(57)【要約】【課題】            カルシウム結合型発光蛋白質の保存方法、硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物、これに少なくとも吸水性高分子を加えた組成物、およびこれを含有する化粧料、並びにこれらにカルシウムイオンを含む水を接触または浸透させることにより達成される連続発光方法を提供する。【解決手段】        カルシウム結合型発光蛋白質溶液に硫安を添加した後に、凍結乾燥させることを特徴とする、カルシウム結合型発光蛋白質の保存方法。【選択図】          なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム結合型発光蛋白質溶液に硫安を添加した後に、凍結乾燥させることを特徴とする、カルシウム結合型発光蛋白質の保存方法。
【請求項２】
カルシウム結合型発光蛋白質がイクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインからなる群から選択される天然由来蛋白質または組換え蛋白質である、請求項１記載のカルシウム結合型発光蛋白質の保存方法。
【請求項３】
硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物。
【請求項４】
カルシウム結合型発光蛋白質がイクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインからなる群から選択される天然由来蛋白質または組換え蛋白質である、請求項３記載の硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物。
【請求項５】
請求項３または４記載の凍結乾燥物に、少なくとも吸水性高分子を加えた組成物。
【請求項６】
請求項５記載の組成物を含有する化粧料。
【請求項７】
請求項５記載の組成物または請求項６記載の化粧料に、カルシウムイオンを含む水を接触または浸透させることにより達成される連続発光方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質の保存方法、硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物、これに少なくとも吸水性高分子を加えた組成物、およびこれを含有する化粧料、並びにこれらにカルシウムイオンを含む水を接触または浸透させることにより達成される連続発光方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム結合型発光蛋白質は微量のカルシウムイオン（１０−８mole/liter  以上）と接触するだけで瞬間発光する。このように、カルシウム結合型発光蛋白質であるイクオリンのカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く、その発光感度もまた市販の検出装置においての検出限界が１ピコグラム以下と非常に高いものである。このため、イクオリンは、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムの動的変化のイメ−ジプローブとして好適に用いられている。また、イクオリンの発光がカルシウムイオンとの特異的結合による発光であるため、通常の化学発光で問題になるバックグランドがほとんどなく、且つ反応自体が瞬間発光で数秒以内に終了するため、短時間にＳ／Ｎ比（signal/noise ratio）のよいシグナルを得ることができるため、判断が容易であるという利点を有する。
【０００３】
ところが、蛋白質の濃縮および保存の操作は単純かつ補助的にみえて熟練を必要とし、こうした操作中に苦労して純化した蛋白質が失活、変性したり、腐敗したりすることがしばしば経験することであるように（例えば、非特許文献１参照）、カルシウム結合型発光蛋白質溶液でも同様に、低温で保存していても発光活性が失活してしまう。また、低温で乾燥が行えることから変性が少なく、諸性質を保持できるため、微生物保存試料を作製するときに凍結乾燥がよく使われるけれども、試料の変性を完全に妨げるわけではなく、凍結だけで活性を失う試料では凍結乾燥しても変性してしまうことが多い。また蛋白質を凍結乾燥する際には保護物質も種々用いられるが、凍結の場合によく用いられるグリセロールや多価アルコールは使われず、比較的高分子な糖類などが多く使われる（例えば、非特許文献２参照）。凍結乾燥して保存した場合でも、吸水させたカルシウム結合型発光蛋白質の発光活性は、吸水前の発光活性の半分以下に低下してしまう。そのため、カルシウム結合型発光蛋白質溶液の長期保存は容易ではない。
