(57)【要約】【課題】  新規血小板由来増殖因子ペプチドアナログに対する抗体を提供する。【解決手段】  以下のもの：2005112862.tif 000026のうちのいずれかから選択される血小板由来増殖因子ペプチドアナログ（ペプチドは環化していてもよい）に結合する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のもの：
2005112862.tif 000018
のうちのいずれかから選択される血小板由来増殖因子ペプチドアナログに結合する抗体。
【請求項２】
ペプチド
2005112862.tif 000019
に結合する請求項１の抗体。
【請求項３】
下記のもの：
（ｉ）以下のものからなる群より選択される第１の配列：
2005112862.tif 000020
（ｉｉ）第１の配列に連結されており、以下のものからなる群より選択される第２の配列：
2005112862.tif 000021
および
2005112862.tif 000022
ならびに所望により
（ｉｉｉ）該第１の配列と該第２の配列との間に存在するスペーサーエレメント
を必須として含む血小板由来増殖因子ペプチドアナログに対する抗体。
【請求項４】
スペーサーエレメントが４ないし６個のアミノ酸残基およびヘテロ二官能基架橋剤からなる群より選択されるものである請求項３の抗体。
【請求項５】
該スペーサーがポリグリシルである請求項４の抗体。
【請求項６】
該スペーサーが−（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ）−である請求項４の抗体。
【請求項７】
該スペーサーがＳＭＣＣ（Ｎ−（４−カルボキシ−シクロヘキシル−メチル）−マレイミド）である請求項４の抗体。
【請求項８】
該第１の配列がＧＰ１またはＧＰ２である請求項３ないし７のいずれかの抗体。
【請求項９】
該第２の配列がＧＰ７である請求項３ないし７のいずれかの抗体。
【請求項１０】
ペプチドが環状である請求項１ないし３のいずれかの抗体。
【請求項１１】
ペプチドが下記アミノ酸配列：
2005112862.tif 000023
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、環化しているものである、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
下記アミノ酸配列：
2005112862.tif 000024
2005112862.tif 000025
［式中：
［Ｘａ］＝架橋スペーサーアーム；
------［ａａ１］＝環化前のＣ末端のアミノ酸残基であることを示す；
------［ａａ２］＝環化前のＮ末端のアミノ酸残基であることを示す］
からなる血小板由来増殖因子ペプチドアナログに結合する抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかにおいて定義されたペプチドを免疫原として使用することを含む方法を用いて得られる抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
血小板由来増殖因子アナログおよび細胞抗増殖剤としてのそれらの使用に関する。さらに本発明は、血小板由来増殖因子アナログに対する抗体、それらの製造方法ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、結合組織細胞に対する有効なマイトジェンであり、線維芽細胞および平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖を促進する［３３］。該増殖因子は、別々の遺伝子の産物である２個の非常に相同的な（配列の相同性は６０％まで）ポリペプチド鎖からなる２８〜３１ｋＤのダイマーで非常に塩基性（Ｐｉ＝９．８〜１０）の糖蛋白である。Ａ（染色体７上）およびＢ（染色体２２上）と命名された遺伝子産物が集合してジスルフィド結合ヘテロダイマー（ＰＤＧＦ−ＡＢ）またはホモダイマー（ＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢ）を形成する。ヒト・血小板に存在するＰＤＧＦの分析は、それが、ＡＢが優勢形態（７０％まで）である３種すべてのダイマー形態の混合物であることを明らかにしている［１０；１２］。ＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードしているヒト・プロト−腫瘍遺伝子（prot-oncogene）ｃ−ｓｉｓ［２１］は、形質転換レトロウイルスであるサル・肉腫ウイルスのｖ−ｓｉｓ腫瘍遺伝子のヒト・相同体として同定されている。この腫瘍遺伝子は、ＰＤＧＦ−ＢＢとして同定された蛋白ｐ２８ｖ−ｓｉｓをコードしている［５］。
