(57)【要約】【課題】  酵素の働きを利用してリジンのα−アミノ保護体からα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を製造する新規方法を提供する。また、α−アミノ基に保護基を有するリジンもしくは上記α−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体からα−アミノアジピン酸誘導体を製造するための酵素的または微生物的方法を提供する。【解決手段】  リジンのα−アミノ保護体のアミノメチル基のアルデヒド基への変換をアミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌を用いることにより、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を製造する。またα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体のアルデヒド基からカルボキシル基への変換を、好適にはアルデヒドオキシダーゼ、またはアルデヒドオキシダーゼ生産菌を用いることにより、α−アミノアジピン酸誘導体を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基を、アミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌を用いてアルデヒド基に変換することを特徴とする、
下式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項２】
上記のＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基をアルデヒド基に変換する反応を、カタラーゼの存在下で行うことを特徴とする、請求項１に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項３】
アミンオキシダーゼがAspergillus niger に由来するものであり、またアミンオキシダーゼ生産菌がAspergillus nigerである、請求項１または２に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの方法で得られたα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩について、アミノ保護基の脱離処理を行う、α−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒドまたはその塩の製造方法。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれかの方法で得られた下記式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で示されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩を用いて、当該化合物のアルデヒド基をカルボキシル基に変換することを特徴とする、
下式３：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ （３）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項６】
上記のアルデヒド基からカルボキシル基への変換反応を、アルデヒドオキシダーゼまたはアルデヒドオキシダーゼ生産菌を用いて行うことを特徴とする、請求項５に記載するα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項７】
アルデヒドオキシダーゼがAspergillus nigerに由来するものであり、またアルデヒドオキシダーゼ生産菌がAspergillus nigerである、請求項６に記載するα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項８】
アミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌、及び
下記式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で示されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体のアルデヒド基をカルボキシル基に変換し得る酵素または当該酵素の生産菌を用いて、
下記式１：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基を、カルボキシル基に変換することを特徴とする、下式３：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ （３）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項９】
上記アミノメチル基をカルボキシル基に変換する反応を、カタラーゼの存在下で行うことを特徴とする請求項８に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１０】
アミンオキシダーゼがAspergillus niger に由来するものであり、またアミンオキシダーゼ生産菌がAspergillus nigerである、請求項８または９に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１１】
アルデヒド基をカルボキシル基に変換し得る酵素がアルデヒドオキシダーゼである請求項８または９に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１２】
アルデヒドオキシダーゼがAspergillus nigerに由来するものであり、またアルデヒドオキシダーゼ生産菌がAspergillus nigerである、請求項１１に記載するα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１３】
アミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌を用いて、
下記式１：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基を、カルボキシル基に変換することを特徴とする、
下式３：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ （３）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１４】
アミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌がAspergillus nigerである、請求項１３に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１５】
アミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌がAspergillus nigerAKU 3302 (受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７１１)である、請求項１３に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【請求項１６】
請求項８乃至１５のいずれかの方法で得られたα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩について、さらにアミノ保護基の脱離処理を行う、α−Ｌ−アミノアジピン酸若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸またはその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素または微生物を利用したα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体、およびα−アミノアジピン酸誘導体の製造方法に関する。特に本発明は、α−アミノ基が修飾されてなるα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体、およびα−アミノアジピン酸誘導体の製造方法に関する。なお、α−アミノアジピン酸は、非蛋白性のアミノ酸であり、抗リュウマチ剤、乾癬治療剤及び制ガン剤として有用なメトトレキセート誘導体（特許文献１参照）等の医薬品製造の中間体として重要な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
従来より、医薬品や化粧品の製造中間体として、多くのα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体や、α−アミノアジピン酸を始めとするα−アミノアジピン酸誘導体の製造方法が検討され、種々提案されている。
【０００３】
例えばα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体の製造法としてＮ-アセチル-2-アミノ-6-ヘプタン酸をオゾン処理して塩酸を添加して加熱することによってＮ-アセチル-DL-α-アミノアジピン酸-δ-セミアルデヒドを製造する方法、またα−アミノアジピン酸誘導体の製造方法として、エチルアセトアミドシアノアセテートを5-ブロモ-1-ペンテンでアルキル化した後アルカリ加水分解し、得られた2-アミノ-6-ヘプタン酸 をオゾン分解することによってα-アミノアジピン酸を製造する方法などの化学的合成法が知られている（例えば、非特許文献１等参照のこと）。しかしながら、かかる化学合成法は操作が煩雑で多量の副産物が生成されるという欠点が指摘されている。
【０００４】
また特許文献２には、α−アミノアジピン酸セミアルデヒドに関連する物質としてＮ−アシル−α−アミノアジピン酸−γ−セミアルデヒドエチレンアセタールの化学的製造方法が、また特許文献３には、上記Ｎ−アシル−α−アミノアジピン酸−γ−セミアルデヒドエチレンアセタールを酵素処理（アシラーゼ処理）することによってα−アミノアジピン酸−γ−セミアルデヒドエチレンアセタールを製造する方法が、さらに特許文献４には、当該α−アミノアジピン酸−γ−セミアルデヒドエチレンアセタールをアルスロバクター属に属する微生物菌体またはその処理物を用いて製造する方法がそれぞれ記載されている。しかし、これらのいずれもアルデヒド基が修飾された化合物の製造方法に関するものであり、本発明が対象とするアルデヒド基がフリーの状態にある化合物を対象とするものではない。
【０００５】
一方、α−アミノアジピン酸並びにその誘導体の製造方法としては、Ｌ−リジンのε−ベンジルオキシカルボニル誘導体を過マンガン酸塩で酸化して、ベンジルオキシカルボニルカルバモイル体にする方法（例えば、非特許文献２等参照のこと）や、上記過マンガン酸塩に代えて次亜塩素酸塩を用いて酸化生成したニトリル体を加水分解する方法（例えば、非特許文献３等参照のこと）などの化学的合成法、並びにリジンをカンジタ菌由来のε−デヒドロゲナーゼで酸化する方法（例えば、非特許文献４等参照のこと）やリジンのα−アミノ基保護体にストレプトミセス属、ロドコッカス属、アスペルギルス属、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属、アエロモナス属、コリネバクテリウム属、またはエンテロバクター属に属する微生物の培養物を作用して、そのアミノメチル基をカルボキシル基に変換する方法（例えば、特許文献５等参照のこと）などの微生物的方法が知られている。
【０００６】
しかし、上記の化学的合成法では強い酸化剤や塩基を用いるために副反応を生じる可能性があり、純度高くα−アミノアジピン酸セミアルデヒドやα−アミノアジピン酸、並びにこれらの誘導体を取得することは困難である。また微生物的方法では、使用する微生物が産生する酵素が明らかでないため、再現性の悪さと収率の低さが問題となる場合がある。
【０００７】
ところで、現在までにＬ−リジンの６位のアミノ基に作用してα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド（非酵素的にＬ−Δ１−ピペリダイン−６−カルボン酸になり、両化合物は平衡状態を保つ）を生成する酵素としては、Ｌ−リジン６アミノ転移酵素（EC2.6.1.36）、及びリジン６脱水素酵素（EC1.4.1.-）が知られており、Candida albicans由来のリジン６脱水素酵素を用いたα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒドの製造方法（例えば、非特許文献４等参照のこと）およびＬ−リジン６アミノ転移酵素とＬ−Δ１−ピペリダイン−６−カルボン酸脱水素酵素を用いてα−Ｌ−アミノアジピン酸を製造する方法が報告されている（例えば、非特許文献５等参照のこと）。しかし、これらの方法はいずれも原料として遊離のＬ−リジンを用いる方法であり、α−アミノ基が修飾されたＬ−リジンを原料としてα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体を製造する方法は報告されていない。さらにリジン６脱水素酵素を用いるためには補酵素再生系が必要であり、またＬ−リジン６アミノ転移酵素を用いるためにはアミノ基受容体の添加が必要である。
【０００８】
またＬ−リジンの６位のアミノ基に作用する酵素としてペプチジルリジンオキシダーゼ（EC1.4.3.13）が知られているが、本酵素はペプチド中に存在するリジン残基に作用する酵素であり、遊離のリジンの６位のアミノ基に作用する酵素とは区別される。また、当該酵素のα−アミノ基が修飾されてなるＬ−リジンへの作用は知られていない。
【０００９】
