(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘミアセタール水酸基を有する糖の該水酸基を特異的に酸化する新規な糖質酸化酵素に関し、さらには、該酵素をコードする遺伝子および該酵素を用いるアルドン酸の製造方法を提供する。【解決手段】３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素であって、該サブユニットが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列からなる糖質酸化酵素。（ａ）特定の配列で表わされるアミノ酸配列（ｂ）他の特定の配列で表わされるアミノ酸配列（ｃ）さらに異なった特定配列で表わされるアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素であって、該サブユニットが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列からなる糖質酸化酵素。
（ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列
【請求項２】
３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素であって、該サブユニットが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のＤＮＡによってコードされる糖質酸化酵素。
（ａ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項３】
３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素をコードする糖質酸化酵素遺伝子であって、該サブユニットが以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列からなる糖質酸化酵素遺伝子。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列
【請求項４】
３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素をコードする糖質酸化酵素遺伝子であって、該サブユニットが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のＤＮＡによってコードされる糖質酸化酵素遺伝子。
（ａ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項５】
請求項１または２記載の糖質酸化酵素を、ヘミアセタール水酸基を有する糖に接触させることを含むアルドン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘミアセタール水酸基を有する糖の水酸基を特異的に酸化する新規な酵素およびその酵素をコードする遺伝子、ならびにその酵素をヘミアセタール水酸基を有する糖に接触させるアルドン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルドン酸は、カルシウムなどの金属との塩形態である場合においても、水溶性を示すことから、ミネラル補強剤として優れている。アルドン酸は、ラクトースなどの糖を酸化して得られる。アルドン酸は、糖のヘミアセタール水酸基が酸化されていることから、ヒトが摂取した場合でも生体内の加水分解酵素などによって分解されることなく、腸内に到達でき、ビフィズス菌増殖などを促進することができる。
【０００３】
さらに、アルドン酸は、臓器移植の際に、ドナーから摘出した臓器を一時保存する場合の保存液としても用いられており、その利用範囲はますます広くなっている。
【０００４】
糖のヘミアセタール水酸基を化学的に酸化する方法では、一般的に、高い収率でアルドン酸を生成することが困難であり、また、酸化反応部位の選択性が不充分であり、副生成物を生じるため収率が低く、分離精製などにも苦労を要するなどの問題があった。
【０００５】
そこで、一般的に基質特異性が高い酵素反応により、オリゴ糖のヘミアセタール水酸基の酸化反応を触媒しようという試みがなされている。
【０００６】
糖のヘミアセタール水酸基を酸化する酵素としては、グルコースオキシダーゼが知られている（特許文献１）。しかし、グルコースオキシダーゼの基質となる糖は、Ｄ−グルコースのみであり、ラクトースなどその他の糖を利用できず、工業的利用の範囲はかなり制限されていた。
【０００７】
一方で、ヘミアセタール水酸基を酸化する酵素およびその酵素を発現する菌体が報告されている（特許文献２）。この酵素は、アシネトバクター  バウマンニ  Ｎｏ．７Ｗ２−３（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  Ｎｏ．７Ｗ２−３）、ブルクホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｎｏ．２４−２−１）など由来である。また、アルドン酸の製造は、これらの菌体と糖を接触させる方法、糖を含む培地でこれら菌体を培養する方法、菌体をそのまま触媒として糖と反応させる方法などにより行っている。しかし、このような酵素は、実際には精製されておらず、その一次構造やそれをコードする遺伝子配列なども不明であることから、大量発現することが不可能であり、この方法ではアルドン酸を量産することは困難であった。
