(57)【要約】【課題】  器具の機能障害の原因を診断するコントロール製品の提供。【解決手段】  ａ．少なくとも１種の白血球下位集団類似体、ここで前記白血球下位集団類似体は血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように処理された赤血球から誘導されており、そして前記類似体は器具の動作において使用される試薬に対して応答性に止まる、および  ｂ．プラスチックビーズ、を含んでなる血液学的コントロール製品。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．器具の中に血液学的コントロール製品を入れる、ここで前記コントロール製品は少なくとも１種の白血球類似体を含有し、前記白血球類自体は血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように処理された血球から誘導されており、そして前記類似体は器具の動作において使用される試薬に対して応答性に止まる、そして
ｂ．器具における前記コントロール製品の空間的位置を分析する、ここで前記分析は、
（１）Ｄ．Ｃ．（直流電流）体積、
（２）ＲＦ（高周波数の）大きさ、
（３）不透明度、および
（４）光散乱、
からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択される、
ｃ．前記器具が前記分析からの機能障害を有するかどうかを決定する、そして
ｄ．器具の機能障害の原因を決定するために前記分析の結果を報告する、
ことを含んでなる血液学的コントロール製品を使用する方法。
【請求項２】
前記コントロール製品が少なくとも１種の好中球類似体を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物理的性質の測定がＤＣ平均、ＤＣ標準偏差、ＲＬＳ（回転光散乱）平均、ＲＬＳ標準偏差、不透明度の平均、不透明度の標準偏差、および計数比、山対谷の比、白色時間および日時およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コントロール製品が溶解可能な赤血球の添加をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
血液学的試料の中に存在する未固定の赤血球を溶解するために有効な量で溶解試薬を添加することをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記器具の機能障害が器具のゲイン、デブリおよび雑音、器具のポンプ体積および器具のレーザーアラインメントおよびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ポンプ体積が溶解試薬のポンプ体積を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポンプ体積がクエンチ試薬の体積を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記器具のレーザーアラインメントがＸ軸のアラインメントを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記コントロール製品が少なくとも３つの異なる白血球類似体を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記コントロール製品が少なくとも４つの異なる白血球類似体を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液学的コントロール製品が血漿物質の水溶液をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記血漿物質がコレステロール、コレステロールエステル、リポタンパク質コレステロール、リポタンパク質コレステロールエステル、リン脂質と結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロールエステル、リン脂質と結合したリポタンパク質コレステロール、アルブミンと結合したリポタンパク質コレステロールおよびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血液学的コントロール製品が少なくとも好中球類似体およびリンパ球類似体を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記血液学的コントロール製品がラテックス粒子とさらに結合している、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
ａ．器具の中に血液学的コントロール製品を入れる、ここで前記コントロール製品は少なくとも１種の白血球類似体を含有し、前記白血球類似体は血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように処理された血球から誘導されており、前記類似体は器具の動作に対して応答性に止まり、そしてここで前記コントロール製品はヒト白血球の少なくとも１つの物理的性質をシミュレートし、前記性質は、
（１）Ｄ．Ｃ．電流により測定された体積、
（２）高い周波数（ＲＦ）の大きさ、
（３）不透明度、および
（４）光散乱、
からなる群から選択される、
ｂ．前記コントロール製品の前記物理的性質を測定する、そして
ｃ．器具の機能障害の原因を診断するために器具における前記測定の結果を報告する、ことを含んでなる、少なくとも１つの白血球類似体の集団を含有する血液学的コントロール製品を使用する方法。
【請求項１７】
前記コントロール製品が少なくとも１種の好中球類似体を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記物理的性質の測定がＤＣ平均、ＤＣ標準偏差、ＲＬＳ平均、ＲＬＳ標準偏差、不透明度の平均、不透明度の標準偏差、および計数比、山対谷の比、白色時間および日時およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記コントロール製品が溶解可能な赤血球の添加をさらに含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
血液学的試料の中に存在する未固定の赤血球を溶解するために有効な量で溶解試薬を添加することをさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記器具の機能障害が器具のゲイン、デブリおよび雑音、器具のポンプ体積および器具のレーザーアラインメントおよびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ポンプ体積が溶解試薬のポンプ体積を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポンプ体積がクエンチ試薬の体積を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記器具のレーザーアラインメントがＸ軸のアラインメントを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記コントロール製品が少なくとも３つの異なる白血球類似体を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記コントロール製品が少なくとも４つの異なる白血球類似体を含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記血液学的コントロール製品が血漿物質の水溶液をさらに含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記血漿物質がコレステロール、コレステロールエステル、リポタンパク質コレステロール、リポタンパク質コレステロールエステル、リン脂質と結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロールエステル、リン脂質と結合したリポタンパク質コレステロール、アルブミンと結合したリポタンパク質コレステロールおよびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記血漿物質の水溶液が血球体積および光散乱の参照点に関して前記白血球類似体の各々の区別を可能とするために有効量で存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記血液学的コントロール製品がラテックス粒子とさらに結合している、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
前記血液学的コントロール製品が少なくとも好中球類似体およびリンパ球類似体を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
ａ．ある量の患者の血液試料の中の白血球の下位集団の空間的位置を分析して、測定したパラメーターの統計学的に有意な値を獲得する、ここで前記分析は、
（１）Ｄ．Ｃ．体積、
（２）ＲＦ大きさ、
（３）不透明度、および
（４）光散乱、
からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択される、
ｂ．器具の機能障害の原因を診断するために器具における前記測定の結果を報告する、ことを含んでなる品質をコントロールする方法。
【請求項３３】
前記機能障害が溶解のデブリおよび雑音、器具の試薬のポンプ体積の設定、器具のレーザーアラインメント、器具のゲインの設定、流速の不一致およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
患者の血液試料が溶解試薬に暴露されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
測定されたパラメーターが山対谷の比、計数比、白色時間、日時、ＤＣ平均、ＤＣ標準偏差、不透明度の平均、不透明度の標準偏差、ＲＬＳ平均、ＲＬＳ標準偏差およびそれらの組み合わせから成る群より選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも２つの測定されたパラメーターを使用し、そして測定されたパラメーターの１つが白血球集団のＤＣ平均である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポンプ体積が溶解試薬のポンプ体積を含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポンプ体積がクエンチ試薬の体積を含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記器具のレーザーアラインメントがＸ軸のアラインメントを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
ａ．少なくとも１種の白血球類似体、ここで前記白血球類似体は血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように処理された血球から誘導されており、そして前記類似体は器具の動作において使用される試薬に対して応答性に止まる、および
ｂ．ラテックス粒子、
を含んでなる血液学的コントロール製品。
【請求項４１】
前記白血球類似体が少なくとも１種の好中球類似体を含んでなる、請求項４０に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項４２】
前記コントロール製品が溶解可能な赤血球の添加をさらに含んでなる、請求項４０に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項４３】
前記コントロール製品が少なくとも３つの異なる白血球類似体をさらに含んでなる、請求項４２に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項４４】
前記コントロール製品が少なくとも４つの異なる白血球類似体をさらに含んでなる、請求項４３に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項４５】
前記コントロール製品が血漿物質の水溶液をさらに含んでなる、請求項４４に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項４６】
前記血漿物質がコレステロール、コレステロールエステル、リポタンパク質コレステロール、リポタンパク質コレステロールエステル、リン脂質と結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロールエステル、リン脂質と結合したリポタンパク質コレステロール、アルブミンと結合したリポタンパク質コレステロールおよびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項４５に記載の血液学的コントロール製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液学的器具の系の品質コントロール能力を増加する新規な方法に関する。この方法は、血液の細胞集団を区別するために（１）Ｄ．Ｃ．電流により測定される体積、（２）高い周波数（ＲＦ）の大きさ、（３）不透明度、および（４）光散乱を測定する器具についての特定の実用性を有する。この方法は、（１）Ｄ．Ｃ．電流により測定される体積および（２）高い周波数（ＲＦ）の大きさを測定する器具についての追加の実用性を見出した。この方法は、また、Ｄ．Ｃ．電流のみにより細胞体積を測定する器具についての実用性を見出した。
【背景技術】
【０００２】
品質コントロールは長い間臨床的血液学における必要かつ日常的手法であった。白血球の下位集団を区別することを包含する、赤血球および白血球の計数における正確度は、一部分、適切なコントロール製品およびコントロール製品を使用する方法に依存する。現在入手可能な粒子計数のための多数の型の装置では、器具の機能障害の可能性が常に存在するので、コントロール製品を使用する品質コントロールが必要である。自動的粒子計数装置について品質コントロールプログラムを維持する伝統的方法は、全血標準として新鮮なヒト血液を準備することから成っていた。しかしながら、この新鮮な血液は１日間だけ使用可能であり、したがって、耐久性ある血液製品が開発された。
【０００３】
対照血球類似体を含有し、血球計数装置の正確度および精度を監視する血液学コントロール製品は重要である。このような血球計数装置を使用するとき、白血球の区別および他のパラメーターの正確度を維持するために血球類似体を使用する新規な方法が要求されていることが認識される。
【０００４】