【０００３】
ヒト・ＰＤＧＦのＡおよびＢ鎖のクローニングおよびアミノ酸配列は、両方の鎖は疎水性リーダー配列を伴う前駆体分子として合成され、両方の鎖は成熟の間にＮ末端における蛋白分解的開裂を受けることを示した。Ｂ鎖はＣ末端においてもプロセッシングされる［２１；２０］。
αおよびβと命名された２種の異なる受容体タイプに対して異なる親和性で結合することにより、ＰＤＧＦの３種のイソ体はそれらの生物学的効果を発揮する。リガンド結合は受容体のダイマー化を誘導し；ＰＤＧＦのＡサブユニットはα−受容体に結合し、その一方では、Ｂサブユニットはα−およびβ−両方の受容体に結合する［２］。
ＰＤＧＦダイマーを還元剤で処理した場合、蛋白はその生物学的活性を不可逆的に失い、蛋白コンフォーメーションが重要なジスルフィド結合の還元により崩壊されることが示唆される［１６］。ＰＤＧＦは、２本の鎖の間で非常に保存的な８個のシステイン残基を有する。６個の残基は３つの分子内ジスルフィド結合：Ｃｙｓ−１６−−−Ｃｙｓ−６０、Ｃｙｓ−４９−−−Ｃｙｓ９７およびＣｙｓ−５３−−−Ｃｙｓ−９９に関与している。他の２個のシステイン残基は非対称分子間ジスルフィド結合Ｃｙｓ−４３−−−Ｃｙｓ−５２に関与している［１１］。
【０００４】
ＰＤＧＦ受容体を求めて１２５Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢと競争するＰＤＧＦ−Ｂ鎖配列由来の異なるペプチドの能力についての系統的な分析は、受容体結合のために重要であると思われるアミノ酸残基３５〜４０および７８〜８３に対応するＢ鎖における２つの領域の同定を導いた。該２つの配列に対応するペプチド（ＡＮＦＬＶＷ−−−ＥＩＶＲＫＫＰ）は、ＰＤＧＦに対するアンタゴニストとして有効であることが見いだされているが、詳細な分析は、純粋なペプチドはより不活性であることを示している［６］。
ＰＤＧＦまたは相同的なｖ−ｓｉｓ遺伝子の欠失および置換突然変異体ならびにＰＤＧＦ−Ａ／Ｂキメラを用いる部位特異的突然変異研究は、ＰＤＧＦの生物学的活性のために重要である多くのアミノ酸残基を同定した。領域Ｉｌｅ−２５−−−Ｐｈｅ−３８は、ｖ−ｓｉｓ遺伝子の部位特異的突然変異により、結合ドメインであると同定された［９］。アミノ酸残基Ａｓｎ−３４は、ＰＤＧＦ−Ａ／ＢキメラのＰＤＧＦ−Ｂ様形質転換有効性にとり必須であることが見いだされた［２７］。両方の受容体タイプに対する結合が低下した変異体を選択する異なる機能アッセイを用いて、Ｉｌｅ−３０およびＡｒｇ−２７（重要度は低い）が重要であることが示された［３］。ポリリジンおよびプロタミンのごとき塩基性ポリペプチドは、ＰＤＧＦのその受容体への結合を阻害し、結合相互作用におけるリガンドの正電荷に関する役割が示唆される。受容体結合ドメインは、塩基性アミノ酸に富むＣ末端における領域、すなわち残基Ｌｙｓ−８０−−−Ｃｙｓ９７であると帰属されている［３９］。この領域は、ＡおよびＢ両鎖において保存的であり、それゆえＰＤＧＦα−受容体への両鎖の結合に必要とされうる配列Ｖａｌ−７８−−−Ａｒｇ−７９−−−Ｌｙｓ−８０−−−Ｌｙｓ−８１−−−Ｐｒｏ８２を含む。カチオン性配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓが配列Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕに置換されている変異ＰＤＧＦ−Ａ鎖は、ＰＤＧＦα−受容体への結合親和性および線維芽細胞におけるマイトジェン活性の両方の著しい低下を示す［７］。ＰＤＧＦ−ＢＢに対して生じた中和モノクローナル抗体を用いる初期の研究は、Ｔｈｒ−２０とＣｙｓ−４３との間のセグメントがＰＤＧＦ−ＢＢの表面ドメインであり、受容体結合に必要なアミノ酸残基を含んでいることを示している［２２］。
【０００５】
最近、ヒト・組み換えＰＤＧＦのホモダイマーＢＢイソ体の結晶構造が決定された［２６］。該蛋白ポリペプチド鎖は折り畳まれて非常によじれた２つのβ−ストランドの逆平行ペアーとなっており、３つの分子内ジスルフィド結合の普通でない節の多い配置を含んでいる。ダイマー化は、受容体認識部位を形成する可能性が最も高い伸長したダイマーの各末端における３つの表面ループのクラスター化を導く。該３つのループは：ループ１：Ｉｌｅ−２５−−−Ｌｅｕ−３８、ループII：Ｃｙｓ−３５−−−Ｖａｌ−５８およびループIII：Ｖａｌ−７８−−−Ｌｙｓ−８１である。
