(57)【要約】      （修正有）【課題】真核細胞（特に分裂酵母細胞）のテロメアの長さを調節する方法を提供する。【解決手段】RPA1タンパク質のアミノ酸配列が変異したRPA1変異体を作出するRPA1変異体作出工程と、テロメア反復結合因子（TRF）のアミノ酸配列を変異させるTRF変異工程とを含む真核細胞のテロメアの長さを調整する方法、および分裂酵母の特定の塩基配列からなる遺伝子（rad11遺伝子）を変異させ、分裂酵母rad11変異株を作出するrad11変異株作出工程と、前記rad11変異株作出工程で作出された分裂酵母rad11変異株の遺伝子のうち特定塩基配列からなる遺伝子（taz1遺伝子）を変異変異させるtaz1遺伝子変異工程とを含む、分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法などに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
RPA1タンパク質のアミノ酸配列が変異したRPA1変異体を作出するRPA1変異体作出工程と、
テロメア反復結合因子（TRF）のアミノ酸配列を変異させるTRF変異工程とを含む、
真核細胞のテロメアの長さを調整する方法。
【請求項２】
分裂酵母の配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子（rad11遺伝子）を変異させ、分裂酵母rad11変異株を作出するrad11変異株作出工程と、
前記rad11変異株作出工程で作出された分裂酵母rad11変異株に存在する配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子（taz1遺伝子）を変異させるtaz1遺伝子変異工程とを含む、
分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法。
【請求項３】
前記rad11変異株作出工程で作出された分裂酵母rad11変異株は、Rad11タンパク質の223番目のアミノ酸がチロシンに改変したタンパク質を発現するものである請求項２に記載の分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法。
【請求項４】
前記taz1遺伝子変異工程は、taz1遺伝子、またはtaz1遺伝子の発現領域の少なくとも一部を欠損させることによりtaz1遺伝子の発現を抑制する工程である請求項２、または請求項３に記載の分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法。
【請求項５】
前記taz1遺伝子変異工程は、相同組換えによりtaz1遺伝子領域と、taz1遺伝子領域の少なくとも一部が欠損したDNA断片とを組換える工程であり、
前記taz1遺伝子変異工程において意図する組換えが起きた細胞を選択する選択工程を更に含む、請求項２、または請求項３に記載の分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法。
【請求項６】
分裂酵母の配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子（rad11遺伝子）を変異させ作出される分裂酵母rad11変異株であって、更に配列番号３で示されるtaz1遺伝子を破壊した分裂酵母変異株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞のテロメアの長さを調整する方法などに関し、特に分裂酵母rad11変異株のtaz1遺伝子を破壊することによって、テロメアの長さを調整する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
テロメアは、染色体の末端に位置し、一般に反復配列からなる。テロメアでみられる基本的な構造体を維持する機構は、種を越えて保存されている場合が多いので、ある生物で得られた結果は、他の生物種でも成立する可能性が高い。ヒトなどの真核生物における正常細胞は、細胞が分裂するごとにテロメアが短くなる。そして、テロメアが短くなると、細胞が分裂できなくなり、その細胞が自殺（アポトーシス）する。一方、がん細胞は、細胞分裂をしてもテロメアが短くならないので、無限に増殖できる。これは、テロメアを伸ばす酵素であるテロメアーゼが、がん細胞のテロメアを伸長することによる。したがって、がん細胞のテロメアの長さを制御できれば、がんの治療などテロメア関連疾患の治療に有用であると考えられる。
【０００３】
分裂酵母（シゾサッカロマイセズ・ポンベ：Schizosaccharomyces pombe）は、ヒトの遺伝子と相同性の高い遺伝子を多くもつ真核生物である。したがって、分裂酵母のテロメアの長さを制御できれば、分裂酵母の研究に役立つだけでなく、ヒトのテロメア関連疾患の治療などにも有効である。分裂酵母では、テロメアを維持できなくなると、染色体が融合し環状化して生命を維持する。また、分裂酵母は、テロメアーゼをコードする遺伝子を破壊した場合も、染色体が環状化することが知られている（Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, Weinrich SL, Andrews WH, Lingner J, Harley CB, Cech TR. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.   Science. 1997 Aug 15;277(5328):955-9.）。しかしながら、分裂酵母において、テロメアの長さを制御する方法は、あまり知られていない。
【０００４】
分裂酵母にくらべて出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ：Saccharomyces cerevisiae）では、テロメアに関する研究が進んでいる。出芽酵母では、rfa1遺伝子（出芽酵母の複製タンパク質Aのラージサブユニット（RPA1）をコードする遺伝子）を変異させて得られるrfa1-D228Y株は、テロメアが短くならないこと、及び出芽酵母rfa1-D228Y株のyku70変異を伴った2重変異株では、テロメアが短くなることが知られている（非特許文献１（Smith, J. et. al., Biochimie, 82, pp. 71-78 (2000)）参照）。
