(57)【要約】【課題】  本発明の目的はイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法を提供すること、並びに、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを簡便かつ効率的に製造する方法を提供すること、また、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株自体を提供することである。【解決手段】  酵母を１０〜１００ＭＰａの圧力下で培養し、前記圧力下で増殖し得る酵母を選抜する、または、酵母を４℃〜１７℃で培養し、前記温度にて増殖し得る酵母を選抜する。得られるイソアミルアルコールおよび／または上述した酢酸イソアミル高生産酵母株を培養し、前記酵母株にイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを産出させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を１０〜１００ＭＰａの圧力下で培養し、前記圧力下で増殖し得る酵母を選抜することを含む、対応する標準酵母株に比較してイソアミルアルコールの生産能が少なくとも１．５倍、および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍増大した酵母をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
酵母の培養が２０〜６０ＭＰａの圧力下で行われることを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
酵母の培養が３０〜６０ＭＰａの圧力下で行われることを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
酵母がサッカロミセス属酵母であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
酵母を４〜１７℃にて培養し、前記温度条件下で増殖し得る酵母を選抜することを含む、対応する標準酵母株に比較してイソアミルアルコールの生産能が少なくとも１．５倍、および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍増大した酵母をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項６】
酵母の培養が４〜１５℃で行われることを特徴とする請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
酵母の培養が６〜１０℃で行われることを特徴とする請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
酵母がサッカロミセス属酵母であることを特徴とする請求項５乃至請求項７のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列において塩基番号１３４８〜２４２７の領域に変異を有する配列によって定義されるポリヌクレオチドであって、前記変異によって前記領域がコードするアミノ酸配列に変異が生じている前記ポリヌクレオチドを保持しており、かつ、対応する標準酵母株に比較してイソアミルアルコールの生産能が少なくとも１．５倍、および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍増大した酵母を培養してイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを前記酵母株に産生させることを特徴とするイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法。
【請求項１０】
配列番号６、８、１０または１２に記載の配列を有するポリペプチドを、コードするポリヌクレオチドを保持する酵母を培養してイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを前記酵母株に産生させることを特徴とする請求項９に記載のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法。
【請求項１１】
酵母がサッカロミセス属酵母であることを特徴とする請求項１０に記載のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法。
【請求項１２】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列において塩基番号１３４８〜２４２７の領域に変異を有する配列によって定義されるポリヌクレオチドであって、前記変異によって前記領域がコードするアミノ酸配列に変異が生じている前記ポリヌクレオチドを保持する酵母を、他の酵母株（親株）と接合させ、胞子を形成させ、前記胞子から得られる酵母のうち前記親株に比較してイソアミルアルコール生産能が少なくとも１．５倍および／または酢酸イソアミル生産能が少なくとも１．５倍増大した酵母株を選抜することを特徴とするイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能が増大した酵母株の作製方法。
【請求項１３】
配列番号６、８、１０または１２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保持する酵母を、他の酵母株（親株）と接合させ、胞子を形成させ、前記胞子から得られる酵母のうち前記親株に比較してイソアミルアルコール生産能が少なくとも１．５倍および／または酢酸イソアミル生産能が少なくとも１．５倍増大した酵母株を選抜することを特徴とするイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能が増大した酵母株の作製方法。
