(57)【要約】      （修正有）【課題】インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞に分化する前駆間葉系幹細胞及び、その細胞の精製、調製方法。【解決手段】ａ）多能性幹細胞を培養し分化させる段階、およびｂ）神経外胚葉マーカーである（Ｓｏｘ１）を発現している細胞を選別し分離する段階、により、前駆間葉系幹細胞を得と共に、上記前駆間葉系幹細胞を培養して血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲα）陽性かつ胎児肝キナーゼ１（ＦＬＫ１）陰性の細胞を選別する間葉系細胞を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞からインビトロにおいて分化させた前駆間葉系幹細胞であって、Ｓｏｘ１陽性である細胞。
【請求項２】
多能性幹細胞が哺乳動物由来である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
Ｓｏｘ１の全部または一部が標識タンパク質で置き換えられている、請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
間葉系幹細胞を得るために使用する、請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
ａ）多能性幹細胞を培養し分化させる段階、および
ｂ）Ｓｏｘ１を発現している細胞を選別し分離する段階、
の各段階を含む、前駆間葉系幹細胞の調製方法。
【請求項８】
多能性幹細胞が哺乳動物由来である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
段階ａ）においてコラーゲンＩＶでコートした培養プレート上で多能性幹細胞を培養する、請求項７ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
段階ａ）においてレチノイン酸添加培地中で多能性幹細胞を培養する、請求項７ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
レチノイン酸の濃度が１０−７Ｍである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階ａ）を開始してから４日目に段階ｂ）を実行する、請求項７ないし１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
Ｓｏｘ１の全部または一部が標識タンパク質で置き換えられている、請求項７ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
段階ｂ）が、ＦＡＣＳによるものである、請求項７ないし１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項７ないし１６のいずれかに記載の調製方法により得られる前駆間葉系幹細胞。
【請求項１８】
ａ）請求項１ないし請求項６のいずれか、または請求項１７に記載の細胞を培養する段階、
ｂ）ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、および
ｃ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階、
の各段階を含む、間葉系幹細胞の調製方法。
【請求項１９】
ａ）多能性幹細胞を培養し分化させる段階、
ｂ）Ｓｏｘ１を発現している細胞を選別し分離する段階、
ｃ）ｂ）で分離した細胞を培養し、ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、および
ｄ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階、
の各段階を含む、間葉系幹細胞の調製方法。
【請求項２０】
請求項１８または請求項１９に記載の調製方法により得られる間葉系幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた前駆間葉系幹細胞に関するものである。また、本発明は、そのような細胞の精製を可能にする新しい精製、調製方法にも関連する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系細胞は、中胚葉系細胞と同様に、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、脂肪細胞へと分化できる多分化能を有する細胞である。多分化能と自己複製能力を有する中胚葉系細胞が、発生の進行に伴ってその能力を喪失するのに対して、間葉系細胞は幹細胞として成体内に長く存在することが知られている。そのため、間葉系幹細胞は、細胞移植治療に有用であると期待されている（非特許文献１）。
【０００３】
