(57)【要約】【課題】ポリペプチド、核酸等の生物活性物質を細胞内または核内へ輸送する活性を有するポリペプチドを効率よくスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドを含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列、及び該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的物質またはそれをコードする塩基配列を含む核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする輸送ポリペプチドのスクリーニングに用いるための分子。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドを含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列、及び該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的物質またはそれをコードする塩基配列を含む核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする輸送ポリペプチドのスクリーニングに用いるための分子。
【請求項２】
２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドと該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的タンパク質との融合タンパク質を含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列及び該目的タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドを含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列を含み、かつ該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される非タンパク性目的物質が結合した核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする、請求項１に記載の分子。
【請求項４】
上記核酸部が、候補ポリペプチドをコードする塩基配列と目的タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合したものであることを特徴とする請求項２に記載の分子。
【請求項５】
上記核酸部が、候補ポリペプチドをコードする塩基配列を有する核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合したものであり、さらに該スペーサーに非タンパク性目的物質が結合したものであることを特徴とする請求項３に記載の分子。
【請求項６】
上記分子がさらに標識物質を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の分子。
【請求項７】
上記標識物質がスペーサーに結合していることを特徴とする請求項６に記載の分子。
【請求項８】
上記標識物質が、核酸部に含まれるヌクレオチド残基および／または目的タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸の相補鎖を構成するヌクレオチド残基に結合していることを特徴とする請求項６に記載の分子。
【請求項９】
上記タンパク質部が、２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドと、該候補ポリペプチドを無細胞翻訳系で発現させることを可能とする支持体蛋白質との融合タンパク質を含むものであることを特徴とする請求項２に記載の分子。
【請求項１０】
上記候補ポリペプチドがランダムなアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の分子または該分子の群。
【請求項１１】
２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドをコードする塩基配列、および該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的物質またはそれをコードする塩基配列を有する核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合していることを特徴とする核酸。
【請求項１２】
２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドをコードする塩基配列、および該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合していることを特徴とする、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合したものであり、さらに該スペーサーに、該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的物質が結合したものであることを特徴とする、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１４】
上記スペーサーが標識物質を含むことを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれかに記載の核酸。
【請求項１５】
上記候補ポリペプチドがランダムなアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれかに記載の核酸または該核酸の群。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれかに記載の核酸または該核酸の群をタンパク質合成系において転写／翻訳することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の分子または該分子の群の製造方法。
【請求項１７】
輸送ポリペプチドのスクリーニング方法であって、
（１）標的細胞と請求項１０に記載の分子の群とを接触させる工程；
（２）標的細胞内または標的細胞の核内に導入された上記分子の核酸部分に含まれる核酸を増幅する工程；及び
（３）増幅された核酸の塩基配列を解析し、該塩基配列がコードするポリペプチドを輸送ポリペプチドと同定する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
上記工程（１）と（２）の間に、さらに、（ａ）標的細胞表面から細胞または核内部に導入されていない該分子を除く工程を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記工程（２）が、標的細胞から該分子を選択的に抽出し、該分子の核酸部に含まれる核酸が選択的に増幅されるような処理を含むことを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的細胞から該分子を選択的に抽出し、該分子の核酸部に含まれる核酸が選択的に増幅されるような処理が、（２ａ）標的細胞の破砕物を６０００〜１００００×Ｇで５〜３０分間遠心分離を行い、さらに（２ｂ）上清中の該分子の核酸部分をＤＮＡの１本鎖にすることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記工程（２ｂ）の後に、上清中に含まれる核酸を熱変性処理することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１７で選択されたポリペプチドを候補ポリペプチドとして請求項１１から１４のいずれかに記載の核酸または核酸の群を製造し、該核酸または核酸の群をタンパク質合成系において転写／翻訳し、得られた分子または分子の群を用いて請求項１７から２１の何れかに記載の方法を行う、またはこれらの方法を繰り返すことを特徴とする、輸送ポリペプチドのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリペプチド又は核酸のような生物活性物質の細胞内または核内への輸送に係るポリペプチドのスクリーニング方法、並びに該方法に用いられる分子および核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
治療、診断等の目的で用いられるタンパク質や核酸等は、高分子であること等のために目的の細胞内に到達することができず、主に細胞外や表面上で作用するものが使用されてきた。また、低分子化合物であっても、例えば、脳血液関門を通過することができず、これらを脳細胞内に送達することができなかった。一般に、生物活性物質を細胞に導入する方法として、マイクロインジェクションやエレクトロポレーション法等、主に試験管内でそれらを細胞に導入する方法や、上記物質の細胞への導入を促進する生物学的または合成ベクターに結合または封入して細胞へ投与する方法が提案されている。しかし、これらの方法は、生体において適用しようとすると、細胞傷害性や輸送効率等で問題があった。
【０００３】
これに対し、生体内でタンパク質や核酸等を細胞内、あるいは核内へ輸送しているポリペプチドがあることが明らかとなり、種々のポリペプチドを利用した細胞への生物活性物質の細胞への輸送方法が開発されている。具体的には、例えば、ＨＩＶ−１ｔａｔタンパク質の特定部分ポリペプチド（これを「ＴＡＴポリペプチド」又は「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ（ＰＴＤ）ポリペプチド」と称することがある）を利用する方法（例えば特許文献１を参照）等が提案されている。
【０００４】
しかし、上記方法においてはポリペプチドとして天然に存在するものを用いるため、その細胞特異性や、輸送効率については限界があり、さらに高い輸送活性を有するポリペプチドや、輸送活性に細胞特異性を有するポリペプチドの開発が望まれていた。
【０００５】
一方、細胞内または核内輸送ポリペプチドのスクリーニング方法として、直接蛍光標識されたポリペプチドを細胞に導入させる方法、蛍光を発するタンパク質を支持体としてポリペプチドを含むようなタンパク質を細胞に導入させる方法、発光または発色を触媒するタンパク質を支持体としてポリペプチドを含むようなタンパク質を細胞に導入させる方法、抗体により検出されるタンパク質を支持体としてポリペプチドを含むようなタンパク質を細胞に導入させる方法等が開発されている。また、検出系としては、フローサイトメトリー法や顕微鏡観察法が用いられている。
【０００６】
しかし、これらの方法では、多種類の候補となるポリペプチドを解析することは難しい。また、蛍光物質やペプチド、核酸、多糖及び低分子化合物などを細胞内へ導入させるため、輸送ペプチドにこれらの物質を付加することは難しい。
【０００７】
従来の技術として、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙを用いて輸送ペプチドを探索する方法が報告されている（例えば、特許文献２を参照）。しかし、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙは、そのペプチドの発現にＰｈａｇｅを用いるために、発現する配列に偏りが生じる可能性があり、また、ライブラリーのダイバーシティーサイズにも限界がある。さらに、Ｐｈａｇｅは非常に大きいため、細胞または核内輸送ポリペプチドが効率よく機能するか疑問があり、細胞または核内輸送ポリペプチドをライブラリーから探索する方法としては問題があった。
【０００８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法（例えば、特許文献３を参照）は、核酸とそれがコードするタンパク質が一対一で対応付けられている分子（以下、これを「インビトロバイラス分子」、「ＩＶＶ分子」又は「Ｖｉｒｉｏｎ」と称することがある）を用いて、様々の分子間の相互作用を検出する方法である。この分子は、無細胞発現系によるタンパク質の発現により得られることから、発現したい配列を細胞毒性などを考慮することなく発現させることができ、一度に扱える分子数に制限がなく、少なくとも１０１２の対応づけ分子を一度に扱うことができる。このことから、ライブラリーとして使用する場合にも、１０１２以上という大きなダイバーシティーサイズをもつペプチドライブラリーとして作製することができる。
【０００９】
しかし、ＩＶＶ分子を細胞又は核内輸送ポリペプチドのスクリーニングに用いるためには、ＩＶＶ分子を細胞又は核内輸送ポリペプチドによって輸送される目的物質を伴って細胞内に導入されることができるか、ＩＶＶ分子を導入した細胞を検出することができるか、また細胞内に導入されたＩＶＶ分子からＰＣＲを用いてその核酸部分を増幅できるか等、細胞又は核内への輸送ポリペプチドのスクリーニング方法のために適性化しなければならない等の問題点があった。
【００１０】
【特許文献１】
特開平１０−３３１８６号公報
【特許文献２】
ＷＯ０１／１５５１１号公報
【特許文献３】
ＷＯ９８／１６６３６号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ポリペプチド、核酸等の生物活性物質を細胞内または核内へ輸送する活性を有するポリペプチドを効率よくスクリーニングする方法を提供することを課題とする。具体的には、２〜１００アミノ酸残基からなるポリペプチドを含むタンパク質部と、これをコードする塩基配列および該ポリペプチドにより標的細胞へ輸送される目的物質またはそれをコードする塩基配列を有する核酸部を含み、該タンパク質部のＣ末端と核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする分子、およびこれを用いて上記スクリーニングを行う方法を提供することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＴＡＴポリペプチドと該ポリペプチドにより輸送されるタンパク質との融合タンパク質のＣ末端と、該融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸部の３’末端とが直接共有結合をしている分子であって、蛍光物質により標識されている分子を作製し、これを標的細胞と共培養したところ、該細胞内に標識物質が検出される、即ち細胞内に標識物質が移行されることが判明した。さらに、この細胞を分離し、細胞内に導入された上記分子の核酸部分に含まれる核酸をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅したところ、上記融合タンパク質をコードする塩基配列であることを確認できた。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【００１３】
