(57)【要約】【課題】  本発明は、毛周期の発毛、脱毛機構などに関与する因子を見出し、皮膚の発毛・脱毛状況の予知方法の提供、さらには従来にない全く新規、且つ効果的な育毛剤、除毛剤の提供を課題とする。【解決手段】  本発明は、皮膚の発毛・脱毛状態を予知するための皮膚検査方法を提供する。この方法は、皮膚中の成長期毛包において発現の亢進する遺伝子を指標とする。また、本発明はかかる遺伝子をしようとする育毛剤、除毛剤のスクリーニング方法も提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の発毛・脱毛状態を予知するための皮膚検査方法であって、皮膚中のセクレチン、細胞質性ポリA結合性タンパク質１、真核系翻訳開始因子５、エフリン受容体（ＥｐｈＡ４）、カルボニックアンヒドラーゼ６、カテプシンＥ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター１（アルファー1・アンチトリプシン１、セルピン１アルファ）、ベータＡ４クリスタリン、ヌクレオポリン様プロテイン２、高グリシン/チロシンタンパク質タイプI  E5、スティミュレーテド・バイ・レチノイックアシッド・ジーン６（stimulated by retinoic acid gene 6)、アクアポリン１、サイトケラチン１２、リンパ系増強因子結合因子（ＬＥＦ−１）、神経芽細胞腫myc関連癌遺伝子１、フォークヘッドボックスＮ1、コネキシン３０、コネキシン２６、テナシンＣ、シンデカン１、クラステリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼＩＶ、スモールプロリンリッチプロテイン１Ａ、酸性ケラチン複合体１  遺伝子３、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１、塩基性ケラチン複合体  遺伝子６ｇ、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１７、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１９、ラント関連転写因子１（Runx1,AML1)、細胞質性・活性化Ｔ細胞の核因子３（ＮＦＡＴ３）、エフリン受容体（ＥｐｈＢ１）、シチジン５’−三リン酸シンターゼ、ディファレンシャル・ディスプレイ・アンドアクティベーデッド・バイｐ５３（differential display and activated by p53)、BMP-2誘導キナーゼ、ビタミンＤ受容体、Ｐカドヘリン、ストラティフィン、フィン・プロトオンコジーン、トランスフォーミング成長因子アルファ、パッチドホモログ２、モノクローナル抗体Ｋｉ６７により同定される抗原及びバソヌクリンから成る群から選ばれる１又は複数のタンパク質をコードする遺伝子が亢進している場合、発毛し易い及び／又は賢固な毛幹を形成し易い皮膚であると判断し、当該遺伝子の発現が減少している場合、脱毛し易い及び／又は細毛化が起き易い皮膚であると判断することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記タンパク質がセクレチン、細胞質性ポリA結合性タンパク質１、真核系翻訳開始因子５、エフリン受容体（ＥｐｈＡ４）、カルボニックアンヒドラーゼ６、カテプシンＥ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター１（アルファー1・アンチトリプシン１、セルピン１アルファ）、ベータＡ４クリスタリン、ヌクレオポリン様プロテイン２、高グリシン/チロシンタンパク質タイプI  E5、スティミュレーテド・バイ・レチノイックアシッド・ジーン６（stimulated by retinoic acid gene 6)、アクアポリン１、サイトケラチン１２、ラント関連転写因子１（Runx1,AML1)、細胞質性・活性化Ｔ細胞の核因子３（ＮＦＡＴ３）、エフリン受容体（ＥｐｈＢ１）、シチジン５’−三リン酸シンターゼ、ディファレンシャル・ディスプレイ・アンドアクティベーデッド・バイｐ５３（differential display and activated by p53)及び／又はBMP-2誘導キナーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記皮膚中の遺伝子の発現の亢進が、皮膚中の前記タンパク質の量を測定することにより決定される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記測定が前記タンパク質に特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法による、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記皮膚中の前記遺伝子の発現の亢進が、皮膚から抽出された前記タンパク質をコードするmRNAの量を測定することにより決定される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記mRNAの測定をポリメラーゼ連鎖反応法により行う、請求項５記載の方法。
【請求項７】
発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を請求項１又は２に規定する遺伝子の発現及び／又は当該遺伝子のタンパク質産物の活性を亢進する能力について評価し、当該亢進能力を有する候補薬剤を発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子として選定することを特徴とする方法。
【請求項８】
更に、前記亢進能力を有する候補薬剤を毛周期同調モデル動物に適用し、発毛促進及び／又は脱毛抑制及び／又は毛包の太毛化促進効果を有する候補薬剤を選定することを含んで成る、請求項７記載の方法。
【請求項９】
発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を請求項１または２に規定する遺伝子の発現及び／又は当該遺伝子のタンパク質産物の活性を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有する候補薬剤を発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として選定することを特徴とする方法。
