(57)【要約】【課題】  励起光を干渉させて回折格子を形成し、プローブ光を回折させて物性を測定する測定装置において、調整作業が容易な測定装置を提供する。【解決手段】  光学顕微鏡本体２１と、２本の励起光Ｅ１、Ｅ２がそれぞれの励起光Ｅ１、Ｅ２が対物レンズ３２の異なる周縁部分を通過するようにして対物レンズ通過後に屈折するようにし、さらに屈折した２本の励起光Ｅ１、Ｅ２が測定点で交差するようにして干渉縞を生じさせることにより回折格子を誘起するようにした励起光入射光学系と、プローブ光Ｐが対物レンズ３２の中央部分を通過するようにし、さらに対物レンズ通過後にプローブ光Ｐが測定点を通過するようにしたプローブ光入射光学系と、測定点を通過するプローブ光Ｐが回折格子によって回折されることにより得られる回折光を検出する検出器とを備え、回折光により試料の物性測定を行うことができるようにする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを用いて測定点近傍を光学的に観察する光学顕微鏡本体と、
２本の励起光が対物レンズの光軸に平行に入射するとともにそれぞれの励起光が対物レンズの異なる周縁部分を通過するようにして対物レンズ通過後に屈折するようにし、さらに屈折した２本の励起光が測定点で交差するようにして測定点近傍に干渉縞を生じさせることにより回折格子を誘起するようにした励起光入射光学系と、
プローブ光が対物レンズの光軸に平行に入射するとともに対物レンズの中央部分を通過するようにし、さらに対物レンズ通過後にプローブ光が測定点を通過するようにしたプローブ光入射光学系と、
測定点を通過するプローブ光が回折格子によって回折されることにより得られる回折光を検出する検出器とを備えたことを特徴とする光学顕微鏡測定装置。
【請求項２】
励起光入射光学系は２本の励起光が測定点で全反射するように調整されることを特徴とする請求項１に記載の光学顕微鏡測定装置。
【請求項３】
測定点を二次元的に走査する走査部をさらに備えたことを特徴とする請求項１記載の光学顕微鏡測定装置。
【請求項４】
励起光とプローブ光が、一つの光源からの出射光を光路分割部により分割することにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の光学顕微鏡測定装置。
【請求項５】
少なくとも励起光入射光学系またはプローブ光入射光学系のいずれかに入射光の光路を調整する光路調整部をさらに備えたことを特徴とする請求項に1記載の光学顕微鏡測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小領域の測定を行う光学顕微鏡を応用した光学顕微鏡測定装置に関し、さらに詳細には試料に２本の励起光を交差するように照射してこれらの光により誘起された屈折率分布により試料表面に回折格子を形成し、この回折格子により得られる回折光から試料の物性を測定する光学顕微鏡測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に２本の励起光を交差するように入射すると、光の干渉効果により試料表面に明暗部分を有する干渉縞を作ることができる。この明と暗の部分では光の強度が異なることから、試料面に干渉縞を反映した温度分布が生じ、さらに温度分布に起因して干渉縞を反映した屈折率分布が生じる。この干渉縞を反映した屈折率分布は入射光に対して回折格子を形成することになる。
【０００３】
この現象を利用して２本の交差する光により誘起された回折格子を用いて試料の顕微測定を行う技術が開示されている。（非特許文献１参照）。
この方法は、光の吸収のみを利用した顕微測定技術であり、従来の光学顕微鏡で慣用されているような蛍光ラベル化処理をするまでもなく、それと同様の高感度な測定が可能であり、新たな測定技術として新市場を形成することが期待されている。
【０００４】
図４は、従来から用いられている回折格子を利用した顕微測定技術の概略構成を示す図である。
レーザー光Ｌは、ガラス板４により反射光と透過光に分割される。このうち反射光はプローブ光２となり、透過光は励起光１となる。ガラス板４を透過した励起光１は、さらにビームスプリッター３で二つの光路に分割され、励起光１ａ、１ｂとなる。さらに各励起光１ａ、１ｂはそれぞれ平面ミラー１２ａ、１２ｂにより光路が調整された上で、凸レンズ９ａ、９ｂにより試料７上の一点で交差するようにして集光される。
