(57)【要約】【課題】            豚丹毒菌に対する抗体を保有している豚に対しても抗体産生を大きく惹起し、かつ感染防御能を顕著に向上させ得る豚丹毒生ワクチン用溶解用液を提供する。【解決手段】        本発明は、豚丹毒生菌を用いた生ワクチンを水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解して接種することにより、豚丹毒菌に対する抗体を保有した豚においても抗体産生を大きく惹起し、かつ感染防御能を顕著に向上させることが可能な新規な豚丹毒生ワクチンに関する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油乳剤または水中油中水乳剤であることを特徴とする豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）生ワクチン用溶解用液。
【請求項２】
水中油乳剤であることを特徴とする請求項１に記載の溶解用液。
【請求項３】
水中油乳剤が、5〜50％容量の油性成分、0.5〜30％容量の界面活性剤及び20〜90％容量の水性成分より構成される請求項１または２に記載の溶解用液。
【請求項４】
油性成分が流動パラフィンなどの鉱物油、またはスクワレン、スクワラン、植物油、脂肪酸エステルなどの非鉱物油、界面活性剤が多糖脂肪酸エステル、多価アルコール脂肪酸エステル、およびそれらのポリオキシエチレン・エーテル、水性成分がリン酸緩衝液や生理食塩水より、それぞれ選択される請求項１から３のいずれかに記載の溶解用液。
【請求項５】
水中油中水乳剤であることを特徴とする請求項１に記載の溶解用液。
【請求項６】
水中油中水乳剤が、30〜90％容量の油性成分、0.5〜30％容量の界面活性剤および5〜85％容量の水性成分より構成される請求項１または５に記載の溶解用液。
【請求項７】
油性成分が流動パラフィンなどの鉱物油、またはスクワレン、スクワラン、植物油、脂肪酸エステルなどの非鉱物油、界面活性剤が多糖脂肪酸エステル、多価アルコール脂肪酸エステル、およびそれらのポリオキシエチレン・エーテル、水性成分がリン酸緩衝液や生理食塩水より、それぞれ選択される請求項１、５または６のいずれかに記載の溶解用液。
【請求項８】
凍結乾燥豚丹毒生ワクチンを封入したバイヤルと請求項１から６に記載の溶解用液を封入したバイヤルからなる豚丹毒生ワクチン製剤。
【請求項９】
当該溶解用液が水中油乳剤であることを特徴とする請求項７に記載の豚丹毒生ワクチン製剤。
【請求項１０】
当該溶解用液が水中油中水乳剤であることを特徴とする請求項７に記載の豚丹毒生ワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、豚に用いる豚丹毒生ワクチンの溶解用液に関する。詳細には、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）に対する抗体を保有している豚に対しても抗体産生を大きく惹起し、かつ感染防御能を顕著に向上させ得る豚丹毒生ワクチン用溶解用液に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚丹毒は豚丹毒菌というグラム陽性細菌が引き起こす全世界的に発生を見る疾病である。豚丹毒に罹患した豚は急性の敗血症を発症し、この場合、通常２，３日で斃死することが多い。また、敗血症死を逃れた感染豚は慢性の心内膜炎や関節炎を発症し、それが原因となる発育不全を引き起こす。このように豚丹毒は養豚界に多大な損害を引き起こすことから、わが国では届け出伝染病に指定されている。また、この菌は人にも類丹毒と呼ばれる皮膚疾患の他、まれに心内膜炎や敗血症を引き起こし、公衆衛生学上も重要な菌である。
【０００３】
豚丹毒感染予防のために豚丹毒生ワクチンが用いられており、優れた免疫効果と安全性が認められている。従来の豚丹毒生ワクチンは、凍結乾燥された豚丹毒生ワクチンを、添付された生理食塩水またはリン酸緩衝液などのワクチン用溶解用液で溶解して接種に用いられている。
【０００４】
しかしながら、本ワクチンは生ワクチンであるため、母豚から獲得した移行抗体または感染などによって獲得した抗体を保有している豚に対してワクチンを接種した場合、抗体によりワクチンが攻撃をうけ、本ワクチン接種による抗体産生を大きく惹起するのが困難という問題がある（例えば、非特許文献１参照）。従って、従来の豚丹毒生ワクチンを接種する際には、対象豚の移行抗体が消失したこと、または豚丹毒菌に対する抗体を保有していないことを事前に確認した上で接種する必要があり、このことがワクチンプログラムの障害になっている。
【０００５】
