(57)【要約】【課題】  Ｒｅｖ蛋白核外移行制御物質の新規アッセイ法を提供すること。【解決手段】  ＨＩＶ由来ＤＮＡを細胞にトランスフェクションさせ、その結果として発現する構成タンパク質ｐ２４をＥＬＩＳＡ法により定量することで、被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を評価する。その際、阻害率０％の細胞試料および阻害率１００％の細胞試料を対照に使用して、両者との比較により被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価する。また、ルシフェラーゼ遺伝子をＨＩＶ由来ＤＮＡと同時に各細胞にトランスフェクションさせ、ルシフェラーゼ活性を基準に各細胞から抽出した粗タンパク液を希釈し、各希釈液においてｐ２４の生成量を測定する。このようなアッセイ方法により、被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性について良好な定量性と再現性を示す結果が得られた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ由来ＤＮＡをトランスフェクション後、被検物質を投与した細胞について、所定のＨＩＶ構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、Ｒｅｖ核外移行制御物質のアッセイ法。
【請求項２】
所定のＨＩＶ構成タンパク質として、ｐ２４の発現量を測定することを特徴とする、請求項１記載のアッセイ法。
【請求項３】
ＥＬＩＳＡ法によってｐ２４の発現量を測定することを特徴とする、請求項２記載のアッセイ法。
【請求項４】
宿主細胞においてＲＲＥ領域がＲＮＡに転写され、かつ、Ｒｅｖ蛋白を発現させるＨＩＶ由来ＤＮＡがトランスフェクションされた第１群の細胞、
宿主細胞においてＲｅｖ蛋白を発現させないか、又は本来の機能を失ったＲｅｖ蛋白を発現させるＨＩＶ由来ＤＮＡがトランスフェクションされた第２群の細胞、および、
第１群の細胞と同じＨＩＶ由来ＤＮＡがトランスフェクションされた後、被検物質が投与された第３群の細胞、のそれぞれについて、所定のＨＩＶ構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、Ｒｅｖ核外移行制御物質のアッセイ法。
【請求項５】
所定のＨＩＶ構成タンパク質として、ｐ２４の発現量を測定することを特徴とする、請求項４記載のアッセイ法。
【請求項６】
ＥＬＩＳＡ法によってｐ２４の発現量を測定することを特徴とする、請求項５記載のアッセイ法。
【請求項７】
第１群の細胞を阻害率０％、第２群の細胞を阻害率１００％として、両者との比較により被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、請求項４記載のアッセイ法。
【請求項８】
各群の細胞に対して、ＨＩＶ由来ＤＮＡに加えて外来遺伝子を導入し、この外来遺伝子の発現量に応じて各群の細胞からのタンパク質抽出液を希釈し、これら希釈液における所定のＨＩＶ構成タンパク質の発現量を測定することを特徴とする、請求項７記載のアッセイ法。
【請求項９】
外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を導入することを特徴とする、請求項８記載のアッセイ法。
【請求項１０】
ＨＩＶ由来ＤＮＡおよび外来遺伝子をプラスミドにより細胞内導入し、さらにトランスフェクション量調整用のプラスミドを各群の細胞に導入することを特徴とする、請求項８又は９記載のアッセイ法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアッセイ法に使用されるアッセイ用キット。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアッセイ法に使用されるアッセイ用装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒｅｖ蛋白核外移行制御物質の新規アッセイ法とその利用に関するものであり、好適には、Ｒｅｖ蛋白の核外移行阻害を作用機序とした抗ＨＩＶ薬の探索に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
