(57)【要約】【課題】  均一な磁性を有し、分散安定性に優れ、粒径分布の狭い磁性体内包粒子及びその製造方法、それを用いてなる免疫測定用粒子、並びに、それら磁性体内包粒子又は免疫測定用粒子を用いる免疫測定法を提供する。【解決手段】  有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなる磁性体内包粒子であって、前記磁性体は、分散した状態で粒子内部に包含されており、前記有機高分子物質を構成する炭素元素と前記磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差が０．３以下である磁性体内包粒子。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなる磁性体内包粒子であって、
前記磁性体は、分散した状態で粒子内部に包含されており、
前記有機高分子物質を構成する炭素元素と前記磁性体を構成する金属元素との構成比率の
絶対偏差が０．３以下であることを特徴とする磁性体内包粒子。
【請求項２】
磁性体は、磁性体内包粒子を形成する重合過程において粒子内部で金属イオンが酸化して
形成されたものであることを特徴とする請求項１記載の磁性体内包粒子。
【請求項３】
金属イオンは、鉄イオンであることを特徴とする請求項２記載の磁性体内包粒子。
【請求項４】
有機高分子物質は、アクリル系モノマーからなる重合体を主構成成分とすることを特徴と
する請求項１、２又は３記載の磁性体内包粒子。
【請求項５】
アクリル系モノマーは、グリシジル基を有するモノマーであることを特徴とする請求項４
記載の磁性体内包粒子。
【請求項６】
有機高分子物質は、グリシジル基を有するモノマーとスチレン系モノマーとからなる重合
体を主構成成分とすることを特徴とする請求項１、２又は３記載の磁性体内包粒子。
【請求項７】
有機高分子物質中のスチレン系モノマーに由来するモノマー単位の比率が、５〜９０重量
％であることを特徴とする請求項６記載の磁性体内包粒子。
【請求項８】
有機高分子物質を構成する重合体のモノマー成分として、更に、下記一般式（１）で表さ
れるポリエチレングリコール（メタ）アクリレート又は下記一般式（２）で表される化合
物を有することを特徴とする請求項４、５、６又は７記載の磁性体内包粒子。
ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ  （１）
式中、ＲはＨ又はＣＨ３を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。
【化１】
2005308485.tif 000013
式中、ＸはＨ又はＳＯ３−ＮＨ４＋を表し、ｎは３〜３０の整数を表す。
【請求項９】
有機高分子物質は、架橋されていることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７
又は８記載の磁性体内包粒子。
【請求項１０】
粒子表面に、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム
基、ジメチルアミノ基及びスルホン酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基
を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９記載の磁性体内
包粒子。
【請求項１１】
平均粒径が０．０５〜１μｍであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７
、８、９又は１０記載の磁性体内包粒子。
【請求項１２】
磁性体の含有量が０．１〜５０重量％であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０又は１１記載の磁性体内包粒子。
【請求項１３】
磁性体の平均粒径が２〜１０ｎｍであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１又は１２記載の磁性体内包粒子。
【請求項１４】
粒子表面に抗原又は抗体と共有結合可能な官能基を有するリンカーが結合していることを
特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３記載
の磁性体内包粒子。
【請求項１５】
抗原又は抗体と共有結合可能な官能基は、エポキシ基であることを特徴とする請求項１４
記載の磁性体内包粒子。
【請求項１６】
リンカーは、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルであることを特徴とする請求
項１４又は１５記載の磁性体内包粒子。
【請求項１７】
水系溶媒中において親水基を有さないモノマー及び／又は親水基を有するモノマーを重合
して粒子を形成する工程と、
前記粒子中に金属イオンを取り込みながら前記金属イオンを酸化して磁性体を形成する工
程とからなり、
前記粒子を形成する工程と前記磁性体を形成する工程とを同時に進行させることを特徴と
する磁性体内包粒子の製造方法。
【請求項１８】
親水基を有さないモノマーは、グリシジル基を有するアクリル系モノマー、又は、グリシ
ジル基を有するアクリル系モノマー及びスチレン系モノマーであることを特徴とする請求
項１７記載の磁性体内包粒子の製造方法。
【請求項１９】
粒子を形成するモノマーは、親水基を有さないモノマー及び親水基を有するモノマーから
なり、親水基を有するモノマーは、下記一般式（１）で表されるポリエチレングリコール
（メタ）アクリレート又は下記一般式（２）で表される化合物であることを特徴とする請
求項１７又は１８記載の磁性体内包粒子の製造方法。
ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ  （１）
式中、ＲはＨ又はＣＨ３を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。
【化２】
2005308485.tif 000014
式中、ＸはＨ又はＳＯ３−ＮＨ４＋を表し、ｎは３〜３０の整数を表す。
【請求項２０】
粒子を形成する工程において、共重合モノマーとして反応性乳化剤を添加することを特徴
とする請求項１７、１８又は１９記載の磁性体内包粒子の製造方法。
【請求項２１】
粒子を形成する工程において、重合開始剤を後添加することを特徴とする請求項１７、１
８、１９又は２０記載の磁性体内包粒子の製造方法。
【請求項２２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は
１６記載の磁性体内包粒子に、抗原又は抗体が吸着又は結合してなることを特徴とする免
疫測定用粒子。
【請求項２３】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は
１６記載の磁性体内包粒子又は請求項２２記載の免疫測定用粒子を用いることを特徴とす
る免疫測定法。
【請求項２４】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は
１６記載の磁性体内包粒子を標識として用いることを特徴とする免疫測定法。
【請求項２５】
免疫クロマト法を用いることを特徴とする請求項２３又は２４記載の免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、均一な磁性を有し、分散安定性に優れ、粒径分布の狭い磁性体内包粒子及びそ
の製造方法、それを用いてなる免疫測定用粒子、並びに、それら磁性体内包粒子又は免疫
測定用粒子を用いる免疫測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、磁性体含有高分子粒子の作製法として（１）作製済みの高分子粒子に鉄イオンを含
ませて磁性体を作製する方法、（２）モノマーから高分子粒子を重合する過程で作製済み
の磁性体粒子を含ませる方法（特許文献１参照）、（３）別々に作製した高分子粒子と磁
性体粒子とを複合化させる方法（特許文献２参照）が知られている。また、この他、（４
）磁性体粒子を高分子等で被覆する方法（特許文献３参照）がある。
【０００３】
（１）の方法は鉄イオンを高分子粒子に吸収させるため、表面に磁性体が露出し、磁性体
が酸化するという課題があった。また（２）の方法は磁性体粒子が均一に高分子粒子に取
り込まれないという課題や、粒径の制御が困難で粒径分布の広い物となるという課題があ
った。また、（３）の方法は高分子粒子が凝集するため、粒径の小さな粒子には使用でき
ないという課題がある。また、（４）の方法は、被覆が均一にできないため、浮遊性や分
散性が悪く、また、磁性体粒子表面の一部が露出する場合があった。
【０００４】
一方、微量免疫測定法としては、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光イム
ノアッセイ等が従来から知られており、既に実用化されている。これらの方法は、それぞ
