(57)【要約】【課題】生化学解析用ユニットのスポット領域に好ましい量のプローブ溶液を点着する。【解決手段】クイルピン５０は、プローブ溶液５１を保持している。隣接するスポット領域にプローブ溶液が混合しないスポット容積を規定する。スポット容積とメンブレンのポア率からプローブ溶液の点着量を算出する。点着量から点着時間を規定する。クイルピン５０の先端を生化学解析用ユニット１０のスポット領域１４に接触させる。プローブ溶液５１は、スポット領域１４に圧入されているメンブレン１３に点着される。点着範囲１８が徐々に広がる。規定された点着時間に到達すると、クイルピン５０を上昇させる。プローブ溶液の点着量が均一になり、隣接するスポット領域のプローブ溶液との混合を防止できる。【選択図】        図１７
2005030869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学解析用ユニットに設けられ、吸着性材料を備えたスポット領域にプローブ溶液を点着させる点着方法において、
前記吸着性材料の体積空隙率をＰとし、前記スポット領域の貫通孔面積と吸着性材料の厚みで形成される容積をＶ（ｍ３  ）としたときに、
前記プローブ溶液の前記スポット領域への点着量Ｓ（ｍ３  ）を
０．０１×Ｐ×Ｖ≦Ｓ≦Ｐ×Ｖの範囲とすることを特徴とするプローブ溶液の点着方法。
【請求項２】
前記プローブ溶液を前記スポット領域に点着する時間を０．１秒以上３秒未満とすることを特徴とする請求項１記載のプローブ溶液の点着方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プローブ溶液の点着方法に関し、特に詳しくは、生化学解析用ユニットに形成されているスポット領域にプローブ溶液を点着する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生化学解析用ユニットは生体由来物質、例えばＤＮＡの塩基配列の解析などに用いられる。この生化学解析用ユニットは、特許文献１に示すように、基板に微細な貫通孔を多数設け、各孔内に多孔質材料等の吸着性物質を充填し、吸着性領域（以下、スポット領域と称する）を形成している。各スポット領域には分子構造又は特性が既知の特異的結合物質（以下、プローブと称する）がスポット領域に固定されている。この生化学解析用ユニットでは、各スポット領域が完全に分離されているので、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）と比較して高精度の測定が可能となることに特徴がある。塩基配列の解析の際には、プローブと相補的である特異的結合物質（以下、ターゲットと称する）とプローブとを特異的結合反応させる。
【０００３】
プローブは、塩基配列や組成などが既知のものであり、生体由来のホルモン類，腫瘍マーカー，酵素，抗体，抗原，アブザイム，レセプタ，その他のタンパク質，リガンド，核酸，ｃＤＮＡ，ＤＮＡ，ＲＮＡなどと特異的結合が可能なものが用いられている。また、ターゲットは、生体由来物質であるホルモン類，腫瘍マーカー，酵素，抗体，抗原，アブザイム，レセプタ，その他のタンパク質，リガンド，核酸，ｃＤＮＡ，ＤＮＡ，ｍＲＮＡなどを生体から抽出、単離して採取し、化学的処理、化学修飾などの処理を施した後に、標識のため放射性物質や蛍光物質を付与する。または、酵素とその酵素に接触することで発光，発色，蛍光放出などが生じる基質とからなる反応性標識体も用いても良く、この場合には酵素をターゲットに付与する。
【０００４】
例えば、標識のために放射性物質を用いた場合には、特異的結合反応の有無を蓄積性蛍光体シートを用いて検出する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。蓄積性蛍光体シートには、放射性物質から放出される放射線により露光される輝尽性蛍光体を含む領域（以下、輝尽性蛍光体領域と称する）が形成されている。生化学解析用ユニットのスポット領域と蓄積性蛍光体シートの輝尽性蛍光体領域とを密着させると、特異的結合反応されたスポット領域からの放射線により輝尽性蛍光体領域が露光される。蓄積性蛍光体シートに励起光を照射して、露光された輝尽性蛍光体領域から発せられた輝尽光を光電的に検出して、生化学解析用データを生成し、この生化学解析用データに基づいてＤＮＡの塩基配列等の生化学解析を実行する。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０３６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在、生化学解析用ユニットには、スポット領域の高密度化が要求されている。そのため、高密度に形成されたスポット領域にプローブ溶液を点着する際に、隣接するスポット領域にまでプローブ溶液が拡散してしまい、ノイズ発生の原因となる場合がある。
