(57)【要約】【課題】上記課題を解決すべく、ＭＪＤ１遺伝子における正常なアリルと異常な（変異体）アリルに由来するＲＮＡを特異的に識別することが可能なsiＲＮＡを提供すること。【解決手段】マカド−ジョセフ病遺伝子の野生型アリルと変異体アリルを識別することができるsiＲＮＡ、ＲＮＡの一次配列に非依存的に、マカド−ジョセフ病の変異体アリル由来のｍＲＮＡと特異的に結合することができるsiＲＮＡ、及び、センス鎖に塩基配列：5’- g cag cag cag cgg gac cua - 3’（配列番号１）を含むsiＲＮＡ。【選択図】  図２
2005304321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マカド−ジョセフ病遺伝子の野生型アリルと変異体アリルを識別することができるsiＲＮＡ。
【請求項２】
ＲＮＡの一次配列に非依存的に、マカド−ジョセフ病の変異体アリル由来のｍＲＮＡと特異的に結合することができるsiＲＮＡ。
【請求項３】
センス鎖に塩基配列：5’- g cag cag cag cgg gac cua - 3’（配列番号１）を含むsiＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載のsiＲＮＡを活性成分として含有するキャリア。
【請求項５】
請求項１〜３の何れか一項に記載のsiＲＮＡを発現するＤＮＡベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜３の何れか一項に記載のsiＲＮＡ、請求項４記載のキャリア、又は請求項５記載の発現ベクターのいずれかを含む組成物。
【請求項９】
請求項１〜３の何れか一項に記載のsiＲＮＡで細胞をトランスフェクションし、該細胞内に取り込まれたsiＲＮＡの作用によってマカド−ジョセフ病遺伝子の変異体アリルの発現を特異的に抑制する方法。
【請求項１０】
請求項１〜３の何れか一項に記載のsiＲＮＡで細胞をトランスフェクションし、該細胞内に取り込まれたsiＲＮＡの作用によってマカド−ジョセフ病遺伝子の変異体アリル産物による細胞毒性を減少させる方法。
【請求項１１】
請求項８記載の組成物を投与することによって、インビボでトランスフェクションを行わせる、請求項９又は１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マカド−ジョセフ病遺伝子の変異体アリルの発現を特異的に抑制することができるsiＲＮＡ（short interfering ＲＮＡ）及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マカド−ジョセフ病(ＭＪＤ)は、小脳性運動失調、錐体及び錐体外路徴候、末梢神経障害および眼筋麻痺によって臨床的に特徴づけられる常染色体優性遺伝の神経変性疾患であり、１０〜１５年程度で寝たきりとなり、治療は現在のところ対症療法のみでる。この原因遺伝子であるＭＪＤ１遺伝子中の３塩基配列（ＣＡＧ）の繰り返し配列（ＣＡＧリピート）の数は、正常人では１３〜３６であるのに対して、ＭＪＤ患者では６２〜８２にまで伸長している[1]。ＭＪＤの病因は、変異体ＭＪＤ蛋白質の異常伸長したッポリグルタミンによる「毒性機能の獲得」であると考えられる[2,3]。
【０００３】
従って、ＭＪＤに対する最も有効且つ簡単な治療手段はこの異常な変異体蛋白質を減少させることである。更に、野生型のＭＪＤ１遺伝子産物（アタキシン−３：ataxin-3）は、小胞体の特性調節[4]及びＤＮＡ修復[5]のような細胞の生存にとって重要な役割を果たしていると考えられるから、この野生型蛋白質に影響を与えずに、変異体アタキシン−３のみを選択的に減少させる必要がある。
【０００４】
ＲＮＡ干渉(RNAi)は、二重鎖ＲＮＡ(dsRNA)によって開始される、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングプロセスである。これは、２１−２３個のヌクレオチドのsiＲＮＡが生成され、それによって相同なＲＮＡの分解が引き起こされる、という多段階ステップのプロセスを有している。このsiRNAは遺伝子特異的な抑制を媒介する為に十分な長さが必要であると同時に、哺乳動物細胞中でのdsRNAによる悪影響を回避するために十分に短いものである。
