(57)【要約】【課題】  標識粒子として磁性粒子を用いて被検体の検出を行なう方法において、磁性超微粒子の磁化を検出すると所定の出力波形が得られるが、その出力波形は、検査試薬の所与領域内に存在する磁性超微粒子全体の磁化量に対応して得られる波形であり、検出波形に基づき検体中の抗原又は抗体の量をデジタルデータで定量的に取り扱うことは不可能である。したがって、簡易な方法で、被検体の寮をデジタルデータで定量的に取り扱うことを目的とする。【解決手段】  標識粒子として磁性粒子を用い、生体化学反応により残留する磁性粒子に高周波磁界を印加し熱量を発生させることによって、磁性粒子の数に対応した物理量の変化を検出し、被検体溶液中に含有される物質を検出する方法であって、抗原等の標的物質の検出を容易にかつ定量的に行うものである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性粒子を用いた被検体溶液中の被検体を検出する方法であって、特異的に固定された前記磁性粒子への交流磁界の印加によって前記磁性粒子を加熱して、少なくとも、前記磁性粒子または該磁性粒子の周辺領域のいずれか一方の、温度変化もしくは該温度変化に起因する物理量変化を検出することによって、被検体溶液中に含有される被検体を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
第１の物質を所定の領域へ配する工程と、
表面に第２の物質を形成した前記磁性粒子が混入する被検体溶液を、前記第１の物質が配された領域へ注入する工程と、
前記第１の物質と直接的あるいは間接的に固定されなかった前記磁性粒子を除去する工程と、を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
筐体と、前記筐体に形成されかつ第１の物質が配された流路と、前記流路に交流磁界を印加する手段とを有し、磁性粒子を含む溶液中の被検体を検出する検出装置であって、前記交流磁界を印加したときに変化する、少なくとも、前記磁性粒子または該磁性粒子の周辺領域のいずれか一方の温度変化もしくは該温度変化に起因する物理量変化を検出する手段を含むことを特徴とする検出装置。
【請求項４】
多孔質材を前記流路中に配置し、該多孔質材に前記第１の物質が固定されていることを特徴とする請求項３記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は検出装置および検出方法に関し、特に磁性粒子のヒステリシス損を利用した検出装置および検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の免疫分析の技術には、特定の標的物質のみと反応する２次標的物質捕捉体を結合させた蛍光物質等の標識粒子を検査試料中に分散させ、これを前記標的物質とのみ反応する１次標的物質捕捉体が結合された反応場へ注入し、所望の標的物質が存在する場合には標的物質と２次標的物質捕捉体との結合により前記標識粒子を反応場に固定し、未反応の標識粒子を反応場から除去した後、検出する方法が用いられている。ただし、標的物質とは、従来のイムノアッセイで扱われている物質であり、例えば抗体、抗原、蛋白質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、核酸、細胞等が挙げられる。また、標的物質捕捉体とは、上記標的物質と特異的に結合する物質である。
【０００３】
また特許文献１には、磁性超粒子を用いた磁気免疫測定方法が記載されている。
【特許文献１】特開昭６３−１０８２６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、例えば放射免疫分析法（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙもしくはＩＲＭＡ：ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）は、放射性核種によって、競合抗原あるいは抗体を標識し、比放射能の測定結果から抗原を定量的に測定する。この方法の利点は、感度が高いことがあげられるが、放射性核種の安全性の問題が有り、専用の施設や装置が必要となる。また、抗体の修飾に酵素を用いる酵素抗体法（ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ  ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ）は、放射免疫分析法と比較した場合、扱いが容易であり、かつ実用的な感度を満たしているが、更なる感度向上と取り扱いの容易さが求められている。
