(57)【要約】【課題】  本発明は、クローニング効率、シーケンス効率のよい発現ベクター構築用ベクターに目的とする遺伝子をクローニングし、これを迅速に植物形質転換用ベクターに組換えることができる発現ベクター構築用ベクターを提供する。【解決手段】  ｐＵＣ系のクローニングベクターに２つのａｔｔ部位と、その間にプロモーターとターミネーターと、当該プロモーターとターミネーターで挟まれたクローニングサイトとを挿入した発現ベクター構築用ベクター及びこれにさらに任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドをコードする遺伝子を挿入した発現ベクター構築用ベクターとを構築し、λファージ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系を利用して植物形質転換用ベクターに迅速に組換えることを可能とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物を宿主とする発現ベクターを構築するために用いられ、
２つのａｔｔ部位と、その間にプロモーター及びターミネーターと、当該プロモーターとターミネーターとで挟まれた、１個以上の制限酵素部位を有するＤＮＡセグメントとを有することを特徴とする発現ベクター構築用ベクター。
【請求項２】
ｐＵＣ型プラスミドであることを特徴とする上記請求項１に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項３】
上記ターミネーターが、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域であることを特徴とする請求項１又は２に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項４】
上記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はアクチンプロモーターであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項５】
任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする塩基配列を組み込んでいることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項６】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項７】
上記機能性ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるぺプチドであることを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが以下の（ａ）又は（ｂ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター構築用ベクター。
（ａ）配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４又は１７７に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドであることを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、配列番号１６５又は１６８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター構築用ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の発現ベクター構築用ベクターと、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターとを含む植物形質転換用キット。
【請求項１４】
さらに、上記発現ベクター構築用ベクターおよび植物形質転換用ベクターにおける２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡセグメントを組換えるリコンビナーゼを含む植物形質転換用キット。
【請求項１５】
インビトロにおいて、請求項１〜１２のいずれかに記載の発現ベクター構築用ベクターに目的とする遺伝子をクローニングしたベクターと、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターとの間で、リコンビナーゼを用いて、それぞれの２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡセグメントを組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築する方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法により構築された植物を宿主とする発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物を宿主とする発現ベクターを構築するための構築用ベクター及びその利用方法に関するものであり、特に、クローニング効率やシーケンス効率に優れた発現ベクターを構築するために好ましく用いられる構築用ベクター及びその利用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物の形質転換方法としてアグロバクテリウムを介した植物の形質転換方法が広く用いられている。巨大なＴｉプラスミドベクターの中に植物細胞に運ぶ外来遺伝子を組み込む方法として幾つかの方法が開発されてきたが、現在では大腸菌とアグロバクテリウムの両者で複製可能なバイナリーベクターを用いる方法が主流である。
【０００３】
また、植物に限定されるものではないが、バクテリオファージ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系においては、インテグラーゼは、ＤＮＡ中のａｔｔ部位を認識し、それらに隣接するＤＮＡ配列を交換することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。そこで、この組換え部位を操作した組換え部位を利用して、目的遺伝子を発現ベクター間で組換える組換えクローニングにかかる発明が開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
【０００４】
ところで、本発明者は、Class II ＥＲＦ（ethylene responsive element binding factor）遺伝子群であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、Ｚｎフィンガータンパク（Zinc Finger Protein）の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質をそれぞれコードする遺伝子及びこれから切り出したＤＮＡと転写因子を含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することを見出している（例えば、特許文献３〜８参照）。そして、これらの遺伝子がコードするタンパク質又はペプチドには（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐなる共通のモチーフ（但し、Ｘは、任意のアミノ酸残基を示す。）が存在することを明らかにしている（例えば、非特許文献２）。
【０００５】
本発明者はまた、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また当該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している（例えば、非特許文献３）。
【０００６】
このような植物の遺伝子の転写を抑制する技術は、いろいろな植物遺伝子について、生体内でその機能を解析することに有用である。具体的には、任意の遺伝子を標的（ターゲット遺伝子）とし、例えば、上記エフェクタープラスミドを植物細胞に導入してターゲット遺伝子の転写を抑制する。これにより、エフェクタープラスミドが導入された植物では、当該ターゲット遺伝子の機能が抑制されることになる。そのため、当該植物に現れる状態（表現型）を観察することで、当該ターゲット遺伝子の機能を解析することができる。
【特許文献１】特表平１１−５０７２３６号公報（平成１１年（１９９９）６月２９日公表）
【特許文献２】特表２００２−５００８６１公報（平成１４年（２００２）１月１５日公表）
【特許文献３】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献５】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献７】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献８】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【非特許文献１】Landy.A.,Current Opinions in Genetics and Devel. 3:699-707(1993)
【非特許文献２】Ohta,M.,Matsui,K.,Hiratsu,K.,Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M.,The Plant Cell, Vol.13,1959-1968,August,2001
【非特許文献３】Hiratsu,K.,Ohta,M.,Matsui,K.,Ohme-Takagi,M.,FEBS Letters 514(2002)351-354
