(57)【要約】【課題】            薬物結合能、選択的分子認識能、溶解度等の分子特性の測定や分離条件設定が容易である取り扱い易い液体クロマトグラフィーでの使用に適した充填剤の開発。【解決手段】        糖がリガンドを介して担体に固定されていることを特徴とする糖結合充填剤、上記分離剤のリガンドが、炭素原子数４〜１２のアルキル基である糖結合充填剤、さらには、リガンドと糖が、硫黄結合、窒素結合又は酸素結合を介して結合されている上記充填剤、さらには、上記糖がイオン交換能を有する単糖である上記充填剤を提供する。本発明はさらにマンノース又はガラクトースがプロピルアミノ基を介して担体に固定されている糖結合充填剤を提供する。さらに本発明は、担体にリガンドを結合し、ついで糖を結合させる、又は糖結合シリル化剤を担体に結合する糖結合充填剤の製造方法を提供する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖がリガンドを介して担体に固定されていることを特徴とする糖結合充填剤。
【請求項２】
リガンドが、炭素原子数４〜１２のアルキル基であることを特徴とする請求項１記載の糖結合充填剤。
【請求項３】
リガンドと糖が、硫黄結合、窒素結合又は酸素結合を介して結合されていることを特徴とする請求項３記載の糖結合充填剤。
【請求項４】
糖がイオン交換能を有する単糖であることを特徴とする請求項１記載の糖結合充填剤
【請求項５】
担体がシリカゲルであることを特徴とする請求項１記載の糖結合充填剤。
【請求項６】
請求項１記載の糖結合充填剤の蛋白質又は糖蛋白質の分子認識特性を有する分離剤としての使用。
【請求項７】
担体にリガンドを結合し、ついで糖を結合させることを特徴とする糖結合充填剤の製造方法。
【請求項８】
糖結合シリル化剤を合成し、ついで該シリル化剤をシリカゲルに結合させることを特徴とする糖結合充填剤の製造方法。
【請求項９】
マンノース又はガラクトースがプロピルアミノ基を介して担体に固定されていることを特徴とする糖結合充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖結合充填剤およびその製造方法に関する。さらに詳細には、各種生理活性な化合物の分離剤さらには糖蛋白質の分子認識特性をも有しうる分離剤として有用であり、かつ再現性良く製造でき、寿命が長く、分離能が良く、選択性の高い糖結合充填剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛋白質を直接担体に被覆したり、プロピルアミノ基をリガンドとして担体に結合して充填剤を合成し、薬物の結合定数を測定したり、生理学上の流体中で薬物を前以て除蛋白することなく直接に定量することが行われていた（非特許文献１、２）。しかしながら、これらの充填剤は蛋白質の品質が安定でないために再現性の高い充填剤を供給することが難しかった。
【０００３】
膜蛋白質の特性を調べる方法としては、天然物から抽出した膜蛋白質を担体に被覆したりあるいは膜状に固定した粒子を用いて測定する方法と、移動液中に抽出した膜蛋白質を加えて移動液中での吸着や分配現象に基づいて測定する方法とが行われてきた。しかしこれらの方法は、天然物からの抽出物を原料としているために、膜蛋白質は微量であり、純度が悪く、再現性の良い、使いやすいシステムの構築が困難であった。
【０００４】
糖を結合させた充填剤としては、シリカゲルを担体とするプロピルアミノ基結合充填剤にグルコースを結合させたものが開発された（非特許文献３）。この充填剤は分子ふるい液体クロマトグラフィーに適していると報告された。しかしながら、この充填剤は緩衝液中での寿命が従来から使用されている分子ふるいクロマトグラフィー用充填剤より短く、広く用いられるには至らなかった。さらに、多糖類としてアミローズをシリカゲルに結合させた充填剤は光学異性体分離用充填剤として広く用いられている（非特許文献４）。
【０００５】
また、蛋白質の基本的分子認識を有する分離剤としては、蛋白質のアニオン交換能を担っていると考えられているアニオン交換基であるグアニジル基（特許文献１）や、蛋白質のカチオン交換能を担っていると考えられているカチオン交換基であるカルボキシル基を結合させた充填剤が開発され、例えば、人血清アルブミンの薬物結合能の測定（非特許文献５）やイオン交換体としてのクロマトグラフィー用分離剤として用いられている（特許文献２）。糖の回収率の良い糖分離用充填剤としても用いられている（特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−１６０７１９号公報
【特許文献２】特開２０００−９７０８号広報
【非特許文献１】H. Yoshida, I. Morita, G. Tamai, T. Masujima, Y. Tsuru, N. Takai and H. Imai, Chromatographia, 19 (1984) 466-472.
【非特許文献２】N. Lammers, H.D. Bree, C.P. Groen, H.M. Ruijten, B.J.D. Jong, J. Chromatogr., 496 (1989) 291-300.
