(57)【要約】【課題】  ＩｇＥの産生抑制を介して、効果的に炎症／アレルギーを抑制する物質乃至組成物を提供することを課題とする。それら物質／組成物は、ステロイド剤のような重篤な副作用を示さず、従って、日常的な食事等を通じて、炎症に代表されるアレルギーの諸症状を緩和できる点で有利である。【解決手段】  蜂蜜のヘキサン抽出物を含むことを特徴とするＩｇＥ産生抑制のための組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蜂蜜のヘキサン抽出物を含むことを特徴とする、ＩｇＥ産生抑制のための組成物。
【請求項２】
蜂蜜由来の成分を含むＩｇＥ産生抑制のための組成物であって、該成分が、Ｃ１８の逆相クロマトグラフィーカラムを用い、
Ａ：０．１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸水溶液、および
Ｂ：トリフルオロ酢酸／水／アセトニトリル（０．１：４０：６０、Ｖ／Ｖ／Ｖ）
を溶出液として、Ａ：Ｂが１００：０からＡ：Ｂが８０：２０まで４０分かけて線速度３．０ｃｍ／分で直線勾配溶出する蜂蜜のヘキサン抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーにおいて、カラム長を１５ｃｍとしたときに、保持時間が２５分以下の画分に存在することを特徴とする、前記組成物。
【請求項３】
前記高速液体クロマトグラフィーにおけるピーク頂点の保持時間が８．０〜１０．４分の成分および／または１２．０〜１４．４分の成分および／または２１．８〜２４．２分の成分を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記保持時間が８．０〜１０．４分の成分が分子量１８３Ｄａを有し、保持時間１２．０〜１４．４分の成分が分子量１８５Ｄａを有し、保持時間２１．８〜２４．２分の成分が分子量１６７Ｄａ有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
蜂蜜のヘキサン抽出物を配合することを特徴とする、ＩｇＥ産生抑制組成物の製造方法。
【請求項６】
Ｃ１８の逆相クロマトグラフィーカラムを用い、
Ａ：０．１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸水溶液、および
Ｂ：トリフルオロ酢酸／水／アセトニトリル（０．１：４０：６０、Ｖ／Ｖ／Ｖ）
を溶出液として、Ａ：Ｂが１００：０からＡ：Ｂが８０：２０まで４０分かけて線速度３．０ｃｍ／分で直線勾配溶出する蜂蜜のヘキサン抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーにおいて、カラム長を１５ｃｍとしたときに、保持時間が２５分以下の画分に存在する蜂蜜由来の成分を配合することを特徴とする、ＩｇＥ産生抑制組成物の製造方法。
【請求項７】
前記高速液体クロマトグラフィーにおけるピーク頂点の保持時間が８．０〜１０．４分の成分および／または１２．０〜１４．４分の成分および／または２１．８〜２４．２分の成分を配合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記保持時間が８．０〜１０．４分の成分が分子量１８３Ｄａを有し、保持時間１２．０〜１４．４分の成分が分子量１８５Ｄａを有し、保持時間２１．８〜２４．２分の成分が分子量１６７Ｄａ有する、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＥ産生抑制のための組成物に関する。特に、ＩｇＥの産生抑制に基づく、炎症／アレルギーの予防および／または治療のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床医学の分野では、多くの疾患が最終的に炎症に至るため、これを効率的に抑えるためにステロイド系の抗炎症剤が用いられてきた。しかしながら、こうしたステロイド系抗炎症剤は、体内のホルモンバランスを変化させるといった副作用の影響が大きいため、その利用に限界がある。特に、アトピー性皮膚炎や気管支喘息といったアレルギー性炎症のように致命的ではないものの、日常的な苦痛を伴う疾患に対しては、副作用の比較的大きなステロイド系抗炎症剤を多用するよりは、むしろ、日常生活における食事等で症状を緩和することが、患者の負担を減少させるための有効な手段と考えられている。
【０００３】
ところで、そのようなアレルギー発症のメカニズムは、多くの研究者によって研究されており、このメカニズムの最初にＩｇＥとよばれる抗体が血中で増加することが知られている。従って、アレルギー発症に関する研究においては、血中でのＩｇＥ動態を知ることが重要であり、とりわけ、アレルギーの抑制においては、当該ＩｇＥの増加を抑制する物質や方法を探ることが重要な課題となる。このような背景から、ＩｇＥ産生を抑制する物質に関し、非特許文献１には、蜂蜜が効果的であることが記載されている。
