(57)【要約】【課題】  簡便、迅速、確実且つ高感度な壷状菌病病原菌の検出・定量方法の提供。【解決手段】  本発明は、壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドや、壷状菌１８ＳｒＤＮＡを増幅し得るプライマー対を用いて、ＰＣＲ法等の遺伝子工学的手法によって海苔壷状菌病病原菌を検出・定量する方法を提供する。本発明の海苔壷状菌病病原菌検出・定量方法を用いれば、簡便、迅速、確実且つ高感度に壷状菌の存在を検出・定量することができるので、壷状菌感染の発生前あるいは発生初期の段階で感染拡大阻止のための対策を講じることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選ばれる請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ハイブリダイズし得る領域が、当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域である請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１である請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
塩基配列が配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３からなる群から選ばれる請求項４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
遺伝子増幅反応により壷状菌１８ＳｒＤＮＡを増幅し得る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対。
【請求項７】
当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選ばれる請求項６記載のプライマー対。
【請求項８】
当該遺伝子増幅反応において、少なくとも一方のプライマーが当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域にハイブリダイズし得る請求項７記載のプライマー対。
【請求項９】
当該遺伝子増幅反応において、一方のプライマーが当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域にハイブリダイズし得、他方のプライマーが当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのエクソン領域にハイブリダイズし得る請求項８記載のプライマー対。
【請求項１０】
当該イントロン領域と当該エクソン領域とが隣接している請求項９記載のプライマー対。
【請求項１１】
当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１である請求項１０記載の海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対。
【請求項１２】
当該イントロン領域の塩基配列が配列番号５であり、当該エクソン領域の塩基配列が配列番号６である請求項１１記載のプライマー対。
【請求項１３】
当該イントロン領域の塩基配列が配列番号７であり、当該エクソン領域の塩基配列が配列番号８である請求項１１記載のプライマー対。
【請求項１４】
ｉ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなる請求項１２記載のプライマー対。
【請求項１５】
ｉ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなる請求項１２記載のプライマー対。
【請求項１６】
ｉ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなる請求項１３記載のプライマー対。
【請求項１７】
請求項６〜１６のいずれかに記載のプライマー対を用いて遺伝子増幅反応を行い、特異的遺伝子増幅産物の存在を指標として壷状菌の存在を検出することを特徴とする海苔壷状菌病病原菌検出方法。
【請求項１８】
請求項６〜１６のいずれかに記載のプライマー対を用いて遺伝子増幅反応を行い、特異的遺伝子増幅産物の量を指標として壷状菌の存在量を定量することを特徴とする海苔壷状菌病病原菌定量方法。
【請求項１９】
請求項６〜１６のいずれかに記載のプライマー対を含有することを特徴とする海苔壷状菌病病原菌検出・定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は海苔壷状菌病病原菌の検出・定量方法、及びそれに用いられるオリゴヌクレオチド又はプライマー対に関する。
【背景技術】
【０００２】
壷状菌病は、海苔養殖において毎年発生し、多大な被害を及ぼす病害である。壷状菌病に感染した海苔は光沢がない商品価値の低い乾燥海苔にしかならず、また養殖網から外れてしまうため生産量が下がる。
壷状菌病の病原菌である壷状菌（olpidioid fungus）は、海苔に細胞内絶対寄生する全実性、単細胞の鞭毛菌である。壷状菌は卵菌網、クサリフクロカビ目のOlpidioipsis属の一種であると考えられているものの、分離培養が困難なことから、詳細な菌の分類、同定はなされていない（非特許文献１及び２参照）。また、本菌の生理生態については、海苔葉体に感染したときにおける特性のみが調べられているに過ぎない（非特許文献３及び４参照）。
壷状菌の有効な駆除方法は見つかっていないため、壷状菌病の防除対策のためには壷状菌感染発生をより早く確認し、海苔を漁場から早期に引き上げることが重要である。
しかし、現在行われている壷状菌病の検査としては、養殖海苔を定期的にサンプリングして、顕微鏡下で壷状菌感染の有無を確認することが行われているのみである。しかし、この検査方法によっては、壷状菌感染がある程度拡大してしまった後においてはじめて感染が確認できるので、感染が確認された時点ではすでに手遅れとなる事態が頻発していた。また、顕微鏡による壷状菌感染の判定は難しく、熟練を要する作業であり、検査に多くの人数、労力、費用を要するなどの欠点を有していた。
そこで、壷状菌の存在を、壷状菌病発生前あるいは発生初期の段階で簡便、迅速、確実且つ高感度に検出する検出方法の開発が望まれていた。
一方、海苔の病原菌の検出方法として、例えば特許文献１に開示された方法が公知であるが、壷状菌の検出方法は知られていない。
【特許文献１】特開２００２−１１２７７４号公報
【非特許文献１】日水試、第２６巻、５４３〜５４８頁、１９６０年
【非特許文献２】Asia-Pasific Mycological Conference on Biodiversity and Biotechnology (AMC2002), Kunming, China, November 4-8, 2002抄録
【非特許文献３】長大水研報、第２８巻、１３１〜１４５頁、１９６９年