このような移行抗体の問題を解消するために、不活化された豚丹毒ワクチンも開発されているが、生ワクチンが１回の注射で有効であるのに対して、不活化ワクチンは複数回注射する必要がある。
【０００６】
【非特許文献１】「家保通信」，第２４４号，２００３年６月，p.2，http://www.pref.oita.jp/15800/chikusan/kahotuushinn/2003_06.pdf
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、豚丹毒菌に対する抗体を保有した豚においても抗体産生を大きく惹起し得る豚丹毒生ワクチンを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以上の課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、新規な組成を有するワクチン用溶解用液を用いることにより、豚丹毒菌に対する抗体保有豚の抗体産生を大きく惹起する豚丹毒生ワクチンを作製することに成功した。
【０００９】
すなわち、本発明の特徴は、鉱物油または非鉱物油を生理的食塩水またはリン酸緩衝液などの水溶液と乳化して調製された水中油（Ｏ／Ｗ）乳剤または水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）乳剤を、別に凍結乾燥された豚丹毒生ワクチンの溶解用液として用いることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、豚丹毒菌に対する抗体を保有している豚に対しても抗体産生を大きく惹起し、かつ感染防御能を顕著に向上させ得る豚丹毒生ワクチンを提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の豚丹毒生ワクチン用溶解用液として使用される水中油乳剤及び水中油中水乳剤は油性成分、界面活性剤及び水性成分より構成される。
【００１２】
油性成分としては、流動パラフィンなどの鉱物油、またはスクワレン、スクワラン、植物油、脂肪酸エステルなどの非鉱物油が使用可能である。
【００１３】
界面活性剤としては、多糖脂肪酸エステル、多価アルコール脂肪酸エステル、およびそれらのポリオキシエチレン・エーテルなどが使用可能である。
【００１４】
水性成分としては、リン酸緩衝液や生理食塩水などが使用される。
【００１５】
これら各成分を適宜混合して本発明の水中油乳剤または水中油中水乳剤からなる溶解用液が調製される。
【００１６】
水中油乳剤の場合、油性成分５〜50%容量に、界面活性剤（多糖脂肪酸エステル、多価アルコール脂肪酸エステル、およびそれらのポリオキシエチレン・エーテルなど）および水性成分（リン酸緩衝液、生理食塩水など）50〜95%容量を添加し、高速ホモジナイザーで乳化し、水中油乳剤を調製する。
【００１７】
一方、水中油中水乳剤の場合は、まず、界面活性剤を混合した油性成分50〜80％容量に、水性成分20〜50％容量を添加しながら高速ホモジナイザーなどで乳化し、１次乳化物を調製する。続いて、得られた１次乳化物10〜70％容量に、界面活性剤を混合した水性成分30〜90％容量を添加しながら高速ホモジナイザーで乳化し、水中油中水乳剤を調製する。
【００１８】
また、水中油中水乳剤の調製は上記に示した方法だけに限定されず、鉱物油（流動パラフィンなど）または非鉱物油（スクワレン、スクワラン、脂肪酸エステルなど）に界面活性剤（無水マンニトールオレイン酸エステルなど）を混合した油性成分2.5〜50%容量に、油性成分と同温度に加温した水性成分（リン酸緩衝液、生理食塩水など）50〜97.5%容量を添加しながら高速ホモジナイザーなどで乳化し、水中油中水乳剤を調製してもよい。
【００１９】
本発明に用いられる豚丹毒生ワクチンは、市販されている乾燥豚丹毒生ワクチンが使用可能である。このような市販の乾燥豚丹毒生ワクチンは、弱毒豚丹毒菌を製造用培地で培養後、安定剤を加え、凍結乾燥したのち減圧下でバイヤルに封入したものである。
【００２０】
本発明の乾燥豚丹毒生ワクチン製剤は、乾燥豚丹毒生ワクチンが封入されたバイヤルと本発明の水中油乳剤または水中油中水乳剤からなる溶解用液が封入されたバイヤルで構成される。本豚丹毒生ワクチンは、生ワクチン乾燥品に、添付の水中油乳剤または水中油中水乳剤からなる溶解用液を加えて溶解し、定められた量を豚の皮下に注射して使用される。
【００２１】
以下に実施例により本発明を詳述するが、本実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
《水中油乳剤の調製》
流動パラフィン５％容量、無水マンニトールオレイン酸エステル５％容量、リン酸緩衝液52.5%容量、および精製水37.5%容量を添加し、高速ホモジナイザーで乳化し、水中油乳剤を作製した。
