(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料成分検出において、ゴミなどの付着、試料液の減少等の異常状態を判定し、精度の高い検出法を提供する。【解決手段】光検出領域から発する光を少なくとも複数の波長帯に分離して検出する手段とを有し、該複数の波長帯の一つが実質的に励起光成分と同じ波長帯とし、励起光成分の光強度を検出し、あらかじめ決められた所定の強度（閾値）と比較する。【効果】試料の異常の判定が可能で、高精度な蛍光測定が実現できる。【選択図】図２ａ
2005300292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光検出領域に生体試料成分を捕捉し、該光検出領域からの蛍光を検出して目的の該生体試料成分を定量する生体試料成分検出法において、該生体試料成分または、実質的に該生体試料成分と同じ成分は蛍光体で標識され、光検出領域に該蛍光体を励起するための励起光を照射し、光検出領域から発する光を少なくとも複数の波長帯に分離して検出し、該複数の波長帯の一つが実質的に励起光成分と同じ波長帯であり、励起光成分と同じ波長帯の光強度をあらかじめ決められた所定の強度範囲と比較し、該強度範囲を超える強度である場合に、該光検出領域の蛍光測定が適正であるかどうかを判定することを特徴とする生体試料成分検出法。
【請求項２】
請求項１記載の生体試料成分検出法において、上記光検出領域は、実質的に平面状の基板面に形成された反応領域であることを特徴とする生体試料成分検出法。
【請求項３】
請求項１に記載の生体試料成分検出法において、該光検出領域で、増幅反応を行った後、または、増幅反応と並行して光検出を行うことを特徴とする生体試料成分検出法。
【請求項４】
請求項１に記載の生体試料成分検出法において、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、及びタンパクチップのいずれかに生体試料を担持することを特徴とする生体試料成分検出法。
【請求項５】
請求項１に記載の生体試料成分検出法において、マイクロプレートのウェルに生体試料を担持することを特徴とする生体試料成分検出法。
【請求項６】
回転円盤上に配置された光検出領域と、複数の液体を別々に保持する複数の試薬保持部と、該液体を遠心力によって移動させることのできる流路を有するカートリッジ状構造体と、該液体が発する蛍光及びその周辺から発する散乱光を検出する光測定部と、該光測定部の信号に基づいて該光検出領域の蛍光測定が適正であるかどうかを判定する手段を有することを特徴とする生体試料成分検出装置。
【請求項７】
請求項６記載の生体試料成分検出装置において、上記光検出領域は、マイクロプレートのウェルであることを特徴とする生体試料成分検出装置。
【請求項８】
回転を制御できる回転円盤と、該回転円盤上に配置された光検出領域と、回転円盤上に配置された試料を保持する試薬保持部と、該回転円盤上に配置された前記試料を遠心力によって前記光検出領域へ移動できる流路と、該光検出領域から発する光を検出する光測定部と、該光測定部の信号に基づいて該光検出領域における前記試料の状態を表示する表示装置を有することを特徴とする生体試料分析装置。
【請求項９】
請求項８記載の生体試料分析装置であって、前記表示装置が、前記光検出領域において結露が生じているとき、試料の測定状態が異常状態である旨を表示することを特徴とする生体試料分析装置。
【請求項１０】
請求項８記載の生体試料分析装置であって、前記表示装置が、前記光検出領域において試料が所定値より減少しているとき、試料の測定状態が異常状態である旨を表示することを特徴とする生体試料分析装置。
【請求項１１】
請求項８記載の生体試料分析装置であって、前記表示装置が、前記光検出領域において試料が片寄っているとき、試料の測定状態が異常状態である旨を表示することを特徴とする生体試料分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光ラベルされた生体試料の検出を正確に行うための方法に関し、特に、不測のゴミなどによって、間違った結果を出さないようにするための方法、また、ＤＮＡなどの増幅時における試料液の蛍光を正確に計測するための方法及びそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、蛋白質等の分析技術は、遺伝子解析や遺伝子診断を含む医学、生物学の分野で重要である。特に最近では、ＤＮＡマイクロアレイ（又はＤＮＡチップなどの名称で呼ばれる）やタンパクチップ等を使って検査分析する方法及び装置が注目されている。マイクロアレイは、ガラス等の基板を使用し、これを複数（数百〜数千万個）の領域に分けて、各々に目的の（通常、種類の異なる）ＤＮＡ等のプローブを固定化し、各々を微小な反応領域にしたものである。これと検体とを反応させることで、検体中の目的ＤＮＡやタンパクなどが前記固定化されたプローブと結合して捕捉され、定量される。このＤＮＡマイクロアレイの各反応領域に捕捉された目的ＤＮＡの蛍光標識から発せられる蛍光強度の読み取りには、通常スキャナーと呼ばれる顕微鏡（共焦点蛍光顕微鏡）様の装置が使用される（例えば、特許文献２参照）。この装置は、アレイ上にレーザ光などの励起光を照射し、生じる蛍光を干渉フィルタなどの分光素子を使って励起光と分離し、蛍光強度を光検出器にて検出し、捕捉した目的ＤＮＡやタンパク等を定量・定性比較する。
【０００３】
ＤＮＡ等の標的核酸の検出・定量などは、マイクロアレイ以外に、マイクロプレート、マイクロチューブ等で、増幅させながらのリアルタイム蛍光検出も知られている（特許文献４参照）。
【０００４】
マイクロアレイでの蛍光測定では、ゴミの付着が大きな問題となる。ゴミの付着している部分の蛍光強度は正確な値にならないので、測定値から除去する必要がある。通常、マイクロアレイのスポットの大きさが１００ミクロン径程度であり、ゴミの大きさは数ミクロン以下であることが多いため、スポット内にゴミが１個あってもその部分のみの信号を除去することで、残りの領域の蛍光強度からそのスポットの蛍光測定が可能になる。マイクロアレイはより高密度化の方向に有り、スポット径もより小さくなってきている。しかし、スポット径が小さくなってくると、ゴミとの大きさの違いがなくなり、前述のような手法での測定が困難となる。基板の傷についても同様である。
