(57)【要約】      （修正有）【課題】  NF-κBのシグナル伝達系において、NAKの活性化に関与する蛋白質を見出す。【解決手段】  NAKと特異的に結合してその活性化を誘導する蛋白質NAP1、即ち特定の配列で示すアミノ酸配列を有する蛋白質及びその遺伝子を見出した。また、前記NAP1のNAK結合ドメインを含む部分蛋白質、例えば、特定の配列で示すアミノ酸配列の158−270残基のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びそれらの遺伝子配列をも提供する。更に、NAKとNAP1の結合阻害剤のスクリーニング方法をも提供する。NAKとNAP1の結合阻害剤は、リウマチ関節炎，腸炎，喘息，皮膚炎，自己免疫疾患等に有効である。【選択図】  図１
2005124541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)に示すNAP1蛋白質。
(a)配列番号１に示すアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
【請求項２】
以下の(a)〜(h)のいずれかに示すNAP1部分蛋白質。
(a)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−270残基のアミノ酸配列を含み、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(b)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−302残基のアミノ酸配列を含み、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(c)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−270残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(d)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(e)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−392残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(f)配列番号１に示すアミノ酸配列の102−392残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(g)配列番号１に示すアミノ酸配列の102−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(h)配列番号１に示すアミノ酸配列の1−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
【請求項３】
請求項１又は２に記載の蛋白質に対するモノクローナル抗体
【請求項４】
以下の(a)又は(b)に示すNAP1蛋白質をコードするＤＮＡ。
(a)配列番号１に示すアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
【請求項５】
以下の(a)〜(h)のいずれかに示すNAP1部分蛋白質をコードするＤＮＡ。
(a)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−270残基のアミノ酸配列を含み、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(b)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−302残基のアミノ酸配列を含み、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(c)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−270残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(d)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(e)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−392残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(f)配列番号１に示すアミノ酸配列の102−392残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(g)配列番号１に示すアミノ酸配列の102−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
(h)配列番号１に示すアミノ酸配列の1−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質
【請求項６】
以下の(a)又は(b)のＤＮＡ。
(a)配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNAKとの結合能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４〜６に記載のＤＮＡを含有する組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組み換えベクターにより形質転換された細胞。
【請求項９】
細胞が哺乳類由来である、請求項８に記載の形質転換された細胞。
【請求項１０】
細胞が昆虫由来である、請求項８に記載の形質転換された細胞。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の蛋白質の、NAKと結合してその活性化を誘導する蛋白質としての使用。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の蛋白質と試験化合物とNAKとを混合する工程、及び、前記蛋白質とNAKとの結合を調べその結合を阻害する試験化合物を選択する工程を含む、NAKとNAP1の結合阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
NAKとNAP1の結合阻害剤が、リウマチ関節炎，腸炎，喘息，皮膚炎，自己免疫疾患，アルツハイマー，動脈硬化，癌，ウイルス性炎症，後天性免疫不全症候群(AIDS)，アレルギー，急性呼吸窮迫症候群(ARDS)，変形性関節症，毒素ショック，心筋梗塞，アトピー性皮膚炎，鼻炎，カタル，エリテマトージス，乾癬，大腸炎，全身性炎症反応症候群(SIRS)，敗血症，多発性筋炎，皮膚筋炎，混合結合組織病(MCTD)，シェーグレン症候群及び痛風からなる群から選択される１以上の疾患の治療剤である、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ分野に属するもので、炎症性サイトカインであるTNF-αやIL-1の遺伝子発現の制御に関与する転写因子NF-κBの上流に位置するNAP1(NAK-associated protein 1)蛋白質とこれをコードする核酸、さらにこれらを用いた方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
炎症性サイトカインであるTNF-αやIL-1などの多くは、病原体の感染や自己免疫反応によって種々の細胞より産生され、生体内で幅広い生理活性を示す（Hill, C.S. and Treisman, R., 1995, Cell）。これらの遺伝子発現の制御には、転写因子NF-κBが関与していることが知られている（Verma, I.M. et al., 1995, Genes Dev.）。NF-κBの活性化には、抑制因子I-κB(Inhibitor of NF-κB)およびIKK(I-κB kinase)複合体が重要な役割を担っている。NF-κBは休止状態では細胞質内でI-κBと複合体を形成しているが、細胞外より刺激が伝わるとまずIKKがリン酸化されて活性化し、活性化されたIKKがこのI-κBをリン酸化する。I-κBがリン酸化を受けると、NF-κBは複合体より遊離して核内に移行する。核内に移行したNF-κBは、自身が認識するDNA配列と結合し、様々な遺伝子の転写が開始される。
【０００３】
一方、NAK(NF-κB activating kinase、別名T2KもしくはTBK1)は、腫瘍壊死因子α(TNF-α)や血小板由来増殖因子(PDGF)の刺激によって活性化され、IKKをリン酸化する（Tojima, Y. et al., 2000, Nature）。その活性化の詳細なメカニズムは明らかではなく、これを解明するためには、まずNAKと相互作用する蛋白質を同定することが必要である。
【０００４】
【非特許文献１】Hill, C.S. and Treisman, R., 1995, Cell
【非特許文献２】Verma, I.M. et al., 1995, Genes Dev.
