(57)【要約】【課題】  本発明は、低コストに製造および検出することができ、操作が簡便かつＳ／Ｎ比が高く精度よい検出を実現できるマイクロアレイを提供することを目的とする。【解決手段】  本発明者らは、上記目的を達成すため、鋭意検討した結果、微細加工技術を用いて、試料を担持させる反応領域３を線形状の空間として複数並列的に配置することにより、試料間の干渉を防止した高精度な検出を実現できると共に、安価なラインセンサーにより簡便かつ高精度にデータの読み取りが可能であることを見出した。更に、微細加工される部材として、ポリジメチルシロキサンに着目することにより、更なる低コスト化、および簡便かつ高精度の検出を実現できることを見出した。これらの知見を基礎として本発明を完成するに至った。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１部材と第２部材との間に生体関連分子を担持する生体関連分子マイクロアレイであって、
前記第１部材もしくは前記第２部材の何れか一方において、他方の部材に対する接触面に複数の溝を並列形成し、反応領域となる空間を複数設けてある生物関連分子マイクロアレイ。
【請求項２】
第１部材と第２部材との間に生体関連分子を担持する生体関連分子マイクロアレイであって、
前記第１部材および前記第２部材の互いの接触面に複数の溝を並列形成し、反応領域となる空間を複数設けてある生物関連分子マイクロアレイ。
【請求項３】
第１部材と第２部材との間に生体関連分子を担持する生体関連分子マイクロアレイであって、
前記第1部材には、前記第２部材に対する接触面に複数の線形凸部を並列形成し、
前記第２部材には、前記第１部材に対する接触面に前記線形凸部と一対一に嵌合可能な複数の線形溝部を並列形成し、
前記線形凸部と前記線形溝部とを嵌合させつつ、前記第１部材と前記第２部材とを当接させたとき、前記線形凸部と前記線形溝部との間に反応領域となる空間が形成されるように構成してある生物関連分子マイクロアレイ。
【請求項４】
前記反応領域と外部を連通可能とし、前記反応領域に試料を供給する試料供給口と反応領域から試料を回収する試料回収口を設けてある請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体関連分子マイクロアレイ。
【請求項５】
前記第１部材および前記第２部材のうち少なくとも何れか一方を構成する基材が、ポリジメチルシロキサン、もしくは、ポリメタクリル酸メチルなど透明シリコンゴムあるいはプラスチック樹脂である請求項１〜４の何れか１項に記載の生体関連分子マイクロアレイ。
【請求項６】
生体関連分子を担持する生体関連分子マイクロアレイであって、
複数の線状反応領域を並設したマイクロアレイ本体を有する生物関連分子マイクロアレイ。
【請求項７】
前記マイクロアレイ本体を構成する基材が、ポリジメチルシロキサン、もしくは、ポリメタクリル酸メチルなど透明シリコンゴムあるいはプラスチック樹脂である請求項６に記載の生体関連分子マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体関連分子マイクロアレイに関し、特に、構成部材の微細加工により形成された反応領域がバーコード状に配置された生体関連分子マイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、環境事業のマーケットでは、土壌浄化と水安全性の領域で問題となる微生物の動態を的確に把握したいという強い要請がある。つまり、上下道水に存在する病原微生物の存在を連続又はリアルタイムにモニタリングすることや、水の安全基準となる大腸菌群、腸内細菌群などを迅速、かつ、正確に定量、同定したいという需要である。また、土壌修復事業の分野でも原位置修復に先立って、対象汚染土壌にどのような微生物が存在しているのか、を正確に調べることにより、的確な修復方法を提案したいという要求もある。さらに、有用微生物を導入するバイオオーギュメンテーションに用いる指標微生物の動態調査、事前事後の土壌診断等、種々の環境事業分野において微生物の的確な動態把握が要求されている。
【０００３】
しかしながら、現状では研究室に試料を持ち帰って熟練した検査官によって培養や顕微鏡観察によって検査されており、連続的または現場サイドでリアルタイムにモニタリングを行うことは困難であった。近年、微生物のリボゾームＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析による同定等、遺伝子レベルでの検出方法が報告されているが、何れも研究室レベルに留まり、現場で使われていることは希であり、微生物属以下の種の同定に関してはほとんど対応することができていないというのが現状であった。これらの現状を鑑みて、微生物属以下の種の同定に関して、種間での遺伝子多型性に焦点をあてた種レベルでの識別方法が試みられている。
【０００４】
また、近年のゲノムプロジェクトに代表される遺伝子解析研究の進展に伴い、遺伝子研究は新たな段階を迎えつつあり、今後はゲノム上に存在する遺伝子の機能解析の研究が非常に重要になりつつある。生体における遺伝子は、時間的かつ空間的に調整されており、この調節機構を網羅的に解明する遺伝子発現モニタリング研究が進められている。また、ヒトゲノムのＤＮＡの塩基配列は人により異なっており、特に、1塩基が異なる状態は一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれ、かかる相違は個々の薬剤感受性や罹病性の相違に関連するとして、疾病に関連する遺伝子のマッピング、ゲノム新薬、テーラーメイド医療の実現にむけた遺伝子多型の解析研究が進められている。
【０００５】