【０００５】
また特許文献１に記載の方法では、磁性超微粒子の磁化を検出すると所定の出力波形が得られるが、その出力波形は、検査試薬の所与領域内に存在する磁性超微粒子全体の磁化量に対応して得られる波形であり、検出波形に基づき検体中の抗原又は抗体の量をデジタルデータで定量的に取り扱うことは不可能である。
【０００６】
したがって現在用いられている検出方法では，上記の様に容易かつ定量的な検出は不可能であり、これらの要求を満たす検出方法の提案が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は磁性粒子のヒステリシス損を利用する検出方法に関し、前記課題に鑑み、標識粒子として磁性粒子を用い、例えば生体化学反応のような特異的な結合により残留する磁性粒子に交流磁界を印加し熱量を発生させることによって、磁性粒子の数に対応した温度変化もしくは該変化に起因する物理量の変化を検出し、抗原等の被検出物の定量的な検出を容易に行うものである。
【０００８】
本発明に用いられる標的物質捕捉体は従来用いられているものが使用可能であり、標的物質捕捉体の反応場への固定は、反応場の内壁に標的物質捕捉体と結合が容易な物質を化学的にあるいは物理的に担持させ、その後標的物質捕捉体を反応場へ注入し結合させることが可能であり、種々の標的物質捕捉体が使用可能である。
【０００９】
また、磁性粒子に固定させる２次標的物質捕捉体も上記と同様に種々のものが使用可能である。
【００１０】
反応場は例えば被検体溶液を流す流路の一部であって、交流磁界の印加によって発熱しない材料である必要がある。また、磁性粒子から発せられた熱量が逃げないように、熱伝導率が低い材料で構成されているか、あるいは反応場の周りが熱シールドしてあることが好ましい。
【００１１】
標識粒子として用いる磁性粒子は、効率的に発熱させるためにヒステリシス損の大きな材料が好ましい。
【００１２】
磁性粒子に交流磁界を印加する方法としては、どのような手段でも利用可能であるが、例えば反応場の近くあるいは反応場内にコイルを配置させ、これに交流電流を流すことで達成できる。コイルの中に鉄心等の透磁率の高い材料を充填することでより効率良く磁界を発生させることが可能である。また、磁石を自転あるいは公転させることによっても磁性粒子に交流磁界を印加することが可能である。交流磁界を印加する際には、例えば反応場の検体の出入り口を塞ぐ等、発生した熱量が反応場に留まるようにすることでより精密な定量検出が可能となる。
【００１３】
検出方法としては、温度変化により起電力が変化する熱電対や、抵抗値の変わるサーミスタ等電気的検出が可能である。本発明に利用可能な熱電対やサーミスタには、室温付近で使用可能なものを用い、熱電対は、例えば、クロロアルメル−アルメル、銅−コンスタンタン、クロメル−コンスタンタン、白金ロジウム−白金などが挙げられ、サーミスタは、チタン酸バリウムニッケル、マンガン、コバルト、鉄等の遷移金属の酸化物が挙げられる。また、赤外線放射温度計による温度変化の検出も可能である。さらに、反応場内の溶媒の屈折率の変化を利用する熱レンズや表面プラズモン共鳴等の光学的検出も可能である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検出方法によれば、様々な標的物質の検出が可能であり、反応場に固定された磁性粒子すべてに交流磁界を印加するために、その磁性粒子の数に対応した検出信号が得られ標的物質の定量的検出が容易に行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、磁性粒子を用いた被検体溶液中の被検体を検出する方法であって、前記磁性粒子への交流磁界の印加によって前記磁性粒子を加熱して、少なくとも、前記磁性粒子または該磁性粒子の周辺領域のいずれか一方の、温度変化もしくは該温度変化に起因する物理量変化を検出することによって、被検体溶液中に含有される被検体を検出する。まず、被検体と磁性粒子を抗原抗体反応等により固定させて、被検体の数に対応する磁性粒子を捕捉する。その後、磁性粒子に交流磁界を印加することによって発熱させ、その温度変化そのもの、もしくは該温度変化に起因する物理量変化を検出する。ここで物理量変化とは、屈折率の変化、磁性粒子の磁化変化等であり、該物理量変化は磁性粒子そのものであってもよいし、磁性粒子が溶液中に分散しているのであれば、溶液、該溶液を入れるための筐体（流路）等の温度変化及び該温度変化に起因する物理量変化を検出するものである。以下実施例において本発明の具体的な構成を詳細に説明する。
