(57)【要約】    【課題】  生体内で酸化傷害を受けたタンパク質の検出、定量、及び酸化傷害部位の確定に効果的であり、かつ製造が容易で、価格が安い、酸化傷害タンパク質解析用タグ、及び該解析用タグを用いる酸化傷害タンパク質の解析方法を提供する。    【解決手段】  親和性ペプチドタグ、及び反応基Zを有する少なくとも１つの残基Z、かつ下記式(1)で表される、酸化傷害タンパク質解析用タグ：      (His)l-(X-His)m-(X)n-(Y)p-Z      (1)（式中、Xはヒスチジンを除く任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体であり、Yはリンカーであり、lは０又は１、ｍは４〜１００の整数、ｎは０、又は１、かつpは０、又は１である）。    【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親和性ペプチドタグ、リンカーY、及び反応基を有する少なくとも１つの残基Zからなる、酸化傷害タンパク質解析用タグあって、該親和性ペプチドタグが少なくとも３個の(X-His)単位を有し、かつXは任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体である、前記解析用タグ。
【請求項２】
該親和性ペプチドタグが少なくとも４個の(X-His)単位を有する、請求項１記載の解析用タグ。
【請求項３】
親和性ペプチドタグ、及び反応基を有する少なくとも１つの残基Zからなる酸化傷害タンパク質解析用タグであって、該親和性ペプチドタグが少なくとも３個の(X-His)単位を有し、かつXは任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体である、前記解析用タグ。
【請求項４】
該親和性ペプチドタグが少なくとも４個の(X-His)単位を有する、請求項３記載の解析用タグ。
【請求項５】
親和性ペプチドタグ、及び反応基Zを有する少なくとも１つの残基Z、かつ下記式(1)で表される、酸化傷害タンパク質解析用タグ：
(His)l-(X-His)m-(X)n-(Y)p-Z      (1)
（式中、Xはヒスチジンを除く任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体であり、Yはリンカーであり、lは０又は１、ｍは４〜１００の整数、ｎは０、又は１、かつpは０、又は１である）。
【請求項６】
前記Xが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群から選ばれたアミノ酸である、請求項５記載の解析用タグ。
【請求項７】
Xが、システイン、及びトリプトファンからなる群から選ばれたアミノ酸である、請求項５記載の解析用タグ。
【請求項８】
式(1)中、ｍが５〜２５の整数である、請求項５記載の解析用タグ。
【請求項９】
式(1)中、ｍが６〜１５の整数である、請求項５記載の解析用タグ。
【請求項１０】
リンカーYが、アミノ酸、及び／又はアミノ酸誘導体３〜３０個を含むペプチド配列である、請求項５記載の解析用タグ。
【請求項１１】
リンカーYが、標識分子を含む請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ。
【請求項１２】
残基Zの反応基がヒドラジノ基、又はヒドラジノカルボニル基である、請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ。
【請求項１３】
下記式(2)で表される請求項５記載の解析用タグ：
HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-NH(CH(CH3))CO(NH(NH2))      式(2)。
【請求項１４】
下記式(3)で表される請求項５記載の解析用タグ。：
HGHAHGHGHAHG-EGAGA-NH(CH(CH3))CO(NH(NH2))              式(3)。
【請求項１５】
さらに親和性タグ、及び／又はリンカーYが、蛍光物質、安定同位体元素、又は放射性同位元素で標識されていることを特徴とする、請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ。
【請求項１６】
請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグを含む、酸化傷害タンパク質解析用キット。
【請求項１７】
請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグを含む、酸化傷害タンパク質精製用キット。
【請求項１８】
請求項１、３又は５のいずれか１項記載の酸化傷害タンパク質解析用タグを、試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、次いで、該担体から該酸化傷害タンパク質、又は酸化傷害タンパク質と該解析用タグとの複合体を回収することを特徴とする、酸化傷害タンパク質の検出方法。
【請求項１９】
さらにプロテアーゼにより、該解析用タグのリンカーを切断する工程を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグを、試料と混合し、該混合物を、該解析用の親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、次いで、該担体から酸化傷害タンパク質、又は該解析用タグと酸化傷害タンパク質との複合体を回収することを特徴とする、酸化傷害タンパク質の精製方法。
【請求項２１】
請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ１、及び該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２を、試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により分子量の相違によるダブレットピークを検出することを含む、酸化傷害タンパク質の解析方法。
【請求項２２】
請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ１と標準試料とを反応させ、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法。
【請求項２３】
解析用タグ１と該解析対象の試料とを反応させ、かつ解析用タグ２と該標準試料とを反応させる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
解析用タグ１と解析用タグ２とを等モル量用いる、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
該標準試料が、健常人の組織から得た試料であり、かつ該解析対象の試料が疾患を有する人から得た試料である、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
請求項１、３又は５のいずれか１項記載の解析用タグ１、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２、及び該解析用タグ１を安定同位体標識し、かつ解析用タグ２と分子量が異なる解析用タグ３とを準備し、解析用タグ１及び２と標準試料とを反応させ、次いで解析用タグ１及び３と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から、解析用タグ１〜３と酸化傷害タンパク質との複合体、又は解析用タグ１〜３のリンカーYと酸化傷害タンパク質との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法。
【請求項２７】
