(57)【要約】      （修正有）【課題】  合成ペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、この抗体を用いるＳＲＳＶ(小型球形ウイルス)感染の検出に関する。【解決手段】  配列：Cys Asp Thr Asn Asn Asp Phe Gln Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe を含む合成ペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、この抗体を含む、ＳＲＳＶの抗原または抗原性フラグメントの検出試薬、検出方法、検出キットおよびモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列：
Cys Asp Thr Asn Asn Asp Phe Gln Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe
を含む合成ペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【請求項２】
ＳＲＳＶ(小型球形ウイルス)、ＳＲＳＶの抗原または抗原性フラグメントを認識またはに結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１または２記載の抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を含むことを特徴とするＳＲＳＶ検出試薬。
【請求項５】
ＳＲＳＶを含む疑いのある検体を、請求項４に記載の試薬と接触させ、ＥＬＩＳＡにより検出することを特徴とするＳＲＳＶ検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載のＳＲＳＶの検出方法を行うためのＳＲＳＶ検出キット。
【請求項７】
請求項３に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４６３である、請求項７記載のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
合成ペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、この抗体を用いるＳＲＳＶ(小型球形ウイルス)感染の検出試薬、検出方法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＲＳＶ(Small Round Structured Virus:小型球形ウイルス)は、ＮＬＶ(Norwalk-like virus:ノーウォーク関連ウイルス)ともいわれ、直径３０ナノメートル(１ナノは１０億分の１)ほどの微小なウイルスでヒトの腸内でしか増殖しない。下痢、嘔吐、腹痛、吐き気、発熱などの症状を伴う食中毒の原因となるウイルスである。汚水の流れ出る河口付近に生息するカキ・二枚貝の内臓に付着している。７０℃で１分間加熱すれば予防できるが、これらのものを加熱不十分や生での摂食で食中毒が起きる。最近はウイルス保菌者の排泄物などによるヒトからヒトへの感染も多くなっている。
【０００３】
食中毒が発生した場合、被害を最小限にとどめるために、原因究明の検査を患者の糞便や疑われる食品などの検体について行う。細菌の場合はそれぞれ特徴があるのでそれにあった培地を用いて目的の菌をみつけることができるが、ウイルスは細菌のように合成培地では増殖しないので、生きた細胞を用いることになるが、ＳＲＳＶはこの方法でも増殖することができない。そこで検査の方法としてはウイルス粒子を電子顕微鏡によって直接見つける方法か、検体から採取したＳＲＳＶの遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの断片を増幅し、増幅産物を、電気泳動、分光蛍光光度計を用いて検出する方法が用いられている。
【０００４】
最近、モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる検出方法が報告されているが、用いられるモノクローナル抗体は、ＮＶカプシドタンパクをコードするＯＲＦ２を用いたバキュロウイルス発現システムで発現されたウイルス様中空粒子(Ｖirus-like particles：ＶＬＰs)を抗原として作製されたモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体を用いた検出キットは、Ｇenogroup Ｉ(ＧＩ)とＧenogroup II(ＧII)をそれぞれ検出することがわかっている(非特許文献１)。