【非特許文献３】R.E. Huisden, J.C. Kraak and H.Poppe, J. Chromatogr., 508 (1990) 289−299.
【非特許文献４】N. Enomoto, S. Furukawa, Y. Ogasawara, H. Akano, Y. Kawamura, E. Yashima and Y. Okamoto, Anal. Chem., 68 (1996) 2798−2804.
【非特許文献５】T.Hanai,R.Miyazaki,T.Kinoshita,Anal.Chim.Acta,378(1999)77-82.
【非特許文献６】T.Hanai, Advances in Chromatography, 40 (2000) 315−357,
【非特許文献７】T.Hanai, R.Miyazaki, T.Kinoshita, F.Ahmed, B.Modrek, J. Liq. Chromatogr. & Rel. Technol., 22 (1999) 2613−2625」
【非特許文献８】J.L. Speier, J.A. Webster, J. Org. Chem., 21(1956)1044−46.
【非特許文献９】T. Kinoshita, M. Miyayama, Y. Kyodo, Y. Kamitani, M. Miyamasu, N, Nimura, T. Hanai, Biomdical Chromatography, 7 (1993) 64−67.
【非特許文献１０】S. Ciccotosto, M.J. Kiefel, S. Abo, W. Stewart, K. Quelch, and M. von Itzstein, Glycoconjugate Journal, 15 (1998) 663−669、
【非特許文献１１】R.L. Whistler, M.L. Wolfrom eds. Methods in Carbohydrate Chemistry, Academic Press Inc. New York and London, 2 (1963) 211−220.）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
シリカゲルを基剤として表面を処理した充填剤は、理論段数が高く、分離し易く、取り扱いが容易なため、広く使用されている。このため、高速液体クロマトグラフィー（以下HPLCという）の初期に広く使用された合成有機高分子充填剤は用いられることが少なくなった。他方、シリカゲル系充填剤の表面修飾基の種類は少なく、オクタデシル基で化学修飾した充填剤が分離の50％以上で使用されていると言われている。しかしながら、この充填剤は表面が疎水性であり、シリカゲルの孔径の違いによる以外の選択性が少ないため、とりわけ生理活性な化合物の特性、例えば薬物結合能、選択的分子認識能、溶解度等の測定や分離条件設定には困難な工夫をせざるを得ない。
【０００８】
液体クロマトグラフィーを用いて上記した分子特性の測定や分離条件設定を容易にするためには、生体成分の特性を有し、かつ選択性のある、取り扱い易い充填剤の開発が必要である。本発明者らが先に開発したグアニジル基を結合した充填剤は従来のイオン交換体のように化学的にイオン交換容量とイオン強度に着目して合成されたものではない。グアニジル基結合充填剤は生体内のイオン交換機能を模した充填剤である。さらに。環境問題及び必要試料量を少なくするという問題を解決するためにはカラムサイズを小さくする必要があり、このためには、物理的強度の高いシリカゲルを支持体とする充填剤を合成する必要がある。また、液体クロマトグラフィーの分離条件設定を容易ならしめるためには、選択性のある取り扱い易い充填剤の開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は糖がリガンドを介して担体に固定されていることを特徴とする糖結合充填剤を提供する。本発明はさらに、上記分離剤のリガンドが、炭素原子数４〜１２のアルキル基である充填剤を提供する。本発明はさらに、リガンドと糖が、硫黄結合、窒素結合又は酸素結合を介して結合されている上記充填剤を提供する。本発明はさらに、上記糖がイオン交換能を有する単糖である上記充填剤を提供する。本発明はさらに蛋白質又は糖蛋白質の分子認識特性を有する分離剤として有用な糖結合充填剤を提供する。さらに本発明は、担体にリガンドを結合し、ついで糖を結合させることを特徴とする蛋白質又は糖蛋白質分離剤の製造方法を提供する。本発明はさらに糖結合シリル化剤を合成し、ついで該シリル化剤をシリカゲルに結合させる糖結合充填剤の製造方法を提供する。本発明はさらにマンノース又はガラクトースがプロピルアミノ基を介して担体に固定されている糖結合充填剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の糖結合充填剤は、従来のジオール結合体のようにアルコール性水酸基に着目して合成された充填剤ではなく、生体内の糖蛋白質の機能を模した充填剤である。とりわけ生体成分の分離精製及び糖蛋白質の分子認識能を測定できるという特性を有する。本発明の糖結合充填剤は、環境問題および必要試料量を少なくする問題を考慮するとカラムサイズを小さくする必要があり、このために物理的強度が高いシリカゲルを担体とすることもできる。また、多量の試料を処理するために有機合成高分子を支持体として合成することも可能である。本発明の糖結合充填剤は蛋白質又は糖蛋白質分離剤としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
