(57)【要約】【課題】  新規乳酸菌、それを用いた動物用栄養組成物およびその製造法を提供することにある。【解決手段】新規乳酸菌は、エンテロコッカスＳＴ２（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８６）として寄託されている。本新規乳酸菌をブドウ糖液で培養した培養液を、細菌性下痢（水溶性下痢）に感染した哺乳子豚延べ２０頭に、１ｃｃを経口投与した。  投与２４時間後に１４頭（７０％）が完治した。６頭（３０％）については、軟便症状が続いたが、４８時間後にはすべての哺乳子豚が完治した。【選択図】  図１
2005168302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の菌学的性質を有するエンテロコッカス属に属する新規乳酸菌。
試験項目                                試験結果
１．形態                          ：  連鎖球菌＊１
２．グラム染色性                  ：  ＋
３．胞子                          ：  −
４．運動性                        ：  −
５．酸素に対する態度              ：  通性嫌気性
６．カタラーゼ                    ：  −
７．グルコースからのガスの生成    ：  −
８．生成乳酸                      ：  Ｌ（＋）
９．１０℃での生育                ：  ＋
１０．４５℃での生育                ：  ＋
１１．５０℃での生育                ：  −
１２．６．５％NaCl存在下での生育    ：  ＋
１３．ｐＨ９．６での生育            ：  ＋
１４．４０％胆汁存在下での生育      ：  ＋
１５．黄色色素の生成                ：  −
１６．アルギニンジヒドロラーゼ      ：  ＋
１７．馬尿酸の加水分解              ：  −
１８．エスクリンの加水分解          ：  ＋
１９．０．１％メチレンブルーミルクでの生育  ：  ＋
２０．酸の生成
Ｄ−キシロース              ：  −
Ｌ−ラムノース              ：  −
シュークロース              ：  ＋
ラクトース                  ：  ＋
メリビオース                ：  ＋
ラフィノース                ：  ＋
メレチトース                ：  −
グリセロール                ：  −
アドニトール                ：  −
ソルビトール                ：  −
マンニトール                ：  −
菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（mol％）＊２    ：  ３８
＊１  写真−１
＊２  ＨＰＬＣ法によった。
【請求項２】
請求項１の新規乳酸菌を含有した動物用栄養組成物。
【請求項３】
さらに酵母、酵母細胞壁およびキノコ菌糸体のうち少なくとも一種を含有した請求項１または２の動物用栄養組成物。
【請求項４】
前記新規乳酸菌と、酵母および／または酵母細胞壁あるいはキノコ菌糸体との比が重量比で、４０〜９０：６０〜１０である請求項３の動物用栄養組成物。
【請求項５】
さらにキトサンを含有した請求項２〜４の動物用栄養組成物。
【請求項６】
前記新規乳酸菌とキトサンの比が重量比で、９９．０〜９９．９：１．０〜０．１である請求項５の動物用栄養組成物。
【請求項７】
キトサンが、甲殻類由来のもの、および／または微生物由来のものである請求項５または７の動物用栄養組成物。
【請求項８】
前記新規乳酸菌と酵母および／または酵母細胞壁とキトサンとの比が重量比で、４０．０〜９０．０：５９．０〜９．１：１．０〜０．１あるいは３９．９〜８９．０：６０．０〜１０．０：１．０〜０．１である請求項５の動物用栄養組成物。
【請求項９】
動物が家畜である請求項２〜８のいずれかの動物用栄養組成物。
【請求項１０】
家畜が豚である請求項８の動物用栄養組成物。
【請求項１１】
請求項１の新規乳酸菌を用いてヨーグルト状物を形成して動物用栄養組成物を製造する動物用栄養組成物の製造方法。
【請求項１２】