【非特許文献１】「日本臨床」第６０巻第６号第１１８８〜１１９３頁(２００２年)、日本臨床社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
電子顕微鏡による方法や、遺伝子断片を用いる方法は、検体の処理などの検出可能な試料に持って行くまでに熟練した技術と時間がかかることや、さらに検出過程にも時間がかかる、大量の検体を処理できないなどの欠点があり、被害の拡大や社会的不安の解消のためには早期原因究明が必要なために、簡便で短時間にかつ、ＳＲＳＶ(ＮＶ(ＮＬＶ))に汚染されたかきによる食中毒は微量のウイルスで発症するために高感度のＳＲＳＶの検出方法が待たれていた。これにこたえてモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡによる方法が開発されつつある。本発明者らは、さらに短時間で処理でき、操作が簡便で多検体を同時に処理できる方法を求めて鋭意検討を重ね本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１は抗原として適当な領域を、ＳＲＳＶのＬordsdale株およびＣamberwell株に共通する３７０番目から３８３番目のアミノ酸配列を含む下記のアミノ酸配列：
Cys Asp Thr Asn Asn Asp Phe Gln Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe    (配列番号１)
を選択し、Ｎ末端にキャリアーとしてＫＬＨを付加し、これを免疫原として作製されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。
【０００７】
この抗体は、ＳＲＳＶ(小型球形ウイルス)、ＳＲＳＶの抗原または抗原性フラグメントを認識またはこれらに結合することができる。
【０００８】
本発明の第２は、上記のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む、ＳＲＳＶの感染の検出試薬であり、第３は、ＳＲＳＶを含む疑いのある検体を、上記のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と接触させ、ＥＬＩＳＡにより検出することを特徴とするＳＲＳＶ検出方法である。
【０００９】
本発明の試薬にはＳＲＳＶに感染している疑いのある患者を診断するための診断薬およびＳＲＳＶに汚染されている疑いのある食材を検査する検査薬が含まれる。
【００１０】
また、検体にはＳＲＳＶに感染している疑いのある患者から採取される検体、例えば、便など、またはＳＲＳＶに汚染されている疑いのある食材の一部である検体が含まれる。
【００１１】
本発明に用いられるＥＬＩＳＡには蛍光ＥＬＩＳＡが含まれる。
【００１２】
本発明の第４は、上記のＳＲＳＶ検出方法の実施に用いられるキットである。
【００１３】
本発明の第５は、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであり、このハイブリドーマは、平成１５年８月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４６３のもとに寄託された。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法によれば、迅速、簡便かつ高感度で食品中特にカキからのウイルスの早期検出が可能であり、被害を最小限にとどめることができる。本発明の検出システムでは、ＳＲＳＶが魚介類に含まれている場合が多いことから、生鮮食品の微生物検査を行う機関などの活用が期待される。また、食品検査だけでなく検便検査としても使用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
高感度で正確性の高いイムノアッセイ系を構築するには、質の高い抗体を用いることが必要である。そこで様々なデータベース上で公開されているＳＲＳＶの生物情報より抗体のエピトープとして最適であると考えられるアミノ酸領域を選定し、この領域に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。ＳＲＳＶは株によって抗原性に違いがあるため、近年最も日本で発生頻度の高い株(Ｌordsdale、Ｃamberwell)に焦点を絞り抗体を作製した。
【００１６】
合成ペプチドの設計
ＳＲＳＶのカプシドはＮ蛋白という１種類の蛋白が集合しており、Ｎ蛋白はＰ2、Ｐ1、Ｓという３つの領域に分かれる。Ｐ2領域が最も外側に位置しており抗体と最も反応しやすい領域と考えられる。Ｐ2領域のアミノ酸配列を基に疎水性の程度および立体構造より抗原エピトープとして適切な領域の検索をした。ＮＶの中で、近年最も日本で発生頻度の高い株(Lordsdale、Camberwell)に焦点を絞り、それぞれの株のアミノ酸配列で特異的な領域と共通な領域(以下、Camber/Lordsとする)の合計３ヵ所(図１、a)、b)、c)参照)について合成ペプチドを作製した。