【０００７】
本発明は、スポット領域が高密度に形成された生化学解析用ユニットにプローブ溶液を点着する際に、隣接するスポット領域にプローブ溶液が拡散することを抑制し、データ解析時のノイズの発生を抑制するプローブ溶液の点着方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明のプローブ溶液の点着方法は、生化学解析用ユニットに設けられ、吸着性材料を備えたスポット領域にプローブ溶液を点着させる点着方法において、前記吸着性材料の体積空隙率をＰとし、前記スポット領域の貫通孔面積と吸着性材料の厚みで形成される容積をＶ（ｍ３  ）としたときに、前記プローブ溶液の前記スポット領域への点着量Ｓ（ｍ３  ）を  ０．０１×Ｐ×Ｖ≦Ｓ≦Ｐ×Ｖの範囲とする。前記体積空隙率Ｐが、６０％〜７０％の範囲の吸着性材料を用いることが好ましい。前記吸着性材料には、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して使用することもできる。前記スポット領域の容積Ｖが５×１０−１３  ｍ３  〜１０×１０−１２  ｍ３  の範囲であることが好ましい。又、前記プローブ溶液を前記スポット領域に点着する時間を０．１秒以上３秒未満とすることが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。図１に示すように生化学解析は、大別して生化学解析用ユニットの製造工程，スポッティング工程，特異的結合反応工程，データ読み取り工程及びデータ解析工程で構成される。本発明において特異的結合反応は、ハイブリダイゼーション反応，抗原・抗体反応，リガンド・レセプタ反応等を含む。
【００１０】
図２に生化学解析用ユニットの一態様を示し、その断面図を図３に示す。生化学解析用ユニット１０は、基板１１に貫通孔１２が形成されている。その基板１１の一方の面から吸着性材料（以下、メンブレンと称する）１３を貫通孔１２に圧入しスポット領域１４を形成している。また、多数のスポット領域１４からなる略矩形の輪郭をしたブロック（以下、スポット領域ブロックと称する）１５が規則的に区画されている。これは、データ読み取りの際の位置決めが容易になるために好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１１】
基板１１の厚みＬ１が約１００μｍの場合には、メンブレン１３の厚みＬ２は１３０μｍ〜１８０μｍの範囲のものを用いることが好ましいが、この範囲に限定されるものではない。基板表面１１ａとメンブレン表面１３ａとの間隔Ｌ３が約２０μｍ程度とすることが好ましく、最大スポット範囲１６は、貫通孔１２の孔径Ｄとメンブレン厚みＬ２で形成され、その容積Ｖ（ｍ３  ）となる。なお、メンブレン表面１３ａが基板表面１１ａよりも凹んでいることが好ましい。
【００１２】
これは、スポッター４０によりプローブ溶液を各スポット領域に点着する際に、点着されたプローブ溶液が基板表面１１ａ上を流れて他のスポット領域内に吸着することを防止するためである。また、プローブ溶液がメンブレンに浸透するまでの液溜めともなる。さらに、放射性標識物質が付与されたターゲットを用いて解析を行うときには、各スポット領域から放出される放射線により輝尽性蛍光体を露光する際に、隣接する各スポット領域から放出される放射線が互いに干渉することが抑制される。
【００１３】
基板１１の材質としては、生化学解析用ユニット１０のスポット領域１４内部での光の散乱を防止するために、光を減衰させる材質が好ましく、金属、セラミック、プラスチックなどがあげられる。基板１１の厚みＬ１は、５０μｍ〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ〜５００μｍの範囲のものを用いることである。
