(57)【要約】【課題】  ストレプトミセス属ＦＲ−００８由来ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与するそれぞれの蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を提供する。【解決手段】  本発明の塩基配列には、ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与するケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、アシルキャリアー蛋白質（ＡＣＰ）、ケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）及びエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインをコードする遺伝子と、ＡＢＣトランスポーター、シトクロームＰ−４５０モノオキシゲナーゼ、フェレドキシン、チオエステラーゼ、糖生合成蛋白質、ＦＡＤ−依存性モノオキシゲナーゼ、４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸シンダーゼ（ＡＤＣ）及びＡＤＣリア−ゼなどの変形酵素をコードする遺伝子がすべて含まれる。【選択図】  図２【図２】2005124566.tif 000025
2005124566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列を有するＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子クラスター。
【請求項２】
配列番号１の遺伝子をコードする領域をいずれか一つ以上欠失するか或いは不活性化したストレプトミセスＦＲ−００８変異株を培養することを特徴とするＦＲ−００８ポリケチド変異体の製造方法。
【請求項３】
ｆｓｃＭＩ遺伝子をコードする、配列番号１の１３，５２２−１４，８９８領域を欠失するか或いは不活性化したストレプトミセスＦＲ−００８変異株を培養することを特徴とする、ＦＲ−００８−Ｖ、ＦＲ−００８−ＶＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩＩ或いはＦＲ−００８−ＩＸの、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
ｆｓｃＭＩＩ遺伝子をコードする、配列番号１の１４，９５３−１６，０１１領域を欠失するか或いは不活性化したストレプトミセスＦＲ−００８変異株を培養することを特徴とする、ＦＲ−００８−Ｖ、ＦＲ−００８−ＶＩ、ＦＲ−００８−ＶＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩＩ、ＦＲ−００８−ＩＸ、ＦＲ−００８−Ｘ、ＦＲ−００８−ＸＩ或いはＦＲ−００８−ＸＩＩの、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
ＦＲ−００８−Ｖ、ＦＲ−００８−ＶＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩＩ、ＦＲ−００８−ＩＸ、ＦＲ−００８−Ｘ、ＦＲ−００８−ＸＩ及びＦＲ−００８−ＸＩＩからなる群から選択される、ＦＲ−００８ポリケチド変異体。
【請求項６】
（ａ）配列番号２の５１−４６５（ＡＴＰ依存性カルボン酸：ＣｏＡリガーゼ（ＣｏＬ））、５８１−６４７（ＡＣＰＬ）、６６１−１，０９４（ＫＳ１）、１，２０２−１，５０９（ＡＴ１）及び１，５９６−１，６６２（ＡＣＰ１）領域で構成されたアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３の８，８０８−９，２２１（ＫＳ１０）、９，３３０−９，６２７（ＡＴ１０）、９，６８０−９，８６７（ＤＨ１０）、１０，１８３−１０，３６６（ＫＲ１０）、１０，４６９−１０，５３６（ＡＣＰ１０）、６，９６６−７，３８３（ＫＳ９）、７，４９０−７，７９２（ＡＴ９）、７，８４５−８，０２９（ＤＨ９）、８，３３１−８，５１４（ＫＲ９）、８，６１８−８，６８５（ＡＣＰ９）、５，２５３−５，６７５（ＫＳ８）、５，７７５−６，０７４（ＡＴ８）、６，１２７−６，３１０（ＤＨ８）、６，５９０−６，７７３（ＫＲ８）、６，８７４−６，９４１（ＡＣＰ８）、３，５２９−３，９５４（ＫＳ７）、４，０５９−４，３５６（ＡＴ７）、４，４０７−４，５９５（ＤＨ７）、４，８８４−５，０６３（ＫＲ７）、５，１６３−５，２３０（ＡＣＰ７）、１，７８７−２，２１２（ＫＳ６）、２，３１８−２，６１７（ＡＴ６）、２，６７０−２，８５９（ＤＨ６）、３，１５５−３，３３８（ＫＲ６）、３，４３８−３，５０５（ＡＣＰ６）、３４−４６０（ＫＳ５）、５７６−８７５（ＡＴ５）、９２８−１，１１２（ＤＨ５）、１，４１７−１，５９６（ＫＲ５）及び１，６９６−１，７６３（ＡＣＰ５）領域で構成されたアミノ酸配列；（ｃ）配列番号４の３，７０３−４，１０３（ＫＳ４）、４，２４７−４，５５０（ＡＴ４）、４，６００−４，７２２（ＤＨ４）、５，１０３−５，２８６（ＫＲ４）、５，３８９−５，４５６（ＡＣＰ４）、１，５９７−２，０２３（ＫＳ３）、２，１３９−２，４４２（ＡＴ３）、２，４９４−２，６８４（ＤＨ３）、２，９７０−３，３２２（ＥＲ３）、３，３２５−３，５０８（ＫＲ３）、３，６１０−３，６７７（ＡＣＰ３）、３３−４６０（ＫＳ２）、５７１−８７４（ＡＴ２）、１，２２４−１，４０６（ＫＲ２）及び１，５０８−１，５７４（ＡＣＰ２）領域で構成されたアミノ酸配列；（ｄ）配列番号５の３３−４５６（ＫＳ２１）、５４５−８５１（ＡＴ２１）、９０３−１，０８３（ＤＨ２１）、１，３７８−１，５６１（ＫＲ２１）、１，６６８−１，７３５（ＡＣＰ２１）及び１，８１４−２，０１８（ＴＥ２１）領域で構成されたアミノ酸配列；（ｅ）配列番号６の５，６４２−６，０６９（ＫＳ２０）、６，１５８−６，４６３（ＡＴ２０）、６，５１５−６，６９３（ＤＨ２０）、７，０１７−７，３２２（ＥＲ２０）、７，３３０−７，５１２（ＫＲ２０）、７，６１５−７，６８２（ＡＣＰ２０）、４，１１７−４，５４４（ＫＳ１９）、４，６３３−４，９３６（ＡＴ１９）、５，２６３−５，４４５（ＫＲ１９）、５，５５２−５，６１９（ＡＣＰ１９）、２，０７１−２，４９８（ＫＳ１８）、２，５９０−２，８９６（ＡＴ１８）、２，９４８−３，１２７（ＤＨ１８）  ３，４２８−３，７３３（ＥＲ１８）、３，７４１−３，９２４（ＫＲ１８）、４，０２５−４，０９２（ＡＣＰ１８）、３４−４６０（ＫＳ１７���、５４８−８５０（ＡＴ１７）、９０２−１，０８１（ＤＨ１７）、１，３８４−１，６８９（ＥＲ１７）、１，６９７−１，８８０（ＫＲ１７）及び１，９８２−２，０４９（ＡＣＰ１７）領域で構成されたアミノ酸配列；及び（ｆ）配列番号７の７，９３５−８，３５２（ＫＳ１６）、８，４６４−８，７６７（ＡＴ１６）、９，０９９−９，２８０（ＫＲ１６）、９，３８７−９，４５２（ＡＣＰ１６）、６，４２５−６，８４５（ＫＳ１５）、６，９３５−７，２４１（ＡＴ１５）、７，５５９−７，７２５（ＫＲ１５）、７，８３８−７，８９８（ＡＣＰ１５）、４，８７２−５，２９７（ＫＳ１４）、５，４０８−５，７２０（ＡＴ１４）、６，０４９−６，２２５（ＫＲ１４）、６，３３１−６，３９８（ＡＣＰ１４）、３，３４２−３，７６５（ＫＳ１３）、３，８７２−４，１７０（ＡＴ１３）、４，４９９−４，６７６（ＫＲ１３）、４，７８２−４，８４９（ＡＣＰ１３）、１，７８８−２，２０９（ＫＳ１２）、２，３１３−２，６２１（ＡＴ１２）、２，９７２−３，１５０（ＫＲ１２）、３，２５４−３，３１４（ＡＣＰ１２）、３８−４５２（ＫＳ１１）、５６３−８６４（ＡＴ１１）、９２１−１，１０５（ＤＨ１１）、１，４１０−１，５９２（ＫＲ１１）及び１，６９４−１，７６０（ＡＣＰ１１）領域で構成されたアミノ酸配列を含むＦＲ−００８のモジュラーＰＫＳ。
【請求項７】
請求項６のＦＲ−００８のモジュラーＰＫＳをコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子であって、配列番号１の２０，９２７−２６，１５８領域（ｆｓｃＡ）、２８，９８３−６０，８６０ｃ領域（ｆｓｃＣ）、６０，９６２−７７，５８７ｃ領域（ｆｓｃＢ）、７７，９８３−８４，１３２ｃ領域（ｆｓｃＦ）、８４，１７０−１０７，４８５ｃ領域（ｆｓｃＥ）及び１０７，４９６−１３６，１４８ｃ領域（ｆｓｃＤ）の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項９】
配列番号８または９のアミノ酸配列を有するＡＢＣトランスポーター蛋白質。
【請求項１０】
請求項９のＡＢＣトランスポーター蛋白質をコードするｆｓｃＴ１またはｆｓｃＴＩＩ遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０に記載のｆｓｃＴ１及びｆｓｃＴＩＩ遺伝子が、それぞれ配列番号１の２６，３３３−２７，３４０及び２７，５６１−２８，２８０領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項１２】
配列番号１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列を有する調節蛋白質。
【請求項１３】
請求項１２の調節蛋白質をコードするｆｓｃＲＩ、ｆｓｃＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩまたはｆｓｃＲＩＶ遺伝子。
【請求項１４】
請求項１３に記載のｆｓｃＲＩ、ｆｓｃＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩ及びｆｓｃＲＩＶ遺伝子が、それぞれ配列番号１の３，１５０−３，８１８ｃ、４，３７７−７，２０５ｃ、７，２１０−１０，３２０ｃ及び１０，２９８−１３，３１５ｃ領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項１５】
配列番号１４のアミノ酸配列を有するシトクロームＰ−４５０モノオキシゲナーゼ。
【請求項１６】
請求項１５のシトクロームＰ−４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子ｆｓｃＰ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のｆｓｃＰ遺伝子が、配列番号１の１６，１０６−１７，２８７領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項１８】
配列番号１５のアミノ酸配列を有するフェレドキシン蛋白質。
【請求項１９】
請求項１８のフェレドキシン蛋白質をコードするｆｓｃＦＥ遺伝子。
【請求項２０】
請求項１９に記載のｆｓｃＦＥ遺伝子が、配列番号１の１７，３３４−１７，５２８領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項２１】
配列番号１６のアミノ酸配列を有するチオエステラーゼ。
【請求項２２】
請求項２１のチオエステラーゼをコードするｆｓｃＴＥ遺伝子。
【請求項２３】
請求項２２に記載のｆｓｃＴＥ遺伝子が、配列番号１の１７，５５６−１８，４１３領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子
【請求項２４】
配列番号１７のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２５】
請求項２４のグリコシルトランスフェラーゼをコードするｆｓｃＭＩ遺伝子。
【請求項２６】
請求項２５に記載のｆｓｃＭＩ遺伝子が、配列番号１の１３，５２２−１４，８９８領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項２７】
配列番号１８のアミノ酸配列を有するＧＤＰ−ケト糖・アミノトランスフェラーゼ。
【請求項２８】
