(57)【要約】【課題】  表皮細胞が生分解基板上で厚く重層化し、かつ角質化された培養表皮およびその簡便な培養方法の開発。【解決手段】  表皮細胞を播種、接着された生分解性基材を培養液の液面付近で培養することにより、表皮細胞が生分解基板上で厚く重層化し、かつ十分に角質化された培養表皮を得ることができる。また、生分解性基材の少なくとも片面に繊維芽細胞を培養液中における液面付近で培養し、生分解性基材上に真皮層を形成した膜状物を作成後、膜状物の少なくとも片面に表皮細胞を培養液中における液面付近で培養することにより培養皮膚も得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性基材と、該生分解性基材の片面に表皮細胞が約４〜１０層重層化され、かつ角質化された培養表皮。
【請求項２】
生分解性基材と、該生分解性基材の片面に表皮細胞により形成した自己増殖層と、該自己増殖層の外面に表皮細胞により形成した約４〜１０層の重層化層と、該重層化層の外面に表皮細胞により形成した角質層からなる請求項１に記載の培養表皮。
【請求項３】
生分解性基材がコラーゲン、ポリ乳酸またはポリグリコール酸からなる請求項１に記載の培養表皮。
【請求項４】
生分解性基材がシート、不織布またはスポンジからなる請求項１に記載の培養表皮。
【請求項５】
生分解性基材の片面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面付近にて重層化培養することにより得られた培養表皮。
【請求項６】
培養液の液面付近が、培養液の液面を０ｍｍとしたとき、生分解性基材の上面が培養液の深さ約０〜７ｍｍまでの位置である請求項５に記載の培養表皮。
【請求項７】
生分解性基材の片面に表皮細胞を播種、接着させ、該面を上に向けた状態で、培養液の液面付近にて重層化培養する工程を含むことを特徴とする培養表皮の製造方法。
【請求項８】
生分解性基材の片面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面を０ｍｍとしたとき、生分解性基材の上面が培養液の深さ約０〜７ｍｍまでの位置で培養することを特徴とする請求項７に記載の培養表皮の製造方法。
【請求項９】
生分解性基材の片面に繊維芽細胞を播種し、培養することで形成された真皮層を坦持した生分解性基材を作成し、次いで該真皮層を坦持した生分解性基材の真皮層側の面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面付近で培養することにより得られた培養皮膚。
【請求項１０】
生分解性基材の片面に繊維芽細胞を播種し、培養することで形成された真皮層を坦持した生分解性基材を作成し、次いで該真皮層を坦持した生分解性基材の生分解性基材側の面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面付近で培養することにより得られた培養皮膚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性基材と、該生分解性基材の片面に表皮細胞が約４〜１０層重層化され、かつ角質化された培養表皮および培養表皮製造方法に関する。さらには、上記培養表皮と真皮層とを組み合わせた培養皮膚に関する。
【背景技術】
【０００２】
広範囲に及ぶ皮膚欠損創の治療手段として、健常皮膚片から採取した表皮細胞及び繊維芽細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することで、患者へ移植する表皮または皮膚を再構築させる技術が開発されてきている。これらの治療に用いられる移植法には、繊維芽細胞を含むコラーゲンゲルなどからなる真皮代替物上に表皮細胞を増殖培養して作製した繊維芽細胞および表皮細胞の両者を含む皮膚類似構造物を移植する複台人工皮膚移植法と、増殖培養した表皮細胞からなる培養表皮のみを移植する表皮細胞単独移植法が知られている。
【０００３】
複台人工皮膚移植法における培養皮膚は、栄養分の供給ならびに適用創面からの浸出液の排出を円滑に行いうるもの（特許文献１、２）や、移植面積の収縮を抑えたもの（特許文献３）、生着性をより向上させたもの（特許文献４）などが報告されている。これらの培養皮膚は真皮成分を欠く皮膚全層欠損創に対する移植に適しているが、逆に真皮層を必要としない培養表皮のみを移植する表皮細胞単独移植法に適するものではない。
【０００４】
