(57)【要約】【課題】海馬ＣＡＩ領域の虚血性神経細胞死が、個体差なく、定量的にかつ再現性をもって生じるような一過性前脳虚血モデル非ヒト動物、その作製方法及びその利用を提供すること。【解決手段】マウスのような非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈とを、海馬ＣＡＩ領域の虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような閉塞手段及び閉塞時間で閉塞することにより、海馬ＣＡＩ領域の虚血性神経細胞死が、個体差なく、定量的にかつ再現性をもって生じるような一過性前脳虚血モデル非ヒト動物を作製する。該閉塞手段としては、脳幹損傷を生ずることなく、かつ頚動脈と脳底動脈の閉塞を不完全クリップを生ずることなく最小限に圧迫するように付勢された血管挟持ミニチュアクリップが用いられる。また、該虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような閉塞時間としては、略１４分程度の閉塞時間が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈を、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような閉塞手段及び閉塞時間で閉塞することを特徴とする一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項２】
非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈の閉塞が、両側頚動脈と、脳底動脈の閉塞であることを特徴とする請求項１記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項３】
閉塞手段が、脳幹損傷を生ずることなく、かつ頚動脈と脳底動脈の閉塞を不完全クリップを生ずることなく最小限に圧迫するように付勢された血管挟持クリップであることを特徴とする請求項１又は２記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項４】
血管挟持クリップが、一対の挟持ブレード、該一対の挟持ブレードに続く交差部、弧状の鉗子把持部及び一対の挟持ブレードに挟持圧を付勢する湾曲部より形成されるミニチュアクリップであることを特徴とする請求項３記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項５】
ミニチュアクリップの挟持ブレードの先端をテーパリングさせたことを特徴とする請求項４記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項６】
海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈の閉塞時間が、略１４分であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項７】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法により作製された一過性前脳虚血モデル非ヒト動物。
【請求項９】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項８記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物。
【請求項１０】
マウスが、Ｃ５７ＢＬ／ＮＣｒｊ又は１２９／ＳｖＥｍｓであることを特徴とする請求項９記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物。
【請求項１１】
請求項８〜１０記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物に、虚血性損傷関連遺伝子を導入して評価することを特徴とする虚血性損傷関連遺伝子の病態生理学的機能の評価方法。
【請求項１２】
請求項８〜１０記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物に、被検物質を接触せしめ、神経細胞の損傷の程度を評価することを特徴とする前脳虚血障害に作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前脳虚血障害に作用する物質のスクリーニングが、前脳虚血障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニングであることを特徴とする請求項１２記載の前脳虚血障害に作用する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が、個体差なく、定量的にかつ再現性をもって生じるような一過性前脳虚血モデル非ヒト動物、その作製方法及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脳梗塞などの脳虚血に起因する疾患は患者に重篤な後遺症を残し、社会的問題を生み出しており、その予防法と治療法の開発が強く求められている。脳虚血に陥った場合、脳内のニューロン（神経細胞）の機能が損なわれるが、それに伴う脳内の生体反応、神経細胞の虚血に対する反応などについてはほとんど解明されておらず、そのためにこれら疾患の予防法や治療法の開発も進んでいないのが現状である。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ａｔｔａｃｋ）は脳卒中の先駆けとして起き、短時間で消失する症状であり、虚血性脳疾患の前触れ発作、警告発作と位置づけられている。
【０００３】
一般的に、ＴＩＡから次第に脳梗塞等の重篤な脳血管障害に移行する危険性が高く、逆にＴＩＡを抑制することにより、重篤な脳血管障害の発症や再発を抑制できるとされている。ＴＩＡ患者のＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ：米国国立衛生研究所）診断基準〔クラシフィケーション  オブ  セレブロバスキュラー  ディズィーズ（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）ＩＩＩ（脳血管性疾患の分類）、Ｓｔｒｏｋｅ（脳卒中）２１巻：６５３−６５４、１９９０年〕では、“ＴＩＡとは、虚血によると考えられる脳機能の局所性障害が短時間出現する発作である。”と定義されている。通常は、一つの血管系（左または右の総頸動脈系、または椎骨・脳底動脈系）に限定され、他には原因が見い出されない。
【０００４】
一過性前脳虚血は、海馬ＣＡ１領域等、脳の損傷を受けやすい部位において選択的な神経細胞の損傷を引き起こす（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ２３９，  ５７−６９，  １９８２、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３２，  １２３９−１２４６，  １９８２、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ６４，  ３１９−３３２，  １９８４）。脳神経細胞は血流障害に対して極めて脆弱で、なかでも海馬ＣＡ１領域の錐体細胞は一過性の虚血後、エネルギー状態は速やかに回復するにも関わらず、数日後に細胞死に陥る。そのため遅発性細胞死と呼ばれているが、そのメカニズムはまだ解明されていない点が多い。この虚血性神経細胞死に対する予防・処置方法や予防・治療薬を開発するには、その虚血性損傷の病態生理を解明することが必要であるが、虚血性神経細胞死の代表的な例として、海馬ＣＡ１神経細胞における虚血性損傷の病態生理を解明するために、数多くの研究が行われてきたが、前記のように、その詳細なメカニズムの大部分は未知のままであった。
【０００５】