多種類の遺伝子を網羅的に解析することができるマイクロアレイ技術は、包括的な遺伝子発現モニタリング、ゲノムの変異、多型性を検出する上で、ポストゲノム時代の重要な基盤技術として、環境事業分野、医療分野から基礎生物学の分野まで注目されている。特に、ここ数年来、ＤＮＡマイクロアレイ技術は、飛躍的な技術的進歩を遂げている。ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）とは、ミクロな技術を使って、ガラス等の基板上に高密度に整列固定化された遺伝子ＤＮＡに対して、蛍光分子等で標識した標的核酸をハイブリダイゼイズさせ、基板上に結合した標識を蛍光スキャナー等で画像化し、解析処理するというものである。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイは、その製造方法により、光リソグラフィータイプとスポッティングタイプに大別される。光リソグラフィータイプは光リソグラフィーとコンビナトリアルケミストリーを融合させることにより、オリゴヌクレオチドを基板上に合成する方法である。具体的には、基板上に結合した塩基を光によって脱離する官能基で保護し、反応部位のみを照射できるような光リソグラフィック・マスクを用いることにより特定領域の塩基だけに光を照射して官能基を脱離させた後、水酸基が保護された塩基と反応させ、基板上の保護基が脱離している塩基とカップリングさせるという工程を繰り返すことにより、数十万種類のオリゴヌクレオチドをガラス基板上に合成するものである（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。一方、スポッティングタイプは、ロボットアームによってDNAを基板上に並べて付着(スポット)させて高密度DNAマイクロアレイを作製する方法であり、高精細度の高速ロボットスポッターを用いることにより、予め調製したＤＮＡプローブを、固相化剤によりコーティングした基板上に高密度にスポットするものである（例えば、非特許文献２、特許文献２参照。）。既に調製してあるプローブを使うことにより、研究者の望みのDNAマイクロアレイをつくることができる。
【０００７】
しかしながら、DNAマイクロアレイ技術は開発途上の段階にあり、解決すべき技術上の問題点があった。光リソグラフィータイプは、設計、作成に時間がかかり高価であるため、使用が一部の研究機関に限られるのが現状であった。一方、スポッティングタイプは、基板上にＤＮＡプローブを含む液滴を微量滴下することにより、基板上にＤＮＡプローブを固定化するため、滴下された液滴が基板表面で拡散し、隣接するスポットを干渉してコンタミネーションを起すという問題点があり、更に、各スポットの密度と均一性を担保できないため、精度、再現性の面でも満足できるものではなかった。また、スポット部の周囲に付着した固相化剤の存在によりターゲットDNAが非特異的に基板上に吸着し、ノイズを上昇させてS/N比を低下させるという問題点もあった。
【０００８】
そして、マイクロアレイに光を照射した際に発生する蛍光には、蛍光標識から発生する蛍光の他に、基板自体から発生する蛍光が含まれるため、これがバックグラウンドとなり、Ｓ／Ｎ比を低下させるという問題点があった。また、検出に際しては、通常、市販のマイクロアレイスキャナーを用いて各スポットの蛍光を検出しデータを得ているが、レーザー発振機や光学系システムは非常に高価であり、また、高精度の検出のためには、スポットの位置をマイクロスキャナーに正確に位置決めをする必要があった。したがって、従来法は、精度面、また、コスト面、操作の簡便性の観点から、十分満足できるものであるとは言い難かった。
【非特許文献１】Ｆｏｄｅｒ  ＳＰ，  Ｒａｖａ  ＲＰ，  Ｈｕａｎｇ  ＸＣ，  Ｐｅａｓｅ  ＡＣ，  Ｈｏｌｍｅｓ  ＣＰ，  Ａｄａｍｓ  ＣＬ「生物学的チップによるマルチプレクス型生化学的アッセイ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｉｐｓ）」  １９９３年  ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）  第３６４巻  ｐ５５５−５５６
【特許文献１】米国特許第５，７４４，３０５号明細書
【非特許文献２】Ｓｈｅｎａ，Ｍ．，  Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．，  Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，  および  Ｂｒｏｗｎ，  Ｐ．Ｏ．，「相補ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現パターンの定量的モニタリング（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」、１９９５年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７０巻、ｐ．４６７−４７０
【特許文献２】米国特許第５，８０７，５２２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、上記したようなマイクロアレイ技術に係る実状に鑑みてなされたものであり、低コストに製造および検出することができ、操作が簡便かつＳ／Ｎ比が高く精度よい検出を実現できるマイクロアレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すため、鋭意検討した結果、微細加工技術を用いて、試料を担持させる反応領域を線形状の空間として複数並列的に配置することにより、試料間の干渉を防止した高精度な検出を実現できると共に、安価なラインセンサーにより簡便かつ高精度にデータの読み取りが可能であることを見出した。更に、微細加工される部材として、ポリジメチルシロキサンに着目することにより、更なる低コスト化、および簡便かつ高精度の検出を実現できることを見出した。これらの知見を基礎として本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、複数の並列する、線形状の反応領域となる空間を設けた生体関連分子マイクロアレイに関し、該空間に生体関連分子を担持することにより、生体関連分子によって選択的に捕獲される標的物質を検出するものである。以下、反応領域となる空間の配置形状からバーコードアレイと略することがある。