コントロール製品は、新鮮な全血のそれにできるだけ密接に近似すべきである。ブタクサの花粉、ポリスチレン、ラテックス、種々の有機物質および固定されたヒト赤血球を使用して、適当な大きさの粒子の安定な懸濁液を調製することが試みられてきた。これらの懸濁液のいずれも、白血球の少なくとも４つの下位集団の白血球の分化についてのコントロール製品として使用するために適当であることが証明されなかった。
【０００５】
品質コントロールを維持するために使用される物質（以後、血液学的コントロール製品またはコントロール製品と呼ぶ）は、また、特定の条件下に、血液学的器具を較正するために使用できる。本発明の目的に対して、器具が適切に機能しているかどうかを決定するために使用されるコントロール製品は、液状媒質の中に懸濁した１種または２種以上の類似体を含有し、前記類似体は、分析するとき、器具が分析できる血液の少なくとも１つの物理的性質または生物学的性質をシミュレートする。本明細書において使用するとき、類似体は標的集団の少なくとも１つの物理的性質または生物学的性質をシミュレートする粒子として定義される。それ自体として、ある自動的機械は、コントロール製品が他の機械による分析に対して感受性の追加のパラメーター成分を有するにかかわらず、コントロール製品のある成分のみを分析することができる。従来、器具の動作の品質コントロールを提供するためにコントロール製品を使用する方法は、まだ開発されてきていない。コントロール製品は、典型的には、白血球の少なくとも４つのサブグループ、すなわち、リンパ球、単球、好中球および好酸球、についての検査を提供する。コントロール製品の先行技術の使用は、器具が類似体の適切な計数および百分率を提供するかどうかを検査することに集中されてきている。しかしながら、本発明の方法は器具の動作を評価および診断する追加の情報を提供する。
【０００６】
コントロール製品は、比較基準に基づいて、問題の決定に関して新鮮な血液の被検試料がなにを構成したかを正確に示さなくてはならないことが明らかである。さらに、赤血球のような血液成分は、血液ドナーから取り出した後、ゆっくり溶血しかつ数時間以内に大きさおよび形状を変化することがあるので、コントロール製品は新鮮な血液をシミュレートすることが、いかに重要であるかが明らかである。同様に、安定化されていない白血球は変質的変化に悩まされる。
【０００７】
一般に、類似体を製造する先行技術の方法は、固定前にもとの体積を維持するか、または減少した赤血球を使用することに集中された。固定前に浸透圧的環境を操作することによって、細胞を収縮または膨張させることは制限を有した。従来、約３０％〜５０％より大きく非ヒト赤血球を収縮または膨潤することは、過度の細胞の会合または溶解を引き起こした。
【０００８】
米国特許第３，８７３，４６７号（Ｈｕｎｔ）は、ヒト血液中の血漿と置換する非タンパク質の水性懸濁液中の、洗浄し、安定化されたヒト赤血球の懸濁液を含んでなる血液学的対照コントロールを教示している。対照コントロールにおける安定性は、細胞の平均細胞体積を実質的に変化させないで、細胞に球形を取らせる水性懸濁流体または物質の中に細胞を含め、ならびに経時的分解の通常の傾向に対する耐性を細胞付与することによって、細胞をコンディショニングすることによって達成される。さらに、水性懸濁流体は生物学的活性を阻害する環境を細胞のために生成する。好ましい態様において、実質的に増加した平均細胞体積を有するように処理され、固定されたヒト赤血球の少量を対照コントロールの中に含める。固定された細胞は細胞体積の変化に対して耐性であり、かつ安定化された細胞を溶解する溶解試薬の作用下の溶解に対して耐性である。対照コントロール中の固定された赤血球は、ヒト血液中の白血球集団を代用する。
【０００９】
米国特許第４，７０４，３６４号（Ｃａｒｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）において、コールター・カウンター（ＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲTM）Ｓ−プラス（Ｐｌｕｓ）型分析器により代表される電子粒子カウンターについての限界および追加の操作的性能についてのコントロールが開示されている。しかしながら、コールター（ＣＯＵＬＴＥＲTM）ＶＣＳアナライザー電子光学的粒子のカウンターのための全血球のコントロール製品を使用する新規な方法が要求されている。ＶＣＳ分析器は白血球の少なくとも４つの集団の区別を可能とする。
【００１０】
大きさの範囲、体積の分布、光散乱の範囲、電気的不透明度および導電性の感度に基づく血液中の白血球の少なくとも４つの集団を他の細胞から区別する、ヒト白血球の自動化弁別的計数のシステムは、コントロール製品が正常のヒト血液中のそれぞれの細胞の前記範囲、分布および感度を正確にシミュレートすることを必要とする。
【００１１】
ヒトのリンパ球、単球、好中球、好塩基球および好酸球は、特定の大きさの分布範囲および光学的特性を有する。白血球の各下位集団についての大きさの上限および下限の双方は、対照コントロール製品において表されるべきである。さらに、コントロール製品における各白血球下位集団の平均細胞体積は、ヒト血液のそれに近似すべきである。そのうえ、コントロール製品において使用される液状懸濁媒質は細胞の有意な収縮または膨潤を引き起こさないことが必要である。なおさらに、コントロール製品の老化は体積分布のヒストグラムの特性または他のパラメーターを劣化させてはならない。多パラメーターの器具のためのコントロール製品における白血球類似体についてそれ以上の要件は、計数しかつ区別するために、全血コントロール製品における類似体細胞が溶解試薬により完全に溶解してはならないことである。
【００１２】
種々の媒質が血球類似体と組み合わせて使用されてきている。米国特許第４，２９９，７２６号において、多目的の希釈剤および媒質が開示されている。希釈剤は赤血球をプレコンディショニングするために使用され、そしてラクトース、アジ化ナトリウムおよび非イオン界面活性剤から本質的に成り、pHが調節されそして浸透圧濃度が調節されている。媒質は全血コントロール製品の担体のために使用され、そしてラクトース、殺真菌剤および抗生物質を含む。媒質は、また、赤血球の膜を変更する追加の成分を含み、胆汁塩およびコール酸誘導体、抗ヒスタミン性質を有するフェノチアジン化合物およびそれらの塩、および局所麻酔性質を有する４−アミノ−安息香酸エステル誘導体およびそれらの塩を包含する。
【００１３】
先行技術の媒質の１つの欠点は、赤血球および固定ヒト白血球または白血球類似体と組み合わせて使用するとき、コントロール製品が白血球の少なくとも４つの集団を区別する器具において白血球をシミュレートしないことである。測定しようとする赤血球および白血球の特定のパラメーターは、白血球の対照コントロール製品に適当な媒質の必要な特性のいくつかを指令する。赤血球の値を知ることが望ましい。いったんこの測定が認識されかつ赤血球が計数されると、パッケージされた細胞体積またはヘマトクリットを計算することができる。したがって、コントロール製品の懸濁媒質は、平均細胞体積（ＭＣＶ）を測定することができるように、試料中の赤血球の体積を平衡化しかつ安定化することができるべきである。
【００１４】
また、コントロール製品は、ヒト血小板の大きさおよび分布の大きさに対応する大きさの下限における妨害を多分を示す粒状物質を含有しないようにすべきである。付随して、懸濁媒質は、コントロール製品のパッケージ後における微生物の増殖を防止するために、静菌剤を必要に応じて含む。赤血球および白血球は通常異なる大きさを有するが、それらの大きさはオーバーラップする傾向があるか、または少なくともある健康状態においてオーバーラップすることがある。そのうえ、これらの２つの型の血球の不透明度は、また、オーバーラップすることがある。赤血球およびリンパ様白血球は、不都合なことには、細胞大きさがかなりオーバーラップし、そして大きさの区別単独により一方を他方の存在下に計数することは実際的ではない。伝統的実施において、強い溶解試薬が使用され、このような溶解試薬は赤血球を問質溶解し、赤血球を非常に小さい粒子にするか、または膜を可溶化して、赤血球が計数されないようにし、そして細胞質の、全部でないにしても、大部分を白血球から除去し、計数のためにそれらの溶解耐性核のみを残す。もとの白血球の細胞体積は著しく影響を受け、最小に減少するので、この古い形の血球大きさ分析により、単一のみの白血球集団が識別可能である。
【００１５】
米国特許第３，７４１，８７５号（Ａｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）は、弁別的白血球計数法を記載している。モノアルデヒド、例えば、ホルムアルデヒドである細胞学的固定剤を血液試料に添加する。固定ステップ後に溶血剤を添加して、赤血球がヘモグロビン含量を溶液の中に放出するようにする。特定の細胞化学的基質、発色性沈澱カップリング試薬、およびpH緩衝剤の添加は、固定化酵素を含有する特定の型の細胞において不溶性色素を沈澱させる。次いで、染色された血球を含有する溶液を測光カウンターに通過させる。特定の種類の細胞の中に含有される異なる酵素について異なる特定の基質を使用すると、異なる種類の細胞の絶対的および相対的計数値が得られる。細胞学的固定溶液はモノアルデヒドのみを使用した。ジアルデヒドは架橋しそして細胞外沈澱を生成するので、不適当であると述べられている。
【００１６】
米国特許第４，４８５，１７５号（Ｌｅｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）は、溶解剤として第四アンモニウム塩を使用しかつコールター・カウンターＳ−プラス型自動化血液カウンター（この器具は直流電界励起のみを使用する）を使用して、白血球のリンパ球、単核、および顆粒球の集団の３体積弁別的決定の方法および試薬系に関する。
【００１７】
米国特許第４，７５１，１７９号（Ｌｅｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）は、溶解試薬および固定剤として急速活性架橋剤、例えば、グルタルアルデヒドの中にサポニンを含む試薬系を記載しており、前記系は再現的に全血影響を与えて赤血球を支質溶解させかつ白血球を変性して、流れ分析器具による検出および分類のための４つの明確なクラスターを明らかにするデータを発生する。クラスターは血液の中に見出される４つの主要な白血球の型、すなわち、リンパ球、単球、好中球および好酸球を表し、こうして白血球の弁別的分析法を提供する。Ｌｅｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．によれば、Ｄ．Ｃ．体積、または種々の角度における光散乱を使用する白血球の流れ分析の従来の方法は、リンパ球、顆粒球および単球に対応する、白血球の２つのみのクラスターを示した。白血球の分類のためにＬｅｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．が使用したパラメーターは、Ｄ．Ｃ．（コールター〔Ｃｏｕｌｔｅｒ〕）体積、高い周波数（ＲＦ）の大きさ、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）不透明度（ＲＦ大きさ／ＤＣ体積）、種々の角度範囲における光散乱、および種々の照明波長における蛍光の２またはそれ以上の組み合わせを包含する。
【００１８】
コールター原理を使用する電子カウンターは、最初に米国特許第２，６５６，５０８号に記載され、粒子計数の真の反映を表す。コールター原理によれば、顕微鏡的大きさの粒子が電解質の液体の中に懸濁され、粒子の寸法に近づく程度の小さい寸法の電界に通過させるとき、電界の電気インピーダンスの瞬間的変化が存在するであろう。電界が直流（ＤＣ）または低い周波数の電流により励起される場合、電気的変化は粒子の値に密接に比例する。商業的装置において、変化はいくつかの適当な意味により検出され、そしてカウンターおよび分析器を操作するために使用される。このような装置に関連する分析器は、粒子の体積に基づいて集団に粒子を分類しかつ選別する。
【００１９】
コールター原理の発明は米国特許第３，５０２，９７４号（Ｃｏｕｌｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）において実質的に拡張され、ここにおいてＤＣ電界の励起に加えてラジオ周波数（ＲＦ）の電流を使用して、研究する粒子に関するＤＣ体積の情報ばかりでなく、かつまた粒子を構築する物質の組成および特質による情報を得ている。この特許は、同一の大きさであるが、物質が異なる粒子を区別することができる装置を開示している。低い周波数または直流（ＤＣ）およびラジオ周波数（ＲＦ）の電流の励起の双方により粒子感知電界を発生させることによって、電界を通過する単一の粒子の通過から２またはそれ以上の出力信号を誘導することができる。これは下記の事実のためである。すなわち、粒子、例えば、細胞は低い周波数または直流の電界に関してほとんど常に絶縁されているが、粒子は取り囲む電解質と異なるようにラジオ周波数の電流を運搬または妨害することができる。これは、均質な粒子の場合の誘電率の差のためであるか、または極めて薄い膜の中に囲んで、電解質と異なる導電性を有する内容物を有する血球の場合において、嚢様構造のためである。したがって、すべてのＤＣ電流は血球の回りに行くが、ＲＦ電流のあるものはそれを通過する。ＲＦ電流が粒子を通過する容易さは、光の透過と同様に、「電気的透明度」または単に「透明度」と呼ばれる測度であるが、これに対してＲＦ電流を妨害する粒子の能力は「不透明度」と呼ばれる。後の刊行物において、「不透明度」はＤＣインピーダンスで割ったＲＦインピーダンスとして定義される。
【００２０】
粒子の相対的電気的不透明度は、粒子含量、それゆえ分類の目的のための粒子の型、の識別の特徴となる。粒子の異なる型の各々が異なる不透明度を有する程度に、粒子の間の差が検出可能である。しかしながら、有意に異なる粒子は実質的に同一の透明度を有することができ、そしてこの方法において、このような粒子は効果的に分類することができない。米国特許第３，８３６，８４９号（Ｃｏｕｌｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）において、検出可能な結果が得られるように、粒子を処理することによって、粒子の型の透明度を選択的に変化させることができることが教示されている。
【００２１】
コールター・カウンターＳ−プラス型自動化血球カウンターは、全血の試料を等張希釈剤中で希釈し、溶解剤を添加し、その後短時間に計数を開始するように設計される。したがって、希釈剤−溶解剤系は、溶解期間の間に赤血球の完全な問質溶解を実施するために十分に急速な、赤血球溶解反応速度を提供しなくてはならない。さらに、白血球体積の変化はデータ収集ステップの間に最小でなくてはならず、そして理想的には数分間安定であるべきである。
【００２２】