エイズ患者、即ちＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）に感染し、発症した患者の数は発見以来世界規模で増え続けており、早急な治療法の確立が必須である。現段階での化学療法としては、逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤を併用して用いる方法が一般に採られている。
【０００３】
逆転写酵素は、ウィルスＲＮＡをＤＮＡへと読み換える際に必要なＨＩＶが保有している酵素であり、その阻害剤としてはＡＺＴ等が挙げられる。
【０００４】
プロテアーゼは、ウィルス蛋白翻訳後に必要となる酵素で、その阻害剤としてはサキナビル等が用いられている。
【０００５】
ところでＨＩＶ遺伝子は、ＲＮＡ結合蛋白であるＲｅｖ蛋白をコードしている。このＲｅｖ蛋白は核外移行シグナル（ＮＥＳ）を持ち、ウィルスｍＲＮＡの核外輸送に必要であり、ひいてはＨＩＶの複製・増殖に必須の蛋白といえる。このＲｅｖ蛋白の機能を阻害・抑制する物質として、これまでleptomycin B（ＬＭＢ）およびvaltrate等が報告されている（下記の非特許文献１・２参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Wolff, B. et al., Chemistry & Biology, 1997, 4, 139-147頁
【非特許文献２】Murakami, N. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 2807-2810頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、Ｒｅｖ蛋白はＨＩＶ由来の蛋白であり、核内でＨＩＶ遺伝子と結合したのち、核外へと移行し、ＨＩＶ遺伝子が翻訳されてウィルス構成タンパクが作られる。Ｒｅｖ蛋白の核外移行はＨＩＶの増殖に必須であることから、Ｒｅｖ蛋白がＨＩＶ制圧のためのターゲットとして注目を集めている。
【０００８】
従来、Ｒｅｖ蛋白の核外移行の検出は、抗Ｒｅｖ抗体を用いて行われていた（非特許文献１記載の実験方法も、抗Ｒｅｖ抗体を用いた実験系を採用している）。しかしながら、市販の抗Ｒｅｖ抗体は感度が良好ではなくロット差が大きいことと、抗Ｒｅｖ抗体を動物から調製する場合において、純度や感度にバラツキが見られることから、実験結果に再現性が得られにくい欠点があった。また、定量性という点においても問題を残していた。
【０００９】
Ｒｅｖ蛋白の核外移行はＨＩＶの増殖に必須であることから、Ｒｅｖ蛋白の核外への動きを精度良く検出し、その検出法を利用した核外移行を制御する物質の発見がＨＩＶ制圧の足がかりとなる可能性がある。それゆえ、精度の良好なＲｅｖ蛋白核外移行制御物質のアッセイ法構築が必要となる。
【００１０】
本発明は上記の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、新規なＲｅｖ蛋白核外移行制御物質のアッセイ法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、抗Ｒｅｖ抗体を用いることなく、ＥＬＩＳＡ法といった簡便な方法を用いた新規なＲｅｖ蛋白核外移行制御物質のアッセイ法を構築し、その定量性についても良好な再現性を確認し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、産業上および医療・医学上有用な、下記Ａ）〜Ｌ）の発明を包含するものである。
Ａ）  ＨＩＶ由来ＤＮＡをトランスフェクション後、被検物質を投与した細胞について、所定のＨＩＶ構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、Ｒｅｖ核外移行制御物質のアッセイ法。
