(57)【要約】【課題】幹細胞あるいは胚性幹細胞を、フィーダー細胞を用いずに未分化な状態で培養させ得る分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを用い田培養液およびこの分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞を提供する。【解決手段】低分子化合物、特にインドール誘導体に、未分化な、多能性の胚性幹細胞の増強効果を見出した。低分子化合物、特にインドール誘導体を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。インドール誘導体を用いて胚性幹細胞を培養することにより、フィーダー細胞非存在下で、大量にかつ安全で未分化に胚性幹細胞を培養する方法。インドール誘導体を含む幹細胞の培養液。インドール誘導体を分化抑制剤として用いて培養、作製された細胞。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子化合物を有効成分とする幹細胞分化抑制剤。
【請求項２】
低分子化合物がインドール誘導体である、請求項１に記載の分化抑制剤。
【請求項３】
インドール誘導体が一般式式（Ｉ）で表される化合物、その塩またはエステル化合物である請求項２に記載の分化抑制剤。
【化１】
2005013152.tif 000005
（式中、Ｒ１〜Ｒ９は同一または異なった電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。）
【請求項４】
Ｒ１〜Ｒ９はアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アリールアミノビニル基、水素原子よりなる群から選ばれる基または原子である請求項３に記載の分化抑制剤。
【請求項５】
インドール誘導体が、一般式（ＩＩ）で表される化合物、その塩またはエステル化合物である請求項２に記載の分化抑制剤。
【化２】
2005013152.tif 000006
Ａ１〜Ａ３は同一であっても良い低級アルキル基、低級アルコキシ基、水素原子を表し、Ａ４は低級アルキル基、アリールアミノビニル基を表す。
【請求項６】
式（Ｉ）で表される化合物が、
２−メチル−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール、１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール、２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール、２−［２−（４−メトキシ−フェニルアミノ）−ビニル］−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オールまたは１−（２−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オールのいずれかの化合物、その塩またはそのエステル化合物である請求項２に記載の分化抑制剤。
【請求項７】
低分子化合物が、ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ３）を活性化しない化合物である請求項１〜６のいずれかに記載の分化抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の分化抑制剤を用いて幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする幹細胞培養方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の分化抑制剤を用いて胚性幹細胞を未分化状態で培養することを特徴とする胚性幹細胞培養方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の分化抑制剤を有効成分として含有する、幹細胞を未分化状態で増殖するための培養液。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の分化抑制剤を用いて未分化状態で培養された幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低分子化合物、特にインドール誘導体またはその塩を有効成分とする幹細胞分化抑制剤、それを用いる幹細胞培養方法、培養液およびそれを用いて作製された幹細胞株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
外傷や病気、さらには加齢などによって傷害を受けた臓器・組織は、再生を促進し、その機能を回復させる必要がある。特に、心臓・肝臓・腎臓・膵臓などの実質臓器は生命維持に必須であるためその機能低下・廃絶は死に直結することから、臓器移植により救命を図る移植医療が盛んに行われている。しかし、恒常的なドナー不足からその解決には新たなアプローチが必要になっている。
【０００３】
最近になり、胚、或いは成体に存在し、無制限に分裂して、ひとつ或いは複数の方向に分化する能力を有すると考えられる幹細胞を利用して組織・器官の作製を行い、欠損組織の補填を行う再生医療が、従来の臓器移植の欠点を凌駕する治療法として注目されている。
具体的には、幹細胞を増殖させた後、分化させ細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築を行い、それを生体内へ移植したり人工臓器として利用したりすることなどが考えられている。幹細胞を細胞移植治療や組織工学に利用できれば、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できると期待される。
幹細胞は、血管、神経、血液、軟骨、骨、肝臓、膵臓など数々の分野で同定されているが、そのなかでも特に全ての細胞型に分化する能力を有する全能性幹細胞は、上述の再生医療分野のほか、創薬、および遺伝子治療に用いるための細胞ならびに組織を容易に提供し得る細胞として特に注目されている。
全能性幹細胞の一例として、胚性幹（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍ、以下ＥＳ）細胞や、胚性生殖（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ、以下ＥＧ）細胞が知られている。ＥＳ細胞は、マウスの胚盤胞期の内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ，  ＩＣＭ）から分離された細胞株である（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２９２，  ｐ１５４，  １９８１年）。個体を構成する細胞は胚盤胞期の内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ，以下  ＩＣＭ）あるいは原腸胚上層（ｅｐｉｂｌａｓｔ、以下エピブラスト）から派生した一次外胚葉に由来しており、ＩＣＭ  およびエピブラストは全能性を持った幹細胞群であるといえる。ＥＳ細胞は各種個体形成組織への分化能を保持し、正常な胚とキメラ胚を形成させることにより、成体のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を保有している。また、試験管内の分化誘導条件によっても、血液細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、色素細胞、膵内分泌細胞など様々な細胞を生成させる能力をもっている（仲野徹、最新医学別冊−再生医学、ｐ８１−８９、２０００）。
ＥＧ細胞は始原生殖細胞をＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）とｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）存在下で培養することにより樹立された細胞であり（Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ、７０、ｐ８４１、１９９２年、Ｒｅｓｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、３５９、ｐ５５０、１９９２年）、ＥＳ細胞と同様に各種組織への分化能を有している。
