(57)【要約】【課題】  溶液中の過酸化水素濃度の連続的測定を、簡便に、少量の試料でも、低濃度まで、高感度に、選択性よく行うことのできる計測部を提供する。また、その計測部を利用した、オキシダーゼ基質用の計測装置を提供する。【解決手段】  過酸化水素計測部用の電極として、特定の活性を有するタンパク質を化学修飾により表面に固定化した、内部を測定液が貫通する炭素繊維フェルト部材を用いる。また、オキシダーゼ基質の計測にあたり、上流に、オキシダーゼを化学修飾法により固定化した炭素繊維フェルト部材を有する反応部、下流に、前述の過酸化水素計測部を配置する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、尿、血清、脳脊髄液、食品など、多くの共存成分を含む測定対象から微量の試料を採取し、それを連続的に定量分析するための微少量オンラインバイオセンサの検出部位、および反応部位に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、医療、環境、食品等の分野において、バイオセンサが注目されている。なかでも、グルコース等のオキシダーゼ基質を定量する必要性が大となり、種々の試みがなされている。分析には、試料液をその都度取り替えるバッチ式と、液を連続的に流すフロー式があるが、バッチ式では、測定試料が変わるたびに洗浄操作が必要で煩雑であり、フロー式が好ましい。また、オキシダーゼ基質を定量するには種々の方式があるが、基質をオキシダーゼと反応させ、生ずる過酸化水素を測定するのが有力な方法である。
過酸化水素計測用の電極としては、いくつかのタイプが知られているが、オキシダーゼ基質に適用するには、いくつかの要件を満足することが必要となる。オキシダーゼ基質のような生体試料の場合には、多くの共存成分を含むため、選択性が必要である。また、測定目的や状況を考えると、低濃度領域においても、高感度に測定できることが要求される。さらに、通常の測定以上に、簡便で、低コストであることが前提となる。また、連続的にフロー式で測定するには、液の移動に抵抗が少なく、円滑に流れることが必要である。これらの要件を満足する適切な電極系を見つけるため、種々の検討がなされてきた。
例えば、選択性を上げるために、フィルタ効果を有する構造とすることが行われているが、電極構造が複雑化するのが難点である。
電極材料として、白金などが用いられるが、価格が高いのが欠点である。【０００３】  電極材料として、電池用ではあるが、炭素が良好な特性を有し、特に、炭素繊維よりのフェルト部材は、液の透過抵抗が小さいことが指摘されている（特許文献１参照）。
また、蜂の巣状の空隙を有するガラス状炭素（ＲＶＣ：Ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅｄ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ｃａｒｂｏｎ）に酵素を共有結合で固定、即ち化学修飾し、過酸化水素の検出に用いることが提案されている（非特許文献１参照）。
さらに、炭素繊維フェルト部材表面に、ペルオキシダーゼとしての西洋ワサビペルオキシダーゼと、電子メディエータとしてのトルイジンブルーを同時に化学修飾することも行われている（非特許文献２参照）。なお、この場合は、酵素活性中心と炭素繊維フェルト間の直接電子移動反応ではなく、メディエータが介在して、電極への電子移動を可能としている。【０００４】
【特許文献１】        特開２００１−２７９５６６号公報（第２頁・段落番号０００１）
【非特許文献１】        Ｈ．Ｊ．Ｗｉｅｃｋ  他：Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１５８巻、１３７−１４１頁、１９８４年
【非特許文献２】        Ｙ．Ｈａｓｅｂｅ  他：Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６８巻、９０４−９０６、２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  過酸化水素を連続的に計測するのに用いられる電極、特に、オキシダーゼ基質計測用装置系に用いる電極には、種々の解決すべき課題がある。すなわち、上述のように、良好な選択性、広い測定範囲、特に低濃度領域での定量性、高い感度、使用の簡便性、低コスト、小さな液抵抗など、多様な、かつ高度の要求を満足しなければならない。【０００６】  前述のように、特許文献１において、炭素が電極材料として優れた性質を有し、フェルト状で用いると、液透過性が良好であることが述べられている。しかし、特許文献１は、ナトリウムー硫黄電池等の二次電池に関するものであり、本発明の目的である過酸化水素の計測用として有効であることは、全く述べられていない。
