(57)【要約】【課題】ハイブリダイゼーションを高速に行う。【解決手段】バイオアッセイ用基板１は、ＣＤ等の光ディスクと同様の主面が円形の平板状の形状を呈している。基板１は、中心孔２を中心に回転駆動される。基板１は、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖）とサンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖）とのハイブリダイゼーション反応の場となるウェル８が表面１ａに複数個形成されている。基板１には、ウェル８の下層に透明電極膜４が形成されている。ハイブリダイゼーション時には、基板１の上面１ａ側から外部電極１８を近接し、透明電極膜４と外部電極１８との間に交流電力を印加して、基板１に対して垂直方向の交流電界を与える。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置において、
上記生化学反応を行う反応領域と、上記反応領域に形成された電極を有する基板を保持する保持手段と、
上記基板の上記電極に対向するように配設された外部電極と、
上記基板の上記電極と上記外部電極との間に電界を発生させる電界制御手段と
を備える生化学反応装置。
【請求項２】
上記基板の上記電極は、上記反応領域の下層に形成された導電層であり、
上記外部電極は、上記導電層と平行な平面を有すること
を特徴とする請求項１に記載の生化学反応装置。
【請求項３】
上記電界制御手段は、上記電極と上記外部電極との間に交流電界を発生させること
を特徴とする請求項１に記載の生化学反応装置。
【請求項４】
上記電極は、探針状に形成されていること
を特徴とする請求項１記載の生化学反応装置。
【請求項５】
上記電極は、アクセプタ又はドナーイオンがドープされた半導体から構成されていること
を特徴とする請求項１記載の生化学反応装置。
【請求項６】
生化学反応に用いられる基板である生化学反応用基板において、
上記生化学反応を行う反応領域と、
上記反応領域内に電界が形成されるように、外部電極との間に電界を発生させる電極とを備えていること
を特徴とする生化学反応用基板。
【請求項７】
上記生化学反応は、ヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション反応であり、
上記反応領域は、上記ヌクレオチド鎖を固定可能な内部処理がされている表面層を有し、
上記電極は、上記表面層の下層に形成された導電層であること
を特徴とする請求項６に記載の生化学反応用基板。
【請求項８】
上記反応領域は、当該基板上に配設されたウェルであり、
上記表面層は、上記ウェルの底面に形成され、
上記導電層は、上記ウェル内において、上記外部電極との間の電界が、上記表面層に対して略垂直方向に形成されるように、上記ウェルの下層に形成されること
を特徴とする請求項７に記載の生化学反応用基板。
【請求項９】
上記導電層は、上記表面層に対向する位置に配置された電極との間に電界を形成させること
を特徴とする請求項７記載の生化学反応用基板。
【請求項１０】
円板状であり、読み取り制御情報が記録されていること
を特徴とする請求項６記載の生化学反応用基板。
【請求項１１】
上記導電層は、光透過性を有すること
を特徴とする請求項７記載の生化学反応用基板。
【請求項１２】
平板状の基板表面に対して、底面が第１の官能基で修飾された複数のウェルを形成し、
上記第１の官能基と結合する第２の官能基により一端が修飾されたヌクレオチド鎖を含む溶液を各上記ウェル内に滴下し、
平板状の基板に対して垂直方向の交流電界を印加しながら上記第１の官能基と第２の官能基とを結合させ、上記ヌクレオチド鎖を上記ウェルの底面に結合させること
を特徴とするハイブリダイゼーション用の基板製造方法。
【請求項１３】
上記平板状の基板には、上記ウェルの下層に導電性材料からなる電極膜が形成されており、
上記基板表面に対して外部電極を近接させ、当該外部電極と上記電極膜との間に交流電力を加えることにより、上記平板状の基板に対して垂直方向に交流電界を印加すること
を特徴とする請求項１２記載のハイブリダイゼーション用基板の製造方法。
【請求項１４】
上記外部電極は、アクセプタ又はドナーイオンがドープされた半導体から構成されること
を特徴とする請求項１２記載のハイブリダイゼーション用の基板製造方法。
【請求項１５】
平板状の基板の表面に形成されておりプローブ用のヌクレオチド鎖の一端が底面に結合されたウェルの内部に対して、サンプル用のヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、
上記平板状の基板に対して垂直方向に交流電界を印加し、上記プローブ用のヌクレオチド鎖と上記サンプル用のヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションすること
を特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項１６】
上記平板状の基板には、上記ウェルの下層に導電性材料からなる電極膜が形成されており、
上記基板表面に対して外部電極を近接させ、当該外部電極と上記電極膜との間に交流電力を加えることにより、上記平板状の基板に対して垂直方向に交流電界を印加すること
を特徴とする請求項１５記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１７】
上記外部電極は、アクセプタ又はドナーイオンがドープされた半導体から構成されること
