(57)【要約】【課題】  ＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質をはじめとする蛋白質を簡便に精製するための吸着剤、及び、該吸着剤を用いた簡略化された蛋白質の精製方法を提供する。【解決手段】  プロリン及びヒドロキシプロリンから選ばれる少なくとも１種のアミノ酸が水不溶性の担体上に固定化されている蛋白質の吸着剤。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロリン及びヒドロキシプロリンから選ばれる少なくとも１種のアミノ酸が水不溶性の担
体上に固定化されていることを特徴とする蛋白質の吸着剤。
【請求項２】
少なくとも１個のプロリン残基又はヒドロキシプロリン残基を含有し、前記プロリン残基
又はヒドロキシプロリン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基で
あり、２〜５０個のアミノ酸残基からなるペプチドが、水不溶性の担体上に固定化されて
いることを特徴とする蛋白質の吸着剤。
【請求項３】
プロリン残基又はヒドロキシプロリン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸残基は、ロイシ
ン残基又はアラニン残基であることを特徴とする請求項２記載の蛋白質の吸着剤。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の蛋白質の吸着剤を用いることを特徴とする蛋白質の精製方法。
【請求項５】
ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を精製することを特徴とする請求項
４記載の蛋白質の精製方法。
【請求項６】
ＰＰＩａｓｅは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求
項５記載の蛋白質の精製方法。
【請求項７】
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴
とする請求項６記載の蛋白質の精製方法。
【請求項８】
ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする
請求項７記載の蛋白質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質をはじめとする蛋白質を簡便に精製するための蛋
白質の吸着剤、及び、その吸着剤を用いた蛋白質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質を単一に精製する手段の１つとしてクロマト分離技術が利用されているが、クロマ
ト分離技術に用いられる担体としては、架橋アガロースゲルやビニルポリマー系ビーズ等
の親水性担体をベースとした、イオン交換、疎水性相互作用、ゲル濾過等のさまざまな分
離モードの異なる担体が市販されている。これらは、蛋白質の各種担体に対する親和性の
違いを利用したものであり、通常いくつかの異なる分離モードを有する担体を組み合わせ
て目的蛋白質を精製している（非特許文献１）。
【０００３】
グルタチオンをカップリング法により固定化した担体は、グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）と特異的な親和性を有するため、ＧＳＴとの融合蛋白質として発現さ
せた蛋白質の精製に利用される（特許文献１）。ＧＳＴとグルタチオンとの親和性は特異
性が高いため、この精製ステップによって高純度に目的蛋白質を精製することができる。
また、イミノジ酢酸を担持させた担体は、ニッケル等の金属イオンをキレートさせること
ができるので、ニッケル−ヒスチジンとの親和性を利用してヒスチジンに富む蛋白質を特
異的に高純度で精製することが可能である（特許文献２）。
【０００４】
一方、異種生物由来の蛋白質を大腸菌をはじめとするバクテリアの宿主発現系を用いた蛋
白質発現法により発現させる場合、目的蛋白質のフォールディング異常により、立体構造
が天然型と異なった異常型蛋白質しか得られない場合がある。このような蛋白質は宿主内
で封入体と呼ばれる凝集体として発現したり、宿主細胞のプロテアーゼにより、分解され
たりすることが知られている。このような問題点を解決するためには、目的蛋白質の宿主
細胞内での折り畳み反応が正確に行われるよう制御することが極めて重要であると考えら
れる。上記のＧＳＴとの融合蛋白質や、ヒスチジンヘキサペプチドとの融合蛋白質は、グ
ルタチオン固定化担体やニッケルキレート担体を用いることにより宿主由来蛋白質から高
純度で精製することが可能であるが、上記のフォールディング異常に関する問題点を解決
するものではなく、利用できる蛋白質には制限があった。この問題を解決するために、本
発明者らはすでに分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏ
ｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）との融合発現系を提案しており、こ
の発現系により、従来法では封入体として発現した蛋白質を、活性を有する可溶性蛋白質
として宿主内に発現させることに成功している。これらの融合蛋白質を特異的に精製する
ための担体として、これまでにＰＰＩａｓｅの阻害剤として知られる免疫抑制剤のＦＫ５
０６（タクロリムス）やシクロスポリンＡ等をリガンドとして固定化した担体を用いる方
法が考えられている。しかしながら、これらのＰＰＩａｓｅの阻害剤は非常に高価である
ため、より安価なリガンドを用いる方法が望まれていた。また、これらのＰＰＩａｓｅの
阻害剤は担体に固定化するために、アミノ基やカルボキシル基等の適当な官能基を導入し