また、非特許文献１においては、酵素で化学修飾した多孔性ガラス状炭素（ＲＶＣ）を過酸化水素定量用電極に用いている。しかし、ＲＶＣは、物理的に極めてもろく、焼成後の成形が難しいこと、必要なサイズ、形状のものを得るには、鋳型に原料樹脂を封入して焼結するため、工程が煩雑であること、更には、表面官能基が少なく反応性に乏しく、機能性分子の固定化が十分に行われにくいこと等の難点があり、本発明の目的に使用するには不適当である。
また、非特許文献２においては、炭素繊維フェルト表面にペルオキシダーゼと電子メディエータとを同時に化学修飾した過酸化水素検出電極が述べられている。しかし、電子メディエータを同時に用いることは、それだけ電極系の調製が煩雑となり、化学修飾反応の調節も難しくなる。さらに、本文献は、測定がバッチ方式であり、本発明の連続的な、フロー方式での良好な電極については全く述べられていない。【０００７】  過酸化水素の連続測定に対する社会的ニーズは大きいが、上述の多様な、かつ、高度の課題を解決することが必要である。部分的な対応策では不十分であり、これらの課題をすべて、同時に解決することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者は、上記目的を達するために鋭意検討を重ねた結果、溶液中の過酸化水素濃度の連続測定用電極として、遷移金属錯体を補酵素として活性中心に有するタンパク質を、化学修飾法により表面に固定化した炭素繊維フェルト部材内部を測定液が貫通する、直接電子移動型の電極を用いることが有効であることを見出した。すなわち、これらの諸要件をすべて満足する電極を用いることにより、従来得られなかった大きな効果を発揮することが可能となったものである。【０００９】  また、上流に、オキシダーゼを化学修飾法により表面に固定化した炭素繊維フェルト部材を有する反応部を配置し、下流に、上記の電極を有する過酸化水素計測部を配することにより、オキシダーゼ基質を連続的に計測できる、優れた装置を得ることに成功した。
【発明の効果】
【００１０】  本発明により、溶液中の過酸化水素濃度の連続的測定を、簡便に、低コストで、少量の測定試料でも、広い範囲に渉って、特に、低濃度領域においても、高感度で、共存物の影響を受けずに、選択性よく行うことのできる計測部を提供することができる。
また、本発明により、その過酸化水素の計測部を、所定のオキシダーゼ基質反応部と組み合わせることにより、生体等に由来する、多くの共存成分を含む複雑な測定対象から、特定のオキシダーゼ基質を連続的に測定することができる装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  以下、本発明の実施の形態について詳しく説明する。
本発明において、遷移金属錯体を補酵素として活性中心に有するタンパク質とは、ポリペプチド鎖内部の空孔である活性中心に遷移金属錯体を持つタンパク質である。錯体を形成する金属としては、鉄、コバルト、ニッケルなどがある。
なかでも、ヘムタンパク質、すなわち、鉄イオン（Ｆｅ３＋またはＦｅ２＋）ポルフィリン錯体を持つタンパク質は、特性、取り扱い性、価格などの点で好適である。
ヘムタンパク質のうちでも、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、カタラーゼ、チトクロムＣ、チトクロムＣオキシダーゼ、チトクロムｂ５は身近に存在するものであり、より好適である。
ヘモグロビンは、生体内で酸素を運搬する機能を有している。ミオグロビンは、酸素を貯蔵、補給する働きがある。ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チトクロムＣ、チトクロムＣオキシダーゼなどは、触媒作用を有する酵素である。【００１２】  活性なタンパク質を過酸化水素測定に利用するためには、溶液中で固定した状態に保つ必要がある。固定化法としては、一般に、物理吸着法、架橋化法、包括法及び化学修飾法（共有結合法）が知られている。
物理吸着法は、処理は比較的簡単ではあるが、結合力が弱く、脱離し易い。架橋化法は、タンパク質同士を架橋化試薬によって不溶化する方法であるが、処理が煩雑であり、また、活性を十分発揮できないことがある。包括法は、担体のマトリックス内に、タンパク質を閉じこめる方法であるが、測定物質が活性中心に接近しにくい難点がある。
