(57)【要約】【課題】必要とする試料である核酸の量が少なくて、かつ、より正確な遺伝子発現などの解析が行える核酸の検出方法を提供する。【解決手段】アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として、センス鎖ｃＤＮＡを合成し、これをハイブリダイゼーションに用いる。前記アンチセンス鎖ＲＮＡはリニア増幅法によって合成することが好ましく、これよりセンス鎖ｃＤＮＡを合成する際は、ランダムプライマーを用い、蛍光標識することが好ましい。さらに、このようにして作製されたセンス鎖ｃＤＮＡを三次元マイクロアレイを用いて検出することで、遺伝子の発現量比などの解析を正確に行うことができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として、センス鎖ｃＤＮＡを合成し、これをハイブリダイゼーションに用いることを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項２】
アンチセンス鎖ＲＮＡが、発現量に略比例して増幅されたアンチセンス鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の核酸の検出方法。
【請求項３】
アンチセンス鎖ＲＮＡを、リニア増幅法によって合成することを特徴とする請求項１又は２記載の核酸の検出方法。
【請求項４】
アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型としてセンス鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで該センス鎖ｃＤＮＡを標識することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項５】
アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として、標識されたヌクレオチドを用いてセンス鎖ｃＤＮＡを合成することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
ヌクレオチドが、蛍光標識されていることを特徴とする請求項５記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
センス鎖ｃＤＮＡを、ランダムプライマーを用いて合成することを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項８】
前記センス鎖ｃＤＮＡをターゲットとして、マイクロアレイを用いて検出することを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項９】
マイクロアレイが、ターゲットと相補的なＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを固相化したものであることを特徴とする請求項８記載の核酸の検出方法。
【請求項１０】
マイクロアレイが三次元構造を有することを特徴とする請求項８又は９記載の核酸の検出方法。
【請求項１１】
三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるマイクロアレイを用いて、核酸を検出する方法であって、請求項１０記載のターゲットの一部と相補的に結合するプローブを、液体収容部に配置する工程と、
前記ターゲットを含む液体試料をマイクロアレイ内外で流動させて、該ターゲットと前記プローブとの間でハイブリッドを形成させる条件下で、液体試料とプローブとを接触させる工程と、
ハイブリッドの結合強度の違いに基づいて変化するシグナル強度を、非特異的ハイブリッドを解離させる条件下で、検出する工程と、を含むことを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項１２】
プローブの塩基長が、２０〜７０ｍｅｒであることを特徴とする請求項１１記載の核酸の検出方法。
【請求項１３】
液体試料とプローブとを接触させる前に、液体試料を６０〜１００℃で、１〜１０分間加熱することを特徴とする請求項１１又は１２記載の核酸の検出方法。
【請求項１４】
ターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション反応、及びシグナル強度を検出する際の温度条件が、３０〜７０℃であることを特徴とする請求項１１ないし１３のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項１５】
ターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション反応を、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥを含む溶液中で行うことを特徴とする請求項１１ないし１４のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項１６】
液体試料とプローブとを接触させる工程において、液体試料を間欠的に３０〜２００回流動させることを特徴とする請求項１１ないし１５のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項１７】