【０００５】
特許文献２は試料からの蛍光と励起光の反射光を併用して試料の性状を測定する方法を開示している。
【０００６】
容器を使って増幅させながら、蛍光検出する方法も一般的に行われている。通常はマイクロプレート、マイクロチューブ等を反応容器兼検出容器としている。また特許文献１には、回転可能のカートリッジ状構造体に、血液などの試料液中のＤＮＡやウィルスＲＮＡなどを捕捉する捕捉部、各種試薬を別々に保持する試薬保持部等を備え、回転により発生する遠心力により、試薬液の搬送を行う抽出検出モジュール（以下、遠心モジュールと表記）が記載されている。本モジュールは、血液などの試料をセットすれば、モジュール内ですべての反応及び検出を行うことが出来、外部への汚染の可能性が非常に小さく有効なデバイスである。
【０００７】
しかし、上記のいずれの文献においても、試料からの蛍光が純粋に正常な状態で測定されているのか判定することを示していない。
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ０３／０５９４８４号公報
【０００９】
【特許文献２】特開２００２−３１０８８６号公報
【特許文献３】特開２００２−１８１７０８号公報
【特許文献４】特開２００２−１８９８６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
検出工程も反応と同じ容器において行うのが簡単である。試料液中の検出すべき標的成分（ＤＮＡ、ウィルスＲＮＡなど）は微量であることが多く、試料液から標的成分を抽出後、通常、ＰＣＲ法または恒温増幅法等により増幅し、蛍光検出により測定を行う。抽出後の、増幅反応を行うときにはどの方法を使っても反応液を加温する必要がある。その際、反応液の蒸発などによる反応液の減少、結露による水滴の形成により、蛍光測定に対して不正確な結果を与える可能性がある。また、バルブを使わずに遠心力により試薬液の搬送をおこなうため、液体の状態、モジュールの状態によっては、所定の位置に液体を保持出来ない場合も想定される。この場合、測定試料液の有り無し、及び量、状態を正確に判定する必要がある。
【００１１】
本発明の目的は、上記の課題を解決し、ゴミなどが付着したり、試料液が減少したり、無くなったりする等の異常状態の場合に、異常であることを認識し、目的の試料の定量結果に影響を与えない、また、精度の高い生体試料成分検出法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明は以下の生体試料成分検出法及び生体試料検出装置を提供するものである。
【００１３】
まず、本発明は、光検出領域に生体試料成分を捕捉し、該光検出領域からの蛍光を検出して目的の該生体試料成分を定量する生体試料成分検出法において、該生体試料成分または、実質的に該生体試料成分と同じ成分は蛍光体で標識され、光検出領域に該蛍光体を励起するための励起光を照射し、光検出領域から発する光を少なくとも複数の波長帯に分離して検出し、該複数の波長帯の一つが実質的に励起光成分と同じ波長帯であり、励起光成分と同じ波長帯の光強度をあらかじめ決められた所定の強度範囲と比較し、該強度範囲を超える強度である場合に、該光検出領域の蛍光測定が適正であるかどうかを判定することを特徴とする生体試料成分検出法を提供するものである。
【００１４】
更に、上記生体試料成分検出法において、上記光検出領域は、実質的に平面状の基板面に形成された反応領域であることを特徴とする生体試料成分検出法を提供する。また、上記生体試料成分検出法において、該光検出領域で、増幅反応を行った後、または、増幅反応を行っているのと同時に継続して光検出を行うことを特徴とする生体試料成分検出法を提供する。更に、上記生体試料成分検出法において、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、及びタンパクチップのいずれかに生体試料を担持することを特徴とする生体試料成分検出法を提供する。そして、上記生体試料成分検出法において、マイクロプレートのウェルに生体試料を担持することを特徴とする生体試料成分検出法を提供する。
【００１５】
本発明は、回転円盤上に配置された光検出領域と、複数の液体を別々に保持する複数の試薬保持部と、該液体を遠心力によって移動させることのできる流路を有するカートリッジ状構造体と、該液体が発する蛍光及びその周辺から発する散乱光を検出する光測定部と、該光測定部の信号に基づいて該光検出領域の蛍光測定が適正であるかどうかを判定する手段を有することを特徴とする生体試料成分検出装置を提供するものである。
【００１６】
目的の生体試料成分は蛍光検出により測定する。蛍光検出では、マイクロアレイ（ＤＮＡ、タンパク）または、マイクロプレート、マイクロチューブ、遠心モジュールの所定の光検出部に蛍光体を励起するための励起光を照射する手段と、光検出領域から発する光を少なくとも複数の波長帯に分離して検出する手段とを有し、該複数の波長帯の一つが実質的に励起光成分と同じ波長帯とし、励起光成分の光強度を検出し、あらかじめ決められた所定の強度（閾値）と比較する。あらかじめ決められた所定の強度は、試料容器及び試料液が正常であるときの励起光成分の光強度測定した結果に基づき安全係数を乗じて設定した値であり、通常超えることはない値である。
【００１７】
測定強度が閾値を超える強度である場合に、該光検出領域の蛍光測定が適正でないと判定する。また、上記光検出領域では、増幅反応を行った後に測定してもよいし、増幅反応を行いながら、リアルタイム蛍光検出を行いつつ、上記判定を行っても良い。増幅反応は種々の方式が適用可能である。好ましくは、恒温で行う方式が簡便で実施しやすい。
【００１８】
本発明のその他の実施形態として、回転を制御できる回転円盤と、該回転円盤上に配置された光検出領域と、回転円盤上に配置された試料を保持する試薬保持部と、該回転円盤上に配置された前記試料を遠心力によって前記光検出領域へ移動できる流路と、該光検出領域から発する光を検出する光測定部と、該光測定部の信号に基づいて該光検出領域における前記試料の状態を表示する表示装置を有することを特徴とする生体試料分析装置がある。