Ｂ）  所定のＨＩＶ構成タンパク質として、ｐ２４の発現量を測定することを特徴とする、上記Ａ）記載のアッセイ法。
Ｃ）  ＥＬＩＳＡ法によってｐ２４の発現量を測定することを特徴とする、上記Ｂ）記載のアッセイ法。
Ｄ）  宿主細胞においてＲＲＥ領域がＲＮＡに転写され、かつ、Ｒｅｖ蛋白を発現させるＨＩＶ由来ＤＮＡがトランスフェクションされた第１群の細胞、宿主細胞においてＲｅｖ蛋白を発現させないか、又は本来の機能を失ったＲｅｖ蛋白を発現させるＨＩＶ由来ＤＮＡがトランスフェクションされた第２群の細胞、および、第１群の細胞と同じＨＩＶ由来ＤＮＡがトランスフェクションされた後、被検物質が投与された第３群の細胞、のそれぞれについて、所定のＨＩＶ構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、Ｒｅｖ核外移行制御物質のアッセイ法。
Ｅ）  所定のＨＩＶ構成タンパク質として、ｐ２４の発現量を測定することを特徴とする、上記Ｄ）記載のアッセイ法。
Ｆ）  ＥＬＩＳＡ法によってｐ２４の発現量を測定することを特徴とする、上記Ｅ）記載のアッセイ法。
Ｇ）  第１群の細胞を阻害率０％、第２群の細胞を阻害率１００％として、両者との比較により被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価することを特徴とする、上記Ｄ）記載のアッセイ法。
Ｈ）  各群の細胞に対して、ＨＩＶ由来ＤＮＡに加えて外来遺伝子を導入し、この外来遺伝子の発現量に応じて各群の細胞からのタンパク質抽出液を希釈し、これら希釈液における所定のＨＩＶ構成タンパク質の発現量を測定することを特徴とする、上記Ｇ）記載のアッセイ法。
Ｉ）  外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を導入することを特徴とする、上記Ｈ）記載のアッセイ法。
Ｊ）  ＨＩＶ由来ＤＮＡおよび外来遺伝子をプラスミドにより細胞内導入し、さらにトランスフェクション量調整用のプラスミドを各群の細胞に導入することを特徴とする、上記Ｈ）又はＩ）記載のアッセイ法。
Ｋ）  上記Ａ）〜Ｊ）のいずれかに記載のアッセイ法に使用されるアッセイ用キット。
Ｌ）  上記Ａ）〜Ｊ）のいずれかに記載のアッセイ法に使用されるアッセイ用装置。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、従来法ではなし得なかった良好な定量性と再現性を示すＲｅｖ蛋白核外移行制御物質の新規アッセイ法を提供するものであり、本発明のアッセイ法を利用することで、ＨＩＶ制圧の鍵となるＲｅｖ蛋白の核外移行を制御する新規物質を効率よく発見することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の具体的態様等について更に詳しく説明する。
【００１５】
〔１〕本発明のＲｅｖ蛋白核外移行制御物質のアッセイ法
本発明は、前述のように、ＨＩＶ由来ＤＮＡをトランスフェクション後、被検物質を投与した細胞について、所定のＨＩＶ構成タンパク質の発現量を測定し、この測定結果をもとに被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価する方法である。
【００１６】
「ＨＩＶ由来ＤＮＡ」は、ＨＩＶ遺伝子の既知配列をもとに調製されたＤＮＡである。ＨＩＶ由来ＤＮＡは、プラスミドなどのベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞にトランスフェクションさせる方法が好ましい。また、ウィルスＤＮＡの全長を用いると、トランスフェクション後にＨＩＶウィルスそのものが産生されてしまう。そこで、ウィルスの産生を回避すべく、ＨＩＶ由来ＤＮＡには、ｐｏｌ、ｅｎｖといった構造遺伝子のうち、いずれかの遺伝子領域の全部又は一部を取り除いたＤＮＡを使用することが好ましい。
【００１７】
