(57)【要約】【課題】  蛍光観察のための焦点合わせを短時間に、かつ簡単に行なうことができる観察装置の焦点合わせ方法を提供する。【解決手段】  標本７から発せられる蛍光を観察可能にした顕微鏡に適用される焦点合わせ方法であって、標本７に対して対物レンズ６を介して光を照射し反射光と蛍光を発生させる第１の工程、標本７からの反射光より標本７面に対する焦点合わせを行う第２の工程、第２の工程による標本７面に対する焦点合わせの結果に基づいて蛍光に対する焦点合わせを行なう弟３の工程とを具備する。【選択図】      図１
2005284136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本から発せられる蛍光を観察可能にした観察装置に適用される焦点合わせ方法であって、
前記標本に対して対物レンズを介して光を照射し反射光と蛍光を発生させる第１の工程と、
前記標本からの反射光より前記標本面に対する焦点合わせを行う第２の工程と、
前記第２の工程による前記標本面に対する焦点合わせ位置を基準にして前記蛍光に対する焦点合わせを行なう弟３の工程と
を具備したことを特徴とする観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項２】
前記第２の工程は、前記標本からの反射光の輝度から前記標本面に対する焦点位置を検出し、前記第３の工程は、前記第２の工程で検出された焦点位置からの蛍光の輝度から前記蛍光に対する焦点合わせを行なうことを特徴とする請求項１記載の観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項３】
前記第３の工程は、前記焦点位置からの蛍光の輝度を検出するためのゲインを上げる方向に調整されることを特徴とする請求項２記載の観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項４】
前記第３の工程は、前記第２の工程で検出された焦点位置から前記標本の内部方向に焦点位置を移動して前記蛍光に対する焦点合わせを行なうことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項５】
標本から発せられる蛍光を観察可能にした観察装置に適用される焦点合わせ方法であって、
前記標本に対して対物レンズを介して光を照射し反射光と蛍光を発生させる第１の工程と、
前記標本からの反射光より前記標本面に対する焦点合わせを行う第２の工程と、
前記第２の工程による前記標本面に対する焦点合わせ位置を基準にして前記蛍光に対する観察を可能とする弟３の工程と
を具備したことを特徴とする観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項６】
前記第１の工程は、前記標本面の一部に光を照射して反射光を発生させることを特徴とする請求項５記載の観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項７】
標本から発せられる蛍光を観察可能にした観察装置に適用される焦点合わせ方法であって、
前記標本に対して対物レンズを介して光を照射し反射光と蛍光を発生させる第１の工程と、
前記標本からの反射光の撮像画像より前記標本面に対する焦点合わせを行う第２の工程と、
前記第２の工程による前記標本面に対する焦点合わせ位置を基準にした前記蛍光の撮像画面より前記蛍光に対する焦点合わせを行なう弟３の工程と
を具備したことを特徴とする観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項８】
前記弟３の工程は、前記対物レンズの色収差に基づいて前記蛍光観察時の焦点位置を補正可能としたことを特徴とする請求項７記載の観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項９】
前記第２および第３の工程は、共焦点効果を発生する手段を介してそれぞれの撮像画像を取得することを特徴とする請求項７または８記載の観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項１０】
前記対物レンズとして、焦点可変部を有する可変焦点レンズが用いられることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の観察装置の焦点合わせ方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれかに記載の焦点合わせ方法を適用した観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本から発せられる蛍光を観察可能にした顕微鏡などの観察装置の焦点合わせ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、観察装置として、光源からの励起光を対物レンズにより標本に集光し、標本より発せられる蛍光を対物レンズを介して結像レンズにより集光するとともに、鏡筒内に配置されるプリズムを透過した蛍光を受光手段で受光し、画像化するような蛍光顕微鏡が知られている。
【０００３】
このような蛍光顕微鏡による蛍光観察は、まず、（ａ）最初に標本に対する焦点の粗合わせを行い、次に、（ｂ）光源による照明強度を落すと同時に、（ｃ）受光手段での感度を上げ、（ｄ）さらに微調整の焦点合わせを行なう。そして、実際に取得した画像を見ながら（ｂ）と（ｃ）の操作を繰り返し、良好な画像が表示された時点で蛍光観察を行なう。
【０００４】
