(57)【要約】【課題】分泌型蛋白質と、目的膜蛋白質とを含有する融合蛋白質であって、前記分泌型蛋白質のＣ末端に、前記目的膜蛋白質が連結している融合蛋白質。【解決手段】バクテリアの組換え蛋白質発現系を改良することによって、創薬研究において重要な組換え膜蛋白質の調製方法及び組換え膜蛋白質を提供する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌型蛋白質と、目的膜蛋白質とを含有する融合蛋白質であって、
前記分泌型蛋白質のＣ末端に、前記目的膜蛋白質が連結している
ことを特徴とする融合蛋白質。
【請求項２】
分泌型蛋白質は、膜透過性ペプチド若しくはその２０残基以上の部分配列からなるペプチド、又は、膜蛋白質若しくはその細胞外ドメインに位置する２０残基以上の部分配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１記載の融合蛋白質。
【請求項３】
膜透過性ペプチドは、バクテリアのペリプラズム由来蛋白質であることを特徴とする請求項２記載の融合蛋白質。
【請求項４】
膜蛋白質は、バクテリア由来の膜蛋白質であることを特徴とする請求項２記載の融合蛋白質。
【請求項５】
分泌型蛋白質は、他のペプチドと相互作用する性質を有するペプチドであることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の融合蛋白質。
【請求項６】
分泌型蛋白質は、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼの全長又はその１０残基以上の部分配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の融合蛋白質。
【請求項７】
ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼは、ＰｐｉＡ、ＦｋｐＡ、ＳｕｒＡ又はＰｐｉＤであることを特徴とする請求項６記載の融合蛋白質。
【請求項８】
分泌型蛋白質は、蛋白質のジスルフィド結合の形成・交換を触媒する蛋白質因子の全長又はその１０残基以上の部分配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の融合蛋白質。
【請求項９】
蛋白質のジスルフィド結合の形成・交換を触媒する蛋白質因子は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ又はＤｓｂＤであることを特徴とする請求項８記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
分泌型蛋白質と、目的膜蛋白質との間にプロテアーゼの認識部位を有するペプチドを有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
分泌型蛋白質のシグナルペプチドのＣ末端に、３〜１００アミノ酸からなるタグを有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
目的膜蛋白質のＣ末端に、３〜１００アミノ酸からなるタグを有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
タグは、ポリＡｒｇ−ｔａｇ、ポリＨｉｓ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、ストレプトアビディン結合ペプチド、カルモジュリン結合ペプチド又はキチン結合ペプチドであることを特徴とする請求項１１又は１２記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
目的膜蛋白質は、イオンチャンネル内在型膜受容体蛋白質であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
目的膜蛋白質は、チロシンカイネース型膜受容体蛋白質であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
目的膜蛋白質は、Ｇ蛋白質共役型膜受容体蛋白質であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６記載の融合蛋白質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６記載の融合蛋白質が細胞膜に発現していることを特徴とする融合蛋白質産生バクテリア。
【請求項１９】
分泌型蛋白質が細胞外に提示され、かつ、目的膜蛋白質が細胞膜上に発現しているものであることを特徴とする請求項１８記載の融合蛋白質産生バクテリア。
【請求項２０】
請求項１８又は１９記載の融合蛋白質産生バクテリアを製造する方法であって、宿主バクテリアに請求項１７記載の発現ベクターを導入する工程、及び、融合蛋白質を発現するバクテリアを回収する工程を有することを特徴とする融合蛋白質産生バクテリアの製造方法。
【請求項２１】
スフェロプラスト化されたものであることを特徴とする請求項１８及び１９記載の融合蛋白質産生バクテリア。
【請求項２２】
請求項２１記載の融合蛋白質産生バクテリアを製造する方法であって、宿主バクテリアに請求項１７記載の発現ベクターを導入する工程、融合蛋白質を発現するバクテリアを回収する工程、及び、バクテリアをスフェロプラスト化する工程を有することを特徴とする融合蛋白質産生バクテリアの製造方法。
【請求項２３】
請求項１８、１９又は２１記載の融合蛋白質産生バクテリアに被験物質を作用させる工程を有することを特徴とする目的膜蛋白質に対する親和性の評価方法。
【請求項２４】
請求項１８、１９又は２１記載の融合蛋白質産生バクテリアを固相化する工程、及び、固相化された前記融合蛋白質産生バクテリアに被験物質を作用させる工程を有することを特徴とする目的膜蛋白質に対する親和性の評価方法。
【請求項２５】
請求項１８、１９又は２１記載の融合蛋白質産生バクテリアの細胞膜画分。
【請求項２６】
請求項２５記載の細胞膜画分に被験物質を作用させる工程を有することを特徴とする目的膜蛋白質に対する親和性の評価方法。
【請求項２７】
請求項２５記載の細胞膜画分を固相化する工程、及び、固相化された細胞膜画分に被験物質を作用させる工程を有することを特徴とする目的膜蛋白質に対する親和性の評価方法。
【請求項２８】
被験物質は、完全長抗体、抗体Ｈ鎖の全長、抗体Ｌ鎖の全長、単鎖抗体、抗体Ｈ鎖可変領域、又は、抗体Ｌ鎖可変領域であることを特徴とする請求項２３、２４、２６又は２７記載の目的膜蛋白質に対する親和性の評価方法。
【請求項２９】
請求項１８、１９又は２１記載の融合蛋白質産生バクテリアに融合蛋白質を発現させる工程、及び、分泌型蛋白質のリガンドが固定化された固相担体によって前記融合蛋白質を回収する工程を有することを特徴とする融合蛋白質の製造方法。
【請求項３０】
分泌型蛋白質は、ＦＫＢＰ型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであり、
分泌型蛋白質のリガンドは、ＦＫ５０６又は前記ＦＫＢＰ型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼに対して前記ＦＫ５０６と同等以上の結合力を有する化合物である
ことを特徴とする請求項２９記載の融合蛋白質の製造方法。
