(57)【要約】【課題】新規な超好熱菌の提供。【解決手段】有機廃棄物を８５℃以上の温度で発酵させて得られたたい肥に由来する、８０℃以上で増殖することのでき、至適塩分濃度が低い超好熱菌（  カルドトリックス    サツマエ  （Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ ｓａｔｓｕｍａｅ）  。５０℃以下では増殖せず、７０〜８５℃で活発に生育する。胞子を形成せず、グラム陰性で絶対好気性桿菌である。有機廃棄物を高温で発酵させたい肥を製造するときの発酵微生物として有用である。また、耐熱性酵素の生産に利用される。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
８０℃以上で増殖することができ、至適塩分濃度が１％以下である超好熱菌カルドトリックス・サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）
【請求項２】
ＹＭＯ  ８０３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１２）である請求項１に記載のカルドトリックス・サツマエ
【請求項３】
ＹＭＯ  ８０６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１３）  である請求項１に記載のカルドトリックス・サツマエ
【請求項４】
ＹＭＯ  ８１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１４）  である請求項１に記載のカルドトリックス・サツマエ
【請求項５】
ＹＭＯ  ８１２株である請求項１に記載のカルドトリックス・サツマエ
【請求項６】
ＹＭＯ  ８１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１５）  である請求項１に記載のカルドトリックス・サツマエ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、たい肥を起源とし、８０℃以上で増殖することができ、至適塩濃度の低い新規超好熱菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、家畜糞、し尿、汚泥、都市ごみなどの有機廃棄物に、好熱性微生物を作用させてこれらを好気的に発酵させ、無臭化乾燥させてたい肥を製造することが行われている。そして、このような好熱性微生物としてサーモアクチノミセス属またはサーモモノスポラ属に属する好熱性放射菌  （特許文献１）  、バチルス菌、ゲオバチルス属、乳酸生成菌等の好熱好気性芽胞形成菌混合物  （特許文献２）  、好気性枯草菌  （特許文献３）  、リグニン可溶化能を有するサーマスアクティクス属細菌  （特許文献４）  、好気性繊維分解菌クロストリジュウム    サーモセルム  サーマスアクティクス  （特許文献５）  等が知られている。しかし、これらの微生物を利用しても、発酵時には発酵熱によって発酵温度は７０℃以上に上昇するものの、その温度はせいぜい８０℃にとどまり、雑菌、特に芽胞形成性雑菌を死滅させることができなかった。また、得られる肥料中の有用な菌体もせいぜい１ｇ当り  （肥料乾物）１億前後であって、肥料として使用したときに肥効作用を充分発揮させることができなかった。
【０００３】
本発明者らは、汚泥処理におけるこのような問題を解決するために、汚泥を８５℃以上、好ましくは９５℃以上の高温で発酵処理して雑菌、草種子等を死滅させ、汚泥を清浄化し、しかも有用な菌体を多数含む発酵物を得るべく検討を行った。その結果、生汚泥に、霧島火山地帯の土壌から得られた８５℃以上の温度で生育する細菌培養物を加えて混合し、通気発酵させて８５℃以上の発酵温度で汚泥中に含有される雑菌、種子を死滅させ、汚泥を清浄化し、有用な菌体のみを多数含有する汚泥発酵物を得る方法を見出し、特許を取得した  （特許文献６）  。そして、この汚泥発酵物は、たい肥として利用され、このなかにはＢａｃｉｌｌｕｓ属、 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属に属する中温性好気性芽胞菌、高温性好気性芽胞菌、好熱菌等が多数見出された。
すなわち、この汚泥発酵物１ｇには、表１に示すとおり好気性細菌はじめ、高温性細菌、耐熱性芽胞を中心として汚泥発酵物グラム当り約１０億の細菌を含んでいた。
【０００４】
【表１】
2005013063.tif 000002
【０００５】
また、この培養において培養平板上に優勢に生育した集落を鈎菌して分離菌とし、その分離菌について形態観察などを行って、発酵に関与するような微生物を検索したところ表２に示すような微生物が介在していることが判明した。
【０００６】
【表２】
2005013063.tif 000003
【０００７】
このように多形性、無芽胞グラム陽性桿菌、好気性芽胞菌  （中温性及び高温性）  が主に介在していることが判明した。
また、一方、  Ｒ＆Ｄ  プランニング発行    山里一英他３名編「微生物の分離法」の記載を参考にして好熱菌の測定を行った。好熱菌の優勢菌は好気性芽胞菌  （高温性）  であった。
