(57)【要約】【課題】  より基質特異性の高いエンテロペプチダーゼを提供する。【解決手段】  Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysからなるアミノ酸配列を特異的に認識するが、Boc-Glu(Obzl)-Ala-Arg-MCAまたはZ-Phe-Arg-MCAは認識しない、魚類由来のエンテロペプチダーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamideを特異的に切断するが、Boc-Glu(Obzl)-Ala-Arg-MCAまたはZ-Phe-Arg-MCAを切断しない、魚類由来のエンテロペプチダーゼ。
【請求項２】
ニホンメダカ（Olyzias latipes）由来の、請求項１に記載のエンテロペプチダーゼ。
【請求項３】
下記のａまたはｂに示された蛋白質。
ａ．配列番号１に示されたアミノ酸配列からなる蛋白質
ｂ．配列番号１に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、エンテロペプチダーゼ活性を有する蛋白質
【請求項４】
請求項３に記載の蛋白質をコードするDNA。
【請求項５】
下記のａまたはｂに示されたDNA。
ａ．配列番号２に示された塩基配列からなるDNA
ｂ．配列番号２に示された塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、エンテロペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
【請求項６】
配列番号３に示されたアミノ酸配列からなる蛋白質、もしくは配列番号３に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、プロセッシングを受けてヘテロダイマーとなった、エンテロペプチダーゼ。
【請求項７】
下記のａまたはｂに示されたDNA。
ａ．配列番号４に示された塩基配列からなるDNA
ｂ．配列番号４に示された塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、プロセッシングを受けてエンテロペプチダーゼとなる蛋白質をコードするDNA
【請求項８】
配列番号５に示されたアミノ酸配列からなる蛋白質、もしくは配列番号５に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、プロセッシングを受けてヘテロダイマーとなった、エンテロペプチダーゼ。
【請求項９】
下記のａまたはｂに示されたDNA。
ａ．配列番号６に示された塩基配列からなるDNA
ｂ．配列番号６に示された塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、プロセッシングを受けてエンテロペプチダーゼとなる蛋白質をコードするDNA
【請求項１０】
請求項４、５、７、または９のいずれかに記載のDNAを含む組換えベクター。
【請求項１１】
請求項４、５、７または９のいずれかに記載のDNAまたは請求項１０に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを特徴とする、エンテロペプチダーゼ蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１、２、３、６または８のいずれかに記載の蛋白質に対する特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のアミノ酸配列を認識し、かつ高い選択性を持ってそのペプチド結合を切断することのできる、ニホンメダカ由来のエンテロペプチダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロペプチダーゼは、高等動物において、複数の加水分解酵素からなる腸内消化のカスケードを制御するペプチダーゼとして報告された、十二指腸粘膜に存在する酵素蛋白質である（非特許文献１）。エンテロペプチダーゼは、トリプシン様セリンプロテアーゼの一種であり、トリプシノーゲンのN末端配列（ウシトリプシノーゲンではVa1-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）を特異的に認識し、LysのＣ末端側でペプチド結合を切断する。すなわち、膵臓からの消化液に存在するトリプシン前駆体であるトリプシノーゲンの酸性活性ペプチドを認識し、これを切断することによって、トリプシノーゲンをトリプシンへと変換させる酵素である。
【０００３】
本酵素により活性化されたトリプシンは、さらにトリプシノーゲンおよび他の膵臓由来プロテアーゼ前駆体（チモーゲン）等を活性化し、これら他の消化酵素との協調的な作用により、食物蛋白質の分解に関わる。したがって、本酵素は、消化器官、特に腸管における蛋白質消化代謝を調節する、重要な酵素蛋白質である。
【０００４】
これまでに、ウシのエンテロペプチダーゼの単離、精製、さらには同ペプチダーゼをコードするDNAのクローニングについての研究が進み（非特許文献２、３）、さらにブタ（非特許文献４）、ヒト（非特許文献５）、ラット（非特許文献６）ならびにマウス（非特許文献７）などからも、エンテロペプチダーゼの単離報告がなされている。さらに、Ｘ線結晶構造解析による、ウシエンテロペプチダーゼの立体構造も報告されている（非特許文献８）。
【０００５】
近年、Va1-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysからなるアミノ酸配列を認識し切断するというエンテロペプチダーゼの基質特異性を利用して、遺伝子組換え的に生産させた有用蛋白質を効率的に回収しようとする試みが行われている。すなわち、Va1-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysからなるアミノ酸配列を介して、所望の蛋白質を構成要素とする融合蛋白質を調製し、後にエンテロペプチダーゼを用いて融合蛋白質を切断し、目的蛋白質を回収しようとするものである。
【０００６】
この目的のための試薬用酵素として、米国ニューイングランドバイオラブ社からウシ由来のエンテロペプチダーゼ（カタログ番号8070）が、またノバジェン社からもウシ由来のエンテロペプチダーゼ（カタログ番号69066-3）が、それぞれ市販されている。
【非特許文献１】Pavlov, I. P. ら、“The work of the digestive glands”, 英国、1902年。
【非特許文献２】La Vallie, E. R.,ら、J. Biol. Chem.、1993年、第268巻、p.28811−23817。
【非特許文献３】Kitamoto, Y.ら、Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A.、1994年、第91巻、p.7558−7592。
【非特許文献４】Matsushima, M.ら、J. Bio. Chem.、1994年、第269巻、p.19976 −19982。
【非特許文献５】Kitamoto, Y.ら、Biochemistry、1995年、第34巻、p.4562−4568。
【非特許文献６】Yahagi, N.ら、Biochem, Biophys. Res. Commun.、1996年、第219巻、p.806−812。
【非特許文献７】Yuan X.ら、J. Physiolol.、1998年、第37巻、p.G342−G849。
【非特許文献８】Lu, D.ら、J. Mol. Biol.、1999年、第292巻、p.361-878。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のエンテロペプチダーゼを利用した目的蛋白質の生産ならびに回収においては、エンテロペプチダーゼが本来切断すべきペプチド結合のみが、酵素反応により加水分解されなければならない。すなわち、エンテロペプチダーゼの高い基質特異性が、この方法を有用ならしめ、その価値を決定付けている。
【０００８】
しかしながら、これまでに報告され、市販されている前述の２種のウシエンテロペプチダーゼについては、その基質特異性は必ずしも厳格なものではなく、所望の部位のみならず、それ以外の部位での切断も起こる可能性があった。
【０００９】