【０００５】
このように二本の励起光１ａ、１ｂが試料面で交差することにより、励起光１ａ、１ｂは干渉し、試料面上に強度分布（干渉縞）が形成される。
試料表面に到達した２本の励起光１ａ、１ｂは、試料７により吸収される（２本の光が全反射する場合は、試料内に滲み出したエバネッセント波が吸収される）。このとき光が強い部分（干渉縞の明の部分）は光が弱い部分（干渉縞の暗の部分）よりも多くの光が吸収されるため、試料７には光の強度分布すなわち干渉縞模様に対応した温度分布が形成される。
【０００６】
そして光吸収による温度上昇に起因して試料７の屈折率が縞状に変化したり、試料７が膨張してその形状が縞状に変化したりするため、この縞状分布を反映した回折格子が形成されることになる。
【０００７】
一方、プローブ光２は、プリズム５を通過した後、平面ミラー１３により光路が調整され、さらにλ／２波長板６により偏光面が９０度回転させらせた上で、励起光１ａ、１ｂによって誘起された回折格子部分を通過する。なお、プローブ光２の偏光面を回転させているのは、励起光１とプローブ光２とが干渉するのを避けるためである。
この結果、プローブ光２は回折格子によって回折され、回折光１１が生成される。この回折光１１を光検出器１０により検出することで試料の物性を測定する。
【０００８】
また、試料７が載置されるステージ８を二次元的に走査することにより、試料上の各点での信号強度分布が測定される。この測定結果をマッピングすることにより試料の二次元像を得ることができる。
【０００９】
また、試料７に誘起された回折格子は、時間とともに伝播消滅していく。この伝播消滅の速さは、試料７の表面弾性に依存するので、この過程を時間分解測定し、回折格子の伝播・消滅の速度を測定することにより、表面弾性などの物性を測定することができる。
【００１０】
また、上述した文献（非特許文献１）では、励起光およびプローブ光の光源にパルスレーザーを用いるとともに、プリズム５を光路方向に沿って動かすことにより遅延光路を形成するようにし、励起光を先に試料に到達させて回折格子が生成してから、任意の遅れ時間後にプローブ光が到達するようにして、その伝播・消滅の速度定数を評価し、二次元像を得ている（過渡回折測定）。
【非特許文献１】Harata Akira, Tsuguo Sawada, Applied Physics Letters, 1991, 58, 1839-1841.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述した回折格子を利用した顕微測定法では、測定に際して、励起光、プローブ光を試料界面に合わせたり、試料上の測定しようとする位置に合わせたりする調整を行う必要がある。この調整を行うとき、測定点付近の微細な様子を実際に光学顕微鏡で観察しながら調整を行うことが望ましい。
しかしながら、測定点付近を光学顕微鏡で観察できるようにするためには、光学顕微鏡の対物レンズを、プローブ光や励起光が通過する位置に置くようにする必要がある。したがって、以下のようないくつかの課題を有していた。
【００１２】
回折格子を利用した顕微測定の測定光学系（以下回折測定光学系という）と光学顕微鏡の光学系とを、1台の装置上に搭載しようとしても、試料の直上付近に回折測定光学系に使用する３つのレンズと光学顕微鏡の対物レンズとを置かなければならず、物理的にこれら２つの光学系を同じ位置に同時に置くことができないことになる。
もし２つの光学系を搭載しようとするならば、片方を試料の直上から退避させた状態で他方を試料の直上に置くことができる退避機構を設ける必要がある。そのため、たとえ光学顕微鏡光学系を搭載したとしても、回折測定光学系の調整作業を光学顕微鏡下で行うことができなかった。
したがって、２本の励起光とプローブ光とを試料上の一点で交差させ、かつ測定しようとする位置に合わせる調整作業には顕微鏡が利用できず、肉眼による目視で行わなければならず、困難な作業となっていた。
【００１３】