【００１９】
また、前記表示装置が、前記光検出領域において結露が生じているとき、試料の測定状態が異常状態である旨を表示することができる。更に、前記表示装置が、前記光検出領域において試料が所定値より減少しているとき、試料の測定状態が異常状態である旨を表示することもできる。また、前記表示装置が、前記光検出領域において試料が片寄っているとき、試料の測定状態が異常状態である旨を表示することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、蛍光測定側で励起波長成分の強度を検出することによって、試料の異常を判定することが出来、高精度な蛍光測定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施形態を以下に示す。
〔実施例１〕
最初に、本発明で用いられる遠心モジュールの操作について説明する。図１ａ及び図１ｂに本発明で用いる遠心型化学分析モジュールの重要ポイントの構造を示した。図１ｂは所定の分析流路構成を持つセグメント又は遠心モジュール１３の１つを示し、実際の分析にあたっては、図１ｂに示すセグメント１３を複数個、たとえば４から１２個を図１ａに示す保持ディスク１２に嵌め合いにより設置する。遠心モジュール１３は、たとえばＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）製である。遠心モジュール１３は１回ごとに処分可能なディスポーザブルとしても良い。
【００２２】
図１ｂにおいて、各種の試薬は微小容器２０７，２０８，２０９，２１０，２１１に保持され、その上面は樹脂フィルムで密閉されている。操作者は、全血容器２００に全血を分注し、ディスクを回転させると、全血は遠心力によって外周側に移動し、密度差により血球成分２０１と血清成分２０２とに分離する。
【００２３】
血清成分を保持する容器２０２から毛細管（キャピラリ）２０３が分岐しており、一旦内周側に戻る構造になっている。そのため血清は毛細管を超えることができない。
【００２４】
回転を止めると、血清は毛細管流動により毛細管２０３を完全に満たす。再度ディスクを回転させると、毛細管から血清が流出する。毛細管の出口は入り口（血清容器からの分岐部）より外周にあるので、サイフォン効果で毛細管の血清が全て流出する。このとき第１の試薬容器２０７を密閉しているフィルムに通気孔を開けると、容器２０７から試薬が流出し、血清と混合する。試薬を供給したいタイミングでディスクを回転させる直前に通気孔を開けるのがよい。
【００２５】
第１の試薬と血清が十分に反応した後、ディスクの回転を止め、第２の試料容器２０８のフィルムに孔を開ける。再度ディスクを回転させると、試薬が反応容器に流入し、反応容器内の液を追い出し、結合フィルタ２０４を経て回収容器２０５に流れ込む。結合フィルタ２０４はガラス繊維で構成されており、核酸がガラス表面に捕捉される。更に第３、第４の試薬を容器２０８，２０９から流入させ、ガラス繊維に付着した核酸を洗浄する。結合フィルタ２０４を通過した液は回収容器２０５に流れ込み、試料容器２１１に保持された溶離液以外は回収容器下流のサイフォンから流出する。核酸を含んだ溶離液は回収容器２０５に保持される。使用した試薬、洗浄液などは、回収容器から廃棄液容器２０６に送られる。
【００２６】
図２ａに本発明の生体試料成分検出法を使った分析装置の全体図を示す。図２ａは外観斜視図であり、図２ｂはその一部断面図であり、図３はその制御ブロック図である。分析装置１０は遠心用モータ１１とモータ１１により回転可能な状態に支持された保持ディスク１２と、その内部に位置決めされて保持され遠心モータ１１の回転により抽出・反応をその内部で行うことのできる遠心モジュール１３を備える。また、回転時に遠心モジュール１３を安定に保持するためのディスク押え蓋１４、遠心モジュール１３の位置つまり保持ディスク１２の回転位置を正確に制御するためのディスク位置決め用検出器１５、遠心モジュール１３内の液の搬送を制御するための穿孔ピンを配置した穿孔ユニット１６を有する。更に、光検出のための光学検出光照射・受光部１７と光学検出ユニット１８、データの解析表示などを行うコントローラＰＣ１９を備えている。また、保持ディスク内の位置決め用マーカ、保持ディスク１２部の温度調節のためのヒータなどの温調ユニット、制御回路、電源回路なども必要であるが、図２ａ、図２ｂでは省略した。
【００２７】
図３に示す制御ブロックにより、図２ａ，図２ｂの装置を制御する。まず、コントローラＰＣ３０１に測定条件を入力することにより分析が始まり、分析装置１０内の制御ＣＰＵ３０２の元で、種々の制御が行われる。制御部には、モータ制御部３０３、光検出制御部３０６、穿孔制御部３０５、温度制御部３０４がある。モータ制御部３０３は、モータ、回転数センサ、位置決めセンサ、異常検出センサ（モータ温度、回転数異常等）を制御し、ＣＰＵ３０２の指示のもとで、モータを指定の回転数、加速・減速時間で、回転させ、遠心力により遠心モジュール１３内の液の移送を行う。
【００２８】
図３における穿孔制御部３０５は、穿孔ユニット１６内に収めた複数の穿孔ピンを押し出すためのモータを制御する。指定の位置のピンを押し出すことで、遠心モジュール１３内の指定した試薬ポートの樹脂フィルムに孔をあけ、遠心力による該試薬液の移送が行える。なお、この動作の前には、モータ制御部による保持ディスク１２、遠心モジュール１３の位置決めが必要であり、その位置決め後に行われる。
【００２９】
温度制御部３０４は、遠心モジュール１３または、保持ディスク１２の温度を調節し、遠心モジュールに密着したヒータ４と温度センサ（図示せず）、保持ディスク１２を収めている回転槽内に設けたヒータ及びクーラーと温度センサを周知の方法により制御する。光検出制御部は、光源、光検出器、フィルタ切り替え用モータ、フィルタ識別センサ、遮蔽用シャッタ、異常検出用センサ（光源のランプ切れなど）データ転送部を制御し、発光する光強度を測定する。
【００３０】