解析用タグ１、２及び３を等モル量用いる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該標準試料が、健常人から得た試料であり、かつ該解析対象の試料が疾患を有する人から得た試料である、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内で酸化傷害を受けたタンパク質の検出、定量、精製、及び酸化傷害部位の確定に用いる酸化傷害タンパク質解析用タグ、及び該タグを用いる解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本人の死因のトップを占めるガン、心臓病、脳卒中、糖尿病、及び老人性痴呆症などの疾病に、活性酸素が何らかの形で関与しているといわれている。特に、タンパク質のアルギニン残基、リジン残基、プロリン残基、及びスレオニン残基が活性酸素により酸化傷害を受け、様々な疾病を引き起こす原因となることが報告されているが、その分子的機序は明らかにされていない部分が多い。その理由は、酸化傷害タンパク質を検出し、定量、及び酸化傷害部位の確定を行うための有効な方法がないためである。
【０００３】
従来、生体組織・細胞中に存在する微量のタンパク質の収集は、標的タンパク質をビオチン化し、そのビオチンとアビジンとの親和性を利用する方法により行われてきた (特許文献1、及び特許文献2)。しかし、タンパク質の可溶化剤、変性剤などが存在すると、ビオチンとアビジンとの親和性がなくなるため、該方法は酸化傷害タンパク質の解析には使用できないという問題があった。また、この方法は未反応ビオチンの除去が困難であり、標的タンパク質との分離が難しいという問題もあった。
【０００４】
また、従来標的タンパク質の検出、同定、又は定量は、ヒスチジンタグ (His-Tag) を利用する方法により行われてきた。例えば、安定同位体で標識されたヒスチジンタグに、チオール基と結合する2,2-ジピリジルジスルフィド基を導入することにより、システインを含むペプチドの検出、同定、及び定量する方法である (非特許文献1)。また、該ヒスチジンタグは、疾病組織と健常組織とに含まれるシステイン残基を網羅的に定量比較するためにも使用できる。しかし、細胞外でヒスチジンタグを合成する場合、HisとHisとをペプチド結合させる反応の効率が非常に低く、その製造が困難、かつコストが高いという問題があった。
【０００５】
このように、前記方法により、生体組織・細胞中のタンパク質を検出、定量、又は同定することができるが、タグの製造や使用対象には制限があり、酸化傷害タンパク質を検出、精製、及び酸化傷害部位の確定を行う有効な方法にはなり得なかった。このため、酸化傷害タンパク質を効果的に解析ができる方法、及び機能性タグが求められていた。
【特許文献１】特表平０９−５０５７９９
【特許文献２】特開平０９−５４０９４
【非特許文献１】Josper V. Olsenらの論文, Mol. Cell Proteomics. 2004, Jan;3(1):82-92. Epub, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生体内で酸化傷害を受けたタンパク質の検出、精製、定量、及び酸化傷害部位の確定に効果的であり、かつ製造が容易で、価格が安い、酸化傷害タンパク質解析用タグ (TOP; Tags for Oxidized Proteins)、及び該タグを用いる酸化傷害タンパク質の解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは研究を行った。その結果、ヒスチジンとアミノ酸とを組み合わせて形成したタグが、キレート化されたNi2+などの金属イオンと高い親和性を有し、従来知られているヒスチジンタグと同様、親和性ペプチドタグとして、用いることができることを見出した。そして、タンパク質中の酸化傷害部位と結合する反応基と、酸化傷害タンパク質を精製・濃縮するための親和性ペプチドタグとをリンカーでつないだ酸化傷害タンパク質解析用タグ (TOP; Tags for Oxidized Proteins) を用いることにより、酸化傷害タンパク質の検出、精製、定量、及び酸化傷害部位の確定が効果的に行えるという知見を得た。本発明は、かかる知見に基づきなされたものである。
【０００８】
したがって、本発明は、親和性ペプチドタグ、リンカー、及び反応基を有する少なくとも１つの残基Zからなる酸化傷害タンパク質解析用タグであって、該親和性ペプチドが少なくとも３個、好ましくは４又は５個以上の(X-His)単位を有し、かつXは任意のアミノ酸、またはアミノ酸誘導体である酸化傷害タンパク質解析用タグを提供する。
【０００９】
また、本発明は、親和性ペプチドタグ、及び反応基を有する少なくとも１つの残基Zを含み、かつ下記式(1)で表される酸化傷害タンパク質解析用タグを提供する。
(His)l-(X-His)m-(X)n-(Y)p-Z      (1)
(式中、Xはヒスチジンをのぞく任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体であり、Yはリンカーであり、lは0又は1、mは4〜100の整数、nは0、又は1かつpは0、または1である。)
さらに、本発明は、前記解析用タグを含む、酸化傷害タンパク質解析用キット、及び酸化傷害タンパク質精製用キットを含む。
【００１０】
さらに、本発明は、前記解析用タグを、酸化傷害タンパク質を含む試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属イオンを保持する担体と接触させ、次いで、該担体から該酸化傷害タンパク質、または酸化傷害タンパク質と該解析用タグとの複合体を回収することを特徴とする、酸化傷害タンパク質の検出方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、親和性タグ、又はリンカーYに蛍光試薬、RI試薬などの検出部位を付加した解析用タグを、酸化傷害タンパク質を含む試料と混合し、該混合物を、該親和性ペプチドタグと結合する金属イオンを保持する担体と接触させ、次いで、該担体から該解析用タグを回収することにより、試料中に存在する微量酸化傷害タンパク質を濃縮し、高感度に検出する方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、前記解析用タグを、酸化傷害タンパク質を含む試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、次いで、該担体から該酸化傷害タンパク質、又は酸化傷害タンパク質と該解析用タグとの複合体を回収することを特徴とする、酸化傷害タンパク質の精製方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、前記解析用タグを、酸化傷害タンパク質を含む試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、次いで、該担体から酸化傷害タンパク質と結合した該解析用タグを回収し、さらに抗体を用いた、ウエスタンブロッティング法と組み合わせた、二段タンパク質精製方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、酸化傷害タンパク質の解析方法であって、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）、及び該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２とを、解析対象の試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により分子量の相違によるダブレットピークを検出することを含む、該酸化傷害タンパク質の解析方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、酸化傷害タンパク質の解析方法であって、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）と標準試料とを反応させ、次いで該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、酸化傷害タンパク質の解析方法であって、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２、及び該解析用タグ１を安定同位体標識し、かつ解析用タグ２と分子量が異なる解析用タグ３とを準備し、解析用タグ１及び２と標準試料とを反応させ、次いで解析用タグ１及び３と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から、解析用タグ１〜３と酸化傷害タンパク質との複合体、又は解析用タグ１〜３のリンカーYと酸化傷害タンパク質との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法を提供する。