液体試料とプローブとを接触させる工程後に、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥを含む溶液をマイクロアレイ内外で流動させて、非特異的ハイブリッド及び未反応の液体試料を取り除くことを特徴とする請求項１１ないし１６のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の検出方法に関するものである。特に、アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型としてセンス鎖ｃＤＮＡを合成し、このセンス鎖ｃＤＮＡをマイクロアレイなどにおけるハイブリダイゼーションに用いる核酸の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイは、通常、１〜数十センチ四方程度のスライドガラスやシリコンなどからなるプレート（担体）上に、数千〜数十万種の既知のＤＮＡなどの断片（プローブ）を配列、固相したものである。
これらプローブに、相補性を利用して未知のＤＮＡなどの核酸（ターゲット）をハイブリダイズさせる。あらかじめこの未知の核酸に標識をつけ、未知の核酸がどのプローブとハイブリダイズしたかを調べることによって、未知の核酸が何であるかが分かるようになっている。
【０００３】
前記ハイブリダイズ用の核酸を調製する方法として、一般に、以下の２通りの方法が知られている：
▲１▼  ｍＲＮＡやｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成する方法（例えば、非特許文献１参照。）。
▲２▼  リニア増幅法とも呼ばれ、ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成し、さらに二本鎖のｃＤＮＡを形成した後、センス鎖ｃＤＮＡを鋳型にしてＲＮＡを増幅させる（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
また、標識方法としては、上記▲１▼の方法で調製されるｃＤＮＡは、例えば、逆転写する際に蛍光物質のついたｄＵＴＰ（例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＴＰ）を取り込ませて標識する。一方、上記▲２▼の方法で調製されるＲＮＡは、例えば、ランダムプライマーを用いて標識する。
【０００５】
【非特許文献１】
林崎良英、外「ＤＮＡマイクロアレイ実践マニュアル」、羊土社、２０００年１１月、ｐ．６６−７２
【非特許文献２】
林崎良英、外「ＤＮＡマイクロアレイ実践マニュアル」、羊土社、２０００年１１月、ｐ．８０−９０
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記▲１▼の方法によって得られたｃＤＮＡを用いて、マイクロアレイで遺伝子発現などの解析を行う場合、適量の核酸を作製するためには、多量のｍＲＮＡ又はｔｏｔａｌＲＮＡが試料として必要である。ｃＤＮＡを合成する鋳型となるｍＲＮＡが、例えば、１０μｇ以下の場合、正確な逆転写反応を行うことができず、得られたｃＤＮＡをマイクロアレイに用いても正しい遺伝子の発現量比を検出できない。
【０００７】
一方、上記▲２▼の方法によって得られたＲＮＡを用いて、マイクロアレイで遺伝子発現などの解析を行う場合、通常２μｇ程度のｍＲＮＡが試料として必要である。これは、▲１▼の方法より必要とする試料の核酸の量が少ないものの、最終的に標識される核酸がＲＮＡであることから、分解がおこり易い。その結果、ＤＮＡよりも多量のＲＮＡをマイクロアレイのハイブリダイゼーションに用いる必要がある。さらに、多量のＲＮＡを用いることで、核酸の高次構造を形成し易くなるため非特異的結合が増加する。その結果、このようなＲＮＡをマイクロアレイに用いても正確な遺伝子の発現量比を検出できない。
【０００８】
したがって、本発明は、必要とする試料である核酸の量が少なくて、かつ、より正確な遺伝子発現などの解析が行える核酸の検出方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
かかる課題を解決するため、本発明は、アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として、センス鎖ｃＤＮＡを合成し、これをハイブリダイゼーションに用いる核酸の検出方法を提供する。
また、本発明は、前記アンチセンス鎖ＲＮＡが、発現量に略比例して増幅されたアンチセンス鎖ＲＮＡである核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、前記アンチセンス鎖ＲＮＡをリニア増幅法によって合成する核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、前記アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型としてセンス鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで合成したセンス鎖ｃＤＮＡを標識する核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、前記アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として、標識されたヌクレオチドを用いてセンス鎖ｃＤＮＡを合成する核