【０００４】
因みに、前記アレルギー発症に関する研究において、血中でのＩｇＥ動態を知る目的で、ＩｇＥの産生に関与するリンパ球集団を生体外に取り出して、ＩｇＥの産生を誘導させる実験系が構築されている（非特許文献２）。しかしながら、上述の実験系での培養系においては、ＩｇＥの産生が十分ではなく、該培養方法をＩｇＥの安定な産生を必要とする実験系に安定的に用いることに問題があった。これに関して、本発明者らは、先に改良された被験物質のＩｇＥ産生抑制能をアッセイする方法に関して、別途、特許出願を行っている（特願２００３−１７９６４４号）。
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９７，  ｖｏｌ．１１４，ｐｐ．３８５−３８８
【非特許文献２】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３３（２０００）ｐｐ．３３−４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、ＩｇＥの産生抑制を介して、効果的にアレルギーを抑制する物質乃至組成物を提供することを課題とする。それら物質／組成物は、ステロイド剤のような重篤な副作用を示さず、従って、日常的な食事等を通じて、炎症に代表されるアレルギーの諸症状を緩和できる点で有利である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決するために、先に本発明者等が開発した高感度のＩｇＥ産生抑制能アッセイ法に基づいて鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、ＩｇＥ産生抑制能は、蜂蜜のヘキサン抽出画分において特異的に認められることが明らかとなった。前記非特許文献１においては、単に蜂蜜がＩｇＥ産生抑制に有効であると記載されているのみであり、そのいずれの画分が活性を有するかについては、何等、示唆されていない。蜂蜜自体は、本発明のＩｇＥ抑制効果のみならず、種々の有利な生理活性を示し、またその風味も独特で好ましいものであるから、例えば食品等においてもそのままで好適に配合可能であるが、ある種の食品においては、目的とする嗜好性や形態により、それを多量に配合し得ない場合がある。特に、甘味やカロリー低下を重視する今日の食品需要動向を鑑みれば、ＩｇＥの産生抑制を目的として、糖分を比較的多く含む蜂蜜を多量に配合することに抵抗がないとはいえない。しかして、蜂蜜の持つ優れたＩｇＥ産生抑制効果を示す画分だけを抽出し、或いは当該成分を部分的に精製して用いることができれば、当該有益な生理活性を損なうことなく、或いはそれを更に増幅して、食品等の組成物に対し高い自由度を持って配合可能になると考えられるのである。
【０００７】
したがって、本発明の第一は、
（１）蜂蜜のヘキサン抽出物を含むことを特徴とするＩｇＥ産生抑制のための組成物である。
【０００８】
さらに、ＩｇＥ産生抑制能を有する蜂蜜のヘキサン抽出物において、該抽出物の特定の画分が、当該生理活性について特異的に作用していることも明らかとなった。
【０００９】
したがって、本発明の第二は、
（２）蜂蜜由来の成分を含むＩｇＥ産生抑制のための組成物であって、該成分が、Ｃ１８の逆相クロマトグラフィーカラムを用い、
Ａ：０．１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸水溶液、および
Ｂ：トリフルオロ酢酸／水／アセトニトリル（０．１：４０：６０、Ｖ／Ｖ／Ｖ）
を溶出液として、Ａ：Ｂが１００：０からＡ：Ｂが８０：２０まで４０分かけて線速度３．０ｃｍ／分で直線勾配溶出する蜂蜜のヘキサン抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーにおいて、カラム長を１５ｃｍとしたときに、保持時間が２５分以下の画分に存在することを特徴とする、前記組成物である。
【００１０】
前記高速液体クロマトグラフィーにおける保持時間が８．０〜１０．４分の成分、１２．０〜１４．４分の成分、および２１．８〜２４．２分の成分のいずれもに本発明の高いＩｇＥ産生抑制効果が確認された。
【００１１】
したがって、本発明の第三は、
（３）前記高速液体クロマトグラフィーにおけるピーク頂点の保持時間が８．０〜１０．４分の成分および／または１２．０〜１４．４分の成分および／または２１．８〜２４．２分の成分を含む、上記（２）の組成物である。
【００１２】
また、前記成分の更なる解析により、当該保持時間を有する成分が、各々、特定の分子量を有する単一成分であることが明らかとなった。
【００１３】
したがって、本発明の第四は、