また、回折測定光学系は試料付近に３枚のレンズを置かなければならない。これら３枚のレンズが互いに接触しないように配置するには、試料からある程度離れた位置に配置せざるを得ない。そのため、高開口数のレンズを使用することができず、解像度を上げることが困難であった。
また、３枚のレンズを試料の直上で並列に配置することになるため、装置が大型化することとなっていた。
【００１４】
また、光学顕微鏡光学系を搭載したとしても、回折測定光学系を用いるときは上述したように光学顕微鏡光学系を退避させておくこととなり、両者の像を同時に取得できないため、回折測定光学系による測定に光学顕微鏡像の測定を利用することが十分ではなかった。
【００１５】
そこで、本発明は上記のような課題を解決し、光学顕微鏡による位置調整と回折測定光学系による位置調整とを関連して行うことができ、調整作業を簡単に行うことができる光学顕微鏡測定装置を提供することを目的とする。
【００１６】
また、従来の光学顕微鏡による界面測定では、感度を上げて測定するために蛍光ラベル化を行うことがあったが、蛍光ラベル化を行わなくても非破壊で感度が高い界面測定が可能である光学顕微鏡測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するためになされた本発明は、対物レンズを用いて測定点近傍を光学的に観察する光学顕微鏡本体と、２本の励起光が対物レンズの光軸に平行に入射するとともにそれぞれの励起光が対物レンズの異なる周縁部分を通過するようにして対物レンズ通過後に屈折するようにし、さらに屈折した２本の励起光が測定点で交差するようにして測定点近傍に干渉縞を生じさせることにより回折格子を誘起するようにした励起光入射光学系と、プローブ光が対物レンズの光軸に平行に入射するとともに対物レンズの中央部分を通過するようにし、さらに対物レンズ通過後にプローブ光が測定点を通過するようにしたプローブ光入射光学系と、測定点を通過するプローブ光が回折格子によって回折されることにより得られる回折光を検出する検出器とを備えるようにしている。
【発明の効果】
【００１８】
この発明によれば、２本の励起光とプローブ光とを、光学顕微鏡本体の対物レンズの光軸に平行になるように入射する。このとき２本の励起光はそれぞれ対物レンズの中央部分を通過させずに周縁部分を別々に通過するようにし、かつ、プローブ光は対物レンズの中央部分から通過するようにし周縁部分は通過しないようにして、３本の光をそれぞれ別々の光路にて試料に入射させる。
２本の励起光は対物レンズを通過した後、大きく屈折して試料界面に斜め入射することとなる。一方、プローブ光は対物レンズの中央部分を通過した後、光軸にほぼ平行にまっすぐ進むようになる。
【００１９】
このような光学系を有する装置において、光学顕微鏡で通常の観察を行う場合の手順で対物レンズのピント合わせをして試料界面の光学像が見えるようにする。すると、光学顕微鏡のピントが合った状態では、２本の励起光は光学顕微鏡の対物レンズの光軸に沿って平行に入射しているので、（色収差が問題とならない対物レンズを用いるかぎり）試料界面上に焦点がくるように調整されていることになる。
【００２０】
また、プローブ光については、対物レンズの中央部分からレンズ光軸に平行に入射するようにしているので、プローブ光は試料界面にほぼ垂直に入射するようになっている。
そして、光学顕微鏡のピントが合った状態では、２つの励起光と同様にプローブ光についても試料界面上に焦点がくるように調整されていることになる。
【００２１】
したがって、光学顕微鏡による目視下で対物レンズのピントを試料界面に合わせることにより、自動的に２本の励起光とプローブ光との焦点が試料界面上にくるようになる。
さらに、光学顕微鏡下で、測定しようとする試料領域が測定点にくるように試料を移動して、所望の測定領域、２本の励起光の各焦点、プローブ光焦点が正確に重なるようにする。
【００２２】
このようにして光学顕微鏡目視下で対物レンズのピントを合わせるだけで、２本の励起光の各焦点、プローブ光焦点を自動的に測定点に合わせることができ、しかも、光学顕微鏡目視下で測定したい試料領域を簡単に測定点に合わせることができるので光学系の調整を容易に行うことができる。