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、前記ヌクレオチドが蛍光標識されている核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、前記センス鎖ｃＤＮＡを、ランダムプライマーを用いて合成する核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、前記センス鎖ｃＤＮＡをターゲットとして、マイクロアレイを用いて検出する核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、前記マイクロアレイが、前記ターゲットと相補的なＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを固相化したものである核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、前記マイクロアレイが三次元構造を有する核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるマイクロアレイを用いて、核酸を検出する方法であって、
前記ターゲットの一部と相補的に結合するプローブを、液体収容部に配置する工程と、
前記ターゲットを含む液体試料をマイクロアレイ内外で流動させて、該ターゲットと前記プローブとの間でハイブリッドを形成させる条件下で、液体試料とプローブとを接触させる工程と、
ハイブリッドの結合強度の違いに基づいて変化するシグナル強度を、非特異的ハイブリッドを解離させる条件下で、検出する工程と、を含む核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる核酸の検出方法において、プローブの塩基長が、２０〜７０ｍｅｒである核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる核酸の検出方法において、液体試料とプローブとを接触させる前に、液体試料を６０〜１００℃で、１〜１０分間加熱する核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる核酸の検出方法において、ターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション反応、及びシグナル強度を検出する際の温度条件が、３０〜７０℃である核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる核酸の検出方法において、ターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション反応を、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥを含む溶液中で行う核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる核酸の検出方法において、液体試料とプローブとを接触させる工程において、液体試料を間欠的に３０〜２００回流動させる核酸の検出方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる核酸の検出方法において、液体試料とプローブとを接触させる工程後に、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥを含む溶液をマイクロアレイ内外で流動させて、非特異的ハイブリッド及び未反応の液体試料を取り除く核酸の検出方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明に使用される核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工的ヌクレオチドを含むＤＮＡ又はＲＮＡの何れをも意味する。
核酸は、センス鎖とアンチセンス鎖に分けられる。例えば、ｍＲＮＡをセンス鎖としたとき、このｍＲＮＡと同一又は同等の塩基配列を持つ核酸はセンス鎖である。一方、前記ｍＲＮＡと相補的な塩基配列を持つ核酸はアンチセンス鎖である。
【００１１】
ハイブリダイゼーションとは、相補的な塩基配列を持つ同種又は異種な二本の核酸の間に結合が形成される現象であり、核酸の組み合わせの例として、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、及びＲＮＡ−ＲＮＡが挙げられる。
ハイブリッドとは、これら同種又は異種の核酸がハイブリダイゼーションによって形成する二重鎖である。
【００１２】
本発明の核酸の検出方法は、アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として、センス鎖ｃＤＮＡを合成し、これをハイブリダイゼーションのターゲットとして用いて検出する。センス鎖ｃＤＮＡを合成する際、鋳型となるアンチセンス鎖ＲＮＡは、以下のようにして作製することが好ましい。
生体組織や細胞からＲＮＡを抽出し、これを鋳型とし、リニア増幅法によってＲＮＡが抽出された組織又は細胞内での遺伝子の発現量に略比例してｍＲＮＡを増幅させる。
ＲＮＡは、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡの何れでもよいが、抽出する容易さなどの観点から、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出するのが好ましい。また、生体組織などからＲＮＡを抽出する方法は公知のものであればよく、グアニジンチオシアネート法などが例として挙げられる。