一方で、カルシウム結合型発光蛋白質溶液に硫安を添加することで、その保存安定性が増すことが知られている。しかし溶液であるため、その操作性の点で必ずしも十分とはいえず、その取扱いは容易なものではない。また、蛋白質を凍結乾燥する場合には、０．５Ｍ以上の無機塩が共存するときは、いったん透析またはゲル濾過で脱塩したのち凍結乾燥しないと、乾燥中に融け始め発泡することが多いことが知られている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
したがって、安定化剤である高濃度硫安の存在下でイクオリンを溶液状態で安定的に保存できることは知られているが、前述の通り、イクオリン溶液を凍結乾燥すると発光活性が半分以下に低下すること、および一般的に蛋白質は無機塩が存在すると凍結乾燥中に融け始め発泡することが多いことも知られているため、通常イクオリン溶液を凍結乾燥することは行われていない。そのため、イクオリン溶液を凍結乾燥した場合にも硫安が安定剤として機能することは知られておらず、ましてや、予想すらされていない。
このような状況下にあるため、取扱いが容易な状態で長期間に渡りカルシウム結合型発光蛋白質を安定に保存する方法が提供されることが強く望まれている。
【０００５】
上述の通り、カルシウム結合型発光蛋白質は微量のカルシウムイオン（１０−８mole/liter  以上）と接触するだけで瞬間発光するため、長時間連続的に発光させることはできなかった。例えば、イクオリンはカルシウムイオンと接触すると５秒以内に発光が終わる（例えば、非特許文献４参照）。そのためたとえ、カルシウム結合型発光蛋白質を単独で化粧料に含有させてもカルシウムイオンと接触すると直ちに瞬間発光をしてしまい、それ以降化粧料が発光することはない。
一方、長時間連続発光させる手段として、化学発光を利用することが考えられる。化学発光は、溶液中で長時間連続発光させることが比較的容易である。しかし、化学発光に関与する試薬（有機化合物及び無機化合物）や発光増強に関与する試薬（有機化合物）には、そのほとんどに発ガン性に関わる物質あるいは毒性に関わる発光基質が含まれる。例えば、ルミノール発光反応に使用されるトリシアン銅（I）酸カリウムは有毒なシアン化合物であり、反応ｐＨは水酸化ナトリウムを用いた強アルカリ系であり危険である。また、活性酸素の供給源として、１０％以上の高濃度である過酸化水素水を使用することも、生体には問題がある。また、ピロガロール（１,２,３-トリヒドロキシベンゼン）を用いた化学発光反応では、それ自身有毒である。化学発光の色を変える為や発光時間の持続のために使用されている増感剤フルオレセン化合物やローダミン関連化合物ローダミンＢ及びローダミンＢ６は発ガン性の指摘がされている（例えば、非特許文献５参照）。これらの増感剤すべてについて、発ガン性を有することが証明されているわけではないが、すべて芳香族化合物であり毒性は容易に推定できる。
そのため、生体に使用しても安全な生物発光系による簡易で長時間連続発光可能な部材（組成物）の提供が強く望まれている。また、これらの部材（組成物）を含有する化粧料の提供も望まれている。
【０００６】
【非特許文献１】社団法人日本生化学会編集,「生化学実験講座１  タンパク質の化学Ｉ  −分離精      製−」,東京化学同人,１９７７年,Ｐ．５５
【非特許文献２】社団法人日本生化学会編集,「基礎生化学実験法１  基本操作」,東京化学同人,      ２００１年,Ｐ．６６
【非特許文献３】社団法人日本生化学会編集,「生化学実験講座１  タンパク質の化学Ｉ  −分離精        製−」,東京化学同人,１９７７年,Ｐ．５８
【非特許文献４】今井一洋編集,「生物発光と化学発光  基礎と実験」,廣川書店,１９８９年,      Ｐ．３６−４９
【非特許文献５】Bassam, Z. Shakhashiri著（池本勲訳）,    「教師のためのケミカルデモンストレーション２：化学発光／錯体」丸善株式会社,      1９９７年,P.５５−６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、カルシウム結合型発光蛋白質の保存において変性が少なく長期の保存が可能なカルシウム結合型発光蛋白質の保存方法、およびその方法によって得られた凍結乾燥物を提供することである。また、長期間に亘って生物発光が可能な組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質溶液に硫安を添加した後に、凍結乾燥させることを特徴とする、カルシウム結合型発光蛋白質の保存方法である。
本発明は、前記方法により得られる、硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物である。
また本発明は、前記凍結乾燥物に少なくとも吸水性高分子を加えた組成物である。
さらに本発明は、前記組成物を含有する化粧料である。
