(57)【要約】【課題】抗原抗体反応を用いた、免疫法による抗原あるいは抗体の検出、あるいは、相補的な核酸配列のハイブリダイゼーションによる、核酸の検出において、取り扱いが容易であり、結果が出るまでの時間が短く、より高感度な検出を実現する。【解決手段】検体中の標的物質を検出するための素子であって、前記検体を搬送するための流路と、前記流路の外面に設けられたコイルと、前記外面にコイルが設けられた流路内に位置し、前記標的物質を捕捉するための第１の捕捉体が固定化された反応領域とを備え、前記標的物質が前記第１の捕捉体に捕捉され、且つ、前記標的物質と特異的に結合し得る第２の捕捉体を表面に有する磁性体が前記標的物質に捕捉されたときに、前記コイルに物理的な特性の変化を生ずることを特徴とする検出素子。【選択図】  図２
2005315744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的物質を検出するための素子であって、
前記検体を搬送するための流路と、
前記流路の外面に設けられたコイルと、
前記外面にコイルが設けられた流路内に位置し、前記標的物質を捕捉するための第１の捕捉体が固定化された反応領域とを備え、
前記標的物質が前記第１の捕捉体に捕捉され、且つ、前記標的物質と特異的に結合し得る第２の捕捉体を表面に有する磁性体が前記標的物質に捕捉されたときに、前記コイルに物理的な特性の変化を生ずることを特徴とする検出素子。
【請求項２】
前記物理的な特性の変化を検出するための素子を更に備えていることを特徴とする請求項１記載の検出素子。
【請求項３】
前記物理的な特性の変化が、前記コイルによって形成された磁場における、磁束の密度の変化であることを特徴とする請求項１または２記載の検出素子。
【請求項４】
前記物理的な特性の変化が、前記コイルのインダクタンスの変化であることを特徴とする請求項１または２記載の検出素子。
【請求項５】
前記反応領域に、少なくとも２つの前記コイルが配置され、
前記コイル間に、前記物理的な特性の変化を検出するための素子を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の検出素子。
【請求項６】
前記反応領域が、多孔質材料または微小構造体を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の検出素子。
【請求項７】
検体中の標的物質を検出するための装置であって、
請求項１乃至６のいずれかに記載の検出素子を設置するための設置部と、
前記標的物質が前記第１の捕捉体に捕捉され、且つ、前記標的物質と特異的に結合し得る第２の捕捉体を表面に有する磁性体が前記標的物質に捕捉されたときに、前記コイルに生じる物理的な特性の変化を検出するための検出手段を有することを特徴とする検出装置。
【請求項８】
検体中の標的物質を検出するためのキットであって、
前記キットは、
前記検体を搬送するための流路と、前記流路の外面に設けられたコイルと、前記コイルが設けられた部位の前記流路内に位置し、前記標的物質を捕捉するための反応領域とを備えた検出素子と、
表面に前記標的物質と特異的に結合する捕捉体を有した磁性微粒子を含む検査試薬とを有することを特徴とする標的物質検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の標的物質を検出する検出素子、検出装置、および素子と試薬を含む検出用キットに関連する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康問題や環境問題、更には安全性の問題に対する意識の高まりと共に、これらの問題に関与する生物学的、化学的物質の微量検出手法が望まれるようになってきた。
【０００３】
しかし、これらの物質（以降標的物質と記載する場合もある）が含まれている試料の採取量は限られており、かつ標的物質は様々な物質が複雑に混在した中に微量しか含まれていないことが多いため、測定は高い精度（再現性）と感度とが要求されると共に、信頼度の高い分析結果を正確に得ることが求められている。
また、ヒトの健康問題に応えるための臨床検査機器として使用する際の用途から考えると、検体取得から、検出結果の出力までの時間いわゆるＴｕｒｎＡｒｏｕｎｄＴｉｍｅを短縮することが強く求められている。また、同時に臨床検査機器としての使用では、操作の容易性が強く求められている。
【０００４】
このような検体中の抗原抗体反応を用いた、免疫法による検出手法が多数提案されている。そのなかでも、取り扱いの容易性から標的物質に特異的に結合する抗体を磁性体微粒子表面に固定したビーズ法によるものが多数提案されている。
磁性体微粒子を用いた電気化学ルミネッセンスによるものが開示されている（特許文献１参照）。ただしこれは、磁性体微粒子の磁気的性質を微粒子の捕集についてのみ用いているにすぎない。
【０００５】
一方、磁性微粒子を用いて，磁性体の機能を用いた検出手法をもったものとして、反応セルの底面に磁性体微粒子を抗原抗体反応により固定し、外部に設けたコイルのインダクタンス変化を検出するものが開示されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