【００１２】
すなわち、本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、第１部材と第２部材との間に生体関連分子を担持する生体関連分子マイクロアレイであって、
前記第１部材もしくは前記第２部材のいずれか一方において、他方の部材に対する接触面に複数の溝を並列形成し、反応領域となる空間を複数設けてあることを特徴とする。
【００１３】
更に、本発明の第２の発明は、第１部材と第２部材との間に生体関連分子を担持する生体関連分子マイクロアレイであって、
前記第１部材および前記第２部材の互いの接触面に複数の溝を並列形成し、反応領域となる空間を複数設けてあることを特徴とする。
【００１４】
本発明の第３の発明は、第１部材と第２部材との間に生体関連分子を担持する生体関連分子マイクロアレイであって、
前記第1部材には、前記第２部材に対する接触面に複数の線形凸部を並列形成し、
前記第２部材には、前記第１部材に対する接触面に前記線形凸部と一対一に嵌合可能な複数の線形溝部を並列形成し、
前記線形凸部と前記線形溝部とを嵌合させつつ、前記第１部材と前記第２部材とを当接させたとき、前記線形凸部と前記線形溝部との間に反応領域となる空間が形成されるように構成してあることを特徴とする。
【００１５】
本発明の第４の発明は、本発明の第１〜３の発明の生体関連分子マイクロアレイであって、前記反応領域と外部を連通可能とし、前記反応領域に試料を供給する試料供給口と反応領域から試料を回収する試料回収口を設けたこと特徴とする。
【００１６】
本発明の第５の発明は、本発明の第１〜４の発明の生体関連分子マイクロアレイであって、前記第１部材および前記第２部材のうち少なくとも何れか一方を構成する基材が、ポリジメチルシロキサン、もしくは、ポリメタクリル酸メチルなど透明シリコンゴムあるいはプラスチック樹脂であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の第６の発明は、生体関連分子を担持する生体関連分子マイクロアレイであって、複数の線状反応領域を並設したマイクロアレイ本体を有することを特徴とする。
【００１８】
本発明の第７の発明は、前記マイクロアレイ本体を構成する基材が、ポリジメチルシロキサン、もしくは、ポリメタクリル酸メチルなど透明シリコンゴムあるいはプラスチック樹脂であることを特徴とする。
【００１９】
ここで、本明細書中の「生体関連分子マイクロアレイ」という用語は、生体関連分子が担持される、もしくは、実際に担持されたマイクロアレイを意味し、実際に担持されていないものも含む概念である。「生体関連分子」という用語は、被検対象物を認識し得るプローブ分子、つまり、互いに親和性を有する物質の一方を選択的に検出し得る分子認識能を有するものを意味する。したがって、基板上に固定されて互いに親和性を有する物質の一方を選択的に検出し得る分子認識能を有する限り、何れの物質をも含む概念であり、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物等のＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸等の核酸、タンパク質、ペプチド、糖、細胞、微生物等、が好ましく例示されるが、これらに限定されるものではない。生体関連物質は、市販品を利用することができ、細胞、組織等から適当な抽出、精製手段を用いて得られたものを、また、人工的に合成されたものを利用することもできる。生体関連物質として核酸を用いる場合には、公知の方法を用いて細胞もしくは組織より抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡを利用することができ、更には、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。また、タンパク質、ペプチドの場合は、細胞若しくは組織等から抽出、精製されたタンパク質、タンパク質をプロテアーゼ等により酵素的若しくは化学的に切断したペプチド断片、組み換え遺伝子技術を用いて合成されたタンパク質、抗体、酵素等を用いることができる。ここで、物質識別能とは、互いに親和性を有する物質を選択的に識別しえることを意味し、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡの塩基間でのハイブリダイゼーション（相補的結合）能、抗体、抗体フラグメント−抗原間、または、調節因子、受容体−ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、レクチン等間、または、酵素−基質、補酵素等間の生体応答能が、好ましく例示される。したがって、本発明のマイクロアレイは、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、糖鎖チップ、微生物チップ、細胞チップ等として、構成することが可能であり、核酸の配列情報の決定、遺伝子の発現や変異、多様性などの解析、および目的タンパク質の精製、同定、タンパク質の発現、相互作用、翻訳後修飾等の機能解析に好ましく、利用可能である。
【００２０】
