(57)【要約】【課題】            目的の蛋白質マルチマーを経済的に、かつ効率的に生産し、またガスや液体などの流体から金属イオン等所定のリガンドを分離し、及び／または濃縮するための手段として有効なトランスジェニック植物を提供すること。【解決手段】        自発的に会合して生物的に活性なマルチマーを形成しうるポリペプチドをコードする少なくとも二つの哺乳類遺伝子を含む体細胞及び胚細胞を含むトランスジェニック植物。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコポリペプチドマルチマー及び植物物質を含むグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、該グリコポリペプチドの一つが(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と(b)コア部分及びＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有し、前記組成物がシアル酸残基を含まず、前記植物物質が双子葉植物または米及びとうもろこしから選択される単子葉植物由来である、上記グリコポリペプチドマルチマー組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における外来の蛋白質マルチマーの発現、これらの蛋白質マルチマーを発現するトランスジェニック植物、植物中で生産される外来のグリコポリペプチドマルチマーおよび植物由来のグリコポリペプチドマルチマーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
広範囲の宿主細胞中でポリペプチドを発現しうることが知られている。種々の構造遺伝子が哺乳類およびウイルスから単離され、その構造遺伝子とは異なる起源由来の翻訳開始および停止調節シグナルと結合して、これらの調節シグナルが機能する宿主に導入された。
経済的理由から、遺伝子工学的に作成した単細胞微生物を使用して種々のポリペプチドを生産することが望ましい。しかし、単細胞生物および哺乳類細胞の性質が本質的に異なることから、単細胞微生物内でのポリペプチドのホールディングおよびプロセシングは、哺乳類細胞内でのホールディングおよびプロセシングと全く異なると考えられる。結果的に単細胞微生物由来の哺乳類ポリペプチドが、必ずしもうまくホールディング、またはプロセシングしてそのポリペプチドの望ましい生物学的、または生理学的活性を提供するとは限らない。
【０００３】
成功の度合いは別として、植物中で哺乳類ポリペプチドを発現する試みが行われている。
最初の外来遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：４９６（１９８４）およびデブロック（ＤｅＢｌｏｃｋ）等、ＥＭＢＯ  Ｊ．，３１：６８１（１９８４）に述べられているアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ベクターを使用して生産したタバコ植物である。この研究で生産されたトランスジェニック植物は、導入されたトランスジーンにより特定の抗生物質に対して耐性となった。これらの最初のトランスジェニック植物は、植物のプロトプラスト、すなわち機械的、または酵素消化により細胞壁を除去した植物細胞に、外来遺伝子を導入することにより生産した。葉、茎および根など再生可能な植物部分に基づくトランスホーメーション法を利用することでいくつかの双子葉植物のトランスホーメーションが可能となった。マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび粒子ガン技術を含む種々の遊離ＤＮＡ供給システムで、トウモロコシおよび米等の単子葉植物のトランスホーメーションが可能となった。
【０００４】
蛋白質マルチマー、すなわち二つの異なるポリペプチド鎖からなる蛋白質の有意な収率での発現は、まだ達成されていない。これら蛋白質マルチマーのアッセンブリをコントロールする因子としては、十分な量の各ポリペプチド鎖が同じ細胞構造体の中に存在しなければならないこと以外は、まだ十分分かっていない。
植物細胞中での蛋白質マルチマーの発現には、同じ植物細胞内に各ポリペプチド鎖をコードする遺伝子が存在することが必要である。同一細胞内に両遺伝子を導入できる確率は、非常に低い。また、たとえこのような単一細胞のコトランスホーマントが生成しても、これから植物体が再生されなければ意味がない。
炭水化物残基を含む蛋白質マルチマー、グリコポリペプチドマルチマーは、動植物体内に存在する。植物および動物両グリコポリペプチドマルチマーは、ポリペプチドに存在するアスパラギン残基に直接結合する共通のペンタサッカライドコア、Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧＬｃＮＡＣβ１−４ＧＬｃＮＡｃ−，を有する。コーンフェルド（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）およびコーンフェルド（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４：６３１（１９８５）参照。
【０００５】
また、植物および動物のグリコポリペプチドマルチマーは、共通するペンタサッカライドコアに直接結合するオリゴサッカライドのアウターブランチを有する。動植物のグリコポリペプチドアウターブランチは、Ｎ−アセチルグルコサミンを有しているが、イーストに存在するアウターブランチだけは、マンノースを含んでいる。
動植物のグリコポリペプチドは、存在するオリゴサッカライドのアウターブランチに直接結合する種々の末端炭化水素を含んでいる。哺乳類のグリコポリペプチドを含む動物のグリコポリペプチドは、末端炭化水素として存在するシアル酸を有している。一方、植物のグリコポリペプチドマルチマーは、それを含んでいない。スターム（Ｓｔｕｒｍ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１３３９２（１９８７）参照。
分泌性ＩｇＡは、鎖（Ｊ鎖）と分泌要素を繋ぐ二つのＩｇＡ分子からなるグリコポリペプチドマルチマーである。ＩｇＡは、ミルク、唾液、涙、呼吸系分泌物および腸分泌物等の分泌物中に存在する主要なクラスの抗体である。
分泌性ＩｇＡは、過酷な環境による変性に対して耐性がある。この変性耐性には、ＩｇＡ分子、Ｊ鎖および分泌要素を含む複合型分泌性ＩｇＡ分子が、正確かつ効率的に集合することが必要である。
【０００６】
現在、特定の方法で生成したトランスジェニック植物中で、蛋白質マルチマーが比較的高収率で発現できることが知られている。さらに、トランスジェニック植物中でシアル酸を含まないグリコポリペプチドマルチマーの正確で効率的な発現方法が開発された。
また、動物に対する種々の抗原特異性を有する種々の抗体を含むシアル酸含有可溶性免疫グロブリンを提供することによりその動物を受動免疫化することが出来ることが分かった。タケット（Ｔａｃｋｅｔ）等、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．，３１８：１２４０（１９８８）およびエイブル（Ｅｉｂｌ）等、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９：１−７（１９８８）参照。今日まで、所定の病原に結合しうるグリコポリペプチドマルチマーカプセルを投与することにより動物を受動免疫化するという報告はない。
シアル酸を含まず、かつ所定の病原と結合しうるグリコポリペプチドマルチマーのカプセルを投与することによる受動免疫の誘導方法が発見された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
