(57)【要約】【課題】  ケモカイン産生が亢進することで生じる免疫及び炎症性疾患の予防又は治療のための医薬品を提供すること。【解決手段】  下式【化１】2005187451.tif 000007で示される化合物を有効成分として含有するケモカイン産生阻害剤。  本発明に係る化合物は、ヒト血管内皮細胞におけるTNF-α刺激によるIL-8、MCP-1産生に対して抑制活性を有するので、免疫及び炎症性疾患の予防又は治療剤として有用である。すなわち、本願発明により、慢性下気道感染症、間質性肺炎、肺線維症などのような炎症性肺疾患、急性及び慢性リューマチ関節炎等の予防又は治療剤を提供することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2005187451.tif 000006
で示される化合物を有効成分として含有するケモカイン産生阻害剤。
【請求項２】
ケモカインがインターロイキン−８である請求項１記載のケモカイン産生阻害剤。
【請求項３】
ケモカインがＭＣＰ−１である請求項１記載のケモカイン産生阻害剤。
【請求項４】
抗炎症剤である請求項１記載のケモカイン産生阻害剤。
【請求項５】
抗リューマチ関節炎剤である請求項１記載のケモカイン産生阻害剤。
【請求項６】
抗炎症性肺疾患剤である請求項１記載のケモカイン産生阻害剤。
【請求項７】
アスペルギルス属に属し、請求項１記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、これを採取することを特徴とする請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項８】
微生物がアスペルギルス エスピー TF-0770を用いることを特徴とする請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項９】
請求項１記載の化合物の生産能を有するアスペルギルス エスピー TF-0770株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−８（Interleukin-8、以下「IL-8」と略す。）及びMCP-1（Monocyte Chemotactic Protein-1：ヒト単球走化活性因子、以下「MCP-1」と略す。）の産生抑制活性を有するシクロペンタンジオール誘導体を有効成分とする免疫及び炎症性疾患の予防剤及び治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、好中球や単球等の白血球の遊走と局所への浸潤を誘導する走化性物質としてその存在が知られている。この「ケモカイン」とは、4つのシステイン残基(Cys)を有し、それぞれのCysを通じてS-S(ジスルフィド)結合を形成する分子量8-12KDの塩基性ヘパリン結合性のタンパク質の総称であり、現在までIL-8、MCP-1及びランテスなど約30種の分子が同定されている。  
そして、このケモカインは生体の炎症反応に重要な役割を担っており、正常組織では検出されず炎症部位で検出され、白血球の組織炎症部位への浸潤を促進させ、炎症の惹起に関与する。
【０００３】
例えば、IL-8は主に好中球を活性化し、細胞接着分子の発現を亢進し、好中球の血管内皮細胞への接着を高める。IL-8は好中球走化能も有し、損傷組織で産生されるIL-8は血管内皮細胞に接着した好中球の組織への遊走を促進し、好中球浸潤に伴う炎症が惹起される。MCP-1もIL-8と同じ機序で炎症を惹起させる。すなわち、MCP-1は主に単球及びTリンパ球を活性化し、これら血球の炎症部位への浸潤に関与する。
【０００４】
例えば、慢性下気道感染症、間質性肺炎、肺線維症などのような炎症性肺疾患、急性及び慢性リューマチ関節炎の患者には、IL-8、MCP-1の両方かあるいはいずれか１つのケモカインの産生が亢進していることがよく知られている。したがって、IL-8、 MCP-1のようなケモカイン産生を抑制する化合物は、たとえば、好中球、単球、Tリンパ球、好酸球、好塩基球あるいはNK細胞などの組織浸潤に基づく種々の疾患の治療及び予防を目的として、抗炎症性肺疾患剤、抗関節炎剤として用いられるものと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、ケモカイン産生が亢進することで生じる免疫及び炎症性疾患の予防又は治療のための医薬品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、式で示されるシクロペンタンジオール誘導体がケモカイン産生を抑制することを見出し、この化合物を有効成分とする医薬を提供する。
【０００７】
