(57)【要約】    【課題】  安価な炭素源を用いて機能性バクテリアセルロースを提供すること。    【解決手段】  微生物培養用標準培地において、炭素源としてグリセリンを含むことを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産培地、および該培地を用いて生産された新規な生分解性多糖を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物培養用標準培地において、炭素源の少なくとも一部としてグリセリンを含むことを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産培地。
【請求項２】
培地中のグリセリン濃度が０．１〜２．０％であることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
培地中のグリセリン濃度が１．０％であることを特徴とする請求項２に記載の培地。
【請求項４】
炭素源としてさらにグルコースを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の培地。
【請求項５】
グルコース１重量部に対してグリセリンを１重量部含むことを特徴とする請求項４に記載の培地。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の培地中でセルロース生産菌を培養することを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産方法。
【請求項７】
セルロース生産菌が酢酸菌であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法により生産されるバクテリアセルロース様多糖。
【請求項９】
請求項８に記載のバクテリアセルロース様多糖を培地から分離回収すると同時にフィラメント状またはシート状に成形することを特徴とする、バクテリアセルロース様多糖の成形方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法により成形されたバクテリアセルロース様多糖フィラメント。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法により成形されたバクテリアセルロース様多糖シート。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれかに記載の培地を含む培養液の容器中の培養液上層に集積したゲル状バクテリアセルロース様多糖薄層を、連続的に巻き取りロールにより緊張下で収束することを特徴とする、バクテリアセルロース様多糖フィラメントの製造方法。
【請求項１３】
請求項１から５のいずれかに記載の培地を含む培養液の容器中の培養液上層に集積したゲル状バクテリアセルロース様多糖薄層を、連続的に巻き取りロールにより巻き取ることを特徴とする、バクテリアセルロース様多糖シートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物により生産されるバクテリアセルロース様の新規な多糖およびその炭素源に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは主に高等植物によってつくられるが、微生物の中にもセルロースをつくるものが知られている。そのような微生物としては、Acetobacter属、Agrobacterium属、Rhizobium属、Sarcina属、Pseudomonas属、Achromobacter属、Alcaligenes属、Aerobacter属、Azotobacter属などがある。このなかでも酢酸菌、Acetobacter属の一種はセルロースを菌体外に大量に生産することが知られている。
【０００３】
これらの微生物により産生されるセルロースは、微生物セルロースまたはバクテリアセルロースとよばれている。バクテリアセルロースは、木材中のセルロースと異なりヘミセルロースやリグニンをまったく含まない純粋なセルロースである。また、高結晶性、高弾性、高吸水性等すぐれた物理的性質をもち、さまざまな工業材料としての可能性や食品材料としての応用が期待されている。
【０００４】
バクテリアセルロースは菌体から産生された後もしばらくは非晶状態を保持しているが、時間が経過するにつれて結晶化が進み、最終的には木綿や亜麻のセルロースと同一のＸ線回折像を示し、セルロースＩ型の結晶構造を形成する。セルロースＩ型はＩα結晶とＩβ結晶の複合結晶であり、木綿などの高等植物由来セルロースはＩβ成分が多いが、バクテリアセルロースの場合はＩα成分が多い。
【０００５】
バクテリアセルロースは膜の網目構造を利用した分離膜や高強度を利用した音響振動板、分散化したセルロースの水分保持機能を利用した添加剤などへの利用が可能であることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
また、効率的な生産ができるように、回転円板型、攪拌型、連続紡糸型などさまざまな形態のバイオリアクターが検討されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１０−１９５７１３号公報
【非特許文献１】セルロース学会編、「セルロースの事典」、初版、朝倉書店、２０００年１１月１０日、ｐ．４３−４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