コールターＶＣＳ型は半自動化分析器具であり、ＤＣ（コールター）体積、コールター透明度および種々の角度範囲における光散乱を使用することによって、血液を分析する。コールターＶＣＳ型は、合計の白血球計数において５つの部分の区別を得るために試薬系を使用し、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球の集団の定量的分析を提供する。試薬系はクエンチを含み、これは弱い「酸性」の溶解後に添加され、それは白血球への溶解作用を大きく減少するために操作される。クエンチの短時間後、器具は残留する白血球の体積、透明度および光散乱の特性を測定し始める。ＶＣＳ型は、溶解期間の間に赤血球の完全な問質溶解を行うために十分に急速な赤血球の溶解反応速度を提供するが、白血球の体積、コールター透明度および光散乱の性質に影響を与えてはならない。本発明において使用できるコールター・カウンター器具は、ＶＣＳ，ＳＴＫＳおよびＭＡＸＭである。しかしながら、Ｓ型およびＳ−プラス型は、全血コントロール製品の中に存在する白血球の下位集団のすべてを区別することができないが、むしろ白血球類似体の合計の計数を提供することができる。さらに、Ｓ−プラス型のあるものは２つの白血球の集団を区別することができる。
【００２３】
新規な電気光学的粒子計数装置は、器具が製造業者の規格内で適切に機能しかつ器具の機能障害の原因を診断しているかどうかを決定する新規な方法の開発を必要とする。この規格はコールター型の粒子カウンターとともに有用である血液学的コントロール製品を使用する方法に主として向けられるが、本明細書に開示する懸濁媒質、類似体およびコントロール製品、および本明細書に記載するそれらの使用法は、一般に、粒子カウンターとともに広い用途を見出すことを理解すべきである。したがって、用語「電気光学的粒子カウンター」は、コールター・カウンター器具に加えて、粒子の大きさ、質量、体積、透明度または光散乱を示す信号に電子的に応答する電子識別回路（「限界」）により種々の大きさの粒子を識別する任意の他の型の粒子カウンターを包含することを理解すべきである。コールターおよびコールター・カウンターは、コールター・コーポレーション（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の登録商標である。
【発明の開示】
【００２４】
本発明は、血液学的コントロール製品を使用する方法に関連し、前記方法は、器具の中に血液学的コントロール製品を入れることを含んでなり、前記コントロール製品は少なくとも１種の白血球類似体を含有し、前記白血球類似体は血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように処理された血球から誘導されており、そして前記類似体は器具の動作において使用される試薬に対して応答性に止まる。新規なコントロールパラメーターを使用して、コントロール製品の空間的位置を分析し、前記分析はＤ．Ｃ．体積、ＲＦ大きさ、不透明度、および光散乱からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択される。より好ましくは、少なくとも２つの異なる物理的性質を測定する。次いで、器具の機能障害の原因を診断するために、このような測定の結果を報告する。
【００２５】
さらに、本発明は、器具が製造業者の分析規格内で機能しているかどうかをするために、少なくとも１つの白血球類似体の集団を含有するコントロール製品を使用する方法に関する。この方法は、器具の中に血液学的コントロール製品を入れることを含んでなり、前記コントロール製品は少なくとも１種の白血球類似体を含有し、前記白血球類似体は血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように処理された血球から誘導されており、そして類似体は器具の動作に対して応答性に止まる。コントロール製品はヒト白血球の少なくとも１つの物理的性質をシミュレートし、前記性質はＤ．Ｃ．電流により測定された体積、高い周波数（ＲＦ）の大きさ、不透明度、および光散乱からなる群から選択される。より好ましくは、コントロール製品はヒト白血球の少なくとも２つの物理的性質をシミュレートする。次いで、コントロール製品の物理的性質から少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの物理的性質を測定する。器具の機能障害の原因を診断するために、このような測定の結果を報告する。
【００２６】
なおさらに、本発明は、ある量の患者の血液試料の中の白血球の下位集団の空間的位置を分析して、測定したパラメーターの統計学的に有意な値を獲得し、前記分析は、Ｄ．Ｃ．体積、ＲＦ大きさ、不透明度、および光散乱からなる群の少なくとも１つのメンバーから選択され、そして器具の機能障害の原因を診断するために器具における前記測定の結果を報告する、ことを含んでなる方法に関する。
【００２７】
そのうえ、血液学的試料を血漿物質の水溶液を含んでなる細胞懸濁液と組み合わせ、そして生ずる混合物を器具において分析して機能障害の原因を診断することに関し、前記分析はＤ．Ｃ．体積、ＲＦ大きさ、透明度、および光散乱からなる群の少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つのメンバーから選択される。
発明の詳細な説明
本発明を理解しかつ説明する目的で、下記の用語を定義する。
【００２８】
ビーズ：ビーズはフローサイトメトリー分析のための安定かつ不活性の標準として使用することができる粒子（通常、ポリスチレンのラテックスまたはある形態から作られた）である。ビーズはＦＳＣ（フローサイトメトリーのデータの貯蔵のための標準的フォーマット）設定を標準化するために、異なる狭い規定された大きさで得ることができる。ビーズは、また、蛍光検出の設定を標準化するために、種々の蛍光色素に接合させて得ることができる。
【００２９】
チャンネル：チャンネルは、フローサイトメーターが粒子が放射する信号の強度を特性決定するとき使用する用語である。大部分のサイトメーターは光信号を１０２４チャンネルについて２５６に分割する。高いチャンネル番号を有する信号は、低いチャンネル番号より輝いている。しかしながら、１つのチャンネル番号により定められる信号と他のチャンネル番号により定められる信号との間の定量的関係は、所定のプロトコールの増幅器および光検出器の電圧特性に依存するであろう。
【００３０】
同軸流れ：より幅広い流れ内の液体の狭いコアの流れ。この型の流れはフローサイトメトリーにおいて重要である。なぜなら、それは比較的広いノズルを通して流れる粒子を空間的に緊密に拘束し、粒子が順次に光ビームを通過するとき、正確かつ安定な照明を可能とするからである。
【００３１】
補償：補償は、異なる蛍光色素の蛍光スペクトルの間のオーバーラップについて補正するフローサイトメーターの能力である。補償なしでは、所定の蛍光色素からの蛍光は、異なる蛍光色素の検出するために割り当てる光検出器上に、ある程度記録することがある。
【００３２】
コールター体積：粒子が狭いノズルを通して流れるとき、粒子が電解質を置換するとき起こる電気抵抗の増加は、粒子のコールター体積である。電気抵抗のこの増加は粒子の体積に粗く関係づけられるだけである。
【００３３】
コア：コアはシース流れの中央の中に注入され、層流の流体力学的考察によりそこに維持される流内流である。コアはフローサイトメーターにおいて分析すべき試料処置を含有する。
【００３４】
漏話：漏話は「誤った」光検出器からの信号であり、これは１つの蛍光色素が放射した蛍光が異なる蛍光色素からの蛍光に対して通常特異的である光検出器上のフィルターを通して得られる、波長の多少の光を含有するために生ずる。「補償」を参照のこと。
【００３５】
ＣＶ：変動係数は、１連の値の標準偏差をそれらの値の平均で割った値として定義される。それはヒストグラムのピークを記載するためにフローサイトメトリーにおいて使用される。あるプロトコールにおいて、それは集団内の粒子の特性における変動を評価するために使用することができる。ＤＮＡ分析（ここですべての正常粒子は同一の特性を有すると仮定される）において、それはフローサイトメトリーのアラインメント（およびオペレーターの技量）を評価するためにしばしば使用することができる。
【００３６】
固定：細胞のタンパク質を変性する方法。フローサイトメトリーにおける定着は、危険な生物学的物質不活性化しかつ、また、フローサイトメーターへの即時のアクセスが存在しない染色された細胞を保存するために使用される。パラホルムアルデヒドは細胞の前方および側面の散乱特性を保存する（しかし、自己蛍光を多少の増加させる）ので、フローサイトメトリーにおいて選択される固定剤である。
【００３７】
フローセル：フローセルは、シース流の中央に試料流を送出すフローサイトメーターにおける装置である。あるサイトメトリーの立体配置において、流れがフローセルを去った後、照明を「空気中で」で行う。
【００３８】
蛍光色素：蛍光色素は光を吸収し、次いで異なる色の光（常により長い波長の）を放射する色素である。
【００３９】
前方の散乱：前方散乱は、光が粒子を通過して光ビームのもとの方向から発散するように曲がった、照明光ビームからの光である。照明光ビームから小さい角度に曲がった光の強度は、粒子の屈折率ならびに断面積に関係づけられる。前方散乱の信号は細胞体積と相関しない。
【００４０】
ゲイン：ゲインは増幅器への電子コントロールであり、所定の信号を光電子増倍管が受け取ったとき生ずる電流密度を決定する。光電子増倍管の増幅器のゲインの変動は、出力信号がフローサイトメトリーのデータに変換されるとき、それらの信号の出現を変化させることがある。
【００４１】
ゲート：引き続いて分析されるフローサイトメトリーのデータについてなされる制限である。ライブゲートは記憶のためにコンピューターが受け取るデータを制限する。分析ゲートは特定の分析手法からのある種の記憶されたデータを単に排除する。ゲートは、混合集団の分析をその混合集団内のある種の細胞に制限するために使用される。
【００４２】
粒状性：粒状性は、フローサイトメーターにおいて照明光ビームから直角に偏向された光を記載するために、側面の散乱と同義に使用される用語である。この光の強度は、不正確な方法において、光ビームを通して流れる粒子の内部または表面の不規則性に関係づけられる。
【００４３】
光散乱：メジアン角光散乱（ＭＡＬＳ）は、１０°〜７０°の間の角度において得られた光散乱の情報として定義される。低い角光散乱（ＬＡＬＳ）は、０°を排除する、光ビーム軸に関して１０°以下の角度において得られた光散乱の情報である。高い角光散乱（ＨＡＬＳ）は、レーザー軸に対して９０°に中心をなす光散乱の情報である。
【００４４】
線形増幅器：線形増幅器は、光電子増倍管からの信号を増加して測定可能とする１つの手段である。線形増幅器は、増幅器からの出力電流が光検出器から誘導される入力電流に正比例するような方法において、信号を増加する。
【００４５】
対数増幅器：対数増幅器は、光電子増倍管からの信号を変更して測定可能とする１つの手段である。対数増幅器は、増幅器からの出力電流が光検出器から誘導される入力電流の対数に比例するような方法において信号を変更する。
【００４６】
光検出器：光検出器は、光を感知し、その光からのエネルギーを電気信号に変換する装置である。検出器の作動範囲内で、電気信号は光の強度に比例する。光電子増倍管および光ダイオードは光検出器の２つの型である。
【００４７】
光ダイオード：比較的強い光信号を検出するために使用される光検出器の１つの型。それはその陽極（出力）端における電流を増加するために印加された高い電圧をもたない。
【００４８】
光電子増倍管：光電子増倍管は、比較的弱い信号を検出するために使用される光検出器の１つの型である。その出力電流は印加された高い電圧により増加される。
【００４９】
回転光散乱：回転光散乱（ＲＬＳ）は、ＭＡＬＳ／ＤＣパルスピークの情報の比から誘導されたデータの変換である。ＲＬＳの機能は細胞の大きさ成分を除去し、細胞の内部構造にいっそう関係する測定値を生ずる作用を有する。
【００５０】
シース：フローサイトメーターのフローセルからまたはその内部の同軸流れの間に、中央の試料コアがその中に含有される流体である。
【００５１】
側面の散乱：側面の散乱は、照明光ビーム中で粒子から跳ね返り、側面に偏向する照明光ビームと同一の色の光である。「側面」は、通常、光ビームの線に対して直角（直交する向き）のレンズにより定められる。また、それは直角の光または９０°のＬＳと互換的に呼ばれる。側面に散乱したこの強度は、一般的方法において、粒子の表面または内部の粗さまたは不規則性に関係づけられる。
【００５２】
空間的位置：空間的位置は、分析のドメインにおける分析された集団の位置である。ＶＣＳ器具の例において、分析のドメインはＤ．Ｃ．電流、高い周波数（ＲＦ）の大きさおよび光散乱により測定された体積である。他の例は、分析された集団がＤ．Ｃ．電流により測定された体積のみによる場合であり、空間的位置はＤ．Ｃ．ドメイン内の分析された集団の平均位置であろう。
【００５３】
限界：限界は、ある強度より低い信号を無視するようにＡＤＣを作ることができる電子装置である。前方散乱の限界は、非常に小さい粒子、デブリおよび電子的または光学的雑音を獲得から排除するためにフローサイトメトリーにおいて最も普通に使用される。
【００５４】
ＶＣＳ技術：ＤＣ（コールター）体積、コールター容量またはＲＦ大きさ、および種々の角度範囲における光散乱を使用することによって血液を分析する器具。
【００５５】
波長：波長は、エネルギー含量およびまた（我々の眼が感受性である光を使用して）その色に正確に関係づけられる光の特性である。短い波長の光は、より長い波長の光より多いエネルギーを有する。
【００５６】
現在の多白血球集団の分析は、品質コントロールとして使用するための特定の大きさおよび体積の増分および特定の光散乱特性の類似体を必要とする。本発明の方法において、電気光学的粒子のカウンターの限界の設定を検査するために、リンパ球、単球、好中球、および好酸球である主要な白血球成分の少なくとも１種の類似体を調製することが必要である。好ましくは、本発明の方法のために、少なくとも好中球類似体を調製することが必要である。より好ましくは、好中球およびリンパ球の類似体を調製することが必要である。これより以前において、体積の増加は光散乱の増加に関係づけられ、光散乱の増加はヒト白血球以外の白血球類似体の少なくとも４つの異なる集団を作ることを妨害した。類似体および類似体の分析に使用する器具はいっそう複雑となり、類似体の懸濁媒質はそれらの複雑さを補足しなくてはならない。さらに詳しくは、懸濁媒質はこれらの類似体および器具と適合性であり、かつ類似体の物理的および生理学的性質を補足しなくてはならない。
【００５７】
