(57)【要約】【課題】  ウイルス感染症、特に、フィロウイルスに代表されるムチン型糖タンパク質を有するウイルスによる感染症の予防および／または治療方法、並びにそのための医薬組成物を提供することを目的とする。【解決手段】  ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染症の予防および／または治療方法であって、該方法は、そのような処置の必要な患者において、マクロファージ上のマクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ＭＧＬ）とウイルス粒子上のムチン型糖鎖との相互作用を阻害することを含む、前記方法および当該方法のために有用な医薬品組成物が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染症の予防および／または治療方法であって、該方法は、そのような処置の必要な患者において、マクロファージ上のマクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ＭＧＬ）とウイルス粒子上のムチン型糖鎖との相互作用を阻害することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記相互作用の阻害が、そのような処置の必要な患者に対して、有効量のＭＧＬに対する特異的結合パートナーまたは可溶化ＭＧＬタンパク質を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特異的結合パートナーが、抗ＭＧＬ抗体または当該抗体の反応性フラグメントである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記可溶化ＭＧＬタンパク質が、ｈＭＧＬの細胞外ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
更に、ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮとウイルス粒子上のＮ結合型糖鎖との間の相互作用を阻害する請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスがフィロウイルス科のウイルスである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フィロウイルス科のウイルスがエボラウイルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染症の予防および／または治療のための医薬品組成物であって、該組成物は、治療有効量のマクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ＭＧＬ）に対する特異的結合パートナーまたは可溶化ＭＧＬタンパク質を含むことを特徴とする、前記医薬品組成物。
【請求項９】
前記特異的結合パートナーが、抗ＭＧＬ抗体または当該抗体の反応性フラグメントである請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
前記可溶化ＭＧＬタンパク質が、ｈＭＧＬの細胞外ドメインを含む、請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
更に、ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮに対する特異的結合パートナー或いは可溶化ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮタンパク質を含む、請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮに対する特異的結合パートナーが、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または当該抗体の反応性フラグメントであり、Ｌ−ＳＩＧＮに対する特異的結合パートナーが、抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体または当該抗体の反応性フラグメントである、請求項１１に記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
前記可溶化ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮタンパク質が、それらのタンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項１１に記載の医薬品組成物。
【請求項１４】
前記ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスがフィロウイルス科のウイルスである、請求項８乃至１３のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項１５】
前記フィロウイルス科のウイルスがエボラウイルスである、請求項１４に記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィロウイルス感染症に代表されるウイルス感染症の治療方法および当該治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィロウイルス
霊長類に対するフィロウイルス感染症は、他の出血熱ウイルスによるものと比べても、極めて重篤な出血兆候と高い死亡率を示す。該感染症を引き起こすフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスにおいては、マールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）とエボラ（Ｅｂｏｌａ）の２つの属が知られており、更に後者は４つの種、すなわち、ザイール（Ｚａｉｒｅ）、スーダン（Ｓｕｄａｎ）、アイボリー・コースト（Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ）およびレストン（Ｒｅｓｔｏｎ）を含む。４種のうちでは、ザイール種が最も強毒性と考えられており、感染者の約９０％が死亡したことも報告されている（１９７６年のザイール（現コンゴ）とスーダンの流行では、発病した５００名中４３０名が死亡）。該ウイルスによる感染症の経過について、感染後の潜伏期は４〜１６日であり、発病後直ちに、頭痛や背腰痛が始まる。発病後２日目前後には高熱、眼球結膜炎、咽頭炎、咳を伴う胸痛などが生じ、ついで、嘔吐や下痢の症状にたり、時に血便〜タール便となることもある。患者は急速に脱水状態に陥り、５乃至７日目から歯肉、鼻、膣、皮下等からの出血、吐血、下血等の出血傾向がみられるほか、かゆみのない斑丘疹性の発疹が全身性に現れる。患者の約半数は発病後４乃至１０日目に強い中毒症状と播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を呈して死亡するが、もちこたえれば３週目以後、回復する。
