(57)【要約】【課題】  測定に当たり高価な装置や器具を必要とせず、測定の操作が簡便であり、測定に要する時間が極めて短く、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程；前記接触後その一定量を多孔性膜上に添加する工程；並びに前記多孔性膜上の着色域を測定する工程、を含むことを特徴とする試料中のタンパク質の測定方法である。また、本発明は、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬、並びに多孔性膜、を含むことを特徴とする試料中のタンパク質の測定キットである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程；前記接触後その一定量を多孔性膜上に添加する工程；並びに前記多孔性膜上の着色域を測定する工程、を含むことを特徴とする試料中のタンパク質の測定方法。
【請求項２】
試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程において、塩を共存させることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
タンパク質と会合体を形成する色素がエリスロシンＢである請求項１又は請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
水溶性高分子化合物がポリアルキレングリコールである請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬、並びに多孔性膜、を含むことを特徴とする試料中のタンパク質の測定キット。
【請求項６】
タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬が、更に塩を含有することを特徴とする請求項５記載の測定キット。
【請求項７】
タンパク質と会合体を形成する色素がエリスロシンＢである請求項５又は請求項６記載の測定キット。
【請求項８】
水溶性高分子化合物がポリアルキレングリコールである請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、試料中に微量に含まれるタンパク質を簡便かつ高感度に測定することができる測定方法及び測定キットに関する。本発明は、分析化学、生命科学、及び医療の分野において有用であり、特に臨床検査分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】  血清又は血漿のタンパク質濃度は、脱水、網内系疾患又は慢性感染症等において高値となる。また、血漿タンパクの漏出、栄養不良又は肝機能障害等において低値となる。
このように血清又は血漿のタンパク質濃度は、各種疾患又は各種病態に伴って変化するので、その測定は疾患の診断及び治療において重視されている。【０００３】  また、尿中のタンパク質は、腎疾患、心疾患、血液疾患、黄だん又は高熱等において出現する。
この尿中のタンパク質を測定することも、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。【０００４】  従来のタンパク質の測定方法（測定キット）としては、まず、タンパク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片を用いる方法がある。しかし、この試験片を用いる方法は、検出限界が１０〜２０ｍｇ／ｄＬであり、試料中に微量に含まれるタンパク質を測定することができないものであった。また、この方法は、試料中の他の物質や非結合態色素の影響を受けて、測定誤差が生じる場合もあった。【０００５】  また、タンパク質中の４個のペプチド結合がアルカリ溶液中で２価の銅イオンとキレート結合して紫色に発色する反応を利用するＢｉｕｒｅｔ法は、検出限界が１０ｍｇ／ｄＬであるが、測定の操作は煩雑であり測定に時間が掛かるものであった。【０００６】  そして、やはり２価の銅イオンとフェノール試薬を用いるＬｏｗｒｙ法は、検出限界が２．５ｍｇ／ｄＬと感度は高いが、測定の操作は煩雑であり測定に時間を要するものであった。【０００７】  また、ピロガロールレッド・モリブデン錯体が酸性条件下でタンパク質と結合することにより青紫色に変色する反応を利用するピロガロールレッド・モリブデン錯体発色法は、検出限界が２ｍｇ／ｄＬと感度は高いが、やはり測定の操作は煩雑なものであり測定に時間が掛かるものであった。【０００８】  また，木下らは、試料中のタンパク質をメンブランフィルタ上に濃縮し、その後フィルタをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光染色し、洗浄後にスポットの蛍光強度を測定する方法を報告している。しかしながら、この方法においては、タンパク質とＦＩＴＣとの反応に３０分も要し、また妨害物質を除去するために染色後には洗浄を必要とするという煩雑なものであった（非特許文献１参照。）。【０００９】  そして、藤田らは、タンパク質と色素−金属錯体との沈殿会合体をフィルタで物理的に補集した後、水酸化ナトリウム水溶液で再溶解し、この溶液の吸光度を測定する方法を報告している。しかしながら、この方法においては、沈殿物の目詰まりのため定量性が決して良好とは言えず、またフィルタ上の着色を観察するものではなく、再溶解液を測定するものであるため、簡易迅速な分析に適さないものであった（非特許文献２参照。）。【００１０】  上述した従来のタンパク質の測定方法及び測定キットは、検出限界が高く、すなわち測定の感度が低いものであり、測定の操作が煩雑であり、そして測定に時間を要するものであった。【００１１】  なお、本発明者らは、先に、ａ）タンパク質を含有する可能性がある試料と、タンパク質とイオン会合体を形成する色素を混合し、前記イオン会合体を沈殿させずにイオン会合体溶液を形成させる工程；ｂ）前記イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すことにより、前記イオン会合体溶液中に溶解した前記会合体を前記フィルタに吸着させる工程；及び、ｃ）前記フィルタ上の前記会合体を定性・定量的に分析する工程を順次行う、試料中のタンパク質の分析方法を開発した（特許文献１参照。）。【００１２】
【特許文献１】特開平１１−３０４８０３号公報
【非特許文献１】「分析化学」、第２３巻、第１５４３頁〜第１５４４頁、１９７４年
【非特許文献２】「分析化学」、第４４巻、第７３３頁〜第７３８頁、１９９５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】  本発明の課題は、測定に当たり高価な装置や器具を必要とせず、測定の操作が簡便であり、測定に要する時間が極めて短く、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】  本発明は、以下の発明を包含するものである。
（１）  試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程；前記接触後その一定量を多孔性膜上に添加する工程；並びに前記多孔性膜上の着色域を測定する工程、を含むことを特徴とする試料中のタンパク質の測定方法。
（２）  試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程において、塩を共存させることを特徴とする前記（１）記載の測定方法。
（３）  タンパク質と会合体を形成する色素がエリスロシンＢである前記（１）又は（２）記載の測定方法。
（４）  水溶性高分子化合物がポリアルキレングリコールである前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の測定方法。
（５）  タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬、並びに多孔性膜、を含むことを特徴とする試料中のタンパク質の測定キット。
（６）  タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬が、更に塩を含有することを特徴とする前記（５）記載の測定キット。
（７）  タンパク質と会合体を形成する色素がエリスロシンＢである前記（５）又は（６）記載の測定キット。
（８）  水溶性高分子化合物がポリアルキレングリコールである前記（５）〜（７）のいずれか１つに記載の測定キット。
【発明の効果】
【００１５】  本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、測定に当たり高価な装置や器具を必要とせず、測定の操作が簡便であり、測定に要する時間が極めて短く、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法
１．試料
