(57)【要約】【課題】試薬の操作中ならびに保存中に、増幅反応が進んでしまうという問題を克服し、等温での核酸増幅に使用される試薬の安定性、性能ならびに使用操作の簡便性を大幅に改善すること。【解決手段】増幅に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して標的遺伝子配列と競合する配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ、当該オリゴヌクレオチドと前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの間のＴｍ値に対する、前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと該プライマーの塩基配列と実質的に相補的な標的遺伝子の核酸配列との間のＴｍ値の比が、１．２〜３．３の範囲であり、さらに当該オリゴヌクレオチドの３’末端が伸長できないようにブロックされたオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ、遺伝子増幅反応液中に共存させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子増幅試薬の安定化方法であって、遺伝子増幅反応に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用し、当該オリゴヌクレオチドと前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの間のＴｍ値に対する、前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと該プライマーの塩基配列と実質的に相補的な標的遺伝子の核酸配列との間のＴｍ値の比が、１．２〜３．３の範囲であり、さらに当該オリゴヌクレオチドの３’末端が伸長できないようにブロックされたオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ、遺伝子増幅反応液中に共存させることを特徴とする方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子増幅反応における試薬およびキットの安定性・操作条件の簡便化の改良に関し、特に等温遺伝子増幅法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、目的の遺伝子を増幅する技術は、数多く報告されている。
例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献１〜３参照）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献４参照）、さらに最近では温度サイクリングを必要とせず、一定温度で遺伝子を増幅する遺伝子増幅法である、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献５参照）、改良ＳＤＡ法（例えば、特許文献６〜８参照）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献９参照）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法（例えば、特許文献１０または１１参照）など様々な方法が報告されている。
【０００３】
上記遺伝子増幅法においては、頻繁に非特異的増幅が生じるという問題点を解決するため、色々な解決策がとられてきた。例えば、ＰＣＲ法においては、その一つとしてホットスタート法とよばれる高温になって初めて核酸ポリメラーゼを働かすことによって非特異的増幅を解決しようとする方法がある。この方法には、ポリメラーゼに対する抗体を使用する方法（例えば、非特許文献１参照）、高温で融解するワックス内にマグネシウムをトラップさせる方法（例えば、特許文献１２または１３参照）、ある種の核酸によって核酸ポリメラーゼを可逆的に阻害させる方法（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー社製））などが存在する。
これらの方法は、６５℃〜９８℃という変性・増幅温度を用いるＰＣＲ法においては有用な改良法であるが、４０℃〜６５℃という中程度高温で等温で遺伝子増幅反応を行う上記遺伝子増幅方法などには活用できない技術であった。
【０００４】
また、増幅反応における特異性を高める、つまり希望しない副反応を阻害する方法としては、非伸長性のオリゴブロッカーを増幅用プライマー間に設定しこの共存下でＰＣＲ反応を実施する方法（例えば、特許文献１４参照）、ペプチド核酸を用いるＰＣＲ法（例えば、非特許文献２または特許文献１５参照）などが開示されている。しかしながら、これらの方法は中程度高温での等温遺伝子増幅法には適応し難い方法である。そして上記に挙げた改良法は、特にＰＣＲ法においての非特異的増幅を阻害することに限定されており、等温遺伝子増幅法における試薬混合物の安定性や煩雑な操作の改善を可能にするものではなかった。
【０００５】
その他の増幅反応における特異性を高める方法としては、伸長反応温度以下ではセルフアニーリング（自己ループ化）するプライマーを用いるＰＣＲ法（例えば、非特許文献３参照）がある。しかしながら、このようなループプライマーを作成するためにはプライマー配列そのものに加え、１０ｍｅｒ程度のループ形成用オリゴヌクレオチド部分を追加合成しなければならない。また、該方法に使用するプライマーは３０〜４０ｍｅｒ必要であり、ループ部分と合わせると計４０〜５０ｍｅｒと非常に長いものとなり、一般的に使用されるプライマーの使用条件にそぐわず、工業的でもない。さらに、該方法は、６０〜７２℃のアニーリング温度が必要であり、さらにＰＣＲ１サイクル毎に２℃ずつアニーリング温度を上昇させていかなければならない。このように、該方法は非常に煩雑でありかつ等温遺伝子増幅法には使用できない方法である。
【０００６】
また、２本鎖プライマー対および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法（例えば、特許文献１６参照）がある。該方法は、ホモジニアス遺伝子増幅法であり、プライマーの鋳型鎖への非特異的結合を阻害するための伸長できない少なくとも１つのエネルギー衰弱型オリゴヌクレオチドを共存させる方法である。しかしながら、試薬混合物の安定性に関しては何ら言及されていない。
【０００７】