【０００５】
近年、このＲＮＡ干渉によるターゲット遺伝子に対する非常に高い発現抑制能を利用して、疾病の遺伝子治療用の強力なツールとして医療の分野への応用が期待されている。
【０００６】
ＭＪＤ１遺伝子に対するＲＮＡ干渉法も報告されているが、これはＣＡＧリピート直下に位置するグアニン／シトシンの一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism）に着目して、異常遺伝子及び正常遺伝子をそれらの一次配列の相違から識別するものである（非特許文献１）。この報告に記載されたsiRNAは、Ｑ１６６Ｃ（１６６回のＣＡＧリピートの直下に「Ｃ」が結合した塩基配列）を有する配列の発現を抑制する一方で、Ｑ２８Ｇ（２８回のＣＡＧリピートの直下に「Ｇ」が結合した塩基配列）を有する配列の発現には僅かな影響しか及ぼさなかった。但し、Ｑ２８Ｃについては調べられていない。
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５１６０６２号公報
【特許文献２】特表２００３−５２９３７４号公報
【特許文献３】特表２００３−５３５５８３号公報
【非特許文献１】Miller VM, Xia H, MarrGL, et al. Allele-specific silencing of dominant disease genes. Proc. Natl.Acad. Sci., USA 2003; 100: 7195-7200
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＭＪＤ１遺伝子におけるＣＡＧリピート直下に位置するグアニン／シトシンの一塩基多型に関して、変異体と正常なＭＪＤ１の対立遺伝子（アリル）の間に極端な偏りが存在することが判明している。即ち、変異体対立遺伝子は排他的に(CAG)nCのみを有しているのに対して、正常な対立遺伝子は(CAG)nCと(CAG)nGの両方を同頻度で有している [7,8](図１Ａ)
。
【０００９】
従って、単なる一塩基多型（一次配列の相違）に基づく上記の非特許文献１に記載のＲＮＡ干渉法では、ＭＪＤ患者の約半数においては正常と異常の遺伝子を識別できず、又、正常人においても、約５０％の確率で(CAG)nC型の正常な対立遺伝子の発現が抑制されてしまう可能性がある為、臨床応用の面では大きな障害となることが予想される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決すべく、ＭＪＤ１遺伝子における正常なアリルと異常な（変異体）アリルに由来するＲＮＡを特異的に識別することが可能なsiＲＮＡを提供するものである。
【００１１】
即ち、本発明は、マカド−ジョセフ病遺伝子の野生型アリルと変異体アリルを識別することができるsiＲＮＡ、に係る。
更に本発明は、ＲＮＡの一次配列に非依存的に、マカド−ジョセフ病の変異体アリル由来のｍＲＮＡと特異的に結合することができるsiＲＮＡ、に係る。
【００１２】
また、本発明は、上記siＲＮＡを活性成分として含有するキャリア、及び、siＲＮＡを発現するＤＮＡベクターに係る。
【００１３】
又、本発明は、上記のsiＲＮＡ、キャリア、又はＤＮＡ発現ベクターのいずれかを含む組成物にも係る。この組成物は、例えば、医薬用途としてマカド−ジョセフ病の治療に使用することができる。
【００１４】
更に、本発明は、上記siＲＮＡで細胞をトランスフェクションし、該細胞内に取り込まれたsiＲＮＡの作用によってマカド−ジョセフ病遺伝子の変異体アリルの発現を特異的に抑制する方法、及び、上記siＲＮＡで細胞をトランスフェクションし、該細胞内に取り込まれたsiＲＮＡの作用によってマカド−ジョセフ病遺伝子の変異体アリル産物による細胞毒性を減少させる方法、に係る。該細胞の種類に特に制限はないが、例えば、本明細書の実施例中で使用されているようなヒト等の哺乳動物細胞を挙げることが出来る。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のsiＲＮＡにより、全てのマカド−ジョセフ病患者の遺伝子型において、患者の有する正常な遺伝子の発現を損なわずに、異常な変異体遺伝子の発現のみを特異的に抑制することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のsiＲＮＡは当業者に公知の任意の方法で作成することが出来る。例えば、以下の実施例に示すように、当業者に周知の方法によって容易に化学合成することができる。本発明のsiＲＮＡの好適具体例の一つとして、センス鎖に塩基配列：5’- g cag cag cag cgg gac cua - 3’（配列番号１）を含むsiＲＮＡを挙げることが出来る。尚、この塩基配列は、上記非特許文献１に記載された配列（5’- CAG CAG CAG