近年のマウスにおける遺伝子操作の発展は、生体内の特異的遺伝子の過剰発現又は標的欠損の効果を研究することにおいて、新たな機会を提供した。この試みは、生体内の虚血性脳損傷の分子構造を調べるのに、強力な手段となり、局所的な虚血性損傷に、いくつかの重大な遺伝子が関与していることを証明した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５，  １８８３−１８８５，  １９９４）。しかし、これらの遺伝子技術の発展により得られた情報は、脳の部分的な全壊死（ｐａｎｎｅｃｒｏｓｉｓ）を引き起こす局所的な虚血性脳損傷に限定されている。これは、マウスの、再現可能な全体的な前脳虚血モデルが不足しているからである。虚血性損傷の結果における不一致は、同じ系統（ｓｔｒａｉｎ）であっても、主として、ウィリス動脈輪（ｃｉｒｃｌｅ  ｏｆ  Ｗｉｌｌｉｓ）を通る側副血流（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ）の個体差に起因している（Ｓｔｒｏｋｅ  ２８，  １８０５−１８１０，  １９９７、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  １８，  ５７０−５７９，  １９９８、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８８，
１０３−１０９，  １９９９、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ８６８，  １４−２１，  ２０００）。
【０００６】
したがって、例えば、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分子レベルで解析するには、その解析のための遺伝子変異マウスを用いたモデルの確立が急務であるが、個体差及び死亡率の問題から定量性および再現性のあるモデルは困難であった。
９０年代に入って、遺伝子変異動物を用いた脳虚血研究のために、マウスの虚血モデルの開発が精力的に試みられてきた。しかし、海馬遅発性神経細胞死研究のための一過性虚血モデルに関しては、脳血管の構築の個体差に基づく問題、小動物であるが故の技術的困難性（生存率）の問題が多く、満足できるモデルがない。一過性虚血モデルに関する今までの報告を以下にまとめる。
【０００７】
１）両側頚動脈閉塞モデル（２−ｖｅｓｓｅｌ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ：２−ＶＯ）
この方法は、両側頚動脈を閉塞して一過性虚血を生じさせる方法で、今まで最も多く研究されている（Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．  １３，  ６８３−６９２，  １９９３、Ｓｔｒｏｋｅ  ２８，  １８０５−１８１１，  １９９７、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ７５２，  ２０９−２１８，  １９９７、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．  １８，  ５７０−５７９，  １９９８、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ７８０，  ３０４−３１０，  １９９８、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４３，  ９００−９０８，  １９９８）。これらのモデルでは、後頭蓋窩からの側副血行による残存血流が問題となり、最も側副血行の少ないＢ６  ｓｔｒａｉｎを用いた報告が多い。しかし、同ｓｔｒａｉｎの中でも個体差が大きく、同じ時間の閉塞にても海馬ＣＡ１錐体細胞が全く正常のものから、全てが細胞死に陥るものまで大きなばらつきがでる。
【０００８】
２）両側頚動脈閉塞＋低血圧モデル（２−ＶＯ＋ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ）
２−ＶＯに全身性の低血圧を組み合わせたモデルである（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８８，  １０３−１０９，  １９９９、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ８６８，  １４−２１，  ２０００）。Ｃ５７Ｂ６  ｓｔｒａｉｎを用いて１５分以上の虚血で８０％以上の海馬の神経細胞死が生じ、このときの海馬の血流は２％以下に低下したとされるが、発明者の追試では死亡率が非常に高い。
【０００９】
３）両側頚動脈閉塞＋脳底動脈閉塞モデル（３−ｖｅｓｓｅｌ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ：３−ＶＯ）
２−ＶＯに、クリップを用いて一過性に脳底動脈閉塞を組み合わせたモデルである（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７２，  ３４３−３５４，  １９９６）。報告上は、Ｃ５７Ｂ６、ＳＶ１２９の両ｓｔｒａｉｎの１０分間の虚血にて定量的評価が可能な神経細胞死（８０％の細胞脱落）が観察されている。本モデルの死亡率は２５〜６７％の死亡率と報告されているが、同じ研究グループの後の報告では（Ｓｔｒｏｋｅ  ２８，  １８０５−１８１１，  １９９７）、死亡率が高すぎるために２−ＶＯに移行したと記載されている。
【００１０】
４）その他
新生児モデル（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ８１０：１１４−１２２，１９９８）、心停止モデル（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．    Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ６５，  １３５−１４２，  １９９９、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ５，  ２１２７−２１３４，  １９９９、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．  ３２２，  ９１−９４，  ２００２）などもあるが、海馬の遅発性神経細胞死の評価には適していない。
以上のように、一過性虚血モデルに関する多くの報告はあるが、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が、個体差無く、定量的かつ再現性を持って生じるモデルを作製することは困難であった。
【００１１】
【非特許文献１】
米国国立衛生研究所  診断基準〔クラシフィケーション  オブ  セレブロバスキュラー  ディズィーズ（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）ＩＩＩ（脳血管性疾患の分類）、Ｓｔｒｏｋｅ（脳卒中）２１巻：６５３−６５４、１９９０。
【非特許文献２】
Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ２３９，  ５７−６９，  １９８２。
【非特許文献３】
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３２，  １２３９−１２４６，  １９８２。
【非特許文献４】
Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ６４，  ３１９−３３２，  １９８４。
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５，  １８８３−１８８５，  １９９４。
【非特許文献６】
Ｓｔｒｏｋｅ  ２８，  １８０５−１８１０，  １９９７。
【非特許文献７】
Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  １８，  ５７０−５７９，  １９９８。
【非特許文献８】
Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８８，  １０３−１０９，  １９９９
【非特許文献９】
Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ８６８，  １４−２１，  ２０００。
【非特許文献１０】
Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．  １３，  ６８３−６９２，  １９９３。
【非特許文献１１】
Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ７５２，  ２０９−２１８，  １９９７。
【非特許文献１２】
Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ７８０，  ３０４−３１０，  １９９８。
【非特許文献１３】
Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４３，  ９００−９０８，  １９９８。
【非特許文献１４】
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７２，  ３４３−３５４，  １９９６。
【非特許文献１５】
Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ８１０，  １１４−１２２，  １９９８。
【非特許文献１６】
Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ６５，  １３５−１４２，  １９９９
【非特許文献１７】
Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５，  ２１２７−２１３４，  １９９９。
【非特許文献１８】
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．  ３２２，  ９１−９４，  ２００２。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が、個体差なく、定量的にかつ再現性をもって生じるような一過性前脳虚血モデル非ヒト動物、その作製方法及びその利用を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、マウスのような非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈とを、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような閉塞手段及び閉塞時間で閉塞することにより、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が、個体差なく、定量的にかつ再現性をもって生じるような一過性前脳虚血モデル非ヒト動物を作製することが可能であることを見い出し本発明を完成するに至った。該閉塞手段としては、脳幹損傷を生ずることなく、かつ頚動脈と脳底動脈の閉塞を不完全クリップを生ずることなく最小限に圧迫するように付勢された血管挟持ミニチュアクリップが用いられる。また、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような閉塞時間としては、略１４分程度の閉塞時間が用いられる。
【００１４】
すなわち、本発明の概要について示せば、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分子レベルで解析するには、遺伝子変異マウスのような非ヒト動物を用いたモデルの確立が急務であるが、従来、個体差及び死亡率の問題から定量性及び再現性のあるモデルの作製は困難であった。本発明者は、脳底動脈用に開発した上記特殊小クリップを用いて、マウスの頚動脈と脳底動脈をクリップにて１４分間閉塞することで、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なく定量的かつ再現性をもって生じるモデルを開発した。本モデルにより、遺伝子変異マウスを研究に用いることが可能となり、今後の分子レベルでの虚血性神経細胞死の研究が進展し、分子標的の発見に大きな寄与をすることが期待できる。更に、本発明のモデル非ヒト動物を用いて、前脳虚血障害に作用する物質及び前脳虚血障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニングを行うことも可能である。
【００１５】
本発明の虚血モデル非ヒト動物の開発経緯について述べれば、本発明者は、前記のとおり種々報告された海馬遅発性神経細胞死研究のための一過性虚血モデルについて、それらの所見をもとに、全てのモデルを追試した。両側頚動脈閉塞モデル（２−ＶＯ）及び両側頚動脈閉塞＋低血圧モデル（２−ＶＯ＋ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ）について追試した。しかし、後交通動脈（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｎｇ  ａｒｔｅｒｙ）を経由した側副血行（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ）の変動により、生存率及び成功率の両方を高く維持したまま、海馬ＣＡ１領域において再現性のある損傷を得ることは困難であった。心停止モデルも行ったが、蘇生可能な心停止時間内では有意な神経細胞死は生じなかった。
【００１６】
そこで、２−ＶＯに、クリップを用いて一過性に脳底動脈閉塞を組み合わせたモデル、すなわち、両側頚動脈閉塞＋脳底動脈閉塞モデル（３−ＶＯ）の原法にもどり追試したが、脳底動脈のクリップの形状が適さないために不完全クリップ、脳幹損傷などが生じていると考えられた。そこで、１）クリップが、脳幹損傷を生ずることなく、かつ頚動脈と脳底動脈の閉塞を不完全クリップを生ずることなく最小限に圧迫するように付勢された血管挟持ミニチュアクリップで、かつクリップ先端をテーパリング（ｔａｐｅｒｉｎｇ）させた特殊なクリップを作製し、２）挿管を行わないで自発呼吸下のマスク補助呼吸とする、３）気管や頚動脈の圧迫を最小限にする術野を確保する等の点を改良した。これによりＢ６系でほぼ１００％近い動物で血流が１０％以下に低下し、その８０％近くが、４日以上生存するようになった。４日目の評価では、８分虚血では細胞死がほとんど認められなかったが、１４分まで延長することにより、海馬で均一な９０％以上の神経細胞死が生じることが判明した。これらの神経細胞死は、８分、１０分、１２分、１４分群（各Ｎ＝８〜１０）で再現性を確認している。
【００１７】
本発明は、本発明の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法により作製された、一過性前脳虚血モデル非ヒト動物を包含する。本発明のモデル非ヒト動物としては、特には、Ｃ５７ＢＬ／ＮＣｒｊ又は１２９／ＳｖＥｍｓのような系統のマウスに適用して作製することができる。本発明の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物は、該虚血モデル非ヒト動物に虚血性損傷関連遺伝子を導入して、遺伝子変異一過性前脳虚血モデル非ヒト動物を確立することが可能で、虚血性損傷関連遺伝子の病態生理学的機能の評価に用いることができる。したがって、本発明は、該遺伝子変異一過性前脳虚血モデル非ヒト動物を用いて、虚血性損傷関連遺伝子の病態生理学的機能の評価を行う方法を包含する。更に、本発明の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物は、該モデル非ヒト動物に被検物質を接触せしめ、神経細胞の損傷の程度を評価することにより、前脳虚血障害に作用する物質のスクリーニング及び前脳虚血障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニングを行うことができる。したがって、本発明は、本発明のモデル非ヒト動物を用いて、前脳虚血障害に作用する物質及び前脳虚血障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニングを行う方法を包含する。