れアイソトープ、酵素、蛍光物質等を標識として付加した抗原又は抗体を用い、これと特
異的に反応する抗体又は抗原の有無を検出する方法である。このような免疫測定法に際し
て、磁性体内包粒子は、効率よくかつ簡便にＢ／Ｆ分離を行うために用いられている。ま
た、Ｂ／Ｆ分離以外の使用（特許文献４参照）や、磁性体内包粒子自体を標識材料とする
免疫測定法（特許文献５、特許文献６、特許文献７参照）が開示されている。
【０００５】
磁性体内包粒子自体を標識とする免疫測定法において、その測定精度は磁性体内包粒子の
均質性、すなわち、粒子毎の磁性体含有量の均一性に依存する。しかしながら、市販され
ている磁性体内包粒子は、磁性体含有量にバラツキがあり、従来公知の磁性体内包粒子の
製造法では、磁性体含有量の均一性を制御することは困難である。
磁性体内包粒子を免疫測定法に使用する際、抗原や抗体を結合させる工程や被検出物質
と混合する工程において、磁性体内包粒子を緩衝液等に分散した分散液として取り扱う場
合が生じる。このため、磁性体内包粒子には、分散液の状態で粒子が自然沈降しないよう
な分散安定性の高いものであることが望ましい。しかしながら、市販されている磁性体内
包粒子は、分散液の状態で、しばらく放置するとその一部が沈降する等という取り扱い性
についての問題がある。
【０００６】
【特許文献１】特開平９−２０８７８８号公報
【特許文献２】特開平６−２３１９５７号公報
【特許文献３】特開平６−９２６４０号公報
【特許文献４】特開２０００−８８８５２号公報
【特許文献５】特開平６−１４８１８９号公報
【特許文献６】特開平７−２２５２３３号公報
【特許文献７】特表２００１−５２４６７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題に鑑み、均一な磁性を有し、分散安定性に優れ、粒径分布の狭い磁性
体内包粒子及びその製造方法、それを用いてなる免疫測定用粒子、並びに、それら磁性体
内包粒子又は免疫測定用粒子を用いる免疫測定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなる磁性体内包粒子で
あって、上記磁性体は、分散した状態で粒子内部に包含されており、上記有機高分子物質
を構成する炭素元素と上記磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差が０．３以
下である磁性体内包粒子である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明の磁性体内包粒子は、有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなる
ものである。
上記有機高分子物質は、粒子のコアを形成するための親水基を有さないモノマーと、水中
で安定に分散する粒子を形成しつつ粒子のシェルを形成するための親水基を有するモノマ
ーとからなる重合体を主構成成分とするものである。
【００１０】
＜親水基を有さないモノマー＞
上記親水基を有さないモノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−
メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン系モノマー
；塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類；アクリロニト
リルなどの不飽和ニトリル類；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレー
ト、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリ
ル（メタ）アクリレート、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチ
ル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシ
ル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、テトラヒドロフルフリル（
メタ）アクリレートなどのアクリル系モノマー等が挙げられる。これら親水基を有さない
モノマーは単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。
【００１１】
上記親水基を有さないモノマーとしては、好ましくは、メチル（メタ）アクリレート、エ
チル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）
アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、エチレングリコール（メタ）アクリレ
ート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アク
リレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、テ
トラヒドロフルフリル（メタ）アクリレートなどのアクリル系モノマーが用いられる。
【００１２】
上記親水基を有さないモノマーとしては、より好ましくは、重合による粒子形成と磁性体
形成とを同時進行するため、粒子重合中に高濃度に金属イオンを取り込む能力に優れたグ
リシジル基を有するアクリル系モノマーが用いられる。上記アクリル系モノマーの中でも
、特にグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）は鉄イオン及びマグネタイトとの親和性が高
いため特に好適に使用される。
【００１３】
また、上記グリシジル基を有するアクリル系モノマーとスチレン系モノマーとを併用する
ことも好ましい。
上記親水基を有さないモノマーとして、グリシジル基を有するアクリル系モノマーとスチ
レン系モノマーとを併用する場合、上記有機高分子物質中のスチレン系モノマーに由来す
るモノマー単位の比率は５〜９０重量％であることが好ましい。５重量％未満であると、
得られる粒子の水中での分散安定性が低くなり、重合中に自己凝集し易くなり、また、９
０重量％を超えると、磁性体の前駆体である金属イオンとの親和性が低くなり、粒子内に
形成する磁性体が少なくなる。
上記グリシジル基を有するアクリル系モノマーとスチレン系モノマーとを併用する際に、
更に、メチルメタクリレートを併用してもよい。
【００１４】
また用途によっては、上記親水基を有さないモノマーとして架橋性モノマーが使用され、
上記有機高分子物質が架橋されていてもよい。
上記架橋性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニ
ルナフタレン、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオール
ジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロ
ールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレ
ート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート及び
その異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性
モノマーは単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。
これらの架橋性モノマーのなかでも、エチレングリコールジ（メタ）アクリレートは鉄イ
オン及びマグネタイトとの親和性が高いため好適に使用される。
【００１５】
＜親水基を有するモノマー＞
上記親水基を有するモノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸
、フマル酸、マレイン酸などの重合性不飽和結合を有するカルボン酸；重合性不飽和結合
を有するリン酸エステル；重合性不飽和結合を有するスルホン酸エステル；ジメチルアミ
ノエチルメタクリレート４級塩、ジエチルアミノエチルメタクリレート４級塩などのアク
リロイル基を有するアミンの塩やビニルピリジンなどのビニル基を有する含窒素化合物の
塩のようにカチオン基を有するビニル系モノマー；２−ヒドロキシエチルメタクリレート
、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、メチロール
アクリルアミド、グリセロールメタクリレート（ＧＬＭ）などの非イオン性ビニル系モノ
マー等の一般に親水性モノマーと称されているものの他、親水基を有する反応性乳化剤等
が挙げられる。これら親水基を有するモノマーは、単独で用いてもよく、２種以上を併用
しても良い。
【００１６】
上記親水基を有する反応性乳化剤としては、例えば、下記一般式（２）〜（９）で表され
る反応性乳化剤類が挙げられる。
