(57)【要約】【課題】  宿主タンパク質から容易に精製できるペプチドを製造するための方法および組成物を提供すること。【解決手段】  油体へと標的化されることができる融合ポリペプチドであって、（ａ）融合ポリペプチドの油体への標的化をもたらすのに十分な油体タンパク質の部分を含む第一のペプチドと、（ｂ）第二のペプチドであって、ただし天然油体タンパク質の一部分以外である第二のペプチド、とを含有する、融合ポリペプチド。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
油体へと標的化されることができる融合ポリペプチドであって、
（ａ）融合ポリペプチドの油体への標的化をもたらすのに十分な油体タンパク質の部分を含む第一のペプチドと、
（ｂ）第二のペプチドであって、ただし天然油体タンパク質の一部分以外である第二のペプチド、
とを含有する、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記第一のペプチドが、少なくとも油体タンパク質の疎水性部分を含むことを特徴とする、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）部分における油体タンパク質がオレオジンであることを特徴とする、請求項１または２記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
油体へと標的化されることができる融合ポリペプチドであって、
（ａ）融合ポリペプチドの油体への標的化をもたらすのに十分な油体タンパク質の部分を含み、かつ以下のアミノ酸配列：
【化１】
2005013236.tif 000010
（ここで、
aa25は、いかなるアミノ酸であってもよく；
aa26は、中性の脂肪族アミノ酸であり；
aa31は、３〜６個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa33は、３〜６個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa36は、３〜５個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa37は、中性の非置換アミノ酸であり；
aa39は、中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa41は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり；
aa44は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり；
aa46は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり；
aa47は、中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa51は、グリシン、ロイシン、アラニン、バリンまたはイソロイシンであり；
aa53は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはスレオニンであり；
aa59は、中性の非置換脂肪族または芳香族アミノ酸であり；
aa72は、スレオニン、アラニンまたはロイシンであり；
aa73は、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはスレオニンであり；
aa74は、アラニンまたはグリシンであり；
aa75は、ロイシンまたはスレオニンであり；
aa76は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または硫黄置換アミノ酸であり；
aa77は、イソロイシン、アラニンまたはバリンであり；
aa78は、中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa83は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり；
aa84は、グリシンであり；
aa85は、グリシンまたはアラニンであり；
aa86は、フェニルアラニンまたはロイシンであり；
aa89は、アラニン、スレオニンまたはグリシンであり；
aa90は、アラニンまたはグリシンであり；
aa92は、酸素置換を有する中性の脂肪族アミノ酸であり；
aa93は、バリンまたはセリンであり；
aa94は、フェニルアラニンまたはロイシンであり；
aa96は、中性の硫黄置換脂肪族アミノ酸または中性の芳香族複素環アミノ酸であり；
aa97は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または硫黄置換アミノ酸であり；
aa98は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換芳香族アミノ酸であり；
aa99は、いかなるアミノ酸であってもよく：
aa100は、酸素置換アミノ酸であり、脂肪族または芳香族であってよく；
aa101は、中性の非置換脂肪族または芳香族アミノ酸である）
を含む第一のペプチドであって、ただし以下の（ｉ）または（ｉｉ）：
（ｉ）次式を有するペプチド：
A-K-A-A-T-A-V-T-A-G-G-S-L-L-V-L-
S-S-L-T-L-V-G-T-V-I-A-L-T-V-A-T-P-L-L-V-
I-F-S-P-I-L-V-P-A-L-I-T-V-A-L-L-I-T-G-F-
L-S-S-G-G-F-G-I-A-A-I-T-V-F-S-W-I-Y-K ★-Y-
A
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列が保存的アミノ酸置換されており、かつ上記融合ポリペプチドの油体への標的化をもたらすことのできるペプチド
ではない第一のペプチドと、
（ｂ）第二のペプチドであって、ただし天然油体タンパク質の一部分以外である第二のペプチド、
とを含有する、融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記第二のペプチドが、インターロイキン−１−β：
Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｓ−Ｎ−Ｄ−Ｋ
のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記第二のペプチドが、免疫源を与える抗原性アミノ酸配列を有している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
融合ポリペプチドを暗号化し、かつ、
（ａ）融合ポリペプチドの油体への標的化をもたらすのに十分な油体タンパク質の部分を暗号化する第一のＤＮＡ配列と、
（ｂ）ペプチドを暗号化する第二のＤＮＡ配列であって、ただし天然油体タンパク質の一部分以外である、第二のＤＮＡ配列
とを含有する、キメラＤＮＡ構成体。
【請求項８】
前記第一のＤＮＡ配列が、少なくとも油体タンパク質の疎水性部分を暗号化することを特徴とする、請求項７記載のキメラＤＮＡ構成体。
【請求項９】
（ａ）部分における油体タンパク質がオレオジンであることを特徴とする、請求項７または８記載のキメラＤＮＡ構成体。
【請求項１０】
前記キメラＤＮＡ配列と操作可能に結合している少なくとも一種の調節配列を含有するベクターＤＮＡであって、宿主細胞中の前記キメラＤＮＡを複製させることができるベクターＤＮＡを更に有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載のキメラＤＮＡ構成体。
【請求項１１】
前記調節配列が、更に宿主細胞中の前記キメラＤＮＡを形質発現させることができる、請求項１０記載のキメラＤＮＡ構成体。
【請求項１２】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のキメラＤＮＡ構成体。
【請求項１３】
形質発現カセットであって、
成分として、転写の方向に、
−種子中で形質発現される遺伝子の転写開始調節ＤＮＡ配列；
−請求項７〜１２のいずれか１項に記載のキメラＤＮＡ構成体；および
−翻訳および転写停止領域
を有しており、ここで前記の成分が操作可能に結合しており、前記キメラＤＮＡ配列の形質発現は前記調節ＤＮＡ配列によって調節されている、形質発現カセット。
【請求項１４】
前記調節ＤＮＡ配列および前記第一のＤＮＡ配列のうち少なくとも一種が、
Arabidopsis thalianaのゲノムに由来する、請求項１３記載の形質発現カセット。
【請求項１５】
種子中で目的のペプチドを形質発現させる方法であって、
ゲノム組み込み条件下で形質発現カセットによって宿主双子葉植物細胞を形質転換させ、ここでこの形質発現カセットが、成分として、転写の方向に、
種子中でのＤＮＡ配列の形質発現をもたらすのに十分な、種子中で形質発現される遺伝子の領域５’から翻訳開始部位への部分を有する第一のＤＮＡ配列；
目的のペプチドの油体への標的化をもたらすのに十分な油体タンパク質の部分を暗号化する第二のＤＮＡ配列；及び
目的のペプチドを暗号化する第三のＤＮＡ配列であって、ただしこのペプチドが、天然油体タンパク質の一部分以外である第三のＤＮＡ配列；並びに
翻訳および転写停止領域
を含み、ここで前記の成分が操作可能に結合しており、前記第二のＤＮＡ配列の形質発現が、種子中での形質発現をもたらすように前記第一のＤＮＡ配列によって調節されている、種子中で目的のペプチドを形質発現させる方法。
【請求項１６】
前記調節および前記第一のＤＮＡ配列のうちの少なくとも一種が、Arabidopsis thalianaに由来する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
種子中で目的のペプチドを形質発現させる方法であって、
ゲノム組み込み条件下でＤＮＡ構成体によって宿主双子葉植物細胞を形質転換させ、ここでこのＤＮＡ構成体が、
目的のペプチドを暗号化する第一のＤＮＡ配列であって、ただしこのペプチドが、天然油体タンパク質の一部分以外である第一のＤＮＡ配列と、
油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子を有する第二のＤＮＡ配列であって、種子中での前記遺伝子の形質発現をもたらすのに十分な、前記ＯＢＰ遺伝子の調節領域５’から翻訳開始部位までの部分を有する第二のＤＮＡ配列
とを有しており、前記第一のＤＮＡ配列が、前記調節領域の制御の下で形質発現され、これによって前記ＤＮＡ構成体が前記双子葉植物細胞のゲノム中へと組み込まれ；
前記双子葉植物を成長させて種子を生じさせ、これによって目的の前記ペプチドを、前記ＯＢＰ遺伝子の形質発現産物との融合タンパク質として形質発現させる
ことを含む、種子中で目的のペプチドを形質発現させる方法。
【請求項１８】
前記種子の細胞中で油体から前記融合タンパク質を分離することを更に含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記分離が、
前記種子の細胞を溶解させて前記油体を放出させ；
前記油体を破壊することによって前記融合ポリペプチドを放出させることを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記分離が、
目的の前記ペプチドのＮ末端の前に位置する前記融合ポリペプチド中のプロテアーゼ認識部位を認識しうるプロテアーゼに対して前記融合ポリペプチドを接触させることを更に含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記接触に先立って、前記ＯＢＰ遺伝子の形質発現産物に対して結合しうる抗体を有する固体担体に対して前記融合タンパク質を結合させることを更に含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
目的の精製ペプチドを得る方法であって、
ゲノム組み込み条件下でＤＮＡ構成体によって宿主双子葉植物細胞を形質転換させ、ここでこのＤＮＡ構成体が、
目的のペプチドを暗号化する第一のＤＮＡ配列であって、ただしこのペプチドが、天然油体タンパク質の一部分以外である第一のＤＮＡ配列と、
油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子を有する第二のＤＮＡ配列であって、種子中での前記遺伝子の形質発現をもたらすのに十分な、前記ＯＢＰ遺伝子の調節領域５’から翻訳開始部位までの部分を有する第二のＤＮＡ配列
とを有しており、前記第一のＤＮＡ配列が前記調節領域の制御の下で形質発現され、これによって前記ＤＮＡ構成体が前記双子葉植物細胞のゲノム中へと組み込まれ；
前記双子葉植物を成長させて種子を生じさせ、これによって目的の前記ペプチドを、前記ＯＢＰ遺伝子の形質発現産物との融合タンパク質として形質発現させ；
前記種子の細胞から油体を分離し；
この油体を破壊することによって前記融合タンパク質を放出させ；
目的の前記ペプチドを精製する
ことを含む、精製ペプチドを得る方法。
【請求項２３】
目的の前記ペプチドが、植物ゲノムによって暗号化されたペプチド以外である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
目的の前記ペプチドが、油体中に天然に存在しているペプチド以外である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記分離が、
前記種子からの細胞の溶解に続いて油体フラクションを回収すること
