(57)【要約】【課題】立体障害が生じる一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションを高速且つ確実に行う。【解決手段】ハイブリダイゼーション装置１０は、全てのプローブのディネーチャ温度Ｔｍよりも高い温度までバッファ溶液の温度を上昇させる（期間ｓ３）。それとともに溶液に対して交流電界を印加することにより、プローブ及びターゲットを伸張させ、ターゲットをプローブに接近させる。その後、ゆっくりと溶液の温度を全てのプローブのアニーリング温度（Ｔａ１、Ｔａ２）以下まで下降させる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的となるヌクレオチド鎖が浮遊した溶液を有するするとともに、検出用のヌクレオチド鎖（プローブ）の一端が上記空間内に固定されている反応領域を１又は複数有する反応手段と、
上記溶液を加熱する加熱手段と、
上記溶液に電界を印加する電界印加手段と、
上記加熱手段の動作制御をすることにより上記溶液の温度を制御するとともに、上記電界印加手段の動作制御をすることにより上記溶液中の電界を制御するコントローラとを備え、
上記コントローラは、
上記反応手段に固定されている全ての上記プローブの溶解温度よりも高い温度まで上記溶液の温度を上昇させるとともに上記溶液に対して交流電界を印加し、
上記全てのプローブのアニーリング温度以下まで上記溶液の温度を下降させること
を特徴とするハイブリダイゼーション装置。
【請求項２】
上記コントローラは、
各プローブのアニーリング温度で上記溶液の温度を一時的に一定に保つこと
を特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項３】
標的となるヌクレオチド鎖を浮遊させた溶液を有するとともに、１又は複数種類の検出用のヌクレオチド鎖（プローブ）の一端を固定し、
固定されている全ての上記プローブの溶解温度よりも高い温度まで上記溶液の温度を上昇させるとともに上記溶液に対して交流電界を印加し、
上記全てのプローブのアニーリング温度以下まで上記溶液の温度を下降させること
を特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
各プローブのアニーリング温度で上記溶液の温度を一時的に一定に保つこと
を特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１本鎖のヌクレオチド鎖と、その相補的なヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション装置及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等において、ＤＮＡチップ等を利用したハイブリダイゼーションによるＤＮＡ解析が行われている。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ解析は、ガラスやシリコン等の基板上に配置されたＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（Complementary DNA）等の既知の塩基配列のＤＮＡ（ＤＮＡプローブ）とハイブリダイゼーションさせることによって、検体から得られたＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）の塩基配列を解析するものである。特に、ＤＮＡチップを用いた場合は、多種、多数のプローブＤＮＡが１つの基板上に配置されているため、網羅的なＤＮＡ解析を行うことができる。
【０００３】
ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡単に説明すると、ガラス基板やシリコン基板上に固相化されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＡＮを逆転写ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、前記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うという手法である。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−２８１５３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、溶液中の一本鎖のＤＮＡは、通常の状態では、自己の相補的な配列の塩基同士でハイブリダイゼーションを起しており、ランダムコイル状になっている。そのため、他の一本鎖のＤＮＡとハイブリダイゼーションさせようとしても、立体障害が大きく、高速に結合しない。さらに、自己の塩基同士で既にハイブリダイゼーションを起している場合、相補的な配列同士の結合が１００％行われず、不完全に終わってしまう場合がある。