一方、アミンオキシダーゼ（EC1.4.3.4あるいはEC1.4.3.6）はメチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミンなどの脂肪族アミン類やベンジルアミン等の芳香族アミン類から、酸化的にアミノ基を遊離してアルデヒド類と過酸化水素を生成する酵素である。当該酵素は、動物、植物、及び微生物に広く分布するが、遊離アミノ酸類に作用するＬ−アミノ酸オキシダーゼ（EC1.4.3.2）やＤ−アミノ酸オキシダーゼ（EC1.4.3.3）あるいはリジンに作用するＬ−リジンオキシダーゼ（EC1.4.3.-）やリジン６-脱水素酵素とは酵素学的性質において全く異なる酵素である（ゆえに異なる酵素番号が付けられている。）。また、当該酵素を用いてα−アミノ基が修飾されたＬ−リジンやＤ−リジンからNα-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体やNα-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を生成することについても一切報告されていない。
【特許文献１】ＷＯ９２／０９４３６
【特許文献２】特開平１１−１４００７６号公報
【特許文献３】特開平１１−１４００７７号公報
【特許文献４】特開平１１−２０６３９７号公報
【特許文献５】特開平７−２９８８９２号公報
【非特許文献１】Aspen, A. J. and Meister, A, Biochemistry, 1, p.600-605, 1962
【非特許文献２】Int. J. Pept. Prot. Res., 30, 552, 1987
【非特許文献３】Syn. Comm., 10, 127, 1980
【非特許文献４】Hammer, T. and Bode, R.: Zentralbl. Microbiol., 147, 65-70, 1992
【非特許文献５】ファインケミカル，32巻、51-57, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、酵素の働きを利用してα−アミノ基に保護基を有するリジンからα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を製造する新規方法を提供することを目的とする。また本発明は、上記方法によって得られたα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を用いて、さらにα−アミノアジピン酸誘導体並びにα−アミノアジピン酸を製造する方法を提供することを目的とする。さらにまた本発明は、α−アミノ基に保護基を有するリジンからα−アミノアジピン酸誘導体並びにα−アミノアジピン酸を製造するための酵素的または微生物的方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討していたところ、α−アミノ基を保護したＬ−リジンやＤ−リジンにアミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌を作用させることにより、Ｌ−リジンやＤ−リジンの６位のアミノメチル基（―ＣＨ2ＮＨ2）が酸化的脱アミノ反応でアルデヒド基（―ＣＨＯ）に変換され、α-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体あるいはα-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体が生成することを見いだした。そして本発明者らは、当該方法によれば、リジン６脱水素酵素やＬ−リジン６アミノ転移酵素を用いる場合と異なり、補酵素再生系やアミノ基受容体等の第二の基質を添加することなく、α-Ｌ-アミノアジピン酸誘導体あるいはα-Ｄ-アミノアジピン酸誘導体の製造中間体として有用なセミアルデヒド誘導体を効率よく、しかも高い純度で製造することができることを確認した。
【００１２】
さらに、本発明者らは、上記方法によって得られたα-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体あるいはα-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を、更にアルデヒドオキシダーゼまたはアルデヒドオキシダーゼ生産菌と反応させることによって、アルデヒド基（−ＣＨＯ）がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に変換されて、α-Ｌ-アミノアジピン酸誘導体あるいはα-Ｄ-アミノアジピン酸誘導体が生成すること、並びに、α−アミノ基を保護したＬ−リジンやＤ−リジンにアミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する能力を有する菌を作用させることにより、Ｌ−リジンやＤ−リジンの６位のアミノメチル基（−ＣＨ2ＮＨ2）が、アルデヒド基（−ＣＨＯ）への変換を経てカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）にまで変換され、一反応系でα-Ｌ-アミノアジピン酸誘導体あるいはα-Ｄ-アミノアジピン酸誘導体が生成できることを見いだした。
【００１３】
本発明は、かかる知見に基づいて開発、完成されたものであり、下記の態様を有するものである。
【００１４】
（Ｉ）α-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩の製造方法
項１．下記式１：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基を、アミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌を用いてアルデヒド基に変換することを特徴とする、
下式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩の製造方法。
項２．  上記のＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基をアルデヒド基に変換する反応を、カタラーゼの存在下で行うことを特徴とする、項１に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩の製造方法。
項３．  アミンオキシダーゼがAspergillus niger に由来するものであり、またアミンオキシダーゼ生産菌がAspergillus nigerである、項１または２に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩の製造方法。
【００１５】
（II）α-アミノアジピン酸セミアルデヒドまたはその塩の製造方法：
項４．  上記項１乃至３のいずれかの方法で得られたα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩について、アミノ保護基の脱離処理を行う、α−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒドまたはその塩の製造方法。
【００１６】
（III）α-アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法：
項５．  項１乃至３のいずれかの方法で得られた
下記式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で示されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩を用いて、当該化合物のアルデヒド基をカルボキシル基に変換することを特徴とする、
下式３：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ （３）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【００１７】
当該項５は、下記のように書き換えることもできる；
項５'．下記式１：
（Ａ）  ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基を、アミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌を用いてアルデヒド基に変換して、下式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩を製造する工程；及び
（Ｂ） 上記工程で得られた上記式２で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩のアルデヒド基をカルボキシル基に変換することを特徴とする、
下式３：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ （３）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【００１８】
項６．上記のアルデヒド基からカルボキシル基への変換反応を、アルデヒドオキシダーゼまたはアルデヒドオキシダーゼ生産菌を用いて行うことを特徴とする、項５または項５'に記載するα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項７．アルデヒドオキシダーゼがAspergillus nigerに由来するものであり、またアルデヒドオキシダーゼ生産菌がAspergillus nigerである、項６に記載するα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項８．アミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌、及び
下記式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で示されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体のアルデヒド基をカルボキシル基に変換し得る酵素または当該酵素の生産菌を用いて、
下記式１：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基を、カルボキシル基に変換することを特徴とする、
下式３：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ （３）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項９．上記アミノメチル基をカルボキシル基に変換する反応を、カタラーゼの存在下で行うことを特徴とする項８に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項１０．アミンオキシダーゼがAspergillus niger に由来するものであり、またアミンオキシダーゼ生産菌がAspergillus nigerである、項８または９に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項１１．  アルデヒド基をカルボキシル基に変換し得る酵素がアルデヒドオキシダーゼである項８または９に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項１２．  アルデヒドオキシダーゼがAspergillus nigerに由来するものであり、またアルデヒドオキシダーゼ生産菌がAspergillus nigerである、項１１に記載するα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項１３．アミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌を用いて、
下記式１：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基を、カルボキシル基に変換することを特徴とする、
下式３：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ （３）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項１４．アミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌がAspergillus nigerである、項１３に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
項１５．アミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌がAspergillus nigerAKU 3302 (受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７１１)である、項１３に記載のα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法。
【００１９】
（IV）α-アミノアジピン酸またはその塩の製造方法：
項１６．  項８乃至１５のいずれかの方法で得られたα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体またはその塩について、さらにアミノ保護基の脱離処理を行う、α−Ｌ−アミノアジピン酸若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸またはその塩の製造方法。
【００２０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）α-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩の製造方法
本発明の製造方法は、アミンオキシダーゼの酵素作用を利用することを特徴とするものであって、詳細には、下記式１：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体（以下、本明細書において「リジンのα−アミノ基保護体」と総称する）のアミノメチル基（−ＣＨ2ＮＨ2）を、アミンオキシダーゼを利用してアルデヒド基（−ＣＨＯ）に変換することによって、