胚性幹細胞（Embryonic stem cell, ＥＳ細胞）は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であり、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分化し得る。最も研究が進んでいるマウスの胚性幹細胞は、発生３.５日の胞胚内の内部細胞塊より樹立された多能性と自己複製能を持つ細胞である。この細胞は、通常の培養培地に血清と白血病阻害因子（leukemia inhibitory factor：ＬＩＦ）と呼ばれる増殖因子を加えるだけで、未分化の状態を保持させつつ、増殖を維持させることが可能である。マウス胚性幹細胞は、発生３.５日目の胞胚に注入し、その胞胚を母体に戻すことによって、インビボで再びすべての組織細胞に分化することができ、キメラマウスやノックアウトマウスの作成に利用されている。また、近年、胚性幹細胞をインビトロで操作して、様々な成熟組織細胞へ分化させることが可能になっている。このような、胚性幹細胞の持つ分化多能性と簡単な操作性から、将来の医療において、細胞を用いる移植治療の材料としての利用が期待されている。
【０００４】
胚性幹細胞を強制的にインビトロで分化させた場合、成熟細胞が出現することは本発明者や他のグループの研究で明らかとなった（例えば、非特許文献１ないし３参照）。現在、胚性幹細胞は様々な分化段階にある幹細胞を経て完全な成熟細胞に至ると考えられているが、その分化過程には未だ不明な点が多い。胚性幹細胞から間葉系細胞への分化に関しては、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞への分化方法が知られているが（例えば、非特許文献５参照）、どのような過程を経てこれらの細胞に分化するのかは、はっきりしていない。
【０００５】
【非特許文献１】マーク・エフ・ピッテンガー（Mark F. Pittenger）、他９名、「サイエンス（Science）」、（米国）、１９９９年、２８４号、１４３−１４７頁
【非特許文献２】西川伸一、外４名、「デベロップメント（development）」、（英国）、１９９８年、１２５号、ｐ．１７４７−１７５７
【非特許文献３】仲野徹、他２名、「サイエンス（Science）」、（米国）、１９９４年、２６５号、１０９８−１１０１頁
【非特許文献４】江良択実、他４名、「ブラッド（Blood）」、（米国）、２０００年、９５号、８７０−８７８頁
【非特許文献５】中辻憲夫編：実験医学別冊・ポストゲノム時代の実験講座４「幹細胞・クローン研究プロトコール」、羊土社（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の技術的課題は、インビトロで分化した多能性幹細胞から、間葉系幹細胞に分化する前駆間葉系幹細胞を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために研究を重ねた結果、胚性幹細胞をレチノイン酸存在下で培養すると、前駆間葉系幹細胞が分化の早期段階で出現し、この細胞集団は、驚くべきことに、神経外胚葉マーカーであるＳｏｘ１を発現していることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた前駆間葉系幹細胞を提供する。この細胞はＳｏｘ１陽性であり、この細胞は間葉系幹細胞への分化能を有する。
【０００９】
本発明は、以下の段階を含む前駆間葉系幹細胞の調製方法を提供する：
ａ）多能性幹細胞を培養し分化させる段階、および
ｂ）Ｓｏｘ１を発現している細胞を選別し分離する段階。
本発明はまた、この方法で得られる前駆間葉系幹細胞も提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、多能性幹細胞からインビトロで分化させた前駆間葉系幹細胞を高度に精製・調製することが可能になる。このようにして得られた前駆間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞に分化し、間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞などの間葉系細胞へ分化し得る。従って、本発明の細胞は、薬物等の研究開発用細胞としての汎用性が高く、細胞移植治療において有用である。本発明はまた、インビトロで多能性幹細胞を分化させ、目的の間葉系細胞を得るにあたり、その効率を高めるのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、多能性幹細胞からインビトロにおいて分化させた前駆間葉系幹細胞であって、Ｓｏｘ１陽性である細胞を提供する。好ましくは、多能性幹細胞は哺乳動物由来である。また、好ましくは、多能性幹細胞は胚性幹細胞である。本発明では、Ｓｏｘ１に標識タンパク質が融合されていてもよい。標識タンパク質は、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。本発明の前駆間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞を得るために使用できる。
【００１２】
本発明はまた、以下の各段階を含む前駆間葉系幹細胞の調製方法を提供する： 
