(57)【要約】【課題】  化学及び生化学反応の検定並びに特定の被検物の存在及び量の決定のためのシステムの提供。【解決手段】  １又は複数の分子構造の固有の誘電特性を利用する分子結合現象及びその他の環境効果を検出するためのシステム及び方法を提供する。分子結合層をシグナル経路伝いにカップリングさせる。検査シグナルをこのシグナル経路伝いに伝搬し、これによりこの検査シグナルはこの分子結合層にカップリングし、そして応答してシグナル応答を示す。【選択図】      図１Ａ
2005308761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドを含む又は含むものと予測される第一溶液中の当該リガンドの結合を調べるための方法であって、ここで当該第一溶液は任意的に当該リガンドに加えて溶解又は懸濁された成分を含むものであり、
前記第一溶液をシグナル経路と接触させ、ここで当該シグナル経路は導電性伝送素子、接地素子及び当該導電性伝送素子と当該接地素子との間に配された誘電層を含んで成り、ここで分子結合層が当該シグナル経路に電磁カップリングされ、そして当該分子結合層は前記導電性伝送素子の少なくとも一部と前記接地素子の少なくとも一部との間に配置され、当該シグナル経路は１０MHz と１０００ＧＨｚとの間の周波数において電磁シグナルの伝搬を支持するように形状化されており、ここで前記シグナル経路の少なくとも一部が共面導波管を含んで成り；
前記分子結合層に対する前記リガンドの結合の検出を可能にする感度を供するように選定された回路パラメーターを使用し；
前記シグナル経路伝いに１０MHz と１０００ＧＨｚとの間の周波数を有する第一入力シグナルを伝送し、これにより当該入力シグナルを前記分子結合層にカップリングさせ；
前記第一溶液と接触させたまま、前記第一入力シグナルが前記分子結合層と相互作用した後の第一変調シグナルを検出し；
前記分子結合層に対する同一又は異なるリガンドの結合の有無を指標する対照シグナルに対する前記第一変調シグナルの対比を行い；そして
前記対照シグナルに対する前記第一変調シグナルの類似点又は相違点を抗リガンドに対する当該リガンドの結合の度合い又はタイプの指標として解読する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記対比が対照シグナルに対する前記第一変調シグナルの対比を含んで成り、ここで
（１）当該対照シグナルは、第二溶液と接触させたまま、入力シグナルと前記分子結合層との相互作用の際に得られるものであり、当該第二溶液は前記第一溶液の中に任意的に存在する前記任意成分を含み、そして更には（ａ）前記リガンドを含む、（ｂ）前記抗リガンドに結合する別のリガンドを含む、もしくは（ｃ）前記抗リガンドに結合するリガンドを全く含まないものであるか、又は
（２）前記対照シグナルは少なくとも一種の前記別のリガンドを利用して（１）で規定する対照シグナルにより得たデーターから計算されたものである；
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分子結合層が前記リガンドに特異的に結合する抗リガンド分子を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記分子結合層を前記伝送素子と直接接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記導電伝送素子が誘導化された表層を有し、そして前記分子結合層が当該誘導化された表層に共有結合している、請求項１記載の方法。
【請求項６】
分子結合層が前記伝送素子から隔離され、且つそれに電磁カップリングされている、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記入力シグナルが１００MHz 超、１００GHz 未満の周波数を有する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記入力シグナルが共振シグナルを含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項９】
未知のリガンドの分類を決定するための方法であって、
第一分子結合層にカップリングされたシグナル経路を用意し、ここで当該シグナル経路は導電伝送素子、接地素子及びそれらの間に配された誘電層を含んで成り、ここで当該分子結合層はＮ通りのリガンドサブ構造に対する結合のためのＮ通りの抗リガンドを含んで成り、また当該シグナル経路の少なくとも一部が共平面導波管を含んで成り；
前記第一分子結合層の上に複数種の未知のリガンドを含む溶液を適用し；
それに応答して、前記シグナル経路伝いに第二分子結合層を形成させ、ここで当該第二分子結合層は前記Ｎ通りの抗リガンド及び当該Ｎ通りの抗リガンドに結合した任意の前記未知のリガンドを含んで成り、そして当該第一及び第二分子結合層は前記導電性伝送素子の少なくとも一部と前記接地素子の少なくとも一部との間に配置され、；
複数種の検査シグナルを前記第二分子結合層に伝搬し、ここで当該検査シグナルは各々１０MHz と１０００ＧＨｚとの間ので作動し、そして当該検査シグナルの各々は前記リガンドサブ構造のいずれかに結合する前記Ｎ通りの抗リガンドのうちの少なくとも１種とカップリングし、そして応答して、前記サブ構造に対する前記抗リガンドの結合の存在の指標となる測定応答値を示し；
前記測定応答値との対比のために既知のシグナル応答を用意し、ここで当該応答は既知のリガンド分類を規定し、ここで当該既知のシグナル応答のうちの所定の数が所定の範囲内で前記測定応答値と相関するなら、前記未知のリガンドが前記既知の分類に属していることが決定される；
工程を含んで成る方法。
【請求項１０】
リガンドと分子結合層との間で形成される分子結合現象を検出するために形状化されたバイオアッセイ装置であって：
１０MHzと１０００ＧＨｚとの間の周波数の検査シグナルの伝搬を支持するように作動可能なシグナル経路、ここで当該シグナル経路は
（１）（ａ）導電伝送素子；
（ｂ）接地素子；及び
（ｃ）当該導電伝送素子と当該接地素子との間に配された誘電層；
を含んで成る；並びに
（２）前記シグナル経路伝いの少なくとも一部に形成され、且つ当該シグナル経路に電磁カップリングされた分子結合層、ここで当該シグナル経路の少なくとも一部は共面導波管を含んで成り、またここで当該分子結合層は前記リガンドに結合可能であり、また当該分子結合層は前記導電性伝送素子の少なくとも一部と前記接地素子の少なくとも一部との間に配置されている；
を含んで成るバイオアッセイ装置。
【請求項１１】
前記分子結合層が前記導電伝送素子の一部に形成されている、請求項１０記載のバイオアッセイ装置。
【請求項１２】
前記シグナル経路が４５MHz 〜２０GHz の検査シグナルの伝搬を支持するように作動可能である、請求項１０記載のバイオアッセイ装置。
【請求項１３】
前記分子結合層が前記シグナル経路の末端に配されている、請求項１０記載のバイオアッセイ装置。
【請求項１４】
前記分子結合層が前記シグナル経路の連続部分に配されている、請求項１０記載のバイオアッセイ装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
生物医療科学の事実上全分野が化学及び生化学反応の検定並びに特定の被検物の存在及び量の決定のためのシステムを必要とする。この必要性は生化学経路を地図化し、そしてその役割を疾患過程に関連付ける基礎科学研究室から、患者の臨床学的に関連する被検物のレベルを日常的に追跡する臨床診療所に至るまで及んでいる。その他の分野には医薬の研究、軍事的用途、獣医学、食品学、及び環境用途が挙げられる。どのケースでも、特定の被検物又は被検物の群の存在及び量の決定が要される。
【０００２】
化学、生化学、バイオテクノロジー、分子生物学、その他の分野における分析のため、往々にして１又は複数種の分子構造の存在が検出され、そして構造間の結合が測定されている。注目の分子構造には、典型的には、限定することなく、細胞、抗体、抗原、代謝物、タンパク質、薬剤、小分子、タンパク質、酵素、核酸、並びにその他のリガンド及び被検物が挙げられる。医薬においては、例えば、細胞構成物、例えばレセプターもしくはサイトカイン、又は抗体もしくは抗原であって、様々な疾患過程のためのマーカーを担い、生理学的流体の中にもとから存在しているか、又はその素の中に導入されたものの存在を決定するのは極めて有用である。更に、ＤＮＡ及びＲＮＡ分析は診断、遺伝子検査、並びに研究、農業及び医薬的開発において極めて有用である。分子性細胞生物学の急速進歩並びに正常及び疾患系の理解を理由に、蛍光物質又は放射性同位元素等のラベルを必要とせず、定量且つ定性的であり、注目の分子に特異的であり、感度が高く、しかも比較的簡単に実施できる検査方法のニーズが高まりつつある。
【０００３】
かかる分野の需要に合う数多くの方法がここ数年開発されている。例えば、酵素連結免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、様々な蛍光アッセイ、マススペクトル、比色アッセイ、ゲル電気泳動、並びにより特殊なアッセイのホスト。これらのアッセイ技術のほとんどが特殊な準備、詳しくはラベルの付加又は検査すべき試料の多労な精製及び増幅を必要とする。リガンドと抗リガンドとの間での結合現象を検出するため、結合の有無又は程度に関連する検出可能シグナルが必要とされる。通常、シグナルは注目のリガンド又は抗リガンドのいずれかに接合したラベルにより供与される。検出可能なシグナルを供与し、そしてそのために適切なラベルが存在する物理又は化学的効果には、放射能、蛍光、化学発光、リン光及び酵素活性等、様々なものが挙げられる。ラベルは分光学、放射能学、又は光学追跡方法により検出できる。残念ながら、たいていの場合、特定のアッセイに必要な分子の一つ又は全てをラベルすることは困難又は不可能な場合さえもある。また、ラベルの存在は２分子間の分子認識を、立体効果等の様々な理由により不能にしてしまうこともある。更に、このようなラベルアプローチのいずれも結合現象の正確な状態を決定せず、従って例えばレセプターに対する活性部位結合を非不活性部位結合、例えばアロステリック結合を区別できず、それ故現況の検出方法を介して機能的情報を得ることはできない。従って、ラベルの必要性を排除し、しかも機能的情報を供与するような結合現象を検出する方法は上記のアプローチを著しく進歩せしめるであろう。
【０００４】
生化学系を研究するためのその他のアプローチは組織試料及び細胞系の如き所定のクラスの生物系を特性決定する様々なタイプの誘電測定値を利用する。１９５０年代においては、その時期において公知の物質の誘電特性の測定のための標準技術を利用し、生物学的組織の誘電特性を測定する実験が行われていた。それ以来、このような測定を実施するための様々なアプローチは周波数変域測定、及び時間変域技術、例えば時間変域誘電スペクトルを含むようになった。このようなアプローチにおいて、実験は通常、様々なタイプの同軸伝送ライン、又は物質の誘電特性決定に典型的に利用されているその他の伝送ライン及び構造を利用して実施された。これには広域にわたる生物系の誘電特性の用途及び関係を調べる研究が含まれる。その関心は哺乳動物種の様々な器官から、細胞膜及びオルガネラ効果を含む細胞及びサブ細胞系に及んでいる。最近、分子系の誘電特性の変化の検出の改善のため、上記の技術の小型化が試まれている（例えば、米国特許第５，６５３，９３９；５，６２７，３２２及び５，８４６，７０８号参照のこと）。典型的には、これらは生物学的試料（組織、細胞系又は分子系）を電気回路トポロジーのシャント又は一連の素子として利用する。この形態は、検出戦略において有用な周波数に対するいくつかの実体的な制約、及び検出する分子系の感度に対する著しい制約等、いくつかの欠点を有する。
【０００５】
一般に、ほとんどのアッセイシステムの特異性及び感度の領域において制約が存在する。細胞塊及び非特異的結合は往々にしてアッセイをノイジーにしてしまい、そして有用な情報の枠粋を困難又は不可能にしてしまう。前述の通り、一部のシステムは注目の被検物全てにラベルを付加する、又は正確な光学測定を実施するには複雑すぎる。更に、前述の通り、このような検出技術のほとんどが結合現象の役割についての情報を供しない。従って、ラベル抜きで、リアルタイムで、被検物の存在又は程度、所定の系内で実際に起きている結合現象の機能及びタイプを直接モニターできる実用的且つ経済的な可能実施可能なアッセイは著しい進歩であろう。
【０００６】
より詳しくは、生物医療産業は、様々な水性系又はその他の流体系生理学的システム、例えば核酸結合、タンパク質間相互作用、小分子結合、並びにその他の注目の化合物に極めて幅広く適用できる改良された概して基礎的な技術を必要とする。理想的には、このアッセイは高度に特異的なプローブ、例えば特異的抗体及び正確に相補性の核酸プローブを必要とせず；天然環境、例えば全血、細胞質ゾル混合物、及びその他の天然系において有効であり；分子の天然特性を測定することにより機能し、そして結合現象を実際にモニターするための追加のラベル又はトレーサーを必要とせず；一部の用途にとって、結合現象の性質、例えば所定の化合物が特定の薬剤レセプターに対して作動因子又は拮抗因子として働くかどうかについての所望の情報を供し、そして結合現象が起きたかどうかの指標となる単なるマーカーとして機能するものではない；べきであろう。多くの用途にとって、それは高度に小型化可能であり、且つ高度に平行式であるべきであり、これにより複雑な生化学経路を地図化できるか、又は極めて少量及び莫大な量のコンビナトリアル化合物が薬剤スクリーニングプロトコールに利用できるようになる。多くの用途において、更には複雑な一連の反応をリアルタイムでモニターできるようにすべきであり、これにより正確な動力学及び親和力情報がほぼ直ちに得られるようになりうる。おそらく最も重要には、ほとんどの商業用途にとって、それは安価で使い易く、サンプル準備工程が少なく、生産可能なエレクトロニックス及びディスポーザブル部品、例えばアッセイのために使用でき、その後廃棄でき、しかも多種多様なアッセイ用途に高度に適用可能なバイオアッセイ用表層チップであるべきである。
【０００７】
その他の産業が検出、同定又は追加の分析のために似た要件を有することに注目すべきである。ほとんどの用途は生物学的分子の利用を包含するが、特異的な結合性パートナーが入手できるなら、又はその分子自体が下記の表層に付加できるなら、事実上全ての分子が検出できる。
本発明は上記の及びそれ以外の多くのニーズを満たす。
【０００８】
発明の概要
本発明は１又は複数の結合分子構造体及び局部環境の固有誘電特性を利用する分子結合現象及びその他の環境作用を検出する、そして更には局部環境、特に生物系内の分子状物質の存在及び濃度並びに物理特性を同定するためのシステム及び方法を提供する。
【０００９】
本発明の第一の態様において、分子結合現象を検出する方法はシグナル経路、及びそのシグナル経路伝いに形成される分子結合層を同意する工程を含む。検査シグナルをシグナル経路伝いに伝搬し、そしてこの分子結合層に結合させる。このカップリングに応答して、このシグナルは応答を供し、それは分子結合現象及び分子結合層それ自体の双方の指標となる。
【００１０】
本発明の第二の態様において、未知のリガンドの分類を決定するための方法を紹介する。この方法は、Ｎ通りの対応のリガンドサブ構造に対する結合のためのＮ通りの対応の抗リガンドを有する第一分子結合層にカップリングされたシグナル経路を用意する工程を含んで成る。次に、いくつかの未知のリガンドを含む溶液を前記分子結合層に適用する。応答して、第二分子結合層がこのシグナル経路伝いに形成される。その第二分子結合層はＮ通りのリガンドを有する。Ｎ通りの対応の検査シグナルをＮ通りの対応のリガンドに伝搬する。既知のリガンド分類を規定するＮ通りのシグナル応答が供される。最後に、各々の検査シグナルはＮ通りのリガンド／抗リガンド複合体にカップリングし、そして応答して前記Ｎ通りのサブ構造の各々の存在の指標となるＮ通りの対応の測定応答値が示され、その結果所定の数の前記Ｎ通りの既知のシグナル応答が所定の範囲内でこのＮ通りの測定応答値に相関するなら、そのリガンドは既知の分類に属することとなる。
【００１１】
本発明の第三の態様において、未知の分子結合現象を同定するための方法を紹介する。この方法はシグナル経路を用意し、このシグナル経路の上に第一リガンドを含む第一溶液を適用し、そして応答してこのシグナル経路伝いに第一分子結合層を形成し、これによりこの第一分子層は第一リガンドを含むこととなり、そしてこの第一経路及び第一溶液伝いに配されることとなる。第一検査シグナルをこのシグナル経路伝いに伝搬し、ここでその部分は連続伝送ラインを含んで成る分子結合層を含み、これによりこのシグナルはこの分子結合層にカップリングし、そして応答して第一シグナル応答を示す。既知の分子結合現象に対応する既知のシグナル応答を供させ、そしてこの第一シグナル応答をこの既知のシグナル応答と対比し、もしこの第一シグナル応答が所定の範囲内で既知のシグナル応答と相関するなら、その未知の分子結合現象は既知の分子結合現象を含んで成ることとなる。
【００１２】
本発明の第四の態様において、溶液中のリガンドの未知の濃度を定量するための方法を紹介する。この方法は少なくとも一の抗リガンドを有する第一分子結合層にカップリングされたシグナル経路を用意し、この分子結合層の上に既知の濃度のリガンドを有する溶液を適用し、そしてこのシグナル経路伝いに検査シグナルを伝搬する工程を含む。次に、第一シグナル応答を測定し、そして外挿アルゴリズムを作製する。次に第二検査シグナルを伝搬し、そして第二シグナル応答を測定する。この第二シグナル応答を次にこのアルゴリズムと相関させる。
【００１３】
本発明の第五の態様において、溶液中のリガンドの存在を検出するための生物電気インターフェースを提供する。この生物電気インターフェースはシグナル経路、リガンドを供与するための溶液及び分子結合層を含む。この分子結合層はリガンドを含み、そしてシグナル経路及び溶液伝いにカップリングされている。
【００１４】
本発明の第六の態様において、検査シグナルを用い、分子結合層に係る１又は複数の特性、例えばリガンドの存在を検出するためのバイオアッセイ装置を提供する。この装置は検査シグナルの連絡のための第一ポート及び第二ポート、並びにその間の導性領域を有するシグナル経路を含む。このバイオアッセイ装置は更に、リガンドを有することがあり、且つシグナル経路にカップリングされた分子結合層を含む。このバイオアッセイ装置は更に前記分子結合層にカップリングされた溶液を含んでよく、それはこのリガンドを分子結合層へと輸送しうる。
【００１５】
本発明の第七の態様において、分子結合現象を検出するためのシステムを紹介する。このシステムは検査シグナルをランチングするためのシグナルソース、当該シグナルソースにカップリングされたバイオアッセイ装置、及びこのバイオアッセイ装置にカップリングされた第二検出器を含む。このバイオアッセイ装置はシグナル経路と、リガンド及び抗リガンドを含むことがあり、且つ溶液及びこのシグナル経路にカップリングされうる分子結合層とを含む。検査シグナルをこの分子結合層の領域全体を通じて連続であるこのシグナル経路伝いに伝搬させ、そしてこの分子結合層にカップリングさせ、そして応答して前記分子結合現象の存在の指標となるシグナル応答を示させる。
【００１６】
一の観点において、本発明は構造の特性、例えば誘電特性、構造特性、結合現象、等を決定するための典型的には約１MHz 〜１０００GHz の電磁線と分子結合層内の分子構造体との相互作用の利用にある。また、本発明は分子結合層がカップリングされ、その中の被検物が検出されるシグナル経路を有する生物電気インターフェース上の検査シグナルを利用する。
【００１７】
本発明の特性及び利点は以下の図面及び詳細な説明を参照することで一層理解できるであろう。
【００１８】
発明の詳細な説明
目次
Ｉ．用語の定義
II．序文
Ａ．バイオ−アッセイシステム
Ｂ．本システムの化学的性質
III ．バイオ−アッセイ装置
Ａ．装置の構造
Ｂ．結合表面の化学的性質
Ｃ．生物−電気インターフェース
Ｄ．特定の態様
IV．測定方法論
Ａ．一般的概観
Ｂ．分子結合現象の検出
Ｃ．誘電特性における変化の検出
Ｄ．分子結合現象の同定
Ｅ．結合分子構造のクラスの同定
Ｆ．濃度定量
Ｇ．バイオ−アッセイ装置の自己較正
Ｖ．測定系
Ａ．周波数測定系
Ｂ．時間変域測定系
Ｃ．誘電緩和測定系
VI．実施例
VII ．応用
【００１９】
Ｉ．用語の定義
本明細書で使用するとき、生物学的な“結合パートナー”又は“リガンド／抗リガンド”又は“リガンド／抗リガンド複合体”の用語は、結合複合体、例えば抗体−抗原、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどを形成するために、他の分子を特異的に認識（例えば結合）する分子を言及する。生物学的な結合パートナーは単分子の対に制限される必要がない。従って、例えば、単一リガンド又は２又は複数の“抗リガンド”の調和的な作用によって結合することができる。
【００２０】
本明細書で使用するとき、“リガンド”又は“被検物”又は“マーカー”の用語は検出されるあらゆる分子を言及する。特異的に又は非特異的にリガンドと結合する抗リガンドとの、その相互作用を通して、あるいはリガンドの特有の誘電特性によって、それは検出される。リガンドのいくつかの部分の認識のために、特異的に又は非特異的に前記リガンドに結合する別の分子（すなわち抗リガンド）が存在するあらゆる分子として、リガンドは一般に定義される。例えば、抗リガンドは抗体であることがあり、そしてリガンドは抗体に特異的に結合する抗原の様な分子であることがある。この文書の目的のために、抗原が前記の表面に結合し、そして抗体が検出される分子に結合する現象において、前記抗体はリガンドになり、そして前記抗原は抗リガンドである。本リガンドはまた、細胞、細胞膜、細胞小器官及びその合成的な類似体から成ることがある。
【００２１】
この発明の実施のために適当なリガンドは、限定しないが、抗体（抗体／エピトープ複合体を形成する）、抗原、核酸（例えば天然又は合成のＤＮＡ，ＲＮＡ，ｇＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡなど）、レクチン、糖類（例えばレクチン／糖複合体を形成する）、糖タンパク質、受容体及びそれらの同じ性質のリガンド（例えば増殖因子及びそれらの会合受容体、サイトカイン及びそれらの会合受容体、シグナル受容体など）、薬剤候補などの小分子（天然物又はコンビナトリアルライブラリーで構築され、そして／保存された合成類似体のどちらかに由来）、代謝産物、薬物の濫用及びそれらの代謝副産物、ビタミン並びに他の天然及び合成の化合物の様な補因子、酸素及び生理学的な体液において見出される他の気体、細胞、細胞の構成物、細胞膜及び会合する構造物、植物源及び動物源において見出される他の天然の生成物、他の部分的な又は完全な合成生成物などを含む。
【００２２】
本明細書で使用するとき、“抗リガンド”の用語は別の分子（すなわちリガンド）と特異的に又は非特異的に結合する分子を言及する。抗リガンドはまた、それが特異的に結合するリガンドとの、その相互作用を通して、又はそれ自身の特有の誘導特性によって検出される。本明細書で使用するとき、通常、抗リガンドは単独で又は前記表層上に固定化される結合対の部分として、前記表層上に固定化される。いくつかの態様において、抗リガンドはシグナル経路の又は導電性の表層上の分子から成ることがある。あるいは、一度抗リガンドがリガンドに結合すると、生じた抗リガンド／リガンド複合体は、次の結合の目的のための抗リガンドになるとみなすことができる。
【００２３】
本明細書で使用するとき、“特異的に結合”の用語は、タンパク質又はポリペプチド、核酸、あるいはレセプター又は本明細書に記載の他の結合パートナーを言及する場合、タンパク質及び／又は他の生物製剤の異種集団中の注目の同じ性質のリガンドを決定する結合反応を言及する。従って、指定の条件下（例えば抗体の場合のイムノアッセイ条件）、特定のリガンド又は抗体は、その特定の“標的”に結合し（例えばホルモンはそのレセプターに特異的に結合する）、そして試料中に存在する他のタンパク質に、あるいは生物体又は生物体に由来する試料においてリガンド又は抗体が接触しうる他のタンパク質に、有意な量で結合しない。同様に、核酸はあらかじめ選択した条件下で互いにハイブリダイズしうる。