さらに、上記微生物の検索において優勢に分離された中温性好気性芽胞菌  （分離菌ａ）、高温性好気性芽胞菌  （分離菌ｂ）及び好熱菌  （分離菌ｃ）について形態観察、生理学的性状試験及び菌体内の  ＤＮＡのＧＣ含量の測定を行った。その結果を表３に示した。
【０００８】
【表３】
2005013063.tif 000004
2005013063.tif 000005
【０００９】
分離菌ａ  は、いずれの種とも性状が一致せず、種の確定には至らなかった。分離菌ｂ  は、ややアルカリ性（ｐＨ８．０〜８．５）の培地で良好な生育を示し、ｐＨ７．０  では生育しないが、その他の性状試験結果から  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓや  Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ  に近い種と思われた。しかし、どちらとも非典型となる性状があり種の確定には至らなかった。また、分離菌ｃ  は、バチルス    ステロサーモフィルス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）  と菌学的性状が一致し同種であると同定されるものの、ＧＣ含量が大きく異なるので、近縁の種と思われる。
これらの分離菌は、工業技術院生命工業技術研究所  （現    独立行政法人    産業技術総合研究所微生物寄託センター）に寄託されており、分離菌ａ  は、ＹＭ−０１  受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０８５  、分離菌ｂ  は、ＹＭ−０２  受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０８６  、分離菌ｃは、ＹＭ−０３  受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０８７  とそれぞれ受託番号が付されている。
【００１０】
本発明者らは、これらのたい肥中の高温で生育する微生物の存在について、さらに検討したところ、驚くべきことに７５℃以上の高温で活発に増殖し、８５℃においても増殖が認められるが５０℃以下では増殖が認められない新規な属に属する超好熱菌カルドトリックス・サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ  ｓａｔｕｍａｅ）ＹＭ０８１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９８）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３３）を見出して特許出願した（特願２００１−３９１５６１；ＰＣＴ／ＪＰ０２／１３４２４）。ところが、その後このたい肥中の超好熱菌についてさらに検討したところ、１６ｓｒＤＮＡ塩基配列においてカルドトリックス・サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株と９８％以上の相同性を有するが、栄養要求性や至適塩濃度などの菌学的性質においてＣａｌｄｏｔｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ  ＹＭ０８１株と相違する数種の微生物の菌株を得た。
【００１１】
【特許文献１】特開昭５５−１２１９９２号公報
【特許文献２】特開昭５１−１２９７５９号公報
【特許文献３】特開平６−５１９７号公報
【特許文献４】特開平６−１０５６７９号公報
【特許文献５】特開平６−１９１９７７号公報
【特許文献６】特許第３０６４２２１号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、汚泥を８５℃以上で発酵させて得られたたい肥中から超好熱菌のカルドトリックス・サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｒｉｘ  ｓａｔｕｍａｅ）の新菌株を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために、前記汚泥を８５℃以上で発酵させて得られるたい肥  （商品名  サツマソイル）中に存在する好熱性微生物の検索を試みたところ、通常の細菌の培養温度  （３０〜４０℃）  では増殖せず、７０〜８５℃、特に８０℃以上で活発に生育する絶対好気性菌を見出した。そして、この菌について１６ＳｒＤＮＡ  の塩基配列に基づく系統分類解析を行った。その結果、この絶対好気性菌は、グラム陰性で胞子形成能がないにもかかわらず、図１に示されるような胞子形成能を持つグラム陽性土壌細菌  Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属と近縁であるがこれらとは少なくとも属レベルにおいて独立の細菌であることを見出した。本発明者らは、これをカルドトリックス    サツマエ    Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ ｓａｔｓｕｍａｅ，  ＹＭ０８１  菌と命名し、この菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９８  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３３）が付与された。