【０００３】
このような背景から、エボラウイルス感染症、すなわち、エボラ出血熱は、厳重な隔離治療を要する国際伝染病とされている。なお、レストン種は、非ヒト霊長類の実験において、エボラのほかの種に比べて病原性が弱いことが報告されており、実際に、ヒトにおける症候性の感染は確認されていない。
【０００４】
分子生物学的に、フィロウイルスは、エンベロープを有する非分節性１本鎖（−）極性のＲＮＡウイルスであり、少なくとも７種の構造タンパク質を含む。それら全てのタンパク質は、モノシストロン性ポリアデニル化ｍＲＮＡ転写体から翻訳される。フィロウイルスゲノムの３’末端から４番目の遺伝子は、エンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）をコードしており、ウイルスの宿主細胞膜に対する受容体結合および融合に関与していると考えられている（非特許文献１および２）。当該遺伝子からは、エンベロープＧＰと非構造性の分泌型糖タンパク質が発現される（非特許文献３および４）。これらの糖タンパク質は、高度にグリコシル化されており、Ｎ−結合型糖鎖およびＯ結合型糖鎖（ムチン型糖鎖）を有するが、該糖鎖においては、ウイルス種および該ウイルスの増殖に用いた細胞株の相違に依存して、末端シリル化のパターンが異なる（非特許文献５）。
【０００５】
前記フィロウイルスの感染に関する近年の研究は、樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３接着性ノンイテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）または肝臓／リンパ節特異的ＩＣＡＭ−３接着性ノンイテグリン（Ｌ−ＳＩＧＮ）が、該ウイルスの感染において重要な役割を担っていることを明らかにした。すなわち、非特許文献６乃至９は、ＤＣ−或いはＬ−ＳＩＧＮが細胞表面に過剰発現された場合に、それらの分子が、高度にグリコシル化されたエボラＧＰを認識し、更に該ウイルスの偽タイプおよび真性ウイルスによる感染を促進することを示した。とりわけ、ウイルスのＧＰに結合した高マンノース型Ｎ−グルカンが、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮのようなレクチンとの相互作用において重要であると考えられている（非特許文献１０）。
【０００６】
ＭＧＬ
マクロファージおよびミエロイド由来の関連細胞群は、ガレクチン−３（ｇａｌｅｃｔｉｎ−３）、シアロアドヘシン（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）、マンノース受容体等の細胞表面または可溶性糖タンパク質を認識する多様なレクチン類を発現していることが知られている。マクロファージ上のこれらのレクチンは、細胞間接着、造血新生、エンドサイトーシス、および壊死した細胞や分子の清掃に関与している。マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ＭＧＬ）は（非特許文献１１）、上記のレクチンの１種であり、マクロファージおよび未成熟樹状細胞上に発現する２型膜貫通型タンパク質である。本発明者等は、先に、マウスにおいて該レクチンをクローニングしており（非特許文献１２および１３)、更にその遺伝子産物（スプライシングバリアントを含む）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ガラクトース末端性糖タンパク質のエンドサイトーシスに関与していることを報告している（非特許文献１４および１５）。
【０００７】
また、ヒトＭＧＬ（ｈＭＧＬ）も同定されており、やはりこのレクチンも、Ｏ結合型のガラクトース／Ｎ−アセチルガラクトサミンを有する糖鎖（すなわち、ムチン型糖鎖）を特に強く認識する。ヒトにおいて、このタンパク質は、単球由来の未成熟樹状細胞およびマクロファージ上で発現し、ガラクトシル化された糖タンパク質抗原のエンドサイトーシス受容体として機能することが報告されている（非特許文献１２および１６）。
【０００８】
上記ｈＭＧＬは、これまでのところ、マクロファージ上でのガラクトース／Ｎ−アセチルガラクトサミンに特異的な唯一のＣ型レクチンであり、前記ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮとは異なるリガンド特異性を示すことが確認されている（非特許文献１２）。
【０００９】
しかしながら、ＭＧＬとウイルス糖タンパク質との相互作用に関する直接的な知見は存在しなかった。特に、上記ＤＣ−ＳＩＧＮやＬ−ＳＩＧＮのフィロウイルス感染過程における関与、およびそれらの間での異なるリガンド特異性についての報告を考慮すれば、その他のレクチン分子、とりわけ、ＭＧＬ分子がウイルスの感染過程に関与するとの示唆は存在しなかった。
【非特許文献１】Takada, A., C. Robison, H. Goto, A. Sanchez, K. G. Murti, M. A. Whitt, and Y. Kawaoka, "A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 94, pp. 14764-14769 (1997)
【非特許文献２】Wool-Lewis, R. J. and P. Bates, "Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.", J. Virol., vol. 72, pp. 3155-3160 (1998)
【非特許文献３】Sanchez, A., S. G. Trappier, B. W. Mahy, C. J. Peters, and S. T. Nichol, "The virion glycoproteins of Ebola viruses are encoded in two reading frames and are expressed through transcriptional editing.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 93, pp. 3602-3607 (1996)