また本発明は、前記組成物または化粧料に、カルシウムイオンを含む水を接触または浸透させることにより達成される連続発光方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の保存方法を用いることで、変性がほとんどない長期間保存可能なカルシウム結合型発光蛋白質が得られる。また、本発明の凍結乾燥物に少なくとも吸水性高分子を加えた組成物およびこれを含有する化粧料は、生物発光による長時間連続発光が可能である。さらに、生物発光を利用するものであるから、化学発光を利用するものに比べ、人体への影響は少なく安全である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質の溶液に硫安を添加した後に、凍結乾燥させることを特徴とする、カルシウム結合型発光蛋白質の保存方法である。また、この方法により得られる、硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物である。カルシウム結合型発光蛋白質としては、イクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインが好ましく、イクオリンが特に好ましい。これらのカルシウム結合型発光蛋白質は、天然由来蛋白質であると組換え蛋白質であるとを問わないが、大量生産を行う観点から、培養が比較的容易な組換え蛋白質であることが好ましい。また、後述するように化粧料やアミューズメント等の用途を目的とするので、生体に使用しても安全なようにこれらのカルシウム結合型発光蛋白質は粗精製物であるよりも、高純度精製物であることが好ましい。なお、カルシウム結合型発光蛋白質の培養方法および高純度精製物への精製方法については、組換えイクオリンを例として実施例において詳細に記載をしたので、これを参考に行えば当業者であれば容易に実施可能である。また、イクオリン以外のカルシウム結合型発光蛋白質についても、公知の方法により入手可能である。
【００１１】
本発明の保存方法において添加する硫安（硫酸アンモニウム）の量は、凍結乾燥させて保存しておいたカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物を解凍した際に、その発光活性が著しく低下することがない範囲の量であれば特に制限されるものではない。その量は、硫安を添加するカルシウム結合型発光蛋白質の溶液中の濃度によらず、溶液中の硫安の濃度にのみ依存する。すなわち硫安の濃度が、０．０１〜２．０Ｍの範囲であればよい。好ましくは０．５〜２．０Ｍの範囲である。より好ましくは１．０〜１．５Ｍの範囲である。
【００１２】
凍結乾燥は、当業者が通常行う方法によって行うことができる。たとえば、所定量の硫安を添加した所定濃度のカルシウム結合型発光蛋白質溶液を−８０℃で凍結させ、次いで凍結乾燥装置を用いてこれから水分を除去することで行える。こうして得られる硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物は保存安定性に優れ、長期間に亘りその発光活性を著しく低下させることなく保存することができる。具体的には、２年以上保存可能であった。すなわち、この凍結乾燥物を解凍し、ここにカルシウムイオンを含む水を添加して発光活性を測定しても凍結乾燥する前の発光活性とほぼ同じ値を示した。本発明の保存方法を用いれば、発光活性が低下する理由が考えられないことから、半永久的に発光活性を著しく低下させることなくカルシウム結合型発光蛋白質を保存することが期待できる。また、凍結乾燥物であることから、その取扱いやすさは、溶液のものに比べ著しく良好である。
【００１３】
本発明の組成物は、前記凍結乾燥物に少なくとも吸水性高分子を加えたものである。そして後述する通り、本発明の組成物にカルシウムイオンを含む水を接触または浸透させることにより、連続発光させることができる。その際、接触した水によって解凍されたカルシウム結合型発光蛋白質の溶液が、同様に接触した水を吸収中である吸水性高分子に速やかに浸透することで、吸水性高分子の細孔のより奥深くにまで浸透する。その結果、カルシウムイオンは表面のカルシウム結合型発光蛋白質とから先に接触し、順次発光するので、奥深くまでカルシウム結合型発光蛋白質が浸透していれば、それだけ長い時間連続発光をすることが可能となる。したがって吸水性高分子は、カルシウム結合型発光蛋白質が通過可能な細孔サイズを有するものであり、かつ、ゲル化したときにカルシウム結合型発光蛋白質による発光を確認可能な透明なものであれば特に制限されるものではない。
カルシウム結合型発光蛋白質の溶液が吸水性高分子に速やかに浸透するためには、カルシウム結合型発光蛋白質の分子が通過可能な細孔サイズを有する吸水性高分子を用いる必要がある。例えば、球状イクオリンは短軸方向に約２０×１０−１０ｍ(メートル)、長軸方向に約３０×１０−１０ｍの分子サイズである。一般に知られている吸水性高分子は、微細な細孔の吸水性高分子を除き、カルシウム結合型発光蛋白質が通過可能な細孔サイズを有している。また、カルシウムイオンはカルシウム結合型発光蛋白質よりもイオン半径が小さいため、カルシウム結合型発光蛋白質が通過可能であれば、ゲル化した吸水性高分子の細孔を容易に通過できる。