懸濁媒質は主として血液から調製された白血球類似体とともに使用される。白血球類似体を調製する１つの方法は、多数の型の血液計数器具のための複数の限界の設定と合致するように、異なる源からの処理された血球を提供する。血球の選択において、主要な制限はもとの細胞の平均細胞体積である。なぜなら、それは所望の類似体の平均細胞体積に関係するからである。本発明の範囲を限定しないで、特定の動物からの血球を特に述べることができ、ここで他の動物からの赤血球および白血球を本発明の方法において使用できることを理解すべきである。
【００５８】
本発明の方法において有用な白血球類似体の１つの調製方法は、赤血球を低浸透圧溶液と混合して細胞の体積を拡張し、細胞のヘモグロビン含量を変化させてヒト白血球の光散乱および透明度をシミュレートし、そして、前記白血球を固定して、血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性でありかつ固定された白血球がヒト白血球の性質に類似する、Ｄ．Ｃ．電流ように測定された体積、高い周波数（ＲＦ）の大きさ、透明度および光散乱から成る群より選択される少なくとも２つの性質を有するようにすることを含んでなる。好酸球の血球類似体を製造する方法は類似するが、ヘモグロビン含量の変化は血球からそれを漏出させるよりむしろ細胞中でそれを変性することによって達成される。追加の態様は、ヒト白血球の体積および光散乱特性を有する類似体を生ずる。
【００５９】
この方法は、また、もとの体積よりも５０％より大きく赤血球を膨潤させることができ、これは所望の類似体の調製のための動物細胞の選択において、いっそう広い寛容度を提供する。好ましい方法において、赤血球はもとの体積の７５％より大きく膨潤される。
【００６０】
本発明の方法とともに使用するために適当な類似体を調製する目的で、家禽の赤血球、例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、および好ましくはガンの赤血球はアルデヒドで安定化して、より小さい白血球類似体を生成できることが発見された。また、「魚類」、器具の動作サメ族および爬虫類、好ましくはアリゲーターを包含する他の非ヒト脊椎動物は、適切に処理したとき、より大きい大きさのヒトの単球、好中球および好酸球に類似する類似体を生ずる、所望の大きさの範囲の赤血球を有することが発見された。これらの赤血球は、一般に、きわめてすぐれた懸濁能力および高度に再現性ある体積分布の特性を示す。しかしながら、考慮、例えば、合理的費用における入手可能性を考慮しなくてはならない。
【００６１】
そのうえ、全血対照製品において白血球のパラメーターを決定するとき、赤血球が血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように、赤血球を固定する。
【００６２】
鳥類、アリゲーターおよびテンジクザメの細胞は核化されるが、赤血球の調節された溶血を可能とする本明細書に記載する方法が与えられると、ヒト白血球の代替物として前記細胞の使用に対して、核の存在は必須ではなく、また決定的ではない。好ましくは、細胞中のヘモグロビンの２０〜８０重量％、より好ましくは３０〜７０重量％が解放される。細胞膜の崩壊およびヘモグロビンのそれ以上の損失を防止する固定剤、例えば、有機アルデヒドで細胞を安定化する。
【００６３】
本発明の方法において有用な白血球類似体を調製する他の方法は、白血球の５つの下位集団の少なくとも１つをシミュレートするようにヒト白血球を安定化することを包含する。
【００６４】
さらに、この分野において知られている他の白血球類似体を使用するとき、本発明の方法は有用である。これらの安定化された白血球類似体細胞はコントロール製品においてヒト白血球のための満足すべき代替物を提供する。
【００６５】
本発明の方法において使用するために適当なコントロール製品を製造する好ましい方法は、ヒトリンパ球をシミュレートするために固定したガン赤血球、ヒト単球、好中球、および好酸球をシミュレートするために固定したアリゲーター赤血球の懸濁液を混合し、すべてを懸濁媒質中でかつヒト白血球をシミュレートするように単一の組成物を形成するような比率で集合させることによって調製された組成物を具体化する。次いで、コントロール製品を溶解可能なヒト赤血球、および安定化された血小板または血小板類似体と混合して、単一の多分析コントロール製品を形成する。
【００６６】
下記の記載は、本発明の方法において使用するために赤血球を使用してコントロール製品を調製する好ましい方法を説明する。
【００６７】
収集ステップにおいて、赤血球を抗凝固剤、例えば、生理的塩類溶液（塩化ナトリウム）の中に溶解したエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のアルカリ金属塩の中に懸濁させる。他の抗凝固剤および塩は、それらが不都合な溶血または細胞会合を引き起こさないかぎり、有効であると考えられる。
【００６８】
新鮮な赤血球を洗浄してドナー特異的血漿通過を除去しなくてはならない。これにより、多数の血球ドナーからの赤血球を混合するとき、赤血球の凝集の可能性が減少する。赤血球を一緒にプールして均質な複合体を得る。
【００６９】
赤血球のプールをプロセシング助剤として血清物質で前処理することができる。血清物質を使用する前処理は、赤血球を破裂させないで赤血球の膨潤を可能とする。低浸透圧の環境への赤血球の暴露は、平均血球体積を増加し、かつ光散乱ヒストグラムの幅を減少するという主要な効果を有する。赤血球の溶質濃度から減少した溶質濃度を有する低浸透圧の環境の結果として、赤血球の大きさは増加する。赤血球の内側の溶質濃度が赤血球の外側の濃度より大きいとき、水が赤血球の中に動いて濃度を平衡化する傾向が存在する。それ自体、赤血球の内側の水の動きは膨潤を引き起こす。低浸透圧の環境は、ナトリウム化合物、カリウム化合物またはそれらの双方、または所望の溶質濃度を与えることが当業者に知られている他の組成物の溶液を含むことができる。
【００７０】
本明細書において定義するとき、血清はコレステロール、コレステロールエステル、および血清血漿の中に見出される１種または２種以上の他の化合物と結合したコレステロール、およびそれらの混合物を含んでなる。好ましくは、このような他の化合物はリポタンパク質およびリン脂質およびそれらの混合物をさらに含んでなる。当業者は理解するように、典型的にはコレステロールはほぼ３０％のエステルを含有するであろう。さらに当業者は理解するように、リポタンパク質は水溶液の中にコレステロールを維持するであろう。好ましくは、前処理における血清物質は、コレステロール、コレステロールエステル、リポタンパク質コレステロール、リポタンパク質コレステロールエステル、リン脂質と結合したコレステロールおよびそれらの混合物から成る群より選択される。最も好ましくは、血清物質はリン脂質と組み合わせたコレステロールコレステロールを含んでなる。このような好ましい態様の適当な商業的に入手可能な例は、ＰｅｎｔｅｘTMＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｓｕｐｅｒ−Ｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．）であり、これは高い密度のリポタンパク質コレステロールおよびリン脂質と組み合わせたリポタンパク質コレステロールエステルである。したがって、より小さい血球がもとの体積の３０％〜５０％より大きく膨潤するとき、前処理は必要である。さらに、使用する血清物質の濃度は、低浸透圧溶液により引き起こされる血球の膨張の量の関数、ならびに、血球のヘモグロビンを血球から漏れさせる固定反応のプロセス条件の双方であると考えられる。主として室温におけるアルデヒド濃度のために血球をほぼ２時間以内に固定し、そして低浸透圧の圧力がほぼ１５０ミリ浸透圧モルであるプロセスにおいて、前処理は不必要であるように思われる。前処理を使用するとき、好ましくはコレステロールの濃度は１×１０6血球／μｌの血球計数に対して０．１〜５．０mgである。高過ぎるコレステロール濃度を使用する場合、血球は溶解する傾向がある。低過ぎるコレステロール濃度を使用する場合、血球は膨潤するとき破裂するであろう。
【００７１】
血球を破裂させないで血球を膨潤する先行技術の試みは、細胞膜を強化する機能をするプロセシング助剤、例えば、酒石酸カリウムナトリウムの使用に集中した。しかしながら、このアプローチは期待される３０〜５０％より大きい膨張を許さず、調節された溶血性を有する血球を提供しない。
【００７２】
本発明の方法を１工程のプロセスにおいて血球を同時に膨潤および固定することによって開示するが、２以上の工程を使用して血球を血清物質で前処理し、血球を膨潤させてヘモグロビンのコントロールされた放出を可能とし、その後血球を固定することができることは、この方法の範囲内である。しかしながら、このような手法は各工程のための条件、さらに詳しくは、血球の固定のタイミングをコントロールするという問題を有することが期待される。
【００７３】
本発明の方法において使用するためのコントロール製品を製造する好ましい方法において、リン酸ナトリウムの水溶液を固定試薬と所望の浸透圧に組み合わせることによって、低浸透圧溶液を形成する。自然血液の正常張度に関して浸透圧が低くなるほど、一部分血球の外側から血球の内側へ動く水のために、血球の膨潤はより多くなるであろう。浸透圧は、初期血球大きさ、血球計数、および所望の最終血球大きさに依存して、好ましくは０〜１５０ミリ浸透圧モルであり、さらにより好ましくは好酸球類似体について６５〜９５ミリ浸透圧モル、単球類似体について０〜２０ミリ浸透圧モル、白血球類似体について５〜３５ミリ浸透圧モル、そして好中球類似体について４５〜６５ミリ浸透圧モルの範囲である。上記の好ましい範囲は等張生理食塩水で洗浄した血球に基づき、そしてさらにほぼ２０，０００〜５０，０００血球／μｌの固定反応における血球計数に基づく。
【００７４】
付随的に、温度血球の膨潤速度に独立に影響を与えるように思われず、固定反応速度に事実影響を与える。血球が膨張するにつれて、固定反応がヘモグロビンのそれ以上の解放を防止するまで、ヘモグロビンはコントロールされた速度で血球の中から外に漏れる。ヘモグロビンの大部分は低浸透圧処理の最初の５分以内に解放されるであろう。したがって、血球の同時の膨潤および固定において、溶液中の固定温度を低下させると、血球が膨潤する間における、固定プロセスおよびヘモグロビンの解放速度をコントロールすることができる。固定反応が完結したとき、血球は血液学的試験手法において使用される通常の溶解試薬の影響下の溶解または分解に対して耐性である。
【００７５】
本発明の方法において使用するコントロール製品を製造する他の方法において、グルタルアルデヒドを含有する冷却した低張溶液に血球を添加する。冷却した固定溶液は０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃の温度であり、最も好ましくは固定処理はリンパ球および単球の類似体について２〜８℃において、好中球および好酸球の類似体について室温において実施される。低下した温度は、選別装置、例えば、コールター・カウンターＶＣＳ分析器により測定して、定量的に異なる血球を提供することが示された。定量的差は、室温における固定に比較して、より高い平均細胞体積を包含する。
【００７６】
膨潤する血球の固定は、細胞膜を強化しかつ膜の分解を防止するために重要である。これは、血球を有機アルデヒド、例えば、モノアルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド、またはジアルデヒド、例えば、グルタルアルデヒドの溶液と接触させることによって達成される。グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドより急速に反応するので、好ましいアルデヒドである。ほぼ２０，０００〜５０，０００血球／μｌの血球計数に基づいて、最終濃度が約０．０５％〜０．８％、より好ましくは０．１％〜０．６％の範囲内であるかぎり、グルタルアルデヒドは最終濃度より高い濃度において添加することができる。適当なアルデヒドおよびその濃度の選択についての実際の制限は、血球数、不都合な血球会合の排除の機能的制限、および固定反応のコントロールにおけるパラメーターとしてである。固定反応の条件は使用する特定の動物細胞および調製する白血球類似体について変化するであろう。
【００７７】
グルタルアルデヒドを使用する大部分の室温の固定は２時間以内に起こるが、コールター・カウンター血液学的器具において使用する通常の赤血球溶解剤に対して赤血球を完全に耐性にするためには、より長い時間が要求される。赤血球を注意して選択すると、グルタルアルデヒドを使用する固定時間の長さは、温度、グルタルアルデヒドの濃度、血球数および解放されるヘモグロビンの所望の量に依存して、２〜７２時間、好ましくは３〜３０時間の範囲であろう。最も好ましい態様において、ほぼ２０，０００〜５０，０００血球／μｌの血球計数についての固定時間は、単球およびリンパ球の類似体について１０〜２４時間であり、そして好酸球および好中球の類似体について３〜１８時間である。標的としたヒト白血球の集団についてより低い平均細胞体積を有する部分的に固定された赤血球において、不完全な固定が生ずることがある。一般に、固定の上限は調製の便利さに基づく。固定後、血球は液相から遠心および重力手段により分離され、次いでリン酸緩衝生理食塩水で洗浄される。
【００７８】
固定溶液のpHは７．０〜９．０である。固定溶液のpHが低過ぎる場合、凝集が起こり、高過ぎる場合、血球は破裂することがある。さらに、pHはヘモグロビンの解放に影響を与える。固定反応が急速に起こり過ぎる場合、細胞はヘモグロビンを解放することができない。したがって、pH範囲はほぼ７．０〜９．０、好ましくは７．５〜８．５である。最も好ましい態様において、固定溶液のpHは好中球および好酸球の類似体について８．０±０．２であり、そして単球およびリンパ球の類似体について７．８±０．１である。
【００７９】
好酸球類似体は同様な方法において調製されるが、ただし低張グルタルアルデヒド溶液は好ましくは室温において調製され、そして低張グルタルアルデヒド溶液は、細胞を完全に固定するよりむしろ、血球中のヘモグロビンを軽度に架橋するために主として使用される。それ自体、ほぼ２０，０００〜５０，０００血球／μｌの血球計数についてのグルタルアルデヒドの濃度はほぼ０．１〜０．４％、より好ましくは０．２〜０．３％である。ヘモグロビンを軽度に架橋し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、血球をタンパク質変性試薬、例えば、第四アンモニウム化合物、または血球内のヘモグロビンを沈澱させることが当業者に知られている他の変性剤でさらに処理する。変性溶液のpHは９．０〜１２．０、好ましくは１０．０〜１１．０であるべきである。処理は血球体積を減少させない。タンパク質変性試薬を使用する処理は、膨潤した血球の光散乱特性を増加させて、ヒト好酸球に類似する、要求される光散乱特性を有する膨潤した血球を提供する。ヘモグロビンの変性およびヘモグロビンのコントロールされた解放の双方は、血球におけるヘモグロビン組成を変化するという効果を有する。しかしながら、光散乱の性質は、単球およびリンパ球の類似体におけるヘモグロビンのコントロールされた解放と好酸球類似体におけるヘモグロビンの変性との間において顕著に異なる。一般に、血球からのヘモグロビンの解放は血球の光散乱および透明度を減少させるであろう。血球におけるヘモグロビンの変性は血球の光散乱を増加するであろう。