また本発明の特徴である、流路を用いたものとしては、流路周囲にコイルを設置した送液デバイスが開示されているが、磁性体微粒子を用いた検体中の標的物質量の検出は行っていない（特許文献２参照）。
【特許文献１】特許第３１２８５４１号
【特許文献２】特開２００２−２８６５９４号公報
【非特許文献１】ＡｎａｌＣｈｅｍ．２００４Ｍａｒ１５；７６（６）：１７１５−９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように微量な標的物質を検出するためにさまざまな検出素子、検出装置が開発されつつある。微量な標的物質を検出するために高感度であることは当然であることながら、取り扱いの容易性や、結果が出るまでの時間の短縮が求められている。本発明では、特に、抗原抗体反応を用いた、免疫法による抗原あるいは抗体の検出、あるいは、相補的な核酸配列のハイブリダイゼーションによる、核酸の検出において、取り扱いが容易であり、結果が出るまでの時間が短く、より高感度な検出を実現する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、検体中の標的物質を検出するための素子であって、前記検体を搬送するための流路と、前記流路の外面に設けられたコイルと、前記外面にコイルが設けられた流路内に位置し、前記標的物質を捕捉するための第１の捕捉体が固定化された反応領域とを備え、前記標的物質が前記第１の捕捉体に捕捉され、且つ、前記標的物質と特異的に結合し得る第２の捕捉体を表面に有する磁性体が前記標的物質に捕捉されたときに、前記コイルに物理的な特性の変化を生ずることを特徴とする検出素子に関する。
【０００９】
また、本発明は、検体中の標的物質を検出するための装置であって、本発明の検出素子を設置するための設置部と、前記標的物質が前記第１の捕捉体に捕捉され、且つ、前記標的物質と特異的に結合し得る第２の捕捉体を表面に有する磁性体が前記標的物質に捕捉されたときに、前記コイルに生じる物理的な特性の変化を検出するための検出手段を有することを特徴とする検出装置に関する。
【００１０】
また、本発明は、検体中の標的物質を検出するためのキットであって、前記キットは、前記検体を搬送するための流路と、前記流路の外面に設けられたコイルと、前記コイルが設けられた部位の前記流路内に位置し、前記標的物質を捕捉するための反応領域とを備えた検出素子と、表面に前記標的物質と特異的に結合する捕捉体を有した磁性微粒子を含む検査試薬とを有することを特徴とする標的物質検出用キットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の効果としては、磁性体微粒子が固定される流路反応領域の周囲にコイルを配置することにより、反応領域の外側にコイルを配置した場合と比較して、コイルに生じる物理的変化が大きく検出できることがあげられる。すなわち、より高感度な検出が可能になることがいえる。また、反応領域に多孔質材料、微小構造体を用いることによって、単位体積あたりの表面積が大きくなることから、反応効率の向上が可能になる。すなわち、より短時間での検出が可能となる。また、磁気標識を用いることによる検出であることから、酵素、蛍光の生体由来の標識と比較して、経時的な劣化がなく、製造単位毎の差が少ないことによる取り扱いの容易性があげられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、検体中の標的物質を検出するための素子であって、前記検体を搬送するための流路と、前記流路の外面に設けられたコイルと、前記外面にコイルが設けられた流路内に位置し、前記標的物質を捕捉するための第１の捕捉体が固定化された反応領域とを備え、前記標的物質が前記第１の捕捉体に捕捉され、且つ、前記標的物質と特異的に結合し得る第２の捕捉体を表面に有する磁性体が前記標的物質に捕捉されたときに、前記コイルに物理的な特性の変化を生ずることを特徴とする検出素子である。
【００１３】
反応領域は表面積を大きくするために多孔質あるいは微小構造体により形成されていることが好ましい。
【００１４】
本発明では、反応領域を流路中に複数形成する場合、複数の反応領域の各々にコイルを形成し、コイルが発生する磁界が同一直線になるように複数の反応領域を形成することが好ましい。
【００１５】
本発明は、更に、流路を環状に形成する場合、環状の流路を周回するようにコイルを形成し、流路の流入端と流出端で磁界が略同一直線になるように形成することが好ましい。
【００１６】
本発明でコイル磁束密度の変化を検出する場合、コイルの端部にコイルの形成する磁界と略垂直な平面に磁束密度検出素子を形成することが好ましい。磁束密度検出素子は、流路中あるいは流路の外側でコイルの形成する磁界と略垂直な平面に設けることができる。
【００１７】
複数のコイルが形成され磁束密度検出素子を流路中に設ける場合は、複数のコイルの間の流路中に磁束密度検出素子を設けることが好ましい。
【００１８】
流路が環状に形成されている場合、磁束密度検出素子は、流入端あるいは流出端の流路中あるいは流入端と流出端の間に設けることが好ましい。
【００１９】
更に、本発明は、本発明の検出素子を設置するための設置部と、前記標的物質が前記第１の捕捉体に捕捉され、且つ、前記標的物質と特異的に結合し得る第２の捕捉体を表面に有する磁性体が前記標的物質に捕捉されたときに、前記コイルに生じる物理的な特性の変化を検出するための検出手段を有することを特徴とする検出装置である。