請求項２７のＧＤＰ−ケト糖・アミノトランスフェラーゼをコードするｆｓｃＭＩＩ遺伝子。
【請求項２９】
請求項２８に記載のｆｓｃＭＩＩ遺伝子が、配列番号１の１４，９５３−１６，０１１領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項３０】
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ。
【請求項３１】
請求項３０のＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼをコードするｆｓｃＭＩＩＩ遺伝子。
【請求項３２】
請求項３１に記載のｆｓｃＭＩＩＩ遺伝子が、配列番号１の１３６，５５８−１３７，７６６ｃ領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項３３】
配列番号２０のアミノ酸配列を有するＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼ。
【請求項３４】
請求項３３のＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼをコードするｆａｃＯ遺伝子。
【請求項３５】
請求項３４に記載のｆａｃＯ遺伝子が、配列番号１の５７４−１，９５０ｃ領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項３６】
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＡＤＣシンダーゼ。
【請求項３７】
請求項３６のＡＤＣシンダーゼをコードするｐａｂＡＢ遺伝子。
【請求項３８】
請求項３７に記載のｐａｂＡＢ遺伝子が、配列番号１の１８，６１０−２０，７８１領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【請求項３９】
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＡＤＣリア−ゼ。
【請求項４０】
請求項３９のＡＤＣリア−ゼをコードするｐａｂＣ遺伝子。
【請求項４１】
請求項４０に記載のｐａｂＣ遺伝子が、配列番号１の２，２６４−３，０３７ｃ領域の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトミセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＦＲ−００８由来ＦＲ−００８ポリケチド合成のための遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリケチドとは、ポリケチド合成酵素の作用により一連の縮合および引き続く変形を通して２炭素ユニットから合成される化合物のことで、カビや放線菌を含むいくつかのバクテリアから生産される（非特許文献１、２）。ポリケチドは、非常に様々な構造を有する生理的活性分子であり、その種は、多様な活性を有する幾多の化合物を含む。
【０００３】
一般にこのような天然状態のポリケチドを用いた生産方法は、その効率が低くて産業的利用に難があり、従来の化学的方法によるポリケチド化合物の生産にはまた、経済的・技術的に多くの難があった。
【０００４】
このような関心から、天然状態のポリケチドを効率よく生合成するための研究が進み、その関連遺伝子を利用した組換え生産方式が開発され始めた。すなわち、ポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子の組換え技術を用いたクローニング、分析及び操作などの研究が行われ、これら技術により、自然または宿主から発生する水準より高い水準のポリケチド生産が可能になった（特許文献１〜１４、非特許文献３〜５）。
【０００５】
ポリケチドは、天然では、ポリケチド合成酵素（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＰＫＳ）という５０余種の酵素とキャリア蛋白質の連続的な活性によって合成される。これは脂肪酸の合成と類似している（非特許文献６、７）。例えば、エリスロマイシンの核心構造はおよそ２５個の連続された酵素反応によって作われる。ＰＫＳには２つの主要な型があり、一つは「モジュール型」ＰＫＳであり、他の一つは「反復（ｉｔｅｒａｃｔｉｖｅ）」ＰＫＳである（非特許文献８）。
【０００６】
モジュラーＰＫＳ（１型）は、ポリケチド炭素鎖の組み立てと変形のすべての段階がそれぞれ他の触媒部位によって行われる一方、反復ＰＫＳ（２型）は、一つの触媒部位が生合成経路上で一回以上使用される。典型的なモジュラーＰＫＳは複数の大きなポリペプチド鎖で構成されているが、これらはＮ末端からＣ末端方向へ負荷モジュール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ）、多重拡張モジュール（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｏｄｕｌｅｓ）、そして放出モジュール（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ）に区分される（非特許文献９）。
【０００７】
負荷モジュールは、アシルトランスフェラーゼ（ａｃｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＴ）およびアシルキャリアー蛋白質（ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＣＰ）からなる。多重拡張モジュールは、基本的にケトシンターゼ（ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅ；ＫＳ）、ＡＴ、ＡＣＰを含み、このような基本モジュールのほかに伸長ポリケチド鎖のβ−炭素を変形させる酵素を含むこともある。最後に、放出モジュールは、チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ；ＴＥ）、およびしばしばシクラーゼ活性を含むこともある。
【０００８】
一般に負荷モジュールは、ポリケチドの合成に用いられる第一のビルディングブロックと結合し、第一の拡張モジュールにそれを運搬する。多重拡張モジュール上のＡＴは、特定のアシル（アセチルまたはプロピオニル）−ＣｏＡを認識し、そしてアシルＣｏＡをチオールエステルとしてＡＣＰに転移させる。同時に各モジュールのＡＴは、特定のマロニル（マロニルまたはα−置換型マロニル）−ＣｏＡのマロニル基をチオールエステルとしてそのモジュールのＡＣＰに転移させる。次に、トランスエステル化（ｔｒａｎｓｔｅｒｅｆｉｃａｔｉｏｎ）により、負荷モジュールのアシル基が第一のモジュールのＫＳに転位する。次いで、マロニル基のα炭素に共有結合し、脱炭酸が起こり、結果的に負荷ユニットより２炭素長い骨格を有する新しいアシル−ＡＣＰを生成する（伸長または延伸）。
【０００９】
各拡張モジュールで２炭素伸長するポリケチド鎖は、共有結合チオールエステルとして拡張モジュールから次の拡張モジュールへ転位され、前記過程を繰り返す。各モジュールは、炭素−炭素結合の形成に関与するＫＳ、ＡＴ及びＡＣＰのほかに、伸長されるポリケチド鎖が次のモジュールに転移される前に、このポリケチド鎖に２炭素単位のβ−ケト基が付加された直後にこのβ−ケト基を変形させる酵素を含むこともある。この変形酵素には、ケト基をアルコールに還元するケトレダクターゼ（ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＫＲ）、アルコールを脱水して二重結合を作るデヒドラターゼ（ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ；ＤＨ）、二重結合を単一結合に変換するエノイルレダクターゼ（ｅｎｏｙｌ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＥＲ）がある。
【００１０】
モジュールによっては、この変形酵素を全く含まないものもあり、ＫＲ（１）、ＫＲ＋ＤＨ（２）、ＫＲ＋ＤＨ＋ＥＲ（３）をそれぞれ含むものもある。これら変形酵素は各２炭素単位のβ炭素の酸化状態を決定する（０＝ケトン；１＝アルコール；２＝二重結合；３＝単結合）。各モジュールのＡＴの特異性と共にこの変形酵素によって、多様なポリケチド産物が得られる。伸長されるポリケチド鎖がＰＫＳの最後のモジュールまで移動すると、放出モジュールまたはチオエステラーゼ活性部位に当たる。ここでポリケチドは切断されて環状構造になる。また、ポリケチドの核心分子に炭水化物、メチル基を添加するか、或いは他の変形を誘導するテイラー酵素（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ＴＥ）によってさらに変わることができる。
【００１１】
前述したようにポリケチドは、ＰＫＳの連続的な作用によりカルボン酸ユニットの縮合によって形成される。微生物に存在するほとんどのＰＫＳ遺伝子は、微生物染色体にクラスターとして存在すると知られている（非特許文献１０）。１９９０年に、６−デオキシエリスロノリドＢ（６ｄＥＢ）の形成に関与するＤＥＢＳ遺伝子が初めて報告され（非特許文献１１、１２）、以後現在まで１１種のポリケチドの全体または一部遺伝子のクローニング及び塩基配列が報告された。今まで報告されたポリケチドの遺伝子情報を表１に示す。
【００１２】
【表１】
2005124566.tif 000003
ストレプトミセス属ＦＲ−００８から生成されるＦＲ−００８ポリケチドは、カンジシジンＤのようにアグリコンがある４−アミノアセトフェノンを有するヘプタエンマイクロライドである（非特許文献１３）。ＦＲ−００８ポリケチドは、抗真菌活性だけでなく蚊の幼虫に対しても毒性が強いとされ、農業および医薬への活用価値が非常に高いポリケチドである（非特許文献１４）。
【００１３】
【化１】
2005124566.tif 000004
ＦＲ−００８ポリケチド合成遺伝子の場合、１９９４年に初めてクローニングされた。（非特許文献１５）。Ｈｕらは、コスミドベクターを用いてストレプトミセス属ＦＲ−００８の染色体ライブラリを作製し、これから一部のＰＫＳ遺伝子を有する１６個のコスミドクローンを選別したが、遺伝子塩基配列は報告されなかった。
【００１４】
よって、本発明者らは、ストレプトミセス属ＦＲ−００８由来ＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子をクローニングし、その塩基配列を確認することで本発明を完成した。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９３／１３６６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９５／０８５４８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９６／４０９６８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ９７／０２３５８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第ＷＯ９８／２７２０３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第ＷＯ９８／４９３１５号パンフレット
【特許文献７】米国特許第４８７４７４８号明細書
【特許文献８】米国特許第５０６３１５５号明細書
【特許文献９】米国特許第５０９８８３７号明細書
【特許文献１０】米国特許第５１４９６３９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５６７２４９１号明細書
【特許文献１２】米国特許第５７１２１４６号明細書
【特許文献１３】米国特許第５８３０７５０号明細書
【特許文献１４】米国特許第５８４３７１８号明細書