さらに酵母、酵母細胞壁およびキノコ菌糸体を添加する請求項１１の動物用栄養組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記新規乳酸菌と酵母および／または酵母細胞壁あるいはキノコ菌糸体とを重量比で、４０〜９０：６０〜１０で添加する請求項１２の動物用栄養組成物の製造方法。
【請求項１４】
前記ヨーグルト状物にキトサンを添加する請求項１１〜１３の動物用栄養組成物の製造方法。
【請求項１５】
前記新規乳酸菌とキトサンの比が重量比で、９９．０〜９９．９：１．０〜０．１である請求項１４の動物用栄養組成物の製造方法。
【請求項１６】
キトサンが、甲殻類由来のもの、および／または微生物由来のものである請求項１４または１５の動物用栄養組成物の製造方法。
【請求項１７】
前記新規乳酸菌と酵母および／または酵母細胞壁とキトサンとを重量比で、４０．０〜９０．０：５９．０〜９．１：１．０〜０．１あるいは３９．９〜８９．０：６０．０〜１０．０：１．０〜０．１で添加する請求項１４の動物用栄養組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する新規乳酸菌およびそれを含有する動物用栄養組成物ならびにその製造方法属に属する新規乳酸菌、微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活の欧風化に伴った食肉の需要増大と食肉の自由化に対応するに、食肉の生産性向上が課題となっている。その方策の一つとして飼育密度を高めた多頭化飼育が試みられているが、これが飼育環境を悪化させてストレスとなり、下痢、軟便を起こして却って、生産性の低下を招くことが多かった。特に、離乳期の幼畜では急激な環境の変化と相俟ってこの傾向が強く、この時期の発育不良は全成育期間に亘っての成長速度に悪影響を及ぼし、飼料効率の低下、成育期間の延長などを招く結果となっている。
【０００３】
かかる問題点の改善に、従来、抗生物質、抗菌物質の投与が行われてきた。しかし、これら薬剤は添加し得る飼料の種類及び添加量が厳しく制限されているだけでなく、最近は食肉への残存が懸念されるようになり、これら薬剤によらない飼料による飼育が緊急事として開発が切望されている。またこの作用機構としては腸内の有用菌の増加または有害菌の抑制によって下痢、軟便を抑制する方式が有力とされている。
【０００４】
ところで、人間の栄養においては、プロバイオティクスは、充分に経口摂取した場合には健康促進効果を示す生存微生物と規定されている（J．Nutr．130：384S〜390S，2000、M．E．Sanders）。
【０００５】
近年、家畜の栄養のためにプロバイオティクスがますます注目されてきている。プロバイオティクスのために通常使用される規定は、R．Fullerのそれであり（Journal  of  Applied  Bacteriology  1989、66、365−378）、それによると該バイオテックスは餌添加物として加えられ、そして良好なフローラが“平衡維持”されるので、宿主動物のために有益な作用を示す微生物を含有している。この規定の表現は、プロバイオティクスの作用の根底になるメカニズムが如何に僅かしか知られていないかを明らかにしている。
【０００６】
プロバイオティクスは微生物組成物が消化管のいたるところでプラスの影響を及ぼすように、農業家畜栄養で使用されている（例えばAsian−Aus．，J．Anim．Sci．，2000、第１３巻、No．１、第86〜95頁参照）。しかしながらプロバイオティクスによる能力の向上は飼料用抗生物質のレベルに達していない。抗生物質と反対にバクテリアの特定の代謝生成物、又は微生物に阻害又は致命的な作用をする菌類が問題ではなく、反対に、通常まだ生存しており、消耗されそして微生物叢（microflora）の組成変化によって農業家畜の能力を向上させるのに役立ち得る微生物自体である。
【０００７】
かかる添加物によって達成できる改善は抗生物質的に活性の物質ほどに大きくはない。３〜６％の程度の成長（増加）及び飼料転換率の改善が現実的に生じる（H．Jeroch等、Ernaehrung  landwirtschaftlicher  Nutztiere（1999），第390頁）。