【非特許文献４】Transactions of the Mycological Society of Japan, vol. 18, p279-285, 1977
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記事情に鑑み、本発明は、簡便、迅速、確実且つ高感度な壷状菌病病原菌の検出・定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究したところ、壷状菌染色体ＤＮＡの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子コード領域（１８ＳｒＤＮＡ）の塩基配列が、壷状菌に極めて特異性の高い塩基配列であり、ＰＣＲ法等の遺伝子工学的手法による壷状菌病病原菌の検出・定量に極めて適していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は以下の（１）〜（１８）に関する。
（１）壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチド。
（２）当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選ばれる上記（１）記載のオリゴヌクレオチド。
（３）ハイブリダイズし得る領域が、当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域である上記（２）記載のオリゴヌクレオチド。
（４）当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１である上記（３）記載のオリゴヌクレオチド。
（５）塩基配列が配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３からなる群から選ばれる上記（４）記載のオリゴヌクレオチド。
（６）遺伝子増幅反応により壷状菌１８ＳｒＤＮＡを増幅し得る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対。
（７）当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選ばれる上記（６）記載のプライマー対。
（８）当該遺伝子増幅反応において、少なくとも一方のプライマーが当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域にハイブリダイズし得る上記（７）記載のプライマー対。
（９）当該遺伝子増幅反応において、一方のプライマーが当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域にハイブリダイズし得、他方のプライマーが当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのエクソン領域にハイブリダイズし得る上記（８）記載のプライマー対。
（１０）当該イントロン領域と当該エクソン領域とが隣接している上記（９）記載のプライマー対。
（１１）当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１である上記（１０）記載の海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対。
（１２）当該イントロン領域の塩基配列が配列番号５であり、当該エクソン領域の塩基配列が配列番号６である上記（１１）記載のプライマー対。
（１３）当該イントロン領域の塩基配列が配列番号７であり、当該エクソン領域の塩基配列が配列番号８である上記（１１）記載のプライマー対。
（１４）ｉ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなる上記（１２）記載のプライマー対。
（１５）ｉ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなる上記（１２）記載のプライマー対。
（１６）ｉ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなる、上記（１３）記載のプライマー対。
（１７）上記（６）〜（１６）のいずれかに記載のプライマー対を用いて遺伝子増幅反応を行い、特異的遺伝子増幅産物の存在を指標として壷状菌の存在を検出することを特徴とする海苔壷状菌病病原菌検出方法。
（１８）上記（６）〜（１６）のいずれかに記載のプライマー対を用いて遺伝子増幅反応を行い、特異的遺伝子増幅産物の量を指標として壷状菌の存在量を定量することを特徴とする海苔壷状菌病病原菌定量方法。
（１９）上記（６）〜（１６）のいずれかに記載のプライマー対を含有することを特徴とする海苔壷状菌病病原菌検出・定量キット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の海苔壷状菌病病原菌検出・定量方法を用いれば、簡便、迅速、確実且つ高感度に壷状菌の存在を検出・定量することができるので、壷状菌感染の発生前あるいは発生初期の段階で感染拡大阻止のための対策を講じることができる。また、海苔網を撤去した期間中に漁場における壷状菌の発生をモニターすることにより、漁場への海苔網の張り込みを適切な時期に開始することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、真核生物の間では１８ＳｒＤＮＡの塩基配列は非常によく保存され、特異性が低く、また該遺伝子は一般にイントロンを有していないのに対して、壷状菌の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列は極めて特異性が高く、また驚くべきことに壷状菌の１８ＳｒＤＮＡが複数のイントロンを有していることを利用して、壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドや、壷状菌１８ＳｒＤＮＡを増幅し得るプライマー対を用いて、ＰＣＲ法等の遺伝子工学的手法によって壷状菌病病原菌を検出・定量する方法を提供する。
【０００８】
壷状菌染色体ＤＮＡは複数の１８ＳｒＤＮＡを有する。壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列は、壷状菌に感染した海苔葉体等から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、自体公知の方法、例えば「The Journal of Eukaryotic Microbiology, vol. 46, p.637-647, 1999」等に記載された方法により、１８ＳｒＤＮＡをＰＣＲ法等により増幅し、クローニング、シークエンシングをすることにより得ることが出来る。
【０００９】
本発明の海苔壷状菌病病原菌検出・定量方法に用いることのできる壷状菌１８ＳｒＤＮＡは特に限定されないが、好ましくは１８ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選ばれる塩基配列である１８ＳｒＤＮＡを用いる。