【請求項１０】
更に、前記阻害能力を有する候補薬剤を毛周期同調モデル動物に適用し、発毛抑制及び／又は脱毛促進及び／又は毛包の太毛化抑制効果を有する候補薬剤を選定することを含んで成る、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
皮膚の発毛・脱毛状態を予知するための皮膚検査方法であって、皮膚中の配列番号１に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１８１００８Ｋ０３Ｒｉｋ）、配列番号２に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１１１００３２Ｄ１６Ｒｉｋ）及び／又は配列番号３に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（４７３３４０１Ｈ２１Ｒｉｋ）に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現が亢進している場合、発毛し易い及び／又は賢固な毛幹を形成し易い皮膚であると判断し、当該遺伝子の発現が減少している場合、脱毛し易い及び／又は細毛化が起き易い皮膚であると判断することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記皮膚中の前記ポリヌクレオチドの発現の亢進が、皮膚から抽出された前記当該ポリヌクレオチドに相補性のmRNAの量を測定することにより決定される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記mRNAの測定をポリメラーゼ連鎖反応法により行う、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を皮膚中の配列番号１に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１８１００８Ｋ０３Ｒｉｋ）、配列番号２に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１１１００３２Ｄ１６Ｒｉｋ）及び／又は配列番号３に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（４７３３４０１Ｈ２１Ｒｉｋ）に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現を亢進する能力について評価し、当該亢進能力を有する候補薬剤を発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子として選定することを特徴とする方法。
【請求項１５】
更に、前記促進能力を有する候補薬剤を毛周期同調モデル動物に適用し、発毛促進及び／又は脱毛抑制及び／又は毛包の太毛化促進効果を有する候補薬剤を選定することを含んで成る、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を皮膚中の配列番号１に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１８１００８Ｋ０３Ｒｉｋ）、配列番号２に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１１１００３２Ｄ１６Ｒｉｋ）及び／又は配列番号３に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（４７３３４０１Ｈ２１Ｒｉｋ）に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有する候補薬剤を発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として選定することを特徴とする方法。
【請求項１７】
更に、前記阻害能力を有する候補薬剤をヘアサイクル同調モデル動物に適用し、発毛抑制及び／又は脱毛促進及び／又は毛包の太毛化抑制効果を有する候補薬剤を選定することを含んで成る、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
アセトアゾラミド、スルファニルアミド及びメタゾラミドの１又は複数を発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として含有する、除毛用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の発毛・脱毛状態を予知する方法、さらには育毛剤及び除毛剤のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪は美的外観上極めて重要視される。従って、先天的又は後天的要因による脱毛は多くの人々、特に男性にとって深刻な悩みである。特に高齢化社会、ストレス社会といわれる現代社会では、頭部毛髪が様々な後天的な原因により、脱毛の危機にさらされる機会がますます多くなってきている。これに対応して、発毛や毛髪の太毛化の促進を含む育毛効果を発揮するより優れた育毛剤を提供すべく、様々な試みがなされている。一方、特に女性の場合、美的外観上、手足、腋などにおける体毛や髭などのむだ毛の処理が行われており、例えばシェーバーなどを用いる機械的除毛方法、脱毛剤を用いてむだ毛を毛根から除去する方法、除毛剤を用いてその化学的作用によりむだ毛を除去する方法などの体毛除去方法が開発、利用されている。
【０００３】
このように、頭髪に関しては育毛が、そして腋、手足に関しては除毛が求められる状況がある。いずれについても、毛包に関する研究をはじめ、様々な試みがなされているが、未だ的確な処理、治療方法が見出されるに至っていない。
【０００４】
毛包は皮膚の付属器官の一つで一定の周期をもって常に生え変わり、自己再生を繰り返す能力をもつ器官として特徴付けられる。毛包は皮膚外部に露出したいわゆる毛髪と、皮膚真皮に埋没した毛幹を生み出す元になる毛根鞘や毛母細胞、毛乳頭細胞などから形成されている。発生学的には皮膚−真皮の相互作用により毛包原基が形成され、下部方向に皮膚が伸長することで毛包は形成される（成長期）。発生の最終段階として毛幹の伸長は一定期間継続するが、やがて停止し、アポトーシスによって毛根鞘、毛母細胞の部分が退縮に向かう（退行期）。この一連の過程で、真皮奥深くまで伸長していた毛包は皮膚近くまで短くなり、毛乳頭のサイズも小さくなる。やがて休止期を経て、再び毛母細胞は活性化され新しい周期の成長期へと向かう。この周期がほぼ一生を通じて繰り返される（毛周期）。