【０００６】
本発明は、立体障害が生じる一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションを高速且つ確実に行うことができるハイブリダイゼーション装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るハイブリダイゼーション装置は、標的となるヌクレオチド鎖が浮遊した溶液を有するとともに、検出用のヌクレオチド鎖（プローブ）の一端が上記空間内に固定されている反応領域を１又は複数有する反応手段と、上記溶液を加熱する加熱手段と、上記溶液に電界を印加する電界印加手段と、上記加熱手段の動作制御をすることにより上記溶液の温度を制御するとともに、上記電界印加手段の動作制御をすることにより上記溶液中の電界を制御するコントローラとを備え、上記コントローラは、上記反応手段に固定されている全ての上記プローブの溶解温度よりも高い温度まで上記溶液の温度を上昇させるとともに上記溶液に対して交流電界を印加し、上記全てのプローブのアニーリング温度以下まで上記溶液の温度を下降させる。
【０００８】
本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、標的となるヌクレオチド鎖を浮遊させた溶液を有するとともに、１又は複数種類の検出用のヌクレオチド鎖（プローブ）の一端を固定し、固定されている全ての上記プローブの溶解温度よりも高い温度まで上記溶液の温度を上昇させるとともに上記溶液に対して交流電界を印加し、上記全てのプローブのアニーリング温度以下まで上記溶液の温度を下降させる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るハイブリダイゼーション装置及び方法では、全てのプローブの溶解温度よりも高い温度まで溶液の温度を上昇させるとともに溶液に対して交流電界を印加し、その後に、全てのプローブのアニーリング温度以下まで溶液の温度を下降させる。
【００１０】
このような本発明に係るハイブリダイゼーション装置及び方法では、融解温度より高くするとともに交流電界が印加されるので、全ての標的となるヌクレオチド鎖（ターゲット）と全てのプローブの結合が解けて且つ交流電界の電気力線の方向に伸張し、伸張した状態でアニーリング温度以下となる。
【００１１】
従って、本発明に係るハイブリダイゼーション装置及び方法では、高速且つ確実にハイブリダイゼーションを起させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明が適用されたハイブリダイゼーション装置について説明をする。
【００１３】
本発明が適用されたハイブリダイゼーション装置１０の構成を図１に示す。ハイブリダイゼーション装置１０は、塩基配列が既知の検出用の一本鎖のヌクレオチド鎖（以下、プローブという。）と、検体から検出した標的となるヌクレオチド鎖（以下、ターゲットという。）とをハイブリダイゼーションさせる装置である。ハイブリダイゼーションは、相補的な塩基配列のヌクレオチド鎖間で行われる。このため、このハイブリダイゼーション処理を行った後に、ターゲットがどのプローブと反応したかを検出することによって、ターゲットの塩基配列を解析することが可能となる。
【００１４】
ハイブリダイゼーション装置１０は、図１に示すように、ハイブリダイゼーション反応の場となるバッファ溶液１１を保留する内部空間を形成する反応容器１２を備えている。反応容器１２内には、バッファ溶液１１が注入されている。
【００１５】
反応容器１２の内部側壁の所定の位置には、プローブの末端の一方が接続されている。例えば、プローブの末端を官能基（例えばビオチン）により修飾し、反応用器１２の内側壁の一部も対となる官能基（例えばストレプトアビジン）により表面修飾する。そして、官能基同士を結合することにより、プローブの一方の末端を反応用器１２内の所定の位置に結合させることができる。反応容器１２内に結合するプローブの数は１つでもよいし、複数であってもよい。ここでは、異なる塩基配列の２つのプローブＰ１，Ｐ２が接続されているものとする。また、プローブの結合位置は、溶液１１内に浸る位置であれば、側壁に限らず底面でもよい。
