(57)【要約】【課題】  種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を短期間で簡単に得ることのできる細胞活性化方法及びこれを用いる細胞製造方法並びに医薬組成物を提供すること。【解決手段】  医薬組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞（以下、前駆細胞と称する）のＣＤ３分子を介して当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に刺激（主刺激）を与えるＣＤ３アゴニストと、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞のＣＤ５２分子を介して当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に刺激（副刺激）を与えるＣＤ５２アゴニストとを有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与える細胞活性化方法。
【請求項２】
ＣＤ５２アゴニストは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントを有している請求項１に記載の細胞活性化方法。
【請求項３】
ＣＤ５２アゴニストは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントを有している請求項１又は２に記載の細胞活性化方法。
【請求項４】
ＣＤ５２アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントと、当該細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントとを有している請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞活性化方法。
【請求項５】
細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントからなり、当該細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントからなる請求項４に記載の細胞活性化方法。
【請求項６】
ＣＤ３アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ３分子に結合する抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを有している請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞活性化方法。
【請求項７】
ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストの少なくとも一方は、ヒト化抗体及びヒト抗体の少なくとも一方を有している請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞活性化方法。
【請求項８】
ヒト化抗体は、マウスヒト化抗体又はラットヒト化抗体キャンパス−１Ｈである請求項７に記載の細胞活性化方法。
【請求項９】
生体外又は生体内でＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与える請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞活性化方法。
【請求項１０】
ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストにより末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血に存在可能な細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与える請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞活性化方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞活性化方法を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を製造する細胞製造方法。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞活性化方法によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬組成物。
【請求項１４】
細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与えるＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストを有している医薬組成物。
【請求項１５】
ＣＤ５２アゴニストは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントを有している請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＣＤ５２アゴニストは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントを有している請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＣＤ５２アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントと、当該細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントとを有している請求項１４から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントからなり、当該細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントからなる請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＣＤ３アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ３分子に結合する抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを有している請求項１４から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストの少なくとも一方は、ヒト化抗体及びヒト抗体の少なくとも一方を有している請求項１４から１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ヒト化抗体は、マウスヒト化抗体又はラットヒト化抗体キャンパス−１Ｈである請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与えるＣＤ５２アゴニストを有している医薬組成物。
【請求項２３】
ＣＤ５２アゴニストは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントを有している請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＣＤ５２アゴニストは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントを有している請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８キラーＴ細胞、ＣＴＬ）の分化誘導、増殖促進及び機能増強のために、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞からなる免疫細胞を活性化させる細胞活性化方法及びこれを用いた細胞製造方法並びに医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
【特許文献１】特開２００３−１０２４７１号公報
【０００３】
生体の持つ免疫機能を利用して癌を治療するいわゆる癌免疫療法としては、例えば、腫瘍特異的抗原、免疫能を高めるＢＣＧ等を用いるワクチンや癌細胞を特異的に攻撃するモノクローナル抗体からなる生物製剤を使用する方法と、生体から取り出した免疫担当細胞に適当な処理をして抗癌機能をもたせ、抗癌機能を有した免疫担当細胞を生体に戻すいわゆる養子免疫療法とが挙げられる。養子免疫療法としては、例えば、生体の末梢血から単球（単核球）を取り出し、取り出した単球を分化させて樹状細胞を増殖し、増殖した樹状細胞に腫瘍抗原を処理し、腫瘍抗原が処理された樹状細胞を生体に戻すいわゆる樹状細胞療法が挙げられる。斯かる樹状細胞療法では、生体内で腫瘍細胞を特異的に攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞を樹状細胞が誘導すると考えられている。また、例えば、非特異的な抗癌作用を持つナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と称する）やナチュラルキラーＴ細胞（以下、ＮＫＴ細胞と称する）を生体外に取り出して活性化させ、活性化されたＮＫ細胞やＮＫＴ細胞が増殖した後に生体内に戻す方法も養子免疫療法の一つとして考えられている。
【０００４】
細胞を体外で活性化させて体内に戻す養子免疫療法の先駆的な療法としては、例えば、いわゆるＬＡＫ（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ）療法が挙げられる（Ｌｏｔｚｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１：４４２０，１９８１）。ＬＡＫ療法は、リンパ球増殖因子であるリコンビナントヒトインターロイキン２（以下、ＩＬ−２と称する）が使用可能となった１９８０年代から利用することができるようになり、癌患者から採取した末梢血リンパ球を高濃度のＩＬ−２存在下で培養して得たＮＫ細胞の一つである抗腫瘍活性を有するＬＡＫ細胞を癌患者の体内に移入し、この移入と同時に高用量のＩＬ−２を投与する療法である。斯かるＬＡＫ療法については、悪性黒色腫や腎癌で２５例中１１例に対して効果を奏するとの報告もされたが、当該報告以後の追試での効果は認められておらず、従って、ＬＡＫ療法のみによる治療効果は、医学的根拠に乏しいことから認め難い。
【０００５】