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ここで、公知の植物形質転換用ベクターを用いた場合、用途によっては、十分な効率性を達成できない場合がある。
【０００８】
具体的には、上記植物形質転換用ベクターであるバイナリーベクターとして、一般に利用できるものとしては、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩＧなどが知られている。ところが、これらのバイナリーベクターのサイズは１０ｋｂｐ以上もあり、且つローコピーであるため、目的遺伝子を導入したバイナリーベクターで大腸菌を形質転換した後、確認のために実施されるＤＮＡシーケンスも困難となっており、クローニング効率も十分でない。
【０００９】
また、上述したエフェクタープラスミドを用いた植物遺伝子の転写を抑制する技術でも、エフェクタープラスミドとしてバイナリーベクターを用いる場合は、上記と同様の問題が生じる。即ち、バイナリーベクターに転写因子や転写を抑制するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んで大腸菌で増殖する等の作業は手間のかかるものとなっている。
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、クローニング効率、シーケンス効率を高めた、植物を宿主とする発現ベクターを構築するための構築用ベクター及びその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、２つのａｔｔ部位と、その間にプロモーター及びターミネーターと、目的とする遺伝子を挿入できる挿入部位とを有する発現ベクター構築用ベクターを構築し、このベクターに目的遺伝子をクローニングし、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターとの間で、リコンビナーゼを用いて２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡ断片を迅速に組換えることにより、迅速に植物を宿主とする発現ベクターを得ることができるようにして、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターは、上記の課題を解決するために、植物を宿主とする発現ベクターを構築するために用いられ、２つのａｔｔ部位と、その間にプロモーター及びターミネーターと、当該プロモーターとターミネーターとで挟まれた、２個以上の制限酵素部位を有するDNAセグメントとを有することを特徴とする。
【００１３】
上記発現ベクター構築用ベクターは、ｐＵＣ型プラスミドであることが好ましい。また、上記発現ベクター構築用ベクターにおいては、上記ターミネーターが、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓターミネーター）であることが好ましく、上記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）又はアクチンプロモーターであることが好ましい。
【００１４】
本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターの代表的な一例としては、例えば、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする塩基配列を組み込んでいる構成を挙げることができる。
【００１５】
上記機能性ペプチドとして具体的には、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。
【００１６】
さらに、上記機能性ペプチドのより具体的な例としては、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるぺプチドを挙げることができる。
【００１７】
さらに、上記機能性ペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のペプチドであってもよい。
（ａ）配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１８】
また上記機能性ペプチドとして具体的には、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものをであってもよい。
【００１９】
また上記機能性ペプチドとして具体的には、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２０】
さらに上記機能性ペプチドの具体的な例としては、配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４又は１７７に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドを挙げることができる。
【００２１】
その他、上記機能性ペプチドが、配列番号１６５又は１６８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【００２２】
本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターの利用方法の一つとしては、例えば、上記の発現ベクター構築用ベクターと、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターとを含む植物形質転換用キットを挙げることができる。この植物形質転換用キットにおいては、さらに、上記発現ベクター構築用ベクターおよび植物形質転換用ベクターにおける２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡセグメントを組換えるリコンビナーゼを含むことが好ましい。
【００２３】
あるいは、本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターの他の利用方法としては、例えば、インビトロ（in vitro）において、上記の発現ベクター構築用ベクターに目的とする遺伝子をクローニングしたベクターと、２つのａｔｔ部位を有するベクターとの間で、リコンビナーゼを用いて、それぞれの２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡセグメントを組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築する方法や、この方法により構築された植物を宿主とする発現ベクターを挙げることができる。
【００２４】
上記構成又は方法によれば、植物を宿主とする発現ベクターを構築する場合の、クローニング効率やシーケンス効率を高めることができる。
【００２５】
また、上述したエフェクタープラスミドを用いた植物遺伝子の転写を抑制する技術においても、エフェクタープラスミドの構築におけるクローニング効率やシーケンス効率を高めることができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の２つのａｔｔ部位に挟まれたプロモーターとクローニングサイトとターミネーターとを有する構築用ベクターは、以上のように、目的遺伝子を組み込んでクローニングした後、λファージ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系を用いて迅速に植物形質転換用のベクターに組換えることができるものである。
【００２７】
それゆえ、本発明にかかる構築用ベクターは、クローニング効率、シーケンス効率を高めた構築用ベクターとして役立つともに、植物形質転換用ベクターへの組換えも効率よく行うことが可能である。それゆえ、本発明にかかる構築用ベクターは、植物を宿主とする発現ベクターを構築する過程におけるクローニング効率、シーケンス効率を飛躍的に高めるという効果を奏する。
【００２８】
また、本発明の２つのａｔｔ部位に挟まれたプロモーターと、クローニングサイトと、転写抑制転換ペプチド塩基配列と、ターミネーターとを有する構築用ベクターは、以上のように、特定の標的遺伝子に結合する転写因子等を組み込んでクローニングした後、λファージ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系を用いて迅速に植物形質転換用のベクターと組換えることができるものである。
【００２９】
それゆえ、簡便で効果的に遺伝子の転写を抑制できるとともに、植物を宿主とする発現ベクターへのクローニング効率、速度が飛躍的に高まるので、迅速な植物遺伝子の生体内での機能解析が可能となり、ひいては産業的に有用な遺伝子の探索効率を増大させることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
（１）発現ベクター構築用ベクター
本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターは、植物を宿主とする発現ベクターを構築するために用いられるベクターであって、２つのａｔｔ部位と、その間にプロモーター及びターミネーターと、当該プロモーターとターミネーターとで挟まれたクローニングサイト（１個以上の制限酵素部位を有するDNAセグメント）とを有している。上記発現ベクター構築用ベクターを用いることにより、上記クローニングサイトに組み込んだ目的遺伝子を効率的にクローニングし、植物形質転換用ベクターに迅速に組換えることができる。
【００３２】