即ち、本発明によれば、２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドを含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列、及び該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的物質またはそれをコードする塩基配列を含む核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする輸送ポリペプチドのスクリーニングに用いるための分子が提供される。
【００１４】
好ましくは、２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドと該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的タンパク質との融合タンパク質を含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列及び該目的タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする、上記分子が提供される。
【００１５】
好ましくは、２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドを含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列を含み、かつ該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される非タンパク性目的物質が結合した核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする、上記分子が提供される。
【００１６】
好ましくは、上記核酸部は、候補ポリペプチドをコードする塩基配列と目的タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合したものである。
好ましくは、上記核酸部は、候補ポリペプチドをコードする塩基配列を有する核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合したものであり、さらに該スペーサーに非タンパク性目的物質が結合したものである。
【００１７】
好ましくは、上記分子はさらに標識物質を含む。
好ましくは、上記標識物質はスペーサーに結合している。
好ましくは、上記標識物質は、核酸部に含まれるヌクレオチド残基および／または目的タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸の相補鎖を構成するヌクレオチド残基に結合している。
【００１８】
好ましくは、上記タンパク質部は、２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドと、該候補ポリペプチドを無細胞翻訳系で発現させることを可能とする支持体蛋白質との融合タンパク質を含むものである。
好ましくは、上記候補ポリペプチドがランダムなアミノ酸配列からなることを特徴とする、上記分子または該分子の群が提供される。
【００１９】
さらに本発明によれば、２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドをコードする塩基配列、および該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的物質またはそれをコードする塩基配列を有する核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合していることを特徴とする核酸が提供される。
【００２０】
好ましくは、２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドをコードする塩基配列、および該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合していることを特徴とする上記核酸が提供される。
好ましくは、２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸の３’末端に、スペーサーを介して核酸誘導体が結合したものであり、さらに該スペーサーに、該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的物質が結合したものであることを特徴とする上記核酸が提供される。
【００２１】
好ましくは、上記スペーサーは標識物質を含む。
好ましくは、上記候補ポリペプチドはランダムなアミノ酸配列からなる。
【００２２】
さらに本発明によれば、上記した何れかの核酸または該核酸の群をタンパク質合成系において転写／翻訳することを特徴とする、上記した本発明の分子または該分子の群の製造方法が提供される。
【００２３】
さらに本発明によれば、輸送ポリペプチドのスクリーニング方法であって、
（１）標的細胞と請求項１０に記載の分子の群とを接触させる工程；
（２）標的細胞内または標的細胞の核内に導入された上記分子の核酸部分に含まれる核酸を増幅する工程；及び
（３）増幅された核酸の塩基配列を解析し、該塩基配列がコードするポリペプチドを輸送ポリペプチドと同定する工程；
を含むことを特徴とする方法が提供される。
【００２４】
好ましくは、上記工程（１）と（２）の間に、さらに、（ａ）標的細胞表面から細胞または核内部に導入されていない該分子を除く工程を含む。
好ましくは、上記工程（２）は、標的細胞から該分子を選択的に抽出し、該分子の核酸部に含まれる核酸が選択的に増幅されるような処理を含む。
好ましくは、標的細胞から該分子を選択的に抽出し、該分子の核酸部に含まれる核酸が選択的に増幅されるような処理は、（２ａ）標的細胞の破砕物を６０００〜１００００×Ｇで５〜３０分間遠心分離を行い、さらに（２ｂ）上清中の該分子の核酸部分をＤＮＡの１本鎖にすることを特徴とする。
好ましくは、上記工程（２ｂ）の後に、上清中に含まれる核酸を熱変性処理する。
【００２５】
本発明によればさらに、前記の輸送ポリペプチドのスクリーニング方法で選択されたポリペプチドを候補ポリペプチドとして前記の本発明の核酸または核酸の群を製造し、該核酸または核酸の群をタンパク質合成系において転写／翻訳し、得られた分子または分子の群を用いて上記のスクリーニング方法を行う、またはこれらの方法を繰り返すことを特徴とする、輸送ポリペプチドのスクリーニング方法が提供される。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下にさらに詳細に説明する。
（１）候補ポリペプチドを含むインビトロバイラス分子
本発明は、ポリペプチド又は核酸のような目的物質を細胞内または核内に輸送する機能を有するポリペプチド（本明細書中では、これを「輸送ポリペプチド」と称することがある。）のスクリーニング方法、並びに該スクリーニング方法に用いるための分子等に関するものである。本発明のスクリーニング方法において輸送ポリペプチドの候補として用いられるポリペプチド（本明細書中では、これを「候補ポリペプチド」と称することがある）は、２〜１００アミノ酸残基からなり、これをコードするＤＮＡをタンパク質合成系において転写、翻訳することにより製造され得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、２〜４０アミノ酸程度のランダムなアミノ酸配列からなるものを用いることが、効率的なスクリーニング方法を行う上で好ましい。２〜４０アミノ酸程度のランダムなアミノ酸配列を含むライブラリーを用いる場合、輸送ポリペプチドとして得られたアミノ酸配列が、そのまま輸送ポリペプチドとして用いることができる可能性が高いことから、輸送ポリペプチドを探索するためのライブラリーとして有用である。
【００２７】
また、候補ポリペプチドをコードするＤＮＡとして、４１以上のアミノ酸残基からなるランダムなアミノ酸配列を含むライブラリー、もしくは、厳密にはランダムなアミノ酸配列ではないが、自然界から得られた配列に基づくｃＤＮＡライブラリーなども用いることができる。このようなライブラリーを用いる場合、輸送ポリペプチドとして機能する配列は、本発明のスクリーニング方法で得られたアミノ酸配列の部分配列である可能性が高い。輸送ポリペプチドはできるだけ少ないアミノ酸残基からなることが望ましいため、得られたアミノ酸配列から、輸送ポリペプチドとしての機能を有する部分断片を選択することが好ましい。選択の方法としては、例えば、得られたアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを既知の方法によって作製し、後述する方法等によって細胞内への導入効果を指標としてスクリーニングする方法等が挙げられる。さらに、該スクリーニングによって多種類の候補ポリペプチドが得られた場合には、上記のスクリーニング方法を繰り返し、最適な輸送ペプチドを得ることができる。また、既知の輸送ポリペプチドに変異が導入されたものも用いることができる。
【００２８】
候補ポリペプチドを含むＩＶＶ分子としては、該ポリペプチドを含むタンパク質部と、該ポリペプチドをコードする塩基配列、及び必要に応じて該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的物質またはそれをコードする塩基配列を有する核酸部を含み、該タンパク質部のＣ末端と核酸部の３’末端とが直接共有結合をしていることを特徴とする分子が挙げられる。
【００２９】
候補ポリペプチドを含むＩＶＶ分子の具体例としては、
（ｉ）２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドと該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される目的タンパク質との融合タンパク質を含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列及び該目的タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしている分子；並びに、
（ｉｉ）２〜１００アミノ酸残基からなる候補ポリペプチドを含むタンパク質部と、該候補ポリペプチドをコードする塩基配列を含み、かつ該ポリペプチドにより標的細胞内へ輸送される非タンパク性目的物質が結合した核酸部とを含み、該タンパク質部のＣ末端と該核酸部の３’末端とが直接共有結合をしている分子；を挙げることができる。ここで候補ポリペプチドが短鎖である場合、上記核酸部には該候補ポリペプチドをコードする塩基配列と、下述する支持体タンパク質をコードする塩基配列を含み、又そのタンパク質部は候補ポリペプチドと支持体タンパク質の融合タンパク質となることが好ましい。
【００３０】
上記（ｉ）の場合は、核酸部が、目的タンパク質をコードする塩基配列を有する場合であり、この場合には、タンパク質部には候補ペプチドと目的タンパク質とが融合タンパク質として含まれている。
【００３１】
本発明で用いる目的物質（即ち、目的タンパク質、又は非タンパク性目的物質）としては、本発明のスクリーニング方法を行うための分子として使用できれば特に制限はない。しかし、候補ポリペプチドが短鎖であるため、これをタンパク質合成系、特に無細胞タンパク質合成系において発現させることが難しいため、比較的短いポリペプチドをタンパク質合成系で発現させることを可能とする支持体タンパク質等を目的物質として用いることが好ましい。目的タンパク質である支持体タンパク質と候補ポリペプチドとの融合タンパク質は、上記のいずれがＮ末側またはＣ末側でもよい。
【００３２】
支持体タンパク質としては、一般的には、以下の条件を満たすものが好ましい。（１）球状タンパク質であってフォールディングしやすい、（２）安定性がある、（３）ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を含まない等である。これらの条件を満たすタンパク質としては、例えば、Ｏｃｔ−１のＰｏｕ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｏｍａｉｎ（７３アミノ酸残基）（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６２，８５２−８５４）等が挙げられる。このタンパク質は１つだけＣｙｓ残基を含むため、このＣｙｓ残基をＡｌａ残基に置換した変異体（配列番号３）等が特に好ましく用いられる。このようなタンパク質は提示しようとするペプチドにＣｙｓが含まれていてもこの支持体タンパク質とＳ−Ｓ結合して構造を変えることはない。また、このＯｃｔ−１のＰｏｕ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｄｏｍａｉｎはＮ末端側とＣ末端側が離れているためにランダムなペプチドをＮ末端側に提示した際に、Ｃ末端側にあるスペーサー部分（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法の場合）と相互作用しにくいと考えられる。このタンパク質は４つのαヘリックスからなりフォールディングしやすいと考えられる。また、無細胞翻訳系においては短いペプチドは発現されにくいことから、このような支持体と融合タンパク質を作る必要性がある。
【００３３】
本発明で用いる支持体タンパク質は、３０〜２００アミノ酸残基からなる球状タンパク質から成ることを特徴とする。好ましくは、システイン残基を含まず、βシート構造を有さず、αヘリックス構造からなり、立体構造においてＮ末端とＣ末端が離れていることが好ましく、また他の生体高分子と相互作用しないタンパク質であることが好ましい。
【００３４】
非タンパク性目的物質としては、一般的に生物活性を有する核酸、糖等のような高分子物質や、医薬活性成分等の低分子物質、さらには量子ビーズ・光増感剤・原子等のナノ分子等が挙げられる。このような目的物質を付加する位置としては、後述するスペーサー部分が挙げられる。
【００３５】
また、上記ＩＶＶ分子には、これが細胞または核内に導入された場合に、簡便に検出できるよう、標識物質を含むことも好ましい。標識物質としては、細胞または核内にＩＶＶ分子が導入されたことを検出し得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光物質や、西洋ワサビペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の呈色アッセイに用いられる酵素等が好ましく用いられる。標識物質は、ＩＶＶ分子のいずれの場所に付加されていてもよいが、後述するスペーサー部分や、核酸部に含まれる核酸の相補鎖を構成するヌクレオチド残基に結合させて導入することが好ましい。また、蛍光を発するタンパク質（ＧＦＰ等）をＩＶＶ分子のタンパク質部に候補ポリペプチドとの融合タンパク質として付加することもできる。上記呈色アッセイに用いられる酵素も、ＩＶＶ分子のタンパク質部に候補ポリペプチドなどとの融合タンパク質として付加することができる。