本発明における試料としては、タンパク質を含む可能性がある試料であれば特に限定されないが、例えば、ヒト若しくは動物に由来する試料、植物に由来する試料、微生物に由来する試料、食物、飲料、飲料水、薬剤、試薬、又は環境試料等を挙げることができる。【００１７】  ヒト若しくは動物に由来する試料は、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは羊水；脳、心臓、腎臓、若しくは肝臓などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。【００１８】  食物は、特に限定されず、例えば、食肉、野菜、穀物、果物、卵、水産物、又は加工食品等を挙げることができる。【００１９】  飲料は、特に限定されず、例えば、ジュース、牛乳、茶、コーヒー、又は酒類等を挙げることができる。【００２０】  薬剤は、特に限定されず、例えば、輸液、注射液、散剤、又は錠剤等を挙げることができる。【００２１】  なお、測定に用いる試料の形態は、液体である必要があるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。
また、必要に応じて、希釈又は濃縮処理を行ってもよい。【００２２】２．タンパク質と会合体を形成する色素
本発明におけるタンパク質と会合体を形成する色素は、静電気的引力又は疎水相互作用等によってタンパク質と会合体を形成することができる色素であれば、特に限定されずに用いることができる。【００２３】  このタンパク質と会合体を形成する色素としては，例えば、エリスロシンＢ若しくはエオシンなどのキサンテン系色素；クマシブリリアントブルー（ＣＢＢ）、ブロモクロロフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、若しくはブロモクレゾールパープルなどのトリフェニルメタン系色素；又はバッファローブラック、アシドオレンジ１２、メチルオレンジ、オレンジＧ、若しくはアゾスルファチアゾールなどのアゾ色素等を挙げることができる。【００２４】  このタンパク質と会合体を形成する色素としては、疎水性が高いものが好ましい。
また、このタンパク質と会合体を形成する色素としては、そのｐＫａが測定を行おうとするタンパク質のｐＩ（等電点）よりも低いものが好ましい。【００２５】  このタンパク質と会合体を形成する色素としては、エリスロシンＢ及びクマシブリリアントブルーが好ましく、エリスロシンＢが特に好ましい。【００２６】  このタンパク質と会合体を形成する色素の濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中のタンパク質を測定することができないので、水溶性高分子化合物の存在下に試料と接触させるときの濃度で、１μＭ以上であることが好ましく、１０μＭ以上であることがより好ましく、５０μＭ以上であることが特に好ましい。【００２７】  また、このタンパク質と会合体を形成する色素の濃度は、高すぎると試料中にタンパク質が存在しなくとも濃い着色域が生じてしまい、タンパク質が存在するときとの判別が難しくなるので、水溶性高分子化合物の存在下に試料と接触させるときの濃度で、１，０００μＭ以下であることが好ましく、５００μＭ以下であることがより好ましく、２５０μＭ以下であることが特に好ましい。【００２８】３．水溶性高分子化合物
本発明における水溶性高分子化合物は、水溶性の高分子化合物であれば、特に限定されずに用いることができる。【００２９】  この水溶性高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール等を挙げることができる。
このポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールとしては、例えば、分子量２００〜４，０００，０００のものを用いることができる。分子量１，０００〜４００，０００のものがより好ましく、分子量２，０００〜４０，０００のものが特に好ましい。【００３０】  この水溶性高分子化合物を、タンパク質と会合体を形成する色素とともに試料と接触させることにより、多孔性膜上に生じる着色域が、試料中にタンパク質が存在する場合と存在しない場合とで差異を生じるようになり、判別が可能となる。
従って、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットによる測定においては、水溶性高分子化合物は必須である。【００３１】  この水溶性高分子化合物の濃度は、低すぎると試料中にタンパク質が存在する場合とタンパク質が存在しない場合とで着色域に明瞭な差異が生じないので、タンパク質と会合体を形成する色素とともに試料と接触させるときの濃度で、０．０１％以上であることが好ましく、０．１％以上であることがより好ましく、０．５％以上であることが特に好ましい。【００３２】  また、この水溶性高分子化合物の濃度は、高すぎると粘性が上昇する可能性があり、そうなると分注量に誤差が生じることにもなり、また試薬のろ過を行う場合に時間が掛かってしまうので、タンパク質と会合体を形成する色素とともに試料と接触させるときの濃度で、１５％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましく、５％以下であることが特に好ましい。【００３３】４．塩
本発明による試料中のタンパク質の測定においては、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程において、塩を共存させることにより、測定の感度を更に高めることができるので好ましい。【００３４】  この塩の濃度は、より測定の感度を上げるためには、塩及び水溶性高分子化合物の存在下において試料及びタンパク質と会合体を形成する色素を接触させるときの濃度で、１０ｍＭ以上であることが好ましく、４０ｍＭ以上であることがより好ましく、７０ｍＭ以上であることが特に好ましい。【００３５】  また、この塩の濃度は、高すぎると試料中にタンパク質が存在しなくとも濃い着色域が生じてしまい、タンパク質が存在するときとの判別が難しくなるので、塩及び水溶性高分子化合物の存在下において試料及びタンパク質と会合体を形成する色素を接触させるときの濃度で、２，０００ｍＭ以下であることが好ましく、１，０００ｍＭ以下であることがより好ましく、５００ｍＭ以下であることが特に好ましい。【００３６】  この塩としては、例えば、陽イオン及び陰イオンよりなる化合物を挙げることができる。【００３７】  この陽イオンとしては、正の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
この陽イオンとしては、１価の陽イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陽イオンであってもよい。
そして、この陽イオンとしては、例えば、金属イオン、アンモニウムイオン、又はその他の陽イオン等を挙げることができる。【００３８】  この金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、又はその他の金属イオン等を挙げることができる。【００３９】  アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。【００４０】  アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、又はバリウムイオン等を挙げることができる。【００４１】  遷移金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は銅イオン等を挙げることができる。【００４２】  その他の金属イオンとしては、例えば、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。【００４３】  アンモニウムイオンとしては、例えば、一級のアンモニウムイオン、二級のアンモニウムイオン、三級のアンモニウムイオン、又は四級のアンモニウムイオン等を挙げることができる。【００４４】  その他の陽イオンとしては、例えば、炭素原子、ケイ素原子、ホウ素原子、窒素原子（アンモニウムイオン以外の場合において）、リン原子、若しくは硫黄原子などが正の電荷を帯びている原子、又は原子団等を挙げることができる。【００４５】  この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。【００４６】  なお、この陽イオンとしては、１価の陽イオンが好ましい。【００４７】  そして、この１価の陽イオンとしては、アルカリ金属イオンが好ましい。特に、ナトリウムイオンが好ましい。【００４８】    なお、この陽イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。【００４９】  また、陰イオンとしては、負の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。