(57)【要約】【課題】積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層構造の積層状態で存在する積層細胞層を簡単に、かつ効率的に作製することができる培養担体、該培養担体を使用した培養物と培養方法、ならびに前記培養物を使用した生体組織の再生方法の提供。【解決手段】多孔質層と非多孔質層を有し、かつ生分解性材料で構成されたことを特徴とする細胞培養担体、該培養担体の複数個が多孔質層を上側として積み重ねて構成され、かつ最下層の非多孔質層の生分解速度が、他の非多孔質層や多孔質層の生分解速度に比較して小さいことを特徴とする細胞培養担体、前記各培養担体の多孔質層中に増殖用細胞培養が保持されていることを特徴とする細胞培養担体、この増殖用細胞を播種した培養担体を培養した培養物、および該培養物を利用した細胞組織再生方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質層と非多孔質層を有し、かつ生分解性材料で構成されたことを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
多孔質層が連続多孔層で構成されたものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
非多孔質体の一部を凍結乾燥処理して多孔質化したものであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
多孔質体の一部を溶剤処理又は熱処理して非多孔質化したものであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養担体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の培養担体の複数個が多孔質層を上側として積み重ねて構成され、かつ最下層の非多孔質層の生分解速度が、他の非多孔質層や多孔質層の生分解速度に比較して小さいことを特徴とする細胞培養担体。
【請求項６】
多孔質層における孔の大きさはが５０〜５００μｍであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項７】
生分解性材料の選択および／または多孔質層の孔形状あるいは多孔度をコントロールすることによって、以下の要件を満足するものであることを特徴とする請求項５または６に記載の細胞培養担体。
（１）最下層の非多孔質層の生分解速度は他の非多孔質層や多孔質層の生分解速度に比較してもっとも小さく、所定の培養が完了した未分解であり、
（２）多孔質層は生分解速度が非多孔質層より大きく所定の培養が完了する迄に分解するものであり、
（３）さらに最下層の非多孔質層を除く非多孔質層の生分解速度は前記最下層の非多孔質層と多孔質層の間の大きさで、多孔質層における所定の培養および該多孔質層の分解が完了する迄は増殖用細胞が混合しないように分離層としての機能を奏するが、所定の培養が完了した時点では分解するもの。
【請求項８】
培養担体の多孔質層中に増殖用細胞培養が保持されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養担体
【請求項９】
最下位の非多孔質層の強度が、増殖用細胞層の培養が完了した時点で該非多孔質層上に載持された培養物を保持するに十分な強度を有するものであることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項１０】
最下位の非多孔質層が、生体組織の再生誘導のための足場になるものであることを特徴とする請求項９に記載の細胞培養担体。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞培養担体を培養した培養物。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養担体の多孔質層中に増殖用細胞を播種後、該細胞培養担体を積み重ね、該積み重ね状態で増殖用細胞の培養を行うとともに最下位に存在する非多孔質層を除く非多孔質層と多孔質層の分解を行い、培養された増殖用細胞層を未分解の非多孔質層上に重力落下させることを特徴とする増殖用細胞の培養物の作製方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の培養物を生体に移植して細胞増殖させることを特徴とする生体組織の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞層が多層の形で積層された積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層の形で積層された積層細胞層を作製するために使用される培養担体、増殖用細胞が播種された前記の培養担体、増殖用細胞が播種された前記の培養担体の培養物とその培養方法、および前記培養物を使用した生体組織の再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、組織欠損部位への移植用材料として、代表的なものに人工皮膚が挙げられる。