(57)【要約】【課題】  培養骨の培養期間を短縮するとともに、培養骨の品質を高める。【解決手段】  患者から採取した細胞を培養して得た間葉系幹細胞を骨補填材に担持させ、前記骨補填材に担持させた前記間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させる培養骨、もしくは患者から採取した細胞をもとに得た間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させた後に前記骨芽細胞を骨補填材に担持させる培養骨の製造方法において、前記患者から採取した細胞を培養する培養液、または前記間葉系幹細胞を培養する培養液、もしくは前記骨芽細胞へと分化させた後の培養液に多血小板血漿を添加する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取した細胞を培養して得た間葉系幹細胞を骨補填材に担持させ、前記骨補填材に担持させた前記間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させる培養骨、もしくは患者から採取した細胞をもとに得た間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させた後に前記骨芽細胞を骨補填材に担持させる培養骨の製造方法において、
前記患者から採取した細胞を培養する培養液、または前記間葉系幹細胞を培養する培養液、もしくは前記骨芽細胞へと分化させた後の培養液に多血小板血漿を添加することを特徴とする培養骨の製造方法。
【請求項２】
前記患者から採取した細胞は、間葉系幹細胞を含む細胞であることを特徴とする請求項１記載の培養骨の製造方法。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞を含む細胞は、骨髄細胞または脂肪細胞であることを特徴とする請求項１記載の培養骨の製造方法。
【請求項４】
培養細胞を担持させた骨補填材が、ゲル化した多血小板血漿で覆われていることを特徴とする培養骨。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養骨の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨組織に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成するいわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した間葉系幹細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。この方法によると、間葉系幹細胞が骨補填材を足場にして増殖し、増殖した多くの間葉系幹細胞を含む培養骨が骨欠損部に補填されるので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数が大幅に短縮される。
【特許文献１】特開２００３−０５５２３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
培養骨の製造方法としては、間葉系幹細胞を骨補填材に担持させ、培養した後に骨芽細胞へと分化させる方法と、間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させた後に骨補填材に担持させる方法とがある。
ところで、間葉系幹細胞は培養の過程で骨芽細胞へと分化するが、骨分化後は骨芽細胞の増殖能が低下し、骨芽細胞が産出する骨基質の生成量が少なくなるため、骨基質が所定の量に達して培養骨が移植可能な状態になるまでの培養期間が長引く一因となっている。
【０００５】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、培養骨の培養期間を短縮することができ、しかも培養骨の品質を高めることができる培養骨の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するための手段として、次のような構成の培養骨の製造方法を採用する。
すなわち本発明の培養骨の製造方法は、患者から採取した細胞を培養して得た間葉系幹細胞を骨補填材に担持させ、前記骨補填材に担持させた前記間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させる培養骨、もしくは患者から採取した細胞をもとに得た間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させた後に前記骨芽細胞を骨補填材に担持させる培養骨の製造方法において、