重量増加および飼料転換率へ逆の影響を及ぼし得る因子には下痢の発生もある。この点についてはKirchgessner等（Arch．Anim．Nutr．，1993、第４４巻、第111−121頁）は、バチルス・セレウス調製物の色々な投与量で下痢の発生頻度にあまり影響がないことを発見した。反対に別の著者はＢ．セレウス・トヨイ（B．cereus  toyoi）（lbenおよびLeibetseder，Tieraerztl．Mschr．76（1989）、第363−366頁、Ostag  Vienna出版社）、Ｂ．セレウス・リフェニホルミスおよびＢ．セレウス（Kyriakis等、Reseanch  in  Veterinary  Science  1999，67，第223−228頁）およびエンテロコッカス・フェシム（Enterococcus  faecium）（MaennerおよびSpieler，Microecology  and  Therapy，第２６巻、243−256頁、1997）の添加によって下痢の発生が統計的に減少することが確認されたことを開示している。多くの最近の文献（O．Simon，G  Breves，第六回豚および家禽栄養学会（６th  Pig  and  Poultry  Nutritionmeeting）、2000、回報、第45−50頁）では、効果が不明瞭でありそして統計的立証が困難である。例えば養豚での重量増加＞１％の向上は、全部で２３回の試験で１４回だけしか認められなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本願の発明者らは、動物特に豚の育成に有用な新菌株を求めて鋭意探索したところ、豚等の動物の育成に極めて有効な新規乳酸菌を豚の腸内から分離することに成功した。
本発明の課題は、これに基づき新規乳酸菌、それを用いた動物用栄養組成物およびその製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、下記構成（１）〜（１７）の本発明によるエンテロコッカス属に属する新規乳酸菌およびそれを含有する動物用栄養組成物ならびにその製造方法により達成される。
（１）下記の菌学的性質を有するエンテロコッカス属に属する新規乳酸菌。
試験項目                                試験結果
１．形態                          ：  連鎖球菌＊１
２．グラム染色性                  ：  ＋
３．胞子                          ：  −
４．運動性                        ：  −
５．酸素に対する態度              ：  通性嫌気性
６．カタラーゼ                    ：  −
７．グルコースからのガスの生成    ：  −
８．生成乳酸                      ：  Ｌ（＋）
９．１０℃での生育                ：  ＋
１０．４５℃での生育                ：  ＋
１１．５０℃での生育                ：  −
１２．６．５％NaCl存在下での生育    ：  ＋
１３．ｐＨ９．６での生育            ：  ＋
１４．４０％胆汁存在下での生育      ：  ＋
１５．黄色色素の生成                ：  −
１６．アルギニンジヒドロラーゼ      ：  ＋
１７．馬尿酸の加水分解              ：  −
１８．エスクリンの加水分解          ：  ＋
１９．０．１％メチレンブルーミルクでの生育  ：  ＋
２０．酸の生成
Ｄ−キシロース              ：  −
Ｌ−ラムノース              ：  −
シュークロース              ：  ＋
ラクトース                  ：  ＋
メリビオース                ：  ＋
ラフィノース                ：  ＋
メレチトース                ：  −
グリセロール                ：  −
アドニトール                ：  −
ソルビトール                ：  −
マンニトール                ：  −
菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（mol％）＊２    ：  ３８
＊１  写真−１
＊２  ＨＰＬＣ法によった。
（２）  上記（１）の新規乳酸菌を含有した動物用栄養組成物。
（３）  さらに酵母、酵母細胞壁およびキノコ菌糸体のうち少なくとも一種を含有した上記（１）または（２）の動物用栄養組成物。
（４）  前記新規乳酸菌と、酵母および／または酵母細胞壁あるいはキノコ菌糸体との比が重量比で、４０〜９０：６０〜１０である上記（３）の動物用栄養組成物。
（５）  さらにキトサンを含有した上記（２）〜（４）の動物用栄養組成物。
