(57)【要約】  【課題】動物を用いた有機アニオン性薬物の毒性評価において、より簡便で、より検討期間が短く、的確な評価が可能な毒性評価方法および薬物の毒性を発現させた病態モデル動物の提供。  【解決手段】投与した薬物の血漿中未変化体濃度のＡＵＣ（area under the concentration-time curve）が、同一条件下の薬物投与における正常ラットのＡＵＣに対し１.５倍以上となるＭｒｐ２（multidrug resistance-associated protein２）が欠損しているげっ歯動物に、有機アニオン性薬物を投与し、該薬物の血漿中未変化体濃度が高まることにより、前記薬物の毒性を特異的に発現させて、毒性学検査で異常を検出する、薬物の毒性評価方法。該Ｍｒｐ２が欠損しているげっ歯動物としては、高ビリルビン血症ラット（Hyperbilirubinemic Rats）が使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
投与した薬物の血漿中未変化体濃度のＡＵＣ（area under the concentration-time curve）が、同一条件下の薬物投与における正常ラットのＡＵＣに対し１.５倍以上となるＭｒｐ２（multidrug resistance-associated protein２）が欠損しているげっ歯動物に、有機アニオン性薬物を投与し、該薬物の血漿中未変化体濃度が高まることにより、前記薬物の毒性を特異的に発現させて、毒性学検査で異常を検出する、薬物の毒性評価方法。
【請求項２】
前記Ｍｒｐ２が欠損しているげっ歯動物が、高ビリルビン血症ラット（Hyperbilirubinemic Rats）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与が経口投与である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
単回投与時における血漿中未変化体濃度を測定し、正常ラットのＡＵＣに対し、１.５倍以上のＡＵＣになる投与量を薬物の１日投与量とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記１日投与量の薬物を７日間ないし１４日間連続投与する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記毒性学的検査が、血液学的検査、生化学的検査、臓器重量検査または病理組織学的検査から選ばれる１種以上である請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記毒性学的検査が、生化学的検査また病理組織学的検査である、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記有機アニオン性薬物がＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤である請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤がプラバスタチンである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機アニオン性薬物がメトトレキサートである請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
高ビリルビン血症ラットに、有機アニオン性薬物を投与して、該薬物の毒性を発現させた病態モデル動物。
【請求項１２】
前記有機アニオン性薬物としてのＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤の投与による、横紋筋融解症を特異的に発症させた高ビリルビン血症ラットである請求項１１に記載の病態モデル動物。
【請求項１３】
投与した薬物の血漿中未変化体濃度のＡＵＣ（area under the concentration-time curve）が、同一条件下の薬物投与における正常ラットのＡＵＣに対し１.５倍以上となるＭｒｐ２（multidrug resistance-associated protein２）が欠損しているげっ歯動物に、有機アニオン性薬物及び被検化合物を投与し、該薬物の血漿中未変化体濃度が高まることにより特異的に発現する毒性の程度を毒性学検査で検出することを特徴とする、薬物の毒性を軽減する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
前記Ｍｒｐ２が欠損しているげっ歯動物が、高ビリルビン血症ラット（Hyperbilirubinemic Rats）である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