【００２０】
コイルの物理特性の変化は、コイルの磁束密度の変化あるいはインダクタンスの変化であることが好ましい。コイルのインダクタンスの変化は発振周波数の周波数の変化で検出することができる。この場合、コイルを発振回路と接続し、インダクタンスの変化により変る発振回路の発振周波数を計数することで測定できる。この場合発振回路はＬＣ発振回路であることが好ましい。
【００２１】
本発明は更に、少なくとも検体を搬送する流路と、該流路に形成された反応領域と、少なくとも流路に形成された反応領域の周囲を周回するように設けられたコイルと、反応領域に固定された標的物質と特異的に捕捉する第一の捕捉体とを有する流路と、磁性体微粒子の表面に固定された前記標的物質と特異的に結合する第二捕捉体が表面に固定された磁性体微粒子を含む検査試薬とを含むことを特徴とする標的物質検出用キットである。この場合、流路中に磁束密度検出素子が形成されていても良い。
【００２２】
本発明を実現するための実施の形態について以下、図面を用いて説明する。
＜検出素子＞
図２を用いて、本実施の形態を説明する。
【００２３】
流路１０１は、本実施の形態の説明では、キャピラリ状の管路を用いているが、チップ上に形成された溝を用いた流路であってもかまわない。
【００２４】
反応領域１０２は、流路１０１に多孔質材料あるいは微小構造体を形成したものを用いる。多孔質材料、微小構造体としては、多孔質構造体（図７（ａ））、オパール構造体（図７（ｂ））、逆オパール構造体（図７（ｃ））、微粒子集合構造体（オパール構造体の各微粒子が不規則に並んでいる状態）（不図示）、柱状構造体（図７（ｄ））、凸状構造体（図７（ｅ））、凹状構造体（図７（ｆ））、突起状構造体（図７（ｇ））、繊維状構造体（図７（ｈ））、中空状構造体（図７（ｉ））などが挙げられる。
【００２５】
標的物質と特異的な結合対を形成する捕捉体が、これらの多孔質材料表面に固定されている。標的物質捕捉体は、標的物質と特異的な結合対を形成するものであれば、特に制約はない。具体的には、検体中に含まれる標的物質は、非生体物質と生体物質に大別される。
【００２６】
非生体物質として産業上利用価値の大きいものとしては、環境汚染物質としての塩素置換数／位置の異なるＰＣＢ類、同じく塩素置換数／位置の異なるダイオキシン類、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質（例：ヘキサクロロベンゼン、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、アミトロール、アトラジン、アラクロール、ヘキサクロロシクロヘキサン、エチルパラチオン、クロルデン、オキシクロルデン、ノナクロル、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン、ＤＤＴ、ケルセン、アルドリン、エンドリン、ディルドリン、エンドスルファン（ベンゾエピン）、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキサイド、マラチオン、メソミル、メトキシクロル、マイレックス、ニトロフェン、トキサフェン、トリフルラリン、アルキルフェノール（炭素数５〜９）、ノニルフェノール、オクチノニルフェノール、４−オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジ−ｎ−ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジエチル、ベンゾ（ａ）ピレン、２，４ージクロロフェノール、アジピン酸ジ−２−エチルヘキシル、ベンゾフェノン、４−ニトロトルエン、オクタクロロスチレン、アルディカーブ、ベノミル、キーポン（クロルデコン）、マンゼブ（マンコゼブ）、マンネブ、メチラム、メトリブジン、シペルメトリン、エスフェンバレレート、フェンバレレート、ペルメトリン、ビンクロゾリン、ジネブ、ジラム、フタル酸ジペンチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジプロピル）等が挙げられる。
【００２７】
生体物質としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される生体物質が含まれ、更に詳しくは、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質から選択される生体分子を含んでなるものであり、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質の何れかから選択された物質を含むものであれば、如何なる物質にも本発明を適用することができる。更には、前記の「生体物質」を産生する細菌や細胞そのものも、本発明が対象とする「生体物質」として標的物質となり得る。
【００２８】
具体的なタンパク質としては、いわゆる疾病マーカーが挙げられる。
【００２９】