【非特許文献３】Tojima, Y. et al., 2000, Nature
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
NF-κBによって転写制御される遺伝子の発現を効率よく且つ刺激特異的に制御するためには、そのシグナル伝達において、より刺激受容体に近い段階での制御が理想的である。ところが、NF-κB のシグナル伝達系においては、NAKまでしか明らかになっておらず、その上流に位置する蛋白質はこれまで見い出されていない。そこで、本発明は、NAKの活性化に関与する蛋白質を見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、NAKと相互作用する蛋白質を探索し、これと特異的に結合してその活性化を誘導する蛋白質とその遺伝子を発見し、本蛋白質をNAP1(NAK-associated protein 1)と名付けた。即ち、本発明は、NAKと特異的に結合してその活性化を誘導する蛋白質NAP1に関するものであり、(a)配列番号１に示すアミノ酸配列からなる蛋白質、及び(b)配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質を提供する。
【０００７】
本発明はまた、前記NAP1のNAK結合ドメインである部分蛋白質もしくはNAK結合ドメインを含む部分蛋白質、例えば、(a)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−270残基のアミノ酸配列を含み、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質、(b)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−302残基のアミノ酸配列を含み、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質、(c)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−270残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質、(d)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質、(e)配列番号１に示すアミノ酸配列の158−392残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質、(f)配列番号１に示すアミノ酸配列の102−392残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質、(g)配列番号１に示すアミノ酸配列の102−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質、及び(h)配列番号１に示すアミノ酸配列の1−302残基のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質を提供するものである。
【０００８】
本発明は更に、前記NAP1蛋白質又はそのNAK結合ドメインである部分蛋白質、もしくは、そのNAK結合ドメインを含む部分蛋白質の、NAKと結合してその活性化を誘導する蛋白質としての使用及びNF-κBのシグナルを活性化する蛋白質としての使用に関するとともに、それら蛋白質に対するモノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
また、本発明は、前記蛋白質又は部分蛋白質をコードするＤＮＡをも提供する。そのようなＤＮＡは、(a)配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、及び、(b)配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNAKとの結合能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、前記NAP1部分蛋白質をコードするＤＮＡである。
【００１０】
本発明は、これらのＤＮＡから更に発展して、これらＤＮＡを含有する組み換えベクター、これらＤＮＡにより形質転換された細胞をも提供する。ここで、細胞としては、哺乳類由来細胞や昆虫由来細胞等を使用することができる。
【００１１】
本発明は、これらNAP1蛋白質、遺伝子のみならず、関係する様々な方法を提供するものである。即ち、１つには、NAP1蛋白質又はその部分蛋白質と試験化合物とNAKとを混合する工程、及び、前記蛋白質とNAKとの結合を調べその結合を阻害する試験化合物を選択する工程を含む、NAKとNAP1の結合阻害剤のスクリーニング方法に関する。NAKとNAP1の結合阻害剤は、リウマチ関節炎，腸炎，喘息，皮膚炎，自己免疫疾患，アルツハイマー，動脈硬化，癌，ウイルス性炎症，後天性免疫不全症候群(AIDS)，アレルギー，急性呼吸窮迫症候群(ARDS)，変形性関節症，毒素ショック，心筋梗塞，アトピー性皮膚炎，鼻炎，カタル，エリテマトージス，乾癬，大腸炎，全身性炎症反応症候群(SIRS)，敗血症，多発性筋炎，皮膚筋炎，混合結合組織病(MCTD)，シェーグレン症候群及び痛風からなる群から選択される１以上の疾患の治療剤として使用される。
【００１２】
本発明は他に、(1)NAP1蛋白質の活性測定法、(2)NAP1の発現調節あるいはNAP1とNAKの会合調節による、NF-κBの活性化が関与する遺伝子転写および蛋白質発現の制御方法、(3)NAP1遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能なハイブリダイゼーションプローブとプライマー、(4)NF-κBの活性化に至るシグナル伝達経路の研究方法をも提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るNAP1は、NF-κBに至るシグナル伝達経路の研究用ツールとして有用である。また、NF-κBの転写制御の異常による病態の治療や予防を目的とした薬物開発において、NAP1は新規の薬物標的となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、NAKと特異的に結合してその活性化を誘導する蛋白質NAP1に関するものであり、(a)配列番号１に示すアミノ酸配列からなる蛋白質、及び(b)配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NAKとの結合能を有する蛋白質を提供する。これは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる蛋白質のみならず、その一部が欠失、置換及び／または付加された蛋白質であっても、NAKとの結合能を有する蛋白質であれば、本発明の技術的範囲に含むことに他ならない。アミノ酸の欠失、置換及び／または付加については、当業者の技術常識により、容易に実施することができる。特に、後述のNAK結合ドメイン以外の部分においては、改変の自由度は高い。
