(57)【要約】【課題】  PGE2産生抑制剤及び抗炎症剤の提供。【解決手段】スフィンゴ脂質を含む医薬組成物。スフィンゴ脂質がセラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質又はガングリオシドである医薬組成物。スフィンゴ脂質を配合してプロスタグランジンE2産生抑制作用を付与した抗炎症剤、添加剤及び基剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴ脂質を含む医薬組成物。
【請求項２】
スフィンゴ脂質が、セラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質、又はガングリオシドである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
プロスタグランジンE2産生抑制剤である請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗炎症剤である請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項５】
スフィンゴ脂質を含み、プロスタグランジンE2産生抑制作用を付与した添加剤又は基剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴ脂質を含むプロスタグランジンE2産生抑制剤に関する。また、本発明は、スフィンゴ脂質を配合して、プロスタグランジン産生抑制作用を付与した抗炎症剤、添加剤及び基剤に関する。              
【背景技術】
【０００２】
生体に存在する脂質には、スフィンゴ脂質、コレステロール、グリセロリン脂質等があり、これらの脂質はタンパク質とともに細胞膜の基本骨格を形成している。このうち、スフィンゴ脂質に属するものとしては、セラミドが代表的である。セラミドは、スフィンゴ脂質の基本構造であるスフィンゴシンに脂肪酸が結合した物質である。セラミドは角質の細胞をつなぐ角質細胞間脂質の約５０％を占めており、保湿機能を持つため化粧品などによく使用されている。そして、セラミドを含む食品（植物性セラミド）を摂取し続けると、肌の水分保持機能の改善やコラーゲンを安定化させるともいわれている。さらに、最近の基礎研究の進歩により、セラミドが従来考えられていた膜のコンポーネントとしてだけではなく、細胞内においてその機能を調節する生理活性物質の一つであることが明らかとなり、セラミドは脂質メディエーターとして、アポトーシス、細胞の増殖・分化に関わることが報告されている（非特許文献１、２）。従って、セラミドは細胞情報伝達系の基質や情報分子となるなど、複数の機能を有する物質として注目されている。
【０００３】
ところで、本発明者は、これまで歯周疾患の炎症応答について、培養ヒト歯肉線維芽細胞及び歯根膜細胞を用いて、代表的なケミカルメディエーターであるプロスタグランジンE2産生メカニズムを検討し報告を行った（非特許文献３〜８）。プロスタグランジンE2は、炎症時の発熱・発痛・血管透過性亢進及び骨吸収促進作用を有する代表的な炎症性因子であり、歯周疾患の進行に関与すると考えられている。これまでに、歯周疾患に対するプロスタグランジンE2の特徴として、炎症歯肉組織中においては健康歯肉組織中よりも高濃度のプロスタグランジンE2が検出されること、炎症歯肉組織中と歯肉溝浸出液中プロスタグランジンE2濃度には相関があり、さらに歯槽骨吸収にも強く関与していること等が知られている（非特許文献９〜１２）。
【０００４】
また、スフィンゴシン骨格を有する化合物に歯周病を予防及び改善する効果があること（特許文献１）、及びセラミドの細胞内での増加又は作用を抑制する薬剤が、抗炎症剤として有用であることも知られている（特許文献２）。しかし、スフィンゴシン骨格を有する化合物が抗炎症機序のどのプロセスを抑制するのかは、不明である。
【特許文献１】特開2001-158735号公報
【特許文献２】特開2000-86601号公報
【非特許文献１】Pettus BJ., et al., Biochem. Biophys. Acta, 1585, 114-125, (2002)
【非特許文献２】Van Blitterswijk WJ., et al., Biochem. J., 3639, 199-211, (2003)
【非特許文献３】Segawa M., et al., Life Sci., 72(7), 795-803, (2003)
【非特許文献４】Nakao S., et al., Mol. Cell Biochem., 268(1-2), 113-118, (2002)
【非特許文献５】Nakao S., et al., Cell Calcium, 29(6), 446-452, (2001)
