(57)【要約】      （修正有）【課題】  ケラタン硫酸関連糖鎖の生産に有用な新規な触媒、これを用いたケラタン硫酸関連糖鎖の生産方法、GlcNAcの転移方法等を提供する。【解決手段】  下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分とし、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する能力を有する触媒並びにこれを用いたケラタン硫酸関連糖鎖の生産方法及びGlcNAcの転移方法；（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質；（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分とし、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する能力を有する触媒。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が、下記式（１）又は（２）で示されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の触媒。
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （１）
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （２）
【請求項３】
請求項１又は２に記載の触媒の作用下で、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触、反応させる工程を少なくとも含む、非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖の生産方法。
【請求項４】
「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（１）で示され、かつ、「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（３）で示されるものであることを特徴とする、請求項３に記載の生産方法。
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-R  （１）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-R  （３）
（但し、−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基若しくはアグリコンを示す。）
【請求項５】
「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（２）で示され、かつ、「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（４）で示されるものであることを特徴とする、請求項３に記載の生産方法。
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-R  （２）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-R  （４）
（但し、−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基若しくはアグリコンを示す。）
【請求項６】
請求項１又は２に記載の触媒の作用下で、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触、反応させる工程を少なくとも含む、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」へのGlcNAcの転移方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラタン硫酸関連糖鎖の新規な生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中で使用する略号は以下の通りである。
【０００３】
β3Gn-T：β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase）。なお、β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-1は「β3Gn-T1」、β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-2は「β3Gn-T2」、という要領で略記する。従って、β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-7は「β3Gn-T7」と略記される。
【０００４】
biGP：Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAc
β1-3：β1-3グリコシド結合
β1-4：β1-4グリコシド結合
core1-O-pNP：Galβ1-3GalNAcα1-O-p-ニトロフェニル（Galβ1-3GalNAcα1-O-p-nitrophenyl）
Gal：ガラクトース（galactose）
GalNAc：N-アセチルガラクトサミン（N-acetylgalactosamine）
GalNAcα1-O-pNP：GalNAcα1-O-p-ニトロフェニル（GalNAcα1-O-p-nitrophenyl）
GlcNAc：N-アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）
iGn-T：i抗原産生β3Gn-T
L2L2：Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc
L2L4：Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc
L4L4：SO3--6Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc
Lac-O-pNP：ラクトース-O-p-ニトロフェニル（lactose-O-p-nitrophenyl）
LNF-III：ラクト-N-フコペンタオース-III（lacto-N-fucopentaose-III；Fucα1-3(Galβ1-4)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）
LNnT：ラクト-N-ネオ-テトラオース（lacto-N-neo-tetraose；Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）
LNT：ラクト-N-テトラオース（lacto-N-tetraose；Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）
PCR：ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
PVL：Psathyrella velutina レクチン（Psathyrella velutina lectin）
RCA-I：Ricinus communis アグルチニン-I（Ricinus communis agglutinin-I）
(SO3--6)：6-O-硫酸エステルを示す。
【０００５】
tetraGP：テトラ・アンテナリー Ｎ−グリカン（tetra-antennary N-glycan;  Galβ1-4GlcNAcβ1-2(Galβ1-4GlcNAcβ1-4)Manα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-2 (Galβ1-4GlcNAcβ1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAc 
UDP：ウリジン 5'-二リン酸（uridine 5'-diphosphate）
