(57)【要約】【課題】アマドリ転位産物（アマドリ化合物）の生成自体の阻害を指標とするものでもなく、また、最終的な後期段階生成物（ＡＧＥ）生成の阻害を指標とするものでもない別の機序を指標とする方法、すなわち、メイラード前期反応のアマドリ化合物（鍵物質）の分解を促進する薬剤を探索することによって、従来知られていないメイラード反応抑制剤を新たに提供する。【解決手段】アミノ化合物と還元糖とを含むメイラード反応系に、リボフラビン又はその誘導体を共存させることによって、全体として、メイラード反応を遅らせることができる。リボフラビン又はその誘導体が、メイラード反応中間生成物のアマドリ化合物の分解を促進させる作用を有するからである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アマドリ化合物の分解を促進する成分を含有することを特徴とするメイラード反応抑制剤。
【請求項２】
アマドリ化合物の分解を促進する成分は、リボフラビン又はその誘導体である、請求項１記載のメイラード反応抑制剤。
【請求項３】
リボフラビン又はその誘導体は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である、請求項２記載のメイラード反応抑制剤。
【請求項４】
アミノ化合物と還元糖とを含むメイラード反応混合物に、
アマドリ化合物の分解を促進させる成分を共存させることによって、
メイラード反応を遅らせることを特徴とする
メイラード反応の抑制方法。
【請求項５】
アマドリ化合物の分解を促進する成分として、リボフラビン又はその誘導体を用いる、請求項４記載の抑制方法。
【請求項６】
リボフラビン又はその誘導体として、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を用いる、請求項５記載の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メイラード反応抑制剤及びメイラード反応の抑制方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質やアミノ酸等のアミノ化合物と還元糖との非酵素的反応は一般にメイラード反応（褐変反応）と呼ばれ、例えば、食品の着色や劣化、香気成分の生成等に広く関与していることが知られている（非特許文献１参照）。
また、メイラード反応は生体内においても進行し、タンパク質の糖化は種々の生活習慣病や老化で促進される種々の疾患、例えば、糖尿病合併症、アルツハイマー病、動脈硬化症等の疾患にも関連していることも明らかにされつつある（非特許文献２参照）。
【０００３】
メイラード反応は、大別すると次の２段階の反応、すなわち、
（ｉ）還元糖のホルミル基がタンパク質のＮ末端アミノ基や、リジンのε−アミノ基と反応してシッフ塩基を形成した後、１，２−エナミノールを経てアマドリ転位産物（アマドリ化合物）が生成する前期反応；及び
（ii）酸化、脱水、縮合、分子内及び分子間における架橋などの複雑な反応を経て、次第に黄褐色化すると共に、マクロファージ等が持つＡＧＥ（advanced glycation end products）受容体によっても認識可能な蛍光をもつ不可逆的なメイラード反応後期段階生成物（ＡＧＥ）を産生する後期反応；
に分けられる。
ここで、メイラード反応の最終産物のＡＧＥは、上記したような前期反応のアマドリ転位産物の酸化、脱水、縮合などの複雑な反応を経て生成した種々の構造体の総称であり、例えば、カルボキシメチルリジン、ピラリン、ペントシジン、クロスリン、イミダゾロン等が分離同定されているが、生体内ＡＧＥの多くは未同定である。また、タンパク質の二量体以上の重合体も、ＡＧＥとして知られている。
【０００４】
上記したメイラード反応を抑える薬剤（抑制剤／阻害剤）が入手できれば、種々の生活習慣病あるいは老化で促進される種々の疾患の治療薬もしくは予防薬としての利用が期待できる。このような見地から探索されたメイラード反応抑制剤として、従来から、トコフェロール類とアスコルビン酸とをリン酸エステルを介して結合させた化合物（特許文献１参照）や、種々の植物由来の抽出物（特許文献２参照）等が知られている。なお、メイラード反応抑制剤の探索方法は、上記特許文献１ではアマドリ転位産物（アマドリ化合物）の生成自体の阻害を指標として行われており、また、特許文献２では、最終的な後期段階生成物（ＡＧＥ）生成の阻害を指標として行われている。
【０００５】
【非特許文献１】早瀬文孝、化学と生物、３１（９）、５９２（１９９３）
【非特許文献２】永井竜児、佐野裕之、堀内正公、化学と生物、３６（２）、８３（１９９８）
