(57)【要約】【課題】架橋剤を使用せず、十分な安定性と止血性を併せ持ち、かつ哺乳類由来コラーゲンやゼラチンが潜在的に有する病原体の危険性の少ない止血材を、魚類由来コラーゲンを用いて提供する。【解決手段】魚類由来コラーゲンとその熱変性物との混合物を、架橋剤を用いない方法で架橋処理して得られ、３７℃のカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝食塩水に対する溶解性が７０％未満である成形体は、良好な止血性と適度な生体内安定性を有し、止血材として好適に用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類由来コラーゲンとその熱変性物との混合物を、架橋剤を用いない方法で架橋処理して得られる成形体。
【請求項２】
カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に対する溶解性が７０％未満である請求項１に記載の成形体。
【請求項３】
紫外線またはγ線を用いて架橋処理して得られる請求項２に記載の成形体。
【請求項４】
加熱により架橋処理して得られる請求項２に記載の成形体。
【請求項５】
スポンジ状多孔体である請求項３または４に記載の成形体。
【請求項６】
綿状物である請求項３または４に記載の成形体。
【請求項７】
フィルム状である請求項３または４に記載の成形体。
【請求項８】
シートである請求項３または４に記載の成形体。
【請求項９】
止血材用である請求項１ないし８のいずれかに記載の成形体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコラーゲンとその熱変性物からなる止血材等として有用な成形体に関する。
具体的には、魚類由来コラーゲンとその熱変性物との混合物に特定の架橋処理を施すことにより作成した、安定性、血小板接着性および安全性に優れた成形体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
外科手術時における毛細血管出血や血管吻合部からの出血に対し、従来から各種止血材が用いられてきた。止血材には血液凝固反応を惹起させ血栓形成を促進する性質が要求される。また、止血後に除去の必要な止血材を用いた場合、再度血液が滲出してくることがあるため、使用された止血材は生体内分解作用により徐々に消失することが望ましい。これらの理由から、生体内止血機構の一つである一次止血に関与し、かつ生体親和性に優れるコラーゲンあるいはその変性物であるゼラチンが止血材として好ましく用いられてきた。
【０００３】
現在実用化されているゼラチン製止血材には、スポンジ、粉末、あるいはフィルム状に成形した架橋ゼラチンがある。コラーゲン製止血材には、シートや粉末状に成形した微線維性コラーゲン塩酸塩がある。しかし、上記ゼラチン製止血材は止血性に優れるものの安定性が十分でない場合があった。また、上記コラーゲン製止血材は安定性に優れるものの止血性が十分でなく、シートにすると剛直になり、粉末にすると静電気により飛散しやすく、操作性に難のある場合があった。
【０００４】
前記の欠点を解決すべく、コラーゲンあるいはゼラチン止血材の操作性あるいは止血性の改良を目指した更なる研究が行われてきた。操作性を向上させるためにコラーゲンを綿状に加工した止血材が開示されている（人工臓器１９（３），１２３５（１９９０）（非特許文献１））、架橋処理を施していないために止血時における安定性が不十分であり、良好な止血性が得られない場合があった。また、特開平７−１６３８６０公報（特許文献１）にはゼラチンとポリアニオンをカルボジイミドで架橋したゼラチンゲルが開示されている。該ゼラチンゲルは良好な接着性を有するため止血材としての有効性が示唆されている。しかしカルボジイミド等架橋剤の多くはコラーゲンの止血能を左右すると言われるフリーアミノ基をマスクする上、残留架橋剤を除去する手間がかかるという難点があった。更に、特開平８−１９６６１４号公報（特許文献２）には安定性と止血性をあわせ持つ綿状架橋コラーゲン繊維が開示されている。しかし、この止血材は牛皮由来コラーゲンを用いており、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）を引き起こす異常プリオンに代表される各種病原体の存在を否定できないという問題点があった。
