などに、製剤の分野で既知の固体又は液状担体を用い、所望により、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤などと共に製剤化される。
以下に実施例を示して、本発明を詳しく説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
実施例１  ｃＤＮＡマイクロアレイ及びＲＴ−ＰＣＲによるＩＧＡＮの解析
（１）ＩＧＡＮのモデルマウスの作成
ＩＧＡＮモデルマウス（以下、ＨＩＧＡマウスという）はクローズドコロニーとして市販のddYマウスを用い、選択育種により選抜して得ることができる。なお、作成は特願2001−56276に記載の方法と同様に行うことができる。
方法：
１）クローズド・コロニーであるddY系マウス（日本エス・エル・シー株式会社）の雌52匹と雄52匹（G0世代）を使用する。これらマウスの４ヶ月齢における血清IgA値の平均（mg/dl）は、雌が27.1±2.2、雄が43.3±3.3であった。
２）雌雄それぞれから高値を示す５匹を選抜し（G0選抜個体）、これらを交配することによって次世代（選抜第１代；G1世代）を得た。G0選抜個体の平均血清IgA値は、雌が65.0±7.9、雄が90.5±2.3であった。G1世代における平均血清IgA値（４ヶ月齢）は、雌が44.2±4.0（n=52）、雄が58.4±6.0（n=55）であった。
【００５６】
３）次にG1世代より、４ヶ月齢の血清IgA値を指標として６ペアーの雌雄を選抜し、それらを交配することによってG2世代を得た。G1選抜個体の平均血清IgA値は、雌が109.6±12.6、雄が147.8±15.6であり、G2世代の平均値（４ヶ月齢）は、雌が161.0±12.0（n=54）、雄が180.4±18.1（n=42）であった。
４）同様に、毎世代４ヶ月齢における血清IgA値を指標とする選抜交配を繰り返した。その結果、第４代で選抜交配による効果は頭打ちになった。なお、G2選抜個体の平均血清IgA値は、雌が293.5 ± 28.2、雄が358.9 ± 50.6であり、G３世代の平均値（４ヶ月齢）は、雌が159.4 ± 11.9(46)、雄が222.6 ± 27.2(42)であった。さらに、G３選抜個体の平均血清IgA値は、雌が235.8 ± 25.3、雄が548.7 ± 130.3であり、G4世代の平均値（４ヶ月齢）は、雌が238.5 ± 21.0(50)、雌が214.8 ± 20.3(39)であった。
【００５７】
40世代に渡る兄妹交配を経て近交系として育成されたマウス受精卵は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１５０の下で、通商産業省生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター寄託されている（受託日：平成１２年１２月２５日）。
このＨＩＧＡマウスは、▲１▼血中のIgA濃度が高いこと、▲２▼腎臓の糸球体にIgAが高濃度に沈着すること、▲３▼前記▲２▼が引き金となって、メサンギウム細胞の増殖およびメサンギウム基質の造成が起こり、糸球体硬化症を発症することを特徴とする。このHIGAマウスの発症する糸球体腎炎は、ヒトIgA腎症に酷似している。
ＨＩＧＡマウスは一貫して高い血清IgAレベルを示し、該動物の腎組織には緩やかなメサンギウム細胞の増殖から、細胞外基質の蓄積を伴うメサンギウムの顕著な増大まで各種のメサンギウムの傷害が顕微鏡下で観察される。ＨＩＧＡマウスはヒトＩＧＡＮのほぼ全ての臨床的・病理的特徴を示すことから、ヒトＩＧＡＮの適当な動物モデルであると考えられる。
【００５８】
（２）ＨＩＧＡマウス腎臓の組織学的な解析
ＨＩＧＡマウスの腎臓の重量は６週齢においてはddYマウスとほぼ等しい(292 ± 6.1 vs. 278 ± 7.5 mg, n = 4)が、２５週齢ではＨＩＧＡマウスのほうが明らかに大きくなる(465 ± 15.2 vs. 395 ± 9.5 mg, n = 4, P < 0.01)。