【非特許文献４】Volchkov, V. E., S. Becker, V. A. Volchkova, V. A. Ternovoj, A. N. Kotov, S. V. Netesov, and H.-D. Klenk, "GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases.", Virology, vol. 214, pp. 421-430 (1995)
【非特許文献５】Feldmann, H. and M. P. Kiley, "Classification, structure, and replication of filoviruses.", Curr. Top. Microbiol. Immunol., vol. 235, pp. 1-22 (1999)
【非特許文献６】Alvarez, C.P., F. Lasala, J. Carrillo, O. Muniz, A. L. Corbi, and R. Delgado, "C-type lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis and in trans.", J. Virol., vol. 76, pp. 6841-6844 (2002)
【非特許文献７】Baribaud, F., S. Pohlmann, and R. W. Doms, "The role of DC-SIGN and DC-SIGNR in HIV and SIV attachment, infection, and transmission.", Virology, vol. 286, pp. 1-6 (2001)
【非特許文献８】Baribaud, F., S. Pohlmann, G. Leslie, F. Mortari, and R. W. Doms, "Quantitative expression and virus transmission analysis of DC-SIGN on monocyte-derived dendritic cells.", J. Virol., vol. 76, pp. 9135-9142 (2002)
【非特許文献９】Simmons, G., J. D. Reeves, C. C. Grogan, L. H. Vandenberghe, F. Baribaud, J. C. Whitbeck, E. Burke, M. J. Buchmeier, E. J. Soilleux, L. J. Riley, R. W. Doms, P. Bates, and S. Pohlmann, "DC-SIGN and DC-SIGNR bind ebola gycoproteins and enhance infection of macrophages and endothelial Cells.", Virology, vol. 305, pp. 115-123 (2003)
【非特許文献１０】Lin, G., G. Simmons, S. Pohlmann, F. Baribaud, H. Ni, G. J. Leslie, B. S. Haggarty, P. Bates, D. Weissman, J. A. Hoxie, and R. W. Doms, "Differential N-linked glycosylation of Human Immunodeficiency Virus and Ebola Virus envelope glycoproteins modulates interactions with DC-SIGN and DC-SIGNR.", J. Virol., vol. 77, pp. 1337-1346 (2003)
【非特許文献１１】Oda S., Sato M., Toyoshima S. and Osawa T., "Purification and characterization of a lectin-like molecule specific for galactose/N-acetylgalactosamine from tumoricidal macrophages.", J. Biochem. (Tokyo), vol. 104, pp. 600-605 (1988)
【非特許文献１２】Suzuki N, Yamamoto K, Osawa T, Irimura T., "Molecular cloning and expression of cDNA encoding human macrophage C-type lectin : its unique carbohydrate specificity for Tn antigen.", J. of Immunology, vol. 156: pp. 128-135 (1996)
【非特許文献１３】Tsuiji M., Fujimori M., Ohashi Y., Higashi N., Onami T.M., Hedrick, S.M., Irimura T., "Molecular cloning and characterization of a novel mouse macrophage C-type lectin, mMGL2, which has a distinct carbohydrate specificity from mMGL1.", J. Biol. Chem., vol. 277, pp. 28892-28901 (2002)
【非特許文献１４】Denda-Nagai, K., Kubota N., Tsuiji M., Kamata M. and Irimura T., "Macrophage C-type lectin on bone marrow-derived immature dendritic cells is involved in the initialization of glycosilated antigens.", Glycobiology, vol. 12, pp. 443-450 (2002)