単回投与時における血漿中未変化体濃度を測定し、正常ラットのＡＵＣに対し、１.５倍以上のＡＵＣになる投与量を薬物の１日投与量とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記毒性学的検査が、生化学的検査また病理組織学的検査である、請求項１３ないし請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記有機アニオン性薬物がＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤である請求項１３ないし請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤がプラバスタチンである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現する毒性が横紋筋融解症である請求項１３ないし請求項１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物モデルを用いた有機アニオン性薬物の毒性評価方法、さらには該薬物の毒性により疾患を発症した病態モデル動物、および該毒性を軽減する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、コンビナトリアル・ケミストリーやハイ・スルースプリット・スクリーニング（略称ＨＴＳ）などの医薬品開発における技術の発達に伴い、医薬品の探索段階において評価するべき化合物の数が大幅に増えてきている。そのため、探索段階の次の段階である開発研究段階や臨床段階において発見される毒性的な問題点をいち早く見極めてこれを回避するための毒性的検討が必要になってきている。
その一方で、多くの薬物は、毒性における種差だけでなく、低溶解性、低消化管透過性、低代謝的安定性、高クリアランスを原因とする全身暴露量の低さという、動態学的な、あるいは物理化学的な問題を抱えているため、しばしば探索段階における正当な毒性試験の評価が困難なことがある。その結果、毒性試験は時として医薬品の探索段階あるいは開発段階における律速段階になることがあり、医薬品開発において特に重要な位置付けにある。
【０００３】
たとえば高脂血症治療薬として用いられるプラバスタチンなどのＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、ヒトにおける副作用として横紋筋融解症などの筋障害が臨床的に報告されている（非特許文献１など参照）。
このためプラバスタチン投与によるその副作用（毒性）として横紋筋融解症の発症を動物実験で確認するため、さらにはその治療薬や毒性を軽減させる処置の模索などのために、横紋筋融解症発症の病態モデル動物を作製しようとの試みがなされてきた。しかしながら、これまでの報告によると、プラバスタチンを単独投与することにより該病態モデル動物を効率的に作製することは困難である。木村らは、プラバスタチン単独で長期連続投与しても横紋筋融解症は認められないことを報告している（非特許文献２参照）。ピエルニ（Pierni）らは、１００mg／kgのプラバスタチンを３ヶ月間連続してラットに経口投与しても横紋筋融解症は発症せず、他のスタチン系薬物に比し、プラバスタチンは毒性が出にくいことを報告している（非特許文献３参照）。スミス（Smith）らは、２００、６００および１２００mg／kgのプラバスタチンをラットに対して１日２回、２〜４週間連続して経口投与したとき、横紋筋融解症の発症率が各々、０％、３３％、１００％であることを報告するが、その発症の程度は不完全であることも報告している（非特許文献４参照）。
【０００４】
プラバスタチン投与により横紋筋融解症を発症させた実験動物は、唯一、免疫抑制剤であるサイクロスポリンの同時併用系で報告されている。上記Smithらは同じ論文（非特許文献４参照）のなかで、サイクロスポリンＡを、１０mg／kg／日の割合で静脈内に併用投与しながら、ラットに体重１kgあたり２００mgおよび６００mgのプラバスタチンを１回量として、１日２回、２〜４週間連続して経口投与したとき、横紋筋融解症の発症率は各々、６２％および１００％であることを報告している。しかしながら、この場合も発症率および発症増悪度にはバラツキがあることが報告されている。
【０００５】
また、プラバスタチン以外の医薬品の毒性による病態モデル動物例としては、葉酸拮抗系抗腫瘍剤であるメトトレキサートについて、０.６mg／kg／日のメトトレキサートを１４日間連続してラットに経口投与することにより、造血器や消化管に障害が認められたとする報告がある（非特許文献５参照）。
【０００６】
ところで、高ビリルビン血症および高ビリルビン尿を特徴とする自然発症ミュータントの高ビリルビン血症ラット（Hyperbilirubinemic Rats）が知られている。たとえば、ＳＤ（Sprague-Dawley）ラット（ＳＤＲ）を由来とするＥＨＢＲ（Eisai Hyperbilirubinemic Rats）およびWistar由来のＴＲ−ラット（ＴＲＲ）である。高ビリルビン血症ラットは、正常動物では肝臓の刷子縁膜側に発現し、有機アニオン性の生体内物質や薬物の排泄を司るmultidrug resistance-associated protein２（げっ歯類：Ｍｒｐ２，ヒト：ＭＲＰ２）が発現していない変異ラットである。遺伝形質は、常染色体上単一劣性遺伝様式であり、ホモ結合体が黄疸症状を示す。この黄疸症状は生涯に亘り持続的であり、異常行動や発育阻害は示さない。
【０００７】
上記高ビリルビン血症ラットは、ヒトにおける先天性ビリルビン代謝異常で、直接型高ビリルビン血症を示すDubin-Johnson症候群の動物モデルとして有用であることが知られている。またビリルビンだけでなく、Ｍｒｐ２の欠損した高ビリルビン血症ラットに、Ｍｒｐ２の基質となる有機アニオン性の生体内物質や薬物の胆汁排泄に関する研究が進められている。胆汁への排泄能の低いこれらラットでは、たとえば前記プラバスタチンまたはメトトレキサートなどを静注すると、これらの血漿中濃度が正常動物に較べて上昇することが示されている（非特許文献６〜７参照）。