【０００８】
【特許文献１】特開昭５７−８６２８３号公報
【特許文献２】特開２００１−２４５６５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヘミアセタール水酸基を有する糖の該水酸基を酸化する新規な糖質酸化酵素に関し、さらには、該酵素をコードする遺伝子および該酵素を用いるアルドン酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素であって、該サブユニットが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列からなる糖質酸化酵素に関する。
（ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列
【００１１】
前記サブユニットが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のＤＮＡによってコードされることが好ましい。
（ａ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ
【００１２】
また、本発明は、３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素をコードする糖質酸化酵素遺伝子であって、該サブユニットが以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列からなる糖質酸化酵素遺伝子である。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列
【００１３】
前記サブユニットが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のＤＮＡによってコードされることが好ましい。
（ａ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ
【００１４】
さらに、本発明は、前記糖質酸化酵素を、ヘミアセタール水酸基を有する糖に接触させることを含むアルドン酸の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の糖質酸化酵素によれば、ラクトースをはじめ、マルトースおよびセロビオースなどの糖が有するヘミアセタール水酸基を酸化し、高収率でアルドン酸を生成することができる。また、この糖質酸化酵素遺伝子によれば、この遺伝子を組換え技術により、たとえば大腸菌に導入して、大量発現して得られた糖質酸化酵素を用いることによりアルドン酸を量産することができる。さらに、エラープローンＰＣＲ、部位特異的変異導入などの遺伝子工学的手法を用いることにより、たとえば、基質特異性、比活性などに優れた組換え酵素を得ることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素に関し、サブユニットは、それぞれ配列番号８、９および１０で表わされるアミノ酸配列からなる。
【００１７】
本発明における糖質酸化酵素とは、ヘミアセタール水酸基を有する糖の該水酸基を特異的に酸化する酵素を意味する。
【００１８】
本明細書において、ヘミアセタール水酸基を有する糖としては、たとえば、ラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、セロビオース、マルトース、メリビオース、４’−ガラクトシルラクトースなどがあげられる。なかでも、本発明の糖質酸化酵素の基質特異性が高く、また基質として安価に製造されている点で、ラクトース、グルコース、マルトースが好ましく、ラクトースがより好ましい。
【００１９】
以下、本明細書において、「糖」とは、ヘミアセタール水酸基を有する糖を意味する。
【００２０】
前記ヘミアセタール水酸基を有する糖は、本発明の糖質酸化酵素に作用させることによってアルドン酸に変換される。たとえば、ラクトースは、本発明の糖質酸化酵素に作用させることによってラクトビオン酸に変換される。本明細書において、アルドン酸とは、アルドースのヘミアセタール水酸基が酸化されたもの、あるいはアルドース末端を有する二糖以上の糖の還元末端のヘミアセタール水酸基が酸化されたものをいい、その塩の形態も含む。
【００２１】
本発明の糖質酸化酵素には、配列番号８、９および１０で表されるいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるサブユニットを有するタンパク質も、該タンパク質が糖の有するヘミアセタール水酸基を酸化する能力を有する限り含まれる。
【００２２】
特定のアミノ酸を欠失、置換または付加する方法としては、エラープローンＰＣＲ、部位特異的変異導入などの従来公知の方法が用いられ、当業者であれば容易に実施し得る。