（４）前記保持時間が８．０〜１０．４分の成分が分子量１８３Ｄａを有し、保持時間１２．０〜１４．４分の成分が分子量１８５Ｄａを有し、保持時間２１．８〜２４．２分の成分が分子量１６７Ｄａ有する、上記（３）の組成物である。
【００１４】
更に、本発明の別の側面は、上記蜂蜜由来の抽出物、画分および／または成分を配合することを特徴とするＩｇＥ産生抑制組成物の製造方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ＩｇＥの産生を抑制するための組成物であって、該組成物は、蜂蜜のヘキサン抽出物を含むことを特徴とする。抽出されるべき蜂蜜としては、各種蜜源由来のものを用いてよく、或いは脱蛋白等の簡易な精製処理が施された蜂蜜も好適に使用できる。好ましくは、レンゲ由来の蜂蜜が、その有効成分含量が顕著に多いと考えられることから、好適に用い得る。なお、レンゲ由来の蜂蜜とは、一般に、レンゲ草（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｓｉｎｉｃｕｓ  Ｌ．）の花を蜜源とした養蜂により得られる蜂蜜であり、産地は国内、海外を問わない。また、本明細書においてレンゲ由来の蜂蜜というときには、主にレンゲ植物を蜜源として得られた蜂蜜を指すことに留意すべきである。すなわち、一般の養蜂においては、蜜源となる植物を厳格に制限することは困難な場合があり、レンゲ類を主要蜜源とした場合にも、他の蜜源植物由来の花蜜を含む場合がある。しかしながら、そのような場合にも、レンゲ類の植物を主要蜜源として意図して採集され、現に当該レンゲ由来の花蜜を主要な成分とする蜂蜜は、本願にいうレンゲ由来の蜂蜜である。更には、当該レンゲ由来の蜂蜜は、採取されたそのままの形態のほか、例えば当業者に公知の殺菌や乾燥、或いは精製、例えば上記のような脱蛋白処理を行ったものであっても差し支えない。
【００１６】
本発明の蜂蜜のヘキサン抽出物を得るには、単に前記蜂蜜を、当業者に公知のいずれかの方法によりヘキサンを溶媒として抽出するだけでよい。例えば、粘度等を低下させるために、適宜、水で希釈した蜂蜜とヘキサンを所定の比率で混合し、これを十分に攪拌して蜂蜜中に存在する有効成分をヘキサン層に移行させた後、放置して水層とヘキサン層を分離させる。次いで、ヘキサン層を回収し、溶媒であるヘキサンを留去等すればよい。或いは、攪拌によりエマルジョンが形成される場合には、遠心分離等の液／液分離手段により、或いは所望によりエマルジョン分離のための塩（ＮａＣｌ等）を水層に添加して該エマルジョンを破壊し、効率的にヘキサン層を回収してもよい。
【００１７】
本発明においては、更に前記ヘキサン抽出物中の特定の画分が有意なＩｇＥ産生抑制効果を有することが示された。当該画分は、蜂蜜のヘキサン抽出物から逆相クロマトグラフィーを用いて調製され、典型的にはＣ１８カラムを利用した高速液体クロマトグラフィーにより分画できる。すなわち、本発明における好適なＩｇＥ産生抑制組成物は、蜂蜜に由来する成分からなり、Ｃ１８カラム、例えばＭｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ（商品名、製造元：関東化学株式会社）を用いた室温下での直線勾配（リニアーグラディエント）溶出において、移動相Ａとして０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液を用い、また移動相Ｂとしてトリフルオロ酢酸／水／アセトニトリルの０．１：４０：６０（Ｖ／Ｖ／Ｖ）の混合用液を用いて、当該移動相の比（Ａ：Ｂ）を１００：０〜８０：２０（Ｖ／Ｖ）まで４０分間かけて直線的に変化させて、前記カラムのサイズが４．６ｍｍＩＤｘ１５０ｍｍのときには、移動相の流速を０．５ｍｌ／分とした場合に、０〜約２５分、好ましくは約２４．２分迄に溶出する画分に含まれる成分を用いて調製することもできる。
【００１８】
また、前記のクロマトグラフィー条件では、保持時間が約９．２分（ピーク頂点：ピーク幅約２．４分）、約１３．２分（同：ピーク幅約２．４分）および約２３．０分（同：ピー基幅約２．４分）であり、分子量が、各々、１８３、１8５および１６７Ｄａと推定される成分において、顕著なＩｇＥ産生抑制効果が確認された。したがって、前記画分は、これらの成分のいずれかまたは全てを含むことが好ましい。
【００１９】
このように、本発明のＩｇＥ産生抑制組成物は、蜂蜜のヘキサン抽出物、或いは該抽出物からの特定の画分を含有するものであり、その含有量は、適用対象となる炎症／アレルギー患者の年齢、性別、症状の重篤度等、および組成物の形態（医薬品や食品等）や意図する投与方法に基づいて、個別に決定されるべきものではあるが、一般に、組成物全体に対して１重量％〜１００重量％であることが好ましい。
【００２０】