図４は光学検出部の全体構造図であり、図５は遠心モジュールへの光照射部の拡大である。図４において、遠心モジュールの光検出領域３（抽出／検出ポート）、光学検出光照射受光部１７、光学検出ユニット１８の部分を図示している（遠心モジュールそのものは、特許文献１参照）。図５において、遠心モジュール１３の光検出領域３（抽出／検出ポート）３は、その下部が透明な凹状の材質で、その上部は透明フィルム２でカバーされており、適当な容量の空間を形成しており、光測定用のセルの構造となっている。その空間には測定試料液５を保持し光検出される。測定試料液５には、例えば抽出されたＲＮＡと増幅検出するための試薬が混合されている。
【００３１】
増幅のための試薬には周知のＮＡＳＢＡ法のキットを使用する。検出用のプローブには、周知のようなオリゴヌクレオチドにレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合したもので、ハイブリすることによって蛍光発光が起きるように調整された型のプローブを使用する。この状態で、外部ヒータ４により、反応液を４１℃になるように調節し、蛍光測定を行う。異なる増幅法でも同様に実施可能である。その場合、試薬の種類、温度等の設定値は各増幅法に従う。
【００３２】
光学検出光照射・受光部１７は遠心モジュールの近傍に配置し、遠心モジュールへの光照射と蛍光などの受光を行い、光学検出ユニット１８はそれ以外の光源、分光、光検出などを含み、目的の光強度の測定を行い、両者は光ファイバにて連結している。レーザ光源や水銀ランプ等の励起光源２０の光をレンズ２１、励起光照明用単色化フィルタ２２、ダイクロイックミラーブロック２３、対物レンズ２５を通して光ファイバ２６（ＮＡ＝０．２２、コア径４００μｍ）に導入する。光ファイバ２６の他端は光学検出光照射・受光部１７に配置され、レンズ２８により光検出領域（抽出／検出ポート）３に集光される。レンズ２８、光ファイバ２６はホルダ２７に位置調整可能なように固定され、また、ホルダ全体はＸＹＺ移動機能を有し、光検出領域（抽出／検出ポート）３位置へ正確に光照射を行えるようにしている。
【００３３】
光検出領域（抽出／検出ポート）３内の測定試料液５から生じる蛍光（散乱光、反射光などを含む）は、レンズ２８により集められ、光ファイバ２６を介して光学検出ユニット１８に導入する。
【００３４】
蛍光等は再び対物レンズ２５でコリメートし、ダイクロイックミラーブロック２３、蛍光測定用カットフィルタ２４で必要な光成分を選別し、レンズ２９により集光し、検出器で検出する。今回は検出器として、分光器３０とＣＣＤラインセンサ３１を使用する。波長ごとに分割された光強度が計測され、そのデータが制御ユニット３２を介し、コントローラＰＣ１９に送られ処理される。
【００３５】
図６は蛍光測定用カット６の１例である。蛍光測定では、通常、蛍光測定用カットフィルタは励起光を可能な限り透過させないような特性のフィルタ（例えば励起波長透過率０．０００１％以下、蛍光波長帯透過率８０％以上）とするのが一般的である。図５ではラインセンサにより励起波長成分と、蛍光波長成分を同時に分光して検出する。そのため、図６のように、励起波長域の透過率が０．１％程度、蛍光波長帯透過率８０％以上のように、励起波長成分を一部透過するような特性とする。一般に蛍光体からの蛍光強度は（蛍光体濃度が１ｎＭ程度と低いため）非常に弱く、散乱光強度はそれに比して十分に大きいため、そのままでは強度比が大きく同一検出器では測定できない。また、従来型フィルタでは、散乱光成分がカットされてしまい、散乱光強度をモニタできなくなる。そこで、図６のようなフィルタを使用し、観察すべき蛍光の強度と、標準的な散乱光強度がほぼ同じ強度レベルになるように設定するのが望ましい。
【００３６】
図７は分析装置での操作手順のフロー図である。基本的には、特許文献１と同様の方法で行う。まず、遠心モジュールの所定の位置に検体を注入し、保持ディスクに装着する。ディスクを所定の回転速度、回転時間で回転・停止して血清分離する。その後、必要な試薬（洗浄液を含む）をそれぞれ所定の順番に導入することで、ウィルスＲＮＡなどの目的の成分を抽出する。１番目のモジュールに１番目の試薬を導入するため、モータにより回転させて、１番目のモジュールの位置合わせを行い、１番目の試薬の位置でシールフィルムを穿孔する。これをモジュール分行う。
【００３７】
その後ディスクを所定の回転速度、回転時間で回転・停止し、１番目の試薬を移動させて混合する。この操作を必要な試薬分行うことで、光検出領域（抽出／検出ポート）に目的の成分を抽出する。その後、増幅用試薬１（プライマーなど）を同様の操作で注入混合し、増幅検出工程に移る。まず光検出領域（抽出／検出ポート）部を６５℃に加温し、その後冷却して４０℃以下にする。位置決め、増幅用試薬２（酵素液など）貯蔵部のシールを穿孔し、これをモジュール分行う。所定の回転速度、回転時間で回転・停止して酵素液などを混合し、４１℃に加温・維持することで、増幅反応を起こす。この増幅状態を蛍光検出工程にて測定する。
【００３８】
図８は分析装置での検出工程手順のフロー図である。指定した光計測時間間隔ｔ１で繰り返し測定し、時間経過を測定する。トータルの測定時間はｔ０とする。通常ｔ０は６０分から９０分程度に、ｔ１は０．５分程度に設定する。１番目のモジュールの位置合わせを行い、蛍光測定する。本例では蛍光検出の対象となる蛍光体を２種（例えばＦＡＭ、ＲＯＸ）想定し、励起波長が、おのおの２種（例えば、４８０ｎｍと５９０ｎｍ）である場合を示す。フィルタＢＯＸ切換え器３３でＢＯＸ−Ａ３４ａとＢＯＸ−Ｂ３４ｂを切り替える。
【００３９】
ＢＯＸ−Ａ３４ａ、ＢＯＸ−Ｂ３４ｂはそれぞれ励起光照明用単色化フィルタ２２ａ及び２２ｂ、ダイクロイックミラーブロック２３ａ及び２３ｂ、蛍光測定用カットフィルタ２４ａ及び２４ｂを有し、異なる励起波長で蛍光測定することができる。そこで、フィルタＢＯＸ切換え器３３でＢＯＸ−Ａ３４ａに切り替えて光検出を行い、ついで、ＢＯＸ−Ｂ３４ｂに切り替えて光検出を行う。これをモジュール分行う。この動作をｔ１間隔で時間ｔ０間続ける。
【００４０】