【請求項３１】
分泌型蛋白質は、シクロスポリン結合型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであり、
分泌型蛋白質のリガンドは、シクロスポリン又は前記シクロスポリン結合型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼに対して前記シクロスポリンと同等以上の結合力を有する化合物である
ことを特徴とする請求項２９記載の融合蛋白質の製造方法。
【請求項３２】
分泌型蛋白質は、パーブリン型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであり、
分泌型蛋白質のリガンドは、ジュグロン又は前記パーブリン型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼに対して前記ジュグロンと同等以上の結合力を有する化合物である
ことを特徴とする請求項２９記載の融合蛋白質の製造方法。
【請求項３３】
請求項２９、３０、３１又は３２記載の融合蛋白質の製造方法により得られた融合蛋白質にプロテアーゼを作用させる工程を有することを特徴とする膜蛋白質の製造方法。
【請求項３４】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６記載の融合蛋白質と、分泌型蛋白質のリガンドとが結合している複合体であって、
前記分泌型蛋白質は、ＦＫＢＰ型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、シクロスポリン結合型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、又は、パーブリン型のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであり、
前記リガンドは、ＦＫ５０６、シクロスポリン、ジュグロン、又は、前記ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼに対してそれらと同等以上の結合力を有する化合物である
ことを特徴とする複合体。
【請求項３５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５若しくは１６記載の融合蛋白質、請求項１８、１９若しくは２１記載の融合蛋白質産生バクテリア、又は、請求項２５記載の細胞膜画分を動物に免疫する工程を有することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項３６】
動物は、ヒト抗体産生トランスジェニック動物であることを特徴とする請求項３５記載の抗体の製造方法。
【請求項３７】
請求項２３、２４、２６、２７又は２８記載の目的膜蛋白質に対する親和性の評価方法によって得られた抗体を評価する工程を有することを特徴とする請求項３５又は３６記載の抗体の製造方法。
【請求項３８】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５若しくは１６記載の融合蛋白質、請求項１８、１９若しくは２１記載の融合蛋白質産生バクテリア、又は、請求項２５記載の細胞膜画分を動物に免疫した後、免役された前記動物より分離される抗体遺伝子であって、少なくとも抗体の抗原認識領域の６残基以上のペプチドをコードするものであることを特徴とする抗体遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、創薬研究において重要な組換え膜蛋白質の調製方法及び組換え膜蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
膜蛋白質、特に膜受容体は細胞表面でリガンドと結合することで活性化され、細胞内情報伝達のカスケードを作動させる重要な働きを担っている。膜受容体のアゴニスト（作動薬）、アンタゴニスト（拮抗薬）は医薬品候補となるため、膜受容体の効率的な生産技術及びこれを用いた評価方法を開発することは創薬研究において非常に重要である。
【０００３】
また、膜受容体に対する抗体医薬市場は年々伸びているが、実用化されている抗体医薬のターゲットとなる膜受容体の種類は限られている。抗膜受容体抗体の開発には、免疫原となる膜受容体及び免疫応答によって産生された抗体の評価の双方に組換え膜受容体を必要とする。例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のような７回膜貫通型膜受容体はその効率的生産技術が開発されていないためこれらをターゲットする抗体をはじめとする医薬の開発は遅れている。
【０００４】
従来は、一般的に、創薬のターゲットとなる哺乳動物由来の膜受容体は、ＣＨＯ細胞のような動物細胞、ｓｆ９細胞のような昆虫細胞での発現が試みられていたが、細胞膜画分への発現効率は低く、また細胞膜に発現しても、細胞膜上に存在する多種類の他の膜蛋白質の存在が問題となっていた。また、細胞膜に移行するまでに宿主のプロテアーゼによってすみやかに分解される等の問題もあった。また、昆虫細胞や動物細胞は取り扱いが煩雑であることや、目的の膜受容体を発現させる工程に至るまでに多くの工程と長い時間を要するという問題もあり、より簡便に活性型の組換え膜受容体を調製する技術が望まれていた。簡便な方法としてバクテリアを宿主として用いる方法があるが、バクテリアでは哺乳動物由来の膜受容体は発現が難しく、発現しても、正しい構造を形成することはなく、哺乳動物で発現させたものと同様の活性を有する膜受容体を得ることは困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、バクテリアの組換え蛋白質発現系を改良することによって、創薬研究において重要な組換え膜蛋白質の調製方法及び組換え膜蛋白質を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、分泌型蛋白質と、目的膜蛋白質とを含有する融合蛋白質であって、上記分泌型蛋白質のＣ末端に、上記目的膜蛋白質が連結している融合蛋白質である。
以下に本発明を詳述する。
【０００７】
本発明の融合蛋白質は分泌型蛋白質を含有する。
上記分泌型蛋白質は、本発明の融合蛋白質において、目的膜蛋白質のリーダー蛋白質として機能する。
上記分泌型蛋白質はＮ末端に約２０〜３０アミノ酸残基からなるシグナルペプチドをもった前駆体としてリボゾームで合成される。シグナルペプチドは分泌型蛋白質の膜透過には必須であり、膜透過の過程でシグナルペプチダーゼによって切断され、成熟体蛋白質が生ずる。
【０００８】
上記分泌型蛋白質としては特に限定されず、例えば、膜透過性ペプチド、膜蛋白質等が挙げられる。
上記分泌型蛋白質としては、Ｎ末端にシグナルペプチドを有するものであれば、膜透過性ペプチドの２０残基以上の部分配列からなるペプチドや、膜蛋白質の細胞外ドメインに位置する２０残基以上の部分配列からなるペプチドを用いることもできる。
【０００９】
上記膜透過性ペプチド及び上記膜蛋白質としてはＮ末端にシグナルペプチドを有するものであれば特に限定されないが、膜透過性の点からバクテリアのシグナルペプチドを有する蛋白質が好ましく、透過性ペプチドとしてはバクテリアのペリプラズム由来蛋白質が好ましく、上記膜蛋白質としてはバクテリア由来の膜蛋白質が好ましい。
