(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により標的ｍＲＮＡを切断しタンパク質発現を抑制するのに適した、１５から２７塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチド又はそのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出すために有効なスクリーニング方法の提供。【解決手段】初期工程において、所望する長さの塩基対の数を有するセンス鎖ＲＮＡのおよそ半数の塩基が重複するセンス鎖ＲＮＡと、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡのプールからスクリーニングを行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡｉにより標的ｍＲＮＡを切断し、タンパク質発現を抑制するのに適した、１５から２７塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチド又はそのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出すために有効なスクリーニング方法であって、下記１）および２）の工程を含むスクリーニング方法。
１）初期工程：標的ｍＲＮＡのＯＲＦ内から、所望の長さの二重鎖形成部を構成する塩基対の数を２で除し、小数点以下を切り捨てた数又はその数に１を加えた数の塩基毎に始まる、当該所望の長さのセンス鎖ＲＮＡを選択し、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるプールからスクリーニングを行い、オリゴ二本鎖ＲＮＡを選別する。ただし、必要に応じて、適宜、スクリーニングに用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端を１ないし５塩基ずらした位置から始まるオリゴ二本鎖ＲＮＡについてスクリーニングを行う。
２）最終工程：前段階のスクリーニングにおいて選別したオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端に該当する標的ｍＲＮＡの塩基を中心として上流側及び下流側ともに１ないし４塩基の範囲で１塩基毎にずらした位置から始まる、当該所望の長さのオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖と、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるプールからスクリーニングを行い、最終的なオリゴ二本鎖ＲＮＡを見出し、そのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出す。ただし、必要に応じて、適宜、スクリーニングに用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端を１ないし３塩基ずらした位置から始まるオリゴ二本鎖ＲＮＡについてスクリーニングを行う。
【請求項２】
上記初期工程と最終工程の間に、次の中間工程を含む請求項１記載のスクリーニング方法。
中間工程：前段階のスクリーニングにおいて選別したオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端に該当する標的ｍＲＮＡの塩基を中心として上流側及び下流側ともに２ないし１０塩基ずらした位置から始まる、当該所望の長さのオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡと、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるプールからスクリーニングを行い、オリゴ二本鎖ＲＮＡを更に選別する。
【請求項３】
オリゴ二本鎖ヌクレオチドが、オリゴ二本鎖ＲＮＡである請求項１又は請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
オリゴ二本鎖ヌクレオチドの標的遺伝子が、癌遺伝子、ウイルス遺伝子および炎症関連遺伝子である請求項１又は請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
オリゴ二本鎖ヌクレオチドの標的遺伝子が、ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＨＩＶウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子又はＦａｓ遺伝子である請求項１又は請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
オリゴ二本鎖ＲＮＡの標的遺伝子が、癌遺伝子、ウイルス遺伝子および炎症関連遺伝子である請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
オリゴ二本鎖ＲＮＡの標的遺伝子が、ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＨＩＶウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子又はＦａｓ遺伝子である請求項３記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により標的ｍＲＮＡを切断し、タンパク質発現を抑制するのに適した、１５から２７塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチド及びそのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出すために有効なスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入することにより、導入したｄｓＲＮＡと相同的な配列をもつｍＲＮＡが特異的に分解され、したがって当該ｍＲＮＡのコードする遺伝子産物の合成が抑制される現象である。ＲＮＡｉは最初に線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において発見された現象（例えば、非特許文献１を参照）であったが、その後、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、原虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、ヒドラ、植物（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、さらには哺乳動物細胞ではマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、卵細胞および初期胚においても観察された（例えば、特許文献１ないし２を参照）。
【０００３】
一方、分化した哺乳動物細胞においては、線虫などと同様のＲＮＡｉによるタンパク質発現抑制効果を得る目的で、３０塩基対以上のｄｓＲＮＡを導入してもＲＮＡｉの効果は観察されなかった。これは、３０塩基対以上のｄｓＲＮＡの侵入がウイルス感染として認識されることによりインターフェロンが誘導され、インターフェロン応答として知られる２つの経路が活性化されたためである。一つの経路は、インターフェロンがｄｓＲＮＡ依存的プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を誘導し、このＰＫＲがｄｓＲＮＡと結合して活性化され、翻訳因子ｅＩＦ２αをリン酸化することによって翻訳を阻害する経路である。もう一方の経路はインターフェロンが２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素（２−５Ａ合成酵素）を誘導し、これがＲＮＡａｓｅ  Ｌを活性化することでｍＲＮＡなどの１本鎖ＲＮＡを非特異的に切断する経路である。これらの経路が活性化されると、細胞内の全ての遺伝子発現が低下する。したがって、３０塩基対以上のｄｓＲＮＡの導入は、インターフェロン応答により細胞内の全ての遺伝子発現を低下させるため、標的遺伝子に特異的な発現抑制（ノックダウン）効果が得られなかったのである（例えば、非特許文献２を参照）。
【０００４】