【００５０】  この陰イオンとしては、１価の陰イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陰イオンであってもよい。【００５１】  そして、この陰イオンとしては、例えば、ハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。【００５２】  ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。【００５３】  有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、又はシュウ酸イオン等を挙げることができる。【００５４】  その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、亜硫酸イオン、ピロ亜硫酸イオン、亜二チオン酸イオン、チオ亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、ペルオキソ亜硝酸イオン、リン酸イオン、亜リン酸イオン、ピロ亜リン酸イオン、次亜リン酸イオン、二リン酸イオン、ホウ酸イオン、炭酸イオン、シアン酸イオン、イソシアン酸イオン、又はケイ酸イオン等を挙げることができる。【００５５】  なお、この陰イオンとしては、１価の陰イオンが好ましい。【００５６】  そして、この１価の陰イオンとしては��ハロゲンイオンが好ましい。特に、塩素イオンが好ましい。【００５７】  また、この陰イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。【００５８】  本発明において、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程において、共存させる塩としては、アルカリ金属イオンとハロゲンイオンの塩が好ましく、特に、塩化ナトリウムが好ましい。【００５９】５．ｐＨ
本発明において、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる際のｐＨとしては、タンパク質と会合体を形成する色素のｐＫａよりも低いｐＨであることが好ましい。【００６０】  即ち、前記の際のｐＨとしては、測定を行おうとするタンパク質のｐＩ（等電点）よりも低く、かつ前記色素のｐＫａよりも低いｐＨであることが好ましい。【００６１】  前記の際のｐＨが、前記ｐＫａ及び前記ｐＩよりも高いと、試料中にタンパク質が存在する場合と存在しない場合とで多孔性膜上の着色域の差異が明瞭ではなく、試料中のタンパク質を測定するのがより難しくなる。【００６２】  しかし、前記の際のｐＨが、前記ｐＩ及び前記色素のｐＫａよりも低いと、試料中にタンパク質が存在する場合と存在しない場合とで多孔性膜上の着色域の差異が明瞭となり、試料中のタンパク質の測定が容易となる。
但し、余りｐＨが低いとタンパク質が変性、不溶化される。【００６３】  ヒト血清中の主なタンパク質はアルブミン（ｐＩ：４．６）であるので、タンパク質と会合体を形成する色素としてエリスロシンＢ（ｐＫａ：３．２）を用いてヒト血清試料中のタンパク質を測定する際には、ヒト血清試料、エリスロシンＢ、及び水溶性高分子化合物を接触させる際のｐＨとしては、ｐＨ２．０〜４．０が好ましく、ｐＨ２．５〜３．１であることがより好ましい。【００６４】  なお、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいて用いる試薬には、前記接触時のｐＨが上記のｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を含有させることが好ましい。この緩衝剤としては、既知の緩衝剤を用いることができる。【００６５】６．多孔性膜
本発明における多孔性膜は、多数の微細な孔を有する膜であって、その膜上に微量の溶液を添加したときにその溶液を吸収することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。【００６６】  この多孔性膜の材質としては、例えば、セルロースアセテート、セルロース混合エステル（ニトロセルロース及びセルロースアセテートの混合物）、ポリカーボネート、又はポリビニリデンフロライド等を挙げることができる。【００６７】  この多孔性膜の孔径としては、０．１〜３μｍが好ましく、０．４５〜２μｍがより好ましい。【００６８】  例えば、この多孔性膜として、「ＭＦ−メンブランフィルター（タイプＨＡ；セルロース混合エステル；孔径０．４５μｍ）〔ミリポア社〕」、「メンブランフィルター（タイプＪＨ；孔径０．４５μｍ）〔ミリポア社〕」、又は「ＳＥＬＥＣＡ−Ｖ（セルロースアセテート膜）〔東洋濾紙社〕」等を挙げることができる。【００６９】  特に、「ＭＦ−メンブランフィルター（タイプＨＡ；セルロース混合エステル；孔径０．４５μｍ）〔ミリポア社〕」が、試料中にタンパク質が存在する場合と存在しない場合とで多孔性膜上の着色域の差異が明暸であるので好ましい。【００７０】７．試料中のタンパク質の測定
本発明における試料中のタンパク質の測定について、以下説明を行う。
（１）接触工程
まず、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程であるが、前記の試料、前記のタンパク質と会合体を形成する色素、及び前記の水溶性高分子化合物を接触させることができれば，どのような方法でもよい。この接触により、水溶性高分子化合物の存在下、試料中に含まれるタンパク質と、タンパク質と会合体を形成する色素とを反応させ、「タンパク質−タンパク質と会合体を形成する色素」の会合体を形成させる。このときの濃度については、前記の通りである。【００７１】  なお、前記の通り、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる工程において、塩を共存させることが好ましい。【００７２】  この、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる時間であるが、１分間以上であることが好ましく、３分間以上であることがより好ましく、５分間以上であることが特に好ましい。【００７３】試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる温度であるが、特に限定はない。但し、６０℃以上であると、タンパク質が変性する可能性があるので、０〜５０℃が好ましく、５〜４５℃がより好ましく、１５〜４０℃が特に好ましい。【００７４】  この、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物の接触は、１段階で行ってもよいが、２段階以上の複数段階で行ってもよい。【００７５】  例えば、１段階で行う場合は、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬と、試料とを混合して接触させる。【００７６】  また、２段階で行う場合は、例えば、タンパク質と会合体を形成する色素を含有する試薬と、試料とを混合し、その後、この混合液に水溶性高分子化合物を含有する試薬を混合して、接触させる。
あるいは、水溶性高分子化合物を含有する試薬と、試料とを混合し、その後、この混合液にタンパク質と会合体を形成する色素を含有する試薬を混合して、接触させる。【００７７】  なお、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる際に、塩を共存させる場合であるが、この塩は、タンパク質と会合体を形成する色素及び／又は水溶性高分子化合物を含有する試薬に適宜含有させればよい。【００７８】  例えば、タンパク質と会合体を形成する色素、水溶性高分子化合物、及び塩を含有する試薬を調製し、これを試料と混合し、接触させてもよい。【００７９】  また、タンパク質と会合体を形成する色素及び塩を含有する試薬を調製し、これを試料と混合し、その後、この混合液に水溶性高分子化合物を含有する試薬を混合して、接触させてもよい。【００８０】  あるいは、水溶性高分子化合物及び塩を含有する試薬を調製し、これを試料と混合し、その後、この混合液にタンパク質と会合体を形成する色素を含有する試薬を混合して、接触させてもよい。【００８１】  更に、塩を含有する試薬を調製し、これを試料と混合し、その後、この混合液にタンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬を混合して、接触させてもよい。【００８２】  そして、タンパク質と会合体を形成する色素、水溶性高分子化合物及び塩を含有する試薬を調製し、これを試料と混合して、接触させてもよい。【００８３】（２）添加工程
次に、前記接触後その一定量を多孔性膜上に添加する工程であるが、これも、前記の試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物との接触の後、得られた混合液の一定量を前記の多孔性膜の上に添加するのであれば、特に限定なく行うことができる。【００８４】  なお、前記の多孔性膜上に添加する一定量であるが、これは微量である程、測定に要する試料や試薬を節約できるので好ましいが、余り微量過ぎると多孔性膜上の着色域の測定が難しくなるので、１〜１００μＬであることが好ましく、３〜５０μＬであることがより好ましく、５〜２０μＬであることが特に好ましい。【００８５】（３）着色域測定工程