さらに、中程度高温での等温遺伝子増幅法に使用される核酸ポリメラーゼは、４０℃から６５℃に至適な温度を持っているが、５℃から３７℃においてもそれなりのプライマー伸長活性を示す。従って、中程度高温での等温遺伝子増幅法を実施する場合は、非特異的な増幅が生じるのを防止するために、増幅混合物は氷上で取り扱いさらに核酸を含有する検体を該増幅混合物に添加した後も氷上で取り扱い予め適温に加熱されたヒーターあるいは温浴中に一気に入れて反応を開始するという、大変面倒な取り扱いを余儀なくされていた。
また、多検体を一度に測定する場合には、全検体の反応液を調製するための所要時間がかなりかかり、最初に調製された反応液では、予定の反応開始、すなわち所定の温度でのインキュベーション開始までの間に反応が進んだり、副反応が進行したりして再現性に乏しい結果となる場合があった。
さらに、一度調製した試薬は通常の冷蔵庫で保存しておいても、数時間から数日で増幅反応が起ってしまい、調製後の試薬の保存性が悪いといった問題点があった。
そして、再現性を改善するため、これら多くの増幅法では標的遺伝子とプライマーをあらかじめ変性アニーリングさせるため加熱後冷却したり、アルカリ処理後中和したりといった面倒な前処理を余儀なくされていた。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第４，６８３，１９５号
【０００９】
【特許文献２】
米国特許第４，６８３，２０２号
【００１０】
【特許文献３】
米国特許第４，８００，１５９号
【００１１】
【特許文献４】
欧州特許出願第３２０３０８号
【００１２】
【特許文献５】
特公平７−１１４７１８号
【００１３】
【特許文献６】
米国特許第５，１９６，７７７号
【００１４】
【特許文献７】
国際公開第９５／２５１８０号パンフレット
【００１５】
【特許文献８】
国際公開第９９／４９０８１号パンフレット
【００１６】
【特許文献９】
国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【００１７】
【特許文献１０】
国際公開第００／５６８７７号パンフレット
【００１８】
【特許文献１１】
国際公開第０２／１６６３９号パンフレット
【００１９】
【特許文献１２】
米国特許第５，５９９，６６０号
【特許文献１３】
米国特許第６，４０３，３４１号
【特許文献１４】
米国特許第５，８４９，４９７号
【特許文献１５】
米国特許第５，８９１，６２５号
【特許文献１６】
米国特許第５，３４８，８５３号
【非特許文献１】
バイオテクニークズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２５巻、第７１６〜７２２ページ（１９９８年）
【非特許文献２】
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻、第２４９３〜２４９６ページ（１９９２年）
【非特許文献３】
バイオテクニークズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２９巻、第１０１８〜１０２４ページ（２０００年）
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試薬の操作中ならびに保存中に、４℃という低温であっても増幅反応が進んでしまうという問題を克服し、等温での核酸増幅に使用される試薬の安定性、性能ならびに使用操作の簡便性を大幅に改善することにある。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、増幅に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーに対して標的遺伝子配列と競合する配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ、当該オリゴヌクレオチドと前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの間のＴｍ値に対する、前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと該プライマーの塩基配列と実質的に相補的な標的遺伝子の核酸配列との間のＴｍ値の比が、１．２〜３．３の範囲であり、さらに当該オリゴヌクレオチドの３’末端が伸長できないようにブロックされたオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ、遺伝子増幅反応液中に共存させることにより、上記課題を解決できることを見出した。
【００２３】
さらに本発明者らは、核酸ポリメラーゼの至適温度までは伸長できないオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドプライマーに結合しており、該至適温度になった時点で該オリゴヌクレオチドは前記プライマーから解離し、該プライマーが標的遺伝子に結合し、核酸ポリメラーゼによって伸長し、増幅を行うことで、標的遺伝子とプライマーとが室温下で共存していても、試薬の安定性が改善されることを見出し、本発明を完成させた。
【００２４】
本発明の第１の発明は、遺伝子増幅試薬の安定化方法であって、遺伝子増幅反応に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用し、当該オリゴヌクレオチドと前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの間のＴｍ値に対する、前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと該プライマーの塩基配列と実質的に相補的な標的遺伝子の核酸配列との間のＴｍ値の比が、１．２〜３．３の範囲であり、さらに当該オリゴヌクレオチドの３’末端が伸長できないようにブロックされたオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ、遺伝子増幅反応液中に共存させることを特徴とする方法に関する。
【００２５】
本発明の第１の発明において、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２６】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の方法のためのキットに関する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本明細書においてデオキシリボヌクレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
【００２８】
