(57)【要約】【課題】  複雑なサイトカインの組合せや感染の危険のあるストローマ細胞を必要とせずに、未分化状態に維持可能な高等動物細胞および分化状態の制御が可能な高等動物細胞を提供すること。【解決手段】  本発明の第１の態様は、活性化型AktをコードするＤＮＡを細胞に導入することにより、未分化状態に維持可能な高等動物細胞を提供する方法、活性化型Aktを発現する高等動物細胞、高等動物細胞の未分化状態を維持するために該細胞に導入される、活性化型AktをコードするＤＮＡおよびかかるＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。また、本発明の第２の態様は、Aktの活性を人為的操作により制御が可能なように活性化型AktをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを細胞内に導入することを含む、分化状態の制御が可能な高等動物細胞を提供する方法およびかかる方法によって提供される細胞を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化型AktをコードするＤＮＡを細胞に導入することにより、未分化状態に維持可能な高等動物細胞を提供する方法。
【請求項２】
細胞が幹細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞がＥＳ細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
活性化型Aktを発現する高等動物細胞。
【請求項５】
高等動物細胞の未分化状態を維持するために該細胞に導入される、活性化型AktをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項７】
Aktの活性を人為的操作により制御が可能なように活性化型AktをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを細胞内に導入することを含む、分化状態の制御が可能な高等動物細胞を提供する方法。
【請求項８】
該組換えベクターが活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞に４−ＯＨＴを接触させることにより高等動物細胞を未分化状態に維持することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法。
【請求項１０】
活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞を４−ＯＨＴの非存在下に維持することにより細胞の分化を誘導することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法。
【請求項１１】
該組換えベクターがLoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した細胞をCreの非存在下に維持することにより高等動物細胞を未分化状態に維持することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法。
【請求項１３】
LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した細胞にCreを作用させることにより細胞の分化を誘導することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれかに記載の方法により提供される細胞。
【請求項１５】
活性化型Akt-Merを発現する高等動物細胞。
【請求項１６】
LoxP-Akt-LoxPによってコードされる活性化型Aktを発現する高等動物細胞。
【請求項１７】
高等動物細胞の分化状態を制御するために該細胞に導入される、活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
高等動物細胞の分化状態を制御するために該細胞に導入される、LoxP-Akt-LoxPを含むＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１７または１８のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化状態に維持可能な高等動物細胞および分化状態の制御が可能な高等動物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
「分化」とは細胞・組織などが形態的・機能的に特殊化し、異なった部分に分かれることをいい、「未分化」とはいまだに分化が進んでいないことを意味する。分化した細胞から発生・分化の時間を遡行して行き当たる「完全に未分化」という状態は、同時に分化において全能であることを意味する。
【０００３】
幹細胞とは自己複製能と分化能を持った未分化細胞である。種々の臓器で幹細胞の存在が知られている。例えば、造血幹細胞、小腸のクリプトの基底細胞は自己複製能と多種類の細胞への分化能をもっている。また、最近になって、神経や骨格筋など、従来は再生しないと考えられていた組織にも幹細胞が存在することが明らかにされている。幹細胞はその潜在的な増殖能をいかして、体外において増幅した後で細胞移植に用いる再生医療に利用できるのではないかという期待が高まっている。
【０００４】
臓器に固有の幹細胞のほかに、初期胚から樹立された幹細胞として胚性幹細胞（ＥＳ細胞）がある。ＥＳ細胞は初期胚にもどされると、正常発生過程に取りこまれて、生殖細胞を含むすべての細胞に分化することができる「全能性」を持った細胞である。例えば、マウスＥＳ細胞は試験管内においてもいくつかの細胞系列への分化が可能であることが立証されている。インビボに比較するとインビトロにおける分化能はかなり制限されているが、血液細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、神経細胞、インスリン分泌細胞などに分化誘導することが可能であるとされている。
【０００５】
高等動物において、幹細胞を分化多能性を維持した状態で培養し増殖させる技術は、再生医学や創薬研究開発に必須の技術であるが、いまだ発展途上である。特定の幹細胞を複数のサイトカインを複雑に組合せることによって未分化に維持することは可能である。例えば、マウスＥＳ細胞の未分化性はＬＩＦ（白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor））の存在によって維持される。しかし、かかる未分化状態は、非常に限られた一定期間維持することはできるが、その方法は経験的に開発されたため、個々の幹細胞によって大きく異なる。さらに未分化状態を維持するにはＬＩＦなどの高価なサイトカインが多量に必要であるためコストもかかる。
【０００６】
また、幹細胞を培養するために細胞種ごとに樹立された特殊なストローマ細胞（支持細胞またはフィーダー細胞）も多く存在するが、幹細胞にストローマ細胞が混入してしまう可能性やストローマ細胞由来の細胞内ウイルスなどの病原体が幹細胞に感染する可能性を考えると、再生医療への応用は実質的に不可能である。
【０００７】
このため、多くの高等動物に適用することができ、且つ、サイトカインやストローマ細胞を必要としない、高等動物細胞の分化状態の制御方法の開発が望まれている。
【０００８】
かかる重要性に鑑み、幹細胞システムについては多くの研究がなされている。特許文献１にはウサギＥＳ細胞の維持方法が開示されているが、この方法は支持細胞（ストローマ細胞）を必要とするものである。特許文献２にもＥＳ細胞の維持方法が開示されているが、未分化状態の維持にはＬＩＦなどのサイトカインが必要とされる。また、特許文献３には未分化細胞を得る方法およびそれを分化させる方法が開示されているが、未分化状態の維持には支持細胞の存在または高価な増殖因子の存在が必要とされる。
【０００９】
最近の知見によると、マウスES細胞の未分化状態は、LIFの添加によりLIFの下流のJAK/STAT3シグナル伝達系が活性化されることによって維持され、LIFを除去してJAK/STAT3シグナル伝達系を阻害するとマウスES細胞は迅速に分化誘導される（非特許文献１）。このようにLIF/JAK/STAT3シグナル伝達系は、マウスES細胞の維持に必要十分であるのに対し、ヒトを含む霊長類のES細胞の維持にはLIF/JAK/STAT3シグナル伝達系の活性化は必須ではないことが報告されている（非特許文献２）。さらに別の経路であるWnt/β-カテニンシグナル伝達系がマウスおよびヒトのES細胞の維持に寄与しているという報告もある（非特許文献３）。
【００１０】
本発明者らは高等動物幹細胞の未分化状態を制御する普遍的なメカニズムの研究を行なう過程で、リン脂質ＰＩＰ２（ホスファチジルイノシトール 4,5-二リン酸）をＰＩＰ３（ホスファチジルイノシトール 3,4,5-三リン酸）にリン酸化するＰＩ３キナーゼが、様々な幹細胞の分化多能性の制御に関与することを明らかにしてきた。
具体的には、ＰＩ３シグナル伝達経路の上流に存在する腫瘍抑制因子ＰＴＥＮを欠損させることにより、ＰＩ３キナーゼの下流のAktなどの分子が過剰に活性化される結果、細胞が脱分化し、多能性を獲得する可能性があることを示した（非特許文献４を参照されたい）。
【特許文献１】特表２０００−５０８９１９号公報
【特許文献２】特表２００２−５２５０４２号公報
【特許文献３】特表２００４−５００１０３号公報
【非特許文献１】Stem Cells, 22, 770-778(2004)
【非特許文献２】Stem Cells, 22, 861-872(2004)
【非特許文献３】Nature Medicine, 10, 1,55-63(2004)
【非特許文献４】T Kimura et al, Development 130, 1691-1700 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、複雑なサイトカインの組合せや感染の危険のあるストローマ細胞を必要とせずに、未分化状態に維持可能な高等動物細胞および分化状態の制御が可能な、高等動物の細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このたび、本発明者らはそのＰＩ３キナーゼの下流のシグナル伝達タンパク質であるセリン・スレオニンキナーゼAktタンパク質およびその酵素活性を可逆的に制御し得るタンパク質を発現させることにより、幹細胞を分化多能性を維持した状態で培養・増殖させる技術および所望に応じて分化させる技術を確立した。
【００１３】