【００１７】
【化１】
2005308485.tif 000002
【００１８】
上記親水基を有するモノマーのなかでも、下記一般式（１）で表されるポリエチレングリ
コール（メタ）アクリレートや上記一般式（２）で表される反応性乳化剤は、水中で粒子
を安定に分散する能力が高く、磁性体の生成を妨げないので好適に使用される。
ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ  （１）
式中、ＲはＨ又はＣＨ３を表し、ｎは１〜２０の整数を表す。
上記一般式（２）中、ｎは３〜３０の整数を表し、好ましくは５〜２０の整数を表す。
【００１９】
本発明の磁性体内包粒子は磁性体含有量のバラツキが小さいことが好ましい。磁性体内包
粒子の磁性体含有量のバラツキを評価する方法としては、ＳＥＭ−ＥＤＸを用いる方法、
同期発光分析を利用する方法等が挙げられる。
上記ＳＥＭ−ＥＤＸは、ＳＥＭ観察を行っている微小領域のＥＤＸ分析（定性分析、定量
分析、マッピング、粒子解析等）を行う装置であり、磁性体含有量のバラツキを測定する
ことができる。
上記同期発光分析を利用する測定装置としては、例えば、パーティクルアナライザー（Ｄ
Ｐ−１０００、堀場製作所社製）が市販されている。パーティクルアナライザーは、アス
ピレータによりサンプリングした固体微粒子に、ヘリウムマイクロ波誘導プラズマの高い
励起エネルギーを照射して、固体微粒子１個ずつの同期発光を計測する仕組みで、固体微
粒子の幅広い用途元素の分析、及び、様々な成分の混在状態を解析することが可能である
。
【００２０】
磁性体内包粒子の磁性体含有量のバラツキは、有機高分子物質を構成する炭素元素と磁性
体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率の
バラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値（絶対偏差）で比較評価す
ることができる。上記偏差値は、その数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく
、即ち磁性体内包粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、即
ち磁性体内包粒子の均一性が低いことを示している。
【００２１】
本発明の磁性体内包粒子は、有機高分子物質を構成する炭素元素と磁性体を構成する金属
元素との構成比率の絶対偏差が０．３以下である。０．３を超えると、免疫測定法に利用
した場合、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化し、得られる測定データの信頼
性が低くなる。好ましくは０．２７以下であり、より好ましくは０．２５以下であり、更
に好ましくは０．２０以下である。
【００２２】
上記磁性体は、磁性体内包粒子を形成する重合過程において粒子内部で金属イオンが酸化
して形成したものであるのが好ましい。
＜金属イオン＞
上記金属イオンは、磁性体を形成するものであれば特に限定されないが、好ましくは、鉄
イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン等であり、より好ましくは鉄イオンである。磁
性体であるマグネタイトは塩化第２鉄を酸化剤等で酸化して得られる。重合開始剤により
、上述のモノマーの重合を開始するとともに２価の鉄イオンの酸化（マグネタイト化）を
行うことにより磁性体（マグネタイト）内包粒子が調製される。
【００２３】
上記磁性体の平均粒径は１〜３０ｎｍである。１ｎｍ未満であると、磁性体の磁性応答特
性が減少し、即ち磁性体内包粒子の磁性応答特性が減少し、免疫測定に使用した際の測定
感度が低下する。また、３０ｎｍを超えると、粒子内での分散性が低下する。好ましくは
、２〜２０ｎｍであり、より好ましくは、２〜１０ｎｍである。
【００２４】
本発明の磁性体内包粒子において、上記磁性体は分散した状態で磁性体内包粒子内部に包
含されている。即ち、本発明の磁性体内包粒子においては、磁性体が粒子表面に露出する
ことなく、粒子内部に分散した状態で存在している。
【００２５】
本発明の磁性体内包粒子の磁性体含有量は、０．１〜５０重量％の範囲で調整するのが好
ましい。０．１重量％未満であると、磁性体内包粒子の磁性応答特性が減少し、免疫測定
に使用した際の測定感度が低下する。また、５０重量％を超えると、粒子の重合操作性が
低下し、粒子重合中に金属イオンを取り込み難くなる。より好ましくは０．１〜４０重量
％であり、更に好ましくは１〜３０重量％である。
【００２６】
また、本発明の磁性体内包粒子は、必要に応じて、粒子表面にカルボキシル基、水酸基、
エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、スルホン酸基等
の官能基を有していてもよい。これらの官能基を介して抗原や抗体と共有結合を行うこと
ができる。
【００２７】
上記官能基は、各々の官能基を有するモノマーを重合用モノマー混合物に予め配合するか
、又は、重合途中に添加することにより磁性体内包粒子の表面に導入することができる。
上記官能基を有するモノマーとしては、例えば、カルボキシル基を有するモノマーとして
は（メタ）アクリル酸等が挙げられ、水酸基を有するモノマーとしては２−ヒドロキシエ
チル（メタ）アクリレート等が挙げられ、エポキシ基を有するモノマーとしてはグリシジ
ル（メタ）アクリレート等が挙げられ、トリエチルアンモニウム基を有するモノマーとし
てはトリエチルアンモニウム（メタ）アクリレート等が挙げられ、ジメチルアミノ基を有
するモノマーとしてはジメチルアミノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００２８】
本発明の磁性体内包粒子は、必要に応じて粒子表面に抗原又は抗体と共有結合可能な官能
基を有するリンカーが結合していてもよい。
＜リンカー＞
上記リンカーとは、磁性体内包粒子を免疫測定に使用した際、有機高分子物質からなる粒
子と抗原、抗体等の化合物との間に存在することになる化学物質である。上記リンカーは
、立体障害が起こらないような長さで、かつ、非特異的吸着が生じにくい化合物であり、
有機高分子物質からなる粒子及び抗原、抗体等の化合物と結合する前は、その分子末端に
、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、トシル基、チオール基等の抗原又は
抗体と共有結合可能な官能基を有していることが好ましい。本発明におけるリンカーとし
ては、粒子表面のグリシジル基含有モノマー由来のエポキシ基、又はエポキシ基の開環に
より生じる水酸基、アミノ基等と抗原、抗体等を適当な距離を置いて結合し得るものであ
れば特に限定されない。好ましくは、エポキシ基を複数末端に有する化合物、例えば、ポ
リエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエ
ーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグ
リシジルエーテル等が挙げられる。より好ましくは、ポリエチレングリコールジグリシジ
ルエーテルが挙げられる。
このようなリンカーを磁性体内包粒子の粒子表面に導入することにより、例えば、磁性体
内包粒子に結合する抗原、抗体、試薬等の反応性を上げることが可能となり、即ち感度良
く精密な測定が可能となり、また、磁性体内包粒子の粒子表面がタンパク質に対して非吸
着性のものであっても、リンカーがタンパク質との結合性を有するので、抗原又は抗体を
磁性体内包粒子に確実に結合させることが可能となる。
【００２９】
本発明の磁性体内包粒子の平均粒径は、その重合条件により０．０５〜１μｍの範囲で調
整するのが好ましい。０．０５μｍ未満であると、凝集しやすくなり、分散安定性が低下
し、１μｍを超えると、例えば、磁性体内包粒子を懸濁液中で使用する場合は、磁性体内
包粒子が沈殿し易くなり、また、免疫クロマト法のように磁性体内包粒子を多孔性担体中
で使用する場合は、多孔性担体中で磁性体内包粒子が移動しにくくなるなど、試薬として
の取り扱い性が低下する。より好ましくは、０．０６〜０．８μｍであり、更に好ましく
は、０．０７〜０．５μｍである。
【００３０】
本発明の磁性体内包粒子は、水系溶媒中において上記親水基を有さないモノマー及び／又
は上記親水基を有するモノマーを重合して粒子を形成する工程と、上記粒子中に金属イオ
ンを取り込みながら上記金属イオンを酸化して磁性体を形成する工程とからなり、上記粒
子を形成する工程と上記磁性体を形成する工程とを同時に進行させる方法により製造され
る。
【００３１】
水系溶媒中において親水基を有さないモノマー及び／又は親水基を有するモノマーを重合
して粒子を形成する工程においては、重合開始剤が用いられる。
＜重合開始剤＞
上記重合開始剤としては特に限定されず、例えば、水溶性の有機アゾ化合物、無機過酸化