を特徴とする請求項１５記載のハイブリダイゼーション方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置、ＤＮＡチップ等の生化学反応用基板、ヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションするハイブリダイゼーション方法、並びに、プローブ用のヌクレオチド鎖が固定されたハイブリダイゼーション用の基板製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡ（全長又は一部）が微細配列されたいわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれる基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析手法は、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）を逆転写ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅してサンプルＤＮＡを生成し、そのサンプルＤＮＡをＤＮＡチップ上に固相化（固定化）されたプローブＤＮＡに対して滴下して、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。そして、ＤＮＡの２重らせん内に蛍光標識剤を挿入し、所定の検出器でその蛍光測定を行う。このことにより、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとの塩基配列が同一であるか否かを判別する。
【０００４】
ここで、ＤＮＡが負に帯電していることを利用して、固定化されているプローブＤＮＡの近傍にプラス電極を設けることにより、浮遊しているサンプルＤＮＡをプローブＤＮＡの方向に移動させて、ハイブリダイゼーションを高速化させる技術が知られている（特許文献１参照）。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００１−２３８６７４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、一本鎖ＤＮＡは、溶液中で直鎖状とはならずにランダムコイル状となるので、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとを結合するには立体障害が大きく、ハイブリダイゼーションを高速に行うことが困難である。浮遊しているサンプルＤＮＡを電界によってプローブＤＮＡの方向に移動させたとしても、その立体障害の度合いは変わらず高速にハイブリダイゼーションを行うことは困難である。
【０００７】
そこで、本発明では、このような従来の課題を解決するため、ハイブリダイゼーションを高速に行うことができる生化学反応装置を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明では、ハイブリダイゼーションを高速に行うとともに構造が簡易な生化学反応用基板を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明では、ハイブリダイゼーションを高速に行うとともに構造が簡易なハイブリダイゼーション用基板を製造する基板製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明では、高速で容易にハイブリダイゼーションを行うことができるハイブリダイゼーション方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る生化学反応装置は、基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置であって、上記生化学反応を行う反応領域と、上記反応領域に形成された電極を有する基板を保持する保持手段と、上記基板の上記電極に対向するように配設された外部電極と、上記基板の上記電極と上記外部電極との間に電界を発生させる電界制御手段とを備える。
【００１２】
本発明に係る生化学反応用基板は、生化学反応に用いられる基板である生化学反応用基板であって、上記生化学反応を行う反応領域と、上記反応領域内に電界が形成されるように、外部電極との間に電界を発生させる電極とを備えている。
【００１３】
本発明に係る基板製造方法は、ハイブリダイゼーション用基板の製造方法であって、平板状の基板表面に対して底面が第１の官能基で修飾された複数のウェルを形成し、上記第１の官能基と結合する第２の官能基により一端が修飾されたヌクレオチド鎖を含む溶液を各上記ウェル内に滴下し、平板状の基板に対して垂直方向の交流電界を印加しながら上記第１の官能基と第２の官能基とを結合させ、上記ヌクレオチド鎖を上記ウェルの底面に結合させる。
【００１４】
この基板製造方法では、プローブ用のヌクレオチド鎖を表面に対して垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させながら、一端を平板状の基板の表面に接続する。
【００１５】
本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、平板状の基板の表面に形成されておりプローブ用のヌクレオチド鎖の一端が底面に結合されたウェルの内部に対して、サンプル用のヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、上記平板状の基板に対して垂直方向に交流電界を印加しながら、上記プローブ用のヌクレオチド鎖と上記サンプル用のヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションする。
【００１６】
このハイブリダイゼーション方法では、一端を平板状の基板の表面に接続してプローブ用のヌクレオチド鎖をウェル内に固定化し、平板状の基板の表面に対して垂直方向の交流電界を与えてウェル内のヌクレオチド鎖を垂直方向に伸張及び移動させる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態として、本発明を適用したＤＮＡ解析用のバイオアッセイ用基板及びこのバイオアッセイ用基板を用いてＤＮＡ解析を行うバイオアッセイ方法について説明をする。
【００１８】
（バイオアッセイ用基板）
図１に本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板１の上面を模式的に表した図を示し、図２に本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板１の断面を模式的に表した図を示す。