【００２３】
本発明の糖質酸化酵素は、生成されたアルドン酸に対しては活性を有さない点で、バークホルデリア（Burkholderia）属であることが好ましく、とくにバークホルデリア・グラディオリ（Burkholderia gladioli）の近縁種であることがより好ましい。
【００２４】
前記糖質酸化酵素が、バークホルデリア属に属する微生物が産生する糖質酸化酵素の場合、以下の理化学的性質を有することが好ましい。
（１）反応至適温度：４０〜４２℃
（２）反応至適ｐＨ：６．５〜８．０
（３）熱安定性：４５℃以下。ｐＨ７．０で８時間処理したのち、８５％以上の活性を保持している。
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜８。２８℃、８時間処理したのち、９０％以上の活性を保持している。
【００２５】
本発明はまた、それぞれ配列番号５、６および７の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる３つのサブユニットからなる糖質酸化酵素に関する。
【００２６】
本発明の酸化酵素には、配列番号５、６および７の塩基配列からなるそれぞれのＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるサブユニットを有するタンパク質も、該タンパク質が糖の有するヘミアセタール水酸基を酸化する能力を有する限り含まれる。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の操作により実施することができる。たとえば、ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡを固定したフィルターを、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中でプレインキュベーションした後、目的のＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡを加えた後、４７〜５２℃、８〜１６時間インキュベーションすることで行うことができる。
【００２８】
ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件としては、目的のＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡを加えた後のインキュベーションを、５３〜５８℃、８〜１６時間で行うことがあげられ、さらにストリンジェントな条件としては、６０〜６５℃、８〜１６時間で行うことがあげられる。その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で４２℃、１５分間軽く振盪し、この洗浄を２回行う。洗浄後、ＤＮＡを固定したフィルターは、オートラジオグラフィーによりＸ線フィルムに感光される。
【００２９】
本発明はまた、前記糖質酸化酵素を効果的に組換え生産するために使用することができる該糖質酸化酵素をコードする糖質酸化酵素遺伝子に関する。本発明の糖質酸化酵素は、前記のとおり３つのサブユニットからなり、サブユニットは、それぞれ配列番号８、９および１０で表わされるアミノ酸配列からなる。
【００３０】
本発明の糖質酸化酵素遺伝子には、配列番号８、９および１０で表わされるいずれかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるサブユニットを有するタンパク質をコードする遺伝子も、該遺伝子によってコードされるタンパク質が、糖の有するヘミアセタール水酸基を酸化する能力を有する限り含まれる。
【００３１】
さらに、前記糖質酸化酵素の３つのサブユニットは、それぞれ配列番号５、６および７の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされることが好ましい。
【００３２】
本発明の糖質酸化酵素遺伝子には、配列番号５、６および７の塩基配列からなるそれぞれのＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子も、該遺伝子によってコードされるタンパク質が、糖の有するヘミアセタール水酸基を酸化する活性を有する限り含まれる。
【００３３】
本発明は、前記糖質酸化酵素を、ヘミアセタール水酸基を有する糖に接触させることを含むアルドン酸の製造方法に関する。
【００３４】
アルドン酸の製造方法としては、たとえば、本発明の糖質酸化酵素の産生能を有する微生物を、ヘミアセタール水酸基を有する糖を含む培地において培養する方法、該微生物を触媒として糖に直接接触させる方法、本発明の酵素を糖に直接接触させる方法などがあげられる。本発明においては、組換え技術により得られた本発明の糖質酸化酵素遺伝子の産生能を有する微生物を用い、大量に当該酵素が得られることから、酵素を糖に直接接触させる方法が簡便かつ生産性の点から好ましい。以下、酵素を糖に直接接触させる方法について説明する。
【００３５】