【０００５】
このような毛周期の発毛、脱毛機構などには多数の因子が複雑に関与、機能しているものと考えられている。毛周期へのケラチン関連タンパク質やアポトーシス関連酵素、例えばカスパーゼの関与は知られているが、未だ関与の知られていないその他多数のタンパク質、遺伝子が存在しているものと考えられ、その詳細な解明が期待される状況下にある。
【０００６】
【非特許文献１】M. Naganuma et al., Journal of Dermatological Science 25(2001) 29-35
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、毛周期の発毛、脱毛機構などに関与する因子を見出し、皮膚の発毛・脱毛状況の予知方法の提供、さらには従来にない全く新規、且つ効果的な育毛剤、除毛剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、毛周期の発毛、脱毛機構などに関与する因子の網羅的な解析を試みた。詳しくは、本発明者はワックス脱毛を同時に施すことで毛周期を同調させた数匹のマウスについて、ワックス脱毛を施して１３日目の毛周期が成長期に移行した毛包（以下、「成長期毛包」と称する場合がある）を多数有する皮膚由来のＲＮＡのマイクロアレイ解析の結果、ワックス脱毛を施していないコントロールマウスの毛包（以下、「休止期毛包」と称する場合がある）を多数有する皮膚由来のＲＮＡのマイクロアレイ解析結果と比べ、下記の遺伝子の発現が特異的に亢進されていることを見出した。従って、ヒトの皮膚において、下記の遺伝子の発現を調べることで、発毛し易い又は脱毛し易い皮膚であると判断することが可能であることが明らかとなった。
【０００９】
（１）毛包形成・毛幹形成への関与について既知の遺伝子であって、成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ１０倍以上亢進している遺伝子
・リンパ系増強因子結合因子（ＬＥＦ−１）
・神経芽細胞腫ｍｙｃ関連癌遺伝子１
・フォークヘッドボックスＮ１
・コネキシン３０
・コネキシン２６
・テナシンＣ
・シンデカン１
・クラステリン
・スモールプロリンリッチプロテイン１Ａ
【００１０】
（２）毛包への何らかの関与は未知であるが、発現するタンパク質の機能は既知の遺伝子であって、成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ１０倍以上亢進している遺伝子
・セクレチン
・細胞質性ポリＡ結合性タンパク質１
・細胞質性ポリＡ結合性タンパク質２
・真核系翻訳開始因子５
・高グリシン／チロシンタンパク質タイプＩ  Ｅ５
・ポリオウィルス受容体関連１
・エフリン受容体（ＥｐｈＡ４）
・カリウム膜電位依存性チャネル・Ｉｓｋ関連サブファミリーメンバー
・ハンチンティン相互作用タンパク１関連
・ニューロナルプロテイン
・フォルミンファミリータンパク質ＦＨＯＳ２
・カルボニックアンヒドラーゼ６
・カテプシンＥ
・ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ
・セリンプロテアーゼインヒビター１（アルファー１・アンチトリプシン１、セルピン１アルファ）
・グルタチオン過酸化酵素
・ベータＡ４クリスタリン
・プレクストリンホモロギー用ドメイン・ファミリーＡ・メンバー２
・ヌクレオポリン様プロテイン２
・二重特異性脱リン酸化酵素２
・膜貫通４スーパーファミリーメンバー４
・スティミュレーテド・バイ・レチノイックアシッド・シーン６（stimulated by retinoic acid gene 6）
・ハンチンティン相互作用タンパク１関連
・ミトコンドリア外膜４０ホモログ（酵母）トランスロカーゼ
・アクアポリン１
・ゴルジ自己抗原ゴルジンサブファミリーａ４
・チューブリンベータ５
・バキュロウィルスＩＡＰリピート含有５
・ユビキチン抱合酵素Ｅ２Ｓ
・サイトケラチン１２
【００１１】
（３）毛包への何らかの関与は未知であり、発現するタンパク質も未知であって、成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ１０倍以上亢進している遺伝子
・１８１００８Ｋ０３Ｒｉｋ（又はそれと３４％の相同性を有するＣｈａ遺伝子（カチオントランスポートレギュレーター遺伝子））；
・１１１００３２Ｄ１６Ｒｉｋ（ＫＡＰ４−７と高い相同性を示す）；
・４７３３４０１Ｈ２１Ｒｉｋ（ＫＡＰ６−１と高い相同性を示す）
【００１２】
（４）毛包形成・毛幹形成への関与については既知の遺伝子であって、成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ５倍以上亢進している遺伝子
・塩基性ケラチン複合体  遺伝子６ａ
・ビタミンＤ受容体
・Ｐカドヘリン
・ストラティフィン
・フィン・プロトオンコジーン
・トランスフォーミング成長因子アルファ
・パッチドホモログ２
・モノクローナル抗体Ｋｉ６７により同定される抗原
・バソヌクリン
【００１３】
（５）毛包への関与は未知である遺伝子であって、成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ５倍以上亢進している遺伝子
・ラント関連転写因子１（Ｒｕｎｘ１，ＡＭＬ１）
・細胞質性・活性化Ｔ細胞の核因子３（ＮＦＡＴ３）
・密着結合タンパク２（ＺＯ−２）
・クローディン１
・ニンジュリン１
・ポリオウィルス受容体関連２
・プレセニリン１
・タビー様タンパク４
・ネイキッドキューティクル２ホモログ（ショウジョウバエ）
・マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１３
・サイクリン依存キナーゼ４
・ハーベイラット肉腫ウィルスオンコジーン
・ＭＡＤホモログ（ショウジョウバエ）６
・ＲＡＢ１５
・エフリン受容体（ＥｐｈＢ１）
・タンパクチロシン脱リン酸化酵素・非受容体タイプ１１
・分泌担体膜タンパク２
・トランスゲリン２
