(57)【要約】【課題】キク科植物の多くの品種で効率的に形質転換体を作製させる、キク科植物の形質転換方法を提供すること。【解決手段】次の（ａ）〜（ｅ）の各工程からなることを特徴とする、キク科植物の形質転換方法。（ａ）キク科植物の組織片を、植物ホルモンを含んだ培地で前培養する工程、（ｂ）当該組織片をウイスカとともに液体中に分散させた後、遠心処理により当該組織片にウイスカを付着させる工程、（ｃ）ウイスカが付着した当該組織片を超音波処理することにより損傷させる工程、（ｄ）当該組織片と外来遺伝子を有するアグロバクテリウム細菌とを共存培養する工程、（ｅ）共存培養した当該組織片を培養して形質転換植物を再生させる工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）〜（ｅ）の各工程を含むことを特徴とするキク科植物の形質転換方法。
（ａ）キク科植物の組織片を、植物ホルモンを含んだ培地で前培養する工程、
（ｂ）当該組織片をウイスカとともに液体中に分散させた後、遠心処理により当該組織片にウイスカを付着させる工程、
（ｃ）ウイスカが付着した当該組織片を超音波処理することにより損傷させる工程、
（ｄ）当該組織片と外来遺伝子を有するアグロバクテリウム細菌とを共存培養する工程、
（ｅ）共存培養した当該組織片を培養して形質転換植物を再生させる工程。
【請求項２】
キク科植物の組織片を、植物ホルモンを含んだ培地で前培養する期間が２〜８日であることを特徴とする、請求項１に記載のキク科植物の形質転換方法。
【請求項３】
組織片が、茎、花茎、葉、根または花器であることを特徴とする、請求項１に記載のキク科植物の形質転換方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの方法により形質転換されたキク科植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なキク科植物の形質転換方法に関し、より詳しくは、効率のよい汎用性のあるキク科植物の形質転換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、植物に種々の性質を付与する目的で、外来遺伝子を導入した形質転換植物体が作成されているが。その場合には対象となる植物への効率的な遺伝子導入方法を確立する必要がある。本発明で対象とするキク科植物へ外来遺伝子を導入する方法として、アグロバクテリウム細菌を用いる生物的な形質転換法が利用されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
アグロバクテリウム細菌を用いる形質転換法は、植物において最も広く用いられている遺伝子導入技術である。この技術は、土壌生息細菌であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium  rizogenesis）の病原性を利用するもので、アグロバクテリウムが保有するＴ−ＤＮＡの一部を目的とする外来遺伝子で置換して、該細菌を植物組織に感染させることにより外来遺伝子が植物細胞内に導入、形質転換されることが知られている。例えば、タバコにおいては、葉片にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを感染することにより、容易に形質転換植物体を得ることができる（例えば非特許文献２参照）。
【０００４】
近年、物理的な遺伝子導入方法としてウイスカ法が利用されている（特許文献１参照）。これは、微細な針状の構造を持った単結晶、DNA溶液および細胞を、同一容器内で混合することにより、外来遺伝子を植物細胞に導入する方法である。しかしながら、ウイスカを用いたキク科キク属植物の形質転換の報告は見られない。
【０００５】
遺伝子組換えによって、有用遺伝子を導入した形質転換植物体を作成する際、個体ごとに遺伝子の発現量などが異なるため、多くの独立した個体を作成し、その中から導入した形質の安定した個体を選抜する必要がある。
【０００６】
キク科植物への形質転換においては、効率および汎用性の高い形質転換方法はまだ確立されていない。例えば、キク科キク属の品種を用いた形質転換においては、葉片にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを感染させることにより、遺伝子が導入された形質転換植物体が得られている。しかしながら、感染に用いた組織片から再生する形質転換植物体数は少なく、その形質転換率は低い。また品種間にも効率の大きな差が認められる（例えば、非特許文献１、３，４，５参照）。