更に、本発明の組成物を医薬組成物として臨床的に用いる場合は、その投与形態にあわせて薬学的に許容される添加剤を加え各種製剤とすることができる。該薬学的に許容される添加剤としては、製剤分野において通常用いられる各種の添加剤が使用可能であり、例えば、ゼラチン、乳糖、白糖、酸化チタン、澱粉、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、マイクロクリスタリンワックス、白色ワセリン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、植物油、ベンジルアルコール、アラビアガム、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピルシクロデキストリン等が挙げられる。これらの添加剤との混合物として製剤化される剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の固形製剤；または例えばシロップ剤等の液体製剤が挙げられ、これらは、製剤分野における通常の方法によって調製することができる。また、本発明の組成物は、種々の食品、例えば、固体、液体、ゾル、ゲル状食品等に任意に配合することも可能である。該配合は、当該技術分野で公知の任意の製造方法によって行うことができ、例えば、キャラメル、ビスケット或いはチョコレート等の固体食品；飲料等の液体食品；あずき粥等のレトルト食品等に原料として、あるいは、別途、容易に配合することができる。
【００２１】
又、上記の組成物は、食品添加物の形態で使用することもできる。当該食品添加物は、当業者にとって周知の方法を用いて、例えば、デキストリン、コーンスターチ、乳糖等の各種の賦型剤類や乳化剤等の副原料と共に、本発明のＩｇＥ産生抑制画分等を混合またはカプセル化等をすることにより製造することができる。また、所望により、保存料や香料等を添加してもよい。
【００２２】
前記のとおり、本発明の蜂蜜のヘキサン抽出物或いは該抽出物からの特定の画分が示す優れたＩｇＥ産生抑制効果は、本発明者等が別途出願している極めて鋭敏なアッセイ方法により明らかとなった。すなわち、本発明にかかる抽出物等のＩｇＥ産生抑制能は、ヒトから分離したリンパ球を、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で培養し、被験物質の存在下で該リンパ球にＩｇＥを産生させて、そのＩｇＥの量を検出することにより初めて明らかとなったのである。以下に、該方法を簡略に説明する。
【００２３】
上記アッセイで使用するリンパ球および血漿は一般的な密度勾配遠心法により分離できるが、以下の手順で行うのが好ましい。すなわち、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  Ｐｌｕｓを分注したチューブに個体から採取した血液を重層して遠心分離した後、血漿をチューブに採取し別途保存する。次に、残りの遠心分離物中のリンパ球を採取して別のチューブに注入し、ＥＲＤＦ培地等を加えた後に遠心分離する。上清を吸引除去することでリンパ球を洗浄した後、同様の培地を加え、細胞を懸濁後、さらに遠心分離する。上清を除去後、細胞保存液を加えて細胞の密度を調節し、チューブに分注する。
【００２４】
これとは別に、蜂蜜のヘキサン抽出物等の試料をＥＲＤＦ等の培地と混合し、段階希釈法にて数種類の段階希釈液を作製した後、ろ過滅菌して試料溶液を作製する。また、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、抗原、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＥＲＤＦ等の培地を混合した物に、前記血漿が特定の濃度となるように加えて、免疫賦活液を調製する。血漿は予め滅菌された穴径０．２ミクロンのフィルタを用いて滅菌するが、不溶物が多い場合は０．４ミクロンのフィルタでろ過した後、０．２ミクロンのフィルタでろ過して使用する。
【００２５】
これらによる細胞培養（体外免疫）においては、まず、前記リンパ球保存物に培地を加えた後、遠心分離して上清を除去する。再度、培地を加えて該リンパ球を懸濁し、特定の濃度になるように調節したリンパ球懸濁液を作製する。培養プレートに前記試料溶液、免疫賦活液およびリンパ球懸濁液を注入し、好ましくは静置培養する。使用する培養プレートは、一般的な滅菌された組織培養用プレートであり、特に９６ウェル培養プレートが好ましい。静置培養としての条件は、一般的な３７℃定温インキュベータで行うが、特に３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒに調整するのが好ましい。
【００２６】