を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１３または１４に記載の形質発現カセットを有する双子葉植物細胞。
【請求項２７】
請求項１３または１４に記載の形質発現カセットを含有する双子葉植物。
【請求項２８】
請求項１３または１４に記載の形質発現カセットを含有する双子葉植物の種子。
【請求項２９】
油体中の目的のペプチドを得る方法であって、
種子中の前記ペプチドを、融合ポリペプチドの前記油体への標的化をもたらすのに十分な油体タンパク質の部分との融合ポリペプチドとして形質発現させることを含み、ただし前記ペプチドが、天然に生ずる油体タンパク質の一部分以外である、油体中の目的のペプチドを得る方法。
【請求項３０】
前記融合ポリペプチドが、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドであることを特徴とする、請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞成分から容易に精製できる、目的のタンパク質を、組換え手段によって製造する方法に関するものである。植物中、特に種子中の目的とするタンパク質を、油体タンパク質およびこの目的のタンパク質を含有するキメラペプチドとして形質発現することによって、本発明を例示する。
【背景技術】
【０００２】
植物中で種々のタンパク質が形質発現されてきた。しかし、植物中の外来タンパク質の形質発現を得る方法が一般的に可能なことは示されてきたけれども、この源から精製タンパク質を得ることには、幾つかの制限があった。これらの制限としては、植物に由来する物質を実質的に含まない純粋なタンパク質を得るのに必要な精製工程や、得られた組換えタンパク質が水性緩衝液と接触しているときに、この精製工程の間に製造される抽出物中で生じうる劣化がある。
【０００３】
大豆、なたね、ひまわり、およびコーン、にんじん等の多数の他の植物種のような、脂肪種子を保持する植物は、その種子中にトリグリセライドを貯蔵している。この植物では、これらのトリグリセライドが、種子を発芽させ、続いて実生させるためのエネルギー源として作用する。このトリグリセライドは、食品中で、および食品の製造中に、また幾つかの工業的用途のための植物油として、広く使用されている。
【０００４】
トリグリセライドは、水と混和せず、水溶液の表面上に浮かぶことによって、またはこの水相中に懸濁液として小さい球状体またはリポソームを形成することによって、区分と混和しない。こうした球状体は、もしも修飾された表面層によって安定化されていない場合には、自然に合体するであろう。この合体によって、雑多な寸法の球状体の懸濁液がもたらされうる。種子においては、トリグリセライドを貯蔵するときには、この油球状体は実際には、通常は均一な寸法のカプセル化された脂質または油体である。これらの油体の表面に会合するのは、幾つかのタンパク質が散在しているハーフユニット膜であり、一般的には油体タンパク質と呼ばれている。
【０００５】
少なくとも一つの族の油体タンパク質は、種の間で高度に保持されている幾つかの特性を有している。この族の油体タンパク質は、「オレオジン（oleosin）」と呼ばれている。これらのタンパク質の親水性のＮまたはＣ末端は、まったく分散しているように見えるが、一方この親油性の内部領域（中央コア）は、種の間で高度に保存されているように見える。このオレオシンは、油体と強く会合し；この油体への強い会合は、主要部では、これらの中央コアの親油性に起因しているようである。従って、植物由来物質から組換えタンパク質を分離する方法を提供することによって、オレオシンのような油体タンパク質が、組換えタンパク質の製造において有用でありうるかどうかを決定することに、興味がもたれる。
関連文献
植物中での外来（組換え）ペプチドの生産は、種々のアプローチを利用して実験されてきており、強い構成性植物プロモーター〔例えば、カリフラワーモザイクウイルスからの−シイモンス（Sijmons）等、１９９０年、「Bio/Technology」８：２１７〜２２１頁〕および外来タンパク質の暗号化を利用した転写融合；器官特異的配列による転写融合〔ラドケ（Radke）等、１９８８年、「Theoret. Appl.Genet.,」７５：６８５〜６９４頁〕；および続いて組換えタンパク質の開裂を必要とする転写融合〔ヴァンデル  ケルコーブ（VanderKelcove）等、１９８９年、「Bio/Technology」７：９２９〜９３２頁〕が挙げられる。植物細胞中で形質発現されてきた外来タンパク質としては、細菌〔フレイリー（Fraley）等、１９８３年、「Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 」８０：４８０３〜４８０７頁〕、動物〔ミスラ（Misra）およびゲダム（Gedamu）１９８９年、「Theor. Appl. Genet.」７８：１６１〜１６８頁〕、菌類および他の植物種〔フレイリー（Fraley）等、１９８３年、「Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 」８０：４８０３〜４８０７頁〕からの活性タンパク質が挙げられる。
【０００６】
幾つかのタンパク質は、通常は組み込みの標識は、組織特異的な方法で形質発現してきており、種子中で幾つか挙げられる〔セン  グプタ−ゴパラン（Sen Gupta-Gopalan）等、１９８５年、「Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 」８２：３３２０〜３３２４頁：ラドケ（Radke）等、１９８８年、「Theore. Appl. Genet.,」７５：６８５〜６９４頁〕。これらの報告文は、種子貯蔵タンパク質プロモーターを、種子特異的形質発現を駆動する手段として使用することに、特に集中している。こうした装置を使用して、ヴァンデルケルコーブ（VanderKelcove）等は、１９８９年「Bio/Technology」７：９２９〜９３２頁において、「Arabidopsis thaliana」および「Brassica napus」の種子中に高価値ペプチド（ｌｅｕ−エンケファリン）を形質発現した。このペプチドの収率は極めて低いが、しかし植物組織内での動物ペプチドホルモンの形質発現の可能性を示している。トウモロコシオレオジンが、トウモロコシオレオジン遺伝子によって形質転換された「Brassicanapus」中の種子油体中で、形質発現した。この遺伝子は、主要な種子貯蔵タンパク質であるナピンを暗号化する「Brassica」遺伝子からの調節因子の制御下に形質発現した。この形質発現の一時的な調節および組織特異性は、ナピン遺伝子のプロモーター／ターミネーターに関して正しいことが報告された。リー（Lee）等「Proc. Nat'l. Acad. Sci. 」（USA）１９９１年：８８：６１８１〜６１８５頁参照。
【０００７】
種子中で生成する油球状体は、すべてが似た寸法であるようであり、これらが安定化されていることを示している〔ファン（Huang ）Ａ．Ｈ．Ｃ、１９８５年、「植物分析の現代的方法：Modern meths. PlantAnalysis」１巻、１４５〜１５１頁、スプリンガー−ベルラグ  ベルリン〕。もっと接近して検査すると、これらが単なる油球状体ではなく、むしろ膜によって包囲された油体であることが発見された。これらの油体は、オレオソーム、脂質体およびスフェロソームと、顕微鏡学者によって種々に命名されてきた〔ガー（Gurr）MI．、１９８０年、「植物の生化学：The Biochemistry of Plants 」４：２０５〜２４８頁、Acad.Press オルランド  Ｆｌａ〕。僅かな種の油体が研究されてきており、この一般的結論は、これらが普通ではない「ハーフユニット」膜によってカプセル化されており、「ハーフユニット」膜は古典的な脂質二層を備えておらず、むしろその内側上には疎水性基を有し、その外側には親水性基を有する単一の両親媒性層を備えている〔ファン（Huang）Ａ．Ｈ．Ｃ、１９８５年、「植物分析の現代的方法：Modern meths. PlantAnalysis」１巻、１４５〜１５１頁、スプリンガー−ベルラグ  ベルリン〕。
【０００８】
脂質体の内容物の分析が示すところでは、トリグリセライドおよび膜材料は別として、この油体の表面または内腔と会合した幾つかのポリペプチドまたはタンパク質もある〔ボウマンヴァンス（Bowman-Vance）およびファン、１９８７年、「J. Biol. Chem.」２６２：１１２７５〜１１２７９頁、マーフィー等、１９８９年、「Biochem.J. 」２５８：２８５〜２９３頁、テイラー等、１９９０年、「Planta」１８１：１８〜２６頁〕。油体タンパク質は、広い範囲の分類学的に分散した種の中で同定されてきており〔モロー等、１９８０年、「PlantPhysiol.」６５：１１７６〜１１８０頁、キュー等、１９８６年、「Biochem.J. 」２３５：５７〜６５頁〕、油体中で独特に局在化していることが見いだされており、野菜組織のオルガネラ中では発見されていない。「Brassicanapus」（なたね）においては、成長中の種子の油体と会合している少なくとも三種のポリペプチドがある〔テイラー（Taylor）等、１９９０年、「Planta」１８１：１８〜２６頁〕。
【０００９】
油体が会合したタンパク質の数と寸法とは、種から種へと変化しうる。例えば、コーンにおいては、油体中に二つの免疫学上区別されるポリペプラド族が見いだされる〔ボウマン−ヴァンスおよびファン、１９８８年、「J. Biol.Chem.」２６３：１４７６〜１４８１頁〕。オレオジンは交互に親水性、疎水性および親水性の領域を有していることが発見された〔ボウマン−ヴァンスおよびファン、１９８７年、「J. Biol. Chem.」２６２：１１２７５〜１１２７９頁〕。コーン、なたねおよびニンジンからのオレオジンのアミノ酸配列が得られた。キューおよびファン、１９９０年、「J.Biol. Chem.」２６５：２２３８〜２２４３頁、ハツォポウロス（Hatzopoulos ）等、１９９０年、「植物細胞：plant Cell」２：４５７〜４６７頁をそれぞれ参照。なたねのような脂肪種子においては、オレオジンは、全種子タンパク質の８％〔テイラー（Taylor）等、１９９０年、「Planta」１８１：１８〜２６頁〕〜２０％〔マーフィー等、１９８９年、「Biochem.J. 」２５８：２８５〜２９３頁〕を含有していてよい。この水準は、多数の種子貯蔵植物において見られる水準に匹敵している。
【００１０】
油体タンパク質を暗号化する遺伝子は、トウモロコシ〔トウモロコシ：ボウマン−ヴァンスおよびファン、１９８７年、「J. Biol.Chem.」２６２：１１２７５〜１１２７９頁；およびキューおよびファン、１９９０年、「J.Biol. Chem.」２６５：２２３８〜２２４３頁〕、およびニンジン〔ハツォポウロス等、１９９０年、「植物細胞：plant Cell」２：４５７〜４６７頁〕の、二つの種について報告されてきた。
【非特許文献１】シイモンス（Sijmons）等、１９９０年、「Bio/Technology」８：２１７〜２２１頁
【非特許文献２】ラドケ（Radke）等、１９８８年、「Theoret. Appl.Genet.,」７５：６８５〜６９４頁
【非特許文献３】ヴァンデル  ケルコーブ（Vander Kelcove）等、１９８９年、「Bio/Technology」７：９２９〜９３２頁
【非特許文献４】フレイリー（Fraley）等、１９８３年、「Proc. Nat'l.Acad. Sci. USA 」８０：４８０３〜４８０７頁
【非特許文献５】ミスラ（Misra ）およびゲダム（Gedamu）１９８９年、「Theor.Appl. Genet. 」７８：１６１〜１６８頁
【非特許文献６】フレイリー（Fraley）等、１９８３年、「Proc. Nat'l.Acad. Sci. USA 」８０：４８０３〜４８０７頁
【非特許文献７】セン  グプタ−ゴパラン（Sen Gupta-Gopalan）等、１９８５年、「Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 」８２：３３２０〜３３２４頁
【非特許文献８】ラドケ（Radke ）等、１９８８年、「Theore.Appl. Genet.,」７５：６８５〜６９４頁
【非特許文献９】ヴァンデルケルコーブ（VanderKelcove ）等は、１９８９年「Bio/Technology」７：９２９〜９３２頁
【非特許文献１０】リー（Lee ）等「Proc.Nat'l. Acad. Sci. 」（USA ）１９９１年：８８：６１８１〜６１８５頁
【非特許文献１１】ファン（Huang ）Ａ．Ｈ．Ｃ、１９８５年、「植物分析の現代的方法：Modernmeths. Plant Analysis」１巻、１４５〜１５１頁、スプリンガーベルラグ  ベルリン
【非特許文献１２】ガー（Gurr）MI．、１９８０年、「植物の生化学： The Biochemistry of Plants」４：２０５〜２４８頁、Acad. Press オルランド  Ｆｌａ
【非特許文献１３】ファン（Huang ）Ａ．Ｈ．Ｃ、１９８５年、「植物分析の現代的方法：Modernmeths. Plant Analysis」１巻、１４５〜１５１頁、スプリンガーベルラグ  ベルリン
【非特許文献１４】ボウマン−ヴァンス（Bowman-Vance）およびファン、１９８７年、「J. Biol.Chem.」２６２：１１２７５〜１１２７９頁