【００１０】
７回膜貫通型膜蛋白質であるＧＰＣＲ等の膜蛋白質のＮ末端は細胞外ドメインに位置する。このため、上記目的膜蛋白質のＮ末端側に、これらのバクテリアのシグナルペプチドを有する分泌型蛋白質を連結することにより、本発明の融合蛋白質をバクテリアに発現させた場合は、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＳＲＰ（Ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）等の蛋白質因子が関与する蛋白質輸送システムによって速やかに膜へ移行し易くなるため、目的膜蛋白質が細胞質内のプロテアーゼにより分解されにくくなる。また、上記のバクテリアのシグナルペプチドを有する蛋白質は、ほぼ確実にペリプラズムへ分泌されるため、上記目的膜蛋白質は膜上に正しい折り畳み構造で発現しやすくなる。
【００１１】
上記分泌型蛋白質としては、人工的にＮ末端にシグナルペプチドが付与された蛋白質を用いることもできる。上記シグナルペプチドとしては、例えば、ＰｅｌＢ（Ｐｏｗｅｒ，ＢＥ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ  １１３，９５）、ＯｍｐＡ（Ｔａｎｊｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３，１９９７）、大腸菌マルトース結合蛋白質のシグナルペプチド（Ｆｉｋｅｓ，ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，２３５２）等が挙げられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．エンドキシラナーゼ由来のシグナルペプチドが付与された蛋白質を分泌型蛋白質として使用した場合は、高効率な分泌発現が可能となる（Ｊｅｏｎｇ，ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７，３９８）。
上記分泌型蛋白質として、バクテリアのペリプラズム由来蛋白質や、バクテリア由来の膜蛋白質を用いる場合でも、そのシグナルペプチドを上記のようなものに置き換えることで効率良く本発明の融合蛋白質を生産することが可能になる。
【００１２】
上記分泌型蛋白質は、他のペプチドと相互作用する性質を有することが好ましい。
上記分泌型蛋白質としては、例えば、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（以下、ＰＰＩａｓｅという）や、蛋白質のジスルフィド結合の形成・交換を触媒する蛋白質因子が好適に用いられる。これらの酵素を用いることにより、目的膜蛋白質の細胞外ドメインの構造形成を効率良く行うことができる。
上記分泌型蛋白質としては、また、ＰＰＩａｓｅや、蛋白質のジスルフィド結合の形成・交換を触媒する蛋白質因子の１０残基以上の部分配列からなるペプチドを用いることもできる。
【００１３】
上記ＰＰＩａｓｅは、ペプチドにおけるプロリン残基の立体異性化反応を触媒する蛋白質群であり、蛋白質の折り畳み構造の形成にも重要な役割を果たしている。
上記ＰＰＩａｓｅとしては、例えば、ＰｐｉＡ、ＦｋｐＡ、ＳｕｒＡ、ＰｐｉＤ等の大腸菌のペリプラズム由来のＰＰＩａｓｅが挙げられる。これらの大腸菌のペリプラズム由来のＰＰＩａｓｅには、実質的に同等の機能を有しているもの、即ち、実質的に同等のポリペプチド、少なくともこれらの１部分を含むポリペプチド、及び、１部のアミノ酸を他のアミノ酸に改変したもの等も含まれる。
【００１４】
上記ＰＰＩａｓｅにはシクロフィリン（シクロスポリン結合蛋白質）、ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合蛋白質）及びパーブリンの３つのファミリーが存在し、大腸菌のペリプラズムにもこの３つのファミリーに属するＰＰＩａｓｅが見出されている。
上記ＰｐｉＡ（ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＮＡＳ  ８７，４０２８）はシクロフィリンに、上記ＦｋｐＡ（Ｂｏｔｈｍａｎｎ，Ｈ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１７１００）はＦＫＢＰに、上記ＳｕｒＡ（Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０，２８５）及びＰｐｉＤ（Ｄａｒｔｉｇａｌｏｎｇｕｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，３９６８）はパーブリンに、それぞれ属するものである。
【００１５】
上記ＰｐｉＡはシクロスポリンに対する親和性が低いが、アミノ酸変異導入を施すことによって親和性を向上させることも可能である。
上記ＦｋｐＡはＦＫ５０６に対する結合力が強く、上記ＦｋｐＡと目的膜蛋白質との融合蛋白質を精製する際に、ＦＫ５０６又はその誘導体が固定化された担体を用いることにより容易に精製することができる。
上記ＳｕｒＡやＰｐｉＤ等のパーブリンファミリーに属するＰＰＩａｓｅは、ジュグロン（Ｊｕｇｌｏｎｅ）によって強く阻害される。上記ＳｕｒＡやＰｐｉＤと目的膜蛋白質との融合蛋白質もジュグロン又はその誘導体が固定化された担体を用いることにより容易に精製することができる。
【００１６】
上記ＰＰＩａｓｅは、ＰＰＩａｓｅ活性依存的又は非依存的に蛋白質の構造形成に関与している。上記ＦｋｐＡは、ＰＰＩａｓｅ活性とは別に蛋白質の凝集形成を抑制するシャペロン活性を有するものである（Ｒａｍｍ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１７１０６）。また、上記ＳｕｒＡ及びＰＰｉＤは膜蛋白質の折り畳みに関与していることが報告されている（Ｃｌａｉｒｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，３９６８；Ｌａｚａｒ，ＳＷ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，１７７０）。このため、上記大腸菌のペリプラズム由来のＰＰＩａｓｅを分泌型蛋白質として含有する融合蛋白質を大腸菌に発現させることで、目的膜蛋白質を大腸菌の膜上に正しい構造で発現させることができる
上記ＰＰＩａｓｅとしては、大腸菌以外のバクテリア由来のものであって、上記大腸菌のペリプラズム由来のＰＰＩａｓｅと相同性の高いアミノ酸配列を有するものを用いることもできる。アミノ酸配列の相同性は、ＣｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトによって同定することができる。
【００１７】
本発明で用いられるＰＰＩａｓｅとしては、シグナルペプチド、及び、プロリンの立体異性化やリガンドとの結合に必要な領域を含む断片からなるペプチドを用いることもできる。また、本発明で用いられるＰＰＩａｓｅとしては、古細菌や真核生物由来のＰＰＩａｓｅを用いることもでき、古細菌や真核生物由来のＰＰＩａｓｅにバクテリアで機能するシグナルペプチド付加したものを用いることもできる。
【００１８】