ＨＩＧＡマウスでは約１０−２５週齢の間にメサンギウム細胞の増殖が観察され、40週齢を過ぎるとメサンギウムの基質の顕著な増大が見られる。この顕微鏡的に病理的な変化を観察できる時期の前後、すなわち６週、２５週齢においてＨＩＧＡとコントロールとしてのddYについて、組織学的な解析を行った。
【００５９】
６週齢及び２５週齢それぞれの雌のＨＩＧＡマウスより腎臓を摘出し、パラフィンで方埋を行った。パラフィン切片につきパス染色を行い、光学顕微鏡を用いて観察を行った。この組織学的研究において、６週齢では病理的特徴は検出されなかった (図２（Ａ）)。一方、２５週齢においてはメサンギウム細胞が顕著に増殖し、メサンギウム基質の増大によりボウマン嚢や糸球体の毛細血管が圧迫されていた (図２（Ｂ）)。
【００６０】
（３）ｃＤＮＡマイクロアレイを用いるＨＩＧＡマウスの腎臓における遺伝子発現変化の解析
ＤＮＡマイクロアレイによる解析は、それぞれ６週齢と２5週齢のＨＩＧＡマウス及びｄｄＹマウスの腎臓より調製したｍＲＮＡを鋳型として用いて行った。実施例に記載のラット腎糸球体のメサンギウム細胞の培養及び各処理、それを用いる標準化腎臓ｃＤＮＡマイクロアレイの作製、ｃＤＮＡプローブの調製、ハイブリダイゼーションとマイクロアレイの蛍光強度の測定、及び半定量的ＲＴ−ＰＣＲは以下の方法で行った。
【００６１】
１）メサンギウム細胞の培養及び各処理
常法に従いラット腎糸球体のメサンギウム細胞の培養を行った。細胞の培養には10％(v/v)ウシ胎児血清（FCS）を添加したRPMI1640を用いた。6穴プレートで培養したメサンギウム細胞に16−24時間スタベーションをかけ、成長因子若しくはＳＰＰを添加した、0.4% FAF-BSAを含む無血清のRPMI1640でインキュベーションすることにより、このＳＰＰ処理を行った。各処理の2、4、8、26時間後にXTT assay kit (ロッシェ・ダイアグノティクス社)を用いてメサンギウム細胞の増殖を測定した。また、各処理の0.5、2、4、8、26時間後にIsogen（ニッポンジーン）を用い、添付の指示に従い、total RNAの単離を行った。
【００６２】
２）標準化腎臓ｃＤＮＡマイクロアレイの作製
Bonaldo et alの方法（ＵＳＰ5702898) に一部改良を施して標準化ｃＤＮＡマイクロアレイを作成した。詳細は、本出願人による特願2000−329998に記載されている。即ち、ｃＤＮＡライブラリーより調製したＤＮＡ溶液を酵素処理により環状一本鎖ＤＮＡ化し、別にライブラリーよりPCR法で調製したビオチン化ＤＮＡとハイブリダイズさせ、ビオチン化ＤＮＡとハイブリダイズしたものを除き、残った環状一本鎖ＤＮＡライブラリーを二本鎖化し、大腸菌を形質転換するか、あるいは、ｃＤＮＡライブラリーより調製したDNA溶液を酵素処理により環状一本鎖DNA化し、別にライブラリーより調製した相補的なビオチン化RNAとハイブリダイズさせ、ビオチン化RNAとハイブリダイズしたものを除き、残った環状一本鎖DNAライブラリーを二本鎖化し、大腸菌を形質転換する方法、のいずれによって得ることができる。なお、ＤＮＡ溶液の環状一本鎖化、ＤＮＡのビオチン化、ハイブリダイゼーション、及び環状一本鎖ライブラリーの二本鎖化、大腸菌の形質転換は、当該技術分野で既知の方法に従い、当業者が入手可能な酵素や培地等を用いて行うことができる。
作成した標準化腎臓ｃＤＮＡライブラリーより、大腸菌のクローンを無作為に4,224個単離した。これらのクローン全部の部分塩基配列決定を行い、アレイにスポットしたユニークなクローンの数を見積もったところ2,878クローンであった。
【００６３】
３）プローブの調製
上記１）の成長因子処理した細胞からそれぞれ2μgのpoly(A)+ RNAよりCy3-またはCy5-と結合したdUTP（アマシャムファルマシア）を基質に、Superscipt II reverse transcriptase (ライフテクノロジー社)を用い、供給者指定の条件下で３７℃、３０分間、逆転写反応を行った。その後、ラベルしたプローブをMicroconフィルター（ミリポア社）で濃縮し、10μlのハイブリダイゼーション液（0.3％ SDS、20μg  poly(A)+ DNA、20μg 酵母tRNAを含む3.4 X SSC）で希釈した後マイクロアレイとのハイブリダイゼーションに用いた。
