(57)【要約】【課題】  本発明は、毛周期の脱毛機構に関与する因子を見出し、皮膚の脱毛状況の予知方法の提供、さらには従来にない全く新規、且つ効果的な育毛剤の提供を課題とする。【解決手段】  第一の観点において、本発明は、頭髪の抜け易さ及び／又は細毛化を予知するための頭皮検査方法を提供する。この方法は、頭皮中のＭＭＰ−１１の発現が正常な頭皮中の発現に比べて亢進している場合、頭髪が抜け易い及び／又は細毛化し易い状態にあると判断することを特徴とする。【選択図】      図１
2005308730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
頭髪の抜け易さ及び／又は細毛化を予知するための頭皮検査方法であって、頭皮中のマトリックスメタロプロテアーゼ１１（ＭＭＰ−１１）の発現が正常な頭皮中の発現に比べて亢進している場合、頭髪が抜け易い及び／又は細毛化し易い状態にあると判断することを特徴とする、頭皮検査方法。
【請求項２】
前記頭皮中のＭＭＰ−１１の発現の亢進が、頭皮中のＭＭＰ−１１の量を測定することにより決定される、請求項１記載の頭皮検査方法。
【請求項３】
前記測定がＭＭＰ−１１に特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法による、請求項２記載の頭皮検査方法。
【請求項４】
前記頭皮中のＭＭＰ−１１の発現の亢進が、頭皮から抽出されたＭＭＰ−１１をコードするmRNAの量を測定することにより決定される、請求項１〜３のいずれか１項記載の頭皮検査方法。
【請求項５】
前記mRNAの測定をポリメラーゼ連鎖反応法により行う、請求項４記載の頭皮検査方法。
【請求項６】
育毛剤をスクリーニングする方法であって、ＭＭＰ−１１の発現及び／又は活性を阻害する薬剤を育毛剤として選定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項７】
更に、前記阻害能力を有する候補薬剤を毛周期同調モデル動物に適用し、育毛効果を有する候補薬剤を選定することを含んで成る、請求項６記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ１１（ＭＭＰ−１１）を指標とした頭皮の毛の抜け易さ、細毛化のし易さについて予知する検査方法、さらには育毛剤のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪は美的外観上極めて重要視される。従って、先天的又は後天的要因による脱毛は多くの人々、特に男性にとって深刻な悩みである。特に高齢化社会、ストレス社会といわれる現代社会では、頭部毛髪が様々な後天的な原因により、脱毛の危機にさらされる機会がますます多くなってきている。これに対応して、発毛や毛髪の太毛化の促進を含む育毛効果を発揮するより優れた育毛剤を提供すべく、毛包に関する研究をはじめ、様々な試みがなされているが、未だ的確な処理、治療方法が見出されるに至っていない。
【０００３】
毛包は皮膚の付属器官の一つで一定の周期をもって常に生え変わり、自己再生を繰り返す能力をもつ器官として特徴付けられる。毛包は皮膚外部に露出したいわゆる毛髪と、皮膚真皮に埋没した毛幹を生み出す元になる毛根鞘や毛母細胞、毛乳頭細胞などから形成されている。発生学的には皮膚−真皮の相互作用により毛包原基が形成され、下部方向に皮膚が伸長することで毛包は形成される（成長期）。発生の最終段階として毛幹の伸長は一定期間継続するが、やがて停止し、アポトーシスによって毛根鞘、毛母細胞の部分が退縮に向かう（退行期）。この一連の過程で、真皮奥深くまで伸長していた毛包は皮膚近くまで短くなり、毛乳頭のサイズも小さくなる。やがて休止期を経て、再び毛母細胞は活性化され新しい周期の成長期へと向かう。この周期がほぼ一生を通じて繰り返される（毛周期）。
【０００４】
このような毛周期の発毛、脱毛機構などには多数の因子が複雑に関与、機能しているものと考えられている。毛周期へのケラチン関連タンパク質やアポトーシス関連酵素、例えばカスパーゼの関与は知られているが、未だ関与の知られていないその他多数のタンパク質、遺伝子が存在しているものと考えられ、その詳細な解明が期待される状況下にある。
