(57)【要約】【課題】免疫増強および調節効果を示すポリガンマグルタミン酸の用途を提供すること。【解決手段】本発明によるポリガンマグルタミン酸を含む免疫増強用組成物は、毒性および副作用がほとんどないので、予防の目的で長期間服用するときも安心して用いられ、感染性疾患の予防および治療用としても使用でき、また、免疫力の低下した、免疫力の抑制された患者に対し、免疫力増強および調節のための医薬品、および健康機能食品として用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のポリガンマグルタミン酸と薬学的に許容される担体を含む免疫増強用組成物。
【請求項２】
ポリガンマグルタミン酸は、１ｋＤａ〜１５０００ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の免疫増強用組成物。
【請求項３】
ポリガンマグルタミン酸を含有するワクチン用アジュバント。
【請求項４】
ポリガンマグルタミン酸は、１ｋＤａ〜１５０００ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請求項３に記載のワクチン用アジュバント。
【請求項５】
ポリガンマグルタミン酸および食品学的に許容される添加剤を含み、免疫増強効果を有する機能性食品。
【請求項６】
有効量のポリガンマグルタミン酸を含むことを特徴とする免疫増強効果を有する家畜用飼料組成物。
【請求項７】
ポリガンマグルタミン酸を、人間を除いて免疫増強が必要な動物に有効量を投与することを特徴とする動物の免疫増強方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫増強および調節活性を同時に有するポリガンマグルタミン酸の用途に係り、より具体的には、ワクチン用アジュバントの用途、有効量のポリガンマグルタミン酸を含む免疫増強用組成物、機能性食品および飼料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫は、生まれた時から有している先天性免疫（innate immunity）と後天的な生活などに適応して得られる獲得免疫（acquired immunity）に大別される。先天性免疫は、一名「自然免疫」ともいい、抗原に対して非特異的に反応するものであって特別な記憶作用はない。先天的な免疫体系としては、抗原の侵入を遮断する皮膚、粘液組織、強酸性の胃酸、血液に存在する補体（complement）などがある。細胞としては、食菌作用を担当するマクロファージおよび多形核白血球（polymorphonuclear leukocyte）、感染細胞を死滅できるＫ細胞などがある。実際にほとんどの感染はこの先天性免疫によって防御される。
【０００３】
また、獲得免疫は一名「後天性免疫」ともいい、最初に侵入してきた抗原に対して記憶することができ、再び侵入したときに特異的に反応して効果的に抗原をとり除くことのできる特徴があって、先天性免疫を補強する役目を果たす。通常の免疫はこれを意味する。かかる獲得免疫は、便宜上、体液性免疫（humoral immunity）と細胞性免疫（cell-mediated immunity）とに分けて理解される。
【０００４】
体液性免疫は、Ｂリンパ球が抗原を認知した後に分化して抗体を分泌し、この抗体は主に感染した細菌をとり除く機能を発揮する。抗体は体液に存在しており、免疫グロブリン（immunoglobulin:Ｉｇ）という糖タンパク質でなっている。これにはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどがあり、それぞれ独特の機能を果たし、一部機能は重複したりする。ＩｇＡ抗体は胎盤を介して胎児に伝達される特徴がある。このような免疫を母性免疫（ｍaternal immunity）というが、このために生まれた後、数ヶ月の間はあまり感染しない。
【０００５】
細胞性免疫は、胸腺から由来したＴリンパ球が抗原を認知してリンホカイン（lymphokine）を分泌したり、直接的に、感染した細胞を殺す役目をする。分泌したリンホカインはマクロファージを活性化させ、食作用（phagocytosis）を助けたりする。このような細胞性免疫は主に、ウイルスまたは細胞内で育つことのできる細菌に感染された細胞をとり除く機能を果たす。獲得免疫は、病原体またはその毒素を免疫源として予防接種することによって得ることができるが、このような免疫を人工兔疫（artificial immunity）という。
【０００６】
免疫機能が低下すれば、過敏反応（allergy、hypersensitivity）を引き起こす場合があるが、該アレルギーのような過敏反応は、発現時間と反応形態に基づいて４つのタイプに分けることができる。
【０００７】
第Ｉ型（即時型）は、ほとんどのアレルギー反応が属する典型的なものであって、その症状としては、喘息、季節性あるいは通年性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、結膜炎、食品や薬物によるアレルギー、アトピー性皮膚炎、じんま疹、蜂針に対するアレルギー反応などがある。
第II型（抗体関与）は、体液性免疫の細胞溶解反応や炎症反応を引き起こすが、その症状としては、不適合輸血による赤血球の溶血、新生児溶血性疾患がある。
第III型は、抗原抗体反応や小分子量の抗原によって発生する。急性糸球体腎炎、過敏性肺炎を引き起こす。
