(57)【要約】【課題】  Ｍ期細胞に特異的に発現するタンパク質を認識するモノクローナル抗体を提供すると共に、さらに、そのモノクローナル抗体を用いてＭ期細胞を高収率で標識、採取、検出する方法を提案する。【解決手段】  ヒトの有糸分裂機細胞に特異的に発現する二重リン酸化されたミオシンIIの調節軽鎖を認識するモノクローナル抗体、並びに、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。このモノクローナル抗体を用いることにより、有糸分裂期細胞を高精度で標識、検出することができ、さらに、有糸分裂期細胞を高収率で採取可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有糸分裂期の細胞に特異的に発現する、ニ重リン酸化されているミオシンIIの調節軽鎖を認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ニ重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するモノクローナル抗体。
【請求項３】
ニ重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、一重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列、及びリン酸化されていない配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識しないモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する有糸分裂期細胞標識剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて、有糸分裂期細胞を検出する方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて、有糸分裂期細胞を採取する方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する有糸分裂期細胞検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有糸分裂期細胞に特異的に発現するタンパク質を認識するモノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、並びにその利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動植物の体細胞等の真核細胞は細胞周期に従って細胞分裂を行い、娘細胞に遺伝物質を分配する。このような真核細胞における細胞周期は、ＤＮＡ複製のための準備期間であるＧ１期、ＤＮＡ複製に要する期間であるＳ期、有糸分裂のための準備期間であるＧ２期、有糸分裂期であるＭ期、の４つの期間から構成されている。このような細胞周期のうち、特に、有糸分裂期（以下、Ｍ期と称する）における機序は未解明の部分が多い。このため、Ｍ期の細胞のみを選択的に採取して、詳細な解析を行う必要がある。
【０００３】
Ｍ期細胞では、染色体が凝集することが知られている。このため、ＤＮＡ染色を行うとＭ期細胞を顕微鏡により観察することができる。従って、Ｍ期細胞を選択的に採取する方法としては、様々な細胞周期の状態にある細胞が集まった細胞集合体から、ＤＮＡ染色後、Ｍ期細胞を顕微鏡で観察しながら採取する方法が一般的に用いられている。
【０００４】
また、最近では、フローサイトメトリーを用いてＭ期細胞のみを分離する方法が行われている。この方法は、まず、細胞をＤＮＡと結合する蛍光試薬で染色後、フローサイトメトリー機器を用いて蛍光染色光をパルス処理し、細胞集合体をＧ１、Ｓ、Ｇ２＋Ｍの３つのグループに分類する。そして、Ｍ期細胞をＧ２＋Ｍのグループから分離、採取する方法である。
【０００５】
また、有糸分裂期（以下、Ｍ期と称する）の細胞において、ニ重リン酸化されたミオシンIIの調節軽鎖（以下、ＭＲＬＣと称する）が特異的に発現されることが報告されている。
【非特許文献１】Gerashchenko BI, Ueda K, Hino M, Hosoya H.共著、「Phosphorylation at threonine-18 in addition to phosphorylation at serine-19 on myosin-II regulatory light chain is a mitosis-specific event.」、Cytometry 2002 Mar 1; 47(3): 150-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述のような従来のＤＮＡ染色後の顕微鏡観察によるＭ期細胞の分離、採取方法は、１つ１つの細胞を観察しながらＭ期細胞のみを分離するため、非常に効率が悪いという問題があった。
【０００７】
また、上述のような従来のフローサイトメトリーを用いたＭ期細胞の分離、採取方法では、分離の精度が低いという問題があった。即ち、分離された細胞のうち、約２０％しかＭ期細胞が含まれておらず、収率が低いという問題があった。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｍ期細胞に特異的に発現するタンパク質を認識するモノクローナル抗体を提供すると共に、さらに、そのモノクローナル抗体を用いてＭ期細胞を高収率で標識、採取、検出する方法を提案することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、ヒト由来の有糸分裂期（以下、Ｍ期と称する）細胞に特異的に発現されるニ重リン酸化されているミオシンIIの調節軽鎖（Myosin-II Regulatory Light Chain、以下、ＭＲＬＣと称する）を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明に係るモノクローナル抗体は、（ａ）Ｍ期の細胞に特異的に発現する、ニ重リン酸化されているＭＲＬＣを認識するモノクローナル抗体である。
【００１１】
上記モノクローナル抗体は、本発明者らが今回新たに、Ｍ期細胞に特異的に発現する、ニ重リン酸化されているＭＲＬＣを認識するモノクローナル抗体として生産したものである。ニ重リン酸化されているＭＲＬＣとは、ＭＲＬＣにリン酸基が２つ結合しているものをいう。本発明では、例えば、ヒト由来のＭＲＬＣタンパク質の１８番目のスレオニンと１９番目のセリンとに、それぞれリン酸基が一つずつ結合しているものが挙げられるが、これに限られるものではない。