また、標的物質は、生体関連物質によって捕獲される物質、つまり、部材に担持された生体関連物質と、先に示したような選択的に識別可能な親和性を有して相互作用する物質である。例えば、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物等のＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸等の核酸、タンパク質、ペプチド、糖、細胞、微生物等、が好ましく例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
マイクロアレイに供せられる被検試料は、環境もしくは生体中に存在する標的物質の存在が疑われる試料の何れをも含む概念である。土壌、水等の環境試料、生体試料、食品試料等を例示することができ、これらは、好ましくは、適当な前処理が施され、また、このましくは、適当な標識で標識される。例えば、標的物質が核酸の場合は、上記試料から微生物、動物もしくは、植物の細胞もしくは組織を抽出、精製もしくは単離し、得られた細胞もしくは組織から適当な手段により核酸試料を調製することが好ましい。細胞、組織からの調製は、通常の核酸の調製方法に基づいて行われる。ｍＲＮＡの場合は、標識ｄＮＴＰの存在下での逆転写反応により、標識ｃＤＮＡとすることが好ましく、また、原核細胞では、トータルＲＮＡを、また、遺伝子の変異や多型を調べる際には、標識プライマ−、若しくは標識ｄＮＴＰの存在下で標的領域をＰＣＲにより増幅しておくことが好ましい。更に、基板上のＤＮＡ断片がオリゴヌクレオチドである場合には、低分子化しておくことが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態を添付した図面に基づき詳細に説明するしかしながら、本発明は、以下に例示する実施の形態に限定されるものではなく、適当な改変形態も本発明に含まれることは理解できよう。
（第１の実施の形態）
図１は、本発明のバーコードアレイの上面図であり、本発明の基本的構成を示す概略図である。図２は、図１のＡ−Ａ線断面図であり、第１の実施の形態として構成された場合における本発明のバーコードアレイを模式的に図示する。以下、図２における上側を「上方」、と、下側を「下方」というものとする。
【００２３】
図１および図２に示す通り、本発明のバーコードアレイは、第１部材１と第１部材１の上面に固定配置された第２部材２から構成されており、第１部材１と第２部材２との間には、バーコード形状に配置された反応領域３となる空間が設けられている。
【００２４】
第１部材１は平坦な板状体として構成されている。第２部材２は平坦な板状の基材に表面処理が施され、その第１部材１との接触面に、複数の一方向に延伸する溝６がバーコード形状に並列形成されている。つまり、第2部材２は、その第1部材との接触面側に、複数の線形状の溝６と、該各溝６を区画する隔壁７が交互に並列する空間構造を有している。各溝６は、互いに略平行に配置されることが好ましい。また、図２においては、溝６の断面形状は、溝６の底部が平坦な四角形であるが、これに限定されるものではなく、底部に向かって狭くなる逆三角形や台形等、任意の形状に形成してもよい。
【００２５】
そして、第２部材２に形成された各隔壁７の下端面は、第１部材１と緊密に接着されている。このように構成することにより、第2部材２に形成された各溝６の開口は封止され、隔壁７と第１部材１により完全に隔てられた線形形状の反応領域３となる空間が形成される。これにより、反応領域３から外部、つまり、隣接する反応領域３に流体が散逸するのを確実に防止することができることから、隣接する反応領域３間での試料のコンタミネーションを確実に防止することが可能となる。
【００２６】
第1部材１と第２部材２を構成する基材としては、例えば、ガラス板、石英板、シリコンウェファーなどが好ましく例示されるが、従来用いられる何れの公知の材料をも用いることができる。特に、成形容易性および光学的特性の観点から、光学的観点から、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ、以下、ＰＤＭＳと略する。）、アクリル樹脂のポリメタクリル酸メチル（ｐｏｌｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ、PMMA、ポリメチルメタクリレート）が好ましく例示される。また、第1部材１と第２部材２を同一の基材を用いて形成することができ、また、異なる基材を用いて形成することもできる。第１部材１、第２部材２の形状、大きさ、厚さ等、いずれも、特に、制限はないが、形状は板状体であることが特に好ましい。また、部材の大きさは、反応領域３の数、大きさ、形状等に応じて適宜決定され、一例として、２６×７６ｍｍが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、第１部材１、第２部材２の厚さは、部材を構成する基材の種類、部材に要求される形状の安定性、設けられる反応領域３の数、大きさ、形状等に応じて適宜決定されるものとし、第１部材１と第２部材２の適合性をも考慮して決定される。  
【００２７】
ＰＤＭＳは、シリコンエラストマーの一種であり、透明性が極めて高く、光学的特性に優れており、広い波長領域での吸収が小さく、特に、可視光領域での吸収が極めて小さく、蛍光検出にもほとんど影響しないため、ＰＤＭＳをマイクロアレイ基板として用いることにより、Ｓ／Ｎ値を低くできる。更に、鋳型に対する追従性が高く、ナノからミクロンオーダーでの微細加工が容易であり、任意の微細構造に成形しやすいという特性を有している点で、各種光学機器に最適な形にマイクロアレイを微細加工できるという利点がある。また、ＰＤＭＳはそれ自体、ガラス、アクリル樹脂などと密着性がよい性質を有しており、微細加工を施されたＰＤＭＳ部材に平坦なガラス、アクリル樹脂部材を当接させることにより、接着剤等での接着等の接着手段を用いなくとも流路や、チャンバーを形成することが可能となる。