【００１０】
本明細書中、塩基配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４である壷状菌１８ＳｒＤＮＡを、それぞれ、１８ＳｒＤＮＡ−１、１８ＳｒＤＮＡ−２、１８ＳｒＤＮＡ−３、１８ＳｒＤＮＡ−４と呼ぶ。上記壷状菌１８ＳｒＤＮＡは、エクソン領域とイントロン領域からなる。エクソン領域は、１８ＳｒＤＮＡにおいて、転写、スプライシングの後に、成熟１８ＳｒＲＮＡの構成部分となる領域を指す。イントロン領域は、１８ＳｒＤＮＡにおいて、転写はされるが、その後スプライシングにより除去され、成熟１８ＳｒＲＮＡの構成部分とならない領域を指す。
【００１１】
配列番号１は、壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−１の塩基配列である。当該配列の全長は１７２７ｂｐであるが、このうち１〜５６５残基はエクソン１の領域（配列番号６に相当する）、５６６〜１０５６残基はイントロン１の領域（配列番号５に相当する）、１０５７〜１０９５残基はエクソン２の領域、１０９６〜１５５３残基はイントロン２の領域（配列番号７に相当する）、１５５４〜１７２７残基はエクソン３の領域（配列番号８に相当する）である。
【００１２】
配列番号２は、壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−２の塩基配列である。当該配列の全長は２５１３ｂｐであるが、このうち１〜６０４残基はエクソン１の領域、６０５〜９３９残基はイントロン１の領域、９４０〜１０１３残基はイントロン２の領域、１０１４〜１２７７残基はエクソン２の領域、１２７８〜１７２９残基はイントロン３の領域、１７３０〜１９２７残基はエクソン３、１９２８〜２３３９残基はイントロン４の領域、２３４０〜２５１３残基はエクソン４の領域である。
【００１３】
配列番号３は、壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−３の塩基配列である。当該配列の全長は４１３７ｂｐであるが、このうち１〜６０４残基はエクソン１の領域、６０５〜１０６０残基はイントロン１の領域、１０６１〜１６３８残基はエクソン２の領域、１６３９〜２０４０残基はイントロン２の領域、２０４１〜２１４４残基はエクソン３の領域、２１４５〜２５４８残基はイントロン３の領域、２５４９〜２７０８残基はエクソン４の領域、２７０９〜３７６５残基はイントロン４の領域、３７６６〜４１３７残基はエクソン５の領域である。
【００１４】
配列番号４は、壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−４の塩基配列である。当該配列の全長は３５３２ｂｐであるが、このうち１〜６０４残基はエクソン１の領域、６０５〜１０６０残基はイントロン１の領域、１０６１〜１６３８残基はエクソン２の領域、１６３９〜２０４０残基はイントロン２の領域、２０４１〜２１４４残基はエクソン３の領域、２１４５〜２５４８残基はイントロン３の領域、２５４９〜２７０８残基はエクソン４の領域、２７０９〜３１６０残基はイントロン４の領域、３１６１〜３５３２残基はエクソン５の領域である。
【００１５】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量方法に用いることのできるオリゴヌクレオチドは、壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。好ましくは、当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列は配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選ばれ、最も好ましくは配列番号１である。
【００１６】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよいが、分子の安定性等を考慮すると、好ましくはＤＮＡである。また、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよいが、「オリゴヌクレオチド」は、好ましくは、一本鎖である。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するもの又は合成されたもののいずれでもよいが、１００ｂｐ程度以下の大きさのものであれば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することが可能である。
【００１７】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドの大きさは、検出・定量方法に応じて適宜選択することが可能であるが、通常１０〜１０００ｂｐである。当該オリゴヌクレオチドを遺伝子増幅反応に用いるプライマーとして用いる場合には、当該オリゴヌクレオチドの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１５〜１００ｂｐ、より好ましくは１８〜５０ｂｐ、更に好ましくは１８〜３０ｂｐ、最も好ましくは１８〜２３ｂｐである。また、当該オリゴヌクレオチドをサザンブロッティング等のプローブとして用いる場合には、当該オリゴヌクレオチドの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１２〜５００ｂｐであり、更に好ましくは５０〜４００ｂｐである。
【００１８】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドのGCコンテントは、特に限定されないが、４０〜６０％であることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドは、検出・定量感度を高めるために修飾されていてもよい。当該修飾としては、特に限定されないが、例えば、蛍光（ＦＩＴＣ，ローダミン、テキサスレッド、6-カルボキシ-フルオレッセイン(FAM)、テトラクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(TET)、2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(JOE)、ヘキソクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(HEX)、6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン(TAMRA)等）標識、ビオチン標識、ジゴキシゲニン標識、放射性同位体（３２Ｐ、３Ｈ）標識等が挙げられる。
【００２０】