ゲル化した吸水性高分子が不透明であっても、論理的にはカルシウム結合型発光蛋白質により連続発光させることは可能である。しかし、それではゲル化した吸水性高分子の奥深くにカルシウム結合型発光蛋白質の溶液が浸透した場合に、目視による確認を行えない可能性があるため、吸水性高分子はゲル化したときにカルシウム結合型発光蛋白質による連続発光を確認可能な透明なものであることが好ましい。透明であれば、奥深くに浸透した場合であっても発光現象が起こっているか否かを目視で確認することも可能である。また、ゲル化した吸水性高分子は、透明であれば発光を確認できるので無色であると有色であるとを問わない。
【００１４】
本発明の組成物における吸水性高分子は、原料面から分類すると、でんぷん系、セルロース系、合成高分子系に分けられ、その何れを用いてもよい。合成高分子系には、ポリアクリル酸塩系、ポリビニルアルコール系、ポリアクリルアミド系、ポリオキシエチレン系があり、その何れを用いてもよい。好ましくは、ポリオキシエチレン系の吸水性高分子である。
また、本発明の組成物における吸水性高分子は、イオン基または親水基の種類から分類すると、アニオン系、カチオン系、両性系、非イオン系に分けられ、その何れを用いてもよい。アニオン系は、ポリアクリル酸塩系、ポリスルホン酸塩系、アクリル酸グラフト系、アクリル酸共重合系、その他に分けられ、その何れを用いてもよい。カチオン系は、４級アンモニウム塩系、その他に分けられ、その何れを用いてもよい。非イオン系は、ポリビニルアルコール系、ポリアクリルアミド系、ポリオキシエチレン系、その他に分けられ、その何れを用いてもよい。非イオン系では、好ましくはポリオキシエチレン系の吸水性高分子である。
これらの本発明の組成物における吸水性高分子は、その多くが市販されており、また、特許公開公報、非特許文献により文献公知であるので、当業者であれば容易に入手可能である。
【００１５】
本発明の組成物は、硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物に少なくとも吸水性高分子を加えたものであればよい。前記の通り、接触した水を吸収したカルシウム結合型発光蛋白質の溶液がゲル化した吸水性高分子に速やかに浸透することで、より長時間連続発光をすることが可能となる。つまり、吸水性高分子がカルシウム結合型発光蛋白質を含むゲルとなるため、これにカルシウムイオンを含有する水溶液を加えることで可能となる。このようなことから、硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物と吸水性高分子とが混合されている組成物が好ましい。より好ましくは、両者が均一に混合されているものである。また、速やかに浸透することでより長時間連続発光をすることが可能となることを考慮すると、吸水性高分子はパウダー状のものであることが好ましい。なお、パウダー粒子は微細なものであることがより好ましい。さらにパウダー状の吸水性高分子は、他の材料に練り込んだり、混ぜたりし易いので、化粧料用、アミューズメント用および玩具用に特に適している。
また、吸水性高分子の細孔サイズ、または吸水性高分子と硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物との割合をコントロールすることにより、暗闇では勿論、明るい場所でも肉眼で確認できる程に、本発明の組成物を連続的に発光させることができる。
【００１６】
本発明の組成物に、カルシウムイオンを含む水を接触または浸透させることで、組成物を連続発光させることができる。
本発明の組成物に接触または浸透させる水のカルシウムイオン濃度が高い場合には、発光強度は大きくなるけれども連続発光時間が短くなる。逆に、カルシウムイオン濃度が低い場合には、発光強度は大きくなるけれども連続発光時間は長くなる。また、連続発光時間はそのままで発光強度を大きくしたい場合には、組成物中のカルシウム結合型発光蛋白質濃度を高くし、かつ、接触または浸透させる水のカルシウムイオン濃度もそれに応じて高くすればよい。
【００１７】
本発明の組成物は、水分を含まない状態のままでも、またこれにカルシウムイオンを含まない水を加えて硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物を吸水性高分子に吸収させた状態でも使用することができる。
さらに本発明の組成物には、本発明の効果を損なわない範囲において、他の任意成分を適宜配合することができる。配合しうる任意成分としては、粉体、希釈剤、ゲル化剤、粘度調整剤、油剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、褪色防止剤、酸化防止剤、消泡剤、水溶性成分、美容成分、香料等などが挙げられる。
