(57)【要約】【課題】対象となる遺伝子の発現制御機能等を有する機能性核酸配列を、高い確度で選別して設計する。【解決手段】  設計候補の機能性核酸配列および、既知の該機能性配列から特徴抽出を行うカーネル法を用いて高次元特徴空間での教師付き学習により既知の機能性核酸配列データを訓練パターンとして活性判別モデルを構築または、判別モデルに帰着させて回帰させ、標的遺伝子に対して有効な機能性核酸を分析する。該機能性配列データを特徴空間に写像する計算方法にミスマッチ・ストリング・カーネルを用い、教師付き学習にサポート・ベクター・マシン（ＳＶＭ）または、サポート・ベクター・回帰（ＳＶＲ）を適用する。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性核酸配列の設計方法において、機能性核酸配列データから特徴抽出を行うカーネル法を用いて高次元特徴空間での教師付き学習により該機能効果の有無を判別分析または回帰分析させる方法。
【請求項２】
以下の特徴を有する請求項１記載の機能性核酸配列設計方法；
（１）既知の核酸配列、活性データおよび機能性核酸配列候補の塩基配列データを合わせ、該機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性有無に関わる特徴配列の計数をおこない、
（２）前記既知核酸の配列データの特徴ベクトルをサポート・ベクター・マシン（Support Vector Machine）に適用し学習モデルを構築する、
（３）前記モデルに対して機能性核酸配列の固定長塩基配列データを適用し、判別関数の値によって該機能効果の有無を判別分析させる。
【請求項３】
以下の特徴を有する請求項１記載の機能性核酸配列設計方法；
（１）既知の核酸配列、活性データおよび機能性核酸配列候補の塩基配列データを合わせ、該機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性有無に関わる特徴配列の計数をおこない、
（２）前記既知核酸の配列データの特徴ベクトルをサポート・ベクター・回帰（Support Vector Regression）に適用し学習モデルを構築する、
（３）前記モデルに対して機能性核酸配列の固定長塩基配列データを適用し、判別関数の値によって該機能効果の有無を回帰分析させる。
【請求項４】
機能性核酸配列データからの特徴抽出計算方法にミスマッチ・ストリング・カーネル（Mismatch String Kernel）を用いることを特徴とする請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
固定長の塩基配列が、塩基数２〜３０からなる請求項２または３記載の方法。
【請求項６】
機能性核酸が、短い干渉RNA（siRNA）、アンチセンス核酸、おとり型核酸（デコイ）、リボザイムまたはアプタマーである請求項１、２、３、４または５記載の方法。
【請求項７】
機能性核酸が、短い干渉RNA（siRNA）である請求項請求項１、２、３、４または５記載の方法。
【請求項８】
請求項1〜７に記載された方法をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータ読み取り可能なプログラム。
【請求項９】
機能性核酸配列の設計方法において、機能性核酸配列データから特徴抽出を行うカーネル法を用い、高次元特徴空間での教師付き学習により該機能効果の有無を判別分析または回帰分析させる装置。
【請求項１０】
以下の特徴を有する請求項９記載の機能性核酸配列設計装置；
（１）既知の核酸配列、活性データおよび機能性核酸配列候補の塩基配列データを合わせ、該機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性有無に関わる特徴配列の計数をおこない、
（２）前記既知核酸の配列データの特徴ベクトルをサポート・ベクター・マシン（Support Vector Machine）に適用し学習モデルを構築する、
（３）前記モデルに対して機能性核酸配列の固定長塩基配列データを適用し、判別関数の値によって該機能効果の有無を判別分析させる。
【請求項１１】
以下の特徴を有する請求項９記載の機能性核酸配列設計装置；
（１）既知の核酸配列、活性データおよび機能性核酸配列候補の塩基配列データを合わせ、該機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性有無に関わる特徴配列の計数をおこない、
（２）前記既知核酸の配列データの特徴ベクトルをサポート・ベクター・回帰（Support Vector Regression）に適用し学習モデルを構築する、
（３）前記モデルに対して機能性核酸配列の固定長塩基配列データを適用し、判別関数の値によって該機能効果の有無を回帰分析させる。
【請求項１２】
機能性核酸配列データからの特徴抽出計算方法にミスマッチ・ストリング・カーネル（Mismatch String Kernel）を用いることを特徴とする請求項９、１０または１１記載の装置。
【請求項１３】
固定長の塩基配列が、塩基またはアミノ酸数２〜３０からなる配列である請求項１１または１２記載の装置。
【請求項１４】
機能性核酸が、短い干渉RNA（siRNA）、アンチセンス核酸、おとり型核酸（デコイ）、リボザイムまたはアプタマーである請求項９、１０、１１、１２または１３記載の装置。