β3Gn-Tは、UDP-GlcNAcからGal/GalNAc残基の３位にGlcNAc残基を転移してβ結合を形成する酵素である。現在までに、β3Gn-Tであると考えられる６種類のタンパク質（β3Gn-T2〜T7）及びiGn-Tがクローニングされており、これらの活性の有無や、これらの基質特異性等についての検討がなされてきた。
【０００６】
非特許文献１には、ヒト由来のβ3Gn-T7のアミノ酸配列及びそのｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、非特許文献２には、ヒト由来のβ3Gn-T7のアミノ酸配列が開示されている。しかし、非特許文献１及び２に開示された「β3Gn-T7」が本当にβ3Gn-Tとしての酵素活性を有するのか否か、及び、酵素活性を有するとしても具体的に如何なる糖鎖に対して作用するのか等については明らかにされていなかった。
【０００７】
一方、ケラタン硫酸は、Ｎ−アセチルラクトサミン（-3Galβ1-4GlcNAcβ1-）の直線状のポリマーであり、それぞれの単糖の６位に種々の程度に硫酸基が含有されうる。Ｎ−アセチルラクトサミン骨格を有する硫酸化糖（ケラタン硫酸、硫酸化ラクトサミン、硫酸化ポリラクトサミン等を含む；本明細書中では、これらをまとめて「ケラタン硫酸関連糖鎖」という。）には、種々の生理活性があることが知られており（特許文献１）、これを酵素的に合成する方法が望まれていた。
【０００８】
【非特許文献１】カタオカ、Ｋ．（Kataoka, K.）ら、“ヒト UDP-GlcNAc: βGal β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ 7 (B3GNT7), mRNA（Homo sapiens UDP-GlcNAc: betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 7 (B3GNT7), mRNA）”、NM_145236、[online]、2003年10月5日、ＮＣＢＩ、[平成１５年10月９日検索]、インターネット＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=21687138&dopt=GenBank&term=NM_145236&qty=1＞
【０００９】
【非特許文献２】カタオカ、Ｋ．（Kataoka, K.）ら、“UDP-GlcNAc：βGal β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ ７ （ヒト）（UDP-GlcNAc：betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 7 （Homo sapiens））”、NP_660279、[online]、2003年10月5日、ＮＣＢＩ、[平成１５年10月９日検索]、インターネット＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=protein&list_uids=21687139&dopt=GenPept&term=NP_660279&qty=1＞
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９６／１６９７３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ケラタン硫酸関連糖鎖の生産に有用な新規な触媒、これを用いたケラタン硫酸関連糖鎖の生産方法、GlcNAcの転移方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の発明者らは上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、β3Gn-T7が、非還元末端にケラタン硫酸関連糖鎖構造を有する特定の糖鎖に特異的にGlcNAc残基を転移する反応を触媒することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分とし、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する能力を有する触媒（以下、「本発明触媒」という。）を提供する。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性を有するタンパク質。
【００１３】
なかでも、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が、下記式（１）又は（２）で示されるものであることが好ましい。
【００１４】
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （１）
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （２）
また本発明は、本発明触媒の作用下で、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触、反応させる工程を少なくとも含む、非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖の生産方法（以下、「本発明生産方法」という。）を提供する。
【００１５】
なかでも、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（１）で示され、かつ、「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（３）で示されるものであることが好ましい。
【００１６】
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （１）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （３）
また、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（２）で示され、かつ、「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（４）で示されるものであることも好ましい。
【００１７】
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （２）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （４）
さらに本発明は、本発明触媒の作用下で、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触、反応させる工程を少なくとも含む、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」へのGlcNAcの転移方法（以下、「本発明転移方法」という。）を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明触媒を用いることにより、非還元末端にGlcNAc残基を有するケラタン硫酸関連糖鎖を工業的規模で大量かつ安価に生産でき、これによって本発明生産方法が提供されることから極めて有用である。本発明生産方法や本発明転移方法も、非還元末端にGlcNAc残基を有するケラタン硫酸関連糖鎖の簡便、迅速、大量かつ安価な生産等に利用することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明触媒
本発明触媒は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分とし、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する能力を有する触媒である。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性を有するタンパク質。
【００２０】