CGG GAC CTA TC -
3’と比較して３つの塩基が異なるものである（上記各配列中の下線部分）。
【００１７】
尚、動物細胞内でＲＮＡ干渉が生起するには、siRNAは２１〜２３塩基程度で、且つそれぞれの３’側に２塩基突出している必要がある。従って、上記のセンス鎖を有する本発明のsiＲＮＡは、より具体的には、例えば、本明細書の図１にsiRNA MJD3 として示されるものである。
【００１８】
本発明のsiＲＮＡを、例えば、マカド−ジョセフ病の治療に利用する場合には、当該技術分野で公知の任意のドラッグ・デリバリー・システムを使用することが出来る。ＲＮＡ自体は不安定な物質であり、例えば、血液中に注入したような場合にはＲＮＡ分解酵素などによって分解されてしまう。そこで、各種機能性リポソーム又は高分子ミセルなどのキャリア内にsiＲＮＡを封入したり、又は、siＲＮＡの両端に、例えば、接着因子又は抗体分子などの標的誘導分子やＰＥＧを結合させることによってsiＲＮＡを修飾し、血液又は細胞内での安定性を高めることが可能である。
【００１９】
体内で効果的にsiＲＮＡを発現させて作用させる別の方法として、本発明siＲＮＡの発現ベクター、即ち、該siＲＮＡに対応するＤＮＡを外来ＤＮＡ断片として組み込んで得られる発現ＤＮＡベクターがある。このような発現ベクターとしては、当業者に公知の適当なベクター系を適宜選択し、当該技術分野で公知の適当な方法で作成することが出来る。このような本発明のsiＲＮＡに対応するＤＮＡ断片も当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来る。
【００２０】
尚、このような発現ベクターにおいては、プロモーターの下流に、siＲＮＡのセンス鎖に対応するＤＮＡ配列とアンチセンス鎖に対応するＤＮＡ配列が１本のＤＮＡにコードされている「ヘアピン型」又は「ステムループ型」と呼ばれる型のものがある。これは、体内で転写されてヘアピン（ステムループ）状のＲＮＡとなり、その後、酵素反応を受けてsiRNAが生成される。
【００２１】
このような発現ベクターの具体例として、例えば、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター等の各種ウイルスベクターを挙げることが出来る。アデノウイルスベクターは神経細胞等の分裂速度が遅い細胞を含む幅広い細胞への遺伝子導入が可能であり、且つ、インビボでの導効率がほぼ１００％である。導入遺伝子は通常、宿主細胞の染色体外に存在し、染色体への組み込みは稀である。従って、導入遺伝子の発現は一過性で通常１〜４週間である。又、アデノ随伴ウイルスベクターは、安全性が高く、神経細胞のような非分裂細胞にも導入可能であり、更に、宿主染色体に導入遺伝子が組み込まれるために、１年以上にも及ぶ導入遺伝子の長期的発現が可能な系である。
【００２２】
以上のsiＲＮＡを活性成分として含有するキャリア、及び、siＲＮＡの発現ベクターは当業者に公知の方法で作成することが出来る。又、これらを含む組成物は、その目的、成分等に応じて、緩衝液及び補助剤等の当業者に公知の任意の成分が含まれており、更に、その使用・投与方法等に応じて、溶液、懸濁液又は乳濁液等の任意の形態とすることが出来る。
【００２３】
本発明方法において、細胞のトランスフェクションは当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。例えば、上記の本発明組成物を、例えば、注射等の適当な手段を用いてヒトを含む動物体内に適当な経路で投与することによって、インビボでトランスフェクションを行わせることも可能である。このような場合には、本発明方法はマカドージョセフ患者への遺伝子治療方法として機能することになる。或いは、以下の実施例に示されるように、各種培養細胞系に対してインビトロでトランスフェクションを行うことも可能である。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００２５】