【０００６】
【特許文献１】特許第２８５４６３１号公報
【特許文献２】特開平１１−１０６３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、上記特許文献１におけるような、アマドリ転位産物（アマドリ化合物）の生成自体の阻害を指標とするものでもなく、また、上記特許文献２におけるような、最終的な後期段階生成物（ＡＧＥ）生成の阻害を指標とするものでもない別の機序を指標として探索することによって、従来知られていないメイラード反応抑制剤を新たに提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を達成するために、本発明は以下の構成をとった。
すなわち、本発明は、アミノ化合物と還元糖とのあいだの反応中間生成物であるアマドリ化合物の分解を促進する成分を含有するメイラード反応抑制剤を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、アミノ化合物と還元糖とを含むメイラード反応混合物（反応系）に、反応中間生成物であるアマドリ化合物の分解を促進させる成分を共存させることによって、全体として、メイラード反応を遅らせることを特徴とするメイラード反応の抑制方法も提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のメイラード反応抑制剤又は抑制方法では、アミノ化合物と還元糖とのあいだの反応中間生成物であるアマドリ化合物（鍵物質）の分解を促進する成分を含有させるので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）で、アマドリ化合物の分解が速やかに起こり、したがって、アマドリ化合物が蓄積せず、後期段階生成物（ＡＧＥ）の生成も抑制されると推定している。
本発明のメイラード反応抑制剤は、種々の生活習慣病や老化で促進される種々の疾患、例えば、糖尿病合併症（血糖値が高値を示す糖尿病に合併して起こる冠動脈心疾患、脳血管障害、神経障害、白内障、腎障害、網膜症、関節硬化症等の疾患）、アルツハイマー病、動脈硬化症等の疾患の治療薬又は予防薬として、特に有用と思われる。
また、有効成分としてリボフラビン又はその誘導体を用いた場合は、これらはビタミン（又は補酵素）の一種であり、製剤の安全性は極めて高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明について、更に詳しく説明する。
本発明者等は、アマドリ転位産物（アマドリ化合物）の生成自体の阻害を指標とするものでもなく、また、最終的な後期段階生成物（ＡＧＥ）生成の阻害を指標とするものでもない別の機序を指標として、メイラード前期反応のアマドリ化合物（鍵物質）の分解の促進を指標とすることに着想し、いくつかの生理活性物質を検討した結果、補酵素型ビタミンＢ２であるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）でアマドリ化合物の分解を促進し、また、後期段階生成物(ＡＧＥ)の生成も抑えることを見出し、先に述べたように、新規なメイラード反応抑制剤を完成することができた。
【００１２】
本発明のメイラード反応抑制剤で、アマドリ化合物の分解を促進する成分として好ましいものは、リボフラビンやその誘導体である。
リボフラビンは、Ｂ群ビタミンのうちの耐熱性成長促進因子の一つのビタミンＢ２で、化学構造は既知であり、イソアロキサジンの誘導体である。水に溶け、水溶液は黄色で、黄色の蛍光を発する。レバー、卵黄、酵母、乾しシイタケ、緑黄野菜、チーズ、肉類、牛乳、納豆等に多く含まれている。
リボフラビン誘導体としては、補酵素型リボフラビンがあり、好ましいものは、フラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ；リボフラビン−５’−リン酸）やフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）であり、特に好ましいものは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である。
リボフラビンやその誘導体を使用する場合の濃度は、アマドリ化合物の分解を促進する範囲で用いる。ＦＡＤを使用する場合は、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．１ｍＭ〜２．０ｍＭである。
【００１３】