【実施例１】
【００１６】
図１に本発明の検出方法に用いる検出系の断面の模式図を示す。また、図１の断面と直交する面での断面の模式図を図２に示す。筐体１０１であるガラス基板上にレーザーにより幅１００μｍ、深さ４０μｍの流路２０１を形成する。さらに流路２０１の端部に検体を注入するために注入口２０２および排出口２０３を形成する。流路２０１の上部には厚さ約５０ｎｍの金薄膜１０５を表面に蒸着したプリズム１０４が設置される。金薄膜１０５表面は、検体中のタンパク質が物理吸着するのを防ぐため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で表面処理される。また、抗体５０１を担持するために金薄膜１０５表面以外の流路２０１の内壁は、まず親水化処理が施された後、アミノシランカップリング剤処理される。さらに１次抗体５０１を固定化させるためのグルタルアルデヒド等架橋剤を用いて、前記アミノカップリング剤由来のアミノ基とペプチド鎖間を化学結合させ所望のタンパク質を補足する１次抗体５０１が固定されている。
【００１７】
この検出装置を用い、以下のプロトコールに従って前立腺癌のマーカーとして知られている前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検出を行なうことができる。流路の内壁には、ＰＳＡを認識する１次抗体５０１が固定化されている。
（１）抗原（被検体）であるＰＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（被検体溶液）を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（２）未反応のＰＳＡをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
（３）マグネタイトビーズ（磁性粒子）により標識された抗ＰＳＡ抗体（２次抗体）溶液を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（４）未反応の該標識抗体をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、流路中を同リン酸緩衝生理食塩水で満たす。
【００１８】
上記のプロトコールにより、１次抗体、抗原および２次抗体を介して磁性粒子（マグネタイトビーズ）が反応場に固定される。ただし、磁性粒子の平均直径は約４００ｎｍでスーパーパラ磁性を示す。（図８参照）図８において、１０７は反応場、５０１は１次抗体、５０２は２次抗体、５０３は抗原、６０３は磁性粒子をあらわしている。すなわち、被検体溶液中に被検体（ＰＳＡ）が含まれている場合には、磁性粒子が捕捉され、被検体が含まれない場合には、磁性粒子は反応場に捕捉されない。
【００１９】
その後、レーザー光３０５をプリズム１０４を介して入射し、その反射光を受光器３０４で測定する。金薄膜１０５の表面で全反射する入射角度前後に渡って入射角度を、高い角度分解能を有する自動ゴニオステージで入射光と反射光の角度が常に同じ値になるようにしながらスキャンし、反射率の測定を行う。次にコイル４０１に交流電源４０２により５００Ｈｚの周波数の高周波電流を流すことで流路に交流磁界を印加する。磁性粒子は上記交流磁界により発熱し流路２０１内の液体を加熱するため、検体内に所望の抗原が存在する場合は、抗原抗体反応により担持された磁性粒子が発熱することで、流路２０１内の液体の屈折率が変化し、磁界印加前と比して反射率が異なる。これにより検体中の抗原が検出可能である。一例として液体が水の場合、角度分解能０．００２５°のゴニオステージを設置したＫｒｅｔｃｈｍａｎｎ配置型のＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）で測定すると、プラズモン共鳴角度が小さくなる様子が確認される。
【００２０】