【００１４】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルなどを用いることができる。または、ステンレス鋼や黄銅などの合金も用いることができるが、必ずしもこれらに限定されない。また、セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア等があげられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００１５】
プラスチックとしては、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレンやポリプロピレンなど）、ポリスチレン、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレートなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、含フッ素ポリマー（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレンなど）、含塩素フッ素ポリマー（例えば、ポリクロロトリフルオロエチレンなど）、ポリカーボネート、ポリエステル（例えば、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなど）、ポリアミド（例えば、ナイロン−６やナイロン−６６など）、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ケイ素樹脂（例えば、ポリジフェニルシロキサンなど）、フェノール樹脂（例えば、ノボラックなど）、エポキシ樹脂、ポリウレタン、セルロース類（例えば、酢酸セルロースやニトロセルロースなど）などが挙げられる。または、コポリマー（例えば、ブタジエン−スチレン共重合体など）、さらには前記プラスチックをブレンドしたものも挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００１６】
プラスチックを基板材料として用いると貫通孔の開口が容易となり好ましいが、光の減衰が生じ難い場合もあり、隣接するスポット領域から放出される光が混合する場合もある。そこで、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に充填させることが好ましい。光を減衰させるために、前記プラスチックに金属酸化物粒子やガラス繊維などを充填することが好ましい。金属酸化物粒子としては、二酸化ケイ素、アルミナ、二酸化チタン、酸化鉄、酸化銅などがあげられるが、必ずしもこれらに限定されない。光を減衰させるということは、スポット領域から発せられる光が、基板壁を透過して、隣接するスポット領域に到達する光強度が小さくなることを意味し、１／５以下になることが好ましく、１／１０以下になることがより好ましい。
【００１７】
貫通孔１２の形成方法は、パンチング法、放電パルス法、蝕刻技術法（フォトリソグラフィー法），電解エッチング法，エキシマレーザー及びＹＡＧレーザーなどのレーザーを基板に照射する方法などがあるがこれらに限定されるものではない。基板の材料に応じて、公知のいずれかの方法により所望の貫通孔を形成する。なお、図４にピン２０を用いたパンチング法より貫通孔１２を形成する方法を示す。
【００１８】
貫通孔１２の密度を高めるために、貫通孔の開口部の面積は、５ｍｍ２  未満であることが好ましく、より好ましくは１ｍｍ２  未満であり、０．３ｍｍ２  未満がより好ましく、０．０１ｍｍ２  未満がさらに好ましい。そして、最も好ましくは０．００１ｍｍ２  以上である。また、貫通孔の断面形状は、略円形状に限定されず、例えば楕円形状であっても良い。
【００１９】
貫通孔１２のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）Ｐ１は、５０μｍ〜３０００μｍの範囲が好ましく、貫通孔１２の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）Ｐ２は、１０μｍ〜１５００μｍの範囲とすることが好ましい。また、貫通孔１２の密度は、１０個／ｃｍ２  以上が好ましく、１００個／ｃｍ２  以上がより好ましく、さらに好ましくは５００個／ｃｍ２  以上、さらに最も好ましくは１０００個／ｃｍ２  以上となるように形成することである。
【００２０】