これに対し、化学修飾法は、タンパク質を担体、本発明の場合は、炭素繊維フェルト部材に共有結合によって、化学的に結合させる方法であり、タンパク質が脱離することはなく、また、目的の活性、すなわち、過酸化水素計測の優れた特性を保持することが可能である。本発明の効果は、化学修飾法による場合のみ発揮することができる。【００１３】  ペルオキシダーゼのなかでも、西洋ワサビペルオキシダーゼは、その特性、入手のしやすさなどの点で好適である。しかし、過酸化水素計測用電極としての特性は、化学修飾の方法によって大きく異なっている。種々の検討の結果、炭素繊維フェルト部材に、まず、活性ハロゲン基含有複素環化合物を反応させ、次いで、この環化合物に、西洋ワサビペルオキシダーゼを反応させることにより、優れた結果が得られることを見出した。特に、活性ハロゲン基含有複素環化合物として、塩化シアヌルを用いると著しい効果があることを見出した。【００１４】  本発明における炭素繊維フェルト部材は、ポリアクリロニトリル系繊維などの有機耐炎繊維または、ポリアクリロニトリル系耐炎繊維と石油ピッチ系、石炭ピッチ系の炭素繊維等から構成される前駆体フェルト状物を、不活性雰囲気中で炭素化処理して得られる。
炭素材電極は、電極としての電位窓が広いこと、表面に、フェノール基、カルボニル基、ラクトン基、カルボキシル基、キノン基などの官能基を有し、表面修飾が容易であること、様々な形状、形態、サイズへの加工が容易であること、化学薬品に安定であること、安価で入手しやすいことなどの特徴がある。
炭素繊維フェルト部材は、上記の特徴に加えて、極めて大きな電極表面積を有すること、検液のフロースルーに対する抵抗が小さいこと等により、フロースルー型の連続測定用電極として、極めて優れた特性を有している。【００１５】  炭素繊維フェルトは、高温の炭化処理を受けて製造されるが、この炭化処理温度が電極特性に大きく影響し、１６００〜２４００℃が好ましい。１６００℃以下では、電極特性が十分でないことがあり、一方、２４００℃以上では、電極特性が向上しないばかりか、逆に低下し、また、フェルト部材の力学特性が低下することがある。
また、フェルトを構成する繊維の太さも重要な因子であり、直径として、２〜２０μｍが好ましい。２μｍ以下では、フェルトの製造がしにくく、安定して良好な形状のフェルトを調製しにくい。一方、２０μｍ以上では、目的とする電極特性を発揮できないことがある。【００１６】  過酸化水素との反応、計測に際しての電極との電子のやり取り方式には、メディエータ型と直接電子移動型とが知られている。メディエータ型とは、活性タンパク質と共にメディエータが存在し、このメディエータと電極との間で電子移動が行われる方式である。直接電子移動型とは、メディエータを存在させずに、直接、活性タンパク質と電極との間で電子移動を行う方式である。本発明は、直接電子移動型を選択することにより、メディエータ共存に伴う種々の煩雑性等を回避し、扱いやすい電極系としたものである。【００１７】  本発明の過酸化水素計測用電極は、種々のオキシダーゼ基質計測用装置に利用することができる。
すなわち、上流に、オキシダーゼを化学修飾法により表面に固定化した炭素繊維フェルト部材を有する反応部を配置し、下流に、上述の本発明による過酸化水素計測用電極を有する過酸化水素計測部を配設することにより、オキシダーゼ基質を連続的に計測できる、優れた分析装置を得ることができる。
上流の反応部での溶液中のオキシダーゼ基質と、炭素繊維フェルト部材に固定されたオキシダーゼとの反応で生じた過酸化水素を、下流の計測部において、活性タンパク質を固定化した炭素繊維フェルト電極を用いて計測する。この際、上流で固定するオキシダーゼの種類を変えることにより、それに対応した各種のオキシダーゼ基質を計測できる。
本発明のオキシダーゼ基質計測用装置を用いて測定できるオキシダーゼ基質としては、グルコース、尿酸、コレステロール、Ｌ−乳酸、ビリルビン、Ｌ−グルタミン酸、アスコルビン酸、アミノ酸、キサンチン、ヒポキサンチン、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）、ピルビン酸、ヒスタミン、セロトニン、コリン、エタノール、メタノール、グリコール酸、亜硫酸、グリセロールなどがある。【００１８】  なかでも、本発明のオキシダーゼ基質計測用装置は、尿酸の測定に有用である。すなわち、上流の反応部の炭素繊維フェルト部材に固定化するオキシダーゼとして、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）を用いることにより、検液中の尿酸の測定が可能である。
尿酸の測定を行うに際し、本発明の効果を十分に発揮する方法について検討した結果、反応部の炭素繊維フェルト部材への尿酸オキシダーゼの固定化方法が大きな影響を有することが判明した。
化学修飾法として、炭素繊維フェルト部材に活性アミノ基含有アルコキシシラン化合物を反応させる第１段階、これにマレイミド基含有化合物を反応する第２段階、続いて尿酸オキシダーゼを反応させる第３段階よりなる方法、あるいは、ハロゲン化チオニルを介した化学結合による方法のいずれかであることにより、非常に優れた結果が得られることを見出した。