このようにして得られた組成物は、化粧料中に配合することができる。本発明の組成物が配合される化粧料の具体的な例としては、口紅、口紅オーバーコート、クリーム、乳液、化粧水、クレンジング、ファンデーション、ほほ紅、白粉、アイカラー、アイブロウ、アイライナー、マスカラ、リップクリーム、整髪料、メイクアップリムーバー、シャンプー、リンスなどがあり、また化粧料の形態としては、クリーム状、ゲル状、乳液状、液状、固形状等が挙げられる。
【００１８】
本発明の組成物およびこれを含有する化粧料は、生物発光による長時間連続発光が可能である。また、生物発光を利用するものであるから、化学発光を利用するものに比べ、人体への影響は少なく安全である。
したがって本発明の組成物は、アミューズメント、玩具に安心して（安全に）利用することが可能であり、かつ、長時間連続して発光させることが可能である。また、発光を開始させる際に、身近に存在する水道水を利用することが可能であるので、利便性においても優れるものである。
また本発明の組成物は、口紅、口紅オーバーコート、クリーム、乳液、化粧水、クレンジング、ファンデーション、ほほ紅、白粉、アイカラー、アイブロウ、アイライナー、マスカラ、リップクリーム、整髪料、メイクアップリムーバー等の化粧料に配合することにより、人体への影響が少なく安全でありながら、汗や人体表面に存在するカルシウムイオンにより連続発光する化粧品を提供することができる。
【００１９】
そして、例えば後述の表１に示したように、１.２Ｍ硫安を含むイクオリン溶液を凍結乾燥処理しても、その活性が保持されることは明らかである。また、生分解性能が高く化粧用素材として用いられているセルロース系のセルフローＴＡ２５（商品名：チッソ社製）のパウダーは、イクオリンとの混合時にほとんど発光活性がないことが明らかである。この結果から、凍結乾燥させたイクオリンを調製した後に、パウダー粒子と混合させることで、さらにイクオリンを安定化させ、かつカルシウムイオンとの反応を制御することが可能であることがわかる。
【実施例１】
【００２０】
（イクオリンの製造）    
１）組換えアポイクオリンの大腸菌での発現
大腸菌においてアポイクオリンを発現させるために、イクオリン遺伝子を包含するｐＡＱ４４０（特開昭６１−１３５５８６号公報）から構築した、アポイクオリン遺伝子発現ベクターｐｉＰ−ＨＥ（特開平１−１３２３９７号公報）を用いた。宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、常法によりｐｉＰ−ＨＥで該菌株を形質転換した。得られた形質転換株を３０℃で一晩培養後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する５０ｍｌのＬＢ液体培地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７.２）に植菌し、さらに３０℃で８時間培養した。次いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地２Ｌに添加し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。培養後、菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）によって分離した。菌体および培養液はともに発現したアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料とした。
【００２１】
２）菌体からのイクオリンの精製
集菌した菌体を、還元剤であるジチオスレイトール（和光純薬社製）２００ｍｇを含む４００ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液中に懸濁させ、氷冷下において超音波破砕装置で２分間処理して菌体を破砕し、１２０００×ｇで２０分間遠心後、上澄み液を集めた。得られた上澄み液に化学合成したセレンテラジンを産生アポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように少量のメタノールに溶かしこみ、４℃で５時間以上放置した。この上澄み液を直ちに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２ｃｍ×１０ｃｍ）に添加してイクオリンを吸着させ、カラムから溶液の２８０ｎｍでの吸光度が０.０５以下になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７.６でカラムを洗浄した。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオリン画分を０.１Ｍ−ＮａＣｌ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出させた。
【００２２】