なお、動物やヒトでは、摂取されたリボフラビン（ビタミンＢ２、遊離型）は、生体内では、補酵素型（活性型）リボフラビンであるフラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）やフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）へと変化して、その生理的機能が発揮される。そのために、後述のｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験では、メイラード反応抑制剤として補酵素型リボフラビン（ここでは、ＦＡＤ）を用いている。なお、ｉｎ  ｖｉｖｏの実験では、通常は、補酵素型ばかりではなく遊離型リボフラビンを用いることができる。生体内では、遊離型リボフラビンは補酵素型リボフラビンへと変化するからである。
【００１４】
本発明のメイラード反応抑制剤は、治療薬、予防薬、保健薬（保健食品を含む）などのほかに、動物薬や試薬としても利用できる。
治療薬、予防薬、保健薬、動物薬などとする場合の製剤の形態（剤形）は特に限定されない。日本薬局方等に記載された製剤の形態（注射剤、錠剤、顆粒剤、散剤、坐薬、軟膏等）の中から適宜選ぶことができる。また、投与ルートとしては、有効成分が遊離型リボフラビンか補酵素型リボフラビンのどちらであるかも考え合わせて、経口的投与か、非経口的投与（例えば、静脈注射、点滴、筋肉注射、皮下注射、大腸内投与、経皮）かを、適宜に選ぶ。
【００１５】
製剤の品質を確保し、あるいは有効成分の安定性や吸収性を高めるために、種々の添加剤を加えることができる。添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤などがある（日本医薬品添加剤協会編集、医薬品添加物辞典、薬事日報社（１９９４年））。
【００１６】
次に、メイラード反応の抑制方法について説明する。本発明の抑制方法は、上で述べたように、アミノ化合物と還元糖とを含むメイラード反応混合物に、反応中間生成物であるアマドリ化合物の分解を促進させる成分を共存させることによって、メイラード反応を遅らせることを特徴とする。
ここで、アマドリ化合物の分解を促進させる成分については、先のメイラード反応抑制剤で述べた説明と同様なので省略する。
【００１７】
メイラード反応の一方の基質として用いるアミノ化合物は、生体中に存在する各種のアミノ酸、ペプチド又はポリペプチド（タンパク質を含む）等である。
【００１８】
メイラード反応の他方の基質として用いる還元糖は、アルドースの１位、又はケトースの２位の炭素原子が置換を受けていない単糖及びオリゴ糖であり、アルカリ性条件下で還元性を示すものである。例えば、単糖では、グルコース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、フラクトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース等のペントース等があり、オリゴ糖では、シュクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース等がある。
【００１９】
上記アミノ化合物と還元糖とを含むメイラード反応混合物（メイラード反応系）には、ｐＨ緩衝剤、防腐剤等の添加剤を加えることができる。また、反応系の媒体は、基質であるアミノ化合物や還元糖、及びリボフラビンやその誘導体が容易に溶ける水が好ましく用いられる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例によって、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１〜３
（１）アマドリ化合物の調製
検出・定量の容易なアマドリ化合物を得るため、アミノ化合物としてｐ−トルイジン、還元糖としてＤ−グルコースを選び、下記反応式（化１）に示すようにしてフルクトーストルイジン（式（II）のアマドリ化合物；単に「アマドリ化合物」又は「基質」ともいう）を調製した。調製方法は、J.E. Hodge and B.E. Fisher “Amadori Rearrangement Products” in Methods in Carbohydrate Chemistry （R.L. Whistler and M.L. Wolfrom eds.), pp.99-107, Academic Press, New York 1963に従がった。
具体的には、２．５ｍｌの水に１０ｇのＤ−グルコースと８ｇのｐ−トルイジンとを溶解し、これに０．５ｍｌの２Ｎ酢酸を添加し、３０分煮沸還流した。次に、１００ｍｌのエタノールを加えて、生成物を結晶化した。これを２４時間低温に放置した後に、濾過して結晶を回収した。更に、エタノール−ジエチルエーテル（容量比で２：３）混液で洗浄し、脱水・乾燥し、精製品とした。以下は、この精製品（アマドリ化合物）を用いた。