【００１７】
その結果Ｌordsdale株、Ｃamberwell株で共通な３７０番目から３８３番目のアミノ酸配列(a))が、ＳＲＳＶの多数の株に保存されており、また、モノクローナル抗体の作製による確認でも、モノクローナル抗体の反応性が最も高かった。そこでその箇所について合成ペプチドを作製し、Ｎ末端にキャリアーとしてＫＬＨを付加し、これを免疫原に用いた。合成ペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
Cys Asp Thr Asn Asn Asp Phe Gln Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe      配列番号１
【００１８】
免疫スケジュール
上記で作製した合成ペプチドを生理食塩水で希釈し、アジュバントと混和する。この抗原液をマウスに腹腔内投与する。さらに追加免疫し、ＥＬＩＳＡ法にてマウス血清中抗体価の測定し、血中抗体価が６４０００倍になるまでこの操作を繰り返す。細胞融合の３日前にも合成ペプチドを腹腔内に投与する。
【００１９】
細胞融合
最終免疫後、脾臓を摘出し、ＤＭＥＭ培地に個々の細胞に分散させる。遠心後、ＤＭＥＭ培地を加え、脾細胞を浮遊させ、融解緩衝液を添加して赤血球を溶血させる。再度遠心洗浄後ＤＭＥＭ培地中に浮遊させ、細胞数を計測した後、この脾細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１株を遠心管内で混合する。遠心分離後、上清を除去し、ＤＭＥＭ培地で洗浄する。再度遠心し上清を完全に除去した後、ポリエチレングリコール(PEG)６０００およびＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ培地を加える。遠心洗浄を行い、上清を除いた後マウス骨髄腫細胞の数を調整し、ウシ胎児血清(FCS)を含むＤＭＥＭ培地を加える。３７℃１日間培養し、翌日、細胞を回収し洗浄後、マウス骨髄腫細胞数を調整し、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン(ＨＡＴ)を含む１５％ＦＣＳ・ＤＭＥＭ培地を加える。９６ウェルプレートに分注し３７℃で１０〜１４日培養してハイブリドーマのみを増殖させる。ＥＬＩＳＡ法により目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニング後、４８ウェルプレートに陽性クローンを移しアミノプテリンを含まない１５％ＦＣＳ／ＨＴ／ＤＭＥＭ培地を加え培養を続ける。
【００２０】
細胞が十分発育した後、再度ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行い、陽性クローンについて限界希釈法を用いたクローニングを行う。このスクリーニングとクローニングを２〜３回行い、単一クローン化する。その結果、Ｌordsdale株およびＣamberwell株に共通のアミノ酸配列に対する抗体を産生するハイブリドーマを得る。
【００２１】
モノクローナル抗体の作製法
得られたハイブリドーマを約１週間培養を行う。培養後、培地を遠心し上清を分離後、硫酸アンモニウムを５０％飽和濃度となるように加え、塩析を行う。一晩静置後、遠心し、上清を捨て、沈殿をＰＢＳで溶解しＰＢＳで透析した。これをアフィニティークロマトグラフィーで精製しＬordsdale株、Ｃamberwell株共通のアミノ酸配列に対する精製抗体を得る。
【００２２】
上記のモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡに用いる。通常のＥＬＩＳＡ(エンザイムイムノアッセイ：酵素免疫測定法、ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ)および蛍光ＥＬＩＳＡ(ＦＥＬＩＳＡ)であってもよい。好ましくは、蛍光ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡの標識、基質、酵素なとの組合せは適宜決定する。
【００２３】
例えば、サンドイッチ蛍光ＥＬＩＳＡシステムの検出系として、まずプレートにモノクローナル抗体を固相化する。ブロッキング後、検体を反応させる。その後ビオチン標識をしたマウスモノクローナル抗体又はウサギポリクローナル抗体を反応させ、アビジン標識ガラクトシダーゼを反応させ、最後に基質溶液(例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシド)を加える。これを蛍光ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーで各wellの蛍光強度を測定する。