【００３６】
また、上記ＩＶＶ分子は、これを精製する目的で、ある物質と特異的に結合する性質を有する物質を含むこともできる。具体的には、例えば、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、ＨＩＳ×６等のタグペプチドやｂｉｏｔｉｎ等の親和性物質等が挙げられる。タグペプチド、親和性物質は、ＩＶＶ分子中のタンパク質部のいずれの場所にあってもよいが、タグペプチドはＩＶＶ分子のタンパク質部のＣ末端あるいはＮ末端に付加することが好ましく、親和性物質は後述するスペーサー部分に付加することが好ましい。
【００３７】
（２）インビトロバイラス分子の合成方法
（ｉ）鋳型ＤＮＡ
上記ＩＶＶ分子は、候補ポリペプチドをコードする塩基配列を含むＲＮＡの３’末端にスペーサーを介して核酸誘導体が結合していることを特徴とするＲＮＡ（以下、これを「鋳型ＲＮＡ」と称することがある）を、タンパク質合成系において翻訳することにより合成することができる（図１）。ここで、上記ＲＮＡは、鋳型となるＤＮＡ（図１の「鋳型ＤＮＡ」）をそれ自体公知の通常用いられる方法により転写した後、スペーサーや核酸誘導体と結合させることによって作製することができる。鋳型ＤＮＡは、候補ポリペプチドを含むＩＶＶ分子のタンパク質部をコードする塩基配列を有し、その５’末端側には（１）該ＤＮＡが転写、翻訳を受けるために必要な配列、（２）スペーサーを結合するための配列等を含むことができる。
【００３８】
候補ポリペプチドとしてランダムなアミノ酸配列からなるものを用いる場合、候補ポリペプチドをコードする塩基配列を有する核酸は、例えばＤＮＡ合成機を用いて公知の方法により合成することができる。具体的には、アミノ酸をコードする１番目、および２番目のコドンについて各ｄＮＴＰを２５％の割合で混ぜたレジンにより合成し、３番目のコドンについてはｄＧＴＰとｄＣＴＰを５０％の割合で混ぜたレジンにより合成する方法（ＮＮＳ法：Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）、あるいは３番目のコドンをｄＧＴＰとｄＴＴＰを５０％の割合で混ぜたレジンを用いて合成する方法（ＮＮＫ法：Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０）等が挙げられる。
【００３９】
ＤＮＡの転写、翻訳のために必要な配列とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳の際にリボソームによって認識される塩基配列あるいはスタートコドン等が挙げられる。プロモーターの種類は、適用する発現系に適したものを適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、大腸菌ウィルスＳＰ６のＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって認識されるＳＰ６プロモーター配列や大腸菌ウィルスＴ７やＴ３のＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって認識されるプロモーター配列等が挙げられる。
【００４０】
翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＲＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ配列）に対応するＤＮＡ配列や原核細胞のリボソームによって認識されるシャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）、オメガ配列等のｔａｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓのリボソームによって認識される配列、ｒａｂｂｉｔβ−ｇｌｏｂｌｉｎ、Ｘｅｎｏｐｕｓβ−ｇｌｏｂｌｉｎあるいはｂｒｏｍｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓのリボゾーム認識領域などが挙げられる。
【００４１】
スペーサーを結合するための配列とは、鋳型ＤＮＡを転写した後に、後述するスペーサーを結合するための配列であり、具体的には、スペーサーの一部と相補性を有する塩基配列をいう。
【００４２】
このような塩基配列を有する鋳型ＤＮＡは、天然のＤＮＡから調製したものでもよいし、遺伝子組み換え技術により作製したものでもよく、また化学合成により作製したものでもよい。複数のＤＮＡ断片を結合させることが必要である場合、通常用いられる公知の方法によることができる。また、構成要素である核酸の全てがデオキシリボヌクレオチドである必要はなく、その一部のみがＤＮＡタイプであるものでもよく、それ以外の領域は、リボヌクレオチドでもＰＮＡタイプでもよい。またペプチドや糖等が結合したものでもよい。
【００４３】
鋳型ＤＮＡはこれを公知の方法により転写し、得られたＲＮＡ（以下、これを「１本鎖ＲＮＡ」と称することがある）をエタノール沈殿等の適当な方法を用いて精製した後に、後述するスペーサー、および核酸誘導体等との結合に用いることが好ましい。
【００４４】
（ｉｉ）鋳型ＲＮＡ
上記（ｉ）で取得された１本鎖ＲＮＡに結合させる核酸誘導体は、本発明の核酸構築物を使用してタンパク質合成系において翻訳を行った場合、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物であれば特に制限はない。このような核酸構築物を使用してタンパク質合成を行うと、合成されたタンパク質のＣ末端に上記１本鎖ＲＮＡを含む核酸が結合したＩＶＶ分子が合成される。核酸誘導体として、具体的には、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。
【００４５】
また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。
【００４６】
また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本方法において用いられる核酸誘導体に含まれる。
【００４７】
核酸誘導体としては、ピューロマイシン、ＰＡＮＳ−アミノ酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
【００４８】
本発明の１本鎖ＲＮＡに結合させるスペーサーとしては、ＷＯ９８／１６６３６号公報に記載のものが用いられるが、具体的には、ポリエチレン又はポリエチレングリコールあるいはその誘導体などの高分子物質や、オリゴヌクレオチドやペプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質等が用いられる。これらのうち、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。スペーサーの長さは特に限定されないが、好ましくは、分子量１５０〜６０００であるか、または主鎖の原子数は１０原子から４００原子であり、さらに好ましくは、分子量６００〜３０００であるか、または主鎖の原子数が４０原子から２００原子である。スペーサーには、上記（１）のＦＩＴＣ等の蛍光物質およびその誘導体、ビオチン等の親和性物質およびその誘導体の他に、デオキシリボヌクレオチドなどの核酸およびその誘導体、あるいは生化学または化学反応により切断される結合を持つ物質、例えば、５−置換−２−ニトロアセトフェノン誘導体などの光分解性物質等を含むことができる。
【００４９】
１本鎖ＲＮＡと上記スペーサー並びに核酸誘導体の結合方法は、ＷＯ９８／１６６３６号公報に記載の方法を用いることができるが、以下の方法によれば、さらに結合効率を高めることができる。
【００５０】
好ましい鋳型ＲＮＡの製造方法としては、（１）互いに相補的な配列（上記（ｉ）でスペーサーを結合するための配列としたもの）を有する１本鎖ＲＮＡと１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体とをアニーリングさせる工程；及び（２）アニーリング産物をＲＮＡリガーゼで処理して、１本鎖ＲＮＡの３’末端と１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とを連結する工程を含むものが挙げられる。
【００５１】
ここで、１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体とは、３’末端に核酸誘導体がスペーサーを介して結合している１本鎖ＤＮＡを意味する。１本鎖ＤＮＡにおける核酸誘導体は上記したのと同様のものを用いることができる。１本鎖ＤＮＡの誘導体として、一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列に相補的な１本鎖ＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列の３’末端に、該１本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列を有し、さらに核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で該１本鎖ＤＮＡ配列のいずれかに結合しているものを使用することができる。なお、このような核酸構築物はＴ字型の構造を有するため、本明細書においては、Ｔ−Ｓｐａｃｅｒとも称する。
【００５２】
なお、本明細書で言う「１本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列」とは、核酸構築物（Ｔ−Ｓｐａｃｅｒ）と１本鎖ＲＮＡとのライゲーションにより得られる本発明の鋳型ＲＮＡを翻訳した後に、合成物を逆転写反応系に導入した場合に、逆転写反応を開始するためのプライマー配列として作用する塩基配列を意味し、一般的には、１本鎖ＲＮＡの配列と相補的な配列から構成されることが好ましい。
【００５３】
さらに、上記（１）の親和性物質が結合している１本鎖ＤＮＡとしては、１本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる１本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、該１本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該１本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列を有し、さらに核酸誘導体を末端に有するスペーサーが該１本鎖ＤＮＡのいずれかに枝分かれした状態で結合しており、該１本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側に親和性物質が結合しているもの等が挙げられる。親和性物質は、ＩＶＶ分子を精製するためや、固相に結合させるために用いられる。
【００５４】
また、親和性物質を付加した１本鎖ＤＮＡを用いる場合には、親和性物質が付加している位置の５’末端側には、制限酵素認識部位が存在することが好ましい。制限酵素認識部位は通常は、ＤＮＡの２本鎖から構成される。このような制限酵素認識部位を導入することにより、ＩＶＶ分子を親和性物質から切り離すことができる。例えば、ＩＶＶ分子を親和性物質を介して固相に結合させている場合、ＩＶＶ分子を固相（支持体）上から切り離すことが可能になる。即ち、親和性物質同士（例えば、ビオチン−ストレプトアビジンなど）の結合等により支持体に強く結合したＩＶＶ分子を３７℃という温和な条件下で制限酵素によって切り離し精製することができる。制限酵素認識部位の配列は特に限定されず、ＰｖｕＩＩなど任意の制限酵素認識配列を使用することができる。
【００５５】
一方で、ポリｄＡ配列とポリｄＴ配列のような、最適な条件下では強固な親和性を示すが、そのような条件外では親和性を示さないような親和性物質同士を用いる場合、また、より強固な親和性をもつ物質によって、競合的にその親和性を阻害されるような親和性物質同士を用いる場合には、すべての共有結合を切断することなく精製できるので好ましい。
【００５６】
このような１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によって製造することができる。具体的には、リン酸ジエステル結合で合成ユニットを結合させる場合は、ＤＮＡ合成機に一般的に用いられているホスホアミダイド法などにより固相合成で合成することが可能である。ペプチド結合を導入する場合は、活性エステル法などにより合成ユニットを結合させるが、ＤＮＡとの複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可能な保護基が必要になる。
【００５７】
本方法では、結合するべき１本鎖ＲＮＡと１本鎖ＤＮＡ（又はその誘導体）は互いに相補的な配列を有することが必要である。互いに相補的な配列を有す１本鎖ＲＮＡと１本鎖ＤＮＡとを好適な条件下でアニーリングすることにより両者を会合させ、次いで、ＲＮＡリガーゼで処理することにより両者を効率よく連結することができる。
【００５８】
このような１本鎖ＲＮＡと１本鎖ＤＮＡとの結合方法としては、Ｙ−ライゲーション法により１本鎖ＲＮＡの３’末端と、そのＲＮＡ中の配列と相補的な配列を有するＤＮＡの５’末端とをＲＮＡリガーゼで共有結合させる方法等が挙げられる。本発明の方法で用いる１本鎖ＲＮＡは３’末端側に５’から３’方向にアニーリング配列とブランチ配列とを有することが好ましい。
【００５９】
本明細書で言うブランチ配列とは、１本鎖ＲＮＡ及び１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体中のアニーリング配列同士がアニーリングした際に互いにアニーリングせず、１本鎖の状態で存在する配列である。１本鎖ＲＮＡ及び１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体中におけるブランチ配列の長さは、両者をＲＮＡリガーゼ処理により連結できる程度の長さであれば特に限定されない。一般にブランチ配列の長さは短い方が連結効率は高いが、上限は特に制限されない。ブランチ配列の長さは、好ましくは１から１００塩基、より好ましくは１から１０塩基程度である。両核酸中のブランチ配列の長さは同一でも異なっていてもよい。
【００６０】
本明細書で言うアニーリング配列とは、結合すべきＤＮＡとアニーリングすることができる配列であり、１本鎖ＲＮＡ中のアニーリング配列に相補的な配列が、結合すべき１本鎖ＤＮＡ中に存在することになる。アニーリング配列の長さは、両鎖がハイブリダイズすることができるのに十分な長さであれば特に限定されないが、一般的には１０から５０塩基、より好ましくは１０から３０塩基程度である。