【００１２】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、（ｂ）ニ重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するモノクローナル抗体である。
【００１３】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、（ｃ）ニ重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、一重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列、及びリン酸化されていない配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識しないモノクローナル抗体である。
【００１４】
上記「ニ重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド」とは、後述するように、ヒト由来のＭＲＬＣの抗原決定基（エピトープ）領域であり、その７番目のスレオニン残基及び８番目のセリン残基が、ともにリン酸化されているものである。本発明に係るモノクローナル抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの７番目のスレオニン残基及び８番目のセリン残基がそれぞれリン酸化されている場合のみ、このポリペプチドを特異的に認識する。しかし、本発明に係るモノクローナル抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの７番目のスレオニン残基及び８番目のセリン残基のどちらか一方のアミノ酸残基のみがリン酸化されている場合、即ち、一重リン酸化されている場合、及び、どちらのアミノ酸残基もリン酸化されていない場合は、これらのポリペプチドを認識しないことが実験的に示された。即ち、本発明に係るモノクローナル抗体は、リン酸基の位置や個数を非常に高精度で認識できることがわかった。このため、本発明に係るモノクローナル抗体は、高精度で、ニ重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識できる。
【００１５】
また、本発明に係る有糸分裂期細胞標識剤は、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれか一つのモノクローナル抗体を含有するものである。上述したように、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれか一つのモノクローナル抗体は、高精度で二重リン酸化されたＭＲＬＣを認識することができる。このため、本発明に係る有糸分裂期細胞標識剤を用いることにより、高精度でＭ期細胞を標識することができる。後述の実施例に示すように、本発明に係る有糸分裂期細胞標識剤を用いることで、従来のＤＮＡ染色によるＭ期細胞の検出に比べて、検出率を約３倍高めることができる。
【００１６】
また、本発明に係る有糸分裂期細胞を検出する方法は、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれか一つのモノクローナル抗体を用いて行うものである。これにより、高精度でＭ期細胞を検出することができる。
【００１７】
また、本発明に係る有糸分裂期細胞を採取する方法は、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれか一つのモノクローナル抗体を用いて行うものである。これにより、高収率でＭ期細胞を採取することができる。
【００１８】
また、本発明に係る有糸分裂期細胞検出キットは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか一つのモノクローナル抗体を含有するものである。このキットを用いることにより、容易にＭ期細胞を検出することができ、研究用または検査用にＭ期細胞を用いることができる。
【発明の効果】
【００１９】
以上のように、本発明に係るモノクローナル抗体は、有糸分裂期細胞において特異的に発現する二重リン酸化されたＭＲＬＣを精度良く認識することができる。このため、本発明に係るモノクローナル抗体は、高精度で有糸分裂細胞に特異的に結合するという効果を奏する。
【００２０】
従って、本発明に係る有糸分裂期細胞標識剤、有糸分裂期細胞検出方法、有糸分裂期細胞検出キットを用いることにより、高精度で有糸分裂期細胞を標識、検出することができる。さらに、本発明に係る有糸分裂期細胞採取方法を用いることで、高収率で有糸分裂期細胞を採取可能であるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、有糸分裂期（Ｍ期）細胞を特異的に認識する、新規なモノクローナル抗体を生産するとともに、このモノクローナル抗体の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明に係るモノクローナル抗体の構造、特徴について説明し、次いでこのモノクローナル抗体の生産方法、機能、及び利用方法等について説明することとする。
【００２３】
（１）本発明に係るモノクローナル抗体
本発明者らは、以前、有糸分裂期（以下、Ｍ期と称する）の細胞において、ニ重リン酸化されたミオシンIIの調節軽鎖（以下、ＭＲＬＣと称する）が特異的に発現されることを報告していることから（Gerashchenko BI, Ueda K, Hino M, Hosoya H. Phosphorylation at threonine-18 in addition to phosphorylation at serine-19 on myosin-II regulatory light chain is a mitosis-specific event. Cytometry 2002 Mar 1; 47(3): 150-7）、この現象に着目し、この現象を利用した高精度のＭ期細胞の分離、採取方法等を開発しようと鋭意努力を重ねた。
【００２４】
その結果、本発明者らは、Ｍ期の細胞を精度良く検出等することを目的とし、Ｍ期細胞に特異的に発現する二重リン酸化されたＭＲＬＣに対するモノクローナル抗体を生産することに成功し、独自に本発明を完成した。
【００２５】