（６）  前記新規乳酸菌とキトサンの比が重量比で、９９．０〜９９．９：１．０〜０．１である上記（５）の動物用栄養組成物。
（７）  キトサンが、甲殻類由来のもの、および／または微生物由来のものである上記（５）または（７）の動物用栄養組成物。
（８）  前記新規乳酸菌と酵母および／または酵母細胞壁とキトサンとの比が重量比で、４０．０〜９０．０：５９．０〜９．１：１．０〜０．１あるいは３９．９〜８９．０：６０．０〜１０．０：１．０〜０．１である上記（５）の動物用栄養組成物。
（９）  動物が家畜である上記（２）〜（８）のいずれかの動物用栄養組成物。
（１０）  家畜が豚である上記（８）の動物用栄養組成物。
（１１）  上記（１）の新規乳酸菌を用いてヨーグルト状物を形成して動物用栄養組成物を製造する動物用栄養組成物の製造方法。
（１２）  さらに酵母、酵母細胞壁およびキノコ菌糸体を添加する上記（１１）の動物用栄養組成物の製造方法。
（１３）  前記新規乳酸菌と酵母および／または酵母細胞壁あるいはキノコ菌糸体とを重量比で、４０〜９０：６０〜１０で添加する上記（１２）の動物用栄養組成物の製造方法。
（１４）  前記ヨーグルト状物にキトサンを添加する上記（１１）〜（１３）の動物用栄養組成物の製造方法。
（１５）  前記新規乳酸菌とキトサンの比が重量比で、９９．０〜９９．９：１．０〜０．１である上記（１４）の動物用栄養組成物の製造方法。
（１６）  キトサンが、甲殻類由来のもの、および／または微生物由来のものである上記（１４）または（１５）の動物用栄養組成物の製造方法。
（１７）前記新規乳酸菌と酵母および／または酵母細胞壁とキトサンとを重量比で、４０．０〜９０．０：５９．０〜９．１：１．０〜０．１あるいは３９．９〜８９．０：６０．０〜１０．０：１．０〜０．１で添加する上記（１４）の動物用栄養組成物の製造方法。
【００１０】
この新規乳酸菌の菌学的性質の試験および分類は、下記の文献に従い行なった。
１）Sneath,P.H.A., Mair,N.S., Sharpe,M.E. and Holt,J.G. : “Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology” Vol.2(1986) Williams & Wilkins.
２）Holt,J.G., Krieg,N.R., Sneath,P.H.A., Staley,J.T. and
Williams,S.T. : “Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology” Ninth Edition(1994) Williams & Wilkins.
３）厚生省生活衛生局監修：“食品衛生検査指針−微生物編−”(1990)日本食品衛生協会．
４）Farrow,J.A.E. and Collins,M.D. : Int.J.syst.Bacteriol.,
35, 73-75(1985).
５）Collins,M.D., Farrow,J.A.E., Kilpper-B&auml;ls,R. and
Schleifer,K.H. : Int.J.Syst. Bacteriol., 34, 220-223(1984).
６）Schleifer,K.H. and Kilpper-B&auml;ls,R. : Int. J.Syst.
Bacteriol., 34, 31-34(1984).
【００１１】
その結果、その微生物は、そのＤＮＡ分析からエンテロコッカス属に属する同定されたが、２連球の割合が９０％近くにのぼること、水酸化ナトリウムにてｐＨ１２に調整したＬＢ培地にてわずかな生育が確認され、特に強いアルカリ性耐性を備えていること、５５４ｎｍの光を当てると赤色の蛍光を発生するという他のエンテロコッカスにはない性質を有しているので、新規乳酸菌であることが確認された。当該新規乳酸菌は、エンテロコッカスＳＴ２（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８６）として工業技術院生命工学工業技術研究所微生物寄託センターに寄託されている。
【００１２】
以下、本発明の新規乳酸菌の菌学的性質を説明する。
本発明のエンテロコッカス属に属する新規乳酸菌は、下記の菌学的性質を有する。
試験項目                                試験結果
１．形態                          ：  連鎖球菌＊１（図１の写真参照）
２．グラム染色性                  ：  ＋