例としては、胎児期に肝細胞で産生され胎児血中に存在する酸性糖蛋白であり、肝細胞癌（原発性肝癌）、肝芽腫、転移性肝癌、ヨークサック腫瘍のマーカーとなるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、肝実質障害時に出現する異常プロトロンビンであり、肝細胞癌で特異的に出現することが確認されるＰＩＶＫＡ−ＩＩ、免疫組織化学的に乳癌特異抗原である糖蛋白で、原発性進行乳癌、再発・転移乳癌のマーカーとなるＢＣＡ２２５、ヒト胎児の血清、腸および脳組織抽出液に発見された塩基性胎児蛋白であり、卵巣癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、膵癌、胆道癌、肝細胞癌、腎臓癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌のマーカーである塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、進行乳癌、再発乳癌、原発性乳癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１５−３、膵癌、胆道癌、胃癌、肝癌、大腸癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１９−９、卵巣癌、乳癌、結腸・直腸癌、胃癌、膵癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ７２−４、卵巣癌（特に漿液性嚢胞腺癌）、子宮体部腺癌、卵管癌、子宮頸部腺癌、膵癌、肺癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１２５、上皮性卵巣癌、卵管癌、肺癌、肝細胞癌、膵癌マーカーとなる糖蛋白であるＣＡ１３０、卵巣癌（特に漿液性嚢胞腺癌）、子宮体部腺癌、子宮頸部腺癌のマーカーとなるコア蛋白抗原であるＣＡ６０２、卵巣癌（特に粘液性嚢胞腺癌）、子宮頸部腺癌、子宮体部腺癌のマーカーとなる母核糖鎖関連抗原であるＣＡ５４／６１（ＣＡ５４６）、大腸癌、胃癌、直腸癌、胆道癌、膵癌、肺癌、乳癌、子宮癌、尿路系癌等の腫瘍関連のマーカー抗原として現在、癌診断の補助に最も広く利用されている癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膵癌、胆道癌、肝細胞癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＤＵＰＡＮ−２、膵臓に存在し、結合組織の弾性線維エラスチン（動脈壁や腱などを構成する）を特異的に加水分解する膵外分泌蛋白分解酵素であり、膵癌、膵嚢癌、胆道癌のマーカーとなるエラスターゼ１、ヒト癌患者の腹水や血清中に高濃度に存在する糖蛋白であり、肺癌、白血病、食道癌、膵癌、卵巣癌、腎癌、胆管癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫のマーカーとなる免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）、膵癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、肝細胞癌、肺腺癌、胃癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＮＣＣ−ＳＴ−４３９、前立腺癌のマーカーとなる糖蛋白質であるγ−セミノプロテイン（γ−Ｓｍ）、ヒト前立腺組織から抽出された糖蛋白であり、前立腺組織のみに存在し、それゆえ前立腺癌のマーカーとなる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺から分泌される酸性ｐＨ下でリン酸エステルを水解する酵素であり、前立腺癌の腫瘍マーカーとして用いられる前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、神経組織及び神経内分泌細胞に特異的に存在する解糖系酵素であり、肺癌（特に肺小細胞癌）、神経芽細胞腫、神経系腫瘍、膵小島癌、食道小細胞癌、胃癌、腎臓癌、乳癌のマーカーとなる神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、子宮頸部扁平上皮癌の肝転移巣から抽出・精製された蛋白質であり、子宮癌（頸部扁平上皮癌）、肺癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌のマーカーとなる扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ抗原）、肺腺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるシアリルＬｅＸ−ｉ抗原（ＳＬＸ）、膵癌、胆道癌、肝癌、胃癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＳＰａｎ−１、食道癌、胃癌、直腸・結腸癌、乳癌、肝細胞癌、胆道癌、膵癌、肺癌、子宮癌のマーカーであり、特に他の腫瘍マーカーと組み合わせて進行癌を推測し、再発予知・治療経過観察として有用である単鎖ポリペプチドである組織ポリペプタイド抗原（ＴＰＡ）、卵巣癌、転移性卵巣癌、胃癌、大腸癌、胆道系癌、膵癌、肺癌のマーカーとなる母核糖鎖抗原であるシアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）、肺の非小細胞癌、特に肺の扁平上皮癌の検出に有効な腫瘍マーカーであるシフラ（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ；ＣＹＦＲＡ）、胃液中に分泌される蛋白消化酵素であるペプシンの２種（ＰＧＩ・ＰＧＩＩ）の不活性型前駆体であり、胃潰瘍（特に低位胃潰瘍）、十二指腸潰瘍（特に再発、難治例）、ブルンネル腺腫、ゾーリンガーエリソン症候群、急性胃炎のマーカーとなるペプシノゲン（ＰＧ）、組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白であり、急性心筋梗塞等により心筋に壊死が起こると、高値を示すＣ−反応性蛋白（ＣＲＰ）、組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白である血清アミロイドＡ蛋白（ＳＡＡ）、主に心筋や骨格筋に存在する分子量約１７５００のヘム蛋白であり、急性心筋梗塞、筋ジストロフィー、多発性筋炎、皮膚筋炎のマーカーとなるミオグロビン、心不全の病態把握に有用である、３２のアミノ酸からなる心室由来の脳性利尿性ペプチドであるＢＮＰ、同様に、心房由来の利尿性ペプチドであるＡＮＰ、骨格筋，心筋の可溶性分画を中心に存在し、細胞の損傷によって血液中に遊出する酵素であって、急性心筋梗塞、甲状腺機能低下症、進行性筋ジストロフィー症、多発性筋炎のマーカーとなるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）（骨格筋由来のＣＫ−ＭＭ型，脳，平滑筋由来のＣＫ−ＢＢ型，心筋由来のＣＫ−ＭＢ型の３種のアイソザイム及びミトコンドリア・アイソザイムや免疫グロブリンとの結合型ＣＫ（マクロＣＫ））、横紋筋の薄いフィラメント上でトロポニンＩ，Ｃとともにトロポニン複合体を形成し，筋収縮の調節に関与している分子量３９，０００の蛋白であり、横紋筋融解症、心筋炎、心筋梗塞、腎不全のマーカーとなるトロポニンＴ、骨格筋・心筋いずれの細胞にも含まれる蛋白であり，測定結果の上昇は骨格筋，心筋の障害や壊死を意味するため、急性心筋梗塞症、筋ジストロフィー、腎不全のマーカーとなる心室筋ミオシン軽鎖Ｉ、また、近年ストレスマーカーとして注目されてきているクロモグラニンＡ、チオレドキシン、８−ＯＨｄＧ、コルチゾール等も含まれる。
【００３０】
本発明における捕捉体の一種である「抗体」とは、自然界の生物体内で産生される、あるいは遺伝子組み替え技術やタンパク工学技術、更には有機反応等により全体的または部分的に合成された免疫グロブリンを意味する。更に、特異的結合能を保持するその全ての誘導体もまた、本発明における「抗体」に含まれる。この用語はまた、免疫グロブリンの結合ドメインに相同か、または高度に相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む（キメラ抗体およびヒト化抗体を含む）。これらの「抗体」、或いは「免疫グロブリン」は、自然界の生物体内で産生せしめる、あるいは全体的または部分的に合成、修飾される。
【００３１】
「抗体」、或いは「免疫グロブリン」は、標的物質に対して特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。
【００３２】
「抗体」、或いは「免疫グロブリン」は、任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得、任意のヒトのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）を含み、本発明においては、ＩｇＧクラスの誘導体がより好ましい。
【００３３】
本発明における「抗体フラグメント」或いは「抗体断片」とは、抗体或いは免疫グロブリンの全長に満たない長さの抗体の任意の分子或いは複合体をいう。抗体フラグメントは、少なくとも、抗体の全長の持つ特異的結合能力の重要な部分を保持することが好ましい。
【００３４】
抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ディアボディー、およびＦｄフラグメントが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００３５】
抗体フラグメントは、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、酵素的または化学的に、インタクトな抗体のフラグメント化によって産生され得るか、あるいは部分抗体配列をコードする遺伝子より組換え的に産生され得る。あるいは、抗体フラグメントは、全体的にまたは部分的に合成的に産生され得る。抗体フラグメントは、必要に応じて、一本鎖抗体フラグメントとすることもできる。あるいは、フラグメントは、例えば、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合によって連結される複数の鎖を含み得る。フラグメントはまた、必要に応じて、複数の分子の複合体でも良い。機能的な抗体フラグメントは、代表的には、少なくとも約５０のアミノ酸を含み、より代表的には少なくとも、約２００のアミノ酸を含む。