【００１７】
本明細書において「親和性ペプチドタグ」とは、キレート化した遷移金属イオン、特にNi2+ に親和性を有するペプチドのタグをいう。本明細書において「リンカーY」とは、親和性ペプチドタグと反応基をつなぐ部分をいい、前記親和性ペプチドタグのN末端、又はC末端のいずれにか結合し、かつ反応基を導入する化合物の非反応基と結合することができるものをいう。また、本明細書の「反応基を有する残基Z」とは、酸化傷害タンパク質と選択的に結合する官能基、酸化傷害タンパク質と選択的に結合できる基を有する原子団、又は酸化傷害タンパク質と選択的に結合できる分子をいう。なお、本発明の解析用タグにおいては、「リンカーY」及び／又は「残基Z」は、親和性ペプチドタグのN末端、又はC末端のいずれに配置されていてもよい。
【００１８】
本発明の標的物質である酸化傷害タンパク質とは、酸化傷害部位を含むタンパク質、及び酸化傷害部位を含むタンパク質の断片ペプチドをいう。また、残基Zの反応基とは、酸化傷害部位と結合する基、又は原子団のことをいう。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の酸化傷害タンパク質解析用タグの利点を挙げると、人工的に大量生産が可能であり、プロテアーゼ消化部位、安定同位体、蛍光試薬、及びRI試薬の導入が容易であるという利点がある。
また、本発明の解析用タグの利点を挙げると、生体内で酸化傷害を受けたタンパク質のみを分取することができ、酸化傷害部位を特定することができ、逆相カラムへの親和性が弱いため、未反応の解析用タグの除去が容易であるという利点がある。
さらに、本発明の解析用タグの利点を挙げると、変性剤存在下で反応させることができるため、反応中の消化酵素による影響を受けず、膜タンパクなどの不溶性酸化傷害タンパク質にも適応できるという利点がある。
さらに、該解析用タグの利点を挙げると、市販の安定同位体標識F-MOC誘導体アミノ酸を使って任意の安定同位体標識が可能であり、疾病にともなう酸化傷害タンパク質を質量分析計で直接定量分析を行うことができるという利点がある。
したがって、本発明の解析用タグを使用することにより、酸化傷害を受けたタンパク質の検出、精製、定量、及び酸化傷害部位の確定を容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に本発明を、その実施形態に基づき詳細に説明する。
本発明の酸化傷害タンパク質解析用タグは、親和性ペプチドタグ、及びタンパク質の酸化傷害部位と結合する反応基を有する少なくとも１つの残基Zを有し、かつ下記式(1)で表される酸化傷害タンパク質解析用タグである。
(His)l-(X-His)m-(X)n-(Y)p-Z      (1)
式中、Xはヒスチジンをのぞく任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体であり、Yはリンカーであり、lは0、又は1、nは0、又は1、かつpは0、又は1である。また式中、mは4〜100、好ましくは５〜２５、さらに好ましくは６〜１５の整数である。また、式中(1)は、該リンカーY、及び残基Z、該親和性ペプチドタグのC末端、又はN末端のいずれかに結合していることを示している。なお、式中の「His」は、ヒスチジン、又はキレート化したNi2+などのイオンに親和性を示すヒスチジンの誘導体を示す。また、残基Zは、酸化傷害タンパク質と結合する反応基そのものでもよい。
【００２１】
本発明の標的物質は、酸化傷害部位を有するタンパク質、及び該タンパク質の断片ペプチドである。本発明の解析用タグは、生体中に存在する酸化傷害タンパク質を標的物質として、検出、精製、定量、及び酸化傷害部位の確定する場合、優れた効果を発揮する。また、酸化傷害タンパク質とは、活性酸素などにより、酸化傷害部位を有するタンパク質であり、例えば、アルギニン残基、リジン残基、プロリン残基、及びスレオニン残基がアルデヒド化したものである。
【００２２】
本発明の親和性ペプチドタグとは、式(1)の(His)l-(X-His)m-(X)nで表されるペプチド断片をいう。式中、Xは、任意のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体である。該アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、及び非天然のアミノ酸の双方を含み、本発明の親和性ペプチドタグで利用できるものであれば特に制限はない。
【００２３】
該アミノ酸の例を挙げると、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンなどがある。本発明の親和性ペプチドタグと、キレート化Ni2+イオンと親和性を強くする場合、Xとして該イオンと親和性を有するシステイン、又はトリプトファンを用いるのが好ましい。また、精製に用いるアフィニティーカラムの性質に応じて、非極性側アミノ酸、極性無電荷側アミノ酸、又は極性電荷アミノ酸からXを選択することにより、高い純度で酸化傷害タンパク質を精製することができる。
【００２４】
また、該アミノ酸誘導体には、これらに限定されるものではないが、前記アミノ酸に対応する下記化合物がある。式中、Ｒは各アミノ酸固有の基である。
RCH(NH2)CO-［アシル基］ 
RCH(NH2)CO21−［アニオン］ 
RCH(NH2)CONH2［アミド］ 
RCH(NH2)CH2OH［アルコール］ 
RCH(NH2)CHO［アルデヒド］ 
RCH(CO2H)NH-［N-置換基］
これら誘導体のうち、ヒスチジンの誘導体の例を挙げると、ヒスチジル、ヒスチジナート、ヒスチジンアミド、ヒスチジノール、ヒスチジナール及びN-ヒスチジノなどがあり、アラニンの誘導体には、アラニル、アラニナート、アラニンアミド、アラニノール、アラニナール及びアラニノがあり、また、グリシンの誘導体には、グリシル、グリシナート、グリシンアミド、グリシノール、グリシナール、及びグリシノがある。
【００２５】
なお、本発明の解析用タグが酸化傷害タンパク質を含む試料に多量に存在することで、酸化傷害部位と該解析用タグとの反応効率が向上する。したがって、未反応の解析用タグを容易に除去することは、非常に大きな利点である。この特性は、親和性ペプチドタグの特性に依存している。(His-X)mのXの選択によりこうした特性を持たせることが可能である。
【００２６】
本発明のリンカーYは、親和性ペプチドタグと反応基を有する残基Zを連結させるものであれば、特に制限はされない。例えば、親和性ペプチドタグのC末端、又はN末端に結合し、かつ残基Zの反応基以外の基に結合する分子である。本発明で、好ましいリンカーは、アミノ酸、またはアミノ酸誘導体３〜３０個、好ましくは３〜１５個、さらに好ましくは３〜９個を含むペプチドである。また、単体のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体を用いることもできる。該リンカーで用いるアミノ酸、及びアミノ酸誘導体は、前記親和性ペプチドで用いるものと同じでよい。