本発明の第１の態様は、活性化型AktをコードするＤＮＡを細胞に導入することにより、未分化状態に維持可能な高等動物細胞を提供する方法、活性化型Aktを発現する高等動物細胞、高等動物細胞の未分化状態を維持するために該細胞に導入される、活性化型AktをコードするＤＮＡおよびかかるＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。
【００１４】
本発明の第２の態様は、Aktの活性を人為的操作により制御が可能なように活性化型AktをコードするＤＮＡを含む組換えベクター、好ましくは活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを含む組換えベクター、またはLoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを含む組換えベクター、を細胞内に導入することを含む、分化状態の制御が可能な高等動物細胞を提供する方法およびかかる方法によって提供される細胞を提供する。
【００１５】
本態様はさらに具体的には、
１）活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞に４−ＯＨＴ（４−ヒドロキシタモキシフェン 4-hydroxy tamoxifen）を接触させることにより高等動物細胞を未分化状態に維持することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
２）活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞を４−ＯＨＴの非存在下に維持することにより細胞の分化を誘導することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
３）活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞に４−ＯＨＴを接触させて未分化状態を維持した後、４−ＯＨＴを除去して未分化細胞を分化させることを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
４）LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した細胞をCreの非存在下に維持することにより高等動物細胞を未分化状態に維持することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
５）LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した細胞にCreを作用させることにより細胞の分化を誘導することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
６）LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した細胞をCreの非存在下に維持して未分化状態を維持した後、Creを作用させて未分化細胞を分化させることを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
および、かかる方法によって得られる未分化細胞および分化細胞を提供する。
【００１６】
本態様はさらに活性化型Akt-Merを発現する高等動物細胞、高等動物細胞の分化状態を制御するために該細胞に導入される、活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。
本態様はまた、LoxP-Akt-LoxPによってコードされる活性化型Aktを発現する高等動物細胞、高等動物細胞の分化状態を制御するために該細胞に導入される、LoxP-Akt-LoxPを含むＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、細胞内シグナル伝達経路の構成因子であるAktを標的とするため、高価なサイトカインやストローマ細胞を必要としない。さらに従来技術では幹細胞の発現する受容体の違いにより異なる組み合わせのサイトカインあるいはストローマ細胞を必要とするが、本発明の方法は、特定の幹細胞だけでなく、霊長類を含むすべての高等動物細胞に普遍的に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の第１および第２の態様において、高等動物細胞とは、ヒト、カニクイザル等のサル、ブタ、マウスを含む哺乳類細胞およびその他の脊椎動物細胞のことを指すが、好ましくは哺乳類細胞である。また、本発明における高等動物細胞は好ましくは幹細胞であり、さらに好ましくはＥＳ細胞である。ＥＳ細胞は市販のものを用いてもよいし、当業者に周知の方法によって調製してもよい。
【００１９】
まず、本発明の第１の態様における、活性化型AktをコードするＤＮＡを細胞に導入することにより、未分化状態に維持可能な高等動物細胞を提供する方法について説明する。
【００２０】
AktとはＰＨ（Plekstrin Homology)ドメインをＮ末端に有するセリン／スレオニンキナーゼであり、その活性化にはThr308とSer473の２ヶ所のリン酸化が必要であり、このリン酸化は通常ＰＩ３キナーゼの下流で制御されている。また、Aktはあらゆる高等動物細胞に普遍的に存在する。例えば、Aktは、酵母から線虫・ショウジョウバエ、哺乳類まで保存されたタンパク質である（酵母については、Fabrizio P. et al., Science 2001 Apr 13:292(5515):288-290. Epub 2001 Apr 05を、線虫については、Paradis S. et al., Genes Dev. 1998 Aug 15:12(16):2488-98を、ショウジョウバエについては、Staveley BE. et al., Curr. Biol. 1998 May 7:8(10):599-602を参照されたい）。また、哺乳類のAkt（Akt-1,-2,-3)は様々な組織でユビキタスに発現している（Altomare D. A. et al., Oncogene 11:1055-1060, Altomare, D. A. et al., Oncogene 116:2407-2411, Brodbeck D. et al., J. Biol. Chem. 274:9133-9136, Nakatani K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:906-910を参照されたい）。 
本発明に用いる活性化型Aktとは、Aktのキナーゼ活性が恒常的に活性化されているものであれば特に限定されない。また、それはいかなる高等動物由来のものであってもよいが、好ましくはヒト由来のものである。また、本発明に用いる活性化型Aktの由来は、導入される細胞と同種由来であってもよく、異種由来であってもよい。
【００２１】
Aktのキナーゼ活性が恒常的に活性されているものとしては、野生型ヒトAktのThr308とSer473が恒常的にリン酸化されているものが含まれる。その例としては、野生型AktのＮ末端のＰＨドメインを欠損させ、その代わりにＮ末端にミリスチン酸化シグナルを付加したものが挙げられる。ミリスチン酸化シグナルによって、Aktは恒常的に膜結合型となり、細胞膜に存在するキナーゼによって恒常的にリン酸化され、そのキナーゼ活性が活性化型となる（図１Ａを参照されたい）。
【００２２】
配列番号１に、ヒト活性化型Aktをコードするヌクレオチド配列を示す。また配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
本発明の第１の態様の活性化型Aktには、配列番号１によってコードされるタンパク質（即ち配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）が含まれるが、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質であって、恒常的にAkt活性を有するものも本発明の活性化型Aktに含まれる。同様に、配列番号２のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、恒常的にAkt活性を有するものも本発明の活性化型Aktに含まれる。
【００２３】
活性化型AktをコードするＤＮＡを細胞に導入する方法としては、安定に該ＤＮＡを細胞に導入できる方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、リポフェクション法、リポソーム融合法、アデノウイルスベクター・レトロウイルスベクター・レンチウイルスベクターなどウイルスベクターを用いた遺伝子導入法などが挙げられる。
【００２４】
活性化型AktをコードするＤＮＡを細胞に導入することにより、サイトカインや支持細胞を必要とせずに細胞の未分化状態が維持される。
【００２５】
また、本発明の第１の態様は、活性化型Aktを発現する高等動物細胞を提供する。高等動物細胞は上記のように好ましくは哺乳類細胞、より好ましくは霊長類細胞の幹細胞、特に好ましくはそれらのＥＳ細胞である。
【００２６】
さらに、本発明の第１の態様は、高等動物細胞の未分化状態を維持するために該細胞に導入される、活性化型AktをコードするＤＮＡを提供する。かかるＤＮＡとしては、上記の活性化型AktをコードするＤＮＡであれば特に限定されないが、例えば、野生型AktのＰＨドメインが欠損しておりその代わりにＮ末端にミリスチン酸化シグナルを付加した活性化型Aktをコードする配列番号１に記載のＤＮＡが挙げられるがこれに限定されない。すなわち、配列番号１のＤＮＡに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するＤＮＡであって機能的な活性化型Aktをコードするものも本発明のＤＮＡに含まれる。あるいは、配列番号１のＤＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、機能的な活性化型Aktをコードするものも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２７】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば以下のようなハイブリダイゼーション工程および洗浄工程を含む条件を指す。
１）ハイブリダイゼーション工程
ハイブリダイゼーション液（１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭウシ血清アルブミン、０．２％  Ficoll400、０．２％ポリビニルピロリドン、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中、６５℃で、一晩（１６時間以上）ハイブリダイゼーションを行う。
