(57)【要約】      （修正有）【課題】  関節リウマチを簡便かつ正確に検定するための方法、及び、それを実施するための検定キットを提供する。【解決手段】  検体ドナーから採取した検体中におけるアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定することからなる関節リウマチの検定方法。  検体が、滑膜組織、滑液、又は、血液であり、ＥＬＩＳＡ法又はウェスタンブロット法を用いて、検体中におけるアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定する検定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体ドナーから採取した検体中におけるアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定することを特徴とする関節リウマチの検定方法。
【請求項２】
検体が、滑膜組織、滑液、又は、血液であることを特徴とする請求項１記載の検定方法。
【請求項３】
ＥＬＩＳＡ法又はウェスタンブロット法を用いて、検体中におけるアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定することを特徴とする請求項１又は２記載の検定方法。
【請求項４】
検体ドナーがヒトであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の検定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の検定方法を行うための関節リウマチ検定キット。
【請求項６】
検体ドナーから採取した検体を抗アネキシンＶＩＩ抗体と反応させることを特徴とするアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度の測定方法。
【請求項７】
検体が、滑膜組織、滑液、又は、血液であることを特徴とする請求項６記載の測定方法。
【請求項８】
抗アネキシンＶＩＩ抗体を固相に結合させる工程を含む請求項６又は７記載の測定方法。
【請求項９】
抗アネキシンＶＩＩ抗体が抗ヒトアネキシンＶＩＩ抗体である請求項６〜８のいずれか１項に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの検定方法、及び、上記方法を行うための検定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、症状として関節炎が観察される疾患には、関節リウマチ（以下、ＲＡともいう）、変形性関節症（以下、ＯＡともいう）、全身性エリテマトーデス（以下、ＳＬＥともいう）等がある。これらの疾患は症状として関節炎が観察されるという点では共通するが、例えば、ＲＡは、リンパ球等の白血球浸潤、滑膜細胞の異常増殖、血管新生、骨・軟骨の破壊等の多様な病理組織学的な変化が観察される目下のところ原因が特定されていない慢性炎症性疾患であるのに対して、ＯＡは、関節軟骨の変性、骨辺縁の肥厚及び滑膜の変化を特徴とする主として加齢とともに発生する変形性関節疾患であるので、ＯＡとＲＡでは治療法が異なる。従って、適切な治療を行うためには、いずれの疾患であるかを正しく診断することが重要となる。
【０００３】
ＲＡの関節炎病変局所では、さまざまなサイトカインが検出されているが、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）やインターロイキン−１（ＩＬ−１）はサイトカインカスケードの初発に関与しており、これらのサイトカインは、マクロファージ、繊維芽細胞や血管内皮細胞から、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、顆粒球・マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等の炎症性サイトカインやケモカインの産生誘導を引き起こし、ＲＡの病態形成において中心的な役割を果たしている（非特許文献１）。更にＴＮＦ−αやＩＬ−１は、血管内皮細胞への接着分子の誘導も引き起こし、白血球等の炎症性細胞の集積をうながすことも知られている。
【０００４】
また、ＲＡの病変部位や周辺からはカリクレイン、ブラジキニン、ヒスタミン、セロトニン、血小板活性化因子、活性酸素、蛋白分解酵素等の様々な生理活性物質が放出され、関節の炎症や疼痛に関与している。
【０００５】
ＲＡ罹患者の滑膜における血管新生にも多くのサイトカインが関与しており、例えば、ＴＮＦ−α、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α、β（ＴＧＦ−α、β）等が挙げられる。ＴＧＦ−βはＲＡの炎症に抑制的に働くが、血管新生に関しては促進因子であり、逆に炎症に関与するインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、血管新生には抑制的に働く。
【０００６】
ＲＡは、リウマチ因子濃度や細胞表面でのケモカインレセプター５の発現量と高い相関性を有することが知られており（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）、従来、血液中のリウマチ因子濃度を測定したり、生検によって細胞を採取し当該細胞表面でのケモカインレセプター５の発現量を測定したりすることによって検定されてきた。
しかしながら、ＲＡをより簡便にかつ特異的に測定することのできる検定方法が望まれていた。
【０００７】
アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）は、カルシウムイオンとリン脂質に結合するという特性を有するタンパク質のファミリーであり、種々の生物や組織で見出されている。
アネキシンファミリーのうち、アネキシンＶＩＩはＣａ２＋／ＧＴＰ依存性膜結合タンパク質であり、アポリポタンパク質Ａ−１に結合することが知られている。
アネキシンＶＩＩはリン脂質からなる小胞を融合する機能を有するが、この機能はＰＫＣ依存性リン酸化により増強される。アネキシンＶＩＩの膜融合活性は、セリンとスレオニンがＰＫＣによりリン酸化されると増強されるが、タンパク質チロシンキナーゼ依存性リン酸化やｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ依存性リン酸化では増強されない。
【０００８】
また、アネキシンＶＩＩのダウンレギュレーションがβ−ガラクトース特異的レクチンであるガレクチン−３の抗アポトーシス作用を抹消することが判明している。