【００８０】
好酸球類似体を調製する好ましい方法は、赤血球のプールを水性血清物質で前処理し、赤血球を膨潤させ、赤血球中のヘモグロビンを変性させ、そして赤血球を固定することを含んでなる。当業者は理解するように、血清物質を使用する前処理を必要とする量の膨潤を必要としない、適当な大きさの赤血球を選択することができるコントロール製品を製造することは、この方法の範囲内に入る。このような場合において、この方法は赤血球中のヘモグロビンを変性してヒト白血球の光散乱の性質シミュレートし、そして血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように赤血球を固定することを含んでなる。それ自体、処理された赤血球はヒト白血球に類似する光散乱および体積の性質を有するであろう。しかしながら、赤血球がある程度に膨潤しない場合、赤血球は生来球形でないので、光散乱の標準偏差は最大の細胞集団の境界内に入らないであろう。球形化剤の添加はこの問題を排除することができる。
【００８１】
赤血球を膨潤し、赤血球からヘモグロビンを解放させ、解放中のヘモグロビンを変性し、ならびに当業者に知られている方法により赤血球を収縮させる、上記において開示したプロセシング工程の組み合わせを使用することによって、器具の機能障害の原因を診断する新規な方法において使用することができる、Ｄ．Ｃ．体積、ＲＦ大きさ、透明度および光散乱の複数の異なる物理的パラメーターを有する類似体を設計する方法が得られる。さらに詳しくは、赤血球の収縮および膨潤は上記のパラメーターのすべてに影響を与えるが、赤血球中のヘモグロビンの変化は透明度および光散乱の特性に影響を与えることがある。
【００８２】
本明細書において開示する懸濁媒質は、また、他のこの分野において知られている方法により調製される白血球類似体とともに使用される。１つのこのような他の方法は、実施例５に記載するように白血球の５つの下位集団をシミュレートするために、ヒト白血球を固定することを含む。
【００８３】
対照血球コントロール製品は、任意のこの分野において知られている方法または前述の方法のいずれかにより調製された、１種または２種以上の白血球類似体を含むことができる。白血球類似体は任意の適当な媒質、例えば、リン酸緩衝生理食塩水および米国特許第４，２１３，８７６号、米国特許第４，２９９，７２６号、米国特許第４，３５８，３９４号および米国特許第３，８７３，４６７号に詳細に記載されている媒質の中に貯蔵することができる。
【００８４】
下記の特定の例は、米国特許第４，２９９，７２６号に開示されている。
【００８５】
赤血球に長期間の安定性を付与する安定化媒質−好ましい処方物
概算量                                  リットル処方物
１．蒸留水                                    ５００ml
２．プロピルパラベン                        ０．３〜１．０ｇ
３．メチルパラベン                          ０．５〜１．０ｇ
４．プロカイン塩酸塩                        ０．１〜０．５ｇ
５．デオキシコール酸                        ０．１〜０．９ｇ
６．ラクトース                            １０．０〜５０．０ｇ
７．アクチジオン                            ０．１〜０．６ｇ
８．クエン酸三ナトリウム２Ｈ２Ｏ            ３．０〜８．０ｇ
９．クエン酸１Ｈ２Ｏ                        ０．３〜０．９ｇ
１０．リン酸二水素ナトリウム１Ｈ２Ｏ        ０．８〜２．５ｇ
１１．フェネルガン塩酸塩                    ０．１〜１．０ｇ
１２．コリスチメテイト、ナトリウム          ０．２〜０．９ｇ
１３．ペニシリンＧ、ナトリウム      ０．５×１０６〜３×１０６単位
１４．硫酸カナマイシン                      ０．２〜０．８ｇ
１５．硫酸ネオマイシン                      ０．２〜１．０ｇ
１６．５’−ＡＭＰ                          ０．４〜１．０ｇ
１７．アデニン                              ０．２〜０．８ｇ
１８．イノシン                              ０．４〜１．０ｇ
１９．硫酸ジヒドロストレプトマイシン        ０．２〜１．０ｇ
２０．テトラサイクリン塩酸塩                ０．２〜１．０ｇ
２１．３０％ウシアルブミン                  １００〜３５０ml
２２．蒸留水                                １リットルとする量
【００８６】
上記において列挙した化学物質の多数はいくつかの名称で商業的既知であるので、与えた名称はＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第７版（１９８９）、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．ニュージャージイ州ラウェイに列挙されている普通名である。
【００８７】
コントロール製品を製造するとき、上清流体を白血球類似体から除去し、次いで白血球類似体を懸濁媒質の中に再懸濁させる。好ましい懸濁媒質は血漿物質の水溶液を含んでなる。本明細書において定義するとき、血漿物質の水溶液は、血清物質（上記において定義した通である）、血清物質と血漿タンパク質との組み合わせ、およびそれらの混合物の水溶液を含んでなる。さらに本明細書において定義するとき、血漿タンパク質は血漿の中に含有される１種または２種以上のタンパク質を含んでなる。好ましくは、このような血漿タンパク質はアルブミン、リポタンパク質、グロブリン、フィブリノゲン、およびそれらの混合物を含んでなる。より好ましくは、血漿物質はコレステロール、コレステロールエスエル、リポタンパク質コレステロール、リポタンパク質コレステロールエステル、リン脂質と結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロールエステル、リン脂質と結合したリポタンパク質コレステロール、アルブミンと結合したリポタンパク質コレステロール、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００８８】
サポニンに基づく溶解系における赤血球の溶解のための血漿物質の実用性を確証するために、水性血漿物質を洗浄した赤血球に添加する。水溶液はリン酸緩衝生理食塩水中の３％血漿物質を含んでなっていた。結果は下記の通りである：
試料      血漿物質                                        溶解
１．    ヒトアルブミン                                    あり
２．    脂肪酸を除去したアルブミン                        なし
３．    リポタンパク質コレステロールを有する試料２        あり
４．    ウシ血清アルブミン                                なし
５．    リポタンパク質コレステロールを有する試料４        あり
６．    アルブミン結合コレステロール                      あり
７．    モノマーのアルブミン                              あり
８．    ウシ血清アルブミン、カパレート安定化              なし
９．    リポタンパク質コレステロールを有する試料８        あり
１０．    ポリマー増強ウシ血清アルブミン                  あり
１１．    ヒトアルブミン                                  あり
１２．    ブタアルブミン                                  あり
１３．    米国特許第４，２９９，７２６号の媒質            なし
１４．    リポタンパク質コレステロールを有する試料１３    あり
１５．    界面活性剤と結合したコレステロール              なし
１６．    リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）                  なし
１８．    レシチン                                        なし
１９．    リポタンパク質コレステロールを有するＰＢＳ      あり
【００８９】
前述の試験結果から、洗浄した赤血球への血漿物質の添加はサポニン溶解系中の溶解を可能とすることが決定された。アルブミンは赤血球およびサポニンと相互作用して溶解作用を実行すると考えられる。しかしながら、洗浄した赤血球およびウシ血清アルブミンを他の成分、例えば、米国特許第４，２９９，７２６号に開示されているものと組み合わせると、アルブミンは溶解を引き起こさない。しかしながら、リポタンパク質コレステロールを添加すると、溶解が行われる。そのうえ、リポタンパク質コレステロールをＰＢＳに添加すると、溶解が行われる。
【００９０】
前述したように赤血球から調製された白血球類似体を使用するとき、血漿物質の水溶液は、器具において使用する少なくとも１２時間前に、血液学的組成物に添加することが好ましい。１種または２種以上の白血球類似体を溶解可能なヒト赤血球と組み合わせて、溶解試薬を使用する器具のための単一の多分析参照血漿コントロール製品調製するとき、血漿物質の水溶液は結合したコレステロールを含んでなることが最も好ましい。最も好ましい血漿物質の適当な例は米国特許第４，２９０，７７４号（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているようなＭｏｄｕｃｙｔｅTMであり、これはアルブミンと結合した高い密度のリポタンパク質コレステロールである。懸濁媒質中のコレステロールの最終濃度は、最終製品における血球計数に依存して、４００〜１，２００、好ましくは６００〜１，０００mg／ｌの範囲である。
【００９１】
本明細書において開示する好ましい方法により調製される白血球類似体を使用するコントロール製品について、不十分な濃度のコレステロールを好ましい媒質の中に使用する場合、参照血球コントロール製品における赤血球は効率よく溶解せず細胞膜を溶解しないので、サポニン溶解試薬系を使用するとき、雑音およびデブリは存在せず、そして白血球類似体は溶解反応のために要求される大きさより低い平均細胞体積を有するであろう。媒質が高過ぎる濃度のコレステロールを含有する場合、参照血球コントロール製品における赤血球は効率よく溶解せず細胞膜を溶解しないので、雑音およびデブリは存在しない。
【００９２】
さらに詳しくは、コントロール製品を器具、例えば、コールターＶＣＳ型技術を使用する器具（これは米国特許第４，７５１，１７９号に記載されているような試薬系を使用する）においてを使用して、白血球の少なくとも２つの集団、（１）リンパ球系（リンパ球）および（２）骨髄性細胞（好中球、単球、好酸球および好塩基球）を区別するとき、好ましい懸濁媒質はより弱い溶解試薬と非固定赤血球との間の反応を起こさせるので、赤血球は溶解するが、白血球類似体は実質的に影響を受けない状態にあり、白血球類似体の各型の計数を可能とする。米国特許第４，７５１，１７９号により教示されるように、溶解試薬は２つの形態を有する：（１）サポニンを含有する溶解希釈剤、これは同時に全血試料を希釈しかつその赤血球を間質溶解する機能をする；または（２）非溶解血液希釈剤および引き続くサポニンを含有する溶解試薬から構成された２つの部分の系。
【００９３】
先行技術の媒質、例えば、米国特許第４，２１３，８７６号、米国特許第４，２９９，７２６号、または米国特許第４，３５８，３９５号に記載されているものを使用するとき、本明細書において開示する好ましい方法により調製される白血球類似体は標的とする白血球集団について所望の体積より小さい。さらに詳しくは、好ましい懸濁媒質を白血球類似体（赤血球または白血球から調製された）とともに使用するとき、類似体のＤ．Ｃ．体積は標的とする白血球集団について所望の範囲内にある。
【００９４】
より好ましい態様において、懸濁媒質はさらに非イオン界面活性剤の添加を含んでなる。界面活性剤は高い親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する。ＨＬＢは典型的には１５より大きい、より好ましくは１７より大きい値を有する。典型的には、界面活性剤は、白血球類似体に悪影響を及ぼさないで、赤血球にいっそう特異的に溶解作用をなすために有効な量で存在する。さらに、界面活性剤はコントロール製品中の遊離コレステロールを安定化するので、コレステロールは溶液の中に分離しない。当業者は理解するように、界面活性剤の有効量は実験的に決定することができるが、典型的にはコントロール製品の０．５重量％より少ない。
【００９５】
適当な非イオン界面活性剤は下記一般式のアルキルポリエーテルアルコールを包含する：Ｒ−Ｘ−（Ｙ）ｎ−Ｈ、式中Ｒは親油性鎖Ｃ8−Ｃ18炭素原子であり、Ｘは−Ｏ−、
【００９６】
【化１】
2005128029.tif 000002
【００９７】
−ＣＯＯ−であり、そしてＹはＣＨ２ＣＨ２Ｏ−またはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏであり、ｎは１５〜５０の整数である。これらの界面活性剤の適当な商業的例は、ＤｉａｚｏｐａｎTMＳＳ−８３７（ＧＡＦ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）、ＴｒｉｔｏｎTMＸ４０５（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａａｓ）、およびＰｌｕｒｉｏｎｉｃ  ＦTM−１２７  ＰＲＩＬＬ（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐ．）を包含する。
【００９８】
