(57)【要約】【課題】造血幹細胞および造血前駆細胞から選ばれた少なくとも１種を含む細胞から白血球を体外培養にて分化誘導を行う新たな方法を提供し、特にノッチリガンドを利用した方法を提供することを目的にする。さらに、特定のノッチリガンドを用いることにより、特定の白血球系細胞、すなわち、リンパ球系前駆細胞、骨髄球系前駆細胞を各々分化誘導して作製する手法を提供することを目的とする。【解決手段】造血幹細胞および造血前駆細胞から選ばれた少なくとも１種を含む細胞を、ノッチリガンドタンパク質の存在下で培養して白血球に分化誘導させることからなる白血球の製造方法である。ノッチリガンドタンパク質としてデルタ−１またはジャグド−１を用いてリンパ球に分化誘導させることができ、ノッチリガンドタンパク質としてデルタ−４を用いて骨髄球に分化誘導させることができる。【選択図】  選択図なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞および造血前駆細胞から選ばれた少なくとも１種を含む細胞を、ノッチリガンドタンパク質の存在下で培養して白血球に分化誘導させることからなる白血球の製造方法。
【請求項２】
ノッチリガンドタンパク質としてデルタ−１またはジャグド−１を用いてリンパ球に分化誘導させる請求項１記載の白血球の製造方法。
【請求項３】
ノッチリガンドタンパク質としてデルタ−４を用いて骨髄球に分化誘導させる請求項１記載の白血球の製造方法。
【請求項４】
造血幹細胞および造血前駆細胞から選ばれた少なくとも１種を含む細胞が、ＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、細胞分化抗原陰性細胞である請求項１〜３のいずれか１項に記載の白血球の製造方法。
【請求項５】
造血幹細胞および造血前駆細胞から選ばれた少なくとも１種を含む細胞が、ＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、細胞分化抗原陰性、Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３陽性細胞である請求項４記載の白血球の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、白血球を体外培養により分化誘導して製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
造血幹細胞はすべての血液細胞を生み出すことができる細胞であり、骨髄、臍帯血に比較的多く含まれることが知られている。この造血幹細胞から生み出される白血球は、血液細胞の分化系譜および機能から大別すると、リンパ球と骨髄球に分けられる。現在の概念では、造血幹細胞から、初めにリンパ球系前駆細胞と骨髄球／赤芽球／巨核球前駆細胞との２つの種類への分化が起こる。その後、リンパ球系前駆細胞からＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などの成熟リンパ球へと分化し、一方の骨髄球／赤芽球／巨核球前期細胞からは顆粒球、単球、赤血球、血小板へと最終分化する（非特許文献１）。
【０００３】
特に、最も初期の上記リンパ球系前駆細胞と骨髄球／赤芽球／巨核球前駆細胞との２つの種類への分化をコントロールすることができれば、造血幹細胞から目的とする細胞を生み出すことが可能となる。
白血球は、主に感染症、癌などの疾病に対する免疫作用を司る。したがって、培養によって作製した各種白血球は、白血球系の特定の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製したり、刺激した細胞を用いる細胞医療へ利用することができる。
【０００４】
現在の技術では、体外培養においては目的の細胞を高効率に製造することは困難な点が多い。特に、リンパ球系細胞の増殖、分化誘導にはインターロイキン−７（ＩＬ−７）が有効であるとされている。ＩＬ−７は、リンパ球系前駆細胞の増殖、生存に必須の分子であり、初期の研究では、Ｂ細胞の初期分化に効果があるとされたが、同様にＴ細胞の初期分化にとっても重要な働きを担っている（非特許文献２）。しかしながら、ＩＬ−７自身には、造血幹細胞からリンパ球系細胞への分化の振り分けを行っているわけではないと推察されている。
【０００５】
このような状況に鑑み、本発明者らは、ノッチシグナルに興味を持ち、ノッチリセプターを用いることによって、造血幹細胞からリンパ球系前駆細胞と骨髄球系前駆細胞を峻別して分化誘導できるのではないかと推察して、鋭意検討を行った。