【０００５】
一方、分裂酵母では、rad11遺伝子（分裂酵母の複製タンパク質Aのラージサブユニット（RPA1）をコードする遺伝子）を変異させて得られるrad11−D223Y変異株では、分裂酵母の野生株よりもテロメアの長さが短くなることが知られている（非特許文献２（Yuuki Ono, Kazunori Tomita, Akira Matsuura, Takuro Nakagawa, Hisao Masukata, Masahiro Uritani, Takashi Ushimaru, and Masaru Ueno.  A novel allele of fission yeast rad11 that causes defects in DNA repair and telomere length regulation A novel allele of fission yeast rad11 that causes defects in DNA repair and telomere length regulation.  Nucleic Acids Res. 2003  31(24): 7141-7149.）参照）。
【０００６】
また、分裂酵母のテロメア結合タンパク質Taz1をコードするtaz1遺伝子を破壊すると、テロメアが異常に長くなることが知られている（非特許文献３（Cooper JP, Nimmo ER, Allshire RC, Cech TR.  Regulation of telomere length and function by a Myb-domain protein in fission yeast.  Nature. 1997 Feb 20;385(6618):744-747.）参照）。このことから、Taz1タンパク質は、テロメアーゼがテロメアに結合するのを物理的に抑制し、テロメアーゼの機能を阻害すると考えられている。なお、本明細書において、「遺伝子を破壊する」とは、ある遺伝子の塩基配列に変異を加え、その遺伝子の機能が発現しない状態にすることを意味する。
【０００７】
また、マウスTRF1のエクソンを破壊すると、初期胚の段階でマウスが死亡したことから、マウスTRF1は生育に必須であることが示された（非特許文献４（Iwano T, Tachibana M, Reth M, Shinkai Y.  Importance of TRF1 for functional telomere structure.  J Biol Chem. 2003 Oct 14、Karlseder J, Kachatrian L, Takai H, Mercer K, Hingorani S, Jacks T, de Lange T. Targeted deletion reveals an essential function for the telomere length regulator Trf1. Mol Cell Biol. 2003 Sep;23(18):6533-41.）参照）。
【非特許文献１】Smith, J. et. al., Biochimie, 82, pp. 71-78 (2000)
【非特許文献２】Yuuki Ono, Kazunori Tomita, Akira Matsuura, Takuro Nakagawa, Hisao Masukata, Masahiro Uritani, Takashi Ushimaru, and Masaru Ueno.  A novel allele of fission yeast rad11 that causes defects in DNA repair and telomere length regulation A novel allele of fission yeast rad11 that causes defects in DNA repair and telomere length regulation.  Nucleic Acids Res. 2003  31(24): 7141-7149.
【非特許文献３】Cooper JP, Nimmo ER, Allshire RC, Cech TR.  Regulation of telomere length and function by a Myb-domain protein in fission yeast.  Nature. 1997 Feb 20;385(6618):744-747.
【非特許文献４】Iwano T, Tachibana M, Reth M, Shinkai Y.  Importance of TRF1 for functional telomere structure.  J Biol Chem. 2003 Oct 14、Karlseder J, Kachatrian L, Takai H, Mercer K, Hingorani S, Jacks T, de Lange T. Targeted deletion reveals an essential function for the telomere length regulator Trf1. Mol Cell Biol. 2003 Sep;23(18):6533-41.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、真核細胞（特に分裂酵母細胞）のテロメアの長さを調節する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、真核細胞（特に分裂酵母細胞）のテロメアの長さを調節することによりテロメア関連疾患の治療方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、真核細胞（特に分裂酵母細胞）のテロメアの長さを調節することできるテロメア関連疾患の予防・治療剤を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、テロメアの消失した真核細胞（特に分裂酵母細胞）を作出することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
〔１〕上記課題の少なくとも一つ以上を解決するため、本発明の真核細胞のテロメアの長さを調整する方法は、RPA1タンパク質のアミノ酸配列が変異したRPA1変異体を作出するRPA1変異体作出工程と、テロメア反復結合因子（TRF）のアミノ酸配列を変異させるTRF変異工程とを含む真核細胞のテロメアの長さを調整する方法である。