Ｔｕｓｃｈｌらの研究グループがショウジョウバエの細胞抽出液を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で、加えたｄｓＲＮＡが２１から２３塩基対のｄｓＲＮＡに分解されていることを見いだし、それらの分解されたＲＮＡが標的であるｍＲＮＡの配列認識のガイドとして働く仲介物質であることが示唆された（例えば、非特許文献３を参照）。そして、実際に化学合成した２１から２２塩基対の二本鎖のＲＮＡを上記の反応系に添加することにより、標的ｍＲＮＡが切断されることが確かめられた。Ｔｕｓｃｈｌらのグループは、このような、ＲＮＡｉによるタンパク質発現抑制活性を有する短い二本鎖のＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と名づけた（例えば、非特許文献４を参照）。またｓｉＲＮＡは、それを構成するそれぞれのＲＮＡ鎖の３’末端に２から３塩基の一本鎖の状態で存在する部分、すなわち、いわゆる突出部を有するものが上記の反応系で強いタンパク質発現抑制活性をもつことが報告されている。さらにＴｕｓｃｈｌらのグループは、ｓｉＲＮＡが上記のインターフェロン応答の問題なしに、分化した哺乳動物細胞においても配列特異的な遺伝子発現抑制活性を示すことを報告した（例えば、特許文献３および非特許文献５を参照）。したがって、ｓｉＲＮＡを用いることで、哺乳動物においても、ＲＮＡｉを利用した標的遺伝子のノックダウンによる、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制を行うことが可能となった。
【０００５】
ＲＮＡｉを利用したタンパク質発現抑制において、標的のｍＲＮＡを切断するために必要なタンパク質として、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ヌクレオチド分解酵素複合体）と呼ばれるタンパク質複合体が考えられている。ＲＩＳＣは二本鎖であるｓｉＲＮＡの３’突出部を認識してｓｉＲＮＡを複合体内に取り込み、ターゲットのｍＲＮＡ配列を認識するためのガイドとしていると考えられている。すなわち、この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を持つｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断すると考えられている。
【０００６】
ＲＩＳＣは細胞質で形成するため、ＲＮＡｉを利用して標的遺伝子をノックダウンする方法においては、ｓｉＲＮＡを細胞質に導入すればよい、すなわち、核まで移行させなくてもよい、という利点がある。また、ｓｉＲＮＡは天然型のヌクレオチドの構成で十分な効果が得られ、修飾は必須ではない。さらに、導入するＲＮＡの量はアンチセンス法で導入するアンチセンスＤＮＡの量と比較して桁違いに少なくても十分な効果を有することからも、簡便で効果的な方法として着目されている。ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉに関する総説については、以下の文献を参照されたい（例えば、非特許文献６ないし７を参照）。また、アンチセンス鎖だけでもＲＮＡｉ効果の発現が認められたという報告もある（例えば、非特許文献７を参照）。
【０００７】
ｓｉＲＮＡの細胞質への導入方法としては、カチオン性リポソーム又はその他のカチオン性担体などの担体をベクターとして用いる方法、およびリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法など細胞に直接導入する方法、などが用いられている。また、ｓｉＲＮＡを細胞内で発現するようｓｉＲＮＡをコードする配列を組み込んだ発現ベクターを細胞内に導入する方法も研究されている（例えば、非特許文献８ないし９を参照）。
【０００８】
ところで、標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡｉを発揮しうる最適なｓｉＲＮＡを見出すためには、究極的には標的ｍＲＮＡの上流側から１塩基毎にずらして始まる、所望の長さのｓｉＲＮＡについて、そのＲＮＡｉをスクリーニングする必要がある。そのような方法では、膨大な数のｓｉＲＮＡについてスクリーニングを行なう必要があり、経済的ではない。
【０００９】
また、ある標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡｉを発揮しうるｓｉＲＮＡの配列について一応の指針が示されているが、当該指針は一つの目安であって何ら確実なものではない（例えば、非特許文献８を参照）。
【特許文献１】国際公開第０２／４４３２１  Ａ２号パンフレット
【特許文献２】特表２００２−５１６０６２号公報
【特許文献３】国際公開第０１／７５１６４  Ａ２号パンフレット
【非特許文献１】Ａ．Ｆｉｒｅら、“Ｎａｔｕｒｅ”、１９９８年、３９１巻、ｐ．８０６−８１１
【非特許文献２】Ｋ．Ｕｉ−Ｔｅｉら、“ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ”、２０００年、４７９巻、ｐ．７９−８２
【非特許文献３】Ｐ．Ｄ．Ｚａｍｏｒｅら、“Ｃｅｌｌ”、２０００年３月３１日、１０１巻、１号、ｐ．２５−３３
【非特許文献４】Ｓ．Ｍ．Ｅｌｂａｓｈｉｒら、“Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”、２００１年１月１５日、１５巻、２号、ｐ．１８８−２００
【非特許文献５】Ｓ．Ｍ．Ｅｌｂａｓｈｉｒら、“Ｎａｔｕｒｅ”、２００１年５月２４日、４１１巻、ｐ．４９４−４９８
【非特許文献６】森田  隆および吉田  佳世、「タンパク質  核酸  酵素」、２００２年、４７巻ｐ．１９３９−１９４５
【非特許文献７】Ｊ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら、“Ｃｅｌｌ”、２００２年９月６日、１１０巻、５号、ｐ．５６３−５７４
【非特許文献８】Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、“Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、２００２年５月、２０巻、５号、ｐ．４９７−５００
【非特許文献９】Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、２００２年４月１９日、２９６巻、ｐ．５５０−５５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、より効率的な方法により標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡｉを発揮しうるより最適なオリゴ二本鎖ヌクレオチド又はそのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出すためのスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、標的ｍＲＮＡがＲＮＡｉを発揮するオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの中央付近で切断されることに着目し、所望する長さの塩基対の数を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡにおいて、およそ半数の塩基が重複する形の塩基毎に始まるセンス鎖ＲＮＡと、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡのプールについて、まずはスクリーニングを行えば、ＲＮＡｉを発揮しうるより最適なオリゴ二本鎖ヌクレオチド及びそのアンチセンス鎖ＲＮＡを効率的に選別できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明として、例えば、下記（１）（２）のものを挙げることができる。
（１）ＲＮＡｉにより標的ｍＲＮＡを切断し、タンパク質発現を抑制するのに適した、１５から２７塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチドのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出すために有効なスクリーニング方法であって、下記１）および２）の工程を含むスクリーニング方法。
１）初期工程：標的ｍＲＮＡのＯＲＦ内から、所望の長さの二重鎖形成部を構成する塩基対の数を２で除し、小数点以下を切り捨てた数又はその数に１を加えた数の塩基毎に始まる、当該所望の長さのセンス鎖ＲＮＡを選択し、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるプールからスクリーニングを行い、オリゴ二本鎖ＲＮＡを選別する。ただし、必要に応じて、適宜、スクリーニングに用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端を１ないし５塩基ずらした位置から始まるオリゴ二本鎖ＲＮＡについてスクリーニングを行う。