再生イクオリンと未再生のアポイクオリンとの分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファーストフローゲルを用いて行った。即ち、Ｑ−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液を、硫酸アンモニウムの最終濃度が２Ｍになるように調整した。次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、その上澄み液を、２Ｍ−硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６で平衡化したブチルセファロース４ファーストフローカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２ｃｍ×８ｃｍ）に通し、硫酸アンモニウム濃度１Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の再生イクオリン画分を収集した。
一方、未再生のアポイクオリンは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６でのみ溶出された。再生イクオリン画分について、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。その結果、精製画分について分子量２５ｋＤａ蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約８０％で、８０ｍｇの高純度イクオリンを得た。
【００２３】
３）培養液からのイクオリンの精製
培養液からの高純度アポイクオリンの精製は、特開平１−１３２３９７号公報に記載の方法に従って実施した。即ち、培養液を酸性化処理してｐＨ５以下にし、４℃で放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液に溶解させた。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同様にイクオリンへの再生後、Ｑ−セファロ−スカラムクロマト法、ブチルセファロース４ファーストフローカラムクロマト法を用いて、純度９８％以上のイクオリンを取得した。得られた精製イクオリンについて、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、分子量２５ｋＤａ蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。培養液より得られたアポイクオリン５０ｍｇから高純度イクオリン４５ｍｇを得た。
【実施例２】
【００２４】
（硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物の調製）    
実施例１の操作を繰り返すことで得た高純度イクオリン１４０μｇを含む ５０ μｌ溶液を、イムノアッセイ用チューブ  （７５×１２ｍｍ、ヌンク社製：カタログ番号４７５４７７）に移し、このときの発光をチューブごとアトー社製のルミノメーター  モデルＡＢ２２００で測定した。次に凍結乾燥させるべく、チューブを−８０℃で１０分間放置して凍結を行い、常法により凍結乾燥装置（東京理科社製、フリーズドライヤーＦＤ−８１）で６時間凍結乾燥を行った。凍結乾燥直後の硫安を含むイクオリン溶液の凍結乾燥物の発光量を測定したが、発光装置のバックグランド値と同じ値を示し、ほとんど発光は検出されなかった（表１）。すなわち、硫安を含むイクオリン溶液から水を除去することで、発光反応の制御が可能であることがわかった。安定な保存方法として有効であった。
なお比較のために、硫安を含まないイクオリン溶液についても同様の操作を行った。
【００２５】
【表１】
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【実施例３】
【００２６】
（吸水後の発光活性の確認）    
実施例２で調製した硫安を含むカルシウム結合型発光蛋白質溶液の凍結乾燥物の全量を乳鉢でよくかき混ぜほぐした後、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ を含む３０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．６)  緩衝液２ｍｌを加え、室温（２０〜３０℃）で、 ６０分間放置した。放置後の発光活性を前記と同様の方法で測定した。表１に示した通り、凍結乾燥物よりは大きい値を示すものの、それ程大きな値ではなかった。
次に、ここに過剰なカルシウムを添加することにより、イクオリンの発光特性である瞬間発光（Ｉｍａｘ）を測定した。
【実施例４】
【００２７】
（前記凍結乾燥物に少なくとも吸水性高分子を加えた組成物の調製）    