前記の培養後、細胞の計測および培養により産生されたＩｇＥの定量を行う。細胞の計測は、血球計算盤もしくは、セルカウンターで行えるが、培養後、一部培養液を回収した後の各ウェルにトリパンブルー溶液を加え、生細胞数と死細胞数を計測するのが好ましい。ＩｇＥ量は、酵素抗体法で測定するが、特にＥＬＩＳＡによる測定が好ましい。すなわち、炭酸ナトリウム緩衝液に抗ＩｇＥ抗体を混合した溶液を特定の濃度になるようにＥＬＩＳＡプレートに注入する。抗ＩｇＥ抗体としては、ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体、ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体をあげることができる。一定時間放置した後、プレートの溶液を廃棄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて数回洗浄操作を繰り返す。
【００２７】
培養上清または標準ＩｇＥについて標準希釈系列を作製したものをプレートに加えて静置した後、ウェル溶液を廃棄して、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で数回洗浄する。その後、ＢＳＡ／ＰＢＳと酵素標識抗ＩｇＥ抗体を混合してプレートに加えて静置し、ウェルの溶液を廃棄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で数回洗浄し、酵素基質を加え、その所定時間後に吸光度を測定することで検量線から培養上清中のＩｇＥ濃度を算出することが好ましい。各培養上清のＩｇＥ量は、当該標準ＩｇＥをプロットした検量線から求めることができる。
【００２８】
以下に、本発明の実施例を例示するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
ＩｇＥアッセイ
リンパ球の分離
１５ｍｌコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  ２１９６）にＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃１７−１４４０−０２）を４ｍｌずつ分注し、各提供者から得た５ｍｌの血液をその上に静かに重層し、４００×ｇにて常温で３０分間遠心分離（トミー精工  ＬＣ−１２０）した。上から血漿、リンパ球、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ、赤血球の層が存在することを確認して、オートピペット（ドラモンド  ＰＡ−３００）を用いて血漿をチューブに採取し、−２０℃に保存した。次に、オートピペットを用いて、Ｆｉｃｏｌｌを採取しないように血漿側からリンパ球を採取し、各チューブとも最大で１０ｍｌ程度になるように５０ｍｌチューブ（ＢＤ社  ３５−２０７０）に注入した。ＥＲＤＦ培地（極東製薬  ＃２６５００）を１７．７ｇ、ＮａＨＣＯ３（和光純薬  １９１−０１３０５）を１．３ｇ、超純水１０００ｍｌに溶解し０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＧＰＢ  ５０１０）にてろ過滅菌して調整したＥＲＤＦ培地を、全容積が４５ｍｌになるように加え、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。その後、上清を吸引除去し、１０ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、細胞を懸濁後、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。細胞の密度が１〜３×１０７細胞／ｍｌになるように予め調製しておいた細胞保存液（１０％ＤＭＳＯ／２０％ＦＢＳ／７０％ＥＲＤＦ培地（ＦＢＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＤＭＳＯ：Ｗａｋｏ））に懸濁し、クライオチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃４３０２８９）に分注し、−８０℃で保存した。
【００３０】
アッセイ
蜂蜜の各抽出成分に対するＩｇＥ産生抑制アッセイは、以下の手順で行った。
Ａ．蜂蜜の抽出処理
脱蛋白処理した蜂蜜（秋田屋本店より入手）の１００ｍｌを３００ｍｌの水で希釈した。分液漏斗を用いて、該希釈液を４００ｍｌのヘキサンにより抽出した。エマルジョン層が形成されたため、遠心分離により、エマルジョンを破壊して水層とヘキサン層に分離した。ヘキサン層を回収し、減圧下、１ｍｌに濃縮した。水層は、更に、同様にして４００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を回収し、０．５ｍｌに濃縮した。水層は、更に４００ｍｌのクロロホルムにて抽出した。クロロホルム層を回収後、減圧乾固した。残った水層は８０ｍｌまで、減圧濃縮した。
【００３１】
Ｂ．試料溶液の作製