そのため、この非特異的切断を抑制するために、エンテロペプチダーゼの反応温度、使用する酵素量、酵素反応条件を厳格に調節する必要があるが、一般に容易な操作ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、これまでに報告例の無い、魚類由来のエンテロペプチダーゼに着目し、ニホンメダカ（Olyzias latipes）の卵巣及び腸から、エンテロペプチダーゼならびにそれをコードする遺伝子のクローニングに成功した。さらに、この様にして得た魚類エンテロペプチダーゼが、哺乳動物特にウシ由来のエンテロペプチダーゼに比べて、極めて高い基質特異性を有していることを確認し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysからなるアミノ酸配列を特異的に認識するが、Boc-Glu(Obzl)-Ala-Arg-MCAまたはZ-Phe-Arg-MCAは認識しない、魚類由来の、特にニホンメダカ(Olyzias  latipes）由来のエンテロペプチダーゼである。
【００１２】
また、本発明は、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号１に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、エンテロペプチダーゼ活性を有する蛋白質に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、配列番号２に示された塩基配列からなるDNA、または配列番号２に示された塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、エンテロペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA、該DNAを含む組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、宿主細胞を培養することを特徴とする、エンテロペプチダーゼ活性を有する蛋白質の製造方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、配列番号３または５に示されたアミノ酸配列からなる蛋白質、もしくは配列番号３または５に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、プロセッシングを受けてヘテロダイマーとなった、エンテロペプチダーゼに関する。
【００１５】
さらに、本発明は、配列番号４または６に示された塩基配列からなるDNA、もしくは
配列番号４または６に示された塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、プロセッシングを受けてエンテロペプチダーゼとなる蛋白質をコードするDNAに関する。
【００１６】
（DNA）
本発明のDNAは、ニホンメダカの卵巣ならびに腸内からクローニングされた、エンテロペプチダーゼをコードするDNA（以下、Epolと称する）に関する。Epolは、メダカ卵巣あるいは小腸から単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングや、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるDNAであってもよい。その形態としてはcDNA、ゲノムDNAの他、化学合成DNAなどが含まれるが、特に制限はない。
【００１７】
また、Epolの塩基配列が提供されれば、これより導かれるRNAの配列や、相補的なDNAおよびRNAの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のDNAに対応するRNAあるいは本発明のDNAと相補的な配列を有するDNAおよびRNAもまた提供するものと理解すべきである。
【００１８】
なお、本発明のDNAには、配列番号２、４または６に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAをも含むものである。
【００１９】
配列番号２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAは、そのDNAにコードされる蛋白質がエンテロペプチダーゼ活性を保持する範囲内において、また、配列番号４または６に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAは、そのDNAにコードされる蛋白質がプロセッシングを受けてエンテロペプチダーゼとなる範囲内において、塩基配列のバリエーションが許容される。
【００２０】
例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるDNA断片の変異・欠失・連結等により、部分的にDNA配列が変化したものであっても、これらDNA変異体が配列番号２、４または６に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンテロペプチダーゼと機能的に同等な蛋白質を提供するDNAであれば、配列番号２、４または６に示したDNA配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
【００２１】
上記のDNA変異の程度は、配列番号に記載のDNA配列と80％以上の相同性を有するものであれば許容範囲内である。また、ハイブリダイズする程度としては、通常の条件下、例えばDIG DNA Labeling kit（ベーリンガー・マンハイム社製Cat No.1175033）でプローブをラベルした場合に、３２℃のDIG Easy Hyb溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Cat No.1603558）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列表で特定した核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
【００２２】
本発明のDNAは、メダカ由来のエンテロペプチダーゼを組換え的に生産するために使用することができる。すなわち、本発明のDNAは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換エンテロペプチダーゼの生産方法に有用である。
【００２３】
本発明における形質転換細胞は、当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のDNAを組み入れることが可能である。その際、Epolをプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、Epolの宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いたエンテロペプチダーゼの生産において好適に用いられる。
【００２４】
（蛋白質）
本発明のエンテロペプチダーゼは、Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamideを特異的に切断するが、Boc-Glu(Obzl)-Ala-Arg-MCAまたはZ-Phe-Arg-MCAは切断しない、ニホンメダカ由来のエンテロペプチダーゼである。
【００２５】
より具体的には、ニホンメダカの卵巣ならびに腸内からクローニングされた、全３９９７塩基対（ｂｐ）のDNA(配列番号７）に存在するＯＲＦの、全１０３６個のアミノ酸残基からなる蛋白質（EP1036、配列番号３)、該ORFにコードされる蛋白質の４３３〜１０３６番目のアミノ酸残基からなる蛋白質（EP604）、または該ORFにコードされる蛋白質の７９５〜１０３６番目のアミノ酸残基からなる蛋白質（EP242）である。
【００２６】
これまでに報告されている既知のエンテロペプチダーゼは、一本鎖ポリペプチド蛋白質として生合成され、これが限定的分解を受けることにより、Ｎ末端側約１２０ｋＤａの重鎖とＣ末端側約４７ｋＤａの軽鎖がジスルフィド結合でつながった構造をとることが知られている。また、上記の軽鎖が、Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysなるアミノ酸配列の認識と切断活性を担っていることが知られている。
【００２７】
本発明のエンテロペプチダーゼについて確認したところ、Ｃ末端側の２４２番目のアミノ酸残基からなる部分ペプチド、すなわちEP242がエンテロペプチダーゼ活性を有していることが確認された。一方、メダカの小腸ならびに卵巣において、それぞれEP1036ならびにEP604に相当する蛋白質の発現も確認された。
【００２８】
従って、本発明のエンテロペプチダーゼのうち、EP1036ならびにEP604は、卵巣等で一本鎖ポリペプチド蛋白質として生合成された後にプロセッシングを受け、２本鎖構造をとるものと推察される。
【００２９】