非特許文献２で提示された糖結合充填剤と本発明により提供された糖結合充填剤の担体と糖との間の結合基を化学式で比較するとつぎのようにあらわされる。
非特許文献２の糖結合充填剤
プロピルアミノ基結合グルコース→−(CH2)3Nグルコース
本発明の糖結合充填剤
ヘキシル基Ｓ結合グルコース→−(CH2)6Ｓグルコース
ヘキシル基Ｓ結合ガラクトース→−(CH2)6Ｓガラクトース
ヘキシル基Ｓ結合グルコサミン→−(CH2)6Ｓグルコサミン
この結合した糖はジオール基と比べて極性が高いだけでなく、糖蛋白質の特性を生かしたのが本発明の糖結合充填剤である。但し、グルコースは糖蛋白質構成糖ではなく、エネルギー糖であるが、原料として他の糖類に比べて安価であり有用である。この充填剤は有機合成高分子を担体としてもシリカゲルを担体としても合成することができる。有機合成高分子を担体とした充填剤は化学的に安定であるが物理的に不安定で高理論段数のあるカラムを得ることが難しいが多量処理に適している。シリカゲルを担体として合成した充填剤は物理的強度が高いので高速液体クロマトグラフィー用充填剤に適している。上記の糖結合充填剤はリガンドとしてヘキシル基を用いているために化学的に安定である。アルキル基結合は化学的に安定であり、アルキル基の鎖長がペンチル以上であると化学的な安定性が増加する。アルキル基の長さは炭素原子数４〜１２、より好ましくは炭素原子数６〜１２である。アルキル鎖と糖との結合は直接結合、Ｎを介した結合、Ｓを介した結合、Ｏを介した結合のいずれでもよいが、化学的安定性の見地から、Ｓを介した結合がとくに好ましい。なお本発明において、糖とはグルコサミン、マンノース、ガラクトース、アラビノース、フラクトース、グルコース、フコース、グルクロン酸、シアル酸、キシロース、ガラクトサミン及びそれらの誘導体を含む意味で使用される。
【００１２】
先に提案したグアニジル基（特許文献１）と従来のイオン交換基とをグアニジル基に対応するアニオン交換基に限定して化学式で比較すると次のように表される。
プロピル基→−(CH2)3NH2
ジエチルアミノエチル基→−(CH2)2N(CH2CH3)2
トリメチルアンモニウム基→−CH2N(CH3)3
トリエチルアンモニウム基→−CH2N(CH2CH3)3
グアニジル基→−CH2−NH−C(NH)NH2
このグアニジル基は他のイオン交換基と異なり、3個の窒素原子を有しており、蛋白質構成のアミノ酸の一つであるアルギニンの置換基である。このグアニジル基はアニオン交換能をもち、蛋白質のアニオン交換能を担っていると考えられる。この充填剤は有機合成高分子を担体としても、シリカゲルに代表される無機合成高分子を担体としても合成することができる。しかしながら、有機合成高分子を担体としたものは化学的に安定であるが物理的に不安定で高理論段数のあるカラムを得ることは難しい。しかし多量処理に適した充填剤である。シリカゲルに代表される無機合成高分子を原料として合成したものは物理的強度が高いので高速液体クロマトグラフィー用充填剤として適している。本発明で使用されるグルコサミン結合充填剤はグアニジル基結合充填剤と同じように有機合成高分子を担体にしても、シリカゲルに代表される無機合成高分子を担体にしても合成することができる。化学式で比較すると次のように表される。
グルコサミノ基→−S−C6H12O4N
このグルコサミノ基は今までに開発されたイオン交換基とは異なり、イオン交換能を有する糖であり、糖蛋白質のオリゴ糖構成糖であり、オリゴ糖の分子認識能に重要な役割を担っていると考えられている。このグルコサミンの一級アミノ基は弱アニオン交換性だけでなく水素結合能も有している。
【００１３】
本発明で使用される糖を有する化合物を固定化する担体としては、無機系担体としてシリカ、シリカゲル、多孔性アルミナ、有機系担体としてポリスチレン、ポリスチレン水酸基ゲル、メタアクリレートゲル、エチレングリコール、デンプン、ビニルアルコール等が例示される。これらの担体は、あらかじめリガンドを固定化したものでもよく、市販品として容易に入手できる。シリカゲルとしては、"Spherisorb Si"(フェーズセパレーション社製),"YMS Gel Silicagel 60"(山村化学社製),多孔性アルミナとして、"Alumina Alox 60"(ナーゲル社製),"LiChrosorb Alox T"(メルク社製）等が市販されている。
【００１４】