本発明において、上記ＨＩＶ由来ＤＮＡ（あるいは同ＤＮＡが挿入されたベクター）に求められる条件としては、導入により、宿主細胞において（１）Ｒｅｖ蛋白が発現すること、（２）Ｒｅｖが結合するＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）領域が転写されること、（３）Ｒｅｖの核外移行により検出対象である所定の構成タンパク質（例えばｐ２４）が発現すること、である。
【００１８】
なお、ＨＩＶウィルスには様々なタイプ、サブタイプ、ウィルス株が知られているが、いずれの配列をもとに上記ＨＩＶ由来ＤＮＡを調製してもよい。使用するベクターの種類についても、上記の条件を満たす限りにおいて特に限定されない。
【００１９】
「トランスフェクション」の方法についても特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など従来公知のトランスフェクション法（形質転換法）を使用することができる。このうちリン酸カルシウム法は、後述の実施例において使用したトランスフェクション法であるが、簡便で効率も良好な方法である。
【００２０】
後述の実施例において、「細胞」（宿主細胞）にはＨｅＬａ細胞を使用した。勿論、ＨｅＬａ細胞以外の細胞種を使用してもよい。トランスフェクション法にリン酸カルシウム法を採用する場合は、付着性細胞を使用することが好ましく、例えばＫＢ、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７、Ｔ２４、ＨＴ１０８０、ＰＣ３等の細胞種の使用が例示される。
【００２１】
検出対象となる「所定のＨＩＶ構成タンパク質」としては、Ｒｅｖ蛋白との結合により核外へ運搬されたＨＩＶ由来ＲＮＡから翻訳された構成タンパク質であればよいが、Ｇａｇタンパク質であるｐ５５の構成単位であり、同一のエピトープを有するｐ２４を好適なものとして挙げることができる。ｐ２４については、ＥＬＩＳＡ法を用いた市販の検出キットも存在し、精度良く検出することができる。
【００２２】
本アッセイ法において、構成タンパク質の「発現量」の測定は細胞試料に対して行うが、細胞試料には、細胞破砕液、または細胞破砕液を遠心操作によって分画したタンパク質抽出液（粗タンパク液）を使用することが好ましい。
【００２３】
「発現量」の測定には、好ましくはＥＬＩＳＡ法(enzyme linked immunosorbent assay：酵素免疫測定法）を使用することができる。ＥＬＩＳＡ法においては、酵素活性を指標に目的タンパク質の発現量を測定・評価する。例えば、ｐ２４の発現量を測定する場合、まず抗原ｐ２４を特異的に認識する抗ｐ２４抗体を用いて抗原−抗体反応を行い、試料中の抗原と抗体とを結合させる。次に、抗ｐ２４抗体に直接、又は間接的に結合した酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）に対してその基質を加えることで酵素反応を進行させる。酵素反応による発色を利用して試料の吸光度を測定することによって、試料中のｐ２４の発現量を測定・評価することができる。
【００２４】
ＥＬＩＳＡ法においては、使用する酵素の種類、抗体と酵素との結合方法などについて種々の改変が可能であり、本発明においてはいずれの方法を使用してもよい。また、ＥＬＩＳＡ法以外に、検出対象となるＨＩＶ構成タンパク質に対する抗体を蛍光物質あるいは化学発光物質で直接的又は間接的に標識し、試料から得られた蛍光量あるいは化学発光量をもとに当該タンパク質の発現量を測定してもよい。
【００２５】
ＨＩＶ構成タンパク質の発現量が少ないときは、被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性は高いと評価でき、他方、発現量が多いときは、被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性は低いと評価できる。これは以下の理由による。
【００２６】
