(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物の提供。【解決手段】  ヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物は、金属用キレート剤、特定リガンドおよび好ましくはプロテアーゼ阻害剤とともにヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の濃縮物を含み、ｖＷＦの活性を保護し、ＦＶＩＩＩに対する防御効果も維持し、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の安定性を改善する。金属用キレート剤はＥＤＴＡが、リガンドはヘパリンが好ましく、プロテアーゼ阻害剤の濃度は０．０１ＩＵより大きい濃度が好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属用キレート剤、特定リガンドおよび好ましくはプロテアーゼ阻害剤とともにヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の濃縮物を含むことを特徴とする、ヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項２】
前記金属用キレート剤は、前記濃縮物の２〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で使用されることを特徴とする、請求項１に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項３】
前記金属用キレート剤はＥＤＴＡであることを特徴とする、請求項１に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項４】
前記金属用キレート剤はＥＤＴＡＣａＮａ２（ＥＤＴＡのナトリウムおよびカルシウム塩）であることを特徴とする、請求項１に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項５】
前記リガンドは、前記濃縮物の０．１〜１０Ｕ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする、請求項１に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項６】
前記リガンドはヘパリンであることを特徴とする、請求項１に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項７】
前記リガンドはヘパリンナトリウムであることを特徴とする、請求項１に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項８】
前記プロテアーゼ阻害剤は、０．０１  ＩＵ／ＩＵ  ＦＶＩＩＩより大きい濃度で存在することを特徴とする、請求項１に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項９】
前記プロテアーゼ阻害剤は、０．０１〜１  ＩＵ／ＩＵ  ＦＶＩＩＩの濃度で存在することを特徴とする、請求項８に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項１０】
前記プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）であることを特徴とする、請求項１に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【請求項１１】
前記セリンプロテアーゼ阻害剤はアンチトロンビンであることを特徴とする、請求項１０に記載のヒト由来のＦＶＩＩＩもしくはｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の生物学的に安定な液体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）もしくはフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）または第ＶＩＩＩ因子／フォン・ビルブラント因子複合体（ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ）の生物活性の安定性が維持され、治療上使用することが可能な液体組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＶＩＩＩ（第ＶＩＩＩ凝固因子）は、血液凝固の固有の経路のコースに必須である血漿タンパク質である。このＦＶＩＩＩの欠損または欠陥は、Ｘ染色体に関連した遺伝病である血友病Ａとして知られる凝固メカニズムの衰退を招く。フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）は、損傷した血管表面への血小板付着を担う血漿タンパク質であり、したがってｖＷＦの量的または質的欠陥（フォン・ビルブラント病）は初期止血の衰退をもたらす。さらに、ｖＷＦは、血漿中でＦＶＩＩＩ輸送体として作用する（非特許文献１）。
【０００３】
自然状態でのＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体は、ＦＶＩＩＩ：ｖＷＦにおいて１：１００の比を有し、すなわちｖＷＦのおよそ１００個の分子毎に対してＦＶＩＩＩの１個の分子が存在し、したがってＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の安定性の結果は、精製ｖＷＦ濃縮物に当てはまる。
【０００４】
精製ＦＶＩＩＩ濃縮物は、血友病Ａの治療用に臨床的実践で使用されている。高含有量のｖＷＦを有するＦＶＩＩＩ濃縮物もまた、フォン・ビルブラント病の治療用に治療上使用することができる。
【０００５】
