(57)【要約】【課題】本発明者らは、植物由来ポリフェノールについて各種実験を行い、生化学的・医学的な見地から研究した結果、植物由来ポリフェノールのなかでもプロアントシアニジンが腸管免疫系を介して全身免疫系を改善することを見出した。本発明の目的は、植物由来プロアントシアニジンの安全性の高い新規な免疫調節剤、並びにこれを含有する医薬品および機能性食品を提供することにある。【解決手段】植物由来のプロアントシアニジン成分を有効成分として含有することを特徴とする免疫調節剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来ポリフェノール成分を有効成分として含むことを特徴とする免疫調節剤。
【請求項２】
植物がリンゴ、ナシ、モモ、ブドウ、大麦、グァバ、ホップ、小豆、松樹皮であることを特徴とする請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項３】
ポリフェノール成分がプロアントシアニジン類であることを特徴とする請求項１または２に記載の免疫調節剤。
【請求項４】
プロアントシアニジン類がプロシアニジン類であることを特徴とする請求項１または２に記載の免疫調節剤。
【請求項５】
医薬品であることを特徴とする請求項１−４のいずれか１項に記載の免疫調節剤。
【請求項６】
機能性食品であることを特徴とする請求項１−４のいずれか１項に記載の免疫調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口免疫抑制活性を有する免疫調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品は、大きく三つの機能に分けることができる。栄養機能である１次機能、嗜好機能である２次機能、および生体調節や疾病予防機能である３次機能がある。食品の３次機能は、食品中の成分を長期間にわたり継続的に摂取することによる共存有害物質に対する中和解毒作用や、人の様々な体調機能の調節、生命維持、健康増進に働く作用など、高次の生命活動に対する調節機能である。
【０００３】
具体的には、食品による生体リズムの調節、吸収機能の調節、神経の覚醒と鎮静、免疫機能の強化や調整等の生体防御、老化抑制などに関わる機能と定義されている。その生理活性の例として、抗酸化活性（脂質過酸化抑制、ラジカル消去、潰瘍予防、動脈硬化予防）、抗菌活性、血圧上昇抑制、抗炎症活性、抗アレルギー活性、育毛促進活性、抗変異原性、発ガン抑制等が報告されている。
【０００４】
最近、我が国においてアトピー性皮膚炎や花粉症などのアレルギー患者が増加の一途をたどり深刻な社会問題となっている。また、国民の約３割が何らかのアレルギー症状を訴えているといわれている。これを受け厚生労働省では平成14年4月1日から特定原材料５品目（卵、牛乳、小麦、そば、落花生）の表示を義務化するなど、食物アレルギー患者への対策がなされている。アレルギーは、体調機能の調節ならびに生体防御機能に異常をきたした状態と捉えることができる。すなわち、通常、我々は異物が体内に進入すると、その異物を排除する防御機構を有している。この防御機構の代表的なものとして進入した異物（抗原）特異的な反応により除去するのが免疫反応である。この免疫反応が何らかの理由により過剰あるいは異常に反応し、炎症など生体に障害を与える反応がアレルギーである。また、食物アレルギーでは、食品アレルゲンが腸管を介して生体内へ吸収された場合、通常は抗原に対して応答しない（腸管免疫寛容）が、アレルゲンの透過性が増大すると腸管での免疫系が不十分な体質の人では、アレルギーを発症する。
【０００５】
アレルギー症状の改善方法は、専ら抗アレルギー薬を主体とした医学的治療の分野で考えられ、I 型アレルギー発症に大きく関与するヒスタミンなどの化学伝達物質阻害剤、ステロイド薬などによるアレルギー症状の緩和を目的とした対症療法や原因となる食品アレルゲンの除去に依存しているのが現状である。
【０００６】
しかし、食品の持つ三次機能が明らかにされるにつれて、アレルギー症状を抑制する食品の存在、例えば茶やヨーグルト（乳酸菌）、ニンジン、リンゴ、ブドウ種子に免疫調節機能が認められるようになった。とりわけ抗アレルギー活性は、甲殻類のキチンや糖鎖のコンドロイチン硫酸、植物由来のポリフェノールであるタンニンや赤い色素のアントシアニンが関わっていると報告されている。茶のほかにも、カカオ種子、赤ダイコンなど様々な植物において研究がなされている。これらの報告をふまえ、食品やその成分のアレルギー反応に対する影響を明らかにし、その影響を正しく評価することはアレルギー疾患の予防と治療に対して重要な意義を持つと思われる。
【０００７】