【０００７】
【特許文献１】特許第３３１２８６７号公報
【非特許文献１】「育種学研究」、２００２年、第４巻、別冊第１号、p.１７１
【非特許文献２】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」１９８５年、第２２７巻、Ｐ．１２９〜１３１
【非特許文献３】「育種学雑誌」、１９９８年、第４８巻、別冊第１号、ｐ．１９１
【非特許文献４】「園芸学雑誌」、１９９８年、第６７巻、第６号、ｐ．９５８〜９６４
【非特許文献５】「ブリーディングサイエンス（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００２年、  第５２巻、ｐ．４３〜５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、キク科植物の多くの品種で形質転換に必要な種々の遺伝子を容易に導入し、効率的に形質転換体を作製させうる、キク科植物の形質転換方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、キク科植物の組織片を特定の期間前培養した後、ウイスカとともに液体中に分散させた状態において、遠心処理ならびに超音波処理を行うことにより組織片を損傷させた後、アグロバクテリウム法による遺伝子導入に用い、形質転換させた組織片から植物体を再生させることにより、効率的で新規なキク科植物の形質転換方法を見出した。
【００１０】
したがって、第１の本発明の要旨するところは、次の（ａ）〜（ｅ）の各工程を含むことを特徴とするキク科植物の形質転換方法にある。
（ａ）キク科植物の組織片を、植物ホルモンを含んだ培地で前培養する工程、
（ｂ）当該組織片をウイスカとともに液体中に分散させた後、遠心処理により当該組織片にウイスカを付着させる工程、
（ｃ）ウイスカが付着した当該組織片を超音波処理することにより損傷させる工程、
（ｄ）当該組織片と外来遺伝子を有するアグロバクテリウムとを共存培養する工程、
（ｅ）形質転換された組織片を培養して形質転換植物を再生させる工程。
【００１１】
また、第２の本発明の要旨するところは、組織片が、茎、花茎、葉、根または花器であることを特徴とする、請求項１に記載のキク科植物の形質転換方法にある。
【００１２】
また、第３の本発明の要旨するところは、キク科植物の組織片を、植物ホルモンを含んだ培地で２〜８日間前培養したのち、アグロバクテリウム遺伝子導入法に用いることを特徴とする請求項１に記載のキク科植物の形質転換方法にある。
【００１３】
また、第４には、上記の各工程（ａ）〜（ｅ）により、形質転換されたキク科植物にある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、キク科植物の多くの品種で、花色改良遺伝子、耐虫性遺伝子、耐病性遺伝子、耐寒性遺伝子、耐暑性遺伝子、耐塩性遺伝子、環境浄化遺伝子、形態形成関連遺伝子、エチレン生成抑制遺伝子などの有用遺伝子を導入することが容易となり、効率的に形質転換体を作製させる、キク科植物の形質転換方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に本発明の方法について具体的に説明する。本発明に係るキク科植物の形質転換方法は、上記（ａ）〜（ｅ）の各工程からなる。以下に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）各工程を詳細に説明する。
【００１６】
（１）工程（ａ）（前培養工程）
（イ）本発明の工程（ａ）で用いられるキク科植物の組織片の前培養は次のように実施される。
まず、第１に、本発明に用いられるキク科植物としては、次のものが挙げられる。
キク属（Dendranthema）、
シオン属（Aster）、
キンセンカ属（Calendula）、
エゾギク属（Callistephus）、
ベニバナ属（Carthamus）、
コスモス属（Cosmos）、
ダリア属（Dahlia）、
ガザニア属（Gazania）、
ガーベラ属（Gerbera）、
ヒマワリ属（Helianthus）、
セネシオ属（Senecio）、
ジニア属（Zinnia）、
ノコギリソウ属（Achillea）、
アゲラタム属（Ageratum）、
カイザイク属（Ammobium）、
ヒナギク属（Bellis）、