上記蛋白質のジスルフィド結合の形成・交換を触媒する蛋白質因子としては、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ等の大腸菌由来のＤｓｂ蛋白質が挙げられる。これらの大腸菌由来のＤｓｂ蛋白質には、実質的に同等の機能を有しているもの、即ち、実質的に同等のポリペプチド、少なくともこれらの１部分を含むポリペプチド、及び、１部のアミノ酸を他のアミノ酸に改変したもの等も含まれる。
上記Ｄｓｂ蛋白質は、ＰＰＩａｓｅと同様に、ペリプラズム蛋白質の構造形成に重要な役割を果たしている。
【００１９】
上記ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤは、全て活性発現に必須のＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフ（Ｘは任意のアミノ酸）を有する。上記ＤｓｂＡはＤｓｂＢと連携してＳ−Ｓ結合の形成を触媒し、上記ＤｓｂＣはＤｓｂＤと連携して、Ｓ−Ｓ結合の架け変え（異性化）を触媒している。
また、上記ＤｓｂＢ及びＤｓｂＤは膜貫通型蛋白質であるが、細胞外ドメインに活性部位を有しており、それぞれ上記ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣと共同的に働く（Ｒｉｔｚ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５，２１−４８）。
以上のことから、上記ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤの細胞外ドメインと目的膜蛋白質とを融合蛋白質として発現させることで、目的膜蛋白質に正しいＳ−Ｓ結合を導入してバクテリアの細胞膜上に発現させることが可能となる。また、上記ＤｓｂＡはＤｓｂＢに対して特定の酸化還元環境において強い親和性を示し、上記ＤｓｂＣはＤｓｂＤに対して特定の酸化還元環境において強い親和性を示す（Ｋｉｓｈｉｇｉｍａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７０７２；Ｈａｅｂｅｌ，ＰＷ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１，４７７４）。このため、上記ＤｓｂＡと目的膜蛋白質との融合蛋白質は、上記ＤｓｂＢ又はその活性ドメインを含む断片が固定化された担体によって容易に精製することができ、上記ＤｓｂＣと目的膜蛋白質との融合蛋白質は、上記ＤｓｂＤ又はその活性ドメインを含む断片が固定化された担体によって容易に精製することができる。
【００２０】
本発明の融合蛋白質は、分泌型蛋白質のシグナルペプチドのＣ末端、又は、目的膜蛋白質のＣ末端に、３〜１００アミノ酸からなるタグを有することが好ましい。
上記タグとしては、例えば、ポリＡｒｇ−ｔａｇ（Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２，７６）、ポリＨｉｓ−ｔａｇ（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｙｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，１３２１）、ＦＬＡＧ−ｔａｇ（Ｐｒｉｃｋｅｔｔ，ＫＳｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７，５８０）、ストレプトアビディン結合ペプチド（Ｗｉｌｓｏｎ，ＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＰＮＡＳ  ９８，３７５０）、カルモジュリン結合ペプチド（Ｓｔｏｆｋｏ−Ｈａｈｎ，ＲＥ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０２，２７４）、キチン結合ペプチド（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６，４４６５）、ＳＰＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ  Ｊ．４，１０７５）、ＺＺ（Ｍｏｋｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，３７９）、ＳＰＧ（Ｎｙｇｒｅｎ，ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １，６９）等が挙げられる。なかでも、ポリＡｒｇ−ｔａｇ、ポリＨｉｓ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、ストレプトアビディン結合ペプチド、カルモジュリン結合ペプチド、キチン結合ペプチドが好ましい。
上記タグを有することにより、本発明の融合蛋白質の精製を容易にすることができる。
【００２１】
本発明の融合蛋白質は、分泌型蛋白質と、目的膜蛋白質との間にプロテアーゼの認識部位を有するペプチドを有することが好ましい。
上記プロテアーゼとしては特に限定されず、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、プリシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。上記プロテアーゼの認識部位を有するペプチドとしては、プロテアーゼの認識部位を含む５〜３０アミノ酸程度のものが好ましい。上記プロテアーゼの認識部位を有するペプチドのプロテアーゼの認識部位以外の部分は特定の２次構造を形成しないものなら特に限定されず、いかなる配列であってもよいが、例えば、グリシン、セリンのようなサイズの小さい中性アミノ酸を多く含むものが好ましい。
分泌型蛋白質と、目的膜蛋白質との間にプロテアーゼの認識部位を有するペプチドを有することにより、本発明の融合蛋白質を精製した後、プロテアーゼを作用させて目的膜蛋白質を分泌型蛋白質から切り出し、目的膜蛋白質のみを回収するができる。
【００２２】
上記目的膜蛋白質としては特に限定されず、既知、未知を問わず、哺乳動物、線虫、酵母等の真核生物のゲノムにコードされる、全ての膜蛋白質又は膜受容体蛋白質が挙げられる。
上記膜受容体蛋白質は構造的によく保存された各ファミリーを形成しており、大きく（１）イオンチャンネル内在型、（２）チロシンカイネース型、及び、（３）Ｇ蛋白質共役型（ＧＰＣＲ）の３つに分類される。上記イオンチャンネル内在型の受容体は、リガンドが結合すると、受容体そのものに存在するイオンチャネルが開き、Ｎａ＋やＣａ２＋等を細胞内外のイオン勾配を利用して細胞内に移動させる。上記チロシンカイネース型の受容体は、リガンドの結合をリン酸化活性の上昇に転換して、一連のカスケードを引き起こすことによりシグナルを増幅する。上記Ｇ蛋白質共役型の受容体は、受容体自身はイオンチャネルや酵素活性をもたず、リガンドの結合による情報をＧ蛋白質を介して細胞内に伝達する。
上記目的膜蛋白質としては、なかでも、イオンチャンネル内在型膜受容体蛋白質、チロシンカイネース型膜受容体蛋白質、及び、Ｇ蛋白質共役型膜受容体蛋白質が好ましい。
【００２３】
上記膜受容体蛋白質をターゲットとする創薬研究においては、（１）オーファンレセプター（天然リガンドが同定されていない膜受容体蛋白質）のリガンド探索、（２）膜受容体蛋白質に特異的に結合する低分子リガンド又は抗体の探索と結合特性の解析、（３）膜受容体蛋白質の立体構造解析が重要である。本発明の融合蛋白質はこれらの研究全てに貢献するものである。
