(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトｂｃｌ−２蛋白質の生合成を特異的に強く抑制する物質を提供する。【解決手段】ヒトｂｃｌ−２蛋白質のメッセンジャーＲＮＡの特定の塩基配列に対応するｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列を用いる。【効果】本発明のｓｉＲＮＡによってヒトｂｃｌ−２蛋白質の発現を強く抑制することが出来る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトｂｃｌ−２蛋白質の発現を抑えるｓｉＲＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトｂｃｌ−２蛋白質の発現を抑制するｓｉＲＮＡ配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｂｃｌ−２遺伝子はヒト濾胞性Ｂ細胞リンパ腫に付随するｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）転座点の解析から、辻本らによって単離された癌遺伝子である（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８，１９８６）。その後、Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒのグループによって、ｂｃｌ−２蛋白質の過剰発現がリンパ球系細胞に誘導されるアポトーシスを抑制することが示され（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３４８：３３４−３３６，１９９０）、ｂｃｌ−２はアポトーシスのメカニズム研究の中心的存在となり、現在に至っている。現在までにｂｃｌ−２遺伝子の類似関連遺伝子として、ｂｃｌ−ｘ，ｂｃｌ−ｗ，ｍｃｌ−１，ｂｆｌ−１／Ａ１，ｂａｘ，ｂａｄ，ｂｉｋなどが同定・報告され、ｂｃｌ−２ファミリーと呼ばれている。ｂｃｌ−２蛋白質はＣ末端付近に膜貫通領域を有し、ミトコンドリア外膜、小胞体膜および核外膜などの核分画に局在する。ｂｃｌ−２はアポトーシス誘導刺激によるミトコンドリアの膜電位低下とそれに伴うａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＡＩＦ）やシトクロムｃの細胞質への流出を阻害することにより、抗アポトーシス作用を示す（Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．：Ｎａｔｕｒｅ，３８７，７７３−７７６，１９９７）。
細胞の癌化は増殖異常だけでなく、アポトーシス異常が関与する。多くの固形癌由来の癌細胞は抗癌剤によるアポトーシスに抵抗性を示し、こうしたアポトーシス耐性が化学療法に対する抵抗性に関連することも明らかとなってきた。ｂｃｌ−２は抗癌剤によるアポトーシス作用に大きく影響している。実際に、アポトーシス抑制因子であるｂｃｌ−２遺伝子を癌細胞に導入すると、種々の抗癌剤に対するアポトーシス耐性が引き起こされる。臨床癌においても、ｂｃｌ−２蛋白質の関与が指摘されている。非ホジキンリンパ腫ではｂｃｌ−２蛋白質の発現が高い場合には、予後が悪いことが示されている（Ｒａｓｓｉｄａｋｉｓ，Ｇ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ，１００，３９３５−３９４１，２００２）。以上のように、ｂｃｌ−２は癌治療の戦略上、とても魅力的な標的遺伝子であるといえる。したがってｂｃｌ−２蛋白質の発現を抑える方法を考案することが癌の治療の確立に大きく寄与すると考えられる。
【０００３】
ｂｃｌ−２蛋白質はミトコンドリア外膜、小胞体膜および核外膜などに局在するので、抗体等で、その作用を阻害するなどの戦略が成立しないため、ｂｃｌ−２蛋白質の生合成そのものを抑制することが必須となる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトｂｃｌ−２蛋白質の生合成を特異的に強く抑制する物質を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
特定の蛋白質の生合成を阻害するためには、その蛋白質の生合成を指令するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とすることが考えられる。すなわち、標的遺伝子のｍＲＮＡの働きを抑制し、かつそのｍＲＮＡ自体を分解に導く戦略、つまりＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅを基本原理とする遺伝子発現制御システムを選択した。ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの現象は、１９９８年、Ｆｉｒｅらによって報告された、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに２本鎖ＲＮＡを導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定遺伝子のノックダウンに成功したという発表（Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ：３９１，８０６−８１１，１９９８）により広く知られるようになった。使用された２本鎖ＲＮＡのターゲット遺伝子に対する特異性は、非常に高くターゲット配列に相補しない２本鎖ＲＮＡでは一切の発現制御効果を示さなかった。