最近になって、マウス以外でもＥＳ細胞株の樹立が報告され、マウスＥＳ細胞と同様多分化能を有していることが示されている（ウシＥＳ細胞：Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，  ３１，  ｐ１５−１７，  １９８９年、  豚ＥＳ細胞：Ｓｔｒｏｊｅｋら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，  ３３：ｐ９０１，  １９９０年、羊ＥＳ細胞：Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ、Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅ  ｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６  ：ｐ１８５，  １９８７年、ハムスターＥＳ細胞：Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７、ｐ２２４，１９８８年、  アカゲザルＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、  ９２、ｐ７８４４、  １９９５年、マーモセットＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、５５、ｐ２５４、１９９６年、ヒトＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８２，  ｐ１１４５，  １９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  １８，  ｐ３９９，  ２０００年）。
【０００４】
ＥＳ細胞の未分化を維持するには、通常胎仔由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いて共培養することが必要である。霊長類のＥＳ細胞株の未分化維持においても同様の方法が用いられている（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２，  ｐ７８４４，  １９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８２，  ｐ１１４５，  １９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  １８，  ｐ３９９，  ２０００年）。
しかし、マウス初代線維芽細胞の調製は煩雑である。即ち、妊娠マウスから１３．５から１５．５日の胚を取り出し、酵素処理によって胚体を分解し、ディッシュ上に得られた線維芽細胞を回収する。初代細胞であるため、品質管理は複雑で、ＧＭＰ適応レベルの管理は困難であり、ＥＳ細胞の未分化維持能も、用いる胚体により異なる可能性が考えられる。この煩雑な調製作業を経由しないＥＳ細胞培養方法として、マウス胚線維芽細胞のセルラインであるＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ  ５６−Ｘ）を用いる方法がある。しかし、ＳＴＯ細胞のＥＳ細胞未分化維持能は変化しやすく、ＥＳ細胞の安定的な培養にはマウス初代線維芽細胞の方が優れている。
また、最近になって異種動物間での内在性ウィルスの感染例が報告されている（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，  ４０７，  ｐ９０，  ２０００年）。医療用途でのヒトＥＳ細胞の利用を目的とした培養方法においては異種動物細胞間での接触をでき得る限り回避した培養方法の開発が望まれている。従って、マウス由来細胞を用いる上記のＥＳ細胞未分化維持培養方法は、医療用途を目的としたＥＳ細胞の培養には適していない。
マウス由来フィーダー細胞を用いない霊長類ＥＳ細胞の培養方法として、マウス初代線維芽細胞の分泌成分を培養培地中に加える方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。  しかし、この場合においても培養中のＥＳ細胞がマウス細胞から分泌される未同定の因子に曝されることから、このような環境で培養されたＥＳ細胞は医療用途の使用には適していないうえに、内在性ウィルスの感染の危険性も残されている。従って、マウス初代線維芽細胞との共培養による欠点が全く解消されていない。
マウス由来フィーダー細胞並びにマウスフィーダー細胞由来分泌成分を用いないマウスＥＳ細胞の未分化維持培養方法として、ゼラチンをコートした培養皿を用いる培養方法が既に知られているが、この場合には、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ，  ＬＩＦ）の培地への添加が必須である（例えば、非特許文献１参照）。。ＬＩＦはサイトカインであることから高コスト、保存性などの問題があり大量培養には適していない。加えて、ＬＩＦの効果は極めて特定のマウス系統（１２９／ｓｖ系やＣ５７ＢＬ／６系）由来のＥＳ細胞に限定的であり、他種動物において顕著な効果は見られない。特に霊長類のＥＳ細胞においては、培地中へのＬＩＦの添加のみでは未分化状態を維持することができないことが明らかにされている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００５】
従って、全能性幹細胞を、低コストで安全かつ大量に培養することを可能にする分化抑制剤はこれまでなく、また、全能性幹細胞を、低コストで安全かつ大量に培養する方法も知られていなかった。
本発明の分化抑制剤は、低分子化合物を有効成分として含有するが、低分子化合物が全能性幹細胞の未分化状態を維持することはこれまで知られていなかった。従って、一般式（Ｉ）で示される低分子化合物が有する全能性幹細胞の未分化維持作用は全く知られていなかった。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−１７１６３号公報
【非特許文献１】
Ｓｍｉｔｈら、  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  １２１，  ｐ１，  １９８７年
【非特許文献２】
Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２，  ｐ７８４４，  １９９５年、
【非特許文献３】
Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８２，  ｐ１１４５，  １９９８年
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、幹細胞或いは胚性幹細胞を、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずに、未分化状態で培養させ得る分化抑制剤を提供することにある。また、本発明の課題は、このような分化抑制剤を用いて、フィーダー細胞或いはフィーダー細胞由来成分を用いずに幹細胞或いは胚性幹細胞を未分化の状態で培養する方法を提供すること、このような分化抑制剤を含む細胞培養液を提供すること、およびこのような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を達成するためになされたものであって、幹細胞ならびに胚性幹細胞を未分化な状態で培養させ得る分化抑制剤、それを用いた幹細胞ならびに胚性幹細胞の培養方法、このような分化抑制剤を含む細胞培養液、およびこのような分化抑制剤を用いて培養して作製された細胞株に関する。
【０００９】
すなわち、本発明は、低分子化合物、特にインドール誘導体を有効成分とする幹細胞分化抑制剤に関する。
本発明におけるインドール誘導体には、次の式（Ｉ）で示される化合物を挙げることができる。
【００１０】
【化３】
2005013152.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｒ１〜Ｒ９は、同一または異なった電子吸引基、電子供与基または水素電子を示す。具体的には、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アリールアミノビニル基、水素原子などが例示される）。
【００１２】
さらに、本発明は、前記の幹細胞分化抑制剤を用いて幹細胞、特に胚性幹細胞を未分化状態で培養する方法に関する。
また、本発明は、前記の幹細胞分化抑制剤を用いた幹細胞の培養液に関する。
さらに、本発明は、前記の幹細胞分化抑制剤を用いて培養し作製された細胞に関する。
【００１３】
本発明によれば、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞を、未分化なまま、期間を延長してまたは無期限に、大量にかつ安全に増殖させることができる。本発明によって提供される分化抑制剤、それを用いた培養方法、培養液は、細胞移植用途で用いる細胞ソースとしての幹細胞、好ましくは胚性幹細胞を産生するために適用され得る。幹細胞、好ましくは胚性幹細胞を利用することにより得られる多くの恩恵に加え、本発明によって提供される分化抑制剤およびそれを用いた培養方法は、１つもしくは多数の遺伝的な改変を有する胚性幹細胞を産生するために適用され得る。このような適用の例は、疾患について細胞ベースでのモデルの開発、ならびに遺伝病を処置するために移植について特異化された組織の開発を含むが、これに限定されない。