【００２８】
反応領域３の形状は線形状の空間であり、バーコード形状に、第１部材１と第2部材２の間に複数並列形成されている。反応領域３は、生体関連分子の固相化領域として、基板に固相化される生体関連分子、試料、反応溶液の注入、キャピラリー現象によるこれらの拡散のための流路として、生体高分子をガラスPDMS等の基板に結合させる反応に用いるべく構成される。
【００２９】
また、ハイブリダイゼーション、抗原抗体応答反応等の実施領域として、さらには、生体関連分子等を固相化した状態で保存する際にはチャンバーとしての役割を有するべく構成されている。
【００３０】
この他に、ハイブリダイゼーション、抗原抗体応答反応等の実施は、反応領域３に生体関連分子を固相化した後、アレイを構成する二つの部材の内のいずれか一方（例えば、構成部材がガラスと線形状に加工したPDMSである場合には、PDMS）を剥がし、生体関連分子を固相化した領域全体をカバーできる別の部材（例えば、PDMSチャンバー）で覆い、ハイブリダイゼーション、抗原抗体応答反応等を、このチャンバー内で同時に行うように構成することも可能である。このように構成することにより、アレイ全体を一つの反応槽中で反応させることが可能となることから、煩雑な処理を経なくとも、線形状に形成された各反応領域３を同一の試料で均等に接触させることが可能となる。
【００３１】
反応領域３の長さ、幅、奥行き、および反応領域３間の間隔等、いずれも、特に制限はなく、生体関連分子、反応液、試料等を充分かつ均等に展開し、反応に良好な反応液を保持でき、所望の反応を実施できる空間を確保できれば、適宜設計されるものである。反応領域３の幅は、１０−２００μｍとすることが好ましく例示されるが、これに限定されるものではない。また、反応領域３の幅や間隔をバーコードのように変えて判定情報を読み取れるように構成することも可能である。
【００３２】
そして、図１に示す通り、反応領域３と外部を連通可能とする、試料供給口４と試料回収口５を設けた構成とすることができる。試料供給口４は、適切な試料供給手段と接続され反応領域３内に試料を供給する開口であり、試料回収口５は、適切な試料回収手段と接続され反応領域３外に試料を回収、排出する開口である。試料供給口４と試料回収口５は、かかる機能を有し、反応領域３内における所望の反応を妨害するものではない限り、その形状、大きさ、設定位置等、特に制限はなく、適宜設計され得る。したがって、図１においては、第２部材２の反応領域３の長手方向の一端に試料供給口４を設け、また、他端に試料回収口５を設けた構成が開示されているが、これに限定されるものではなく、試料供給口４と試料回収口５とが一つの開口を共有するべく構成することも可能であり、また、第2部材２の反応領域３の真上、または、側方向に、また、第１部材１に形成することも可能である。
【００３３】
適切な試料供給手段、試料回収手段としては、ガラス製シリンジ、プラスチックシリンジ、マイクロピペッター、フッ化エチレン樹脂チューブ・シリコンチューブ、塩ビチューブ、ペリスタポンプ、プランジャーポンプ、シリンジポンプ等が、もしくは、これらを組み合わせが、好ましく例示される。これらの材質は、核酸、タンパク質等の試料中の物質を非特異的に吸着しないものであることが好ましい。
【００３４】
次に、本発明の第１の実施の形態のバーコードアレイの製造方法について説明する。まず、部材表面に微細加工を施す、つまり、第２部材２の第１部材１との接触面に溝６構造を形成する。基板表面に溝を形成する方法は、公知の微細加工技術のいずれの方法をも使用することができる。直接的に形成する方法として、微細加工用ドリル、ブロード等を用いて機械的切削加工法により溝部分を取り除く方法、フォトリソグラフィー、電子ビームリソグラフィー等の電離放射線リソグラフィーまたはＡＦＭリソグラフィー、物理的、化学的エッチングにより、溝部分を取り除く方法等、あるいは、これらの方法を組み合わせて用いることが例示される。更に、上記で説明した方法に準じて作製した、所望の溝構造に反転する凸部構造を有する鋳型を用いて該空間構造を転写することにより、間接的に溝を形成することも可能であり、例えば、鋳型を用いた射出成形、もしくは高温でのプレスモールド等を用いることができる。
【００３５】
微細構造が施される部材を構成する基材としてＰＤＭＳを用いる場合には、ＰＤＭＳは鋳型に対する追従性が高いので、鋳型を用いて形成する方法が特に好ましく利用できる。鋳型を用いることにより、一旦、鋳型を作製すると、簡便かつ安価に大量のチップを生産できるため、製造コスト削減することができる。
【００３６】
次に、微細加工を施された第２部材２の隔壁７（凸部）の上端面と、第１部材１を接着させることにより、溝６の開口を封止する。第１部材１と第２部材２は、好ましくは緊密に接着されるものとし、これにより、反応領域間での試料のコンタミネーションを確実に防止することが可能となる。接着方法は、接着剤を塗布することにより接着可能であるが、ＰＤＭＳはそれ自身、ガラス、アクリル樹脂などの平面に密着するという性質を有することから、一方の部材にＰＤＭＳを用いた場合は、他方の部材として例えば、平らなガラスを用いる場合、ガラス用洗剤(セミコクリーン（フルウチ化学製）等、または０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液等)で有機物、ゴミなどを取り除けば接着剤なしで接着することが可能となる。また、プラズマエッチング装置を用いて表面を酸素で処理するとより強固な接着が可能となる。
【００３７】