本明細書においてリボヌクレオチド（本明細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。
【００２９】
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より３’末端にかけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を指す。
【００３０】
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素のことを言い、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば鎖置換（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３１】
本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮＡ鎖のことを「置換鎖」と称する。
【００３２】
本明細書において「Ｔｍ値」とは、ＤＮＡの２本鎖が熱変性して１本鎖になる温度のことをいう。言い換えれば、鋳型ＤＮＡとオリゴヌクレオチドが２本鎖を形成する理論的な限界温度のことを言う。当該Ｔｍ値は計算により算出する事ができる。特に限定はされないが、例えば最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、あるいはＧＣ％法が例示される。
【００３３】
最近接塩基対法では、
Ｔｍ  ＝  （１０００ΔＨ）／（−１０．８  ＋  ΔＳ  ＋  Ｒｌｎ（Ｃｔ／４））  −２７３．１５  ＋  １６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］
ΔＨ  ；  ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計［ｋｃａｌ／ｍｏｌ］
−１０．８  ；  ΔＳ（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）［ｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ］
ΔＳ  ；  ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計［ｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ］
Ｒ  ；気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ・ｍｏｌ）
Ｃｔ  ；オリゴのｔｏｔａｌモル濃度［ｍｏｌ／ｌ］
Ｎａ＋；  Ｎａ＋のモル濃度［ｍｏｌ／ｌ］
で算出でき、特に限定はされないが、パラメーターをオリゴのｔｏｔａｌモル濃度は０．５μＭ、Ｎａ＋のモル濃度は５０ｍＭに設定する場合が例示される。
【００３４】
Ｗａｌｌａｎｃｅ法では、
Ｔｍ  ＝  ２（  Ａ  ＋  Ｔ  ）  ＋  ４（  Ｇ  ＋  Ｃ  ）
（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ・・・各ヌクレオチドの発生数）
で算出できる。
【００３５】
ＧＣ％法では、
Ｔｍ  ＝  ８１．５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ＋  ４１（  ＸＧ  ＋  ＸＣ  ）  −  ５００／Ｌ−０．６２Ｆ
Ｎａ＋；Ｎａ＋のモル濃度［ｍｏｌ／ｌ］
ＸＧ，ＸＣ；ＧおよびＣのモル分率
Ｌ；二本鎖を形成する部分のオリゴヌクレオチドの長さ
Ｆ；ホルムアミドのモル濃度
で算出できる。
【００３６】
本発明の方法においてＴｍ値の調節は、例えば（１）Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙの配列に変異を持たせる、（２）核酸アナログを導入する、（３）プライマーよりも短い配列を設定する、（４）使用するバッファーの塩濃度を調整する、などといった方法が利用できる。
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の方法
本発明の方法は、遺伝子増幅試薬の安定化のためのオリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。即ち、遺伝子増幅反応に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーと実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドと前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの間のＴｍ値に対する、前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと該プライマーの塩基配列と実質的に相補的な標的遺伝子の核酸配列との間のＴｍ値の比が、１．２〜３．３の範囲であり、さらに当該オリゴヌクレオチドの３’末端は使用される条件において核酸鎖が伸長されないよう修飾されているオリゴヌクレオチドを遺伝子増幅反応に共存させることが好ましい。なお、ここで「実質的に相補的な核酸配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング可能な核酸配列を意味する。以下、本発明の当該オリゴヌクレオチドをＳｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙと称する。
【００３８】
上記Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙは、デオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであるものが好ましい。該Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙは、特に限定されるものではないが、核酸増幅反応に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーにアニーリング可能な配列であればよく、その長さはプライマー長と同等あるいはそれ以上またはそれ未満でもよい。好ましくは、使用するプライマー長未満のオリゴヌクレオチドであり、かつ該Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙとキメラオリゴヌクレオチドプライマーとの間のＴｍ値に対する、前記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと該プライマーの塩基配列と実質的に相補的な標的遺伝子の核酸配列との間のＴｍ値の比［（キメラオリゴヌクレオチドプライマーと該プライマーの塩基配列と実質的に相補的な標的遺伝子の核酸配列との間のＴｍ値）／（Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙとキメラオリゴヌクレオチドプライマーとの間のＴｍ値）］は、好ましくは１．２〜３．３の範囲、さらに好ましくは１．５〜２．５の範囲である。前記Ｔｍ値は、最近接塩基対法、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、あるいはＧＣ％法で算出する事ができ、特に、最近接塩基対法、Ｗａｌｌａｎｃｅ法が好適である。