【請求項１４】
酵母がサッカロミセス属酵母であることを特徴とする請求項１３に記載のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能が増大した酵母株の作製方法。
【請求項１５】
配列番号６、８、１０または１２に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保持することを特徴とする酵母。
【請求項１６】
サッカロミセス属酵母であることを特徴とする請求項１５に記載の酵母。                                                                                            
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株のスクリーニング方法、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の作製方法、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の利用方法、特に、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株を用いたイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
清酒中には香りを呈する成分が非常に多く含まれており、数百種類に及ぶ成分が微妙に調和されてその香りが形作られている。中でも酢酸イソアミルは、吟醸香の主成分の一つであり香りの華やかさという点では特に重要な成分である。酢酸イソアミルはアセチルＣｏＡおよびイソアミルアルコールから、酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＴＦａｓｅ）を介して生成される。
【０００３】
酢酸イソアミルの生産量を増加させるには、基質となるイソアミルアルコールの生産量を増加させることが一つの手段である。イソアミルアルコールの基質はロイシンであることが知られている。一方、イソアミルアルコール合成経路の律速酵素であるα−イソプロピルマレートシンターゼ（α−ＩＰＭ）はロイシンによるフィードバック阻害を受けることが知られているため、ロイシン濃度を上げてもイソアミルアルコール生産量は頭打ちとなると考えられている。
【０００４】
α−イソプロピルマレートシンターゼ（α−ＩＰＭ）のフィードバック阻害を受けない変異株の育種方として、ロイシンアナログである５−５−５−トリフロオロロイシン（ＴＦＬ）耐性株の取得が報告されている（例えば、非特許文献１：栗山と水津、「清酒酵母のＡＡＡＦａｓｅについて」、清酒酵母の研究（１９９２）ｐ. １４５；または、非特許文献２：アシダ  エフ, コダマ  ワイ, アシカリ  ティ（Ａｓｈｉｄａ  Ｆ，Ｋｏｄａｍａ  Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ  Ｔ. ），Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）Ｖｏｌ．４８，ｐ. ２０７参照。）。この方法で取得された変異株のうちいくつかはα−イソプロピルマレートシンターゼ（α−ＩＰＭ）をコードするＬＥＵ４遺伝子における変異であることが示されている。しかしながら、スクリーニングの原理からしてこの方法では、そもそもロイシンを細胞外から十分に取り込めない変異株が多く取得されることになるので、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産株をスクリーニングする方法としては効率的ではない。
【０００５】
一方、酵母のユビキチンリガーゼＲｓｐ５の発現量が低下した変異株ｎｐｉｌでは、ロイシン輸送体であるＢａｐ２の発現量が増大することが報告されているが、（例えば、非特許文献３：オームラ  エフ, コダマ  ワイ, アシカリ  ティ（Ｏｍｕｒａ  Ｆ，Ｋｏｄａｍａ  Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ  Ｔ．），「酵母パーミアーゼＢａｐ２ｐのＮ−末端はその分解に重要な役割を果たす（Ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  Ｂａｐ２ｐ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）」，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１，Ｖｏｌ．２８７，ｐ．１０４５−１０５０；または、非特許文献４：オームラ  エフ, コダマ  ワイ, アシカリ  ティ（Ｏｍｕｒａ  Ｆ，Ｋｏｄａｍａ  Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ  Ｔ．），「酵母の分枝鎖アミノ酸の基礎代謝回転にはC-末端尾部を必要とする」（Ｔｈｅ  ｂａｓａｌ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  Ｂａｐ２  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｉｔｓ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔａｉｌ）」，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００１．ｖｏｌ．１９４，ｐ. ２０７−２１４参照。）、実際のロイシン取り込み速度やイソアミルアルコール生産能については何ら報告されていない。
【０００６】
