(57)【要約】      （修正有）【課題】試料に含まれる核酸、タンパク質、ハプテンなどの標的物質を強いシグナルで検出できるプローブセット及び熱変性の工程を必要としない標的物質検出方法を提供する。【解決手段】標的物質と結合可能な標的結合物質及び塩基配列Ｘ１を有する一次プローブと、前記塩基配列Ｘ１とハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ１ｃ及び塩基配列Ｘ２ｃを有する二次プローブと、前記塩基配列Ｘ２ｃとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ２を有する三次プローブを含むプローブセットによる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質と結合可能な標的結合物質及び塩基配列Ｘ１を有する一次プローブと、前記塩基配列Ｘ１とハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ１ｃ及び塩基配列Ｘ２ｃを有する二次プローブと、前記塩基配列Ｘ２ｃとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ２を有する三次プローブと、を含むプローブセット。
【請求項２】
前記三次プローブが、前記塩基配列Ｘ１ｃとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ１をさらに有する請求項１記載のプローブセット。
【請求項３】
前記一次プローブが、前記塩基配列Ｘ１とは異なる位置に、塩基配列Ｙ及び前記塩基配列Ｙとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｙｃとを有する請求項１又は２記載のプローブセット。
【請求項４】
前記一次プローブの塩基配列Ｘ１が前記塩基配列Ｙ又は前記塩基配列Ｙｃと隣接する請求項３記載のプローブセット。
【請求項５】
前記一次プローブの塩基配列Ｘ１が一次プローブの一端に位置し、前記二次プローブが前記塩基配列Ｘ１ｃと前記塩基配列Ｘ２ｃとが隣接した塩基配列であり、前記三次プローブが前記塩基配列Ｘ２と前記塩基配列Ｘ１とが隣接した塩基配列である請求項２〜４の何れかに記載のプローブセット。
【請求項６】
前記標的物質が核酸、タンパク質、多糖類、ホルモンからなる群より選択される請求項１〜５の何れかに記載のプローブセット。
【請求項７】
前記標的結合物質が核酸、抗体及びレセプターからなる群より選択される請求項１〜６の何れかに記載のプローブセット。
【請求項８】
請求項１記載のプローブセットを含む標的物質検出用試薬。
【請求項９】
請求項１記載のプローブセットを含む試薬及びライゲースを含む試薬を備えた標的物質検出用試薬キット。
【請求項１０】
以下の工程を含む標的物質検出方法：
（ａ）標的物質を含む試料と、標的物質と結合可能な標的結合物質及び塩基配列Ｘ１を有する一次プローブと、前記塩基配列Ｘ１とハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ１ｃ及び塩基配列Ｘ２ｃを有する二次プローブと、前記塩基配列Ｘ２ｃとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ２を有する三次プローブと、を準備する工程；
（ｂ）前記一次プローブと標的物質とを結合させる工程；
（ｃ）前記一次プローブと前記二次プローブとをハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記二次プローブと前記三次プローブとをハイブリダイズさせる工程。
【請求項１１】
前記工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（ｃ）及び工程（ｄ）の順に各工程を実行し、前記標的物質と前記一次プローブと前記二次プローブと前記三次プローブとが結合した検出用複合体を形成させる請求項１０記載の標的物質検出方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）及び工程（ｂ）の順に各工程を実行し、前記標的物質と前記一次プローブと前記二次プローブと前記三次プローブとが結合した検出用複合体を形成させる請求項１０記載の標的物質検出方法。
【請求項１３】
（ｅ）  前記検出用複合体を構成する三次プローブと前記検出用複合体を構成しない遊離の二次プローブとをハイブリダイズさせる工程、及び
（ｆ）  前記工程（ｄ）及び工程（ｅ）を繰り返すことにより前記検出用複合体を伸長させる工程、を含む請求項１１又は１２記載の標的物質検出方法。
【請求項１４】
前記検出用複合体を形成する各プローブの隣り合う末端同士を連結させる工程をさらに含む請求項１０〜１３の何れかに記載の標的物質検出方法。
【請求項１５】