これら細胞膜の多くはコラーゲンに代表される生体由来の吸収性材料を細胞増殖の基材として細胞を三次元で培養することにより作製されている。しかしながら、このようにして作製した細胞膜は単層構造であり、増殖された細胞層が積層された形で存在する積層細胞層、特に多種類の細胞が増殖され、かつこれら細胞層が接着された積層細胞層を作製することは困難であった。
【０００３】
多種類の細胞が多層構造の積層状態で存在する積層細胞層を作製する方法としては、例えば単層の細胞層を積層する方法が用いられているが（非特許文献１）、この方法では単層の細胞層を連続的に積層する必要があり、多くの手間がかかり効率的でない。
【０００４】
【非特許文献１】バイオマテリアルス２４（２００３）２３０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
解決しようとする課題は、積層細胞層、特に多種類の細胞層が多層構造の積層状態で存在する積層細胞層を簡単に、かつ効率的に作製することができる培養担体、該培養担体を使用した培養物と培養方法、ならびに前記培養物を使用した生体組織の再生方法の提供することにある。なお、本発明でいう多種類の細胞層が多層構造の積層状態で存在する積層細胞層とは、複数の細胞層が積層状態で存在するものは全て含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１は、非多孔質層と多孔質層を有し、かつ生分解性材料で構成されたものであることを特徴とする細胞培養担体にある。
【０００７】
本発明の第２は、前記第１の細胞培養担体の複数個が多孔質層を上側として積み重ねて構成され、かつ最下層の非多孔質層の生分解速度が、他の非多孔質層や多孔質層の生分解速度に比較して小さいことを特徴とする細胞培養担体にある。
【０００８】
本発明の第３は、前記第１または第２の培養担体の多孔質層中に増殖用細胞培養が播種されていることを特徴とする細胞培養担体にある。
【０００９】
本発明の第４は、前記第３の細胞培養担体を培養した培養物にある。
【００１０】
本発明の第５は、前記第１あるいは第２の細胞培養担体の多孔質層中に増殖用細胞を播種後、該細胞培養担体を積み重ねた状態で増殖用細胞の培養を行うとともに最下位に存在する非多孔質層を除く非多孔質層と多孔質層の分解を行い、培養された増殖用細胞層を未分解の非多孔質層上に重力落下させることを特徴とする増殖用細胞の培養物の作製方法にある。
【００１１】
本発明の第６は、前記第４の培養物を生体に移植して細胞増殖させることを特徴とする生体組織の再生方法にある。
【００１２】
以下、本発明の実施態様を図面に基づいて具体的に説明する。
１．細胞培養担体の構成
本実施態様の図２で示される細胞培養担体は、図１に示される多孔質層１と非多孔質層２を有し、生分解性材料で構成された培養担体およびこの培養担体と同様に多孔質層３と非多孔質層４を有し、生分解性材料で構成されている細胞培養担体の２個をそれぞれ多孔質層を上側として積み重ねたものである。本実施態様の細胞培養担体は上述のように２個の細胞培養担体を積み重ねたものであるが、本発明の培養担体の積み重ね数は目的とする積層細胞層の使用分野あるいは用途に応じて適宜決定され、例えば再生皮膚用の増殖細胞層を目的とする場合には、表皮細胞を増殖するために使用する培養担体、真皮細胞を増殖するために使用する培養担体、および血管内皮前駆細胞を増殖するために使用する培養担体の３個を積み重ねたもので構成される。
【００１３】
前記図２に示す細胞培養担体の多孔質層１と多孔質層３および非多孔質層２と非多孔質層４の生分解速度は、使用する生分解性材料の選択および／または多孔質層の孔形状あるいは多孔度によってコントロールすることができる。すなわち、多孔質層は非多孔質層に比較して生分解速度が速く、また多孔度が大きい程、生分解速度が速く、また多孔質層の多孔形状として、例えば連続多孔層の方が独立多孔気泡層に比較して生分解速度が速く、かつ栄養が供給され易い。