【０００５】
コラーゲンは、少なくとも部分的にコラーゲン螺旋構造を有するタンパク質あるいは糖タンパク質と定義される。グリシン残基が３個目ごとに、またその他のアミノ酸残基としてプロリン残基、ヒドロキシプロリン残基が高頻度に存在するペプチド鎖の３重らせん（コラーゲン螺旋）を形成する。
コラーゲンは無脊椎動物あるいは脊椎動物の組織、特に皮膚から多く抽出することができる。
コラーゲンには構造の違いによって１９種類の型の存在が報告されており、さらに同じ型に分類されるコラーゲンにも数種類の異なる分子種が存在する場合がある。
【０００６】
中でも、Ｉ、ＩＩおよびＩＶ型コラーゲンが主にバイオマテリアルの原料として用いられている。Ｉ型はほとんどすべての結合組織に存在し、生体内に最も多量に存在するコラーゲン型である。特に腱、真皮および骨に多く、工業的にはこれらの部位から抽出される場合が多い。ＩＩ型は軟骨を形成するコラーゲンであり、ＩＶ型は基底膜を形成するコラーゲンである。ＩおよびＩＩ型はコラーゲン線維を形成する能力を有し、試験管内でコラーゲン線維構造を回復させることができる。ＩＶ型は線維形成能力を有しないが、基底膜における細胞分化に関与しているとされる。
【０００７】
コラーゲンに熱を加えると分子量１０万程度のポリペプチド鎖３本から成るコラーゲンの三重らせん構造がほぐれ、それぞれのポリペプチド鎖がランダムコイル状の熱変性物を与える。そのような構造変化を起こす温度は変性温度と呼ばれ、熱変性物はゼラチンと呼ばれる。コラーゲンの変性温度は溶液状態の時に最も低くなり、由来する生物の生活環境温度に対応すると言われている。哺乳類では３７℃前後、魚類はおおむね哺乳類よりも低く、寒流系の魚類では２０℃を下回る場合もある。ゼラチンはコラーゲンに比べ水溶性が高い他に、生体内プロテアーゼによる分解を受けやすいことが知られている。
【０００８】
上記の如き特徴から魚類由来コラーゲンは生体内において不安定である考えられ、バイオマテリアルあるいは医療材料の原料としてはほとんど注目されてこなかった。しかし、現状の主なコラーゲン供給源であるウシ、ブタなどの家畜が潜在的に有している病原体が伝播して供給が停止する可能性や、製品を用いる人間に対して病原体が感染する可能性が低いという利点がある。
【０００９】
【非特許文献１】
人工臓器１９（３），１２３５（１９９０）
【特許文献１】
特開平７−１６３８６０公報
【特許文献２】
特開平８−１９６６１４号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のコラーゲン製あるいはゼラチン製止血材が有する課題を同時に解決する止血材を提供することを目的としている。すなわち、架橋剤を使用せず、十分な安定性と止血性を併せ持ち、かつ哺乳類由来コラーゲンやゼラチンが潜在的に有する病原体伝播の危険性の少ない止血材を、魚類由来コラーゲンを用いて提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこのような状況に鑑み、前記問題点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果、魚類由来コラーゲンおよびその熱変性物の混合物に、架橋剤を用いないで架橋処理を施した成形体が前記問題点を同時に解決することを見出し、本発明をするに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記の魚類由来コラーゲンおよびその熱変性物との混合を架橋剤を用いない架橋方法により安定化した成形体を提供するものである。