【請求項１５】
機能性核酸が、短い干渉RNA（siRNA）である請求項請求項９、１０、１１、１２または１３記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の機能解析に用いられている機能性核酸の設計方法に関する。
詳しくは、（１）標的遺伝子の発現抑制、翻訳阻害等の機能を有する機能性核酸配列の設計方法において、（２）統計的学習理論におけるカーネル法を用いた設計候補配列の翻訳阻害活性を高い確度で予測し、（３）機能制御等の効果を有する機能性核酸配列を選別して設計する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム情報の利用技術の確立は今日重要な研究課題となっている。そのゲノム情報の流れの中で、医学、農業、園芸および醗酵の分野を含む多くの商業上重要な産業において機能性核酸配列を用いた遺伝子発現機制御技術の果たす役割が近年非常に大きくなってきている。  
【０００３】
遺伝子発現制御技術において重要な手段は、RNA干渉（RNA interference、以下RNAi）、アンチセンス分子、センス分子、おとり型核酸、リボザイムおよびその他の遺伝子配列および／またはペプチドあるいは化学物質などの非核酸分子を使用して遺伝子配列の発現に影響を与えることである。
すなわち干渉RNA、アンチセンス核酸等、特定遺伝子の機能制御を果たす核酸は、創薬標的遺伝子を選定するターゲット・バリデーション（Target  Validation）、遺伝子機能解析などにおいて非常に有用なツールとなっている。
特に、RNA干渉は、標的遺伝子(メッセンジャーRNA、以下mRNA)を破壊すること（ノックダウン）で発現を抑制するため、遺伝子の機能解析に有効な方法として注目を集めている。
【０００４】
当初、哺乳類細胞に対しては、二本鎖RNAがインターフェロン反応による非特異的な阻害効果を引き起こすため、RNAiによるノックダウンは難しいと考えられてきた。しかし、2001年TuschlらによってRNAiの中間体で21〜23塩基からなる短い干渉RNA（small interfering RNAs、以下siRNA）を用いることにより、インターフェロン応答の経路を回避して、哺乳類細胞でRNAiを効率よく引き起こす事が示されたことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２)。
近年では、siRNAを用いることでRNAi技術が医薬への応用に広く利用されるようになってきた。
【０００５】
アンチセンス核酸は、ワトソン−クリックの塩基対形成により特定されるように、未成熟ｍＲＮＡもしくは成熟したｍＲＮＡのいずれかの相補的配列に特異的に結合してＤＮＡから蛋白質への遺伝情報の流れを阻害する。多大な数にのぼる最近の研究により、標的蛋白質を研究するための生化学的道具としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの利用性が証明されている(非特許文献３，非特許文献４)。
【０００６】
おとり型核酸は、染色体上に存在する、転写調節因子が結合する部位と特異的に結合する核酸およびその類似体である。喘息、癌、心臓病、動脈瘤、自己免疫疾患およびウイルス感染症などの種々の疾患は、それぞれ異なる症状を示すにもかかわらず、その大部分は、１種類または数種類のタンパク質が、異常発現（過剰発現または過少発現）したことに起因することが示唆されている。
一般に、これらタンパク質の発現は、種々の転写活性因子および転写抑制遺伝子などの転写調節因子によって制御されており、これら転写調節因子によって制御される遺伝子の発現に起因する疾患を処置する試みが報告されている(非特許文献５)。
【０００７】
上述の機能性核酸の設計は、目的遺伝子の発現に影響を与える機能を予測して設計することが非常に重要である。
例えば、siRNAの設計においては、標的mRNAに対して阻害活性を有する配列を選択することが重要である。
siRNA配列の決定方法は、経験的ルールから標的mRNAのsiRNAに用いる候補配列を選抜し、既知のsiRNA配列の特徴からsiRNA候補配列の翻訳阻害活性の推定を行い、RNAiに用いる配列の優先順位となる情報を付与する方法が一般的である。
【０００８】
具体的な方法は例えば、以下の方法が挙げられる。  
１、スタートコドンから、75塩基以上下流の最初のAAを見つける。
２、AAに続く19塩基を記録する。
３、AA-(N19)の配列のGCコンテンツが50%前後であることを確認する。
４、選択した21塩基を配列データベース（例、NCBI databaseのnrに対するBLAST-search）にかけて、配列が目的遺伝子に対して特異的であることを確認する。
その他では、EMBOSSのsirnaソフト（free ware；www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/Apps/sirna.html）等を用いても同様に選抜可能である。
【０００９】
アンチセンス核酸配列の決定方法は、標的mRNAの2次構造予測、好適な局所RNA2次構造モチーフ（ステム構造、ループ構造など）の同定、好適なターゲット配列に相補的なアンチセンス核酸配列の決定、分子内および分子間の非特異的相互作用の除外などによってなされる（非特許文献６）。標的mRNAの2次構造予測としては数種類のコンピュータープログラムが既に開発され、継続的にアップデートされている（非特許文献７、非特許文献８）。