前記検出用複合体を形成する各プローブの隣り合う末端同士を、ライゲースを用いて連結させる工程をさらに含む請求項１０〜１３の何れかに記載の標的物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる標的物質を検出するためのプローブセット及びこのプローブセットを用いた標的物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料中の標的核酸を検出するための方法として、サザンハイブリダイゼーション(southern hybridization)、ノーザンハイブリダイゼーション(northern hybridization)、in situ ハイブリダイゼーション(in situ hybridization)などがよく知られている。これらは、標的核酸をブロッティングしたメンブレンや固定した細胞などに、ラベル化したプローブをハイブリダイズさせ、このラベルを検出することによって標的核酸の存在及び／又はその位置を検出する方法である。これらの方法は、標的核酸の増幅を行わないため、特に試料中の標的核酸が微量である場合、シグナルが弱く検出感度が低い。
【０００３】
核酸増幅を行って試料中の核酸を検出する方法の一つとして、特許文献１に記載された方法を用いることができる。この方法は以下のステップを含む。標的核酸を含む試料、プローブＡ、及びプローブＢを混合して反応用混合液を作製する。標的核酸にプローブＢを環状にハイブリダイズさせ、プローブＢの５’末端と３’末端をライゲースにより結合させる。反応用混合液を９０度以上の高温にして標的核酸とプローブＢとのハイブリダイゼーションを熱変性させる。熱変性させると、環状のプローブＢに一本鎖の標的核酸が貫通する構造を取り得る。反応用混合液の温度を下げ、環状のプローブＢにプローブＡを環状にハイブリダイズさせ、プローブＡの５’末端と３’末端をライゲースにより結合させる。このようにして標的核酸１分子に鎖状にプローブＡ及びプローブＢを結合させる。標的核酸に結合したプローブＡ及びプローブＢをラベル化することにより、試料に微量に含まれる核酸でも強いシグナルで検出することが可能となる。
【０００４】
しかしながら、上記方法は核酸のみを標的としており、タンパク質など他の物質を検出することができない。また、反応用混合液を９０度以上の高温にして熱変性を行うステップが必要であり、一定時間反応用混合液を高温に保つ装置が必要となる。
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２３８９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、試料に含まれる核酸、タンパク質、ハプテンなどの標的物質を強いシグナルで検出できるプローブセット及び熱変性の工程を必要としない標的物質検出方法を提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、標的物質と結合可能な標的結合物質及び塩基配列Ｘ１を有する一次プローブと、前記塩基配列Ｘ１とハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ１ｃ及び塩基配列Ｘ２ｃを有する二次プローブと、前記塩基配列Ｘ２ｃとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ２を有する三次プローブと、を含むプローブセットにより標的物質を強いシグナルで検出できることを見出し、熱変性の工程を必要としない標的物質検出方法に関する本発明を完成することができた。
【０００８】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．標的物質と結合可能な標的結合物質及び塩基配列Ｘ１を有する一次プローブと、前記塩基配列Ｘ１とハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ１ｃ及び塩基配列Ｘ２ｃを有する二次プローブと、前記塩基配列Ｘ２ｃとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ２を有する三次プローブと、を含むプローブセット。
２．前記三次プローブが、前記塩基配列Ｘ１ｃとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ１をさらに有する前項１記載のプローブセット。
３．前記一次プローブが、前記塩基配列Ｘ１とは異なる位置に、塩基配列Ｙ及び前記塩基配列Ｙとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｙｃとを有する前項１又は２記載のプローブセット。
４．前記一次プローブの塩基配列Ｘ１が前記塩基配列Ｙ又は前記塩基配列Ｙｃと隣接する前項３記載のプローブセット。
５．前記一次プローブの塩基配列Ｘ１が一次プローブの一端に位置し、前記二次プローブが前記塩基配列Ｘ１ｃと前記塩基配列Ｘ２ｃとが隣接した塩基配列であり、前記三次プローブが前記塩基配列Ｘ２と前記塩基配列Ｘ１とが隣接した塩基配列である前項２〜４の何れかに記載のプローブセット。