物、有機過酸化物等が挙げられる。
上記重合開始剤の好適な例としては、過硫酸カリウム（以下「ＫＰＳ」と記す；重合温度
７０℃）、アゾビスアミジノプロパン塩酸塩（重合温度７０℃）、２，２−アゾビス［２
−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジハイドロクロライド（重合温度６０℃）
、過硫酸アンモニウム（重合温度７０℃）等が挙げられる。このうち過酸化物系重合開始
剤であるＫＰＳや過硫酸アンモニウムは、重合開始とともに２価の鉄イオンの酸化に寄与
することが期待され、ＫＰＳや過硫酸アンモニウムを用いた場合は、モノマーと鉄イオン
による重合とマグネタイト生成とが同時に進行することが想定される。アゾビスアミジノ
プロパン塩酸塩及び２，２−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］
ジハイドロクロライドは酸化力が弱く、２価の鉄イオンの緩やかな酸化反応に関与する重
合開始剤となる。なお、アゾビスアミジノプロパン塩酸塩としては、商品名「Ｖ−５０」
（和光純薬工業社製）が、２，２−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロ
パン］ジハイドロクロライドとしては、商品名「ＶＡ−０４４」（和光純薬工業社製）が
市販されている。
上記重合開始剤は、Ｆｅ２＋の酸化により消費されたり、Ｆｅ３＋によってラジカル活性
を失う場合があるため、粒子成長を促す目的で、粒子成長過程に後添加することが有効で
ある。この場合、新たな２次粒子は形成されず、粒子表面がポリマーで被覆される。
【００３２】
＜ｐＨ調整剤＞
本発明において、重合と同時に磁性体を作製するためには、重合系内のｐＨは塩基性に調
整されるのが好ましい。上記重合開始剤としてＫＰＳや過硫酸アンモニウムを用いた系で
は、水中での分散安定性がよく粒径分布の狭い単分散粒子が得られるというメリットがあ
るが、酸化力の制御ができず重合系内が酸性になるために磁石への引き寄せられ方の弱い
粒子になるというデメリットがある。一方、上記重合開始剤として酸化力を持たない２，
２−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジハイドロクロライドを
用いた系では、重合系内のｐＨがほぼ中性であるというメリットがある。
重合系内のｐＨを弱塩基性に保つには、一般的な塩基を使用することができる。好ましく
はＮＨ４ＯＨがｐＨ調整剤として使用される。上記ｐＨ調整剤は、必要に応じて数回添加
することができる。
【００３３】
＜重合方法＞
本発明の磁性体内包粒子は、懸濁重合、分散重合、乳化重合、ソープフリー乳化重合等の
粒子重合法により製造できるが、最終的に得られる磁性体内包粒子のＣｖ値は５％以下で
あることが好ましいので、粒径分布の制御に優れたソープフリー乳化重合により好適に製
造される。
【００３４】
以下、ソープフリー乳化重合による磁性体内包粒子の作製方法を例示するが、この方法に
限定されるものではない。
代表的な重合組成は、
親水基を有するモノマー及び親水基を有さないモノマーからなるモノマー組成物：３ｇ
Ｈ２Ｏ：１００ｇ
からなる。四つ口フラスコに上記モノマー組成物及び水を秤量する。それぞれの口には攪
拌棒、還流冷却管を取り付ける。次に、系を恒温槽に入れ、攪拌しながら系内を窒素置換
する。恒温槽は、添加する重合開始剤の重合温度に調整するのが好ましく、例えば、重合
開始剤としてＫＰＳ、アゾビスアミジノプロパン塩酸塩又は過硫酸アンモニウムを用いる
場合は７０℃とするのが好ましく、重合開始剤として２，２−アゾビス［２−（２−イミ
ダゾリン−２−イル）プロパン］ジハイドロクロライドを用いる場合は５０〜６０℃とす
るのが好ましい。その後、水に溶かした重合開始剤を注射筒で系内に注入する。この時点
を重合開始とし、所定時間後に注射筒を用いて磁性源となるＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏの水溶
液を注入する。ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏは重合開始剤の１／３〜４倍モルを水５ｇに溶かし
たものを使用する。即ち、重合開始剤により上述のモノマーの重合を開始するとともに２
価の鉄イオンの酸化（マグネタイト化）を行うことにより粒子を製造する。
重合は開始から２時間〜２４時間行うことが好ましい。適度な酸化力を得るために、重合
途中にＮＨ４ＯＨを加えてもよく、更に、重合による粒子の成長を促すために、重合途中
に重合開始剤を加えてもよい。この様にして磁性体を分散状態で含有する有機高分子物質
からなる粒子を得ることができる。
【００３５】
上記モノマー組成物には、共重合モノマーとして反応性乳化剤を添加してもよい。
＜反応性乳化剤＞
上記反応性乳化剤としては、例えば、下記一般式（２）〜（１０）で表される反応性乳化
剤類が挙げられる。
【００３６】
【化２】
2005308485.tif 000003
【００３７】
これら反応性乳化剤は、単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。
作製した粒子は、残存モノマー、重合開始剤、未反応の鉄イオン等を取り除くために遠心
分離・再分散を蒸留水で繰り返し行い精製する。遠心分離を行った後、上澄みをデカンテ
ーションにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行う。精製後、得られた磁
性体内包粒子は、ガラス製バイアルに移し、ふた・パラフィルムで密閉・保存する。
【００３８】
本発明の磁性体内包粒子の粒子表面へのリンカーの導入は、例えば、リンカー未導入の磁
性体内包粒子をアルカリ性水溶液中に分散し、続いて、ポリエチレングリコールジグリシ
ジルエーテル等のリンカーとなる化学物質を加えて、２４時間程度混合することによりな
し得る。
【００３９】
上述のようにして得られる本発明の磁性体内包粒子は、粒度分布が狭く、かつ、磁性体含
有量のバラツキが小さいため、極めて均質である。このため、本発明の磁性体内包粒子は
分散安定性が高く取り扱い性に優れている。また、本発明の磁性体内包粒子は、平均粒径
が比較的小さいためコロイド安定性がよい。また、本発明の磁性体内包粒子は、内包する
磁性体が微小なサイズで分散して含有されているため、磁化された際にも残留磁気がなく
、それに起因する自己凝集による沈降も生じない。
【００４０】
本発明の磁性体内包粒子に抗原又は抗体を吸着又は結合させることにより免疫測定用粒子
を得ることができる。抗体又は抗原を磁性体内包粒子に吸着又は結合させる方法としては
、物理吸着法やカルボジイミドを用いた化学結合法等の公知の方法を使用することができ
る。本発明の磁性体内包粒子の粒子表面にエポキシ基を有するリンカーが導入されている
場合は、リンカーを介して抗原又は抗体のアミノ基やチオール基等と化学結合させて、免
疫測定用粒子を作製することができる。このような本発明の磁性体内包粒子に抗原又は抗
体が結合してなる免疫測定用粒子もまた、本発明の１つである。
【００４１】
本発明の磁性体内包粒子や免疫測定用粒子は免疫測定法に用いることができる。本発明の
磁性体内包粒子や免疫測定用粒子を用いる免疫測定法もまた、本発明の１つである。
本発明の免疫測定法としては、磁性体内包粒子を坦体として用いたラジオイムノアッセイ
、酵素イムノアッセイ等の公知の方法が挙げられ、サンドイッチ法や競合法により、目的
とする抗原又は抗体を測定することができる。また、上記方法の標識物質であるアイソト
ープ、酵素等の代わりに、磁性体内包粒子を標識として用いることができる。本発明の磁
性体内包粒子は磁性体を均一に分散含有する粒径分布の狭い粒子であるため、免疫測定法
において標識として用いることにより感度よく精密な測定を行うことができる。
【００４２】
本発明の磁性体内包粒子を標識として用いる免疫測定法の具体例としては、従来、蛍光物
質、着色粒子、金属コロイド等が標識として利用されてきた免疫測定法が挙げられる。な
かでも、近年、簡便かつ迅速に被検出物質を検出する手法としてよく利用されている免疫
クロマト法が好適である。上記免疫クロマト法は、少なくとも２種類の抗体を利用したサ
ンドイッチ法を利用している。上記サンドイッチ法においては、一方の抗体は液相中で移
動可能な状態で標識され、他方の抗体はクロマト担体に永久的に固定化されている。上記
サンドイッチ法の試薬に試料を添加するとまず標識された抗体と被検出物質とが反応し、
その後、標識抗体と被検出物質との複合体がクロマト担体中を移動し、クロマト担体に抗
体が固定化された固定化部に来るとそこで固定化された抗体に補足される。
【００４３】
通常、免疫クロマト法に用いられるクロマト担体は、ポアサイズが５〜２０μｍであり、
現在、一般的なサンドイッチ法は、標識として金属コロイドや着色粒子が用いられ、固定
化部の着色（標識物の捕捉状態）を目視観察する定性検査として用いられている。しかし