【００１３】
たとえば、本発明は、RPA1変異体を作出し、テロメア反復結合因子をコードする遺伝子を変異させることによりテロメア反復結合因子（TRF）のアミノ酸配列を変異させ、真核細胞のテロメアの長さを調整する。
【００１４】
なお、RPA1タンパク質は、複製タンパク質Aのラージサブユニットである。また、RPA1変異体とは、RPA1タンパク質のアミノ酸配列が少なくともひとつ以上（好ましくは１または数個）を変異（置換、欠失、付加、挿入）したものを意味する。なお、本明細書では、テロメア反復結合因子をコードする遺伝子を、「trf遺伝子」ともよぶ。すなわち、ヒトなどでは、テロメア反復結合因子としてTRF1タンパク質、およびTRF2タンパク質が知られており、TRF変異工程ではこれらのうち少なくとも一方のアミノ酸配列を変異させる。また、分裂酵母では、テロメア反復結合因子としてTaz1タンパク質が知られているので、TRF変異工程では分裂酵母のTaz1タンパク質を変異させる。
【００１５】
後述の実施例で明らかにされたように、特に分裂酵母においては、RPA1変異体（rad11変異株）のtaz1遺伝子（配列番号３）を破壊するとテロメアが消失した。したがって、上記のテロメア長の調整方法は、真核細胞（特に分裂酵母）のテロメア長を効果的に制御できると考えられる。
【００１６】
また、rad11遺伝子（配列番号１）及びtaz1遺伝子（配列番号３）の相同遺伝子は、ヒトがん細胞にも見られる。したがって、上記のテロメア長の調整方法は、ヒトがん細胞の治療方法、治療剤の開発に有効に用いることができる。
【００１７】
〔２〕  上記課題の少なくとも一つ以上を解決するため、本発明の分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法は、分裂酵母の配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子（rad11遺伝子）を変異させ、分裂酵母rad11変異株を作出するrad11変異株作出工程と、前記rad11変異株作出工程で作出された分裂酵母rad11変異株を用いて、さらにrad11変異株の配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子（taz1遺伝子）を変異させるtaz1遺伝子変異工程とを含む、分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法である。
【００１８】
なお、分裂酵母rad11遺伝子（配列番号１）は、RPA1タンパク質であるRad11タンパク質（配列番号２）をコードする遺伝子である。また、分裂酵母taz1遺伝子（配列番号３）は、分裂酵母のテロメア反復結合因子（TRF）であるTaz1タンパク質（配列番号４）をコードする遺伝子である。
【００１９】
〔３〕  本発明の分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法は、好ましくは、前記rad11変異株作出工程で作出された分裂酵母rad11変異株は、Rad11タンパク質（配列番号２）の223番目のアミノ酸がチロシンに変異したものである。
【００２０】
〔４〕  本発明の分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法は、好ましくは、前記taz1遺伝子変異工程は、taz1遺伝子、またはtaz1遺伝子の発現領域の少なくとも一部を欠失させることによりtaz1遺伝子の発現を抑制する工程である。ここで、本明細書において、「taz1遺伝子の発現領域」とは、その一部が欠失するとtaz1遺伝子が発現しなくなる領域を意味する。
【００２１】
〔５〕  本発明の分裂酵母のテロメアの長さを調整する方法は、好ましくは、前記taz1遺伝子変異工程は、相同組換えによりtaz1遺伝子領域と、taz1遺伝子領域の少なくとも一部の塩基配列が欠失したDNA断片とを組換える工程であり、前記taz1遺伝子変異工程において意図する組換えが起きた細胞を選択する選択工程を更に含む。ここで、本明細書において、「taz1遺伝子領域」とは、taz1遺伝子が存在する領域を意味する。
【００２２】
〔６〕  上記課題の少なくとも一つ以上を解決するため、本発明の分裂酵母変異株は、分裂酵母の配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子（rad11遺伝子）を変異させ作出される分裂酵母rad11変異株であって、更にtaz1遺伝子が破壊された分裂酵母変異株である。
【００２３】
この分裂酵母２重変異株は、後述の実施例で示されたとおり、テロメアが消失し、染色体が環状化している。したがって、この分裂酵母の２重変異株を用いることで、テロメアの機能を研究でき、それによりテロメア関連疾患の治療方法、および治療剤の開発に有用である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、rad11遺伝子を変異させtaz1遺伝子を変異させるという真核細胞（特に分裂酵母細胞）のテロメアの長さを調節する新たな方法を提供できる。
【００２５】
本発明によれば、真核細胞（特に分裂酵母細胞）のテロメアの長さを調節できるので、テロメア関連疾患の治療方法を提供できる。
【００２６】
本発明によれば、テロメアの消失した真核細胞（特に分裂酵母細胞）を作出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（1.真核細胞のテロメアの長さを調整する方法）
本発明の真核細胞のテロメアの長さを調整する方法（以下、単に「本発明のテロメア長の調整方法」ともいう。）は、RPA1変異体作出工程と、TRF変異工程とを含む。なお、RPA1変異体作出工程は、RPA1変異体（RPA1タンパク質のアミノ酸配列が変異したタンパク質を有する形質変換体）を作出するための工程である。また、TRF変異工程は、trf遺伝子（テロメア反復結合因子（TRF）タンパク質をコードするDNA）を変異させ、TRFのアミノ酸配列を変異するための工程である。
【００２８】
（1.1.RPA1変異体作出工程）