この角度変化を屈折率に換算し、さらに温度変化に換算する。この温度変化を予め作成した検量線により抗原の濃度に換算するとＰＳＡ抗原濃度を検出できる。
【００２１】
また、本実施例においてプリズム１０４を用いた表面プラズモン共鳴の測定法を挙げたが、プリズム１０４の代わりに図３に示すように、ガラス基板表面に例えば５５６ｎｍピッチ、溝深さ５０ｎｍの凹凸を形成し、そこに５０ｎｍの厚さの金薄膜を蒸着した回折格子１０６を用いることも可能である。
【００２２】
さらに、筐体１０１を２重構造にし、２つの筐体の間を真空にするなど熱伝導率を低くすることによって、より高感度な検出が可能となる。
【実施例２】
【００２３】
図４は本実施例の抗原の検出を行なう検出素子の断面の模式図である。検出素子の筐体１０１はセラミックからなりレーザーを用いて幅１００μｍ、深さ４０μｍの流路２０１を形成する。さらに流路の端部に検体を注入するために注入口２０２および排出口２０３が形成される。流路上部には銅３０６とコンスタンタン３０７（銅５５％Ｎｉ４５％の組成からなる合金）からなる熱電対が形成される。銅３０６およびコンスタンタン３０７は蒸着により形成し、これらの接点は流路上部に位置し、筐体１０１から露出した部分を外部電気回路と接続するための電極とする。図５はこの位置関係を示すための図で、デバイスの上方から見た模式図を示す。１次抗体５０１を担持するために流路２０１の内壁には実施例１と同様にアミノシランカップリング剤処理により、例えば抗ＰＳＡ抗体が固定化される。実施例１と同様に以下の順序に被検体溶液を流路２０１に導入し、検体であるＰＳＡの検出を行う。
（１）抗原であるＰＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（２）未反応のＰＳＡをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
（３）マグネタイトビーズ（磁性粒子）により標識された抗ＰＳＡ抗体（２次抗体）溶液を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（４）未反応の該標識抗体をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、流路中を同リン酸緩衝生理食塩水で満たす。
【００２４】
その後、コイル４０１に交流電源４０２により５００ｋＨｚの周波数の高周波電流を流し、流路２０１に交流磁界を印加する。抗原抗体反応により流路２０１内に担持された磁性粒子は、上記交流磁界により発熱し熱電対を加熱する。このときそれぞれ銅３０６およびコンスタンタン３０７からなり、流路２０１から突出し筐体１０１の蓋１０２に形成されている電極はどちらも０℃に保っておき、銅３０６およびコンスタンタン３０７の接点との温度差により熱電対に起電力を誘起させる。磁性粒子の数が多くなるほど流路２０１内の温度は高くなり、熱電対は温度が高くなるほど起電力が大きくなることから、起電力を測定することによって検体中に含有されている抗原の濃度が検出可能である。
【００２５】
また、本実施例においては流路２０１内の温度を熱電対により測定する方法を挙げたが、サーミスタ３０８を用いて温度を測定することも可能である。図６はサーミスタ３０８を用いた場合の測定素子の断面を模式的に示した図である。サーミスタ３０８を筐体１０１の蓋１０２に埋め込んだ構造とし、流路２０１内の熱量がサーミスタ３０８に伝わるように、蓋１０２の内側には銅板１０３が形成されている。この銅板１０３は、熱伝導率が高いものであればどのような材料でも使用可能である。
【実施例３】
【００２６】
図７に本実施例の検出方法及び検出装置を説明するための検出素子の断面図を示す。流路２０１のみを形成したデバイスと赤外線放射温度計の組合せで、検体濃度を検出することができる。実施例１と同様に筐体１０１には熱伝導率の小さなガラスを用いる。また筐体１０１の上部には流路２０１内で発生した熱をデバイス表面に伝えるために銅板１０３からなる蓋を形成する。本実施例では銅板１０３を用いたが熱伝導率の高い材料でかつ機械的強度があればどのような材料を用いても良い。また、蓋は複数の材料からなる構造体としても良く、赤外線が照射される部分のみ熱伝導率の高い材料で構成しその他の部分を熱伝導率の低い材料で構成することによって熱効率を高め、より感度の高い検出素子とすることが可能である。実施例１及び２で述べた手法により、１次抗体５０１の固定化及びＰＳＡ検体の反応を行う。その後、コイルに５００ｋＨｚの周波数の高周波電流を流し、流路２０１に交流磁界を印加する。抗原抗体反応により流路２０１内に担持された磁性粒子は、上記交流磁界により発熱し、デバイス外部に位置した赤外線放射温度計によりその温度変化を測定する。このとき、デバイスの温度を正確に測定するには、予めその放射率を求めておく必要がある。測定された温度の変化量と検体濃度の検量線を作成し、検体濃度の定量を行う。
