(57)【要約】      （修正有）【課題】  ホスホリルコリン基を含有する新規な化合物、及び該化合物からなる表面改質剤の提供。この表面改質剤は、生体適合性、タンパク質吸着抑制、保湿性、その他に様々な有用な機能を物体に付与するものである。【解決手段】式（１）で示されるホスホリルコリン基含有化合物。（１）2005187456.tif 000035  式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。  Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。  Ｒは（２）：−（ＣＨ2）L−，（３）：−ＣＯ−（ＣＨ2）L−，（４）：−（ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2）P−の構造のいずれかであり、式（２）〜（４）中、Ｌは１〜６、Ｐは１〜３を表す。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基含有化合物。
【化１】
2005187456.tif 000029
（１）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
Ｒは下記式（２）〜（４）中の構造のいずれかである（ただし、下記式（２）〜（４）構造において、式（１）の化合物をＡ−Ｒ−Ｂで表す）。
【化２】
2005187456.tif 000030
（２）
【化３】
2005187456.tif 000031
（３）
【化４】
2005187456.tif 000032
（４）
式（２）〜（４）中、Ｌは１〜６、Ｐは１〜３を表す。
【請求項２】
下記式（５）または（６）で示されるホスホリルコリン基含有化合物。
【化５】
2005187456.tif 000033
（５）
【化６】
2005187456.tif 000034
（６）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
【請求項３】
請求項１または２記載のホスホリルコリン基含有化合物からなる表面改質剤。
【請求項４】
グリセロホスホリルコリンの過ヨウ素酸ナトリウムと三塩化ルテニウムによる酸化反応によってカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を合成し、アミノ基を有する有機シラン化合物とカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体から縮合剤によって合成されることを特徴とする前記式（６）記載の化合物の製造方法。
【請求項５】
請求項３記載の表面改質剤で処理された改質粉体。
【請求項６】
請求項３記載の表面改質剤で処理された改質担体からなるクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
請求項３記載の表面改質剤で処理されたフィルター。
【請求項８】
請求項３記載の表面改質剤で表面処理されたガラス製実験器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホスホリルコリン基を含有する新規な化合物、及び該化合物からなる表面改質剤、該表面改質剤により改質された改質粉体、該改質粉体を担体として利用したクロマトグラフィー用充填剤、該表面改質剤により改質されたフィルター及びガラス製実験器具に関する。
【０００２】
本発明の化合物からなる表面改質剤は、生体適合性、保湿性、その他の様々な有用な機能を物体に付与する。
【背景技術】
【０００３】
ホスホリルコリン基を有する重合体は生体適合性高分子として検討されており、この重合体を各種基剤に被覆させた生体適合性材料が開発されている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンの単独重合体及び共重合体で被覆した粉末を、化粧料用粉末として利用して保湿性や皮膚密着性を改善した化粧料が開示されている。
【０００５】
また、特許文献２及び特許文献３には、ホスホリルコリン基を有する重合体で被覆した医療用材料や分離剤が開示されている。
【０００６】
上記の材料は、主に水酸基を有するアクリル系モノマーと２−クロロ−１，３，２−ジオキサホスホラン−２−オキシドを反応させ、更にトリメチルアミンにより４級アンモニウムとすることによりホスホリルコリン構造を有するモノマーを合成しこれを重合して得られる重合体により、その表面が被覆されたものである（重合体の製造方法に関しては特許文献４及び５を参照）。
【０００７】
特許文献４には、２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステルの共重合体が製造され、特許文献５には２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンの単独重合体が製造されている。
【０００８】
一方、タンパク質やタンパク質よりも分子量が小さいポリペプチド等の生体試料をサイズ排除によって分離するＧＦＣ用充填剤には、多くの市販品が存在する。このＧＦＣ用充填剤には、架橋された親水性高分子を担体とする充填剤と、シリカゲルを担体とする充填剤が存在する。
【０００９】
架橋された親水性高分子を担体とする充填剤は、適用できる移動相のｐＨ範囲が広く、汎用性が高い。しかしながら、高分子を担体とする充填剤はシリカゲルを担体とする充填剤よりも、（１）細孔径の制御が困難であるために高理論段数を得づらい。また、（２）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で使用される際にかかる高圧条件に対する強度が悪いことと移動相溶媒によって粒子が膨潤することのために再現性のよいクロマトグラムを得られないことも多い。
【００１０】
シリカゲルを担体とする充填剤は、タンパク質やポリペプチドのシリカゲル担体表面への吸着が問題となる。そこで、分析試料中のタンパク質やポリペプチドのシリカゲルへの吸着を抑制する目的で、非解離性の親水性基によって表面が修飾されたシリカゲルを用いた充填剤が市販されている。
【００１１】
例えば、シリカゲル系ＧＦＣ用カラムとして、昭和電工株式会社からは、Ｓｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ−８０３（製品名）が市販されている。このシリカゲル系カラムは、カタログに、分子量数千から１００万程度のタンパク質の分析に適したシリカゲル系のＧＦＣモードのカラムであると説明されている。
また、株式会社ワイエムシィからは、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ（製品名）が市販されている。これもシリカゲル系のＧＦＣ用カラムであり、ジオール構造を有する官能基をシリカゲル担体に化学結合させたもので、分子量一万から数十万のタンパク質の分離に適用できると説明されている。
【００１２】
非特許文献１には、担体上に化学的にグラフトされたホスホリルコリン基により、タンパク質の吸着が減少することが記載されている。
【００１３】
また、特許文献６および７には、優れた親水性を示すことで知られているベタイン構造を有する有機シラン系表面改質剤（シランカップリング剤）が開示されている。特許文献６では、ジメチルアミノアルキルシランを有機溶媒中１，３−プロパンスルトンと反応させることで、４級アンモニウムの正電荷とスルホン酸の負電荷からなるスルホベタインを有するシランカップリング剤を得ることができるとされている。特許文献７では、４級アンモニウムとカルボキシル基からなるカルボキシベタインを有するシランカップリング剤の製造方法が記載されている。これらのシランカップリング剤は、ガラス等に塗布し、乾燥させることで物質表面を改質することが可能である。しかし、これらの構造のベタインでは物質表面に優れた親水性を付与することができても、ベタイン中の正電荷と負電荷の強さに偏りがあるために電気的に中性にはならない。例えば、スルホベタインではスルホン酸の強酸性によって負電荷を帯び、カルボキシベタインでは４級アンモニウムによる正電荷の性質が現れる。このようなベタイン構造ではタンパク質との間で強すぎるイオン交換相互作用を生じ、タンパク質の非可逆的な吸着をもたらす。
一方、生体適合性やタンパク質吸着の抑制を目的としてこれらのシランカップリング剤が、クロマトグラフィー用充填剤やフィルター類及び実験器具類に用いられた例はない。
【特許文献１】特開平７−１１８１２３号公報
【特許文献２】特開２０００−２７９５１２号公報
【特許文献３】特開２００２−９８６７６号公報
【特許文献４】特開平９−３１３２号公報
【特許文献５】特開平１０−２９８２４０号公報
【特許文献６】特開平５−２２２０６４号公報
【特許文献７】特開昭６３−２９５５９３号公報
【非特許文献１】Ｊｉａｎ  Ｒ．Ｌｕ等、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００１、１７、３３８２−３３８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、ホスホリルコリン基を有する重合体により、物体の表面を被覆して改質する方法では、表面全体を効果的に被覆することは難しい。また、被覆した重合体が物体から剥離するため、耐久性に問題が生じる場合がある。さらには、物体の表面が重合体により被覆されるため、ホスホリルコリン基による生体適合性等の目的とする機能を付与する目的から逸脱して、物体自体に要求されている、細孔等の微細構造のような基本的性質が失われる場合もある。
【００１５】
また、ホスホリルコリン基の誘導体を低分子として物体に導入する場合でも、物体にホスホリルコリン基の誘導体と反応させることができる官能基を先に導入し、ついでホスホリルコリン基の誘導体を反応させる方法では、物体表面に未反応の官能基が物体表面に残るために生体適合性の低下に繋がる。
【００１６】
例えば、まず物体表面にアミノ基を導入し、次にホスホリルコリンのアルデヒド誘導体を物体表面のアミノ基と反応させる場合、多くの未反応のアミノ基が残存してしまう。これらの残存アミノ基は別の低分子化合物を結合させることによってある程度封鎖することが可能であるが、物体表面の親水性を維持することが困難であるうえに全てを封鎖することはできない。物質表面にアミノ基が残存する場合、アミノ基は強い塩基性を有しているために、主に酸性のタンパク質が著しく強いイオン交換的な相互作用を示し、そのほとんどが吸着してしまう。クロマトグラフィー用充填剤としてとらえた場合は当該タンパク質の回収率の悪化や、ピークの著しいテーリングの原因となる。さらに、タンパク質の吸着はその変性をもたらし、生体適合性素材としてとらえた場合は炎症などの原因となるため好ましくない。
【００１７】
本発明は、ホスホリルコリン基を含有する化合物と、この化合物と反応する官能基を有し、かつ、物体表面と結合を生じる官能基を持つ物体とを直接反応させると、簡便かつ高い汎用性をもって、希望する任意の量ホスホリルコリン基を、物体表面に直接付与出来ることを見出した。
そして、該化合物からなる表面改質剤により、改質粉体、該改質粉体を担体として利用したクロマトグラフィー用充填剤、該表面改質剤により改質されたフィルター及びガラス製実験器具が容易に製造できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