【００１３】
リニア増幅法は、例えば以下のようにして行うことができる。
１．  抽出したＲＮＡをオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーを用いて逆転写してアンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成する。
２．１．で合成したアンチセンス鎖ｃＤＮＡと相補的なセンス鎖ｃＤＮＡを合成して二重鎖ｃＤＮＡを形成する。
３．２．で合成された二重鎖ｃＤＮＡのうち、センス鎖ｃＤＮＡを鋳型にしてアンチセンス鎖ＲＮＡを合成、増幅させる。
【００１４】
上記のように、生体組織などから抽出したＲＮＡをリニア増幅法によって増幅すれば、得られるアンチセンス鎖ＲＮＡは、ＲＮＡが抽出された組織又は細胞内の遺伝子の発現量に略比例したものである。したがって、増幅前後で遺伝子の比率はほぼ維持されているので、正確な遺伝子の発現等の解析が可能である。
従来、マイクロアレイなどにおけるハイブリダイゼーションに用いるターゲットのｃＤＮＡを作製するために約１０μｇ以上のｍＲＮＡ、又はそれ以上のｔｏｔａｌＲＮＡ試料を必要としていたが、上記の方法を用いれば、例えば、２μｇのｔｏｔａｌＲＮＡを用いてリニア増幅法によりアンチセンス鎖ＲＮＡを製造して、そのアンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として逆転写、標識することによってＦＩＴＣ蛍光標識されたｃＤＮＡを製造し、このうち１μｇをターゲットとして一度のハイブリダイゼーションに用いると、プローブの塩基配列に特異的な結合が可能となる。
【００１５】
次に、増幅したアンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型としてセンス鎖ｃＤＮＡを合成するが、例えば以下のような方法で行うことが好ましい。
アンチセンス鎖ＲＮＡを逆転写する際、プライマーとしてランダムプライマーを用いることが好ましい。ｍＲＮＡからアンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成する際使用されるオリゴｄＴプライマーを用いたのでは、アンチセンス鎖ＲＮＡと反応しないという問題が生じるからである。
センス鎖ｃＤＮＡを合成する際、以下に示す方法で標識することが好ましい。
（ａ）逆転写の際、標識されたヌクレオチドを用いてセンス鎖ｃＤＮＡを合成する。センス鎖ｃＤＮＡを合成するときに、同時に標識されたヌクレオチドが直接ｃＤＮＡに取り込まれるため、標識されたｃＤＮＡが合成され、合成及び検出が簡便になる。このとき、ヌクレオチドを蛍光標識すれば、ＲＩ標識と比較して安全かつ簡便に検出することができる。
（ｂ）センス鎖ｃＤＮＡが合成された後に標識する。アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型としてセンス鎖ｃＤＮＡを合成した後に、その合成したｃＤＮＡを標識することにより、確実かつ正確な検出が可能となる。
【００１６】
標識する方法は、公知の方法のいずれを用いてもよく、例えば、ヌクレオチドに蛍光物質、Ｐ３２などのラジオアイソトープ、ビオチン、アビジンなどを結合させたものを転写の際、核酸に織り込む方法が挙げられる。また、核酸が合成された後に標識する方法として、例えば、アミノアリル法が挙げられる。
蛍光物質の例として、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＴＰ、  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰなどが挙げられる。
また、これらの他に蛍光ガラスの微粒子を用いたり、蛍光物質以外に金や銀の微粒子、半導体、ガラス、セラミックス、有機樹脂等の誘電体粒子を標識物質として、これらの散乱光により核酸を検出したりすることも可能である。
【００１７】
ターゲットは、マイクロアレイなどによって検出される核酸である。通常、ターゲットは、未知のものであり、既知のプローブとハイブリダイズさせることによってターゲットの核酸が如何なるものかわかるようになっている。
従来、核酸の検出方法において、増幅されたＲＮＡがターゲットとして使用されていたが、ＲＮＡは不安定であり、非特異的ハイブリッドが形成され易いことから、正確な解析は困難であった。ｃＤＮＡをハイブリダイゼーションのターゲットとして用いれば、安定性がよく、また、ＲＮＡ同士で見られる非特異的ハイブリッドが形成されにくい。
【００１８】
以上説明したように、ＲＮＡをリニア増幅法によって増幅させ、さらに増幅したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成することで、必要とする試料を節減できる。また、このようにして作製されたセンス鎖ｃＤＮＡをターゲットとしてプローブとハイブリダイズさせ、検出することによって、生体組織又は細胞内での遺伝子の発現量などがより正確に解析できるようになっている。
【００１９】