そして、前記多孔性膜上の着色域を測定する工程であるが、これも、前記の多孔性膜上への添加の後、この多孔性膜上に生じた着色域を測定するのであれば，特に限定なく行うことができる。【００８６】  この多孔性膜上の着色域の測定であるが、多孔性膜上に生じる着色域は、試料中にタンパク質が存在しない場合にはその着色が薄いものである。これに対して試料中にタンパク質が存在する場合にはその着色が濃いものとなるので、この着色域の着色を測定することにより、試料中にタンパク質が存在するか否かを判別することができる。
また、前記の着色域の着色の濃さを測定することにより、試料中に含まれていたタンパク質の濃度を定量することもできる。【００８７】  なお、前記の多孔性膜上に生じる着色域は、試料中にタンパク質が存在しない場合はその着色域の外縁が若干不明瞭であり、ぼやけたものとなる。
これに対して、試料中にタンパク質が存在する場合はその着色域の外縁が明暸である。更に、その外縁上にはリング状の線がはっきりと見受けられる。
従って、この着色域の外縁が明瞭であること、又は外縁上にリング状の線が見られることにより、試料中のタンパク質の存在を判定することもできる。【００８８】  なお、前記の多孔性膜上の着色域の測定であるが、これは目視により行ってもよく、又は、デンシトメーター、スポットメーター、若しくはＣＣＤ装置等の装置を用いて測定を行ってもよい。【００８９】  また、タンパク質を含まない試料（陰性対照試料又は試薬盲検試料）及び／又はタンパク質を含む試料（陽性対照試料）を測定して得られた多孔性膜上の着色域の着色の濃さ等と、試料を測定して得られた多孔性膜上の着色域の着色の濃さ等とを対比して、試料中のタンパク質の存在の判定を行ってもよい。【００９０】  そして、試料中に含まれていたタンパク質の濃度を定量測定する場合は、タンパク質濃度が既知の試料（標準試料）を測定して得られた多孔比膜上の着色域の着色の濃さ等と、タンパク質濃度が未知の試料を測定して得られた多孔性膜上の着色域の着色の濃さ等とを対比（又は比例計算）すること等により定量値を求めることができる。【００９１】ＩＩ．試料中のタンパク質の測定キット
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、少なくとも、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬、並びに多孔性膜、を含むものである。【００９２】１．試薬
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬を含む。【００９３】（１）タンパク質と会合体を形成する色素
本発明の試料中のタンパク質の測定キットにおける、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬において、タンパク質と会合体を形成する色素は、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」において詳述した通りである。【００９４】  このタンパク質と会合体を形成する色素を前記試薬に含有させる濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中のタンパク質を測定することができないので、水溶性高分子化合物の存在下に試料と接触させるときの濃度が、１μＭ以上となるように試薬に含有させることが好ましく、１０μＭ以上となるように試薬に含有させることがより好ましく、５０μＭ以上となるように試薬に含有させることが特に好ましい。【００９５】  また、このタンパク質と会合体を形成する色素を前記試薬に含有させる濃度は、高すぎると試料中にタンパク質が存在しなくとも濃い着色域が生じてしまい、タンパク質が存在するときとの判別が難しくなるので、水溶性高分子化合物の存在下に試料と接触させるときの濃度が、１，０００μＭ以下となるように試薬に含有させることが好ましく、５００μＭ以下となるように試薬に含有させることがより好ましく、２５０μＭ以下となるように試薬に含有させることが特に好ましい。【００９６】（２）水溶性高分子化合物
本発明の試料中のタンパク質の測定キットにおける、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬において、水溶性高分子化合物は、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」において詳述した通りである。【００９７】  この水溶性高分子化合物の濃度は、低すぎると試料中にタンパク質が存在する場合としない場合とで着色域に明暸な差異が生じないので、タンパク質と会合体を形成する色素とともに試料と接触させるときの濃度が、０．０１％以上となるように試薬に含有させることが好ましく、０．１％以上となるように試薬に含有させることがより好ましく、０．５％以上となるように試薬に含有させることが特に好ましい。【００９８】  また、この水溶性高分子化合物の濃度は、高すぎると粘性が上昇する可能性があり、そうなると分注量に誤差が生じることにもなり、また試薬のろ過を行う場合に時間が掛かってしまうので、タンパク質と会合体を形成する色素とともに試料と接触させるときの濃度が、１５％以下となるように試薬に含有させることが好ましく、１０％以下となるように試薬に含有させることがより好ましく、５％以下となるように試薬に含有させることが特に好ましい。【００９９】（３）塩
本発明の試料中のタンパク質の測定においては、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる際に、塩を共存させて測定を行うことにより、測定の感度を更に高めることができるので好ましい。【０１００】  このため、本発明においては、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬に、塩を含有させることが好ましい。【０１０１】  または、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬には塩を含有させずに、別に塩を含有する試薬を用意して、試料中のタンパク質の測定に用いてもよい。【０１０２】  あるいは、試料中のタンパク質の測定に用いる複数の試薬に、塩を含有させてもよい。【０１０３】  これらの試薬に含有させる塩は、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」において詳述した通りである。【０１０４】  この塩の濃度は、より測定の感度を上げるためには、塩及び水溶性高分子化合物の存在下で試料及びタンパク質と会合体を形成する色素を接触させるときの濃度が、１０ｍＭ以上となるように試薬に含有させることが好ましく、４０ｍＭ以上となるように試薬に含有させることがより好ましく、７０ｍＭ以上となるように試薬に含有させることが特に好ましい。【０１０５】  また、この塩の濃度は、高すぎると試料中にタンパク質が存在しなくとも濃い着色域が生じてしまい、タンパク質が存在するときとの判別が難しくなるので、塩及び水溶性高分子化合物の存在下で試料及びタンパク質と会合体を形成する色素を接触させるときの濃度が、２，０００ｍＭ以下となるように試薬に含有させることが好ましく、１，０００ｍＭ以下となるように試薬に含有させることがより好ましく、５００ｍＭ以下となるように試薬に含有させることが特に好ましい。【０１０６】（４）ｐＨ
本発明において、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬のｐＨとしては、タンパク質と会合体を形成する色素のｐＫａよりも低いｐＨであることが好ましい。【０１０７】  即ち、前記試薬のｐＨとしては、測定を行おうとするタンパク質のｐＩ（等電点）よりも低く、かつ前記色素のｐＫａよりも低いｐＨであることが好ましい。【０１０８】  前記試薬のｐＨが、前記ｐＫａ及び前記ｐＩよりも高いと、試料中にタンパク質が存在する場合と存在しない場合とで多孔性膜上の着色域の差異が明暸ではなく、試料中のタンパク質を測定するのがより難しくなる。【０１０９】  しかし、前記試薬のｐＨが、前記ｐＩ及び前記色素のｐＫａよりも低いと、試料中にタンパク質が存在する場合と存在しない場合とで多孔性膜上の着色域の差異が明暸となり、試料中のタンパク質の測定が容易となる。