２）洗浄工程
洗浄液（０．２ｘＳＳＣ（６．６７ｍＭ  ＮａＣｌ、６．６７ｍＭクエン酸トリナトリウム二水和物ｐＨ７．０、０．１％  ＳＤＳ））で６５℃、３０分の洗浄を２回行う。
【００２８】
さらに、本発明の第１の態様は、上記のような活性化型AktをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。該コンストラクトは上記活性化型AktをコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡの発現を引き起こすプロモーターを含むベクターである。プロモーターとしては活性化型Aktの恒常的な発現を引き起こすものであれば特に限定されず、例えば、ＣＡＧプロモーター、ベータアクチンプロモーターなどのユビキタスに発現する遺伝子のプロモーターを含む転写制御領域、Oct-3/4プロモーターなどの特定の細胞において発現する遺伝子のプロモーターを含む転写制御領域、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーターやＨＩＶ−１のＬＴＲプロモーターなどのウイルス由来の転写制御領域、ＴＲＥなどの細菌あるいはトランスポゾン由来の転写制御領域、ならびにそれらを組み合わせたキメラ転写制御領域などが挙げられ、なかでもＣＡＧプロモーターが好ましい。
かかる活性化型AktをコードするＤＮＡおよびプロモーターを担持するベクターは、宿主細胞に活性化型AktをコードするＤＮＡを導入できるものであれば特に限定されないが、ＤＮＡの導入を確認するための薬剤抵抗マーカー等を有しているものが好ましい。かかるベクターとしては例えばｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ｐＡｄＥａｓｙ、ｐＣＭＶＬａｃＩなどが挙げられる。
【００２９】
本発明の第２の態様は、Aktの活性を人為的操作により制御可能なように活性化型AktをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを細胞内に導入することを含む、分化状態の制御が可能な高等動物細胞を提供する方法および該方法によって提供される細胞を提供する。
すなわち活性化型Aktをコードする配列を有するＤＮＡを含む組換えベクターを導入された細胞において、人為的操作により、活性化型Aktの活性を恒常的に活性化された状態に維持することにより該細胞の未分化状態が保持される。逆に、人為的操作により、活性化型Aktを不活性な状態に維持することにより、細胞は未分化状態から脱して分化する。
かかる方法により、細胞外からの刺激によって細胞の分化・未分化の状態を自在に制御することができる。
【００３０】
本態様の「Aktの活性を人為的操作により制御が可能なように活性化型AktをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを細胞内に導入することを含む」こととしては、活性化型Aktをコードするヌクレオチドとそのキナーゼ活性を細胞外からの刺激により自在に調節（オン・オフ）できるタンパク質をコードするヌクレオチドをインフレームに連結したキメラＤＮＡを含む組換えベクターを細胞内に導入すること、活性化型AktをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを細胞内に導入するとともに活性化型Aktのキナーゼ活性を細胞外からの刺激により自在に調節することができるタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを共移入すること、そして、活性化型AktをコードするＤＮＡと、Akt以外のタンパク質の作用により自在に活性化型Aktをコードする配列を切り出すことが出来る配列とを含むＤＮＡを含む組換えベクターを細胞内に導入すること、などが挙げられる。好ましくは、活性化型Akt-MerをコードするキメラＤＮＡを含む組換えベクターを導入すること、および、LoxP-Akt-LoxP配列を含むＤＮＡを含む組換えベクターを導入することである。
【００３１】
活性化型Akt-Merは、上記のような活性化型Aktと変異型エストロゲン受容体Mer（Modified Estrogen Receptor)がインフレームに連結したキメラタンパク質をいうが、活性化型AktとMerの間にタグ配列を挿入したものも本発明の活性化型Akt-Merに含まれる。
【００３２】
Merは、エストロゲン受容体を改変したものであり、内在性エストロゲンには結合しないが、人為的に合成したエストロゲン誘導体である４−ＯＨＴに結合する。Merのヌクレオチド配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示すが、上記活性化型Aktと同様に、例えば、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質であって、Merの性質を有するものも本発明のMerに含まれる。同様に、配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、Merの性質を有するものも本発明のMerに含まれる。
Merは以下の性質を有する。すなわちMerは、４−ＯＨＴの不在下ではHsp90に結合しており、Hsp90によって活性部位がマスクされるため不活化されている。しかし、細胞外から４−ＯＨＴを添加されるとMerと４−ＯＨＴが結合することによりHsp90がMerから解離し、マスキングが解除され、それにともなって活性化される。
【００３３】
本発明の活性化型AktとMerのキメラタンパク質も同様に４−ＯＨＴの不在下ではMer部分を介してHsp90に結合しているためAkt活性も不活化される。しかし、細胞外から４−ＯＨＴを添加されるとHsp90によるマスキングが解除され、それにともなって活性化型Aktが活性化される。すなわちMerを連結させることにより活性化型Aktの活性を細胞外からの４−ＯＨＴの添加の有無によって自在に調節することができる。
【００３４】
したがって、活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞に４−ＯＨＴを接触させると、活性化型Aktが活性となり、細胞は未分化状態に維持される。逆に活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞に４−ＯＨＴの非存在下に維持すると、活性化型Aktは不活性となり、細胞は分化する。
【００３５】
それゆえ、本発明の第２の態様は、
１）活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞に４−ＯＨＴを接触させることにより高等動物細胞を未分化状態に維持することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
２）活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞を４−ＯＨＴの非存在下に維持することにより細胞の分化を誘導することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
３）活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを導入した細胞に４−ＯＨＴを接触させて未分化状態を維持した後、４−ＯＨＴを除去して未分化細胞を分化させることを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
を提供する。さらに、活性化型Akt-Merを発現する高等動物細胞も本発明に含まれる。
【００３６】
さらに、本発明の第２の態様は、上記１）の方法によって得られる未分化細胞、上記２）または３）の方法によって得られる分化細胞を提供する。本発明の第１の態様と同様に、細胞は好ましくは幹細胞であり、さらに好ましくはＥＳ細胞である。高等動物細胞は好ましくは哺乳類細胞である。
【００３７】
本発明の第２の態様はまた、高等動物細胞の分化状態を制御するために該細胞に導入される、活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡも提供する。かかるＤＮＡとしては、上記の活性化型AktとMerとのキメラタンパク質をインフレームにてをコードするＤＮＡであれば特に限定されない。すなわち、配列番号１のＤＮＡに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するＤＮＡであって機能的な活性化型AktをコードするＤＮＡと、配列番号３のＤＮＡに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するＤＮＡであって機能的なMerをコードするＤＮＡとがインフレームにて結合しているＤＮＡも含まれる。活性化型AktとMerとの間にタグなどをコードするスペーサー配列を含んでいてもよい。あるいは、配列番号１のＤＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、機能的な活性化型AktをコードするＤＮＡと、配列番号３のＤＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、機能的なMerをコードするＤＮＡとがインフレームにて連結されたＤＮＡも本発明に含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、上記のような条件を指す。
【００３８】
さらに、本発明の第２の態様は、上記のような活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。該コンストラクトは上記活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡの発現を引き起こすプロモーターを含むベクターからなる。プロモーター、および活性化型Akt-MerをコードするＤＮＡとプロモーターを担持するベクターは、特に限定されず、上記第１の態様と同様のものを用いればよい。
活性化型Akt-Merは、上記のような活性化型Aktと変異型エストロゲン受容体Mer（Modified Estrogen Receptor)がインフレームに連結したキメラタンパク質をいうが、活性化型AktとMerの間にタグ配列を挿入したものも本発明の活性化型Akt-Merに含まれる。
【００３９】