【非特許文献１５】マーフィー等、１９８９年、「Biochem. J. 」２５８：２８５〜２９３頁
【非特許文献１６】テイラー等、１９９０年、「Planta」１８１：１８〜２６頁
【非特許文献１７】モロー等、１９８０年、「Plant Physiol.」６５：１１７６〜１１８０頁
【非特許文献１８】キュー等、１９８６年、「Biochem. J.」２３５：５７〜６５頁
【非特許文献１９】テイラー（Taylor）等、１９９０年、「Planta」１８１：１８〜２６頁
【非特許文献２０】ボウマン−ヴァンスおよびファン、１９８８年、「J. Biol. Chem.」２６３：１４７６〜１４８１頁
【非特許文献２１】ボウマン−ヴァンスおよびファン、１９８７年、「J. Biol. Chem.」２６２：１１２７５〜１１２７９頁
【非特許文献２２】キューおよびファン、１９９０年、「J. Biol. Chem.」２６５：２２３８〜２２４３頁
【非特許文献２３】ハツォポウロス（Hatzopoulos ）等、１９９０年、「植物細胞：plantCell」２：４５７〜４６７頁
【非特許文献２４】テイラー（Taylor）等、１９９０年、「Planta」１８１：１８〜２６頁
【非特許文献２５】マーフィー等、１９８９年、「Biochem. J. 」２５８：２８５〜２９３頁
【非特許文献２６】ボウマン−ヴァンスおよびファン、１９８７年、「J. Biol. Chem.」２６２：１１２７５〜１１２７９頁
【非特許文献２７】キューおよびファン、１９９０年、「J. Biol. Chem.」２６５：２２３８〜２２４３頁
【非特許文献２８】ハツォポウロス等、１９９０年、「植物細胞：plant Cell」２：４５７〜４６７頁
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
宿主タンパク質から容易に精製できるペプチドを製造するための方法および組成物を提供する。この方法は、キメラＤＮＡ構成体を製造し、このキメラＤＮＡ構成体は、種子特異的油体タンパク質遺伝子の暗号配列を有する油体特異的配列を暗号化する配列を含んでおり、または少なくとも油体タンパク質の疎水性コアの部分を暗号化する配列を含んでおり、および目的とするペプチドの暗号配列であって、これからキメラＤＮＡ構成体を含有する形質発現カセットを製造できる暗号配列を含んでおり；ゲノム組み込み条件下でこの形質発現カセットによって宿主細胞を形質転換し；およびこうして得られたトランスジェニック植物を成長させて種子を生産し、この中で目的とするポリペプチドを、オレオジンを有する融合タンパク質として形質転換させる工程を有している。
【００１２】
目的とするポリペプチドは、種子細胞から油体を分離し、この油体を破壊してその融合タンパク質を放出させることによって、精製することができる。次いで、この油体タンパク質は、層分離によって、他のタンパク質および植物由来物質から容易に分離される。必要に応じて、開裂部位を、目的とするポリペプチドのＮ末端に先立っておよびＣ末端の後ろの少なくとも一か所に位置させて、この融合ポリペプチドを開裂させて層分離によってその成分ペプチドへと分離することができる。従って、この製造装置は、キメラペプチドの油体タンパク質に対する油体タンパク質機能性によって、このキメラペプチドの標的化をもたらし、これがまた、目的とするポリペプチドの急速な精製を可能とする。この製造装置は、薬剤、酵素、流動特性および接着特性を有するペプチドのような多数のペプチドの製造に、用途を見いだしている。
【００１３】
本発明に従って、油体へと標的化されることができる融合ポリペプチドであって：
（ａ）次式
【００１４】
【化１】
2005013236.tif 000002
【００１５】
を有している第一のペプチドであって、ここで
aa25は、いかなるアミノ酸であってもよく；
aa26は、中性の脂肪族アミノ酸であり；
aa31は、３〜６個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa33は、３〜６個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa36は、３〜５個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa37は、中性の非置換アミノ酸であり；
aa39は、中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa41は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり；
aa44は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり；
aa46は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり；
aa47は、中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa51は、グリシン、ロイシン、アラニン、バリンまたはイソロイシンであり；
aa53は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはスレオニンであり；
aa59は、中性の非置換脂肪族または芳香族アミノ酸であり；
aa72は、スレオニン、アラニンまたはロイシンであり；
aa73は、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはスレオニンであり；
aa74は、アラニンまたはグリシンであり；
aa75は、ロイシンまたはスレオニンであり；
aa76は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または硫黄置換アミノ酸であり；
aa77は、イソロイシン、アラニンまたはバリンであり；
aa78は、中性の非置換脂肪族アミノ酸であり；
aa83は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり；
aa84は、グリシンであり；
aa85は、グリシンまたはアラニンであり；
aa86は、フェニルアラニンまたはロイシンであり；
aa89は、アラニン、スレオニンまたはグリシンであり；
aa90は、アラニンまたはグリシンであり；
aa92は、酸素置換を有する中性の脂肪族アミノ酸であり；
aa93は、バリンまたはセリンであり；
aa94は、フェニルアラニンまたはロイシンであり；
aa96は、中性の硫黄置換脂肪族アミノ酸または中性の芳香族複素環アミノ酸であり；
aa97は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または硫黄置換アミノ酸であり；
aa98は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または酸素置換芳香族アミノ酸であり；
aa99は、いかなるアミノ酸であってもよく：
aa100は、酸素置換アミノ酸であり、脂肪族または芳香族であってよく；
aa101は、中性の非置換脂肪族または芳香族アミノ酸である；
第一のペプチドと、これに融合した
（ｂ）第二のペプチドであって、ただしこの第二のペプチドが、「Arabidopsis」または「Brassica」から天然に生ずるオレオジンタンパク質の一部分以外である第二のペプチド
とを含有していることを特徴とする、融合ポリペプチドを提供する。
【００１６】
また、本発明が提供する融合ポリペプチドは、油体の標的となることができ、
（ａ）
（１）次のアミノ酸配列
M-M-G-R-D-R-D-Q-Y-Q-M-S-G-R-G-S-D-Y-S-K-
S-R-Q-I-A-K-A-A-T-A-V-T-A-G-G-S-L-L-V-L-
S-S-L-T-L-V-G-T-V-I-A-L-T-V-A-T-P-L-L-V-
I-F-S-P-I-L-V-P-A-L-I-T-V-A-L-L-I-T-G-F-
L-S-S-G-G-F-G-I-A-A-I-T-V-F-S-W-I-Y-K ★-Y- 
A-T-G-E-H-P-Q-G-S-D-K-L-D-S-A-R-M-K-L-G-
S-K-A-Q-D-L-K-D-R-A-Q-Y-Y-G-Q-Q-H-T-G-G-
E-H-D-R-D-R-T-R-G-G-Q-H-T-T 
中に含まれる少なくとも８つの連続的なアミノ酸配列を含有するペプチド；および
（２）（１）における前記アミノ酸配列またはそのフラグメントに基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブによって同定されるＤＮＡ配列で暗号化されたペプチドからなる群より選ばれた第一のペプチドであって、ただしこの第一のペプチドが、にんじんからの１６ｋｄのオレオジンまたはトウモロコシからの１６ｋｄまたは１８ｋｄのオレオジンを自然発生させる全長以外である
第一のペプチドと、これに融合した
（ｂ）第二のペプチドであって、ただしこの第二のペプチドが、「Arabidopsis」または「Brassica」から天然に生ずるオレオジンタンパク質の一部分以外である第二のペプチド
を含有していることを特徴とする。
【００１７】
本発明で更に提供するキメラＤＮＡ構成体は、（ａ）油体への標的化をもたらすのに十分なオレオジンまたはその一部を暗号化する第一のＤＮＡ配列および
（ｂ）ペプチドを暗号化する第二のＤＮＡ配列であって、ただしこのペプチドが、「Arabidopsis」または「Brassica」から天然に生ずるオレオジンタンパク質の一部分以外である、第二のＤＮＡ配列を含有している。
【００１８】
本発明で更にまた提供する形質発現カセットは：
成分として、転写の方向に；
種子中で形質発現した遺伝子の領域５’から翻訳開始部位への相当部分を有しており、種子中でのＤＮＡ配列の形質発現をもたらす調節ＤＮＡ配列；
（ａ）油体の標的化をもたらすオレオジンまたはその相当部分を暗号化する第一のＤＮＡ配列であって、この第一のＤＮＡ配列が少なくとも一種の制限部位を含んでいる第一のＤＮＡ配列、および（ｂ）ペプチドを暗号化する第二のＤＮＡ配列であって、ただしこのペプチドが、「Arabidopsis」または「Brassica」から天然に生ずるオレオジンタンパク質の一部分以外である第二のＤＮＡ配列を有するキメラＤＮＡ配列；および
翻訳および転写停止領域を有しており；
ここで前記の成分が操作可能に連鎖しており、前記キメラＤＮＡ配列の形質発現が、前記調節ＤＮＡ配列によって調節されている。
【００１９】
また本発明で提供する形質発現カセットは：
油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子であって、種子中でこの遺伝子の形質発現をもらたす、領域５’から翻訳開始部位への相当部分を有しており、かつ前記ＯＢＰ遺伝子のちょうど５’からメチオニン開始コドンまでと５’から翻訳停止信号までとの間に、少なくとも１つの制限部位を有している油体タンパク質遺伝子；および
前記ＯＢＰ遺伝子によって読み取り枠内の前記制限部位中へと挿入されたＤＮＡ配列であって、このＤＮＡ配列が、「Arabidopsis」または「Brassica」から天然に生ずるオレオジンタンパク質の一部分以外であるペプチドを暗号化しているＤＮＡ配列
を有している。
【００２０】
本発明で更に提供する形質発現カセットは：
ペプチドを暗号化する第一のＤＮＡ配列であって、ただしこのペプチドが、「Arabidopsis」または「Brassica」から天然に生ずるオレオジンタンパク質の一部分以外であり、油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子中へと読み取り枠内で挿入されており、油体タンパク質遺伝子が、種子中でこの遺伝子の形質発現をもらたす、前記ＯＢＰ遺伝子の調節領域５’から翻訳開始部位への相当部分を有しており、ここで前記配列が前記調節領域下で形質発現するように前記遺伝子中の部位に挿入されている第一のＤＮＡ配列
を有している。
【００２１】
さらにまた本発明で提供する、種子中で目的のポリペプチドを形質発現させる方法は：
ゲノム組み込み条件下で形質発現カセットによって宿主植物細胞を形質転換させ、ここでこの形質発現カセットが、成分として、転写の方向に、種子中で形質発現した遺伝子の領域５’から翻訳開始部位への相当部分を有しており、種子中でのＤＮＡ配列の形質発現をもたらす第一のＤＮＡ配列；油体の標的化をもたらすオレオジンまたはその相当部分を暗号化する第二のＤＮＡ配列であって、この第二のＤＮＡ配列が、少なくとも一種の天然または合成の制限部位を含んでおり、この制限部位の中へと、目的のポリペプチドを暗号化する第三のＤＮＡ配列が読み取り枠内に挿入されており、ただしこのペプチドが、「Arabidopsis」または「Brassica」から天然に生ずるオレオジンタンパク質の一部分以外である第二のＤＮＡ配列；および翻訳および転写停止領域を有しており；ここで前記の成分が操作可能に連鎖しており、前記第二のＤＮＡ配列の形質発現が、種子中での形質発現をもたらすように前記第一のＤＮＡ配列によって調節されている
ことを含んでいる。
【００２２】
更に本発明で提供する、目的の精製ポリペプチドを得る方法は：
ゲノム組み込み条件下でＤＮＡ構成体によって宿主植物細胞を形質転換させ、ここでこのＤＮＡ構成体が、目的のペプチドを暗号化する第一のＤＮＡ配列を有しており、ただしこのペプチドが、「Arabidopsis」または「Brassica」から天然に生ずるオレオジンタンパク質の一部分以外であり、油体タンパク質（ＯＢＰ）遺伝子中へと読み取り枠内で挿入されており、油体タンパク質遺伝子が、種子中での前記遺伝子の形質発現をもたらす前記ＯＢＰ遺伝子の調節領域５’から翻訳開始部位までの相当部分を有しており、ここでＤＮＡ配列の形質発現が前記調節領域によって調節されるように、前記配列が前記遺伝子中の部位に挿入されており、これによって前記ＤＮＡ構成体が前記植物細胞のゲノム中へと組み込まれ始め；