【００２４】
上記目的膜蛋白質が膜受容体蛋白質である場合、分泌型蛋白質に対する特異的結合リガンドとの結合を介して固層化された本発明の融合蛋白質に、動物組織抽出液等を作用させることにより、目的とする膜受容体蛋白質に対する天然リガンドを回収することができる。得られた天然リガンドは電気泳動、質量分析、アミノ酸配列分析等の方法によって同定することができる。更に、得られた天然リガンドと膜受容体蛋白質との安定複合体の立体構造を解析することで、新規のリガンドを原子レベルで設計することも可能となる。また、膜受容体蛋白質の立体構造解析を行なうためには、結晶化や重水素化のために膜受容体蛋白質の大量発現技術の開発が不可欠であるが、これまでＧＰＣＲの発現は大腸菌や酵母では不可能であるとされており、主にＣＨＯやＣＯＳ−７、ＨＥＫのような動物培養細胞で発現した微量なサンプルを用いて様々な分析が行われていた。これに対して、本発明の融合蛋白質によれば、膜受容体蛋白質を組み換え型蛋白質として安価に大量調製することができる。
【００２５】
本発明の融合蛋白質はバクテリアを宿主として発現されることが好ましく、本発明の融合蛋白質が細胞膜に発現している融合蛋白質産生バクテリアもまた、本発明の１つである。
本発明の融合蛋白質産生バクテリアとしては、組換え蛋白発現系が充分に開発されている大腸菌又は枯草菌に属するものが好ましい。
【００２６】
本発明の融合蛋白質産生バクテリアとしては、分泌型蛋白質の膜移行に関与する細胞内因子であるＳｅｃＢ蛋白質やＳＲＰ蛋白質の遺伝子を含有するプラスミドが導入されているものが好ましい。
ＳｅｃＢ蛋白質やＳＲＰ蛋白質の遺伝子を含有するプラスミドを導入することにより、過剰に生産する分泌型蛋白質の膜への移行を速やかに行うことができ、このため、目的膜蛋白質を効率よく細胞膜上に発現させることができる。
【００２７】
本発明の融合蛋白質産生バクテリアとしては、プロテアーゼが欠損した株であることが好ましい。
上記プロテアーゼが欠損した株としては、例えば、ｌｏｎ、ＯｍｐＴのようなプロテアーゼ構造遺伝子の１部が欠損した大腸菌が挙げられる（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，２８３）。また、上記プロテアーゼが欠損した株として、宿主の生育に悪い影響を与えない限りにおいて、更に他のプロテアーゼを欠損させる遺伝子操作を施したものを用いることもできる。
膜蛋白質は疎水的領域がその大半を占めている場合が多く、これらが膜移行するまでに細胞質内のプロテアーゼによって分解してしまう場合が多いが、プロテアーゼが欠損した株を用いることにより、目的膜蛋白質がプロテアーゼによって分解されるのを防ぐことができる。
【００２８】
本発明の融合蛋白質産生バクテリアは、分泌型蛋白質が細胞外に提示され、かつ、目的膜蛋白質が細胞膜上に発現しているものであることが好ましい。
本発明の融合蛋白質産生バクテリアは、スフェロプラスト化されたものであることが好ましい。上記スフェロプラスト化する方法としては特に限定されず、例えば、本発明の融合蛋白質産生バクテリアに１ｍＭ程度のＥＤＴＡの存在下で適当量のリゾチームを作用させる方法等が挙げられる。
本発明の融合蛋白質産生バクテリアを適当な、培養液、及び、培養条件下で培養することによって本発明の融合蛋白質を生産することができる。
【００２９】
本発明の融合蛋白質産生バクテリアは、本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子を適当なプラスミド又はベクターに組み込み、これらを宿主バクテリアに導入することによって得られる。このような、本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターもまた、本発明の１つである。
本発明の発現ベクターとしては、宿主バクテリア中で複製可能なものであれば特に限定されないが、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等に由来するものが挙げられる。上記プラスミドとしては、例えば、ｐＥＴ２１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０等の枯草菌由来のプラスミド等が挙げられ、上記バクテリオファージとしては、例えば、λｇｔ１０、λＺＡＰ等のλファージが挙げられる。
本発明の発現ベクターは、例えば、まず本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子を精製し、次いで適当な制限酵素で切断し、それを適当なプラスミドの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してプラスミドに連結する方法により構築される。
【００３０】
本発明の発現ベクターは、宿主バクテリア中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合部位、本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。
上記プロモーターとしては、大腸菌等のバクテリア中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＡｒａＢプロモーター、ヒートショックプロモーター等の大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。上記プロモーターとして、ｔａｃプロモーター等のように人為的に設計改変されたプロモーターを用いることもできる。
本発明の発現ベクターは、更に、プロモーターを制御する遺伝子を有していてもよい。
【００３１】
本発明の発現ベクターを宿主バクテリアに導入することにより、本発明の融合蛋白質産生バクテリアを製造することができる。宿主バクテリアに本発明の発現ベクターを導入する工程、及び、融合蛋白質を発現するバクテリアを回収する工程を有する本発明の融合蛋白質産生バクテリアの製造方法、並びに、宿主バクテリアに本発明の発現ベクターを導入する工程、融合蛋白質を発現するバクテリアを回収する工程、及び、バクテリアを細胞壁溶解酵素処理等によってスフェロプラスト化する工程を有する本発明の融合蛋白質産生バクテリアの製造方法もまた、本発明の１つである。
本発明の発現ベクターを宿主バクテリアに導入する方法としては、バクテリアにＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３２】
本発明の融合蛋白質産生バクテリアに融合蛋白質を発現させた後、分泌型蛋白質のリガンドが固定化された固層担体によって本発明の融合蛋白質を回収することにより、本発明の融合蛋白質を効率よく製造することができる。
このような、本発明の融合蛋白質産生バクテリアに融合蛋白質を発現させる工程、及び、分泌型蛋白質のリガンドが固定化された固層担体によって本発明の融合蛋白質を回収する工程を有する融合蛋白質の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００３３】
