(57)【要約】【課題】大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子と、ビブリオコレラのＣＴＸＡ２Ｂ遺伝子又は大腸菌のＬＴＸＡ２Ｂ遺伝子とを連結させて製造される組換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡを含有する発現プラスミド、この発現プラスミドで形質転換された微生物及びこの形質転換微生物によって生産される尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質を提供する。【解決手段】尿路系感染大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子と、粘膜免疫効果を増加させ且つ免疫補助剤として作用する、ビブリオコレラ(Vibrio cholerae)菌の無毒性トキシン遺伝子ＣＴＸＡ２Ｂ又は大腸菌(E. coli)の無毒性トキシン遺伝子ＬＴＸＡ２Ｂとを遺伝子組換えして、この組換えされた遺伝子を大腸菌で発現させ、分離及び精製することにより、尿路系感染大腸菌に対してワクチンとして用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子とビブリオコレラのＣＴＸＡ２Ｂ遺伝子を連結させて製造されることを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項２】
大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子と大腸菌のＬＴＸＡ２Ｂ遺伝子を連結させて製造されることを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項３】
抗原決定基をコードする遺伝子がＦｉｍＨであることを特徴とする請求項１又は２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号３に記載のＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の塩基配列を含有することを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１と２に記載のＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の塩基配列を含有することを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１又は２の組換えＤＮＡを含有することを特徴とする発現プラスミド。
【請求項７】
請求項４又は５の塩基配列を含有することを特徴とする発現プラスミド。
【請求項８】
発現プラスミドがｐＭＡＬ−ｐ２Ｅであることを特徴とする請求項７記載の発現プラスミド。
【請求項９】
請求項７の発現プラスミドを細胞株に導入して形質転換させることにより製造されることを特徴とする形質転換微生物。
【請求項１０】
細胞株が大腸菌であることを特徴とする請求項９記載の形質転換微生物。
【請求項１１】
発現プラスミドがｐＭＡＬ−ｐ２Ｅであることを特徴とする請求項１０記載の形質転換微生物。
【請求項１２】
形質転換微生物がＥ. ｃｏｌｉ ＰＳＣ ＫＣＣＭ−１０５５３又はＥ. ｃｏｌｉ ＰＳＬ ＫＣＣＭ−１０５５２であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換微生物。
【請求項１３】
形質転換微生物がＥ. ｃｏｌｉ ＰＳＣ ＫＣＣＭ−１０５５３又はＥ. ｃｏｌｉ ＰＳＬ ＫＣＣＭ−１０５５２であることを特徴とする請求項１１記載の形質転換微生物。
【請求項１４】
請求項９の形質転換微生物によって生産されることを特徴とする尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質。
【請求項１５】
請求項１０の形質転換微生物によって生産されることを特徴とする尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質。
【請求項１６】
請求項１１の形質転換微生物によって生産されることを特徴とする尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質。
【請求項１７】
請求項１２の形質転換微生物によって生産されることを特徴とする尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質。
【請求項１８】
請求項１３の形質転換微生物によって生産されることを特徴とする尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質。
【請求項１９】
配列番号４のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１４記載の尿路感染大腸菌に対する融合ワクチン蛋白質。
【請求項２０】
配列番号５のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１４記載の尿路感染大腸菌に対する融合ワクチン蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子と、ビブリオコレラのＣＴＸＡ２Ｂ遺伝子又は大腸菌のＬＴＸＡ２Ｂ遺伝子とを連結させて製造される組換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡを含有する発現プラスミド、この発現プラスミドを細胞株に導入して形質転換させることにより製造される形質転換微生物及びこの形質転換微生物によって生産される尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質に関する。
【０００２】
具体的に、本発明は、尿路系感染大腸菌に対する新しい融合蛋白質ワクチンに関するもので、さらに詳しくは、尿路系感染大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子と、粘膜免疫効果を増加させ且つ免疫補助剤として作用する、ビブリオコレラ(Vibrio cholerae)菌の無毒性トキシン遺伝子ＣＴＸＡ２Ｂ又は大腸菌(E. coli)の無毒性トキシン遺伝子ＬＴＸＡ２Ｂとを遺伝子組換えして、この組換えされた遺伝子を大腸菌で発現させ、分離及び精製することにより、尿路系感染大腸菌に対してワクチンとして用いることが可能な融合蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般に、尿路感染症は、尿路臓器などで見られる細菌感染症の総称であって、膀胱炎、腎盂炎及び急・慢性腎盂腎炎などの臨床的所見を示す(Kunin, 1994; Haley et al., 1985)。尿路系感染による疾病は、主に多数の微生物が尿路内で増殖する前までは臨床的な症状が発見されないという特徴があり、呼吸器疾患の次に多い頻度を示す疾病である。尿路感染は、上行性であり、下部尿道を介して細菌が侵入して感染症を起こすものと報告された(Patton et al., 1991)。血行性感染は黄色ブドウ球菌や真菌、結核菌などによって発生する可能性がある。尿路感染症の誘発因子としては妊娠、結石などによる尿路閉鎖、神経因性膀胱、膀胱尿管の逆流、腎疾患、高血圧、糖尿病、導尿管挿入、鎮痛剤及び解熱剤の服用などがある(Kunin, 1994)。一方、女性には主に膀胱炎と腎臓炎が、子供には膀胱炎が、男性には尿道炎が多く発生するものと報告された(Haley et al., 1985)。尿路感染症の合併症として腎臓の乳頭壊死、腎膿瘍及び腎周囲膿瘍などが発生する可能性がある(Stamm et al., 1993)。このような尿路感染の約７０％以上は、大腸菌が原因菌と知られている。この疾患により、米国の場合には年間７００万名以上が１次医療機関を訪ねており、約１００万名以上が病院治療を必要とすると報告された(Hooton, 2003; Kunin, 1994; Patton et al., 1991)。また、この疾病は人体生理的構造及び機能上、女性の尿道長さが短くて広いため細菌の繁殖が容易なので、男性に比べて女性の方が約４〜１０倍程度高い発病率を有するものと知られている。成人女性の５０％以上が尿路感染による疾患で病院を訪ねているが、これは最近の可妊期女性の性生活及び避妊剤の使用と相当関連していることが報告された(Hooton et al., 1996; Kunin, 1994; Stamm et al., 1993; Uehiling et al., 1994)。
【０００４】
尿路感染症は、感染経路によって、上部尿路感染症と下部尿路感染症に大別されるが、腎盂炎などの上部尿路感染症の場合には発熱、むかつき及び嘔吐、肋骨脊椎角部圧痛、血清抗体増加、白血球円柱などの症候が現れ、膀胱炎や尿道炎などの下部尿路感染症の場合には排尿困難、多尿症、切迫性尿失禁、恥骨上部痛などの症状が現われる(Hooton, 2003)。
【０００５】
また、尿路感染症は、感染の状態によって、単純性尿路感染である急性単純性膀胱炎及び急性単純性腎盂腎炎と慢性複雑性尿路感染症に分類される(Stamm et al., 1993)。単純性尿路感染症の場合には、２０〜３０代の尿路感染症において多発的に発生する反面、慢性複雑性尿路感染症の場合には、基礎疾患である尿路結石、水腎症、膀胱腫瘍、膀胱尿管逆流、神経因性膀胱及び前立腺肥大症などの影響によりいずれの年齢層でも多発的に発症することがみられ、特に普通の高齢者又は男性に多く発病するものと報告されている(Gupta et al., 1999b; Haley et al., 1985)。急性単純性膀胱炎の場合、全身性発熱、小便不利、頻尿、血尿及び炎症反応による膿尿などの症状が現われ、適切な抗生剤投与によって好転するものと報告されている(Stamm et al., 1993)。ところが、急性単純性腎臓炎は高熱、側腹痛、膀胱刺激症状が現れ、治療後にも微生物によって再感染が発生して慢性感染への転移などが問題となっているが、約６０％以上が再発して発熱、頻繁な膿尿及び細菌尿を伴う慢性複合性尿路感染症に罹患して腎疾患を深化させ、蛋白尿及び怪死を伴う巣状分節状糸球体硬化症(focal segmental glomerulosclerosis;ＦＳＧ)なども起こすものと知られている(Kunin, 1994)。一方、尿路系感染大腸菌の約５０％がカナマイシン(kanamycin)に耐性を示し、腎盂腎炎、膀胱炎患者の１０％が２〜３年内に再感染する。また、これらの患者の約１０％は一生涯感染に苦しまれていると報告された(Haley et al., 1984; Hooton et al., 1996)。
【０００６】