一般に、受動拡散によって核膜孔を通過できない大きなタンパク質の核内あるいは核外への移行は、輸送担体によって行われる。運搬されるタンパク質には核移行シグナル（ＮＬＳ）あるいは核外移行シグナル（ＮＥＳ）が存在しており、輸送担体はそのシグナルを認識して核内外へとタンパク質を輸送する。Ｒｅｖは、ＮＥＳとＨＩＶ由来ＲＮＡを認識する領域とを持ち合わせており、ＨＩＶ由来ＲＮＡ−Ｒｅｖ―輸送担体という複合体を形成して核外へと輸送される。ここで核外移行を司る輸送担体はＣＲＭ１と呼ばれている。
【００２７】
上記ＨＩＶ由来ＲＮＡは、通常核内でスプライシングを受けたのち翻訳されるのだが、Ｒｅｖが結合することでスプライシングを回避して核外へと運搬され、構成タンパク質が合成される。つまり、構成タンパク質の合成量が多いほど、Ｒｅｖの核外移行は阻害されておらず、他方、構成タンパク質の合成量が少ないほど、Ｒｅｖの核外移行は阻害されているといえる。
【００２８】
被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価する方法としては、阻害率０％の細胞群および阻害率１００％の細胞群を対照とした以下の方法を用いることが好ましい。即ち、細胞を３つのグループに分け、第１群の細胞には前記ＨＩＶ由来ＤＮＡ（前述の（１）〜（３）の条件を満たすもの）をトランスフェクションさせる。第２群の細胞にはこれとは異なるＨＩＶ由来ＤＮＡをトランスフェクションさせる。より具体的には、前述の（１）の条件を欠き、宿主細胞においてＲｅｖ蛋白を発現させないか、又は本来の機能（ＨＩＶ由来ＲＮＡを核外に移行させる機能）を失ったＲｅｖ蛋白を発現させるＨＩＶ由来ＤＮＡが、第２群の細胞にトランスフェクションされる。
【００２９】
第３群の細胞には、第１群の細胞と同じＨＩＶ由来ＤＮＡ（前述の（１）〜（３）の条件を満たすもの）がトランスフェクションされた後、被検物質が投与される。そして所定期間経過後、各群の細胞を破砕しタンパク質抽出液を調製して、各抽出液における、所定のＨＩＶ構成タンパク質（例えばｐ２４）の発現量をＥＬＩＳＡ法などによって測定し、この測定結果をもとに被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量的に評価する。このとき、第１群の細胞を阻害率０％とし、第２群の細胞を阻害率１００％とすれば、両者との比較により被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性（換言すれば、阻害率）を定量的に評価することができる。
【００３０】
上記アッセイ法において、好ましくは、各群の細胞に対して、ＨＩＶ由来ＤＮＡに加えて外来遺伝子を導入し、この外来遺伝子の発現量に応じて各群の細胞からのタンパク質抽出液を希釈し、これら希釈液における所定のＨＩＶ構成タンパク質の発現量を測定する。これにより、トランスフェクション効率をノーマライズすることができる。また、このアッセイ系と無関係の一般的な転写、翻訳などのシステムを阻害していないことを確認することができる。
【００３１】
導入する外来遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子などが例示されるが、特に限定されるものではない。ルシフェラーゼ遺伝子を導入した場合は、常法に従って各試料中のルシフェラーゼ活性を測定し、その測定結果に基づいて各試料を希釈すればよい。
【００３２】
また、ルシフェラーゼ遺伝子の細胞内導入には、当該遺伝子が挿入されたプラスミドを使用すればよいが、当該プラスミドの配列は、Ｒｅｖに非依存的であることが確認された配列であることが望ましい。
【００３３】
上記アッセイ法において、ＨＩＶ由来ＤＮＡおよび外来遺伝子をプラスミドにより細胞内導入し、さらにトランスフェクション量調整用のプラスミドを各群の細胞に導入してもよい。後述の実施例においては、トランスフェクション量調整用のプラスミドとしてＰＵＣ１２を各群の細胞に導入したが、本アッセイ系に影響が出ない限りにおいて、使用するプラスミドの種類は特に限定されるものではない。
【００３４】
〔２〕本発明のアッセイ法の具体例（実施例）
以上説明した本発明のアッセイ法の具体例（実施例）として、次のようなアッセイ系を組み立てた。