【００６１】
本方法で結合される１本鎖ＲＮＡと１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は互いに相補的な配列を有することにより、両者は一定の条件下でアニーリングすることが可能になる。より詳細には、１本鎖ＲＮＡ中のアニーリング配列と、１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体中の上記アニーリング配列と相補的な配列とがハイブリダイズすることにより両配列は二本鎖を形成する。その際、１本鎖ＲＮＡ中のブランチ配列と１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体中のブランチ配列は１本鎖のまま存在するため、これらの部分は全体としてはＹ字の形を形成することになる。Ｙ−ライゲーション法という名称はこの構造体の形に由来する。この方法の特徴は２種の核酸を連結する反応を分子間反応から分子内反応としたことにより連結効率を向上させることができる点にある。従って、低濃度の基質についても応用することが可能である。
【００６２】
本発明の方法では先ず、上記した互いに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡと１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体（以下、これらをまとめて「１本鎖核酸」と称することがある）とをアニーリングさせる。
【００６３】
アニーリングは上記した２種の１本鎖核酸を適当な緩衝液（以後の操作の便宜上から言うと、ＲＮＡリガーゼ用の緩衝液が好ましい）に溶解し、高温から段階的に低温にすることにより行うことができる。このような温度変化はＰＣＲ装置などを用いて行うこともできる。アニーリング条件の一例としては、９４℃から２５℃まで１０分かけて冷却するという条件が挙げられるが、これは一例にすぎず、温度および時間は適宜変更することができる。アニーリングの条件（緩衝液の組成、アニーリング温度、及びアニーリング時間など）は、アニーリング配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。
【００６４】
アニーリング反応における１本鎖ＲＮＡと１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体のモル比はアニーリング反応が進行する限り、特に限定されないが、反応効率の観点からは、１：１〜１：２．５程度であることが好ましい。
１本鎖ＲＮＡと１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体とのアニーリング後、アニーリング産物はＲＮＡリガーゼで処理して、１本鎖ＲＮＡの３’末端と１本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とが連結される。
【００６５】
本発明で用いるＲＮＡリガーゼは２つの１本鎖核酸同士を連結できるものであればよく、好ましくはＴ４ＲＮＡリガーゼを使用できる。
なお、アニーリングの際の溶液としてＲＮＡリガーゼの緩衝液として適当なものを使用した場合には、アニーリング生成物を含む溶液をそのままリガーゼ反応に使用することができ、そうでない場合には、アニーリング生成物を通常の核酸精製方法により回収した後、ＲＮＡリガーゼ用の緩衝液に溶解してリガーゼ反応用の溶液を調製する。
【００６６】
連結反応（リガーゼ反応）の条件は、使用するＲＮＡリガーゼの活性が発揮される条件であればよく、例えば、好適な緩衝液（例えば、Ｔ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＡＴＰ）など）中で、２５℃の温度一定で反応させたり、あるいは２５℃で３０分間と４５℃で２分間のサイクルを反復した後に２５℃で３０分間反応させたりすることができる。ここに示した温度及び反応時間は一例に過ぎず反応効率が高くなるように適宜設定変更することができる。
【００６７】
反応後にフェノール抽出及びエタノール沈殿などの常法で反応生成物を精製することにより、鋳型ＲＮＡを得ることができる。ここで、スペーサーにポリエチレングリコール等を含む場合は、フェノール抽出を用いることができないため、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等のｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌカラム等を用いて精製した後、エタノール沈殿を行う精製法を用いることが好ましい。このようにして得られる鋳型ＲＮＡ自体も本発明の範囲内である。
【００６８】
（ｉｉｉ）鋳型ＲＮＡの翻訳
上記（ｉｉ）に記載の鋳型ＲＮＡをタンパク質翻訳系に導入して上記１本鎖ＲＮＡをタンパク質に翻訳することによりＩＶＶ分子を作製することができる。
核酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知である。具体的には、適当な細胞よりタンパク質合成能を有する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無細胞蛋白質合成系が挙げられる。このような無細胞蛋白質合成系には、リボゾ−ム、開始因子、伸長因子及びｔＲＮＡ等の転写・翻訳系に必要な要素が含まれている。
【００６９】
このような無細胞蛋白質合成系（細胞溶解物由来の系）としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系が挙げられ、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液などが使用できるが、ＤＮＡ又はＲＮＡから目的とする蛋白質を産生するものであればいずれでもよい。また、無細胞翻訳系はキットとして市販されているものを使用することができ、例えば、ウサギ網状赤血球抽出液（Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）や小麦胚芽抽出液（ＰＲＥＴＥＩＯＳ，ＴＯＹＯＢＯ社製；Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）などが挙げられる。
【００７０】
タンパク質翻訳系としては、生細胞を使用してもよく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。
無細胞翻訳系又は生細胞などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又は導入することによってタンパク質合成が行われるものである限り制限されない。
本発明では、鋳型ＲＮＡを上記したような翻訳系に導入して１本鎖ＲＮＡをタンパク質に翻訳した後、リボゾームを除去することによって、ＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成るＩＶＶ分子を製造することができる。
【００７１】
（３）インビトロバイラス分子を用いた輸送ペプチドのスクリーニング方法
（ｉ）逆転写反応
上記（２）で得られるＩＶＶ分子は、このＲＮＡ部分を逆転写することによりＤＮＡとのハイブリッドとすることにより、核酸部分の安定性を保つことができる。また、核酸部とタンパク質部がすべて共有結合しているＩＶＶ分子として得られることから、輸送ペプチドを探索する分子として用いることが好ましい。逆転写反応に必要な試薬及び反応条件は当業者に周知であり、必要に応じて適宜選択することができる。逆転写に用いるプライマーは、上記（２）（ｉｉ）に記載した「１本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列」を用いて行うことが好ましい。
この逆転写反応において、基質として蛍光物質等の標識物質が付加されたｄＮＴＰを用いることによれば、得られる相補鎖に該標識物質が導入され、ＩＶＶ分子を標識することができる。
【００７２】
（ｉｉ）標的細胞とＩＶＶ分子群との接触工程
本発明の輸送ポリペプチドのスクリーニング方法としては、上記（２）で作製したＩＶＶ分子またはＩＶＶ分子群と標的細胞とを接触させ、ＩＶＶ分子を細胞または核内に導入し、細胞中に導入されたＩＶＶ分子を解析する方法が挙げられる。
【００７３】
ここで、標的細胞としては、目的物質の導入を行うためのものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、原核細胞、酵母細胞、真核細胞、植物細胞、ヒトまたは哺乳類動物細胞などが挙げられる。さらに、胚細胞、樹立培養細胞、ヒトの肺、気管、皮膚、筋肉、脳、肝臓、心臓、脾臓、骨髄、胸腺、膀胱、リンパ、血液、膵臓、胃、腎臓、卵巣、睾丸、直腸、末梢または中枢神経、眼、軟骨あるいは内皮のような器官などから取得された細胞、またはその培養細胞、さらには癌細胞等が挙げられる。このような細胞として、例えば、チャイニーズハムスター繊維芽細胞（ＣＨＯ細胞：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）や、アフリカミドリザル腎臓由来細胞（ＣＯＳ７：ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）、ヒト子宮頚癌由来細胞（ＨｅＬａ細胞：Ｃａｎｃｅｒ，Ｒｅｓ．，１２，２６４−２６５（１９５２））、ヒト白血病Ｔリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞：ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−１５２））等が挙げられる。このうち、ヒト子宮頚癌由来細胞やヒト白血病Ｔリンパ腫細胞が好ましく用いられる。また、上記の細胞をある特殊な状態にしたものなども用いることができる。特殊な状態とは、例えば、外来遺伝子を導入した状態、外来遺伝子を発現させた状態や、薬剤などで細胞を刺激してつくらせた状態、細胞を適当な条件下で培養し分化させたような状態などである。
【００７４】
上記標的細胞と、上記（２）で作製したＩＶＶ分子とを接触させる方法としては、特に制限はないが、標的細胞をＩＶＶ分子の存在下で適当な方法により培養する方法などが好ましく用いられる。培養方法、ＩＶＶ分子の添加量、培養温度、培養時間などは、標的細胞やＩＶＶ分子等により適宜選択することができる。具体的には、標的細胞としてＣＨＯ細胞を用いた場合、９６ウェルプレートに１０５個となるようにＨａｍＦ１２＋１０％牛胎児血清培地などにより培養し、該細胞をＰＢＳなどを用いて洗浄した後にＩＶＶ分子１〜１００ｎＭを含むＰＢＳ等を添加し、好ましくは氷冷〜３７℃で置きながら、１〜数時間培養する方法などが挙げられる。
【００７５】
（ｉｉｉ）ＩＶＶ分子が導入された細胞または核内ＩＶＶ分子の核酸部増幅工程、並びに輸送ポリペプチドの同定工程
ＩＶＶ分子と標的細胞を接触させた後、ＩＶＶ分子が導入されている細胞または核内のＩＶＶ分子の核酸部分を増幅する。ＩＶＶ分子が導入された細胞は、これを検出して分離してもよいし、導入されていない細胞とされている細胞が混合されたままでも後述する核酸部分の増幅工程に用いることができる。いずれにしても、培養系において、ＩＶＶが導入された細胞があることは確認しておくことが望ましい。また、細胞表面に多数のＩＶＶ分子が付着した状態なども考えられるので、細胞とＩＶＶ分子の状態を確認することが好ましい。
【００７６】
ＩＶＶ分子の検出方法は、ＩＶＶ分子が細胞外、細胞または核内に存在することが明らかになる方法であれば如何なる方法でもよい。具体的には、上記（１）の標識物質を検出する方法が好ましく用いられる。標識物質として、蛍光物質または蛍光タンパク質を用いた場合、検出手段は、フローサイトメトリー、あるいは蛍光顕微鏡などを用いることができる。また、呈色アッセイを行うための酵素を用いた場合には、必要な基質等を添加した呈色アッセイにより検出することができる。さらに、後述するように、細胞から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＩＶＶ分子の核酸部分が増幅できることを指標として検出することもできる。
【００７７】
いずれの方法においても、細胞または核内に導入されていないが、細胞表面に付着しているＩＶＶ分子を洗浄してから、上記検出を行うことが好ましい。洗浄の方法は、細胞を洗浄する公知の方法から適宜選択して行うことができる。具体的には、例えば、酸やＤＮａｓｅＩなどヌクレアーゼによる処理などが好ましく用いられる。また、フローサイトメトリーによる検出を行う場合、培養後の接着系の細胞はトリプシン処理などを行っておくことも好ましい。
【００７８】
細胞または核内にＩＶＶ分子が導入されていることを確認する方法としては、細胞表面に付着しているＩＶＶ分子と細胞または核内に導入されているＩＶＶ分子を見分け、細胞または核内にＩＶＶ分子が導入されている細胞を確認し得る方法であれば如何なるものでもよい。例えば、検出手段としてフローサイトメトリーを用いた場合には、候補ポリペプチドを含むＩＶＶ分子と、含まないＩＶＶ分子で同様の標的細胞への接触工程を行い、候補ポリペプチドを含むＩＶＶ分子と接触させた細胞の蛍光強度が、含まないＩＶＶ分子と接触させた細胞の蛍光強度に比べて強い場合に、該細胞内にＩＶＶ分子が導入されていると判断する方法が用いられる。また、蛍光顕微鏡を用いる検出方法の場合には、細胞または核内に標識物質である蛍光物質から発せられる蛍光を観察する方法などが挙げられる。
【００７９】
さらに、細胞または核内にＩＶＶ分子が導入された細胞の分離方法として、上記のフローサイトメトリーにより蛍光が検出された細胞をセルソーターにより分離する方法や、蛍光顕微鏡により蛍光が検出された細胞をレーザーキャプチャーを用いて分離する方法等が挙げられる。
【００８０】
かくして取得されたＩＶＶ分子が導入された細胞について、該細胞または核内に存在するＩＶＶ分子の核酸部をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって増幅し、その塩基配列を解析することにより、細胞または核内へ目的物質を輸送する機能を有するポリペプチドを同定することができる。細胞または核内に存在するＩＶＶ分子の核酸部をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって増幅する方法としては、該細胞中のすべての核酸成分を公知の方法で抽出して、それらを鋳型として、上記（２）に記載した１本鎖ＲＮＡ中の候補ポリペプチドをコードする塩基配列を増幅できる２つの塩基配列からなるプライマーによってＰＣＲを行う方法などが挙げられる。ここで、細胞中の核酸成分の抽出は、例えば、Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｒｅｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）などの市販のキットを用いて行うことができる。また、抽出された核酸成分を、５，０００〜１５，０００ｒｐｍ、１０〜３０分間遠心してから、ＲＮａｓｅＨのようなＲＮＡ分解酵素などを用いてＲＮＡを分解し、さらには、その上清をエタノール沈殿などで精製してからＰＣＲを行うと、ＰＣＲの特異的増幅が起こるため好ましい。