【実施例４】
【００２７】
本実施例においては、反応領域に多孔質材を用いた例に関して説明する。図９（ａ）において、筐体１０１とパッキング材６０１とによって、多孔質材６０２によるメンブレンを挟む形状を取っている。筐体１０１には熱伝導率の小さな素材を用いるのがよい。また多孔質材６０２は１次抗体５０１が担持でき、交流磁界の印加で発熱しないものであればどのような材質でも構わず、例えばシリカ等が用いられる。また、サーミスタ３０８を反応領域部に配置している。図９（ｂ）は本実施例の反応場の拡大図である。多孔質材６０２によるメンブレンに実施例１及び２で述べた手法により、１次抗体５０１の固定化をあらかじめ行っておく。１次抗体５０１の固定箇所は、メンブレン全面に実施することはかならずしも必要ではない。パッキング材６０１の開口部にあたる反応領域についてのみ実施すれば構わない。
【００２８】
実施例１及び２で述べた方法によって検体中のＰＳＡ検体の反応を行い、抗原６０４を介して磁性粒子６０３が固定される。その後、コイル４０１に交流電源４０２により５００ｋＨｚの周波数の高周波電流を流し、流路２０１に交流磁界を印加する。抗原抗体反応により流路２０１内に担持された磁性粒子６０３は、上記高周波磁界により発熱する。この発熱によって発生した温度変化を、サーミスタ３０８によって検出することにより検体中の抗原量を定量する。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の検出素子および検出方法は特に、生体物質の検出方法に用いられ、標識粒子として磁性粒子を用い、磁性粒子の数に対応した物理量の変化を検出し、被検体溶液中に含有される物質を検出する方法であって、抗原等の標的物質の検出を容易にかつ定量的に行うものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】プリズムにレーザー光を入射させ表面プラズモン共鳴を利用する本発明の検出方法に用いる検出系の断面の模式図
【図２】プリズムにレーザー光を入射させ表面プラズモン共鳴を利用する本発明の検出方法に用いる検出系の断面の模式図
【図３】回折格子にレーザー光を入射させ表面プラズモン共鳴を利用する本発明の検出方法に用いる検出系の断面の模式図
【図４】熱電対を利用する本発明の検出方法に用いる検出系の断面の模式図
【図５】熱電対を利用する本発明の検出方法に用いる検出系を上方から見たときの各部位の位置関係を示す模式図
【図６】サーミスタを利用する本発明の検出方法に用いる検出系の断面の模式図
【図７】赤外線放射温度計を利用する本発明の検出方法に用いる検出系の断面の模式図
【図８】１次抗体、抗原、２次抗体および磁性粒子が反応場に担持されている様子を示す概念図
【図９】（ａ）は反応領域に多孔質材料を使った場合の検出系の断面の模式図、（ｂ）は多孔質材料反応領域の拡大図
【符号の説明】
【００３１】
１０１  筐体
１０２  蓋
１０３  銅板
１０４  プリズム
１０５  金薄膜
１０６  回折格子が形成されたガラス基板
１０７  反応場
２０１  流路
２０２  注入口
２０３  排出口
３０３  レーザー
３０４  受光器
３０５  レーザー光
３０６  熱電対の一部である銅
３０７  熱電対の一部であるコンスタンタン
３０８  サーミスタ
３０９  赤外線放射温度計
４０１  コイル
５０１  １次抗体
５０２  ２次抗体
５０３  抗原
６０１  パッキング材
６０２  多孔質材
６０３  磁性粒子
６０４  抗原
【図１】
2005315677.tif 000003
【図２】
2005315677.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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