上記培養表皮を作成する方法として、上記培養皮膚の表皮と真皮代替物をコラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素などで剥離させることで作成は可能であるが、直接培養表皮を作製する方法と比較すると、製造工程の点で無駄が生じる。さらに、剥離の際に表皮細胞が損傷してしまい、生着率の低下が危惧される。
【０００５】
一方、培養表皮を直接作成する方法としては、切手大の皮膚から採取した表皮細胞を培養フラスコで大量培養して表皮シートを得るものである。しかし、付着性細胞である表皮細胞のシートを培養フラスコから剥離する際に使用する酵素処理により、剥離前の培養細胞面積が収縮され、必要とする移植面積が得られないばかりでなく、移植面に貼り付ける基底細胞が傷害を受けるために、自家移植において生着率が低下するという問題が指摘されている。また、このようにして培養された表皮シートは、角質化を促すための空気暴露培養ができず、皮膚移植後の感染に対する抵抗力が弱いことも低生着率の一因として考えられている。
【０００６】
【特許文献１】特開平９−４７５０２号公報
【特許文献２】特開平９−４７５０３号公報
【特許文献３】特開平１０−４３２１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
表皮細胞が生分解性基材上で厚く重層化し、かつ角質化した培養表皮とその簡便な培養方法の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）  生分解性基材と、該生分解性基材の片面に表皮細胞が約４〜１０層重層化され、かつ角質化された培養表皮、
（２）  生分解性基材と、該生分解性基材の片面に表皮細胞により形成した自己増殖層と、該自己増殖層の外面に表皮細胞により形成した約４〜１０層の重層化層と、該重層化層の外面に表皮細胞により形成した角質層からなる（１）記載の培養表皮、
（３）  生分解性基材がコラーゲン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる（１）に記載の培養表皮、
（４）  生分解性基材がシート、不織布またはスポンジからなる（１）に記載の培養表皮、
（５）  生分解性基材の片面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面付近にて重層化培養することにより得られた培養表皮、
（６）  培養液の液面付近が、培養液の液面を０ｍｍとしたとき、生分解性基材の上面が培養液の深さ約０〜７ｍｍまでの位置である（５）に記載の培養表皮、
（７）  生分解性基材の片面に表皮細胞を播種、接着させ、該面を上に向けた状態で、培養液の液面付近にて重層化培養する工程を含むことを特徴とする培養表皮の製造方法、
（８）  生分解性基材の片面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面を０ｍｍとしたとき、生分解性基材の上面が培養液の深さ約０〜７ｍｍまでの位置で培養することを特徴とする（７）に記載の培養表皮の製造方法、
（９）  生分解性基材の片面に繊維芽細胞を播種し、培養することで形成された真皮層を坦持した生分解性基材を作成し、次いで該真皮層を坦持した生分解性基材の真皮層側の面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面付近で培養することにより得られた培養皮膚、および、
（１０）  生分解性基材の片面に繊維芽細胞を播種し、培養することで形成された真皮層を坦持した生分解性基材を作成し、次いで該真皮層を坦持した生分解性基材の生分解性基材側の面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面付近で培養することにより得られた培養皮膚に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の培養表皮は、生分解性基材と、該生分解性基材の片面に表皮細胞が約４〜１０層重層化され、かつ角質化されたものであり、培養フラスコではなく、生分解性基材を用いて培養を行うため、酵素処理による細胞の損傷がなく、移植面積の収縮を抑え、培養表皮の生着性が向上するとともに、生着後の感染に対する抵抗力も十分である。さらに、安価で調製が簡単な培養表皮および培養皮膚の作製を可能にする。