本発明において「LoxP-Akt-LoxP」とは、上記第１の態様の活性化型Aktをコードする配列（即ち、例えば、野生型AktのＰＨドメインが欠損しており、その上流にミリスチン酸化シグナルを付加したもの）の上流および下流に、LoxP配列を同方向に有する配列をいう。LoxP配列は、ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat（配列番号２６）であるが、以下に説明するCreの作用により相同組換えを起こす配列であれば、配列番号２６の配列に１または複数の変異を有するものも本発明の「LoxP配列」に含まれる。LoxP-Akt-LoxPを含む発現ベクターは、その活性化型Aktをコードする配列の上流にプロモーターを有し、Creの非存在下では活性化型Aktを発現させるものである。
【００４０】
２つのLoxP配列は、同方向に並んで存在する場合、バクテリオファージP1 Cre リコンビナーゼ（以下単にCreと称する）によって認識され、２つのLoxP配列の間に存在する配列が切り出される。Creは、部位特異的リコンビナーゼであるファージλインテグラーゼファミリーのメンバーである。Creは、２つの同方向に並んだLoxP配列の間のセグメントの切り出しを触媒する酵素である。Creをコードするヌクレオチド配列を配列番号２７に、Creのアミノ酸配列を配列番号２８に示すが、以下に説明するように、野生型Creに１または複数の変異を有するものも本発明の「Cre」に含まれる。
【００４１】
配列番号２６に示すLoxP配列は34bpからなり、両端に13bpのinverted repeat（Cre結合ドメイン）を有し、その間に8bpの領域を有する。Creによる、LoxPに挟まれる領域の切り出しを起こすためには、LoxPの13bpのCre結合ドメインのそれぞれにおいて、8-10塩基が配列番号２６のものと一致していれば十分であるとされている。また、inverted repeatの間の8bp領域も配列番号２６に示すものと相同性を有することが要求される。
【００４２】
したがって、本発明において、LoxPとは、配列番号２６のヌクレオチドにおける両端の13bpにおいて、少なくとも8-10塩基が一致しており、かつ、配列番号２６の各13bpのinverted repeatの間に介在する8bpにおいて、例えば、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を有するものであり、Creによって認識され、２つが正方向に並んだ場合にその間の配列がCreの作用によって切り出されるものであれば、本発明のLoxPに含まれる。
【００４３】
また、本発明においてCreとは、配列番号２７によってコードされるタンパク質（即ち配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）が含まれるが、例えば、配列番号２７のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質であって、LoxPに挟まれた領域を切り出せる活性を有するものも本発明のCreに含まれる。同様に、配列番号２８のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、LoxPに挟まれた領域を切り出せる活性を有するものも本発明のCreに含まれる。
【００４４】
本発明において、LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した高等動物細胞は、Creの非存在下では、LoxPの間に存在する活性化型Aktをコードする配列が切り出されず、プロモーターの作用により、活性化型Aktを発現するものであり、活性化型Aktの発現により、Aktシグナル伝達系路が活性化状態に維持され、細胞が未分化な状態で維持される。しかし、、LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した高等動物細胞にCreを導入することにより、Creの作用により、LoxPの間にある活性型Aktをコードする配列が切り出され、活性化型Aktは細胞内で発現されず、Aktシグナル伝達系路が非活性化状態に維持され、細胞が分化する。即ち、LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡにCreを作用させるか、否かにより、細胞の分化状態を自在に制御することが出来る。
【００４５】
Creの導入方法は、特に限定されず、Creをコードする配列を含むベクターをLoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した高等動物細胞にトランスフェクションする方法や、細胞外からCreを添加する方法、例えば培地に、細胞透過性ペプチドを融合したCreを添加する方法などが挙げられる。細胞透過性ペプチドは、それと融合したタンパク質を、細胞膜を横切って細胞内へ導入するものであり、例えば、HIV-1 TAT、HSV VP22、Antp（trends in CELL BIOLOGY,10, 290-295,2000）およびFGFの疎水性ペプチド（PNAS, 99, 7, 4489-4494 (2002)）などが知られている。なかでも、Creと融合した場合細胞内へCreを効率よく導入することが出来ることが確認されている、HIV1 TATが好適に用いられる（PNAS, 99, 7, 4489-4494 (2002)）。
【００４６】
それゆえ、本発明の第２の態様は、
４）LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した細胞をCreの非存在下に維持することにより高等動物細胞を未分化状態に維持することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
５）LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した細胞にCreを作用させることにより細胞の分化を誘導することを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
６）LoxP-Akt-LoxPを有するＤＮＡを導入した細胞をCreの非存在下に維持して未分化状態を維持した後、Creを作用させて未分化細胞を分化させることを含む高等動物細胞の分化状態の制御方法、
を提供する。さらに、LoxP-Akt-LoxPによってコードされる活性化型Aktを発現する高等動物細胞も本発明に含まれる。
【００４７】
さらに、本発明の第２の態様は、上記４）の方法によって得られる未分化細胞、上記５）または６）の方法によって得られる分化細胞を提供する。本発明の第１の態様と同様に、細胞は好ましくは幹細胞であり、さらに好ましくはＥＳ細胞である。そして高等動物細胞は、好ましくは哺乳類細胞、特に好ましくは霊長類細胞である。
【００４８】
本発明の第２の態様はまた、高等動物細胞の分化状態を制御するために該細胞に導入される、LoxP-Akt-LoxPを含むＤＮＡも提供する。かかるＤＮＡとしては、上記の活性化型AktをコードするＤＮＡの上流および下流に上記のLoxP配列を同方向に有するものであれば特に限定されない。すなわち、配列番号１のＤＮＡに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するＤＮＡであって機能的な活性化型AktをコードするＤＮＡと、その上流および下流に同方向に配列番号２６のＤＮＡに対して、Creによる切断に十分な相同性を有するＤＮＡが結合しているＤＮＡも含まれる。あるいは、配列番号１のＤＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、機能的な活性化型AktをコードするＤＮＡと、その上流および下流に同方向に配列番号２６のＤＮＡに対して、Creによる切断に十分な相同性を有するＤＮＡが結合しているＤＮＡも本発明に含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、上記のような条件を指す。
【００４９】
さらに、本発明の第２の態様は、上記のようなLoxP-Akt-LoxPを含むＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。該コンストラクトは上記LoxP-Akt-LoxPを含むＤＮＡおよび該ＤＮＡの発現を引き起こすプロモーターを含むベクターからなる。プロモーター、およびLoxP-Akt-LoxPとプロモーターを担持するベクターは、特に限定されず、上記第１の態様と同様のものを用いればよい。
LoxP-Akt-LoxPにおいて、活性化型Aktとその上流、下流のLoxP配列の間の距離は特に限定されない。Creの作用により活性化型Aktが切り出される限り、いずれの距離であってもよい。好ましくはCreを含むコンストラクトはトランジェントに導入する。
【００５０】
本発明の第１および第２の態様において使用される細胞は好ましくはES細胞などの幹細胞であるが、分化した細胞を含むあらゆる高等動物細胞を用いることができる。というのは、すべての高等動物細胞においてAktが分化制御に関与しており、本発明の実施例において用いたES細胞、即ちマウスおよびカニクイザルのES細胞で認められた結果は他の幹細胞を含む高等動物細胞でも同様に見出されると考えられるからである。
【００５１】
ＰＴＥＮノックアウトマウスを用いた始原生殖細胞や神経幹細胞における機能解析結果に、本発明の実施例に記載したES細胞に関する知見を合わせると、PI3K-Aktシグナルが、幹細胞や細胞の未分化性を制御していることは明らかである。このPI3K-Aktシグナル・システムはすべての高等動物細胞にユビキタスに発現していること、および、幹細胞を維持するのに用いられてきた様々なサイトカインがこのPI3K-Aktを活性化することが知られている、本発明の実施例の結果とこれらの知見から、マウス以外の霊長類を含むその他の哺乳類の幹細胞システムにおいてもPI3K-Aktシステムが幹細胞の未分化性を制御していると結論付けられる。
【００５２】
具体的には、以下のような知見が得られている。
（１）始原生殖細胞特異的PTENノックアウトマウスにおいては、インビトロで始原生殖細胞が分化全能性をもつEG細胞に脱分化しやすく、インビボでテラトーマが形成される。
（２）神経細胞特異的PTENノックアウトマウスでは、神経幹細胞の数が増え、自己複製能も上る。
（３）これらの細胞では、PI3Kシグナルが亢進し、Aktの恒常的な活性化が認められる。
Kimura T. et al., Development 2003 Apr:130(8):1691-700, Groszer M. et al., Science 2001 Dec 7:294(5549):2186-9. Epub 2001 Nov 01を参照されたい。