ａ）多能性幹細胞を培養し分化させる段階、および
ｂ）Ｓｏｘ１を発現している細胞を選別し分離する段階。
【００１３】
本発明の方法では、好ましくは、多能性幹細胞は哺乳動物由来である。また、好ましくは、多能性幹細胞は胚性幹細胞である。本発明の方法では、Ｓｏｘ１に標識タンパク質が融合されていてもよい。標識タンパク質は、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【００１４】
本発明の段階ａ）では、コラーゲンＩＶでコートした培養プレート上で多能性幹細胞を培養してもよい。また、段階ａ）において培地にレチノイン酸を添加することができ、その濃度は、好ましくは約１０−７Ｍである。
【００１５】
段階ｂ）は、段階ａ）を開始してから４日目に実行するのが好ましい。段階ｂ）は、ＦＡＣＳにより実行できる。
【００１６】
本発明の調製方法により得られる前駆間葉系幹細胞も本発明に含まれ、間葉系幹細胞を得るために使用できる。
【００１７】
本発明はまた、以下の各段階を含む間葉系幹細胞の調製方法を提供する：
ａ）上記の細胞または上記の方法で得られる細胞を培養する段階、
ｂ）ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、および
ｃ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階。
本方法で得られる間葉系幹細胞も、本発明の範囲内である。
【００１８】
あるいは、以下の各段階を含む間葉系幹細胞の調製方法を提供する：
ａ）多能性幹細胞を培養し分化させる段階、
ｂ）Ｓｏｘ１を発現している細胞を選別し分離する段階、
ｃ）ｂ）で分離した細胞を培養し、ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、および
ｄ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階。
本方法で得られる間葉系幹細胞も、本発明の範囲内である。
【００１９】
本明細書において、「間葉系細胞」とは、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、ストロマ細胞、腱細胞などの、間葉系組織を形成する細胞、それらに分化し得る間葉系幹細胞、およびその前駆間葉系幹細胞を意味する。胚発生中に生じる間葉系細胞、動物個体中にある間葉系細胞、インビトロまたはインビボで多能性幹細胞から分化して生じる間葉系細胞は、全て「間葉系細胞」の用語に包含される。
【００２０】
本明細書において、「間葉系幹細胞」とは、１またはそれ以上の間葉系細胞に分化する能力と自己複製能を有する間葉系細胞を意味する。インビトロで多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性である。間葉系幹細胞は、中胚葉系細胞と同様に、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、ストロマ細胞、腱細胞などに分化できる。
【００２１】
本明細書において、「前駆間葉系幹細胞」とは、１またはそれ以上の間葉系幹細胞に分化する能力と自己複製能を有する間葉系細胞を意味する。インビトロで多能性幹細胞から分化させた前駆間葉系幹細胞は、神経外胚葉マーカーであるＳｏｘ１を発現する。前駆間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性である間葉系幹細胞に分化し得る。
【００２２】
本発明者らは、以前に、インビトロで胚性幹細胞を分化させると、間葉系幹細胞が分化の早期段階で出現し、２種類の特別な細胞表面マーカー、即ち、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲα）および胎児肝キナーゼ１（ＦＬＫ１）を、ある一定の様式で発現していることを見出した（特願２００３−１５０６９０）。この知見に基づいて、インビトロで分化した多能性幹細胞から、早期の分化段階にある間葉系幹細胞を調製する方法と、そのような細胞を初めて開発した。その方法は、ａ）多能性幹細胞を培養し分化させる段階、ｂ）ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、およびｃ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階、を含むことを特徴とする。このようにして調製された間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの間葉系細胞へ分化し得る。これらの細胞は、薬物等の研究開発用細胞としての汎用性が高く、例えば、脂肪細胞は、糖尿病や高脂血症の処置用薬物の開発に有用である。また、これらの細胞は、ホルモンや生理活性物質等の産生細胞としても利用でき、脂肪組織を用いる乳房形成などの、形成外科治療や細胞移植治療への応用も可能である。
【００２３】