但し、余りｐＨが低いとタンパク質が変性、不溶化される。【０１１０】  ヒト血清中の主なタンパク質はアルブミン（ｐＩ：４．６）であるので、タンパク質と会合体を形成する色素としてエリスロシンＢ（ｐＫａ：３．２）を用いてヒト血清試料中のタンパク質を測定する際には、エリスロシンＢ及び水溶性高分子化合物を含有する試薬のｐＨとしては、ｐＨ２．０〜４．０が好ましく、ｐＨ２．５〜３．１であることがより好ましい。【０１１１】  なお、前記試薬には、前記試薬のｐＨが上記のｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を含有させることが好ましい。この緩衝剤としては、既知の緩衝剤を用いることができる。【０１１２】（５）その他の試薬成分
本発明における、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬には、必要に応じて、アジ化ナトリウム、抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤；糖類などの安定化剤；他の反応活性化剤；試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる物質；非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤若しくは両性界面活性剤などの界面活性剤；又は他の試薬成分を適宜含有させることができる。【０１１３】（６）試薬の構成
本発明における、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬は、１試薬よりなるものであってもよいし、又は２試薬以上の複数の試薬より構成されるものであってもよい。【０１１４】  前記試薬が、１試薬よりなる場合、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物は同じ試薬に含有されるものである。【０１１５】  また、前記試薬が２試薬より構成される場合、例えば、前記試薬は、タンパク質と会合体を形成する色素を含有する試薬と、水溶性高分子化合物を含有する試薬より構成される。【０１１６】  なお、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる際に、塩を共存させて測定を行う場合、試薬の構成の例として次のものを挙げることができる。【０１１７】（イ）１試薬より構成
タンパク質と会合体を形成する色素、水溶性高分子化合物、及び塩を含有する試薬【０１１８】（ロ）２試薬より構成
・  タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬、並びに塩を含有する試薬【０１１９】・  タンパク質と会合体を形成する色素及び塩を含有する試薬、並びに水溶性高分子化合物を含有する試薬    又は【０１２０】・  水溶性高分子化合物及び塩を含有する試薬、並びにタンパク質と会合体を形成する色素を含有する試薬【０１２１】（ハ）３試薬より構成
タンパク質と会合体を形成する色素を含有する試薬、水溶性高分子化合物を含有する試薬、及び塩を含有する試薬【０１２２】２．多孔性膜
本発明の試料中のタンパク質の測定キットにおける多孔性膜は、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」において詳述した通りである。【０１２３】３．他の物
本発明の試料中のタンパク質の測定キットには、必要に応じて、タンパク質と会合体を形成する色素及び水溶性高分子化合物を含有する試薬、並びに多孔性膜以外の物を含めることができる。【０１２４】  この物としては、例えば、陰性対照試料（試薬盲検試料）、陽性対照試料、標準試料、対照表、希釈液、及び緩衝液等を挙げることができる。【０１２５】４．試料中のタンパク質の測定
本発明の試料中のタンパク質の測定キットを用いて、試料中のタンパク質の測定を行うことについては、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」に記載した通りである。
【実施例】
【０１２６】  以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこの実施例の記載により限定されるものではない。【０１２７】〔実施例１〕（水溶性高分子化合物の効果の確認）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおける、水溶性高分子化合物の効果を確認した。【０１２８】１．試薬
（１）緩衝液
緩衝液として、１００ｍＭモノクロロ酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液〔ｐＨ３．０（２０℃）〕を調製した。【０１２９】（２）塩試薬
塩試薬として、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液を調製した。【０１３０】（３）色素・高分子化合物試薬
色素・高分子化合物試薬として、下記の試薬を各々調製した。【０１３１】（ａ）ＰＥＧ０％試薬
５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。（ポリエチレングリコールは含まない。）【０１３２】（ｂ）ＰＥＧ１％試薬
１．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０１３３】（ｃ）ＰＥＧ３％試薬
３．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０１３４】（ｄ）ＰＥＧ５％試薬
５．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０１３５】（ｅ）ＰＥＧ１０％試薬
１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０１３６】（ｆ）ＰＥＧ１５％試薬
１５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０１３７】２．多孔性膜
多孔性膜として、セルロースアセテート膜（商品名「ＳＥＬＥＣＡ−Ｖ」〔東洋濾紙社〕）を用いた。【０１３８】３．試料
（イ）タンパク質含有試料
タンパク質含有試料として、１０ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製した。【０１３９】（ロ）タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。【０１４０】４．測定
（１）  前記３の（イ）のタンパク質含有試料の８５μＬに、前記１の（１）の緩衝液１０μＬを添加し、混合した。【０１４１】（２）  次に、前記（１）の混合液に、前記１の（２）の塩試薬５μＬを添加し、混合した。【０１４２】（３）  その次に、前記（２）の混合液に、前記１の（３）の色素・高分子化合物試薬５０μＬを添加し、混合した。
なお、色素・高分子化合物試薬は、（ａ）ＰＥＧ０％試薬〜（ｆ）ＰＥＧ１５％試薬の６種類の色素・高分子化合物試薬を、各々別々に用いた。【０１４３】（４）  その後、１０分間室温にて放置した。【０１４４】（５）  次に、前記混合液の５μＬを、前記２の多孔性膜の上に添加した。（この添加した混合液が、この多孔性膜に吸収される様子の模式図を、図１に示した。）【０１４５】（６）  前記添加後、多孔性膜上の着色域の測定を行った。【０１４６】      なお、多孔性膜上の着色域の着色が濃い場合には試料中にタンパク質が存在すると判定し、前記着色域の着色が薄い場合には試料中にタンパク質が存在しないと判定した。【０１４７】  また、試料を前記３の（イ）のタンパク質含有試料から（ロ）のタンパク質不含試料に変えて、前記（１）〜（６）の操作に従い測定を行った。【０１４８】  なお、試料，タンパク質と会合体を形成する色素（エリスロシンＢ）、及び水溶性高分子化合物（平均分子量１０，０００のポリエチレングリコール）を接触させる際の前記ポリエチレングリコールの濃度は、各々下記の通りとなる。【０１４９】（ａ）ＰＥＧ０％試薬を用いたとき：  ０％
（ｂ）ＰＥＧ１％試薬を用いたとき：  ０．３３３％
（ｃ）ＰＥＧ３％試薬を用いたとき：  １．０％
（ｄ）ＰＥＧ５％試薬を用いたとき：  １．６７％
（ｅ）ＰＥＧ１０％試薬を用いたとき：  ３．３３％
（ｆ）ＰＥＧ１５％試薬を用いたとき：  ５．０％【０１５０】５．測定結果
前記測定の結果を、図２に示した。【０１５１】  この図より、以下のことが分かる。
タンパク質（ヒト血清アルブミン）を１０ｍｇ／ｄＬ含む試料においては、いずれの場合でも、多孔性膜上の着色域の着色は濃く、試料中にタンパク質が存在すると判定することができる。【０１５２】  また、タンパク質（ヒト血清アルブミン）を含まない試料においては、試料及びタンパク質と会合体を形成する色素（エリスロシンＢ）の接触時に、水溶性高分子化合物〔ポリエチレングリコール（平均分子量１０，０００）〕が存在しない場合には、多孔性膜上の着色域の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在するときの着色域と差異が見られない。【０１５３】  しかしながら、前記接触時に、水溶性高分子化合物〔ポリエチレングリコール（平均分子量１０，０００）〕が存在する場合は、多孔性膜上の着色域の着色は薄いものであり、試料中にタンパク質が存在しないと正しく判定することができる。【０１５４】  すなわち、試料及びタンパク質と会合体を形成する色素の接触時に、水溶性高分子化合物が存在することにより、試料中のタンパク質の有無を正確に測定することができることが確かめられた。【０１５５】〔実施例２〕（塩の効果の確認）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおける、塩の効果を確認した。【０１５６】１．試薬