本発明のエンテロペプチダーゼは、Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysなるアミノ酸配列に対して、これまで報告されている他生物種由来のエンテロペプチダーゼに比べて、極めて高い特異性を有している。
【００３０】
市販ウシエンテロペプチダーゼに対する特異的基質として、Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide (Sigma社製)が市販されている。NEB社製(Cat.No.#P8070)及び Novagen社製(Cat.No.69066-3)の市販ウシエンテロペプチダーゼは、上記の特異的基質に対しても活性を示すばかりでなく、Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCAおよびZ-Phe-Arg-MCAなどをも切断する。これに対して、EP242は、酵素量依存的にかつ反応時間依存的に、合成基質Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamideを切断する一方、Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCAおよびZ-Phe-Arg-MCAに対しては切断活性を示さなかった。ウシエンテロペプチダーゼを含む、P1位のアルギニン（Arg）を認識する多くのセリンプロテアーゼは、このBoc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCAおよびZ-Phe-Arg-MCAを認識して切断するが、本発明のエンテロペプチダーゼにはかかる切断活性は認められないことから、合成基質に対してより厳格な特性を有していると言える。
【００３１】
さらに、蛋白質基質であるゼラチンに対する切断活性を比較すると、市販のウシ酵素はゼラチン分解活性が強く、分解産物として様々なペプチド断片が生じる一方、EP242は反応後のペプチド断片の種類は極めて少ないものであった（図７）。また、ゼラチンザイモグラフィーによっても、市販ウシ酵素ではゼラチン分解活性が検出されるのに対して、EP242はゼラチン分解活性を殆ど示さないことが確認された（図８）。
【００３２】
以上の結果から、本発明の魚類由来のエンテロペプチダーゼは、哺乳類由来のエンテロペプチダーゼに比べて、蛋白質基質に対しても、より高い基質特異性をもつことが明らかになった。
【００３３】
エンテロペプチダーゼは、バイオテクノロジー分野において、有益な蛋白質を構成要素とする融合タンパク質から、目的となる蛋白質を切り出して回収する際の切り出しツールとして、用いられている。本発明の蛋白質も、エンテロペプチダーゼ切断サイトを有する融合タンパク質に作用し、所望の蛋白質を遊離させることができ、かつ、ウシ由来エンテロペプチダーゼと比較して、非特異的分解作用によると考えられるポリペプチドの生成が、EP242では少ないことが確認された。
【００３４】
以上の様に、本発明のエンテロペプチダーゼは、より厳格にエンテロペプチダーゼサイトを切断することが示された。融合蛋白質への非特異的切断が少ないということは、所望の蛋白質の回収率が向上するという利点をもたらすと共に、非特異的分解による不純ペプチドの混入を押さえることが出来る、という利点を有することを意味する。従って、医薬として所望の蛋白質を製造する際に、共雑物混入防止を回避することが出来、極めて有利な酵素であるといえる。
【００３５】
具体的には、ｔＰＡやインターフェロン等に代表される医薬として利用可能な蛋白質の製造において、かかる所望の蛋白質のＮ末端に、Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysを介して、ヒスチジンタグあるいはグルタチオンＳトランスフェラーゼなどの様にアフィニティーカラム等を用いることで容易に回収可能な蛋白質を接合させた、融合蛋白質を製造させる。その後、該アフィニティーカラムに融合蛋白質を回収後、本発明のエンテロペプチダーゼを作用させることにより、極めて少ない工程数で、共雑蛋白質の混入を押さえながら、所望の蛋白質のみを完全な形で回収することが可能となる。
【００３６】
なお、エンテロペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号１、３、または５に示す蛋白質のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
【００３７】
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においてはセリンプロテアーゼ活性、を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
【００３８】
従って、配列番号１、３または５に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、エンテロペプチダーゼ活性を有する蛋白質を提供するものであれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。
【００３９】
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多形等の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばNTGなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、エンテロペプチダーゼ活性を有する蛋白質を提供する限り、特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内である。
【００４０】
（抗体）
本発明はさらに、本発明のエンテロペプチダーゼに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、エンテロペプチダーゼ全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び/またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（IgG，IgA，IgM，IgD，IgE）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのF(ab')2、パパインで分解したときのFabなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体であってもよい。
【発明の効果】
【００４１】
本発明のエンテロペプチダーゼは、既知のエンテロペプチダーゼに比して、基質特異性が高いという特徴を有する。このことは、対象となる蛋白質の非特異的切断が少ないことを意味する。従って、エンテロペプチダーゼを利用した所望の蛋白質の合成、回収において、活性を維持したままの目的蛋白質の回収率が向上するという利点をもたらし、また、非特異的分解による不純ペプチドの混入を押さえることが出来る。従って、医薬として所望の蛋白質を製造する際に、共雑物混入防止を回避することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（DNA）
本発明のDNAは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するDNAやRNAと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該DNAは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRPO）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
【００４３】
本発明のDNAをDNAライブラリーから得る例としては、めだか卵巣あるいは小腸のゲノムDNAライブラリーやcDNAライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のDNAを有するクローンを増幅させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。
【００４４】
ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその一部を有するDNAを32Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のcDNAライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Maniatis T.等，MolecularCloning，a Laboratory Manual，Cold Spring harbor Laboratory，New York，1982年）行うことができる。