なかでも、上述の第１の方法において、活性化アミノ基含有アルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシランであり、マレイミド基含有化合物がマレイミドをペンダントとして有するポリスチレンである場合には、特に効果が大である。【００１９】  次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。実施例１より実施例９は、過酸化水素の計測に関する記載である。実施例１０より実施例１８は、オキシダーゼ基質測定に関する記載である。
【実施例１】
【００２０】  （塩化シアヌル法によるＨＲＰの固定化）：炭素繊維フェルト（以下、ＣＦと略記）部材（サイズ  １５ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）を準備した。このＣＦは、炭素化処理温度２０００℃、直径７μｍ、標準重量４００ｇ／ｍ２、かさ密度０．１４０（ｇ／ｃｍ３）、空隙率９０％、比抵抗０．５Ωｃｍ、ＢＥＴ法による表面積１５ｍ２／ｇである。
このＣＦを、純水中で超音波洗浄後十分に乾燥させ、塩化シアヌル５０ｍＭを溶解させた乾燥トルエン中に２３〜２４℃で２４時間浸漬させることによりＣＦ表面のＯＨ基を塩化シアヌルで活性化した。室温で３０分間乾燥させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略記）を（１ｍｇ／ｍｌ）の割合で純水に溶解させた酵素溶液に２４ｈ浸漬させＨＲＰを固定化した。固定化に関与する酵素蛋白質の官能基は、リジン残基由来のアミノ基または表面の糖鎖のＯＨ基である。【００２１】  （過酸化水素計測装置）：作製したＨＲＰ固定化ＣＦを図１に示す過酸化水素測定用フロー電解セルに装着した。ＣＦをはさんで下流側には対向電極として白金線を、セルの出口側に参照電極ホルダーを接続して、銀／塩化銀電極を挿入した。このフロー電解セルを検出器として図２に示す過酸化水素測定用フローバイオセンサを作製した。ここで６は無脈流ポンプ、７は試料注入部、８はポテンショスタット、９は記録計である。【００２２】  （測定方法）：０．１Ｍのリン酸緩衝液を一定流速で送液し、ポテンシオスタットＨＡ１５１（北斗電工製）でＨＲＰ固定化ＣＦ電極の電位を参照電極に対して−５０ｍＶに設定して、ベース電流を安定させた。過酸化水素標準液をサンプル注入口より注入してピーク電流応答を記録した。【００２３】  （試料注入量の検証）：試料注入量を５０μｌ、１００μｌ、２００μｌと変え、過酸化水素標準液のピーク電流値に及ぼす影響を検証した。０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０をキャリア液として、流速５．３ｍｌ／ｍｉｎで送液し、過酸化水素濃度０．５、１、３、５、１０、３０、５０および１００μＭの標準溶液で各濃度あたり３回ずつピーク電流値を測定した。その結果、注入量に比例してピーク電流も増大し、センサの感度（ピーク電流値と濃度の直線性の傾き）は、注入量が５０μｌ、１００μｌおよび２００μｌの時、それぞれ０．６８、１．５４、および３．０８μＡ／μＭであり、Ｓ／Ｎ＝３、検出限界電流を０．１μＡとした場合の測定下限濃度は、それぞれ、０．１５μＭ、０．０６５μＭおよび０．０３２μＭであった。また検量線が直線関係を示す上限濃度は、注入量が５０μｌ、１００μｌ、２００μｌのとき、それぞれ１００μＭ、５０μＭ、３０μＭであった。【００２４】  ピーク電流値のキャリア流速依存性について０．５ｍｌ／ｍｉｎ〜５．３ｍｌ／ｍｉｎの範囲で検証した。その結果、１００μＭ過酸化水素標準液（２００μｌ）のピーク電流値はキャリア流速２．３ｍｌ／ｍｉｎの時に最大値を示し、最大流速５．３ｍｌ／ｍｉｎのときでも最大値の９３％を維持していた。このとき１サンプルあたりの測定時間は１分以下で、１時間あたり６０サンプルの連続分析が可能であることを確認できた。【００２５】  通常、非多孔質な電極に酵素を固定化したフロー型検出器では、流速が増大すると酵素反応効率が減少するため、測定感度が著しく減少する。それに対し、多孔質で表面積の大きなＣＦ内部を試料溶液が貫通する本発明による過酸化水素計測装置では、ＣＦの高い電解効率および迅速な直接電子移動反応型ＨＲＰ触媒反応に基づき、高流速域でも迅速・高感度な測定が可能である。【００２６】  （ｐＨ依存性の検証）：ピーク電流値のキャリアｐＨ依存性についてｐＨ４．５からｐＨ９．０の範囲で検討した。その結果、１００μＭ過酸化水素標準液（２００μｌ）のピーク電流値はｐＨ４．５〜ｐＨ８．５の範囲で極めて良好でありｐＨ７．０における最大値に対していずれも９０％以上の応答を示した。しかしｐＨ９．０では５６％であった。したがって本センサは天然酵素を用いる酵素電極としてはｐＨ４．５からｐＨ８．５という比較的広いｐＨ領域で作動する特徴があり、生体試料、環境試料、農工業試料または食品試料など多様な試料にも幅広く適用できる可能性がある。【００２７】  （精度の検証）：１００μＭの過酸化水素標準液（２００μｌ）を７０回連続測定したときの相対標準偏差は０．１２６％であり、極めて高精度の分析が可能であった。