また、角質化されているために、移植後の美容面においても効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明における培養表皮は、生分解性基材を用いることを特徴としている。生分解性基材とは、人や動物の生体内に置いた場合に人や動物組織と融合、または生体内で分解して消失しうる基材を意味するものであって、原材料として生体に適合可能な生分解性高分子が用いられ、例えばコラーゲン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリグリコール酸（ＰＧＡ）などが挙げられる。これらの中でも、細胞親和性、生体適合性の点からコラーゲンが好ましい。さらに好ましくは可溶化処理と同時にコラーゲンの抗原決定基であるテロペプチドの除去処理がなされているアテロコラーゲンである。また、コラーゲンの由来については、特に限定されないが、一般的にはウシ、ブタ、鳥類、魚類、ウサギ、ヒツジ、ネズミ、ヒトなどが挙げられる。コラーゲンはこれらの動物種の皮膚、腱、骨、軟骨、水晶体、臓器などから公知の各種抽出方法を用いることにより得られる。また、コラーゲンのタイプは、I型、II型、III型などの分類可能なタイプのうち限定されるものではないが、取り扱い上の観点から、I型、III型およびI型とIII型の混合型が望ましい。
【００１１】
本発明における生分解性基材の形状はシート、不織布またはスポンジなどが挙げられる。上記シート、不織布、スポンジの形状は、共に移植すべき患部の大きさによって設計すればよい。また、スポンジはプレスなどにより圧縮してもよい。また生分解性基材は、上記シート、不織布およびスポンジからなる郡のいずれかの組み合わせによって作成されたものでもよい。上記生分解性基材の厚さは、約０．０１〜１．０ｍｍ、好ましくは約０．０４〜０．５０ｍｍである。これらの接着は接着剤による接着、糸状物などによる縫合またはシートの作成時に不織布を混ぜ込む方法などにより達成されるが、これに限定されるものではない。
【００１２】
上記シートの作成例として、例えば、コラーゲンシートの場合、特開平９−４７５０３に記載の方法またはこれに準ずる方法に従い作製することができる。酸性またはアルカリ性に可溶化処理されたコラーゲン溶液をポリスチレン製またはポリ−４−フッ化エチレン製などのような撥水性の容器に流し込み、乾燥機の中で乾燥し、シートを得る。このシートを物理的または化学的架橋処理を施し不溶化する。物理的架橋方法の例としては、γ線照射、紫外線照射、電子線照射、プラズマ照射、熱脱水反応による架橋処理などが挙げられ、化学的架橋方法としては、グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレンジイソシアネートなどの架橋剤が挙げられるが特に限定されるものではない。さらに、架橋されたシートを炭酸水素ナトリウム溶液や塩酸などを用いてある程度中和し、蒸留水で洗浄後、再度架橋することにより強度および耐分解性が向上するため好ましい。
【００１３】
上記不織布の作成例として、例えば、コラーゲン不織布を作成する場合、コラーゲン溶液を湿式紡糸などで紡糸することにより得たコラーゲンの糸状物が複数本ほぼ平行に配列された層を、コラーゲン糸状物の配列方向が互いに約７０〜９０度の交差角をなすようにして複数重ねることで得られた積層体を、架橋剤などを用いて架橋した後、さらにコラーゲン溶液を含浸し乾燥させて不織布を得る。その後、架橋・中和を行うことによって得ることができる。このときのコラーゲン溶液の濃度は約５〜７重量％が好ましく、乾燥状態にあるコラーゲン糸１本の直径は約５〜５００ｎｍ、好ましくは約５〜１００ｎｍである。
【００１４】
上記スポンジの作成例として、例えば、目的の組織損傷部に合わせて作製した型に、生分解性高分子の溶液を流し込み、自然乾燥、真空乾燥、凍結融解、真空凍結乾燥などの方法により形成させる。充填後に凍結し、真空にて乾燥する真空凍結乾燥法で形成することが、スポンジを均一に形成する上で好ましい。溶液の濃度は、例えばコラーゲン溶液の場合、それぞれが約０．０５〜３０重量％である。充填する溶液の濃度を調節することにより、充填率が異なるスポンジを得ることができる。また、乾燥条件は、例えばコラーゲン溶液の場合、約０．０８Ｔｏｒｒ以下の真空に保つことが好ましい。凍結乾燥後、型から取り出すことにより、スポンジを得ることができる。さらに、上記スポンジはプレスなどによって圧縮してもよい。
【００１５】