プラスミドの構築、及びsiRNAの設計
ataxin-3発現プラスミドはAkira Kakizuka博士から提供された[4]。該プラスミド中のMJDI
cDNAは、２２(正常、pCMX HA-Q22C)又は７９(伸長したpCMX
HA-Q79C)個のＣＡＧリピート、及びそのＮ末端にヘマグルチニン（haemagglutinin(HA)）が融合された結合断片であった。pCMX
HA-Q22Cの中のＣＡＧリピート直後のシトシンは、QuikChange部位特異的突然変異誘発システム(Stratagene、La
Jolla (CA))を使用して、グアニン(pCMX HA-Q22G)に変更された。更に、これらのMJD cDNAをpIRES-hrGFP-la(Stratagene)へサブローニングし、夫々、pGFP-Q22G、pGFPQ22C及びpGFP-Q79Cを得た。
【００２６】
ＣＡＧリピート及びその3'末端の結合部位をターゲットとすべく、異なる４種類のsiRNAsを設計し（図１Ｂ）、当業者に公知の方法でこれらＲＮＡを化学合成した。即ち、ＣＰＧのＴ−カラムに核酸合成機（ABI
社製、Expedite）でdTを付加後、Ｃ／Ｇ多型における一塩基変化をsiRNAにおけるセンス鎖の５‘末端から夫々、５、８、１１及び１１番目の位置に設けた、siRNA
MJD1、siRNA MJD2、siRNA MJD3、siRNA MJD4を夫々合成し、ＨＰＬＣを用いて精製した。
【００２７】
トランスフェクション及びウェスタンブロット
ataxin-3の発現におけるMJD RNAに対する、上記で作成したsiRNAの効果を検討する目的で、各siRNA（１０又は２５ｎＭ）とataxin-3発現プラスミド（４μｇ）を６ウェル培養プレートで培養されているヒト胎児腎臓細胞系293T（ＡＴＣＣから購入）にLipofectamine Plus 試薬（Life Technologies, Rockville, MD）を用いてコトランスフェクションした。siRNAはアニールさせた後、文献[9]に記載の方法に従い、トランスフェクションした
【００２８】
トランスフェクションの２４時間後に、プロチアーゼインヒビターカクテル（Roche）を含むTNG緩衝液（50m
Tris-HCl, 150mM  NaCl, 1% Triton X-100）によって細胞を回収し、15%のSDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド薄膜(Bio-Rad)上に移した。マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体(Roche)反応させ、増感化学ルミネセンス検出キット(ECL;
Amerham Pharmacia Biotech)を使用して検出した。
【００２９】
その結果、変異体ataxin-3(Q79C)は25nMのsiRNA MJD3によって最も有効に抑制された。又、ウェスタンブロットのシグナル強度上でコントロールに対して96.0%減少した（図２Ａ）。対照的に、野生型ataxin-3(Q22G)の発現は、siRNA
MJD4によって適度に抑制されたが、siRNA MJDl、siRNA MJD2、及びsiRNA MJD3によっては明らかに影響を受けなかった。以上の結果から、本発明のsiＲＮＡの一例であるsiRNA
MJD3は、CとGの間の1つのヌクレオチド変更を最も良く認識し、Q22Gの発現に対する影響は殆どなくて、Q79Cの発現を特異的に抑制した。Q79C発現に対するsiRNA
MJD3の影響は用量依存的であるのに対して、Q22Gの抑制は10nM及び25nM siRNAで類似していた。即ち、25nMのsiRNA MJD3によって、Q22Gは殆ど抑制されず（5.9%）、Q22Cも僅かしか抑制されない（22.5%）のに対して、Q79Cは96.0%