なお、天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように（Ａ）のタンパク質に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められない（Ｂ）のタンパク質も、本発明触媒の有効成分として包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には（Ａ）のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質である。上記の（Ｂ）のタンパク質は、このようなタンパク質を規定するものである。
【００２１】
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基からなるタンパク質の場合、２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。
【００２２】
（Ｂ）のタンパク質は、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性を有する必要がある。
【００２３】
このような活性を有するか否かは、目的のタンパク質、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触、反応させ、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcが転移されるか否かを検出することによって判定できる。例えば、後述の実施例に示すような濾紙電気泳動による解析のほか、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動等による解析によって調べることができる。
【００２４】
このような方法によって、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性を保持しているアミノ酸の欠失、置換、挿入又は転位を有する変異体を容易に選択することができる。
【００２５】
GlcNAc供与体としては、GlcNAcヌクレオチドが好ましい。GlcNAcヌクレオチドとしてはUDP-GlcNAcやdTDP-GlcNAc等が例示されるが、UDP-GlcNAcが好ましい。
【００２６】
また「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」としては、下記式（１）又は（２）で示されるものであることが好ましい。
【００２７】
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （１）
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （２）
なお「アミノ酸配列を含む」とは、そのアミノ酸配列を含有する限りにおいて、他のアミノ酸配列を有していてもよいことを意味する。従って、そのアミノ酸配列からなるタンパク質と、他のタンパク質やペプチド等との融合タンパク質も、本発明触媒の有効成分とすることができる。
【００２８】
融合タンパク質としては、例えばマーカーペプチドとの融合タンパク質等が例示される。このような融合タンパク質は、精製又は分析を容易にすることができるというメリットがある。上記マーカーペプチドとしては例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、His、FLAG、CBP（カルモジュリン結合タンパク質）、GST（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Hisタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、FLAGとの融合タンパク質については抗FLAG抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。このような融合タンパク質の生産は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２９】
本発明触媒の有効成分としては、なかでも配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。
【００３０】
本発明触媒の有効成分であるタンパク質の製造方法は特に限定されず、天然物から上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を単離してもよく、化学合成等によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよく、遺伝子工学的手法によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよい。
【００３１】
遺伝子工学的手法によって、本発明触媒の有効成分とするタンパク質を製造する方法は、以下の通りである。より具体的な方法については、実施例を参照されたい。
【００３２】
前記（Ａ）のタンパク質（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ａ）」という）を用意する。このＤＮＡは、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なったヌクレオチド配列を有するものが存在するが、配列番号１におけるヌクレオチド番号１８１〜１３８３で示されるヌクレオチド配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。このＤＮＡは、GenBank accession No. NM_145236として登録されている。
【００３３】
また、前記（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ｂ）」という）についても、前記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性を有するタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、例えば「ＤＮＡ（ａ）」若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００３４】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００３５】
上記ＤＮＡ（ａ）又はＤＮＡ（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いたタンパク質の発現は、当該ＤＮＡが保持されたベクター（好ましくは発現ベクター）を用いて行うことが好ましい。ＤＮＡのベクターへの組込みは、通常の方法によって行うことができる。
【００３６】
ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系としては、大腸菌（E. coli）と、pET15b（Novagen社製）、pTrcHis（インビトロゲン社製）、pGEX（ファルマシア・バイオテック社製）、pTrc99（ファルマシア・バイオテック社製）、pKK233-3（ファルマシア・バイオテック社製）、pEZZZ18（ファルマシア・バイオテック社製）、pCH110（ファルマシア・バイオテック社製）、pBAD（インビトロゲン社製）、pRSET（インビトロゲン社製）又はpSE420（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、COS細胞や3LL-HK46細胞などの哺乳類細胞と、pcDNA3（インビトロゲン社製）、pGIR201（Kitagawa, H., and Paulson, J. C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1394-1401）、pEF-BOS（Mizushima, S., and Nagata, S. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 5322）、pCXN2(Niwa, H., Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)、pCMV-2（イーストマン・コダック(Eastman Kodak)製）、pCEV18、pME18S（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(1990)）又はpSVL（ファルマシア・バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせのほか、宿主細胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に哺乳類細胞（特にCOS細胞）とpcDNA3との組み合わせが好ましい。