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズし得る２つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド間の特異的かつ検出可能な結合を可能とする条件である。即ち、本発明において「ストリンジェントな条件」とは、海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドと、壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドとの特異的かつ検出可能な結合を可能とする条件である。
【００２１】
「ストリンジェントな条件」はハイブリダイズし得る当該オリゴヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドの配列中のグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の割合（ＧＣコンテント）、大きさ、ハイブリダイゼーションバッファーの組成（塩濃度、ホルムアルデヒド濃度）、温度、その他公知の条件によって適宜選択することが可能である。即ち、ハイブリダイズし得る当該オリゴヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドのＧＣコンテントが高く、大きさが大きくなるほど、安定にハイブリダイズするため、ハイブリダイゼーションバッファーの組成中の塩濃度を減じ、有機溶媒濃度を増加させる、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させることによりストリンジェンシーを増加させる。
【００２２】
好ましくは、「ストリンジェントな条件」はサムブルックら（Sambrook,J.）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Expression of cloned genes in E. coli）（Molecular Cloning：A laboratory manual（1989））Cold Spring harbor Laboratory Press,New York, USA, 9. 47-9. 62及び11.45-11.61」等に記載されたハイブリダイゼーション条件、又は「PCR A Practical Approach (IRL Press, p200, 1991) 」等に記載されたＰＣＲ反応等の遺伝子増幅反応におけるアニーリング条件を意味する。
【００２３】
より具体的には、前者の条件は、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行うことを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．１×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
【００２４】
また、後者の条件は、当業者が遺伝子増幅反応において用いるバッファーを用いて、Ｔｍ値±２０℃、好ましくはＴｍ値±１０℃、より好ましくはＴｍ値±５℃の温度でハイブリダイゼーションを行うことを指す。Ｔｍ値はハイブリダイズし得る当該オリゴヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドの配列、バッファー中の塩濃度等に依存して異なるが、自体公知の方法、例えばnearest neighbor法（例えば「Biochemistry,35,3555-3562,1996」など参照）等により算出することが出来る。通常ＰＣＲ反応に用いられるオリゴヌクレオチドのＴｍ値は６０±２０℃の範囲である。
【００２５】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドは、壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであれば、特に限定されないが、好ましくは、当該１８ＳｒＤＮＡの塩基配列の一部又は全部と同一塩基配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００２６】
壷状菌１８ＳｒＤＮＡは、そのイントロン部分の塩基配列が特に特異性が高いので、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドが、壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る領域は、当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域であることが好ましい。
【００２７】
ここで、「ハイブリダイズし得る領域が壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域である」とは、当該オリゴヌクレオチドが当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズする際に、当該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部、例えば１ｂｐ以上、好ましくは５ｂｐ以上、より好ましくは１０ｂｐ以上、最も好ましくは全長が、当該ポリヌクレオチドにおける当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域においてハイブリダイズし得ることをいう。
【００２８】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドの好ましい態様の一つとしては、当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−１のイントロン領域においてハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが挙げられる。最も好ましくは、当該オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３からなる群から選ばれる。
【００２９】
また、本発明は遺伝子増幅反応により壷状菌１８ＳＤＮＡを増幅し得る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対を提供する。
【００３０】
「壷状菌１８ＳＤＮＡを増幅する」とは、遺伝子増幅反応により壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列、その部分配列、又はそれらの相補的配列からなるポリヌクレオチドを増幅することをいう。
【００３１】
増幅対象の壷状菌１８ＳＤＮＡは、特に限定されないが、好ましくは１８ＳｒＤＮＡ−１、１８ＳｒＤＮＡ−２、１８ＳｒＤＮＡ−３及び１８ＳｒＤＮＡ−４からなる群から選ばれ、より好ましくは１８ＳｒＤＮＡ−１である。
