(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト腸内や病変部位にて検出される各種の菌を特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供する。【解決手段】ラクトバチルス属、クロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、ファイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属、ビフィドバクテリウム属等のヒト腸内細菌を同定するために用いる、特定の塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内細菌検出用プライマー。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３９から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内細菌検出用プライマー。
【請求項２】
配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６、２７と２８、２９と３０、３１と３２、３３と３４、３５と３６、３７と３８、３７と３９から選ばれる２つの塩基配列の組合わせ又はこれら塩基配列の組合わせに相補的な配列を有する腸内細菌検出用プライマー。
【請求項３】
各塩基配列の組合せが、それぞれクロストリジウム  ブチリカム、クロストリジウム  パーフリンジェンス、クロストリジウム  レプタム、クロストリジウム  オルビシンデンス、ユウバクテリウム  デスモランス、フェイカリバクテリウム  プラウツニッチ、ルミノコッカス  アルブス、ルミノコッカス  ブロミ、ルミノコッカス  カリダス、アシドアミノコッカス  ファーメンタンス、ベイヨネラ  クリセチとベイヨネラ  ラッティ、クロストリジウム  シンデンス、ユウバクテリウム  レクターレ、ルミノコッカス  オベウム、ルミノコッカス  プロダクタス、クロストリジウム  コッコイデス、ラクトバチルス  ルミニス、クロストリジウム  クラスターＩのＥＢ００２菌群、クロストリジウム  クラスターIVのＢＡ０３１菌群及びクロストリジウム  クラスターXIVbのＢＡ０７６菌群の検出用プライマーである請求項２記載の腸内細菌検出用プライマー。
【請求項４】
請求項１又は２記載のプライマーの１又は２以上を使用することを特徴とする腸内細菌の検出方法。
【請求項５】
クロストリジウム  ブチリカム、クロストリジウム  パーフリンジェンス、クロストリジウム  レプタム、クロストリジウム  オルビシンデンス、ユウバクテリウム  デスモランス、フェイカリバクテリウム  プラウツニッチ、ルミノコッカス  アルブス、ルミノコッカス  ブロミ、ルミノコッカス  カリダス、アシドアミノコッカス  ファーメンタンス、ベイヨネラ  クリセチとベイヨネラ  ラッティ、クロストリジウム  シンデンス、ユウバクテリウム  レクターレ、ルミノコッカス  オベウム、ルミノコッカス  プロダクタスとクロストリジウム  コッコイデス、ラクトバチルス  ルミニス、クロストリジウム  クラスターＩのＥＢ００２菌群、クロストリジウム  クラスターIVのＢＡ０３１菌群及びクロストリジウム  クラスターXIVbのＢＡ０７６菌群からなる群のヒト腸内細菌を検出するものである請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載のプライマーの１又は２以上を使用することを特徴とする腸内細菌の同定方法。
【請求項７】
クロストリジウム  ブチリカム、クロストリジウム  パーフリンジェンス、クロストリジウム  レプタム、クロストリジウム  オルビシンデンス、ユウバクテリウム  デスモランス、フェイカリバクテリウム  プラウツニッチ、ルミノコッカス  アルブス、ルミノコッカス  ブロミ、ルミノコッカス  カリダス、アシドアミノコッカス  ファーメンタンス、ベイヨネラ  クリセチとベイヨネラ  ラッティ、クロストリジウム  シンデンス、ユウバクテリウム  レクターレ、ルミノコッカス  オベウム、ルミノコッカス  プロダクタスとクロストリジウム  コッコイデス、ラクトバチルス  ルミニス、クロストリジウム  クラスターＩのＥＢ００２菌群、クロストリジウム  クラスターIVのＢＡ０３１菌群及びクロストリジウム  クラスターXIVbのＢＡ０７６菌群から選ばれるヒト腸内細菌を同定するものである請求項６載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト腸内細菌の同定に有用なＤＮＡプライマー及びこれを用いる腸内細菌の検出・同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸内フローラにはおよそ３００種のバクテリアが存在し、健康者は常時ほぼ一定のバランスを保っている。これらの細菌は、消化の補助、ビタミンの合成、外来菌の感染に対する防御的役割等をしているといわれている。これら腸内フローラ構成菌のうち、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、クロストリジウム  クラスター（Clostridium cluster）（非特許文献１）に含まれるクロストリジウム属(Clostridium)、ユウバクテリウム属(Eubacterium)、ルミノコッカス属(Ruminococcus)、フェイカリバクテリウム属(Faecalibacterium)、アシドアミノコッカス属(Acidaminococcus)、ベイヨネラ属(Veillonella)もビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)の細菌と同様にヒト腸内フローラにおける最優勢菌群である。
【０００３】
しかし、これらの腸内細菌は嫌気性菌であることから、分離培養には、特別な装置と試験者の熟練を必要とする。また、通常菌種の同定は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、一般生物学的性状等を検査することにより行われている。しかしながら、表現形質を基にした同定法は、操作が煩雑で多大な時間と労力を要し、試験者の熟練を要する。また、培地上のコロニー数が多くなると、コロニー同士が重なるなどしてしまい、菌数の少ないものを検出できない場合もあった。
【０００４】
近年では、菌種同定にはＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われるようになっている（非特許文献２）。しかしながら、この同定法も長時間を必要とし、迅速な菌種同定を行うには好ましいものではなかった。