ＬＡＫ細胞が使用可能となった後も腫瘍組織に浸潤した免疫担当細胞に関する研究が進められ、その結果、腫瘍細胞の抗原を認識して当該腫瘍細胞に対して特異的な細胞傷害活性を示す細胞が細胞傷害性Ｔ細胞であることが発見されたことから、末梢血ではなく、腫瘍組織に浸潤したリンパ球（ＴＩＬ）を採取し、採取したＴＩＬをＩＬ−２を用いて増殖させて生体内に戻すといういわゆるＴＩＬ療法が試みられた。ＴＩＬ療法は、悪性黒色腫、局所再発乳癌、癌性胸水、癌性腹水、肝細胞癌、大腸癌、非ホジキンリンパ腫等に対して有効であるとの報告もあるが、ＴＩＬの採取が煩雑であると共に、ＴＩＬの増殖に長期間の培養を要するためにＴＩＬの腫瘍への集積性や抗腫瘍活性が低下してしまう虞があり、また、抗腫瘍効果を抑制する細胞が出現してしまう虞もある。
【０００６】
また、腫瘍細胞に対する強力な活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導させるためには、細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞としてのＴ細胞と樹状細胞等の抗原提示細胞とを共培養して当該Ｔ細胞を刺激することが必要であるとされている。即ち、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導させるためには、ＣＤ８分子を有するＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に、抗原提示細胞のＨＬＡクラス１分子に結合した抗原ペプチドを認識させることによりＴ細胞に主刺激を与え、この主刺激に加えて、Ｔ細胞のＣＤ２８分子等を介して当該ＣＤ８Ｔ細胞に副刺激を与えることが必要とされている。このため、腫瘍細胞にのみ発現する特異抗原及びそのエピトープの研究が進められ、新たな腫瘍抗原が次々に発見されつつある。
【０００７】
上述のような研究により発見された新たな腫瘍抗原を手掛かりに、腫瘍抗原を処理した樹状細胞や腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を生体外で大量に分化誘導して生体内に戻す方法が研究されている。斯かる方法としては、例えば、腫瘍抗原を取り込ませた樹状細胞を自己末梢血リンパ球と共に培養することで腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞のクローンを誘導、増殖させる方法がある（Ｄｕｄｌｅｙ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２５：２４３−５１，２００２，Ｙｅｅ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９：１６１６８−７３，２００２）。
【０００８】
我国では、上述のような方法に加えて、癌に対する自己活性化リンパ球移入療法が高度先進医療として一部の大学や民間医療施設で行われてきた。斯かる自己活性化リンパ球移入療法としては、例えば、末梢血リンパ球を抗ＣＤ３抗体で刺激し、ＩＬ−２で長期間培養して増殖させ、増殖させた末梢血リンパ球を癌患者の体内に戻すいわゆるＣＤ３−ＬＡＫ療法が比較的簡単な療法として挙げられ、ＣＤ３−ＬＡＫ療法により活性化されて抗腫瘍活性を有することとなる細胞は、主としてＣＤ８Ｔ細胞であり、ＬＡＫ療法で利用される活性化ＮＫ細胞ではない（Ｏｃｈｏａ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２７２８，１９８７）。ＣＤ３−ＬＡＫ療法は、現在種々の癌に対して利用されており、肝細胞癌の治癒切術後の再発抑制効果が特に認められるとの報告がなされている（Ｔａｋａｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５６：８０２，２０００）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上述のようなＣＤ３−ＬＡＫ療法では、生体内に戻された活性化Ｔ細胞の抗腫瘍活性が低く（Ｇｅｌｌｅｒ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３２８０，１９９１）、このＣＤ３−ＬＡＫ療法により実際に癌を縮小させた奏功率（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ＋ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、１０％前後とされている（Ｇｏｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２：２４６１，２００２）。
【００１０】
ＣＤ３−ＬＡＫ療法の癌に対する奏功率が低い理由としては、第一に増殖した細胞傷害性Ｔ細胞のパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）発現が低いこと、第二にリンパ節に移動するためのケモカイン受容体、特にＣＣＲ７が細胞傷害性Ｔ細胞から消失してしまうことが考えられる。
【００１１】
ＣＤ３−ＬＡＫ療法の癌に対する奏功率が低い第一の理由に関しては、標的腫瘍細胞の細胞膜に孔を穿つ機能を有するパーフォリンを多く発現させるためには、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞が抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び副刺激分子（通常ＣＤ２８分子）からの二つのシグナルを受けることが必要であると考えられ、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞がＴＣＲを介する一つのシグナルのみを受けた場合には、増殖した細胞傷害性Ｔ細胞内のパーフォリンが十分に増加しないと考えられる。斯かるパーフォリンが少ない場合には、細胞傷害性Ｔ細胞は、癌細胞の表面組織に孔を穿つ機能が著しく低減することから癌細胞に対して強力な攻撃を行うことができないことが考えられる。
【００１２】
ＣＤ３−ＬＡＫ療法の癌に対する奏功率が低い第二の理由に関しては、ＣＤ３−ＬＡＫ療法により増殖した細胞傷害性Ｔ細胞では、細胞傷害性Ｔ細胞が末梢リンパ節に移動するのに必要とされるケモカイン受容体、特にＣＣＲ７があまり発現しないために、生体に投与した細胞傷害性Ｔ細胞が末梢リンパ節に到達し得ず、従って、末梢リンパ節に転移した癌に対して効果を発揮し得ないことが考えられる。尚、腫瘍免疫反応を生じる末梢リンパ節に対する癌の転移を防止することは極めて重要であると考えられている。
【００１３】
また、以上に述べたような免疫療法を実用的な治療として利用する場合には、次のようないくつかの問題点がある。斯かる問題点としては、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、治療効果を奏し得る程度にまで細胞傷害性Ｔ細胞を増殖させるのに煩雑な操作及び多大な時間を要してしまい、短期間で簡単に細胞傷害性Ｔ細胞を増殖させることが困難である点、既知の腫瘍抗原は未だ少ないために腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を多種多様の癌に対応させることが困難である点、生体から取り出した腫瘍のリンパ球（ＴＩＬ）をあらゆる患者に対応させることが困難である点及び抗ＣＤ３抗体のみによる刺激により活性化されたリンパ球では、パーフォリン発現が低く、またＣＣＲ７も消失しているために、癌に対する奏功率を高めることが困難である点が挙げられる。
【００１４】
一方、本発明者は、抗４Ｃ８抗体の作用により他のＴ細胞に対して抑制的な作用を有するＣＤ４陽性Ｔ細胞由来の調節性Ｔ細胞を誘導することを示しており（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３７１０，２００２）、斯かる調節性Ｔ細胞の誘導に関しては、特許文献１においても示されている。また、本発明者は、抗ＣＤ５２抗体（抗４Ｃ８抗体）が経血管内皮細胞遊走抑制活性を有することも発見している（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：９７９，１９９９；ＷＯ９９／１２９７２号公報）。しかしながら、抗４Ｃ８抗体等によりＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与え、副刺激が与えられた細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に基づいて腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等を殺傷するような研究はなされていない。
【００１５】
本発明は、前記諸点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を短期間で簡単に得ることのできる細胞活性化方法及びこれを用いる細胞製造方法並びに医薬組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的とするところは、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞及びこれを含む医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第一の態様の細胞活性化方法は、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与える。
【００１８】
第一の態様の細胞活性化方法によれば、上述の構成を具備しているために、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによりＣＤ３分子及びＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に主刺激及び副刺激を与えることで、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に強力な活性化を生じさせることができ、このように活性化された細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に強力な分化誘導を生じさせて増殖を促進させることができ、従って、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現してリンパ節に移動可能となった細胞傷害性Ｔ細胞を短期間で簡単に増加させることができ、而して、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。また、第一の態様の細胞活性化方法を用いることによって得られる細胞傷害性Ｔ細胞は、正常細胞と腫瘍細胞等との分別を他の免疫細胞よりも正確に行い得る。加えて、第一の態様の細胞活性化方法に基づいて得られた細胞傷害性Ｔ細胞を当該細胞活性化方法により再度刺激することで、多量のパーフォリン及びＣＣＲ７を有していると共に、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して強力かつ非特異的な細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。このような効果を奏し得る第一の態様の細胞活性化方法は、悪性腫瘍、ウイルス感染症等の疾患・病態の治療に関して直接的（生体へのアゴニスト投与等）に又は間接的（細胞傷害性Ｔ細胞の製造等）に利用され得る。斯かる効果を奏し得る第一の態様の細胞活性化方法は、本発明者が抗４Ｃ８抗体等のＣＤ５２アゴニストの細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に対する効能に関して鋭意検討し、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによりＣＤ３分子及びＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激（共刺激）を与えて活性化させた場合に、当該活性化によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞が、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現していることを新たに見出したという結果に基づいて初めて構成し得るのである。