最後に、第IV型（遅延型）は、Ｔリンパ球とマクロファージによる細胞性免疫反応の一形態であって、結核菌のツベルクリン反応、移植拒否反応、ウイルスのような微生物が侵入してきた場合に反応する重要な反応を引き起こす。
【０００８】
上述したような原因などを理由にして、免疫機能に障害が発生するという問題点を克服するために、様々な免疫機能増強剤および治療剤が開発されて使用されている。
【０００９】
しかし、別途の治療剤を長期間服用する場合、個々人ごとに免疫力の差があってその副作用の問題点が大きいという短所がある。特に、免疫疾患は治療より予防が重要であるが、現在市販されている治療剤は、予防のための服用は難しい。したがって、副作用の可能性のある別途の免疫機能強化剤を服用しなくても、免疫機能障害を予防および治療することのできる方法が要求される。
【００１０】
一般に、今まで知られている免疫増強物質としては、キノコ抽出物と植物抽出物がよく知られており、かかる素材による効果が継続的に報告されている。キノコ抽出物としては、クレスチン、レンチナンおよびＡＨＣＣなどが代表的なものであり、植物抽出物としては、ミスルトーが代表的な免疫力増強物質である。
【００１１】
既存の免疫増強物質には、１９７６年日本で製品化に成功したものであるツリガネタケの菌糸体から抽出した多糖類のクレスチン（Krestin、ＰＳＫ）がある。これはマクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞の活性を増加させる共に、インターフェロン、インターロイキン−２のような各種のサイトカインの産生を促進して免疫力を増強させる物質である。また、レンチナンは、日本国立癌センターの天原吾郎博士による、１９７８年パリで開かれた国際会議においてシイタケから抽出した多糖類が癌に対して免疫増強効果があるという研究報告によって知られるようになった。そして、ＡＨＣＣ（Active Hexose Correlated Compound:活性化された糖関連化合物の集合体）は、キノコ菌糸体を培養した後、様々な種類の酵素を反応させて抽出した免疫機能賦活物質である。植物抽出物であるミスルトー（mistletoe）はヤドリギの英語名であり、世界全域に分布する、多種類の木を宿主にして成長する半寄生植物であるが、我が国（韓国）では昔から民間医学製剤として使用されて来た。ヨーロッパ地域でもヤドリギは我が国と同様に様々な疾患に対する神秘の薬剤として知られ、民間で伝統的に使用されて来た免疫増強物質である。
【００１２】
その以外にも免疫力を増強させる物質としては、人参（紅参、仙参など）、ニンニク、竹塩、豆類食品、発酵食品｛みそ、唐辛子みそ、清麹醤（納豆のようなもの）など｝、緑汁と各種野菜、果物、有機ゲルマニウム、各種酵母食品、淡水タスルギ（melanian snail：黒い巻貝）、ニレの木の皮、自然穀類（玄米、発芽玄米、麦、ハト麦、小豆、もちあわなど）、各種海藻類（ワカメ、昆布など）などがある。
【００１３】
しかし、微生物より産生されるポリガンマグルタミン酸の免疫増強および／または免疫調節活性に対しては現在までに報告されたものはない。
【特許文献１】国際公開第０２／５５６７１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
これに対し、本発明者らはバシラス菌の産生するポリガンマグルタミン酸が、マクロファージの活性化のみならず、Ｔリンパ球とＢリンパ球の増殖、分化および活性化を誘導することを立証することにより、ポリガンマグルタミン酸が免疫活性増強剤として有用であることを確認し、また、前記ポリガンマグルタミン酸がワクチン用アジュバントの効果を示すことを確認し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明の主な目的は、免疫増強および調節効果を示すポリガンマグルタミン酸の用途を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記ポリガンマグルタミン酸を有効成分として含むことを特徴とする飼料組成物および機能性食品を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ポリガンマグルタミン酸をワクチン用アジュバントとして用いる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するために本発明は、有効量のポリガンマグルタミン酸と薬学的に許容される担体を含む免疫増強用組成物を提供する。
また、本発明はポリガンマグルタミン酸を含有するワクチン用アジュバントを提供する。
また、本発明は有効量のポリガンマグルタミン酸および食品学的に許容可能な添加剤を含み、免疫増強効果を有する機能性食品を提供する。
また、本発明は有効量のポリガンマグルタミン酸を含むことを特徴とする免疫増強効果を有する家畜用飼料組成物を提供する。
また、本発明はポリガンマグルタミン酸を、人間を除いて免疫増強が必要な動物に有効量を投与することを特徴とする動物の免疫増強方法を提供する。
また、本発明において、前記ポリガンマグルタミン酸は、１〜１５０００ｋＤａの分子量を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、免疫増強および調節活性を有するポリガンマグルタミン酸の用途に係り、より具体的には、有効量のポリガンマグルタミン酸を含む免疫増強用組成物、ワクチン用アジュバント、機能性食品および飼料組成物を提供する効果がある。