【非特許文献１】栗山と水津、「清酒酵母のＡＡＡＦａｓｅについて」、清酒酵母の研究、清酒酵母研究会、平成４年６月１９日ｐ. １４５
【非特許文献２】アシダ  エフ, コダマ  ワイ, アシカリ  ティ（Ａｓｈｉｄａ  Ｆ，Ｋｏｍａｄａ  Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ  Ｔ．），Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第４８巻、第２０７頁
【非特許文献３】オームラ  エフ, コダマ  ワイ, アシカリ  ティ（Ｏｍｕｒａ  Ｆ，Ｋｏｄａｍａ  Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ  Ｔ．）、「酵母パーミアーゼＢａｐ２ｐのＮ−末端はその分解に重要な役割を果たす（Ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ）」、  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００１年、２８７巻、ｐ. １０４５−１０５０
【非特許文献４】オームラ  エフ, コダマ  ワイ, アシカリ  ティ（Ｏｍｕｒａ  Ｆ，Ｋｏｄａｍａ  Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ  Ｔ．）、「酵母の分枝鎖アミノ酸の基礎代謝回転にはC-末端尾部を必要とする（Ｔｈｅ  ｂａｓａｌ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  Ｂａｐ２  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｉｔｓ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔａｉｌ）」、  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．、２００１年、第１９４巻、ｐ. ２０７−２１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法を提供することである。
また、本発明の目的はイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを簡便かつ効率的に製造する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能の増大した酵母株を作製する方法を提供することである。本発明の目的は、酵母株、特に醸造用酵母株のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大させる方法を提供することでもある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、生体膜に何らかの変異を有する酵母株の特性を解析するため、高圧下または低温下でも増殖可能な変異株を多数取得し、これらの酵母株を解析してきた。その解析過程において、高圧または低温下で酵母を培養することによってイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの生産能が著しく増大した酵母株を取得し得ることを見出した。
本発明は、酵母を１０〜１００ＭＰａの圧力下で培養し、前記圧力下で増殖し得る酵母を選抜することを含む、対応する標準酵母株に比較してイソアミルアルコール生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは１．６〜５．０倍、より好ましくは１．８〜２．８倍、および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは１．６〜１０倍、より好ましくは２〜７．６倍に増大した株をスクリーニングする方法である。
更に、本発明は、酵母の培養が２０〜６０ＭＰａ、特に好ましくは３０〜６０ＭＰａで行われる、上記イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法である。
【０００９】
また、本発明は酵母を２４℃で培養し、４〜１７℃の温度条件下で増殖し得る酵母を選抜することを含む、対応する標準酵母株に比較してイソアミルアルコールの生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは１．６〜５．０倍、より好ましくは１．８〜２．８倍および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは１．６〜１０倍、より好ましくは２〜７．６倍に増大した株をスクリーニングする方法である。
更に本発明は、酵母の培養が４〜１５℃、特に好ましくは６〜１０℃で行われる、上記イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法である。
【００１０】
本発明の、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株をスクリーニングする方法において、必要に応じてイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの生産能について評価する工程が更に追加される。
なお、「対応する標準酵母株」とは、本発明のスクリーニングにかけられる酵母が属する種または菌株において標準的特性を有する酵母をいう。この「標準酵母株」は野生株酵母でありえるが、例えば醸造用酵母が本発明のスクリーニングにかけられる場合は「標準酵母株」とは前記醸造用酵母において標準と考えられている酵母株をいい、一般には野生型酵母とは異なる。
【００１１】