ＨＩＶ遺伝子（ＨＩＶ由来ＤＮＡ）を細胞にトランスフェクションさせ、その結果として発現する構成タンパク質ｐ２４をＥＬＩＳＡ法により定量することで、被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を評価する。その際、トランスフェクション効率をノーマライズする目的、および本アッセイ系のほかに一般的な転写、翻訳などのシステムを阻害していないことを確認する目的で、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミドを同時にトランスフェクションする。このようなアッセイ系により、Ｒｅｖ核外移行阻害物質として、ルシフェラーゼ活性を抑制せず、ｐ２４の産生を抑制する化合物を探索する。
具体的には以下の手順１〜７に従って、Ｒｅｖ核外移行阻害物質のアッセイを行った。
【００３５】
〔アッセイの方法〕
手順１：  培養ＨｅＬａ細胞を、６ウエルプレート（well plate）に４×１０4 cells/3mL/well で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で培養し、２１時間後に培地を新鮮なものに入れ替えた。
【００３６】
手順２：  播種してから２４時間後に、リン酸カルシウム法によってプラスミド懸濁液をトランスフェクションする。プラスミドには、以下の４種類を使用した。
（１）ｐｃＲＲＥ：  ＨＩＶ遺伝子よりｐｏｌ領域を欠落（又は不活化）させたＨＩＶ由来ＤＮＡを導入したプラスミド
（２）ｐｃＲＲＥ／Δｒｅｖ：  上記プラスミドｐｃＲＲＥからＲｅｖ蛋白をコードするｒｅｖ遺伝子領域を欠落（又は不活化）させたプラスミド
（３）ｌｕｃ：  ルシフェラーゼ遺伝子をコードし、その上流にＲＳＶプロモーターを組み込んだプラスミド
（４）ＰＵＣ１２：  トランスフェクションするＤＮＡ総量を調節するために使用されるプラスミド。一般的なクローニングベクターである。
そして、細胞をＡ群とＢ群とに分け、上記（１）〜（４）のプラスミドを適宜組み合わせて、各群の細胞に対してトランスフェクションを行った。具体的には、Ａ群の細胞に対して、ｐｃＲＲＥ、ｌｕｃおよびＰＵＣ１２を、また、Ｂ群の細胞に対してはコントロールとして、ｐｃＲＲＥ／Δｒｅｖ、ｌｕｃおよびＰＵＣ１２をトランスフェクションさせた。
【００３７】
手順３：  トランスフェクションから３７℃、５％ＣＯ2で１６時間培養したのち、培地で２回洗浄してリン酸カルシウムの沈殿を除いた。
次に、新鮮な培地に入れ替え、Ａ群を被検物質投与群と非投与群とに分け、投与群の細胞に対して、ＤＭＳＯ終濃度１％となるように被検物質のＤＭＳＯ溶液を添加した。他方、Ａ群の非投与群およびＢ群の細胞に対してはＤＭＳＯのみを添加した。
【００３８】
手順４：  被検物質添加後３７℃、５％ＣＯ2で１２時間培養し、その後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、lysis buferを加えて各群の細胞を破砕した。細胞破砕液を回収し、遠心操作によって不溶画分を沈殿させ、上清を粗タンパク液とした。
【００３９】
手順５：  各群の粗タンパク液のルシフェラーゼ活性を常法に従って測定した。
【００４０】
手順６：  ルシフェラーゼ活性を基準に粗タンパク液を希釈した後、各群においてＨＩＶ構成タンパク質であるｐ２４の生成量を測定した。ｐ２４の測定には、市販のｐ２４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ZeptoMetrix社製）を使用し、キット説明書記載の方法に従って行った。
また、各群の粗タンパク液の希釈は、ルシフェラーゼ活性が各群一定の値になるように、次のように行った。例えば、ルシフェラーゼ活性10,000 RLU/10μLに合わせて希釈する場合、Ａ群の活性：25,000 RLU/10μL、Ｂ群の活性：500,000 RLU/10μL、Ｃ群の活性：125,000 RLU/10μLであれば、それぞれＡ群：２．５倍、Ｂ群：５０倍、Ｃ群：１２．５倍に希釈した粗タンパク液を用いてｐ２４の発現量を評価した。