【００１８】
すなわち具体的には本発明は、非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈を、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような閉塞手段及び閉塞時間で閉塞することを特徴とする一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法（請求項１）や、非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈の閉塞が、両側頚動脈と、脳底動脈の閉塞であることを特徴とする請求項１記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法（請求項２）や、閉塞手段が、脳幹損傷を生ずることなく、かつ頚動脈と脳底動脈の閉塞を不完全クリップを生ずることなく最小限に圧迫するように付勢された血管挟持クリップであることを特徴とする請求項１又は２記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法（請求項３）や、血管挟持クリップが、一対の挟持ブレード、該一対の挟持ブレードに続く交差部、弧状の鉗子把持部及び一対の挟持ブレードに挟持圧を付勢する湾曲部より形成されるミニチュアクリップであることを特徴とする請求項３記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法（請求項４）や、ミニチュアクリップの挟持ブレードの先端をテーパリングさせたことを特徴とする請求項４記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法（請求項５）や、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈の閉塞時間が、略１４分であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法（請求項６）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法（請求項７）からなる。
【００１９】
また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物の作製方法により作製された一過性前脳虚血モデル非ヒト動物（請求項８）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項８記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物（請求項９）や、マウスが、Ｃ５７ＢＬ／ＮＣｒｊ又は１２９／ＳｖＥｍｓであることを特徴とする請求項９記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物（請求項１０）や、請求項８〜１０記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物に、虚血性損傷関連遺伝子を導入して評価することを特徴とする虚血性損傷関連遺伝子の病態生理学的機能の評価方法（請求項１１）や、請求項８〜１０記載の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物に、被検物質を接触せしめ、神経細胞の損傷の程度を評価することを特徴とする前脳虚血障害に作用する物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、前脳虚血障害に作用する物質のスクリーニングが、前脳虚血障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニングであることを特徴とする請求項１２記載の前脳虚血障害に作用する物質のスクリーニング方法（請求項１３）からなる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は、マウスのような非ヒト動物の頚動脈と脳底動脈を、脳幹損傷を生ずることなく、かつ頚動脈と脳底動脈の閉塞を不完全クリップを生ずることなく最小限に圧迫するように付勢された血管挟持クリップのような閉塞手段を用いて、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なくかつ再現性をもって生じるような閉塞時間で閉塞することにより一過性前脳虚血モデル非ヒト動物を作製することよりなる。該頚動脈と脳底動脈の閉塞は、両側頚動脈と脳底動脈との閉塞により行われる。該頚動脈と脳底動脈の閉塞は、その閉塞に際して、脳幹損傷を生ずることなく、かつ頚動脈と脳底動脈の閉塞を不完全クリップを生ずることなく最小限の圧迫が維持されるように行われることが必要であり、そのためには後述する特殊な血管挟持クリップを用いて、操作される。
【００２１】
本発明の頚動脈と脳底動脈の閉塞時間としては、対象により多少の変動はあるが、高い生存率を得、かつ海馬で均一な９０％以上の神経細胞死を生じさせるためには、略１４分の閉塞時間が必要である。本発明で脳底動脈用に開発した特殊な血管挟持クリップを用いて、マウスの頚動脈と脳底動脈を略１４分間閉塞することで、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死を個体差なく定量的かつ再現性をもって生じさせることができる。
【００２２】
本発明で用いられる血管挟持用特殊クリップについて説明する。本発明で用いられる血管挟持用特殊クリップの一具体例は、図１（参考写真１参照）のＣに示される。図中、血管挟持クリップ（１）は、血管を挟持する一対の相対向する挟持ブレード（２，２）を有し、該一対の挟持ブレードに続く交差部（３、３）、及び該交差部に続く弧状の鉗子把持部（４、４）、更には一対の挟持ブレード（２，２）に挟持圧を付勢する湾曲部（５）より形成される。該血管挟持クリップ（１）は、頚動脈と脳底動脈の閉塞に際して、不完全クリップを生ずることなく、かつ最小限の圧迫が維持されるように、血管挟持クリップ（１）の材質及び一対の挟持ブレードに挟持圧を付勢する湾曲部（５）のバネ圧が調整される。血管挟持クリップ（１）の材質は、通常、ステンレスやコバルト・クロム合金、或いはチタンが用いられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２３】
血管挟持クリップ（１）の挟持ブレード（２，２）の先端は、頚動脈と脳底動脈の閉塞に際して、脳幹損傷等の危険を防止するために、テーパリングさせて形成される（６、６）。本発明で用いられる血管挟持クリップは、脳幹損傷等の危険を防止し、かつ特に脳底動脈の効果的な閉塞を可能とするために、通常、６〜７ｍｍ程度のミニチュアクリップとして形成される。本発明の血管挟持クリップ（１）は、その本質的な機能を保持する範囲で、適宜設計変更を行うことが可能である。
本発明の血管挟持クリップを用いて、特に脳底動脈の閉塞を行うには、専用の鉗子（クリップアプライヤー）先端の把持部にクリップの湾曲部（５）を収容して、弧状の鉗子把持部（４、４）を開いた鉗子把持部に嵌合し、鉗子のグリップを握り込むことによって、鉗子先端を閉じて、血管挟持クリップの挟持ブレード（２，２）を所定の間隔に開いた状態とする。血管を挟持するには、一対の開いた挟持ブレード間に血管を入れ、鉗子の握り込みを開放することによって、血管を挟持した形で、クリップを解放することにより行われる。
【００２４】
本発明の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物としては、ヒト以外の適宜の哺乳動物を対象とすることができるが、通常、一過性前脳虚血モデル動物として実験等に用いるには、Ｃ５７ＢＬ／ＮＣｒｊ又は１２９／ＳｖＥｍｓのような系統のマウスを用いるのが好ましい。