（１）緩衝液
緩衝液として、１００ｍＭモノクロロ酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液〔ｐＨ３．０（２０℃）〕を調製した。【０１５７】（２）塩試薬
（ａ）塩不含試薬
純水を、塩不含試薬として用意した。【０１５８】（ｂ）塩含有試薬
１Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液を調製し、塩含有試薬とした。【０１５９】（３）色素・高分子化合物試薬
色素・高分子化合物試薬として、１．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液を調製した。【０１６０】２．多孔性膜
多孔性膜として、セルロースアセテート膜（商品名「ＳＥＬＥＣＡ−Ｖ」〔東洋濾紙社〕）を用いた。【０１６１】３．試料
（イ）タンパク質不含試料
純水を、タンパク質を含まないタンパク質不含試料（タンパク質濃度：０ｍｇ／ｄＬ）とした。【０１６２】（ロ）０．０３ｍｇ／ｄＬ試料
０．０３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．０３ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０１６３】（ハ）０．１ｍｇ／ｄＬ試料
０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．１ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０１６４】（ニ）０．３ｍｇ／ｄＬ試料
０．３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．３ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０１６５】（ホ）０．７ｍｇ／ｄＬ試料
０．７ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．７ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０１６６】（ヘ）１ｍｇ／ｄＬ試料
１．０ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、１ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０１６７】（ト）２ｍｇ／ｄＬ試料
２．０ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、２ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０１６８】４．測定
（１）  前記３の試料の８５μＬに、前記１の（１）の緩衝液１０μＬを添加し、混合した。
なお、試料は、（イ）タンパク質不含試料、（ロ）０．０３ｍｇ／ｄＬ試料、（ハ）０．１ｍｇ／ｄＬ試料、（ヘ）１ｍｇ／ｄＬ試料、及び（ト）２ｍｇ／ｄＬ試料を各々別々に用いた。【０１６９】（２）  次に、前記（１）の混合液に、前記１の（２）の（ａ）の塩不含試薬５μＬを添加し、混合した。【０１７０】（３）  その次に、前記（２）の混合液に、前記１の（３）の色素・高分子化合物試薬５０μＬを添加し、混合した。【０１７１】（４）  その後、１０分間室温にて放置した。【０１７２】（５）  次に、前記混合液の５μＬを、前記２の多孔性膜の上に添加した。【０１７３】（６）  前記添加後、多孔性膜上の着色域の測定を行った。
なお、多孔性膜上の着色域の着色が濃い場合には試料中にタンパク質が存在すると判定し、前記着色域の着色が薄い場合には試料中にタンパク質が存在しないと判定した。【０１７４】  また、塩試薬を前記１の（２）の（ａ）塩不含試薬から（ｂ）塩含有試薬に変え、かつ試料を前記３の（イ）タンパク質不含試料、（ロ）０．０３ｍｇ／ｄＬ試料、（ハ）０．１ｍｇ／ｄＬ試料、（ニ）０．３ｍｇ／ｄＬ試料、及び（ホ）０．７ｍｇ／ｄＬ試料を各々別々に用いて、前記（１）〜（６）の操作に従い測定を行った。【０１７５】  なお、試料、タンパク質と会合体を形成する色素（エリスロシンＢ）、及び水溶性高分子化合物（平均分子量１０，０００のポリエチレングリコール）を接触させる際の前記の塩（塩化ナトリウム）の濃度は、各々下記の通りとなる。【０１７６】（ａ）塩不含試薬を用いたとき：  ０ｍＭ
（ｂ）塩含有試薬を用いたとき：  ３３ｍＭ【０１７７】５．測定結果
前記測定の結果を、図３に示した。【０１７８】  この図より、以下のことが分かる。
塩不含試薬を用いたときには、最低１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む試料まで、試料中にタンパク質が存在すると判定することができる。すなわち、検出限界は、１ｍｇ／ｄＬである。【０１７９】  しかしながら、塩含有試薬を用いたときには、最低０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む試料まで、試料中にタンパク質が存在すると判定することができる。すなわち、検出限界は、０．１ｍｇ／ｄＬである。【０１８０】  本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び水溶性高分子化合物を接触させる際に、塩が存在しなくとも検出限界が１ｍｇ／ｄＬと非常に高感度であるが、塩を共存させることにより測定の感度を更に１０倍高めることができることが確かめられた。【０１８１】〔実施例３〕（尿試料の測定）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにより、尿試料中のタンパク質の測定を行った。【０１８２】１．試薬
（１）緩衝液
緩衝液として、１００ｍＭモノクロロ酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液〔ｐＨ３．０（２０℃）〕を調製した。【０１８３】（２）塩試薬
１Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液を調製し、塩試薬とした。【０１８４】（３）色素・高分子化合物試薬
色素・高分子化合物試薬として、１．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液を調製した。【０１８５】２．多孔性膜
多孔性膜として、セルロースアセテート膜（商品名「ＳＥＬＥＣＡ−Ｖ」〔東洋濾紙社〕）を用いた。【０１８６】３．試料
（イ）タンパク質不含尿希釈試料
ヒトの尿を純水で３０倍希釈したものを、タンパク質を含まないタンパク質不含尿希釈試料（タンパク質濃度：０ｍｇ／ｄＬ）とした。【０１８７】（ロ）０．０３ｍｇ／ｄＬ尿希釈試料【０１８８】  前記（イ）のタンパク質不含尿希釈試料にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し、０．０３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む尿希釈試料を調製して、０．０３ｍｇ／ｄＬ尿希釈試料とした。【０１８９】（ハ）０．１ｍｇ／ｄＬ尿希釈試料
前記（イ）のタンパク質不含尿希釈試料にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し、０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む尿希釈試料を調製して、０．１ｍｇ／ｄＬ尿希釈試料とした。【０１９０】（ニ）０．３ｍｇ／ｄＬ尿希釈試料
前記（イ）のタンパク質不含尿希釈試料にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し、０．３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む尿希釈試料を調製して、０．３ｍｇ／ｄＬ尿希釈試料とした。【０１９１】（ホ）０．７ｍｇ／ｄＬ尿希釈試料
前記（イ）のタンパク質不含尿希釈試料にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し、０．７ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む尿希釈試料を調製して、０．７ｍｇ／ｄＬ尿希釈試料とした。【０１９２】４．測定