【非特許文献１５】Higashi, N., Morikawa A., Fujioka K., Fujita Y., Sano Y., Miyata-Takeuchi M., Suzuki N. and Irimura T., "Human macrophage lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is a marker for cells at an intermediate stage in their differentiation from monocytes into macrophages.", Int. Immunol., vol. 14, pp. 545-554 (2002)
【非特許文献１６】Higashi, N., K. Fujioka, K. Denda-Nagai, S. Hashimoto, S. Nagai, T. Sato, Y. Fujita, A. Morikawa, M. Tsuiji, M. Miyata-Takeuchi, Y. Sano, N. Suzuki, K. Yamamoto, K. Matsushima, and T. Irimura, "The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.", J. Boil. Chem., vol. 277, pp. 20686-20693. (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ウイルス感染症、特に、フィロウイルスに代表されるムチン型糖タンパク質を有するウイルスによる感染症の予防および／または治療方法、並びにそのための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮに加えて、ＭＧＬのウイルス感染過程への関与が明らかとなった。更には、当該感染が、ウイルス粒子上の特定の糖鎖と、当該糖鎖に対して特異的な細胞表面レクチン分子との相互作用を阻害することにより、顕著に抑制されうることが明らかとなった。
【００１２】
従って、本発明の第１の側面は、ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染症の予防および／または治療方法であって、該方法は、そのような処置の必要な患者において、マクロファージ上のマクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ＭＧＬ）とウイルス粒子上のムチン型糖鎖との相互作用を阻害することを含む、前記方法を提供する。
【００１３】
該方法は、好ましくは、そのような処置の必要な患者に対して、有効量のＭＧＬに対する特異的結合パートナー、例えば、抗ＭＧＬ抗体または当該抗体の反応性フラグメントを投与することを含む。或いは、該方法は、そのような処置の必要な患者に対して、有効量の可溶化ＭＧＬタンパク質、例えば、ｈＭＧＬの細胞外ドメインを含んでなるタンパク質を投与することを含み得る。
【００１４】
また、フィロウイルスにおいては、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの当該ウイルス感染における関与も明らかにされており、従って、本発明においては、ＭＧＬと同時にＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮと該ウイルス上の糖鎖の相互作用を阻害することも好ましい。そのような相互作用の阻害に好適な手段としては、そのような処置の必要な患者に対して、有効量のＭＧＬに対する特異的結合パートナーまたは可溶化ＭＧＬタンパク質を投与するのと同時に、或いは順次に、ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮに対する特異的結合パートナー或いは可溶化ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮタンパク質を投与することが例示できる。
【００１５】
本発明の方法が好適な適用対象であるムチン型糖鎖を有するウイルスとしては、フィロウイルス、すなわち、エボラおよびマールブルグウイルスが例示され、これらのウイルス感染症において、本発明の方法は特に有効である。
【００１６】
本発明のもう１つの側面は、前記ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染症の予防および／または治療用の医薬組成物を提供する。好ましくは、該医薬組成物は、マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ＭＧＬ）に対する特異的結合パートナーの治療有効量を、薬学的に許容できる単体とともに含むものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、ＭＧＬと、ウイルス粒子上のムチン型糖鎖、典型的には、エンベロープＧＰ上のムチン型糖鎖との相互作用を阻害することにより、該ウイルスによる感染を制御することを特徴とする。
【００１８】
ここで、ムチン型糖鎖（或いはＯ結合型糖鎖とも称される）とは、一般的に、そのＮ−アセチルガラクトサミンがセリンやトレオニンのヒドロキシル基にＯ−グリコシド結合している糖鎖を指す。ウイルス粒子に存在するタンパク質は、そのような糖鎖により修飾され得ることが広く知られており、従って、本発明で用いる「ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルス」の用語には、エンベロープＧＰに代表されるウイルス粒子の糖タンパク質が、前記ムチン型の糖鎖により修飾されているウイルスを包含し得る。当該ウイルスとしては、フィロウイルス科のウイルス、すなわちエボラウイルスおよびマールブルグウイルスが例示できるが、これに限定されない。
【００１９】
すなわち、本発明は、前記「ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルス」の感染成立過程におけるＭＧＬの重大な関与を解明したことを基礎に、当該レクチンの機能を阻止することで、人を含む哺乳動物における当該ウイルス感染症の治療や予防を可能にする。また、本発明では、そのようなＭＧＬの機能を阻止する際において、当該ＭＧＬに対する特異的結合パートナー、例えば抗ＭＧＬ抗体の使用が効果的であることが実証された。
【００２０】