すなわち、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基含有化合物を提供するものである。
【化７】
2005187456.tif 000002
（１）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
Ｒは下記式（２）〜（４）中の構造のいずれかである（ただし、下記式（２）〜（４）構造において、式（１）の化合物をＡ−Ｒ−Ｂで表す）。
【化８】
2005187456.tif 000003
（２）
【化９】
2005187456.tif 000004
（３）
【化１０】
2005187456.tif 000005
（４）
式（２）〜（４）中、Ｌは１〜６、Ｐは１〜３を表す。
【００１９】
また、本発明は、下記式（５）または（６）で示されるホスホリルコリン基含有化合物を提供するものである。
【化１１】
2005187456.tif 000006
（５）
【化１２】
2005187456.tif 000007
（６）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
【００２０】
また、本発明は、上記のホスホリルコリン基含有化合物からなる表面改質剤を提供するものである。
【００２１】
また、本発明は、グリセロホスホリルコリンの過ヨウ素酸ナトリウムと三塩化ルテニウムによる酸化反応によってホスホリルコリン基およびカルボキシル基を有する化合物を合成し、アミノ基を有する有機シラン化合物とホスホリルコリン基およびカルボキシル基を有する化合物から縮合剤によって合成されることを特徴とする前記式（６）記載の化合物の製造方法を提供するものである。
【００２２】
さらに、本発明は、上記の表面改質剤で処理された改質粉体を提供するものである。
【００２３】
また、本発明は、上記の表面改質剤で処理された改質担体からなるクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【００２４】
さらに、本発明は、上記の表面改質剤で処理されたフィルターを提供するものである。
【００２５】
また、本発明は、上記の表面改質剤で表面処理されたガラス製実験器具を提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の化合物、該化合物からなる表面改質剤を使用すれば、各種物体の表面を、一段階の極めて簡便な反応によって、希望する任意の量のホスホリルコリン基を付与することが可能である。その結果、ホスホリルコリン基により希望する機能を有する改質粉体、該改質粉体を担体として利用したクロマトグラフィー用充填剤、該表面改質剤により改質されたフィルター及びガラス製実験器具が容易に製造できる。
【００２７】
さらに詳しく言えば、本発明によれば、タンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少ないホスホリルコリン基を、簡便かつ定量的に物体表面の微細構造を損なうことなく導入することができる。また、ホスホリルコリン基以外の未反応官能基が導入されることも無いために、極めて生体適合性の高い素材を提供することが可能である。
【００２８】
シリカゲル等のクロマトグラフィー用担体に適用した場合は極めて優れたＧＦＣ用充填剤となる。本発明の表面改質剤を用いて合成されるクロマトグラフィー用充填剤の特徴は、ＧＦＣモードに起因する分子量の違いによる分離はもちろんのこと、タンパク質やポリペプチドの持つ等電点や疎水性の違いに応じた、優れた分離能を有することである。
さらに、イオン交換性や疎水性は移動相の塩濃度やｐＨに応じて調節することができるために、タンパク質に応じたユニークな分離をすることが可能である。そのうえ、タンパク質が粉体表面に非可逆的吸着を起こすことがないので、タンパク質の変成、失活を伴うことなく分離・分取・分析することが可能である。
【００２９】
フィルター及びガラス製実験器具を本発明の表面改質剤を用いて処理した場合は、極めてタンパク質吸着の少ないフィルター及びガラス製実験器具を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
なお、本発明の化合物は、精製、非精製を問わず表面改質が可能で、タンパク質吸着抑制などの効果を得ることができる。
【００３１】
下記式（１）、または（５）若しくは（６）で示されるホスホリルコリン基含有化合物は新規化合物である。
【化１３】
2005187456.tif 000008
（１）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
Ｒは下記式（２）〜（４）中の構造のいずれかである（ただし、下記式（２）〜（４）構造において、式（１）の化合物をＡ−Ｒ−Ｂで表す）。
【化１４】
2005187456.tif 000009
（２）
【化１５】
2005187456.tif 000010
（３）
【化１６】
2005187456.tif 000011
（４）
式（２）〜（４）中、Ｌは１〜６、Ｐは１〜３を表す。
【化１７】
2005187456.tif 000012
（５）
【化１８】
2005187456.tif 000013
（６）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
【００３２】
「式（１）、または（５）若しくは（６）のホスホリルコリン基含有化合物の製造方法」
下記式（７）に示したホスホリルコリン誘導体を蒸留水に溶解させる。下記式（７）のホスホリルコリン誘導体は公知の化合物であり市販品を入手できる。
【化１９】
2005187456.tif 000014
（７）
【００３３】
式（７）の化合物の水溶液を氷水浴中で冷却し、過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより下記式（８）に示すアルデヒド基を有するホスホリルコリン誘導体を抽出する。構造式及びＮＭＲスペクトルを図１に、Massスペクトルを図１８に示す。
【化２０】
2005187456.tif 000015
（８）
【００３４】
次に、式（８）のメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを０．５当量添加する。この混合溶液を室温で所定時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウムを適量添加し、室温に戻して１６時間撹拌する。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続ける。沈殿をろ過した後、式（５）及び／又は式（６）のメタノール溶液を得る。
【００３５】
次に、本発明の化合物の精製方法について説明する。本発明の化合物の精製方法は以下に限るものではない。
得られたメタノール溶液を減圧濃縮し、残留物を蒸留水に溶解させる。この水溶液を試料とする。疎水性相互作用とカチオン交換能を有する高速液体クロマトグラフィー用カラムである、カプセルパックＳＣＸ ＵＧ８０ Ｓ−５ （サイズ：４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）（株式会社資生堂）をＨＰＬＣ装置に接続し、０．２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）を１ｍＬ／分の流速で流して平衡化させたのちに、試料を１０μＬ注入する。検出器として示差屈折計を用いることでクロマトグラムを得られ、目的とする化合物を単離することができる。
ただし、本発明の化合物からなる表面改質剤は、精製前のメタノール溶液の段階で、そのまま用いることが可能である。
【００３６】
上記の手順は、式（５）または（６）に示した化合物中のｍ、ｎが変わっても同様に行うことができる。ここで示した手順はｍ＝３、ｎ＝２の場合である。さらにアミノ基を有するシラン化合物として３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン等を用いることによってシラン部位とホスホリルコリン基の間に２級アミンを挿入することも可能で、これについても上記と同様の手順で行うことができる。反応溶媒は特に限定されず、上述したメタノール以外にも水や、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒を用いることができる。ただし、反応中の有機シラン化合物の重合を防ぐためには脱水溶媒が好ましい。
また、式（５）または（６）中のメトキシ基（ＯＣＨ3）がエトキシ基（ＯＣ2Ｈ5）である場合にはメタノールをエタノールに変えて反応を行い、Ｃｌの場合はジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドに変更する。
さらには、Ｓｉと結合するメトキシ基またはエトキシ基またはＣｌの内、２つまたは１つがメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれかで置換されている場合も上記の手法と同様に製造することができる。
【００３７】
「表面改質剤」
上記式（５）および（６）の化合物は物質の表面改質剤として有用である。すなわち、物質表面に容易に希望する量のホスホリルコリン基を導入して改質するものである。具体的には、水酸基を表面に有している物質の場合、その物質表面の水酸基と式（５）および（６）の化合物のＳｉ−ＯＣＨ3から脱水反応によって化学結合を形成させる。この化学反応はほとんどの有機溶媒中で、１０℃から２５０℃の温度範囲で極めて容易に定量的に進行する。この脱水反応によって化学的、物理的に極めて安定なホスホリルコリン基による表面改質を施すことができる。
【００３８】
なお、物質表面に水酸基が存在しない場合は、式（５）および（６）の化合物を揮発性溶媒に溶解させ、その溶液を物質表面に塗布、溶媒を乾燥させる方法が有効である。具体例としては、式（５）および（６）の化合物をメタノールに溶解させ、それを物質表面に塗布する。次に１０℃から２５０℃の温度範囲でメタノールを気化させる。さらに必要に応じて加熱処理を行う。このとき、式（５）および（６）の化合物のＳｉ−ＯＣＨ3どうしが脱水反応を起こし、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を生成し、物質表面を被覆することが可能である。Ｓｉ−ＯＣＨ3どうしが脱水反応を起こしＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を生成する反応は公知である。メタノールの揮発の際にこのように生成する膜は、ほとんどの物質表面に微量に存在する水酸基と所々で結合を生じるために安定性の良好な表面改質法となる。本法は水酸基を持たない物質のみならず、水酸基を有する物質についても極めて有効な表面改質法である。
【００３９】
本発明の表面改質剤により改質される物質（若しくは素材）は、生体適合性及び親水性に優れた材料及び成形品となる。生体適合性を有するホスホリルコリン基を素材表面に直接有する材料として、化粧料、医用材料（人工臓器、手術用器具など）、クロマト用充填剤、塗料等、幅広い用途に応用可能である。