（１）  前記３の各試料の８５μＬに、それぞれ前記１の（１）の緩衝液１０μＬを添加し、混合した。【０１９３】（２）  次に、前記（１）の混合液に、前記１の（２）の塩試薬５μＬを添加し、混合した。【０１９４】（３）  その次に、前記（２）の混合液に、前記１の（３）の色素・高分子化合物試薬５０μＬを添加し、混合した。【０１９５】（４）  その後、１０分間室温にて放置した。【０１９６】（５）  次に、前記混合液の５μＬを、前記２の多孔性膜の上に添加した。【０１９７】（６）  前記添加後、多孔性膜上の着色域の測定を行った。
なお、多孔性膜上の着色域の着色が濃い場合には試料中にタンパク質が存在すると判定し、前記着色域の着色が薄い場合には試料中にタンパク質が存在しないと判定した。【０１９８】５．測定結果
前記測定の結果を、図４に示した。【０１９９】  この図より、以下のことが分かる。
ヒト尿の希釈試料中のタンパク質を測定したときにも、最低０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む試料まで、試料中にタンパク質が存在すると判定することができる。すなわち、検出限界は、０．１ｍｇ／ｄＬである。【０２００】  このことより、様々な成分を含む尿希釈試料の測定においても、これらの成分による影響を受けることなく、正確かつ高感度に試料中のタンパク質の測定が行えることが確かめられた。【０２０１】〔実施例４〕（多孔性膜を変えての測定）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいて、セルロースアセテート膜よりなる多孔性膜、及びセルロース混合エステルよりなる多孔性膜を用いて測定を行った。【０２０２】１．試薬
（１）緩衝液
緩衝液として、１００ｍＭモノクロロ酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液〔ｐＨ３．０（２０℃）〕を調製した。【０２０３】（２）塩試薬
塩試薬として、２００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を調製した。【０２０４】（３）色素・高分子化合物試薬
色素・高分子化合物試薬として、２．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液を調製した。【０２０５】２．多孔性膜
（ａ）セルロースアセテート膜よりなる多孔性膜（商品名「ＳＥＬＥＣＡ−Ｖ」〔東洋濾紙社〕）【０２０６】（ｂ）セルロース混合エステルよりなる多孔性膜（商品名「ＭＦ−メンブランフィルター（タイプＨＡ；孔径０．４５μｍ）」〔ミリポア社〕）【０２０７】３．試料
（イ）タンパク質不含試料
純水を、タンパク質を含まないタンパク質不含試料（タンパク質濃度：０ｍｇ／ｄＬ）とした。【０２０８】（ロ）０．０５ｍｇ／ｄＬ試料
０．０５ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．０５ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２０９】（ハ）０．１ｍｇ／ｄＬ試料
０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．１ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２１０】（ニ）０．２ｍｇ／ｄＬ試料
０．２ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．２ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２１１】（ホ）０．５ｍｇ／ｄＬ試料
０．５ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．５ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２１２】（ヘ）１ｍｇ／ｄＬ試料
１．０ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、１ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２１３】（ト）２ｍｇ／ｄＬ試料
２．０ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、２ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２１４】４．測定
（１）  前記３の各試料の６５μＬに、それぞれ前記１の（１）の緩衝液１０μＬを添加し、混合した。【０２１５】（２）  次に、前記（１）の混合液に、前記１の（２）の塩試薬２５μＬを添加し、混合した。【０２１６】（３）  その次に、前記（２）の混合液に、前記１の（３）の色素・高分子化合物試薬２５μＬを添加し、混合した。【０２１７】（４）  その後、１０分間室温にて放置した。【０２１８】（５）  次に、前記混合液の５μＬを、前記２の「（ａ）セルロースアセテート膜よりなる多孔性膜」の上に添加した。【０２１９】（６）  前記添加の２分後に、多孔性膜上の着色域の測定を行った。
なお、多孔性膜上の着色域の外縁が明暸でありその外縁上にリング状の線が見られる場合には試料中にタンパク質が存在すると判定し、前記着色域の外縁が不明瞭でありぼやけたものである場合には試料中にタンパク質が存在しないと判定した。【０２２０】  また、多孔性膜を前記２の「（ｂ）セルロース混合エステルよりなる多孔性膜」に変えて、前記（１）〜（６）の操作に従い測定を行った。【０２２１】５．測定結果
前記測定の結果を、図５に示した。【０２２２】  多孔性膜が「（ａ）セルロースアセテート膜よりなる多孔性膜」の場合は、最低０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む試料まで、着色域の外縁が明瞭でありその外縁上にリング状の線が見られるので、試料中にタンパク質が存在すると判定することができる。すなわち、検出限界は、０．１ｍｇ／ｄＬであった。【０２２３】  また、多孔性膜が「（ｂ）セルロース混合エステルよりなる多孔性膜」の場合においても、最低０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む試料まで、着色域の外縁が明瞭でありその外縁上にリング状の線が見られるので、試料中にタンパク質が存在すると判定することができる。すなわち、検出限界は、０．１ｍｇ／ｄＬであった。【０２２４】  これらのことより、本発明においては、多孔性膜上の着色域の外縁の明暸さによっても試料中のタンパク質の存在の有無を判定できること、及び多孔性膜がセルロースアセテート膜よりなる多孔性膜であっても、又はセルロース混合エステルよりなる多孔性膜であっても、試料中のタンパク質を正確かつ高感度に測定できることが確かめられた。【０２２５】〔実施例５〕（種々の水溶性高分子化合物の検討）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいて、種々の水溶性高分子化合物を用いて測定を行った。【０２２６】１．試薬
（１）緩衝液
緩衝液として、１００ｍＭモノクロロ酢酸ナトリウ厶−塩酸緩衝液〔ｐＨ３．０（２０℃）〕を調製した。【０２２７】（２）塩試薬
塩試薬として、２００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を調製した。【０２２８】（３）色素・高分子化合物試薬
色素・高分子化合物試薬として、下記の試薬を各々調製した。【０２２９】（ａ）ＰＥＧ４０００試薬
２．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量４，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３０】（ｂ）ＰＥＧ８０００試薬
２．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量８，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３１】（ｃ）ＰＥＧ１００００試薬
２．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量１０，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３２】（ｄ）ＰＥＧ２００００試薬
２．０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〔平均分子量２０，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３３】（ｅ）α−ＣＤ試薬
２．０％α−サイクロデキストリン（α−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３４】（ｆ）β−ＣＤ試薬