本発明の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物は、該一過性前脳虚血モデル非ヒト動物に、虚血性損傷関連遺伝子を導入して評価することにより、虚血性損傷関連遺伝子の病態生理学的機能の評価を行うことができる。該虚血性損傷関連遺伝子の病態生理学的機能の評価に際してのモデル動物への遺伝子の導入方法、及びその発現産物の検知、測定方法は、この分野で既に公知の方法を用いて実施することができる。
また、本発明は、本発明の一過性前脳虚血モデル非ヒト動物に、被検物質を接触せしめ、神経細胞の損傷の程度を評価することにより、前脳虚血障害に作用する物質のスクリーニング及び前脳虚血障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニングを行うことができる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［材料及び方法］
（動物の取り扱い）
オスＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ（ＢＬ／６；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ）と生後８〜１２週の１２９／ＳｖＥｍｓ（ＳＶ１２９；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスを本研究に使用した。動物実験に関する全過程は、東京大学のガイドライン（実験動物の取り扱いと使用に関するガイドライン）に従って行った。
【００２６】
（脳血流（ＣＢＦ）測定のための準備）
虚血の前日、ＣＢＦ測定のためにマウスの処理を行った。知覚麻痺を誘導した後、マウスを１．５％ハロタンを含む、３０％Ｏ２／７０％Ｎ２Ｏの混合液でオープンフェースマスクを使用して処理した。側面から、耳介前の皮膚の切開を行い、側頭筋は鼻側に翻転した。内径１．０ｍｍ、外径３．０ｍｍ、長さ３．０ｍｍのビニールチューブを頭蓋骨にシアノクリレートと共に頬骨弓の根元から１ｍｍ上部及び後部に左右対称に取りつけ、レーザードップラー血流計（ｍｏｄｅｌ  ＡＬＦ−２１，  Ａｄｖａｎｃｅ社製）で脳皮質の微小灌流を測定した。動物は虚血まで、ケージに戻して餌と水を自由に摂取できる状態で飼育した。
【００２７】
（前脳虚血）
知覚麻痺を誘導した後、マウスを１．５％ハロタンを含む３０％Ｏ２，７０％Ｎ２Ｏの混合液で鎮静し、誘導カニューレに対称的に挿入したレーザードップラー微小灌流プローブで脳皮質血流を測定した。硫酸アトロピン（０．２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、アミカシン（１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を投与した。直腸の温度を虚血後３０分後まで暖房カーペット（Ｍｏｄｅｌ  ＡＴＢ−１１００，日本光電社製）で３７．０℃に調節した。側頭筋の温度は針型マイクロプローブ（ＭＴ−２６／２，  Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を通して体温計（Ｍｏｄｅｌ  ＢＡＴ−１２，  Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で監視し、暖房ランプで３７．０℃に維持した。
【００２８】
頚部、胸骨の正中切開に続き、両側の総頚動脈を最初に隔離した。次に、気管と食道を右側に圧排させて、環椎後頭膜を露出した。硬膜とその下部に位置するクモ膜を３０−標準規格注射針で四角に除去し、（繋留クモ膜柱：ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ａｒａｃｈｎｏｉｄ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）を切除して脳底動脈を脳幹から遊離させた（図１Ｄ、Ｅ）。これらの処理の後、本発明で用いるブレードの直径が０．２ｍｍの先端をテーパリング構造とした（ｔａｐｅｒｅｄ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）ステンレス製のオリジナルクリップ（ＦＵＪＩＴＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ株式会社製）で脳底動脈を閉塞した（図１Ｃ、図２）。脳底動脈の血流の停止を直接確認した後、２個のＹａｓａｒｇｉｌクリップを使用して両方の総頚動脈を連続して閉塞した（図１Ａ、Ｂ、Ｆ及びＧ）。
【００２９】
虚血時間は、左側の頚動脈に最後のクリップをつけてから測定した。齧歯類用呼吸装置（Ｍｏｄｅｌ  ７０２５，  Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ社製）のフェイスマスクを通して、虚血中及び虚血後の自発呼吸を補助した。虚血後８〜１８分後、クリップを取り除き、血流が回復したことを全ての事例で各動脈を顕微鏡で直接観察して確認した。再灌流後直ちにハロタンを中止し、２０分以内に動物を換気装置から離した。閉創後、動物をケージに戻し、３３．０℃に設定した加湿保温装置に入れた。直腸の温度を虚血後、２、６、２４、４８、９６時間後に測定した。全ての動物に虚血後３０分及び２４時間後に乳酸を含むリンガー溶液（０．５ｍｌ）を皮下投与した。
【００３０】
（生理的パラメータの測定）
１４〜分虚血を行ったＢＬ／６マウス（ｎ＝６、ＢＬ／６  ＢＰ群）、及びＳＶ１２９マウス（ｎ＝６、ＳＶ１２９  ＢＰ群）の血圧を左側の大腿動脈に挿入したたＰＥ−１０カニューレにより増幅器（ｂｉｏａｍｐｌｉｆｉｅｒ）（Ｍｏｄｅｌ  ＡＤ−６０１Ｇ、日本光電社製）で測定した。動脈圧は虚血後５及び３０分後に血液ガス測定装置（Ｍｏｄｅｌ  ２４８，  Ｃｈｉｒｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）及びグルコースアナライザー（Ｇｌｕ−１，ＴＯＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社製）を用いて測定した。
【００３１】
（海馬直流（ＤＣ）電位）
ＢＬ／６マウスの別の群（ｎ＝６、ＢＬ／６  ＤＣ群）、及び群ＳＶ１２９マウスの別の群（ｎ＝６、ＳＶ１２９  ＤＣ群）では、海馬直流（ＤＣ）電位を塩化銀ワイヤーと右海馬（ブレグマの後部１．９ｍｍ、正中の１．２ｍｍ右側、深さ１．２ｍｍ）内に挿入したガラス製マイクロピペット電極（チップ直径１０〜２０μｍ）で、首の筋肉内の照合電極と連結してＤＣ増幅器（Ｍｏｄｅｌ  ＡＤ−６４１Ｇ、日本光電社製）で測定した（Ｎｅｕｒｏｌ  Ｒｅｓ  １７，  ９−１６，  １９９５）。
【００３２】
（海馬ＣＡ１領域内の神経細胞損傷組織の評価）
ＢＬ／６マウス群には、８分（ｎ＝１１、ＢＬ／６  ８分群）、１０分（ｎ＝１５、ＢＬ／６  １０分群）、１２分（ｎ＝１１、ＢＬ／６  １２分群）又は１４分（ｎ＝１８、ＢＬ／６  １４分群）の虚血を行い、ＳＶ１２９マウス群には１４分（ｎ＝１１、ＳＶ１２９  １４分群）、１６分（ｎ＝９、ＳＶ１２９  １６分群）、１８分（ｎ＝１４、ＳＶ１２９  １８分群）の虚血を行った。４日後、脳は４％のパラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）で灌流固定され、パラフィン処理した。背部海馬を含む冠状断面部分（厚さ４μｍ）をクレシルバイオレットブルー（ｃｒｅｃｙｌ  ｆａｓｔ  ｖｉｏｌｅｔ  ｂｌｕｅ）で染色し、海馬ＣＡ１領域内の生存神経細胞を数えた。
さらに、ＢＬ／６マウス群では、動物は同様に処理し、１４分の虚血後２４時間（ｎ＝６、ＢＬ／６  ２４時間群）及び２８日後（ｎ＝７、２８時間群）に解析した。
動脈閉塞のない偽手術群（コントロール群）は、ＢＬ／６マウス群（ｎ＝６、ＢＬ／６  ｓｈａｍｅ群）及びＳＶ１２９（ｎ＝６、ＳＶ１２９  ｓｈａｍｅ群）を用いて作製した。
【００３３】
（虚血による損傷のＴＵＮＥＬ染色）