【００８１】
さらに、上記で得られた鋳型を９０〜１００℃で１０分程度の熱処理を行って、必要に応じて氷冷した後に、ＰＣＲを行うことも好ましい。
【００８２】
上記の輸送ポリペプチドの同定を行う場合、増幅された核酸部を有するＩＶＶが細胞または核内に導入されていたのか、あるいは細胞表面に付着していたのか明らかではない。そこで、上記したＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を、それ自体公知の方法で分離精製し、このＤＮＡ断片を再度上記（２）に記載の方法で鋳型ＤＮＡとして、ＩＶＶを調製し、上記のスクリーニング方法を行うことにより、輸送ポリペプチドの濃縮を行うことができる。具体的には、１サイクル目のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片と２サイクル目のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を比較し、２サイクル目でＤＮＡ量が増加したＤＮＡ断片にコードされる候補ポリペプチドを目的物質の輸送機能があると同定する。また、上記したフローサイトメトリーや顕微鏡により細胞または核内の蛍光観察を行い、１サイクル目と２サイクル目を比較し、細胞または核内に輸送されたＩＶＶの蛍光の増強を確認することで、選択された輸送ポリペプチドを目的物質の輸送機能があると同定しても良い。
【００８３】
輸送ポリペプチドを含むＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片を、既知の方法に従ってクローニングし、シークエンス解析により、含まれる輸送ポリペプチドをコードする塩基配列を同定する。
【００８４】
（４）選択された輸送ポリペプチドの解析および利用
かくして選択同定された輸送ポリペプチドは、これが一つ以上の目的物質と結合した複合体を調製して、標的細胞に接触させることによって、目的物質を標的細胞へ輸送することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００８５】
【実施例】
実施例１ スペーサーの作製
以下のような修飾ＤＮＡをスペーサーの原料としてＤＮＡ合成機で合成した。
ＤＮＡ１：（ｔｈｉｏｌ）（Ｓｐｃ）（Ｓｐｃ）（Ｓｐｃ）（Ｓｐｃ）ＣＣ（ＺＦＰ）
ＤＮＡ２：（Ｐｓｏ）ＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（Ａｔ）ＣＣＧＣ
ＤＮＡ３：ＣＣＣＧＧ（Ｆｔ）ＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【００８６】
上記配列中の（ｔｈｉｏｌ）、（Ｓｐｃ）、（Ｂｔ）、（Ｆｔ）、（Ａｔ）及び（Ｐｓｏ）はユニットの略称であり、すべてグレンリサーチ社製の合成試薬を用いて配列中に導入した。これらユニットの略称、合成（導入）試薬の品名及びその化学名は、それぞれ次の通りである。
【００８７】
（ｔｈｉｏｌ）
５’−Ｔｈｉｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｒＣ６
（Ｓ−Ｔｒｉｔｙｌ−６−ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘｙｌ）−（２−ｃｙａｎｏｅｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
【００８８】
（Ｓｐｃ）
Ｓｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ１８
１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
【００８９】
（Ｆｔ）
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＴ
５’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−５−［Ｎ−（（３’，６’−ｄｉｐｉｖａｌｏｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌ）−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］−２’−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
【００９０】
（Ａｔ）
Ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ
５’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−５−［Ｎ−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］−２’−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
【００９１】
（Ｐｓｏ）
Ｐｓｏｒａｌｅｎ  Ｃ６  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
２−［４’−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−４，５’，８−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｓｏｒａｌｅｎ］−ｈｅｘｙｌ−１−Ｏ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
【００９２】
また、（ＺＦＰ）はＮα−（Ｎα−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ）−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ残基を示し、次の通り合成した試薬を用いて配列に導入した。
ピューロマイシン２塩酸塩（和光純薬工業社製）２５０ｍｇを水３ｍｌに溶かし、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）２ｍｌ、１０％炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加えた。撹拌しながらこの溶液にＺ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（ＢＡＣＨＥＭ社製）２００ｍｇ（１．１当量）をＤＭＥ  ２ｍｌに溶かした溶液を加え、さらに１０％炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍｌを加えた。１時間室温で撹拌したのち析出した固体をグラスフィルター上で濾取し、５０％ＤＭＥ水溶液２ｍｌで２回、水２ｍｌで３回、冷却したＤＭＥ  ２ｍｌで２回洗浄したのち真空ポンプで乾燥してＮα−（Ｎα−ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）−ピューロマイシンを得た。
【００９３】
（１）スペーサーの作製（Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ）
ＤＮＡ２（１２ｎｍｏｌ）とＤＮＡ３（１２ｎｍｏｌ）をＴＢＳ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）０．４８ｍｌに溶かし、８５℃で４０秒加熱したのち室温で放冷した。氷浴上で５分放置したのちハンディＵＶランプ（３６５ｎｍ）で８分間光照射し、反応生成物を逆相ＨＰＬＣで精製した。このＤＮＡ（４ｎｍｏｌ）を０．１Ｍ  リン酸水素２ナトリウム水溶液１５μｌに溶かし、Ｎ−（６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＥＭＣＳ）（架橋剤；同仁化学社製）の５ｍＭ  ＤＭＦ溶液４μｌを加えて２０分室温で撹拌した。この溶液にＤＮＡ１（２０ｎｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）４０μｌに溶かした溶液を加え、さらに室温で１６時間撹拌した。逆相高速液体クロマトグラフィ（逆相ＨＰＬＣ）でＤＮＡ１とＤＮＡ２とＤＮＡ３の反応産物ＤＮＡが架橋剤を介して結合した目的物を単離し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かしてキモトリプシン溶液を基質に対して酵素の重量比が１０％程度になるように加えて３６℃で１時間放置した。逆相ＨＰＬＣで精製し、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡを得た。
【００９４】
実施例２ ＩＶＶ分子の作製
ＩＶＶ分子の作製は、特願２００２−２１１４０５号明細書に記載の方法に準じて以下のとおり行った。また、作製方法を図１に示した。
（１）鋳型ＤＮＡ構築と１本鎖ＲＮＡの作製
既知の輸送ペプチドとしてＨＩＶのＴＡＴポリペプチドを用い、支持体としてその下流にＯｃｔ−１の一部（ＰＯＵ）をコードするＤＮＡを構築した（ＴＴＰ：配列番号１）。また、ネガティブコントロールとしてＰＯＵのみをコードするＤＮＡを構築した（ＴＰ：配列番号２）。上記ＤＮＡ配列は、転写効率の高い大腸菌ウィルスＴ７のＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって認識されるＤＮＡ配列（Ｔ７プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ配列）と原核細胞のリボソームによって認識される（シャイン・ダルガノ配列：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）を上流に有し、その下流にＦＬＡＧ配列、スペーサーと連結するための配列（Ｙ−ｔａｇ）がコードされている。
【００９５】
ＴＴＰの具体的な構築方法としては、特開２００３−７０４８３号公報に記載の方法に準じて行った。具体的には以下のとおりである。ＴＡＴポリペプチドを含む一本鎖ＤＮＡを合成し（配列番号３）、支持体として用いるＰＯＵ配列を含む２本鎖ＤＮＡ（配列番号４）の等モル数を、プライマーを使わず以下の条件で伸長反応サイクルを行った。ＥＸ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用い、反応条件は、９５℃で３０秒、６４℃で２０秒、７２℃で２０秒のサイクルを２５回繰り返した。この連結産物をエタノール沈殿し、さらに、その連結産物と合成したＴ７プロモーター配列とＫｏｚａｋ配列を含む一本鎖ＤＮＡ（配列番号５）とを、上記と同様に連結反応させ、ＴＴＰ  ＤＮＡ（配列番号１）を得た。上記のように作製したＤＮＡを、反応液１００μｌあたり５μｇを加え、ＲＮＡ合成キットＲｉｂｏｍａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率をあげるため、またｍＲＮＡの分解を防ぐためにキャップアナログ（ＲＮＡ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ａｎａｌｏｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。キャップアナログおよび過剰のＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）を除去するために、プライマー除去剤（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｍｏｖｅｒ；Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使ってエタノール沈澱を行った。
【００９６】
（２）鋳型ＲＮＡの作製（ｍＲＮＡとスペーサーとの連結）
実施例１（１）で作製したスペーサー（Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ）と上記で作製したｍＲＮＡとの連結は、特開２００２−２９１４９１号公報に記載の方法に準じて行った。具体的には以下の通りである。
【００９７】
実施例２（１）で作製したＴＰ及びＴＴＰ  ｍＲＮＡとスペーサーを１：１．２〜１．５の割合（モル比）で混合し、Ｔ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）に溶解し、特異性をあげるため変性剤としてＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を最終濃度５％になるように加えた。得られた混合物は、ＰＣＲ装置を用いて、９４℃〜２５℃まで１０分かけて冷却することによりアニーリングした。
【００９８】
つづけて、上記のアニーリングした溶液中にＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＢｉｏＬａｂｓ社製）とＴ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を至適量加え、２５℃で３０分間から２時間反応させた。
反応後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使って、ライゲーション産物を精製した。ライゲーションの効率を確認するために、４％アクリルアミド８Ｍ尿素変性ゲル電気泳動、６５℃、２５０Ｖの条件でサンプルを泳動し、Ｖｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化した。また、スペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）についても確認した。この結果から、ｍＲＮＡとスペーサーとの結合率（ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体の形成率）は８０〜９０％であることが確認できた。
【００９９】
（３）ＩＶＶ分子形成
ＴＰ及びＴＴＰ鋳型ＲＮＡ：４８０ｐｍｏｌを小麦胚芽無細胞翻訳系ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、２６℃で３０分間反応し翻訳させ、ピューロマイシンに翻訳されたペプチドを結合させる（Ｖｉｒｉｏｎ化）ために最終濃度が４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｍ  ＫＣｌになるように塩を加え、２６℃で１時間反応させた。
【０１００】
（４）鋳型ＲＮＡ及びＩＶＶ分子の翻訳系からの精製