【００３２】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対は、特に限定されないが、遺伝子増幅の反応効率の観点から、好ましくは特異的遺伝子増幅産物の大きさが５０〜１０００ｂｐ、より好ましくは１００〜６００ｂｐとなるように選択される。遺伝子増幅産物の大きさが５０ｂｐ以下であると、未反応のプライマー等との判別が困難となり、また、ＰＣＲ産物の大きさが１０００ｂｐ以上であると、遺伝子増幅の反応効率が低下し、非特異的な遺伝子増幅産物が産生されるなどして、検出感度が低下する。
【００３３】
当該海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対におけるプライマーは、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドから選択される。好ましくは、当該プライマー対は増幅対象の壷状菌１８ＳｒＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるプライマーの対である。より好ましくは、当該プライマーは増幅対象の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列の一部又は全部と同一塩基配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対においては、特に限定されないが、少なくとも一方のプライマーが、遺伝子増幅反応において、増殖対象の壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域にハイブリダイズし得ることが好ましい。このことにより、遺伝子増幅反応の特異性がより高められる。
【００３５】
より好ましくは、遺伝子増幅反応において、一方のプライマーが増殖対象の壷状菌１８ＳｒＤＮＡのイントロン領域にハイブリダイズし得、他方のプライマーが当該壷状菌１８ＳｒＤＮＡのエクソン領域にハイブリダイズする。
【００３６】
更に好ましくは、当該イントロン領域と当該エクソン領域とが隣接していることが好ましい。このことにより、遺伝子増幅産物の大きさが制限され、遺伝子増幅の効率が上昇し、検出・定量感度が高くなる。
ここで、「イントロン領域とエクソン領域とが隣接している」とは、当該イントロン領域と当該エクソン領域とが壷状菌染色体ＤＮＡの同一１８ＳｒＤＮＡに存在し、且つ、当該イントロン領域と当該エクソン領域との間に他のイントロン領域又は他のエクソン領域が存在しないことをいう。
【００３７】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対の好ましい態様の一つとしては、遺伝子増幅反応において、
i)壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−１のイントロン１の領域（配列番号５に相当する）にハイブリダイズし得るプライマー、及び
ii)壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−１のエクソン１の領域（配列番号６に相当する）にハイブリダイズし得るプライマーからなるプライマー対、ならびに、
i)壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−１のイントロン２の領域（配列番号７に相当する）にハイブリダイズし得るプライマー、及び
ii)壷状菌１８ＳｒＤＮＡ−１のエクソン３の領域（配列番号８に相当する）にハイブリダイズし得るプライマーからなるプライマー対が挙げられる。
【００３８】
更に、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対の最も好ましい態様としては、
ｉ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなるプライマー対（プライマー対Ａと呼ぶことがある）、
ｉ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなるプライマー対（プライマー対Ｂと呼ぶことがある）、並びに
ｉ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；及び
ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
からなるプライマー対（プライマー対Ｃと呼ぶことがある）が挙げられる。
【００３９】
中でも、検出・定量感度の点から、プライマー対Ｂが優れている。
【００４０】
以下、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチド又はプライマー対を用いた海苔壷状菌病病原菌検出・定量方法について詳述する。
【００４１】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチド又はプライマー対を用いて、海苔壷状菌病原菌を検出・定量する方法としては、特に限定されないが、例えば、遺伝子増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）（例えば、WO 00/28082参照）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）（例えば、WO 00/56877参照）など）、サザンブロッティング法、ノザンブロッティング法等が挙げられるが、測定・定量感度の視点から、遺伝子増幅反応が好ましく、ＰＣＲ反応が特に好ましい。
【００４２】
海苔壷状菌病病原菌の検出・定量にあたっては、検査対象から全ＤＮＡ、好ましくは染色体ＤＮＡを回収する。当該対象としては、特に限定されないが、例えば海苔葉体、海水、海底泥、乾燥海苔、焼海苔等が挙げられる。
【００４３】
海苔葉体からの全ＤＮＡの回収は、特に限定されないが、例えば特開２００２−１１２７７４号公報等に記載されたＣＴＡＢ法や、ＤＮＡ抽出キット  Isoplant II（ニッポンジーン社製）等の自体公知の方法を用いて行うことができる。海苔が壷状菌に感染している場合は、回収される全ＤＮＡ中に、海苔由来のＤＮＡと壷状菌由来のＤＮＡが含まれる。
【００４４】
海水からの全DNAの回収は、特に限定されないが、例えばフィルター等を用いた自体公知の方法により、海水中に浮遊する壷状菌遊走子を集菌する。集菌の際に使用するフィルターは、保留粒子径０．８μｍのメンブレンフィルター（ADVANTEC社製、K080A047A）が好ましい。回収された壷状菌遊走子からの全ＤＮＡの回収はＣＴＡＢ法や、ＤＮＡ抽出キット Isoplant II（ニッポンジーン社製）等の自体公知の方法を用いて行うことができる。
【００４５】
海底泥からの全ＤＮＡの回収は、特に限定されないが、例えばガラスビーズ等を用いた自体公知の方法を用いて行うことができる。例えば、泥試料と共に０．５ｍｍガラスビーズ（BIOSPEC社製）をスクリューキャップ付き２ｍｌチューブ等に入れ、MINI-BEADBEATER（BIOSPEC社製）等を用いて強震することにより、泥中の細胞、遊走子等を破砕する。その後、例えばＳＤＳ水溶液等を用いた自体公知の方法により全DNAを回収するが、その際通常１％ＳＤＳ水溶液に変えて０．１％サルコシン酸ナトリウムを加えた液を用いるのが好ましい。あるいは、ＤＮＡ抽出キット Isoplant II（ニッポンジーン社製）等を用いることも可能である。
