(57)【要約】【課題】  分析成分が付着している疑いのある検体採取具に、それが存在するか否かを定性的又は定量的に分析する技術分野において、咽頭、鼻腔、外耳、子宮頚部、尿道内試料を採取し、そしてその中に含まれる分析成分を、検体採取具より簡便かつ効率的に回収する方法を提供する。【解決手段】  少なくとも一端が開放された中空構造を有する支持体の開放端に、液体吸収性を有する検体採取部材が取り付けられた微生物検体採取具を用いて、検体採取部材で検体を採取し、次いで、検体採取部材を抗原抽出液と接触させて検体から抗原を抽出し、この抗原抽出液を支持体の中空部を通過させて支持体の他端から回収することを特徴とする微生物抗原回収方法。【選択図】  図１。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一端が開放された中空構造を有する支持体の開放端に、液体吸収性を有する検体採取部材が取り付けられた微生物検体採取具を用いて、検体採取部材で検体を採取し、次いで、検体採取部材を抗原抽出液と接触させて検体から抗原を抽出し、この抗原抽出液を支持体の中空部を通過させて支持体の他端から回収することを特徴とする微生物抗原回収方法。
【請求項２】
多孔質体が、支持体の中空構造の内部と検体採取部材にわたって充填されていることを特徴とする請求項１記載の微生物抗原回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析成分が付着している疑いのある検体採取具に、それが存在するか否かを定性的又は定量的に分析するための感染症簡易診断用抗原抽出方法に関する。本発明は、医療診断、健康診断等に好適に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、咽頭内または鼻腔内に存在する微生物を検査するため、微生物の付着した綿棒を培地または抗原抽出用試薬に湿潤させ、抗原を過剰に希釈（希釈液）して抗原濃度を低下させ、希釈液の一部のみを検査に使用する方法が記載されている。
【０００３】
一般に、人の咽頭内または鼻腔内等に存在する微生物を検査、測定する場合は、綿棒等の採取器具を用いて前記部分の粘膜表皮を採取する。微生物が付着している綿棒は、通常、分析対象成分である抗原を取り出すために特定の抗原抽出液に浸し、綿球部分から微生物抗原を搾り出すように溶液中に取り出し、回収した後に分析される。
【０００４】
しかし、上記のような従来の微生物抗原の抽出法では、綿球表面に付着していると思われる微生物が綿球の内部に移動するため、綿球に残存する抗原を効率よく回収するのは困難であるという問題点があった。
【０００５】
【非特許文献１】感染症誌、７５（２００１）山崎ら、ｐ．１０４７−１０５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、咽頭、鼻腔、外耳、子宮頚部、尿道内等から試料を採取し、その中に含まれる分析成分を、微生物検体採取具から簡便、かつ、効率的に回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のとおりである。
（１）  少なくとも一端が開放された中空構造を有する支持体の開放端に、液体吸収性を有する検体採取部材が取り付けられた微生物検体採取具を用いて、検体採取部材で検体を採取し、次いで、検体採取部材を抗原抽出液と接触させて検体から抗原を抽出し、この抗原抽出液を支持体の中空部を通過させて支持体の他端から回収することを特徴とする微生物抗原回収方法。
（２）  多孔質体が、支持体の中空構造の内部と検体採取部材にわたって充填されていることを特徴とする（１）に記載の微生物抗原回収方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の抗原抽出回収方法によると、検体から微生物を抽出する際の抽出液量を最小限に設定でき、検査具への添加時の抗原濃度が高められる。さらに、通常、微生物検体採取具に残存してしまう抗原を全量、検査具へと使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、少なくとも一端が開放された中空構造を有する支持体の開放端に、液体吸収性を有する検体採取部材が取り付けられた微生物検体採取具を用いて、検体採取部材で検体を採取し、次いで、検体採取部材を抗原抽出液と接触させて検体から抗原を抽出し、この抗原抽出液を支持体の中空部を通過させて支持体の他端から回収することを特徴とする微生物抗原回収方法であり、一つの好ましい態様においては、多孔質体が、支持体の中空構造の内部と検体採取部材にわたって充填されている。