また、この菌の１６Ｓｒ  ＤＮＡの全塩基配列は配列表配列番号１のとおりの塩基配列を示す。
【００１４】
この超好熱菌は、前記した鹿児島市のし尿等の有機廃棄物を特許第３０６４２２１  号公報に記載される方法に従って高温で発酵させて得られる堆肥  （商品名サツマソイル  ）から分離された。この分離方法としては、次の方法が用いられた。  表４に記載の組成の培地  ５ｍｌに、前記たい肥約０．１ｇを加えて、８０℃に保温し、継代をくりかえして濃縮した後、同一の培地にゲランガムを加えたプレート上に単離、精製を反復した。
【００１５】
【表４】
2005013063.tif 000006
【００１６】
このようにして得られた菌体の微生物学的性質及び分類学的位置は次のとおりであった。
１）    形態  巾  ０．５μｍ  、長さ  ３μｍ  の長桿菌である。グラム染色の結果は陰性を示し、菌体の超薄切片の電子顕微鏡観察も細胞表層構造がグラム陰性型であること、すなわち、細胞膜（形質膜）、細胞壁に加えて、外膜の存在を示した。胞子形成能はない。
２）    ７０〜８５℃で活発に生育し、５０℃以下では増殖の認められない。７５℃以上の高温で活発に増殖し、８５℃においても増殖が認められる。絶対好気性である。
３）    増殖の至適ｐＨは中性である。増殖可能なｐＨ範囲は  ６〜９  である。
また、弱好塩性を示す。
４）    アルブミン、カゼインなど各種たんぱく質、およびでん粉の資化性がある。
５）    ウレアーゼ生産性がある。硝酸還元能はない。硫化水素生産性、インドール生産性はない。
６）      ＤＮＡの  Ｇ＋Ｃ  含量は７０．０％である。
７）    １６ＳｒＤＮＡ  の塩基配列に基づく系統分類解析を行った。その結果を図１及び表６に示す。また１６ＳｒＤＮＡ  の全塩基配列は配列表配列番号１に記載のとおりの塩基配列となった。
このように、この菌体は、グラム陰性で胞子形成能がないにも拘わらず、
胞子形成能を持つグラム陽性土壌細菌  Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属と近縁であるが、これらとは少なくとも属レベルにおいて独立の細菌である。
【００１７】
これらのことより、本発明の微生物は、眞正細菌に属し、超好熱菌であることが判明した。また１６ＳｒＤＮＡ  の塩基配列からは  Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに近縁であるが、これとは独立の属を形成していることが判明した。
【００１８】
そして、本発明者らは、さらに表６に示す培地を基本成分とする培地を用いて、新菌種の探索を行ったところ、数種の高度好熱菌を分離することができた。そして、これらの分離した菌を、ＹＭＯ  ８０３、ＹＭＯ  ８０６、ＹＭＯ  ８１１、ＹＭＯ  ８１２、ＹＭＯ  ８１３と命名した。これらの菌株は、ＹＭ０８１株と同じ種と同定できることが判明した。しかしこれらの菌体は、いずれも至適塩分濃度が１％以下であって、カルドトリックス・サツマエ（Ｃａｌｄｏｔｒｉｘ  ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の至適塩分濃度が３％であるのに対し、至適塩分濃度が低い点に特徴を有する。
これらすべての菌株は、長桿菌で、胞子形成能がなく、グラム陰性の高度高熱性真正細菌で少なくとも８０℃で増殖が可能である。これらすべての菌株は、炭素源、窒素源としてカゼイン、可溶性でんぷんを利用し、ｐＨ７．５〜８．５の範囲の至適ｐＨを有している。しかし、栄養要求性や至適塩濃度など増殖に関する性質はそれぞれ異なっている。また、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列はそれぞれ株毎に異なるが、ＹＭ０８１株を含め相互に配列相同性が９８％以上あり、すべて同一種と同定できる。
【００１９】
【発明の効果】
し尿等の有機廃棄物を原料として発酵培養物を接種し、発酵を行うと、多数の  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属に属する中等度好熱菌等によって発酵温度が上昇する。その後、発酵温度が上昇するに従い、本発明の数種の超好熱菌カルドトリックスが高温型コンポストにおける有機廃棄物の分解と発酵に関与するようになる。従って、本発明の超好熱菌は有機廃棄物（し尿、家畜糞、都市ごみ、汚泥等）をその塩分濃度が低い部分であっても高温で分解し、発酵させたい肥を製造する種菌、培地等として有用に利用される。
さらに、この超好熱菌の産生するプロテアーゼおよびアミラーゼは高温で活性を有するので、この性質を利用して耐熱性酵素を製造することが期待される。
【００２０】
【実施例】
次に本発明の参考例及び実施例について説明する。しかし、本発明はこれらの参考例及び実施例に限定して解釈されるべきではない。
【参考例１】
１．菌体培養物の調製