基板１１に表面処理を行い図５（ａ）に示す表面処理層１１ｂ，１１ｃを形成する。これにより後述する接着剤の接着性が向上する。基板１１の材料に金属，合金（例えば、ステンレス鋼など）を用いた際には、コロナ放電，プラズマ放電または陽極酸化法などの少なくともいずれかの方法により表面処理層１１ｂ，１１ｃを形成する。表面処理層１１ｂ，１１ｃは、カルボニル基，カルボキシル基などの極性基が導入され、親水性である金属酸化膜の層となっている。
【００２１】
次に、表面処理層１１ｂ，１１ｃ上に接着剤１７を塗工する（図５（ｂ）参照）。なお、接着剤１７を塗工する方法は、特に限定されるものではないが、ロール塗布，ワイヤーバー塗布，ディップ塗布，ブレード塗布，エアナイフ塗布などにより行うことができる。接着剤１７には、スチレンブタジエンゴム，アクリロニトリルブタジエンゴムが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。なお、余剰の接着剤１７は、ブレードにより掻き落としたり、レーザー光の照射により熱分解させて除去する方法などにより行う。なお、本発明において、基板表面処理及び接着剤塗工の工程は省略することもできる。
【００２２】
スポット領域１４中に圧入されるメンブレン１３には、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して用いることもできる。本発明において用いられるメンブレンは、多孔質材料（有機，無機，有機／無機）、繊維材料（有機，無機）のいずれでもよく、それらを混合して用いても良い。また、体積比の空隙率（以下、体積空隙率と称する）Ｐが、６０％〜７０％の範囲のものを用いることが好ましく、微細孔の平均孔径は０．２μｍ〜３μｍの範囲にあるものを用いることが好ましい。
【００２３】
有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、ポリマーを用いることが好ましい。ポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２４】
無機多孔質材料も、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などが挙げられる。また、活性炭などの炭素多孔質材料も好ましく用いられる。
【００２５】
また、有機繊維材料，無機繊維材料も特に限定されるものではない。例えば、前記セルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などの有機繊維材料や、ガラス繊維、金属繊維などの無機繊維材料を用いることができる。また、メンブレン１３の強度を高めるため、多孔質材料を溶解する溶媒に不溶な繊維材料を混合させても良い。
【００２６】
図６には、貫通孔１２へメンブレン１３を圧入しスポット領域１４を形成する一実施形態を示す。基板１１とメンブレン１３とを重ね合わせて上下からプレス板２１，２２でプレスする。その後に基板１１とメンブレン１３とを移動して、次のプレスを行う。なお、メンブレン１３に有機多孔質材料及び／または有機繊維材料を用いているときには、プレス板２１をヒータ２３で加熱することで、メンブレン１３の可撓性が向上して圧入が容易となる。
【００２７】
また、他の実施形態としてローラ２４，２５を用いてメンブレン１３を貫通孔１２へ圧入する方法を図７に示す。この場合にも、基板１１側に設けられているローラ２４にヒータ２６を取り付けて加熱することが好ましい。また、貫通孔１２にメンブレン１３を圧入するためにローラ２４，２５の少なくともいずれか一方を加圧ローラとすることがより好ましい。以上の製造工程を経て得られる生化学解析用ユニット１０の断面図を図８に示す。貫通孔内にメンブレン１３の一部が圧入され、スポット領域１４が形成されている。
【００２８】
また、本発明に用いられる生化学解析用ユニット１０は、スポット領域，スポット領域ブロック及び各スポット領域内に設けられているスポット領域の数，サイズ，配置形態などは、図２に示したものに限定されるものではない。生化学解析を行う際には、各スポット領域の反応状況を一度に多数知ることができるように、多数のスポット領域が形成されているものを用いることが好ましい。例えば、図９に示す生化学解析用ユニット３０では、７０ｍｍ×９０ｍｍの基板３１に直径３００μｍのスポット領域３２が形成されている（図９（ｂ）参照）。スポット領域３２を１０×１０個形成されているスポット領域ブロック３３が、１２×１６ブロック配置している（図９（ａ）参照）。生化学解析用ユニット３０には、１９２００のスポット領域３２が形成されており、１バッチの解析でＤＮＡマイクロアレイと同程度の情報を高精度に得ることができる。なお、スポット領域の断面を略円形に形成した場合には、それらの中心距離を４００μｍとすることが好ましい。