タンパク質のリン酸化は、多くの細胞内タンパク質にみられる翻訳後修飾反応である。リン酸化はタンパク質の局部構造を直接変化させると同時に、多くの場合アロステリックに作用してタンパク質のコンフォメーション変化を誘起し、その性質を瞬時に変化させる。タンパク質のリン酸化、脱リン酸化は種々のタンパク質リン酸化酵素（プロテインキナーゼ）、タンパク質脱リン酸化酵素（ホスホプロテインフォスファターゼ）により行われている。このようなタンパク質のリン酸化、脱リン酸化反応は、その瞬時性と可逆性により細胞内シグナル伝達系の素反応として非常に重要な役割を果たしている。即ち、タンパク質のリン酸化は、タンパク質の構造や機能を動的に変化させ、様々な生命現象のトリガーとして働いていることが知られている。従って、タンパク質のリン酸化は種々の生命現象と深く関連しているため、タンパク質のリン酸化反応の解析を通じて、生命現象を解析し理解することは非常に重要である。
【００２６】
例えば、ミオシンII（myosin-II）というタンパク質は、細胞分裂の過程において、核の分裂が完了した後に起こる細胞質の分配に関与していることが示唆されている。また、このミオシンIIは、細胞質分離時の作動力として機能しており、生体内でその調節軽鎖（ＲＬＣｓ）をリン酸化されることにより、その機能が制御されていると考えられている。このようなミオシンIIの調節軽鎖（ＭＲＬＣ）のリン酸化は、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ：Myosin Light Chain Kinase）やprotein kinase C（ＰＫＣ）によって行われている。
【００２７】
そこで、本発明者らは、ミオシンIIの調節軽鎖（ＭＲＬＣ）の二重リン酸化はＭ期細胞に特異的な現象であって、有糸分裂の制御機構の１つではないかと考えている。
【００２８】
このため、本発明者らは、細胞分裂という生命現象におけるミオシンIIの作用に注目し、細胞分裂周期のＭ期において特異的に発現する二重リン酸化されたＭＲＬＣに対するモノクローナル抗体を生産し、該モノクローナル抗体を利用してＭ期の細胞を高精度で検出等する手段を独自に開発した。この手段は、有糸分裂という、未だ十分に理解されているとはいえない生命現象を解明するための重要な手段となる可能性が高い。
【００２９】
即ち、本発明に係るモノクローナル抗体は、Ｍ期細胞に特異的に発現する二重リン酸化されたＭＲＬＣを認識するものであればよい。なお「二重リン酸化されたＭＲＬＣ」とは、リン酸基が２つ結合しているＭＲＬＣをいう。例えば、１８番目のスレオニン残基と１９番目のセリン残基とがリン酸化されているＭＲＬＣを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、二重リン酸化されたＭＲＬＣの抗原決定基（エピトープ）領域である、二重リン酸化された配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識するものであればよい。なお、「二重リン酸化された配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド」とは、二重リン酸化されたＭＲＬＣのエピトープ領域（ヒト由来のＭＲＬＣの１２番目から２２番目のアミノ酸残基）であり、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、７番目のスレオニン残基と８番目のセリン残基とがそれぞれリン酸化されているものをいう。
【００３１】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、ニ重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、一重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列、及びリン酸化されていない配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識しないものであることが好ましい。なお、「一重リン酸化されている」とは、リン酸基が１つだけ結合していることをいう。例えば、７番目のスレオニン残基のみがリン酸化されている場合や、８番目のセリン残基のみがリン酸化されている場合を挙げることができる。
【００３２】
本実施の形態では、本発明に係るモノクローナル抗体として、本発明者らがヒト由来の二重リン酸化されたＭＲＬＣのエピトープ領域（ヒト由来のＭＲＬＣの１２番目から２２番目のアミノ酸残基）であり、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、７番目のスレオニン残基と８番目のセリン残基とがそれぞれリン酸化されているポリペプチドを抗原として生産したモノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２を挙げて説明する。なお、ＭＡｂとは、Monoclonal Antibodyのことである。
【００３３】
また、上記モノクローナル抗体は、免疫グロブリンクラス（immunoglobulin class）が、ＩｇＧのモノクローナル抗体であることが好ましいが、それ以外の免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＭやＩｇＡであってもよく、特に限られるものではない。
【００３４】
（２）モノクローナル抗体の生産方法
本発明に係るモノクローナル抗体を生産する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、抗原でマウスを免疫した後、そのマウス脾臓リンパ球とマウス由来のミエローマ細胞とを融合させてなる抗体産生ハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を得ればよい。なお、本実施の形態における「産生」とは、ハイブリドーマによる抗体の生合成を指し、「生産」とは、この抗体の生合成に加えて各種人為的な作用を含む、本発明に係るモノクローナル抗体を得るための全体的な流れを指すものとする。
【００３５】
ハイブリドーマ３Ｃ２、４Ｆ１２の生産方法は、従来公知の方法、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96(1985)）等を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００３６】
本実施の形態に係るモノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２は、後述する実施例に示すように、７番目のスレオニン残基と８番目のセリン残基とをリン酸化した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として、ハイブリドーマ３Ｃ２、４Ｆ１２を作製して取得された。
【００３７】