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）は、ショウジョウバエで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター型膜蛋白質であり、無脊椎動物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされている。このノッチリセプターを活性化して、細胞の分化を抑制するシグナルを伝達するリガンド分子としては、ショウジョウバエノッチのリガンドとしてショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）およびショウジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２つが見いだされており、リセプターのノッチと同様に広い動物種からノッチリガンドホモログが見いだされている（非特許文献３）。
【０００６】
哺乳類のノッチリセプターは４つの分子が存在し、それぞれノッチー１〜４と命名されている。一方、哺乳類のノッチリガンド分子に関しては５種類の分子が報告されている。詳しくは、デルタ型リガンドとして、デルター１（別名：ＤＬＬ１。本明細書では、デルター１、という）、デルター４（別名：デルター２、ＤＬＬ４。本明細書では、デルター４、という）、デルター３（別名：ＤＬＬ３。本明細書では、デルター３、という）が、セレイト型リガンドとして、ジャグドー１（別名：セレイトー１。本明細書では、ジャグドー１、という）、ジャグドー２（別名：セレイトー２。本明細書では、ジャグドー２、という）が２０００年６月末時点までに報告されている。
【０００７】
哺乳類の代表例として、ヒト遺伝子クローニングに関する代表的な引用文献を示す。ヒトデルター１は、特許文献１および非特許文献４に開示されている。ヒトデルター４は、特許文献２および非特許文献５に開示されている。ヒトデルター３は、特許文献３および非特許文献６に開示されている。ヒトジャグドー１は特許文献４、特許文献１および非特許文献７に開示されている。ヒトジャグドー２は、特許文献５および非特許文献８に開示されている。
【０００８】
これら５種のノッチリガンドが血液細胞の分化を抑制することは、特許文献１，２、３および５に、コロニーを形成する血液未分化細胞およびＬＴＣ−ＩＣで測定される血液未分化細胞に対する作用が示され、造血幹細胞の体外培養に関する用途について開示されている。また、これらの文献において、ノッチリガンドタンパク質の作製方法が示されている。ノッチリガンドの造血再構築能を有する造血幹細胞に対する作用は、特許文献６および非特許文献９に記載されている。
【０００９】
リンパ球分化とノッチに関しては、既にノッチリセプターのノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスを用いた解析から、成熟リンパ球への最終分化にとって必須分子であることは知られている（非特許文献１０）。一方、ノッチリガンドに関しては、近年、デルター１を遺伝子導入したストローマ細胞が、Ｔ細胞の最終分化の支持能を獲得することが示された（非特許文献１１）。
いずれにしても、これらの研究は、リンパ球系前駆細胞から機能細胞（終末分化を遂げたＴ細胞，Ｂ細胞）への分化作用を明らかにしたに留まり、造血幹細胞からリンパ球系前駆細胞、骨髄球系前駆細胞の分化の振り分けという、それ以前の白血球系細胞分化に対する作用を明らかにしておらず、ノッチリガンドのこの部分に対する作用は不明であった。
【００１０】
【特許文献１】
国際公開第９７／１９１７２号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９８／５１７９９号パンフレット
【特許文献３】
特開平１１−２９９４９３号公報
【特許文献４】
国際公開第９６／２７６１０号パンフレット
【特許文献５】
国際公開第９８／０２４５８号パンフレット
【特許文献６】
国際公開第０２／１６５５６号パンフレット
【非特許文献１】
Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ，  ３，  ｐ１３７，  ２００２年
【非特許文献２】
Ｍｅｒｔｓｃｈｉｎｇ  ら、Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６，  ｐ２８５，  １９９８年
【非特許文献３】
Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，  ｐ７７０，  １９９９年
【非特許文献４】
Ｇｒａｙ  ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １５４，  ｐ７８５，  １９９９年
【非特許文献５】
Ｓｈｕｔｔｅｒ  ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １４，  ｐ１３１３，  ２０００年
【非特許文献６】
Ｂｕｌｍａｎ  ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２４，  ｐ４３８，  ２０００年
【非特許文献７】