【００３７】
ＤＮＡを組込むベクターは、目的とするタンパク質を発現するように構築されたものを用いることができる。ＤＮＡからのタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、通常の方法に従って行うことができる。
【００３８】
例えば、目的とするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを適当な宿主に導入することによって宿主を形質転換し、この形質転換体を生育させ、その生育物から発現されたタンパク質を採取することによって行うことができる。
【００３９】
ここで「生育」とは、形質転換体である細胞や微生物自体の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養された宿主細胞・分泌物・排出物等を包含する概念である。生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わせて適宜選択できる。
【００４０】
生育物からのタンパク質の採取も、タンパク質の公知の抽出・精製方法によって行うことができる。
【００４１】
例えば目的とするタンパク質が、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。また目的とするタンパク質が細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によって目的とするタンパク質を抽出することができ、その抽出物をそのまま用いてもよい。
【００４２】
これらの培地や抽出物から、タンパク質をさらに精製することもできる。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、目的とするタンパク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００４３】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００４４】
目的とするタンパク質が製造されたか否かは、アミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析することによって確認することができる。
【００４５】
本発明触媒は、上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質の少なくとも一方を含有していればよい。すなわち本発明触媒としては、上記（Ａ）及び（Ｂ）のタンパク質をそのまま本発明触媒としてもよく、両者の混合物を用いてもよく、これらのタンパク質に加えて、これらのタンパク質に悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の成分を含有させてもよい。
【００４６】
本発明触媒の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合し、又は担体に包括させた固定化酵素形態のいずれであってもよい。
【００４７】
本発明触媒は、後述する本発明生産方法や、本発明転移方法等に利用することができる。
＜２＞本発明生産方法
本発明生産方法は、本発明触媒の作用下で、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触、反応させる工程を少なくとも含む、非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖の生産方法である。
【００４８】
「本発明触媒」については、前記＜１＞で説明した通りである。
【００４９】
「GlcNAc供与体」としては、GlcNAcヌクレオチドが好ましい。GlcNAcヌクレオチドとしてはUDP-GlcNAcやdTDP-GlcNAc等が例示されるが、UDP-GlcNAcが好ましい。
【００５０】
「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」は、非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する限りにおいて特に限定されない。この「糖鎖」には、タンパク質、脂質その他の非糖質部分（アグリコン）が結合していても良い。
【００５１】
「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」としては、下記式（１）又は（２）で示されるものであることが好ましい。
【００５２】
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-R  （１）
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-R  （２）
本発明触媒の作用下で、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触、反応させる方法は、これらの分子が相互に接触して本発明触媒の作用が発揮される限りにおいて特に限定されない。例えばここで本発明触媒を（Ｘ）、GlcNAc供与体を（Ｙ）、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」（Ｚ）と略記することとすると、（Ｙ）と（Ｚ）との混合物に（Ｘ）を接触させ反応させてもよく、（Ｚ）と（Ｘ）との混合物に（Ｙ）を接触させ反応させてもよく、（Ｘ）と（Ｙ）との混合物に（Ｚ）を接触させ反応させてもよく、これら三者を同時に接触させ反応させてもよい。
【００５３】
また、本発明触媒を担体（例えば、ゲル、ビーズ、膜、プレート、ファイバー等）に固定させ、これにGlcNAc供与体と「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」とを接触させ反応させてもよい。
【００５４】
これら三者を接触させた後の反応の条件は、本発明触媒の有効成分であるタンパク質が作用を発揮する条件である限りにおいて特に限定されない。
【００５５】
例えば、本発明触媒の有効成分であるタンパク質の至適ｐＨ付近で反応させることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。例えば、ｐＨ６．５〜７付近で反応させることが好ましい。
【００５６】
またこのときの温度も、本発明触媒の有効成分であるタンパク質の活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、３５℃〜３７℃程度が例示される。
【００５７】
また本発明触媒の有効成分であるタンパク質の活性を増加させる物質がある場合には、その物質を添加してもよい。例えば、Mn２＋を用いることによって、本発明触媒の有効成分であるタンパク質の活性が上昇する。
【００５８】
逆に、EDTA、Mg２＋、Ca２＋等を用いた場合には、本発明触媒の有効成分であるタンパク質の活性が阻害されることから、本発明生産方法におけるこのような二価イオンの使用は避けることが好ましい。
【００５９】
反応時間は、ｐＨ条件、温度条件、作用させるタンパク質及び基質の量、並びにどの程度の生産量を所望するか等によって適宜調節することができる。反応時間を長くすれば生産量を増すことができ、反応時間を短くすれば生産量を減ずることができる。