【非特許文献６】Nakao S., et al., Mol. Cell Biochem., 209(1-2), 113-118, (2000)
【非特許文献７】Nakao S., et al., Eur. J. Pharmacol., 395(3), 247-253, (2000)
【非特許文献８】Ogata Y., et al., Life Sci., 64(4), 71-77, (1999)
【非特許文献９】Goodson JM., et al., Prostaglandins, 6, 81-85, (1974)
【非特許文献１０】Tsai CC., et al., J. Dent., 26, 97-103, (1998)
【非特許文献１１】Ohm K., et al., J. Periodont Res., 19, 501-511, (1984)
【非特許文献１２】Rasmussen L., et al., J. Clin. Periodontol., 27, 41-52, (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、スフィンゴ脂質を含む医薬組成物、プロスタグランジンE2産生抑制剤、及び抗炎症剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために誠意研究を行った結果、セラミドがプロスタグランジンE2の産生抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明はスフィンゴ脂質を含む医薬組成物である。スフィンゴ脂質としては、例えばセラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質、又はガングリオシドが挙げられる。上記医薬組成物は、プロスタグランジンE2産生抑制剤又は抗炎症剤として使用することができる。また、スフィンゴ脂質はプロスタグランジンE2産生抑制作用を有しており、プロスタグランジンE2産生抑制効果を引き起こすための各種添加剤又は基剤として使用することも可能である。従って、本発明のスフィンゴ脂質は、食品又は化粧品に含めることも、歯磨剤や洗口剤に含めることもできる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、スフィンゴ脂質を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、プロスタグランジンE2産生抑制剤及び抗炎症剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．概要
プロスタグランジンE2(PGE2)は、炎症時の発熱、発痛、血管透過性亢進及び骨吸収促進作用を有する代表的な炎症性因子である。そのため、その産生過程に関与する多くの分子は、抗炎症剤の開発ターゲットとして注目されている。
【００１０】
本発明者は、歯肉線維芽細胞をモデルに用いてPGE2産生機構におけるスフィンゴ脂質の効果を検討した結果、スフィンゴ脂質がPGE2の産生を抑制することを見出した。このことは、スフィンゴ脂質を配合してPGE2の産生抑制作用を付与した本発明の医薬組成物は、抗炎症剤として有用であることを意味する。従って、本発明において、セラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質、ガングリオシドなどのスフィンゴ脂質を、PGE2産生抑制剤、及び抗炎症剤などの医薬組成物に含有して使用することができる。また、本発明においては、PGE2の産生抑制を目的として、上記スフィンゴ脂質を添加剤又は基剤として使用することが可能である。
【００１１】
２．スフィンゴ脂質
本発明において、スフィンゴ脂質とは、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、デヒドロフィトスフィンゴシン等のスフィンゴイド骨格を分子中に有する脂質であり、例えばスフィンゴ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴリン糖脂質、セラミド、セレブロシド、リゾスフィンゴ脂質等、又はこれらの混合物が挙げられる。
【００１２】
上記のスフィンゴ脂質は、細胞膜を構成する成分であり、その大部分がスフィンゴ糖脂質やスフィンゴリン脂質として存在している。スフィンゴ脂質は、脳や神経系又は赤血球に多く含まれている。また、種々の食品中にも多く含まれている。
【００１３】
スフィンゴ脂質の生理作用に関しては、これまでに非常に多くの報告がされている。例えば、スフィンゴシンタンパク質リン酸化酵素Ｃを阻害する作用、単球やマクロファージ系細胞の分化を促進する作用、上皮細胞成長因子レセプターの機能を調節する作用などである。また、スフィンゴ脂質の中でも、ガングリオシドは、神経繊維伸展作用を有しているため、脳虚血障害やパーキンソン病による脳障害の治療にも応用されている。
