(57)【要約】【課題】  線虫に関する専門的技術及び知識を持たない者であっても、特定の線虫を分別捕集できる手段を提供する。【解決手段】  線虫を含む多孔質媒体の孔隙部分を液体で満たし、その液体を一定方向に流動させ、液体の流動に対する線虫の応答行動を指標として線虫を分別捕集することを特徴とする線虫の分別捕集方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫を含む多孔質媒体の孔隙部分を液体で満たし、その液体を一定方向に流動させ、液体の流動に対する線虫の応答行動を指標として線虫を分別捕集することを特徴とする線虫の分別捕集方法。
【請求項２】
線虫の応答行動が、液体の流動に沿って移動する行動、又は液体の流動に抵抗し、その場に居続けようとする行動であることを特徴とする請求項１記載の線虫の分別捕集方法。
【請求項３】
多孔質媒体が、土壌、砂、粒状物質集積物、繊維多孔質、又は微細せん孔若しくは凹凸加工物のいずれかであることを特徴とする請求項１又は２記載の線虫の分別捕集方法。
【請求項４】
液体を一定方向に流動させる手段が、多孔質媒体内の液体成分を局所的に蒸散させる手段、水位高低差により多孔質媒体中の液体成分を移動させる手段、多孔質媒体に微小流量制御ポンプを接続し、液体を供給又は排出する手段、吸水性ポリマー、吸着紙、半透膜、繊維多孔質、若しくは植物根を多孔質媒体に接触させ、多孔質媒体の液体成分を吸引する手段であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項記載の線虫の分別捕集方法。
【請求項５】
土壌に吸水材を接触させ、土壌中の水分を吸水材の方向へ流動させた後、吸水材のみ又は吸水材とその周辺の土壌を取り去ることを特徴とする特定線虫の除去方法。
【請求項６】
特定線虫が、植物寄生線虫であることを特徴とする請求項５記載の特定線虫の除去方法。
【請求項７】
吸水材が、吸水性ポリマー、吸着紙、半透膜、繊維多孔質、又は植物根であることを特徴とする請求項５又は６記載の特定線虫の除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線虫を食性、サイズ、走性に応じて分別捕集する方法に関する。この方法は、土壌に生息して移動能力を有する雑多な線虫の中から特定の線虫のみを分離することができるため、農作物に被害を与える植物寄生線虫の同定あるいは駆除技術として利用可能である。
【背景技術】
【０００２】
土壌中に生息して移動能力を有する雑多な線虫類を捕集する一般的な方法としてベルマン法（非特許文献１）及び二層遠心浮遊法（非特許文献２）が挙げられる。ベルマン法では、採取した土壌を重力水並びに毛管水により充満させて、線虫の移動に重要な役割を果たしている表面張力の影響を無効にし、重力作用のみにより線虫の移動が生じて水中に沈降してくることを利用している。二層遠心分離法では、ショ糖を入れた遠心管に土壌を入れて遠心分離することにより、ショ糖表面に土壌よりも比重の軽い線虫が捕集されることを利用している。これらの方法により採取した雑多な線虫群から特定種の線虫を分別捕集する方法として、専門家が線虫の形態的特徴を観察し、顕微鏡下で目標線虫を視認しながら毛髪などの微細な物体の先端に一個体ずつ吸着させて取り出す方法が知られている。また、農産物が寄主となる植物寄生線虫の被害防止を目的とした捕集については、捕獲作物を圃場に植え付けて目的とする線虫を誘引し捕集する方法が知られている。
【０００３】
植物寄生線虫の駆除方法として、土壌燻蒸剤、蒸気消毒、熱水土壌潅注、潅水化、太陽熱消毒、線虫寄生細菌の感染などによる方法が開発されている。ただし、土壌の健全性（植物生産能力）は土壌生物相のバランスにより維持されており、土壌生物の存在が不可欠であるが、病害線虫を駆除する目的で熱水や燻蒸剤により土壌生物を死滅させてそのバランスを破壊するため、土壌健全性を損なう可能性が高い。そのために特定の植物寄生線虫のみの防除が望ましいとされており、特定線虫の駆除方法については絶対寄生細菌の圃場散布による防除方法や、土壌のメチオニン処理による防除方法などが開発されている。
