(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を提供する方法を提供する。【解決手段】第１の場所でトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製するステップと、第１の場所から離れた第２の場所にトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を輸送するステップとを含む。好ましくは、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞が、多様なヒトまたは動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡまたはｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入することにより調製される。さらなる態様では、少なくとも１つの容器およびその容器に配置された少なくとも１個のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を含む培養系が提供される。【選択図】図２
2005304501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を提供する方法であって、
ａ）第１の場所でトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製するステップと、
ｂ）前記第１の場所から離れた第２の場所に前記トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を輸送するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製するステップは、ヒトまたは動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡまたはｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のヒトまたは動物の膜タンパク質は、ヒト有機カチオントランスポーター１（ｈＯＣＴ１）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド１（ｈＯＡＴＰ１）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド２（ｈＯＡＴＰ２）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド８（ｈＯＡＴＰ８）、ヒトタウロコール酸Ｎａ＋共輸送タンパク質（ｈＮＴＣＰ）、ラット有機アニオン輸送ポリペプチド（ｒＯａｔｐ１）、ヒトペプチドトランスポーター１（ｈＰＥＰＴ１）、ヒトペプチドトランスポーター２（ｈＰＥＰＴ２）、ヒト有機アニオントランスポーター１（ｈＯＡＴ１）、ヒト有機アニオントランスポーター３（ｈＯＡＴ３）、ラット有機アニオントランスポーター３（ｒＯａｔ３）、およびラット有機アニオン輸送ポリペプチド４（ｒＯａｔｐ４）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配達前に前記トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を少なくとも１つの容器に配置するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの容器はマルチウェルプレートのウェルであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記配置するステップの後でかつ配達前に、前記の少なくとも１つのウェルを密封するステップをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記配置するステップ後でかつ配達前に、前記少なくとも１つの容器を密封するステップをさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
配達前に緩衝液を前記少なくとも１つの容器中に配置するステップをさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記配達するステップは、前記トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞の温度を維持するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度は、１０〜２０℃の範囲に維持されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記温度は、１６℃に維持されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記輸送するステップは、自動車、トラック、飛行機、列車、船、およびその組合せからなる群から選択される輸送方法により輸送するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの容器と、
前記容器中に配置された少なくとも１個のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞と
を含む培養系であって、
前記容器は前記容器の輸送を可能にするように密封されることを特徴とする培養系。
【請求項１４】
少なくとも１個のアフリカツメガエル卵母細胞をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の培養系。
【請求項１５】
あらかじめ水を注入された少なくとも１個のアフリカツメガエル卵母細胞をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の培養系。
【請求項１６】
前記容器中に配置された緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の培養系。
【請求項１７】
前記容器はマルチウェルプレートのウェルであることを特徴とする請求項１３に記載の培養系。
【請求項１８】
少なくとも１種の試薬をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の培養系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜輸送タンパク質などのヒトまたは動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡまたはｃＤＮＡをあらかじめ注入したアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