６．前記標的物質が核酸、タンパク質、多糖類、ホルモンからなる群より選択される前項１〜５の何れかに記載のプローブセット。
７．前記標的結合物質が核酸、抗体及びレセプターからなる群より選択される前項１〜６の何れかに記載のプローブセット。
８．前項１記載のプローブセットを含む標的物質検出用試薬。
９．前項１記載のプローブセットを含む試薬及びライゲースを含む試薬を備えた標的物質検出用試薬キット。
１０．以下の工程を含む標的物質検出方法：
（ａ）標的物質を含む試料と、標的物質と結合可能な標的結合物質及び塩基配列Ｘ１を有する一次プローブと、前記塩基配列Ｘ１とハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ１ｃ及び塩基配列Ｘ２ｃを有する二次プローブと、前記塩基配列Ｘ２ｃとハイブリダイズ可能な塩基配列Ｘ２を有する三次プローブと、を準備する工程；
（ｂ）前記一次プローブと標的物質とを結合させる工程；
（ｃ）前記一次プローブと前記二次プローブとをハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記二次プローブと前記三次プローブとをハイブリダイズさせる工程。
１１．前記工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（ｃ）及び工程（ｄ）の順に各工程を実行し、前記標的物質と前記一次プローブと前記二次プローブと前記三次プローブとが結合した検出用複合体を形成させる前項１０記載の標的物質検出方法。
１２．前記工程（ａ）、工程（ｃ）、工程（ｄ）及び工程（ｂ）の順に各工程を実行し、前記標的物質と前記一次プローブと前記二次プローブと前記三次プローブとが結合した検出用複合体を形成させる前項１０記載の標的物質検出方法。
１３．（ｅ）  前記検出用複合体を構成する三次プローブと前記検出用複合体を構成しない遊離の二次プローブとをハイブリダイズさせる工程、及び
（ｆ）  前記工程（ｄ）及び工程（ｅ）を繰り返すことにより前記検出用複合体を伸長させる工程、を含む前項１１又は１２記載の標的物質検出方法。
１４．前記検出用複合体を形成する各プローブの隣り合う末端同士を連結させる工程をさらに含む前項１０〜１３の何れかに記載の標的物質検出方法。
１５．前記検出用複合体を形成する各プローブの隣り合う末端同士を、ライゲースを用いて連結させる工程をさらに含む前項１０〜１３の何れかに記載の標的物質検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプローブセットを用いると、試料中に含まれる核酸、タンパク質、ハプテンなどの標的物質に一次プローブを結合させ、さらに二次プローブ及び三次プローブを前記一次プローブに結合させることによって検出用複合体を形成させ、この検出用複合体に基づいて前記標的物質を強いシグナルで検出することができる。また本発明の標的物質検出方法によると、熱変性の工程を必要せずに検出用複合体を形成させることができ、この検出用複合体に基づいて前記標的物質を強いシグナルで検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書における「核酸」とは、ＤＮＡやＲＮＡだけではなく、ＰＮＡ (Peptide Nucleic Acid)やＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、これらの類縁体など、人工的に合成された核酸（以下、人工核酸とする）をも含む。また、本明細書における「塩基配列（以下、単に配列ともいう）」とはＤＮＡやＲＮＡの塩基配列だけでなく、ＰＮＡ、ＢＮＡ、これらの類縁体など、人工核酸の塩基配列をも含む。
【００１１】
＜標的物質＞
本発明のプローブセットによって検出される標的物質としては特に限定されない。例えば、核酸、タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、オータコイド、ハプテンなどが挙げられる。細菌や花粉などの細胞も標的物質となり得る。
【００１２】
＜プローブセット＞
本実施形態で用いられるプローブセットは一次プローブ、二次プローブ、及び 三次プローブの３種類のプローブを含む。標的物質を検出する際には、標的物質とこれらのプローブが結合した検出用複合体が形成される。
以下、各プローブについて説明する。
【００１３】
（１）一次プローブ
一次プローブは、標的物質と結合可能な物質（以下、「標的結合物質」とする）と塩基配列Ｘ１とを有する。この配列Ｘ１は後述する二次プローブが有する塩基配列Ｘ１ｃとハイブリダイズすることが可能である。配列Ｘ１は一次プローブの末端に位置することが好ましい。
【００１４】