本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターは、２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、クローニングサイトという各ＤＮＡセグメント（構成要素）を少なくとも有していればその具体的な構成は特に限定されるものではないが、これら各ＤＮＡセグメントの位置関係は次のようになる。
【００３３】
すなわち、上記各ＤＮＡセグメントのうち、２つのａｔｔ部位は最も外側に存在させ、これらａｔｔ部位の内側に、プロモーター、ターミネーター、クローニングサイトを配置させる。クローニングサイトは、上記のように目的遺伝子を組み込む部位であるので、プロモーターおよびターミネーターの間に配置させる。
【００３４】
したがって、本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターは、一方のａｔｔ部位を基準とすれば、当該ａｔｔ部位、プロモーター、クローニングサイト、ターミネーター、他方のａｔｔ部位の順でこれら各ＤＮＡセグメントが並ぶ構成となっている。以下、基となるベクターと各ＤＮＡセグメントとについて詳細に説明する。なお、以下の説明では、便宜上、発現ベクター構築用ベクターを、単に構築用ベクターと略す。
【００３５】
＜ベースベクターの種類＞
本発明にかかる構築用ベクターは、基となるベクター（以下の説明では、便宜上、ベースベクターと称する）に、上記２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、クローニングサイト等を組み込んで構築すればよい。ここで、上記ベースベクターとしては、目的遺伝子を導入した構築用ベクターで形質転換された宿主細胞を特異的に検出できるものであれば、特に限定されるものではなく、公知のプラスミド、ファージ、コスミド等を好適に用いることができる。
【００３６】
上記ベースベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ｐＹＥＳ２等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；各種レトロウイルス；等が挙げられる。
【００３７】
上記プラスミドの具体的な種類は特に限定されるものではないが、大腸菌（E. coli）内でも増殖できるベクターが好ましく用いられ、さらには比較的サイズの小さいものがより好ましく用いられる。具体的には、例えば、ｐＵＣ型プラスミドを好ましく用いることができる。ｐＵＣ型プラスミドは、サイズが小さく（＜３ｋｂｐ）宿主大腸菌内でのコピー数が多いため、これを用いることにより、クローニング効率及びシーケンスの作業効率を高めることができる。
【００３８】
＜ａｔｔ部位＞
本発明にかかる構築用ベクターに含まれる上記ａｔｔ部位とは、公知のλファージ由来の組換え部位であり、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認識されるａｔｔ配列であればよい。このようなａｔｔ配列としては、例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ配列等を挙げることができる。
【００３９】
上記ａｔｔ配列を用いれば、本発明にかかる構築用ベクターにおいては、λインテグラーゼによりＤＮＡ中のこれら組換え部位（ａｔｔ部位）の配列が認識され、これらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを交換することが可能となる。
【００４０】
上記ａｔｔ部位は、野生型λファージ由来の組換え部位であってもよいし、野生型λファージ由来の組換え部位を操作した組換え部位であってもよい。ここでいう、操作した組換え部位とは、組換え反応の特異性や効率を増強するために公知の遺伝子工学的手法により操作された組換え部位を指し、市販のベクター等に含まれる組換え部位を用いてもよい。
【００４１】
＜プロモーター＞
上記クローニングサイトの上流にあるプロモーターは、植物体内で他の遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）又はアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。
【００４２】
上記各プロモーターを用いれば、本発明にかかる構築用ベクターにより構築される植物形質転換用ベクターに、上記プロモーターを組み込むことができる。そのため、得られる植物形質転換用ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００４３】
＜ターミネーター＞
本発明にかかる構築用ベクターに用いられるターミネーターは、転写集結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよいが、本発明では、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓターミネーター）を好ましく用いることができる。
【００４４】
本発明にかかる構築用ベクターにおいては、このＮｏｓターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。なお、本発明におけるターミネーターの位置としては、後述するように、クローニングサイトの下流とすることが好ましい。
【００４５】
＜クローニングサイト＞
本発明にかかる構築用ベクターは、発現させる目的遺伝子をプロモーターおよびターミネーターの間に組み込むために、制限酵素により認識される部位（説明の便宜上、制限酵素部位と称する）を有している必要がある。特に本発明では、この制限酵素部位としてクローニングサイトが含まれていることが好ましい。本発明で用いられるクローニングサイトは、制限酵素部位を１個以上有する二本鎖オリゴヌクレオチドであれば特に限定されるものではない。
【００４６】
当該クローニングサイトに含まれる制限酵素部位は、目的遺伝子を切り出すために用いられる制限酵素の種類に合致するものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、後述する実施例では、SmaＩ、SalＩ等の制限酵素部位を含んでいる。このクローニングサイトの具体的な種類は特に限定されるものではなく、用途に応じて公知の方法で合成した合成ポリヌクレオチド（言い換えれば「オーダーメード」のクローニングサイト）を用いてもよいが、市販のベクターに含まれているクローニングサイト（言い換えれば「レディーメード」のクローニングサイト）を切り出して用いてもよい。
【００４７】
＜その他のＤＮＡセグメント＞
本発明にかかる構築用ベクターは、上記ａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、クローニングサイト以外のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、目的遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、本発明にかかる構築用ベクターは、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【００４８】
＜構築用ベクターの作製方法、並びに生産方法＞
本発明にかかる構築用ベクターの作製方法については、特に限定されるものではなく、上記ベースベクターに、上述した各ＤＮＡセグメント（２つのａｔｔ部位、プロモーター、ターミネーター、クローニングサイト等）を所定の順序となるように導入すればよい。
【００４９】
上記各ＤＮＡセグメントを導入する際に用いられる試薬、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。また、本発明にかかる構築用ベクターを作製するためのストラテジーについても特に限定されるものではなく、上記各ＤＮＡセグメントを、所定の順序で効率的に配列させることができるようになっていればよい。また、上記作製方法に用いられるホスト（宿主細胞）も特に限定されるものではなく、大腸菌等を用いればよい。
【００５０】
本発明にかかる構築用ベクターの生産方法、すなわち、上記作製方法で作製された構築用ベクターを増殖させる方法についても特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。一般的には、ベースベクターとして大腸菌でも増殖できるベクターを用いた場合には、大腸菌をホストとして当該大腸菌細胞内で増殖させればよい。このときベースベクターや作製された構築用ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。また、大腸菌細胞から増殖した構築用ベクターを回収する方法も特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。
【００５１】
（２）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする塩基配列を組み込んだ構築用ベクター
本発明にかかる構築用ベクターの具体的な用途は特に限定されるものではないが、本実施の形態では、代表的な一例として、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（以下の説明では、便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）をコードする塩基配列を組み込んだ場合を挙げて説明する。該構築用ベクターは、植物遺伝子の転写の抑制に用いられるエフェクタープラスミドを発現ベクターとして構築するために用いられる。
【００５２】
上記エフェクタープラスミドを構築するための構築用ベクターは、上記（１）で説明した構成を有する発現ベクター構築用ベクターにおいて、さらに、転写抑制転換ペプチドをコードする塩基配列（以下の説明では、便宜上、転写抑制転換ペプチド塩基配列と称する）をプロモーターおよびターミネーターの間に組み込んだ構成を有している。換言すれば、上記エフェクタープラスミドを構築するための構築用ベクターは、上記その他のＤＮＡセグメントとして、上記転写抑制転換ペプチド塩基配列を含んでいる構成であると言える。