有機系担体としては、ポリスチレンゲルとして、"日立ゲル  3010、3011、3019”（日立社製）、"MCI GEL GHP 20P"(三菱化学社製）、"Shodex polymer pak D"(昭和電工社製）、"TSK GEL 110,111"(東ソー社製）、メタアクリレートゲルとして、"Shodex RS pak DE613"(昭和電工社製）、"TSK GEL LS 120,130,140"(東ソー社製）、エチレングリコールとして、"TSK GEL LS 160"(東ソー社製）, デンプンとして、TSK GEL LS 170"(東ソー社製）, ビニルアルコール系として、"Asahipak GS 220-620"(昭和電工社製）等が市販されている。これらの担体は、分離剤の用途に応じ適宣選択使用できる。
【００１５】
本発明の、グルコース基含有化合物をＳ結合を介して担体に固定化した糖結合充填剤の製造法の一例を次に説明する。糖結合シリル化剤を合成するのには、まず、糖をアセチル化した後、1位をブロム化し、さらにチオアセチル化しておく。つぎにリガンドとして、例えば5ーブロモ−1−ペンテンを結合し、さらに1位の2重結合の所に、Speierらの方法（非特許文献８）により、例えばトリクロロシランを結合させてシリル化剤とする。ついでアルキル基結合充填剤を合成するのと同様の合成方法でこのシリル化剤とシリカゲルを例えばトルエン中で反応させて糖結合シリカゲルを得る。
【００１６】
反応性は良いが毒性の強いシリル化剤を合成することなく、担体に順次結合して、糖結合充填剤を合成するのには、まず、担体にビニル基結合を結合しておく。次に糖をアセチル化した後、1位をブロム化し、さらにチオアセチル化しておく。先に合成したビニル基結合担体のビニル基に臭素酸を作用させて、ブロム化してからテトラアセチルチオアセチル糖と反応させて糖結合充填剤を合成する。
【００１７】
従来使用されてきた担体としては、多糖類から作られるセルロース、アガロース、セファデックス等、石油化学製品で球状、細管状や網状にしたポリビニールアルコール、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン等に代表される柔らかな有機高分子系、及びシリカ、アルミナ、チタニア等に代表される無機高分子系のものがある。これらの担体はそのまま吸着濾過剤として、あるいは液体クロマトグラフィー用充填剤として使われている。また、これら担体の表面を天然高分子の蛋白質、多糖類、あるいは合成高分子のシリコーンゴム、カーボワックス、ポリシロキサン等で表面処理して担体の特性を変え、適用範囲を広げる試みもなされてきた。
【００１８】
これらの担体の特性を高めるために、表面を低分子化合物で化学処理する方法も、分離剤として、例えばクロマトグラフィー用充填剤用として広く採用されてきた。すなわち、天然高分子で表面処理をする場合には、天然高分子がたとえ安定に供給されたとしても、その品質、純度が一定でないため、再現性のある充填剤を得ることが難しい。しかし、低分子化合物を用いて、化学反応により担体の表面処理を行う場合には、品質管理が容易であり、品質、特性の安定した製品として市場に供給されている。本発明においては、これらの担体を使用して糖結合充填剤を製造することができる。
【００１９】
中性糖であるマンノースやグルコース等を結合させた結合剤の場合には極性な高分子は結合剤表面に固定化された糖に阻害されて結合剤に保持されることなく、カラムを素通りし、いわゆる分子ふるい効果によって、原則として大きな分子から先に溶出する。疎水性な低分子化合物は表面の糖の隙間から結合剤の内面に達して、結合剤の担体や糖を結合させたリガンドに保持される。このような糖結合充填剤は所謂、生体成分直接注入する、生体成分中の薬物分析に適したクロマトグラフィー用充填剤として使え、分析対象とする薬物の極性に応じて、疎水性なリガンドのアルキル鎖の長さを調整すれば夾雑物の除去をもできる。
【００２０】
アニオン交換能を有する、アミノ基があるグルコサミンのアミノ基によるイオン交換においては、アニオンの交換であり、海水中に多く含まれているクロルイオン、フッ素イオン、ブロムイオン、硝酸イオン、硫酸イオン等の各種無機イオン、植物中に多く含まれているシュウ酸、りんご酸、クエン酸。マレイン酸等の有機イオンのみならず、溶けることによってアニオンになる各種有機化合物を金属イオン、アミン等のカチオン及び多環芳香族化合物、糖類等の中性化合物からアニオン性化合物を選択的に吸着する機能を有する。とりわけ、生体内酸性代謝物や酸性薬物（アニオン性）の分離精製に適している糖結合充填剤であり、生体内のアニオン交換反応及びアミノ基の水素結合能を調べるのに適した糖結合充填剤である。さらに述べると、グルコサミンは膜蛋白質の基本となる糖であり、多くのオリゴ糖はグルコサミンを介して蛋白質の構成アミノ酸と結合している。このアミノ基は水素結合能も有し、糖蛋白膜の分子認識に重要な役割を演じていると考えられている。このことからもグルコサミン結合充填剤は特異的選択能があると考えられる。
【００２１】
本発明の糖結合充填剤は、天然高分子を固定化した充填剤に比べて、品質、特性の安定した製品を市場に供給することができる。さらに、用途に応じて適宣担体を選択することにより、酸や塩基にも耐える製品とすることができ、広い用途に適応した充填剤を供給することができることとなる。とりわけ生化学の分野での応用が広く期待できる。
【００２２】