しかし、このような蛍光観察にともなう操作は、照明強度を調整しながら粗調整と微調整の焦点合わせを行なうなど操作手順が多く、操作に慣れないオペレータにとっては誤操作を招き易いという問題があった。
【０００５】
また、最近になって、タンパク標本（ＧＦＰ）を観察するアプリケーションが増えている。このようなタンパク標本の場合、蛍光量が極めて少ないため、上述した（ａ）の焦点の粗合わせに時間がかかり過ぎたり、あるいは（ａ）の焦点の粗合わせを素早く行なうため照明強度を上げ過ぎたりすると、標本の退色により標本からの蛍光量がさらに少なくなって蛍光観察まで行き着かないという問題が生じる。
【０００６】
一方、最近になって、標本に対してレーザ光を励起光として２次元走査し、標本から発せられる蛍光をピンホールを介して検出器で検出し、この検出器の出力をデジタル信号に変換した後、メモリに記憶し、画像として表示するようにした走査型レーザ顕微鏡が注目されている。このような走査型レーザ顕微鏡についても、画像の合焦点調整を行なう合焦点調整機能を有するものもある。
【０００７】
特許文献１は、走査型レーザ顕微鏡の合焦点調整方法の一例を示すもので、最初にピンホールを光路から取り除き、光検出器による非共焦点検出により大まかな合焦位置を求め、続けて、ピンホールを光路に挿入して検出器により共焦点を検出して狭い範囲での合焦位置を求める方法が開示されている。
【特許文献１】特開平９−２１８３５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、このような特許文献１の焦点合わせ方法についても、蛍光量が極めて少ないタンパク標本などの場合は、非共焦点検出による大まかな合焦位置の検出にも時間がかかることがある。そこで、非共焦点検出による合焦位置の検出を素早く行なうため、レーザ光の強度を上げることが考えられるが、レーザ光の強度を上げ過ぎると、標本の退色により蛍光量が減少してしまい、蛍光観察が困難になるという問題を生じる。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、蛍光観察のための焦点合わせを短時間に、しかも簡単に行なうことができる観察装置および観察装置の焦点合わせ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１記載の発明は、標本から発せられる蛍光を観察可能にした観察装置に適用される焦点合わせ方法であって、前記標本に対して対物レンズを介して光を照射し反射光と蛍光を発生させる第１の工程と、前記標本からの反射光より前記標本面に対する焦点合わせを行う第２の工程と、前記第２の工程による前記標本面に対する焦点合わせ位置を基準にして前記蛍光に対する焦点合わせを行なう弟３の工程とを具備したことを特徴としている。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記第２の工程は、前記標本からの反射光の輝度から前記標本面に対する焦点位置を検出し、前記第３の工程は、前記第２の工程で検出された焦点位置からの蛍光の輝度から前記蛍光に対する焦点合わせを行なうことを特徴としている。
【００１２】
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記第３の工程は、前記焦点位置からの蛍光の輝度を検出するためのゲインを上げる方向に調整されることを特徴としている。
【００１３】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記第３の工程は、前記第２の工程で検出された焦点位置から前記標本の内部方向に焦点位置を移動して前記蛍光に対する焦点合わせを行なうことを特徴としている。
【００１４】
請求項５記載の発明は、標本から発せられる蛍光を観察可能にした観察装置に適用される焦点合わせ方法であって、前記標本に対して対物レンズを介して光を照射し反射光と蛍光を発生させる第１の工程と、前記標本からの反射光より前記標本面に対する焦点合わせを行う第２の工程と、前記第２の工程による前記標本面に対する焦点合わせ位置を基準にして前記蛍光に対する観察を可能とする弟３の工程とを具備したことを特徴としている。
【００１５】
請求項６記載の発明は、請求項５記載の発明において、前記第１の工程は、前記標本面の一部に光を照射して反射光を発生させることを特徴としている。
【００１６】
請求項７記載の発明は、標本から発せられる蛍光を観察可能にした観察装置に適用される焦点合わせ方法であって、前記標本に対して対物レンズを介して光を照射し反射光と蛍光を発生させる第１の工程と、前記標本からの反射光の撮像画像より前記標本面に対する焦点合わせを行う第２の工程と、前記第２の工程による前記標本面に対する焦点合わせ位置を基準にした前記前記蛍光の撮像画面より前記蛍光に対する焦点合わせを行なう弟３の工程とを具備したことを特徴としている。
【００１７】
請求項８記載の発明は、請求項７記載の発明において、前記弟３の工程は、前記対物レンズの色収差に基づいて前記蛍光観察時の焦点位置を補正可能としたことを特徴としている。
【００１８】
請求項９記載の発明は、請求項７または８記載の発明において、前記第２および第３の工程は、共焦点効果を発生する手段を介してそれぞれの撮像画像を取得することを特徴としている。
【００１９】
請求項１０記載の発明は、請求項１乃至９のいずれかに記載の発明において、前記対物レンズとして、焦点可変部を有する可変焦点レンズが用いられることを特徴としている。
【００２０】