【００２４】
本明細書で使用するとき、“単離した”“精製した”又は“生物学的に純粋な”の用語は、天然の状態で見出されるとき、通常付随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を言及する。
【００２５】
本明細書で使用するとき、“核酸”の用語は一本鎖又は二本鎖の形態のどちらかにおける、デオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマーを言及し、そして特別の事情が無い限り、天然のヌクレオチドと同様の挙動で機能できる、天然のヌクレオチドの知られている類似体を含む。
【００２６】
本明細書で使用するとき、“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”の用語は、アミノ酸残基のポリマーを言及するために、交換可能で使用される。前記用語を、１又は複数のアミノ酸残基が天然アミノ酸に対応する人工的な化学的類似体であるアミノ酸のポリマー、及び天然アミノ酸ポリマーに適用する。
【００２７】
本明細書で使用するとき、“抗体”の用語は１又は複数のポリペプチドから成るタンパク質を言及し、これはイムノグロブリン遺伝子又はイムノグロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的によってコードされる。認識されたイムノグロブリン遺伝子は、カッパー、ラムダ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミューの定常領域遺伝子、並びに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパー又はラムダのどちらかとして類似される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、次にこれは、イムノグロブリンのクラス、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義する。
【００２８】
典型的なイムノグロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含んで成ることが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同一の対から成り、各対は１つの“軽”鎖（約２５kD）及び１つの“重”鎖（約５０〜７０kD）を有している。各鎖のＮ末端は、主に抗原の認識を担う、約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定している。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）の用語は、それぞれ軽鎖及び重鎖を言及する。
【００２９】
抗体は、インタクトイムノグロブリンとして、又は様々なペプチダーゼでの分解によって生成した、多くの十分に特性決定されたフラグメントとして存在する。従って、例えばペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合より下方において抗体を分解してＦ（ａｂ）′2 を生成し、ここでＦ（ａｂ）′2 は、それ自身がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖であるＦａｂ二量体である。Ｆ（ａｂ）′2 を、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を開裂するおだやかな条件下還元することができ、それによってＦ（ａｂ）′2 二量体はＦａｂ′単量体に変換する。Ｆａｂ′単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な記述のために、Fandamertal Immunology, W.E. Paul. ed. Raven Press, N.Y. (1993) を参照のこと）。様々な抗体フラグメントはインタクト抗体の分解によって定義されるが、その様なＦａｂ′フラグメントが化学的に、又は組換えＤＮＡ方法論を利用することによって、そのどちらかでｄｅ  ｎｏｖｏ合成されうることを当業者は正しく認識するだろう。従って、本明細書で使用するときの、抗体の用語は、抗体全体の修飾によって生成した、又は組換えＤＮＡ方法論を用いてｄｅ  ｎｏｖｏ合成した、そのどちらかの抗体フラグメントもまた含む。好ましい抗体は、一本鎖抗体、より好ましくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖は供に結合し（直接的に、又はペプチドリンカーを通して）、つながったポリペプチドを形成する。
【００３０】
一本鎖Ｆｖ（“ｓｃＦｖ”又は“ｓｃＦｖ”）ポリペプチドは共有結合したＶＨ：：ＶＬのヘテロ二量体であり、これは直接的に、又はペプチドをコードするリンカーによって、そのどちらかによって結合したＶＨ及びＶＬをコードする配列を含む、核酸から発現することができる。Ｈｕｓｔｏｎ等の、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 5879-5883 (1988) 。自然に凝集し、しかし化学的に独立した、抗体Ｖ領域由来の軽及び重ポリペプチド鎖を、ｓｃＦｖ分子に変換するための多くの構造は、抗原結合部位の構造に実質的に類似する、三次元構造に折りたたまれるだろう。例えば米国特許第５，０９１，５１３号及び第５，１３２，４０５号及び第４，９５６，７７８号を参照のこと。
【００３１】
“抗原結合部位”又は“結合部分”は、抗原結合に関与するイムノグロブリン分子の部分を言及する。抗原結合部位は、重（“Ｈ”）鎖及び軽（“Ｌ”）鎖の、Ｎ末端の可変（“Ｖ”）領域のアミノ酸残基によって形成する。重鎖及び軽鎖のＶ領域内で高度に分岐した３つのストレッチは“超可変領域”として言及され、これは“骨格領域”又は“ＦＲ”として知られる保存性の高い隣接し合うストレッチの間に挿入されている。従って“ＦＲ”の用語は、イムノグロブリンにおける超可変領域の間、及びそれの近接に、天然に見出される。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合“表面”を形成するために、三次元空間において互いに関係して配列する。この表面は、標的抗原の認識及び結合を媒介する。重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、“相補性決定領域”又は“ＣＤＲ”として言及され、そして例えばＫａｂａｔ等のSequences of proteins of immunological interest, 4th ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda. MD (1987)によって特徴づけられている。
【００３２】
本明細書で使用するとき、“免疫結合”及び免疫結合特性”の用語は、イムノグロブリン分子と、前記イムノグロブリンに特異的な抗原との間に起こる、非共有結合を言及する。本明細書で使用するとき、生物学的試料は、注目の被検物のためにアッセイされるべき、健康な及び／又は病気の状態における、生物学的な組織又は体液の試料である。その様な試料は、限定しないが、唾液、羊水、血液、血液細胞（例えば白血球）、組織又は精製した針生検試料、尿、腹膜水、及び胸膜水、あるいはそれらに由来の細胞を含む。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採収される冷凍切片な、組織の切片を含むことがある。前記試料はヒトの患者から典型的に採収されるが、前記アッセイを、あらゆる哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ由来の試料における注目の被検物を検出するために使用することができる。前記試料は、所望ならば、適当な緩衝溶液中での希釈又は濃縮によって必要なだけ前処理されることがある。好ましくは生理学的なpHにおける、リン酸、トリスなどの様々な緩衝液の１つを使用する、多くの標準的な緩衝水溶液のいずれかを使用することが出来る。
【００３３】
本明細書で使用するとき、“シグナル経路”はＤＣ静電場を含む、あらゆる有用な周波数の電磁シグナルを支持することが可能な生物電気インターフェース伝いの伝送媒体を言及する。完全でないシグナル経路のリストは、導電及び誘電導波管構造、横方向電磁的（ＴＥＭ）伝送ラインの様な複合的導体伝送媒体、四重極及び八重極の回線の様なＴＥ，ＴＭ又はＴＥＭモード伝搬を支持する、３又はそれ以上の導電素子を有する伝送回線、例えばクアドロポール及びオクツポールライン、カップリングした導波管、カップリングするか又はしないことがある共振キャビティー構造、他の非形式構造物、例えば線、プリント回路、並びに他の分布回路及び集中インピーダンス導電構造物などを含む。本シグナル経路はシグナル面、接地面、又は両構造の組合わせを含んで成る。典型的に本シグナル経路は、ＭＢＬの表層に非直交である方向に沿って形成される。シグナル経路が導電層又は領域から成る態様において、導電領域はその領域を超えて連続的に広がる。シグナル経路が非金属、すなわち導波管である態様において、シグナル経路は最少量のシグナル損失を有する経路として、又は３mhos／ｍ超の導電性を有するとして定義される。
本明細書で使用するとき、“分子結合層”又は“ＭＢＬ”の用語は、生物−電気インターフェースに沿ったシグナル経路にカップリングした少なくとも１つの分子構造（すなわち被検物、抗リガンド、又はリガンド／抗リガンド対など）を有する層を言及する。本分子結合層は、１又は複数のリガンド、抗リガンド、リガンド／抗リガンド複合体、リンカー、重合体及び他の材料のマトリックス、あるいは本明細書に記載の他の分子構造物から成ることがある。更に、本分子結合層は極度に多様であることがあり、そして１又は複数の結合基を有することがある、マトリックス層及び／又は絶縁層を含む１又は複数の成分を含むことがある。本ＭＢＬは、リガンドがシグナル経路から物理的に分離している場合、直接的若しくは間接的な物理的連結を介すか、又は電磁的結合を介すかのどちらかによって、信号経路にカップリングする。本ＭＢＬは、全て当業界における標準的な慣行に従い、例えばチオールリンカー、ビオチン化した金属などによって誘導化した表面から成ることがある。
本明細書で使用するとき、“結合現象”は最低２つの分子構造、例えばリガンド及び抗リガンドの間の相互作用又は会合を言及する。前記の２つの分子構造が直接的又は間接的に物理的な接触をする場合、あるいは前記の２つの構造が物理的に分離するが、それらの間で電磁的にカップリングする場合、前記相互作用は起こりうる。医学的な文脈における、関心のある結合イベントの例は、限定しないが、リガンド／受容体、抗原／抗体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、核酸の誤対合、相補的核酸及び核酸／タンパク質を含む。あるいは、“結合現象”の用語はシグナル経路に結合する、本明細書に記載の単一の分子又は分子的構造、例えばリガンド、又は抗リガンド／リガンド複合体を言及する。この場合におけるシグナル経路は、第２の分子的構造である。
【００３４】
本明細書で使用するとき、“リガンド／抗リガンド複合体”の用語は、抗リガンドに結合したリガンドを言及する。前記結合は特異的又は非特異であることがあり、そして前記結合は典型的に共有結合、水素結合、免疫学的結合、ファンデルワールスカ、又は他の結合の型である。
【００３５】
本明細書で使用するとき、“カップリング”の用語は、直接的又は間接的な物理的接続を介して、又はシグナルカップリングのあらゆる形態、例えば静電的又は電磁的カップリングを介してのどちらかによる、２つの構造の間のエネルギーの転移を言及する。
【００３６】
本明細書で使用するとき、“検査信号”の用語は、電磁スペクトル内で定義されたあらゆる有用な周波数におけるシグナル伝搬を言及する。例えば、本検査信号の周波数は１MHz 又はそれ以上、例えば５MHz ，１０MHz ，２０MHz ，４５MHz ，１００MHz ，５００MHz ，１GHz ，５GHz ，１０GHz ，３０GHz ，５０GHz ，１００GHz ，５００GHz ，１０００GHz 及びそれらの間にわたる周波数である。
【００３７】
本明細書で使用するとき、“酵素”の用語は、他の化合物又は“基質”における化学反応の活性化エネルギーを低下するために、触媒として働くタンパク質を言及し、反応における最終生成物は意味しない。
【００３８】
本明細書で使用するとき、“溶液”の用語は、リガンドが属する材料を含む。完全でない溶液のリストは、固体、液体又は気体の状態における材料を含む。固体の溶液は、炭水化物、タンパク質、オリゴヌクレオチド、あるいは代わりに、有機性多量体材料、例えばナイロン、レーヨン、ダクロン、ポリプロピレン、テフロン、ネオプレン、デルリンなどを含む、天然又は合成の分子を含むことがある。液体の溶液は、水性、有機性又は他の主要な成分を含むもの、ゲル、ガス、及び懸濁液を含む。例示的な溶液はセルロース、デキストラン誘導体、ｄ−ＰＢＳの水溶液、トリス緩衝液、脱イオン水、血液、生理的緩衝液、髄液、尿、唾液、水、有機溶媒を含む。前記の溶液は、リガンド及び／又は抗リガンドを、結合表面に適用する材料を言及するために、ここで使用する。前記溶液は解析されるべき試料を含む。
本明細書で使用するとき、“連結基”又は“リンカー”の用語は、バイオアッセイ装置上にあらゆる２つの成分を付着するために使用する、化学的構造物を言及する。従って、本連結基は、一方の成分と結合する第１の連結部分、例えば導電表面を有し、そして別の成物と結合する第２の連結部分、例えばマトリックス又は抗リガンドを有する。
【００３９】
本明細書で使用するとき、“バイオアッセイ装置”は、分子結合層が形成される構造物を言及する。本バイオアッセイ装置は、領域がくぼんだ表面、又は密閉的に封入した囲いから成ることがあり、これらの全ては任意の特定の大きさ又は形状であってよい。
【００４０】
本明細書で使用するとき、“バイオアッセイシステム”は、バイオアッセイ装置を電磁的に探り、そして検出するために必要な構成部分との関係で上述したバイオアッセイ装置を言及する。これらの構成部分は、限定しないが、シグナル経路、基材、電子装置、例えばシグナル発生器、オシロスコープ、並びにバイオアッセイ装置からのシグナルを探り、そして検出するために必要なベクトル解析器、電磁的シグナルを探り、そして検出することができ、そしてデータなどを解析することができるマイクロチップ及びマイクロプロセッサーを含む。
【００４１】
本明細書で使用するとき、“共振”及び“共鳴”の用語は、周波数の関数として、素速く変化する誘電応答を一般に言及する。
【００４２】
本明細書で使用するとき、“生物−電気的インターフェース”はシグナル信号の伝搬を支持するためのシグナル経路と、分子結合層の間のインターフェース構造を言及する。
【００４３】
本明細書で使用するとき、“マトリックス”又は“結合マトリックス”の用語は、スペーサーとして、又は結合に利用できる表面積を増すために、又は増大した結合のための分子の配向を最適化するために、あるいはバイオアッセイ装置を最適化するためのあらゆる他の結合特性を向上させるために使用される、バイオアッセイチップ上の材料の層を言及する。マトリックス層はデキストランの様な炭水化物、ポリアミノ酸、架橋及び非架橋のタンパク質などから成ることができる。
【００４４】
II．序文
Ａ．バイオ−アッセイシステム
本発明は、多くの分子が示す固有の誘電特性を基に、膨大な数の分子を識別することができる所見を利用する。これらを識別する誘導特性は結合した分子構造にシグナルをカップリングすることによって観察することができる。固有の誘電特性は、それに固有のシグナル応答を与えるシグナルを変調する。そして独特の信号応答は、リガンド及び、分子結合層を構成する他の分子を検出し、そして同定するために使用することができる。
【００４５】
図１．Ａは、本発明に従うバイオアッセイシステム１００の１つの態様を図解する。システム１００は、２つの導体、シグナル面、接地面、回路トポロジーにおいて例示され、それはマイクロストリップ中の集中又は分布素子回路、ストリップライン、共面導波管、スロットライン又は同軸システムを含む多数のアーキテクチャーにおいて具現化されうる。更に、電子工学業界の者は、本システムがシグナル導体導波管システム、あるいは３又はそれ以上の導体システムに容易に変更されうることを、容易に認識するだろう。
【００４６】
例示した様に、システム１００はシグナルソース１１０、伝送ライン１２０、接地面１３０、バイオアッセイ装置１５０、及びシグナル検出器１６０を含む。例示した態様はバイオアッセイ装置１５０に結合した２つの伝送ライン１２０を例示するが、代わりの態様において、単独伝送ラインがバイオアッセイ装置にカップリングすることができ、あるいは更なる代わりとして、３又はそれ以上の伝送ラインがバイオアッセイ装置１５０にカップリングすることができる。伝送ライン１２０は、実施の際の所望の周波数以上の、信号の伝搬を支持することができる材料から作られる。伝送ライン１２０は、金の様な導電層として表され、従来の写真平板の、又は半導体の処理技術を用いて、基板、例えばアルミナ、ダイアモンド、サファイア、ポリイミド、又はガラス上に据えられる。
【００４７】
更にシステム１００は、伝送ライン１２０にカップリングしたバイオアッセイ装置１５０を含む。バイオアッセイ装置１５０は、導電層１５３が配列される支持基材１５１を含む。導電層１５３は、検査信号の伝搬を支持するためのインターフェースを形成する。支持基材１５１は、いずれかの絶縁性材料、例えばガラス、アルミナ、ダイアモンド、サファイア、シリコン、ヒ化ガリウム又は半導体処理において使用される他の絶縁性材料から成る。
【００４８】
分子結合層（ＭＢＬ）１５６は、インターフェース伝送ライン１５３の１又は複数の領域にカップリングする。カップリングが、例示した様なインターフェース伝送ライン１５３とＭＢＬ１５６の間の直接的な接続を介してか、又は更に以下に記載した様な、シグナルカップリングを通して起こりうることを電子工学の業界の者は認識するだろう。
【００４９】
ＭＢＬ１５６は主に１又は複数のリガンドから成るが、本明細書に記載の他の分子及び構造物もまた含まれることがある。ＭＢＬ１５６はわずかに１つの結合リガンド層から成ることができ、例えば１次結合の場合であり、あるいはそれは２，３，４，５又はそれ以上の結合リガンド層から成ることができ、例えば２次又は高度な結合イベントが起こる場合である。複合的なリガンド層は異なる結合表面１５５で、同一のインターフェース伝送ライン１５３を超えて起こることができる。
【００５０】
例示した態様において、誘電基材１５８は溶液１５７と接地面１５９との間に位置する。例示した態様において、誘電層１５８及び接地面１５９は、バイオアッセイ装置１５０内に位置するが、代わりの態様において、１又は複数のものが外側に位置することがある。更に、ＭＢＬ１５６及び溶液１５７の配置を交換していずれか一方を接地面へと近づけるか、又はこのような層配置の他に、インターフェース伝送ライン１５３の近位に配置してよい。
【００５１】
システム１００は、検査シグナルを伝送ライン１２０へ、及びバイオアッセイ装置１５０の方へ送り出す信号ソース１１０を含む。シグナル検出器１６０は、生じるシグナル（反射したか又は送信したかのどちらか、あるいはその両方）を検出するために伝送経路に沿って位置する。シグナルがバイオアッセイ装置１５０のインターフェース伝送ライン１５３に沿って伝搬するとき、ＭＢＬ１５６の誘電特性は検査シグナルを変調する。次に、変調したシグナルを回復することができ、そして以下で更に記述する、バイオアッセイ装置内で起こる分子の結合現象を検出及び同定するために使用することができる。
【００５２】
本発明の代わりの態様において、本明細書に記載のリガンド、抗リガンド／リガンド複合体又は他の分子構造の検出及び同定は、それがインターフェース伝送ライン１５３から物理的に分離される場合に可能である。この態様において、前記リガンドは独立しているが、インターフェース伝送ライン１５３に電気的に又は電磁的にカップリングしている。インターフェース伝送ライン１５３と、つり下げられたリガンドとの間のカップリングは、インターフェース伝送ライン１５３に沿って伝搬し、その結果、検出されそして／あるいは同定される検査シグナルの応答を変えるであろう。インターフェース伝送ライン１５３と、つり下げられたリガンドとの間の最大の分離は、インターフェース伝送ライン１５３と前記リガンドとの間の媒体の有効な誘電定数、総カップリング領域、シグナル検出器の感度、溶液中の前記リガンドの濃度、及び所望の検出時間、これらの様な因子によって決定される。分離の距離は、典型的におよそ１０-1ｍ，１０-2ｍ，１０-3ｍ，１０-4ｍ，１０-5ｍ，１０-6ｍ，１０-7ｍ，１０-8ｍ，１０-9ｍ，１０-10 ｍ又はそれらの間のいずれかの範囲である。
【００５３】
細胞を基にしたアッセイの如き、いくつかの態様において、ＭＢＬは溶液を通してシグナル経路に、電磁的にカップリングすることができる。従って細胞、並びに特に細胞膜及び膜を基にした構造は前記シグナルにカップリングすることができる。
【００５４】
図１Ｂは、共振マイクロストリップ回路１７０の配置を含んで成るバイオアッセイシステムの第２の態様を図解する。各々の共振回路１７０は、開路スタブ１７６で終わる伝送ライン１７２から成る。回路設計業界の者は、他の共振構造を集中素子、分配素子、又は両方の回路トポロジーの組合わせにおいて適用することができることを認識するだろう。
【００５５】
図１Ｃは、１つの共振回路１７０の断面図を図解する。開路スタブ１７６は、共振回路１７０の生物電気インターフェースを形成し、そして図１Ａ中に示した生物電気インターフェースと厳密に平行である。特に開路スタブ１７６は、誘電層１７６上に据えられたインターフェース伝送ライン１７６ａから成り、そして接地面１７６ｃの上に位置する。
【００５６】
この態様において、ＭＢＬ１７６ｄは、伝送ライン１７６ａに、直接的な接続を介してカップリングする。ＭＢＬ１７６ｄは特異的又は非特異的方法において、インターフェース伝送ラインに沿って結合することができる。上文の様に、問題の分子構造物はつり下げられることがあるが、結合イベントの検出及び同定の情報を提供するために、インターフェース伝送ライン１７６ａに電気的にカップリングするか、又は電磁的にカップリングすることがある。
【００５７】
インターフェース伝送ライン１７６ａの大きさは、考慮すべき事柄、例えば所望の測定時間（大きい面積は、より早い検出時間をもたらす）、所望の共振周波数ｆres 、より高い効率を達成するための、又は結合現象を強調するために不連続性を引き起こすための所定のインピーダンス整合条件、及び全体の配置を形成する工程によって影響を受ける。例えば、従来のマイクロ波写真平板を使用するならば、結合表面の領域は、比較的厚い誘電層、例えばアルミナ、ダイアモンド、サファイア、ジュリオド又は他の従来の基板材料を用いて１０-1ｍ2 〜１０-6ｍ2 に及ぶことがある。あるいは、半導体処理を用いるならば、結合表面の領域は、比較的薄い、ヒ化ガリウム又はシリコンの誘電層を用いて１０-6ｍ2 〜１０-12 ｍ2 に及ぶことがある。
【００５８】
従来のマイクロ波設計技術又はＣＡＤ道具、例えばＭｉｃｒｏｗａｖｅ  ＳｐｉｃｅTM，ＥＥｓｏｆ  ＴｏｕｃｈｓｔｏｎｅTM及びＬｉｂｒａTMを用いて、伝送ライン１７２の長さ及びインピーダンス、インターフェース伝送ライン１７６ａの大きさ、並びに誘電層１７６ｂの厚さ及び誘電定数は、所望の共振周波数点ｆres で、共振シグナル応答を示す、共振構造などを選択することができる。前記の所望の共振周波数ｆres の点は典型的に、関心の分子が、それらの誘電特性において劇的な変化を示し、その測定がそれらの検出を可能にする、それ以上の周波数範囲である。あるいは、前記の共振周波数点ｆres を、シグナル検出の最も幅広い範囲を見込むための、所望の試験周波数範囲の中心として定義することができる。例示した態様において、前記の共振周波数ｆres は１０MHz ，２０MHz ，４５MHz ，１００MHz ，５００MHz ，１GHz ，５GHz ，１０GHz ，３０GHz ，５０GHz ，１００GHz ，５００GHz ，１，０００GHz 又はそれらの間にわたる周波数を含む。