いかなる理論にも拘束されたくないが、好ましい懸濁媒質中の赤血球、弱い溶解剤（例えば、サポニン）、および血漿物質の間の相互作用が存在すると、現在、考えられる。さらに詳しくは、血漿物質は細胞膜コレステロールに影響を与え、コレステロールはさらに溶解試薬に対して白血球類似体の応答に影響を与えると、現在、考えられる。そのうえ、界面活性剤は溶解反応を赤血球に対していっそう特異的とし、しかも測定したコントロールパラメーターに関して白血球類似体に悪影響を及ぼさないとさらに考えられる。さらに、界面活性剤、また、細胞膜または血漿物質の中に見出されるコレステロールに影響を与えることがあるとさらに考えられる。
【００９９】
６カ月までの安定性を有する血液学的参照コントロール製品のための好ましい懸濁媒質は、血漿物質および任意の適合性殺真菌剤および殺細菌剤、および任意の補助剤、例えば、プリンヌクレオシド、胆汁溶質、およびコール酸誘導体、フェノチアジン化合物および抗ヒスタミン性質を有するそれらの塩、および４−アミノ安息香酸エステルおよび誘導体および美的性質を有するそれらの塩、ならびに赤血球のための球形化剤、またはそれらの組み合わせの水溶液を包含する。１種または２種以上の白血球類似体は組み合わせて、赤血球のための既知の溶解剤とともに使用するための単一の参照血球コントロール製品とすることができるので、好ましい懸濁媒質の処方物は白血球類似体のすべてについて同一である。
【０１００】
当業者は理解するように、懸濁媒質は細胞の溶解を回避するために十分な張度を有すべきである。懸濁媒質のための好ましい処方は下記の通りである：
懸濁媒質
概算量                                        リットル処方物
１．蒸留水                                          ５００ml
＊２．プロピルパラベン                            ０．３〜１．０ｇ
＊３．メチルパラベン                              ０．５〜１．０ｇ
＊４．プロカイン塩酸塩                            ０．１〜０．５ｇ
＊５．デオキシコール酸                            ０．１〜０．９ｇ
＊６．ラクトース                                １０．０〜５０．０ｇ
＊７．アクチジオン                                ０．１〜０．６ｇ
＊８．クエン酸三ナトリウム２Ｈ２Ｏ                ３．０〜８．０ｇ
＊９．クエン酸１Ｈ２Ｏ                            ０．３〜０．９ｇ
＊１０．リン酸二水素ナトリウム１Ｈ２Ｏ            ０．８〜２．５ｇ
＊１１．フェネルガン塩酸塩                        ０．１〜１．０ｇ
＊１２．コリスチメテイト、ナトリウム              ０．２〜０．９ｇ
＊１３．ペニシリンＧ、ナトリウム                  ０．５×１０６〜３×１０６単位
＊１４．硫酸カナマイシン                          ０．２〜０．８ｇ
＊１５．硫酸ネオマイシン                          ０．２〜１．０ｇ
＊１６．５’−ＡＭＰ                              ０．４〜１．０ｇ
＊１７．アデニン                                  ０．２〜０．８ｇ
＊１８．イノシン                                  ０．４〜１．０ｇ
＊１９．硫酸ジヒドロストレプトマイシン            ０．２〜１．０ｇ
＊２０．テトラサイクリン塩酸塩                    ０．２〜１．０ｇ
＊２１．３０％ウシアルブミン                      １００〜３５０ml
２２．リポタンパク質コレステロール                ４００〜１，２００mg
２３．蒸留水                                      １リットルとする量
＊赤血球および類似体に長期間の安定性を付与するために好ましい任意の成分。
【０１０１】
製造されたコントロール製品は、器具の機能障害の原因を監視および診断するために使用することができる。本発明において、下記に関連する問題について器具を監視および診断することができる血液学的コントロール製品を使用する方法が開発された：
１．溶解のデブリおよび雑音
２．器具の試薬のポンプ体積の設定
３．器具のレーザーアラインメント
４．器具のゲインの設定
５．フローセルにおける流速の不一致
【０１０２】
この方法は、先行技術の方法により提供される器具のオペレーターによる試験結果の診断的非特異性または検査である非特異的フラギングより、いっそう特異的な器具の機能障害の型および原因の指示を提供する。下記において、従来記載されたコントロール製品を使用する新規な方法を説明する。当業者は理解するように、コントロール製品は細胞のデブリおよび無効の赤血球により引き起こされる雑音を監視するために溶解可能な赤血球を含有しなくてはならない。この方法は、器具の機能障害の原因を決定するために、コントロール製品の物理的性質の新規なコントロールパラメーターを使用する。これらの物理的性質は、下記のものからなる群より選択される：
（１）Ｄ．Ｃ．電流により測定された体積、
（２）高い周波数（ＲＦ）の大きさ、
（３）不透明度、および
（４）光散乱。
【０１０３】
白血球集団を系の動作のインジケーターとして使用する。好ましくは、好中球およびリンパ球の下位集団をコントロールパラメーターとして使用し、そして器具の動作を決定するために測定する。より好ましくは、好中球の集団をコントロールパラメーターとして使用し、そして系の動作の指示として測定する。
【０１０４】
細胞のデブリのための雑音の問題が存在するかどうかを決定するために、２つのコントロールパラメーターの使用を用いる。コントロールパラメーターは計数比（ＣＯＵＮＴ  ＲＡＴＩＯ）および経過時間（ＥＬＡＰＳＥＤ  ＴＩＭＥ）である。計測比は、特定の経過時間の間の分析において記録される事象の合計の計数と比較した、分析における白血球の数の測度である。経過時間は、通常秒で、測定される時間である。計数される白血球／計数された合計の事象の比が１００％に近づくにつれて、細胞のデブリまたは器具の機能障害に関連する雑音の問題は排除される。
【０１０５】
ＶＣＳ技術を用いる器具において計数比を使用して１例は、白血球類似体の数と、特定の経過時間について得られた８１９２粒子の合計の計数との比較である。この比が約９５％より小さい場合、雑音または妨害が問題であるという指示が存在する。９５％において、雑音または妨害が問題であるという指示が存在する。特定の問題はこの開示においてさらに説明する追加の試験によりさらに確証される。
【０１０６】
器具を問題について監視および診断するための他のアプローチは、患者の正常な血液の統計的に有意な数のパラメーターの同一の組の連続する平均の新鮮な血液の監視を使用することである。この平均がコントロールパラメーターの期待する範囲外であるとき、器具の機能障害の初期の指示が存在する。器具の機能障害は本明細書に記載するコントロール製品を使用してさらに評価することができる。
【０１０７】
器具が適切に機能しているかどうかの１つの指示は、器具が測定した細胞のデブリまたは雑音を決定することである。過剰の細胞のデブリは、不完全な溶解、温度条件または溶解反応の妨害のための反応速度の変化により引き起こされることがある。種々の器具システムは血球計数およびデータの蓄積時間の制限を有するので、過剰の細胞のデブリまたはいずれかの源からの雑音は白血球集団の適切な獲得および分析を妨害する。細胞のデブリまたは雑音の問題の原因は、下記のものを含むいくつかの問題に寄与することがある：
Ａ．シース流体および血液試料の流れの不均衡のための導電率の雑音。
Ｂ．不適切な赤血球溶解により引き起こされる溶解の雑音。
Ｃ．部分的詰まり、残留物の詰まりまたは他の問題により引き起こされる流れの雑音。
【０１０８】
機能障害が試料流のポンプ体積の間の不一致により引き起こされる導電率の雑音のためであるかどうかを決定するために、目盛り定めした容器を使用して、血液試料に添加した試薬の各々を測定する。移された試薬の体積は前もって決定した値の範囲内にあるべきである。試薬の体積が規定した限界内にない場合、試薬のポンプを調節して小出しされる試薬の体積を増減する。
【０１０９】
ＶＣＳ技術を用いる器具の例において、溶解試薬およびクエンチ試薬の流れのポンプ体積を測定する。目盛り定めした容器を使用して、これらの体積の各々を測定する。試薬の体積は前もって決定した値の範囲内にあるべきである。試薬の体積が規定した限界内にない場合、試薬のポンプを調節して提供される体積を増減する。
【０１１０】
浸透圧的に感受性の固定血球類似体集団を含有する調製したコントロール製品をさらに使用して、試薬のポンプ体積を監視する。溶解試薬の体積の変化は、希釈した血液試料の最終の浸透圧濃度に影響を与え、そして類似体集団の測定した体積に影響を与えるであろう。より低い浸透圧濃度はコントロール血球類似体の測定した体積を増加し、そしてより高い浸透圧濃度はコントロール血球類似体の測定した体積を減少させる。シース流体を電気的にバランスさせるために要求される導電率の限界を越える試薬のポンプ体積の変動は、コントロール血球の体積の変化に加えて、雑音を生成するであろう。
【０１１１】
したがって、導電率の雑音が前述の方法により最小となった後、不適切な赤血球の溶解から生ずる溶解の雑音は、既知の数の安定化された赤血球および少なくとも１つの白血球類似体の細胞集団を含有するコントロール製品を使用して検査される。溶解が問題である場合、コントロール血球は最大計数比の約９５％より低い計数比を示すであろう。さらに、試薬の体積は前述の方法により調節することができるが、溶解反応の温度に関する溶解の反応速度は影響を受けるであろう。さらに詳しくは、実験室の器具の室温が５０°Ｆである場合、溶解の雑音を最小するために、温度が９０°Ｆである場合と異なる溶解試薬およびクエンチ試薬を溶解反応は必要とするであろうことが発見された。
【０１１２】
ＶＣＳ型技術を用いる器具の例において、溶解試薬およびクエンチ試薬を血液試料と反応させて、測定に適当な白血球の溶解しかつ希釈した懸濁液を形成する。ＶＣＳ型器具において、血球を溶解試薬と反応させて、低張血球を膨潤させ、赤血球および血小板を溶解させ、そして赤血球および血小板の膜を溶解させる。クエンチ試薬との反応は膨潤および溶解を停止させ、そして白血球の自然大きさへの白血球の再平衡化のプロセスを開始する。反応の特質のために、溶解試薬およびクエンチ試薬は浸透圧濃度および導電率の双方において非常に異なる。試料流の最終の浸透圧濃度および導電率は溶解試薬、クエンチ試薬および血液試料の体積、浸透圧濃度および導電率に比例する。
【０１１３】
２つのコントロールパラメーターを使用して、試薬のポンプ体積が規定内にあるかどうかを決定するか、または機能障害の原因を決定する。計数比および好中球のＤＣ平均（ＮＥＵＴＲＯＰＨＩＬ  ＤＣ  ＭＥＡＮ）の監視は、導電率の許容度内および導電率の許容度を越えたポンプ体積の変化の区別を促進する。好中球のＤＣ平均は、ＤＣチャンネルにおける好中球の平均値である。
【０１１４】
器具を問題について監視および診断する上にアプローチは、患者の正常な血液の統計的に有意な数のパラメーターの同一の組の連続する平均の新鮮な血液の監視を使用することである。この平均がコントロールパラメーターの期待する範囲外であるとき、器具の機能障害の初期の指示が存在する。器具の機能障害は本明細書に記載するコントロール製品を使用してさらに評価することができる。
【０１１５】
白血球の計数比は、希釈の導電率または浸透圧濃度として表した、既知の試薬の濃度および測定したポンプ体積から計算した試薬のポンプ体積に関係づけられることが発見された。第１図は、試験すべき希釈した血液試料の流れの中の希釈した血液試料の導電率に比較した、白血球の計数比の比較を表す。第１図に示すように、クエンチ試薬の体積が増加するにつれて、計数比はプラトーに増加する。クエンチ体積が最適な範囲を越えて増加するとき、計数比は実質的に減少する。
【０１１６】
コントロール製品を使用して匹敵する第１図を得るために、適切な溶解を提供することが期待される第１体積において、溶解試薬の体積を準備する。クエンチ体積は、不十分なクエンチ試薬を準備することから過剰量のクエンチ試薬を準備することに調節する。クエンチ試薬の体積が不十分であるとき、計数比は有意に減少する。クエンチ体積が増加するとき、計数比は上昇し、そして最適な動作範囲の上のプラトーはクエンチ体積を最適な範囲の上に増加して、計数比を実質的に減少させる。この情報が得られると、クエンチ試薬のポンプを調節して、プラトーの中央にあるクエンチ試薬の体積を得ることができる。
【０１１７】
クエンチ体積が調節された後、溶解試薬のポンプを再調節することができる。コントロール製品の好中球のＤＣ平均は溶解試薬のポンプ体積に関係づけられることが発見された。単球の集団は好中球の集団に類似する感度を示す。溶解試薬のポンプを調節して、コントロール製品の前に測定した好中球のＤＣ平均に対応する浸透圧濃度を得る。前に測定した好中球のＤＣ平均は、参照器具からのアッセイ値として得られる。
【０１１８】
第２図は、血液試料を溶解試薬およびクエンチ試薬で希釈した後、分析する血液試料の浸透圧濃度に比較した、好中球のＤＣ平均の比較を示す。第２図に示すように、浸透圧濃度が増加するにつれて、コントロール製品の好中球のＤＣ平均は減少する。
【０１１９】
残った詰まりまたは部分的詰まりのための問題が存在するかどうかを決定するために、白色時間（ＷＨＩＴＥ  ＴＩＭＥ）および日時（ＤＡＴＥ  ＴＩＭＥ）の２つのコントロールパラメーターを使用する。これらの２つのコントロールパラメーターはこれらの型の問題の決定を促進する。白色時間は白血球類似体の数と分析に要する時間との積である。日時はコントロール試料を分析した日である。既知の数の白血球類似体を含有するコントロール製品とともに、これらの２つのコントロールパラメーターを使用すると、器具の動作の問題に関する情報が得られることが見出された。
【０１２０】
本発明の方法において、コントロール製品を少なくとも毎日使用する。白色時間および日時を記録して、流れの問題の存在について意味ある情報を得る。さらに詳しくは、白色時間を日時に対してグラフにすると、器具の流れ動作の傾向を決定するために、器具の動作の２次元のグラフを得ることができる。
【０１２１】
ＶＣＳ型器具において、試料の流速を検査するために別の方法が得られる。ＶＣＳ器具は、それで分析された各患者の血液試料について、白色時間および日時を記録する。統計学的に有意な数の患者の血液試料についてこれらのコントロールパラメーターを比較することによって、器具の流れ動作の歴史を監視するために拡張したデータベースを得ることができる。さらに詳しくは、各患者の血液試料について白色時間および日時を記録することによって、残留する詰まりまたは部分的詰まりが発生したかどうかを決定することができる。残留する詰まりは引き続く試料の流れを制限するが、血球数／秒の検出可能な特性を生成しないことがある。部分的詰まりは、フローセルを通る血球の流れを減少するので、白血球の計数を得るために要する時間を増加することがある。