２）最終工程：前段階のスクリーニングにおいて選別したオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端に該当する標的ｍＲＮＡの塩基を中心として上流側及び下流側ともに１ないし４塩基の範囲で１塩基毎にずらした位置から始まる、当該所望の長さのオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖と、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるプールからスクリーニングを行い、最終的なオリゴ二本鎖ＲＮＡを見出し、そのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出す。ただし、必要に応じて、適宜、スクリーニングに用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端を１ないし３塩基ずらした位置から始まるオリゴ二本鎖ＲＮＡについてスクリーニングを行う。
（２）上記工程１）と２）の間に、次の中間工程を含む上記（１）のスクリーニング方法。
中間工程：前段階のスクリーニングにおいて選別したオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端に該当する標的ｍＲＮＡの塩基を中心として上流側及び下流側ともに２ないし１０塩基ずらした位置から始まる、当該所望の長さのオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡと、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるプールからスクリーニングを行い、オリゴ二本鎖ＲＮＡを更に選別する。
【００１３】
なお、初期工程及び最終工程において必要に応じて、適宜、スクリーニングに用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端をずらす場合とは、例えば、当該センス鎖ＲＮＡと標的ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡとの相同性が８５％以上である場合を挙げることができる。
【００１４】
また、中間工程においても、スクリーニングに用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡと標的ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡとの相同性が８５％以上である場合等には、適宜、オリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端に該当する標的ｍＲＮＡの塩基を中心として上流側又は下流側ともに１ないし４塩基ずらした位置から始まるオリゴ二本鎖ＲＮＡについてスクリーニングを行うことが望ましい。
【００１５】
本発明においては、上記（１）の初期工程と最終工程のスクリーニング方法を含んでいれば十分であるが、所望するオリゴ二本鎖ヌクレオチドの二重鎖形成部の長さによっては、初期工程と最終工程との間に、上記（２）に相当する中間工程を１ないし２追加することができる。
【００１６】
本明細書においてオリゴ二本鎖ヌクレオチドとは、１５から２７塩基対の二重鎖形成部を有する、１５ないし３１塩基のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドの対であって、そのアンチセンス鎖がオリゴＲＮＡであるオリゴヌクレオチドの対と定義される。
【００１７】
また、本明細書で二重鎖形成部とは、本発明のオリゴ二本鎖ヌクレオチドにおいて、当該オリゴ二本鎖ヌクレオチドを構成するヌクレオチドの対が二重鎖を形成している部分であって、標的ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡを含む部分をいう。そして、それぞれのオリゴヌクレオチドの二重鎖形成部につづく３’側又は５’側に一本鎖がある場合には、これを突出部と呼ぶ。
【００１８】
本発明に係るオリゴ二本鎖ヌクレオチドは、１５ないし３１塩基のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドの対であり、１７ないし２３塩基のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドの対が好ましい。
【００１９】
なお、本発明に係るオリゴ二本鎖ヌクレオチドは、そのセンス鎖オリゴヌクレオチドの一部又は全部がデオキシリボヌクレオチドないしリボヌクレオチドであってもよく、また修飾ヌクレオチドであってもよい。
【００２０】
また、本発明に係るオリゴ二本鎖ヌクレオチドは、少なくとも一方のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端又は５’末端にヌクレオチドを１ないし４塩基を突出部として有していても、有していなくてもよい。
【００２１】
突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチドであってもよく、又は、デオキシリボヌクレオチドであってもよい。特に望ましい態様は、突出部としてヌクレオチドを２塩基有するオリゴ二本鎖ヌクレオチドである。さらに望ましくは、突出部としてｄＴｄＴ、ＵＵ、又は、二重鎖形成部に続いて標的ｍＲＮＡと相補鎖を形成しうる配列である。
【００２２】
本発明は、ＲＮＡｉを有する１５から２７塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチドのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出すために有効であるが、好ましくは１８から２２塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチドのアンチセンス鎖ＲＮＡを、より好ましくは１９塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチドのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出すために有効である。
【００２３】
本発明に係るオリゴ二本鎖ヌクレオチドの標的遺伝子としては、例えば、ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ−ａｂｌなどの癌遺伝子、ＨＩＶウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子などに係るウイルス遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子やＦａｓ遺伝子などに係る炎症関連遺伝子が挙げられる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により標的ｍＲＮＡを切断しタンパク質発現を抑制するのに適した、１５から２７塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチド又はそのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出すために有効なスクリーニング方法の提供に貢献する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明に係るスクリーニング方法の詳細は実施例に示すが、標的ｍＲＮＡをｂｃｌ−２ｍＲＮＡとし、その標的ｍＲＮＡを切断しＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制するのに適した、１９塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ヌクレオチドのアンチセンス鎖ＲＮＡを見出す場合について以下に述べる。
【００２６】
初期工程：一次スクリーニング
ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）内から、約９塩基毎に始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるプールからスクリーニングを行う。