【００１６】
なお、例えば、複数のウェルが形成されたＤＮＡチップを用いる場合には、一つのウェル（反応容器）内には１種類のプローブのみが結合されるが、チップ全体としては異なる塩基配列のプローブが多数結合されることとなり、本発明はこのようなＤＮＡチップを用いた場合でも適用することができる。
【００１７】
また、ハイブリダイゼーション装置１０は、一対の電極１３（例えば、プラス電極１３-１及びマイナス電極１３-２）と、この一対の電極１３に電力を印加する電源１４とを備えている。一対の電極（プラス電極１３-１及びマイナス電極１３-２）は、図２に示すように、電源１４により電圧が印加されたときに、反応容器１２内の溶液１１中に電界を与えることができるように、全体が例えば薄板状に形成され、反応容器１２を外側から挟むように設けられている。また、さらに、プローブの結合位置の反対側からプローブに向かう方向へ沿って電気力線が発生し、さらに、プローブに近づくに従い電気力線間の距離が短くなるように（電気力線の密度が高くなるように）、一対の電極１３の大きさ及び配置の構成がされている。例えば、プローブが反応容器１２の側壁に結合されていれば、プラス電極１３-１を反応容器１２のプローブが結合された側壁部分に対応した外部側壁に設け、マイナス電極１３-２をその反対側の外部側壁に設け、さらに、プローブ側の側壁に設けた電極（プラス電極）の大きさを、反対側の電極（マイナス電極１３-２）の大きさよりも充分に小さくすれば、以上のような電気力線を形成することができる。なお、このように電気力線を形成するのは、プローブ及びターゲットを溶液１１中で伸張させるとともに、ターゲットを電気泳動させてプローブに近づけるためである。
【００１８】
また、ハイブリダイゼーション装置１０は、溶液１１の温度を検出する温度センサ１５と、溶液１１の温度を保持、上昇及び下降させるヒータ/クーラ１６を備えている。ハイブリダイゼーション装置１０では、温度センサ１５及びヒータ/クーラ１６を備えているので、反応容器１２内の溶液１１の温度を特定の温度に調整することができる。
【００１９】
また、ハイブリダイゼーション装置１０は、コントローラ１７を備えている。コントローラ１７は、ヒータ/クーラ１６に対して制御命令を与えて反応容器１２内の溶液１１の温度を制御するとともに、電源１４の出力電圧及び電流を制御して反応容器１２内の溶液１１に印加する電界を制御する。
【００２０】
つぎに、以上のような構成のハイブリダイゼーション装置１０によるハイブリダイゼーション手順について説明をする。
【００２１】
なお、図３は、ハイブリダイゼーションを行っている際の各経過時刻（期間ｓ１〜ｓ９）での反応容器１２内の溶液１１の温度を示している。
【００２２】
ハイブリダイゼーション処理を開始する前に、図４に示すように、まず、予めバッファ溶液１１中にターゲット（標的ヌクレオチド鎖）Ｔを滴下しておく。このとき、バッファ溶液１１内の温度は低く、室温もしくはTm以下のTmでもTaでもなく生化学反応に寄与しない温度となっている。また、バッファ溶液１１内の電界は印加されていない。従って、反応容器１２の溶液１１中のプローブＰ及びターゲットＴは、鎖がさまざまな方向に乱れているコイル状（スーパーコイル、ランダムコイル）となっている。また、プローブＰは所定の位置に固定されているが、ターゲットＴは溶液１１で浮遊している。
【００２３】
続いて、ヒータ/クーラ１６を制御して、複数のプローブＰのディネーチャ温度（融解温度）Ｔｍのうちの最も高いディネーチャ温度Ｔｍ-ｍaｘより高い温度まで、反応容器１２内の溶液１１の温度を上昇させる（期間ｓ２）。
【００２４】
ここで、水素結合により安定化した二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡに熱を加えると、一本鎖に分離する。全てが二本鎖の状態を１００％ヘリックスとし、熱を加えることにより全てが一本鎖になる状態を０％ヘリックスとすると、ちょうど半分のＤＮＡ又はＲＮＡが二本鎖を形成している状態を５０％ヘリックスという。このときの温度がディネーチャ温度（融解温度）Ｔｍと定義されている。ディネーチャ温度Ｔｍは、二本鎖が安定であれば融解温度Ｔｍは高く（８０度〜９０度）、不安定であれば低い（３９度〜４０度）と推定される。一般に、融解温度Ｔｍは、ＧＣ塩基対含量、ヌクレオチド鎖の長さ、塩基対のミスマッチ（塩基対が一致しないこと）、溶液１１の塩濃度と組成といった項目により変動する。融解温度Ｔｍは、これらの影響により変動するが、経験的に次式によりその温度を推定することができるとされている。