【００３９】
本発明のＳｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙには、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙとしての機能を失わない範囲で１以上の核酸アナログを含有させることができ、さらに当該核酸アナログは複数の種類を組み合わせて使用することもできる。該核酸アナログとしては、特に限定するものではないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチド、あるいは７−デアザグアニンなどの修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドアナログ、リボース誘導体を有する核酸アナログ等を使用することができる。
【００４０】
また、本発明のＳｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙは、その３’末端が使用される条件において核酸鎖が伸長されないよう修飾されている。修飾方法は特に限定されるものではないが、公知の化学合成法を使用することができ、アミノ化、ビオチン化、リン酸化等の方法を使用することができる。
【００４１】
本発明に使用されるＳｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド  バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
【００４２】
本発明の方法において上記Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙは、目的の遺伝子の核酸断片を複製あるいは増幅させる際に使用するプライマーと実質的に相補的な塩基配列を有するため、プライマーとアニーリングすることができる。また、上記複製あるいは増幅反応中においては、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙは当該プライマーがハイブリダイズする目的の遺伝子の核酸鎖と競合する。その結果、本発明の方法において、目的の遺伝子の核酸断片を特異的に、言い換えれば、非特的な複製あるいは増幅を抑制させることができる。
【００４３】
本発明の方法において、ＤＮＡポリメラーゼには、ＤＮＡの鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。また、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用することができる。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルス  カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージ  フラグメント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。
【００４４】
Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼである、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）等が挙げられる。
【００４５】
また、本発明におけるＲＮａｓｅＨは、本発明の方法に使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、種々のウイルス、ファージ、原核、真核生物由来のいずれであってもよい。さらに、細胞性ＲＮａｓｅＨあるいはウイルス性ＲＮａｓｅＨのいずれであってもよい。例えば、上記細胞性ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌ＲＮａｓｅＨＩが、ウイルス性ＲＮａｓｅＨとしてはＨＩＶ−１由来ＲＮａｓｅＨが例示される。本発明の方法においてＲＮａｓｅＨは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型のいずれもが使用できる。特に限定はされないが、例えば大腸菌由来ＲＮａｓｅＨＩ、ピロコッカス属細菌由来、アルカエオグロバス属細菌由来あるいはサーモコッカス属細菌由来のＲＮａｓｅＨＩＩ、あるいはバチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、メタノコッカス・ヤナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｈｉ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のリボヌクレアーゼＨが好適に使用できる。
【００４６】
また、本発明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅＨの切断反応の効率はプライマーの３’末端近傍の塩基配列に左右され、所望のＤＮＡの増幅効率に影響することが考えられるので、使用するＲＮａｓｅＨに最適なプライマーをデザインすることは当然のことである。
【００４７】
本発明に使用される反応バッファーには、緩衝成分、マグネシウム塩やその他の金属塩、ｄＮＴＰを含有するものが使用される。また、使用する酵素の金属要求性等に応じて塩の種類及び濃度を最適化するのは当然のことである。緩衝成分は、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）が好適に使用できる。特にビシン、トリシン、ヘペス、あるいはリン酸塩を緩衝成分として含有するバッファーが本発明に好適である。従って、反応温度、使用するエンドヌクレアーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ等によって、最適な緩衝液を選択すればよい。