次に、特に、好ましい形態として、鋳型法を用いたＰＤＭＳチップの具体的な作成手順について簡単に説明する。鋳型の形成は、公知の微細加工技術を何れをも使用することができ、フォトリソグラフィー技術とエッチング技術を組合わせて利用することが、好ましく例示される。フォトリソグラフィー加工は、シリコンやガラス等の加工する基板上にフォトレジスト（感光性樹脂）を塗布し、熱処理後、所望の流路パターンを形成したフォトマスクを通してレジストを露光し、レジスト層を熱処理した後、所定の現像液で現像することにより行われる。フォトレジストは、露光した部分が現像させるポジ型と、露光されない部分が現像されるネガ型の双方を使用することができ、スピンコート、ロールコート、ディップコート等、公知の手段により、基板上に均一に塗布される。現像液は、レジストの種類に応じて適宜選択され、ポジ型レジストには、水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液が、ネガ型レジストは、キシレン／アセトン混合液が好ましく、使用される。
【００３８】
次に、好ましくは、上記フォトリソグラフィー処理された基板を、エッチング加工する。エッチングは、硫酸、硝酸、リン酸、フッ酸などの薬液中で行われるウェットエッチング、トリフルオロメタン、テトラフルオロメタン、又は、ヘキサフルオロエタン等を含む、反応性ガスを放電させてプラズマ状態にし、この時発生するラジカル（反応種）とイオンを固体材料と反応させて反応生成物として取り除き、微細パターンを形成するプラズマエッチングに代表される、ドライエッチングの何れをも使用することができるが、溝構造を転写する部材の鋳型からの離型の容易化を図れるとの観点から、エッチングの一方で、ＣＦ、ＣＦ2ラジカル等が基板に付着して離型を容易にする保護膜を形成するプラズマエッチングが特に、好ましく例示される。
【００３９】
続いて、上記のようにして作製された凹凸形状の空間構造をもつ鋳型を型枠内に固定化し、未架橋のＰＤＭＳを適当な重合剤を混合して型に流し込み、硬化させることで、鋳型構造をＰＤＭＳに転写する。硬化後、鋳型から剥離することにより、所望の構造の形状パターンを有するＰＤＭＳ基板が作製できる。硬化温度は、好ましくは、２３℃〜１５０℃であり、硬化温度に応じて、硬化時間を設定するものとし、２３℃にて２４時間、６５℃にて４時間，７５℃にて２時間３０分間、１００℃にて1時間、１５０℃にて１５分間が例示され、好ましくは、７５℃にて２時間３０分間で行うものとする。
【００４０】
次に、本発明の第１の実施の形態のバーコードアレイを用いた標的物質の検出方法について例示的に説明する。まず、反応領域３に、標的物質に対して物質識別能を有する生体関連分子を担持する。生体関連分子は反応領域３となる空間を囲む第1部材１、第２部材２表面に固相化される。第１部材１表面、第2部材２表面の何れかのみに固相化すること、また、双方に固相化すること何れも可能である。また、固相化は、第1部材１と第２部材２を接着させた後に行うこともできるが、これらを接着する前に行うことも可能であり、適宜、選択されるものである。部材の接着後に生体関連物質の固相化を行う場合は、生体関連物質を含有する試料を、試料注入口から注入することにより行われる。
【００４１】
部材表面に生体関連分子を固相化する方法は、公知の何れの方法を利用することができ、固相化される物質の種類や部材を構成する基材の種類に応じて、適宜最適な方法が選択される。例えば、固相化される生体関連分子が核酸の場合は、静電結合、共有結合が、また、タンパク質の場合は、共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法、あるいは、生物学的特異結合等の担体結合法、架橋法、高分子物質で包み込む包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）が好ましく利用される。核酸に関して、具体的方法としては、DNAの荷電を利用してポリリジン、ポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで担体表面に静電結合させる方法、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤で表面処理された担体に、末端に官能基としてアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチン等が導入されたDNAとを共有結合させる方法等を好ましく例示することができる。その後、必要に応じて、紫外線照射、化学架橋剤によるクロスリンク形成、表面のブロッキング、洗浄等の処理を行うものとする。ここで、固相化とは、生体関連分子が本来の活性を損なうことなく、基板表面から実質的に脱離しないことを意味する。
【００４２】
次に、標的物質を捕獲するための反応を実施する。試料供給口４から、適当な前処理を行った被検試料溶液、ハイブリダイゼーション溶液等の反応溶液、洗浄液等を、反応領域３内に供給し、所定の反応後、試料回収口５を介して、反応領域３から、回収、排出する。
【００４３】
また、ハイブリダイゼーション、抗原抗体応答反応等の実施は、反応領域３に生体関連分子を固相化した後、アレイを構成する二つの部材の内のいずれか一方（例えば、構成部材がガラスと線形状に加工したPDMSである場合には、PDMS）を剥がし、生体関連分子を固相化した領域全体をカバーできる別の部材（例えば、PDMSチャンバー）で覆い、ハイブリダイゼーション、抗原抗体応答反応等を、このチャンバー内で同時に行うように構成することも可能である。このように構成することにより、アレイ全体を一つの反応槽中で反応させることが可能となることから、煩雑な処理を経なくとも、線形状に形成された各反応領域３を同一の試料で均等に接触させることが可能となる。
【００４４】
