(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的で効果的な分離を可能にしながら、背圧も低下させる固定相の新規な組成物を得ること。【解決手段】本発明は、改善されたクロマト分離のための新規な組成物、カラム、及び方法を提供する。特に、新規なカラムの充填剤は、クロマト分離と効率を全体的に改善するように提供される。本発明は、小さな分子、タンパク質、又は核酸の分離に使用される粒子あるいは粒子の混合物を有する充填材料を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマト分離で使用するためのカラムであって、
（ａ）ハウジングと、及び
（ｂ）前記ハウジング内に配置される固定相であって、前記固定相は、各々が粒度分布と平均粒径とを有する２つ又はそれより多い成分からなる充填剤材料からなり、任意の２つの平均粒径の差が、より大きな平均値の４０％未満または４０％に等しい、固定相とを含む、カラム。
【請求項２】
前記固定相が、有機材料、無機材料、ハイブリッド材料、及びこれらの組み合わせからなるグループから選択された材料からなる、請求項１に記載のカラム。
【請求項３】
前記分布の２つのピークにおける径の差が、前記２つのピークそれぞれにおける径の平均の３５％未満または３５％に等しい、請求項１に記載のカラム。
【請求項４】
前記カラムが液体クロマト分離に使用され得る、請求項１に記載のカラム。
【請求項５】
前記カラムが分取分離に使用され得る、請求項４に記載のカラム。
【請求項６】
前記カラムがガスクロマト分離に使用され得る、請求項１に記載のカラム。
【請求項７】
前記充填剤材料が二量体を含む、請求項１に記載のカラム。
【請求項８】
クロマト分離に使用するためのカラムであって、
（ａ）ハウジングと、及び
（ｂ）前記ハウジング内に配置される固定相であって、前記固定相は、５００〜３０００の粒子数と１μｍ〜４μｍの平均粒径とを有する第１の成分と、５００〜３０００の粒子数と１μｍ〜４μｍの平均粒径とを有する第２の成分とからなる、固定相とを含む、カラム。
【請求項９】
クロマトグラフィの充填剤材料において固定相として使用するための物質の組成物であって、前記充填剤材料は、分布の２つのピークにおける径の差が、２つのピークにおける径の平均値の４０％未満または４０％に等しい、二峰性の数平均粒度分布を有する、粒子または異なる多孔性粒子の混合物を含む、組成物。
【請求項１０】
前記固定相が、有機材料、無機材料、ハイブリッド材料、及びそれらの組み合わせからなるグループから選択された材料からなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記固定相は、分布の２つのピークにおける２つの径の差が、２つのピークにおける径の平均値の３５％未満または３５％に等しい、二峰分布を有する粒子を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が液体クロマト分離に使用され得る、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、分取分離に使用され得る、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、ガスクロマト分離に使用され得る、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記充填剤材料が、二量体を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記充填剤材料は、球状である粒子と球状粒子の二量体である複合結合構造である粒子とを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
クロマト分離の方法であって、
（ａ）分布の２つのピークにおける粒径の差が、２つのピークの径の平均値の４０％未満または４０％に等しい粒度分布を有する粒子を含む充填剤材料を有する固定相にサンプルを接触させるステップと、及び
（ｂ）前記サンプル成分を分離するステップとを含む、クロマト分離の方法。
【請求項１８】
前記固定相が、有機材料、無機材料、及びそれらの組合せからなるグループから選択された材料からなる、請求項１７に記載のクロマト分離の方法。
【請求項１９】
カラムが液体クロマト分離に使用され得る、請求項１７に記載のクロマト分離の方法。
【請求項２０】
カラムがガスクロマト分離に使用され得る、請求項１７に記載のクロマト分離の方法。
【請求項２１】