本発明のポリガンマグルタミン酸を含む組成物は、免疫増強および調節活性を同時に有しており、毒性および副作用がほとんどないので予防の目的で長期間服用するときも、安心して用いられる。また、細菌またはウイルスによる感染性疾患の予防および治療用として用いることができ、抗癌療法によって免疫力の低下した患者や、ＡＩＤＳまたは癌によって免疫力の抑制された患者に対し、免疫力の増強および調節のための医薬品および健康機能食品として用いることができると共にワクチン用アジュバントとしても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のポリガンマグルタミン酸を含む免疫増強用組成物は、薬学的な組成物の製造に通常使用する適切な賦形剤および希釈剤を更に含むことができる（Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishig Co., Easton ＰＡ）。また、本発明によるポリガンマグルタミン酸を含む免疫増強用組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射剤の形態に剤形化して用いることができる。
【００１９】
ポリガンマグルタミン酸を含む組成物に含まれていても良い担体、賦形剤、希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、澱粉、グリセリン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、硫酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げられる。
【００２０】
製剤化する場合、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、かかる固形製剤は前記ポリガンマグルタミン酸に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウムやタルクのような潤滑剤も用いることができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻繁に用いられる単純希釈剤である、水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれていても良い。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水溶性製剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ハードファット（witepsol）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリシルヴァ脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【００２１】
本発明のポリガンマグルタミン酸含有組成物の使用量は、患者の年齢、性別、体重によって変動し得るが、一般に、５〜５００ｍｇ／kｇの量、好ましくは１００〜２５０ｍｇ／kｇの量を一日に１回〜３回に分けて投与することができ、その投与量は投与経路、疾患の程度、性別、体重、年齢などに応じて増減され得る。したがって、前記投与量はどのような面からでも本発明の範囲を限定するものではない。
【００２２】
本発明で用いられるポリガンマグルタミン酸そのものは毒性や副作用がほとんどないので、予防の目的として長期間服用する際には、安心して使用することのできる薬剤である。
【００２３】
本発明において、ポリガンマグルタミン酸は免疫調節を目的とする食品や飲料に添加されても良い。このとき、食品や飲料中におけるポリガンマグルタミン酸の量は、一般に全体の食品重量の０.０１〜３０重量％の範囲で添加することができ、健康飲料組成物は１００ｍｌを基準にして０.０１〜１０ｇ、好ましくは ０.１〜２ｇの割合で添加することができ、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは飲料の形態が可能である。
【００２４】
本発明の健康飲料組成物は、指示された割合で必須成分として前記ポリガンマグルタミン酸を含む以外には、液体成分には特別な制限はなく、通常の飲料と同様に様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物としては、例えば、モノサッカライド（ブドウ糖、果糖など）、ジサッカライド（マルトース、スクロースなど）およびポリサッカライド（デキストリン、シクロデキストリンなど）のような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。上述したもの以外の香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（レバウディオシドＡ、グリシルリジンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルタームなど）を有利に使用できる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、一般に、約１〜２０ｇ、好ましくは、約５〜１２ｇである。