これら生体調節機能に関する報告がされている様々な食品や食品成分の中でも盛んに研究が行われて
いる成分群の一つとして植物由来のポリフェノール成分が挙げられる。ポリフェノールとは、複数のフェノール性水酸基を有する化合物群の総称であり、非常に広範な成分からなる化合物群である。代表的なものとしてフェノール酸類、クマリン類、フラボノイド類、タンニン類、等が知られている。ポリフェノール化合物の生合成には、質・量的な差異はあるが高等植物の大部分は何らかのポリフェノール化合物を生合成していると考えられている。植物性食品に含まれるポリフェノールは、主に色素成分や苦み成分を構成し、様々な生理活性を示すことが知られている。
【０００８】
例えば、リンゴ由来のポリフェノールはI 型アレルギーの発症における重要なステップであるヒスタミン遊離の抑制活性、経口投与によるI 型アレルギーモデルマウスに対する耳介肥厚抑制活性、リンゴ由来プロシアニジン類の重合度別各画分共存下での相乗効果、アトピー性疾患患者臨床的適応が確認されている。
【０００９】
リンゴは、日本で年間88万トンが生産され、最も親しみの深い果実の一つであり、今日では栽培技術や品種改良が進み、味、大きさ、外観など様々な品種が栽培されている。リンゴのポリフェノール類は、クロロゲン酸などのカフェー酸誘導体、カテキン、エピカテキンのカテキン類、ケルセチン配糖体類およびアントシアン系色素等のフラボノイド類、ならびにカテキン類が重合したプロシアニジン類（縮合型タンニン類）に分類される。プロシアニジン類は強酸性条件下で加熱分解することで構成カテキン単位に対応したアントシアニジンを生成する。プロアントシアニジンは植物の成分として量的に希少なものでなく、日常的な食品成分として高い安全性が期待できることから、近年その生理活性に関心が高まっている。リンゴ由来プロシアニジン類はカテキンおよびエピカテキンを構成単位とし、これらが4β→8または4β→6で結合することにより重合したもので少なくとも15量体まで存在していることが報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上説明してきたように、アレルギーの発症機構を考えるとアレルギー症状の改善方法には、ヒスタミンなどの化学伝達物質阻害剤、ステロイド薬などの薬剤の開発以外に、腸管免疫を調節し、全身免疫を改善する物質を見いだせば、生体の免疫恒常性を安定に保ち、アレルギー予防や治療に役立てることが期待できる。また、アレルギー予防や治療として、植物由来のプロアントシアニジン成分を摂取することは安全性の面からもこれまでの食経験があり、毎日摂取することにも問題が少ないと考えられ、安全でかつ有効な予防および治療剤を提供することができる。
【００１１】
このような背景の下、本発明者らは、植物由来ポリフェノールについて各種実験を行い、生化学的・医学的な見地から鋭意研究に努めた結果、植物由来ポリフェノールのなかでもプロアントシアニジンが腸管免疫系を介して全身免疫系を改善することを見出した。本発明の目的は、植物由来プロアントシアニジンの安全性の高い新規な免疫調節剤、並びにこれを含有する医薬品および機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明によれば、植物由来のプロアントシアニジン成分を有効成分として含有することを特徴とする免疫調節剤が提供される。本発明の成分であるプロアントシアニジン類はリンゴ、ナシ、モモ、ブドウ、大麦、グァバ、ホップ、小豆、松樹皮などに含まれる化合物である。
【発明の効果】
【００１３】
後述のように、植物由来ポリフェノール画分およびプロアントシアニジン画分は免疫感作マウスの脾細胞におけるTh1型サイトカインであるIFN−γ産生の有意な促進及びTh2型サイトカインであるIL−5、IL−10産生の有意な抑制を認め、Th1/Th2バランスをTh1に誘導した。また、上皮内リンパ球の表面抗原組成であるTCRγδの組成を有意に増加させることが明らかになった。その結果、ポリフェノール画分、特に、プロアントシアニジン画分を摂取していた免疫感作マウスにおいて経口免疫寛容を誘導していることが明らかとなり、免疫調節剤として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明について詳細に説明する。本発明において免疫調節剤の有効成分として用いられるプロアントシアニジン成分は市販のものや植物から直接抽出・分離したものが利用できる。本発明でいうプロアントシアニジンは、植物体中に存在する縮合型タンニン類、すなわちフラバン−３−オール類を構成単位として４→８又は４→６で縮合もしくは重合により結合した化合物の混合物であって、これらは酸処理によりシアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジン等のアントシアニジンを生成する。本発明では上記構成単位の２〜１５量体以下の高分子のプロシアニジン、プロデルフィニジン、プロペラルゴニジン等のプロアントシアニジンである。