・カイネシンファミリーメンバー１１
・ミクロチューブル関連タンパク
・シチジン５’−三リン酸シンターゼ
・レシチン−レチノールアシルトランスフェラーゼ
・タンパク脱リン酸化酵素１
・フューズドトウズ
・ディファレンシャル・ディスプレイ・アンドアクティベーデッド・バイｐ５３（differential display and activated by）
・結合介在・調節タンパク質
・ドリコール脱リン酸化酵素（ベータＤ）マンノシルトランスフェラーゼ２
・リピン３
・アデニリルシクラーゼ関連ＣＡＰプロテインホモログ１
・ＢＭＰ−２誘導キナーゼ
・ガスデルミン
・サイクリンＥ
・ウリジンポスホリラーゼ
・Ｓフェーズキナーゼアクチベーター
・動原体自己抗原Ａ
・ストリアチン
・カゼインＫａｐｐａ
・溶質輸送対ファミリー４（陰イオン交換体）メンバー１
・４  １／２  ＬＩＭドメイン２（four and half LIM domain 2）
・アンジオテンシン転換酵素（ペプチジルペプチダーゼＡ）２
・ｅｔｓ相同因子
【００１４】
上記遺伝子以外に、下記の遺伝子も、休止期毛包と比べ、成長期毛包における発現の有意な亢進が認められた。
（６）ケラチン関連遺伝子であり、成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ１０倍以上亢進している遺伝子
・酸性ケラチン複合体１  遺伝子３
・酸性ケラチン複合体１  遺伝子１
・塩基性ケラチン複合体  遺伝子６ｇ
・酸性ケラチン複合体１  遺伝子１７
・酸性ケラチン複合体１  遺伝子１９
・塩基性ケラチン複合体  遺伝子６ａ
・ケラチン関連タンパク３−３
・ケラチン関連タンパク９−１
・ケラチン関連タンパク１４
・ケラチン関連タンパク５−４
・ケラチン関連タンパク１２−４
【００１５】
欠損することで毛包の形成に異常をきたす報告が既になされている遺伝子が数多く発現亢進する一方で、毛包との関連の報告が存在しない遺伝子については、毛幹形成との関係でこれら遺伝子の発現がこのように顕著に亢進されることは極めて驚くべき事実である。これらの遺伝子も、既報のものと同様、毛幹形成にとって必須であるものと推認できる。
【００１６】
第一の観点において、本発明は、皮膚の発毛・脱毛状態を予知するための皮膚検査方法を提供する。この方法は、皮膚中の成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ５又は１０倍以上亢進している遺伝子、特に皮膚中のセクレチン、細胞質性ポリA結合性タンパク質１、真核系翻訳開始因子５、エフリン受容体（ＥｐｈＡ４）、カルボニックアンヒドラーゼ６、カテプシンＥ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター１（アルファー1・アンチトリプシン１、セルピン１アルファ）、ベータＡ４クリスタリン、ヌクレオポリン様プロテイン２、高グリシン/チロシンタンパク質タイプI  E5、スティミュレーテド・バイ・レチノイックアシッド・ジーン６（stimulated by retinoic acid gene 6)、アクアポリン１、サイトケラチン１２、リンパ系増強因子結合因子（ＬＥＦ−１）、神経芽細胞腫myc関連癌遺伝子１、フォークヘッドボックスＮ1、コネキシン３０、コネキシン２６、テナシンＣ、シンデカン１、クラステリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼＩＶ、スモールプロリンリッチプロテイン１Ａ、酸性ケラチン複合体１  遺伝子３、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１、塩基性ケラチン複合体  遺伝子６ｇ、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１７、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１９、ラント関連転写因子１（Runx1,AML1)、細胞質性・活性化Ｔ細胞の核因子３（ＮＦＡＴ３）、エフリン受容体（ＥｐｈＢ１）、シチジン５’−三リン酸シンターゼ、ディファレンシャル・ディスプレイ・アンドアクティベーデッド・バイｐ５３（differential display and activated by p53)、BMP-2誘導キナーゼ、ビタミンＤ受容体、Ｐカドヘリン、ストラティフィン、フィン・プロトオンコジーン、トランスフォーミング成長因子アルファ、パッチドホモログ２、モノクローナル抗体Ｋｉ６７により同定される抗原及びバソヌクリンから成る群から選ばれる１又は複数のタンパク質をコードする遺伝子が亢進している場合、発毛し易い及び／又は賢固な毛幹を形成し易い皮膚であると判断し、当該遺伝子の発現が減少している場合、脱毛し易い及び／又は細毛化が起き易い皮膚であると判断することを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、前記タンパク質は、セクレチン、細胞質性ポリA結合性タンパク質１、真核系翻訳開始因子５、エフリン受容体（ＥｐｈＡ４）、カルボニックアンヒドラーゼ６、カテプシンＥ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター１（アルファー1・アンチトリプシン１、セルピン１アルファ）、ベータＡ４クリスタリン、ヌクレオポリン様プロテイン２、高グリシン/チロシンタンパク質タイプI  E5、スティミュレーテド・バイ・レチノイックアシッド・ジーン６（stimulated by retinoic acid gene 6)、アクアポリン１、サイトケラチン１２、ラント関連転写因子１（Runx1,AML1)、細胞質性・活性化Ｔ細胞の核因子３（ＮＦＡＴ３）、エフリン受容体（ＥｐｈＢ１）、シチジン５’−三リン酸シンターゼ、ディファレンシャル・ディスプレイ・アンドアクティベーデッド・バイｐ５３（differential display and activated by p53)及び／又はBMP-2誘導キナーゼである。
【００１８】
好ましくは、皮膚中の遺伝子の発現の亢進は、皮膚中の前記タンパク質の量を測定することにより決定される。さらに好ましくは、この測定は上記タンパク質に特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法による。