【００１９】
バイオアッセイ用基板１の全体形状は、例えばＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｄｉｓｋ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｄｉｓｋ）等の光ディスクと同様に、主面が円形とされた平板状となっている。バイオアッセイ用基板１の主面の中心には、中心孔２が形成されている。中心孔２には、当該バイオアッセイ用基板１がＤＮＡ解析装置に装着されたときに、当該バイオアッセイ用基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。
【００２０】
バイオアッセイ用基板１は、図２に示すように、下層側から、基板層３と、透明電極層４と、固相化層５と、ウェル形成層６とから形成されている。なお、バイオアッセイ用基板１のウェル形成層６側の表面を上面１ａ、基板層３側の表面を下面１ｂというものとする。
【００２１】
基板層３は、詳細を後述する蛍光標識剤を励起する励起光及び蛍光標識剤の蛍光を透過する材料である。例えば、基板層３は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の材料で形成されている。
【００２２】
透明電極層４は、基板層３上に形成された層である。透明電極層４は、例えばＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）やアルミニウム等の光透過性があり且つ導電性を有する材料から形成されている。透明電極層４は、基板層１１上に例えばスパッタリングや電子ビーム蒸着等により２５０ｎｍ程度の厚さに成膜される形成される。
【００２３】
固相化層５は、透明電極層４上に形成された層である。固相化層５は、プローブＤＮＡの一端を固相化させるための材料から形成されている。本例では、固相化層５は、シランにより表面修飾可能なＳｉＯ２が例えばスパッタリングや電子ビーム蒸着により５０ｎｍ程度の厚さに成膜された層となっている。
【００２４】
ウェル形成層６は、固相化層５上に形成された層である。ウェル形成層６は、複数のウェル８が形成された層である。
【００２５】
ウェルは、その内部空間が、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖）とサンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖）との相互反応の場、具体的には、ハイブリダイゼーション反応の場となる。ウェル８は、バイオアッセイ用基板１の上面１ａ側に開口したくぼみ状となっており、サンプルＤＮＡが含まれた溶液等の液体が滴下されたときにその液体を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっている。例えば、ウェル８は、開口部が１００μｍ四方の大きさに形成され、深さが５μｍ程度とされて、底面１１に固相化層５が露出している。
【００２６】
このようなウェル形成層６は、図３に示すように、固相化層５の上に感光性ポリミイド１３をスピンコート等で５μｍ程度の厚さに塗布する（ステップＳ１）。続いて、塗布した感光性ポリミイド１３上に所定のパターンのフォトマスク１４を形成し、このフォトマスク１４用いて感光性ポリミイド１３露光及び現像する（ステップＳ２）。このことにより、ウェル形成層６に複数のウェル８が形成される（ステップＳ３）。
【００２７】
さらに、ウェル８は、一端が官能基により修飾されたプローブＤＮＡが底面１１（固相化層５が露出した部分）に結合するように、当該底面１１が官能基により表面修飾されている。例えば、ウェル８は、図４に示すように、ＳＨ基１５を有するシラン分子１６により、底面１１（ＳｉＯ２から形成されている固相化層５）が表面修飾されている。このため、ウェル８の底面１１には、例えばＳＨ基で一端が修飾されたプローブＤＮＡを結合させることができる。このようにバイオアッセイ用基板１では、ウェル８の底面１１に、プローブＤＮＡの一端を結合させることができるので、図５に示すように、底面１１から垂直方向に鎖が伸びるように、プローブＤＮＡ（Ｐ）を結合させることができる。
【００２８】
また、バイオアッセイ用基板１では、図１に示すように、複数のウェル８が、主面の中心から外周方向に放射状に向かう複数の列上に、例えば４００μｍ程度の間隔で等間隔に並んで配置されている。
【００２９】
また、バイオアッセイ用基板１には、バイオアッセイ用基板１の下面１ｂ側からレーザ光を照射することにより読み取り可能なアドレスピット９が形成されている。アドレスピット９は、バイオアッセイ用基板１の平面上における各ウェル８の位置を特定するための情報である。アドレスピット９から情報を光学的に読み取ることによって、複数存在するウェル８のうち、現在レーザ光を照射している位置の１つのウェル８がどれであるかを特定することが可能となる。このようなアドレスピット９が設けてあることによって、後述する滴下装置による溶液の滴下位置の制御や、対物レンズによる蛍光検出位置の特定を行うことができる。
【００３０】
以上のようなバイオアッセイ用基板１では、円板状に形成されているため、光ディスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、レーザ光のフォーカシング位置を制御するためのフォーカシングサーボ制御、半径方向に対するレーザ光の照射位置や滴下装置による滴下位置の制御のための位置決めサーボ制御、並びに、アドレスピット９の情報検出処理をすることができる。つまり、アドレスピット９に記録してある情報内容と、そのアドレスピット９の近傍にあるウェル８とを対応させておくことにより、アドレスピット９の情報を読み出すことで、特定の１つのウェル８に対してのみレーザ光を照射して蛍光が発光しているウェル８の位置を特定したり、特定の１つのウェル８の位置と滴下装置との相対位置を制御して、その特定の１つのウェル８に対して溶液を滴下したりすることができる。
【００３１】