【００１５】
本発明はまた、前記NAP1のNAK結合ドメインである部分蛋白質をも提供するものである。そのような部分蛋白質の最小領域は、配列番号１に示すアミノ酸配列の158−270残基のアミノ酸配列からなるものである。これについても、当業者の技術常識に基づいて、１もしくは数個のアミノ酸を欠失、置換及び／または付加することができる。このNAK結合ドメインの最小領域を含むNAP1の部分蛋白質であれば、NAK結合能を有する蓋然性が極めて高いため、それらの部分蛋白質も本発明の技術的範囲に含まれる。ただし、前記最小領域のN末端側に延長されたNAP1部分蛋白質においては、若干、NAKとの結合能が弱くなる傾向にあるため、アミノ酸配列を延長する場合は、C末端側を延長するのが好ましい。そのようなNAP1部分蛋白質としては、配列番号１に示すアミノ酸配列の158−302残基のアミノ酸配列からなる蛋白質を例示することができる。このように、NAK結合ドメインの最小領域のC末端側に延長されたNAP1部分蛋白質であれば、N末端側の延長によるNAKとの結合能低下を防止することも可能である。
【００１６】
本発明は更に、前記蛋白質又は部分蛋白質をコードするＤＮＡをも提供する。そのようなＤＮＡは、(a)配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、及び、(b)配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNAKとの結合能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、前記NAP1部分蛋白質をコードするＤＮＡである。即ち、NAP1蛋白質のみならず、NAKとの結合能を有する全てのNAP1部分蛋白質をコードするＤＮＡを含むものである。ストリンジェントな条件下でとは、当業者に周知のハイブリダイゼイションの条件下でということである。
【００１７】
以下に、本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明で提供される遺伝子や蛋白質の全部あるいは一部は、以下の方法で作製、回収および同定された遺伝子や蛋白質に限定されるものではない。
【００１８】
(1)NAP1遺伝子のクローニング
NAP1は、NAKと相互作用する蛋白質として同定することができる。そこで、例えば、酵母two-hybrid法を用いてその検索を行うことができる。酵母two-hybrid法は、酵母の転写因子GAL4が、DNA結合ドメイン(GAL4-DBD)と転写活性化ドメイン(GAL4-TAD)に分けることができる特性を利用している。即ち、NAKと相互作用する蛋白質を検索する場合であれば、GAL4-DBDとNAKとのキメラ蛋白質を構築し、一方でGAL4-TADとNAKと相互作用する可能性のある蛋白質とのキメラ蛋白質を構築し、両者を酵母で同時に発現させる。NAKと相互作用する蛋白質が発現しているコロニーでのみ、GAL4の活性化が起こり、下流のβ-ガラクトシダーゼの発現が増強される。陽性となったコロニーは、導入遺伝子の配列決定や常法に従った遺伝子クローニングを行う（Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL : Sambrook, J. and Russell, D.W., Cold Spring Harbor Laboratory）。相互作用する蛋白質の検索対象遺伝子群としては、Stratagene社やClontech社より市販されている種々のヒト臓器由来cDNAライブラリや細胞由来cDNAライブラリなどを用いることが可能である。
【００１９】
(2)NAP1蛋白質の発現
次に、クローニングされた遺伝子を一般的な組み換え技術を用いて発現ベクターに組み込み、これで大腸菌や培養細胞などを形質転換すれば、遺伝子工学的にNAP1蛋白質を発現させることができる。組み換えベクターを用いて動物の体内で産生、例えばNAP1組み換えバキュロウイルスをカイコ幼虫に感染させて産生させ、これを抽出してもよい。あるいはRoche Diagnostics社のラピッドトランスレーションシステム(RTS)などの一般に利用可能な無細胞蛋白質発現系を用いることもできる。
【００２０】
NAP1蛋白質は、精製や検出を容易にするために、形質転換に際して、そのC末端あるいは好ましくはN末端に一般に利用可能な各種のタグ、例えばポリヒスチジンタグ、Mycタグ(Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu)あるいはGSTタグ(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)等が組み込まれたベクターを用いれば、これらタグとの融合蛋白質として発現させることもできる。
【００２１】
NAP1蛋白質の各部位の機能を調べるためには、クローニングされたNAP1をコードする遺伝子の一部分のみをベクターに組み込み、欠損変異体として発現させることもできる。遺伝子の一部のみを取り出すには、クローニングされた配列を適当な制限酵素で切断し、新たなベクターにライゲーションする方法や、翻訳領域の途中の配列に特異的なプライマーを用いたPCRによって増幅した目的断片をベクターに組み込む方法などがある。
【００２２】
以上のように、NAP1蛋白質を得るには、組み換え技術を用いて遺伝子工学的に産生するのが容易であるが、本蛋白質の全部もしくは一部を哺乳類、好ましくはヒトの組織あるいは細胞から単離精製しても、あるいは化学的に合成してもかまわない。
【００２３】