【００３６】
本発明における「可変ドメイン」とは、標的物質（抗原）の種類により特異的な結合／捕捉機能を発揮するために抗原毎に異なるアミノ酸配列部分を有する、免疫グロブリンの先端のドメインであり、通常Ｆｖと記される。
【００３７】
Ｆｖはまた、「重鎖の可変ドメイン（以下ＶＨと記す場合もある）」、及び「軽鎖の可変ドメイン（以下ＶＬと記す場合もある）」から成り、免疫グロブリンＧではＶＨ、ＶＬドメインを通常それぞれ２ずつ含む。
【００３８】
本発明における「免疫グロブリン重鎖或いは軽鎖の可変ドメインの機能部分（以下単に「機能部分」と記す場合もある）」とは、前記可変ドメインのなかで標的物質（抗原）との間の特異性を実際に担っている部分であり、学術的にＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ：超可変領域）と呼ばれる部分、及びその中でも特に標的物質（抗原）との間の特異性を実際に担っている部分という意味においても用いている。
【００３９】
これら標的物質と捕捉体との相互作用は、本発明の素子により結合前後の物理的／化学的変化量が検出可能であればいかなる相互作用でもよいが、より好ましくは、「抗原−抗体反応」、「抗原−アプタマー（特定構造を有するＲＮＡ断片）」「リガンド−レセプター相互作用」、「ＤＮＡハイブリダイゼーション」「ＤＮＡ−タンパク質（転写因子等）相互作用」、「レクチン−糖鎖相互作用」等が挙げられる。
【００４０】
図２でコイル１０３は、反応領域を周回するように形成されている。コイル１０３の下部に磁束密度を検出するための検出素子１０４が設置されている。
【００４１】
検出素子は、さまざまな形式の素子を用いることができる。例えば、ホール素子、ＭＲ素子、フラックスゲート素子、ＭＩ素子、ＴＭＦ素子等を用いることができる。磁性微粒子１０５の表面には、前述の標的物質捕捉体（磁性微粒子固定抗体）３０４が固定されている（図６参照）。
【００４２】
図１の反応領域１０２に磁性体微粒子１０５は、図６に示すように、反応領域１０２を形成する多孔質材料あるいは微小構造体の表面に形成した反応領域固定抗体３０４と磁性微粒子１０５の表面に固定された標的物質捕捉体（磁性微粒子固定抗体）３０４との間に、標的物質３０２が固定されている。
【００４３】
磁性体微粒子１０５の材料としては、鉄、コバルト、ニッケル等またはこれらの合金である強磁性体が好ましく、超常磁性を持つことが好ましい。一般に、強磁性体材料の粒径が数１００ｎｍ〜数１０ｎｍ以下になると低い磁界で飽和を示すにもかかわらず、ヒステリシスを示さず、残留磁化もない超常磁性を示す。磁性体微粒子１０１の粒径は超常磁性特性を示すサイズであることが好ましい。また、微粒子の主材料がポリマーであり、複数の超常磁性特性を持つ磁性体微粒子がポリマー中に分散した構成であれば、数１００ｎｍ以上のサイズを実現することも可能である。
【００４４】
検出は、コイル１０３に定電流を流し、磁束密度計測素子１０４によって、コイル１０３によって形成された磁場による磁束密度を計測する。磁束密度は、コイル内に固定される１０５の磁性微粒子の量に関連する。この計測された磁束密度から、標的物質量を計測するための方法としては、事前に複数の濃度が既知の標的物質溶液を用い濃度と計測される磁束密度とを計測し検量線を求め、この検量線を用いて、未知の濃度の検体溶液の磁束密度から検体中の標的物質量を求めることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、図を用いて本発明を説明するが、実施例は、本発明の範囲をなんら限定するものではない。
（第１の実施例）
まず第１の実施例を、図を用いて説明する。
＜素子作成方法＞
図１の流路素子は、ジーエルサイエンス社製のモノリスキャピラリ−カラムＭｏｎｏＣａｐを用いることができる。当該製品は、キャピラリ内に、３次元構造を持ったシリカの多孔質材料が固定化されているものである。
【００４６】
シリカ表面を３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン処理によって、エポキシ基を提示した状態にする。その後に、抗ヒトインスリンモノクローナル抗体溶液をキャピラリカラムに導入し、シリカ表面に抗体を固定化した。その後にリン酸バッファ溶液にて洗浄した。抗体のＦｃ部位にはエポキシ基との反応性が高いアミノ基が多く存在するため、抗体の多くは抗原認識部位がフリーな状態で固定された。
【００４７】
上記方法にて、作成した抗体固定化キャピラリの周囲に図１のコイル１０３を形成した。この構成のキャピラリを２つ用意し、流路の上下２ヶ所に形成されたコイルの間に磁束密度センサ素子１０４を封入したキャピラリを接合した。この接合時には、センサ素子および、既に固定した抗体の機能を損なわないように、熱による融着は避けることが望ましい。具体的には、接着による方法或いは、キャピラリの接合用の部材による方法が望ましい。
【００４８】
ここでは、コイルが対向した構成を示したが、図２のような単一のコイルを用いた方法でも構わない。また、本実施例では、流路形状が直線状で流路中に検出素子を配したものを用いたが、図３に示すような構造をとることで検出素子を流路の外側に配することもできる。
【００４９】