【００６４】
４）ハイブリダイゼーションとマイクロアレイの蛍光強度の測定
ｃＤＮＡマイクロアレイに対し、上記３）の方法で調製した、ラベルしたプローブを用いて65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。洗浄はカバーガラスをはずした後、2 x SSC（0.5% SDSを含む）を用いて室温で5分間2回行い、引き続いて0.2 x SSC（0.5% SDSを含む）を用いて40℃で3分間、最後に0.2 x SSCを用いて3分間洗浄を行った。低速遠心によりスライドガラスを乾燥させた後、スキャンアレイ5000（ビーエム機器）で蛍光強度を測定し、Array Gauge（富士フィルム）を用いて解析を行った。
【００６５】
５）半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
半定量的RT-PCRは、RT-PCRと同様にして行うが、内部部標準を設け、PCR反応で産物が対数的に増えるサイクル数をあらかじめ決めておいてその範囲で増幅反応を行う点において異なる。
ｍＲＮＡは上記と同様の条件下で３７℃、３０分間、逆転写反応を行い、希釈した後、プラチナPCRスーパーミックス（ライフテクノロジー社）を用いて、供給者指定の条件に従って行った。反応液の組成は、プラチナPCRスーパーミックス ４５μｌ、鋳型ＤＮＡ １μｌ、プライマー 各１０μＭである。１２から２５サイクルの間でｃＤＮＡ断片を増幅し、各反応において半定量的解析を行う対数期を決定した。ＰＣＲプライマーを報告されている配列（GenBank）の配列情報に従って合成した。ＰＣＲ産物は適当な制限酵素で消化し、増幅したＰＣＲ産物が目的のものと一致するかどうかの確認を行った。PCR産物の濃度解析は、画像解析ソフトMacBAS v.2.51（富士写真フイルム）を使用し、発現量が一定であるとされているRibosomal S9、β―アクチンおよびGAPDH遺伝子の発現量を同時に測定して、サンプルごとの操作由来の誤差を補正した。
使用したプライマーは、マウス及びラットのＥｄｇファミリーの遺伝子の配列情報（GenBank)に従って合成した。各プライマーの配列を以下の表及び配列番号７〜38に示す。
【００６６】
【表１】
2005300158.tif 000003
【００６７】
(i)  ｃＤＮＡアレイを用いるＩＧＡＮモデルマウスの腎臓における遺伝子発現変化の解析
ＨＩＧＡマウスと、年齢および性別が等しいコントロールddYマウスの腎臓から調製したｍＲＮＡを用いて、上記２）〜４に記載の方法に従ってハイブリダイゼーションを行い、マイクロアレイの蛍光光度を測定した。
解析の結果、図３に示すようにＨＩＧＡマウスの遺伝子発現パターンは、コントロールに比べて２５週齢よりも６週齢において散乱の程度が大きいことが分かった。これは、組織学的な変化が観察される前に多くの遺伝子が差動的に発現（differential gene expression）することを表している。６週齢と２５週齢のＨＩＧＡマウス腎臓で差動的に発現するｃＤＮＡクローンをそれぞれ553クローン、156クローンづつ同定し、それらの70％以上は発現が増加するものであることを見出した。これら差動的に発現する遺伝子をデータベースにより調べたところ、92クローン及び22クローン（それぞれ６週齢、２５週齢）がGenBankのＥＳＴとのみマッチするものであり、65クローン及び28クローンはGenBankでマッチするものがなかった。差動的に発現する遺伝子のうち、成長因子やその受容体及び細胞増殖に関連する分子の発現が増加しており、その発現プロファイルは、ＨＩＧＡマウス腎臓における異常な細胞増殖に対する自己防御のメカニズムを反映していると考えられた（表２参照）。
【００６８】
【表２】
2005300158.tif 000004
【００６９】
関連する遺伝子群の１つは成長因子やその受容体でありメサンギウム細胞において強力な分裂促進効果を持つと報告されているものであり、もう一つの遺伝子群はＧＰＣＲ（Ｇ蛋白質共役型受容体）であり、化学誘引性の脂質メディエーターであるロイコトリエンＢ４に対する受容体、5-ヒドロキシトリプタミン受容体（5HT-2）、ＳＰＰ受容体であるＥｄｇ-５が含まれる。