ＰＤＧＦに対する抗体は、ＰＤＧＦプロセッシングおよび生合成の研究に非常に有用であろう。おそらく分子が種間で保存的であるためにＰＤＧＦに対する高結合活性抗体を作成することは困難であったが、ごく最近になって、ＰＤＧＦに対するモノクローナル抗体が利用できるようになった［２２；３４；１２；３８］（非特許文献１〜４）。ヒト・血小板から精製された蛋白または組み換え蛋白または合成ペプチドを用いてＰＤＧＦに対するウサギおよびヤギの抗血清が２つの鎖に対して作成され、いくつかのものは鎖特異性および中和活性を有していた［２８；１７；１３；３７；３０］（非特許文献５〜９）。しかしながら、ペプチドに対して生成された抗体は、ネイティブな分子を認識することができず、あるいはその生物学的活性を中和することができなかった。
【０００６】
ＰＤＧＦは多くの生物学的な系に関連している。もともと、ＳＳＶ形質転換に関連しているＰＤＧＦと形質転換因子との間の密接な類似性は、該因子の過剰生産はヒト・悪性疾患の発生に関与しているという考えを導いた［１４］。多くの腫瘍細胞系の試験は、ＡおよびＢ鎖は共通してかかる細胞系において発現されることを示した［１５；２４］。一般的には、ＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ受容体の異常な発現はある種の腫瘍の増殖に対する刺激に関連している可能性がある。また、ＰＤＧＦの過剰活性も、過剰細胞増殖に関連したある種の非悪性疾患の発生の一部分である。例は、平滑筋細胞の増殖に対するＰＤＧＦにより誘導される刺激が罹患血管内膜の厚膜化の一因である可能性のあるアテローム性動脈硬化、ならびにＰＤＧＦが結合組織細胞の増殖刺激に関与している可能性のある慢性線維症の進行を包含する［３２］。フェルンス（Ferns）ら［８］（非特許文献１０）は、ラットの血管形成術の実験的モデルにおいて静脈から投与されたＰＤＧＦに対するポリクローナル抗体が障害を受けた動脈の内膜における平滑筋細胞の蓄積を阻害することを示し、一方では、ＰＤＧＦ投与は培地中のＳＭＣ増殖を２〜３倍誘導し、より重要なことには、培地から内膜へのＳＭＣの移行を２０倍増加させた［１９］。
【０００７】
しかしながら、ＰＤＧＦは正常な機能を有する。ＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ受容体は胚組織および胎盤において発現され［２３；１８］、そのことは発達の間のＰＤＧＦの機能を示唆する。神経の発達におけるＰＤＧＦの役割も確認されており［２５］、ＰＤＧＦおよびその受容体は末梢および中枢神経系に存在している［４０；３６］。ＰＤＧＦは、結合組織細胞の増殖ならびに化学走性、および炎症細胞の化学走性を刺激することが知られており、そのことは傷害の治癒における役割を示唆する［４；３５］。最近、ＰＤＧＦは、その傷害治癒能力を見るための臨床試験に用いられている。局所的に適用されたＰＤＧＦは大きな褥瘡の治癒を刺激する［３１］。ＰＤＧＦ  β−受容体は毛細血管内皮細胞上に生じ［２９］、さらにＰＤＧＦは弱い血管形成活性を有し［２９］、そのことは、その刺激効果が傷害の治癒にとり重要であることを示唆しうる。
有益ならびに不利な種々のＰＤＧＦの役割は、ＰＤＧＦアゴニストおよびアンタゴニストを非常に望ましいものとする。それらを傷害の治癒におけるＰＤＧＦ代替物またはＰＤＧＦの悪影響の阻害剤として用いることができる。また、中和活性を有する抗体は、ＰＤＧＦのマイトジェン効果に対するものであっても、さらに／または化学走性効果に対するものであっても、ＰＤＧＦの悪影響に対する阻害剤として有用でありうる。
【非特許文献１】ラロシェル,ダブリュ（LaRochelle,W.）、ロビンズ,ケイ・シー（Robbins,K.C.）およびアーランソン,エス・エイ（Aaranson,S.A.）（１９８９年）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）,第９巻,３５３８〜３５４２頁
【非特許文献２】シライシ,ティー（Shiraishi,T.）ら（１９８９年）クリニカ・キミカ・アクタ（Clin.Chim.Acta）,第１８４巻,６５〜７４頁