前記患者から採取した細胞を培養する培養液、または前記間葉系幹細胞を培養する培養液、もしくは前記骨芽細胞へと分化させた後の培養液に多血小板血漿を添加することを特徴とする。
【０００７】
本発明においては、前記患者から採取した細胞は、間葉系幹細胞を含む細胞であることが望ましい。また、前記間葉系幹細胞を含む細胞は、骨髄細胞または脂肪細胞であることが望ましい。
【０００８】
患者から採取した細胞を培養する培養液、または間葉系幹細胞を培養する培養液、もしくは骨芽細胞へと分化させた後の培養液に、多血小板血漿（以下、ＰＲＰ）を添加することにより、間葉系幹細胞が骨芽細胞へと分化する際、骨芽細胞の増殖能が低下せず、骨分化後も骨芽細胞の増殖が起こる。骨芽細胞の増殖が活発になると、骨芽細胞が産出する骨基質の生成量が増加する。
【０００９】
また、間葉系幹細胞を培養する培養液、もしくは骨芽細胞へと分化させた後の培養液にＰＲＰを添加すると、骨補填材上に付着した細胞や、培養液およびＰＲＰに含まれる成長因子が、ＰＲＰにより生じるゲルに内包され、骨細胞の成長、増大が促進される。
【００１０】
なお、細胞を培養する培養液にＰＲＰを添加する場合、添加の時期は、細胞の培養期間が後期に入り、間葉系幹細胞が十分に成長してからが望ましい。
【００１１】
本発明の培養骨は、培養細胞を担持させた骨補填材が、ゲル化した多血小板血漿で覆われていることを特徴とする。
【００１２】
骨補填材をゲル化したＰＲＰで覆うと、ＰＲＰが培養骨の輸送時に振動吸収材として機能して培養骨の損傷が防止される。また、この培養骨をゲルごと骨欠損部に移植すると、ＰＲＰの殺菌力によって移植時の細菌感染や炎症の発生が防止される。さらに、骨補填材に付着した細胞が直接生体に暴露されないので、アロ移植を行ったときの抗原性低減が期待できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、患者から採取した細胞を培養する培養液、または間葉系幹細胞を培養する培養液、もしくは骨芽細胞へと分化させた後の培養液に、ＰＲＰを添加することにより、間葉系幹細胞が骨芽細胞へと分化する際、骨芽細胞の増殖能が低下せず、骨分化後も骨芽細胞の増殖が起こり、骨芽細胞が産出する骨基質の生成量が増加する。また、骨補填材上に付着した細胞や、培養液およびＰＲＰに含まれる成長因子が、ＰＲＰにより生じるゲルに内包され、骨細胞の成長、増大が促進される。これにより、骨基質が所定の量に達して培養骨が移植可能な状態になるまでの培養期間を短縮することができる。
その結果、患者に対する骨移植までの期間が短縮されるので、治療に要する期間を短くして患者の治癒を早めることができる。
【００１４】
本発明によれば、培養細胞を担持させた骨補填材をゲル化したＰＲＰで覆うことにより、ゲル化したＰＲＰが培養骨の輸送時に振動吸収材として機能して培養骨の損傷が防止されるので、品質を損なうことなく培養骨を供給することができる。また、この培養骨をゲルごと骨欠損部に移植すると、ＰＲＰの殺菌力によって移植時の細菌感染や炎症の発生が防止される。さらに、骨補填材に付着した細胞が直接生体に暴露されないので、アロ移植を行ったときの抗原性低減が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
この発明の第１の実施形態に係る培養骨の製造方法について、図１を参照して説明する。
本実施形態の培養骨の製造方法は、図１に示すように、患者から採取した骨髄細胞を所定の培地内で培養することにより間葉系幹細胞を取得する一次培養工程Ｓ１１と、取得された間葉系幹細胞を骨補填材に担持させる担持工程Ｓ１２と、骨補填材に担持させた間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させる二次培養工程Ｓ１３とを備えている。
【００１６】
患者から採取した骨髄細胞を培養する前工程として、患者から骨髄液を採取し、採取した骨髄液から骨髄細胞を分離する工程Ｓ００がある。骨髄細胞の分離には、例えば遠心分離機を使用する。次に、分離した骨髄細胞を、培養容器に投入された培地と混合する。培地には、例えばＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を、例えば８４：１５：１の配合割合で混合したものを使用する。抗生剤は、例えばペニシリン系抗生物質である。
【００１７】