【００５３】
このように、本発明にかかる構築用ベクターとして、上記転写抑制転換ペプチド塩基配列を組み込んだベクターを用いれば、当該構築用ベクターのクローニングサイトに任意の転写因子又は任意の転写因子のＤＮＡ結合ドメインの遺伝子をin frameで組み込むことによって、その転写抑制転換ペプチドと転写因子等とのキメラ遺伝子を簡単に作製することができる。なお、説明の便宜上、転写因子又は転写因子のＤＮＡ結合ドメインをまとめて上記のように「転写因子等」と表現する。したがって、以降の説明では、「転写因子等」を「転写因子」とおきかえてもよいし、「転写因子のＤＮＡ結合ドメイン」とおきかえてもよい。
【００５４】
上記転写抑制転換ペプチドは、任意の転写因子等と融合させることにより、当該転写因子を転写抑制因子に変換することができる。そのため、特定の標的遺伝子の発現調節領域に結合させる転写因子等をコードする遺伝子を上記構築用ベクターに組み込むことによって、当該標的遺伝子の転写抑制を行う発現ベクターを容易に作製することができる。その結果、この発現ベクターを用いて、植物遺伝子の生体内における機能解析を効率化させることが可能となる。
【００５５】
なお、ここで言う「標的遺伝子」とは、上記転写抑制転換ペプチドと融合させる転写因子等のターゲットとなる任意の遺伝子を指す。すなわち、転写抑制転換ペプチドと転写因子等とのキメラ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、植物に導入する。ここでキメラ遺伝子より生じたキメラタンパク質の転写因子又は転写因子のDNA結合ドメインが、生体中の標的遺伝子の発現調節領域に結合して、標的遺伝子の転写を抑制する。
【００５６】
＜転写抑制転換ペプチド＞
本実施の形態で用いられる上記転写抑制転換ペプチドとは、任意の転写因子を転写抑制因子に転換できるペプチドであればよい。すなわち、上記転写抑制転換ペプチドは、当該転写抑制転換ペプチドを転写因子と融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）により、当該転写因子により支配される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドを指す。このような転写抑制転換ペプチドとしては、具体的には、例えば、本発明者らによって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献３〜８、非特許文献２・３等参照）を挙げることができる。
【００５７】
従来の技術で説明したように、本発明者は、シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質等が実際に遺伝子の転写を抑制することを見出し、これらのタンパク質は、（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐなる共通のモチーフを有することを明らかにした。さらに本発明者は、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。
【００５８】
また、本発明者は、上述したように、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。なお、説明の便宜上、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードする遺伝子をまとめて「転写因子遺伝子」と表現する。したがって、以降の説明では、「転写因子遺伝子」を「転写因子をコードする遺伝子」とおきかえてもよいし、「転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子」とおきかえてもよい。
【００５９】
したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Class II ＥＲＦ（ethylene responsive element binding factor）遺伝子群であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、Ｚｎフィンガータンパク（Zinc Finger Protein）の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等から切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。
【００６０】
上記転写抑制転換ペプチドの具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（ただし、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（ただし、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（ただし、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを表す。）
＜式（１）の転写抑制転換ペプチド＞
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸又は２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６１】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときに容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６２】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６３】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号２０、２１に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号２０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号２１に示すアミノ酸配列である。
【００６４】
＜式（２）の転写抑制転換ペプチド＞
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸又は２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６５】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときに容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６６】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６７】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号２２、２３に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号２２に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号２３に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号８２に示す。
【００６８】
＜式（３）の転写抑制転換ペプチド＞
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００６９】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸又は２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００７０】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときに容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定される物ではない。
【００７１】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときに容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００７２】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号２４〜３２に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２４、２５又は２６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２７、２８又は２９に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３０、３１又は３２に示すアミノ酸配列である。
【００７３】
＜式（４）の転写抑制転換ペプチド＞
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号５、１４、３３に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号５に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１４に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号３３に示すアミノ酸配列である。