請求項１１の発明は、請求項１乃至１０のいずれかに記載の焦点合わせ方法を適用した観察装置である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、標本面からの反射光を用いて焦点合わせを行ない、この焦点位置を基準にして蛍光に対する焦点合わせを行なうようにしたので、標本から発せられる蛍光量が少なく焦点合わせが難し場合でも、短時間に、しかも簡単に蛍光観察を行なうことができる。
【００２２】
また、本発明によれば、短時間で蛍光に対する焦点合わせまでを行なうことができるので、標本の退色などのダメージを最小限に抑えることができ、安定して良好な蛍光観察を実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２４】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態の焦点合わせ方法が適用される走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。図１において、１はレーザ光源で、このレーザ光源１は、複数のスペクトルを持つレーザ光を発生するものである。
【００２５】
レーザ光源１からのレーザ光の光路には、レーザ調光手段２が配置されている。レーザ調光手段２は、例えばＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ）から構成されており、システム制御部１４からの調光信号などによりレーザ光源１のレーザ光の単色化や光量調整を可能にしている。
【００２６】
レーザ調光手段２から出射されるレーザ光は、光学ユニット３に入射される。光学ユニット３には、レーザ調光手段２から出射されるレーザ光の光路上にキューブ４が配置されている。キューブ４は、不図示のターレットに搭載され、電動または手動で異なる特性のものに交換できるようになっている。この場合、キューブ４は、反射２０％、透過８０％のハーフミラーを有するものと、レーザ光源１からのレーザ光を反射し、標本７からの蛍光を透過するダイクロイックミラーを有するものが用意されている。
【００２７】
キューブ４の反射光路には、ガルバノミラー５が配置されている。このガルバノミラー５は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラーを有し、これらのミラーによりレーザ光を２次元方向（ＸＹ軸方向）に走査するようになっている。
【００２８】
ガルバノミラー５で走査されたレーザ光は、顕微鏡本体１９に入射される。顕微鏡本体１９には、ガルバノミラー５で走査されたレーザ光の光路上に、対物レンズ６を介して標本７を載置したステージ１１が配置されている。ステージ１１は、Ｚ軸制御部１２で制御されるモータ１２ａにより対物レンズ６の光軸Ｏに沿って上下方向（Ｚ軸方向）に移動され、この移動により対物レンズ６と標本７の相対距離を変化させることで標本７のピント合わせを可能にしている。この場合、Ｚ軸制御部１２は、システム制御部１４からのＺ位置信号により制御される。また、ステージ１１の変位量は、Ｚ軸制御部１２によりモニタされ、システム制御部１４に返送される。
【００２９】
これにより、ガルバノミラー５から出射される光は、対物レンズ６を通り、ステージ１１上の標本７に集光され、また、標本７から発せられる検出光（反射光または蛍光）は、対物レンズ６およびガルバノミラー５を通り、キューブ４まで戻る。
【００３０】
キューブ４の透過光路には、ミラー８が配置されている。ミラー８の反射光路には、バリアフィルタ９、ピンホール１３および受光手段１０が配置されている。
【００３１】
この場合、バリアフィルタ９は、２種類用意され、一方は、レーザ光源１からのレーザ光と同等の標本７からの反射光を透過するような特性を有し、他方は、標本７から発せられる蛍光波長のみを透過し蛍光以外の波長をフィルタリングするような特性を有している。これら２種類のバリアフィルタ９は、不図示のターレットに搭載され、、システム制御部１４の制御信号により選択的に光路に挿入される。ピンホール１３は、対物レンズ６の焦点と光学的に共役な位置である共焦点位置に配置され、検出光（反射光または蛍光）を共焦点検出するものである。受光手段１０は、ピンホール１３により共焦点検出された検出光を検出するもので、この検出光をシステム制御部１４からのゲイン調整信号に従って光電変換し画像輝度信号を出力するようにしている。
【００３２】
受光手段１０には、画像処理部１５が接続されている。画像処理部１５は、システム制御部１４からの制御信号に従って受光手段１０の画像輝度信号に対しゲインやオフセットを掛け合わせて画像データを生成し、この画像データをモニタ１６に表示させるようになっている。
【００３３】
次に、このような構成した走査型レーザ顕微鏡の焦点合わせについて、図２に示すフローチャートに従い説明する。まず、ステップ２０１で、光学素子の設定を行なう。この場合、キューブ４として、反射２０％、透過８０％のハーフミラーを有するものを光路に挿入し、また、バリアフィルタ９として、標本７からの反射光を透過する特性のものを光路に挿入する。
【００３４】
次に、ステップ２０２で、レーザ光源１からレーザ光を発生する。レーザ光は、キューブ４のハーフミラーで減光され、ガルバノミラー５により２次元走査され、対物レンズ６に入射し、ステージ１１上の標本７に集光される。標本７面で反射した光は、対物レンズ６およびガルバノミラー５を通りキューブ４まで戻る。
【００３５】
キューブ４のハーフミラーは、標本７からの反射光の大部分を透過する。キューブ４のハーフミラーを透過した光は、ミラー８で反射し、バリアフィルタ９を透過してピンホール１３に入射し共焦点検出される。ピンホール１３で共焦点検出され反射光は、受光手段１０で受光される。
【００３６】