また、本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列において塩基番号１３４８〜２４２７の領域に変異を有する配列によって定義されるポリヌクレオチドであって、前記変異によって前記領域がコードするアミノ酸配列に変異が生じている前記ポリヌクレオチドを保持する酵母を培養してイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを前記酵母株に産生させることを特徴とする、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法でもある。
【００１２】
特に本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列においてＰｒｏ514 がＴｈｒ514 に置換されたアミノ酸配列（配列番号６）を有するポリペプチド、Ｃｙｓ517 がＴｙｒ517 に置換されたアミノ酸配列（配列番号８）を有するポリペプチド、Ｃｙｓ517 がＰｈｅ517 に置換されたアミノ酸配列（配列番号１０）を有するポリペプチド、または、Ａｌａ799 がＴｈｒ799 に置換されたアミノ酸配列（配列番号１２）を有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（それぞれ、配列番号５、７、９および１１に記載の配列を有する）を保持する酵母を培養してイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを前記酵母株に産生させることを特徴とする、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法である。
【００１３】
本発明に使用するイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母はＲＳＰ５遺伝子内、特にＨＥＣＴドメインをコードする領域に変異を有する酵母である。より具体的には、本発明に使用する酵母は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列において塩基番号１３４８〜２４２７の領域に変異を有する配列によって定義されるポリヌクレオチドであって、前記変異によって前記領域がコードするアミノ酸配列に変異が生じている前記ポリヌクレオチドを保持する酵母である。特に、本発明に使用するイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は配列番号２に記載のアミノ酸配列においてＰｒｏ514 がＴｈｒ514 に置換されたアミノ酸配列（配列番号６）を有するポリペプチド、Ｃｙｓ517 がＴｙｒ517 に置換されたアミノ酸配列（配列番号８）を有するポリペプチド、Ｃｙｓ517 がＰｈｅ517 に置換されたアミノ酸配列（配列番号１０）を有するポリペプチド、または、Ａｌａ799 がＴｈｒ799 に置換されたアミノ酸配列（配列番号１２）を有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（それぞれ、配列番号５、７、９および１１）を保持する酵母である。本発明に使用するイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は、対応する標準酵母株に比較してイソアミルアルコール生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも１．８倍に増大し、および／または、対応する標準酵母株に比較して酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも２倍に増大している。
【００１４】
このような酵母株には、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＡＹ１８Ａ  （受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５３２）、ＦＡＹ１２Ｃ（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５３３）、ＦＡＹ１７１Ｅ（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５３４）、ＦＡＹ２９Ｅ（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９５３５）によって特定される酵母株などが含まれる。
また、本発明は、上述したイソアミルアルコールおよび／または上述した酢酸イソアミル高生産酵母株自体である。特に本発明は上述したポリヌクレオチドを有するイソアミルアルコールおよび／または上述した酢酸イソアミル高生産酵母株自体でもある。
【００１５】
更に本発明は、上記いずれかのスクリーニング方法によって得られるイソアミルアルコールおよび／または上述した酢酸イソアミル高生産酵母株を培養し、前記酵母株にイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを産生させることを特徴とする、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの製造方法である。
【００１６】
また、本発明は、醸造に用いられている酵母菌株等を親株として、本発明の、または本発明の方法によって得られるイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株とを接合させて胞子を形成させ、この胞子から得られる酵母から親株に比較してイソアミルアルコール生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも１．８倍増大し、および／または酢酸イソアミル生産能が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１．６倍、より好ましくは少なくとも２倍に増大した酵母株を選抜することを特徴とする、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能が増大した酵母株を作製する方法、または、前記親株のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大させる方法である。