以下本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】
製造例１  有機ポリマー系Ｎマンノース充填剤の製造
ポリビニールアルコール樹脂にプロピルアミノ基を導入した、Asahipak NH2P−50（旭化成社製）0.5ｇを25mLのメタノールに懸濁し、そこに0.5ｇのマンノースと5ｍｇの塩化アンモニウム、さら200ｍｇのナトリウムシアノボロハイドライドを加えて16時間還流した。冷却後、メタノール、水、アセトン、ジエチルエーテルそれぞれ100mLで洗浄した後、風乾して溶媒を除去し、Ｎマンノース結合充填剤を得た。
【００２４】
製造例２  シリカ系Ｎマンノース充填剤の製造
プロピルアミノ基結合シリカゲル0.5ｇを25mLのメタノールに懸濁し、そこに0.5ｇのマンノースと5mgの塩化アンモニウム及び200ｍｇのナトリウムシアノボロハイドライドを加えて16時間還流した。冷却後、メタノール、水、アセトン、ジエチルエーテルそれぞれ100mLで洗浄した後、風乾して溶媒を除去し、Ｎマンノース結合充填剤を得た。製造例１と２の反応においてマンノースを使ったのはマンノースがグリコシル反応を起こしやすく、さらにアマドリ転移体を作りにくい実験結果（非特許文献９）に基づいている。
【００２５】
製造例３  シリカ系Ｓグルコース充填剤の製造
5gのグルコースを25mLの氷酢酸と0.4mLの過塩素酸を混ぜた溶液中に加えて反応後、反応液を氷中に加えて結晶化させ、濾過洗浄をして、ペンターO−アセチルグルコースを得た。次に1gのペンタ−O−アセチルグルコースを2mLの臭素酸の酢酸溶液に加えて1位のアセチル基をブロム基に変えた。このものをエーテル抽出して結晶化させた。さらに、ウイリアムソンのエーテル合成に類似した反応を用い、臭素化糖とカリウムチオアセテートを縮合した。即ち、300ｍｇのテトラ−O−アセチルグルコピラノシルブロマイドを、430ｍｇのカリウムチオアセテート430ｍｇを無水アセトニトリル30mLに溶かしておいた溶液に加えてテトラ−O−アセチルグルコピラノースチオアセテートを酢酸エチルで抽出して得た（非特許文献１０）。他方、シリカゲル2.65ｇと1.40mLのヘキセニルトリクロロシランをトルエン中で反応させてヘキセニル基結合シリカゲルを合成する。次に、2gのヘキセニル基結合シリカゲルを20mLの臭素酸酢酸溶液に加えてブロモヘキシルシリカゲルを合成し、反応液を濾過後アセトンで洗浄して乾かす。1ｇのブロモヘキシルシリカゲルを、24mLの無水ジメチルホルムアミドに476mgのテトラーO−アセチルグルコピラノースチオアセテートを溶かしておいた溶液に加え、さらに無水ジエチルアミンを加えて反応させて、１−テトラ−O−アセチルグルコピラノースヘキシル結合シリカゲルを得た。最後に、ツエンプレン法（非特許文献１１）でメトキシナトリウムを無水メタノールに溶かした溶液で洗うことにより、アセチル基を除いて１−グルコピラノースヘキシル結合シリカゲルを得た。
【００２６】
製造例４  シリカ系Ｓグルコサミン充填剤の製造
5gのＮ−アセチルグルコサミンを50mLのアセチルクロライド中に加え、酢酸エチルで抽出した後飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄してから酢酸エチルを蒸発させてトリ−０−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミンを得た。次に4ｇのトリ−０−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミンを、6ｇのカリウムチオアセテートを無水アセトニトリル320mLに溶かしておいた溶液に加えてトリ−０−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミンチオアセテートを酢酸エチルで抽出して得た。他方、シリカゲル2.65ｇを、1.40mLのヘキセニルトリクロロシランを含むトルエン中で反応させてヘキセニル基結合シリカゲルを合成した。次に、２ｇのヘキセニル基結合シリカゲルを20mLの臭素酸酢酸溶液に加えてブロモヘキシルシリカゲルを合成し、反応液を濾過後アセトンで洗浄して乾かした。435ｍｇのブロモヘキシルシリカゲルを、10mLの無水ジメチルホルムアミドに180ｍｇのトリ−０−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミンチオアセテートを溶かしておいた溶液に加え、さらに無水ジエチルアミン1.6mLを加えて反応させて、１−トリ−０−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミンヘキシル結合シリカゲルを得た。最後に、メトキシナトリウムを無水メタノールに溶かした溶液で洗うことにより、アセチル基を除いて１−グルコサミンヘキシル結合シリカゲルを得た。
【００２７】
実施例１  人血清中の薬物とアルブミンを代表とする蛋白質の分離