【００５３】
また、幹細胞を維持するのに用いられる様々な増殖因子(SCF,FGF,EGF,VEGF,LIFなど）はその受容体が直接にPI3Kを活性化したり、間接的にPI3KあるいはPI3Kを介さずにAktを活性化する。総説として、Cantley LC. Science 2002 May 31:296(5573):1655-7, Cantley LC. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Apr 13;96(8):4240-5, Hemmings BA. Science 1997 Jan 31:275(5300):628-30を参照されたい。
【００５４】
さらに、本発明はES細胞や幹細胞の未分化性を維持するだけでなく、高等動物細胞全般、すなわち、分化した細胞を脱分化させ未分化細胞に戻す態様も含むがこれは以下の知見に支持される。
（１）始原生殖細胞特異的PTENノックアウトマウスで、生殖細胞が分化全能性幹細胞に脱分化しやすい。
（２）細胞株を用いた解析により、線維芽細胞、腺癌細胞系が、PI3Kを活性化することにより、より未分化な性質を示すことが報告されている。
Kobayashi M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,4874-4879(1999), Singh B. et al., Genes Dev. 16,984-993(2002)を参照されたい。
【００５５】
本明細書中、塩基配列の相同性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, 1990、Karlin S &Altschul SF: Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【実施例１】
【００５６】
（ES細胞の培養）
ES細胞はマウス由来のE14Tg2a株を用い、これは理化学研究所から分与された。
ES細胞の培養は、ES培地 [GMEM（Glasgow minimum essential medium：Sigma社）に、非働化した10 % FCS（fetal calf serum）、1×非必須アミノ酸（Gibco社）、1 mM ピルビン酸ナトリウム（Gibco社）、LIF（leukemia inhibitory factor）、100 μM  2-メルカプトエタノール（ナカライテスク社）、100 U/ml ペニシリン（Sigma社）、 100 μg/ml ストレプトマイシン（Sigma社）を添加した培地] を用い、CO2インキュベーター中で37 ℃、5 % CO2で行った。LIFは、マウスLIFを発現するCHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）の上清を、約１０００Ｕ／ｍｌで用いた。タイトレーションは、Mouse ESGRO (LIF: Chemicon社）をスタンダードとして用いた。
【００５７】
（Akt発現ES細胞の樹立）
CAGプロモーターの支配下に、活性化型AktとIRES-EGFP（mRNAの転写を確認するためのマーカーであり、そのヌクレオチド配列を配列番号５に示す）を連結した遺伝子発現プラスミドを構築し、支持細胞非依存性マウスES細胞株E14Tg2aに導入した。そしてAkt発現細胞を、まず同じプラスミド上にあるネオマイシン耐性遺伝子を利用し、G418（ネオマイシン誘導体）耐性コロニーとして同定した。次にそのコロニーの中からAktを均一に発現しているクローンをEGFPの蛍光強度を指標に選択した。導入したAktの活性化状態をリン酸化Aktに対する抗体で調べたところ、強い活性化が認められた。
活性化型Akt発現ベクターの構築の模式図を図１Ｂに示す。
【００５８】
具体的には、pCAG-neoベクター（pCXNベクター）（Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J.Gene. 1991 Dec 15;108(2):193-199.に記載）のクローニングサイトに、pMY-IRES-EGFP（Murata K, Kumagai H, Kawashima T, Tamitsu K, Irie M, Nakajima H, Suzu S, Shibuya M, Kamihira S, Nosaka T, Asano S, Kitamura T.The EMBO Journal Vol. 18,pp. 4754-4765, 1999に記載）由来のEcoRI-SalI断片（IRES-EGFP部分に相当する）を挿入したベクター、pCAG-neo-IRES-EGFPベクターを作製した。pCS2 Akt activeベクター(Masuyama N, Oishi K, Mori Y, Ueno T, Takahama Y, Gotoh Y. J Biol Chem. 2001 Aug 31;276(35):32799-32805. Epub 2001 Jul 03.に記載)由来の1.1 kb BamHIフラグメントを、pCAG-neo-IRES-EGFPベクターのBamHIサイトにクローニングし、活性化型Akt発現ベクターpCAG-neo-myr-△PH-Akt-IRES-EGFPを構築した。
【００５９】
次に、制限酵素PvuI消化により直鎖状にした活性化型Akt発現ベクター30μgを、8×106個のマウスES細胞株E14Tg2aに遺伝子導入した。ES細胞への遺伝子導入は、GenePulser （BioRad社）を用いて、230V、500mFの条件で行った。遺伝子導入後24時間目から200μg/mlのG418（ナカライテスク社）による薬剤選択を開始し、10日目に一様にEGFPを発現するコロニーを蛍光顕微鏡下で選び、クローン化した。
【００６０】
図２は、FACSにより、myr-△PH-Akt-IRES-EGFPを遺伝子導入したES細胞におけるEGFP蛍光強度を測定した結果を示す。EGFPの蛍光を指標に均一に活性化型Aktを発現するES細胞を選択した。
【００６１】
次に、そのクローンの中から、FACSCabibur（Beckton Dickinson社）を用いたFACS（fluorescent activated cell sorter）解析で、98％以上の細胞がEGFP（enhanced green fluorescent protein）を発現するクローンを選択した。これらクローンにおける活性化型Aktタンパクの発現は、活性化型Aktを特異的に認識する抗体（Cell Signaling社）を用いたウエスタン・ブロット解析により確認した。
【００６２】
図３は、ウエスタン・ブロットにより、Aktの活性状態をリン酸化Aktを特異的に認識する抗体を用いて調べた結果を示す。コントロール細胞では、内在性のAktがほとんど活性化していなかったが、活性化型Akt発現クローンでは、myr-△PH-Aktの強い活性化が認められた。
【００６３】
これら活性化型Akt発現ES細胞を、未分化状態を維持するサイトカインであるLIFの存在下で培養した後、LIFを除去し、ES細胞の未分化状態を、コロニーの形態とES細胞特異的マーカーであるアルカリホスファターゼ染色で解析した。
【００６４】
（未分化ES細胞コロニーの検定法）
ES細胞を、3×103個/ウェルの密度で6 ウェル ディッシュ（Nunc社）に播種し、LIF添加または非添加のES培地で培養した。培養4日目、8日目の細胞を、4% PFA（parafolmaldehyde：Merck社）で固定した後、未分化ES細胞のマーカーであるアルカリフォスファターゼの活性を、アルカリフォスファターゼ染色キット（Sigma社）を用いて、推奨プロトコールに従い、検出した。このアルカリフォスファターゼ染色と細胞形態から、未分化細胞からのみ成るコロニー・一部に分化細胞を含むコロニー・分化細胞からのみ成るコロニーの３つに分類した。
【００６５】
図４は、LIF存在下およびLIF除去後４日目、８日目のコロニーをES細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼで染色した結果を示す。コントロールの活性化型Aktを発現しない細胞は形態的にほぼ完全に分化したのに対し、ほとんどのAkt発現細胞のコロニーは未分化なES細胞の形態を維持し、アルカリホスファターゼ陽性を示した。LIF除去８日目においても、活性化型Akt発現ES細胞のコロニーは未分化性を維持していた。
【００６６】
図５は、アルカリホスファターゼ陽性コロニーを定量した結果を示す。LIF除去後４日目、８日目におけるAkt発現細胞の未分化なコロニーの割合はコントロール細胞に対して有意に増加していた。
【００６７】
次に、Akt発現ES細胞における未分化マーカーおよび分化マーカーの遺伝子発現パターンを解析した。
【００６８】
（RT-PCR法）
LIF添加または非添加のES培地で培養した培養４日目、８日目の細胞から、RNeasy Kit（Qiagen社）を用いて、推奨プロトコールに従い、total RNAを回収した。次に、total RNA 1 μgから、ThermoScript RT-PCR system（Invitrogen）を用いて、推奨プロトコールに従い、cDNAを合成した。PCRの条件は、 （95℃ 、1分）×１サイクル、（95℃ 、30 秒：60℃、30秒：72℃ 、40 秒）×nサイクル、（72℃ 、7分）×１サイクルで行った。増幅のサイクル数nは、下表の遺伝子名の後のカッコ内に示した。プライマーは以下のものを用いた。
【００６９】
Rex-1 (20)5'-AACGGCAAAGACAAGTGGCC-3', 5'-GGAGGAAGTGGAGCAAAACC-3'（配列番号６、７）Oct3/4 (18)5'-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3', 5'-AGAGAAGGATGTGGTTCGAG-3'（配列番号８、９）
Nanog (25)5'-ATGAGTGTGGGTCTTCCTGGTCC-3', 5'-GACTCCACCAGGTGAAATATGA-3'（配列番号１０、１１）PGC 7 (25)5'-CAATCTTGTTCCGAGCT-3', 5'-GCAGTCTACGGAACCGCATT-3'（配列番号１２、１３）TNAP (22)5'-GTGGATACACCCCCCGGGGC-3', 5'-TGCATTGGGGCCAACCTTGAC-3'（配列番号１４、１５）