【００１４】
スフィンゴ脂質のセラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質、ガングリオシドなどの化合物の製造は、その方法に限定されるものではない。例えば、動植物を原料として、加熱、火炎、アルコール添加、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過などの処理を単独で、又は適宜組み合わせて行うことにより得ることができる。なお、スフィンゴ脂質は熱安定性を有するので、医薬組成物を作製する際に極めて取り扱いやすい。
【００１５】
３．プロスタグランジンE2(PGE2)
炎症の反応機序は炎症の時期によって異なっており、さまざまな薬理学的活性物質が生体内に局所的に生成、遊離され、反応を媒介する。このような物質は炎症のケミカルメディエーターと呼ばれ、ヒスタミン、セロトニン、ブラジキニン、プロスタグランジン類、ロイコトリエン類、血小板活性化因子、白血球遊走因子などがある。この炎症のケミカルメディエーターのうち、プロスタグランジン類は、抗炎症剤の薬理作用に深く関わっており、細胞にさまざまな起炎性刺激が加えられると、プロスタグランジンやその他の薬理活性物質が生成される。
【００１６】
PGE2は求心神経系で発痛作用を生じる。この作用はブラジキニンやヒスタミンなどの発痛物質に比べてかなり弱いが、上記の発痛物質の血管透過性亢進作用を著明に増強する。従って、PGE2は上記の発痛物質の痛覚神経終末に対する刺激作用を著明に増強して、痛覚過敏を誘発する。
【００１７】
また、細菌感染や、組織損傷、炎症などにより発熱が起こる。感染した細菌の外毒素などは、好中球やマクロファージによる内因性発熱物質（例えば、インターロイキン、サイトカイン類）の産生と遊離を刺激する。そして、遊離した内因性発熱物質は視床下部におけるPGE2合成を誘発する。この生産されたPGE2は視床下部の体温調節機構に作用し、サーモスタットの設定点を引き上げ体温上昇（発熱）を引き起こす。
【００１８】
従って、さまざまなケミカルメディエーターのうち、PGE2は抗炎症機序においてキーとなる役割を担っていることが明らかであり、抗炎症剤のターゲット分子となり得る。
【００１９】
４．医薬組成物
本発明において、スフィンゴ脂質は、PGE2産生抑制剤、抗炎症剤を目的とした医薬組成物として使用することができる。PGE2産生抑制活性、又は抗炎症活性を有する限り、スフィンゴ脂質は、それらの構造の一部が改変されてもよく、あるいは修飾された誘導体であっても良い。誘導体としては、薬理上許容される塩、エステル又はプロドラック等を挙げることができる。薬理上許容される塩としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属若しくはこれらの水酸化物、又は炭酸塩、無機塩若しくは有機塩を付加した酸付加塩等を挙げることがきるがこれに限定されない。エステルは、アルコール又はカルボン酸とのエステル化反応で生じるエステルであれば特に限定されない。プロドラックとは、生体に投与されたのちにスフィンゴ脂質に変化して、PGE2産生抑制作用又は抗炎症作用を示す化合物を意味し、セラミドをラクトセラミドにしたものなどを例示することができる。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、精製された成分のみを含むものに限定されず、スフィンゴ脂質を含む粗精製物であってもよい。
【００２１】
また、本発明の医薬組成物は、他のPGE2産生抑制剤又は抗炎症剤と併用してもよい。
【００２２】
本発明のスフィンゴ脂質は、PGE2産生抑制作用を有するため、PGE2産生抑制剤として、PGE2産生抑制作用を有する添加剤若しくは基剤として有用である。本発明のスフィンゴ脂質を添加剤又は基剤とする医薬組成物の用途は、例えば抗炎症剤が挙げられるがこれに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、本発明のスフィンゴ脂質を含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
【００２３】
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤又はシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。
【００２４】