本発明者はケモカイン産生を抑制する化合物を見出すため、始めに簡便なスクリーニング法として遺伝子組み換えにより作製したショウジョウバエを用いて自然免疫経路を阻害する物質を探索した。ケモカインやサイトカインの産生、あるいは抗菌ペプチドの産生などを制御している自然免疫の機構は、昆虫からヒトまで共通であることが、最近の研究により明らかとなっている。例えば、ヒトのTNF-α刺激によるケモカイン・サイトカイン産生までの経路は、ショウジョウバエの自然免疫反応を制御するimd経路と相同性を示す。本発明では、この自然免疫の種間共通性を利用してケモカイン産生を抑制する化合物を同定した。まず、遺伝子組み換えショウジョウバエを用いてリポ多糖によって刺激されるimd経路の活性化を抑制する化合物を探索した。その結果、ショウジョウバエの自然免疫経路による内因性抗菌物質発現を抑制する特定のシクロペンタンジオール誘導体物質を見出した。この化合物は、imd経路のうちアダプター分子ImdからRel転写因子Relishにシグナルが伝達される細胞内カスケードに作用していることが明らかとなった。ImdはTNF経路におけるRIPのホモログであり、RelishはNFkBのホモログであることから、このシクロペンタンジオール誘導体物質がヒトのTNF-α刺激によるケモカイン・サイトカイン産生までの経路に作用することが予想された。実際、ヒト血管内皮細胞でTNF-α刺激によるIL-8、MCP-1産生に対しても抑制活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
具体的には、（１）下記式[Ｉ]
【０００９】
【化１】
2005187451.tif 000002
【００１０】
で示される化合物を有効成分として含有するケモカイン産生阻害剤、（２）ケモカインがインターロイキン−８である前記ケモカイン産生阻害剤、（３）ケモカインがＭＣＰ−１（Monocyte Chemotactic Protein-1）である前記ケモカイン産生阻害剤、（４）抗炎症剤である前記ケモカイン産生阻害剤、（５）抗リューマチ関節炎剤である前記ケモカイン産生阻害剤、（６）抗炎症性肺疾患剤である前記ケモカイン産生阻害剤、（７）アスペルギルス  エスピー（Aspergillus sp.）TF-0770(FERM-19560)を用いることを特徴とする前記式[Ｉ]で示される化合物の製造方法及び（８）アスペルギルス  エスピー（Aspergillus sp.）TF-0770(FERM-19560)株である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物はヒト血管内皮細胞におけるTNF-α刺激によるIL-8、MCP-1産生に対して抑制活性を有するので、免疫及び炎症性疾患の予防又は治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明のケモカイン産生阻害剤の有効成分は、式
【００１４】
【化２】
2005187451.tif 000003
【００１５】
の構造式で示されるシクロペンタンジオール誘導体物質である。このシクロペンタンジオール誘導体物質は、例えば、アスペルギルス属に属し、ショウジョウバエの自然免疫経路阻害活性を有するシクロペンタンジオール誘導体物質を産生する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物から該シクロペンタンジオール誘導体物質を採取することにより製造することができる。
【００１６】
本発明のシクロペンタンジオール誘導体物質を生産する菌株は、本発明者らが土壌から新たに分離した菌株であり、微生物の名称「アスペルギルス  エスピー  TF-0770 （Aspergillus sp.TF-0770）」及び微生物寄託番号「FERM P-19560 」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１７】
この菌株の菌学的性状を以下に示す。  
（１）培地上での生育状態 
本菌は、各種寒天平板培地上で、生育および胞子形成共に良好である。各種培地上、２５℃、１週間で形成したコロニーの特徴を次の表１に示した。なお色の表示は、A.Kornerupら著『Dizionario dei colori』Musterschmidt(1978年)のカラーコードを引用した。
【００１８】
【表１】
2005187451.tif 000004
【００１９】
培地１：ツアペック麦芽エキス寒天培地(CYA)  
培地２：麦芽エキス寒天培地(MEA)
培地３：*-3：２０％スクロース入りツアペック麦芽エキス寒天培地(CY20S)
培地４：ポテト・デキストロース寒天培地(PDA)（栄研化学（株）製、Ｅ−ＭＦ２１）