【０１２２】
さらに、これらのパラメーターを患者の試料について監視するとき、流速が悪影響を受けたかどうか、および白血球の計数を得るために期待される時間を雑音およびデブリのレベルが妨害するかどうかを発見するための２次元の分析を得ることができる。過剰のデブリは、特定した数の白血球を得るために必要な時間の量を減少するであろう。この２次元分析は、先行技術の複雑な多次元の分析を超えた改良を提供した。
【０１２３】
フローセルの精度による問題を決定する先行技術方法は、前もって決定した時間の間に検出される白血球の数を測定することであった。さらに詳しくは、器具のオペレーターは既知の数の白血球を有する特別に選択した新鮮な血液を使用し、そして器具が白血球を検出するために要した時間を測定する。器具が特定した時間内に白血球を検出した場合、フローセルの問題が存在しないことが推定された。しかしながら、この測定は特定の分析のための器具についての情報を提供しただけであった。この測定は、延長した期間にわたって器具の動作に関する意味ある情報を提供しなかった。さらに詳しくは、白血球の計数／単位時間のグラフはその１日についての器具の動作の瞬間的観測を提供するだけである。数日にわたる器具の動作の観測を得るために、結果の３次元の変化が必要であった。そのうえ、本発明の方法は既知の数の血球を有するコントロール製品を使用し、これにより特別に選択した新鮮な血液を得ること、およびそれが含有する白血球の数の決定の必要性を排除する。
【０１２４】
さらに、コントロール製品を使用して、器具のレーザー、レーザーオプチックスまたはレーザーアラインメントを使用する問題が存在するかどうかを決定する器具を監視することができる。レーザーアラインメントは、Ｘ，ＹおよびＺに対応する３次元を有する。
【０１２５】
現在、レーザーアラインメントおよびゲインの調節を設定し、次いで監視するために使用される材料はラテックスの微小粒子である。ラテックス粒子を使用する方法は、集団の平均およびラテックス集団の変動係数を監視することである。しかしながら、レーザーのレンズがレーザービームの信号を不明瞭にするほこりまたは他のデブリを蓄積する場合、先行技術の実施は、レーザービームに対する妨害を克服するためにレーザーのゲインを増加することによって、不明瞭を許した。さらに、ラテックス粒子は器具において使用される試薬に対して応答性ではない。そのうえ、ラテックス粒子は、器具において目盛り定めモードで働くことが要求される、別のコントロール製品である。ラテックス粒子は、器具の動作を監視するために実行される追加の仕事を必要とする。したがって、器具において使用する試薬に対して応答し、かつ器具におけるレーザーの動作の指示を提供する、単一の血液学的コントロール製品を得ることは有利である。
【０１２６】
Ｘ軸のアラインメントは最も感受性の軸であり、そしてコントロール製品の光散乱の位置および分布に対する最大の影響を生成することが決定される。Ｘ軸が適切に整列し、そして分布幅が最小であるとき、コントロール製品の回転した光散乱位置は最大に存在する。アラインメントはわずかのミスアラインメントに、次いで大きいミスアラインメントに低下するにつれて、ヒストグラムにおけるコントロール製品の位置は左にシフトし、平均値は減少し、そして回転した光散乱のチャンネル分布は広くなる。
【０１２７】
新鮮な血液を分析しそしてＸ軸のミスアラインメントが存在するとき、白血球の集団は左にシフトし（低い光散乱）計数した白血球の損失および雑音の増加が発生する。ミスアラインメントがいっそう極端となるとき、新鮮な血液の分析への作用は、白血球の下位集団が没入し、そして区別が喪失することである。
【０１２８】
Ｙ軸およびＺ軸のミスアラインメントは、Ｘ軸のミスアラインメントにより引き起こされるとき白血球が示す同一種類の白血球の集団の位置の変化を示さない。レンズが最も鮮鋭な影像を提供する適切な焦点にレンズがあるかどうかを決定することに、Ｚ軸のアラインメントは関係することが決定された。Ｚ軸が正しいアラインメントにない場合、生ずる散乱プロットは白血球のはっきりした明確なクラスターを示さないであろう。さらに詳しくは、光散乱／ＤＣ体積のヒストグラムにおいて、好中球の集団からのリンパ球および単球の集団の分離は明確でないであろう。体積集団の光散乱ピークの分離の低下が存在するであろう。さらに詳しくは、個々の集団における振幅の減少および集団間の谷の振幅の増加が存在するであろう。
【０１２９】
コントロール製品のリンパ球の集団は低い光散乱を決定する情報を提供するが、好中球の集団は高い光散乱を決定する情報を提供することが見出された。これらの２つの集団の位置の間の関係は、集団の位置、例えば、レーザーアラインメント（バイアス）およびＤＣ，ＲＦおよびＬＳゲイン（比例する）の調節へのバイアスおよび比例する効果の双方を生成する系の変動を監視する。
【０１３０】
２つのコントロールパラメーターの使用を使用して、レーザーの操作による問題を決定することができる。好中球ＲＬＳ平均（ＮＥＵＴＲＯＰＨＩＬ  ＲＬＳ  ＭＥＡＮ）および山対谷の比（ＰＥＡＫ  ＴＯ  ＶＡＬＬＥＹ  ＲＡＴＩＯ）の監視は、レーザーの動作およびＸ軸およびＺ軸のアラインメントの指示を提供するであろう。リンパ球ＲＬＳ平均（ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥ  ＲＬＳ  ＭＥＡＮ）は、好中球ＲＬＳ平均に類似する感度を示す。好中球ＲＬＳ平均は、光散乱チャンネルにおける好中球の平均値である。リンパ球ＲＬＳ平均は、光散乱チャンネルにおけるリンパ球の平均値である。山対谷の比（ＰＶＲ）は、好中球の集団の回転した光散乱信号／リンパ球および単球の集団、および好中球の集団の間で形成した谷の回転した光散乱信号の振幅の比である。
【０１３１】
ＰＶＲは、レーザーによる問題が存在するかどうかを決定する方法において使用する、信頼すべき品質コントロールのパラメーターを提供する。コントロール製品を使用するとき、山対谷の比は前もって決定した限界数を満足すべきである。ＰＶＲがこの数を満足するか、またはそれを超える場合、レーザーは最適に作動している。さらに詳しくは、前もって決定した数を満足するＰＶＲは、好中球の集団および白血球および単球の集団の明瞭な分離が存在することを示す。ＰＶＲが前もって決定した数より小さい場合、レーザーによる問題が存在するという指示が存在する。
【０１３２】
前述したように、先行技術の実施は汚れたレンズを補償するためにレーザーのゲインの増加を許した。しかしながら、ラテックス粒子は、光学的妨害が存在するとき、光散乱の信号のゲインの誤った調節に関する、特定の情報を提供しない。ゲインの調節が不適切に増加されたとき、好中球ＲＬＳ平均を包含する回転した光散乱ヒストグラムにおける全体の好中球の集団の位置が右にシフトすることが決定された。
【０１３３】
本発明の方法によれば、ＰＶＲが前もって決定した値より小さく、そして好中球ＲＬＳ平均が前もって決定した値より大きいことが決定されると、器具は光学的妨害またはＸ軸またはＺ軸のアラインメントによる問題を有することが示される。したがって、技術者はレンズをきれいにし、そしてレーザーアラインメントを目盛り定めすることを知るであろう。さらに、また、決定されたＰＶＲが前もって決定した値よりも小さく、そして好中球ＲＬＳ平均が前もって決定した値より小さいことが決定される場合、器具はゲインの増加により補償されなかった光学的妨害またはＸ軸またはＺ軸のアラインメントによる問題を有することが示される。そのうえ、ＰＶＲが前もって決定した値の範囲内にあり、そして好中球ＲＬＳ平均が前もって決定した値より大きいか、または小さい場合、レーザーのゲインが不適切に設定されていることが示される。なおさらに、ＰＶＲが前もって決定した値より小さく、そして好中球ＲＬＳ平均が前もって決定した値の範囲内である場合、レーザーは力を喪失しているので、レーザーの交換を要求とする。
【０１３４】
器具が製造業者の規格書に従い動作しているかどうかを決定するためのコントロールパラメーターのいくつかの使用、および機能障害の原因を診断するためのコントロールパラメーターの使用を以上の明細書は説明しているが、表１は詳細な分析を提供し、そのコントロールパラメーターは、器具のシステムによる問題の検出および診断するために、コントロール製品または患者の血液試料の統計学的に有意な値について使用することができる。この表において、下記の略号を使用する：
ｓ＝適用可能な器具の機能についての感度
ＳＤ＝標準偏差
ＯＰ＝不透明度
ｘ＝コントロール製品または試料の測定
【０１３５】
【表１】
2005128029.tif 000003
【０１３６】
さらに、ポリスチレンまたは他のプラスチックのビーズをコントロール製品に添加して、器具の動作をさらに示すことができる単一の参照コントロール製品を調製することができる。さらに詳しくは、コントロールパラメーターと一緒にこの型のコントロール製品を使用すると、器具の動作についての情報を得ることができる。例えば、ラテックス粒子のＤＣゲインが規定内にあるが、コントロール製品が規定範囲外のＤＣ平均を有する場合、試薬のポンプ体積による問題が存在するという指示が存在する。
【０１３７】
この型のコントロール製品をＶＣＳ技術を用いる器具において使用するとき、前述の例は溶解試薬またはクエンチ試薬の体積による問題が存在することを示す。さらに詳しくは、ＶＣＳ型器具において、ラテックス粒子のＤＣゲインが規定内にあるが、コントロール製品が製造業者の規定より上のＤＣ平均を有する場合、溶解試薬の体積は最適なレベルより大きいか、またはクエンチ試薬の体積は最適なレベルより小さいという指示が存在する。なおさらにＶＣＳの例において、ラテックス粒子のＤＣゲインが規定内にあるが、コントロール製品が製造業者の規定より下のＤＣ平均を有する場合、溶解試薬の体積は最適なレベルより小さいか、またはクエンチ試薬の体積は最適なレベルより大きいという指示が存在する。
【０１３８】
本発明の方法において使用するための白血球類似体を調製する方法を、下記の実施例に記載する。実施例１はガンの細胞を処理するために好ましい試薬および技術の特定の実施例であり、処方物は本発明の方法において使用できるものの単なる例示であることを理解すべきである。実施例２，３および４はアリゲーターの細胞を処理するために好ましい試薬および技術の特定の実施例であり、処方物は本発明の方法において使用できるものの単なる例示であることを理解すべきである。実施例５は、ヒト白血球を使用して白血球類似体の５つの下位集団を生成する酵素を示し、処方物は本発明の方法において使用できるものの単なる例示であることを理解すべきである。実施例６は、４つの白血球集団のアセンブリーを示す。これらの実施例は単なる例示である白血球類似体のための処方物を提供することを理解すべきである。
【０１３９】
記載する試薬および／または技術は、また、ガンおよびアリゲーター以外の動物からの血球に適用可能である。この開示に従い、他の成分および比率を使用することができる。
実施例１
ガンの赤血球からのリンパ球類似体
下記は、動物の選別したリンパ球類似体を得るために、ガンの赤血球を処理するための好ましい試薬および推奨される特定の手法の工程の特定の実施例である。処方物および手法は単なる例示であり、そして本発明においてこの開示に従い、他の成分、比率および手法を使用することができることを理解すべきである。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
リットル処方物
１．１塩酸性リン酸ナトリウム：０．２ｇ
２．２塩酸性リン酸ナトリウム・７Ｈ２Ｏ：２．０ｇ
３．アジ化ナトリウム：０．１ｇ
４．塩化ナトリウム：９．４ｇ
５．蒸留水で１リットルにする：pHほぼ７．４；浸透圧濃度３１５〜３４５mOsm／kg。
白血球低張溶液
１．塩基性リン酸ナトリウム：０．２ｇ
２．２塩基性リン酸ナトリウム・７Ｈ２Ｏ：２．０ｇ
３．蒸留水で１リットルにする：pHほぼ７．８；浸透圧濃度１５〜２５mOsm／kg。
手  法
１．約１４０〜１７０fLの平均細胞体積範囲を有する鳥類の赤血球を選択する。充填した鳥類の赤血球をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。
２．１．０〜５．０mgのコレステロールを２×１０６／μ１の血球計数に添加し、室温において２〜６時間インキュベートする。
３．商用２５％グルタルアルデヒド製品を冷却した白血球低張溶液に添加することによって、約０．１〜０．８％のグルタルアルデヒド含量を有するグルタルアルデヒド固定試薬を調製する。好ましくは、温度は２〜８℃である。グルタルアルデヒドの好ましい濃度はほぼ０．３５％である。
４．洗浄した赤血球を測定した量の工程３の固定剤に１：３５の希釈において添加する。密閉した容器に移し、この容器を２〜８℃において１８〜２４時間ゆっくり回転する。ヘモグロビン含量の減少はほぼ６０重量％であると計算される。
５．上清流体を取り出し、血球をＰＢＳで数回洗浄し、適当な貯蔵用溶液の中に再懸濁させる。
６．リンパ球類似体を単独で放置するために、洗浄固定した血球を本発明の懸濁媒質の中に再懸濁させ、濃度を調節して正常のヒト血液中のヒトリンパ球の濃度にシミュレートする。
７．コントロール製品のための多血液学的パラメーターのために、他の血液学的組成物および多パラメーターの血液学的コントロール製品に所望の類似体を有する本発明の懸濁媒質の中に洗浄固定した血球を添加し、血球計数はリンパ球の比率を測定するために適当である。
８．適当な安定剤を使用して、固定した血球を６カ月を超える期間の間貯蔵することができる。
【０１４０】
上記実施例に従うが、他の種類の哺乳動物の赤血球を使用すると、匹敵する結果が得らられる。
実施例２
アリゲーターの赤血球からの単球類似体
下記は、単球類似体を得るために、アリゲーターの赤血球を処理するための好ましい試薬および推奨される特定の手法の工程の特定の実施例である。処方物および手法は単なる例示であり、そして本発明においてこの開示に従い、他の成分、比率および手法を使用することができることを理解すべきである。
単球低張溶液
１．１塩基性リン酸ナトリウム：０．１ｇ
２．２塩基性リン酸ナトリウム：１．０ｇ
３．蒸留水で１リットルにする：pHほぼ７．８；浸透圧濃度５〜１５mOsm／kg。血球のための洗浄溶液（ＰＢＳ）、実施例１に記載されている通りである。
手  法
１．約３５０〜４５０fLの平均細胞体積範囲を有するアリゲーターの赤血球を選択する。充填したアリゲーターの赤血球をＰＢＳで洗浄する。
２．１．０〜５．０mgのコレステロールを１×１０６／μ１の血球計数に添加し、室温において３〜５時間インキュベートする。