一次培養工程Ｓ１１は、混合した骨髄細胞と培地とを培養容器ごとインキュベータ内に配置して、例えば３７±０．５℃、５％ＣＯ２濃度に保持することにより行う。培養容器内においては、骨髄細胞中に含まれる間葉系幹細胞が、培養容器の底面に付着しながら成長する一方、他の造血系の細胞等は培地内に浮遊する。そして、一次培養工程Ｓ１１の期間、例えば８〜１０日間の内の所定の時期、例えば１日置きに定期的に培地を交換することにより、培養容器の底面に付着している間葉系幹細胞のみを抽出する。
【００１８】
一次培養工程Ｓ１１の期間が後期に入り、間葉系幹細胞が十分に成長したら、培養容器内の培養液にＰＲＰを添加する。これにより、ＰＲＰが培地内に残った骨髄細胞や成長した間葉系幹細胞に作用し、間葉系幹細胞が骨芽細胞へと分化する際、骨芽細胞の増殖能が低下せず、骨分化後も骨芽細胞の増殖が起こる。骨芽細胞の増殖が活発になると、骨芽細胞が産出する骨基質の生成量が増加する。
【００１９】
一次培養工程Ｓ１１が終了すると、培養容器の底面には、成長した間葉系幹細胞が付着している。そこで、例えばトリプシンのような蛋白質分解酵素を培養容器内に供給することにより、間葉系幹細胞を培養容器底面から剥離させる。次に、剥離させた間葉系幹細胞を、例えば遠心分離機を使用してトリプシン等の他の成分から分離し、担持工程Ｓ１２を開始する。
【００２０】
担持工程Ｓ１２は、分離した間葉系幹細胞を、骨補填材に注入することにより行う。骨補填材は、例えば特開平５−２３７１７８号公報に開示されている方法により製造したβ−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体である。このような骨補填材に、分離した間葉系幹細胞を含む液体を注ぎかけると、無数の孔に間葉系幹細胞が浸透していき、骨補填材から脱落することなく担持されることになる。
【００２１】
二次培養工程Ｓ１３は、間葉系幹細胞を担持させた骨補填材を、骨形成培地を入れた培養容器内に配置し、当該の培養容器を、所定の条件を整えた環境下に保持することにより行う。培地には、一次培養工程Ｓ１１において使用されるものとは異なり、ＭＥＭ、ＦＢＳの他に、例えばデキサメサゾンやβグリセロフォスフェートのような分化誘導因子や、ビタミンＣのような栄養剤が混合される。これにより、間葉系幹細胞が骨補填材を足場にして増殖し、骨欠損部への移植が可能な培養骨が製造される。
【００２２】
上記のような培養骨の製造方法によれば、患者から採取した骨髄細胞を培養する培養液にＰＲＰを添加することにより、間葉系幹細胞が骨芽細胞へと分化する際、骨芽細胞の増殖能が低下せず、骨分化後も骨芽細胞の増殖が起こり、骨芽細胞が産出する骨基質の生成量が増加するので、骨基質が所定の量に達して培養骨が移植可能な状態になるまでの培養期間を短縮することができる。その結果、患者に対する骨移植までの期間が短縮されるので、治療に要する期間を短くして患者の治癒を早めることができる。
【００２３】
この発明の第２の実施形態に係る培養骨の製造方法について、図２を参照して説明する。なお、上記第１の実施形態において既に説明した構成要素には同一符号を付して説明は省略する。
本実施形態の培養骨の製造方法は、上記第１の実施形態において図１を参照して説明した製造方法と同じく、骨髄細胞の分離工程Ｓ００、一次培養工程Ｓ１１、担持工程Ｓ１２、二次培養工程Ｓ１３の３つの工程を備えている。ただし、上記第１の実施形態では、一次培養工程Ｓ１１の後期に、培養容器内の培養液にＰＲＰを添加したのに対し、本実施形態では、図２に示すように、二次培養工程Ｓ１３に入ってから、培養容器内の培養液にＰＲＰを添加する。これにより、ＰＲＰが分化する前の間葉系幹細胞や分化した後の骨芽細胞に作用し、骨芽細胞の増殖が活発になって骨芽細胞が産出する骨基質の生成量が増加する。さらに、培養液がＰＲＰによってゲル化し、骨補填材上に付着した細胞や、培養液およびＰＲＰに含まれる成長因子がゲルに内包され、骨細胞の成長、増大が促進される。
【００２４】
上記のような培養骨の製造方法によれば、骨補填材上に付着した細胞や、培養液およびＰＲＰに含まれる成長因子が、ＰＲＰにより生じるゲルに内包されることにより、骨細胞の成長、増大が促進されるので、骨の培養期間を短縮することができる。
【００２５】
また、上記のような培養骨によれば、ゲル化したＰＲＰが培養骨の輸送時に振動吸収材として機能し、培養骨の損傷が防止されるので、品質を損なうことなく培養骨を供給することができる。また、この培養骨をゲルごと骨欠損部に移植すると、ＰＲＰの殺菌力によって移植時の細菌感染や炎症の発生が防止される。さらに、骨補填材に付着した細胞が直接生体に暴露されないので、アロ移植を行ったときの抗原性低減が期待できる。