【００２７】
中間工程：二次スクリーニング
一次スクリーニングで高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の見られたオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端が、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの配列において該当する塩基を中心に、３塩基毎にずらした１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡのスクリーニングを行う。
【００２８】
最終工程：三次スクリーニング
二次スクリーニングで高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の見られたオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡの５’末端が、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの配列において該当する塩基を中心に、１塩基毎にずらした１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡのスクリーニングを行う。
【００２９】
選別したセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡのＲＮＡｉの評価は、後述の実施例に詳細を示すが、当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを培養系の癌細胞などにカチオン性リポソームなどを用いてトランスフェクションし、所定時間培養した後、当該癌細胞におけるＢｃｌ−２タンパク質発現量およびその低下度をウエスタンブロッティングで評価することにより行うことができる。また、上述した方法だけでなく、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ量、又は細胞増殖抑制を指標とする方法によっても評価することができる。
【００３０】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１  スクリーニングとその評価
ｉ）オリゴ二本鎖ＲＮＡの調製
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するオリゴＲＮＡの合成は、自動核酸合成装置を用いた標準的なホスホアミダイト法による固相合成で行った。合成は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（米国  コロラド州）又は日本バイオサービス（埼玉県）に合成を依頼するか、又は本発明者らが行った。
【００３２】
本発明者らが行った手順を簡単に述べる。自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９）を用いて、標準的なホスホアミダイト法により所望の塩基配列を形成するよう、モノマーを逐次縮合した。濃水酸化アンモニウム−エタノール（３：１）混合液を用いてＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）よりヌクレオチド鎖を開裂させ、さらに同溶液中で５５℃、１８時間おいて脱保護した。その後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液を用いて室温で２０時間処理し、２’位のシリル基を脱保護した。得られたオリゴリボヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーにて精製した。さらに、８０％酢酸水溶液にて室温で３０分処理し、５’位のＤＭＴｒ基を脱保護した後、イオン交換クロマトグラフィーにて再度精製した。脱塩後に得られたオリゴヌクレオチドは、キャピラリーゲル電気泳動により９０％以上が目的の全長物質であることを確認した。
【００３３】
こうしてオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するオリゴＲＮＡの各々を合成し、二重鎖形成部が相補的な２本のオリゴＲＮＡを、後述するように等モルで混合することでオリゴ二本鎖ＲＮＡとして用いた。
【００３４】
ｉｉ）スクリーニングにおける評価方法
スクリーニングにおける評価は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを担体と共に各種癌細胞に導入し、タンパク質の発現量をウエスタンブロッティングを用い評価することにより、およびｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用い準定量することにより、又はセルカウンティングアッセイを用い細胞増殖抑制活性を評価することにより行った。
【００３５】
オリゴ二本鎖ＲＮＡと担体の複合体の調製
担体として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールと精製卵黄レシチンを含むカチオン性リポソーム（以下「リポソームＡ」という）を用い、オリゴ二本鎖ＲＮＡとの複合体を調製した。オリゴ二本鎖ＲＮＡ  １重量部に対してリポソームＡ  １６重量部を混合して複合体を調製した。以下に、オリゴ二本鎖ＲＮＡの終濃度１０μＭの複合体溶液、２ｍｌの調製について示す。ただし、オリゴ二本鎖ＲＮＡ複合体の濃度は、オリゴ二本鎖ＲＮＡが完全に二本鎖形成していると仮定したときに複合体に含まれているオリゴ二本鎖ＲＮＡのモル濃度で示している。
【００３６】
３００μＭになるように注射用水に溶解したセンス鎖およびアンチセンス鎖それぞれ６６．６μｌを試験管中で混合した。これに８６６．８μｌの１０％マルトースを添加し、両鎖をそれぞれ２０μＭの濃度で含む溶液１ｍｌを調製した。これをオリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液とした。
【００３７】
１６ｍｇ／ｍｌのリポソームＡ分散液２６８μｌに１０％マルトース７３２μｌを添加し、４．３ｍｇ／ｍｌのリポソームＡ分散液１ｍｌを調製した。このリポソーム分散液１ｍｌに上記オリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液１ｍｌを、撹拌しながら徐々に添加した。以上の操作により、オリゴ二本鎖ＲＮＡの終濃度が１０μＭであるオリゴ二本鎖ＲＮＡ−リポソーム複合体溶液を調製した。この複合体を６００Ｗのバス型超音波装置を用いて２分間分散処理することにより複合体の粒子を均一にした。
【００３８】
下記評価系における陰性対照および陽性対照
すべての評価系において、陰性対照としては、ルシフェラーゼの発現を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡ（ＧＬ３）をトランスフェクションしたものを用い、陽性対照としては、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有するＢ７１７  オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしたものを用いた。
【００３９】
ウエスタンブロッティングによるタンパク質発現抑制活性の評価
上記のオリゴ二本鎖ＲＮＡ−リポソーム複合体を用いてオリゴ二本鎖ＲＮＡを細胞内にトランスフェクションさせることで、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現が抑制されるかどうかをウエスタンブロッティングを用い評価した。
【００４０】
