(57)【要約】【課題】ウエルプレートの各ウエルに培養された生物試料を位相差観察する際に、培養液によってレンズ作用が生じる場合でも、コントラストを低下させることなく試料の像を観察することが可能な位相差顕微鏡を提供する。【解決手段】輪帯形状の照明光束を生成する照明光束生成手段６と、当該照明光束生成手段６を光軸方向へ移動させるための移動手段９とを備えた照明光学系３と、対物レンズ１０と、当該対物レンズ１０内に配置された輪帯形状の位相変換手段１４とを備えた観察光学系４とからなる位相差顕微鏡１であって、移動手段９によって照明光束生成手段６を移動させることにより、照明光束生成手段６が位相変換手段１４に対して共役となるように調整することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
輪帯形状の照明光束を生成する照明光束生成手段と、当該照明光束生成手段を光軸方向へ移動させるための移動手段とを備えた照明光学系と、
対物レンズと、当該対物レンズ内に配置された輪帯形状の位相変換手段とを備えた観察光学系とからなる位相差顕微鏡であって、
前記移動手段によって前記照明光束生成手段を移動させることにより、前記照明光束生成手段が前記位相変換手段に対して共役となるように調整することを特徴とする位相差顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の位相差顕微鏡において、
前記照明光束生成手段は、照明光を射出する射出面が輪帯形状の光源からなり、
前記移動手段によって前記光源を移動させることにより、前記光源における前記射出面が前記位相変換手段に対して共役となるように調整することを特徴とする位相差顕微鏡。
【請求項３】
請求項１に記載の位相差顕微鏡において、
前記照明光束生成手段は、光源と、当該光源から射出された照明光を試料に対して集光するための集光手段と、当該集光手段と前記試料との間に配置されており前記集光手段からの光を制限するための輪帯形状の開口を備えた開口絞りとからなり、
前記移動手段によって前記開口絞りを移動させることにより、前記開口絞りが前記位相変換手段に対して共役となるように調整することを特徴とする位相差顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、位相差顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生物試料などの観察に好適な位相差顕微鏡が多数提案されている。図４は、斯かる従来の位相差顕微鏡の一般的な構成を示している。図４に示す従来の位相差顕微鏡３０において、光源３１から射出された照明光は、コレクタレンズ３２によって略平行光束とされる。この略平行光束は、拡散板３３を介して、輪帯形状（リング形状）の開口絞り３４によって制限される。この開口絞り３４を通過した光は、コンデンサレンズ３７によって集光され、ステージ３８に載置された後述する培養容器内の試料Ｏを照明する。
【０００３】
そして、試料Ｏを透過した直接光（０次の回折光）は、対物レンズ３９に入射し、該対物レンズ３９内のリング状の位相膜４０を透過することによって位相が変換される。尚、この位相膜４０は、対物レンズ３９内であって、開口絞り３４と共役な位置に設けられている。さらに、この位相膜４０は対物レンズ３９の開口数の違いによってその径が異なるため、開口絞り３４は位相膜の径に応じて開口の径が異なる開口絞り３５や開口絞り３６などに適時変更される。
また、試料Ｏによって回折された回折光（試料Ｏによって回折されることで直接光に対して位相がずれた０次以外の回折光）は、対物レンズに入射し、該対物レンズ内のリング状の位相膜以外の部分を透過する。
【０００４】
これらの直接光と回折光とは、結像レンズ４１によって結像されて撮像素子４２の撮像面上で干渉する。これにより、撮像面上には試料Ｏの拡大像Ｉが形成されて、撮像素子４２によって撮像されることとなる。
以上のように位相差顕微鏡では、試料Ｏの屈折力差や厚みなどによって生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変換して像の明暗として可視化することで、試料Ｏの像を観察することができる。尚、このような位相差顕微鏡は、１９３５年にＦ．Ｚｅｒｎｉｋｅによって発明され、その原理に関しては、例えば応用光学１（倍風館、１９９０、鶴田匡夫、Ｐ．２５６−２５９  位相差法）や、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ＭｃＧｒａｗ−ｈｉｌｌ、１９８１、Ｊｅｎｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ、Ｐ．６０２−６０４  Ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）などに記載されている。