【非特許文献１】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｊ．Ａ．、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、３３２：１０７−１４、１９９１
【非特許文献２】Ｈｏｐｗｏｏｄ、Ｄ．Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４：５３１−５３７、１９９３
【非特許文献３】Ｆｕ、Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３：９３２１−６、１９９４
【非特許文献４】ＭｃＤａｎｉｅｌ、Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１５４６−５０、１９９３
【非特許文献５】Ｋｕｈｓｔｏｓｓ、Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ．１８３：２３１−６、１９９６
【非特許文献６】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｊ．Ａ，．Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、３３２：１０７−１４、１９９１
【非特許文献７】Ｈｏｐｗｏｏｄ、Ｄ．Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４：５３１−７、１９９３
【非特許文献８】Ｋｈｏｓｌａ、Ｃ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９７：２５７７−９０、１９９７
【非特許文献９】ＨｏｐｗｏｏｄおよびＳｈｅｒｍａｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２４：３７−６６、１９９０
【非特許文献１０】Ｈｏｐｗｏｏｄ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９７：２４６５−９７、１９９７
【非特許文献１１】Ｃｏｒｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：１７６−８、１９９０
【非特許文献１２】Ｄｏｎａｄｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：６７５−９、１９９１
【非特許文献１３】ＹｕａｎおよびＺｈｏｕ、Ｊ．Ｈｕａｚｈｏｎｇ  Ａｇｒｉｃｕｌｔ．Ｕｎｉｖ．、９：２０９、１９９０
【非特許文献１４】ＬｉａｎｇおよびＺｈｏｕ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３：１３０−６、１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の主な目的は、ストレプトミセス属ＦＲ−００８由来ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与するそれぞれの蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記塩基配列の遺伝子のいずれか一つ以上を欠失させるか或いは不活性化した変異株を用いてＦＲ−００８ポリケチド変異体を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明では、ストレプトミセス属ＦＲ−００８由来ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与する蛋白質をコードする全体遺伝子（１３８，２０３ｂｐ）の遺伝子塩基配列を分析した。この塩基配列には、ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与するケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、アシルキャリアー蛋白質（ＡＣＰ）、ケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）及びエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインをコードする遺伝子と、ＡＢＣトランスポーター、シトクロームＰ−４５０モノオキシゲナーゼ、フェレドキシン、チオエステラーゼ、糖生合成蛋白質、ＦＡＤ−依存性モノオキシゲナーゼ、４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸シンダーゼ（ＡＤＣ）及びＡＤＣリア−ゼなどの変形酵素をコードする遺伝子とが、すべて含まれる。
【００１８】
本発明は、配列番号１の塩基配列を有するＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子クラスターの全体塩基配列を提供する。配列番号１は、ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与するｆｓｃＡ、ｆｓｃＢ、ｆｓｃＣ、ｆｓｃＤ、ｆｓｃＥ、ｆｓｃＦ、ｆｓｃＴＩ、ｆｓｃＴＩＩ、ｆｓｃＲＩ、ｆｓｃＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩ、ｆｓｃＲＩＶ，ｆｓｃＰ、ｆｓｃＦＥ、ｆｓｃＴＥ、ｆｓｃＭＩ、ｆｓｃＭＩＩ、ｆｓｃＭＩＩＩ、ｆｓｃＯ、ｐａｂＡＢ及びｐａｂＣで構成された２１個の読み取り枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を含む１３８，２０３ｂｐの遺伝子塩基配列である。
【００１９】
本発明において、ＦｓｃＡ、ＦｓｃＢ、ＦｓｃＣ、ＦｓｃＤ、ＦｓｃＥ及びＦｓｃＦはモジュラー（１型）ポリケチドシンダーゼを、ＦｓｃＴＩ及びＦｓｃＴＩＩはＡＢＣトランスポーター蛋白質を、ＦｓｃＲＩ、ＦｓｃＲＩＩ、ＦｓｃＲＩＩＩ及びＦｓｃＲＩＶは調節蛋白質を、ＦｓｃＰはシトクロームＰ−４５０モノオキシゲナーゼを、ＦｓｃＦＥはフェレドキシン蛋白質を、ＦｓｃＴＥはチオエステラーゼを、ＦｓｃＭＩはグリコシルトランスフェラーゼを、ＦｓｃＭＩＩはＧＤＰ−ケト糖・アミノトランスフェラーゼを、ＦｓｃＭＩＩＩはＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼを、ＦｓｃＯはＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼを、ＡＤＣは４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸シンダーゼを、ＰａｂＣはＡＤＣリア−ゼをそれぞれ示す。
【００２０】
本発明はまた、前記塩基配列に含まれるいずれか一つ以上の遺伝子を欠失させるか或いは不活性化した変異株を用いてＦＲ−００８ポリケチド変異体を製造する方法、及び前記方法によって製造されたＦＲ−００８ポリケチド変異体を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号１の遺伝子をコードする領域をいずれか一つ以上欠失するか或いは不活性化したストレプトミセスＦＲ−００８変異株を培養することを特徴とするＦＲ−００８ポリケチド変異体の製造方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、ｆｓｃＭＩ遺伝子をコードする、配列番号１の１３，５２２−１４，８９８領域を欠失するか或いは不活性化したストレプトミセスＦＲ−００８変異株を培養することを特徴とする、ＦＲ−００８−Ｖ、ＦＲ−００８−ＶＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩＩ或いはＦＲ−００８−ＩＸの、上記の製造方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、ｆｓｃＭＩＩ遺伝子をコードする、配列番号１の１４，９５３−１６，０１１領域を欠失するか或いは不活性化したストレプトミセスＦＲ−００８変異株を培養することを特徴とする、ＦＲ−００８−Ｖ、ＦＲ−００８−ＶＩ、ＦＲ−００８−ＶＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩＩ、ＦＲ−００８−ＩＸ、ＦＲ−００８−Ｘ、ＦＲ−００８−ＸＩ或いはＦＲ−００８−ＸＩＩの、上記の製造方法。
【００２４】
本発明において、前記ＦＲ−００８ポリケチド変異体は、下記構造式を有するＦＲ−００８−Ｖ、ＦＲ−００８−ＶＩ，ＦＲ−００８−ＶＩＩ、ＦＲ−００８−ＶＩＩＩ，ＦＲ−００８−ＩＸ、ＦＲ−００８−Ｘ、ＦＲ−００８−ＸＩまたはＦＲ−００８−ＸＩＩであることを特徴とする。
【００２５】
【化２】
2005124566.tif 000005
【００２６】
【化３】
2005124566.tif 000006
【００２７】
【化４】
2005124566.tif 000007
【００２８】
【化５】
2005124566.tif 000008
【００２９】
【化６】
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【００３０】
【化７】
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【００３１】
【化８】
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【００３２】
【化９】
2005124566.tif 000012
本発明はまた、（ａ）配列番号２の５１−４６５（ＡＴＰ依存性カルボン酸：ＣｏＡリガーゼ（ＣｏＬ））、５８１−６４７（ＡＣＰＬ）、６６１−１，０９４（ＫＳ１）、１，２０２−１，５０９（ＡＴ１）及び１，５９６−１，６６２（ＡＣＰ１）領域で構成されたアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３の８，８０８−９，２２１（ＫＳ１０）、９，３３０−９，６２７（ＡＴ１０）、９，６８０−９，８６７（ＤＨ１０）、１０，１８３−１０，３６６（ＫＲ１０）、１０，４６９−１０，５３６（ＡＣＰ１０）、６，９６６−７，３８３（ＫＳ９）、７，４９０−７，７９２（ＡＴ９）、７，８４５−８，０２９（ＤＨ９）、８，３３１−８，５１４（ＫＲ９）、８，６１８−８，６８５（ＡＣＰ９）、５，２５３−５，６７５（ＫＳ８）、５，７７５−６，０７４（ＡＴ８）、６，１２７−６，３１０（ＤＨ８）、６，５９０−６，７７３（ＫＲ８）、６，８７４−６，９４１（ＡＣＰ８）、３，５２９−３，９５４（ＫＳ７）、４，０５９−４，３５６（ＡＴ７）、４，４０７−４，５９５（ＤＨ７）、４，８８４−５，０６３（ＫＲ７）、５，１６３−５，２３０（ＡＣＰ７）、１，７８７−２，２１２（ＫＳ６）、２，３１８−２，６１７（ＡＴ６）、２，６７０−２，８５９（ＤＨ６）、３，１５５−３，３３８（ＫＲ６）、３，４３８−３，５０５（ＡＣＰ６）、３４−４６０（ＫＳ５）、５７６−８７５（ＡＴ５）、９２８−１，１１２（ＤＨ５）、１，４１７−１，５９６（ＫＲ５）及び１，６９６−１，７６３（ＡＣＰ５）領域で構成されたアミノ酸配列；（ｃ）配列番号４の３，７０３−４，１０３（ＫＳ４）、４，２４７−４，５５０（ＡＴ４）、４，６００−４，７２２（ＤＨ４）、５，１０３−５，２８６（ＫＲ４）、５，３８９−５，４５６（ＡＣＰ４）、１，５９７−２，０２３（ＫＳ３）、２，１３９−２，４４２（ＡＴ３）、２，４９４−２，６８４（ＤＨ３）、２，９７０−３，３２２（ＥＲ３）、３，３２５−３，５０８（ＫＲ３）、３，６１０−３，６７７（ＡＣＰ３）、３３−４６０（ＫＳ２）、５７１−８７４（ＡＴ２）、１，２２４−１，４０６（ＫＲ２）及び１，５０８−１，５７４（ＡＣＰ２）領域で構成されたアミノ酸配列；（ｄ）配列番号５の３３−４５６（ＫＳ２１）、５４５−８５１（ＡＴ２１）、９０３−１，０８３（ＤＨ２１）、１，３７８−１，５６１（ＫＲ２１）、１，６６８−１，７３５（ＡＣＰ２１）及び１，８１４−２，０１８（