も抑制された。予想外にも、(CAG)79C及び(CAG)22Cにおけるターゲット配列は同一であるにも拘らず、siRNA MJD3は、別の野生型対立遺伝子(Q22C)の発現をあまり減少させることはなかった（図２Ｂ）。
【００３０】
更に、抑制結果における上記の傾向は、DsRed蛍光をトランスフェクション効率のコントロールとして使用し、ataxin-3(pGFP-Q22CあるいはpGFP-Q79C)と共に内部リボソームエントリー部位によって発現されるGFPの蛍光が減少することによっても確認された（図２Ｃ）。
【００３１】
以上の結果から、本発明のsiＲＮＡは、マカド−ジョセフ病遺伝子の野生型アリルと変異体アリルを識別することができることが確認された。更に、本発明のsiＲＮＡは、ＲＮＡの一次配列に非依存的に、マカド−ジョセフ病の変異体アリル由来のｍＲＮＡと特異的に結合することが確認された。
【００３２】
細胞死の評価
変異体-3の発現によって引き起こされる細胞死に対するsiRNAの影響を評価するために、２４ウェル培養プレート内のNeuro2a細胞（ＡＴＣＣから購入）をpCMXQ79C(1μｇ/ウェル)及びsiRNA
MJD3(100nM/ウェル)でコトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、Neuro2aの細胞死は、トリパンブルー排除法、及びCytotox
96非放射性細胞毒性検定(Promega)による細胞質の乳酸脱水素酵素(LDH)活性測定の両方で分析することにより決定された。
【００３３】
その結果、トランスフェクションの48時間後に、変異体MJD(Q79C)の発現はNeuro2aに有毒だった。しかしながら、野生型ataxin-3(Q22GとQ22C)の発現は細胞生存に影響を及ぼさなかった。即ち、siRNA
MJD3は突然変異体ataxin-3の毒性を著しく抑制し、それによる細胞死を、夫々62.8%（LDH検定）及び75.9%（トリパンブルー排除法）で減少させることができた。
尚、統計分析は、スチューデントt-検定及び単一因子ＡＮＯＶＡ、並びにそれに続くFisher’s
protected 1east-significant differenc post hoc testを使用して行った。
【００３４】
本発明は、以下の理論的考察に何等制約を受けるものではないが、本発明のsiＲＮＡがＭＪＤ１遺伝子における正常なアリルと異常な（変異体）アリルに由来するＲＮＡを特異的に識別することができる理由として、すべてのＲＮＡ配列がsiRNAに等しくアクセス可能だとは限らないということである。即ち、特にターゲットＲＮＡが高度に折り重ねられたものである場合、或る種の標的配列はその二次構造内に埋め込まれているかもしれない[10]。更に、高度に折り重ねられたRNAに対するsiRNAの最適なの標的部位は、リボザイムに対するものと殆ど同じであり、その開裂効率はターゲットRNAの二次構造による影響を非常に受けるものである[9]。
【００３５】
ＭＪＤ遺伝子のC/G多型の標的部位は、コンピューター予測上では二次構造においてタイトなステム形態を示すCAGリピートのすぐ下流である。従って、GAGリピート長の大きな差異によるMJD
RNAの二次構造の変化がsiRNA MJD3による効果に影響を及ぼしている可能性が考えられる。
【００３６】
或いは、別の可能性として、(CAG) 79Cよりも(CAG)22Cに対して優先的に結合するＲＮＡ結合蛋白質が存在し、そのために、siRNA
MJD3が(CAG)22Cへ接近するのを妨げられている、ということである。ＭＪＤｍＲＮＡに対するＲＮＡ結合蛋白質は未だ発見されていないが、筋緊張性ジストロフィー蛋白質キナーゼ遺伝子におけるＣＵＧリピートは、リピート長依存的にＣＵＧ結合蛋白質と結合することが判っている[11]。更に、ハンチントン舞踏病においてＣＡＧリピートに付着するＲＮＡ結合蛋白質の存在が示唆されている[12]。
【００３７】
［引用文献］
1. Kawaguchi Y, Okamoto T, Taniwaki M,
et al. CAG expansions in a novel gene for
Machado-Joseph disease at chromosome
14q32.1. Nat Genet 1994;8:221-228.