Ｏｄａ  ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ４３，  ｐ３７６，  １９９７年
【非特許文献８】
Ｌｕｏ  ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７，  ｐ６０５７，  １９９７年
【非特許文献９】
Ｋａｒａｎｕ  ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９２，  ｐ１３６５，  ２０００年、Ｋａｒａｎｕ  ら、Ｂｌｏｏｄ，            ９７，ｐ１９６０，  ２００１年
【非特許文献１０】
Ｉｚｏｎ  ら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４，  ｐ１９２，  ２００２年
【非特許文献１１】
Ｓｃｈｍｉｔｔ  ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  １７，  ｐ７４９，  ２００２年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、造血幹細胞および造血前駆細胞から選ばれた少なくとも１種を含む細胞から白血球を体外培養にて分化誘導を行う新たな方法を提供し、特にノッチリガンドを利用した方法を提供することを目的にする。さらに、特定のノッチリガンドを用いることにより、特定の白血球系細胞、すなわち、リンパ球系前駆細胞、骨髄球系前駆細胞を各々分化誘導して作製する手法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために、初めにマウス骨髄細胞を表面抗原に対する抗体を用いて細胞を分画し、リンパ球系前駆細胞と骨髄球系前駆細胞を共に含む細胞群について詳細に解析した。
長期の骨髄再構築能を有する造血幹細胞は、ＣＤ３４陰性、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ１陽性、分化抗原（Ｌｉｎ）陰性に存在する。また、ＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ１陽性、Ｌｉｎ陰性画分には、短期骨髄再構築能を有する造血前駆細胞が存在する。そして、これらの表面抗原の違いによって、これら細胞が精製できることが知られている（Ｏｓａｗａ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７３，  ｐ２４２，  １９９６年）。
【００１３】
本発明者らは、リンパ球系前駆細胞と骨髄系前駆細胞の分化の振り分けが起こるとする時期は、長期骨髄再構築能を有する画分ではなく、短期骨髄再構築能を有する造血前駆細胞画分、すなわち、ＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ１陽性、Ｌｉｎ陰性画分を用いて作用解析をするのが望ましいと考え、この細胞画分をさらに詳細に表面抗原抗体を用いて分画して、ノッチリガンドの作用を解析した。
その結果、上記表面抗原であり、さらにＦｌｋ２／Ｆｌｔ３陽性である細胞、すなわち、ＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ１陽性、細胞分化抗原陰性、Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３陽性である細胞を、ノッチリガンドタンパク質を含む培養条件で培養を行うと、デルター１またはジャグドー１を添加した培養条件では、リンパ球系の表面抗原Ｂ２２０陽性細胞の比率が高まり、骨髄球系の表面抗原Ｇｒ−１（顆粒球系細胞表面抗原），Ｍａｃ−１（単球／マクロファージ系細胞表面抗原）の陽性細胞の比率は低下し、リンパ球系細胞への分化の促進作用が認められた。一方、デルター４を添加した培養条件では、逆にＢ２２０陽性細胞はほとんど認められず、Ｇｒ−１，Ｍａｃ−１陽性の細胞が７０％以上の存在比率となった。
【００１４】
このことから、リンパ球系細胞への分化を促進する培養条件として、少なくともノッチリガンドであるデルター１またはジャグドー１の添加が有効であり、骨髄球系細胞への分化を促進する培養条件として、少なくともノッチリガンドであるデルター４の添加が有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）  造血幹細胞および造血前駆細胞から選ばれた少なくとも１種を含む細胞（以下、造血幹／前駆細胞、という）を、ノッチリガンドタンパク質の存在下で培養して白血球に分化誘導させることからなる白血球の製造方法。
（２）  ノッチリガンドタンパク質としてデルタ−１またはジャグド−１を用いてリンパ球に分化誘導させる（１）に記載の白血球の製造方法。
（３）  ノッチリガンドタンパク質としてデルタ−４を用いて骨髄球に分化誘導させる（１）に記載の白血球の製造方法。