【００２９】
図１０に示すスポッター４０は、直交座標形プロッタ４１にスポットヘッド４２を取り付けたものであり、Ｘ，Ｙ及びＺのスライドユニット４３，４４，４５を統括的に制御する制御部４６及びタイマ回路４７とを備えている。各スライドユニット４３〜４５は、サーボモータ（図示しない）の駆動の送りネジを利用し、送りネジにより各スライドをガイドに沿って高精度に移動させる。
【００３０】
Ｘスライドユニット４３は、Ｘテーブル４３ａを１方向に、Ｙスライドユニット４４は、Ｙテーブル４４ａを前記１方向に対して直交する方向に、さらにＺスライドユニット４５はＺテーブル４５ａを垂直方向にそれぞれ移動する。また、Ｘテーブル４３ａには、多数のプローブ溶液が分注されているウェルプレート４８と、生化学解析用ユニット１０が取り付けられている。なお、プローブ溶液は、前述した構造などが既知の生体由来物質例えば、ＤＮＡなどを溶質としたものである。スポットヘッド４２は、Ｚテーブル４５ａに設けた支持板４９に設けられており、複数のプローブ溶液点着手段であるクイルピン５０を備えている。各スライドユニット４３〜４５の駆動によりクイルピン５０は、ウェルプレート４８から所定のプローブ溶液を吸い上げ、生化学解析用ユニット１０の所定のスポット領域に点着する。
【００３１】
クイルピン５０は、正面側の図１１（ａ）及び側面側の図１１（ｂ）に示すように、割溝５０ａが形成されており、その割溝５０ａ内にプローブ溶液５１が保持されている。なお、本発明に用いられるプローブ溶液点着手段は、クイルピン５０の形状に限定されず、図１２に示すようにピン先端５２に螺旋溝が形成されており、その螺旋溝にプローブ溶液５３が吸い上げられるものを用いることもできる。さらに点着手段は、ピンに限定されずに、図１３に示すようにキャピラリー５４を用いてその中にプローブ溶液５５を吸い上げるものを用いることもできる。また、クイルピン開口部５０ｂのスポット径も特に限定されないが、５×１０−３ｍｍ〜１００×１０−３ｍｍの範囲であることが好ましい。また、螺旋溝の断面積は、１×１０−９ｍ２  〜８×１０−９ｍ２  の範囲であることが好ましい。キャピラリー５４の先端径も特に限定されないが、１０×１０−３ｍｍ〜２００×１０−３ｍｍの範囲であることが好ましい。
【００３２】
プローブ溶液となるＤＮＡ断片の水性液は、プローブ分子および水溶性増粘剤を蒸留水，ＴＥバッファ溶液（１０ｍＭ  Ｔｏｒｉｓ−ＨＣＬ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ），ＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝液）などの水性媒体に溶解もしくは分散して調製する。水性液の粘度は、使用するピンのタイプによっても異なるが、一般には１ｍＰａ・ｓ〜１００ｍＰａ・ｓの範囲にある。例えば、クイルピン５０であれば水性液の粘度は、２ｍＰａ・ｓ〜５０ｍＰａ・ｓの範囲にあることが好ましく、特に好ましくは２ｍＰａ・ｓ〜２０ｍＰａ・ｓの範囲にある。水溶性増粘剤が水溶性高分子物質である場合には、一般に０．１重量％〜５重量％の範囲で添加され、好ましくは０．３重量％〜３重量％の範囲にある。増粘剤が多価アルコールや糖類である場合には、一般に５重量％〜５０重量％の範囲で添加され、好ましくは１０重量％〜４０重量％の範囲にある。
【００３３】
水溶性増粘剤としては、例えば合成もしくは天然の水溶性高分子物質；グリセロールなどの多価アルコール；トレハロース，アルギン酸ナトリウム，でんぷんなどの糖類を挙げることができる。
【００３４】
プローブ溶液を各スポット領域に点着するが、隣接するスポット領域にそのプローブ溶液が混合しない量を点着することが必要である。図３に示している最大スポット範囲１６は、好ましい一態様であり、図示したものに限定されるものではない。本発明においては、最大スポット範囲１６は隣接するスポット領域間でプローブ溶液の混合が生じない範囲であれば良い。最大スポット範囲１６内にプローブ溶液を点着することで、プローブ溶液が、メンブレン１３に浸透して隣接するスポット領域に混入することを防止できる。
【００３５】