2. Ross CA. When more is less:
pathogenesis of glutamine repeat neurodegenerative
diseases. Neuron 1995;15:493-496:
3. Ikeda H, Yamaguchi M, Satoshi 5, Aze
Y, Narumiya 5, Kakizuka A. Expanded
polyglutamine in the Machado-Joseph
disease protein induced cell death in vitro and
in vivo. Nat Genet 1996;13:196-201.
4. Kobayashi T, Tanaka K, Jnoue K,
Kakizuka A. Functional ATPase activity of
p97/valosin-containing protein (VCP) is
required for the quality control of
endoplasmic reticulum in neuronally
differentiated mammalian PC12 cells. J Biol
Chem 2002;277:47358-47365.
5. Wang G, Sawai N, Kotliarova 5, Kanazawa I, Nukina N..Ataxin-3, the MJD1 gene
product, interacts with the two human
homologs of yeast DNA repair protein RAD23,
HHR23A and HHR23B. Hum Mol Genet
2000;9:1795-1803.
6. Elbashir 5, Harborth J, Lendeckel W,
Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21
nucleotide RNAs mediate RNA interference
in cultured mammalian cells. Nature
2001 ;411 :494-498.
7. Matsumura R, Takayanagi T, Murata K,
Futamura N, Hirano M, Ueno S.
Relationship of (CAG)nC configuration to
repeat instability of the Machado-Joseph
disease gene. Hum Genet 1996;98:643-645.
8. Gaspar C, Lopes-Cendes I, Hayes 5, et
al. Ancestral origins of the Machado-Joseph
disease mutation: a worldwide haplotype
study. Am J Hum Genet. 2001;68:523-528.
9. Yokota T, Sakamoto N, Enomoto Y, et
al. Inhibition of intracellular hepatitis C
virus replication by synthetic and
vector-derived small interfering RNAs. EMBO Rep
2003;4:602-608.
10. Yoshinari K, Miyagishi M, Taira K,
et al. Effect on RNAi of the tight structure,
sequence and position of the targeted
region. Nucleic Acids Res 2OO4;32:691-699.~
11. Philips AV, Timchenko L, Cooper TA.
Disruption of splicing regulated by a CUG-
binding protein in myotonic dystrophy.
Science 1998;280:737-741.
12. McLaughlin BA, Spencer C, Eberwine
J. CAG trinucleotide RNA repeats interact
with RNA-binding proteins. Am J Hum
Genet 1996;59:561-569.
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のsiＲＮＡに基づく核酸医薬は、マカドージョセフ患者への遺伝子治療の可能性を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図中、Ａ（上）はヒトMJD1遺伝子における CAGリピートの直ぐ下流にあるG/G多型を示す。Ａ（下）は５６人のＭＪＤ患者におけるG/G多型及びCAGリピートの分布を示す。伸長したアリルは全て(CAG)nCを有しており、一方、正常アリルは(CAG)nGと(CAG)nGを同頻度で有する（0.46及び0.54）。矢印は本明細書に実施例で使用したataxin3-発現ベクター構築物におけるCAGリピートを示す。  Ｂは、MJD1 mRNA中の(CAG)nGをターゲットにしたsiRNAの配列を示す。尚、大文字はＤＮＡを意味する。
【図２】変異体MJD1の発現に対する本発明siRNAの特異的な抑制効果を示す電気泳動の写真である。Ａ及びＢの棒グラフの各値は平均及びＳＥＭを示す。Ｃは、293T細胞のGFPイメージ(x200)を示す写真である。
【図３】哺乳類細胞における変異体Ataxin 3による毒性に対するsiRNAMJD3の影響を示すＬＤＨアッセイ（*** p<0.0001）及びトリパンブルーエクスクル−ジョン法（** p<0. 001）のよる検出結果示す。Q22C 又はQ22Gの過剰発現によっても細胞毒性は示されなかった。尚、pcDNA3.1 プラスミド（Invitrogen）を偽トランスフェクションとして使用した。棒グラフの各値は平均及びＳＥＭを示す。
【図１】
2005304321.tif 000003
【図２】
2005304321.tif 000004
【図３】
2005304321.tif 000005