本発明において好適に使用しうる上記抗ＭＧＬ抗体は、ＭＧＬ全体あるいはその部分ペプチドを抗原として、当業者に公知のいかなる方法によって調製してもよく、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（IgG，IgA，IgM，IgD，IgE）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。典型的には、本発明の抗体をポリクローナル抗体の形態で得る場合、当該ポリクローナル抗体は、ＭＧＬ若しくはその部分配列（合成ペプチド等）を免疫原として用いて免疫した動物の抗血清より調製する。具体的に、当該免疫動物からの抗血清は、例えば、アジュバントを含む前記免疫原を免疫動物に皮下注射し、当該皮下投与を適当な間隔（例えば１週間）で所定の回数（例えば５回）繰り返し、最終免疫後に全血を採集して、これを分離することで得ることができる。そのような方法は、例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、第２.４章（発行元：John Wiley & Sons, Inc., New York)等に記載されている。ついで、前記抗血清からのポリクローナル抗体の精製は、動物の免疫に用いたＭＧＬまたはその部分ペプチドをクロマトグラフィー用の樹脂、例えば、ＣＮＢｒ活性化セファロースやＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ともにAmersham Pharmacia社製）に共有結合で固相化し、該固相化樹脂に上記抗血清を供して当該抗血清中の抗体を特異的に樹脂上に吸着させ、ついで、該樹脂上に吸着した抗体を適切な緩衝液やカオトロピックイオン等を用いて溶出させて回収することでも達成できるが、これに限定されない。
【００２１】
また、本発明の抗体をモノクローナル抗体として得る場合は、当業者に既知の手法を用いて、ＭＧＬで免疫した実験動物、好ましくはマウス・ラット・ハムスターなどのげっ歯類動物の脾細胞とミエローマ細胞株等の細胞融合用のペアレントセルを融合させ、得られたハイブリドーマの中から好適なものを選択してクローン化し、次いで、その融合細胞を生体外または生体内で培養し、この培養混合物より特異性の高いモノクローナル抗体を採取する。
【００２２】
ｈＭＧＬのｃＤＮＡは、Suzuki N, Yamamoto K, Osawa T, Irimura T., "Molecular cloning and expression of cDNA encoding human macrophage C-type lectin : its unique carbohydrate specificity for Tn antigen.", J. of Immunology, vol. 156: pp. 128-135 (1996)においてクローニングされている。従って、免疫原としてのＭＧＬは、これらのｃＤＮＡに基づき、それ自体当業者に公知の方法により調製することもできる。
【００２３】
特に好ましい抗ｈＭＧＬ抗体は、引用することによりここに援用する、前記、Suzuki N, Yamamoto K, Osawa T, Irimura T., "Molecular cloning and expression of cDNA encoding human macrophage C-type lectin : its unique carbohydrate specificity for Tn antigen.", J. of Immunology, vol. 156: pp. 128-135 (1996)、或いはHigashi, N., Morikawa A., Fujioka K., Fujita Y., Sano Y., Miyata-Takeuchi M., Suzuki N. and Irimura T., "Human macrophage lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is a marker for cells at an intermediate stage in their differentiation from monocytes into macrophages.", Int. Immunol., vol.14, pp. 545-554 (2002)の記載に基づいて調製可能である。
【００２４】
また、本発明では、上記の抗体を酵素消化処理して得られるような当該抗体の反応性フラグメントを用いてもよい。当該抗体フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマー又はダイマー、Ｌ鎖モノマー又はダイマー、１個のＨ鎖および１個のＬ鎖からなるダイマー等が含まれる。該フラグメントは、例えばペプシンやパパイン等のプロテアーゼにより完全な抗体を消化するか、消化後、必要に応じて還元剤で処理することにより得ることができる。Ｈ鎖およびＬ鎖モノマーは、完全な抗体をジチオスレイトール等の還元剤で処理した後、精製した鎖状体を分離することにより得ることもできる。従って、本発明において、「特異的結合パートナー」の用語には、これら、抗体の反応性フラグメント、或いは該フラグメントと他のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。
【００２５】
本発明においては、上記のようなＭＧＬとムチン型糖鎖の相互作用を阻害するために、可溶化ＭＧＬタンパク質を投与することも好適な態様のひとつであると考えられる。該ＭＧＬの可溶化は、例えばインタクトなｈＭＧＬを適当な化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール側鎖の導入により達成することもでき、そのようなタンパク質の化学修飾自体は当業者にとって公知である。より好適には、組換え技術を用いてｈＭＧＬの細胞外ドメインを適切な宿主において発現させ、これを回収・精製して、本発明の可溶化ＭＧＬタンパク質として用いることができる。例えば、引用することによりここに援用する、Suzuki N, Yamamoto K, Osawa T, Irimura T., "Molecular cloning and expression of cDNA encoding human macrophage C-type lectin : its unique carbohydrate specificity for Tn antigen.", J. of Immunology, vol. 156: pp. 128-135 (1996)に記載の、ｈＭＧＬ推定細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡからの組換えｈＭＧＬは、当該目的に好適に使用し得る。加えて、上記細胞外ドメインと他のタンパク質との融合タンパク質も使用可能であろう。