RPA1変異体作出工程は、RPA1変異体（RPA1タンパク質のアミノ酸配列が変異したタンパク質をコードする遺伝子を有する形質変換体）を作出するための工程である。RPA1変異体作出工程は、rpa1遺伝子取得工程と、塩基配列変異工程と、形質変換細胞（変異株）の作出工程とを含む。ここで、rpa1遺伝子取得工程は、RPA1タンパク質をコードするDNA(rpa1遺伝子)を真核細胞から取得するための工程であり、塩基配列変異工程は、rpa1遺伝子の少なくともひとつ以上の塩基配列を変異（改変）させるための工程である。また、形質変換細胞（変異株）の作出工程は、所定のDNAを導入した形質変換細胞（株）を作出するための工程である。
【００２９】
以下、RPAタンパク質（複製タンパク質A）について説明する。RPA（replication protein A）は、DNAに結合し、DNAの複製や、再結合、修復などに関与するタンパク質である。RPAは、複製要素A（RFA）として知られ、ヒトではSSB（一本鎖DNA結合タンパク質：配列番号５）として知られている。RPAは、約70KDaのRPA1、約36kDaのRPA2、約14kDaのRPA3からなる3つのサブユニットからなる（Wold, M. S. (1997) Annu. Rev. Biochem., 66, 61-92.）。このうちラージサブユニットRPA1をコードする遺伝子がrpa1遺伝子である。なお、分裂酵母では、RPA1をコードする遺伝子はrad11遺伝子である。rad11遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示すとおりである。
【００３０】
（1.1.1.rpa1遺伝子取得工程）
rpa1遺伝子取得工程は、rpa1遺伝子を真核細胞から得るための工程である。たとえばrpa1遺伝子を真核生物由来の細胞から調整したゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから、rpa1遺伝子を含むクローンをスクリーニングすることによって、rpa1遺伝子を得ることができる。また、真核生物のゲノムDNAやcDNAなどのDNAを鋳型とするPCRによっても、rpa1遺伝子を得ることができる。
【００３１】
RPA1変異体作出工程（rpa1遺伝子取得工程）において用いられる真核細胞は、真核生物由来の細胞であれば特に限定されず、公知の真核細胞を用いることができる。このような真核生物としては、ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ネナガヒトヨタケ（Coprinus cinereus）、分裂酵母、出芽酵母などが挙げられる。
【００３２】
以下では、PCRによってrpa1遺伝子を取得する場合について説明する。PCRによってrpa1遺伝子を取得する場合、常法に従って、真核細胞からゲノムDNAまたはcDNAを調製すればよい。次いで、得られたゲノムDNAまたはcDNAを鋳型としたPCRを行う。このPCRにおいては、RAP1タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列をコードするDNA、及びＣ末端側のアミノ酸配列をコードするDNAをプライマーとして用いる。次いで、PCRによって増幅した断片を適当なベクターに連結する。好ましくは、ジデオキシ法などの公知の方法やシークエンサーを用いることにより得られたDNAがrpa1遺伝子であることを確認する。
【００３３】
（1.1.2.塩基配列変異工程）
塩基配列変異工程は、rpa1遺伝子の少なくともひとつ以上（好ましくは１から数個(2,3,4,5個)）の塩基配列を変異させ、RPA1タンパク質のアミノ酸配列を少なくともひとつ以上変異させるための工程である。塩基配列変異工程は、たとえばrpa1遺伝子取得工程で得たrap1遺伝子を用い、PCRを利用した部位特異的変異誘発法［西郷薫ら：分子生物学実験プロトコールI、第263頁〜第270頁、丸善、1997］など公知の変異導入PCRにより行うことができる。このようにして、RPA1タンパク質の少なくともひとつ以上のアミノ酸配列が変異したタンパク質をコードするDNA（以下、「変異型rpa1遺伝子」ともいう。）を得ることができる。なお、上記では、RPA1変異体作出工程の後に塩基配列変異工程を行う場合について説明したが、塩基配列変異工程の後にRPA1変異体作出工程を行うことにより2重変異体を作製しても良い。この塩基配列変異工程においては、宝酒造社製のキットなど公知のPCRキットを利用できる。
【００３４】
（1.1.3.形質変換細胞（変異株）の作製工程）
変異型rap1遺伝子を含む組換えベクターを作製し、その組換えベクターを宿主細胞に導入することにより、変異型RPA1タンパク質（RPA1タンパク質の少なくともひとつ以上のアミノ酸配列が変異したタンパク質）を発現する形質変換細胞(変異株)を作製できる。以下では、組換えベクター作製工程と、形質変換細胞（変異株）作製工程について説明する。
【００３５】
（1.1.3.1.組換えベクターの作出）
適当なベクターに変異型rpa1遺伝子を連結(挿入)することにより、組換えベクターを得ることができる。ベクターは、宿主細胞中に導入でき、宿主細胞中で複製できるものであれば特に限定されず、公知のベクターを用いることができる。ベクターとして、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。より具体的には、酵母が宿主である場合のプラスミドベクターは、pAUR224、pMAC561aur 、YEp13、YEp24、YCp50などが挙げられ、動物細胞が宿主である場合のウイルスベクターは、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスなどが挙げられる。たとえば、変異型rpa1遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で消化し、ベクターDNAの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに連結することにより、ベクターに変異型rpa1遺伝子を導入できる。
【００３６】