（４）  造血幹／前駆細胞が、ＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、細胞分化抗原陰性細胞である（１）〜（３）のいずれか１つに記載の白血球の製造方法。
（５）  造血幹／前駆細胞が、ＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、細胞分化抗原陰性、Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３陽性細胞である（４）に記載の白血球の製造方法。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製などの一連の分子生物学的な実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
【００１６】
造血幹細胞培養に関しては、一般的な動物細胞培養に関する成書にしたがって行うことができる。特に、血液細胞培養に関しては、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編のＣｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，  １９９４，  Ａ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を挙げることができる。幹細胞関連実験手法に関しては、例えば、中辻憲夫  編  幹細胞・クローン研究プロトコール、実験医学別冊  ポストゲノム時代の実験講座４、２００１年、羊土社を挙げることができる。特に、本発明に関連する技法は、上記の中辻編の中の第３章  造血系、血管系幹細胞に纏められている。この中でも、本発明に用いた手法に関しては、第３章３造血幹細胞の分離・移植と再構築において、詳細にその手法が解説されている。
【００１７】
本発明において、ノッチリガンドタンパク質とは、哺乳類で見出されている少なくとも４種類のノッチリセプター（ノッチ−１〜４）を通して、いわゆる、ノッチシグナルの伝達を行う蛋白質の総称である。より具体的には、実施例に示した分子を含むデルター１、デルター４、デルター３、ジャグドー１、ジャグドー２などが含まれる。また、その分子形態は、特許文献１、２、３および５に記載されている細胞外蛋白質、細胞外部分蛋白質、ＤＳＬドメインポリペプチドなどの総称として示され、上記のノッチシグナルの伝達を起こすことができる蛋白質として規定される。この場合、ノッチシグナルの伝達とは、ノッチリセプターを介して細胞に何らかの変化を起こすことを意味する。
【００１８】
実施例にはマウス骨髄細胞を用いた例を示したが、実際に医療に応用される場合にはヒト細胞を用いたものとなる。ヒト造血幹／前駆細胞は、骨髄のみならず臍帯血、末梢血などからも得ることができる。したがって、本発明の造血幹／前駆細胞には、骨髄、臍帯血、末梢血由来の造血幹／前駆細胞も含まれる。
本発明において、造血幹細胞とは、移植によって長期骨髄再構築能があり、自己増幅（Ｓｅｌｆ  Ｒｅｎｅｗａｌ）能とすべての血液細胞を生む出す完全な多分化能を有する細胞として規定される。造血前駆細胞とは、長期の骨髄再構築能および完全な多分化能を有さないが、ある程度の多分化能と自己増殖能を有する細胞として規定される。造血幹／前駆細胞とは、上記２種類の細胞の混合物または少なくとも一方の細胞として規定される。リンパ球系前駆細胞とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞など、リンパ球系細胞へ分化可能な細胞として規定される。骨髄球系前駆細胞とは、マクロファージ、顆粒球などの骨髄球系細胞へ分化可能な細胞として規定される。
【００１９】
具体的なノッチリガンドタンパク質の作製は参考例１に記した。本明細書では、ヒトノッチリガンドを用いて行った例が記載されているが、必ずしも使用するノッチリガンドはヒト分子に限定はされない。哺乳類由来ノッチリガンドであれば同様な効果が期待される。しかしながら、臨床応用上、ヒト細胞を用いて行う際は、抗原性などの点からヒトノッチリガンドの方が望ましい。
さらに、ノッチリガンドタンパク質の存在形態について、多量体構造を有する構造体もある。例えば、本発明で使用したヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質は、特許文献１、２、３および５に記載されているように、二価の蛋白質となっている。このように、複数価、すなわち、多量体として存在する分子は、一般的に一価、すなわち、単量体として存在する分子よりその活性が強いことが期待できる。
【００２０】