プローブは、ターゲットと相補的に結合し得るＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドであり、マイクロアレイに固相化されていることが好ましい。マイクロアレイは、多くの遺伝子の相互作用の解明に用いられており、スループットが高く非常に有効な技術である。マイクロアレイを用いると、特異性が高く正確な情報を多くの遺伝子に対して得られるため大きな効果を有する。
【００２０】
プローブとしてｃＤＮＡ、又は、オリゴヌクレオチドを用いると、塩基配列に特異的な検出が可能となる。プローブの塩基長としては、２０〜７０ｍｅｒであることが好ましく、より好ましくは４０〜６０ｍｅｒである。塩基長が２０ｍｅｒ未満の場合、非特異的なハイブリッド形成が増加する傾向にあり、７０ｍｅｒを超えると、プローブの合成に要する時間、費用の観点から好ましくない。
【００２１】
三次元マイクロアレイは、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるものであれば、特に制限はないが、自家蛍光の少ない材質が好ましい。液体収容部に適する材質の例として、酸化アルミニウムが挙げられる。ここで、液体収容部は、プローブを固相化するための最小単位であり、プローブスポットとも呼ばれる。
【００２２】
三次元マイクロアレイは、例えば、スライドグラス上にプローブが固相化されたマイクロアレイ（以下、二次元マイクロアレイ）に比べて、多量のプローブを固相化することができる。また、従来の二次元マイクロアレイでは、プローブを定量的に固相化することが困難なため、各プローブの固相化量に、ばらつきが生じることが多かった。これに対し、三次元マイクロアレイは、定量的なプローブの固相化が可能なため、発現量の解析などの定量的な実験に好適である。
【００２３】
本発明の核酸の検出方法は、上記ターゲット及び三次元マイクロアレイを用いて行われるものであって、以下の工程を含むことを特徴とする。
即ち、アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として、核酸（ターゲット）を作製する工程（１）と、ターゲットの一部と相補的に結合するプローブを液体収容部に配置する工程（２）と、ターゲットを含む液体試料をマイクロアレイ内外で流動させて、ターゲットとプローブとの間でハイブリッドを形成させる条件下で、液体試料とプローブとを接触させる工程（３）と、ハイブリッドの結合強度の違いに基づいて変化するシグナル強度を、非特異的ハイブリッドの形成を解離させる条件下で、検出する工程（４）である。
【００２４】
ターゲットを作製する工程（１）では、組織や細胞などからＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを鋳型としてセンス鎖ｃＤＮＡを合成する。この際、前述したように、リニア増幅法を用いて抽出したＲＮＡを増幅し、さらに、ランダムプライマーを用いて増幅したＲＮＡを逆転写、蛍光標識してセンス鎖ｃＤＮＡを合成するのが好ましい。
次いで、このようにして合成されたセンス鎖ｃＤＮＡをターゲットとし、例えば、滅菌蒸留水などに溶解させて液体試料として用いる。また、後段で説明するが、プローブとのハイブリッド形成を容易にする目的で、適宜、塩などを添加することができる。
本発明の核酸の検出方法は、上記のようにして作製されたセンス鎖ｃＤＮＡをハイブリダイゼーションのターゲットとして用いるので、必要とする試料量を節約でき、また、試料内の遺伝子発現量比に忠実な核酸の検出ができる。
【００２５】
本発明において、プローブを液体収容部に配置する工程（２）では、まず、前述したように、例えば、２０〜７０ｍｅｒの塩基長を有し、ターゲットとハイブリダイズし得るＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを作製する。
このようなプローブを定量的に各液体収容部に配置・固相化することは、上述したように比較的容易なため、各液体収容部のプローブ量にばらつきが少なく、再現性に優れた測定を実施することができる。
【００２６】
次いで、液体試料とプローブとを接触させる工程（３）は、液体試料をマイクロアレイ内外で流動させて、ターゲットとプローブとの間でハイブリッドを形成させる条件下で行う。
このように、三次元マイクロアレイの内外に液体試料を流動させることによって、各液体収容部の空間に、容易にターゲットを含む液体試料を流動させることができるため、確実にターゲット分子とプローブ分子とが接触でき、ハイブリッド形成を短時間で行うことができる。
【００２７】
ターゲットとプローブとのハイブリッドを形成させる際、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥ溶液中で行うことが好ましい。つまり、上記範囲の塩濃度となるように、ＳＳＰＥ溶液を液体試料に添加して、ハイブリダイゼーション反応を行う。ここで、ＳＳＰＥ溶液は、例えばＳＳＰＥ溶液（２０倍）を希釈して調製することができる。ＳＳＰＥ溶液（２０倍）の組成は、３．０Ｍ  塩化ナトリウム、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム、０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である。ＳＳＰＥ溶液の塩濃度は希釈の程度を表し、例えば、塩濃度が６倍であるＳＳＰＥ溶液とは、ＳＳＰＥ溶液（２０倍）を２０分の６倍に希釈したものである。ＳＳＰＥ溶液の塩濃度については、塩濃度が高いほうが、ハイブリッド形成が行われ易いためシグナル強度の増大に寄与するが、塩濃度が６倍を超えると、その増加率が減少する傾向にある。一方、塩濃度が低いほうがハイブリッド形成の特異性は上昇するが、塩濃度が０．１倍未満の場合、反応時間を長くする必要がある。