なお、本実施形態では、免疫させる動物としてマウスを用いたが、ラット、ウサギ等のその他の実験動物を用いてもよく、特に限定されるものではない。また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術等によっても生産できる。
【００３８】
このようにして得られたハイブリドーマクローン３Ｃ２、４Ｆ１２は、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２を大量に産生することができるものである。
【００３９】
また、同様にして、本発明に係るモノクローナル抗体、即ち、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれか一つのモノクローナル抗体を大量に産生することができるハイブリドーマを作製することも可能である。
【００４０】
さらに、本発明に係るモノクローナル抗体は、例えば、ヒトまたはその他生物由来の二重リン酸化されたＭＲＬＣ、その抗原決定基（エピトープ）を含むフラグメントまたはその誘導体、あるいはそれらのアナログ、またはそれらの変異体、もしくはそれらを発現する細胞を免疫源（抗原）として用いることにより産生することができる。
【００４１】
即ち、本発明に係るモノクローナル抗体は、例えば、ヒトまたはその他生物由来の二重リン酸化されたＭＲＬＣ、その抗原決定基（エピトープ）を含むフラグメントまたはその誘導体、あるいはそれらのアナログ、またはそれらの変異体、もしくはそれらを発現する細胞を認識することができる。
【００４２】
なお、ここにいう「変異体」は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたものをいう。
【００４３】
また、上記抗原としては、ポリペプチドであれば特に限定されるものではないが、抗原決定基とする物質をキャリアタンパク質に結合してなる抗原タンパク質が用いられてもよい。
【００４４】
具体的には、上記抗原がハプテンであれば、抗体の産生等を誘導する能力をもたないため、抗体を産生することができないが、抗原を異種由来のタンパク質などの生体高分子からなる担体と共有結合させて抗原タンパク質を得て、これで免疫すれば、抗体産生を誘導することができる。上記担体としては、特に限定されるものではなく、オボアルブミン、γグロブリン、ヘモシアニン等、この分野で従来公知の各種タンパク質を好適に用いることができる。
【００４５】
なお、ここでいう「ポリペプチド」とは、アミノ酸が数個結合した短いペプチド、及びタンパク質を含むものである。また、ポリペプチドは、天然に存在するもの、化学的、生物学的方法にて合成されたものを含む。
【００４６】
また、本発明に係るモノクローナル抗体の生産においては、ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を、従来公知の方法で精製したり、修飾したりする工程が含まれていてもよい。
【００４７】
（３）本発明に係るモノクローナル抗体の機能解析
上記モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２は、後述する実施例に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、７番目のスレオニン残基及び８番目のセリン残基がともにリン酸化されているポリペプチドを特異的に認識する。しかし、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの７番目のスレオニン残基及び８番目のセリン残基のどちらか一方のアミノ酸残基がリン酸化された場合、及び、どちらのアミノ酸残基もリン酸化されていない場合は、前記ポリペプチドを認識しない。
【００４８】
従って、上記モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２は、リン酸基の位置や個数を精度良く認識することができ、二重リン酸化されている配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを精度良く認識することができることが実験的に示された。
【００４９】
このことから、本発明に係るモノクローナル抗体は、二重リン酸化されたＭＲＬＣを精度良く認識することができると考えられる。即ち、本発明に係るモノクローナル抗体は、二重リン酸化されたＭＲＬＣを特異的に発現するＭ期細胞を特異的に認識できると考えられる。
【００５０】
（４）本発明に係るモノクローナル抗体の利用法
本発明に係るモノクローナル抗体は、二重リン酸化されたＭＲＬＣを特異的に認識する新規な抗体である。また、上述したように、本発明者らは、ヒトのＭ期細胞では１８番目のスレオニン残基及び１９番目のセリン残基がともにリン酸化されたＭＲＬＣが特異的に発現することを見出している。そのため、以下の有用性を有する。
【００５１】
（４-１）  本発明に係るＭ期細胞標識剤
本発明に係るモノクローナル抗体は、Ｍ期細胞を標識するためのＭ期細胞標識剤として用いることができる。即ち、本発明に係るＭ期細胞標識剤の具体的な組成は、上記モノクローナル抗体を含んでいればよく、特に限定されるものではない。具体的には、使用対象の細胞の種類に応じて、Ｍ期細胞を標識するために、本発明に係るモノクローナル抗体の機能が発揮できるような緩衝液等が含まれていればよい。
【００５２】
即ち、上記モノクローナル抗体は、特異的な抗原抗体反応により、二重リン酸化されたＭＲＬＣを介してＭ期細胞と結合する。このため、上記モノクローナル抗体を、目視で、または機械的に識別できる手段を用いて標識すると、モノクローナル抗体が結合したＭ期細胞も高精度で標識され、識別可能となる。
【００５３】
上記モノクローナル抗体の標識手段としては、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、蛍光物質で標識する方法が挙げられる。即ち、上記モノクローナル抗体を蛍光物質で標識した場合、Ｍ期細胞は蛍光物質により標識される。従って、その蛍光を指標にフローサイトメトリーを用いて、Ｍ期細胞を検出することができる。なお、上記モノクローナル抗体を標識する方法は上記蛍光物質によるものに限られない。
【００５４】
（４−２）  本発明に係るＭ期細胞検出方法、採取方法等
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、Ｍ期細胞を検出、又は採取するための手段として用いることができる。即ち、本発明に係る有糸分裂期細胞を検出する方法、並びに、有糸分裂期細胞を採取する方法は、上記モノクローナル抗体を用いていればよく、その他の構成手段は特に限定されるものではない。
【００５５】