【００４５】
イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規DNAはまた、ゲノムDNAライブラリーもしくはcDNAライブラリーを鋳型とするPCR(Polymerase Chain Reaction)によっても得る事ができる。
【００４６】
PCRは、配列番号２、４または６に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作成し、任意のDNAライブラリーに対し、公知の方法（例えばMichael A．I.等，PCR Protocols，a Guide to Methods and Applications，Academic Press、1990年参照）等を行って、本発明のDNAを得る事もできる。
【００４７】
上記各種方法で使用するDNAライブラリーは、本発明のDNAを有するDNAライブラリーを選択して使用する。当該DNAライブラリーは、本発明のDNAを有するライブラリー、好適にはメダカの卵巣あるいは小腸由来のライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、本発明のDNAを有する細胞からcDNAライブラリーを作成するのに適した細胞を選び、公知の方法（J.Sambrook 等、Molecular Cloning，a Laboratory Manual 2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989年参照）に従って、cDNAライブラリーを作製し、利用することができる。
【００４８】
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
【００４９】
本発明のDNAを有する組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のDNAに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。
【００５０】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成DNAアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のDNAに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のDNAを基に任意かつ容易に加工することができる。
【００５１】
また本発明のDNAを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
【００５２】
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
【００５３】
DNAをベクターに導入する方法は公知である（J.Sambrook等、Molecular Cloning，a Laboratory Manual 2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク(New York)，1989年、参照）。すなわち、DNAとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片をDNAリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
【００５４】
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、メダカの卵巣あるいは小腸から調製することができるが、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー430A型、パーキンエルマージャパン（株）製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度ならびに回収量の面から、遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
【００５５】
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、E.coli、B.subtilisあるいはS.cerevisiaeに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、COS７細胞、CHO細胞、Hela細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
【００５６】
組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック1991年3月20日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
【００５７】
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換体を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換体の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換体の培養については各種の成書（たとえは、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、1992年、参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。
【００５８】
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりHPLCシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００５９】
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヒキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
【００６０】
また、組換えDNA分子を利用して無細胞系の合成方法（J.Sambrook、et al.：Molecular Cloning 2nd ed.(1989年)）で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
【００６１】
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、エンテロペプチダーゼとして機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。 
【００６２】
（特異的抗体）
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
【００６３】
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（FCA）や不完全アジュバント（FIA）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それか抗体の作製に使用しうる精製度のものであれはいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約10〜20アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
【００６４】
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
【００６５】
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れは良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
【００６６】
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の牌細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからmRNAを採取し、これをもとにcDNAライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を、公知方法を組み合わせて精製することができる。
【００６７】
以下、本発明を、非限定的な実施例を示してさらに詳述する。
【実施例１】
【００６８】
メダカエンテロペプチダーゼをコードするDNAのクローニング