各々が、自己結合性ポリペプチドをコードする複数の哺乳類遺伝子を核ゲノムに統合した形で含み、かつ自己結合性ポリペプチド自体を含む植物細胞によって構成される有性的に再生可能なトランスジェニック植物中で、アブザイム、免疫グロブリン、酵素などの生物学的、または生理学的に活性な蛋白質マルチマーが比較的効率的に生成された。これらのポリペプチドは、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーなどの生物学的に活性なポリペプチドマルチマーとして植物細胞中に存在する。これらのトランスジェニック植物は、形態的には正常であるが、実質的にすべての細胞には哺乳類遺伝子が存在する。各遺伝子産物は、実質的にその植物細胞の全て、あるいは一部に存在しうる。即ち、その産物は、特定の細胞、組織あるいは器官に局在しうる。
【０００８】
先のトランスジェニック植物は、第一の植物種の核ゲノムに蛋白質マルチマーの構成部分である自己結合性のモノマーポリペプチドをコードする第一の哺乳類遺伝子を導入し、生存可能な第一のトランスホーマントを作製することにより生成する。同様に、これも蛋白質マルチマーの構成部分であるもう一つの自己結合性のモノマーポリペプチドをコードするもう一つの哺乳類遺伝子を、第二の同じ植物種の核ゲノムに導入して生存可能な第二のトランスホーマントを作製する。このようにして得た第一および第二のトランスホーマントを有性的に掛け合わせて培養し、子孫の植物を作製して、そこから蛋白質マルチマーを生産するトランスジェニック植物を単離する。
【０００９】
本発明を具現化するトランスジェニック植物は、目的の蛋白質マルチマーを経済的に、かつ効率的に生産するのに有効なだけでなく、ガスや液体などの流体から金属イオン等所定のリガンドを分離、および、または濃縮するための手段として有効である。
このトランスジェニック植物は、グリコシル化したコア部およびアウターブランチを含むアセチルグルコサミンを有するポリペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有し、かつ検出可能なシアル酸残基を含まないグリコポリペプチドを生産する。
【００１０】
所定の病原に対する受動免疫は、予防に十分なグリコポリペプチドマルチマー濃度となる量の、病原抗原に結合可能で生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーカプセルを動物に投与することにより誘導される。この投与されるグリコポリペプチドマルチマーには、検出可能なシアル酸残基は含まれず、グリコシル化したコア部分およびアウターブランチを含むＮ−アセチルグルコサミンを有するポリペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列が含まれる。
また、本発明は、グリコシル化したコア部分およびアウターブランチを含むＮ−アセチルグルコサミンを有するポリペプチドおよび免疫グロブリンのアミノ酸残基配列を含むグリコポリペプチドマルチマーで、かつ検出可能なシアル酸残基を含まず、植物細胞などのような保護コート中にカプセル化されたグリコポリペプチドマルチマーを含む生物学的に活性な組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
Ａ・定義
双子葉植物：胚が二つの種子葉または双子葉を有する開花植物。双子葉植物には、タバコ、トマト、アルファルファを含む豆類、樫、楓、薔薇、ミント、カボチャ、ヒナギク、クルミ、サボテン、菫およびキンポウゲがある。
単子葉植物：胚が一つの子葉または種子葉を有する開花植物。単子葉植物には、ユリ、芝、トウモロコシ、オーツ麦、小麦および大麦を含む穀類、ラン、菖蒲、タマネギおよび椰子がある。
【００１２】
低級植物：シダ、裸子植物、毬果植物、トクサ、ヒカゲノカズラ、苔類、マツモ、蘚類、紅藻類、褐藻類、配偶体、シダの芽胞体および緑藻類を含む非開花植物。
真核性ハイブリッドベクター：真核細胞にポリペプチドをコードするＤＮＡ（挿入物）を導入しうるＤＮＡ。
染色体外リボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）：リボゾームＲＮＡをコードする一つ以上の遺伝子を有し、かつ自分自身で複製しうる（染色体の複製とは独立に）染色体以外に存在する単細胞真核生物のＤＮＡ。
【００１３】
パリンドロームＤＮＡ：一つ以上の対称中心を有するＤＮＡ配列。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸。
Ｔ−ＤＮＡ：転移したＤＮＡのセグメント。
ｒＤＮＡ：リボゾームＤＮＡ。
ＲＮＡ：リボ核酸。
ｒＲＮＡ：リボゾームＲＮＡ。
Ｔｉ−プラスミド：腫瘍誘導プラスミド。
Ｔｉ−ＤＮＡ：Ｔｉ−プラスミド由来のＤＮＡのセグメント。
【００１４】
挿入物：ｒＤＮＡにとって外来の、構造遺伝子および場合によってはさらに別のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列。
構造遺伝子：ポリペプチドをコードし、適当なプロモーター、ターミネーション配列、場合によっては他の調節ＤＮＡ配列を含む正しい読み枠を有する遺伝子。
シグナル配列：ポリペプチドに結合し、小胞体への該ポリペプチドの結合および蛋白質の分泌に必要なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。
（選択的）遺伝子マーカー：トランスホームした細胞を非トランスホーム細胞から選別しうる発現型をコードするＤＮＡ配列。
プロモーター：遺伝子の発現コントロール要素で、ＲＮＡポリメラーゼが特異的にこれに結合しこの遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始する一つ、または一群のＤＮＡ配列の認識部位。
【００１５】
誘導可能プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および合成開始速度を外部刺激で調節できるプロモーター。このような刺激には、光、熱、嫌気的ストレス、栄養条件の変化、代謝物の有無、リガンドの存在、微生物の攻撃、損傷などがある。
ウイルスプロモーター：ウイルスの遺伝子の５’末端にあるプロモーターと実質的に同じのＤＮＡ配列を有するプロモーター。典型的プロモーターは、ハング（Ｈｕａｎｇ）等、Ｃｅｌｌ，２７：２４５（１９８１）に述べられているＭＭＴＶのｐ２１蛋白質をコードする遺伝子の５’末端にある。（本明細書で引用しているすべての文献は、参考として引用している。）
合成プロモーター：生物的にではなく化学的に合成したプロモーター。通常、合成プロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼの開始効率を至適化する配列変異を含んでいる。
構成的プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始速度がほぼ一定で、比較的に外部刺激には影響されないプロモーター。構成的プロモーターの例には、ポスコフスキー（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉ）等、ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，２７１９（１９８９）およびオデル（Ｏｄｅｌｌ）等、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０（１９８５）に述べられているカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターがある。
【００１６】
時間調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始速度が、発生の特定の時間に調節されるプロモーター。時間調節プロモーターの例は、チュア（Ｃｈｕａ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１（１９８９）に述べられている。