急性単純性尿路感染症の治療は、病原菌死滅及び再感染への罹患を減少させるための目的で行われる。特に再感染防止のための治療は尿路感染症治療において非常に重要であると報告されている。一般に、適正期間の治療を行わない場合、急速に再発すると報告されているが、これは新しい大腸菌或いは新しい細菌類によるものと思われる。主に抗生剤の投与による治療で２４時間内に細菌尿が無くなるが、膿尿や関連症状は数日間持続するものと報告されている(Hooton, 2003)。
【０００７】
急性単純性感染の別の種類である腎盂腎炎の場合、腎臓及び尿路上皮に深い感染を起こすが、この際には数日間の非経口的治療を行うものと知られている。このような治療には普通２週間以上の期間がかかり、アンピシリン(ampicillin)などの抗生剤よりはtrimethoprimsulfamethoxazole(TMP/SMX)(BactrimR)のような化学療法剤がさらに効果的であると知られている(Gupta, et al., 1999a, 1999b; Hooton, 2003; Nicolle, 2003)。その他にもアミノグリコシド(aminoglycosides)、セファロスポリン(cephalosporins)及びキノロン(quinolone)などが使用される(Nicolle, 2003)。
【０００８】
慢性複雑性感染の場合、一般的な抗生剤、化学療法剤の使用による治療が行われるが、長期間の薬物投与による副作用及び合併症発生の危険性が高いものと報告されている(Kunin, 1994)。ところが、このような治療による１）抗生剤耐性菌類の出現、２）頻繁な再感染によるコスト増加、及び３）高い感染率（年０.５〜０.７％）などの問題点によって尿路感染症治療のための効果的なワクチンの開発必要性が増加している(Hooton et al., 1996; Kunin, 1994; Patton et al., 1991)。
【０００９】
現在まで尿路系感染大腸菌に対するワクチンが製品化された例はなく、但し前臨床段階にあるものがあるが、次の開発戦略によって大腸菌に対するワクチンが作らなければならない。（１）菌の生存に必須的なアドヘシン(adhesin)が抗原蛋白質として用いられることが好ましく、（２）抗原蛋白質は免疫性が高くて毒性がないべきである。（３）粘膜の上皮細胞間接合部に棲息している微生物に対して粘膜免疫反応を誘発させることが可能な抗原蛋白質が必要であり、（４）単独抗原蛋白質では大部分、免疫性が弱いため、免疫原性を増加させることが可能な免疫補助剤(adjuvant)が必要である。（５）服用便利で副作用のない経口用ワクチンが必要である(Service, 1997)。
【００１０】
一方、尿路感染症大腸菌が生産するＧａｌ−Ｇａｌ ｐｉｌｉは尿路系上部上皮細胞への特異的付着に関与し、溶血素(hemolysin)は様々な種類の細胞破壊性と菌の細胞内への侵入を関与するものと明らかになった(Roberts et al., 1994)。韓国では、これらの遺伝子組換え及びペプチド合成によるワクチンの開発が行われたが、低い抗原性などによって期待するだけの多くの効果を得ることができなかった。外国では、Ｌａｇｅｒｍａｎｎ等（２０００）が尿路感染性大腸菌のＦｉｍＨ蛋白質を遺伝子組換えによってワクチンとして開発しようとする研究を行っていると知られている(Kunin, 1994; Pattone et al., 1991)。最近、これらの研究グループは、ＦｉｍＨを用いたカニクイザル(Cynomolgus monkey)における尿路感染症に対するワクチン効果を報告したことがある(Kunin,1994)。これによれば、免疫補助剤ＭＦ５９とＦｉｍＨを４匹の実験動物に投与した結果、３匹でワクチン効果が見られたが、この場合、効果的なワクチン効果にも拘らず、免疫補助剤を共に投与しなければならないという不便さがある。特に、経口用ワクチンとして用いるためには粘膜免疫反応を誘発させなければならず、また毒性がなくてワクチンの抗原蛋白質に対して免疫性を増加させることが可能な免疫補助剤が必須的である(Foss et al., 1999)。
【００１１】
免疫反応に関与する細胞は、機能の効果的な遂行のために組織又は器官を構成するが、これをリンパ系(lymphoid system)という。リンパ系は、実質的にリンパ球を生産し分化させる１次（或いは中枢）リンパ組織系（胸腺、骨髄）と、リンパ球と抗原との接触又はリンパ球間の相互作用を助ける２次（或いは末梢）リンパ組織系（脾臓、リンパ節及び粘膜リンパ器官など）に分類される。２次リンパ組織系のうち生体リンパ組織の１／３以上を占める粘膜リンパ器官は、数多くの必須栄養素の消化と吸収の中枢的な場所であり、有害な異物と病原性微生物に対する物理学的障壁の役割を行ううえ、免疫防御システムで重要な免疫学的障壁機能を担当している(Kagnoff et al., 1996)。このような粘膜リンパ器官は、気道からの肺組織と肺胞細胞に関連した気管支関連リンパ組織（Bronchus Associated Lymphoid Tissue；ＢＡＬＴ)、口天井と鼻が連結される部位の鼻腔粘膜関連リンパ組織(Nasal Associated Lymphoid Tissue；ＮＡＬＴ)及び腸管リンパ組織(Gut Associated Lymphoid Tissue；ＧＡＬＴ)に区分することができる(Kiyonoe et al., 1996)。一方、Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ（１９８４）は、ＢＡＬＴとＧＡＬＴを合わせてＭＡＬＴ(Mucosal Associated Lymphoid Tissue) と命名することを提案した。ＭＡＬＴは生体内で最も大きいリンパ組織であって、腸管の粘膜部位に存在して腸管免疫系内ＩｇＡ免疫反応を始めとして生体防御において非常に重要な役割を担当するものと知られている(Mestecky, 1987)。一方、ＭＡＬＴにおけるいろいろの免疫器官のうち、パイエル板(Peyer’s patch)は腸管内核心的なリンパ器官であるうえ、ｓＩｇＡ生産のためのインダクティブ(inductive)部位として知られており、ルーメンドーム(lumen dome)は抗原の吸収に重要な、特定化されたＭ細胞からなるflattered上皮で覆われている(de Haan et al., 1995; Frey et al., 1997; Roit et al., 1992)。このようなＭ細胞は、ルーメンから可溶性抗原や細菌、ウィルスなどを飲作用(pinocytosis)又は食菌作用によって捕獲してリンパ細胞に移動させることにより細胞の活性化に寄与する(Kerneis et al., 1997)。すなわち、腸管内にあるパイエル板のリンパ球は、Ｍ細胞によって摂取された抗原と反応して活性化された後、リンパ小節の胚中心(germinal center)で分化、成熟し、粘膜から速く移動して前駆体ｓＩｇＡ+Ｂ細胞とＣＤ４+Ｔｈ細胞を活性化させて腸間膜リンパ節(Mesenteric Lymph Node；ＭＬＮ)へ移動して血流に到達するために胸管(thoracic duct；ＴＤ)内に取り入って体内を循環する(Kerneis et al., 1997)。これら移動する細胞はｉｇＡ効果器(effector)部位に入ってｓＩｇＡの輸送が起こる。結局、パイエル板(Peyer’s patch)を含んだ腸管免疫系は腸管の免疫学的防御システムに寄与するうえ、全身性(systemic)炎症を調節してアレルギー反応及び自己免疫疾患などを効果的に抑制することができる。
【００１２】
粘膜に棲息している微生物に対するワクチンにおいて大部分の蛋白質は、腸管関連リンパ組織によって分解或いは吸収されない(de Haan et al., 2000; Kerneis et al., 1997; Kunin, 1994)。ところが、粘膜免疫を強く誘発させうる補助物質として知られているコレラから生成されるコレラトキシン(cholera toxin；ＣＴＸ)及び大腸菌から生成される易熱性エンテロトキシン(heat-labile enterotoxin；ＬＴＸ)蛋白質はＧM1−ガングリオシド(ganglioside)の吸着とＧＡＬＴの屈性(tropism)によって強い粘液免疫反応を誘発させるものと報告された(de Haan et al., 1996; Freytag et al., 1999; Pizza et al., 2001)。しかし、２つの蛋白質の両方ともＡ１小単位体の毒性によって、自然状態では粘膜免疫補助剤として使用できず、現在、変種、或いはＡ小単位体の毒素が除去されたＣＴＸＢ、ＬＴＸＢ又はＡｌ小さ単位体が除去されたＣＴＸＡ２Ｂ、ＬＴＸＡ２Ｂなどが免疫補助剤として使用されている(Agren et al., 1999; Douce et al., 1999; Haley et al., 1985; Hooton et al., 1996)。ワクチンの開発と関連して粘膜免疫補助剤として用いられるＣＴＸＡ２Ｂに対して、Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ等（１９８９）は、ＣＴＸＡ１部分に蛋白質抗原としての連鎖球菌(Streptococcal)アドヘシンで代替した後、ＣＴＸＢに化学的に連結させたワクチンを作り、Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ等（１９９５）とＲｕｓｓｅｌｌ等（１９９１）は、ＣＴＸＡ１部分に蛋白質抗原のStreptococcal mutant adhesin I/IIのsaliva-binding region（ＳＢＲ）で代替した後、ＣＴＸＢに遺伝子組換え
技術で連結させた融合遺伝子組換えワクチンがＧM1−ガングリオシドを経由して分泌性ＩｇＡ抗体(secretory IgA antibody;ｓＩｇＡ Ａｂ)を分泌させる粘液免疫を効果的に誘発させることにより、粘膜に病原性細菌が付着したり集落を形成したりすることを効果的に防ぐことができると報告した(de Haan et al., 1995; Horokopakis et al., 1998; Lebens et al., 1994; Saito et al., 2001; Tochikubo et al., 1998; Verweijet al., 1998)。Ｈａｒｏｋｏｐａｋｉｓ等（１９９７）は、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ワクチンの開発においてＣＴＸＡ１部分にsterptococcal protein adhesin I/IIのsa