３．商用２５％グルタルアルデヒド製品を冷却した単球低張溶液に添加することによって、約０．１〜０．８％のグルタルアルデヒド含量を有するグルタルアルデヒド固定試薬を調製する。好ましくは、温度は２〜８℃である。グルタルアルデヒドの好ましい濃度はほぼ０．１５％である。
４．洗浄した赤血球を測定した量の工程３の固定剤に１：５０の希釈において添加する。密閉した容器に移し、この容器を室温において１８〜２４時間ゆっくり回転する。ヘモグロビン含量の減少はほぼ４０重量％であると計算される。
５．上清流体を取り出し、血球をＰＢＳで数回洗浄し、適当な貯蔵用溶液の中に再懸濁させる。
６．単球類似体を単独で放置するために、洗浄固定した血球を本発明の懸濁媒質の中に再懸濁させ、濃度を調節して正常のヒト血液中のヒト単球の濃度にシミュレートする。
７．コントロール製品のための多血液学的パラメーターのために、他の血液学的組成物および多パラメーターの血液学的コントロール製品に所望の類似体を有する本発明の懸濁媒質の中に洗浄固定した血球を、単球の測定に適当な濃度において、添加する。
８．適当な安定剤を使用して、固定した血球を６カ月を超える期間の間貯蔵することができる。
【０１４１】
実施例３
アリゲーターの赤血球から好酸球類似体
下記は、好酸球類似体を得るために、アリゲーターの赤血球を処理するための好ましい試薬および推奨される特定の手法の工程の特定の実施例である。処方物および手法は単なる例示であり、そして本発明においてこの開示に従い、他の成分、比率および手法を使用することができることを理解すべきである。
単球低張溶液
１．１塩基性リン酸ナトリウム：０．３２ｇ
２．２塩基性リン酸ナトリウム：８．０８ｇ
３．蒸留水で１リットルにする：pHほぼ８．０；浸透圧濃度７５〜８５mOsm／kg。
好酸球ヘモグロビン変性処理溶液
１．塩化ジメチルジココアンモニウム：２．５ｇ
２．トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：６．０６ｇ（有機系緩衝剤）
３．蒸留水で１リットルにする：pHほぼ１０．５。
好酸球後処理洗浄溶液
１．ポリオキシエチル化アルキルフェノール：５ｇ（ＤａｚｏｐａｎTMＳＳ−８３７、ＧＡＦケミカル・コーポレーション）
２．蒸留水で１リットルにする。
【０１４２】
血液のための洗浄溶液（ＰＢＳ）、実施例１に記載されている通りである。
手  法
１．約４００〜５００fLの平均細胞体積範囲を有するアリゲーターの赤血球を選択する。充填したアリゲーターの赤血球をＰＢＳで洗浄する。
２．０．２５〜１．２５mgのコレステロールを１×１０６／μ１の血球計数に添加し、室温において２〜５時間インキュベートする。
３．商用２５％グルタルアルデヒド製品を好酸球低張溶液に添加することによって、約０．１〜０．８％のグルタルアルデヒド含量を有するグルタルアルデヒド固定試薬を調製する。グルタルアルデヒドの好ましい濃度はほぼ０．２％である。
４．洗浄した赤血球を測定した量の工程３の固定剤に１：５０の希釈において添加する。密閉した容器に移し、この容器を室温において１８〜２４時間ゆっくり回転する。
５．上清流体を取り出し、血球をＰＢＳで数回洗浄する。
６．洗浄した赤血球を好酸球ヘモグロビン変性処理溶液に１：１０希釈において添加する。密閉した容器に移し、この容器を室温において２〜４時間ゆっくり回転する。
７．上清流体を取り出し、血球を好酸球後処理洗浄溶液で数回洗浄して、好酸球ヘモグロビン変性処理溶液を除去する。次いで、適当な貯蔵用溶液の中に懸濁させる。
８．好酸球類似体を単独で放置するために、洗浄固定した血球を本発明の懸濁媒質の中に再懸濁させ、濃度を調節して正常のヒト血液中のヒト好酸球の濃度にシミュレートする。
９．多血液学的コントロール製品のために、他の血液学的組成物および多パラメーターの血液学的コントロール製品に所望の類似体を有する本発明の懸濁媒質の中に洗浄固定した血球を、好酸球の測定に適当な濃度において、添加する。
１０．適当な安定剤を使用して、固定した血球を６カ月を超える期間の間貯蔵することができる。
【０１４３】
実施例４
アリゲーターの赤血球からの好中球類似体
下記は、好中球類似体を得るために、アリゲーターの赤血球を処理するための好ましい試薬および推奨される特定の手法の工程の特定の実施例である。処方物および手法は単なる例示であり、そして本発明においてこの開示に従い、他の成分、比率および手法を使用することができることを理解すべきである。
好中球低張溶液
１．１塩基性リン酸ナトリウム：０．２３ｇ
２．２塩基性リン酸ナトリウム：５．３２ｇ
３．蒸留水で１リットルにする：pHほぼ８．０；浸透圧濃度４５〜６５mOsm／kg。
【０１４４】
血球のための洗浄溶液（ＰＢＳ）、実施例１に記載されている通りである。
手  法
１．約４００〜５００fLの平均細胞体積範囲を有するアリゲーターの赤血球を選択する。充填したアリゲーターの赤血球をＰＢＳで洗浄する。
２．商用２５％グルタルアルデヒド製品を好中球低張溶液に添加することによって、約０．１〜０．８％のグルタルアルデヒド含量を有するグルタルアルデヒド固定試薬を調製する。グルタルアルデヒドの好ましい濃度はほぼ０．４％である。
３．洗浄した赤血球を測定した量の工程３の固定剤に１：５０の希釈において添加する。密閉した容器に移し、この容器を室温において１８〜２４時間ゆっくり回転する。
４．上清流体を取り出し、血球をＰＢＳで数回洗浄し、適当な貯蔵用溶液の中に再懸濁させる。
５．充填した血球を非イオン界面活性剤溶液に添加する。前記溶液はドナー血球の体積を標準化する傾向がある。この溶液は、１リットルの蒸留水中の０．５ｇのほぼ１３．５のＨＬＢを有するオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎTMＸ−１００、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．）を含んでなる。
６．上清流体を取り出し、血球をＰＢＳで数回洗浄し、適当な貯蔵用溶液の中に再懸濁させる。
７．好中球類似体を単独で放置するために、洗浄固定した血球を本発明の懸濁媒質の中に再懸濁させ、濃度を調節して正常のヒト血液中のヒト好中球の濃度にシミュレートする。
７．多血液学的コントロール製品のために、他の血液学的組成物および多パラメーターの血液学的コントロール製品に所望の類似体を有する本発明の懸濁媒質の中に洗浄固定した血球を、好中球の測定に適当な濃度において、添加する。
８．適当な安定剤を使用して、固定した血球を６カ月を越える期間の間貯蔵することができる。
【０１４５】
実施例５
ヒト白血球からの白血球類似体の５つの下位集団
１．全血をデキストラン（分子量１００，０００〜５０，０００）溶液に１：２０の希釈において添加し、重力手段により１〜３時間沈降させる。
２．白血球、血小板および多少の残留赤血球を含む上清を取り出す。
３．工程２の製品を３００ＲＣＦ以下において約１０分間遠心する。血小板を吸引して、白血球のボタン、残留赤血球、および血球を再懸濁させる少量の血漿を残す。
４．適当な溶解剤、例えば、水を添加して、白血球から赤血球を溶解する。
５．工程４の製品を遠心し、上清を除去し、充填された白血球を残す。充填された白血球をほぼ等しい体積の生理食塩水の中に再懸濁させる。
６．白血球を適当な等浸透圧固定溶液、例えば、５％ホルムアルデヒドおよび９５％ＰＢＳ（容量％）に１：１０の希釈において添加し、密閉した容器に移し、この容器を室温において１８〜３０時間ゆっくり回転する。
７．ほぼ０．１％濃度のグルタルアルデヒドを有するグルタルアルデヒト固定溶液を１：１希釈においてプールに添加し、さらに８〜１２時間固定を続ける。
８．上清流体を取り出し、血球をＰＢＳで数回洗浄し、適当な貯蔵用溶液の中に再懸濁させる。
９．５つの下位集団の白血球類似体のアセンブリーを単独で放置するために、洗浄固定した血球を本発明の懸濁媒質の中に再懸濁させ、濃度を調節して正常のヒト血液中のヒト白血球の濃度にシミュレートする。
１０．多血液学的コントロール製品のために、他の血液学的組成物および多パラメーターの血液学的コントロール製品に所望の類似体を有する本発明の懸濁媒質の中に洗浄固定した血球を添加し、血球計数は白血球比率を測定するために適当である。
１１．適当な安定剤を使用して、固定した血球を６カ月を超える期間の間貯蔵することができる。
【０１４６】
実施例６
正常ヒト血液試料中の白血球の標的とする組成をシミュレートするためのサブアセンブリーにおいて、下記量の個々の成分を使用する：
原溶液
０．１５０Ｌ  実施例１  リンパ球              ５００×１０３／μｌ
０．０４０Ｌ  実施例２  単球                  ５００×１０３／μｌ
０．０３０Ｌ  実施例３  好酸球                ５００×１０３／μｌ
０．２８０Ｌ  実施例４  好中球                ５００×１０３／μｌ
０．５００Ｌ  希釈剤    リン酸緩衝生理食塩水
４つの白血球集団の最終のアセンブリーにおいて、上清流体を取り出し、次いで１．０リットルの８００mgのコレステロールの最終濃度を有するＭｏｄｕｃｙｔｅTMの水溶液の中に血球を再懸濁させる。
【０１４７】
既知の適当な安定剤を添加して、このアセンブリーを約６カ月までの間貯蔵することができる。
【０１４８】
白血球集団についての比および合計の血球計数を調節して、ヒト血液における病理学的状態、ならびに正常な状態を表すことができる。これらの組成物は、特にコールター原理を用いる自動化粒子分析器具のための、コントロール製品および目盛り定め製品において同様に有効である。さらに、ラテックス粒子をコントロール製品に添加して、器具の動作をさらに指示することができる、単一のコントロール製品を形成することができる。
【０１４９】
その後、最終の赤血球、白血球および血小板の計数、ならびにヘモグロビン含量およびヘマトクリットが所望の範囲の中に入るような比率において、未処理のヒト赤血球、シミュレートした白血球、および安定化またはシミュレートした血小板の懸濁液を添加することができる。
【０１５０】
安定化された血小板はこの分野において知られている方法により調製する。有効な方法は下記のものを包含する：
１．前もって選択した範囲のpHおよび浸透圧濃度に維持された水溶液中の、ヨードアセトアミドおよびイミノジ酢酸またはそれらの溶質、ならびに適合性の静菌剤の組み合わせ、米国特許第４，４０５，７１９号に記載されている。
【０１５１】
２．０．１〜５％の濃度のグルタルアルデヒドおよびある種の異性体の線状アルコールのエトキシレートの混合物である非イオン界面活性剤を含有する固定剤−安定化組成物、米国特許第４，３８９，４９０号にいっそう詳しく記載されている。
【０１５２】
３．ヒト血小板のそれに近い大きさ範囲および体積安定を有するように必要に応じて安定化され、結合されそして配合された赤血球を含んでなるヒト血小板類似体、米国特許第４，２６４，４７０号に記載されている。
【０１５３】
血液学的パラメーターの各々について値を変化させて、異常に低い状態および異常に高い状態を表すことができる。正常血液中の白血球計数は５，０００〜１１，０００／マイクロリットル（μｌ）であり、リンパ球の値は２０〜４０％であり、単核細胞の値は１０％より少なく、顆粒球の値は６０〜８０％であり、好酸球の値はほぼ５％であり、そして好塩基球はほぼ２％より少ない。赤血球についてのヒト血液における正常な範囲は、４，０００，０００〜５，０００，０００血球／μｌである。正常ヘモグロビンの値は１２〜１６ｇ／１００mlである。用語「ヘマトクリット」は、充填された赤血球の体積／白血球の体積の比として定義される。ヒトにおける正常の比は約４５％である。平均血球値は、充填赤血球の体積（ml／リットルの血液）／赤血球（１０６／μｌ）の比である。平均血球ヘモグロビン濃度は、充填赤血球の１００ml当たりのヘモグロビンの平均重量を示す指数（％）である。平均血球ヘモグロビンは、ヘモグロビン含量（ｇ／ｌ）／赤血球（１０６／μｌ）の比である。
【０１５４】
以上の明細書において、本発明を例示の目的で詳細に説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで本明細書における詳細において種々の変化および変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】試験すべきコア中の希釈血液試料の導電率と比較した白血球の計数比の比較である。
【図２】溶解試薬およびクエンチ試薬で希釈した後、分析する血液試料の浸透圧濃度と比較した好中球のＤＣ平均の比較である。
【図１】
2005128029.tif 000004
【図２】
2005128029.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月19日(2005.1.19)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１種の白血球下位集団類似体、ここで前記白血球下位集団類似体は血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように処理された赤血球から誘導されており、そして前記類似体は器具の動作において使用される試薬に対して応答性に止まる、および
ｂ．プラスチックビーズ、
を含んでなる血液学的コントロール製品。
【請求項２】
前記白血球下位集団類似体が少なくとも１種の好中球類似体を含んでなる、請求項１に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項３】
前記コントロール製品が溶解可能な赤血球の添加をさらに含んでなる、請求項１に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項４】
前記コントロール製品が少なくとも３つの異なる白血球下位集団類似体をさらに含んでなる、請求項１に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項５】
前記コントロール製品が血漿物質の水溶液をさらに含んでなる、請求項４に記載の血液学的コントロール製品。
【請求項６】
前記類似体が赤血球に由来する、請求項１〜５のいずれか１項記載の血液学的コントロール製品。
【請求項７】
前記ビーズがラテックス、ポリスチレン又はその他のプラスチック材料から成る、請求項１〜６のいずれか１項記載の血液学的コントロール製品。
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月3日(2005.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ａ．少なくとも１種の白血球下位集団類似体、ここで前記白血球下位集団類似体は血液学的試験手法において使用される溶解試薬による分解に対して耐性であるように処理された血球から誘導されており、そして前記類似体は器具の動作において使用される試薬に対して応答性に止まる、および
ｂ．プラスチックビーズ、
を含んでなる血液学的コントロール製品。