１）メダカ卵巣ならびに小腸のポリ(A)+RNAの調製
体長２cm以上の成熟メスニホンメダカ（Olyzias latipes）を購入し、27℃で 14時間の明期と10時間の暗期とする飼育条件下で飼育し、毎日、暗期から明期の転換期に排卵するようになるまで馴化させた。馴化を確認後、排卵直前期のメダカの卵巣及び腸を取り出し、直ちに液体窒素中で凍結保存したメダカ卵巣から、ISOGEN（RNA抽出用試薬、ニッポンジーン社）を用いて全RNAを調製した。
【００６９】
メダカ卵巣に、試料500mgあたり1 mlのISOGENを加えてホモゲナイズした。室温に5分間放置した後、0.2 mlのクロロホルムを加えて15秒間激しく振盪し、その後3分間室温に放置した。4℃で12,000 rpmで15分間遠心を行い、水相を回収した。
【００７０】
回収したサンプルに0.5 mlのイソプロパノールを加えて室温に10分間放置した後、4℃で12,000 rpmで15分間遠心した。ここで生じた沈殿画分に70%エタノールを加えてvortexした後、4℃で12,000 rpmで5分間遠心をした。沈殿画分を失わないように70%エタノール層を捨て、さらに残存する70%エタノールを乾燥により完全に除いた後、沈殿画分を44 μl のMilli-Q水に溶解した。
【００７１】
得られたサンプルからゲノム由来のDNAを完全除去するために以下のようにDNase処理を行った。すなわち、Milli-Q水（44 μl）に溶解した粗トータルRNA画分に、1 μl のDNase（1 unit/μl、プロメガ社製）と5 μlのDNase添付緩衝液を加えて37℃で1時間反応させた。反応終了後、50 μlのフェノール液と50 μlのCIAA液を加えて激しく振盪し、室温にて13,000 rpmで5分間遠心した。水相を集め、これに50 μlのCIAA液を加えて激しく振盪し、再度、室温にて13,000 rpm、5分間の遠心により水相を集めた。回収した水相に125 μl の100%エタノールと5 μlの3M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）を加えて-80℃で15分間放置後、4℃で13,000 rpmで10 分間遠心して沈殿画分を得た。得られた沈殿画分に70%エタノールを400 μl加えて遠心（4℃、13,000 rpm、5 分間）した。上清のエタノールを捨て、さらに乾燥によって完全にエタノールを除去した後、沈殿画分を300 μlのmilli-Q水に溶解した。メダカ腸からも、上と同様の方法により全RNAを調製した。
【００７２】
この一連の操作によって、ゲノムDNAを含まない全RNAを約1 mg/mlの濃度で得られた。
【００７３】
得られたメダカ卵巣の全RNAの１mgを、0.5mlの滅菌水に溶解し、65℃で15分間加熱後、氷中で急冷する。これに0.5mlの20mM Tris-HCl (pH 7.5)/2 mM EDTA/1M NaClを加え、既に20mM TE/NaCl (TE (Tris-HCl (pH 7.5), 1mM EDTA): 0.5M NaCl= 1:1)で平衡化しておいた 0.2mlのオリゴdTセルロースカラム(Parmacia社製)に通し、通過した溶液を65℃で15分間の熱変成後、2回カラムに通した。次いで、約2.0mlのTE/NaClでカラムを洗浄後、溶出用緩衝液（20mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM EDTA）を加えてポリ(A)+RNAを溶出・精製した。RNAの量をUV分光器により測定したところ、この操作で得られたポリ(A)+RNA量は20μgであった。また、同様の操作により、メダカ腸からもポリ(A)+RNAを調製した。
【００７４】
２）縮重プライマーの作製
哺乳類で知られているセリンプロテアーゼファミリー間でよく保存されているアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを合成した。すなわち、5’ 縮重センスプライマーとして、活性中心残基の一つであるHisを含む領域Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cysに基づいて5’-GT(T/G)(G/C)TCC(G/T)(A/T)C(A/T)GCTGC(T/C/A)CACTG-3’を、3’縮重アンチセンスプライマーとして、活性中心残基の一つであるSerを含む領域Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Proに基づいて5’-(A/T)GGGCC(A/T)CC(A/G/T)GAGTC(A/T)CC-3’を合成した。 
【００７５】
３）縮重プライマーを用いたRT-PCR
１）で調製した卵巣全RNA 2μgを用いて、SUPERSCRIPT First Strand Synthesis System for RT-PCR (インビトロゲン社)を用いて１本鎖DNAの合成を行った。すなわち、まずRNA／プライマー混合液を以下の組成で作製した。
【００７６】
【表１】
2005253325.tif 000002
上記混合物を、70℃で10分間加温した。氷上に１分間置き、以下の試薬を順に加えた。
【００７７】
【表２】
2005253325.tif 000003
上記混合物を、42℃で5分間プレインキュベートした。次いでSUPERSCRIPT II （逆転写酵素）を1 μl（200 units）加えよく混合後、42℃で50分間インキュベートした。次いで70℃で15分間インキュベートし反応を停止させた。氷上で冷やした後、RNase Hを1 μl（2 units）加え、37℃で20分間インキュベートすることにより鋳型RNAを分解し、一本鎖cDNAを得た。
【００７８】
このcDNAを鋳型として、実施例４で作製した縮重プライマーを用いてPCRを行った。PCR反応液の組成は以下の通りである。
【００７９】
【表３】
2005253325.tif 000004
【００８０】
上記反応液をよく混合後、PCR反応を行った。PCRは、最初に94℃で3分間熱した後、94℃で60秒間の熱変性、55℃で600秒間のアニーリング、72℃で60秒間の伸長反応の条件を１サイクルとして、35サイクル行った。
【００８１】
反応終了後、このPCR産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供試した。PCR産物は、電気泳動後のゲルを、エチジウムブロマイドを加えた緩衝液に15分間浸した後に、UV照射により検出した。増幅された産物は、約450ヌクレオチドからなるDNAであった。
【００８２】
上記の増幅されたPCR産物を、ジーンクリーンキット（Q-BIO gene 社）を用いて、アガロースゲルから切り出し精製を行った。次いで、このPCR産物を、T-Vectorに連結し、この組換えプラスミドを大腸（JM109）に形質転換した。単一コロニーをTerrific Broth培地中で培養し、プラスミドを精製して、ABI PRISM Big-Dye Terminator Cycle Sequence Kit Version 2（Applied Biosystems社）を用い、蛍光自動DNAシークエンサー（Applied Biosystems社、373型）により解析した。その結果、解析されたPCR産物の一つが、ヒトエンテロペプチダーゼの部分配列と高い相同性を示すことが確認され、単離されたcDNA断片がメダカエンテロペプチダーゼをコードするDNAの一部であると予測された。
【００８３】
４）メダカ卵巣cDNAライブラリーの調製
cDNAライブラリーの調製は、プロメガ社製のUniversal RibiClone cDNA Synthesis Systemを用いて行った。１）で得られたポリ(A)+RNAを鋳型として、二本鎖cDNAの合成を行った。
【００８４】
まず、以下の組成で一本鎖cDNAを合成した。
【００８５】
【表４】
2005253325.tif 000005
【００８６】
上記混合物を、70℃で10分間加温した。氷上に１分間置き、以下の試薬を順に加えた。
【００８７】
【表５】
2005253325.tif 000006
【００８８】
上記溶液を42℃で60分間インキュベートすることにより一本鎖cDNAを合成した。
【００８９】
次に、得られた一本鎖cDNAの反応液に、以下の試薬を順に加えた。
【００９０】
【表６】
2005253325.tif 000007
【００９１】
上記反応液を、14℃で240分間インキュベートし、その後70℃で10 分間の酵素失活処理を行うことにより二本鎖cDNAを合成した。
【００９２】