従来、人血清中の薬物を直接注入して分離分析を行うためにはジオール結合充填剤や蛋白質結合充填剤、内面疎水性充填剤が使われてきた。しかしながら、本発明の製造例３で得られたシリカ系Ｓグルコース充填剤を使用した中性糖結合カラムを使うとpHを調整した水溶液だけで分離できる。分析条件及人血清アルブミンと酸性薬物の保持時間の例を次に示した。結果を表１に示す。
カラム：グルコース結合シリカゲル、長さ100mm, 内径  2.1mm,
溶離液：50mM 燐酸ナトリウム液、pH 7.40,
流速：0.2mL/min,
カラム温度：３７℃
検出：紫外部吸収  220-300 nm。
【００２８】
実施例２  グルコサミン結合カラムの選択性の測定
製造例４で得られたシリカ系Ｓグルコサミン充填剤の選択性を測定するために、5種のクロロフェノールのクロマトグラフィー挙動を調べた。結果を図１に示す。
カラム：グルコサミン結合シリカゲル、長さ50mm, 内径  2.1mm,
溶離液：３３．３％メタノールを含む50mM 燐酸ナトリウム液、pH 2.0−11.0,
流速：0.2 mL/min,
カラム温度：37゜C
検出：紫外部吸収  254nm。
【００２９】
実施例３  プロピルアミノマンノース基結合カラムの選択性の測定
製造例２で得られたプロピルアミノマンノース充填剤の選択性を実施例２と同様に操作して試験した。結果を図２に示す。
カラム：プロピルアミノマンノース結合シリカゲルカラム、長さ100mm、内径2.1mm
溶離液：２０％メタノールを含む50 mM 燐酸ナトリウム液、pH 4.0−7.0,
流速：0.2mL/min,
カラム温度：37゜C
検出：紫外部吸収  254nm。
比較例１〜３
【００３０】
疎水性結合能を調べるための逆相液体クロマトグラフィー用充填剤であるペンチル基結合シリカゲルカラム（比較例１）、アミノ基の特性を比較するためのプロピルアミノ基結合シリカゲルカラム（比較例２）、イオン交換能を比較するためのグアニジノ結合カラム（比較例３）について次の条件でクロマトグラフィー挙動を調べた。結果をそれぞれ図３〜図５に示す。
【００３１】
比較例１
カラム：ペンチル基結合シリカゲルカラム、長さ50mm, 内径2.1 mm,
溶離液：３３．３％メタノールを含む50mM燐酸ナトリウム液、pH 2.0−11.0,
流速：0.2mL/min,
カラム温度：37゜C
検出：紫外部吸収  254 nm。
【００３２】
比較例２
カラム：プロピルアミノ基結合シリカゲルカラム、長さ50mm, 内径2.1 mm,
溶離液：１０％メタノールを含む50mM燐酸ナトリウム液、pH 3.0−10.0,
流速：0.2mL/min,
カラム温度：37゜C
検出：紫外部吸収  254 nm。
【００３３】
比較例３
カラム：グアニジル基結合ポリビニールゲルカラム、長さ50mm, 内径4.6 mm,
溶離液：５０％メタノールを含む50mM燐酸ナトリウム液、pH 6.0−8.0,
流速：1.0mL/min,
カラム温度：37゜C
検出：紫外部吸収  254 nm。
【００３４】
表１  グルコース結合カラムにおける各種化合物の溶出時間
溶出時間（分）               溶出時間（分）
フラクトース            １．０９      メフェナム酸                ４．５１
パラアミノ馬尿酸        １．１０      ナリジクス酸                ２．６１
アモキシシリン          １．１６      ナプロキセン                ２．０５
バルビツール酸          １．０４      ニコチン酸                  １．１２
安息香酸                １．０９      フェニルブタゾン            ２．８０
フロセミド              ２．０４      サリチル酸                  １．１２
パラヒドロキシ安息香酸  ２．５７      スルファメトキサゾール      １．１８
イブプロフェン          ２．２１      トラザミド                  ３．２２
インドメタシン          １．２０      トルブタミド                １．９９
イオパノ酸              ７．０８      ワルファリン                ２．０９
糖化アルブミンを４８重量％含む人血清アルブミン                    １．００
糖化アルブミンを３重量％含む人血清アルブミン                      １．１８。
【００３５】
実施例４  グルコサミン結合カラムの薬物選択性の測定
実施例２のグルコサミン結合カラムの薬物選択性を測定するため、比較例１のペンチル基結合カラム、実施例１のグルコース結合カラムを用い、表２にまとめた薬物の保持挙動を調べた。対象として選んだカラムは疎水性結合能を調べるため、逆相液体クロマトグラフィー用充填剤であるペンチル基結合シリカゲルカラム、糖の特性を比較するためのグルコース結合カラムを使用した。結果を表２に示す。
溶離液：ペンチル基結合カラムでは５０％のメタノール、グルコサミン及びグルコース結合カラムでは３３．３％のメタノールを含む５０ mM燐酸ナトリウム液、pH4.0
流速：０．２mL/min.