２．０％β−サイクロデキストリン（β−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３５】（ｇ）γ−ＣＤ試薬
２．０％γ−サイクロデキストリン（γ−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３６】（ｈ）ＨＰ−α−ＣＤ試薬
２．０％ヒドロキシプロピル−α−サイクロデキストリン（ＨＰ−α−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３７】（ｉ）ＨＰ−β−ＣＤ試薬
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３８】（ｊ）ＨＰ−γ−ＣＤ試薬
２．０％ヒドロキシプロピル−γ−サイクロデキストリン（ＨＰ−γ−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２３９】（ｋ）ＨＢ−α−ＣＤ試薬
２．０％ヒドロキシブチル−α−サイクロデキストリン（ＨＢ−α−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４０】（ｌ）ＣＡ−β−ＣＤ試薬
２．０％カチオニック−β−サイクロデキストリン（ＣＡ−β−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４１】（ｍ）ＭＡ−β−ＣＤ試薬
２．０％マルトシル−β−サイクロデキストリン（ＭＡ−β−ＣＤ）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４２】（ｎ）デキストラン１０試薬
２．０％デキストラン〔平均分子量１０〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４３】（ｏ）デキストラン５００試薬
２．０％デキストラン〔平均分子量５００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４４】（ｐ）デキストラン７１５００試薬
２．０％デキストラン〔平均分子量７１，５００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４５】（ｑ）デキストラン１５００００試薬
２．０％デキストラン〔平均分子量１００，０００〜２００，０００〕、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４６】（ｒ）ＢＬ−９ＥＸ試薬
２．０％ＢＬ−９ＥＸ（非イオン性界面活性剤）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４７】（ｓ）ＢＬ−２５試薬
２．０％ＢＬ−２５（非イオン性界面活性剤）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４８】（ｔ）ＮＰ−１５試薬
２．０％ＮＰ−１５（非イオン性界面活性剤）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２４９】（ｕ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００試薬
２．０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（非イオン性界面活性剤）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２５０】（ｖ）ＰＯＮＰＥ−２０試薬
２．０％ＰＯＮＰＥ−２０（非イオン性界面活性剤）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２５１】（ｗ）ＫＦ−６０１１試薬
２．０％ＫＦ−６０１１（変性シリコンオイル）、及び５００μＭエリスロシンＢを含む水溶液。【０２５２】２．多孔性膜
セルロース混合エステルよりなる多孔性膜（商品名「ＭＦ−メンブランフィルター（タイプＨＡ；孔径０．４５μｍ）」〔ミリポア社〕）【０２５３】３．試料
（イ）タンパク質不含試料
純水を、タンパク質を含まないタンパク質不含試料（タンパク質濃度：０ｍｇ／ｄＬ）とした。【０２５４】（ロ）０．０５ｍｇ／ｄＬ試料
０．０５ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．０５ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２５５】（ハ）０．１ｍｇ／ｄＬ試料
０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．１ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２５６】（ニ）０．２ｍｇ／ｄＬ試料
０．２ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．２ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２５７】（ホ）０．５ｍｇ／ｄＬ試料
０．５ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、０．５ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２５８】（ヘ）１ｍｇ／ｄＬ試料
１．０ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、１ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２５９】（ト）２ｍｇ／ｄＬ試料
２．０ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製し、２ｍｇ／ｄＬ試料とした。【０２６０】４．測定
（１）  前記３の各試料の６５μＬに、それぞれ前記１の（１）の緩衝液１０μＬを添加し、混合した。【０２６１】（２）  次に、前記（１）の混合液に、前記１の（２）の塩試薬２５μＬを添加し、混合した。【０２６２】（３）  その次に、前記（２）の混合液に、前記１の（３）の色素・高分子化合物試薬２５μＬを添加し、混合した。
なお、この色素・高分子化合物試薬は、（ａ）ＰＥＧ４０００試薬〜（ｗ）ＫＦ−６０１１試薬の計２３種類の試薬を各々別々に用いた。【０２６３】（４）  その後、１０分間室温にて放置した。【０２６４】（５）  次に、前記混合液の５μＬを、前記２の多孔性膜の上に添加した。【０２６５】（６）  前記添加の２分後に、多孔性膜上の着色域の測定を行った。
なお、多孔性膜上の着色域の外縁が明暸でありその外縁上にリング状の線が見られる場合には試料中にタンパク質が存在すると判定し、前記着色域の外縁が不明瞭でありぼやけたものである場合には試料中にタンパク質が存在しないと判定した。【０２６６】５．測定結果
色素・高分子化合物試薬が、（ａ）ＰＥＧ４０００試薬、（ｂ）ＰＥＧ８０００試薬、（ｃ）ＰＥＧ１００００試薬、及び（ｄ）ＰＥＧ２００００試薬の場合には、最低０．１ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミンを含む試料まで、着色域の外縁が明瞭でありその外縁上にリング状の線が見られ、試料中にタンパク質が存在すると判定することができた。すなわち、検出限界は、０．１ｍｇ／ｄＬであった。【０２６７】  しかしながら、色素・高分子化合物試薬が他の試薬の場合においては、試料中にタンパク質が存在する場合と存在しない場合とで、多孔性膜上の着色域の差異は大きくはなく、水溶性高分子化合物としてポリエチレングリコールを用いたときに比べると顕著ではなかった。【０２６８】  すなわち、本発明における水溶性高分子化合物としては、ポリエチレングリコールが好ましいことが確かめられた。【０２６９】
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】  本発明の試料中のタンパク質の測定において、多孔性膜上に添加した混合液が多孔性膜に吸収される様子を示した模式図である。
【図２】  本発明の試料中のタンパク質の測定における、水溶性高分子化合物の効果を示した図である。
【図３】  本発明の試料中のタンパク質の測定における、塩を共存させることの効果を示した図である。
【図４】  本発明の試料中のタンパク質の測定における、尿試料中のタンパク質の測定結果を示した図である。
【図５】  本発明の試料中のタンパク質の測定における、セルロースアセテート膜よりなる多孔性膜、又はセルロース混合エステルよりなる多孔性膜を用いたときの測定結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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