下式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（以下、本明細書において「α−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体」と総称する）を製造する方法である。
【００２１】
ここで上記式１及び２においてＲで示されるアミノ基の保護基としては、リジンのα位のアミノ基を保護しえる官能基であればよく、この限りにおいて特に制限されるものではない。具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基等の炭素数１〜５の低級アルカノイル基；フェニルアセチル基、４−メトキシフェニルアセチル基等の炭素数８〜９の芳香族置換アセチル基；ベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基等の炭素数７〜８の芳香族アシル基；ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基等の炭素数８〜９の芳香族置換アルキルオキシカルボニル基；ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル基、ｐ−(p'−メトキシフェニルアゾベンジルオキシカルボニル基等の置換ベンジルオキシカルボニル基；ｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の炭素数１〜５のアルコキシカルボニル基；シクロヘキシルオキシカルボニル基；トリフルオロアセチル基等を挙げることができる。より具体的には、一般にペプチド合成で使用されるアミノ保護基の中から上記目的に適うものを適宜選択して用いることができる（例えば、「タンパク質化学１」共立出版株式会社発行、昭和54年9月15日発行、第406-443頁；「ペプチド合成の基礎と実験」丸善株式会社発行、昭和60年1月20日発行、第16-40頁；「PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS」THIRD EDITION, Theodora W. Greene, Peter G.M.Wuts共著、JOHN WILEY & SONS, INC.等参照のこと）。
【００２２】
さらに、アミノ基とカルボキシル基とを同時に保護するタイプの保護基、例えば、環状構造を形成する保護基なども使用することができる。
【００２３】
これらの保護基でα−アミノ基が修飾されてなるリジンのα−アミノ基保護体は、遊離体であってもまた塩の形態であってもよく、本発明においてはこれらいずれの形態のものをも出発原料として使用することができる。
【００２４】
ここで塩としては、リジンのα−アミノ基保護体と共に塩を形成し得るものであればよく、例えば酢酸や酒石酸等との有機酸塩；塩酸や硫酸等との無機酸塩；トリエチルアミン、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミンピペジリン又はＮ―エチルピペリジン等との有機塩基塩；水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等との無機塩基塩；ナトリウムやカリウム等とのアルカリ金属塩；カルシウム等とのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；銅等との重金属錯塩；アンモニウム塩等が使用される。好ましくは、薬学的に許容される塩である。なお、生成産物であるα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体の塩も、上記に対応して各種の塩を挙げることができる。
【００２５】
これらのＬ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体は、Ｌ−リジン若しくはＤ−リジンを原料として周知の方法に従って合成することができるし、また簡便には商業的に入手することもできる。
【００２６】
上記リジンのα−アミノ基保護体に作用させるアミンオキシダーゼは、α−アミノ基に保護基を持つ（但し、ε−アミノ基はフリー）Ｌ−リジン誘導体またはＤ−リジン誘導体のε−アミノ基（６位のアミノ基）に作用する酵素であれば特に制限するものではない。アミンオキシダーゼ（EC1.4.3.6.、EC1.4.3.4.）は、従来より動物、植物及び微生物に広く存在することが知られているが、本発明で用いられるアミンオキシダーゼは、アミンオキシダーゼ（EC1.4.3.6.、EC1.4.3.4.）のなかでも、ｎ−ブチルアミンに対して酸化能を有するモノアミンオキシダーゼであることが好ましい。かかるアミンオキシダーゼの由来（起源）は問わないが、工業的には、細菌類、カビ類、酵母類、及び放線菌類などの微生物に由来するアミンオキシダーゼが望ましい。
【００２７】
なお、アミンオキシダーゼを生産する微生物（以下、本明細書では「アミンオキシダーゼ生産菌」と総称する）として、例えば山田らの文献（Agric. Biol. Chem., Vol.29, No.2, p.117-123, 1965）には、Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus sojae, Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Munascus purpureus, Munascus anka, 及びFusarium oxysporumなど、多数のアミンオキシダーゼ生産菌が報告されている。また、こうしたアミンオキシダーゼ生産菌は、各種の微生物分譲機関からも入手することができ、例えば（株）エヌシーアイエムビ・ジャパンからは、アミンオキシダーゼ生産菌としてArthrobacter sp. 11625が入手可能である。
【００２８】
本発明で好適に使用できるアミンオキシダーゼ生産菌の具体的な例示として、カビ類であるAspergillus属、特にAspergillus nigerに属するAspergillus niger AKU 3302株（H.Yamada er al., Agric. Biol. Chem., 29(10), 912-917, 1965）を挙げることができる。なお、 Aspergillus niger AKU 3302株は、上記の文献に記載されているように公知の菌株であるが、本発明の実施をより確実に保証するために、発明者らは、当該Aspergillus niger AKU 3302（識別のための表示）を、平成１６年３月３日に、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７１１として寄託した（通知番号：15産生寄第2022号）。
【００２９】
上記アミンオキシダーゼは、酵素そのものを商業的に入手して使用することもできるし、また上記アミンオキシダーゼ生産菌から単離精製して使用することもできる。アミンオキシダーゼ生産菌からのアミンオキシダーゼの単離精製は、その分子量並びに酵素作用（酸化作用）における基質特異性などを指標として、慣用の酵素精製法（例えば、ロバートＫ．スコープス著「タンパク精製法―理論と実際」シュプリンガー・フェアラーク東京（株）発行、昭和63年6月1日発行など参照）に従って行うことができるが、より具体的には、例えば山田らの方法（Agric. Biol. Chem., 29, 117-123, 1965）に従って、基質となるｎ−ブチルアミンを含む培地でアミンオキシダーゼ生産菌を培養することでアミンオキシダーゼの産生を誘導させ、次いで得られたアミンオキシダーゼ生産菌の菌体（または産生したアミンオキシダーゼを菌体外に分泌する場合は培地）から、足立と山田の方法（Agric. Biol. Chem., 33, 1707-1716, 1965）に従って、アミンオキシダーゼを単離精製する方法を用いることもできる。なお、本発明で用いるアミンオキシダーゼは、副生成物を抑制して所望のセミアルデヒド誘導体を純度よく生成するという点からは精製アミンオキシダーゼを用いることが好ましいが、セミアルデヒド誘導体を製造するという目的からは、特にそれに制限されるものではなく、アミンオキシダーゼの粗精製物を用いることもできる。
【００３０】
アミンオキシダーゼ生産菌は、上記の内因性アミンオキシダーゼを生産する微生物に限らず、上記アミンオキシダーゼをコードする遺伝子（外来性遺伝子）を遺伝子工学的に導入した微生物（例えば、大腸菌や酵母など）であってもよい。本発明で用いられるアミンオキシダーゼ生産菌には、かかる遺伝子組み換えによって後天的にアミンオキシダーゼを生産する能力を備えた微生物も含まれる。なお、アミンオキシダーゼをコードする遺伝子は公知であり、例えば「Boris Schilling and Konrad Lerch： Mol. Gen. Genet., 247, 430-438 (1995)」にはAspergillus nigerが産生するmonoamine oxidase (EC 1.4.3.4:フラビン含有酵素)の遺伝子についてそのクローニングとE. coliでの発現方法が、また「Ivo Frebort, Hisanori Tamaki, Hiroki Ishida and others (10 人)： Eur. J. Biochem.,237, 255-265 (1996)」にはAspergillus niger AKU 3302が産生するamine oxidase (EC 1.4.3.6:銅とキノン類含有酵素)等の遺伝子についてそのクローニング方法が記載されている。
【００３１】
上記、アミンオキシダーゼ生産菌を培養する培地は、特に限定されず、通常の微生物の培養に用いられるものであればよい。例えば、炭素源としては、上記アミンオキシダーゼ生産菌が利用可能なものであればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、グリセロール、ソルビトールなどの糖アルコール、フマル酸、クエン酸等の有機酸が使用できる。これらの炭素源の培地への添加量は、通常、０.１〜１０％程度とすることが望ましい。また窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、りん酸アンモニウム等の無機酸アンモニウム塩やフマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸アンモニウム塩、ないし肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等の天然窒素源が使用できる。これらの窒素源の培地への添加量は、通常、０.１〜１０％程度とすることが望ましい。また、無機塩類としては、例えば、りん酸カリウム、りん酸ナトリウム、等のりん酸アルカリ金属や塩化カリウム、塩化ナトリウム、等の塩化アルカリ金属、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸金属塩が使用できる。これらの無機塩類の培地への添加量は、通常、０.００１〜１％程度とすることが望ましい。
【００３２】
培養は、使用する生産菌の種類に応じて液体培養法または固体培養法を任意に選択し使用することができる。例えば、カビ類を用いた酵素生産の場合は、多種類の酵素がバランスよく生産され、また液体培養法では生産されない酵素も生産され分泌されるなどの利点があることから固体培養法が好適に使用される。固体培養法に用いられる固体培地としては、米、大豆、小麦ふすま、オガクズ、及びバガスなどの天然農作物を利用した固体培地が主として用いられる。さらにこれらの固体培地に適度の栄養補給物質を添加して培養することも可能である。またスポンジ、発泡担体（ウレタンフォーム）の合成高分子物質に液体培地含浸させたものを固体培地とした固体培養法も試みられている。
【００３３】
なお、これらの培地の中には、n-プロピルアミン, n-ブチルアミン, ベンジルアミン, 1,3-プロピレンジアミン, プトレッシン（1,4-ブタンジアミン） 等の脂肪族アミン類、芳香族アミン類、またはジアミン類などの各種アミン類や、アミンオキシダーゼの反応基質であるＬ−リジンもしくはＤ−リジンを配合することもでき、そうすることによって、アミンオキシダーゼを大量に発現産生することができる。
【００３４】
アミンオキシダーゼ生産菌の培養は、上記の培地で２０〜４０℃、好ましくは２８〜３５℃、またｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５〜８の範囲で、好気的条件下で実施すればよい。
【００３５】
本発明に利用できる微生物の培養物としては、その微生物の全培養液、菌体、培養濾液およびそれらの処理物があげられる。菌体の処理物としては、乾燥菌体やアセトン、トルエン、メタノール等の有機溶媒で処理した菌体、菌体抽出物、固定化処理物等をあげることができる。また、培養濾液の処理物としては、その培養液の濃縮物、乾燥粉末があげられる。更に、その培養菌体および培養濾液より酵素を分離精製し用いることもできる。
【００３６】
リジンのα−アミノ基保護体とアミンオキシダーゼとの反応は、通常水性溶媒を利用して、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲、温度条件１０〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは１０〜３０℃の範囲で行うことができる。水性溶媒としては、上記ｐＨ範囲で緩衝能を備える緩衝液を用いることが好ましく、リン酸緩衝液を好適に例示することができる。なお、本発明の反応を妨げないことを限度として、当該水性溶媒には有機溶媒が含まれていても良い。反応は、振とう、攪拌、または通気などの手段を採用することによって好気的条件下で行うことが望ましい。
【００３７】
反応に使用するアミンオキシダーゼの量は、特に制限されないが、例えば基質100mmolに対して通常1,000 〜 500,000 単位、好ましくは 5,000 〜 200,000単位、より好ましくは 10,000 〜 100,000 単位の範囲から適宜選択することができる。