前記植物を成長させて種子を生じさせ、これによって目的の前記ポリペプチドを、前記ＯＢＰ遺伝子の形質発現産物と共に融合タンパク質として形質発現させ；
前記種子の細胞から油体を分離し；
この油体を破壊することによって前記融合タンパク質を放出させ；および
目的の前記ポリペプチドを精製する
ことを含んでいる。
図面の簡単な説明
図１Ａは、「Arabidopsis thaliana」からの油体タンパク質遺伝子（オレオジン）のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配列（１７ｋＤａのタンパク質）を示す。下線を引いたのは、ダイレクトリピート（Ｒ１およびＲ２）および逆行反復（Ｔ）、ＣＡＣＡ、ＴＡＴＡ、ＴＡＡＴおよびポリアデニル化信号である。イントロン配列を小文字活字で示し、推定したＡＢＡ−結合部位を肉太活字で示す。
【００２３】
図１Ｂは、にんじんからの１６ｋｄの油体タンパク質、トウモロコシからの１８ｋｄおよび１６ｋｄの油体タンパク質および「Arabidopsisthaliana」からの１７ｋｄの油体タンパク質の配列の比較を示しており、このタンパク質の保存および分岐領域を示す；このアミノ酸配列は、このタンパク質の中央領域の配列の保存を示すように配列されている。
【００２４】
図２は、外来ペプチドを暗号化する遺伝子による油体タンパク質遺伝子の融合のために使用する構成体を示す。ＩＡは、ＯＢＰに対する所望のペプチドのＣ末端融合である。ＩＢは、ＯＢＰに対する所望のペプチドのＮ末端融合である；ＩＩは、ＯＢＰ内での所望のペプチドの内部融合である；およびＩＩＩは、二つの実質的に完全な油体タンパク質標的配列の間に包含された所望のペプチドの二量体間転写融合である。図（Ａ）の上部には、油体タンパク質への所望のペプチドの転写融合のために使用するＤＮＡ構成体を示す。図（Ｂ）の下部には、遺伝子産物の配置を示しており、この油体への翻訳および運搬の上部上に示されている。この図への鍵は、次の通りである：左側が底であって右側が上方であるハッチングが施されたボックスは、ＯＢＰプロモーターまたは他の種子特異的プロモーターを示しており；右側が底であって左側が上方であるハッチングが施されたボックスは、所望のペプチド暗号配列を示し；空白のボックスは、油体タンパク質暗号配列、またはＯＢＰ保存モチーフに基づいた合成標的配列を示し；垂直および水平にハッチングされたボックスは、ポリアデニル化信号を含む遺伝子ターミネーターを示し；ハッチングされた円は、プロテアーゼ認識モチーフを示し；ラセン状の線は、ＯＢＰの天然ＣまたはＮ末端を示す。
【００２５】
図３は、Ｃ−末端融合の構成体についての詳細な配置を示す。示してあるこの配置は、典型的な油体タンパク質遺伝子および融合ペプチドの融合のリンカーとしての、コラゲナーゼ認識モチーフ暗号配列であり、植物中でのクローニングおよび形質転換のために、ここではＮｃｏＩを使用して連鎖されている。
【００２６】
図４は、融合ペプチドベクターの構成、これらの植物中への導入および続く抽出と所望の組換えペプチドの測定の方法を図式的に示している。
【００２７】
図５は、ｐＣＧＯＢＰＩＬＴの構成の概略図を示す。破線のボックスは、オレオジンプロモーターを示し；左側が上方で右側が底のハッチングが施されたボックスは、オレオジン暗号配列を示し；水平および垂直のハッチングが施されたボックスはイントロンを示し；点描されたボックスは３’非翻訳配列を示し；左側が上方で右側が底の、間隔が広いハッチングが施されたボックスは、プロテアーゼ開裂部位を暗号化する配列を備えたインターロイキン１−β配列を示す（直接の上流で因子Ｘａまたはトロンビン）。
【００２８】
図６は、オリゴヌクレオチドＧＶＲ１１のデザインを示す。図３Ａにおいて示される「Ａ．thaliana」オレオジンの３’暗号配列は、因子Ｘａ／ＩＬ−１−β暗号配列に対して翻訳融合され、ＴＡＡ停止コドンが続く。将来のクローニング目的のためには、ＰｖｕＩおよびＳａ１Ｉ制限酵素認識部位が含まれる。ＰｖｕＩ制限部位の生成によって、アラニン（ａｌａ）のための更なる暗号配列がもたらされる。下線を引いたのは、この制限酵素認識部位である。上線を引いたのは、この「Ａ．thaliana」オレオジン配列および因子Ｘａ認識配列である。この実際の開裂部位は、アスタリスク（星）で示す。図３Ｂにおいては、ＧＶＲ１１の配列を示す。「Ａ．thaliana」オレオジンと融合させるためには、このプライマーＧＶＲ１１は、このトップ鎖に対して相補的な配列である必要がある。
【００２９】
図７は、ＯＢＰＩＬＴのヌクレオチド配列を示す。下線を引いたのは、ＩＬ−１−βを暗号化する配列である；因子Ｘａ認識部位を暗号化する配列は、肉太文字で示す。ノパリンシンターゼターミネーター配列は、小文字活字で示す。
【発明の実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明に従って、容易に精製されるペプチドを製造するための方法および組成物を提供する。本方法は、オレオジンのような油体特異的配列の相当部分を暗号化するＤＮＡ配列を含む形質発現カセットを製造して、油体および目的すとるペプチドへの標的化をもたらし；この形質発現カセットを植物細胞宿主中へと形質転換し；トランスジェニック植物を発生させ、これを成長させて種子を生産させ、これからキメラタンパク質を形質発現させ、油体へと輸送する、各工程を有している。このキメラペプチドは、目的とするペプチドと、オレオジンのような油体タンパク質とを含有している。この目的とするペプチドは、一般的には、通常種子中で形質発現されないかまたは油体上に見いだされない外来ペプチドである。担体または標的手段として油体タンパク質を使用することによって、この外来タンパク質の精製を得る単純な方法を得ることができる。このキメラタンパク質は、細胞タンパク質のバルクから、（遠心分離または浮上法のような）一工程で分離される；また、この分離も、この油体との接触から非特異的プロテアーゼを除去するので、このタンパク質は、抽出の間劣化から保護される。外来ペプチドを暗号化するこの遺伝子は、植物、細菌、菌類または動物源を含むあらゆる源に由来していてよい。望ましくは、このキメラペプチドは、オレオジンからの目的のペプチドの開裂を可能とする配列を含有しているであろう。本方法は、種々のペプチドを形質発現させるのに使用することができ、これは次に容易に精製される。
【００３１】
外来性の組換えタンパク質を油体へと標的化することで、次のものを含んで、幾つかの利益が得られる。このタンパク質は、細胞内容物のバルクから、遠心分離による細胞溶菌の後に、分離することができる。この油体のフラクションは、この抽出物の表面上に浮上するであろう。このタンパク質には、必要に応じて、プロテアーゼ認識部位を含有するペプチドリンカーを備えることができる。これによって、この油体からのペプチドの放出が可能となる。このタンパク質は、これが親油性保存領域内にあるようにして、組換えポリペプチド中へと導入することができる。これによって、この組換えペプチドの油体中へのインターナリゼーションがもたらされ、従ってこれをプロテアーゼの攻撃から保護する。
【００３２】
この形質発現カセットは、一般的には、その転写の５’−３’方向中に、油体タンパク質と関連するプロモーターおよび上流領域によって代表されるような、成長中の種子中での形質発現を可能とする転写および翻訳調節領域を含むであろうし、これが、種子中でのキメラタンパク質、油体標的化手段および目的のタンパク質をもたらすアミノ酸配列を含有するキメラタンパク質を暗号化するＤＮＡ配列、および植物中で機能する転写および翻訳終結領域の、形質発現をもたらすであろう。また、一種以上のイントロンも存在していてよい。
【００３３】
この油体特異的抗体には、油体タンパク質、特にオレオジンのフラグメントにアナロジーが見いだされる。この油体特異的配列は、油体タンパク質から得ることができる配列のものと同じであってよく、これは目的のタンパク質の油体への所望の標的化をもたらすのに十分な相同性を有している。「得ることができる」によって、意図しているのは、所望の標的化をもたらす天然の油体タンパク質アミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列であり、天然、合成またはその組み合わせであってよい。特に興味深いのは、異なる植物種の間で高度に保存されているように見える油体タンパク質の中央疎水性領域、そのフラグメントおよびそのアミノ酸レベルでの相同配列である。
【００３４】
「Arabidopsis thaliana」の油体タンパク質に対して推定されたアミノ酸配列は、次の通りである。
10                  20
M-M-G-R-D-R-D-Q-Y-Q-M-S-G-R-G-S-D-Y-S-K-
30                  40
S-R-Q-I-A-K-A-A-T-A-V-T-A-G-G-S-L-L-V-L-
50                  60
S-S-L-T-L-V-G-T-V-I-A-L-T-V-A-T-P-L-L-V-
70                  80
I-F-S-P-I-L-V-P-A-L-I-T-V-A-L-L-I-T-G-F-
90                   100
L-S-S-G-G-F-G-I-A-A-I-T-V-F-S-W-I-Y-K ★-Y- 
110               120
A-T-G-E-H-P-Q-G-S-D-K-L-D-S-A-R-M-K-L-G-
130               140
S-K-A-Q-D-L-K-D-R-A-Q-Y-Y-G-Q-Q-H-T-G-G-
150 
E-H-D-R-D-R-T-R-G-G-Q-H-T-T 
約２５〜１０１までのアミノ酸は、中央疎水性領域を有する。
【００３５】
幾つかの用途のための標的化手段として特に興味深いのは、油体への標的化をもたらす次式の油体特異的配列またはそのフラグメントである：
【００３６】
【化２】
2005013236.tif 000003
【００３７】
ここで：
ｐｐ１およびｐｐ２は、同じであるかまたは異なっており、天然の油体タンパク質とは同じであっても異なっていても良く、通常は異なっており；これらは水素であってよく、表示したポリペプチドの末端部分を示しており、または合計で最大１０００のアミノ酸、もっと通常は最大約５００のアミノ酸を有するポリペプチドであってよく、合計で僅か１個のアミノ酸を有していてよく、または独立してまたは分離して、１〜１００のアミノ酸、もっと通常は１〜７５のアミノ酸、更に特定的には５〜５０のアミノ酸からなるポリペプチドであってよい；これらのポリペプチドは、特定目的のために特異的に記述された配列を修飾するという特定の用途を有するであろう；
ａａ２５は、いかなるアミノ酸であってもよく、一般的には３〜６個の炭素原子を有する中性の脂肪族アミノ酸であってよく、更に特定的にはロイシンまたはアラニンであってよい；
ａａ２６は、中性の脂肪族アミノ酸であり、特にはアラニンまたは３〜４個の炭素原子を有する水素置換アミノ酸であり、特にはスレオニンまたは５〜６個の炭素原子を有する塩基性アミノ酸であり、特にはリジンである；
ａａ３１は、３〜６個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり、特にはアラニン、バリン、ロイシンまたは芳香族非置換アミノ酸であり、特にはフェニルアラニンである；
ａａ３３は、３〜６個の炭素原子を有する中性の非置換脂肪族アミノ酸であり、特にはアラニン、バリンまたはロイシンまたは酸素置換脂肪族アミノ酸であり、特にはスレオニンである；
ａａ３６は、３〜５個の炭素原子を有する中性の脂肪族非置換アミノ酸であり、特にはロイシンまたは３〜４個の炭素原子を有する中性の脂肪族酸素置換アミノ酸であり、特にはスレオニンまたはセリンである；
ａａ３７は、中性の非置換アミノ酸であり、特にはロイシンまたは硫黄置換アミノ酸であり、特にはメチオニンである；
ａａ３９は、中性の脂肪族非置換アミノ酸であり、特にはバリンまたは芳香族非置換アミノ酸であり、特にはフェニルアラニンである；
ａａ４１は、中性の脂肪族非置換または酸素置換アミノ酸であり、特にはアラニン、ロイシンまたはセリンである；
ａａ４４は、中性の脂肪族非置換または酸素置換アミノ酸であり、特にはアラニン、イソロイシンまたはスレオニンである；
ａａ４６は、中性の脂肪族非置換アミノ酸または酸素置換アミノ酸であり、特にはアラニン、バリンまたはスレオニンである；
ａａ４７は、中性の脂肪族非置換アミノ酸であり、特にはグリシンまたはアラニンである；
ａａ５９は、中性の脂肪族または芳香族非置換アミノ酸であり、特にはロイシンまたはフェニルアラニンである；
ａａ７６は、中性の脂肪族非置換または硫黄置換アミノ酸であり、特にはアラニン、ロイシンまたはメチオニンである；
ａａ７８は、中性の脂肪族非置換アミノ酸であり、特にはアラニンであり、または中性の硫黄または酸素置換を有する脂肪族アミノ酸であり、特にはメチオニンまたはスレオニンである；
ａａ８３は、中性の脂肪族の非置換または酸素置換アミノ酸であり、特にはグリシン、セリンまたはスレオニンである；
ａａ９２は、酸素置換を有する中性の脂肪族アミノ酸であり、特にはセリンまたはスレオニンである；