海馬ＣＡ１領域における神経損傷の形態学的評価を行うために、ＢＬ／６マウスのパラフィン灌流には、８分（ｎ＝２）又は１４分（ｎ＝２）分虚血にしたものを用いた。脱パラフィン処理の後、これらの部位をプロテイネースＫで処理した後、取り扱い説明書（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従い、断片化されたＤＮＡをビオチン標識したｄＵＴＰ及びターミナルトランスフェラーゼ（ＴＵＮＥＬ法）を用いて可視化した。視床網様核を解析するために、１４分間虚血ＢＬ／６マウスを２４時間後に屠殺したものを同様の方法で解析した。
【００３４】
（解析）
全ての値は平均値±標準偏差（ＳＤ）で表示され、ＣＡ１領域の細胞数（神経密度）及び脳血流（ＣＢＦ）のデータは、一元配置分散分析（ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ：ＡＮＯＶＡ）を用いて、有意差をＰ＜０．０５に設定したＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔで検定した。他の生理学的パラメーターは、対応のない両側ｔ−検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）を用いることにより、有意差をＰ＜０．０５にあわせたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔで比較検定した。
【００３５】
［結果］
（生理的パラメーター）
１４分虚血を行ったＢＬ／６及びＳＶ１２９  ＢＰ群で測定した生理的パラメーターを、表１に示した。なお、平均動脈圧及び動脈ガスの虚血及び虚血後のデータに関しては、虚血開始後８分後及び、再灌流後１５分後にそれぞれ測定した。全ての値は、平均±標準偏差（ＳＤ）で示した（ｐ＜０．０５）。なお、ＢＳは、血糖値を示す。一般的に、大抵、パラメーターの標準偏差は広く、この小さな齧歯動物のパラメーターを狭い範囲内に調整することは困難であることを示していた。それにもかかわらず、本発明者の実験条件下においては、平均値はほぼ生理学的範囲に収まり、虚血前ｐＨ及び虚血後の血糖値以外に、ＢＬ／６及びＳＶ１２９との間に、著しい相違点がなかった。
組織学的分析を行った動物の直腸及び側頭筋の温度は、表２に示すように、３７．０±０．４℃で厳密に管理された。
なお、表２は、１４分虚血したＣ５７ＢＬ／６マウスとＳＶ１２９マウスの体温及びＣＢＦプロファイルを示す。全ての値は、平均±ＳＤで示す。虚血ＲＴ、ＴＴ及びＣＢＦは虚血開始後２．５分及び１２分に測定した値である。虚血後のデータは、再灌流後３０分に測定した。ＲＴ：直腸温度、ＴＴ：側頭筋温度。群により著しい違いは観察されなかった。
【００３６】
【表１】
2005013120.tif 000002
【００３７】
【表２】
2005013120.tif 000003
【００３８】
（ＣＢＦの測定）
皮質のＣＢＦは、全ての動物において、３つの血管をクリップした後、直ちに減少し、虚血期間中一定であった（図３）。ＢＬ／６及びＳＶ１２９群の２．５分後及び再循環前のＣＢＦ平均値は、両方の群で、虚血前コントロールに対し１０％程度に減少したが、個体による変動はＳＶ１２９においての方が大きかった（表２）。統計的に、群、又は左右による（ｐ＞０．０５）著しい違いはなく、両方の群において、ＣＢＦは双方同型の減少を示した。全ての値は、平均±標準偏差（ＳＤ）で示す。虚血ＲＴ、ＴＴ及びＣＢＦは虚血開始後２．５分及び１２分に測定した値である。虚血後のデータは、再灌流後３０分に測定した。なお、表中の記号はそれぞれ、ＲＴ：直腸温度、ＴＴ：側頭筋温度、を示す。群により著しい違いは観察されなかった。
【００３９】
（無酸素性脱分極）
３−血管閉塞（３−ｖｅｓｓｅｌ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）後、ＢＬ／６  ＤＣ群において５７．０±１４．６秒、ＳＶ１２９  ＤＣ群においては５７．４±１１．９秒遅れて、急激な直流電位（ＤＣポテンシャル）のネガティブシフトが記録されたが（図３）、脱分極時間に有意差はなかった（対応のない両側（ｉｎ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）ｔ検定においてｐ＞０．０５）。再灌流したところ、ＤＣポテンシャルはさらにネガティブシフトを示し、その後、ゆっくりと回復した。
【００４０】
（生存率及び手術の不成功）
上記のような急性実験と比較して、この小さな齧歯モデルにおける手術の成功及び生存率は、後に組織学的成果を評価するための、重要な要素である。本研究者らは、人工呼吸の失敗、脳底動脈からの出血、気道障害などの技術的な問題に遭遇し、その動物は再灌流の間に、又はその直後に死亡した。しかし、本発明者はついに、その一連の研究において、虚血継続時間及び動物の系統（ｓｔｒａｉｎ）には依存しない、全体的な成功率９４．０％を達成した（ｎ＝１１６、ＳＶ１２９及びＢＬ／６の全ての動物より算出）。
再灌流が成功した後の生存率において、ＢＬ／６群では、虚血継続時間に関わらず４日後の生存率が８５．９％（ｎ＝６９）という妥当な結果であった。１４分虚血後の生存率は、２４時間後には１００％であったが、２８日目には５８．３％に減少した。一方、ＳＶ１２９群の４日目の生存率は、虚血継続時間に比例して減少し、１４分及び１６分虚血では、それぞれ１００％であったが、１８分虚血では５１．９％であった。
【００４１】
（海馬ＣＡ１領域における神経細胞損傷）
図４（参考写真２参照）で示されるように、虚血継続時間が増加すると、ＢＬ／６マウスにおいて、ＣＡ１領域で、一貫した神経細胞損傷が見られた。８分虚血後に、いくつかの神経細胞が変性を示したが（図４Ｃ及びＤ）、大部分の錐体神経細胞が、１４分虚血後４日目に核の凝縮変性を示した（図４Ｅ及びＦ）。１４分虚血後２８日目に、これらの変性した神経細胞が完全に消失して、神経細胞死又は損失が確認された（図４Ｇ及びＨ）。ＴＵＮＥＬ染色により検出されたＤＮＡ断片は、この虚血群においては４日目に認められたが、虚血後２４時間目、又は８分虚血の後には観察されなかった（図５（参考写真３参照）Ａ、Ｂ及びＣ）。これらの観察により、本研究者らのモデルを使用したＢＬ／６マウスは、１４分虚血後４日目で、重度の回復不可能な神経細胞損傷を導いたことが示唆された。
【００４２】
これらのＣＡ１神経細胞損傷を、Ｂ／Ｌ６群の虚血継続時間と生存期間に従って、定量的に比較した（図６Ａ）。生存神経細胞の数は、８分虚血後にわずかに減少したが（通常の７８．５±８．５％  、ｐ＞０．０５）、１０分より長い虚血後には、継続時間に依存して顕著に減少し、１４分虚血後には、通常のコントロールの８．４±１２．７％に達し、この虚血性損傷において、個体差が最小限の、一貫した損傷が認められた。１４分虚血後の時間的評価においては（図６Ｂ）、２８日目と比較して４日目以降はＣＡ１神経細胞損傷が増加しなかった。
Ｂ／Ｌ６マウスにおける観察とは逆に、ＳＶ１２９マウスでは、重度な神経細胞損傷は観察されなかった（図６Ｃ）。神経細胞数は、１４分虚血後６７．８±３０．７％に留まり、虚血時間が１６分から１８分に増加しても、神経細胞のさらなる減少は観察されず、ＳＶ１２９における異なった虚血性損傷を示した。
【００４３】
（他の領域における虚血性損傷）
クレシルバイオレット及びＴＵＮＥＬ染色で評価したところ、虚血後４日目に、ＢＬ／６マウス群の海馬内で、虚血性損傷が観察された。ＣＡ２領域においては、神経細胞変性が、８分虚血後の動物の３２％、１２分虚血後には１００％で観察された。同様に、ＣＡ３領域では、ＴＵＮＥＬ陽性神経細胞で示されように、神経細胞変性が、８分間虚血後の動物の１４％、１０〜１４分虚血後の動物の４６〜７５％で観察された（図５Ｅ）。さらに、歯状回の顆粒細胞で、散在性の神経細胞変性が明らかになり（図５Ｄ）、１０分及び１２分虚血後の動物の２７〜３３％で観察され、１２分虚血後に最も高い頻度で生じた（動物の８６％）。海馬以外でも、ＴＵＮＥＬ陽性細胞をＢ／Ｌ６マウスの１４分虚血後に観察した（図７：参考写真４参照）。主に、第３〜５皮質層、視床の腹外側及び網様核並びに線条体の背外側で、これらの細胞を観察した。しかし、これらの損傷の程度又は強さは、動物個体間で変動があった。