白色粉体である実施例２で得られたイクオリン−吸水性高分子の凍結乾燥物の全量を乳鉢でよくかき混ぜほぐした後、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ を含む３０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．６)  緩衝液２ｍｌを加え、室温（２０〜３０℃）で、 ６０分間放置して、吸水性高分子の膨潤をはかった。すなわち、緩衝液を吸収させた。その結果、イクオリン−吸水性高分子の凍結乾燥物が膨潤した物（以下「イクオリン−吸水性高分子膨潤複合体」という。）を得た。膨潤直後に、イクオリン−吸水性高分子膨潤複合体について、その発光量を同様に測定した。その結果、イクオリンを吸水性高分子に浸透させた時に比べ、明らかに強い連続発光が観察された（表１）。これは、吸水性高分子の製造過程で吸水性高分子自身に不純物として含まれていた微量のカルシウムイオンが、吸水性高分子が膨潤する過程で吸水性高分子より放出され、これがイクオリンと反応して発光した可能性がある。イクオリン−吸水性高分子膨潤複合体の性状を表１に示した。イクオリン−吸水性高分子膨潤複合体は、吸水性高分子の分子サイズにより様々な性状を示す。したがって、吸水性高分子を適宜選択することで様々な使用目的に対応することが可能である。
【実施例５】
【００２８】
（イクオリン−吸水性高分子膨潤複合体の発光測定）    
次に、イクオリン−吸水性高分子膨潤複合体に過剰なカルシウムを添加することにより、イクオリンの発光特性である瞬間発光（Ｉｍａｘ）を測定した。
具体的には、実施例５の方法で調製した０．１ｍｌのイクオリン−吸水性高分子膨潤複合体を、調製時（０時間）の溶液と４８時間室温（２０〜３０℃）で放置した後の溶液に、０．３ｍｌの５０ｍＭ塩化カルシウム溶液（３０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ７．６）を添加し、瞬間発光量（Ｉｍａｘ）をアトー社製のルミノメーター  モデルＡＢ２２００で測定した。その結果を表１に示した。明らかに、本来イクオリンの持つ瞬間発光のパターンを示し、その発光量も十分に保持していた。一方、コントロールとして用いた吸水性高分子未処理且つイクオリンの安定化剤である高濃度硫安の非存在下サンプルでは、イクオリンは著しく活性が低下していた。このことにより、吸水性高分子添加および凍結乾燥処理する方法は、安定化剤である高濃度（１．０〜１．５Ｍ）硫安の存在下でイクオリンを溶液状態で保存する通常行われる方法と同様に、イクオリンの安定的保存方法として有効であることが明らかとなった。したがって、イクオリン−吸水性高分子の凍結乾燥物および膨潤複合体は、固体粉末による保存およびカルシウムによる瞬間発光のための固体素材としても提供できることが明らかとなった。また上記の通り、安定化剤である高濃度硫安の存在下でイクオリンを溶液状態で安定的に保存できることは知られていたが、イクオリン溶液を凍結乾燥した場合にも硫安が安定剤として機能することは知られていなかった。ましてや、予想すらされていなかった。ところが、表１に示した通り、イクオリン溶液に硫安を添加した後に、凍結乾燥させたところ、イクオリンを安定的に保存することができた。すなわち、硫安を含むイクオリン溶液の凍結乾燥物に、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ を含む３０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．６)  緩衝液２ｍｌを加えたら、発光活性を示した。
【実施例６】
【００２９】
（イクオリン−吸水性高分子の凍結乾燥物の長期保存試験）    
イクオリン−吸水性高分子の凍結乾燥物を、４℃および−８０℃の各々の温度で保存した。これらを室温に戻した後、その一部を抜き出して実施例６に記載の方法によって測定し、その瞬間発光量から活性を算出した。その結果、４℃では保存開始から３ヶ月経過しても、−８０℃では保存開始から６ヶ月経過しても、９０％以上の活性保持が認められ、安定的長期保存可能であることを確認した。このことから、イクオリン−吸水性高分子の凍結乾燥物を、カルシウムイオンの存在下にイクオリンを連続発光させる固体素材としても提供できることが明らかとなった。
【実施例７】
【００３０】
（セルロース系吸水性高分子−粉末イクオリン混合物の調製と発光）    
イクオリン２５ｍｇを含む１．２Ｍ硫安３．５ｍｌを凍結乾燥させて、黄色粉末状のイクオリンを得た。次いで、これを乳鉢で微細化させた後、セルフローＴＡ２５（商品名：チッソ社製）２５ｇとよく混合させ、セルロース系吸水性高分子−粉末イクオリン混合物を調製した。セルロース系吸水性高分子−粉末イクオリン混合物を暗所にて、水道水の入った容器内に振り掛けたところ、イクオリンパウダー単独では３０秒以内で発光が終わるのに対して、5分以上の十分な発光を肉眼で確認できた。すなわち、セルロース系吸水性高分子−粉末イクオリン混合物は、固体でありながらイクオリン−吸水性高分子膨潤複合体と同等な性能を有することを確認することができた。