【０００５】
さらに、ヒト腸内細菌はほぼすべてが嫌気性細菌であることからその多くが分離・培養されていない。従って、これら分離・培養されていない菌種を無視しては、腸内フローラのバランスを正確に把握したとは言えない。特にクロストリジウム  クラスターは、特に重要な役割をしており、これらに属する未同定菌群を検出する方法が望まれていた。
【０００６】
上記検出法の問題点を解消するため、本出願人らはある種の腸内細菌に特異的なプローブやプライマーを用いて、菌の同定を行う方法を検討し、例えば特許文献１にはバクテロイデスグループ細菌に特異的なプローブを、特許文献２にはビフィドバクテリウム属細菌に特異的なプライマーを、特許文献３には、ヒト腸内フローラ中の未同定菌群に対する特異的なプライマーとプローブを開示している。この方法によれば、菌の同定・検出を簡便、迅速に行えるが、ヒト腸内や病変部位にはこの他にも様々な細菌が存在しており、特に最優勢で存在している他の菌種をカバーできるプライマーセットが要望されている。
【非特許文献１】Collins, M. D., et al. (1994)INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 44,812-826
【非特許文献２】Collins, M.D.,et al(1989)INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 39,105-108
【特許文献１】特開平１１−２８０９０号公報
【特許文献２】特開平１１−１２３０９３号公報
【特許文献３】特開２００２−１４２７７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、腸内細菌の同定等に使用しうるプライマーを設計するためには、遺伝子のシークエンシング、アライメント等かなりの手間がかかるばかりか、せっかく設計した配列でプライマーを合成しても、特異性が得られない場合もある。このため、プライマーの種類がなかなか増えず、腸内、病変部での菌の動向を把握するには未だ不充分である。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、ヒト腸内や病変部位にて検出される各種の菌を特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
斯かる現状に鑑み本発明者は鋭意研究を行ったところ、クロストリジウム  クラスターに含まれるクロストリジウム属やユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属やベイヨネラ属細菌、ラクトバチルス属細菌、糞便から得られたＤＮＡを用いた１６Ｓ ｒＤＮＡクローンライブラリー法から見出されたクロストリジウム  クラスターに属する未同定菌群のそれぞれに特異的なＤＮＡプライマーが得られ、これらを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に上記の菌の同定・解析が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、配列番号１〜３９から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内細菌検出用プライマーを提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明は、上記プライマーの１又は２以上を使用することを特徴とする、ヒト腸内細菌の検出方法又は同定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度にクロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属やラクトバチルス属細菌の同定を行うことができる。また、他の菌に特異的なプライマー等と組み合わせて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行うことができる。さらに、同定、解析の結果から消化管等の状態を把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のプライマーは、クロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属やラクトバチルス属細菌、さらに、クロストリジウム  クラスターに属する未同定菌群に特異的であり、ヒト腸管で頻繁に検出される菌に特異的な配列を有するものである。より具体的には、アシドアミノコッカス  ファーメンタンス(Acidaminococcus fermentans)、クロストリジウム  ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム  レプタム(Clostridium leptum)、クロストリジウム  オルビシンデンス(Clostridium orbiscindens)、クロストリジウム  パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム  シンデンス(Clostridium sindens)、ユウバクテリウム  デスモランス(Eubacterium desmolans)、ユウバクテリウム  レクターレ(Eubacterium rectale)、フェイカリバクテリウム  プラウツニッチ(Faecalibacterium prausnitzii)、ルミノコッカス  アルブス(Ruminococcus albus)、ルミノコッカス  ブロミ(Ruminococcus bromii)、ルミノコッカス  カリダス(Ruminococcus callidus)、ルミノコッカス  オベウム(Ruminococcus obeum)、ルミノコッカス  プロダクタス(Ruminococcus productus)とクロストリジウム  コッコイデス(Clostridium coccoides)、ベイヨネラ  クリセチ(Veillonella criceti)とベイヨネラ  ラッティ(Veillonella ratti)、そしてラクトバチルス  ルミニス(Lactobacillus ruminis)、クロストリジウム  クラスター  Iに含まれるＥＢ００２菌群、クロストリジウム  クラスター  ＩＶに含まれるＢＡ０３１菌群、クロストリジウム  クラスター XIVbに含まれるＢＡ０７６菌群に特異的なプライマーがある。
【００１４】
本発明のプライマーを作製するにあたり、そのターゲットには、系統分類の指標として信頼性の高い１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析にはＰＣＲ法等の手段が必要になるため、ＲＮＡではなくＤＮＡを用いた。