【００４６】
このように回収された対象のＤＮＡは、適切な緩衝液、例えばＴＥ（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）等に溶解され、当該発明に係る検出・定量方法に用いられる。
【００４７】
次に、対象のＤＮＡと本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチド又はプライマー対とを接触させることにより、対象の全ＤＮＡ中の壷状菌由来１８ＳｒＤＮＡを検出・定量する。当該検出・定量の方法は、上述の通りである。
【００４８】
例えば、サザンブロッティング法は、自体公知の方法により行うことができる。
即ち、対象の全ＤＮＡは適当な制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動あるいは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等に供される。次に、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等の適切な膜にトランスファーし、固相化される。固相化された対象のＤＮＡと本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドとをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーションの有無・強度により、対象中の壷状菌の存在の有無を検出し、あるいは存在量を定量する。
当該ハイブリダイゼーションの検出・定量は、自体公知の方法により行うことができるが、検出・定量感度を高めるために、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドは修飾されていることが好ましい。
【００４９】
ＰＣＲ反応においては、対象の全ＤＮＡと本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対とを接触させる。ＰＣＲ反応は例えば「Science, 230, 1350 (1985)」等に記載された、自体公知の方法により行う。
即ち、対象の全ＤＮＡ、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対、ＴａｑポリメラーゼをＰＣＲバッファー中に加え、ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物を得る。Ｔａｑポリメラーゼ、ＰＣＲバッファーの組成は、自体公知のものから適宜選択する。また、ＰＣＲ反応における温度設定、時間、サイクル数は、ＰＣＲ反応に用いられる対象のＤＮＡの量、海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対等に応じて適宜設定される。ＰＣＲ反応におけるアニーリングの温度は、上記「ストリンジェントな条件」に設定されることが好ましい。
得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動あるいは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等に供され、分離される。当該ゲルは、エチジウムブロマイド染色液等の自体公知の染色液により染色され、トランスイルミネーター等を用いて当該ＰＣＲ産物が検出される。得られた特異的ＰＣＲ産物の有無・量を指標として、対象中の壷状菌の存在の有無を検出し、存在量を定量する。
【００５０】
得られたＰＣＲ産物の量が少なく、エチジウムブロマイド染色液等の自体公知の染色液を用いても検出できない場合には、ＰＣＲ産物は上記電気泳動による分離後に、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等の適当な膜にトランスファーし、固相化される。固相化されたＰＣＲ産物と本発明に係る適当な海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドとをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーションの有無・強度により、対象中の壷状菌の存在の有無を検出し、あるいは存在量を定量する。用いられる「適当な海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチド」は、当該ＰＣＲ産物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものであれば、特に限定されないが、好ましくは当該ＰＣＲ産物と同一のＤＮＡ塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。好ましくは、当該「適当な海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチド」は、検出・定量感度を高めるために修飾されている。
【００５１】
また、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量方法において用いられるＰＣＲ反応は、リアルタイムＰＣＲ法(例えば「TaqMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996」参照)であってもよい。
この場合、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対に加えて、適切な検出用蛍光標識プローブを用いる。当該検出用蛍光標識プローブは、リアルタイムＰＣＲ法の種類等に応じて適宜設定されるが、好ましくは本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用オリゴヌクレオチドから選択される。
【００５２】
本発明に係る海苔壷状菌病病原菌定量方法により対象中の海苔壷状菌病病原菌を定量する場合には、ポジティブコントロールとして、壷状菌染色体ＤＮＡ標準試料を同時に用いることが好ましい。当該標準試料は、あらかじめ壷状菌染色体ＤＮＡ量が既知であることが好ましい。対象のＤＮＡを用いて得られたハイブリダイゼーションの強度又は特異的遺伝子増幅産物の量等と、当該標準試料を用いたときのイブリダイゼーションの強度又は特異的遺伝子増幅産物の量等とを比較し、対象中の壷状菌染色体ＤＮＡ量を算出することができる。
【００５３】