しかしながら、高ビリルビン血症ラットを医薬品の毒性評価に用いることについては全く知られておらず、また高ビリルビン血症ラットにビリルビンに起因する疾患以外の薬物疾患を発症させること、さらには特定の疾患を発症した病態モデル動物および該モデル動物を用いた毒性（副作用）を軽減する化合物のスクリーニングについては全く知られていない。
【非特許文献１】澤田ら、月刊薬事、1994年、36（3）、p.627-641
【非特許文献２】木村ら、薬理と治療、1987年、15（12）、p.4957-73
【非特許文献３】Pierno, Sら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、1995年、275（3）、p.1490-1496
【非特許文献４】Smithら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、1991年、257（3）、p.1225-1235
【非特許文献５】村上ら、Journal of Toxicological Science、1998年、23、supplement V、p.681-699
【非特許文献６】Chen. Cら、Pharmaceutical Research、2003年、20（1）、p.31-37
【非特許文献７】山崎ら、第９回肝代謝研究会（宇都宮）報告集、1993年、p.121-136
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
医薬品開発においては、目的とする薬理活性のみでなく、高い安全性が要求されるため、医薬品の毒性試験は重要であるが、毒性試験は時として医薬品の探索段階あるいは開発段階において律速段階になることがあり、より簡便で、より検討期間が短く、的確な評価が可能な毒性評価方法あるいは疾患モデル動物が求められている。
本発明の目的は、動物を用いた有機アニオン性薬物の毒性評価において、より簡便で、より検討期間が短く、的確な評価が可能な毒性評価方法、疾患モデル動物、あるいは該毒性を軽減する化合物をスクリーニングする方法を提供することである。
特に、背景技術における問題点、より具体的に言えば、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるプラバスタチンであれば、より投与期間が短い、より投与量が少ない、単独投与でも症状が観察できる、あるいは他剤との併用がなく、そして毒性の発症率や増悪度が完全であること；メトトレキサートであれば、投与期間が短いなど、のうちの少なくとも１つ以上を克服した有機アニオン性薬物の毒性評価方法、疾患モデル動物、あるいは、より簡便かつ確実に該毒性を軽減させる化合物をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねてきた結果、Ｍｒｐ２が欠損しているげっ歯動物に、有機アニオン性薬物を投与すれば、該薬物の血漿中未変化体濃度が高まることにより、前記薬物の毒性を特異的に発現させることができるのではないかと発想した。これを後述する実施例に示すように高ビリルビン血症ラットに対して、有機アニオン性薬物としてプラバスタチンを投与したところ、その臨床的副作用と報告され、かつ動物実験での発症が困難とされていた横紋筋融解症を的確に発症させることができることが確認できた。これは、投与したプラバスタチンの血漿中未変化体濃度のＡＵＣが正常ラットよりも高くなり、横紋筋融解症を発症させる濃度に達したためと考えられる。明確な横紋筋融解症の発症モデルを得るためのプラバスタチン量は、従来の正常ラットに横紋筋融解症を発症させるために必要とされていた薬物量に比べ少なく、的確な病態モデルラットを高い確率で作製できることが確認できた。これにより、毒性評価のための、（１）投与期間を短縮できること、（２）薬物投与量減らせること、（３）１日あたりの薬物投与回数を減らせること、（４）薬物の単独投与で毒性発現が認められること、（５）毒性発現の程度（発症率および発症増悪度）およびヒトにおいて認められる副作用との類似性が向上すること等の特徴のうちの一つ以上の特徴を有して、毒性評価が可能であることを見出した。また、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるプラバスタチンの毒性である横紋筋融解症を発症させる際、被検化合物を同時に投与することで、該化合物が横紋筋融解症の発症を軽減できるか否かを確認することが可能であることを見出し、以下のような本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の第一の態様として、投与した薬物の血漿中未変化体濃度のＡＵＣ（area under the concentration-time curve）が、同一条件下の薬物投与における正常ラットのＡＵＣに対し１.５倍以上となるＭｒｐ２が欠損しているげっ歯動物に、有機アニオン性薬物を投与し、該薬物の血漿中未変化体濃度が高まることにより、前記薬物の毒性を特異的に発現させて、毒性学的検査で異常を検出する、薬物の毒性評価方法を提供する。
【００１１】