また、本発明の表面改質剤は、分離若しくは分析装置用の配管、配管接続部品、サンプリングのためのニードル、サンプルバイアル、検出器セル等の試験液が接触する部材の改質方法として有用であり、特には、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＮＭＲの接続配管や電気泳動装置のキャピラリー配管等の素材が好ましく改質される。テフロン（登録商標）管、テフゼル管、ピーク樹脂管、フューズドシリカ管等の素材である。
【００４０】
「カルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を用いた式（６）記載の化合物の製造方法」
ホスホリルコリンの誘導体は極めて親水性が高く、有機溶媒への溶解度が極端に低い。ホスホリルコリンの誘導体の合成はジオキサホスホラン類を出発物質とする全合成法と、大豆などに含まれるリン脂質であるホスファチジルコリンの加水分解によって得られるグリセロホスホリルコリンを出発物質とする合成法に大別される。ホスホリルコリンの誘導体は溶解する有機溶媒が限られるために合成ルートが複雑になり、製造にかかるコストが高く実用化の障壁となっている。この合成の複雑さとコストの問題は全合成法において顕著に現れるが、本発明の製造方法によればホスホリルコリンの誘導体にとっての良溶媒中で極めて簡便かつ高収率でカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を製造することができ、加えて安価で大量に入手することのできるホスファチジルコリン由来のグリセロホスホリルコリンから製造することが可能であって、コストの面でも優れている。最終的に式（６）記載の化合物についても簡便かつ高収率で得ることができる。
【００４１】
グリセロホスホリルコリン、過ヨウ素酸ナトリウム、３塩化ルテニウム（水和物）をアセトニトリル水溶液に加える。室温にて攪拌した後、ろ過し、濾液から溶媒を除去する。得られた固形物からメタノールにて目的物を抽出、続いてメタノールを留去することによって下記式（９）に示すカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を得る。構造式及びＮＭＲスペクトルを図１６に、Massスペクトルを図１７に示す。
なお、反応溶媒は水でも可能であり、また、過ヨウ素酸以外にも他の過ヨウ素酸塩や過ヨウ素酸などを用いることも可能であり、三塩化ルテニウム以外にも、他の二価及び／または三価のルテニウム化合物やそれらの水和物などを用いることも可能である。
【化２１】
2005187456.tif 000016
（９）
【００４２】
次に、式（９）に示した化合物のメタノール溶液に、３−アミノプロピルトリメトキシシランを０．５等量、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とＮ−エチル−Ｎ'−３−ジアミノプロピルカルボジイミド(ＥＤＣ)をそれぞれ１等量添加する。この混合溶液を室温にて３時間攪拌することにより、式（６）に示す化合物を得た。
なお、反応溶媒はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、クロロホルムなどメタノール以外でも可能であり、また、ＮＨＳ、ＥＤＣ以外にも、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルボキシジイミダゾール（ＣＤＩ）などを用いることも可能である。
上記の手順は、式（６）に示した化合物中のｍ、ｎが変わっても全く同様に行うことができる。ここで示した手順はｍ＝３、ｎ＝２の場合である。ただし、反応中の有機シラン化合物の重合を防ぐためには脱水溶媒が好ましい。
また、式（６）中のメトキシ基（ＯＣＨ3）がエトキシ基（ＯＣ2Ｈ5）である場合にはメタノールをエタノールに変えて反応を行い、Ｃｌの場合はジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドに変更する。
さらには、Ｓｉと結合するメトキシ基またはエトキシ基またはＣｌの内、２つまたは１つがメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれかで置換されている場合も上記の手法と全く同様に製造することができる。
【００４３】
「改質粉体」
本発明の表面改質剤は水酸基を有する粉体を改質するために好ましく使用できる。
本発明の改質粉体は以下の方法にて製造される。この方法により、ホスホリルコリン基を粉体表面に直接的に有する改質粉体、すなわち、ホスホリルコリン基が粉体表面に化学的な結合にて導入されている改質粉体が容易に製造できる。
【００４４】
この改質粉体は、ホスホリルコリン基を有する重合体で被覆することによりホスホリルコリン基を導入した粉体と比較して、重合体の剥れによりホスホリルコリン基を失うことがないという利点を有する。また、重合体で被覆されていないので、粉体自体の微細構造を損なうことがないという利点を有する。具体的には、本発明の表面改質剤を用いることによって粉体表面が有する立体的な数ｎｍ程度の微細構造（微細孔など）を埋めることなく表面をホスホリルコリン基で被覆することが可能である。
【００４５】
また、ホスホリルコリン基の誘導体を低分子として物体に導入する場合でも、物体にホスホリルコリン基の誘導体と反応させることができる官能基を先に導入し、ついでホスホリルコリン基の誘導体を反応させる方法では、物体表面に未反応の官能基が物体表面に残るために生体適合性の低下に繋がる。例えば、まず物体表面にアミノ基を導入し、次にホスホリルコリンのアルデヒド誘導体を物体表面のアミノ基と反応させる場合、多くの未反応のアミノ基が残存してしまう。これらの残存アミノ基は別の低分子化合物を結合させることによってある程度封鎖することが可能であるが、物体表面の親水性を維持することが困難であるうえに全てを封鎖することはできない。物質表面にアミノ基が多く残存する場合、アミノ基は強い塩基性を有しているために、主に酸性のタンパク質が著しく強い電気的な相互作用を示し、そのほとんどが吸着してしまう。クロマトグラフィー用充填剤としてとらえた場合は当該タンパク質の回収率の悪化や、ピークの著しいテーリングの原因となる。さらに、タンパク質の吸着はその変性をもたらし、生体適合性素材としてとらえた場合は炎症などの原因となり、好ましくない。
【００４６】
本発明による表面改質剤は合成時、アミノ基を有する有機シラン化合物に対してホスホリルコリンのアルデヒド誘導体を過剰に添加し、双方を液相中で反応させる。アミノ基とアルデヒド基の反応性は非常に高く、アルデヒドを過剰に添加した場合はほぼ１００％のアミノ基がアルデヒドと反応することが知られている。したがって、本発明による表面改質剤には未反応のアミノ基は検出されない。このために本発明による表面改質では、物体表面に未反応のアミノ基を混在させることなくホスホリルコリン基だけを導入することができる。このことにより、固相上で２段階の反応を行う方法よりも、極めて生体適合性に優れ、タンパク質の吸着の少ない粉体を得ることができる。
【００４７】
「改質粉体の製造方法」
式（５）または（６）の化合物の０．３ｍｍｏｌ／ｍＬの濃度のメタノール溶液２０ｍＬに、蒸留水２０ｍＬを加え、表面改質を施す粉体を添加する。粉体の質量はその比表面積によって調整する必要がある。例えば、１００ｍ2／ｇの粉体の場合、その添加量は１０ｇ程度が適当である。この粉体分散液をオイルバス中８０℃で還流し、５時間後に粉体をろ過し、メタノールで洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥することで改質粉体を得る。
【００４８】
用いる粉体は特に制限されない。用途に応じて一般に平均粒径０．０１〜１０μｍあるいは０．０１〜１０００μｍ程度の任意の物体を意味する。具体的な粉体としては、例えば、無機粉末（例えば、タルク、カオリン、雲母、絹雲母(セリサイト)、白雲母、金雲母、合成雲母、紅雲母、黒雲母、パーミキュライト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸バリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸ストロンチウム、タングステン酸金属塩、マグネシウム、シリカ、ゼオライト、硫酸バリウム、焼成硫酸カルシウム(焼セッコウ)、リン酸カルシウム、弗素アパタイト、ヒドロキシアパタイト、セラミックパウダー、金属石鹸(例えば、ミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム)、窒化ホウ素、酸化セリウム等）；有機粉末（例えば、ポリアミド樹脂粉末(ナイロン粉末)、ポリエチレン粉末、ポリメタクリル酸メチル粉末、ベンゾグアナミン樹脂粉末、ポリ四弗化エチレン粉末、ポリメチルシルセスキオキサン粉末、シリコーンエラストマー粉末、セルロース粉末等）；無機白色顔料（例えば、二酸化チタン、酸化亜鉛等）；無機赤色系顔料（例えば、酸化鉄(ベンガラ)、チタン酸鉄等）；無機褐色系顔料（例えば、γ−酸化鉄等）；無機黄色系顔料（例えば、黄酸化鉄、黄土等）；無機黒色系顔料（例えば、黒酸化鉄、低次酸化チタン等）；無機紫色系顔料（例えば、マンガンバイオレット、コバルトバイオレット等）；無機緑色系顔料（例えば、酸化クロム、水酸化クロム、チタン酸コバルト等）；無機青色系顔料（例えば、群青、紺青等）；パール顔料（例えば、酸化チタンコーテッドマイカ、酸化チタンコーテッドオキシ塩化ビスマス、酸化チタンコーテッドタルク、着色酸化チタンコーテッドマイカ、オキシ塩化ビスマス、魚鱗箔等）；金属粉末顔料（例えば、アルミニウムパウダー、カッパーパウダー等）；ジルコニウム、バリウム又はアルミニウムレーキ等の有機顔料（例えば、赤色２０１号、赤色２０２号、赤色２０４号、赤色２０５号、赤色２２０号、赤色２２６号、赤色２２８号、赤色４０５号、橙色２０３号、橙色２０４号、黄色２０５号、黄色４０１号、及び青色４０４号などの有機顔料、赤色３号、赤色１０４号、赤色１０６号、赤色２２７号、赤色２３０号、赤色４０１号、赤色５０５号、橙色２０５号、黄色４号、黄色５号、黄色２０２号、黄色２０３号、緑色３号及び青色１号等）；天然色素（例えば、クロロフィル、β−カロチン等）等が挙げられる。
【００４９】
上記の製造方法により、親水性のホスホリルコリン基を任意の量で含有する粉体が簡単に得られる。また、粉体が合成ポリマーの場合、その親水部として、カルボン酸基、水酸基、１級〜３級アミノ基、スルホン酸基、リン酸基、ポリオキシエチレン基、アンモニウム基、アミド、カルボキシベタイン、糖類等を含有してもよく、これらの種類及び含有量で、粉体の機能を設計できる。さらに、その疎水部として、炭素原子数２〜２２の直鎖状または分岐アルキル、コレステロール等の環状アルキル、オレイル等不飽和結合を含むアルキル基、ベンゼン環、ナフタレン環、ピレンをはじめとする炭化水素系芳香族、ピリジン環、イミダゾール、チアゾール、インドール等のヘテロ系芳香族、パーフルオロアルキル、ポリアルキルシロキサン等の疎水基を含有してもよく、粉体の用途に応じて選択し、設計できる。合成ポリマー粉体の疎水基の結合形態は、エステル、エーテル、アミド、ウレタン、尿素結合等により直接ポリマー主鎖と結合されていても良いし、スペーサーを介して主鎖と結合されていても良い。スペーサーの種類としては、親水性のポリエチレンオキサイド、疎水性のポリプロピレンオキサイド、直鎖状アルキル（炭素原子数２〜２２）等が挙げられる。