(3)NAP1蛋白質の回収および検出
こうして発現させた融合蛋白質は、抗c-Myc抗体や抗GST抗体を用いることによってより容易に回収できる。具体的には、これらの抗体を適当な担体に固定し、発現細胞溶解液と共にインキュベートすることによってNAP1融合蛋白質を捕捉し、担体を洗浄して非特異的に結合した蛋白質などを除去した後に、界面活性剤や塩溶液で溶出、あるいはタグを切断して溶出し、回収すればよい。より簡便な方法として、免疫沈降法によって沈殿・濃縮することもできる。
【００２４】
NAP1蛋白質の検出は、ウエスタンブロット法が簡便である。まず、NAP1蛋白質を含む溶液をSDS-PAGEで分離した後、PVDFやニトロセルロースなど蛋白質を保持できる膜に転写する。転写された蛋白質と抗タグ抗体とをこの膜上で反応させ、さらにペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどで標識されたプロテインA、プロテインGあるいは適当な二次抗体などと反応を行い、標識に応じた方法で検出すればよい。検出法は、4-クロル-1-ナフトールと過酸化水素による発色法や、ECL Westernblot Detecting System(Amersham社)などによる化学発光法などが広く用いられており、いずれの方法も利用可能である。
【００２５】
以上の方法は、NAP1の同定後に抗NAP1抗体を作成すれば、これを用いても同様に回収や検出ができる。また、NAP1蛋白質の異なる2つの部位を認識する抗体を作成し、サンドイッチELISA(Enzyme-Linked ImmunoSolvent Assay)法によって検出することもできる。放射性同位元素で抗体を標識すれば、RIA(RadioImmunoAssay)法を用いることも可能である。抗NAP1抗体および標識抗体を市販の細胞膜透過試薬や適当な界面活性剤を用いて細胞内に浸透させれば、NAP1蛋白質の細胞内染色が可能であり、NAP1蛋白質細胞内局在や刺激による分布変化などの研究に用いることができる。
【００２６】
(4)NF-κB活性化シグナルの確認
本発明のNAP1蛋白質は、転写因子NF-κBのシグナルの上流において、NAKと結合することによりこの経路の活性化を制御している。よってNAP1蛋白質のシグナルを検出するにはNAKとの結合を検出すればよい。その最も簡便な方法は免疫共沈法である。これは、NAP1とNAKが共存する状態で、NAP1に対する抗体を用いて免疫沈降を行い、NAKも共に沈降してくるかどうかを、NAKに対する抗体を用いたウエスタンブロット法で検出する方法である。沈降と検出で用いる抗体は逆の組み合わせでもかまわない。さらに他の蛋白質との複合体形成を調べる場合には，調べたい蛋白質に対する抗体で検出すればよい。免疫沈降および検出に用いる抗体は、NAP1、NAKおよび複合体を構成する候補蛋白質が各種のタグとの融合タンパクとして発現させた物であれば、それらタグに対する抗体でもかまわない。
【００２７】
さらに、NAP1によるこのシグナル伝達系の活性化の確認は、NF-κB特異的な遺伝子発現を検出することでも可能である。NF-κBがその転写を制御している遺伝子は、プロ炎症性因子であるTNF-αやIL-1をはじめとして多種多様であり、それらのmRNA転写や翻訳後の蛋白質を検出すればよい。mRNAの検出法は、ノザンブロット法、リボヌクレアーゼプロテクション法（Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL : Sambrook, J. and Russell, D.W., Cold Spring Harbor Laboratory）、競合PCR法、リアルタイム定量PCR法、DNA-ELISA法、レポーターアッセイなどが利用可能であり、リアルタイム定量PCR法が簡便かつ定量性が高く、広く用いられている。複数の遺伝子発現を同時に検出する方法では、SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法（Velculescu, V.E. et al., 1995, Science）やDNAマイクロアレイ法（Brown, P.O. et al., 1999, Nature Genet.）などが用いられており、DNAマイクロアレイは近年の技術的進歩によって特異性や定量性が飛躍的に上昇し、用いられる機会が増えている。翻訳後の蛋白質を検出する場合は、ウエスタンブロット法、ELISA法、RIA法などが利用できる。
【００２８】
次に、NF-κB特異的な転写活性の変化を検出するためのレポーターアッセイについて説明する。これは、NF-κBが認識する配列の下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を組み込んだベクターで細胞を形質転換し、その細胞において組み込んだレポーターの酵素活性を測定する方法である。組み込む酵素などはルシフェラーゼの他、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリフォスファターゼ (SEAP:SEcreted Alkaline Phosphatase) やGFPなどの蛍光蛋白質などが用いられ、それぞれ対応した酵素活性や蛍光を検出すればよい（Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL : Sambrook J. and Russell D.W., Cold Spring Harbor Laboratory）。
【００２９】
NF-κBの活性化の伝達系において、NAP1の直下はNAKであるが、NAK以降NF-κBまでは公知である。よって、途中の蛋白質の活性などを検出することも可能である。例を挙げれば、直下NAK蛋白質の活性型であるセリンリン酸化したNAKをこれに特異的な抗体で検出する方法、さらに下流のIKKβのセリンリン酸化を抗リン酸化IKKβ抗体で検出する方法、I-κBのセリンリン酸化を抗リン酸化I-κB抗体で検出する方法、I-κBの分解を抗I-κB抗体で検出する方法、核抽出液を調製してNF-κBの核内移行および標的核酸配列への結合をゲルシフトアッセイで検出する方法などがある。
【００３０】
(5)NAP1蛋白質の発現調節