【００２４】
上記の蛍光ＥＬＩＳＡシステムの検出系を適当なキットのパーツとし、キットとして調製する。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、単に説明のためであって、本発明を制限するものではない。
実施例１
抗原の調製
ＳＲＳＶのカプシドは、Ｐ2、Ｐ1、Ｓという３つの領域に分かれているＮ蛋白という１種類の蛋白によりなり、Ｐ2領域が最も外側に位置しており抗体と最も反応しやすい領域と考えられ、Ｐ2領域のアミノ酸配列を基に疎水性の程度および立体構造より抗原エピトープとして適切な領域の検索をした。ＮＶの中で、近年最も日本で発生頻度の高い株(Lordsdale,Camberwell)に焦点を絞り、それぞれの株のアミノ酸配列で特異的な領域と共通な領域(以下Camber/Lordsとする)合計３ヵ所について合成ペプチドを作製した(図１参照)。  
【００２６】
その結果Ｌordsdale株、Ｃamberwell株に共通な３７０番目から３８３番目のアミノ酸配列(a))が、ＳＲＳＶの多数の株に保存されており、また、モノクローナル抗体を作製による確認でも、モノクローナル抗体の反応性が最も高かった。そこでその箇所について合成ペプチドを作製し、Ｎ末端にキャリアーとしてＫＬＨを付加し、これを免疫原に用いた。合成ペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである
ＫＬＨ−Cys Asp Thr Asn Asn Asp Phe Gln Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe
【００２７】
実施例２
抗ＮＶカプシド蛋白モノクローナルおよびポリクローナル抗体の作製
Ａ−１．マウスモノクローナル抗体の作製
合成ペプチドを免疫原とし、抗原量をマウス1匹あたり20μg、アジュバントはRIBI  Adjuvant  System  R‐700を用いて腹腔接種により約3週間隔で免疫を行った。抗体価が上昇したマウスの脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールを用いて常法により細胞融合を行った。ＥＬＩＳＡによる陽性抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング後、限界希釈法により2〜3回クローニングを行った。クローニングを行った抗体産生ハイブリドーマを無血清培地で大量培養し、アフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナル抗体を精製した。一部はビオチン標識を行った。
【００２８】
LordsdaleとCamberwell株のエピトープとなりうるアミノ酸配列のうち株特異的領域より設計した合成ペプチドを用いて免疫したマウスにおいては、2回目の免疫後、抗体価が十分上昇したマウスを用いて細胞融合を行った。両株に共通のアミノ酸配列より設計した合成ペプチドを用いて免疫したマウスにおいては3回目の免疫後1匹のマウスで抗体価の十分な上昇を確認したため細胞融合を行った(表１)。
【表１】
2005082558.tif 000002
【００２９】
その結果複数のハイブリドーマを得た(表２)。それぞれのハイブリドーマから産生される抗体を患者便より抽出したウイルス粒子と反応させたところ、共通の配列を認識するクローン1株で最も良好な反応を示した。このクローンを大量培養後、抗体を精製しサンドイッチ蛍光ＥＬＩＳＡシステム構築の検討を行うことにした。
【表２】
2005082558.tif 000003
【００３０】
Ａ−２．ウサギポリクローナル抗体の作製
合成ペプチドを免疫原とし、抗原量をウサギ1羽あたり50μg、アジュバントはRIBI  Adjuvant  System  R−730を用いて皮下接種により約4週間隔で免疫を行った。抗体価が上昇したウサギから全採血を行った。採血後、血清を分離し、カプリル酸法でIgG精製を行い、一部はビオチン標識を行った。
【００３１】
Lordsdale株のアミノ酸配列より設計した合成ペプチドを用いて免疫したウサギは、2回目の抗原投与で抗体価が十分であったため全採血を行った。両株の共通配列より設計した合成ペプチドを用いて免疫したウサギは3回目の免疫後ブースターを行い、全採血した(表３)。これらの抗血清を精製しウイルス粒子と反応させたところ、Lordsdale株で作製した抗血清の方が反応性が高かったのでこの抗血清を用いてビオチン標識抗体の検討を行うことにした。