本発明の薬剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該薬剤に含有される活性成分であるスフィンゴ脂質の種類などにより異なるが、適宜決定することができる。但し、この範囲に限定されるものではない。
【００２５】
例えば、注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に0.1μg /ml担体〜10mg /ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とする患者に対し、１日あたり１回〜数回投与でき、投与量は適宜決定することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射又は腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤又は乳濁剤として調製することもできる。注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。また、注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００２６】
５．食品、化粧品
本発明のスフィンゴ脂質は、飲食物、化粧品に含まれた形態でも提供される。本発明の医薬組成物を飲食物及び化粧品に添加することにより、その飲食物にPGE2産生抑制活性、又は抗炎症活性を付与することができる。そのためには、有効量を摂取できるようにスフィンゴ脂質を食品、化粧品等に配合すればよい。
【００２７】
添加される飲食物としては、肉製品、加工野菜、惣菜類、菓子、パン、清涼飲料、果実飲料、酒類等又はその他の食品素材と混合した健康食品等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他の食品素材とは、例えば、糖類、食用タンパク質、アルコール、ビタミン、増粘多糖類、アミノ酸、色素、香料、乳化剤、膨張剤、保存剤等である。また。化粧品等としては、化粧クリーム、化粧水、乳液、ファンデーション、口紅、マニキュア、整髪料、ヘアトニック、育毛料、シャンプー、リンス、化粧石けんなどが挙げられ、歯磨剤、洗口剤等の日用品に使用することもできる。化粧品を調整する場合には、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、動植物抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、保存剤、通常の化粧品原料として使用されているものを適宜配合して製造することができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００２９】
特に、本発明の実施例では、炎症のモデルとしてヒト歯肉由来線維芽細胞を用いたが、本発明は、該細胞に対する作用に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
１．材料及び方法
（１）セラミド
セラミドは、下記式（１）で示すC2-セラミド（N-acetyl-D-erythro-sphingosine）をエタノールに溶解し実験に用いた。対照として不活性型セラミドである下記式（２）で示すC2-セラミドのアナログ（Dihydro-N-acetyl-D-erythro-sphingosine）を同様にエタノールに溶解したものを用いた。
【００３１】
【化１】
2005187341.tif 000002
【００３２】
【化２】
2005187341.tif 000003
【００３３】
（２）細胞培養
健康な成人および歯周病を有する患者より採取した3-5mmの歯肉結合組織片を培養シャーレー上に静置し、アウトグロースした細胞をヒト歯肉線維芽細胞として継代培養を行い使用した。細胞培養条件は37℃、５％CO2インキュベーター内で、10％FCSおよび100 unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有するD-MEM培地を培養液として使用した。
（３）プロスタグランジンE2測定
歯肉線維芽細胞を24穴のプレートで培養を行い、コンフルエントに達した時点でD-MEM培地から10％FCSを除外した培地に交換した後、以下の組み合わせでセラミド存在化および非存在化で刺激を行い、培養上清に遊離されるプロスタグランジンE2をELISA法を用いて測定した。細胞への刺激は、特に言及しない限り (i)IL-1β、(ii) IL-1β＋C2-ceramide、(iii) IL-1β＋C2-ceramideアナログの３通りの組み合わせで行った。
【００３４】
２．結果
（１）IL-1βによるPGE2産生に対するセラミドの抑制効果
歯肉線維芽細胞にIL-1β(500 pg/ml)、C2-ceramide(25μM)、C2-ceramideアナログ(25μM)を上記の組み合わせで作用させ、培養上清中に産生されるPGE2量を経時的に測定した。