【００７４】
特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００７５】
＜転写抑制転換ペプチドのより具体的な例＞
上記転写抑制転換ペプチドの具体的な例として、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７に示される何れかのアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである。
【００７６】
なお、上記配列番号１〜１７に示されるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドが上記転写抑制転換ペプチドであることは、合成したこれらのペプチドを、前述した特許文献３〜８、非特許文献２・３に記載されている方法によって確認している。
【００７７】
さらに、上記配列番号１、４に示されるアミノ酸配列を有する上記オリゴペプチドは、植物における転写因子であるＥＩＮ３遺伝子に結合し、シロイヌナズナ植物体を形質転換させることにより、上記転写抑制転換ペプチドであることを確認している。
【００７８】
同様に、上記配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する上記オリゴペプチドは、植物における転写因子であるＣＵＣ１遺伝子に結合し、シロイヌナズナ植物体を形質転換させさせることにより、上記転写抑制転換ペプチドであることを確認している。
【００７９】
同様に、上記配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する上記オリゴペプチドは、植物における転写因子であるＰＡＰ１遺伝子やＡｔＭＹＢ２３に結合し、シロイヌナズナ植物体を形質転換させることにより、上記転写抑制転換ペプチドであることを確認している。
【００８０】
＜その他の転写抑制転換ペプチド＞
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ａ）又は（ｂ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ａ）配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００８１】
上記の「配列番号１８又は１９に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００８２】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法又はGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて異変が導入される。
【００８３】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００８４】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記式（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００８５】
本発明者は、さらに上記シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質等に存在する（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐなる共通のモチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００８６】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β3は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ2は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００８７】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４又は１７７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることがでる。このうち、配列番号１３８、１４１、１４７、１５３、１７１、１７４又は１７７のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号１１７、１２６、１５６、１５９又は１６２のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号１２９、１３２、１３５、１４４、又は１５０のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号１２０又は１２３のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００８８】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号１６５又は１６８で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００８９】
上記配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４又は１７７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドについては、以下に示すようにして転写抑制転換ペプチドであることを確認している。まず上記各ペプチドをコードするポリヌクレオチド（該ポリヌクレオチドの塩基配列については後述する）を合成し、該ポリヌクレオチドと酵母のＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインのコード領域とを連結し、さらに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないで、エフェクタープラスミドを構築する。またカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域と、ＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列と、さらにカリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターのＴＡＴＡ領域をプロモーター領域に結合した、ルシフェラーゼ遺伝子からなるレポーター遺伝子を構築する。これらのエフェクタープラスミドとレポーター遺伝子とを同時にシロイヌナズナ葉にパーティクルガンを用いて導入し、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の活性を測定することによって、転写抑制転換ペプチドであるか否かを調べることができる。
【００９０】
このときの結果を表１に示す。
【００９１】
【表１】
2005013214.tif 000003
【００９２】
表１によれば、レポーター遺伝子のみを導入したルシフェラーゼ活性に比して、上記各ペプチドをコードするポルヌクレオチドをエフェクタープラスミドとして同時に導入した場合において明らかにルシフェラーゼ活性が低下しており、上記配列番号１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１７１、１７４又は１７７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが転写抑制転換ペプチドであることがわかる。
【００９３】
＜転写抑制転換ペプチド塩基配列＞
上記転写抑制転換ペプチドをコードする塩基配列（転写抑制転換ペプチド塩基配列）は、遺伝暗号に基づき、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいれば特に限定されるものではない。
【００９４】
上記転写抑制転換ペプチド塩基配列としては、例えば配列番号８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９,１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１１９、１２１、１２２、１２４、１２５、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４５、１４６、１４８、１４９、１５１、１５２、１５４、１５５、１５７、１５８、１６０、１６１、１６３、１６４、１６６、１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５、１７６、１７８又は１７９で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００９５】