【比較例１】
【００２８】  実施例１と同一のＣＦを超音波洗浄した後、化学修飾処理を行わずにＨＲＰ溶液に２４時間浸してＨＲＰを物理的にＣＦに吸着させた。実施例１と同様の方法で過酸化水素の計測を行った結果、１００μＭ過酸化水素標準液（２００μｌ）に対するピーク電流値は実施例１の１０％以下であった。また測定の精度（再現性）に難があり、同一濃度の試料を連続的に測定した際、測定回数とともにピーク電流値が減少した。これはＣＦ表面に物理的に吸着したＨＲＰが徐々に脱離するためと考えられる。
【比較例２】
【００２９】  炭素化処理温度を、８００℃とした以外は、実施例１と同様にして調製したＣＦ部材を用い、実施例１と同様にＨＲＰを固定して、過酸化水素計測用フロー電解セルに設置した。１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）に対するピーク電流値は実施例１の値の１０％以下であった。
【比較例３】
【００３０】  炭素化処理温度を２７００℃とした以外は、実施例１と同様にしてＣＦ部材の調製を試みた。フェルト化の過程で繊維が脱落しやすく、良好なフェルトを得ることができなかった
【比較例４】
【００３１】  直径が１μｍの炭素繊維よりフェルト作製を試みたが、工程を順調に進めることができず良好な試料を得ることができなかった。
【比較例５】
【００３２】  繊維直径が３０μｍであること以外は、実施例１と同様にして作製したＣＦ部材を用い、実施例１と同様にして、１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク電流値を測定したところ、実施例１の値の７％であった。
【実施例２】
【００３３】  ＨＲＰの固定化に際し、塩化シアヌルの代わりにヨウ化シアヌルを用いた以外は、実施例１と同様にして１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク電流値を測定したところ、実施例１の値の８３％であった。
【実施例３】
【００３４】  ＨＲＰの固定化に際し、塩化シアヌルの代わりに２，４，６−トリクロロピリミジンを用いた以外は、実施例１と同様にして１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク電流値を測定したところ、実施例１の値の５８％であった。
【実施例４】
【００３５】  ＨＲＰの固定化に際し、塩化シアヌルの代わりに２，３，５−トリクロロピリジンを用いた以外は、実施例１と同様にして１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク電流値を測定したところ、実施例１の値の４１％であった。
【実施例５】
【００３６】  ＨＲＰの固定化に際し、塩化シアヌルの代わりに塩化チオニルを用いた以外は、実施例１に準じて、ＨＲＰを固定化した。塩化チオニル処理に先立ち、ＣＦを１５％の熱硝酸で３０分酸化処理して表面のカルボキシル基の密度を増大させた。洗浄・乾燥後、５０ｍＭ塩化チオニルを溶解させたトルエン溶液中、２３℃で２４時間反応させ、酸塩化物を形成させた後、実施例１と同様にＨＲＰ溶液に浸し、リジン残基の一級アミノ基と酸塩化物からアミド結合を形成させＨＲＰを化学修飾した。実施例１と同様にして１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク電流値を測定したところ、実施例１の値の５２％であった。
【実施例６】
【００３７】  ＨＲＰの固定化に際し、実施例５の塩化チオニルのかわりに水溶性のカルボジイミドＥＤＣ（正式名１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸）を用いた以外は、実施例５と同様にしてＨＲＰを固定化した。この方法は表面ＣＯＯＨとＥＤＣからｏ−アシルイソ尿素中間体を形成させ、蛋白質リジン残基の一級アミノ基とアミド結合を形成させる方法である。
実施例１と同様にして１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク電流値を測定したところ、実施例１の値の４４％であった。
【実施例７】
【００３８】  活性中心にヘムを持つミオグロビン（馬心筋由来）をＨＲＰの代わりに塩化シアヌル法でＣＦに固定化した。市販のミオグロビンを透析後、凍結乾燥した粉末を用い、実施例１と同様にミオグロビンをＣＦに化学修飾した。これを検出器として実施例１と同様に１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク応答を測定した。ＨＲＰ同様に再現性の良い応答が得られた。ピーク応答は実施例１の値の６０％であり、２μＭ以上の過酸化水素が検出可能であった。
【実施例８】