これらの方法として、ヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質として発現させて、抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多量体として発現させる方法、抗体認識部位をＣ末端またはＮ末端に発現するキメラタンパクとして発現させ、発現させたノッチリガンドタンパク質の細胞外部分を含むポリペプチドを、Ｃ末端またはＮ末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応させることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジスルフィド結合により２量体を形成させる方法など挙げられる。また別の方法として、ノッチリガンドタンパク質の活性に何等影響を与えない方法でジスルフィド結合を生じさせる形のペプチドを、Ｃ末端、Ｎ末端またはその他の部位に発現するように作成された融合タンパクより構成された、二量体以上の高い比活性を有する多量体型ノッチリガンドを得ることもできる。また、さらにノッチリガンドタンパク質の群の中から選ばれる１つ以上の蛋白質を、遺伝子工学的に２つ以上直列または並列に並べ、多量体構造を発現させる方法などもある。現在知られている二量体以上の多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。したがって、遺伝子工学的な技術により作製される、二量体またはそれ以上の形態を有する形のノッチリガンドタンパク質に関しても本発明に含まれる。
【００２１】
その他の方法として、化学的な架橋剤を用いて多量体化する方法が挙げられる。架橋剤として、例えば、リシン残基を架橋するジメチルスベロイミデート２塩酸塩など、システイン残基のチオール基で架橋するＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドなど、アミノ基とアミノ基を架橋するグルタールアルデヒドなどが挙げられ、これらの架橋反応を利用して、二量体以上の多量体を形成させることができる。したがって、化学的な架橋剤により作製される二量体またはそれ以上の多量体の形態を有す形のノッチリガンドタンパク質も本発明に含まれる。
【００２２】
本発明において、これらのノッチリガンドタンパク質の存在下で培養がおこなわれる。ノッチリガンドタンパク質の存在下とは、一般に、培養培地溶液中に溶けて存在する場合と、培養に用いられる培養容器、培養に用いられる培養基材などの固体表面などに存在する場合がある。実施例では培養培地溶液に直接添加して行っているが、必ずしもこの方法でなくともよい。固定化の方法としては、静電的な蛋白質の吸着による方法、蛋白質のアミノ基、カルボキシル基を利用したり、適当なスペーサーを用いたり、上記の多量体化で用いられる架橋剤を使用して、培養容器に蛋白質を共有結合させる方法などを挙げることができる。培養容器としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラスなど、動物細胞の培養で使用可能なあらゆる培養容器が使用できる。培養基材としては、セルロース、デキストラン、コラーゲンなどから構成された、マイクロキャリアなど動物細胞の培養において培地中に分散させて使用可能なあらゆる培養基材が含まれる。
【００２３】
実施例のおいて、マウス成獣骨髄由来のＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ１陽性、Ｌｉｎ陰性画分の細胞を用いたが、ヒトにおいてはＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｌｉｎ陰性画分を含む細胞を用いるのが好ましく、より好ましくはＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｌｉｎ陰性、Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３陽性画分を含む細胞を用いる。
培養条件に関して、実施例では無血清培地エス・クロン（登録商標）ＳＦ０３（三光純薬社製）を用いたが、この培地はマウスの造血細胞培地として開発されており、必ずしもこれに限定はされない。一般的な動物細胞培養培地であれば基本的にいずれでもよい。例えば、動物細胞基本培地場合には、ダルベッコ改変イーグル培地：ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ（以上  ＧＩＢＣＯ社製、米国）などが挙げられる。さらにこれらの基礎培地に、血清または血清代替物としての各種増殖因子を添加して用いることもできる。実施例では、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−７を使用したが、必ずしもこれに限定はされない。
【００２４】