３．胞子                          ：  −
４．運動性                        ：  −
５．酸素に対する態度              ：  通性嫌気性
６．カタラーゼ                    ：  −
７．グルコースからのガスの生成    ：  −
８．生成乳酸                      ：  Ｌ（＋）
９．１０℃での生育                ：  ＋
１０．４５℃での生育                ：  ＋
１１．５０℃での生育                ：  −
１２．６．５％NaCl存在下での生育    ：  ＋
１３．ｐＨ９．６での生育            ：  ＋
１４．４０％胆汁存在下での生育      ：  ＋
１５．黄色色素の生成                ：  −
１６．アルギニンジヒドロラーゼ      ：  ＋
１７．馬尿酸の加水分解              ：  −
１８．エスクリンの加水分解          ：  ＋
１９．０．１％メチレンブルーミルクでの生育  ：  ＋
２０．酸の生成
Ｄ−キシロース              ：  −
Ｌ−ラムノース              ：  −
シュークロース              ：  ＋
ラクトース                  ：  ＋
メリビオース                ：  ＋
ラフィノース                ：  ＋
メレチトース                ：  −
グリセロール                ：  −
アドニトール                ：  −
ソルビトール                ：  −
マンニトール                ：  −
菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（mol％）＊    ：  ３８
＊  ＨＰＬＣ法によった。
【００１３】
培養方法
本発明の新規乳酸菌は、ＢＣＰ加寒天培地あるいはＭＲＳ寒天培地表面に、白金耳を用いて菌をかき取り、画線し、培養温度３７℃で４８時間静置培養することによって培養する。
【００１４】
保存方法
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した１０％スキムミルク中にＢＣＰ加寒天培地あるいはＭＲＳ寒天培地上の菌を白金耳でかき取って植えつけ、３７℃で４８時間保温する。カゼインの凝固を確認した後、滅菌したグリセリンを等量加えてよく撹拌し、マイナス８０℃の低温槽中で凍結保存する。
本発明の動物用栄養組成物は、以下に示す方法で形成されたヨーグルト状物として提供されることが望ましい。
【００１５】
ヨーグルト状動物用栄養組成物の製造方法
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した１０％スキムミルク３ｍｌ中に、ＢＣＰ加寒天培地あるいはＭＲＳ寒天培地で培養した本新規乳酸菌を白金耳でかき取って植えつけ、３７℃で４８時間保温する。カゼインの凝固が確認されれば、さらに１０％スキムミルク１００ｍｌ中に凝固物３ｍｌを加え、３７℃で保温の後、カゼインの凝固を確認する。このように、次第に１０％スキムミルクの堆積規模を大きくすれば、ヨーグルトを大量に製造することができる。
【００１６】
本発明の新規乳酸菌は、製造したヨーグルト状動物用栄養組成物１ｍｌ中に、３．８〜１．１×１０９個程度含まれている。
この新規乳酸菌は、バクテリオシンを生産して、有害細菌の生育を抑制したり、また、新規乳酸菌の細胞壁は腸管細胞を刺激して、免疫能を活性化する作用があることが予想される。以上の作用により、この新規乳酸菌を動物に摂取させることにより、動物、特に豚の育成効果を高めているものと思われる。
【００１７】
本発明の動物用栄養組成物は、さらに酵母、酵母細胞壁およびキノコ菌糸体の少なくとも一種を添加、含有していることが好ましい。本動物用栄養組成物を摂取した動物の免疫賦活力が増すからである。
酵母としては、Saccharomyces（サッカロミセス）属に属する酵母等、例えばビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、パン酵母等、あるいは海洋酵母等を用いることが好ましく、またキノコ菌糸体としては、アガリクス菌糸体、メシマコブ菌糸体シイタケ菌糸体等を用いることができる。酵母細胞壁としては、上記酵母の細胞壁を用いることができる。これらの添加により、解毒作用が発揮される。