【非特許文献１】Elbashir et al., Nature, 411, 494, 2001
【非特許文献２】実験医学  vol.20 No.18,2002
【非特許文献３】Rothenberg  et  al.,J.Natl.Cancer  Inst.  1989,81,1539-1544
【非特許文献４】Zon,  G.Pharmaceutical  Res.  1988,5,539-549
【非特許文献５】Tomita et al., Arthritis & Reumatism, 42, 2532, 1999
【非特許文献６】Far st al., Bioinformatics, 17, 1058, 2001
【非特許文献７】Mathews et al., J. Mol. Biol., 288, 911, 1999
【非特許文献８】Zuker et al., Curr. Opin. Struc. Biol., 10, 303, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前述のとおり遺伝子発現制御技術に用いる機能性核酸配列の設計は、目的遺伝子の発現に影響を与える機能を予測して設計することが非常に重要である。しかし、あらかじめ標的遺伝子に対する阻害効果を予測して配列を選択することはきわめて困難であり、十分に効果のある配列を見出すために多くの作業と時間を費やす必要があった。
【００１１】
例えば、ｍRNAに対する阻害活性の機能を有するsiRNAの配列の場合、あらかじめ上記のとおり経験的な指標で塩基配列を選抜するが、最初に見つけたAA-(N19)のGCコンテンツが50%から大きくずれている等条件に合致しなかった場合は、さらに下流のAA-(N19)を選択する等の作業が追加され、数千の塩基数を持つRNAから目的の配列を見いだすのは非常に非効率的であった。
あらかじめ標的遺伝子に対する阻害効果を予測して配列を選択することはきわめて困難であることから、１つの標的遺伝子について最低2〜4種類のsiRNAを設計する事が必要であった。場合によっては、10以上設計して試験を行っても、十分に効果のある配列を見つけられなかったりすることもあった。
【００１２】
また、従来のアンチセンス核酸の配列決定は標的mRNAの2次構造予測を介して行われていたが、その予測に用いる熱力学的パラメータは試験管内の理想状態で取得されたデータに基づくため、必ずしも細胞内での実際の構造を反映しているとは限らず、十分に効果のある配列を見つけられなかったりすることがあった（Ho et al., Nature Biotechnol., 16, 59, 1998）。
これらのことから、対象となる遺伝子の発現制御機能を有する機能性核酸配列を高い確度で選別して設計することは、実験のコスト軽減・効率化において非常に重要な課題であった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討の結果統計的学習理論におけるカーネル法と呼ばれる手法により目的遺伝子の発現制御機能活性の高い機能性核酸配列を選別する方法を確立した。
本発明者らは、カーネル法による機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性の有無に関わる特徴配列の計数をおこない、教師付き学習であるサポート・ベクター・マシン（ＳＶＭ）または、サポート・ベクター・回帰（ＳＶＲ）により、既知の機能性核酸配列データを訓練パターンとして活性判別モデルを構築または、判別モデルに帰着させて回帰させ、標的遺伝子に対して有効な機能性核酸を分析することで本発明を完成させた。
【００１４】
即ち本発明の特徴は、以下のとおりである、
［１］    機能性核酸配列の設計方法において、機能性核酸配列データから特徴抽出を行うカーネル法を用い、高次元特徴空間での教師付き学習により該機能効果の有無を判別分析または回帰分析させる方法。
［２］      以下の特徴を有する上記１記載の機能性核酸配列設計方法；
（１）既知の核酸配列、活性データおよび機能性核酸配列候補の塩基配列データを合わせ、該機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性有無に関わる特徴配列の計数をおこない、
（２）前記既知核酸の配列データの特徴ベクトルをサポート・ベクター・マシン（Support Vector Machine）に適用し学習モデルを構築する、
（３）前記モデルに対して機能性核酸配列の固定長塩基配列データを適用し、判別関数の値によって該機能効果の有無を判別分析させる。
［３］      以下の特徴を有する上記１記載の機能性核酸配列設計方法；
（１）既知の核酸配列、活性データおよび機能性核酸配列候補の塩基配列データを合わせ、該機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性有無に関わる特徴配列の計数をおこない、
（２）前記既知核酸の配列データの特徴ベクトルをサポート・ベクター・回帰（Support Vector Regression）に適用し学習モデルを構築する、