図２に示す本実施態様の細胞培養担体は、上述のように使用する生分解性材料の選択および／または多孔質層の孔形状あるいは多孔度をコントロールすることによって、最下層の非多孔質層４の生分解速度は他の非多孔質層２や多孔質層１，３の生分解速度に比較してもっとも小さく構成され所定の培養が完了した未分解であるのに対して、多孔質層１，３は生分解速度がもっとも大きく構成され所定の培養が完了する迄に分解する分解速度のものであり、さらに非多孔質層２は生分解速度が前記最下層の非多孔質層４と多孔質層１，３の間の大きさで、該層の上下層として存在する増殖用細胞が播種されている多孔質層１，３が所定の培養が完了する迄は前記多孔質層１，３の増殖用細胞が混合しないように分離層としての機能を奏するが、所定の培養が完了した時点で分解するものである。
【００１４】
前記図２に示す細胞培養担体は、前記のような構成を採用することにより、以下のような優れた効果を奏することができる。
すなわち、所定の培養が完了した時点においては非多孔質層２や多孔質層１，３は生分解により分解させ、多孔質層１，３において培養された培養物は最下位の非多孔質層４に載持させ、かつ該非多孔質層４を所定の培養が完了した時点においても該非多孔質層４上に載持された培養物を保持するに十分な強度を維持しているので、該培養物の取扱い、例えば生体へ移植する等に際しての取扱い、あるいは移植の作業が簡単となるだけでなく、通常、培養物を生体組織に移植して組織の再生誘導を行う場合、血液細胞を除いて欠損部位組織の再生誘導のために足場を必要とするが、前記最下位の非多孔質層４は、生体組織の再生誘導における足場の機能を奏することができるので、別途生体組織の再生誘導に際して前記のような足場の機能を奏する材料を使用する必要がなく、生体組織の再生誘導を簡単に行うことができるという効果を奏することができる。
なお、本実施態様の細胞培養担体においては、細胞培養担体の円柱形状のものを採用しているが、円柱形状のものに限らず、非多孔質層および多孔質層を形成できるものであれば任意の形状のもの、例えば４角形や膜形状のものが挙げられる。
【００１５】
本実施態様を含めて本発明で採用可能な生分解性材料としては、大きく分けて合成高分子材料、天然高分子材料および無機材料がある。
高分子材料としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酪−カプロラクトン共重合体等が挙げられ、特に前記共重合体はその共重合成分の共重合比を変えることにより、その特性、例えば前記生分解性の速度を変更することができる。
天然高分子材料としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸等が挙げられる。また、これら天然高分子材料、コラーゲン、ゼラチン等は架橋処理することにより、その生分解性を任意に変更することができる。その他、生分解性無機材料としては、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウムが挙げられる。
【００１６】
２．細胞培養担体の作製法
本発明の培養担体の作製方法としては、例えば以下のようなものが挙げられる。
（１）多孔質体の一部を溶剤処理または熱処理して非多孔質化する方法
（２）非多孔質体の一部を凍結乾燥処理して多孔質化する方法
（３）多孔質層層と非多孔質層を接合する方法
前記（１）の方法で使用する多孔質体としては、例えば生分解性材料を発泡剤を使用して発泡させた発泡体が挙げられ、この発泡体の発泡条件あるいは使用する発泡剤の種類を選択することにより、適宜その多孔度および／または孔形状をコントロールすることができる。また、多孔質層における孔の大きさは、５０〜５００μｍが好ましい。多孔質層における孔の大きさが５０未満では、細胞・培養液が入りにくくなり、十分に細胞が育たない。５００μｍを超えると強度が弱くなる。
【００１７】
３．前記細胞培養担体を利用した増殖用細胞の培養方法
目的の増殖細胞層の層数に応じた数の前記細胞培養担体を準備し、各細胞培養担体の多孔質層の孔中に目的の増殖細胞を得るために必要な増殖用細胞を播種した。この増殖用細胞の播種は、例えば前記増殖用細胞を滅菌、例えばγ線滅菌した前記細胞培養担体の多孔質層面上に供給した後、該供給された増殖用細胞を多孔質層中に埋入させることにより行うことができる。前記埋入手段としては、例えば前記増殖用細胞を播種した細胞培養担体を遠心させる遠心回転手段、あるいは滅菌された圧力ガスによる圧入手段が挙げられる。