変異型rpa1遺伝子は、導入された宿主細胞中で発現できなければならない。そこで、ベクターは、プロモーター、及び変異型rpa1遺伝子のほか、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカーなどを含有することが好ましい。選択マーカーは、たとえばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子、G418耐性遺伝子などが挙げられる。酵母を宿主とする場合のプロモーターは、たとえばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどを用いることができる。動物細胞を宿主とする場合のプロモーターは、たとえばSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーターなどを用いることができる。
【００３７】
（1.1.3.2.形質転換細胞（変異株）の作出）
組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換細胞または変異株を作出できる。ここで、宿主は、真核生物細胞であって、テロメアを含む線状染色体を有するであればよい。具体的な宿主としては、分裂酵母、出芽酵母などの酵母や、COS細胞、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などの動物細胞、またはSf9、Sf21などの昆虫細胞が挙げられる。
【００３８】
組換えベクターを宿主に導入する方法としては、組換えベクターを宿主に導入する公知の方法を採用できる。このような組換えベクターを宿主に導入する方法としては、エレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163(1983)] 、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。
【００３９】
（1.1.4.分裂酵母のRPA1変異体作出工程ついて）
分裂酵母におけるRPA1タンパク質は、Rad11タンパク質である。本明細書では、分裂酵母におけるRPA1変異体作出工程を、特にrad11変異株作出工程ともいう。rad11変異株作出工程では、rad11遺伝子の塩基配列を変異させることによって、分裂酵母のPRA1タンパク質のアミノ酸配列を変異させる。
【００４０】
rad11変異株としては、Rad11タンパク質のうち1個から数個のアミノ酸配列が置換、欠失、付加、挿入されたものをコードする遺伝子を有するものが挙げられ、より具体的にはRad11タンパク質の223番目のアミノ酸がチロシンに変異したものをコードする遺伝子を有するものが挙げられる。
【００４１】
（1.2.TRF変異工程）
TRF変異工程は、trf遺伝子（テロメア反復結合因子(telomeric repeat binding factor:TRF)タンパク質をコードするDNA）を変異させ、TRFの少なくともひとつ以上のアミノ酸配列を変異させるための工程である。ヒトでは、テロメア反復結合因子としてTRF1タンパク質（配列番号６）、およびTRF2タンパク質（配列番号７）が知られている。ヒトにおけるtrf遺伝子は、trf1遺伝子、およびtrf2遺伝子である。また、分裂酵母では、テロメア反復結合因子としてTaz1タンパク質（配列番号４）が知られており、分裂酵母におけるtrf遺伝子は、taz1遺伝子（配列番号３）である。
【００４２】
(1.2.1.遺伝子の変異方法)
遺伝子を変異させる方法としては、公知の遺伝子変異方法を採用できる。遺伝子を変異させる方法として好ましくは、相同組換え法が挙げられる。
【００４３】
trf遺伝子を相同組換えにより変異させるためには、trf遺伝子の全てまたは少なくとも一部の塩基配列を欠損させるか、trf遺伝子の所定領域を他の塩基配列で置き換えたDNAであって、trf遺伝子の機能を発現しないもの（以下、「trf遺伝子変異DNA」ともいう。）を用いればよい。すなわち、trf遺伝子変異DNAを宿主に導入し、形質転換することでTRFタンパク質が発現しない形質転換体を得ることができる。trf遺伝子の所定領域を他の塩基配列で置き換えたDNAとしては、trf遺伝子の塩基配列を10個〜1200個他の塩基配列で置き換えたDNA、trf遺伝子の塩基配列を100個〜1500個他の塩基配列で置き換えたDNA、trf遺伝子の塩基配列を1000個〜1300個他の塩基配列で置き換えたDNA、trf遺伝子の塩基配列を50個〜100個他の塩基配列で置き換えたDNAや、trf遺伝子の塩基配列を500個〜1200個他の塩基配列で置き換えたDNAなどが挙げられる。
【００４４】
(2.テロメアの長さを測定する方法)
サザンハイブリダイゼーション法により、テロメアの長さを解析できる。サザンハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行えばよい。たとえば、酵母細胞のテロメア長を解析する場合、まず対照の酵母細胞及び被検酵母細胞からゲノムDNAを抽出する。次いで、得られたゲノムDNAを適当な制限酵素（例えば、XhoIなど）で消化した後、アガロースゲル電気泳動によってDNA断片を分離する。その後、ナイロン膜上にアルカリ条件下で分離したDNA断片を転写する。テロメア配列と特異的にハイブリダイズする標識プローブを、この転写物に適当な条件下でハイブリダイズさせる。この際のプローブとしては、配列番号８の配列、およびその相補鎖からなる２本鎖DNAが挙げられる。膜を洗浄後、オートラジオグラフィーまたはイメージングプレートなどで視覚化し、対照酵母細胞のレーンと被検酵母細胞のレーンとを比較することによって、テロメアの長さを比較できる。
【００４５】
(3.染色体の確認)
なお、たとえばPFGE（ハ゜ルスフィールト゛ケ゛ル電気泳動）によって、染色体の有無を確認できる。PFGEとしては、たとえば「パルスフィールドグラジエント電気泳動法（PFG）-巨大分子の解析」. 長谷川聡, 菊池韶彦.実験医学, 5,1073-1079. (1987):、「パルスフィールドゲル電気泳動法」 三好浩之, 大木  操.、実験医学別冊遺伝子工学ハンドブック（羊土社刊）, 177-183. (1992)）などに記載の方法を用いればよい。PFGEは、メガベース(Mb=106塩基)規模のDNA断片を、各電極に交互の電場をかけることで、移動するDNA断片の方向を変える。このようにして、PFGE によれば、DNAを有効に分離できるので、染色体の有無を確認できる。
【００４６】
（4.テロメア長調節剤及びテロメア関連疾患の治療剤）