６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞（上皮癌細胞）、Ａ３７５細胞（メラノーマ細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳癌細胞）、又はＡ５４９（肺癌）細胞を２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）中、３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養した。翌日、培養ディッシュから培地を吸引し、２．７ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）を加えて培地交換した。そこに、１０％マルトース水溶液中で混合したオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比はオリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）溶液を０．３ｍｌ添加し、終量を３ｍｌとした。このときのオリゴ二本鎖ＲＮＡの最終濃度は３ｎＭ又は１０ｎＭである。３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内にて７２時間培養した。細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、セルスクレーパーを用いて１．５ｍｌチューブに移した。１０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を取り除いた後、２０から１００μｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０）を加えて細胞を溶解した。氷上で３０分間静置し、１００，０００×ｇで１５分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、電気泳動用サンプルとした。
【００４１】
電気泳動はポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ  ＮＰＧ−５２０Ｌ又はＥ−Ｔ５２０Ｌ）を用い、１レーンあたり総タンパク質の量を１５μｇとしたサンプルをアプライした。泳動終了後、ポリビニリデンフルオラド（ＰＶＤＦ）膜にゲル内のタンパク質を転写し、５％スキムミルク含有ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ−ＭＬＫ；ここで、ＰＢＳＴの組成は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）中室温で１時間ブロッキングした。まず、Ｂｃｌ−２タンパク質の検出を行った。ブロッキングが終了したＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ−ＭＬＫで５００倍に希釈したマウス抗ヒトＢｃｌ−２モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ  Ｍ０８８７）中にて、４℃で一晩振盪して一次抗体と結合させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴ−ＭＬＫで１５００倍に希釈したＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ  Ｐ０４４７）中にて室温で２時間振盪し、二次抗体と結合させた。ＰＢＳＴで洗浄後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光させ、フィルムに露光した。
【００４２】
Ｂｃｌ−２タンパク質の検出終了後、同じＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、Ｂｃｌ−２と同様にＡｃｔｉｎタンパク質の検出を行った。一次抗体にはヤギ抗ヒトＡｃｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−１６１６）を、二次抗体にはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇ抗体（ＤＡＫＯ  Ｐ０４４９）を用いた。それぞれＰＢＳＴ−ＭＬＫで２５００倍、３０００倍に希釈して使用した。
【００４３】
その評価は、陰性対照および陽性対照におけるＢｃｌ−２タンパク質のバンドの濃さを基準として、目視により行った。目視の結果、陽性対照と同等である場合には「＋」、陽性対照よりも薄い場合には「＋＋」、陰性対照よりも薄いが、陽性対照よりも濃い場合には「±」とした。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現抑制活性の評価
オリゴ二本鎖ＲＮＡのトランスフェクションによるＢｃｌ−２タンパク質発現抑制作用はｍＲＮＡの発現抑制に起因するかどうかを調べるため、ｂｃｌ−２のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲを用い準定量することにより評価した。
【００４５】
６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞（上皮癌細胞）を２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）中、３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養した。翌日、培養ディッシュから培地を吸引し、２．７ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）を加えて培地交換した。そこに、１０％マルトース水溶液中で混合したオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比はオリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）溶液を０．３ｍｌ添加し、終量を３ｍｌとした。このときのオリゴ二本鎖ＲＮＡの最終濃度は１０ｎＭである。ＣＯ2インキュベーター内にて２４時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、０．５ｍｌのＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いて細胞を溶解し、１．５ｍｌチューブに移した。２００μｌのクロロホルムを加え、水層と有機層とに分離し、水層からトータルＲＮＡを単離した。
【００４６】
トータルＲＮＡ２μｇを鋳型に、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  １１１４６−０１６）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成した。この逆転写反応液中に含まれるｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型に用い、キャピラリーＰＣＲ法による検出定量システム（ライトサイクラー、ロッシュ・ダイアグノスティックス）を用いてｂｃｌ−２および構成的発現遺伝子であるＧＡＤＰＨ（Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）特異的なＰＣＲ増幅を行い、ｍＲＮＡ量の準定量を行った。ｂｃｌ−２のＰＣＲ増幅には１００ｎｇのトータルＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、ＧＡＤＰＨのＰＣＲ増幅には０．５ｎｇのトータルＲＮＡ由来のｃＤＮＡをそれぞれ鋳型に用いた。
【００４７】
その評価は、陰性対照におけるｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量又はＧＡＤＰＨのｍＲＮＡ量を１としたときのサンプルのｍＲＮＡ量の相対的な割合として評価した。
【００４８】
セルカウンティングアッセイによる細胞増殖抑制活性の評価
オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションすることによる細胞増殖抑制効果を調べるため、セルカウンティングアッセイによる細胞増殖抑制効果を測定することで評価した。
【００４９】
９６穴プレートにＡ４３１細胞（上皮癌細胞）を５×１０2ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｄ６０４６）中で２４時間培養した。培養プレートから培地を吸引し、１３５μｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。そこに、１０％マルトース水溶液中で混合したオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比はオリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）溶液を１５μｌ添加し、終量を１５０μｌとした。ＣＯ2インキュベーター内で６日間培養した。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１５μｌずつ添加し、ＣＯ2インキュベーター内で呈色反応を２時間行った。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長は５９５ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００５０】