【非特許文献３】ハート,シー・イー（Hart,C.E.）、ベイリー,エム（Bailey,M.）、カーチス,ディー・エイ（Curtis,D.A.）、オズボーン,エス（Osborn,S.）、レイネス,イー（Raines,E.）、ロス,アール（Ross,R.）およびフォーストーム,ジェイ・ダブリュ（Forstrom,J.W.）（１９９０年）バイオケミストリー（Biochemistry）,第２９巻,１６６〜１７２頁
【非特許文献４】バスボトン,エフ・エス（Vassbotn,F.S.）、ランゲランド,エヌ（Langeland,N.）、ハーゲン,アイ（Hagen,I.）およびホルムセン,エイ（Holmsen,A.）（１９９０年）バイオケミ・バイオフィジ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）,第１０５４巻,２４６〜２４９頁
【非特許文献５】レイネス,イー・ダブリュ（Raines,E.W.）およびロス,アール（Ross,R.）（１９８２年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）,第２５７巻,５１５４〜５１６０頁
【非特許文献６】ヘルジン,シー−エイチ（Heldin,C-H.）、ウェスターマーク,エイ（Westermark,A.）およびワステソン,エイ（１９８１年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）,第７８巻,３６６４〜３６６８頁
【非特許文献７】フアング,ジェイ・エス（Huang,J.S.）、フアング,エス・エス（Huang,S.S.）およびデュエル,ティー・エフ（Deuel,T.F.）（１９８３年）ジャーナリ・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell Biol.）,第９７巻,３８３〜３８８頁
【非特許文献８】サイバーグ,ジェイ（Thyberg,J.）ら（１９９０年）ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（J.Cell Sci.）,第９７巻,２１９〜２２９頁
【非特許文献９】ロビンズ,ケイ・シー（Robins,K.C.）ら（１９８３年）ネイチャー（Nature）,第３０５巻,６０５〜６０９頁
【非特許文献１０】フェルンス,ジー・エイ・エイ（Ferns,G.A.A.）ら（１９９１年）サイエンス（Science）,第２５３巻,１１２９〜１１３２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の解決課題は、血小板由来増殖因子アナログおよび細胞抗増殖剤としてのそれらの使用を提供すること、ならびに該血小板由来増殖因子アナログに対する抗体であって、ＰＤＧＦの悪影響を抑制する抗体、それらの製造方法ならびにそれらの使用を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
（１）以下のもの：
2005112862.tif 000002
のうちのいずれかから選択される血小板由来増殖因子ペプチドアナログに結合する抗体、
（２）ペプチド
2005112862.tif 000003
に結合する（１）の抗体、
（３）下記のもの：
（ｉ）以下のものからなる群より選択される第１の配列：
2005112862.tif 000004
（ｉｉ）第１の配列に連結されており、以下のものからなる群より選択される第２の配列：
2005112862.tif 000005
および
2005112862.tif 000006
ならびに所望により
（ｉｉｉ）該第１の配列と該第２の配列との間に存在するスペーサーエレメント
を必須として含む血小板由来増殖因子ペプチドアナログに対する抗体、
（４）スペーサーエレメントが４ないし６個のアミノ酸残基およびヘテロ二官能基架橋剤からなる群より選択されるものである（３）の抗体、
（５）該スペーサーがポリグリシルである（４）の抗体、
（６）該スペーサーが−（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ）−である（４）の抗体、
（７）該スペーサーがＳＭＣＣ（Ｎ−（４−カルボキシ−シクロヘキシル−メチル）−マレイミド）である（４）の抗体、
（８）該第１の配列がＧＰ１またはＧＰ２である（３）ないし（７）のいずれかの抗体、
（９）該第２の配列がＧＰ７である（３）ないし（７）のいずれかの抗体、