NAP1蛋白質が生理的条件下でどのような役割を果たしているか、またNF-κBの活性化を誘導する情報伝達における重要性を評価するためには、NAP1蛋白質の機能、または発現を増強あるいは阻害し、NAP1の作用が正常とは異なる条件下で種々の反応を観察することが極めて重要である。例えば、NAP1を介したシグナルを増強するためには、ベクターにNAP1の遺伝子を組み込み、細胞内で過剰発現させる、あるいはトランスジェニック技術によって生体内で発現を増強させる方法などがある。
【００３１】
一方、NAP1の機能を阻害する方法としては、前述したNAP1の一部だけを組み換えた欠失変異体や機能発現に重要なアミノ酸をアラニンなどの別のアミノ酸に置換した変異体を発現させる方法がある。NAP1蛋白質の発現を阻害する方法で最も一般的なのは、遺伝子ターゲティングである（Capecchi, M.R., 1989, Science）。遺伝子ノックアウト動物を作成する基本技術であるこの方法は、マウス初期胚の内部細胞塊由来で全ての臓器に分化する能力を維持したまま培養できる胚性幹細胞(ES細胞)に、目的遺伝子の一部あるいは全部を欠損させたターゲティングベクターを組み込み、ES細胞の染色体上で相同組み替えによって変異を導入するものである。相同組み替えが起こったES細胞クローンを単離同定し、これを妊娠マウスより取り出した胚盤胞に注入した後に、仮親となるマウスの子宮に移植することでキメラマウスが得られる。さらにこのキメラマウスの生殖細胞が組み換えES細胞より分化していれば、子孫に変異遺伝情報を伝えることが可能となり、目的遺伝子のノックアウトマウスが得られる。
【００３２】
より簡便に遺伝子の発現抑制を行う方法としては、アンチセンス、リボザイム、キメラオリゴなどの技術が用いられてきたが、これらの技術は標的遺伝子の性質に依存する部分が多く、配列や分子設計は試行錯誤を繰り返さなければならなかった。近年、この問題を解決できる技術としてRNAi(RNA interference)が確立された。RNAiにおいて阻害を行うのは標的遺伝子の配列に特異的な短い二本鎖RNA(siRNA)であり、これを細胞に導入するとmRNA中の相補的な配列を認識し、認識されたmRNAは細胞内のエンドヌクレアーゼによって切断される。siRNAは他のmRNAの切断に再利用される（Scherr, M. et al., 2003, Curr Med Chem.）（Tijsterman, M. et al., 2003, Annu Rev Genet.）。
【００３３】
(6)NAP1蛋白質の阻害剤の探索
NAP1は、NAKと結合することによって、NF-κBへのシグナルを活性化する。それ故、この結合を調節できる物質は、NF-κBシグナルを調節することが可能であり、この経路の研究、および種々の炎症性疾患をはじめとするNF-κBが関与する疾病の治療において、極めて重要である。NAP1とNAKとの結合を阻害する物質の探索は、この2つの蛋白質と阻害候補物質とを共存させ、結合が起こるかどうかを検出すればよい。例を挙げれば、免疫共沈法とウエスタンブロット法とを組み合わせて、阻害候補物質の存在下でNAP1とNAKが共沈するかどうかを調べればよい。あるいはNAKを担体やアッセイプレート等に固定し、一方でNAP1を放射性同位体等でラベルすれば、バインディングアッセイが可能である。この場合、NAKを固定し、NAP1をラベルしても構わない。さらに、これらの探索は、完全長のNAP1およびNAK蛋白質のみならず、これらの蛋白質の結合に関与するドメインやペプチドのみでも可能である。他に、NAP1の阻害は、その発現自身を阻害してもよく、アンチセンス技術等が利用可能である。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。
（1）酵母two-hybrid法を用いたNAP1 cDNAのクローニング
pBTM116-NAKベクターはpcDNA3.1Myc/HisA-NAKをテンプレートとしてプライマーS-1; 5'-AAA CCC GGG ATG CAG AGC ACT TCT AAT CAT CTG-3'とAS-1; 5'-AAA GTC GAC CTA AAG ACA GTC AAC GTT GCG AAGを用いてPCRを行い、全長NAK cDNAを含むPCR産物をSmaI/SalIで消化した。消化したPCR産物をpBTM116ベクターのSmaI/SalIサイトに挿入して構築した。このpBTM116-NAKで酵母L40株(LYS::lexA-HIS3)に形質転換し、さらにその株をHeLa細胞のcDNAライブラリ(Clontech)で形質転換した。陽性コロニーをヒスチジン、ロイシン、トリプトファンを欠く酵母合成培地で選択し、次にそれらコロニーのβ-ガラクトシダーゼ活性を確認した。ヒトNAP1のcDNAは、上記のtwo-hybridクローンより得られたプローブを用いて、ヒト精巣cDNAのλファージライブラリ(Stratagene)より常法により確認した。ヒトNAP1 cDNAは、予測された翻訳領域中に停止コドンとATG開始コドンを読み枠のシフトがない形で含んでいる（図1）。
【００３５】
（2）ノザンブロット法によるNAP1を発現する組織の分析
ノザンブロッティングに用いるプローブには、pcDNA3.1/myc-HisA-NAP1をEcoRIとXhoIで制限酵素処理して得られた約1200bpの断片を用いた。この断片をmultiple DNA labeling systems(アマシャム社)を用いて[alpha-32P]dCTP(222TBq/mmol: ニューイングランドニュークレア社)によりラベルし、Multiple Tissue Northern Blots （クロンテック社）のフィルターに対して、5xSSPE, 5xDenhardt’s, 50%ホルムアミド、0.5%SDS, 100μg/ml熱変性サケ精子DNAを含む水溶液で、42℃にて24時間ハイブリダイゼーションを行った。その結果、NAP1転写産物は検索した全ての臓器(心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸および末梢血リンパ球)由来のcDNA中に、3.2および4.2kbの2つのバンドとして検出された（図2）。
【００３６】
（3）NAP1蛋白質の細胞内免疫蛍光染色