生分解性高分子化合物であるセルロースは生活に密接な関係があるため生産量が増えつつあるが、地球環境保全の観点からセルロース生産の樹木依存性を低め、バイオマスによるセルロース生産を増やしリサイクル化することが望まれている。しかし、酢酸菌などのバクテリアにより生産されるセルロースは、生産コストが高く、商品化することは難しい。
【０００８】
生産性を改善するために、糖蜜蝋やパルプスラッジなどの安価に入手できる原料の利用や遺伝子組換えによる育種改良が検討されているが、いまだに生産性に見合う手段は見出されていない。また、採算をとるために化学修飾によりセルロースに他の糖残基を導入する試みもなされているが、化学修飾では環境への負荷が高いため、低負荷型の反応でセルロースを機能化することが望まれている。
【０００９】
また、紙資源をリサイクルする方法、即ちセルロースを加水分解してグルコースへと分解し、グルコースを炭素源として微生物によってセルロースを生産する方法も試みられているが、このような方法も高コストであり、グルコースに代わる安価な炭素源が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、グリセリン単独またはグリセリンに加えてグルコースなどの他の炭素源を含有する培地でセルロース生産菌を培養することにより、物性の優れた多糖が効率よく生産されることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明は、微生物培養用標準培地において、炭素源の少なくとも一部としてグリセリンを含むことを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産培地を提供する。
【００１２】
培地中のグリセリン濃度は、好ましくは０．１〜２．０（Ｗ／Ｖ）％の範囲であり、特に好ましくは１．０（Ｗ／Ｖ）％である。
【００１３】
培地中の炭素源の総量は、使用するセルロース生産菌の種類に応じて適宜定めればよく、特に限定されない。例えば、酢酸菌を用いる場合、好ましくは０．５〜４．０（Ｗ／Ｖ）％、より好ましくは１．０〜３．０（Ｗ／Ｖ）％、特に好ましくは２．０（Ｗ／Ｖ）％である。
【００１４】
炭素源としてグリセリンのみを用いた場合でも、炭素源としてグルコースを単独で用いた場合よりわずかに少ない量のバクテリアセルロース様多糖が生産されるが、グリセリンとグルコースを組み合わせて用いることにより、さらに物性の優れたバクテリアセルロース様多糖が収量よく生産される。この場合、グルコースとグリセリンとの比は特に限定されないが、グルコース１重量部に対してグリセリン０．４重量部以上含む場合収率がよく、特に、グルコース１重量部に対してグリセリンを１重量部含むのが収率および物性の面から好ましい。
【００１５】
本発明において、グルコースに代わる新炭素源として用いられるグリセリンは、脂肪酸の工業生産過程で副生するものであり、安価に入手できる。したがって、本発明の培地を用いることによって、バクテリアセルロース様多糖の生産コストの削減をはかることが可能となる。
【００１６】
本発明の培地を用いて得られるバクテリアセルロース様多糖は、グルコース残基の間にグリセリン由来の残基が導入された、新規構造を有するものである。すなわち、本発明によって、環境低負荷型の機能性多糖の効率的生産が達成される。
【００１７】
また、本発明は、炭素源としてグリセリンを含む培地中でセルロース生産菌を培養することを特徴とするバクテリアセルロース様多糖の生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
炭素源として安価なグリセリンを含む培地を用いてセルロース生産菌を培養することにより、高吸収性、高生分解性など、新規な構造・物性を示す生分解性多糖が低環境負荷型反応で高収率で得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
培養に用いる微生物は、セルロースを生産する菌であれば特に限定されず、上記のセルロース生産菌のいずれを用いてもよい。特に酢酸菌、なかでもアセトバクター・キシリナム(Acetobacter Xylinum)が好適である。セルロース生産菌がグリセリン存在下で良好に増殖するものであれば、そのまま培養すればよい。好ましくは、セルロース生産菌をグリセリンを含む培地で継代培養して順化させることにより、グリセリンに親和性の高い菌が得られる。
【００２０】
培養に用いる培地としては、酢酸菌を用いる場合は、例えば、炭素源、バクトペプトン、イーストエクストラクト、第一リン酸ナトリウム、クエン酸からなるヘストリン−シューラム(Hestrin-Schramm)（以下ＨＳと称する）標準培地において、炭素源としてグリセリンを含む培地を挙げることができるが、これに限定されるものではない。炭素源としてグリセリンを含み、従来から知られているセルロース生産菌が生育できるものであれば、いかなる培地を用いてもよい。
【００２１】
培養条件としては、使用するセルロース生産菌が生育できる条件を適宜選択すればよい。例えば、酢酸菌を生産菌として用いる場合は、培地のｐＨは３〜７、好ましくは６〜７付近に制御すればよく、培養温度は室温、例えば、１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の範囲とすればよい。
【００２２】
培養期間は、例えば、培地を交換せずに静置培養する場合は、約７日間程度でバクテリアセルロース様多糖のゲル状薄膜が形成される。連続培養、即ち、培地を一定量に維持しながらゲルを回収し続けると同時に、新たな培地を添加する方法においては、半永久的に培養しつづけることが出来る。この場合も、最初にゲル状薄膜を回収するまでに約２日程度静置が必要である。