【００１０】
つまり、本発明は、液体吸収性を有する検体採取部材に付着した微生物抗原を、検体採取具の内部中空構造を通じて吸引、または毛細管現象により通過させて、後で述べるように、図１に示す検体採取具の試料取り出し口４のような採取具末端部位から、検体の抽出抗原を回収する新規な微生物抗原回収方法である。
微生物検体採取具の内部中空構造の中空部に充填されている多孔質体には、分析成分と特異的に結合する標識抗体を含む、種々の試薬が含浸されていてもよい。
【００１１】
近年、迅速、かつ、簡便に免疫学的検査が行える方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されている。免疫クロマトグラフ法は、検体採取具である綿棒で検体を採取し、抗原抽出液中に綿棒を浸漬した後、抗原抽出液中に分析対象成分である抗原を取り出し、免疫クロマトグラフ法を利用した検査具により検査が行われる。免疫クロマトグラフ法は公知の通り、抽出液中に得られた分析対象成分が、検査具に配置されているニトロセルロース膜、ガラス繊維等の展開部を速やかに下流側へと移動する。
【００１２】
本発明においても、分析対象成分は、上流側である液体吸収性を有する検体採取部材から、下流側である試料取り出し口に毛細管現象または吸引により移動する。
感染症迅速診断技術分野において、検体採取具である綿棒から分析対象成分である抗原を抗原抽出液で抽出する場合、検体は唾液、喀痰等の体液が付着している。該抗原抽出液を全量または一部を添加する検査具においては、体液の粘性による根詰まり等の液移動障害を発生する可能性があり、抗原抽出液をより過剰に用いる、または体液をトラップするためのフィルターを前処理として施す工夫がなされている。
【００１３】
本発明において、液体吸収性を有する検体採取部材としては、綿球、スポンジ状の多孔質体、液滴形状に成形した紙材料等が使用できる。綿球には、綿繊維等の天然繊維のほか、再生繊維、ポリエステル繊維等の化学繊維が使用される。綿球を用いた場合、綿球に用いられている繊維がフィルター効果を果たすため、採取された体液が綿球表面に留まる。そのため、抗原抽出液の使用量を低減できる。さらに、粘性の低い溶液を、試料取り出し口より採取することが可能となる。したがって、検体採取部材としては、綿球が好ましい。
検体採取部の形状は、一般に、液滴形状、円柱形状等である。検体採取部材は、人体の検体採取個所より検体を採取するため、その大きさは検体採取個所により異なる。したがって、人体より検体を採取できる大きさであればよい。
【００１４】
少なくとも一端が開放された中空構造を有する支持体としては、例えば、紙軸、プラスチック軸、木軸等が使用できる。支持体は、人体の検体採取個所により、長さ、太さ等が異なる。したがって、人体より検体を採取できる大きさであればよい。支持体は、人体より検体を採取するため、人体を傷つけないために、剛直性材料よりも可塑性材料が好ましい。支持体の内部中空構造の表面は、ポリエチレングリコール等の一般的に用いられる親水化処理材をコーティング処理することにより、液流れをスムーズにし、毛細管現象を安定化させることができる。
【００１５】
支持体の中空構造の内部には、多孔質体を充填することが好ましい。多孔質体は、毛細管現象により接触した溶液を上流側より下流側へとスムーズに移動させるため、検体採取部材から中空部にわたって充填することが好ましい。多孔質体としては、例えば、プラスチックを焼結した多孔質体、スポンジのようなプラスチック製多孔質体、ガラス繊維、ニトロセルロース膜等が用いられる。多孔質体は、綿球よりも高吸水性にすることによって毛細管現象を円滑になるので好ましい。
【００１６】
本発明における回収方法は、１）内部中空構造内を毛細管現象により抗原抽出液を移動させ、試料取り出し口より回収する方法、２）内部中空構造内をポンプ等による吸引により抗原抽出液を移動させ、試料取り出し口より回収する方法、３）内部中空構造の中空内に充填した多孔質体中を毛細管現象により抗原抽出液を移動させ、試料取り出し口より回収する方法、４）内部中空構造の中空内に充填した多孔質体中をポンプ等の吸引により抗原抽出液を移動させ、試料取り出し口より回収する方法等が用いられる。
