(57)【要約】【課題】捕捉抗体と標識抗体の会合に由来する非特異吸着を抑制し、測定感度の向上を図る。【解決手段】  測定用プローブの抗体タンパク１１に対して遊離のアミノ残基（ＮＨ2）１２を置換して、その後に封止のための原子団１３を設ける処理が施されている。これにより、捕捉抗体と標識抗体の会合による非特異吸着が抑制される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体タンパクを担体に固定した免疫法測定用プローブにおいて、前記抗体タンパク上のアミノ残基を置換して封止する処理を施したことを特徴とする免疫法測定用プローブ。
【請求項２】
前記担体は光導波路としたことを特徴とする請求項１に記載の免疫法測定用プローブ。
【請求項３】
前記置換により誘導される原子団は親水性かつ非塩基性であることを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫法測定用プローブ。
【請求項４】
前記原子団は官能基としてヒドロキシ基又はオキソ基を含む原子団であることを特徴とする請求項３に記載の免疫法測定用プローブ。
【請求項５】
蛍光又は発光の検出を行う請求項１〜４の何れか１つの請求項に記載の免疫法測定用プローブ。
【請求項６】
抗体タンパク上のアミノ残基を置換する封止処理工程と、次いで前記抗体タンパクを担体に固定する工程とを有することを特徴とする免疫法測定用プローブの製造方法。
【請求項７】
担体に対し抗体タンパクを固定する工程と、次いで前記抗体タンパク上のアミノ残基を置換する封止処理工程とを有することを特徴とする免疫法測定用プローブの製造方法。
【請求項８】
前記置換はＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルと前記アミノ残基との反応によることを特徴とする請求項６又は７に記載の免疫法測定用プローブの製造方法。
【請求項９】
アミノ残基を置換して封止する処理を施した抗体タンパクを備えた請求項１〜５の何れか１つの請求項に記載の測定用プローブを用いることを特徴とする免疫法測定用プローブを用いた免疫測定方法。
【請求項１０】
蛍光又は発光の検出を行うことを特徴とする請求項９に記載の免疫法測定用プローブを用いた免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク、化学物質などを相応する抗体を用いて測定する免疫法測定用プローブ及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫法は簡便かつ選択性の高い測定法として、細菌、ウイルス、タンパク質などの検出に多用されている。その中でも、担体に固定された捕捉抗体で測定対象の抗原を捕捉し、次いでこの抗原を標識抗体でラベルするサンドイッチ法は、非特許文献１に記載されているように選択性や定量性を向上させ易い方法である。
【０００３】
また、標識物質に様々な機能性物質を用いることで、検出感度の向上を図ることに適しており、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫法）、蛍光免疫法、化学発光免疫法などに応用されている。特に、蛍光や発光を用いる方法は、特許文献１、２のように光学装置と組み合わせることにより短時間で高感度な検出が行い易い。
【０００４】
サンドイッチ法における実質的な検出限界は、抗原−抗体反応によらない標識抗体の吸着、所謂非特異吸着に影響を受ける。即ち、抗原量の増加に対する応答信号量の増加が鋭敏であっても、非特異吸着に由来する信号以下の信号増加分は、潜在的に発生する誤差として扱われる。
【０００５】
非特異吸着の一般的な形態としては、標識抗体が未被覆の捕捉抗体の担体である基材に吸着する現象があり、これに対しては、特許文献３、４のように当該反応に不活性なタンパク又は合成高分子による基材の被覆、所謂ブロッキングが行われる。
【０００６】
【非特許文献１】免疫学辞典（東京化学同人）２４１頁
【特許文献１】特許第２０１２０５４号公報
【特許文献２】米国特許６１３６６１１号公報
【特許文献３】特許第２５７２２６７号公報
【特許文献４】特開平４−１９５６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
高感度な測定、つまりより小さな信号量を扱う場合においては、基材への非特異吸着が十分に抑えられていても、なお問題となる非特異吸着が見られる場合があり、これは捕捉抗体と標識抗体の親和的会合に起因すると考えられ、これを従来のブロッキングにより抑制することは困難である。
【０００８】
本発明の目的は、上述の問題点を解消し、非特異吸着を抑制した免疫法測定用プローブ及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するための本発明に係る免疫法測定用プローブは、抗体タンパクを担体に固定した免疫法測定用プローブにおいて、前記抗体タンパク上のアミノ残基を置換して封止する処理を施したことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係る免疫法測定用プローブの製造方法は、抗体タンパク上のアミノ残基を置換する封止処理工程と、次いで前記抗体タンパクを担体に固定する工程とを有することを特徴とする。
【００１１】
更に、本発明に係る免疫法測定用プローブの製造方法は、担体に対し抗体タンパクを固定する工程と、次いで前記抗体タンパク上のアミノ残基を置換する封止処理工程とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る免疫法測定用プローブ及びその製造方法によれば、捕捉抗体と標識抗体の会合に由来する非特異吸着を抑制し、サンドイッチ法を含む免疫法において測定感度の向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明を図示の実施例に基づいて詳細に説明する。