【００２８】
また、液体試料とプローブとを接触させる工程において、液体試料を間欠的に３０〜２００回流動させることが好ましい。３０回未満の場合、標識された核酸分子とプローブ分子との接触頻度が不十分なため、ハイブリッド形成反応が十分に行われないことが多い。一方、２００回を超えると、反応時間が長くなる割にハイブリッド形成の効率が低下する傾向にある。
【００２９】
また、液体試料をプローブに接触させる前に、予め、液体試料を６０〜１００℃で１〜１０分間、より好ましくは７０〜９５℃で２〜５分間加熱することが好ましい。また、液体試料を加熱後、急冷を行うことがさらに好ましい。液体試料を加熱することによって、その中に含まれるターゲット分子のもつれ（分子内結合及び／又は分子間結合）が解け、また、急冷することによって、前記もつれが再発生するのを防ぐ。このように前処理されたターゲットを含む液体試料をハイブリダイゼーションに用いることによって、非特異的なハイブリッドの形成が抑制される。
さらに、ハイブリッドを形成させる好ましい条件として、所定の温度範囲とすることが好ましいが、温度条件については後段で詳しく説明する。
【００３０】
次いで、ハイブリッドの結合強度の違いに基づいて変化するシグナル強度を検出する工程（４）は、非特異的ハイブリッドの形成を解離させる条件下で行う。具体的には、液体試料とプローブとを接触させる工程を終了した後に、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥ溶液をマイクロアレイ内外で流動させることにより洗浄を行う。この際に、ＳＳＰＥ溶液の塩濃度が０．１倍未満の場合、特異的ハイブリッド形成をも解離させる可能性があり、６倍を超えると、液体試料に含まれる未反応の標識された核酸と、プローブとの間で、非特異的なハイブリッドを形成する可能性が高くなる。
このように、ハイブリッド形成反応終了後に、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＥ溶液をマイクロアレイ内外で流動させることによって、非特異的ハイブリッド及び未反応の液体試料を取り除き、より正確な測定を実施することができる。
【００３１】
また、ハイブリッド形成反応、及びシグナル強度を検出する際の温度条件が、３０℃〜７０℃であることが好ましく、より好ましくは４５〜５５℃である。ハイブリッド形成反応の観点から言えば、反応温度が３０℃未満の場合、非特異的なハイブリッド形成が増加する傾向にある。また、反応温度を高く設定したほうが、ハイブリダイゼーション反応の特異性が増すため好ましいが、高く成りすぎると、ハイブリッド形成に要する時間が長くなる、若しくは、特異的なハイブリッド形成までもが阻害されてしまう可能性がある。
【００３２】
また、シグナル強度の検出の観点から言えば、３０℃未満の場合、非特異的ハイブリッド形成を解離させることが困難となる。また、７０℃を超えると、非特異的ハイブリッド形成だけではなく、特異的なハイブリッド形成までも解離させてしまう可能性があり、全体的にハイブリダイゼーション強度が低下する傾向にある。すると、全体的なシグナル強度が弱くなるため、シグナルの検出が困難となってしまう。ここで、シグナルとは、プローブ分子にハイブリダイズしている核酸分子に付加している標識から発せられる蛍光、放射能、化学発光などや、誘電体粒子を標識としたときの散乱光などであり、これらの中でも、費用と取り扱いの良さから蛍光が好ましい。また、シグナルは定量的に測定できることが好ましい。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明を詳しく説明する。
【００３４】
試験例１
ヒト培養細胞を試料に用いて、下記の要領でターゲットの作製を行った。
１．試料となる生体組織又は細胞からｔｏｔａｌＲＮＡ２μｇをグアニジンチオシアネート法により抽出した。
２．抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型としてリニア増幅法によりアンチセンス鎖ＲＮＡ２μｇを合成した。
３．さらに、アンチセンス鎖ＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーを用いた逆転写法によって、センス鎖ｃＤＮＡ２μｇを作製した。このとき、ＦＩＴＣ標識を行った。
４．ＦＩＴＣ標識されたセンス鎖ｃＤＮＡの１μｇを滅菌蒸留水３５μｌに溶解させｃＤＮＡ溶液とし、９５℃で５分間加熱して変性させ、その後、氷水中で急冷した。
５．前記ｃＤＮＡ溶液に、２０×ＳＳＰＥ溶液を１５μｌ加えて（最終塩濃度６×ＳＳＰＥ溶液）、液体試料とした。
【００３５】
＜プローブの設計及び固相化＞
プローブとする所望のＤＮＡに特異的な塩基配列に基づいて、下記のＤＮＡプローブを設計した。
2005013095.tif 000002
次いで、このプローブをマイクロピペットにより液体収容部が酸化アルミニウムからなる三次元マイクロアレイ上にスポットし、固相化した。
【００３６】
＜ハイブリダイゼーション及び核酸の検出＞
上記液体試料を前記３次元マイクロアレイ内外に１５０回流動させ、ハイブリッド形成を行った。なお、このときの反応温度を５０℃に設定した。