【０００５】
また従来、上述の培養容器、詳しくは生物試料を培養するための小さな凹部（以下、「ウエル」という。）を格子状に多数配列した培養容器（以下、「ウエルプレート」という。）が知られている。例えば、直径６ｍｍ程度のウエルを９６個備えたウエルプレートが知られている。斯かるウエルプレートを用いて生物試料を培養し、該ウエルプレートを上述のような位相差顕微鏡のステージに配置して生物試料を観察する場合、ウエルの直径が小さいために各ウエル内の培養液は、液面の表面張力によって湾曲し、溶液と空気の面でレンズ作用を引き起こしてしまう。このレンズ作用により、位相差顕微鏡において本来共役関係にあるべき開口絞りと位相膜との光学的な位置関係が崩れてしまう。このため、位相差顕微鏡本来の効果を得ることができず、観察される生物試料の像は、コントラストが低下したものとなってしまうという問題がある。
【０００６】
この問題を解決するための顕微鏡として、上記レンズ作用を打ち消すようなレンズを各ウエルに対向して適時設置する構成の位相差顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００７】
【特許文献１】
特開２０００−４８７１号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、各ウエル内の培養液の液面にて生じるレンズ作用は、液面の高さやウエルの直径の違いによって異なるため一定ではない。また、近年では大量の生物試料を検査するために、より多数のウエルを備えたウエルプレート、例えば３８４個のウエルを備えたウエルプレートが用いられるようになっている。したがって、このようなウエルプレートにおける各ウエルはその直径がますます小さくなり、このことによってレンズ作用もより顕著になってきている。
このため、上記特許文献１に開示されている従来の位相差顕微鏡によってこれらの場合に対応しようとする場合、レンズ作用を打ち消すようなレンズをウエルプレートに対応して多数準備しなければならなくなる。これにより、製造コストが増大してしまうばかりでなく、多数準備したレンズの交換に手間を要することとなるため作業が煩雑になってしまう。
【０００９】
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、ウエルプレートの各ウエルに培養された生物試料を位相差観察する際に、培養液によってレンズ作用が生じる場合でも、コントラストを低下させることなく試料の像を観察することが可能な位相差顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために請求項１に記載の発明は、
輪帯形状の照明光束を生成する照明光束生成手段と、当該照明光束生成手段を光軸方向へ移動させるための移動手段とを備えた照明光学系と、
対物レンズと、当該対物レンズ内に配置された輪帯形状の位相変換手段とを備えた観察光学系とからなる位相差顕微鏡であって、
前記移動手段によって前記照明光束生成手段を移動させることにより、前記照明光束生成手段が前記位相変換手段に対して共役となるように調整することを特徴とする位相差顕微鏡を提供する。
【００１１】
また、請求項２に記載の位相差顕微鏡は、
請求項１に記載の位相差顕微鏡において、
前記照明光束生成手段は、照明光を射出する射出面が輪帯形状の光源からなり、
前記移動手段によって前記光源を移動させることにより、前記光源における前記射出面が前記位相変換手段に対して共役となるように調整することを特徴とする。
【００１２】
また、請求項３に記載の位相差顕微鏡は、
請求項１に記載の位相差顕微鏡において、
前記照明光束生成手段は、光源と、当該光源から射出された照明光を試料に対して集光するための集光手段と、当該集光手段と前記試料との間に配置されており前記集光手段からの光を制限するための輪帯形状の開口を備えた開口絞りとからなり、
前記移動手段によって前記開口絞りを移動させることにより、前記開口絞りが前記位相変換手段に対して共役となるように調整することを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の各実施の形態に係る位相差顕微鏡について添付図面を参照して詳細に説明する。
（第１実施形態）
図１は、本発明の第１実施形態に係る位相差顕微鏡の光学系を示す概略構成図である。
図１に示すように、本実施形態に係る位相差顕微鏡１は、ステージ２に載置された試料（生物試料）Ｏを照明するための照明光学系３と、照明された試料Ｏを観察するための観察光学系４とからなる。
【００１４】