【００２７】
また、ペプチド以外のリンカーYの例を挙げると、単独のアミノ酸、又はアミノ酸誘導体、脂肪酸、又は脂肪酸エステルなどがあり、必要に応じてスペーサーとして、長炭素鎖を有するリンカーYを、本発明の解析用タグに導入できる。さらに、本発明では、リンカーYを付与せず、親和性ペプチドタグに反応基を有する残基Zを直接付加してもよい。この場合、親和性ペプチドタグのC又はN末端に前記アミノ酸誘導体を付加することにより、容易に残基Zを形成する化合物と結合させることができる。
【００２８】
また、本発明では、該リンカーYに標識分子を付加してもよい。該標識分子を導入することで、標的物質を高感度、かつ容易に検出することができる。該標識分子として、蛍光物質、安定同位体、及び放射性同位体を用いることができる。本発明で用いる蛍光物質は特に制限されないが、例を挙げると、フルオレセイン、ローダミン、又はロドールなどのキサンテン色素、シアニン色素、クマリン色素、ポルフィリン色素、及びこれらの複合色素などがある。また、該標識分子として同位体元素、重水素、三重水素、15N、13C又は14Ｃの炭素同位体を挙げることができる。例えば、重水素などの同位体元素を含むアミノ酸を付加することで、該リンカーＹに標識分子を容易に導入することができる。また、必要に応じて、親和性ペプチドタグ部分をこれらの標識分子で標識してもよい。
【００２９】
また、リンカーYとして、アミノ酸、又はペプチドを用いることにより、酸化傷害タンパク質と親和性タグとを切り離すためのプロテアーゼ認識部位を容易に導入することができる。該認識部位を認識するプロテアーゼにより、酸化傷害タンパク質と結合した解析用タグを、親和性ペプチドタグと酸化傷害タンパク質とに分け、該タンパク質を濃縮することができる。本発明で用いるプロテアーゼは、リンカーＹ、又はリンカーＹと反応基Ｚ間のアミノ酸のペプチド結合を選択的に切断するものであれば特に制限されない。
【００３０】
本発明で用いるプロテアーゼの例を挙げると、キモトリプシンA（芳香族アミノ酸残基のC端側）、エンドプロテイナーゼ Glu-C (プロテアーゼV8)、エンドプロテイナーゼ Lys-C、ファクターXa（Arg残基のC端側）、プラスミン（Arg, Lys残基のC端側）、スロンビン（Arg残基のC端側）及びトリプシン（Arg, Lys残基のC端側）などのセリンプロテアーゼ、セルモリシン（疎水性L-アミノ酸（特にIle, Leu, Val, Phe, Met, Ala）残基のC端側）、ディスパーズ（Leu-Phe結合）、エンドプロテイナーゼ Arg-C、アミノペプチダーゼM（遊離α-アミノ基やα-イミノ基をもつL-アミノ酸のN未端側）、カルボキシペプチダーゼB（C未端のArg, Lys）、及びカルボキシペプチダーゼY（タンパク質・ペプチドのC未端のL-アミノ酸を加水分解する。Proを分解）などがある。
【００３１】
本発明の残基Zの反応基（化学基）とは、酸化傷害タンパク質の酸化傷害部位と結合することができるものをいい、かかる反応性の基であれば、特に制限されない。例えば、酸化傷害部位と結合する反応基の例を挙げると、ヒドラジノ基（-NHNH2）、ヒドラジノカルボニル基（ヒドラジド基、-CONHNH2）、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、および第二級アミンなどがある。これらの基の中で特にヒドラジノ基、及びヒドラジノカルボニル基が好ましい。また、該第２級アミンの例を挙げると、下記式化合物がある。
【００３２】
R1-NH-R2      (第２級アミン)
ここで、R1はリンカーと結合する基であり、R2はアルキル基、アリール基などである。また、R2に電子吸引基、電子供与基などを導入することにより、第２級アミンの反応性を制御することが可能である。該第２級アミンの例を挙げると、ピロール、ピロリン、ピロリジン、及びピペリジンなどがある。
【００３３】
なお、残基Zは、同じ反応基、又は異なる反応基を少なくとも１個以上、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個有するものである。
該反応基 (化学基) を付与するため、残基ZをリンカーY、又は親和性ペプチドタグのC末端、又はN末端に結合することができ、かつ該反応基を有する残基Zを、直接親和性ペプチドタグに結合させることもできる。該残基Zの形成に用いることができる化合物の例を挙げると下記のものがある。
【００３４】
NH2(CH2)n-CHNH2-CONHNH2
H2N-(CH2)n-CONHNH2
H2N-(CH2)n-NH2
ここで、nは、３〜１００、好ましくは、３〜３０、さらに好ましくは３〜１０の整数である。
【００３５】
次に本発明の解析用タグを複数組み合わせて利用する方法について説明する。
すなわち、本発明の好ましい実施態様を挙げると、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）、及び該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２とを、解析対象の試料と混合し、該混合物を、該解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により分子量の相違によるダブレットピークを検出することを含む、該酸化傷害タンパク質の解析方法がある。
【００３６】
該酸化傷害タンパク質の解析方法では、酸化傷害タンパク質と未標識解析用タグとの複合体と、酸化傷害タンパク質と安定同位体解析用タグとの分子量の相違から、ダブレットピークの質量分析スペクトルが得られる。したがって、酸化傷害タンパク質を示すスペクトルの特定が容易、かつ確実になるという利点がある。
【００３７】
該解析方法において、解析用タグ１と２を使用割合は任意に決めることができるが、通常、解析用タグ１と２を等モル量用いるのが好ましい。
さらに、本発明の好ましい実施態様を挙げると、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という）、と標準試料とを反応させ、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から該酸化傷害タンパク質と解析用タグ１又は２とリンカーYとの複合体、或いは酸化傷害タンパク質と該解析用タグ１又は２との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法がある。
【００３８】
該酸化傷害タンパク質の解析方法では、標準試料由来の酸化傷害タンパク質と未標識解析用タグとの複合体と、解析対象試料の酸化傷害タンパク質と安定同位体解析用タグの複合体との分子量の相違から、標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較することができる。したがって、標準試料由来の酸化傷害タンパク質の量と、解析対象試料中の酸化傷害タンパク質の量を比較し、検出された酸化傷害タンパク質の疾病などとの関係を判断できるという利点がある。
【００３９】
なお、該解析方法では未標識の解析用タグ１と該解析対象の試料とを反応させ、かつ標識した解析用タグ２と該標準試料とを反応させてもよい。
また、該解析方法において、解析用タグ１と２を使用割合は任意に決めることができるが、通常、解析用タグ１と２を等モル量用いるのが好ましい。
さらに、本発明の好ましい実施態様を挙げると、これまで記載した酸化傷害タンパク質解析用タグ（以下、解析用タグ１という。）、該解析用タグ１を安定同位体標識した解析用タグ２、及び該解析用タグ１を安定同位体標識し、かつ解析用タグ２と分子量が異なる解析用タグ３とを準備し、解析用タグ１及び２と標準試料とを反応させ、次いで解析用タグ１及び３と解析対象の試料とを反応させ、双方の反応液を混合し、該混合物を、これら解析用タグの親和性ペプチドタグと結合する金属原子を保持する担体と接触させ、該担体から、解析用タグ１〜３と酸化傷害タンパク質との複合体、又は解析用タグ１〜３のリンカーYと酸化傷害タンパク質との複合体を回収し、質量分析により標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較する、酸化傷害タンパク質の解析方法がある。