（３）前記モデルに対して機能性核酸配列の固定長塩基配列データを適用し、判別関数の値によって該機能効果の有無を回帰分析させる。
［４］      機能性核酸配列データからの特徴抽出計算方法にミスマッチ・ストリング・カーネル（Mismatch String Kernel）を用いることを特徴とする上記１、２または３記載の方法。
［５］      固定長の塩基配列が、塩基数２〜３０からなる上記２または３記載の方法。
［６］      機能性核酸が、短い干渉RNA（siRNA）、アンチセンス核酸、おとり型核酸（デコイ）、リボザイムまたはアプタマーである上記１、２、３、４または５記載の方法。
［７］    機能性核酸が、短い干渉RNA（siRNA）である上記上記１、２、３、４または５記載の方法。
［８］      上記1〜７に記載された方法をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータ読み取り可能なプログラム。
［９］      機能性核酸配列の設計方法において、機能性核酸配列データから特徴抽出を行うカーネル法を用い、高次元特徴空間での教師付き学習により該機能効果の有無を判別分析または回帰分析させる装置。
［１０］      以下の特徴を有する上記９記載の機能性核酸配列設計装置；
（１）既知の核酸配列、活性データおよび機能性核酸配列候補の塩基配列データを合わせ、該機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性有無に関わる特徴配列の計数をおこない、
（２）前記既知核酸の配列データの特徴ベクトルをサポート・ベクター・マシン（Support Vector Machine）に適用し学習モデルを構築する、
（３）前記モデルに対して機能性核酸配列の固定長塩基配列データを適用し、判別関数の値によって該機能効果の有無を判別分析させる。
［１１］      以下の特徴を有する上記９記載の機能性核酸配列設計装置；
（１）既知の核酸配列、活性データおよび機能性核酸配列候補の塩基配列データを合わせ、該機能性核酸配列データから特徴抽出による固定長の塩基配列を特徴ベクトルとして活性有無に関わる特徴配列の計数をおこない、
（２）前記既知核酸の配列データの特徴ベクトルをサポート・ベクター・回帰（Support Vector Regression）に適用し学習モデルを構築する、
（３）前記モデルに対して機能性核酸配列の固定長塩基配列データを適用し、判別関数の値によって該機能効果の有無を回帰分析させる。
［１２］      機能性核酸配列データからの特徴抽出計算方法にミスマッチ・ストリング・カーネル（Mismatch String Kernel）を用いることを特徴とする上記９、１０または１１記載の装置。
［１３］      固定長の塩基配列が、塩基数２〜３０からなる配列である上記１１または１２記載の装置。
［１４］      機能性核酸が、短い干渉RNA（siRNA）、アンチセンス核酸、おとり型核酸（デコイ）、リボザイムまたはアプタマーである上記９、１０、１１、１２または１３記載の装置。
［１５］    機能性核酸が、短い干渉RNA（siRNA）である上記上記９、１０、１１、１２または１３記載の装置。
［１６］    機能性核酸の配列の塩基数が、１５〜３０である上記１〜７記載の方法
［１７］    機能性核酸の配列の塩基数が、１５〜３０である上記９〜１５記載の装置
【発明の効果】
【００１５】
機能性核酸配列の設計方法において、該機能性配列データを特徴空間に写像する計算方法にカーネル法を用いて、サポート・ベクター・マシンまたは、サポート・ベクター・回帰により、該機能効果の有無を判別させることで、既知情報から高い確度での阻害活性の高い機能性核酸配列を選別することができるようになった。これにより、実験のコスト軽減・効率化が促進された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明における用語の定義について説明する
本発明において、
「機能性核酸」とは、目的遺伝子の発現に影響を与える機能を有する核酸配列のことをいう。例えば、ｍRNAを破壊して遺伝子発現を抑制する干渉RNA（RNAi）または、短い干渉RNA（siRNA）、核酸配列において目的のｍＲＮＡに相補的な遺伝子構造物であるアンチセンス核酸の他、おとり型核酸（デコイ）、リボザイムまたはアプタマー等が挙げられる。
「カーネル法」とは機械学習、基本属性で記述されたデータをカーネル関数という２つの対象間の関係を表す関数を用いて、判別あるいは回帰分析やクラスタリングを行う手法を意味する。
「教師付き学習」とは、入出力データが与えられているが、それらを近似する関数が分からない時に、データから関数のパラメータを推定することをいう。学習とは、学習機のパラメータを適当な学習則を用いることで、変化させることを示し、ここでいう学習機とは入出力関係を持ったもので 、ニューラル・ネットワーク（Neural Network） 、ラジアル・ベーシス・ファンクション・ネットワーク（Radial Basis Function Network）等、神経回路を模倣したもの或いはサポート・ベクター・マシン等、統計モデル全般を示す。
「判別分析」とは、いくつかの変数に基づいて，各データがどの群に所属するかを判定する分析方法で、例えば、線形判別分析、近傍法等が挙げられる。