【００４４】
［考察］
本研究で、本発明者は、Ｂ／Ｌ６マウスで、海馬ＣＡ１領域に、一定した再現性の高い神経細胞変性が生じる前脳虚血モデルを作製した。このモデルにおいて、皮質のＣＢＦは充分に減少し、無酸素性脱分極が１分以内に得られ、全ての実験動物において海馬における完全に近い虚血を示した。
ＣＡ１領域において定量的に再現性のある損傷を有する前脳虚血モデルの作製は、以前から多くの研究者が試みていた。２−血管閉塞又は低血圧の２−血管閉塞がその例である（Ｓｔｒｏｋｅ  ２８，  １８０５−１８１０，  １９９７、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．  １８，  ５７０−５７９，  １９９８、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８８，  １０３−１０９，  １９９９、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ８６８，  １４−２１，  ２０００）。しかし、後交通動脈を経由した側副血行の変動により、生存率及び成功率の両方を高水準で維持したまま、ＣＡ１において再現性のある損傷を得ることは困難であった。側副血行路に依存しない心停止モデルを作製することを試みたが、動物が蘇生可能な虚血時間帯内にＣＡ１神経細胞損傷をおこすことはできなかった（Ｋａｗａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。
【００４５】
そこで、本発明者は、以前Ｐａｎａｈｉａｎらが行った、脳底動脈閉鎖（３−血管閉塞）を両側総頚動脈閉塞と組合わせて試みた（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７２，  ３４３−３５４，  １９９６）。しかし、動物の生存率は、研究グループにより報告されたほど高くなく（Ｓｔｒｏｋｅ  ２８，  １８０５−１８１０，  １９９７）、一定のＣＡ１神経細胞損傷はなかった。マウスの脳底動脈は、実際は、脳幹の狭い溝を通り、クモ膜梁で脳軟膜とクモ膜と連結している（図８：参考写真５参照）。この観点から、本来Ｐａｈａｎｉｈｉｎａらが使用していたＺｅｎクリップは（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７２，  ３４３−３５４，  １９９６）、脳幹を圧迫して損傷することなく、脳底動脈を完全にクリップするには大きすぎる。そこで、溝に合った新たなミニチュアのテーパード・クリップ（ｔａｐｅｒｅｄ  ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｃｌｉｐ）を開発し、動脈を脳幹表面より完全に放した後に適用した。
【００４６】
特にマウスがモデルの場合は、非虚血動物を除外するために、虚血モデルにおけるＣＢＦの減少を確認することは重要である。本発明者のモデルにおいて、中大脳動脈及び後大脳動脈の境界領域から、両側で皮質ＣＢＦを測定したところ、全ての動物で、著しくＣＢＦが減少し、ＣＢＦの平均値は１０％以下であった。ＣＢＦの値が、Ｋｉｔａｇａｗａら（Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．  １８，  ５７０−５７９，  １９９８）による２−血管閉塞モデルが示した除外基準より、僅かに高かったにもかかわらず、ＤＣポテンシャル測定による無酸素性脱分極は、全ての動物においておよそ６０秒で得られ、それは心停止モデル（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ  ３２２，  ９１−９４，２００２）と匹敵し、その結果、海馬におけるほぼ完全な虚血を確認した。その結果生じたＣＡ１領域における神経細胞損傷は、持続時間に依存して増加し、８分虚血後には、神経細胞変性は極小であったが、１４分虚血後にほぼ完全な神経細胞変性が観察された。この観察は、虚血継続時間を調整することによって、本発明者のモデルにおいて、再現可能な神経細胞損傷を誘導することが可能であることを示唆している。
【００４７】
更に、これらの重度な損傷が、例外なく全ての動物で、両側で、観察されたことに注目しなくてはならない。このような再現性は、前脳虚血のこれまでのモデルでできなかったさまざまな介入を評価することにおいて、モデルの信頼性を高めることになる。生存率が虚血後の時間に依存して減少したので、虚血後４日目のＣＡ１領域における神経細胞損傷を評価した。１４分虚血後４日目の神経細胞死は、ほぼ完全で、回復不能であった。さらに、４日目の生存率８５．９％（ｎ＝６９）は、さまざまな定量的評価に適用できる。しかし、実際、２８日目の生存率５８．３％は、高くない。それでもなお、このモデルは、以前に発表したＣＡ１錐体神経細胞の神経細胞再生の研究など（Ｃｅｌｌ  １１０，  ４２９−４４１，  ２００２）、制限された状況における長期間生存モデルとして使用できる。
【００４８】
ラットや砂ネズミと比較して（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２３９，  ５７−６９，  １９８２、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３２，  １２３９−１２４６，  １９８２、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  ６４，  ３１９−３３２，  １９８４）、完全なＣＡ１神経細胞損傷に要する虚血時間は、ＢＬ６マウスの方が長かった。虚血性損傷は、虚血の程度（残存血流）や温度など多くの要因に依存しているため、虚血継続時間の違いを、種の違いと直接結びつけることはできない。しかし、本発明の研究においては、虚血中及び虚血後に正常体温を保ち、無酸素性脱分極による心停止と匹敵する、ほぼ完全な虚血を示した。これらの観察は、種の違いによる虚血への影響を示唆しているかもしれないが、詳細な機序は解明されていない。
【００４９】
これらの観察に従って、ＳＶ１２９マウスで得た結果から、多くの遺伝子改変マウスの遺伝的背景として通常使用されている系統について（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １９，  １７７−１８１，  １９９６）、慎重に決定しなければならない。無酸素性脱分極により証明されたように、本発明者のモデルで、海馬の完全な虚血が、ＳＶ１２９マウス群でも達成されたにもかかわらず、ＢＬ／６マウスと比較すると、同様の重度の神経細胞損傷は１４分虚血後には観察されなかった。この観察結果は、齧歯動物の中の違いに加えて、マウスの血流に依存しない系統による違いを示唆している。事実、カイニン酸にて誘導された神経細胞変性の系統による違いは、マウスにおいてすでに証明されている。（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９４，  ４１０３−４１０８，  １９９７）。この相違の理由は現在、解明されていないが、共通の遺伝的背景なしに研究を計画したり、解釈する場合には、この点に注意しなくてはならない。系統による違いを避けるために、何代にもわたる戻し交配は、突然変異遺伝子を変えずに多くのＢＬ／６の遺伝的背景を作製するのに有用である。
【００５０】
本研究においては、ＢＬ／６マウスを用いて、３−血管閉塞（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ３−ｖｅｓｓｅｌ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）変法１４分虚血により、ＣＡ１に定量的かつ再現性のある損傷を生じる前脳虚血モデルを作製した。このモデルは、遺伝的操作を行ったマウスを用いて生体内の神経細胞死の分子構造を解明する研究において、多大な貢献が可能である。同様の虚血性損傷は、頻度や強度が未だ一定していないが、ＣＡ３、歯状回、大脳皮質、線条体及び視床など他の領域でも観察された。これらの領域における定量的な評価方法の更なる改善により、このモデルの虚血研究における応用範囲を更に広げることができる。