【００１９】
本発明の第二の態様の細胞活性化方法では、第一の態様の細胞活性化方法において、ＣＤ５２アゴニストは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントを有している。
【００２０】
本発明の第三の態様の細胞活性化方法では、第一又は第二の態様の細胞活性化方法において、ＣＤ５２アゴニストは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントを有している。
【００２１】
第二又は第三の態様の細胞活性化方法によれば、上述の構成を具備しているために、抗４Ｃ８抗体若しくはそのフラグメント又はキャンパス−１Ｈ若しくはそのフラグメントにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、多くの細胞傷害性Ｔ細胞にケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を発現させることができ、特に、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、より多くの細胞傷害性Ｔ細胞にケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を発現させることができる。
【００２２】
本発明の第四の態様の細胞活性化方法では、第一から第三のいずれかの態様の細胞活性化方法において、ＣＤ５２アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントと、当該細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントとを有している。
【００２３】
本発明の第五の態様の細胞活性化方法では、第四の態様の細胞活性化方法において、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントからなり、当該細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントからなる。
【００２４】
第四又は第五の態様の細胞活性化方法によれば、上述の構成を具備しているために、例えば、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントをＣＤ５２分子の一の部位に結合させ、加えて、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントをＣＤ５２分子の他の部位に結合させることで、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞を好適に活性化させ得る。
【００２５】
本発明の第六の態様の細胞活性化方法では、第一から第五のいずれかの態様の細胞活性化方法において、ＣＤ３アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ３分子に結合する抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを有している。
【００２６】
本発明の第七の態様の細胞活性化方法では、第一から第六のいずれかの態様の細胞活性化方法において、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストの少なくとも一方は、ヒト化抗体及びヒト抗体の少なくとも一方を有している。
【００２７】
本発明の第八の態様の細胞活性化方法では、第七の態様の細胞活性化方法において、ヒト化抗体は、マウスヒト化抗体又はラットヒト化抗体キャンパス−１Ｈである。
【００２８】
本発明の第九の態様の細胞活性化方法では、第一から第八のいずれかの態様の細胞活性化方法において、生体外又は生体内でＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与える。
【００２９】
本発明の第十の態様の細胞活性化方法は、第一から第九のいずれかの態様の細胞活性化方法において、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストにより末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血に存在可能な細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与える。
【００３０】
本発明の細胞製造方法は、第一から第十のいずれかの態様の細胞活性化方法を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を製造する。また、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、第一から第十のいずれかの態様の細胞活性化方法によって得られる。更に、本発明は、第一から第十のいずれかの態様の細胞活性化方法によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬組成物によっても後述の各態様の医薬組成物と異なる他の一態様として構成され得る。
【００３１】
本発明の第一の態様の医薬組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与えるＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストを有している。
【００３２】
第一の態様の医薬組成物によれば、上述の構成を具備しているために、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによりＣＤ３分子及びＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に主刺激及び副刺激を与えることで、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に強力な活性化を生じさせることができ、このように活性化された細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に強力な分化誘導を生じさせて増殖を促進させることができ、従って、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現してリンパ節に移動可能となった細胞傷害性Ｔ細胞を短期間で簡単に増加させることができ、而して、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。また、第一の態様の医薬組成物を用いることによって得られる細胞傷害性Ｔ細胞は、正常細胞と腫瘍細胞等との分別を他の免疫細胞よりも正確に行い得る。加えて、第一の態様の医薬組成物を用いて得られた細胞傷害性Ｔ細胞を当該医薬組成物により再度刺激することで、多量のパーフォリン及びＣＣＲ７を有していると共に、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して強力かつ非特異的な細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。このような効果を奏し得る第一の態様の医薬組成物は、悪性腫瘍、ウイルス感染症等の疾患・病態の治療に関して直接的（生体へのアゴニスト投与等）に又は間接的（細胞傷害性Ｔ細胞の製造等）に利用され得る。斯かる効果を奏し得る第一の態様の医薬組成物は、本発明者が抗４Ｃ８抗体等のＣＤ５２アゴニストの細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に対する効能に関して鋭意検討し、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによりＣＤ３分子及びＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激（共刺激）を与えて活性化させた場合に、当該活性化によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞が、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現していることを新たに見出したという結果に基づいて初めて構成し得るのである。
【００３３】
本発明の第二の態様の医薬組成物では、第一の態様の医薬組成物において、ＣＤ５２アゴニストは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントを有している。
【００３４】
本発明の第三の態様の医薬組成物では、第一又は第二の態様の医薬組成物において、ＣＤ５２アゴニストは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントを有している。
【００３５】
第二又は第三の態様の医薬組成物によれば、上述の構成を具備しているために、抗４Ｃ８抗体若しくはそのフラグメント又はキャンパス−１Ｈ若しくはそのフラグメントにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、多くの細胞傷害性Ｔ細胞にケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を発現させることができ、特に、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、より多くの細胞傷害性Ｔ細胞にケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を発現させることができる。