図９は図１ｂに示した１つの遠心モジュールを用いて、試薬液の移動状態を説明する図である。増幅工程での液移動・反応状態を説明する。図は説明部のみを図示し、それ以外は省略している。光検出領域（抽出／検出ポート）部には抽出工程にて目的の成分が抽出されている。また、試薬Ａ，試薬Ｂポートにはそれぞれ増幅反応検出用の試薬が封入されている（図９（ａ））。穿孔ユニットにて試薬Ａのシールに孔を空ける（図９（ｂ））。回転することで、遠心力により試薬Ａ内の試薬が光検出領域（抽出／検出ポート）部に移動し混合される（図９（ｄ））。光検出領域（抽出／検出ポート）部を６５℃に加温し、５分保持し、その後冷却して４０℃以下にする。
【００４１】
穿孔ユニットにより試薬Ｂのシールに孔を空ける。回転することで、遠心力により試薬Ｂ内の試薬が光検出領域（抽出／検出ポート）部に移動し混合される（図９（ｉ））。遠心モジュールを４１℃に加温・維持することで、増幅反応を起こすことができる。
【００４２】
図１０ａ，図１０ｂ及び図１０ｃは以上の操作で得られる光検出結果の例である。レポーター蛍光色素がＦＡＭのオリゴヌクレオチドを使用する。励起光の単色化フィルタには４７０−４９０ｎｍを通すフィルタを、蛍光測定用カットフィルタには、特注のフィルタを使用する（ＧＧ４９５色ガラスフィルタで代用可能でもある）。ＣＣＤラインセンサ３１では、３５０−７００ｎｍの光を検出することができるが、本実施例では、４７０−４９０ｎｍ帯（励起光波長成分）の強度、及び５３０−５４０ｎｍ帯（蛍光体蛍光波長成分）の強度をデータとして取り出す。
【００４３】
図１０ａ（ａ）は、４１℃に保持してから、０．５分ごとに得られる信号強度の測定結果の図を示している。経過時間の順に（遠心モジュールＮｏ，検出波長，経過時間（０．５分ごとの回数））＝（１，１，０），（１，２，０），（２，１，０），（２，２，０），…・，（５，１，１），（５，２，１），（６，１，１），（６，２，１），…・の順番に検出信号強度が得られる。
【００４４】
図１０ａ（ｂ）は任意の遠心モジュールの信号のみを抽出したものであり、時間変化を示す。Ｉ（λ１１，λ１２，ｔ）は蛍光波長成分、Ｉ（λ１１，λ１１，ｔ）は励起光波長成分の強度を示す。図１０ａ（ｂ）は正常に測定される場合の変化で、時間とともに増幅反応が起き、蛍光が増大する。その際、励起光波長成分の強度はほとんど変化せず、閾値を越えることもなかった。閾値は正常な状態での励起光波長成分の強度測定を約１０回行い、その平均値＋−６σとした。この値は、測定系によって変動するので、条件を変える場合はあらかじめ決定する必要がある。
【００４５】
図１０ｂ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は測定値が異常の場合の光検出結果の時間経過を示す。図１０ｂ（ａ）は試料液が加温により、図１０ｂ（ａ）の右に図示したような現象が起こって、内部または容器内壁に気泡が発生した場合、または散乱体となる塵がはいってきた場合の結果に相当する。蛍光波長成分の変化はあまり違いはないが、励起光波長成分の強度が揺らいでおり、閾値を越えている状態である。図１０ｂ（ｂ）は気泡などの散乱体が極端に多くなった場合であり、蛍光波長成分も異常に変化してしまう。図１０ｂ（ｃ）は別の異常例である。図１０ｂ（ｃ）の右に図示したように、光検出領域（抽出／検出ポート）部内における測定溶液の局在状態が変わった場合の変化の１例である。
【００４６】
このように測定溶液中の散乱体の形成を励起光波長成分の強度で検知することができる。これらは、反応そのものはどれも同じであり、本来同じ結果のものであるが、従来のように、目的の蛍光体の波長成分のみ測定すると、図１０ｂ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のＩ（λ１１，λ１２，ｔ）の図のように、強度つまり核酸濃度が異なるという結果になる場合がある。励起光波長成分の強度を同時にモニタすることによって、反応液の異常を検知でき、間違った結果をだすのを防ぐことが出来、検出精度を高めることができる。
【００４７】
なお、水滴が形成されてしまう場合、反応液量が減少することになり、反応試薬濃度の上昇を引き起こす。この場合、増幅反応の阻害要因になる可能性がある。本例では、このような異常も検知できる。また、遠心モジュールデバイスに歪み、傷などの不具合があった場合でも、傷によって励起光波長成分の強度が大きくなることから、同様に検知可能である。
【００４８】
本例の使用プローブは１種類であるが、複数種類であっても同様に実現できる。特に励起波長が１種類で、目的の蛍光体が複数の場合には、まったく同じ構成で実現できる。図１０ｃ（ａ）には別の異常例である。散乱光強度Ｉ（λ１１，λ１１，ｔ）が図のように揺らいでおり、その影響が蛍光強度Ｉ（λ１１，λ１２，ｔ）が出ており、Ｉ（λ１１，λ１１，ｔ）が大きくなるに合わせてＩ（λ１１，λ１２，ｔ）が増大する。Ｉ（λ１１，λ１２，ｔ）に対するＩ（λ１１，λ１１，ｔ）の影響がほぼ一定であるため、これを補正することで、図１０ｃ（ｂ）のようにＩ（λ１１，λ１１，ｔ）の影響を除いた蛍光強度のみの部分を算定することができ、正確な測定が可能になる。
【００４９】
図２１は、測定中におけるコントローラＰＣ１９の測定画面の概略である。６個の遠心モジュールをセットして測定したときの場合の一例である。各遠心モジュール毎に表示ウィンドウが割り当てられ、蛍光強度変化についての光検出結果の時間波形（図１０ａ（ｂ），図１０ｂ，図１０ｃ（ａ）と同様の波形）及び遠心モジュール毎の温度制御状態などの測定結果がリアルタイムに（Ａ）領域に表示される（表示波形の種類はユーザが選べるようになっている）。
【００５０】
各表示ウィンドウの下部（Ｂ）に各情報表示ウィンドウがあり、モジュール番号、制御温度、実温度などの表示を行う。また、装置全体の状態については別ウィンドウにて、経過時間、サンプル情報、回転数、ステップ数などの情報を表示する。表示ウィンドウ内の表示データは、図にあるような蛍光強度結果の場合以外に、モジュールの温度経過（制御結果）の履歴なども切り替えて表示させることができる。図１０ｂ（ａ）−（ｃ）のような結果の場合、該当するモジュールの表示ウィンドウ内に異常状態を示す「測定異常」「試料液異常」等のアラートメッセージを表示させる。また、全モジュールが異常の場合、測定を中断するか、継続するかのメッセージウィンドウを表示し、ユーザに判断させる機能も有する。また、図１０ｃ（ａ）に該当している場合、「補正実行？」のメッセージボックスを点滅させ、ユーザ判断を促すようにする。また、装置全体の情報に関しても（Ｃ）領域に表示する。