本発明は、上記発明の間葉系細胞よりも初期の分化段階にある、前駆間葉系幹細胞を提供する。この細胞は、上記のＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性である間葉系幹細胞に分化するので、多能性幹細胞の代わりに本発明の前駆間葉系幹細胞を使用して上記の発明を実施すると、間葉系幹細胞の収率が改善される。多能性幹細胞を培養して間葉系幹細胞を得る場合に、ＰＤＧＦＲαおよびＦＬＫ１の発現様式により細胞を選別する段階に先立ち、Ｓｏｘ１発現細胞を分離する段階を実行しても、間葉系幹細胞の収率が改善される。
【００２４】
本明細書において、「インビトロ」とは、反応や培養が胚を含む生体外で実施されることを意味する。インビトロで細胞を培養および／または分化させる際には、細胞の成育に適するあらゆる培地、試薬及び容器を使用し得る。また、本明細書における「インビボ」は、反応や培養が胚を含む生体内で実施されること、またはある現象が生体内で起こることを意味する。
【００２５】
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉および内胚葉系幹細胞から選ばれる少なくとも２つに分化する能力を有する自己複製可能な幹細胞を意味し、これには、胚性幹細胞（embryonic stem cell: 胚性幹細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell: ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell: ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cells: ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell: ＡＰＳ細胞）、骨髄幹細胞などが含まれる。ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジを含む哺乳類、鳥類、爬虫類などの多様な動物に由来する多能性幹細胞を使用し得るが、通常は哺乳類に由来するものである。
【００２６】
本明細書において、「胚性幹細胞」は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であって、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分化し得る細胞を意味する。本発明では、胞胚内の内部細胞塊より新たに樹立した胚性幹細胞を使用してもよく、あるいは既に樹立された細胞系統を使用してもよい。
【００２７】
Ｓｏｘ１は、ＳＯＸファミリーの転写因子であり、ＨＭＧｂｏｘと呼ばれるＤＮＡ結合モチーフを有することを特徴とする。このＨＭＧｂｏｘは、もともと、性決定転写因子であるＳｒｙに関連したモチーフとして同定された。ＳＯＸファミリーは、哺乳類の分化、例えば、性決定、神経、血液、血管等の分化に幅広く関与する。ＳＯＸ１は、神経分化に重要であるだけでなく、眼のレンズの発生でも大切な役割を果たしている（Pevny LH, Sockanathan S, Placzek M et al., A role for SOX 1 in neural determination. Development 125: 1967-1978, 1998 参照）。
【００２８】
ＰＤＧＦＲαは、膜貫通型受容体であり、細胞内部分にチロシンキナーゼ活性を有する（Soriano, P., Development 124; 2691-2700, 1997）。そのリガンドは血小板由来増殖因子である。ＰＤＧＦＲαを欠損したマウスは、体節および血管形成分化に異常をきたす。
ＦＬＫ１は、ＰＤＧＦＲαと同様に、細胞内部分にチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通型受容体である（Shalaby, F., Cell 89; 981-990, 1997）。そのリガンドは血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）である。ＦＬＫ１を欠損したマウスは、血液および血管内皮細胞の分化に異常をきたし、胎生致死である。
【００２９】
本明細書において、ある分子について「陽性である」は、細胞が当該分子を発現していることを意味し、「陰性である」は、発現していないことを意味する。細胞がある分子を発現しているか否かは、後述のＦＡＣＳ等により判定できる。
【００３０】
多能性幹細胞を未分化状態で維持するには、多能性幹細胞維持用培地を使用する。例えば、胚性幹細胞維持用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に、血清、ＬＩＦ、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール等を添加したものであり、組成の一例を挙げると、８５％ＫＮＯＣＫＯＵＴ Ｄ−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０−４Ｍ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０.１ｍＭ ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦである。後述するＳｏｘ１−ノックイン胚性幹細胞の場合、組成の一例は、９０％グラスゴー最小必須培地、１０％ＦＢＳ、１０−４Ｍ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０.１ｍＭ ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦである。