照明光学系３は、図１に示すように複数の発光ダイオード５を輪帯形状（リング状）に並べて配置することによって構成された光源６と、後述する駆動部９とからなる。光源６を構成する複数の発光ダイオード５は、それぞれステージ２に載置された試料Ｏへ向かって照明光Ｌを射出するように配置されている。このようにして、光源６における照明光の射出面６ａの形状は、後述する対物レンズ１０内の位相膜１４の形状と相似のリング形状となっている。斯かる構成の光源６は、射出面６ａが対物レンズ１０内の位相膜１４に対して光学的に共役となるように配置され、位相膜１４上にはリング形状の光源像が形成されることとなる。また光源６は、支持棒８を介して例えば電動モータなどの駆動部９に連結されており、該駆動部９によって光軸ＡＸ方向へ移動することができる。これにより、対物レンズ１０内の位相膜１４に対する光源像の投影倍率を変化させることができる。尚、光源６として、上記発光ダイオード５の他、リング形状のその他の平面発光板を採用することや、キセノンランプなどの光源と光ファイバとを用い、該光ファイバの射出端をリング状に構成したものを採用することもできる。
【００１５】
観察光学系４は、ステージ２側から順に、対物レンズ１０と、後述するベルトランレンズ１１と、結像レンズ１２と、撮像素子１３とからなる。対物レンズ１０内には、光源６から射出されて試料Ｏに入射した照明光のうちで該試料Ｏを透過した直接光（０次の回折光）の位相を変換するためのリング形状の位相膜１４が設けられている。さらに、対物レンズ内１０には、直接光を減光するために、位相膜１４と重なり合うようにリング形状のニュートラルデンシティフィルタ１５（以下、「ＮＤフィルタ」という。）が設けられている。これらの位相膜１４とＮＤフィルタ１５により、直接光を後述する回折光と干渉させることが可能となる。また、撮像素子１３はモニタ１６に接続されており、観察者はモニタ１６を介して試料Ｏを観察することができる。
【００１６】
本実施形態において、ステージ２には、図２に示すようなウエルプレート１７が載置される。ウエルプレート１７に設けられた各ウエル１８には、培養液が注入され、各ウエル１８の底面に接して生物試料Ｏが培養されている。各ウエル１８に注入された培養液１９の液面１９ａは、上述のように各ウエル１８の直径が小さいため、表面張力によって湾曲しレンズ作用を生じる。
【００１７】
斯かる構成の位相差顕微鏡１において、光源６から射出された照明光は、ステージ２上のウエルプレート１７に培養されている位相物体である生物試料Ｏへ入射する。
試料Ｏを透過した直接光は、対物レンズ１０に入射して該対物レンズ１０内のリング状の位相膜１４とＮＤフィルタ１５を透過することによって、位相が変換されさらに減光される。また、試料Ｏによって回折された回折光（試料によって回折されることで直接光に対して位相がずれた０次以外の回折光）は、対物レンズ１０に入射し、該対物レンズ１０内のリング状の位相膜１４以外の部分を透過する。
そして、これらの直接光と回折光とは、結像レンズ１２によってそれぞれ結像されて撮像素子１３の撮像面上で干渉する。これにより、撮像面上には試料の位相差に応じたコントラストの拡大像Ｉが形成されて撮像素子１３によって撮像される。この撮像された生物試料Ｏの拡大像Ｉは、モニタ１６に表示されて観察者によって観察されることとなる。
以上のように本実施形態に係る位相差顕微鏡１では、試料Ｏの屈折力差や厚みなどによって生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変換して像の明暗として可視化することで、試料Ｏの像を観察することができる。
【００１８】
次に、本実施形態において最も特徴的な構成について説明する。
本実施形態に係る位相差顕微鏡１は、ウエルプレート１７における培養液１９の液面１９ａで生じる上述のレンズ作用によって光源６（詳細には、光源６における照明光の射出面６ａ）と対物レンズ１０内の位相膜１４との光学的に共役な位置関係が崩れてしまう場合に、この崩れた位置関係を補正するように（光源６が位相膜１４に対して光学的に共役となるように）光源６を駆動部９によって光軸ＡＸ方向へ移動させる構成である。光源６と位相膜１４とが光学的に共役な位置関係となることによって位相膜１４上に光源像が形成されるため、このとき試料Ｏを透過した直接光は位相膜１４へ適切に入射することとなる。
【００１９】
以下に、光源６の位置の調整について説明する。
まず、対物レンズ１０の射出瞳を観察するためのレンズであるベルトランレンズ１１を観察光学系４の光路内に挿入する。このベルトランレンズ１１の挿入により、直接光がＮＤフィルタ１５へ入射する様子を観察することができる。ここで、ＮＤフィルタ１５は、上述のように位相膜１４と重なり合って配置されたリング形状のフィルタであるため、直接光がＮＤフィルタ１５へ適切に入射することは、直接光が位相膜へ適切に入射することを意味する。
【００２０】