ないといけないといった制約があり、操作性に問題があった。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５６５４１７６号明細書
【特許文献２】特許第２６８６０９０号公報
【非特許文献１】新生化学実験講座  日本生化学会編  第１巻  「蛋白質Ｉ  分離・精製・性質」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、ＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質をはじめとする蛋白質を簡便に
精製するための吸着剤、及び、該吸着剤を用いた簡略化された蛋白質の精製方法を提供す
ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は蛋白質の吸着剤に係るものであり、第１の態様が、プロリン及びヒドロキシプロ
リンから選ばれる少なくとも１種のアミノ酸が水不溶性の担体上に固定化されている吸着
剤であり、第２の態様が、少なくとも１個のプロリン残基又はヒドロキシプロリン残基を
含有し、上記プロリン残基又はヒドロキシプロリン残基のＮ末端側に隣接するアミノ酸残
基が疎水性アミノ酸残基であり、２〜５０個のアミノ酸残基からなるペプチドが、水不溶
性の担体上に固定化されている吸着剤である。
本発明の蛋白質の吸着剤を用いる蛋白質の精製方法もまた、本発明の１つである。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明の第１の態様の吸着剤は、プロリン及びヒドロキシプロリンから選ばれる少なくと
も１種のアミノ酸が水不溶性の担体上に固定化されているものである。
上記プロリン又はヒドロキシプロリンとしては特に限定されず、Ｌ型及びＤ型のいずれの
タイプのアミノ酸であってもよいが、好ましくはＬ型プロリン又はＬ型ヒドロキシプロリ
ンである。
【０００９】
本発明の第２の態様の吸着剤は、少なくとも１個のプロリン残基又はヒドロキシプロリン
残基を含有し、そのＮ末端側に隣接するアミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基であり、２〜
５０個のアミノ酸残基からなるペプチドが、水不溶性の担体上に固定化されているもので
ある。第２の態様の吸着剤におけるプロリン及びヒドロキシプロリンは、第１の態様の吸
着剤におけると同様である。
上記ペプチドにおいて、プロリン残基又はヒドロキシプロリン残基のＮ末端側に隣接して
配置される疎水性アミノ酸残基としては、例えば、アラニン、フェニルアラニン、イソロ
イシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、トリプトファン等のアミノ酸残基が
挙げられる。なかでもロイシン残基又はアラニン残基が好ましい。また、これらのアミノ
酸残基はＬ型であることが好ましい。
【００１０】
上記ペプチドは２〜５０個のアミノ酸残基からなるものである。アミノ酸残基数が、５０
個を超えると、ペプチドの合成工程が煩雑になり、得られる吸着剤が高価になる。上記ペ
プチドのアミノ酸残基数の好ましい下限は３個であり、好ましい上限は２０個である。よ
り好ましい上限は１０個である。
【００１１】
上記ペプチドとしては、例えば、スクシニル−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニ
トロアニリド、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２等の、株式会社ペプチド研究所やＢＡＣ
ＨＥＭ社等から市販されているものを用いることもできる。
【００１２】
上記ペプチドを合成するには、例えば、固相合成法、段階的伸長法、フラグメント縮合法
等の液相合成法等のペプチド合成において通常用いられる方法を用いることができる。な
かでも固相合成法は操作が簡便であり好ましい。
上記固相合成法は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、第８５巻、第２１４９〜２１５４頁（１９６３年）；日本
生化学会編「生化学実験講座１  蛋白質の化学ＩＶ  化学修飾とペプチド合成」、第２０
７〜４９５頁；日本生化学会編「続生化学実験講座２  蛋白質の化学（下）」等に詳述さ
れている。
【００１３】
本発明で用いられる水不溶性の担体としては、水、生理食塩水等の溶液に不溶性であり、
アミノ酸やペプチドとの間で共有結合を形成するためのアミノ基、カルボキシル基、水酸
基等の反応性に富む官能基を有するものが挙げられる。
上記水不溶性の担体としては、有効表面積が広いことより多孔性であるものが好ましく、
例えば、排除限界蛋白質分子量が約１０６〜１０９の範囲内であるか、又は、平均細孔径
が約５０〜１０００ｎｍの範囲内であるものが好適に使用される。
【００１４】
本発明で用いられる水不溶性の担体のうち市販されているものとしては、例えば、ＣＭ−
セルロファイン（生化学工業社製）等のセルロース系担体、ＣＭ−トヨパール６５０Ｃ（
東ソー社製）等のポリビニルアルコール系担体、ＣＭ−トリスアクリルＭ（アマシャムバ
イオサイエンス社製）等のポリアクリルアミド系担体、セファロースＣＬ−４Ｂ（アマシ
ャムバイオサイエンス社製）等のアガロース系担体等の有機質担体、及び、ＣＰＧ−１０
−１０００（米国エレクトロ−ニュークレオニクス社製）等の多孔性ガラス等の無機質担
体が挙げられる。
【００１５】
本発明で用いられる水不溶性の担体の粒径は、０．０５〜１０００μｍであることが好ま
しい。０．０５μｍ未満であると、得られた吸着剤に目的の蛋白質を含有する溶液を流し
込んだ場合、溶液が流れにくく操作性に劣り、１０００μｍを超えると、得られた吸着剤