【００１５】
プライマーは、本発明者がシークエンスを行って得た塩基配列とデータベース（DDBJ、Genbank等）とを比較・検討することにより得たものである。
【００１６】
プライマーの設計の際には、同定の対象となる菌とその近縁の菌の配列のアライメントを行った。すなわち、Collins, M. D., et al. (1994)INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 44,812-826）による分類に基づいて近縁菌種を選択し、アライメントを行った。その結果、標的とした菌種に特異的な配列が存在したため、この領域をターゲットとしたＰＣＲプライマーを設計した。その結果、配列番号１〜３９から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相乗的な配列を有するプライマーが得られた。
【００１７】
また、オリゴヌクレオチドの長さはプライマーによって異なっており、１８〜２６塩基となっている。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数塩基の塩基配列を増減させたものを用いても良い。
【００１８】
このようにして得られた本発明プライマーのうち、配列番号１及び２記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム  ブチリカムに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００１９】
また、配列番号３及び４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム  パーフリンジェンスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２０】
また、配列番号５及び６記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム  レプタムに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２１】
また、配列番号７及び８記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム  オルビシンデンスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２２】
また、配列番号９及び１０記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ユウバクテリウム  デスモランスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２３】
また、配列番号１１及び１２記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、フェイカリバクテリウム  プラウツニッチに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２４】
また、配列番号１３及び１４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス  アルブスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２５】
また、配列番号１５及び１６記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス  ブロミに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２６】
また、配列番号１７及び１８記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス  カリダスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２７】
また、配列番号１９及び２０記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、アシドアミノコッカス  ファーメンタンスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２８】
また、配列番号２１及び２２記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ベイオネラ  クリセチ及びベイオネラ  ラッティに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２９】
また、配列番号２３及び２４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム  シンデンスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３０】
また、配列番号２５及び２６記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ユウバクテリウム  レクターレに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３１】
また、配列番号２７及び２８記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス  オベウムに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３２】
また、配列番号２９及び３０記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス  プロダクタス及びクロストリジウム  コッコイデスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３３】
また、配列番号３３及び３４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム  クラスターＩに属するＥＢ００２菌群に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３４】
また、配列番号３３及び３４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム  クラスターIVに属するＢＡ０３１菌群に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３５】