ａａ９５は、中性の脂肪族硫黄置換アミノ酸または中性の芳香族複素環アミノ酸であり、特にはトリプトファンである；
ａａ９７は、中性の脂肪族の非置換または硫黄置換アミノ酸であり、特にはバリン、ロイシン、イソロイシンまたはメチオニンである；
ａａ９８は、中性の非置換脂肪族アミノ酸または芳香族酸素置換アミノ酸であり、特にはアラニン、ロイシンまたはチロシンである；
ａａ９９は、いかなるアミノ酸であってもよい：
ａａ１００は、酸素置換アミノ酸であり、脂肪族または芳香族であり、特にはチロシンまたはスレオニンである；
ａａ１０１は、中性の非置換の脂肪族または芳香族アミノ酸であり、特にはアラニン、ロイシンまたはフェニルアラニンである。
【００３８】
油体タンパク質への標的化をもたらしうる配列を暗号化するＤＮＡの源として特に興味深いのは、「Arabidopsis」または「Brassica napus」から得ることができる油体タンパク質遺伝子であり、これは種子中で目的のタンパク質の形質発現をもたらす〔テイラー等１９９０年「Planta」１８１：１８〜２６頁参照〕。この油体の標的化能力をもたらすのに必要な領域およびアミノ酸配列は、油体タンパク質の高度に疎水性の中央領域であるように見える。
【００３９】
所望の特性を有する他の油体タンパク質を同定するためには、油体タンパク質が分離されたかまたは分離されているときには、このタンパク質は部分的に配列決定されていてよく、これによってｍＲＮＡを同定するためにプローブをデザインすることができる。こうしたプローブは、植物の異なる種の間で高度に保存されている中央疎水性領域の暗号領域を標的化するようにプローブがデザインされているときには、特に価値がある。この結果、この領域用のＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、他の植物種から油体タンパク質の暗号配列を同定するのに、特に有用でありうる。ｍＲＮＡの濃度を更に高めるためには、ｃＤＮＡを生産することができ、このｃＤＮＡは、非油体生産細胞からｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが差し引かれている。次いで、この残留したｃＤＮＡは、植物細胞から調製した適当なライブラリーを使用して、相補的配列のゲノムをプロービングするのに使用することができる。次いで、緊縮条件下にこのｃＤＮＡとハイブリッド形成する配列を分離することができる。
【００４０】
ある場合には、上記したように、油体タンパク質遺伝子プローブ（保存領域）を使用して、プローブを採用することによって、直接にｃＤＮＡゲノムライブラリーをスクリーニングし、このプローブにハイブリッド形成する配列を同定することができる。また、この分離を、種子特異的ｃＤＮＡ形質発現ライブラリーの標準免疫学的スクリーニング技術によって実施することができる。テイラー等１９９０年「Planta」１８１：１８〜２６頁に記載された精製手順および抗体調製プロトコルを使用して、油体タンパク質のための抗体を容易に得ることができる。抗体を使用したｃＤＮＡ形質発現ライブラリースクリーニングを、実質的にヒュン（Huynh ）等〔１９８５年、「ＤＮＡクローニング」第１巻、「実際的アプローチ：practicalapproach」D. M. Glover , IRLプレス、第49〜78頁）〕の技術を使用して、実施する。配列の確認は、中央疎水性領域内に見られる高度の保存性によって、容易にすることができる（図１参照）。サンガー等〔「Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 」１９７７年、７４：５４６３〜５４６７頁〕またはマクサムおよびギルバート〔１９８０年、「Meth.Enzymol.」１９８０年６５：４９７〜５６０頁〕の方法によるＤＮＡ配列決定を、すべての推定されるクローンおよび実施する相同性の調査のために、実施することができる。この中央疎水性領域を暗号化する配列の相同性は、異なる種の間でアミノ酸レベルおよびヌクレオチドレベルの双方で、通常７０％以上である。もし抗体が入手可能であれば、配列の同定の確認も、サムブルック等〔「Molecularcloning 」１９９０年、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  プレス  第８〜４９から８〜５１頁〕に記載されたように、種子ｍＲＮＡ調製からのハイブリッド選択および翻訳実験によって実施することができる。
【００４１】
種子から製造したｃＤＮＡクローンは、あらゆる入手可能な油体タンパク質遺伝子の保存された暗号領域から製造したｃＤＮＡプローブを使用して、スクリーニングできる〔例えば、ボウマン−ヴァンスおよびファン、「J. Biol. Chem.」１９８７年、２６２：１１２７５〜１１２７９頁〕。幼植物のｃＤＮＡに比較して、種子ＤＮＡと一層強いハイブリッド形成を有するクローンを選択する。このスクリーニングを繰り返して、直接抗体スクリーニングまたはハイブリッド選択および翻訳を使用して、成長中の種子の油体と会合している特定のｃＤＮＡを同定する。この特異的ｃＤＮＡに相補的なｍＲＮＡは、試験する他の組織には存在していない。次いで、このｃＤＮＡを使用して、主題のｃＤＮＡとハイブリッド形成する、選択されたゲノムライブラリーおよびフラグメントをスクリーニングする。
【００４２】
種子中でこのキメラ遺伝子の形質発現を得るためには、種子中で優先的に形質発現したあらゆる遺伝子から得られる翻訳開始およびリボソームに対してｍＲＮＡを結合させることを担っている、非翻訳５’配列の転写開始調節領域および翻訳開始調節領域、「リボソーム結合部位」を、使用することができる。こうした遺伝子の例としては、ナピンからのような種子貯蔵タンパク質が挙げられる〔ジョセフソン等「J. Biol. Chem.」１９８７年、２６２：１２１９６〜１２２０１頁；スコーフィールドＳ．Ｒ．およびクローチＭ．Ｌ．「J.Biol. Chem.」１９８７年２６２：１２２０２〜１２２０８頁〕。好ましくは、この領域を、油体タンパク質から得ることができる〔「Arabidopsis」、にんじん〔ハツォポウロス等、前出〕またはトウモロコシ〔ファン等、１９８７年および１９９０年、前出〕からの油体タンパク質から得ることができる。この領域は、一般的には、この構造遺伝子暗号配列の５’から翻訳開始まで少なくとも１００ｂｐを有しており、５’からこれと同じ翻訳開始まで最大２．５Ｋｂを有している。この開始調節領域の転写および翻訳機能要素のすべてが、これと同じ遺伝子に由来しているか、またはこれと同じ遺伝子から「得ることができる」ことが好ましい。「得ることができる」によって、意図しているのは、このキメラタンパク質を暗号化するＤＮＡ配列の転写に所望の特異性をもたらすのに十分に、天然配列のものに類似したＤＮＡ配列である。これは、天然のおよび合成の配列を含んでおり、合成および天然の配列の組み合わせであってよい。
【００４３】
この転写レベルは、修飾された種子をもたらしうるＲＮＡの量を提供するのに十分でなければならない。「修飾された種子」によって意味しているのは、同じ種の形質転換されていない植物の種子から検出可能な異なるフェノタイプを有する種子であり、例えば、問題の形質発現カセットをそのゲノム中に有していないものである。フェノタイプの種々の変更は興味深い。これらの変更としては、油体タンパク質の過形質発現または得られたキメラタンパク質の油体上または細胞質中でのＯＢＰの蓄積が挙げられる。
【００４４】
目的のポリペプチドは、いかなるタンパク質であってもよく、例えば、酵素、抗凝固剤、神経ペプチド、ホルモン、または粘着前駆体が挙げられる。タンパク質の例としては、インターロイキン−１−β、抗凝固剤ヒルジン、酵素β−グルコロニダーゼまたは免疫グロブリンのＶＨまたはＶＬ鎖の転写融合を有する単鎖抗体が挙げられる。目的のポリペプチドを暗号化するこのＤＮＡ配列は、合成、天然に由来するもの、またはこれらの組み合わせであってよい。目的のポリペプチドを暗号化するＤＮＡの性質または源によっては、植物優先コドンによってＤＮＡ配列を合成することが望ましいであろう。この植物優先コドンは、宿主細胞として目的の特定の植物種中で最大の量で形質発現したタンパク質中の最も高い頻度のコドンから決定することができる。
【００４５】
採用する終結領域は、多くの場合に終結領域が相対的に交換可能なように見えるので、主として便利なものでありうる。この終結領域は、この転写開始領域と共に天然であってよく、目的のポリペプチドを暗号化するＤＮＡと共に天然であってよく、または他の源に由来していてよい。便利な終結領域は、オクトピンシンターゼまたはノパリンシンターゼ終結領域のような、「Ａ．tumefaciens」のＴｉプラスミドから入手することができる。
【００４６】
目的のペプチドを暗号化する遺伝子に対する、標的配列を暗号化するＤＮＡ配列の結合は、末端融合、内部融合、および重合融合を含む種々の方法で生じうる。すべての場合において、この融合は、油体タンパク質の読み取り枠を阻害しないよう、およびこのジャンクションの中または近くでいかなる翻訳停止信号をも避けるようにして、なされる。異なる種類の末端および内部融合を、これらのインビボの配置の表示と共に、図２に示す。
【００４７】
記載したすべての場合において、このペプチドを暗号化する遺伝子の結合は、好ましくは、プロテアーゼ標的モチーフを暗号化するリンカーを含むであろう。これによって、いったんは融合タンパク質として抽出されたペプチドの放出が可能となる。採用しうる可能な開裂部位は、トロンビンの認識モチーフ（ｌｅｕ−ｖａｌ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｇｌｙ）〔フジカワ等、「Biochemistry」1972年、11:4892 -4899 頁〕、因子Ｘａ（ｐｈｅ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａａ．）〔ナガイ等、「Proc. Nat'l. Acad.Sci. USA 」1985年、82:7252 -7255 頁〕またはコラゲナーゼ（ｐｒｏ−ｌｅｕ−ｇｌｙ−ｐｒｏ）〔ショルティセク（Scholtissek）およびグロス（Grosse）「Ｇｅｎｅ」：１９８８年、６２：５５−６４頁〕のものである。
【００４８】
オーバーハング（張出部）内に制限、チューイングバックまたは充填のような適当な操作によって、太い末端を設けること、リンカーの結合等することによって、このフラグメントの相補的末端を、接合および結合のために設けることができる。これらの種々の工程を実施する際には、クローニングを採用することで、ＤＮＡの量を増幅し、このＤＮＡの分析を可能としてこれらの操作が適当な状態で生じたことを確証することができる。広範なクローニングベクターを採用すことができ、ここでこのクローニングベクターとしては、「Ｅ．ｃｏｌｉ」中で作用する複製系と、形質転換細胞の選択を可能とする標識とが挙げられる。ベクターを例示すると、ｐＢＲ３３２、ｐＵＣ系列、Ｍ１３ｍｐ系列、ｐＡＣＹＣ１８４等が挙げられる。従って、この配列は、適当な制限部位でベクター中へと挿入することができ、こうして得られたプラスミドを使用して「Ｅ．ｃｏｌｉ」宿主を形質転換させ、この「Ｅ．ｃｏｌｉ」を適当な栄養培地中で成長させ、この細胞を回収および溶菌し、このプラスミドを回収する。分析としては、配列の分析、制限分析、電気泳動等を挙げることができる。各操作の後に、この最終の構成体中で使用されるＤＮＡ配列を、制限して次の配列に接合させることができ、ここで部分構成体の各々を、同じまたは異なるプラスミド中でクローニングすることができる。
【００４９】
植物宿主細胞中へとＤＮＡを導入するために、種々の技術を採用できる。例えば、キメラＤＮＡ構成体は、タバコのような双子葉植物および「Brassica napus」のような油性植物から得られた宿主細胞中へと、〔モロニー（Moloney ）等「Plant CellRep. 」1989年8:238-242 頁〕 または〔ヒンチ等「Bio/Technol.」1988年、6:915-922 頁〕に記載されたもの、または本分野に習熟した物に既知の他の技術のような、形質転換プロトコルによる標準アグロバクテリウムベクターを使用して、導入することができる。例えば、植物細胞の形質転換に対してＴ−ＤＮＡを使用することは、集中的に研究がなされており、ＥＰＡシリアルナンバー１２０，５１６号；ホエケマ（Hoekeme）：バイナリー植物ベクター系オフセット−drukkerij Kanters B.V.  アルブラッシャーダム（Arblasserdam）１９８５年、第５章：Ｋｎａｕｆ等、「アグロバクテリウムによる宿主領域形質転換の遺伝的分析：GeneticAnalysis of Host range Expressionby Agrobacterium」：「細菌の分子遺伝学：MolecularGenetics of the Bacteria」「植物の相互作用：Plant interaction 」プーラー（Puhler）Ａ．版、シュプリンガー−バーラグ、ニューヨーク州、１９８３年、第２４５頁およびアン（Ａｎ）等「ＥＭＢＯ  Ｊ．」１９８５年４：２７７〜２８４頁に詳細に記載されている。便宜上は、組織片をＡ．ツメファシエンスまたはＡ．リゾジェネスと共に培養することによって、植物細胞への転写構成体の転移可能とすることができる。アグロバクテリウムを使用した形質転換に続いて、この植物細胞を、選択のために適当な選択培地中で分散させ、カルスへと成長させ、苗条を成長させ、根付き培地中で成長させることによって、カルスから小植物を再生させる。このアグロバクテリウム宿主は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への転移に必要なｖｉｒ遺伝子を有するプラスミドを含有することができ、Ｔ−ＤＮＡを有していてもよく、いなくともよい。注入およびエレクトロポレーションのためには、（下記を参照）非武装Ｔｉプラスミド（その腫瘍遺伝子、特にそのＴ−ＤＮＡ領域が欠けている。）をこの植物細胞中へと導入することができる。