【非特許文献１】M. Naganuma et al., Journal of Dermatological Science 25(2001) 29-35
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、毛周期の脱毛機構に関与する因子を見出し、皮膚の脱毛状況の予知方法の提供、さらには従来にない全く新規、且つ効果的な育毛剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、毛周期の脱毛機構などに関与する因子の網羅的な解析を試みた。詳しくは、本発明者はワックス脱毛を同時に施すことで毛周期を同調させた数匹のマウスについて、ワックス脱毛を施して２１日目の毛周期が退行期に移行した毛包（以下、「退行期毛包」と称する場合がある）を多数有する皮膚由来のＲＮＡのマイクロアレイ解析の結果、ワックス脱毛を施していないコントロールマウスの毛包（以下、「休止期毛包」と称する場合がある）を多数有する皮膚由来のＲＮＡのマイクロアレイ解析結果と比べ、ＭＭＰ−１１の遺伝子の発現が特異的に亢進されていることを見出した。従って、ヒトの皮膚において、ＭＭＰ−１１の発現や活性を調べることで、脱毛し易い頭皮であるかどうか判断することが可能であることが明らかとなった。
【０００７】
ＭＭＰ−１１（別名ストロメライシン３）は亜鉛依存性の細胞外メタロプロテアーゼであり、変態期のカエルの小腸において、オタマジャクシの小腸細胞（上皮系細胞）のアポトーシス及び細胞の移動に必要とされることが判っている（「Requirement for Matrix Metalloprotease StromeLysin-3 in Cell Migration and Apoptosis during Tissue Remolding in Xenopus Laevis」Atsuko Ishizuka-Oka, et al., The Journal of Cell Biology, Vol.150, No.5, Sept.4 (2000) pp.1177-1188。）。またそれは癌間質細胞にも存在し、癌細胞の細胞死を制御する。ＭＭＰ−１１の基質としてα１−アンチトリプシンやインスリン成長因子結合タンパク質Ｉ（ＩＧＦ−ＢＰＩ）などが同定されているが、ＭＭＰ−１１は他のマトリックスメタロプロテアーゼとは異なり、細胞外マトリックスに対する活性をもたないことで知られている。このように、ＭＭＰ−１１に関する研究報告は相当数存在するが、ＭＭＰ−１１と毛包との関係、ましてや脱毛機構との関係を示唆する報告はない。従って、ＭＭＰ−１１の発現が毛周期の退行期において亢進することは当業者にとって予測できない事実である。
【０００８】
第一の観点において、本発明は、頭髪の抜け易さ及び／又は細毛化を予知するための頭皮検査方法を提供する。この方法は、頭皮中のＭＭＰ−１１の発現が正常な頭皮中の発現に比べて亢進している場合、頭髪が抜け易い及び／又は細毛化し易い状態にあると判断することを特徴とする。
【０００９】
好ましくは、頭皮のＭＭＰ−１１の発現の亢進は、頭皮中のＭＭＰ−１１の量を測定することにより決定される。さらに好ましくは、この測定はＭＭＰ−１１に特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法による。
【００１０】
また、上記頭皮中の遺伝子の発現の亢進は、頭皮から抽出されたＭＭＰ−１１をコードするmRNAの量を測定することにより決定されてもよい。好ましくは、上記mRNAの測定はポリメラーゼ連鎖反応法、特に定量ポリメラーゼ連鎖反応法により行う。
【００１１】
本発明はまた、ＭＭＰ−１１の発現及び／又は活性を阻害する薬剤を育毛剤として選定することを特徴とする育毛剤のスクリーニング方法を提供する。この方法は、候補薬剤をＭＭＰ−１１の発現及び／又は活性を亢進させる能力について評価し、当該亢進能力を有する候補薬剤を育毛剤として選定することを特徴とする。好ましくは、更に上記亢進能力を有する候補薬剤を動物モデル、例えば毛周期同調モデル動物に適用し、育毛効果を有する候補薬剤を選定する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、皮膚の脱毛や細毛化を予知するための頭皮検査方法や、新規育毛剤の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