【００５９】
測定の間、溶液１７６ｅは１又は複数の開路スタブ１７２の上に適用される。ＭＢＬ１７６ｄは、溶液内の１又は複数の分子がインターフェース伝送ライン１７６ａに結合するときに形成する。この場合において、前記のＭＢＬ１７６ｄ及び溶液は、更に以下に記述するプラスチック回路として電気的にふるまい、これはその最初の共振周波数点の上又は下へと共振周波数点ｆesのシフトを引き起こす。周波数におけるこのシフトは検出することができ、そして分子の結合現象の発生を指摘するために使用される。前記のシグナル応答はまた、以下に記載する、結合分子構造の同定を確かめるための、広範なスペクトルを超えて質問されることがある。各々の共振回路１７０を、異なる分子構造に結合するために製作することができ、そして各共振回路１７０をアドレスで呼び出せる様に作ることができ、それによって同一の溶液内の多数の分子構造物の、同時の検出及び同定を可能にする。代わりの態様において、各共振回路１７０を、異なる共振周波数を示すために設計することができ、この場合において、全ての共振回路１７０は、分子の結合を決定するために、連続的な周波数スペクトルを超えて質問されることがある。
【００６０】
Ｂ．本システムの化学的性質
本システムの化学はバイオアッセイ装置内、及び特に導電層（図１Ａ〜１Ｃにおけるインターフェース伝送ライン）に沿って、一般に起こる。導電層は、高周波数の検査シグナルの伝搬を支持するために導電的である形態を有する材料から製作される。導電的な表面は、所望の試験周波数範囲に勝る適切な導電性を示し、しかも上述の分子の結合の良い質を有する材料から構築される。その様な材料は、限定しないが、金、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、銅、銀、亜鉛、スズ、アンチモン、ガリウム、カドミウム、クロム、マンガン、コバルト、イリジウム、プラチナ、水銀、チタン、アルミニウム、鉛、鉄、タングステン、ニッケル、タンタル、レニウム、オスミウム、タリウム又はそれらの合金を含む。導電層はまた、化学的に不純又は純粋なカーボン、シリコン、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、ヒ化イジウム−ガリウムなどを含む、構造において結晶又は非結晶のどちらかであることができる半導体材料から形成されることがある。導電性の材料はまた、特に導電性であるポリマー、例えばポリアセチレン、ポリチオフェンなどから形成されることがある。導電層は、適用が必要である場合に、厚いか又は深さにおいてわずかに数個の分子層であることがある。導電層は蒸発した薄い金属層又はヒ化ガリウムのエピキシャル層又は知られた半導体処理技術を通して導電性を与えられた他の半導体材料から成ることがある。更に、導電層は公知の方法から誘導されることがあり、例えばＫｕｍａｒ等の“Patterned Self-Assembled Monolayer and Mesoscale Phenomena”， Accounts of Chemical Research，28 : 219-226 (1995) を参照せよ。
【００６１】
更に、導電層は分子の結合を容易にするために、導電性である形態を有する材料から製作される。リガンドは直接的に、他の分子構造物を通すか、又は結合のための両方の配置を通して間接的に導電層に結合することができる。導電層に結合することができる分子の範囲は、限定しないが、タンパク質、核酸、小分子、糖類、脂質、及び他の関心のある分子を含む。前記の化学的性質は、前記表面に付着した分子のただ唯一の化学種、前記表面に付着した異なる化学種の完全な配置、又は前記表面及び溶液中の関心のリガンドに間接的に付着した化学種の間での複数の結合現象を含む。
【００６２】
導電層にリガンドが付着することに関連する典型的な化学的性質は、リガンドの性質及びそれに結合するいずれかの抗リガンド、並びにアッセイにおけるそれらの機能に通常依存する。前記表面上で起こりうる相互作用の可能な型のリストは、限定しないが：タンパク質／タンパク質相互作用、ＤＮＡ／タンパク質相互作用、ＲＮＡ／タンパク質相互作用、核酸のハイブリダイゼーション、例えば塩基対の誤対合解析、ＲＮＡ／ＲＮＡ相互作用、ｔＲＮＡ相互作用、酵素／基質相互作用、抗原／抗体相互作用、小分子／タンパク質相互作用、薬剤／受容体相互作用、膜／受容体相互作用、固相のリガンドにおける立体配座の変化、タンパク質／糖類相互作用、及び脂質／タンパク質相互作用を含む。
実際の表面の化学的性質を、１次結合及び２次結合として、１つの態様内に記載することができる。分子の結合の、付加的な層もまた起こりうる。１次結合は、導電的な表面への抗リガンドの付着を言及し、これはリンカー分子の補助を通して起こることができる。２次結合は、リガンドの、ＭＢＬ内の他の分子であることがある抗リガンドへの結合、又は導電的な表面自身への間接的な結合を言及する。典型的に、前記の結合は、固定化された固相の抗リガンドに結合する液相のリガンドを含む。例えば１次結合は、バイオアッセイ装置の導電層への特異的な抗体の付着であることがあり、そして２次結合は、抗体への、試料溶液中の特異的な抗原の結合を含むであろう。あるいは、２次結合は導電的な表面へのタンパク質の直接的な付着であることがあり、例えば金の導電層に直接的に付着するタンパク質のアミン末端である。
【００６３】
前述の結合は、１又は複数の導電層の領域に沿って、分子結合層（ＭＢＬ）１８０の形態を生じ、この１つの態様を図１Ｄに図解する。この態様において、ＭＢＬ１８０は第１リンカー１８１、絶縁体１８２、第２リンカー１８３、マトリックス１８４、第３リンカー１８５、抗リガンド層１８６、及びリガンド層１８７から任意に成る。
【００６４】
第１リンカー１８１は絶縁層１８２と導電層（示していない）との間の接着を提供する。第１リンカー１８１はチオール、アミン、アミドなどの分子、あるいはクロム又はチタンのような金属から成る。絶縁層１８２は、導電層と、ＭＢＬ１８０と、溶液（示さない）との間の障壁を提供する。絶縁層１８２は、ＭＢＬ及び／又は溶液にさらすことによる、導電層の構造的な劣化を防ぐための、密閉的な障壁を提供することができる。あるいは、又は更に、ＤＣ、又は測定と抵触しうるＭＢＬ及び／又は溶液への導電層からの低周波数エネルギーの流れを阻害するために、絶縁層１８２は電気的に非導電性材料から成ることがある。前記絶縁層はポリイミド、アルミナ、サファイア、非導電性ポリマー、半導体絶縁性材料、例えば二酸化ケイ素又はヒ化ガリウム、あるいは密閉性の及び／又は電気的に絶縁の特性を提供する他の材料を含む。前記絶縁層はまた空気、又は別の気体物質から成ることがあり、この場合、リンカー１８１は除去されるであろう。
【００６５】
第２リンカー１８３は絶縁層１８２とマトリックス１８４との間の接着を提供し、そして第１リンカー１４８１と同一又は類似の分子から成る。マトリックス層１８４はポリマー層から成ることがあり、しかし任意に炭水化物、タンパク質、ポリアミノ酸層などでもある。第３リンカー１８５は、抗リガンド１８６にマトリックス層を接着するために適当な分子から成り、そして第１の及び／又は第２のリンカー、１８１及び１８３のいずれかと同一又は類似の分子から成ることがある。
【００６６】
抗リガンド１８６は、溶液内でリガンド１８７に特異的又は非特異的に結合するために、そして／あるいは溶液の物理的特性、例えば温度、pH、イオン強度などを測定するために使用される。抗リガンドは、リガンド１８７に特異的又は非特異的に結合する分子、又は分子構造物から成る。例えば、リガンドが抗原から成る場合、抗リガンド１８６は抗体から成るであろう。リガンド１８７は、抗リガンド１８６に特異的又は非特異的に結合する分子、又は分子構造物から成る。
【００６７】
一般に、ＭＢＬは一体化シグナル経路に沿う電磁的検査シグナルと、本明細書に記載した様に測れる程度に相互作用することが十分であろう。従って、変化する誘電特性を示す、本質的にあらゆるＭＢＬ組成物を解析することができる。多くの態様において、ＭＢＬは、厚さが約１〜５Åと１cmの間に及ぶだろう。単純な分子の結合現象にとって、前記の範囲は通常約１０Å〜１０，０００Å、典型的に１００Å〜５，０００Å、又は５００Å〜１，０００Åであろう。より大きな相互作用（例えば細胞）において、ＭＢＬは１μｍ〜１００μｍ、好ましくは５μｍ〜５０μｍに及ぶだろう。絶縁体、マトリックスなどと供に、前記のサイズはかなり高い値に及ぶだろう。
【００６８】
図１Ｄの態様は、ＭＢＬの配置の可能性全てを網羅することを意図していない。当業者は、特定の適用に述べた様に、ＭＢＬを作製する非常に多くの組合わせを設計できることを認識するだろう。第１、第２及び第３のリンカー１８１，１８３，１８５、絶縁層１８２、及びマトリックス層１８４が条件を満たしていない場合、ＭＢＬは抗リガンド１８６及びリガンド１８７から成る。また更に、第１リンカー１８１及び絶縁層１８２は除かれることがある。１又は複数の前述の層を除き、又は追加の層を加える、他の代わりの態様は当業者にとって自明である。
【００６９】
更に、場所ごとにまとまり、又は無作為に層を成すことができ、又は特定の配置の形式に依存して分布する異種の分子からＭＢＬは成ることがある。例えば、図１Ｅは空間的に分かれた、４つの異なる抗リガンド１９０，１９１，１９２及び１９３を有する、ＭＢＬ１８０の平面図を図解する。図１Ｆは、４つの異なる抗リガンド１９０，１９１，１９２及び１９３が無作為にくまなく分布した、ＭＢＬ１８０を図解する。別の態様において、図１Ｇは、シグナル経路１５３にカップリングした溶液１５７において、細胞１９４を含むＭＢＬ１８０の断面図を例示する。別の態様において、膜結合構造（示さない）を持つ細胞膜１９５は、シグナル経路にカップリングした溶液１５７中にある。前記の層は、例えばリンカー、マトリックス、抗リガンド、リガンド及び１又は複数の絶縁層を含むことができる。いくつかの態様において、イオンの輸送、サイズ又は電荷の選択を調節するか、あるいは抗リガンド又は他の分子構造物の接着を支持する様な、１又は複数の膜を適用することができる。
【００７０】
電気的にＭＢＬは、単離され、そして結合現の環境変化、例えばpH変化、温度、イオン強度などの存在下の、結合分子の構造的及び立体配置的な特性、並びにその中での変化を部分的に特定できる、独特な誘電特性を示す。
【００７１】
溶媒和性媒体（溶液）の局所的な構造と一緒の、結合した分子の構造の誘電特性はまた、第１の又は他の高次元な結合によって引き起こされる分子内及び分子間の結合の変化、並びに導電層近くの溶媒和性媒体の移動に寄因しうることができる。
【００７２】
一度導電層が提供されると、供に働くためのシステムを選択する目的のための、生物及び化学の文献に当業者は一般に精通しているであろう。生物学的システムへの、一般的な導入のため、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc, and John Wiley & Sons, Inc. (through 1997 Supplement) (Ausubel) ; Watson et al. (1987)  Molecular Biology of the Gene. Fourth Edition, The Benjamin/Cummings Publishing CO., Menlo Park, CA ; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, Second Edition Garland Publishing, NY ； The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merek & Co., Rathway, NJを参照せよ。生物試薬及び実験装置の製造会社由来の製品の情報もまた、生物学的システムのアッセイにおける有用な情報を提供する。その様な製造会社は、例えばSIGMA chemical company (Saint Louis, MO), R & D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), GIBCO BRL Life Technologies, Inc, (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland. Applied Biosytems (Foster City, CA)、及び当業者に知られた、多くの他の製造会社を含む。
【００７３】
生物学的試料は、公知の技術、例えば静脈穿刺、腰椎穿刺、体液試料、例えば唾液又は尿、あるいは生検などを用いて、患者から得ることができる。生物学的材料がヒト由来ではなく、例えば商業的に関連のある家畜であるとき、血液及び組織の試料は都合のよいことに、家畜処理工場より得られる。同様に、本発明で使用される植物材料は、都合の良いことに農業又は園芸の供給源又は天産物の他の供給源より得ることができる。あるいは、生物学的試料は、組織及び／又は血液が保存されているセル又は血液バンクから、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏの供給源、例えば細胞培養から得ることができる。生物学的材料の供給源として使用するための、細胞培養を確立するための技術は当業者に公知である。 Freshney, Culture of Animal Cells. a Manual of Basic Technigue, Third Edition, Wiley-Liss, NY (1994) は細胞培養の概論を提供する。
【００７４】
本発明を数多くの態様において実施することができる。いくつかを以下に詳述し、付加的な態様及び適用を適用の欄において詳述する。
【００７５】
１つの態様において、本発明はシグナル経路に結合する分子構造物を検出するために使用する。この態様において、シグナルはシグナル経路に沿って伝搬する。それが伝搬する場合、それは結合構造物にカップリングし、そして変調する。変調した応答の解析は結合を示唆する。
別の態様において、本発明を２次結合を同定するために使用することができる。例えば、１次結合は、導電的な表面への抗体の付着であることがある。２次結合は溶液中での固定化抗体と、その抗原の間の結合の測定を含むことがある。１次結合が先の段落において記載した様に検出された後に、その抗体を含む溶液をバイオアッセイ装置に加え、再び応答を測定する。変化は、結合現象が起こったことを示唆するであろう。
【００７６】
１つの観点において、本発明はリガンド、例えばタンパク質を１次結合段階において同定するために使用されることがある。較正時において、数多くの知られたタンパク質の応答を決定することができ、そして保存することができる。アッセイ表面に未知のタンパク質が付着した後、本システムの誘電特性を測定することができ、そして本シグナルの誘電特性を、前記の表面上のタンパク質を同定するために使用することができる。各タンパク質の指紋応答が保存されるので、未知の応答を保存した応答と比較することができ、パターン認識を未知のタンパク質を同定するために使用することができる。
【００７７】
別の態様において、本発明を配列形式において使用することができる。本装置は各々が特異的な抗リガンドに結合した、複数の、アドレスで呼び出せる部位を有するだろう。本装置に溶液を輸送した後、各部位における結合の応答が測定され、そして特徴づけられるだろう。アドレスで呼び出せる各部位では、独特な核酸が抗リガンドとして付着する。前記試料をさらした状態で、相補的な配列が適当な部位に結合するだろう。各部位での応答は、配列が結合したかどうかを示唆するだろう。その様な測定はまた、結合した配列が、抗リガンドと完全な対合であるかどうか、あるいは１又は複数の誤対合があるかどうかを示唆するだろう。この態様はまた、タンパク質及びタンパク質のクラスを同定するために使用されることがある。
別の態様において、この発明は、次に、特定の被検物又はリガンドの未知の濃度を決定するために使用するであろう標準曲線又は滴定曲線を生成するために使用されることがある。例えば、抗体は本装置に接着することがある。本装置はリガンドの、いくつかの異なる濃度、及び測定した各濃度のための応答にさらされることがある。その様な曲線はまた、線量反応曲線として、当業者に知られている。未知の試料は本装置にさらされることがあり、そしてその応答が測定される。その応答は、未知の試料におけるリガンドの濃度を決定するために標準曲線と比較することができる。
【００７８】
別の態様において、この発明は、老化及び他の安定性の問題による損失のため、内部で自己較正するために使用することができる。例えば、抗体−抗原系と供に、この発明は、未知のものをさらす前に、１次的な応答を測定することによって、前記表面上の活性な抗体の量を測定させる。前記の１次的応答の量は、本装置にとどまる活性な抗体の量を反映する定数によって、２次的な応答、抗原結合を調節するために使用される。
【００７９】
III ．バイオ−アッセイ装置
Ａ．装置の構造
構造的に、本バイオ−アッセイ装置はシグナル経路及び生物電気インターフェースを含む。前記シグナル経路は単一入力／出力シグナルポート；１つの入力シグナルポート経路及び１つの出力ポート経路、複数の入力及び／又は出力信号ポート経路から成ることができる。シグナル経路を、導電性電線、伝送ライン、導波管構造、共振キャビティー、又は所望の周波数範囲を超える検査シグナルの伝搬を支持する、他の伝送媒体のいずれかなどの多くの異なる構成物において実現することができる。可能な態様のために、R.E. Collins Foundations for Microwave Engineering, McGraw-Hill Publishing Co., 1966 ; and S. March, Microwave Transmission Lines and Their Phvsical Realizations. Les Besser and Associates, Inc., 1986を参照せよ。更に、本バイオ−アッセイ装置はまた、様々な異なる配置において実現することができる。限定的でない配置は、従来の製造技術、従来のエッチング及び写真平板、又は半導体の処理技術を用いて、大幅に小型化した構造物を含む。
【００８０】
図２Ａは断面図において示した様なバイオ−アッセイ装置の１つの態様を図解する。バイオ−アッセイ装置２３０は頂上板２３１、接触端子２３７、及び底面板２３９から成る。頂上板２３１は、配置されたインターフェース伝送ライン２３３を有する底面を含む。誘電基板２４０及び接地面２５０はバイオ−アッセイ装置の外部に位置する。頂上板２３１及び／又は誘電基板２４０は、ガラスの様な絶縁性材料から作られ、これは好ましくは従来の写真平板又は金スパッタ、エッチング又は化学蒸着（ＣＶＤ）処理に適合する。他の材料、例えばアルミナ、珪素、ヒ化ガリウム又は他の絶縁性材料を代わりに使用することができる。
【００８１】
図２Ａに図解した様に、インターフェース伝送ライン２３３の底面は分子結合層２３４と接触している。図解した様に、ＭＢＬは、異なる層又は型の、結合した分子構造物、及び溶液内で生じた分子構造物から成ることがある。代わりの態様において、ＭＢＬ２３４はインターフェース伝送ライン２３３の小さな又は大きな部分にわたることがあり、そして示した様な結合した異なる分子構造物から成ることができる。ＭＢＬは抗リガンド／リガンド構造物単独、又は図１Ｄに示した様な、リンカー、マトリックス、及び絶縁層の様々な中間物から成ることがある。条件を満たす場合、絶縁層１８２（図１Ｄ）は、空気、ポリイミド、アルミナ、ダイアモンド、サファイア、又は半導体絶縁性材料、例えば二酸化ケイ素若しくはヒ化ガリウム、あるいは非導電性材料、更に他の従来の絶縁性材料から成ることがある。前記絶縁層の厚さ及び誘電定数は、ＭＢＬ２３４及びインターフェース伝送ライン２３３が信号の伝送の間、供にきつくカップリングする程度のものである。絶縁層１８２の厚さは、１０-1ｍ，１０-2ｍ，１０-3ｍ，１０-4ｍ，１０-5ｍ，１０-6ｍ，１０-7ｍ，１０-8ｍ，１０-9ｍ，１０-10 ｍ、又はそれ以下の厚さであり、あるいはそれらの間にある値であることができ、これは要求されるカップリングの量、絶縁層の誘電定数、及びカップリング領域の総計に依存する。カップリングは、多層の、同一平面上の、又は導波管の回路トポロジーにおいて、並んで及びオフセットにカップリングした配置を含む多くの異なる配置を通して達成することができる。条件を満たす絶縁層は、溶液媒体からインターフェース伝送ラインを密封的に封入するために、及び／又は分子の結合現象の発生を出来る限り中断する溶液への、ＤＣ若しくは低周波数電流の流れを防ぐために有利であることができる。
【００８２】
インターフェース伝送ライン２３３は、シグナル伝搬を支持することが可能な、そしてＭＢＬ２３４と結合することが可能な材料から成る。前記材料はＭＢＬの構成に依存して変化するが、ものによって金、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、銅、銀、亜鉛、スズ、アンチモン、ガリウム、カドミウム、クロム、マンガン、コバルト、イリジウム、プラチナ、水銀、チタン、アルミニウム、鉛、鉄、タングステン、ニッケル、タンタル、レニウム、オスミウム、タリウム又はそれらの合金を含むだろう。あるいは、インターフェース伝送ライン２３３は、１又は複数の標的分子（リガンド）との結合を形成するための、１又は複数の分子構造物（抗リガンド）（これはＭＢＬ２３４の一部を形成する）を含むことがある。インターフェース伝送ラインを含んで成る材料はまた、リンカーの付着を増大するために、及びシグナル伝搬を支持するために、選択されることがある。インターフェース伝送ライン２３３を形成するために使用することができる他の材料は、当業者に容易に理解されるだろう。
【００８３】
前記リガンドは溶液２６０、例えばダルベッコリン酸緩衝塩溶液（ｄ−ＰＢＳ）などを用いるＭＢＬ２３４に輸送されうる。関心のタンパク質、核酸、又は他のリガンドを、様々な技術を用いて、例えばウィッキング、ピペッティング、ディッピング、ドロッピング、直接接触、又は毛細管作用を通して結合表面に適用することができる。
【００８４】
特定の態様において、インターフェース伝送ライン２３３は、低いシグナル損失及び外部の伝送ライン２７０への近接インピーダンス整合（ｃｌｏｓｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｍａｔｃｈｉｎｇ）を提供するために設計される。小さいシグナル損失は、導電性材料、例えば金、銅、アルミニウム、酸化スズインジウム（ＩＴＯ）又は上述した導電性材料から、インターフェース伝送ライン２３３を製作することによって達成される。近接インピーダンス整合は、基板、溶液、及びＭＢＬの、相対的な誘電特性に依存して、外部の伝送ライン２７０の幅に近くにおいてインターフェース伝送ライン２３３の幅を定めることで達成される。インターフェース伝送ライン２３２と、外部の伝送ライン２７０との間のシグナル連絡は、接触端末２３７を経由して提供される。上文で説明した様に、ＭＢＬ２３４及び溶液媒体２６０はどちらか一方が接地面２５０の近位に配置されていてよく、又はこのような層位置の他に、インターフェース伝送ライン２３２の近位に配置されていてよい。
【００８５】
集中素子形態、分布形態、又は両者の組合わせにおける追加のアナログ及び／又はデジタル回路構成が、バイオ−アッセイ装置の入力及び／又は出力ポートにおいて含まれることがある。例えば、インピーダンス整合回路及び／又は緩衝増幅器回路を、入力ポートにおいて採用してよい。代わりに、又は更に、インピーダンス整合回路及び１又は複数の出力増幅器は出力シグナルを更に増幅させるために用いられることがある。電子回路の業界の者は、他の型の条件付き回路が、同様に代わりの態様において使用されることがあることを認識するだろう。