ながら、市販されている磁性体内包粒子は、クロマト担体中に滞留したり、展開させる側
のクロマト先端部位付近に不均一に残留したりする等の問題点を有し、金属コロイドや着
色粒子に比べクロマト展開性が大きく劣るため、免疫クロマト法への適性がない。
【００４４】
これに対して、本発明の磁性体内包粒子は、ポアサイズに比べ充分に小さな粒径であるた
め、毛細管現象でクロマト担体中を展開（移動）することができる。即ち、本発明の磁性
体内包粒子は、平均的なポアサイズ（１０〜１２μｍ）のクロマト担体に展開した場合、
上述のような不均一な滞留が認められず、クロマト展開性が非常に優れている。これは、
本発明の磁性体内包粒子は、１）粒度分布が狭く、２）磁性体含有量が均一であり、３）
残留磁気による自己凝集が生じないため、と推察される。すなわち、本発明の磁性体内包
粒子は、従来の磁性体内包粒子と異なり、免疫クロマト法への適性を有している。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によれば、親水基を有さないモノマーと親水基を有するモノマーとを共重合して粒
子を形成する反応と、粒子内に金属イオンを取り込ませながら金属イオンを変性して磁性
体を形成する反応とを同時に行うことにより、均一な磁性を有し、かつ、粒径分布の狭い
磁性体内包粒子を得ることができる。本発明の磁性体内包粒子に抗原又は抗体を吸着又は
結合させることにより本発明の免疫測定用粒子を得ることができる。また、本発明の磁性
体内包粒子又は免疫測定用粒子を用いて免疫測定法を行うことにより、感度良く精密な測
定が可能になる。更に、本発明の磁性体内包粒子を標識として免疫測定法を行うことによ
り、感度よく精密な測定が可能になる。
また、本発明の磁性体内包粒子にリンカーが導入されている場合には、例えば、磁性体内
包粒子に結合する抗原、抗体、試薬等の反応性を上げることが可能となり、即ち感度良く
精密な測定が可能となり、本発明の磁性体内包粒子の粒子表面がタンパク質に対して非吸
着性のものであっても、リンカーがタンパク質との結合性を有するので、抗原又は抗体を
磁性体内包粒子に確実に結合させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。
【００４７】
（実施例１〜７）
２００ｍＬの四つ口フラスコに表１に示す各種モノマー及び水９０ｇを秤量した。それぞ
れの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を７０℃の
恒温槽に入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら系内を３０分間窒素置換した。その後、水に
溶かした重合開始剤であるＫＰＳ  ０．０６ｇを１０ｇの水に溶解し注射筒で系内に注入
した。この時点を重合開始時とし、適度な酸化力を得るために、重合途中にＮＨ４ＯＨ水
溶液（ＮＨ４ＯＨ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）を加えた。また、重合開始から２分後
に注射筒を用いてＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ水溶液（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１６５ｇを
水５ｇに溶解）を注入した。重合は重合開始から２０時間行った。
作製した粒子は、遠心分離・再分散を蒸留水で４回繰り返し行うことで精製した。この際
、遠心分離は２０℃、１３５００ｒｐｍで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカン
テーションにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を
得た。
【００４８】
【表１】
2005308485.tif 000004
【００４９】
表中の記載は以下のとおりである。
ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート
ＥＧＤＭ：エチレングリコールジメタクリレート
ＡＡｍ：アクリルアミド
ＰＥ−９０：ポリエチレングリコールメタクリレート（ｎ＝２）
ＰＥ−３５０：ポリエチレングリコールメタクリレート（ｎ＝８）
ＮＥ−２０：
【００５０】
【化３】
2005308485.tif 000005
【００５１】
式中、ＸはＨを表す。
【００５２】
ＳＥ−２０：
【００５３】
【化４】
2005308485.tif 000006
【００５４】
式中、ＸはＳＯ４ＮＨ４を表す。
【００５５】
得られた磁性体内包粒子分散液について、目視で粒子の分散状態を観察した。また、精製
した磁性体内包粒子を水で希釈し、金属メッシュで支持したコロジオン膜上に沈着固定し
て、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、粒子の形態を観察した。
【００５６】
実施例１で得られた磁性体内包粒子は、一部凝集塊が認められ、時間が経つにつれて磁性
体内包粒子が沈降する分散安定性のやや低いものであったため、超音波処理により再分散
した。一方、親水基を有するモノマーとしてポリエチレングリコールメタクリレートを用
いた実施例２〜５、及び、反応性乳化剤を用いた実施例６、７は、いずれも凝集塊が認め
られず、分散安定性の高い磁性体内包粒子が得られた。特に、反応性乳化剤を用いた実施
例６、７で得られた磁性体内包粒子は、粒子サイズが小さく、分散安定性が優れているこ
とが認められた。また、実施例１〜７で得られた磁性体内包粒子は、いずれも磁性体内包
粒子内部に磁性体を分散状態で含み、粒子表面がきれいな輪郭であることが観察された。
図１に実施例２の磁性体内包粒子のＴＥＭ写真（平均粒径；磁性体内包粒子０．２１μｍ
、磁性体５ｎｍ）を示した。また、実施例１〜７における磁性体内包粒子の磁性体の平均
粒径を表２に示した。
【００５７】
【表２】
2005308485.tif 000007
【００５８】
更に、実施例１〜７で作製した磁性体内包粒子が、磁石へ引き寄せられることを確認する
ために、１．５ｍＬのマイクロチューブに磁性体内包粒子の分散液を少量取り、蒸留水で
適当に希釈して磁石つきマイクロチューブ立て（ＤＹＮＡＬ社製、ＭＰＣ（登録商標）−
Ｍ）にチューブを立てて、分散している磁性体内包粒子が磁石に引き寄せられることを目
視により確認した。特に、親水基を有するモノマーとしてポリエチレングリコールメタク
リレートを用いた実施例２〜５は、他の実施例１、６、７に比べ磁力が大きいことがうか
がえた。
【００５９】
（実施例８）
２００ｍＬの四つ口フラスコに下記に示す各種モノマー及び水を秤量した。
ＧＭＡ／ＥＧＤＭ／ＡＡｍ／Ｈ２Ｏ＝２．８３５／０．０１５／０．１５／９０（単位：
ｇ）
それぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を７
０℃の恒温槽に入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら系内を３０分間窒素置換した。その後
、水に溶かした重合開始剤であるＫＰＳ  ０．０６ｇを１０ｇの水に溶解し注射筒で系内
に注入した。この時点を重合開始時とし、重合開始１分後に適度な酸化力を得るためＮＨ
４ＯＨ水溶液（ＮＨ４ＯＨ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）を加えた。また、重合開始か
ら２分後に注射筒を用いてＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ水溶液（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１
６５ｇを水５ｇに溶解）を注入した。重合は重合開始から２時間行った。
【００６０】
作製した粒子は、遠心分離・再分散を蒸留水で４回繰り返し行うことで精製した。この際
、遠心分離は２０℃、１３５００ｒｐｍで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカン
テーションにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を
得た。
【００６１】
（実施例９）
重合開始後、下記物質の添加を以下の所定時間に変更したこと、重合時間を重合開始から
３時間としたこと以外は実施例８と同様に磁性体内包粒子を得た。
ＮＨ４ＯＨ水溶液（ＮＨ４ＯＨ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）：重合開始３０分後
ＫＰＳ（ＫＰＳ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）：重合開始６０分後
【００６２】
（実施例１０）
重合開始後、下記物質の添加を以下の所定時間に変更したこと、ＧＭＡをさらに後添加し