NAP1蛋白質のヒト培養細胞における局在を調べるために、Sf9細胞で発現させた組み換えヒトNAP1蛋白質を抗原として、常法に従ってNAP1蛋白質に対するモノクローナル抗体を作成した。より具体的には、組み換えヒトNAP1蛋白質の50μg PBS溶液と2 mgのアルミニウムゲルとBordetella pertussis 109細胞不完全アジュバントとのエマルションを調製し、これを6週令の雌Balb/cマウスに1週間の間隔で腹腔内に免疫した。2週間目に同量のNAP1タンパク質を尾静脈より注入してブーストし、その4日後にNAP1に対する抗体価が上昇していることをELISAで確認した。このマウスの脾細胞を分離し、P3.U1マウスミエローマ細胞株とポリエチレングリコール溶液中で細胞融合させた。融合細胞をHAT選択培地(0.1mM ヒポキサンチン、0.4μM アミノプテリン、16μM チミジンおよび10% ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地)に1穴あたり1.4 x 105細胞で96穴培養プレート(住友ベークライト)に播種した。増殖してきた融合細胞は、限界希釈法でのサブクローニングを2回繰り返した後、プリスタン処理したヌードマウス(Balb/c nu/nu; 日本クレア)に接種し、腹水を回収した。腹水中に産生されたモノクローナル抗体は、カプリル酸および硫酸アンモニウム沈殿によって精製した。
【００３７】
このモノクローナル抗体を用いて、MDAH041ヒト線維芽細胞株におけるNAP1蛋白質の局在を調べた。即ち、同細胞を4% パラホルムアルデヒドで固定後、0.2% Triton X-100で膜透過化処理した。抗NAP1モノクローナル抗体溶液(200倍希釈)中でインキュベートした後、Cyanin-3標識抗マウスIgGヤギ抗体(200倍希釈、Jackson Immuno Research)で染色し、蛍光顕微鏡を用いて検出した。その結果、蛍光はMDAH041細胞の細胞質に検出された。尚、抗NAP1モノクローナル抗体の代わりに正常マウス血清を用いた場合には、蛍光は認められなかった。これより、NAP1は、MDAH041細胞においては細胞質に存在することが示された（図3）。
【００３８】
（4）NAKとの結合に必要なNAP1蛋白質の最小領域の確認
NAP1は、酵母two-hybrid法でNAKと相互作用する蛋白質として見いだされた。よってNAP1とNAKが結合することは明らかであるが、その結合に必要となるNAP1の領域は不明である。そこで本発明者らは、NAP1全領域もしくは一部の領域を欠く変異NAP1とGSTとの融合蛋白質を大腸菌で発現させ、Sf9細胞において別に発現させたNAKとのインビトロバインディングアッセイを行った。
【００３９】
まず、種々の変異体を構築するために、NAP1をコードする遺伝子を含む組み換えプラスミドを構築した。即ち、テンプレートにヒトNAP1 cDNA、5'側および3'側プライマーにそれぞれ5'-AAA GAA TTC GCC ACC ATG GAT GCA CTG GTA GAA GAT-3' (S-1)および5'-AAA CTC GAG ATT CTT ATA AAG GCA GTT CTG-3' (AS-1)を用いてPCRを行った。このPCR産物を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化し、pcDNA3.1Myc/HisAプラスミド(Invitrogen)にライゲーションした。
【００４０】
NAP1の全長を含む大腸菌発現ベクター1)pGEX-NAP1は、pcDNA3.1Myc/His6NAP1プラスミドをEcoRIおよびXhoIで消化し、そのフラグメントをpGEX5X-1プラスミドベクターにライゲーションして構築した。NAKに対する結合に関与するNAP1の領域を決定するための各変異体発現ベクター2)から7)は、pcDNA3.1Myc/His6NAP1プラスミドをテンプレートとして下記のプライマーセットを用いたPCR産物をEcoRIおよびXhoIで消化し、そのフラグメントをpGEX5X-1プラスミドベクターにライゲーションして構築した。
2)pGEX-NAP1(N101)：102−392残基、5’-AAA GAA TTC GAT AGA GAT AAT TTG AAG AGC-3’ およびAS-1
3)pGEX-NAP1(N157)：158−392残基、5’-AAA GAA TTC TGG GAG GTG GAA AAG TTG AGC-3’ およびAS-1
4)pGEX-NAP1(N270)：271−392残基、5’-AAA GAA TTC ACA AAA CTG CAC TTG ATG AAT-3’ およびAS-1
5)pGEX-NAP1(C302)：1−302残基、S-1および5’-AAA CTC GAG AGG GGA AGA TGT GGT ATG ACA-3’ 
6)pGEX-NAP1(C270)：1−270残基、S-1および5’-AAA CTC GAG GCT GTC TCT TCC AAG GTC TTC-3’ 
7)pGEX-NAP1(C157)：1−157残基、S-1および5’-AAA CTC GAG GTT TGA TGA AGG TGG ATT TAA-3’ 
【００４１】
変異体発現ベクター8)は次に示す方法で構築した。
8)pGEX-NAP1(158−270)：158−270残基
pcDNA3.1Myc/His6NAP1プラスミドをテンプレートとして、5’側および3’側プライマーにそれぞれ5’-AAA GAA TTC GCC ACC ATG TGG GAG GTG GAA AAG TTG AGC-3’および5’-AAA CTC GAG GCT GTC TCT TCC AAG GTC TTC-3’を用いてPCRを行った。このPCR産物を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化し、pcDNA3.1Myc/HisAプラスミド(Invitrogen)にライゲーションした (pcDNA3.1Myc/His6NAP1(158-270))。これを再度制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化し、そのフラグメントをpGEX5X-1プラスミドベクターにライゲーションして構築した。
【００４２】
変異体発現ベクター9)は次に示す方法で構築した。
9)pGEX-NAP1(Δ158−270)：158−270残基を欠損