【００８６】
図２Ｂはバイオ−アッセイ装置の第２の態様を図解する。この態様において、底面板２３９の頂上側の表面上で形成するインターフェース伝送ライン２３３の上のスペースを、溶液が占める。インターフェース伝送ライン２３３の頂上面側は、ＭＢＬ２３４が付着する結合表面を形成する。誘電層２４０はインターフェース伝送ライン２３３と、接地面２５０との間に位置する。接触端末２３７は外部の伝送ライン２７０にシグナル経路を提供する。インターフェース伝送ライン、頂上板、底面板、接触端末、及び誘電層は、上述した様な材料及び方法から形成することができる。ＭＢＬもまた、図１Ｄにおいて上述した様に形成することができ、その変形型も同様である。更に、ＭＢＬ２３４及び溶液媒体２６０はいずれか一方を接地面２５０の近くに配置し、あるいはこれらの層の位置に加えて、インターフェース伝送ライン２３３の近位に配置することができる。
【００８７】
更なる構造的な態様は、伝送ライン、導波管、及び共振キャビティーの複数の素子を有するバイオ−アッセイ装置を含み、ここでＭＢＬは、検出の特異性及び感度を増幅する様な方法において、１又は複数の回線又はキャビティーの素子に接着することができる。その様な構造の例は、平行に配置したシグナル結合物、共振キャビティー又は導波管を含み、これらに沿って、素子上に結合したＭＢＬは、結合構造のない別の平行素子として比較して、シグナル伝搬特性を変え、かくて複合シグナルのモード特性変え、直ちに検出可能な出力シグナル特性を生じる。後者のこれらの効果は、周波数、周波数安定性、及び極めて高い精度をもって周波数のごく小さい変化を測定する公知の技術を利用する。
【００８８】
Ｂ．結合表面の化学的性質
図３は生物−電気インターフェースの導電層に沿って発生する結合表面の化学の、１つの態様を図解する。生物電気インターフェースは基板３２０、導電層３３０、ＭＢＬ３４０、及び溶液３５０を含む。基板３２０は、誘電層又は、アルミナ、ダイアモンド、サファイア、プラスチック、ガラスなどを含む、本明細書に記載の基板材料のいずれかであることができ、そして導電層３２０への構造的な支持を提供することができる。代わりの態様において、基板３２０は除かれ、そして構造的な支持が絶縁層３４２を経由して提供される。
【００８９】
導電層３３０は上述した様な、所望の周波数以上のシグナル伝搬を増大し、ＭＢＬ３４０の結合を増大する材料及び形態から成る。２つの導体回路トポロジーにおいて、導電層３３０はシグナル又は接地面から成ることがある。しかしながら、どちらかの場合において、第２の導電層（シグナル面又は接地面のいずれかであり、示していない）は基板３２０の下方（図２Ｂの配置）、又は溶液３５０から取り出された少なくとも１つの基板の層（図２Ａの反対の配置）のいずれかに位置する。あるいは、導電層は、これらの高さの両方に位置することがある。
【００９０】
溶液３５０は、ＭＢＬ３４０のリガンドの流れを許すため、ＭＢＬ３４０にカップリングする。溶液３５０からＭＢＬ３４０へのリガンドの流れは直接的又は非直接的であることがある。溶液は移動媒体のいずれか、例えば気体、液体、又は固相の材料から成り、いくつかの例は、水性ｄ−ＰＢＳ、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などである。
【００９１】
生物電気インターフェースに沿って、ＭＢＬは溶液の少なくとも１つの部分と、シグナル経路との間に位置し、その様なＭＢＬは、その部分に沿って、溶液よりシグナル経路に一層近接である。図３の態様において、ＭＢＬ３４０は溶液３５０と導電層３３０との間に位置し、後者により近い（図２Ａに示した）。１つの態様において、溶液はシグナル面と接地面との間に位置する（図２Ｂに示した）第２の態様において溶液はシグナル−接地面領域の外側に位置する。
【００９２】
導電性表面へのＭＢＬの結合に関与する典型的な化学的性質は、ＭＢＬの性質及び内容、アッセイにおけるその機能に通常依存するだろう。ＭＢＬは本明細書に記載した様なリガンド、リガンド／抗リガンド複合体、又は他の分子構造物から成ることができる。典型的にリガンドは可能な限り表面に近く、機能的に損われておらず、抗リガンドの表面密度は、最も大きな誘電効果を提供するのに十分な大きさであるが、例えば立体障害又は近くの分子により固定化した抗リガンドの活性のある結合部位を物理的に妨害することによって、結合の機能を損わない程度の大きさである。
【００９３】
リガンドは直接的に又は図３に示した様な中間構造物で、導電層３２０に特異的又は非特異的に、結合することができる。特異的な結合を望むならば、リンカーを、結合を容易にするために、例えば導電層３２０が溶液にさらされる様に結合するために任意に使用することができる。
結合層を稠密に詰めることを確実にするために、チオール基、Ｆａｂ、又はプロテインＡの様なタンパク質は、導電層３２０に沿う、抗体又は他の抗リガンドの結合を容易にするために使用することができる。これらの及び類似の物質を、写真平板、半導体処理、又は他の従来の適用技術を含む、多くの方法において、導電層３２０に適用することができる。
【００９４】
更に、いくつかのリガンド及び抗リガンドを複数の方法において、結合することができる。これらのリガンドは統計的に有意な形態を典型的に持ち、又は部位特異的な方法において結合するために操作されることがある。いくつかの抗リガンドは、部位特異的な方法において、前記表面に任意に結合する。例えば、オリゴヌクレオチドは１つの末端で結合することができる。一般に抗リガンドは、抗リガンドの機能を損わない方法、例えば、好ましくは、表面変性を最小化する濃度において付着するであろう。
【００９５】
結合表面での抗リガンドの濃度は特異的な検体に依存して変化することがある。例えば、タンパク質のための典型的な濃度は、１０7 ／cm2 ，１０8 ／cm2 ，１０9 ／cm2 ，１０10／cm2 ，１０11／cm2 ，１０12／cm2 ，１０13／cm2 ，１０14／cm2 ，１０15／cm2 、又はそれらの間の濃度である。核酸のための典型的な濃度は１０7 ／cm2 ，１０8 ／cm2 ，１０9 ／cm2 ，１０10／cm2 ，１０11／cm2 ，１０12／cm2 ，１０13／cm2 ，１０14／cm2 ，１０15／cm2 ，１０16／cm2 ，１０17／cm2 ，１０18／cm2 ，１０19／cm2 ，１０20／cm2 、又はそれらの間の濃度である。血液全体における検体のための典型的な濃度は、５５Ｍ，２５Ｍ，１０Ｍ，１Ｍ，０．５Ｍ，１０-1Ｍ，１０-2Ｍ，１０-3Ｍ，１０-4Ｍ，１０-5Ｍ，１０-6Ｍ，１０-7Ｍ，１０-8Ｍ，１０-9Ｍ，１０-10 Ｍ，１０-11 Ｍ，１０-12 Ｍ，１０-13 Ｍ，１０-14 Ｍ，１０-15 Ｍ，１０-16 Ｍ，１０-17 Ｍ，１０-18 Ｍ、又はそれらの間の濃度で変動する。
【００９６】
生物電気インターフェースを通すシグナルの伝送を変えるために、十分なリガンドをＭＢＬ内に付着するべきである。結合表面に付着しているリガンドの量は、１，１０，１０2 ，１０3 ，１０4 ，１０5 ，１０6 ，１０7 ，１０8 ，１０9 ，１０10，１０11，１０12，１０13、又はそれ以上のリガンド、及び導電層の表面積に依存する、それらの間のいずれかの数から成る。前記シグナル応答がバイオ−アッセイの装置又はチップ上の配置とは異なる、固有の誘電特性によって決定されるので、前記リガンドを導電層に沿う、あらかじめ定めた領域に適用する必要がない。ＭＢＬは、１０10cm2 〜１０24cm2 、典型的に１０15cm2 〜１０20cm2 にあり、より小さな分子のための表面密度を一般に有するだろう。前記リガンド層は、１層程度の厚さであることができるが、２，３，４，５又は１０あるいはそれ以上の層が任意に使用される。
【００９７】
一旦リガンドが導電層に結合すると、本システムの化学的性質及び／又は構造的な生物学的性質が効果を示す。リガンドの誘電特性が結合構造物の特性であるシグナル応答をもたらし、それによって結合現象の検出、及び構造物における関心の他の特性の検出を可能にする。結合現象によって提供される固有の応答は固定化抗リガンド、その標的リガンド、及び近くの分子（例えば水及び遊離イオン）の再配置に依存するだろう。前記表面に結合できる分子の範囲は、限定しないが、タンパク質、核酸、小分子、糖類、脂質、及び他の関心の分子のいずれかを含む。
【００９８】
典型的に、ＭＢＬの分子は水溶液、ｄ−ＰＢＳ、トリス、血液、生理的緩衝液、髄液、尿、汗、唾液、他の体性分泌物、有機溶媒などから成ることができる溶液内に配置される。他の溶液は気体、懸濁液、ゲル、並びに有機性の及び無機性の化合物を含むことができる。
【００９９】
２次的な結合反応は、バイオ−アッセイ装置のＭＢＬで起こる。溶液におけるリガンドは、結合層の抗リガンドと接触する様に、バイオ−アッセイ装置内で輸送される。溶液における前記リガンドの濃度は変化し、そして１０-1Ｍ，１０-2Ｍ，１０-3Ｍ，１０-4Ｍ，１０-5Ｍ，１０-6Ｍ，１０-7Ｍ，１０-8Ｍ，１０-9Ｍ，１０-10 Ｍ，１０-11 Ｍ，１０-12 Ｍ，１０-13 Ｍ，１０-14 Ｍ，１０-15 Ｍ，１０-16 Ｍ，１０-17 Ｍ，１０-18 Ｍ，１０-19 Ｍ，１０-20 Ｍから成ることができる。結合の様な相互作用が、リガンドと抗リガンドとの間で起こるとき、前記リガンドは結合現象の化学平衡特性によって指示される様に、任意に結合層の一部に成る。
【０１００】
ＭＢＬは結合リガンドを含み、そして溶液の分子もまた含むことがある。前記の結合リガンドは、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、及び本明細書で論じた他の分子の全てを含む、いずれかの分子であることができる。更にＭＢＬは結合表面層への抗リガンドの結合を保護するためにリンカーを含むことがある。
更に、リガンドとの抗リガンドとの相互作用は、抗リガンドのみが付着した結合層の特徴的な誘電特性を変化させる。例えば、抗リガンドＡが結合層を形成する抗リガンドであるならば、伝送ラインに沿って伝搬する検査シグナルの誘電応答は、抗リガンドＡの構造の特性を反映するだろう。リガンドＢが抗リガンドＡに結合するとき、結合層の構造及び／又は誘電特性は、ＢへのＡの結合により変化するだろう。Ａの構造は、Ｂがそれに結合したときに変化することがあり、それによって異なるシグナル応答を提供する。結合の相互作用によるシグナルにおける変化は、Ｂに対するＡの結合の特徴であるだろう。従って、結合の相互作用の存在は、前記シグナルの変化から決定することができる。
【０１０１】
更に、結合の型あるいは結合での、構造的な及び／又は配置の変化についての情報を、相互作用により変化したシグナル応答の一部を注目することによって得ることができる。リガンドＢを、抗リガンドＡへのその結合におけるシグナルの変化によって任意に検出し、そして同定する。抗リガンドＡへのリガンドＢの結合は抗リガンドＡ及びその近接における、構造の変化、又は分子構造若しくは周りの溶液における他の変化を引き起こす。これらの変化はＭＢＬの誘電特性を変え、それによって信号経路に沿う、試験信号伝搬の信号応答を変える。試験信号における変化は、リガンドＢの結合イベントを検出するために使用することができ、特定の変化はリガンドＢを同定するために使用することができる。知られている分子の構造と機能との間の関係において、例えば酵素、抗体、受容体などの場合において、結合したリガンドの機能を、そのスペクトルの同定から推測することができる。
【０１０２】
１つの態様において、抗リガンドの１つの型を、ＭＢＬを形成するために結合表面に適用することができ、リガンドは２つの分子の間の結合イベントを検出するためにＭＢＬを通過して適用される。別の態様において、抗リガンドは混合物であることができ、そして結合層伝いに適用されるリガンドは知られている検体又は抗体である。前記のシグナル応答における特異的な変化を検出することによって、抗リガンドと相互作用する特定のリガンドは、リガンド又は抗リガンドにおいて導入される、構造的な及び他の変化、及びそれらに由来するスペクトル応答により検出することができる。その様な態様は、各々の特定の抗リガンドの空間的な分離を必要としないが、むしろスペクトルの応答に由来する特異性の所望のレベルを導き、その結果、与えられる結合の相互作用は、起こった結合現象のアッセイの一部を注目することよりもむしろ、電磁的な応答を見ることによって決定される。
【０１０３】
別の態様において、抗リガンドは、結合層上の既知の分子であることができ、そしてリガンドは未知の混合物、例えば血液全ての試料としてバイオ−アッセイ装置伝いに適用される。この場合において、特定のリガンド、例えば血液中の抗体の存在は、シグナルがバイオ−アッセイ装置に流されることによって生じるスペクトルにおける特定のシグナル及びピークの存在又は不在によって検出される。あるいは、リガンドの結合での、抗リガンド又はリガンドにおけるスペクトルの変化により、それを検出することができる。その様な態様は、前記シグナルが結合現象の性質についての情報を含むため、結合の化学的性質単独よりも検出の特異性を増大する。従って、特異的結合は、非特異的結合以上に識別することができ、そして検出の全体の特異性は、化学的性質のみの特異性より、大幅に向上することができる。
【０１０４】
バイオ−アッセイ装置の使用を通して形成した検出のシステムは、検出がリアルタイム内で任意に起こり、そして多くの試料を直ちに解析することができるので、大量検出システムを提供する。応答期間はナノ秒規模でモニターされる。前記の分子が互いに結合するとすぐに検出が起こる。低濃度、又は低い結合親和性による分子間の結合現象を測定するために、より多くの時間が任意に要求される。拡散速度によって、実際の時間が任意に制約される。これらの潜在的な制約とは別に、幾千もの化合物がとても速く、例えば１時間以内に本システムを通して任意に流される。例えば、チップ製造技術を用いることで、１０，０００のチャンネル装置（新たな微流体工学のいくつかを用いる）が可能となり、そして、小容量及びそれによる短い拡散時間、並びに反応の開始のみを測定する運動測定値と供に、１時間あたり１０００万の試料が任意に測定される。知られた濃度により、結合親和性が運動性単独から、任意に算出され、そしてそれにより前記装置は非常に速い時間規模で調べることができ、そして親和性が算出され、そして／あるいは運動曲線の傾きから見積もることがある。運動性及び親和性のための参考文献は、あらゆる標準的な生化学又は化学のテキスト、例えば Mathews and van Holde, Biochemistry, Bejamin Cummings, New York, 1990において見出すことができる。
Ｃ．生物−電気的インターフェース
本生物電気インターフェースは、ＭＢＬ及びシグナル経路がそれに沿って形成される構造である。上述した様に、シグナル経路は導電性又は誘電性の導波管構造、２つの導体構造、例えば従来のシグナル／接地面構造、又は当業界で知られている３又はそれ以上の導体構造から成ることができる。一般に、シグナル経路の導電性領域の厚さは最小の信号損失を提供するために設計される。例えば、金の伝送ラインの典型的な厚さは０．１〜１０００μｍ程度の、好ましくは約１〜１０μｍである。
【０１０５】
前記シグナル経路は、ＭＢＬに対して非直交である方向に沿って形成される。１つの態様において、ＭＢＬが形成する表面上の接線に検査シグナルは平行に伝搬する。他の態様において、検査シグナルはＭＢＬの結合表面に対して±１°，±２°，±３°，±４°，±５°，±１０°，±１５°，±２０°，±３０°，±４０°，±４５°，±５０°，±６０°，±７０°，±８０°、又は±８５°の角度、又はそれらの間のいずれかで伝搬することができる。第１の態様において、本シグナル経路は２つの導体構造における伝送ラインから成り、そしてシグナル経路の方向は、電磁気の業界において知られているポインチングベクトルによって定められる。第２の態様において、生物電気的インターフェース領域に沿って連続的に伸びる、導電性の領域又は層から本伝送ラインは成ることができる。第３の態様において、所望の作用周波数範囲にわたり生物電気インターフェース伝いにてシグナル損失の最低の量を有する経路として、本シグナル経路を定義することができる。第４の態様にいて、３mhos／ｍ超のa.c.導電率を有する、すなわち食塩水溶液を超える、典型的には５mhos／ｍ超の、しかし理想的に１００〜１０００mhos／ｍの範囲内、及びそれ以上の導電率を有するとして、本シグナル経路と定義することができる。
生物−電気的インターフェースの運転は、前記インターフェースのための等価回路モデルを開発することで、より理解することができる。提示した等価回路モデルを２つの導体回路トポロジーにおいて示すが、回路設計業界の者は、それぞれが単一の導体導波管トポロジー、共振回路トポロジー、及び３又はそれ以上の導体を持つ回路トポロジーにおてい実行することができることを直ちに認識するだろう。
【０１０６】
図４Ａは、図２Ａに示した生物電気インターフェース構造のための、等価回路モデル４２０の１つの態様を図解する。回路設計業界の者は、図解した回路モデルが完全ではないこと、及び他の等価回路モデルが図２Ａの生物−電気的インターフェースに由来することがあることを認識するだろう。
【０１０７】
図解した前記等価の回路モデルは、直列ブロック４２２ａ，４２４ａ、及び４２６ａを含み、これは全て図２Ａに示した様に、インターフェース伝送ライン２３２，ＭＢＬ２３４、及び溶液２６０の直列電気的効果をそれぞれ表す。インターフェース伝送ライン、ＭＢＬ、並びに溶液回路ブロック４２２ａ，４２４ａ、及び４２６ａは、前記インターフェース伝送ライン、前記ＭＢＬ、及び前記溶液がそれぞれ、前記インターフェースに沿って、可能な縦のシグナル経路を提供するので、平行にカップリングしている。前記のＭＢＬ及び溶液が接地面に、きわめて近接に位置する場合の代わりの態様において、等価回路モデル４２０のインターフェース伝送ライン及び接地面は交換される。前記のＭＢＬ及び溶液が、インターフェース伝送ライン及び接地面の両方に、きわめて近く位置する場合の態様において、図２Ａは等価回路の上半分を表し、同一の溶液及びＭＢＬを使用するならば、その下半分は同一である。
【０１０８】
等価回路モデル４２０は、更に分路（シャント）回路ブロック４２２ｂ，４２４ｂ、及び４２６ｂを含み、これは図２Ａに示した誘電層２４０，ＭＢＬ２３４、及び溶液２６０をそれぞれ表わす。分路ブロック４２２ｂ，４２４ｂ、及び４２６ｂの直列配向は、ＭＢＬ、溶液、及び誘電層を通してインターフェース伝送ラインから、接地面、図２Ａに示した配置へと直列的に起こる、これらの各エレメントの物理的な配置から生じる。
【０１０９】
図４Ｂは、図４Ａに示した等価回路モデルに相当する回路４３０の１つの態様を図解する。回路設計の業界の者は、他の回路配置が可能であることを、直ちに認識するだろう。直列回路ブロック４２２ａ，４２４ａ、及び４２６ａのそれぞれが、直列にカップリングした抵抗器及び誘導子から成る。分路回路ブロック４２２ｂ，４２４ｂ、及び４２６ｂそれぞれが平行−カップリングの抵抗器及びコンデンサーから成る。直列抵抗器Ｒｔ，Ｒｍ，Ｒｓは、インターフェース伝送ライン、ＭＢＬ、及び溶液の固有抵抗のインダクタンスをそれぞれ表す。分路抵抗器Ｒｍ′，Ｒｓ′，Ｒｄは、ＭＢＬ、溶液、及び誘電層の固有抵抗それぞれ表す。直列誘導子Ｌｔ，Ｌｍ，Ｌｓは、インターフェース伝送ライン、ＭＢＬ、及び溶液をそれぞれ表わす。分路コンデンサーＣｍ，Ｃｓ，Ｃｄは、ＭＢＬ２３４、溶液２６０、及び誘電層２４０のキャパシタンスをそれぞれ表わす。集合的に、前述した抵抗器、誘導子、及びコンデンサーは出力信号Ｖｏに入力信号Ｖｉを変換する回路４３０を定義する。
【０１１０】
ＭＢＬの誘電特性は、これらの層のそれぞれに相当する回路素子の価値を主に決定する。例えば、図４Ｂに図解した態様において、ＭＢＬの磁化率は分路キャパシタンスＣｍの値を主に定義する。更に、ＭＢＬの分散特性は、分路抵抗性Ｒｍ′を主に定義する。Ｃｍ及びＲｍ′の値は、生物−電気的インターフェースのシグナル応答の有意な値を定義する。従って、生物−電気的インターフェースのシグナル応答は、ＭＢＬの誘電特性の強い特徴であり、以下に記載する、分子結合現象の検出及び同定のために使用することができる。
【０１１１】
溶液２６０が水溶液である場合の態様において、それに関係する誘電特性は、インターフェース伝送ラインに沿うシグナル伝搬に不利である。具体的に、水及び他の高度に水溶性の溶液、例えば全血液は、相対的に高い抵抗Ｒｓ及び相対的に低い抵抗Ｒｓ′、並びにスペクトルのある領域における電磁的放射に関する吸収特性を示す。これらのパラメーターの大きさが、インターフェース伝送ラインに沿う、非常に高いシグナル損失を生じる。本発明のインターフェース伝送ラインと、溶液との間の位置は、絶縁形態を提供するか、又は他にシグナル及び溶液のカップリングを調節し、それによってシグナル損失を調節し、そしてシグナル伝搬の他のパラメーターを変化させる。
【０１１２】
図４Ｃは、図２Ｂに示した生物−電気的インターフェース構造のための、等価回路モデル４５０の１つの態様を図解する。回路設計の業界の者は、図解した回路モデルが外部に存在しないこと、及び他の等価回路モデルが図２Ｂの生物−電気的インターフェース由来であることがあることを認識するだろう。
【０１１３】
図解した等価回路モデル４５０は直列の、及び分路の回路ブロック４５２ａ及び４５２ｂを含み、これらは電気的にインターフェース伝送ラインを表す。等価回路モデル４５０はまた、ＭＢＬ回路ブロック４５４と、それに直列にカップリングした溶液回路ブロック４５６を含み、これは電気的にＭＢＬ及び溶液を表わす。上文で説明した様に、直列及び分路ブロック４５２ａ及び４５２ｂの配置は、従来の伝送ライン構造を規定する。更に、ＭＢＬ及び溶液の回路ブロック４５４及び４５６の直列的な配列は、インターフェース伝送ラインから、ＭＢＬを通して、溶液へと伸びる信号界線分に由来し、この配置を図２Ｂに示す。代わりの回路モデルは、代わりに接地面にきわめて近接している、又はそれらの位置に加えて、インターフェース伝送ラインに近い、ＭＢＬ及び溶液を使用する上文のバイオ−アッセイ装置であることができる。
【０１１４】
図４Ｄは、図４Ｃに示した等価回路モデルに相当する回路４７０の１つの態様を図解する。回路設計の業界の者は、他の回路配置が可能であることを容易に認識するだろう。直列及び分路の回路ブロック４５２ａ及び４５２ｂは、集合的にインターフェース伝送ラインのための従来のモデルを表す。ＭＢＬ回路ブロック４５４は、インターフェース伝送ラインと、溶液回路ブロックとの間にカップリングし、そして、１つの態様において、平行にカップリングしたコンデンサーＣｍ、抵抗器Ｒｍ及び誘導子Ｌｍから成る。集合的に、前述した抵抗器、誘導子、及びコンデンサーは、入力シグナルＶｉを出力シグナルＶｏへ変換する回路４７０を規定する。
【０１１５】
上文で説明した様に、ＭＢＬ及び溶液の誘電特性は各電気的な素子の値に作用するだろう。特に、ＭＢＬの磁化率及び他の誘電特性は、Ｌｍの値を強力に規定し；そしてＭＢＬの分散特性並びに導電性及び他の誘電特性は、Ｒｍの値を有意に決定するだろう。従って、生物電気インターフェースのシグナル応答は、ＭＢＬの誘電特性の強力な特徴であり、そして以下で更に記述するように、分子の結合現象を検出及び同定するために使用することができる。
【０１１６】
Ｄ．特定の態様
図５Ａ〜５Ｇは、２つの導体回路トポロジーにおいて使用される生物電気インターフェースの特定の態様を図解する。回路設計の業界の者は、それぞれが単一の導体導波管トポロジー、及び３又はそれ以上の導体回路トポロジーにおいて使用されうることを容易に認識するだろう。
各態様はシグナル面５２０、誘電層５３０、及び接地面５５０から成る。シグナル面５２０、接地面５５０又はその両方にカップリングするのは、ＭＢＬ５１５及び溶液５１０である。各態様において、ＭＢＬ５１５はインターフェース伝送ライン５２０と直接接解するか、又はそれにカップリングするかのどちらかであることができる。シグナル面５２０がＭＢＬ５１５と直接接触する場合、シグナルの伝搬を支持し、そしてタンパク質、核酸、炭水化物、酵素など、リガンドを接着する、その両方が可能な材料からそれらは形成される。その様な材料は、限定しないが、金、ＩＴＯ、銅、銀、亜鉛、スズ、アンチモン、ガリウム、カドミウム、クロム、マンガン、コバルト、イリジウム、プラチナ、水銀、チタニウム、アルミニウム、鉛、鉄、タングステン、ニッケル、タンタル、レニウム、オスミウム、タリウム、又はそれらの合金を含む。使用することができる他の材料は当業者に容易に理解されるだろう。