liva-binding region（ＳＢＲ）で代替し、その後遺伝子組換えでＣＴＸＡ２Ｂに結合させた後、マウス実験を行った結果、血清におけるＩｇＧとＩｇＡの抗体が高く誘導されることを示した。Ｈａｌｌなど（２００１）は、腸炎(enterotoxigenic Escherichia coli；ＥＴＥＣ)ワクチンを製造するために、ＣＴＸＢにＥＴＥＣ−ＣＴＸＢを連結した融合ワクチンを製造して臨床実験を行った結果、ＩｇＡの場合、子供は７０〜９６％が、成人は３１〜６９％が増加することを示したうえ、ＩｇＧの場合にも、子供は４４〜７５％が、成人は２５〜８１％が高く現れることを示した。また、Ｋｉｍ等（２００１）は、ヘリコバクター・ピロリ菌(Helicobacter pylori)のｈｐａアドヘシンをＣＴＸＡ２Ｂに遺伝学的に連結させた融合蛋白質ワクチンを製造して動物実験を行った結果、血清でＩｇＡ抗体が高く現れたうえ、胃粘膜におけるｓＩｇＡ抗体も高く誘導されたことを示し、予防ワクチンとしての効果を立証した。また、Ｌｅｅ等（２００３）は、百日咳毒素(Pertussis Toxin)のＳ１断片をＣＴＸＡ２Ｂに遺伝学的に連結した融合ワクチンを作ってマウス実験を行った結果、予防効果で相当効力があるものと報告した。
【００１３】
また、ワクチンの開発と関連して免疫補助剤として用いられるＬＴＸＡ２Ｂに対して、Ｌｏｒｅｇｉａｎ等（１９９９）は、単純ヘルペスウイルス(herpes simplex virus(ＨＳＶ−１))のＤＮＡ重合酵素から得た２７−ｍｅｒペプチド(antiviral peptide)をＬＴＸＢ小単位体に遺伝子組換え技術で連結した癒合蛋白質（ＬＴＸＢ−Ｐｏｌ）を製造した。一方、ウィルスのＤＮＡ合成は核内で起こるが、このような合成はウィルスによって暗号化されたＵＬ４２というアクセサリファクタ(accessory factor)の相互作用によって起こる。製造された融合蛋白質はＬＴＸＢとペプチド成分をもっており、ポリメラーゼ−ＵＬ４２複合体の破壊によってin vitroでウィルスのＤＮＡ重合酵素活性を抑制することを示した。これは蛋白質キャリア(carrier)としての役割をしたが、ＨＳＶワクチンに対する可能性を与えているようである。
【００１４】
このようなＣＴＸＡ２Ｂ及びＬＴＸＡ２Ｂを免疫補助剤として使用するときの利点は、１）粘膜上皮細胞の透過性をより増加させることができ(Lycke, 1997)、２）ＭＨＣ ｃｌａｓｓ IIの発現及びＩＬ−１の生成増加による抗原提示を誘導させ(Bormander et al
., 1991; Millar et al., 2001; Nashar et al., 1993)、３）Ｂ細胞を刺激してｓＩｇＡを生成させる粘膜免疫を誘導することができる点である(Haley et al., 1985; Langermann, 1996; Roit et al., 1992)。したがって、尿路感染症ワクチンの開発においてもこのような免疫補助剤の特性を用いることが必要であると考えられる(Hess et al., 2000)。
【００１５】
大腸菌による尿路感染の発病及び進行過程に多くの有害性因子が関与しているが、尿路感染を引き起こすための先行条件は、まず病原感染性大腸菌が尿路宿主細胞内で適正の集落を形成しなければならないことである(Kunin, 1994; Patton et al., 1991)。集落の形成は大腸菌の特定アドヘシンが粘膜表面で発現する特定の受容体、すなわちマンノース(mannose)に付着することにより行われるが、このような尿路感染性大腸菌の集落形成は感染部位及び組織に限定されると報告された(Abraham et al., 1985; Beachey et al., 1981; Beachey et al., 1988; Wizemann et al., 1999)。一方、大腸菌のアドヘシンは主にフィムブリエ(fimbriae)又はフィブリレ(fibrillae)から構成されており、大腸菌の特定アドヘシンが結合するための宿主細胞の特定受容体は主に糖脂質(glycolipid)又は糖蛋白質(glycoprotein)からなっている(Beachey et al., 1988; Thankavel et al., 1997)。
【００１６】
このような集落形成のための宿主細胞及び組織の付着は、尿路感染性大腸菌の特定アドヘシンによって錠と鍵の形で行われると報告された(Abraham et al., 1988; Beachy et al., 1988; Jones et al., 1993; Jones et al., 1995; Kunin, 1999)。一般に、バクテリアの上皮細胞への付着調節には大きくStreptocciのリポタイコ酸(lipoteichoic acid；ＬＴＡ)の調節と大腸菌の１型フィムブリエ(type 1 fimbriae)の調節によって行われる。StreptococciにおけるアドヘシンはＬＴＡであって、上皮細胞に連結されたフィブロネクチン(fibronectin)分子と共に脂肪部分を介して相互作用する。また、１型フィブリエート(type 1 fimbriate)大腸菌は、フィムブリエの端部に位置した大きさ２９ｋＤａの小単位体である。ＦｉｍＨアドヘシンが、宿主細胞の糖蛋白質受容体にあるＤ−マンノース残基に結合することにより、相互作用が起こると報告した(Beachey et al., 1988; Krogfelt et al., 1990)。このような尿路感染性大腸菌などで見られる特定のアドヘシンは、非常に保存的なものと知られている(Abraham et al., 1988; Kunin, 1994; Palaszynski et al., 1998)。
【００１７】
Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ等の研究（１９９７）は、ＦｉｍＨノックアウト(knockout)変種を用いて、尿路感染性大腸菌の表面蛋白質ＦｉｍＨが尿路感染性大腸菌の尿路内付着及び集落形成による感染において決定的な役割をし、これを抑制する場合、９０％以上の感染を防止することができることを確認するなど、細胞アドヘシンの重要な役割を究明したことがある(Jones-Carson et al., 1999; Minion et al., 1986; Palaszynski et al., 1998)。特に尿路感染性大腸菌などで見られる１型ｐｉｉの先端部位に存在するＦｉｍＨが膀胱上皮組織の糖脂質受容体の小単位体、すなわちマンノース部分に特異的に結合するが、このような結合は細菌性尿道感染と直接的な関連があると報告した(Langermann et al., 2001; Knudsen et al., 1998)。特に、ＦｉｍＣＨ複合体の利用時に細菌性尿路感染を防止することが可能な適切なワクチンとしての可能性を提案した。その理由はＦｉｍＣがペリプラスムシャペロン(periplasmic chaperon)の機能を持つが、全体のアドヘシンを安定化しかつ適切に絡ませるにおいて非常に重要な役割を担当するためであると報告された(Langermann et al., 2001)。
【００１８】
これまで尿路系感染大腸菌の病原性因子である抗原決定基を暗号化する遺伝子としては、宿主細胞の粘膜上皮細胞に存在するマンノースに結合する１型ｐｉｌｉのＦｉｍＨアドヘシン、Ｐ−フィムビリエ(fimbriae)のＰａｐＧアドヘシン(Hultgren et al., 1989)、易熱性トキシン（ＬＴＸ）、耐熱性トキシン（ＳＴＸ）、アエロバクチン(aerobactin)、溶血素、血清抵抗性及びＫＩ莢膜などが知られている(Abraham et al., 1988; Hutgren et al., 1993)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者は、尿路系感染大腸菌に対して免疫原性に優れるうえ、胃内の環境で安定であり、粘膜免疫反応を促進するワクチンを開発するために広範囲な研究を行った結果、免疫補助剤として作用するビブリオコレラ菌の無毒性トキシン遺伝子ＣＴＸＡ２Ｂ又は大腸菌の無毒性トキシン遺伝子ＬＴＸＡ２Ｂと、大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子とを融合して生産されたワクチンが、かかる問題点を解決し得ることを確認し、本発明の完成に至った。参考として、ビブリオコレラ菌の無毒性トキシン遺伝子（ＣＴＸＡ２Ｂ）とStreptococcus mutansのアドヘシン遺伝子(adhesin gene)とを結合させて製造された融合蛋白質を経口用ワクチンとして投与した結果、分泌性免疫蛋白質(sIgA)及び体液性免疫蛋白質(Serum IgG)の生成を促進されたという研究報告が発表された(Hajishengallis, et al., J. Immunol., 154, 4322(1995))。ところが、コレラの無毒性トキシンＣＴＸＡ２Ｂ又は大腸菌の無毒性トキシンＬＴＸＡ２Ｂと尿路系感染大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子とを結合させてワクチンを製造した技術は今までなかった。したがって、ビブリオコレラ菌のＣＴＸＡ２Ｂ又は大腸菌のＬＴＸＡ２Ｂと大腸菌のＦｉｍＨ遺伝子とを結合させて誘導蛋白質ワクチンを製造したのは本発明が最初である。
【００２０】
尿路感染又は膀胱炎の場合、世界的に７０〜８０％が腸内細菌(enterobacteria)によって感染し、この中の６０％以上が治療後に再発していると報告されている。これにより、大腸菌がいろいろの抗生剤に対するた耐性をもっており、抗生剤の限界性、すなわちｐＨに対する不安定性、治療費、副作用等の問題のため、大腸菌に対する予防及び治療が可能なワクチンの開発が急に要求される実状である。
【００２１】
このような状況で開発された本発明において尿路感染性大腸菌の抗原蛋白質のうちアドヘシンを用いる理由は、アドヘシンが、免疫反応を誘導させ且つ粘膜の免疫グロブリン(immunoglobulin)も誘発させることが可能な蛋白質として知られており、尿路感染性大腸菌が尿路粘膜の表面に集落を形成するようにする必須的な蛋白質であるためである。また、いろいろの抗原蛋白質とは異なり、毒性がなく、全ての尿路感染性大腸菌に存在する蛋白質であり、分子サイズ２９ｋＤａの尿路内でも他の抗原蛋白質に比べて安定している蛋白質として知られているからである。
【００２２】
一方、尿路感染症を誘発する初期段階の宿主細胞付着に決定的に関与する１型フィムブリエの小蛋白質であるＦｉｍＨアドヘシンは、全身免疫反応を誘発させることができるが、粘液性免疫反応が弱いため、アドヘシン単独では尿路感染性大腸菌に対するワクチンとしての可能性が足りないので、本発明では、粘液性免疫補助剤であって粘膜免疫性を２倍以上増加させることができると知られているビブリオコレラトキシンＣＴＸ及び大腸菌易熱性エンテロトキシンＬＴＸの毒性部位（Ａ１小単位体）を除去したＣＴＸＡ２Ｂ及びＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質を遺伝子組換え技術を用いて連結したＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２ＢとＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質をクローニングして大腸菌内で発現させ、分離及び精製して融合蛋白質に対する生化学的及び免疫原性に対する特性を調査した。