【００２５】
上記以外に、本発明の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、ミネラル、合成風味剤、天然風味剤、着色剤、充鎮剤（チーズ、チョコレートなど）、ぺクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含んでも良い。その他、本発明の各組成物は、天然フルーツジュースおよびフルーツジュース飲料、穀類飲料および野菜飲料の製造のための果肉および穀物を含んでも良い。かかる成分は独立的に、または組み合わせで用いることができる。このような添加物の割合は、それほど重要ではないが、本発明の全体組成物の１００重量％当り、約０.０１〜２０重量％の範囲で選択されることが一般的である。
【００２６】
本発明で用いられるポリガンマグルタミン酸は、免疫増強が必要な動物（例えば、牛、馬、羊、ヤギ、豚、犬、猫、家禽、ラット、マウスなど）に有効量を投与することによって、動物の免疫を増強することができる。この場合、ポリガンマグルタミン酸は有効量を飼料に添加し、飼料添加物として投与してもよい。本発明の飼料添加物は、感染性疾患に対する免疫力を増強させるために飼料組成物の全体重量に対し、ポリガンマグルタミン酸が０.０１〜９５重量％、好ましくは、０.１〜８０重量％の範囲内で添加されてもよい。
【００２７】
本発明のポリガンマグルタミン酸を、ワクチン用アジュバントとして共に使用できる抗原性成分としては、免疫原性が不良な抗原がペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはこれらに相応する核酸配列、またはワクチンの対象とする標的細胞またはこの溶解質、またはこれらの配合物からなる群から選択してもよい。本発明のワクチン用アジュバントは、非経口、粘膜（経口、鼻腔、肺）および経皮性経路によるワクチンの投与時に共に用いることができる。
【００２８】
抗原性タンパク質を発現する微生物をワクチンの用途として用いる場合、本発明のポリガンマグルタミン酸をアジュバントとして用いることが好ましい。特に、前記抗原性タンパク質を発現する乳酸菌を経口用ワクチンとして用いる場合、本発明のポリガンマグルタミン酸をワクチン用アジュバントとして共に用いることが好ましい。
【００２９】
また、本発明のポリガンマグルタミン酸は、癌、特に前立腺、結腸、肺、乳房、卵巣、頭頚部、外陰部、膀胱および脳癌、神経膠腫だけでなく、非伝染性慢性疾患を予防して治療するのに用いられる医薬組成物に加えて用いることができる。また、ウイルスおよび細菌感染性疾患を予防・治療するために用いられる医薬組成物、および自己免疫疾患を治療するために用いられる医薬組成物と共に使用してもよい。
【００３０】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は、専ら本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
ポリガンマグルタミン酸の製造
ポリガンマグルタミン酸製造用の基本培地（５％のＬ−グルタミン酸の添加されたＧＳ培地；グルコース ５％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １％、ＫＨ２ＰＯ４ ０.２７％、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ０.４２％、ＮａＣｌ ０.０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.３％、ビタミン溶液 １ｍｌ/Ｌ、ｐＨ６.８）３Ｌが入っている５Ｌの大きさの発酵機に、バシラス・サブティラスチョンククチャン（Bacillus subtilis var chungkookjanｇ, ＫＣＴＣ ０６９７ＢＰ）菌株の培養液１％を接種し、撹拌速度１５０ｒｐｍ、空気注入速度１ｖｖｍにして３７℃で７２時間培養した後、２Ｎ硫酸溶液を加えてｐＨが３.０となるように調節することにより、ポリガンマグルタミン酸が含まれた試料液を得た。
【００３２】
前記試料液を４℃で１０時間静置して醗酵液内の多糖類をとり除き、そこにエタノールを醗酵液の２倍量の体積となるように添加した後、充分に混合した。混合液を４℃で１０時間静置した後、遠心分離してポリガンマグルタミン酸の沈殿物を得た。前記沈殿物に蒸留水を加えて溶解させ、タンパク質分解酵素を１００μｇ/ｍｌとなるように加えて３７℃の恒温機で６時間静置して反応させ、ポリガンマグルタミン酸の試料に存在する細胞外タンパク質を分解させた。これを充分量の蒸留水で透析して遊離したグルタミン酸をとり除いた後、濃縮させて純粋なポリガンマグルタミン酸を得た。
【００３３】
用途に応じて必要な場合、前記製造されたポリガンマグルタミン酸を適切な方法で切断して一定の分子量に製造して用いたり、適切な方法で分離して一定の分子量別に回収して用いることができ、以下の実施例で用いたポリガンマグルタミン酸の平均分子量はＧＰＣ分析の結果、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１２００ｋＤａおよび２０００ｋＤａであった。
【実施例２】
【００３４】
ポリガンマグルタミン酸による、マクロファージからＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの遺伝子発現誘導