本発明において、メンブレン１３への好ましい点着量Ｓは、基板の厚みＬ１，材質、貫通孔の形状，孔径Ｄ，隣接するスポット領域間の孔ピッチＰ１，孔間隔Ｐ２、メンブレンの材質の種類，厚みＬ２（図２及び図３参照），微細孔の平均孔径，体積空隙率Ｐ、スポット容積Ｖ、点着手段（図１１ないし図１３）の形態，点着手段のスポット径、プローブ溶液の溶媒の種類，物性（例えば、濃度，粘度など）などにより適宜決定され、下記の式で表わされる範囲とする。
０．０１×Ｖ×Ｐ≦Ｓ≦Ｖ×Ｐ
（０．０１×Ｖ×Ｐ）より点着量Ｓが少ないと、標識が不十分となるおそれがあり、データ解析に困難が生じる場合がある。また、（Ｖ×Ｐ）より大きいと、隣接するスポット領域へ浸透し、そのスポット領域に点着されたプローブ溶液と混合するおそれがある。なお、スポット容積Ｖも、基板形態，メンブレン形態により決定されるが、本発明では、５×１０−１３  ｍ３  〜１０×１０−１２  ｍ３  の範囲であることが好ましいが、本発明はその範囲に限定されるものではない。
【００３６】
例えば、基板１１の厚みＬ１が１００μｍであり、材質は、ステンレス板を用いる。また、貫通孔１２の形状を円形とし，貫通孔の孔径Ｄを３００μｍとし、孔ピッチＰ１を４００μｍとし、孔間隔Ｐ２を１００μｍとする。メンブレン１３には厚みＬ２が１８０μｍの多孔質吸着性材料を用い、微細孔の平均孔径０．４５μｍ，平均体積空隙率Ｐが７０％のものを用いる。点着手段にクイルピンを用い、溶媒に蒸留水，ＳＳＣなどの水性媒体を用いたプローブ溶液を調製する。以上の各条件から、スポット容積Ｖの最大値は、８．９×１０−１２  ｍ３  となる。この条件では、点着時間Ｔ２は０．１秒以上３秒未満とすることが好ましい。
【００３７】
図１４にピンがメンブレン表面に接触している時間（以下、ピン接触時間と称する）とスポット量の相対値との関係をグラフに示す。実験は、蛍光試薬を混合させたプローブ溶液を用いる。スポット領域１４にそのプローブ溶液を点着させた後に、蛍光スキャナー（ＦＵＪＩ  ＦＬＡ−５０００）でスポット領域１４から発光される蛍光強度を測定し、その測定値からスポット量を算出する。なお、実験は、ピン接触時間を０．１秒とし、３２個のスポット領域１４にプローブ溶液を点着し、蛍光強度からスポット量の平均値及び偏差を算出する。平均値を棒グラフに示し、また、スポット量ばらつき（ＣＶ＝偏差／平均値×１００％）を丸でプロットする。ピン接触時間を０．３秒，３秒，５秒に変え、それぞれのスポット量とスポット量ばらつきも併せて図１４に示す。
【００３８】
点着時間（ピン接触時間）Ｔ２が０．１秒より短いと、解析に必要なプローブの量をスポット領域に点着できない場合がある。また、３秒以上であると点着したプローブ溶液が基板の下面のメンブレンを浸透して隣接するスポット領域に含まれるプローブ溶液と混合するおそれが生じる。そこで、３秒未満とすることでプローブ溶液の混合を防止すると共に、スポット量のばらつきを小さくすることもできる（図１４参照）。この点着時間の範囲内で点着時間Ｔ２を決定すると、点着量Ｓのばらつきを最小限にすることができる。なお、前記点着時間Ｔ２は、本発明の一形態であり、その範囲に限定されるものではない。
【００３９】
図１５に示すように生化学解析用ユニット７０の基板７１に特性が異なる２枚のメンブレン７２，７３を圧入してスポット領域７４を形成しても良い。メンブレンの特性としては、例えば、体積空隙率Ｐの相違や、プローブと結合しやすい官能基の有無などが挙げられる。なお、用いるメンブレンの枚数は２枚に限定されるものではなく、３枚以上を用いても良い。このように複数種類のメンブレンを用いてスポット領域７４を形成することで、一バッチの生化学解析を行う際に、メンブレンに固定するプローブの選択を広げることができる。
【００４０】
図１０，１６及び図１７にて本発明に係るプローブ溶液の点着方法を説明する。予め、目的とするプローブ溶液の吸い上げ時間Ｔ１と、点着量Ｓに対応する点着時間Ｔ２を制御部４６にセットする。目的とするプローブ溶液が分注されているウェルプレート４８上までスポットヘッド４２の位置を移動する。吸い上げ位置にスポットヘッド４２が移動したと判断した場合には、スポットヘッド４２を下降させる。このときに、タイマ回路４７をスタートさせ、その後に制御部４６が予め決められた吸い上げ時間Ｔ１を経過したか否かの判断を行う。吸い上げ時間Ｔ１を経過すると、スポットヘッド４２を上昇してプローブ溶液の吸い上げを終了する。
【００４１】