本発明の酵素を糖に直接接触させる方法においては、前記糖質酸化酵素として、粗酵素および精製酵素ならびに酵素加工物などを使用することができる。
【００３６】
粗酵素は、たとえば、培養後の菌体を破砕し、遠心分離などにより不溶性画分を除去して得ることができる。菌体の破砕方法としては、超音波処理法、凍結融解法、フレンチプレスなどによる高圧法、酵素処理法、またはこれらの組み合わせなどがあげられる。
【００３７】
また、精製酵素は、前記粗酵素を当業者に公知の手段、すなわち、ろ過、酢酸ナトリウム分画、硫安分画、親水性有機溶媒沈殿、界面活性剤処理、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、または各種カラムクロマトグラフィーの組み合わせにより得ることができる。
【００３８】
また、前記粗酵素液および精製酵素は、限外ろ過などで濃縮して用いることができる。
【００３９】
酵素加工物としては、たとえば、粗酵素および精製酵素を固定化した固定化酵素などがあげられる。固定化酵素は、公知の方法により調製でき、たとえば、アルギン酸ゲルやκ−カラギーナンなどのよるゲル包括法、および架橋結合法、担体結合法などにより調製することができる。
【００４０】
本発明のアルドン酸の製造方法において用いることのできる前記糖質酸化酵素の産生能を有する微生物は、前記糖質酸化酵素遺伝子を用いる組換え技術により得ることができる。組換え技術において宿主となり得る微生物としては、その酵素の使用用途により種々のものを選択することができ、大腸菌をはじめ、シュードモナス属やアセトバクター属などのグラム陰性細菌、バチルス属細菌などのグラム陽性細菌、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母、アスペルギルス・ニガーなどの糸状菌、バークホルデリア属の微生物などがあげられるが、これらには限定されず、異種タンパク質の産生に適した宿主微生物であればどのようなものでも用いることができる。
【００４１】
本発明の糖質酸化酵素遺伝子を発現するために用いることができるベクターとしては、ｐＵＣ１８および１１８、ｐＵＣ１９および１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫおよびＫＳ、ｐＢＲ３２２、ならびにｐＡＣＹＣ１８４などがあげられる。
【００４２】
本発明の糖質酸化酵素遺伝子を、ベクターに導入する方法は、たとえば、制限酵素処理を用いてＤＮＡを切断し、ＤＮＡリガーゼなどを用い該ＤＮＡ断片を発現ベクターの適切な位置に結合閉鎖させることによりベクターに導入することができる。制限酵素としては、たとえば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素があげられる。
【００４３】
また、前記ベクターを宿主となり得る微生物に導入する方法としては、たとえば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム処理を用いたコンピテントセル法などがあげられる。
【００４４】
本発明における前記糖質酸化酵素の産生能を有する微生物の培養に使用する培地として、各種細胞の通常の培養条件で行うことができる。当該培地に含まれる成分としては、微生物の種類にもよるが、たとえば、本発明の糖質酸化酵素遺伝子を導入した大腸菌の場合には、グルコースなど資化可能な炭素源、トリプトン、酵母エキス、Ｋ2ＨＰＯ4、ならびにＫＨ2ＰＯ4を含む培地を使用することができる。高密度培養を可能とするために、グリセロール、ラクトース、マルトース、シュクロースおよびキシロースなどを添加することが好ましく、とくにラクトースがより好ましい。該糖質酸化酵素のタンパク質産生の誘導のために、ラクトースまたはＩＰＴＧを用いることが好ましい。培地のｐＨ、培養温度は、該微生物が生育し得るｐＨおよび温度であればよく、通常ｐＨ６．５〜７．０に調節し、１８〜３７℃で培養するのが好ましい。
【００４５】
粗酵素は、前記のとおり、培養および酵素が誘導された微生物を破砕することによって得ることができる。
【００４６】
酵素を糖に直接接触させることによりアルドン酸を製造する場合の酵素量は、たとえば、０．２〜１０Ｕ／ｍｌであることが好ましく、０．３〜３．０Ｕ／ｍｌであることがより好ましい。酵素量が、０．２Ｕ／ｍｌ未満でも、１０Ｕ／ｍｌより多くても、単位酵素あたりの生産性が下がる傾向がある。
【００４７】
ここで、１Ｕとは、ｐＨ７．０、４０℃の条件下で、８３ｍＭ（３重量％）のラクトースから、１分間に１μｍｏｌのラクトビオン酸を生成する酵素量をいう。
【００４８】
本発明のアルドン酸の製造方法における反応液のｐＨは、たとえば、４．５〜８．０であることが好ましく、６．５〜７．０であることがより好ましい。反応液のｐＨが、４．５未満でも、８．０より高くても、単位酵素あたりの生産性が下がる傾向がある。
【００４９】