まず、ポリガンマグルタミン酸が免疫系の一次的な免疫反応に重要なマクロファージの活性化に及ぼす影響を調べた。このとき、マクロファージの活性化の指標として、マクロファージが分泌する主なサイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の遺伝子発現誘導能およびＴ−リンパ球およびＢ−リンパ球の増殖、分化および活性化に関与するＩＬ−１βの遺伝子発現誘導能を調べた。
【００３５】
そのために、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）のマクロファージ株（ＲＡＷ ２６４.７:ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）をＤＭＥＭ（１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン, １０％ ＦＢＳ添加）培地に浮遊させた後、６ウェル・プレートに１×１０６／ｗｅｌｌで分注し、一日間ＣＯ２培養器で培養した後、ポリガンマグルタミン酸（γ−ＰＧＡ:１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１２００ｋＤａ）を添加し、それぞれ０.１％、０.０１％、０.００１％の濃度になるようにＦＢＳが含まれていないＤＭＥＭ培地で希釈して１時間培養した。
【００３６】
このとき、陽性対照群としては、既存のよく知られているＬＰＳ（lipopolysaccharide; Ｓｉｇｍａ,ＵＳＡ）を用い、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で刺激した。刺激のための培養が終わった後、各ウェルのＲＡＷ ２６４.７細胞株を収去して細胞内に存在するＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの遺伝子発現誘導能の指標であるｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲで確認した。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen、Germany）を用いてｍＲＮＡを分離した後、得られたＲＮＡをＤＥＰＣ−ＤＷに溶かし、分光光度計を用いて濃度および純度を測定した。
【００３７】
抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｋｉｔ（Qiagen、Germany）を用いた。全体のＲＮＡから１μｇのｍＲＮＡに、ＲＮＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ ０.５ｍＭ、オリゴ ｄＴ プライマー １μＭ、ＲＮａｓｅ阻害剤 ０.５ｕｎｉｔ、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素 ０.２ｕｎｉｔを添加し、３７℃で１時間反応させた。最後に、９５℃で５分間加熱してｃＤＮＡを得た。
【００３８】
前記合成されたｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β遺伝子に対するプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅを基礎にして設計した。各遺伝子に対するプライマーは次の通りである。
ＴＮＦ−α用 Ｆプライマー:５'−ＣＡｇ−ｇＣＡ−ｇｇＴ−ＴＣＴ−ｇＴＣ−ＣＣＴ−ＴＴＣ−Ａ−３'（配列番号１）
ＴＮＦ−α用 Ｒプライマー:５'−ＣＡＣ−ＴＴｇ−ｇＴｇ−ｇＴＴ−ＴｇＣ−ＴＡＣ−ｇＡＣ−ｇ−３'（配列番号２）
ＩＬ−１β用 Ｆプライマー：５'−ｇＣＴ−ＡＣＣ−ＴｇＴ−ｇＴＣ−ＴＴＴ−ＣＣＣ-ｇＴｇ−ｇ−３'（配列番号３）
ＩＬ−１β用 Ｒプライマー:５'−ＴＴｇ−ＴＣｇ−ＴＴｇ−ＣＴＴ−ｇｇＴ−ＴＣＴ−ＣＣＴ−Ｔｇ−３'（配列番号４）
【００３９】
ＰＣＲは、ｃＤＮＡ ５０nｇに、２×ｐｒｅｍｉｘ ｂｕｆｆｅｒ（Bioneer）１０μｌ、前記プライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ入れ、全量が２０μｌ になるようにした後、９５℃で４０秒間前変性させた後、９５℃で４０秒、５５℃で４０秒、７２℃で６０秒間、３５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ産物５μｌずつを、１％アガロース・ゲルで電気泳動させた（図１）。
【００４０】
図１において、Ａは全ての細胞で発現する、β−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡを対照群として示したものであり、ＢはマウスのＴＮＦ−α ｍＲＮＡの発現誘導能を示したものであり、ＣはマウスのＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現誘導能を示したものである。図１に示すように、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの発現誘導能の場合は、対照群の細胞に比べて発現率の増加は確認できなかったが、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現誘導能の場合は、ＬＰＳで処理した細胞と類似した発現率の増加を確認することができた。このような結果により、本発明のポリガンマグルタミン酸が、一次的な免疫反応に重要なマクロファージの活性化の指標として、マクロファージが分泌する主なサイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の遺伝子発現誘導効果と共に、Ｔ−リンパ球およびＢ−リンパ球の増殖、分化および活性化に関与するＩＬ−１βの遺伝子発現誘導効果も発揮するということを確認することができた。