【００３６】
本発明の第四の態様の医薬組成物では、第一から第三のいずれかの態様の医薬組成物において、ＣＤ５２アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントと、当該細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントとを有している。
【００３７】
本発明の第五の態様の医薬組成物では、第四の態様の医薬組成物において、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントからなり、当該細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ５２分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントからなる。
【００３８】
第四又は第五の態様の医薬組成物によれば、上述の構成を具備しているために、例えば、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントをＣＤ５２分子の一の部位に結合させ、加えて、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントをＣＤ５２分子の他の部位に結合させることで、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞を好適に活性化させ得る。
【００３９】
本発明の第六の態様の医薬組成物では、第一から第五のいずれかの態様の医薬組成物において、ＣＤ３アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＣＤ３分子に結合する抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを有している。
【００４０】
本発明の第七の態様の医薬組成物では、第一から第六のいずれかの態様の医薬組成物において、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストの少なくとも一方は、ヒト化抗体及びヒト抗体の少なくとも一方を有している。
【００４１】
本発明の第八の態様の医薬組成物では、第七の態様の医薬組成物において、ヒト化抗体は、マウスヒト化抗体又はラットヒト化抗体キャンパス−１Ｈである。
【００４２】
本発明の第九の態様の医薬組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激を与えるＣＤ５２アゴニストを有している。
【００４３】
第九の態様の医薬組成物によれば、上述の構成を具備しているために、ＣＤ５２アゴニストによりＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＴ細胞受容体に対するＭＨＣ−１分子の結合等に基づいてＣＤ３分子を介する主刺激が与えられた場合に、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に強力な活性化を生じさせることができ、このように活性化された細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の強力な分化誘導を生じさせて増殖を促進させることができ、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現してリンパ節に移動可能となった細胞傷害性Ｔ細胞を短期間で簡単に増加させることができ、而して、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。斯かる効果を奏し得る第九の態様の医薬組成物は、本発明者が上述のように抗４Ｃ８抗体等のＣＤ５２アゴニストの細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に対する効能に関して鋭意検討をして得られた結果に基づいて初めて構成し得るのである。
【００４４】
本発明の第十の態様の医薬組成物では、第九の態様の医薬組成物において、ＣＤ５２アゴニストは、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントを有している。
【００４５】
本発明の第十一の態様の医薬組成物では、第九又は第十の態様の医薬組成物において、ＣＤ５２アゴニストは、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントを有している
【発明の効果】
【００４６】
本発明によれば、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を短期間で簡単に得ることのできる細胞活性化方法及びこれを用いる細胞製造方法並びに医薬組成物を提供し得る。また、本発明によれば、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞及びこれを含む医薬組成物を提供し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
次に、本発明の実施の形態の例について更に詳細に説明する。尚、本発明はこれら例に何等限定されないのである。
【００４８】
本例の医薬組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞（以下、前駆細胞と称する）のＣＤ３分子を介して当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に刺激（主刺激）を与えるＣＤ３アゴニストと、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞のＣＤ５２分子を介して当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に刺激（副刺激）を与えるＣＤ５２アゴニストとを有している。
【００４９】
ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによる刺激（共刺激）が与えられる細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞は、本例では、少なくともＣＤ８分子、ＣＤ３分子及びＣＤ５２分子を有している。細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞は、末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血に存在可能な単核球からなり、好ましくは、末梢血に存在可能な末梢血単核球からなる。前駆細胞は、例えば、活性化前のＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ２８−Ｔ細胞等を含む）によって具体化される。
【００５０】
本例におけるＣＤ３アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞の表面に発現するＣＤ３分子に作用し、このＣＤ３分子を介して当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞内にシグナルを伝達することによって主刺激を生じさせる物質からなる。本例におけるＣＤ５２アゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞の細胞表面に発現するＣＤ５２分子に作用し、このＣＤ５２分子を介して当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞内にシグナルを伝達することによって副刺激を生じさせる物質からなる。
【００５１】
ＣＤ３アゴニストは、本例では、抗ＣＤ３抗体を主たる有効成分として含有している。抗ＣＤ３抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞のＣＤ３分子に結合することによって当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に認識されるようになっている。ここで、ＣＤ３アゴニストは、抗ＣＤ３抗体に代えて又は加えて、抗ＣＤ３抗体と同様にＣＤ３分子に結合し、認識される抗ＣＤ３抗体のフラグメントを有効成分として含有していてもよく、斯かるフラグメントは、抗原認識部位を有しているＦａｂフラグメントからなるのが好ましい。
【００５２】
抗ＣＤ３抗体は、ヒト化抗体（マウスヒト化抗体、ラットヒト化抗体等を含む）又はヒト抗体として構成されていてもよい。
【００５３】
ＣＤ３分子に対してアゴニスティックである抗ＣＤ３抗体は、例えば、ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８００１）、ＵＣＨＴ１（Ｂ．Ｄ．Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＨＩＴ３ａ（Ｂ．Ｄ．Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって具体化される。
【００５４】
ＣＤ３アゴニストは、上述の抗ＣＤ３抗体に加えて、ＣＤ３分子に対する天然又は合成のリガンドとなり得るあらゆる分子を含有していてもよく、例えば、Ｔ細胞抗原受容体とＣＤ３分子とからなる複合体の形成やＣＤ３分子を介する細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞への信号伝達をもたらし得る種々の物質、特にアゴニスト作用を有する抗体又はそのフラグメントを含有していてもよく、斯かる抗体又はそのフラグメントは、例えば、ヒトＴ細胞抗原受容体Ｖｂｅｔａ６．７に対する抗体であるＯＴ１４５（Ｐｏｓｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３：７８８８−９２）によって具体化されてもよい。また、ＣＤ３アゴニストは、上述の抗ＣＤ３抗体に加えて、可溶性を有するＭＨＣ−１分子としてのＨＬＡ分子、ＨＬＡ分子及び抗原ペプチドを有するテトラマー分子等のＴ細胞抗原受容体を認識してアゴニスト作用をもたらし得る物質を含有していてもよい。
【００５５】