【００１７】
本発明において、特に、本発明の酵母、本発明によってスクリーニングされる酵母または本発明の方法に使用する酵母はサッカロミセス属酵母、特にサッカロミセス・セレビシアエである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、対応する標準酵母株に比較してイソアミルアルコールの生産能が少なくとも１．５倍および／または酢酸イソアミルの生産能が少なくとも１．５倍増大した酵母株、特にサッカロミセス・セレビシアエを含むサッカロミセス属酵母株が得られる。また、本発明により、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを効率的かつ簡便に生産することができる。さらに、本発明により、醸造に用いられている酵母のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において、最初に酵母を通常の培地、例えばＹＰＤ（１％バクトイーストエクストラクト、２％バクトペプトン、２％Ｄ−グルコース）培養液で、酵母培養に用いられる通常の温度、例えば２４℃〜３７℃、好ましくは２４℃〜３０℃にて終夜振盪培養を行う。これを前培養物として用いて続く操作を行う。本発明の方法を適用し得る酵母、および本発明の方法に使用し得る酵母はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母が好ましく、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（出芽酵母）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）が含まれ、特にサッカロミセス・セレビシアエが好ましい。これらの酵母は醸造工業にも広く利用されており、中でも酒類、特に清酒醸造用にこれらの酵母がよく使用されている。
【００２０】
上記終夜振盪した細胞培養液を適切な新しい培養液、好ましくは終夜培養に用いたのと同じ組成の培養液、に一定量加える。新たな培地を添加する終夜培養液（前培養物）の量は一般には新たな培地の０．０１％〜１０％、好ましくは０．１％〜５％（体積％）である。また、培養液の全量は特に限定されず、処理の簡便性、必要な上清またはイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの量を考慮して決定することができる。終夜培養液を添加した新しい培養液を含む容器に入れ、容器全体を高圧容器内に入れる。次に、高圧ハンドポンプを用いて容器内部を加圧し、好ましくは１０〜１００ＭＰａ（約１００〜１０００気圧）、より好ましくは２０〜６０ＭＰａ、特に好ましくは３０〜６０ＭＰａ、の圧力条件下で好ましくは１週間〜３ヶ月間、より好ましくは３週間〜２ヶ月培養する。培養温度は、酵母の培養に通常使用される温度、例えば、２４℃〜３７℃、好ましくは２４℃〜３０℃でよく、一般には約２４℃が利用される。培養後、容器を減圧し、細胞培養液１００〜５００μｌをＹＰＤ寒天培地に塗布し、一般的な実験室条件にて培養、すなわち、大気圧下、前述した通常の培養温度にて培養して出現したコロニーを別個に独立した菌株として回収することができる。大気圧とは、大気によって生じる圧力を言い、一般に１０１．３ｋＰａ程度の圧力であって、自然環境下で通常発生し得る圧力をいう。酵母、特にサッカロミセス・セレビシアエは１５〜２５ＭＰａの圧力下で顕著な増殖阻害が起こることが知られている。従って、このとき得られる菌株を本明細書において特に高圧増殖変異株と呼ぶこともある。得られた高圧増殖変異株を更にイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル産生能について評価することができる。
【００２１】
あるいは、上述のように終夜振盪した培養液（前培養物）１００〜５００μｌを酵母培養に使用される通常の寒天培地、例えばＹＰＤ寒天培地に塗布し、大気圧下、４〜１７℃、好ましくは４〜１５℃、より好ましくは６℃〜１０℃という低温条件下で好ましくは１週間〜３ヶ月間、より好ましくは３週間〜２ヶ月間培養して出現したコロニーを独立した菌株として個別に回収する。本明細書において、この条件下で得られる菌株を特に低温増殖変異株と呼ぶことがある。得られた低温増殖変異株についても更にイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル産生能について評価することができる。
【００２２】
得られた高圧増殖変異株または低温増殖変異株のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの生産能は、これらの酵母株を通常の条件下（常温および通常の大気圧条件を含む）で培養し、培養上清中のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを測定することによって評価することができる。本発明の方法に使用する、または本発明の方法によって得られるイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は、酵母が生理的に活性である培地（但しロイシンを含む）を用いて一般的な培養条件を用いて培養することによりイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを多量に産生することができる。