上記のようにして得られたヘキサン層からの濃縮物に水を加えて１０ｍｌとしたもの、酢酸エチル層からの濃縮物に水を加えて２ｍｌにしたもの、クロロホルム層の乾固体物を４ｍｌのエタノールに溶解したものを試料とした。濃縮した水層は、そのまま試料として用いた。濃縮した水層（１６０μｌ）、ヘキサン層の試料（２０μｌ）、酢酸エチル層の試料（４μｌ）およびクロロホルム層の試料（８μｌ）を、各々、１０ｍｌのＥＲＤＦ培地を混合した。これらの試料溶液は、全て、初発の蜂蜜の濃度に換算して、蜂蜜の２％濃度を与える。次いで、試料溶液を０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＬＧＶＲ  ２５  ＬＳ）を用いて、ろ過滅菌した。以下、段階希釈法にて、上記混合液から２ｍｌ採取したものを１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合し、ろ過滅菌したものを蜂蜜の０．２％試料溶液とし、この混合液から２ｍｌ採取し、同様に１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合してろ過滅菌して蜂蜜の０．０２％の試料溶液を各々作製した。
【００３２】
Ｃ．免疫賦活液の調製
保存しておいたヒト血漿を３７℃のウォーターバスで解凍した後、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。その後、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＬＨＶＲ  ２５  ＬＳ）を用いてろ過した。ろ過したヒト血漿１ｍｌに、０．１ｍｌのＩＬ−２（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２２０２）、０．１ｍｌのＩＬ−４（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２００４）、０．１ｍｌのＩＬ−６（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２００６）、０．１ｍｌのＭＤＰ（ｓｔｏｃｋ  １ｍｇ／ｍｌ）（Ｃｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＲ００４）、抗原としてＣｅｄａｒ  ｐｏｌｌｅｎ（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（ＬＳＬ  ＬＧ  ５２２９）、０．５ｍｌのＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．５ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、全量を２．５ｍｌとした。
【００３３】
Ｄ．リンパ球懸濁液の作製
−８０℃に保存しておいたリンパ球（１×１０７細胞）を３７℃培養器（アステック社  ＡＣ−１６５）にて解凍した後に５０ｍｌチューブに移し、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地を加えた後、４００×ｇにて常温で５分間遠心分離した。上清を除去した後、２．５ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、リンパ球を懸濁し、４×１０６細胞／ｍｌとなるように調製した。
【００３４】
Ｅ．細胞培養の条件
９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３０７２）に、Ｂ．で調製した試料溶液を１００μｌ、Ｃ．で調製した免疫賦活液を５０μｌ、Ｄ．で調製したリンパ球懸濁液を５０μｌ注入し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒに調整した培養器（アステック社  ＡＣＩ−１６５）内で、１０日間培養した。
【００３５】
細胞数測定
上記の９６ウェルプレートの各ウェルからピペットマン（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｐ−２００）を用いて１００μｌずつ培養液を回収した。培養液を回収した後の各ウェルに５０μｌのトリパンブルー溶液を加え、血球計算盤（ミナトメディカル  ＫＡ−１１５  ビルケンチュルク型）にて生細胞数と死細胞数をカウンター（ライオン事務機  ２２７−０１）を用いて計測した。
【００３６】
ＩｇＥ量のＥＬＩＳＡによる測定