（１０）ペプチドが環状である（１）ないし（３）のいずれかの抗体、
（１１）ペプチドが下記アミノ酸配列：
2005112862.tif 000007
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、環化しているものである、（１０）の抗体、
（１２）下記アミノ酸配列：
2005112862.tif 000008
2005112862.tif 000009
［式中：
［Ｘａ］＝架橋スペーサーアーム；
------［ａａ１］＝環化前のＣ末端のアミノ酸残基であることを示す；
------［ａａ２］＝環化前のＮ末端のアミノ酸残基であることを示す］
からなる血小板由来増殖因子ペプチドアナログに結合する抗体、
（１３）（１）〜（１２）のいずれかにおいて定義されたペプチドを免疫原として使用することを含む方法を用いて得られる抗体
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＰＤＧＦアナログに対する抗体、それらの製造方法ならびにそれらの使用が提供され、本発明の抗体を用いれば、ＰＤＧＦの悪影響に関連した疾病の治療および予防が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、本明細書に記載する新規ＰＤＧＦアナログに対する抗体を提供するものである。
【００１２】
また本発明は、新規ＰＤＧＦペプチドアナログ、およびそれらからなる、あるいはそれらを含有する、抗増殖剤、詳細には、抗アテローム性動脈硬化剤、抗アテローム発生剤、抗炎症剤または抗線維症剤として使用する組成物を提供する。また、本発明は、かかる新規ＰＤＧＦペプチドアナログ、およびそれらからなる、あるいはそれらを含有する、傷害の治癒に使用するためのＰＤＧＦアゴニストとして使用する組成物を提供する。
本発明による特別なＰＤＧＦアナログは下表１において同定されている。好ましくは、本発明の他の態様および具体例において調製され使用される本発明ＰＤＧＦペプチドは、９０％よりも高純度であり、より好ましくは９５％よりも高純度であり、さらにより好ましくは９９％よりも高純度である。
【００１３】
本発明による医薬組成物は、好ましくは、医薬上許容される希釈剤および／または担体と一緒になった１種またはそれ以上のＰＤＧＦアナログからなる。適当な担体／希釈剤は当該分野においてよく知られており、所望により緩衝塩および保存料のごときさらなる成分を含んでいてもよいセイラインまたは他の滅菌水性媒体、あるいは砂糖、澱粉、塩またはそれらの混合物を包含する。
本発明によるペプチドは、投与プロトコールおよび／または患者のニーズに適合するどのような形態での使用に提供されてもよい。
【００１４】
上記の医薬上許容される組成物とは異なり、ペプチドを、例えば、単独でまたは組み合わせて、親液性化または凍結乾燥された固体の形態で提供してもよい。
ＧＰ１、ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ９およびＧＰ１０（下表１において同定されている）（それぞれ、配列番号：１、２、３、４、５および６）からなる群より選択される第１のアナログおよびＧＰ５、ＧＰ６、ＧＰ７、ＧＰ８、ＧＰ２１ａ、ＧＰ２１およびＧＰ２２（下表１において同定されている）（配列番号：７、８、９、１０、１１、１２および１３）からなる群より選択される第２のペプチドアナログからなる結合ペプチドは本発明の範囲内である。
さらに本発明は、アッセイおよびアッセイ用キットに使用するための新規ＰＤＧＦペプチドアナログを提供する。
【００１５】
１個またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている、あるいはスペーサー、例えば、チチオール基またはジアミノ基または下表２に示すＧＰ１１、ＧＰ１２、ＧＰ１３ならびにＧＰ１４（それぞれ、配列番号：１４、１５、１６および１７）のように複数のグリシンのごときアミノ酸残基を挿入されている本明細書で記載され同定されたペプチドアナログは本発明の範囲内であることが理解されよう。また、スペーサーはホモ−またはヘテロ−二官能基架橋剤であってもよく、例えば、下表３に示すペプチドＧＰ２０およびＧＰ２３（それぞれ、配列番号：１８および１９）のようにヘテロ二官能基架橋剤Ｎ−（４−カルボキシ−シクロヘキシル−メチル）−マレイミドであってもよく、もちろん、通常は、ペプチド必須活性は不変である。
【００１６】