【００６０】
また本発明生産方法には、前記の接触、反応工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
【００６１】
本発明触媒の作用下で、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触させて反応させることにより、非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖が生産される。
【００６２】
例えば、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」として下記式（１）で示される糖鎖を採用すれば、「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」として下記式（３）で示される糖鎖が生産される。
【００６３】
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-R  （１）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-R  （３）
（−Ｒは水素原子又はグリコシド結合した糖残基若しくはアグリコンを示す。）
また、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」として下記式（２）で示される糖鎖を採用すれば、「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」として下記式（４）で示される糖鎖が生産される。
【００６４】
Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （２）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3(SO3--6)Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc  （４）
非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖が生産されたか否かは、例えば、後述の実施例に示すような濾紙電気泳動による解析のほか、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動等による解析によって調べることができる。
【００６５】
また、生成物中から「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を単離する方法等は、公知の糖鎖の分離方法によって行うことができる。
＜３＞本発明転移方法
本発明転移方法は、本発明触媒の作用下で、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」を相互に接触、反応させる工程を少なくとも含む、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」へのGlcNAcの転移方法である。
【００６６】
「本発明触媒」についての説明は前記＜１＞で、「GlcNAc供与体」、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」及びこれらを相互に接触、反応させる工程に関する説明は前記＜２＞で説明した内容と同じである。
【００６７】
本発明転移方法においても、前記の接触、反応工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
【００６８】
また、「非還元末端にGalβ1-4(SO3--6)GlcNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcが転移されたか否かは、例えば、後述の実施例に示すような濾紙電気泳動による解析のほか、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動等による解析によって調べることができる。
【００６９】
本発明転移方法は、生体外（イン・ビトロ）で実施されてもよく、生体内（イン・ビボ）で実施されてもよい。
【００７０】
なお、後述の実施例からも明らかな通り、本発明触媒の有効成分であるタンパク質は、GlcNAc供与体から、tetraGP及びbiGP（いずれも非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を保持する）並びにcore1-O-pNP（非還元末端にGalβ1-3GalNAc構造を保持する）に対してもGlcNAcを転移する能力を有することが判明した。したがって本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を有効成分とし、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」及び／又は「非還元末端にGalβ1-3GalNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する能力を有する触媒も提供する。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜４０１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、GlcNAc供与体から「非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」又は「非還元末端にGalβ1-3GalNAc構造を有する糖鎖」の非還元末端にGlcNAcを転移する活性を有するタンパク質。
【００７１】
「非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」としてはtetraGP及びbiGPが、「非還元末端にGalβ1-3GalNAc構造を有する糖鎖」としてはcore1-O-pNPが好ましい。
【００７２】
また同様に、本発明は、本発明触媒の有効成分であるタンパク質、GlcNAc供与体、「非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」（又は「非還元末端にGalβ1-3GalNAc構造を有する糖鎖」）を相互に接触、反応させる工程を少なくとも含む、非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造（又はGlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAc構造）を有する糖鎖の生産方法も提供する。
【００７３】
なかでも、「非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（５）で示され、かつ、「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（８）で示されるものであることが好ましい。
【００７４】
Galβ1-4GlcNAcβ1-2(Galβ1-4GlcNAcβ1-4)Manα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-2 (Galβ1-4GlcNAcβ1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAc  （５）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2(Galβ1-4GlcNAcβ1-4)Manα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-2(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAc  （８）