【０１１７】
誘電層５３０は、空気、ポリイミド、テフロン、網状絶縁性材料、例えば二酸化ケイ素又はヒ化ガリウム、あるいは他の絶縁性材料から成ることができる。誘電層５３０の厚さ及び誘電定数は、当業界で知られた、所望の伝送ラインインピーダンスを提供するために選択される。溶液５１０はあらゆる輸送媒体、例えばダルベッコリン酸緩衝塩溶液（ｄ−ＰＢＳ）であり、これは目的の分子構造物を提供する。関心のタンパク質、核酸、又は他のリガンドは、ウィッキング、ピペッティング、又は毛細管作用を通してなど、様々な技術を用いて生物−電気的インターフェースに付着することができる。
【０１１８】
図５Ａ及び５Ｂは、マイクロストリップ回路トポロジーにおいて表わされるインターフェースの断面図を図解し、ここで溶液５１０、及びＭＢＬ５１５は、インターフェース伝送ライン５２０の上下及び下方にそれぞれ位置する。図５Ｃ及び５Ｄは、溶液５１０及びＭＢＬ５１５が、それぞれ接地面５５０の上方及び下方に位置するインターフェースの断面図を例示する。
【０１１９】
図５Ｅは共面導波管トポロジーにおいて表されるインターフェースの断面図を図解する。この態様において、溶液５１０及びＭＢＬ５１５は、インターフェース伝送ライン５３０の上方に位置している。あるいは、溶液５１０及びＭＢＬ５１５は、インターフェース伝送ライン５３０の下方に、又は、１若しくは複数の共面接地面５５０の上方若しくは下方に位置することができる。図５下はストリップ線路回路トポロジーにおいて表されるインターフェースの断面を図解する。この配置において、溶液５１０及びＭＢＬ５１５は、インターフェース伝送ライン５３０の上方に位置する。他の態様において、これらの層は代わりに、又は更にインターフェース伝送ライン５３０の下方、あるいは１又は複数の接地面５５０の上方又は下方に位置することができる。
【０１２０】
図５Ｇは同軸回路トポロジーにおいて使用される、生物−電気インターフェースの１つの態様を図解する。キャビティー５７０を有する第１絶縁体５３０ａは、インターフェース中心導体５３０の周りの境界線を示す。ＭＢＬ５１５はインターフェース中心導体５３０の覆われていない部分に最も近接して位置している。第２絶縁体５４０ｂは、外部導体５５０と第１絶縁体５４０ａの間に提供され、そして溶液５１０が存在するキャビティー５７０を形成する、外部導体５５０の周りの境界線を示す。第１及び第２絶縁体５３０ａ及び５３０ｂの、半径及び誘電特性は、同一は異なる値であることができ、そしてそれぞれ、所望の回線インピーダンス及び試験信号の周波数範囲以上の、必要な測定感受性を提供するために選択される。代わりの態様において、ＭＢＬ５１５は外部導体５５０のきわめて近接に位置する。この態様において、第２絶縁体５３０ｂはＭＢＬを、前記外部導体にきわめて近接して形成させるためのキャビティーを含み、そして前記の第１絶縁体は、中心導体３２０を完全に制限する。更に代わりとして、ＭＢＬ５１５及び溶液外部導体の外側に位置することができる。
【０１２１】
生物−電気的インターフェースは適用に依存する様々な形状において製造されることがあり、例えば正方形、長円、方形、三角形、円形、又はそれらの一部であり、あるいは不規則な幾何学的形状、例えば皮下注射針の穴に合うものである。生物−電気的インターフェースのサイズは適用に依存して変化し、そしておよそ１０ｍ2 ，１ｍ2 ，１０-1ｍ2 ，１０-2ｍ2 ，１０-3ｍ2 ，１０-4ｍ2 ，１０-5ｍ2 ，１０-6ｍ2 ，１０-7ｍ2 ，１０-8ｍ2 ，１０-9ｍ2 ，１０-10 ｍ2 ，１０-11 ｍ2 ，１０-12 ｍ2 、又はそれらの間のいずれかで変動するサイズを有するだろう。生物電気インターフェースを針の穴程度に小さいものに合うように製造することができる。前記インターフェースは他の診断上の適用、例えばプロテオミクスに適応するために、択一的に改良されることがある。生物電気インターフェースのサイズ又は形状は、シグナル伝搬及びそれらに沿う分子結合が可能であることだけを必要とする。
【０１２２】
Ｖ．測定方法論
Ａ．一般概念
本発明の測定方法論は、莫大な数の分子がその固有の誘電特性、例えば分散効果、共振効果及び当該分子の周囲の溶液に対する効果に基づき別のものと区別できるという観点を利用する。本発明において、検査シグナルがＭＢＬにカップリングすると、このＭＢＬは検査シグナルのエネルギーと相互作用し、固有のシグナルの応答を供する。この固有のシグナル応答がＭＢＬを構成する分子を検出及び同定するために利用されうる。
【０１２３】
当業者はほとんどの分子が周波数が変わると誘電特性の変動を示すことを理解するであろう。例えば、ある分子は１又は複数の電磁スペクトル領域において周波数の関数としてその誘電特性における劇的な変化を示しうる。この分子が劇的な誘電変化を示す周波数バンドは往々にして分子の分散レジム（ｒｅｇｉｍｅ）と称する。このようなレジムにわたり、分子の誘電定数、誘電率、ダイポール及び／又はマルチポールモーメント、並びに感受性は周波数の関数として劇的に変化するであろう。このような数値は往々にして複雑であり、シグナル応答において生ずる大きさの変化及び位相変化の双方に起因する実体部分及び虚像部分の双方を有する。この分散レジムは様々な周波数、ＲＦ、マイクロ波、ミリメーター波、遠赤外及び赤外周波数等に及んでいる。
【０１２４】
分子の誘電特性は検査シグナルを分子にカップリングさせ、そして得られるシグナルを観察することにより観察できる。検査シグナルがこの分子の分散レジム内の周波数、特に共振周波数において分子を励起すると、この分子はシグナルと強く相互作用し、そして得られるシグナルはその実測増幅及び位相において劇的な変動を示し、かくして固有のシグナル応答が生ずる。この応答を結合した分子構造体の検出及び同定に利用することができる。更に、ほとんどの分子は同じ又は異なる周波数バンドで様々な誘電特性を示すであろうため、各々は分子構造を同定するのに利用できる固有のシグナル応答を発生せしめる。
【０１２５】
分子結合現象の検出及び同定は誘電特性を分子レベルにおいて検出及び測定することにより成し遂げることができる。分子レベルでの誘電特性は分子のマルチポールモーメントにより規定でき、そのポテンシャルエネルギーは当業界に公知の通りの無限数列として表わすことができる：
【数１】
2005308761.tif 000003
【０１２６】
この無限数列は多重項から成り、各々は電気電場、磁場又は電磁場の存在下での分子の誘電特性の度合いの変化を表わす。第一項はモノポールモーメントと称され、そして分子上の総電荷により生ずる静電ポテンシャルエネルギーのスカラ量を表わす。第二項又は「ダイポールモーメント」はベクトル量であり、３通りの自由度から成る。第三項又は「クアドロポールモーメント」は第二ランクのテンソルであり、そして９通りの自由度にわたる分子応答を表わす。一般に、Ｎ番目の項は第Ｎ−１ランクのテンソルであり、３N-1 通りの自由度を有するが、対称性が自由度の総数を小さくしうる。理解できる通り、高次元のモーメントは分子の誘電特性についての一層詳細な情報を供し、それ故分子の固有誘電徴候をより多く供する。なぜならポテンシャルの勾配が電場を供するからである：
【数２】
2005308761.tif 000004
【０１２７】
高次元のモーメントの馬力は距離の関数として急降下し、それ故その要因を測定することは難しい。例えば、ダイポールモーメントに基づく場はｒ-3で低下し、そしてクアドロポールモーメントに基づく場はｒ-4で低下する。かくして、このアプローチは結合分子と検査シグナル経路との間での近似並びにそれらの間での低シグナル損失を要する。分子結合現象の検出は強いシグナル吸収溶液、例えば全血試料又はイオン溶液内で往々にして起こるため、結合現象とシグナル経路との間でのシグナル損失はかなり大きくなり、そして高次元モーメントの検出は極めて困難となる。
【０１２８】
更に、各々のマルチポール項は様々な態様で電場にカップリングする。これはまず所定の静電システムのエネルギーを探すことにより実証される：
【数３】
2005308761.tif 000005
静電ポテンシャルをＴａｙｌｏｒ数列で展開する：
【数４】
2005308761.tif 000006
【０１２９】
【数５】
2005308761.tif 000007
であるため、
【数６】
2005308761.tif 000008
【０１３０】
更に、外部場の場合、∇・Ｅ＝０のため、
【数７】
2005308761.tif 000009
となる。
【０１３１】
これを上記のエネルギー式に挿入すると、
【数８】
2005308761.tif 000010
となる。
【０１３２】
これは各々のマルチポール項がどのように質問場（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ）と相互作用するかを示す。総電荷ｑとポテンシャル；ダイポールｐと電場；クアドロポールＱｉｊと電場勾配、等。これは、高次元マルチポールモーメントの検出による２番目の困難性を示す。高次元モーメントをカップリングさせるのに十分な場勾配を達成することはバルク試料では困難である。
【０１３３】
本発明は前述の生物電気インターフェースを含ませることにより上記の障害を解消する。このインターフェースはシグナル経路伝いにカップリングされたＭＢＬを含む。このＭＢＬは非常に薄く、且つ高度に不均質な層（誘電性の観点から）から成り、かくして電磁的なプロービングされる構造との必須の近似性及び高次元のマルチポールモーメントにカップリングされるのに十分な場勾配を供する。このような量は、分子の誘電特性の大いに向上した調査を担うより高次元なモーメントの検出を可能にする。ＭＢＬをシグナル及び／又は接地面により近づけて配置することは、その上で伝搬されるシグナルが溶液の中へと吸収されることから孤立させ、それ故シグナル損失を小さくし、そして結合現象をより正確に検出及び同定するためにより高度の検査周波数を利用することを可能にする。このようにして、本発明は分子のダイポール及び他の高次元なマルチポールモーメントに由来する要因を含む回復又はシグナル応答の度合を著しく高める。
【０１３４】
本発明の記載のバイオアッセイ装置を利用し、ＭＢＬに係る数多くの特性が検出されうる。図６Ａは本方法の一の態様を示す。まず、工程６０２においてＭＢＬがシグナル経路伝いに形成されてカップリングされる。記載の通り、ＭＢＬはリガンド、抗リガンド／リガンド複合体等から成っていてよく、そしてシグナル経路と直接もしくは間接的に物理接触しているか、又は電磁気的にカップリングされている。このシグナル経路は二導体送伝トポロジーでシグナル面又は接地面から成っていてよい。
【０１３５】
次に、工程６０４において、検査シグナルをシグナル経路伝いに伝搬する。この検査シグナルは任意の周波数、例えば１０MHz のシグナル周波数又は４５MHz 〜２０GHz の周波数域の任意の時間変動シグナルであってよい。次に、工程６０６において、検査シグナルはＭＢＬにカップリングし、そして応答してこのカップリングに対するシグナル応答を発生する。次にこのシグナル応答を回収し、そして分子結合層の１又は複数の特性としての情報を提供する。
【０１３６】
このバイオアッセイ装置はＭＢＬの莫大な数の特性、例えば分子結合現象、リガンド濃度、ＭＢＬの誘電特性の変化、検出される結合現象の分類、等の検出及び特定についての情報を供するのに利用できうる。更に、このバイオアッセイ装置は使用現場での品質管理及び精度に有用な自己較正能力を含む。記載の方法及び構造により、改良及び更なる用途は当業者に明らかとなるであろう。
【０１３７】
溶液中の分子のダイポール、クアドロポール及び高次元マルチポールモーメントを検出及び測定する能力は数多くの理由により当業界における有意な進歩を担う。最初に、数多くの注目の生物医療分子、例えばタンパク質は著しく異なる構造を有し、それ故異なるマルチポールモーメントを有する。かくして、一定の分子についてのマルチポールモーメントの同定は固有である当該分子の特性を示し、それ故この分子の同定を可能にする。第二に、構造及び機能は生物医療関連の多くの分子、例えばタンパク質に密接に関係する。従って、一定の分子のその機能に直接関係する特性を検出する能力とは、その機能が活性全体のためにモニターされうることを意味する。第三に、局部的な生理環境は往々にして一定の分子の構造及び機能において重要な役割を果たし、従って上記の物理特性を検出する能力とは、その分子が一定のシステムにおける変化を測定することを目的とするモニター及びプローブとして利用できうることを意味する。従って、分子及び細胞システムについての複雑且つ情報性の特性を検出可能な電子データーフォーマットに翻訳する能力により、本明細書において論ずる分野における新たな可能性が出現する。
【０１３８】
Ｂ．結合分子構造の検出
本明細書に記載のバイオアッセイ装置はシグナル経路伝いで生ずる分子結合現象の検出を可能にする。検出可能な結合現象には一次、二次及び高次元結合現象が含まれる。例えば、予め存在するＭＢＬがない二導体生物電気インターフェースでは、導性層の分子がリガンドに対する結合のための抗リガンドを構成し、リガンドがＭＢＬを形成するであろう。別の態様において、抗リガンド及びリガンドの双方がＭＢＬの中に含まれている。この態様では、図１Ｄに示すように、ＭＢＬはリンカー、マトリックス分子、絶縁層又は各々の組合せを介してシグナル経路表層に付加されている。
【０１３９】
図６Ａはこの工程の一の態様を示す。まず工程６０２において、シグナル経路は所望の作動周波数でのシグナルの伝搬を助けることのできる材料から形成される。このシグナル経路は本明細書に記載のバイオアッセイ装置のいずれかにおける単一のポート経路、二ポート経路、又はマルチポール経路から成っていてよい。更に、このシグナル経路は伝送ライン、共振キャビティ又は導波管構造として具現化できうる。
【０１４０】
次に工程６０４において、対象の分子又は分子構造体を含む溶液を用意する。工程６０６では、リガンドから成るＭＢＬを溶液から形成させ、そしてこのシグナル経路の少なくとも一部と溶液との間にカップリングさせる。次に工程６０８において、検査シグナルをシグナル経路伝いに伝搬させる。他方、この検査シグナルを溶液の適用の際にランチングさせ、結合現象の結果として生ずるシグナル応答をリアルタイムで観察できるようにする。工程６１０では、検査シグナルを伝搬し、ＭＢＬにカップリングさせ、そしてリガンドの存在を示すシグナル応答を発生させる。次に工程６１２及び６１４において、検査シグナルを回収し、その応答はリガンドの検出を示す。
【０１４１】
ＭＢＬの誘電特性は任意の数のシグナル応答の誘導に寄与し得、各々は分子結合の指標となりうる。例えば、ＭＢＬの分散特性は周波数で劇的に変動しうる。この場合、検査シグナル応答は、分子結合現象が結合表層伝いにおいて生ずると増幅度及び／又は位相応答において大きな変化を示し、それ故結合表層伝いの分子結合現象の検出のための手段を司る。
【０１４２】
別の態様において、ＭＢＬの誘電緩和特性は入力シグナルのパルス時間の関数として変動するであろう。この場合、検査シグナルは特定のパルス時間での又はその付近での吸収されたパワー値の変化、又は位相もしくは増幅度の如き検査シグナルのいくつかのその他のパラメーターの変化を示すであろう。吸収されたパワー又はその他のパラメーターの変化を観察することにより、結合表層伝いの結合現象が検出されうる。その他の量、例えば特徴的なインピーダンス、伝搬速度、増幅度、位相、分散、損失、誘電率、成受性、周波数及び誘電定数も分子結合現象の考えられるインジケーターである。
【０１４３】
上記の方法はシグナル経路伝いの直接又は間接的な抗リガンド又はリガンドの一次結合の検出に利用できうる。同様に、図６Ａの方法は抗リガンドに対するリガンドの二次結合の検出のためのも利用できうる。図６Ａはシグナル経路伝いに生ずる一次又は二次結合現象の検出に制約されない。事実、シグナル経路伝いに又は溶液中に懸濁されて生ずる三次及び高次元結合現象もこの方法を利用して検出できる。
【０１４４】
図６Ｂはシグナル経路伝いに生ずる二次及び高次元結合現象を検出するための第二の方法を示す。最初に、工程６０２において、一次結合現象を検出し、そしてシグナル応答を測定する。その一の態様を工程６０２〜６１２に示した。次いで工程６２２において、一次結合現象シグナル応答を保存し、そして基底応答として利用する。次に工程６２４において、第二分子溶液をこのバイオアッセイ装置に加え、そして結合表層の上で循環させる。次に工程６２６において、図６Ａの工程６０８〜６１２を繰り返して第二シグナル応答を得る。次に工程６２８において、この第二シグナル応答及び基底応答を対比させる。わずかな変化又は変化なしは２つのシグナル応答が極めて近いことを示し、ＭＢＬの構造及び誘電特性は新しい溶液内の分子の添加によって改変されていないことを示唆する。この場合、二次結合は有意に起きていない（工程６３０）。もしその対比が所定域外の変化をもたらしたなら、ＭＢＬの構造及び／又は誘電特性は改変しており、それ故二次結合現象が示唆される（工程６３２）。二次結合現象を示唆するのに利用される量は上記の量、例えば増幅度、位相、周波数、分散、損失、誘電率、成受性、インピーダンス、伝搬速度、誘電定数及びその他の因子を追随するであろう。三次又は高次元結合現象がこのアプローチにより検出されうる。
【０１４５】
二次又は高次元結合現象を検出する別の方法は特定の一次結合現象の予備知識を必要としない。この態様において、このバイオアッセイ装置はアッセイ開発段階において既知のパラメーターで作動するようにデザインされており、従って例えば使用現場においてたとえこのようなパラメーターのいずれかの予め規定された変化が検出されようとも、１又は複数の結合現象が起きたかどうかはわかるようになる。この態様において、一次結合現象の予備測定は必要ではなく、なぜなら作製時又は設計時において初期特性決定が既になされているからである。
【０１４６】
二次結合現象は一次結合分子の構造の変化を検出することによっても成し遂げられうる。分子が結合すると、それは未結合状態と比べてその分子構造内でのコンホメーション又はその他の変化を受ける。このような変化は一次結合分子の誘電特性に影響を及ぼし、また周囲の溶液の変化を誘導する。その変化は上記の図６Ｂの工程６２０〜６２８を利用して検出できる。一次結合分子の誘電特性の変化を指標するようにモニターできうる量には、前述の量、例えば増幅度、位相、周波数、分散、損失、誘電率、成受性、インピーダンス、伝搬速度、誘電定数及びその他の因子が挙げられる。
【０１４７】
Ｃ．分子結合層の誘導特性の変化の検出
本明細書に記載のバイオアッセイ装置は温度、pH、イオン強度等の変化の結合としてのＭＢＬの誘電変化の測定にも利用できる。
【０１４８】
図６Ｃはこの方法の典型的な態様を示す。この方法は結合現象を同定するための開示方法に密接に追随するが、但しこの方法はＭＢＬの誘電特性の変化の検出及び定量を可能にする。
【０１４９】
この方法は初期誘電特性を有する溶液をこのバイオアッセイ装置に加えると工程６４１から始まり、シグナル応答を測定して記録する。一の態様において、この工程は工程６０２〜６１２に従って実施する。所定の時間又は操作の後、ここでも一の態様では工程６０２〜６１２に従い第二測定を行い、そして第二シグナル応答を記録する（工程６４２）。工程６４３で、第一と第二シグナルとの対比を行い、２つのシグナルが所定の範囲内で相関するかを決定する。もしそうなら、この溶液の特性は任意の誘電変化を受けていないものと認められる（工程６４４）。
【０１５０】
もしシグナル応答が所定の範囲内で相関しないなら、この溶液の１又は複数の誘電特性が変化を受けたものと認められる（工程６４５）。任意的に、誘電特性の変化は以下のようにして定量化できうる。工程６４６において、第二シグナルを保存し、そして既知のシグナル応答と相関させる。最も相関する応答がこの溶液の誘電特性を特定し、そしてこの第一シグナル応答を誘電特性の初期値と相関させることができ、その差が特定された誘電特性を変化させる値の決定のために利用できうる（工程６４７）。
【０１５１】
Ｄ．結合分子構造の同定
記載のバイオアッセイ装置を利用して、既知のリガンドを特性決定し、次いで未知のリガンド構成を有する溶液中のそれを同定することが可能となる。図６Ｄはこの方法の一の態様を示す。まず工程６５２において、大量の分子構造を測定し、そしてその応答を下記の１又は複数の測定システムを利用して保存する。一の態様において、この工程は工程６０２〜６１２に従って実施する。各々の保存した応答は溶液内にある単一のリガンド又は同溶液内にある多重リガンドに対応しうる。次に工程６５４において、測定を未知の溶液で行う。一の態様において、この工程は工程６０２〜６１２に従って実施する。次に工程６５６において、この溶液のシグナル応答を保存されたシグナル応答と対比させ、それとの相関度を決定する。工程６５８において、未知の応答と最大の相関性を示す保存応答を選択することにより同定する。対比は１又は複数のデータ点を利用して実施して１又は複数の保存応答間での相関を決定し、そしてそれは相関を決定するためのパターン認識ソフトウェア又は類似の手段の利用を包含しうる。この方法は一次、二次又は高次元の結合分子構造体の同定に利用されうる。
【０１５２】
Ｅ．結合分子構造体のクラスの同定
既知の分子サブ構造、例えば似かよったクラスのタンパク質に共通するドメインもしくはその他の構造相同性又は核酸における配列相同性を特性決定することも可能である。一の態様において、この方法は図６Ｄに示すように進めるが、工程６５２で、Ｎ個の分子サブ構造を測定し、そしてその応答を保存する。各々の貯蔵したシグナル応答は１又は複数のサブ構造に対応しうる。この方法を工程６５４，６５６及び６５８に記載の通りにして、十分な数の構造が検出され、そして未知の化合物と同定するために特性決定できるまで続ける。十分な数の相関が認められたら、未知の分子構造を分類することが可能となる。
【０１５３】
図６Ｅは未知のリガンドを分類することができうるその他の方法を示す。この方法は未知の化合物上の構造モチーフへの結合を検出することにより未知のリガンドを同定する。まず、工程６６０において複数のアドレス可能なアレーを有するバイオアッセイ装置を用意する。各々のアレーは特定のリガンドサブ構造の抗リガンドを有する。次に工程６６２において、特定のサブ構造の存在をその対応の抗リガンドへの各々の結合、しかる後の特性決定により検出する。一の態様において、この工程は工程６０２〜６１２に従って実施する。次に、工程６６４において、各々の結合現象を親和、動力及びスペクトル応答の如き量の同定により特性決定する。工程６６６において、既知と未知の応答との間での相関を行う。未知の応答が既知の応答と相関するなら、このリガンドは既知の応答に対応するリガンドとして同定される。このサブ構造が相関及び非相関応答の両者を示すなら、相関した応答を未知のリガンドのより上位概念的な分類の構築のために利用されうる。この方法は任意の分子構造、例えば同一クラス内にある又はよく認められる構造相同性を有するタンパク質の同定に利用されうる。
【０１５４】
所定の未知の化合物の高度なスペクトル分析が構造及び機能についての検討に誘導されることが可能であり、なぜなら既知の構造との対比を行い、そして外挿が所定のレベルの分類を誘導されるからである。
【０１５５】
Ａ．特異的、対、非特異的結合
特異的リガンド結合は非特異的結合とは結合現象のスペクトルフィンガープリントにより区別できる。注目の所定の結合現象、例えば抗原に対する抗体結合はまず注目のリガンドだけを含む精製溶液及びＭＢＬ上のこのリガンドに特異的な抗リガンドで特性決定される。幅広いスペクトル研究を行い、いつこのスペクトル内で最大の応答が認められるかを調べる。次いでこのアッセイを専用の用途において一般的である溶液、例えば全血で繰り返し非特異的な結合が応答に対してどのような効果を及ぼすかを決定する。かくて、特異的な結合の決定因子である様々な点が見つかり、また非特異的な結合の決定因子である独立の組の点が見つかる。これら多点の小集団を実際のアッセイ用途のために選定する。特異的な結合による応答と非特異的な結合による応答とを対比することにより、特異的な結合の程度が決定できうる。