ＴＥ２１）領域で構成されたアミノ酸配列；（ｅ）配列番号６の５，６４２−６，０６９（ＫＳ２０）、６，１５８−６，４６３（ＡＴ２０）、６，５１５−６，６９３（ＤＨ２０）、７，０１７−７，３２２（ＥＲ２０）、７，３３０−７，５１２（ＫＲ２０）、７，６１５−７，６８２（ＡＣＰ２０）、４，１１７−４，５４４（ＫＳ１９）、４，６３３−４，９３６（ＡＴ１９）、５，２６３−５，４４５（ＫＲ１９）、５，５５２−５，６１９（ＡＣＰ１９）、２，０７１−２，４９８（ＫＳ１８）、２，５９０−２，８９６（ＡＴ１８）、２，９４８−３，１２７（ＤＨ１８）、３，４２８−３，７３３（ＥＲ１８）、３，７４１−３，９２４（ＫＲ１８）、４，０２５−４，０９２（ＡＣＰ１８）、３４−４６０（ＫＳ１７）、５４８−８５０（ＡＴ１７）、９０２−１，０８１（ＤＨ１７）、１，３８４−１，６８９（ＥＲ１７）、１，６９７−１，８８０（ＫＲ１７）及び１，９８２−２，０４９（ＡＣＰ１７）領域で構成されたアミノ酸配列；及び（ｆ）配列番号７の７，９３５−８，３５２（ＫＳ１６）、８，４６４−８，７６７（ＡＴ１６）、９，０９９−９，２８０（ＫＲ１６）、９，３８７−９，４５２（ＡＣＰ１６）、６，４２５−６，８４５（ＫＳ１５）、６，９３５−７，２４１（ＡＴ１５）、７，５５９−７，７２５（ＫＲ１５）、７，８３８−７，８９８（ＡＣＰ１５）、４，８７２−５，２９７（ＫＳ１４）、５，４０８−５，７２０（ＡＴ１４）、６，０４９−６，２２５（ＫＲ１４）、６，３３１−６，３９８（ＡＣＰ１４）、３，３４２−３，７６５（ＫＳ１３）、３，８７２−４，１７０（ＡＴ１３）、４，４９９−４，６７６（ＫＲ１３）、４，７８２−４，８４９（ＡＣＰ１３）、１，７８８−２，２０９（ＫＳ１２）、２，３１３−２，６２１（ＡＴ１２）、２，９７２−３，１５０（ＫＲ１２）、３，２５４−３，３１４（ＡＣＰ１２）、３８−４５２（ＫＳ１１）、５６３−８６４（ＡＴ１１）、９２１−１，１０５（ＤＨ１１）、１，４１０−１，５９２（ＫＲ１１）及び１，６９４−１，７６０（ＡＣＰ１１）領域で構成されたアミノ酸配列を含むＦＲ−００８のモジュラーＰＫＳ及びこれをコードする遺伝子を提供する。
【００３３】
本発明において、前記遺伝子は、配列番号１の２０，９２７−２６，１５８領域（ｆｓｃＡ）、２８，９８３−６０，８６０ｃ領域（ｆｓｃＣ）、６０，９６２−７７，５８７ｃ領域（ｆｓｃＢ）、７７，９８３−８４，１３２ｃ領域（ｆｓｃＦ）、８４，１７０−１０７，４８５ｃ領域（ｆｓｃＥ）及び１０７，４９６−１３６，１４８ｃ領域（ｆｓｃＤ）の塩基配列を有することを特徴とする。本発明で、配列上における「ｃ」という表示は、転写方向が相補鎖で反対方向に進むことを示す。
【００３４】
本発明はまた、配列番号８または９のアミノ酸配列を有するＡＢＣトランスポーター蛋白質及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＴ１またはｆｓｃＴＩＩ）を提供する。前記ｆｓｃＴ１及びｆｓｃＴＩＩ遺伝子はそれぞれ配列番号１の２６，３３３−２７，３４０及び２７，５６１−２８，２８０領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００３５】
本発明はまた、配列番号１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列を有する調節蛋白質及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＲＩ、ｆｓｃＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩまたはｆｓｃＲＩＶ）を提供する。前記ｆｓｃＲＩ、ｆｓｃＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩ及びｆｓｃＲＩＶ遺伝子は、それぞれ配列番号１の３，１５０−３，８１８ｃ、４，３７７−７，２０５ｃ、７，２１０−１０，３２０ｃ及び１０，２９８−１３，３１５ｃ領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００３６】
本発明はまた、配列番号１４のアミノ酸配列を有するシトクロームＰ−４５０モノオキシゲナーゼ及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＰ）を提供する。前記ｆｓｃＰ遺伝子は、配列番号１の１６，１０６−１７，２８７領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００３７】
本発明はまた、配列番号１５のアミノ酸配列を有するフェレドキシン蛋白質及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＦＥ）を提供する。前記ｆｓｃＦＥ遺伝子は、配列番号１の１７，３３４−１７，５２８領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００３８】
本発明はまた、配列番号１６のアミノ酸配列を有するチオエステラーゼ及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＴＥ）を提供する。前記ｆｓｃＴＥ遺伝子は、配列番号１の１７，５５６−１８，４１３領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００３９】
本発明はまた、配列番号１７のアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＭＩ）を提供する。前記ｆｓｃＭＩ遺伝子は、配列番号１の１３，５２２−１４，８９８領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００４０】
本発明はまた、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＧＤＰ−ケト糖・アミノトランスフェラーゼ及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＭＩＩ）を提供する。前記ｆｓｃＭＩＩ遺伝子は、配列番号１の１４，９５３−１６，０１１領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００４１】
本発明はまた、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＭＩＩＩ）を提供する。前記ｆｓｃＭＩＩＩ遺伝子は、配列番号１の１３６，５５８−１３７，７６６ｃ領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００４２】
本発明はまた、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼ及びこれをコードする遺伝子（ｆｓｃＯ）を提供する。前記ｆｓｃＯ遺伝子は、配列番号１の５７４−１，９５０ｃ領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００４３】
本発明はまた、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＡＤＣシンダーゼ及びこれをコードする遺伝子（ｐａｂＡＢ）を提供する。前記ｐａｂＡＢ遺伝子は、配列番号１の１８，６１０−２０，７８１領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【００４４】
本発明はまた、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＡＤＣリア−ゼ及びこれをコードする遺伝子（ｐａｂＣ）を提供する。前記ｐａｂＣ遺伝子は、配列番号１の２，２６４−３，０３７ｃ領域の塩基配列を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００４５】
本発明は、新しいポリケチドであるＦＲ−００８の生合成に関与する遺伝子の塩基配列を提供する効果がある。本発明が提供する遺伝子塩基配列の全体または一部は、ポリケチドＦＲ−００８を生産し得る組換え微生物の開発と、ストレプトミセス属ＦＲ−００８または他の種におけるポリケチド活性部位の発見とに、利用することができる。また、本発明が提供する遺伝子塩基配列の全体または一部の変形を行い、既存のＦＲ−００８ポリケチドの生産性増加を図るか、または新しいＦＲ−００８ポリケチドの変異体作製に利用することができる。
【００４６】
特に、本発明が提供する遺伝子塩基配列の全体または一部は、原（ｓｏｕｒｃｅ）生産菌株であるストレプトミセス属ＦＲ−００８以外の他の細胞におけるＦＲ−００８ポリケチド及びその変異体の生産にも利用することができ、本発明の遺伝子塩基配列の全体または一部のＤＮＡ断片と類似の相同性を持つ他の遺伝子とのＤＮＡシャッフリングを行い、分子進化に利用することができ、このような過程を経て新しいポリケチドを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００４８】
ＦＲ−００８ポリケチド合成遺伝子のクローニング研究の結果、コスミドベクターを用いてストレプトミセス属ＦＲ−００８の染色体ライブラリを作製し、これからＰＫＳ遺伝子を有する１６個のコスミドクローンが選別された（Ｈｕら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４：１６３−７２、１９９４）。一方、本発明に用いられたストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＦＲ−００８菌株は、韓国生命工学研究院の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に２００３年１０月２０日付で寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ  １０５２９ＢＰ）。
【００４９】
本発明では、既に作製された１６個のコスミドクローンの中のｐＨＺ１４５、ｐＨＺ１３７、ｐＨＺ２２０及びｐＨＺ１９４と、プラスミドクローンであるｐＪＴＵ６とのすべての遺伝子の塩基配列を分析し、また新しいコスミドクローンであるｐＪＴＵ１０の遺伝子塩基配列を分析した。これにより、コスミド及びプラスミドのＤＮＡ塩基配列を除外した残りの塩基配列から、ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与する遺伝子塩基配列（１３８，２０３ｂｐ）を明らかにした（図１）。
【００５０】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するに過ぎないもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例に限定されないのは、当該分野で通常の知識を有する者には明らかなことである。
【実施例１】
【００５１】
（コスミドクローンからのＰＫＳ遺伝子塩基配列の分析）
Ｈｕらが作製した１６個のコスミドクローンの中のｐＨＺ１４５、ｐＨＺ１３７、ｐＨＺ２２０及びｐＨＺ１９４と、プラスミドクローンであるｐＪＴＵ６とを、遺伝子塩基配列分析に利用した（Ｈｕら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４：１６３−７２、１９９４）。
【００５２】
超音波処理によってコスミドＤＮＡを断片化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、各アガロースゲルから適切な大きさのＤＮＡ断片を分離し、Ｔ４  ＤＮＡ重合酵素及びＴ４  ＤＮＡキナーゼを用いて各断片の両端を処理した。処理されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩで切断されたプラスミドｐＵＣ１９にクローニングした。コスミドｐＨＺ１４５、ｐＨＺ１３７及びｐＪＴＵ６の場合、約５ｋｂ大きさのＤＮＡ断片を分離して利用し、ｐＨＺ２２０及びｐＨＺ１９４の場合、約１ｋｂ大きさのＤＮＡ断片を分離して利用した。