なお、配列番号１のペプチドは、配列番号８３又は８４の塩基配列にコードされており、配列番号２のペプチドは、配列番号８５又は８６の塩基配列にコードされており、配列番号３のペプチドは、配列番号８７又は８８の塩基配列にコードされており、配列番号４のペプチドは、配列番号８９又は９０の塩基配列にコードされており、配列番号５のペプチドは、配列番号９１又は９２の塩基配列にコードされており、配列番号６のペプチドは、配列番号９３又は９４の塩基配列にコードされており、配列番号７のペプチドは、配列番号９５又は９６の塩基配列にコードされており、配列番号８のペプチドは、配列番号９７又は９８の塩基配列にコードされており、配列番号９のペプチドは、配列番号９９又は１００の塩基配列にコードされており、配列番号１０のペプチドは、配列番号１０１又は１０２の塩基配列にコードされており、配列番号１１のペプチドは、配列番号１０３又は１０４の塩基配列にコードされており、配列番号１２のペプチドは、配列番号１０５又は１０６の塩基配列にコードされており、配列番号１３のペプチドは、配列番号１０７又は１０８の塩基配列にコードされており、配列番号１４のペプチドは、配列番号１０９又は１１０の塩基配列にコードされており、配列番号１５のペプチドは、配列番号１１１又は１１２の塩基配列にコードされており、配列番号１６のペプチドは、配列番号１１３又は１１４の塩基配列にコードされており、配列番号１７のペプチドは、配列番号１１５又は１１６の塩基配列にコードされており、配列番号１１７のペプチドは、配列番号１１８又は１１９の塩基配列にコードされており、配列番号１２０のペプチドは、配列番号１２１又は１２２の塩基配列にコードされており、配列番号１２３のペプチドは、配列番号１２４又は１２５の塩基配列にコードされており、配列番号１２６のペプチドは、配列番号１２７又は１２８の塩基配列にコードされており、配列番号１２９のペプチドは、配列番号１３０又は１３１の塩基配列にコードされており、配列番号１３２のペプチドは、配列番号１３３又は１３４の塩基配列にコードされており、配列番号１３５のペプチドは、配列番号１３６又は１３７の塩基配列にコードされており、配列番号１３８のペプチドは、配列番号１３９又は１４０の塩基配列にコードされており、配列番号１４１のペプチドは、配列番号１４２又は１４３の塩基配列にコードされており、配列番号１４４のペプチドは、配列番号１４５又は１４６の塩基配列にコードされており、配列番号１４７のペプチドは、配列番号１４８又は１４９の塩基配列にコードされており、配列番号１５０のペプチドは、配列番号１５１又は１５２の塩基配列にコードされており、配列番号１５３のペプチドは、配列番号１５４又は１５５の塩基配列にコードされており、配列番号１５６のペプチドは、配列番号１５７又は１５８の塩基配列にコードされており、配列番号１５９のペプチドは、配列番号１６０又は１６１の塩基配列にコードされており、配列番号１６２のペプチドは、配列番号１６３又は１６４の塩基配列にコードされており、配列番号１６５のペプチドは、配列番号１６６又は１６７の塩基配列にコードされており、配列番号１６８のペプチドは、配列番号１６９又は１７０の塩基配列にコードされており、配列番号１７１のペプチドは、配列番号１７２又は１７３の塩基配列にコードされており、配列番号１７４のペプチドは、配列番号１７５又は１７６の塩基配列にコードされており、配列番号１７７のペプチドは、配列番号１７８又は１７９の塩基配列にコードされている。
【００９６】
また必要に応じて、上記転写抑制転換ペプチド塩基配列には、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。また、上記転写抑制転換ペプチドの読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合には、これら読み枠を一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００９７】
上記付加的な塩基配列を含んだ転写抑制転換ペプチド塩基配列の具体例としては、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７に示される塩基配列を挙げることができる。これら塩基配列は、次の表２に示すように配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７に示されるアミノ酸配列に対応するものであり、後述する実施例１・２のクローニングサイトに挿入する場合に用いられるものである。
【００９８】
【表２】
2005013214.tif 000004
【００９９】
表２によれば、配列番号１のペプチドは、配列番号３４又は３５の塩基配列にコードされており、配列番号２のペプチドは、配列番号３６又は３７の塩基配列にコードされており、配列番号３のペプチドは、配列番号３８又は３９の塩基配列にコードされており、配列番号４のペプチドは、配列番号４０又は４１の塩基配列にコードされており、配列番号５のペプチドは、配列番号４２又は４３の塩基配列にコードされており、配列番号６のペプチドは、配列番号４４又は４５の塩基配列にコードされており、配列番号７のペプチドは、配列番号４６又は４７の塩基配列にコードされており、配列番号８のペプチドは、配列番号４８又は４９の塩基配列にコードされており、配列番号９のペプチドは、配列番号５０又は５１の塩基配列にコードされており、配列番号１０のペプチドは、配列番号５２又は５３の塩基配列にコードされており、配列番号１１のペプチドは、配列番号５４又は５５の塩基配列にコードされており、配列番号１２のペプチドは、配列番号５６又は５７の塩基配列にコードされており、配列番号１３のペプチドは、配列番号５８又は５９の塩基配列にコードされており、配列番号１４のペプチドは、配列番号６０又は６１の塩基配列にコードされており、配列番号１５のペプチドは、配列番号６２又は６３の塩基配列にコードされており、配列番号１６のペプチドは、配列番号６４又は６５の塩基配列にコードされており、配列番号１７のペプチドは、配列番号６６又は６７の塩基配列にコードされている。
【０１００】
ここで、実施例１・２のクローニングサイトには、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列の場合を例に挙げると、配列番号３４に示される塩基配列と配列番号３５に示される塩基配列をアニールして２本鎖として挿入する。
【０１０１】
また、配列番号１８、１９に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、例えば、それぞれ配列番号６８、６９に示される塩基配列を挙げることができる。
【０１０２】
＜転写抑制転換ペプチド塩基配列を組み込んだ構築用ベクターの使用方法＞
上記転写抑制転換ペプチド塩基配列を組み込んだ構築用ベクターは、発現ベクターであるエフェクタープラスミドを構築するために用いられる。具体的には、まず、上記転写抑制転換ペプチド塩基配列の上流側に、任意の転写因子遺伝子を組み込む。これにより、上記構築ベクターは、一方のａｔｔ部位を基準とすれば、当該ａｔｔ部位、プロモーター、クローニングサイト、転写因子遺伝子、転写抑制転換ペプチド塩基配列、ターミネーター、他のａｔｔ部位の順でこれら各ＤＮＡセグメントが並ぶ構造となり、転写因子遺伝子および転写抑制転換ペプチド塩基配列によりキメラ遺伝子が形成される。
【０１０３】
上記構築用ベクターにおいては、植物形質転換用ベクターに組換えられるＤＮＡセグメントは、２つのａｔｔ部位に挟まれた部分、即ち、プロモーター、クローニングサイト、キメラ遺伝子（転写因子遺伝子および転写抑制転換ペプチド塩基配列）、ターミネーターの部分となる。それゆえ、上記構築用ベクターから、キメラ遺伝子を迅速に植物形質転換用のベクターに組換えることで、上記エフェクタープラスミドを構築することができる。
【０１０４】
得られたエフェクタープラスミドを用いて形質転換した形質転換体においては、上記キメラ遺伝子に対応するキメラタンパク質が産生される。このキメラタンパク質においては、上記転写因子は上記転写抑制転換ペプチドにより転写抑制因子に変換されるため、この転写因子の標的遺伝子の転写が抑制され、当該標的遺伝子の発現は起こらない。
【０１０５】
このように、上記転写抑制転換ペプチドは、任意の転写因子を転写抑制因子に変換することができる。そのため、特定の標的遺伝子の転写を支配している転写因子等を組み込むことによって、その標的遺伝子の転写抑制を行うことができる。その結果、植物体に変化が見られれば、それから標的遺伝子の機能を解析することができる。
【０１０６】
上記転写抑制転換ペプチドは、さらに機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の発現を抑制する能力を有している。それゆえ、本発明にかかる構築用ベクターに転写抑制転換ペプチド塩基配列が組み込まれていれば、重複する転写因子活性の機能の解析にも利用することができる。
【０１０７】
例えば、芽生えの頂芽の形成を制御する転写因子として、ＣＵＣ１タンパク質およびＣＵＣ２タンパク質が知られている。これらタンパク質をコードするＣＵＣ１遺伝子およびＣＵＣ２遺伝子は、両方が変異を持つ場合にのみ、その植物体の子葉がカップ状の形態を示し、かつ頂芽の分裂組織の形成が行われないことが知られている。
【０１０８】
これら重複した機能を持つ遺伝子の一方のみ、例えばＣＵＣ１遺伝子に、上記転写抑制転換ペプチドを結合させたキメラ遺伝子を、植物体内で発現させる。この場合でも、発現したキメラタンパク質は、ＣＵＣ１タンパク質だけでなく、ＣＵＣ２タンパク質の転写活性をも抑制する。
【０１０９】
植物は上記の例のように、機能的に重複した複数の転写因子を持つ場合が多い。ここで、上記転写抑制転換ペプチドを用いて機能変換した転写抑制因子は、優性形質（ドミナント）で作用する。そのため、本発明を利用することで、これまで一遺伝子のノックアウトでは明らかにされなかった転写因子の機能解析が可能となる。また、小麦等のように複２倍体ゲノムを持つ植物にも適応することもできる。
【０１１０】
上述した用途は、基本的に、転写抑制による植物の機能の解析であり、それゆえ、本発明を研究用素材に利用できる用途となっているが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、農作物の品種改良等の用途にも用いることができる。
【０１１１】
具体的には、花卉において、色素代謝系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することによって、これまでには得られなかった色違いの花弁を有する花を創作することを可能にすることができる。また、穀物や野菜等において、アレルゲンとなるタンパク質を抑制することによって、アレルゲンの少ない食物の生産を可能にする。さらに、材木において、リグニン合成の遺伝子の発現を抑制することによって、リグニン含量の少ない木を作製し、これにより高品質のパルプを生産することも可能である。