次に、ステップ２０３，２０４で、受光手段１０と画像処理部１５のゲイン調整などをしながら焦点合わせを行なう。この場合、Ｚ軸制御部１２によりモータ１２ａを介してステージ１１を上下方向（Ｚ軸方向）に移動する。このステージ移動とともに標本７からの反射光の光量が変化し、受光手段１０の画像輝度信号に応じた画像処理部１５の画像データの輝度値も変化する。このときシステム制御部１４により受光手段１０と画像処理部１５のゲイン調整により画像データの輝度値が飽和しないようにする。
【００３７】
そして、画像処理部１５の画像データの輝度値が最大になるところでステージ１１の移動を停止する。このときのステージ１１の停止位置が標本７表面に対する合焦位置となる。
【００３８】
ここで、標本７からの反射光を用いて焦点合わせを行なうのは、反射光は蛍光よりも光量が多く、一般的に蛍光の数１０倍〜数１００倍の光量となるため、高い輝度が得られるためである。
【００３９】
次に、ステップ２０５で、光学素子の再設定を行なう。この場合、キューブ４として、レーザ光源１からのレーザ光を反射し、標本７からの蛍光を透過するダイクロイックミラーを有するものを光路に挿入し、また、バリアフィルタ９として、標本７からの蛍光を透過する特性を有するものを光路に挿入する。
【００４０】
この状態で、レーザ光の励起により標本７より発生した蛍光は、対物レンズ６、ガルバノミラー５を通つてキューブ４まで戻り、ダイクロイックミラーを透過し、ミラー８で反射しバリアフィルタ９を透過してピンホール１３に入射し、共焦点検出される。ピンホール１３で共焦点検出され蛍光は、受光手段１０で受光される。
【００４１】
次に、ステップ２０６，２０７で、受光手段１０と画像処理部１５のゲイン調整などをしながら蛍光による焦点合わせの微調整を行なう。この場合、ゲイン調整の調整方向としては、蛍光は反射光より光量が少ないので、受光手段１０と画像処理部１５のゲインを上げる方向のゲイン調整を行なうようになる。
【００４２】
この場合も、Ｚ軸制御部１２によりモータ１２ａを介してステージ１１を移動させる。ところで、蛍光観察では、標本７として細胞が用いられることが多く、細胞内の核や繊維などを蛍光試料でマーキングして観察を行なう。このことから、上述した反射光による焦点合わせが標本７表面であるのに対し、標本７の内部に焦点合わせを行なうことが多い。
【００４３】
このことから、反射光による標本７表面の焦点位置に位置決めされたステージ１１を、さらに、標本７内部に向かう方向に移動させる。そして、画像処理部１５の画像データの輝度値が最大になる点でステージ１１の移動を停止する。このときのステージ１１の位置が、標本７から発する蛍光に対する合焦位置となる。
【００４４】
この後、ステップ２０８で、蛍光観察が行われる。
【００４５】
従って、このようにすれば、最初に標本７表面からの反射光を用いて焦点合わせを行ない、その後、この焦点位置を基準として蛍光に対する焦点合わせを行なうようにしたので、標本７から発せられる蛍光量が少なく焦点合わせが難し場合でも、短時間に、しかも簡単に蛍光観察のための焦点合わせを行なうことができる。
【００４６】
また、短時間のうちに蛍光観察のための標本７の焦点合わせを行なうことができるので、標本の退色などのダメージを最小限に抑えることができ、安定して良好な蛍光観察を実現することができる。
【００４７】
さらに、蛍光に対する焦点合わせ動作は、反射光による焦点合わせをした後は、標本７の内部方向への合焦操作に限定して行なうことができるので、蛍光の焦点合わせまでに無駄な動作がなく、能率の良い焦点合わせを行なうことができる。
【００４８】
なお、上述した一連の動作は、顕微鏡機能として組み込むようにしてもよい。この場合は、例えばアプリケーションのＧＵＩ（グラフィカル  ユーザ  インターフェース）上にボタンを設け、オペレータがボタンを操作することで、自動的に実行するようにプログラミング制御される。
【００４９】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００５０】
図３は、本発明の第２の実施の形態の焦点合わせ方法が適用される走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５１】
この場合、レーザ光源１の他に、レーザ光源２１が設けられている。また、レーザ光源１からのレーザ光の光路上には、ハーフミラー２２が配置されている。このハーフミラー２２は、レーザ光源１からのレーザ光を透過し、レーザ光源２１からのレーザ光を反射するもので、レーザ光源１、２２からのレーザ光の光路を同一にするようにしている。
【００５２】
ここで、レーザ光源１は、標本７に反射光を発生させるためのものである。レーザ光源２１は、標本７の蛍光の励起を行なうためのもので、標本７の蛍光の励起波長に合わせて最適なものが用いられる。また、一つのレーザ光源で複数の波長を出力できるものを使用すれば、レーザ光源１、２２は、一方のみでよい。
【００５３】
ハーフミラー２２の出射光路には、レーザ調光手段２３が配置されている。このレーザ調光手段２３は、上述したと同様、ＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ）から構成されており、レーザ光源１、２２からのレーザ波長の光の強度を調光できるようになっている。また、レーザ調光手段２３は、画像をサンプリングする速度よりも十分に速い速度で調光を変化させることができるもので、レーザ光源１からのレーザ光の走査領域を限定してＯＮ／ＯＦＦできるようにしている。例えば、ガルバノミラー５による標本７上での走査領域がラスタスキャンによる正方形の場合でも、レーザ調光手段２３のＯＮ／ＯＦＦによりレーザ光を照射させる領域を円形に設定することができる。