また本発明の第二の態様として、投与した薬物の血漿中未変化体濃度のＡＵＣが、同一条件下の薬物投与における正常ラットのＡＵＣに対し１.５倍以上となるＭｒｐ２が欠損しているげっ歯動物に、有機アニオン性薬物及び被検化合物を投与し、該薬物の血漿中未変化体濃度が高まることにより特異的に発現する毒性の程度を毒性学的検査で検出することを特徴とする、薬物の毒性を軽減する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１２】
上記第一の態様、並びに第二の態様に記載の「投与した薬物が血漿中未変化体濃度のＡＵＣが、同一条件下の薬物投与における正常ラットのＡＵＣに対して１.５倍以上となるＭｒｐ２が欠損しているげっ歯動物」とは、同じ薬物量を同じ条件（たとえば、経口等）で投与した際、投与した薬物の正常ラットのＡＵＣに対して１.５倍以上という血漿中未変化体濃度のＡＵＣになる薬物投与量で処理したＭｒｐ２欠損動物である。すなわち、Ｍｒｐ２欠損動物のＡＵＣが正常動物のＡＵＣの少なくとも１.５倍以上になるような投与量を設定することで、該薬物の検討対象の毒性が特異的に発現する。
この投与量の設定にあたっては、たとえば、該毒物の毒性発現用量の下限付近で２〜３点の投与量を設定し、Ｍｒｐ２欠損動物と正常動物のＡＵＣを比較する。Ｍｒｐ２欠損動物のＡＵＣが正常動物のＡＵＣの１.５倍以上となる用量で、評価の対象となる毒性が的確に検証できる投与量を設定することが望ましく、また、非特異的・非選択的な毒性、すなわち、体重増加抑制や体重減少あるいは他臓器に全身的におよぶ毒性等が現れない投与量を設定することが好ましい。たとえば、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるプラバスタチンに基づく横紋筋融解症であれば、５０mg／kg、１００mg／kg、２００mg／kg、４００mg／kgの各点で検討し、適切な投与量として２００mg／kgを容易に設定できる。また、メトトレキサートに基づく造血器や消化管の障害であれば、０.２mg／kg、０.６mg／kgの各点で検討し、適切な投与量として０.６mg／kgを容易に設定できる。非特異的・非選択的な毒性が現れないで該薬物の毒性を評価するには、たとえばＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例：プラバスタチン）やメトトレキサートでは、Ｍｒｐ２欠損動物のＡＵＣが正常動物のＡＵＣの１.５倍以上であり、３倍以下であることがより好ましい。
【００１３】
本発明において、Ｍｒｐ２が欠損しているげっ歯動物としては、高ビリルビン血症ラットが使用できる。たとえばＳＤラットを由来とするＥＨＢＲおよびWister由来のＴＲ−ラット等が挙げられる。ＥＨＢＲが好ましく使用される。
【００１４】
本発明における薬物の投与は経口投与で行うことができる。
本発明において、単回投与時における血漿中未変化体濃度を測定し、正常ラットのＡＵＣに対し、１.５倍以上のＡＵＣになる投与量を薬物の１日投与量とすることが望ましい。
上記１日投与量は、１回または２〜４回に分けることも可能であるが、１回で投与することが好ましい。
上記１日投与量の薬物を、７日間ないし１４日間連続投与することにより、該薬物の毒性を発現させることができる。
【００１５】
本発明における毒性学的検査としては、通常、血液学的検査、生化学的検査、臓器重量検査または病理組織学的検査などが挙げられ、生化学的検査また病理組織学的検査が好ましい。
【００１６】
本発明において、上記薬物は、有機アニオン性薬物である。
有機アニオン性薬物として、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤が挙げられ、特にプラバスタチンが挙げられる。
また有機アニオン性薬物として、メトトレキサートが挙げられる。
【００１７】
本発明では、また有機アニオンに対する胆汁排泄能が低下した変異ラットである高ビリルビン血症ラットに、有機アニオン性薬物を投与して、該薬物の毒性を発現させた病態モデル動物をも提供する。
たとえば病態モデル動物として、有機アニオン性薬物としてのＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤の投与による、横紋筋融解症を特異的に発症させた高ビリルビン血症ラットが挙げられる。
【００１８】
本発明の上記第二の態様の薬物の毒性を軽減する化合物をスクリーニングする方法においては、被検化合物をアニオン性薬物の投与前あるいは同時に投与することが可能であるが、同時に投与することが好ましい。また、毒性の程度を毒性学的検査で検出し、たとえば、毒性の発症率あるいは発症増悪度を低下させる化合物を選択することで、該薬物の毒性を軽減する化合物をスクリーニングすることができる。たとえば、有機アニオン性薬物であるＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤のプラバスタチンをＥＨＢＲに投与することにより横紋筋融解症を発症させることができ、被検化合物をプラバスタチンの投与前あるいは同時投与することで、横紋筋融解症の発症率あるいは発症増悪度を軽減することが可能な化合物を選定できる。
【００１９】
以下本発明をより詳細に説明する。
本発明において、投与した薬物の血漿中未変化体濃度のＡＵＣが、同一条件下の薬物投与における正常ラットのＡＵＣに対し１.５倍以上となるＭｒｐ２が欠損したげっ歯動物としては、高ビリルビン血症ラット（Hyperbilirubinemic Rats）を使用することができる。高ビリルビン血症ラットは、たとえば、ＳＤラット（ＳＤＲ）を由来とするＥＨＢＲ（Eisai Hyperbilirubinemic Rats）およびWistar由来のＴＲ−ラット（ＴＲＲ）である。