本明細書で免疫法測定用プローブと称するものは、捕捉抗体が固定され、測定対象である抗原を含む検体に接触してその抗原量を測定するための不溶性担体から成る小片を指しているが、ＥＬＩＳＡ法に多用されるウェル、イムノクロマト用の短冊型シート、装置に着脱して用いられる種々の形状の部材が挙げられる。
【００１４】
図１はその一例のポリスチレン製の測定用プローブ１を示し、フランジ部位２の上部にレンズ部位３が設けられ、下部に光導波路となるファイバ部位４が設けられ、ファイバ部位４の先端は吸光塗料塗布部５とされている。
【００１５】
そして、担体となるファイバ部位４は抗体タンパクが固定される。抗体タンパク１１は、図２（ａ）に示すように遊離のアミノ残基（ＮＨ2）１２を置換して、（ｂ）に示すように封止のための原子団１３を設ける処理が施されている。これは抗体タンパク上１１のアミノ残基１２を修飾した際に、捕捉抗体と標識抗体の会合に由来する非特異吸着が抑制される現象を本発明者らが見い出したことによる。
【００１６】
本発明の効果を示す詳細な機構は解明されていないが、卵白アビジンとストレプトアビジンの相違のように、塩基性の強い部材で非特異吸着が起こり易いことから、抗体タンパク上の遊離アミノ基が非特異吸着の原因となることが推測され、これを封止することで効果が現れると考えられる。従って、置換原子団としては塩基性のものは避けるべきである。また、その他の会合を促進し易いものとして、極度に疎水性の高いものも避けるべきであり、親水性のものが好ましい。
【００１７】
前記の条件に好適な原子団として、ヒドロキシ基（−ＯＨ）又はオキソ基（＝Ｏ）を含むものが挙げられる。オキソ基を含むものとしては、カルボニル、アミド、イミド、ホスホリル、スルホニルなどが挙げられる。糖類（単糖、オリゴ糖で塩基性でないもの）、リン酸、乳酸、ビオチン、ピルビン酸、アスコルビン酸などは、前期構造を含む生化学的成分として利用し易い。また、これらを端末に有する炭素数６程度までの短鎖アルキル基なども用いることができる。
【００１８】
逆に、好ましくない原子団としては、一級アミン、含窒素共役系（ピリジン環、イミダゾール環など）など塩基性のものが挙げられる。親水性かつ非塩基性の原子団であっても、抗体の機能を阻害するようなものは好ましくない。例えば、立体障害の極度に大きいものが挙げられる。標識の機能に干渉しないことも重要であり、例えば蛍光標識物質に対して消光剤となるものは好ましくない。また、抗体が認識するエピトープ（抗原決定基）が好ましくないことは云うまでもない。
【００１９】
この測定用プローブ１の製造方法はとしては、（１）抗体タンパク１１上のアミノ残基１２を置換して封止する処理を施し、その後に抗体タンパク１１をファイバ部位４に固定する方法と、（２）ファイバ部位４に抗体タンパク１１を固定し、その後に抗体タンパク１１上のアミノ残基１２を置換して封止する方法の２つがある。後者は固液反応のための速度的不利が考えられるが、ｐＨや濃度の都合などで原料の抗体溶液に対する反応が行い難い場合に有用である。また、未反応の試薬や副生成物の除去が容易という利点もある。
【００２０】
なお、ファイバ部位４に露出部があって、これに対するブロッキングが必要な場合は、併せて公知のブロッキング操作を行うことが望ましい。
【００２１】
置換の方法としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルとアミノ残基との反応を用いることが好ましい。抗体タンパク上のアミノ残基の置換方法としては、種々の公知の化学反応を用いることができるが、抗体タンパクの機能を損う虞れが少ない方法として、常温付近で十分な反応が可能である次の化学式１に示すＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルによる置換反応が好ましい。なお、Ｒ１は誘導する原子団を含む部位、Ｒ２は抗体タンパクである。誘導する原子団にカルボキシル基を用意しておき、適当な縮合剤によりＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルとする。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
本発明はより微小な信号の優位性が必要となる免疫測定法に対して有意義であって、蛍光又は発光の検出を行う系に対して極めて効果的である。蛍光標識や化学発光標識などを用いる手法は、色素の吸収を測定するよりも一般に高感度であるが、非特異吸着成分についても高感度に検出してしまうので、これを抑制することに意義がある。従って、本発明を組み合わせることで感度向上に対する相乗効果が得られる。
【００２４】
次に、エバネッセント波励起蛍光免疫法に適用した実験例を説明する。以下の例は、本発明のより好適な形態の１つであるが、本発明の適用範囲を限定するものではない。
【００２５】
封止処理用のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルは、表１に示す誘導試薬とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（過剰量）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミンとジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、室温で縮合反応を行い、カラムクロマトグラフィにより精製して得た。
【００２６】
表１
Ｎｏ．                  実験例１     実験例２     実験例３     比較例
誘導試薬            ６−アジポイル  ビオチン  パントテン酸  (封止なし)
グルコース