【００３９】  ヘモグロビン（子牛赤血球由来）についても実施例７のミオグロビン同様に透析処理し、実施例１および７と同様の方法でヘモグロビン固定化ＣＦを得た。実施例１と同様に過酸化水素のピーク応答を測定した。ＨＲＰおよびミオグロビン同様に再現性の良い応答が得られ、１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク電流値はＨＲＰの場合の５３％であり、１０μＭ以上の過酸化水素濃度で検出が可能であった。
【実施例９】
【００４０】  活性中心に補酵素としてコバルト錯体であるビタミンＢ１２を有するヒスチダーゼ（ＥＣ４．３．１．３、微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来）を実施例７のミオグロビン同様に透析処理した後、実施例１および７と同様の方法でヒスチダーゼ固定化ＣＦを得た。１ｍＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）のピーク応答を測定した所、実施例１の値の３５％であった。
【比較例６】
【００４１】  金属イオンを持たない牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用い、実施例１および７と同様の方法でＢＳＡ固定化ＣＦを得た。同様に過酸化水素のピーク応答を測定したが、この場合は、１００μＭ過酸化水素標準溶液（２００μｌ）に対して全く応答が見られなかった。
【００４２】  以上の結果から、本発明による過酸化水素の応答は、遷移金属錯体を補酵素として活性中心に有するタンパク質を化学修飾したＣＦにおいてのみ観察されることが示された。また、タンパク質としての西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び、化学修飾剤としての塩化シアヌルの組合せが、直接電解還元反応に基づくピーク電流応答を効率よく得るためには、極めて有効であることが明らかとなった。
【実施例１０】
【００４３】  オキシダーゼ基質測定装置の作製例として、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）を固定化したＣＦを反応層とする尿酸センサについて実施例を例示する。ＣＦは、実施例１で用いたものと同じものを用いた。過酸化水素計測用電極は、実施例１で作製したＨＲＰ固定化ＣＦを使用した。作製したウリカーゼ固定ＣＦを図３に示すシステムの過酸化水素計測用ＣＦの上流に設置した。ウリカーゼ固定化ＣＦで尿酸を酸化し、生成した過酸化水素をＨＲＰ固定化ＣＦで測定することにより、尿酸濃度が測定できる。【００４４】  純水中で超音波洗浄後十分に乾燥させたＣＦを１０％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）トルエン溶液中、２３℃で２４時間反応させ、ＣＦ表面のＯＨ基を介してＣＦ表面をアミノシリル化した。トルエン中で１０分間超音波洗浄し吸着種を除去した後、マレイミドペンダントポリスチレン（ＭＰＳ）１ｍｇ／ｍｌの塩化メチレン溶液中で２４時間反応させＭＰＳ被覆ＣＦを得た。次に、このＭＰＳ被覆ＣＦをウリカーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）水溶液２ｍｌに２４時間２３℃で浸漬し、ＭＰＳのマレイミド残基を介してウリカーゼを固定化した。ＭＰＳのマレイミド残基は、タンパク質のリジンおよびシステイン残基と反応し、共有結合を介して酵素蛋白質が固定化される。【００４５】  次に、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．０をキャリアとして４．３ｍｌ／ｍｉｎで送液し、検出電位を−５０ｍＶとして、各々の尿酸濃度が０．１、０．３、０．５、１、３、５、１０、３０、５０および１００μＭの標準溶液を各濃度あたり３回ずつ注入し、ピーク電流値を測定した。ピーク電流応答は再現性に優れ、ピーク電流値と尿酸濃度の関係を示す検量線は、０．１μＭ〜３０μＭの範囲で良好な直線性を示した（線形性、０．９９４７）。センサの感度に相当する検量線の直線領域の傾きは２．２６μＡ／μＭであり、Ｓ／Ｎ比を３．０とし、０．１μＡを検出限界電流とした場合の尿酸の検出下限濃度は０．０４４μＭであった。１０μＭの尿酸標準液を、３０回連続測定した場合の相対標準偏差は０．１８５％であり、高精度で尿酸を測定できた。【００４６】  また、センサの長期保存安定性について検証した。本例のＡＰＴＥＳ／ＭＰＳ法で作製したウリカーゼＣＦおよび実施例１の塩化シアヌル法で作製したＨＲＰ固定化ＣＦを０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０に浸し４℃で冷蔵庫に保管した。０．１μＭ〜３０μＭの濃度範囲における検量線の傾きは、作製初日を１００％として、１週間後に９７％、２週間後に９５％の感度を保っており、本発明のセンサは、長期安定性にもかなり優れていることが明らかとなった。