【００５０】
本発明の改質粉体は、親水性及び保湿性に優れた粉体である。生体適合性を有する粉体として、化粧料、医用材料、クロマト用充填剤、塗料等の幅広い用途に応用可能である。
【００５１】
「表面改質剤で処理された改質担体からなるクロマトグラフィー用充填剤」
本発明の表面改質剤により、担体表面を改質して容易に希望する量のホスホリルコリン基を有するクロマトグラフィー用充填剤を製造することが出来る。
具体的には、担体表面に存在する水酸基と、式（５）および（６）の化合物のＳｉ−ＯＣＨ3との脱水反応によってホスホリルコリン基を担体表面に導入する。
【００５２】
式（５）および（６）の化合物のメタノール溶液（０．３ｍｍｏｌ／ｍＬ）２０ｍＬに、蒸留水２０ｍＬを加え、平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１００ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲルを４ｇ添加する。この粉体分散液をオイルバス中８０℃で還流し、５時間後に粉体をろ過し、メタノールで洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥することでホスホリルコリン基を表面に直接有する粉体を容易に得ることができる。
反応溶媒は水−メタノール混合溶媒以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、これらを単一、または組み合わせて用いることができる。
【００５３】
なお、担体表面に水酸基が存在しない場合は、式（５）および（６）の化合物を揮発性溶媒に溶解させ、その溶液を物質表面に塗布、その後溶媒を乾燥させる方法が有効である。具体的には、式（５）および（６）の化合物のメタノール溶液（０．３ｍｍｏｌ／ｍＬ）を物質の比表面積応じて適量を直接物質に塗布する。次に１０℃から２５０℃の温度範囲でメタノールを気化させる。このとき、式（５）および（６）の化合物のＳｉ−ＯＣＨ3どうしが脱水反応を起こし、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を生成し、物質表面を覆うことが可能である。この脱水反応は公知である。メタノールの揮発の際にこのように生成する膜は、ほとんどの物質表面に微量に存在する水酸基とも所々で結合を生じるために安定性の良好な表面改質を行うことができる。本法は水酸基を持たない物質のみならず、水酸基を有する物質についても極めて有効な表面改質法である。
【００５４】
担体表面に先にアミノ基を導入してから、グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られるアルデヒド体を含有する化合物を導入させる方法と、本発明の表面改質剤を用いる方法との最大の相違点は、物体表面における未反応のアミノ基の有無である。
すなわち、本発明による表面改質剤を用いた場合は、物質表面に未反応のアミノ基を混在させることなくホスホリルコリン基だけを導入することができる。先にアミノ基を粉体表面に導入する場合は、２段階目のホスホリルコリン基を導入させる反応が、液相中のグリセロホスホリルコリンのアルデヒド体と固相表面のアミノ基とが反応しなければならないために拡散律速や固相表面の立体構造による立体障害、ホスホリルコリン基自体の立体性等によって反応率が低い。約３０％のアミノ基にしかホスホリルコリン基を導入することができない。残存したアミノ基は別の低分子化合物を結合させることによってある程度封鎖することが可能であるが、物体表面の親水性を維持することが困難であるうえに全てを封鎖することはできない。
【００５５】
また、物質表面にアミノ基が多く残存する場合、アミノ基は強い塩基性を有しているために、主に酸性のタンパク質が著しく強い電気的な相互作用を示し、そのほとんどが吸着してしまう。クロマトグラフィー用充填剤としてとらえた場合は当該タンパク質の回収率の悪化や、ピークの著しいテーリングの原因となる。さらに、タンパク質の吸着はその変性をもたらし、生体適合性素材としてとらえた場合は炎症の原因となり、好ましくない。
【００５６】
これに対して、本発明による表面改質剤は、合成時、アミノ基を有する有機シラン化合物に対してホスホリルコリンのアルデヒド誘導体を過剰に添加し、双方を液相中で反応させる。アミノ基とアルデヒド基の反応性は非常に高く、アルデヒドを過剰に添加した場合はほぼ１００％のアミノ基がアルデヒドと反応することが一般的に知られている。
したがって、本発明による表面改質剤には未反応のアミノ基は検出されない。このために本発明による表面改質剤を用いることで、物体表面に未反応のアミノ基を混在させることなくホスホリルコリン基だけを導入することができる。このことにより、固相上で２段階の反応を行う方法よりも、極めて生体適合性に優れ、タンパク質の吸着の少ない粉体を得ることができる。
【００５７】
また、球状粉体を液相に分散させることによって表面改質をする場合、強度の弱い粉体では撹拌中に粉体が崩壊する現象が知られている。本法では、一段階かつ短時間で直接ホスホリルコリン基を粉体に導入することが可能となるために、固相上で２段階の反応を行う方法よりも粉体の撹拌時間が４分の１以下で済み、より幅広い構造、素材の粉体に適用することが可能である。具体的には細孔径が１０００オングストロームを越えるような機械的強度の弱い粉体についても粉体形状を損なうことなく表面改質を行うことができる。
【００５８】
本発明で使用する担体には、シリカ、シリカゲル、活性炭、ゼオライト、アルミナ、粘土鉱物等の無機多孔質体、多孔質の有機高分子樹脂がある。担体は粉体が好ましい。好ましくは球型または破砕型多孔質シリカゲルである。球状多孔質シリカゲルの平均粒径は１〜２００μｍ、好ましくは１〜１０μｍ、球状多孔質シリカゲルの細孔の平均径が１０〜２０００オングストローム、好ましくは８０〜１０００オングストロームで、比表面積は０．０１〜８００ｍ2／ｇ、好ましくは８０〜６００ｍ2／ｇである。
【００５９】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤をＧＦＣ用カラムとして使用すると、タンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少なく、高い分離能力を発揮する。
すなわち、タンパク質およびポリペプチドの吸着を抑制することに優れたカラム充填剤である。したがって、タンパク質およびポリペプチドを分子量の違いによって分離するモード（ＧＦＣモード）に適用することが可能である。
【００６０】
さらに、本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、ホスホリルコリン基の有する双電荷によって試料の分子量の違いのみならず、試料の持つ微弱な電荷の違いに基づいた、より高い分離能力を有するカラム充填剤である。このように、双電荷を有する官能基がタンパク質の吸着を抑制するために導入された例は無く、本発明の表面処理剤によって製造されるクロマトグラフィー用充填剤はこれまでにない新しいＧＦＣ用カラム充填剤である。この電荷を有するという特徴によって、タンパク質やポリペプチドを分子量の違い以上にそれらが有する電荷に応じて分離できるだけでなく、移動相のｐＨや塩濃度を変化させることによって充填剤表面とタンパク質やポリペプチドとの相互作用の強さを制御することも可能であることを示している。したがって、移動相のｐＨや塩濃度を最適化することで目的とするタンパク質やポリペプチドを自在に保持させることができる。
ＧＦＣモードはタンパク質や酵素を失活させずにこれらを分離、精製できることから、未知生体試料の単離や医療用途の面でも本発明のカラム充填剤の高分離能が役立つことが期待される。
【００６１】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、具体的には、タンパク質およびポリペプチドの吸着が極めて少ない高分離能カラム充填剤として、例えばヒト血清中のタンパク質の分離、または、タンパク質をトリプシン消化して得られた試料に含まれるポリペプチドの分離、または生体中に含まれる未知タンパク質の活性評価に基づいた分離・分取に優れている。
【００６２】
「表面改質剤で処理されたフィルター」
生体試料中に含まれるタンパク質等を分析する場合、生体由来の夾雑物を除去する前処理が必要となる。具体的には、血液中のタンパク質濃度を測定する場合、タンパク質が溶解している血清を得るために、血球や血小板などをろ過、もしくは遠心分離等を用いてあらかじめ除去する必要がある。血液などのろ過では、用いられるフィルターにタンパク質が吸着するためにタンパク質の定量性が低下するという問題がある。この他にも、遠心力を用いて細孔の空いた膜を通過させる２層構造の容器がタンパク質試料の濃縮や脱塩、溶媒置換等の目的で汎用されている。例えばＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ 遠心式フィルターユニット（製品名）（日本ミリポア株式会社）が挙げられる。このフィルターユニットは上部に濃縮前の試料を入れ、下部が遠心分離器の外側を向くように設置し、５０００Ｇほどの遠心力を加えることによりろ過を達成する。このような器具のろ過膜についてもタンパク質の回収率が５０％近くまで下がる場合があり、良好ではないという課題がある。
【００６３】
式（５）および（６）の化合物によってフィルター表面を改質することにより、タンパク質の吸着が極めて少ないフィルターを得ることができる。式（５）および（６）中のＳｉ−ＯＣＨ3が、フィルター表面の水酸基と脱水反応を起こし、結合することで、簡便にタンパク質吸着抑制能力に優れたホスホリルコリン基を導入することができる。金属製、ガラス製、ガラス繊維製など、用いられているフィルターのほとんどの表面が酸化物に由来する水酸基を有しているために、幅広い素材に対して有効である。
【００６４】
なお、水酸基を有しない素材の場合は、式（５）および（６）の化合物を揮発性溶媒に溶解させ、その溶液にフィルターまたはその素材を浸せきし、その後溶媒を乾燥させ、洗浄する方法が有効である。具体的には、式（５）および（６）の化合物のメタノール溶液（０．３ｍｍｏｌ／ｍＬ）を物質の比表面積応じた適量に直接物質を浸ける。次に１０℃から２５０℃の温度範囲でメタノールを気化させる。このとき、式（５）および（６）の化合物のＳｉ−ＯＣＨ3どうしが脱水反応を起こし、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を生成し、物質表面を覆うことが可能である。この脱水反応は公知である。メタノールの揮発の際にこのように生成する膜は、ほとんどの物質表面に微量に存在する水酸基とも所々で結合を生じるために比較的強靱な表面改質を行うことができる。本法は水酸基を持たない物質のみならず、水酸基を有する物質についても極めて有効な表面改質法である。
【００６５】