前記充填剤材料は、球状である粒子と球状粒子の二量体である複合結合構造である粒子とを含む、請求項１のカラム。
【請求項２２】
クロマト分離の方法であって、その方法が、
固定相にサンプルを接触させるステップであって、前記固定相が充填剤材料を有し、前記充填剤材料が、第１、及び第２の成分からなり、前記第１の成分の数平均粒度分布が前記第２の成分の数平均粒度分布よりも広く、前記第１の成分の最大粒径が前記第２の成分の最大粒径に近い、ステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率液体クロマト分離を行うための組成物および方法に関し、より具体的には、クロマトグラフィのカラムの充填剤に関する新規な組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いる分離は、液体の流れの中のいくつかの成分の溶質分子が、固定相として知られる粒子の充填された床を介して濾過されるという事実に依存する。これにより、粒子が互いから効率的に分離される。各成分が固定相に対して異なる親和性を有することにより、各成分は異なる速度で移動し、カラムから排出される時間も異なる。分離効率は、溶質バンドがカラムを通過する際の広がりの量によって決定される。
【０００３】
一般に、クロマトグラフィのカラムを介した溶質の通過とバンドの広がりを説明するために、段理論が使用される。段理論は、いくつかの速度因子の観点からバンドの広がりを説明する。例えば、分離は、複数の接続された等しい別々の仮想の段で行われると考えられ、これらの各体積は固定相と移動相の両方を含み、各々の中では完全な平衡が確立されている。このような各段は「理論的な」段と呼ばれる。こうした場合、カラム内の理論的な段の数は、分離度から計算される。カラムの長さは、理論的な段に関してこの計算に重要である。計算された理論的な段ごとのカラムの長さは、「理論的な段に等しい高さ」、即ちＨと呼ばれ、バンドが広がる現象の尺度である。
【０００４】
バンドの広がりは、分離に重要であり、分離の質を表す。例えば、概して分離におけるバンドが広ければ広いほど、分離が悪くなるか、又はカラム効率が悪くなる。
【０００５】
また、分離は相と相の関係にも基づく。クロマトグラフィにおいて、一方の相は固定相であり、他方の相は移動相である。２つの相の間で事実上完全な平衡が達成されないように、移動相は比較的速い速度で固定相を通過する。これは、分離を行う際に、ピークの広がりを避け、きれいで効率的な分離を得るために考慮されなければならない。
【０００６】
クロマトグラフィのカラムに段理論を適用する際に、最初は、溶質のすべてがカラムの第１の段の体積中に存在すると仮定される。分散は分配係数に基づく。この例では、分配係数は、遭遇する溶質の濃度について一定であり、溶質は各段の体積中で２つの相の間でそれ自体急速に分散する。
【０００７】
最小のピークの広がりを提供するカラムは、きれいな分離を示し、ＨＰＬＣシステムとプロセスに望ましい。カラムに入れられる充填剤の特性とカラムを充填する方法は、サンプル成分のきれいで効率的な分離を得る際に非常に重要である。従って、カラムの性能に悪影響を与える、相対的なバンドの広がりを決定する種々のプロセスを最小化することが望ましい。カラム段の高さＨに対するこれらの各プロセスの影響は、速度論によって、移動相速度ｕ、充填剤の粒径ｄｐ、移動相における溶質の拡散係数のような実験変数に関連づけられ得る。理論的な段Ｈに等しい高さに寄与する、ＨＰＬＣの主要なバンド広がりのプロセスは一般に、Van Deemterの式によって考察される。さらに、この式を単純化して、粒径、流量速度、及び拡散係数の３つの重要な変数を関連づけることができる。この簡単にされた式では、粒径が増大すると、効率は減少するはずである。流量速度が増加すると、物質移動項が効率を支配し、低下は速度と粒径の積に比例することが式によって予測される。分析クロマトグラフィ、製品の純度、分取クロマトグラフィにおいて溶質の最適な分離を得ることを確実なものにするためには、バンドの広がりを最小化することが望ましいことを理解されたい。
【０００８】
しかしながら、カラム効率の点でより小さな粒子から得られる利点は、より高いシステムストレスによる増加した装置コストと低下した信頼性を含む、高い背圧の欠点によって相殺されるはずである。さらに通常は、液体クロマトグラフィのカラムに使用される粒子は、理想的には単分散されて、できる限り狭い粒度分布を有しなければならないと断言される。例えば、非特許文献１には、粒径の異なる不規則な形状の材料の混合物が、対応する同等の平均粒径より大きな圧力を有する充填剤を生成することが開示されている。DewaeleとVerzeleによる研究は、２つの成分混合物に限定されていた。混合物の中の各成分は、単分散の粒度分布と分布の平均を有する。さらに、粒度分布の平均は、互いに４０％よりも大きい分だけ異なる。言いかえれば、平均粒径の大きく異なる粒子の混合物は、システム全体の背圧の低減に役に立たない。