アネキシンＶＩＩ遺伝子は、前立腺癌、乳癌及びグリオブラストーマに対する腫瘍サプレッサー遺伝子の候補とされており、アネキシンＶＩＩ（＋／−）ヘテロ接合体マウスでは、巨人症及び多臓器腫大が発症し、認識可能な腫瘍の平均発生率は２３％であることが報告されている。
このように様々な方面から研究されているアネキシンＶＩＩであるが、関節リウマチとの関係については今まで全く報告されていない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｓａｍｐｅｙ  ＡＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００１；４４：１２７３−１２８０
【非特許文献２】Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １０１，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９８８，７４６−７５４
【非特許文献３】Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ  ＆  ＲＨＥＵＭＡＴＩＳＭ  Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．５，Ｍａｙ  ２００１，１０２２−１０３２
【非特許文献４】Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ  ＆ＲＨＥＵＭＡＴＩＳＭ  Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．５，Ｍａｙ  ２００１，１０５６−１０７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上述の現状に鑑みて、関節リウマチを簡便かつ正確に検定するための方法、及び、それを実施するための検定キットを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＲＡ罹患者とＯＡ罹患者又は健常者との滑膜細胞におけるプロテオームの差異を調べることにより、アネキシンＶＩＩの発現量やリン酸化がＲＡ罹患者とＯＡ罹患者又は健常者とでは有意に異なることを見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、検体ドナーから採取した検体中におけるアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定することからなる関節リウマチの検定方法である。
また本発明は、上記検定方法を行うための関節リウマチ検定キットでもある。
更に本発明は、検体ドナーから採取した検体を抗アネキシンＶＩＩ抗体と反応させることからなるアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度の測定方法でもある。
以下に本発明を詳述する。
【００１２】
本発明においては、検体中のアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定することによってＲＡを検定することができる。
上記検体としては、例えば、滑膜組織、滑液、血液（血清、血漿、リンパ球等）などが挙げられる。
上記検体として滑膜組織を使用する場合は生検によって検体ドナーの関節から滑膜組織を採取し、上記検体として滑液や血液を使用する場合は注射器等によって滑液や血液を採取し、適宜調製する。
これらの検体のなかでも、採取が容易で、かつ、ドナーに対する負担が少ない点から、滑液、血液が好適に用いられる。
【００１３】
本発明の検定方法においては、採取した検体中のアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定した後、これを、ＯＡ罹患者又は健常者の検体中の標準的なアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度と比較することにより、上記検体を提供したドナーがＲＡを患っている可能性が高い否かを検定することができる。この際、アネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度が高いほどＲＡに罹患している可能性が高いと検定することができる。
【００１４】
アネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定するための手段としては特に限定されないが、抗原抗体反応を利用してアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩを検出する方法が挙げられる。この場合、抗体としては、滑膜組織、滑液、血液（血清、血漿、リンパ球等）に存在するアネキシンＶＩＩを特異的に認識する抗体を使用する。アネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定する手段としては、具体的には、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法が好ましい。
【００１５】
ＥＬＩＳＡ法を用いてアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定する場合には、公知のＥＬＩＳＡ法を用いることができる。具体的には、ポリスチレン等の固相に抗アネキシンＶＩＩ抗体を結合させ、そこに検体を添加し、酵素標識抗体を反応させて可視化することにより、固相に結合した酵素活性を測定する。これによって検体中のアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定することができる。
【００１６】
また、ウェスタンブロット法を用いてアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定する場合にも、公知のウェスタンブロット法を用いることができる。具体的には、検体にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の変性剤を加えた後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、電気泳動終了後、ニトロセルロース膜等に転写した後、抗アネキシンＶＩＩ抗体を用いて可視化することによって、アネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定することができる。
上記抗アネキシンＶＩＩ抗体としては、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【００１７】