さらに、以上のようなバイオアッセイ用基板１では、ウェル８の上部側から電極を近接させれば当該電極と透明導電層４との間に平行電界を形成させることができる。そのため、例えば、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行う場合には、ウェル８に対して交流電界を与えることによって、ウェル内に浮遊するＤＮＡを伸張させてハイブリダイゼーションの進行を促進させることができる。
【００３２】
（ＤＮＡ解析方法）
つぎに、以上のようなバイオアッセイ用基板１を用いたＤＮＡ解析方法について説明をする。
【００３３】
まず、一端がＳＨ基で修飾されたプローブＤＮＡが含有した溶液Ｓを所定のウェル８に対して滴下する。このとき、１つのバイオアッセイ用基板１に対して、複数種類のプローブＤＮＡが滴下する。だたし、１つのウェル８内には１種類のプローブＤＮＡが入るようにする。なお、各ウェル８にいずれの種類のプローブＤＮＡを滴下するかは、予めウェルとプローブＤＮＡとの対応関係を示す配置マップ等を生成しておき、その配置マップに基づき滴下制御する。
【００３４】
また、溶液Ｓの滴下制御は、光ディスクの駆動システムと同様にバイオアッセイ用基板１を駆動制御することにより行う。すなわち、図６に示すように、バイオアッセイ用基板１を上面１ａを上にして平行に保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Ｖをバイオアッセイ用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射してアドレスピット９を検出することによりウェル８の位置を特定しながら、滴下位置の制御を行えばよい。
【００３５】
続いて、図７に示すように、バイオアッセイ用基板１の上面１ａ側の外部から、ウェル８の開口部の大きさよりも充分大きい平坦面１８ａ（例えば直径が３００μｍの円状の面）が先端部に形成された探針状の外部電極１８を、所定のウェル８に対して上記先端部が覆いかぶるように近接する。続いて、この外部電極１８と透明電極層４との間に交流電圧を印加して、バイオアッセイ用基板１の主面に対して垂直方向の交流電界を印加する。例えば、ウェル８内に、１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。
【００３６】
このように交流電界を所定のウェル８に印加すると、ウェル８内の溶液中に浮遊しているプローブＤＮＡ（Ｐ）がバイオアッセイ用基板１の主面に対して垂直方向に伸張するとともに、そのプローブＤＮＡがバイオアッセイ用基板１に垂直方向に移動する。このため、予め表面修飾処理がされた底面１１に、そのプローブＤＮＡの修飾端が結合し、ウェル８の底面１１にプローブＤＮＡを固相化（固定化）することができる。
【００３７】
バイオアッセイ用基板１の主面に対して垂直な平行電界を印加するためには、外部電極１８の先端部に平坦面１８ａが形成され、その平坦面が透明電極層４と平行であることが望ましい。また、この平坦性を確保するために先端部分にアクセプタ又はドナーイオンを高ドープしたＳｉやＧａＡｓ等の鏡面研磨された半導体ウェハを、探針状の金属の先端部分に取り付けてもよい。半導体ウェハを取り付ける場合には、探針状の金属と半導体ウェハとのショットキーバリアを小さくするとともにオーミックコンタクトを得るために、チタンや金等の材料を介して半導体ウェハを接続するのが望ましい。
【００３８】
交流電界を印加すると一本鎖ＤＮＡ（ヌクレオチド鎖）が伸張及び移動する理由は、次のとおりである。すなわち、ヌクレオチド鎖内では、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素イオン（陽電荷）とによってイオン雲が形成されていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトルが、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長するためである。さらに、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は、電気力線が集中する部位に向かって移動もする（Ｓｅｉｉｃｈｉ  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｙａｍａｎａｓｈｉ，  Ｓｈｉｎ−ｉｃｈｉ  Ｔａｚａｗａ，  Ｏｓａｍｕ  Ｋｕｒｏｓａｗａ  ａｎｄ  Ｍａｓａｏ  Ｗａｓｈｉｚｕ：  ”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ＡＣ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ”，  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１，  ｐ．７５−８３  （１９９８）参照）。
【００３９】
このように、交流電界を印加すると、プローブＤＮＡがその電界に平行な方向に伸張して立体障害の少ない状態となり、プローブＤＮＡと底面１１とが結合しやすい状態となる。そして、プローブＤＮＡと底面１１とが結合することにより、ウェル８の底面１１にプローブＤＮＡを固相化（固定化）することができる。
【００４０】
続いて、生体から抽出したサンプルＤＮＡが含有した溶液をバイオアッセイ用基板１上の各ウェル８に滴下する。
【００４１】
続いて、サンプルＤＮＡの滴下後、バイオアッセイ用基板１の上面１ａ側の外部から、上記外部電極１８を所定のウェル８に対して覆いかぶせるように近接する。続いて、温度を６０度Ｃ程度に維持しながら、外部電極１８と透明電極層４との間に交流電圧を印加する。すなわち、加熱しながらバイオアッセイ用基板１の主面に対して垂直方向の交流電界を印加する。例えば、ウェル８内に１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。
【００４２】