【特許文献１】米国特許第４，０１７，５２８号
【特許文献２】米国特許第６，５２８，１６７号
【特許文献３】米国特許第６，６８６，０３５号
【特許文献４】米国特許第３，７８２，０７５号
【特許文献５】米国特許第３，８５５，１７２号
【特許文献６】米国特許第４，０１０，２４２号
【特許文献７】米国特許第４，７０５，７２５号
【特許文献８】米国特許第４，４７７，４９２号
【非特許文献１】Dewaele及びVerzele著、「J.Chromatography」260（1983年）13−21
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、効率的で効果的な分離を可能にしながら、背圧の増加および不十分な分離と効率という問題を避けることのできる新規な材料（単数または複数）を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、クロマトグラフィの装置、方法、及び充填剤の組成物を提供する。充填剤の組成物は、粒度分布（ＰＳＤ）と粒度分布の平均を有する２つ又はそれより多い成分からなる。任意の２つの粒度分布の平均の差は、大きな成分の平均の４０％未満である。
【００１１】
粒子は、クロマトグラフィの使用に適した任意の無機材料またはハイブリッドの無機材料／有機材料からなることができる。
【００１２】
また、本発明は、より高い背圧を有する充填剤に比べて広げられたＰＳＤを有する粒子を含むクロマトグラフィのカラム及び充填剤も提供する。
【００１３】
また、本発明は、種々の有機材料および無機材料を分離するための粒子または充填剤を作成および使用する方法も提供する。
【００１４】
最後に、本発明は、全体的な分離と効率の向上に役立つ粒子の二量体を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による組成物をクロマトグラフィの固定相に使用することにより、本質的に同じ効率の固定相に対して背圧が低減されることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明を詳細に説明する前に、留意すべきは、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる際には、単数形は、文脈で別段に記載されない限り複数形も含む。従って、例えば「材料」という用語は、材料の組み合わせを含み、「化合物」という用語は複数の化合物の混ぜ物を含み、「窒化物」という用語は複数の窒化物を含む等である。
【００１７】
本発明を説明および特許請求するにあたり、次の用語を以下に述べられる定義に従って使用する。
【００１８】
本明細書において用いられる場合に、「本質的に」という用語は、述べられた値の１０％以内の物理特性平均を示す。
【００１９】
用語「充填剤材料」は、非多孔性充填剤材料、多孔性充填剤材料、あるいは多孔性充填剤材料、非多孔性充填剤材料又は表面的に多孔性の充填剤材料の混合物を指す。この用語は、限定することは意図されておらず、上記材料の組合せおよび混合物を含む。
【００２０】
用語「固定相」は、必要に応じて粒子表面を所定のクロマト分離で有用にするように、結合された有機部分を有する有機材料または無機材料からなる粒子を含む相を指す。特定の例では、これらの粒子または材料は、カラム内に固定されて移動しない。無機材料の例は、以下に限定されないが、シリカ、ジルコニウム、及び酸化チタンである。有機材料の例は、スチレンジビニルベンゼン共重合体である。また、無機材料は、当業界では「ハイブリッド」粒子として知られている物質を含むことができる。このハイブリッド粒子は、同じ構造の有機部分と無機部分を含み、Merck社に譲渡された特許文献１と、Waters社に譲渡された特許文献２と特許文献３に説明されている。上記３つの特許文献はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
次に、図面を参照しながら本発明を説明する。図面は一定の縮尺に従わずに描かれており、特に、特定の寸法は、明確に表すために誇張されている場合がある。
【００２２】
実施例１