空間調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始速度が葉、茎または根など器官の特定の構造内で調節されるプロモーター。空間調節プロモーターの例は、チュア（Ｃｈｕａ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１（１９８９）に述べられている。
空間時間調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始速度の速度が発生の特定の時間に特定の器官で調節されるプロモーター。典型的な空間時間調節プロモーターの例には、チュア（Ｃｈｕａ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１７４−１８１（１９８９）に述べられているＥＰＳＰシンテースー３５Ｓプロモーターがある。
一本鎖抗原結合蛋白質：免疫グロブリン軽鎖可変部のアミノ酸配列（ＶL ) のカルボキシ末端を免疫グロブリン重鎖可変部のアミノ酸配列（ＶH ) のアミノ末端に結合するペプチド結合でＶL に繋がったＶH からなるポリペプチド。
【００１７】
一本鎖抗原結合蛋白質コード遺伝子：一本鎖抗原結合蛋白質をコードする組み換え遺伝子。
蛋白質マルチマー：一つの球状蛋白質を形成するように互いに会合する二つ以上のポリペプチドを含む球状蛋白質。
ポリペプチドおよびペプチド：隣り会うアミノ酸残基のαアミノおよびカルボキシ基間のペプチド結合により互いに連結される一連の線状アミノ酸残基。
蛋白質：ポリペプチドのように互いに連結する約５０個以上の一連のアミノ酸残基。
キレート剤：金属を結合しうる化合物、ペプチド、または蛋白質、キレート剤の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２，３−ジメルカプトプロパネル−１−スルホン酸（ＤＭＰＳ）および２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）等がある。
【００１８】
金属キレート化複合体：キレート剤に結合した金属を含む複合体。
免疫グロブリン産物：少なくとも免疫グロブリン重鎖の免疫学的活性部を含み、特定の抗原に特異的に結合しうるポリペプチド、蛋白質または蛋白質マルチマー。代表的な免疫グロブリン産物には、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン分子、実質的免疫グロブリン分子、当分野でＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメントおよびＦV フラグメントとして知られている部分を含むパラトープを有する免疫グロブリンの一部分等がある。
免疫グロブリン分子：互いに結合する免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含み、抗原と特異的に結合しうる蛋白質マルチマー。
Ｆａｂフラグメント：互いに共有結合で結合する免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含み、特定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン分子の一部を含む蛋白質マルチマー。一般に、Ｆａｂフラグメントは、従来法を用いたパパインによる実質的免疫グロブリン分子の蛋白質分解的消化によって調製する。しかし、Ｆａｂフラグメントは、従来法により免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の目的部分を適当な宿主細胞内で発現させる事によっても調製できる。
【００１９】
ＦV フラグメント：互いに共有結合で結合する免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含み、抗原と特異的に結合しうる蛋白質マルチマー。一般に、ＦV フラグメントは、従来法を用い免疫グロブリン重鎖可変部と免疫グロブリン軽鎖可変部の目的部分を適当な宿主細胞内で発現させることにより調製する。
無性増殖：葉、茎または根の断片、単一の植物細胞（プロトプラスト）およびカルスから全植物体を再生することによる子孫の生産。
グリコシル化コア部分：全てのアスパラギン結合オリゴサッカライドに共通するペンタサッカライドコア。このヘンタサッカライドコアは、Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４６ＬｃＮＡＣβ１−４  ６ＳｃＮａｃ（ＡＳＮアミノ酸）の構造を持つ。一般に、このペンタサッカライドは、これに結合する二つのアウターブランチを有する。
Ｎ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチ：アスパラギン結合オリゴサッカライドのペンタサッカライド（グリコシル化コア部分）に結合する別のオリゴサッカライド。哺乳類および植物の両方に存在するアウターブランチは、マンノースのみを含むイーストのアウターブランチと対照的にＮ−アセチルグルコサミンを含む。哺乳類のアウターブランチは、そのアウターブランチの末端に直接結合するシル酸残基を有する。
【００２０】
グリコペプチドマルチマー：単一の球状蛋白子を形成するように互いに結合するグリコシル化ポリペプチドまたは蛋白質および少なくとも一つのポリペプチドまたは蛋白質を含む球状蛋白質。ヘテロ二量体およびホモ二量体糖蛋白質の両方とも蛋白質マルチマーとなりうる。グリコシル化ポリペプチドおよび蛋白質は、アスパラギンのアミド基にＮ−アセチルグルコサミンのＣ（１）が結合するｎ−グリカンである。
免疫グロブリンスーパーファミリー分子：免疫グロブリンまたは免疫グロブリン関連ドメインに有意に相同的なドメインサイズおよびアミノ酸残基配列を有する分子。その相同性の有意性は、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９１：５２４−５４５（１９８３）に述べられているアラインプログラムのようなコンピュータプログラムを用いて統計的に決定する。３以下の典型的アラインスコアはテストした分子が免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであることを示している。
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーには、表Ａに示された、また、ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）およびバークレー（Ｂａｒｃｌａｙ）、免疫グロブリン遺伝子、ｐ３６１、アカデミックスプレス、ニューヨーク，ＮＹ（１９８９）に報告されているものを含むいくつかの主要クラスの分子が含まれる。
【００２１】
表Ａ
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの既知メンバー
免疫グロブリン
重鎖（ＩｇＭ）
軽鎖カッパ
軽鎖ラムダ
Ｔ細胞レセプター（Ｔｃｒ）複合体
Ｔｃｒ  α鎖
Ｔｃｒ  β鎖
Ｔｃｒ  ガンマ鎖
Ｔｃｒ  Ｘ鎖
ＣＤ３  ガンマ鎖
ＣＤ３  σ鎖
ＣＤ３  ε鎖
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原
クラスＩ  Ｈ鎖
β2 −ミクログロブリン
クラスII  α
クラスII  β
β2 −ｍ  関連抗原
ＴＬ  Ｈ鎖
Ｑａ−２  Ｈ鎖
ＣＤｌａ  Ｈ鎖
Ｔリンパ球抗原
ＣＤ２
ＣＤ４
ＣＤ７
ＣＤ８  鎖Ｉ
ＣＤ８  鎖IIｄ
ＣＤ２８
ＣＴＬＡ４
造血／内皮抗原
ＬＦＡ−３
ＭＲＣ  ＯＸ−４５
脳／リンパ抗原
Ｔｈｙ−１
ＭＲＣ  ＯＸ−２
免疫グロブリンレセプター
ポリＩｇ  Ｒ
Ｆｃ  ガンマ  ２ｂ／ガンマ  １Ｒ