【００７０】
発現データから得られる特定のパターンの数々は、ＩＧＡＮにおいて起こっている反応を反映しているものと考えられる。特に、細胞周期や細胞増殖の制御に関与する幾つかの遺伝子の発現変化が多く見られた。それらの多くは成長因子やその受容体でありＩＧＡＮ患者の腎臓においてＰＤＧＦ及びＰＤＧＦ受容体の発現の上昇が見られるという臨床における知見と一致する。そして、マイクロアレイの結果をもとにＰＤＧＦ誘導によるメサンギウム細胞の増殖において顕著なＥｄｇ-５のアップレギュレーションが見られることを見出した。これらのことを統合すると、疾患の進行を促進する新規のＰＤＧＦ/ＰＤＧＦ受容体- Ｅｄｇ-５パスウェイを想定することができる。（図１）
【００７１】
(ii)ＲＴ−ＰＣＲによるＥｄｇファミリーの発現レベルの解析
Ｅｄｇファミリーの８つのサブタイプの発現レベルについて、サブタイプ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより解析を行った。ＲＴ−ＰＣＲは、上記表１に記載のPCTプライマーを用い、５）に記載の半定量的ＲＴ−ＰＣＲと同様の条件下で行った。
結果を図４に示す。図４において、（Ａ）は６週齢（６Ｗ）及び２５週齢（２５Ｗ）のＨＩＧＡマウスと、該ＨＩＧＡマウスと年齢及び性別が等しいｄｄｙマウスの腎臓から調製したｍＲＮＡを用いてＥｄｇファミリーの８つのサブタイプの発現レベルについて解析した結果を示す写真の模写図である。（Ｂ）は（Ａ）に示した結果をＨＩＧＡ／ddyの比で表したグラフである。（Ａ）から、Ｅｄｇ-８を除くすべてのＥｄｇファミリーメンバーが腎臓において検出可能であることが分かる。また、（Ｂ）から、６週齢では幾つかのＥｄｇサブタイプがddYに比べＨＩＧＡマウスで上方制御されていること、特にＥｄｇ-５とＥｄｇ-6の発現がＨＩＧＡマウスではｄｄｙマウスの数倍まで上昇していることが明らかである。一方、２５週齢ではそれぞれのＥｄｇサブタイプの発現について十分な変化は見られない。これは、Ｅｄｇファミリーの上方制御がＩＧＡＮの早い段階で起こっていることを示唆している。なお、Ｅｄｇ-６は血小板における主要なＳＰＰ受容体サブタイプであることから、上記６週目での上方制御には、実験で用いたｍＲＮＡが浸潤した血小板由来のＥｄｇ-６転写物が関与していると考えられる。これは、血小板で特異的に発現することが知られている血小板因子４（platlet factor 4）のｍＲＮＡも同様に増幅されたことによって裏付けられた（データなし）。
【００７２】
（iii）マウス腎臓由来のＥｄｇファミリーの半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる解析上記の方法でＨＩＧＡマウスの腎臓由来のｍＲＮＡについて半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、表２に示すように、ＰＤＧＦ、bＦＧＦ、ＥＧＦをコードする遺伝子も、それぞれの受容体と同様に発現が増加していることが確認された。また、この実験によりそれぞれの分子の遺伝子発現についても詳細に得ることができ、このＲＴ−ＰＣＲで得られた遺伝子発現パターン変化は全体的にマイクロアレイの結果と高い相関を示すものであった。
【００７３】
(iv)  ＰＤＧＦ誘導増殖性ラットメサンギウム培養細胞におけるＥｄｇ-５の上方制御
ＰＤＧＦ-ＢＢのような成長因子は、メサンギウム細胞においてスフィンゴミエリナーゼやセラミナーゼを活性化し、その結果、新規のＳＰＰが合成されると考えられている（J Biol Chem 1995 Oct 6;270(40):23305-9 Differential regulation of sphingomyelinase and ceramidase activities by growth factors and cytokines. Implication for cellular proliferation and differentiationCoroneos E, Martinez M, McKenna S, Kester M）。上記のＨＩＧＡマウス腎臓におけるＰＤＧＦとＰＤＧＦ受容体の発現上昇は、ＰＤＧＦがメサンギウム細胞においてＳＰＰの合成だけではなくＳＰＰ受容体の発現にも影響を及ぼしていることを示唆している。そこで、ラットのメサンギウム培養細胞を用いてＥｄｇ遺伝子の発現に対する成長因子の効果について解析した。