次に、生化学解析用ユニット１０の所定のスポット領域までスポットヘッド４２を移動する。スポットヘッド４２が所定の位置に到達したと制御部４６が判断すると、移動を中止してスポットヘッド４２を下降させて点着をスタートさせると共にタイマ回路４７をスタートさせる。スポットヘッド４２を下降させると、図１７（ａ）に示すようにクイルピン５０の先端がスポット領域１４のメンブレン表面１３ａに接触して点着を開始する。制御部４６は、予め規定されている点着時間Ｔ２に到達するまで、クイルピン５０の位置を停止してプローブ溶液５１をメンブレン１３に浸透させてスポット範囲１８を拡大させる（図１７（ｂ））。
【００４２】
点着時間が予め規定された時間Ｔ２に到達すると、スポットヘッド４２を上昇させることにより、クイルピン５０からメンブレン１３へのプローブ溶液の点着が停止する（図１７（ｃ））。メンブレン表面１３ａに残存していたプローブ溶液５１がメンブレン１３内を浸透し、図１７（ｄ）に示すようにプローブ溶液は、スポット範囲１８を形成する。なお、クイルピン５０は、洗浄されて次の点着を行う。
【００４３】
図１７では、一度の吸い上げ工程で吸い上げたプローブ溶液を全て一箇所のスポット領域に点着する形態を図示して説明したが、本発明は、その形態に限定されない。例えば、一度に吸い上げたプローブ溶液を複数箇所に点着する方法も本発明には含まれる。また、吸い上げ時間Ｔ１や点着時間Ｔ２を設定する際には、スポットヘッドの下降時間を考慮することにより、より厳密に点着量Ｓを制御できる。また、クイルピン開口部５０ｂからプローブ溶液５１がメニスカスにより液滴が膨らんでいるときには、その液滴がメンブレン１３に接触したときからプローブ溶液５１の供給が開始されるので、クイルピン５０の先端の材質やプローブ溶液５１の物性からメニスカス量を考慮することがより好ましい。
【００４４】
また、メンブレン１３は、毛管現象によりクイルピン５０の先端からプローブ溶液５１を吸引する作用が働くので、プローブ溶液が最大スポット範囲に到達する前に、クイルピン５０の先端をメンブレン１３から離すように、点着時間Ｔ２を予め決めておくことがより好ましい。
【００４５】
以上の工程を繰り返すことにより、各スポット領域にプローブ溶液が点着された生化学解析用ユニットが得られる。そして、紫外線照射法などによりプローブをメンブレンに固定する。このときに、プローブが存在しないスポット領域や基板表面に直接にターゲットが付着することを防止するためにブロッキング処理を行うことが好ましい。これにより、データ読み取り時における基板表面やメンブレン表面からのノイズの発生を抑制できる。
【００４６】
構造が未知で生体由来物質をターゲットに用い、標識物質として蛍光物質を付与し、標識ターゲットとする。この標識ターゲットを溶質として反応溶液８１を調製する。図１に示すリアクタ８０にプローブを固定した生化学解析用ユニット３０をセットして特異的結合反応を行う。リアクタ８０は、反応溶液８１を強制的に反応容器８２内にポンプ８３で流動、循環させるため、スポット領域３２に固定されているプローブと標識ターゲットとの特異的結合反応がおきやすくなり、再現性，定量性に優れるデータを得ることができるために好ましいが、振盪式反応器により反応させても良い。
【００４７】
反応溶液８１をスポット領域３２を横切るように強制的に流動させた後、強制的に流動させた時間よりも長い時間、流動を停止することが好ましい。強制的に流動させる時間および流動を停止する時間は、プローブ、ターゲットの種類、量等によって異なり一概には言えないが、強制的に流動させる時間が１分〜３０分の場合、流動を停止する時間は３０分〜１時間が好ましい。なお、１分間強制的に流動させた後、３０分間流動を停止し、再び１分間強制的に流動させた後、３０分間流動を停止するといったように、流動と停止をサイクルで繰り返し行ってもよい。
【００４８】
その後に、反応容器８２内に反応溶液８１に代えて洗浄液（例えば、超純水など）を送液して、プローブと特異的結合反応した標識ターゲット以外の反応溶液８１を反応容器８２内から除去する洗浄工程を行う。
【００４９】