「回帰分析」とは、順序尺度を含む量的な変数について、複数の独立変数によって１つの従属変数を説明する際に用いる解析方法で、例えば、データの散らばりに対して直線を当てはめることで、二つの変数の関係を要約する手法等が挙げられる。独立変数が１変数の場合の単回帰分析、独立変数が２変数以上の場合の重回帰分析等が挙げられる。
「サポート・ベクター・マシン」（以下ＳＶＭ）とは、あるカーネル関数によって特徴ベクトルを適切な特徴空間に写像した後に、２つのカテゴリー（クラス）を分離する超平面を２次計画問題の解により求める手法である。
求める超平面は、線形分離を実現するもののうち、超平面と訓練パターンの距離の最小値であるマージンの量を最大にするものであり、汎化能力の点で優れたものである。ＳＶＭ分析の概念は例えば、津田 宏治“サポートベクターマシンとは何か”, 電子情報通信学会誌, 83, 6, pp. 460--466, 2000のFigure 1に示されている。
「サポート・ベクター・回帰」（以下ＳＶＲ）とは、訓練データの入力・出力データをε−インセンシティブ  バンド（ε-insensitive band）と呼ばれる一定範囲内に収めるように学習させて、回帰問題をサポート・ベクター・マシンと類似した判別問題に帰着させる回帰分析手法である。カーネル関数を利用した非線形写像への展開や超高次元のデータに適用してもサポート・ベクター・マシンと同様に高い予測精度が得られる。ＳＶＲの概念は例えば、Scholkopf, B., et al. , “New support vector algorithms.” Neural Computation 12, 1207-1245の1209頁Figure 1に示されている。
「ミスマッチ・ストリング・カーネル（Mismatch String Kernel）」とは、連続して任意の固定長の塩基をｋ−ｍｅｒ例えば、ｋ＝３，ｋ＝４、ｋ＝５等、ｋを任意の塩基数で複数の各固定長出現回数を計数する手法である。ミスマッチ・ストリング・カーネルによる特徴配列抽出の概念を図３に示す。図３ではミスマッチ・ストリング・カーネルによる特徴抽出を具体的に説明するためｋ＝５の場合の配列断片抽出例を挙げている。
固定長の塩基数ｋ−ｍｅｒは、ｋ＝２〜３０の範囲であればよく、好ましくはｋ＝２〜２１が挙げられ、より好ましくはｋ＝２〜８が挙げられ、最も好ましくはｋ＝２〜５が挙げられる。ｋ−ｍｅｒは１−ｍｅｒの不一致を許容できる。
「カーネル関数」とは、入力パターンの元の特徴ベクトルを判別分析または回帰分析に適した高次元特徴空間に写像する関数である。例えば、入力ベクトル空間を２次の多項式のカーネル関数で変換された写像を用いるとすると、写像した先で線形識別を行うことは、もとの空間で２次の識別関数を構成することに対応する。
一般には、こうした非線形の写像によって変換した特徴空間の次元は非常に大きくなる傾向にあるが、ＳＶＭまたはＳＶＲにおいて、写像後の高次元空間における識別関数の内積計算を、特徴ベクトルの写像を計算せずに直接カーネル関数によって置き換えることによって、計算量を小さくする手法が使われている。これはカーネルトリックと呼ばれている。カーネル関数により写像された特徴空間が無限次元になることもあるが、線形識別器の汎化性能は特徴空間の次元数ではなくVC(Vapnik-Chervonenkis)次元に支配されるので、本質的に特徴空間の次元数と関係はない。この汎化性能と特徴空間の次元数の関係は関数解析におけるVC(Vapnik-Chervonenkis)理論によって証明されている(V.Vapnik , Statistical Learning Theory , Wiley, 1998)。
本発明のＳＶＭまたはＳＶＲのカーネル関数としては、多項式カーネル例えば、
【００１７】
【数１】
2005038377.tif 000002
ガウシアン・カーネル例えば、
【００１８】
【数２】
2005038377.tif 000003
シグモイドカーネル例えば、
【００１９】
【数３】
2005038377.tif 000004
などが挙げられる。
また、本発明のＳＶＲは例えば、Scholkopf, B., et al. , “New support vector algorithms.” Neural Computation 12, 1207-1245の1207頁〜1212頁 (1.1)〜(2.15)記載の数式で定式化される
本発明で使用されるＳＶＭソフトウエアは一般的に無償配布・市販されているものであればよく、TinyＳＶＭ、LIBSVM、SVM light等が挙げられる。
本発明で使用されるＳＶＲソフトウエアは一般的に無償配布・市販されているものであればよく、TinyＳＶＭ、LIBSVM等が挙げられる。
【００２０】
本発明の第一の態様は、機能性遺伝子の該機能効果を有する核酸配列を設計する方法である。
既知情報から得られる遺伝子の機能制御に対する活性を有する機能性核酸配列の計数データと目的遺伝子、例えば、ｍRNA等から抽出した機能性核酸配列候補から得られる計数データを、教師付学習（ＳＶＭまたは、ＳＶＲ）を用い、目的遺伝子の遺伝子発現制御効果の有無を判別または回帰分析させることによって機能性核酸配列を決定する設計方法である。
以下に、本発明の方法の手順を図１を参照して説明する。図１は、本発明の請求項１に記載の発明の原理を説明するための図である。