反応後、マイクロアレイ上の生体関連分子と相互作用した被検試料中の標的物質を、例えば、標識物質を指標として検出する。検出手段は、好ましくは、バーコードリーダーのようなラインセンサーが例示される。安価なラインセンサーでデータの読み取りが可能であることから、検出コストの軽減を図ることができる。また、ラインセンサーで読み取る際には、反応領域上を走査する限り、反応領域に直交する方向、もしくは、斜交する方向等、いずれの方向から読み取ることが可能であるため、マイクロスキャナーを利用する場合のような厳密な位置決めが不要であるため操作を簡便化することが可能となる。
【００４５】
ここで、本発明の第１の実施の形態においては、第２部材２に溝６を形成した形態を例示的に説明したが、第１部材１に溝６を形成した逆形態も、好ましく本実施の形態として、例示される。
（第２の実施の形態）
次に、図３をもって、本発明の第２の実施の形態のバーコードアレイについて、説明する。図３は、図１のＡ−Ａ線断面図であり、第２の実施の形態として構成された場合における本発明のバーコードアレイを図示する。第１の実施の形態のバーコードアレイと同一の構成については、図中、同一の符号をもって、説明を省略する。
【００４６】
第１部材１および第2部材２は共に、平坦な板状の基材に表面処理が施され、その他方の部材との接触面に、複数の一方向に延伸する溝６がバーコード形状に並列形成されている。つまり、第１部材１と第2部材２とは共に、その第1部材１との接触面側に、複数の線形状の溝６と、該各溝６を区画する隔壁７とが交互に並列する空間構造を有している。そして、第1部材１と第２部材２とを当接させた時に、第１部材１に形成された溝６と、第２部材２に形成された溝６とが、夫々、一対一に対向するように構成されている。
【００４７】
そして、第１部材１に形成された各隔壁７の上端面と第２部材２に形成された各隔壁７の下端面とは緊密に接着されている。このように構成することにより、第１部材に第2部材に形成された各溝６の開口が1つの空間を形成し、隔壁７、第１部材および第２部材により完全に隔てられた線形状の反応領域３となる空間が形成される。
（第３の実施の形態）
次に、図４をもって、本発明の第３の実施の形態のバーコードアレイについて説明する。図４は、図１のＡ−Ａ線断面図であり、第３の実施の形態として構成された場合における本発明のバーコードアレイを模式的に図示する。第１の実施の形態のバーコードアレイと同一の構成については、図中、同一の符号をもって説明を省略する。
【００４８】
第１部材１は、平坦な板状の基材に表面処理が施され、第２部材２との接触面に、複数の一方向に延伸する線形凸部８がバーコード形状に並列形成されている。そして、第２部材２も、平坦な板状の基材に表面処理が施され、第１部材１との接触面に前記線形凸部８と一対一に嵌合可能な複数の線形溝部１０を並列形成されている。つまり、第１部材１は、その第２部材２との接触面側に、複数の線形凸部８と、該線形凸部８を区画する凹部９とが交互に並列する空間構造を有し、第２部材２は、その第1部材１との接触面側に、複数の線形溝部１０と、該各溝部１０を区画する隔壁７とが交互に並列する空間構造を有している。そして、前記線形凸部８と前記線形溝部１０とを嵌合させつつ、前記第１部材１と前記第２部材２とを当接させたとき、前記線形凸部８と前記線形溝部８との間に反応領域３となる空間が形成されるように構成している。
【００４９】
そして、第１部材１に形成された各凹部９と第２部材２に形成された隔壁７とが緊密に嵌合接着されている。このように構成することにより、前記線形凸部８と前記線形溝部１０との間に反応領域３となる線形形状の空間が形成され、該空間は、隔壁７、第１部材１および第２部材２により外部から完全に隔てられる。このように、基板表面において、反応領域と反応領域以外の領域との間に高低差を設けておき、反応領域表面に検出の焦点をあわせることにより、バックグラウンドからのノイズ検出量を低減させることが可能となり、Ｓ／Ｎ値を向上させることが可能となる。
【００５０】
第１部材１に形成される線形凸部８の高さ、形状等、および、第２部材２に形成される線形溝部１０の高さ、形状は、前記線形凸部８と前記線形溝部１０とを嵌合させつつ、前記第１部材１と前記第２部材２とを当接させたとき、前記線形凸部８と前記線形溝部１０との間に反応領域３となる空間が形成されるよう構成される限り、適宜設定されるものではあるが、線形凸部８の高さは、好ましくは、１μｍ〜１ｃｍに形成され、特に好ましくは、１０μｍ〜１ｍｍである。
【００５１】
ここで、本発明の第３の実施の形態として、第１部材１に線形凸部８を、第２部材２に線形溝１０を形成する形態を例示的に説明したが、第１部材１に線形溝１０を、第２部材２に線形凸部８を形成する逆形態も好ましい本実施の形態として例示される。
（他の実施の形態）
以下に、本発明の他の実施の形態に関して説明する。
（１）  本発明の生体関連分子マイクロアレイの構成として、一方もしくは双方に微細加工を施した二つの部材を接着させ、その間に形成された反応領域内に生体関連分子を担持させるものについて説明したが、微細加工を施した一の部材のみで構成したものを採用してもよい。つまり、一の部材を造溝加工して、複数の線状の溝を並列形成し、この線状溝を反応領域として生体関連分子を担持させて反応を行うものでもよい。加工される部材としては、成形容易性および光学的特性の観点から、光学的観点から、ポリジメチルシロキサン、もしくは、ポリメタクリル酸メチルなど透明シリコンゴムあるいはプラスチック樹脂等が例示される。このように構成することにより、閉鎖系領域だけでなく、開放系領域でおいても、ハイブリダイゼーション等の反応を実施することができると共に、成形容易、かつ、光学的特性にも優れた生体関連分子マイクロアレイを提供することができる。