また、「非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（６）で示され、かつ、「非還元末端にGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」が下記式（９）で示されるものであることが好ましい。
【００７５】
Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Galβ1-4GlcNAcb1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAc  （６）
GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAc  （９）
また、「非還元末端にGalβ1-3GalNAc構造を有する糖鎖」が下記式（７）で示され、かつ、「GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAc構造を有する糖鎖」が下記式（１０）で示されるものであることが好ましい。
【００７６】
Galβ1-3GalNAcα1-O-p-ニトロフェニル  （７）
GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα1-O-p-ニトロフェニル  （１０）
さらに本発明は、本発明触媒の有効成分、GlcNAc供与体及び「非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」（又は「非還元末端にGalβ1-3GalNAc構造を有する糖鎖」）を相互に接触、反応させる工程を少なくとも含む、「非還元末端にGalβ1-4GlcNAc構造を有する糖鎖」（又は「非還元末端にGalβ1-3GalNAc構造を有する糖鎖」）へのGlcNAcの転移方法も提供する。
【００７７】
これらの説明については、本発明触媒、本発明生産方法及び本発明転移方法と同様である。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
＜１＞材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
【００７９】
UDP-[6-3H]GlcNAc(2.21 TBq/mmol)は、アメリカン・ラジオラベルド・ケミカルズ・インク（American Radiolabeled Chemicals Inc.；St. Louis, MO）から購入した。core1-O-pNP、GalNAcα1-O-pNP及びLNF-IIIは、フナコシ株式会社（Funakoshi Co., Ltd.）から購入した。ウシ・ミルク由来のb1,4-galactosyltransferase（bovine milk b1,4-galactosyltransferase）、UDP-Gal及びUDP-GlcNAcは、シグマ社 （Sigma；St. Louis, MO）から購入した。LNT及びLNnTは、Kobata, A. (1972) Methods Enzymol., 28, 262-271の記載に従ってヒトの乳汁から調製した。RCA-Iが結合したアガロース（RCA-I-agarose）(4 mg/ml ゲル) は、株式会社ホーネンコーポレーション（Hohnen Co.）から入手した。PVLは、Kochibe, N., and Matta, K.L. (1989) J. Biol. Chem., 264, 173-177に記載された方法で調製し、これをCNBr-活性化セファロース 4B（CNBr-activated Sepharose 4B；アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））の説明書に従ってこれに結合させた。BiGP及びtetraGPは、GM1 ガングリオシドーシス（GM1 gangliosidosis）の患者から、Yamashita, K., Ohkura, T., Okada, S., Yabuuchi, H., and Kobata, A. (1981) J. Biol. Chem., 256, 4789-4798に記載の方法で調製した。ストレプトコッカス 6646K由来のb-ガラクトシダーゼ（Streptococcus 6646K b-galactosidase）及びBacillus sp.由来のケラタナーゼII（keratanase II；Bacillus sp.）は、 生化学工業株式会社（Seikagaku Co.）から購入した。L2L2、L2L4及びL4L4は、生化学工業株式会社（Seikagaku Co.）から恵与された。 
＜２＞方法
１．β3Gn-TsのcDNAクローニング
β3Gn-T3、-T6及び T7 の全長のオープンリーディングフレームをコードするcDNAを、ヒト結腸のBD Marathon-Ready cDNA(クローンテック社；Clontech, Palo Alto, CA)を鋳型として、PCRで増幅した。β3Gn-T2、-T4、-T5及び iGn-Tの場合においては、スーパースクリプト・ヒト脳cDNAライブラリー（SuperScript human brain cDNA library（インビトロジェン社（Invitrogen））を鋳型として用いた。オリゴヌクレオチド・プライマーとしては、クローニングの目的とするそれぞれの酵素に応じて以下のものを用いた。
5'-tttaagcttGAGAAATGAGTGTTGGA-3'（β3Gn-T2；正方向プライマー；配列番号３）
5'-ttttctagaACACAACATGGGAAC-3'（β3Gn-T2；逆方向プライマー；配列番号４）
5'-tttaagcttGGCCAGGATGAAGTATC-3'（β3Gn-T3；正方向プライマー；配列番号５）
5'-ttttctagaGGAAGGTGTCGCCC-3（β3Gn-T3；逆方向プライマー；配列番号６）
5'-tttaagcttCCAGCTGCCGTTCATG-3'（β3Gn-T4；正方向プライマー；配列番号７）
5'-ttttctagaGTCCACTCTCAGGCT-3'（β3Gn-T4；逆方向プライマー；配列番号８）
5'-tttaagcttGAGTGGATATGAGA-3'（β3Gn-T5；正方向プライマー；配列番号９）
5'-ttttctagaGGTTTGACTCAGTGACA-3'（β3Gn-T5；逆方向プライマー；配列番号１０）
5'-tttaagcttATGGCTTTTCCCTGCCG-3'（β3Gn-T6；正方向プライマー；配列番号１１）
5'-ttttctagaCCTCAGGAGACCCGGTG-3'（β3Gn-T6；逆方向プライマー；配列番号１２）
5'-tttaagcttCCGCCATGTCGCTGTG-3'（β3Gn-T7；正方向プライマー；配列番号１３）
5'-ttttctagaGCACCTGGAGCT-3'（β3Gn-T7；逆方向プライマー；配列番号１４）
5'-tttaagcttGGCGTAGTCTGTGGCC-3'（iGn-T；正方向プライマー；配列番号１５）
5'-ttttctagaGCCAAGAGGCTGACT-3'（iGn-T；逆方向プライマー；配列番号１６）
配列中の小文字は、適当な制限酵素部位を含んでいることを示している。増幅したcDNAをHindIII及びXbaIで消化し、pcDNA3(インビトロジェン社；Invitrogen)の制限酵素部位の間でクローン化した。構築されたプラスミドは、アプライド・バイオシステムズ PRISM 310 ジェネティック・アナライザー（Applied Biosystems PRISM 310 Genetic Analyzer；PEバイオシステムズ社製（PE Biosystems））を用いて配列決定した。COS-7細胞中でのβ3Gn-Tsの一過性の発現と、そのクルードな膜画分の調製は、Seko, A., Hara-Kuge, S., and Yamashita, K. (2001) J. Biol. Chem., 276, 25697-25704に記載された方法で行った。クルードな膜画分は、酵素活性の評価に用いた。
２．β3Gn-T活性のアッセイ