【００１９】
また、上記皮膚中の遺伝子の発現の亢進は、皮膚から抽出された前記タンパク質をコードするmRNAの量を測定することにより決定されてもよい。好ましくは、上記mRNAの測定はポリメラーゼ連鎖反応法により行う。
【００２０】
本発明はまた、発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子をスクリーニングする方法も提供する。この方法は、候補薬剤を上記遺伝子の発現及び／又は当該遺伝子のタンパク質産物の活性を亢進する能力について評価し、当該亢進能力を有する候補薬剤を発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子として選定することを特徴とする。好ましくは、更に上記亢進能力を有する候補薬剤を毛周期同調モデル動物に適用し、発毛促進及び／又は脱毛抑制及び／又は毛包の太毛化促進効果を有する候補薬剤を選定する。
【００２１】
別の態様において、本発明は発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、候補薬剤を上記遺伝子の発現及び／又は当該遺伝子のタンパク質産物の活性を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有する候補薬剤を発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として選定することを特徴とする。好ましくは、更に、上記阻害能力を有する候補薬剤を毛周期同調モデル動物に適用し、発毛抑制及び／又は脱毛促進及び／又は毛包の太毛化抑制効果を有する候補薬剤を選定する。
【００２２】
更なる態様において、本発明は、成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ１０倍以上亢進しているカルボニックアンヒドラーゼ６の阻害剤たるアセトアゾラミド、スルファニルアミド及びメタゾラミドの１又は複数を発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として含有する医薬又は皮膚外用組成物を提供する。かかる組成物は、発毛抑制、脱毛促進及び／又は毛包の太毛化抑制効果を発揮することで除毛剤となり得る。
【００２３】
第二の観点において、本発明は皮膚の発毛・脱毛状態を予知するための皮膚検査方法であって、皮膚中の配列番号１に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１８１００８Ｋ０３Ｒｉｋ）もしくはそれと相同性の高いＣｈａ（カチオントランスポートレギュレーター）遺伝子、配列番号２に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１１１００３２Ｄ１６Ｒｉｋ）、又は配列番号３に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（４７３３４０１Ｈ２１Ｒｉｋ）に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現が亢進している場合、発毛し易い及び／又は賢固な毛幹を形成し易い皮膚であると判断し、当該遺伝子の発現が減少している場合、脱毛し易い及び／又は細毛化が起き易い皮膚であると判断することを特徴とする方法を提供する。
【００２４】
好ましくは、皮膚中の上記ポリヌクレオチドの発現の亢進は、皮膚から抽出された上記ポリヌクレオチドに相補性のmRNAの量を測定することにより決定される。また、好ましくは、上記mRNAの測定はポリメラーゼ連鎖反応法により行う。
【００２５】
本発明はさらに、発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を皮膚中の配列番号１に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１８１００８Ｋ０３Ｒｉｋ）、配列番号２に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１１１００３２Ｄ１６Ｒｉｋ）及び／又は配列番号３に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（４７３３４０１Ｈ２１Ｒｉｋ）に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現を亢進する能力について評価し、当該亢進能力を有する候補薬剤を発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子として選定することを特徴とする方法を提供する。好ましくは更に、上記促進能力を有する候補薬剤を毛周期同調モデル動物に適用し、発毛促進及び／又は脱毛抑制及び／又は毛包の太毛化促進効果を有する候補薬剤を選定する。
【００２６】
本発明はさらに、発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を皮膚中の配列番号１に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１８１００８Ｋ０３Ｒｉｋ）、配列番号２に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１１１００３２Ｄ１６Ｒｉｋ）及び／又は配列番号３に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（４７３３４０１Ｈ２１Ｒｉｋ）に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有する候補薬剤を発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として選定することを特徴とする方法を提供する。好ましくはさらに、上記阻害能力を有する候補薬剤をヘアサイクル同調モデル動物に適用し、発毛抑制及び／又は脱毛促進及び／又は毛包の太毛化抑制効果を有する候補薬剤を選定する。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは周知の方法又はそれに準じる方法、例えばJ.SambrookらMolecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法に従って行うことができ、そして高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばナトリウム濃度が約１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ、温度が約５０〜70℃、好ましくは約６０〜６５℃であることを含む条件をいう。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、皮膚の発毛・脱毛状態を予知するための皮膚検査方法や、新規育毛剤、除毛剤の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