【表３】
2005082558.tif 000004
【００３２】
実施例３
二次抗体のビオチン標識
Ｂ−１．マウスモノクローナル抗体のビオチン標識
実施例２のＡ−１(２．１．２)で作製したマウスモノクローナル抗体5ml（2.37mg/ml）を炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8.5)で一晩透析し、Bradford法でタンパク定量を行った。その後、超純水で溶解したEZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotinを抗体5ml（2.32mg/ml）に1.05ml（580μg）（50μg  ビオチン：１mg  抗体）混和した。氷上で2時間放置後、リン酸緩衝液（pH7.4）で4℃一晩透析した。
【００３３】
約2000mlの培養上清よりビオチン標識したマウスモノクローナル抗体を約5ml（2.822mg/ml）作製した。
【００３４】
Ｂ−２ウサギポリクローナル抗体のビオチン標識
実施例２のＡ−２(２．１．３)で作製したウサギポリクローナル抗体2ml（1.10mg/ml）を炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8.5)で一晩透析し、Bradford法でタンパク定量を行った。その後、超純水で溶解したEZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotinを抗体1ml（1.42mg/ml）に130μl（71.1μg）（50μg  ビオチン：１mg  抗体）混和した。氷上で2時間放置後、PBS（pH7.4）で4℃一晩透析した。
【００３５】
約60mlの血清よりビオチン標識したウサギポリクローナル抗体を約1ml（0,830mg/ml）作製した。
【００３６】
実施例４
サンドイッチ蛍光ＥＬＩＳＡシステムの構築
Ａ．ＥＬＩＳＡプレートの検討
FALCON3912(FALCON社製)、CORNING(CORNING社製)、IMMULON(IMMULON社製)、Labsystems(Labsystems社製)蛍光ＥＬＩＳＡ用プレート(黒)の4種類で検討を行った。
【００３７】
結果
FALCON3912 ＥＬＩＳＡ用プレートとIMMULON ＥＬＩＳＡ用プレートはバックグランドが高く、陰性サンプルと陽性サンプルの蛍光強度の差がせまかった。蛍光ＥＬＩＳＡ用プレートについては検出感度が低かった。CORNINGＥＬＩＳＡ用プレートは陰性サンプルと陽性サンプルの差が明らかに見られ、比較的非特異反応も少なく、感度も他のプレートに比べ高かった。
【００３８】
Ｂ．ブロッキング試薬と反応時間の検討
Ａ工程と同様に0,5%、3%ウシ血清アルブミン（SIGMA社）、1%スキムミルク（DIFCO社）、ブロックエース(大日本製薬)、ブロッキング ワン（ナカライテスク社）を用いてブロッキング試薬の検討を行い、良好な結果の試薬についてはブロッキング時間の検討も行った。
【００３９】
結果
0,5%ウシ血清アルブミンと1%スキムミルクは陰性サンプルと陽性サンプルの差はせまく、バックグランドが高かった。3%ウシ血清アルブミンとブロックエースはバックグランドは低く、感度も良好な結果となった。3%ウシ血清アルブミンとブロックエースを用いてブロッキング時間の検討を行った。ブロッキング時間を4℃一晩と、室温2時間で検討したところ、室温2時間に比べ、4℃一晩でブロッキングした場合は両試薬とも結果が安定しなかった。室温2時間での反応で両試薬を比較したところブロックエースより3%ウシ血清アルブミンが良好な結果が得られた。また、室温2時間のブロッキング時間で3%ウシ血清アルブミンとブロッキング ワンを比較したところ3%ウシ血清アルブミンの方が感度がよかった。ブロッキング時間は室温で2時間とした。
【００４０】
Ｃ．酵素・基質の検討
ＥＬＩＳＡプレートに抗ＮＶマウスモノクローナル抗体をPBSで9μg/mlに調整し、4℃で一晩固相化した。ブロッキング剤として3%のPBS-BSAを用いて、2時間室温で反応を行い、サンプルはSRSV患者便からのウイルス抽出液をカキ抽出液又はPBSでウイルス量が1000、500、250、125、63、32、16、０（PBSのみ）となるように希釈し、室温で2時間反応させた。ビオチン標識抗体はPBS-Tween20で250ng/mlに調製し室温で1時間反応させた。酵素はβ-ガラクトシダーゼ-アビジン（VECTOR社、SIGMA社、Molecular Probes社）の3社と、基質は4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシド（SIGMA社、Molecular Probes社）の2社を組み合わせて検討した。酵素はPBS-Tween20で１Uになるように調製し、室温で30分反応させ、基質はDMSOで溶解後、0,01Mのリン酸緩衝液で40μg/mlに調整し、室温で30分反応させた。