ヤグルマソウ属（Centaurea）、
アザミ属（Cirsium）、
コレオプシス属（Coreopsis）、
ディモルフォセオ属（Dimorphotheca）、
エキノプス属（Echinops）、
フェリシア属（Felicia）、
ガイラルディア属（Gaillardia）、
ミヤコワスレ属（Gymnaster）、
ムギワラギク属（Helichrysum）、
ローダンセ属（Helipterum）、
リアトリス属（Liatris）、
ルドベキア属（Rudbeckia）、
ストケシア属（Stokesia）、
タゲテス属（Tagetes）。
上記に例示したキク科植物の中で、好ましくは、キク属に含まれるキク品種である。
【００１７】
（ロ）次に、このようなキク科植物の組織片を植物ホルモンを用いて前培養するには、まず、キク科植物の植物体の茎または花茎などから組織片を採取し、これを有効塩素濃度０．１〜１％、好ましくは０．２〜０．６％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０〜６０分間、好ましくは１５〜４５分間浸漬し、殺菌処理する。
【００１８】
次いで、組織片を取り出して、滅菌水で３〜５回洗浄し、表面に付着した次亜塩素酸ナトリウム水溶液を取り除く。これを、無菌条件下で所望の大きさ、例えば茎組織を用いる場合は、３ｍｍ〜１０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜７ｍｍ長の小片に切断して調製される。
【００１９】
これを例えばムラシゲ・スクーグ培地（以下「ＭＳ培地」という。）にショ糖１０ｇ／ｌ（リットル．培地１リットル当りの量を示す。以下同じ。）〜６０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｇ／ｌ〜４０ｇ／ｌ、植物ホルモンとして、オーキシン類を０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌとサイトカイニン類を０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、寒天６ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、好ましくは７ｇ／ｌ〜８ｇ／ｌを加えた固体培地に置床する。これを、１２℃〜２２℃、好ましくは１５℃〜２０℃の恒温室に入れて明所下に培養すると、置床２〜８日後に組織片の切断面にカルスの形成が認められる。
【００２０】
上記した前培養工程に用いる培地としては、ＭＳ培地のほかに、Ｂ５培地、ニッチ（Ｎｉｔｓｈ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地などをＭＳ培地に準じて用いることができる。
【００２１】
また、本発明の組織片の前培養工程では、培地に加えられる植物ホルモンとして、オーキシン類としてナフタレン酢酸（以下、「ＮＡＡ」という。）またはインドール酢酸（以下、「ＩＡＡ」という。）と、サイトカイニン類としてベンジルアデニン（以下、「ＢＡ」という。）またはカイネチンまたはチジアズロンなどを挙げることができる。
【００２２】
このような植物ホルモンはその種類に応じて、適宜その添加量を選択して用いられる。例えば、ＮＡＡとＢＡを組み合わせて用いる場合は、ＮＡＡおよびＢＡは、ともに０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌの量で用いられる。
【００２３】
また、組織片の培養を行う場合の明所条件は、照度が５００〜１００００ルクス、好ましくは５００〜２０００ルクスであり、光照射時間が１日に５〜２４時間、好ましくは１４〜１８時間である。
【００２４】
（２）工程（ｂ）（組織片にウイスカを付着させる工程）
本工程は、前記工程（ａ）によって前培養されたキク科植物の組織片をウイスカとともに液体中に均一に分散し、懸濁させた状態にさせた後、混合物を遠心処理することによりウイスカを植物組織片ヘ付着させる工程である。
【００２５】
本発明に用いるウイスカとは、微細な針状の構造を持った単結晶をいう。本発明に用いるウイスカとしては、細胞に刺さり、細胞を損傷させうることができるものであればなんら限定されるものではないが、寸法が細胞の大きさと比較して、大きすぎるものであってはならない。具体的には、直径が０．０１〜１０μｍ、好ましくは、０．５〜１μｍ、長さが、１〜１００μｍ、好ましくは３〜４０μｍである。ウイスカの材質は、チタン酸カリウム、炭酸カルシウム、ホウ酸アルミニウム、窒化ケイ素、酸化亜鉛、塩基性硫酸マグネシウム、マグネシア、ホウ酸マグネシウム、二ホウ化チタン、カーボングラファイト、硫酸カルシウム、サファイア、シリコンカーバイドなどが挙げられ、好ましくはチタン酸カリウム、炭酸カルシウム、ホウ酸アルミニウムである。