《水中油中水乳剤の調製》
流動パラフィン40%容量に無水マンニトールオレイン酸エステル10%容量を混合した油性成分に、リン酸緩衝液50％容量を添加しながら、高速ホモジナイザーで乳化し、水中油中水乳剤を作製した。
【実施例２】
【００２３】
《乾燥豚丹毒生ワクチンを水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解したときの生菌数》
水中油乳剤または水中油中水乳剤が生菌数にどのように影響するかを調べる目的で、乾燥豚丹毒生ワクチン（(財)化学及血清療法研究所製）を水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解したときの生菌数の経時的推移を確認する実験を行った。
【００２４】
乾燥豚丹毒生ワクチンを、実施例１で得られた水中油乳剤または水中油中水乳剤（各20mL）で溶解し室温で保存した。溶解直後および溶解後２時間目のワクチンを生理食塩水で10倍段階希釈し、各希釈液0.1mLずつを５％羊脱繊維血液加寒天培地各３枚ずつに接種した。37℃、48時間培養し、各段階の希釈液毎の豚丹毒菌の集落数の平均値、希釈倍数および培地への接種量から生菌数を算出した。また、対照としてリン酸緩衝液で溶解したワクチンも同様に算出した。
【００２５】
【表１】
2005187375.tif 000002
【００２６】
表1で示したように、溶解直後および溶解後２時間目の生菌数は、水中油乳剤、水中油中水乳剤およびリン酸緩衝液を供試したときとの間に顕著な差は認められなかった。したがって、水中油乳剤および水中油中水乳剤は乾燥豚丹毒生ワクチンの溶解用液として使用可能であると考えられた。
【実施例３】
【００２７】
（１）抗体保有豚に対する有効性
水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解した乾燥豚丹毒生ワクチンの豚丹毒菌抗体保有豚に対する抗体応答を確認した。
【００２８】
実施例１で得られた水中油乳剤または水中油中水乳剤それぞれ20mLで溶解した乾燥豚丹毒生ワクチン（(財)化学及血清療法研究所製）、および対照としてリン酸緩衝液で溶解した同ワクチンを、抗体保有豚（生菌発育凝集抗体価：５〜８倍）の頸部皮下に１mL接種した。抗体応答の比較は、生菌発育凝集抗体価の経時的な推移をもとに行った。
【００２９】
生菌発育凝集抗体価の判定は、管底に膜状の沈澱物を生じるものを生菌発育凝集反応「＋」、管底中央に円形の菌塊のみを生じるものを生菌発育凝集反応「−」とした。「＋」以上の生菌発育凝集反応を生じる被検血清の最高希釈倍数の逆数を豚丹毒菌生菌発育凝集抗体価とした。この結果を表２に示した。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
従来のリン酸緩衝液で溶解した乾燥豚丹毒生ワクチン接種群の生菌発育凝集抗体価は、ワクチン接種後においても低下しつづけた。一方、水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解したワクチン接種群のそれは接種後３〜４週目に上昇に転じ、同11〜12週目までそれぞれ12.7〜20.2倍および5.0〜8.0倍で推移した。
【００３２】
（２）豚丹毒菌強毒藤沢株による攻撃試験
さらに、前記（１）の供試豚に対して、ワクチン接種後１２週目に、体側部皮内に豚丹毒菌強毒藤沢株（108CFU）を接種し、臨床症状を７日間観察した。観察終了後の剖検時には、主要臓器から攻撃菌の回収を試みた。この成績を表３に示した。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
表３から明らかなように、豚丹毒菌攻撃試験において、水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解したワクチン接種群の発熱、全身反応および起立性の異常が認められた期間は、リン酸緩衝液で溶解したワクチン接種群のそれらに比べていずれも短期間であった。さらに、リン酸緩衝液で溶解したワクチン接種群からは観察終了後の剖検時に攻撃菌が回収されたのに対し、水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解したワクチン接種群からは回収されなかった。
【００３５】
以上のように、乾燥豚丹毒生ワクチンを水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解することにより、豚丹毒菌抗体保有豚に対しても生菌発育凝集抗体価を惹起し、発症を抑制することが認められ、乾燥豚丹毒生ワクチンを水中油乳剤または水中油中水乳剤で溶解することの有効性が確認された。