ＴＰ及びＴＴＰ鋳型ＲＮＡ：４８０ｐｍｏｌを上記の方法でＩＶＶ分子化し、ｂｕｆｆｅｒ交換をするために、Ｍｉｃｒｏ  ＢｉｏＳｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ−Ｐ６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて脱塩後、１Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００になるように調整し、９．６ｎｍｏｌのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄＯｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｐｒｏｂｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を結合させたＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ（Ｔａｋａｒａ社製）３６０μｌと４℃、約１時間結合させた。その後、上清をとり、洗浄ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（１Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で３回洗い、ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で１回洗い、ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で１回洗い、次いで、ＭｉｌｌｉＱ水１２０μｌで３回溶出して鋳型ＲＮＡ及びＶｉｒｉｏｎを得た。
【０１０１】
５Ｍ尿素変性５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでサンプルを泳動した。スペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）を使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化した。結果を図２に示す。図２ＡはＴＰ、図２ＢはＴＴＰの結果である。レーン１はビリオン化後に脱塩したもの６μｌ、レーン２は翻訳系からの精製の際の上清の１０μｌ、レーン３は翻訳系からの精製の際の洗浄液の１０μｌ、レーン４は翻訳系からの精製の際の溶出液の６μｌ、レーン５は翻訳液からの精製後のビーズの１８分の１である。
【０１０２】
（５）スペーサーを用いたＩＶＶ分子の精製後の逆転写反応
ＴＰ及びＴＴＰについて、スペーサーを用いたＩＶＶ分子精製時の溶出画分を、ＴｒｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｓａｗａｄｙ社製）を用いて逆転写した。また、蛍光シグナル量を増大させるために、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を共に取り込ませた。溶出画分３６０μｌに５×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ：１４４μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ：３６μｌ、１０ｍＭ  ＧＴＰ：３６μｌ、１０ｍＭ  ＴＴＰ：３６μｌ、１０ｍＭ  ＣＴＰ：７．２μｌ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ：３６μｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）１８μｌ、ＲＴａｓｅ（１００Ｕ／μｌ）３６μｌ、蒸留水１０．８μｌを加え、５０℃で１時間反応させた。
【０１０３】
（６）スペーサーを用いた鋳型ＲＮＡのＣｙ５−ｄＣＴＰ導入逆転写反応の確認鋳型ＲＮＡへのＣｙ５−ｄＣＴＰ導入効率の確認を行った。ＴＴＰ及びＴＰ鋳型ＲＮＡをＣｙ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）と共にＴｒｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｓａｗａｄｙ社製）を用いて逆転写した。それぞれ、鋳型ＲＮＡ  １０ｐｍｏｌに５×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ：４μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ：１μｌ、１０ｍＭ  ＧＴＰ：１μｌ、１０ｍＭ  ＴＴＰ：１μｌ、１０ｍＭ  ＣＴＰ：０．２μｌ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ：１μｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０  Ｕ／μｌ）０．５μｌ、ＲＴａｓｅ（１００  Ｕ／μｌ）１μｌを加え、５０℃で１時間反応させた。また、同条件で反応を行ったものにＲＮａｓｅＨ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡとアニーリングしているＲＮＡを消化することで残る鋳型ＲＮＡに相補なｃＤＮＡを確認した。それぞれの反応産物を、８Ｍ尿素変性４％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ＶｉｓｔｒａＧｒｅｅｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で染色し、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒ  （ＢｉｏＲａｄ社製）で画像化した。また、蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ及びＣｙ５）についても画像化した。
【０１０４】
この結果を図２Ａ（ＴＰ）およびＢ（ＴＴＰ）のレーン６に示す。図から明らかなように、逆転写産物および逆転写反応後ＲＮａｓｅＨ処理をした産物は予想される大きさに検出でき、また、Ｃｙ５のｃＤＮＡ鎖への導入も確認できた。さらに、逆転写効率に影響を与えない条件で１分子当り１．５から２．５個のＣｙ５−ｄＣＴＰが導入できることがわかった。
【０１０５】
（７）抗ＦＬＡＧ抗体を用いたＩＶＶ分子の精製
ＴＰ及びＴＴＰについて、実施例２（５）で逆転写反応したもの７２０μｌを、ｆｉｎａｌ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．５μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡになるように調製した。これを、５２．５μｇの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を結合させたプロテインＧセファロースビーズ２０μｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に４℃、約１時間から一晩結合させ、６０μｌのＰＢＳで３回洗い、２０μｌの１００μＭ  ３×ＦＬＡＧ  ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で３回溶出し、ＩＶＶ分子を得た。精製効率を確認するために、５Ｍ尿素変性５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでサンプルを泳動した。スペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ及びＣｙ５）を使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化した。結果を図２に示す。図２ＡはＴＰ、図２ＢはＴＴＰの結果を示す。それぞれ、上段はスペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）を使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化したものであり、下段は、逆転写反応でｃＤＮＡ鎖に導入された蛍光（Ｃｙ５）を使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で画像化したものである。それぞれ、レーン６は逆転写反応後の溶液６μｌ、レーン７は抗ＦＬＡＧ抗体に結合させた後の上清１０μｌ、レーン８はＰＢＳによる洗浄液１０μｌ、レーン９はＦＬＡＧ  ｐｅｐｔｉｄｅによる溶出液６μｌ、レーン１０は溶出後のビーズの８分の１を示す。レーン６〜１０のサンプルはＲＮａｓｅ  Ｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、３７℃で３０分間反応させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓをｃＤＮＡとしたものを泳動した。ＦＬＡＧ  ｐｅｐｔｉｄｅによる溶出画分に、高純度に精製されたＶｉｒｉｏｎ液を得ることができた。細胞内移行実験には、この溶出画分を用いた。
【０１０６】
実施例３ ＩＶＶ分子の細胞内移行実験
（フローサイトメトリー法を用いた細胞内移行の確認）
ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートに１０４個／ウェルとなるように植え込み、ＨａｍＦ１２＋１０％牛胎児血清培地を用い、３７℃、５％  ＣＯ２の条件で２〜３日間培養した。これをＰＢＳで２回洗浄した後に、実施例２で得られた蛍光色素で標識したＴＰ及びＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ  ２．４３ｐｍｏｌ／５４μｌ（４５．０ｎＭ）を添加し、ｏｎ  ｉｃｅで１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを加え３７℃、５分間インキュベートした。これに２００μｌの培地を加えＴｒｙｐｓｉｎ反応を停止させた後に、ピペッティングを行い回収した。調製した細胞はフローサイトメトリー法により解析した。フローサイトメトリー法において、蛍光の検出は、ＦＩＴＣの場合ＦＬ１、Ｃｙ５の場合ＦＬ４が用いられた。Ｃｙ５で検出した結果を図３に示す。
【０１０７】
図３Ａは横軸にＣｙ５の蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットしたものである。ＰＢＳ（蛍光物質を含まない）およびＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを添加した細胞で検出された蛍光強度に対して、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを添加した細胞の蛍光強度が有意に増加した。これは、既知の実験方法を用いた同濃度のＴＡＴポリペプチドを含む融合タンパク質による解析結果と同程度であった。また、ＴＰ  ＶｉｒｉｏｎでもＰＢＳと比べるとわずかに蛍光強度が高まっているように見えるが、後の共焦点顕微鏡を用いた細胞内移行の確認実験において、ＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが添加された細胞では、細胞内や核内に蛍光は検出されず、一部細胞塊を形成しているものに細胞表面のみに蛍光が認められた。このことから、ＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが添加された細胞でみられた蛍光強度の高まりは、細胞表面に非特異的に付着したＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎによるものだと考えられ、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが特異的に細胞内に移行したといえる。
【０１０８】
図３ＢはＡの結果を、横軸にＣｙ５の蛍光強度、縦軸に細胞の大きさによりプロットしたものである。Ａと同様にＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを添加した細胞において、細胞の蛍光強度が全体的に増強していることが確認できた。また、Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎでも同様な結果を得た。
図３Ｃは、全細胞に対して、蛍光強度が増加したエリア（図３ＢのＭで示す範囲）に含まれる細胞の割合を数値化したものである。
【０１０９】
（共焦点顕微鏡を用いた細胞内移行の確認）
上記実施例３（１）と同様に細胞内移行処理をした後、共焦点顕微鏡で観察した。ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを添加した細胞においては、全ての細胞の細胞内に蛍光が認められ、特に核に強い蛍光が認められ核への集積が起こっているものもあった。このことからＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎは、細胞内及び核内に取り込まれていることが明らかとなった。一方、ＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを添加した細胞においては、ほとんど蛍光が検出されなかったが、一部細胞塊を形成しているものについては細胞表面のみに蛍光が認められた。このことから、フローサイトメトリーにおいてＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが添加された細胞でみられた蛍光強度の高まりは、細胞表面に非特異的に付着したＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎによるものだと考えられ、ＴＴＰＶｉｒｉｏｎが特異的に細胞内に移行したといえる。
【０１１０】
（細胞内移行したＩＶＶ分子のＰＣＲを用いた回収の確認）
実施例３（１）と同様に１．３２ｐｍｏｌのＴＴＰ及びＴＰビリオンを用いて細胞内移行処理をした。回収した細胞はＰＢＳで洗った後、−８０℃で凍結保存した。この細胞に１０μｌのＬｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ：ＰＩＥＲＣＥ社）を加え、細胞を懸濁した。次いで、細胞膜、および核膜の破壊を行うために、Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  ＰＣＲＲｅａｇｅｎｔのプロトコールに従い、以下の条件で懸濁液を熱処理した。