【００２３】
また、分離された融合蛋白質をマウスにそれぞれ経口投与して血清と膣粘液における抗体生成を比較して尿路感染性大腸菌に対するワクチンとしての可能性を検討し、免疫補助剤としてのＬＴＸＡ２ＢとＣＴＸＡ２Ｂ蛋白質の機能を調査した。
【００２４】
また、融合蛋白質に免疫されたマウスに尿路感染大腸菌を感染させ、尿路病原性大腸菌に対する予防効果と組織検査、ひいてはマウスに尿路感染性大腸菌を感染させた後、融合蛋白質をマウスに経口投与した後、治療ワクチンとしての効果があるかを検討し、組織学的検査によって確認した。
【００２５】
本発明の目的は、大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子と、ビブリオコレラのＣＴＸＡ２Ｂ遺伝子又は大腸菌のＬＴＸＡ２Ｂ遺伝子とを連結させて製造される組換えＤＮＡを提供することにある。
【００２６】
本発明の他の目的は、前記組換えＤＮＡを含有する発現プラスミドを提供することにある。
【００２７】
本発明のさらに他の目的は、前記発現プラスミドで形質転換された微生物を提供することにある。
【００２８】
本発明のさらに他の目的は、前記形質転換された微生物によって生産される尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
上記目的を達成するための本発明は、次のような特徴を有する。
【００３０】
（１）大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子とビブリオコレラのＣＴＸＡ２Ｂ遺伝子を連結させて製造される組換えＤＮＡである。
【００３１】
（２）大腸菌の抗原決定基をコードする遺伝子と大腸菌のＬＴＸＡ２Ｂ遺伝子を連結させて製造される組換えＤＮＡである。
【００３２】
（３）上記（１）又は（２）において、抗原決定基をコードする遺伝子がＦｉｍＨである。
【００３３】
（４）配列番号３（＝図２）に記載のＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の塩基配列を含有する組換えＤＮＡである。
【００３４】
（５）配列番号１と２（＝図２）に記載のＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の塩基配列を含有する組換えＤＮＡである。
【００３５】
（６）上記（１）又は（２）の組換えＤＮＡを含有する発現プラスミドである。
【００３６】
（７）上記（４）又は（５）の塩基配列を含有する発現プラスミドである。
【００３７】
（８）上記（７）において、発現プラスミドがｐＭＡＬ−ｐ２Ｅである。
【００３８】
（９）上記（７）の発現プラスミドを細胞株に導入して形質転換させることにより製造される形質転換微生物である。
【００３９】
（１０）上記（９）において、細胞株が大腸菌である。
【００４０】
（１１）上記（１０）において、発現プラスミドがｐＭＡＬ−ｐ２Ｅである。
【００４１】
（１２）上記（１０）において、形質転換微生物がＥ．ｃｏｌｉ ＰＳＣ ＫＣＣＭ−１０５５３又はＥ．ｃｏｌｉ ＰＳＬ ＫＣＣＭ−１０５５２である。
【００４２】
（１３）上記（１１）において、形質転換微生物がＥ．ｃｏｌｉ ＰＳＣ ＫＣＣＭ−１０５５３又はＥ．ｃｏｌｉ ＰＳＬ ＫＣＣＭ−１０５５２である。
【００４３】
（１４）上記（９）〜（１３）のいずれか一つの形質転換微生物によって生産される尿路感染大腸菌に対するワクチン蛋白質である。
【００４４】
（１５）配列番号４（＝図１）のアミノ酸配列を含有する尿路感染大腸菌に対する融合ワクチン蛋白質である。
【００４５】
（１６）配列番号５（＝図２）のアミノ酸配列を含有する尿路感染大腸菌に対する融合ワクチン蛋白質である。
【００４６】
本発明の発明者は、大腸菌のＦｉｍＨ遺伝子とビブリオコレラ菌のＣＴＸＡ２Ｂ遺伝子及び大腸菌のＬＴＸＡ２Ｂ遺伝子の融合ＤＮＡによって発現される融合蛋白質が大腸菌内で生産されるようにするため、まず、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）で大腸菌のＦｉｍＨ遺伝子とビブリオコレラ菌のＣＴＸＡ２Ｂ及び大腸菌のＬＴＸＡ２Ｂ遺伝子を得た。それぞれの断片遺伝子を制限酵素ＢａｍＨIとＨｉｎｄIIIで切断した後、さらにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで２つの遺伝子を結合させた。このように結合した遺伝子とｐＭＡＬ−ｐ２Ｅプラスミドを制限酵素ＢａｍＨIとＨｉｎｄIIIで切断した後、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼで２
つの遺伝子を結合させた。この融合したプラスミドをｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｃｔｘＡ２Ｂ及びｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｌｔｘＡ２Ｂと命名し、これを大腸菌ＴＢ１にＨａｎａｈａｎ，Ｄの方法で形質転換させた(DNA cloning Vol.1. A practical Approach, IRL press, 1985, 135)。ｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｃｔｘＡ２Ｂ及びｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｌｔｘＡ２Ｂを含有する大腸菌形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＳＣ及びＥ．ｃｏｌｉ ＰＳＬと命名し、２００４年１月６日韓国種菌協会（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５５３とＫＣＣＭ−１０５５２で寄託した。
【発明の効果】
【００４７】
本発明によれば、副作用が少なくて効果が卓越した経口用ワクチンを獲得することができるので、再発性尿路感染症を相当減少させることができるものと期待されることは勿論のこと、抗生剤の濫用による耐性菌の出現を防ぎ、尿路感染症における化学療法剤の依存度を相当減らすものと予想される。また、低コストで短時間内に事業化及び製品化が可能であり、容易に構成成分を変更することにより、様々なワクチン類への応用のための技術を習得することができるものと思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものに過ぎずない。本発明の範囲がこれらに局限されないのは、当業界で通常の知識を有する者には明らかなことである。
【００４９】
実施例１：尿路系感染大腸菌の染色体ＤＮＡの分離
尿路感染性大腸菌をＴＳＢ(tryptic soy broth)培地に接種し、３７℃で１２時間培養した後、染色体ＤＮＡ分離法を用いて大腸菌の染色体ＤＮＡを分離した。
【００５０】
実施例２：ｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ融合遺伝子の増幅及びクローニング
ｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ融合遺伝子の断片製造は、ｃｔｘａ２ｂ遺伝子の前部の１２塩基をｆｉｍＨ遺伝子の後部に付けたｆｉｍＨ′遺伝子（９２４ｂｐ）と、ｆｉｍＨの後部の１２塩基をｃｔｘａ２ｂ遺伝子の前部に付けたｃｔｘａ２ｂ′遺伝子（５７８ｂｐ）を５′末端にはＢａｍＨI、３′の末端にはＨｉｎｄIIIの制限酵素認識部位を持つようにデ
ザインしたオリゴヌクレオチドプライマー(oligonucleotide primer)を用いて重合酵素連鎖反応方法で製造した融合遺伝子を増幅させた。得られた重合酵素連鎖反応の増幅産物を１％のアガロースゲルで電気永動し、ＥｔＢｒで染色した後、紫外線光でＤＮＡバンドを観察した結果、ｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂの計算されたサイズに相当する１,４７８塩基対の位置でハッキリとしたＤＮＡバンドを確認した（図３）。これら増幅されたｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ融合遺伝子の断片をＤｓａI、ＰｓｔI及びＳＳｐI制限酵素によって切断
し、融合遺伝子の大きさが正確であるかを確認した結果、切断した部位で正確なバンド位置を確認することができた。確認された融合遺伝子を、ＢａｍＨIとＨｉｎｄIII制限酵素
によって切断された発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２Ｅにクローニングした。その結果、ｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂの融合遺伝子のクローニング産物を得ることができた（図４Ａ）。この産物は、ＢａｍＨIとＨｉｎｄIII制限酵素によって切断されてベクターと挿入
ＤＮＡ（ｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ遺伝子の断片）に分けられ、ｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ遺伝子の大きさに相当する１,４７８塩基対の位置と、ベクターの大きさに相当する６,６９５塩基対の位置でハッキリとしたＤＮＡバンドを確認することができた（図４Ｂ）。また、前記オリゴヌクレチドプライマーを用いて、重合酵素連鎖反応でクローニングされたｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ融合遺伝子の断片部分の大きさを１％のアガロースゲルで電気永動し、ＥｔＢｒで染色した後、紫外線光でＤＮＡバンドを確認した結果、１,４７８塩基対の位置でハッキリとしたＤＮＡバンドを再確認した（図４Ｃ）。ＤｓａI、ＰｓｔI及
びＳＳｐIのいろいろの制限酵素によってクローニングされた全体ｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｃ
ｔｘａ２ｂベクターを切断し、大きさが正確であるかを確認した結果、切断された部位で正確なバンド位置を確認することができた。正確な核酸配列は核酸塩基配列分析キット(Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit;ＵＳＢTM)を用いて確認した。その結果、ｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ遺伝子のアミノ酸配列を知ることができた。核酸の類似性検査結果、ｆｉｍＨ及びｃｔｘａ２ｂ遺伝子と１００％一致することを確認した（Blatter et al., 1997; Domenighimi et al., 1995; Mekalanos et al., 1983）。一方、ビブリオコレラのＤＮＡから得たｃｔｘａ２ｂ遺伝子は、ｃｔｘａのストップコドン(stop codon)とｃｔｘｂのスタートコドン(start codon)が重畳されて４つのヌクレオチドＡＴＧＡとして存在することをＤＮＡ塩基配列によって確認することができた（図２）。
【００５１】
実施例３：ｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂ融合遺伝子の増幅及びクローニング
ｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂ融合遺伝子の断片は、ｌｔｘａ２ｂの前部の１２塩基をｆｉｍＨ遺伝子の後部に付けたｆｉｍＨ′遺伝子（９２４ｂｐ）と、ｆｉｍＨの後部の１２塩基をｌｔｘａ２ｂ遺伝子の前部に付けたｌｔｘａ２ｂ′遺伝子（６１１ｂｐ）を５′末端にはＢａｍＨI、３′の末端にはＨｉｎｄIII制限酵素認識部位を持つようにデザインしたオ
リゴヌクレオチドプライマー(oligonucleotide primer)を用いて重合酵素連鎖反応方法で製造した融合遺伝子を増幅させた。得られた重合酵素連鎖反応の増幅産物を１％のアガロースゲルで電気永動し、ＥｔＢｒで染色した後、紫外線光でＤＮＡバンドを観察した結果、ｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂの計算されたサイズに相当する１,５１１塩基対の位置でハッキリとしたＤＮＡバンドを確認した（図５）。確認された融合遺伝子をＢａｍＨIとＨｉ
ｎｄIII制限酵素によって切断された発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２Ｅにクローニングした。
その結果、ｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂの融合遺伝子クローニング産物を得ることができた（図６Ａ）。この産物は、ＢａｍＨIとＨｉｎｄIII制限酵素によって切断されたベ
クターと挿入ＤＮＡ（ｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂ遺伝子の断片）に分けられ、ｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂ遺伝子の大きさに相当する１,５１１塩基対の位置と、ベクターの大きさに相当する６,６９５塩基対の位置でハッキリとしたＤＮＡバンドを確認することができた（図６Ｂ）。また、前記製造したオリゴヌクレチドプライマーを用いて重合酵素連鎖反応方法でクローニングされたｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂ融合遺伝子の断片部分の大きさを１％のアガロースゲルで電気永動し、ＥｔＢｒで染色した後、紫外線光でＤＮＡバンドを確認した結果、１,５１１塩基対の位置でハッキリとしたＤＮＡバンドを再確認した（図６Ｃ）。正確な核酸配列は核酸塩基配列分析キット(Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit;ＵＳＢTM)を用いて確認した結果、ｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂ遺伝子のアミノ酸配列を知ることができた。核酸の類似性検査結果、ｆｉｍＨ及びｌｔｘａ２ｂ遺伝子と１００％一致することを確認した（Blatter et al., 1997; Domenighimi et al., 1995; Dallas et al., 1980; Domenighini et al., 1995; Spicer et al., 1981）。一方、大腸菌ＤＮＡから得たｌｔｘａ２ｂ遺伝子はｌｔｘａのストップコドンとｌｔｘｂのスタートコドンが重畳されて４つのヌクレオチドＡＴＧＡとして存在することをＤＮＡ塩基配列によって確認することができた（図１）。
【００５２】
実施例４：大腸菌の形質転換
大腸菌ＤＨ５α菌株を用いて、被感染能力を持つ菌(competent cell)を次の方法で製造して使用した。ＬＢ液体培地７ｍｌにＤＨ５αを接種した後、１２〜１４時間３７℃の振盪培養器で培養した。その後、その中の１ｍｌを５０ｍｌのＬＢ液体培地に接種した後、０Ｄ600で０.５〜０.６となるまで振盪培養した後、５分間氷に放置した。培養液３０ｍｌを滅菌管に移した後、４℃、１２,０００×ｇで５分間遠心分離した。上澄液を除去した後、氷に放置された形質転換緩衝溶液（５０ｍＭ ＣａＣｌ2）１５ｍｌをタッピング(tapping)して氷に放置する。４℃、１２,０００×ｇで５分間遠心分離した後、上澄液を捨て、形質転換緩衝液（５０ｍＭ ＣａＣｌ2）３ｍｌを加えた後、４℃で３時間放置する。製造された２００μｌの被感染能力を持つ菌にクローニングされたプラスミドを２μｌ加えた後、３０分間氷で攪拌してから放置した。その後、９０秒間４２℃で熱衝撃を与えた後、２分間氷に放置した。ここで、ＬＢ液体培地を１ｍｌ加えた後、３７℃の振盪培養器で２００×ｇの速度にて１時間振盪培養させ、その後７,０００×ｇで遠心分離して細胞沈澱物を得た後上澄液１ｍｌを除去し、これを混濁した後、抗生剤含有ＬＢ固体培地に１０μｌと１００μｌずつそれぞれ塗抹して一晩中３７℃で培養した。蛋白質発現のために、大腸菌Ｋ１２ ＴＢ１菌株を前述の方法と同様に形質変換した。抗生剤含有ＬＢ固体培地に１０μｌと１００μｌずつそれぞれ塗抹した後、１８時間以上培養した。ベクター内のクローニング部位にβ−ｇａｌ遺伝子が挿入されている場合には、Ｘ−ｇａｌ基質を付加して抗生剤含有ＬＢ固体培地上で無色の尿路感染症大腸菌を探し出して培養して分離した。ｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｃｔｘＡ２Ｂ及びｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｌｔｘＡ２Ｂを含有する大腸菌形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＳＣ及びＥ．ｃｏｌｉ ＰＳＬと命名し、２００４年１月６日に韓国種菌協会（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５５３とＫＣＣＭ−１０５５２で寄託した。
【００５３】
実施例５：重合酵素連鎖反応
ｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂを増幅するための重合酵素連鎖反応は、ｆｉｍＨ′、ｃｔｘａ２ｂ′５０ｎｇをテンプレートとしてプライマーを、２０ｐｍｏｌｅ、０.２５ｍＭ ｄＮＴＰｓとＴａｋａｒａ社のｐｆｕ重合酵素を用いて供給会社の重合酵素連鎖反応方法(High fidelity PCR kit: Boehringer Mannheim, U.S.A)によって９４℃で１２０秒間変性させ、９４℃で１０秒間さらに変性させ、５５℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で６０秒間伸張することを１０回繰り返し行った後、さらに９４℃で１５秒間変成させ、５８℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で１８０秒間伸張することを２０回繰り返し行い、最後に７２℃で４２０秒間伸張した後、４℃で貯蔵した。
【００５４】
ｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂを増幅するためのＰＣＲ反応は、ｆｉｍＨ′とｌｔｘａ２ｂ′５０ｎｇをテンプレートとして、前述したｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂの増幅と同一の方法で行った。但し、差異点は５４℃で６０秒間アニーリングし、さらに５８℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で１６０秒間伸張するときに若干の差があることである。
【００５５】
実施例６：ＧＭ１−ガングリオシド(ganglioside)ＥＬＩＳＡ分析
コレラトキシン（ＣＴＸ）及び大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴＸ）のＢ小単位体は、粘膜層に存在するモノシアロガングリオシド(monosialogangliside)ＧM1と特異的に結合する性質を持っており、ＥＬＩＳＡを用いてＣＴＸ及びＬＴＸ、特にＣＴＸＢ及びＬＴＸＢを定量するときに使用することができる。ＧM1−ガングリオシドＥＬＩＳＡは、まず、ＧM1−ガングリオシドをＰＢＳで１μｇ／ｍｌとなるように希釈した後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で一晩中培養する。プレートの各ウェルをＰＢＳで３回洗い出し、水気を完全除去した後、ブロッキング溶液（ＰＢＳに１％のＢＳＡ）を２００μｌずつ入れた後、３７℃で１時間反応させた。プレートのウェルをＰＢＳで３回洗い出し、サンプルを希釈した溶液をプレートに１００μｌずつ入れて３７℃で２時間反応させた。ウェルをＰＢＳで洗い出し、１次抗体(anti-CTX goat antibody, Biogenesis Co., 2060-0004)を２,０００倍希釈し、各ウェルに１００μｌずつ入れて３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳでウェルを洗い出し、２次抗体(anti-goat IgG alkaline phosphatase conjugate antibody, Sigma Co., A4187)を５,０００培希釈し、各ウェルに１００μｌずつ入れて３７℃で２時間反応させる。ＰＢＳＴでウェルを洗い出し、para-nitrophenylphosphate(ｐＮＰＰ)溶液を各ウェルに１００μｌずつ入れて３７℃で３０分間反応させる。反応後、ＥＬＩＳＡリーダ(reader)を用いて波長４０５ｎｍでサンプルの吸収光度を測定した。
【００５６】
実施例７：ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の発現
ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂの蛋白質発現を確認するために、まず、ｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂを含有している大腸菌ＴＢ１を、０.２％のグルコースが含有されたＬＢ培地に培養した後、ＯＤ600で培養液の吸光度が０.５〜０.６に到達したとき、ＩＰＴＧの最終濃度が０.０１、０.０５、０.１、０.３、０.５及び１.０ｍＭとなるように入れ、クローニングされた遺伝子をそれぞれ誘導発現させた。ＩＰＴＧの誘導後、０、２、４、６、８、１０、１２、２４及び４８時間経過の菌体をそれぞれ採取して７％と１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気永動した後、クーマシーブルー(commassie blue)試薬で染色した結果、ＭＢＰ（４２.２ｋＤａ）と結合したＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２（３６ｋＤａ）蛋白質の大きさとして推定される約７８ｋＤａと、ＣＴＸＢ蛋白質として推定される大きさ１４ｋＤａの蛋白質バンドがＩＰＴＧ誘導後に全ての培養時間で確認された（図７Ａ、図７Ｃ）。これは遺伝的に連結させたｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ融合遺伝子を発現ベクターにクローニングして発現させた時、Ｍｅｋａｌａｎｏｓ等（１９８３）によって言及されたｃｔｘオペロンでのように、２つの蛋白質が同一のメッセージによって翻訳されることを確認することができた。また、同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで免疫ブロット分析を行った結果、ＭＢＰとＣＴＸＢ抗体を用いて、ＭＢＰ／ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２及びＣＴＸＢに特異的な蛋白質バンドを確認した（図７Ｂ、図７Ｄ）。また、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ蛋白質の存在位置をＧM1−ガングリオシドＥＬＩＳＡ法で確認し、細胞外のペリプラスム空間で主に溶解性の形で発現されることを確認した。
【００５７】
また、ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂの蛋白質発現を確認するために、前述の方法と同一行って７％と１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気永動した後、クーマシーブルー試薬で染色した結果、ＭＢＰ(maltose binding protein, ４２.２ｋＤａ)と結合したＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２（３７ｋＤａ）蛋白質の大きさとして推定される約７９ｋＤａとＬＴＸＢ蛋白質として推定される大きさ１４ｋＤａの蛋白質バンドがＩＰＴＧ誘導後に全ての培養時間で確認された（図８Ａ、図８Ｃ）。これは遺伝的に連結させたｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂ遺伝子を発現ベクターにクローニングして発現させたとき、ｃｔｘオペロンでのように２つの蛋白質が同一のメッセージによって翻訳されることを確認することができた。また、同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで免疫ブロット分析を行った結果、ＭＢＰとＬＴＸＢ抗体を用いて、ＭＢＰとＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２及びＬＴＸＢに特異的な蛋白質バンドを確認した（図８Ｂ、図８Ｄ）。また、ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質の存在位置をＧM1−ガングリオシドＥＬＩＳＡ法で確認し、細胞外のペリプラスム空間で主に溶解性の形で発現されることを確認した。
【００５８】
実施例８：融合蛋白質の精製
ｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｃｔｘａ２ｂ及びｐＭＡＬｆｉｍＨ／ｌｔｘａ２ｂプラスミドを含む大腸菌ＴＢ１によって生産されるＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質を分離及び精製するために蛋白質生成最適条件で培養して２Ｌの培養液からそれぞれ２３ｍｇと３４ｍｇの総蛋白質を得た。ペリプラスム空間で分離するために、Ｎｅｕ等（１９６５）によって言及された浸透圧衝撃方法とアミロース樹脂で充填された吸着クロマトグラフィ（２×１０ｃｍ）を用いて供給会社の指示方法(pMALTM Protein Fusion and Purification System, New England Biolabs, INC, USA)によって精製して得られた各蛋白質分画をＵＶ２８０ｎｍで確認した結果、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂの場合には２３〜２８番の分画で、ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂの場合には３６〜４４番の分画でそれぞれ蛋白質精製が行われた。ＧM1−ガングリオシドＥＬＩＳＡ法を用いて分画を確認した結果、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂは１８〜２２番の分画で、ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂは２９〜３４番の分画でそれぞれＧM1−ガングリオシド活性を示した。また、精製した蛋白質の純度検定と純粋蛋白質の確認を行うために、各蛋白質のＵＶ測定とＧM1−ガングリオシド活性を示した分画をamicon centriprep concentratorによって濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７Ａ、図７Ｃ）とＭＢＰ、ＣＴＸ及びＬＴＸ抗体を用いてそれぞれの蛋白質に対してウェスタンブロット(western blot)を行った。その結果、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質は、大きさ７８ｋＤａ（ＭＢＰ／ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２）と１４ｋＤａ（ＣＴＸＢモノマー）の精製された蛋白質バンドを同時に確認することができた（図９Ｂ、図９Ｄ）。ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質も大きさ８１ｋＤａ（ＭＢＰ／ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２）と１４ｋＤａ（ＬＴＸＢモノマー）の蛋白質精製バンドを同時にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ｃ）とウェスタンブロット（図１０Ａ、図１０Ｂ）で確認することができた。一方、各精製された蛋白質をブラッドフォード(Bardford)法で定量した結果、２Ｌの培養液から最終分離したＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂの融合蛋白質の量はそれぞれ０.６ｍｇと０.８ｍｇであった。
【００５９】
実施例９：ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の免疫原性実験
実験群は総６個の群に設定し、各群は６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス６匹から構成して１０日間隔で３回免疫化させ、毎回１００μｇと２５μｇのＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質、２００μｇのＦｉｍＨ蛋白質、２０μｇのＣＴＸＡ２Ｂ、２０μｇのＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質をゾンデを用いて経口投与した。対照群はＰＢＳ(phosphate buffered saline, ｐＨ７.２)を経口投与した。この際、使用する動物を経口投与前２時間と投与後１時間絶食させた。３回の免疫化後、７日に剖検して血液サンプルを採取した。採取した血清におけるＩｇＧ抗体の量をＥＬＩＳＡ法で定量した。
【００６０】
血清におけるＩｇＧ抗体生成量を対照群、ＦｉｍＨ、ＣＴＸＡ２Ｂ及びＬＴＸＡ２Ｂ単一投与群と比較した結果、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質投与群における抗体生成量が非常に高い有意性を示した（図１１）。
【００６１】
純粋精製されたＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の粘液でｓＩｇＡ抗体生成を調査するために、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹を１群としてＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２ＢとＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質をそれぞれ１００μｇ投与した群、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２ＢとＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質をそれぞれ２５μｇ東予した群、ＦｉｍＨ蛋白質を１００μｇ投与した群、ＣＴＸＡ２ＢとＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質をそれぞれ２μｇ投与した群、及び対照群としてＰＢＳを投与した群の８群に分け、１０日間隔で３回経口投与して免疫化させた。粘液サンプルはマウスの膣洗浄によって採取した。膣洗浄の前に、３日間ペントバルビタール(pentobarbital)１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内に注射して麻酔させ、マウスの膣を介してマイクロピペットを用いてマウス当たりＰＢＳ５０μｌの各サンプルを別途に集めて遠心分離して上澄液のみを集めた。採取したサンプルでｓＩｇＡ抗体の生成量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。最終免疫化１０日後、粘膜でｓＩｇＡ抗体の生成量を対照群、ＦｉｍＨ、ＣＴＸＡ２Ｂ及びＬＴＸＡ２Ｂ投与群と比較したところ、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の投与群が単一投与群より抗体の生成量が非常に有意的であった（図１２）。