【００２６】
ところで、上記の各実施形態においては、間葉系幹細胞を、患者から採取した骨髄液から間葉系幹細胞を取得しているが、本発明の培養骨の製造方法においては、骨髄液のみならず、患者から採取した脂肪等の細胞から間葉系幹細胞を取得してもよい。この場合、患者から採取した細胞にＰＲＰを添加しても、上記のような効果がある程度期待できる。
【００２７】
また、培養骨の製造方法としては、上記のＳ００〜Ｓ１３の各工程を備える方法以外にも、図３または図４に示すように、患者から採取した骨髄細胞を所定の培地内で培養することにより間葉系幹細胞を取得する一次培養工程Ｓ２１と、取得された間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化させる二次培養工程Ｓ２２を、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化させた後に骨補填材に担持させる担持工程Ｓ２３とを備える方法がある。この方法を採用して培養骨を製造する場合も、一次培養工程Ｓ２１または二次培養工程Ｓ２２において培養容器内の培養液にＰＲＰを添加することにより、上記と同様の効果が得られる。
【００２８】
上記の各実施形態においては、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて、培養容器の底面から間葉系幹細胞、骨芽細胞および骨基質を剥離させることとしたが、これに代えて、温度応答性培養容器を使用することにしてもよい。
温度応答性培養容器は、その底面に温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定したものである。このような温度応答性培養容器は、その底面が、３２℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、境界温度よりも低温に冷却することにより高い親水性を呈する。
【００２９】
したがって、培養温度の３７℃では、間葉系幹細胞、骨芽細胞は、疎水性を呈する培養容器の底面に付着して成長するが、培養終了後に、培養容器の温度を３２℃以下に冷却することにより、底面を親水性に切り替えて、細胞を容易に剥離させることができる。このようにすることで、蛋白質分解酵素を使用しなくて済むので、細胞を傷つけることなく非侵襲的に回収することができる。
【００３０】
また、抗生剤として、ペニシリン系抗生物質を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、これに代えて、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００３１】
また、上記実施形態においては、ＭＥＭとＦＢＳと抗生剤との配合割合が、例えば８４：１５：１となることとしたが、これに代えて、ＭＥＭ：ＦＢＳ：抗生剤＝８０〜９０：５〜１０：０．１〜５となるようにしてもよい。
また、培地構成成分Ａ，Ｂ，ＣをＭＥＭとＦＢＳと抗生剤の３成分からなるものとして説明したが、これに代えて他の培地構成成分、あるいは、追加の培地構成成分を採用することにしてもよい。特に、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を培地構成成分として混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
【００３２】
また、骨補填材として、βリン酸三カルシウムの顆粒を例示して説明したが、これに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の培養骨の製造方法の第１の実施形態を示すフローチャートである。
【図２】本発明の培養骨の製造方法の第２の実施形態を示すフローチャートである。
【図３】本発明の培養骨の製造方法のその他の実施形態を示すフローチャートである。
【図４】同じく、本発明の培養骨の製造方法のその他の実施形態を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００３４】
Ｓ１１    一次培養工程
Ｓ１２    担持工程
Ｓ１３    二次培養工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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