上述の通り、上記遺伝子に関し毛周期における毛包形成・毛幹形成への関連の報告はない。本発明者はワックス脱毛前の休止期毛包を多く含むコントロールとしての皮膚及びワックス脱毛後１３日目の成長期毛包を多く含む皮膚各々由来のＲＮＡのマイクロアレイ解析の結果、成長期毛包を多く含む皮膚において上記各遺伝子の発現が特異的に亢進されていることを見出した。従って、これら遺伝子を指標とすることで、発毛のし易さ、脱毛のし易さを予知することができるものと推認できる。さらには、これらの遺伝子を指標とし、育毛効果を有する薬剤や除毛効果を有する薬剤を効率良く見つけ出すことが可能となる。ここでいう育毛効果とは、頭髪の発毛促進、例えば毛髪の本数を増加、脱毛の抑制、毛髪の太毛化などを意味する。また、ここでいう除毛効果とは、頭髪、眉毛、睫毛以外の体毛、例えば髭、脇毛、手足などの体毛の発毛抑制、例えば発毛する体毛の本数の減少、脱毛の促進、体毛の細毛化、長さの減少などを意味する。
【００３０】
毛周期同調マウス
８週齢前後のマウスの体毛は主に毛周期の休止期にある。これを脱毛ワックスによって除毛した場合、急激に休止期から成長期に移行し、毛が再生する。その際、皮膚の色はピンク色から灰青色になる。除毛処理後９日前後で発毛が開始し、１３日前後で毛幹形成が完成する。発毛開始したマウスの皮膚色は灰青色から再びピンク色になる。マウスの毛周期の個体差はあまりないため、複数のマウスにこのような脱毛ワックス処理を同時に施すことで、複数のマウス間で毛周期を同調させることができる（特開平９−２２１４１４号公報）。本発明において、成長期毛包を多数含む皮膚はワックス脱毛処理してから１３日目のマウスの皮膚とし、休止期毛包を多数含む皮膚はワックス脱毛を施す直前の皮膚とした。
【００３１】
皮膚しみ形成を予知するための皮膚検査方法
本発明は、皮膚、好ましくはヒト皮膚の発毛・脱毛状態を予知するための皮膚検査方法を提供する。この方法は、皮膚中の成長期毛包における発現が休止期毛包に比べ５又は１０倍倍以上亢進している遺伝子、即ちセクレチン、細胞質性ポリA結合性タンパク質１、真核系翻訳開始因子５、エフリン受容体（ＥｐｈＡ４）、カルボニックアンヒドラーゼ６、カテプシンＥ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター１（アルファー1・アンチトリプシン１、セルピン１アルファ）、ベータＡ４クリスタリン、ヌクレオポリン様プロテイン２、高グリシン/チロシンタンパク質タイプI  E5、スティミュレーテド・バイ・レチノイックアシッド・ジーン６（stimulated by retinoic acid gene 6)、アクアポリン１、サイトケラチン１２、リンパ系増強因子結合因子（ＬＥＦ−１）、神経芽細胞腫myc関連癌遺伝子１、フォークヘッドボックスＮ1、コネキシン３０、コネキシン２６、テナシンＣ、シンデカン１、クラステリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼＩＶ、スモールプロリンリッチプロテイン１Ａ、酸性ケラチン複合体１  遺伝子３、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１、塩基性ケラチン複合体  遺伝子６ｇ、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１７、酸性ケラチン複合体１  遺伝子１９、ラント関連転写因子１（Runx1,AML1)、細胞質性・活性化Ｔ細胞の核因子３（ＮＦＡＴ３）、エフリン受容体（ＥｐｈＢ１）、シチジン５’−三リン酸シンターゼ、ディファレンシャル・ディスプレイ・アンドアクティベーデッド・バイｐ５３（differential display and activated by p53)、BMP-2誘導キナーゼ、ビタミンＤ受容体、Ｐカドヘリン、ストラティフィン、フィン・プロトオンコジーン、トランスフォーミング成長因子アルファ、パッチドホモログ２、モノクローナル抗体Ｋｉ６７から成る群から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子から成る群から選ばれる遺伝子の発現がコントロール皮膚中のそれらと比べ亢進している場合、発毛し易い又は賢固な毛幹を形成し易い皮膚であると判断することを特徴とする。その評価基準として、例えば皮膚中の上記遺伝子の発現がコントロール皮膚中のそれらと比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％以上亢進していたなら「発毛し易い又は賢固な毛幹を形成し易い皮膚である」と判断する、としてよい。また、その評価基準として、例えば皮膚中の上記遺伝子の発現がコントロール皮膚中のそれらと比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％以上減少していたなら「脱毛し易い又は細毛化が起き易い皮膚である」と判断する、としてよい。
【００３２】