【比較例７】
【００４７】  オキシダーゼ基質測定装置の反応部において、ウリカーゼを化学修飾法により固定化せず、ウリカーゼを物理的に吸着させたＣＦを作製した。すなわち、比較例１と同様の処理により、ＨＲＰに代わり、ウリカーゼを吸着させた。実施例１０と同様に尿酸の測定を行ったが、測定のたびにピーク応答が減少して安定した応答を得ることができなかった。ウリカーゼのＣＦ表面からの脱離が原因であると考えられる。
【実施例１１】
【００４８】  ウリカーゼ固定化を、実施例５で例示した塩化チオニル法で行った。実施例１０と同様に尿酸を測定した結果、実施例１０には及ばないが、かなり良好な応答が得られた。センサの感度は２．０８μＡ／μＭで実施例１０の９２％であり、尿酸の検出下限濃度は、０．０４８μＭであった。
【実施例１２】
【００４９】  ウリカーゼの固定化を、実施例１で例示した塩化シアヌル法で行った。実施例１０と同様に尿酸を測定した結果、センサの感度は１．１１μＡ／μＭで実施例１０の４９％であり、尿酸検出下限濃度は、０．１１μＭであった。
【実施例１３】
【００５０】  ウリカーゼの固定化を、グルタルアルデヒド架橋法で行った。実施例１０と同様にＡＰＴＥＳによりＣＦ表面をアミノシリル化した後、１％グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液に２３℃で２４時間反応させＧＡ活性化ＣＦを得た。次にウリカーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）水溶液２ｍｌにＧＡ活性化ＣＦを２３℃で２４時間浸漬し、酵素蛋白質のリジン残基のアミノ基とＧＡ間でシッフ塩基を形成させウリカーゼを固定化した。実施例１０と同様に尿酸を測定した結果、センサの感度は実施例１０の４９％、検出下限濃度は、０．１１μＭであった。
【実施例１４】
【００５１】  ウリカーゼの固定化を、実施例６で例示したＥＤＣ法で行った。酵素タンパク質としてＨＲＰの変わりにウリカーゼを用いた以外は、実施例６と同様の方法でウリカーゼ固定化ＣＦを作製した。実施例１０と同様に尿酸を測定した結果、センサの感度は実施例１０の４５％、検出下限濃度は、０．１３μＭであった。
【実施例１５】
【００５２】  実施例１０のＡＰＴＥＳ−ＭＰＳ法で作製したウリカーゼ固定化ＣＦおよび実施例１のＨＲＰ固定化ＣＦを用い、血清や尿の希釈液を試料として、尿酸濃度を測定した。ヒトの尿や血清中の尿酸濃度はそれぞれ１０−３Ｍ、１０−４Ｍオーダーであるため、センサの測定可能濃度域を考慮して血清および尿の希釈倍率をそれぞれ４００倍および４０００倍とした。尿および血清試料に対するセンサ応答は再現性にすぐれており、検量線から算出した尿酸濃度は、比色分析法（ウリカーゼ・ＴＯＯＳ法：尿酸Ｃテストワコー）と良好な相関性を示した。【００５３】  以上のように、ウリカーゼを固定化したＣＦを反応層としてＨＲＰ固定化ＣＦと組み合わせた本発明による分析装置は、１０−７Ｍ〜１０−５Ｍの尿酸に対して高精度な連続分析が可能で、尿や血清試料の計測にも十分適用可能であることが確認できた。
【実施例１６】
【００５４】  本発明によるセンサは、反応層として用いるオキシダーゼの種類を変えることにより、そのオキシダーゼ基質が測定対象となる。グルコース測定を目的として、和光純薬製グルコースオキシダーゼ（微生物アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来，ＥＣ１．１．３．４、１６５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を用い、実施例１と同様の塩化シアヌル法によりＣＦに固定化した。【００５５】  次に、グルコースピーク電流値の最適化を行い、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５、キャリア流速４．３ｍｌ／ｍｉｎ、印加電圧−０．１２Ｖにおいて検量線を作成したところ、０．１ｍＭ〜１ｍＭのグルコースに対して良好な直線関係を示した。清涼飲料水や酒、血清や尿の希釈液を実試料サンプルとして、グルコースの定量を行った結果、本発明によるセンサの分析値と、市販の比色分析法（グルコーステストワコー、ｏ−トルイジン・ホウ酸法）による分析値との間に良好な相関性が認められた。
【実施例１７】
【００５６】  グルタミン酸の測定を目的として、グルタミン酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１１、微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｘ−１１９−６由来，２９ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を実施例１と同様に塩化シアヌル法でＣＦに固定化した。実施例１６と同様の条件で検量線を作成したところ、グルタミン酸１０−５Ｍ〜１０−３Ｍまでの範囲で測定可能であった。