たこと、重合時間を重合開始から３時間としたこと以外は実施例８と同様に磁性体内包粒
子を得た。
ＫＰＳ（ＫＰＳ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）：重合開始６０分後
ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ水溶液（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）：
重合開始６０分後
ＧＭＡ  ０．５ｇ：重合開始１２０分後（尚、重合開始前には実施例８と同様にＧＭＡ  
２．８３５ｇを四つ口フラスコに添加した）
ＮＨ４ＯＨ水溶液（ＮＨ４ＯＨ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）：重合開始１２０分後
【００６３】
（実施例１１）
重合開始後、下記物質の添加を以下の所定時間に変更したこと、重合時間を重合開始から
４時間としたこと以外は実施例８と同様に磁性体内包粒子を得た。
重合開始１分後  ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ＝０．１６５／５（ｇ）
ＮＨ４ＯＨ水溶液（ＮＨ４ＯＨ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）：重合開始１分後
ＫＰＳ（ＫＰＳ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）：重合開始１２０分後
【００６４】
実施例８〜１１で得られた磁性体内包粒子に対し、実施例１と同様にしてＴＥＭによる磁
性体内包粒子の形態観察を行なった。
実施例９、１０は、いずれも、実施例８よりも多くの磁性体を含み、粒径が増大している
ことが認められた。また、実施例１１では、内部に実施例９、１０と同程度の磁性体を含
み、粒子表面がきれいな輪郭であることが観察された。
これまでの実験より、粒子成長の速い段階でＮＨ４ＯＨを加えることは、成長を阻害する
要因になっていることが推測された。一方、重合開始剤の後添加は、重合率がほぼ１００
％になり、また、２次粒子が形成されず粒子表面がポリマーで覆われていることが観察さ
れ、有効な手段であることが確認された。実施例８〜１１における磁性体内包粒子の磁性
体の平均粒径を表３に示した。
【００６５】
【表３】
2005308485.tif 000008
【００６６】
（実施例１２）
実施例２で得られた磁性体内包粒子１．０ｇを１０％アンモニア水５０ｍＬに投入し、７
０℃で２０時間攪拌した。次いで、イオン交換水を用いて遠心洗浄を３回行い、５０ｍＬ
のイオン交換水に分散させた。続いて、エチレングリコールジグリシジルエーテル３０ｇ
を添加混合し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを１１に調整した後、室温で２４時
間攪拌した。反応後、イオン交換水を用いて遠心洗浄を３回行い、エポキシ基を有するリ
ンカーが結合した磁性体内包粒子を得た。
【００６７】
（実施例１３）
２００ｍＬの四つ口フラスコにスチレン３．０ｇ、グリシジルメタクリレート３．０ｇ、
エチレングリコールジメタクリレート０．０３ｇ、ポリエチレングリコールメタクリレー
ト０．３ｇ及び水２００ｇを秤量した。それぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却
管、セラムラバーを取り付けた。系を７０℃の恒温槽に入れ、２００ｒｐｍで攪拌しなが
ら系内を３０分間窒素置換した。その後、水に溶かした重合開始剤であるＫＰＳ  ０．１
ｇを２０ｇの水に溶解し注射筒で系内に注入した。この時点を重合開始時とし、２分後に
注射筒を用いてＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ水溶液（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．２ｇを水２０
ｍＬに溶解）を注入した。適度な酸化力を得るために、重合途中にＮＨ４ＯＨ  ０．４ｇ
を加えた。重合は重合開始から２０時間行った。
【００６８】
作製した粒子は、遠心分離・再分散を蒸留水で４回繰り返し行うことで精製した。この際
、遠心分離は２０℃、１３５００ｒｐｍで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカン
テーションにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を
得た。
【００６９】
（実施例１４）
スチレン２．０ｇ、グリシジルメタクリレート４．０ｇに変更したこと以外は実施例１３
と同様に磁性体内包粒子を作製した。
【００７０】
（実施例１５）
スチレン４．０ｇ、グリシジルメタクリレート１．０ｇに変更したこと以外は実施例１３
と同様に磁性体内包粒子を作製した。
【００７１】
（実施例１６）
実施例１３で作製した磁性体内包粒子１．０ｇを１０％アンモニア水５０ｍＬに投入し、
７０℃で２０時間攪拌した。次いで、イオン交換水を用いて遠心洗浄を３回行ない、５０
ｍＬのイオン交換水に分散させた。続いて、エチレングリコールジグリシジルエーテル３
０ｇを添加混合し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを１１に調整した後、室温で２
４時間攪拌した。反応後、イオン交換水を用いて遠心洗浄を３回行ない、エポキシ基を有
するリンカーが結合した磁性体内包粒子を得た。
【００７２】
（実施例１７及び１８）
２０００ｍＬの四つ口フラスコに表４に示す各種モノマー及び水８００ｇを秤量した。そ
れぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を７０
℃の恒温槽に入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら系内を３０分間窒素置換した。その後、
水に溶かした重合開始剤である過硫酸アンモニウム０．２ｇを１０ｇの水に溶解し注射筒
で系内に注入した。この時点を重合開始時とし、適度な酸化力を得るために、重合途中に
ＮＨ４ＯＨ水溶液（ＮＨ４ＯＨ  ０．５ｇを水１０ｇに溶解）を加えた。また、重合開始
から２分後に注射筒を用いてＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ水溶液（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．
３ｇを水２０ｇに溶解）を注入した。重合は重合開始から２０時間行った。
作製した粒子は、遠心分離・再分散を蒸留水で４回繰り返し行うことで精製した。この際
、遠心分離は２０℃、１３５００ｒｐｍで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカン
テーションにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を
得た。
【００７３】
【表４】
2005308485.tif 000009
【００７４】
表中の記載は以下のとおりである。
ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート
ＥＧＤＭ：エチレングリコールジメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
ＨＳ−１０：
【００７５】
【化５】
2005308485.tif 000010
【００７６】
式中、ＸはＳＯ３−ＮＨ４＋を表し、ｎは１０を表す。
【００７７】
（実施例１９）
実施例１７で得られた磁性体内包粒子１．０ｇを１０％アンモニア水５０ｍＬに投入し、
７０℃で２０時間攪拌した。次いで、イオン交換水を用いて遠心洗浄を３回行い、５０ｍ
Ｌのイオン交換水に分散させた。続いて、エチレングリコールジグリシジルエーテル３０
ｇを添加混合し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを１１に調整した後、室温で２４
時間攪拌した。反応後、イオン交換水を用いて遠心洗浄を３回行い、エポキシ基を有する
リンカーが結合した磁性体内包粒子を得た。
【００７８】
（実施例２０）
実施例２で得られた磁性体内包粒子から免疫測定用粒子を作製した。
実施例２で得られた磁性体内包粒子３０ｍｇにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ
７．５）６ｍＬを加え、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣
に、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにリン酸緩
衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液を１ｍＬ加え、室温にて２０時