フィルターのような微細孔を有する物体をホスホリルコリン基で表面処理する場合は、既に公知化されているホスホリルコリン基を有するポリマーでコートすることは困難である。ポリマーが微細孔を塞いでしまい、フィルターとしての能力を低下させてしまうことが主な原因である。式（５）および（６）のような低分子を用いることで、微細孔といった担体の構造特性を損なうことなく担体表面を改質させることが可能となった。さらに、担体表面とは物理吸着ではなく、化学結合を生成させることができるので耐久性の面でも大変優れている。
【００６６】
「表面改質剤で処理されたガラス製実験器具」
ガラス製実験器具とは、保存容器、計量用器具、セル、分取用チップ、サンプル分取用シリンジ等の実験器具である。本発明の表面改質剤を用いて処理した場合は、タンパク質吸着が極めて少ない実験器具を得ることができる。
【実施例】
【００６７】
次に本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
【００６８】
「合成例１  ホスホリルコリン基を含有するアルデヒド化合物」
Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン（４５０ｍｇ）を蒸留水１５ｍｌに溶解し、氷水浴中で冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム（７５０ｍｇ）（和光純薬工業株式会社）を添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物を抽出した。下記化合物（８）に構造を示す。式（８）の化合物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に、Massスペクトルを図１８に示す。
【化２２】
2005187456.tif 000017
（８）
【００６９】
「実施例１：式（５）および（６）の化合物の製造」
合成例１の化合物７．５ｇを脱水したメタノール３０ｍＬ に溶解させ、容器内を乾燥窒素で置換する。次に、化合物１のメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシラン（信越化学工業株式会社）を３．６ｇ添加した。この混合溶液を、室温で５時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）２．５ｇを添加し、室温に戻して１６時間撹拌した。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続けた。沈殿をろ過した後、目的物質である下記式（１０）および（１１）の化合物のメタノール溶液を得た。
【化２３】
2005187456.tif 000018
（１０）
【化２４】
2005187456.tif 000019
（１１）
【００７０】
「実施例２：改質粉体の製造」
実施例１で製造した式（１０）および（１１）の化合物を含むメタノール溶液に蒸留水３５ｍＬを加え、さらに平均粒子径５μｍ、平均細孔径３０ｎｍで比表面積が１４０ｍ2／ｇのシリカゲルを１４ｇ添加した。この粉体分散溶液を８０℃で５ｈ還流した。還流の後メタノール１００ｍＬでろ過洗浄し、目的物質を得た。
【００７１】
以上の手順で、実施例１の表面改質剤で処理した改質粉体の元素分析値を「表１」に示す。表中のＣ％またはＮ％とは、粉体に含まれる炭素元素または窒素元素の質量％を示している。この値から、実施例１の表面改質剤による処理後の粉体の炭素と窒素の原子数比（Ｃ／Ｎ）は５．０８となる。式（１０）および（１１）の表面改質剤のメトキシ基部位が全て結合した後のＣ／Ｎは５であるから、表面改質剤が破壊されることなく粉体に導入されたことを示している。
【００７２】
【表１】
2005187456.tif 000020
【００７３】
また、このシリカゲルの１３Ｃ−ＣＰＭＡＳスペクトルおよび１３Ｃ−ＰＳＴＭＡＳスペクトルを図２に示す。ＰＳＴＭＡＳスペクトルとは自由運動をしている分子鎖のスペクトルを選択的に得る手法で、粉体表面の修飾鎖の解析に広く用いられている手法である。図２では、５４．２ｐｐｍにコリン基の炭素に起因するスペクトルが観測される。
【００７４】
一方、図３に示した同シリカゲルの３１Ｐ−ＣＰＭＡＳスペクトルでは、対象として測定したＮａＨ2ＰＯ4とほぼ同じ化学シフト値にピークが検出されたことから、リン酸基の存在を確認することができる。図２によってコリン基の存在が、また図３によってリン酸基の存在が確認されたことから、ホスホリルコリン基を担体シリカゲル表面に導入することができたと考えられる。
【００７５】
さらに、図２からは、ケイ素原子とホスホリルコリン基の間に存在するプロピルの炭素に起因するスペクトルが９ｐｐｍ、２３ｐｐｍ付近に観測され、ホスホリルコリン内のエチルに由来するスペクトルは６０ｐｐｍ、６９ｐｐｍ付近に観測される。以上のことから、式（５）および（６）の構造が破壊されることなく、シリカゲルに導入できていることが分かる。なお、ホスホリルコリン基とプロピルトリメトキシシランの結合部分は式（５）に示した２級アミンのものと、式（６）に示したアミド結合のものが混在している。
【００７６】
図４に本実施例で合成した改質粉体のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。１６５０ｃｍ-1付近にアミド結合に特有の吸収を観測することができた。
【００７７】
「実施例３：クロマトグラフィー用充填剤」
実施例２で製造した改質粉体を、担体として、通常のスラリー法により、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのエンプティカラムに充填した。クロマトグラムの取得条件は次の通りである。
移動相：５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸バッファー ＋ ５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ｐＨ６．８
流速：１００μＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ
【００７８】
実施例３のカラムを本条件で用いた場合の校正曲線を図５に示した。図５に示した校正曲線は測定範囲で極めて直線性が良い。タンパク質の吸着が少ないために、充填剤表面とタンパク質との相互作用が極めて小さく、結果として分子量の大きい分子から早く溶出するＧＦＣモードでの分離が行われたことが分かる。次に、上記条件でヒト血清タンパク質を分離した結果を図６に示す。
試料として用いたのはコンセーラＮ（製品名）を蒸留水により２倍希釈したもので、２μＬを注入した。ヒト血清のような実試料でも分子量順のＧＦＣモードでの分離が行われており、大変実用性が高いことが分かる。
【００７９】
「比較例１」
次に、市販品のクロマトグラフィー用カラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ８０３、昭和電工株式会社製）を市販の状態のまま用いてヒト血清試料（コンセーラＮ（製品名）を蒸留水にて二倍に希釈した）中のタンパク質の分離を試みた。比較例で挙げた本カラムは、実施例３で述べたカラムと同じ内径と長さである。
この充填剤は多孔性シリカゲルの表面に、親水性基を化学結合させたサイズ排除モード用の充填剤であると説明されている。平均細孔径３００オングストローム、平均粒子径５μｍであり、実施例１で述べた充填剤との比較に好適である。分子量１万から数十万のタンパク質の分離に適していると説明されている。
Ｓｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ８０３は、非解離性の親水性基を用いているために、本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤と違って電荷を帯びた官能基を有していない。したがってタンパク質とのイオン的な相互作用はほとんど無いと考えられる。
実施例３と同様に、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸バッファー（Ｎａ2ＨＰＯ4およびＫＨ2ＰＯ4から調製）に５００ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを加えた移動相を用い、流速を０．１ｍｌ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度２５℃にてヒト血清試料（コンセーラＮ（製品名）を純粋にて二倍に希釈した）のタンパク質の分離を試みた。検出はＵＶ２８０ｎｍで行った。結果を図７（ｂ）に示す。
なお、比較のために、図７（ａ）には実施例３で得た本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤での同条件、同試料でのクロマトグラムを示した。
さらに図８（ａ）に、本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤を、塩濃度１５０ｍＭで適用した場合のクロマトグラムを、図８（ｂ）にはＳｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ８０３を塩濃度１５０ｍＭで適用した場合のクロマトグラムを示す。図８での塩濃度以外の条件は図７と同様である。
【００８０】
本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤を使用したクロマトグラム（図７（ａ））においては、ヒト血清において主要なタンパク質であるγ−グロブリンとアルブミンの他に、トランスフェリンのピークがショルダー状に確認されていることが大きな特徴である。ピークの帰属は単離された各タンパク質の市販品を用いて行った。
【００８１】
これに対して、従来のＧＦＣ用充填剤を使用した場合は（図７（ｂ））、アルブミンとトランスフェリンが全く分離されない。これは、単離された市販品の各タンパク質の溶出時間が同じであったことから確認された。
アルブミンとトランスフェリンの分子量はそれぞれ、約６９，０００と７５，０００であり、非常に似通っている。従来のＧＦＣ用カラムではアルブミンとトランスフェリンのような分子量の近い試料を分離することはできない。本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤はタンパク質の吸着が極めて少ないだけでなく、ホスホリルコリン基の持つ双電荷によってタンパク質と微弱なイオン的相互作用を持つために、分子量の近いタンパク質についても等電点や疎水性の違いに基づいて分離することができることが分かる。
すなわち、本発明のクロマトグラフィー用充填剤はＧＦＣモードにおいて、分子量の違いだけでなくタンパク質の持つ等電点や疎水性の違いに応じて試料を分離することができることが分かる。
【００８２】
本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤が微弱なイオン交換相互作用を有していることは、移動相の塩濃度を下げることによって確認することができる。
移動相の塩濃度が５００ｍＭである図７（ａ）では、本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤でもトランスフェリンはアルブミンのピークのショルダーとして認識される程度であるが、移動相の塩濃度を１５０ｍＭに下げた図８（ａ）ではトランスフェリンとアルブミンのピークはベースライン分離を達成している。