さらに本発明は、下表４に示すＧＰ４およびＧＰ８由来の環状ペプチドであるＧＰ２４およびＧＰ２５の合成および使用を提供する。
さらに本発明は、アッセイおよびアッセイ用キットに使用するための、遊離形態あるいは蛋白または固体粒子のごとき担体分子に結合した形態のいずれかであるＰＤＧＦペプチドアナログ、ならびに下表５に示すような、例えば、ビオチンまたはフルオレセインイソチオシアネートで修飾されたペプチドＧＰ１５、ＧＰ１６、ＧＰ１９、ＧＰ１７およびＧＰ１８（それぞれ、配列番号：２０、２１、２２、２３および２４）を提供する。
【００１７】
さらに本発明は、有効量の上記定義のＰＤＧＦペプチドアナログの使用または投与、特に宿主に対する使用または投与による、細胞増殖、詳細には平滑筋細胞、３Ｔ３−線維芽細胞、結合組織細胞または炎症細胞の増殖を阻害または刺激する方法を提供する。
さらに本発明は、有効量の上記定義のＰＤＧＦペプチドアナログの、例えば宿主に対する使用または投与からなる、ＰＤＧＦにより誘導されるＤＮＡ合成の阻害または刺激方法を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、上で同定された細胞のごとき細胞の増殖および／または化学走性の阻害または刺激に使用するための上記定義のＰＤＧＦペプチドアナログを提供する。
さらに本発明は、ＰＤＧＦに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産のための免疫原として使用する、特別には診断、予防および治療用途の上記定義のＰＤＧＦペプチドアナログ、特に、本発明結合ペプチドアナログを提供する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のかかる製造方法も本発明の範囲内である。得られた抗体用いてＰＤＧＦの過剰な作用あるいは悪影響を抑制することができる。
【００１９】
本発明において、例えば、有効量の１種またはそれ以上の上記定義のＰＤＧＦペプチドアナログを投与または使用することによる、ＰＤＧＦにより誘導されるＤＮＡ合成を阻害する方法において新規ＰＤＧＦアナログが提供され使用される。
本明細書記載のいずれの方法においても、本発明ペプチドの投与をいずれのプロトコールによっても投与することができる。好ましくは、宿主、特別にはヒト宿主への投与は静脈注射または輸液によるものであり、全身的であっても局所的であってもよい。本発明ペプチドのかかる投与は、意図された部位におけるペプチドの活性の所望の有効な結果を生じさせるような量で行う。よって、「有効」量を構成する量は、患者の体重、必要とされる活性の程度、活性が意図された部位、治療または予防される症状の重さのごとき種々のパラメーター（それらすべてが当業者に十分理解され認識されている）に依存しうる。
一般的には、約１ないし約１００ｍｇ ｍｌ−１、より好ましくは約１ないし約１０ｍｇ ｍｌ−１の血漿中濃度を与えるペプチドの量（または全量）が投与されるであろう。
添付図面を参照して本発明はさらに詳細に説明されるであろう。
【００２０】
方法
【００２１】
１）ＰＤＧＦ−ＢＢペプチドアナログの合成
ＦＭＯＣ−ポリアミド連続法を用いるミリジェン９０５０ペプシンセサイザー（Milligen 9050 Pepsynthesizer）による固相により、下表１に掲載する、修飾された、あるいは修飾されていない一連のＰＤＧＦ関連ペプチドを合成した。
合成完了後、ペプチドのＮ末端のアセチル化を行った。ジメチルホルムアミド中の４５％無水酢酸を用いて固体支持体上で樹脂をアセチル化した。脱保護および樹脂の開裂を通常の方法で行った。
ペプチドがまだ樹脂に結合しており、かつ脱保護の前に、ビオチン化およびＦＩＴＣ標識を行った。ビオチン−カプロエート−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（Ｂ−ＮＨＳ）およびフルオレセインイソチオシアネートを用いてペプチドの遊離Ｎ末端を標識した。
ＨＰＬＣによりすべてのペプチドを少なくとも９５％の均一性にまで精製し、質量スペクトル法によりそれらの分子量を決定した。図７、８および９は、それぞれ、ペプチドＧＰ４、ＧＰ８およびＧＰ１４のＨＰＬＣおよび質量スペクトルのプロフィールを示す。
【００２２】
２）培養中の線維芽細胞に対するＰＤＧＦの影響
レイネス（Raines）およびロス（Ross）［２８］により記載された[３Ｈ]−チミジン取り込みアッセイを用いて、ネズミ・線維芽細胞系Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３．Ａ３１に対するペプチドの刺激または阻害効果を調べた。