【００４１】
結果
それぞれの酵素と基質を組み合わせた結果、酵素がストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ-アビジン（SIGMA社）、基質は4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシド（SIGMA社）の組み合わせで感度がよく最も良好な結果となった(図２)。
【００４２】
Ｄ．ビオチン標識抗体の検討
ＥＬＩＳＡプレートに抗ＮＶマウスモノクローナル抗体をPBSで9μg/mlに調整し、4℃で一晩固相化した。ブロッキング剤は3%のPBS-BSAを用いて、2時間室温で行い、サンプルはSRSV患者便からのウイルス抽出液をカキ抽出液又はPBSでウイルス量が1000、500、250、125、63、32、16、8、4、2、1、0（PBSのみ）となるように希釈し、室温で2時間反応させた。ビオチン標識抗体はマウスモノクローナル抗体、ウサギポリクローナル抗体ともに250ng/mlに調製し室温で1時間反応させた。酵素はVECTOR社、基質はSIGMA社を用いて検討を行った。
【００４３】
結果
マウスモノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体の両者とも大きなばらつきはなく、感度も良好であった（図３）。
【００４４】
Ｅ．蛍光ＥＬＩＳＡと通常のＥＬＩＳＡの比較
ＥＬＩＳＡプレートに抗ＮＶマウスモノクローナル抗体をPBSで6μg/mlに調整し、4℃で一晩固相化した。ブロッキング剤は3%のPBS-BSAを用いて、2時間室温で行い、サンプルはSRSV患者便からのウイルス抽出液をPBSでウイルス量が1000、500、250、125、63、32、0（PBSのみ）となるように希釈し、室温で2時間反応させた。ビオチン標識抗体はマウスモノクローナル抗体を250ng/mlに調製し室温で1時間反応させた。蛍光ＥＬＩＳＡの酵素はβ-ガラクトシダーゼ-アビジン（VECTOR社）、基質は4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシド（SIGMA社）を用い、通常のＥＬＩＳＡは酵素にHRP-Avidin（Zymed）、基質はクエン酸リン酸緩衝液にO-フェニレンジアミンを溶解し30%の過酸化水素を使用直前に混合し調製したもの、反応停止液は5N硫酸を用いた。
【００４５】
結果
蛍光ＥＬＩＳＡと通常のＥＬＩＳＡでは明らかに差が見られ、蛍光ＥＬＩＳＡではウイルスが低濃度でも検出が可能であった(図４)。
【００４６】
考察
サンドイッチ蛍光ＥＬＩＳＡシステムの検出系として、まずプレートにモノクローナル抗体を固相化する。ブロッキング後、サンプルとなるカキ中腸腺抽出液を反応させる。その後ビオチン標識をしたマウスモノクローナル抗体又はウサギポリクローナル抗体を反応させ、アビジン標識ガラクトシダーゼを反応させる。最後に基質溶液である4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトシドを加える。これを蛍光ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーで各wellの蛍光強度を測定する。通常のＥＬＩＳＡと蛍光ＥＬＩＳＡを比較してわかるように、蛍光ＥＬＩＳＡの方が感度がよく、ウイルスが低濃度でも検出が可能ということがわかった。
【００４７】
実施例５
サンプル調製方法の検討
Ａ．カキからのウイルス抽出方法
市販の殻むきカキを購入した。ハサミでカキの外套膜を取り、中腸腺を取り、-80℃で凍結保存した。ピンセット、ハサミを用いて中腸腺の周りに付着している脂質部分を可能な限り除去した。中腸腺3個とPBS10mlをサンプリングバックに入れ、ストマッカーで30秒間粉砕した。粉砕液を遠心管に移し、カキの残渣をPBSで洗い出し、再び遠心管に移し、1500Xｇで10分遠心し、上清を10000Xｇで20分冷却遠心した。上清20mlと、24％PEG6000、6,3%NaCl混合液10mlを遠心管に入れ、4℃で一晩又は常温で2時間撹拌した。この試料を10000Xｇで20分冷却遠心し、上清を丁寧に除去後、PBSを500μl加え、沈渣を浮遊させた。試料をエッペンチューブに移し、20000Xｇで20分冷却遠心し、この上清をウイルス抽出液とした。
【００４８】
ウイルス抽出液のＲＴ ＰＣＲ反応
