(57)【要約】【課題】    安定供給が可能であり、骨芽細胞への誘導が可能な細胞及びそれを利用した、骨芽細胞の形成方法を提供すること。【解決手段】  ヒト羊膜上皮細胞層中に存在し、骨芽細胞へ分化誘導可能な細胞を提供した。また、ヒト羊膜上皮細胞層に含まれる細胞を、骨芽細胞分化培地で培養し、骨芽細胞を誘導することを含む、骨芽細胞の形成方法を提供した。【効果】  本発明の細胞は、ヒト羊膜由来であり、ヒト羊膜は大きな組織でしかも出産後に医療廃棄物として処理されるものであるから安定供給が可能である。本発明の細胞又はこれから誘導された骨芽細胞は、骨の欠損部に移植することにより、骨の修復を行うことができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト羊膜上皮細胞層中に存在し、骨芽細胞へ分化誘導可能な細胞。
【請求項２】
ヒト羊膜上皮細胞層中に存在する、骨芽細胞へ分化誘導可能な細胞を含む、骨芽細胞形成用細胞。
【請求項３】
ヒト羊膜上皮細胞層に含まれる細胞を、骨芽細胞分化培地で培養し、骨芽細胞を誘導することを含む、骨芽細胞の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞へ分化誘導可能な細胞及び骨芽細胞の形成方法に関する。本発明は、骨の修復等に有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来より、外傷や骨腫瘍の除去等により骨の修復が必要な場合には、患者本人の大腿骨等の自家骨を採取し、これを移植することが行われている。しかしながら、この方法は、患者の負担が大変大きい。一方、再生医学や組織工学の分野では、骨細胞に分化し得る幹細胞(骨幹細胞）を移植することにより骨の修復を行うことが研究されている。従来より、骨幹細胞は、骨髄中や脂肪細胞層中に見出されている。しかしながら、これらは安定供給に難がある。
【０００３】
【非特許文献１】Pittenger MF et al., Science 284:143,1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、安定供給が可能であり、骨芽細胞への誘導が可能な細胞及びそれを利用した、骨芽細胞の形成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者は、鋭意研究の結果、ヒト羊膜上皮細胞層中に、骨芽細胞分化培地で培養することにより骨芽細胞に分化誘導可能な細胞が含まれていることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、ヒト羊膜上皮細胞層中に存在し、骨芽細胞へ分化誘導可能な細胞を提供する。また、本発明は、ヒト羊膜上皮細胞層中に存在する、骨芽細胞へ分化誘導可能な細胞を含む、骨芽細胞形成用細胞を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜上皮細胞層に含まれる細胞を、骨芽細胞分化培地で培養し、骨芽細胞を誘導することを含む、骨芽細胞の形成方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ヒト羊膜上皮細胞層中に存在し、骨芽細胞へ分化誘導可能な細胞が初めて提供された。本発明の細胞は、ヒト羊膜由来であり、ヒト羊膜は大きな組織でしかも出産後に医療廃棄物として処理されるものであるから安定供給が可能である。本発明の細胞又はこれから誘導された骨芽細胞は、骨の欠損部に移植することにより、骨の修復を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
上記の通り、本発明の細胞は、ヒト羊膜上皮細胞層から分離されるものである。羊膜は、胎児由来の組織であるが、母体由来の胎盤に付着した状態で採取することができ、しかも、子宮内壁の全体を被覆する大きな組織であるので、大量に採取することができる。さらに、胎盤やそれに付着している羊膜は、医療廃棄物として処理されるものであるので、採取に倫理上の問題も生じない。
【０００９】
本発明の細胞は、ヒト羊膜の羊膜上皮細胞層＋間葉細胞層を絨毛膜層から剥離し、これをトリプシン処理することにより、トリプシン溶液中に分離、回収することができる。このようにして分離、回収される細胞には、骨芽細胞に分化誘導可能な細胞以外の細胞も含まれるが、それらの細胞をそのまま後述の方法で培養することにより、骨芽細胞を形成することができる。従って、トリプシン溶液中に分離、回収することができる上記細胞は、さらに分離することなく骨芽細胞形成用細胞としての用途を有する。
【００１０】