【００５４】
レーザ調光手段２３から出射されるレーザ光の光路上にハーフミラー２４が配置されている。このハーフミラー２４は、反射２０％、透過８０％のものが用いられる。
【００５５】
ハーフミラー２４の反射光路には、上述したガルバノミラー５を含む構成が配置され、また、透過光路には、ダイクロイックミラー２５とミラー８が配置されている。ダイクロイックミラー２５は、レーザ光源１からのレーザ光を反射し、標本７からの蛍光を透過するような特性を有している。ダイクロイックミラー２５の反射光路には、バリアフィルタ２６、ピンホール２７および受光手段２８が配置されている。
【００５６】
バリアフィルタ２６は、レーザ光源１からのレーザ光の波長のみを透過するものが用いられている。ピンホール２７は、対物レンズ６の焦点と光学的に共役な位置である共焦点位置に配置され、反射光を共焦点検出するものである。受光手段２８は、ピンホール２７により共焦点検出された反射光を検出するもので、この検出光をシステム制御部１４からのゲイン調整信号に従って光電変換し画像輝度信号を出力するようにしている。
【００５７】
ミラー８の反射光路には、図１と同様なバリアフィルタ９、ピンホール１３および受光手段１０が配置されている。ここでのバリアフィルタ９は、標本７から発せられる蛍光波長のみを透過し蛍光以外の波長をフィルタリングするような特性のものが用いられている。
【００５８】
画像処理部１５は、システム制御部１４からの制御信号に従って受光手段１０または２８の画像輝度信号に対しゲインやオフセットを掛け合わせて画像データを生成し、この画像データをモニタ１６に表示させるようになっている。
【００５９】
その他は、図１と同様である。
【００６０】
次に、このような構成した走査型レーザ顕微鏡の焦点合わせについて、図４に示すフローチャートに従い説明する。
【００６１】
まず、ステップ４０１で、光学素子の設定を行なう。この場合、ハーフミラー２４には、反射２０％、透過８０％のもの、ダイクロイックミラー２５には、レーザ光源１のレーザ光を反射し、標本７からの蛍光を透過する特性のもの、バリアフィルタ２６は、レーザ光源１からのレーザ光の波長のみを透過するもの、バリアフィルタ９は、標本７から発せられる蛍光波長のみを透過し蛍光以外の波長をフィルタリングするような特性のものがそれぞれ用いられる。
【００６２】
次に、ステップ４０２で、レーザ調光手段２３によりレーザ光源１からのレーザ光の標本７上での走査領域を設定する。この場合、レーザ調光手段２３で設定される走査領域は、標本７上の一部、ここでは、ガルバノミラー５のラスタスキャンによる標本７上の走査領域の一部であり、例えば、走査領域の端部や中心部など、ユーザにより適宜選択できるようになっている。
【００６３】
次に、ステップ４０３で、レーザ光源１、２１からレーザ光を発生する。これらレーザ光源１、２１からのレーザ光は、ハーフミラー２４で反射し、ガルバノミラー５を介して対物レンズ６に入射し、ステージ１１上の標本７に集光される。この場合、レーザ光源２１からのレーザ光は、ガルバノミラー５のラスタスキャンによる標本７上の走査領域に照射されるのに対して、レーザ光源１からのレーザ光は、レーザ調光手段２３により設定された一部の走査領域にのみ照射される。
【００６４】
標本７から発せられる蛍光と反射光は、対物レンズ６およびガルバノミラー５を通りハーフミラー２４まで戻り、さらにハーフミラー２４を透過してダイクロイックミラー２５に入射する。このうち標本７からの反射光は、ダイクロイックミラー２５で反射し、バリアフィルタ２６を透過してピンホール２７に入射し共焦点検出される。ピンホール２７で共焦点検出され反射光は、受光手段２８で受光される。一方、標本７からの蛍光は、ダイクロイックミラー２５を透過し、ミラー８で反射し、バリアフィルタ９を透過してピンホール１３に入射し共焦点検出される。ピンホール１３で共焦点検出された光は、受光手段１０で受光される。
【００６５】
次に、ステップ４０４、４０５で、受光手段２８と画像処理部１５のゲインを調整して焦点合わせを行なうと同時に、蛍光観察を可能にする。この場合も、焦点合わせを行なうには、Ｚ軸制御部１２によりモータ１２ａを介してステージ１１を上下方向（Ｚ軸方向）に移動し、画像処理部１５の画像データ（反射画像）の輝度値が最大になる位置を合焦位置として求める。このときシステム制御部１４により受光手段２８と画像処理部１５のゲンイ調整を行い、画像データ（反射画像）の輝度値が飽和しないようにする。
【００６６】
一方、受光手段１０で受光された蛍光は、光電変換されて画像輝度信号として画像処理部１５に入力される。画像処理部１５は、システム制御部１４からの制御信号により受光手段１０の画像輝度信号に対しゲインやオフセットを掛け合わせて画像データを生成し、この画像データを蛍光画像としてモニタ１６に表示する。
【００６７】
従って、このようにすれば、標本７表面からの反射光を用いて焦点合わせを行い、この焦点の合った画像を見ながら蛍光画像を観察することができる。こうすることで、例えば、生きた生物標本や、実験動物を用いたＩｎ  Ｖｉｖｏ観察や、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ内の場合、観察中に標本が動いて焦点が合わなくなってしまうことがあっても、反射画像により速やかに焦点を合わせを行なうことができるので、これらの観察を効率的に行なうことができる。これらの操作は、ユーザ自身が行うこともできるが、システム制御部１４に自動制御させることも可能である。