「標的結合物質」としては、上述した標的物質に結合可能な物質であれば特に限定されない。例えば、標的物質が核酸の場合、この核酸に相補的な塩基配列を有する核酸などが用いられる。標的物質がタンパク質の場合は、このタンパク質に特異的な抗体、アプタマーなどが用いられる。標的物質が抗体である場合は、その抗体に特異的に結合する抗原を用いてもよい。標的物質がホルモン、神経伝達物質、オータコイドなどの場合は、これらと結合できる受容体などが用いられる。標的物質がハプテンの場合は、このハプテンに特異的な抗体などが用いられる。標的物質が細胞の場合は、その細胞の表面に露出している物質に特異的な抗体などが用いられる。
【００１５】
一次プローブは、塩基配列Ｓ及びこの塩基配列Ｓにハイブリダイズ可能な塩基配列Ｓｃを有していてもよい。この場合、配列Ｓは配列Ｓｃとハイブリダイズし、一次プローブは、この部分がダブルストランドとなりステムループ構造を形成する。ステムループ構造を形成させることによって、一次プローブを安定化することができる。配列Ｓの長さは、上記構造を形成できるように配列Ｓｃとハイブリダイズすることができれば特に限定されないが、配列Ｓ及び配列ＳｃのＴｍ値が検出用複合体を形成させるときの反応温度よりも高くなることが好ましい。具体的には、配列Ｓの長さは７塩基以上にすることが好ましい。
【００１６】
（２）二次プローブ
二次プローブは、一次プローブの配列Ｘ１にハイブリダイズ可能な配列Ｘ１ｃと配列Ｘ２ｃとを有する。
二次プローブは、配列Ｘ１ｃと配列Ｘ２ｃとが核酸やヘキサエチレングリコール等のポリエーテルアルコールなどの高分子を介して接続されていてもよいが、これらの配列が直接連結された構造であることが好ましい。配列と配列とが上記のような高分子を介して接続されている場合、本明細書では介在する部分を介在部と称する。
【００１７】
（３）三次プローブ
三次プローブは、二次プローブの配列Ｘ２ｃにハイブリダイズ可能な配列Ｘ２を有する。さらに三次プローブは、配列Ｘ１を有するのが好ましい。この場合、三次プローブは、配列Ｘ２と配列Ｘ１との間に介在部を有していてもよいが、これらの配列が直接連結された構造であることが好ましい。
【００１８】
一次プローブの配列Ｘ１が一次プローブの末端に位置し、二次プローブが配列Ｘ１ｃ及び配列Ｘ２ｃを連結させた構造であり、三次プローブが配列Ｘ１及び配列Ｘ２を連結させた構造であることにより、これらのプローブが検出用複合体を形成したときに各プローブの末端を後述する方法により連結させることが可能となる。
【００１９】
配列Ｘ１，配列Ｘ１ｃ、配列Ｘ２、配列Ｘ２ｃの長さはそれぞれ特に限定されないが、好ましくは４〜２０塩基、より好ましくは４〜１０塩基、最も好ましいのは４〜８塩基である。
【００２０】
＜標的物質の検出＞
本発明の標的物質を検出するための方法は、次の工程を含む方法による。
（ａ）標的物質を含む試料と、標的物質と結合可能な標的結合物質及び配列Ｘ１を有する一次プローブと、前記配列Ｘ１とハイブリダイズ可能な配列Ｘ１ｃ及び配列Ｘ２ｃを有する二次プローブと、前記配列Ｘ２ｃとハイブリダイズ可能な配列Ｘ２を有する三次プローブと、を準備する工程
（ｂ）前記一次プローブと標的物質とを結合させる工程
（ｃ）前記一次プローブと前記二次プローブとをハイブリダイズさせる工程
（ｄ）前記二次プローブと前記三次プローブとをハイブリダイズさせる工程。
上記工程を含む方法であれば、（ｂ）〜（ｄ）の工程の順序は特に限定されない。
さらに、（ｅ）前記検出用複合体を構成する三次プローブと前記検出用複合体を構成しない遊離の二次プローブとをハイブリダイズさせる工程、及び
（ｆ）前記工程（ｄ）及び工程（ｅ）を繰り返すことにより前記検出用複合体を伸長させる工程などを含んでいてもよい。
【００２１】
標的物質を検出するための方法としては、様々な方法が考えられ、特に限定されない。例えば、プレートを用いる方法がある。この方法によると、先ず、試料に含まれる物質をプレートのウェルに固定し、ここに上記プローブセットを添加して、反応させる。試料に標的物質が含まれる場合、ウェルに固定された標的物質とプローブが結合するため、反応液を除去しても検出用複合体がウェル中に固定される。
【００２２】
また、図１に示すように磁気ビーズを用いる方法もある。この方法によると、先ず、標的結合物質に磁気ビーズを付加し、これを内側又は外側の一部に磁気を有する物質又は鉄などの磁気に吸着する物質（以下、捕捉領域とする）を備えたキャピラリ内に流す。これと同時又はこの後に、上述のプローブセットと試料とをキャピラリ内に流す。図１に示すように、試料に標的物質が含まれる場合は、磁気ビーズを有する標的結合物質と、検出用複合体の標的結合物質が標的物質を介してサンドイッチ状に結合する。このサンドイッチ状の複合体はキャピラリ内の捕捉領域に固定される。標識物質に結合できない検出用複合体、二次プローブと三次プローブのみが結合した複合体などは捕捉領域にトラップされることはなく、そのまま流れていく。なお、磁気ビーズを有する標的結合物質が認識する標的物質の部位と、検出用複合体の標的結合物質が認識する標的物質の部位は異なっていることが好ましい。なお、磁気ビーズの代わりに、鉄などの磁気に吸着する物質を用い、キャピラリの内側又は外側の一部に磁気を有する物質を備えてもよい。