本方法により抽出された抗原溶液中の抗原濃度は一般的な免疫測定法により検出できる。
【００１７】
具体的に説明すると、通常の、いわゆる酵素免疫測定法(ELISA法)により測定可能であり、その標識酵素としてはHRP(Horse Radish Peroxidase)やALP(Alkaline  Phosphatase)等が使用できる。酵素反応用基質も、TMB（3,3,',5,5'-TetraMethylBenzidine）、NBT/BCIP（Nitro  Blue  Tetrazolium/ 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate）、OPD(o-PhenyleneDiamine)等の一般的に用いる試薬を適宜使用することができる。
【００１８】
次に、図面を参照しながら本発明を説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまで一例であって、本発明は、これらに限定されるものではない。
図１は、本発明に用いられる微生物検体採取具の一例の断面図である。両端が開放された中空部５を有する綿棒からなる支持体２の一方の開放端に、試料採取用綿球１が接続、固定されている。
【００１９】
図１に示す試料導入口３と試料採取用綿球１は連通されている。検体採取部材に綿球１をこすりつけて試料（検体）を綿球に付着させ、試料の付着した綿球を適量の抗原抽出液に浸漬して試料から抗原を抽出する。支持体の中空部の他端にある試料取り出し部４から吸引具で吸引することによって、綿球中に保持されている抽出された抗原を、綿球中に吸収されている液体と共に試料取り出し部４から回収する。
支持体２は、回収時間を短縮するために、１個所以上の切断可能部位を持つことができ、その上流側の接続部分から得られた溶液は、イムノクロマト等の適当な微生物診断用検出デバイスにより分析成分の検出に用いることができうる。
【００２０】
図２は、本発明に用いられる微生物検体採取具の他の例の断面図である。支持体２は切断部６により、図３に示すように支持体７と８に二分割することができる。綿棒２からなる一方の支持体７の中空部５にろ紙、ガラス繊維等の多孔質体１０が配置されている。多孔質体は、中空部の開放端からの突出部３が綿球１内に挿入され、他端は、切断部６を越えて、もう一方の支持体８の一部にまで挿入されている。もう一方の支持体８の内部は、充填物１１で、充填されている
【００２１】
試料採取用綿球１に付着した試料を抗原抽出液に浸漬し、抽出された抗原は、抗原中質液と共に多孔質体に吸収され、毛細管現象または吸引により多孔質体内を左から右方に移動する。支持体２を支持体７と支持体８に分割し、支持体７から突出した多孔質体の試料取り出し部９から抽出された抗原を抗原中質液と共に回収する。
図４は、試料導入口１２および１３が、さらに支持体の先端付近の周面にも存在する例を示し、図５は、支持体を９０度回転させた断面図である。
【実施例】
【００２２】
本発明を実施例に基づいて説明する。
【００２３】
［実施例１］
図１に示す、長さ１５０ｍｍ、直径３ｍｍφ、1mmφの中空部を有するプラスチック製支持体２の先端に綿球を取り付けた微生物検体採取具を用いた。支持体２は、綿球を取り付ける前に、1%BSAを含むリン酸緩衝液（pH7.4）を中空部に注入し、1時間放置し、乾燥させた。試料採取用綿球１は20mgのレーヨン繊維で構成され、支持体２の先端より３ｍｍ突出し、液滴形状に設置した。
試料採取用綿球１に生理食塩水30μLを吸収させ、0.1%のTritonX-100を含むリン酸緩衝液（pH7.4）1ｍｌ中に浸漬させ吸引したところ、試料導入口３を経て試料取りだし口９に到達した溶液を採取することができた。
【００２４】
［実施例２］
（分析対象成分の準備）
実施例１の微生物検体採取具を用いて、ハエモフィルス  インフルエンザエ（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション、米国バージニア）１Ｅ７CFU/mlを含むリン酸緩衝液30μlを綿球部分に付着させた。この綿球部を0.1%のTritonX-100を含むリン酸緩衝液0.2ml中に浸漬し、試料取り出し口９より抽出抗原液を吸引回収し、分析溶液Ａとした。
【００２５】