また図３（ａ）は、磁束密度センサ素子１０４をコイルの直下に形成し、磁束密度センサ素子１０４を避けるよう流路を形成したものである。
【００５０】
図３（ｂ）は、流路を円弧状に形成し、流路の外側にコイルを形成したトロイダル型のコイルを形成し、流路と出路との切れ目に磁束密度センサ素子１０４を配したものである。この場合、コイルを１つ構成すれば、円を描く磁気回路を形成できる。尚、図３（ｂ）の場合、環状の流路の流入端あるいは流出端の流路中に磁束密度センサ素子１０４を設けても良い。
【００５１】
図３（ａ）（ｂ）のような構成をとることによって、流路内に磁束密度検出素子を設置する必要がなくなるので、検出装置のコストダウンを計ることができる。
【００５２】
尚、図１および図３（ａ）のように２つのコイルの間に磁束密度センサ素子１０４を配する場合、コイルから発生する磁界が、磁束密度センサ素子１０４に対し同一の方向であることが必要である。図１および図３（ａ）のような構成をとる場合、磁束密度センサ素子１０４の上部に配されたコイルと磁束密度センサ素子１０４の下部に配されたコイルとは逆方向に周回させる、あるいは同一方向にコイルを周回させた場合、コイルに印加する電流の向きを逆にする必要がある。
【００５３】
図１および図３（ａ）のように磁束密度センサ素子１０４の上下の２ヶ所にコイルを形成しておくと、磁力線が、２つのコイルを通るように形成されるため、外側に広がることなく、高密度な状態で磁束密度を計測することができるため、高感度化を図ることが可能となる。
＜検出試薬＞
図６の１０５に示している、磁性体微粒子に標的物質捕捉体を固定した試薬の製造方法であるが、この磁性体微粒子には、ダイナルバイオテック社のポリスチレンビーズにＦｅ2Ｏ3が分布した平均粒径が２．８μｍのダイナビーズＭ−２７０Ｅｐｏｘｙを用いる。本ビーズ溶液と、抗ヒトインスリンモノクローナル抗体溶液とを混合し、一晩インキュベートする。このとき、ここで用いる抗ヒトインスリンモノクローナル抗体は、キャピラリに固定する抗体とは別の結合サイトを認識するものが望ましい。インキュベート後に磁石にて、磁性体微粒子を捕集した状態で、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（界面活性剤）を含んだ、リン酸バッファ溶液にて洗浄する。洗浄後、磁石を外し、リン酸バッファ溶液に攪拌分散させる。
＜検出工程＞
上記で記載した、素子を用いて検出する手順について説明する。
【００５４】
標的物質を含んだ検体溶液と上記検出試薬をあらかじめ混合する。混合後、図１で説明したキャピラリに混合溶液を導入する。導入後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（界面活性剤）を含んだ、リン酸バッファ溶液を導入し、洗浄する。この状態で、前述の図６で説明したように、反応領域１０２を形成する多孔質材料あるいは微小構造体の表面に形成した反応領域固定抗体３０４と磁性微粒子１０５の表面に固定された標的物質捕捉体（磁性微粒子固定抗体）３０４との間に、標的物質３０２が固定されている。
【００５５】
この状態で、２つのコイル１０３に同一方向に磁場が形成されるような定電流を流す。この結果、磁束密度計測素子１０４によって、コイルによって形成された磁場による磁束密度が計測される。
【００５６】
この磁束密度は、コイル内に固定される１０５の磁性微粒子の量に関連する。この計測された磁束密度から、標的物質量を計測するための方法としては、事前に既知の複数濃度のインスリン溶液を用いて、前記手順によって、濃度と計測される磁束密度とを計測し検量線を求めておく。この検量線を用いて、未知の濃度の検体溶液の磁束密度から検体中の標的物質量を求めることができる。
【００５７】
なお、今回の手順では、あらかじめ検体と試薬を混合した後に、素子に混合溶液を導入したが、先に検体溶液を素子に導入し、洗浄後に試薬溶液を導入しても構わない。ただし、インスリンのような１種の結合サイトが１分子について１箇所の単量体については、前者の手順が望ましいが、Ｃ反応性蛋白のような同一の結合サイトが複数あるような、多量体については、磁性体ビーズが凝集するため、後者の手順をとることが望ましい。
（第２の実施例）
第２の実施例について、図４および図５を用いて説明する。
＜検出素子構成＞
図４の流路素子は、μフルイディクスを用いたチップ状の素子形状をとっている。図４は、反応領域についてのみ切断して取り出した概念図である。
【００５８】
チップの上部カバー２０１とチップの基板２０２は、本実施例では耐熱ガラスを用いている。チップの基板２０２に形成された流路１０１は、基板２０２に溝を形成することによって形成されている。流路１０１にコイル１０３の一部が形成され、チップの上部カバー２０１側にもこのコイル１０３の一部が形成されている（チップの上部カバー２０１の裏面側に形成されるので図示せず）。上部カバー２０１とチップの基板２０２とを勘合した際に、流路１０１に形成されたコイル１０３の一部と基板２０２側に形成されたコイル１０３とが接続しコイル１０３が形成される。
【００５９】
流路１０１形成されるコイル１０３の一部および基板２０２側に形成されるコイル１０３の一部は、金（Ａｕ）のリフトオフプロセスで形成することができる。流路１０１と基板２０２とにコイル１０３の一部となる配線を形成後、上部カバーと基板を接合してチップが完成する。