【００３８】
反応液中のリジンのα−アミノ基保護体の量が減少して、それに対応する生成物、すなわちα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体の生成量が、実質的な量に達した時点で、反応を終了することができる。通常、上記の条件で１〜１０日、好ましくは１〜４日反応することによって、反応を終了することができる。
【００３９】
当該反応液は、そのまま若しくは必要に応じて遠心分離などで不溶物を除去した後に、イオン交換樹脂処理、吸着処理、ゲルろ過処理、晶析、濃縮等、慣用の単離精製手段に供することができ、これによってα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を回収もしくは単離精製することができる。生成したセミアルデヒド誘導体は、簡便には後述する実施例に示すように、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣによって、原料であるリジンのα−アミノ基保護体と分離して取得することができる。
【００４０】
以上、リジンのα−アミノ基保護体を原料とする、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体の製造は、前述するようにアミンオキシダーゼをそのまま用いて行ってもよいが、アミンオキシダーゼに代えてアミンオキシダーゼ生産菌を利用することもできる。この場合、アミンオキシダーゼ生産菌はアミンオキシダーゼを産生しえる状態で使用される。
【００４１】
アミンオキシダーゼ生産菌を利用した上記セミアルデヒド誘導体の製造は、具体的には、上記の反応系に、アミンオキシダーゼに代えて、アミンオキシダーゼ生産菌の全培養物、菌体、培養濾液及びこれらの処理物を、Ｌ−リジン若しくはＤ−リジンのα−アミノ基保護体とともに配合し、上記反応条件に従って反応処理することによって行うことができる。アミンオキシダーゼ生産菌の培養方法は、前述の通りである。ここで、菌体の処理物としては、菌体破砕物、乾燥菌体、凍結乾燥菌体、またはアセトン,トルエンまたはメタノール等の有機溶媒で処理した菌体、菌体抽出物、固定化処理物等をあげることができる。また、全培養物の処理物としては、全培養物の濃縮物、抽出物（さらに乾燥したもの及び濃縮したものも含まれる）及び乾燥粉末を、さらに培養濾液の処理物としては、培養濾液の濃縮物、抽出物及び乾燥粉末をあげることができる。
【００４２】
また、アミンオキシダーゼ生産菌を培養している培養培地に、出発原料であるリジンのα−アミノ基保護体を添加してα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を製造することもできる。
【００４３】
本発明のα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体の製造方法は、上記反応をカタラーゼ共存下で行うことが好ましい。カタラーゼの作用によって、Ｌ−リジンまたはＤ−リジンのアミノ保護体のメチルアミノ基の酸化によって生じる過酸化水素の分解を促進することで、α−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（２）の生成を促すことができるからである。反応系におけるカタラーゼの使用割合は、アミンオキシダーゼの反応で生成される過酸化水素を速やかに分解できる量であれば特に限定されない。制限されないが、具体的にはアミンオキシダーゼと同等量〜２倍量程度を例示することができる。
【００４４】
斯くして調製されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（２）またはその塩は、さらにアミノ保護基を脱離する処理に供することもでき、それによって、下式：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨ2)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ
で示されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒドまたはその塩を調製することができる。
【００４５】
アミノ保護基の脱離方法は、一般に、例えば「『ペプチド合成の基礎と実験』丸善株式会社発行、昭和60年1月20日発行、第16-40頁」、または「『PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS』THIRD EDITION, Theodora W. Greene, Peter G.M.Wuts共著、JOHN WILEY & SONS, INC.」等に記載されている慣用方法に従って行うことができる。具体的には、例えばパラジウムやニッケルなどの金属を利用した水素添加法、ナトリウム／液体アンモニウムによる脱離方法、酸による脱離法（例えば、フッ化水素、スルホン酸類、ホウ素化合物、臭化水素酢酸溶液、トリフルオロ酢酸、臭化水素トリフルオロ酢酸溶液、塩化水素若しくはその溶液、ＴＦＡ・チオアニソール系、ギ酸及び酢酸など）、及び塩基による脱離方法（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化リチウムなどの無機塩、ピリジン、ヒドラジン等の有機アミン類等）を挙げることができる。
【００４６】
（ＩＩ）α-アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法
本発明のα-アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法は、大きく下記の２種類の方法に分類することができる。
【００４７】
(II-1) 前述の（１）方法によって得られたα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはそれらの塩を用いて、α−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体（以下、本明細書ではこれらを総称して「α−アミノアジピン酸誘導体」ともいう）またはそれらの塩を製造する方法。
【００４８】
(II-2)  リジンのα−アミノ基保護体またはその塩を用いて、α−アミノアジピン酸誘導体またはそれらの塩を製造する方法。
【００４９】
(II-1)の方法
上記(II-1)の方法は、反応原料として、前述の（Ｉ）方法によって得られたα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩を用いることを特徴とするものである。具体的には、前述の（Ｉ）方法によって得られた下記式２：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で示されるα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩を用いて、当該化合物のアルデヒド基（−ＣＨＯ）をカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に変換することを特徴とする、下式３：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ （３）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−アミノアジピン酸誘導体またはその塩の製造方法である。
【００５０】
ここで式２及び３で示されるＲのアミノ基の保護基は、（Ｉ）において前述の通りである。またα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体の塩も、（Ｉ）において前述の通りである。
【００５１】
式２で示される化合物（２）のアルデヒド基（−ＣＨＯ）をカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に変換する方法は、特に制限されるものではなく、慣用の方法に従って行うことができる。例えば、過マンガン酸カリウム、酸化銀、活性二酸化マンガン、二クロム酸ピリジウム、または有機過酸化物（過酢酸、メタクロロ過安息香酸）等を用いて酸化する化学的方法、化合物（２）のアルデヒド基をカルボキシル基に変換する能力を有する酵素を用いる酵素的方法、当該酵素の生産菌を用いる微生物的方法を挙げることができる。ここで、化合物（２）のアルデヒド基をカルボキシル基に変換する能力を有する酵素としては、例えばアルデヒドオキシダーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼを挙げることができる。また、α−アミノアジピン酸セミアルデヒドの酸化に関与する酵素としてΔ1-piperideine-6-carboxylate dehydrogenaseが知られている（Juan L. de la Fuente et al., Biochem.J., 327, 59-64, 1997）。
【００５２】
後述する実施例３及び６で示すように、アミンオキシダーゼ生産菌でもあるAspergillus niger AKU 3302（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７１１）を利用しても、化合物（２）のアルデヒド基（−ＣＨＯ）をカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に変換することができる。実施例７で示すように、これはAspergillus niger AKU 3302株が有するアルデヒドオキシダーゼ活性に基づくものと考えられる。
【００５３】
これらのことから、Aspergillus niger AKU 3302株は、α−アミノ基に保護基を有する（但し、ε−アミノ基はフリー）Ｌ−リジン誘導体またはＤ−リジン誘導体のε−アミノ基（６位のアミノ基）に作用するアミンオキシダーゼ活性と、α−アミノ基に保護基を有する（但し、ε−アミノ基はフリー）Ｌ−セミアルデヒド誘導体またはＤ−セミアルデヒド誘導体のアルデヒド基に作用するアルデヒドオキシダーゼ活性の両方の作用を有していることがわかる。
【００５４】
かかる知見は本発明者等により初めて見いだされたものであり、ゆえに本発明は、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩のアルデヒド基（−ＣＨＯ）をカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に変換して、α−アミノアジピン酸誘導体またはその塩を製造する微生物的方法の一つとして、アミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌、好ましくはAspergillus niger に由来する菌、より好ましくはAspergillus niger AKU 3302株を用いる方法を好適に提供する。
【００５５】
α−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（２）とアルデヒドオキシダーゼまたはアルデヒドオキシダーゼ生産菌との反応は、通常水性溶媒を利用して、ｐＨ条件４〜１０、好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８の範囲、温度条件１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃の範囲で行うことができる。水性溶媒としては、上記ｐＨ範囲で緩衝能を備える緩衝液を用いることが好ましく、リン酸緩衝液を好適に例示することができる。なお、本発明の反応を妨げないことを限度として、当該水性溶媒には有機溶媒が含まれていても良い。反応は、振とう、攪拌、または通気などの手段を採用することによって好気的条件下で行うことが望ましい。
【００５６】
また当該反応で用いるアルデヒドオキシダーゼ生産菌は、アルデヒドオキシダーゼを産生し得る状態にある菌体であることが好ましい。かかる菌体の調製は、例えば山田らの方法（Agric. Biol. Chem., 29, 117-123, 1965）に従って、誘導物質としてn-プロピルアミン, n-ブチルアミン, ベンジルアミン, 1,3-プロピレンジアミン, プトレッシン（1,4-ブタンジアミン） 等の脂肪族アミン類、芳香族アミン類またはジアミン類などの各種アミン類を含む培地でアルデヒドオキシダーゼ生産菌を培養することにより実施することができる。なおアルデヒドオキシダーゼ生産菌の培養方法並びに使用する培地については、（１）において前述の通りである。
【００５７】
アルデヒドオキシダーゼ生産菌は菌体の処理物であってもよい。ここで、菌体の処理物としては、菌体破砕物、乾燥菌体、凍結乾燥菌体、またはアセトン,トルエンまたはメタノール等の有機溶媒で処理した菌体、菌体抽出物、固定化処理物等をあげることができる。
【００５８】
反応液中のα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（２）の量が減少して、それに対応する生成物、すなわちα−アミノアジピン酸誘導体（３）の生成量が、実質的な量に達した時点で、反応を終了することができる。通常、上記の条件で１〜１０日程度、好ましくは１〜４日程度反応することによって、反応を終了することができる。
【００５９】
当該反応液は、そのまま若しくは必要に応じて遠心分離などで不溶物を除去した後に、イオン交換樹脂処理、吸着処理、ゲルろ過処理、晶析、濃縮等、慣用の単離精製手段に供することができ、これによってα−アミノアジピン酸誘導体（３）を回収もしくは単離精製することができる。生成したα−アミノアジピン酸誘導体（３）は、簡便には後述する実施例に示すように、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣによって、原料であるα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（２）と分離して取得することができる。
【００６０】