１．魚類由来コラーゲンとその熱変性物との混合物を、架橋剤を用いない方法で架橋処理して得られる成形体。
２．カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に対する溶解性が７０％未満である前記１に記載の成形体。
３．紫外線またはγ線を用いて架橋処理して得られる前記２に記載の成形体。
４．加熱により架橋処理して得られる前記２に記載の成形体。
５．スポンジ状多孔体である前記３または４に記載の成形体。
６．綿状物である前記３または４に記載の成形体．
７．フィルム状である前記３または４に記載の成形体。
８．シートである前記３または４に記載の成形体．
９．止血材用である前記１ないし８のいずれかに記載の成形体。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明における魚類由来コラーゲンとは、魚類から抽出されるコラーゲンであれば特に限定されない。収量等の観点から、魚皮から得られるＩ型コラーゲン、またはＩ型コラーゲンを主成分とする各型コラーゲンの混合物が好ましく用いられる。本発明の目的を達成できる範囲で、該コラーゲンの物理化学的性質を変化させるべく公知の化学修飾を施しても良い。化学修飾としてはメチル化、スクシニル化、アセチル化などが挙げられる。既知の如く、コラーゲン分子はその両末端にテロペプチドと呼ばれる螺旋構造を持たないペプチド鎖が存在する。この中には１２〜２７個のアミノ酸残基を含んでおり、コラーゲンの抗原性はこの部分によって発現すると言われている。そのため、本発明における魚類由来コラーゲンもテロペプチドを取り除くことが好ましい。テロペプチドはペプシン等のたんぱく質分解酵素により公知の方法で取り除くことができる。
【００１４】
本発明において使用する魚類はその種類について特に限定されるものではない。しかし、希少な種ではコラーゲンの安定供給が困難であることと、水産加工工程で発生する大量の魚皮が水産廃棄物として処理されている現状に鑑み、これらの廃棄物を新たな資源として有効利用するという観点から水産廃棄物として発生する魚皮を用いることが好ましい。
【００１５】
前述の通り、コラーゲンに熱を加えるとコラーゲンの三重らせん構造がほぐれ、それぞれのポリペプチド鎖がランダムコイル状の熱変性物（ゼラチン）を与える。熱変性したコラーゲンは必ずしも完全に三重らせん構造を失っているわけではなく、中性水溶液中、変性温度以下で部分的に三重らせん構造を回復する場合がある。本発明におけるコラーゲンの熱変性物とは、加熱することによりコラーゲンらせん構造を少なくとも部分的に失ったコラーゲンを意味する。該熱変性物は、コラーゲン水溶液を加温することにより、あるいはコラーゲン乾燥体を加温した水に直接溶かすことにより得ることができる。本発明においては、コラーゲンサスペンション（コラーゲンが不完全に溶解した状態で溶媒中均一に分散している状態）も水溶液として扱う。
【００１６】
コラーゲン水溶液の濃度は０．１〜１．０（ｗ／ｖ）％の範囲であることが好ましい。より好ましくは０．２〜０．５（ｗ／ｖ）％である。コラーゲン水溶液の濃度が低すぎると、得られる成形体がスポンジ状あるいは綿状の場合は粗になり、フィルム状の場合は薄くなるために、扱いにくくなる場合や、止血性を十分に発揮できなくなる場合がある。コラーゲン水溶液の濃度が高すぎると、粘度が高くなり扱いが困難になる場合がある。水溶液のｐＨは、低すぎても高すぎてもコラーゲンの分解を引き起こす場合があり好ましくない。水溶液のｐＨは２．０〜１０の範囲が好ましい。
【００１７】
魚類由来コラーゲン熱変性物水溶液は、上記魚類由来コラーゲン水溶液を加熱処理することにより得ることができるし、魚類由来コラーゲン凍結乾燥物を加熱した溶媒に加えることにより得ることもできる。コラーゲン熱変性物水溶液の粘度に対する濃度依存性は、コラーゲン水溶液に比べ大幅に低く、コラーゲンよりも高濃度で水溶液を調製することができる。コラーゲン熱変性物濃度は０．１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲であることが好ましい。より好ましくは０．２〜５（ｗ／ｖ）％である。水溶液のｐＨはコラーゲン水溶液に準ずる。