【００６８】
また、標本７上から反射光を取得する領域を走査領域の一部に面状や点状に限定して設定できるので、標本の退色などのダメージを最小限に抑えることができ、良好な蛍光観察を実現することができる。
【００６９】
なお、上述した実施の形態では、反射光用のレーザ光源１と励起用のレーザ光源２１を別々にして用いたが、１個のレーザ光源で十分な反射画像と蛍光画像を取得できる場合は、レーザ光源１または２１により反射画像用と蛍光画像用を兼用してもよい。
【００７０】
また、上述では、標本７からの反射光をバリアフィルタ２６を透過してピンホール２７に入射させているが、反射光に対するピンホール２７は、ピンホール径を大きく設定する方法と、小さく設定する方法の２通りがあり、使用用途によって使い分けるようにしてもよい。これらは、予めシステム制御部１４に用意されるプログラム上で設定され、自動的に選択される。
【００７１】
ここで、図５（ａ）（ｂ）は、標本７と対物レンズ６の共焦点時と非共焦点時のそれぞれの焦点位置と画像輝度値の関係を示すものである。まず、ピンホール２７のピンホール径を大きく設定すると、共焦点効果が無くなり非共焦点状態となる。ここで、標本７表面付近に焦点位置がある場合、画像輝度との関係は、同図Ａとなって、ボケ像となって見える。このような場合は、一般的なオートフォーカスの手法を用いて標本７表面に焦点を合わせる。一方、ピンホール２７のピンホール径を小さく設定すると、標本７の焦点位置と画像輝度の関係は、同図Ｂのようになる。この場合、蛍光が標本７内部の細胞部で発生している場合、焦点位置が標本７の外側にあると輝度値は低く、標本７表面よりも内側に入ったところで急激に上昇する。したがって、標本７が対物レンズ６に近づくようにステージ１１を移動したとき、画像の輝度値があらかじめ設定されたしきい値Ｃを超えたところを合焦位置とすれば、簡単に焦点合わせを行なうことができる。このことから、標本７の表面もしくは内側を観察対象としている生標本の場合は、共焦点を利用した合焦方法が有効である。
【００７２】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。
【００７３】
図６は、本発明の第３の実施の形態の焦点合わせ方法が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００７４】
この場合、レーザ光源１に代えてハロゲンランプ３１を設けている。ハロゲンランプ３１は、白色光を光学ユニット３に入射する。
【００７５】
ハロゲンランプ３１からの白色光の光路には、キューブ３２が配置されている。キューブ３２は、不図示のターレットに搭載され、電動または手動で異なる特性のものに交換できるようになっている。この場合、キューブ３２は、反射２０％、透過８０％のハーフミラーを有するものと、ハロゲンランプ３１からの光を反射し、標本７からの蛍光を透過するダイクロイックミラーを有するものが用意されている。
【００７６】
キューブ３２の反射光路には、回転ディスク３３が配置されている。回転ディスク３３は、円盤上にスリット穴が空けられており、回転させて光を通すことで共焦点効果を得ることができるものである。
【００７７】
回転ディスク３３を透過したレーザ光は、顕微鏡本体１９に入射される。顕微鏡本体１９には、回転ディスク３３を透過したレーザ光の光路上に、対物レンズ６を介して標本７を載置したステージ１１が配置されている。
【００７８】
一方、キューブ３２の透過光路には、ＣＣＤカメラ３４が配置されている。このＣＣＤカメラ３４は、標本７からの検出光（反射光または蛍光）を撮像するもので、システム制御部１４からの制御信号に従って反射画像信号または蛍光画像信号を出力するようにしている。
【００７９】
ＣＣＤカメラ３４には、画像処理部１５が接続されている。画像処理部１５は、システム制御部１４からの制御信号に従ってＣＣＤカメラ３４の反射画像信号または蛍光画像信号に対しゲインやオフセットを掛け合わせて画像データを生成し、この画像データをモニタ１６に表示させるようになっている。
【００８０】
なお、システム制御部１４は、反射画像信号または蛍光画像信号に従って、Ｚ軸制御部１２により標本７を載置したステージ１１のＺ軸方向の制御ができるようになっており、例えば、反射画像信号で輝度が最も高くなるところにＺ軸を合わせる処理ができるようになっている。
【００８１】
次に、このような構成した共焦点顕微鏡の焦点合わせについて、図７に示すフローチャートに従い説明する。まず、ステップ７０１で、光学素子の設定を行なう。この場合、キューブ３２として、反射２０％、透過８０％のハーフミラーを有するものを使用する。
【００８２】
次に、ステップ７０２で、回転ディスク３３を回転させるとともに、ハロゲンランプ３１からの光を照射する。ハロゲンランプ３１から光は、キューブ３２のハーフミラーで減光され、回転ディスク３３を介して対物レンズ６に入射し、ステージ１１上の標本７に集光される。標本７面で反射した光は、対物レンズ６を介して回転ディスク３３に入射し、共焦点効果のある反射光として、キューブ３２のハーフミラーを透過し、ＣＣＤカメラ３４で撮像される。
【００８３】
次に、ステップ７０３，７０４で、画像処理部１５のゲイン調整などをしながら焦点合わせを行なう。この場合、ＣＣＤカメラ３４で撮像された反射画像は、反射画像信号として画像処理部１５を経由してシステム制御部１４に送られる。システム制御部１４は、反射画像信号に従ってＺ軸制御部１２によりステージ１１を上下方向（Ｚ軸方向）に移動させ、反射画像信号の輝度が最も高くなるところを探して、焦点合わせをする。このとき、必要に応じて画像処理部１５により画像ゲインの調整を行なう。