【００２０】
高ビリルビン血症ラットは、有機アニオンに対する胆汁排泄能が低下した変異ラットであり、正常動物では肝臓の刷子縁膜側に発現し、有機アニオン性の生体内物質や薬物の排泄を司るmultidrug resistance-associated protein２（げっ歯類：Ｍｒｐ２，ヒト：ＭＲＰ２）が発現していない。遺伝形質は、常染色体上単一劣性遺伝様式であり、ホモ結合体が黄疸症状を示す。この黄疸症状は生涯に亘り持続的であり、異常行動や発育阻害は示さない。原因遺伝子は、Ｍｒｐ２遺伝子であり、ＥＨＢＲは、Ｍｒｐ２遺伝子の２５６４番目の塩基ＧがＡに置き換わり、ストップコドンになることにより、ＴＲＲは、Ｍｒｐ２遺伝子の３９３番目のアミノ酸をコードする塩基の１つが欠落し、フレームシフトが起きた結果、４０１番目でストップコドンになることに原因される。
【００２１】
薬物は有機アニオン性薬物であり、代謝物がＭＲＰ２もしくはＭｒｐ２の基質になるものも含め、ロイコトリエン類（ロイコトリエンＣ４、ロイコトリエンＤ４、ロイコトリエンＥ４）、高脂血症治療剤（プラバスタチン、ナフェノピン）、抗菌剤（グラパフロキサシン、オラムフロキサシン）、抗腫瘍剤およびその類縁化合物（イリノテカン、7-エチル-10-ヒドロキシ-カンプトテシン、5-メチルテトラヒドロ葉酸、メトトレキサート、Fluo-3：1-[2-amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)]-2-(2'-amino-5'-methyl-phenoxy)-ethane-N,N,N',N'-trtraacetic acid penta ammonium salt）、ＡＣＥII阻害剤（テモカプリル、テルミサルタン）、痛風治療剤（プロベネシド）、解熱鎮痛剤（アセトアミノフェン）、生理活性ペプチド（ＢＱ１２３：cyclo[D-Trp-D-Asp-L-Pro-D-Val-L-Leu]、ＢＱ４８５：Perhydroazepino-N-carbonyl-L-Leu-D-Trp-D-Trp、ＢＱ５１８：[D-Trp-D-Asp-L-Pro-D-Thg-L-Leu]）、酵素阻害剤（Ｅ３０４０：6-Hydroxy-5,7-dimethyl-2-methylamino-4-(3-pyridylmethyl)benzothiazole)、その他試薬類（2,4-ジニトロベンゼン、スルフォブロモフタレイン）、有機アニオン性の生体成分および天然物（オクラトキシンＡ、エストラジオール）等が挙げられる。
【００２２】
有機アニオン性薬物は、上記のうちでもＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤であることが好ましく、プラバスタチンであることがより好ましい。
また有機アニオン性薬物としてメトトレキサートも好ましい。
【００２３】
薬物の投与量は、薬物の種類、動物の種によっても異なるが、高ビリルビン血症ラットの場合、上記薬物は、単回投与時における血漿中未変化体濃度を測定し、正常ラットのＡＵＣに対し、１.５倍以上のＡＵＣになる投与量を薬物の１日投与量とすることが望ましい。またこの１日投与量の薬物を、７日間ないし１４日間連続投与すれば、毒性を発現することができる。
【００２４】
本発明では、投与した薬物の血漿中未変化体濃度が高まることにより、該薬物の毒性を特異的に発現させて、毒性学検査で異常を検出する。
毒性学的検査は、血液学的検査、生化学的検査、臓器重量検査または病理組織学的検査などであり、特に生化学的検査また病理組織学的検査である。
有機アニオン性薬物がプラバスタチンである場合には、生化学的検査の異常として、たとえば、血中クレアチンホスホキナーゼ（Creatine Phosphokinase，ＣＰＫ）の上昇などが観察され、病理組織学的検査として、たとえば、横紋筋の融解を観察することが可能である。
また、有機アニオン性薬物がメトトレキサートである場合には、造血器や消化管に障害を観察することが可能である。
【００２５】
本発明において、顕著に認められることが可能な有機アニオン性薬物の毒性所見としては、たとえば以下のものが挙げられる。
ピリドンカルボン酸系抗菌剤（例：グラパフロキサシン等）の毒性所見であれば、たとえば、間質性肺炎、低血糖、横紋筋融解症、偽膜性大腸炎、過敏症、腎障害、白血球減少、血小板減少、好酸球増多、下痢、口内炎、便秘、肝機能障、痙攣、ふらつき、振戦、心悸亢進、腱障害などが挙げられる。
【００２６】
抗悪性腫瘍薬イリノテカンの毒性所見であれば、たとえば、汎血球減少、白血球減少、抗中球減少、貧血症状、高度な下痢、間質性肺炎、食欲不振、腸管麻痺、腸管運動亢進、口内炎、ＧＯＴ・ＧＰＴ上昇、黄疸、Al-P・ビリルビン・ＬＤＨ上昇、ＢＵＮ・クレアチニン上昇、電解質異常、蛋白尿、血尿、呼吸困難、発疹、脱毛、色素沈着、浮腫、末梢神経障害、心電図異常、血圧低下、好酸球増多、発熱、総蛋白減少、アルブミン減少、カルシウム異常、尿酸異常、糖尿などが挙げられる。
【００２７】