このような処理をすると、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが垂直方向に伸張して立体障害の少ない状態となるとともに、サンプルＤＮＡがバイオアッセイ用基板１に対して垂直方向に移動する。この結果、互いの塩基配列が相補的な関係にあるサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが同一のウェル８内にある場合には、それらがハイブリダイゼーションを起こす。
【００４３】
続いて、ハイブリダイゼーションを起こさせた後に、蛍光標識インターカレータ等をバイオアッセイ用基板１のウェル８内に滴下する。このような蛍光標識剤は、ハイブリダイゼーションを起こしたプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの二重らせん間に挿入して結合する。
【００４４】
続いて、バイオアッセイ用基板１の表面１ａを純水等で洗浄し、ハイブリダイゼーションを起こしていないウェル８内のサンプルＤＮＡ及び蛍光標識剤を除去する。この結果、ハイブリダイゼーションを起こしたウェル８内にのみ、蛍光標識剤が残存することとなる。
【００４５】
続いて、光ディスクの駆動システムと同様にバイオアッセイ用基板１を駆動制御することにより、ウェル８からの蛍光の検出を行う。すなわち、バイオアッセイ用基板１を保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Ｖをバイオアッセイ用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射してアドレスピット９を検出することによりウェル８の位置を特定する。それと同時に、励起光をバイオアッセイ用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射して、その励起光に応じて生じる蛍光をやはり下面１ｂ側から検出する。そして、どのウェル８から蛍光が発生されているか否かを検出する。
【００４６】
続いて、バイオアッセイ用基板１上の蛍光が発生していたウェル８の位置を示すマップ作成する。そして、その作成したマップ、並びに、各ウェル８にどのような塩基配列のプローブＤＮＡが滴下されていたかを示す配置マップに基づき、サンプルＤＮＡの塩基配列の解析を行う。
【００４７】
以上のようにバイオアッセイ用基板１を用いたＤＮＡ解析方法では、溶液中に浮遊したプローブＤＮＡを基板１の表面に対して垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させながら、一端をウェル８の底面１１に接続する。従って、バイオアッセイ用基板１に対して垂直に電界を与えるので、例えば、基板上に電極をパターニングして生成しなくてもよいため、非常に簡易的な層構造の電極を用いて、プローブＤＮＡを固定することができる。
【００４８】
また、以上のようにバイオアッセイ用基板１を用いたＤＮＡ解析方法では、溶液中に浮遊したサンプルＤＮＡ及び一端がウェル８の底面に固定されたプローブＤＮＡに対して、垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させる。従って、サンプルＤＮＡ及びプローブＤＮＡがともに同方向に伸張及び移動するので、ハイブリダイゼーションが促進する。さらに、このような電界を与えるための電極を基板上に電極をパターニングして生成しなくてもよいため、非常に簡易的な層構造の電極を用いて、プローブＤＮＡを固定することができる。
【００４９】
なお、本実施の形態では、外部電極１８の形状を探針状として少数のウェル８に対してのみ交流電界を与える例を示したが、外部電極１８はこのようなものに限られず、ウェル８に対して垂直方向の交流電界を与えられればどのような形状であってもよい。例えば、バイオアッセイ用基板１の主面とほぼ同一の大きさの円板状の電極を用いて、全ウェル８に対して同時に交流電界を印加するようにしてもよい。また、本実施の形態では、バイオアッセイ用基板１内に透明電極膜４を設けているが、透明電極膜４を設けずに、下面１ｂ側の外部から外部電極１８と同様の電極を近接させてウェル８に対して垂直方向の電界を与えてもよい。
【００５０】
（ＤＮＡ解析装置）
つぎに、本発明の実施の形態のバイオアッセイ基板１を用いてＤＮＡ解析を行うＤＮＡ解析装置５１について、図８を参照して説明をする。
【００５１】
ＤＮＡ解析装置５１は、図８に示すように、上述した外部電極１８と、バイオアッセイ用基板１を保持して回転をさせるディスク装填部５２と、ハイブリダイゼーションのための各種溶液を貯留するとともにバイオアッセイ用基板１のウェル８にその溶液を滴下する滴下部５３と、バイオアッセイ用基板１から励起光を検出するための励起光検出部５４と、上記の各部の管理及び制御を行う制御／サーボ部５５とを備えている。
【００５２】
ディスク装填部５２は、バイオアッセイ用基板１の中心孔２内に挿入して当該バイオアッセイ用基板１を保持するチャッキング機構６１と、チャッキング機構６１を駆動することによりバイオアッセイ用基板１を回転させるスピンドルモータ６２と有している。ディスク装填部５２は、上面１ａ側が上方向となるようにバイオアッセイ用基板１を水平に保持した状態で、当該バイオアッセイ用基板１を回転駆動する。ディスク装填部５２では、バイオアッセイ用基板１を水平に保持することによって、ウェル８に滴下された溶液が垂れてしまうといった問題を回避することができる。
【００５３】
滴下部５３は、試料溶液Ｓや蛍光標識剤Ｓ´を貯留する貯留部６３と、貯留部６３内の試料溶液Ｓや蛍光標識剤Ｓ´をバイオアッセイ用基板１に滴下する滴下ヘッド６４とを有している。滴下ヘッド６４は、水平に装填されたバイオアッセイ用基板１の上面１ａの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド６４は、バイオアッセイ用基板１のアドレスピットから読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてバイオアッセイ用基板１との相対位置を半径方向に制御し、サンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）を含有する試料溶液Ｓを所定のウェル８の反応領域８に正確に追従して滴下する構成とされている。また、貯留部６３は、貯留部６３と滴下ヘッド６４との組み合わせは、ハイブリダイゼーションのために使用する試料溶液の数だけある。