混合シートの作成例としては、例えば、コラーゲンシートとコラーゲン不織布の混合シートの場合、シートの作成方法により容器に流し込まれた酸性、アルカリ性、または中性のコラーゲン溶液の上にコラーゲン不織布を敷き、乾燥させる。乾燥して得られた混合シートは片側がフィルム層、もう片側が不織布層の２層になっており、この混合シートを熱脱水架橋や架橋剤を用いて架橋し、その後、中和・洗浄を行うことにより混合シートが得られる。
【００１６】
さらに本発明における培養表皮に用いる表皮細胞は、同種培養移植、および自家培養移植などの選択する移植方法に準じ調製される。同種培養移植を用いる場合、対象の動物と同種の動物から細胞を調製し、例えば、ヒトが対象である場合はヒト由来の細胞、ウシが対象である場合はウシ由来の細胞を調製することが好ましい。また、表皮細胞を供給する組織としては、新生児および成人陰茎部の包皮や口膣粘膜由来上皮細胞、胎児由来臍帯付属組織などが挙げられ、どの組織を使用してもよい。さらに、自家培養移植を用いる場合は、移植すべき対象の個体自身から細胞を調製することが好ましい。
【００１７】
上記表皮細胞は、以下の手順で調製される。清潔な環境下で採取された皮膚（表皮および真皮の一部、もしくは皮膚全層）を消毒し、ストレプトマイシン或いはバンコマイシンなどの抗生物質を含有する生理食塩水、ハンクス液またはリン酸緩衝液などの緩衝液に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃度約５００〜２０００Ｕ／ｍｌに調製した培地に浸漬して表皮と真皮に分離する。ここで、使用する培地は、ＭＣＤＢ１５３培地またはダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）などの市販されている培地を使用すればよい。
【００１８】
次に得られた表皮をトリプシン濃度約０．０１〜０．５０重量％に調製したハンクス液中に移し、約３７℃、約１０〜２０分間浸漬する。次に１０重量％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭなどの培地中に移し、振盪することにより細胞を分散させ、約２００〜６００×ｇ、約４〜１０分間の遠心分離にて得ることができる。
【００１９】
本発明における培養表皮は表皮細胞が重層化していることを特徴としている。重層化の程度は約４層〜１０層、好ましくは約６〜１０層である。重層化の程度はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオジン染色）などで染色した場合、目視でその層数を数えることによって容易に特定できる。これらの重層化によって形成された層を重層化層と呼ぶ。この重層化層の厚みは、例えば人間の表皮細胞を球形と想定した場合、重層化の程度は、４０〜２００μｍ、好ましくは約６０〜２００μｍである。
【００２０】
さらに、本発明における培養表皮は角質化されていることを特徴としている、角質化とは、重層化細胞内にケラチンを生じ、細胞がこれによって完全に満たされ、核をはじめ全ての小器官を失って乾燥死滅した状態を意味する。この角質化によって形成された層を角質化層と呼び、重層化層の最外層で形成する。この角質化層は、健常な皮膚を触った時に感じられるかさかさ感を奏ずるものである。さらに、ＨＥ染色などによって、細胞が脱核して薄い皮膜状の層が形成されていることを目視で確認することができる。また、免疫染色で表皮分化マーカーであるＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１０，１４を用いて染色することにより、重層化層を特異的に染色して角質層を確認することもできる。
【００２１】
さらに、本発明の培養表皮は、生分解性基材と、該生分解性基材の片面に表皮細胞により形成した自己増殖層と、該自己増殖層の外面に表皮細胞により形成した約４〜１０層の重層化層と、該重層化層の外面に表皮細胞により形成した角質層からなることを特徴としている。自己増殖層とは、生分解性基材上の表面で表皮細胞が増殖し、重層化を行うための土台としての役割を担う層である。
【００２２】
また、本発明の培養表皮は、生分解性基材の片面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面付近で培養することにより得られることを特徴としている。培養液の液面付近とは、培養液の液面を０ｍｍとしたとき、生分解性基材の上面が培養液の深さ約０〜７ｍｍまでの位置であることを意味する。