その評価は、オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしていないＡ４３１細胞の細胞数を１００％としたときの相対的な細胞数の割合を生細胞率として評価した。
【００５１】
ｉｉｉ）スクリーニング
Ｂｃｌ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡの配列として、登録されているものを比較検討したところ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２７２５８として登録されているｂｃｌ−２の完全長ｍＲＮＡの配列がコンセンサスであることを確認した。このＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２７２５８の塩基配列（以下、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡという：配列番号１６３）に基づいて、後述の実施例に示す一次（初期）、二次（中間）、三次（最終）スクリーニングにより、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を抑制する活性を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡを探索した。
【００５２】
スクリーニングに用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡは、１９塩基のセンス鎖ＲＮＡおよびこれに相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として有し、それぞれの３’末端にｄＴｄＴの突出部を有するようにした。また、スクリーニングに用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡは「Ｂｘｘｘ」で表し、ここで、「ｘｘｘ」はオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖の５’末端の塩基のｂｃｌ−２  ｍＲＮＡにおける翻訳開始点からの位置の番号を表すこととした。
【００５３】
初期工程：一次スクリーニング
一次スクリーニングにおけるオリゴ二本鎖ＲＮＡのプールは、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）内から、９塩基毎に始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡと、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるものとした。ただし、ＢＬＡＳＴサーチの結果、用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡ中に、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡについての連続１７塩基以上の相同配列が存在する場合には、適宜、１ないし２塩基シフトさせ、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡとの相同配列が１６塩基以下の配列を使用した。
【００５４】
一次スクリーニングの結果、Ｂ００２（配列番号１および配列番号８２）、Ｂ０１０（配列番号２および配列番号８３）、Ｂ０２８（配列番号３および配列番号８４）、Ｂ０３７（配列番号６および配列番号８７）、Ｂ０４６（配列番号１４および配列番号９５）、Ｂ０５５（配列番号１５および配列番号９６）、Ｂ０６５（配列番号１６および配列番号９７）、Ｂ０７３（配列番号１７および配列番号９８）、Ｂ０８４（配列番号１８および配列番号９９）、Ｂ１３６（配列番号１９および配列番号１００）、Ｂ１７２（配列番号２０および配列番号１０１）、Ｂ１９９（配列番号２１および配列番号１０２）、Ｂ２０７（配列番号２２および配列番号１０３）、Ｂ２５３（配列番号２３および配列番号１０４）、Ｂ２６２（配列番号２４および配列番号１０５）、Ｂ２８０（配列番号２５および配列番号１０６）、Ｂ３２５（配列番号２６および配列番号１０７）、Ｂ３５２（配列番号２７および配列番号１０８）、Ｂ３９７（配列番号２８および配列番号１０９）、Ｂ４３３（配列番号２９および配列番号１１０）、Ｂ４４２（配列番号３２および配列番号１１３）、Ｂ４５１（配列番号３３および配列番号１１４）、Ｂ４６９（配列番号３６および配列番号１１７）、Ｂ４７８（配列番号３９および配列番号１２０）、Ｂ５１６（配列番号４０および配列番号１２１）、Ｂ５２３（配列番号４１および配列番号１２２）、Ｂ５３９（配列番号４６および配列番号１２７）、Ｂ５５８（配列番号４９および配列番号１３０）、Ｂ５７６（配列番号５０および配列番号１３１）、Ｂ５８６（配列番号５１および配列番号１３２）、Ｂ５９５（配列番号５２および配列番号１３３）、Ｂ６０４（配列番号５３および配列番号１３４）、Ｂ６１３（配列番号５４および配列番号１３５）、Ｂ６２２（配列番号５９および配列番号１４０）、Ｂ６３１（配列番号６２および配列番号１４３）、Ｂ６４２（配列番号６５および配列番号１４６）、Ｂ６４９（配列番号６６および配列番号１４７）、Ｂ６５４（配列番号６７および配列番号１４８）、Ｂ６５８（配列番号６８および配列番号１４９）、Ｂ６６７（配列番号６９および配列番号１５０）、Ｂ６７６（配列番号７０および配列番号１５１）、Ｂ７０３（配列番号７３および配列番号１５４）、Ｂ７１２（配列番号７６および配列番号１５７）、Ｂ７１７（配列番号７７および配列番号１５８）、およびＢ７２１（配列番号７９および配列番号１６０）のオリゴ二本鎖ＲＮＡにＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性が認められた。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性をウエスタンブロッティングにより評価した結果をこの節の最後に示した表１に示す。
【００５５】
一次スクリーニングでＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性のあったオリゴ二本鎖ＲＮＡのうち、特に活性の高かった９つのオリゴ二本鎖ＲＮＡを以下に示す。
【００５６】
Ｂ０３７：
センス鎖
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACA-dTdT-3'（配列番号６）
アンチセンス鎖
5'-UGUACUUCAUCACUAUCUC-dTdT-3'（配列番号８７）
Ｂ４３３：
センス鎖
5'-GGGAGGAUUGUGGCCUUCU-dTdT-3'（配列番号２９）
アンチセンス鎖
5'-AGAAGGCCACAAUCCUCCC-dTdT-3'（配列番号１１０）
Ｂ４６９：
センス鎖
5'-AUGUGUGUGGAGAGCGUCA-dTdT-3'（配列番号３６）
アンチセンス鎖
5'-UGACGCUCUCCACACACAU-dTdT-3'（配列番号１１７）
Ｂ５３９：
センス鎖
5'-ACCUGAACCGGCACCUGCA-dTdT-3'（配列番号４６）
アンチセンス鎖
5'-UGCAGGUGCCGGUUCAGGU-dTdT-3'（配列番号１２７）
Ｂ６２２：
センス鎖
5'-CCUCUGUUUGAUUUCUCCU-dTdT-3'（配列番号５９）
アンチセンス鎖
5'-AGGAGAAAUCAAACAGAGG-dTdT-3'（配列番号１４０）
Ｂ６３１：
センス鎖
5'-GAUUUCUCCUGGCUGUCUC-dTdT-3'（配列番号６２）
アンチセンス鎖
5'-GAGACAGCCAGGAGAAAUC-dTdT-3'（配列番号１４３）
Ｂ７０３：
センス鎖
5'-UAUCUGGGCCACAAGUGAA-dTdT-3'（配列番号７３）
アンチセンス鎖
5'-UUCACUUGUGGCCCAGAUA-dTdT-3'（配列番号１５４）
Ｂ７１７：
センス鎖
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGC-dTdT-3'（配列番号７７）
アンチセンス鎖
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3'（配列番号１５８）