【００２６】
次に、組織片およびウイスカを分散させる液体としては、蒸留水、等張液、緩衝液、組織培養用培地などが挙げられる。その際の等張液としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2などの無機塩を添加して０．０１〜７Ｍ、好ましくは、０．５〜２Ｍにした液体が挙げられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などが挙げられる。
【００２７】
組織培養用培地としては、例えばＭＳ培地、Ｂ５培地、ホワイト培地、ニッチ培地などが挙げられる。等張液または組織培養用培地を用いる場合は糖類を添加して用いるのがよく、その際の糖類としては、例えばショ糖、果糖、ブドウ糖、ソルビトール、マンニトールなどが挙げられ、糖類の濃度は０.０１〜７Ｍ、好ましくは０.５〜２Ｍで使用される。
【００２８】
本発明に用いる液体のｐＨは、ｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ５〜７である。本発明に用いる液体の容量は、特に限定されるものではないが、組織片の容量１ｍｌに対して、１０μｌ〜２ｍｌ、好ましくは、３００〜７００μｌになるよう調整して用いる。
【００２９】
本発明に用いる組織片の容量は、特に限定されるものではないが、組織片と共に液体中に混合されるウイスカの量は組織片の容量に伴い調整され、組織片容量１ｍｌ当たり、ウイスカ１〜１００ｍｇ、好ましくは、４〜４０ｍｇになるように添加される。このようにして得られた上記組織片およびウイスカは液体と一緒に同一容器に加えて混合する。
【００３０】
本発明で使用する容器は、例えば、遠心管、ガラス試験管、ポリプロピレン製試験管、シャーレ、フラスコなどが使用できるが、無菌で取り扱える容器であれば、これらに限定されるものではない。
【００３１】
組織片およびウイスカは、液体中で均一に混合され、分散されるよう容器を振って撹拌するが、特に激しく撹拌する必要はない。
【００３２】
このようにして、液体中に分散させた組織片およびウイスカの混合物（以下、「混合物」と略す）を得ることができる。      
【００３３】
本発明における遠心処理は、遠心加速度が３，０００〜５０，０００×ｇ、好ましくは、１０，０００〜３０，０００×ｇで、遠心時間が、１０秒〜４０分、好ましくは５〜１０分間行う。
【００３４】
また、組織片へのウイスカの付着量を高めるために同様の遠心処理を１〜２０回、好ましくは３回繰り返して行うのがよい。
【００３５】
（３）工程（ｃ）（組織片を超音波処理で損傷させる工程） 
本工程は、工程（ｂ）で遠心処理を行った後に組織片とウイスカを含む混合物に超音波照射することによりウイスカを振動させ、ウイスカにより細胞を穿孔し、細胞を損傷させる工程である。
【００３６】
本発明に用いる超音波処理は、周波数が１ｋ〜１ＭＨｚ、好ましくは１０〜６０ｋＨｚで、照射時間が０．２秒〜２０分間、好ましくは３０秒〜２分間で、強度は、０．０１〜１０Ｗ／ｃｍ2、好ましくは０．１〜１Ｗ／ｃｍ2で照射を行うのがよい。
【００３７】
（４）工程（ｄ）（組織片と外来遺伝子を有するアグロバクテリウム細菌を共存培養し、外来遺伝子を導入する工程）
上記の工程（ｃ）で超音波処理され、細胞が穿孔た混合物は、そのままアグロバクテリウムの感染に用いることもできるが、好ましくは、混合物からウイスカを取り除くために洗浄を行った後にアグロバクテリウムの感染に用いた方がよい。その際に用いる洗浄液は、蒸留水、等張液、緩衝液、培地などが挙げられるが、好ましくは、前述の等張液または培地を用いることである。
【００３８】