酵母が生理的に活性である培地とは、酵母がイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを合成し得る培地をいい、これらには酵母培養用に調製された実験室内培養用培地だけでなく、醸造工程において酵母がイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを合成し得る、固体、半固体、流動体、液体等の状態である外部環境を構成する物質、組成物、又は混合物も含まれる。一般には、本発明の、または本発明の方法によって得られる酵母は大気圧下、すなわち、約１０１．３ｋＰａ（約１気圧）程度であって自然環境下で一般に生じ得る圧力下で培養されるが、大気圧の２５０倍までの高圧下で培養しても大気圧下と同等の効率で同等の量のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを産生させることができる。
【００２３】
イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルの生産能の評価は、例えば、野生型酵母および上記変異株を、１ｇ／Ｌ〜２ｇ／Ｌ程度のロイシンを含む、酵母に用いられる通常のロイシン含有培地（例えばＹＰＤ培地）中の通常の条件下、例えば大気圧下、２４〜３０℃にて振盪培養し、例えば１２時間後、２４時間後、好ましくは４８時間後の培養上清中のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル濃度を測定することによって行うことができる。溶液中のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル濃度の測定方法および測定装置は当業者にはよく知られており、例えばガスクロマトグラフィー分析によって測定することができる。これにより、本発明のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の培養上清には培養開始２４時間後および４８時間後には、対応する標準酵母株に比較して、１．５倍以上の酢酸イソアミルが蓄積されることを確認することができる。「対応する標準酵母株」とは、前述したように、本発明のスクリーニングにかけられる酵母が属する種または菌株において標準的特性を有する酵母をいい、どのような特性がそれぞれの種、または菌株において「標準的」であるかは当業者によく知られている。
培養上清に蓄積されたイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルは上清中に存在したまま使用することも、常法に従って回収および精製することもできる。培養上清が醸造生産物として使用される場合は一般にはイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミルを回収する必要はない。
【００２４】
得られた変異株について、更に遺伝的背景を解析することができる。例えば、まず、変異株からゲノムＤＮＡを抽出し、適切なクローニングベクターに挿入してライブラリーを作製する。使用するベクターは後に簡便に回収できることが望ましく、例えば、複製可能な非組み込み型ベクターが好ましい。
作製したライブラリーを酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等を用いて野生型酵母に導入し、上述した温度条件、または圧力条件下で、通常の培地を用いて１週間〜３週間培養する。更に、得られたクローンに対して上述したようにイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を評価し、これらの生産能が増大したクローンからプラスミドＤＮＡを回収する。回収したプラスミドＤＮＡに含まれるゲノム遺伝子断片の配列を調べることによって、ゲノム上に生じた変異の位置および変異配列を特定することができる。酵母からのゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの抽出、適切なクローニングベクター、酵母の遺伝子導入方法、ヌクレオチド配列決定法、一般的な核酸の取り扱い方法を含む分子生物学的技術は当業者にはよく知られたものである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  II（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９４）；また、サッカロミセス・セレビシアエのゲノムの遺伝地図、物理地図に関する情報はｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／等から入手可能である。）。
【００２５】
特に、本発明の、および本発明の方法によって得られる、イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は一般に第５染色体右腕に存在するＲＳＰ５遺伝子内に変異を有する。好ましくは、それらの変異はＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼＲＳＰ５遺伝子内に変異を有する。好ましくは、それらの変異はＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼＲｓｐ５をコードするＲＳＰ５遺伝子中の触媒部位であるＨＥＣＴドメイン（配列番号３および４参照）をコードする領域にあり、アミノ酸置換を生じるようなタイプの変異である。このような変異型ＲＳＰ５遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の列を配列番号５〜１２に示した。Ｒｓｐ５のアミノ酸配列はサッカロミセス・セレビシアエ間、特にサッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・パストリアヌスの間では非常によく保存されている。特にＨＥＣＴドメインのアミノ酸配列は、酵母間、特にサッカロミセス属酵母間でよく保存されており、サッカロミセス・セレビシアエの種々の株、例えば、ビール酵母、清酒酵母、ワイン酵母の間ではほぼ１００％保存されている。