非特異吸着信号            ×            ×           ×           ○
３×１０2ＣＦＵ／ｍｌ     ○            ○           ○           ×
３×１０4ＣＦＵ／ｍｌ     ○            ○           ○           ×
３×１０6ＣＦＵ／ｍｌ     ○            ○           ○           ○
【００２７】
抗体タンパクにはウサギ抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ポリクローナル抗体を用いた。封止処理は１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液（ｐＨ９．３）１ｍｌに前記エステルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５μｍｏｌ／ｍｌ）１２５μｌを加え、４℃で１２時間撹拌することで行った。この溶液を４０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４に希釈し、実験例１〜３として、この溶液に測定用プローブ１のファイバ部位４を１６時間浸漬することで抗体タンパクを固定した。また、比較例として処理なし抗体タンパクを同様に固定した。これら測定用プローブ１は、念のために牛血清アルブミン溶液でブロッキング処理を行って使用した。
【００２８】
蛍光標識抗体は未処理の同じ抗体タンパクに、Ｃｙ５  bisfunctional reactive dye（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて作製した。緩衝液はポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを０．５質量％含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。検体はこの緩衝液にそれぞれ３×１０2ＣＦＵ／ｍｌ、３×１０4ＣＦＵ／ｍｌ、３×１０6ＣＦＵ／ｍｌとなるように、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を分散させた。
【００２９】
これらの測定用プローブ１の効果を確認するための検証は、図３に示す測定装置を用いて行った。即ち、測定用プローブ１を測定ポート２１内の液槽部２２に挿入し、フランジ部位２により固定した。測定ポート２１には、液槽部２２に対する送液口２３、排液口２４が設けられている。
【００３０】
半導体レーザー光源２５からの光（６３５ｎｍ）は、レンズ２６、ハーフミラー２７、レンズ２８を通過して測定用プローブ１の上方のレンズ部位３から測定用プローブ１内に入射される。ファイバ部位４において励起された帰還光は、ハーフミラー２７で水平方向に取り出され、フィルタ２９、レンズ３０を介して分光され、フォトダイオード３１で検出される。
【００３１】
測定手順は下記の通りである。
【００３２】
（１）ベースラインの測定（３回繰り返す）
緩衝液を液槽部２２に注入し、測定用プローブ１自体の散乱及び反射に基く信号光をフォトダイオード３１で測光する。
【００３３】
（２）非特異的吸着分の測定（３回繰り返す）
（イ）２μｇ／ｍｌの蛍光標識抗体タンパクを含む緩衝液を液槽部２２に注入し、５分間静置する。
（ロ）緩衝液２ｍｌを液槽部２２に送液し、終了後の液浸状態で信号光を測光する。
【００３４】
（３）検体の測定（低濃度から高濃度に順次連続する）
（イ）検体１ｍｌを１０分間かけて徐々に液槽部２２に送液する。
（ロ）緩衝液２ｍｌを液槽部２２に送液する。
（ハ）２μｇ／ｍｌの蛍光標識抗体を含む緩衝液を液槽部２２に注入し、５分間静置する。
（ニ）緩衝液２ｍｌを液槽部２２に送液し、終了後の液浸状態で信号光を測光する。
【００３５】
これらの測定結果は表１に示す通りであり、表中の○及び×はそれぞれ有意か非有意かの判定を示している。この判定は非特異吸着信号についてはベースライン信号の標準偏差の３倍以上の増加分、検体信号については非特異吸着信号の標準偏差の３倍以上の増加分をもって有意とした。捕捉抗体タンパクの処理を行うことで非特異吸着信号を抑制し、より低濃度の検体を判定できることが確認された。
【００３６】
また実験例４として、実験例２で使用したビオチン結合エステルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５μｍｏｌ／ｍｌ）７５μｌをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）６００μｌに混合し、この溶液に比較例と同様の封止処理をしない測定用プローブ１を３０分浸漬した。
【００３７】
ブロッキング処理は行わずに、実験例１〜３と同様の蛍光免疫測定を行った結果、非特異吸着信号は僅かに見られたが、３×１０4ＣＦＵ／ｍｌを有意に検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】測定用プローブの側面図である。
【図２】本発明の封止処理の概念図である。
【図３】測定装置の構成図である。
【符号の説明】
【００３９】
１  測定用プローブ
２  フランジ部位
３  レンズ部位
４  ファイバ部位
５  吸光塗料塗布部
１１  抗体タンパク
１２  アミノ残基
１３  封止のための原子団
２１  測定ポート
２５  半導体レーザー光源
３１  フォトダイオード
【図１】
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【図２】
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【図３】
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