コラーゲン IV (18)5'-CAAGCATAGTGGTCCGAGTC-3', 5'-AGGCAGGTCAAGTTCTAGCG-3'（配列番号１６、１７）Brachyury (22)5'-ATGCCAAAGAAAGAAACGAC-3', 5'-AGAGGCTGTAGAACATGATT-3'（配列番号１８、１９）GAPDH (15)5'- GGGTGGAGCCAAACGGGTCATC-3' 5'- GCTGAACGGGAAGCTCACTGGC-3'（配列番号２０、２１）
【００７０】
図６は、LIF除去後８日目の細胞からtotal RNAをとり、RT-PCRを行った結果を示す。Oct-3/4、Nonog、Rex-1、PGC7、TNAPを未分化細胞マーカーとして用いた。Col.IVを内胚葉のマーカー、Brachyuryを中胚葉のマーカーとして用いた。コントロール細胞ではLIF除去後８日目には、Oct-3/4、Nonog、Rex-1、PGC7、TNAPといった未分化細胞マーカーの発現は減少するが、Akt発現細胞ではそれらの発現がすべて維持されていた。一方、コントロール細胞で、内胚葉分化マーカーであるCol,IV（コラーゲンIV)や中胚葉分化マーカーであるBrachyuryの発現が増強しているのに対し、Akt発現細胞ではそれらの増強は認められなかった。
【００７１】
さらに、LIF非存在下におけるAkt発現ES細胞の全体的な遺伝子発現パターンをマイクロアレイ解析で網羅的に解析した。
【００７２】
（マイクロアレイ解析）
上記のtotal RNAを用いて、Affymetrix社の推奨プロトコールに従い、蛍光標識したcRNAを合成した。次に、このcRNAを用いて、マイクロアレイ（Murine Genome U74 Set A version 2：Affymetix社）解析を、Affimetrix社の推奨プロトコールに従い行った。
【００７３】
図７は、LIF除去後４日目の細胞からmRNAをとり、マイクロアレイ解析を行った結果を示す。コントロールのES細胞で分化に伴い発現が減少する遺伝子２００個（未分化細胞マーカー）の９０％が、またコントロールのES細胞で分化に伴い発現が増加する遺伝子１３９個（分化細胞マーカー）の９１％が、Akt発現細胞では発現が変化していなかった。
【００７４】
すなわち、LIF非存在下におけるAkt発現ES細胞の全体的な遺伝子発現パターンは、LIF存在下におけるコントロールES細胞の遺伝子発現パターンとほとんど変わらなかった。
以上の結果は、活性化型Aktを発現させることで、LIF非添加時でも未分化状態を維持できることを示す。
【実施例２】
【００７５】
（Akt-Mer発現ES細胞の樹立）
活性化型Aktを発現させることにより、LIF非存在下でも未分化状態を維持したES細胞が分化全能性を有しているかどうかをAktの酵素活性を可逆的に制御できる活性化型Akt-Merを発現するES細胞株を樹立して検討した。活性化型Akt発現細胞の場合と同様に、CAGプロモーターの支配下に、キメラ遺伝子活性化型Akt-MerとIRES-EGFPを連結した遺伝子発現プラスミドを構築し、支持細胞非依存性マウスES細胞株E14Tg2aに導入した（図１Ｃ）。活性化型Akt-Mer発現細胞を、まず同じプラスミド上にあるネオマイシン耐性遺伝子を利用し、G418耐性コロニーとして同定した。次にそのコロニーの中からAktを均一に発現しているクローンをEGFPの蛍光強度を指標に選択した。
活性化型Akt-Mer発現ベクターの構築の模式図を図１Ｃに示す。
【００７６】
具体的には、pCS2 Akt activeベクターを鋳型にして、
5’-cggaattcaccatggggagtagcaag-3’（配列番号２２）、
5’-cggaattcggatccagcgtaatctggaacatcgtatgggtaggccgtgctgctggccgag-3’（配列番号２３）
のプライマーを用いてPCRを行い、5’末端にEcoRIサイト、3’末端にBamHIサイトをもち、stopコドンを除いた活性化型Akt cDNAを増幅した。また、pCAG-MerCreMerベクター（SCL/tal-1-dependent process determines a competence to select the definitive hematopoietic lineage prior to endothelial differentiation. Endoh M, Ogawa M, Orkin S, Nishikawa S. EMBO J. 2002 Dec 16;21(24):6700-6708に記載）を鋳型にして、
5’- cgggatccggagatccacgaaatgaaatg-3’ （配列番号２４）、
5’- cgggatccgtcgactcagatcgtgttggggaagcc-3’ （配列番号２５）
のプライマーを用いてPCRを行い、5’末端に活性化型Merにインフレームで連結できるBamHIサイト、3’末端にSalIサイトをもつMer cDNAを増幅した。次に、この２つのDNA断片を、pCAG-neo-IRES-EGFPベクターのEcoRI- XhoIサイトにクローニングし、Akt-Mer発現ベクターpCAG-neo-myr-△PH-Akt-Mer-IRES-EGFPを構築した。次に、制限酵素PvuI消化により直鎖状にしたAkt-Mer発現ベクター30μgを、8×106個のマウスES細胞株E14Tg2aに遺伝子導入した。ES細胞への遺伝子導入・クローン化は、上記「Akt発現ES細胞の樹立」方法と同様に行った。
【００７７】
図８は、FACSにより、活性化型Akt-Merを遺伝子導入したES細胞におけるEGFP蛍光強度を測定した結果を示す。EGFPの蛍光を指標に均一にAkt-Merを発現するES細胞をスクリーニングした。
【００７８】
図９は、LIF除去後８日目のコロニーをES細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼで染色した結果を示す。４−ＯＨＴを培養液中に添加してAktの酵素活性を活性化させたときは、LIF非存在下でも多くの未分化コロニーが認められ、アルカリホスファターゼ陽性を示した。一方、４−ＯＨＴを培養液中に添加せずにAktの酵素活性を不活性状態にしたときは、未分化コロニーはほとんど認められず、形態的にほぼ完全に分化した。添加した４−ＯＨＴの濃度は800nMであった。
【００７９】
図１０は、アルカリホスファターゼ陽性コロニーを定量した結果を示す。LIF除去後８日目における、４−ＯＨＴを添加して培養した活性化型Akt-Mer発現細胞の未分化なコロニーの割合は、４−ＯＨＴを添加しない場合やコントロール細胞に対して有意に増加していた。
【００８０】
以上の結果から、４−ＯＨＴの添加の有無により活性化型Akt-Merの酵素活性を制御することで、ES細胞の未分化性が自在に制御できることが示される。
【実施例３】
【００８１】
（OP9システムを用いた血液細胞系への分化誘導）
次に、LIF非存在下で４−ＯＨＴ添加時に認められた未分化な活性化型Akt-Mer発現ES細胞が分化全能性を有するかどうかを、その指標となる血液細胞への分化誘導能を調べることにより解析した。この実施例ではストローマ細胞ＯＰ９（Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Nakano T, Kodama H, Honjo T. Science, 1994 Aug 19;285(5175):1098-1101およびIn vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Nakano T, Kodama H, Honjo T. Science, 1996 May 3;272(5262):722-724を参照）を用いた試験管内分化誘導系を用いた。
【００８２】
具体的には、OP9システムを用いた血液細胞系への分化誘導培養は、OP9培地 [α-MEM（minimum essential medium：Sigma社）に、非働化した20 % FCS（fetal calf serum）、1×非必須アミノ酸（Gibco社）、1% L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン（Sigma社）、 100 μg/ml ストレプトマイシン（Sigma社）を添加した培地] を用い、CO2インキュベーター中で37 ℃、5 % CO2で培養した。
【００８３】
6 ウェルディッシュ に集密になって１〜2日目のOP9支持細胞の上に、1×104個のES細胞を播種し血液細胞への分化を誘導した。分化誘導3日目に半分培地を交換し、5日目に中胚葉コロニーの数を顕微鏡下でカウントした。次に、この分化誘導5日目の細胞を0.1% トリプシン（Gibco社）ではがし、シート状のOP9細胞を除いた後、新しいOP9細胞上に105個播種し、分化誘導8日目の血液細胞コロニー数を顕微鏡下でカウントした。成熟した血液細胞を得るために、この造血細胞をピペッティングにより回収し、もう1度新しいOP9細胞上に播種し、分化誘導１２日目に血液細胞数を血球計算盤でカウントした。血液細胞は、サイトスピン後、May-Grunwald-Giemsa染色を行った。
【００８４】
図１１は、LIF非存在下で、４−ＯＨＴ添加、不添加の条件で活性化型Akt-Mer発現ES細胞および活性化型Akt-Mer非発現コントロールES細胞を培養した結果を示す。分化能は、４−ＯＨＴ不添加の条件下でOP9ストローマ細胞上での血液細胞への分化能で評価した。
【００８５】
図１１Ａは、分化誘導５日目の中胚葉コロニー数、図１１Ｂは分化誘導８日目の胎児型血液細胞コロニー数および図１１Ｃは分化誘導１２日目の成人型血液細胞数を示す。
図１２は、分化誘導１２日目の活性化型Akt-Mer発現細胞から分化したさまざまな血液細胞を示す。
【００８６】
LIF非存在下で４−ＯＨＴ添加時に認められた未分化なAkt-Mer細胞を、OP9支持細胞上で４−ＯＨＴを除去して培養すると、通常のES細胞と同様に、培養５日目に多くの中胚葉系のコロニーをつくり（図１１Ａ）、培養８日目には胎仔型血液細胞を（図１１Ｂ）、培養１２日目にはさまざまな成体型血液細胞を産生した（図１１Ｃ、図１２）。このように分化した血液細胞は、コントロール細胞では認められなかった。以上のように、Aktの効果で未分化状態を維持したES細胞は、Aktの活性を不活性化することで分化全能性を発揮できるようになることが示された。
【実施例４】
【００８７】
（Aktは、マウスES細胞の未分化状態をSTAT3、ERK、β-カテニン非依存的に維持する）
様々なシグナル伝達系路がマウスES細胞における多分化能を制御している。本発明者らは、Akt シグナル伝達系が、かかるシグナル伝達カスケードに影響することによって未分化状態を維持している可能性について調べた。
【００８８】