抗悪性腫瘍薬のメトトレキサートの毒性所見であれば、たとえば、アナフラキシー様症状（呼吸困難、血圧低下等）、骨髄抑制、汎血球減少、劇症肝炎、肝不全、肝組織の壊死・繊維化・硬変、急性腎不全、尿細管壊死、ネフロパチー、間質性肺炎、肺繊維症、表皮壊死、出血性腸炎、壊死性腸炎、痙攣、片麻痺、脳症、昏睡、膵炎、骨粗鬆症、発疹、蕁麻疹、発熱、敗血症、低ガンマグロブリン血症、黄疸、脂肪肝、ＧＯＴ・ＧＰＴ・Ａｌ-Ｐの上昇、血尿、ＢＵＮ・クレアチニン上昇、消化管潰瘍・出血、口内炎、下痢、食欲不振、メレナ、イレイス、舌炎、口唇腫脹、光線過敏症、好斑、色素沈着、色素脱出、皮下斑状出血、座瘡、脱毛、咳嗽、呼吸困難、無精子症、卵巣機能不全、流産、膀胱炎、耳下腺炎、結膜炎、低蛋白血症、感染症などが挙げられる。
【００２８】
ＡＣＥII阻害剤のテモカプリルの毒性所見であれば、たとえば、血管浮腫、汎血球減少、無顆粒球症、急性腎不全、ネフローゼ症候群、発疹、白血球減少、好酸球増多、貧血、血小板減少などが挙げられる。また、テルミサルタンの毒性所見であれば、血管浮腫、高カリウム血症、腎機能障害（血清クレアチニン上昇、血中尿酸値上昇）、失神・意識喪失、肝機能障害（ＡＳＴ、ＡＬＴＡＬＰ、ＬＤＨ上昇）、黄疸、発疹、蕁麻疹、白血球減少、心悸亢進、ふらつき、上室性期外収縮、心房細動、上室性頻脈、下痢、食欲不振、消化不良、胃炎、口内炎、咳、喀痰増加、咽頭炎、耳鳴、ＣＲＰ陽性、ＣＰＫ上昇、浮腫、発熱、頻尿、結膜炎などが挙げられる。
【００２９】
ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例：プラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン等）の毒性所見であれば、横紋筋融解症、肝障害、ミオパシー、末梢神経障害、ループス様症候群、血管炎、発疹、便秘、下痢、口内炎、肝機能異常、ＢＵＮ・血清クレアチニン上昇、筋脱力、ＣＰＫの上昇、尿酸の上昇、尿潜血、浮腫、脱毛などが挙げられる。
【００３０】
卵胞ホルモン製剤（例：エストラジオール等）の毒性所見であれば、アナフラキシーショック、血栓塞栓による血流障害、静脈内炎症、接触皮膚炎、かぶれ、水痘、化膿性湿疹、色素沈着、皮膚剥脱、子宮内膜増殖、浮腫、発疹、蕁麻疹、アレルギー性接触皮膚炎、肝機能障害（ＧＯＴ・ＧＰＴ・Ａｌ-Ｐの上昇）、発熱、血栓、血圧上昇、胆汁鬱滞性黄疸などが挙げられる。
【００３１】
痛風治療剤（例：プロベネシド等）の毒性所見であれば、溶血性貧血、再生不良性貧血、アナフラキシー様症状、肝壊死、ネフローゼ症候群、発熱、皮膚炎、食欲不振、頻尿などが挙げられる。
解熱鎮痛剤（例：アセトアミノフェン等）の毒性所見であれば、アナフラキシー様症状、表皮壊死、喘息発作、肝障害、黄疸、間質性肺炎、好酸球性肺炎、顆粒球減少、血小板減少、血小板機能低下、食欲不振などが挙げられる。
【００３２】
投与した薬物の血漿中濃度を高めることにより毒性を発現する本発明によれば、同じ薬効の薬物群の中でも、その毒性を特異的に発現させることが困難であった薬物であっても毒性評価を効率よく、かつ的確に行うことができる。たとえばスタチン系ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤のうちでも、前述したプラバスタチンは、そのＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤の副作用としての毒性発現モデルとして、横紋筋融解症を動物モデルで発症させることは、ロバスタチン、シンバスタチンなどのＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤に比べて困難であったが、本発明によれば横紋筋融解症を特異的に発症した動物モデルを作製することができる。
【００３３】
本発明によれば、有機アニオン性薬物による毒性所見が明確にできるので、本発明を、その副作用を軽減する化合物のスクリーニング方法としても用いることが可能である。たとえば、有機アニオン性薬物であるＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤のプラバスタチンをＥＨＢＲに投与することにより、横紋筋融解症を発症させることができるが、他の化合物をプラバスタチンの投与前あるいは同時投与することで、横紋筋融解症の発症率あるいは発症増悪度を軽減することが可能な化合物を選定することができる。
【００３４】
本発明に係る薬物の毒性評価方法は、通常、以下の手順で行われる。
（投与手順）
前日よりの摂餌量および投与直前のラット体重を測定（記録）し、所定量の薬液をゾンデを装着した注射筒を用いて胃内へ強制投与する。投与後は一般症状を観察する。
（血液学的検査手順）
抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いて採取した血液を検体として測定する。
（生化学的検査）
抗凝固剤としてヘパリンを用いて採取した血液または血漿を検体として測定する。
（臓器重量）
血液学的検査および生化学的検査用に血液を採取した後、放血致死させたラットは開腹後所定の臓器を摘出し，重量を記録する。
（病理組織学的検査）
摘出した器官を１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液にて固定後、パラフィンブロックを作製する。薄切した切片にヘマトキシリン・エオジン染色を施し、顕微鏡により観察する。
【００３５】
また本発明の薬物の毒性を軽減する化合物をスクリーニングする方法は、通常、以下の手順で行われる。
（投与手順）
前日よりの摂餌量および投与直前のラット体重を測定（記録）し、所定量の薬液をゾンデを装着した注射筒を用いて胃内へ強制投与する。投与後は一般症状を観察する。被検化合物の投与開始時期は、該薬物の投与開始以前、もしくは同時投与とする。