【００２３】
３）３Ｔ３細胞およびヒト・平滑筋細胞への１２５Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合に対するＰＤＧＦペプチドの影響
エングストロム（Engstrom）ら［６］により記載されたようにＰＤＧＦ−ＢＢ結合阻害アッセイを行った。ネズミ・線維芽細胞系３Ｔ３．Ａ３１およびヒト・大動脈平滑筋細胞を用いた。
【００２４】
４）ＰＤＧＦ−ペプチドに対する抗血清の生産
フロイントのアジュバントと混合された遊離形態であるかまたは担体蛋白（チログロブリンまたはキーホール・ヘモシアニン）に結合したペプチドを用いてウサギおよびマウスを免疫した。ＥＬＩＳＡ、ドットブロットアッセイ、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後ウェスタンブロッティングにより、ペプチドおよびＰＤＧＦに対する抗体の生産に関して抗血清を試験した。
【００２５】
５）ヒト・平滑筋細胞への１２５Ｉ−ＰＤＧＦの結合に対する抗−ＰＤＧＦペプチドの影響
製造者（スウェーデン、ウプサラ（Uppsala）のファルマシア（Pharmacia））により記載されたようにして、プロテインＧ−セファロースカラムによるアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリクローナルな抗−ＰＤＧＦペプチド抗血清のＩｇＧを抗血清から精製した。ペプチドについての方法（上記方法３）と本質的に同じ手順でを用いて、ヒト・平滑筋細胞への放射性標識ＰＤＧＦ−ＢＢの結合に対するＩｇＧの影響を調べた。その試験においてペプチドをＩｇＧに置き換えた。
【００２６】
結果
培養中の細胞におけるチミジン取り込みを刺激する能力に関してペプチドを試験した。
図１は、いくつかのペプチドに関して得られた結果の例を示す。ペプチドＧＰ４は、ＰＤＧＦ−ＢＢに対するアゴニストとして作用して、最高の刺激効果を示した。また、Ｃ末端システイン残基の還元およびアルキル化によりＧＰ４のマイトジェン効果は完全に消失した。このことは、該ペプチドは細胞とともにインキュベーションしている間にダイマー形態を形成することにより作用すること、および刺激活性の増大を起こすのはダイマー化であることを強く示唆する。ＧＰ４と同じアミノ酸配列であるがＣ末端システインがないペプチドＧＰ２の低い刺激効果によってもこの結論が支持される。
ペプチドＧＰ８はＧＰ４ほど刺激的でない。
【００２７】
３Ｔ３細胞への放射性標識ＰＤＧＦ−ＢＢの結合に対する結合を阻害する能力に関していくつかのペプチドを試験した。図２Ａに示すように、ＧＰ４は試験濃度においてはあまり大きくない結合阻害を示した。
図２Ｂに示すように、ペプチドＧＰ２０およびＧＰ１４はヒト・平滑筋細胞への標識ＰＤＧＦの結合に対する強力な阻害剤であった。
【００２８】
ＥＬＩＳＡにより調べたところ、図３Ａおよび３Ｂに示すように、チログロブリンに結合したＧＰ４ならびにＧＰ８ペプチドで免疫されたウサギは、対応する免疫ペプチドに対する高力価の抗体を生じた。
【００２９】
また、ＧＰ４で免疫されたウサギのうち１匹はネイティブなＰＤＧＦ−ＢＢと反応する抗体を生産し、該抗体はヒト・組み換え線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ならびに上皮成長因子（ＥＧＦ）とは交差反応性を有しなかった。これを図４に示す。
【００３０】
下表６、７および８は、ＰＤＧＦ由来のペプチドに対して生成したポリクローナルおよびモノクローナル抗体の免疫化学的特徴づけの結果をまとめてある。
ネイティブおよび還元ＰＤＧＦ−ＢＢとのポリクローナル抗血清反応性のウェスタンイムノブロット分析（表６）は、ペプチドＧＰ４およびＧＰ２１ａはネイティブなＰＤＧＦと反応する抗体を生成したことを示す。競争的ＥＬＩＳＡのデータを表７に示す。チログロブリンに結合したペプチドＧＰ４に対して生成された１５種のモノクローナル抗体ハイブリドーマは表８に示すように免疫化学的に特徴づけられた。図５Ａおよび５Ｂは、ＰＤＧＦ−ＢＢに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗血清に関する典型的な滴定曲線を示す。
【００３１】