【００５３】
遺伝子塩基配列の分析は、各ｐＵＣ１９クローンで塩基配列分析機（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ））を用いて行い、ダイターミネーター配列決定化学（ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）方法を使用した。遺伝子塩基配列の分析は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いた。分析プログラムはｐｈｒａｐ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．９９０３２９（ｗｗｗ．ｐｈｒａｐ．ｏｒｇ）を使用し、コンティグビューイング（Ｃｏｎｔｉｇ  ｖｉｅｗｉｎｇ）と編集（ｅｄｉｔｉｎｇ）にはｃｏｎｓｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １１（ｗｗｗ．ｐｈｒａｐ．ｏｒｇ）を使用した。一塩基当たり最低６回（ｄｅｐｔｈ）以上の塩基配列分析を繰り返した。
【００５４】
上記の方法で分析された全体塩基配列は１３８，２０３ｂｐであった。全体塩基配列でＧ＋Ｃ含量は約７４．６％であり、全体読み取り枠は２０個であった。ショットガンシークエンシングによるギャップは、プライマーウォーキングやその他クローンの配列確認によって埋められた。読み取り枠の分析及び保存されたドメインデータベース検索に対する遺伝子塩基配列は、ＦｒａｍｅＰｌｏｔ  ２．３．２を用いて分析した（ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｊｕｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＦＲａｍｅｐｌｏｔ．ｐｌ）。
【００５５】
このような遺伝子塩基配列の分析の結果、Ｈｕらの研究結果で得られた前記４個のコスミドクローンと１個のプラスミドクローンには、ＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子の一部が抜けていることが分かる。Ｈｕらは、第４のコスミドクローンであるｐＨＺ１９４がＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子の最後の部分を含有すると報告しているが（Ｈｕら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４：１６３−７２、１９９４）、実際に遺伝子塩基配列を分析した結果、ｐＨＺ１９４コスミドクローンは、ＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子の一部と共にストレプトミセスＦＲ−００８由来染色体の一部及びバックボーンコスミドであるｐＨＺ１３２を２個有すると確認された。
【００５６】
したがって、ＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子の全体塩基配列を確保するために、Ｈｕらの論文に報告されたコスミドライブラリから、ＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子の最後の部分を含有するコスミドクローンを探索した。探索方法は、前記ｐＨＺ１９４コスミドクローンが含有するＦＲ−００８ポリケチド生合成遺伝子の一部からＰＣＲによって作製したプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。下記配列番号２３と２４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その結果、２１８ｂｐ長のＰＣＲ産物が得られた。前記ＰＣＲ産物で、プローブを用いたサザンハイブリダイゼーション方法を行い、その結果、２個のコスミドクローン（ｐＪＴＵ１０、ｐＪＴＵ１１）が確認された。そのうちｐＪＴＵ１０を選択して前記のような遺伝子塩基配列分析を行い、その結果、ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与する全体遺伝子（１３８，２０３ｂｐ）を確保した。
配列番号２３：５’ＴＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＡ  ３’
配列番号２４：５’ＣＧＣＧＴＣＣＧＧＴＧＣＴＣＡＣＧ  ３’。
【００５７】
それぞれの遺伝子について分析した結果は、次のようである。配列番号１から２０，９２７−２６，１５８領域及び２８，９８３−１０７，４８５領域の塩基配列はＦＲ−００８マイクロライド・バックボーン合成に関与するＰＫＳ遺伝子をコードする塩基配列である。この二つの位置に６個の読み取り枠（ｆｓｃＡ、ｆｓｃＢ、ｆｓｃＣ、ｆｓｃＤ、ｆｓｃＥ、ｆｓｃＦ）が存在し、この二つの位置の間に二つのＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子が存在する。各ＰＫＳ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、表２に示す。
【００５８】
【表２】
2005124566.tif 000013
ｆｓｃＡは、負荷モジュール及び拡張モジュール１をコードする。ｆｓｃＡでの負荷モジュール及び拡張モジュールのＰＫＳドメインに対応するそれぞれのアミノ酸配列を、表３に示す。
【００５９】
ｆｓｃＣは、６個の拡張モジュール（拡張モジュール５、６、７、８、９及び１０）をコードする。ｆｓｃＣでの６個拡張モジュールのＰＫＳドメインに対応するそれぞれのアミノ酸配列を、表４に示す。
【００６０】
ｆｓｃＢは、３個の拡張モジュール（拡張モジュール４、３及び２）をコードする。ｆｓｃＢでの３個拡張モジュールのＰＫＳドメインに対応するそれぞれのアミノ酸配列を、表５に示す。
【００６１】
【表３】
2005124566.tif 000014
【００６２】
【表４】
2005124566.tif 000015
【００６３】
【表５】
2005124566.tif 000016
ｆｓｃＦは、１個の拡張モジュール（拡張モジュール２１）と一つのチオエステラーゼとをコードする。ｆｓｃＦでの１個の拡張モジュールと一つのチオエステラーゼとのＰＫＳドメインに対応するそれぞれのアミノ酸配列を、表６に示す。
【００６４】
【表６】
2005124566.tif 000017
ｆｓｃＥは、４個の拡張モジュール（拡張モジュール１７、１８、１９及び２０）をコードする。ｆｓｃＥでの４個の拡張モジュールのＰＫＳドメインに対応するそれぞれのアミノ酸配列を、表７に示す。
【００６５】
【表７】
2005124566.tif 000018
ｆｓｃＤは、６個の拡張モジュール（拡張モジュール１６、１５、１４、１３、１２、１１）をコードする。ｆｓｃＤでの６個の拡張モジュールのＰＫＳドメインに対応するそれぞれのアミノ酸配列を、表８に示す。
【００６６】
計１５個のＰＫＳ変形酵素に対応する読み取り枠が存在し、これらは変形酵素、転写調節蛋白質及びＡＢＣトランスポーターを含む。それぞれの遺伝子塩基配列及びアミノ酸配列領域を、表９に示す。
【００６７】
【表８】
2005124566.tif 000019
【００６８】
【表９】
2005124566.tif 000020
ＦＲ−００８生合成に関与する遺伝子がコードする蛋白質の機能を、表１０及び表１１に示す。
【００６９】
【表１０】
2005124566.tif 000021
【００７０】
【表１１】
2005124566.tif 000022
【実施例２】
【００７１】
（ＦＲ−００８生合成に関与するＰＫＳ遺伝子の機能）
ｆｓｃＡ乃至ｆｓｃＦの遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を既存の１型ＰＫＳのアミノ酸配列と比較・分析した後、それぞれの機能を図２に示す。
【００７２】
ｆｓｃＡ遺伝子の転写は、ｆｓｃＣ、ｆｓｃＢ、ｆｓｃＦ、ｆｓｃＥ及びｆｓｃＤとは反対方向に行われる。また、ＦＲ−００８ポリケチドの生合成には２１回の縮合反応が求められることと一致して、ｆｓｃＡ乃至ｆｓｃＦの遺伝子内に計２１個のモジュールが存在していることが確認された（図２、図３）。
【００７３】
ＦｓｃＡ蛋白質は、ＦＲ−００８アグリコン生合成の開始に関与する負荷モジュールと、ＫＳ−ＡＴ−ＡＣＰで構成された第１の縮合モジュールを持つ。負荷モジュールにはＣｏＡリガーゼ（ＣｏＬ）とＡＣＰドメインとがある。ＣｏＬドメインはまた、リパマイシン、ピマリシン及びカンジシジン生合成遺伝子からも発見されている（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ、Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：７８３９−４３、１９９５；Ａｐａｒｉｃｉｏ、Ｊ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１０１３３−９、１９９９；ＣａｍｐｅｌｏおよびＧｉｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４８：５１−９、２００２）。
【００７４】
ＦｓｃＢ蛋白質は、ＦＲ−００８アグリコン生合成の２−４拡張過程に関与する２〜４個の拡張モジュールを持つ。ＦｓｃＢ内に存在する３個のＡＴドメインは、活性部位であるＧＨＳＸＧのＮ末端に保存的配列であるＲＶＤＶＶＸＸＸＸＸＸＸＭＸＳ（Ａ）ＸＡＸＸＷのアミノ酸配列を持ち、これはメチルマロン酸の特異的特徴を持つ（Ｔａｎｇ、Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ、２１６：２５５−６５、１９９８；Ｈａｙｄｏｃｋ、Ｓ．Ｆ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３７４：２４６−８、１９９５）。モジュール２はＫＳ、ｍＡＴ、ＫＲ及びＡＣＰドメインを、モジュール３はＤＨ−ＥＲ−ＫＲ還元ループを、それぞれ持つ。モジュール４内に存在するＤＨ４は、Ｎ末端にて保存的アミノ酸配列であるＨＰＬＬが欠如しており、またＣ末端にて５６個のアミノ酸がないことが明らかになり、これにより活性を有していないと考えられる。しかし、カンジシジンアグリコン生合成の２〜４拡張過程に関与するＣａｎＰ２蛋白質の場合、ＫＳドメインのＮ末端が明らかになってはいないが、このような不活性ＤＨドメインは有しないと報告されている。
【００７５】
ＦｓｃＣ及びＦｓｃＤ蛋白質は、ヘキサモジュラー（ｈｅｘａｍｏｄｕｌａｒ）蛋白質の他の２つの例を提示する。ＦｓｃＣは１０，６２５アミノ酸長を、ＦｓｃＤは９，５５０アミノ酸長を、それぞれ持つ。ＦｓｃＣは、ＦＲ−００８に存在する計７個の二重結合のうち６個の二重結合を組み合わせる。縮合段階５〜１０に関与するモジュール５〜１０はすべて、ＤＨ−ＫＲ還元ループを持つ。計６個のＤＨドメインは、保存的活性部位であるＧＸＧＸＸＧＸＸＸＡを持つ。ＦｓｃＣに存在するすべてのＡＴドメインは、アセテート特異性を持つ。ＦｓｃＣは、６個の同一のＤＨ−ＫＲ還元ループを持つ蛋白質であって、これは今まで発見されずにいた形態である。一方、ＮｙｓＣ、Ｒａｐｓ２及びＡｍｐｈＣは、計５個のＤＨ−ＫＲと共にＤＨ−ＥＲ−ＫＲ還元ループを持つ。
【００７６】
ＦｓｃＤは、ＦＲ−００８マクロラクトン環形成での拡張過程１１〜１６に関与するモジュール１１〜１６で構成される。モジュール１１は、ＫＳ−ＡＴ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰドメイン構造と共に最後の二重結合を組み合わせる。拡張過程１０〜１１が隣接の二つの二重結合（７個の二重結合のうち最後の２個）の形成に関与するが、一方、ストレプトミセスＦＲ−００８染色体上のモジュール１１に対応する遺伝子は、モジュール１０に対応する遺伝子から約１１０ｋｂ離れたところに存在する。