【０１１２】
（３）本発明の利用方法
＜植物形質転換用キット＞
本発明の具体的な利用方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、本発明にかかる構築用ベクターと、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターとを含む植物形質転換用キットを挙げることができる。この植物形質転換用キットには、さらに、上記構築用ベクターの２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡセグメントと植物形質転換用ベクターの２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡセグメントとを組換えるリコンビナーゼを含んでいてもよい。
【０１１３】
上記植物形質転換用ベクターとしては、２つのａｔｔ部位と、選択マーカーとを有する植物形質転換用のベクターであれば特に限定されるものではなく、公知のものを用いてもよい。中でも、バイナリーベクターとして機能できるものであることが好ましく、例えば、ｐＢＩ系のベクターであるｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１などを好適に使用することができる。
【０１１４】
上記植物形質転換用ベクターが有するａｔｔ部位とは、公知のλファージ由来の組換え部位であり、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認識されるａｔｔ配列であればよい。具体的には、前記（１）の＜ａｔｔ部位＞で説明したような各配列を挙げることができる。このａｔｔ配列を用いれば、上記植物形質転換用ベクターにおいて、λインテグラーゼによりＤＮＡ中のこれら組換え部位（ａｔｔ部位）の配列が認識され、これらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを交換することが可能となる。
【０１１５】
上記ａｔｔ部位は、野生型λファージ由来の組換え部位であってもよいし、野生型λファージ由来の組換え部位を操作した組換え部位であってもよい。ここでいう、操作した組換え部位とは、組換え反応の特異性や効率を増強するために公知の遺伝子工学的手法により操作された組換え部位を指し、市販のベクター等に含まれる組換え部位を用いてもよい。
【０１１６】
上記植物形質転換用ベクターが有する選択マーカーとしては、特に限定されるものではないが、好ましくは、各種の抗生物質耐性遺伝子を挙げることができる。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＲＴ）などを挙げることができる。これらのマーカーは、必要に応じて、上記のベクター中に公知の方法により導入することができる。ｐＢＩ系の基本ベクタープラスミドは、導入された植物での選択マーカーとしてカナマイシン遺伝子のみを有するが、これに代えてハイグロマイシン耐性遺伝子を導入してもよい。イネにおいては、カナマイシンは、選択マーカーとしては余りよく機能しないことがある。
【０１１７】
上記植物形質転換用ベクターには、さらに、形質転換植物における発現部位を可視化してモニターするための遺伝子を導入することもできる。このような遺伝子の一例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を挙げることができる。しかし、こうしたマーカーが多数ベクター中に入ることによって、目的遺伝子の発現が影響を受ける可能性もあるので、必ずしも入っていればよいとは限らない。
【０１１８】
上記リコンビナーゼは、構築用ベクターと植物形質転換用ベクターとの間において、２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡ断片の組換えを促進する酵素であれば特に限定されるものではなく、市販のリコンビナーゼを用いることができる。
【０１１９】
＜植物を宿主とする発現ベクターおよびその構築方法＞
本発明には、上述した構築用ベクターを用いて植物を宿主とする発現ベクターを構築する方法と、この方法により得られる発現ベクターも含まれる。
【０１２０】
上記構築方法は、上述したように、インビトロ（in vitro）において、上記構築用ベクターに目的遺伝子をクローニングしたベクターと、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターとの間で、リコンビナーゼを用いて、それぞれの２つのａｔｔ部位に挟まれたＤＮＡセグメントを組換える方法であればよく、その詳細な条件等については特に限定されるものではない。
【０１２１】
上記目的遺伝子は、植物を宿主とする発現ベクターを用いて発現させたいタンパク質をコードする遺伝子であればよく、その具体的な種類は特に限定されるものではない。このようなタンパク質としては、例えば、薬理活性を有するタンパク質、医薬品又は工業用材料などとして有用なタンパク質を製造するのに必要な酵素などが挙げられる。
【０１２２】
上記方法により得られる発現ベクターは、植物用のプロモーターおよびターミネーターと、その間に配置される目的遺伝子とを有しており、植物を宿主として上記目的遺伝子にコードされているタンパク質を発現するものである。代表的な一例としては、前記（２）で説明したように、目的遺伝子として、転写抑制転換ペプチドおよび転写因子遺伝子とを連結させたキメラ遺伝子を組み込んだベクターを挙げることができる。このような発現ベクターを用いた植物の形質転換方法については特に限定されるものではなく、例えば、アグロバクテリウムを用いた減圧浸潤法などの公知の方法により行うことができる。
【０１２３】
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。それゆえ、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１２４】
以下、実施例及び図１ないし図５に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２５】
〔実施例１：本発明にかかる構築用ベクターの構築〕
本発明の構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
【０１２６】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号７２）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号７３）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号７４）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号７５）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１２７】
（２）クローンテック社製（Clontech社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１２８】
（３）配列番号７６，７７の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号７６，７７の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩが含まれる。
【０１２９】
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１３０】
〔実施例２：本発明にかかる構築用ベクターの構築〕
本発明の構築用ベクターであるｐＡｃｔＧを、図２に示すように、以下の工程（１）〜（３）のとおりに構築した。
【０１３１】
（１）上記ベクターｐ３５ＳＧを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化し、電気泳動にてＣａＭＶ３５Ｓ領域を除去し、ａｔｔＬ１断片を回収する。
【０１３２】
（２）東京大学より譲渡されたプラスミドｐＡｃｔＦ１／ＴＡ（N.Sentoku, Y.Sato, M.Matsuoka, Develop.Biol.220,358-364(2000))を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩで消化し、電気泳動にてＡｃｔｉｎプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を回収した。
【０１３３】
（３）得られたＤＮＡ断片を、ＣａＭＶ３５Ｓを除去した上記ｐ３５ＳＧプラスミド断片のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位に挿入した。これをさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化し、回収しておいたａｔｔＬ１断片を挿入し、ベクターｐＡｃｔＧを完成させた。
【０１３４】
〔実施例３：本発明にかかる転写抑制転換ペプチド塩基配列を組み込んだ構築用ベクターの構築〕
本発明の転写抑制転換ペプチド塩基配列を組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧとｐＡｃｔＳＲＤＸＧとを、図３及び図４に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
【０１３５】