図６に示すように、ペプチドＧＰ４ならびにＧＰ２１ａで免疫されたウサギ由来のＩｇＧフラクションは、培養中のヒト・平滑筋細胞への放射性標識ＰＤＧＦ−ＢＢの結合の阻害において有効であった。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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［Ｘａ］＝架橋スペーサーアーム；
------［ａａ１］＝環化前のＣ末端のアミノ酸残基であることを示す；
------［ａａ２］＝環化前のＮ末端のアミノ酸残基であることを示す
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【００３２】
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のＰＤＧＦアナログペプチドは、例えばＰＤＧＦの作用を増強するための医薬の製造等に使用でき、それらに対する抗体はＰＤＧＦの悪影響に関連する疾病の治療および予防のための医薬の製造等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、種々のＰＤＧＦ関連ペプチドの相対的なマイトジェン効果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、１２５Ｉ−ＰＤＧＦ結合アッセイの結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１２５Ｉ−ＰＤＧＦ結合アッセイの結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＧＰ４に対する抗−Ｔｇ−ＧＰ４の滴定結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＧＰ８に対する抗−Ｔｇ−ＧＰ８の滴定結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する抗−Ｔｇ−ＧＰ４の滴定結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＦＧＦならびにＥＧＦに対する抗−Ｔｇ−ＧＰ４の滴定結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する直接的ＥＬＩＳＡによる、選択ポリクローナル抗体の滴定結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する直接的ＥＬＩＳＡによる、モノクローナル抗体の滴定結果を示す。
【図６】図６は、ヒト・平滑筋細胞への放射性標識ＰＤＧＦ−ＢＢの結合に対する抗−ペプチド抗体による阻害を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ペプチドＧＰ４のＨＰＬＣを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ペプチドＧＰ４の質量スペクトルのプロフィールを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ペプチドＧＰ８のＨＰＬＣを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ペプチドＧＰ８質量スペクトルのプロフィールを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ペプチドＧＰ１４のＨＰＬＣを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ペプチドＧＰ１４質量スペクトルのプロフィールを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2005112862.tif 000035
【図６】
2005112862.tif 000036
【図７Ａ】
2005112862.tif 000037
【図７Ｂ】
2005112862.tif 000038
【図８Ａ】
2005112862.tif 000039
【図８Ｂ】
2005112862.tif 000040
【図９Ａ】
2005112862.tif 000041
【図９Ｂ】
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【配列表】
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