pcDNA3.1Myc/His6NAP1プラスミドをテンプレートとして外側の5'側および3'側プライマーにそれぞれS-1およびAS-1プライマーを、内側の5'側および3'側プライマーにそれぞれ5'-GAA CTA CTA AGA AAA CTG AAA ACC ACA AAA CTG CAC TTG ATG AAT-3' および5'-AAA ATT CAT CAA GTG CAG TTT TGT GTT TGA TGA TGA AGG TGG ATT TAA-3' を用いたtwo-step PCRを行い、このPCR産物を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化し、pcDNA3.1Myc/HisAプラスミド(Invitrogen)にライゲーションした(pcDNA3.1Myc/His6NAP1(Δ158-270))。これを再度制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化し、そのフラグメントをpGEX5X-1プラスミドベクターにライゲーションして構築した。
【００４３】
一方でNAKは、Myc/His6タグとの融合蛋白質としてSf9細胞で発現させた（Tojima, Y. et al., 2000, Nature）。この細胞溶解液とGST-NAP1あるいはGST-変異NAP1融合蛋白質とを混合し、インキュベートした。その後、抗GST抗体で免疫沈降し、SDS-PAGEおよび抗Myc抗体でウエスタンブロットし、これら蛋白質の結合を検出した。その結果、N末端側101残基および157残基目までを欠く上記N101およびN157変異NAP1とNAKとの結合は、NAP1全長の場合と全く差はなく、NAP1のN末端側157残基はNAKとの結合に関与していないことが確認された。これに対して、270残基目までを欠くN270変異NAP1では、NAKとの結合が認められなかった。一方、N末端より303残基目からC末端までを欠くC302変異NAP1とNAKとの結合は、NAP1全長の場合と差は認められなかった。しかし、N末端より271残基目からC末端までを欠くC270変異NAP1とNAKとの結合は、全長の場合もしくは158-270変異NAP1と比較して減弱し、N末端より158残基目からC末端までを欠くC157変異NAP1では、結合は完全に消失した。さらに、N末端より158残基目から270残基までのみの158-270変異NAP1とNAKとの結合は全長の場合と差がなく、逆にそれ以外の領域(N末端から157残基目までと271残基目からC末端まで)のみで構成されるΔ158-270変異NAP1は結合が完全に消失した。以上の結果から、NAKとの結合に必要とされるNAP1の最小の領域は、N末端より158残基目から270残基までであり、N末端側157残基は、NAKとの結合を妨害する要因を含む可能性があることが示唆される。しかし、その妨害要因は、N末端より271残基目以降の領域の存在により解消され、特に271残基目から302残基目までの領域がその中心的な役割を果たしていることが示唆される（図4）。
【００４４】
以上の結果から、全長NAP1と同等のNAKとの結合能を有するNAP1部分蛋白質としては、以下のような部分蛋白質を例示することができる。
(1) 158−270残基  (2) 158−302残基  (3) 158−392残基  (4) 102−392残基  (5) 102−302残基  (6) 1−302残基  
また、NAKとの結合能が若干落ちるNAP1部分蛋白質としては、以下のような部分蛋白質を例示することができる。
(1) 1−270残基  (2) 102−270残基
尚、これらは、いずれも配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端からの残基数で示している。また、これらNAP1部分蛋白質は、NAKとの結合能を有する限り、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されていてもよい。
【００４５】
（5）ゲルクロマトグラフィーによるNAP1と相互作用する蛋白質の解析
HeLa細胞を20ng/ml TNF-αで10分間処理した。無刺激コントロールは刺激群の処理が終了するまで培養を続けた。Cytosolic S100抽出液をSuperrose-6ゲル濾過カラムにかけ、0.1% Brij-35および250mM NaClを添加したbufferAで溶出し、600μlごとに分画した。この抽出液をIKKα、IKKγ、NAKもしくはNAP1に対する抗体でウエスタンブロットした。NAP1はNAKを含む600kDa以下の蛋白質複合体として溶出され、分子量は59kDaと見積もられた。また、NAKを含む250kDa以下の蛋白質複合体としても溶出され、こちらの分子量は47kDaと見積もられた。この溶出パターンはIKKαおよびIKKγのそれとは異なり、NAP1がNAKと相互作用しているが、IKK複合体には含まれていないことを示すものである（図5）。
【００４６】
（6）NAP1によるNF-κBの活性化増強（レポーターアッセイ）
293T細胞を35mmシャーレに播種し、0.5μgのpcDNA3FlagNAK、もしくはベクターのみをトランスフェクトした。同時にpcDNA3.1Myc/His6NAP1、pcDNA3.1Myc/His6(158-270)、pcDNA3.1Myc/His6(Δ158-270)のいずれかを0, 1.25もしくは2.5μg、さらに0.1μg NF-κB-Luc レポータープラスミドと0.1μg pmiwZ βガラクトシダーゼ発現ベクターをFuGENE6 transfection Kit(Boehringer)添付のプロトコルに従ってトランスフェクトして共発現させた。トランスフェクションの30時間後にβガラクトシダーゼの発現量で正規化し、ルシフェラーゼ活性をEnhanced Luciferase Assay Kitを用いてルミノメーターによって測定した。
【００４７】
NAP1全長を発現させた細胞のルシフェラーゼ活性は、わずかに増加するのみであった。一方、NAP1およびNAKを共発現させることによって、ルシフェラーゼ活性は相乗的に上昇した。158-270変異NAP1でもルシフェラーゼ活性の上昇が認められたが、Δ158-270変異NAP1を共発現させても、NAKを単独で発現させた場合と差はなかった。これは、NAKとの結合力を持つNAP1(全長もしくは158-270変異体)とNAKが共存することによって、NF-κBの活性化が増強されたことを示している(図6)。