【００３１】
本発明による多能性幹細胞の培養方法における具体的な操作は、当該技術分野で常套の操作及び条件に従って行うことができる。例えば、中辻憲夫編：実験医学別冊・ポストゲノム時代の実験講座４「幹細胞・クローン研究プロトコール」、羊土社（２００１年）、Hogan, G. ら編：マウス胚の操作：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY(1994)、Robertson, E. J. 編：奇形ガンおよび胚性幹細胞、A Practical Approach，IRL Press Oxford，UK (1987) などの記載を参酌して適宜に決定することができる。
【００３２】
胚性幹細胞を例に代表的な継代操作と培養条件を説明すると、以下のとおりである。即ち、ディッシュをゼラチンでコートし、そのディッシュに１０,０００個／ｃｍ２の濃度で胚性幹細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養する。翌日１度培地を交換し、２日目でコンフレントになったら、リン酸緩衝塩水で１〜２回リンスし、その後十分量の０.２５％（Ｗ／Ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡを、細胞層を覆うように添加して約５分間放置する。トリプシン液を除去し、適量の胚性幹細胞培養用培地を添加し、ピペッティングによりディッシュから分離させる。この細胞懸濁液から、通常遠心分離により細胞を沈殿させる。上清を除去後、沈殿した細胞を胚性幹細胞培養用培地に再懸濁し、再び１０,０００個／ｃｍ２の濃度で、ゼラチンコートしたディッシュに播種し、培養する。
【００３３】
多能性幹細胞を分化させるためには、上記の多能性幹細胞維持用培地からＬＩＦを除いた、多能性幹細胞分化用培地で多能性幹細胞を培養する。組成の一例を挙げると、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンである。多能性幹細胞分化用培地で多能性幹細胞を培養すると、多能性幹細胞は未分化状態から脱して様々な細胞への分化を開始する。本明細書において培養日数に言及する場合は、多能性幹細胞分化用培地で培養した日数を意味する。
【００３４】
本発明の方法では、レチノイン酸存在下で多能性幹細胞を間葉系細胞に分化させる処理を施すことができる。例えば、胚性幹細胞の場合、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む胚性幹細胞分化用培地を使用して、コラーゲンＩＶコートディッシュ上で胚性幹細胞を培養し、培養２日目および３日目、または培養２日目から４日目まで、レチノイン酸を培養培地に添加し、インキュベートする。
【００３５】
多能性幹細胞維持用培地および分化用培地には、抗生物質などの培養に有用な他の物質を添加することができ、培地の各成分に代えて、同等の機能を有する代替物を使用してもよい。また、培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。
【００３６】
Ｓｏｘ１、ＰＤＧＦＲα、ＦＬＫ１などのマーカー遺伝子の発現を指標に細胞を選択する際には、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用できる。ＦＡＣＳは、通常、フローサイトメーター、レーザー発生装置、光学系、データ処理装置および細胞分取装置を備えている。ＦＡＣＳの機能は、蛍光標識細胞の自動分離および、蛍光強度のコンピューターによる分析である。ＦＡＣＳにより、特定物質で蛍光標識した細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射し、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布として表示し、特定のシグナル情報を発する細胞を分取することができる。ＦＡＣＳの装置は Becton-Dickinson 等から市販されており、当業者は、製造者の指示に従って操作できる。
【００３７】