【００１４】
以下の用語は他で述べない限り、この節中で提供されるように定義される。本明細書で使用される他の全ての用語は、他に述べない限り、その用語に関する特定の分野でのその語法に関して定義される。
幹細胞：幹細胞とは、特異化された機能を有する他の細胞型、即ち、最終的に分化した細胞、もしくは、より狭い範囲の細胞型に分化可能な他の幹細胞型に分化し得る細胞を指す。
全能性幹細胞：全能性幹細胞とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る細胞のことを言う。
多能性幹細胞：多能性幹細胞とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの１つへと分化し得る細胞をいう。多能性細胞の１つの例は、骨髄幹細胞であり、この細胞は神経細胞以外の、リンパ球および赤血球のような種々の血液細胞型へと分化し得る。従って、全ての全能性細胞は多能性であるのに対して、全ての多能性細胞が全能性であるわけではないことが認識される。
胚性幹細胞：胚性幹細胞とは、幹細胞の中でも特に前着床段階の胚の、桑実胚または胚盤胞段階から得られた全能性の細胞をいい、ＥＳ細胞とも呼ばれる。  また、胚性幹細胞には、精子あるいは卵子になると決まっている、胚または胎児（胎仔）の始原生殖細胞に由来する多能性の幹細胞のことをいう場合もある。ただし、この細胞は胚性生殖（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ、ＥＧ）細胞と呼ばれて胚性幹細胞と区別される場合もある。本明細書中で用いる胚性幹細胞は、いかなる動物種のものであってよく、例えばヒトを含む霊長類、霊長類以外の哺乳類、鳥類などの胚性幹細胞が挙げられる。
全能性：全能性とは、多能性の細胞および完全に分化した細胞（すなわち、種々の細胞へと、もはや分化し得ない細胞）を含む任意の細胞型へと分化し得る状態を言う。
多能性：多能性とは、必ずしも全ての型にならないけれども、異なる多数の細胞型のうちの１つへと分化し得る状態をいう。
未分化：未分化とは、１つの細胞、或いは複数の細胞からなる任意の細胞集団が、１つまたは複数の、さらに分化が進んだ状態の細胞に分化し得る能力を有する状態である細胞、或いは該細胞を含む細胞集団である状態であることをいう。
フィーダー：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダーとは、  全能性幹細胞がその上にプレートされ、プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供するものをいう。
フィーダー細胞：本発明を記載する目的のために用いられるフィーダー細胞とは、  全能性幹細胞がその上にプレートされる非全能性幹細胞をいい、非全能性幹細胞は、プレートされた全能性幹細胞の増殖の助けとなる環境を提供する。
細胞由来成分：細胞から分泌される成分、内容物、および細胞膜成分など、細胞に由来する全ての成分をいう。
【００１５】
本発明は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞を未分化の状態で、増殖および維持させ得る分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを用いた培養液、それを用いて培養し作製された細胞株を提供する。本発明で提供する分化抑制剤、培養方法および培養液は、従来より簡便に、安全に、未分化の胚性幹細胞を増殖しそして維持する。本発明の分化抑制剤を含む細胞培養方法はまた、特定の分化誘導因子、および分化誘導因子の有用な組み合わせについてスクリーニングするために使用され得る。本発明の分化抑制剤、および培養方法を使用して、未分化な胚性幹細胞を増殖させる能力は、重要な治療適用を有する単一もしくは複数の遺伝的改変を有する胚性幹細胞系を産生する能力を含む重要な利益を提供する。
【００１６】
本発明の分化抑制剤は、化学的に安定な低分子化合物で、幹細胞を未分化な状態で維持する活性を有するものであればいずれも用いることができるが、好ましくはインドール誘導体があげられる。さらに好ましくは式（Ｉ）で示される構造を有するインドール誘導体、その塩、またはエステル化合物が望ましい。式中、Ｒ１〜Ｒ９としては、同一または異なった電子吸引基、または電子供与基または水素原子から選ばれる基、または原子が挙げられる。電子供与基とは、ベンゼン環へ電子を供与し得る置換基、電子吸引基とはベンゼン環上のπ電子を吸引する性質を有する置換基をいう。また、Ｈａｍｍｅｔｔの置換基定数σを用いてσ＜０を電子供与基、σ＞０を電子吸引基と定義することもできる（基礎有機反応論、橋本静信ら著、三共出版、１９９７年）。より好ましくは、  Ｒ１〜Ｒ９は、同一または異なった、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基、ナフチル基、フリル基、チエニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルカルボニル基、ベンゾイル基、ナフトイル基、フロイル基、テノイル基、ジアルキルカルバモイル基、アセチル基、ブタノイル基、メトキシカルボニル基、シクロアルキル基、ベンジルオキシ基、アダマンチルオキシ基、アリールアミノビニル基、ヒドロキシル基、ニトロ基よりなる群から選ばれる基、あるいはハロゲン原子または水素原子などが挙げられる。さらには、  Ｒ１〜Ｒ９はアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アリールアミノビニル基、水素原子よりなる群から選ばれる基または原子であることが望ましい。
【００１７】
本発明はこれらの化合物のうち、次の式（ＩＩ）で示されるインドール誘導体またはその塩を用いることが特に好ましい。
【化４】
2005013152.tif 000003
Ａ１〜Ａ３は同一であっても良い低級アルキル基、低級アルコキシ基、水素原子を表し、Ａ４は低級アルキル基、アリールアミノビニル基を表す。
【００１８】
化合物（ＩＩ）において、Ａ１〜Ａ４で示される低級アルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。特に好ましくはメチルである。
【００１９】
化合物（ＩＩ）において、Ａ１〜Ａ４で示される低級アルコキシ基としては、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられるが、特に好ましくはメトキシである。
【００２０】
化合物（ＩＩ）において、Ａ４で示されるアリールアミノビニル基としては式（ＩＩＩ）で示される基を用いることが望ましい。式（ＩＩＩ）で示されるＡｒ（アリール基）としては、例えば、フェニル基、トリル基、メトキシフェニル基、キシリル基、ナフチル基、アントリル基などが挙げられるが、特に好ましくは、４−メトキシフェニル基である。
【化５】
2005013152.tif 000004
【００２１】
化合物（ＩＩ）の塩としては、薬学的に許容しうる塩が望ましい。例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などを形成しても良い。
【００２２】
化合物ＩまたはＩＩのエステル化合物としては、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、無機酸エステルなどがあげられる。
【００２３】
本発明の分化抑制剤の濃度としては、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用することが望ましく、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲で使用することである。
【００２４】