【非特許文献１】深谷昌次・石井象二郎・山崎輝男編：昆虫実験法、日本植物防疫協会発行、p494 (1959)。
【非特許文献２】高木一夫：二層遠沈浮遊法による土壌線虫の分離、日本応用動物昆虫学会誌14巻、pp108-110 (1970)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ベルマン法及び二層遠心分離法による線虫類捕集方法では、土壌に生息して移動能力を有する雑多な線虫を捕集しているだけであり、特定の線虫を分別捕集することはできない。これらの方法で捕集した線虫から特定の線虫を取り出すためには専門的技術ならびに知識が必要とされるため、効率的な分別捕集が困難であるという問題がある。
【０００５】
一方、農業においては農作物に寄生する線虫の有無を圃場単位で確認することは、寄生による被害を最小限に抑えるという観点から必要不可欠な作業であるが、ベルマン法や二層遠心浮遊法で捕集した線虫は専門家でなければ同定が困難であるという問題がある。
【０００６】
この発明は、前述したような当該技術の有している課題を解決するために、線虫の移動能力や走性が微細構造や土壌水移動に影響を受けることを利用して、雑多な線虫群の中から特定種の線虫を分別する方法、あるいは土壌生物相のバランスを破壊することなしに特定種の線虫を捕集除去する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、線虫が存在している媒体の有する微細な孔隙に存在する液体の流動に対してその種類に応じて特徴的な行動をとることを実験により見いだした。すなわち、食性ならびに生育段階に応じて異なる大きさと移動能力を有する線虫の生活は、食物探索の点から生息環境の有する孔隙ネットワークなどの微細構造に依存していると同時に、その微細構造中の液体移動にも影響を受けると推論し、検証実験を行った。その検証過程において、微細構造中での液体移動に対する線虫の応答は、線虫の大きさ、移動能力、走性等に依存することを発見し、さらには従来の知見から植物寄生線虫の移動能力や大きさが他の食性を有する線虫と異なる部分があることを勘案することにより、線虫の上記特性が線虫を大まかに分別するための手段として有効であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は以下の（１）〜（７）を含む。
（１）線虫を含む多孔質媒体の孔隙部分を液体で満たし、その液体を一定方向に流動させ、液体の流動に対する線虫の応答行動を指標として線虫を分別捕集することを特徴とする線虫の分別捕集方法。
（２）線虫の応答行動が、液体の流動に沿って移動する行動、又は液体の流動に抵抗し、その場に居続けようとする行動であることを特徴とする（１）記載の線虫の分別捕集方法。
（３）多孔質媒体が、土壌、砂、粒状物質集積物、繊維多孔質、又は微細せん孔若しくは凹凸加工物のいずれかであることを特徴とする（１）又は（２）記載の線虫の分別捕集方法。
（４）液体を一定方向に流動させる手段が、多孔質媒体内の液体成分を局所的に蒸散させる手段、水位高低差により多孔質媒体中の液体成分を移動させる手段、多孔質媒体に微小流量制御ポンプを接続し、液体を供給又は排出する手段、吸水性ポリマー、吸着紙、半透膜、繊維多孔質、若しくは植物根を多孔質媒体に接触させ、多孔質媒体の液体成分を吸引する手段であることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれか記載の線虫の分別捕集方法。
（５）土壌に吸水材を接触させ、土壌中の水分を吸水材の方向へ流動させた後、吸水材のみ又は吸水材とその周辺の土壌を取り去ることを特徴とする特定線虫の除去方法。
（６）特定線虫が、植物寄生線虫であることを特徴とする（５）記載の特定線虫の除去方法。