【００６０】
流路１０１に、第１の実施例と同様に抗ヒトインスリン抗体を固定する。固定方法としては、金のコイル表面を、ＮＨＳ基を有するチオール処理する。続いて、抗ヒトインスリン抗体溶液を流し固定する。
【００６１】
また、チップ上の素子のもう一つの形態として、図５の素子形状を示す。本形態は、チップ上部カバー２０１およびチップ基板２０２にそれぞれ流路反応領域に平行したスリット２０３が形成されている。尚、チップ上部カバー２０１およびチップ基板２０２に形成されたスリット２０３は両者ともに基板を貫通するように形成され、基板２０２に流路溝１０１が形成されている。
【００６２】
コイル１０３を形成する配線１０３は、チップ上部カバー２０１上およびチップ基板２０２の下面およびチップ上部カバー２０１チップ基板２０２に形成されたスリット２０３の側面に形成されている。
【００６３】
１０１の流路は、２０２の基板を加工することにより形成される。ここでは、基板材料として、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を用いている。反応領域の流路を酸素プラズマ処理した直後に、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン処理によって、エポキシ基を提示した状態にする。その後に、抗ヒトインスリンモノクローナル抗体溶液を流路に導入することによって、抗体を固定する。
【００６４】
また、上記図４および図５ともに、コイルを発振回路の一要素となるように例えば、図８に示すＬＣ発振回路に接続する。
＜検出試薬＞
検出試薬は第１の実施例と同一のものを用いることができる。
＜検出工程＞
上記で記載した、素子を用いて検出する手順について説明する。標的物質を含んだ検体溶液と上記検出試薬をあらかじめ混合する。混合後、図４あるいは図５に示されたチップに混合溶液を導入する。導入後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（界面活性剤）を含んだ、リン酸バッファ溶液を導入し、洗浄する。この状態で、図６に示すような、複合体が流路の反応領域表面に形成されている。この状態で、図８の発振回路の端子４０２に直流電源（図示せず）より定電圧を供給する。
【００６５】
図８の発振回路の端子４０１からの発振周波数を周波数カウンタによって計測する。この図８発振回路の発振周波数は、コイルのインダクタンスに関係するため、捕捉された磁性体微粒子の量に応じて発振周波数が変化する。
【００６６】
計測された発振周波数から、未知の濃度の標的物質量の濃度を計測するためには、事前に既知の複数濃度のインスリン溶液を用いて、前記手順によって、濃度と計測される発振周波数とを計測し検量線を求めておく。この検量線を用いて、未知の濃度の検体溶液の周波数から検体中の標的物質量を求めることができる。
【００６７】
発振回路は、コイルのリアクタンスとコンデンサの容量により発振周波数が変化するＬＣ発振回路であれば、図８の回路に限定されるものではない。
【００６８】
本発明は、磁性体微粒子が固定される流路反応領域の周囲にコイルを配置することにより、反応領域の外側にコイルを配置した場合と比較して、コイルに生じる物理的変化が大きく検出できる。すなわち、より高感度な検出が可能になることがいえる。また、反応領域に多孔質材料、微小構造体を用いることによって、単位体積あたりの表面積が大きくなることから、反応効率の向上が可能になる。すなわち、より短時間での検出が可能となる。また、磁気標識を用いることによる検出であることから、酵素、蛍光の生体由来の標識と比較して、経時的な劣化がなく、製造単位毎の差が少ないことによる取り扱いの容易性があげられる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明を構成する素子の概念図。
【図２】本発明を構成する素子の概念図。
【図３】本発明を構成する素子の概念図。
【図４】本発明の実施例２を構成する素子の概念図。
【図５】本発明の実施例２を構成する素子の概念図。
【図６】本発明の反応領域の複合体の概念図。
【図７】本発明の反応領域の多孔質、微細構造図の概念図。
【図８】本発明の実施例２に用いる発振回路図。
【符号の説明】
【００７０】
１０１    流路
１０２    反応領域
１０３    コイル
１０４    磁束密度検出素子
１０５    磁性体微粒子
２０１    上部カバー
２０２    基板
２０３    スリット
３０１    反応領域材料
３０２    標的物質
３０３    反応領域固定抗体
３０４    磁性微粒子固定抗体
４０１    発振出力
４０２    直流電源
【図１】
2005315744.tif 000003
【図２】
2005315744.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2005315744.tif 000007
【図６】
2005315744.tif 000008
【図７】
2005315744.tif 000009
【図８】
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