【００２６】
また、本発明においては、ＭＧＬとムチン型糖タンパク質の相互作用の阻害と並行して、ＤＣ-ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮとそのリガンドの相互作用阻害を行うことがいっそう好ましい。ＤＣ−ＳＩＧＮ或いはＬ−ＳＩＧＮのそのような機能阻害の具体的な方法は、引用することによりここに援用する、国際公開公報ＷＯ  ００／６３２５１および国際公開公報ＷＯ  ０１／６４７５２に記載されている。これらの国際公開公報に記載の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体或いは可溶化ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、本発明において適用可能な特に好ましい例である。
【００２７】
本発明の抗体（その反応性の断片を含む）、或いは可溶化タンパク質を医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
【００２８】
本発明の抗体および可溶化タンパク質等は、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、また、必要に応じて、薬学的に許容され得る補助成分を添加し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくは坐薬等の固形製剤；又は例えばシロップ剤、エリキシル剤若しくは注射剤等の液体製剤としてもよく、これらは、製剤分野における通常の方法によって調製することができる。なお、液体製剤にあっては、用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁させる形であってもよい。又、特に、注射剤の場合、必要に応じて生理食塩水又はブドウ糖液に溶解又は縣濁させてもよく、更に緩衝剤や保存剤を添加してもよい。従って、薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等を含み、例えば、ゼラチン、乳糖、白糖、酸化チタン、澱粉、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、マイクロクリスタリンワックス、白色ワセリン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、植物油、ベンジルアルコール、アラビアガム、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、シクロデキストリン又はヒドロキシプロピルシクロデキストリン等が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
本発明の抗体および可溶化タンパク質等は、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、それらの治療有効量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよく、そのような投与のための組成物は、本発明の抗体等を全組成物の１〜１００重量％、好ましくは１０〜８０重量％の割合で含有することができる。
【００３０】
上記組成物となした抗体および可溶化タンパク質等の、投与量および投与回数は、患者の性別、年齢、体重、症状の程度および目的とする処置の種類と範囲等により異なるが、一般に経口投与の場合、成人１日あたり１〜５０ｍｇ／ｋｇを１〜数回に分けて、又、非経口投与の場合は、１〜１０ｍｇ／ｋｇを１〜数回に分けて投与するのが好ましい。
【００３１】
更に説明せずとも、これまでの説明を与えられた当業者は、本発明を充分に活用し得る。以下、説明のみの目的で実施例を与える。
【実施例１】
【００３２】
エボラウイルス上のムチン型糖鎖とMGLとの相互作用は、エボラウイルスの感染過程で重要な役割を果たす
I．方法
（１）ウイルス
エボラウイルス：ザイール（Ｚａｉｒｅ）種のＭａｙｉｎｇａ株を用いた。
【００３３】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）：血清型インディアナ（Ｉｎｄｉａｎａ）を用いた。
【００３４】
ＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰ：水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を欠き、更にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現するように改変したウイルス株（ＶＳＶΔＧ＊）に対し、エボラウイルス（Ｚａｉｒｅ株）のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）を導入した（Takada, A., C. Robison, H. Goto, A. Sanchez, K. G. Murti, M. A. Whitt, and Y. Kawaoka, "A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 94, pp. 14764-14769 (1997)参照）。
【００３５】
ＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰΔｍｕｃ：上記ＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰにおいて、インタクトなＺａｉｒｅ株エンベロープ糖タンパク質（ＺａｉｒｅＧＰ）の代わりに、ムチン様ドメイン（アミノ酸３１１−４６６）を欠失したエボラウイルスＧＰ（ＺａｉｒｅＧＰΔｍｕｃ）を導入した偽ウイルスを作製した（Simmons, G., R. J. Wool-Lewis, F. Baribaud, R. C. Netter, and P. Bate, "Ebola virus glycoproteins induce global surface protein down-modulation and loss of cell adherence.", J. Virol., vol. 76, pp. 2518-2528 (2002)参照）。
【００３６】
ＶＳＶΔＧ＊−ＶＳＶＧ：対照として、上記ＶＳＶΔＧ＊に、ＶＳＶ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎを導入した株であるＶＳＶΔＧ＊−ＶＳＶＧを用いた（上記、Takada（1997）参照）。