【００２３】
本発明によって得られたバクテリアセルロース様多糖を、例えば、１（Ｗ／Ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウムおよび４％（Ｗ／Ｖ）水酸化ナトリウム水溶液などの洗浄液で洗浄するのが好ましい。例えば、ゲルをフィラメントまたはシートに製造する場合は、巻き取りロールで巻き取る前に、該洗浄処理を施すとよい。
【００２４】
本発明はまた、上記の方法により生産されるバクテリアセルロース様多糖を提供する。本発明により、フィラメント状のみならず、シート状のバクテリアセルロース様多糖を得ることが可能となる。フィラメント状のバクテリアセルロース様多糖を得るには、本発明による培地を含む培養容器中でセルロース生産菌を培養し、培養液上層に集積したゲル状バクテリアセルロース様多糖を、連続的に巻き取りロールにより緊張下で収束させるとよい。また、シート状のバクテリアセルロース様多糖を得るには、フィラメント状の場合と同様にして培養液状層に集積させたゲル状バクテリアセルロース様多糖を収束させずに、連続的に巻き取りロールにより巻き取るとよい。
【００２５】
本発明によって提供されるバクテリアセルロース様多糖は新規な構造、即ち、セルロースを構成する糖単位であるグルコース残基の間に、グリセリン由来の残基が導入された構造を有すると考えられる。セルラーゼ受容性がセルロースと同程度、またはセルロース以上であることから、セルロースに近い構造を有するといえる。
【００２６】
また、本発明のバクテリアセルロース様多糖は、結晶化度がセルロースより低い。このため、より生分解性に優れ、かつ、アセテートの製造などにおいて化学修飾を受けやすいという特徴を有する。また、強度や吸水性などの物理的性質も優れたものである。
【００２７】
本発明はさらに、上記のバクテリアセルロース様多糖を培地から分離回収すると同時にフィラメント状またはシート状に成形することを特徴とする、バクテリアセルロース様多糖の成形方法を提供する。
【００２８】
培地から分離回収すると同時に直接フィラメント状またはシート状に成形することにより、生産工程が簡略化され、コストの低減をはかることができる。
【００２９】
本発明はさらに、上記方法により成形されたバクテリアセルロース様多糖フィラメントおよびバクテリアセルロース様多糖シートを提供する。
【００３０】
このような成形物には様々な用途が考えられるが、例えば製紙、紡績、食品包装、医療用材料、化粧品、衛生用品などの分野で有用に利用できる。
【００３１】
本発明はまた、上記の培地を含む培養液の容器中の培養液上層に集積したゲル状バクテリアセルロース様多糖薄層を、連続的に巻き取りロールにより緊張下で収束することを特徴とする、バクテリアセルロース様多糖フィラメントの製造方法も提供する。さらに、該ゲル状バクテリアセルロース様多糖薄層を、連続的に巻き取りロールにより巻き取ることを特徴とするバクテリアセルロース様多糖シートの製造方法も提供する。
【００３２】
この方法によれば、培養液上層に集積した本発明のバクテリアセルロース様多糖のゲル状薄層をウエット状態において連続的に巻き取りロールにより収束することにより、簡単に、本発明のバクテリアセルロース様多糖からなるフィラメントを製造することができる。また、収束を行わずに所望の幅のシートが得られるように巻き取りロールを調整して巻き取ることにより、本発明のバクテリアセルロース様多糖からなるシートを製造することが出来る。
【００３３】
本発明のバクテリアセルロース様多糖フィラメントまたはシートは以下に説明する装置を用いて製造される。図１、２および３はそれぞれ、本発明の多糖フィラメントおよびシートの製造装置を示す。該装置は主に、静置培養容器、洗浄槽（３、７）および巻き取りローラー（４、９）から構成される。より具体的には、該装置は、平板状の静置培養容器中の培養液上層に集積したゲル状バクテリアセルロース様多糖薄層を、ピックアップローラー（２、８）を介してＳＤＳ水溶液などの洗浄液で処理後、巻き取りローラー（４、９）により緊張下（図１および図２）あるいは緊張すること無しに（図３）連続的にフィラメントまたはシートを巻き取るものである。
【００３４】
フィラメントを製造する場合は、ゲル状多糖を収束しながら巻き取る構成にすればよく、シートを製造する場合は、所望の幅になるよう調整しながら巻き取る構成にすればよい。また、一時に複数のフィラメントまたはシートを製造する場合には、培養容器中に巻き取り方向に対して平行である複数の培養液仕切り板を設けるとよい。
【００３５】
上記の装置を用いてバクテリアセルロース様多糖フィラメントまたはシートを製造する方法を簡単に説明する。
【００３６】
培養液を培養容器に連続的に添加しつつ静置培養を行い、培養液上層にバクテリアセルロース様多糖を集積させる。ここで、培養液上層に生成したゲル状バクテリアセルロース様多糖薄層を所望の太さとなるように伸長しつつ収束することにより、フィラメントが製造される（図１）。また。所望の幅になるようにゲルを緊張下で巻き取ることにより、所望のシートが製造される（図２）。また、非緊張下で巻き取ることによっても本発明のシートが得られる（図３）。
【００３７】
このように巻き取り装置付き浅皿培養装置を用いると、培養器表面から直接本発明の新規な多糖をフィラメントまたはシートとして収穫できるため、多糖フィラメントまたはシートの生産コストをさらに低くすることができる。
【００３８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００３９】