【００２１】
【化１】
2005220108.tif 000002
【００２２】
（２）ＦＡＤによるアマドリ化合物分解の促進
１００μＭの基質（アマドリ化合物）に対して、ＦＡＤ（酸化型、Ｓｉｇｍａ社製）を各々、１００μＭ、１ｍＭ及び１０ｍＭ加え、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、３７℃で反応させ、経時的にサンプリングし、反応開始時の基質量を１００％としてその残存量を測定し、ＦＡＤ無添加（対照）と比較した。なお、基質（アマドリ化合物）の分析は、波長２４０ｎｍの吸収を指標とする逆相高速液体クロマトグラフィー（カラム：センシュー科学のＯＤＳ−１２５１−Ｎ（４．６φ×２５０ｍｍ）、溶出液：５０容量％エタノール、溶出速度：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）で行なった。この条件では、基質（アマドリ化合物）の保持時間は約１０ｍｉｎである。反応時間が１ｈのときの基質（アマドリ化合物）残存量の結果を表１に示す。ＦＡＤ無添加区（対照）では、基質はそのまま残存していたが、ＦＡＤ添加区では、その添加濃度に呼応するように基質の分解が促進された。
【００２３】
【表１】
2005220108.tif 000003
なお、ＦＡＤ添加区では、分解反応の進行とともに、分解産物の一つであるｐ−トルイジン（保持時間が約１６分）の生成量の増加が観察された。
【００２４】
実施例４〜６
ＦＡＤは、水溶液中で活性酸素種を生成することが知られている。そこで、次に、活性酸素種がＦＡＤによるアマドリ化合物の分解促進作用に関与しているかどうかを調べた。
試験は、ＦＡＤ（１ｍＭ）が存在する上記反応系で、各種の活性酸素種消去剤の共存下に２４ｈ反応させ、基質（アマドリ化合物）の分解促進が阻害されるかどうかを調べた。なお、活性酸素種消去剤としては、スーパーオキシド消去酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；Ｓｉｇｍａ社製）、過酸化水素消去酵素であるカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）、及びヒドロキシラジカル消去剤である５，５’−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ  Ｎ−ｏｘｉｄｅ（ＤＭＰＯ；同仁化学製）を各々用いた。活性酸素消去剤の添加濃度は、ＳＯＤが３００ｕ／ｍｌ、カタラーゼが０．３ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＰＯが２５ｍＭで行った。試験結果を表２に示した。いずれの活性酸素種消去剤も、ＦＡＤによるアマドリ化合物の分解促進作用を殆ど阻害していないことが分かる。したがって、ＦＡＤによる上記分解促進作用は、活性酸素種の生成とは無関係な機序で起こると考えている。
【００２５】
【表２】
2005220108.tif 000004
【００２６】
実施例７
タンパク質としてリゾチームを選び、還元糖としてはＤ−グルコースを選んだ。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、５０℃で、リゾチーム（最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を２００ｍＭのＤ−グルコースと、１〜４日間反応させ、反応物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析した。
ＦＡＤ無添加区（対照）では、反応１日目で、二量体のバンドが現れ、反応２日目で、二量体のほかに三量体のバンドも現れた。これらの二量体や三量体のバンドは、反応の経過と共に増加した。一方、ＦＡＤ（１００ｍＭ）添加区では、反応１日目で、二量体のバンドが現れたが、ＦＡＤ無添加区（対照）に比べて少なかった。また、反応２日目で、二量体のほかに三量体のバンドも現れたが、これらの量もＦＡＤ無添加区（対照）に比べて少なかった。
【００２７】
実施例８
反応温度を３７℃、反応時間を６日としたほかは、上記実施例７と同様に試験を行い、ＦＡＤ無添加区（対照）における二量体の生成量と、ＦＡＤ添加区（１００ｍＭ）における二量体の生成量とを比較した。ＦＡＤ添加区における二量体の生成量は、ＦＡＤ無添加区（対照）における二量体生成量の４０％（すなわち、二量体生成の抑制率は６０％）であった。