【００２３】
上述のようにプレートのウェルやキャピラリ内の捕捉領域などに固定された検出用複合体は、以下に示すようにラベル化され、そのシグナルに基づいて標的物質を検出することができる。
検出用複合体に、例えばエチジウムブロマイド、オレゴングリーン(oregon green), サイバーグリーン(SYBR GREEN)などの色素をインターカレートさせ、この色素による蛍光が標的物質を検出するためのシグナルとなる。
また、プローブセットを構成する少なくとも一つのプローブに予めＦＩＴＣのような蛍光物質を結合させておくことで、この蛍光物質による蛍光をシグナルとすることができる。ＦＩＴＣではなく、１２５Ｉや３２Ｐなどのラジオアイソトープなどを結合させておくこともでき、これらの発する放射線をシグナルとすることもできる。
また、少なくとも一つのプローブにアルカリホスファターゼを結合させておき、この酵素にジゴキシゲニンやアクリジニウムエステルなどの発光・発色物質、ジオキセタンなどの発光物質、４−メチルウンベリフェリルリン酸などの蛍光物質などを反応させて生ずる発光、蛍光又は発色をシグナルとすることができる。
また、少なくとも一つのプローブにアビジン又はビオチンを結合させておき、さらに蛍光物質、発色物質等を結合させたビオチン又はアビジンを標的物質に付加し、これらを反応させることにより、この蛍光、発色等をシグナルとすることができる。
また、少なくとも一つのプローブにドナー蛍光色素及びアクセプター蛍光色素を結合させておき、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用してこれらが発する蛍光をシグナルとすることができる。
【実施例】
【００２４】
以下に、本発明の理解をより確実にするために、実施例を示して説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではないことはいうまでもない。
【００２５】
（実施例１）
以下の特徴を有するプローブを作製する。
（１）一次プローブ
図２（ａ）に示すように、一次プローブは標的結合物質と、一次プローブの５’末端側に位置する配列Ａ１ｃとを有する。また、一次プローブは配列Ａ１ｃに隣接して配列Ｓｃ、及び配列Ｓを有する。標的結合物質は配列Ｓの５’末端と配列Ｓｃの３’末端の間に位置する。
（２）二次プローブ
図２（ａ）に示すように、二次プローブは５’末端側に配列Ａ１を有し、３’末端側に配列Ａ２を有する。二次プローブは配列Ａ１及びＡ２を連結させた塩基配列である。
（３）三次プローブ
図２（ａ）に示すように、三次プローブは３’末端側に配列Ａ１ｃを有し、５’末端側に配列Ａ２ｃを有する。三次プローブは配列Ａ２ｃ及びＡ１ｃを連結させた塩基配列である。
【００２６】
各プローブの５’末端はリン酸化されている。
【００２７】
上記配列のうち、配列Ａ１は配列Ａ１ｃと、配列Ａ２は配列Ａ２ｃと、配列Ｓは配列Ｓｃと、それぞれハイブリダイズできるよう設計されている。これにより、標的物質と結合した一次プローブに二次プローブがハイブリダイズし、さらに三次プローブがハイブリダイズして検出用複合体が形成される。さらにこの検出用複合体に遊離の二次プローブ及び三次プローブが順次ハイブリダイズし、検出用複合体は直鎖状に伸長する。各配列を構成する塩基の種類は特に限定されない。
【００２８】
図２は、上記各プローブが結合して検出用複合体を形成するまでの検出原理を示した模式図である。図２では、各プローブの核酸がＤＮＡである場合を示すが、各プローブがＲＮＡや人工核酸などのその他の核酸である場合でも同様の検出原理である。
【００２９】
先ず、（ａ）に示すように、標的物質を含む試料と、プローブセットと、ライゲースとを混合させる。配列Ｓと配列Ｓｃとは相補的であるため、これらはハイブリダイズし、一次プローブは５’末端側に配列Ａ１ｃが突出したステムループ構造を形成している。
（ｂ）においては各プローブが結合して検出用複合体を形成する。先ず、一次プローブの配列Ａ１ｃに二次プローブの配列Ａ１がハイブリダイズする。次に、二次プローブの配列Ａ２に三次プローブの配列Ａ２ｃがハイブリダイズする。さらに、三次プローブの配列Ａ１ｃに、一次プローブにハイブリダイズしていない遊離の二次プローブがハイブリダイズする。以降、検出用複合体の突出した配列に、遊離の二次プローブ又は三次プローブが順次ハイブリダイズして検出用複合体が伸長する。この伸長と同時にライゲースによって各プローブの隣接する末端は連結され、（ｃ）に示すような安定な検出用複合体となる。
（ｄ）に示すように、この検出用複合体に、例えばエチジウムブロマイド、オレゴングリーン、サイバーグリーンなどの蛍光色素をインターカレートさせる。この色素による蛍光に基づいて、試料中の標的物質の検出が可能となる。ここでは、インターカレート色素を用いた検出方法を例示したが、上述したようなその他の公知の核酸検出方法を用いる事も可能である。
【００３０】