【００７４】
上記１）の方法に従いラット腎糸球体のメサンギウム細胞の培養を行った。即ち、10％(v/v)ウシ胎児血清（FCS）を添加したRPMI1640を用いて培養した。６穴プレートで培養したメサンギウム細胞（５×１０４cells/ウエル）に16−24時間スタベーションをかけ、成長因子を添加した無血清のRPMI1640により処理を行った。ＳＰＰ処理の際には、0.4% FAF-BSAを含む無血清のRPMI1640を用いた。各処理の2、4、8、26時間後にXTT assay kit (ロッシェ・ダイアグノティクス社)を用いてメサンギウム細胞の増殖を測定した。また、各処理の0.5、2、4、8、26時間後にIsogen（ニッポンジーン）を用いて total RNAの単離を行った。
具体的には、10 ng/ml ＰＤＧＦ-ＢＢ、10 ng/ml bＦＧＦ、20 ng/ml ＥＧＦを加えて、0.5、2、4及び8時間培養して刺激した。その結果、表３に示すようにＰＤＧＦ-ＢＢによる２時間刺激の場合に、Ｅｄｇ-５の発現が誘導された。
【００７５】
【表３】
2005300158.tif 000005
メサンギウム細胞を記載の成長因子で2時間刺激した。発現の割合βアクチンで標準化した。数値は、それぞれ３回行った独立した３つの実験の平均± S. E. M.で表した。*P<0.05 （対コントロール）
【００７６】
なお、高濃度のＰＤＧＦ（40ng/ml）の２時間の刺激では、中程度のＥｄｇ-１、Ｅｄｇ-3のアップレギュレーション(２時間で、1.9 ± 0.43-及び1.7 ± 0.45-倍、n = 3)及び十分なＥｄｇ-５のアップレギュレーション(２時間で、1.8 ± 0.14-倍、P < 0.05、n = 3)が誘導された。しかし、成長因子による刺激の効果は、Ｅｄｇ-4、Ｅｄｇ-6、Ｅｄｇ-7の発現については検出できなかった（データ示さず）。
【００７７】
次いで、種々の成長因子の細胞増殖における効果についても研究を行った。図５に示すようにＰＤＧＦ-ＢＢ (10 ng/ml)、bＦＧＦ (10 ng/ml)のメサンギウム細胞増殖における効果はＥＧＦ (20 ng/ml)よりも顕著であった（図中、黒四角はｂFGF、黒三角はPDGF-BB、黒丸はEGFを表す）。
また、既にメサンギウム細胞増殖に関与していると報告されている最初期遺伝子の発現についても実験を行ったところ、c-fosとearly growth response gene-1は、これら全ての成長因子によって0.5時間刺激後アップレギュレートを示し、特にＰＤＧＦ-ＢＢの効果が際立っていた（データ示さず）。
【００７８】
上記と同様に、スタベーションをかけた後、成長因子の代りにＳＰＰを添加したRPMI1640を用い、同様に実験した。その結果、10μlの濃度で添加したときＳＰＰはメサンギウム細胞の増殖及び最初期遺伝子の発現に大きな効果を及ぼした(２６時間で1.2倍、P < 0.05、n = 3)。しかしＥｄｇファミリー受容体の発現におけるＳＰＰの効果については検出することができなかった。
【００７９】
以上のように、マイクロアレイ及びＲＴ−ＰＣＲの解析によりＨＩＧＡマウス腎臓において、メサンギウム細胞の増殖が観察される前にＥｄｇファミリー、特にＥｄｇ-５が発現の増加を示すことが明らかになった。現在まで、ＳＰＰ (Ｅｄｇ-1、3、5、6、8)とリゾフォスファチジン酸 (Ｅｄｇ-2、4、7)に高い親和性を持つ受容体である８つのＧＰＣＲがＥｄｇファミリーとして同定されている。上記の結果は、ＳＰＰはＥｄｇ-１、Ｅｄｇ-3、Ｅｄｇ-５を経てメサンギウム細胞の増殖を誘導する。加えて増殖性メサンギウム細胞において、ＰＤＧＦがこれらのＥｄｇ受容体特にＥｄｇ-５をアップレギュレートしていることを初めて示すものである。Ｅｄｇ-５は、ラットの褐色細胞種PC12細胞においてＳＰＰ誘導による神経突起の後退や細胞の円唇化を仲介すること、ラットＨＴＣ４肝細胞腫細胞において細胞増殖及び抗アポトーシス作用を示すことが報告されているが、Ｅｄｇ-５のＩＧＡＮにおける役割については未だ知られていない。