反応終了後、６×ＳＳＰＥ溶液５０μｌを３回更新させながら、各々１回ずつ流動させて洗浄を実施した。
洗浄終了後、蛍光顕微鏡に搭載したＣＣＤカメラ（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、ＷＩＢＡフィルターカセット（オリンパス光学工業株式会社製）を使用して蛍光画像を取得した。各種プローブを固相化したプローブスポットの平均蛍光強度を図１に示す。なお、図１及び後述する図３において、アンチはアンチセンス鎖を表し、センスはセンス鎖を表す。
【００３７】
図１より、ＧＡＰＤＨ、β−ａｃｔｉｎ共に、ターゲットをアンチセンス鎖のプローブとハイブリダイズさせた場合、センス鎖のプローブとハイブリダイズさせた場合より強い平均蛍光強度を示していることがわかる。アンチセンス鎖ＲＮＡを増幅し、それを鋳型としてランダムプライマーを用いた逆転写により合成したセンス鎖ｃＤＮＡをターゲットとして用いているので、アンチセンス鎖のプローブとのハイブリダイゼーションによる平均蛍光強度が強いことは、ターゲットとプローブとが特異的に結合したことを示している。
【００３８】
試験例２
ヒト培養細胞を試料として用い、試験例１と同様にして、ターゲットの作製、プローブの固相化、ハイブリダイゼーション及び核酸の検出を行った。プローブは、下記のＤＮＡプローブを使用した。
2005013095.tif 000003
【００３９】
試験例３
ヒト培養細胞ｔｏｔａｌＲＮＡ２μｇを抽出し、これを鋳型としてリニア増幅により、アンチセンス鎖ＲＮＡ２μｇを作製した。このアンチセンス鎖ＲＮＡをＦＩＴＣ標識したセンス鎖ＲＮＡのうち１μｇを、マイクロアレイにおいてハイブリダイゼーションさせた。このとき、プローブの設計、固相化、ハイブリダイゼーション及び核酸の検出条件は、試験例２と同様であった。
ＧＡＰＤＨは、ポジティブコントロールとして、試験例２及び試験例３において発現量に差がないと予測される遺伝子であり、ｐＲＬ−ＴＫは、ネガティブコントロールとして、試験例２、試験例３共に検出されないと予想される遺伝子である。
【００４０】
図２は、試験例２と試験例３におけるポジティブコントロールとネガティブコントロールのプローブを使用した場合の蛍光強度の比率（ＧＡＰＤＨ／ｐＲＬ−ＴＫ）を示す。図２より、同量の試料を使用したにも関わらず、試験例２は試験例３の３倍強の前記比率を示していることがわかる。試験例２の核酸の検出方法は、試験例３に比べてより効果的に核酸の特異的結合を検出することができることが判明した。
【００４１】
試験例４
ラット肝臓細胞を試料として用い、試験例１と同様にして、ターゲットの作製、プローブの設計、固相化、ハイブリダイゼーション及び核酸の検出を行った。
試験例５
マイクロアレイに二次元マイクロアレイを使用した以外は、試験例４と同様の条件でターゲットを作製、これをハイブリダイゼーションさせ検出した。
試験例４及び試験例５における各種プローブを使用したときの平均蛍光強度を図３に示す。
【００４２】
図３より、二次元マイクロアレイを使用した場合、各種プローブを使用したときの蛍光強度にあまり差がないことがわかる。一方、三次元マイクロアレイを使用した場合、ポジティブコントロールであるアンチセンス鎖ＧＡＰＤＨとアンチセンス鎖β−ａｃｔｉｎで高い蛍光強度を示し、ネガティブコントロールであるセンス鎖ＧＡＰＤＨとセンス鎖β−ａｃｔｉｎで低い蛍光強度を示していることがわかる。したがって、三次元マイクロアレイを用いた核酸の検出方法によって、特異的結合をより効果的に検出できることが判明した。
【００４３】
試験例６
下記の試料及びＤＮＡプローブを用い、試験例１と同様にして、ターゲットの作製、プローブの固相化、ハイブリダイゼーション及び核酸の検出を行った。
試料：正常ヒト繊維芽細胞株ＴＩＧ−１（以下、ＴＩＧ−１と略す）
ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ３２０ＤＭ（以下、ＣＯＬＯ３２０ＤＭと略す）
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ｐＲＬ−ＴＫは、ネガティブコントロールとして、ヒトゲノム中に存在しない遺伝子であり、ｃ−ｍｙｃは、ＣＯＬＯ３２０ＤＭにおいて特異的に発現が上昇すると予測される遺伝子であり、β−ａｃｔｉｎは、代表的なハウスキーピング遺伝子であり、ＧＡＰＤＨは、インターナルコントロールとして、両細胞間で発現量の変動がないと予測される遺伝子である。
【００４４】
ＴＩＧ−１由来の液体試料を用いたハイブリダイゼーション結果を図４（Ａ）、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来の液体試料を用いたハイブリダイゼーション結果を図４（Ｂ）に示す。なお、各プローブの配置位置を左側に示す。
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）より、共にネガティブコントロールであるｐＲＬ−ＴＫの発現は認められないことから、ハイブリダイゼーション反応が特異的に進行したことが示された。また、ｃ−ｍｙｃとβ−ａｃｔｉｎについて観察すると、ＴＩＧ−１由来のターゲット（Ａ）に比べて、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来のターゲット（Ｂ）のほうがより強い蛍光強度を示していることから、これらの遺伝子の発現量はＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来のターゲットにおいてより発現されていることが判明した。ＧＡＰＤＨについては、両試料とも発現量に差がないことが確認された。