【００１８】
本発明におけるコラーゲンとその熱変性物を混合する方法としては、コラーゲン水溶液と熱変性物水溶液を別途調製し、それらを混合して均一にする方法であれば特に限定されないが、コラーゲンの変性を防ぐため、両水溶液はコラーゲンの変性温度以下であることが望ましい。該水溶液のイオン強度や酸性度によってはコラーゲン分子が凝集して水溶液に濁りを生じさせたりゲル化したりする場合があるが、本発明の目的を達成できる限りは起こっても構わない。
【００１９】
本発明における架橋剤を用いない架橋方法は特に限定されないが、紫外線照射、γ線照射、真空下における加熱処理などの公知の方法を用いることができる。
【００２０】
加熱処理の場合、真空下で行わなければ架橋が生成しない。真空下であっても、温度が低すぎると架橋が生成せず、温度が高すぎると架橋は生成するもののコラーゲンのほとんどが変性してしまい好ましくない。具体的には、真空下、９０〜１６０℃の範囲で加熱処理することが好ましい。より好ましくは１００〜１４０℃である。なお、本発明における真空とは、気圧２０Ｐａ以下の減圧状態を指すものとする。
【００２１】
これらの架橋方法は、止血材の乾燥体を用途（使用目的）に合わせて、所望の形状に成形した後に行ってもよいし、紫外線照射あるいはγ線照射の場合、窒素等の不活性ガスで置換した前記コラーゲン／熱変性物水溶液に対して架橋処理を施してもよい。
窒素等の不活性ガスで置換せずに紫外線照射あるいはγ線照射を行うと、コラーゲンの変性あるいは切断が起こり好ましくない。
【００２２】
本発明における溶解性とは、下記の方法により止血材試験片を３７℃のカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（以下、ＰＢＳと略す。）に２日間浸漬した場合に溶出するコラーゲンペプチドの割合により求めた値（％）を言う。実際に生体内で使用した場合、コラーゲンおよびゼラチンは各種のタンパク質分解酵素による分解を受けるが、その際の安定性を本発明における溶解性によりおおむね見積もることができる。ゼラチンは水に対する溶解性が極めて高く、架橋処理を施さない場合は３７℃ＰＢＳに対して速やかに溶解する。一方、コラーゲンは特有の３重らせん構造によってゼラチンよりも水に対する溶解性は低いが、架橋処理を施さない場合は３７℃ＰＢＳに対して徐々に溶解する。魚類由来コラーゲンは変性温度が低く、哺乳類由来コラーゲンよりも溶解性が高い。
【００２３】
止血剤は溶解性が高すぎると、出血部に適用した際、止血が成される前に止血材が溶け出してしまい好ましくない。本発明の止血材では溶解性は７０％未満が好ましく、より好ましくは５０％未満である。
【００２４】
本発明のスポンジ状多孔体は、コラーゲン／熱変性物水溶液を型に流し込んだ後、凍結乾燥により成形して得られるものであれば特に限定されない。空孔サイズを制御するために、本発明の効果を阻害しない範囲でポリエチレングリコールや流動パラフィンなど無毒性の添加物を加えてもよい。また、空孔サイズはコラーゲン／  熱変性物水溶液の濃度、凍結時の温度などにより制御可能である。本発明のスポンジ状多孔体は、乾燥状態でも十分に柔軟性を有するが、患部の形状に合わない場合は各種溶液に膨潤させて用いることができる。該溶液は精製水や生理食塩水などの水溶液が好ましく用いられるが、それに血液凝固を促進する物質を含ませることもできる。
血液凝固を促進する物質としては、例えば、フィブリン、トロンビン等が挙げられる。
【００２５】