ＦｃεＲＩ（α）
神経分子
神経粘着分子（ＭＣＡＭ）
ミエリン関連ｇｐ（ＭＡＧ）
ＰO ミエリン蛋白質
腫瘍抗原
ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）
成長因子レセプター
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプター
コロニー活性化因子−１（ＣＳＦ１）レセプター
非−細胞表面分子
α1 Ｂ−糖蛋白質
基底膜結合蛋白質
＊ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）およびバークレー（Ｂａｒｃｌａｙ），免疫グロブリン遺伝子、ｐ３６１，アカデミックスプレス、ＮＹ（１９８９）および、免疫学的に興味のある蛋白質の配列、第四編、Ｕ．Ｓ．，デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービング（１９８７）参照。
【００２２】
触媒部位：反応物の結合および反応速度の改良を行いうる分子の一部。触媒部位は、ポリペプチドまたは蛋白質、酵素、有機物、有機金属化合物、金属等に存在しうる。一つの触媒部位は、一つ以上のポリペプチド鎖または化合物に存在する幾つかの部分から成り立つこともある。これらの各触媒部位が会合して大きな触媒部位領域が生成する。触媒部位は、金属に結合する一つのポリペプチドまたは蛋白質によっても生成しうる。
酵素部位：触媒部位を含む蛋白質分子の一部分。ほとんどの酵素部位は、非常に高い選択的基質特異性を示す。一つの酵素部位は、同じポリペプチド鎖の異なるセグメント状に存在する二つ以上の酵素部位部分を含むこともある。これらの酵素部位部分が、互いに会合しより大きい酵素部位が生成する。また、酵素部位の一部が金属のこともある。
自家受粉：雄の花部分から同じ植物の雌の花部分への花粉の移動。一般に、この過程で種子が生成する。
【００２３】
交雑受粉：雄の花部分から別の植物の雌の花部分への花粉の移動。一般に、この過程で生育可能な子孫が生まれる種子が生成する。
エピトープ：免疫グロブリン産物によって特異的に認識される分子の一部分。これは、決定基または抗原決定基とも呼ばれる。
アブザイム：酵素または触媒として作用しうる免疫グロブリン分子。
酵素：触媒作用により、しばしば特異的に基質の特定の変化を促進または生成しうる蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、ＲＮＡ分子、または蛋白質マルチマー。
Ｂ．蛋白質マルチマーを含むトランスジェニック植物の生成法。
本発明は、第一および第二のポリペプチドを含む蛋白質マルチマーを含む植物を生成させる新しい方法を提供する。一般にこの方法は、以下の要素を合わせ持っている。
【００２４】
１．第一の植物種のゲノムに、第一ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入して第一トランスホーマントを作製する。
２．第二の植物種のゲノムに、第二ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入して第二トランスホーマントを作製する。
３．第一および第２トランスホーマントから子孫集団を生産する。
４．その集団から蛋白質マルチマーを有する子孫を単離する。
本発明で生産した植物は、生物学的機能構造を維持した形で互いに会合する第一および第二ポリペプチドを含む蛋白質マルチマーを含んでいる。本発明の一つの形態の蛋白質マルチマーは、所定のリガンドに特異的に結合し、リガンドと単離する複合体を作るためのリガンド結合部位間に十分に強い結合を有する複合体を形成するリガンド結合部位を形成するリガンド結合ポリペプチド（レセプター）である。別の態様の蛋白質マルチマーは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む免疫グロブリン分子である。この免疫グロブリン重鎖および軽鎖は互いに会合し、かつ競合的に阻害される能力で証明されるように所定の抗原に特異的な抗原結合部位を有する構造を維持するこの蛋白質マルチマーが抗原結合蛋白質である場合、そのアフィニティーまたは結合性は一般に１０5 Ｍ-1以上、通常１０6 Ｍ-1以上および好ましくは１０8 Ｍ-1以上である。
【００２５】
また、別の態様の蛋白質マルチマーは、免疫グロブリン重鎖の一部分および免疫グロブリン軽鎖の一部分を含むＦａｂフラグメントである。この免疫グロブリン重鎖および軽鎖は互いに会合し、所定の抗原に特異的な抗原結合部位を有する構造を維持する。Ｆａｂフラグメント状の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子の抗原結合部位と同じ結合アフィニティーを有する。
また、別の態様のトランスジェニック植物には、少なくとも免疫グロブリン重鎖可変部の一部および少なくとも免疫グロブリン軽鎖可変部の一部を含むＦｖフラグメントをである蛋白質マルチマーを含む。この免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変部は、植物細胞内で自発的に会合し、所定の抗原に特異的な結合部位を有する生物学的に活性な構造を維持する。Ｆｖフラグメント状の抗原決定部位は、免疫グロブリン分子に存在する抗原結合部位が示すアフィニティーと同じアフィニティーを示す。
また、他の態様の蛋白質マルチマーは、基質を結合し、かつその基質からの産物の生成を触媒する酵素である。触媒性蛋白質マルチマーの基質結合部位（リガンド結合部位）のトポロジーは、おそらく基質に対するアフィニティー（会合定数またはｐＫａ）よりも活性のほうに重要であるが、所定の基質に対するこの蛋白質マルチマーの会合定数は、１０3 Ｍ-1以上、通常１０5 Ｍ-1または１０6 Ｍ-1、好ましくは１０Ｍ7 Ｍ-1以上である。
【００２６】
本発明にしたがって作製した蛋白質マルチマーが、免疫グロブリン重鎖可変部の少なくとも一部を他のポリペプチド鎖と会合した形で含むアブザイムである時、この別のポリペプチド鎖には、免疫グロブリン軽鎖可変部の少なくとも生物学的活性部分を含んでいる。また、これら二つのポリペプチドは、それぞれ単独のポリペプチド、すなわちモノマーのアフィニティーまたは会合定数とは異なる、好ましくはより高い所定のリガンドに対する結合アフィニティーまたは会合定数を有する構造を維持している。有用な蛋白質マルチマーは、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変部由来の一つまたは両方のポリペプチド鎖を含んでいる。一般に、所定の抗原の結合には軽鎖（ＶL）および重鎖（ＶH）可変部を含むポリペプチドを一緒に使用する。
【００２７】
１．第一ポリペプチドをコードする遺伝子の第一植物種への挿入
目的の第一ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する方法はよく知られている。たとえば、“分子クローニング技術ガイド”，Methods In Enzymology,１５２巻、バーガー（Berger）およびキメル（Kimmel）編、（１９８７）および Current Protocols in Molecular Biology,  オースベル（Ausubel)等編、ジョンウィリーアンドサンズ版、ＮＹ（１９８７）参照（これらの文献は、参考として引用している）。
【００２８】