（７）吸水材が、吸水性ポリマー、吸着紙、半透膜、繊維多孔質、又は植物根であることを特徴とする（５）又は（６）記載の特定線虫の除去方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の線虫の分別捕集方法は、線虫を含む多孔質媒体の孔隙部分を液体で満たし、その液体を一定方向に流動させ、液体の流動に対する線虫の応答行動を指標として線虫を分別捕集することを特徴とするものである。
【００１１】
多孔質媒体は、線虫が移動可能な寸法の孔隙を有しているものであればどのようなものでもよいが、一般的な線虫の体幅分布を考慮して孔隙断面直径が0.02mm〜0.2mm程度の微細孔隙からなり、かつ孔隙間がネットワーク状に連結した状態にあることが好ましい。このような媒体として土壌、砂、粒状物質集積物、繊維多孔質、微細せん孔若しくは凹凸加工物（0.1mm以下の精度で機械的加工が可能な手法により製作されたものが好ましい。）などを例示できる。
【００１２】
孔隙を満たす液体の種類は、線虫の生存を妨げるものでなければどのようなものでもよいが、水溶液であることが好ましい。このような液体として蒸留水、水道水、ショ糖水溶液、生理食塩水などを例示できる。
【００１３】
分離捕集対象とする線虫の種類は、その生活環の何れかの時点で多孔質媒体内部を移動する能力を有する種類であればどのようなものでもよい。また、線虫は該媒体内部に自生しているものでも、あるいは外部から該媒体内部に人為的に導入されたものでもよいが、植物寄生線虫であることが好ましい。植物寄生線虫としてはネコブセンチュウ、シストセンチュウ、ネグサレセンチュウなどを例示できる。
【００１４】
液体を一定方向に流動させる手段は特に限定されないが、多孔質媒体内の液体成分を局所的に蒸散させる手段、水位高低差により多孔質媒体中の液体成分を移動させる手段、多孔質媒体に微小流量制御ポンプを接続し、液体を供給又は除去する手段、吸水性ポリマー、吸着紙、半透膜、繊維多孔質、若しくは植物根を多孔質媒体に接触させ、多孔質媒体の液体成分を吸引する手段などを用いるのが好ましい。微小流量制御ポンプの例としてマイクロシリンジポンプ、ダイヤフラムポンプがあげられる。吸水性ポリマーの例としてデンプン-ポリアクリロニトリル加水分解物、ポリアクリル酸ソーダ架橋物、セルロース架橋物、吸着紙の例として濾紙、半透膜の例としてフェロシアン化銅の沈殿膜、セロファン膜、ポリアミド膜、セルロースアセテート膜、繊維多孔質の例としてポリスルホン中空糸膜、セルロース中空糸膜、ポリウレタン中空糸膜、植物根の例としてサツマイモ、ニンジン、ダイコン、ゴボウ、ナス、トマト、マリーゴールド、ソバなどを例示できる。
【００１５】
液体の流動に対する線虫の応答行動とは、例えば、液体の流動に沿って移動する行動、液体の流動に抵抗し、その場に居続けようとする行動などである。
【００１６】
上記の線虫の分別捕集方法は、特定線虫の除去方法に応用することができる。即ち、土壌に吸水材を接触させ、土壌中の水分を吸水材の方向へ流動させた後、吸水材のみ又は吸水材とその周辺の土壌を取り去ることを特徴とする特定線虫の除去方法が提供される。
【００１７】
ここで使用する吸水材としては、上述した吸水性ポリマー、吸着紙、半透膜、繊維多孔質、植物根などを例示できる。
【００１８】
この方法によって除去されるのは、水の流動に沿って移動する線虫である。後述の実施例に示すように、植物寄生線虫の一つであるMeloidogyne incognitaは、水の流動に沿って移動するが、このような性質は植物寄生線虫一般にみられるものと推測される。従って、この方法は、植物寄生線虫の除去方法として有効であると考えられる。
【００１９】
以下に本発明の特定線虫の除去方法の一態様を説明する。
【００２０】