本発明において、綿状物はコラーゲン／熱変性物水溶液の紡糸により得られる綿状成形体であれば特に限定されないが、凝固液中に射出して紡糸する公知の湿式紡糸法により作成した綿状成形体が好ましく用いられる。凝固液としては、エタノール等の極性有機溶媒、塩濃度の高い中性水溶液、アルカリ水溶液が好ましく用いられる。本発明の綿状物は、乾燥状態でも十分に柔軟性を有するが、患部の形状に合わない場合はスポンジ状多孔体と同様の方法で各種溶液に膨潤させて使用することができる。
【００２６】
本発明において、フィルムとは、厚さ１００μｍ未満の薄膜状成形体を言う。フィルムの製造法は特に限定されるものではないが、風乾あるいは溶媒キャスティング法により作成したフィルムが好ましく用いられる。本発明のフィルムは、乾燥状態でも十分に柔軟性を有するが、患部の形状に合わない場合はスポンジ状多孔体と同様の方法で各種溶液に膨潤させて使用することができる。
【００２７】
本発明において、シートとは、厚さ１００μｍ以上のシート状成形体を言う。シートの製造法は特に限定されないが、（１）本発明の綿状物をプレス等によりシート状に成形する方法、（２）型に流し込んだコラーゲン溶液あるいはダイから押し出したコラーゲン溶液を凝固相中で固化させる方法、（３）本発明のスポンジ状多孔体をプレス等によりシート状に成形する方法により作成したシートが好ましく用いられる。
【００２８】
本発明における成形体には、本発明で目的とする効果を阻害しない範囲で他の天然高分子などが加えられても構わない。天然高分子としてはアルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、フィブリンなどが挙げられる。
【００２９】
本発明における成形体は止血材として好適に用いることができるが、本発明の成形体が有する良好な安定性、血小板接着性および安全性を利用する用途であれば特に限定されない。具体的には、生体接着剤、閉鎖材、創傷被覆材等の用途が挙げられる。
【００３０】
以下に本発明を、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例によって限定されるものではない。
【００３１】
【実施例】
１．魚類由来コラーゲンの抽出および精製：
室温下、サケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  Ｋｅｔａ）の皮をクロロホルム／メタノール混合溶媒に３回浸して十分に脱脂した後、皮に含まれるクロロホルムをメタノールで洗浄し、さらに水で洗浄してメタノールを除去した。脱脂皮約１３０ｇを３リットルの０．５Ｍ酢酸溶液に加え、４℃で３日間静置抽出した。膨潤した鮭皮をガーゼでろ過して除き、ろ液を１０，０００Ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、鮭皮の破片などを沈殿させた。１００，０００Ｇ、４℃で３０分間超遠心分離した。
【００３２】
上清にペプシン３０ｍｇを加え、４℃で撹拌しながら２日間ペプシン消化した。ついで、５％塩化ナトリウムにて２４時間塩析し、１０，０００Ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清は捨てて、コラーゲン残渣を０．５Ｍ酢酸溶液に４℃、２日間溶解した後、５％塩化ナトリウムにて２４時間塩析する操作を２回繰り返した。
得られたコラーゲンの０．５  Ｍ酢酸溶液を透析膜に入れ、脱イオン水に透析し、完全中性化したコラーゲン溶液を凍結乾燥した。
【００３３】
２．魚類由来コラーゲンおよびその熱変性物水溶液の調製：
魚類由来コラーゲン凍結乾燥物の質量を測り、４℃、ｐＨ３希塩酸水溶液に０．４（Ｗ／Ｖ）％になるように加え、撹拌しながら完全に溶解させ、魚類由来コラーゲン水溶液を得た。
また、この魚類由来コラーゲン水溶液を約６０℃に加温して魚類由来コラーゲン熱変性物水溶液は、魚類由来コラーゲン熱変性物水溶液を得た。
【００３４】
３．止血材試験片の作成
上記魚類由来コラーゲン水溶液および魚類由来コラーゲン熱変性物水溶液を適宜、混合、撹拌し、プラスチック製細胞用ディッシュに流し込み、乾燥剤入りデシケーター中で乾燥してフィルムに成形した。流し込む水溶液量はフィルム厚みが約１０μｍになるように調整した。乾燥後、２５４ｎｍ単波長紫外線を強度０．１７ｍＷ／ｃｍ２で２４時間照射し、約１ｃｍ２の大きさに切り取り止血材試験片とした。