(II-2)  リジンのα−アミノ基保護体またはその塩を用いて、α−アミノアジピン酸誘導体またはそれらの塩を製造する方法。
【００６１】
上記(II-1)の方法は、前述する（Ｉ）の方法に引き続いて行うことができる。すなわち、α−アミノアジピン酸誘導体は、リジンのα−アミノ基保護体またはその塩を原料として、一連の製造工程により製造することもできる。
【００６２】
かかる製造方法は、下記の工程からなる。
(a) アミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌を用いて、式１で示されるリジンα−アミノ基保護体またはその塩のアミノメチル基をアルデヒド基に変換して、式２で示されるα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩を製造する工程；及び(b) 上記工程で得られたα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはその塩を、化学的方法、酵素的方法または微生物的方法（例えば、アルデヒドオキシダーゼまたはアルデヒドオキシダーゼ生産菌を用いる方法が例示できる）のいずれかの方法を用いて、そのアルデヒド基をカルボキシル基に変換して、式３で示されるα−アミノアジピン酸誘導体またはその塩を製造する工程。
【００６３】
上記(a)の工程において、反応系にカタラーゼを共存させることもできる。
【００６４】
なお、α−アミノアジピン酸誘導体の製造は、上記(a)と(b)の工程を、それぞれ別個の操作工程として、(a)工程に引き続いて(b)工程を実施することによって行うこともできるが、(b)の工程を酵素的方法または微生物的方法によって行う場合には、一つの操作工程として行うこともできる。この場合、α−アミノアジピン酸誘導体の製造方法は、下記のように規定することができる：
(c) アミンオキシダーゼまたはアミンオキシダーゼ生産菌、及びα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（２）のアルデヒド基をカルボキシル基に変換し得る酵素またはその生産菌を用いて、リジンのα−アミノ基保護体（１）またはその塩のアミノメチル基を、カルボキシル基に変換して、α−アミノアジピン酸誘導体（３）またはその塩を製造する工程。
【００６５】
なお、理論に拘束されないが、かかる一反応系において、上記の(a)の反応工程と(b)の反応工程が連続して生じているものと考えられる。また、この反応系にカタラーゼを共存させることもできる。
【００６６】
上記のα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（２）のアルデヒド基をカルボキシル基に変換し得る酵素の生産菌として、好適にはアルデヒドオキシダーゼ生産菌を挙げることができる。また後述する実施例４、５及び８で示すように、アミンオキシダーゼ生産菌であり、且つアルデヒドオキシダーゼ生産菌でもあるAspergillus niger AKU 3302株は、前述する(a)の工程と(b)の工程の両方の反応を触媒する作用を有している。このため、α−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体（２）のアルデヒド基をカルボキシル基に変換し得る酵素の生産菌としてAspergillus niger AKU 3302株などのようにアミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌を用いる場合には、(c)の工程においてリジンのα−アミノ基保護体（１）またはその塩にアミンオキシダーゼとアルデヒドオキシダーゼの両方を生産する菌、好ましくはAspergillus niger AKU 3302株を作用させることで、目的のα−アミノアジピン酸誘導体（３）またはその塩を得ることができる。
【００６７】
斯くして調製されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体（３）またはその塩は、さらにアミノ保護基を脱離する処理に供することもでき、それによって、下式：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨ2)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ
で示されるα−Ｌ−アミノアジピン酸若しくはα−Ｄ−アミノアジピン酸またはその塩を調製することができる。
【００６８】
アミノ保護基の脱離方法は、慣用方法に従って行うことができるが、具体的な方法は（Ｉ）において前述の通りである。
【発明の効果】
【００６９】
本発明によれば、Ｌ−リジンまたはＤ−リジンのα−アミノ基保護体を出発原料として、酵素的または微生物的反応によって、式２で示されるα−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を効率よく、しかも高い純度で製造することができる。当該α−Ｌ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはα−Ｄ−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体は、α−Ｌ−アミノアジピン酸またはα−Ｄ−アミノアジピン酸の製造中間体として有用であり、これらα−アミノアジピン酸の製造原料として有効に利用することができる。さらに本発明によれば、Ｌ−リジンまたはＤ−リジンのα−アミノ基保護体を出発原料として、微生物的反応によって、式３で示されるα−Ｌ−アミノアジピン酸誘導体またはα−Ｄ−アミノアジピン酸誘導体を製造するための新規な方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
以下、試験例及び実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例及び実施例になんら限定されるものではない。
【００７１】
試験例１      アミンオキシダーゼの基質特異性
（１）アミンオキシダーゼ生産菌
Agric. Biol．Chem．，29, 117-123, 1965には、アミンオキシダーゼ生産菌が多数報告されているが、以下の試験例では、その生産菌の中から最もよく研究されており、京都大学大学院農学研究科発酵生理及び醸造学研究室で保存されているAspergillus niger 属に属する菌体（Aspergillus niger AKU 3302）を用いた。なお、当該Aspergillus niger AKU 3302株は、平成１６年３月３日に、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、Aspergillus niger AKU 3302（識別のための表示）、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７１１として寄託されている（通知番号：15産生寄第2022号）。
【００７２】
（２）アミンオキシダーゼの取得
上記Aspergillus niger AKU 3302を、山田及び足立らの方法（Agric. Biol. Chem., 29, 117-123, 1965）に準じてn-ブチルアミンを含む培地（0.1% n-butylamine, 3.0% glucose, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4, 0.05% KCl, pH 6.0）を用いて３０℃で２日間、培養して、アミンオキシダーゼを誘導生成した。次いで、培養物から菌体を回収し、得られた菌体からAdachi, O. and Yamada, H.の方法（Agric. Biol. Chem., 33, 1707-1716, 1969）に従って精製し、アミンオキシダーゼ（分子量：native enzyme = 252,000 (gel filtration), ２量体酵素）を取得した。得られた精製アミンオキシダーゼは、ＳＤＳ電気泳動分析によって分子量125,000〜130,000に位置する単一のバンドとして確認された。
【００７３】
（３）アミンオキシダーゼの基質特異性
上記で取得した精製アミンオキシダーゼについて基質特異性を調べた。具体的には、下記の方法に従って、表１に示す各化合物（基質）を上記の精製アミンオキシダーゼと反応させて、基質の酸化反応によって生じる過酸化水素の生成速度（nmol/ml/min）を調べた。
【００７４】
＜過酸化水素の生成速度の測定方法＞
１) ６２.５ｍＭにそれぞれ調整した基質含有水溶液０.８ｍｌを過酸化水素測定用発色液０.１９ｍｌと混合して３０℃で３分間加温する。
２) 加温後、これに（２）で調製した精製アミンオキシダーゼの水溶液（9800 unit/mg protein）を０.０１ｍｌ添加して反応を開始する。
３) ３０℃で５分間加温して、過酸化水素の生成量を５５５ｎｍの吸光度で測定する。
なお、過酸化水素測定用発色液は、１０ｍｌの０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に、１.０２ｍｇの４−アミノアンチピリン、５.３８ｍｇのＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ナトリウム塩、２加水物）および０.２５ｍｇのペルオキシダーゼを溶解して調製した。
【００７５】
結果を表１に併せて示す。
【００７６】
【表１】
2005304477.tif 000002
【００７７】
その結果、n-ブチルアミンを基質とした場合、１分間に33.3ナノモルの過酸化水素が生成され、n-ブチルアミンのアミノメチル基が酸化的に脱アミノ化されたことが確認された。
【００７８】
一方、アミノ酸及びアミノ酸誘導体を基質とした場合は、α位のアミノ基を保護したリジンにだけ特異的に反応し、フリーのリジン、グルタミン、アスパラギン及びアルギニン等の塩基性アミノ酸、並びにα位のアミノ基を保護したグルタミン、アスパラギン及びアルギニンには全く反応しなかった。このことから、（２）で取得したアミンオキシダーゼがα位を保護したリジンの６位のアミノ基に特異的に作用することが明らかになった。
【００７９】
試験例２
Ｌ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｌ-リジンを５０ｍＭになるように０.２Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）に溶解し、このNα-Ｚ-Ｌ-リジン溶液１ｍｌに対して、試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼを０.７５単位添加し、３０℃で２４時間加温した。そしてこの反応によるアンモニアの生成量を、アンモニア態窒素測定用試薬キット「アンモニア・テスト ワコー」（和光純薬（株）製）を説明書に従って用いて、藤井・奥田法変法で比色分析を行って測定した。その結果、反応時間と共に６３０ｎｍの吸光度が増大し、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンの酸化で生成した過酸化水素量とほぼ等量のアンモニアの生成が確認された。このことからNα-Ｚ-Ｌ-リジンのアミノメチル基が酸化的に脱アミノ化されることが明らかになった。
【００８０】
試験例３
Ｄ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｄ-リジンを５０ｍＭになるように０.２Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）に溶解し、このNα-Ｚ-Ｄ-リジン溶液を試験例２と同様に、試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼと反応させ、Nα-Ｚ-Ｄ-リジンから生成したアンモニアの量を測定した。その結果、反応時間と共に６３０ｎｍの吸光度が増大し、Nα-Ｚ-Ｄ-リジンの酸化で生成した過酸化水素量とほぼ等量のアンモニアの生成が確認された。このことからNα-Ｚ-Ｄ-リジンのアミノメチル基が酸化的に脱アミノ化されることが明らかになった。
【００８１】
試験例４
Ｌ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｌ-リジンを５０ｍＭになるように０.２Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）に溶解し、このNα-Ｚ-Ｌ-リジン溶液１ｍｌに対して、試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼを０.２５単位添加し、３０℃で４日間加温した。加温期間中、１日ごとに反応液を採取して遠心分離し、その上清画分をTSK-GEL DEAE-5PWカラム（東ソー社製；内径ｘ長さ＝7.5 mm x 7.5 cm）を用いて、下記の条件でＨＰＬＣ分析した。
【００８２】
＜ＨＰＬＣ分析＞
移動相：Ａ液−精製水、Ｂ液−０.５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液
グラジェント条件：0−5分：A/B=100/0、 5−15分：A/B=40/60、 15−25分：A/B=40/60
カラム温度：４０℃
流速：０.８ｍｌ/分
検出器：島津UV-VIS Detector SPD-10AV
測定波長：２１０ｎｍ。
【００８３】
なお、上記ＨＰＬＣ条件では、Nα-Ｚ-Ｌ-リジン（標準品）の保持時間は約３.４分〔図１（Ｃ）中、ピーク２〕、並びにNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸（標準品）の保持時間は約２１.４分である〔図１（Ｃ）中、ピーク４〕。
【００８４】