間撹拌混和した。その後、未反応の抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を除去するために１
５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行い、更に、得られた沈渣をリン酸緩衝液（１０
０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）６ｍＬに懸濁させ、再度１５０００ｒｐｍにて２０分間遠
心分離を行った。その後、得られた沈渣を、牛血清アルブミンを１重量％の濃度になるよ
うにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液６ｍＬに懸濁させ
、室温で１時間撹拌してブロッキング処理を行い、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体が磁
性体内包粒子に結合された免疫測定用粒子を得た。
次に、得られた免疫測定用粒子を冷蔵保存するため、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心
分離を行い、得られた沈渣を、牛血清アルブミンの濃度が１重量％になるようにリン酸緩
衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解し、更に、アジ化ナトリウムを０．０１
重量％の濃度になるように溶解した溶液６ｍＬに懸濁させ、すぐに冷蔵保存した。
【００７９】
（実施例２１、２２及び２３）
実施例１２、１６及び１９で得られたリンカーが結合した磁性体内包粒子から免疫測定用
粒子を作製した。
実施例１２、１６及び１９で作製したリンカーが結合した磁性体内包粒子１２ｍｇに０．
１Ｍホウ酸緩衝液１ｍＬを加え、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、上清を
除去した。得られた沈渣に、０．１Ｍホウ酸バッファーを３８０μＬ、抗α−ｈＣＧモノ
クローナル抗体溶液（５．０ｍｇ／ｍＬ）を２０μＬ加え、充分混和して、室温にて２０
時間攪拌した。反応液は１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−
ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、磁性体内包粒子への抗α−ｈＣＧモノクロ
ーナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの５５％であることを確認した。得
られた沈渣は１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を
行った。その沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを５％（
ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液９００μＬに懸濁させ、３７℃で１時間攪拌し
、ブロッキング処理を行った。その後１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行い、沈
渣に０．１Ｍホウ酸バッファー１ｍＬを添加し、超音波で分散させた。続いて、１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミン及びグリセロールを各々５％（ｗ／ｖ
）の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度にな
るように溶解した溶液１ｍＬに懸濁させ、免疫測定用粒子を得た。
【００８０】
（比較例１〜３）
比較例としてエスタポール  Ｍ１−０３０／４０（メルク社製）の３ロットを用いた。
【００８１】
（比較例４）
比較例１の磁性体内包粒子から免疫測定用粒子を作製した。
比較例１の磁性体内包粒子１２．５ｍｇにｐＨ９．５の水酸化カリウム水溶液１ｍＬを加
え、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に添加されている
界面活性剤を除去した。続いて、得られた沈渣に、０．０２Ｍリン酸緩衝液６２５μＬ及
び予め調整した２％濃度のカルボジイミド溶液（ＰＢＳ緩衝液）０．６２５ｍＬを添加し
、３７℃恒温槽中で１．５時間攪拌した。反応溶液は、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠
心分離を行い、上清を除去後、０．０２Ｍリン酸緩衝液１．２ｍＬを添加し、超音波で再
分散した。前述の遠心洗浄操作を３回繰り返し、未反応のカルボジイミドを除去した。続
いて、得られた沈渣に、０．１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノク
ローナル抗体２００μｇ加え、３７℃恒温槽中で一晩攪拌した。翌日、反応溶液に３０ｍ
Ｍグリシン溶液（ホウ酸緩衝液）５０μＬを添加し、３７℃恒温槽中で３０分間攪拌した
。その後、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノク
ローナル抗体を除去した。なお、磁性体内包粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結
合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの６３％であることを確認した。得られた沈渣は
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。得ら
れた沈渣は、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で３０分間攪拌し、ブロッキ
ング処理を行った。その後、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、その沈渣を
牛血清アルブミン及びグリセロールを各々５％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１
％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに
分散させ、免疫測定用粒子を得た。
【００８２】
＜評価＞
（１）分散安定性の評価
実施例１３〜１８で得られた磁性体内包粒子及び比較例１〜３の磁性体内包粒子を用いて
、固形分１％の分散液を調製し、超音波分散後、静置して沈降粒子の発生を目視で観察し
た。比較例１〜３の磁性体内包粒子を用いた場合は分散直後に一部の沈降が認められた。
また、静置した翌日にはサンプル瓶の底面に沈降層が形成され、分散安定性が悪いことが
わかった。一方、実施例１３〜１８の磁性体内包粒子では、静置した翌日においても沈降
物は認められず、分散安定性が優れていることが明らかとなった。
【００８３】
（２）粒子形状の評価
実施例１３〜１８で得られた磁性体内包粒子及び比較例１〜３の磁性体内包粒子を水で希
釈し、金属メッシュで支持したコロジオン膜上に沈着固定して、透過型電子顕微鏡（ＴＥ
Ｍ）により、粒子の形態を観察した。
ＴＥＭで観察された磁性体内包粒子と磁性体の平均粒径を表５に示した。
【００８４】
【表５】
2005308485.tif 000011
【００８５】
表５より、実施例１３、１４、１５及び１６で得られた磁性体内包粒子は、いずれも均一
粒径の球形粒子で、磁性体を内包していることが観察された。一方、比較例１〜３ではい
ずれも粒径が１００〜１０００μｍの磁性体内包粒子が混ざっていて不均一であった。ま
た、比較例１〜３ではいずれも磁性体内包粒子表面に磁性体が露出しているのが確認され
た。
【００８６】
更に、作製した磁性体内包粒子（実施例１３、１４、１５及び１６）が、磁石へ引き寄せ
られることを確認するために、１．５ｍＬのマイクロチューブに磁性体内包粒子の分散液
を少量取り、蒸留水で適当に希釈して磁石つきマイクロチューブ立て（ＤＹＮＡＬ社製、
ＭＰＣ（登録商標）−Ｍ）にチューブを立てて、分散している磁性体内包粒子が磁石に引
き寄せられることを視覚により確認した。
【００８７】
（３）磁性体含有量のバラツキの評価
パーティクルアナライザー（ＤＰ−１０００  堀場製作所社製）を用いて、実施例１５〜
１８及び比較例１〜３の磁性体内包粒子について、有機高分子物質を構成する炭素元素と
磁性体を構成する鉄元素の同期発光を測定し、その測定データの偏差値を算出した。結果
は表６に示した。
【００８８】
【表６】
2005308485.tif 000012
【００８９】
実施例及び比較例の磁性体内包粒子の偏差値を比較すると、実施例１５〜１８の磁性体内
包粒子の偏差値は小さく、磁性体含有量のバラツキが小さいことが分かる。一方、比較例
１〜３の磁性体内包粒子は、偏差値が大きく、磁性体含有量のバラツキが大きいことが明
らかとなった。
【００９０】