LIFによるSTAT3の活性化は、マウスES細胞の多分化能の維持に十分な役割を果たすことが知られている。最近、bcr-ablがSTAT3のリン酸化を介してES細胞の多分化能を維持していることが報告された（Coppo P, Dusanter-Fourt I, Millot G, Noguenia MM, Dugray A, Bonnet ML, Mitjavia-Garcia MT, Le Pasteur D, Guihot F, Vaincheneker W, Sainteny F, Turhan AG, Oncogene 22:4102-4110(2003)）。
【００８９】
また、LIFの下流にあるERK シグナル伝達系はES細胞の自己複製能を負に制御するため、ERKシグナリングの阻害によりES細胞の分化が妨げられることが知られている（Burdon T, Stracey C, Chambers I, Nichols J, Smith A, Dev. Biol. 210;30-43,(1999)）。
【００９０】
Aktシグナル伝達系が、未分化状態を維持している可能性を調べるために、Akt-発現ES細胞におけるSTAT3、ERKおよびβ-カテニンの活性を調べた。
【００９１】
コントロールおよびAkt-発現ES細胞をLIFの不在下で一晩培養した。LIF刺激によるSTAT3 (図１３)およびERK (図１４)活性化カイネティクスをそれぞれ、抗-ホスホ-STAT3および抗-ホスホ-ERK抗体を用いたウェスタンブロット分析により調べた。
【００９２】
Akt-発現細胞におけるSTAT3の活性化カイネティクスをホスホ-STAT3特異的抗体を用いて調べたところ、Akt非発現コントロール細胞とAkt-発現ES細胞の間には有意差は観察されなかった(図１３)。
【００９３】
Akt-発現ES細胞においては、ERK シグナル伝達経路は通常に活性化されており、その活性化は阻害されているというよりむしろ向上していた(図１４)。
【００９４】
一方、Wnt/β-カテニンシグナル伝達系は、ES細胞における多分化能の維持に役割を果たしていることが報告されている（Nature Medicine, 10, 1,55-63(2004)）。Wntは、βカテニンのプロテアソーム-媒介分解を、グリコーゲンシンターゼキナーゼ 3β (GSK3β)の阻害を介してブロックする。その結果、β-カテニンが核内に蓄積し、転写因子T細胞因子(TCF)とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子を活性化する。GSK3βの活性はまた、Akt-媒介リン酸化によって阻害されるが、WntシグナリングおよびAktシグナリングはGSK3βにおいてクロストークされないと一般に考えられている。
【００９５】
この知見と一致して、β-カテニンの細胞内局在を免疫染色により分析したところ、コントロールおよびAkt-発現ES細胞の両方においてβ-カテニンは細胞質に局在し、核内には蓄積しなかった(図１５)。
【００９６】
さらに、以下に説明するルシフェラーゼアッセイを行ったところ、β-カテニン/TCFについてのタンデムな結合部位を担持するルシフェラーゼレポーター遺伝子はAkt-発現細胞では活性化されていなかった(図１６)。したがって、Akt シグナリングは、STAT3、ERKおよびβ-カテニンシグナル伝達系路に依存せずに未分化状態を維持することが確認された。
【００９７】
図１６は、β-カテニン/TCF複合体の転写活性を示す。ES細胞に、β-カテニン/TCF結合部位のタンデムリピートを担持するTOP レポータープラスミドとコントロールのFOPレポータープラスミドをトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性(平均±SD)はスチューデントｔ検定によって分析した。TOP レポーター遺伝子の活性化は、Akt-発現細胞において観察されなかった(p=0.20)。安定な突然変異によりβ-カテニンを発現するES細胞をポジティブコントロールとして用いた。
［ルシフェラーゼアッセイ］
トランスフェクションの２０時間前、ウェルあたり5×104 細胞にてゼラチンで被覆した24ウェル組織培養プレートに播いた。各ウェルにおいて細胞に、150ngのpTOPFLASHまたはpFOPFLASHベクターおよび20ngのルシフェラーゼ（Renilla reniformis 由来）をLipofectamine2000 (Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。48時間後、ルシフェラーゼ活性をluminometerで測定し、Dual Luciferase Assay System (Promega)を用いてトランスフェクション効率についてデータを規準化した。
【実施例５】
【００９８】
本実施例では、LoxP-Akt-LoxPが高等動物細胞の分化制御に有用であることを示した。具体的には、LoxP-Akt-LoxPを有する組換えベクターを導入したマウスES細胞を、Creの不在下に維持すると、Akeの活性によりES細胞が未分化状態に維持され、Creを作用させるとLoxP-Akt-LoxPから活性化型Aktをコードする配列が切り出され、Akt活性が低下することにより、ES細胞が分化することを示した。
【００９９】
（LoxP-Akt-LoxPを有するプラスミドの構築）
LoxP-Akt-LoxPを有するプラスミド（その構造を図１７に示す）の構築は、図１−Ｄに示す手順により行った。
即ち、ＰＨドメインが欠失しておりＮ末端にミリスチン化シグナルを有する、活性化Aktをコードする配列の上流と下流に、LoxP配列（配列番号２６）を同方向で担持するベクターを作成した。
まず、同方向に２つのLoxP配列を有するベクターpBS246（Invitrogen)のEcoRI切断部位を除き、プラスミドpBS246△EcoRIを作成した。プラスミドpBS246△EcoRIは２つのLoxP配列の間にSmaI切断部位を有する。次ぎに、pBS246△EcoRIのSmaI切断部位に、pCAGIPuro由来のEcoRV-PstI断片を導入し、pBS-IRES-Puroを作成した。ここで、IRES-Puroは、IRESの後にピューロマイシン耐性遺伝子が連結したものである。
【０１００】
そして、pBS-IRES-PuroのEcoRI切断部位に、実施例２において作成したpCAG-neo-myr-△PH-Akt-Mer-IRES-EGFP（ＰＨドメインが欠失しておりＮ末端にミリスチン化シグナルを有する、活性化Aktをコードする配列を含む）由来のEcoRI断片を導入し、pBS-Akt-IRES-Puroを作成した。次ぎに、EGFP発現ユニットを導入するために、pBS-Akt-IRES-PuroのSpeI切断部位に、pIRES-EGFP（Clontech)由来のSmaI-SacI断片を導入し、pBS-Akt-IRES-Puro-EGFPを作成した。最後に、プラスミドpCAG-neoのNotI切断部位に、pBS-Akt-IRES-Puro-EGFP由来のNotI断片を導入し、プラスミドpCAG-Akt-IRES-Puro-EGFPを得た。プラスミドpCAG-Akt-IRES-Puro-EGFPは図１７に示すように、活性化型Aktをコードする配列の上流と下流にそれぞれLoxP配列を同方向にて担持する。以下、本実施例において、このベクターを単に「LocP-Akt-LoxPベクター」と略称する。
【０１０１】
（LocP-Akt-LoxPベクターのマウスES細胞への導入）
LocP-Akt-LoxPベクター（30μg）を8x106のマウスES細胞にエレクトロポーレーションによって導入した。エレクトロポーレーションは、Gene Pulser II(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて0.23Kv、500μFにて行った。LocP-Akt-LoxPベクターを有する細胞を1μg/mlのピューロマイシンによって選抜した。
【０１０２】
（LIF依存性の確認）
LocP-Akt-LoxPベクターを導入したマウスES細胞のES性がLIFに依存するかを調べるために、該ES細胞を100細胞/cm2の密度で培地 [GMEM（Glasgow minimum essential medium：Sigma社）に、非働化した10 % FCS（fetal calf serum）、1×非必須アミノ酸（Gibco社）、1 mM ピルビン酸ナトリウム（Gibco社）、100 μM  2-メルカプトエタノール（ナカライテスク社）、100 U/ml ペニシリン（Sigma社）、 100 μg/ml ストレプトマイシン（Sigma社）を添加した培地]に播き、ALP（アルカリホスファターゼ）染色キット（Sigma, St Louis, MO）を用いて、培養の4日後、または8日後に染色した。
【０１０３】
（Creによる分化制御の確認）
LocP-Akt-LoxPベクターを導入したマウスES細胞を100細胞/cm2の密度で培地 [GMEM（Glasgow minimum essential medium：Sigma社）に、非働化した10 % FCS（fetal calf serum）、1×非必須アミノ酸（Gibco社）、1 mM ピルビン酸ナトリウム（Gibco社）、100 μM  2-メルカプトエタノール（ナカライテスク社）、100 U/ml ペニシリン（Sigma社）、 100 μg/ml ストレプトマイシン（Sigma社）を添加した培地]に播き、LIFの不在下で5日間培養した。これら細胞を同密度で継代し、LIFの不在下でさらに6日間培養した。
【０１０４】
Akt発現カセットを切り出すために、Cre-発現プラスミド、pMC-Cre-puro を、1×105のLocP-Akt-LoxPベクターを有する細胞に、Lipofectamine2000 (Invitrogen)を用い、製造業者の指示に従って、一過性に導入した。EGFPを発現するコロニーをピックアップし、Aktが発現していないことをウェスタンブロットにより確認した。
【０１０５】
本実施例により、AktがマウスES細胞の多分化能を維持するのに十分であることが示された。
ES細胞固有の特性は、複数の細胞系列に分化する能力を有することである。本発明者らはLIFの非存在下で培養したAkt-発現ES細胞が多分化能を維持しているかを調べた。このため、LoxP-Akt-LoxPベクター(図１７)をEB3フィーダーフリーES細胞に導入した。かかる。LoxP-Akt-LoxPベクターを有する細胞にCre-発現プラスミドをトランスフェクションすると、Creの作用（Cre-媒介組換え）によりAkt-発現カセットは切り出されるが、EGFPはAktが除かれたES細胞においても発現した。Akt発現をウエスタンブロットにより調べたところ、Cre-媒介組換えの後にはAkt発現は検出されなかった。そこで、AktのCreによる切り出し後のES細胞の分化能を調べた。