【００５４】
また、滴下部５３では、バイオアッセイ用基板１上の所定の位置に正確に試料溶液Ｓを滴下するために、例えば、いわゆる「インクジェットプリンティング法」に基づく滴下方法が採用されている。「インクジェットプリンティング法」は、滴下ヘッド６４にいわゆるインクジェットプリンタで用いられるインク噴出機構を適用する方法であり、インクジェットプリンタのようなノズルヘッドからバイオアッセイ用基板１に試料溶液Ｓを噴射するものである。
【００５５】
励起光検出部５４は、光学ヘッド７０を有している。光学ヘッド７０は、水平に装填されたバイオアッセイ用基板１の下方側、すなわち、下面１ｂ側に配置されている。光学ヘッド７０は、例えば、図示していないスレッド機構等により、バイオアッセイ用基板１の半径方向に移動自在とされている。
【００５６】
光学ヘッド７０は、対物レンズ７１と、対物レンズ７１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ７２と、導光ミラー７３とを有している。対物レンズ７１は、その中心軸がバイオアッセイ用基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ７２に支持されている。従って、対物レンズ７１は、バイオアッセイ用基板１の下方側から入射された光束を当該バイオアッセイ用基板１に対して集光することができる。２軸アクチュエータ７２は、バイオアッセイ用基板１の表面に対して垂直な方向、及び、バイオアッセイ用基板１の半径方向の２方向に対物レンズ７１を移動可能に支持している。２軸アクチュエータ７２を駆動することにより、対物レンズ７１により集光された光の焦点を、バイオアッセイ用基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。従って、この光学ヘッド７０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。
【００５７】
導光ミラー７３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド７０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー７３には、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー７３は、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ７１に入射する。対物レンズ７１に入射された励起光Ｐ及びサーボ光Ｖは、当該対物レンズ７１により集光されてバイオアッセイ用基板１に照射される。また、導光ミラー７３には、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖの反射光Ｒが、バイオアッセイ用基板１から対物レンズ７１を介して入射される。導光ミラー７３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。
【００５８】
なお、光学ヘッド７０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ７２を駆動する駆動信号は、制御／サーボ部５５から与えられる。
【００５９】
また、励起光検出部５４は、励起光Ｐを出射する励起光源７４と、励起光源７４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ７５と、コリメータレンズ７５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー７３に照射する第１のダイクロックミラー７６とを有している。
【００６０】
励起光源７４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源７４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光である。なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ７５は、励起光源７４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー７６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖ（その反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー７６は、光路Ｘ上に４５°の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ７５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー７３に励起光Ｐを照射している。
【００６１】
また、励起光検出部５４は、蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード７７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ７８と、光学ヘッド７０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード７７に照射する第２のダイクロックミラー７９とを有している。
【００６２】