本発明の実施に有用な遺伝子には、免疫グロブリン産物、免疫グロブリン分子、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、酵素、レセプターおよびアブザイムに含まれるポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変部をコードする遺伝子は、特に好ましい。典型的には、所定の抗原を結合しうる免疫グロブリンの免疫グロブリン重鎖可変部および軽鎖可変部をコードする遺伝子を使用する。これらの遺伝子は、目的の活性を有する抗原性リガンド、すなわち所定の抗原で免疫化した脊椎動物、好ましくは哺乳動物の細胞から単離する。免疫化は従来法で行い、またその動物中の抗体値をモニターすることで目的のアフィニティーに対する目的の免疫段階を測定できる。一般に、部分免疫動物は一回だけの免疫化で作製し、応答が検出された直後にそれらの動物から細胞を回収する。完全免疫化動物は、通常二、三週間間隔での宿主哺乳動物への複数回の抗原注射で達成されるピーク値を示す。
通常、最後の注射から３−５日後、脾臓を取り出し、標準的技術を用いて脾臓中に存在する再配列Ｂ細胞から、免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を単離する。Current Protocols in Molecular Biology,  オースベル（Ausbel) 等編、ジョンウィリーアンドサンズ版、ＮＹ（１９８７）および“抗体”，ラボラトリーマニュアル、ハーロー（Harlowe)およびレーン（Lane）編、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８８）参照。
【００２９】
ＶHおよびＶLポリペプチドをコードする遺伝子は、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧまたはＩｇＭ，もっとも好ましくはＩｇＭおよびＩｇＧ生産細胞から得られる。クローニングのための免疫グロブリン可変部遺伝子を含むゲノムＤＮＡのフラグメントを調製する方法はよく知られている。たとえば、ハーマン（Herrmann)等、Methods in Enzymol., １５２：１８０−１８３（１９８７）；フリシャフ（Frischauf), Methods in Enzymol.,  １５２：１８３−１９０（１９８７）；フリシャフ（Frischauf), Methods in Enzymol.,  １５２：１９９−２１２（１９８７）参照。（これらの文献は、参考として引用している。）
免疫グロブリン産物をコードする遺伝子を単離するのに有用なプローブには、ＶH およびＶLのフレームワーク部をコードするＶHおよびＶL配列の不変部をコードする配列および全再配列免疫グロブリン遺伝子の不変部に対するプローブが含まれる。これらの配列は、使用可能な情報源から入手しうる。たとえば、アーリー（Early)およびフード（Hood）， Genetic Engineering，セトロー（Setlow）およびホレンダー（Hollaender）編、３巻、１５７−１８８，プレナムバプリシングコーポレーション、ＮＹ（１９８１）；およびカバ（Kabat)等、免疫学的に重要な配列、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ（１９８７）参照。
【００３０】
蛋白質マルチマーのポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子は、そのポリペプチドを発現する遺伝子を含むゲノムＤＮＡまたはそのポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいずれからも単離できる。ゲノムポリペプチドを使用する上での困難は、イントロンで分断されているそのポリペプチドをコードする配列の繋ぎ合わせである。適当なエクソンを含むＤＮＡフラグメントを単離し、イントロンを切りだし、適当な順番および方向でそのエクソンをつなぎ合わせなければならない。これらすべての操作が非常に困難であることから、配列が全ポリペプチドに渡り連続しているｍＲＮＡを用いるもう一つの方法が選ばれる。ペプチドまたは蛋白質をコードするｍＲＮＡを単離する方法はよく知られている。たとえば、 Current Protocols in Molecular Biology,  オースベル（Ausbel) 等編、ジョンウィリーアンドサンズ版、ＮＹ（１９８７）、“分子クローニング技術ガイド”， Methods In Enzymology，１５２巻、バーガー（Berger）およびキメル（Kimmel）編、（１９８７）およびモレキュラークローニング、ラボラトリーマニュアル、マニアチス（Maniatis)等、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２）参照。
【００３１】
一般に、単離したポリペプチドコード遺伝子は、発現ベクターに機能的に結合する。本発明の遺伝子の発現には、宿主細胞に適合する発現ベクター、好ましくは植物細胞に適合するものを使用する。植物における遺伝子発現に有用な典型的発現ベクターはよく知られており、ロジャース（Rogers）等、Meth. in Enzymol., １５３：２５３−２７７（１９８７）が述べているアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導性（Ti）プラスミドに由来するベクターが含まれる。しかし、その他の発現ベクターも植物内で機能しうることが知られている。たとえば、バーマ（Verma)等、ＰＣＴ  刊行番号ＷＯ８７／００５５１；およびコッキング（Cocking)およびダベイ（Davey)，Science,２３６：１２５９−１２６２（１９８７）参照。
【００３２】
先に述べた発現ベクターには、プロモーターなどの発現コントロール要素を含んでいる。ポリペプチドコード遺伝子は、発現ベクターに機能的に結合しており、プロモーター配列へのＲＮＡポリメラーゼの結合および目的のポリペプチドコード遺伝子の合成が可能である。このポリペプチドコード遺伝子を発現する上で有効なのは、誘導可能な、ウイルス由来、合成由来、構成的、時間調節可能な、空間調節可能な、および時間空間調節可能なプロモーターである。発現ベクターの選択、および最終的にポリペプチドコード配列が機能的に結合するプロモーターの選択は、当分野でよく知られているように目的の機能性、たとえば、蛋白質発現の位置や時間およびトランスホームする宿主細胞に直接依存する。これらは、組み替えＤＮＡ分子を構築する上で本質的な制限となっている。しかし、本発明を実施するのに有用な発現ベクターは、少なくとも複製、および好ましくは機能的に結合したＤＮＡセグメントに含まれるポリペプチドコード遺伝子の発現も行いうる。
【００３３】
好ましい態様において、ポリペプチドコード遺伝子の発現に用いる発現ベクターには、植物細胞中で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーが含まれる。好ましい薬剤耐性マーカーは、発現によりカナマイシン耐性となる遺伝子、即ち、ロジャース（Rogers）等、Methods For Plant Molecular Bioogy, ワイスバッハ（Weissbach)およびＨ．ワイスバッハ（Weissbach)編、アカデミックプレス、サンディエゴ、ＣＡ（１９８８）に述べられているような、ノパリンシンテースプロモーター、Ｔｎ５  ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIおよびノパリンシンテース３’非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。有用な植物発現ベクターは、ファルマシア（ピスカタウェイ、ＮＪ）から市販されている。
相補的粘着末端を介してベクターにＤＮＡを機能的に結合させる方法がいくつか開発されている。たとえば、挿入するＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに相補的なホモポリマートラックを付加する。ついで、その相補的ホモポリマーテール間の水素結合によりそのベクターおよびＤＮＡセグメントを結合し、組み換えＤＮＡ分子を生成する。
【００３４】