に目的の蛋白質を含有する溶液を流し込んだ場合、吸着剤粒子同士の間隙が広いので蛋白
質と吸着剤との接触効率が悪く、精製効率が低くなることがある。より好ましい下限は０
．１μｍであり、より好ましい上限は１００μｍである。
【００１６】
上記プロリン、ヒドロキシプロリン、又は、ペプチドは、水不溶性の担体１ｇあたり０．
０１〜６００μｍｏｌを固定化することが好ましい。固定化量が０．０１μｍｏｌ／ｇ未
満であると、精製効率が悪く、６００μｍｏｌ／ｇを超えても精製効率は向上しない。よ
り好ましい下限は１０μｍｏｌ／ｇであり、より好ましい上限は５００μｍｏｌ／ｇであ
る。
【００１７】
上記プロリン、ヒドロキシプロリン、又は、ペプチドを担体に固定化する方法としては、
例えば、担体が有するカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させること
によって、スクシンイミドオキシカルボニル基に変換し、これに上記のアミノ酸又はペプ
チドをアミノ基の部分で反応させる方法（活性エステル法）；担体が有するアミノ基又は
カルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬の存在下で、上記のアミ
ノ酸又はペプチドのカルボキシル基又はアミノ基を縮合反応させる方法（縮合法）；担体
と上記のアミノ酸又はペプチドとをグルタルアルデヒド等の２個以上の官能基を有する化
合物を用いて架橋する方法（担体架橋法）等の一般にアミノ酸やペプチドを担体上に固定
化する方法を用いることができる。
【００１８】
上記プロリン、ヒドロキシプロリン、又は、ペプチドを担体に固定化する場合、スペーサ
ーとして３〜２０原子程度のリンカーを介して共有結合で固定化すると、上記プロリン、
ヒドロキシプロリン、又は、ペプチドからなるリガンドと目的蛋白質とが相互作用しやす
くなる。
【００１９】
本発明の吸着剤は蛋白質を精製するために用いることができる。本発明の吸着剤により精
製される蛋白質としては特に限定されないが、例えば、ＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ
−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、又は、ＰＰＩａｓｅを含
有する融合蛋白質が好適に挙げられる。
【００２０】
上記ＰＰＩａｓｅは、蛋白質のフォールディングに関与する蛋白質折り畳み因子の１つで
あり、細胞内でフォールディング途上のターゲット蛋白質中のアミノ酸のうち、プロリン
残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活
性）を有するものである。
【００２１】
上記ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型及びパーブリン型の３種類に分類される
。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害される
ＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫阻害
剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。一
方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュ
グロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害されるものである。この３種類のＰＰＩ
ａｓｅの間には、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。
【００２２】
本発明の吸着剤は、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を精製するため
に好適に用いられるが、なかでも分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを精製するた
めに好適に利用される。分子シャペロン活性とは、変性した蛋白質を元の天然型にリフォ
ールディングさせる活性、又は、変性した蛋白質の不可逆的な凝集を抑制する活性を意味
し、ＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性である。例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素
、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田、
バイオサイエンスとインダストリー  ５６，  ５９３−、１９９８年）、これらを６Ｍ塩
酸グアニジン等の蛋白質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈
した際に開始する変性蛋白質の再生率や、変性蛋白質の凝集の抑制率でその検定対象物質
の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性蛋白質の再生率を評価する方
法としては、例えば、ロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０、３６１−、１９９５年）が挙げられ、変性蛋白質
の凝集抑制を評価する方法としては、田口らの方法（Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６９、８５２９−、１９９４年）等が挙げられる。
【００２３】
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅのうち、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、例
えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、バクテリア由来トリガーファクタータイプＰ
ＰＩａｓｅ（Ｈｕａｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９、１２５４−、２０００年）、Ｆ
ｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ａｒｉｅ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９、１９９−、
２００１年）、真核生物由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ  ２７４、１７１５−、１９９６年）等が挙げられる。また、シクロフィリン型ＰＰＩ
ａｓｅとしては、例えば、真核生物由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ等が挙げられる（
Ｐｉｒｋｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８、７９５−、２００１年）。なお、本発明の
吸着剤に対して適用可能なＰＰＩａｓｅには、これらのＰＰＩａｓｅと実質的に同等のポ
リペプチド、少なくともこれらの一部分を含むポリペプチド、及び、一部のアミノ酸を他
のアミノ酸に改変したもの等も含まれる。上記ＰＰＩａｓｅと３０％以上の相同性を有す
る蛋白質であれば本発明の吸着剤で精製することができる。好ましい相同性は５０％以上
であり、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上である。なお、蛋白質の
相同性はＣｕｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いて判断することができる。また、
これらの相同性を示すポリペプチドであれば生物種が限定されるものではない。
【００２４】
本発明の吸着剤で精製されるＰＰＩａｓｅとしては、なかでもＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが
好ましく、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがより好ましい。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより、２種類に大別でき
る。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は分子量が２６
〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明の吸着剤により精製される古細菌由来Ｆ
ＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれであってもよい
が、ショートタイプの方が好ましい。なお、上記した分子量の幅はこれまで見いだされて
いるＰＰＩａｓｅの分子量幅であり、本発明の吸着剤により精製される古細菌由来ＦＫＢ
Ｐ型ＰＰＩａｓｅは、この分子量幅に限定されず、実質的に同じグループに属するもので
あればいずれであってもよい。
【００２５】
本発明の吸着剤を用いて蛋白質を精製する場合、あらかじめリン酸緩衝液やトリス緩衝液
、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の所望の緩衝液で吸着剤を平衡化しておき、目的の蛋白質を含む蛋
白質混合液を添加する。この場合、吸着剤はカラム管に充填しておいても良く、試験管等
に吸着剤を充填した後、蛋白質混合液を添加して吸着剤を懸濁してもよい。上記緩衝液中
に硫酸アンモニウムや塩化ナトリウム等を添加して、上記緩衝液の塩濃度を調節してもよ
く、また、上記緩衝液中にＥＤＴＡ、ＤＴＴ、各種界面活性剤等の蛋白質の研究で一般的
に用いられる添加剤を加えてもよい。
【００２６】
目的の蛋白質を本発明の吸着剤に吸着させた後、適当な緩衝液を用いて吸着剤を洗浄する
ことにより不純物を除去することができる。緩衝液中にプロリン、ヒドロキシプロリン、
又は、第２の態様の吸着剤を使用した場合は上記ペプチド等を添加して調製した溶離液を
、洗浄後の吸着剤に添加し、目的蛋白質とプロリン、ヒドロキシプロリン、又は、上記ペ
プチドとを競合させることで、吸着剤から目的蛋白質を溶出させることができる。上記溶
離液中には、エチレングリコール、グリセリン、メタノール、疎水性アミノ酸水溶液等の
目的蛋白質と担体との相互作用をうち消すための添加剤を加えておいてもよい。
本発明の吸着剤を用いる蛋白質の精製方法もまた、本発明の１つである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、ＰＰＩａｓｅの特性を利用することにより、これまでバクテリア、酵母
、昆虫細胞等を用いた蛋白質発現系において問題となっていた封入体の形成を防ぎつつ、
且つ、得られた蛋白質をワンステップの精製法により、高純度で精製することが可能とな
る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。
【００２９】
（実施例１）プロリン固定化担体の調製
１０ｍｌのバイオラッド社製アフィゲル１０を精製水で洗浄後、０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３
の存在下で５００ｍＭ濃度のＬ−プロリン水溶液（和光純薬工業社製）と混合し、室温に
て１時間、４℃にて４時間インキュベートした。これによりアフィゲル１０のハイドロキ
シサクシンイミドエステル誘導体とＬ−プロリンのアミノ基とがカップリングされ、Ｌ−