このようにして得られた組織片を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌と共存培養し、遺伝子導入を行う。すなわち、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＢＡ４４０４）をＬＢ培地で１昼夜培養した培養液に、上記に記載の方法により損傷させられたキク花茎組織片を５〜６０分間、好ましくは１０〜３０分間浸漬処理する。浸漬処理後、これを例えばＭＳ培地にショ糖１０ｇ／ｌ〜６０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｇ／ｌ〜４０ｇ／ｌ、植物ホルモンとして、オーキシン類を０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌとサイトカイニン類を０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌ、寒天６ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、好ましくは７ｇ／ｌ〜８ｇ／ｌ、カサミノ酸を０．５ｇ／ｌ〜３ｇ／ｌ、好ましくは１ｇ／ｌ〜２ｇ／ｌ、アセトシリンゴン５ｍｇ／ｌ〜５０ｍｇ／ｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜３０ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とした固体培地に置床する。これを、１２℃〜２２℃、好ましくは１５℃〜２０℃の暗所下に、１日間〜７日間、好ましくは２日間〜４日間培養することにより、共存培養を行いアグロバクテリウムの感染を行う。
【００３９】
２）本発明で形質転換させるために導入される遺伝子の種類は特定のものに限定されることはない。そのような例としては、次のものが挙げられる。
（１）花色改良遺伝子
（２）耐虫性遺伝子
（３）耐病性遺伝子
（４）耐寒性遺伝子
（５）耐暑性遺伝子
（６）耐塩性遺伝子
（７）環境浄化遺伝子
（８）形態形成関連遺伝子
（９）エチレン生成抑制遺伝子
【００４０】
（５）工程（ｅ）（外来遺伝子を導入された組織片を培養して形質転換キク科植物を再生する工程）
上記のようにしてアグロバクテリウムに感染した組織片を、次のようにして調製した培地、すなわち、例えばＭＳ培地に、ショ糖１０ｇ／ｌ〜６０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｇ／ｌ〜４０ｇ／ｌ、植物ホルモンとして、オーキシン類を０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌとサイトカイニン類を０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、寒天６ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、好ましくは７ｇ／ｌ〜８ｇ／ｌ、選抜薬剤としてジェネテシンを５ｍｇ／ｌ〜５０ｍｇ／ｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜３０ｍｇ／ｌ、除菌薬剤としてカルベニシリンを５０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００ｍｇ／ｌ〜３００ｍｇ／ｌをそれぞれ加えた固体培地、に置床する。
【００４１】
これを、１２℃〜２２℃、好ましくは１５℃〜２０℃の明所下に培養すると、約３か月後に組織片から不定芽が形成される。
【００４２】
形成された不定芽を、メスを用いて組織片から切除して分離・採取し、これをＭＳ培地に、ショ糖１０ｇ／ｌ〜６０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｇ／ｌ〜４０ｇ／ｌ、カルベニシリンを５０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００ｍｇ／ｌ〜３００ｍｇ／ｌ、オーキシン類を０．０１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｌ〜１ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とし、寒天６ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、好ましくは７ｇ／ｌ〜８ｇ／ｌを加えた固体培地、に置床した。これを１５℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２５℃の明所下に培養すると、培養約３０日後に発根したキク形質転換植物体が得られる。
【００４３】
ここに明所条件は、工程（ａ）と同様でよく、照度が５００〜１０，０００ルクス、好ましくは５００〜２，０００ルクスであり、光照射時間は１日５〜２４時間、好ましくは１４〜１８時間である。