合成した二本鎖cDNAをT4 DNAポリメラーゼ10 unitsによって平滑化し、次いで、500mM EDTA溶液5μl を添加して酵素反応を停止させた。次いで、TE-飽和フェノール／クロロホルムによる抽出及びエタノール沈殿を行った後、滅菌水に溶解して二本鎖cDNA溶液を得た。合成した二本鎖cDNAの伸長度は、アガロースゲル電気泳動に供試することにより確認した。
【００９３】
次に、以下の反応組成の溶液を調製し、二本鎖cDNAにアダプターを付加した。
【００９４】
【表７】
2005253325.tif 000008
【００９５】
上記反応液を、15℃で20時間インキュベートすることにより、二本鎖cDNAの両末端にEcoRIアダプターを付加した。次いで、T4 DNA リガーゼを不活性化するために70℃で10分間加熱処理した。
【００９６】
回収したcDNA 溶液30μlに10 × T4キナーゼ緩衝液4μl、100mM ATP 2μl、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(10units/μl)を1μlを加え、さらに滅菌水を用いて終量を40μlとした。37℃で60分間反応させて、cDNAの5’ 末端をリン酸化した。反応終了後、フェノール／クロロホルム抽出を行い、さらにエタノール沈殿によりリン酸化cDNAを回収した。
【００９７】
回収したリン酸化cDNAを〜50μl の蒸留水に溶解し、TEN (10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM NaCl、pH 8.0)で平衡化したSephacryl S-1000スピンカラムに供して、未付加のアダプター及び1000bp以下のcDNAを除去した。カラムから溶出されたcDNAをエタノール沈殿により回収した。
【００９８】
上記のようにして得られた、両端にEcoRI制限酵素部位を有するcDNAに以下の反応組成の溶液加え、λgt10のarmを付加した。
【００９９】
【表８】
2005253325.tif 000009
【０１００】
上記反応液を、26℃で10分間保温した。このライゲーション反応液のうち4μlを、Giga Pack II Gold (Stratagene社製) を用いてin vitro パッケージングに供した。
【０１０１】
パッケージングされた組換えバクテリオファージを含むパッケージング溶液にE. coli C600hfl株を加え、37℃で15分間培養した。これを7mlのトップアガロース (48℃) に加え、9cm × 13cm 角型シャーレ（栄研器財社製）を用いたLBアガロース＋10mM MgSO4 プレート(LB broth base (Invitrogen社製)、10mM MgSO4・7H2O、1.5%寒天、pH 7.4)上に、１枚当たり30,000個のプラークが形成されるように計20枚のプレートに播き、合計600,000個のプラークからなるｃDNAライブラリーを作製した。
【０１０２】
５）メダカ卵巣cDNAライブラリーからのクローンの単離
メダカエンテロペプチダーゼcDNAクローンの全長配列をクローニングするために、上記３）のPCR産物を、４）で調製したメダカ卵巣及び腸cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。プローブの32P標識は、DNAラベリングキット（TAKARA社製）を使用して行った。
【０１０３】
４)で得られたプレート上に、予め大きさを合わせて切断した強化ニトロセルロースメンブレン(9 ×13cm, S&S社製)をのせ、DNAをメンブレンにトランスファーさせた。
【０１０４】
メンブレンを、アルカリ変性液 (0.5M NaOH、1.5N NaCl) を浸した濾紙上に５分間静置し、一旦ペーパータオルで余分な水分を除去した後、メンブレンを中和溶液（0.5M Tris-HCl、pH 7.6、2 × SSC）を浸した濾紙上に５分間静置し中和した。メンブレンを2 × SSC溶液でリンスした後、50℃で1 時間乾燥させ、UVクロスリンカー（フナコシ社製）でDNAをメンブレンに固定した。
【０１０５】
固定したメンブレンを一旦、0.05% SDSを含む 5 × SSPEに浸した後、100mlのプレハイブリダイゼーション溶液（5 × SSPE、5 × Denhardt’s溶液、0.5% SDS ）で65℃で3時間プレハイブリダイゼーションを行った。そこに100μg/ml 変性ニシン精子DNA、 1 ×106 cpm/ml のプローブを加え、65℃、18時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション完了後、0.05% SDSを含む2 × SSCを用い、室温で5分間、次いで50℃で15分間の洗浄を2回行った。さらに0.1% SDS を含む0.1 × SSCを用い50℃で15分間の洗浄を2回行った。
【０１０６】
このメンブレンをＸ線フィルム (Kodak社製) に重ね、-80℃で一晩オートラジオグラフィーを行った。Ｘ線フィルムを現像したところ、1個の陽性シグナルが得られた。得られたシグナル付近のプラークを掻き取り、それをSM溶液（100mM NaCl、100mM MgSO4、50mM Tris-HCl、pH 7.5、0.01% ゼラチンを含む）に懸濁した。このファージ懸濁液を適度に希釈してプレーティングし、上記と同様のスクリーニングを行い、組換え体ファージを得た。
【０１０７】
６）組換え体λgt10 DNAの大量調製
クローン化したファージをそれぞれプレーティングし、37℃で6-8時間インキュベートし、続いて4℃で3時間インキュベートした後、SM溶液に数滴のクロロホルムを加え室温で2時間放置した。SM溶液を回収し、混入した軟寒天を遠心分離により除去した。遠心後の上清からQIAGEN Lamda Mini Kit（QIAGEN社製） を用いてDNAを精製した。
【０１０８】
７）挿入断片の塩基配列決定
６）で調製したλgt10 DNAをEcoRIで消化し、挿入部分を分離精製後、ベクターpBlueScript II (Stratagene社製) のEcoRI部位にクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ABI PRISM Big-Dye Terminator Cycle Sequence Kit Version ２（Applied Biosystems社）を用い、蛍光自動DNAシークエンサー（Applied Biosystems社、373型）により解析した。その結果、全長3997bpの長さを有する本発明の遺伝子のうち、塩基番号2748から3997までの1250bpに相当する部分塩基配列が得られた。
【０１０９】
８）メダカ腸のランダムcDNAライブラリーの調製
卵巣cDNAライブラリーをスクリーニングしたときに用いたプローブを使用して、メダカ腸のランダムcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。プローブの32P標識は、DNAラベリングキット（TAKARA社製）を使用して行った。
【０１１０】
１）のメダカ腸のポリ(A)+RNAを鋳型として、プロメガ社製のUniversal RibiClone cDNA Synthesis Systemを用いて二本鎖cDNAの合成を行った。まず一本鎖cDNAを合成した。反応条件は、プライマーとしてrandom hexameric primersを用いた以外は、実施例６と同じである。その後、二本鎖cDNA合成、T4 DNAポリメラーゼによる平滑化、EcoRIアダプターの付加、ライゲーション及びパッケージングは５）と同様に行った。
【０１１１】
パッケージングされた組換えバクテリオファージのE. coli C600hfl株への感染とプレーティングは５）と同様に行った。9cm × 13cm 角型シャーレ上に、１枚当たり30,000個のプラークが形成されるように計20枚のプレートに播き、合計600,000個のプラークからなるライブラリーを作製した。
【０１１２】
９）メダカ腸のランダムcDNAライブラリーからのクローンの単離
前記８）で得られたプレート上に、予め大きさを合わせて切断した強化ニトロセルロースメンブレン(9 ×13cm, S&S社製)をのせ、DNAをメンブレンにトランスファーさせた。メンブレンを変性、中和後、DNAをメンブレンに固定し、７）で調製した500 bpのエンテロペプチダーゼcDNA断片をプローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、５）と同様であった。この第一次スクリーニングにより4個の陽性シグナルが得られ、第二次、第三次スクリーニングを行ってクローン化し、組換え体ファージを得た。
【０１１３】
クローン化したファージから、６）と同様の方法により、組換え体λgt10 DNAを大量調製し、精製した。