【００３７】
各ウイルスは、各々、ベロ（Ｖｅｒｏ）Ｅ6細胞内で増殖させ、使用時まで−８０℃で保存した。
【００３８】
（２）細胞
サル腎臓ベロＥ６細胞およびヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）は、１０％子牛胎児血清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地内で、夫々、培養した。
【００３９】
エボラウイルスを含む全ての被感染物質は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈにおいて、バイオセイフティーレベル４の施設内で取り扱った。
【００４０】
（３）ヒトＭＧＬの発現
ヒトＭＧＬ遺伝子として、ｈＭＧＬ６Ａのコード配列（Suzuki N, Yamamoto K, Osawa T, Irimura T., "Molecular cloning and expression of cDNA encoding human macrophage C-type lectin : its unique carbohydrate specificity for Tn antigen.", J. of Immunology, vol. 156: pp. 128-135 (1996)およびHigashi, N., K. Fujioka, K. Denda-Nagai, S. Hashimoto, S. Nagai, T. Sato, Y. Fujita, A. Morikawa, M. Tsuiji, M. Miyata-Takeuchi, Y. Sano, N. Suzuki, K. Yamamoto, K. Matsushima, and T. Irimura, "The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.", J. Boil. Chem., vol. 277, pp. 20686-20693. (2002)）を、哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン製）に、センス方向（ＣＲ４）およびアンチセンス方向（ＣＲ７：コントロール）で挿入した。エレクトロポレーションにより、Ｋ５６２細胞を上記のプラスミドで形質転換し、形質転換体をＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８硫酸塩、ＧＩＢＣＯ製）で選択した。更に、ｈＭＧＬ６Ａ＋細胞は、Higashi, N., Morikawa A., Fujioka K., Fujita Y., Sano Y., Miyata-Takeuchi M., Suzuki N. and Irimura T., "Human macrophage lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is a marker for cells at an intermediate stage in their differentiation from monocytes into macrophages.", Int. Immunol., vol. 14, pp. 545-554 (2002)に記載の抗ヒトＭＧＬ抗体（ＭＬＤ−１）を用いて作製したイムノマグネティックビーズを利用して、富化した。形質転換体は、その後、限界希釈によりクローン化し、ＭＧＬ発現細胞クローンとしてＣＲ４−４またはＣＲ４−１０、およびコントロールとしてＣＲ７の各クローンを、続く感染実験に用いた。
【００４１】
（４）形質転換体に対するウイルス感染実験
偽タイプ・ウイルスを用いた実験では、Ｋ５６２形質転換体（コントロールであるＣＲ７クローンを含めて）の１０５細胞／クローンを、エボラウイルスＧＰを導入したＶＳＶ（偽タイプ・エボラウイルス：ＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰおよびＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰΔｍｕｃ）、或いはＶＳＶの偽タイプ・ウイルス（ＶＳＶΔＧ＊−ＶＳＶＧ；対照）で感染した。感染率は、ＦＡＣＳによりＧＦＰ陽性Ｋ５６２細胞数を測定し、ＣＲ７クローンに対する結果を１００として標準化することで評価した。
【００４２】
真性エボラウイルスおよびＶＳＶによるＫ５６２細胞に対する感染実験では、予めベロ細胞において該ウイルスのＴＣＩＤ５０を測定し、各Ｋ５６２形質転換体（１０７細胞／クローン）につきＴＣＩＤ５０（ベロ細胞に対する）が１０５の割合となるようにして細胞を感染した。その後、１〜３日目の細胞培養の上清を回収し、上清の単位容積あたりウイルスの感染価（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を、ベロ細胞におけるＴＣＩＤ５０として測定した。
【００４３】
ＩＩ．結果
ＩＩ−１）偽タイプ・エボラウイルス感染実験
該感染実験の結果を図１に示す。ムチン様ドメインを保持するＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰ偽タイプ・エボラウイルス（以下、「ＺａｉｒｅＧＰ」と略す。）は、コントロールのＣＲ７と比較して、ｈＭＧＬを発現する形質転換体であるＣＲ４−４およびＣＲ４−１０クローンにおいて極めて高い感染率を示すことが明らかとなった。また、ＶＳＶの偽タイプ・ウイルスであるＶＳＶΔＧ＊−ＶＳＶＧ（以下、「ＶＳＶＧ」略す。）の感染実験結果から、ＶＳＶＧのｈＭＧＬ形質転換体ＣＲ４−４およびＣＲ４−１０に対する感染率は、コントロールのＣＲ７クローンに対するものと同等であったことから、ＭＧＬ発現細胞におけるウイルス感染の増加は、エボラウイルスに特異的であると結論された。
【００４４】
また、エボラウイルスＧＰからのムチン様ドメインの欠失により、ｈＭＧＬ発現細胞に対する該ウイルスの感染性は顕著に減少することも示された。すなわち、ムチン様ドメインを欠く偽タイプのＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰΔｍｕｃ（以下。「ＺａｉｒｅＧＰΔｍｕｃ」と略す。）では、ＣＲ７に対するｈＭＧＬ発現細胞での感染率上昇が極僅かに認められたのみであり、ＣＲ４系列クローンにおいては、ＺａｉｒｅＧＰで認められた顕著な感染率上昇は示されなかった。
【００４５】