（血液学的検査手順）
抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いて採取した血液を検体として測定する。
（生化学的検査）
抗凝固剤としてヘパリンを用いて採取した血液または血漿を検体として測定する。
（臓器重量）
血液学的検査および生化学的検査用に血液を採取した後、放血致死させたラットは開腹後所定の臓器を摘出し、重量を記録する。
（病理組織学的検査）
摘出した器官を１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液にて固定後、パラフィンブロックを作製する。薄切した切片にヘマトキシリン・エオジン染色を施し、顕微鏡により観察する。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、従来より簡便で、より検討期間が短く、的確な評価が可能な毒性評価方法および疾患モデル動物が提供される。本発明は、毒性評価のための、（１）投与期間を短縮できること、（２）薬物投与量減らせること、（３）１日あたりの薬物投与回数を減らせること、（４）薬物の単独投与で毒性発現が認められること、（５）毒性発現の程度（発症率および発症増悪度）およびヒトにおいて認められる副作用との類似性が向上すること等の特徴のうちの一つ以上の特徴を有しているので、より簡便で、より検討期間が短く、的確な毒性評価が可能である。
また本発明によれば、薬物による毒性所見が明確に検出できるので、該薬物の副作用を軽減できる化合物のスクリーニングも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下に実験例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
［実験例１］プラバスタチンのファルマコキネッテクス
プラバスタチンの２００mg／kgをＥＨＢＲ及びＳＤＲに、各々経口投与したところ、ＡＵＣはＥＨＢＲにおいてＳＤＲの１.８倍を示した。経口投与においてＥＨＢＲではＳＤＲに比べて、プラバスタチンの暴露量が実質的に増えていることが明らかになった。
【００３９】
［実験例２］プラバスタチンの毒性試験
プラバスタチンの２００mg／kgを１日1回１４日間連続して、ＥＨＢＲ及びＳＤＲに各々経口投与したところ、ＥＨＢＲでは、全例（５例）に血中ＣＰＫの上昇（溶媒投与群に対して１６.６倍）、横紋筋の融解が認められた。しかしながら、ＳＤＲには同様の所見は全く認められなかった。横紋筋の融解についての結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
2005124573.tif 000002
【実施例２】
【００４１】
［実験例３］メトトレキサートのファルマコキネッテクス
メトトレキサートの０.６mg／kgをＥＨＢＲおよびＳＤＲに各々経口投与したところ、ＥＨＢＲのＡＵＣはＳＤＲに比べて１.６倍を示し、ＥＨＢＲではメトトレキサートの暴露量が実質的に増えていることが明らかになった。
【００４２】
［実験例４］メトトレキサートの毒性試験
メトトレキサートの０.６mg／kgを１日１回７日間連続して、ＥＨＢＲに経口投与したところ、全例（５例）に造血器・消化管・肝臓に障害が認められた。ＳＤＲにおいても造血器に障害は認められたものの、その程度はＥＨＢＲに比べ弱かった。その結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2005124573.tif 000003
【実施例３】
【００４４】
［実験例５］プラバスタチンの毒性に及ぼすイコサペント酸エチル（ＥＰＡ-Ｅ）の影響
ＥＨＢＲに対し、プラバスタチンの２００mg／kg、ならびにプラバスタチンの２００mg／kgとＥＰＡ-Ｅの１００または３００mg／kgとを１日１回１４日間連続して経口投与したところ、ＥＰＡ-Ｅとの併用投与群において、プラバスタチン投与による血中ＣＰＫ活性の上昇を正常レベルにまで低下させ、血中ミオグロビン活性の上昇をプラバスタチン単独投与群の４分の１に抑制し、また横紋筋融解症の発症増悪度の軽減が認められた。横紋筋の融解についての結果を表３に示す。なお、ＥＰＡ-Ｅのみの投与では何らの所見も観察されなかった。
【００４５】
【表３】
2005124573.tif 000004
【００４６】
以上の結果から、プラバスタチンでは、単回の経口投与で、ＳＤＲに比べＥＨＢＲのＡＵＣが１.８倍、メトトレキサートでは、単回の経口投与で１.６倍になっていることが示された。また、反復投与時において、生化学的検査および病理組織学的検査において、プラバスタチン、メトトレキサートとも明確な毒性所見が観察された。
また、ＥＨＢＲに対し、ＥＰＡ-Ｅとプラバスタチンとを連続して経口投与したところ、ＥＰＡ-Ｅとの併用投与群において、プラバスタチン投与による血中ＣＰＫ活性の上昇を正常レベルにまで低下させ、血中ミオグロビン活性の上昇をプラバスタチン単独投与群の４分の１に抑制し、また横紋筋融解症の発症増悪度の軽減が観察された。すなわち、ＥＰＡ-Ｅはプラバスタチンの横紋筋融解症の軽減効果を有することが明らかとなった。
【００４７】
以下、本発明を従来の報告と対比して説明する。