【０１５６】
Ｂ．一定のリガンドの特性決定
往々にして、一定の分子の所定の性質を決定することが所望される。その例には、タンパク質が属するクラスの決定又は一定の遺伝子もしくは他の核酸配列がどのタイプの多形態であるかの決定が挙げられる。これは様々な方法で行うことができうる。タンパク質は往々にして構造相同体の数及びタイプ、又は同一もしくは類似のタンパク質クラスに見い出せるサブ構造により分類される。例えば、Ｇ−プロテインは一般に細胞膜に見い出され、そして細胞外環境と細胞内環境との間のシグナル変換経路を媒介し、常に細胞膜を７回横断する構造を有する。かかる構造は事実上Ｇプロテインに限定される。その他のタンパク質のクラスは似たような構造相同性を有し、そしてそのため、一のクラスのタンパク質をこのような相同性に基づき別のクラスのものと区別することのできる任意の方法は多くの生物医療研究分野において経済的に有用である。所定の分子の誘電特性がその分子の電荷分布の幾何学形態により結合的に決定できるとすると、そして更にほとんどのタンパク質が固有の構造又は幾何学形態を有するとすると、各々のタンパク質はそのタンパク質の誘電特性を測定することにより固有に測定できうる。かくして、単純な誘電特徴、例えば本発明により構築されるものが、所定のタンパク質の固有の同定を担うことがあり、そして更にはタンパク質のいくつかの予め公知のタンパク質のクラスへの分類を可能にしうる。バイオアッセイ装置上で一定のタンパク質の特定のサブ構造に特異的な一群の抗リガンドを利用することにより更に細かい分類をこの分類方法論に付与することができうる。例えば、特定のサブ構造、例えばドメインに特異的な抗体の群が前記サブ構造の有無の決定のために利用されうる。かくして、任意の一定のタンパク質は所定のサブ構造の有無及びタンパク質の誘電特性自体の双方により特性決定されうる。この分類戦略に対する更なる細かい分類の付与は上記の特性に対する温度、pH、イオン強度及びその他の環境的効果を見つけることを含みうる。
【０１５７】
核酸も似たような態様に従って特性決定できうる。例えば、一定の遺伝子は所定の塩基対配列を有することで知られる。往々にして自然にはこの配列における変化は少ないであろう。例えば、多くの細胞膜内の塩化物イオン輸送チャンネルをコードする遺伝子において、一般に単一塩基対突然変異又は変化がある。かかる変化はヒトにおいていわゆる嚢胞性線維症なる疾患を招く。従って、一定の核酸配列を小さな変化について特性決定することは極めて重要である。かかる変化は往々にして多形性と称され、そしてかかる多形性は現在各々の既知の多形態に対する相補鎖の形成により検出されている。一定の遺伝子は何百又は何千もの多形態のどれかを形成しうるため、各々の多形態に対する相補鎖を構築するのは大変な作業である。本明細書に記載の発明を利用することで、非相補性結合又はハイブリダイゼーションは先の段落に記載と同じ数多くの物理特性を測定することにより検出及び区別できうる：ハイブリダイゼーション現象の誘電特性を特性決定し、そして既知のデーターと相関させ、これにより生じたハイブリダイゼーションのタイプは完全に又は不完全に決定できる。かくして、一定の核酸配列から成る抗リガンドにより、何百もの様々な多形態が（リガンドとして）結合現象の特性決定により検出できうる。当業者は更なる改良、例えばハイブリダイゼーションプロセスの変化のためのストリンジェンシー条件の改良、又は温度を変えて融点を決定すること等を行うことが可能であることを理解するであろう。それらはハイブリダイゼーションプロセスの性質の別のインジケーターを担う。
【０１５８】
所定の結合現象がレセプターをオンもしくはオフにするか、又は似たようにして、いく通りかのその他のアロステリック効果を形成するかを調べるため、薬剤−レセプター相互作用を特性決定できうる。例えば、所定のレセプターを抗リガンドとして用いてよく、そして既知の作動因子を第一リガンドとして用いてよい。次いでその相互作用を誘電応答に従って特性決定し、そしてこの応答を保存する。次に、薬剤候補のためにスクリーニングする化合物を前記レセプターとの結合特性との観点で観察する。結合して似たような誘電応答を生み出す分子はレセプターに対して既知の作動因子と似かよった効果を有することがわかり、それ故作動因子である蓋然性がはるかに高くなるであろう。この態様は事実上全てのタイプの注目の標的−レセプター結合現象を特性決定するのに利用でき、そして結合現象が起きたか否かだけを決定する現状の検出戦略に勝る顕著な改善を示す。当業者は本発明を適用できる数多くのその他の結合現象があることを容易に理解するであろう。
【０１５９】
上記の方法に利用されうるサブ構造の例には：タンパク質の第二及び第三構造、例えばアルファーヘリックス、ベーターシート、トリプルヘリックス、ドメイン、バレル構造、ベーターターン及び第四構造において見い出せる様々な対称群、例えばＣ2 対称、Ｃ3 対称、Ｃ4 対称、Ｄ2 対称、立方対称及び２０面対称〔G. Rose (1979), Heirarchic Organization of Domains in Globular Proteins, J. Mol. Biol. 134 : 447-470〕。分析できうる核酸のサブ構造とは：配列相同性及び配列多形性、ＤＮＡのＡ，Ｂ及びＺ形態、一本鎖及び二本鎖形態、スーパーコイル形態、アンチコドンループ、Ｄループ並びにｔＲＮＡ及びｔＲＮＡ分子の様々なクラスにおけるＴψＣループが挙げられる〔W. Saenger (1984) Principles of Nucleic Acid Structure. Springer-Verlag, New York ; 及びP. Schimmel, D. Soll and J. Abelson （編）(1979) Transfer RNA. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.〕。
【０１６０】
Ｆ．濃度の定量
本明細書に記載のバイオアッセイ装置はリガンドの濃度を定量するためにも利用できうる。図６Ｆはこの方法の一の態様を示す。この場合、この装置は事前較正されておらず（工程６７９）、まず工程６７０において、測定被検物に対する適当な結合特性、例えば結合親和か又は反応速度を有する抗リガンドを選定する。このような特性は抗リガンドの平衡定数がその直線作用領域の中央付近にくるように選定する。単一の抗リガンドの利用では濃度の範囲が広すぎる用途の場合、異なる親和力及び／又は直線作用範囲を有する複数のリガンドを使用し、これによりはるかに広い範囲にわたる濃度についての値が得られる。
【０１６１】
次に工程６７２及び６７４において、抗リガンドをバイオアッセイ装置又はチップに付加し、そしてこの装置を測定システムに接続する。工程６７４において、応答が最大特異性についての特性決定を必要とするかの決定を下す。もしそうなら、被検物の結合力が最大の結合力となる周波数を決定する（工程６７５ａ）、非特異的結合力が最大の効果を有する領域を決定する（工程６７５ｂ）、及び被検物結合力に基づく固有応答を決定する（工程６７５ｃ）スペクトル分析を実施する。特性決定が必要でないなら、又は必要なら、その完了後、この装置を較正にかける。この工程は既知の濃度のリガンドをバイオアッセイ装置に供給し、そして得られる応答を測定する一の態様で実施する（工程６７６ａ）。他方、較正のためにより多くのデーター点が必要なら（工程６７６ｂ）、異なる濃度を有する試料を選定し（工程６７６ｃ）、そしてこの濃度に対する応答を測定してよい（工程６７６ａ）。一の態様においてこの測定は工程６０２〜６１２に従って行う。次いで工程６７７において、上記の応答由来の較正点を記録することにより外挿アルゴリズムを作製する。次に工程６７８において、未知のリガンド濃度の試料を測定する。この工程は未知の試料をバイオアッセイ装置に供給し、力価検定アルゴリズムに対する応答を換算し、そしてそれからリガンド濃度を決定することによる一の態様で成し遂げられる。
【０１６２】
所定のバイオアッセイ装置が事前較正されているか、又は設計により較正されている場合、必要とされる唯一の工程はリガンド又は被検物を表層に適用し、そして応答を測定することにある。かかるバイオアッセイ装置は様々な態様で具現化されうる。例えば、いくつかの回路パラメーター、例えばインピダンス又は共振回路の特徴的な周波数を結合現象が起きるときに所定通りに変化するように設計してよく、そしてパラメーター変化の値は用量応答性を有するよう更に設計してよい。かくして、かかる回路パラメーターの測定は、適当なアルゴリズムを介して分析すると、所定の被検物又はリガンドの濃度についての定量値を供するであろう。
【０１６３】
Ｇ．バイオアッセイ装置の自己較正
記載のバイオアッセイ装置は自己診断能力、それ故現場使用品質管理及び保障を有する。一定の目的とする用途の場合、特定の抗リガンド（第一結合物質）は溶液中の注目の一定のリガンド（第二結合物質）に対する抗リガンドとして働くであろう。この第一結合物質は作製時に付加してよく、そして第二結合物質は現場で付加してもよい。かくして、作製時の変動（特に第一物質の付加）は装置のその特異的なリガンドへの結合能力の変動を及ぼすであろう。しかしながら、結合するリガンドの量は抗リガンドの結合量と正比例し、それ故その二者の比率測定が可能となる。
【０１６４】
図６Ｇはこの方法の一の態様を示す。最初に工程６８０において、シグナル経路伝いに様々な濃度の適当な抗体を結合させることにより分子結合表層を形成し、そしてこれらの濃度各々についての得られる応答を特性決定し、各濃度についてのいくつかの値「ｘ」を得る。次に、行程６８２において、このリガンドについて似たような力価曲線をいく通りかの異なるリガンド濃度についての抗体／リガンド結合応答を測定することにより作製し、そしてリガンド力価曲線を事前決定しておく。次に、工程６８４において、スケール係数Ａを抗体結合のリガンド結合に対する応答の比をとることにより作製する。使用時に、未較正のアッセイをまず試験し（工程６８６）、結合抗体量「ｘ」及びそれから得られるスケール係数「ｙ」を決定する。次いでリガンドをアッセイに適用し、そして応答を測定し（工程６８９）、そして応答及び所定の力価曲線をスケール係数「ｙ〕によりスケール化し（工程６９０）、未知濃度を決定する。
【０１６５】
図６Ｆの工程は溶液中のリガンドの量を定量できるように改良してもよい。この改良において、バイオアッセイ装置の結合表層は所定の親和力及びリガンド特異性を有する抗リガンドを含む。この溶液を次にこの装置に適用し、そして応答を測定する。このシグナル応答は結合したリガンドの量に比例するであろう。かくして、任意の所定のリガンドの力価検定は適当な直線作用範囲で抗リガンドを選定することにより実施できる（その平衡定数が数log 単位の所望の濃度範囲内にある範囲を検定する）。上記と同じ比率分析を、内部コントロール及び較正が信頼性の確保のために必要とされる丈夫で精密な定量アッセイを作り出すために適用してよい。
【０１６６】
記載の方法は各々多種多様な態様（即ち、ソフトウェア、ハードウェア又は双方の組合せ）及び様々なシステムで実施できうる。一の態様において、記載の方法はソフトウェアプログラムとして実施できる。
【０１６７】
図７Ａは記載の方法各々を実施するために設計されたソフトウェアプログラムを実行するためのコンピューターシステム７１０の例である。コンピューターシステム７１０はモニター７１４、スクリーン７１２、キャビネット７１８及びキーボード７３４を含む。マウス（図示せず）、ライトペン又はその他のＩ／Ｏインターフェース、例えばバーチャルリアリティーインターフェースもＩ／Ｏコマンドの提供用に含ませてよい。キャビネット７１８にはＣＤ−ＲＯＭドライブ７１６、ハードドライブ（図示せず）又はデジタルデーターを保存及び検索するのに利用されうるその他の保存データー媒体、及び本方法の組込まれたソフトウェアプログラム等が収納されている。ＣＤ−ＲＯＭ７１６は脱着式媒体として示しているが、その他の脱着式タンジブル媒体、例えばフロッピーディスク、テープ及びフラッシュメモリを使用してよい。キャビネット７１８には馴れ親しまれているコンピューターコンポネント（図示せず）、例えばプロセッサー、メモリー等も収納されている。
【０１６８】
図７Ｂは記載の方法の組込まれたソフトウェアプログラムを実行するのに利用されている典型的なコンピューターシステム７１０の簡略システムブロックダイアグラムを示す。図７Ａに示すように、コンピューター７１０はＩ／Ｏコントローラー７２４と任意的に相互作用するモニター７１４を含む。コンピューターシステム７１０は更にサブシステム、例えばシステムメモリー７２６、セントラルプロセッサー７２８、スピーカー７３０、脱着式ディスク７３２、キーボード７３４、固定ディスク７３６及びネットワークインターフェース７３８を含む。記載の方法に利用するのに適当なその他のコンピューターシステムは追加の又は少ないサブシステムを含みうる。例えば、その他のコンピューターシステムはデジタルデーターの処理のための複数のプロセッサー７２８（即ち、マルチプロセッサーシステム）を含みうる。矢印、例えば７４０はコンピューターシステム７１０のシステムバスアーキテクチャーを示す。しかしながら、これらの矢印７４０はサブシステムをリンクするのを司る任意のインターコネクションスキームの代表例である。例えば、セントラルプロセッサー７２８をシステムメモリー７２６に接続するのにローカルバスを使用してよい。図７Ｂに示すコンピューターシステム７１０は本発明に利用するのに適当なコンピューターシステムの一例にすぎない。本発明に利用するのに適当なサブシステムのその他の形態は当業者に容易に明らかとなるであろう。
【０１６９】
Ｖ．測定システム
様々な測定システムが上記の方法を実施するために利用できうる。図８〜１０は考えられる測定システムの３つの例を示す：周波数変域検査システム、時間変域（ｔｉｍｅ  ｄｏｍａｉｎ）検査システム及び誘電緩和測定システム。
【０１７０】
Ａ．周波数測定システム
図８Ａは本発明に係る周波数測定システムの一の態様を示す。このシステム８００はバイオアッセイ装置入力８５２にカップリングされたシグナルソース８１０及びバイオアッセイ装置出力８５８にカップリングされたシグナル検出器８９０を含む。任意的に、追加のシグナルソースをバイオアッセイ装置出力８５８にカップリングしてよく、そして追加のシグナル検出器を検査回路入力８５２にカップリングし、完全な２ポート測定能力を供してよい。このシステムはシグナル検出器が反射シグナルを受容するためにシグナル経路にカップリングされた１ポート検査システムへと改良してよい。特定の態様において、上記の周波数測定システムはネットワーク分析器、例えばＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ由来のモデルNo. ８５１０Ｃから成る。その他の高周波数測定システム、例えばスカラネットワーク分析器を使用してよく、それは伝送及び反射シグナルに基づくシグナル情報を供する。
【０１７１】
上記の方法論に従って測定を行った。まず、入射シグナル８６０を検査回路に対してランチングし、そして伝送並びに／又は反射シグナル８７０及び８９０のそれぞれを次に回収する。得られるシグナル応答を固有の周波数応答又は「スペクトルフィンガープリント」の形態でとり、その２つの例を図８Ｂ及び８Ｃに示す。図８Ｂは共振が周波数ｆres において生ずる一のタイプの周波数応答である。ここで、応答８７０は急降下及び急上昇し、この周波数で出力ポートに達するエネルギーはほとんどない又は有意でないことを示唆する。共振は周波数ｆstart からｆstopにわたって変化するＭＢＬの誘電特性及びインピダンスにより生ずる。異なるリガンドは異なる周波数点において共振するであろう。更に、一部のリガンドは測定バンドｆstart からｆstopにわたる複数の共振周波点を示しうる。リガンドが一旦一又は複数の固有の共振点を有するものとして特性決定されたら、このデーターは未知の溶液中のリガンドの存在を同定するために利用できうる。この特性決定はマルチポールモーメント及び共振周波数の実験データーから又は理論計算から確認できる。更に、第二結合現象の存在を検出するとき、このデーターはいつ被検物が１又は複数の固有の共振点における変化によりリガンドに結合するかを示唆しうる。
【０１７２】
図８Ｃは分子構造を検出又は同定するために利用できるその他のタイプの周波数応答を示す。この場合、周波数応答は概して単調な上昇又は下降トレンドを示し、若干増幅変動がある。応答の傾き及び／又は増幅変動は結合分子の検出及び／又は固有の特性決定に利用されうる。かくして、この記載の態様で、共振周波数点、傾き、トレンド及び検査シグナル位相の変動が分子結合現象の固有の同定のために利用できうる。この周波数応答は入力ポート８５２、出力ポート８５８、又は双方のポートにおいて測定され、結合分子構造が固有に同定されうる。
【０１７３】
図９は本発明に係る周波数測定システムの第二の典型的な態様を示す。検査中のバイオアッセイ装置９２０は中央コンダクター９２１、キャビティー９２２ａを有する第一絶縁体９２２、第二絶縁体９２３、及び外部導体９２４を有する同軸トポロジー（図５に示す）から成る。溶液９２６はキャビティー９２２ａを占める。むろん、その他の回路トポロジーの装置も検査できうる。
【０１７４】
溶液９２６をキャビティー９２２ａに入れたら、この溶液９２６内の分子は中央導体９２１の近位にてＭＢＬ９２１ａを形成する。測定の間、シグナルソース９１０は入射検査シグナル９１２を中央導体９２１にランチングする。ＭＢＬ９２２ａは入射検査シグナル９１２を調節し、そして反射検査シグナル９３２はリガンドを同定するために利用できる固有のシグナル応答を供する。１−ポート同軸形態は例えば皮下針構造として具現化されうる。
【０１７５】
Ｂ．時間変域測定システム
図１０は本発明に係る時間変域測定システム１０００の一の態様を示す。このシステムは検査回路入力１０２２にカップリングされたパルスソース１００２及び検出器１００４を含む。 別の態様において、追加のパルスソース及び検出器が出力ポート１０２８にカップリングされていてよく、完全な２−ポート測定能力が供される。更に他に、このシステムは反射シグナルを受容するためのシグナル経路にシグナル検出器がカップリングされた１−ポート検査システムを含んで成りうる。特定の態様において、時間変域測定システムはＴｅｋｔｒｏｎｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の時間変域反射測定器、例えばモデルNo. １１８０１から成る。その他の高周波数測定システム、例えば伝送及び反射シグナルパルスに基づくシグナル情報を供する時間変域測定モードを有するネットワーク分析器を更に使用してよい。
【０１７６】
時間変域測定システムにおいて入力検査シグナル１０６０は時間変域パルスから成り、その反射部分は経時的に示されうるものである。本態様において、入射パルス１０６０はアッセイ表層にしっかりとカップリングされた伝送ラインの一部に向ってランチングする。ＭＢＬの誘電特性により、入射パルス１０６０の一部は検出器１００４に向って反射される。反射パルス１０７０はＭＢＬの誘電特性に特徴的な固有の形状及び／又はタイムディレーを示し、それはリガンド、抗リガンド及び周囲の溶液の誘電特性により著しく規定される。かくして、反射パルス１０７０のパルス形状及びディレーはリガンドの特性決定及び同定に利用できる。この時間変域検査システムは独立して使用するか、又は高周波数検査システムと一緒に使用して、１又は複数の未知のリガンドを同定できうる。
【０１７７】
Ｃ．誘電緩和測定システム
当業界に周知の通り、リガンドの誘電緩和周波数は、電場を分子に適用したときに分子レベルの誘電特性が変化する速度である。リガンドの誘電特性に従い、誘電緩和周波数は主に各分子に固有の構造及び結合幾何により規定される。従って、一旦測定できたら、リガンドの誘電緩和周波数をその同定のために利用できる。
【０１７８】
誘電緩和周波数はリガンドが周波数でのパワーを吸収する速度を測定することにより定量できる。図１１はこの測定を行うためのシステム１１０の一の態様を示す。この測定システム１１００は図１０に示す時間変域測定システム１１００と似ており、そして検査固定入力１１２２にカップリングされたパルスソース１１０２及び検出器１１０４を含む。追加のパルスソース及び検出器が出力ポート１１２８にカップリングされ、完全２−ポート測定能力を供してよい。特定の態様において、時間変域測定システムは時間変域反射測定計、例えばＴｅｋｔｒｏｎｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のモデルNo. １１８０１から成る。その他の高周波数測定システム、例えば伝送及び反射シグナルパルスに基づくシグナル情報を供する時間変域測定モードを有するネットワーク分析器を更に利用してよい。
【０１７９】
入力検査シグナル１１６０は独立のパルス群から成り、各々の群は２以上の入射パルス及び異なるパルスインターバルを有する。パルス群１１６２及び１１６４は結合層にしっかりとカップリングされた伝送ラインの一部に向ってライチングする。パルス群１１６２が誘電緩和時間と実質的に同等なインターバルを有するなら（緩和周波数の往復）、ＭＢＬは以降のパルスにおいてしだいに弱まっていくエネルギを吸収するようになるであろう。シグナル吸収の低下は入力ポート１１２２又は出力ポート１１２８において反射応答１１７０で測定されうる。別の測定量として、残留シグナルパワーを入力ポート１１２２又は出力ポート１１２８において測定できうる。
【０１８０】
シグナル吸収の変化速度及び変化の起こるパルスインターバルをプロットし、そして未知の結合分子の特性決定及び同定に使用できる。このシステムの特性は独立して、又は上記の時間及び／もしくは周波数変域検査システムと一緒に使用してよい。
【０１８１】
上記のシステム全てにおいて、当業者はかかるシステムをマイクロ波モノリシック集積回路（ＭＭＩＣ）等の技術を利用してチップレベルにまでスケールダウンできることを容易に理解するであろう。かかるミニチュア化システムは何百、何千又は何万もの化合物を同時に検出及び測定することのできる高度に平行なシステムにまで容易に拡張できる。このようなシステムは、結合現象自体により、例えば特徴的なインピダンス、それ故伝送及び／又は反射係数を変え、又はかかる回路のバンドパス特性を変え、そしてこれをオン／オフゲートとして利用することによりスイッチされる「論理ゲート」を生み出すように構築できる。
【０１８２】
VI．実施例
Ａ．実施例１：表層に対するリガンド結合の検出
ウレアーゼのＩＴＤ表層に対する一次結合は図２Ａに示すバイオアッセイ装置で実証された。このバイオアッセイ装置の結合表層は化学蒸着（ＣＶＤ）を介してＩＴＯ沈着処理したカバーガラスを含んで成る。このＩＴＯ伝送ラインを微細な破砕又は亀裂がその中に含まれてないよう慎重に調べた。伝送ラインをＴＤＲモジュールの付いたＴｅｋｔｒｏｎｉｘ  １１８０１シグナル分析器で測定し、そして３２Ωの広域バンド対照インピダンスを有することが認められた。ラインの長さは約２．６nsecであり、その結合表層は３４Ωのインピダンス、及び約２００psecの長さを有することが見い出された。上部と下部プレートとの距離は１０mil であり、そしてチャンバーは長さ１／２″であった。側壁は使用しなかった；その代わり、上部及び下部プレートの毛細管作用が溶液を固定した。
【０１８３】
次に、このバイオアッセイ装置をｄ−ＰＢＳの溶液で満たした。このバイオアッセイ装置を充填させておいて、基底伝送損失（Ｓ21）及びはね返り損失（Ｓ11）Ｓ−パラメーターの測定を４５MHz 〜１GHz の検査周波数域で行った。測定はＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ由来のネットワーク分析器モデルNo. ＨＰ８５１０Ｂを利用して行い、保存した。次に、ウレアーゼを１０：１の過剰容量で加えた。伝送損失及びはね返り損失Ｓ−パラメーターの測定を繰り返し、そして基底測定値と対比させた。