【００２３】
本発明の培養表皮の製造方法は、表皮細胞を播種した生分解性基材の面を上に向けた状態で、培養液の液面付近で培養する工程を含むことを特徴としている。培養液の液面付近で培養する工程とは、具体的には、培養液の液面を０ｍｍとしたとき、培養液中における生分解性基材の上に向けた面の位置が、７ｍｍ以下、好ましくは３ｍｍ以下で培養する。この液面からの位置は、培養液の量で適時調整すればよい。また、生分解性基材が培養液面から８ｍｍ以下になる場合は、培養皿などを土台として用いて液面高さを調節して培養すればよい。
【００２４】
さらに本発明の培養表皮の製造方法は、生分解性基材の片面に表皮細胞を播種（播種工程）し、培養することで自己増殖層を形成した後（自己増殖工程）、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面を０ｍｍとしたとき、生分解性基材の上面が培養液の深さ約０〜７ｍｍまでの位置で培養すること（重層化工程）を特徴としている。
【００２５】
上記播種工程における生分解性基材の少なくとも片面に播種させる方法は、特開２０００−６０５４２に記載の方法またはこれに準ずる方法で実施することができるが、これに限定されるものではない。具体的には生分解性基材上に表皮細胞を懸濁した培養液の極微量の液滴をマイクロピペッタ−等の器具を使用することにより行う。懸濁液の液滴中における細胞の量としては、細胞密度にして約１．０×１０４〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌの細胞懸濁液を約５０〜１００μｌ加えるのが望ましい。この際、使用する培養液は、ＭＣＤＢ１５３培地またはＤＭＥＭ培地などの市販されている培地を使用すればよい。こうして生分解性基材上に滴下された液滴中の細胞は、生分解性基材の上で接着するまで３７℃、湿度１００％、５容量％炭酸ガスの培養条件で約０．５〜５時間インキュベートすることで播種することができる。
【００２６】
上記自己増殖工程では、生分解性基材上の表面で表皮細胞が増殖し、重層化を行うための土台となる自己増殖層を形成することを目的としている。この自己増殖工程は公知の培養方法で行うことができ、培養条件として例えば室温約３７度、湿度約１００％、５容量％二酸化炭素雰囲気化で培養する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、培養する日数は、細胞がコンフルエントになる状態によって変化するが、一般的には、約８〜１２日間である。
【００２７】
上記自己増殖工程で使用する培養液（自己増殖培養液）は、例えば、ＭＣＤＢ１５３培養液に、自己増殖因子であるカルシウムをキレートしたＦＣＳ（約０．１〜１．０重量％）、ホスホエタノールアミン（約０．１〜１．０μＭ）、エタノールアミン（約０．１〜１．０μＭ）、アンホテリシンＢ（約０．１〜１．０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（約５〜２０μｇ／ｍｌ）、インスリン（約１〜１０μｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（約１〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（約５〜２０μｇ／ｍｌ）、ハイドロコルチゾン（約０．０５〜０．５μＭ／ｍｌ）および牛脳下垂体エキス（約２〜１５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加えたものが挙げられるが、これに限定されるものではない。以下この自己増殖工程において使用する培養液を自己増殖培養液と呼ぶ。
【００２８】
さらに、上記重層化工程において、表皮細胞が重層化および角質化することで本発明の培養表皮は製造される。重層化工程における表皮細胞の培養方法は、上記した培養液表面における培養であり、培養液の液面を０ｍｍとしたとき、生分解性基材の上面が培養液の深さ約０〜７ｍｍまでの位置であることを意味する。培養する日数は、表皮細胞が角質化したことが確認できればよく、一般的には７〜１４日で培養は終了する。
【００２９】
上記重層化工程で使用する培養液（重層化培養液）は、例えば、自己増殖培培養液にＤＭＥＭ＋１０重量％ＦＣＳ培養液を２０重量％になるようにさらに添加したものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