本発明の2重変異体（すなわち、RAP1タンパク質の変異体のtrf遺伝子を変異したもの）のDNA断片（以下、本発明のDNAともいう。）を用いれば、テロメアの長さを調整することができ、またテロメアに関連する疾患を治療できる。すなわち、本発明のDNAは、テロメア長調節剤及びテロメア関連疾患の治療剤の有効成分となりうる。とくに、分裂酵母rad11変異株のDNAのうちtrf遺伝子を破壊したDNA断片は、後述の実施例で確認されたように、これを分裂酵母に導入し、形質転換することにより分裂酵母のテロメアの長さを調整できる。したがって、このDNA断片は、分裂酵母のテロメア長調整剤として有用であるとともに、分裂酵母のテロメア関連疾患の治療剤としても有用である。
【００４７】
なお、本発明のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAも、テロメアの長さを調整するために使用できる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、バッファのナトリウム濃度が、33〜70mM、好ましくは50〜66mMであり、温度が40〜70℃、好ましくは55〜68℃での条件をいう。
【００４８】
なお、本明細書において、「テロメア関連疾患」とは、疾患の発症にテロメアの長さが関連するあらゆる疾患をいう。テロメア関連疾患としては、悪性腫瘍(例えば、肝細胞癌、乳癌、胃癌などのがん；黒色腫、脳腫瘍など)や、正常細胞の染色体に比べてテロメアが短くなっている老化性疾患などが挙げられる。
【００４９】
本発明のDNAは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。また、本発明のDNAは適当なベクターに導入し、宿主を形質転換することにより投与しても良い。
【００５０】
本発明のDNAの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、癌患者（60ｋｇとして）においては、一日につき約0.01〜30μｇ程度、好ましくは0.1〜20μｇ程度、より好ましくは0.1〜10μｇ程度を投与する。他の動物の場合も、60ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５１】
（5.テロメアの長さを調整した分裂酵母の利用方法）
本発明のテロメアの長さを調整した分裂酵母は、分裂酵母の研究に有効であるほか、ヒトまたはヒト以外の真核生物におけるテロメア関連疾患の治療方法、および治療剤の開発に有効に利用できる。
【００５２】
（6.ヒト細胞のテロメアの長さを調整する方法）
ヒトのHeLa細胞のRPA1をsiRNA処理を行い3日培養すると、RPA1がほとんど発現しなくなり細胞抽出液にはRPA1がほとんど検出できなくなることが報告されている（Zou L, Elledge SJ. Sensing DNA damage through ATRIP recognition of RPA-ssDNA complexes.  Science. 2003 Jun 6;300(5625):1542-8.）。そこでTRF1タンパク質とRPA1タンパク質とを同時にsiRNA処理するか、あるいはTRF2タンパク質とRPA1タンパク質とを同時にsiRNA処理することで、ヒト細胞のテロメアの長さを調整できる。
【００５３】
以下、本明細書における配列は、以下のとおりである。
配列番号１：分裂酵母rad11遺伝子の塩基配列
配列番号２：分裂酵母Rad11タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：分裂酵母taz1遺伝子の塩基配列
配列番号４：分裂酵母Taz１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトSSBタンパク質
配列番号６：ヒトTRF1タンパク質
配列番号７：ヒトTRF2タンパク質
配列番号８：プローブ
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
【実施例１】
【００５４】
（１）変異株rad11-D223Yの作成
宝酒造社製のキット（TaKaRa  site-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km）を用い、取り扱い説明書にしたがって変異株rad11-D223Yを作製した。
【００５５】
rad11+遺伝子を含むDNA断片をPCRにより増幅した。PCRは、センスプライマーとして配列番号９に記載の下記プライマーを、アンチセンスプライマーとして配列番号１０に記載のプライマーを用い、分裂酵母のゲノムＤＮＡを鋳型とした。PCRの条件は、９４℃  １５秒、５２℃  ４５秒、６８℃  ３分を３０サイクルであった。
配列番号９  ：5' GAT AAA ATT GGT AAT CCC G 3'
配列番号１０  ：5' AAA TAG TGT ATC GTC AGG CTA 3'
【００５６】
PCRを用いて増幅したrad11+遺伝子を含むDNA断片をベクター（T7 Blue vector）にライゲーションし、サブクローニングした。このプラスミドをpT7-rad11と命名した。
【００５７】
このプラスミド（pT7-rad11）を制限酵素EcoRI とXbaIとを用いて消化し、約800bp の断片を得た。一方、pkf18をEcoRI とXbaIで切断したものを準備し、先に得られた約800bp の断片をライゲーションさせた。このライゲーション産物を大腸菌（E.coli JM109）に導入し、大腸菌を形質転換させた。これにより、プラスミド（pT7-rad11）を増殖した。
【００５８】
次に、rad11-D223Y遺伝子を含むプラスミドを得るために変異導入PCRを行った。変異導入PCRは、先に回収したプラスミド(pkF18-rad11)を制限酵素で消化したものを鋳型として、配列番号１１で表される下記の変異プライマー、及びキットに含まれる選択プライマー（selection primer）を用いて行った。このようにして、rad11遺伝子の667番目のgをtに変異させたDNAを取得した。PCRの条件は、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を３０サイクルであった。
【００５９】
配列番号１１：  5' TCC CCA CTT TCA TAG AGT AAA T 3'