【００４８】
次に、pcDNA3.1Myc/His6NAP1を0, 1.25もしくは2.5μgと0.1μg NF-κB-Luc レポータープラスミドと0.1μg pmiwZ βガラクトシダーゼ発現ベクターとを、FuGENE6 transfection Kit(Boehringer)添付のプロトコルに従ってトランスフェクトして共発現させた。30時間後に、5ng/ml TNF-αもしくは40nM PMAで6時間刺激し、誘導されるルシフェラーゼ活性を測定した。pcDNA3.1Myc/His6NAP1組み換え293T細胞は、TNF-α刺激時又はPMA刺激時のルシフェラーゼ活性がそれぞれ10倍および5倍に増加した。この結果は、NAP1の過剰発現によって、それぞれの刺激時のシグナル伝達が増強されたことを示しており、NAP1およびNAKがこれら刺激伝達経路に関与していることを示唆している(図7)。
【００４９】
（7）2本鎖RNAによるNAP1蛋白質の発現阻害試験(RNAi)
NAP1の発現阻害を目的とした二本鎖RNA(NAP1 siRNA)は、ヒトNAP1 cDNAの翻訳領域中の100−120塩基を標的とした下記配列で、B-bridge International社にて合成した（NAP1 siRNA : 5'-TCTGTTGCTTCCCATTTTGCT-3'）。HeLa細胞(5 x 105細胞)にこのsiRNA 5μgをOligofectamin(Invitrogen)を用いて導入した。15時間後および30時間後にこの操作を繰り返し、計3回の導入を行った。陰性対照としてはGFPに対するsiRNA(Lipardi, C., 2001, Cell)を同様にHeLa細胞に導入した。siRNAを導入したHeLa細胞をIP-キナーゼバッファー(50mM HEPES pH8.0, 150mM NaCl, 25mM EGTA, 1mM EDTA, 0.1% Tween20, 10% グリセロール, 20μg/ml トリプシンインヒビター, 2μg/ml アプロチニン, 5μg/ml ロイペプチン, 100μg/ml PMSF, 50mM フッ化ナトリウム, 0.1mM オルトバナジン(V)酸ナトリウム)で処理し、細胞破片を10,000 x g、10分間の遠心で除去し、細胞溶解液を得た。この溶解液に抗NAP1抗体を添加して免疫沈降させ、細胞溶解液および免疫沈降物は抗NAP1抗体および抗NAK抗体でウエスタンブロットを行った。
【００５０】
ウエスタンブロットにおいて、NAP1 siRNAを導入した細胞溶解液では、抗NAP1抗体で検出されるバンドは、陰性対照として用いたGFP siRNAを導入した細胞と比較して著明に減弱(90%)した。一方、抗NAK抗体で検出されるバンドは、細胞溶解液では変化はなかったが、抗NAP1抗体免疫沈降物では著明に減弱していた。この事実は、NAP1とNAKは細胞内で相互作用しており、抗NAP1抗体による免疫沈降によりNAKが共沈してくることを示している(図8)。
【００５１】
また、NAP1 siRNAが実際にNF-κBの活性化を調節するかどうかを調べるために、レポーターアッセイを行った。HeLa細胞(1 x 105細胞)にNAP1 siRNAもしくはGFP siRNA 1μg、NF-κB-Luc レポータープラスミド 0.8μgおよびpmiwZ βガラクトシダーゼ発現ベクター0.2μgをLipofectamin 2000(Invitrogen)を用いてコトランスフェクトし、共発現させた。48時間後に10ng/ml TNF-αもしくは20nM PMAで6時間刺激し、誘導されるルシフェラーゼ活性を測定した。NAP1 siRNAを導入した細胞ではルシフェラーゼの発現が減弱しており、NAP1が発現阻害されることによって、これらの刺激の伝達も阻害されることを示している(図9)。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】NAP1遺伝子のDNA配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示した図である。
【図２】ノザンブロットによりヒトの各臓器におけるNAP1遺伝子の発現を確認した図である。
【図３】免疫蛍光染色によりMDAH041ヒト繊維芽細胞におけるNAP1蛋白質の局在を確認した図である。
【図４】NAKとの結合に必要なNAP1蛋白質の最小領域を確認するためのGST融合蛋白質の模式図、およびそれらとNAKとの結合を確認したウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】ゲルクロマトグラフィーによってIKK複合体の各構成蛋白質とNAP1蛋白質との相互作用を確認した図である。
【図６】ルシフェラーゼアッセイによってNF-κBの活性化に対するNAP1とNAKとの相乗作用を確認した図である。図の下部に示す黒塗りの三角は、トランスフェクトしたベクターの相対量を示している。またFLはトランスフェクトした領域がNAP1およびNAKの全長(FullLength)であることを示している。
【図７】TNF-αおよびPMA刺激によるNF-κBの活性化をNAP1が増強することを、ルシフェラーゼアッセイを用いて確認した図である。図の下部に示す黒塗りの三角はトランスフェクトしたベクターの相対量を示している。またFLはトランスフェクトした領域がNAP1およびNAKの全長(FullLength)であることを示している。
【図８】NAP1 siRNAによってNAP1の発現が抑制されることを確認したウエスタンブロットの結果を示す図である。図中のIPは免疫沈降(ImmunoPrecipitation)に用いた抗体を示し、IBはウエスタンブロット(ImmunoBlot)に用いた抗体を示している。
【図９】NAP1 siRNAによってTNF-αおよびPMA刺激によるNF-κB活性化が抑制されることをルシフェラーゼアッセイを用いて確認した図である。黒カラムはNAP1 siRNAを、白カラムは対照としてGFP siRNAを導入した細胞の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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