反応液のｐＨはアルドン酸の生成に伴って低下するので、反応液のｐＨを一定に保つために、反応液に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウムなどの金属塩などを添加することが好ましく、簡便な点では炭酸カルシウムがとくに好ましい。該金属塩は、基質の１／１０〜１／４量反応溶液中に添加することが好ましく、１／８〜１／７倍量であることがより好ましい。１／１０量未満では、反応後期にラクトビオン酸の生成によるｐＨの低下がおこるため、単位酵素あたりの生産性が低下する傾向があり、１／４倍量より多いと反応液の粘度が上がる傾向がある。また、反応液に該金属塩を含有させることにより、各種アルドン酸塩を得ることも可能である。
【００５０】
本発明のアルドン酸の製造方法における反応温度は、たとえば、３０〜４５℃であることが好ましく、４０℃であることがより好ましい。反応温度が３０℃以下では、高濃度基質中では反応速度が低下する傾向があり、４５℃より高いと単位酵素あたりの生産性が下がる傾向がある。
【００５１】
本発明のアルドン酸の製造方法における反応液中の糖の濃度は、たとえば、１０〜４０重量％であり、好ましくは、２０〜３０重量％である。糖の濃度が１０重量％未満では、単位酵素あたりの生産性の低下する傾向があり、４０重量％より多いと、基質の粘性が高くなるため、単位酵素あたりの生産性の低下傾向がある。
【００５２】
本発明のアルドン酸の製造方法における反応時間は、たとえば、１８０時間以下であることが好ましく、７２時間以下であることがより好ましい。１８０時間より長いと、単位酵素あたりの生産性の低下傾向がある。
【００５３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
ヘミアセタール水酸基酸化活性を有するバークホルデリア由来の糖質酸化酵素遺伝子の単離
（１）バークホルデリア  エスピー株（Burkholderia sp.）からの染色体ＤＮＡの調製
バークホルデリア  エスピー株（受領機関  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受領日  平成１６年４月８日、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−  ２０００２）より染色体ＤＮＡを常法に従って調製した。すなわち、該菌株をＬＢＡ用液体培地（ポリペプトン １０ｇ、酵母エキス ３ｇ、ＮａＣｌ ２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ４ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ラクトース ５０ｇ、グリシン ３ｇ；１Ｌ、ｐＨ７．０）を用いて、３０℃で４８ｈ振盪培養した。
【００５５】
増殖した菌体を遠心分離により回収し、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０．３％  ショ糖、リゾチーム（濃度１ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液に懸濁し、３７℃で２時間処理した。次いで、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間インバート撹拌したのち、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウムを加え、等倍量の２-プロパノールを加え混合し染色体ＤＮＡを析出させた。
【００５６】
これを遠心分離により沈殿させ、７０％エタノールで洗浄したのち、乾燥し、適当量のＴＥバッファーに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００５７】
（２）ＰＣＲによる糖質酸化酵素の部分遺伝子の増幅
バークホルデリア  セパシア（Burkholderia cepacia）由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の中から高く保存されている領域の塩基配列に基づいて、約３０塩基の塩基配列からなるミックストヌクレオチドプライマーを作製した。
【００５８】
以下に合成したプライマーを示す。
フォワードプライマー：５’−ＧＴＣＧＧｓＧＧｓＡＣｓＡＣｓＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣ−３’（配列番号１）(ｓ＝ＣとＧのミックス)
リバースプライマー：５’−ＣＴＧＴＡＣＣＡｓＣＡｓｋＣｓＴＴＧｄＡｓＴＡＣＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号２）（ｋ＝ＧとＴ、ｄ＝ＡとＧとＴのミックス）
【００５９】
このプライマーを用いて、前記（１）で得た染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応することによりＤＮＡ増幅を行なった結果、特異的にＤＮＡが増幅した。
【００６０】
前記ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡの塩基配列を常法により解析したところ、バークホルデリア  エスピー株由来の増幅断片は、配列番号３に示される約０．７ｋｂの塩基配列を含むことが分かった。
【００６１】