【００８４】
次に、ステップ７０５で、光学素子の再設定を行なう。この場合、キューブ４として、レーザ光源１からのレーザ光を反射し、標本７からの蛍光を透過するダイクロイックミラーを有するものを使用する。
【００８５】
この状態で、ハロゲンランプ３１からの光の励起により標本７より発生した蛍光は、対物レンズ６を介して回転ディスク３３に入射し、共焦点効果のある蛍光として、キューブ３２に戻り、ダイクロイックミラーを透過し、ＣＣＤカメラ３４で撮像される。
【００８６】
ＣＣＤカメラ３４で撮像された蛍光画像は、蛍光画像信号として画像処理部１５に送られる。画像処理部１５は、システム制御部１４からの制御信号に従ってＣＣＤカメラ３４の蛍光画像信号に対しゲインやオフセットを掛け合わせて画像データを生成し、モニタ１６に表示させる（ステップ７０６）。これにより、モニタ１６には、蛍光標本の明るさに影響されない合焦された蛍光画像が表示される。
【００８７】
ところで、このようにして取得される反射画像と蛍光画像のそれぞれの焦点面は、対物レンズ６の色収差の分だけずれを生じることがある。この場合、ステップ７０７で、システム制御部１４は、色収差による焦点面のズレをあらかじめ計算して、反射画像で焦点合わせをした焦点面の位置から蛍光画像の焦点面の位置を光学的に計算し、Ｚ軸制御部１２によりステージ１１を上下方向（Ｚ軸方向）に移動させて補正する。
【００８８】
その後、ステップ７０８、７０９で、焦点合わせされた焦点位置を記録した後、蛍光観察に移行する。
【００８９】
従って、このようにしても、蛍光を観察するのに標本７から発せられる蛍光量が少なく焦点合わせが難し場合でも、短時間のうちに簡単な操作で蛍光観察までを行なうことができる。
【００９０】
また、ＣＣＤカメラ３４で撮像した画像の輝度から自動的に反射画像の合焦までを行い、さらに、色収差を計算して蛍光画像の合焦を行なうようになるので、ユーザは殆ど操作をすることなく焦点合わせを行なうことができる。また、回転ディスク３３による共焦点効果を用いているので、より精度の高い焦点合わせが可能となる。
【００９１】
蛍光観察で焦点がずれてしまったときにも、キューブ３２をハーフミラーに変更するだけで、反射光による焦点合わせをやり直すことができる。また、ＣＣＤカメラ３４を用いているので、走査型レーザ顕微鏡に比べ、フレームレートが高くでき、高速に焦点合わせを行なうこともできる。
【００９２】
（第４の実施の形態）
次に、本発明の第４の実施の形態を説明する。
【００９３】
上述した実施の形態では、標本７を載置したステージ１１を上下方向に移動するようにしたが、これに代えて可変焦点レンズを使用することができる。図８は、可変焦点レンズの概略構成を示すもので、対物レンズ本体４１の先端部に液晶レンズや水レンズなどで構成される焦点可変部４２が設けられ、可変焦点レンズ４０として構成されている。
【００９４】
この可変焦点レンズ４０は、焦点可変部４２に不図示の制御部から制御信号が与えられると、制御前の焦点面Ｄを制御後の焦点面Ｅに移動できるようになっている。
【００９５】
このような可変焦点レンズ４０を用いれば、ステージ１１を移動させるのに比べ、焦点合わせのための速度を格段に高速化できるので、焦点合わせ作業をさらに素早くできるようになる。また、図９に示すように、標本７内部に観察したい細胞７ａが存在するような場合、上述した対物レンズ６では、標本７表面で焦点を合わせてから、対物レンズ６を標本７に近づけるようにするため、標本７と衝突するおそれがあるが、可変焦点レンズ４０を使用することで、可変焦点レンズ４０自体を移動させることなく、焦点面をＤからＥに移動するだけで標本７内部の細胞７ａを観察することができる。また、このような可変焦点レンズ４０を対物レンズ６として用いることは、第４の実施の形態で述べた色収差の補正にも有効である。
【００９６】
（第５の実施の形態）
次に、本発明の第５の実施の形態を説明する。
【００９７】
図１０は、本発明の第５の実施の形態の焦点合わせ方法が適用される光学顕微鏡の概略構成を示している。
【００９８】
図１０において、５１は顕微鏡本体で、この顕微鏡本体５１には、標本５２を載置したステージ５３と対物レンズ５４が対峙して配置されている。ステージ５３は、焦準ハンドル５５の操作により対物レンズ５４の光軸Ｏに沿って上下方向（Ｚ軸方向）に移動され、この移動により対物レンズ５４と標本５２の相対距離を変化させることで標本５２のピント合わせを可能にしている。
【００９９】
顕微鏡本体５１には、光源としてランプ５６が設けられている。ランプ５６は、白色光を発している。ランプ５６からの白色光の光路には、キューブ５７が配置されている。キューブ５７は、顕微鏡本体５１内部に設けられ、電動または手動で異なる特性のものに交換できる機構となっている。この場合、キューブ５７は、反射２０％、透過８０％のハーフミラーを有するものと、ランプ５６からの白色光を反射し、標本５２からの検出光（反射光または蛍光）を透過するダイクロイックミラーを有するものが用意され、これらを交換可能にしている。
【０１００】
キューブ５７の透過光路には、鏡筒５８が配置されている。鏡筒５８は、キューブ５７を透過する標本５２からの検出光を目視により観察できるようになっている。
【０１０１】
次に、このような構成した光学顕微鏡の焦点合わせについて、図１１に示すフローチャートに従い説明する。まず、ステップ１１０１で、光学素子の設定として、キューブ５７をハーフミラーに設定をする。
【０１０２】
次に、ステップ１１０２、１１０３で、ランプ５６からの光を、キューブ５７で減光されて対物レンズ５４に入射し、ステージ５３上の標本５２に集光させる。標本５２面で反射した光は、対物レンズ５４を介してキューブ５７に達し、キューブ５７を透過し、鏡筒５８により反射画像として観察される。