本発明は、また皮膚、好ましくはヒト皮膚の発毛・脱毛状態を予知するための皮膚検査方法であって、皮膚中の配列番号１に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１８１００８Ｋ０３Ｒｉｋ）もしくはそれと相同性の高いＣｈａ（カチオントランスポートレギュレーター）遺伝子、配列番号２に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（１１１００３２Ｄ１６Ｒｉｋ）、又は配列番号３に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド（４７３３４０１Ｈ２１Ｒｉｋ）に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現が正常な皮膚中の発現に比べて亢進している場合、しみ形成のし易い皮膚であると判断することを特徴とする方法を提供する。その評価基準として、例えば皮膚中の上記ポリヌクレオチドの発現がコントロール皮膚中のそれらと比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％以上亢進していたなら「発毛し易い又は賢固な毛幹を形成し易い皮膚である」と判断する、としてよい。また、その評価基準として、例えば皮膚中の上記ポリヌクレオチドの発現がコントロール皮膚中のそれらと比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％以上減少していたなら「脱毛し易い又は細毛化が起き易い皮膚である」と判断する、としてよい。
【００３３】
ハイブリダイゼーションは周知の方法又はそれに準じる方法、例えばJ.SambrookらMolecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法に従って行うことができ、そして高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばナトリウム濃度が約１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ、温度が約５０〜70℃、好ましくは約６０〜６５℃であることを含む条件をいう。
【００３４】
検査すべき皮膚は、例えば頭皮、顔、腋、腕、肢など、発毛又は脱毛が気になるあらゆる部分の皮膚であってよい。発毛のし易さ、賢固な毛幹の形成のし易さを予知したい場合、コントロール皮膚として、手のひら、足の裏など、毛包が形成されない部分の皮膚に由来の皮膚を用いてよい。また、脱毛のし易さ、細毛化のし易さを評価したい場合、コントロールとして側頭部、後頭部など、健常に頭髪が形成される部分であってよい。
【００３５】
皮膚中の上記遺伝子の亢進や減少は、例えば皮膚中の当該遺伝子によりコードされるタンパク質の量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定は上記タンパク質に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。また、皮膚からRNAを抽出し、上記タンパク質をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）により行われる。
【００３６】
皮膚中の上記遺伝子に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現は、皮膚からRNAを抽出し、上記ポリヌクレオチドに対応するmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）により行われる。
【００３７】
上述の通り、本発明は、成長期毛包を多く含む皮膚及び休止期毛包を多く含む皮膚由来のＲＮＡのマイクロアレイ解析の結果、休止期毛包皮膚と比べ、成長期毛包皮膚において上記遺伝子の発現が特異的に亢進されていることを見出したことに基づく。
【００３８】
従って、皮膚中の上記遺伝子の発現及び／もしくその遺伝子産物たる上記タンパク質の活性を抑えることで、発毛抑制、脱毛促進及び／又は毛包の太毛化抑制することができるものと推認される。
【００３９】
従って、本発明は上記遺伝子の発現を阻害する化合物や生薬を含む薬剤を、発毛抑制因子、脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として含んで成る、除毛用の医薬又は皮膚外用組成物を提供する。本発明に係る上記組成物は皮膚の脱毛、細毛化に有効利用できる。
【００４０】
別の観点において、皮膚中の上記遺伝子の発現及び／もしくその遺伝子産物たる上記タンパク質の活性を促進することで、発毛促進、脱毛抑制及び／又は毛包の太毛化促進することができるものと推認される。
【００４１】
従って、本発明はさらに、上記遺伝子の発現を促進する化合物や生薬を含む薬剤を、発毛促進因子、脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として含んで成る育毛用医薬又は皮膚外用組成物を提供する。本発明に係る上記組成物は皮膚の育毛、太毛化に有効利用できる。
【００４２】
本発明の医薬又は皮膚外用組成物は、例えば水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、カプセル、固形剤などの形態で適用される。従来から公知の方法でこれらの形態に調製したうえで、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤、水−油２層系、水−油−粉末３層系、注射剤、内服剤（錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤など）、坐剤などとして、身体に塗布、貼付、噴霧、注射、飲用、挿入することができる。当該組成物は上記化合物や生薬を含む薬剤を、特に限定することなく、組成物全量に基づき例えば０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度含有するであろう。
【００４３】
これらの剤型の中でも、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤などの皮膚外用剤が、本発明の目的に適する剤型である。なお、ここで記す皮膚外用剤には、医薬品、医薬部外品（軟膏剤など）、化粧料［洗顔料、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスクなどの基礎化粧品；ファンデーション、口紅などのメーキャップ化粧品；口腔化粧品、芳香化粧品、毛髪化粧品、ボディ化粧品など］が含まれる。特に本発明の医薬又は皮膚外用組成物は、育毛料又は除毛剤としての適用が好適である。
【００４４】