比較対照として、ハエモフィルス  インフルエンザエ１E７CFU/mlを含むリン酸緩衝液30μlを綿球部分に付着させた綿棒を、0.2mlの0.1%のTritonX-100を含むリン酸緩衝液に５秒間浸漬させ、綿棒を取り出した溶液を分析溶液B、前記同様にハエモフィルス  インフルエンザエ１E７CFU/mlを含むリン酸緩衝液30μlを綿球部分に付着させた綿棒を、0.2mlの0.1%のTritonX-100を含むリン酸緩衝液に５秒間浸漬させ、該綿棒の綿球部分から溶液を搾り出すように取り出して回収した溶液を分析溶液Ｃとし、準備した。
【００２６】
（分析対象成分の測定）
ａ）免疫クロマトデバイスの調製
イ）試料添加部の調製
不織布（旭化成株式会社製、幅５mm×長さ３２ｍｍ×厚さ０．２ｍｍ）を1%BSA、1%Tween20を含むリン酸緩衝液（pH7）中に浸漬させ、乾燥させた。
【００２７】
ロ）標識抗体の調整
リン酸緩衝液溶液にて希釈して濃度調整した抗ハエモフィルス  インフルエンザエ  ポリクローナル抗体溶液（Biodesign社、ウサギ）を準備した。この抗体溶液を0.12μmラテックス粒子100mgと２時間室温で混合した。その後、遠心分離（7500g、４℃、1時間）し、標識抗体をペレットとして回収した。これのペレットを、1%BSAを含むリン酸緩衝液で2回洗浄した。得られた標識抗体を、1%BSAを含むリン酸緩衝液中に懸濁した。
【００２８】
ハ）抗体固定化部の調製
リン酸緩衝液にて希釈して濃度調整をした抗ハエモフィルス  インフルエンザエ  ポリクローナル抗体溶液を準備した。この抗体溶液を、ニトロセルロース膜（ミリポア社製、幅５mm×長さ３５ｍｍ×厚さ０．０２ｍｍ）上の所定の領域に塗布し、乾燥させた。
【００２９】
ニ）免疫クロマトデバイスの作製
上記試料添加部イ）と上記抗体固定化部ハ）と吸収剤（セルロース膜、ワットマン社製幅５mm×長さ２５ｍｍ×厚さ２．６５ｍｍ）を接着剤の塗布されたプラスチック基板上（シュレイシェルアンドシュエル社製、幅５mm×長さ７５ｍｍ×厚さｘｘｍｍ）に、所定の方法に従い設置した。具体的には、上記抗体固定化部ハ）をプラスチック基盤の短辺Aから３０ｍｍ離した位置をスタート地点として、プラスチック基盤に重ねるように設置し、次いで、上記試料添加部イ）をプラスチック基板の短辺Aの位置をスタート地点として、プラスチック基盤に重ねるように設置した。最後にプラスチック基盤の短辺Bをスタート地点として、吸収剤をプラスチック基盤に重ねるようにして設置した。
【００３０】
ｂ）免疫クロマトデバイスを用いた抗原検出
免疫クロマトデバイスの試料添加部に分析溶液Ａを100μl添加し２分間静置した。この後、1%の標識抗体を100μl添加し15分間静置した。次いで、分析溶液Ｂ、Ｃについても同様の操作を行った。
その結果を以下に示す。
上記免疫クロマトデバイスニ）では、抗原が存在した場合上記抗体固定化部ハ）の抗体と分析溶液中の抗原が抗原抗体反応で結合し、次いで、添加された標識抗体が抗体に捕捉された抗原と反応する。上記標識抗体は呈色しているため、捕捉された抗原と反応した標識抗体の抗体固定化部の色強度を抗原検出感度とした。
【００３１】
抗原検出感度
分析溶液Ａ        強陽性
分析溶液Ｂ          陰性
分析溶液Ｃ          陽性
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、分析成分が付着している疑いのある検体採取具に、それが存在するか否かを定性的又は定量的に分析するための感染症簡易診断用抗原抽出方法であり、医療診断、健康診断等に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に用いる微生物検体採取具の一例の断面図。
【図２】本発明に用いる微生物検体採取具の他の例の断面図。
【図３】図２の採取具を分割した断面図。
【図４】試料導入口を複数設置した検体採取部材付近の断面図。
【図５】図４の支持体を90度回転させた断面図。
【符号の説明】
【００３４】
１      綿球
２      支持体
４      試料取り出し部
５      支持体の中空部
９      多孔質体の試料取り出し部
１０      多孔質体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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