二次プローブ及び三次プローブは互いにハイブリダイズ可能な配列を有しているため、一次プローブと結合せずに遊離の状態でハイブリダイズし、二次プローブ及び三次プローブのみで二重鎖が伸長することが考えられる。しかしながら、一次プローブの配列Ａ１ｃに隣接する配列Ｓｃが配列Ｓと二重鎖を形成することにより、一次プローブの配列Ａ１ｃに二次プローブの配列Ａ１がハイブリダイズすると、配列Ｓの末端と隣り合う二次プローブの末端がスタッキング効果により、通常よりも安定に位置することができる。さらに、一次プローブと二次プローブとの複合体に三次プローブが結合するときも同じことが言える。即ち、二次プローブ及び三次プローブの遊離の状態のＴｍ値よりも、複合体のＴｍ値の方が高くなる。従って、試料とプローブセットとを反応させる際に適切な反応温度を設定することにより、遊離の状態で二次プローブと三次プローブとが結合することを最小限に抑制することができるため、非特異反応が起こりにくくなる。
【００３１】
検出用複合体を構成する各プローブの末端は連結されることが好ましい。これにより、検出用複合体はより安定になり、分解や洗浄操作などに対する耐久性を増大させることができる。各プローブの塩基配列がＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列である場合、ライゲースを用いて各プローブの末端を連結することができる。ライゲースを用いて各プローブを連結する場合、各プローブの５’末端又は３’末端を予めリン酸化しておく必要がある。また、各プローブの塩基配列がＰＮＡやＢＮＡなどの人工核酸の場合は、光結合などによって各プローブの末端を連結させることができる。光結合による人工核酸の連結法としては、例えば米国特許ＵＳ６５９３０８８Ｂ１号公報記載の方法を用いることができる。
【００３２】
（実施例２）
以下の特徴を有するプローブを作製する。
（１）一次プローブ
図３（ａ）に示すように、一次プローブはプローブの５’末端側から順に、グアニンを有するヌクレオチドが５個並んだポリヌクレオチド配列Ａ１ｃと、アデニンを有するヌクレオチドが１０個並んだポリヌクレオチド配列Ａ２ｃと、配列Ａ１ｃとを有し、３’末端には標的結合物質を有する。一次プローブのポリヌクレオチド部分の塩基配列は配列番号１に示される。
（２）二次プローブ
図３（ａ）に示すように、二次プローブは、プローブの５’末端側から順に、シトシンを有するヌクレオチドが５個並んだポリヌクレオチド配列Ａ１と、チミンを有するヌクレオチドが１０個並んだポリヌクレオチド配列Ａ２とが並んだ構造を有する。二次プローブの塩基配列は配列番号２に示される。
（３）三次プローブ
図３（ａ）に示すように、三次プローブは、プローブの５’末端側から順に、配列Ａ１ｃと配列Ａ２ｃとを有する。三次プローブの塩基配列は配列番号３に示される。
【００３３】
各プローブの５’末端はリン酸化されている。
【００３４】
図３は上記各プローブが結合して検出用複合体を形成するまでの検出原理を示した模式図である。図３では、各プローブの核酸がＤＮＡである場合を示すが、各プローブがＲＮＡや人工核酸である場合でも同様の検出原理である。
先ず、（ａ）に示すように、標的物質を含む試料と、プローブセットと、ライゲースとを混合させる。
（ｂ）において、一次プローブに二次プローブがハイブリダイズする。さらに、一次プローブの突出した配列Ａ１ｃにさらに遊離の二次プローブが結合する。一次プローブは配列Ｓ及び配列Ｓｃをプローブ内に有していないが、一次プローブに一つ目の二次プローブがハイブリダイズすることによって上述したスタッキング効果を得ることができる。
（ｃ）に示すように、（ｂ）で形成された複合体に二次プローブ及び三次プローブが次々に結合し、検出用複合体が伸長する。この伸長と同時にライゲースによって各プローブの隣接する末端は連結され、（ｄ）に示すような安定な検出用複合体となる。
（ｅ）に示すように、この検出用複合体に、例えばエチジウムブロマイド、オレゴングリーン、サイバーグリーンなどのインターカレート色素を結合させ、この色素による蛍光を検出する事により、試料中の標的物質の検出が可能となる。他にも、上述したような公知の検出法を用いることも可能である。
【００３５】
上記のようなプローブセットは、試料中の標的物質を検出するための試薬として提供され得る。又は、各プローブ及び／又はライゲースを別々に収容した試薬キットとして提供され得る。
【００３６】
（実験例１）
ステムループ構造を有しビオチンを付加された一次プローブ、伸長用の二次プローブ及び三次プローブを用いて、ハイブリダイゼーションとライゲーションを行うことで、検出用複合体が形成され、伸長するか否かを電気泳動により確認した。図４には本実験の反応を模式的に示した。
【００３７】
＜材料＞
1) 一次プローブ
5'-GATATGGTATAGGATATGTT(BIOTIN)TTTCATATCCTATAC-3' （配列番号４）
2) 二次プローブ
5'-CATATCCTATAC-3' （配列番号５）
3) 三次プローブ
5'-GATATGGTATAG-3' （配列番号６）