タンパク質、特に不安定な生物活性を有するタンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ）の安定性は、それらの治療用調製物にとって主要な問題である。この問題は、製品を凍結乾燥させることでこれまで解決されてきており、したがってＦＶＩＩＩ、ｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦの濃縮物の治療用調製物は、それらの生物活性を保護するために凍結乾燥形態で入手可能である。現段階では、液体最終配合物でのＦＶＩＩＩ、ｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖｗＦの治療用濃縮物は世界中のどこにも販売されていない（非特許文献２）。
【０００６】
凍結乾燥は、高価であり、さらに製品の収量を減少させるプロセスである。したがって、液体配合物は、凍結乾燥物の再構成を回避するため、より簡単な投与を可能にする。また、適切な注入デバイスに予め計りとった液体製品（すぐに使用できる）を患者に利用しやすくすることができることにより、患者が抱く患者の疾患および患者に製品への依存の理解の点で心理的な有益性をもたらし得る。
【０００７】
上述のように、これ以降に挙げる文献に関わらず、現段階では、液体配合物でのＦＶＩＩＩ、ｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の治療用濃縮物は世界中のどこにも販売されていない。
【０００８】
ＦＶＩＩＩの安定性に関するこれまでの参照文献が存在する。
【０００９】
特許文献１は、アルギニンならびに洗浄剤および／または有機ポリマーを有するＦＶＩＩＩの配合物に関する。この配合物は、安定剤としてアルブミンを添加することや、それを用いて１０００ＩＵ／ｍｇを上回る比活性を達成することも予知していない。このＦＶＩＩＩは凍結乾燥最終形態である。
【００１０】
特許文献２は、凍結乾燥ＦＶＩＩＩ濃縮物の再構成を容易にする目的で、アルギニンを有する配合物に関する。
【００１１】
特許文献３は、プロセス工程中でＦＶＩＩＩを安定化するために、炭水化物を使用することに関する。このＦＶＩＩＩも凍結乾燥最終形態である。
【００１２】
特許文献４は、血漿タンパク質、特に凝固因子、具体的にはＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの安定な液体配合物に関するが、それはｖＷＦにも関する。概して、その目的は、４℃〜３７℃で３年以上の安定性であり、活性の５０％を維持することである。実施例の大部分は、ＦＩＸに関するものであり、異なる分子が関与しているため、その安定性は、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の安定性に匹敵しない。ＦＶＩＩＩを用いて実施した試験は、その目的が最終生成物の安定性ではなく、連続短期注入（数時間または数日）用のポンプでの使用であるため、３７℃で実施されている。それらの試験では、５日後のＦＶＩＩＩの水性配合物がその活性の５０％以上を損失した。したがって、液体配合物（水中）は、それが治療用製品として販売されるのに十分な安定性、すなわち必要とされる６ヶ月以上、好ましくは１年以上の貯蔵寿命を提供しない。
【００１３】
特許文献５は、ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱおよびＦＩＸの溶液中の安定化に関する。この安定化は、炭水化物の添加、ならびに溶液の酸素含有量の低減あるいは酸化防止剤の添加および／または酸素の乏しい雰囲気中もしくは不活性ガス中での保管により実施される。この配合物は、ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱ（これは、相当する遺伝子に由来する配列の大部分が排除された遺伝子操作により得られるタンパク質である）を参照して開発され特許となっている。提示されたデータは、２５℃で１２ヶ月間の安定性および７℃で１８ヶ月間の安定性を実証する。ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱは遺伝的に改質された分子であるため、それらの結果は、血漿由来の天然ヒトＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体に匹敵しない。ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱは、非ヒト細胞で「試験管内で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」合成されるのに対し、血漿由来のヒトＦＶＩＩＩは、ヒト肝臓で「生体内で（ｉｎ  ｖｉｖｏ）」合成される。このことは、これらの分子間にかなりの差異（例えば、分子中の糖の含有量の変化（これは、血漿半減期のような薬物動態の差異に反映される））が存在することを意味する。さらに、ｒ−ＦＶＩＩＩ  ＳＱは、分子の一部（ほぼ４０％）の欠失を包含する。著者によっては、組換え由来の第ＶＩＩＩ因子を用いた阻害剤の開発におけるより大きな影響を報告している。このことにより、可能であれば、ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱのようなこれらの組換え因子は天然ヒトＦＶＩＩＩとさらに識別される。したがって、血漿由来のヒトＦＶＩＩＩの分子はｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱと異なる分子であり、それらは異なる分子であるため、その安定性は比較することができないことが考慮されなくてはならない。ｖＷＦはｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱには存在しないことも留意されなくてはならない。
【００１４】
特許文献６は、皮下、筋内または皮内投与用の１０００ＩＵ／ｍｌの最小濃度でのｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱの配合物に関する。上述の場合と同じ分子が関与するため、その結果は、ヒト由来のＦＶＩＩＩ、ｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体に匹敵しない。