また、配列番号３５及び３６記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム  クラスターXIVbに属するＢＡ０７６菌群に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３６】
また、配列番号３７、３８及び３９記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ラクトバチルス  ルミニスに特異的にＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては配列番号３７と３８、又は配列番号３７と３９を組み合わせて用いることが好ましい。
【００３７】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成することができる。その特異性は、以下の実施例に示す近縁種のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌種の特異性に問題はなかった。
【００３８】
一方で、配列番号１〜３９に示す配列以外にも種特異的な配列が見出されている。しかしながら、これらの配列や他の公知のプライマーで同定を行っても、別の種に属する株と反応したり、目的とする種の株と反応しない場合もあり、使用上好ましいものではなかった。このようなプライマーを用いてもＰＣＲ反応時の条件設定によって種特異的な反応性は達成されるものと考えられるが、現状ではそのような条件は見出されていない。
【００３９】
本発明のプライマーとしては、上記の配列に相補的な配列も使用可能であり、また上記配列に1〜数個の塩基を付加させた配列でも使用可能である。
【００４０】
本発明のプライマーは、  クロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属やラクトバチルス属細菌への特異性を有するため、これらを用いて糞便、腸内細菌を迅速に同定できる。また、各菌の選択培地もしくは、非選択培地上に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌の簡易同定を行うことができる。
【００４１】
本発明のプライマーを用いて糞便等の検体から前記腸内細菌を検出するには、例えば（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）上記プライマーの１又は２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程、及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程により行うことができる。
【００４２】
より詳細には、まず、糞便等のサンプル１mL程度を遠心分離して得られるペレットから塩化ベンジル法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。
【００４３】
また、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験や生物、生化学的性状試験等の煩雑な操作を行うことなく、菌の同定を行うためには、例えば、まずボイリング法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。
【００４４】
ＤＮＡを抽出する方法としては、上記ボイリング法、常法であるMarmaur法、その変法である酵素法、及び簡便法である上記塩化ベンジル法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。
【００４５】
このように、コロニーや糞便サンプル等から抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下であった菌種の検出も可能であった。また、ＰＣＲを行う際に、鋳型のＤＮＡ量を段階希釈しＰＣＲを行えば、目的とする菌の定量化も可能である。
【００４６】
また、本発明のプライマーは、単独でもプローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組み合わせても用いることができる。
【００４７】
また、本発明のプライマーを用いれば、ヒト、動物等の腸内細菌叢等の解析も行える。すなわち、上記ビフィドバクテリウム属細菌用プライマーやその他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
実施例１（クローンライブラリー法）
健康成人５名（Ａ，Ｂ，Ｃ、Ｅ、Ｇ）の糞便を用い、以下の手順に従い、糞便中の菌の系統樹を作成した。
【００５０】
（１）糞便からのＤＮＡ抽出：
２５mgの糞便をＰＢＳバッファーに浮遊・遠心回収を３〜４回繰り返して洗浄後、ＤＮＡ抽出バッファー（100mM Tris-HCl, 40mM EDTA, pH9.0）に懸濁して総量を４５０μＬとし、５０μＬの１０％ＳＤＳ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール、３００mgのガラスビーズ（直径０．１mm）を加え、激しく振とうし、菌体を破砕した。上清を別のチューブに移し、フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿、７０％エタノールでの洗浄を順に行い、風乾して最後に１０００μＬのＴＥ（10mM Tris-HCl(pH８．０)、1mM EDTA）に溶解した。
【００５１】
（２）１６Ｓ  ｒＤＮＡ増幅ＰＣＲ反応：
増幅プライマーの異なる２系統で行った。総量を２５μＬとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH8.3)、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ mixture、０．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０ngの鋳型糞便ＤＮＡ、さらに系列Ａとして全生物に共通なプライマー（表１）８ＦとＢｉ８をそれぞれ０．２μＭずつと１５Ｒを０．４μＭ、又は、系列Ｂとして全生物に共通なプライマー（表１）６３ＭＦと１３９１ＭＲを０．４μＭを含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（MJ Research社）により、９４℃２０秒、５５℃１５秒、７２℃１８０秒を２５サイクル、ＰＣＲ反応を行った。
【００５２】
（３）増幅産物のクローニング：