【００２３】
そして、２つの励起光の干渉作用で測定領域に形成された回折格子にプローブ光を入射させることにより、このプローブ光が回折されて回折光が生じる。この回折光信号を検出器により測定することにより、試料の物性を測定することができる。
【００２４】
例えば、回折光信号強度に関連する物性として、吸光度、屈折率温度係数、熱伝導率、弾性率（ヤング率）、キャリア生成・消滅速度等があり、上記構成により、これらの情報を取得することができる。
しかも回折を利用した測定により、蛍光ラベル化等の特別な処理をすることなく試料を高感度に測定することができる。
【００２５】
励起光入射光学系は２本の励起光を測定点で全反射するように調整されるようにしてもよい。
これによれば、２本の励起光が試料界面で全反射されることにより、励起光はエバネッセント波として試料界面から試料内に約１００ｎｍ程度滲み出すようになる。このエバネッセント波は、界面近傍の試料により吸収されるので２本の励起光の干渉により生じる干渉縞を反映した温度分布が試料表面に形成され、回折格子を形成することができる。
すなわち、励起光を試料界面で全反射させた場合にも回折格子を利用した顕微測定を行うことができ、この測定により試料界面のごく近傍の情報を得ることができる。
【００２６】
対物レンズと試料との間は異なる屈折率を有する少なくとも２つ以上の材料層で覆われるとともに、各材料層は試料から離れるにつれて屈折率が高くなるように構成されるようにしてもよい。
これによれば、２本の励起光はそれぞれ各材料層を通過しながら試料界面に対して斜め入射することになるが、対物レンズから試料に向かって進むにつれて各材料層の屈折率が順次小さくなるので各材料層間を通過する際に、励起光の入射角が浅くなるように屈折する。したがって励起光の入射角を順次浅くすることができ、試料界面で全反射条件を満足させることが容易になる。
【００２７】
また、測定点を二次元的に走査する走査部をさらに備えるようにしてもよい。
これによれば、走査部により対物レンズに対する試料の位置を相対的に変化させながら測定を繰り返すことにより、回折光から得られる物性情報の二次元像を得ることができる。
【００２８】
また、励起光とプローブ光が、一つの光源からの出射光を光路分割部により分割することにより形成されるようにしてもよい。
これによれば、光源を一つにすることができ、装置コストを抑えることができる。
【００２９】
また、少なくとも励起光入射光学系またはプローブ光入射光学系のいずれかに入射光の光路を調整する光路調整部をさらに備えてもよい。光路調整部としては具体的にはそれぞれの光学系の光路上にミラーのような光学部品を介在させて、調整機能を持たせるようにすることができる。
これによれば、対物レンズのピントを合わせたときに、２つの励起光の各焦点、プローブ光の焦点が測定点にきていない場合（例えばプローブ光がレンズ中心を通過していない場合や、色収差がある場合）でも、光学顕微鏡目視下において簡単に光路を調整することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明を実施するための形態について図面を用いて説明する。なお、以下に説明する実施形態は一例にすぎず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で変形実施することが可能である。
【００３１】
図１は、本発明の一実施形態である光学顕微鏡測定装置の構成を示す図である。また、図２は図１における励起光学系およびプローブ光学系を説明する拡大図である。
この光学顕微鏡測定装置は、主に、光学顕微鏡本体２１と、回折光を検出する検出器２２と、レーザー光源２３と、レーザー光源２３から出射されるレーザー光Ｌをプローブ光Ｐと励起光Ｅとに分割するためのスプリッタ２４と、励起光Ｅを２つの励起光Ｅ１、Ｅ２とに分割するスプリッタ２５と、プローブ光Ｐの光路を調整するミラー２６と、励起光Ｅ１、Ｅ２の光路を調整するミラー２７と、プローブ光Ｐおよび励起光Ｅ１、Ｅ２の光量を調整する光量調整器２８（例えば直線偏光板）と、プローブ光Ｐの位相を励起光の位相と半波長ずらすための半波長板３８とから構成される。
【００３２】