【実施例３】
【００４１】
ポリガンマグルタミン酸による、マクロファージからＴＮＦ−αの分泌誘導
実施例２と同様にして、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）マクロファージ株 ＲＡＷ ２６４.７にポリガンマグルタミン酸（γ−ＰＧＡ:１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１２００ｋＤａ）をそれぞれ０.１％、０.０１％、０.００１％の濃度で刺激して培養した後、各ウェルの培養上清液を収去して培養上清液に存在するＴＮＦ−α（Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、ＢＤ）の分泌誘導能をＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて測定した。
【００４２】
用意された９６ウェル（ＴＮＦ−αの抗マウス モノクロナール抗体でコーティングされたプレート）にＴＮＦ−α標準溶液５０μｌと培養上清液５０μｌを入れて常温で１時間および２４時間、それぞれ反応させた。その後、洗浄緩衝液（３００μｌ/ｗｅｌｌ）で５回洗浄した後、第一次抗体であるｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ抗マウス ＴＮＦ−αポリクロナール抗体１００μｌを添加し、常温で１時間反応させ、洗浄緩衝液（３００μｌ/ｗｅｌｌ）で５回洗浄した。その後、第２次抗体である、ａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ １００μｌを入れ、常温で３０分間反応させて７回洗浄した後、ＴＭＢ発色溶液で３０分間反応させた後、５０μｌのｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎで発色を固定した。そして、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡ 読み取り機で測定し、ＴＮＦ−α量を分析した。その結果を図２に示した。図２において、Ａはマクロファージに試料を処理して１時間以降の培地内に分泌されるＴＮＦ−αを測定した結果であり、Ｂは試料を処理して２４時間以降の培地内に分泌されるＴＮＦ−αを測定した結果である。
【００４３】
図１および図２に示された結果から分かるように、ポリガンマグルタミン酸がマクロファージ刺激剤として優れた効果を有することが確認でき、マクロファージの活性化に際し、濃度および分子量に依存する傾向を示した。そして、ポリガンマグルタミン酸の最も効果的な濃度および分子量はそれぞれ、０.１％および１２００ｋＤａであった。
【００４４】
ポリガンマグルタミン酸は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの遺伝子発現誘導能および分泌誘導能において、いずれも陽性対照群として用いた細菌内毒素であるＬＰＳよりは低かった。このようなポリガンマグルタミン酸の作用がＬＰＳに比べて弱いということは、生体免疫反応においては非常に好ましい現象であると言える。なぜならば、適当なＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの分泌は生体防御機構に有益であるものの、過多な分泌は生体に致命的なショックを引き起こすなど、副作用が大きいからである。結局、本発明によるポリガンマグルタミン酸は、免疫増強だけでなく、免疫調節機能をも有していると考えられる。
【実施例４】
【００４５】
ポリガンマグルタミン酸による、ウイルス抗原に対する抗体産生
免疫原性を高めるために、すなわち兔疫応答を高めるために抗原と共に注射する物質をアジュバント（adjuvant）という。Ｆｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔは、鉱物に界面活性剤のＡｒｌａｃｅｌ−Ａを加えたものてあり、ここに可溶性抗原をよく混ぜて懸濁液として作って、皮内あるいは皮下に注射して抗体産生力を高める。結核菌を加えたものを完全アジュバントといい、加えていないものを不完全アジュバントという。結核菌成分中のｗａｘ−Ｄがアジュバントの効果を示す。その他、ミョウバン、水酸化アルミニウム、ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ、百日咳ワクチンなどもアジュバント効果があるものとして知られている。
【００４６】
本発明のポリガンマグルタミン酸も実施例２および実施例３で観察したように、主な抗原提示細胞であるマクロファージも活性化させるので、抗体産生に寄与するアジュバントとしての役目を果たせると予測し、本研究を次のように行った。
【００４７】