【００５１】
なお、画面表示以外に、結果をプリンタなどで印刷する場合、測定リストの該当試料の行に」「試料液異常」等のコメントを追加して出力する。図１０ｃ（ａ）に該当する場合には、「強度補正済」とのコメントをつけた上で補正された強度にもとづく結果を出力する。
〔実施例２〕
図１１は、生体試料成分検出法を使った分析装置の別の光学検出部３９の構成図である。蛍光検出の方法は図４と基本的には同様である。分光器とラインセンサに代えて光検出器として光電子増倍管４０を使用して光強度を検出し、ＡＤ変換器４１で光電子増倍管の信号を増幅しＡＤ変換し、制御ユニット３２に送られる。蛍光の分光を蛍光測定用カットフィルタ２４ａ及び２４ｂで行うため、このフィルタは通常の蛍光検出用の特性を有するものとし、励起光を可能な限り透過させないような特性のフィルタとする。実施例１で示した散乱光などの検出は、別光学系にて行う。図のように、遠心モジュールの上部に光源として発光ダイオード（ＬＥＤ）４２を配置し、その光をレンズ４３で集光し、散乱光などはレンズ４４で集めホトダイオード４５で検出し、制御ユニット３２に送る方式としている。
【００５２】
散乱光モニタは位置あわせを厳密に行うことは、必ずしも必要ないので、上面から直接検出することで観測領域を広く取ることができ、広い範囲での異常を検地することができる。また、必ずしも励起波長と同一である必要がないので、測定しやすい波長に容易に設定できる。分光もいらないので、調整が簡単であり、上記のように簡便に構築できる。また、散乱光測定と目的の成分の光検出を別の光学系で行う構成にすれば、蛍光のみでなく、例えば化学発光での測定にも転用でき、応用が広がる。
【００５３】
図１２は本実施例での検出工程手順のフロー図である。実施例１の手順に対してＬＥＤの光照射関連の部分が追加されている。光学系が２種存在するため、それぞれの光が互いに影響し合わないようにするため、光電子増倍管での測定の前にＬＥＤを遮断する工程、ＬＥＤ測定の前に光源２０からの光を遮蔽する工程を追加する。
〔実施例３〕
図１３は、生体試料成分検出法を使った分析装置に関する別の光学検出部の構成図である。２種の蛍光体を使う場合、それぞれの蛍光体を独立して検出する光検出ユニットを設けている。光検出ユニット４６は、光ファイバ４７、レンズ４８を介して、ある遠心モジュール内の光検出領域（抽出／検出ポート）部を照射・検出する。別の光検出ユニット４９は、光ファイバ５０、レンズ５１を介して、別の遠心モジュール内の光検出領域（抽出／検出ポート）部を照射・検出する。図１４、図１５は、光検出ユニット４６、４９の構成図を示す。光検出ユニット４６では蛍光体ＦＡＭに対応し、励起光源６０として中心波長４７５ｎｍの青色ＬＥＤを使用する。
【００５４】
ＬＥＤ光をレンズ６１、励起光照明用単色化フィルタ６２、ダイクロイックミラーブロック６３、対物レンズ６５を通して光ファイバ４７（ＮＡ＝０．２２、コア径４００μｍ）に導入する。光ファイバで受光された蛍光などは、再び対物レンズ６５でコリメートし、ダイクロイックミラーブロック６３、蛍光測定用カットフィルタ６４で必要な光成分を選別し、レンズ６６により集光し、分光器６７とＣＣＤラインセンサ６８を使用する。波長ごとに分割された光強度が計測され、そのデータが制御ユニット３２に送られる。
【００５５】
光検出ユニット４９では蛍光体ＲＯＸに対応し、励起光源７０として中心波長５５０ｎｍの緑色ＬＥＤを使用する。ＬＥＤ光をレンズ７１、励起光照明用単色化フィルタ７２、ダイクロイックミラーブロック７３、対物レンズ７５を通して光ファイバ５０（ＮＡ＝０．２２、コア径４００μｍ）に導入する。光ファイバで受光された蛍光などは、再び対物レンズ７５でコリメートし、ダイクロイックミラーブロック７３、蛍光測定用カットフィルタ７４で必要な光成分を選別し、レンズ７６により集光し、分光器７７とＣＣＤラインセンサ７８を使用する。波長ごとに分割された光強度が計測され、そのデータが制御ユニット３２に送られる。
【００５６】
散乱光の測定は実施例１と同様に行われる。本例の場合、複数の蛍光体を検出する際、フィルタ切換えによる時間ロスを少なくすることができ、Ｓ／Ｎのよい測定が可能になる。また、フィルタ切換えが不要のため、遠心モジュールのホルダ１２を一定速度で回転させながら、所定の位置に戻ってきたときに光検出するという連続測定が可能になり、回転と停止を繰り返す方式に比べ、動作が容易で、機械的に安定な測定が可能になる。
〔実施例４〕
測定溶液の状態を、光の散乱ではなく、光の吸収で行う方式について説明する。増幅反応検出用の試薬に蛍光ラベルとは別であり、蛍光測定に影響のない色素溶液を添加して増幅反応を上記と同様に実施し、測定する。図１６は、生体試料成分検出法を使った分析装置における別の光学検出部の構成図である。１種類の蛍光体を使う場合の構成図である。光検出ユニット３９は、実施例２と同じ構造のものを使用する。
【００５７】
光ファイバ２６、レンズ２８を介して、ある遠心モジュール１３内の光検出領域（抽出／検出ポート）部を照射し、実施例２と同様にして蛍光検出する。さらに、別の光源ユニット８０、レンズ８２、光ファイバ８３、光検出ユニット８４を用意し、別の位置にある遠心モジュール内の光検出領域（抽出／検出ポート）部の情報を取得する。図１７は光検出ユニットの構成図である。光源ユニット８０はランプ８５の光をレンズ８６と単色フィルタ８７、スリット８８で細くコリメートした光束を形成し、遠心モジュール内の光検出領域（抽出／検出ポート）部内の測定溶液に照射し、その透過光をレンズ８２で集光し、光ファイバを介して、光検出ユニット８４に導く。更にレンズ８９、ＮＤフィルタ９０を介して透過光強度を光検出器で検出し、ＡＤ変換して制御ユニットに送られる。
【００５８】
単色フィルタの波長は、添加した色素の吸収極大を示す波長が望ましいが、吸収のある波長であれば特に限定されない。これにより、蒸発などにより液量が少なくなったり、液が移動したりすれば、透過光強度が増大する。また気泡などができれば、散乱により透過光強度が減少する。このように透過光の強度変化をモニタすることによって液の状態が把握でき、異常を検知することができる。