培地５：サブロー寒天培地(SA)（栄研化学（株）製、Ｅ−ＭＦ０３）
*培地１、２、３：Maren A. Klich、John I. Pitt著『A Laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs』Commonwealth Scientific and Industrial Rese arch Organization、 Division of Food Processing（1988年）。
【００２０】
（２）形態
本菌がＣＹＡ寒天平板上、２５℃、７日間の培養で形成したコロニーから、光学顕微鏡にて形態的特徴を観察した結果、分生子柄は滑面、150〜360 x 3〜9.0 μｍ。先端に球形〜半球形の頂のうを形成する。頂のうの直径は、7.0〜18.0 μｍ、上部2/3から1/2部分でメトレを生じる。メトレは、5.0〜8.0 x 1.2〜2.0 μｍ、フィアライドは、5.0〜6.4 x 1.2〜2.0 μｍである。分生子は滑面、球形〜亜球形で、直径は2.0〜2.8 μｍ。潜入菌糸の側面から直接または短い柄を介して滑面、球形から亜球形、直径4.0〜8.0 μｍの厚膜胞子様
細胞が多数単生する。  
なお、培養を１カ月以上延長してもテレオモルフの形態は認められなかった。
【００２１】
（３）生理的性質
・生育温度範囲及び最適温度
本菌株はｐＨ６．０のサブロー液体培地において、１５〜４５℃の範囲で生育し、最適温度は３３〜３８℃である。
・生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ
本菌株はＹｐＳｓ液体培地中、２５℃においてｐＨ３〜１０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜６である。
【００２２】
（４）好気性、嫌気性の区別 ； 好気性
上記の形態的特徴および培養上の性状は、宇田川 俊一、椿 啓介 編『菌類図鑑』講談社（1978年）およびK. B. Raper、D. I. Fennell著『The genus Aspergillus』The Williams & Wilkins Company（1965年）等に記載されたアスペルギルス（Aspergillus）属の特徴と良く一致するものであり、本菌株が、不完全菌亜門、アスペルギルス（Aspergillus）属の１菌種であることが明らかとなった。
【００２３】
以上の知見から、本菌株を「アスペルギルス  エスピー  TF-0770 （Aspergillus sp.TF-0770）」と命名した。
シクロペンタンジオール誘導体物質の生産は大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地でTF-株を好気的条件下で培養することにより行う。
【００２４】
培地は主として液体培地を用い、炭素源、窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先駆物質および消泡剤を加えることができ、pHは7前後に調製する。炭素源としては、例えばグルコース、シュウクロース、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまたは混合して用いる。窒素源としては、例えば肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コーン・スティープ・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独または混合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを、単独または混合して用いる。消泡剤としてはアデカノール、シリコン化合物などを用いることができる。
【００２５】
培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気的培養が適しており、pH 4〜10、25〜35℃で2〜5日間、望ましくはpH 6〜7、25〜28℃で4日間培養する。
【００２６】
本発明の化合物は、発酵生産物について一般的な方法で精製を行うことにより得られる。すなわち、培養終了後、遠心分離または濾過により培養濾液を得、ダイヤイオンHP-20（商品名、三菱化学社製）などのポリスチレン樹脂に吸着させた後、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。菌体は低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出する。次いでこの菌体抽出液および吸着樹脂からの溶出液を合わせて減圧濃縮し、有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ブタノールなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび逆層分配用ODSを充填したカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーに伏すことにより本発明化合物を精製単離することができる。