上記の結果は、エボラを含むフィロウイルス感染における、ＤＣ−ＳＩＧＮやＬ−ＳＩＧＮの役割に関するこれまでの知見に加えて、これらとは特異性の異なるレクチンであるＭＧＬの、当該ウイルス感染に対する重大な関与を示し、特にウイルス上のムチン型糖鎖と細胞上のＭＧＬとの相互作用の果たす役割の重要性を実証した。
【００４６】
ＩＩ−２）真性エボラウイルスおよびＶＳＶでの感染実験
ウイルスによる細胞感染後、１、２および３日目における細胞培上清中のウイルス感染価（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を測定した結果を、図２に示す。Ｋ５６２細胞におけるｈＭＧＬ発現は、該細胞のＶＳＶに対する感染〜ウイルス粒子生産に影響を与えない。しかしながら、エボラウイルスにおいては、該ウイルス粒子のｈＭＧＬ発現細胞による生産が１００倍以上に達する。とりわけ、コントロールのＣＲ７では、本実験に用いた感染多重度において、上清中に感染性のエボラウイルス粒子の生産が認められなかった。この結果も、ｈＭＧＬのエボラウイルス感染に対する関与を明確に支持する。
【実施例２】
【００４７】
エボラウイルス上のムチン型糖鎖とMGLとの相互作用の阻害は、エボラウイルスの感染過程を制御し得る
I．方法
（１）ウイルス
実施例１の、ＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰおよびＶＳＶΔＧ＊−ＶＳＶＧ（対照）を用いた。
【００４８】
（２）細胞
実施例１に記載した。
【００４９】
（３）ヒトＭＧＬの発現
実施例１に記載した。
【００５０】
（４）抗体
ＭＬＤ−１：抗ヒトＭＧＬモノクロ−抗体であるＭＬＤ−１は、Higashi, N., Morikawa A., Fujioka K., Fujita Y., Sano Y., Miyata-Takeuchi M., Suzuki N. and Irimura T., "Human macrophage lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is a marker for cells at an intermediate stage in their differentiation from monocytes into macrophages.", Int. Immunol., vol. 14, pp. 545-554 (2002)の記載に基づき調製した。
【００５１】
（５）抗体によるウイルス感染阻害実験
各クローンの細胞（１０５細胞／クローン）を、上記ＭＬＤ−１（２００倍希釈腹水液として）または通常のマウス腹水液（対照）と共に３０分間インキュベートした。次いで、ＺａｉｒｅＧＰ或いはＶＳＶ  Ｇを、前記抗体の存在下で感染させた。感染率の評価方法は、偽タイプ・ウイルスについての実施例１に同じである。
【００５２】
ＩＩ．結果
結果を図３に示す。ＺａｉｒｅＧＰの感染において、抗ｈＭＧＬ抗体の投与は、該ウイルスの感染率を顕著に減少させる。ＶＳＶＧの結果から、この効果は、エボラウイルスに代表されるムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスにおいて極めて顕著であることがわかり、ＭＧＬ−ウイルス上ムチン型糖鎖間の相互作用の阻害が、該糖鎖を有するウイルスの感染予防および／または治療に有効であることを示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の一態様において、ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染症の予防および／または治療用の医薬組成物が提供される。好ましくは、該医薬組成物は、マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ＭＧＬ）に対する特異的結合パートナーまたは可溶化ＭＧＬタンパク質の治療有効量を、薬学的に許容できる単体とともに含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）をもとに作製したエボラウイルスの偽タイプ・ウイルスであるＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰ（ＺａｉｒｅＧＰ）と、該ウイルスのＧＰにおいてムチン様ドメインの欠失した、ＶＳＶΔＧ＊−ＺａｉｒｅＧＰΔｍｕｃ（ＺａｉｒｅＧＰΔｍｕｃ）および対照としてのＶＳＶΔＧ＊−ＶＳＶＧ（ＶＳＶ  Ｇ）をヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）のｈＭＧＬ発現形質転換体（ＣＲ４−４およびＣＲ４−１０）およびコントロール（ＣＲ７）に感染させた場合の感染率を、ＦＡＣＳにより測定した結果を示す。図は、感染細胞をＦＡＣＳにより計測し、バックグラウンドの感染率を各データから差し引いて表現している。また、コントロールであるＣＲ７の感染細胞数を１００として基準化し、相対感染率（％）を表している。実験は、３連で行い、代表的なデータを示している。
【図２】図２は、真性ＶＳＶ（対照）および真性エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ）によるｈＭＧＬ発現形質転換体（ＣＲ４−１０）およびコントロール（ＣＲ７）の感染率を、感染後、１、２および３日目に回収した培養上清（1ｍｌ）中のウイルス感染価（ＴＣＩＤ５０）として表す。実験は２連で行い、代表的なデータを示した。
【図３】図３は、ウイルス感染に対する抗ヒトＭＧＬ抗体の効果を示す。抗ヒトＭＧＬ抗体である抗ｈＭＧＬモノクルーナル抗体ＭＬＤ−１（ｈＭＧＬ  Ａｂ）の、偽タイプ・エボラウイルス（ＺａｉｒｅＧＰ）およびＶＳＶ（ＶＳＶ  Ｇ）感染に対する効果を、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）のｈＭＧＬ発現形質転換体（ＣＲ４−１０）およびコントロール（ＣＲ７）において比較している。対照の抗体（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｂ）は、通常のマウス腹水液として添加された。３連の実験において、代表的なデータを示した。コントロールであるＣＲ７の感染細胞数を１００として基準化し、相対感染率（％）を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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