（継代培養）
グリセリンを含む寒天培地中−２０℃で保存した酢酸菌(Acetobacter xylinum ATCC-23769)を炭素源としてグルコースを含むＨＳ培地（表１）で立ち上げた。次いで、グリセリン：グルコース＝１：１の混合炭素源を含むＨＳ培地（グリセリン、グルコースそれぞれ１（Ｗ／Ｖ）％含有）に該酢酸菌０．５ｍｌを接種した。図４に示すように、０．５ｍｌの酢酸菌培養液を５０ｍｌのエルレンマイヤーに入れた１５ｍｌの新鮮な培地に継代することを３−６回繰り返した。この継代培養により、グリセリンに親和性の高い酢酸菌を得た（培養条件は以下の通りであった：温度２８℃、ｐＨ６．０、期間３日／継代）。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
（本培養）
表１の培地の炭素源として、グルコースとグリセリンの比率を変化させた培地各１５ｍｌを５０ｍｌのエルレンマイヤーに入れ、上記のようにして継代培養した酢酸菌０．５ｍｌを加えて２８℃で７日間静置培養した（図１を参照）。
【００４２】
培地表面に生成した多糖ゲルを１％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液中で５時間、次いで４％（Ｗ／Ｖ）水酸化ナトリウム水溶液で５時間それぞれ還流洗浄を行い、充分水洗後、ろ紙に挟んで乾燥させた。
【００４３】
（多糖の分析）
得られた多糖フィルムについてＦＴ−ＩＲ、ＸＲＤ、引張り強度試験、セルラーゼ(EC3.2.1.4)による加水分解特性、加水分解物の液体クロマトグラフィー等の試験を行って、生産された多糖の特性を確かめた。表２にその結果を示す。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
上記の様に炭素源としてグルコースのみを用いた場合に比べ、グリセリンを用いた場合では、得られた多糖の結晶化度が低かった。結晶化度が低いとセルラーゼによる分解を受けやすいため、生分解性の高い多糖が得られたといえる。
【００４６】
また、グルコースのみを用いた場合に比べ、グリセリンを用いた場合には結晶化度が低いということは、前者は構成糖残基がグルコースのみであるホモ多糖であり、後者は構成糖残基がグルコースだけでなく、グリセリン由来の残基を含むヘテロ多糖である可能性を示唆している。
【００４７】
収率は、グルコース：グリセリン＝１：１の混合培地の場合に最も高かったが、グリセリンを含む培地においては総じて高い収率が得られている。本発明により、バクテリアセルロース生産に用いるグルコースを安価なグリセリンに置きかえることにより、高い収率で多糖が得られることが見出された。
【００４８】
上記のグルコース：グリセリン＝１：１の混合培地の場合に得られた多糖をセルラーゼで加水分解して得られた溶液をＨＰＬＣで分析した結果を図５に示す。本発明による多糖のセルラーゼ加水分解物は、セルロースを構成するグルコースやセロビオースより分子量が高い画分に見られた。セルラーゼはグルコース残基間のβグリコシド結合のみを切断することから、グルコース残基にグリセリン由来の残基が結合し、その分、分子量が高くなっているものと推定される。本発明のバクテリアセルロース様多糖は、グルコース残基の間にグリセリン由来の残基が１つ程度存在する新規な構造を有していると推定される。
【実施例２】
【００４９】
グリセリンの代わりに、炭素源として、グリセルアルデヒド、グリセリン酸、グリセリン、エリスロースを用いて継代培養した酢酸菌を用いて、上記のグリセリンの場合と同様にして培養した場合に得られる多糖について評価した。結果を以下の表３に示す。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
炭素源としてグリセルアルデヒドを用いた場合でも、多糖膜が得られたが、膜は薄く、強度も弱いものであり、シートの形態を保持することが出来ないものであった。グリセリンを用いた場合は、強度の強い多糖膜が得られ、培養上層に集積した膜を取り出しただけでもしっかりとしたシート形態を保持するものであった。これを図６に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明によるセルロース様多糖フィラメントの製造装置を示す図である。
【図２】本発明によるセルロース様多糖シートの緊張下での製造装置を示す図である。
【図３】本発明によるセルロース様多糖シートの非緊張下での製造装置を示す図である。
【図４】本発明によるセルロース生産菌、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter Xylinum)の継代培養工程および本培養工程を示す図である。
【図５】グリセリン：グルコース＝１：１培地で得られた本発明の多糖をセルラーゼで加水分解して得られた溶液をＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。
【図６ａ】炭素源としてグリセリンを用いた場合の多糖膜を示す。
【図６ｂ】炭素源としてグリセルアルデヒドを用いた場合の多糖膜を示す。
【符号の説明】
【００５３】
１．シンカー
２．ピックアップローラー
３．洗浄槽
４．巻き取りローラー
５．多糖フィルム
６．フィラメント延伸方向
７．洗浄槽
８．ピックアップローラー
９．巻き取りローラー
１０．金属板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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