【００１５】
例えば、リンゴ果実からのプロアントシアニジン成分の抽出・精製は特開平７−２８５８７６号公報、特開２０００−１６９５１号公報および特開２００２−８７９７８号公報に記載の方法を利用することができる。原料であるリンゴは特開平７−２８５８７６号公報に記載されているようにリンゴ未熟果を利用しても良いし、特願２０００−２７７２２８に記載されているようにリンゴ野生種（Crab Apple）を利用しても良い。
【００１６】
まず、特開平７−２８５８７６号公報の方法に基づいて抽出物を得る。具体的には、リンゴ果実を洗浄した後、そのままもしくは亜硫酸を添加しながら破砕、圧搾により果汁を得、遠心分離、濾過などにより清澄果汁を調製できる。清澄果汁は適宜、公知の手法により濃縮しても良い。粗リンゴポリフェノール成分の抽出方法としては、得られた果汁を原料として用いても良いが、果実をアルコール類と混合して破砕し、そのまま浸漬し、圧搾、又は加熱還流しながら抽出し、次いでアルコールを溜去した後、遠心分離及び濾過、又はヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒による分配及び濾過を行い、清澄抽出物を得る方法を挙げることができる。
【００１７】
ついで、特開２０００−１６９５１号公報の方法にて上記抽出物を精製する。具体的には、ポリフェノールを選択的に吸着できる吸着剤、例えばスチレンジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、陰イオン交換樹脂などが充填されたカラムに上記の清澄果汁又は清澄抽出液を通すことによりポリフェノール成分を吸着させる。次いで、蒸留水によってカラムを洗浄した後、２０〜１００％、好ましくは４０〜６０％のアルコール溶液をカラムに通すことによりポリフェノール成分を溶出、回収できる。得られたアルコール溶液画分からアルコールを溜去すると粗リンゴポリフェノール画分となる。この粗リンゴポリフェノール画分には、図１に示すような成分が含まれている。
【００１８】
更に、粗リンゴポリフェノール画分を特開２００２−８７９７８号公報に開示された方法で処理し、プロアントシアニジン画分を得る。具体的には、得られた粗ポリフェノール画分を酢酸メチルを液相として用いた固液抽出によりプロシアニジン２〜５量体画分と６量体以上画分に分離精製することも可能である。酢酸メチルに抽出されないプロシアニジン６量体以上画分は、公知の方法により酢酸メチルを溜去する。酢酸メチルに抽出されたプロシアニジン２〜５量体画分は公知の方法により抽出溶液を濃縮した後、蒸留水に溶解させる。更に、プロシアニジン２〜５量体画分は順相クロマトグラフィーにより重合度別（分子量別）に分離精製し、重合度数の均一なプロシアニジンオリゴマーを得ることができる。
【００１９】
また、プロアントシアニジンとしては、合成法によって得られたものも用いることができる。
【００２０】
このようにして調製されたプロアントシアニジン製剤は免疫調節剤として医薬品に用いることができる。医薬組成物としては、従来からの免疫調節剤と混合しても良い。免疫調節剤を含有する医薬品は、公知の方法により錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤などの経口剤、座剤、軟膏、噴霧剤、注射剤などの非経口剤とすることができる。この際、製薬化において用いられることが知られている、種種の添加剤を用いることもできる。
【００２１】
また、免疫調節剤を含有する食品一般として、あるいは、食品一般に添加して免疫調節能を有する食品として好適に用いることができる。具体例としては、アルコール飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、コーヒーや紅茶などの清涼飲料、アイスクリーム、飴、ガム、菓子、パン、麺類などに用いることができる。
【００２２】
更にまた、アトピー性皮膚炎などの一部のアレルギー患者に対しては、免疫調節剤を化粧品に添加して用いることもできる。添加される化粧品としては、石鹸、洗顔料、クリーム、乳液、化粧水、パウダー、香水、口紅などの皮膚化粧品や浴用化粧品、更にはシャンプー、リンスなどの毛髪用化粧品ならびに歯磨き粉などを挙げることができる。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