【００７７】
モジュール１３は、メチルマロン酸の特異的ＡＴドメインを持ち、拡張過程１３でＫＳ−ｍＡＴ−ＫＲ−ＡＣＰドメインを構成し、メチルマロン酸−ＣｏＡ拡張子（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）を挿入する役割を果たす。モジュール１２、１４、１５及び１６は、同一のＫＳ−ＡＴ−ＫＲ−ＡＣＰドメイン構造を持つが、例外的にＫＲ１５は不活性化されている。しかし、活性部位モチーフでのＫＲ１５によるＲ−Ｐ置換には難がある。ＫＲ１５はまた、ＮＡＤＰ結合部位で二つの保存的Ｇアミノ酸残基が欠如しており、内部に１０個のアミノ酸が欠如している。ナイスタチン、アンホテリシン及びピマリシンと同様に、不活性ＫＲドメインはカルボキシル基群がＣ−２８であり、これはほとんどの場合、ＦＲ−００８ポリケチドのＣ−２５とＣ−２８との間に６個のケタール環が形成されるということである（Ｂｒａｕｔａｓｅｔら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，．７：３９５−４０３、２０００；Ｃａｆｆｒｅｙら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、８：７１３−２３、２００１；Ａｐａｒｉｃｉｏら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、７：８９５−９０５、２０００）。
【００７８】
ＦｓｃＥ蛋白質はモジュール１７〜２０を構成し、これはＦＲ−００８ポリケチド生合成の拡張過程１７〜２０に関与する。モジュール１７のＥＲドメインは、モジュール３、１８、２０のＥＲドメインのＮ末端よりアミノ酸６７個ほど短くなり、これにより不活性になる。モジュール１９は、ＫＳ−ＡＴ−ＫＲ−ＡＣＰのドメイン構造を持つ。モジュール１９のＫＲドメインの活性部位は、チロシンがロイシンと取り替えられることで不活性になる。
【００７９】
ＦｓｃＦはモジュール２１を構成し、これはＣ末端に鎖終結チオエステラーゼドメインを持つ。ＦｓｃＦでのＤＨドメインの活性は、最後の拡張過程には不要である。このような非活性は、ナイスタニン（ＮｙｓＫ）、リファマイシン（ＲｉｆＢとＲｉｆＣ）及びアンホテリシン（ＡｍｐｈＪ）ポリケチドにおいても同様である。ＦｓｃＦのＫＳ−ＡＴ−ＫＲ−ＡＣＰドメインは、ＦＲ−００８マクロラクトン環のＣ−４０に−ＯＨ基を加える。なお、ＴＥドメインは、成熟ＦＲ−００８ポリケチドの放出に関与するＦｓｃＦのラクトン形成に役割を果たす。モジュール２１のＫＲドメインは、公知のＫＲドメインと比べてすべての活性モチーフと残基に差異はないが、ＦＲ−００８の構造から考察すると、その活性がないと推測される。
【００８０】
ＦｓｃＦのＴＥドメインと共にｐａｂＡＢ遺伝子の上流に存在するｆｓｃＴＥ遺伝子は、チオエステラーゼをコードするものと知られている。ピクロマイシン（ＰｉｃＡＶ）、チロシン（Ｔｙ１０）、ナイスタチン（ＮｙｓＥ）及びピマリシン（ＰｉｍＩ）のような抗生剤生合成遺伝子クラスターに存在する他の２個のＴＥ活性と同様に、ＦｓｃＴＥはＴＥＩＩに高い相同性を持つ。しかし、ｆｓｃＴＥはＴＥＩドメインとは低い相同性を示す。
【００８１】
ＴＥＩＩは、ポリケチド生合成で拡張過程を妨害するおそれがある間違った中間物質を除去する役割を果たすものと知られており、これは正常な水準の抗生物質の生産を維持するためである（Ｂｕｔｌｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、６：２８７−９２、１９９９；Ｔａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、６：５５３−８、１９９９）。チロシンＴＥＩＩの作用についての最近の研究結果もこれを裏付けている。
【実施例３】
【００８２】
（ｐ−アミノ安息香酸合成酵素遺伝子の機能）
ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）は、ＦＲ−００８生合成の開始ユニットの役割を行うｐ−アミノアセトフェノンの前駆体物質である。ｆｓｃＴＥとｆｓｃＡとの間にｐａｂＡＢが存在し、この遺伝子がコードする蛋白質は、５−アミノ−４−デオキシコリスミン酸（ＡＤＣ）シンダーゼである（図３）。これはＰａｂＡＢｓに相当な相同性を示し、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＭＲＵ３５７０のＰａｂＡＢとは９３％、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのＰａｂＡＢとは４６％の相同性を、それぞれ示す。
【００８３】
転写調節遺伝子ｆｓｃＲＩの上流に存在するｐａｂＣは、２５７個のアミノ酸からなり、４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸（ＡＤＣ）リア−ゼをコードする。ＰａｂＣは、ＰａｂＡＢによって生成されたＡＤＣをＰＡＢＡ或いはピルビン酸に転換させる役割と、アシノ基転移酵素またはピリドキサール−５燐酸依存性酵素の役割と、を果たすと予測される。
【実施例４】
【００８４】
（転写調節機作に関与する遺伝子の機能）
ＦＲ−００８ポリケチド生合成において、４個の転写調節遺伝子（ｆｓｃＲＩ、ｆｒｓＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩ、ｆｓｃＲＩＶ）が存在する。これら遺伝子がコードするすべての蛋白質は、ＬｕＸＲファミリーの転写調節蛋白質に属する。
【００８５】
ＦｓｃＲＩは、２２２アミノ酸で構成され、ストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）のポリエンマイクロライド生合成遺伝子クラスター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０７０９４９）に存在するＰｌｅＲとは６０％の相同性を、ナイスタチン生合成の調節に関与すると考えられるＯＲＦ４がコードする蛋白質とは５９％の相同性を、それぞれ持つ（Ｂｒａｕｔａｓｅｔら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、７：３９５−４０３、２０００）。また、いくつかの二成分反応（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）調節蛋白質とも相同性を示す。
【００８６】
ＦｓｃＲＩＩ蛋白質（９４２個アミノ酸）は、カンジシジン調節に関与すると考えられるストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）由来ｃｈｏ類似蛋白質の最初の５９５個のアミノ酸配列に８４％以上の相同性を示す。３４７個のアミノ酸をさらに持つにも関わらず、Ｎ末端の５９５個のアミノ酸にこのような高い相同性を示すことは、驚くべきことである。ＦｓｃＲＩＩは、ナイスタチン生合成に関与するＮｙｓＲＩＩ調節蛋白質（９２７個アミノ酸）に４２％の相同性を示す。
【００８７】
ＦｓｃＲＩＩＩは、１，０３６個のアミノ酸を持ち、ＮｙｓＲＩＩ（９５３個アミノ酸）に相当な相同性を示す。ＦｓｃＲＩＶ蛋白質は、１，００５個アミノ酸を持ち、ＮｙｓＲＩ（９６６個アミノ酸）に高い相同性を示す。ＮｙｓＲＩＩＩ、ＮｙｓＲＩＩ及びＮｙｓＲＩと同様に、ＦｓｃＲＩＩ、ＦｓｃＲＩＩＩ及びＦｓｃＲＩＶが、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＳＡ−ＣＯＯ由来コレステロールオキシダーゼ−シトクロームＰ４５０オペロンの隣接地域で発見される転写調節蛋白質に相同性を持つということは、注目するに値する。
【実施例５】
【００８８】
（未確認（ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）糖の生合成に関連する遺伝子の機能）
ＦｓｃＭＩ（４５８個アミノ酸）は、真核細胞のＵＤＰ−グルルクロノシルトランスフェラーゼと高い相同性を示し、これはＣ−２１位置でＦＲ−００８のアグリコンへの糖の付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）に関与すると推定される（図３）。
【００８９】
ＦｓｃＭＩＩ（３５２個アミノ酸）は、ペロサミン（４，６−ジデオキシ−４−アミノマンノース）の生合成に関与するアシノ基転移酵素と類似している。ｆｓｃＭＩＩＩ遺伝子は、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼと類似の４０２個のアミノ酸をコードする。マイコサミン（３，６−ジデオキシ−３−アミノ−Ｄ−マンノース）の生合成経路は、ＧＤＰ−６−デオキシ−４−ケトマンノースのＧＤＰ−６−デオキシ−３−ケトマンノースへの異性体化、及びアシノ基転移によるＧＤＰ−マイコサミンの生産までを含むものとして、提示された（Ｃａｆｆｒｅｙら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、８：７１３−２３、２００１）。よって、ＦｓｃＭＩＩＩとＦｓｃＭＩＩは、それぞれマイコサミン生合成経路に関与すると推定される。
【００９０】
ＧｅｎＢａｎｋデータベースの検索結果、ＦｓｃＭＩは、ＡｍｐｈＤＩと５４．７％、ＮｙｓＤＩと５２．４％、そしてＰｉｍＫと６０．５％の相同性をそれぞれ持ち、ＦｓｃＭＩＩは、ＣａｎＡと９２％、ＡｍｐｈＤＩＩ、ＮｙｓＤＩＩ及びＰｉｍＣと７４〜７６％の相同性をそれぞれ持ち、ＦｓｃＭＩＩＩは、ＡｍｐｈＤＩＩＩ、ＮｙｓＤＩＩＩ及びＰｉｍＪと７７〜７９％の相同性を持つ。
【００９１】
上述したすべての蛋白質は、アンホテリシン、ナイスタチン、ピマリシンまたはカンジシジン遺伝子クラスターでマイコサミンの生合成及び付着に関与すると推定される。これは、ＦＲ−００８遺伝子クラスターでＦｓｃＭＩ、ＦｓｃＭＩＩ及びＦｓｃＭＩＩＩがマイコサミンの生合成及び付着に関与することと一致する。
【実施例６】
【００９２】
（変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）遺伝子及びトランスポーター遺伝子の機能）
ｆｓｃＰ遺伝子とｆｓｃＦＥ遺伝子は、それぞれシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼとフェレドキシンをコードする。これらはＰ４５０モノオキシゲナーゼのシステムを構成するが、ＦｓｃＰはＣ−１８位置にカルボキシル基を生成させる役割を果たし、ＦｓｃＦＥはＰ４５０システムで電子伝達に関与すると推定される（Ｏ’ＫｅｅｆｅおよびＨａｒｄｅｒ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２０９９−１０５、１９９１）。
【００９３】
ｐａｂＣの下部に存在するｆｓｃＯ遺伝子は、ＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼをコードする（図３）。これは、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８のＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼと３４％の相同性を持つ。
【００９４】
ｆｓｃＡとｆｓｃＣ遺伝子との間に、ｆｓｃＴ１及びｆｓｃＴＩＩ遺伝子が位置する（図３）。これらは、ＡＴＰ依存性ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーに属する蛋白質と非常に高い相同性を示し、ＦＲ−００８ポリケチドの流出（ｅｆｆｌｕＸ）に関与すると推定される。これは、ＦＲ−００８ポリケチドが細胞質から外部への放出による自己防御（ｓｅｌｆ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）機作の一つと考えられる。現在まで知られたすべてのポリエンクラスターが、互いにホモ二量体としての役割を果たす二つのトランスポーター蛋白質を有するということは、非常に面白い（Ｂｏｌｈｕｉｓら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、２１：５５−８４、１９９７）。