【００６０】
変異導入後のpkF18-rad11を大腸菌（E.coli MV1184）に導入し、大腸菌を形質転換させた。これにより変異導入後のrad11遺伝子を増幅した。変異導入後のpkF18-rad11を制限酵素NheIとClaIで切断し、その断片をpT7-rad11をNheIとClaIで切断したDNAと連結した。変異済みのpT7-rad11を制限酵素SmaIで切断し、SK-URAを制限酵素HincII ,SmaIにより切断して得た平滑URA4 insert をライゲーションし、大腸菌（E.coli XL-1）に導入することにより増殖した。プラスミドpT7-rad11-URA4をAatIIで切断し、分裂酵母h+ に形質転換させた。0.2％ 5-FOA によりURA4を抜き、かつ染色体上のrad11に変異が入っている株を選択した。このようにして分裂酵母rad11-D223Y変異株を得た。
【００６１】
（２）分裂酵母rad11-D223Y変異株のtaz1遺伝子破壊
taz1遺伝子の319番目-1491番目の領域をURA4に置き換えたDNA断片を下記の配列番号１２で表されるプライマー、及び配列番号１３で表されるプライマーを用いて増幅した。PCRの条件は、９４℃  １５秒、５８℃  ４５秒、６８℃  ３分３０秒を３０サイクルであった。
【００６２】
配列番号１２：5'CGG AAT TCC CGG GGA TGA TAA GCG TGC AAA GTA CAG AA 3'
配列番号１３：5'CGC GGA TCC TTA AGA TTG ATA ATT AAC AAG CTC TTC 3'
【００６３】
上記のDNA断片を上記（１）で製造したh+ rad11-D223Y に形質転換させた。その後、URA4を含まない培地で生育可能な株を選択した。このようにして、分裂酵母rad11-D223Y変異株のtaz1遺伝子を破壊したものを得た。taz1遺伝子が破壊されていることを、PCRにより確認した。配列番号１２と配列番号１４で表されるプライマーを用いて増幅した。PCRの条件は、９４℃  １５秒、５８℃  ４５秒、６８℃  ３分３０秒を３０サイクルであった。
【００６４】
配列番号14：5' TGA AAT TCG TAA TTC AAC CTC TTT 3'
【００６５】
（３）サザンハイブリダイゼーションによるテロメアDNAの検出
分裂酵母の野生株、rad11-D223Y変異株、taz1破壊株、rad11-D223Yとtaz1の２重変異株（独自に作製したものを2種類）をそれぞれ用意した。それぞれの分裂酵母からゲノムDNAを単離・増幅したのち、制限酵素で消化した。その後、電気泳動させ、アルカリ変性させた。このゲル泳動パターンを、メンブレンフィルターにブロッティング（転写）した。テロメアのリピート配列を持つDNAプローブにペルオキシダーゼを付加させ、転写膜とハイブリダイズさせた。このものに発光基質を作用させ、分裂酵母のテロメアDNAを検出した。
【００６６】
より具体的には、以下のようにしてテロメアDNAを検出した。まず、野生株の分裂酵母、分裂酵母rad11-D223Y変異株、分裂酵母taz1破壊株、rad11-D223Yとtaz1の２重変異株（2種類作出した。）から、ゲノムDNAを単離した。これらのDNAを制限酵素ApaIで消化した。その後、2％アガロースゲル電気泳動を行った。
【００６７】
0.25NのHClをゲル上に浸るまで加え、5分放置した。ピペットでHClを全て吸い取った。変性溶液を加え、６分放置した。その後、液を全て吸い取った。その後、ゲル上に中和溶液を加え６分放置した。その後、中和溶液を全て吸い取った。20×SSCを載せ、１時間放置した。UV クロスリンカーで、メンブレンにDNAを転写した（UV強度は1200J/m2とした。）。メンブレンを温め、以下の緩衝液で浸し、60℃で15分〜30分ゆっくりと振とうさせた。
【００６８】
緩衝液に以下のプローブを加え、泡を取り除いて60℃で一晩（8時間程度）ゆっくりと振とうさせた。
【００６９】
NaCl0.146gを緩衝液5mlに溶かした。そして、阻害試薬0.2gを加え4％にした。阻害試薬を溶解させた後、60℃に維持した。プローブとして、1μlのクロスリンカーを４μlのミリQで薄め、氷上に置いた。
【００７０】
DNA 50ngを5分間ボイルした。その後、迅速に氷上におき、軽く遠心した。急冷したDNAに５μlの反応緩衝液を加えよく混ぜた。2μlのラベル試薬を加えてよく混ぜた。さらに、薄めたクロスリンカーを加え、よく混ぜた。37℃で30分インキュベートした。
【００７１】
表１  第1洗浄バッファの成分
１L系          １５０ml系
尿素                     １２０g       １８g
SDS                      １g           ０,１５g
0.5M  燐酸Na（pH7）      １００ml      １５ml
NaCl                     ８,７g        １,３０５g
1M MgCl2                 １０ml        １,５ml
ブロック試薬             ２g           ０,３g
【００７２】
表２  第２洗浄バッファの成分
２００ml系  
20×ストック        １０ml
1M MgCl2        ４００μ
【００７３】
メンブレンを予熱しておいた第１洗浄バッファで２回軽くすすいだ。メンブレンとバッファを60℃で10分間振とうさせた。第１洗浄バッファを捨て、第２洗浄バッファで２回メンブレンをすすいだ。第２洗浄バッファで攪拌して５分間室温で洗浄した。第２洗浄バッファを捨てた、メンブレンを検出試薬に5分間浸し、ラベリングを施した。ラベリングしたメンブレンをX線により感光した。
【００７４】
この結果を図１に示す。図１中、レーン１は野生株、レーン２はrad11-D223Y変異株、レーン３はtaz1破壊株、レーン４はrad11-D223Yとtaz1の２重変異株、レーン５は、rad11-D223Yとtaz1の２重変異株についてのサザンハイブリダイゼーションの結果を表す。（なお、レーン４の2重変異株とレーン５の2重変異株とは、別々に作出したものである。）
【００７５】