【００４８】
該緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは  １５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨ６．０〜９．５、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．２の範囲のものが使用される。例えば、２２ｍＭ〜４６ｍＭのトリシンを含有するｐＨ７．５〜９．２のバッファー、２５ｍＭ〜５０ｍＭのリン酸カリウムを含有するｐＨ７．０〜８．０のバッファー、１６ｍＭ〜４０ｍＭのヘペス−水酸化カリウムを含有するｐＨ７．０〜８．０のバッファーが好適に使用できる。また、マグネシウム塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムあるいは硫酸マグネシウムが好適に使用でき、その濃度は、最終濃度で１ｍＭ〜２０ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。また、カリウム塩を含んでいても良く、例えば酢酸カリウムの場合、最終濃度で８０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲が好ましい。さらに、ＤＮＡ伸長反応の基質となるｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、特に好ましくは０．２ｍＭ〜１．２ｍＭの範囲である。使用するプライマーの量は、反応液量５０μｌ当たり１ｐｍｏｌ〜１０００ｐｍｏｌの範囲であり、特に１０ｐｍｏｌ〜１５０ｐｍｏｌの範囲が好ましい。さらに、反応液中には増幅反応の安定化等を目的とした添加物を共存させることができ、それぞれ最終濃度として０．１％以下のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％以下のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、４ｍＭ以下のプトレスシン２塩酸塩あるいは０．０１％以下のプロピレンジアミンを添加してもよい。この他、ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロロリジノン）、グリセロール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび／またはホルムアミドを含んでもよく、これらの有機溶媒の添加により、オリゴヌクレオチドプライマーの非特異的なアニーリングが軽減されることが期待される。
【００４９】
本明細書において、鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。
【００５０】
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
【００５１】
本発明に使用される核酸増幅反応としては、特に限定されるものではないが、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、改良ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法など公知の核酸増幅方法を使用することができ、好適にはＩＣＡＮ法が使用できる。
【００５２】
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
【００５３】
（２）本発明のキット
本発明は、標的遺伝子の核酸の増幅あるいは検出方法に使用されるキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、本発明の方法におけるＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼの使用のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼならびに鎖置換反応用緩衝液を含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるいは、市販の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、ＲＮＡを鋳型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。
【００５４】
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば本発明の方法のための試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
【００５５】
さらに、本発明のキットにおいては、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれていてもよい。また、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼやＲＮａｓｅＨが含まれていてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していてもよい。
【００５６】
さらに、標的核酸の検出方法に使用されるキットは、上記の指示書、増幅反応のための試薬類の他、標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマー、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙ、増幅された標的核酸を検出するための試薬、例えばプローブ等を含むものであってもよい。
また、本発明のキットは、上記の本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙ、及び／又は本発明のプローブを含有するキットも包含する。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例において用いた合成ＤＮＡは、ＡＢＩ社の合成機によって製造した。
ＩＣＡＮ法は、国際公開第０２／１６６３９号パンフレット記載の方法で行った。また、本発明で用いたＡｆｕ（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来ＲＮａｓｅＨは、国際公開第０２／２２８３１号パンフレット記載の方法で調製した。
【００５８】
実施例１  Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙによるＩＣＡＮ法におけるＩＣＡＮ増幅試薬ミックスチャーの安定化