本発明に係るＭ期細胞を検出する方法の一例をより具体的に説明すれば、図４（ａ）に示すように、検体取得工程、細胞溶液調製工程、標識工程、検出工程を含んでいればよく、特に限定されるものではない。
【００５６】
また、本発明に係るＭ期細胞を採取する方法の一例をより具体的に説明すれば、図４（ｂ）に示すように、検体取得工程、細胞溶液調製工程、標識工程、分別・採取工程を含んでいればよく、特に限定されるものではない。
【００５７】
検体取得工程とは、目的とする細胞（検体）を取得する工程であればよく、特に限定されるものではない。目的の細胞を取得するための手段としては、例えば、生物の個体そのものから、または生物の器官や組織等から目的の細胞を採取する工程であればよく、従来公知の方法を利用でき、特に限定されるものではない。例えば、生物個体、器官や組織等から、ホモジナイザー等の機器を用いて、後述の細胞溶液調製工程の前処理として、細胞を取得する工程等が挙げられる。なお、市販されている細胞を用いてもよい。
【００５８】
細胞溶液調製工程とは、上記検体取得工程にて取得された細胞を用いて、従来公知の方法で細胞溶液を調製する工程であればよく、このときの調製条件、例えば、細胞の濃度、温度、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については、特に限定されるものではない。
【００５９】
標識工程とは、上記細胞溶液調製工程にて調製した細胞溶液を用いて、本発明に係るモノクローナル抗体により、Ｍ期細胞を標識する工程であればよく、このときの反応条件、例えば、細胞の濃度、抗体の濃度、反応温度や反応時間、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については特に限定されるものではない。また、標識手段も従来公知の方法であればよく、例えば、目視で、または機械的に識別できるように標識すればよい。具体的には、後述する実施例に示すように、蛍光物質を用いることができるが、特に限定されるものではない。
【００６０】
検出方法とは、上記標識工程で標識されたＭ期細胞を検出する工程であればよく、特に限定されるものではない。具体的には、顕微鏡等による目視観察により、または、蛍光等の情報を感知できる機器（例えば、フローサイトメトリー機器）により機械的にＭ期細胞を検出する工程等が挙げられる。
【００６１】
分別・採取工程とは、上記標識工程で標識されたＭ期細胞を、他の細胞周期細胞と分別し及び／又は採取する工程であればよく、特に限定されるものではない。具体的には、顕微鏡により目視で、または機器（例えば、セルソーター等）により機械的にＭ期細胞を、他の細胞周期細胞と分別し及び／又は採取する工程等が挙げられる。
【００６２】
なお、図４（ｂ）において、標識工程と分別・採取工程との間に、検出工程を含んでいてもよい。この場合、具体的には、Ｍ期細胞を上記標識工程にて標識した後、フローサイトメトリー機器等を用いて、Ｍ期細胞を検出し、さらに、セルソーター等で、検出されたＭ期細胞を採取することになり、高収率でＭ期細胞を採取可能である。即ち、本発明に係るモノクローナル抗体を用いることにより、Ｍ期細胞を高精度で検出し、高収率で精度よく採取することができる。
【００６３】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、例えば、後述する実施例に示すように、上記モノクローナル抗体と、ＤＮＡを標識するＰＩ（Propidium Iodide）とで細胞を順番に標識し、複数パラメータのフローサイトメトリー法で分析し、細胞を細胞周期ごとに分類する手段として用いることもできるが、Ｍ期細胞の検出、採取方法は、上記方法に限られるものではない。
【００６４】
（４−３）  本発明に係るＭ期細胞検出キット
また、本発明に係るＭ期細胞の検出キットは、本発明に係るモノクローナル抗体を含有していればよい。即ち、本発明に係るＭ期細胞の検出キットの具体的な組成は、上記モノクローナル抗体を含んでいればよく、特に限定されるものではない。具体的には、使用対象の細胞の種類に応じて、Ｍ期細胞を検出するために、本発明に係るモノクローナル抗体の機能が発揮できるような緩衝液等が含まれていればよい。この検出キットを用いることにより、例えば、Ｍ期細胞を用いて基礎研究をおこなう際に、容易にＭ期細胞を検出することができ、種々の研究に用いることができる。
【００６５】
つまり、上記本発明に係るＭ期細胞標識剤、Ｍ期細胞を検出、又は採取する方法、検出キット等を用いて採取されたＭ期細胞を利用し、細胞分裂のなかでも特に明らかとなっていない有糸分裂のメカニズムについて詳細な解析を行うことができる。
【００６６】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、細胞分裂の機構の解明を通して、分化異常により引き起こされる疾患等、及び癌の診断、検査、及び、治療等にも利用できる可能性がある。即ち、細胞分裂の機序解明という基礎的研究への利用のみならず、細胞の増殖、分化異常により引き起こされる疾患、さらには癌化の診断や、治療、臨床検査等にも利用可能である。
【００６７】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、各種細胞の運動時におけるミオシンの機能や、その制御の機構を解明するための重要な手段としても用いることができる可能性がある。
【００６８】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００６９】
〔実施例１〕  ハイブリドーマ３Ｃ２、４Ｆ１２の作製
以下の実施例では、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ３Ｃ２、４Ｆ１２の作製方法を概略説明する。
【００７０】
具体的には、以下の方法で行った。まず、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、７番目のスレオニン残基と８番目のセリン残基とがそれぞれリン酸化されている、リン酸化ペプチドを合成した。また、免疫する物質が十分に免疫原性をもつには、分子量が10,000以上必要であるため、本発明者らは、Ｎ末端またはＣ末端にシステイン残基を導入し、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）を用いてキャリアタンパク質に結合させて、抗原タンパク質として免疫に用いた。キャリアタンパク質としては、ＫＬＨ(Keyhole Limpet Hemocyanin)を用いた。
【００７１】
次に、上記抗原タンパク質を用いて腹腔内注射により、Balb/cマウスを免疫した。免疫は６回行った。
【００７２】