（４）クロマト展開性の評価１
（４）−１  クロマト展開性の確認
実施例２１、２２及び比較例４の免疫測定用粒子を固形分０．０４５％（ｗ／ｖ）になる
ように、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）及びトリトン−１００  ０．０３％（ｗ／ｖ）
濃度になるように調整した生理食塩水に分散した。各々の分散液３０μＬをポアサイズ１
０〜１２μｍのニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ  Ｐ７０、日本ミリポア社製）に
スポットし、円形状に分散液を展開させた。展開した分散液は、いずれも直径約１８ｍｍ
の円状であった。その後、乾燥させ、磁性体内包粒子の展開により着色された円形の直径
を計測した。結果は、実施例１８の免疫測定用粒子を用いた場合で１６ｍｍであり、実施
例１９の免疫測定用粒子を用いた場合で１７ｍｍであり、比較例４の免疫測定用粒子を用
いた場合で１２ｍｍであった。
実施例２１、２２においては、免疫測定用粒子の展開域が媒体の展開域の約９２％であっ
たことから、クロマト担体中を展開媒体と共にスムーズに展開していることが分かった。
一方、比較例４では、上記展開域が、約７０％であることから実施例２１、２２に比べる
と展開性に劣る。また、比較例４では、スポット中心部付近の着色が濃く不均一な展開で
あることが分かった。
【００９１】
（４）−２  試験片の作製
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ  Ｐ７０、日本ミリポア社製）を幅２０ｃｍ×長
さ６ｃｍに裁断し、その長さ方向上端より３ｃｍの部位（反応部位）に、抗β−ｈＣＧモ
ノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏ
ｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、３７
℃で２時間乾燥した後、牛血清アルブミン（和光純薬工業社製）を１重量％の濃度になる
ようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液に１時間浸漬し
、ブロッキング処理を行った。更にその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０
．１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解
した溶液に洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗β−ｈＣＧモノク
ローナル抗体を固定化した試験片を得た。
得られた試験片を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッ
ド（ＡＰ２２  日本ミリポア社製）を、下端に幅５ｍｍ×長さ１５ｍｍのコンジュゲート
パッド（グラスファイバー  日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片
とした。
【００９２】
（４）−３  免疫測定の実施
実施例２１〜２３及び比較例４の免疫測定用粒子を０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度になるよ
うに、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、  トリトン−１００  ０．０３％（ｗ／ｖ）及
びｈＣＧが０ｍＩＵ／ｍＬ、２５ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬ、１０００ｍＩＵ／
ｍＬ及び５０００ｍＩＵ／ｍＬ濃度になるように試験液を調整した生理食塩水に分散した
。
次に、作製した試験片のコンジュゲートパッドにｈＣＧが所定濃度の試験液１００μＬを
それぞれ滴下した。
滴下１０分後、実施例２１〜２３の免疫測定用粒子を用いた場合は、ｈＣＧが０ｍＩＵ／
ｍＬを除いた試験片は、反応部位において免疫測定用粒子に基づく着色が認められた。ま
た、その着色度合いは、ｈＣＧ濃度に依存していることが確認された。また、反応部位に
おいてｈＣＧ濃度に応じた磁性が確認され、磁性を標識とする免疫測定法に有用であるこ
とが示された。
一方、比較例４の免疫測定用粒子を用いた場合は、いずれの試験片も反応部位及び反応部
位までの部位で免疫測定用粒子に基づく着色が認められた。特に、コンジュゲートパッド
を重ねた部位付近の着色が強く、免疫測定用粒子が滞留していることが認められ、ｈＣＧ
が１０００ｍＩＵ／ｍＬ以上では、その部位は反応部位よりも強く着色していることが認
められた。比較例４の免疫測定用粒子を用いた場合は、１）試験片に免疫測定用粒子が滞
留する、２）被検出物質濃度に応じて展開する免疫測定用粒子量が変動する、３）被検出
物質が存在しなくても（ｈＣＧ：０ｍＩＵ／ｍＬ）非特異的に反応部位に免疫測定用粒子
がキャプチャーされることから、磁性を標識とする免疫測定法には適用できないことが示
された。
【００９３】
（５）クロマト展開性の評価２
（５）−１  試験片の作製
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ、日本ミリポア社製）を幅３０ｃｍ×長さ６ｃｍ
に裁断し、その長さ方向上端より３ｃｍの部位（反応部位）に、実施例２０の免疫測定用
粒子で用いたものとは異なる反応エピトープを有する抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を
２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４
）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、３７℃で２時間乾燥した
後、牛血清アルブミン（和光純薬社製）を１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１
００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行
った。更にその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．１重量％の濃度になる
ようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液にて洗浄後、シ
リカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体固定化膜
を得た。
得られた抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体固定化膜を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向上端に
幅５ｍｍ×長さ２ｃｍの吸水用ろ紙（日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定し
て試験片とした。
【００９４】
（５）−２  免疫測定の実施
リン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に実施例２０の免疫測定用粒子を０．
１重量％の濃度になるように溶解し、更に牛血清アルブミンを１重量％の濃度になるよう
に溶解し、更にアジ化ナトリウムを０．０１重量％の濃度になるように溶解した溶液を作
製し、該溶液２０μＬを９６ウェルマイクロプレート（ナルジェヌンクインターナショナ
ル社製）の各ウェルに添加した。
次に、ＨＢｓ抗原標準品（５０ＩＵ／ｍＬ）を所定の濃度になるようにリン酸緩衝液（１
００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）で希釈し、各々１００μＬをウェルに添加混合後、試験
片をウェル内に入れ、立位するように立てた。
３０分後、試験片を取り出した所、反応部位においてＨＢｓ抗原濃度に応じた磁性が確認
され、実施例２０の免疫測定用粒子は磁性を標識とする免疫測定法に有用であることが示
された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、上述の構成よりなるので、疎水モノマーと親水性モノマーとを共重合して粒子
を形成する反応と、粒子内に金属イオンを取り込ませながら金属イオンを変性して磁性体
を形成する反応とを同時に行い、磁性体を分散状態で含有する粒子とし、この表面にリン
カーを導入することにより、均一な磁性を有し、かつ、粒径分布の狭い磁性体内包粒子を
得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】実施例２で得られた磁性体内包粒子（平均粒径；磁性体内包粒子０．２１μｍ、磁性体５ｎｍ）のＴＥＭ写真である。
【図１】
2005308485.tif 000015