【００１５】
特許文献７は、特定濃度の二価金属イオンの存在を溶液中のｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱの安定性の改善と関連させており（具体的には、Ｚｎ２＋およびＣｕ２＋）、また界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ）およびヒスチジンの存在も考慮している。この特許は、ｒ−ＶＩＩＩ  ＳＱを安定化するための別の試みを表しており、本発明の主題から逸脱している。
【００１６】
したがって、治療用製品として使用することができるのに十分な期間、液体配合物において生物活性を提示することが可能であるような、すなわち６ヶ月以上の間溶液中で安定である血漿由来の天然ヒトＦＶＩＩＩ、ｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の安定化に関する従来技術は存在しない。
【特許文献１】スペイン特許第ＥＳ  ２．１１１．５７９号
【特許文献２】米国特許第５，３９９，６７０号
【特許文献３】スペイン特許第２．０９７．１２０号
【特許文献４】米国特許第５，９２５，７３８号
【特許文献５】ＰＣＴ  ＷＯ  ９６／３００４１号
【特許文献６】ＥＰ  ７１０  １１４号
【特許文献７】ＰＣＴ  ＷＯ  ０１／０３７２６号（ＥＰ  １  １９４  １６１号）
【非特許文献１】Physiological and clinical aspects of Von Willebrand factor; Haematologica Vol 86, suppl. 4, November 2001
【非特許文献２】W. Wang et al./International Journal of Pharmaceutics 259/2003; 1-15
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、治療上使用することが可能であるのに十分な期間（５℃で６ヶ月以上）、ＦＶＩＩＩ、ｖＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の活性の十分な安定化を可能にする液体配合物（ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦの最小回収率およそ５０％）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者等により実施した研究は、ｖＷＦの活性に対する強力な酸化防止剤（例えば、ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン））の負の作用、および金属用キレート剤によるそれらの置き換えがｖＷＦの活性を保護し、またＦＶＩＩＩに対する防御的効果も維持するという事実を解明した。
【００１９】
さらに、実施した研究により、プロテアーゼ阻害剤（例えば、アンチトロンビン）および特定リガンド（ヘパリン）の添加によりＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の安定性の改善が達成されたことが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
したがって、特にアルブミン、アミノ酸、界面活性剤、酸化防止剤（例えば、ビタミンＣ）を含有し、および／また酸素の乏しい雰囲気中で保管されるベース配合物に関して、金属用キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（２〜１００ｍｍｏｌ／ｌ））、プロテアーゼ阻害剤（例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）および特にアンチトロンビン（０．０１〜１  ＩＵ／ＩＵ  ＦＶＩＩＩ））、および特定リガンド（例えば、ヘパリン（０．１〜１０Ｕ／ｍｌ））の添加により、液体配合物中のＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の十分な安定性が達成され、治療用製品として使用することができる。
【００２１】
［実施例］
ＦＶＩＩＩ凝固剤（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）は国際単位で表され、その濃度は国際単位／ミリリットル（ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌ）で表される。ｖＷＦ活性は、リストセチン補因子（ＲＣｏ）、ＩＵ／ｍｌとして表される。
【実施例１】
【００２２】
２つの異なる濃度（２５ＩＵ／ｍｌおよび１００ＩＵ/ｍｌ）でのアルブミン５％、アルギニン２００ｍｍｏｌ／ｌ、ヒスチジン２５ｍｍｏｌ／ｌ、ＣａＣｌ２５ｍｍｏｌ／ｌとともに配合したＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体（２５および１００ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌ）の５℃および２５℃での安定性の結果（活性の回収率％）。
【００２３】
【表１】
2005112855.tif 000002
【００２４】
【表２】
2005112855.tif 000003
【００２５】
結果は、５℃で得られるＦＶＩＩＩ回収率と２５℃で得られるＦＶＩＩＩ回収率との間に良好な相関を示し、２５℃での１週の保存期間（加速安定性研究の条件）が５℃（目標温度）で１ヶ月の保存期間に等価であるということが表で観察される。
【実施例２】
【００２６】
下記とともに配合したＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体（２５ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌ）は以下の安定性の結果を与える：
【００２７】
【表３】
2005112855.tif 000004
【００２８】
【表４】
2005112855.tif 000005