【００９５】
ＦｓｃＦＥ（６４個アミノ酸）がカンジシジン生合成に関与するＣａｎＦと１００％の相同性を持つことは注目するに値する。ＦｓｃＰはＣａｎＣと９６％の相同性を示す。ＦｓｃＴＩとＦｓｃＴＩＩは、それぞれＣａｎＲＡ及びＣａｎＲＢと８５％及び７６％の相同性を示す。このようなカンジシジン及びＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与する蛋白質間の高い相同性は、二つの合成遺伝子クラスターにおいて相対的に最近の共通の起源を持つということを暗示する。
【実施例７】
【００９６】
（ＦＲ−００８ポリケチド及びカンジシジン生合成遺伝子の比較）
ＦＲ−００８は、ストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）から生産されるポリケチドであるカンジシジンＤと同一の４−アミノアセトフェノンを持つアグリコンを持つ（ＹｕａｎおよびＺｈｏｕ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７：１４２−７、１９９１；ＹｕａｎおよびＺｈｏｕ、Ｊ．Ｈｕａｚｈｏｎｇ  Ａｇｒｉｃｕｌｔ．Ｕｎｉｖ．９：２０９、１９９０）。
【００９７】
ストレプトミセス属ＦＲ−００８は、二つの線状プラスミドであるｐＨＺ２２７（１３０ｋｂ）とｐＨＺ２２８（３０ｋｂ）とを有するが、カンジシジン生産菌株であるストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＩＭＲＵ３５７０は、線状プラスミドを全く有していない。また、ストレプトミセス属ＦＲ−００８は胞子形成がよくできるが、ストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＩＭＲＵ３５７０は、胞子形成がよくできないという生物学的に大きな差がある。両微生物はこのように多くの差異があるにもかかわらず、各菌株が生産するポリケチドが同一の４−アミノアセトフェノンを有するアグリコンを持つため、アグリコン合成に関与する遺伝子は非常に高い相同性を持つ。
【００９８】
Ｃａｍｐｅｌｏらは、カンジシジン合成遺伝子の一部（３９，３１４ｂｐ）の遺伝子塩基配列を報告した（ＣａｍｐｅｌｏおよびＧｉｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４８：５１−９、２００２）。この遺伝子塩基配列と本発明の塩基配列とを比較した結果、非常に高い相同性を示した。これを表１２に示す。
【００９９】
【表１２】
2005124566.tif 000023
表１２によれば、各比較位置の間の部分（ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）では、二つの遺伝子塩基配列が高い相同性を示していない。この部分を表１３に示す。カンジシジンの３９，４１４ｂｐ遺伝子は、ＦＲ−００８の配列番号１の５，４２１−４４，８０５位置に存在するｆｓｃＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩ、ｆｓｃＲＩＶ、ｆｓｃＭＩ、ｆｓｃＭＩＩ、ｆｓｃＰ、ｆｓｃＦＥ、ｆｓｃＴＥ、ｐａｂＡＢ、ｆｓｃＡ、ｆｓｃＴＩ、ｆｓｃＴＩＩ及びｆｓｃＢでモジュール４のＫＳドメインに該当する蛋白質をコードし、これはｃａｎＡ（アミノトランスフェラーゼ）、ｃａｎＣ（シトクロームＰ−４５０）、ｃａｎＦ（フェレドキシン）、ｃａｎＴ（チオエステラーゼ）、ｐａｂＡＢ（ＰＡＢＡシンターゼ）、ｃａｎＲＡ（ＡＢＣ  トランスポーター）、ｃａｎＲＢ（ＡＢＣトランスポーター）及びｆａｃＯの一部（Ｃｈｏ様蛋白質）をコードする。
【０１００】
【表１３】
2005124566.tif 000024
ストレプトミセス属によって生産されるＦＲ−００８と、ストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）によって生産されるカンジシジン複合体とを、ＨＰＬＣで分析した結果、両抗生剤は確実に区別することができなかった（図４）。両抗生剤をまぜてＨＰＬＣ分析を行った結果、各抗生剤の主な４個ピークの保持時間は変わらず（図４）、ＦＲ−００８−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのＵＶスペクトルはカンジシジン複合体のスペクトラムと正確に一致した。また、ＬＣ／ＭＳ１／ＭＳ２分析結果も同一であった。よって、ストレプトミセス属ＦＲ−００８はＳ．ｇｒｉｓｅｕｓが生産するカンジシジン複合体と一致する４つの成分を生産すると見られる。
【０１０１】
ＦＲ−００８ＩＩのｍ／ｚ  １１０８がＦＲ−００８ＩＩＩのｍ／ｚ  １１０８と同じなので、ＦＲ−００８ＩＩはＦＲ−００８ＩＩＩの異性体であると思われる。また、両物質のピークは、カンジシジン−ＩＩ及びカンジシジン−ＩＩＩ（ｍ／ｚ  １１０８）のピークと同一であり（図４）、理論的な分子量（ＭＷ  １１０９）もカンジシジンＤの分子量（Ｃ５９Ｈ９４Ｎ２Ｏ１８）と同一である。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルによってＦＲ−００８−ＩＩの主な官能基を確認し、１３Ｃ  ＮＭＲ分析結果で確認されたＦＲ−００８ＩＩの構造を、図５に示す。
【０１０２】
ＦＲ−００８ＩＩのＣ−１５とＣ−１９の間にはへミケタール環は発見されていない。また、δ９６．９のケタールはマイコサミンのＣ−１に位置し、δ２０２．２と１９６．７間の４個のケトン基はそれぞれＣ−３、Ｃ−７、Ｃ−１５、Ｃ−４３に位置する。６個のへミケタール環は、ＦＲ−００８複合体で平衡を維持している異性体ＦＲ−００８−ＩＩＩに起因するものと示される。
【０１０３】
ポリヒドロキシ・ケトンであるアンホテリシンＢが様々な環状ケタール形態の平衡構造になっていることが、６個環の環状ケタール構造と６個ケタール環なしの構造とが同時に存在するということで証明された。
【０１０４】
ＦＲ−００８−ＩとＦＲ−００８−ＩＩ（ＩＩＩ）との間の分子量の差は、２ダルトンである。この差は、ＫＲ２１活性がケト還元を触媒するのに不十分なので、不完全に還元されたポリケチド鎖が、チオエステラーゼ（ＴＥ）によって媒介される段階に移るか、またはＴＥが、環化前の酸化型ポリケチドと、ＫＲ２１によって還元された形態のポリケチドとを区別できないため、Ｃ−３位置にケト基とヒドロキシ基とを有する混合物が生じるということで説明することができる。
【０１０５】
ＭＳ１  ｍ／ｚ  １０９２のＦＲ−００８−ＩＶ／カンジシジン−ＩＶは、ＦＲ−００８−ＩＩ（ＩＩＩ）／カンジシジン−ＩＩ（ＩＩＩ）（ＭＳ１  ｍ／ｚ  １１０８）と１６ダルトンの分子量差を示す。ＦＲ−００８−ＩＶ／カンジシジン−ＩＶと、ＦｓｃＯ（ＦＡＤ−依存性モノオキシゲナーゼ）機能を持つＦＲ−００８−ＩＩ（ＩＩＩ）／カンジシジン−ＩＩ（ＩＩＩ）との構造上の相関関係については、いくつかの代案の可能性を持つ。
【実施例８】
【０１０６】
（グリコトランスフェラーゼ（ＦｓｃＭＩ）除去実験）
ＦｓｃＭＩの除去（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）のために、ｆｓｃＭＩを含むｐＨＺ１４５の６．６ｋｂ  ＫｐｎＩ断片をｐＩＪ２９２５（ＪａｎｓｓｅｎおよびＢｒｉｂｂ、Ｇｅｎｅ、１２４：１３３−４、１９９３）に挿入してｐＪＴＵ２６を作製した。アプラマイシン耐性遺伝子を含む１．４ｋｂ  ＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ  ＤＮＡ断片をｐＪＴＵ２６のＢａｌＩ部位（ｆｓｃＭＩの開始コドンから５６４ｂｐ下流に存在）に挿入してｐＪＴＵ３８を作製した。ｐＪＴＵ３８の８．０ｋｂのＢｇ１ＩＩ  ＤＮＡ断片をｐＨＺ１３５８（Ｓｕｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４８：３６１−７１、２００２）のＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＪＴＵ５６を作製した。ＲＰ４誘導体であるｐＵＺ８００２を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７（ＭａｃＮｅｉｌら、Ｇｅｎｅ、１１５：１１９−２５、１９９２；Ｍａｚｏｄｉｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１：３５８３−５、１９８９）を利用した接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）により、ｐＪＴＵ５６でストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＦＲ−００８を形質転換することで変異株Ｃ１０１を得た。前記変異株はＣＳ３（配列番号２５）及びＣＳ４（配列番号２６）のプライマーを用いたＰＣＲで確認した。
配列番号２５：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＧＴＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’
配列番号２６：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＴ−３’。
【０１０７】
野生型のストレプトミセス属ＦＲ−００８染色体ＤＮＡを鋳型として用いる場合、８４０ｂｐの断片が生成されるが、突然変異株の場合、１．４ｋｂのアプラマイシン耐性遺伝子（ａｃｃ（３）ＩＶ）の挿入により２．２ｋｂの断片が生成される。
【０１０８】
この変異株の培養液をＬＣ／ＭＳｎで分析した結果、野生型ストレプトミセス属ＦＲ−００８で生成されるポリケチドのほかに、糖がついていないポリケチドＶ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸが生成された（図６）。この結果から、ＦｓｃＭＩがポリケチド生成においてグリコトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であることが確認された。
【実施例９】
【０１０９】
（アミン転移酵素（ＦｓｃＭＩＩ）除去実験）
ＦｓｃＭＩＩの除去のために、ｆｓｃＭＩＩ遺伝子を含むｐＨＺ１４５の５．５ｋｂ  ＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片をｐＩＪ２９２５に挿入してｐＪＴＵ２７を作製した。ｐＨＺ１３５８のアプラマイシン耐性遺伝子を含む１．４ｋｂ  ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片をｐＪＴＵ２７のＰｓｔＩ  部位（ｆｓｃＭＩＩの開始コドンから４３６ｂｐ下流に存在）に挿入してｐＪＴＵ３１を作製した。ｐＪＴＵ３１の６．９ｋｂのＢｇ１ＩＩ  ＤＮＡ断片を  ｐＨＺ１３５８のＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＪＴＵ５８を作製した。ＲＰ４誘導体であるｐＵＺ８００２を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７を用いた接合により、ｐＪＴＵ５８でストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＦＲ−００８を形質転換することで変異株ＣＳ１０２を得た。前記変異株をＣＳ５（配列番号２７）及びＣＳ６（配列番号２８）のプライマーを用いたＰＣＲで確認した。
配列番号２７：５’−ＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＧＴＣＡＣ−３’