プロリンがアフィゲル１０担体上に固定化された。次に１Ｍエタノールアミンと上記担体
とを１時間反応させることにより、担体上の余剰の官能基をブロッキングした。得られた
担体を精製水にて洗浄し、目的のプロリン固定化担体（吸着剤）とした。
【００３０】
（実施例２）ヒドロキシプロリン固定化担体の調製
Ｌ−プロリンの代わりにＬ−ヒドロキシプロリン（和光純薬工業社製）を用いたこと以外
は実施例１と同様の操作によりヒドロキシプロリン固定化担体（吸着剤）を調製した。
【００３１】
（実施例３）プロリルペプチド（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）固
定化担体の調製
Ｌ−プロリンの代わりにＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ペプチド研
究所社製）を用いたこと以外は実施例１と同様の操作によりプロリルペプチド固定化担体
（吸着剤）を調製した。
【００３２】
（実施例４）超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１由来ショートタ
イプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）の発現
分子シャペロン活性を有する古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８（Ｉ
ｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５７、４６５−、２００１年））の発現プラスミドｐ
ＥＦＥ１−３（Ｉｉｄａ、Ｇｅｎｅ  ２２２、２４９−、１９９８）によりＥ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１（ＤＥ３）株をトランスフォーメーションした。ＴｃＦＫＢＰ１８の遺伝子配
列は配列表の配列番号１に示した。２Ｌの三角フラスコに２×ＹＴ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｅ
ｘｔｒｕｃｔ  １６ｇ／Ｌ、  ＢＡＣＴＯ  ＴＲＹＰＴＯＮ  ２０ｇ／Ｌ、  ＮａＣｌ  
５ｇ／Ｌ、アンピシリン  １００μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）７００ｍＬを入れ、組み換え
大腸菌２〜３白金耳を接種した。３５℃で２４時間回転培養（１１０ｒｐｍ）した後、遠
心分離（１００００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）にて菌体を回収した。得られた菌体は１ｍＭ  
ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁した。得られ
た菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清部（可溶性画分）と沈殿部に分離した。可
溶性画分５μｌを１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色したところ、ＴｃＦＫＢＰ
１８に相当するバンドが検出された。バンド密度をデンシトメーターで測定したところ、
ＴｃＦＫＢＰ１８に相当するバンドは、大腸菌可溶性画分に含まれる全蛋白質の約１０％
であった。
【００３３】
（実施例５）プロリルペプチド固定化担体を用いたＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）の
精製
実施例３で調製したプロリルペプチド固定化担体５ｍｌを、内径１．６ｃｍのカラム管に
充填し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ硫酸アンモニウム含有、ｐＨ７．０）で
あらかじめ平衡化した。平衡化したカラムに、実施例４で調製したＴｃＦＫＢＰ１８を含
む大腸菌破砕液の可溶性画分３ｍｌ（１．８Ｍ硫酸アンモニウム含有）をアプライした後
、上記１．８Ｍ硫酸アンモニウムを含有したリン酸ナトリウム緩衝液３０ｍｌで洗浄後、
更に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ硫酸アンモニウム含有）３０ｍｌで洗浄
した。次に３０％エチレングリコールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌを
カラムに添加し、溶出される蛋白質画分を回収した。得られた蛋白質溶液５μｌを１６％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色したところ、ＴｃＦＫＢＰ１８に相当するバンドが
検出された。全蛋白質のバンド密度をデンシトメーターで測定したところ、ＴｃＦＫＢＰ
１８に相当するバンドは、上記蛋白質溶液に含まれる全蛋白質の約９５％であり、大腸菌
破砕液と比較してＴｃＦＫＢＰ１８が９．５倍に精製された。３０％エチレングリコール
により溶出される蛋白質溶液には、ＴｃＦＫＢＰ１８以外の蛋白質はほとんど検出されな
かった。
また、ＴｃＦＫＢＰ１８のバンド密度と蛋白質溶液の液量から算出されるＴｃＦＫＢＰ１
８の回収率は約６０％であった。以上より、本発明により調製した蛋白質の吸着剤により
、ＰＰＩａｓｅをはじめとする蛋白質が簡便に精製されることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、上述の構成よりなるので、これまでバクテリア、酵母、昆虫細胞等を用いた蛋
白質発現系において問題となっていた封入体の形成を防ぎつつ、且つ、得られた蛋白質を
ワンステップの精製法により、高純度で精製することが可能となる。
【配列表】
2005082537000001.app