本発明の関節リウマチの検定方法の適用範囲は特に限定されず、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス等の哺乳動物であればよいが、なかでもヒトに対して好ましく適用することができる。
【００１８】
上記検定方法を実施するための検定キットもまた、本発明の１つである。本発明の検定キットの態様は、本発明の検定方法を簡便に実施するための検定キットであれば特に限定されない。具体的には、検体中に含まれるアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩを特異的に認識する抗アネキシンＶＩＩ抗体を含有し、抗原抗体反応を利用して検体中のアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定できる検定キットが好ましい。上記検定キットとしては、検体中のアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定することを可能にする抗体や器材等を少なくとも１種含んでいればよい。
【００１９】
特に、アネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度の測定にあたってＥＬＩＳＡ法を利用する場合には、抗アネキシンＶＩＩ抗体を固定化した担体等が検定キット中に含まれることが好ましい。
【００２０】
一方、アネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度の測定にあたってウェスタンブロット法を利用する場合には、抗アネキシンＶＩＩ抗体のほか、ＳＤＳ等の変性剤、ポリアクリルアミドゲル等の電気泳動に必要な器材、ニトロセルロース膜等の転写膜等が検定キット中に含まれることが好ましい。
【００２１】
検体ドナーから採取した検体を抗アネキシンＶＩＩ抗体と反応させてアネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度を測定する方法もまた、本発明の１つである。
上記反応にあたっては、上述のように、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロット法を用いることができる。
【００２２】
アネキシンＶＩＩ又はリン酸化アネキシンＶＩＩの濃度の測定にあたっては、抗アネキシンＶＩＩ抗体を固相に結合させる工程を含むことが好ましい。また、検体ドナーがヒトである場合には、抗アネキシンＶＩＩ抗体として、抗ヒトアネキシンＶＩＩ抗体を使用する。
【００２３】
更に、ＲＡ罹患者から採取した滑膜細胞にアネキシンＶＩＩのＳｉＲＮＡを導入することによりインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）やストロメライシン１（ＭＭＰ３）の分泌が阻害されることが確認できる。これにより、ＲＡ罹患者の滑膜細胞におけるアネキシンＶＩＩのリン酸化や過剰発現は、滑膜の炎症、滑膜細胞の増殖、血管新生や軟骨破壊を引き起こすサイトカインやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のエキソサイトーシスを誘導する作用を有すると考えられる。従って、滑膜細胞におけるアネキシンＶＩＩの発現やアネキシンＶＩＩ発現後のリン酸化を阻害することにより、ＲＡの諸症状を改善することができると考えられる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、アネキシンＶＩＩを指標とした新規なＲＡの検定方法及びそれに供する検定キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２６】
試験例１；ＲＡ罹患者とＯＡ罹患者との滑膜細胞におけるタンパク質産生の比較（二次元電気泳動法）
（１）サンプル調製
ＲＡ罹患者５名及びＯＡ罹患者５名からそれぞれ採取した滑膜細胞を、１０ｃｍシャーレに１〜５×１０５個／１０ｍＬ蒔き、ＣＯ２  インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２  の条件下で培養し、８０〜９０％になった時点で、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ、７Ｍ  ｕｒｅａ、２Ｍ  ｔｈｉｏｕｒｅａ、４％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５）３００μＬに溶解し、１．５ｍＬチューブに回収した。滑膜細胞溶解液をボルテックスミキサーで攪拌した後、軽く遠心し、次いで、液体窒素で凍結した後融解する処理を５回繰り返した。その後、遠心（４℃、１５０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎｓ）を行ない、得られた上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収し、上清のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
【００２７】
（２）二次元電気泳動
２−Ｄ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて添付のプロトコルに従い上清を処理し、二次元電気泳動用試料を調製した。得られた二次元電気泳動用試料に対して、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ（２４ｃｍ、ｐＨ４−７、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、添付のプロトコルに従い一次元目等電点電気泳動を行った。１つのゲルには２００μｇのタンパク質を充填した。
次いで、Ｅｔｔａｎ  ＤＡＬＴ  Ｇｅｌ  １２．５（１２．５％アクリルアミドゲル、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、添付のプロトコルに従い、Ｅｔｔａｎ  ＤＡＬＴｓｉｘ（アマシャムバイオサイエンス社製）により、二次元目ＳＤＳ電気泳動を行った。
【００２８】
（３）リン酸化タンパク質の検出
二次元電気泳動により分離したタンパク質を、Ｐｒｏ−Ｑダイヤモンド（インビトロジェン社製）を用いて添付のプロトコルに従い染色することにより、リン酸化タンパク質を検出した。染色結果は、バリアブルアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて解析した。
（４）総タンパク質の検出