６５℃：３０秒→８℃：３０秒→６５℃：９０秒→９７℃：１８０秒→８℃：６０秒→６５℃：１８０秒→９７℃：６０秒→６５℃：６０秒→８０℃：６０秒これを蒸留水で５０μｌにメスアップし、１０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を１μｌ加え、３７℃、３０分インキュベートし、エタノール沈殿した後、２０μｌの蒸留水に溶解してＶｉｒｉｏｎ回収液とした。この回収液を１０倍希釈、１０２倍希釈、１０３倍希釈、１０４倍希釈、１０５倍希釈して、その２．５μｌをＰＣＲ用のサンプルとした。
【０１１１】
定量用のスタンダードとしては、ＣＨＯ細胞１０６個／Ｔｕｂｅに１００μｌのＬｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を懸濁し、上記サンプルと同様に懸濁液を熱処理して、エタノール沈殿後、２５０μｌの蒸留水に溶解し、細胞溶液２．５μｌ（ＣＨＯ細胞１０４個分）に濃度既知の１本鎖ＴＰ、ＴＴＰ鋳型ＲＮＡのｃＤＮＡ、１０−１０９分子／μｌを１μｌ加えた。
【０１１２】
これらを鋳型としてＴＴＰ及びＴＰに共通なセンスプライマー（配列番号６）とアンチセンスプライマー（配列番号７）を用いて、ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９５℃／３０ｓｅｃ、６８℃／２０ｓｅｃ、７２℃／２０ｓｅｃのサイクルを２５〜３０回繰り返した。
【０１１３】
上記のＰＣＲ産物の各２．５μｌ（１／１０量）を２％−アガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化して増幅産物のバンドを検出し、定量用スタンダードと比較してサンプルの定量を行った。
【０１１４】
結果を図４に示した。図４において、上段はＴＴＰを示し、下段はＴＰを示す。レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン▲１▼〜▲９▼は定量用のスタンダード（▲１▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０分子、▲２▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０２分子、▲３▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０３分子、▲４▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０４分子、▲５▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０５分子、▲６▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０６分子、▲７▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０７分子、▲８▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０８分子、▲９▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０９分子）を示し、レーン（１０）（図中は丸数字、以下同）〜（１４）は細胞にそれぞれＴＰあるいはＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ添加後のサンプル（（１０）：２×１０−５μｌ添加、（１１）：２×１０−４μｌ添加、（１２）：２×１０−３μｌ添加、（１３）：２×１０−２μｌ添加、（１４）：０．２μｌ添加）を示す。また、それぞれのバンド強度から定量した結果、ＶｉｒｉｏｎのかわりにＰＢＳを添加した細胞においては、ＰＣＲによる増幅は見られなかった。ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎの場合、Ｖｉｒｉｏｎ添加後の全回収液２０μｌ中には４．５２×１０８分子含まれることになり、添加したＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ数（７．９５×１０１１分子）の１〜１．７６×１０３が回収されたことになる。これに対してＴＰＶｉｒｉｏｎの場合、Ｖｉｒｉｏｎ添加後の全回収液２０μｌ中には３．９１×１０７分子含まれることになり、添加したＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ数（７．９５×１０１１分子）の１〜２．０３×１０４が回収されたことになる。この結果、ＴＴＰ  Ｖｉｒｏｎの方がＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎよりも約１２倍多く回収されており、このことは、ＰＣＲを用いた解析においても、ＴＴＰ  ＶｉｒｉｏｎがＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎよりも約１２倍濃縮されていることを示している。
【０１１５】
（４）ＰＣＲ産物のクローニングと塩基配列解析
上記実施例３（３）で得られたＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ及びＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを添加した細胞をサンプルとしたそれぞれのＰＣＲ産物をクローニングし（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓを使用）、塩基配列解析を行った（サワディーテクノロジーに委託）。塩基配列解析の結果、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを添加した細胞からはＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ遺伝子のみが確認され、ＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを添加した細胞からはＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ遺伝子のみが確認された。
【０１１６】
実施例４ 細胞液中のＶｉｒｉｏｎのＰＣＲによる増幅条件の検討
細胞液に含まれる鋳型ＲＮＡあるいはＶｉｒｉｏｎをテンプレートとしてＰＣＲを行う際、細胞懸濁液には、大量の破砕された細胞由来の物質（タンパク質及び核酸など）が含まれ、これらが、ＰＣＲを妨げる可能性が考えられる。そこで、細胞液に含まれるテンプレートを、効率よく増幅できるサンプルの調製法を検討した。
【０１１７】
（１）細胞液中からのＰＣＲ用テンプレートの回収条件の検討
１０−１０から１０−１ｐｍｏｌ／μｌの鋳型ＲＮＡ  １μｌに、細胞溶解液であるＬｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔを５μｌ（ＰＩＥＲＣＥ社製）、２ｕ／μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を１μｌ加え３７℃、３０分インキュベートした。次いで、半量はそのままＰＣＲ、半量はエタノール沈殿をした後に３．５μｌの蒸留水に溶解した後にＰＣＲを行った。ＴＴＰに特異的なセンスプライマー（配列番号８）とアンチセンスプライマーとして共通プライマー（配列番号９）を用いてＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴａＫａＲａ社製）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９４℃／３０ｓｅｃ、６０℃／２０ｓｅｃ、７２℃／６０ｓｅｃのサイクルを２５〜３５回繰り返した。
その結果を図５Ａに示す。（−）はエタノール沈殿操作なしであり、（＋）はエタノール沈殿操作を行ったものである。この結果、エタノール沈殿をした方がＰＣＲの増幅効率が良かった。
【０１１８】
（２）細胞液を含むＶｉｒｉｏｎを用いたＰＣＲ条件の検討
１０から１０５分子のＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ：１μｌに５×１０４個の細胞懸濁液２．５μｌを加え、４℃で１時間放置した後に６．５μｌのＬｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔを加えて熱処理をした。これに１４０μｌのＰＢＳを加えた後に８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞塊を除去したものとしなかったものを、それぞれＲＮａｓｅ  Ｈ処理、エタノール沈殿をして、５μｌの蒸留水に溶解した。次いで、実施例４（１）と同様にＴＡＴ特異的プライマー（配列番号８及び９）でＰＣＲを行った。
【０１１９】
その結果を図５Ｂに示す。（−）は遠心操作なしであり、（＋）は遠心操作を行ったものである。この結果から、細胞溶解後、熱処理をした細胞液を遠心して細胞塊を除去した方がＰＣＲの増幅効率が良かった。
【０１２０】
この時、細胞のゲノム由来と思われるＴＴＰ以外の増幅産物を除去するために、上記に加え、さらに細胞液を９８℃、１０分間処理したところ、細胞のゲノム由来の増幅産物は検出されなくなった。その結果を図５Ｃに示す。（−）は熱処理を行わなかったものであり、（＋）は熱処理を行ったものである。
【０１２１】
実施例４の結果は、すべてＰＣＲ産物の各２．５μｌ（１／１０量）を２％−アガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化して増幅産物のバンドを検出した。
【０１２２】
実施例５ ＴＰ及びＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ混合ＰｏｏｌからのＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎの選択
実施例２で調整したＴＰ及びＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを以下のような混合比で５０μｌ、２セット調整した。
▲１▼ＴＰ：５．６５×１０１１分子／ＴＴＰ：１０６分子
▲２▼ＴＰ：５．６５×１０１１分子／ＴＴＰ：１０４分子
▲３▼ＴＰ：５．６５×１０１１分子／ＴＴＰ：１０３分子
▲４▼ＴＰ：５．６５×１０１１分子／ＴＴＰ：１０２分子
▲５▼ＴＰ：５．６５×１０１１分子／ＴＴＰ：１０分子
上記２セットのうち、１セットは細胞に添加し、もう１セットは選択前のサンプルとして使用した。
【０１２３】
細胞添加用Ｖｉｒｉｏｎを実施例３（１）と同様に細胞に添加し、４℃、１時間反応させ、細胞内移行反応後、回収した細胞はＰＢＳで洗って、−８０℃で凍結保存した。この細胞に２０μｌのＰＢＳと２０μｌのＬｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ：ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え、細胞を懸濁した。次いで、実施例３（１）と同様に、細胞膜、および核膜の破壊を行うために、Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコールに従い、懸濁液を熱処理した。これを蒸留水で２００μｌにメスアップし、１０Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を１μｌ加え、３７℃、３０分インキュベートした。その後、小型高速遠心機で、８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を回収した。この上清を、エタノール沈殿した後、２０μｌの蒸留水に溶解してＶｉｒｉｏｎ回収液とした。この回収液を１０倍希釈、１０２倍希釈、１０３倍希釈、１０４倍希釈、１０５倍希釈して、そのうちの２．５μｌをＰＣＲ用のサンプルとした。また、ＰＣＲを行う前にサンプルを９８℃、１０分間熱処理した。選択前用のサンプルも同様に調製した。
【０１２４】
はじめに、このＶｉｒｉｏｎ添加細胞由来のサンプルをＴＴＰ及びＴＰ共通センスプライマー（配列番号１０）及び共通アンチセンスプライマー（配列番号９）を用いて添加前と比較解析した。実施例３と同様に上記のＶｉｒｉｏｎ回収液２．５μｌを１０倍ずつ段階希釈したもの１０２、１０３、１０４倍の希釈液各２．５μｌをテンプレートとして２５サイクル増幅した。このＰＣＲ産物の各２．５μｌ（１／１０量）を２％−アガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化して増幅産物のバンドを検出し、定量用スタンダードと比較してサンプルの定量を行った。
【０１２５】
その結果を図６Ａに示す。図６Ａに示すように、共通プライマー（配列番号９及び１０）を用いた場合は、Ｖｉｒｉｏｎの細胞添加前後にかかわらずＴＰのみが検出された。添加前において、バンド強度からＴＰ量を定量したところ、全回収液２０μｌ中に７．４×１０１１分子含まれると計算された。細胞添加後におけるＴＰ量をバンド強度から定量したところ、全回収液２０μｌ中には７．２×１０７分子含まれると計算された。このことから，添加したＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎは洗浄によりに約１／１０４に減少したことがわかる。また、この結果ではＴＴＰの増幅が確認できなかったが、ＰＣＲの原理からＴＴＰが増幅されていたとしても、この共通プライマー（配列番号９及び１０）で増幅を確認するためにはこの検出系では検出感度以下であると思われる。
【０１２６】
このことから、このＰＣＲ産物をＴＴＰに特異的なセンスプライマー（配列番号８）を用いてＰＣＲを行うことによって、ＴＴＰの増幅を確認した。アンチセンスプライマーとしては、共通プライマー（配列番号９）を使用した。１０３倍希釈した細胞添加前のＶｉｒｉｏｎ回収液、２．５μｌを共通プライマー（配列番号９及び１０）で増幅し、このＰＣＲ産物を１０３倍希釈して、その２．５μｌをＴＡＴ特異的プライマー（配列番号８および９）で３５サイクル増幅した。また、細胞添加後の回収Ｖｉｒｉｏｎ液を共通プライマー（配列番号９及び１０）で増幅し、このＰＣＲ産物を１０３倍希釈してＴＡＴ特異的プライマー（配列番号８及び９）で３５サイクル増幅した。結果を図６Ｂに示す。ＴＡＴ特異的プライマー（配列番号８及び９）を用いたＴＴＰの検出感度は、細胞添加前では１０４分子だったのに対して、細胞添加後では１０分子からＴＴＰのバンドが検出可能となった。このことは、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが特異的に細胞内に移行したことで、ＴＰ及びＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ混合Ｐｏｏｌにおいて、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが約１０３倍濃縮されたことを示す。