（３）完全長遺伝子の取得
前記（２）において得られたＰＣＲ増幅断片を用い、常法に従い完全長遺伝子の取得を試みた。
【００６２】
まず、供試菌から抽出した染色体ＤＮＡをＳａｕＩＩＩＡＩエンドヌクレアーゼにより部分消化し、ショ糖密度勾配遠心を行なった。それらをフラクションコレクターで分画し、その画分をアガロースゲル電気泳動した。ゲルからの切り出しによって約２０ｋｂのランダムなＤＮＡ断片を回収した。この断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ切断、アルカリフォスファターゼ処理したコスミドベクターｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にライゲーションし、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製)を用いインビトロパッケージングしたのち、大腸菌への形質導入を行なうことにより、コスミドライブラリーを作製した。ついで、前記（２）において得られたＰＣＲ増幅断片(配列番号３)をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。オートラジオグラフィーによりポジティブクローンを調べることにより、３０個のポジティブクローンが得られた。
【００６３】
得られたポジティブクローンからアルカリＳＤＳ法でコスミドベクターを回収し、コスミドベクターを種々の制限酵素で切断することにより制限酵素地図を作製した。ついで、前記同プローブを用いて、得られたコスミドベクターについてサザンハイブリダイゼーションを行なった。これらのなかから、ポジティブを示す約３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ塩基断片（配列番号４）を得た。
【００６４】
大腸菌用発現ベクターｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）を、前記断片を挿入し得るようサブクローン化、ｐＧＥＭ１１Ｚｆ（−）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のマルティプルクローニングサイトを使用することにより該ベクターに制限酵素サイトを付加した。該大腸菌用発現ベクターｐＵＣ１９に、前記塩基断片（配列番号４）を挿入したプラスミドをｐＨＮａ−３と命名した。
【００６５】
エレクトロポレーション法で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−Ｉ ｂｌｕｅ ＭＲ Ｆ’株)を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ１００μＭ、Ｘ−ｇａｌ４０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で生じるコロニーの青白セレクションで、ポジティブを示す大腸菌クローンを採取した。得られた形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ１００μＭを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩培養し、遠心分離により菌体を回収した。
【００６６】
この菌体を滅菌した５０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕し、遠心分離機により上清と菌魂に分別回収した。得られた上清を細胞破砕粗抽出液とし、この粗抽出液に基質濃度（終濃度）３重量％のラクトースを供し、４０℃で３０分間反応させた。ついで、実施例３と同様にＨＰＬＣ分析を行なったところ、ラクトビオン酸の生成が確認された。
【００６７】
さらに、前記塩基配列（配列番号４）を常法により解析したところ、ＰＣＲにより得られた断片の塩基配列（配列番号３）を有することが確認された。さらに、得られたＤＮＡ配列（配列番号４）を基に得られた推定アミノ酸配列から、得られた糖質酸化酵素は３つのサブユニットからなることが分かった。
【００６８】
得られた糖質酸化酵素のそれぞれのサブユニットを、配列番号５〜７に示す。また、当該糖質酸化酵素のサブユニットの推定アミノ酸配列を、配列番号８〜１０に示す。
【実施例２】
【００６９】
酵素の以下の理化学的性質について検討した。
（至適温度）
５０ｍＭリン酸緩衝液中、ｐＨ７．０で２時間、３０〜６０℃の範囲で１０量％のラクトースを基質にして活性測定を行なった。その結果を図１に示す。４０℃付近で高い活性を示した。
【００７０】
（至適ｐＨ）
５０ｍＭリン酸緩衝液（４０℃）中、ｐＨ３〜１０の範囲で１０重量％のラクトースを基質にして活性測定を行なった。その結果を図２に示す。ｐＨ６．５〜８の範囲で高い活性を示した。
【００７１】
（熱安定性）
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０〜６０℃の各温度で８時間処理したのち、１０量％のラクトースを基質にして本酵素の残存する活性測定を行なった。その結果を図３に示す。４５℃以下で８５％以上の活性が残存していた。