【００５１】
［図面の解説］
以下に、本発明の実施例で作成された図面の解説を記載する。
図１（参考写真１参照）は、本発明の実施例における、前脳虚血の誘導過程を示す図である。
なお、Ａ：動脈の略図。３つの矢印でクリップの位置を示す。Ｂ：３−血管閉塞の外科的図。Ｃ：脳底動脈用のクリップは、直径０．２ｍｍのステンレススチールで作製した。刃の先端を、顕微鏡を使用し、ダイヤモンドドリルでテーパーした。スケールバー：１ｍｍ。Ｄ：気管と食道を右側に圧排したところ、硬膜及びクモ膜組織が左側から露出した。Ｅ：脳底動脈を露出するために、硬膜とその下にあるクモ膜組織を、四角に取除いた。Ｆ：脳底動脈にミニチュアクリップを当てた。Ｇ：脳底動脈で、血流停止を観察した。また、ＣＣ：総頚動脈  ＢＡ：脳底動脈  Ａｏ：大動脈  Ｔｒ：気管、をそれぞれ示す。
【００５２】
図２は、本発明の実施例における、冠状断で、脳底動脈をクリップしているイメージを示す図である。ミニチュアクリップを使用すると、脳幹を圧迫することなく、脳底動脈を閉塞することができる。
【００５３】
図３は、本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＤＣポテンシャルとＣＢＦの変化を示す図である。
なお、ＣＢＦは、虚血直後にコントロールの１０％以下に減少し、１４分虚血の間一定であった。ＤＣポテンシャルのネガティブシフトを、虚血開始後１分後に観察し、再灌流後さらなるネガティブシフトを示した。
【００５４】
図４（参考写真２参照）は、本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの海馬ＣＡ１領域のクライシルバイオレット染色を使用した組織学的評価を示す図である。
なお、通常のコントロール領域はＡ及びＢで表した。８分虚血後、ＣＡ１には、変性を示した神経細胞は少なかった（Ｃ及びＤ）。しかし、１４分虚血後には、ＣＡ１神経細胞は４日目に、再現性をもって変性した（Ｅ及びＦ）。２８日目には、さらにはっきりと観察できた。（Ｇ及びＨ）スケールバー＝５００ミクロン（左コラム）及び５０ミクロン（右コラム）。
【００５５】
図５（参考写真３参照）は、本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの海馬におけるＴＵＮＥＬ染色を示す図である。
なお、ＴＵＮＥＬ染色により現れたＤＮＡ断片は、８分虚血後４日目（Ａ）、１４分虚血後２４時間後（Ｂ）のＣＡ１領域では観察されなかった。他方、１４分虚血後４日目には、ＴＵＮＥＬ陽性細胞をＣＡ１（Ｃ）領域で観察した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、歯状回（Ｄ）及びＣＡ３領域（Ｅ）で、１４分虚血後４日の、数匹の動物でも観察された。スケールバー＝５０ミクロン。
【００５６】
図６は、本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６及びＳＶ１２９のＣＡ１神経細胞損傷の定量的評価を示す図である。
Ａ：ＣＡ１神経細胞計測数を偽手術（ｓｈａｍ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）、８分虚血、１４分虚血を行った群で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの虚血後４日目に比較した。生存する神経細胞は  ｓｈａｍ群と比較した場合、１０分、１２分、１４分虚血後、著しく減少した。Ｂ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの１４分虚血後の異なる時点でのＣＡ１神経細胞計測数を測定した。神経細胞数の急激かつ大幅な減少は、２４時間後ではなく、４日及び２８日目で観察され、また、４日目で完全に変化することが観察された。Ｃ：１４〜１８分虚血を行ったＳＶ１２９マウスの、４日目の同様の解析。１４分虚血後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比較して、軽度ではあるが有意な虚血性損傷を観察した。虚血時間を１８分に延ばしても、この系統では、さらなる損傷はなかった。全ての値は、平均±ＳＤで表される。＊ｓｈａｍ  コントロール群と比較したときの有意差。（ｐ＞０．０００１）。
【００５７】
図７（参考写真４参照）は、本発明の実施例における、１４分虚血後のＣ５７ＢＬ／６マウスのＴＵＮＥＬ染色を示す図である。
なお、ＴＵＮＥＬ陽性細胞が海馬以外の部位でも観察された。虚血後４日目の皮質（Ａ及びＢ）。虚血後４日目の線条体（Ｃ）。虚血後２４時間目の視床網様核（Ｄ）。虚血後４日目の腹側外側の視床（Ｅ）。スケールバー＝２５０ミクロン（Ａ）及び５０ミクロン（Ｂ〜Ｅ）。
【００５８】
図８（参考写真５参照）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳底動脈の組織学的解析を示す図である。
なお、Ａ：無傷な動物では、脳底動脈は、クモ膜組織に覆われ、狭い溝に埋もれていて、クモ膜小柱により軟膜につながっている（▲）こと、及び、Ｂ：虚血モデルを作製した動物では、クモ膜組織は切断され、（▼）、脳底動脈はクモ膜小柱から切断され、脳幹を圧迫して損傷することなく、テーパード・クリップでクリップすることが可能となる。スケールバー＝１００ミクロン。脳底動脈に炭素色素を注入したことを、それぞれ示す。
【００５９】
【発明の効果】
モデル動物を用いて、海馬の遅発性神経細胞死を定量的かつ安定的に解析することは、個体差や死亡率の問題から困難であったが、本発明により、脳底動脈用に開発した特殊ミニチュアクリップを用いて、マウスの頚動脈と脳底動脈を十数分間閉塞することで、海馬ＣＡ１領域の虚血性神経細胞死が個体差なく、しかも定量的かつ再現性をもって生じるモデル動物が作製された。これにより、該モデルとして遺伝子変異動物を用いることにより、分子レベルでの虚血性神経細胞死の解明に貢献することができる。また、本発明で作製された一過性前脳虚血モデル非ヒト動物は、前脳虚血障害に作用する物質や前脳虚血障害に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニングに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例における、前脳虚血の誘導過程を示す図である。
【図２】本発明の実施例における、冠状断で、脳底動脈をクリップしているイメージを示す図である。
【図３】本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＤＣポテンシャルとＣＢＦの変化を示す図である。
【図４】本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの海馬ＣＡ１領域のクライシルバイオレット染色を使用した組織学的評価を示す図である。
【図５】本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの海馬におけるＴＵＮＥＬ染色を示す図である。
【図６】本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６及びＳＶ１２９のＣＡ１神経細胞損傷の定量的評価を示す図である。
【図７】本発明の実施例における、１４分虚血後のＣ５７ＢＬ／６マウスのＴＵＮＥＬ染色を示す図である。
【図８】本発明の実施例における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳底動脈の組織学的解析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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