QIAamp Viral RNA Miniキットを用いてRNAの抽出を行った。（操作法は添付書に従った。）この反応液をDNase処理するためサンプルRNAを12,0μl、5× First-Strand buffer 1,5μl、DDW 0,5μl、DNase Ｉ 1,0μl混合し、37℃30分反応後、75℃5分反応させた。次にRT反応のため、DNase処理RNA 7,5μl、5× First-Strand buffer 2,25μl、10mM dNTPs 0,75μl、Random Primer(1,0μg) 0,375μl、RNAasin(33unit／μl) 0,5μl、100mM DTT 0,75μl、Super Script RTII(200u／μl) 0,75μl、DDW 2,125μl混合し、42℃1時間反応後、99℃5分加熱し4℃で保存した。
【００４９】
Nested PCRによるウイルスの確認
1st PCRは、上記のウイルス抽出液のＲＴ ＰＣＲ反応(２．４．２)で調製したｃDNAを5μl、10× Ex Taq Buffer 5μl、2,5mM dNTPs 4μl、50μM COG2F 0,5μl、50μM G2SKR 0,5μl、DDW 34,75μl、Ex Taq 0,25μlを混和し、サーマルサイクラーで94℃2分、94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒を40サイクル行い4℃で保存した。
【００５０】
2nd PCRは、1st PCRの反応液を5μl、10× Ex Taq Buffer 5μl、2,5mM dNTPs 4μl、50μM G2SKF 0,5μl、50μM G2SKR 0,5μl、DDW 34,75μl、Ex Taq 0,25μlを混和し、サーマルサイクラーで94℃2分、94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒を30サイクル行い4℃で保存する。このサンプルを1,5%アガロースゲルを用いて電気泳動し380bp付近のバンドの有無を確認した。バンドが確認されたサンプルを陽性サンプル、確認されなかったサンプルを陰性サンプルとした。
【００５１】
蛍光ＥＬＩＳＡによるカキ抽出液からのウイルスの検出
上記のRT-PCRにより陰性と確認されたカキ抽出液サンプルをPBSで２、４、８倍希釈した。この希釈液にウイルス数が判明している患者糞便からのウイルス抽出液を加え、サンドイッチ蛍光ＥＬＩＳＡに記載(「００４２」参照)と同様の方法により蛍光ＥＬＩＳＡを用いてカキ抽出液からのウイルスの検出を行った。
【００５２】
結果
カキ抽出液を2倍希釈したサンプルにウイルスを100個加えた場合においてもウイルスの加えていない陰性サンプルと比較して、蛍光強度に明らかな差が見られた(表４)。
【００５３】
考察
蛍光ＥＬＩＳＡによるカキ抽出液からのウイルスの検出において、本条件下で行った場合、ウイルスが200個程度でも検出が可能であることが明らかとなった。
表４  蛍光ＥＬＩＳＡによるカキ抽出液からのウイルスの検出
2005082558.tif 000005
【００５４】
実施例６  免疫
実施例１で作製した合成ペプチドを生理食塩水で終濃度が１００μg/mlとなるように溶解し、RIBI Adjuvant System R-700(RIBI社)に混和した。この抗原液を６週齢のＢＡＬＢ/ｃマウス１匹あたり、合成ペプチド濃度が、０.０２mg/mlとなるように腹腔内投与をした。約３週間後、同様に追加免疫し、１週間後ＥＬＩＳＡ法にてマウス血清中抗体価の測定を行った。血中抗体価が６４０００倍になるまでこの操作を繰り返した。細胞融合の３日前に合成ペプチドを生理食塩水で０.０４mg/mlになるよう調製し、０.５mlを腹腔内に投与した。
【００５５】
実施例７  細胞融合
最終免疫後３日目にマウスより、無菌的に脾臓を摘出しＤＭＥＭ培地(GIBCO社)５ml中でハサミを用いて細切後、ストレイナー(メッシュ)で個々の細胞に分散させた。遠心後、ＤＭＥＭ培地を２０ml加え、脾細胞を浮遊させACK lysis buffer(0.15M NH4Cl、1.0ｍM KHCO3、0.1mM EDTA)５mlを加え赤血球を溶血させた。再度遠心洗浄後ＤＭＥＭ培地５ml中に浮遊させ、細胞数を計測した後、この脾細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１株を１０：３の比率になるように、５０ml容の遠心管内で混合した。１０００rpmで１０分間遠心分離後、上清を除去し３７℃のＤＭＥＭ培地で洗浄した。再度遠心し上清を完全に除去した後、３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)６０００および１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ培地１mlを１分間かけて遠心管を回しながら加えた。１分間保温しながら回転させた後、３７℃のＤＭＥＭ培地２mlを２分間かけて加え、さらに３７℃のＤＭＥＭ培地８mlを５分間かけて加えた。遠心洗浄を２回行い、上清を除いた後マウス骨髄腫細胞の数が５×１０5/mlになるよう１５％ウシ胎児血清(FCS)を含むＤＭＥＭ培地を加えた。直径１００mmシャーレに１５mlずつ分注し、３７℃で１日間培養した。