本発明の融合蛋白質の製造方法において、上記分泌型蛋白質がＦＫＢＰ型のＰＰＩａｓｅである場合は、上記分泌型蛋白質のリガンドは、ＦＫ５０６又はＦＫＢＰ型のＰＰＩａｓｅに対してＦＫ５０６と同等以上の結合力を有する化合物であり、上記分泌型蛋白質がシクロスポリン結合型のＰＰＩａｓｅである場合は、上記分泌型蛋白質のリガンドは、シクロスポリン又はシクロスポリン結合型のＰＰＩａｓｅに対してシクロスポリンと同等以上の結合力を有する化合物であり、上記分泌型蛋白質がパーブリン型のＰＰＩａｓｅである場合は、上記分泌型蛋白質のリガンドは、ジュグロン又はパーブリン型のＰＰＩａｓｅに対してジュグロンと同等以上の結合力を有する化合物である。
【００３４】
本発明の融合蛋白質と、分泌型蛋白質のリガンドとが結合している複合体もまた、本発明の１つである。本発明の複合体において、上記分泌型蛋白質は、ＦＫＢＰ型のＰＰＩａｓｅ、シクロスポリン結合型のＰＰＩａｓｅ、又は、パーブリン型のＰＰＩａｓｅであり、上記リガンドは、ＦＫ５０６、シクロスポリン、ジュグロン、又は、上記ＰＰＩａｓｅに対してそれらと同等以上の結合力を有する化合物である。
【００３５】
本発明の融合蛋白質の製造方法により得られた融合蛋白質がプロテアーゼの認識部位を有する場合は、得られた融合蛋白質にプロテアーゼを作用させることにより、目的とする膜蛋白質を容易に得ることができる。このような膜蛋白質の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００３６】
本発明の融合蛋白質産生バクテリアに被験物質を作用させることにより、目的膜蛋白質に対する被験物質の親和性を評価することができる。このような、本発明の融合蛋白質産生バクテリアに被験物質を作用させる工程を有する目的膜蛋白質に対する親和性の評価方法もまた、本発明の１つである。
【００３７】
本発明の評価方法においては、本発明の融合蛋白質産生バクテリアを固相化して、固相化された本発明の融合蛋白質産生バクテリアに被験物質を作用させることが好ましい。
【００３８】
本発明の融合蛋白質産生バクテリアの細胞膜画分に被験物質を作用させることによっても、目的膜蛋白質に対する被験物質の親和性を評価することができる。
上記細胞膜画分もまた、本発明の１である。
上記細胞膜画分を用いる本発明の評価方法においては、上記細胞膜画分を固相化して、固相化された細胞膜画分に被験物質を作用させることが好ましい。
【００３９】
上記被験物質としては特に限定されないが、例えば、目的膜蛋白質に対する完全長抗体、抗体Ｈ鎖の全長、抗体Ｌ鎖の全長、単鎖抗体、抗体Ｈ鎖可変領域、又は、抗体Ｌ鎖可変領域等が好ましい。
【００４０】
本発明の融合蛋白質、本発明の融合蛋白質産生バクテリア、又は、本発明の細胞膜画分を用いて膜受容体蛋白質等の目的膜蛋白質に対する抗体を調製することができる。このような、本発明の融合蛋白質、本発明の融合蛋白質産生バクテリア、又は、本発明の細胞膜画分を動物に免疫する工程を有する抗体の製造方法もまた、本発明の１つである。
上記抗体を調製するには、まず、本発明の融合蛋白質、本発明の融合蛋白質産生バクテリア、又は、本発明の細胞膜画分を動物に免疫する。
上記動物としては特に限定されず、例えば、マウス、ウサギ、ラット等が挙げられる。
【００４１】
人工的に調製される組み換えマウス・ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、及び、ヒト抗体は、今後、蛋白医薬の中でも最も成長する素材の一つであると予測されている。
現在は、抗原を動物に免疫することで、抗体産生組織からｍＲＮＡを回収し、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって抗体可変領域に相当する遺伝子を増幅し、大腸菌を用いたファージディスプレイ法（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３）等によって抗体可変領域遺伝子のクローニングをしており、クローン化された可変領域遺伝子とヒト抗体遺伝子と融合させることで、キメラ又はヒト化抗体を作製することができる。
本発明の融合蛋白質、本発明の融合蛋白質産生バクテリア、又は、本発明の細胞膜画分を動物に免疫して、免役された動物より抗体遺伝子を分離することにより、目的とする膜蛋白質に対する抗原認識領域を有する抗体遺伝子を得ることができる。得られた抗体遺伝子を用いることにより、目的膜蛋白質に対するキメラ又はヒト化抗体を作製することができる。本発明の融合蛋白質、本発明の融合蛋白質産生バクテリア、又は、本発明の細胞膜画分を動物に免疫した後、免役された動物より分離される抗体遺伝子であって、少なくとも抗体の抗原認識領域の６残基以上のペプチドをコードするものである抗体遺伝子もまた、本発明の１つである。
【００４２】
本発明の抗体の製造方法において用いる動物としては、ヒト抗体産生トランスジェニック動物が好ましい。免疫動物としてヒト抗体産生マウス（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７，３９１；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，７２２）等のヒト抗体産生トランスジェニック動物を用いることにより目的膜蛋白質に対するヒト抗体及びその遺伝子を直接得ることができる。
【００４３】
本発明の抗体の製造方法は、本発明の目的膜蛋白質に対する親和性の評価方法によって、得られた抗体を評価する工程を有することが好ましい。即ち、免疫された動物から血清を採取し、本発明の融合蛋白質産生バクテリアをスフェロプラスト化したものと混合し、更に蛍光標識された二次抗体を作用させる。以上の操作を目的膜蛋白質が発現していないコントロールの宿主バクテリアについても同様に行う。次に、フローサイトメトリー、セルソーター、蛍光標示式細胞分種装置（ＦＡＣＳ）等により本発明の融合蛋白質産生バクテリア及び宿主バクテリアの蛍光標識化の解析を行う。これによって、免疫された動物が目的膜蛋白質の細胞外ドメインを認識する抗体を産生しているかを調べることができる。
【００４４】
上記抗体を治療に用いる場合は、当該抗体は膜受容体蛋白質の細胞外ドメインに結合する必要性があることから、細胞膜上に目的膜受容体蛋白質を正しいオリエンテーションで保持する本発明の融合蛋白質産生バクテリアはこのような解析に極めて有用である。また免疫動物の抗体産生組織から、ハイブリドーマ法や、ファージディスプレイ法によりモノクローナル抗体を単離する場合にも本発明の融合蛋白質産生バクテリアを用いることができる。また、本発明の融合蛋白質、膜受容体蛋白質又は本発明の融合蛋白質産生バクテリアが固層化されたプレートを用いてＥＬＩＳＡ法を行なえば、上記の抗体評価を簡便化することができる。
【００４５】
本発明によれば、バクテリアの分泌発現系を利用することで、ＧＰＣＲを始めとする膜受容体等の膜蛋白質を分泌型蛋白質との融合蛋白質として膜上に発現させ、更に発現した組換え膜蛋白質の活性を保持させた状態で、これらに対するリガンドや抗体のスクリーニングや結合特性を評価する技術を提供することができる。