【００５９】
以上の操作で得られる光検出結果の例を示す。図１８は任意の遠心モジュールの信号のみを抽出したものであり、時間変化を示す。Ｉ（λ１１，λ１２，ｔ）は目的とする蛍光波長成分、Ｉ（λ３１，λ３１，ｔ）は測定溶液の透過光強度を示す。図１８（ｂ）は正常に測定される場合の変化で、時間とともに増幅反応が起き、蛍光が増大する。その際、透過光強度はほとんど変化しない。これに対し、図１８（ａ）は測定値が異常の場合の光検出結果の時間経過を示す。
【００６０】
増幅反応の途中で透過光強度が増大し、測定溶液が移動し、液体の厚さが変わってしまったことを示す。その結果、蛍光強度が見かけ上、減少するように変化する。このように、透過光強度を同時にモニタすることによって、反応液の異常を検知でき、間違った結果をだすのを防ぐことが出来、検出精度を高めることができる。特に液量を直接モニタ・定量可能であり正確な判断ができる。図１８（ｃ）は図１８（ａ）の異常状態を説明するもので、遠心力により、ポート内の液が左図のように片寄っている状態が、測定の途中でポートの底部に落ちてしまい、測定条件が変わってしまった場合を示す。
〔実施例５〕
ＤＮＡマイクロアレイへの蛍光測定の場合について説明する。図１９は本実施例の蛍光測定装置の構成図を示す。実施例１と同様に、レーザ光源や水銀ランプ等の励起光源１１１の光をレンズ１１２、励起光照明用単色化フィルタ１１３、ダイクロイックミラーブロック１１４、対物レンズ１１５を通して、ＸＹＺステージ１４０に保持したＤＮＡマイクロアレイ１４１に照射する。生じる蛍光は、再び対物レンズ１１５で集光し、ダイクロイックミラーブロック１１４、蛍光測定用カットフィルタ１１６を通して分光器１１７に入射させる。
【００６１】
分光器１１７に入った光は分光されＣＣＤラインセンサ１１８にて検出され、その強度がデータ処理ユニット１１９に送られ処理される。ＤＮＡマイクロアレイ１４１のスキャンはＸＹＺステージ１４０で行う。励起光をスキャンしてもよい。また、２次元カメラで検出することも可能である。その場合、蛍光測定用カットフィルタ１１６、分光器１１７、ＣＣＤラインセンサ１１８の部分が図２０のように変更される。励起波長成分検出用フィルタ１４２、蛍光体波長成分測定用フィルタ１４３を保持するフィルタチェンジャー１４４と２次元冷却ＣＣＤカメラ１４５に変更し、均一照明（図示無し）されたＤＮＡマイクロアレイ１４１の像を２種類のフィルタで交互に検出し、画素ごとに励起波長成分の強度を判定すればよい。
【００６２】
本実施例では、例えば、マイクロアレイの基板に傷などがあった場合、実施例１と同様の効果が得られる。また、マイクロアレイでの蛍光測定では、ゴミの付着が大きな問題となる場合がある。ゴミの付着している部分の蛍光強度は正確な値にならないので、一般的には、測定値からその部分の信号を除去している。ゴミの部分の信号強度の分布と、ゴミのない部分の信号強度の分布が統計的に区別がつくため、除去することが可能になる。
【００６３】
しかし、マイクロアレイのスポットが１０ミクロン程度と小さくなった場合、スポット内の画素数がすくなくなり、信号の区別ができなくなってしまう。この場合でも、本実施例では、励起波長成分の強度によって、異常画素を判断することが出来、測定精度を高めることができる。
【００６４】
〔実施例６〕
測定溶液の状態を、複数の位置で検出して判定する方式について説明する。実施例４と同じように増幅反応検出用の試薬に蛍光ラベルとは別で、蛍光測定に影響のない色素溶液を添加しておこなう。散乱の検出でも同様に実施可能である。
【００６５】
図２２は、分析装置の別の光学検出部の構成図である。蛍光検出のための光検出ユニット３９は、実施例４と同じ構造のものを使用する。光ファイバ２６、レンズ２８を介して、ある遠心モジュール１３内の光検出領域（抽出／検出ポート）部を照射し、実施例４と同様にして蛍光検出する。
【００６６】
さらに、遠心モジュールの光検出領域部３内の試料液５の状態を検知するため、光源ユニット１５０及び光検知ユニット１５１を設ける。図では、光学ユニットの配置の関係で、蛍光検出時の遠心モジュールの隣の遠心モジュールの位置で検知を行うようにしている。保持ディスク１２を回転させて全ての遠心モジュールを順番に測定するため、どの位置で行っても問題は無い。蛍光強度の測定結果、試料液の状態検知結果と、遠心モジュールの番号を対応させればよいので、どの位置で測定しても構わない。
【００６７】
図２３に光源ユニット１５０と検知ユニット１５１の構成図を示す。光源ユニット１５０は、ランプ１５２、ピンホール１５３、レンズ１５４、単色フィルタ１５５、絞り１５６からなり、遠心モジュールの光検出領域部３の大きさまたはそれよりやや太い大きさにコリメートした単色光を形成し、光検出領域部３に照射する。
【００６８】
光検出領域部内の測定溶液５等を通過する光を検知ユニット１５１で受光する。つまり、その透過光を、絞り１５７、単色フィルタ１５８、２次元エリアセンサ１５９で検出し、ＡＤ変換して制御ユニットに送られる。
【００６９】
単色フィルタの波長は、添加した色素の吸収極大を示す波長が望ましいが、吸収のある波長であれば特に限定されない。蒸発などにより液量が少なくなったり、液が移動したりすれば、透過光強度が増大する。また気泡などができれば、散乱により透過光強度が減少する。このように透過光の強度変化をモニタすることによって液の状態が把握でき、異常を検知することができる。
【００７０】
本構造により、光検出領域部３内の任意の位置における光強度が検出され、その位置の透過度がわかり、液量が推定される。このため、光検出領域部３内の液の分布が判定でき、液の偏り、また、液の蒸発などによる液量の減少が判定することができる。液量の減少の場合、実施例１に記載したようにコントローラＰＣの測定画面に「液量異常」のアラートメッセージを表示させることで、反応液の異常を検知でき、間違った結果をだすのを防ぐことが出来、検出精度を高めることができる。特に液量を直接モニタ・定量可能であり正確な判断ができる。
【００７１】
また、液の偏りに関しても同様の表示を行うことにより、間違った結果をだすのを防ぐことが出来る。