また、本発明の分化抑制剤はＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合物、特にイソキノリン誘導体を含む。特定のマウス系統の胚性幹細胞は、マウス胎仔由来の線維芽細胞からなるフィーダー細胞の存在、非存在にかかわらず、ＬＩＦによって未分化が維持される。ＬＩＦはＳＴＡＴ３の活性化を介して下流にシグナルを伝えることが知られている（Ｍａｔｓｕｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１８、１５、ｐ４２６１、１９９９年）。しかし、最近になってＳＴＡＴ３を活性化せずに胚性幹細胞の未分化を維持する分化抑制因子が存在することが報告されたことから（Ｄａｎｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  ２０３、  ｐ１４９、  １９９８年）、ＳＴＡＴ３を介さない胚性幹細胞の未分化維持機構が存在すると考えられている。さらに、ＬＩＦが、霊長類胚性幹細胞の未分化維持に効果を示さないことから（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２，  ｐ７８４４，  １９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８２，  ｐ１１４５，  １９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  １８，  ｐ３９９，  ２０００年）、霊長類胚性幹細胞には、ＬＩＦおよびＳＴＡＴ３とは異なるシグナルによって未分化状態を維持する機構が存在することが示唆される。本発明の分化抑制剤にはＳＴＡＴ３の活性化を介さずに胚性幹細胞の未分化を維持する低分子化合物が含まれる。いいかえれば、ＬＩＦとは異なる作用により胚性幹細胞の未分化を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
【００２５】
また、最近の報告によれば、ある種の骨髄由来間葉系幹細胞においても胚性幹細胞と同様に、マウス由来の幹細胞の培養はＬＩＦ依存的であるが、ヒト由来の幹細胞はＬＩＦ非依存的であることが示されている。（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ｐ４１，  ２００２年）これは、多分化能を示す幹細胞は、胚性幹細胞と同様の未分化維持機構を有していることを示唆し、従って、霊長類幹細胞においても、胚性幹細胞と同様に、ＬＩＦ−ＳＴＡＴ３経路とは異なるシグナルによって未分化が維持されている可能性が示唆される。本発明の分化抑制剤には、ＳＴＡＴ３を介さずに細胞の未分化状態を維持する活性を有する低分子化合物が含まれる。
【００２６】
本発明の分化抑制剤は、動物細胞培養用基礎培地である任意の哺乳類細胞培養基本培地に添加して使用することができる。動物細胞基本培地の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地：ＤＭＥＭ、ノックアウトＤＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ：ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ（以上  ＧＩＢＣＯ社製、米国）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施態様としての細胞培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。さらにこれらの基礎培地に血清または血清代替物としての各種増殖因子を添加して用いることもできる。血清は、幹細胞ならびに胚性幹細胞の増殖および生存性の維持に効果的である栄養素を供給する任意の血清、または、血清ベースの溶液であり得る。このような血清の例には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ血清（ＣＳ）、馬血清（ＨＳ）などがあり、また、血清代替物としては当業者に周知のもの、蛋白質、アミノ酸、脂質、ビタミンなどを単独で、或いは組み合わせて用いることが出来る。蛋白質としてはインスリン、トランスフェリン、アルブミン、ペプトン、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ＥｐｉｔｈｅｒｉａｌＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）などが、アミノ酸としてはアルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどが、ビタミンとしては、パントテン酸、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸アミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシンなどが例示されるがこれらに限定されない。１つの実施態様において、血清はウシ胎仔血清である。より特定の実施態様において、ウシ胎仔血清は約２５％と約１％との間の濃度で提供される。さらにより特定の実施態様において、細胞培地でのウシ胎仔血清濃度は１５％である。また、他の実施態様において、血清代替物はノックアウト血清リプレースメント：ＫＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製、米国）である。
【００２７】
細胞培地は、抗酸化剤（還元剤）（例えば、β−＜メルカプトエタノール）も含む。ある好適な実施態様において、β−＜メルカプトエタノールは、約０．１ｍＭの濃度を有する。他の抗酸化剤  （例えば、モノチオグリセロール、もしくは、ジチオス  レイトール（ＤＴＴ）の単独もしくは組み合わせ）が同様の効果のために使用され得る。さらに他の等価な物質は、細胞培養の分野の当業者に周知である。
【００２８】
本発明の分化抑制剤ならびにその有効成分は、任意の培養基材とともにあるいは培養基材に固定して使用することもできる。培養基材には多孔質体を使用することがでる。多孔質体とは、微細な孔を多数有する基材のことをいい、その材質、厚さ、形状、寸法などは特に限定はない。多孔質体の材質は、有機材料、無機材料及び有機材料と無機材料からなる複合材料であっても良い。多孔質体の形状は平板状、球状、棒状、繊維状、中空状のいずれの形態であっても良く、例えば、フィルム、シート、膜、板、不織布、ろ紙、スポンジ、織物、編物、塊、糸、中空糸、粒子等が挙げられる。細胞を培養するにあたって、３次元的に培養できるように細胞を支持する孔の大きさを簡単に制御できることや、基材作製の容易さ及びコストなどを考慮すると不織布がより好ましい。多孔質体の孔の大きさについては、特に限定はないが、細胞を３次元的に支持できるようにすることを考慮すると、平均孔径が、０．１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上５０μｍ以下がさらに好ましい。繊維径については特に限定はないが、０．０３デニール以下が好ましい。
【００２９】
上記の多孔質体は、細胞の接着性や分化維持機能、増殖能を向上させるために、高分子化合物により表面コーティング処理を施されていても良い。高分子物質とは、１種以上の繰り返し構成単位の単量体が１次元、２次元、３次元的に連なった分子量数百以上の物質のことをいう。高分子物質は、大きく天然高分子物質、半合成高分子物質、合成高分子物質の３つに分類することができ、本発明においていずれの高分子物質も使用することができる。
【００３０】
例えば、天然高分子物質としては、マイカ（雲母）、アスベスト（石綿）、グラファイト（石墨）、ダイアモンド、でんぷん、セルロース、アルギン酸等に代表される糖類及びゼラチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン等に代表されるタンパク質等が挙げられる。半合成高分子物質としては、ガラス、硝酸セルロース、酢酸セルロース、塩酸ゴム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。合成高分子物質としては、ポリホスホニトリルクロライド、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体に代表されるような２種類以上の合成単量体からなる共重合体等が挙げられる。
コーティング処理のし易さを考慮すると、有機高分子物質が好ましく、タンパク質やペプチド並びに有機合成高分子物質がさらに好ましい。
【００３１】
本発明の分化抑制剤を固定した培養基材を細胞捕捉材として用いることにより、複数の異なる細胞からなる集団から、幹細胞或いは胚性幹細胞を分離し、かつ、培養を行える方法及び装置が提供され得る。即ち、幹細胞或いは胚性幹細胞と、除去対象細胞を含む細胞含有液を本発明の分化抑制剤を固定した、多孔質体などの培養基材からなる細胞捕捉材が充填されている容器に導入し、細胞捕捉材に幹細胞或いは胚性幹細胞を捕捉させ、除去対象細胞を容器外に導出した後に容器ごと培養することを特徴とする幹細胞或いは胚性幹細胞培養方法であり、また本発明の分化抑制剤を固定化した培養基材からなる細胞捕捉材を容器に充填した細胞培養装置であって、前記細胞捕捉材は細胞培養用担体として使用し得るものであり、前記容器は細胞培養に使用し得るものであることを特徴とする細胞培養装置である。除去対象細胞とは、幹細胞或いは胚性幹細胞以外の全ての細胞をいう。また、幹細胞或いは胚性幹細胞から分化して、多分化能を失った細胞もこれに含まれる。細胞捕捉材に導入する細胞含有液としては、幹細胞或いは胚性幹細胞を含有する細胞液であればいかなるものでもよく、一例として、血液、骨髄、砕片組織液、或いは、幹細胞、胚性幹細胞の培養液などがあげられる。