リン酸化タンパク質を検出した後、続いて、ＳＹＰＲＯルビー（インビトロジェン社製）を用いて添付のプロトコルに従い染色することにより、総タンパク質を検出した。染色結果は、バリアブルアナライザーＴｙｐｈｏｏｎ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて解析した。
【００２９】
以上の解析より、ＯＡ罹患者から採取した滑膜細胞と比べて、ＲＡ罹患者から採取した滑膜細胞において優位にリン酸化されているタンパク質を示す４つのスポットが検出された。４つのスポットのうちｃ２９８について、Ｐｒｏ−Ｑダイヤモンドによる染色結果を図１に示し、その蛍光強度を表１に示した。
【００３０】
【表１】
2005315869.tif 000002
【００３１】
（５）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定
上記ｃ２９８のスポットをゲルから切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて測定した。
【００３２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるｃ２９８の分析により、ｃ２９８に該当するタンパク質がアネキシンＶＩＩ（Ｍｗ；５０２８４ｋＤａ、ｐＩ；６．２５）であることが判明した。
【００３３】
試験例２；ＲＡ罹患者とＯＡ罹患者との滑膜細胞におけるアネキシンＶＩＩ産生の比較（免疫沈降法）
（１）サンプル調製
試験例１（１）で得られた滑膜細胞溶解液をバッファー（３０ｍＭ  ＴｒｉｓＣＬ、７Ｍ  ｕｒｅａ、２Ｍ  Ｔｉｏｕｒｅａ、４％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５）で希釈してタンパク質溶液とした。得られたタンパク質溶液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌａｚｅｒ透析カセットキット（ピアス社製）を使用してＮＰ−４０溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に対して透析し、上記バッファーをＮＰ−４０溶液に置換した。透析後のタンパク質溶液のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。
【００３４】
（２）抗原―抗体の結合
タンパク質溶液からサンプルとして５００μＬをとり、新しい１．５ｍＬチューブに移し、そこに抗アネキシンＶＩＩモノクローナル抗体（シグマアルドリッチ社製、製品番号Ａ４４７５）を１〜５μｇ加えた。その後、サンプルを４℃で１時間穏やかに攪拌した。
【００３５】
（３）免疫複合体の沈降
サンプルに担体としてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）５０μＬを加え、４℃で１時間穏やかに攪拌した。次いで遠心（１２０００ｇ×２０秒）を行ない、上清を除去した。得られた沈殿物にＮＰ−４０溶液を１ｍＬ加え懸濁した後、遠心（１２０００ｇ×２０秒）し、上清を除去した。ＮＰ−４０溶液への懸濁と、遠心処理を更に２回繰り返した。
（４）分離、分析
沈殿物に１×ＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．０６２５Ｍ  ＴｒｉｓＣｌ、２．３％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を３０μＬを加え懸濁し、９５℃で３分処理した後、遠心（１２０００ｇ×２０秒）を行ない、得られた上清を新しいチューブに移した。上清に０．１％  ブロモフェノールブルーを１μＬ加えて、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（２５×２０ｃｍ、１２．５％  アクリルアミド（アクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド＝３７．５：１）、０．３７５Ｍ  ＴｒｉｓＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、０．１％  ＡＰＳ、０．０１３８％  ＴＥＭＥＤ）に供した。次いで、公知の方法に従いウェスタンブロッティングを行ない、ＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜を所定の大きさに切り、ポンソーＳ染色に供し転写ムラがないか確認した。次いで、ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ−ＰＢＳ  ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で３０分間浸してブロッキンクし、続いてＰＢＳ  ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で１０分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のニトロセルロース膜を、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇ抗体を含有する緩衝液中で室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ  ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で１０分間浸し洗浄する操作を３回繰り返し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で５分間インキュベートした後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて添付のプロトコルに従い染色した。
結果を図２に示した。図２の左側がポンソーＳ染色した結果を示し、図２の右側がＥＣＬによる染色結果を示す。
図２より、ＯＡ罹患者の滑膜細胞よりＲＡ罹患者の滑膜細胞のほうが明らかにアネキシンＶＩＩの産生量が多い。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、上述のような構成からなるので、アネキシンＶＩＩという新たなマーカーを用いて簡便かつ特異的に関節リウマチを検定することができる検定方法及び検定キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】試験例１においてＰｒｏ−Ｑダイヤモンドにより染色したｃ２９８スポットを示すＳＤＳ−Ｐａｇｅ用ゲルの写真である。
【図２】試験例２においてウェスタンブロッティングに供したニトロセルロース膜の染色結果を示す写真である。
【図１】
2005315869.tif 000003
【図２】
2005315869.tif 000004