Ｓｏｘ１を発現する細胞を容易に選別および分離するために、Ｓｏｘ１を標識タンパク質で置き換える方法や、Ｓｏｘ１に標識タンパク質を結合させた融合タンパク質で置き換える方法などを使用できる。標識タンパク質は、好ましくは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲＥＤ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）などの蛍光タンパク質、Ｔａｃ抗原などの表面抗原などである。あるいは蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）にて利用可能なあらゆるタンパク質を利用できる。本発明の細胞を移植治療に使用する場合、標識タンパク質は、被移植動物の生命活動に悪影響を与えないものであることが望ましい。置き換えは当業者に周知の遺伝子工学的手法、例えば相同組換え、遺伝子導入により行うことができる。置き換えたタンパク質を発現する遺伝子は、内在性Ｓｏｘ１遺伝子と同じ発現様式で発現するように、相同組換えの手法によりＳｏｘ１の遺伝子座に挿入することが望ましい。これらの遺伝子操作手法は、当業者に周知である（Gene Targeting, a practical approach, Edited by A. L. Joyner, OXFORD university press, 2000, p.1-p.99を参照されたい）。
【００３８】
本発明の前駆間葉系幹細胞を分化させると、ストロマ細胞様形態を有する間葉系幹細胞が出現する。ストロマ細胞の形態は線維芽細胞とよく似ているが、線維芽細胞よりも細胞質が大きく、やや丸みを帯びており、典型的には、図１Ｃ（左図）のような形態である（Kodama HA et al. J. Cell. Physiol. 1982; 112, 89-95 参照）。本発明の間葉系幹細胞の調製方法においては、ストロマ細胞様形態の細胞が細胞全体の１％以上、好ましくは５％以上、最も好ましくは１０％以上を占めた時点で、ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離することができる。未分化状態を維持しない通常の培養条件では、培養５日目あたりでストロマ細胞様形態の細胞が出現し始める。細胞の形態は、一般的な光学顕微鏡、位相差顕微鏡、位相差倒立顕微鏡などにより観察できる。
【００３９】
ＰＤＧＦＲαおよびＦＬＫ１に関して本発明で使用する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、ＦＡＣＳで使用する場合、モノクローナル抗体が好ましい。そのような抗体は、実施例に記載の方法を参照して当業者が作成することができるが、市販のものを使用してもよい。抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体（品番５５８７７４）および抗ＦＬＫ１モノクローナル抗体（品番５５５３０８）は BD Pharmingen から販売されており、容易に入手できる。
【００４０】
本発明における細胞のＳｏｘ１陽性細胞の選別方法について、標識タンパク質との融合タンパク質を使用する方法を詳述したが、Ｓｏｘ１のｍＲＮＡの存在を指標にして選別することも可能である。また、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の選別方法について、抗体を使用する方法を詳述したが、標識タンパク質との融合タンパク質を使用するか、またはこれらの分子のｍＲＮＡの存在を指標にして選別することも可能である。
【００４１】
以下、実施例により本発明の詳細を説明するが、これは本発明の１つの実施態様にすぎず、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４２】
胚性幹細胞から分化した前駆間葉系幹細胞の精製
材料と方法
１．胚性幹細胞の維持
ａ．材料
胚性幹細胞の維持には、表１の試薬および器具を使用した。
【表１】
2005304443.tif 000002
【００４３】
胚性幹細胞維持用培地の組成は、８５％ＫＮＯＣＫＯＵＴ Ｄ−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０−４Ｍ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０.１ｍＭ ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ、であった。Ｓｏｘ１ノックイン胚性幹細胞維持用培地の組成は、９０％Ｇ−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１０−４Ｍ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０.１ｍＭ ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ、であった。
【００４４】
胚性幹細胞は、マウス１２９ｓｖ系統由来のＣＣＥ胚性幹細胞を使用した（Robertson, E. et al. Nature 323, 445-448, 1986）。Ｓｏｘ１ノックイン細胞は、Austin Smith氏らにより、マウス１２９Ｏｌａ系統由来の胚性幹細胞であるＥ１４ｔｇ２ａを使用して作成された細胞を、譲り受けたものである（Aubert J, Stavridis MP, Tweedie S, et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Suppl 1: 11836-11841, 2003）。