標的遺伝子の配列から設計候補配列データを入力し（ステップ１０１）、活性が既知の訓練配列データと設計候補配列データからカーネル法により特徴抽出を行う（ステップ１０２）。訓練データにより教師付き学習を行い（ステップ１０３）、このモデルを用いて設計候補配列データの判別または回帰分析を行う（ステップ１０４）。その分析結果から設計配列を選択する（ステップ１０５）。
本発明の請求項２に記載の方法について図１を参照して説明する。取得する機能性核酸配列の具体例として、siRNAを挙げて説明する。但し、これによって設計する機能性核酸の種類を限定するものではない。
図１の１０１で標的遺伝子であるmRNAから塩基数１０〜３０のオリゴヌクレオチドを抽出し、siRNA候補配列の入力データとする。候補配列は、配列設計の目的とするｍRNA上であればどこから抽出してもよい。例えば、従来の経験的ルールに基づいて開始部位が標的mRNAのスタートコドンより75塩基以上下流でAAで始まり、GC含量が４０〜７０％の配列を選択すること等が挙げられる。
１０２でRNAiの遺伝子発現抑制効果が既知のsiRNA配列をミスマッチ・ストリング・カーネルでの計数により固定長の塩基配列の特徴抽出を行い、１０１で抽出した候補配列とを合わせ、特徴配列の出現度数を計数する。
または、１０２でRNAiの遺伝子発現抑制効果が既知のsiRNA配列および、１０１で抽出した候補配列を合わせ、ミスマッチ・ストリング・カーネルでの計数により固定長の塩基配列の特徴抽出を行い、特徴配列の出現度数を計数する。
上記固定長の塩基数ｋ−ｍｅｒは例えば、ｋ＝３，ｋ＝４，Ｋ＝５等、ｋ＝任意の数で、それぞれのｋ−ｍｅｒで１−ｍｅｒの不一致を許容した複数のｋ−ｍｅｒが挙げられる。本発明では、前記複数の各固定長配列の出現回数を計数する。
１０３で１０２の方法にて特徴抽出したRNAiの遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列データと１０１で抽出した候補配列データを分離し、遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列データのみでＳＶＭによる既知機能性核酸配列の情報モデルを構築する。構築する際に計数データである入力ベクトル空間を非線形特徴空間に写像するためにカーネル関数を用いる。
【００２１】
具体的には、１０２で得られた計数データからRNAiの遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列と標的mRNAへのsiRNA候補配列の計数データを再び分離し、遺伝子発現抑制効果が既知のデータのみで、ＳＶＭによるモデルを構築する。この際、計数データ（入力ベクトル空間）を非線形特徴空間に写像する場合、カーネル関数を用いることができる。カーネル関数は例えば、多項式カーネル、ガウシアンカーネル、シグモイドカーネル等が挙げられ、好ましくは、多項式カーネルが挙げられる。
本発明における多項式カーネルは例えば、以下のように定義される
【００２２】
【数４】
2005038377.tif 000005
【００２３】
１０４で配列の分析を行う。決定方法は、RNAiの遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列データによって構築されたＳＶＭのモデルに対して、機能性核酸配列候補配列のデータを適用し、判別分析結果と判別関数を得る。
１０５でsiRNA候補配列の判定を行い選別する。具体的には、判別関数によって得られた値が正の場合は活性有り、負の場合は活性なしと判断する。判定は、１０４の方法で得られた判別分析結果と判別関数の値の大きさにより、siRNA候補配列の中で実験に用いる配列の候補を選別する。
候補となる配列は、遺伝子発現抑制効果の見込める判別関数の値が大きいものを優先的に選別する。
設計候補となる配列の塩基数は、１５〜３０の範囲であればよく、好ましくは１５〜２５が挙げられ、より好ましくは１８〜２３が挙げられ、最も好ましくは１８〜２１が挙げられる。
【００２４】
ＳＶＭモデル構築に用いる解析用モデル構築対象データは阻害活性が既知の機能性核酸配列であれば取得先は限らていない。例えば、in houseにおけるsiRNA活性データまたは、既存のデータベース（例えば、日本バイオサービス社のホームページ：http://www.jbios.co.jp/）等から取得できる。
解析用モデル構築において、阻害活性無しの基準は、阻害活性が５０％以下のものであればよく、好ましくは３０％以下のものを基準とする。
【００２５】
本発明の請求項３に記載の方法について図１を参照して説明する。取得する機能性核酸配列の具体例として、siRNAを挙げて説明する。但し、これによって設計する機能性核酸の種類を限定するものではない。
図１の１０１〜１０３は前記１０１〜１０３と同様の方法で特徴抽出したRNAiの遺伝子発現抑制効果が知の機能性核酸配列データと１０１で抽出した候補配列データを分離し、遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列データのみでＳＶＲによる既知機能性核酸配列の情報モデルを構築する。構築する際に計数データである入力ベクトル空間を非線形特徴空間に写像するためにカーネル関数を用いる。
【００２６】