また、前記増殖用細胞は前記埋入手段によっては多孔質層の表面部分にしか埋入できない場合があるとしても、生分解性材料の分解に伴い多孔質層内部にも埋入、あるいは増殖が可能となる。
【００１８】
上述のようにして増殖用細胞を播種した細胞培養担体を必要な個数だけ積み重ね、該積み重ね状態で培養液（例えば血清を含有した培養液）を有する容器中に浸漬して増殖用細胞層を培養し、培養養開始後、最下層の非多孔質層を除いた非多孔質層非および多孔質層が分解消失させ、前記多孔質層中で増殖された培養細胞層を最下層の非多孔質層上に重力落下させ積層細胞層を形成させる。前記のようにして作成した培養物は、それを生体に移植して細胞増殖させることにより生体組織の再生を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
細胞培養担体および該培養担体を使用した細胞膜の作製方法
【実施例１】
【００２０】
細胞培養担体１および該細胞培養担体を使用した積層細胞層の作製方法
図１および２に基づいて説明する。
分子量１０万の乳酸−カプロラクトン共重合体を１,４−ジオキサンに溶解し５％の溶液とし、この溶液を膜状で−５０℃にて凍結した。この膜状凍結物の片面のみを２５℃に２分置き溶解させた後に、凍結乾燥法を用いて片面のみが多孔質化した３個の乳酸−カプロラクトン共重合体膜（厚さ５００μｍ）を細胞培養担体として得た。得られた前記乳酸−カプロラクトン共重合体膜の少なくとも多孔質面は放電により親水化処理を行って細胞接着性を向上させた。さらにこの細胞培養担体の少なくとも多孔質層面、好ましくは全体をγ線滅菌した。上述のように親水化処理およびγ線滅菌を行った３個の細胞培養担体の多孔質面上に、それぞれ表皮細胞、真皮細胞、血管内皮前駆細胞をそれぞれ１．０×１０４個ずつ播種し、播種後、３００ｒｐｍで遠心することで多孔質内部細胞を埋入した。前記増殖用細胞を播種した膜状の細胞培養担体を積層して、該積層状態で１０％血清含有培養液中に浸漬して培養を行った。１５日後には多孔質部位はほぼ分解し、消失部分に細胞が増殖されていることが確認された。培養開始から２０日後、非多孔質層が分解され始め、各細胞膜の接着が見られた。
【実施例２】
【００２１】
細胞培養担体２および該細胞培養担体を使用した積層細胞層の作製方法
前記実施例１において、前記表皮細胞および真皮細胞を播種する細胞培養担体は、分子量１０万の乳酸−カプロラクトン共重合体をポリグリコール酸に替えた以外は同様にして作製し、また、血管内皮前駆細胞を播種する細胞培養担体は実施例１と同様にして作製した。これら各細胞培養担体を実施例１と同様に積み重ねて培養した。本実施例の細胞培養担体は、ポリグリコール酸で構成された多孔質部位がほぼ分解し、消失部分に細胞が増殖されていることが確認された時点、さらにはポリグリコール酸で構成された非多孔質層が分解され始め、各細胞膜の接着が見られた時点においても、前記乳酸−カプロラクトン共重合体で構成された最下位の非多孔質は未分解であった。
なお、前記表皮細胞、真皮細胞および血管内皮前駆細胞の培養に適した培養液としては、それぞれ従来用いられているものを使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明の培養担体を利用して、例えば皮膚再生用の積層細胞層層を製造することができる。すなわち、皮膚は角化細胞、色素細胞やメルケル細胞等で構成される表皮層、線維芽細胞と呼ばれる細胞でつくられた線維と基質で構成される真皮層および真皮の下にあり、脂肪細胞を含み、血管や神経幹も走っている下皮を基本構成とするものであるが、皮膚細胞は他の生体組織、またこれに代わる物質に付着して増殖し，平面上に層を作る性質があり、従来、細胞培養床としてポリスチレンや合成高分子物質に天然高分子物質をコーティングしたもの等を利用して細胞増殖が行われている。また、本発明の培養担体を利用すると、皮膚再生用の積層細胞層の他、血管再生用の積層細胞層、内臓臓器再生用の積層細胞層等を容易に作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】培養担体の１構成単位（ユニット）を示した説明図である。
【図２】培養担体の２構成単位（ユニット）を積重ね培養担体を示した説明図である。
【符号の説明】
【００２４】
１    多孔質層
２    非多孔質層
３    多孔質層
４    非多孔質層
【図１】
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【図２】
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