【００５０】
非アグロバクテリウム技術を採用することによって、本明細書に記載した構成体を使用して、広範な双子葉および単子葉植物中で形質発現および形質転換させることが可能となる。これらの技術は、アグロバクテリウム形質転換系中では取扱にくい種に対して、特に有用である。遺伝子を転移させるための他の技術としては、バイオリスティクス（Biolistics）〔サンフォード「Trends in Biotech.」１９８８年、６：２９９〜３０２頁〕、エレクトロポレーション〔フロム等「Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 」1985年、82:5824-5828頁〕〔リッグスおよびベイツ「Proc. Nat'l. Acad.Sci. USA 」1986年、83:5602-5606頁〕またはＰＥＧ  媒介ＤＮＡ摂取〔ポトリクス（Potrykus）等「Mol.Gen. Genet.」1985年、199:169-177 頁〕が挙げられる。
【００５１】
宿主細胞としては、多数の種子保持植物のいずれからの細胞も使用することができ、ここでこの細胞は、茎、葉、根、または種子またはこの種子による再生構造体のような、植物の一部分に由来している。この細胞は、分離された細胞または植物の一部分であってよく、例えば、リーフディスクであってよい。「Brassica napus」に対するような、特定の用途においては、この宿主細胞は、一般的には、〔モロニー等「PlantCell Rep. 」1989年8:238-242 頁〕に記載された子葉柄に由来することができる。商業的な脂肪種子を使用する他の例としては、大豆植物片における子葉形質転換〔ヒンチ等「Biotechnology」1988年、6:915-922 頁〕および綿の茎の形質転換〔アンベック等「Biotechnology 」１９８１年、５：２６３〜２６６頁〕が挙げられる
形質転換に続いて、この細胞を、例えば、リーフディスクとして、選択培地中で成長させる。いったん苗条が現れ始めると、これらを切開して根付き培地上へと配置する。十分な苗条が形成された後、これらの植物を土壌へと移す。次いで、推定された形質転換植物について、標識の存在下に試験する。適当なプローブ、例えばＡ．「thaliana」遺伝子を使用して、サザンブロッティングをゲノムＤＮＡ上で実施して、宿主細胞ゲノム中への所望の配列の組み込みが生ずることを示す。
【００５２】
この形質転換カセットは、通常は、植物細胞中で選択用の標識へと接合されるあろう。便宜上は、この標識は、除草剤、カナマインシ、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール等のような、特に抗生物質に対して抵抗性であってよい。この採用した特定の標識は、導入されたＤＮＡを欠いた細胞に対して、形質転換された細胞の選択を可能とするであろうものであってよい。
【００５３】
上記したように構成された形質発現カセット中の融合ペプチドは、成長中の種子中で少なくとも優先的に形質発現する。従って、通常の方法に従って成長する形質転換植物は、種子を定着させる。例えば、〔マコーミック等「Plant cell Reports」１９８６年、５：８１〜８４頁〕参照。種子胚のような、転写が生ずるものと予期される組織から分離されたＲＮＡと共に、適当な遺伝子プローブを使用して、ノザンブロッティングを実施することができる。次いで、この転写産物の寸法を、この融合タンパク質転写産物に対して予期される寸法と比較する。
【００５４】
次いで、油体タンパク質を、この種子から分離し、分析を実施して、この融合ペプチドが形質転換したことを測定する。分析は、例えば、ＰＡＧＥでありうる。この融合ペプチドを、この融合ペプチドのオレオジン部分に対する抗体を使用して、検出することができる。次いで、こうして得られた融合ペプチドの寸法を、この融合タンパク質について予期された寸法と、比較することができる。
【００５５】
二世代以上のトランスジェニック植物を成長させ、これと同じ形質発現株で受粉するかまたは異なる株で受粉して、こうして得られた所望のフェノタイプ特性を有するハイブリッドを同定し、この主題のフェノタイプ特性が安定して維持および受継されていることを確証し、次いで種子を収穫して目的のペプチドを分離し、または新しいフェノタイプ特性を有する種子を得るのに使用することができる。
【００５６】
水性の緩衝抽出培地、およびグラインディング、ブレイキング、粉砕または種子細胞を粉砕する他の手段を使用することを含む、種々の技術によって、導入された形質に対して同種または異種の種子から、所望のタンパク質を抽出することができる。次いで、こうして抽出された種子を、（例えば、遠心分離またはブレイの沈降法によって）３つのフラクションへと分離することができる：沈殿または不溶性のペレット、水性の上澄み液、および種子貯蔵脂質および油体を含有する浮遊物「浮きかす（scum）」である。これらの油体は、天然の油体タンパク質と、キメラ油体タンパク質との双方を含有しており、この後者は外来性のペプチドを含有している。これらの油体を、水溶性タンパク質から分離し、水性緩衝液中に再懸濁する。
【００５７】
プロテアーゼ認識モチーフを含有しているリンカーが、この形質発現カセット中に包含されている場合には、この再懸濁緩衝液へと、このリンカー配列の翻訳によって生産されたこの認識モチーフに対して特異的なプロテアーゼを添加する。これによって、必要なペプチドが、この水相中へと放出される。二度目の遠心分離工程によって、ここでこの処理された油体が、その付着タンパク質と共に再浮遊し、必要なペプチドの水溶液を残すであろう。この所望のペプチドは、その性質および所望の用途に従って、沈殿させるか、化学的に修飾するか、または凍結乾燥させることができる。
【００５８】
ある種の用途においては、この油体タンパク質からキメラタンパク質を除去することは、不要でありうる。こうした用途としては、この融合ペプチドが、ＮまたはＣ末端融合に対して寛容であってその活性を保持する酵素を含んでいる場合が挙げられるであろう；こうした酵素は、更なる開裂または精製なしに、使用する事ができる。このキメラ酵素ＯＢＰは、融合タンパク質として基質と接触しうる。もし望むならば、このＯＢＰに対する固定化高力価抗体を含有する免疫アフィニティーカラム（例えば、前出の〔テイラー１９９０年〕を参照）を使用して、この酵素−ＯＢＰ融合タンパク質を精製することも可能である。
【００５９】
本発明についての他の用途は、次の通りである。ＯＢＰは高い百分率の全種子タンパク質を含有しており、従って、単に目的のアミノ酸に富んだ融合タンパク質を生産することによって、高リジン、高メチオニン等のように、種子のある所望の特性を富ませることが可能であり、特に有利な用途を見いだせるのは、ウシ、家禽を含む家畜類やヒトに対する食物源として直接にまたは間接的に使用される穀粒または穀物の変更である。この融合タンパク質として、通常の脂肪種子の粉砕および抽出の際に、油またはあら粉を続いて処理するのを補助できる酵素を挙げることが可能であり、例えば、種子を処理するのに使用する上昇した粉砕温度で活性を保持するであろう、熱安定性の脂質修飾酵素を含有させることがあり、これによって抽出されたトリグリセライドまたはタンパク質製品にたいして価値を付加する。この融合タンパク質の他の用途としては、この作物の耕種学上の健全性を促進する用途が含まれる。例えば、殺虫性のタンパク質や、菌細胞壁または膜のような、耕種上の病害虫に対して特異的な免疫グロブリンの部分を、この油体タンパク質に対して結合させ、これによって特定の植物病害虫による種子への攻撃を減少させることができる。
【００６０】
次の例は、例示のために提供するものであり、限定のために提供するものではない。
【実施例】
【００６１】
例１
油体タンパク質による外来ペプチドの熱融合の形質発現
Ａ．Ｃ−末端融合
５’から転写開始まで少なくとも１００ｂｐを含有する油体タンパク質遺伝子のゲノムクローンを、適当な細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｐＵＣまたはｐＢＲ３２２）中で複製が可能なプラスミドビヒクル中へとクローニングする。制限部位は、遺伝子の親水性Ｃ末端部分を暗号化する領域内に配置する。１９ｋＤａのＯＢＰにおいては、この領域は、典型的には、コドン１２５からこのクローンの末端へと延びている。この理想制限部位は単一であるが、しかし、これは絶対的には不可欠ではない。もし適当な制限部位がこの領域内に位置していない場合には、〔クンケル（Kunkel）「Proc. Nat'l Acad. Sci. USA」１９８５年、８２：４８８〜４９２頁〕の部位特異的突然変異方法に従って、導入することができる。この部位の導入についての唯一の主要な制限は、このＯＢＰクローンの５’から翻訳停止信号までに配置しなければならないことである。
【００６２】
適当なこの突然変異されたクローンによって、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏまたはその多量体のような、プロテアーゼ認識部位についての暗号配列を含有する、合成オリゴヌクレオチドアダプターを生産することができる。これは、プロテアーゼ  コラゲナーゼに対する認識部位である。このアダプターは；このＯＢＰクローンの３’末端の制限部位に対して和合性の５’末端での４塩基オーバーハング、外来ペプチド暗号配列に対する結合を容易にする、このアダプターのこの３’末端の４塩基オーバーハング、およびもし必要であれば更に塩基：を与えるような方法で合成でき、このＯＢＰ暗号配列、このプロテアーゼ認識部位および外来ペプチド暗号配列の間での転移にフレームシフトが無いことを確証する。こうした融合のための典型的な配置を、図３に示す。ここで示した例では、にんじんＯＢＰ〔ハツォポウロス等「Plant cell」１９９０年、２：４５７〜４６７頁〕の停止コドンの近くに存在するＸｈｏ１部位を使用する。これを消化し、記載した二つのオリゴヌクレオチドから構成したアダプターと結合させることができる。このアダプターは、末端の完全なＸｈｏ１オーバーハングを形成するであろうし、この翻訳枠を阻害しないであろう。この他端は、任意に選択される（あらゆる六塩基カッターが十分である）が、しかし所望の外来ペプチドからＡＴＧを包含するＮｃｏ１オーバーハングを形成している。
【００６３】
この最終の結合産物は、ほぼ完全なＯＢＰ遺伝子、コラゲナーゼ認識もちーフに対する暗号配列および所望のペプチド暗号領域を、すべて単一の読み取り枠内に含有するであろう。この三部からなるフラグメントを、外来ＤＮＡを植物内へと転移させるのに広く使用されているような〔フレイリー等「Proc. Nat'l Acad. Sci. USA」１９８３年、８０：４８０３〜４８０７頁〕、アグロバクテリウム  バイナリープラスミド〔ベヴァン（Bevan ）等「Nucl. Acid Res. 」１９８４年、１２：８７１１〜８７２１頁〕中へとクローニングし、これを使用して〔モロニー等「Plant cell Rep. 」１９８９年、８：２３８〜２４２頁〕の方法または類似の手順を使用して、なたねのような脂肪種子植物を形質転換する。トランスジェニック植物を、この形質転換実験から回収することができ、これらを成長させて開花させることができる。次いで、この植物は、自己受粉によって種子を結ぶ。
【００６４】
これらの種子を成熟に到達させ（６０〜８０日）、次いで収穫し、水性抽出緩衝液中で粉砕する〔テイラー等、「Planta」１９９０年、１８１：１８〜２６頁〕。このスラリーを５０００×ｇで２０分間遠心分離すると、表面浮きかすが得られるであろう。この浮きかすを再び回収し、コラゲナーゼ測定緩衝液中で激しく振とうさせることによって懸濁させる〔ショルティセクおよびグロス「Ｇｅｎｅ」：１９８８年、６２：５５−６４頁〕。五単位のコラゲナーゼを添加し、この懸濁液を４時間振とうさせて培養する。この時間の経過後に、この懸濁液を再び５０００×ｇで２０分間遠心分離する。この表面浮きかすを除去し、この水相のタンパク質含有量を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析する。ほぼ必要とされるペプチドの寸法のバンドを見いだし、硫酸アンモニウムを使用してこのタンパク質を沈殿させ、限外濾過または凍結乾燥を使用して濃縮することができる。
【００６５】
Ｂ．Ｎ−末端融合
油体タンパク質の親水性のＮ末端によって、このＮ末端へのペプチドの融合を可能とする一方、この外来ペプチドが、この油体の外側表面上で保持されるであろうことを引き続いて保証する。この融合体の配置を、図２ＩＢに示す。
この配置は、Ｃ−末端融合に対して使用したのと類似の出発物質から構成することができるが、しかし油体タンパク質遺伝子の翻訳開始に近接した好都合な制限部位の同定が必要である。好都合な部位は、多くの油体タンパク質遺伝子中に、ちょうど５’からこの最初のＡＴＧへの単一の塩基変化の導入によって、暗号配列のいかなる変化もなしに、生じさせることができる。このようにはるかに研究された油体タンパク質においては、この第二のアミノ酸は、そのコドンが「Ｇ」で始まるアラニンである。この配列の文脈を下に示す。
2005013236.tif 000004