【００７２】
なお、光源ユニット１５０と検知ユニット１５１の構造は、上記の構造のほか、面発光ライトをフィルタで単色化し、遠心モジュールの光検出領域部に結像させて照射し、光検出領域部の像をフィルタを通して２次元エリアセンサに結像させて検出しても同様に実現できる。さらに、２次元エリアセンサに代えて、光検出領域部の必要な位置の像を得るように、ラインセンサ、または複数の光検出器を結像位置に配置しても実現できる。
【００７３】
また、複数の位置での透過光を受光することに代えて、複数の位置での散乱光および、散乱光の角度依存を検出することにより、液の減少、結露の状態を判断することができ、間違った結果を出すのを防ぐことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１ａ】本発明において用いられる分析装置の遠心ディスクの構造を示す斜視図。
【図１ｂ】図１ａのディスクに設置される遠心モジュールの構造を示す平面図。
【図２ａ】実施例１の生体試料成分検出法を使った分析装置の外観斜視図。
【図２ｂ】図２ａの分析装置の側断面図。
【図３】図２ａ，２ｂの分析装置の制御ブロック図。
【図４】光学検出システムの例を示す一部断面概略図。
【図５】実施例１の遠心モジュールへの光照射状態の拡大図。
【図６】実施例１の蛍光測定用カットフィルタの特性を示すグラフ。
【図７】実施例１の分析装置における分析操作手順図。
【図８】実施例１の蛍光検出工程手順図。
【図９】実施例１の遠心モジュールを用いた試薬液等の移動工程を説明するフロー図。
【図１０ａ】実施例１の正常な場合の光検出結果の例を示すグラフ。
【図１０ｂ】実施例１の測定値が異常である場合の光検出結果の例を示すグラフ。
【図１０ｃ】実施例１の測定値が他の異常である場合の光検出結果の例を示すグラフ。
【図１１】実施例２の光学検出部の構成図。
【図１２】実施例２の検出工程フロー図。
【図１３】実施例３の光学検出部の構成図。
【図１４】実施例３の光検出ユニットの構成図。
【図１５】実施例３の他の例による光検出ユニットの構成図。
【図１６】実施例４の光学検出部の構成図。
【図１７】実施例４の光検出ユニットの構成図。
【図１８】実施例４の光検出結果の例を示すグラフ。
【図１９】実施例５の蛍光測定装置の構成図。
【図２０】実施例５の蛍光測定装置の別の主要部の構成図。
【図２１】実施例１の測定の表示画面例。
【図２２】実施例６の光学検出部の概略構成図。
【図２３】実施例６の光源ユニット及び検出ユニットの構成図。
【符号の説明】
【００７５】
２…透明フィルム、３…光検出領域、４…ヒータ、５…測定試料液、１０…分析装置、１１…遠心用モータ、１２…保持ディスク、１３…遠心モジュール、１４…ディスク押え蓋、１５…ディスク位置決め用検出器、１６…穿孔ユニット、１７…光学検出光照射・受光部、１８…光学検出ユニット、１９…コントローラＰＣ、２０…励起光源、２１、２２，２２ａ，２２ｂ、６２，１１３…励起光照明用単色化フィルタ、２３，２３ａ，２３ｂ、６３、７３、１１４…ダイクロイックミラーブロック、２４，２４ａ，２４ｂ…蛍光測定用カットフィルタ、２５、６５、７５、１１５…対物レンズ、２６、４７、５０、８３…光ファイバ、２７…ホルダ、２１、２８、２９、４３、４４、４８、５１、６１、６６、６８、７１、７６、８２、８６、８９、１１２、１５４…レンズ、３０、６７、７７，１１７…分光器、３２…制御ユニット、３３…フィルタＢＯＸ切換え器、３４ａ，３４ｂ…フィルタＢＯＸ、３９、４６、４９、８４、１５１…光検出ユニット、３９、４０…光電子増倍管、４１…ＡＤ変換器、４２…発光ダイオード、４５…ホトダイオード、６０、７０，１１１…励起光源、６４、７４、１１６…蛍光測定用カットフィルタ、６７、７７、１１７…分光器、３１、６８、７８、１１８…ＣＣＤラインセンサ、７２、７４、１１３…蛍光測定用カットフィルタ、８０、１５０…光源ユニット、８５、１５２…ランプ、８７、１５５，１５８…単色フィルタ、８８…スリット、９０…ＮＤフィルタ、１１９…データ処理ユニット、１４０…ＸＹＺステージ、１４１…ＤＮＡマイクロアレイ、１４２…励起波長成分検出用フィルタ、１４３…蛍光体波長成分測定用フィルタ、１４４…フィルタチェンジャー、１４５…２次元冷却ＣＣＤカメラ、１５３…ピンホール、１５６、１５７…絞り、１５９…２次元エリアセンサ、３０２…ＣＰＵ、３０３…モータ制御部、３０４…温度制御部、３０５…穿孔制御部、３０６…光検出制御部。
【図１ａ】
2005300292.tif 000003
【図１ｂ】
2005300292.tif 000004
【図２ａ】
2005300292.tif 000005
【図２ｂ】
2005300292.tif 000006
【図３】
2005300292.tif 000007
【図４】
2005300292.tif 000008
【図５】
2005300292.tif 000009
【図６】
2005300292.tif 000010
【図７】
2005300292.tif 000011
【図８】
2005300292.tif 000012
【図９】
2005300292.tif 000013
【図１０ａ】
2005300292.tif 000014
【図１０ｂ】
2005300292.tif 000015
【図１０ｃ】
2005300292.tif 000016
【図１１】
2005300292.tif 000017
【図１２】
2005300292.tif 000018
【図１３】
2005300292.tif 000019
【図１４】
2005300292.tif 000020
【図１５】
2005300292.tif 000021
【図１６】
2005300292.tif 000022
【図１７】
2005300292.tif 000023
【図１８】
2005300292.tif 000024
【図１９】
2005300292.tif 000025
【図２０】
2005300292.tif 000026
【図２１】
2005300292.tif 000027
【図２２】
2005300292.tif 000028
【図２３】
2005300292.tif 000029