ＣＤ５２アゴニストは、本例では、抗ＣＤ５２抗体の一つとしての抗４Ｃ８抗体を主たる有効成分として含有している。抗４Ｃ８抗体は、本例では、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞のＣＤ５２分子に結合することによって当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に認識されるようになっている。ここで、ＣＤ５２アゴニストは、抗４Ｃ８抗体に代えて又は加えて、抗４Ｃ８抗体と同様にＣＤ５２分子に結合し、認識される抗４Ｃ８抗体のフラグメントを含有していてもよく、斯かるフラグメントは、抗原認識部位を有しているＦａｂフラグメントからなるのが好ましい。尚、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントにより副刺激が与えられる細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞には、抗腫瘍効果を有するインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）やＩＬ−２等のサイトカイン産生が強く誘導され得る。
【００５６】
抗４Ｃ８抗体のクラスは、ＩｇＧ３である。抗４Ｃ８抗体は、ヒト化抗体（マウスヒト化抗体、ラットヒト化抗体等を含む）又はヒト抗体として構成されていてもよい。
【００５７】
ヒト化抗体は、例えば、ハイブリドーマＪＭ−１により産生される抗ＣＤ５２抗体の可変領域をヒト抗体のフレームワークに移植することによって得られる。
【００５８】
ヒト抗体は、例えば、再配列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、抗原の監査により当該抗原に特異的なヒト抗体を産生するマウス（例えばＴｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７：７２２）を使用することによって得られる。
【００５９】
ＣＤ５２アゴニストは、抗４Ｃ８抗体に代えて又は加えて、ＣＤ５２分子に結合する天然又は合成のリガンド、換言すれば、ＣＤ５２分子を介してシグナルを誘導するあらゆる分子又は抗原としてのＣＤ５２分子に対する抗体を含有していてもよく、斯かる分子又は抗体は、ＣＤ５２分子のいずれの部位を認識するものであってもよく、ＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞にシグナルを伝達することができるものであればよい。ＣＤ５２アゴニストは、例えば、抗４Ｃ８抗体に代えて又は加えて、ＣＤ５２分子に結合するキャンパス−１Ｈ（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）又はそのフラグメントを有効成分として含有していてもよく、キャンパス−１Ｈのフラグメントは、抗原認識部位を有しているＦａｂフラグメントからなるのが好ましい。
【００６０】
キャンパス−１Ｈは、本例では、ＣＤ５２分子に結合するラットヒト化抗体キャンパス−１Ｈ（ラットヒト化抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）を意味する。尚、キャンパス−１Ｈは、例えば、Ｂ細胞リンパ腫患者の治療薬として、また末梢血リンパ球を除去する抗体として知られているが、本例では、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に副刺激を与えるための抗体の一つとして用いる。
【００６１】
ＣＤ５２アゴニストは、ＣＤ５２分子を発現している細胞と候補化合物を接触させて、その相互作用又はＣＤ５２刺激応答を検出するＣＤ５２との相互作用を指標にしたスクリーニングを行うことによって得られる。
【００６２】
ＣＤ５２アゴニストは、上述の抗４Ｃ８抗体に加えて、ＣＤ５２分子に対する天然又は合成のリガンドとなり得るあらゆる分子を含有していてもよい。抗４Ｃ８抗体及びリガンドとなり得る分子は、益山らの報告（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：９７９−９８９；ＷＯ９９／１２９７２号公報）に従い、ヒトＴ細胞を免疫した動物より得られたモノクローナル抗体からＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管外遊走を抑制することを指標に選別することによって得ることが可能である。
【００６３】
抗４Ｃ８抗体又は抗４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２分子に結合する抗体からなる抗ＣＤ５２抗体は、コラーゲンゲル上に単層培養したヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）にヒトＴ細胞を添加培養し、一定時間後、ＨＵＶＥＣ下に遊走したＴ細胞を抗原として用いることによって取得することが可能である。
【００６４】
ＣＤ５２アゴニストに含有されて好適な抗体等は、抗４Ｃ８抗体と同一エピトープを認識する抗体の選抜工程と、細胞傷害性Ｔ細胞の分化・増殖誘導能を評価する工程とを組み合わせることによっても容易に得られる。
【００６５】
本例の医薬組成物を用いて前駆細胞を活性化させる場合は、ＣＤ３アゴニストにより前駆細胞のＣＤ３分子を介して当該前駆細胞に主刺激を与え、ＣＤ３アゴニストによる主刺激と共に、ＣＤ５２アゴニストにより前駆細胞のＣＤ５２分子を介して当該前駆細胞に副刺激を与える。ＣＤ３アゴニストによる細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞への主刺激は、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞の分化に関わる主たる刺激伝達経路を通じてなされる。ＣＤ３アゴニストによる主刺激は、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞の分化を促進するという反応を惹起する。ＣＤ５２アゴニストによる細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞への副刺激は、主たる刺激伝達経路とは他の刺激伝達経路を通じてなされる。ＣＤ５２アゴニストは、ＣＤ３アゴニストによる主刺激と同時に又は主刺激の前若しくは後に、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に副刺激を与える。ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストにより主刺激及び副刺激が与えられた前駆細胞は、これらの刺激に基づいて誘導されて分化、増殖し、細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞となる。斯かる細胞傷害性Ｔ細胞は、後述の各実施例で示しているように、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現していることから、臓器及び臓器に従属している各リンパ節まで移動することができる程度の高い走化性を有していると共に腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対する高い殺傷能力を有している。
【００６６】
また、本例の医薬組成物を用いてナイーブＴ細胞又はメモリーＴ細胞からなる細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる場合も、前駆細胞を活性化させる場合と同様に、細胞傷害性Ｔ細胞に主刺激及び副刺激を与える。主刺激及び副刺激が与えられた細胞傷害性Ｔ細胞は、これらの刺激に基づいて分化誘導して増殖する。ここで、本例の医薬組成物を用いて活性化されて増殖した細胞がＣＤ３アゴニスト及び抗４Ｃ８抗体若しくは抗４Ｃ８抗体のフラグメントを有するＣＤ５２アゴニストによる刺激を受けて増殖した細胞傷害性Ｔ細胞である場合には、多量のパーフォリン及びＣＣＲ７を有している細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。多量のパーフォリン及びＣＣＲ７を有している細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＣＲ７リガンドに対する高い走化性及び腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対するより高い殺傷能力を示し得る。
【００６７】
本例の医薬組成物は、生体内に経口投与される緩衝水剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等からなる薬剤に含有されて用いられてもよく、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等により生体内に非経口投与される注射剤、点滴剤、座剤等からなる薬剤に含有されて用いられてもよく、生体内に投与される医薬組成物は、凍結乾燥されていてもよく、治療効果上許容される担体、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、賦形等の種々の添加物と共に薬剤に含有されて用いられてもよい。ここで、医薬組成物を含有する薬剤は、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを更に含有しているのが好ましく、斯かるキャリアは、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、緩衝生理食塩水又はこれらを適宜組み合わせたものによって具体化されてもよい。また、医薬組成物は、患者又は患者以外の人から採取した細胞傷害性Ｔ細胞、前駆細胞等の免疫細胞、特にＴ細胞やこれらの細胞を含む末梢血、リンパ球、リンパ節細胞、胸腺細胞、臍帯血、腫瘍組織等に対して生体外で用いられてもよく、この場合には、生体外で活性化されて分化し、増殖し又は機能増強した細胞傷害性Ｔ細胞は、自家又は他家の生体内に移入される。
【００６８】
医薬組成物の投与法及び投与量は、前臨床試験や臨床試験の過程との関連において適宜決定される。医薬組成物を経口投与する場合には、投与量は、通常、成人に対して１日当たり約０．０１ｍｇから１０００ｍｇであり、斯かる経口投与を１回又は数回に分けて行う。また、医薬組成物を非経口投与する場合には、投与量は、通常、成人に対して１回当たり約０．０１ｍｇから１０００ｍｇである。尚、経口投与又は非経口投与による医薬組成物の投与量は、年齢、体重及び病気の症状に応じて決定される。
【００６９】
また、医薬組成物は、基礎研究の場において開発された実験系をほぼそのまま治療の場において再現するものであるともいえるいわゆるエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）の方法に用いられてもよい。エクスビボの方法は、生体外で細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞を活性化させることとなることから、医薬組成物の生体内への投与が体内吸収、代謝、または未知の因子による干渉作用等により期待した程度の治療効果を奏さない場合があり得ることに鑑みれば、比較的実用化におけるリスクの低い方法と考えられる。
【００７０】