Ｂ７２１：
センス鎖
5'-AGUCAACAUGCCUGCCCCA-dTdT-3'（配列番号７９）
アンチセンス鎖
5'-UGGGGCAGGCAUGUUGACU-dTdT-3'（配列番号１６０）
Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の高かった９つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ０３７、Ｂ４３３、Ｂ４６９、Ｂ５３９、Ｂ６２２、Ｂ６３１、Ｂ７０３、Ｂ７１７およびＢ７２１）についてＲＴ−ＰＣＲによりｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量を評価した。その結果を図１に示す。その結果、一次スクリーニングで得られた９つのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞のすべてにおいて、陰性対照と比較してｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量の減少が観察された。
【００５７】
中間工程：二次スクリーニング
二次スクリーニングのオリゴ二本鎖ＲＮＡのプールは、一次スクリーニングで高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の見られたＢ７１７以外の８つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ０３７、Ｂ４３３、Ｂ４６９、Ｂ５３９、Ｂ６２２、Ｂ６３１、Ｂ７０３およびＢ７２１）、および、それらのセンス鎖ＲＮＡの５’末端に該当するｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの塩基を中心としてそれぞれ上流側および下流側に３塩基および６塩基ずらした位置から始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡから構成されるものとした。ただし、ＢＬＡＳＴサーチの結果、用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡ中に、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡについての連続１７塩基以上の相同配列が存在する場合には、適宜、１ないし２塩基シフトさせ、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡとの相同配列が１６塩基以下の配列を使用した。
【００５８】
二次スクリーニングの結果、Ｂ０３１（配列番号４および配列番号８５）、Ｂ０３４（配列番号５および配列番号８６）、Ｂ０３７（配列番号６および配列番号８７）、Ｂ０４０（配列番号８および配列番号８９）、Ｂ０４３（配列番号１１および配列番号９２）、Ｂ４３３（配列番号２９および配列番号１１０）、Ｂ４３６（配列番号３０および配列番号１１１）、Ｂ４３９（配列番号３１および配列番号１１２）、Ｂ４６３（配列番号３４および配列番号１１５）、Ｂ４６６（配列番号３５および配列番号１１６）、Ｂ４６９（配列番号３６および配列番号１１７）、Ｂ４７２（配列番号３７および配列番号１１８）、Ｂ４７５（配列番号３８および配列番号１１９）、Ｂ５３３（配列番号４３および配列番号１２４）、Ｂ５３６（配列番号４５および配列番号１２６）、Ｂ５３９（配列番号４６および配列番号１２７）、Ｂ５４３（配列番号４７および配列番号１２８）、Ｂ５４５（配列番号４８および配列番号１２９）、Ｂ６１６（配列番号５７および配列番号１３８）、Ｂ６１９（配列番号５８および配列番号１３９）、Ｂ６２２（配列番号５９および配列番号１４０）、Ｂ６２５（配列番号６０および配列番号１４１）、Ｂ６２８（配列番号６１および配列番号１４２）、Ｂ６３１（配列番号６２および配列番号１４３）、Ｂ６３４（配列番号６３および配列番号１４４）、Ｂ６３６（配列番号６４および配列番号１４５）、Ｂ６９７（配列番号７１および配列番号１５２）、Ｂ７００（配列番号７２および配列番号１５３）、Ｂ７０３（配列番号７３および配列番号１５４）、Ｂ７０６（配列番号７４および配列番号１５５）、Ｂ７０９（配列番号７５および配列番号１５６）、Ｂ７１９（配列番号７８および配列番号１５９）、Ｂ７２１（配列番号７９および配列番号１６０）、Ｂ７２４（配列番号８０および配列番号１６１）、およびＢ７２７（配列番号８１および配列番号１６２）のオリゴ二本鎖ＲＮＡにＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性が認められた。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性をウエスタンブロッティングにより評価した結果をこの節の最後に示した表１に示す。
【００５９】
二次スクリーニングでＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性のあったオリゴ二本鎖ＲＮＡのうち、特に活性の高かった７つのオリゴ二本鎖ＲＮＡを以下に示す。
【００６０】
Ｂ０３７：
センス鎖
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACA-dTdT-3'（配列番号６）
アンチセンス鎖
5'-UGUACUUCAUCACUAUCUC-dTdT-3'（配列番号８７）
Ｂ０４３：
センス鎖
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'（配列番号１１）
アンチセンス鎖
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'（配列番号９２）
Ｂ４３６：
センス鎖
5'-AGGAUUGUGGCCUUCUUUG-dTdT-3'（配列番号３０）
アンチセンス鎖
5'-CAAAGAAGGCCACAAUCCU-dTdT-3'（配列番号１１１）
Ｂ４６９：
センス鎖
5'-AUGUGUGUGGAGAGCGUCA-dTdT-3'（配列番号３６）
アンチセンス鎖
5'-UGACGCUCUCCACACACAU-dTdT-3'（配列番号１１７）
Ｂ５３３：
センス鎖
5'-CUGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'（配列番号４３）
アンチセンス鎖
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'（配列番号１２４）
Ｂ６１６：
センス鎖
5'-AUGCGGCCUCUGUUUGAUU-dTdT-3'（配列番号５７）
アンチセンス鎖
5'-AAUCAAACAGAGGCCGCAU-dTdT-3'（配列番号１３８）
Ｂ６３１：
センス鎖
5'-GAUUUCUCCUGGCUGUCUC-dTdT-3'（配列番号６２）
アンチセンス鎖
5'-GAGACAGCCAGGAGAAAUC-dTdT-3'（配列番号１４３）
これらのうち、Ｂ０４３およびＢ５３３のオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞のｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲにより評価した結果を図２ａに示す。その結果、いずれのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞においても、陰性対照と比較してｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量の減少が観察された（図２ａ）。さらに、陽性対照であるＢ７１７のオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしたときよりもｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ量は減少していた（図２ａ）。一方、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量には影響が見られなかった（図２ｂ）。また、Ａ４３１細胞に、Ｂ０４３およびＢ５３３のそれぞれのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした後、７２時間培養した細胞中のＢｃｌ−２タンパク質の発現量を、ウエスタンブロッティングにより評価した結果を示す写真を図２ｃに示す。オリゴ二本鎖ＲＮＡを１０ｎＭでトランスフェクションした際には、選択されたオリゴ二本鎖ＲＮＡはＢｃｌ−２タンパク質の発現を顕著に抑制することが観察された（図２ｃ上段）。一方、コントロールであるＡｃｔｉｎタンパク質の量には影響が見られなかった（図２ｃ下段）。