【０１８４】
表１は１００MHz 及び１GHz についてのこれらの値を示し、そしてはね返り損失及び伝送損失測定応答を図１２Ａ及び１２Ｂに示す。このデーターはバイオアッセイ検査固定装置がｄ−ＰＢＳ充填チップ及びｄ−ＰＢＳ＋タンパク質充填装置間で１００MHz 及び１GHz のそれぞれにおいて−０．５dB及び−０．４２dBのはね返り損失（Ｓ11）変化を示すことを示唆する。この固定装置は１００MHz 及び１GHz のそれぞれにおいて＋０．３２５dB及び＋０．４５０dBの伝送損失変化（Ｓ21）を示した。
【０１８５】
シグナル応答がバルク効果（溶液中のタンパク質）によるのか、又は結合表層へのタンパク質結合によるのかを決定するため、各々の応答を記載し、そしてタンパク質溶液を２５：１の過剰容量（２mlのｄ−ＰＢＳ、対、０．０７５mlのチャンバーサイズ）でフラッシングした。このバイオアッセイ装置を次に前述の通りにして４５MHz 〜１GHz で再測定した。
【０１８６】
表１の最後の２行を対比させることでわかる通り、タンパク質をバイオアッセイ装置からフラッシングする効果ははね返り損失及び送伝損失測定に対して最小の効果を有した。このことは、実測効果が事実上バイオアッセイ装置内での結合表層へのウレアーゼ結合によることを示唆した。一般に、リガンドを含む溶液のリガンドを含まない溶液による置換は応答をほとんど又は全く変化させないことに注目すべきである。
表１
ウレアーゼの一次結合の効果
──────────────────────────────────
周波数 溶液中のタンパク質 ｄ−ＰＢＳフラッシュ後
Ｓ11    １００MHz       −５００ milli-dB       −４７５ milli-dB 
１GHz       −４２０ milli-dB       −２００ milli-dB 
Ｓ21    １００MHz       ＋３２５ milli-dB       ＋３００ milli-dB 
１GHz       ＋４５０ milli-dB       ＋４００ milli-dB 
──────────────────────────────────
【０１８７】
Ｂ．実施例２：一次結合を介するコラゲナーゼ及びリゾチームの同定
上記の実施例１に記載のものと類似の且つ似たようにして調製及び特性決定したバイオアッセイ装置を利用し、我々は１〜１０GHz の周波数域にわたり種々のタンパク質の種々の応答を調べる一連の実験を実施した。各々の実験のために同一の装置を利用したが（装置間での組立における微妙な違いを排除するため）、各々のタンパク質の適用毎にＳＤＳでよく洗った。図１２Ｃ及び１２Ｄはコラゲナーゼ及びリゾチーム試料の一次結合効果の伝送損失測定を示す。いずれの場合も、シグナルパターンはリガンドを固有に検出及び同定するのに利用できる山と谷のパターンを示した。特に、コラゲナーゼ試料の周波数応答は５GHz 付近で強力な正のピークを示した。リゾチーム試料の応答は５GHz 付近で比較的平らな応答を、そして８GHz 付近で強い正のピークを示した。調べたその他の数多くのタンパク質各々については、応答は各タンパク質に固有であり、そして群内の未知のタンパク質の同定を容易にした。むろん、更なるスペクトル点を対比させ、そして分析してこれら及びその他の分子物質を区別することができうる。応答は未知の試料の同定のために保存して後に再呼出してよい。更に、強度の弱いピークを特定のリガンドについてのパターンを決定するためにまとめて調べてよい。
【０１８８】
Ｃ．実施例３：二次結合の検出：デキストランに対するコンカナバリンＡ
本用途は上記の実施例１に記載のものに類似し、且つ似たようにして調製及び特性決定したバイオアッセイ装置を利用しての二次結合検出の例を提供する。コンカナバリンＡ（ｃｏｎ−Ａ）はジャックビーンに見い出せうるグルコース結合タンパク質であり、そして一次結合抗リガンドとして利用した。ここで利用するｃｏｎ−ＡはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。グルコース多糖であるデキストランをｃｏｎ−Ａの結合のためのリガンドとして用い、特異性を実証するためのデキストラン結合をもとにもどす競合手段としてグルコースを用いた（デキストラン及びグルコースもＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙより入手した）。
【０１８９】
伝送ラインは実施例１に記載のものと同じとし、見かけ上３２Ωの対照インピダンス、並びに８０ΩのＤＣ抵抗及び３４Ωの見かけ上ＴＤＲインピダンスを有するＩＴＯカバーガラスを有する。約１５μＭの濃度のｃｏｎ−Ａ溶液をバイオアッセイ装置に直接入れ、そして平衡に到達させた。目視検査による確認に従い、蒸発損失はチャンバーを乾かしてしまわなかった。システムをフラッシングして安定化させた後、デキストランを加えてｃｏｎ−Ａに結合させた。シグナル変化が検出されたら、このチャンバーを１０mg／mlのｄ−ＰＢＳでフラッシングし、そしてシグナル応答の２回目の測定をした。１GHz での効果を図１２Ｅに示す。未結合応答を基底応答として用いた。示す通り、結合した応答は未結合応答よりも０．２５dB小さいようであった。結合特異性は結合デキストランをグルコースで競合追い出し、次いでｄ−ＰＢＳフラッシングによりグルコースを遊離させることにより確認した。後者の工程はデキストランを装置に加える前に得られる基底値にまでシグナルをもどし、かくして結合現象の特異性が実証された。
【０１９０】
Ｄ．実施例４：小分子結合の検出
上記の実施例１に記載のものと類似の、且つ似たようにして調製及び特性決定したバイオアッセイ装置を利用し、このバイオアッセイ検査固定装置及びネットワーク分析器設備が、大型分子に対する小分子結合も本発明に従って検出しうることを実証する。バイオアッセイ装置に高めの周波数で調べるため、この装置をＦａｒａｄａｙボックスの中に再現良く、且つ慎重に入れ、それを外的要因から遮断した。これは装置を２０GHz の周波数まで調べられることを可能にする。まず、ｃｏｎ−Ａをバイオアッセイ装置に加え、そして生物電気インターフェースに結合させた。伝送損失測定を行い、保存し、そして図１２Ｆに示すように基底応答１２５２として用いた。
【０１９１】
次に、１０mg／mlのグルコース濃度をこのバイオアッセイ装置に加え、そしてｃｏｎ−Ａ抗リガンドに対する結合に用いた。伝送損失測定を行い、そして基底応答１２５２に対してプロットして小分子結合によるシグナル応答の変化を決定した。
【０１９２】
図１２Ｆからわかる通り、ｃｏｎ−Ａに対するグルコースの結合に相当する結合応答１２５４は基底測定側１２５２から区別できる。詳しくは、結合応答１２５４は基底応答１２５２では観察できない２本の大きなピークを１６〜２０GHz に示す。実測シグナル応答１２５２と１２５４との差はグルコースがｃｏｎ−Ａ抗リガンドに結合したときの検出の基礎を担う。その後ｄ−ＰＢＳバッファーだけでフラッシングし、そして応答は結合グルコースがｃｏｎ−Ａから解離すると復帰した。むき出しのチップ（即ち、抗リガンドとしてのｃｏｎ−Ａなし）に対するグルコースの効果を調べる独立の実験は、グルコース単独が上記の周波数スペクトルでは電磁質問に対する応答に対してあるにしてもわずかな効果しかないことを示し、従って示している結果がｃｏｎ−Ａに対するグルコース結合の効果に専らよることを示している。
【０１９３】
この実験をアビジンに対するビオチン結合で繰り返した。アビジンをこのバイオアッセイ装置に抗リガンドとして加え、そして送伝損失測定を行い、保存し、そして基底応答１２６２として利用した。次に、１μＭの濃度のビオチンを加え、そして送伝損失測定を基底測定値に対して行った。その結果を図１２Ｇに示す。
【０１９４】
アビジンに結合したビオチンに対応する結合応答１２６４は１４〜１６GHz で深く落ち込み、そして２０GHz 付近で大きなピークとなる。基底応答（未結合アビジンを示す）と結合応答１２６４（結合アビジンを示す）との差は劇的であり、そして結合アビジン分子の検出に利用できる。
【０１９５】
Ｅ．実施例５：力価の定量
これらの実験は抗リガンドに対するリガンド結合に基づくシグナル変化の度合いが占領されている部位の関数であることを実証する。上記の実施例１に記載のものと類似の、且つ似たようにして調製及び特性決定したバイオアッセイ装置を利用する検査システムをｃｏｎ−Ａに対するデキストラン、競合インヒビターとしてのグルコースと共に使用した。ｃｏｎ−Ａの結合定数を中心に一連の希釈系列を作った。抗リガンドとしてのデキストランをｃｏｎ−Ａに、１００％結合が起こるように結合させた。デキストランを競合追い出しするために一連の競合グルコース濃度を、分子結合表層上のデキストラン濃度が相応して減少するように利用した。
【０１９６】
上記の標準の伝送ライン形態を使用した。ｃｏｎ−Ａを分子結合層に結合させ、そしてこのシステムを安定化させた。このバイオアッセイ装置をｄ−ＰＢＳでフラッシングし、そして１GHz でのデーターを得た。この競合力価検定の結果を図１２Ｈに示す。この結果はグルコース濃度が０から１５mg／dlへと上昇する際にどのようにシグナルが変化するかを示す。デキストランが放出され、そしてグルコースが結合するｃｏｎ−Ａのシグナルは変化する（これは事実上、デキストランの要求量（ａｖｉｄｉｔｙ）を測定する）。
【０１９７】
表２は一定の選定濃度についてのグルコース濃度の関数としての伝送損失の変化の程度を示す。
表２
────────────────────────────
デキストラン完全結合              ＋３２０ milli-dB 
────────────────────────────
１mg／mlのグルコース              ＋２８０ milli-dB 
────────────────────────────
１．３３mg／mlのグルコース        ＋２７５ milli-dB 
────────────────────────────
２mg／mlのグルコース              ＋２４０ milli-dB 
────────────────────────────
５mg／mlのグルコース              ＋１１５ milli-dB 
────────────────────────────
１０mg／mlのグルコース            −５ milli-dB 
────────────────────────────
【０１９８】
簡単なグルコース滴定をｃｏｎ−Ａのスペクトルの共振点においても実施した。図１２Ｉはこの共振点でのグルコース濃度の関数としてのはね返り損失の変化を示し、二つの効果が実証される：第一に、グルコースはリガンドとしての用量依存性効果を有し、それは抗リガンド（この場合、ｃｏｎ−Ａ）に対してそれが有する効果を基礎とする。第二に、スペクトルの中には、他の領域と比べリガンド／抗リガンド結合現象に対してはるかに高感度な応答を示す領域がある。
【０１９９】
濃度を１ピコモル（１０-15 モル）以下にするデキストラン溶液の一連の系列希釈はこのような低い濃度でさえも、結合を示す有意なシグナル応答が認められることを示した。シグナルの蓄積にかかる時間は数分から１０分に至り、しかしながらその応答は高濃度でのデキストランの検出の特徴を有した。
【０２００】
Ｆ．実施例６：核酸の検出
核酸を検出する能力を実証するため、金表層に付加された抗リガンドとしてのポリリジンを使用するバイオアッセイ装置を作製した。金表層を除き実施例１に記載のものと類似の、且つ似たようにして調製及び特性決定したバイオアッセイ装置を用い、仔牛胸腺ＤＮＡの高濃度溶液（約２０μＭ）をｄ−ＰＢＳバッファーの中に調製した。ポリリジンをバイオアッセイ装置に載せ、そして伝送損失応答を測定した。この応答を経時的に安定性について検定し、そして保存した。次いでチャンバーをバッファーでフラッシングし、その応答を再びフラッシングによる変化及びその後の安定性について検定し、そしてその応答を基底応答として保存した。
【０２０１】
次いでＤＮＡを含む溶液をバイオアッセイ装置の中に入れ、そして応答変化を得られる応答を基底値から差し引くを介して測定し、そして安定性について観察した。このバイオアッセイ装置をバッファーでフラッシングしてバルク中のＤＮＡを除去し、バイオアッセイ装置表層上にＤＮＡ／ポリリジン複合体だけを残した。得られる変化を図１２Ｊに示す。
【０２０２】
Ｇ．実施例７：pH及び塩度の効果
シグナルにおけるpH及び塩度の効果を２通りの異なる実験で測定した。pHの効果を調べるため、３．９０〜９．８０に範囲する一連のバッファーのpHを測定した。各々のバッファーの６０Hzの導電率を測定し、遊離イオンの変化について補正した。次に、１００MHz ，１GHz 及び１０GHz での伝送損失応答を測定した。その結果を図１２Ｋに示す。
【０２０３】
溶液のイオン濃度を変えたときの効果を検討するために似たような実験を実施した。単純なｄ−ＰＢＳから始めるいくつかの溶液を作製し、そして様々な量の塩化ナトリウムを加えた。次いで６０Hzの導電率を測定して記録し、そしてそのサンプルをバイオアッセイ装置の中に系列的に入れ、そして伝送応答を１００MHz ，１GHz 及び１０GHz において測定した。これらの結果を図１２Ｌにおいてプロットした。
【０２０４】
これらのプロットの双方が示す通り、一定の環境的変化は実測パラメーターの変化をもたらす。
【０２０５】
Ｈ．実施例８：全血の検出
トロポニン−Ｉ（ＴＮ−Ｉ）の検出を、未処理ヒト全血で行い、混雑な環境内での検出能力を確認した。未処理ヒト血液をクエン酸ナトリウムで処理して凝血を阻止した。ＴＮ−Ｉのエピトープに対応する抗ＴＮ−Ｉ抗体を較正の目的のために利用した。このバイオアッセイ装置のインターフェース伝送ラインを抗ＴＮ−Ｉ  Ａｂ（抗リガンド）でコーティングした。血液試料を１０ng／mlの濃度のＴＮ−Ｉでスパイクし、そして第二の同一の血液試料はコントロールとしてスパイクしておかなかった。
【０２０６】
この実験は、装置に抗ＴＮ−Ｉ  Ａｂ抗リガンドを付加し；次いでスパイクにかけていない試料を装置伝いに流し；試料チャンバーを数回フラッシングしてノイズ交換が何であるかを調べ；しかる後に試料をスパイクする（それはノイズフロアーを確立するため数回交換を行うこともある）；から成る。いずれの場合も、伝送損失の変化を測定した。検定として、抗ＴＮ−Ｉ  Ａｂ抗リガンドを装置から取り出した。この実験を次にコントロールとして繰り返し、２種類の血液試料（ＴＮ−Ｉスパイク以外は同一と仮定）の任意のその他の特性が変化を担うかを検討した。以下の表は１GHz でのプローブシグナルについてのこの実験の結果を示す。
スパイクなし試料                  スパイク試料
──────────────────────────────
コントロール    ＜２０ milli-dB         ＜２０ milli-dB 
抗−ＴＮ−Ｉ    ＜２０ milli-dB       ＋２７５ milli-dB 
──────────────────────────────
【０２０７】
第二系列の実験においては、１０種類の血液試料を診療所から入手し、ヘパリンで抗凝血処理する以外は未処理とした。この試料の一つを２部に分け、そしてその一方を先の段落に記載の通りにしてＴＮ−Ｉ抗原でスパイクした。次いでバイオアッセイ装置を表層上の抗−ＴＮ−Ｉ抗体で調製した。各試料をこのバイオアッセイ装置に順次流し、その後のためにスパイク試料を保存しておいた。先の実験のように１GHz で調べたこれらの試料各々の応答を図１２Ｍに示す。スパイクした試料は他の（スパイクしていない）試料とは明確に区別できた。
【０２０８】
Ｉ．実施例９：分子のクアドロポールモーメントの検出
全表層に対するアビジンの結合の効果を、分子のクアドロポールモーメントの検出可能性を検討するために調べた。アビジンは四量体であり、これは未結合状態での分子の対称性により未結合状態では極めて小さいダイポールモーメントを有する。図Ｎはプロットにおいて示す特徴的なピークを有するアビジン結合の結果を示す。これらのピークは、図１２Ｇに示すように、ビオチンの結合により生ずるピークよりも著しく小さかった。
【０２０９】
VII ．用途
本発明の方法及びシステムは様々な用途に利用でき、その例を本明細書に記載する。
【０２１０】
本発明はリガンドと抗リガンドとの間での結合レベルを定量するために利用でき、それ故酵素の活性に対するその他の分子の効果の検討のために利用できる。例えば、溶液中のその他の分子は結合レベルを下降又は上昇することがあり、従って酵素のインヒビター又はインデューサーの同定が検討できうる。
【０２１１】
感染性病原体（ウィルス、細菌、菌類、等）又は癌性腫瘍の存在は、病原体、腫瘍細胞、又は病原体もしくは腫瘍の成分、例えばタンパク質、細胞膜、細胞抽出物、腫瘍マーカー、例えばＣＥＡもしくはＰＳＡ、その他の抗原性エピトープ等に対する抗リガンドの結合をモニターすることにより検査できる。例えば、本発明はバイオアッセイ装置上の抗体により、患者の血液内の病原又は腫瘍マーカーの結合を検出することにより病原体又は腫瘍を検査することができる。更に、例えば患者血液由来の抗体のウィルスタンパク質、例えばＨＩＶタンパク質への結合は患者のウィルスに対する曝露のモニターのための一般的な検査である。その他の一般例は前立腺癌の進行のためのマーカーとしての患者血液中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の定量である。
【０２１２】
更に、膜及び非膜レセプター等の薬剤レセプター相互作用、並びに薬剤結合の結果としてのレセプターコンホメーション変化が本発明により決定できる。別の観点において、本発明は脂質相互作用についての情報、例えば脂質に対するリポタンパク質結合及び脂質とのリポソーム相互作用についての情報を提供する。
【０２１３】
別の態様において、本発明の技術は核酸試料をスクリーニングするための遺伝子チップ並びにタンパク質の分類及び理解のためのタンパク質（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）チップの提供に利用できうる。かかるチップは各々の結合現象の親和力、反応速度及び固有誘電特性と同時に測定する本発明の固有能力を利用でき、そしてチップ上の多数のアドレス可能な検査部位においてこれらの測定を行うことができる。正確なアドレス方法は用途に応じるが、一般戦略は下記の通りである：変数Ｋeq，ＫA 及びω＝（ω１，ω２，ω３，…）によりベクトル空間を規定する。ここでこれらの変数は平衡定数、反応速度定数、及び誘電特性を調べるＮ通りの周波数の基礎的なセットである。これにより、Ｎ＋２次元空間が規定でき、その中で全ての結合現象をマッピングすることができる。注目の結合現象のスペクトルを示す対照分子の群、例えば様々な核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの群又はタンパク質ドメインもしくはその他のタンパク質サブ構造に特異的な抗体の選択群を選定し、そしてチップ上のアドレス可能な点に付着させる。特定の分子種又は物質群をチップに導入し、そして各アドレスを上記のベクトル空間（又はその適当なサブセット）の中の各点の値について調べる。各物質はベクトル空間内のアドレスにより示されることができる。システムの複雑さはベクトル空間のサイズ及び表層上の様々な固定化リガンドの総数に依存するであろう。
【０２１４】
上記の例として、４通りの周波数で分析する２種類の核酸プローブを含んで成る単純なシステムを考慮する；そして更に、これらの周波数各々は１０通りの増幅に分類できる。かかるシステムは可能として１億通りのアドレスを有するであろう（第一多形態について１０4 通り、そして第二多形態について１０4 通り）。このシステムの中に配される未知のものは式〔（１，５，３，７）（４，８，６，７）〕の固有のアドレスにより表わされ、ここで最初の４つの数字は４つの選定の周波数においての第一プローブのスペクトル応答を表わし、そして後の４つの数字は４つの選定の周波数においての第二プローブのスペクトル応答を表わす。従って、２種類のプローブ及び４通りの周波数だけで、１億通りの固有のアドレスが作製できる。
【０２１５】
針の腔口の中のミニチュアバイオアッセイ装置を供する「スマートニードル」IVアッセイも本発明の技術を利用するために行うことができる。この態様は緊急施設及びその他の現場環境において利用するための安価で安全な医療診断装置を供与するのに利用できる。利用の例には：急性症状、例えば心臓発作、感染病、例えば細菌性髄膜炎、又は新生／周産期のグループＢ段階感染症、凝固障害、胎児及び新生児の集中治療時の酸素付加；現場での慢性症状の診断、例えば看護人提供所及び遠隔地での診断；が挙げられる。
【０２１６】
多数の生物学的結合パートナーを抱えるバイオアッセイ装置は試料中の多数の被検物の同時アッセイを可能にする。更に、単独の被検物から多種多様な生物学的結合パートナーの物質の測定は非特異的結合のためのコントロールを伺る。検査試料中の様々な被検物の結合度の対比は様々な被検物の相対的増加又は減少の評価を可能にする。
【０２１７】
本発明のバイオアッセイ装置は事実上全ての被検物をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで検出するのに利用できる。好適な態様においてはこの被検物は生物学的分子でありうるが、特異的な結合パートナーが得られるか又は被検物のその他の特性を本明細書に記載の本発明のいずれかの態様で測定できる限り、そのように限定する必要はない。適当な被検物には生物学的材料の中又はそれを処理した材料の中に見い出せる事実上全ての被検物が挙げられる。好適には水性溶液の中に懸濁又は溶解できうる事実上全ての被検物が本発明の方法を利用して検出できる。注目の被検物の例には１）抗体、例えばＨＩＶ（２）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、肝炎（例えばＡ，Ｂ及びＣ型肝炎）、麻疹及び風疹に対する抗体；２）乱用薬剤及びその代謝副産物、例えばコチニン、コカイン、ベンゾルエクゴニン、ベンゾジアザズピン、テトラヒドロカンナビノール、ニコチン、エタノール；３）治療薬、例えばセオフィリン、フェニトイン、アセトアミノフェン、リチウム、ジアゼパム、ノルトリプチリン、セコバルビタール、フェノバルビタール等；４）ホルモン及び成長因子、例えばテストテロン、エストラジオール、１７−ヒドロキシプロゲステロン、プロゲンテロン、タイロキシン、甲状腺刺激ホルモン、小胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、アルファー形質転換成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子Ｉ及びII、成長ホルモン放出阻害因子及び性ホルモン結合グロブリン；並びに５）その他の被検物、例えばグルコース、コレステロール、カフェイン、コルチコステロイド結合グロブリン、ＤＨＥＡ結合糖タンパク質、等が挙げられる。
【０２１８】
上記の通り、適当な被検物には、限定することなく、タンパク質、糖タンパク質、抗原、抗体、核酸、糖類、炭水化物、レチクン、等が挙げられる。しかしながら、大型の多量分子物体、例えば細胞、細胞膜及びその他の細胞構成物も本発明の方法により検出及び／又は定量できる。従って、特徴的な表層マーカー（例えば、レセプター、レチクン等）を有する微生物（例えば細菌、真菌、藻類、等）が検出及び／又は定量できる（例えば、動物又は植物由来の生物学的試料中で）。同様は、特徴的なマーカーを有する細胞タイプ（例えば、特定の組織の細胞特徴）である（例えばＩＬ−１３レセプターを過剰発現する腫瘍細胞：例えば米国特許第５，６１４，１９１号参照）。かくして、特定の病理、特に特定の分化状態（又はその欠如）の指標となる細胞又は特定の組織タイプが検出及び／又は定量できる。
【０２１９】
生物学的結合パートナー（リガンド又は抗リガンド）エフェクター分子の「チップ」表層への接合