【００４５】
ｂ．方法
６ｃｍディッシュをゼラチンでコートした。このディッシュに２ｘ１０５の胚性幹細胞を播種した。翌日、１度培地を交換した。２日目でコンフレントになったら、トリプシンを使用して細胞をディッシュから分離させ、再び２ｘ１０５の濃度で、ゼラチンコートされたディッシュに播種した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で行った。
【００４６】
２．胚性幹細胞の分化
ａ．材料
胚性幹細胞の分化には、表２の試薬および器具を使用した。
【表２】
2005304443.tif 000003
胚性幹細胞分化用培地の組成は、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、であった。
【００４７】
ｂ．遺伝子発現に対するＲＡの効果を調べるためのＲＴ−ＰＣＲ法
ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶコート１０ｃｍディッシュに１ｘ１０５のＣＣＥ胚性幹細胞を播種した。誘導開始２、３、４日目にＲＡを１０−７Ｍの濃度で添加する培養と添加しない培養を行い、それぞれ、誘導開始３、４、５日目に細胞を回収してＲＮＡを回収した。ＲＮＡの回収は、Invitrogen の Trizol (#15596-026) を用いて付属のプロトコールに従い行った。次に Invitrogen のｃＤＮＡ合成キット (#11904-018) を用いて付属のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成し、内胚葉、中胚葉、外胚用のマーカー遺伝子用の合成プライマーを用いて、通常のＲＴ−ＰＣＲ法にて遺伝子の発現を調べた。
【００４８】
ｃ．脂肪細胞への分化誘導
脂肪細胞への誘導は、２−ＭＥを含まない胚性幹細胞分化用培地に表３の試薬を添加することにより行った。コラーゲンＩＶコートディッシュで培養し、培地交換を３日に１回行った。
【表３】
2005304443.tif 000004
【００４９】
３．抗体の作製
当業者に周知の方法で各分子の細胞外部分を認識するモノクローナル抗体を作成した。具体的には、以下のように行った。マウスＰＤＧＦＲαの細胞外部分のｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅させ、このＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のＤＮＡ配列と結合させて融合ｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡをＣＯＳ１細胞に導入し、培養上清中の融合タンパク質を、Protein A カラムを用いて回収した。回収したタンパク質でラットを免疫した。免疫終了後、脾臓を回収し、脾臓細胞を骨髄腫細胞株Ｘ６３．Ａｇ８と融合させてハイブリドーマ細胞を作成した。目的の抗体を得るために、ハイブリドーマ細胞の培養上清中に含有される抗体の中から、融合蛋白およびＰＤＧＦＲαを発現しているＢａｌｂ／ｃ−３Ｔ３細胞に反応する抗体を選別し、そのハイブリドーマ細胞のクローンを同定した。この方法により、ＰＤＧＦＲαを特異的に認識するモノクロナール抗体を得た。
【００５０】
４．抗体染色と FACS Vantage または FacsAria による細胞の選別
ａ．試薬の作成
表４の試薬を使用した。
【表４】
2005304443.tif 000005
脱イオン水９００ｍｌに対して１００ｍｌの１０ｘハンクス緩衝液と１０ｇのＢＳＡ（最終濃度１％）を加えてよく撹拌した。ＢＳＡが溶解したら、０.２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌した。
【００５１】
ｂ．方法
ＧＦＰ−Ｓｏｘ１陽性細胞の純化のために、細胞を細胞分離緩衝液で分離した後、FACS Vantageを使用する場合は１０６細胞／ｍｌ、FacsAriaを使用する場合は１０７細胞／ｍｌで１％ＢＳＡハンクス緩衝液に溶解し、細胞選別に使用した。
ＰＤＧＦＲα陽性細胞の純化のために、抗ＰＤＧＦＲα抗体をビオチン（Molecular probe）で標識し、以下の染色に使用した。細胞を細胞分離緩衝液で分離した後、マウス血清を１０μｌ／細胞１０６個で加え、氷上で２０分間インキュベートした。次に１００ｎｇないし５００ｎｇの抗体を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。２０分後、１％ＢＳＡハンクス緩衝液で細胞を１回洗浄した。ストレプトアビジン−アロピコシアニン（Allopycocyanine）（ＡＰＣ；Becton-Dickinson）を含む５００μｌの１％ＢＳＡハンクス緩衝液に細胞を再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした。最後に１％ＢＳＡハンクス緩衝液で２回洗浄し、FACS Vantageを使用する場合は１０６細胞／ｍｌ、FacsAriaを使用する場合は１０７細胞／ｍｌで１％ＢＳＡハンクス緩衝液に溶解し、細胞選別に使用した。