【０１１４】
１０）挿入断片の塩基配列決定
９）で調製した組換え体ファージ DNAをEcoRIで消化し、挿入部分を分離精製後、ベクターpBlueScript II (Stratagene社製) のEcoRI部位にクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ABI PRISM Big-Dye Terminator Cycle Sequence Kit Version 2（Applied Biosystems社）を用い、蛍光自動DNAシークエンサー（Applied Biosystems社、373型）により解析した。その結果、全長3997bpの長さを有する本発明の遺伝子のうち、塩基番号611から3271までの2661bpに相当する部分塩基配列が得られた。
【０１１５】
この2661bp の配列をもとに、塩基番号630から1106までの477bpに相当する部分配列を制限酵素PstIにより切り出し精製し、これをメダカ腸のランダムcDNAライブラリーのさらなるスクリーニングにプローブとして用いた。上記のプローブを用いてスクリーニングを行った結果、5’側のヌクレオチド配列を含む1363 bpのcDNAを得た。
【０１１６】
以上により、メダカ腸のエンテロペプチダーゼcDNAの全長が得られた（配列番号７）。このcDNAは、1036個のアミノ酸配列を有していた（配列番号３）。NCBI homepage（http://www.ncbi.nlm.nih.gov./）から、ホモロジー検索を行ったが、上記配列と一致するものは存在しなかった。
【実施例２】
【０１１７】
メダカ卵巣特異的なエンテロペプチダーゼcDNAの単離と解析
実施例１で得られた1250 bpのメダカ卵巣エンテロペプチダーゼcDNA断片の5’側配列を得るために5’-RACEを行った。
【０１１８】
5’-RACEは、Invitrogen社製の5’-RACE SystemVer.2を用いてプロトコール通りに行った。実施例１で調製したメダカ卵巣のRNAを鋳型として、第一アンチセンスプライマーとして5’-GAGATCCTCCTTCTG-3’（塩基配列番号2880から2894に対応）を、第二アンチセンスプライマーとして5’-CTGCAATGAAACACCTTCTTCC-3’（塩基配列番号2843から2864に対応）を、さらにnested アンチセンスプライマーとして5’-TCTTCTGATGCTAAACACACAGGC-3’（塩基配列番号2803から2826に対応）を用いて、２ラウンドのPCR反応を行った。
【０１１９】
第一ラウンド反応では、最初に94℃で3分間熱した後、94℃で60秒間の熱変性、60℃で60秒間のアニーリング、72℃で2分間の伸長反応の条件を１サイクルとして、35サイクル行い、最後に72℃で7分間の最終伸長反応を行った。
【０１２０】
第二ラウンド反応では、最初に94℃で3分間熱した後、94℃で60秒間の熱変性、62℃で60秒間のアニーリング、72℃で2分間の伸長反応の条件を１サイクルとして、35サイクル行い、最後に72℃で7分間の最終伸長反応を行った。
【０１２１】
増幅されたPCR産物は約ccc bp DNAであった。増幅産物をpBluescript II plasmid (Stratagene社製)にサブクローニングし、そのヌクレオチド配列を決定した。
【０１２２】
以上により、メダカ卵巣に特異的なエンテロペプチダーゼをコードするフラグメント（配列番号８）を得た。このフラグメントには、604個の推定アミノ酸配列（配列番号５）に相当する1815bpの長さのORF（配列番号６）が含まれていた。
【０１２３】
NCBI homepage上で、ホモロジー検索プログラムを用いて配列番号６に記載した塩基配列から予想される配列番号５のアミノ酸配列の検索を行ったところ、既知の哺乳類エンテロペプチダーゼと相同性を示した。
【実施例３】
【０１２４】
メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質の作製
実施例１、２でクローン化した全長cDNAのうち、セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（塩基番号2477から3205に相当する部分、配列番号２）をリコンビナントタンパク質の合成に用いた。具体的には、N-末端に50残基のベクター由来のアミノ酸が、次にトリプシンによる切断部位としてGln-Ala-Argが、そしてC-末端には配列番号１で表されるエンテロペプチダーゼの活性ドメインが続くという融合タンパク質を、大腸菌発現系を用いて合成した。
【０１２５】
上記の融合タンパク質の合成のため、発現ベクターpET30（Novagen社製）へのインサート導入を以下のように行った。まず、1.2 kbp のメダカ卵巣エンテロペプチダーゼcDNA断片が挿入されたpBluescriptを鋳型として、センスプライマーとして5’-CGCGGATCCCAAGCTGGTGTGGTGGGTGG-3’を、アンチセンスプライマーとして、5’-CCCAAGCTTTCAGTCTAGATCTGAGAA-3’を用い、pfu DNA polymerase (Stratagene社製) を用いてPCRを行った。得られた産物をBamHIおよびHindIIIと反応させ、これを予めBamHI及びHindIII でカットしたpET30プラスミドに連結した。正しくインサートが入った発現ベクターを選別し、導入したインサートの配列確認を行い、正しい配列が導入されたベクターを以下の実験に用いた。
【０１２６】
上記のpET30プラスミドを大腸菌E. coli BL21株（Novagen社製）に形質転換し、大腸菌をカナマイシン（30μg/ml）及びクロラムフェニコール（34μg/ml）を含む培地で37℃で培養した。A600が0.5に達したところで培地にIsopropyl thio-β-D-galactosideを.0.5mM濃度で加え、さらに３時間培養した後、細胞を遠心により回収した。
【０１２７】
上記の細胞を凍結融解処理し、その後、0.5%トリトンX-100で２回洗浄した。得られた試料を、6M尿素と0.5M NaClを含む50mM Tris-HCl (pH 7.6) で、室温で12時間インキュベートすることにより可溶化した。
【０１２８】
上記の可溶化された試料を、予め6M尿素と0.5M NaClを含む50mM Tris-HCl (pH 7.6)緩衝液で平衡化されたNi2+-キレートカラム（Novagen社製）に直接アプライし、カラムに結合したタンパク質を6M尿素、0.5M NaCl及び50mM Histidineを含む50mM Tris-HCl (pH 7.6) 緩衝液により溶出した。溶出画分は、50mM Tris-HCl (pH 8) 緩衝液を用いて透析した。
【０１２９】
エンテロペプチダーゼ融合タンパク質を含む上記の試料は、0.5M NaClを含む50mM Tris-HCl (pH 8) 緩衝液中でTrypsin-Sepharose 4Bゲルと37℃で1時間インキュベートして活性化した後、Trypsin-Sepharose 4Bゲルをフィルター濾過により除去した。この操作によって、メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質 の前駆体(37kDa) が完全に活性型（32kDa）に変換されていることが、SDS-PAGEによって確かめられた。また、上記の操作によって得られた分画をさらにNi2+-キレートカラム（Novagen社製）精製をすることによって、高度に精製された活性型酵素が得られた（図１）。
【０１３０】
（試験例１）
メダカエンテロペプチダーゼと市販ウシエンテロペプチダーゼの合成基質に対する活性の比較
エンテロペプチダーゼの特異的合成基質Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide (Sigma社製) を用いて活性を測定した。すなわち、50mM NaCl、2mM CaCl2を含む20mM Tris-HCl (pH 7.4) 緩衝液、酵素試料及び0.2mM Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamideを含む500μl（終量）の反応液で、37℃で60分間インキュベートした後、0.1M Monochloroacetic acid、30mM sodium acetate及び29mM acetic acid を含む溶液 (pH 4.3) 2.5mlを加えて反応を停止した。酵素により合成基質から切断・遊離されたβ-naphthylamineは、励起波長330nmと蛍光波長410nmを用いて測定した[Mikhailova and Rumsh: FEBS Lett. 442: 226-230 (1999)]。