さらに、図８（ａ）では数多くのタンパク質によるピークを確認することができる。一般に、充填剤表面と移動相内の物質間に働くイオン交換相互作用は、移動相の塩濃度が小さくなるほど強くなることが知られている。これは、移動相の塩濃度が小さくなることで、イオン交換相互作用を受ける物質は強く保持されることを意味している。本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤は、移動相の塩濃度を小さくすることで特にアルブミンに強い保持を生じさせ、トランスフェリンとの完全分離を達成した。
図７、図８のような中性ｐＨ下で負に帯電しているアルブミンを低塩濃度にて保持したことから、本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤がアニオン交換モードを有していることが推察される。
【００８３】
そこで次に、乳酸、酢酸、コハク酸、マロン酸、クエン酸の５種類の有機酸を用いて、本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤の持つアニオン交換能を評価した。評価条件は次の通りである。結果を図９に示す。
カラム：４．６×１５０ｍｍ
移動相：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸バッファ（ｐＨ６．８）
流速：１０００ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ
【００８４】
図９によれば、本願発明の表面改質剤によって調製された充填剤は、カルボン酸の数に応じて各種の有機酸を分離することができた事がわかる。
具体的には、５種のカルボン酸に起因する各ピークを帰属すると、カルボン酸を１つ持つ有機酸２種が最も早く溶離し、次にカルボン酸を２つ持つ有機酸２種が溶離し、最後にカルボン酸を３つ持つクエン酸が溶離している。カルボン酸の数が増えるほど保持が大きくなる傾向が認められることから、この充填剤がアニオン交換能を有していることは明確である。したがって、本願発明の表面改質剤によって処理された粉体はアニオン交換用充填剤としても非常に有効であると言える。以上に示したイオン交換性はタンパク質を吸着、変性させるほどの強さは無く、回収率良くユニークな分離をするために適している。
【００８５】
一方、一般的なＧＦＣ用カラムであるＳｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ８０３は、図８（ｂ）に示したように、１５０ｍＭの塩濃度においてもトランスフェリンとアルブミンを分離することはできない。
本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤は、タンパク質の吸着を抑制するという優れた機能によるＧＦＣモード（サイズ排除モード）に加え、イオン交換モードも存在する極めてユニークな充填剤である。タンパク質の吸着が極めて少ないことから、タンパク質が変性することなく、酵素の活性を保ったままでのタンパク質の分離、精製が可能である。しかも、ＧＦＣモードだけではなくイオン交換モードが混在するために、移動相の塩濃度やｐＨに応じて分離を制御することができる極めて画期的な充填剤である。
【００８６】
「実施例４  クロマトグラフィー用充填剤」
（ケイ素原子とホスホリルコリン基の間に窒素原子を二つ有する、式（１）中Ｒが式（４）ｐ＝１で表される化合物での表面改質）
合成例１の化合物７．５ｇを脱水したメタノール３０ｍＬ に溶解させ、容器内を乾燥窒素で置換する。次に、化合物１のメタノール溶液に３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン（信越化学工業株式会社）を３．６ｇ添加した。
この混合溶液を、室温で５時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウム２．５ｇを添加し、室温に戻して１６時間撹拌した。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続けた。
沈殿をろ過した後、目的物質である下記式（１２）、（１３）の化合物のメタノール溶液を得た。
【化２５】
2005187456.tif 000021
（１２）
【化２６】
2005187456.tif 000022
（１３）
【００８７】
式（１２）および（１３）の化合物を含むメタノール溶液に蒸留水３５ｍＬを加え、さらに平均粒子径５μｍ、平均細孔径３０ｎｍで比表面積が１４０ｍ2／のシリカゲルを１４ｇ添加した。この粉体分散溶液を８０℃で５ｈ還流した。還流の後メタノール１００ｍＬでろ過洗浄し、目的物質を得た。
【００８８】
図１０（ｂ）に、式（１２）および（１３）を導入したシリカゲルを通常のスラリー法により充填し、ヒト血清試料（コンセーラＮ（製品名）を蒸留水にて二倍に希釈した）を注入した時のクロマトグラムを示した。
図１０（ａ）は実施例３で調整した粉体を用いた場合のクロマトグラムである。
実施例３と本実施例の違いは、表面改質剤のスペーサー部分の２級アミンの数が異なることである。なお、図１０（ａ）と（ｂ）で使用したシリカゲルは同一の物である。
ケイ素原子とホスホリルコリン基の間に２級アミンを図１０（ａ）よりも一つ多く持つ図１０（ｂ）では、トランスフェリンとアルブミンの分離がさらに改善されていることが分かる。これはケイ素原子とホスホリルコリン基の間に２級アミンが挿入されたことで修飾基の塩基性が増大し、酸性タンパク質であるアルブミンがより強く保持されたためであると考えられる。
このように、本願発明の表面改質剤は、ホスホリルコリン基によるタンパク質吸着抑制効果に加え、ケイ素原子とホスホリルコリン基の間のスペーサーの性質を変えることで、イオン交換性、疎水性、親水性、水素結合性といった相互作用を付与させることが可能である。
【００８９】
「実施例５：ホウケイ酸ガラス繊維フィルター材料」
＜ホスホリルコリン基結合ホウケイ酸ガラス繊維フィルター材料の調製＞
１００ｍＬ三角フラスコに蒸留水２０ｇ、実施例１で製造した式（１０）および（１１）の化合物（約０．４ｍmol）を含むメタノール溶液１．０ｍＬを入れ振り混ぜた。これにワットマンジャパン株式会社製ホウケイ酸ガラス繊維フィルター（ガラス繊維ろ紙グレードＧＦ／Ｆ、直径２５ｍｍφ、1枚あたり約０．０７０ｇ）８枚を添加後、１００℃に加熱し５時間還流煮沸した。室温に冷却後、フィルターをろ過、洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥してホスホリルコリン基を表面に直接有するホウケイ酸ガラス繊維フィルターを得た。
【００９０】
＜フィルター材料のタンパク質吸着抑制効果の測定＞
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇをリン酸緩衝液１００ｍＬ（タカラバイオ社製ＰＢＳタブレット１錠を蒸留水に溶解し、全量を１００ｍＬとしたもの。ｐＨ７．４〜７．５）に溶解しＢＳＡ溶液とした。ポリプロピレン製３０ｍＬサンプル管３本に調製したＢＳＡ溶液を２．０ｇずつ取り、このうち１本のサンプル管に実施例６で調製したホウケイ酸ガラス繊維フィルターを、別の１本のサンプル管に未処理のホウケイ酸ガラス繊維フィルターを入れ浸漬させた。これを２４時間室温（２５℃）で放置し、Ｌｏｗｒｙ法にてそれぞれ３本のサンプル管中のＢＳＡ溶液を発色、吸光光度分析することによりフィルター１枚あたりのＢＳＡ吸着量を定量分析した（表２）。
本発明のホウケイ酸ガラス繊維フィルターは未処理品と比較してＢＳＡ吸着量が低減されていることがわかった。
【００９１】
【表２】
2005187456.tif 000023
【００９２】
上記結果から、本発明はタンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少ないフィルター材料を提供できることが分かる。
本発明のフィルター材料は、抗体、酵素などの分離、濃縮や血液透析、血液フィルターなどの血液浄化、分析等の広範囲な生体物質のろ過に有用である。
【００９３】
「実施例６：ガラス製バイアル」
＜ホスホリルコリン基結合ガラスバイアルの調製＞
１００ｍＬ三角フラスコに蒸留水２０ｇ、実施例１で製造した式（１０）および（１１）の化合物（約０．４ｍmol）を含むメタノール溶液１．０ｍＬを入れ振り混ぜた。これに日本ウォーターズ株式会社製ガラス製バイアルである、１２×３２ｍｍガラスバイアル  スクリュー式 １０個を添加後、１００℃に加熱し５時間還流煮沸した。室温に冷却後、バイアルをメタノールで洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥してホスホリルコリン基を表面に直接有するガラスバイアルを得た。
このように、本発明の表面改質剤により、タンパク質吸着が極めて少ないガラス製実験器具実験器具を得ることができる。タンパク質の吸着を抑制できない一般的なバイアルでは、実験操作中にタンパク質の試料濃度が経時で減少することが知られている。具体的には、保存容器から液体高速クロマトグラフィーに試料を注入する場合、毎回同量の体積を注入しているにもかかわらず経時でピーク面積が減少するという現象が知られている。本実施例で製造したガラス製バイアルは、タンパク質の吸着抑制に優れているためにこのような現象を回避することが可能である。
なお、高分子を容器内面に吸着させてタンパク質の吸着を抑制する場合は、試料に有機溶媒が含まれると高分子の脱着が起こり、耐久性に問題があることが知られている。高分子による表面被覆は、高分子とポリプロピレン容器のような基材との間の疎水性相互作用による吸着により実現している。試料溶媒中に有機溶媒が含まれると高分子と基材の間の疎水性相互作用が弱まり、高分子が剥離する。一方、本発明の表面改質剤（シランカップリング剤）は、化学結合にて表面修飾を行えるので、試料中の溶媒の影響を実質的に受けることなく、効果を持続することができる。
【００９４】
「実施例７：カルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体の製造」
２００ｍｌフラスコ内に、グリセロホスホリルコリン５ｇ(１９．４ｍｍｏｌ)、過ヨウ素酸ナトリウム１７ｇ(７９．７ｍｍｏｌ、４．１ｅｑ)（和光純薬工業株式会社）、３塩化ルテニウム（水和物）８１ｍｇ(０．３９ｍｍｏｌ、０．０２ｍｏｌｅｑ)（和光純薬工業株式会社）、および、イオン交換水７０g、アセトニトリル３０ｇを加える。室温にて２時間攪拌した後、ろ過し、濾液から溶媒を除去する。得られた固形物からメタノールにて目的物を抽出、続いてメタノールを除去することによって式（９）に示すカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を得た。式（９）の化合物の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１６に、Massスペクトルを図１７に示す。
【化２７】
2005187456.tif 000024
（９）
【００９５】
「実施例８：ケイ素原子とホスホリルコリン基の間にアミド結合を有する、式（１）中Ｒが式（３）Ｌ＝２で表される有機シラン化合物（シランカップリング剤）」