また、ＤＮＡセグメントを発現ベクターに結合するのに、一つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーも使用される。バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼのような平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒しうる酵素の存在下、過剰量の合成リンカー分子と平滑末端ＤＮＡセグメントをインキュベートすることにより合成リンカーを平滑末端ＤＮＡセグメントを結合させる。この反応の産物は、その末端に合成リンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し、合成リンカーの末端に適合する末端を生ずる酵素で切断した発現ベクターとライゲーションする。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、ニューイングランドバイオラブス（バーバリー、ＭＡ）などの業者から市販されている。
ポリペプチドコード遺伝子を植物に導入する方法には、アグロバクテリウム（（Agrobacterium)仲介の植物トランスホーメーション、プロトプラストトランスホーメーション、花粉への遺伝子転位、再生器官への注入、未熟胚への注入がある。これらの方法には、それぞれ長所、短所がある。特定の植物種に遺伝子を導入する特定の方法が、必ずしも別の植物に有効とは限らない。
【００３５】
植物組織全体にＤＮＡを導入でき、プロトプラストから植物体を再生する必要がないことから植物細胞に遺伝子を導入する方法としてアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)仲介転移は、非常に応用性の高い方法である。植物細胞にＤＮＡを導入するためにアグロバクテリウム（Agrobacterium)仲介発現ベクターを使用することはよく知られている。たとえば、フレーリー（Fraley）等、Biotechnology,３：６２９（１９８５）およびロジャース（Rogers）等、Methods in Enzymology,  １５３：２５３−２７７（１９８７）参照。さらに、Ｔｉ−ＤＮＡの組み込みは、ほとんど再配列を起こさない比較的精密なプロセスである。転移させるＤＮＡの領域は境界配列によって決まり、通常介在配列は、スピールマン（Spielmann)等、Mol. Gen. Genet., ２０５：３４（１９８６）およびジョウゲンセン（Jorgensen)等、Mol. Gen. Genet., ２０７：４７１（１９８７）に述べられている方法で植物ゲノムに挿入される。最近のアグロバクテリウム（Agrobacterium)トランスホーメーションベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium)同様大腸菌でも複製可能で、クリー（Klee) 等、Plant DNA Infectious Agents, T. ホーン（Horn）およびＪ．シェル（Schell)編、スプリンガーバーラグ、ＮＹ（１９８５），ｐｐ，１７９−２０３に述べられているように簡便な取扱が可能である。さらに、最近のアグロバクテリウム（Agrobacterium)仲介遺伝子転移に関するベクターの技術的進歩は、ベクター中の遺伝子および制限部位の配列の改良により種々のポリペプチドコード遺伝子の発現が可能なベクターの構築を可能にした。ロジャース（Rogers）等、Methods in Enzymology,  １５３：２５３（１９８７）に述べられているベクターは、挿入したポリペプチドコード遺伝子の直接的発現を目的として、プロモーターおよびポリアデニレーション部位の隣に簡便なマルチリンカー領域を有し、本目的に使用するのに適している。
【００３６】
アグロバクテリウム（Agrobacterium)仲介トランスホーメーションが有効な植物において、この方法は遺伝子転移が容易であり、かつ明確な点で有用である。しかし、バイトビア（Bytebier)等、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,８４：５３４５（１９８７）に報告されているように、アグロバクテリウム（Agrobacterium)ベクターを用いてアスパラガスでトランスジェニック植物が作製されているが、アグロバクテリウム（Agrobacterium)に適した単子葉植物は少ない。したがって、商業的に重要な米、トウモロコシ、および小麦等の穀物類は、他の方法でトランスホームしなければならない。植物のプロトプラストのトランスホーメーションは、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、およびこれらの処理の組み合わせに基づいて行いうる。たとえば、ポトリカス（Potrkus)等、Mol. Gen. Genet., １９９：１７８（１９８５）；フロム（Fromm)等、Nature，３１９：７９１（１９８６）；ウチミヤ（Uchimiya) 等、Mol. Gen. Genet.２０４：２０４（１９８６）；カリス（Calis)等、Genes and Development,  １：１１８３（１９８７）；およびマーコット（Marcotte)等、 Nature,３３５；４５４（１９８８）参照。
【００３７】
種々の植物へのこれらのシステムの応用は、プロトプラストから特定の植物種を再生する能力に依存する。プロトプラストからの穀物を再生する代表的方法は、フジムラ（Fujimura)等、Plant Tissue Culture Letters, ２：７４（１９８５）；トリヤマ（Toriyama) 等、Plant Cell Rep.,  ４：８５（１９８６）；アブダラ（Abdullah) 等、Biotechnology,４：１０８７（１９８６）に報告されている。
葉、および他の組織のアグロバクテリウム（Agrobacterium)仲介トランスホーメーションは、天然でアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)が感染する植物に限られるようである。従って、アグロバクテリウム（Agrobacterium)仲介トランスホーメーションは、双子葉植物に対してもっとも効率的な方法である。しかし、アグロバクテリウム（Agrobacterium)を用いたアスパラガスのトランスホーメーションも成功している。たとえば、バイトビア（Bytebier)等、Proc. Natl. Acad. Sci.，８４：５３４５（１９８７）参照。
【００３８】
プロトプラストからうまく再生できない植物をトランスホームするには、インタクトの細胞または組織にＤＮＡを導入する別の方法が使用される。たとえば、未熟な胚または移植物からの穀物の再生は、ダシル（Dasil), Biotechnology, ６：３９７（１９８８）の方法で行いうる。さらに、“粒子ガン”または高速マイクロプロジェクティル法も使用できる。このような技術を用いて、毎秒１から数１００メートルのスピードに加速した小さな（0.５２５μメートル）金属粒子状のＤＮＡを細胞膜を貫通させ、細胞質に取り込ませる。これらは、クレイン（Klein)等、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,８５：８５０２（１９８８）；およびマガベ（McCabe)等、Biotechnology,  ６：９２３（１９８８）に報告されている。この金属粒子は、細胞の幾つかの層を貫通し、組織片内で細胞のトランスホーメーションを起こす。金属粒子を用いてうまくトウモロコシ細胞がトランスホームされ、また繁殖可能で安定な形質転換タバコおよび大豆植物が生産された。組織断片のトランスホーメーションで、プロトプラスト段階の通過が必要でなくなり、トランスジェニック植物生産のスピードが上がった。
【００３９】