次いで、免疫したマウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞を調製した。この脾臓細胞と別途調製したマウス骨髄由来のミエローマ細胞とを、ポリエチレングリコールにより、融合させた後、ＨＡＴ選択を行った。そして、エライザ法（ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay、酵素結合免疫吸着定量法）によるスクリーニングで、目的とする抗体産生陽性細胞群を選び、それらの細胞群についてクローニング（培養上清を用いたＥＬＩＳＡ法、イムノブロッティング法によるスクリーニング）を行い、二重リン酸化ミオシン調節軽鎖（ＭＲＬＣ）に対する抗体を産生するハイブリドーマ３Ｃ２、４Ｆ１２を得た。
【００７３】
上記の方法でモノクローナル抗体を２種類確立した。これらをそれぞれ、ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２と名づけた。
【００７４】
〔実施例２〕  抗体価のチェック
抗体価のチェックはＥＬＩＳＡ法を用いて行った。具体的には以下に示す方法で行った。
【００７５】
まず、抗原として配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、７番目のスレオニン残基と８番目のセリン残基とにリン酸基が結合しているものを１００μｌ／wellの市販のエライザプレートに固相化し、抗原感作マイクロプレートとした。その後、抗原感作マイクロプレートをスキムミルクにてブロッキングした後、ＰＢＳ（phosphate-buffered saline；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８．０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．３）溶液にて洗浄した。
【００７６】
次いで、１次反応として、段階希釈した正常マウス血清、免疫後のマウス抗血清、ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２を、ブロッキングした抗原感作マイクロプレートに加え、反応させた。
【００７７】
洗浄後、２次反応として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを、上記マイクロプレートに加え、反応させた。
【００７８】
そして、洗浄後、ＴＭＢを上記マイクロプレートに加え、発色反応を行い、市販のプレートリーダにより４５０ｎｍで吸光度を測定した。結果を表１に示す。
【００７９】
【表１】
2005253367.tif 000002
【００８０】
〔実施例３〕  モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２の機能解析
以下の実施例では、上記ハイブリドーマ３Ｃ２、４Ｆ１２によって産生されたモノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２の機能解析を行った。
【００８１】
具体的には、まず、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２が、二重リン酸化されたＭＲＬＣを特異的に認識できるか否かを調べるために、ウエスタンブロッティングを行った。実験方法は、文献（Gerashchenko BI, Ueda K, Hino M, Hosoya H. Phosphorylation at threonine-18 in addition to phosphorylation at serine-19 on myosin-II regulatory light chain is mitosis-specific event. Cytometry 2002 Mar 1; 47(3): 150-7）を参照して行った。
【００８２】
まず、ニワトリの胃から調製したリン酸化されていないＭＲＬＣ（０Ｐ）、一重リン酸化されているＭＲＬＣ（１Ｐ）、二重リン酸化されているＭＲＬＣ（２Ｐ）の混合物をglycerol PAGE gel(14% polyacrylamide)にて分離後、ＰＶＤＦ（Polyvinylidene difluoride）膜に転写した。
【００８３】
次に、レーン１をＣＢＢ（Coomassie brilliant blue）染色し、残りのレーン２〜７は、各抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。なお、ニワトリの胃由来のＭＲＬＣとヒト由来のＭＲＬＣとは非常に類似しているため、ここでは、ニワトリ由来のＭＲＬＣを用いて実験した。
【００８４】
その結果を図１に示す。レーン１には、基質として用いた３種類のＭＲＬＣのＣＢＢ染色の結果を示す。図１に示す一番上の矢印はリン酸化されていないＭＲＬＣの位置を示し、二番目の矢印は一重リン酸化されているＭＲＬＣの位置を示し、一番下の矢印は二重リン酸化されているＭＲＬＣの位置を示す。なお、「一重リン酸化されているＭＲＬＣ」とは、１８番目のスレオニン残基がリン酸化されているものと、１９番目のセリン残基がリン酸化されているものとが含まれている。
【００８５】
レーン２には、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２と、上記３種類のポリペプチドとのウエスタンブロットの結果を示す。レーン３には、モノクローナル抗体ＭＡｂ−４Ｆ１２と、上記３種類のポリペプチドとのブロッティングの結果を示す。
【００８６】
レーン４、レーン７には、それぞれコントロールとして抗体を入れずに、抗原抗体反応させたブロッティングの結果を示す。レーン５、レーン６には、それぞれ二重リン酸化されたＭＲＬＣを認識するポリクローナル抗体ＰＰ１と、上記３種類のポリペプチドとのブロッティングの結果を示す。
【００８７】
この図１に示すように、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２はともに、二重リン酸化されたＭＲＬＣを認識し、リン酸化されていないＭＲＬＣ、及び一重リン酸化されているＭＲＬＣを認識していないことがわかる。このことから、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２はともに、二重リン酸化されたＭＲＬＣを特異的に認識できることが示された。
【００８８】
さらに、ＥＬＩＳＡ法を用いて、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２の基質特異性の程度、即ち、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２が、どの程度、二重リン酸化されたＭＲＬＣを特異的に認識できるのかを調べた。