上記式（９）の化合物３ｇ（１２．４ｍｍｏｌ）を脱水したメタノールに１００ｍｌに溶解させ、容器内を乾燥窒素で置換する。次に、３−アミノプロピルトリメトキシシラン１．１ｇ（６．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．４ｇ（１２．４ｍｍｏｌ）およびN-エチル-N'-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド２．４ｇ（１２．４ｍｍｏｌ）を添加し、−１０℃で１６時間反応させ、下記式（１１）に示すアミド結合をスペーサーに有し、ホスホリルコリン基を末端に有する有機シラン化合物含む溶液を得た。
【化２８】
2005187456.tif 000025
（９）
【化２９】
2005187456.tif 000026
（１１）
また、上記式（９）に示した化合物の代わりに、ホスホリルコリン基とカルボキシル基の間に炭素数５の飽和アルキル鎖を有するＯ−ホスホリルコリンヒドロキシヘキサン酸を用いることで、同様の手順により式（１）中Ｒが式（３）Ｌ＝６で示される化合物を得ることができる。
【００９６】
本発明の表面改質剤は、精製を行わなくともホスホリルコリン基を基材に固定化することが可能である。しかし、例えば、下記の方法で精製することもできる。
＜精製方法＞
得られた溶液を減圧濃縮し、これを蒸留水に溶解させる。この水溶液を試料とする。疎水性相互作用とカチオン交換能を有する高速液体クロマトグラフィー用カラムである、カプセルパックＳＣＸ ＵＧ８０ Ｓ−５（サイズ：４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）（株式会社資生堂）をＨＰＬＣ装置に接続し、０．２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）を１ｍＬ／分の流速で流して平衡化させたのちに、試料を１０μＬ注入する。検出器として示差屈折計を用いることでクロマトグラムを得られ、目的とする化合物を単離することができる。
【００９７】
「実施例９：アミド結合をスペーサーに有し、ホスホリルコリン基を末端に有する有機シラン化合物によって処理された改質粉体」
実施例８で製造した式（１１）の化合物を含む溶液３０ｍＬ（０．２５ｍｍｏｌ／ｍＬ）に蒸留水３５ｍＬを加え、さらに平均粒子径５μｍ、平均細孔径３０ｎｍで比表面積が１４０ｍ2／ｇのシリカゲルを１４ｇ添加した。この粉体分散溶液を８０℃で５ｈ還流した。還流の後メタノール１００ｍＬでろ過洗浄し、目的物質を得た。以上の手順で得られた実施例８の表面改質剤で処理した改質粉体（処理前の炭素含有量０．１５％）の炭素含有量は２．４９％であった。
【００９８】
「リンの定量によるＰＣ基導入の確認」
実施例９で製造したホスホリルコリン基を表面に有する改質粉体のリン元素の定量を行った。本発明の製造方法においてリン元素はホスホリルコリン基固有の元素であり、粉体表面に存在するリン元素を定量することで実際にホスホリルコリン基の導入を確認することができる。
リン元素の定量はモリブデン酸発色法によって行った。以下に定量方法を説明する。
（１）  所定量の粉体を十分洗浄した試験管に計りとる。
（２）  １の粉体に６０％過塩素酸水溶液（和光純薬工業株式会社）を３ｍＬ添加する。
（３）  液の気散を避けるため、２の試験管上部に冷却管を取り付け、１２０℃で１時間、次いで１８０℃で２時間加熱する。本操作にて粉体表面の修飾鎖をすべて酸化させ、特にリン元素についてはリン酸として遊離させる。
（４）  ３の溶液を遠心分離機にかけ（３０００ｒｐｍ、５分）、上清を１ｍＬサンプルチューブに移す。
（５）  ４の溶液に蒸留水１ｍＬと０．５Ｍのモリブデン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）を５００μＬ、および０．５Ｍのアスコルビン酸を５００μＬ添加する。
（６）  ５の溶液を９５℃の湯浴にて５分間熱し、その後冷水で冷却する。
（７）  ６の発色済み溶液を９６穴プレートに２００μＬ滴下し、プレートリーダにて７１０ｎｍにおける発色強度を測定する
（８）  あらかじめ既知の濃度のリン酸溶液の発色強度から得た検量線を元に、サンプルに含まれるリン元素の量を定量する。リン酸の標準溶液は和光純薬工業株式会社より入手できる。
【００９９】
この結果、実施例９で製造したホスホリルコリン基を表面に有する改質粉体のリン元素は０．１３ｍｍｏｌ／ｇgelであった。すなわち０．１３ｍｍｏｌ／ｇgelのホスホリルコリン基を粉体表面に固定化することができたことが分かる。
【０１００】
図１１に本実施例で合成した改質粉体のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
１６５０ｃｍ-1付近にアミド結合に特有の吸収を観測することができた。
【０１０１】
「実施例１０：アミド結合をスペーサーに有し、ホスホリルコリン基を末端に有する表面改質剤（シランカップリング剤）によって処理された液体クロマトグラフィー用充填剤」
実施例９で合成した改質粉体を担体として、通常のスラリー法により、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのエンプティカラムに充填した。クロマトグラムの取得条件は次の通りである。
移動相：５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸バッファー ＋ ５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ｐＨ６．９
流速：２００μＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ
【０１０２】
まず、α２マクログロブリン０．６７ｍｇ／ｍＬ（分子量約８００，０００、略号α２Ｍ）、γ−グロブリン １．３ｍｇ／ｍＬ（分子量約１６０，０００、略号γＧ）、ヒト血清アルブミン １．７ｍｇ／ｍＬ（分子量約７０，０００、略号ＨＳＡ）、リゾチーム０．３ｍｇ／ｍＬ（分子量約１４，０００、略号ＬＹＺ）、ウラシル０．０１７ｍｇ／ｍＬ（分子量１１２、略号Ｕ）を混合した水溶液試料を２μＬ注入したときのクロマトグラムを図１２に示す。α２Ｍ、γ−Ｇ、ＨＳＡ、ＬＹＺはシグマ  アルドリッチジャパン株式会社より、ウラシルはナカライテスク株式会社よりそれぞれ入手した。５本のピークが明確に確認され、これらを市販の単品試料の溶出時間から同定したところ、溶出順序の早い順にα２Ｍ、γＧ、ＨＳＡ、ＬＹＺ、Ｕであった。５本のピーク以外に観測された小さなピークは市販の標準サンプルに含まれる不純物である。アミド結合を介してホスホリルコリン基がシリカゲル上に固定されたことによってタンパク質の吸着が少ないために、充填剤表面とタンパク質との相互作用が極めて小さく、結果として分子量の大きい分子から早く溶出するＧＦＣモードでの分離が行われたことが分かる。
アミド結合は親水性が良好である。タンパク質の吸着を抑制するという観点では物質表面を親水性で、かつ非イオン性の官能基で覆うことが望ましい。ホスホリルコリン基は双性イオン固有の極めて優れた親水性と、双性イオンの電荷バランスの釣り合いから実質的なイオン性は非常に微弱であり、タンパク質の吸着抑制に優れた官能基であるといえる。しかしながら、ホスホリルコリン基を物質表面に固定化させるために用いるスペーサーの疎水性が高いとタンパク質の非特異的不可逆吸着を誘発する。したがって、スペーサーにアミド結合が存在することは極めて重要で、より親水的な表面改質を実現するものである。このスペーサーまでも含めた親水性がタンパク質の吸着抑制において極めて効果的である。
【０１０３】
＜ベタイン構造の表面改質剤との比較例（先行技術との比較）＞
「比較例２」
ホスホリルコリン基とは異なるベタイン構造を有する有機シラン系表面改質剤について、特開平５−２２２０６４号公報には式（１４）に示すスルホベタインを有するシラン化合物が開示されている。また、特開昭６３−２９５５９３号公報には、式（１５）に示すカルボキシベタインを有するシラン化合物が開示されている。
式（１４）および（１５）のシラン化合物と、実施例１の式（１０）および（１１）の化合物との比較を行った。
【化３０】
2005187456.tif 000027
（１４）
【化３１】
2005187456.tif 000028
（１５）
【０１０４】
式（１４）および（１５）の化合物の製造方法は該当する公知文献に従った。
次に、式（１４）の化合物２．０ｇにメタノール２０ｍＬと蒸留水２０ｍＬを加え、さらに平均粒子径５μｍ、平均細孔径３０ｎｍで比表面積が１４０ｍ2／ｇのシリカゲルを５．０ｇ添加した。この粉体分散溶液を８０℃で５ｈ還流させ、式（１４）に示した化合物のシリカゲル上への固定化を行った。還流の後メタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、式（１４）に示した化合物によって表面改質されたシリカゲルを得た。
式（１５）に示した化合物についても同様の操作を行い、式（１５）に示した化合物によって表面改質されたシリカゲルを得た。
続いて、得られた表面改質シリカゲルをそれぞれ通常のスラリー法により、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのエンプティカラムに充填した。クロマトグラムの取得条件は次の通りである。
移動相：５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸バッファー ＋ ５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 
ｐＨ６．９
流速：２００μＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ
【０１０５】
まず、実施例３のホスホリルコリン基を表面に有する充填剤を充填したカラムに対して、α２マクログロブリン０．６７ｍｇ／ｍＬ（分子量約８００，０００、略号α２Ｍ）、γ−グロブリン １．３ｍｇ／ｍＬ（分子量約１６０，０００、略号γＧ）、ヒト血清アルブミン １．７ｍｇ／ｍＬ（分子量約７０，０００、略号ＨＳＡ）、リゾチーム０．３ｍｇ／ｍＬ（分子量約１４，０００、略号ＬＹＺ）、ウラシル０．０１７ｍｇ／ｍＬ（分子量１１２、略号Ｕ）を混合した水溶液試料を２μＬ注入したときのクロマトグラムを図１３に示す。α２Ｍ、γ−Ｇ、ＨＳＡ、ＬＹＺはシグマ  アルドリッチジャパン株式会社より、ウラシルはナカライテスク株式会社よりそれぞれ入手した。
５本のメインピークが明確に確認され、これらを単品試料の溶出時間から同定したところ、溶出順序の早い順にα２Ｍ、γＧ、ＨＳＡ、ＬＹＺ、Ｕであった。これまで述べてきたように分子量の大きい物から溶出するＧＦＣモードである。５本のピーク以外に観測された小さなピークは市販されている標準タンパク質に含まれる不純物である。
【０１０６】
一方、式（１４）で示したスルホベタインを固定化した充填剤を充填したカラムに対して同じ試料を注入したときのクロマトグラムを図１４に示した。５種類の物質のうちヒト血清アルブミンとウラシルしかピークが観測されず、特にリゾチームについてはこの試料濃度において溶出を確認することができなかった。スルホベタインを構成する４級アンモニウムとスルホン酸の間で電気的な中性が達成されず、先端に存在する強酸であるスルホン酸に起因するカチオン交換能が発現した結果、中性で正電荷を有するリゾチームとの間に極めて強いイオン交換相互作用が生じたためである。