具体的には、１０２で得られた計数データからRNAiの遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列と標的mRNAへのsiRNA候補配列の計数データを再び分離し、遺伝子発現抑制効果が既知のデータのみで、ＳＶＲによるモデルを構築する。この際、計数データ（入力ベクトル空間）を非線形特徴空間に写像する場合、カーネル関数を用いることができる。カーネル関数は例えば、多項式カーネル、ガウシアンカーネル、シグモイドカーネル等が挙げられ、好ましくは、多項式カーネルが挙げられる。
上記ＳＶＲにおけるカーネルは例えば、以下のような標準化線形カーネル関数K(x,y)を使用することができる。
【００２７】
【数５】
2005038377.tif 000006
ここで、x,yは任意のsiRNA配列であり、Φ(xk),Φ(yk)はk-merで1-merの不一致を許容して計数した配列特徴ベクトルを意味する。
【００２８】
１０４で配列の分析を行う。決定方法は、RNAiの遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列データによって構築されたＳＶＲのモデルに対して、機能性核酸配列候補配列のデータを適用し、回帰分析結果を得る。回帰分析のアルゴリズムには例えば、Scholkopf, B., et al. , “New support vector algorithms.” Neural Computation 12, 207-1245記載のν-SVRを用いることができる。
１０５でsiRNA候補配列の回帰分析を行い選別する。具体的には、サポート・ベクター・マシンのアルゴリズムを利用した回帰分析方法よって得られたノックダウン活性入出力情報（配列特徴ベクトル,活性情報）から定量的活性予測モデルを構築し、新規配列の定量的活性を予測する。  
設計候補となる配列は、遺伝子発現抑制効果の見込める判別関数の値が大きいものを優先的に選別する。
設計候補となる配列の塩基数は、１５〜３０の範囲であればよく、好ましくは１５〜２５が挙げられ、より好ましくは１８〜２３が挙げられ、最も好ましくは１８〜２１が挙げられる。
【００２９】
ＳＶＭまたはＳＶＲモデル構築に用いる解析用モデル構築対象データは阻害活性が既知の機能性核酸配列であれば取得先限られず、in houseにおけるsiRNA活性データまたは、既存のデータベース（日本バイオサービス社のホームページ：http://www.jbios.co.jp/）等から取得できる。
【００３０】
本発明の第２の態様は、本発明の設計方法をコンピュータで読みとり可能なプログラムとしたものである。
図１の１０１〜１０５の設計方法を実行させるプログラムで、これらは、図１に示したアルゴリズムの手順にそって１つのモジュールであっても、それぞれのパート毎に書かれたモジュールを組み合わせて使用してもよい。これらは磁気ディスク等の記録媒体に記録されている。
【００３１】
本発明の第３の態様は、本発明の設計方法を実行させる装置である。
本発明解析方法を実行させる装置を図２に示す。２０１〜２０４は、本発明の方法にてデータ入力、計数、分析、選別に使用するための装置である。２０５は２０１〜２０４の装置の実行結果を出力するための装置である。
２０１の装置で、siRNA候補として標的mRNAよりオリゴヌクレオチドを抽出し、RNAiの遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列とを合わせ、Mismatch String Kernelよる連続して任意の固定長の塩基を抽出し、特徴配列の出現度数を計数する。
２０２の装置でＳＶＭまたＳＶＲにて遺伝子発現抑制効果が既知の機能性核酸配列によるモデルを構築する。
２０３の装置でsiRNA候補配列の分析を行う。２０２の装置で構築されたＳＶＭまたはＳＶＲのモデルに対して、機能性核酸配列候補配列の判別分析結果と判別関数を算出する。
２０４で２０３の装置で得られた計数結果をもとにsiRNA候補配列の判定を行い阻害活性の有無を選別する。
２０１〜２０４の装置の実行結果は２０５の装置で紙などの記録媒体に印刷することもでき、２０６の装置のディスプレイで表示することもでき、２０７の装置で、ＦＤ，ＭＯ，ＣＤ−ＲＷ，ＤＶＤ−ＲＷ等の磁気または、磁気光ディスク、光ディスク等の記録媒体に出力することもできる。
２０１〜２０７の装置は、全てが一体化した装置でも、各々が分離した装置でも、一部が一体化した装置またそれらを組み合わせた装置であってもよい。
上記の装置は、電子計算機であればよく、サーバー、パーソナルコンピュータ（以下ＰＣ）等が挙げられ、計算機の能力は制限しない。
本発明解析方法を実行させるプログラムを動作させるオペレーションシステムも汎用ソフトウェア（例えば、Linux系OS、マイクロソフトウインドウズ（登録商標）シリーズ等でよい。
以下、本発明設計方法の実施例を挙げる。
【実施例１】
【００３２】
ＳＶＭによるsiRNA阻害活性予測
in houseにおけるsiRNA活性データ(60本)を用いて活性予測モデルを構築し、以下の配列（siRNAs generated by recombinant human Dicer  induce specific and significant but target site-independent gene silencing in human cells,981-987,No.3,Vol31,Nucleic Acids Research）で実験的に検証された公開活性・配列データをＳＶＭ判別分析によって予測した。