ゾウ（Zhou）等、Methods in Enzymology,  １０１：４３３（１９８３）；Ｄ．ヘス（Hess), Intern Rev. Cytol.,  １０７：３６７（１９８７）；ルー（Lou)等、Plant Mol. Biol. Reporter, ６：１６５（１９８８）に報告されているように花粉に直接ＤＮＡを転移させることにより植物にＤＮＡを導入できる。ポリペプチドコード遺伝子の発現は、ペナ（Pena）等、Nature, ３２５：２７４（１９８７）に述べられているように植物の再生器官にＤＮＡを注入することによっても達成される。また、ニューハウス（Neuhaus)等、Theor. Apl. Genet., ７５：３０（１９８７）；およびベンブルーク（Benbrook) 等、Proceedings Bio Expo  １９８６，バターワース、ストーンハム、ＭＡｐｐ．２７−５４（１９８６）に報告されているように未熟胚または乾燥胚の再水和物の細胞に直接ＤＮＡを注入できる。
単一の植物プロトプラストまたは種々の植物断片からの植物の再生もよく知られている。たとえば、Methods for Plant Molecular Biology,  Ａ．ワイズバッハ（Weissbach)およびＨ．ワイズバッハ（Weissbach)編、アカデミックプレス、サンダィエゴ、ＣＡ（１９８８）参照。この再生および生育過程には、トランスホーマント細胞および新芽の選択、トランスホーマント新芽の根づけ、土壌における植物の生育のステップが含まれる。
【００４０】
葉断片からのアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)によって導入された外来遺伝子を含む植物の再生は、ホーシュ（Horsch)等、Science, ２２７：１２２９−１２３１（１９８５）に述べられている方法で行いうる。この操作では、トランスホーマントを選択剤の存在下、フレーリー（Fralev) 等、Rroc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,８０：４８０３（１９８３）に述べられているようにトランスホームされた植物種の新芽の再生を誘導する培地中で生育させる。一般に、この操作で２−４週間以内に新芽が生産され、ついでこれら新芽のトランスホーマントを選択剤とバクテリアの増殖を防ぐ抗生物質を含む適当な根誘導性培地に移す。選択剤の存在下で植物を形成する新芽のトランスホーマントを土壌に移植し、根を作らせる。これらの操作は使用する植物種によって変わるが、その方法はよく知られている。
【００４１】
２．第二ポリペプチドをコードする遺伝子の第二植物種への挿入
自然に第一ポリペプチドと会合し生物学的に機能的な蛋白質マルチマーを形成しうる第二ポリペプチドをコードする遺伝子が有用である。この第二ポリペプチドをコードする遺伝子を第二植物種に導入するのに用いる方法は、遺伝子を第一の同じ植物種に導入するのに用いた方法と同じであり、先に説明した。
【００４２】
３．第一および第二トランスホーマントの子孫集団の生産
第一および第二トランスホーマントから子孫集団を生産するには、メンデル（Mendel)（１８６５）（メンデルのオリジナルペーパーの英語訳は、別の人のコメントとメンデルの書籍目録と共に、植物ハイブリダゼーション実験、エジンバラ、スコットランド、オリバー、ボイド（Olive Boyd) 編、１９６５に見られる）によって述べられている交配として知られている方法で行いうる。
【００４３】
４．蛋白質マルチマーを含む子孫の単離
目的の蛋白質マルチマーを含む子孫は、従来法を用いて生物学的蛋白質マルチマーの存在を検定する事により同定しうる。このような方法には、ウエスタンブロッティング、イムノアッセイ、結合検定法および生物学的蛋白質マルチマーを検出するよう設計された全ての検定法が含まれる。たとえば、免疫学：自己−非自己認識の科学、クレイン（Klein)，ジョンウィリーアンドサンズ版、ＮＹ，ＮＹ（１９８２）参照。
スクリーニング法としては、蛋白質マルチマー上の生物学的活性部位が検出可能なシグナルを生成することにより検出される方法が好ましい。このシグナルは、直接的または間接的に生成され、たとえば、このようなシグナルには、複合体の生成、触媒反応物の生成、エネルギーの放出または取り込み等が含まれる。例えば、この方法で生産される抗体分子を含む子孫を、抗体：ラボラトリーマニュアル、ハーロー（Harlow)およびレーン(Lane)編、コールドスプリングハーバーラボラトリー，コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８８）に述べられているイムノアッセイと同様のＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイ等の標準的イムノアッセイにおいてその抗体が抗原に結合するように処理する。さらに、本発明の特徴には、第一および第二ポリペプチドを含む蛋白質マルチマーを生産する方法を提供することにある。一般に、この方法には、本発明の植物を培養すること、および培養により目的の蛋白質マルチマーを生産する植物を収穫することを含んでいる。
目的の第一および第二ポリペプチドからなる蛋白質マルチマーを含む本発明の植物は、良く知られている方法で培養する。本発明のトランスジェニック植物は、いずれも培養することによりそれらが含む目的の蛋白質マルチマーを単離しうる。
培養後、そのトランスジェニック植物を収穫し、生成した蛋白質マルチマーを回収する。この収穫ステップは、植物体、その葉または、その根の収穫を含む。このステップでその植物を殺してしまう場合と、そのトランスジェニック植物の一部のみを収穫する場合には、その残りの部分をさらに生育させることもできる。
【００４４】
好ましい態様の収穫ステップには、さらに、
（1)  前記トランスジェニック植物の少なくとも一部をホモジナイズして植物パルプを作る、
（2)  前記植物パルプから前記蛋白質マルチマーを抽出し、蛋白質マルチマー含有溶液を作る、および
（3)  前記溶液から前記蛋白質マルチマーを単離する
以上（１）−（３）のステップを含む。
従来法により、トランスジェニック植物の少なくとも一部をホモジナイズして植物パルプを調製する。このトランスジェニック植物の一部が細かく壊れ、植物パルプが生成するならこのホモジナイゼーション操作は手を使っても、機械的、または化学的手段を用いても構わない。この植物パルプはいろいろなサイズのトランスジェニック植物粒子を含んでいる。許容しうる植物粒子のサイズおよびサイズ分布は、植物パルプから蛋白質マルチマーを抽出するのに用いる方法に依存し、それらのパラメーターはよく知られている。
先に示したように生成した植物パルプから蛋白質マルチマーを抽出し、蛋白質マルチマー含有溶液を調製する。この抽出操作は、一般的なもので、当分野でよく知られているものである。たとえば、この抽出操作には、適当な溶媒中での植物パルプの浸せきが含まれる。この適当な溶媒は、植物パルプ中に存在する蛋白質マルチマーを溶解し、蛋白質マルチマー含有溶液を作りうる。この抽出操作に有用な溶媒は良く知られており、水性溶媒、有機性溶媒、およびこれらの組み合わせ物が使用される。
蛋白質単離に関する従来法を用いて、先の溶液から蛋白質マルチマーを単離する。これらの方法には、免疫アフィニティー精製および単離する蛋白質マルチマーの特定のサイズ、電気泳動移動度、生物学的活性および、または荷電に基づく精製法が含まれる。
【００４５】
Ｃ．トランスジェニック植物の作用
本発明は、流体サンプルから所定のリガンドを分離する新しい方法を提供する。この方法は、以下の要素を含んでいる。
１．流体サンプルを本発明のトランスジェニック植物由来の植物細胞と混ぜて、混合物とする。
２．リガンドが植物細胞内に入り、蛋白質マルチマーに結合してその植物細胞内で複合体を生成するのに十分な時間この混合物を維持する。
３．この混合物から複合体含有植物細胞を取り出すことにより、その流体サンプルからリガンドが分離する。