【００４０】
該酸化傷害タンパク質の解析方法では、標準試料由来の酸化傷害タンパク質と未標識解析用タグとの複合体と、解析対象試料の酸化傷害タンパク質と安定同位体解析用タグの複合体との分子量の相違から、標準試料中の酸化傷害タンパク質と、解析対象の試料中の酸化傷害タンパク質との量を比較することができる。さらに、本実施態様では、標準試料、又は解析対象試料のいずれか一方に、検出すべき酸化傷害タンパク質が含まれていない場合、含まれていないことを容易に検出することができる。したがって、本実施態様により、例え、検出すべき酸化傷害タンパク質が含まれていない場合であっても、標準試料由来の酸化傷害タンパク質の量と、解析対象試料中の酸化傷害タンパク質の量を比較し、検出された酸化傷害タンパク質の疾病などとの関係を判断できるという利点がある。
【００４１】
該実施態様を、図６に基づき説明する。図６（１）に示されている解析用タグ１は未標識、解析用タグ２は解析用タグ１を安定同位体で標識した解析用タグ、かつ解析用タグ３は、解析用タグ１を解析用タグ２の２倍量の同一安定同位体で標識した解析用タグである。これら解析用タグはそれぞれ等モル量使用する。解析用タグ１と２とを標準試料に加え、次いで解析用タグ１と３とを解析対象の試料に加え反応後、生成された解析用タグ複合体を回収して質量分析によりスペクトルを得る。
【００４２】
標準試料と解析対象の試料が同量の特定酸化傷害タンパク質を含む場合、図６の（２）に示すように、解析用タグ１〜３のスペクトルが検出され、解析用タグ２及び３のスペクトルは同じ強度、解析用タグ１のスペクトルは、解析用タグ２及び３の２倍の強度になる。標準試料が解析対象試料の２倍の特定酸化傷害タンパク質を含む場合、図６の（３）に示すように、解析用タグ２のスペクトル強度は解析用タグ３の２倍となり、解析用タグ１のスペクトル強度は解析用タグ３の３倍になる。また、解析対象試料が特定酸化傷害タンパク質を含まない場合、図６の（４）に示すように、解析用タグ３のスペクトルは現れず、解析用タグ１及び２のスペクトルは同じ強度になる。さらに、標準試料が特定酸化傷害タンパク質を含まない場合、図６の（５）に示すように、解析用タグ２のスペクトルは現れず、解析用タグ１及び３のスペクトルは同じ強度になる。なお、図６の（４）及び（５）を比較すると分かるように、解析用タグ１のスペクトルに対し、解析用タグ２及び３のスペクトルは現れる距離が異なるので、標準試料と解析対象試料のいずれに特定酸化傷害タンパク質が含まれていないか判断することができる。
【００４３】
なお、本発明の解析用タグのリンカーYは、ペプチドとして形成することができるので、任意の数の安定同位体標識アミノ酸を容易に導入することができる。したがって、本実施態様、及び図６に示したのと同様の方法により、準備した異分子量安定同位体標識解析用タグの数（n）に対し、（n-1）種類の検体を一度に定量比較することができる。
【００４４】
また、該解析方法において、解析用タグ１と２を使用割合は任意に決めることができるが、通常、解析用タグ１と２を等モル量用いるのが好ましい。
なお、これらの実施態様では、標準試料と解析対象試料は特に制限されないが、例を挙げると、標準試料として健常人の血液、血清、臓器などの組織から得た試料を、また解析対象の試料として疾患を有する人の血液、血清、臓器などの組織から得た試料がある。
次に本発明の酸化傷害タンパク質解析用タグの製造方法について説明する。
本発明の親和性ペプチドタグは、該ペプチドタグをコードする核酸分子を適当なベクターに組み込んで発現させるか、又は化学的な合成方法により製造することができる。化学的に合成する場合、合成用担体にアミノ酸を順次結合させ、続いて、リンカーY及び残基Zを結合させる方法と、適当な担体に残基ZとリンカーYを結合させ、そこにアミノ酸を順次結合させていく方法のいずれで製造してもよい。
【００４５】
本発明の親和性ペプチドタグの製造には、通常、市販のペプチド・タンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4-メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、4-ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4-（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、4-（2',4'-ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。
【００４６】
このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする前記ペプチドタグの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。また、リンカーYがアミノ酸、又はその誘導体からなる場合、該ペプチドタグに続いて、自体公知の各種縮合方法に従い、該リンカーYを樹脂上で縮合させ、続いて、リンカーY最後のアミノ酸に所定の化合物を反応させ残基Zを導入する。該反応の最後に樹脂から本発明の解析用タグを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに必要な場合、高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の解析用タグ得る。
【００４７】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド・タンパク質合成に使用する各種活性化試薬を用いることができ、特に、カルボジイミド類が好ましい。該カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-（3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどがある。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
【００４８】
前記保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、ペプチド・タンパク質縮合反応に使用できる溶媒から適宜選択する。例を挙げると、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、又はこれらの混合物を用いることができる。
【００４９】
反応温度は、タンパク質結合形成反応に適している範囲から適宜選択するが、通常−２０℃〜５０℃の範囲である。活性化されたアミノ酸誘導体は、通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストを行い、縮合が不十分な場合には、保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことで十分な縮合を行うことができる。該反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸、又はアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００５０】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2-ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００５１】