【００３５】
図１に示すように、ヒト歯肉由来線維芽細胞を炎症性サイトカインIL-1βで6-24時間刺激すると、時間経過にともないプロスタグランジンE2産生の促進が認められた（図１の○印）。この時、セラミド（C2-ceramide : 25μM）を作用させると、IL-1βによるプロスタグランジンE2産生の抑制が認められた（図１の×印）。これに対して、不活性型C2-ceramideのアナログではIL-1βによるプロスタグランジンE2産生に対しては抑制効果が認められなかった（図１の●印）。
（２）IL-1βによるPGE2産生に対するセラミドの用量依存的抑制効果
歯肉線維芽細胞にIL-1β(500 pg/ml)、C2-ceramide、及びC2-ceramideアナログを、各種用量で上記の組み合わせで24時間作用させ、培養上清中に産生されるPGE2量を経時的に測定した。
【００３６】
ヒト歯肉由来線維芽細胞をIL-1βにより24時間刺激したときのプロスタグランジンE2産生は、10-50μMのセラミド（C2-ceramide）が共存すると、用量依存的に抑制された（図２白抜き棒）。しかし、不活性型のアナログではIL-1βによるプロスタグランジンE2産生に対する抑制効果は認められなかった（図２灰色棒）。
（３）TPAによるPGE2産生に対するセラミドの抑制効果
歯肉線維芽細胞にIL-1β(500 pg/ml)、TPA(100 nM)、C2-ceramide(25μM)及びC2-ceramideアナログ(25μM)を、下記の組み合わせで12時間作用させ培養上清中に産生されるPGE2量を経時的に測定した。刺激を実施した組み合わせは、(i) TPA、(ii) TPA＋C2-ceramide、(iii) TPA＋C2-ceramideアナログ、(iv) IL-1β、(v) IL-1β＋C2-ceramide及び (vi) IL-1β＋C2-ceramideアナログ、の６通りである。
【００３７】
図３は、細胞内のプロテインキナーゼCを直接に活性化し、種々の細胞内反応を起こすホルボールエステル (TPA)によるヒト歯肉由来線維芽細胞でのプロスタグランジンE2産生に対するセラミド（C2-ceramide）の効果を示したものである。細胞を1μMのTPAで12時間刺激をすると、プロスタグランジンE2産生の促進が認められた（図３、TPA添加のパネル、白抜き棒）。TPAと共にセラミド（C2-ceramide : 25μM）を作用させると、TPAによるプロスタグランジンE2産生は有意に抑制された（図３、TPA添加のパネル、灰色点棒）。一方、不活性型C2-ceramideのアナログはTPAによるプロスタグランジンE2産生に対しては抑制効果を示さなかった（図３、TPA添加のパネル、黒色点棒）。
（４）炎症を有する患者の歯肉線維芽細胞におけるPGE2産生とセラミドの抑制作用
歯周疾患を有する患者より採取した歯肉線維芽細胞にIL-1β、C2-ceramide、及びC2-ceramideアナログを、(i)IL-1β(500 pg/ml)、(ii) IL＋C2-ceramide(25μM)、(iii) IL-1β＋C2-ceramideアナログ(25μM)の組み合わせで、24時間作用させ、培養上清中に産生されるPGE2量を経時的に測定した。
【００３８】
【表１】
2005187341.tif 000004
【００３９】
表１は、歯周疾患を有する患者から得られた歯肉線維芽細胞における結果を示したものである。健常なヒトから得られた歯肉線維芽細胞では無刺激時のプロスタグランジンE2産生が平均0.14 ± 0.03 ng/mlであるのに対して、歯周疾患患者からの歯肉線維芽細胞の無刺激時のプロスタグランジンE2産生量は 1.04 ± 0.14 ng/mlと高い傾向が認められた。この歯肉線維芽細胞においてもIL-1βを24時間作用させるとプロスタグランジンE2産生の促進が認められ、IL-1βとセラミド（C2-ceramide : 25μM）を共存させると、IL-1βによるプロスタグランジンE2産生は有意に抑制された。一方、不活性型のC2-ceramideのアナログでは抑制効果は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】IL-1βによるPGE2産生に対するセラミドの抑制効果を示す図である。
【図２】IL-1βによるPGE2産生に対するセラミドの用量依存的抑制効果を示す図である。
【図３】IL-1βとTPAによるPGE2産生に対するセラミドの効果を示す図である。
【図１】
2005187341.tif 000005
【図２】
2005187341.tif 000006
【図３】
2005187341.tif 000007