各種増殖因子としては、血液細胞に効果があるとされるいかなる増殖因子も有効である。例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エフエルティースリーリガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキンー３（ＩＬ−３）、ウィント（Ｗｎｔ）、ヘッジフォッグ（ＨＨ）、骨形成因子（ＢＭＰ）などが挙げられる。血清には、造血幹細胞の増殖および生存性の維持に効果的である栄養素を供給する任意の血清、または血清ベースの溶液が用いられる。このような血清の例として、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ血清（ＣＳ）、馬血清（ＨＳ）などが挙げられる。血清代替物としては、ノックアウト血清リプレースメント：ＫＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製、米国）などが含まれるが、これらに限定されない。ただし、実際にヒトへの臨床応用される場合には、異種由来の成分が少ない方が望ましく、ヒト由来血清を用いるか、内容成分が明らかな血清代替物、無血清培地の使用が好ましい。
【００２５】
細胞培地は、抗酸化剤（還元剤）（例えば、β−メルカプトエタノール）も含む。好ましい実施態様において、β−メルカプトエタノールは、約０．１ｍＭの濃度を有する。他の抗酸化剤  （例えば、モノチオグリセロールまたはジチオス  レイトール（「ＤＴＴ」）の、単独または組み合わせ）が同様の効果のために使用され得る。さらに他の等価な物質は、細胞培養の分野の当業者に周知である。
本発明により、造血幹／前駆細胞からリンパ球前駆細胞および骨髄球前駆細胞を経て、最終的にリンパ球、骨髄球、すなわち白血球を得ることができる。最終分化した白血球を得るために、各種サイトカイン、増殖因子を添加してもよい。例えば、リンパ球を特に増幅する場合は、上記のＩＬ−７のほかにＩＬ−２．ＩＬ−１２などが有効であり、骨髄球の場合にはＧ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）が、これら前駆細胞から最終分化細胞を得る際に有効である。
【００２６】
本発明の方法を用いて得られた培養後細胞は必ずしも均一の細胞とはならない。必ずしも必須では無いが、最終的な細胞製剤が均一な細胞として得られる方が望ましい場合、例えば、非目的細胞が副作用を及ぼすと予想される場合には、作製細胞から目的の細胞を分離精製することが望ましい。その場合は、抗体を用いた方法を用いることが有効である。例えば、実施例で示したフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いる方法、抗体固定化カラムを用いる方法、抗体固定化マグネットビーズを用いる方法など、あらゆる抗体を用いた細胞分離方法が使用可能である。抗体を用いないで細胞を分離する方法としては、適当な生体親和性分子をコートした多孔体、例えば、市販の輸血用白血球除去フィルターを用いて、白血球をフィルター上に集め、フィルターから回収する方法などが挙げられる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を実施例により、具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００２８】
【参考例１】
ノッチリガンド細胞外タンパク質の作製
ヒトノッチリガンドの細胞外部分とヒトＩｇＧ１のＦｃ部分との融合蛋白について、ヒトデルター１は、特許文献１に記載の方法にしたがい、ヒトデルター４は、特許文献２に記載の方法にしたがい、ヒトジャグドー１は、特許文献１に記載の方法にしたがい、各々、作製、精製した。
【００２９】
これらは、ヒトデルター１とヒトＩｇＧＦｃキメラタンパク質（以下、Ｄ１Ｆｃ、という）の発現ベクター、ヒトデルター４とヒトＩｇＧＦｃキメラ蛋白（以下、Ｄ４Ｆｃ、という）の発現ベクター、ヒトジャグドー１とヒトＩｇＧＦｃキメラタンパク質（以下、Ｊ１Ｆｃ、という）の発現ベクターである。
これら発現ベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を有しているため、遺伝子導入細胞はネオマイシン（ジェネティシン（登録商標）、インビロジェン社製）を添加した培地中で選別した。また、これら発現ベクターをＣＨＯ細胞にエレクトロポレーション法にて遺伝子導入した。これらの細胞を無血清培地にて培養し、その上清を集めた。この集められた上清をＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースゲル（アマシャムファルマシア社製）で作成されたカラムに流して、濃縮精製した。濃縮精製したリガンドタンパクを更にゲル濾過にて精製し、同時にカルシウム、マグネシウムを含まないダルベッコリン酸バッファー（以下、ＰＢＳ（−）とする）にバッファー置換を行い、精製分離されたヒトノッチリガンド細胞外蛋白質を得て、以下の実施例で使用した。
【００３０】
【実施例１】
マウス骨髄細胞のＦＡＣＳによる分画
８〜１０週齢のＢ６マウス大腿骨より成書の方法にしたがい、骨髄細胞を採取した。