トリプシン溶液中に分離、回収された細胞を次いで、骨芽細胞分化培地で培養することにより、骨芽細胞を誘導することができる。本発明の細胞の骨芽細胞への分化に用いられる骨芽細胞分化培地としては、公知のいずれの骨芽細胞分化培地をも採用することができる。このような骨芽細胞分化培地の好ましい例としては、100 nMデキサメタゾン、10 mMβ−グリセロールリン酸、0.25 mMアスコルビン酸塩(ascorbate)及び10% FBS (ウシ胎児血清)をDMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 中に含有する培地(非特許文献１)を挙げることができる。培養条件は、特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃で２〜４週間程度培養することが好ましい。また、培養は、5% CO2ガス雰囲気下で行うことが好ましい。なお、骨芽細胞分化培地での培養に先立ち、細胞を通常の動物細胞培養用培地（例えば牛胎児血清含有DMEM培地 (Dulbecco's modified Eagle's medium)で４日〜２週間程度、さらに好ましくは約１週間予備培養することが好ましい。この予備培養の培養条件も、特に限定されないが、5% CO2ガス雰囲気下、３７℃が好ましい。
【００１１】
なお、上記本発明の細胞を一次培養又は継代培養をして得られる培養細胞であって、骨芽細胞に分化誘導可能な細胞も本発明の範囲に含まれる。
【００１２】
骨芽細胞に誘導されたか否かは、アルカリフォスファターゼ及びカルシウムの産生を調べることにより判定することができる（下記実施例参照）。細胞が、アルカリフォスファターゼ及びカルシウムを産生するようになった場合には、骨芽細胞に分化誘導されたと判定される。
【００１３】
本発明の細胞はヒト羊膜由来であり、羊膜は胎児由来であり、免疫寛容を示す。すなわち免疫組織染色ではHLA Class I には陽性反応を呈し、HLA Class II の染色性はない。またFas ligand 陽性細胞が存在している。最近、羊膜組織が拒絶反応を惹起しにくい理由は、HLA Class Ib (HLA-G)の発現とFas ligand 陽性細胞の存在が拒絶抑制に貢献していると考えられている（眼科42:257-269, 2000）。従って、HLAの適合性を問題にすることなく移植することが可能である。
【００１４】
本発明の細胞は、そのまま、あるいは、アルカリフォスファターゼ及びカルシウムを産生する骨芽細胞にまで分化させた後、移植することにより骨の修復や再構成に用いることができる。移植する部位は、特に限定されないが、通常、骨の修復や再構成が望まれる、外傷や骨腫瘍の除去等に起因する骨欠損部である。移植は、公知の骨幹細胞移植と同様に行うことができる。移植する細胞の数は、骨欠損部の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０３〜１０７個程度が適当である。
【００１５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
１．  細胞の分離及び培養
１）胎盤より、羊膜を絨毛層から剥離して分離した。
２）0.25％トリプシン溶液/1.3mM EDTAで37℃、15分間処理を行った。これを5回繰り返し、各トリプシン溶液分画を遠心処理して細胞を集め、10％牛胎児血清（FBS）含有RPMI1640培養液で洗浄した。
３）遠心処理して細胞を集め、10％牛胎児血清（FBS）含有DMEM培養液で懸濁し、培養ディッシュ上に播種し、37℃、5％CO２インキュベーター中で7日間程度初代培養した。
【００１７】
２．  骨芽細胞への分化誘導
１）羊膜上皮細胞を4.0×10４細胞/ｃｍ２で播種し、10％牛胎児血清（FBS）含有DMEM培養液で1週間程度培養を行った。
２）培養液を骨芽細胞分化培地（三光純薬社製: 100 nMデキサメタゾン、10 mMβ−グリセロールリン酸、0.25 mMアスコルビン酸塩及び10% FBSをDMEM中に含有)に置換し、2週間培養を行った。比較対照細胞は、10％牛胎児血清（FBS）含有DMEM培養液で2週間培養を行った。
【００１８】
３．  細胞化学染色
１）培養細胞を4％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、アルカリフォスファターゼ染色キット（シグマ社製）を用いた免疫組織化学染色、およびアリザリンレッドＳ（シグマ社製）を用いてカルシウム染色を行った。操作は、各製品の添付文書に従った。
２）染色した細胞は、光学顕微鏡で観察し分析した。
【００１９】
４．  結果
１）アルカリフォスファターゼ染色の結果、コントロールでは陰性であり、２週間分化誘導を施行した羊膜上皮細胞では陽性を示した。
２）また、アリザリンレッドＳ染色の結果、コントロールでは陰性であり、２週間分化誘導を施行した羊膜上皮細胞では陽性を示した。
【００２０】
以上のように、羊膜上皮細胞の骨分化誘導により、アルカリフォスファターゼ活性およびカルシウム産生が認められ、骨芽細胞への分化誘導が可能であった。