一の態様において、生物学的結合パートナー（リガンド又は抗リガンド）を基礎表層（例えば、生物電気インターフェース）に化学的に接合する。分子を化学的に接合する手段は当業者の周知である（例えば、抗体の抗癌剤、ラベル、例えば放射性ラベル、酵素等への接合について記載するMonoclonal Antibodics : Principles and Applications, Birch and Lennox 編、John Wiley & Sons, Inc. N.Y. (1995) の第４章を参照のこと）。
【０２２０】
表層に結合パートナー（例えば、タンパク質、抗体、糖タンパク質、核酸、レクチン、糖、炭水化物、等）を付加する手順は結合パートナーの化学構造に従って変わるであろう。ポリペプチドは一般に様々な官能基、例えばカルボン酸（ＣＯＯＨ）又は遊離アミン（−ＮＨ2 ）基を含み、それはそれを結合せしめる表層又はリンカー上の適当な官能基との反応に有用である。同様に、その他の生物学的分子、例えば核酸、糖類、炭水化物は全て連結のために適当な箇所となる様々な官能基（例えば、ＯＨ，ＮＨ2 ，ＣＯＯＨ，Ｓ、等）を含む。
【０２２１】
他方、ターゲッティング分子及び／又はエフェクター分子を、更なる反応性官能基の曝露又は付加のために誘導化してよい。誘導化は任意の様々なリンカー分子、例えばPierce Chemical Company, Rockford Illinoisより入手できるものの付加を包含しうる。
【０２２２】
本明細書に記載の「リンカー」を基礎（例えば装置又は器具）表層に生物学的結合パートナー（例えばリガンド又は抗リガンド）の接続のために利用してよい。このリンカーは生物学的結合パートナー及び基礎表層の両者との共有結合の形成が可能である。適当なリンカーは当業者に周知のものであり、そして限定することなく直鎖又は枝分れした炭素リンカー、複素環炭素リンカー、又はペプチドリンカーが挙げられる。
【０２２３】
表層上の基と反応性である１個の官能基及び結合パートナーと反応性である別の官能基を有する二価リンカーが所望のコンジュゲートの形成に利用できうる。他方、誘導化は結合パートナー及び／又は基材の化学処理を包含しうる。例えば、シリカ又はガラス基材をシラン処理して官能基を構築してよい。同様に、タンパク質又は糖タンパク質を、例えばタンパク質抗体に付加された糖成分を過ヨウ素酸物でグリコール切断して遊離のアルデヒド基を構築することにより、誘導化してよい。抗体又はタンパク質もしくは糖タンパク質上の遊離のアルデヒド基は、表層上の遊離のアミン又はヒドラジン基と反応して、それに結合パートナーを結合せしめうる（米国特許第４，６７１，９５８号を参照）。ポリペプチド、例えば抗体又は抗体フラグメント上でのスルフヒドリル基の構築のための手順も公知である（米国特許第４，６５９，８３９号参照）。
【０２２４】
様々な生物学的分子を様々な金属、ガラス、プラスチック等の基材への付加のための多くの手順及びリンカー分子が当業者に周知である。例えば、ヨーロッパ特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８、４，６５９，８３９、４，４１４，１４８、４，６９９，７８４、４，６８０，３３８、４，５６９，７８９及び４，５８９，０７１号；並びにBorlinghaus ら（1987) Cancer Res. 47 : 4071-4075参照のこと。抗体、タンパク質及び糖タンパク質を接合する方法は免疫毒素の分野に豊富にあり、そして例えば「Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates : Aiming the Magic Bullet」Thorpeら、Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982), Waldmann, Science, 252 : 1657 (1991)；米国特許第４，５４５，９８５及び４，８９４，４４３号に見い出せうる。
【０２２５】
核酸結合パートナーの利用
結合パートナーが核酸のとき（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、等）、特異的結合は「ストリンジェント条件」下で達成されるのが好ましく、条件がよりストリンジェントになるほど、ハイブリダイゼーションはより特異的となる。
【０２２６】
任意のプローブ／標的の組合せのためのストリンジェント条件の選択は当業者により日常的に成し遂げられる。更に、ストリンジェンシーは所望のレベルの特異性が得られるまで条件のストリンジェンシーを徐々に高めることにより（例えば、塩を増やす、温度を上昇させる、等）経験的に決定できる。
【０２２７】
ストリンジェント条件の「起点」は周知である。例えば、所望の核酸は相補核酸プローブと５０％のホルムアルデヒドで４２℃のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でハイブリダイズするであろう。その他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件も選定できうる。一般に、ストリンジェント条件は規定のイオン強度及びpHでの特異的な配列についての熱的融点（Ｔm ）よりも約５℃低くなるように選定される。Ｔm は標的配列の５０％が完全対合プローブとハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びpHで）である。典型的には、ストリンジェント条件は塩濃度が少なくとも０．０２モラーであり、pH７であり、そして温度が少なくとも約６０℃であるものをいうであろう。その他の要因、例えばとりわけ相補鎖の基本組成及び大きさ、有機溶媒の存在及び塩基誤対合の程度がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに有意に影響を及ぼしうるため、パラメーターの組合せの方が任意の一つの絶対値よりも重要である。核酸のハイブリダイゼーションの詳しいガイドはAnsubel ら、Current Protocols in Molecula r Biology current Protocols (Greene Publishing Associates, IncとJohn Wiley & Sons, Inc. とのジョイントベンチャー）（1998) にある。
【０２２８】
結合パートナーとして利用するためのオリゴヌクレオチドは例えばBeaucage, S.L. and Carruthers, M.H., 1981, Tetrahedron Lett., 22 (20) : 1859-1862 によりはじめて発表された固相ホスホラミジットトリエステル法に従い、Needman-Van Devanter, D.R.ら1984, Nacleic Acids Res., 12 : 6159-6168に記載の自動合成装置を利用し、化学的に合成できる。オリゴヌクレオチドの精製は自然アクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかによる（Pearson, J.D. and Regnier, F.E. (1983) J. Chrom. 255 : 137-149。合成オリゴヌクレオチドの配列はMaxam, A.M. and Gibert, W. (1980), Methods Enzymol. 65 :499-560 の化学分解法を利用して確認できる。
【０２２９】
当該バイオアッセイ装置は様々な用途、例えば大量の分子の生物学的活性についてのスクリーニング又は生物学的試料の特定の１もしくは複数の成分の有無もしくは濃度についてのスクリーニング、を有するであろう。生物学的活性をスクリーニングするため、例えば結合層を１又は複数種のレセプター、例えば抗体又はまるごとの細胞に曝露する。結合層抗リガンドとリガンドとの相互作用を検出することにより、存在及び濃度は決定できうる。この技術の特定の利点はこの相互作用の検出にラベルを必要としない点にある。個々の分子の固有の特性をその存在及び量、非存在、又は他の分子との相互作用を検出するために利用する。
【０２３０】
バイオアッセイ装置又はチップについてのその他の考えられる用途には診断が挙げられ、それにおいては特定のレセプターに対する様々な抗体を用いて結合層を形成し、そして例えば血液が免疫不全についてスクリーニングされるであろう。このバイオアッセイ装置は任意的に皮下組織用針中腔に合うように作製してよい。結合層上の予め適用された抗リガンドに対する結合のためにごく微量の血液試料で足りるであろう。診断アッセイを、病原体、例えばウィルス又は細菌から、代謝活性、例えばグルコース濃度又は脂質レベル、肝臓酵素、電解質、凝血因子、特異的抗体、例えばＡＮＡ（リウマチ様疾患に利用）及びアレルギー反応抗体、動脈血液酵素付加、薬物乱用、等に至るまで、臨床関連被検物の全域にわたり測定するために行うことができる。
【０２３１】
この能力において利用されるバイオアッセイ装置は安価なディスポーザブルチップであってよく、なぜならそれらは簡単に作製でき、そして半導体加工に制約されないからである。例えば、これらのチップは安価な材料、例えばプラスチック又はガラス基材上で任意的に作製できる。これらのチップを次に以下に記載の装置の中に任意的に入れ、そしてこのバイオアッセイ装置にシグナルを伝搬して血液中のリガンドに基づく結合相互作用を検出する。実際には、ラベルの不要な検出に有用な無数の生物学及び化学的用途のための様々な結合層を含む多種多様な形状及び大きさのバイオアッセイ装置を作製できる。
【０２３２】
未知の及び特性決定されていないタンパク質は未知のタンパク質上の構造モチーフに対する結合を検出することにより分類及び／又は同定できうる。例えば、同じ又は類似のクラスの中のタンパク質は構造相同性を有する；即ち、一定のタンパク質のクラス内にはドメインの如きサブ構造が共通する。多数のアドレス可能なアレーを有するチップを作製することにより（各々のアレーは特定のサブ構造に対する抗リガンドを有する）、未知の分子性物質は下記の通りに分類及び／又は同定できる：特定のサブ構造の存在は各々のその対応の抗リガンドに対する結合により検出される。これらのサブ構造結合現象の各々は例えば親和力、反応速度及びスペクトル応答の如き性質により特性決定される。次いで未知の分子物質の応答と既知のタンパク質由来のデーターとの相関を調べる。完全なフィットがない場合、未知化合物の構造詳細のほとんどは、ＮＭＲスペクトルで有機分子について行うようにして分断してまとめあげることができる。
【０２３３】
別の態様において、この技術は核酸の検出のための遺伝子チップの開発に利用できうる。遺伝子チップは試料中の相補性核酸の検出のために利用される核酸の列（アレー）である。遺伝子チップ上の独立のＤＮＡ分子への結合により測定される相補性ＤＮＡの存在が所望の結果である。相補結合が生じない場合、親和力、融点又はその他のストリンジェンシー条件及び直接スペクトル応答の如き物理量の測定、並びに従前の実測データーとの相関を調べることを介し部分ハイブリダイゼーションで検出及び特性決定ができる。このようにして、核酸配列の形態の単一の抗リガンドは多形態全体について、各々の多形態についての個別の配列を必要とすることなく検出されうる。例えば、数百通りの核酸配列だけで何万通りもの多形態を検出できる。
【０２３４】
遺伝子チップは薬剤標的の同定、細菌同定、ゲノタイピング及びその他の診断ニーズのために設計できうる。この技術は典型的にはプローブとして必須核酸の基材上への付加及びその基材に対する相補性核酸の結合の測定方法を必要とする。通常、試料の核酸は最も一般的には蛍光プローブでラベルすることも必要とする。この技術は試料ＤＮＡのラベリング及びそれに付随する問題を解消する。遺伝子チップは薬剤標的同定、分子診断、並びに生物兵器剤の検出及び同定における特定のニーズのために開発されうる。作製して利用できるその他のタイプの装置はイムノアッセイ装置、薬剤発見装置、及び毒性検査装置、分析装置、等である。
【０２３５】
本明細書に記載の発明は、一次スクリーニング工程から患者分類及び治療追跡に至るまで、新たな薬剤の開発の数多くの観点のためにも利用できうる。薬剤発見の一次段階では、本発明の標的同定、バリデーション及び大量スクリーニング（ＨＴＳ）の促進のために利用できる。標的レセプターはバイオアッセイ装置上の抗リガンドであってよく、そして既知の作動因子、拮抗因子又はアロステリックエフェクターの作用を特性決定することにより、大量スクリーニング手順のための一次標的を迅速に同定及びバクデーションできる。ＨＴＳ工程では、何十万もの化合物をどれが標的に結合するかを決定するために検査できる。本明細書に記載の発明はミニチュア化してよく、これにより高度に平行のスクリーニングプラットホームを具現化できる。そのプラットホームは数百から数千の化合物を同時にスクリーニングでき、且つ同時に結合（例えば作動因子又は拮抗因子）、親和力、反応速度、等の効果を同時に決定できる。更に、かかるミニチュアシステムは非常に少量の化合物で足り、それ故コンビナトリアルライブラリーから当該化合物を入手する価格を大いに節約する。バイオアッセイ装置の利用を介して形成される検出システムは大量検出システムを供し、なぜなら検出は任意的にリアルタイムで行われ、そして多くの試料をすばやく分析できるからである。応答時間はナノ秒のタイムスケールで任意的にモニターできる。分子が互いと結合するや否や、検出が行われる。低い濃度又は弱い結合親和力を有する分子間での結合現象の測定では任意的により長い時間が必要とされる。実際の時間は拡散速度により任意的に制約される。このような潜在的な制約を除けば、数千の化合物をシステムに非常にすばやく、例えば１時間かけて任意的に流す。例えば、チップ作製技術により、１０，０００チャンネルの装置（出現しはじめているいくつかのマイクロ流体技術を利用して）が考えられ、そして少量、それ故短い拡散時間、及び反応の開始時だけを測定する反応速度により、１時間当り数千の試料が任意的に測定される。既知の濃度により、結合親和力は任意的に反応速度だけで計算でき、それ故この装置は非常に早いタイムスケールで調べることができ、そして親和力は反応速度曲線の傾きから計算及び／又は推定できる。反応速度及び親和力についての参考文献はあらゆる標準の生化学又は化学論文、例えば Mathews and van Holde, Biochemistry, Benjamin Cummings, New York, 1990 にある。
【０２３６】
本発明は細胞ベースアッセイにまで簡単に広げることができ、なぜなら検出は試料の精製及び増幅を必要としないことがあるからである。このようなクラスの用途では、細胞系は外的発現を検出することにより、又は細胞を溶解して細胞質ゾル構成物を遊離させ、そして１もしくは複数種の注目の被検物の存在を検出することにより、様々な変化についてモニターされうる。
【０２３７】
本発明は「ラボラトリー・オン・ア・チップ（チップ上の診療所）」用途に適用することもできうる。ミニチュア化のし易さを理由に、数千又は数万のアドレス可能なバイオアッセイ装置が中に含まれている非常に小型のチップが具現化されうる。検出器はある種の「論理ゲート」として具現化し得、それにおいては特定のリガンド又は被検物の存在はゲートをオンにるか又はオフにし、所定の用途に適当なものとする。かかるゲートは結合現象を、オフとオン、１又は０等に対応する二通りの可能な状態の一方へと割り当てられうる。電磁シグナルへと翻訳される様々な態様へと具現化されうる。この二通りの状態は結合及び未結合に対応する共振キャビティーもしくは導波管の周波数の通り、又は結合及び未結合に対応する送伝ラインもしくは導波管における増幅度化、又は特定の回路のバンドパスの変化、等であってよい。
【０２３８】
本発明は開示の態様に限定されない。例えば、当業者は上記のバイオアッセイ装置のシグナル経路が送伝ラインに限定されないことを理解するであろう。その他の伝送媒体、例えば導性又は誘電導波管も代わって利用されうる。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１Ａ】本発明に係るバイオアッセイ装置の第一の態様を示す。
【図１Ｂ】本発明に係るバイオアッセイ装置の第二の態様を示す。
【図１Ｃ】図１Ｂに示すバイオアッセイシステムの断面図を示す。
【図１Ｄ】本発明に係る分子結合層の第一の態様を示す。
【図１Ｅ】本発明に係る立体的に独立した多数の抗リガンドを有する分子結合層の一態様を示す。
【図１Ｆ】本発明に係る多数のクラスの抗リガンドを有する分子結合層の一態様を示す。
【図１Ｇ】本発明に係る１又は複数種の細胞を含んで成る分子結合層を示す。
【図１Ｈ】本発明に係る細胞膜及び膜一体化構造を含んで成る分子結合層を示す。
【図２Ａ】本発明に係るバイオアッセイ装置の第一の態様を示す。
【図２Ｂ】本発明に係るバイオアッセイ装置の第二の態様を示す。
【図３】生物電気インターフェースの導性層伝いで起こる結合表層化学の一の態様を示す。
【図４Ａ】図２Ａに示す生物電気インターフェース構造についての等価回路モデルの一の態様を示す。
【図４Ｂ】図４Ａに示す等価回路モデルに対応する回路の一態様を示す。
【図４Ｃ】図２Ｂに示す生物電気インターフェース構造についての等価回路モデルの一態様を示す。
【図４Ｄ】図４Ｃに示す等価回路モデルに対応する回路の一の態様を示す。
【図５Ａ】本発明に係る２つの導性回路トポロジーにおいて実行される生物電気インターフェースの特定の態様を示す。
【図５Ｂ】本発明に係る２つの導性回路トポロジーにおいて実行される生物電気インターフェースの特定の態様を示す。
【図５Ｃ】本発明に係る２つの導性回路トポロジーにおいて実行される生物電気インターフェースの特定の態様を示す。
【図５Ｄ】本発明に係る２つの導性回路トポロジーにおいて実行される生物電気インターフェースの特定の態様を示す。
【図５Ｅ】本発明に係る２つの導性回路トポロジーにおいて実行される生物電気インターフェースの特定の態様を示す。
【図５Ｆ】本発明に係る２つの導性回路トポロジーにおいて実行される生物電気インターフェースの特定の態様を示す。
【図５Ｇ】本発明に係る２つの導性回路トポロジーにおいて実行される生物電気インターフェースの特定の態様を示す。
【図６Ａ】本発明に係る分子結合現象を検出するための方法の一態様を示す。
【図６Ｂ】本発明に係る二次元及び高次元結合現象を検出するための方法の一態様を示す。
【図６Ｃ】本発明に係る分子結合層の誘電変化を測定するための方法の一態様を示す。
【図６Ｄ】本発明に係る未知の溶液中のリガンドを同定するための方法の一態様を示す。
【図６Ｅ】本発明に係るリガンドのクラスを同定するための方法の一態様を示す。
【図６Ｆ】本発明に係る溶液のリガンド濃度を定量するための方法の一態様を示す。
【図６Ｇ】本発明に係るバイオアッセイ装置の自己診断能力を供するための方法の一態様を示す。
【図７Ａ】図６Ａ〜Ｇに示す方法各々を実施するために設計されたソフトウェアプログラムを実行するためのコンピューターシステムの一態様を示す。
【図７Ｂ】図６Ａ〜Ｇに示す方法各々を実施するために設計されたソフトウェアプログラムを実行するためのコンピューターシステムの一態様を示す。
【図８Ａ】本発明に係る周波数測定システムの一態様を示す。
【図８Ｂ】本発明に係る分子構造を検出又は同定するのに利用できる第一周波数実測応答を示す。
【図８Ｃ】本発明に係る分子構造を検出又は同定するのに利用できる第二周波数実測応答を示す。
【図９】本発明に係る周波数測定システムの第二の態様を示す。
【図１０】本発明に係る時間変域測定システムの第一の態様を示す。
【図１１】本発明に係る誘電緩和測定システムの一態様を示す。
【図１２Ａ】ウレアーゼのＩＴＯ表層に対する第一結合のはね返り損失及び送伝損失測定値のそれぞれを示す。
【図１２Ｂ】ウレアーゼのＩＴＯ表層に対する第一結合のはね返り損失及び送伝損失測定値のそれぞれを示す。
【図１２Ｃ】コラゲナーゼ及びリゾチームの第一結合効果の送伝損失測定値を示す。
【図１２Ｄ】コラゲナーゼ及びリゾチームの第一結合効果の送伝損失測定値を示す。
【図１２Ｅ】結合及び未結合デキストランの送伝損失応答を示す。
【図１２Ｆ】グルコースに結合した及び結合していないｃｏｎ−Ａの応答を示す。
【図１２Ｇ】アビシン応答に対するビオチン／アビジンの送伝損失を示す。
【図１２Ｈ】デキストランとグルコースとの間での競合滴定の結果を示す。
【図１２Ｉ】共振時のグルコース濃度の関数としてのｃｏｎ−Ａのはね返り損失を示す。
【図１２Ｊ】ポリリジン応答に対するＤＮＡ／ポリリジン複合体の送伝損失を示す。
【図１２Ｋ】１００MHz ，１GHz 及び１０GHz での一連のバッファーについてのpHの関数としての送伝損失応答の変化を示す。
【図１２Ｌ】１００MHz ，１GHz 及び１０GHz での一連のバッファーについてのイオン濃度の関数としての送伝損失応答の変化を示す。
【図１２Ｍ】複雑な環境における検出能力を示す１GHz で調べた全血の１０通りの試料についての送伝損失応答を示す。
【図１２Ｎ】クアドロポールモーメント検出を示すアビジン結合の結果を示す。
【図１Ａ】
2005308761.tif 000011
【図１Ｂ】
2005308761.tif 000012
【図１Ｃ】
2005308761.tif 000013
【図１Ｄ】
2005308761.tif 000014
【図１Ｅ】
2005308761.tif 000015
【図１Ｆ】
2005308761.tif 000016
【図１Ｇ】
2005308761.tif 000017
【図１Ｈ】
2005308761.tif 000018
【図２Ａ】
2005308761.tif 000019
【図２Ｂ】
2005308761.tif 000020
【図３】
2005308761.tif 000021
【図４Ａ】
2005308761.tif 000022
【図４Ｂ】
2005308761.tif 000023
【図４Ｃ】
2005308761.tif 000024
【図４Ｄ】
2005308761.tif 000025
【図５Ａ】
2005308761.tif 000026
【図５Ｂ】
2005308761.tif 000027
【図５Ｃ】
2005308761.tif 000028
【図５Ｄ】
2005308761.tif 000029
【図５Ｅ】
2005308761.tif 000030
【図５Ｆ】
2005308761.tif 000031
【図５Ｇ】
2005308761.tif 000032
【図６Ａ】
2005308761.tif 000033
【図６Ｂ】
2005308761.tif 000034
【図６Ｃ】
2005308761.tif 000035
【図６Ｄ】
2005308761.tif 000036
【図６Ｅ】
2005308761.tif 000037
【図６Ｆ】
2005308761.tif 000038
【図６Ｇ】
2005308761.tif 000039
【図７Ａ】
2005308761.tif 000040
【図７Ｂ】
2005308761.tif 000041
【図８Ａ】
2005308761.tif 000042
【図８Ｂ】
2005308761.tif 000043
【図８Ｃ】
2005308761.tif 000044
【図９】
2005308761.tif 000045
【図１０】
2005308761.tif 000046
【図１１】
2005308761.tif 000047
【図１２Ａ】
2005308761.tif 000048
【図１２Ｂ】
2005308761.tif 000049
【図１２Ｃ】
2005308761.tif 000050
【図１２Ｄ】
2005308761.tif 000051
【図１２Ｅ】
2005308761.tif 000052
【図１２Ｆ】
2005308761.tif 000053
【図１２Ｇ】
2005308761.tif 000054
【図１２Ｈ】
2005308761.tif 000055
【図１２Ｉ】
2005308761.tif 000056
【図１２Ｊ】
2005308761.tif 000057
【図１２Ｋ】
2005308761.tif 000058
【図１２Ｌ】
2005308761.tif 000059
【図１２Ｍ】
2005308761.tif 000060
【図１２Ｎ】
2005308761.tif 000061