【００２７】
式の化合物は、ケモカインの産生の亢進によると考えられる種々の疾患の治療又は予防のため、より具体的には、例えば、慢性下気道感染症、間質性肺炎、肺線維症などのような炎症性肺疾患、急性及び慢性リューマチ関節炎治療又は予防のための薬剤として、ヒト又はヒト以外の温血動物に投与することができる。
【００２８】
本発明に係る化合物は、経口又は非経口的に投与することができる。その投与剤型は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、トローチ剤、軟膏剤、クリーム剤、乳剤、懸濁剤、坐剤、注射剤などであり、いずれも慣用の製剤技術（例えば、第１２改正日本薬局方に規定する方法）によって製造することができる。これらの投与剤型は、患者の症状、年齢及び治療の目的に応じて適宜選択することができる。各種剤型の製剤の製造においては、常用の賦形剤（例えば、結晶セルロース、デンプン、乳糖、マンニトールなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）などを用いることができる。
【００２９】
本発明に係る化合物の投与量は、成人を治療する場合で１日５０〜２０００ｍｇであり、これを１日１回又は数回に分けて投与する。この投与量は、患者の年齢、体重及び症状によって適宜増減することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例および試験例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１
シクロペンタンジオール誘導体物質の製造
（１）グルコース２%、ポリペプトン0.5ｇ、酵母エキス0.2ｇ、リン酸一カリウム0.1ｇ、硫酸マグネシウム0.05ｇを含む液体培地100 mlを500 mlの三角フラスコに入れ、120℃、2気圧で20分滅菌した。次いで、この無菌培地にAspergillus sp.TF-0770株を接種し、26℃、200 rpmで96時間回転振とう培養し、種培養とした。  
次に５０L容培養ジャー1基を用いて、種培養と同じ組成の無菌培地３０Lに前記種培養液３００ｍｌを接種し、２６℃、９６時間通気攪拌培養した。培養終了後、吸引濾過により上清液と菌体に分けた。得られた上清液を１．５LのHP-20（商品名、三菱化成社製）に吸着させた。アセトンで溶出し、これを菌体のアセトン抽出液と合わせて濃縮後、その濃縮液を５Lのブタノールで抽出した。この抽出液を減圧濃縮乾燥し、褐色のシロップ状物質82.8ｇを得た。
【００３１】
（２）前項のシロップ状物質82.8 gをメタノール500 mlに溶解し、さらにn-ヘキサン500 mlを加えて抽出した。n-ヘキサン層を除いた後、1000 rpmで10分間遠心分離し、上澄みのメタノール層を減圧濃縮乾固して、褐色油状物質39.2ｇを得た。
【００３２】
（３）前項の褐色油状物質のうち、7ｇを水 450 ml に懸濁させ、酢酸エチル 450 ml で３回抽出した。酢酸エチル層を全て合わせて溶媒を減圧留去し 酢酸エチル可溶画分 5.5 g を得た。この酢酸エチル可溶画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、n-ヘキサン-酢酸エチル、酢酸エチル-メタノールの混合溶媒系で溶出を行い、計７画分を得た。n-ヘキサン-酢酸エチル (1:2) で溶出した画分 543 mg のうち、244 mg を ODS を担体とするカラムクロマトグラフィに付し、水-アセトニトリルの混合溶媒系で溶出を行い、計５画分を得た。水-アセトニトリル (9:1) で溶出した画分 37.3 mg のうち、22.8 mg をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、クロロホルム-メタノールの混合溶媒系で溶出を行い、クロロホルム-メタノール (49:1) で溶出した画分より、化合物１を12.8mg得た。化合物１は((c-4((E)-1-propenyl)-r-1,c-2-cyclopentanediol)である。この化合物のＮＭＲスペクトルについて図１及び図２に示した。
【００３３】
化合物１