光学顕微鏡本体２１は、接眼レンズ３１、対物レンズ３２、顕微鏡鏡筒３３、顕微鏡筐体３４、試料を載置するＸＹステージ３５を有しており、接眼レンズ３１と対物レンズ３２との間の光路上にハーフミラー３６が設けられている。
【００３３】
このハーフミラー３６により２つの光路が結合される。すなわち接眼レンズ３１による顕微鏡光学像観察のための顕微鏡光学系の光路と、顕微鏡筐体３４に設けられたポート３７を介して外部から光を入射するための光学系（励起光入射光学系、プローブ光入射光学系）の光路とが結合され、ハーフミラー３６から対物レンズ３２までの光路が重なるようにしている。
【００３４】
ＸＹステージ３５は、対物レンズ３２に対向するように配置され、試料４０を載置した状態で図示しない駆動機構により、二次元的に走査することができるようにしてある。
【００３５】
試料４０はスライドガラス４１上に載置され、試料４０表面にはカバーガラス４２が載置され、さらにその上をオイル４３で覆うようにしてある。
オイル４３は、全反射条件で励起光Ｅ１、Ｅ２を入射させて測定するときに用いる。すなわち、オイル４３は、励起光Ｅ１、Ｅ２を試料界面にできるだけ浅い入射角で入射するようにして全反射条件を満たしやすくするために用いるものであり、屈折率が試料より大きな材料が選ばれる（カバーガラスが載せられる試料は屈折率がカバーガラスの屈折率より小さい場合である）。
【００３６】
ここで、オイル４３、カバーガラス４２、試料４０からなる例で、全反射条件について説明する。オイル、カバーガラス、試料の屈折率をｎｏ、ｎｇ、ｎｓとし、これらの入射角をΘｏ、Θｇ、Θｓとする。スネルの法則により、
ｎｏsinΘｏ＝ｎｇsinΘｇ＝ｎｓsinΘｓ          （１）
の関係が成り立つ。
ここで、全反射するためには、
sinΘｓ=(ｎｏ／ｎｓ)sinΘｏ＞１              （２）
を満たさなければならない。  ここでsinΘｏ＜１であるので、ｎｏ＞ｎｓでなければならないことになる。
【００３７】
一般に、水中にある試料を測定する場合には、水の屈折率より屈折率が高い液体が必要である。そのため、ここで述べたようにオイルを用いるとよい。
なお、オイルの屈折率として現実的な値は１．５程度であるが、オイル・カバーガラス間で全反射しないようにオイルの屈折率＞カバーガラスの屈折率の関係を満たすかぎりは、屈折率は１．５以上でよい。
上記実施例のように励起光を全反射させた場合には試料界面の像を得ることになるが、全反射させずに励起光を試料内に屈折させるようにしても本発明の原理を利用した測定が可能である。この場合は、試料界面からの情報のみならず、深さ方向の情報を含んだ情報が得られることになる。例えば、厚さが１００μｍ程度である細胞を測定する場合には、細胞中を三次元的に測定することができる。この場合可視光を用いて測定する場合の分解能は、横方向に数μｍ、深さ方向に数μｍとなる。
【００３８】
検出器２２には、例えばフォトダイオードが用いられる。なお、検出器２２の前面には励起光カットフィルターを設けるようにして回折光を選択的に検出できるようにしてある。
また、検出器２２は図示しない駆動機構により、測定点に対する角度を可変にしてあり、任意の回折角を測定することができるようにしてある。駆動機構に代わりに多数のフォトダイオードが空間的に配置されているフォトダイオードアレイを用いることにより、任意の回折角での測定ができるようにしてもよい。
【００３９】
光源２３には、例えばパレス的にレーザーを照射する場合にはＹＡＧレーザーが用いられる。連続照射する場合には、アルゴンレーザーが用いられる。
光源２３から出射されたレーザー光Ｌはスプリッタ２４でプローブ光Ｐと励起光Ｅとに分割されるが、このうちプローブ光Ｐはミラー２６で光路が調整され、さらに光量調整器２８により光量が調整されて、ポート３７から顕微鏡本体２１内に入り、ハーフミラー３６を介して対物レンズ３２の光軸に沿って平行に進み、対物レンズ３２の中央部分に導かれる。
【００４０】
一方、励起光Ｅはスプリッタ２５によってさらに励起光Ｅ１、Ｅ２に分割され、ミラー２７で光路が調整され、さらに光量調整器２８により光量が調整されて、ポート３７から顕微鏡本体２１に入り、ハーフミラー３６を介して対物レンズ３２の光軸に沿って平行に進み、対物レンズ３２の周縁部分に導かれる。