尚、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ハイブリドーマＪＭ−１（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００１年９月２６日付けで受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７７５７で寄託）により作られる抗４Ｃ８抗体を競合試薬として用いて、被検抗体によるＴ細胞染色が抑制されること、換言すれば、ハイブリドーマＪＭ−１により産生される抗ＣＤ５２抗体と同一エピトープを認識することを指標として組み合わせることにより容易に取得することが可能である。
【００７１】
本例の医薬組成物により活性化される細胞傷害性Ｔ細胞は、ＩＬ−２存在下で更に容易に増殖する。ＩＬ−２存在下で増殖した細胞傷害性Ｔ細胞は、抗４Ｃ８抗体により副刺激を再度与えられることによってより多くのパーフォリンを誘導し、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対する殺傷能力がより高められる。尚、細胞傷害性Ｔ細胞に対する抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントによる再度の副刺激は、ＣＤ３アゴニストによる主刺激と共に与えるのが好ましい。
【００７２】
以上のような医薬組成物によれば、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストを有しているために、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによりＣＤ３分子及びＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に主刺激及び副刺激を与えることで、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に強力な活性化を生じさせることができ、このように活性化された細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に強力な分化誘導を生じさせて増殖を促進させることができ、従って、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現してリンパ節に移動可能となった細胞傷害性Ｔ細胞を短期間で簡単に増加させることができ、而して、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。また、本例の医薬組成物を用いることによって得られる細胞傷害性Ｔ細胞は、正常細胞と腫瘍細胞等との分別を他の免疫細胞よりも正確に行い得る。加えて、本例の医薬組成物を用いて得られた細胞傷害性Ｔ細胞を当該医薬組成物により再度刺激することで、多量のパーフォリン及びＣＣＲ７を有していると共に、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して強力かつ非特異的な細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。更に、ＣＤ５２アゴニストが抗４Ｃ８抗体若しくはそのフラグメント又はキャンパス−１Ｈ若しくはそのフラグメントを有している場合には、抗４Ｃ８抗体若しくはそのフラグメント又はキャンパス−１Ｈ若しくはそのフラグメントにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、多くの細胞傷害性Ｔ細胞にケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を発現させることができ、特に、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントにより細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、より多くの細胞傷害性Ｔ細胞にケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を発現させることができる。更にまた、ＣＤ５２アゴニストが抗４Ｃ８抗体若しくはそのフラグメント及びキャンパス−１Ｈ若しくはそのフラグメントを有している場合には、例えば、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントをＣＤ５２分子の一の部位に結合させ、キャンパス−１Ｈ又はそのフラグメントを当該ＣＤ５２分子の他の部位に結合させることで、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞を好適に活性化させ得る。本例の医薬組成物は、悪性腫瘍、ウイルス感染症等の疾患・病態の治療に関して直接的（生体へのアゴニスト投与等）に又は間接的（細胞傷害性Ｔ細胞の製造等）に利用され得る。斯かる効果を奏し得る本例の医薬組成物は、本発明者が抗４Ｃ８抗体等のＣＤ５２アゴニストの細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に対する効能に関して鋭意検討し、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによりＣＤ３分子及びＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に刺激（共刺激）を与えて活性化させた場合に、当該活性化によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞が、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現していることを新たに見出したという結果に基づいて初めて構成し得るのである。
【００７３】
本例の他の医薬組成物は、抗４Ｃ８抗体又はそのフラグメントを有しているＣＤ５２アゴニストを主たる有効成分として含有している。斯かる医薬組成物によれば、例えば、ＣＤ５２アゴニストによりＣＤ５２分子を介して細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞のＴ細胞受容体に対するＭＨＣ−１分子の結合等に基づいてＣＤ３分子を介する主刺激が与えられた場合に、細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞に強力な活性化を生じさせることができ、このように活性化された細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の強力な分化誘導を生じさせて増殖を促進させることができ、ケモカイン受容体、特にＣＣＲ７を高発現してリンパ節に移動可能となった細胞傷害性Ｔ細胞を短期間で簡単に増加させることができ、而して、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。
【実施例１】
【００７４】
実施例１では、ＣＤ５２アゴニストによる副刺激により誘導される細胞傷害性Ｔ細胞のＣＣＲ７及びパーフォリンの発現に関する試験を行う。
【００７５】
まず、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた密度勾配遠心法により健常人の末梢血から単核球を分離し、分離した単核球をナイロンウールカラムに通し、素通り分画を採取してＴ細胞を得た。次に、ＭＡＣＳ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたネガティブセレクションによりＴ細胞からＣＤ８分子を有しているＣＤ８Ｔ細胞を単離した。また、抗ＣＤ３抗体及び抗４Ｃ８抗体若しくはキャンパス−１Ｈ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）のプレートへの固相化は、４８穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各穴にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１００ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ＣＤ３抗体（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ  ＯＫＴ３，Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃ）を３３０μｌ添加し、４℃で２４時間処理し、処理後、抗ＣＤ３抗体を各穴から取り出し、ＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調整した抗４Ｃ８抗体又はキャンパス−１Ｈ（ＣＡＭＰＡＴＨ，Ｂｅｒｌｅｘ）を３３０μｌ加えて、４℃で２４時間静置して行った。
【００７６】
次に、単離したＣＤ８Ｔ細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％  ＦＣＳ＋１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ＋１％  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に１×１０６／ｍｌの濃度で浮遊させ、抗ＣＤ３抗体及び抗４Ｃ８抗体若しくはキャンパス−１Ｈを処理した４８穴プレートの各穴に０．５から１×１０６個添加した。ＣＯ２培養器を用いて３７℃で３日から４日間培養した後、１×１０６／ｍｌに調整して別の培養容器に移し、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を添加して更に培養を続けた。培養液は隔日ごとに半分ずつ交換し、交換する毎にＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を添加した。培養開始から１４日経過した後に、Ｔ細胞を回収、洗浄した。回収したＴ細胞は、９９％以上がＣＤ８陽性、ＴＣＲαβ陽性であった。
【００７７】
ＣＤ８Ｔ細胞に一回目の副刺激を与えた後、ＣＤ５２分子を介してＣＤ８Ｔ細胞に二回目の副刺激を与えた。まず、ＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ＣＤ３抗体２ｍｌを２４時間処理し、処理後、抗ＣＤ５２抗体（抗４Ｃ８抗体（５μｇ／ｍｌ）又はキャンパス−１Ｈ（５０μｇ／ｍｌ））２ｍｌを２４時間処理して抗ＣＤ３抗体及び抗４Ｃ８抗体が固相化された６穴プレートに、前記回収したＴ細胞を１×１０７個加えてＣＯ２培養器で培養した。培養開始から３日から４日経過した後にＣＤ８Ｔ細胞を回収し、斯かるＣＤ８Ｔ細胞を実験に供した。
【００７８】