【０１０３】
次に、ステップ１１０４で、焦準ハンドル５５を操作してステージ５３を上下方向（Ｚ軸方向）に移動し、標本５２のピント合わせを行なう。
【０１０４】
ステップ１１０５で、光学素子の再設定として、キューブ５７をダイクロイックミラーに設定をする。
【０１０５】
この状態で、ランプ５６からの光が照射されると、標本５２より励起された蛍光が対物レンズ５４を介してキューブ５７に達し、キューブ５７を透過し、鏡筒５８により蛍光画像として観察される（ステップ１１０６）。
【０１０６】
従って、このようにしても、蛍光を観察するのに標本５２から発せられる蛍光量が少なく焦点合わせが難し場合でも、短時間のうちに簡単な操作で蛍光観察までを行なうことができる。また、対物レンズ５４に高倍率のものを用いたような場合、焦点がずれが生じることがあっても、標本５２の反射光を用いた焦点合わせを行なうことで、簡単に元の蛍光観察状態を再現することができる。
【０１０７】
また、このような考えは、生物の臓器観察に用いられる硬性鏡対物レンズを用いた観察装置にも適用できる。図１２は、対物レンズ５４に代えて臓器表面５２１に押し付けて使用するタイプの硬性鏡対物レンズ６１を適用した例で、まず、図１２（ａ）に示すように硬性鏡対物レンズ６１を臓器表面５２１から離した状態で、臓器表面５２１からの反射光を用いて臓器表面５２１表面の焦点を合わせを行ない、次に、同図（ｂ）に示すように臓器表面５２１内部の蛍光を発する細胞５２１ａに対する焦点合わせを行なう。この場合、蛍光を発する細胞５２１ａがさらに臓器表面５２１から深い場所にあるときは、同図（ｃ）に示すように硬性鏡対物レンズ６１を臓器表面５２１内に挿入し、この状態で、蛍光を発する細胞５２１ａに対する焦点合わせを行なう。勿論、硬性鏡対物レンズ６１先端を臓器表面５２１に押し当てて臓器表面５２１内部の蛍光に焦点合わせを行なうこともある。また、このような臓器観察は、臓器を生体から取り出した状態で行なってもよいし、生きたままの実験動物に硬性鏡対物レンズ６１を挿入して観察対象の臓器にアプローチしてもよい。
【０１０８】
このような観察装置においても、硬性鏡対物レンズ６１に高倍率のものを用いた場合、僅かに標本５２が動いたことが原因で焦点がずれることがあっても、最初の標本５２の反射光を用いた焦点合わせを行なうことで、簡単に元の蛍光観察状態を再現することができる。
【０１０９】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【０１１０】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明の第１の実施の形態の焦点合わせ方法が適用される走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の焦点合わせ方法を説明するためのフローチャート。
【図３】本発明の第２の実施の形態の焦点合わせ方法が適用される走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。
【図４】第２の実施の形態の焦点合わせ方法を説明するためのフローチャート。
【図５】第２の実施の形態による焦点合わせ方法を説明するための図。
【図６】本発明の第３の実施の形態の焦点合わせ方法が適用される共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図７】第３の実施の形態の焦点合わせ方法を説明するためのフローチャート。
【図８】本発明の第４の実施の形態に用いられる可変焦点レンズの概略構成を示す図。
【図９】第４の実施の形態による焦点合わせ方法を説明するための図。
【図１０】本発明の第５の実施の形態の焦点合わせ方法が適用される光学顕微鏡の概略構成を示す図。
【図１１】第５の実施の形態の焦点合わせ方法を説明するためのフローチャート。
【図１２】第５の実施の形態に硬性鏡対物レンズを適用した時の焦点合わせ方法を説明するための図。
【符号の説明】
【０１１２】
１…レーザ光源、２…レーザ調光手段
３…光学ユニット、４…キューブ、５…ガルバノミラー
６…対物レンズ、７…標本、７ａ…細胞
８…ミラー、９…バリアフィルタ
１０…受光手段、１１…ステージ、１２…Ｚ軸制御部
１２ａ…モータ、１３…ピンホール
１４…システム制御部、１５…画像処理部
１６…モニタ、１９…顕微鏡本体、２１…レーザ光源
２２…ハーフミラー、２３…レーザ調光手段
２４…ハーフミラー、２５…ダイクロイックミラー
２６…バリアフィルタ、２７…ピンホール
２８…受光手段、３１…ハロゲンランプ
３２…キューブ、３３…回転ディスク
３４…ＣＣＤカメラ、４０…可変焦点レンズ、４１…対物レンズ本体
４２…焦点可変部、５１…顕微鏡本体、５２…標本、５２１…臓器表面
５２ａ、５２１ａ…細胞、５３…ステージ、５４…対物レンズ
５５…焦準ハンドル、５６…ランプ、５７…キューブ
５８…鏡筒、６１…硬性鏡対物レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005284136.tif 000009
【図８】
2005284136.tif 000010
【図９】
2005284136.tif 000011
【図１０】
2005284136.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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