南アフリカの爪を持ったカエルであるアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞はよく使用される機能発現系である。卵母細胞発現系は、トランスポーター、イオンチャネルおよびポンプなどの膜タンパク質の機能を研究するために用いられてきた。卵母細胞発現系は、バックグラウンドの低さ、高い発現レベル、および適切な翻訳後修飾を示す。
【０００３】
例えばヒト有機カチオントランスポーター１（ｈＯＣＴ１、ＳＬＣ２２Ａ１）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド１（ｈＯＡＴＰ１、ＳＬＣ２１Ａ３）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド２（ｈＯＡＴＰ２、ＳＬＣ２１Ａ６）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド８（ｈＯＡＴＰ８、ＳＬＣ２１Ａ８）、ヒトタウロコール酸Ｎａ＋共輸送タンパク質（ｈＮＴＣＰ、ＳＬＣ１０Ａ１）、ラット有機アニオン輸送ポリペプチド（ｒＯａｔｐ１、Ｓｌｃ２１ａ１）、ヒトペプチドトランスポーター１（ｈＰＥＰＴ１、ＳＬＣ１５Ａ１）、ヒトペプチドトランスポーター２（ｈＰＥＰＴ２、ＳＬＣ１５Ａ２）、ヒト有機アニオントランスポーター１（ｈＯＡＴ１、ＳＬＣ２２Ａ６）、ヒト有機アニオントランスポーター３（ｈＯＡＴ３、ＳＬＣ２２Ａ８）、ラット有機アニオントランスポーター３（ｒＯａｔ３、Ｓｌｃ２２ａ８）、およびラット有機アニオン輸送ポリペプチド４（ｒＯａｔｐ４、Ｓｌｃ２１ａ１０）などの多様なヒトおよび動物の膜輸送タンパク質（本明細書ではトランスポーターとも呼ぶ）に対する薬物輸送アッセイの確立には、いくつかの技術的問題が存在しうる。これらのトランスポーターの機能を同定するために卵母細胞でこれらを発現させることは困難であり、そのプロセス規模のために多大な時間を必要とする。
【０００４】
【非特許文献１】Wagner, et al., Cellular Physiol. Biochem., 2000, 10, 1-12
【非特許文献２】Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I-III (F. Ausubel, ed. 1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書において、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を提供する方法を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この方法は、第１の場所でトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製するステップと、第１の場所から離れた第２の場所にトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を輸送するステップとを含む。好ましくは、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞は、多様なヒトまたは動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡまたはｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入することにより調製される。
【０００７】
本発明のさらなる態様では、少なくとも１つの容器およびその容器に配置された少なくとも１個のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を含む培養系が提供される。この容器は、容器の輸送を可能にするように密封される。本発明により、有利なことには、使用者は、多様なヒトまたは動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡまたはｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入するという困難な作業を行わずに、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を用いて薬物輸送試験などの試験を行うことができる。
【０００８】
ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡは、多様なヒトまたは動物の膜輸送タンパク質、例えばヒト有機カチオントランスポーター１（ｈＯＣＴ１）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド１（ｈＯＡＴＰ１）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド２（ｈＯＡＴＰ２）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド８（ｈＯＡＴＰ８）、ヒトタウロコール酸Ｎａ＋共輸送タンパク質（ｈＮＴＣＰ）、ラット有機アニオン輸送ポリペプチド（ｒＯａｔｐ１）、ヒトペプチドトランスポーター１（ｈＰＥＰＴ１）、ヒトペプチドトランスポーター２（ｈＰＥＰＴ２）、ヒト有機アニオントランスポーター１（ｈＯＡＴ１）、ヒト有機アニオントランスポーター３（ｈＯＡＴ３）、ラット有機アニオントランスポーター３（ｒＯａｔ３）、およびラット有機アニオン輸送ポリペプチド４（ｒＯａｔｐ４）から選択されるヒトまたは動物の膜輸送タンパク質などをコードしてもよい。
【０００９】
本明細書で使用する「トランスジェニック」は、通常のタンパク質相補体に加えて、膜輸送タンパク質などのヒトまたは動物の膜タンパク質を発現する卵母細胞を示す。
【００１０】
本発明のこれらの特徴およびその他の特徴は、以下の詳細な説明および添付図面の検討を通して、さらによく理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
図１に示すように、方法１０はトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を提供するステップを説明している。
【００１２】