該アミノ酸のカルボキシル基の保護は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2-アダマンチルなどの直鎖状、分枝状、又は環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、4-ニトロベンジルエステル、4-メトキシベンジルエステル、4-クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって行う。
【００５２】
また、セリンの水酸基の保護は、例えば、エステル化、又はエーテル化によって行うことができる。該エステル化に適したる基を挙げると、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などがある。また、該エーテル化に適した基を挙げると、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などがある。
【００５３】
また、チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどがあり、ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどを挙げることができる。
【００５４】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒、又はＰｄ−炭素などの触媒の存在下における水素気流中での接触還元や、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、又はこれらの混合液による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また、液体アンモニア中ナトリウムによる還元などがある。前記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は、前記1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理により除去することができる。前記縮合反応に関与すべきでない官能基の保護、保護基、及びその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択することができる。
【００５５】
前記担体上に形成された本発明の解析用タグを、公知の溶媒、及び離脱剤を用いて処理することにより、該担体から除去し、凍結乾燥法などにより固体、又は粉末の状態で得ることができる。
本発明の解析用タグを用いた、酸化傷害タンパク質の解析方法について説明する。
また、本発明の解析用タグの捕獲に用いる金属イオンは、前記ペプチドタグと親和性を有する限り特に制限されない。該金属イオンの例を挙げると、Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Ca2＋、Co2＋、Mg2＋などの２価金属イオン、特にNi2＋イオンが好ましい。通常、これらの金属イオンを担持する担体は、特に限定する必要はないが、各種ゲル、特にアガロースゲルが好ましい。親和性ペプチドタグを捕獲する金属イオン−担体は、ゲル上で所望の金属イオンを配位したキレート形成を行うことにより調製することができる。該ゲルを固定する支持体として、ガラス板、プラスチック板、96ウェルプレートなどを用いることができる。特に該キレート化金属イオン−ゲルを、ウェル底部に形成した96ウェルプレートを用いることにより、酸化傷害タンパク質検出の自動化を容易に行うことができる。
【００５６】
なお、金属イオン固定化担体と親和性ペプチドタグの結合力は、配位した金属イオンの種類、及び溶液の pHに依存する。本発明においては、該溶液のｐHは通常６〜９，特に7.5〜8.5が好ましい。一方、金属イオン固定化担体と親和性ペプチドタグの結合力は、界面活性剤や高塩濃度バッファーには影響され難いので、これらを必要とする膜タンパク質の精製にも用いることができる。なお、該担体に捕獲された、本発明の解析用タグ−酸化傷害タンパク質複合体は、キレート剤、酸、又はアルカリを加えて、該親和性ペプチドタグと金属イオンとの結合を切り離して回収することができる。また、該複合体は、リンカーYに設けたプロテアーゼ切断部位に、所定のプロテアーゼを作用させることで、担体−解析用タグ複合体から切り離して回収することができる。
【００５７】
回収された酸化傷害タンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー質量分析計、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、イオン対クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーなどを使って同定、及び定量することができる。
【００５８】
本発明の解析用タグを用いて得られた酸化傷害タンパク質は、さらにカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、イオン対クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーなどにより、さらに二次精製することができる。
【実施例】
【００５９】
生体内の活性酸素によって導かれるタンパク質の非生理的な翻訳後修飾（酸化傷害）、特にアルギニン残基、リジン残基、プロリン残基、及びスレオニン残基のアルデヒド化は老化にとどまらず多くの疾病と関連していることが報告されている。本実施例では、親和性タグのC末端側にアルデヒド基と共有結合するヒドラジドを付加した酸化傷害タンパク質解析用タグを調製し、これによってアルデヒド化されたタンパク質を精製して同定した。
【００６０】
（実施例１）酸化傷害タンパク質を標的物質とする酸化傷害タンパク質解析用タグ（I）の製造
本実施例では、下記解析用タグ(I)を製造した。
HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-ヒドラジド
親和性ペプチドタグ  HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG         （配列番号：１）
リンカーY           EGAGA                        （配列番号：２）
ヒドラジド          -NH(CH(CH3))CO(NH(NH2))
該解析用タグ(I)の製造を次のように行った。まず、ポリスチレンクロロトリチルクロライド 樹脂(BeadTech社、3.0 g、1.3 mmol/g、3.9 mmol)をヒドラジン(10 eq.)を含む無水N-メチル-2-ピリロリドン(NMP)(15 mL)溶液中、室温で10時間振とうした。この樹脂をフィルターにかけてろ過し、NMP 20mLで3回洗って、減圧下で乾燥しトリヒドラジン樹脂1を得た。親和性ペプチドタグの合成はこのトリヒドラジン樹脂1を用いて手動で行った。
【００６１】
合成に使用したFmocアミノ酸は0.5 MのNMP溶液として使用した。カップリング試薬はあらかじめNMP(0.5 M)溶液として調製し、活性剤N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)は2Mの濃度に調製した。全工程において、アミノ酸とカップリング試薬をトリヒドラジン樹脂１に対して10等量使用し、１回のカップリング反応は2時間行った。Fmoc 脱保護化は20%ピペリジン-NMP溶液を用いて行った。また、樹脂からのペプチド切断、並びにアミノ酸側鎖の脱保護を行うためTFA/H2O(95:5 v/v)中で、該樹脂を3時間処理した。該樹脂をTFAで洗って、ろ液を減圧蒸留により濃縮した。この溶液にジエチルエーテルを加えて粗ペプチドを沈殿させて、遠心によって集め、H2Oに溶かして凍結乾燥した。該ペプチドの収量を、Shimadzu Shim-pack C-18カラム(250×4.6 mm, 5 μm, 100 Å、HPLC流量 1 mL/min)を用いて、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製HPLC SCL-10A (UV (230 nm)検出器)）で決定した。収率は 7.4%（MALDI-TOF [M+H]+ calcd 2415.8, found 2416.3）であった。