20μl の反応液（50 mM HEPES-NaOH(pH 7.2)、10 mM MnCl2、0.5 %(w/v) Triton X-100、1 mM 受容体基質、2.5μM UDP-[3H]GlcNAc(6.7 x 106 dpm)、30 mM UDP-GlcNAc、0.1 M GlcNAc、1 mM AMP及び適当に希釈した膜画分を含む。）を、37℃で３時間インキュベートした。3Hでラベルされた産生物を、濾紙電気泳動（ピリジン：酢酸：水＝3:1:387、pH 5.4）で精製し、濾紙クロマトグラフィー（ピリジン：酢酸エチル：酢酸：水＝5:5:1:3）に付した。L2L4及びL4L4の場合には、残存しているUDP-[3H]GlcNAcを破壊するために、濾紙電気泳動の前にマイルドな酸加水分解（0.01 N HCl、100℃、10分間）を行った。 [3H]GlcNAc-L2L4及び[3H]GlcNAc-L4L4は、濾紙電気泳動においてUDP-[3H]GlcNAcと分離できないからである。  濾紙クロマトグラフィーの後、濾紙を乾燥させてラジオクロマトグラム・スキャナーで放射活性をモニターして、3H-ラベルされた産生物を水で抽出して放射能をカウントした。GalNAcα-O-pNP、Lac-O-pNP及びcore1-O-pNPの場合には、抽出物をC18 Sep-Pak カラム（ウォーターズ社（Waters Corp., Milford, MA）製）にアプライし、3H-標識された産生物を50％ MeOHで溶出させて放射能をカウントした。空のpcDNA3（β3Gn-Tを組み込んでいないpcDNA3）をトランスフェクトしたCOS-7細胞に由来する膜画分を、内在性のβ3Gn-T活性のコントロールとして用いた。膜画分のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンをスタンダードとして用い、バイオ・ラッド・プロテイン・アッセイ色素試薬（Bio-Rad Protein Assay dye reagent）を用いて推定した。
３．結果と考察
（１）β3Gn-T7によって産生された3H-標識された化合物の分析
まず我々は、β3Gn-T7をトランスフェクトしたCOS-7細胞由来のクルードな膜画分を用いて、β3Gn-T7の酵素特性を解析した。結果を図１に示す。図１中のＡは酵素反応後の混合物を、Ｂは画分ＩのBacillus sp.のkeratanase II 消化物を、Ｃは[3H]Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcのスミス分解産物を、ＤはGalβ1-4[3H]GlcNAc-L2L2の過ヨウ素酸酸化後にスミス分解した産物をそれぞれ示す。ａ及びｂの矢印は、それぞれブロモフェノールブルー(bromophenolblue)及びUDP-[3H]GlcNAcの位置を示す。また、図１中の「Distance from origin」は原点（オリジン）からの距離を、「Radioactivity」は放射活性をそれぞれ示す。
【００８０】
L2L2を受容体基質として含有する反応混合液を濾紙電気泳動に付した場合には、放射活性のピーク（画分Ｉ）が出現した（図１Ａ）。他のピーク（0、6.6及び9.8cm）はL2L2を含有しない反応混合物を用いた場合にも出現したことから（ここではデータは示さない。）、これらのピークはL2L2に由来する化合物のピークではない。
【００８１】
画分Ｉを水で抽出し、以下に示す通り[3H]GlcNAcの結合解析を行った。ケラタナーゼII、すなわちendo-b-N-acetylglucosaminidase（ケラタン硫酸中の6-O-硫酸化 GlcNAcに作用する；Nakazawa, K., Ito, M., Yamagata, T., and Suzuki, S. (1989) in Keratan Sulfate(Greiling, H., and Scott, J.E., eds) pp. 99-110, The Biochemical Society, London.）で画分Ｉを消化すると、移動度が低い位置に放射活性ピークが出現した（図１Ｂ）。このことは、画分Ｉにおける[3H]GlcNAcがL2L2に取り込まれたことを示している。
【００８２】
画分Ｉは、ストレプトコッカス 6646K由来の b-ガラクトシダーゼで消化されない。さらに、画分ＩはPVL-セファロース・カラムに結合し、0.3 M GlcNAcによって溶出されるが、RCA-アガロース・カラムは素通りする。
【００８３】
PVLとRCA-Iは非還元末端のβ-GlcNAcとGalβ1-4(R-6)GlcNAcβ1-にそれぞれ結合することから、[3H]GlcNAcはL2L2の非還元末端のGal残基に結合していると考えられる。
【００８４】
次に、画分Ｉをウシ・ミルク由来のb1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼでガラクトシル化した。その産生物はRCA-アガロースカラムに結合したが、PVL-カラムには結合しなかった。このことは、[3H]GlcNAcのＣ４部位が完全にb-ガラクトシル化されたことを示している。ガラクトシル化された画分Ｉを、Seko, A., Hara-Kuge, S., and Yamashita, K. (2001) J. Biol. Chem., 276, 25697-25704とSpiro, R.G. (1966) Methods Enzymol., 8, 26-52に記載された方法に従って、過ヨウ素酸酸化とスミス分解した。もし、[3H]GlcNAcがL2L2の非還元末端のGalの３位水酸基に結合していれば、この処理によって[3H]GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-ol 及びその部分脱硫酸化誘導体が形成されるはずである。スミス分解による6-O-脱硫酸化（0.05 N H2SO4、80℃、１時間）は、Seko, A., Dohmae, N., Takio, K., and Yamashita, K. (2003) J. Biol. Chem., 278, 9150-9158によって調製した[3H]Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcを用いて確認した（図１Ｃ）。
【００８５】
インタクトな糖鎖のピーク（10.3cm）に加え、モノ脱硫酸化された糖鎖（5.5cm）と、ジ脱硫酸化された糖鎖（オリジン）の２つのピークが存在した。
【００８６】
これに対し、もし[3H]GlcNAcがL2L2の非還元末端GalのＣ−２、Ｃ−４及びＣ−６位に結合すれば、[3H]GlcNAcβ1-O-グリセルアルデヒド(C-2)、[3H]GlcNAcβ1-O-グリセロール(C-6)、又は [3H]GlcNAcβ1-O-スレイトール(C-4)が産生されるはずである。
【００８７】
酸化と分解の後、反応混合液を濾紙電気泳動に付した（図１Ｄ）。３つの放射活性ピーク（II、III及びIV）が検出された。ピークIVは画分Ｉと同じ位置に存在したことから、このピークは[3H]GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(SO3--6)GlcNAc-olであることが示される。ピークIIを薄層クロマトグラフィーに付したところ、β3Gn-T2によって以下の通り調製された[3H]GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcと同じ位置に移動したことから、これはジ脱硫酸化型であることが示された。ピークIIIは、その移動位置からみてモノ脱硫酸化型であると考えられる。この結果から[3H]GlcNAcはL2L2の末端GalのＣ−３位に結合しており、このことからβ3Gn-T7はb1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼであることが証明された。β3Gn-T7をトランスフェクトしたCOS-7細胞由来のクルードな膜画分と、pcDNA3のみをトランスフェクトしたCOS-7細胞由来の膜画分の比活性は、それぞれ4.87及び1.08 pmol/分/mgタンパク質であった。外来性のβ3Gn-T7の比活性（3.79 pmol/分/mgタンパク質）は、内在するβ3Gn-T7活性を差し引くことによって求めた。