前述のように、従来の報告によれば、Pierniら（前記非特許文献３参照）は、１００mg／kgのプラバスタチンを３ヶ月間連続してラットに経口投与しても横紋筋融解症は発症せず、他のスタチン系薬物に比し、プラバスタチンは毒性が出にくいことを報告している。
Smithら（前記非特許文献４参照）は、２００、６００および１２００mg／kgのプラバスタチンを１日２回、２〜４週間連続して経口投与したとき、横紋筋融解症の発症率が各々、０％、３３％、１００％であるが、その発症の程度は不完全であることを報告している。またSmithらは同じ論文のなかで、サイクロスポリンＡを１０mg／kg／dayの割合で静脈内に併用投与しながら、２００および６００mg／kgのプラバスタチンを1日２回、２〜４週間経口投与したとき、横紋筋融解症の発症率は各々、６２％および１００％であることを報告している。
これらに比べ本発明の方法では、１日１回と投与回数を減らすことができ、投与期間も７〜１４日間と短く、また、投与量も少なく、サイクロスポリンＡのような併用薬物を用いず、プラバスタチン単独の投与でも横紋筋融解症が認められ、発症率が１００％と極めて高率であり、しかも発症増悪度が完全であることが明らかとなった。
【００４８】
また、村上ら（非特許文献５参照）は、０.６mg／kgのメトトレキサートを１４日間連続してラットに経口投与したところ、造血器や消化管に障害が認められたことを報告している。
この報告に比べ本発明は、同等の毒性所見が同量の薬物投与でより短期間（７日間）に誘発できることが明らかとなった。
【００４９】
本発明では、薬物の作用のうち、毒性が特異的にみられる。薬物の毒性（副作用）を評価するには、通常、その薬物本来の薬効（治療効果）のための薬物量よりも多量に投与する必要がある。
ところが従来、これを動物モデルたとえば正常ラットにおいてアニオン性薬物の評価をしようとしても、前述のように的確に発症した病態モデル動物を高い作製率で得ることが困難であった。
これを、本発明において達成できた結果から推考すれば、その１つの理由は、正常ラットでは、血中薬物濃度が低いところで飽和する点にあったといえる。すなわち正常なラットでは、薬物を多量に投与しても投与増加量に比例して薬物のＡＵＣは高くならず、ある一定のところで飽和してしまう。このことは実験によっても確かめられている。たとえばプラバスタチンを正常ラットに大量投与しても、消化管からの吸収量自体が頭打ちになるため、ＡＵＣはほとんど上昇しない。正常ラットにおける低い血中濃度は、見ようとする毒性の疾患を的確に発症させるに足りるＡＵＣに達していなかったためと推測される。
さらに他の１つは、正常ラットに投与された多量の薬物は、吸収されずに消化管内に残存し、消化管自体の障害などが誘発され、反復投与毒性試験自体が成立しない恐れがある。多くは、ラットが下痢等により正常に体重増加しないなどの不都合な状態となり、薬剤の全身暴露による毒性が観察可能な病態モデルを作製するに至らない場合が多い。
これに対して、Ｍｒｐ２が欠損したラットは、正常ラットと同程度の消化管からの吸収量を示したとしても、Ｍｒｐ２が欠損していることにより排泄過程が抑制されているため、ＡＵＣは正常ラットに比して上昇する。投与した有機アニオン性薬物のＡＵＣが、正常ラットのＡＵＣに対し１.５倍以上という高い血中濃度が得られ、病態を的確に発症させることができる。高ビリルビン血症ラットにおいては、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤の最も顕著な毒性として、横紋筋融解症の発症が認められる。
Ｍｒｐ２が欠損したラットを用いれば、高いＡＵＣを、多量投与という薬害を生じない低投与量で達成することができるため高い発症率をも達成することができる。
【００５０】
正常ラットにおいて、高ビリルビン血症ラットと同程度のＡＵＣとし、横紋筋融解症の発症を誘発させるためには、１日あたりの投与回数を増やすか、サイクロスポリンＡを併用してプラバスタチン自身の代謝・排泄過程を阻害し、ＡＵＣを上昇させるという手段を要し、前者の場合には、前記したように的確な発症モデルを高い発症率で獲得することが困難であり、後者の場合には薬物の単独評価ができない。
【００５１】
なお薬物本来の薬効（治療効果）については、ラットにおいては、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素が、その阻害剤によって阻害されたとしても、再活性化、いわゆるリバウンドが顕著に起こるため、たとえばTriton負荷により、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素活性が通常ラットより亢進しているモデルラット以外では、プラバスタチンをはじめとしたスタチン系薬物の薬効（血中コレステロールの低下作用）を評価するのは困難であると一般的に考えられている。換言すれば、薬物の薬効には、本来の薬効（治療効果）および毒性（副作用）があるが、本発明のＭｒｐ２が欠損することにより胆汁排泄機能が低下したラットは、その副作用を特異的に評価することができるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
従って、本発明は、医薬品開発において、より簡便で、より検討期間が短く、的確な評価が可能な毒性発現方法あるいは毒性評価方法、または疾患モデル動物として期待される。また、薬物による毒性所見が明確に検出できるので、その薬物の副作用を軽減する化合物のスクリーニング方法としても用いることが可能である。