上述の通り、ＭＭＰ−１１に関し、毛周期における毛包形成・毛幹形成への関連の報告はない。本発明者はワックス脱毛前の休止期毛包を多く含むコントロールとしての皮膚及びワックス脱毛後２１日目の退行期毛包を多く含む皮膚各々由来のＲＮＡのマイクロアレイ解析の結果、退行期毛包を多く含む皮膚においてＭＭＰ−１１遺伝子の発現が特異的に亢進されていることを見出した。ＭＭＰ−１１の発現の亢進が退行期に特異的に起こることを組織レベルで確認するため、本発明者は毛包周囲の組織におけるＭＭＰ−１１を特異的に免疫染色し、光学顕微鏡によりＭＭＰ−１１の発現について経時的に調べたところ、毛周期の成長期段階では発現が全く認められないのに対し、退行期初期では、一般に退行期初期から休止期初期にかけて現れる毛包の先端の結合組織鞘においてＭＭＰ−１１の局在的な発現が認められた。その発現は退行期中期及び退行期後期において一層顕著となった。各毛包が毛周期のどの段階にあるかは、「A Comprehensive Guide for the Accurate Classification of Murine Hair Follicles in Distinct Hair Cycle Stages」SvenMuller-Rover et al., The Journal of Investigate Dermatology Vol.117, No.1, July (2001) に記載の方法に従って判別した。退縮する毛球部を取り囲む結合組織鞘におけるＭＭＰ−１１の局在から、ＭＭＰ−１１は毛包に何らかのシグナルを伝達することで、毛包のアポトーシスを含む脱毛機構に関与することが考えられる。
【００１４】
このように、ＭＭＰ−１１は毛髪が抜けはじめ、また毛髪の細毛化が始まる毛周期の退行期において発現が特異的に亢進することが遺伝子レベル、組織レベルにおいて確認された。従って、ＭＭＰ−１を指標とすることで、頭皮の脱毛や細毛化のし易さを予知できるものと推認できる。また、ＭＭＰ−１１の発現を抑制したり、又はその活性を抑制することで、退行期毛包のアポトーシスなどを抑制し、毛を抜けにくしたり、細毛化を抑えたりするといった育毛効果を達成することができるものと推認できる。従って、ＭＭＰ−１１を指標とし、育毛効果を有する薬剤を効率良く見つけ出すことも可能となる。ここでいう育毛効果とは、頭髪の発毛促進、例えば毛髪の本数を増加、脱毛の抑制、毛髪の太毛化などを意味する。
【００１５】
毛周期同調マウス
８週齢前後のマウスの体毛は主に毛周期の休止期にある。これを脱毛ワックスによって除毛した場合、急激に休止期から成長期に移行し、毛が再生する。その際、皮膚の色はピンク色から灰青色になる。その後、成長期にあった毛は発毛開始から１０日目前後で退行期に移行し、その際、皮膚色は灰青色から再びピンク色になる。除毛処理後１９日目前後で退行期に入り、２１日目前後において退行期の後期を迎える。マウスの毛周期の個体差はあまりないため、複数のマウスにこのような脱毛ワックス処理を同時に施すことで、複数のマウス間で毛周期を同調させることができる（特開平９−２２１４１４号公報）。本発明において、退行期毛包を多数含む皮膚はワックス脱毛処理してから２１日目のマウスの皮膚とし、休止期毛包を多数含む皮膚はワックス脱毛を施す直前の皮膚とした。
【００１６】
毛の抜け易さ、細毛化のし易さを予知するための頭皮検査方法
本発明は、頭皮の毛の抜け易さ、細毛化のし易さを予知するための頭皮検査方法を提供する。この方法は、頭皮中のＭＭＰ−１１の発現がコントロール皮膚中のそれらと比べ亢進している場合、毛が抜けやすい又は細毛化し易い頭皮であると判断することを特徴とする。その評価基準として、例えば頭皮中のＭＭＰ−１１の発現がコントロール皮膚中のそれらと比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％以上亢進していたなら「毛が抜けやすい又は細毛化し易い頭皮である」と判断する、としてよい。コントロール皮膚としては、側頭部、後頭部など、健常に頭髪が形成される部分であってよい。