【００３２】
本発明は幹細胞ならびに胚性幹細胞を増殖するための方法に関する。本発明の分化抑制剤を用いて増殖させた幹細胞ならびに胚性幹細胞の培養物を提供することができる。
【００３３】
本発明の分化抑制剤を用いて培養される細胞には、公知の方法および材料を使用して入手し得る全ての幹細胞および胚性幹細胞が含まれる。幹細胞には以下の公知の方法によって入手し得る幹細胞が一例として挙げられる。骨髄細胞（「骨髄移植ガイド」Ｈ．Ｊ．ディーグ、Ｈ．Ｇ．クリンゲマン、Ｇ．Ｌ．フィリップス著／笠倉新平訳）、骨髄幹細胞（Ｏｓａｗａら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ、  ２７３、  ｐ２４２−２４５、１９９６年、  Ｇｏｏｄｅｌｌら、  Ｊ．Ｅ．Ｍｅｄ．１８３、  ｐ１７９７−１８０６、１９９６年、Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ｐ４１，  ２００２年）、神経幹細胞（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｐ１７０７−１７１０、１９９２年）、組織幹細胞（Ｇｏｏｄｅｌｌら、Ｊ．Ｅ．Ｍｅｄ．１８３、ｐ１７９７−１８０６、１９９６年、松崎ら、実験医学、１９、ｐ３４５−３４９、２００１年、Ｂｌａｕら、Ｃｅｌｌ、１０５、ｐ８２９−８４１、２００１年）、間葉系幹細胞（Ｌｉｅｃｈｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、６、ｐ１２８２−１２８６、２０００年、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４、ｐ１４３−１４７、１９９９年）。
【００３４】
また、培養されるべき胚性幹細胞としては、  以下に示す、公知の方法および材料を使用して入手し得る。マウス胚性幹細胞：Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２９２，  ｐ１５４，  １９８１年、ウシＥＳ細胞：Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３１，ｐ１５−１７，１９８９年、豚ＥＳ細胞：Ｓｔｒｏｊｅｋら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，３３：ｐ９０１，  １９９０年、羊ＥＳ細胞：Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ、Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅ  ｖ．Ｂｉｏｌ．，１９６：ｐ１８５，１９８７年、ハムスターＥＳ細胞：Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７、ｐ２２４，１９８８年、  サルＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２，  ｐ７８４４，  １９９５年、ヒトＥＳ細胞：Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８２，  ｐ１１４５，  １９９８年、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  １８，  ｐ３９９，  ２０００年、ヒトＥＧ細胞：Ｇｅａｒｈａｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９５，  ｐ１３７２６，  １９９８年。また、マウス胚性幹細胞（１２９ＳＶおよびＣ５７／ＢＬ６）は、大日本製薬より購入できる。
【００３５】
本発明により提供される分化抑制剤は、全ての幹細胞および胚性幹細胞に用いることができるが、哺乳類の幹細胞および胚性幹細胞に用いることが望ましく、霊長類の幹細胞および胚性幹細胞に用いることが好ましい。
【００３６】
幹細胞ならびに胚性幹細胞は、一旦単離されると、本発明の分化抑制剤を使用して未分化な状態で培養され得る。
【００３７】
本発明の分化抑制剤を用いて培養した幹細胞、好ましくは胚性幹細胞の未分化程度は幹細胞の細胞膜状に存在するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することにより確認することができる。未分化な胚性幹細胞ではＡＬＰの活性が維持され、分化すると減少することが知られている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６、ｐｐ６８４、１９８８年、Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８２，  ｐ１１４５，  １９９８年）。不溶性基質を用いた染色法、あるいは水溶性基質を用いた分光学的測定法などによりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を検出する方法が挙げられる。
【００３８】
一つの実施態様において、分光学的測定法によりＡＬＰ活性を定量することができる。培養ディッシュ上の細胞にパラニトロフェニルホスフェイト（ｐＮＰＰ）のアルカリ性溶液を添加する。細胞膜上に存在するＡＬＰによってｐＮＰＰが加水分解され、パラニトロフェノールが生じる。生成した溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定することによって、アルカリホスファターゼ活性を定量することができる。実施例４に記載の方法により、本発明の分化抑制剤を添加して培養した胚性幹細胞のＡＬＰ活性を測定すると、分化抑制剤を含まない培地にて培養したコントロールの胚性幹細胞にくらべ有意に高いＡＬＰ活性を有していることが示される。即ち本発明の分化抑制剤が、胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確認される。
【００３９】
他の実施態様において、ＡＬＰ染色法によりＡＬＰ活性を検出することもできる。培養ディッシュ上の細胞に、基質としてリン酸エステル塩とジアゾニウム塩を含む反応溶液を添加する。細胞膜状に存在するアルカリホスファターゼによりリン酸エステル塩が加水分解され、次いでジアゾニウム塩とカップリング反応することによりアゾ色素が生じ、ＡＬＰ活性部位に色素が沈殿する。染色されたコロニー数を計測することにより細胞のＡＬＰ活性を定量化することが可能となり、即ち細胞の未分化度合いを定量することができる。本発明の分化抑制剤を用いて培養した胚性幹細胞をＡＬＰ染色すると、分化抑制剤を用いないコントロール細胞に比べ有意にＡＬＰ活性が高いことが示され、即ち本発明の分化抑制剤が、胚性幹細胞の未分化状態を維持して増殖させ得ることが確認され
る。
【００４０】
また、胚性幹細胞の未分化程度はＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を測定することによって確認することができる。Ｏｃｔ−３／４遺伝子はＰＯＵファミリーに属する転写因子で、胚性幹細胞、胚性癌細胞（ＥＣ細胞）で、未分化状態特異的に発現し（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、６０、ｐ４６１、１９９０年）、胚発生においても未分化細胞系譜においてのみ発現し（Ｓｃｈｏｌｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、７、  ｐ３２３、  １９９１年）、さらに、Ｏｃｔ−３／４遺伝子破壊マウスのホモ個体は胚盤胞期で発生を停止することから未分化状態維持に重要な機能を有していることが明らかにされている（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｃｅｌｌ、  ９５、  ｐ３７９、  １９９８年）。また、一方、Ｏｃｔ−３／４遺伝子の過剰発現は胚性幹細胞の分化を促進することが最近明らかにされ（Ｎｉｗａら、Ｎａｔ  ．Ｇｅｎｅｔ．  ２４、  ｐ３７２、２０００年）、Ｏｃｔ−３／４の発現量をある一定の範囲に保つことが未分化状態の維持に重要である。Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現量を測定する一つの実施態様としては定量的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることができる。
【００４１】