【００８０】
ＨＩＧＡマウス、ＤＮＡマイクロアレイ及びＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＰＤＧＦ誘導下でのＥｄｇ-５アップレギュレーションに関連する一連のシグナル伝達機序を図１に模式的に示した。即ち、ＰＤＧＦで刺激するとメサンギウム細胞はさらにＰＤＧＦを生産・放出し、オートクライン及びパラクラインの機構によって細胞表面のＰＤＧＦ受容体の発現が増加する。そして、ＰＤＧＦはメサンギウム細胞のスフィンゴミエリナーゼとセラミダーゼを活性化し、その結果ＳＰＰの合成が増加する。一方、ＳＰＰは活性化した若しくは凝集性の血小板からも放出される。図１に示すように、ＳＰＰはオートクラインでまたは分子内のセカンドメッセンジャーとして働くことにより、メサンギウム細胞の増殖を引き起こすと考えられる。リガンドであるＳＰＰとその受容体Ｅｄｇ-1、Ｅｄｇ-3、Ｅｄｇ-５（特にＥｄｇ-５）の合成量は相乗的に増加しうる。ＨＩＧＡマウス腎臓で観察されたＰＤＧＦ/ＰＤＧＦ受容体とＥｄｇ-５の発現の増大は、細胞増殖活性につながる成長因子シグナルとリンクするカスケードの増幅のために、ＰＤＧＦ-ＳＰＰ- Ｅｄｇパスウェイが正のフィードバックループ中で作用している可能性を示唆している。実験結果はまた、メサンギウム細胞からのＳＰＰはＥｄｇ-6の発現上昇を通して血小板を活性化し、血小板からのＳＰＰの分泌も促進するというように、ＩＧＡＮの進行中正のフィードバックループ内で次々に作用が起こることを示唆している。そして、これらの悪循環のすべてがＨＩＧＡマウス腎臓において作動していることが増殖性糸球体腎炎の治療困難性の一因であると考えられる。
このように、上記の実験結果は、Ｅｄｇ-５とリガンド（ＳＰＰ）との結合阻害物質（Ｅｄｇ−５アンタゴニスト）が、増殖性糸球体腎炎、特にＩＧＡＮの予防・治療薬の開発に重要な役割を果たすことを示すものである。
【００８１】
実施例２  マイクロフィジオメーターによるスクリーニング
（ｉ）ほ乳類培養細胞での発現
Ｅｄｇ-５受容体を、ヒト胎児性腎臓由来細胞（HEK２９３）あるいは、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（CHO）で発現させる。
高頻度に受容体を発現させるために、配列番号１に記載のヌクレオチド配列のうち、５´あるいは、３´の非転写領域を全て除き、真核細胞の発現ベクターである、pＣＩ−ＮＥＯ（プロメガ株式会社)又はpＣＤＮＡ３.１(Invitrogen)に連結する。
当該遺伝子を連結したpCI-Neoあるいは、pcDNA3.1をLipofectamine Plus Reagent（Life Technologies社製）を用い、添付文書の条件に従って培養細胞、HEK293あるいはCHOに対する形質導入を行う。細胞を400mg/mlのG418を含む細胞培養用培地中で３週間選択培養を行なう。Ｇ４１８耐性の２４クローンを選択し、実施例１に記載のごとく、ＲＴ−ＰＣＲ法でＥｄｇ-５受容体遺伝子を安定に発現している細胞を選択する。選択した細胞を９６穴の細胞培養用プレートを用いて１個の細胞より、増殖させたクローンを再選択して、以後の検討に用いる。ベクターのみを導入したHEK293あるいは、CHOを同時に作製し、ネガティブコントロールとして用いる。
【００８２】
（ｉｉ）マイクロフィジオメーター（サイトセンサー）によるスクリーニング
種々の細胞のシグナル応答に対応して、細胞より、微少な、酸性物質が排出される。これは、細胞内のシグナリングプロセスを活性化するために必要な代謝活性の増大によるものである。サイトセンサー（モレキュラー・デバイス社）は、生細胞の代謝変化で発生する細胞外液の酸性化率（pH変化）を、シリコンセンサーチップを用いて検出することで細胞のシグナル応答を測定することができる。マイクロフィジオメーターとしてサイトセンサーを用いて、細胞表面に発現させた受容体への、リガンド結合による受容体の活性化を検出する。