（２）  次に、一の部材を穴あけ加工して、複数の線状の孔を並列形成し、この線状孔を反応領域として生体関連分子を担持させて反応を行うものでもよく、加工される部材としては、成形容易性および光学的特性の観点から、ポリジメチルシロキサン、もしくは、ポリメタクリル酸メチルなど透明シリコンゴムあるいはプラスチック樹脂等が例示される。
【実施例１】
【００５２】
以下、本発明を実施例により、具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  ＰＤＭＳチップの作製
（１）鋳型の作製
シリコンウェハー（径4インチ、信越化学製）表面を過酸化水素硫酸（過酸化水素：硫酸=1：2）で、続いてバッファードフッ酸で洗浄し、洗浄後、ウェハーを蒸留水ですすぎ、乾燥した。次に、ウェハー上にネガ型エポキシ系硬膜レジストＳＵ−８（Ｍｉｃｒｏ  Ｃｈｅｍ社.製）をスピンコーターを用いてスピンコートした。スピンコートの条件を、以下に示す。
【００５３】
スピンコート条件（1例、流路高100μｍの場合）
ｓｌｏｐｅ  ５秒→５００ｒｐｍ  ５秒→ｓｌｏｐｅ  １０秒→２８００ｒｐｍ  ３０秒→ｓｌｏｐｅ  ５秒
スピンコート後、最低１時間以上、静置した後、ウェハーを６５℃にて１０分間、および、それに続く、95℃にて30分間、熱処理を行った。
【００５４】
次に、ウェハーの上に所望の流路パターンに反転する凸部パターンが得られるフォトマスクをのせ、露光装置上で４５秒間（流路高100μｍの場合）、紫外線照射することにより、露光した。ここで、露光時間は、所望の流路高を得るべく、調製されるものである。露光後、ウェハーを６５℃にて３分間および、それに続く、９５℃にて10分間、熱処理を行った。ウェハーをＳＵ‐８現像液（メルク社）に入れ、１５分間振とうしながらレジスト層を現像することにより、未重合のＳＵ−８を除去した。
【００５５】
次に、２−プロパノールで１０分間振とうしながらウェハーを洗浄し、続いて、蒸留水で洗浄後、ウェハーを乾燥した。乾燥後、プラズマエッチング装置にてウェハー表面をトリフルオロメタン（ＣＨＦ３）で処理した。所望の流路構造に反転した凸部が構築された鋳型を得、以下に示すＰＤＭＳの微細加工用の鋳型として用いた。
【００５６】
（２）鋳型からの転写
Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）とキュア剤（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を製造業者の指示に従い、重量比１０：1の割合で測り取り、混合した。24mm×76mm×2mm寸法のものを作るのに約５g必要となり、形成する基板の寸法に応じて、適量測り取る。
【００５７】
次に、この混合液をデシケーター内で脱気し、脱気後、ウェハーをセットした型に脱気済ＰＤＭＳを流し込んだ。そして、75℃のオーブンで2時間半加熱することによって、硬化させた。硬化したＰＤＭＳを鋳型から剥離することにより、鋳型の凸部が転写された溝を備えたＰＤＭＳチップを作製した。
（発明の効果）
【００５８】
本発明のバーコードアレイによれば、線状形空間に区画成形された反応領域に試料を流し込むことから、隣接する反応領域による干渉を防止できる共に、ターゲットDNAの非特異的な基板上への吸着を防止でき、ノイズを低減できることから、高精度な検出が可能となる。
【００５９】
更に、基板表面において、反応領域と、反応領域以外の領域との間に、高低差を設けることにより、バックグラウンド蛍光等を低減させることが可能となり、Ｓ／Ｎ値を向上させることが可能となる。
【００６０】
また、高価なマイクロアレイスキャナーを用いずとも、汎用のラインセンサーで、検出が可能となり、コスト削減が可能となると共に、マイクロアレイスキャナーのような正確位置決めがなくとも検出が可能であることから、操作の簡便化を図ることが可能となる。
光学的特性に優れたＰＤＭＳを基板を構成する基材として使用することにより、低バックグラウンドを達成でき、高いＳ／Ｎ比により検出が可能となる共に、成形容易性にも優れていることから、ナノ、ミクロンオーダーでの加工が容易となり、各種光学的機器に最適な形に製造が可能となり、鋳型を用いた成形方法を採用することにより、大量生産を可能とし、更なるコスト削減効果が期待できる。
また、本機器は前処理のみ、各々の試料に適した方法を用いることにより、何れの試料にも適用可能であるため、環境試料中に含まれる微生物、食品の遺伝子検査、医療分野における遺伝子診断、テーラーメイド医療などへの応用が期待され、バイオ機器の発展に貢献する。
【００６１】
また、本発明の生体関連分子マイクロアレイによれば、閉鎖系領域だけでなく、開放系領域での反応が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明のバーコードアレイの上面図であって、本発明の基本的構成を示す概略図
【図２】図１のＡ−Ａ線断面図であり、第１の実施の形態として構成された場合における本発明のバーコードアレイを図示する模式図
【図３】図１のＡ−Ａ線断面図であり、第２の実施の形態として構成された場合における本発明のバーコードアレイを図示する模式図
【図４】図１のＡ−Ａ線断面図であり、第３の実施の形態として構成された場合における本発明のバーコードアレイを図示する模式図
【符号の説明】
【００６３】
１    第1部材
２    第２部材
３    反応領域
４    試料供給口
５    試料回収口
６    溝
７    隔壁
８    線形凸部
９    凹部
１０  線形溝部
【図１】
2005030927.tif 000003
【図２】
2005030927.tif 000004
【図３】
2005030927.tif 000005
【図４】
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