【００６２】
実施例１０：ＥＬＩＳＡ法による抗体生成量の測定
９６−ｗｅｌｌ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ(MaxiSorp U16j Nunc, Roskilde, Denmark)に抗原を３０μｇ／ｍｌに希釈させた後、各ウェルに１００μｇずつ処理して３７℃の培養器で一日間反応させた。プレートを０.０５％のＴｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳＴ緩衝液で洗い出し、ＰＢＳに１％のＢＳＡ含有のブロッキング溶液を各ウェル毎に２００μｌずつ加えて３７℃の培養器で２時間反応させた。さらに各ウェルをＰＢＳＴ緩衝液で３回洗い出し、マウス膣の洗浄によって得られたサンプルと血清を１０倍希釈した後、サンプル溶液を１００μｌずつ処理し、常温で１〜２時間反応させた後、各ウェルをＰＢＳＴ緩衝液で３回洗い出し、１％のＢＳＡが含有された緩衝液にalkaline phosphatase conjugate anti-mouse ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭを１,０００倍に希釈して１００μｌずつ処理し、常温で１〜２時間反応させた後、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗い出し、その後ｐ−ニトロフェニルホスファート(nitrophenylphosphate)（ｐＮＰＰ）を１００μｌずつ加えて常温で３０分間反応させる(Elson et al., 1984)。Automatic Microplate Reader(Molecular device, U.S.A)によって４０５ｎｍで結果を判読した。
【００６３】
実施例１１：ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質の予防ワクチン効果
ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質の尿路感染性大腸菌に対する予防ワクチン効果を調査するために、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ（１００μｇ）、ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ（１００μｇ）、ＦｉｍＨ（２００μｇ）、ＣＴＸＡ２Ｂ（２０μｇ）、及びＬＴＸＡ２Ｂ（２０μｇ）蛋白質の濃度でそれぞれ免疫化が行われたマウスに対する尿路感染性大腸菌の感染有無を調べた。実験群は総６個の群に設定し、各群は６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを構成し、それぞれのサンプルを１０日間隔で３回ゾンデを用いて経口投与した。対照群はＰＢＳで経口投与した。３回目の免疫化後、１０日に尿路感染性大腸菌Ｊ９６菌株（５×１０7ＣＦＵ／ｍｌ）を、滅菌した２４−gauge Teflon catheter(外径０.７ｍｍ；長さ１９ｍｍ；Becton Dickinson Infusion Therapy System, Inc., Sandy, Utah)を用いてマウスの尿道を介して膀胱に５０μｌずつ注入した(Asahara et al., 2001; Hopkins et al., 1995; Jones-carson et al., 1999)。感染後３日目に各群のマウスを剖検して膀胱を切り取り、ＰＢＳ１ｍｌに浸漬して粉砕機(ULTRA-TURRAX T25)で粉砕した。各試料を１０倍ずつ希釈させた後、尿路感染性大腸菌Ｊ９６選択固体培地上に１００μｌを接種し、３７℃の培養器で一日間培養した。尿路感染性大腸菌Ｊ９６が培養された固体培地上の集落数を計算して対照群及び単一投与群と比較することにより、尿路感染性大腸菌に対する感染予防効能を測定した。
【００６４】
その結果、対照群では２.３×１０5ＣＦＵ／ｍｌで感染し、ＦｉｍＨ投与群では８.８×１０4ＣＦＵ／ｍｌで感染した。ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ投与群では８.２×１０3ＣＦＵ／ｍｌ、ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ投与群では９.４×１０3ＣＦＵ／ｍｌで感染した。この実験結果、対照群とＦｉｍＨ投与群に比べて、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質をそれぞれ１００μｇ投与した群で予防効果が非常に高かった（図１３）。
【００６５】
実施例１２：組織病理学的検査
ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の尿路感染性大腸菌に対する予防ワクチンとしての効果をさらに調べるために、融合蛋白質で免疫化され且つ尿路感染性大腸菌で感染したマウスから膀胱を切り取り、Ｈ＆Ｅ染色試薬を用いて膀胱組織における炎症誘発時に最も先に浸透する免疫細胞中の一つである好中球(neutrophil)数の増加を組織学的に検査した。対照群の場合、粘膜表面層の周辺に多数の好中球が集まっていることが分かった（図１４−Ａ）。ＣＴＸＡＢ及びＬＴＸＡ２Ｂ投与群も対照群と同様の多数の好中球が集まっていることが分かった（図１４−Ｃ、図１４−Ｅ）。これに対し、ＦｉｍＨ単一投与群の場合、対照群に比べて少ない数の好中球が集まっていることが分った（図１４−Ｂ）。一方、融合蛋白質投与群において好中球が粘膜層の周辺に殆どないことが分かった（図１４−Ｄ、図１４−Ｆ）。これは融合蛋白質によってＩｇＧ及びｓＩｇＡ抗体の生成が誘導されてバクテリアを中和させたか或いは粘膜層にバクテリアが付着せず炎症反応が膀胱内で起こらなかったことを示す。
【００６６】
また、膀胱粘膜層の周辺へのバクテリア付着程度をグラム染色を用いて調査した。対照群の場合、粘膜層の周辺層に素って多数の尿路感染性大腸菌が密集していることが分かった（図１５−Ａ）。ＣＴＸＡ２Ｂ及びＬＴＸＡ２Ｂ投与群の場合にも、対照群と同様の多数の大腸菌が集まっていることが分かった（図１５−Ｃ、図１５−Ｅ）。ＦｉｍＨ単独投与群の場合、対照群に比べて少ないが、大腸菌が粘膜層のラインに沿って集まっていることが分った（図１５−Ｂ）。反面、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質を投与した群では粘膜層の周辺にバクテリア数が相当減少していることが分った（図１５−Ｄ、１５−Ｆ）。
【００６７】
実施例１３：Myeloperoxidase（ＭＰＯ）Assay
ＭＰＯ分析は、炎症誘発時に最も早く浸透する免疫細胞中の一つである好中球の増加を測定することが可能な指標実験である。予防ワクチンの効果に対するＭＰＯを測定するために、実験群は総６つの群に設定し、各群は６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスから構成し、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ（１００μｇ／マウス）、ＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ（１００μｇ）、ＦｉｍＨ（２００μｇ）、ＣＴＸＡ２Ｂ（２０μｇ）及びＬＴＸＡ２Ｂ（２０μｇ）蛋白質を１０日間隔でゾンデを用いて３回経口投与した。対照群はＰＢＳで経口投与した。尿路感染性大腸菌Ｊ９６（５×１０7ＣＦＵ／ｍｌ）を、滅菌した２４−gauge Teflon catheter（外径０.７ｍｍ、長さ１９ｍｍ；Becton Dickinson Infusion Therapy System, Inc., Sandy, Utah）を用いて各群のマウス尿道を介して膀胱に５０μｌずつ注入した。感染３日目にそれぞれのマウスの膀胱を切り取ってＰＢＳ１ｍｌに浸漬し、粉砕機(ULTRA-TURRAX T25)で粉砕した。遠心分離後、沈澱物に０.５％のＨＴＡＢ(Hexaadecyltrimethyl-ammonium Bromide in PBS)５００μｌを加えた後、１０秒間氷状態で超音波処理を行った。細胞抽出液を１０,０００×ｇで遠心分離した後、上澄液を取った(Haraoka et al., 1999)。上澄液を１０μｌずつ９６ウェルプレートに分注した後、各ウェルにＴＭＢ(0.1mg/ml tetramethylbenzidine dihydrochloride, 0.05M phosphate citrate buffer, pH 5.0)溶液を１：１の割合で混合した後、１００μｌずつ分注した。発色が所定の程度に到達すると、６５０ｎｍでマイクロプレートリーダー(Microplate Reader)を用いて吸光度を測定した。
【００６８】
測定の結果、対照群に比べてＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質投与群のいずれも好中球の数が有意的に減少することが分かった（図１６）。これは予防ワクチン効果としての可能性を示す。尿路病原性大腸菌で尿路を感染させる場合、膀胱粘膜部位の血管内に存在する多数の好中球及び白血球が感染部位に集まり、これらの細胞間の免疫反応が増加することにより、炎症反応が大きく拡大し、組織損傷に至ることになる。この際、好中球の数が減少する場合、感染に対する予防効果があると見られる。
【００６９】
実施例１４：ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質の治療ワクチン効果