次に、直接光がＮＤフィルタへ入射する様子をベルトランレンズ１１を介して観察しながら、駆動部９によって光源６を光軸ＡＸ方向へ移動させて光源６と位相膜１４とが光学的に共役となるように調整を行う。尚、直接光がＮＤフィルタ１５へ適切に入射しない場合、すなわち光源６と位相膜１４とが光学的に共役でない場合、直接光は対物レンズ１０内のＮＤフィルタ１５以外の部分を通過することとなるため、この直接光はＮＤフィルタ１５によって減光されず、観察視野は明るくなり、試料の像のコントラストが低くなる。
【００２１】
したがって、ウエルプレート１７における上述のレンズ作用によって光源６と位相膜１４との光学的に共役な位置関係が崩れてしまう場合でも、以上の手順によって光源６の位置を調整することで、光源６と位相膜１４とを光学的に共役にすることができる。
尚、光源６の位置調整の範囲（光源６の移動範囲）は、数ミリメートルから１０ミリメートル程度である。また、対物レンズを交換することで位相膜の大きさが変わった場合には、５０ミリメートル程度まで移動させることもある。
本実施形態における以上の光源６の調整は、撮像素子１３によって画像を取り込み、直接光とＮＤフィルタ５とが重なる様子を視野の明るさや像のコントラストを取り込み、コンピュータによって判断して光源６を駆動することにより、自動で行う構成とすることもできる。
【００２２】
以上より、本実施形態に係る位相差顕微鏡１は、ウエルプレート１７をステージ２に配置して試料Ｏを観察する際に培養液１９の液面１９ａにレンズ作用が生じても、上述の光源６の位置調整を行うことによって、光源６を位相膜１４に対して光学的に共役に配置することができる。これにより、位相差顕微鏡本来１の効果を得て、コントラストが低下することなく試料Ｏの拡大像Ｉを観察することができる。
【００２３】
また、本実施形態に係る位相差顕微鏡１は、同じ規格のウエルプレートを順次交換しながら観察を行う場合、最初の１枚のウエルプレートで光源位置の調整がされていれば、ウエルプレートを交換後に新たに光源位置の調整を行うことなく２枚目以降のウエルプレートで位相差観察を行うことができる。
【００２４】
さらに、本実施形態に係る位相差顕微鏡１は、上述の位相膜１４を備えた対物レンズ１０を、径の異なる位相膜を備えた他の対物レンズと取替えて観察を行う場合でも、同様に上述の光源の位置の調整を行うことによって、光源６を位相膜に対して光学的に共役に配置することができる。このため、本実施形態に係る位相差顕微鏡１は、径の異なる位相膜を備えた複数の対物レンズを任意に用い、用いた対物レンズそれぞれについてコントラストが低下することなく試料の拡大像を観察することができる。
【００２５】
（第２実施形態）
図３は、本発明の第２実施形態に係る位相差顕微鏡の光学系を示す概略構成図である。以下、本実施形態に係る位相差顕微鏡において、上記第１実施形態と同様の構成については同じ符号を付してその説明を省略し、特徴的な部分について詳細に説明する。
図３に示すように、本実施形態に係る位相差顕微鏡２１は、ステージ２に載置された試料Ｏを照明するための照明光学系２２と、照明された試料Ｏを観察するための観察光学系４とからなる。
【００２６】
照明光学系２２は、図３に示すように、光源２３と、コレクタレンズ２４と、拡散板２５と、コンデンサレンズ２６と、リング形状の開口２７ａを有する開口絞り２７と、後述する駆動部９とからなる。開口絞り２７は、対物レンズ１０内の位相膜１４に対して光学的に共役となるように配置され、位相膜１４上には開口絞り２７の開口２７ａの像（以下、「開口絞り２７の像」という。）が形成されることとなる。また、開口絞り２７は、例えば電動モータなどの駆動部９に連結されており、該駆動部９によって光軸ＡＸ方向へ移動することができる。これにより、位相膜１４に対する開口絞り２７の像の投影倍率を変化させることができる。
尚、上記第１実施形態は上述のように位相膜１４上に光源像が形成される構成であるのに対し、本実施形態は位相膜１４上に開口絞り２７の像が形成される構成である。この構成によって本実施形態は、上記第１実施形態と同様に、試料Ｏを透過した直接光を位相膜１４へ適切に入射させることができる。
【００２７】
斯かる構成の位相差顕微鏡２１において、光源２３から射出された照明光は、コレクタレンズ２４によって略平行光束とされた後、拡散板２５を介してコンデンサレンズ２６へ入射する。コンデンサレンズ２６から射出された光は、開口絞り２７によって制限され、ステージ２上のウエルプレート１７に培養されている生物試料Ｏへ入射する。この試料Ｏから射出された直接光および回折光は、上記第１実施形態と同様に観察光学系４を介して干渉し、試料Ｏの拡大像Ｉを形成する。これにより観察者は、モニタ１６に表示されたこの試料Ｏの拡大像Ｉを観察することができる。
以上のように本実施形態に係る位相差顕微鏡２１では、試料Ｏの屈折力差や厚みなどによって生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変換して像の明暗として可視化することで、試料Ｏの像を観察することができる。