【０１０６】
まず、Cre-発現プラスミドによる一過性のトランスフェクション後にEGFP-陽性クローンを選抜し、EGFPの発現をCre-媒介組換えの前後に調べた。その結果、LoxP-Akt-LoxPベクターを有する EB3 ES細胞はLIFの非存在下で11日培養した後も未分化のままであったが、コントロールのES細胞は完全に分化し、LIFを添加してもES細胞に復活することはなかった。  
【０１０７】
Akt-発現カセットをCre発現プラスミドの導入により除去したところ、得られたAkt-欠損細胞の染色体は正常であり、LIFの不在化では分化した。これはLIF-依存性が回復したことを示す(図１８および１９)。
【０１０８】
図１８は、CreによるAktの切り出しの後にLIF-依存性が回復したことを示す。分化したコロニーと未分化のコロニーのパーセンテージをLIFの存在下および不在下で調べた結果を示す(平均±SD)(スチューデントｔ検定; *p<0.0001)。Aktが切り出されたすべてのクローン(#1, #2, #3)はコントロールのES細胞と同様に分化した。
【０１０９】
図１９はアルカリホスファターゼの基質であるFastRedを用いてアルカリホスファターゼ陽性の未分化細胞を染色した図である。
【０１１０】
図１８および図１９から、LIFの存在下ではLoxP-Akt-LoxPベクターを有する EB3 ES細胞は、Creの存在にかかわらず未分化の状態を維持するが、LIFの非存在下では、Creを導入しない場合はAktの活性により未分化状態を維持するが、Creを導入してAktを切り出すと、分化することが理解される。
【０１１１】
次に、LoxP-Akt-LoxPベクターを有する EB3 ES細胞のOP9 ストローマ 細胞を用いるインビトロでの血液系細胞へのインビトロ分化を調べた。かかるES細胞は分化誘導後５日目に中胚葉コロニーを形成し、12日目には様々な血液系細胞、例えば赤血球および顆粒球が生じた（図２０)。また、LoxP-Akt-LoxPベクターを有する EB3 ES細胞を神経系へ誘導することにより、神経系へも分化した。かかる結果により、Akt シグナリングがES細胞の多分化能の維持に十分であることが確認された。
【実施例６】
【０１１２】
（Akt-MerによるカニクイザルES細胞の分化制御）
LIF/STAT3 シグナル伝達系は霊長類のES細胞維持には必要でない。フィーダー細またはフィーダー細胞の培養上清が霊長類ES細胞の維持に必要であること報告されており、これによってフィーダー細胞由来の因子が霊長類 ES細胞の分化制御に関与することが示唆される。Akt シグナル伝達系の霊長類ES細胞の分化制御に関する役割を調べるために、本実施例において、Akt-Merを発現するカニクイザルES細胞株を作成した（Akt-Merを発現するコンストラクトについては、実施例２を参照されたい）。
【０１１３】
（細胞培養）
カニクイザル ES細胞株 CMK6は、Asahi Technoglass Corporation (Chiba, Japan)から購入した。CMK6 細胞をマイトマイシンC-処置マウス胚性線維芽細胞上で培養した。トランスフェクションは実施例５と同様にエレクトロポーレーションにより行った。フィーダーフリー培養のために、CMK6 細胞を0.25% トリプシン、1mM CaCl2および20% KSR中に剥離して細胞塊とした。フィーダー細胞を除くため、かかる細胞塊をゼラチンコーティングしたプレートで30分間培養した。浮遊ES細胞をマトリゲルコーティングしたプレートで1μMの４−ＯＨＴの存在下または非存在下で5日間培養した。胚様体アッセイのために、細胞塊となったES細胞を11日間ペトリ皿で培養した。
【０１１４】
（カニクイザルES細胞によるAkt-Merの発現）
図２１は、FACSによる、コントロールおよびAkt-Mer-発現カニクイザル ES細胞株におけるEGFP 強度を示す。図２２は、1μMの４−ＯＨＴの存在下または不在下で3日間培養したES細胞の、抗-Akt、抗-リン酸化-Aktおよび抗-β-アクチン抗体を用いたウェスタンブロット分析の結果を示す。図２２において、白い矢印は内因性Akt、黒い矢印は導入されたAkt-Merの位置を示す。これらの図からAkt-Mer導入細胞ではAktが発現しており、４−ＯＨＴの添加によって該Aktはリン酸化され、活性化することが理解される。
【０１１５】
（Akt-Mer-発現カニクイザル ES細胞の分化制御）
コントロールおよびAkt-Mer-発現カニクイザルES細胞をフィーダー無しの条件下で1μMの４−ＯＨＴの存在下または非存在下で5日間培養した。
【０１１６】
フィーダー細胞層上で培養した場合、Akt-Mer-発現カニクイザル ES細胞は４−ＯＨＴの添加の有無に拘わらずコントロールのES細胞と形態およびES細胞のマーカーであるALP（アルカリホスファターゼ）やOct-3/4の発現の観点から区別できなかった。しかし、フィーダー無しの条件下で培養すると、コントロールのES細胞は5日以内に分化したが、かなりの割合のAkt-Mer-発現ES細胞は４−ＯＨＴの存在下では未分化のままであり、４−ＯＨＴの非存在下では分化した。
【０１１７】
図２３は、コントロールおよびAkt-Mer-発現カニクイザルES細胞を４−ＯＨＴの存在下または非存在下で5日間培養した場合の分化したコロニー、部分的に分化したコロニーおよび未分化のコロニーのパーセンテージを示す(平均±SD)。コントロールの細胞に対する有意差をスチューデントｔ検定(*p<0.01)により検定した。
【０１１８】
図２４は、フィーダー無しの条件下での代表的なコロニーを示す。図２４の左側に示すように、４−ＯＨＴの存在下ではAkt-Mer-発現細胞は未分化ES細胞の形態を示す。図２４の右側に示すように４−ＯＨＴの存在下ではAkt-Mer-発現細胞はALPおよびOct-3/4（未分化マーカー）について陽性であった。
【０１１９】
（胚様体形成アッセイ）
上述のように、LIFの不在下で11日間培養した後、４−ＯＨＴの非存在下ではAkt-Mer-発現ES細胞は完全に分化したが、４−ＯＨＴの存在下では未分化のままであった。かかるES細胞を胚様体形成アッセイに供したところ、ES細胞は三胚葉に分化した。これらの結果から、Akt シグナル伝達系の活性制御によって、霊長類ES細胞の分化状態も制御できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明の方法および細胞は、再生医療や実験目的に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１−Ａ】図１−Ａは、野生型Akt、活性化型Aktおよび活性化型Akt-Merの模式図を示す。
【図１−Ｂ】図１−Ｂは、活性化型Akt発現ベクターの構築の模式図である。
【図１−Ｃ】図１−Ｃは、活性化型Akt-Mer発現ベクターの構築の模式図である。
【図１−Ｄ】図１−Ｄは、実施例において用いたLocP-Akt-LoxPを有するベクターの構築手順を示す模式図である。
【図２】図２は、活性化型Aktを導入したES細胞のFACSによるEGFP蛍光強度の測定を示す。
【図３】図３は、活性化型Aktを導入したES細胞のAktの活性状態を示す、抗リン酸化Akt抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。
【図４】図４は、活性化型Aktを導入したES細胞とコントロールES細胞のLIFの存在下、不在下でのアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。
【図５】図５は、活性化型Aktを導入したES細胞とコントロールES細胞のアルカリホスファターゼ陽性コロニーを定量した結果である。
【図６】図６は、活性化型Aktを導入したES細胞とコントロールES細胞についてのRT-PCR分析の結果を示す。
【図７】図７は、LIF除去４日目のES細胞についてのマイクロアレイ解析の結果を示す。
【図８】図８は、活性化型Akt-Merを導入したES細胞のFACSによるEGFP蛍光強度の測定を示す。
【図９】図９は、活性化型Akt-Merを導入したES細胞とコントロールES細胞の４−ＯＨＴの存在下、不在下でのアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。
【図１０】図１０は、活性化型Akt-Merを導入したES細胞とコントロールES細胞のアルカリホスファターゼ陽性コロニーを定量した結果である。
【図１１】図１１は、活性化型Akt-Merを導入したES細胞およびコントロール細胞の分化能を示す。
【図１２】図１２は、活性化型Akt-Merを導入したES細胞を分化誘導した結果得られた血液細胞を示す。
【図１３】図１３は、STAT3の活性化カイネティクスを示す。
【図１４】図１４は、ERKの活性化カイネティクスを示す。
【図１５】図１５は、β−カテニンの細胞内局在を示す。
【図１６】図１６は、β-カテニン/TCF複合体の転写活性を示す。
【図１７】図１７は、実施例において用いたLocP-Akt-LoxPを有するベクターの模式図である。
【図１８】図１８は、LoxP-Akt-LoxPベクターを有するES細胞のCreの存在下および非存在下、LIFの存在下および非存在下での分化の程度を示す。
【図１９】図１９は、LoxP-Akt-LoxPベクターを有するES細胞のCreの存在下および非存在下、LIFの存在下および非存在下での分化の程度を示す。
【図２０】図２０は、OP9 ストローマ 細胞システムを用いたLoxP-Akt-LoxPベクターを有するES細胞の分化の誘導を示す。
【図２１】図２１は、コントロールおよびAkt-Mer-発現カニクイザル ES細胞株におけるEGFP 強度を示す。
【図２２】図２２は、抗-Akt、抗-リン酸化-Aktおよび抗-β-アクチン抗体を用いたウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図２３】図２３は、コントロールおよびAkt-Mer-発現カニクイザルES細胞を４−ＯＨＴの存在下または非存在下で培養した場合の分化したコロニー、部分的に分化したコロニーおよび未分化のコロニーのパーセンテージを示す。
【図２４】図２４は、フィーダー無しの条件下での代表的なカニクイザルコロニーを示す。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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