ＦｉｍＨ及びＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ蛋白質の尿路感染性大腸菌に対する治療ワクチンとしての効果を測定するために、実験群は総６個の群に設定し、各群は６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスから構成し、尿路感染性大腸菌Ｊ９６菌株（５×１０7ＣＦＵ／ｍｌ）、滅菌した２４−gauge Teflon catheter(外径０.７ｍｍ；長さ１９ｍｍ；Becton Dickinson Infusion Therapy System, Inc., Sandy, Utah)を用いて各群のマウス尿道を介して膀胱に５０μｌずつ注入した（Asahara et al., 2001; Hopkins et al., 1995; Jones-carson et al., 1999）。感染後１日にＦｉｍＨ（２００μｇ）、ＣＴＸＡ２Ｂ（２０μｇ）、ＬＴＸＡ２Ｂ（２０μｇ）、ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ（１００μｇ）及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ（１００μｇ）をゾンデを用いて経口投与した後、８日、５日間隔で総３回経口投与した。対照群はＰＢＳで経口投与した。最後の投与後３日に、各マウスの膀胱を切り取ってＰＢＳ１ｍｌに浸漬して粉砕した（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ Ｔ２５）。各試料をＰＢＳで１０倍ずつ希釈させた後、尿路感染性大腸菌Ｊ９６選択固体培地上に１００μｌずつ塗抹して３７℃の培養器で一晩中培養した。尿路感染性大腸菌Ｊ９６選択固体培地上の集落数を計算して対照群及び単一投与群と比較して尿路病原性大腸菌に対する治療効果を調査した。
【００７０】
その結果、対照群では８.８×１０5ＣＦＵ／ｍｌで感染し、ＦｉｍＨ単一投与群では３.４×１０5ＣＦＵ／ｍｌで感染した。ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の投与群ではそれぞれ２.４×１０4ＣＦＵ／ｍｌと１.３×１０4ＣＦＵ／ｍｌで感染したことを確認した。対照群及びＦｉｍＨ投与群に比べてＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２ＢとＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質をそれぞれ１００μｇ投与した群において、尿路感染性大腸菌による尿道感染が相当緩和したことからみて、治療効果も高いものと思われる（図１７）。
【００７１】
実施例１５：治療ワクチン効果に対するＭＰ０測定
前述した予防効果実験方法と同一に行った結果、対照群に比べてＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２ＢとＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質投与群のいずれも、好中球の数が有意的に減少することが分かった（図１８）。これは治療ワクチン効果としての可能性を示した。尿路病原性大腸菌で尿路を感染させる場合、膀胱粘膜部位の血管内に存在する多数の好中球及び白血球が感染部位に集まり、これらの細胞間の免疫反応が増加することにより、炎症反応が大きく拡大しし、組織損傷に至る。この際、好中球の数が減少する場合、感染に対する治療効果があると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】尿路系感染大腸菌に対する融合蛋白質のワクチンを生産するために、大腸菌易熱性エンテロトキシン(E. coli heat-labile enterotoxin；ＬＴＸ)の無毒性トキシン遺伝子ＬＴＸＡ２Ｂに生物工学的方法を用いて大腸菌のフィムブリエＨ(Fimbriae H;ＦｉｍＨ)を連結させた融合遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を確認したことを示す。
【図２】尿路系感染大腸菌に対する融合蛋白質のワクチンを生産するために、ビブリオコレラ菌の無毒性トキシン遺伝子ＣＴＸＡ２Ｂに生物工学的方法を用いて大腸菌のフィブリエＨ(Fimbriae H; ＦｉｍＨ)を連結させた融合遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を確認したことを示す。
【図３】尿路系感染大腸菌に対する融合蛋白質のワクチンを生産するために、ビブリオコレラ菌の無毒性トキシン遺伝子ＣＴＸＡ２Ｂに生物工学的方法を用いて大腸菌のフィブリエＨ(Fimbriae H;ＦｉｍＨ)を連結させた融合遺伝子の大きさを電気永動で確認したことを示す。
【図４】ＣＴＸＡ２Ｂ遺伝子とＦｉｍＨ遺伝子を融合した遺伝子を発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２Ｅに生物工学的方法を用いてクローニング（Ａ）させたものに対し、制限酵素処理（Ｂ）と重合酵素連鎖反応（Ｃ）を行い、融合遺伝子の大きさを電気永動によって確認したことを示す。
【図５】尿路系感染大腸菌に対する融合蛋白質のワクチンを生産するために、大腸菌易熱性エンテロトキシン(E. coli heat-labile enterotoxin；ＬＴＸ)の無毒性トキシン遺伝子ＬＴＸＡ２Ｂに生物工学的方法を用いて大腸菌のフィブリエＨ(Fimbriae H; ＦｉｍＨ)を連結させた融合遺伝子の大きさを電気永動で確認したことを示す。
【図６】ＬＴＸＡ２Ｂ遺伝子とＦｉｍＨ遺伝子を融合した遺伝子を発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２Ｅに生物工学的方法を用いてクローニング（Ａ）させたものに対し、制限酵素処理（Ｂ）と重合酵素連鎖反応（Ｃ）を行い、融合遺伝子の大きさを電気永動によって確認したことを示す。
【図７】尿路系感染大腸菌に対する融合蛋白質のワクチンを生産するために、大腸菌内でＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質を発現させたものに対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ，Ｃ）とウェスタンブロット（Ｂ，Ｄ）を行い、融合蛋白質の発現サイズを確認したことを示す。
【図８】尿路系感染大腸菌に対する融合蛋白質のワクチンを生産するために、大腸菌内でＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質を発現させたものに対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ，Ｃ）とウェスタンブロット（Ｂ，Ｄ）を行い、融合蛋白質の発現サイズを確認したことを示す。
【図９】尿路系感染大腸菌に対する融合蛋白質のワクチンを生産するために、大腸菌内でＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質を発現させたものを浸透圧衝撃法と吸着クロマトグラフィを用いてペリプラスム(periplasm)で精製したＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ，Ｃ）とウェスタンブロット（Ｂ，Ｄ）を行い、融合蛋白質の発現サイズを確認したことを示す。
【図１０】尿路系感染大腸菌に対する融合蛋白質のワクチンを生産するために、大腸菌内でＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質を発現させたものを浸透圧衝撃法と吸着クロマトグラフィを用いてペリプラスム(periplasm)で精製したＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｃ）とウェスタンブロット（Ａ，Ｂ）を行い、融合蛋白質の発現サイズを確認したことを示す。
【図１１】ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の免疫原性を試験するために、雌ＢＡＬＢ.／Ｃマウスに融合蛋白質を経口投与した後、血清でのＩｇＧ抗体生成能を融合蛋白質投与群と対照群の比較によって示す。
【図１２】ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質の免疫原性を試験するために、雌ＢＡＬＢ.／Ｃマウスに融合蛋白質を経口投与した後、膣粘液でのＩｇＧ抗体生成能を融合蛋白質投与群と対照群の比較によって示す。
【図１３】ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質のワクチンに対する予防効果を試験するために、雌ＢＡＬＢ.／Ｃマウスに融合蛋白質を経口投与して免疫化させた後、尿路感染性大腸菌をマウスの尿道を介して膀胱に注入し、その後尿路感染性大腸菌の集落数を融合蛋白質投与群と対照群との比較によって示す。
【図１４】ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質のワクチンに対する予防効果を試験するために、雌ＢＡＬＢ.／Ｃマウスに融合蛋白質を経口投与して免疫化させた後、尿路感染性大腸菌をマウスの尿道を介して膀胱に直接注入し、その後炎症誘発時に膀胱粘膜層の周辺に最も早く浸透する免疫細胞中の一つである好中球数の増加を組織病理学的検査のＨ＆Ｅ染色で確認したことを示す。
【図１５】ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質のワクチンに対する予防効果を試験するために、雌ＢＡＬＢ.／Ｃマウスに融合蛋白質を経口投与して免疫化させた後、尿路感染性大腸菌をマウスの尿道を介して膀胱に直接注入し、その後膀胱粘膜層の周辺に存在する尿路感染性大腸菌に対する数を組織病理学的検査のグラム染色で確認したことを示す。
【図１６】ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質のワクチンに対する予防効果を試験するために、雌ＢＡＬＢ.／Ｃマウスに融合蛋白質を経口投与して免疫化させた後、尿路感染性大腸菌をマウスの尿道を介して膀胱に直接注入し、その後炎症誘発時に最も早く浸透する免疫細胞中の一つである好中球数の増加を測定することが可能なＭＰ０分析によって好中球数の増加を融合蛋白質投与群と対照群との比較によって示す。
【図１７】ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質のワクチンに対する治療効果を試験するために、尿路感染性大腸菌を雌ＢＡＬＢ.／Ｃマウスの尿道を介して膀胱に直接注入した後、融合蛋白質を経口投与して免疫化させ、その後尿路感染性大腸菌のコロニー数を融合蛋白質投与群と対照群の比較によって示す。
【図１８】ＦｉｍＨ／ＣＴＸＡ２Ｂ及びＦｉｍＨ／ＬＴＸＡ２Ｂ融合蛋白質のワクチンに対する治療効果を試験するために、尿路感染性大腸菌を雌ＢＡＬＢ.／Ｃマウスの尿道を介して膀胱に直接注入した後、融合蛋白質を経口投与して免疫化させ、その後炎症誘発時に最も早く浸透する免疫細胞中の一つである好中球数の増加を測定することが可能なＭＰＯ分析によって好中球数の増加を融合蛋白質投与群と対照群との比較によって示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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