【００２８】
次に、本実施形態において最も特徴的な構成について説明する。
本実施形態に係る位相差顕微鏡２１は、ウエルプレート１７における培養液１９の液面１９ａで生じる上述のレンズ作用によって開口絞り２７と対物レンズ１０内の位相膜１４との光学的に共役な位置関係が崩れてしまう場合に、この崩れた位置関係を補正するように（開口絞り２７が位相膜１４に対して光学的に共役となるように）開口絞り２７を駆動部９によって光軸ＡＸ方向へ移動させる構成である。開口絞り２７と位相膜１４とが光学的に共役な位置関係となることによって位相膜１４上に開口絞り２７の像が形成されるため、このとき試料Ｏを透過した直接光は位相膜１４へ適切に入射することとなる。
尚、以上の開口絞り２７の位置の調整は、上記第１実施形態における光源の位置の調整と同様に行われる。
【００２９】
また、本実施形態において、直接光が位相膜１４を透過する条件に合う観察視野を広く得るためには、できる限り試料Ｏより離れた位置、つまりコンデンサレンズ２６に近い位置に設置することが望ましい。また、開口絞り２７の開口２７ａの幅（開口２７ａの内径と外径の差）も小さい方が良い。
【００３０】
以上より、本実施形態に係る位相差顕微鏡２１は、ウエルプレート１７をステージ２に配置して生物試料Ｏを観察する際に培養液１９の液面１９ａにレンズ作用が生じても、上述の開口絞り２７の位置の調整を行うことによって、開口絞り２７を位相膜１４に対して光学的に共役に配置することができる。これにより、上記第１実施形態の奏する効果と同様、位相差顕微鏡本来の効果を得て、コントラストが低下することなく生物試料Ｏの拡大像Ｉを観察することができる。
【００３１】
また、本実施形態に係る位相差顕微鏡２１は、同じ規格のウエルプレートを順次交換しながら観察を行う場合、最初の１枚のウエルプレートで開口絞り２７の位置の調整がされていれば、ウエルプレートを交換後に新たに開口絞りの位置の調整を行うことなく２枚目以降のウエルプレートで位相差観察を行うことができる。
【００３２】
さらに、本実施形態に係る位相差顕微鏡２１は、上述の位相膜１４を備えた対物レンズ１０を、径の異なる位相膜を備えた他の対物レンズと取替えて観察を行う場合でも、同様に上述の開口絞り２７の位置の調整を行うことによって、開口絞り２７を位相膜に対して光学的に共役に配置することができる。このため、本実施形態に係る位相差顕微鏡２１は、上記第１実施形態の奏する効果と同様、径の異なる位相膜を備えた複数の対物レンズを任意に用い、用いた対物レンズそれぞれについてコントラストが低下することなく生物試料の拡大像を観察することができる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、ウエルプレートの各ウエルに培養された生物試料を位相差観察する際に、培養液によってレンズ作用が生じる場合でも、コントラストを低下させることなく試料の像を観察することが可能な位相差顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態に係る位相差顕微鏡の光学系を示す概略構成図である。（ａ）は光学系、（ｂ）は光源における照明光の射出面の形状、（ｃ）は位相膜およびＮＤフィルタの形状をそれぞれ示す。
【図２】ウエルプレートの構成を示す図である。（ａ）はウエルプレートを上方から見た図、（ｂ）はウエルプレートの断面図をそれぞれ示す。
【図３】本発明の第２実施形態に係る位相差顕微鏡の光学系を示す概略構成図である。（ａ）は光学系、（ｂ）は開口絞りの形状、（ｃ）は位相膜およびＮＤフィルタの形状をそれぞれ示す。
【図４】従来の位相差顕微鏡の光学系を示す概略構成図である。（ａ）は光学系、（ｂ）は開口絞りの形状、（ｃ）は位相膜の形状をそれぞれ示す。
【符号の説明】
１，２１，３０      位相差顕微鏡
２，３８            ステージ
３                  照明光学系
４                  観察光学系
６，２３，３１      光源
９                  駆動部
１０，３９          対物レンズ
１４，４０          位相膜
１２，４１          結像レンズ
１３、４２          撮像素子
２６，３７          コンデンサレンズ
２７，３４          開口絞り
Ｏ                  生物試料
Ｉ                  拡大像
【図１】
2005004088.tif 000003
【図２】
2005004088.tif 000004
【図３】
2005004088.tif 000005
【図４】
2005004088.tif 000006