(57)【要約】【課題】細胞内で発現しているタンパク質を回収する操作において、細胞破砕液に含まれる不溶性物質を簡単に除去するタンパク質回収デバイスを提供すること。【解決手段】細胞分散液を狭隘な流路を通過させ、該流路によって不純物を捕捉・除去し、タンパク質溶液を回収するタンパク質回収デバイスであり、好ましくは、狭隘な流路が、多孔質固体内の細孔によって構成され、多孔質固体の細孔径の平均が、０．０１μｍ〜５０μｍであり、多孔質固体が多孔質ガラスであるタンパク質回収デバイス。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分散液を狭隘な流路を通過させ、該流路によって不純物を捕捉・除去し、タンパク質溶液を回収することを特徴とするタンパク質回収デバイス。
【請求項２】
狭隘な流路が、多孔質固体内の細孔によって構成される請求項１記載のタンパク質回収デバイス。
【請求項３】
多孔質固体の細孔径の平均が、０．０１μｍ〜５０μｍである請求項２記載のタンパク質回収デバイス。
【請求項４】
多孔質固体が多孔質ガラスである請求項２または３記載のタンパク質回収デバイス。
【請求項５】
多孔質固体が金属あるいはガラスの焼結体である請求項２または３記載のタンパク質回収デバイス。
【請求項６】
多孔質固体がプラスチックである請求項２または３記載のタンパク質回収デバイス。
【請求項７】
細孔の壁面に表面処理が施されている請求項２〜６いずれか記載のタンパク質回収デバイス。
【請求項８】
表面処理がシランカップリング剤処理、表面グラフト重合、表面酸化処理、及びポリマーのコーティングから選ばれる少なくとも一つの方法を含む請求項７記載のタンパク質回収デバイス。
【請求項９】
表面処理が、ホスホリルコリン基を含む高分子のコーティングである請求項７記載のタンパク質回収デバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞や組織を破砕して、タンパク質などの生理活性物質を抽出するさいに、細胞破砕液からタンパク質溶液を回収するためのデバイスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内で発現しているタンパク質の同定・定量は、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発などに有用である（非特許文献１、２参照）。細胞内のタンパク質を回収するためには、まず対象となる細胞の細胞膜を破砕する必要がある。細胞膜の破砕には、界面活性剤、酸、アルカリなどの試薬や酵素による破砕、熱や超音波あるいは機械的せん断力の付加などの方法が用いられている。これらの方法で細胞膜を破砕した場合、破砕液には不溶性の残渣や、破砕されなかった細胞などの不溶性物質が存在するため、これを除去する必要がある。従来の方法では、遠心分離により不溶性物質を沈殿させたのち、上清を回収するという煩雑な操作が必要であった（非特許文献３〜５参照）。そこで、上記のような煩雑な操作を行うことなく、簡単に細胞破砕液からの不溶性物質の除去が可能な、タンパク質の回収手段が求められていた。
【０００３】
【非特許文献１】「病気と分子細胞生物学」、森道夫  編、メディカル・サイエンス・インターナショナル（２００２年）
【非特許文献２】「現代化学増刊４２  プロテオミクス」、鈴木紘一  監修、東京化学同人（２００２年）
【非特許文献３】「新  細胞工学実験プロトコール」、東京大学医科学研究所制癌研究部  編、秀潤社、ｐ．２１８〜２２１（１９９３年）
【非特許文献４】「タンパク質実験ノート  上巻」、岡田雅人  編、羊土社、ｐ．３２〜７０（１９９６年）
【非特許文献５】「バイオ実験の進めかた」、佐々木博己  編、羊土社、ｐ．４２〜４８（２００１年）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、煩雑な遠心分離操作を行うことなく、細胞破砕液からタンパク質を回収する手段を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）細胞分散液を狭隘な流路を通過させ、該流路によって不純物を捕捉・除去し、タンパク質溶液を回収することを特徴とするタンパク質回収デバイス、
（２）狭隘な流路が、多孔質固体内の細孔によって構成される（１）記載のタンパク質回収デバイス、
（３）多孔質固体の細孔径の平均が、０．０１μｍ〜５０μｍである（２）記載のタンパク質回収デバイス、
（４）多孔質固体が多孔質ガラスである（２）または（３）記載のタンパク質回収デバイス、
（５）多孔質固体が金属あるいはガラスの焼結体である（２）または（３）記載のタンパク質回収デバイス、
（６）多孔質固体がプラスチックである（２）または（３）記載のタンパク質回収デバイス、
（７）細孔の壁面に表面処理が施されている（２）〜（６）いずれか記載のタンパク質回収デバイス、
（８）表面処理がシランカップリング剤処理、表面グラフト重合、表面酸化処理、及びポリマーのコーティングから選ばれる少なくとも一つの方法を含む（７）記載のタンパク質回収デバイス、
（９）表面処理が、ホスホリルコリン基を含む高分子のコーティングである（７）（８）記載のタンパク質回収デバイス、
である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
細胞（株化細胞、および、生体組織由来細胞を含む）において発現しているタンパク質の定性・定量を行うことは、疾病の診断や予防法の開発、創薬研究などにおいて、極めて重要な操作である。本発明者は、破砕された細胞を含む溶液（以下、細胞破砕液と略す）を、多孔体などの狭隘な流路を通過させることにより、細胞破砕液に含まれる不溶性物質を効率よく除去することができることを見出した。