【００３５】
４．止血性の測定
止血性は、以下の方法で血小板接着性を測ることにより評価した。
すなわち、採血管（テルモ製、ベノジェクトＩＩ真空採血管；３．１３％クエン酸ナトリウム０．５ｍｌ含有）を用いてヒト静脈血（２３歳男子）を採取し、１時間以内に３００Ｇで１０分間遠心し、上清をＰｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ（以下、ＰＲＰと略記する。）とした。
プラスチック製細胞用ディッシュ上で、止血材試験片約１ｃｍ２にＰＲＰを０．０４ｍｌ滴下した、３７℃、ＣＯ２濃度５％で２時間インキュベートした。
ついで、止血材試験片をＰＢＳで３回洗浄して未接着の血小板を除去した後、２．５％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳに２４時間浸漬し、コラーゲンを十分に固定化した後、止血材試験片をＰＢＳで３回洗浄した。この洗浄後の止血材試験片を１０、２０、５０、７５、９０、９５、９９．５（ｖ／ｖ）％エタノールに順次浸漬して脱水し、更に酢酸イソアミルに３０分間、２回浸漬してエタノールを酢酸イソアミルに置換し、ＣＯ２使用の臨界点乾燥で止血材試験片を乾燥した。乾燥止血材試験片にイオンコーターを用いて金蒸着し、走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭ）を用いて２５，０００倍の倍率で１０視野を観察し、１視野当たりの平均血小板数を求めて血小板接着数（個）とした。
【００３６】
５．溶解性の測定：
止血材試験片を、五酸化リン入りデシケーター中にて室温で２４時間減圧乾燥後、精秤して試料質量とした。
試験片を１０倍量のＰＢＳに浸漬させ、３７℃で２日間静置し、上清をポアサイズ０．４５μｍメンブランフィルターでろ過した。同様の操作で濃度を変えて精秤したコラーゲンの水溶液を６０℃で１時間加熱して、熱変性コラーゲン（ゼラチン）水溶液とし、これらゼラチン水溶液を用いて２４６ｎｍの吸光度とゼラチン濃度の検量線を作成した。
試験片ろ液について２４６ｎｍの吸光度を測定し、検量線に当てはめることによりろ液中のゼラチン濃度を定量し、ゼラチン濃度と試料質量から溶解性（％）を求めた。
【００３７】
実施例１
前述の方法で調製した魚類由来コラーゲン水溶液および魚類由来コラーゲン熱変性物水溶液を、コラーゲン水溶液：コラーゲン熱変性物水溶液（容積比）＝８０：２０の割合になるように混合し、前述の方法で止血材試験片の作成、止血性の測定および溶解性の測定を行った。結果を表に示す。
【００３８】
実施例２
容積比をコラーゲン水溶液：コラーゲン熱変性物水溶液＝４０：６０に変更したこと以外は、実施例１と同様に止血材試験片の作成、止血性の測定および溶解性の測定を行った。結果を表に示す。
【００３９】
実施例３
容積比をコラーゲン水溶液：コラーゲン熱変性物水溶液＝２０：８０に変更したこと以外は、実施例１と同様に止血材試験片の作成、止血性の測定および溶解性の測定を行った。結果を表に示す。
【００４０】
比較例１
容積比をコラーゲン水溶液：コラーゲン熱変性物水溶液＝１００：０に変更したこと以外は、実施例１と同様に止血材試験片の作成、止血性の測定および溶解性の測定を行った。結果を表に示す。
【００４１】
比較例２
容積比をコラーゲン水溶液：コラーゲン熱変性物水溶液＝０：１００に変更したこと以外は、実施例１と同様に止血材試験片の作成、止血性の測定および溶解性の測定を行った。結果を表に示す。
【００４２】
【表１】
2005013457.tif 000002
【００４３】
【発明の効果】
本発明の魚類由来コラーゲンとその熱変性物から得られる成形体は、表に示した通り良好な止血性と適度な生体内安定性を有し、止血材として好適に用いることができる。