【００２６】
本発明のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株は、上述したように単一の遺伝子に変異を生じさせることによって作製できるため、本発明のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株を他の酵母（親株）と接合させて胞子を形成させ、４分子解析によって上述した変異を有する酵母株を選抜する、および／またはこれらの胞子から得られる酵母からイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能が親株に比較して増大した酵母株を選抜することにより、親株に比較してイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大させた酵母株を容易に得ることができる。より具体的には、前述した方法により、醸造工程で使用される有用な酵母株、例えば、清酒酵母のイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル生産能を増大することができる。
【実施例１】
【００２７】
１）イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の作製およびスクリーニング
出芽酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３−Δ２００  ｌｅｕ２−Δ１  ｌｙｓ２−８０１  ｔｒｐ１−Δ１  ａｄｅ２−１０１  ｕｒａ３−５２）、（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．（１９８９），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２，１９−２７）をＹＰＤ（１％バクトイーストエクストラクト、２％バクトペプトン、２％Ｄ−グルコース）１５ｍｌの培養液中、２４℃にて終夜振盪培養を行った。得られた培養液の１００〜５００μｌをＹＰＤ寒天培地に塗布し、大気圧下（一般実験室内気圧下）（約１０１．３ｋＰａ）、４℃、６℃、８℃、１０℃、１５℃、１７℃にて１週間〜３ヶ月間培養した。
出現したコロニーを逐次取得しそれらをイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産候補株（低温増殖変異株）として単離した。低温増殖変異株が２００株得られた。
【００２８】
同様に終夜振盪培養を行うことにより得た酵母細胞培養液１ｍｌをＹＰＤ培養液１５ｍｌに投与しパラフィルムで密封した。これを高圧容器（離合社製）内に入れ、高圧ハンドポンプ（離合社製）を用いて加圧し、２４℃にて、１０ＭＰａ、２０ＭＰａ、３０ＭＰａ、４０ＭＰａ、５０ＭＰａ、６０ＭＰａ、１００ＭＰａ（それぞれ、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、１０００気圧に相当）の圧力条件下で１週間〜３ヶ月間培養した。培養後、容器を減圧し、細胞培養液１００〜５００μｌをＹＰＤ寒天培地に塗布し、大気圧下、２４℃で培養した。
出現したコロニーを逐次取得しそれらをイソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産候補株（高圧増殖変異株とも呼ぶ）として単離した。高圧増殖変異株も２００株得られた。
【００２９】
２）培養上澄中のイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの定量
１）において得られた低温増殖変異株および高圧増殖変異株について、それぞれ、イソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの生産能を調べた。
野生型であるＹＰＨ４９９株および上記１）で得られたそれぞれの変異株を１ｇ／Ｌまたは２ｇ／Ｌのロイシンを含むＹＰＤ培養液中で２４℃にて大気圧下で振盪培養を行った。２４時間後および４８時間後に細胞を遠心操作によって除去し、培養上澄を得た。上澄中に含まれるイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの定量は、島津テクノリサーチ社によるヘッドスペースガスサンプラーを用いたガスクロマトグラフィー分析によって行った。
上記において、２４℃で２４時間振盪培養を行って得られた培養上澄中のイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの量（結果１）を下記表１に、２４℃で４８時間振盪培養を行って得られた培養上澄中のイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルの量（結果２）を下記表２に示す。
【００３０】
その結果、イソアミルアルコールの生産量は、２４時間後にＦＡＹ１８Ａ、ＦＡＹ１２Ｃ、ＦＡＹ１７１Ｅ、ＦＡＹ２９Ｅ株では野生株のそれぞれ１．８、２．０、２．３、１．９倍、４８時間に野生株のそれぞれ２．３、２．４、２．８、２．３倍に増大することが示された。一方、酢酸イソアミルの生産量は、２４時間後にＦＡＹ１８Ａ、ＦＡＹ１２Ｃ、ＦＡＹ１７１Ｅ、ＦＡＹ２９Ｅ株では野生株のそれぞれ２．０、２．７、２．９、２．２倍、４８時間に野生株のそれぞれ３．８、５．１、７．６、５．０倍に増大することが示された。
【００３１】
【表１】
2005124506.tif 000002