【００４４】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの例示のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
（１）工程（ａ）キク科植物の組織片の前培養
キク属（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）のスプレイギク品種「アイーダ」の花茎を、有効塩素濃度が０．５％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に２０分間浸漬し、殺菌処理した後、滅菌水で３回洗浄した。滅菌処理した花茎をメスで７ｍｍ長に切断して小片とし、試験組織片として用いた。
【００４６】
１試験区あたり１００本の組織片を、ＭＳ培地に、ショ糖３０ｇ／ｌ、植物ホルモンとして、ＮＡＡを２．０ｍｇ／ｌとＢＡを１ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐＨ５．８とし、寒天８ｇ／ｌを加えた固体培地に置床した。
【００４７】
この培養に用いられる容器は、滅菌したフタ付きのプラスチック製シャーレ（直径９ｃｍ×高さ１．５ｃｍ）であり、シャーレ１枚あたり組織片１０本を置床している。これを、２０℃で明所（照度５００ルクス、光照射１６時間／日）にて４日間培養することにより組織片の切断面からカルスが形成された。
【００４８】
（２）工程（ｂ）分散工程
１）ウイスカの調製
市販のチタン酸カリウム製ウイスカ（チタン工業株式会社の製品「ＬＳ２０」）５ｍｇを１．５ｍｌ容のチューブ（内径１０ｍｍ、長さ３８ｍｍ）（エッペンドルフ社製）に入れ、エタノールを０．５ｍｌ加えて、一晩放置後、エタノールを完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカを得た。
【００４９】
このウイスカの入ったチューブに減菌水１ｍｌを入れ、よく撹拌した後、これを３０００ｒｐｍ／分、５分間遠心分離し、上清の水を捨てウイスカを洗浄した。この洗浄操作を３回行った後、同チューブ内に、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／ｌを加えたＭＳ液体培地（ｐＨ５．８）を０．５ｍｌ加えてウイスカ懸濁液を得た。
【００５０】
２）組織片とウイスカの混合
上記１）で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブに、上記（１）において前培養された花茎組織片を１００個入れて撹拌し、組織片とウイスカの混合物を得た。
【００５１】
３）遠心処理
次に、この混合物の入ったチューブを１８，０００ｘｇで５分間遠心分離し、遠心後、再度振り混ぜた。この遠心分離と再度振り混ぜる操作を３回行った。
【００５２】
（３）工程（ｃ）超音波処理
このようにして得た混合物の入ったチューブを超音波発生機（浴槽型：媒体として水を使用）の浴槽にチューブが十分浸かるように設置し、周波数４０ｋＨｚ、強度０．２５Ｗ／ｃｍ2で１分間超音波を照射し、照射後、３０分間、４℃で放置した。
【００５３】
このように超音波処理した混合物を４０μｍ孔のナイロンメッシュで濾過し、さらに、ＭＳ液体培地５ｍｌを加えて洗浄する操作を３回くりかえし、ウイスカにより損傷した花茎組織片を得た。
【００５４】
（４）工程（ｄ）アグロバクテリウムの感染
１）アグロバクテリウムの調製
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を保持する、公知の植物細胞形質転換用ベクターｐＩＧ１２１−Ｈｍ（「プラント・アンド・セル・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ
ａｎｄ  Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、１９９０年、第３１巻、ｐ．８０５−８１３）をアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＢＡ４４０４）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に公知の凍結融解法（例えば、「植物細胞工学」、１９９２年、第４巻、第３号、ｐ．１９３−２０３）により移行させた。
【００５５】