【００４６】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１）分泌型蛋白質と目的膜蛋白質との融合蛋白質の発現ベクターの構築ｐＴＷＶ２２８（タカラ社製）のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとの制限酵素サイト間に配列番号１及び２の合成ＤＮＡからなる相補的２本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したものを導入してｐＰＭを作製した。ｐＰＭはＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間に分泌型蛋白質の遺伝子を、ＳｐｅＩサイトとＭｌｕＩサイトの間に目的膜蛋白質の遺伝子を導入できるものである。また翻訳される融合蛋白質において、分泌型蛋白質と目的膜蛋白質との間には、プレシジョンプロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス社製）の認識部位を含むＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＴＳ（アミノ酸は１文字略記で記した）が介在するように設計されている。また、目的膜蛋白質のＣ末端には６個のヒスチジン残基が付加される設計となっている。
【００４８】
大腸菌ＣＴＦ０７３株から、終止コドンを除いたＦｋｐＡ遺伝子（配列番号３）をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＮＣＢＩコード：ＡＥ０１６７６７で登録されている塩基配列を元に設計した。プライマーには５側にＮｄｅＩ制限酵素サイトを、３側にＢａｍＨＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化によってＦｋｐＡ遺伝子を回収し、これを同制限酵素処理及びバクテリアアルカリフォスファターゼ処理が施されたｐＰＭに導入し、目的膜蛋白質をＦｋｐＡとの融合蛋白質として発現させるベクターｐＰＭＦを構築した。
【００４９】
一方、大腸菌由来ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌Ｋ１２株から、終止コドンを除いたＳｕｒＡ遺伝子（配列番号４）をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＮＣＢＩコード：ＡＥ０００１１５で登録されている塩基配列を元に設計した。プライマーには５‘側にＮｄｅＩ制限酵素サイトを、３’側にＢａｍＨＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ処理によってＳｕｒＡ遺伝子を回収し、これを同制限酵素処理及びバクテリアアルカリフォスファターゼ処理が施されたｐＰＭに導入し、目的膜蛋白質をＳｕｒＡとの融合蛋白質として発現させるベクターｐＰＭＳを構築した。
【００５０】
（実施例２）ヒト由来セロトニンレセプターとＦｋｐＡとの融合蛋白質の大腸菌膜画分への発現
７回膜貫通型膜受容体の一つであるヒト由来セロトニンレセプター（５ＨＴ１ａレセプター）と大腸菌由来ＦｋｐＡとの融合蛋白質発現系を構築するためにヒトｃＤＮＡライブラリーから５ＨＴ１ａレセプター遺伝子のクローニングを行った。すなわち、ＮＣＢＩコード：ＨＳＳＥＲＲ５１として登録されている塩基配列情報を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲにより、５ＨＴ１ａレセプター遺伝子を増幅した。５ＨＴ１ａの塩基配列は配列番号５に示した。プライマーには５‘側にＳｐｅＩ制限酵素サイトを、３’側にＨｐａＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理によってＨＴ１ａ遺伝子を回収し、これを同制限酵素処理及びバクテリアアルカリフォスファターゼ処理が施されたｐＰＭＦに導入し、５ＨＴ１ａをＦｋｐＡとの融合蛋白質として発現させるベクターｐＰＭＦＨを構築した。
【００５１】
また５ＨＴ１ａレセプター遺伝子の上流にバクテリアのシグナル配列であるＰｅｌＢに相当する遺伝子が付加されたものをＰＣＲによって作製し、これをｐＰＭのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトに導入した。これにより５ＨＴ１ａのＰｅｌＢによる分泌発現を行う発現ベクターｐＰＭＰＢＨを構築した。
【００５２】
大腸菌ＢＬ２１株にｐＰＭＦＨを導入し、カルベニシリンが１００μｇ／Ｌ含有されたＬＢ液体培地にてＯＤ６００が２．５まで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ添加し、更に２５℃で４時間培養して菌体を回収した。１Ｌ培溶液相当の菌体を１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５％サッカロース、０．５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリド、及び、６０μｇ／ｍＬのリゾチームが添加された１００ｍＬの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にけん濁し、４℃で１時間放置した。これに等量の冷純水を添加混合し更に１時間、４℃で放置した。これを３０秒間処理、２分間放置の超音波処理を３回繰り返し、その後、１５０，０００ｇで１時間超遠心分離を行った。沈殿物を１００ｍＬの５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に再度けん濁した後、１５０，０００ｇで１時間超遠心分離を行った。得られた沈殿物を２５ｍＬの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にけん濁した。サンプルの１部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、更に抗ヒスチジンタグ抗体を用いるウエスターンブロッティングによって融合蛋白質の発現を調べた。ｐＰＭＰＢＨが導入されたＢＬ２１株、ｐＴＷＶ２２８が導入されたＢＬ２１株についても本実施例の方法に従い、膜画分を調製し、同様のウエスターンブロッティングを行った。
【００５３】
その結果、ｐＰＭＰＢＨ及びｐＴＷＶ２２８が導入されたＢＬ２１株画分ではバンドが確認できず、ｐＰＭＦＨが導入されたＢＬ２１株の膜画分のみに目的融合蛋白質の分子量に相当する、分子量約７５ｋＤａのバンドが検出された。以上のことから、５ＨＴ１ａはＰｅｌＢによる分泌発現では大腸菌細胞膜上に発現せず、分泌型蛋白質としてＦｋｐＡを用いる分泌発現によって大腸菌細胞膜上に発現したものと考えられる。
【００５４】
（実施例３）細胞膜画分を用いた５ＨＴ１レセプターのリガンド結合能の評価（１）