マウスより大腿骨を分離し、両末端を鋏で切り落とした後、片方の端よりＰＢＳ（−）を注射針にて１ｍｌ程度勢いよく流し、骨髄組織を容器に採取した。採取された組織をナイロンフイルター（７０μｍ）に通した後、Ｎｙｃｏｍｅｄ社製Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）を用い、添付の説明者にしたがって比重遠心分離を行い、骨髄単核球を分離した。
【００３１】
この細胞をＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＭ；５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（−））で洗浄後、ビオチン化マウスｌｉｎａｇｅ抗体カクテル（Ｇｒ−１抗体、Ｔｅｒ１１９抗体、Ｂ２２０抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体、ＩＬ−７Ｒα抗体を混合して使用、いずれもＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製、以下、特に断りのない限り抗体および蛍光色素はすべてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を加え、氷上で３０分反応させた。その後、ＳＭにて遠心洗浄後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｄｙｎａｌ社製）を添加し、添付の取り扱いマニュアルにしたがって、抗体結合細胞、すなわち、ｌｉｎａｇｅ陽性の除去を行った。
【００３２】
この細胞に、上記のビオチン化マウスｌｉｎａｇｅ抗体カクテルを再度添加し、さらにＦＩＴＣ−マウスＣＤ３４抗体、ＰＥ−Ｃｙ５．５−マウスＳｃａ１抗体、ＡＰＣ−マウスｃ−ｋｉｔ抗体、ＰＥ−マウスＦｌｋ２／Ｆｌｔ３抗体を添加した。これを染色、洗浄の後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＴＲを添加し、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ＢＤ  社）にて解析、ソーティングを行った。培養細胞のソーティングゲートとしてＣＤ３４陽性（ＦＩＴＣ陽性）、Ｓｃａ１陽性（ＰＥ−Ｃｙ５．５陽性）、ｃ−ｋｉｔ陽性（ＡＰＣ陽性）、ｌｉｎａｇｅ陰性（ＴＲ陰性）であり、さらにＦｌｋ２／Ｆｌｔ３陽性（ＰＥ陽性）または同陰性の２種類ゲートを用いた。これら２種類の細胞群を各々別々に、細胞培養用の９６穴プレートに各ウェル１００ｃｅｌｌｓになるようソーティングを行い、実験に用いた。以下、前者の細胞をＦｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞、後者の細胞をＦｌｋ２−ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞とする。
【００３３】
【実施例２】
細胞培養
以下の条件で培養を行った。上記のプレートに、培地として、無血清培地エス・クロン（登録商標）ＳＦ０３（三光純薬社製）に１％牛血清アルブミン、２０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−７、１００ｎｇ／ｍｌヒトＦＬＴ−３Ｌを添加したものを用いた。この培地に対して、参考例のノッチリガンドタンパク質Ｄ１Ｆｃ、Ｄ４ＦｃまたはＪ１Ｆｃを１０μｇ／ｍｌ添加して、ＣＯ２インキュベーターで培養を１４日間行った。
【００３４】
【実施例３】
細胞表面抗原解析によるノッチリガンドの効果確認
培養後、細胞を遠心洗浄し、抗体染色を行って、リンパ球系マーカーＢ２２０陽性細胞と骨髄球系マーカーＧｒ−１、Ｍａｃ−１陽性細胞の比率を調べた。この検出系において、もしリンパ球系前駆細胞への分化誘導が行われていれば、リンパ球系マーカー陽性のリンパ球の存在頻度が増加し、結果としてリンパ球への分化誘導が観察される。一方、骨髄球系前駆細胞への分化誘導が行われていれば、骨髄球系マーカー陽性の骨髄球の存在頻度が増加し、結果として骨髄球への分化誘導が観察される。
【００３５】
初めにコントロール実験として、ノッチリガンドタンパク質未添加状態では、Ｆｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞はリンパ球系に約３０％が、骨髄球系に１％以下が陽性となり、Ｆｌｋ２−ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞はリンパ球系には１％以下が、骨髄球系には約２５％が分化していた。このことから、Ｆｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞は、Ｆｌｋ２−ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞に比べて、若干リンパ球系への分化比率が高く、骨髄球系分化しにくい細胞であると推察された。