最初のステップ１２で、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製する。任意の既知の技法を使用して、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製することができる。好ましくは、膜輸送タンパク質などのヒトまたは動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡまたはｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入することにより、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製する。ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡは、膜輸送タンパク質を含む多様なヒトまたは動物の膜タンパク質をコードしてもよい。非限定例として、ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡは、以下の動物またはヒトの膜輸送タンパク質、つまりヒト有機カチオントランスポーター１（ｈＯＣＴ１、ＳＬＣ２２Ａ１）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド１（ｈＯＡＴＰ１、ＳＬＣ２１Ａ３）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド２（ｈＯＡＴＰ２、ＳＬＣ２１Ａ６）、ヒト有機アニオン輸送ポリペプチド８（ｈＯＡＴＰ８、ＳＬＣ２１Ａ８）、ヒトタウロコール酸Ｎａ＋共輸送タンパク質（ｈＮＴＣＰ、ＳＬＣ１０Ａ１）、ラット有機アニオン輸送ポリペプチド（ｒＯａｔｐ１、Ｓｌｃ２１ａ１）、ヒトペプチドトランスポーター１（ｈＰＥＰＴ１、ＳＬＣ１５Ａ１）、ヒトペプチドトランスポーター２（ｈＰＥＰＴ２、ＳＬＣ１５Ａ２）、ヒト有機アニオントランスポーター１（ｈＯＡＴ１、ＳＬＣ２２Ａ６）、ヒト有機アニオントランスポーター３（ｈＯＡＴ３、ＳＬＣ２２Ａ８）、ラット有機アニオントランスポーター３（ｒＯａｔ３、Ｓｌｃ２２ａ８）、およびラット有機アニオン輸送ポリペプチド４（ｒＯａｔｐ４、Ｓｌｃ２１ａ１０）のいずれかをコードしてもよい。これらのタンパク質およびそれらをコードするｃＲＮＡおよびｃＤＮＡは当技術分野で知られている。
【００１３】
好ましい実施形態では、アフリカツメガエルまたはアフリカツメガエル卵母細胞をＮＡＳＣＯ、Ｆｔ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ５３５３８から入手することができる。ヒトまたは動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを標準的な技法により注入してもよい（例えば、非特許文献１参照）。本発明で使用することができる、従来の分子生物学または細胞生物学の技法も開示されている（例えば、非特許文献２参照）。
【００１４】
トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製すると、ステップ１４で示されるように、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を、調製場所から離れた場所に輸送することができる。本発明では、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞が第１の場所（例えば、製造会社施設）で調製され、離れている第２の場所（例えば、取引先施設）に輸送される。自動車、トラック、飛行機、列車、または船便輸送、あるいはそれらの任意の組合せを含むがこれらに限らない任意の輸送方法を使用することができる。トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞は、２〜４日以内の期間で輸送されることが好ましい。トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞は、一般に７日間生存可能である。
【００１５】
好ましくは、輸送前にトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を１個または複数の容器に配置する（ステップ１６）。容器は、試験管、バイアル瓶、フラスコなどの任意の既知の形状であってよい。好ましくは、図２に示すように、容器１８はマルチウェルプレート２０のウェルである。このマルチウェルプレート２０が、薬物アッセイ処理用装置（例えば、ハイスループット（高い処理量の）スクリーニング（ＨＴＳ）装置）で使用することができるように、従来のマルチウェルプレート標準品（例えば、Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇのスタンダード）に適合することがさらに好ましい。マルチウェルプレート２０は、好ましくは米国ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトンディッキンソンアンドカンパニーの商標「ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（商標）Ｆｌｉｐ−Ｌｏｃｋ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ」で市販されているマルチウェルプレートである。この特定のマルチウェルプレートには、１列１２個のウェルがあるが、任意の数のウェルを本発明に使用することができる。
【００１６】
さらに図２に示すように、任意の数のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞２２を容器１８に配置してもよい。容器１８、１個当たり４〜５個のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞２２を配置するのが好ましい。
【００１７】
好ましくは、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞２２を懸濁するために、緩衝液２４も容器１８に配置する。緩衝液２４は、遠隔場所への輸送を可能にするために、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞２２の生存力を長時間維持する任意の溶液であってよい。緩衝液２４は、ＮＤ９６（９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣＬ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、ｐＨ７．４）または改変バース培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｒｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）（８８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．４１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）であってよい。容器１８のそれぞれにおいて４〜５個のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を懸濁するために、約５ｍｌの緩衝液２４を加えるのが好ましい。さらに好ましくは、容器１８が単一構造の一部（例えば、単一マルチウェルプレートのウェル）であるとき、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞２２が存在しなくてもよい容器１８でも、単一構造の容器１８のそれぞれが等量の緩衝液２４を含む。等量の緩衝液２４により、輸送中のスロッシング作用が弱まり、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞２２に起こり得るダメージが軽減される。