比較対象となるＣＤ３−ＬＡＫ細胞（ＣＤ３−ＬＡＫ）は、次のような一般的な方法によって得た。抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍｌ）で固相化した４８穴プレートの各穴に、末梢血単核球のナイロンウールカラム素通り分画であるＴ細胞を１×１０６個播種した。播種してから２４時間経過後及び７２時間経過後にＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を添加し、計５日間培養した。次に、プレートを移して隔日毎にＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を加えながら細胞を約１０日間培養し、増殖させた。
【００７９】
ＣＤ５２分子が副刺激処理された３×１０５個のＣＤ８Ｔ細胞（以下、ＣＤ５２−ＣＴＬと称する）を培養液５０μｌに浮遊させた後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＣＲ７抗体（Ｄａｋｏ社）を３μｌ加えて、氷上及び暗所で３０分静置した。静置後、０．１％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳで二回洗浄して、１％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定し、ＦＡＣＳｃａｎで生細胞の細胞表面ＣＣＲ７（陽性）の発現を検討した。一方、３×１０５個のＣＤ３Ｔ−ＬＡＫ細胞を培養液５０μｌに浮遊させた後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＣＲ７抗体（Ｄａｋｏ社）を３μｌ加えて、氷上及び暗所で３０分静置した。静置後、０．１％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳで二回洗浄して、１％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定し、ＦＡＣＳｃａｎで生細胞の細胞表面ＣＣＲ７の発現を検討した。各細胞内のパーフォリンは、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で細胞を処理することによりＦＩＴＣ標識抗ｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体（Ａｎｃｅｌｌ）で染色した。
【００８０】
以上のように試験を行った結果、図１に示すように、前ＣＤ８Ｔ細胞のＣＣＲ７の約１８％が陽性であるのに対して、ＣＤ３−ＬＡＫ細胞のＣＣＲ７の約５％、キャンパス１−Ｈに刺激されたＣＤ５２−ＣＴＬのＣＣＲ７の約７０％及び抗４Ｃ８抗体に刺激されたＣＤ５２−ＣＴＬのＣＣＲ７の約８０％が陽性であった。抗４Ｃ８抗体又はキャンパス１−Ｈが用いられて副刺激処理されたＣＤ５２−ＣＴＬのＣＣＲ７＋発現（％）は、刺激処理前のＣＤ８Ｔ細胞（前ＣＤ８Ｔ細胞）のＣＣＲ７＋発現（％）を大きく上回っており、このことから、ＣＤ５２−ＣＴＬの大多数にＣＣＲ７＋が発現していることが示唆されている。ＣＤ３−ＬＡＫ細胞のＣＣＲ７＋発現（％）は、前ＣＤ８Ｔ細胞のＣＣＲ７＋発現（％）を下回っていることから、ＣＤ３−ＬＡＫ細胞からＣＣＲ７＋が消失してしまっていることが示唆されている。また、ＣＤ５２−ＣＴＬの細胞内のパーフォリンの平均蛍光強度は、図２に示すように、２回目の刺激前のＣＤ５２−ＣＴＬよりも２回目の刺激後のＣＤ５２−ＣＴＬの方で著しく増しており、このことからＣＤ５２−ＣＴＬの細胞内のパーフォリンは、２回目の刺激後に著しく増加することが示唆されている。
【実施例２】
【００８１】
実施例２では、ＣＣＲ７リガンドに対する走化性（ケモタキシス）反応に関する試験を行い、ＣＣＲ７が高発現したＣＤ５２−ＣＴＬがＣＣＲ７リガンドに対して反応して、走化性が亢進しているか否かを検討する。
【００８２】
ケモタキシスアッセイは、２４穴プレート用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（５μｍ  ｐｏｒｅ，ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ，Ｃｏｓｔａｒ社）を用いて行った。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下室にＣＣＲ７リガンドであるケモカインＣＣＬ２１（Ｒ＆Ｄ社）を１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で夫々添加した。陰性コントロールとしては、ＣＤ５２−ＣＴＬ及びＣＤ３−ＬＡＫには発現しないＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ２０（Ｒ＆Ｄ社）を用いた。上室にはＣＤ５２−ＣＴＬ又はＣＤ３−ＬＡＫを５×１０５個加えて３７℃で培養した。培養開始から９０分経過した後に、下室に移動した細胞を数えた。ケモタキシス活性（％）は、次の数式（１）を用いて求めた。
【００８３】
（数１）
ケモタキシス活性＝下室移動細胞数／上室添加細胞数・・・（１）
【００８４】
以上のように試験を行った結果、図３の（ｂ）に示すように、ＣＤ５２−ＣＴＬのＣＣＲ７に対するＣＣＬ２１のケモタキシス活性（％）は、ケモカイン濃度１００ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌで著しく上昇している一方、ＣＤ５２−ＣＴＬのＣＣＲ６に対するＣＣＬ２０のケモタキシス活性（％）の上昇は特に見受けられなかった。また、図３の（ａ）に示すように、ＣＤ３−ＬＡＫのＣＣＲ７に対するＣＣＬ２１のケモカイン濃度に対するケモタキシス活性（％）には、ＣＤ５２−ＣＴＬのＣＣＲ７に対するＣＣＬ２１のケモタキシス活性（％）を上回るような上昇反応は一切みられなかった。従って、ＣＤ５２−ＣＴＬは、ＣＣＲ７及びＣＣＬ２１の走化性反応により活発に移動することが見受けられ、斯かるＣＤ５２−ＣＴＬが生体投与された際には、当該ＣＤ５２−ＣＴＬの大多数は、リンパ節に到達し得ることが示唆されている。
【実施例３】
【００８５】
実施例３では、癌細胞及び正常細胞に対するＣＤ５２−ＣＴＬの細胞傷害活性に関する試験を行う。
【００８６】
細胞傷害活性の分析には、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイ法を用いた。標的細胞を５１Ｃｒ１００μＣｉで標識した後に洗浄し、洗浄した標的細胞を９６穴丸底プレート（ＩＣＮ）の各穴に１×１０４個入れ、これに６から５０のＥ／Ｔ比（エフェクター細胞／標的細胞比）でＣＤ５２−ＣＴＬを加えた。ＣＯ２培養器で３７℃で４時間培養し、培養後に上清１００μｌに放出された５１Ｃｒ放射能活性をガンマカウンターで測定した。細胞傷害活性（％）は、次の数式（２）を用いて求めた。
【００８７】
（数２）
細胞傷害活性＝（試験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×100・・・（２）
【００８８】
標的細胞の５１Ｃｒの自然放出は、常に最大放出の２０％以下であった。
【００８９】
標的腫瘍細胞には、ＫａｔｏＩＩＩ（胃癌）、ＴＥ１１（食道癌）及びＤａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）を用い、正常細胞コントロールとしてＣｏｎ−Ａ（１０μｇ／ｍｌ）で３日間刺激したヒト末梢血単核球を用いた。
【００９０】
以上のように試験を行った結果、図４に示すように、ＣＤ５２−ＣＴＬは、ＫａｔｏＩＩＩ、ＴＥ１１に対しては、ＣＤ５２−ＣＴＬ／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）に依存する細胞傷害活性（％）を示唆した。また、ＣＤ５２−ＣＴＬは、Ｄａｕｄｉに対しては、ＣＤ５２−ＣＴＬ／標的細胞比に依存しない細胞傷害活性（％）を示唆した。尚、ＣＤ５２−ＣＴＬは、正常細胞としてのＣｏｎＡ−Ｂｌａｓｔｓ（Ｃｏｎ−Ａ）に対しては、細胞傷害活性（％）を全く示さなかった。
【実施例４】
【００９１】
実施例４では、２４時間培養したＣＤ５２−ＣＴＬの腫瘍細胞に対する細胞傷害活性に関する試験を行う。
【００９２】
腫瘍細胞株には、ＫａｔｏＩＩＩ（胃癌）、ＴＥ１１（食道癌）、ＴＥ２（食道癌）、ＷｉＤｒ−ＴＣ（大腸癌）、ＳＫ−ＭＥＬ−２８（悪性黒色腫）、ＬＣＳＣ＃１（肺腺癌）、ＬＵ６５（肺小細胞癌）を用いた。標的腫瘍細胞１×１０５／ｍｌ（ＳＫ−ＭＥＬ−２８のみ０．５×１０５／ｍｌ）を９６穴平底プレートの各穴に１００μｌずつ播種し、３７℃で３時間、５％ＣＯ２培養器で、腫瘍細胞が９６穴平底プレートに十分に接着するまで培養した。これにＣＤ５２−ＣＴＬを所定のＥ／Ｔ比で１００μｌ加えて、３７℃で２４時間、５％ＣＯ２培養器で培養した。培養後、生細胞の代謝活性を反映するフォルマザン変換能を調べて、ＣＤ５２−ＣＴＬの細胞傷害活性を算出した。斯かる細胞傷害活性（％）は、ＷＳＴ−１（ロシュ・ダイアグノスティックス）を培養液の１０％量加えて２時間培養し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＡ４９２ｎｍ／Ａ６２０ｎｍの２波長で測定し、次の数式（３）を用いて求めた。尚、ＴＳは標的細胞のみを意味し、ＢＧ０は培養液のみのバックグラウンドを意味し、Ｅは標的細胞及びＣＤ５２−ＣＴＬ（エフェクター細胞）を意味し、ＢＧＥＣは、エフェクター細胞のみのバックグラウンドを意味する。
【００９３】
（数３）
細胞傷害活性＝〔｛（ＴＳ−ＢＧ０）−（Ｅ−ＢＧＥＣ）｝／（ＴＳ−ＢＧ０）〕×100・・・（３）
【００９４】
以上のように試験を行った結果、図５に示すように、抗４Ｃ８抗体によるＣＤ５２分子を介する副刺激により誘導されるＣＤ５２−ＣＴＬのＥ／Ｔ比に依存する細胞傷害活性（％）は、６種類の腫瘍細胞の夫々に対して強力であり、また、これらの腫瘍細胞に対して非特異的な傾向を示している。
【実施例５】
【００９５】
実施例５では、ＣＤ５２−ＣＴＬに対するＩＬ−２の増強作用に関する試験を行う。
【００９６】
ＣＤ５２−ＣＴＬのＳＫ−ＭＥＬ−２８に対する細胞傷害活性を、２．５、５、１０及び２０のＥ／Ｔ比で２４時間培養した後、夫々測定した。このように測定した結果、図６に示すように、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）添加によりＥ／Ｔ比に依存する細胞傷害活性（％）が高まることが示された。
【実施例６】
【００９７】
実施例６では、抗４Ｃ８抗体により副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬの細胞傷害活性（％）とキャンパス−１Ｈにより副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬの細胞傷害活性（％）とを比較する試験を行う。
【００９８】