１０ｍｌの１５ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．６）、５μｌのヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（バイオソース・インターナショナル  ＡＨＩ−１８０１）、５μｌのヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体（バイオソース・インターナショナル  ＡＨＩ−１９０１）を混合したものを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に１００μｌ／ウェルになるよう加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、３００μｌ／ウェルとなるようにＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。その後、３００μｌ／ウェルとなるように１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を３００μｌ／ウェルになるように加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。１０００ｎｇ／ｍｌの標準ＩｇＥ溶液から３倍希釈した標準希釈系列（３３３、１１１、３７．０、１２．３、４．１２、１．３７、０．４６、０．１５２ｎｇ／ｍｌ）を作成し、標準希釈系列または回収した培養上清を各々５０μｌ／ウェルになるようにウェルに加え、室温で２時間静置した後、ウェル溶液を廃棄した。その後、３００μｌ／ウェルとなるようにＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。次に、１０ｍｌの１％  ＢＳＡ／ＰＢＳと５μｌのＨＲＰ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＥポリクローナル抗体（バイオソース・インターナショナル  ＡＨＩ  ０５０４）を混合し、１００μｌ／ウェルになるよう各々のウェルに加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を３００μｌ／ウェルになるように加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。そして４．５ｍｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ  ４．０：０．１Ｍクエン酸、０．００６％Ｈ２Ｏ２）に０．５０ｍｇのＡＢＴＳ（Ｗａｋｏ  ０１８  １０３１１）を溶解して作製した液を５０μｌ／ウェルになるように加えた後、プレートリーダー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ．  ＮＪ２３００）にて４１９ｎｍ（Ｓｕｂ．４９０ｎｍ）の吸光度を１５分後、３０分後、４５分後に測定した。各培養上清からのＩｇＥは標準ＩｇＥをプロットした検量線から求めた。生細胞の割合から、ＩｇＥ量の補正を行った。２人の提供者からのリンパ球／血漿を用いたアッセイの結果を図１および図２に示した。図１および図２より、蜂蜜のヘキサン抽出物において、有意なＩｇＥ産生抑制活性が認められた。
【実施例２】
【００３７】
上記のとおり、蜂蜜のヘキサン抽出物中に高いＩｇＥ産生抑制阻害活性が認められたことから、更に、該抽出物の分画を行った。すなわち、実施例１のヘキサン層からの濃縮物に水を加えて１０ｍｌとしたものの５００μｌを、０．１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸で平衡化したＭｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ（商品名、製造元：関東化学株式会社）カラム（４．６ｍｍＩＤｘ１５０ｍｍ、５μｍ）に注入し、０．５ｍｌ／分の流速で、表１の移動相組成による直線勾配溶出により分離した。
【表１】
2005112785.tif 000002
【００３８】
溶出状況を２１０および２８０ｎｍの紫外部吸収でモニターし、得られたクロマトグラムを図３に示す。
【００３９】
図３のクロマトグラムで、０分〜９．２分のピークの後ろまで（フラクション１）、９．２分のピークの後ろ〜１３．２分のピークの後ろまで（フラクション２）、１３．２分のピークの後ろ〜２０．０分のピークの後ろまで（フラクション３）、２０．０分のピークの後ろ〜２３．０分のピークの後ろまで（フラクション４）、２３．０分のピークの後ろ〜４０分まで（フラクション５）、４０分〜６０分まで（フラクション６）、６０分〜８０分まで（フラクション７）および約−６〜０分までの素通り画分（フラクション８）を２回のサンプル注入について分取し、遠心濃縮後、５Ｎ水酸化ナトリウムで中和し、水を加えて全容５００μｌの試験液とした。
【００４０】
実施例１と同様のＩｇＥ産生抑制アッセイを行い、いずれのフラクションに活性があるかを調べた。
【００４１】