アバランジェフォトダイオード７７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード７７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ７８は、アバランジェフォトダイオード７７上に蛍光Ｆを集光するためのレンズである。第２のダイクロックミラー７９は、光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー７３側から見て第１のダイクロックミラー７６の後段に配置されている。従って、第２のダイクロックミラー７９には、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー７９は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光Ｆの波長の光のみを反射して、サーボ光（反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第２のダイクロックミラー７９は、光学ヘッド７０の導光ミラー７３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ７８を介してアバランジェフォトダイオード７７に蛍光Ｆを照射する。
【００６３】
アバランジェフォトダイオード７７では、このように検出した蛍光Ｆの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御／サーボ部５５に供給する。
【００６４】
また、励起光検出部５４は、サーボ光Ｖを出射するサーボ光源８０と、サーボ光源８０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ８１と、サーボ光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路８２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路８２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ８３と、サーボ光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ８４とを有している。
【００６５】
サーボ光源８０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、サーボ光Ｖの波長は、アドレスピットが検出できる程度の波長であり、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なっていれば７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ８１は、サーボ光源８０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束にする。平行光束とされたサーボ光Ｖは光セパレータ８４に入射される。
【００６６】
フォトディテクト回路８２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及びアドレスピットの再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、サーボ光Ｖがバイオアッセイ用基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、サーボ光と同一の７８０ｎｍである。
【００６７】
なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ７１により集光された光の合焦位置と、バイオアッセイ用基板１の基板層３との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が０となったときに、対物レンズ７１とバイオアッセイ用基板１との間の距離が最適になる。位置決めエラー信号は、所定のウェル８の位置と、焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。位置決めエラー信号が０となったときに、サーボ光Ｖのディスク半径方向に対する照射位置が任意のウェル８に一致したこととなる。アドレスピットの再生信号は、バイオアッセイ用基板１に記録されているアドレスピットに記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在サーボ光Ｖを照射しているウェル８を特定することができる。
【００６８】
フォトディテクト回路８２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピットの再生信号を制御／サーボ部５５に供給する。
【００６９】
シリンドリカルレンズ８３は、フォトディテクト回路８２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路８２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。
【００７０】
光セパレータ８４は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面８４ａと１／４波長板８４ｂにより構成されている。光セパレータ８４では、１／４波長板８４ｂの逆側から入射された光を光分離面８４ａが透過し、その透過光の反射光が１／４波長板８４側から入射された場合には光分離面８４ａが反射する機能を有している。光セパレータ８４は、光分離面８４ａが光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー７３側から見て第２のダイクロックミラー７９の後段に配置されている。従って、光セパレータ８４では、コリメータレンズ８１から出射されたサーボ光Ｖを透過して光学ヘッド７０内の導光ミラー７３に対してそのサーボ光Ｖを入射させているとともに、光学ヘッド７０の導光ミラー７３から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折され、シリンドリカルレンズ８３介してフォトディテクト回路８２に反射光Ｒを照射する。
【００７１】
制御／サーボ部５５は、励起光検出部５４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピットの再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。
【００７２】