図１（Ａ）に上記反応開始前のNα-Ｚ-Ｌ-リジンを含む反応液をＨＰＬＣ分析した結果のクロマトグラムを、図１（Ｂ）に上記反応終了後の反応液をＨＰＬＣ分析した結果のクロマトグラムをそれぞれ示す。その結果からわかるように、アミンオキシダーゼによる反応に伴って、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンに相当するピーク（Rt.3.4min）は減少し、保持時間２４.１分付近のピークが出現し、増大する傾向が見られた。なお、その他にはピークの出現並びに増大は殆ど認められなかった。このことから、２４.１分付近に溶出される物質が上記反応の生成物と推定された。そこで、２４.１分付近の溶出画分を分取して、アルデヒド定量用試薬である３−メチル−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）で、当該分画液中に含まれる物質についてアルデヒド基の有無を調べた。具体的には、M. A. Pazらの方法（Archives of Biochemistry and Biophysics, 109, 548-559, 1965）に準じて、０.２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（pH 4.0）０.１５ｍｌに上記分画液を０.０５ｍｌ加えた後、０.１％ (w/v) ＭＢＴＨ溶液を０.０６ｍｌ添加して２５℃で１０分間加温した（MBTH反応１）。次にこの反応液に０.２％(w/v) ＦｅＣｌ3溶液を０.７５ｍｌ添加してさらに１０分間加温して（MBTH反応２）、その吸収スペクトルを調べた。
【００８５】
結果を図２に示す。図中、（Ａ）の実線はMBTH反応１の反応液の吸収スペクトルであり、（Ｂ）の実線はMBTH反応２の反応液の吸収スペクトルである。なお、（Ａ）と（Ｂ）の各波線は、蒸留水とＭＢＴＨとの反応液（ブランク）の吸収スペクトルである（コントロール）。
【００８６】
その結果、図２に示すように、MBTH反応２で620 nm付近と660 nm付近に極大吸収を持つスペクトルが得られ、２４.１分付近に溶出された物質にアルデヒド基が含まれることが明らかになった。
【００８７】
試験例５
Ｄ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｄ-リジンを用いて、試験例４と同様にして、試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼと反応させた後、Nα-Ｚ-Ｄ-リジンからの生成物を上記と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行った。なお、上記ＨＰＬＣ条件で、Nα-Ｚ-Ｄ-リジン（標準品：Fluka）の保持時間は約３.４分である。
【００８８】
ＨＰＬＣ分析の結果、アミンオキシダーゼによる反応に伴って、Nα-Ｚ-Ｄ-リジンに相当するピーク（Rt.3.5min）は減少し、保持時間２４.１分付近のピークが増大する傾向が見られた。なお、その他にはピークの出現並びに増大は認められなかった。このため、２４.１分付近の溶出画分を分取して、得られた画分中に含まれる物質のアルデヒド基について、試験例４と同様にして分析した。
【００８９】
その結果、MBTH反応２で620 nm付近と660 nm付近に極大吸収を持つスペクトルが得られ、２４.１分付近に溶出された物質にアルデヒド基が含まれることが明らかになった。
【００９０】
試験例６
試験例４及び５と同様にして、Nα-Ｚ-Ｌ-リジン及びNα-Ｚ-Ｄ-リジンに、試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼと反応させて、上記ＨＰＬＣ分析において保持時間２４.１分付近に溶出する生成物に相当する反応生成物を、下記条件のＣ18逆相クロマトグラフィーにより分取し、スピードバックで濃縮した。
＜ＨＰＬＣ分析＞
カラム：Syn Pro Pep RPC18 (4.6 x 150 mm)(島津製作所)
移動相：Ａ液−０．１％トリフルオロ酢酸/精製水、
Ｂ液−０．１％トリフルオロ酢酸/アセトニトリル
グラジェント条件：0−5分：A/B=100/0、 5−50分：A/B=55/45、 50−55分：A/B=55/45
カラム温度：４０℃
流速：1.0 ｍｌ/分
検出器：島津UV-VIS Detector SPD-10AV
測定波長：２１０ｎｍ。
【００９１】
得られた試料をそれぞれ70容量％メタノールに溶解してイオントラップ型質量分析装置LCQ Deca（サーモエレクトロン株式会社）で分析した。その結果、いずれの試料からも分子量279にピークが確認された。この分子量はNα-Ｚ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの理論値とよく一致する。このことから、Nα-Ｚ-Ｌ-リジン及びNα-Ｚ-Ｄ-リジンに試験例１のアミンオキシダーゼを反応させて得られた生成物は、それぞれNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド及びNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドであると推察された。このことは、試験例４と５の結果を支持するものであった。
【００９２】
試験例７    アミンオキシダーゼの至適ｐＨ
試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼとＬ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｌ-リジンの反応）の至適ｐＨを求めた。具体的には、Ｌ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｌ-リジンの０.１Ｍ 水溶液を０.２Ｍ リン酸緩衝液（pH 6.0〜pH 8.5）で調製し、その１０ｍｌに試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼを２.３単位添加し、これを３０℃で３日間振とう反応した。この反応液の遠心上清画分について、試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラム（東ソー社製、内径ｘ長さ＝7.5 mm ｘ 7.5 cm）を用いてＨＰＬＣ分析（条件前記）を行い、保持時間２４.１分付近に溶出されるピーク面積から、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンから生成されるNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド量を算出した。
【００９３】
結果を図３に示す。なお、図中、横軸は反応のｐＨ条件（pH 6.0〜pH 8.5）を示し、縦軸はNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量を、最適ｐＨ（pH7.5）での最大生成量を１００％とした換算値（％）で示す。
【００９４】
図３からわかるように、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量はｐＨ６〜８.５において多く、ｐＨ７.５付近が最大であった。このことから、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドを生成する反応において、試験例１のAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼの至適ｐＨは、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７.５前後であることがわかった。
【００９５】
試験例８    アミンオキシダーゼの至適温度
試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼとＬ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｌ-リジンの反応の至適温度を求めた。具体的には、Ｌ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したＮα-Ｚ-Ｌ-リジンの０.１Ｍ水溶液を０.２Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）で調製し、その１０ｍｌに試験例１のAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼを２.３単位添加して、２５℃、３０℃または３５℃の各々の条件で３日間振とう反応した。この反応液の遠心上清画分について、試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラム（東ソー社製；内径ｘ長さ＝7.5 mm x 7.5 cm）を用いてＨＰＬＣ分析（条件：前記）を行い、保持時間２４.１分付近に溶出されるピーク面積から、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンから生成されるNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド量を算出した。
【００９６】
結果を図４に示す。なお、図中、横軸は反応温度（25〜35℃）を示し、縦軸はNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量を、最適温度（30℃）での最大生成量を１００％とした換算値（％）で示す。
【００９７】
その結果、図４に示すように、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド生成量は、いずれも温度でも多く、２５〜３０℃付近が最大であった。
【００９８】
このことから、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドを生成する反応において、Aspergillus niger由来のアミンオキシダーゼの至適温度は、２５〜３０℃、好ましくは３０℃前後であることがわかった。
【００９９】
以上の試験例２〜６の結果より、試験例１で調製したアミンオキシダーゼは、式（１）：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 （１）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるα−アミノ基が保護されてなるＬ−リジンまたはＤ−リジンの６位のアミノメチル基（上記下線部）に特異的に作用して該基をアルデヒド基に酸化し、対応する式（２）：
ＨＯＯＣＣＨ(ＮＨＲ)ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ （２）
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す）
で表されるNα-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体またはNα-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を生成すること明らかになった。
【０１００】
さらに、上記試験例７と８の結果より、Nα-Ｚ-リジンを原料として、アミンオキシダーゼを用いてNα-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体を製造する方法は、酸性領域からアルカリ性領域の比較的広い範囲で実施することが可能であり、また温度条件は３５℃以下が望ましいことが明らかとなった。
【０１０１】
以上の試験結果を基に、Aspergillus niger由来のアミンオキシダーゼを用いたNα-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体、 Nα-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体、Nα-Ｌ-アミノアジピン酸誘導体およびNα-Ｄ-アミノアジピン酸誘導体の製造方法について、以下、実施例を示す。
【０１０２】
尚、本試験例及び実施例では、反応生成物であるα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体やα−アミノアジピン酸誘導体を、その同定を主たる目的として分析用ＨＰＬＣで分画したが、反応生成物を大量に取得するためには、分析用ＨＰＬＣに代えて分取用ＨＰＬＣを用いたり、一般にアミノ酸や有機酸の分離精製に使用されるイオン交換樹脂や疎水性樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー、あるいは有機溶媒などによる選択的な沈殿法を用いた精製分取法を採用することもできる。
【０１０３】
実施例１
Ｌ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｌ-リジンの５０ｍＭ 水溶液を０.２Ｍ リン酸緩衝液（pH 7.5）で調製し、その１０ｍｌに試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼを１００単位添加して、２５℃で３日間振とう反応した（反応系１）。一方で、上記と同一組成からなる反応液に更に6000単位のカタラーゼを加えて、上記と同様に２５℃で３日間振とう反応した（反応系２）。そして、反応系１及び２でそれぞれ生成するNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド量を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（条件：前記）により算出した。また、保持時間３.４分付近のピーク面積の減少から、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンの分解量（ｍＭ）を算出した。
【０１０４】
結果を図５に示す。図中、□はNα-Ｚ-Ｌ-リジンの減少量（カタラーゼ無添加）を、■はＮα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量（カタラーゼ無添加）を、○はNα-Ｚ-Ｌ-リジンの減少量（カタラーゼ添加）を、●はＮα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量（カタラーゼ添加）をそれぞれ示す。