特開平７−２８５８７６号公報および特開２０００−１６９５１号公報に開示された方法により粗リンゴポリフェノール画分を、特開２００２−８７９７８号公報に開示された方法によりプロアントシアニジン画分を調製した。粗リンゴポリフェノール画分を逆相系高速液体クロマトグラフィーを用いて検定したところ、クロロゲン酸類（約２０％）、フロレチン配糖体類（約５％）、フラボノール類（約１５％）、プロアントシアニジン類（約５０％）及びその他褐変物質（約１０％）からなることが確認できた。更に、このプロアントシアニジン類はMALDI-TOF/MSによる解析の結果、フラバン−３−オール類であるカテキンやエピカテキンからなる２量体から１５量体までが確認され、高分子のポリフェノールであった[M.
Ohnishi-Kameyama et al.,Mass Spectrometry, 11, 31−36, 1997]。
こうして得られた粗リンゴポリフェノール画分には、プロアントシアニジン画分を約５０％含有していることが確認され、後述する経口免疫に与える影響を評価するための試料とした。
【００２４】
［試験例１：経口自由摂取における免疫系に及ぼす影響］
（１）マウスへの試料投与と卵白アルブミンによる免疫
下記手法により実施例１で得たプロアントシアニジン画分について試験に用いた。雌性BALB/ｃマウス（７週令、日本チャールズリバーより購入）を室温23±2℃、湿度55±5％の条件にて飼育し、餌（CRF-1）、水は自由に摂取させた。購入後7日間馴化させた後、実験に用いた。また、１％プロアントシアニジン画分溶液は、プロアントシアニジン画分の粉末2
gを200mLの水に溶解して経口自由摂取させた。試料の交換および補充は、給水ビンが空にならないよう注意しながら3日ごとに行った。プロアントシアニジン画分投与群については、通常、第1次免疫の1週間前から１％プロアントシアニジン画分溶液を自由に経口摂取を開始し、脾臓採取の日まで投与を続けた。
【００２５】
OVA (卵白アルブミン)30mgに生理食塩水２mLを完全に溶解させたOVA溶液を、更に100倍希釈し（150μg/mL OVA溶液）、うち１mLを生理食塩水（1250μL）に溶解した。水酸化アルミニウムゲル（750μL）を加え、よく撹拌した。水酸化アルミニウムは沈殿しやすいため、腹腔投与用OVA溶液の調製や腹腔投与の時よく撹拌してから用いた。腹腔投与用OVA溶液（0.4mL)を1mL用シリンジを用いてマウス腹腔内に注射した（第1次免疫）。更に初回免疫の14日後に第2次免疫を行い、翌日採血および解剖を行った。なお、水を自由飲水して免疫応答を施した群を対照群とした。
【００２６】
（２）脾臓細胞の採取と培養
脾臓細胞の採取は、第2次免疫応答後行った。すなわち、目より全採血を行い、頚椎脱臼により安楽死させたマウスを７0％エタノールに浸して消毒した後、クリーンベンチ内で無菌的に行った。ピンセットで上皮を摘み上げ、左脇腹に１cm程切れ目を入れ（腹膜まで切らない、刃の真中辺りで切る）、指で皮を剥いだ。ハサミの先端で腹膜に穴を開け、脾臓を摘出する。RPMI
1640培地を満たしたシャーレ内でナイロンメッシュと2.5mLシリンジのプランジャーを用いて、脾臓をすりつぶすようにして破砕した。細胞懸濁液をナイロンメッシュで濾過した。次に、4℃、250×gで10分間遠心し、上清を除去した（この操作を繰り返した後、沈殿に10％FBS含有RPMI
1640培地を加え、5×10６ cells/mLになるように調製した。細胞懸濁液を24well プレートに2mL/wellで播いた後、4.2 mg/mL  OVAを50μlずつ添加し、37℃、5％CO2インキュベーターにて培養した。3日後と7日後に、ピペットを用いて付着細胞をきれいに取りながら、2mL容マイクロチューブに移し、4℃で、1600rpm、5分間遠心分離を行った後、上清を採取し、-80℃で保存した。
【００２７】
（３）上皮間リンパ球の採取と培養
脾臓細胞の採取と同様に、ハサミで腹膜に穴を開け、腸管を傷つけないように正中線に沿って開腹した。腸間膜を切断しながら腸を切り出し、大腸と大腸をつなぐ腸間膜リンパ節をハサミの先で突き刺すように穴を開け、この間に腸管をくぐらせる。盲腸の手前で切断し、氷冷したHBSS (FBS(−))の入ったシャーレに入れた。胃側を5 mm程度切断後、盲腸側からシリンジを用いて、HBSS (FCS (−))で腸内を洗浄した。次に、腸管を反転させ、37℃、５％
FBS (＋)−HBSSを入れた遠心チューブに4等分に切って絡まないように入れ、37℃、45分間で振とうした。接着性の細胞や細胞片を除去するため、グラスウールカラムに細胞浮遊液を通し、チューブに回収した。更に、予め温めておいた5％