シリカ結合粒子の２つのサンプルを当業者に知られた標準的な方法により準備する。この方法は、例えば、Du Pont社に譲渡された特許文献４、特許文献５、及び特許文献６に説明されている。これらの３つの特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。粒子は、特許文献７に説明された結合化学反応を使用して結合される。特許文献７もDu Pont社に譲渡されており、参照により本明細書に組み込まれる。結合相はＣ−１８（オクタデシル基）材料であった。留意されるべきは、これらの処理技術は、定義された粒度分布（ＰＳＤ）を生成する。これは、業界標準において一般的であり、よく知られている。留意すべきは、本発明はこれらの方法の文脈で説明されるが、本発明は粒度分布を有する成分に限定されると解釈されべきではない。例えば、分布内に存在しないほとんど同一または同様のサイズの粒子を生成する技術が、使用または開発されることができる。本発明はこれらのタイプの材料および文脈にも適用可能である。
【００２３】
図２は、両方のサンプルについて、クールター計数器（フロリダ州ハイアレアのBeckman Instruments社）によって得られた粒度分布を示す。ビン当たりの粒子数は、２５６ビンで１μｍ未満から６μｍまでをカウントした。図２から看取されるように、１つのサンプル（Ａと表示）は単分散であり、１つのピークが約２μｍのところで見られる。クールター計数器で測定すると、第２のサンプルは２つのピークをもたらし、本質的に径が１．８μｍと２．２μｍの粒子の混合物であった。
【００２４】
２つのサンプルは、標準的な技術を使用して直径４．６ｍｍで長さ３０ｍｍのＨＰＬＣカラムへ充填された。ＨＰＬＣ実験は、Agilent 1100装置（デラウェア州ウィルミントン、アジレント・テクノロジーズ社）で行い、カラムを介した移動相の体積流量の関数として背圧を測定し、低減された段高さを線形流量の関数として測定した。溶離剤は、８５：１５のアセトニトリル：水（体積比）で、温度は２０℃であった。サンプルはオクタノフェノンであり、２４５ｎｍのＵＶ検出を用いた。
【００２５】
図３は、ＨＰＬＣ実験からの背圧のプロットを示す。サンプルＡとサンプルＢを示し、サンプルＢは、図４に示すVan Deemterプロットによって判定すると、最適流量でサンプルＡより２０％低い背圧を示す。
【００２６】
図４は、サンプルカラムに関するVan Deemter曲線を示す。両方のカラムについて同じ平均粒径を使用して、低減された段高さを計算した。最大カラム効率の点で最適な流量は、プロット内の最小の位置によって判定される。図から看取されるように、最小の段高さ付近では、段高さは、ほんの数パーセントしか異ならず（サンプルＢについては０．００３８５ｍｍであるのに対し、サンプルＡについては０．００３７２ｍｍ）、曲線の最小は十分に広く、カラムの性能はカラムの動作速度範囲に渡って本質的に同一である。
【００２７】
従って、サンプルＢのより広い粒度分布は、カラムの効率を大幅に犠牲にすることなく、ＨＰＬＣ実験における背圧を大幅に低減するのに効果的であることが分かった。
【００２８】
図５は、上述のように広いＰＳＤを有する粒子を保持するスライドの、５００×の倍率の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す。クールター計数器データとＴＥＭデータを相関させることは、一般に不可能であるが、電子顕微鏡写真内の多数の粒子が二量体として結合しているように見える。従って、機構によって制約されることは望まないが、クールター計数器により測定されたＰＳＤの二峰性特性の一部または全部は、二量体構造により生じた可能性がある。本明細書で請求する本発明の範囲は、二量体粒子構造が存在するＰＳＤを含む。
【００２９】
実施例２
実施例１と同じ結合相、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのＨＰＬＣカラムを準備した。カラムに、１．８μｍの平均粒径と３．５μｍの平均粒径の単峰粒度分布を有する粒子の混合物を充填した。ＨＰＬＣ実験の条件は以下の通りであった。
装置：Agilent 1100（デラウェア州ウィルミントン、アジレント・テクノロジーズ社）
注入容積：  ２μｌ
検出：  １．８μｌセルで２５４ｎｍのＵＶ
移動相：  ６０／４０のメタノール／水
流量：  １．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：  室温
サンプル：  ウラシル、フェノール、４−クロロニトロベンゼン、及びトルエン