1H NMR (400MHz, CDCl3) d 5.33-5.48 (2H, m), 3.98-4.05 (1H, m), 2.53 (1H, br.s), 2.38 (1H,ddd, J = 9.1, 8.9, 6.1 Hz), 2.11 (2H, ddd, J = 13.6, 8.9, 4.6 Hz), 1.64 (3H, d, J = 5.1 Hz), 1.48(2H, ddd, J = 13.6, 9.1, 4.6 Hz);
13C NMR (100 MHz, CDCl3) d 135.5, 123.5, 73.2 (2C), 38.8 (2C), 36.9, 17.8;
EIMS ｍ/z 142, 124, 109, 97, 83, 69, 55, 41 (base);
HREIMS 142.0983 (142.0994 calcd. for C8H12O2)
【００３４】
試験例１  ショウジョウバエの内因性抗菌物質Diptericin発現阻害活性
（試験動物）
ショウジョウバエの内因性抗菌物質 Diptericin の転写制御領域にレポーター遺伝子 lacZ をつないだ遺伝子を導入したショウジョウバエを１８あるいは２５℃で飼育し、実験時に雌の３齢幼虫を選別して用いた。
（試験方法）
ショウジョウバエの幼虫を解剖することで内因性抗菌物質産生器官である脂肪体を露出させ、20%(v/v)牛胎児血清、1%(v/v) antibiotic antimycotic (SIGMA社製) を含んだSchneider's Drosophila 培地中、２５℃で１２時間培養した。化合物１は実施例１のように製造し、目的濃度になるようジメチルスルホキシドに溶解させ、培養培地に添加した。陽対照として自然免疫活性化能を有するリポポリサッカライド(LPS)を精製水に溶解させ、最終濃度10mg/mL になるように培養培地に添加した。各試料につき６匹の幼虫を用いた。Diptericin 遺伝子発現量の指標として、レポータータンパク質であるβ-galactosidase をそれぞれの幼虫について定量し、その平均値を求めた。 試料を全く添加していない時の平均値を０、陽対照の平均値を１００とし、各濃度の化合物１を添加したときの自然免疫抑制作用を求めた。
（結果）表１に示すように、化合物１は濃度依存的に自然免疫抑制作用を示した。
【００３５】
【表２】
2005187451.tif 000005
【００３６】
試験例２：IL-8産生抑制作用
（試験方法）
96ウェルプレートで培養したHUVECにシクロペンタンジオール誘導体を加え３時間インキュベーションした。続いてヒトTNF-α (0.1ng/ml)を添加し１６時間インキュベーションした後、培養液中のIL-8の濃度をELISAキット(R&D systems)で測定した。なお、ポジティブコントロールとしてデキサメサゾンを同時に評価した。
（結果）試験結果を図３にIL-8産生量に対する効果を示す。化合物１は、IL-8の産生を抑制していることがわかる。
【００３７】
試験例３：MCP-1産生抑制作用
（試験方法）96ウェルプレートで培養したHUVECにシクロペンタンジオール誘導体を加え３時間インキュベーションした。続いてヒトTNF-α (0.1ng/ml)を添加し１６時間インキュベーションした後、培養液中のMCP-1の濃度をELISAキット(R&D systems)で測定した。
なお、ポジティブコントロールとしてデキサメサゾンを同時に評価した。
（結果）試験結果を図４にMCP-1産生量に対する効果を示す。化合物１は、MCP-1の産生を抑制していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明に係る化合物は、ヒト血管内皮細胞におけるTNF-α刺激によるIL-8、MCP-1産生に対して抑制活性を有するので、免疫及び炎症性疾患の予防又は治療剤として有用である。すなわち、本願発明により、慢性下気道感染症、間質性肺炎、肺線維症などのような炎症性肺疾患、急性及び慢性リューマチ関節炎等の予防又は治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】重クロロホルム中、400 MHzで測定した化合物１の1H-NMRスペクトルを示す。
【図２】重クロロホルム中、100 MHzで測定した化合物１の13C-NMRスペクトルを示す。
【図３】本願発明(化合物１)のIL-8産生抑制作用を示す。
【図４】本願発明（化合物１）のMCP-1産生抑制作用を示す。
【図１】
2005187451.tif 000008
【図２】
2005187451.tif 000009
【図３】
2005187451.tif 000010
【図４】
2005187451.tif 000011