【００５２】
FACS Vantage（Becton-Dickinson）およびFacsAria（Becton-Dickinson）の使用方法は、付属のガイドブックに準じた。FACS Vantageの場合、ノズルの振動の頻度は２６０００程度、レベルは３Ｖ、drop delay は約１２−１４で行った。
【００５３】
結果と考察
１、ＲＡは中胚葉マーカー、中内胚葉マーカーおよび内胚葉マーカーの発現を抑制する。
ＲＡの添加が胚性幹細胞の試験管内での分化、特に遺伝子発現に対する影響を調べるために、添加、無添加で分化誘導した胚性幹細胞からＲＮＡを抽出し、外胚葉マーカー、中胚葉マーカー、中内胚葉マーカーおよび内胚葉マーカーの発現を検討した（図１）。ＲＡの添加によって中胚葉マーカー、中内胚葉マーカーおよび内胚葉マーカーの発現が強く抑制される。一方、外胚葉マーカー、特に神経外胚葉マーカーであるＳｏｘ１は逆に強く誘導されることが判明した。
【００５４】
２、Ｓｏｘ１−ＧＦＰノックイン胚性幹細胞の樹立
Austin Smithらは、マウスＳｏｘ１遺伝子の開始コドンＡＴＧに合わせて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を挿入したコンストラクトを作成し、胚性幹細胞に導入して相同組換えクローン（Ｓｏｘ１−ＧＦＰノックイン胚性幹細胞）を得た。このクローン細胞をマウス胚盤胞に導入し、ＧＦＰ遺伝子の発現をマウスの発生において調べると、Ｓｏｘ１が発現する神経外胚葉と神経管、眼球での発現が観察された。従って、Ｓｏｘ１は、主に神経外胚葉のマーカーとして使用できる（Aubert J. et al., 前掲）。前節の実験において、ＲＡの添加が中胚葉マーカー、中内胚葉マーカーと内胚葉マーカーの発現を強く抑制し、Ｓｏｘ１の発現を誘導したことから、Ｓｏｘ１−ＧＦＰノックイン胚性幹細胞を使用し、同じくＲＡ添加により誘導される間葉系幹細胞がＳｏｘ１陽性細胞から分化するのか否かを解析した。
【００５５】
３、Ｓｏｘ１−ＧＦＰノックイン胚性幹細胞を用いた細胞起源の解析
本発明者らが確立した培養系では、Ｓｏｘ１陽性細胞は分化誘導を開始して４日目で最大となった（図２）。以前に、本発明者らは、この時点ではＰＤＧＦＲαの発現はまだ見られないことを明らかにした（特願２００３−１５０６９０）。そこで、フローサイトメーターを用いてＳｏｘ１−ＧＦＰの陽性細胞と陰性細胞を純化し、どちらの分画より脂肪細胞に分化し得る間葉系幹細胞が出現してくるかを解析した（図３）。Ｓｏｘ１−ＧＦＰの陰性細胞からは、ほとんど脂肪細胞が出現してこなかったのに対して、Ｓｏｘ１−ＧＦＰの陽性細胞から分化誘導した培養では、多数の脂肪細胞が観察された（図３）。
【００５６】
次に、Ｓｏｘ１−ＧＦＰの陽性細胞の中から、本発明者らが以前に分離したＰＤＧＦＲα陽性の間葉系幹細胞（特願２００３−１５０６９０）が分化し、その細胞が脂肪細胞に分化するのか否かを調べた（図４）。Ｓｏｘ１−ＧＦＰの発現を指標に細胞を分離した後、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性細胞、Ｓｏｘ１−ＧＦＰ陰性細胞の培養を引き続き行い、ＰＤＧＦＲαの発現を解析した。Ｓｏｘ１−ＧＦＰの陽性細胞からは、Ｓｏｘ１−ＧＦＰノックイン胚性幹細胞の分化誘導を始めて１０日目で、３０％の細胞がＰＤＧＦＲα陽性であった。これに対して、Ｓｏｘ１−ＧＦＰの陰性細胞では、少数のＰＤＧＦＲα陽性の出現が観察された。それぞれのＰＤＧＦＲα陽性および陰性細胞を再びフローサイトメーターを用いて純化し、脂肪細胞への分化能力を比較した。その結果、Ｓｏｘ１−ＧＦＰの陽性細胞から分化したＰＤＧＦＲα陽性細胞だけが、脂肪細胞へ分化することが明らかとなった。これらの結果を総合すると、本発明者らが以前に分離した間葉系幹細胞は、神経外胚葉のマーカーであるＳｏｘ１を発現する細胞から、分化してくることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】レチノイン酸添加、無添加で分化誘導した胚性幹細胞について、外胚葉マーカー、中胚葉マーカー、中内胚葉マーカーおよび内胚葉マーカーの発現パターンを示すＲＴ−ＰＣＲの結果である。
【図２】Ｓｏｘ１−ＧＦＰの発現量の推移を示すＦＡＣＳのデータである
【図３】フローサイトメーターを用いてＳｏｘ１−ＧＦＰの陽性細胞と陰性細胞を純化し、どちらの分画より脂肪細胞に分化し得る間葉系幹細胞が出現してくるかを解析した結果である。
【図４】Ｓｏｘ１−ＧＦＰの陽性細胞の中から、ＰＤＧＦＲα陽性細胞が分化し、その細胞が脂肪細胞に分化するのか否かを、フローサイトメーターを用いて調べた結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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