次いで、この実験系を哺乳動物に応用する試みがなされたが、２本鎖ＲＮＡの導入に伴う、インターフェロン作用が働くため、哺乳動物細胞の遺伝子をターゲットとした２本鎖ＲＮＡは使用できない事が大きな問題となった。その後、Ｔｕｓｃｈｌの研究グループがもっとも効率よく遺伝子をノックダウンする２本鎖ＲＮＡの研究をすすめ、３’末端に２塩基のオーバーハングを持った２１−ｍｅｒという短い２本鎖を用いると、哺乳類細胞で問題となっていたインターフェロン作用を引き起こさずにＲＮＡｉを機能させることができると報告した。このような短い２本鎖ＲＮＡをｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ぶ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８，２００１，Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．ｅｔａｌ：Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９，２００１）。申請者らは、ヒトｂｃｌ−２  ｍＲＮＡに作用し、ヒトｂｃｌ−２蛋白質の生合成を阻害可能なｓｉＲＮＡの塩基配列を見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、（１）ヒトｂｃｌ−２蛋白質の生合成を強く抑制するｓｉＲＮＡ配列の決定からなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下添付の図面に従ってこの発明を詳細に説明する。図１は検討した５種のｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡと陰性コントロールとして使用した２種のｓｉＲＮＡの構造を示す。図２は５種のｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡをヒト腎癌細胞（ＡＣＨＮ）に投与し、細胞可溶化液中のｂｃｌ−２蛋白質発現の抑制を調べるウエスタンブロットとバンドの濃さを定量化したデンシトメーター解析のグラフ、図３は、ｂｃｌ−２蛋白質の生合成阻害に最も有効であることが判明したｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３とそのスクランブル配列ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３−ＳＣＲ等をＡＣＨＮ細胞に投与し、回収した細胞の可溶化液中のｂｃｌ−２蛋白質発現の抑制を図２と同様に検討した結果を示す。
【０００８】
１．ｓｉＲＮＡの分子設計について説明する。ヒトｂｃｌ−２のｍＲＮＡ（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８，１９８６）は既に報告されている。その翻訳領域の中で工夫をこらして選択を行った。まず、ＡＡおよびＣＡから始まるターゲット配列よりＧＣ含有量が４５〜５５％の２１塩基の候補配列４２種を選択し、「ＧＣの偏り」が比較的少ない配列８種に候補を絞った。続いて、この８種について、ＢＬＡＳＴサーチによる類似配列の検索を行い、類似配列の少ないターゲットを選択し、かつその近傍二次構造解析結果を参考に、比較的立体障害の影響の少ないと想定できる５種を最終的に選択した。なお、この配列から出発して、ターゲット配列との相補性に影響の少ない置換、付加を行った配列は請求に含まれる。また、ｓｉＲＮＡの３’末端に付加するオーバーハングの選択において、ｄＴｄＴ以外の２塩基についても請求に含まれる。
【０００９】
２．ｓｉＲＮＡによるｂｃｌ−２蛋白質の生合成抑制の効果判定について説明する。ｓｉＲＮＡをｂｃｌ−２蛋白質を発現している細胞に投与し、所定時間後、細胞を回収、これを可溶化し、可溶化液中に含まれるｂｃｌ−２蛋白質を免疫生化学的に定量する。すなわち、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウェスタンブロッティングそしてデンシトメーターによる定量が考えられる。抗ｂｃｌ−２抗体は、市販品を使用する。
【００１０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１１】
（実施例１）ｓｉＲＮＡの作成を行った。ヒトｂｃｌ−２のｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００６３３：Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５２１４−５２１８，１９８６）の翻訳領域および３’末端非翻訳領域から前述の配列選定法に基づいて設計したｓｉＲＮＡ５種をＤｈａｒｍａｃｏｎ社に依託し合成した。合成したｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘは図１に示す如くであり、各ｓｉＲＮＡのｍＲＮＡの標的部位は下記の如くである。
ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃１（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列６５４番目から６７２番目；ＧＡＣＵＣＵＧＣＵＣＡＧＵＵＵＧＧＣＣ；ＧＣ含有量５２％）、
ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃２（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列５１５番目から５３３番目；ＡＣＡＵＣＧＣＣＣＵＧＵＧＧＡＵＧＡＣ；ＧＣ含有量５２％）、
ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列６１４番目から６３２番目；ＧＣＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡ；ＧＣ含有量５２％）、
ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃４（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列１４４３番目から１４６１番目；ＧＣＵＡＣＣＡＡＵＵＧＵＧＣＣＧＡＧＡ；ＧＣ含有量４７％）ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃５（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列４０８１番目から４０９９番目；ＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＡＵＵＣＵＣＵＣＣ；ＧＣ含有量４７％）
【００１２】
配列番号１  ５’−（ＡＡ）ＧＡＣＵＣＵＧＣＵＣＡＧＵＵＵＧＧＣＣ−３’
配列番号２  ５’−（ＣＡ）ＡＣＡＵＣＧＣＣＣＵＧＵＧＧＡＵＧＡＣ−３’
配列番号３  ５’−（ＣＡ）ＧＣＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡ−３’
配列番号４  ５’−（ＡＡ）ＧＣＵＡＣＣＡＡＵＵＧＵＧＣＣＧＡＧＡ−３’
配列番号５  ５’−（ＣＡ）ＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＡＵＵＣＵＣＵＣＣ−３’
【００１３】
（実施例２）ｓｉＲＮＡによるｂｃｌ−２蛋白質生合成の抑制を検討した。ｂｃｌ−２蛋白質を発現しているヒト腎癌細胞（ＡＣＨＮ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１６１１）を３５ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，３００１）に３×１０５個／ディッシュ［ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％／ＭＥＭ培地（ＭＥＭ）］の細胞密度で正確にまき、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１晩前培養した。あらかじめ、２０μＭに濃度調整したｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃１，＃２，＃３，＃４，＃５の各々をそれぞれ５μｌとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  １０５μｌと混合し、プラス試薬（インビトロジェン社）１０μｌを加え、よく混合し、室温で１５分反応させた。さらに、リポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）４μｌを加え、室温で１５分反応させ、ｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は３５ｍｍディッシュで１枚に投与可能な量である。続いてＡＣＨＮ細胞に新鮮なＭＥＭ  ０．８ｍｌを満たし、前述のｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液を０．２ｍｌを加えた後、３７℃、４時間トランスフェクションを行った。このとき、ｓｉＲＮＡの投与濃度は１００ｎＭとなる。１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ  １ｍｌを加え、６時間培養した。細胞をＭＥＭで洗浄し、新鮮なＭＥＭ  ２ｍｌを加え、さらに４８時間培養を続けた後、細胞を可溶化した。調製した各細胞可溶化液をＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２％ゲル，３０μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｌａｎｅ）した後、抗ｂｃｌ−２抗体を用いたウエスタンブロットを行った。その結果を図２Ａに示す。
レーン３および４に示す如く、ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３およびｂｃｌ−２ｓｉＲＮＡ  ＃４を投与することにより、ｂｃｌ−２蛋白質に特異的なバンドの減弱を認めた。各バンドの濃度をデンシトメータで測定したところ、無処理細胞のバンドを１００％とすると、ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃１では３５％、ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃２では５２％、ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３とｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃４ではともに３％、ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃５では３９％のバンドの濃さであることが明らかとなった（図２Ｂ）。抗β−ａｃｔｉｎ抗体によるβ−ａｃｔｉｎのイムノブロットも合わせて行い、各細胞可溶化液中のβ−ａｃｔｉｎ含量に差がないことを示した（図２Ａ）。
【００１４】