本発明のポリガンマグルタミン酸が抗原に対して特異的免疫増進効果を示すか否かを調べた。この実験は抗原特異的な免疫反応に係り、特に抗体産生と関連のあるＢ細胞による体液性免疫反応に及ぼす影響を調べたものである。すなわち、豚の伝染性の消化器疾患を誘発する豚の伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）の核タンパク質（ＮＰ）を抗原として用い、ウサギを実験動物として用いた。
【００４８】
まず、対照群としては、ＴＧＥＮ抗原（４００μｇ/ＰＢＳ ｍｌ）を単独で皮下注射したウサギを用いており、ＴＧＥＮ抗原（４００μｇ/ＰＢＳ ｍｌ）と、分子量がそれぞれ５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび５０ｋＤａのポリガンマグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）とを混合し、皮下注射で投与した実験群に分けた。
【００４９】
このとき、陽性対照群としては、常用化されているＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＡｄｊｕｖａｎｔとＴＧＥＮ抗原（４００μｇ/ＰＢＳ ｍｌ）とを混合し、皮下注射で投与した実験群を用いた。最初の皮下注射の後、２週間後に同じ量の抗原およびそれぞれのポリガンマグルタミン酸複合体を投与した。最初の皮下注射の後、２週間毎にウサギの血清を採り、血清中のＴＧＥＮ抗原に対する抗体の力価（titer）をＥＬＩＳＡ（Enzyme linked Immunosorbent assay）法で測定した。
【００５０】
ＥＬＩＳＡは、ＴＧＥＮ抗原（０.１μｇ/ｍｌ）を用い、プレートをコーティングすることで簡単に行った。プレートをＰＢＳ／５％の牛胎児血清を用いてブロッキングした後、対照群のウサギおよび実験群のウサギの血清を様々な一連の希釈率にしてインキュベーションした。その後、Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅの付着した抗ウサギ−ＩｇＧ抗体（Ｆｃに対して特異的である。）を添加した。上述した全てのインキュベーションを３７℃で１時間行い、上述した各段階の後、ＰＢＳ／０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄した。基質としてはＡＢＴＳ｛2,2-azinobis（3-ethylben-zthiazolinesulfonic acid）｝１ｍｇ／ｍｌを添加して反応を展開した。３０分後に４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡ読取り機で測定した。その結果を図３に示した。
【００５１】
図３に示す結果から分かるように、本発明の分子量別のポリガンマグルタミン酸を複合したＴＧＥＮ抗原を皮下注射したウサギでのＴＧＥＮ抗原に対する抗体力価は、常用化されているＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＡｄｊｕｖａｎｔとＴＧＥＮ抗原とを複合して投与したウサギの抗体力価よりは低かったが、ＴＧＥＮ抗原のみを皮下注射したウサギでのＴＧＥＮ抗原に対する抗体力価よりは高かった。特に、ポリガンマグルタミン酸５０ｋＤａを複合体として用いたウサギの抗体力価が最も高かった。そして、抗体力価の上昇に対する持続性は、最初の注射から、少なくとも６週間までは対照群に比べて有意に増進するという結果を示した。
【００５２】
以上で、本発明の特定部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有する者において、かかる具体的な技術は単なる好ましい実施の形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないということは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した各請求項およびそれらの等価物によって定義されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ポリガンマグルタミン酸の刺激による一次免疫反応細胞であるマクロファージからＴＮＦ−α（tumor necrosis factor-α）およびＩＬ−１βの遺伝子発現誘導能をＲＴ−ＰＣＲで確認した写真である。
【図２】ポリガンマグルタミン酸の刺激による一次免疫反応細胞であるマクロファージからＴＮＦ−αの細胞外分泌発現誘導能をＥＬＩＳＡで確認したグラフである。
【図３】ポリガンマグルタミン酸と豚の伝染性消化器疾患を誘発する豚の伝染性胃腸炎ウイルス（Transmissible Gastroenteritis virus，ＴＧＥ）の核タンパク質（nucleoprotein）抗原複合体をウサギの皮下に注射し、所定の期間が過ぎた後、血清内の核タンパク質抗原に対する特異的ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡで測定してポリガンマグルタミン酸による抗原特異的免疫反応の誘導を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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