ＰＣＲ反応によって得られた増幅産物をＴＡクローニングキット（invitorogen社製）を用いて付属のマニュアル通りにクローニングを行った。すなわちＰＣＲ２．１ベクターにＰＣＲ増幅産物を挿入後、大腸菌に導入し形質転換させた。その後、５０μｇ／mLのアンピシリンと４０mg／mLのＸ−ｇａｌを含むＬＢ（Luria Bertani）寒天培地上に塗抹し、形成した白色コロニーをＬＢ液体培地で増菌後、ＤＮＡを抽出してクローンＤＮＡを得た。
【００５３】
（４）クローンＤＮＡ配列の系統解析：
得られたクローンＤＮＡの配列を解読後、上記で得られたこれまでに分離培養されていない未同定菌群に属する細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列(配列番号４０〜４２)とＤＤＢＪ等のデータベースより得られた近縁な細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と系統解析を行った（図１）。
【００５４】
【表１】
2005124495.tif 000002
【００５５】
実施例２（プライマーの設計及び合成）
クロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属、ラクトバチルス属細菌、さらに上記のクローンライブラリー法で得られたＥＢ００２クローン、ＢＡ０３１クローン、ＢＡ０７６クローンのそれぞれの菌種に近縁な菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を元に、菌種特異的なプライマーの設計を行った。その際、塩基数２０程度、ＧＣ含量が約５０％となる部分を探索した。その結果、フォワード及びリバースのプライマーとして表２に示す３９種類の種特異的プライマーが設計された。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した。
【００５６】
【表２】
2005124495.tif 000003
【００５７】
実施例３（特異性の確認）
以下の方法により、設計したプライマーの特異性を確認した。
【００５８】
（１）プライマーの特異性の確認
（１−１）菌株の純粋培養及びＤＮＡ抽出：表３〜６に示す、１９菌属８２菌種の腸内細菌を０．５％グルコース添加の変法ＧＡＭブロス（ニッスイ社製）を用いて３７℃、嫌気的に一晩培養した。これらの菌体から塩化ベンジル法にてそれぞれＤＮＡを抽出した。
（１−２）ＰＣＲ反応：総量を２５μＬとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ混合物、０．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０ngの鋳型ＤＮＡ、さらにそれぞれ０．４μＭのプライマーを含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（MJ Research社製）により、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒を３２サイクルのＰＣＲ反応を行った。
（１−３）プライマーの特異性の検討：ＰＣＲ反応によって得られた増幅産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌種のＤＮＡとの結合能を確認することで、プライマーの特異性を判定した。すなわち１．５％アガロース（Molecular Biology Certified Agarose；バイオラッド社）でＭｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ社）によりＴＡＥバッファー中で１００Ｖ、２０分電気泳動し、エチヂウムプロマイド（０．５mg/mL）で染色後、紫外線ランプ下でバンドを確認した。その結果、それぞれのプライマーは、標的とした菌種のみから増幅産物が得られ特異性が確認された。
【００５９】
【表３】
2005124495.tif 000004
【００６０】
【表４】
2005124495.tif 000005
【００６１】
【表５】
2005124495.tif 000006
【００６２】
【表６】
2005124495.tif 000007
【００６３】
また、前記と同様のＰＣＲ反応により、公知のプライマーと本発明プライマーの特異性の比較を行った。その結果、表７及び表８に示すように、本発明プライマーは、特開２００１−１１２４８５号記載のＣＩＰＥＲ−Ｆ及びＣＩＰＥＲ−Ｒ、特開２００１−１１２４８５号記載のＣＩＢＵＴ−Ｆ及びＣＩＢＵＴ−Ｒ、特開２００１−１２０２７１号記載のＲｕＯＢＥ−１及びＲｕＯＢＥ−２、及び特開２００１−４６０６３号記載のＲＥＣ−Ｆ及びＲＥＣ−Ｒに比べて、各菌種に対して特異的であった。
【００６４】
【表７】
2005124495.tif 000008
【００６５】
【表８】
2005124495.tif 000009
【００６６】
実施例４（プライマーを用いた細菌叢の解析）
健康成人４６例の糞便２５mgをＰＢＳバッファーに浮遊・遠心回収を３〜４回繰り返して洗浄後、ＤＮＡ抽出バッファー（１００mM Tris-HCl, ４０mM EDTA, pH９．０）に懸濁して総量を４５０μＬとし、５０μＬの１０％ＳＤＳ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール、３００mgのガラスビーズ（直径０．１mm）を加え、激しく振とうし、菌体を破砕した。上清を別のチューブに移し、フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿、７０％エタノールでの洗浄を順に行い、風乾して最後に１０００μＬのＴＥ（１０mM Tris-HCl(pH８．０)、１mM EDTA）に溶解し糞便ＤＮＡを得た。糞便ＤＮＡの１μＬを鋳型としてそれぞれの菌種特異的プライマー（表２）を用いてＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（MJ Research社製）により、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒を３２サイクルのＰＣＲ反応を行った。その結果、表９に示すような結果を得た。
【００６７】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】クローンライブラリー法で得られた未同定菌群を含む腸内細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を用いた近隣結合法による系統樹を示す図である。左下のバーは、５％の塩基置換距離を示す。
【図１】
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【配列表】
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