Ｔｍ＝81.5+(16.6×logM)+{0.41×(G+C)}-(0.72×F)-(500/L)
上式において、Mは一価の正イオンのモル濃度、G+CはＧＣ含量（％）、Fはホルムアミド濃度（％）、Lはプローブの長さ（塩基対 base pair: bp）を意味する。また、Ｔｍは、１％のミスマッチにより、０．５度〜１．４度程度低下する。
【００２５】
従って、反応容器１２の溶液１１の温度をディネーチャ温度Ｔｍより高い温度まで上昇させることによって、プローブＰ及びターゲットＴがたとえ自己ハイブリダイゼーションを起していたとしても、確実にその結合が分離される。
【００２６】
続いて、反応容器１２の溶液１１の温度をディネーチャ温度Ｔｍより高い温度で一定に保ちながら（期間ｓ３）、電源１４を制御して図５に示すような高周波交流電圧を電極１３間に印加する。高周波電圧は、反応容器１２内の溶液１１中に１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚ程度の電界が印加されるのが望ましい（  Masao Washizu and Osamu Kurosawa:”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照。）。
【００２７】
このように高周波交流電圧を印加することによって、図６に示すように、プローブＰ及びターゲットＴが電気力線に沿って伸張し（図中Ｘ１方向）、さらに、ターゲットＴがプラス電極１３-１側に向う方向（つまり、プローブＰへ向かう方向（図中Ｘ１方向））へ、移動をしてゆく。
【００２８】
このようにプローブＰ及びターゲットＴが伸張するのは、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長すると考えられる。加えて、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki, Takeshi Yamanashi, Shin-ichi Tazawa, Osamu Kurosawa and Masao Washizu: ”Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)参照）。
【００２９】
つまり、ハイブリダイゼーション装置１０では、電気力線がプローブＰに向かう方向に発生しているとともに、プローブＰに近づくにつれ電気力線の密度が高くなるように一対の電極１３が構成されているので、プローブＰ及びターゲットＴが同一方向に伸張するとともに、ターゲットＴがプローブＰへ向かって電気泳動してゆく。
【００３０】
そして、ディネーチャ温度Ｔｍより高い温度で高周波電界を印加する状態を一定時間以上保つと、図７に示すように、プローブＰ及びターゲットＴは充分に伸張し、ターゲットＴがプローブＰに近接した状態となる。なお、高周波電界は、ディネーチャ温度Ｔｍより高い温度となってから印加するのではなく、期間ｓ２の温度上昇時から印加を開始してもよい。
【００３１】
続いて、ヒータ/クーラ１６を制御して、反応容器１２内の溶液１１の温度を徐々に下降させる（期間ｓ４）。このとき、電源１４を制御して、“高周波電界”と“無電界”とが交互に繰り返されて印加される図８に示すような電圧を電極１３間に印加する。このような電界を印加することによって、高周波電界の印加時には、プローブＰ及びターゲットＴが伸張及び接近し、電界の無印加時にはプローブＰとターゲットＴとのハイブリダイゼーションが促進される。すなわち、プローブＰとターゲットＴとのハイブリダイゼーション等の相互反応を確実に進行させるためには、電界を印加している状態よりは、物質のブラウン運動に専ら委ねた方がより効率がよいと考えられる。しかしながら、高周波電界を全く印加しなければヌクレオチド鎖が自己ハイブリダイゼーションを起してしまう可能性がある。そのため、ハイブリダイゼーション装置１０では、ディネーチャ温度Ｔｍまで上昇してプローブＰ及びターゲットＴが伸張した後は、高周波電界の印加状態と電界の無印加状態とを交互に繰り返して、伸張及び相互反応との両者を促すようにしている。
【００３２】
続いて、反応容器１２内の溶液１１の温度が、あるプローブＰのアニーリング温度Ｔａ１まで達すると、反応容器１２内の溶液１１の温度をＴａ１で一定時間保持する（期間ｓ５）。このときにも、“高周波電界”と“無電界”とが交互に繰り返されて印加される図８に示すような電圧を、電極１３間に印加する。このようにアニーリング温度Ｔａで温度を一定時間保持することによって、そのプローブＰとターゲットＴとの塩基配列が相補的な関係にあれば、両者の間の結合のみが確実に行われることとなる。