【００４１】
対物レンズ３２の周縁部分を通過した２本の励起光Ｅ１、Ｅ２の光路は、図２に示すように大きく屈折し、試料３０面に対して浅い角度で斜めに入射する。
このとき光路上にオイル４３、カバーガラス４２を置くことにより、励起光Ｅ１、Ｅ２を全反射させることもできる。全反射させるか、試料側に屈折させるかは測定目的により選択すればよい。
【００４２】
そして対物レンズ３２の中央部分を垂直に通過したプローブ光Ｐは、図２に示すように試料３０内をまっすぐ垂直に通過するようにする。このとき試料４０に形成されている回折格子によりプローブ光Ｐは一部が回折光となる。これを検出器２２により検出する。
【００４３】
次に、上記光学顕微鏡測定装置による回折格子を利用した測定を行う際の調整作業について説明する。
上述したように、試料４０はカバーガラス４２とオイル４３とに覆われた状態でＸＹステージ３５上にセットされる。
【００４４】
接眼レンズ３１を覗き、試料４０の光学顕微鏡像を観察しながら対物レンズ３２を調整することにより試料４０とカバーガラス４２との界面にピントを合わせて試料４０の光学顕微鏡像がはっきり見えるようにする。これにより対物レンズ１２の焦点が試料４０の界面にくることになる。
【００４５】
続いて、ポート３７から励起光Ｅ１、Ｅ２を対物レンズ３２の光軸に平行に入射させる。すでに対物レンズ３２のピントが合っているので、励起光Ｅ１、Ｅ２も試料界面上に焦点を結ぶようになる。また、プローブ光Ｐも試料界面に焦点を結ぶようになる。
【００４６】
なお、プローブ光Ｐや励起光Ｅ１、Ｅ２が光軸と平行でなかったり、プローブ光がレンズ中心からずれていたりして、試料４０とカバーガラス４３との界面上で励起光Ｅ１、Ｅ２の焦点とプローブ光Ｐの焦点とが重ならない場合には、これらが一致するようにミラー２６、ミラー２７の両方または片方を調節する。すなわち、はじめからプローブ光Ｐの光路が対物レンズ３２の光軸に完全に一致し、励起光Ｅ１、Ｅ２やプローブ光Ｐが対物レンズ３２の光軸に完全に平行であるときは試料４０とカバーガラス４２との界面に対物レンズ３２のピントを合わせるだけで試料界面上に励起光Ｅ１、Ｅ２、プローブ光Ｐの焦点が自動的にくることになるが、そうでない場合には、ミラー２６、２７で調整するようにしてこれらの焦点が重なるようにする。
【００４７】
さらに、試料４０上の実際に測定しようとする位置が、励起光Ｅ１、Ｅ２の焦点、およびプローブ光Ｐの中心にくるようにステージ３５を調整する。
以上のような簡単な調整作業で、試料界面の測定点に３本の光の焦点を合わせることができる。
【００４８】
そして、ＸＹステージ３５を二次元的に走査して試料４０の各点での回折光を測定し、マッピングするようにすれば回折光から得られる物性情報を反映した二次元像を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
この発明は、２本の励起光を干渉させることによって形成される回折格子を利用した物性測定を行う測定装置であって、回折格子測定光学系の調整を容易にするためにさらに光学顕微鏡を搭載するようにした光学顕微鏡測定装置を製造する際に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の一実施例である顕微鏡測定装置の構成図。
【図２】図１の励起光光学系、プローブ光光学系の構成を説明する図。
【図３】試料界面における全反射条件を説明する図。
【図４】従来からの回折格子測定光学系を説明する図。
【符号の説明】
【００５１】
２１：光学顕微鏡本体
２２：検出器
２３：レーザー光源
２４、２５：スプリッタ
２６、２７：ミラー（光路調整部）
３１：接眼レンズ
３２：対物レンズ
３５：ＸＹステージ（走査部）
３６：ハーフミラー
４０：試料
４２：カバーガラス
４３：オイル
Ｅ１、Ｅ２：励起光
Ｐ：プローブ光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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