【００８９】
具体的には、まず、リン酸化されていない配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−０ｐ）と、７番目のスレオニン残基がリン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−Ｔｐ）と、８番目のセリン残基がリン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−Ｓｐ）と、７番目のスレオニン残基と８番目のセリン残基とがリン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−ｐｐ）とについて、種々の濃度の溶液を調製し、マイクロプレート（flat-bottom microliter, Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan）に添加し、２．０％グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）含有バイカルボネート溶液（bicarbonate buffer）（ｐＨ９．４）と共に、３７℃、２時間、前処理を行った。
【００９０】
次いで、前記マイクロプレートのウェルをＰＢＳ溶液にて２回洗浄した。そして、０．０２％ ＮａＮ3含有３％ スキムミルクで、３７℃、１晩、ブロッキングした。
【００９１】
その後、ＰＢＳ溶液で洗浄後、５０μｌのモノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２を添加し、３７℃、１時間、抗原抗体反応させた。次いで、ウェルをＰＢＳ溶液で洗浄後、５０μｌのペルオキシダーゼ結合抗ウサギ ヤギＩｇＧ抗体（５μｇ／ｍｌ；Cappel, Dudham, NC）を添加して、３７℃、１時間反応させた。
【００９２】
最後に、ＰＢＳ溶液にて洗浄後、０．４ｍｇ／ｍｌ Ｏ―フェニレンジアミン（o-phenylendiamine）と、０．０１２％ Ｈ2Ｏ2とを含有した５０ｍＭ クエン酸−リン酸溶液（citrate-phosphate buffer）（ｐＨ５．０）を加えて、ペルオキシダーゼ反応を行った後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００９３】
その結果をグラフ化したものを図２、図３に示す。図２にはモノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２の基質特異性を調べた結果を、図３には、モノクローナル抗体ＭＡｂ−４Ｆ１２の基質特異性を調べた結果を示す。
【００９４】
（○）は、リン酸化されていない配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−０ｐ）とモノクローナル抗体とを反応させた結果を示す。（●）は、８番目のセリン残基のみが一重リン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−Ｓｐ）とモノクローナル抗体とを反応させた結果を示す。（□）は、７番目のスレオニン残基のみが一重リン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−Ｔｐ）とモノクローナル抗体とを反応させた結果を示す。（■）は、７番目のスレオニン残基及び８番目のセリン残基が二重リン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−ｐｐ）とモノクローナル抗体とを反応させた結果を示す。
【００９５】
その結果、図２、図３に示すように、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、４Ｆ１２はともに、リン酸化されていない配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−０ｐ）、及び、８番目のセリン残基のみが一重リン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−Ｓｐ）、並びに、７番目のスレオニン残基のみが一重リン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−Ｔｐ）を、ほとんど認識しないが、７番目のスレオニン残基及び８番目のセリン残基が二重リン酸化されている配列番号１に示すポリペプチド（Ｍ１−ｐｐ）を特異的に、かつ濃度依存的に認識することがわかった。
【００９６】
即ち、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、４Ｆ１２はともに、非常に特異性高く、７番目のスレオニン残基及び８番目のセリン残基が二重リン酸化されている配列番号１に示すポリペプチドを認識することが実験的に明らかとなった。このことから、モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、４Ｆ１２はともに、非常に特異性高く、二重リン酸化されたＭＲＬＣを認識することが示された。
【００９７】
〔実施例４〕  Ｍ期細胞の検出、採取方法
以下に、本実施の形態に係るモノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、４Ｆ１２を用いたＭ期細胞の検出、採取方法の一例を示す。
【００９８】
実験としては、上記モノクローナル抗体と、ＤＮＡを標識するＰＩ（Propidium Iodide）とでＨｅＬａ細胞（Hela S3 cells；RCB0271、Riken Cell Bank, Tsukuba, Japan）を順番に標識し、複数パラメータのフローサイトメトリー法により分析し、細胞を細胞周期ごとに分類した。その後、細胞の検出精度を確認するために、分類した細胞を顕微鏡で観察した。具体的には、以下の方法で行った。
【００９９】
細胞固着、浸透、間接免疫蛍光ＤＮＡ染色の方法は、基本的には、Dr.J.Lawry（Institute for Cancer Studies, University Medical School, Sheffield, UK）のプロトコールに従ったが、若干の修正を加えて行った。
【０１００】
まず、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄し、２〜３×１０6cells／ｍｌの濃度の細胞溶液とした後、０．５倍量の氷冷した３．７％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ溶液を、細胞溶液の容量が最終的に３ｍｌになるように加えて、室温にて、５分間細胞を固着させた。