【００４１】
手順７：  Ａ群のＤＭＳＯのみ添加群（即ち、被検物質非投与群）のｐ２４産生量をＲｅｖ核外移行が全く阻害されていない値（０％阻害）とし、Ｂ群のｐ２４産生量をＲｅｖが完全に抑制された場合の値（１００％阻害）として、被検物質投与群におけるｐ２４産生量の値から、各被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を評価した。
【００４２】
〔アッセイの結果〕
本実施例のアッセイ系により行ったアッセイの結果が表１に示される。
【表１】
2005315747.tif 000002
【００４３】
表中、「luciferase」は、ルシフェラーゼ活性の測定結果（単位：RLU/10μL）、「ｐ２４産生量」は、上記ＥＬＩＳＡ法によりｐ２４産生量を測定した結果（単位pg/mL）、「抑制率」は、このｐ２４産生量から各被検物質の抑制率（Ｒｅｖ核外移行阻害率）を算出・評価した結果である。
【００４４】
「No treatment (pcRRE)」は、前記プラスミドｐｃＲＲＥをトランスフェクションさせたＡ群のうち被検物質非投与群の結果であり、このときのｐ２４産生量が抑制率０％と設定される。他方、「No treatment (pcRRE/Δrev)」は、前記プラスミドｐｃＲＲＥ／ΔｒｅｖをトランスフェクションさせたＢ群の結果であり、このときのｐ２４産生量が抑制率１００％と設定される。
【００４５】
「LMB」（leptomycin B）は、公知のＲｅｖ核外移行阻害物質である。前述のように、核外移行を担う輸送担体としてＣＲＭ１という蛋白が知られており、ＲｅｖもＣＲＭ１と結合して核外へと輸送される。ＬＭＢは、ＣＲＭ１の５２９番目のＣｙｓ残基と共有結合を形成し、ＣＲＭ１を不活化することが明らかにされている。
【００４６】
本実施例のアッセイ系においても、ＬＭＢを作用させることでｐ２４産生量の顕著な低下が観測された。このときの抑制率は９２．１％と評価された。すなわちＲｅｖの核外移行阻害が起きていること、さらにその阻害の程度が定量化され、数値として把握することができた。
【００４７】
表中の「Sample A・B」は、本実施例のアッセイに使用した被検物質である。両サンプルのうち、サンプルＢは抑制活性を殆ど示さかったが（抑制率６．７％）、サンプルＡについては抑制効果が認められた（抑制率４１．２％）。
【００４８】
このように本実施例のアッセイ系によれば、各被検物質のＲｅｖ核外移行阻害活性を定量化することができ、再現性の点においても良好な結果が得られた。
【００４９】
なお、本実施例のアッセイ方法において、細胞の各培養期間は適宜変更してもよいが、細胞にプラスミドをトランスフェクションさせた後、サンプル処理（被検物質投与）までの培養期間は１６時間程度に設定することが望ましい。これは、トランスフェクションしたＤＮＡが細胞に入っているが、Ｇａｇタンパク質ｐ２４の発現は始まっていないという時間がおよそ１６時間だからである。
【００５０】
被検物質添加後の１２時間培養は、細胞毒性が出にくく、Ｇａｇ産生抑制が見やすい時間に設定してあるため、毒性がなければ１２時間以上に設定してもよい。また、トランスフェクション前の前培養に関しては、トランスフェクション効率が良かった条件を採用しているが、条件は適宜変更してもよい。
【００５１】
〔３〕アッセイ用キット、アッセイ用装置
本発明のアッセイ法をキット化し、あるいはアッセイ用装置とすることが可能である。キット化する場合、上記実施例で使用した各プラスミドのほか、各種試薬、酵素、バッファー、抗体、培地成分などをキットに含めることができ、さらにプレートなどの器具と組み合わせてアッセイ用装置とすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上のように、本発明は、Ｒｅｖ蛋白核外移行制御物質の新規アッセイ法に関するものであり、好適には、Ｒｅｖ蛋白の核外移行阻害を作用機序とした抗ＨＩＶ薬の探索に利用することができるが、他の目的の調査研究にも利用可能である。