ＨＰＬＣ実験の結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
表１から、小さい２．２μｍ粒子の効率の利点は、大きな粒子を３０％まで追加しても実質的に保持され、システム圧力の節約は５．７ＭＰａ（５７ｂａｒ）であることが分かる。図６と図７はこの効果をより明らかに示し、この場合、効率  対  ３．５μｍ粒子のパーセンテージのプロットは、４０％の粒子含有まで横ばい状態であり、圧力  対  ３．５μｍ粒子のパーセンテージのプロットは本質的に線形であることを示す。
【００３２】
「背景技術」の項の説明から、このような粒径の混合物がカラムの動作に必要な背圧に対する係る高効率をどうして示すことができるのかは、すぐに明らかにはならない。機構により制約されることは望まないが、カラムの効率への考えられる寄与は、カラムの充填の容易性が向上し、より小さな粒子の理論的最大値に近いクロマトグラフィ効率につながることから生じるのかもしれない。別の考えられる寄与は、固定相と、固定相が充填されたカラムの壁との間の境界充填効果から生じるのかもしれない。
【００３３】
上記の実施例は特定の粒度分布とクロマトグラフィ条件の組に限定されているが、本発明はこれらの条件に限定されるものと解釈されるべきではない。例えば、この開示から当業者には明らかなように、カラム充填剤は、結合シリカ以外の他の材料からなることができ、シリカのカラムと同様なＰＳＤに起因した同じ利点を依然として保持する。
【００３４】
さらに、ＰＳＤが十分に広く、同じ平均粒径で狭いＰＳＤに比べて背圧に必要な減少をもたらす限り、ＰＳＤが二峰性である必要はない。当業者であれば、必要以上の実験をせずに、背圧と効率の最適化された関係を示すＰＳＤを有する粒子を開発することができるであろう。
【００３５】
固定相の粒子は、必ずしもすべてが同じ程度に多孔性である必要はない。例えば、固定相は、非多孔性である粒子または表面的に多孔性である粒子など、多孔性の程度が異なる粒子の混合物からなることができる。表面的に多孔性の粒子の例は、特許文献８に説明されている。特許文献８もDu Pont社に譲渡され、参照により本明細書に組み込まれる。要約すると、本質的に同じ効率の固定相に対して背圧の低減をもたらす、サイズの異なる多孔性の粒子からなる任意の混合物が、本発明の範囲によって網羅される。
【００３６】
また、本発明の粒子の平均粒径は、上述した例によって制限されるものと解釈されてはならない。平均粒径は、クロマトグラフィの固定相としての粒子の有用性だけによって制限され、典型的には０．５μｍ〜１００μｍ、及び１μｍ〜１０μｍの範囲内である。上記の例は解析用途における粒子の使用に関係するが、所与の背圧力についてより高い効率を得ることができる分取クロマトグラフィで本発明を使用する場合の利点は明らかであろう。
【００３７】
実施例では小さな有機分子（ウラシル、フェノール、トルエン、４−ニトロベンゼン）への本発明の適用を示したが、本発明は大きなポリマ、タンパク質、核酸、ペプチドの分離への使用にも適用される。当業界で知られた他の生物分子も、本発明を使用して分離することができる。
【００３８】
本発明を要約すると、以下の通りである。本発明は、改善されたクロマト分離のための新規な組成物、カラム、及び方法を提供する。特に、新規なカラムの充填剤は、クロマト分離と効率を全体的に改善するように提供される。本発明は、小さな分子、タンパク質、又は核酸の分離に使用される粒子あるいは粒子の混合物を有する充填材料を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＨＰＬＣシステムの移動相の線速度に対して段高さをプロットしたVan Deemterプロットの例を示す図である。
【図２】単分散および多分散（２つのピークを有する）のサンプルの互いに重ねられた粒度分布プロットを示す図である。
【図３】粒子を図２に示された粒度分布と比較するＨＰＬＣ実験について、流量に対する背圧のプロットを示す図である。
【図４】図３に示された実験のVan Deemterプロットを示す図である。
【図５】本発明の粒子の透過電子顕微鏡写真を示す図である。
【図６】カラム充填剤が大小の粒子の混合物であるＨＰＬＣ実験について、大きな粒子のパーセンテージに対する効率のプロットを示す図である。
【図７】図６と同じ実験について、大きな粒子のパーセンテージに対するシステム圧力のプロットを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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