配列番号２８：５’−ＡＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＣ−３’。
【０１１０】
野生型のストレプトミセス属ＦＲ−００８染色体ＤＮＡを鋳型として用いる場合、５０８ｂｐの断片が生成されるが、変異株の場合、１．４ｋｂのアプラマイシン耐性遺伝子（ａｃｃ（３）ＩＶ）の挿入により１．９ｋｂの断片が生成される。
【０１１１】
この変異株の培養液をＬＣ／ＭＳｎで分析した結果、野生型ストレプトミセス属ＦＲ−００８で生成されるポリケチドのほかに、新しい糖がついていないポリケチドＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸと、アミン転移が行われないポリケチドＸ、ＸＩ及びＸＩＩとが生成された（図６及び図７）。この結果から、ＦｓｃＭＩＩがポリケチド生合成過程でアミン転移酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であることが確認された。
【実施例１０】
【０１１２】
（ポリケチド変異体の抗菌活性）
実施例８及び９で生産されたポリケチド変異体の抗菌活性をテストした結果、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＦＲ−００８の変異株であるＣＳ１０１とＣＳ１０２の培養液が添加された部位で、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の成長が抑制される濁り抑制地帯（ｔｕｒｂｉｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）が形成された（図８）。図８において、左側はストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＦＲ−００８、中央は変異株  ＣＳ  １０１、右側は変異株  ＣＳ  １０２が添加されたものをそれぞれ示す。図８に示すように、変異株１０１及び  ＣＳ  １０２の培養液も抗菌活性を示す。これは前記変異株から生成されるポリケチド変異体であるポリケチドＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ及びＸＩＩに起因したのである。
【実施例１１】
【０１１３】
（転写調節遺伝子の代替実験）
転写調節遺伝子であるｆｓｃＲＩＩ及びｆｓｃＲＩＩＩと部分ｆｓｃＲＩ（６，４１４ｂｐ  ＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ３１０３２３の３，８１１−１０，２２５）とを除去するために、コスミドｐＨＺ１３５８に由来するｐＨＺ２００７を作製した。コスミドｐＨＺ２００７は、コスミドｐＨＺ１３５８（Ｈｕら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４：１６３−７２、１９９４）由来の２．８ｋｂのアプラマイシン（ａａｃ（３）ＩＶ）とエリスロマイシン耐性（ｅｒｍＥ）遺伝子カセットとが、レフトアーム（ｌｅｆｔ  ａｒｍ）として用いられる１，５１８ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片と、ライトアーム（ｒｉｇｈｔ  ａｒｍ）として用いられる１，９５２ｂｐ  ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片との間に含まれるようにした。これを、実施例８と同様に、接合により形質導入して変異株を得た。変異株は、ｐＨＺ２００７から由来されたレフトアームとライトアーム、ａｃｃ（３）ＩＶ／ｅｒｍＥ遺伝子カセットをプローブにして、４．３ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片が得られることを、サザンハイブリダイゼーションで確認した。この変異株はＦＲ−００８関連物質を生成しなかった。この結果から、ｆｓｃＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩ及びｆｓｃＲＩ遺伝子はＦＲ−００８生合成に関与することが確認された。
【実施例１２】
【０１１４】
（ＰａｂＡＢ除去実験）
ｐＨＺ１４５コスミドから４．６ｋｂのＢａｍＨＩ断片を得た後、自殺ベクター（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒ）のｐＯＪ２６０にクローニングした。これをＦｓｃＰＩで切断した後再びライゲーションし、ｐａｂＡＢ遺伝子が含まれた１，４９１ｂｐを除去した（インフレームデリーション、４９７アミノ酸）。作られたコスミドを、実施例８と同様に、接合によりストレプトミセス属ＦＲ−００８に形質導入した。ｐａｂＡＢが除去された変異株は、サザンハイブリダイゼーションで確認した。この変異株の培養によってはＦＲ−００８ポリケチドが生合成できないが、ｐ−アミノ安息香酸を添加すると、生合成能が復元された。この結果から、ｐａｂＡＢがｐ−アミノ安息香酸を合成する酵素をコードする遺伝子であることが確認された。
【実施例１３】
【０１１５】
（配列分析に基づく二つのシス二重結合の予測）
二重結合と関連したＫＲドメインを比べて見ると、ＫＲ８とＫＲ９では還元によってＤ立体配置を生産すると知られている（Ｔａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、６：５５３−８、１９９９）、保存されたアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）残基が、それぞれグリシン（Ｇ）とアスパラギン（Ｎ）に変わっていることがわかる。保存されたアスパラギン酸を有するＫＲは、還元後にデヒドラターゼの活性によってトランス二重結合を形成する。二つのシス二重結合を有することは、バシディンＡのＮＭＲ分析によって明らかになり（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２３：４４４−７、１９９８）、構造とＫＲドメインが二重結合の平面構造に関わると報告されている（Ｔａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、６：５５３−８、１９９９）。よって、ＦＲ−００８のＣ２８−Ｃ２９とＣ３０−Ｃ３１の二つの二重結合は、他の類似のＫＲ（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３：６３−９８、１９９０；Ａｕｇｕｓｔら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５：６９−７９、１９９８）と同様に、ＣＩＳ−立体配置を有すると予測される。
【０１１６】
以上本発明内容の特定の部分を詳細に説明したが、このような具体的な技術は、当該分野で通常の知識を有する者にとって、単なる好適な実施例に過ぎないもので、これによって本発明の範囲が限定されないのは明らかなことである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１は、ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与するｆｓｃＡ、ｆｓｃＢ、ｆｓｃＣ、ｆｓｃＤ、ｆｓｃＥ、ｆｓｃＦ、ｆｓｃＴＩ、ｆｓｃＴＩＩ、ｆｓｃＲＩ、ｆｓｃＲＩＩ、ｆｓｃＲＩＩＩ、ｆｓｃＲＩＶ、ｆｓｃＰ、ｆｓｃＦＥ、ｆｓｃＴＥ、ｆｓｃＭＩ、ｆｓｃＭＩＩ、ｆｓｃＭＩＩＩ、ｆｓｃＯ、ｐａｂＡＢ及びｐａｂＣで構成された２１個の読み取り枠を含む１３８，２０３ｂｐの遺伝子塩基配列である。
【０１１８】
配列番号２は、ｆｓｃＡに対応するアミノ酸配列である。
【０１１９】
配列番号３は、ｆｓｃＣに対応するアミノ酸配列である。
【０１２０】
配列番号４は、ｆｓｃＢに対応するアミノ酸配列である。
【０１２１】
配列番号５は、ｆｓｃＦに対応するアミノ酸配列である。
【０１２２】
配列番号６は、ｆｓｃＥに対応するアミノ酸配列である。
【０１２３】
配列番号７は、ｆｓｃＤに対応するアミノ酸配列である。
【０１２４】
配列番号８は、ｆｓｃＴＩに対応するアミノ酸配列である。
【０１２５】
配列番号９は、ｆｓｃＴＩＩに対応するアミノ酸配列である。
【０１２６】
配列番号１０は、ｆｓｃＲＩに対応するアミノ酸配列である。
【０１２７】
配列番号１１は、ｆｓｃＲＩＩに対応するアミノ酸配列である。
【０１２８】
配列番号１２は、ｆｓｃＲＩＩＩに対応するアミノ酸配列である。
【０１２９】
配列番号１３は、ｆｓｃＲＩＶに対応するアミノ酸配列である。
【０１３０】
配列番号１４は、ｆｓｃＰに対応するアミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号１５は、ｆｓｃＦＥに対応するアミノ酸配列である。
【０１３２】
配列番号１６は、ｆｓｃＴＥに対応するアミノ酸配列である。
【０１３３】
配列番号１７は、ｆｓｃＭＩに対応するアミノ酸配列である。
【０１３４】
配列番号１８は、ｆｓｃＭＩＩに対応するアミノ酸配列である。
【０１３５】
配列番号１９は、ｆｓｃＭＩＩＩに対応するアミノ酸配列である。
【０１３６】
配列番号２０は、ｆｓｃＯに対応するアミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号２１は、ｐａｂＡＢに対応するアミノ酸配列である。
【０１３８】
配列番号２２は、ｐａｂＣに対応するアミノ酸配列である。
【０１３９】
配列番号２３は、プライマー配列である。
【０１４０】
配列番号２４は、プライマー配列である。
【０１４１】
配列番号２５は、ＣＳ３のプライマー配列である。
【０１４２】
配列番号２６は、ＣＳ４のプライマー配列である。
【０１４３】
配列番号２７は、ＣＳ５のプライマー配列である。
【０１４４】
配列番号２８は、ＣＳ６のプライマー配列である。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、本発明に用いるそれぞれのコスミド及びクローンが有する遺伝子部分を、全体遺伝子クラスターに示す図である。
【図２】図２は、ＦＲ−００８ポリケチド生合成に関与する遺伝子のモジュール構造を図式化した図で、矢印方向は各遺伝子の転写方向を示す。
【図３】図３は、ＦＲ−００８遺伝子クラスターの方向とＦＲ−００８ポリケチド生合成モデルの仮想図である。Ａ−ＦのＯＲＦはモジュラーＰＫＳ遺伝子を示し、活性ドメインは黒色ブロックで示し、透明ブロックのうち（＊）は不活性ドメインを、イタリック体文字は、サイレントドメインをそれぞれ示す。
【図４】図４は、ＦＲ−００８とカンジシジン複合体を比較して示す図である。
【図５】図５は、ＦＲ−００８ＩＩの１３Ｃ  ＮＭＲデータを示す図である。
【図６ａ】図６ａは、ＦｓｃＭＩ遺伝子が除去された突然変異株で生産された、糖が付いていないポリケチドＶ，ＶＩ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ及びＩＸを示す図である。
【図６ｂ】図６ｂは、ＦｓｃＭＩ遺伝子が除去された突然変異株で生産された、糖が付いていないポリケチドＶ，ＶＩ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ及びＩＸを示す図である。
【図７】図７は、ＦｓｃＭＩＩ遺伝子が除去された突然変異株で生産された、アシノ基転移が起こらないポリケチドＸ，ＸＩ及びＸＩＩを示す図である。
【図８】図８は、ポリケチド変異体であるポリケチドＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ及びＸＩＩの抗真菌活性を示す図である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図８】
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【配列表】
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