一つの実施態様においてはリアルタイムＰＣＲ法が用いられ、幅広いダイナミックレンジをもち、簡便で信頼性のある定量測定が可能である。リアルタイムＰＣＲ技術には、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００ＴＭ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＴａｑ  Ｍａｎプローブを用いる方法や、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（ロシュ・ダイアグノスティック）を用いた方法がある。特に後者の場合はＰＣＲの温度サイクルが数十分で終了する高速反応サイクルのもとで、サイクルごとに合成されるＤＮＡの増幅量変化をリアルタイムに検出できる。リアルタイムＰＣＲ法のＤＮＡ検出法としては、ＤＮＡ結合色素（インターカレーター）、ハイブリダイゼーション・プローブ（キッシングプローブ）、ＴａｑＭａｎプローブおよびＳｕｎｒｉｓｅユニプライマー（モレキュラー・ビーコン）を利用する４種類の方法がある。また、ＤＮＡ結合色素、例えばＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩを利用してＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を解析することができる。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩはＤＮＡの二本鎖特異的に結合色素であり、二本鎖に結合することで本来の蛍光強度が増強される。ＰＣＲ反応時にＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩを加え、伸張反応の各サイクルの終わりに蛍光強度を測定すれば、ＰＣＲ産物の増加が検出できる。Ｏｃｔ−３／４遺伝子を検出するには通常のＰＣＲと同様にＯｃｔ−３／４遺伝子の配列をもとに、市販の遺伝子解析ソフトウェアなどを用いてプライマーを設計する。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩは非特異的産物も検出してしまうため最適なプライマーの設定が必要となる。設計基準としては、オリゴマーの長さ、配列の塩基組成、ＧＣ含量、およびＴｍ値などに留意が必要である。
【００４２】
多くの場合、定量ＰＣＲにおいて明らかにすることを目的とするのは、サンプル一定量当たりの目的ＤＮＡ量である。このためには最初に反応系に加えたサンプル量の評価が必要である。この場合サンプル量を反映するような内部標準となる別のＤＮＡを目的ＤＮＡとは別に測定し、最初に反応系に加えたサンプル量を補正することができる。サンプル量を補正する目的で用いる内部標準には、通常、組織によって発現量に差がないと考えられているハウスキーピング遺伝子を用いることができる。例えば、解糖系の主要酵素であるグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、細胞骨格の構成成分であるβアクチンまたはγアクチン、リボゾームの構成蛋白質であるＳ２６などの遺伝子が挙げられる。
【００４３】
Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現レベルは、本発明の分化抑制剤に暴露された細胞について決定することができる。分化抑制剤に暴露されていない、即ち、胚性幹細胞から分化誘導されたコントロール細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子発現量にくらべ、有意にＯｃｔ−３／４遺伝子の発現量を維持させることができる活性を有する化合物が、胚性幹細胞の未分化を維持する分化抑制剤であるとみなされる。本発明の分化抑制剤を添加して培養した胚性幹細胞のＯｃｔ−３／４遺伝子の発現レベルを評価すると、分化抑制剤を含まない培地にて培養したコントロールの胚性幹細胞にくらべＯｃｔ−３／４遺伝子の発現レベルが有意に高いことが示される。即ち本発明の分化抑制剤が、胚性幹細胞の未分化状態を維持し得ることが確認される。
【００４４】
最適化された胚性幹細胞の未分化維持培養基材をスクリーニングするさらに他の方法として、ステージ特異的胚抗原（Ｓｔａｇｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）（以後ＳＳＥＡと記載）−１、  ＳＳＥＡ−３、  ＳＳＥＡ−４などの未分化な細胞に特異的に発現する抗原を検出方法が挙げられる（Ｓｍｉｔｈら、  Ｎａｔｕｒｅ、  ３３６、  ｐ６８８、  １９８８年、Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、７５、ｐ５５６５、１９７８年、Ｋａｎｎａｇｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２、ｐ２３５５、１９８３年）。
【００４５】
一つの実施態様において、ＳＳＥＡ−１などの表面抗原は、同抗原を認識する特異的抗体（一次抗体）とインキュベートし、さらに蛍光標識のようなレポーターと結合した第二の抗体（二次抗体）とインキュベートすることにより、標識することができる。この操作により目的の抗原を発現する細胞が、蛍光性になる。次いで、標識された細胞を標準的な方法、例えばフローサイトメーターを用いて、計数、さらには分取され得る。次いで、標識および非標識細胞の数は、目的とする培養基材の効果を決定するために比較され得る。あるいは、非標識細胞表面マーカー抗体に曝露された後、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）形式において、その細胞は、抗細胞表面抗原抗体（例えば抗ＳＳＥＡ−１抗体）に対して特異的な第二の抗体に曝露され得、そこから、所望の表面抗原を発現する細胞の数が、比色定量的に、または蛍光を測定することにより定量され得る。表面抗原を発現する細胞を定量するさらに他の方法も、細胞培養の当業者に周知である。実施例２に記載の方法により、本発明の分化抑制剤を添加して培養した胚性幹細胞の表面抗原ＳＳＥＡ−１の発現レベルを評価すると、分化抑制剤を含まない培地にて培養したコントロールの胚性幹細胞にくらべ表面抗原ＳＳＥＡ−１の発現レベルが有意に高いことが示される。即ち本発明の分化抑制剤が、胚性幹細胞の未分化状態を維持し得ることが確認される。
【００４６】
本発明によって提供される、幹細胞、または胚性幹細胞の増殖に対する改善された分化抑制剤、培養方法、および培養液は、幹細胞または胚性幹細胞が有用であるすべての技術に対して適用されることが予想される。
【００４７】
本発明の分化抑制剤、培養方法および培養液を用いて産生される細胞は、分化させ、細胞移植に用いたり、人工支持組織の利用と併せ人工的な組織構築に使用され、生体内へ移植したり人工臓器として利用されうる。幹細胞の細胞移植治療や組織工学への利用は、ドナーにおける移植片摘出後の組織欠損やドナー不足など、従来の自家移植を含む移植治療が抱える問題点を解決できる。
【００４８】
本発明の分化抑制剤は、単独または賦形剤あるいは担体と混合して使用することができる。賦形剤および担体としては薬剤学的に許容されるものが選ばれる。例えば液状担体としては水、アルコール類、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）、もしくは動植物油、合成油などが用いられる。個体担体としては、乳糖、マルトース、シュクロースなどの糖類、アミノ酸類、ヒドロキシセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。また、本発明の分化抑制剤の組成中にｐＨ調整等の目的で、酸やアルカリまたは適量の緩衝剤を加えてもよい。
製剤中の本発明における化合物の含量は製剤により種々異なるが、通常０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９８％の有効成分を含む。
【００４９】
本発明の分化抑制剤、それを用いた培養方法、それを含む培養液により得られた、非改変および改変された幹細胞、好ましくは胚性幹細胞の培養物は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞のモニタリングまたは幹細胞収集を改良する物質についてスクリーニングするために使用される。例えば、推定の幹細胞或いは胚性幹細胞分化誘導物質は、上記の方法を用いて増殖させた細胞培養物へ添加され得る。推定の幹細胞或いは胚性幹細胞分化誘導物質を欠損した対照細胞培養物と比較して、三胚葉系列への分化を誘導し得る物質は、胚性幹細胞分化誘導因子として同定される。
【００５０】
【実施例】
次に本発明を具体化した実施例を示す。この実施例は、本発明を実施する当業者を補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる様式においても、決して本発明の範囲を制限するものではない。