【００１７】
頭皮中のＭＭＰ−１１の亢進は、例えば頭皮中のＭＭＰ−１１の量を直接測定することにより決定することができる。好ましくは、この測定はＭＭＰ−１１に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。また、皮膚からRNAを抽出し、ＭＭＰ−１１をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。ＭＭＰ−１１をコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、例えばＮＣＢＩ  ＵｎｉｇｅｎｅデータベースＭｍ．４５６１において公表されている。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）により行われる。以上の他、ＭＭＰ−１１の酵素活性を測定することによりＭＭＰ−１１の発現量を測定することもできる。他に、ＭＭＰ−１１の発現はin situハイブリダイゼーション法やその酵素活性の測定を通じて決定することができる。
【００１８】
上述の通り、本発明は、退行期毛包を多く含む皮膚及び休止期毛包を多く含む皮膚由来のＲＮＡのマイクロアレイ解析の結果、休止期毛包皮膚と比べ、退行期毛包皮膚においてＭＭＰ−１１の発現が特異的に亢進されていることを見出したことに基づく。従って、頭皮中のＭＭＰ−１１の発現及び／又はその活性を抑えることで、育毛促進することができるものと推認される。
【００１９】
育毛剤のスクリーニング方法
本発明はさらに、育毛剤をスクリーニングする方法も提供する。この方法は、候補薬剤をＭＭＰ−１１の発現及び／又はその活性を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有する候補薬剤を育毛剤として選定することを特徴とする。
【００２０】
好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記阻害能力を有する候補薬剤をモデル動物、好ましくは毛周期同調モデル動物に適用し、育毛効果を有する候補薬剤を選定することを含んで成る。
【００２１】
上記育毛効果について確認する工程はこの候補薬剤をモデル動物、例えば毛周期同調マウスを利用して実施することができる。動物としてはマウスの他にラット、ウサギなど様々な動物が利用できる。好適な態様においては、この薬剤の溶液、例えば水溶液を調製してからモデル動物の皮膚に繰り返し塗布し、発毛や毛髪の太毛化を評価することで、上記育毛効果の有無を判定することができる。
【００２２】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
毛周期同調マウスの作製
Ｃ５７ＢＬマウス（８週齢）１７匹（ワックス脱毛後１日目の皮膚採取用：２匹、３日目：２匹、６日目：２匹、１３日目：３匹、１９日目：３匹、２１日目：３匹、２３日目：２匹）の背部皮膚（２ｃｍ×４ｃｍ）を脱毛ワックス（ＳＵＲＧＩ−ＷＡＸ）で同時に除毛処理し、毛周期の同調されたマウスを作成した。
【００２４】
皮膚からのＲＮＡ採取
マウス背部の皮膚全層を採取し、１センチ角に切断して液体窒素で凍結し破砕後、ISOGEN（日本ジーン社、メーカー推奨プロトコル）によりRNAを抽出、RNeasy（Qiagen社）により精製した。ワックス脱毛処理を施して、１日目、３日目、６日目、１３日目、１９日目、２１日目、２３日目のマウス由来の皮膚よりＲＮＡを採取した。コントロールとして、ワックス脱毛処理を施す直前のマウスの皮膚より、ＲＮＡを採取した。
【００２５】
マイクロアレイ用サンプルの反応
アジレントｃDNAマイクロアレイ用サンプル
サンプルの調製及びハイブリダイゼーションはアジレント社推奨プロトコルに準じた。トータルＲＮＡ10μgを、ｃDNAラベル化キット（アジレント社）を用いてラベル化ｃDNAを合成した。Qiaquick（Qiagen社,メーカー推奨プロトコル）にて精製後、Speed Vacにより溶媒を乾燥した。次に、マウスｃDNAマイクロアレイキット（アジレント社、G410A）を用いてハイブリダイゼーション後、スライドガラスを洗浄した。アジレント社スキャナーによりデータ読み取りを行った。