カラム温度：３７℃
検出：紫外部吸収  ２２０−３００nm。
【００３６】
実施例５  グルコサミン結合カラムの薬物選択性の測定
実施例２のグルコサミン結合カラムのイオン交換選択性を測定するために、比較例１のペンチル基結合カラム、比較例３のグアニジル基結合カラムを用い、薬物の保持挙動を測定し、薬物の物性値の一つであるオクタノール／水分配定数（logP）を基準にして比較した。結果を図６に示す。
溶離液：グアニジル基結合カラムでは５０％のメタノール、グルコサミン結合カラムでは３３．３％のメタノールを含む５０mM燐酸ナトリウム液、pH4.0。ペンチル基結合カラムは５０％メタノールを含む５０mM燐酸ナトリウム液、pH2.0.
流速：０．２mL/min.
カラム温度：３７℃
検出：紫外部吸収  ２２０−３００nm。
【００３７】
表２  グルコサミン結合カラムの選択性（単位保持比）
グルコサミン    グルコース      ペンチル
結合カラム   結合カラム   結合カラム  
フラクトース              0.000           0.000           0.000
パラアミノ馬尿酸          0.976           0.025           0.019
アモキシシリン            0.243           0.049           0.084
バルビツール酸            0.509           0.000           0.027
安息香酸                  3.093           0.075           0.666
フロセミド               19.579           0.053           0.505
パラヒドロキシ安息香酸    3.235           0.108           0.832
イブプロフェン           72.430           0.634          16.566
インドメタシン            4.952           0.113           0.613
イオパノ酸              428.817           1.417          23.727
メフェナム酸            273.526           1.167          20.687
ナリジクス酸              9.484           0.350           1.130
ナプロキセン              32.049          0.148           3.461
ニコチン酸                 1.066          0.033           0.055
フェニルブタゾン          76.035          0.158           4.592
サリチル酸                 7.726          0.000           0.274
スルファメトキサゾール   2.102          0.064           0.224
トラザミド                16.962          0.259           2.977
トルブタミド              14.163          0.171           2.596
ワルファリン              56.992          0.251           5.067。
【００３８】
実施例１のカラムはシリカゲルを支持体として合成したものを内径2.1 mm のセミミクロカラムに充填したものであり、従来の内径 4.6 mm のカラムに比べて必要な溶離液量が５分の１以下であり、廃液処理が容易になり、クロマトグラフを環境に優しく経済的に稼働できた。さらに、人血清アルブミンが定量的に回収できたことにより、蛋白質の特異的吸着は防げたと見なせる。結合に用いたリガンドのアルキル鎖がヘキシルであるのでシリカゲル表面のシラノール基の影響が見られず、薬物のピークのテーリングが押さえられたクロマトグラムが得られた。従来の市販充填剤よりは製造方法が容易で人工合成原料を用いているために再現性の良い、品質が安定した充填剤として供給される利点がある。生理的条件で純度が９７％以上に精製した人血清アルブミン及び４８％の糖化アルブミンを含む人血清アルブミンが分子ふるい効果で溶出され、部分解離した酸性薬物が保持されて溶出された。このことは人血清を直接にこの充填剤の層を通過させることにより除蛋白と薬物を容易に分離することができることを意味する。極性で保持の弱い薬物を保持させるためには薬物の保持を強くするために薬物のイオン化を抑えるか、さらにアルキル基の長い糖結合充填剤にすればよい。結合する糖としては特にグルコースに限定されるものではないが、価格及び純度の点からグルコースが合成原料として適している。