【００５６】
実施例８  ＥＬＩＳＡによる陽性抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
翌日、細胞を回収し洗浄後、マウス骨髄腫細胞が３×１０５/mlになるようにヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン(HAT)を含む１５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地を加えた。９６ウェルプレートに０.１mlずつ分注し３７℃で１０〜１４日培養してハイブリドーマのみを増殖させた。ＥＬＩＳＡ法により目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニング後、４８ウェルプレートに陽性クローンを移しアミノプテリンを含まない１５％ＦＣＳ／ＨＴ／ＤＭＥＭ培地０.５mlを加え培養を続けた。
【００５７】
実施例９  限界希釈法によるクローニング
細胞が十分発育した後、再度ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行い、陽性クローンについて限界希釈法を用いたクローニングを行った。このスクリーニングとクローニングを２〜３回行い、単一クローン化した。その結果Ｌordsdale株、Ｃamberwell株共通のアミノ酸配列に対する抗体を産生するハイブリドーマを得、平成１５年月・・・日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４６３のもとに受託された。
【００５８】
実施例１０  モノクローナル抗体の作製
得られたハイブリドーマを２２５mlの培養用フラスコで３％ＦＣＳ／ＡＳＦ１０４(味の素社)を用いて約１週間培養を行った。培養後、培地を遠心し上清を分離後、硫酸アンモニウムを５０％飽和濃度となるように加え、塩析を行った。４℃で一晩静置後、４℃、１００００rpm、３０分間遠心し、上清を捨て、沈澱物を１０mlのＰＢＳで溶解し３LのＰＢＳで透析した。これをアフィニティークロマトグラフィーで精製しＬordsdale株、Ｃamberwell株共通のアミノ酸配列に対する精製抗体を得た。
【００５９】
モノクローナル抗体によるＳＲＳＶとの反応の確認
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに患者糞便より抽出したウイルスを約８０００粒子/ウェルとなるように希釈し固相化した。ＰＢＳ−０.０５％Ｔween２０(洗浄液)で５回洗浄後、ＰＢＳ−ＢＳＡ(１％)を添加し３７℃にて１時間ブロッキングを行った。洗浄後、ビオチン標識抗ＳＲＳＶカプシドモノクローナル抗体を２〜０.１２５μg/mlの濃度に希釈し、３７℃で１時間浸振反応させた。洗浄後、アビジン標識ペルオキシダーゼ(ZYMED社)を３７℃３０分間浸振反応させ、洗浄後基質であるオルトフェニレンジアミンを３７℃で３０分間反応させた。反応後、５N硫酸溶液を加え反応を停止させ、４９０nmで吸光度を測定した。その結果、ウイルスと反応することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法によれば、迅速、簡便かつ高感度で食品中特にカキからのウイルスの検出することができ、食中毒の被害を最小限にとどめることができる。本発明の検出システムは、ＳＲＳＶが魚介類に含まれている場合が多いことから、生鮮食品の微生物検査を行う機関などでの活用でき、また、食品検査だけでなく検便検査としても使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】LordsdaleおよびCamberwellの３ヵ所のアミノ酸配列を示す。
【図２】酵素・基質の組合せの検討結果を示す折線グラフである。
【図３】ビオチン標識抗体の検討結果を示す折線グラフである。
【図４】蛍光ＥＬＩＳＡと通常のＥＬＩＳＡを比較する折線グラフである。
【図１】
2005082558.tif 000006
【図２】
2005082558.tif 000007
【図３】
2005082558.tif 000008
【図４】
2005082558.tif 000009
【配列表】
2005082558000001.app