【０１０５】
図５からわかるように、カタラーゼの有無に関わらず、いずれの反応系も、出発原料として使用したNα-Ｚ-Ｌ-リジンが溶出される３.４分付近のピーク面積の減少量と生成物であるNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドが溶出される２４.１分付近のピーク面積の増加量とは良く相関していた。また、カタラーゼ非共存下での反応系１の結果（■、□）とカタラーゼ共存下での反応系２の結果（●、○）との対比から、反応系にカタラーゼを共存させておくと、共存させない場合に比べてNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量（またはNα-Ｚ-Ｌ-リジンの分解量）が約３０％増加することがわかった。なお、図５の結果から、カタラーゼを共存させた反応系２では、当初反応液中に含まれていたNα-Ｚ-Ｌ-リジンのほぼ１００％が酸化されて、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドに変換されたことがわかる（反応収率：約１００％）。
【０１０６】
実施例２
Ｄ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｄ-リジンの５０ｍＭ 水溶液を０.２Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）で調製し、その１０ｍｌに１５０単位の試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼ、及び6000単位のカタラーゼを添加して、２５℃で３日間振とう反応した。そして、上記反応により生成するNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒド量を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（条件前記）により算出した。また、保持時間３.５分付近のピーク面積の減少からNα-Ｚ-Ｄ-リジンの分解量（ｍＭ）を算出し、更に、反応によって生じたアンモニアの量を、アンモニア態窒素測定用試薬キット「アンモニア・テスト ワコー」（和光純薬（株）製）を用いた比色分析（藤井・奥田法変法）により測定した。
【０１０７】
結果を図６に示す。図中、○はNα-Ｚ-Ｄ-リジンの減少量を、●はNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量を、△はアンモニアの生成量をそれぞれ示す。
【０１０８】
図６からわかるように、出発原料として使用したNα-Ｚ-Ｄ-リジンが溶出される３.４分付近のピーク面積の減少量と生成物であるNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドが溶出される２４.１分付近のピーク面積の増加量とは良く相関しており、Nα-Ｚ-Ｄ-リジンのほぼ１００％がNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドに変換されていることが確認された（反応収率：約１００％）。また、Nα-Ｚ-Ｄ-リジンの酸化によって生成したアンモニア量もまたNα-Ｚ-Ｄ-リジンの減少量およびNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量と良く相関していた。
【０１０９】
実施例３
（１）試験例１と同様にして、Aspergillus niger AKU 3302（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９７１１）を、Yamada, H. Adachi, O. and Ogata, K.の方法（Agric. Biol. Chem., 29, 117-123, 1965）に準じてn-ブチルアミン含有培地（0.1% n-butylamine, 3.0% glucose, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4, 0.05% KCl, pH 6.0）で３０℃、２日間培養して、アミンオキシダーゼを誘導させ、アミンオキシダーゼ活性を持つ菌体を調製した。次いで該菌体を含む培養液を遠心分離し、集めた菌体を−80℃で凍結し、減圧下で２日間乾燥した。得られた凍結乾燥物を凍結乾燥菌体として調製した。
【０１１０】
（２）実施例１と同様に、Ｌ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｌ-リジンの５０ｍＭ 水溶液を０.２Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）で調製し、その１０ｍｌにカタラーゼ６０００単位と試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼ１５０単位を添加して２５℃で３日間振とう反応した。そして、得られた反応液の一部について遠心分離し、得られた上清を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（条件前記）に供し、２４.１分付近のピーク面積から反応によって生成したNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド量を求めた。その結果、出発原料として使用したＮα-Ｚ-Ｌ-リジンはアミンオキシダーゼとの反応でほぼ完全にNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドに変換されていることが確認された。
【０１１１】
（３）次にこの反応液に、上記（１）で調製した凍結乾燥菌体（Aspergillus niger AKU 3302）を０.１３ｇ添加し、さらに３０℃で３日間振とう反応した。そして、得られた反応液を遠心分離し、得られた上清を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（上記前記）に供した。その結果、保持時間２４.１分付近に溶出されるピークは減少し、一方Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸の保持時間に相当する２１.４分付近にピークの出現並びに増大が認められた。さらに、そのピーク面積は反応時間の増大に伴って増加することが認められた。このことから、上記のアミンオキシダーゼによる反応で生成したNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドは、Aspergillus niger AKU 3302の凍結乾燥菌体の作用によってNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸に変換されたことが確認された。なお、上記反応において、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸への反応収率は４０％であり、さらに出発原料Ｎα-Ｚ-Ｌ-リジンからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸への反応収率は４０％であった。
【０１１２】
実施例４
実施例３の（１）に記載する方法に従って調製したAspergillus niger AKU 3302の凍結乾燥菌体０.４ｇを、０.２Ｍ リン酸緩衝液（pH 7.5）で調製した２０ｍＭ Nα-Ｚ-Ｌ-リジン水溶液１５ｍｌに添加し、３０℃で７日間振とう反応した。そして、得られた反応液の上清を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（条件前記）に供し、得られたクロマトグラム上の保持時間約３.４分におけるピーク面積、約２４.１分におけるピーク面積、及び約２１.４分におけるピーク面積からそれぞれ、反応液中のNα-Ｚ-Ｌ-リジン、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド及びNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸の量を算出した。
【０１１３】
その結果、反応時間の経過に伴って、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンが溶出される３.４分のピークが小さくなり、それに伴ってNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドが溶出される２４．１分のピークが大きくなった。さらに時間が経過するにつれて、当該２４．１分のピークは小さくなり、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸が溶出される２１.４分のピークが大きくなった。上記の反応により、消費されたNα-Ｚ-Ｌ-リジンの約５０％がNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸として得られた（収率：約５０％）。
【０１１４】
実施例５
実施例３（１）に記載する方法において、n-ブチルアミンを含む培地の代わりにNα-Ｚ-DL−リジンを含む培地を用いる以外は、Yamadaらの方法（Agric. Biol. Chem., 29, 117-123, 1965）に従って、Aspergillus niger AKU 3302株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７１１）を３０℃で２日間培養した。次いで該菌体を含む培養液を遠心分離し、集めた菌体を−80℃で凍結し、減圧下で２日間乾燥した。得られた凍結乾燥物を凍結乾燥菌体として調製した。
【０１１５】
この凍結乾燥菌体０.４ｇを０.２Ｍ リン酸緩衝液（pH 7.0）で調製した２０ｍＭ Nα-Ｚ-Ｌ-リジン溶液１５ｍｌに添加し、３０℃で７日間振とう反応した。そして、得られた反応液を遠心分離し、その上清を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（条件前記）に供し、得られるクロマトグラム上の保持時間約３.４分におけるピーク面積、約２４.１分におけるピーク面積、及び約２１.４分におけるピーク面積からそれぞれ、反応液中のNα-Ｚ-Ｌ-リジン、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド及びNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸の量を算出した。
【０１１６】
その結果、反応時間の経過に伴って、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンが溶出される３.４分のピークが小さくなり、それに伴ってNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドが溶出される２４．１分のピークが大きくなった。さらに時間が経過するにつれて、当該２４．１分のピークは小さくなり、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸が溶出される２１.４分のピークが大きくなった。上記の反応により、消費されたNα-Ｚ-Ｌ-リジンの約５０％がNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸として得られた（収率：約５０％）。
【０１１７】
実施例６
（１）Ｄ−リジンのα−アミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護したNα-Ｚ-Ｄ-リジンの５０ｍＭ 水溶液を０.２Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）で調製し、その１０ｍｌに１５０単位の試験例１で調製したAspergillus niger由来のアミンオキシダーゼ、及び6000単位のカタラーゼを添加して、２５℃で３日間振とう反応した。そして、得られた反応液の一部について遠心分離し、得られた上清を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（条件前記）に供し、反応によって生成したNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒド量を求めた。その結果、出発原料として使用したＮα-Ｚ-Ｄ-リジンはアミンオキシダーゼとの反応でほぼ完全にNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドに変換されていることが確認された（反応収率：１００％）。
【０１１８】
（２）次にこの反応液に、上記実施例３（１）に記載する方法に従って調製したAspergillus niger AKU 3302の凍結乾燥菌体を０.１３ｇ添加し、さらに３０℃で３日間振とう反応した。そして、得られた反応液を遠心分離し、得られた上清を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（条件前記）に供した。その結果、保持時間２４.１分付近に溶出されるピークは減少し、一方、Nα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸の保持時間に相当する２１.４分付近にピークの増大が認められた。さらに、そのピーク面積は反応時間の増大に伴って増加することが認められた。このことから、上記のアミンオキシダーゼによる反応で生成したNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドは、Aspergillus niger AKU 3302の凍結乾燥菌体の作用によってNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸に変換されたことが確認された。なお、上記反応において、Nα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドからNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸への反応収率は３０％であり、さらに出発原料Ｎα-Ｚ-Ｄ-リジンからNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸への反応収率は３０％であった）。