図１から、野生株のテロメアは、約１kbpにバンドがみられた。一方、rad11-D223Y変異株では、テロメアが、少し短くなることがわかった。さらに、taz1破壊株では、テロメアが2kbp以上長くなることがわかった。rad11-D2233Yとtaz1の２重変異株では、テロメアが全く検出できなかった。そこで、染色体の有無を確かめるために、以下のパルスフィールド電気泳動を行った。
【００７６】
（４）パルスフィールド電気泳動による分裂酵母の染色体の検出
分裂酵母の野生株、rad11-D223Y変異株、rad3とrad32の2重破壊株、rad11-D223Yとtaz1の２重変異株（独自に作製したものを2種類）をそれぞれ用意した。それぞれを、50mlのEMM3＋ALU培地で培養した。5.5×108 [cells/ml]となるようにSP1緩衝液＋2.0mg/ml サ゛イモリエイス（Zymolyase）-100Tに溶かし、37℃で1時間処理した。108 個の細胞をとって、3,000rpmの回転速度で5分間振盪した。その後、TSE 緩衝液 25μlに溶かし、43℃に温めた。1.0％の低融点アカ゛ロース 65μlに溶かした。細胞懸濁液をフ゜ラク゛モルト゛（plug mold）に移した。4℃で20分で固まった。フ゜ラークを0.5mlPW1 緩衝液で50℃ 2〜6時間洗った。0.5ml PW2 緩衝液に移し、50℃で24時間インキュヘ゛ートした。新しい0.5ml PW2 緩衝液に移した。50℃で、24時間インキュヘ゛ートした。10ml T10×E 緩衝液 4℃ 30分で２回洗浄した。10ml T10×E 緩衝液＋0.04mg/ml PMSF(23μl 0.1M PMSF)を用い50℃で30分２回洗浄した。10ml T10×E 緩衝液で室温にて30分２回洗浄した。(このものは、新しいT10×E 緩衝液 中で4℃、1年間保存可能である)フ゜ラークを1.0%TAE 緩衝液を充填した0.8％ アカ゛ロース ケ゛ルに流した。各緩衝液の成分は、以下のとおりであった。
【００７７】
(1)SP1 緩衝液 (pH 5.6) 
1.2 M D-ソルヒ゛トール     21.86g
50 mM クエン酸ナトリウム   1.47g
50 mM Na2HPO4・7H2O         1.79g
40 mM EDTA                 0.5M 8ml
【００７８】
(2)TSE 緩衝液 (pH7.5)
0.9M D-ソルヒ゛トール    16.44g
10mM Tris-Hcl            1.0M 1ml 
45mM EDTA                0.5M 9ml
【００７９】
(3)PW1 緩衝液 (pH7.5)
50mM Tris-Hcl          1.0 M 5ml
0.25M EDTA             0.5 M 50ml
1％ SDS                10％ 10ml
【００８０】
(4)PW2 緩衝液 (pH9.0)
10mM Tris-Hcl             1.0 M 1ml 
5M EDTA                   18.6g
1％ [wt/vol] N-ラウロイル サルコシン 100％ 10ml 
オートクレーフ゛した後1mg/ml フ゜ロテアーセ゛Kを加える。
【００８１】
(5)T10×E 緩衝液 (pH7.0)
10mM Tris-Hcl           1.0M  1ml
10mM EDTA               0.5M  2ml
【００８２】
TBE 緩衝液400mlに エチシ゛ウムホ゛ロマイト゛（0.5mg/ml）を加え、60分間振盪（約50rpm）しながらケ゛ルを染色した。染色後、精製水で30〜60分間振盪（約50rpm）しながら、脱色した。終了後、カメラ、及びCCDカメラによりケ゛ルを撮影した。
【００８３】
この結果を図２に示す。図２中、レーン１は野生株、レーン２はrad11-D223Y変異株、レーン３はrad3およびrad32の2重破壊株、レーン４はrad11-D223Yとtaz1の２重変異株、レーン５は、rad11-D223Yとtaz1の２重変異株についてのPFGEの結果を表す。（なお、レーン４の2重変異株とレーン５の2重変異株とは、別々に作出したものである。）
【００８４】
図２から、野生株（レーン1）、およびrad11-D223Y株（レーン2）では、染色体由来のバンドが３本観測された。これから、これらの株では染色体が3種類存在することがわかる。一方、rad3およびrad32の2重破壊株（レーン3）、rad11-D223Yとtaz1の２重変異株（レーン4、レーン5）では、いずれもバンドが観測されなかった。ここで、rad3およびrad32の2重破壊株は染色体が環状となり、PFGEでは染色体が観測されないことが知られている（Nakamura TM, Moser BA, Russell P. Telomere binding of checkpoint sensor and DNA repair proteins contributes to maintenance of functional fission yeast telomeres.  Genetics. 2002 Aug;161(4):1437-52.）。このことから、rad11-D223Yとtaz1の２重変異株も染色体が環状となっていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のテロメア長の調整方法によれば、真核細胞（特に分裂酵母細胞）のテロメアの長さを調節できるので、テロメア関連疾患の治療方法として利用できる。
【００８６】
本発明のDNAは、真核細胞（特に分裂酵母細胞）のテロメアの長さを調節できるので、テロメア関連疾患の治療剤の有効成分として利用できる。
【００８７】
本発明のテロメアの消失した真核細胞（特に分裂酵母細胞）により、テロメアの機能を研究でき、それによりテロメア関連疾患の治療方法、および治療剤の開発に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、サザンハイブリダイゼーションにより、テロメアDNAを検出した結果を表す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、パルスフィールド電気泳動により、分裂酵母の染色体を検出した結果を表す図面に代わる写真である。
【図１】
2005168354.tif 000002
【図２】
2005168354.tif 000003
【配列表】
2005168354000001.app