【００３３】
なお、アニーリング温度とは、次のような温度である。つまり、ＤＮＡを水溶液中でTm以上に上昇させるとss-DNAに分かれるが、その水溶液をゆっくりと温度を下げてTmよりも少し低めに長く保つと、ss-DNAは再結合して生物活性を持つds-DNAを形成する。これをDNAのアニーリングと言い、このとき設定したTｍよりも少し低い温度がアニーリング温度である。アニーリング温度は、特に、特定の一点の温度に限定された温度ではない。
【００３４】
続いて、反応容器１２内の溶液１１の温度を徐々に下降させ（期間ｓ６）、各プローブのアニーリング温度まで達すると、それぞれ同様に反応容器１２内の溶液１１の温度を一定時間保持する（期間ｓ７）。
【００３５】
続いて、反応容器１２内の溶液１１の温度を徐々に下降させて、室温もしくはTm以下の
TmでもTaでもなく生化学反応に寄与しない温度Ｔｉまで達すると（期間ｓ８）、電源１４を制御して、 “高周波電界”と“無電界”と“マイナス側パルス電界”とが連続的に繰り返されて印加される図９に示すような電圧を電極１３間に印加する。マイナス側パルス電界が印加されると、図１０に示すように、浮遊しているターゲットＴはプローブＰに向かう方向とは反対方向（図１０中に示すＸ２方向）に電気泳動する。そのため、高周波電界と無電界とマイナス側パルス電界とを連続的に繰り返し印加していくと、ハイブリダイゼーションをせずに溶液１１中に残ってしまったターゲットを伸張しながら、プローブから引き離すことができる。
【００３６】
そして、以上の図９に示すような電界を一定時間印加してハイブリダイゼーションが生じてないターゲットＴをプローブＰから充分引き離した後は（期間ｓ９）、 “無電界”と“マイナス側パルス電界”とが交互に繰り返される図１１に示すような電圧を電極１３間に印加する。このことにより、ターゲットは伸張はしないが高速にプローブから引き離されることとなり、以後、不必要なハイブリダイゼーションが生じなくなる。
【００３７】
以上のように本発明が適用されたハイブリダイゼーション装置１０では、複数のプローブのうちの最も高いディネーチャ温度（融解温度）Ｔｍより溶液の温度を高くするとともに交流電界を印加し、その後徐々に溶液の温度を下げる。このことにより、全ての標的となるヌクレオチド鎖（ターゲット）と全ての検出用のヌクレオチド鎖（プローブ）の結合が解けて且つ交流電界の電気力線の方向に伸張し、伸張した状態でアニーリング温度以下となる。
【００３８】
従って、ハイブリダイゼーション装置１０では、高速且つ確実にハイブリダイゼーションを起させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明が適用されたハイブリダイゼーション装置の構成図を示す。
【図２】電極により印加される電界の電気力線を示す図である。
【図３】ハイブリダイゼーションを行っている際の各経過時刻での反応容器内の溶液の温度を示す図である。
【図４】ハイブリダイゼーションを行う前の反応容器内の状態を示す図である。
【図５】高周波電界を与えるための印加電圧の波形図である。
【図６】プローブ及びターゲットが伸張したときの反応容器内の状態を示す図である。
【図７】ターゲットがプローブに接近したときの反応容器内の状態を示す図である。
【図８】高周波電界及び無電界を交互に与えるときの印加電圧の波形図である。
【図９】高周波電界、無電界、マイナスパルス電界を与えるときの印加電圧の波形図である。
【図１０】残存したターゲットがプローブから離間するときの反応容器内の状態を示す図である。
【図１１】無電界及びマイナスパルス電界を与えるときの印加電圧の波形図である。
【符号の説明】
【００４０】
１０  ハイブリダイゼーション装置、１１  溶液、１２  反応容器、１３  電極、１４  電源、１５  温度センサ、１６  ヒータ/クーラ、１７  コントローラ
【図１】
2005124428.tif 000003
【図２】
2005124428.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005124428.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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