抗４Ｃ８抗体により副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬの腫瘍細胞に対する細胞傷害活性とキャンパス−１Ｈにより副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬの腫瘍細胞に対する細胞傷害活性とを、５、１０、２０、４０のＥ／Ｔ比で夫々測定した。このように測定した結果、図７に示すように、抗４Ｃ８抗体により副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬのＥ／Ｔ比に依存する細胞傷害活性（％）は、キャンパス−１Ｈにより副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬのＥ／Ｔ比に依存する細胞傷害活性（％）よりも高いことが示唆された。尚、キャンパス−１Ｈにより副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬのＥ／Ｔ比に依存する細胞傷害活性（％）は、抗４Ｃ８抗体により副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬよりも若干劣っているが、斯かるキャンパス−１Ｈにより副刺激が与えられたＣＤ５２−ＣＴＬを腫瘍細胞等の治療に用いても十分な抗腫瘍効果を奏し得ると考えられる。
【実施例７】
【００９９】
実施例７では、単層培養ＬＣＳＣ＃１（肺腺癌、その他の癌細胞を含め東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより入手）に対するＣＤ３−ＬＡＫ細胞とＣＤ５２−ＣＴＬ細胞との細胞傷害活性の比較に関する試験を行う。
【０１００】
ＬＣＳＣ＃１は、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０で２４穴プレート（コーニング）に単層になるまで培養した。Ｔ細胞は、実施例１と同様に、健常人から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、さらにナイロンウールカラムを通して得た。このようにして得たＴ細胞の抗体による刺激には、Ｔ細胞の刺激に有効な固相化抗体濃度に幅があるため（抗ＣＤ３抗体  １００ｎｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌ、抗４Ｃ８抗体及びキャンパス−１Ｈ  １−５０μｇ／ｍｌ）、実施例１とは異なる抗体量を用いた。
【０１０１】
ＣＤ３−ＬＡＫ細胞は、抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）を固相化した４８穴プレートを用いて３日間刺激して誘導し、その後ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の添加を３日ごとに繰り返し、大きなプレートに代えながら２週間培養増殖させた。
【０１０２】
１回刺激のＣＤ５２−ＣＴＬ細胞は、抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）と抗４Ｃ８抗体（５μｇ／ｍｌ）とを固相化したプレートを用いて、Ｔ細胞に１回目のＣＤ５２副刺激を３日間与え、その後ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を３日ごとに加えて、大きなプレートに代えながら２週間培養増殖させることによって得た。２回刺激のＣＤ５２−ＣＴＬ細胞は、上述のように１回目のＣＤ５２副刺激が与えられたＴ細胞のうちの一部のＴ細胞に対して、さらに２回目のＣＤ５２副刺激を３日間与えて培養することによって得た。斯かる培養法では、Ｔ細胞は１００倍から１０００倍に増殖した。また、斯かる培養法では、ＣＤ８＋Ｔ細胞が８０％前後を占めた。
【０１０３】
１×１０６／ｍｌの細胞数のＣＤ３−ＬＡＫ細胞、１×１０６／ｍｌの細胞数の１回刺激のＣＤ５２−ＣＴＬ細胞及び１×１０６／ｍｌの細胞数の２回刺激のＣＤ５２−ＣＴＬ細胞の夫々が浮遊する各１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０を、ＬＣＳＣ＃１が単層化された２４穴プレートの各穴に２ｍｌずつ添加し、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）存在下で共培養した。共培養７日目に、ＬＣＳＣ＃１をトリプシン処理で分離した後にトリパンブルー染色で直接顕鏡して当該ＬＣＳＣ＃１の生細胞数を数えた。実験はトリプリケートで行った。
【０１０４】
実施例７における試験では、図８に示すような結果が得られた。斯かる結果によれば、ＣＤ３−ＬＡＫ細胞によるＬＣＳＣ＃１に対する細胞傷害活性は８％であり、１回刺激のＣＤ５２−ＣＴＬ細胞によるＬＣＳＣ＃１に対する細胞傷害活性は３８％であり、２回刺激のＣＤ５２−ＣＴＬ細胞によるＬＣＳＣ＃１に対する細胞傷害活性は８０％であった。
【０１０５】
実施例７における試験の結果によれば、１回刺激のＣＤ５２−ＣＴＬ細胞の細胞傷害活性は、ＣＤ３−ＬＡＫ細胞の細胞傷害活性と比較して大幅に上昇していることが認められ、また、２回刺激のＣＤ５２−ＣＴＬ細胞の細胞傷害活性は、ＣＤ３−ＬＡＫ細胞の細胞傷害活性と比較して更に大幅に上昇していることが認められる。また、実施例７における試験の結果によれば、ＣＤ５２−ＣＴＬ細胞は、癌細胞ＬＣＳＣ＃１に対してＣＤ３−ＬＡＫ細胞よりも強い殺傷効果を有していることが認められる。
【実施例８】
【０１０６】
実施例８では、ＬＣＳＣ＃１のＳＣＩＤマウス腹腔内投与による致死効果に対するＣＤ５２−ＣＴＬ細胞の延命効果に関する試験を行う。
【０１０７】
ここでは、ＬＣＳＣ＃１を腹腔内に実際に移入した担癌動物を使って、ＣＤ５２−ＣＴＬ細胞の投与がＣＤ３−ＬＡＫ細胞に比べて高い延命効果を示すか否かを調べた。
【０１０８】
ＬＣＳＣ＃１は、実施例７と同様に培養されて単層化されたところで短時間トリプシン処理し、トリプシン処理による分離後にＰＢＳで洗浄・浮遊させたものを用いた。Ｔ細胞培養液は、実際の臨床使用を考慮して、ＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン）に自己血漿５％を加えたものを用いた。
【０１０９】
Ｔ細胞は、実施例７と同様にして健常人から得た。ＣＤ３−ＬＡＫ細胞は、抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）を固相化した４８穴プレートを用いて３日間刺激して誘導し、その後ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の添加を３日ごとに繰り返し、大きなプレートに代えながら２週間培養増殖させたものを用いた。ＣＤ５２−ＣＴＬ細胞は、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）と抗４Ｃ８抗体の代わりのキャンパス−１Ｈ（２０μｇ／ｍｌ）とを固相化したプレートを用いて１回目の刺激を３日間行い、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を３日ごとに加えて、大きなプレートに代えながら２週間培養増殖させ、増殖後さらに２回目の同刺激を３日間行い、最後の２４時間はＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）存在下で行ったものを用いた。このようにして得られたＣＤ３−ＬＡＫ細胞及びＣＤ５２−ＣＴＬ細胞の夫々は、後述のようにマウス腹腔内に４×１０７個ずつ投与された。
【０１１０】
ＬＣＳＣ＃１の投与前日、非特異的抗腫瘍活性のあるＮＫ細胞の活性を抑えるため、ＳＣＩＤマウス（７週齢、メス、日本クレアより入手）に抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬、１００μｇ／マウス）を腹腔内に投与した。ＳＣＩＤマウスを３匹ずつ３群（Ａ群、Ｂ群及びＣ群）に分けた。
【０１１１】
Ａ群は、ＬＣＳＣ＃１（１×１０７個／マウス）のみを腹腔内移入した３匹のＳＣＩＤマウスによって構成した。Ｂ群は、ＬＣＳＣ＃１（１×１０７個／マウス）を腹腔内に移入し、当該移入後から３日目及び５日目にＣＤ３−ＬＡＫ細胞（４×１０７個／マウス）を腹腔内に投与した３匹のＳＣＩＤマウスによって構成した。Ｃ群は、ＬＣＳＣ＃１（１×１０７個／マウス）を腹腔内に移入し、当該移入後から３日目及び５日目にＣＤ５２−ＣＴＬ（４×１０７個／マウス）を腹腔内に投与した３匹のＳＣＩＤマウスによって構成した。尚、Ｂ群及びＣ群のＳＣＩＤマウスの夫々の腰部皮下には、ＣＤ３−ＬＡＫ細胞及びＣＤ５２−ＣＴＬ細胞の夫々の腹腔内投与と同時にヒトＩＬ−２（５０００Ｕ）が注射された。コントロールとしてＡ群にも同量のヒトＩＬ−２（５０００Ｕ）が注射された。
【０１１２】
実施例８における試験では、図９に示すような結果が得られた。斯かる結果によれば、ＬＣＳＣ＃１のみを単独投与したＡ群のＳＣＩＤマウスは、癌細胞が腹腔内多臓器に播種した癌性腹膜炎を呈して４０日目に最後の１匹が死亡しており、また、Ａ群のＳＣＩＤマウスの平均生存日数は３１．３日であった。また、斯かる結果によれば、Ｂ群及びＣ群のＳＣＩＤマウスは最終的にはすべて死亡しており、Ｂ群のＳＣＩＤマウスの平均生存日数は３８．３日であり、Ｃ群のＳＣＩＤマウスの平均生存日数は４７．６日であった。
【０１１３】
実施例８における試験の結果によれば、Ｂ群及びＣ群のＳＣＩＤマウスの平均生存日数は、Ａ群のＳＣＩＤマウスの平均生存日数と比較すれば、夫々延長されたことが認められる。また、斯かる結果によれば、ＣＤ５２−ＣＴＬ細胞を投与したＣ群（ｐ＝０．０２５、Ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）には、Ａ群と比較して、統計学的に有意な延命効果が認められるが、Ｂ群には、Ａ群と比較して、統計学的に有意な延命効果が認められず、また、Ｃ群には、Ｂ群と比較しても統計学的に有意な延命効果が認められる（ｐ＝０．０２５、Ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】実施例１における試験結果に関する説明図である。
【図２】実施例１における試験結果に関する説明図である。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、実施例２における試験結果に関する説明図である。
【図４】実施例３における試験結果に関する説明図である。
【図５】実施例４における試験結果に関する説明図である。
【図６】実施例５における試験結果に関する説明図である。
【図７】実施例６における試験結果に関する説明図である。
【図８】実施例７における試験結果に関する説明図である。
【図９】実施例８における試験結果に関する説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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