鹿児島県姶良郡牧園町の霧島火山帯の硫黄地帯の３７〜４０℃の土壌とその付近の水田の青苔の生育している土壌とを混合し、これに蔗糖を  ５００〜１０００倍量の水に溶解した蔗糖水溶液を土壌混合物  １ｍ３当り  ３〜４Ｌ加え、４０〜５０℃で３０〜５０日間放置して培養する。この培養物をいくつかのロットに公共下水道の生汚泥と混合し、空気を吹き込みながら好気的条件下で発酵させ、８５℃以上の発酵温度が得られるロットを菌体培養物とした。
【００２１】
２．  生汚泥の処理
動物糞、下水の汚泥、澱粉カス及び生ゴミの混合物に消石灰を加えて消臭処理し、その８０重量部に前記（１）  で得られた菌体培養物２０重量部を混合し、発酵槽内で通気条件下で発酵を行う。このようにすると発酵物が約１日のうちに常温から８５〜９５℃に上昇する。この温度で発酵を３日間維持し、発酵開始後５日目に切り返し（撹拌）を行う。切り返しにより発酵物の温度は６０℃前後に低下するが約１日のうちに温度８５〜９５℃に上昇する。この温度に５日間維持して発酵を行う。この発酵及び切り返しの操作を数回繰り返すと切り返しのさいの温度及び発酵温度が次第に低下する。４回この操作を繰り返し、切り返しのさいの発酵物の温度が３５℃程度に低下したときを最終発酵日とする。得られた発酵物を菌体培養物として使用する。この菌体培養物は乾燥されて際茶色の顆粒状になっている。
【００２２】
３．原料たい肥の調製
鹿児島市の公共下水道汚泥を圧縮脱水し、水分６８％となった生汚泥８０重量部に対し、前記２で得られた菌体培養物２０重量部を混合し、発酵ヤードに入れ、下から空気を吹き込みながら発酵を行った。発酵開始後７日で温度９８℃に達した。１０日間発酵を行って、発酵温度が９８℃から低下しはじめた時点で、切り返しを行って再度発酵させた。最初９９℃の温度に達した後、すなわち切り返し後１０日目に温度が急速に６０〜７０℃に低下した。この時点で、発酵ヤードに発酵生成物を拡げ急速に温度を常温まで低下させ、茶色の汚泥発酵粉末を得た。この汚泥発酵粉末はたい肥として、または前記発酵を行うための菌体培養物あるいは培地として用いられる。
【００２３】
【参考例２】
超好熱菌の単離
参考例１で得られた、たい肥を試料として約０．１ｇを、表４の培地  ５ｍｌに接種し、８０℃に保温し、継代を繰り返して濃縮したのち、同一組成の培地にゲランガムを加えたプレート上で単離精製を繰り返して超好熱菌を得た。
なお、たい肥試料を、ヘプトン・イーストエキス培地  （各０．５，  ０．３％，  ｐＨ７．２）に加えて７０℃で培養し、増殖した細菌を寒天プレート（ｐＨ７．２、７０℃）  上で単離したことろ、温度７０℃以上で従来から堆肥の発酵をになうとされているＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓほか、その他の多数の新規な好熱性細菌が見出された。
【００２４】
【参考例３】
超好熱菌の微生物学的性質
参考例２で得られた、超好熱菌を、カゼイン０．３  ％、酵母エキス０．２  ％、でん粉０．１  ％、ＮａＣｌ  ３％よりなる、ｐＨ７〜８の寒天培地に接種し、８０℃で２４時間培養し、その微生物学的性質を検討した。その結果を表５に示した。
この超好熱菌の顕微鏡写真を図２〜５に示す。
【００２５】
【表５】
2005013063.tif 000007
2005013063.tif 000008
１６Ｓｒ  ＤＮＡの塩基配列に基づいて全塩基配列を決定し、それに基づ
いて分子系統樹を作成した。この結果を図１及び表６に示す。
【００２６】
【表６】
2005013063.tif 000009
【００２７】
この結果、この超好熱菌は、眞正細菌に属し、グラム陰性で胞子形成能がないにもかかわらず、胞子形成能をもつグラム陰性土壌細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ，  Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属とは近縁であるので、新属に属することは明らかとなった。また、ＤＮＡのＧＣ含量については、表６にみられるように９０％に達する相同性を示す菌はなく、また２つの属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属とＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  属のそれぞれから等距離（各８５％）  離れているので新属と判定される（表６及び図１参照）。そしてこの属をカルドトリックスと命名した。至適増殖温度が８０℃であるので、この菌は超好熱菌であることも明らかとなった。
なお、本発明のカルドトリックス・サツマエ  （Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ ｓａｔｓｕｍａｅ）  ＹＭ０８１株  と枯草菌  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ    ｓｕｂｔｉｌｕｓ）  との生化学的性質を比較すると表７のとおりである。
【００２８】
【表７】
2005013063.tif 000010
【００２９】
【実施例１】