FBS (＋)−HBSSを加え腸管と混ぜ、腸管と共にカラムに入れ、軽く上下に揺すり採取した後、遠心分離（20 ℃、1800 rpm×20 min）した。この細胞懸濁液（3mL）に5.5mLの5％FBS
(+)-HBSSを入れ遠心後、上清を捨て、新たに約2mLの5％FBS (＋)−HBSSを加え懸濁し、別のチューブに移した。残査に５％FBS (＋)−HBSSを加え、穏やかに上下に傾けよく懸濁する。遠心分離（20℃、1800
rpm×20min）した後、上清を約1mL残して除去した。腸管上皮リンパ球は沈殿し、腸管上皮細胞は、液面もしくは液中を漂っているため、浮遊している細胞を沈殿させないよう吸引、除去した。ピペットで懸濁し、細胞懸濁液の状態にした。4.1mL
100％Percollを加え混合し、5％FBS (＋)−HBSSで10mLにし、穏やかによく混合した(44％
Percoll)。2mLの70％Percollをチューブ最下部に静かに重層した。遠心分離（20℃、1800
rpm×20min）後、上静を約3mL残し、培地を吸引、除去した。界面に存在する細胞をピペットで0.5mL残して回収し、別のチューブに移した。HBSSで10mLにfill
upし穏やかに上下に傾け撹拌し、遠心分離（20℃、1800 rpm×10 min）をした。上清を１mL残し、内壁と水面の境をなでるようにしてゆっくり慎重に吸い取った。ピペッティングしながら懸濁した細胞懸濁液を10倍希釈したトリパンブルーで染色し、細胞数を数えた。
約3×106 cells/mLに細胞数を調節し、100μLずつチューブに分注した。次に、マウスのFcγIII/IIレセプターへの免疫グロブリンの非特異的な結合を阻害するためFACSバッファーで100倍希釈したFcブロックを50μLずつチューブに加えた。よく撹拌した後、4℃、5分間インキュベートした。さらに、FACS
バッファーをチューブに１mLずつ加え、よく撹拌した後、4℃、1500 rpmで5分間遠心分離をした。チューブを下に傾け垂れてくる液をパスツールピペット吸引、除去した。抗体を50μLずつ加え、よく撹拌した後、4℃、30分間インキュベートし、反応液をアスピレーターで吸引、除去した。FACSバッファーをチューブに１mLずつ加え、よく撹拌した後、4℃、1500 rpmで5分間遠心分離をした。反応液をアスピレーターで吸引、除去し、BD
Pharmingen Strain Buffer (FBS)を500μLずつチューブに加えた。よく撹拌した後、フローサイトメトリーで測定を行った。
【００２８】
（４）サイトカイン産生量（IFN−γ、IL−4、IL−5、IL−2、IL−10）の測定法
IFN−γの測定は、市販のOptEIA
マウスIFN−γ setを用いて行った。すなわち、96 wellプレ−トに希釈したCapture Antibodyをウエルごとに100μL加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、プレートウォッシャーで5回洗浄した。洗浄後、Assay
Diluentを 200μL加え、室温で1時間反応させた後、5回洗浄した。脾細胞の培養上清もしくは標準品を100μL加え、室温で2時間反応させた後、洗浄した。Working
Detectorを100μL加え、室温で1時間反応させ、10回洗浄した。酵素反応の基質を100μL加え、室温、暗所で30分間反応させた。反応停止液50μLを加え、反応を停止させた後、450
nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。標準品で作成した検量線から検体のIFN-γ量を求めた。
【００２９】
IL−4の測定は、市販のOptEIAマウスIL−4
setを用いて行った。すなわち、96 wellプレートに希釈したCapture Antibodyを100μL加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、プレートウォッシャーで3回洗浄した。洗浄後、Assay
Diluentを200μL加え、室温で1時間反応させた後、3回洗浄した。さらに、脾細胞の培養上清もしくは標準品を100μL加え、室温で2時間反応させた後、5回洗浄した。Working
Detector を100μL加え、室温で1時間反応させ、7回洗浄した。酵素反応の基質として、Substrate Solution（100μL）を加え、室温、暗所で30分間反応させた。Stop
solution（50μL）を加え、反応を停止させた。プレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。標準品より作成した検量線を用いて検体のIL−4量を求めた。