（１）転写抑制転換ペプチド（ＳＲＤＸ（配列番号１７））をコードするＤＮＡ配列（配列番号７８，７９）を合成しアニーリングして、２本鎖ＤＮＡとする。
【０１３６】
（２）ｐ３５ＳＧ、ｐＡｃｔＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧ、ｐＡｃｔＳＲＤＸＧを構築した。
【０１３７】
〔実施例４：本発明の構築用ベクターを用いて植物の形質転換を行った例〕
シロイヌナズナ由来の転写因子ＥＲＦ１タンパク質（配列番号７０）をコードする遺伝子（配列番号７１）を、構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧに組み込み、植物形質転換用ベクターに組換え、植物を形質転換する実施例を以下に示す。シロイヌナズナの形質転換は、Transfomation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration (http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。
【０１３８】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＣＫＫ、ｐＢＩＧＣＫＨを、図５に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
【０１３９】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990)とクローンテック社（Clonteck社、ＵＳＡ）のｐＢＩ１０１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除く。
【０１４０】
（２）インビトロジェン社から購入したGateway(登録商標）ベクターコンバージョンシステムのFragmentＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入する。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、FragmentＡ断片を回収する。
【０１４１】
（３）回収したFragmentＡ断片を上記のｐＢＩ１０１，ｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＣＫＫ、ｐＢＩＧＣＫＨを完成させた。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１４２】
＜構築用ベクターへの目的遺伝子の組み込み＞
本発明の構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＥＲＦ１タンパク質（配列番号７０）をコードする遺伝子（配列番号７１）を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
【０１４３】
（１）シロイヌナズナ由来のＥＲＦ１遺伝子のアミノ酸コード領域を以下のプライマー１、２を用いてＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＥＲＦ１−Ｆ）（配列番号８０）
プライマー２（ＥＲＦ１−Ｒ stopless）（配列番号８１）
（２）得られたＥＲＦ１コード領域のＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１４４】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
【０１４５】
＜植物を宿主とする発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway（登録商標）ＬＲ clonase（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
【０１４６】
（１）まず、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧ１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ buffer ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ TrisCl pH7.0、１ｍＭ EDTA）５．５μＬを加えた。
【０１４７】
（２）この溶液にＬＲ clonase４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、proteinaseＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１４８】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１４９】
＜植物の形質転換＞
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物を得た。
【０１５０】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＥＲＦ１ＳＲＤＸを、土壌細菌（（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell  １９８６)）株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Infiltration medium、下表３）に懸濁した。
【０１５１】
【表３】
2005013214.tif 000005
【０１５２】
（２）この溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ、０．０２％Triton Ｘ-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表４）に蒔種した。
【０１５３】
【表４】
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【０１５４】
（３）蒔種した約５０００粒の種子から平均して２０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物からＤＮＡを調製し、ＰＣＲを用いてＥＲＦ１ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
以上説示したごとく、２つのａｔｔ部位に挟まれたプロモーターとクローニングサイトとターミネーターとを有する本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターは、目的遺伝子を組み込んでクローニングした後、λファージ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系を用いて迅速に植物形質転換用のベクターに組換えることができるものである。
【０１５６】
それゆえ、本発明にかかる構築用ベクターは、クローニング効率、シーケンス効率を高めた構築用ベクターとして役立つともに、植物形質転換用ベクターへの組換えも効率よく行うことが可能である。よって本発明にかかる構築用ベクターは、試験研究用途だけでなく、生理活性タンパク質（ペプチド）、有用酵素等の有用タンパク質の生産に利用することができ、医薬品産業、食品産業等に利用が可能である。
【０１５７】
さらに２つのａｔｔ部位に挟まれたプロモーターと、クローニングサイトと、転写抑制転換ペプチド塩基配列と、ターミネーターとを有する本発明にかかる発現ベクター構築用ベクターは、以上のように、特定の標的遺伝子に結合する転写因子等を組み込んでクローニングした後、λファージ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系を用いて迅速に植物形質転換用のベクターと組換えることができるものである。
【０１５８】
それゆえ、簡便で効果的に遺伝子の転写を抑制できるとともに、植物を宿主とする発現ベクターへのクローニング効率、速度が飛躍的に高まるので、迅速な植物遺伝子の生体内での機能解析が可能となり、ひいては産業的に有用な遺伝子の探索効率を増大させることができる。また、かかる遺伝子の転写抑制を利用すれば、農作物の品種改良等を行なうことができる。例えば、花卉において、色素代謝系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することによって、これまでには得られなかった色違いの花弁を有する花を創作することを可能にすることができる。また、穀物や野菜等において、アレルゲンとなるタンパク質を抑制することによって、アレルゲンの少ない食物の生産を可能にする。さらに、材木において、リグニン合成の遺伝子の発現を抑制することによって、リグニン含量の少ない木を作製し、これにより高品質のパルプを生産することも可能である。よって、発現ベクター構築用ベクターは農業にも利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】実施例１に記載するベクターｐ３５ＳＧの構築方法を示す工程図である。
【図２】実施例２に記載するベクターｐＡｃｔＧの構築方法を示す工程図である。
【図３】実施例３に記載するベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧの構築方法を示す工程図である。
【図４】実施例３に記載するベクターｐＡｃｔＳＲＤＸＧの構築方法を示す工程図である。
【図５】ベクターｐＢＩＣＫＫ及びｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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