【００６１】
したがって、二次スクリーニングで得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡはいずれも、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを特異的に分解し、およびＢｃｌ−２タンパク質の発現を特異的に抑制していることが示された。
【００６２】
最終工程：三次スクリーニング
三次スクリーニングのオリゴ二本鎖ＲＮＡのプールは、二次スクリーニングで高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性のみられた４つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ０３７、Ｂ０４３、Ｂ５３３、およびＢ６１６）および、そのセンス鎖ＲＮＡの５’末端に該当するｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの塩基を中心として上流側および下流側ともに３塩基の範囲で１塩基毎にずらした位置から始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡから構成されるものとした。ただし、合成収率が低下するであろうと予測できるほどＧＣ含量の高い配列はスクリーニングの対象から除いた。
【００６３】
三次スクリーニングの結果、Ｂ０３７（配列番号６および配列番号８７）、Ｂ０３９（配列番号７および配列番号８８）、Ｂ０４０（配列番号８および配列番号８９）、Ｂ０４１（配列番号９および配列番号９０）、Ｂ０４２（配列番号１０および配列番号９１）、Ｂ０４３（配列番号１１および配列番号９２）、Ｂ０４４（配列番号１２および配列番号９３）、Ｂ０４５（配列番号１３および配列番号９４）、Ｂ５３１（配列番号４２および配列番号１２３）、Ｂ５３３（配列番号４３および配列番号１２４）、Ｂ５３４（配列番号４４および配列番号１２５）、Ｂ６１４（配列番号５５および配列番号１３６）、Ｂ６１５（配列番号５６および配列番号１３７）、および、Ｂ６１６（配列番号５７および配列番号１３８）のオリゴ二本鎖ＲＮＡにＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性が認められた。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性をウエスタンブロッティングにより評価した結果を、図３、図４およびこの節の最後に示した表１に示す。
【００６４】
三次スクリーニングでＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性のあったオリゴ二本鎖ＲＮＡのうち、特に高かった３つのオリゴ二本鎖ＲＮＡを以下に示す。
【００６５】
Ｂ０４３：
センス鎖
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'（配列番号１１）
アンチセンス鎖
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'（配列番号９２）
Ｂ５３３：
センス鎖
5'-CUGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'（配列番号４３）
アンチセンス鎖
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'（配列番号１２４）
Ｂ６１４：
センス鎖
5'-GCAUGCGGCCUCUGUUUGA-dTdT-3'（配列番号５５）
アンチセンス鎖
5'-UCAAACAGAGGCCGCAUGC-dTdT-3'（配列番号１３６）
これらのうち、Ｂ０４３およびＢ５３３のオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞の増殖能をセルカウンティングアッセイにより評価した結果を図５に示す。その結果、いずれのオリゴ二本鎖ＲＮＡにおいても、トランスフェクションの際の濃度が１ｎＭ程度で細胞数が減少し始め、１０ｎＭになると細胞数が２０％程度に減少した。したがって、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡはＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制した結果、細胞増殖を抑える効果を発揮することが明らかとなった。
【００６６】
表１に、一次から三次スクリーニングの過程で、タンパク質発現抑制活性の認められたオリゴ二本鎖ＲＮＡを一覧にして示す。
【００６７】
【表１−ａ】
2005013224.tif 000002
【００６８】
【表１−ｂ】
2005013224.tif 000003
【００６９】
【表１−ｃ】
2005013224.tif 000004
【００７０】
【表１−ｄ】
2005013224.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、一次スクリーニングで得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡをＡ４３１細胞内にトランスフェクションして、２４時間培養した後の、その細胞におけるｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲにより準定量した結果を示す。縦軸は陰性対照ＧＬ３をトランスフェクションしたときのｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ量を１とした時、それぞれのオリゴ二本鎖ＲＮＡのトランスフェクション時のｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ量を示す。横軸は検討を行ったオリゴ二本鎖ＲＮＡの名称を示す。
【図２】図２aおよびｂは、オリゴ二本鎖ＲＮＡとしてＢ７１７、Ｂ０４３およびＢ５３３をＡ４３１細胞内にトランスフェクションして２４時間培養した後の、その細胞におけるｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ量（図２ａ）および構成的発現遺伝子であるＧＡＤＰＨのｍＲＮＡ量（図２ｂ）をＲＴ−ＰＣＲにより準定量した結果を示す。図２ｃは、Ｂ７１７、Ｂ０４３およびＢ５３３を終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションして７２時間培養した後の、その細胞におけるＢｃｌ−２タンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより評価した結果を示す。
【図３】図３は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロッティングで行った結果を示す。上段は終濃度３ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションして７２時間培養した後の結果である。
【図４】図４は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロッティングで行った結果を示す。上段は終濃度３ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションして７２時間培養した後の結果である。
【図５】選択したオリゴ二本鎖ＲＮＡの細胞増殖に対する効果をセルカウンティングアッセイにより評価した結果を示す。細胞はＡ４３１細胞を用い、オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした後、６日間培養した後の細胞数を測定した。縦軸は、オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしていないＡ４３１細胞の細胞数を１００％としたときの、それぞれのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしたときの細胞数の割合を示す。横軸は、トランスフェクションしたときの終濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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