【００６６】
この「ＡＴＧ」に先立つアデニンでの一つの塩基変化は、双方の場合に、Ｎｃｏ１部位である・・・ＣＣＡＴＧＧをもたらすであろう。従って、〔クンケル「Proc. Nat'l Acad. Sci. USA」１９８５年、８２：４８８〜４９２頁〕の部位特異的突然変異プロトコルを使用したこの塩基の変更によって、この配列中の他のＮｃｏ１部位を推定することなく、使用のためにこのクローンを生産することができる。
【００６７】
この外来ペプチド用の暗号配列は、このＮｃｏ１部位中へのその直接の結合を可能とするであろう調製物を必要としうる。これは、典型的には、部位特異的突然変異によって１つまたは２つの塩基を変更して（クンケル、１９８５年、前出）、この外来ペプチドの翻訳開始点の周囲でＮｃｏ１部位を発生させることを必要とする。次いで、このペプチドを、標的の翻訳停止に近接して切断する第二の酵素とＮｃｏ１とを使用して、そのクローニングビヒクルから切開する。再び、上記した方法を使用して、第二の好都合な部位を、部位特異的突然変異によって導入することができる。キューおよびファン（１９９０年、前出）によって示唆されてきたように、このＮ−末端メチオニンは、インビボでタンパク質の処理の間に除去することができ、この直接の下流のアラニンはアシル化することができる。この可能性を考慮すると、このタンパク質のＮ−末端にＭｅｔ−Ａｌａ配列を保持することが必要でありうる。これは、このＡｌａコドンの中または後ろにあるこの暗号配列中へと適当な制限部位を導入するような、種々の戦略を適用することによって、容易に達成できる。例えば、部位特異的突然変異によって、この配列を、次のように修飾することができる。
2005013236.tif 000005
へと突然変異する。
【００６８】
一つのコドンのこの変化によって、この暗号配列中へとＳｐｈ１部位が導入されるであろう。第二の変化は、突然変異の同じラウンドの間に導入されうるけれども、コドン６の２つの塩基を変換させて、ＧＧＣ  ＧＣＣ、Ｎａｒ１をもたらすであろう。次いで、この突然変異遺伝子を、Ｓｐｈ１およびＮａｒ１部位を用いて開放させて、３つのコドンを除去しうる方向性のクローニング切断を付与することができる。この部位中へと、配列ＣＡＴＧ・・・（Ｓｐｈ１と和合性）を有する３’オーバーハングと、この反対側の末端にあるＧＣ５’オーバーハングとを含有するアダプターを導入することができる。このアダプターの正確な配列を、下に示す：
2005013236.tif 000006
【００６９】
このアダプターは、Ｓｐｈ１およびＮａｒ１制限部位の双方を再び生じさせ、これらは診断目的のために使用されるであろう。このＳｐｈ１部位は、ここでは、このプラスミドを開放させ、有用なペプチドについての配列を包含するＤＮＡフラグメントをインフレームクローニングするのに、使用することができる。次いで、クローニングの方向性は、このプラスミドのあらゆる非対称的に配置された部位およびＮａｒ１で切断することによって、分析できる。
【００７０】
これらのＮ−末端融合体から得られた構成体は、典型的には図２の例ＩＢのものでありうる。これらは、ＯＢＰプロモーター配列、必要であれば、出発信号としてそれ自身のＡＴＧを有する高価値ペプチド暗号配列のＯＢＰ遺伝子の最初の幾つかのコドン内のインフレーム融合体およびこのＯＢＰ遺伝子およびターミネーターの残部を含有しうる。
【００７１】
この修飾された遺伝子を、バイナリーアグロバクテリウムプラスミド内へと導入し（ベヴァン、１９８４年、前出）、アグロバクテリウム中へと固定化する。上記したようにして形質転換を実施する。種子からの高価値タンパク質の回収を、「Ｃ−末端融合」について記載したようにして、実施する。
【００７２】
Ｃ．内部翻訳融合
第三の型の融合としては、このＯＢＰの暗号配列の内部へと、高価値タンパク質の暗号配列を配置することが挙げられる。この型の融合には、Ｎ−末端融合におけるものと同じ戦略が必要とされるが、しかし低い保存性の領域内の修飾しか機能することはできず、これらのＯＢＰの保存性の高い領域が、成熟タンパク質の標的化に不可欠であると考えられるからである。
この種の融合において鍵となる相違点は、タンパク質の放出部位に対するコラゲナーゼ認識部位を、横に並べる（flanking）必要性である。これが意味しているのは、これまで記載してきたような、標準的なリンカー／アダプター系の代わりに、次の形を有するリンカーを備えることが必要なことである。
2005013236.tif 000007
【００７３】
付着端１および２は、このアダプターをＯＢＰクローン中へと、方向性の方法でクローニングするのに、使用することができる。次いで、こうして組み込まれた制限部位を使用して、適当な制限部位またはリンカーの横に並んだ高価値ペプチド暗号配列を導入する。高価値ペプチド暗号配列中に非対称的に配置された制限部位およびコラゲナーゼ認識モチーフの暗号配列に並んだ二つの制限部位のうちの一つを使用することによって、方向性をチェックする。
【００７４】
これらの構成体をアグロバクテリウム  プラスミドへと固定化し、次いで植物へと固定化することは、既に述べた手順と同じである。トランスジェニック植物の種子からの高価値タンパク質の回収は、油体が分離され、洗浄された後のものとは幾分か異なっており、この油体を脱脂して、脂質相内では油体の内側に隠れうるコラゲナーゼ認識部位を評価することが、必要でありうる。この工程によって、担体として油体タンパク質を使用することによる利益が減少するかもしれないが、しかし他方では、水性媒体中または植物細胞質中では不安定なタンパク質配列に対しては、非常に好ましい。
【００７５】
Ｄ．二量体間転写融合
ＯＢＰの全暗号配列が反復されている構成体を生じさせることが可能である。この構成体から生産した二量体タンパク質は、油体に対してこのＯＢＰを標的化するために必要なすべての因子をやはり含有しうる。こうした構成体は、プロモーター領域、ＯＢＰの全読み取り枠またはほぼ完全な読み取り枠を含有しうるが、しかし翻訳停止および更には第二のＯＢＰの全読み取り枠を排除しており、今回は翻訳「停止」およびターミネーター領域を備えている。
このキメラ遺伝子の構成においては、一対の類似していない制限部位が、二つの複製のジャンクション領域で見いだされるかまたは生産される。これらの部位を使用して、内部翻訳融合について上記したようなリンカーの導入を可能とする。このリンカーは、コラゲナーゼ認識モチーフの組を含有しているだけでなく、高価値タンパク質を暗号化する配列が組み込まれた内部制限部位も含有している。この構成体の形態を、図２ＩＩＩに示す。アグロバクテリウムおよび更には植物へのこの構成体の固定化は、上記した通りである。この形質転換植物の種子からの高価値タンパク質の回収は、上のＣ末端融合について記載したと同じ手順を使用して、実施することができる。
【００７６】
例２
植物中のオレオジンとの融合としてのインターロイキン−１−β（ＩＬ−１
−β）のクローニンクおよび形質発現についての戦略
Ａ．Arabidopsis thalianaオレオジン遺伝子のクローニングおよび配列決定
「Brassica napus」オレオジン遺伝子〔マーフィー等、１９９１年、「Biochem Biophys Acta」１０８８：８６〜９４頁〕を使用して、ＥＭＢＬ３Ａ（ストラタジーン社）中で「Ａ．thaliana」（コロンビア州）のゲノムライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングによって、「Ａ．thaliana」からの１５ｋｂのゲノムフラグメントを含有するＥＭＢＬＡ３Ａクローン（λ２．１）の分離がもたらされる。このオレオジンを、６．６ｋｂのＫｐｎＩ挿入体中、この１５ｋｂのフラグメント（図５）中にマッピングする。このオレオジン遺伝子を含有する、１．８ｋｂのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩフラグメントを末端充填し、ＲＦＭ１３ｍｐ１９のＳｍａＩ部位中でサブクローニングする。この１．８ｋｂの挿入体を、適当な制限酵素によって消化し、Ｍ１３ｍｐ１９中で配列決定のためにサブクローニングする。この「Ａ．thaliana」オレオジン遺伝子の１８００ｂｐの配列を、図１ａに示す。これらすべてのクローニング工程を、〔サムブルック等〔「分子クローニング  実験の手引き：Molecular cloning a labolatry manual」第２版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス〕に従って実施した。
【００７７】
Ｂ．ＩＬ−１−βを暗号化するオリゴヌクレオチドの設計
ＩＬ−１−βは、９つのアミノ酸（ａａ）；ｖａｌ−ｇｌｎ−ｇｌｙ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｓｅｒ−ａｓｎ−ａｓｐ−ｌｙｓからなる〔アントーニ等、１９８６年「J. Immunol. 」１３７：３２０１〜３２０４頁〕。このプロテアーゼ因子Ｘａは、アミノ酸配列ｉｌｅ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇを含有するタンパク質配列を開裂させることができる。開裂は、ａａ  ａｒｇの後ろで生ずる。これらの配列に基づいて、オリゴヌクレオチドをデザインし（ＧＶＲ１１、図５）、これは、ＩＬ−１−β暗号配列に加えて、この因子Ｘａ開裂部位の暗号配列、および「Ａ．thaliana」オレオジン（塩基位置７４２〜７５９）の３’暗号領域の１８のヌクレオチドを含有している。このＩＬ−１−β暗号配列は、「Ｂ． napus」および「Ａ．thaliana」オレオジン（表１）に対して最適のコドン用法を使用して設計した。
【表１】
2005013236.tif 000008
【００７８】
Ｃ．「Ａ．thaliana」オレオジン−ＩＬ−１−β融合体の生産
配列：５’ＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＣ３’
（塩基位置：−８３８から８１４）、オリゴヌクレオチドＧＶＲ１０
５’ＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＣ３’
を設計した。ＧＶＲ１０は、クローニングを容易にするために、ＰｓｔＩ制限部位（下線）を有している。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＧＶＲ１０およびＧＶＲ１１の間の領域を増幅する。この反応混合物は、１６μｌのｄＮＴＰｓ（１．２５ｍＭ）、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭのトリスＨＣｌｐＨ８．３、５００ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、５μｌのＧＶＲ１１（２０μＭ）、１μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１ｕ／μｌ）および６４μｌのＨ２Ｏを含有していた。この反応を、３０サイクル実施した。各サイクルは、９２℃での１分間の変性、４５℃での１分間のアニーリングおよび７２℃での３分間の伸長からなっていた。このＰＣＲ反応によって、１６５２個のヌクレオチドからなる単一のフラグメントが得られた。
Ｄ．「Ａ．thaliana」オレオジン−ＩＬ−１−β（ＯＢＰＩＬ）融合体のクローニング
５’Ｓａ１Ｉ−ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーター−ＥｃｏＲＩ３’配列を、ｐＢＩ１２１（クローンテック  ラボラトリーズ社）から分離し、ｐＵＣ１９のＳａ１／ＥｃｏＲＩ部位中へとクローニングした。このプラスミドをｐＴｅｒｍと呼ぶ。１６５２ｂｐのフラグメント（Ｃ，で説明した）を分離し、制限酵素ＰｓｔＩおよびＳａ１Ｉによって消化した。このフラグメントを、ｐＴＥＲＭ中でクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＵＣＯＢＲＩＬＴ（図５）と呼んだ。このプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、消化ｐＵＣ１９ベクターおよびＥｃｏＲＩ−Ａ．thaliana  オレオジン−ＩＬ−１−β−ｎｏｓ−ＰｓｔＩ融合体ＰｓｔＩ（ＯＢＰＩＬＴ）が得られた。ＯＢＰＩＬＴの完全な配列を、図７に示す。ＯＢＰＩＬＴを、ｐブルースクリプト＋のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ部位中でサブクローニングした。このプラスミド（ｐＢＩＯＢＰＩＬＴ）を、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、このＰｓｔＩ−ＯＢＰＩＬＴ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、選択標識（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）およびＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ特異的部位を含有する、バイナリー  アグロバクテリウム  プラスミド（Ｂｉｎ  １９）〔ベヴァン、Ｍ．「Nucl. Acid Res. 」１９８４年、１２：８７１１〜８７２１頁〕中でサブクローニングした。こうして得られたプラスミドを、ｐＣＧＯＢＰＩＬＴと呼んだ。このクローニング手順の概略図を、図５に示す。種々のバイナリープラスミドの説明については、次を参照する：ｐＧＡ６４２または６４５；〔アン等、１９８５年、「ＥＭＢＯ．Ｊ．」４、２７７〜２８８頁〕またはｐＣＧＮ１５５８または１５５９；〔マクブライドおよびサマーフェルド、１９９０年、「Plant Molec. Biol.」１４：２６９〜２７６頁〕。