すなわち、制御／サーボ部５５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド７０内の２軸アクチュエータ７２を駆動して対物レンズ７１とバイオアッセイ用基板１との間の間隔を制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部５５は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド７０内の２軸アクチュエータ７２を駆動して対物レンズ７１をバイオアッセイ用基板１の半径方向に移動制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部５５は、アドレスピットの再生信号に基づき光学ヘッド７０のスレッド移動制御を行って光学ヘッド７０を所定の半径位置に移動し、目的のウェル位置に対物レンズ７１を移動させる。
【００７３】
また、制御／サーボ部５５は、ハイブリダイゼーション時に、交流電力発生部３１を制御し、電力の供給の制御も行う。
【００７４】
以上のような構成のＤＮＡ解析装置５１では、次のような動作を行う。
【００７５】
ＤＮＡ解析装置５１は、バイオアッセイ用基板１を回転させながら、ウェル８上にサンプルＤＮＡが含有した溶液を滴下し、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。ハイブリダイゼーション時には上述した電界の制御も行う。また、ハイブリダイゼーション処理の済んだバイオアッセイ用基板１上に、蛍光標識剤を含んだバッファ溶液を滴下する。
【００７６】
また、ＤＮＡ解析装置５１は、蛍光標識剤が滴下された後のバイオアッセイ用基板１を回転させ、励起光Ｐを当該バイオアッセイ用基板１の下面１ｂ側から入射させてウェル８内の蛍光標識剤に照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光Ｆをバイオアッセイ用基板１の下方から検出する。
【００７７】
ここで、ＤＮＡ解析装置５１では、励起光Ｐとサーボ光Ｖとを同一の対物レンズ７１を介してバイオアッセイ用基板１に照射している。そのため、ＤＮＡ解析装置５１では、サーボ光Ｖを用いたフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの照射位置、すなわち、蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定することができる。
【００７８】
【発明の効果】
本発明に係る生化学反応装置では、上記生化学反応を行う反応領域と、上記反応領域に形成された電極を有する基板に対して、電極を近接させて上記反応領域に平行電界を形成させる。そのため、例えば、ヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーションを行う場合には、ウェルに対して交流電界を与えることによって、ウェル内に浮遊するヌクレオチド鎖を伸張させてハイブリダイゼーションの進行を促進させることができる。
【００７９】
本発明に係る生化学反応用基板では、上記反応領域内に電界が形成されるように、外部電極との間に電界を発生させる電極とを備えている。従って、この生化学反応用基板では、反応領域に電極を近接させれば上記反応領域に平行電界を形成させることができる。そのため、例えば、ヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーションを行う場合には、ウェルに対して交流電界を与えることによって、ウェル内に浮遊するヌクレオチド鎖を伸張させてハイブリダイゼーションの進行を促進させることができる。
【００８０】
本発明に係る基板製造方法では、プローブ用のヌクレオチド鎖を表面に対して垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させながら、一端を平板状の基板の表面に接続する。従って、この基板製造方法では、平板状の基板に対して垂直に電界を与えるので、非常に簡易的な構成の電極を用いて、高速にプローブ用のヌクレオチド鎖を基板に固定することができる。
【００８１】
本発明に係るハイブリダイゼーション方法では、一端を平板状の基板の表面に接続してプローブ用のヌクレオチド鎖をウェル内に固定化し、平板状の基板の表面に対して垂直方向の交流電界を与えてウェル内のヌクレオチド鎖を垂直方向に伸張及び移動させる。従って、このハイブリダイゼーション方法では、平板状の基板に対して垂直に電界を与えるので、非常に簡易的な構成の電極を用いて、高速にハイブリダイゼーションを行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板の平面図である。
【図２】本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板の断面図である。
【図３】バイオアッセイ用基板のウェルを形成する工程を示した図である。
【図４】ウェルの底面に修飾されるＯＨ基を有するシラン分子を示す図である。
【図５】ウェルの底面に結合したプローブＤＮＡを示す図である。
【図６】バイオアッセイ用基板に対して溶液の滴下制御を説明するための図である。
【図７】バイオアッセイ用基板に対して交流電界の印加の方法を説明するための図である。
【図８】本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板を用いてＤＮＡ解析を行うＤＮＡ解析装置の構成図である。
【符号の説明】
１  バイオアッセイ用基板、２  中心孔、３  基板層、４  透明電極層、５  固相化層、６  ウェル形成層、８  ウェル、９  ピット
【図１】
2005030783.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005030783.tif 000007
【図６】
2005030783.tif 000008
【図７】
2005030783.tif 000009
【図８】
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