【００１８】
任意の既知の技法を用いて、緩衝液２４を容器１８に配置してもよい。トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞２２を配置する前に、緩衝液２４を容器１８に配置することが好ましい。トランスファーピペットなどの任意の既知の技法を用いて、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞２２を容器１８に配置してもよい。
【００１９】
図１のステップ２６で示されるように、容器を輸送前に密封することも好ましい。好ましくは、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞および緩衝液の漏出を防ぐために、容器を液密に密封する。任意の密封装置を使用することができる。例示を目的として図２に示すように、漏れに対して液体を通さないバリアをもたらすために弾力性のあるガスケットまたはシール部材２８（例えば、シリコーンガスケット）を容器１８の全体に配置してもよい。任意の既知の技法を用いて、シール部材２８を容器１８に対して固定してもよい。例えば、容器１８に対してねじ付け、ヒンジで取り付け、ラッチ係合、さもなければ取り外しできるように固定する（例えば、マルチウェルプレート２０にラッチ係合する）シール部材２８を覆うように蓋３０を配置してもよい。蓋３０により、シール部材２８に対して逆行する力が生じ、それによりもたらされるシールを強化させてもよい。シール部材２８は、（例えば、熱接着により）容器に対して取り外しできるように固定されるホイルまたはプラスチックフィルムであってもよい。
【００２０】
トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞は温度感受性があり、輸送ステップ１４の間、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞の温度を維持することが好ましい。より具体的には、温度を１０〜２０℃の範囲、さらに好ましくは１６℃の温度で維持することが好ましい。任意の既知の技法により温度を維持することができる。本発明では、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞が、最初に所望の温度に冷蔵され、その冷蔵温度を維持するために断熱材料内に包装されてもよい。例えば図２に示すように、紙スリーブまたは封筒３２（例えば、重量紙または板紙）および／またはプラスチックスリーブまたは小袋３４を、断熱性を与えるために容器１８の周囲に配置してもよい。紙スリーブまたは封筒３２および／またはプラスチックスリーブもしくは小袋３４を容器１８の周囲にタイトに包装して、シール部材２８に対して逆行する力をさらに生じさせてもよい。さらに、外部断熱包装を用いてもよい。図２に示すように、断熱性の裏地３８を有するカートン３６内に容器１８を梱包してもよい。断熱性だけでなく衝撃耐性を加えるために遊離包装材料４０（例えば、発泡セグメント）を備えてもよい。所望の温度をさらに維持するために、あらかじめ冷却した媒体４２をトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞の外部にさらに詰めてもよい（例えば、あらかじめ４℃に冷蔵された前冷却ゲルパック）。輸送中の温度変動点検を可能にするために、温度デジタルレコーダ４４をトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞と共に包装してもよい。
【００２１】
当分野の技術者には明らかなように、本発明のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を培養系の一部として利用することができる。輸送のために１個または複数の容器に密封されるトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞に加えて、この培養系は対照のアフリカツメガエル卵母細胞を含んでもよい。図１に示すように、未注入のアフリカツメガエル卵母細胞（すなわち、ヒトまたは動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを注入していない）を提供する、または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でアフリカツメガエル卵母細胞に水を注入することによって、対照のアフリカツメガエル卵母細胞を調製してもよい（ステップ４６）。その後、前述と同じ方法で、対照のアフリカツメガエル卵母細胞を、１個または複数の容器に配置し（ステップ４８）、密封し（ステップ２６）、輸送してもよく（ステップ１４）、これらはその温度を維持するステップを含む。図２に、対照のアフリカツメガエル卵母細胞５０を示す。しかし、単一の構造の容器（例えば、マルチウェルプレート）は、混同を避けるため、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞と対照のアフリカツメガエル卵母細胞の両方を含まないことが好ましく、別々の容器を使用することが好ましい。
【００２２】
この培養系は、分析用試薬などのその他の成分を含んでもよい。試薬は、前述のＮＤ９６緩衝液（例えば、５００ｍｌ）、ナトリウム（Ｎａ＋）緩衝液（例えば、５００ｍｌ）、およびＳＤＳ溶解緩衝液（例えば、３０ｍｌ）であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の方法を示すフローチャートである。
【図２】包装されたトランスジェニックおよび対照のアフリカツメガエル卵母細胞の断面図である。
【符号の説明】
【００２４】
１２  ステップ
１４  輸送ステップ
１６  ステップ
１８  容器
２０  マルチウェルプレート
２２  トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞
２４  緩衝液
２６  ステップ
２８  シール部材
３０  蓋
３２  封筒
３４  小袋
３６  カートン
３８  裏地
４０  遊離包装材料
４２  媒体
４４  温度デジタルレコーダ
４６  ステップ
４８  ステップ
５０  対照のアフリカツメガエル卵母細胞
【図１】
2005304501.tif 000003
【図２】
2005304501.tif 000004
【外国語明細書】
2005304501000001.pdf