また、本発明において、上記海苔壷状菌病病原菌検出・定量方法を複数組み合わせることによって、より正確で、感度の高い壷状菌病病原菌の検出・定量が達成できる。例えば、サザンブロッティング法とＰＣＲ反応とを組み合わせることができる。あるいは、同一試料に関して異なる複数の本願発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対を用いてＰＣＲ法により検出・定量を行うこともできる。この場合、当該複数のプライマー対が同一１８ＳｒＤＮＡを増幅し得るものであってもよく、あるいは複数のプライマー対が異なる複数種の１８ＳｒＤＮＡを増幅し得るものであってもよい。
【００５４】
また、本発明は、本発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対を含有することを特徴とする、海苔壷状菌病病原菌検出・定量キットを提供する。当該キットには、好ましくは、更に上記ＰＣＲバッファー、Ｔａｑポリメラーゼ、壷状菌染色体ＤＮＡ標準試料が含有される。
当該キットに含まれる海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対は、好ましくは、上記プライマー対Ａ、プライマー対Ｂ及びプライマー対Ｃからなる群から選ばれる。更に好ましくは、当該キットにはプライマー対Ａ、プライマー対Ｂ及びプライマー対Ｃからなる群から選ばれる２つまたはすべてのプライマー対が含まれる。
【００５５】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
以下に、本発明の実施例として本願発明に係る海苔壷状菌病病原菌検出・定量用プライマー対を用いた海苔壷状菌病病原菌の検出・定量について説明する。
【００５７】
壷状菌病罹病海苔葉体及び壷状菌遊走子から全ＤＮＡを抽出し、それらをＴＥ（１０mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）液に溶解した。そのうちの一部を用いてＰＣＲ反応を行った。Ｔａｑポリメラーゼとしては、Ｚ−ｔａｑポリメラーゼ（Takara社製）を用い、ＰＣＲバッファーは付属のものを用いた。ＰＣＲプライマー対は、
0615R（ 5’-ACACCATACTATTTCTGGCG-3’：配列番号９の塩基配列）
0179Ｆ（ 5’-AAAAACCCAACTGCTTGTCG-3’：配列番号１０の塩基配列）
からなるプライマー対（プライマー対Ａ）、
0599R（ 5’-GGCGTCAGCAGTTGGAACTA-3’：配列番号１３の塩基配列）
0179Ｆ（ 5’-AAAAACCCAACTGCTTGTCG-3’：配列番号１０の塩基配列）
からなるプライマー対（プライマー対Ｂ）、及び
1221F（ 5’-CGGTAGTAGGCGACACCATC-3’：配列番号１１の塩基配列）
1640R（ 5’-TCGCAATGAAGCAAAAAGAC-3’：配列番号１２の塩基配列）
からなるプライマー対（プライマー対Ｃ）を用いた。
ＰＣＲ反応液の組成は、５０μＬの反応液中にＺ−ｔａｑポリメラーゼ（2.5 U/μL）が0.5 μL、１０×Z-taq buffer(30 mM MgCl2含有)が5μL、dNTP mixture(各2.5 mM含有)が4 μL、鋳型DNAが10 ng、プライマーがそれぞれ最終濃度で0.2μMである。ＰＣＲ反応は、最初に９８℃、３分間の熱変性、次いで９８℃、１秒間の熱変性、５５℃、１０秒間のアニーリング、７２℃、２０秒間の伸長反応を４０サイクル、最後に７２℃、５分間の伸長反応を行った。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動に供され、分離された。電気泳動後、当該ゲルをエチジウムブロマイド染色液により染色し、トランスイルミネーターにより観察した。結果を図１に示す。
【００５８】
図１、２及び３から明らかなように、上記プライマー対Ａ、Ｂ及びＣは、鋳型ＤＮＡとして壷状菌病罹病海苔葉体全ＤＮＡ、壷状菌遊走子全ＤＮＡのいずれを用いた場合にも、特異的ＰＣＲ産物を増幅した。従って、プライマー対Ａ、Ｂ及びＣはいずれも海苔壷状菌病病原菌の検出・定量に用いることができることが明らかとなった。
【実施例２】
【００５９】
壷状菌の遊走子液を調製し、２０μｍのナイロンメッシュで壷状菌遊走子をろ過採取した。遊走子は海水を用いて任意の個数に希釈した。希釈に用いた海水は２種類を用いた。一方は、目合い１μｍのメッシュによってろ過された後に、オートクレーブ滅菌した海水（ここではろ過海水と呼ぶ）を用いた。他方は海苔漁場から採取され、紫外線により殺菌された海水（ここでは漁場海水と呼ぶ）を用いた。なお、サンプル海水中の壷状菌遊走子の個数は、海苔葉体と共に培養し、海苔葉体への壷状菌の感染数に基づき算出された。サンプル海水中の壷状菌遊走子は保留粒子径０．８μｍのメンブレンフィルター（ADVANTEC社製、K080A047A）を用いて回収され、ＤＮＡが抽出された。抽出されたＤＮＡはＴＥ（１０mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）液に溶解された。そのうちの一部のＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプライマー対としては、上記プライマー対Ａとが用いられた。ＰＣＲ反応条件は鋳型ＤＮＡ濃度以外は実施例１と同様である。結果を図４及び図５に示す。
【００６０】
図４及び図５から明らかなように、鋳型ＤＮＡ中の壷状菌遊走子由来ＤＮＡの増加にともなって、特異的なＰＣＲ産物が増加した。本実験において、壷状菌遊走子の希釈に用いた海水がろ過海水である場合の検出限界は、鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子１０個相当であり、壷状菌遊走子の希釈に用いた海水が漁場海水である場合の検出限界は、鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子３３３個相当であった。ろ過海水を用いた際の感度が、漁場海水を用いた際の感度と比較して高いことから、本発明にかかる検出・定量方法においては、海水中からの雑物を除去することにより測定・検出感度が上昇することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の海苔壷状菌病病原菌検出・定量方法を用いれば、簡便、迅速、確実且つ高感度に壷状菌の存在を検出・定量することができるので、壷状菌感染の発生前あるいは発生初期の段階で感染拡大阻止のための対策を講じることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】プライマー対Ａ及びＣを用いてＰＣＲ反応を行った際のＰＣＲ産物のアガロース電気泳動像である。レーンＭはサイズマーカー（pHY Marker）、レーン１は鋳型ＤＮＡが壷状菌病罹病海苔葉体全ＤＮＡでありプライマー対がプライマー対ＡであるＰＣＲ産物、レーン２は鋳型ＤＮＡが壷状菌遊走子全ＤＮＡでありプライマー対がプライマー対ＡであるＰＣＲ産物、レーン３は鋳型ＤＮＡが壷状菌病罹病海苔葉体全ＤＮＡでありプライマー対がプライマー対ＣであるＰＣＲ産物、レーン４は鋳型ＤＮＡが壷状菌遊走子全ＤＮＡでありプライマー対がプライマー対ＣであるＰＣＲ産物、レーン７は鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応液に添加していない際のＰＣＲ産物（ネガティブコントロール）を示す。黒三角は期待されるＰＣＲ産物のサイズを示す。