【００３２】
【表２】
2005124506.tif 000003
【００３３】
これらのうち、低温増殖変異株群から単離されたＦＡＹ１８Ａ株および、高圧増殖変異株群から単離されたＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株、ＦＡＹ２９Ｅ株は、いずれも２００３年９月２５日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５３２（ＦＡＹ１８Ａ株）、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５３３（ＦＡＹ１２Ｃ株）、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５３４（ＦＡＹ１７１Ｅ株）、およびＦＥＲＭ  Ｐ−１９５３５（ＦＡＹ２９Ｅ株）が付与されている。
【実施例２】
【００３４】
＜イソアミルアルコールおよび／または酢酸イソアミル高生産酵母株の原因遺伝子の同定＞
実施例１で得られたＦＡＹ１８Ａ株、ＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株およびＦＡＹ２９Ｅ株をザイモリエース（生化学工業）によって細胞溶解度、フェノール・クロロホルム法／エタノール沈でん法によってＤＮＡを抽出し、ＹＣｐｌａｃ１１１ベクターを用いてゲノムライブラリーを作製した。それぞれのライブラリーを酢酸リチウム法を用いて野生型ＹＰＨ４９９株に導入し、ＳＤ寒天培地（０．６７％Ｄｉｆｃｏイーストナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸、２０ｍｇ／アデニン、２０ｍｇ／メチオニン、２０ｍｇ／Ｌ−トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌ−ロイシン、３０ｍｇ／Ｌ−リジン、２０ｍｇ／Ｌ−ヒスチジン、２％Ｄ−グルコース、１．５％精製寒天）に塗布し、実施例１に記載した条件、すなわち、大気圧下（一般実験室内気圧下）（約１０１．３ｋＰａ）、４℃、６℃、８℃、１０℃、１５℃、１７℃にて（条件１）、あるいは、１０ＭＰａ、２０ＭＰａ、３０ＭＰａ、４０ＭＰａ、５０ＭＰａ、６０ＭＰａ、１００ＭＰａの圧力条件下（条件２）で２４℃にて１週間〜３ヶ月間培養した。
【００３５】
条件１または条件２の下で増殖または生存したそれぞれの形質変換株からプラスミドを回収し、再度ＹＰＨ４９９株を形質変換して、同じ条件で培養およびスクリーニングを行った。得られたプラスミドに含まれるゲノム遺伝子断片をＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列の決定を行った。
その結果ＦＡＹ１８Ａ株、ＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株およびＦＡＹ２９Ｅ株の全てにおいて、酵母の第５番染色体右腕に存在するＲＳＰ５遺伝子内に塩基置換変異が生じていることがわかった。ＦＡＹ１８Ａ株、ＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株およびＦＡＹ２９Ｅ株が保持する変異型ＲＳＰ５のコード領域をそれぞれ配列番号５（ＦＡＹ１８Ａ株）、７（ＦＡＹ１２Ｃ株）、９（ＦＡＹ１７１Ｅ株）および１１（ＦＡＹ２９Ｅ株）に示す。ＲＳＰ５はＨＥＣＴ型に属するユビキチンリガーゼＲｓｐ５をコードする遺伝子であり、いずれの変異も酵素の触媒部位であるＨＥＣＴドメインにアミノ酸置換を誘発していた。
【００３６】
具体的には、ＦＡＹ１８Ａ株においてはプロリンをコードするコドンＣＣＡがスレオニンをコードするＡＣＡに変異したことにより配列番号２に示したアミノ酸配列において５１４番のプロリンがスレオニンに置換されていた（配列番号５および６）。ＦＡＹ１２Ｃ株においては、システインをコードするコドンＴＧＴがチロシンをコードするＴＡＴに変異したことにより、配列番号２に示したアミノ酸配列において５１７番のシステインがチロシンに置換されていた（配列番号７および８）。同様に、ＦＡＹ１７１Ｅ株においては、コドンＴＧＴがＴＴＴに変異することにより、配列番号２に示したアミノ酸配列において５１７番のシステインがフェニルアラニンに置換されていた（配列番号９および１０）。また、ＦＡＹ２９Ｅ株においてはコドンＧＣＣがＡＣＣに変異したことにより７９９番のアラニンがスレオニンに置換されていた（配列番号１１および１２）。
【実施例３】
【００３７】
＜放射性ロイシンを用いたロイシンの取り込み試験＞
実施例１で得られたＦＡＹ１８Ａ株、ＦＡＹ１２Ｃ株、ＦＡＹ１７１Ｅ株、ＦＡＹ２９Ｅ株並びに野生株の各々を１５ｍｌのＳＣ（ＳＤ＋Ｓｅｒｉｎｅ  ４００ｍｇ／Ｌ、ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  １００ｍｇ／Ｌ、Ａｓｐａｒａｔｉｏ  ａｃｉｄ  １００ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ２００ｍｇ／Ｌ、Arginine  ２０ｍｇ／Ｌ、Tyrosine  ３０ｍｇ／Ｌ、Isoleucine  ３０ｍｇ／Ｌ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ５０ｍｇ／Ｌ）培養液で大気圧下、２４℃にて２０時間培養し、3 Ｈ−ロイシンを１０００倍希釈の濃度で投与し、１時間後、フィルター濾過によって細胞を回収し、細胞内の放射性物質の量を液体シンチレーションカウンターにより測定した。結果を下記表３に示す。
下記表３に示す通り、これらの変異によってロイシンの取り込み量が野生株に比して増大することがわかった。
【００３８】
【表３】
2005124506.tif 000004
【配列表】
2005124506000001.app