【００７２】
（ｐＨ安定性）
５０ｍＭリン酸緩衝液（２８℃）中、ｐＨ３〜１０の範囲で１０量％のラクトースを基質にして本酵素の残存する活性測定を行なった。その結果を図４に示す。ｐＨ６．５〜８で９０％以上の活性が残存していた。
【実施例３】
【００７３】
ラクトースからのラクトビオン酸の製造
以下のバークホルデリア  エスピー株（野生株）とＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−Ｉ ｂｌｕｅ ＭＲ Ｆ’株／ｐＨＮａ−３（形質転換体）を用いて、ラクトースからラクトビオン酸を製造した。
【００７４】
（１）バークホルデリア  エスピー株（野生株）の種培養培地、本培養培地および粗酵素調製方法はつぎのとおりである。
（種培養培地）
ラクトース １．０重量％、ポリペプトン １．０重量％、酵母エキス ０．５重量％、ＮａＣｌ ０．０５重量％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．２重量％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２重量％、ＮＨ4ＮＯ3 ０．１０重量％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５重量％、ｐＨ７．０
【００７５】
（本培養培地）
ラクトース ７重量％、ポリペプトン ２．０重量％、酵母エキス １．０重量％、ＮａＣｌ ０．１重量％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．４重量％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．４重量％、ＮＨ4ＮＯ3 ０．２０重量％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１重量％、ＣａＣＯ3 ０．９重量％、ｐＨ７．０
【００７６】
（粗酵素調製方法）
前記菌株を、前記前培養培地５ｍｌに一白金耳分植菌し、３０℃で２４時間振とう培養して前培養を行なった。これらの種培養１ｍｌを、前記本培養培地１００ｍｌに接種し、３０℃で５５時間往復振とう培養を行ない、酵素活性の最適な状態まで培養した。本培養終了後、培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）し、約２．５ｇの菌体を得た。この菌体を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、１０ｍｌの同リン酸緩衝液に分散させ、氷冷中で２０〜３０Ｋｃの超音波で菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）し、上清を細胞抽出液(粗酵素)とした。以下（３）に示すように、該粗酵素溶液を用いて製造されたラクトビオン酸の生成量を測定した。
【００７７】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−Ｉ ｂｌｕｅ ＭＲ Ｆ’株／ｐＨＮａ−３（形質転換体）の種培養培地、本培養培地および粗酵素調製方法はつぎのとおりである。
（種培養培地）
トリプトン １．０重量％、酵母エキス ０．５重量％、ＮａＣｌ ０．５重量％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０
【００７８】
（本培養培地）
ラクトース１．６重量％、トリプトン１．２重量％、酵母エキス ２．４重量％、Ｋ2ＨＰＯ4 １．２５４重量％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２３１重量％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ１００μM、ｐＨ７．０
【００７９】
（粗酵素調製方法）
前記菌体を、前記前培養培地５ｍｌに一白金耳分植菌し、３７℃で１６時間振とう培養して前培養を行なった。これらの種培養１ｍｌを、前記本培養培地１００ｍｌに接種し、２８℃で４８時間往復振とう培養を行ない、酵素活性の最適な状態まで培養した。本培養終了後、培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）し、 約２．５ｇの菌体を得た。この菌体を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、１０ｍｌの同リン酸緩衝液に分散させ、氷冷中で２０〜３０Ｋｃの超音波で菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）し、その上清を細胞抽出液(粗酵素)とした。以下（３）に示すように、該粗酵素溶液を用いて製造されたラクトビオン酸の生成量を測定した。
【００８０】
（３）製造されたラクトビオン酸の生成量の測定