【０１０７】
式（１５）で示したカルボキシベタインを固定化した充填剤を充填したカラムに対して同じ試料を注入したときのクロマトグラムを図１５に示した。５種類のピークはスルホベタインを固定化したカラムの場合に比べて良好に溶出しており、α２Ｍ、γ−グロブリン、リゾチーム、ウラシル、ヒト血清アルブミンの順で溶出した。着目すべきことに中性移動相下で負に帯電しているヒト血清アルブミンが特徴的に保持され、低分子であるウラシルよりも後に溶出した。これはカルボキシベタインを構成する４級アンモニウムとカルボキシル基との間で電気的な中性が達成されず、相対的にイオン性の強い4級アンモニウムによる強いアニオン交換性が発現したため、中性で負電荷を有するヒト血清アルブミンとの間に極めて強いイオン交換相互作用が生じたためである。
【０１０８】
このように、一般的によく知られているベタインはイオン的に完全に中性ではない。例に挙げたスルホベタインやカルボキシベタインのようなベタイン構造は優れた親水性を有しているが、強すぎるイオン交換性によってタンパク質の吸着を誘発する。そのなかでホスホリルコリン基はリン酸と４級アンモニウムの電荷のバランスが適切で、ベタイン構造固有の極めて優れた親水性と、非イオン性というタンパク質吸着を抑制する機能に優れていることが分かる。
以上から、これまで報告例がない、ホスホリルコリン基を有する有機シラン系表面改質剤（シランカップリング剤）は、タンパク質非吸着を目的とした物質表面改質に極めて有効であると言える。本発明の表面改質剤を用いることで、タンパク質の吸着が少なく生体適合性に優れた表面改質を施すことができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明のホスホリルコリン基を含有する新規化合物は、表面改質剤として有用である。本発明の表面改質剤は、生体適合性、保湿性、その他に様々な有用な機能を物体に付与する。本発明の表面改質剤により、ホスホリルコリン基により改質される改質粉体、該改質粉体を担体として利用したクロマトグラフィー用充填剤、該表面改質剤により改質されたフィルター、該表面改質剤により改質されたガラス器具が容易に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】合成例１で製造した化合物の構造式及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実施例２で製造した改質粉体の１３Ｃ−ＣＰＭＡＳスペクトルである。
【図３】実施例２で製造した改質粉体の３１Ｐ−ＣＰＭＡＳスペクトルである。
【図４】実施例２で製造した改質粉体のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図５】実施例３で製造した液体クロマトグラフィー用充填剤をＧＦＣモードで用いた場合の校正曲線である。
【図６】実施例３で製造した液体クロマトグラフィー用充填剤を使用してヒト血清タンパク質の分離を行った時のクロマトグラムである。
【図７】移動相塩濃度５００ｍＭにおいてヒト血清タンパク質の分離を行ったときのクロマトグラムである。（ａ）本願発明の表面改質剤を用いて合成した充填剤。（ｂ）Ｓｈｏｄｅｘ ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ８０３。
【図８】移動相塩濃度１５０ｍＭにおいてヒト血清タンパク質の分離を行ったときのクロマトグラムである。（ａ）本願発明の表面改質剤を用いて合成した充填剤。（ｂ）Ｓｈｏｄｅｘ ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ８０３。
【図９】本願発明の表面改質剤を用いて合成した充填剤を用いて５種の有機酸を分離したときのクロマトグラムである。
【図１０】本願発明の表面改質剤のスペーサー部分に２級アミンを挿入した場合の、ヒト血清タンパク質の分離を行ったときのクロマトグラムである。
【図１１】実施例９で合成した改質粉体のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図１２】実施例１０で製造した液体クロマトグラフィー用充填剤によるクロマトグラムである。
【図１３】実施例３で製造した液体クロマトグラフィー用充填剤によるクロマトグラムである。
【図１４】比較例２で製造した式（１４）で示した化合物によって表面改質された液体クロマトグラフィー用充填剤によるクロマトグラムである。
【図１５】比較例２で製造した式（１５）で示した化合物によって表面改質された液体クロマトグラフィー用充填剤によるクロマトグラムである。
【図１６】実施例７で製造した化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１７】実施例７で製造した化合物のＭａｓｓスペクトルである。
【図１８】合成例１で製造した化合物のＭａｓｓスペクトルである。
【図１】
2005187456.tif 000036
【図２】
2005187456.tif 000037
【図３】
2005187456.tif 000038
【図４】
2005187456.tif 000039
【図５】
2005187456.tif 000040
【図６】
2005187456.tif 000041
【図７】
2005187456.tif 000042
【図８】
2005187456.tif 000043
【図９】
2005187456.tif 000044
【図１０】
2005187456.tif 000045
【図１１】
2005187456.tif 000046
【図１２】
2005187456.tif 000047
【図１３】
2005187456.tif 000048
【図１４】
2005187456.tif 000049
【図１５】
2005187456.tif 000050
【図１６】
2005187456.tif 000051
【図１７】
2005187456.tif 000052
【図１８】
2005187456.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月27日(2005.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基含有化合物。
【化１】
2005187456.tif 000054
（１）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
Ｒは下記式（２）〜（４）中の構造のいずれかである（ただし、下記式（２）〜（４）構造において、式（１）の化合物をＡ−Ｒ−Ｂで表す）。
【化２】
2005187456.tif 000055
（２）
【化３】
2005187456.tif 000056
（３）
【化４】
2005187456.tif 000057
（４）
式（２）〜（４）中、Ｌは１〜６、Ｐは１〜３を表す。
【請求項２】
下記式（５）または（６）で示されるホスホリルコリン基含有化合物。
【化５】
2005187456.tif 000058
（５）
【化６】
2005187456.tif 000059
（６）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
【請求項３】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基含有化合物からなる表面改質剤。
【化１−１】
2005187456.tif 000060
（１）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
Ｒは下記式（２）〜（４）中の構造のいずれかである（ただし、下記式（２）〜（４）構造において、式（１）の化合物をＡ−Ｒ−Ｂで表す）。
【化２−１】
2005187456.tif 000061
（２）
【化３−１】
2005187456.tif 000062
（３）
【化４−１】
2005187456.tif 000063
（４）
式（２）〜（４）中、Ｌは１〜６、Ｐは１〜３を表す。
【請求項４】
下記式（５）または（６）で示されるホスホリルコリン基含有化合物からなる表面改質剤。
【化５−１】
2005187456.tif 000064
（５）
【化６−１】
2005187456.tif 000065
（６）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、それぞれ単独に、メトキシ基、エトキシ基またはハロゲンである。ただし、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3のうち、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれでも良い。
【請求項５】
グリセロホスホリルコリンの過ヨウ素酸ナトリウムと三塩化ルテニウムによる酸化反応によってカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を合成し、アミノ基を有する有機シラン化合物と、下記式（９）で示されるカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体から縮合剤によって合成されることを特徴とする下記式（６）で示される化合物の製造方法。
【化２１−１】
2005187456.tif 000066
（９）
【化６−２】
2005187456.tif 000067
（６）
【請求項６】
請求項３記載の表面改質剤で処理された改質粉体。
【請求項７】
請求項４記載の表面改質剤で処理された改質粉体。
【請求項８】
請求項３記載の表面改質剤で処理された改質担体からなるクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項９】
請求項４記載の表面改質剤で処理された改質担体からなるクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１０】
請求項３記載の表面改質剤で処理されたフィルター。
【請求項１１】
請求項４記載の表面改質剤で処理されたフィルター。
【請求項１２】
請求項３記載の表面改質剤で表面処理されたガラス製実験器具。
【請求項１３】
請求項４記載の表面改質剤で表面処理されたガラス製実験器具。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、本発明は、グリセロホスホリルコリンの過ヨウ素酸ナトリウムと三塩化ルテニウムによる酸化反応によってカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を合成し、アミノ基を有する有機シラン化合物と、下記式（９）で示されるホスホリルコリン基およびカルボキシル基を有する化合物から縮合剤によって合成されることを特徴とする下記式（６）で示される化合物の製造方法を提供するものである。
【化２１−２】
2005187456.tif 000068
（９）
【化６−３】
2005187456.tif 000069
（６）