（実施例３）ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡによるｂｃｌ−２蛋白質の生合成抑制の特異性を検討した。すなわち、実施例２において、強力なｂｃｌ−２蛋白質の生合成抑制を認めたｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３のアンチセンス鎖をスクランブルにし、それに相補的な２本鎖ＲＮＡ（ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３−ＳＣＲ）を新たに合成し、陰性コントロールとして用いた。また、葉緑体ゲノム配列から選択したｓｉＲＮＡも新たに合成し、哺乳類細胞に対する陰性コントロールとして用いた。なお、ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃４もｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３とほぼ同等のｂｃｌ−２蛋白質の生合成抑制を示したが、標的配列を３’末端非翻訳領域内から選出しているため、検討から除外した。すなわち、標的配列が翻訳領域内であるｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３を最終選択した。
ｂｃｌ−２蛋白質を発現しているヒト腎癌細胞（ＡＣＨＮ）を実施例２で示した如く、３５ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，３００１）にまき、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で１晩前培養した。あらかじめ、２０μＭに濃度調整したｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３等をそれぞれ５μｌとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  １０５μｌと混合し、プラス試薬（インビトロジェン社）１０μｌを加え、よく混合し、室温で１５分反応させた。さらに、リポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）４μｌを加え、室温で１５分反応させ、ｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は３５ｍｍディッシュで１枚に投与可能な量である。続いてＡＣＨＮ細胞に新鮮なＭＥＭ  ０．８ｍｌを満たし、前述のｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液を０．２ｍｌを加えた後、３７℃、４時間トランスフェクションを行った。このとき、ｓｉＲＮＡの投与濃度は１００ｎＭとなる。１０％  ＦＢＳ／ＭＥＭ  １ｍｌを加え、６時間培養した。細胞をＭＥＭで洗浄し、新鮮なＭＥＭ  ２ｍｌを加え、さらに４８時間培養を続けた後、細胞を可溶化した。調製した各細胞可溶化液をＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２％ゲル，３０μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｌａｎｅ）した後、抗ｂｃｌ−２抗体を用いたウエスタンブロットを行った。その結果を図３に示す。レーン１のｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３においてのみ、ｂｃｌ−２蛋白質の特異バンドが減弱した。レーン２のｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３−ＳＣＲやレーン３の葉緑体ゲノムに対するｓｉＲＮＡを投与しても、ｂｃｌ−２蛋白質の発現は無処理（レーン４）と比較してほとんど抑制されなかった。抗β−ａｃｔｉｎ抗体によるβ−ａｃｔｉｎのイムノブロットも合わせて行い、各細胞可溶化液中のβ−ａｃｔｉｎ含量に差がないことを示した（図３）。
【００１５】
【発明の効果】
以上図示し説明したように本発明のｓｉＲＮＡによってヒトｂｃｌ−２蛋白質の発現を強く抑制することが出来る。
【００１６】
【配列表】
2005013199.tif 000002
【００１７】
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【００１８】
2005013199.tif 000004
【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
2005013199.tif 000007
【００２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明における、５種のｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘと２種のコントロールｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘの構造である。
【図２】この発明の一実施例に関わる、ｓｉＲＮＡなどを投与したＡＣＨＮ細胞のヒトｂｃｌ−２蛋白質の産生抑制を示し、Ａはウエスタンブロットの図であり、ＢはＡで検出したｂｃｌ−２に特異的なバンドの濃さをデンシトメータ解析によって数値化したグラフである。
【図３】この発明の一実施例に関わるｓｉＲＮＡなどを投与したＡＣＨＮ細胞のヒトｂｃｌ−２蛋白質の産生抑制を示す。ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ  ＃３によるｂｃｌ−２蛋白質の産生抑制がその塩基配列に特異的であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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