参考例１で得られた、たい肥を試料としてその約０．１ｇを、表８の組成の培地５ｍｌに接種し、８０℃に保温し、継代を繰り返して濃縮したのち、同一組成の培地にゲランガムを加えたプレート上で単離精製を繰り返して本発明の超好熱菌を得た。これらの分離した菌株を、ＹＭＯ  ８０３、ＹＭＯ  ８０６、ＹＭＯ  ８１１、ＹＭＯ  ８１２、ＹＭＯ  ８１３と命名した。これらの菌株は、前述のようにすべて長桿菌で、胞子形成能がなく、グラム陰性の高度好熱性真正細菌で少なくとも８０℃で増殖が可能である。そして、これらのすべての菌株は、炭素源、窒素源としてカゼイン、可溶性でんぷんを利用し、ｐＨ７．５〜８．５の範囲の至適ｐＨを有している。しかし、次に記載するように栄養要求性や至適塩濃度などの増殖に関する性質は、それぞれ異なっている。特に至適温度が１％以下、特に０．３〜０．８％である点で特徴を有している。
【００３０】
【表８】
2005013063.tif 000011
【００３１】
また、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、それぞれ株毎に異なるが、表１２に示されるようにＹＭ０８１株を含め相互に配列相同性が９８％以上あり、すべて同一種と同定できる。これれの菌株がＹＭ０８１株と異なる性質を有している点のみ、表９に示す。この表から分かるとおり、一部の菌性は、微量金属元素の添加を必要としている。この微量金属元素の組成を表１０に示した。また一部の菌株は増殖にたい肥の抽出液を必要とする。このたい肥抽出液の作成法を表１１に示した。
【００３２】
【表９】
2005013063.tif 000012
【００３３】
【表１０】
2005013063.tif 000013
【００３４】
【表１１】
2005013063.tif 000014
【００３５】
本発明者らは、これらの菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、次の寄託番号を得ている。
2005013063.tif 000015
これらの菌株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列表配列番号２〜６に示す。表１２に示されるとおり、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、それぞれの菌株毎に異なるが、ＹＭ０８１株を含め相互に配列相同性が９８％以上であり、全て同一種であると同定される。これらは、高熱型コンポストにおける有機破棄物の分解は、これらの菌株の共同作業に関与していると考えられる。また、これらの菌株の高熱性の高温的熱性を利用して、耐熱酵素の分離などに用いられる。
【００３６】
【表１２】
2005013063.tif 000016
【００３７】
【配列表】
2005013063.tif 000017
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【００３８】
2005013063.tif 000020
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【００３９】
2005013063.tif 000023
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【００４０】
2005013063.tif 000026
2005013063.tif 000027
2005013063.tif 000028
【００４１】
2005013063.tif 000029
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【００４２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカルドトリックス（Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ）属の１６ＳｒＤＮＡ  に基づく分子系統樹を示す。なお、図中ＹＭ０８１  が本発明の超好熱菌である。
【図２】本発明のカルドトリックス・サツマエ  （Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の光学電子顕微鏡写真を示す。
【図３】本発明のカルドトリックス・サツマエ  （Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図４】本発明のカルドトリックス・サツマエ  （Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ ｓａｔｓｕｍａｅ）ＹＭ０８１株の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図５】本発明のカルドトリックス・サツマエ  （Ｃａｌｄｏｔｈｒｉｘ ｓａｔｓｕｍａｅ）  ＹＭ０８１  株の菌体の超薄切片の電子顕微鏡写真を示す（倍率５，０００  倍）  。
【図１】
2005013063.tif 000034
【図２】
2005013063.tif 000035
【図３】
2005013063.tif 000036
【図４】
2005013063.tif 000037
【図５】
2005013063.tif 000038