【実施例１８】
【００５７】    乳酸の測定を目的として、乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２微生物Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．４０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を実施例１と同様に塩化シアヌル法でＣＦに固定化した。実施例１８および１９と同様の条件で検量線を作成したところ、Ｌ−乳酸１０−６Ｍ〜１０−４Ｍまでの範囲で測定可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】  本発明は、医療、食品、発酵・醸造、環境、工業プロセス、あるいは農林・水産分野等において、利用価値の大きいオキシダーゼ基質計測用装置を提供する。
例えば、医療分野の検査、診断において、血液、尿等の検液中の、グルコース、尿酸、コレステロール、ビリルビン、グルタミン酸、アスコルビン酸、ヒスタミン、セロトニン等の計測に利用され、糖尿病、痛風などの疾患の検査や予防に有効である。
また、食品分野において、グルタミン酸、アミノ酸、グルコース、キサンチン、ヒポキサンチン、アスコルビン酸、コレステロール、アルコール、ヒスタミンなどの計測に利用され、食品成分の分析に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】  本発明の過酸化水素計測用フロー電解セルの概略縦断面図である。
【図２】  本発明の過酸化水素計測用フローバイオセンサの概略構成図である。
【図３】  本発明のオキシダーゼ基質計測用装置の概略構成図である。
【符号の説明】
【００６０】１  作用極：本発明のタンパク質を固定化した炭素繊維フェルト部材
２  対極：白金線
３  参照極：Ａｇ／ＡｇＣｌ
４  白金リード線
５  フロー電解セル
６  無脈流ポンプ
７  試料注入部
８  ポテンショスタット
９  記録計
１０  反応部：オキシダーゼを固定化した炭素繊維フェルト部材を有する反応部
【図１】
2005308704.tif 000003
【図２】
2005308704.tif 000004
【図３】
2005308704.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月9日(2004.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遷移金属錯体を補酵素として活性中心に有するタンパク質を、化学修飾法により表面に固定化した炭素繊維フェルト部材内部を測定液が貫通する、直接電子移動型の過酸化水素計測用電極
【請求項２】
タンパク質が、ヘムタンパクであることを特徴とする請求項１に記載の電極
【請求項３】
ヘムタンパクが、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、カタラーゼ、チトクロムＣ、チトクロムＣオキシダーゼ、チトクロムｂ５の少なくとも一つであることを特徴とする請求項２に記載の電極
【請求項４】
ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼであり、化学修飾法が、活性ハロゲン基含有複素環化合物を介した化学結合によることを特徴とする請求項３に記載の電極
【請求項５】
活性ハロゲン基含有複素環化合物が塩化シアヌルであることを特徴とする請求項４に記載の電極
【請求項６】
炭素繊維フェルト部材が、１６００〜２４００℃の炭素化処理を受け、直径が２〜２０μｍの繊維よりなるものであることを特徴とする請求項１に記載の電極
【請求項７】
上流に、オキシダーゼを化学修飾法により表面に固定化した炭素繊維フェルト部材を有する反応部、下流に、請求項１記載の電極を有する過酸化水素計測部を配置したオキシダーゼ基質計測用装置
【請求項８】
請求項７において、オキシダーゼが、尿酸オキシダーゼであり、化学修飾法が、炭素繊維フェルトに活性アミノ基含有アルコキシシラン化合物を反応させる第１段階、これにマレイミド基含有化合物を反応させる第２段階、続いて尿酸オキシダーゼを反応させる第３段階よりなる方法、あるいはハロゲン化チオニルを介した化学結合による方法のいずれかであることを特徴とする尿酸計測用装置
【請求項９】
活性アミノ基含有アルコキシシラン化合物が３−アミノプロピルトリエトキシシランであり、マレイミド基含有化合物がマレイミド基をペンダントとして有するポリスチレンであることを特徴とする請求項８記載の尿酸計測用装置