線虫が存在する土壌に対して、潅水又は冠水等により内部に水を十分に含む状態にする。次に、吸水性ポリマーを筒状に成型したものを、土壌中に埋設する。このとき土壌の孔隙内の水は吸水性ポリマーの方向に移動することから、水の移動に影響を受けて水の移動方向に同期して動く傾向のある線虫、例えばネコブセンチュウが土壌中に存在する場合には、該線虫が吸水性ポリマーの存在する方向に移動する。十分に長い時間、例えば24時間放置しておくことにより、吸水性ポリマーが起こす緩やかな水の移動により吸水性ポリマー周辺に存在するネコブセンチュウが吸水性ポリマー近傍に集まる。吸水性ポリマー近傍の土壌を吸水性ポリマーと一緒に取り出すことにより、土壌中からネコブセンチュウを除去することができる。
【００２１】
また、取り出された吸水性ポリマー並びに土壌をフィルターに包んで、水を満たした容器に浸しておくことにより、線虫の自重沈降作用で容器底部にネコブセンチュウのみを取り出すことができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の線虫の分別捕集方法は、土壌に生息する雑多な線虫の中から特定の線虫のみを分離することができるため、農作物に被害を与える植物寄生線虫の同定ならびに駆除技術に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００２４】
〔実施例１〕
図１に示す装置を用いて、昆虫寄生線虫Steinernema carpocapsaeの感染態幼虫と植物寄生線虫Meloidogyne incognitaの感染態幼虫の水流に対する応答行動を調べた。
【００２５】
実験に用いた装置は、蓋１、平板２、容器３とからなり、平板２の上面の中央部分には、複数の微細な凹型構造が形成されている領域があり、その周囲は均一に凹んだ部分となっている（図２）。凹型構造は、図３に示すような形の均一な深さの凹み（深さ：0.05mm）であり、前記領域には、この凹みが縦横に整列配置されている。平板２を挿んで、蓋１を容器３に密着させると、凹型構造の上部が蓋１により塞がれ、迷路状の構造が形成される。また、蓋１には、３つの貫通した孔があり、これらの孔は平板２の上面とつながっている。
【００２６】
マイクロピペットにより5μLの蒸留水と共に概ね30個体の線虫を吸引し、注入孔５から凹型構造が形成されている領域に線虫を導入した。線虫導入後、注入孔５にマイクロシリンジポンプを接続し、流量5μL/minで蒸留水を注入する一方、注入孔５の左右にある排出孔４及び排出孔６から蒸留水を排出させた。この状態で蒸留水を10分間注入し続けた場合の線虫の移動する様子を動画像としてコンピュータに保存したのち、画像処理を施して移動している線虫像のみを画像から抽出・重ね合わせ、線虫の移動パターン画像を得た。Steinernema carpocapsaeの移動パターン画像を図４に、Meloidogyne incognitaの移動パターンを画像を図５に、それぞれ示す。なお、図の中央に見える円形の図形は、注入孔５である。
【００２７】
図４に示すように、Steinernema carpocapsaeの移動パターンは注入孔５周辺に局在していることから、該線虫は流れに対して強く抵抗して凹型構造が形成されている領域にとどまり続ける個体が多いことを示している。一方、図５に示すように、Meloidogyne incognitaの移動パターンでは注入孔５周辺から凹型構造が形成されている領域の外側に移動していく個体の軌跡が多数観察されたことから、該線虫は流れに逆らう個体が少なく、流れの方向に沿って移動する個体が多いことを示している。
【００２８】
以上のことから、凹型構造が形成されている領域の水流を制御することにより、線虫の液体流動に対する行動の違いを利用して、凹型構造が形成されている領域に残る線虫と流れに沿って移動する線虫とに分別することが可能であることが示された。
【００２９】
〔実施例２〕
ガラスビーズ充填カラムを模式的な土壌として、植物寄生線虫Meloidogyne incognitaならびに昆虫寄生線虫Steinernema carpocapsaeを同時に導入し、濾紙の吸水によって生じる水の移動を利用して両線虫種を分離する実験を行った。
【００３０】