すなわち、上記各フラクションからの試験液５００μｌのうちの５μｌを用い、実施例１の試料溶液作成と同じ手順で試料溶液を作製した。具体的には、各フラクションからの試験液５μｌを、１０ｍｌのＥＲＤＦ培地を混合した。これらの試料溶液は、全て、初発の蜂蜜の濃度に換算して、蜂蜜の２％濃度を与える。次いで、試料溶液を０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＬＧＶＲ  ２５  ＬＳ）を用いて、ろ過滅菌した。以下、段階希釈法にて、上記混合液から２ｍｌ採取したものを１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合し、ろ過滅菌したものを０．２％試料溶液とし、この混合液から２ｍｌ採取し、同様に１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合してろ過滅菌して０．０２％の試料溶液を、また同様にして０．００２％の試料溶液を作製した。
【００４２】
この試料溶液を用い、後は実施例１と全く同様にしてＩｇＥの産生抑制について試験した。結果を図４に示すが、当該図から、フラクション１、２および４に活性があることが判明した。
【実施例３】
【００４３】
実施例２でのフラクション１、２および４の成分を更に特徴付けるために、ＬＣ／ＭＳを用いて、当該フラクションに含まれるピークの分子量を同定した。
【００４４】
測定には、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８（商品名、製造元：関東化学株式会社）カラム（４．６ｍｍＩＤｘ２５０ｍｍ、５μｍ）を用いた。該カラムに対し実施例２での試料、すなわち、実施例１のヘキサン層からの濃縮物に水を加えて１０ｍｌとしたものを注入し、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、表２の移動相組成による直線勾配溶出にてクロマトグラムを行った。
【表２】
2005112785.tif 000003
【００４５】
クロマトグラムからの溶出液は、マイクロマス社製ＬＣＴ質量分析器に導入し、ポジティブイオンモードで、各ピークに対応する分子の質量を測定した。
【００４６】
図５のクロマトグラムは、本実施例での溶出状況を示し、該クロマトグラム上の１５．９９分のピークが実施例２における図３の９．２分のピークに、１９．３９分のピークが同じく図３の１３．２分のピークに、また２２．９８分のピークが図３の２３．０分のピークに、夫々、対応する。
【００４７】
これら３つのピークとして検出された物質の分子量測定の結果を、図６乃至８に、夫々、示した。当該測定の結果、図５の１５．９９分のピークが分子量１８３Ｄａ、１９．３９分のピークが分子量１８５Ｄａおよび２２．９８分のピークが１６７Ｄａの物質に対応することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
蜂蜜の持つ優れたＩｇＥ産生抑制効果を示す画分だけを抽出し、或いは当該成分を部分的に精製して用いることができれば、当該有益な生理活性を損なうことなく、或いはそれを更に増幅して、食品等の組成物に対し容易に配合し、優れた炎症／アルルギー抑制のための組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、本発明の蜂蜜のヘキサン抽出物のＩｇＥ産生抑制効果を示す図である。提供者１からのリンパ球／血漿を用いたアッセイにより蜂蜜の各抽出画分のＩｇＥ産生抑制効果を比較した。
【図２】図２は、本発明の蜂蜜のヘキサン抽出物のＩｇＥ産生抑制効果を示す図である。提供者２からのリンパ球／血漿を用いたアッセイにより蜂蜜の各抽出画分のＩｇＥ産生抑制効果を比較した。
【図３】図３は、蜂蜜のヘキサン抽出画分の濃縮物を逆相カラムクロマトグラフィーで分離した際のクロマトグラムである。上側のチャートは２１０ｎｍ、下側のチャートは２８０ｎｍでの紫外部吸収による検出。
【図４】図４は、蜂蜜のヘキサン抽出画分に対する逆相カラムクロマトグラフィーでの各フラクションのＩｇＥ産生抑制効果を示す図である。
【図５】図５は、ＬＣ／ＭＳ分析における、蜂蜜のヘキサン抽出画分の濃縮物を逆相カラムクロマトグラフィーで分離した際のクロマトグラムである。２８０ｎｍの紫外部吸収で検出。
【図６】ＬＣ／ＭＳ分析における１５．９９分に溶出されるピークに関する質量スペクトル。
【図７】ＬＣ／ＭＳ分析における１９．３９分に溶出されるピークに関する質量スペクトル。
【図８】ＬＣ／ＭＳ分析における２２．９８分に溶出されるピークに関する質量スペクトル。
【図１】
2005112785.tif 000004
【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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