【００６２】
（実施例２）  酸化傷害タンパク質解析用タグ（II）の製造
本実施例では、下記解析用タグ(II)を製造した。
HGHAHGHGHAHGEGAGA-ヒドラジド
親和性ペプチドタグ  HGHAHGHGHAHG              （配列番号：３）
リンカーY           EGAGA                     （配列番号：２）
ヒドラジド         -NH(CH(CH3))CO(NH(NH2))
配列番号１の親和性ペプチドタグから、配列番号３でヒスチジン数６の親和性ペプチドタグにした他は、実施例１を同様な方法で、該解析用タグを製造し、回収した。
【００６３】
（実施例３）  酸化状態のペプチドの分離及び精製
下記配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドである、アンジオテンシン（以下、AngIIと略す）に、人工的に酸化傷害を与え、アルデヒド化されたAngIIを生成し、その精製を試みた。
【００６４】
AngII：DRVYIHPF      （配列番号：４）
まず、AngII濃度200Mの水溶液を調製した。次いで該AngII溶液10lに、NaOCl 濃度60Mの溶液を加えて、37℃で30分間静置することにより、酸化されたAngII（以下OxAngIIと略す。）の溶液(2)を調製した。次にOxAngII溶液(2) 10lに、実施例２で得た解析用タグ(II)の４ｍM溶液10lを加え、67℃で、10分間反応させることで、酸化傷害タンパク質解析用タグ(II)を付加したOxAngII溶液(3)を調製した。その後、1Mトリス緩衝液(pH9)を用いて溶液(3)のpHを7.5以上とし、該溶液(3)をキレート化されたNi2+イオンを担持した磁気ビーズ（商品名Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN社  米国）に4℃で30分間接触させ、トリス緩衝液(pH 8.0)で3回洗浄した後、0.1% TFAを含むH2Oを用いて該解析用タグ(II)を除去し、精製、濃縮されたOxAngIIを含む溶液(4)を調製した。続いて、各状態のAngIIを液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS, 質量分析: LCQDECA (Thermo Electron 社製, ドイツ), HPLC: ナノスペース SI-2(資生堂製)）で測定した。
【００６５】
該測定結果を図１及び２に基づき説明する。図１及び２は各状態のAngII溶液(1)〜(4)を液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS）で測定した結果である。図１は,MSクロマトグラムであり、図２(1)〜(4)は、図１の(1)〜(4)それぞれの滞留時間19.5〜22.5 分（点線四角領域）で検出されたペプチドの MS スペクトルである。
【００６６】
図１の(1)は未処理のAngIIを含む、一つの状態であるためシャープなクロマトグラムが1本検出されている。AngIIの分子量は約1045.5であり、これを反映して図２のMSスペクトル(1)では、分子量／イオン価価(m/z) 約1046.5 (a1+)に1価にイオン化されたスペクトルが、m/z 約524.7 (a2+)に2価にイオン化されたスペクトルが観測されている。
【００６７】
AngII溶液(2) は、人為的に酸化された AngII（OxAngII）を含み、この状態の変化にともない、図１のMSクロマトグラム(2)が滞留時間の遅い方向にシフトし、数本に分裂している。図２のMSスペクトル(2)もm/z 980〜1140までの様々な酸化状態を反映している。該MSスペクトル(2)の▼b1+ 部分が1価イオン、▼b2+ 部分が2価イオンに対応している。
【００６８】
AngII溶液(3)は、溶液(2)に、実施例２で調製した本発明の解析用タグ(II)を加えて反応させたものであり、図１(3)のクロマトグラムには、滞留時間約20〜21分の間に新たなピークが示されている。また、図２(3)のMS スペクトルの▼c2+ 〜 ▼c6+ で示した部分にそれぞれ2価〜6価のイオンが観測されている。分子量約980〜1140のOxAngIIに本発明の解析用タグ(II)（分子量約1640）が付加することによって分子量は約2620〜2780となり、該分子の2価イオンはm/zは約1310〜1390，3価イオンは約870〜930となる。図１(2)で観測されたOxAngIIの全てがアルデヒド化されているわけではないので、図２(3)で新たに観測された前記解析用タグ(II)付加物のスペクトルの数は減少しているが、概算値と観測されたスペクトルのm/zは一致していた。
【００６９】
AngII溶液(4)は、AngII溶液(3)の試料の中から解析用タグ(II)が付加したOxAngIIをNiカラムで精製したものである。図２(3)で観測されていたOxAngII由来のスペクトル（▼b1+、及び▼b2+）は消失し、図２(3)で新たに観測された解析用タグ(I)-OxAngII由来のスペクトル（▼c2+〜▼c6+）だけが観測された。したがって、本発明の解析用タグ(II)を使うことによって、該解析用タグ(II)と結合する、様々な酸化状態のアルデヒド化されたペプチドが精製されたことが分かる。
【００７０】
(実施例４)   酸化状態ペプチドへの解析用タグ(I)の付加、及び分離
実施例３と同様にAngIIに人工的に酸化傷害を与え、アルデヒド化されたOxAngIIを生成し、該OxAngIIへの解析用タグ(I)の付加、及び分離を試みた。
AngII：DRVYIHPF      （配列番号：４）
解析用タグ(I)：HGHAHGHAHGHAHGHGHAHG-EGAGA-ヒドラジド
まず、AngII濃度200Mの溶液を調製し、該AngII溶液10lに、NaOCl 濃度60Mの溶液を加えて、37℃で30分間静置することにより、OxAngIIの溶液を調製した。次に該OxAngII溶液10lに、実施例１で得た解析用タグ(I)の４ｍM溶液10lを加え、67℃で、10分間反応させることで、該解析用タグ(I)を付加したOxAngII溶液(1)を調製した。その後、1Mトリス緩衝液(pH9)を用いて溶液(1)のpHを7.5以上とし、該溶液(1)をキレート化されたNi2+イオンを担持した磁気ビーズ（商品名Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN社  米国）に4℃で30分間接触させ、トリス緩衝液(pH 8.0)で3回洗浄した。
【００７１】
この磁気ビーズに100mM酢酸アンモニウム溶液20lを加え、さらにV8プロテアーゼ(エンドプロテイナーゼ Glu-C )溶液10lを加えて、25℃で約18時間切断反応を行い、該解析用タグ(I)を除去し、精製、濃縮されたOxAngIIを含む溶液(2)を調製した。続いて、該溶液(1)及び(2)中のAngIIを液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS, 質量分析: LCQDECA (Thermo Electron 社製, ドイツ), HPLC: ナノスペース SI-2(資生堂製)）で測定した。なお、Ｖ８プロテアーゼの切断部位は、該解析用タグ(I)のリンカー（ＥGAGA）左端、親和性ペプチドタグとの境にあるグルタミン酸残基(E)である。
【００７２】