（１）カーネル法による配列の特徴抽出
ピューロマイシン抵抗（Puromycin-resistance） mRNAおよび、H-ras(各mRNAごとに10本、計20本)のデータを用い、特徴抽出のための固定長配列は３，４，５，６−ｍｅｒを使用しそれぞれ１−ｍｅｒの不一致を許容して計数した。
活性、非活性の閾値は50%の阻害活性を基準とした。
（２）予測結果
既知活性データにおいて活性有りが１，  非活性が−１であり、計算値のスコアが正の場合は活性有、負の場合は非活性と予測されたことを意味する。結果を表１に示す。表中prは、ピューロマイシン抵抗 mRNAを表し、hrasは、H-rasを表し、site番号は論文中で設計されたsite番号と一致する順序である。
【００３３】
【表１】
2005038377.tif 000007
SVMによる判別結果とスコアの双方を参考にして、siRNA配列を選抜すると阻害活性のあるsiRNA配列を選抜可能であることが示された。
解析の結果、既知活性データの判定結果との正解率は75%(15/20本一致)あるが、siRNA配列候補は、予測スコアの降順に選択するため、活性を有する配列が選択される確度は非常に高いことが示された。判別結果が誤っている場合でもスコアの降順に選べば、必ず阻害活性のあるsiRNA配列を選抜することが可能である。
【実施例２】
【００３４】
ＳＶＲによるsiRNA阻害活性予測
in house及び文献におけるsiRNA活性データ(88本)を用いて活性予測モデルを構築し、以下の配列（siRNAs generated by recombinant human Dicer  induce specific and significant but target site-independent gene silencing in human cells,981-987,No.3,Vol31,Nucleic Acids Research）で実験的に検証された公開活性値・配列データをＳＶＲ回帰分析で予測した。
（１）カーネル法による配列の特徴抽出
ピューロマイシン抵抗（Puromycin-resistance） mRNA、H-ras(各mRNAごとに10本、計20本)のデータを用い実施例１と同様の方法で計数した。特徴抽出のための固定長配列数もも実施例１と同様に、2,3,4,5-merで1-merの不一致を許容して計数した。固定長毎に出現回数を標準化するために、以下のような標準化線形カーネル関数K(x,y)を使用した。
K(x,y)= Σk<Φ(xk),Φ(yk)>/ <Φ(xk),Φ(xk)><Φ(yk),Φ(yk)>
ここで、x,yは任意のsiRNA配列であり、Φ(xk),Φ(yk)はk-merで1-merの不一致を許容して計数した配列特徴ベクトルを意味する。
（２）予測結果
（１）の方法により得られる特徴ベクトルを入力データ、既知活性値を出力データとしてＳＶＲによる回帰分析を行った。回帰分析のアルゴリズムにはν-SVRを用いた。
実施結果を表２、図１に示す。予測活性値が70%以上のsiRNA配列は実測値においても70%以上の活性値を有することが判明した。
表中prは、ピューロマイシン抵抗 mRNAを表し、hrasは、H-rasを表し、site番号は論文中で設計されたsite番号と一致する順序である。
【００３５】
【表２】
2005038377.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００３６】
機能性核酸配列の設計方法において、該機能性配列データを特徴空間に写像する計算方法にカーネル法を用い、サポート・ベクター・マシンまたは、サポート・ベクター・回帰により、該機能効果の有無を判別させることで、既知情報から高い確度での阻害活性の高い機能性核酸配列を選別することができるようになった。これにより、あらかじめ標的遺伝子に対する阻害効果を予測して配列を選択することが容易になり、実験のコスト軽減および効率化の促進に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明方法の原理を説明した図である。
【図２】本発明方法およびプログラムを実行させる装置の構成を示す機能ブロック図である。
【図３】Mismatch String Kernelによる配列断片の概念を表した図である。具体例としてk-merがｋ＝５の場合の特徴配列抽出の概念を挙げた図である。
【図４】ＳＶＲ分析による実測値および予測値の相関図である
【符号の説明】
【００３８】
１０１  設計候補配列データ入力ステップ
１０２  特徴抽出を行うステップ
１０３  教師付き学習ステップ
１０４  分析ステップ
１０５  設計配列選択ステップ
２０１  データを入力部および特徴抽出部
２０２  教師付き学習部
２０３  判別または回帰部
２０４  候補配列分析部
２０５  出力部
２０６  画像処理及び画像出力部
２０７  記録媒体出力部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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