実施例１
（１）クラミジア／リン菌遺伝子のＩＣＡＮ法による増幅における室温放置での増幅試薬ミックスチャーの安定化の検討
クラミジア（ＣＴ）  ｃｒｉｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ領域より、センスプライマー（配列番号１）および５’末端をビオチン標識したアンチセンスプライマー（配列番号２）を設計、合成した。また、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙとして、３’末端をアミノ修飾したセンスプライマー（配列番号３）および３’末端をアミノ修飾したアンチセンスプライマー（配列番号４）を設計、合成した。
リン菌（ＮＧ）ｃｐｐＢ遺伝子より、センスプライマー（配列番号５）および５’末端をビオチン標識したアンチセンスプライマー（配列番号６）を設計、合成した。また、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙとして、３’末端をアミノ修飾したセンスプライマー（配列番号７）および３’末端をアミノ修飾したアンチセンスプライマー（配列番号８）を設計、合成した。
【００５９】
上記プライマーのみを含む増幅試薬ミクスチャー、およびプライマーおよびＳｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙを含む増幅試薬ミクスチャーをそれぞれ調製した。以下の表１にその組成を示す。（１８反応あたりの容量を表示）
【００６０】
【表１】
2005013122.tif 000002
【００６１】
この増幅試薬に４０μｌの９０ｍＭ酢酸マグネシウム液および２０μｌの内部標準（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）ＤＮＡ（０．９ｐｇ／μｌ）を加え、室温に７０分間放置した。その後、１反応あたり２５μｌずつ分注し、等容量のテンプレートＤＮＡを加え、変性・アニーリング操作をすることなく５５℃、１時間の増幅反応を行った。増幅後、固層プレート発光法により増幅産物を検出した。以下の表２に結果を示す。
【００６２】
【表２】
2005013122.tif 000003
【００６３】
表２に示したように、増幅試薬Ａ（従来法）では増幅不良を起こし目的の遺伝子を検出することができなかった。一方、増幅試薬Ｂでは安定した増幅反応を示し、目的遺伝子を検出することが可能であった。すなわち、本発明の方法が増幅反応の安定化に寄与することが確認できた。
【００６４】
（２）クラミジア／リン菌遺伝子のＩＣＡＮ法による増幅における冷蔵での増幅試薬ミックスチャーの安定化の検討
上記実施例１―（１）と同様の方法で、増幅試薬Ａ、Ｂそれぞれに４０μｌの９０ｍＭ酢酸マグネシウム液および２０μｌの内部標準ＤＮＡ（０．９ｐｇ／μｌ）を加え、４℃、１週間保存し、冷蔵保存試験を行った。以下の表３に結果を示す。
【００６５】
【表３】
2005013122.tif 000004
【００６６】
表３に示したように、増幅試薬Ａにおいては目的遺伝子ＣＴおよびＮＧの検出は可能であったが、ＩＣ（内部標準）の増幅不良を起こし、０コピー区画においてさえＩＣは検出されなかった。一方、増幅試薬Ｂにおいては変性・アニーリング操作をすることなく安定した増幅を示し、全て目的遺伝子を検出することができた。すなわち、本発明の方法が、低温、長期期間の保存・安定化に好適であることが確認できた。
【００６７】
実施例２  クラミジア／リン菌遺伝子のＩＣＡＮ法による増幅における再現性の改善
上記実施例１―（１）と同様の方法で増幅試薬Ａと増幅試薬Ｂそれぞれに４０μｌの９０ｍＭ酢酸マグネシウム液および２０μｌの内部標準ＤＮＡ（０．９ｐｇ／μｌ）を加え、低コピー数のＣＴ，ＮＧテンプレートを用いて変性・アニーリング操作をすることなく１０回の反応を行い同時再現性を比較した。以下の表４に結果を示す。
【００６８】
【表４】
2005013122.tif 000005
【００６９】
表４に示したように、本発明のＳｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙを含む増幅試薬Ｂの方が良好な再現性が得られた。
【００７０】
実施例３  ＨＰＶ６、１１遺伝子ＩＣＡＮ増幅における増幅の安定化
ＨＰＶ６遺伝子より、５’末端をビオチン標識したセンスプライマー（配列番号９）およびアンチセンスプライマー（配列番号１０）を設計、合成した。また、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙとして、３’末端をアミノ修飾したセンスプライマー（配列番号１２）および３’末端をアミノ修飾したアンチセンスプライマー（配列番号１３）を設計、合成した。
ＨＰＶ１１遺伝子より、アンチセンスプライマー（配列番号１１）を設計、合成した。センスプライマーは、ＨＰＶ６遺伝子の５’末端をビオチン標識したセンスプライマー（配列番号９）を用いた。また、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙとして、３’末端をアミノ修飾したアンチセンスプライマー（配列番号１４）を設計、合成した。センスプライマーは、ＨＰＶ６遺伝子の３’末端をアミノ修飾したセンスプライマー（配列番号１２）を用いた。
【００７１】
上記実施例１−（１）と同様の方法で、Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙを含まない増幅試薬Ａ、  Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙを含む増幅試薬Ｂを調製し、それぞれに４０μｌの９０ｍＭ酢酸マグネシウム液および２０μｌの内部標準ＤＮＡ（０．９ｐｇ／μｌ）を加え、変性・アニーリング操作することなく等温増幅させた。以下の表５に結果を示す。
【００７２】
【表５】
2005013122.tif 000006
【００７３】
表５に示したようにＨＰＶ６、１１ＤＮＡの増幅を比較した結果、本発明の方法を用いることにより低コピー数での増幅に改善が認められた。
【００７４】
【発明の効果】
上記の、本発明のオリゴヌクレオチド（Ｓｅｎｓｉｂｌｅ  ｄｅｃｏｙ  ）を使用する遺伝子増幅方法は、中程度高温における等温遺伝子増幅方法に有用である。また、本発明の方法は、増幅試薬の保存・安定化方法として有効である。
【００７５】