Ｆ．アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１中へのｐＣＧＯＢＰＩＬＴの形質転換
１つのＥＨＡ１０１コロニー〔フッド等、１９８６年「J. Bact.」１６８：１２９１〜１３０１頁〕を使用して、５ｍｌのＬＢ＋１００μｇ／ｍｌカナマイシンを培養した。この培養菌を４８時間、２８℃で成長させた。この５ｍｌの培養菌を使用して、５００ｍｌのＬＢ＋１００μｇ／ｍｌカナマイシンを培養した。この培養菌を２８℃で、この培養菌がＯＤ６００＝０．５の密度に到達するまで成長させた（約４時間）。これらの細胞を回転させ（１０分間、５０００×ｇ）、５００ｍｌの無菌Ｈ２Ｏ中に再懸濁した（２回繰り返した）。これらの細胞を再び回転させ、１０％のグリセリンを含有する無菌のＨ２Ｏ３ｍｌ中に再懸濁させた。４０μｌの細胞をエッペンドルフチューブ中に分け、エレクトロポレーションのために直接に使用するか、または将来使用するために−８０℃で貯蔵した。エレクトロポレーションは、〔ボウアー等、「Nucl. Acid. Res.」１９８８年、１６：６１２７〜６１４５頁〕に従って実施した。パルス発生機を、この試料チャンバーと平行に、２５μＦのギャパシター、２．５ｋＶおよび２００オームに設定した。
Ｇ．ｐＣＧＯＢＰＩＬＴによるニコシアナ  タバクム（タバコ）の形質転換
ｐＣＧＯＢＰＩＬＴを含有するＥＨＡ１０１を使用して、タバコリーフディスクを形質転換した。８〜１０センチメーターの長さのタバコ葉を、温室で成長させた植物から採取し、７０％エタノール中で２０分間無菌化し、次いで（「Ｊａｖｅｘ」のような）１０％漂白剤中で８分間無菌化した。次いで、これらの葉を無菌水中で６回洗浄した。この葉のエッジおよび主脈を、この葉から切開し、残った葉片を、５×７ｍｍの四角片または直径５ｍｍの円板へと分割した。約３０のリーフディスクを回収し、小さなペトリ皿中へと配置した。次いで、このアグロバクテリウム溶液を、このタバコディスク上へと注ぎ、９分間培養を生じさせた。次いで、これらの葉片を無菌ワットマン濾紙上でブロッティングし、背軸面側を下にして媒体Ｉ（ＭＳ、３％しょ糖および２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ）上に配置した。共存培養を、続く４８時間の間進行させた。この点で、これらのリーフディスクを、選択培地（ＭＤ、３％しょ糖、２．５ｍｇ／ｌ  Ｂａ、０．１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、および１００ｍｇ／ｌ  カナマイシン）上へと移し、ここでこれらを次の４週間残留させた。いったん苗条が現れはじめると、これらを切開し、根付き培地（ＭＳ、３％しょ糖、０．１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、および５０ｍｇ／ｌ  カナマイシン）上へと配置した。十分に根が形成された後に、このタバコ植物を土壌へと移した。
Ｈ．ｐＣＧＯＢＰＩＬＴによる「Ｂ．ｎａｐｕｓ」の形質転換
「Ｂ．ｎａｐｕｓ」の形質転換を、〔モロニー等「Plant cell Rep. 」１９８９年、８：２３８〜２４２頁〕（この開示を参照して本明細書中に包含する）に従って実施した。
【００７９】
形質転換手順
バイナリープラスミドを含有するアグロバクテリウム  ツメファシエンス株ＥＨＡ１０１の単一のコロニーを、終夜２８℃でＡＢ培地中で成長させた。この懸濁液の５０μｌの試料を、適当な抗生物質を補充したＭＧ／Ｌ培養液５ｍｌ中で終夜２８℃で成長させた。この細菌懸濁液を、遠心分離によって１５分間、１００００×ｇでペレット化し、次いで３％しょ糖を含有するｐＨ５．８のＭＳ培地中１０ｍｌ中に再懸濁させた。この懸濁液の薄膜を使用して、５ｃｍのペトリ皿の底を覆った。切開した各子葉を、上記したプレートから採取し、これらの葉柄の切断面を、この細菌懸濁液中に数秒間浸漬させた。これらを、採取したところから直ちに同じＭＳ培地中へと戻した。この子葉を、アグロバクテリウムによって、７２時間共存培養した。フィーダー層は使用しなかった。
【００８０】
共存培養の後、これらの子葉を、２０μＭのベンジルアデニン、３％のしょ糖、０．７％のｐＨ５．８の生理寒天、５００ｍｇ／ｌのカルベニシリン（「ピオペンアイエルスト：Pyopen Ayerst 」および１５ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン（ボリンゲル社マンハイム）を補充したＭＳ培地を含有する再生培地へと移した。再び、これらの葉柄を、深さ２ｍｍの寒天中に慎重に埋め込んだ。平板密度は、プレート当たり１０個の植物片に維持した。密度が高いと、再生頻度が減少する。
【００８１】
選択および植物の再生
この植物片を、光下および特定の温度条件下で２〜３週間以上、再生培地上で保持した。この時間の間、多くの苗条が、この植物片の半分以上の上に、比較的に小さなカルス生成と共に現れた。これらの苗条の幾つかは、４週間の培養で、漂白を受ける。残留する緑苗条を、再生培地と同じものからベンジルアデニンを除いた苗条伸長培地上へと継代培養した。この培地上での１または２週間によって、生成した苗条クラスターからの頂芽の優性の確立が可能となった。ここに由来する苗条は、ＭＳ培地、３％しょ糖、２ｍｇ／ｌのインドールブチル酸、０．７％の生理寒天および５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含有する「根付き」培地に移した。この段階ではカナマイシンは使用しなかったのは、選択剤なしに一層急速に根付きが生ずる一方、ごく僅かの「逸出植物」が、再生および苗条伸長培地上で２ラウンド目の選択の後に、根付きの際に実際に継代したことを見いだしたからである。
Ｉ．タバコおよび「B.napus 」ゲノム中のＯＢＰＩＬＴの安定な組み込み
推定上の形質発現植物を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性について試験した。この活性を示す植物からのゲノムＤＮＡを分離した。サザンブロッティングを実施することによって、Ｔ−ＤＮＡ周辺の間の配列（ＯＢＰＩＬＴおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）が、タバコおよび「B.napus 」ゲノム中へと、安定に組み込まれたことを示した。このタバコサザンを、「Ａ．thaliana」オレオジン遺伝子、およびこのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を用いて試験した。この「B.napus 」サザンを、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を用いて試験した。
Ｊ．タバコ植物中でのオレオジン−ＩＬ−１−β融合体の形質発現
形質転換されたおよび形質転換されていない植物から得られた成長中の胚から、ＲＮＡを分離した。遺伝子プローブとして「Ａ．thaliana」オレオジンを使用して、ノザンブロッティングを実施した。すべての試験した形質転換植物において、８５０ｎｔの転写産物を検出することができた。これらの転写産物の寸法は、オレオジン−ＩＬ−１−βの予期された寸法に対応している。これらの転写産物は、形質転換されていない植物中では検出できなかった。
Ｋ．オレオジン−ＩＬ−１−βタンパク質の蓄積
油体タンパク質を、形質転換されたタバコ種子〔ホルブルック等、１９９１年「Plant Physical」９７：１０５１〜１０５８頁〕から分離した。ＰＡＧＥを実施し、タンパク質をこのゲルからＰＶＤＦ膜へと移した。「B.napus 」の２２ｋＤａのオレオジンに対して成長した抗体を使用して、このタバコ種子中のオレオジン−ＩＬ−１−β融合体を検出した。この抗体は、「B.napus 」および「Ａ．thaliana」中の主要なすべてのオレオジンを認識する。更に、この抗体は、タバコオレオジンを認識する。タバコオレオジンは、「Ａ．thaliana」および「B.napus 」オレオジンとは、異なる寸法を有している。この形質転換されたタバコ種子中においては、抗２２ｋＤａ抗体は、形質転換されていないタバコ種子中に存在しない２０ｋＤａのタンパク質を認識した。このオレオジン−ＩＬ−１−β融合体の予期された寸法は、２０．１ｋＤａである。これらの結果の要約を、表２に示す。
【００８２】
油体タンパク質に接合した目的のペプチド、またはその相当部分を形質発現させて、油体の入手をもたらすことによって、この目的のペプチドを、容易に精製して他の細胞成分が実質的にないようにすることができる。この融合タンパク質は、精製につづいて開裂させることができ、または開裂なしに使用することができる。この主題の方法および組成物は、目的のポリペプチドを精製するための、早く、簡単な方法をもたらす。
【００８３】
本明細書で引用したすべての出版物および特許出願を、それぞれの各出版物および特許出願が、参照によって包含されるものと特別に各々指定されている場合と同じ程度に、ここで参照として包含する。
【００８４】
ここで、本発明を詳細に説明したが、本分野で通常の知識を有する者であれば明らかであろうように、添付した特許請求の範囲の思想および範囲から離れることなく、本発明に対して多くの変更および修飾を加えることができる。
【００８５】
【表２】
2005013236.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１Ａ−１】「Arabidopsis thaliana」からの油体タンパク質遺伝子（オレオジン）のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配列（１７ｋＤａのタンパク質）を示す。
【図１Ａ−２】「Arabidopsis thaliana」からの油体タンパク質遺伝子（オレオジン）のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配列（１７ｋＤａのタンパク質）を示す。
【図１Ｂ】にんじんからの１６ｋｄの油体タンパク質、トウモロコシからの１８ｋｄおよび１６ｋｄの油体タンパク質および「Arabidopsisthaliana」からの１７ｋｄの油体タンパク質の配列の比較を示しており、このタンパク質の保存および分岐領域を示す。
【図２】外来ペプチドを暗号化する遺伝子による油体タンパク質遺伝子の融合のために使用する構成体を示す。
【図３】Ｃ−末端融合の構成体についての詳細な配置を示す。
【図４】融合ペプチドベクターの構成、これらの植物中への導入および続く抽出と所望の組換えペプチドの測定の方法を図式的に示している。
【図５】ｐＣＧＯＢＰＩＬＴの構成の概略図を示す。
【図６】オリゴヌクレオチドＧＶＲ１１のデザインを示す。
【図７】ＯＢＰＩＬＴのヌクレオチド配列を示す。
【図１Ａ−１】
2005013236.tif 000011
【図１Ａ−２】
2005013236.tif 000012
【図１Ｂ】
2005013236.tif 000013
【図２】
2005013236.tif 000014
【図３】
2005013236.tif 000015
【図４】
2005013236.tif 000016
【図５】
2005013236.tif 000017
【図６】
2005013236.tif 000018
【図７】
2005013236.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月13日(2004.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
【図１Ａ】「Arabidopsis thaliana」からの油体タンパク質遺伝子（オレオジン）のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配列（１７ｋＤａのタンパク質）を示す。
【図１Ｂ】にんじんからの１６ｋｄの油体タンパク質、トウモロコシからの１８ｋｄおよび１６ｋｄの油体タンパク質および「Arabidopsisthaliana」からの１７ｋｄの油体タンパク質の配列の比較を示しており、このタンパク質の保存および分岐領域を示す。
【図２】外来ペプチドを暗号化する遺伝子による油体タンパク質遺伝子の融合のために使用する構成体を示す。
【図３】Ｃ−末端融合の構成体についての詳細な配置を示す。
【図４】融合ペプチドベクターの構成、これらの植物中への導入および続く抽出と所望の組換えペプチドの測定の方法を図式的に示している。
【図５】ｐＣＧＯＢＰＩＬＴの構成の概略図を示す。
【図６】オリゴヌクレオチドＧＶＲ１１のデザインを示す。
【図７】ＯＢＰＩＬＴのヌクレオチド配列を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2005013236.tif 000020
【図１Ｂ】
2005013236.tif 000021
【図２】
2005013236.tif 000022
【図３】
2005013236.tif 000023
【図４】
2005013236.tif 000024
【図５】
2005013236.tif 000025
【図６】
2005013236.tif 000026
【図７】
2005013236.tif 000027