実験にはパスツールピペット（全長14mm、最大内径5mm、最小内径1mm）にガラスビーズ（平均直径約0.4mm）を2g充填したガラスビーズ充填カラム10本を用いた。Meloidogyne incognita（MI）の感染態幼虫の蒸留水懸濁液（平均濃度：0.8頭/μL）50μL、ならびにSteinernema carpocapsae（SC）の感染態幼虫蒸留水懸濁液（平均濃度：0.6頭/μL）50μLを同時にカラム（ピペット）後端に注入し、蒸留水1.5mLを入れた樹脂製遠心管にカラム（ピペット）先端を垂直に立てた状態で浸して、温度25℃、湿度60%の環境に24時間放置した。放置後、樹脂製遠心管を取り外して、マイクロピペットにより遠心管の狭窄底より20μLの蒸留水を採取し、実体顕微鏡を用いて採取蒸留水中に含まれるMIとSCの頭数を計数した。これを２回くり返して線虫種毎の合計をとることにより、各カラムを通過した線虫種毎の頭数とした。
【００３１】
通常、上記の状態では導入された線虫の自発的な移動と重力の影響により、24時間後には大部分の線虫がカラム内を下方に通過して先端から排出される。また、当該線虫種はほぼ同じ大きさを有していることから、ガラスビーズの間隙を通過する能力に差はない。本実験では、5本のカラムは対照群（吸引なし）として開放放置し、残りの5本のカラムには筒状に巻いた濾紙（直径3mm、長さ50mm）をカラム後端から濾紙先端がガラスビーズに接触するように挿入し、ビーズに含まれる毛管水を吸引蒸散させた（処理群：吸引あり）。図６に、処理群及び対照群の両線虫種の平均通過頭数ならびに標準誤差を示す。
【００３２】
図６に示すように、吸引なしの場合にはSC、MIともに平均通過頭数（それぞれ約16頭ならびに24頭）が平均導入頭数（平均濃度より、それぞれ30頭ならびに40頭）の約半数強であった。一方、吸引ありの場合には、SCの平均通過頭数が概ね半数（約14頭）と吸引なしの場合と差がなかったのに対して、MIの平均通過頭数は約3頭と10分の1であった。この結果は、濾紙による毛管水吸引によってMIの通過頭数が大幅に減少したことを示しており、SCが吸引に影響されずにカラムを通過したのに対して、MIは吸引の影響を強く受けてカラム内部に留まる傾向があることを示す。また、本実験環境における濾紙の吸水速度は、実測値で1.54μL/minであることから、カラム先端（内径1mm）での流速は0.49mm/minと推定される。一方、障害物がない場合に該線虫が自重により水中を沈降する速度は5mm/min以上と、濾紙の吸水により生じた流速よりもはるかに大きい。
【００３３】
以上の知見から、多孔質媒体（この場合ガラスビーズ充填カラム）に混在する昆虫寄生線虫と植物寄生線虫において、毛管吸水を利用して両者を分離可能であるであることが示された。同時に、MIとSCはほぼ同じ大きさであるが、SCはMIよりも大きな運動能力を有しているために水流に逆らう能力がMIよりもはるかに高いことが実施例１で示されていることから、当該分離機構は単なる水の流動抵抗によるものではなく、MIが水の流れに従って移動行動をとったことによるものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１で使用した装置を模式的に表した図。
【図２】凹型構造を形成した平板の寸法図。
【図３】平板上に形成されている凹型構造の寸法図。
【図４】Steinernema carpocapsaeの移動パターン画像を示す図。
【図５】Meloidogyne incognitaの移動パターン画像を示す図。
【図６】毛管水吸引処理と線虫の通過頭数との関係を示す図。
【符号の説明】
【００３５】
１  蓋
２  平板
３  容器
４  排出孔
５  注入孔
６  排出孔
【図１】
2005124525.tif 000002
【図２】
2005124525.tif 000003
【図３】
2005124525.tif 000004
【図６】
2005124525.tif 000005
【図４】
2005124525.tif 000006
【図５】
2005124525.tif 000007