実施例２にて調製したＦｋｐＡと５ＨＴ１ａとからなる融合蛋白質を含む膜画分に１％ジギトニン及び０．３％コール酸ナトリウムを添加して可溶化した。これを１００００ｒｐｍで遠心分離し、回収した上清を、１％ジギトニン、０．３％コール酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、及び、１ｍＭイミダゾールを含有する２５ｍＭ  Ｎａ−リン酸酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化されたニッケルセファロースカラムにアプライし、吸着画分を１〜３００ｍＭのイミダゾールの濃度勾配によって溶出した。ＦｋｐＡとセレトニンレセプターの融合蛋白質の画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ヒスチジンタグ抗体によって確認した。回収した画分を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、及び、３ｍＭ  ＥＤＴＡが含有された１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）に透析した。透析内液を、表面プラズモン共鳴による分子間相互作用解析装置用のセンサーチップ表面に固定化した。なお、固定化は、予めセンサーチップの金薄膜の表面にカルボキシメチル基を導入しておき、融合蛋白質中のＦｋｐＡのアミノ基と結合させることにより行った。得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴シグナル解析装置（ビアコア社製、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ）にセットし、リガンドサンプルとして１０〜１００ｎＭのセロトニン溶液をフローセルに流してリガンドを結合させた後、ｐＨ２．５のグリシン溶液によって解離させた。
【００５５】
この結合・解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、解析ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ９．１（ビアコア社製）によって解離定数（Ｋｄ）を算出したところ１５．３ｎＭであった。以上のことから本実施例で調製された５ＨＴ１ａは天然型と同レベルのリガンド結合能があると考えられた。
【００５６】
（実施例４）ヒト由来セロトニンレセプターとＳｕｒＡとの融合蛋白質の大腸菌膜画分への発現
実施例２で得られた５ＨＴ１ａレセプター遺伝子をＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理及びバクテリアアルカリフォスファターゼ処理が施された実施例１で作製されたｐＰＭＳに導入し、５ＨＴ１ａをＳｕｒＡとの融合蛋白質として発現させるベクターｐＰＭＳＨを構築した。
【００５７】
大腸菌ＢＬ２１株にｐＰＭＳＨを導入し、カルベニシリンが１００μｇ／Ｌ含有されたＬＢ液体培地にてＯＤ６００が２．５まで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ添加し、更に２５℃で４時間培養して菌体を回収した。１Ｌ培溶液相当の菌体を１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５％サッカロース、０．５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリド、及び、６０μｇ／ｍＬのリゾチームが添加された１００ｍＬの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にけん濁し、４℃で１時間放置した。これに等量の冷純水を添加混合し更に１時間、４℃で放置した。これを３０秒間処理、２分間放置の超音波処理を３回繰り返し、その後、１５０，０００ｇで１時間超遠心分離を行った。沈殿物を１００ｍＬの５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に再度けん濁した後、１５０，０００ｇで１時間超遠心分離を行った。得られた沈殿物を２５ｍＬの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にけん濁した。サンプルの１部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、更に抗ヒスチジンタグ抗体を用いるウエスターンブロッティングによって融合蛋白質の発現を調べた。実施例２で作製されたｐＰＭＰＢＨが導入されたＢＬ２１株、ｐＴＷＶ２２８が導入されたＢＬ２１株についても本実施例の方法に従い、膜画分を調製し、同様のウエスターンブロッティングを行った。その結果、ｐＰＭＰＢＨ及びｐＴＷＶ２２８が導入されたＢＬ２１株画分ではバンドが確認できず、ｐＰＭＳＨが導入されたＢＬ２１株の膜画分のみに目的融合蛋白質の分子量に相当する、分子量約１００ｋＤａのバンドが検出された。以上のことから、５ＨＴ１ａはＰｅｌＢによる分泌発現では大腸菌細胞膜上に発現せず、分泌型蛋白質としてＳｕｒＡを用いる分泌発現によって大腸菌細胞膜上に発現したものと考えられる。
【００５８】
（実施例５）細胞膜画分を用いた５ＨＴ１レセプターのリガンド結合能の評価（２）
実施例４にて調製したＳｕｒＡと５ＨＴ１ａとからなる融合蛋白質を含む膜画分に１％ジギトニン及び０．３％コール酸ナトリウムを添加して可溶化した。これを１００００ｒｐｍで遠心分離し、回収した上清を、１％ジギトニン、０．３％コール酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、及び、１ｍＭイミダゾールを含有する２５ｍＭ  Ｎａ−リン酸酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化されたニッケルセファロースカラムにアプライし、吸着画分を１〜３００ｍＭのイミダゾールの濃度勾配によって溶出した。ＳｕｒＡとセレトニンレセプターの融合蛋白質の画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ヒスチジンタグ抗体によって確認した。回収した画分を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、及び、３ｍＭ  ＥＤＴＡが含有された１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）に透析した。透析内液を、実施例３の方法と同様にして、表面プラズモン共鳴による分子間相互作用解析装置用のセンサーチップ表面に固定化した。得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴シグナル解析装置（ビアコア社製、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ）にセットし、リガンドサンプルとして１０〜１００ｎＭのセロトニン溶液をフローセルに流してリガンドを結合させた後、ｐＨ２．５のグリシン溶液によって解離させた。この結合・解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、解析ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ９．１（ビアコア社製）によって解離定数（Ｋｄ）を算出したところ８．７ｎＭであった。以上のことから本実施例で調製された５ＨＴ１ａは天然型と同レベルのリガンド結合能があると考えられた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、バクテリアの分泌発現系を利用することで、ＧＰＣＲを始めとする膜受容体等の膜蛋白質を分泌型蛋白質との融合蛋白質として膜上に発現させ、更に発現した組換え膜蛋白質の活性を保持させた状態で、創薬研究において有用な、これらに対するリガンドや抗体のスクリーニングや結合特性を評価する技術を提供することができる。
【配列表】
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