【０１２７】
さらに、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが濃縮されたＴＰ及びＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ混合ＰｏｏｌのＰＣＲ増幅産物を再ＩＶＶ分子化し、細胞に添加するという過程を繰り返すことで、微量のＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ（細胞内及び核内に移行する配列を含む分子）を大量のＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ（細胞内に移行しない配列を含む分子）から選択し、最終的には、大量のＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ（細胞内及び核内に移行する配列を含む分子）のＰｏｏｌを得ることができると考えられる。
【０１２８】
実施例６ 細胞に非特異的に付着したＩＶＶ分子の洗浄法の検討
ＴＴＰ（あるいは、細胞内及び核内に移行する配列を含む分子）Ｖｉｒｉｏｎの選択効率上昇のために、非特異的な鋳型ＲＮＡ及びＶｉｒｉｏｎの細胞膜表面の付着を取り除くため、ＩＶＶ分子の細胞添加後の細胞の回収時に、ＤＮａｓｅＩによる鋳型ＲＮＡ及びＶｉｒｉｏｎの分解を試みた。
【０１２９】
ＣＨＯ細胞は９６ウェルプレートに１０４個／ウェルとなるように植え込み、ＨａｍＦ１２＋１０％牛胎児血清培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２〜３日間培養した。これをＰＢＳで洗浄した後に、実施例２で調製した蛍光色素で標識したＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ：１．０×１０１１分子／６０μｌまたはＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ：３．０×１０１０分子／６０μｌを添加し、ｏｎ  ｉｃｅで１時間インキュベートした。
【０１３０】
（ノーマル条件）
上清を除いた後、ＰＢＳで洗浄し、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ：５０μｌを加え、３７℃、５分間インキュベートし、これに５０μｌの培地を加えてＴｒｙｐｓｉｎ反応を停止させた後に、ピペッティングを行い回収し、ＰＢＳで洗浄した後、沈殿を−８０℃で凍結保存した。
【０１３１】
（ＤＮａｓｅ処理）
上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄後、２ＵｎｉｔｓのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）と１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１００μｌのＰＢＳを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、これに５０μｌの培地を加えてＴｒｙｐｓｉｎ反応を停止させた後に、ピペッティングを行い回収し、ＰＢＳで洗浄した後、沈殿を−８０℃で凍結保存した。
【０１３２】
（ＤＮａｓｅ＋ＥＤＴＡ処理）
上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄後、２ＵｎｉｔｓのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）と１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１００μｌのＰＢＳを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、２５ｍＭのＥＤＴＡを１／１０量加えることによってＤＮａｓｅ  Ｉを失活させ、これに５０μｌの培地を加えてＴｒｙｐｓｉｎ反応を停止させた後に、ピペッティングを行い回収し、ＰＢＳで洗浄した後、沈殿を−８０℃で凍結保存した。
【０１３３】
上記の各サンプルを実施例５と同様に共通プライマー（配列番号９及び１０）を用いたＰＣＲにより解析した。それぞれの条件で、独立に３サンプル（それぞれ、１〜３とする）を解析し、ＰＣＲを２回行った。このＰＣＲ産物の各２．５μｌ（１／１０量）を２％−アガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化して増幅産物のバンドを検出し、実施例３と同様の定量用スタンダードと比較してサンプルの定量を行った。
【０１３４】
図７ＡはＴＰ、ＢはＴＴＰの結果を示す。図７ＡでレーンＭは分子量マーカーを示し、左図及び右図のレーン▲１▼〜▲８▼は定量用の（▲１▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０２分子、▲２▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０３分子、▲３▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ１０４分子、▲４▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０５分子、▲５▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０６分子、▲６▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０７分子、▲７▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０８分子、▲８▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０９分子）を示す。左図及び右図のレーン▲９▼および（１０）は、細胞に添加する前のＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ回収液をテンプレートにしてＰＣＲを行ったたものを示す（回収液を１０３倍希釈：▲９▼、回収液を１０４倍希釈：（１０））。また、左図レーン（１１）〜（１３）はノーマル条件：１〜３、左図レーンは（１４）〜（１６）は、ＤＮａｓｅ処理：１〜３、右図レーン（１１）〜（１３）は、ＤＮａｓｅ＋ＥＤＴＡ処理：１〜３を示す。
【０１３５】
それぞれのバンド強度から含まれるＶｉｒｉｏｎを定量した結果、ノーマル条件ではＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが１．４×１０６分子回収され、添加したＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ量の１／１０４であった。また、上記ＤＮａｓｅ処理を行った場合、ＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが４．９×１０４分子回収され、Ｄｎａｓｅ処理によって、上記ノーマル条件に比べ、約３０倍のＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを除去できたことがわかった。さらに、ＤＮａｓｅ＋ＥＤＴＡ処理を行った場合、ＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが１．３×１０５分子回収され、Ｄｎａｓｅ＋ＥＤＴＡ処理によって、ノーマル条件に比べ、約１０倍のＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを除去できたことがわかった。
【０１３６】
これらのことから、ＤＮａｓｅ処理がＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ除去に一番効果があり、ＤＮａｓｅ処理により、ノーマル条件に比べて約３０倍のＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ除去効果があった。これは細胞表面に付着したＴＰ  ＶｉｒｉｏｎをＤＮａｓｅが分解したと考えられる。また、ＥＤＴＡ処理の追加によりＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎの除去効果はＤＮａｓｅ処理のみに比べ３倍ほど低下した。ＤＮａｓｅ処理のみの場合は、その後の洗浄操作中も残ったＤＮａｓｅが働いてＶｉｒｉｏｎを分解したが、ＥＤＴＡ処理の追加によりＤＮａｓｅは失活し、洗浄操作中の分解が行われなかったと考えられる。以上のことからＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを用いた場合、ＤＮａｓｅ処理することによって非特異的に細胞表面に付着したＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが分解され、回収されてくるＶｉｒｉｏｎ量をノーマル条件に比べ１０倍以上減少することがわかった。これは、濃縮効率がこれまでよりも１０倍以上良くなったことを示す。
【０１３７】
図７ＢでレーンＭは分子量マーカーを示し、左図及び右図のレーン▲１▼〜▲８▼は定量用の（▲１▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０２分子、▲２▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０３分子、▲３▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０４分子、▲４▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ１０５分子、▲５▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０６分子、▲６▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０７分子、▲７▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０８分子、▲８▼：鋳型ＲＮＡ−ｃＤＮＡ  １０９分子）を示す。左図及び右図のレーン▲９▼および（１０）は、細胞に添加する前のＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ回収液をテンプレートにしてＰＣＲを行ったたものを示す（回収液を１０３倍希釈：▲９▼、回収液を１０４倍希釈：（１０））。また、左図及び右図レーン（１１）はノーマル条件１、レーン（１２）はＤＮａｓｅ処理１、レーン（１３）はＤＮａｓｅ処理＋ＥＤＴＡ処理１を示す。
【０１３８】
それぞれのバンド強度から含まれるＶｉｒｉｏｎを定量した結果、ノーマル条件ではＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが６．７×１０６分子回収され、細胞に添加する前のＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ量の１〜５．５×１０３倍であった。また、上記ＤＮａｓｅ処理を行った場合、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが１．４×１０７分子回収され、細胞に添加する前のＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ量の１〜２．６×１０３倍であった。さらに、ＤＮａｓｅ＋ＥＤＴＡ処理を行った場合、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎが２．１×１０７分子回収され、細胞に添加する前のＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ量の１〜１．８×１０３倍であった。
【０１３９】
以上のことから、ＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを用いた場合、ＤＮａｓｅ処理を行っても細胞内に取り込まれたＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを分解しないことがわかった。ＤＮａｓｅ処理は、細胞内に移行したＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ（あるいは細胞内及び核内移行配列を含む分子）を分解せず、一方、細胞内に移行せず、細胞膜に付着したＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ（あるいは細胞内及び核内移行配列を含まない分子）のみを分解し、効率よくＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ（あるいは細胞内及び核内移行配列を含む分子）を回収しＰＣＲで増幅できることがわかった。以上の結果から、ＩＶＶ分子ライブラリーからの細胞内及び核内移行配列を含む分子の選択に有用であると考えられる。
【０１４０】
【発明の効果】
本発明によれば、ポリペプチド又は核酸等の生物活性物質を細胞内または核内へ輸送する活性を有するポリペプチドを効率よくスクリーニングする方法が提供される。この方法によれば、種々のアミノ酸配列を有するポリペプチドを網羅的にスクリーニングすることができるため、既存の輸送ポリペプチドより輸送効率の高いポリペプチドや細胞特異性の輸送活性を有するポリペプチドを取得し得る可能性が高い。
【０１４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明で使用可能なＩＶＶの構築方法を示す。
【図２】図２は、本発明の方法に従い作製したＩＶＶの構築結果を示す。
【図３】図３は、本発明の方法に従いＩＶＶ分子の細胞内移行を確認した結果を示す。
【図４】図４は、本発明の方法に従い細胞内移行したＩＶＶ分子をＰＣＲを用いてその回収を確認した結果を示す。
【図５】図５は、本発明の方法に従い細胞液中のＶｉｒｉｏｎをＰＣＲによって増幅する最適な条件を検討した結果を示す。
【図６】図６は、本発明の方法に従いＴＰ及びＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎ混合  ＰｏｏｌからＴＴＰ  Ｖｉｒｉｏｎを選択した結果を示す。
【図７】図７は、本発明の方法に従い細胞に非特異的に付着したＩＶＶ分子を洗浄する方法を検討した結果を示す。
【図８】図８は、本発明の方法の概略を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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