２）キクへの組換えベクターの導入
上記１）に記載のベクターｐＩＧ１２１−Ｈｍを保持したアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＢＡ４４０４）をＬＢ培地で１昼夜培養した培養液に上記に記載の方法により損傷させられたキク花茎組織片１００個を３０分間浸漬処理した。浸漬処理後、共存培養培地（ＭＳ培地にショ糖３０ｇ／ｌ、植物ホルモンとして、ＮＡＡを２．０ｍｇ／ｌとＢＡを１ｍｇ／ｌ、カサミノ酸を１ｇ／ｌ、アセトシリンゴン２０ｍｇ／ｌをそれぞれ加えｐＨ５．２とし、寒天８ｇ／ｌを加えた固体培地）に置床した。２０℃の温度条件下で暗所にて３日間共存培養を行った。
【００５６】
（５）工程（ｅ）形質転換植物の再生
共存培養後の花茎組織片１００個を、５０ｍｌ容の無菌の遠心管（内径２７ｍｍ、長さ１１５ｍｍ）に移し入れ、洗浄液（ＭＳ液体培地にカルベニシリン３００ｍｇ／ｌを加えたもの）３０ｍｌを加えて洗浄した。さらにこの操作を２回繰り返した後、無菌のろ紙を用いて余分な水分を取り除いた。
【００５７】
洗浄された花茎組織片は、選抜培地（ＭＳ培地にショ糖３０ｇ／ｌ、植物ホルモンとして、ＮＡＡを２．０ｍｇ／ｌとＢＡを１ｍｇ／ｌ、ジェネテシンを２０ｍｇ／ｌ、カルベニシリン３００ｍｇ／ｌをそれぞれ加えｐＨ５．８とし、寒天８ｇ／ｌを加えた固体培地）で培養を行い、２週間おきに５回にわたり新しい選抜培地に移植した。
【００５８】
この培養に用いられる容器は、滅菌したフタ付きのプラスチック製シャーレ（直径９ｃｍ×高さ１．５ｃｍ）であり、シャーレ１枚あたり組織片１０個を置床した。これを、２０℃で明所（照度５００ルクス、光照射１６時間／日）にて約３か月間培養することにより組織片から不定芽が形成された。形成された不定芽を、メスを用いて組織片から切除して分離・採取し、これをＭＳ培地にショ糖３０ｇ／ｌ、カルベニシリン３００ｍｇ／ｌ、植物ホルモンとして、ＩＡＡを０．２ｍｇ／ｌを加え、ｐＨ５．８とし、寒天８ｇ／ｌを加えた固体培地に置床した。これを、２５℃の明所（照度３０００ルクス、光照射１６時間／日）で培養した。培養３０日後に発根したキク形質転換植物体が得られた。
【００５９】
（６）形質転換体の確認（ＧＵＳ活性の測定）
上記の工程（ａ）〜（ｅ）を経て形成された形質転換植物体数を調査した。その調査のため、キク形質転換植物体におけるＧＵＳ遺伝子の発現の確認を、公知の染色方法（下記＊参照）に準じて行った。
【００６０】
すなわち、形質転換キク植物体の葉（５ｍｍ角）を採取し、１５ｍｌ容の遠心管（内径１５ｍｍ、長さ）120ｍｍ）に入れ、染色用バッファー（２ｍＭ  Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β―D−グルクロン酸）、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４，ｐＨ７．０）を２ｍｌ添加して浸漬した。３７℃で一晩保温した後、染色バッファーを取り除き、７０％エタノールを１０ｍｌずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。その結果、表１に示すとおり、いずれの植物体の葉においても青色の発色が認められ、ＧＵＳ遺伝子が導入され、形質転換体であることが証明された。
【００６１】
このように、アグロバクテリウムに感染する前にウイスカにより組織片を損傷させることにより形質転換率が高まり、本発明による形質転換方法が、効率的なキク組織片への遺伝子導入方法であることが示された。
【００６２】
【表１】
2005124487.tif 000002
【００６３】
（注１）組織片１００個に対する形成された植物体数の割合を形質転換率（％）として算定した。
（注２）比較例１は、ウイスカ処理をしない点を除けば、実施例１と同様に実施した。
＊「Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」  、ｐ．３２４−３２７、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＬＴＤ
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の方法を用いれば、例えば、花色改変遺伝子、耐虫性遺伝子などの有用遺伝子を導入した形質転換キク植物体が効率的に作出でき、種々のキク科植物に導入遺伝子の種類により新規な形質転換キク科植物を作製することができる。