さらに、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）において、同一のプローブをスポットしたときの蛍光強度にほとんど差異は認められないことから、上記の核酸の検出方法は再現性に優れていることが判明した。
【００４５】
また、インターナルコントロールであるＧＡＰＤＨの輝度を１：１に補正したときの各遺伝子についての補正蛍光強度を算出した。結果を図５に示す。各遺伝子の発現量の比を比較したところ、表１に示すように、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来のターゲットは、ＴＩＧ−１由来のそれに比べて、ｃ−ｍｙｃの発現量が１１倍、β−ａｃｔｉｎの発現量が１．７倍の上昇が認められた。
【００４６】
さらに、試験例６の上記結果を別の角度から検証するために、ＴＩＧ−１由来のｔｏｔａｌＲＮＡと、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来のｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ｐＲＬ−ＴＫ、ｃ−ｍｙｃ、β−ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨの各遺伝子についてそれぞれ２０ｎｇのｔｏｔａｌＲＮＡを用いてｋｉｎｅｔｉｃ  ＲＴ−ＰＣＲを実施した。このときの条件としては、はじめに９４℃で５分間熱変性させた後、９４℃で３０秒間の熱変性と、６３℃で３０秒間のアニーリングと、７２℃で３０秒間の伸長反応とからなるサイクルとなるように設定した。
【００４７】
各遺伝子について、マイクロアレイに固相化したプローブを含む約２００ｂｐのＰＣＲ産物が得られるようにＰＣＲを行い、１５、１８、２１、２４サイクル目のＰＣＲ産物についてアガロース電気泳動を実施した。ＴＩＧ−１由来のｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動像を模式的に表したものを図６（Ａ）、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動像を模式的に表したものを図６（Ｂ）に示す。
【００４８】
ＧＡＰＤＨの発現量を１としたとき、各遺伝子のバンドの出現サイクル数から見積もられるＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来の試料とＴＩＧ−１由来の試料の遺伝子発現量比は、表１に示すように、ｃ−ｍｙｃで１０倍、β−ａｃｔｉｎで２倍となり、これらの遺伝子発現量の強弱パターンは、前述したマイクロアレイによる解析結果とよい相関が得られた。したがって、本発明の核酸の解析方法を用いた遺伝子の発現量の解析結果は、信頼性の高いものである。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
【発明の効果】
本発明の核酸の検出方法を用いれば、少量の試料を用いて正確な遺伝子発現解析が可能である。また、リニア増幅法を用いてアンチセンス鎖ＲＮＡを作製し、これを逆転写してセンス鎖ｃＤＮＡを合成すれば、この効果は向上する。さらに、センス鎖ｃＤＮＡを標識することによって、核酸の検出が簡便になる。さらに、マイクロアレイを用いて前記ターゲットをプローブとハイブリダイズさせることによって、核酸の配列、配列中の変異の有無、ｍＲＮＡのコピー数等の情報を得ることができる。この際、３次元マイクロアレイを使用することによってプローブの固相化量が増加するため、より効率的に遺伝子発現等の解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト培養細胞由来のセンス鎖ｃＤＮＡを各種プローブとハイブリダイズさせた結果を示すグラフである。アンチはアンチセンス鎖を表し、センスはセンス鎖を表す。
【図２】ヒト培養細胞由来のセンス鎖ｃＤＮＡとセンス鎖ＲＮＡをＧＡＰＤＨ及びｐＲＬ−ＴＫとハイブリダイズさせた結果を示すグラフである。
【図３】ラット肝臓細胞由来のセンス鎖ｃＤＮＡを三次元と二次元マイクロアレイを用いて各種プローブとハイブリダイズさせた結果を示すグラフである。アンチはアンチセンス鎖を表し、センスはセンス鎖を表す。
【図４】ＴＩＧ−１由来（Ａ）とＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来（Ｂ）のセンス鎖ｃＤＮＡを各種プローブとハイブリダイズさせた結果を示すマイクロアレイの概略図である。
【図５】ＴＩＧ−１由来（Ａ）とＣＯＬＯ３２０ＤＭ由来（Ｂ）のセンス鎖ｃＤＮＡを各種プローブとハイブリダイズさせたときの補正蛍光強度を示すグラフである。
【図６】ＴＩＧ−１（Ａ）とＣＯＬＯ３２０ＤＭ（Ｂ）からＲＮＡを抽出し、ｋｉｎｅｔｉｃＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動した結果を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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