【０１０１】
次に、浸透処理の前に細胞を遠心回収し上清を除いた。そして、細胞を氷冷した２ｍｌの７０％メタノールで懸濁し、室温にて１５分間放置した。
【０１０２】
固着／浸透処理後、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液にさらした。次いで、約０．５×１０6cells／１００μｌの細胞溶液を調製し、間接免疫蛍光ＤＮＡ染色に用いた。
【０１０３】
次に、上記モノクローナル抗体を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液にて、２倍、１０倍、２０倍希釈し、各希釈溶液から１０μｌずつ取り出し、前記細胞溶液に添加した。その後、氷上で６０分間反応させた。
【０１０４】
次に、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液にて洗浄後、２０００倍希釈した蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ:fluorescein isothiocyanate）結合抗ウサギ ヤギＩｇＧ抗体（２次抗体）（Cappel、Durham、ＮＣ）を加えて、３０分間、氷上、暗室にてインキュベートした。
【０１０５】
なお、ネガティブコントロールとして、細胞、前記ＦＩＴＣ結合２次抗体のみをインキュベートしたものを用いた。
【０１０６】
その後、細胞を洗浄し、０．１％ＲＮＡｓｅＡ（Sigma）含有、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピディウム（ＰＩ：propidium iodide、Sigma, St. Louis, MO）溶液、３００μｌを用いて、冷蔵庫にて１晩染色を行った。
【０１０７】
次に、フローサイトメトリーとセルソーティング（細胞分別）とを行った。フローサイトメトリーとセルソーティングとは、１５ｍＷのアルゴン−イオンレーザー（４８８ｎｍ）を備えた、ＦＡＣＳＣaliburフローサイトメトリー（Becton-Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA）を用いて行った。
【０１０８】
ＦＩＴＣ蛍光は、５３０／３０ｎｍバンドパスフィルターを通して計測した。そして、ＰＩの蛍光は、５８５／４２ｎｍバンドパスフィルターを通して計測した。
【０１０９】
ＰＩのシグナルは直線的に増幅したが、一方、ＦＩＴＣシグナルは対数増加的に増幅した。データはＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフト（Becton Dickinson）にて解析した。両者の免疫蛍光２次元マップからともに明領域にある細胞をＭ期細胞とみなして抽出した。
【０１１０】
セルソーティングは、リカバリーに重点をおかず、高純度になるように細胞を分類する“シングルセル”ソートモードで行った。細胞は４％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で前処理したコレクションチューブで分類した。そして、顕微鏡観察を行う前に、分類した細胞を遠心分離にて回収した。
【０１１１】
次いで、細胞の検出（セルソーティング）の精度を調べるために、顕微鏡により、分類した細胞の観察を行った。具体的には、分類した細胞をＰＢＳ溶液１００μｌにて再懸濁し、５０μｇ／ｍｌの４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：4’,6-diamidino-2-phenylindole、Nakalai Tesque, Kyoto, Japan）５μｌを用いて再染色した。そして、蛍光顕微鏡（Optiphot microscope, Nikon, Japan）を用いて、核形態論にしたがって分類した。
【０１１２】
その結果を表２に示す。比較のために、従来のＤＮＡ染色法を用いて、フローサイトメトリーにて細胞をソートしたものを、同様に顕微鏡観察にて分類した結果も併せて示す。
【０１１３】
【表２】
2005253367.tif 000003
【０１１４】
上記の表２の上段に記載の“ソート細胞数”は、Ｇ２＋Ｍ領域にあり、かつ二重リン酸化されたＭＲＬＣを持つ細胞の数を示している。なお、「binuceate」とは、１つの細胞質の中に２つの核が並置された状態をいう。
【０１１５】
表２に示すように、本発明に係る検出方法を用いた場合、ソートされた５０９個の細胞の内、約５９％がＭ期の細胞であった。残りの細胞は間期：３０％、binuceate：１１．４％であった。
【０１１６】
一方、従来のＤＮＡ染色による検出方法を用いた場合は、ソートされた細胞１６３９個の内、約２０％がＭ期の細胞であった。残りの細胞は間期：７５．４％、binuceate：４．９％であった。
【０１１７】
従って、本発明に係る検出方法を用いた場合は、従来の方法に比べて、約３倍も高い精度（密度）でＭ期の細胞を検出、採取することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
以上のように、本発明に係るモノクローナル抗体によれば、種々の診断薬や試薬等に利用可能であり、分子生物学的な分野において広範に産業上の利用可能性があるといえる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２、ＭＡｂ−４Ｆ１２の基質特異性を確認するためのウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図２】モノクローナル抗体ＭＡｂ−３Ｃ２の基質特異性をＥＬＩＳＡ法にて調べた結果を示すグラフである。
【図３】モノクローナル抗体ＭＡｂ−４Ｆ１２の基質特異性をＥＬＩＳＡ法にて調べた結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）は本発明に係るＭ期細胞を検出する方法の一例を示す工程図であり、（ｂ）は本発明に係るＭ期細胞を採取する方法の一例を示す工程図である。
【図１】
2005253367.tif 000004
【図２】
2005253367.tif 000005
【図３】
2005253367.tif 000006
【図４】
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【配列表】
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