【００２９】
これらの結果は、強力な還元剤（例えば、ＮＡＣ）のＦＶＩＩＩ：Ｃ活性に対する防御的効果を金属用キレート剤の添加で置換することができることを示す。ＮＡＣの存在はｖＷＦ活性の大きな損失をもたらす。ヘパリンは、ｖＷＦ活性の保護剤として作用することが観察される。
【００３０】
ＦＶＩＩＩ濃度２５ＩＵ／ｍｌでのＥＤＴＡおよびヘパリンナトリウムを含む配合物Ｂ１（これは、２５℃で８週間安定である）を用いた場合、実施例１の結果により５℃で少なくとも８ヶ月の貯蔵寿命を推定することが可能である。
【実施例３】
【００３１】
下記とともに配合したＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体（２５ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌ）は以下の安定性の結果を与える：
【００３２】
【表５】
2005112855.tif 000006
【００３３】
【表６】
2005112855.tif 000007
【００３４】
金属用キレート剤およびヘパリンを含有する溶液中で、強力な還元剤（ＮＡＣ）の存在は、ＦＶＩＩＩ：Ｃに対して大きな有益性なく、ｖＷＦ：ＲＣｏ活性の損失をもたらすのに対し、ＥＤＴＡおよびヘパリンナトリウムを含むＦＶＩＩＩの２５ＩＵ／ｍｌの濃度での配合物Ｂ２、Ｃ２およびＤ２を用いると、５℃で少なくとも８ヶ月の貯蔵寿命を推定することが可能である。
【実施例４】
【００３５】
グリシン２８０ｍｍｏｌ／ｌ、アルギニン３５０ｍｍｏｌ/ｌ、ヒスチジン２５ｍｍｏｌ／ｌ、ＣａＣｌ２５０ｍｍｏｌ／ｌ、アルブミン５％、ビタミンＣ１００ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０  ５０ｐｐｍ、ｐＨ５．１０ならびに下記の可変濃度のＥＤＴＡＣａＮａ２およびヘパリンナトリウムとともに配合したＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体（２５ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌ）は以下の安定性の結果を与える：
【００３６】
【表７】
2005112855.tif 000008
【００３７】
【表８】
2005112855.tif 000009
【００３８】
ＦＶＩＩＩ濃度２５ＩＵ／ｍｌでは、ヘパリンと金属キレート化剤（ＥＤＴＡ）の併用添加により、上述の配合物にｖＷＦの活性に関して高度の安定性が提供される。５℃で少なくとも８ヶ月の貯蔵寿命を推定することが可能である。
【実施例５】
【００３９】
製品の６つの別個のバッチにおける２００ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌでの提唱配合物（グリシン２８０ｍｍｏｌ／ｌ、アルギニン３５０ｍｍｏｌ／ｌ、ヒスチジン２５ｍｍｏｌ／ｌ、ＣａＣｌ２５０ｍｍｏｌ／ｌ、ヘパリン１Ｕ／ｍｌ、ＥＤＴＡＣａＮａ２５０ｍｍｏｌ／ｌ、アルブミン５％、ビタミンＣ１００ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０  ５０ｐｐｍ、配合物のｐＨ６．３）の研究は以下の安定性の結果を与える（２５℃で８週）：
【００４０】
【表９】
2005112855.tif 000010
【００４１】
製品の濃度が増大すると（２５から２００ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌへ）、より低い活性が観察される。研究全体にわたっての活性の発生の監視は、初期と最終時期に加えて、２週、４週および６週の安定性のサンプリングを含む。研究した６つのバッチから得られたデータすべてを使用して、ＦＶＩＩＩ：ＣおよびｖＷＦ：ＲＣｏの活性の全体的な挙動を推定することが可能であり、それを一次速度論に適合させる。この分析から、活性の５０％程度の回収率（ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦ）が２５℃で６週後（これは５℃での６ヶ月と等価である）に得られることを推定することが可能である。
【実施例６】
【００４２】
プロテアーゼ阻害剤の防御的効果の研究。製品の６つの別個のバッチで２００ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌにて提唱配合物を試験した。
【００４３】
グリシン２８０ｍｍｏｌ／ｌ、アルギニン３５０ｍｍｏｌ／ｌ、ヒスチジン２５ｍｍｏｌ／ｌ、ＣａＣｌ２５０ｍｍｏｌ／ｌ、アルブミン５％、ビタミンＣ１００ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０  ５０ｐｐｍ、配合物のｐＨ６．３、ヘパリン１Ｕ／ｍｌ、ＥＤＴＡＣａＮａ２５０ｍｍｏｌ／ｌおよびアンチトロンビン（０．０５Ｉ  Ｕ／ＩＵ  ＦＶＩＩＩ）は以下の安定性の結果を与える（２５℃で８週）：
【００４４】
【表１０】
2005112855.tif 000011
【００４５】
プロテアーゼ阻害剤（アンチトロンビン）の添加により、第ＶＩＩＩ因子に関して、およびリストセチン補因子（ｖＷＦ）の活性に関してともに製品の安定性が増大する。実施例５で実施した分析と並行させた分析により、２５℃で１２週後（これは５℃での１２ヶ月と等価である）に活性（ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦ：ＲＣｏ）の５０％回収率を推定することが可能である。
【００４６】
上記実施例から、低濃度の製品（２５ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍｌ）にて、金属用キレート剤（ＥＤＴＡ）およびヘパリンの添加により、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体に関してより大きな安定性が提供されることが理解されよう。この安定化は、高濃度のＦＶＩＩＩおよびｖＷＦ活性でさえ、プロテアーゼ阻害剤（アンチトロンビン）の添加で改善される。