【００３０】
IL−5の測定は、市販のOptEIAマウスIL−5
setを用いて行った。すなわち、96 wellプレートに希釈したCapture Antibodyを100μL/wellで加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、プレートウォッシャーで3回洗浄した。洗浄後、Assay Diluent（200μL）を加え、室温で1時間反応させた後、3回洗浄した。脾細胞の培養上清もしくは標準品を100μL加え、室温で2時間反応させた後、5回洗浄した。Working
Detector（100μL）を加え室温で1時間反応させ、7回洗浄した。酵素反応の基質として、Substrate Solution（100μL）を加え、室温、暗所で30分間反応させた。Stop
solution（50μL）を加え、反応を停止させた。プレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。標準品から作成した検量線より検体のIL−5量を求めた。
【００３１】
IL−2の測定は、市販のOptEIAマウスIL−2
setを用いて行った。すなわち、96wellプレ−トに希釈したCapture Antibodyを100μL加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、マイクロプレートウォッシャーで3回洗浄した後、プレートに残った液をよく取り除いた。Assay
Diluent 200μL加え、室温で1時間反応させた後、3回洗浄した。脾細胞の培養上清もしくは標準品100μLを加え、室温で2時間反応させた後、5回洗浄した。Working
Detector（100μl）を加え室温で1時間反応させ、7回洗浄した。酵素反応の基質として、Substrate Solution（100μL）を加え、室温、暗所で30分間反応させた。Stop
solution（50μL）を加え、反応を停止させた。プレートリーダーで450 nmの吸光度を測定した。標準品で作成した検量線から検体中のIL−2量を求めた。
【００３２】
IL−10の測定は、市販のOptEIAマウスIL−10
setを用いて行った。すなわち、96wellプレートに希釈したCapture Antibodyを100μL加え、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次いで、マイクロプレートウォッシャーで3回洗浄した。洗浄後、96wellプレートに残った液をよく取り除き、Assay
Diluent（200μL）を加え、室温で1時間反応させた後、3回洗浄した。脾細胞の培養上清もしくは標準品（100μL）を加え、室温で2時間反応させた後、5回洗浄した。Working
Detector（100μL）を加え、室温で1時間反応させ、10回洗浄した。基質溶液（100μL）を加え、室温、暗所で30分間反応させた。Stop solution（50μL）を加え、反応を停止させた。可視プレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。標準品で作成した検量線から検体中のIL−10量を求めた。
【００３３】
（５）リンゴ由来プロアントシアニジン画分のOVA免疫感作マウス由来脾臓細胞におけるIFN−γ、IL−5、IL−10の産生に与える影響
上記手法によりリンゴ由来プロアントシアニジン画分の摂取免疫感作マウスにおける経口自由摂取の免疫系に与える影響をみるため、免疫感作したマウスから摘出した脾細胞をOVAと共に3日間及び7日間培養し、培地に産生される各種サイトカインをELISAで定量し、サイトカイン産生に与える影響を検討した。サイトカインとは、リンパ球（T細胞、B細胞）などから何らかの刺激に応じて細胞外に出すタンパク質で、細胞同士が相互作用を発揮する際の情報交換を行う微量物質である。免疫応答に重要な役割を有するヘルパーT細胞（Th）には、2種類のタイプが存在し、いずれもナイーブCD4＋T細胞（Th0細胞）という同じ前駆細胞から分化する。生体の免疫の恒常性が、このTh1、Th2細胞によって形成される免疫調節のバランス（Th1／Th2バランス）によって保たれていると考えられており、そのバランスはそれぞれが分泌するサイトカインにより制御されている。Ｉ型アレルギー疾患では、Th1／Th2バランスがIL−4を産生するTh2細胞側へ偏ると考えられている。従って、サイトカイン産生量を調べることは、免疫系に与える影響を評価する指標となる。