【配列表フリーテキスト】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１  ；  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｉｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｇｅｎｅ．  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９  ｔｏ  ２２  ａｒｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  ；  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｉｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｇｅｎｅ．  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６  ｔｏ  １８  ａｒｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ａｎｄ  ５’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｂｙ  ｂｉｏｔｉｎ．”
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  ；  Ｔｈｅ  ３’−ＯＨ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ３’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４  ；  Ｔｈｅ  ３’−ＯＨ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ３’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５  ；  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ  ｃｐｐＢ  ｇｅｎｅ．  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８  ｔｏ  ２０  ａｒｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６  ；  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ  ｃｐｐＢ  ｇｅｎｅ．  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １５  ｔｏ  １７  ａｒｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ａｎｄ  ５’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｂｙ  ｂｉｏｔｉｎ．”
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  ；  Ｔｈｅ  ３’−ＯＨ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ３’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８  ；  Ｔｈｅ  ３’−ＯＨ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ３’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９  ；  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ＨＰＶ６  ｇｅｎｅ．  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８  ｔｏ  ２０  ａｒｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ａｎｄ  ５’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｂｙ  ｂｉｏｔｉｎ．”
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０  ；  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ＨＰＶ６  ｇｅｎｅ．  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２０  ｔｏ  ２２  ａｒｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１  ；  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ＨＰＶ１１  ｇｅｎｅ．  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２０  ｔｏ  ２２  ａｒｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２  ；  Ｔｈｅ  ３’−ＯＨ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ３’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３  ；  Ｔｈｅ  ３’−ＯＨ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ３’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ．
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４  ；  Ｔｈｅ  ３’−ＯＨ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ３’  ｅｎｄ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ．
【００７６】
【配列表】
2005013122.tif 000007
2005013122.tif 000008
2005013122.tif 000009
2005013122.tif 000010
2005013122.tif 000011
2005013122.tif 000012
2005013122.tif 000013