4) TE緩衝液 (50mM Tris-HCL (pH7.4), 1mM EDTA)
5) T4ライゲース(T4 Ligase; TAKARA BIO社製) 及び添付のT4ライゲース 緩衝液(×10)
6) 低融点アガロース(NuSieve GTG Agarose; TAKARA BIO社製)
7) マーカー(20bp DNA Ladder; TAKARA BIO社製)
なお、各プローブの５’末端はリン酸化されている。
【００３８】
＜方法＞
0.5mlの滅菌済みマイクロチューブに、以下の物質を加え、10μl の反応用混合液を作製した。
一次プローブ (100pmol/μl): 1μl
二次プローブ (100pmol/μl): 1μl
三次プローブ (100pmol/μl): 1μl
T4ライゲース: 0.5μl
T4ライゲース 緩衝液 (×10): 1μl
TE緩衝液: up to 10μl
【００３９】
この反応用混合液を室温で30分間静置し、検出用複合体の生成及び伸長とライゲーション反応とを行った。反応後の反応用混合液を用いて、４％アガロースゲルで100 V，15分間電気泳動を行った。電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色し、検出用複合体が伸長しているか否かを確認した。
【００４０】
＜結果＞
電気泳動の結果を図５に示す。(i)のレーンはマーカー(20bp DNA ladder)を電気泳動した結果である。(ii)のレーンはネガティブコントロールとして、一次プローブのみを電気泳動した結果である。(iii)のレーンは上記実験の反応用混合液を電気泳動した結果である。(iii)のレーンには(ii)のレーンに見られる一次プローブのバンドよりも大きな分子量を示すバンドが観察された。(iii)のレーンのバンドは伸長した検出用複合体を示すものである。このことは上記実験によってハイブリダイゼーション及びライゲーションが行われ、検出用複合体が伸長したことを示す。
【００４１】
（実験例２）
ステムループ構造を有し、ビオチンを付加された一次プローブ、伸長用の二次プローブ及び三次プローブを用いて、ハイブリダイゼーションとライゲーションを行い、検出用複合体を形成させ、伸長することによって、プレートに固定された標的物質であるストレプトアビジンを検出できるか否かを蛍光測定により確認した。
【００４２】
＜材料＞
1) 固相化プレート(SA plate; Labsystems社製)ストレプトアビジンをコートした黒色の８ウェルプレート
2) 蛍光色素(YOYO-1; Molecular Probes社製)
3) 蛍光測定機(Genius; TECAN社製)
一次プローブ、二次プローブ、三次プローブ、TE緩衝液、T4ライゲース及びT4ライゲース緩衝液は実験例１で用いたものと同じものを使用した。
【００４３】
＜方法＞
0.5mlの滅菌済みマクロチューブ４本に、0.02pmol/μl, 0.1pmol/μl, 0.2pmol/μl, 1pmol/μlの一次プローブを1μlずつと、以下の物質とをそれぞれ加え、50 μlの反応用混合液を作製した。
二次プローブ (100pmol/μl): 5μl
三次プローブ (100pmol/μl): 5μl
T4ライゲース: 2.5μl
T4ライゲース緩衝液: 5μl
TE緩衝液: up to 50μl
【００４４】
反応用混合液を収容した４本のマイクロチューブを室温で15分間静置し、検出用複合体の生成及び伸長とライゲーション反応とを行った。反応後の反応用混合液をSAプレートのウェルにそれぞれ移し、生成した検出用複合体をストレプトアビジンと反応させるためさらに室温で30分間放置した。
【００４５】
SAプレートの各ウェルをTE緩衝液を用いて３回洗浄した後、TE緩衝液で10000倍希釈したYOYO-1を各ウェルに50μl添加し、室温で10分間放置して検出用複合体をラベル化した。その後、蛍光測定機により検出用複合体の発する蛍光を測定した。測定の結果を図６の（Ａ）のグラフに示した。
【００４６】
蛍光測定の後、SAプレートの各ウェルに二次プローブ及び三次プローブをそれぞれ5μl、T4ライゲースを2.5μl、及びT4ライゲース緩衝液を5μl添加し、さらにTE緩衝液を添加して50μlまでメスアップした。反応用混合液を収容したプレートを室温で30分間静置し、再び検出用複合体の伸長反応を行った。プレートの各ウェル中の反応用混合液を同様にYOYO-1で染色し、蛍光を測定した。測定の結果を図６の（Ｂ）のグラフに示した。
【００４７】
さらに、ネガティブコントロールとして実験例１で作製した反応用混合液と同じ組成の反応用混合液を作製して、ライゲーション反応を行わずに染色及び蛍光測定を行った。測定の結果を図６の（Ｎ）に示した。
【００４８】
＜結果＞
図６より、ライゲーション反応を行うことにより、ライゲーション反応を行わなかった場合よりも強いシグナルで蛍光を検出することができた。また、ライゲーション反応を繰り返すことにより、シグナルを増大させることができた。