次に表皮細胞を播種した生分解性基材の面を上に向けた状態で、培養液の液面付近で培養する。具体的には、培養液中における生分解性基材の位置が培養液の液面を０ｍｍとしたとき、７ｍｍ以下、好ましくは３ｍｍ以下で培養する。この液面からの位置は、培養液の量で適時調整すればよい。また、生分解性基材が培養液面から８ｍｍ以下になる場合は、培養皿を土台として用いるなどして液面高さを調節して培養すればよい。
【００３１】
さらに本発明は、上記培養表皮の製造方法を応用して製造された培養皮膚を含んでなる。具体的には、生分解性基材の片面に繊維芽細胞を播種し、培養することで形成した真皮層を形成した真皮層坦持生分解性基材を作成し、次いで該真皮層坦持生分解性基材の真皮層側の面に表皮細胞を播種し、培養することで自己増殖層を形成した後、該自己増殖層を上に向けた状態で、培養液の液面付近で培養することにより得られる。
【００３２】
上記繊維芽細胞は、表皮細胞の調製の際に使用した皮膚片から表皮と真皮に分離する工程において得られた真皮を、ホモジナイザーなどを用いて砕き、約０．１〜１．０重量％のコラゲナーゼＤＭＥＭ溶液に加え、約２〜５時間、約３７℃にて振盪して結合組織を溶解させたうえで約４００×ｇ〜１０００×ｇ、好ましくは約５００×ｇ〜７００×ｇで遠心分離して採取する。もしくは、ホモジナイザーなどにより砕いた真皮組織細片を培養皿内に静置し、一面が培地で浸る程度に１０重量％ウシ脳下垂体含有ＤＭＥＭなどの培地を加え、約１週間後に真皮組織細片から生えだしてきた繊維芽細胞を、トリプシン濃度０．１〜０．５重量％に調製したハンクス溶液などを用いて剥離し、遠心分離・回収する方法によって繊維芽細胞を回収することもできる。得られた繊維芽細胞は１０重量％ウシ脳下垂体含有ＤＭＥＭなどの培地で、５％二酸化炭素雰囲気下、約３７℃にて培養し、得ることができる。さらに得られた繊維芽細胞は継代培養にて増殖させることができる。
【００３３】
上記真皮層の形成は、上記自己増殖工程に準じた方法で培養すればよく、特に限定されるものではない。それ以降の自己増殖層、重層化層および角質化層の形成は上記培養表皮の製造方法に準じて作成することにより、培養皮膚を製造することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に本発明を参考例および実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］
ブタ由来I型、III型混合コラーゲン粉末（日本ハム株式会社製、ＳＯＦＤタイプ、Ｌｏｔ Ｎｏ． ＰＳ０２０２０）を注射用蒸留水（大塚製薬社製）に溶解し、１ｗ／ｖ％に調製した。そして、この１ｗ／ｖ％コラーゲン溶液を容量２０ｍｌ用のポリスチレン製のバランスディッシュに５ｍｌ添加し、乾燥した。乾燥してできたシートをステンレスバッドに移し、バキュームドライオーブン（ＥＹＥＬＡ社製；ＶＯＳ３００ＶＤ型）と油回転真空ポンプ（ＵＬＶＡＣ社製；ＧＣＤ１３５−ＸＡ型）を用いて１２０℃、減圧下（１Ｔｏｒｒ以下）で２４時間熱脱水架橋反応を行った。その後、取り出したシートを３．７５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液中に約１時間浸漬し、次に１．８７５重量%炭酸水素ナトリウム水溶液中に約１時間浸漬することによって中和処理を施した後、注射用蒸留水に約１２時間浸漬し、炭酸水素ナトリウムを洗浄した。蒸留水で洗浄後、乾燥させて再度上記と同様の条件で２４時間熱脱水架橋を施して４ｃｍ×４ｃｍのコラーゲンシートを得た。
【００３６】
［実施例２］
細胞濃度が約２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ（約２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように調製された細胞懸濁液を、１００ｍｍの培養ｄｉｓｈの中央に置いた実施例１で作製した４ｃｍ×４ｃｍのコラーゲンシートの中央部に１００μｌの液滴を滴下した。滴下した細胞懸濁液滴が零れないように気をつけながら、５％ＣＯ２インキュベータ内に３７℃にて３時間放置し、培養基材に播種した表皮細胞を接着した。３時間後、ある程度培養基材に表皮細胞が接着したことを確認した後、自己増殖用培養液を生分解性基材に接着させた細胞群が浸漬するように約１０〜１５ｍｌ添加した。