【０１３１】
4-Methylcoumaryl-7-amide (MCA)を含む合成基質に対するエンテロペプチダーゼの活性は、以下のように行った。すなわち、50mM NaCl、2mM CaCl2を含む20mM Tris-HCl (pH 7.4) 緩衝液、酵素試料及び0.1mM MCA基質を含む500μl（終量）の反応液で、37℃で60分間インキュベートした後、0.1M Monochloroacetic acid、30mM sodium acetate及び29mM acetic acid を含む溶液 (pH 4.3) 2.5mlを加えて反応を停止した。酵素により合成基質から切断・遊離された7-amino-4-methylcoumarinは、励起波長370nmと蛍光波長460nmを用いて測定した[Barrett: Biochem. J. 187: 909-912 (1980)]
【０１３２】
メダカエンテロペプチダーゼは、酵素量依存的にかつ反応時間依存的に、合成基質Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamideを切断した（図２及び図３）。
【０１３３】
次にメダカエンテロペプチダーゼと市販のウシエンテロペプチダーゼの各種合成基質に対する活性を比較した。市販のウシエンテロペプチダーゼとしてNEB社製(Cat.No.#P8070)及び Novagen社製(Cat.No.69066-3)の標品を用いた。Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamideに対するそれぞれの酵素活性が同一となるように測定に使用する酵素量を一定にした。ウシエンテロペプチダーゼが２種のMCA基質（ペプチド研究所製）、Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCAおよびZ-Phe-Arg-MCAに対して強い切断活性を示すのに対して、メダカ酵素はこれらの基質に活性を示さなかった（図４）。メダカエンテロペプチダーゼは、ウシ酵素と同様に、合成基質Boc-Gln-Ala-Arg-MCA、Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、およびBoc-Val-Pro-Arg-MCAには活性を示さなかった。以上の結果から、本発明のメダカエンテロペプチダーゼは、既知の哺乳類由来エンテロペプチダーゼに比べて、より厳格な基質特異性をもつことが示された。
【０１３４】
市販のエンテロペプチダーゼ酵素標品がBoc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCAおよびZ-Phe-Arg-MCAに対して活性を示したことに関して、微量に混在する他のプロテアーゼの活性によるのか否かを検討した。Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCAを用いて、NEB社およびNovagen社のエンテロペプチダーゼに対する、公知の各種プロテアーゼ阻害剤（ＤＦＰ、ベンズアミジン、アンチパイン、ロイペプチン、キモスタチン、Ｅ−６４、アプロニチン、ＳＢＴＩ）の効果を調べたところ、両酵素標品ともほとんど同様の活性阻害パターンが得られた（図５および図６）。これらの結果から、市販エンテロペプチダーゼが示したBoc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCAおよびZ-Phe-Arg-MCAに対する分解活性は、混在する他のプロテアーゼによるのではなく、エンテロペプチダーゼそのものがもっている活性であると考えられた。
【０１３５】
（試験例２）
メダカエンテロペプチダーゼと市販ウシエンテロペプチダーゼのタンパク質基質に対する活性の比較
メダカエンテロペプチダーゼと市販のウシエンテロペプチダーゼのゼラチンに対する活性を調査した。試験例１と同様に、NEB社製及び Novagen社製のウシエンテロペプチダーゼ比較のために用いた。Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamideに対するそれぞれの酵素活性が同一となるように酵素量を合わせた。それぞれの酵素をゼラチンと室温で１、２、３、６時間インキュベートした後、反応物をSDS-PAGEにより解析した。メダカエンテロペプチダーゼに比べて市販のウシ酵素はゼラチン分解活性が強かった（図７）。
【０１３６】
さらに、１２％アクリルアミドゲルを用いたゼラチンザイモグラフィーによって、ウシエンテロペプチダーゼとのゼラチン基質に対する分解活性の比較を行った。ウシエンテロペプチダーゼがゼラチン分解活性を示したのに対して、本発明のエンテロペプチダーゼは、殆どゼラチン分解活性を示さなかった（図８）。
【０１３７】
以上の結果から、本発明のメダカエンテロペプチダーゼは、哺乳類由来のエンテロペプチダーゼに比べて、タンパク質基質に対しても、より高い基質特異性をもつことが明らかになった。
【０１３８】
（試験例３）
メダカエンテロペプチダーゼと市販ウシエンテロペプチダーゼの融合タンパク質切断活性の比較
エンテロペプチダーゼは、その基質認識の厳格さから、バイオテクノロジー分野において、融合タンパク質から目的タンパク質の切り出しツールとして用いられている。本発明のメダカエンテロペプチダーゼの利用価値について検討するため、エンテロペプチダーゼ切断サイトを有する融合タンパク質への作用を調べた。融合タンパク質基質として、Novagen社で販売しているCleavage Control Protein を用い、メダカエンテロペプチダーゼとともに、比較のためNEB社製及び Novagen社製のウシエンテロペプチダーゼの作用も同時に調べた。Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamideに対するそれぞれの酵素活性が同一となるように酵素量を合わせて、50mM NaCl及び2mM CaCl2を含む20mM Tris-HCl (pH 7.4) 緩衝液を用いて、Cleavage Control Protein (3μg) と37℃でインキュベートした。反応開始後80分間、SDS-PAGEにより、融合タンパク質の限定分解の過程を経時的に観察した。その結果、メダカエンテロペプチダーゼは、Cleavage Control Proteinに対して限定分解作用を示した。ウシエンテロペプチダーゼによる限定分解の結果と同様のパターンが得られたことから、Cleavage Control Proteinのエンテロペプチダーゼサイトを特異的に切断したと考えられる。本条件下においては、ウシエンテロペプチダーゼと比較して、非特異的分解作用によると考えられるポリペプチドの生成が、メダカ酵素では少ないことから、本発明のメダカエンテロペプチダーゼは、より厳格にエンテロペプチダーゼサイトを切断とすることが示された（図９）。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質の前駆体(37kDa) が完全に活性型（32kDa）に変換されていることを示す。
【図２】メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質の合成基質に対する活性を示す。
【図３】メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質の合成基質に対する活性を示す。
【図４】メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質のＭＣＡ基質に対する活性を示す。
【図５】市販のウシエンテロペプチダーゼに対する阻害剤の効果を示す。
【図６】市販のウシエンテロペプチダーゼに対する阻害剤の効果を示す。
【図７】メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質の天然基質（ゼラチン）に対する活性を示す（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【図８】メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質の天然基質（ゼラチン）に対する活性を示す（ゼラチンザイモグラフィー）。
【図９】メダカエンテロペプチダーゼリコンビナントタンパク質の融合蛋白質に対する活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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