【００４９】
（実験例３）
ステムループ構造を有し、トロンビンアプタマーの一次構造を有する配列を含む一次プローブ、伸長用の二次プローブ及び三次プローブを用いて、ハイブリダイゼーションとライゲーションとを行い、検出用複合体を形成させ、伸長することによって、ELISAプレートに固定された標的物質であるトロンビンを検出できるか否かを蛍光測定により確認した。
【００５０】
＜材料＞
1) トロンビン（Enzyme-Research社製）
2) ELISA プレート (ELISA Plate; Becton Dickinson社製)
3) トロンビンアプタマーの一次構造を有する配列を含む一次プローブ
5'-GATATGAGTGACTACTGGTTGGTGTGGTTGGGTAGTCACT-3' （配列番号７）
4) 二次プローブ
5'-CATATCCATTAG-3' （配列番号８）
5) 三次プローブ
5'-GATATGCTAATG-3' （配列番号９）
6) TBE緩衝液(45.5mM Tris-Borate (pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0))
TE緩衝液、T4ライゲース、T4ライゲース緩衝液、YOYO-1、及び蛍光測定機は実験例２で用いたものと同じものを使用した。各プローブの５’末端はリン酸化されている。
【００５１】
＜方法＞
トロンビンを50μlのTBE緩衝液に192 pmol溶解した溶液と、96 pmol溶解した溶液と、48 pmol溶解した溶液とをELISAプレートのウェルにそれぞれ添加した後、37℃で２時間インキュベートし、トロンビンをプレートに固定した。その後、TBE緩衝液でプレートのウェルを３回洗浄して、トロンビンプレートを作製した。トロンビンプレートに100pmol/μlの 一次プローブを5μl含むTE緩衝液 50μlを添加して室温にて一時間静置し、トロンビンと一次プローブとを結合させた。プレートの各ウェルをTE緩衝液で三回洗浄した後、TE緩衝液で10000倍希釈したYOYO-1を各ウェルに50μl添加し、10分間静置して蛍光染色を行った。その後、蛍光測定機によりトロンビンと一次プローブとの複合体が発する蛍光を測定した。測定の結果を図７（Ａ）のグラフに示した。
【００５２】
次に、TE緩衝液を用いて各ウェルを三回洗浄し、各ウェルに以下の物質を添加して50μlの反応用混合液を作製した。
二次プローブ (100pmol/μl): 5μl
三次プローブ (100pmol/μl): 5μl
T4ライゲース: 2.5μl
T4ライゲース緩衝液: 5μl
TE緩衝液: up to 50μl
【００５３】
この反応用混合液を収容したプレートを室温で15分間静置し、検出用複合体の生成及び伸長とライゲーション反応とを行った。反応後のプレートの各ウェルをTE緩衝液で三回洗浄した後、TE緩衝液で10000倍希釈したYOYO-1を50μl添加し、10分間静置して蛍光染色を行った。その後、蛍光測定機により検出用複合体の発する蛍光を測定した。測定の結果を図７（Ｂ）のグラフに示した。また、本実験で生成した検出用複合体の模式図を図８に示した。
【００５４】
＜結果＞
図７より、（Ａ）に比べ、（Ｂ）の方が強い蛍光を検出することができた。検出用複合体の生成、伸長によりシグナルが増幅され、標的物質をより高感度で検出できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】磁気ビーズを用いた測定方法を示す図である。
【図２】本発明の検出原理を示した模式図である。（実施例１）
【図３】本発明の別の検出原理を示した模式図である。（実施例２）
【図４】ステムループ構造を有するビオチンを付加された一次プローブを用いた反応模式図である。（実験例１）
【図５】電気泳動の結果を示す図である。（実験例１）
【図６】本発明のプローブセットを用いた検出結果を示す図である。（実験例２）
【図７】本発明のプローブセットを用いた検出結果を示す図である。（実験例３）
【図８】本発明のプローブセットを用いて生成した検出用複合体の模式図である。（実験例３）
【符号の説明】
【００５６】
図５  (i)   マーカー(20bp DNA ladder)
(ii)  一次プローブのみ
(iii) 複合体
図６  (A)   伸張反応後１回目の蛍光強度
(B)   伸張反応後２回目の蛍光強度
(N)   ネガティブコントロール
図７  (A)   トロンビンと一次プローブとの複合体の蛍光強度
(B)   トロンビンと一次プローブとの複合体に二次プローブ及び三次プローブを伸張反応させた後の蛍光強度
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図５】
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【配列表】
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