【図２】プライマー対Ｂを用いてＰＣＲ反応を行った際のＰＣＲ産物のアガロース電気泳動像である。レーンＭはサイズマーカー（100 bp DNA ladder、Takara社製）、レーン１は鋳型ＤＮＡが壷状菌病罹病海苔葉体全ＤＮＡであるＰＣＲ産物、レーン２は鋳型ＤＮＡが壷状菌遊走子全ＤＮＡであるＰＣＲ産物、レーン３は鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応液に添加していない際のＰＣＲ産物（ネガティブコントロール）を示す。黒三角は期待されるＰＣＲ産物のサイズを示す。
【図３】プライマー対Ａ及びＢを用いてＰＣＲ反応を行った際のＰＣＲ産物のアガロース電気泳動像である。レーンＭはサイズマーカー（100 bp DNA ladder、Takara社製）、レーン１は鋳型ＤＮＡが壷状菌病罹病海苔葉体全ＤＮＡでありプライマー対がプライマー対ＢであるＰＣＲ産物、レーン２は鋳型ＤＮＡが壷状菌遊走子全ＤＮＡでありプライマー対がプライマー対ＢであるＰＣＲ産物、レーン３は鋳型ＤＮＡが壷状菌病罹病海苔葉体全ＤＮＡでありプライマー対がプライマー対ＡであるＰＣＲ産物、レーン４は鋳型ＤＮＡが壷状菌遊走子全ＤＮＡでありプライマー対がプライマー対ＡであるＰＣＲ産物を示す。黒三角は期待されるＰＣＲ産物のサイズを示す。
【図４】ろ過海水により壷状菌遊走子を希釈した際のＰＣＲ産物のアガロース電気泳動像である。レーンＭはサイズマーカー（pHY Marker）、レーン１は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子３３３個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン２は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子１６７個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン３は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子２０個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン４は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子１０個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン５は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子５個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン６は鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応液に添加していない際のＰＣＲ産物（ネガティブコントロール）、レーン７は鋳型ＤＮＡとして壷状菌感染海苔葉体全ＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物（ポジティブコントロール）を示す。黒三角は期待されるＰＣＲ産物のサイズを示す。
【図５】漁場海水により壷状菌遊走子を希釈した際のＰＣＲ産物のアガロース電気泳動像である。レーンＭはサイズマーカー（pHY Marker）、レーン１は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子３３３個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン２は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子１６７個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン３は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子２０個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン４は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子１０個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン５は鋳型ＤＮＡとして壷状菌遊走子５個相当のＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物、レーン６は鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応液に添加していない際のＰＣＲ産物（ネガティブコントロール）、レーン７は鋳型ＤＮＡとして壷状菌感染海苔葉体全ＤＮＡを用いた際のＰＣＲ産物（ポジティブコントロール）を示す。黒三角は期待されるＰＣＲ産物のサイズを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１：１８ＳｒＤＮＡ−１
配列番号２：１８ＳｒＤＮＡ−２
配列番号３：１８ＳｒＤＮＡ−３
配列番号４：１８ＳｒＤＮＡ−４
配列番号５：１８ＳｒＤＮＡ−１  イントロン１
配列番号６：１８ＳｒＤＮＡ−１  エクソン１
配列番号７：１８ＳｒＤＮＡ−１  イントロン２
配列番号８：１８ＳｒＤＮＡ−１  エクソン３
配列番号９：壷状菌の１８ＳｒＤＮＡ−１を検出するためのプライマーとして機能するよう設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１０：壷状菌の１８ＳｒＤＮＡ−１を検出するためのプライマーとして機能するよう設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１１：壷状菌の１８ＳｒＤＮＡ−１を検出するためのプライマーとして機能するよう設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２：壷状菌の１８ＳｒＤＮＡ−１を検出するためのプライマーとして機能するよう設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１３：壷状菌の１８ＳｒＤＮＡ−１を検出するためのプライマーとして機能するよう設計されたオリゴヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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