Ｅｄｇ-５受容体の天然のリガンドであるスフィンゴシン １−リン酸（ＳＰＰ）と同時に種々の化合物を細胞外液に加えることによって、ＳＰＰの活性を阻害するアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【００８３】
実施例３  Ｃａ２＋イオン濃度変化によるスクリーニング
（ｉ）ほ乳類培養細胞での発現
Ｅｄｇ-５受容体遺伝子を安定に発現している細胞の選択は、「マイクロフィジオメーターによるスクリーニング」の（ｉ）で記載した方法と同様にして行う。
【００８４】
（ｉｉ）ＦＬＩＰＲシステムによるスクリーニング
受容体を安定に発現する細胞を、９６穴のプレートに５．５ x 104 ／ウエルの密度で培養し、スタンダード・バッファー（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ グルコース、０.４５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、４.２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０μＭプロベネシド）中で、Ｆｌｕｏ−３ ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を取り込ませるために、０.１％牛胎児血清存在下で、３７℃で１時間インキュベートした後、スタンダード・バッファーで洗浄する。ＳＰＰを加えることによるＣａ２＋イオン濃度の一時的な変化は、ＦＬＩＰＲシステム（Fluorometric Imaging Plate Reader：モレキュラー・デバイス社）を用いて、９６穴のプレートを４８８ｎｍで測定することによって知ることができる。
従って、Ｓ１Ｐと同時に種々の化合物を細胞外液中に加えることによって、ＳＰＰの活性を阻害するアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【００８５】
【発明の効果】
本発明方法によれば、Ｅｄｇ-５受容体に対する拮抗作用を含むＥｄｇ−５の活性化の抑制作用に基いて、増殖性糸球体腎炎、特にＩＧＡＮの予防・治療に有用な物質を効率よくスクリーニングし、該疾患の新規な治療法の開発に大いに貢献しうる。
【００８６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＰＤＧＦ−刺激によって起るメサンギウム細胞の増殖シグナル伝達機序を示す模式図である。
【図２】  それぞれ、（Ａ）６週齢及び（Ｂ）２５週齢の、雌のＨＩＧＡマウスより腎臓を摘出し、パラフィンで方埋を行い、パラフィン切片をパス染色したものを光学顕微鏡で観察した結果を示す写真の模写図である。
【図３】  標準化腎臓ｃＤＮＡライブラリーを用いて調製したｃＤＮＡマイクロアレイを用い、ＨＩＧＡマウス（縦軸）と、該ＨＩＧＡマウスと年齢及び性別が等しいddYマウス（横軸）の腎臓から調製したｍＲＮＡを用いて遺伝子発現を解析した結果を示す図であり、（Ａ）は６週齢、（Ｂ）は２５週齢の動物における解析結果である。
【図４】  それぞれ、６週齢（６Ｗ）及び２５週齢（２５Ｗ）のＨＩＧＡマウスと、該ＨＩＧＡマウスと年齢及び性別が等しいddYマウスの腎臓から調製したｍＲＮＡを用いてＥｄｇファミリーの８つのサブタイプの発現レベルについて解析した結果を示す写真の模写図（Ａ）、及び結果をＨＩＧＡ／ddyの比で表したグラフ（Ｂ）である。
【図５】  ＰＤＧＦ-ＢＢ、bＦＧＦ又はＥＧＦによってラットメサンギウム培養細胞に増殖刺激を与え、各処理の2、4、8、26時間後にXTT assay kit (ロッシェ・ダイアグノティクス社)を用いてメサンギウム細胞の増殖を測定した結果を示す図である。図中、四角はbＦＧＦ、三角はＰＤＧＦ-ＢＢ、丸はＥＧＦを培地に添加したときの結果を示す。
【図１】
2005300158.tif 000029
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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