ラクトビオン酸生成酵素の力価を、基質濃度(終濃度)３重量％ラクトース溶液２００μｌと粗酵素溶液２００μｌを混合し、ｐＨ７．０、４０℃で３０分間反応を行ない、ＨＰＬＣ分析することにより測定した。この測定方法において力価１Ｕを、ｐＨ７．０、４０℃の条件下で、８３ｍＭ（３重量％）のラクトースから、１分間に１μｍｏｌのラクトビオン酸を生成する酵素量とした。粗酵素溶液１ｍｌあたりの力価の単位をＵ／ｍｌとした。本明細書では、この測定法を用いてラクトビオン酸測定を行なった。
【００８１】
ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
カラム：Ａｍｉｄｏ−８０(ＴＯＳＯＨ社製)
検出器：示差屈折計
移動相：アセトニトリル：５０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム水溶液＝７０：３０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
ラクトビオン酸変換率＝ラクトビオン酸のエリア面積・ｆLBA／（ラクトビオン酸のエリア面積・ｆLBA＋ラクトースのエリア面積）。ここで、ｆLBA(補正ファクター)＝１．３５
力価（Ｕ／ｍｌ）＝（０．４（反応体積（ｍｌ））×０．０３（基質（ラクトース）濃度（３％）×ラクトビオン酸変換率）／（（３５８（ラクトビオン酸分子量（概算））×１００００００）×３０（分）×０．２粗酵素溶液体積（ｍｌ））
【００８２】
それぞれの抽出液のラクトースからのラクトビオン酸生成の力価は
野生株：０．００５０Ｕ／ｍｌ
形質転換体：０．０６４０Ｕ／ｍｌ
であった。
【００８３】
前記本培養培地１００ｍｌ（５００ｍｌ三角フラスコ）で、形質転換大腸菌、および野生株を培養し、所定の培養時間毎（０、１、２、４、８、１６、２４時間）に各５ｍｌ分の培養液をそれぞれサンプリングし遠心分離で菌体を回収し、前記超音波処理により得られた細胞抽出液（粗酵素）の単位培養液体積・時間あたりの酵素活性を測定した。
【００８４】
形質転換体の２４時間培養サンプルから得た粗酵素が生成したラクトースからのラクトビオン酸生成量を１００％として、形質転換体および野生株の前記粗酵素溶液で各反応時間反応させて得られたラクトビオン酸の生成量を相対的に評価することによって、各培養時間で得られた粗酵素の単位培養体積あたりの酵素活性の経時変化を示した（図５）。
【００８５】
形質転換体の粗酵素溶液は、野生株と比較して、単位培養体積あたり高い酵素活性を有していた。
【実施例４】
【００８６】
本発明の糖質酸化酵素の基質特異性を調べた。基質としては、ラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、４’−ガラクトシルラクトースを使用した。
【００８７】
前記培養によって得られた組換え大腸菌から調製した前記酵素０．５Ｕ／ｍｌを用いて、基質濃度（終濃度）３重量％の各基質をｐＨ７．０、４０℃で３時間反応させ、１０分間１００℃にすることにより反応を停止させた。遠心分離により変性夾雑物を除去し、その反応上清を前記ＨＰＬＣ条件で分析した。単純面積百分率法で各基質からのアルドン酸生成量を重量％で算出した。
【００８８】
基質としてラクトースを使用した場合に得られたアルドン酸の重量％を１００として、それぞれの基質への活性を相対的に評価した。その結果を以下に示す。
【００８９】
Ｄ−グルコースは５２、Ｄ−マンノースは４０、Ｄ−ガラクトースは４４、Ｄ−キシロースは２３、Ｄ−アラビノースは１９、 セロビオースは７６、 マルトースは８９、マルトトリオースは６５、マルトテトラオースは４５、 マルトペンタオースは４２、４’−ガラクトシルラクトースは３４であった。
【００９０】
このように、ラクトース、セロビオースおよびマルトースに対して、極めて高い活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の糖質酸化酵素の反応至適温度を示す図である。
【図２】本発明の糖質酸化酵素の反応至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明の糖質酸化酵素の熱安定性を示す図である。
【図４】本発明の糖質酸化酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】バークホルデリア  エスピー株（野生株：◆）とＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−Ｉ ｂｌｕｅ ＭＲ Ｆ’株／ｐＨＮａ−３（形質転換体：●）による反応液中のラクトースのラクトビオン酸への変換の経時変化を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号１：糖質酸化酵素遺伝子のクローニングのためのフォワードプライマー
配列番号２：糖質酸化酵素遺伝子のクローニングのためのリバースプライマー
【図１】
2005304306.tif 000002
【図２】
2005304306.tif 000003
【図３】
2005304306.tif 000004
【図４】
2005304306.tif 000005
【図５】
2005304306.tif 000006
【配列表】
2005304306000001.app