【００１８】
上記新規乳酸菌と酵母および／または酵母細胞壁の比が重量比で、４０〜９０：６０〜１０、好ましくは５０〜９０：５０〜１０、さらに好ましくは７０〜８０：３０〜２０である。新規乳酸菌の量が上記範囲未満であると、菌の効果が上がらなくなる傾向があり、酵母等の量が上記未満であると、解毒作用が上がらなくなる傾向がある。
【００１９】
本発明の動物用栄養組成物は、さらに水溶性キトサンを含有していることが好ましい。
本キトサンは、甲殻類（カニ、エビ、イカ等）由来のもの、微生物（ケカビ）由来のもの等であることが好ましい。
このキトサンを添加する理由は、特に、豚の肉質を改善するためである。
上記前記新規乳酸菌とキトサンの比が重量比で、９９．０〜９９．９：１．０〜０．１、好ましくは９９．３〜９９．８：０．７〜０．２である。キトサンの量が上記範囲未満であると、肉質の改善がみられなくなる傾向があり、範囲を超えると、発育が悪くなる傾向がある。
【００２０】
上記３種を混合する場合、新規乳酸菌と酵母細胞壁とキトサンとの比は重量比で、４０．０〜９０．０：５９．０〜９．１：１．０〜０．１あるいは３９．９〜８９．０：６０．０〜１０．０：１．０〜０．１とすることが好ましい。
【実施例】
【００２１】
次に、本発明の実施例について説明する。
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した１０％スキムミルク３ｍｌ中に、ＢＣＰ加寒天培地で培養した本新規乳酸菌を白金耳でかき取って植えつけ、３７℃で４８時間保温した。カゼインの凝固が確認されたので、さらに１０％スキムミルク１００ｍｌ中に凝固物３ｍｌを加え、３７℃で保温の後、カゼインの凝固を確認した。以上を繰り返し、１０％スキムミルクの体積規模を大きくし、１００ｋｇのヨーグルト状物（以下、本乳酸菌と称す）を製造した。また、細胞壁として、ビール酵母のものを、また、キトサンとしては、カニ由来の水溶性キトサンを準備した。そして、比較用として、市販のヨーグルト（市販乳酸菌と称す）を準備した。
以上の本乳酸菌、細胞壁、キトサンを重量比で表１のような割合で混合し、動物用栄養組成物のサンプルを作成した。
【００２２】
実施例１
床がコンクリートである養豚場において、実験開始体重３０Ｋｇの子豚４４頭（雌２２頭、去勢２２頭）を７組の実施例区１〜７と４組の対照区１〜４と，に分け、１組雌２頭、去勢２頭として実験用飼料を与えて２０日飼育した。実施例区および対照区の実験用飼料の配合は、市販配合飼料〔原料：穀類（とうもろこし、マイロ）：７２％、植物性油かす類（大豆油かす、なたね油かす）：２３％、動物質性飼料（魚粉）：１％、その他（動物性油脂、糖蜜、食塩、炭酸カルシウム）：４％、成分：粗タンパク質：１６．０％以上、粗脂肪：２．５％以上、粗繊維：４．０％以下、粗灰分：７．５％以下、カルシウム：０．６０％以上、りん：０．５０％以上、ＴＤＮ：７８．０以上〕１０００ｋｇに対してサンプルの動物用栄養組成物を４ｋｇとなるようにした。
飼料、水は不断給与とし、飼育管理は通常養豚場で行われている方法に従った。検査項目として、飼育終了時の体重を測定して増体重を求め，一日の平均体重増、および飼育期間中の餌の摂取量を集計して飼料要求率を求めた。
その結果を図２の表に示した。この表から本発明の動物用栄養組成物の効果が明らかである。
【００２３】
実施例２
下痢について
本新規乳酸菌をブドウ糖液で培養した培養液を、細菌性下痢（水溶性下痢）に感染した哺乳子豚延べ２０頭に、１ｃｃを経口投与した。
投与２４時間後に１４頭（７０％）が完治した。６頭（３０％）については、軟便症状が続いたが、４８時間後にはすべての哺乳子豚が完治した。
本発明の動物用栄養組成物（ヨーグルト状）を製造するときに発生する乳清を、細菌性下痢（水溶性下痢）に感染した乳子豚に、１ｃｃを経口投与したところ同様の結果が得られた。
一方、市販の他の乳酸菌を投与しても、２４時間後の完治率は、最大でも、５０％であった。
【００２４】
実施例３
猫アトピーであり、所々毛が抜けていた猫に、上記の動物用栄養組成物を与えたところ、１０日後ころから毛が生えてきた。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図面代用写真であって、本発明による新規乳酸菌の形態を示す顕微鏡写真である。
【図２】実験の結果を示す表である。
【図２】
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【図１】
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