培養は３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて１日置きに培養液交換を行いながら約８日〜１２日後、表皮細胞の増殖を確認した。自己増殖培養液は、ＭＣＤＢ１５３培養液に、自己増殖因子であるカルシウムをキレートしたＦＣＳ（約０．５重量％）、ホスホエタノールアミン（約０．５μＭ）、エタノールアミン（約０．５μＭ）、アンホテリシンＢ（約０．５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（約１０μｇ／ｍｌ）、インスリン（約５μｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（約５ｎｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（約１０μｇ／ｍｌ）、ハイドロコルチゾン（約０．２μＭ／ｍｌ）、および牛脳下垂体エキス（約６．２５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加えたものを用いた。次に、重層化培養液１０ｍｌに変更して培養を行った。この時も培養基材は培養液中に浮遊するように３７℃で、５％ＣＯ２インキュベータ内で約１０日〜１２日間培養した。このとき、培養液中でのコラーゲンシートの位置が、液面からの深さが約０〜７ｍｍになっていることを確認した。重層化培養液は、上記自己増殖培培養液にＤＭＥＭ＋１０重量％ＦＣＳ培養液を２０重量％になるように添加したものを用いた。以上に工程により培養表皮を作成した。
【００３７】
［実施例３］
表皮細胞と繊維芽細胞を用いて、表皮と真皮を併せ持つ培養皮膚を作製した。まず、表皮細胞及び繊維芽細胞を、ＭＣＤＢ１５３培養液にそれぞれ細胞濃度約２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌの細胞懸濁液を作製し、１００ｍｍの培養皿に参考例１で作製したコラーゲンシートを設置し、その中央部に繊維芽細胞懸濁液１００μｌの液滴を滴下した。次に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて約３時間放置して細胞がコラーゲンシートに接着することを確認した後、コラーゲンシートを反転させて培養皿の中央部に設置し、真皮層の乾燥を防いだ。一方、表面になったコラーゲンシートの中央部に用意した細胞濃度２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌの表皮細胞懸濁液１００μｌの液滴にて滴下し、この状態で３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて約３時間放置し、コラーゲンシートに表皮細胞が接着することを確認した。接着を確認した後、自己増殖用培養液１０ｍｌを培養皿に添加し、コラーゲンシート全体が培地内に浸漬するようにした後、培養は３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて１日置きに培養液交換を行いながら約８日〜１２日後、表皮細胞の増殖を確認した。次に、重層化培養液１０ｍｌに変更し、培養液中でのコラーゲンシートの位置が、液面からの深さが約０〜７ｍｍになっていることを確認した。培養液を１日置きに交換しながら、約８〜１０日間培養した。自己増殖培養液および重層化培養液は、実施例２と同様のものを用いた。こうして作製した培養皮膚は、コラーゲンシートの片面に繊維芽細胞による真皮層及びもう一方の片面に十分な角質層を有し、十分な表皮層を有す培養皮膚を得た。
【００３８】
［試験例］
実施例２で得られた培養表皮を、皮膚全層を欠損させたヌードマウス背に移植した。この時、培養表皮の４辺を各１辺につき７−０バイクリルで５針縫合したが、培養表皮は破れることなく縫合することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の培養表皮は、厚く重層化され、かつ角質化されたものであり、培養表皮の生着性が向上するとともに、生着後の感染に対する抵抗力も十分あることが期待できる。また、同じ基材を用いて移植面積の収縮を抑え、かつ安価で調製が簡単な培養表皮および培養皮膚の作製を可能にする。つまり、患部の面積、深さ等の状態や合併症の有無など患者の症状によって適宜使い分けることが可能である。