【００３６】
１）デルター１添加の効果
Ｄ１Ｆｃ添加により、Ｆｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞は、リンパ球系に約６０％と比率が高まり、骨髄球系に１％以下と変化は無く、添加によりリンパ球系細胞への分化促進効果が確認された。しかしながら、骨髄球系細胞に対してはそのような効果は確認されなかった。一方、Ｆｌｋ２−ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞に対しては、リンパ球系には１％以下と変化は無く、骨髄球系には約５０％若干比率が高まった。このことから、一つの可能性として、Ｆｌｋ２−ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞にはリンパ球へと分化できるリンパ球系前駆細胞は含まれていない、またはデルター１刺激によってもリンパ球系細胞への分化が促進されないタイプの造血前駆細胞しか存在しない可能性が示唆された。
いずれにしても、この結果から、リンパ球系前駆細胞と骨髄球系前駆細胞を共に生み出すことができる細胞であるＦｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞をデルター１刺激することにより、高頻度にリンパ球前駆細胞へ分化できることが明らかになった。
【００３７】
２）デルター４添加の効果
Ｄ４Ｆｃを添加した場合には、Ｆｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞は、リンパ球系に約１％とほぼ完全にその分化が抑制され、その一方で、骨髄球系には約７５％と極めて高効率に分化を促進した。また、Ｆｌｋ２−ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞では、リンパ球系には１％以下、骨髄球系には約７５％と同様に高い骨髄球系細胞への分化を促進した。これらの結果から、デルター４は、リンパ球系前駆細胞と顆粒球系前駆細胞を共に生み出すことができる細胞であるＦｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞を、リンパ球系前駆細胞への分化を抑制し、高頻度に骨髄球前駆細胞へ分化を促進することが明らかとなった。同様にリンパ球への分化がほとんど観察されなかったＦｌｋ２−ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞においても、骨髄球前駆細胞への分化促進効果が確認された。
【００３８】
３）ジャグドー１添加の効果
Ｊ１Ｆｃ添加により、Ｆｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞は、リンパ球系に約５０％と比率が高まり、骨髄球系に３％以下と変化は無く、添加によりリンパ球系細胞への分化促進効果が確認された。しかしながら、デルター１に比べると、その効果は若干弱かった。一方、Ｆｌｋ２−ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞に対しては、リンパ球系には５％程度と大きな変化は無く、骨髄球系には約３０％と大きな変化は無かった。この結果から、デルター１同様、リンパ球系前駆細胞と骨髄球系前駆細胞を共に生み出すことができる細胞であるＦｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞をジャグドー１刺激することにより、リンパ球前駆細胞へ分化をさせることが可能となった。
【００３９】
以上をまとめると、デルター１とジャグドー１は、造血幹／前駆細胞から、リンパ球系前駆細胞への分化を誘導する活性を有し、培養によってこのことが可能となった。一方、デルター４は、造血幹／前駆細胞から、骨髄球系前駆細胞への分化を誘導する活性を有して、培養によってこのことが可能となった。また、これらを可能とする細胞としては、少なくともマウスにおいてはＦｌｋ２＋ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞に存在することが明らかとなった。
上記の培養方法によって、リンパ球系前駆細胞、骨髄球系前駆細胞の分化誘導が行われた結果、白血球、すなわち、リンパ球および骨髄球が培養によって作製できた。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によると、体外で造血幹／前駆細胞を培養する際に、ノッチリガンドを添加することにより白血球を分化誘導することが可能である。さらに、特定のノッチリガンドを用いれば、リンパ球系前駆細胞のみ、骨髄球系前駆細胞のみを峻別して分化誘導することが可能である。このようにして得た細胞は細胞医療、再生医療にとって有用である。