図２にTh1型のサイトカインであるIFN−γ産生量を示した。培養3日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群で3212pg/mL、対照群1241pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIFN−γ産生が有意に促進された。一方、培養7日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群4995pg/mL、対照群5412pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIFN−γ産生に有意な差は見られなかった。
次に、図３にTh2型のサイトカインであるIL−5産生量を示した。培養3日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群114pg/mL、対照群118pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIL−5産生に有意な差は見られなかった。一方、培養7日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群1578pg/mL、対照群1955pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIL−5産生が有意に抑制された。
図４にTh2型のサイトカインであるIL-10産生量を示した。培養3日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群319pg/mL、対照群326pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIL−10産生に有意な差は見られなかったが、培養7日目では、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群774pg/mL、対照群948pg/mLであり、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群に比べIL−10産生が有意に抑制された。
【００３４】
以上の結果から、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は対照群と比較して、培養3日目でIFN−γ産生を有意に促進させ、培養7日目でIL−5及びIL−10産生を有意に抑制した。IFN−γやIL−2を産生するTh1細胞は、IL−4やIL−5、IL−10を産生せず、一方、IL−4やIL−5、IL−10を産生するTh2細胞は、IFN−γやIL−2は産生しないことが知られ、互いに拮抗しながら作用している。従って、Th1型サイトカインであるIFN−γ産生がTh2細胞への分化を抑制的に作用し、Th2型サイトカインであるIL−5及びIL−10産生が抑制され、Th1／Th2バランスをTh1側へシフトさせたことが示唆された。IL−5及びIL−10産生に培養3日目では有意な差は見られなかったのに対し、培養7日目において有意な差が見られたのは、これらサイトカインがT細胞間の情報伝達として機能する際の時間的なずれが生じているためであると考えられる。以上のことから経口摂取されたリンゴ由来プロアントシアニジン画分は、何らかの経路で全身免疫系に影響を与えることが明らかとなった。
【００３５】
全身免疫系に重要な役割を果たしている脾臓由来の免疫担当細胞（T細胞やB細胞など）分化の過程において細胞表面抗原を発現させることが知られている。そこで、脾臓由来の免疫担当細胞に発現した細胞表面抗原を調べることによりCD90.2（CD90.2+CD45R/B220- T細胞）とCD45R/B220（CD90.2-CD45R/B220+B細胞）の組成比をフローサイトメトリーを用いて測定した。脾臓由来T細胞の細胞表面抗原であるCD90.2+CD45R/B220- T細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群 36.80％、対照群
36.68％であり、有意な差は見られなかった。同様に、脾臓由来B細胞の細胞表面抗原であるCD90.2-CD45R/B220+