表１にまとめたように、pH 7.40 では多くの酸性薬物は解離しており、逆相系カラムへの保持が弱い。この条件では比較的保持が強い、フロセミド、パラヒドロキシ安息香酸、イブプロフェン、イオパノ酸、メフェナム酸、ナリジクス酸、ナプロキセン、フェニルブタゾン、トラザミド及びワルファリンと人血清アルブミン及び48％の糖化アルブミンを含む人血清アルブミンの分離が可能である。これらの薬物はpHを低くすると解離が抑えられ、保持が強くなり、アルブミンと分離することができる。
【００３９】
実施例２のグルコサミン結合カラム及び実施例３のマンノース結合プロピルアミノカラムの特性は種々のカラムからのクロロフェノールの溶出順序を比較すると理解できる。対照として用いたカラムはアルキル基結合、疎水性カラムの一例として用いたペンチル基結合カラム（比較例１）、グルコサミンのアミノ基と従来のアミノ基結合（プロピルアミン結合）カラム（比較例２）、イオン交換能を比較するために用いたグアニジル基結合カラム（比較例３）である。実施例３のプロピルマンノース結合シリカゲルカラムではフェノール類の保持が非常に弱く、実施例１で使用したグルコース結合シリカゲルカラムと同じ目的で使えるようであるが、疎水性の強い化合物への適用に適している。また蛋白質は保持されず溶出されると考えられる。
【００４０】
表２にまためたように、これらの薬物が最大保持をとるpHでの保持比を比較すると、グルコサミン結合カラムはグルコース結合カラムとは異なり、アミノ基の影響が強く現れ、特異的充填剤として用いることができる。
【００４１】
標準的クロマトグラフ的挙動としてペンチル基結合カラムで得られた結果を比較すると、異なる結合基を有するカラムの選択性が理解できる。逆相液体クロマトグラフィーにおいて、クロロフェノール類は原則としてフェノール類の疎水性が低い化合物から疎水性の高い化合物への順に溶出される。但し、図３のペンチル基結合シリカゲルカラムの結果に見られるようにフェノール類の解離定数の違いにより、イオン化の程度によりpHが高くなると溶出順序が違ってくる。プロピルアミノ基結合カラムへの保持は非常に弱いが溶出順序はペンチル基結合カラムからの溶出順序と類似しており、図４に見られるように、低いpH及び高いpHではイオン排除効果が観察される。図３に見られるようにフェノール類の溶出順序はグアニジル基結合カラムでも同様であった。他方、グルコサミン結合カラムでは溶出順序が必ずしも疎水性の順序ではなく図５に見られるように、疎水性の弱い2,4−ジクロロフェノールが2,4,6−トリクロロフェノールより強く保持されて、遅れて溶出された。これはグルコサミンの立体特異性によると見なせる。マンノース結合プロピルアミノカラムへのこれらフェノール類の保持は図２に見られるように非常に弱く、溶出順序はペンチル基結合カラムと類似していると言える。
【００４２】
図６は薬物のオクタノール／水分配定数（log P）を基準として、各種カラムで測定した保持比の対数値（log k）を比較したグラフである。図６中の記号は次の意味を表す。１：パラアミノ安息香酸、２：ニコチン酸、３：スルファメトキサゾール、４：ナリジクス酸、５：パラヒドロキシ安息香酸、６：サリチル酸、７：トラザミド、８：安息香酸、９：フロセミド、１０：トルブタミド、１１：ワルファリン、１２：ナプロキセン、１３：フェニルブタゾン、１４：インドメタシン、１５：イブプロフェン、１６：メフェナム酸。
【００４３】
グルコサミン結合カラムの選択性を図６にまとめた酸性薬物の溶出挙動から比較すると、ペンチル基結合カラムでは保持比の大きさは原則として薬物の疎水性の大きさに比例し、グルコサミン結合カラムでも一応薬物の疎水性に対応しているようであるがインドメタシンの保持が極端に弱かった。さらに、グルコサミンのイオン交換能を比較するためにグアニジル基結合カラムの結果と比較するとグルコサミン結合カラムにはフロセミドの保持が非常に弱かった。グルコサミンの保持挙動を定量的に分析することは難しいが、これらのクロマトグラフィー挙動から特徴のある分子認識相であると見なせる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例２のグルコサミン基結合カラムのフェノール類保持挙動を示すグラフである。
【図２】実施例３のプロピルマンノース基結合カラムのフェノール類保持挙動を示すグラフである。
【図３】比較例１のペンチル基結合カラムのフェノール類保持挙動を示すグラフである。
【図４】比較例２のプロピルアミノ基結合カラムのフェノール類保持挙動を示すグラフである。
【図５】比較例３のグアニジル基結合ポリビニールゲルカラムのフェノール類保持挙動を示すグラフである。
【図６】各種カラムで測定した保持比の対数値（log k）による比較を示すグラフである。
【図１】
2005315666.tif 000002
【図２】
2005315666.tif 000003
【図３】
2005315666.tif 000004
【図４】
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【図５】
2005315666.tif 000006
【図６】
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