【００５１】
【実施例１】
「ＥＳ細胞培地の作製」
ＥＳ細胞を増殖させる目的で、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製  Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９９５）に、以下に示す最終濃度で因子を添加してＥＳ細胞培地を調製した：１５％  ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）  もしくは１５％ノックアウト血清リプレースメント：ＫＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社製）、１×非必須アミノ酸ストック（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製  Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１４０−０５０）、２ｍＭ  Ｌ−Ｇ１ｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０−０８１）、１０３ｕｎｉｔ／ｍｌ  ＥＳ  ＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，社製）。ただし、ＥＳ  ＧＲＯはマウスＬＩＦを有効成分として含有する。ＥＳ細胞分化抑制アッセイ用の培地として、上記のＥＳ細胞培地からＥＳＧＲＯを除いたアッセイ培地を作製した。
【００５２】
「ＥＳ細胞の培養」
直径５ｃｍの細胞培養用ディッシュに、蒸留水に０．１％の濃度でＧｅｌａｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製  ＴｙｐｅＡ：ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎＥＳｋｉｎ、Ｇ２５００）を溶解し、滅菌した０．１％ゼラチン水溶液５ｍｌを添加し、３７℃で３０分以上静置した。ゼラチン水溶液を除いて、マイトマイシンＣ（協和発酵社製）処理したマウス胚性初代培養細胞（ライフテックオリエンタル社  Ｃａｔ．Ｎｏ．  ＹＥ９２８４４００）２×１０６個を播種し、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭ５ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（タバイエスペック社製）で５時間以上培養した。マウス胚性幹細胞株Ｄ３ＥＳ細胞（Ｒｏｌｆ  Ｋｅｍｌｅｒ、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒ  Ｉｍｍｕｎｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｓｔｕｈｅｗｅｇ５１、Ｄ−７９１０８Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、より入手可能）を、直径５ｃｍのデイッシュに培養した繊維芽細胞フィーダー層上に播種し、５ｍｌのＥＳ培地で、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで２日間培養して増殖させた。
【００５３】
「ＥＳ細胞分化抑制アッセイ１」
前記「ＥＳ細胞の培養」で培養したＤ３ＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄する。０．２５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、未分化のＤ３ＥＳ細胞のコロニーをフィーダーから脱離させた。５ｍｌのＥＳ細胞培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを分散させ、５０ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工）で１０００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を２０ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．１％のゼラチン水溶液で予めコートした直径２０ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。同様の操作をもう一度繰り返した。その後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、５０ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機で１０００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した後、上清を除き、５ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地に再懸濁した。予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした９６穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０７２、米国）に、１ウェルあたり３２００個の細胞を、１ウェル当たりのＥＳ細胞アッセイ培地が１００μｌになるように播種した。各ウェルに０．４〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または水、或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（Ａ〜Ｅ：  ＡはＩＦ  ＬＡＢ  Ｌｔｄ．社、ウクライナ、Ｂ，ＣはＰＨＡＲＭＥＫＳ社、ロシア、Ｄ，ＥはＳＰＥＣＳ社、オランダから購入）、あるいはＥＳＧＲＯを１０μｌ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで４日間培養した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。またコントロールウェルには、ＤＭＳＯのみを最終濃度で０．１％となるように加えた。分化抑制剤Ａ〜Ｅの構造を図１に示した。
【００５４】
「アルカリホスファターゼ定量」
ＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ活性を、ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ（ＭＯＳＳ  Ｉｎｃ．社製、ＰＲＯＤＵＣＴ  ＮＯ．ＮＰＰＤ−１０００、米国、またはＳＩＧＭＡ社製、Ａ−３４６９、米国製）（以下、ｐ−ＮＰＰ）を用いて定量した。前記「ＥＳ細胞分化抑制アッセイ１」に記載の方法で４日間培養したＥＳ細胞の各ウェルから培地を吸引除去し、その細胞を１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄後、ｐ−ＮＰＰ１００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間静置した。各ウェルに１２．５μｌの８Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。溶液の４０５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４０５）と６９０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．６９０）を吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、型式：ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ１９０）により測定し、Ｏ．Ｄ．４０５−Ｏ．Ｄ．６９０で算出される値をアルカリホスファターゼ活性とした。定量結果をグラフしたものを図２に示した。本発明の分化抑制剤、化合物Ａ〜ＥはコントロールであるＤＭＳＯ（０．１％）に比べて有意にアルカリホスファターゼ活性を増幅させた。即ち、本発明の分化抑制剤は未分化なＥＳ細胞の培養を支持したことがわかる。
【００５５】
【実施例２】
「ＥＳ細胞分化抑制アッセイ２」