B細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群55.99％、対照群55.16％であり、有意な差は見られなかった。一方、T細胞（CD3−ε+）のサブセットであるヘルパーT細胞と細胞障害性T細胞の組成比を測定するため、antiCD4とantiCD8を用いて細胞表面抗原を染色した。リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群と対照群におけるCD4（CD4+CD3-ε+T細胞）とCD8（CD8+CD3−ε+ T細胞）の組成比を求めた。ヘルパーT細胞の細胞表面抗原であるCD4+CD3−ε+ T細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群26.51％、対照群26.95％であり、有意な差は見られなかった。また、細胞障害性T細胞の細胞表面抗原であるCD8+CD3−ε+ T細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群26.51％、対照群26.95％であり、有意な差は見られなかった。
以上の結果から、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群と対照群における脾臓由来T細胞とB細胞およびヘルパーT細胞と細胞障害性T細胞の組成比に変化は見られなかった。つまりプロアントシアニジン画分によるリンパ球の分化誘導への影響は少ないと思われる。
【００３６】
（６）リンゴ由来プロアントシアニジン画分のOVA免疫感作マウス由来上皮内リンパ球における細胞表面抗原の発現に与える影響
腸管上皮内リンパ球は腸管免疫系の免疫担当細胞として重要な役割を果たしている。そこで、腸管上皮内リンパ球に発現しているT細胞レセプター（TCR）のサブセットであるTCRαβとTCRγδの組成比を測定するため、anti TCRαβとanti TCRγδを用いて細胞表面抗原を染色した（図５）。その結果、TCRのサブセットの細胞表面抗原であるTCRαβ+組成は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群は60.19％、対照群59.14％であり、有意な差は見られなかった。一方、TCRのサブセットの細胞表面抗原であるTCRγδ組成は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群16.64％で、対照群9.29％であり、プロアントシアニジン画分投与群は、対照群と比べ有意に発現量が減少していた。しかしながら、細胞障害性T細胞のサブセットであるCD8ααとCD8αβの組成比を測定するため、antiCD8αとantiCD8βを用いて細胞表面抗原を染色した。その結果、CD8α+CD8β−T細胞は、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群36.64％、対照群25.71％であり、有意な差は見られなかった。また、細胞障害性T細胞のサブセットの細胞表面抗原であるCD8α+CD8β+T細胞においても、リンゴ由来プロアントシアニジン画分投与群27.53％、対照群21.1％であり、有意な差は見られなかった。TCRγδ細胞は経口免疫寛容の誘導と関連性が報告されていることから、リンゴ由来プロアントシアニジン画分摂取によるTCRγδ細胞増加により、経口免疫寛容を誘導し、何れかの経路で全身免疫系に影響を与えると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】特開平７−２８５８７６号公報、特開２０００−１６９５１号公報および特開２００２−８７９７８号公報に記載の方法を利用してリンゴから抽出した画分に含まれる代表的なポリフェノール成分の構造式を示した。
【図２】リンゴ由来プロアントシアニジン画分（ACT）のOVA免疫感作マウス由来脾臓細胞（培養３日 (Ａ) と７日 (Ｂ)）におけるIFN−γ産生に与える影響を示した。＊＊ｐ＜0.01vs．control value．
【図３】リンゴ由来プロアントシアニジン画分（ACT）のOVA免疫感作マウス由来脾臓細胞（培養３日 (Ａ) と７日 (Ｂ)）におけるIL−５産生に与える影響を示した。＊＊ｐ＜0.01 vs．control value．
【図４】リンゴ由来プロアントシアニジン画分（ACT）のOVA免疫感作マウス由来脾臓細胞（培養３日 (Ａ) と７日 (Ｂ)）におけるIL−10産生に与える影響を示した。＊ｐ＜0.05vs．control value．
【図５】リンゴ由来プロアントシアニジン画分（ACT）のOVA免疫感作マウス由来上皮内リンパ球における細胞表面抗原の発現に与える影響を示した。＊ｐ＜0.05 vs．control value．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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