【００２６】
解析結果（ＭＭＰ−１１の発現変動）
約９，０００種の遺伝子の発現を網羅的に解析した結果、退行期毛包を含むワックス脱毛処理を施して１９、２１、２３日目の皮膚において、コントロール皮膚と比べ、ＭＭＰ−１１の発現がそれぞれ４．２倍、１０．９倍、９．５倍に亢進されていることが見出された。ワックス脱毛処理０日目を基準に、ＭＭＰ−１１の発現の経時的な変動の結果を図１に示す。図１から明らかなとおり、ＭＭＰ−１１の発現はマウスの毛周期の成長期ではほとんど変動しないが、毛周期の退行期初期（１９日目）から急激に亢進し、２１日目あたりでピークを迎えることがわかった。退行期毛包を多く含む皮膚においてＭＭＰ−１１の発現が亢進していることから、ＭＭＰ−１１を指標とすれば、将来脱毛し易い及び／又は細毛化し易い頭皮であるかどうか予知できることなる。
【００２７】
ＭＭＰ−１１の発現の顕微鏡観察
免疫組織染色（IHC）
ＭＭＰ−１１の発現の亢進が退行期に特異的に起こることを組織レベルで確認するため、毛包周囲の組織におけるＭＭＰ−１１を特異的に免疫染色し、光学顕微鏡によりＭＭＰ−１１の発現について経時的に調べた。詳しくは、ワックス脱毛処理を施して１３日目（主に成長期の毛包を含む）、２１日目（退行期初期、中期、後期の毛包を含む）のマウス由来の皮膚組織を中性ホルマリン固定、パラフィン包埋後、常法に従って組織切片を作成した。これを３％H2O2で20分処理後、20分ブロッキングし、1/50希釈の抗マウスMMP-11抗体(Santa Cruz ; Catalog No.C-20)を1昼夜反応させた。これを洗浄後、ビオチンつき二次抗体を反応させ洗浄、HRP標識ストレプトアビジンを反応させて洗浄、True Blueにより発色させ、包埋し、光学顕微鏡で観察を行った。
【００２８】
その結果、毛周期の成長期段階では発現が全く認められないのに対し、退行期では、一般に退行期初期から休止期初期にかけて現れる毛包の先端の結合組織鞘においてＭＭＰ−１１の局在的な発現が認められた。その発現は退行期中期及び退行期後期において一層顕著となった。退縮する毛球部を取り囲む結合組織鞘におけるＭＭＰ−１１の局在から、ＭＭＰ−１１は毛包に何らかのシグナルを伝達することで、毛包のアポトーシスを含む脱毛機構に関与することが考えられる。
【００２９】
ＭＭＰ−１１の阻害剤の毛包形成への効果
C57BLマウス５匹ずつをワックス脱毛で毛周期を同調させた。退行期に入るワックス脱毛後19日目にメキサメーターを用いて皮膚色を測定した（Ｍ値：メラニン値（日焼けによる皮膚の黒色度））後に、１％DMSO/生理食塩水溶液、又は100μMあるいは１ｍＭ濃度のMMP Inhibitor I（4-Abz-Gly-Pro-D-Leu-D-Ala-OH ; CALBIOCHEM社製  Cat＃444250）を溶解した１％DMSO/生理食塩水溶液を1箇所50μLずつ、1匹につき６箇所、背部皮膚内に皮内注を行った。1回目の皮内注の翌々日（21日目）に再度、同量の阻害剤あるいは溶媒のみを皮内注した。ワックス脱毛19日後から23日目まで毎日メキサメーターを用いて背部皮膚の黒味をＭ値としてメキサメーターで測定することにより毛包形成度を評価した。その結果を図２（棒グラフ）及び図３（折れ線グラフ）に示す。ＭＭＰ−１１の阻害剤は退行の進行を抑制することが明らかとなった。従って、ＭＭＰ−１１阻害剤の成長期延長薬剤としての利用の可能性が示された。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】マイクロアレイのシグナル強度によるＭＭＰ−１１の発現変動結果。
【図２】マウス皮内に注射したMMP Inhibitor Iの退行期抑制効果を示す棒グラフ。
【図３】マウス皮内に注射したMMP Inhibitor Iの退行期抑制効果を示す折れ線グラフ。
【図１】
2005308730.tif 000003
【図２】
2005308730.tif 000004
【図３】
2005308730.tif 000005