本発明の医薬又は皮膚外用組成物においては、所望する剤型に応じて従来公知の賦形剤や香料などをはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、顔料などの粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤などが適宜配合される。さらにこの他の薬効成分を本発明の医薬又は皮膚外用組成物に配合することは、その配合により所期の効果を損なわない範囲内で可能である。
【００４５】
発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子をスクリーニングする方法
本発明はさらに、発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子をスクリーニングする方法も提供する。この方法は、候補薬剤を上記遺伝子の発現を促進する及び／もしくその遺伝子産物たる上記タンパク質の活性を活性化する能力について評価し、当該能力を有する候補薬剤を発毛促進因子及び／又は脱毛抑制因子及び／又は毛包の太毛化促進因子として選定することを特徴とする。
【００４６】
好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記阻害能力を有する候補薬剤をしみモデル動物に適用し、発毛促進及び／又は脱毛抑制及び／又は毛包の太毛化促進効果を有する候補薬剤を選定することを含んで成る。
【００４７】
上記発毛促進及び／又は脱毛抑制及び／又は毛包の太毛化促進効果について確認する工程はこの候補薬剤をモデル動物、例えば毛周期同調マウスを利用して実施することができる。動物としてはマウスの他にラット、ウサギなど様々な動物が利用できる。好適な態様においては、この薬剤の溶液、例えば水溶液を調製してからモデル動物の皮膚に繰り返し塗布し、発毛や毛髪の太毛化を評価することで、上記効果の有無を判定することができる。
【００４８】
発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子をスクリーニングする方法
本発明はさらに、発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子をスクリーニングする方法も提供する。この方法は、候補薬剤を上記遺伝子の発現及び／もしくその遺伝子産物たる上記タンパク質の活性を抑える阻害能力について評価し、当該阻害能力を有する候補薬剤を発毛抑制因子及び／又は脱毛促進因子及び／又は毛包の太毛化抑制因子として選定することを特徴とする。
好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記阻害能力を有する候補薬剤をしみモデル動物に適用し、発毛抑制及び／又は脱毛促進及び／又は毛包の太毛化抑制効果を有する候補薬剤を選定することを含んで成る。
【００４９】
上記発毛抑制及び／又は脱毛促進及び／又は毛包の太毛化抑制効果について確認する工程はこの候補薬剤をモデル動物、例えば毛周期同調マウスを利用して実施することができる。動物としてはマウスの他にラット、ウサギなど様々な動物が利用できる。好適な態様においては、この薬剤の溶液、例えば水溶液を調製してからモデル動物の皮膚に繰り返し塗布し、脱毛や毛髪の細毛化を評価することで、上記効果の有無を判定することができる。
【００５０】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
毛周期同調マウスの作製
Ｃ５７ＢＬマウス（８週齢）３匹の背部皮膚（２ｃｍ×４ｃｍ）を脱毛ワックス（ＳＵＲＧＩ−ＷＡＸ）で同時に除毛処理し、毛周期の同調されたマウスを作成した。
【００５２】
皮膚からのＲＮＡ採取
マウス背部の皮膚全層を採取し、１センチ角に切断して液体窒素で凍結し破砕後、ISOGEN（日本ジーン社、メーカー推奨プロトコル）によりRNAを抽出、RNeasy（Qiagen社）により精製した。成長期毛包を多く含むマウスの皮膚はワックス脱毛処理を施して１３日目のマウス由来の皮膚とした。コントロールとして、ワックス脱毛処理を施す直前のマウスの皮膚を用いた。
【００５３】
マイクロアレイ用サンプルの反応
アジレントｃDNAマイクロアレイ用サンプル
サンプルの調製及びハイブリダイゼーションはアジレント社推奨プロトコルに準じた。トータルＲＮＡ10μgを、ｃDNAラベル化キット（アジレント社）を用いてラベル化ｃDNAを合成した。Qiaquick（Qiagen社,メーカー推奨プロトコル）にて精製後、Speed Vacにより溶媒を乾燥した。次に、マウスｃDNAマイクロアレイキット（アジレント社、G410A）を用いてハイブリダイゼーション後、スライドガラスを洗浄した。アジレント社スキャナーによりデータ読み取りを行った。
【００５４】
解析結果
約９，０００種の遺伝子の発現を網羅的に解析した結果、成長期毛包を多く含む皮膚において、コントロール皮膚と比べ、下記遺伝子の発現が有意に亢進されていることが見出された。成長期毛包を多く含む皮膚においてこれらの遺伝子の発現が亢進していることから、これら遺伝子を指標とすれば、将来毛幹が形成されることを予知できることなる。以下の表にその結果を示す。
【００５５】
【表１】
2005304491.tif 000002
【表２】
2005304491.tif 000003
【００５６】
カルボニックアンヒドラーゼ６の阻害剤の毛包形成への効果
毛周期を同調させたＣ５７ＢＬマウス５匹ずつにアセトアゾラミド100mM、10mM及び溶媒（ジメチルスルホキシド）を塗布した。塗布は、ワックス脱毛後５日目から、毎日１回、背部に100μｌずつ行い、塗布開始後６日目（ワックス脱毛後１１日目）の背部皮膚の黒みをメキサメーターで測定することにより毛包形成度を評価した。
【００５７】
その結果を図１に示す。この結果から、アセトアゾラミドによりカルボニックアンヒドラーゼ６の酵素を活性を阻害することにより、発毛を開始を遅延化させることで発毛を抑制することができることが明らかと成った。従って、成長期毛包において発現の亢進される遺伝子の発現を抑制することで、発毛促進の抑制、脱毛の促進及び／又は体毛の細毛化が可能であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】カルボニックアンヒドラーゼ６の阻害剤の毛包形成への効果。
【図１】
2005304491.tif 000004
【配列表】
2005304491000001.app