【０１１９】
実施例７
上記実施例３（１）に記載する方法に従って調製したAspergillus niger AKU 3302の凍結乾燥菌体４０ｍｇを、０.１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７.０）２.４ｍＬに懸濁し、これに０.５mmガラスビーズを１.２ｇ添加して、細胞破砕機で４分間（２min ｘ２）破砕した。この破砕液を遠心分離し、得られた上清画分を用いてＬ-リジン、Ｄ-リジン、Nα-Ｚ-Ｌ-リジン、Nα-Ｚ-Ｄ-リジン, Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド、及びNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドに対するオキシダーゼ活性を、過酸化水素の生成速度から求めた。その結果を表２に示す。
【０１２０】
【表２】
2005304477.tif 000003
【０１２１】
表２に示すように、Aspergillus niger AKU3302の菌体破砕上清液にNα-Ｚ-Ｌ-リジン、Nα-Ｚ-Ｄ-リジン、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドおよびNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドを酸化するオキシダーゼ活性が認められた。このうち、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンとNα-Ｚ-Ｄ-リジンに対するオキシダーゼ活性は、Aspergillus niger AKU3302の菌体破砕上清液中にアミンオキシダーゼの存在を支持するものである。
【０１２２】
さらに上記の結果は、Aspergillus niger AKU3302による菌体反応によって、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸への変換、またNα-Ｚ-Ｄ-リジンからNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸への変換が可能であること、さらにNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸への反応、及びNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドからNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸への反応が、オキシダーゼによって行われる可能性を示すものである。
【０１２３】
実施例８
実施例３の（１）に記載する方法に従って調製したAspergillus niger AKU 3302の凍結乾燥菌体０.４ｇを、０.２Ｍ リン酸緩衝液（pH 7.5）で調製した２０ｍＭ Nα-Ｚ-Ｄ-リジン水溶液１５ｍｌに添加し、３０℃で７日間振とう反応した。そして、得られた反応液の上清を、上記試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析（条件前記）に供し、得られたクロマトグラム上の保持時間約３.４分におけるピーク面積、約２４.１分におけるピーク面積、及び約２１.４分におけるピーク面積を求めた。このピーク面積から、反応液中のNα-Ｚ-Ｄ-リジン減少量とNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸生成量を求めた結果、消費されたNα-Ｚ-Ｄ-リジンの約５０％のNα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸が得られた（収率：約５０％）。
【０１２４】
実施例９
実施例４と同様にAspergillus niger JCM 5634株（JCMから入手）をYamadaらの方法（Agric. Biol. Chem., 29, 117-123, 1965）に準じてn-ブチルアミン含有培地で３０℃で２日間培養した後、凍結乾燥菌体を調製した。この凍結乾燥菌体０.４ｇを０.２Ｍ リン酸緩衝液, pH 7.5で調製した20 mM Ｎα-Ｚ-Ｌ-リジン溶液１５mlに添加し、３０℃で１２日間振とう反応した。その結果、反応時間と共にＮα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸が溶出される２１.２分付近のピーク面積が増加し、消費されたＮα-Ｚ-Ｌ-リジンの約２０％がＺ-α-Ｌ-アミノアジピン酸に変換された。このことから、Aspergillus nigerを利用することによって、Nα-Ｚ-Ｌ-リジンからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸に変換できることがわかる。
【０１２５】
実施例１０
（１）試験例１と同様にして、Aspergillus niger に属する菌株（Aspergillus niger JCM 5546、Aspergillus niger JCM 5548、Aspergillus niger JCM 5634、Aspergillus niger JCM 5697）を、Yamada, H. Adachi, O. and Ogata, K.の方法（Agric. Biol. Chem., 29, 117-123, 1965）に準じてn-ブチルアミン含有培地（0.1% n-butylamine, 3.0% glucose, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4, 0.05% KCl, pH 6.0）で３０℃、２日間培養した。得られた菌体を、それぞれ細胞破壊機（安井器械製）を用いて、ガラスビーズで破砕した。この破砕液を遠心分離にかけて、得られた上清画分を用いて、試験例１と同様の方法で、n−ブチルアミン、Nα-Ｚ-Ｌ-リジン及びNα-Ｚ-Ｄ-リジンに対するオキシダーゼ活性を、過酸化水素の生成速度から求めた。その結果、いずれの菌体にも上記基質に対するオキシダーゼ活性が認められた。
【０１２６】
（２）また上記の菌体を、それぞれ培養取得後、凍結乾燥し、得られた各凍結乾燥菌体40mgを実施例４と同様に、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.5）で調製した20mM Nα-Ｚ-Ｌ-リジン溶液15mlに添加して30℃で７日間、振とう反応した。得られた反応液を遠心分離し、その上清を、試験例４と同様にして、TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いたＨＰＬＣ分析に供した。その結果、いずれの菌体反応液にもAspergillus niger AKU 3302の場合と同様に、保持時間24.1分（Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド）及び21.4分（Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸）に新しいピークが検出された。
【０１２７】
以上のことから、アミンオキシダーゼを産生する能力のあるAspergillus niger に属する菌株は、いずれもNα-Ｚ-リジンをNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒド及びNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸に変換することができることが明らかになった。
【０１２８】
実施例１１
試験例１と同様にして、Aspergillus niger AKU 3302をn-ブチルアミン含有培地で３０℃、２日間培養し、得られた菌体を、それぞれ細胞破壊機（安井器械製）を用いて、ガラスビーズで破砕した。この破砕液を遠心分離にかけて、得られた上清画分を用いて、試験例１と同様の方法で、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドに対するオキシダーゼ活性を、過酸化水素の生成速度から求めた。その結果、オキシダーゼ活性が認められ、当該菌体が、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドに対するオキシダーゼ活性を有する酵素を産生することが確認された。
【０１２９】
一方、20mM Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドに、上記の上清画分とデヒドロゲナーゼ活性測定用試液（10mlの0.05％トリトンX-100含有0.1M リン酸緩衝液(pH7.0)にニトロブルーテトラゾリウム3mg、NAD＋またはNADP＋20mg、ジアフォラーゼ20単位を溶解した発色液）を加えて30℃で反応した結果、デヒドロゲナーゼ活性の存在を示唆する発色の増加は認められなかった。このことから、本菌体（Aspergillus niger AKU 3302）によって、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドがNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸に変換する反応には、アルデヒドデヒドロゲナーゼではなく、アルデヒドオキシダーゼが関与していることが分かった。
【０１３０】
以上のことから、本菌体（Aspergillus niger AKU 3302）を用いたNα-Ｚ-Ｌ-リジンからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドへの変換、及びNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドからNα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸への変換は、それぞれアミンオキシダーゼ及びアルデヒドオキシダーゼが関与していることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
α−Ｌ−アミノアジピン酸やα−Ｄ−アミノアジピン酸は、非タンパク性のアミノ酸であり、ペプチド性抗生物質や、ペプチド性ホルモンなどの生理活性ペプチドの合成原料として用いられる。またβ−ラクタム抗生物質の発酵生産において前駆体として用いられる。本発明は、α−Ｌ−アミノアジピン酸、α−Ｄ−アミノアジピン酸またはこれらの誘導体、並びにその製造中間体であるセミアルデヒド体を効率よく、工業的に製造するための新たな方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】Nα-Ｚ-Ｌ-リジン、Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸および関連化合物のHPLC分析クロマトグラムを示す。それぞれ横軸は溶出時間（min）、縦軸はＵＶ吸光度（210nm）を示す。(A)反応開始液（Nα-Ｚ-Ｌ-リジン含有）のTSK-GEL DEAE-5PWカラムによる分析(B)４日間反応後の反応生成物のTSK-GEL DEAE-5PWカラムによる分析(C)TSK-GEL DEAE-5PWカラムを用いた標準物質の分析（１．Ｌ-リジン，２．Nα-Ｚ-Ｌ-リジン，３．Ｌ-アミノアジピン酸，４．Nα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸）
【図２】酵素反応生成物（TSK-GEL DEAE-5PWカラムで24.1分付近に溶出された画分）とMBTHとの反応液の吸収スペクトルを示す。横軸は波長（250nm〜700nm）、縦軸は吸光度（Absorbance）を示す。(A) MBTH反応１、(B) MBTH反応２。実線：24.1分付近に溶出された画分とMBTHの反応液、破線：蒸留水とMBTHの反応液。
【図３】Ｎα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成における反応ｐＨの影響を示す。
【図４】Ｎα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成における反応温度の影響を示す。
【図５】アミンオキシダーゼとの反応によるＮα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成とカタラーゼの添加効果を示す。○： Nα-Ｚ-Ｌ-リジンの減少量（カタラーゼ添加）、●：Ｎα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量（カタラーゼ添加）、□：Nα-Ｚ-Ｌ-リジンの減少量（カタラーゼ無添加）、■：Ｎα-Ｚ-Ｌ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量（カタラーゼ無添加）
【図６】アミンオキシダーゼとの反応によるＮα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成を示す。○：Nα-Ｚ-Ｄ-リジンの減少量、●：Ｎα-Ｚ-Ｄ-アミノアジピン酸セミアルデヒドの生成量、△：アンモニアの生成量
【図１】
2005304477.tif 000004
【図２】
2005304477.tif 000005
【図３】
2005304477.tif 000006
【図４】
2005304477.tif 000007
【図５】
2005304477.tif 000008
【図６】
2005304477.tif 000009