【００８８】
β3Gn-T7の至適ｐＨは6.5-7.0であった。反応混合液に、MnCl2に代えて10 mM EDTAを添加した場合、酵素活性は１２％にまで減少した。MgCl2及びCaCl2を添加した場合(いずれも10 mM)には、MnCl2を添加した場合に比して酵素活性は１／３
に減少した。β3Gn-T7の基質特異性を表１に示す。表１に示した数値は、４回の独立した実験に基づく平均値（ＳＤは５％以下）である。
【００８９】
【表１】
2005124513.tif 000002
【００９０】
L2L2、L2L4及びその他のケラタン硫酸関連糖鎖は、LNnTに比してより良い基質となった。このことは、β3Gn-T7が、内部の6-O-硫酸化N-アセチルグルコサミン部分を認識することを示している。しかし、L2L2やL2L4に比してL4L4が基質になりにくいことからみて、非還元末端のGalの6-O-硫酸化はこの酵素活性を阻害することが示された。
【００９１】
さらに、β3Gn-T7はtetraGPとcore1-O-pNPにも作用しうることが示された。Yehらは、β3Gn-T3が、リンパ節の6-硫酸化シアリルルイスＸ抗原（6-sulfo sialyl Lewis X antigen）の生成に至るcore1-伸長活性を有することを示している（Yeh, J.-C., Hiraoka, N., Petryniak, B., Nakayama, J., Ellies, L.G., Rabuka, D., Hindsgaul, O., Marth, J.D., Lowe, J.B., and Fukuda, M. (2001) Cell, 105, 957-969）。この結果は、β3Gn-T7がcore1構造に作用しうる第２の酵素であることを示している。
【００９２】
L2L2、L2L4、tetraGP及びcore1-O-pNPに対するカイネティックなパラメータについては、表２に示した。
【００９３】
【表２】
2005124513.tif 000003
【００９４】
L2L2及びL2L4は、tetraGP及びcore1-O-pNPに比して高いVmax/Km値を示した。このことは、β3Gn-T7がtetraGP及びcore1に比して、L2L2及びL2L4に対してより効率的に作用することを示している。
【００９５】
次に、L2L2及びL2L4が、他のβ3Gn-Tsの良い基質となるか否かについて評価するために、それぞれのβ3Gn-TのcDNAを含有する発現ベクターでCOS-7細胞をトランスフェクトし、酵素源としてクルードな膜画分を調製した。
【００９６】
表３に示す通り、β3Gn-T2及びiGn-TはL2L2に対する活性を有していたが、L2L4及びL4L4は、β3Gn-T7を除いて他のβ3Gn-Tsの基質とはならなかった。TetraGP は、全てのβ3Gn-Tsの良い基質となった。β3Gn-T7の場合とは異なり、β3Gn-T2及びiGn-Tは、L2L2よりもtetraGPを好むことが示された。これらの結果から、β3Gn-T7が、β3Gn-TsのなかでもL2L2に対して最も有効な酵素であることが示された。なお表３中の数値の単位は「pmol/分/mgタンパク質」であり、「ＮＤ」は測定していないことを示す。また、表３に示した数値は、４回の独立した実験に基づく平均値（ＳＤは５％以下）である。
【００９７】
【表３】
2005124513.tif 000004
【００９８】
これらの研究から、ケラタン硫酸の生合成経路は図２の通りであると考えられる。まず、GlcNAc6ST-5が非還元末端のGlcNAcのC-6位に硫酸基を転移する（Akama, T.O., Misra, A.K., Hindsgaul, O., and Fukuda, M.N. (2003) J. Biol. Chem., 277, 42505-42513）。次いで、b4GalT-IV（GlcNAc 6-O-硫酸残基に特異的な唯一のb4GalT）によってガラクトシル化が起こる（Seko, A., Dohmae, N., Takio, K., and Yamashita, K. (2003) J. Biol. Chem., 278, 9150-9158）。本実施例で示した通り、Galβ1-4(SO3--6)GlcNAcはβ3Gn-T7によって延長されうる。最後に、Gal6STによって内部のGal残基が6-O-硫酸化される（Fukuta, M., Inazawa, J., Torii, T., Tsuzuki, K., Shimada, E., and Habuchi, O. (1997) J. Biol. Chem., 272, 32321-32328及びTorii, T., Fukuta, M., and Habuchi, O. (2000) Glycobiology, 10, 203-211）。このことから、Gal6ST、GlcNAc6ST-5、b4GalT-IV、β3Gn-T7及び適当なイニシエーター受容体糖鎖との混合物を用いることによって、ケラタン硫酸のイン・ビトロ合成も可能かも知れない。
【００９９】
KataokaとHuhは、肺ガン細胞（KLN205-MUC1）にβ3Gn-T7のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトすると、より高い運動能と侵襲能を獲得することを示している（Kataoka, K., and Huh, N. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun., 294, 843-848）。この結果は、β3Gn-T7が合成に関与する複合糖質が、ガン細胞の運動性を低減させる可能性を示している。その複合糖質の１つの候補がケラタン硫酸でありうる
ケラタン硫酸の発現は、静止している細胞に比して、移動している角膜上皮細胞中及びストロマのケラトサイトから分化した線維芽細胞中でダウンレギュレートされることが示されている（Davies, Y., Lewis, D., Fullwood, N.J., Nieduszynski, I.A., Marcyniuk, B., Albon, J., and Tullo, A. (1999) Exp. Eye Res., 68, 303-311及びFunderburgh, J.L., Mann, M.M., Sundarraj, N., and Funderburgh, M.L. (2003) J. Biol. Chem., published on August 20, 2003 as manuscript M303292200）。外来性のケラタン硫酸は、角膜細胞及び皮膚細胞中において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２の活性化を阻害する（Isnard, N., Robert, L., and Renard, G. (2003) Cell Biol. Int., 27, 779-784）。KLN205-MUC1細胞において、細胞の移動を阻害する因子として作用するケラタン硫酸が発現されているか否か、興味深い問題である。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、非還元末端にGlcNAc残基を有するケラタン硫酸関連糖鎖の大量生産や、GlcNAc残基の転移等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ヒト由来のβ3Gn-T7によって産生された[3H]GlcNAc-L2L2における[3H]GlcNAcの結合様式の解析を示す図である。
【図２】ケラタン硫酸の予想される生合成経路を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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