前記「ＥＳ細胞の培養」で培養したＤ３ＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄した。０．２５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製  １５０９０−０４６）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、未分化のＤ３ＥＳ細胞のコロニーをフィーダーから脱離させた。５ｍｌのＥＳ細胞培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを分散させ、５０ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工）で１０００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を２０ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．１％のゼラチン水溶液で予めコートした直径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、再度、０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径１５ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、５０ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機で１０００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した後、上清を除き、５ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地に再懸濁した。予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに８×１０４個の細胞を、ＥＳ細胞アッセイ培地が１０ｍｌになるように播種した。各ディッシュに４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、または培地、或いはその混合物に溶解した本発明の分化抑制剤（Ａ〜Ｅ）、あるいはＥＳＧＲＯを１ｍｌ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで７日間培養した。ＤＭＳＯの培地中への持ち込は最終濃度０．１％以下となるようにした。
【００５６】
「ＳＳＥＡ−１抗原の発現量評価」
前記「ＥＳ細胞分化抑制アッセイ２」で培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレイパーで細胞をディッシュから脱離した。細胞数が６×１０５個になるように２％ＦＢＳを含むＨａｎｋｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を３００μｌ加えた。ＨＢＳＳで５０倍希釈したＭＸ−ＳＳＥＡ−１抗体（Ｋｙｏｗａ  Ｍｅｄｅｘ社製）を３０μｌ加え４０分間、氷上で静置した。ＨＢＳＳ  （１ｍｌ）で二回洗浄後、ＨＢＳＳ  （３００μｌ）に再分散し、ＨＢＳＳで２０倍ＦＩＴＣ−Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＭ抗体（ＺＹＭＥＤ社製）を３０μｌ加え３０分間、遮光して氷上で静置した。ＨＢＳＳ  （１ｍｌ）で二回洗浄後、ＨＢＳＳ  （１ｍｌ）に再分散し、２０μｇ／ｍｌ  ＰＩ溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１００μｌ加え、フローサイトメーター測定に用いるサンプルを得た。またフローサイトメーター測定に用いるサンプルは、凝集塊を除く目的で孔径１００μｍのナイロン・メッシュに通した後に測定を行った。フローサイトメーターはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製、米国）を用い、測定条件データ収集解析ソフトウェアはＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製、米国）を用いた。結果を図３に示した。各分化抑制剤を添加して培養した細胞の、１細胞あたりの平均蛍光強度、即ち、１細胞あたりのＳＳＥＡ−１抗原発現強度は、分化抑制剤を含まない培地で培養した細胞にくらべ、有意に亢進していた。また、化合物Ｂ￣Ｅについて同様の実験をしたところ、同様にＳＳＥＡ−１の発現レベルが有意に高いことを示した。即ち、本発明の分化抑制剤は、未分化なＥＳ細胞を維持することが明らかになった。
【００５７】
【実施例３】
「ＳＴＡＴ３活性化アッセイ」
前記「ＥＳ細胞の培養」で培養したＤ３ＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄する。０．２５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、未分化のＤ３ＥＳ細胞のコロニーをフィーダーから脱離させる。５ｍｌのＥＳ細胞培地を添加し、小径ピペットを使用して細胞コロニーを分散させ、  １５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機（トミー精工）で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した。上清を除き、細胞を５ｍｌの新鮮なＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．１％のゼラチン水溶液で予めコートした直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、１５ｍｌの滅菌チューブに移し、卓上遠心機で８００ｒｐｍ、約５分間遠心してペレット化した後、上清を除き、５ｍｌのＥＳ細胞アッセイ培地に再懸濁する。
【００５８】
予め０．１％のゼラチン水溶液でコートした２４穴細胞培養用ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０４７、米国）に、１ウェルあたり１×１０５個の細胞を、１ウェル当たりのＥＳ細胞培地が５００μｌになるように播種し、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで１２時間〜２４時間培養した。次ぎに、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）を用いて、添付のプロトコールに従って、ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃ、またはｐＴＡ−Ｌｕｃベクター（クロンテック社製、米国）を１ウェルあたり０．９μｇをＥＳ細胞にトランスフェクションした。また、内部コントロールとして、ｐＲＬ−ＴＫベクター（プロメガ社製、米国）を各ウェル０．１μｇ、同時にトランスフェクションした。３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで４時間培養後、培地を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄したのち、ＥＳアッセイ培地を各ウェル５００μｌずつ加えた。次いで、各ウェルに０．４〜４０μｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）または水或いはその混合物に溶解した分化抑制剤、あるいは１０〜１０，０００ｕｎｉｔ／ｍｌとなるようにＥＳアッセイ培地で希釈したＥＳＧＲＯを５０μｌ添加し３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで６〜２４時間培養した。続いて、ピッカジーンデュアル・シーパンジー（東洋インキ製造社製、日本）を用いて、添付のプロトコールに従って、各細胞のルシフェラーゼ・レポーター酵素による発光シグナルを測定した。図４に示すように、ＥＳＧＲＯが容量依存的にｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃによるレポーター酵素の発現を亢進させたのに対し、本発明の化合物Ｂは、レポーター酵素の発現を誘導しなかった。
また、化合物Ａ、Ｃ〜Ｅについて同様の実験をしたが、化合物Ｂを使用したときと同様にレポーター酵素の発現を誘導しなかった。
【００５９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化合物Ａ〜Ｅの構造を示す。
化合物Ａ〜Ｅは、式（Ｉ）のＲ１〜Ｒ９が下表に示す基または元素で表される。
【図２】本発明のアルカリホスファターゼ定量の結果を表す。
【図３】本発明のＳＳＥＡ−１抗原の発現量評価における平均蛍光強度の結果を示す。
【図４】本発明のＳＴＡＴ３活性化アッセイの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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