【０００７】
本発明において細胞を破砕する操作は、一般的な方法を用いることができる。たとえば、ショ糖を含む緩衝液に細胞を分散させ、超音波処理や物理的せん断力により細胞膜を破壊し、細胞内のタンパク質を緩衝液中に溶出させる方法などがある。必要に応じて、緩衝液に各種の界面活性剤を添加してもよい。このような操作により得られる細胞破砕液は、破砕されなかった細胞や、破砕残渣などの不溶性物質を含むことが多く、タンパク質の定量・定性分析には適さない。そのため、不溶性物質を除去する手段が必要となる。そのさい、従来用いられている遠心分離による不溶性物質の回収は、操作が非常に煩雑であるために、効率が悪かった。
【０００８】
そこで、本発明では、細胞破砕液を狭隘な流路を通過させることにより、不溶性物質の除去を行った。狭隘な流路は、多孔質固体の細孔によって提供されることが好ましい。細孔の孔径は、０．０１〜５０μｍであることが好ましく、０．１〜３０μｍがより好ましく、０．１〜２０μｍがさらに好ましい。孔径が下限値未満では、細胞破砕液の通過時に目詰まりを起こし易く、上限値を超えると、不溶性物質の除去効果が得られないため、好ましくない。
【０００９】
本発明に用いる多孔質固体は、ガラスや金属などの無機物質、あるいはプラスチックなどの有機物質であってもよいが、多孔質ガラス、および、ガラスあるいは金属の焼結体が好ましく、多孔質ガラスがより好ましい。
【００１０】
多孔質固体の細孔には、タンパク質の吸着・変性の抑制、不純物の吸着を目的として、各種の表面処理を施すことができる。表面処理としては、各種のシランカップリング剤処理、表面グラフト重合、表面酸化処理、ポリマーのコーティングなどの手段を用いることができる。特に、ホスホリルコリン基を含むポリマーのコーティングにより、多孔質固体を通過したさいのタンパク質の吸着と変性を大幅に減少させることが可能である。
【００１１】
本発明において細胞破砕液を多孔質固体中を通過させる手段としては、自然落下、液送ポンプや注射筒などの圧力発生手段による方法などを用いることができる。
本発明のタンパク質回収デバイスは、単体で用いてもよく、他のデバイス、たとえばマイクロフルイディクス技術を応用したバイオリアクター、バイオセンサーなどの一部に組み込むこともできる。
【００１２】
【実施例】
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。
（実施例１）
（１）タンパク質回収デバイスの作製
平均細孔径６μｍ、厚さ１ｍｍ、直径６．５ｍｍの円板状の多孔質ガラスを準備した。これらの多孔質ガラスを、内径６．５ｍｍのプラスチック製チューブ内に１枚ずつ詰め固定した。
（２）細胞破砕液の調製
ＨｅＬａ細胞株を、通常の方法で培養した。細胞を培養皿から剥ぎ取り、リン酸緩衝溶液で洗浄したのち、遠沈により細胞を回収した。上清を取り除いたのち、０．２５Ｍのショ糖を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ）に分散させた。
（３）タンパク質の回収
（２）で調製した細胞破砕液を注射筒に注入し、（１）で作製したタンパク質回収デバイスと接続した。ピストンを押し込むことで、多孔質ガラス内に細胞破砕液を通過させ、通過した液体を回収した。回収した液体は無色透明であり、遠心分離しても沈殿は生じなかった。
【００１３】
（実施例２）
実施例１の（１）において、平均細孔径１３μｍ、厚さ１ｍｍ、直径６．５ｍｍの円板状の多孔質ガラスを用いた以外は、実施例１と同様の方法でタンパク質溶液を回収した。
【００１４】
（比較例）
実施例１の（２）と同様の細胞破砕液を調製し、２０００×ｇの重力加速度で３０分間、遠心分離したところ、沈殿が生成した。上清を回収した。
【００１５】
実施例および比較例の方法で得られたタンパク質溶液を、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、および、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）法により分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のプレキャストゲル「レディーゲルＪ  ５−２０％」を使用し、指定の方法に従って分析した。ＢＣＡ法には、和光純薬工業（株）製の「ＢＣＡプロテインアッセイ試薬」を使用し、指定の方法に従って分析した。
【００１６】
ＢＣＡ法による分析結果を表１に、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を図１に示す。表１に示すように、タンパク質回収量は、実施例と比較例で有意な差はなかった。また、図１に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの位置には、実施例と比較例で差異が無かった。すなわち、回収されたタンパク質の種類にも差はなく、本発明のタンパク質回収デバイスが、細胞破砕液からのタンパク質の回収に有用であることが示された。
【００１７】
【表１】
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【発明の効果】
本発明により、煩雑な遠心分離操作を行うことなく、簡単な方法で、細胞懸濁液に含まれる不溶性物質を除去することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる回収タンパクの分析結果
【符号の説明】
（１）比較例
（２）実施例１（細孔径６μｍ）
（３）実施例２（細孔径１３μｍ）
【図１】
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