洗浄工程を経た後に、生化学解析用ユニット３０は、データ読み取り工程に送られる。データ読み取り工程では、スキャナ９０によって、生化学解析用データが光電的に読み取られる。スキャナ９０は、各スポット領域３２へ励起光を照射する照射光源（図示せず）と、励起光が照射されることにより標識物質から放出される蛍光を受光して光電変換するＣＣＤイメージセンサ９１とからなる。ＣＣＤイメージセンサ９１の受光面前方には、標識物質から放出される蛍光をＣＣＤイメージセンサ９１の受光素子へ導くライトガイド９２が設けられる。ライトガイド９２は、各スポット領域３２の数に対応した複数本の光ファイバから構成され、各光ファイバの一端が前記受光面に、他端がスポット領域にそれぞれ対向するように配置される。特異的結合反応が生じたスポット領域では、標識物質が残留するから、光が発光されるが、特異的結合反応が生じないスポット領域は、光が発光しない。ＣＣＤイメージセンサ９１によって、こうした各スポット領域３２の特異的結合反応の状況を示す画像データが取得される。データ解析工程では、この画像データから生化学解析用データを作成し、これに基づいて生化学解析がなされる。
【００５０】
上記実施形態では、標識物質として、蛍光物質を使用した例で説明しているが、前述した放射性物質，化学反応性標識物質などを標識物質として用いても良い。また、標識方法としては、これら標識物質を直接、ターゲットに付与し、特異的結合反応物質を含む反応溶液に含ませて検出する直接検出標識法の他に、間接検出標識法を使用してもよい。間接検出標識法の一例としては、特異的結合反応物質を含む反応溶液中に標識物質を含ませずに、プローブとターゲットとを反応させ、この後、スポット領域においてプローブと特異的結合反応を生じたターゲットに対して、標識物質が付与された特異的結合物質と結合させることでターゲットの構造などを解析させる方法がある。この間接検出標識法は、プローブと、特異的結合物質とによってターゲットを挟み込むようにすることから、サンドイッチ法と呼ばれる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明のプローブ溶液の点着方法は、生化学解析用ユニットに設けられ、吸着性材料を備えたスポット領域にプローブ溶液を点着させる点着方法において、前記吸着性材料の体積空隙率をＰとし、前記スポット領域の貫通孔面積と吸着性材料の厚みで形成される容積をＶ（ｍ３  ）としたときに、前記プローブ溶液の前記スポット領域への点着量Ｓ（ｍ３  ）を
０．０１×Ｐ×Ｃ≦Ｖ≦Ｐ×Ｃの範囲とするから、特異的結合反応に必要な量のプローブを前記スポット領域に固定できると共に、隣接するスポット領域に点着されているプローブとの混合を防止できる。
【００５２】
また、前記プローブ溶液を前記スポット領域に点着する時間を０．１秒以上３秒未満とすることで、測定に必要なプローブ量を確保でき、またそのプローブ量のばらつきを抑制すると共に、隣接するスポット領域間でのプローブ溶液の混合を防止できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】生化学解析の一連の工程を説明するための工程図である。
【図２】本発明に用いられる生化学解析用ユニットの一実施形態の斜視図である。
【図３】図２の生化学解析用ユニットの要部断面図である。
【図４】図２の生化学解析用ユニットの製造方法を説明するための概略図である。
【図５】図２の生化学解析用ユニットの製造方法を説明するための断面図である。
【図６】図２の生化学解析用ユニットの製造方法を説明するための断面図である。
【図７】図２の生化学解析用ユニットの他の実施形態の製造方法を説明するための断面図である。
【図８】本発明に用いられる生化学解析用ユニットの要部断面図である。
【図９】本発明に用いられる生化学解析用ユニットの他の実施形態の平面図である。
【図１０】本発明に用いられるスポッターの概略斜視図である。
【図１１】本発明に用いられる点着手段の一実施形態の要部概略図である。
【図１２】本発明に用いられる点着手段の他の実施形態の要部概略図である。
【図１３】本発明に用いられる点着手段の他の実施形態の要部概略図である。
【図１４】ピン接触時間とスポット量との関係を説明するためのグラフである。
【図１５】本発明に用いられる生化学解析用ユニットの他の実施形態の要部断面図である。
【図１６】本発明に係るプローブ溶液の点着方法を説明するフロー図である。
【図１７】本発明に係るプローブ溶液の点着方法を説明するための要部断面図である。
【符号の説明】
１０，３０  生化学解析用ユニット
１３  メンブレン
１４  スポット領域
１６  最大スポット範囲
５０  クイルピン
Ｖ  スポット容積
Ｐ  体積空隙率
Ｓ  点着量
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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