該測定結果を図３、４及び表１に基づき説明する。図３は、液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS, 質量分析: LCQDECA (Thermo Electron 社製, ドイツ)、HPLC: ナノスペース SI-2(資生堂製)）で測定した、MS クロマトグラムである。
図３は、各滞留時間における該解析用タグ(I)付加OxAngII（切断前） の MSクロマトグラム 強度(1)、及び該解析用タグ(I)切断後の OxAngII の MSクロマトグラム(2)を示す。また、図４の(1)及び(2)は、それぞれ図３(1)及び(2)の滞留時間9.5〜12分 (破線で囲った部分)で測定されたペプチドの MS スペクトルである。
【００７３】
該解析用タグ(I)の分子量は約2415.8であり、これをV8プロテアーゼで消化すると分子量約2145.65の親和性ペプチドタグと分子量約288.15のリンカーY部分に加水分解される。また、本実施例で生成されてOxAngIIは、アルギニン残基のアルデヒド化を伴ったAngIIで、分子量は約1000.6である。該OxAngIIに該解析用タグ(I)を付加すると、分子量約3398.4 (2415.8+1000.6-18)の該解析用タグ(I)-OxAngIIが生成される。ここで、前記計算式の -18 はアルデヒドと該解析用タグ(I)のヒドラジドが結合する際に、生成、分離される水分子の分子量である。
【００７４】
さらに該解析用タグ(I)-OxAngIIをV8プロテアーゼで消化すると分子量約1270.8 (3398.4-2145.7+18)のOxAngIIとなる。前記計算式における+18はV8プロテアーゼにより該解析用タグ(I)のグルタミン酸残基（E）がC末端で加水分解されたときに付加される水分子の分子量である。各反応後の生成物の分子量、及び観測されたMSスペクトルのm/zを表1にまとめた。なお、図４(1)における▼a2＋〜▼a8+ はそれぞれ親和性ペプチドタグ付加-OxAngIIのスペクトル（2価〜8価）を示し、かつ図４(2)における記号 ▼b1+ 〜▼b3+ はそれぞれ、親和性ペプチドタグ付加-OxAngIIを切断した後OxAngIIスペクトル（1価〜3価）を示している。図４(1)及び(2)の双方とも分子量は計算値（表１）に一致している。したがって、V８プロテアーゼによる親和性ペプチドタグ切断処理により、ほぼ全ての該解析用タグ(I)の親和性ペプチドタグが除去されたことがわかる。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
(実施例５)   安定同位体標識解析用タグ(I)による酸化傷害タンパク質の検出
未知試料を質量分析計で分析する場合、標的タンパク質を判別することが重要である。本実施例では、酸化傷害タンパク質を標的タンパク質として判別するため、安定同位体標識アミノ酸で標識した解析用タグ(I)を使用して、該タンパク質の検出を行った。
【００７７】
まず、水素核を重水素核で標識したアミノ酸を用いて、リンカーY部分（GAGA）形成した他は、実施例１と同じ手順で酸化傷害タンパク質解析用タグ(I)を製造した。該標識解析用タグ(I)を、解析用タグ(I-d10)と表記する。また、標識されていない解析用タグ(I)を、解析用タグ(I-d0)と、また解析用タグ(I-d10)、及び解析用タグ(I-d0)を等量混合したものを解析用タグ(I-mix)と表記する。次に、AngII濃度200Mの溶液を調製し、該AngII溶液10lにNaOCl 濃度60Mの溶液を加えて、37℃で30分間静置することにより、OxAngIIの溶液を調製した。該溶液に、解析用タグ(I-mix)４ｍM溶液10lを加え、67℃で、10分間反応させて、解析用タグ(I-mix)-OxAngIIを形成した。該解析用タグ(I-mix)-OxAngIIを含む溶液を、液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS）で分析し、MS クロマトグラムとMSスペクトルを得た。
【００７８】
図５は、該解析用タグ(I-mix)-OxAngIIを検出したMSスペクトルを示す。挿入図５A、５B及び５Cはそれぞれ、5価（▼5+）、4価（▼4+）、及び3価（▼3+）のMSスペクトルの拡大図である。本実施例では、前記試料溶液中には、分子量約 1000.6のOxAngIIに、分子量約2415.8の解析用タグ(I-d0)と約2425.8の解析用タグ(I-d0)とが脱水反応で付加された、それぞれ分子量約3398.4の解析用タグ(I-d0)-OxAngIIと約3408.4の解析用タグ(I-d10)-OxAngIIが生成されている。このとき観測されたMSスペクトルの1価〜8価イオンのm/zを表２にまとめた。また図5の挿入図から、3価、4価、及び5価イオンにおいて、分子量の差がそれぞれ約3.3、2.5、2.0のダブレットスペクトルが観測された。
【００７９】
したがって、本実施例における標的タンパク質が、酸化傷害タンパク質であることが明瞭に示されている。本発明では、このように安定同位体標識アミノ酸を使うことによって、容易に標識解析用タグをデザインすることができ、複雑な翻訳後修飾を解析することを可能にする。
【００８０】
【表２】
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【００８１】
（配列表の説明）
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
（配列番号１）  実施例１において、酸化傷害タンパク質解析用タグ（I）の製造に用いた親和性ペプチドタグのアミノ酸配列である。
（配列番号２）  実施例１及び２において、酸化傷害タンパク質解析用タグ（I）及び(II)の製造に用いたリンカーYのアミノ酸配列である。
（配列番号３）  実施例２において、酸化傷害タンパク質解析用タグ（II）の製造に用いた親和性ペプチドタグのアミノ酸配列である。
（配列番号４）  実施例３及び４において、酸化傷害ペプチドを作成するために用いられたアンジオテンシン（AngII）のアミノ酸配列である。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、活性酸素によって発症する疾病機序の解明、活性酸素が生体に及ぼす分子機序の解明、及び酸化に伴うタンパク質の機能損失機序の解明を行うことに利用可能である。また、本発明は、疾病特異的な酸化傷害タンパク質の検出方法として活用でき、臨床試薬としての可能性を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、実施例３における各状態のAngII溶液(１)〜(４)を液体クロマトグラフィー質量分析計で測定して得たMSクロマトグラムである。
【図２】図２は、図１(１)〜(４)それぞれの滞在時間19.5〜22.51分(点線四角領域)で検出されたペプチドのMSスペクトルを示す。
【図３】図３は、実施例４において、液体クロマトグラフィー質量分析計で測定した酸化傷害タンパク質解析用タグ(I)付加OxArgII(切断前)のMSクロマトグラム強度(１)、及び該解析用タグ(I)切断後のOxArgIIのMSクロマトグラム(２)を示す。
【図４】図４は、それぞれ図３(１)、及び(２)の滞在時間9.5〜12分(破線で囲った部分)で検出されたペプチドのMSスペクトル(１)、及び(２)である。
【図５】図５は、実施例５における酸化傷害タンパク質解析用タグ(I-mix)-OxArgIIを検出したMSスペクトルを示す。挿入図５A、５B、及び５Cはそれぞれ、５価(▼5+)、４価(▼4+)、及び３価(▼3+)のMSスペクトルの拡大図である。
【図６】図６は、解析用タグ１、２及び３を用いる本発明の実施態様を説明するための、質量分析の強度、及び検出位置などを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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