流体サンプルを蛋白質マルチマーを含む本発明のトランスジェニック植物由来の植物細胞と混合する。この蛋白質マルチマーは、レセプター、酵素、免疫グロブリン産物、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、またはアブザイムである。当業者は、この蛋白質マルチマーが所定のリガンドを結合できなければならないことを理解できよう。流体サンプルは、液体でも気体でもよい。いずれの場合もその混合操作は、植物細胞を液体、または気体のなかに置くことを含む。また、植物細胞をその流体サンプルと完全に混合することもできる。この混合操作は、流体サンプルを植物細胞と良く接触させて混合物を調製しなければならない。
【００４６】
この混合物を、流体サンプル中に存在するリガンドが細胞に入るのに十分な時間維持する。この過程は、拡散などの受動的過程でも、また流体サンプルに高圧を掛けてそれを植物細胞中に送るようなエネルギーを使う過程でもよい。リガンドが植物細胞中に入るのに必要な時間は良く知られており、予めこの至適時間を決定しうる。植物細胞への侵入後、リガンドは蛋白質マルチマーと結合して複合体を形成する。この蛋白質マルチマーがレセプターのとき、生成する複合体はレセプター−リガンド複合体である。この蛋白質マルチマーが免疫グロブリン、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の一部、Ｆａｂフラグメント、またはＦｖフラグメントであるとき、生成する複合体は免疫反応複合体である。蛋白質マルチマーが酵素で、かつリガンドが基質のとき、生成する複合体は酵素−基質複合体である。蛋白質マルチマーがアブザイムであるとき、生成する複合体は免疫反応複合体である。
【００４７】
植物細胞内で複合体が生成した後、その混合物から複合体含有植物細胞を除くことにより流体サンプルからリガンドを分離する。混合物から植物細胞を除く方法はよく知られており、機械的除去、濾過、沈殿およびその他の分離手段が含まれる。
この方法で使用する植物細胞が生植物を構成しているとき、この手段はリガンドを植物内に濃縮する。リガンドが重要な栄養の場合、その細胞内に特定の栄養が濃縮され、その植物の栄養価が増加する。リガンドが環境汚染物の場合、これが植物細胞内に濃縮され環境から除去しうる。もちろん、応用する方法においてリガンドが植物細胞に入らなければならない。植物細胞に入ることが出来るリガンドは、当分野でよく知られている。
また、本発明は金属イオンを含む流体サンプルから金属イオンを分離する方法に関する。この特定の方法には、以下のステップが含まれる。
【００４８】
１．流体サンプルをキレート剤と混合し混合物とする。
２．金属イオンがキレート剤と結合し、金属イオンキレート複合体を形成するのに十分な時間このキレート混合物を維持する。
３．金属イオンキレート複合体を本発明の植物細胞と混ぜ、結合混合物を作る。
４．金属イオンキレート複合体が植物細胞に入り、蛋白質マルチマーと結合して反応複合体を生成するのに十分な時間この結合混合物を維持する。
５．この結合混合物から反応複合体含有植物細胞を除去して、流体サンプルから金属イオンを分離する。
【００４９】
この方法を実施するのに有用なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびビス（ビス−カルボキシメチルアミノプロピル）フェニルイソチオシアネート（ＣＩＴＣ）がある。たとえば、ミアレス（Meares）等、Analytical biochemistry,  １４２：６８−７８（１９８４）参照。流体サンプルは気体でも液体でもよく、キレート剤と混合してキレート混合物を生成する。
このキレート混合物を、金属がキレート剤と結合し金属イオンキレート複合体を生成するのに十分な時間維持する。金属イオンがキレート剤と結合するのに必要な時間は、少なくとも使用するキレート剤の種類および金属の濃度に依存する。少なくとも一つの金属イオンがキレート剤と会合し、それと結合して複合体を作るとき金属イオンキレート複合体が生成する。
この金属イオンキレート複合体を本発明の植物細胞と混合する。これらの植物細胞は、金属イオンキレート複合体を特異的に結合しうる蛋白質マルチマーを含む。たとえば、この植物細胞は、レアドン（Reardon)等、Nature, ３１６：２６５−２６８（１９８５）およびミアレス（Meares) 等、Analytical Biochemistry,  １４２：６８−７８（１９８４）に述べられている免疫グロブリン分子と同じ金属キレート複合体に免疫特異的な免疫グロブリンを含みうる。
【００５０】
この結合混合物を、金属イオンキレート複合体が植物細胞に侵入し蛋白質マルチマーに結合するのに十分な時間維持して、植物細胞との反応複合体を形成する。この結合混合物は、金属イオンキレート複合体が蛋白質マルチマーと結合する条件下に維持しなければならない。このような条件は、当分野でよく知られている。金属イオンキレート複合体が植物細胞に入るのに必要な時間は様々で、少なくとも金属キレート複合体の濃度およびサイズに依存する。金属イオンキレート複合体は、拡散などで受動的に植物細胞に入れることもできるし、また、圧力で強制的に植物細胞に入れることもできる。金属イオンキレート複合体が植物細胞に存在する蛋白質マルチマーと結合するとき生成する反応複合体は、キレート剤に結合した金属イオン、キレート剤、および蛋白質マルチマーを含む。それから反応複合体含有植物細胞を結合混合物から除くことにより、流体サンプルから金属イオンを分離する。植物細胞は、機械的除去、濾過、沈殿およびその他の分離手段を含む従来法で除去できる。本方法で使用する植物細胞が、生植物を構成する場合、本方法で植物中に金属が濃縮される。
【００５１】
本発明のトランスジェニック植物は、従来法を用いてトランスホームした有性的に交配可能な植物種から生産しうる。有用な植物種には、タバコ、トマト、豆、アルファルファ、樫、および楓を含む双子葉植物、芝、トウモロコシ、穀類、オーツ麦、小麦、および大麦を含む単子葉植物、および裸子植物、毬果植物、トクサ、ヒカゲノカズラ、苔類、マツモ、蘚類、藻類、配偶体、シダの胞子体が含まれる。
本発明のトランスジェニック植物は、プロモーターに機能的に結合したポリペプチドコード遺伝子を含んでいる。有用なプロモーターは良く知られており、これには誘導可能プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、時間調節プロモーター、空間調節プロモーター、および空間時間調節プロモーターが含まれる。
【００５２】
本発明の好ましい態様のトランスジェニック植物は、免疫グロブリン産物を含む。有用な免疫グロブリン産物は良く知られており、これには免疫グロブリン重鎖、重鎖および軽鎖を含む免疫グロブリン分子が含まれる。一本鎖抗原結合蛋白質としては、免疫グロブリンの半分、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント等が知られている。免疫グロブリン産物の構造はよく知られており、スタイツ（Stites）等、基礎および臨床免疫学、第四版、ラングメディカルパブリケーション、ロスアラモス、ＣＡに示されている。一本鎖抗原結合蛋白質の構造は、バード（Bird）等、Science,２４２：４２３−４２６（１９８８）およびラドナー（Ladner)のアメリカ特許 No.4,７０4,６９２に示されている。
免疫グロブリン、または抗体分子は、ＩｇＤ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭおよびＩｇＥなど幾つかのタイプの分子を含む非常に大きな分子群である。一般に、抗体分子は、各々二つの重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）からなり、その各々の鎖は可変部（Ｖ）と不変部（Ｃ）の両方を含んでいる。免疫グロブリンの幾つかの領域には、ポリメレースチェーンリアクションを用いて免疫グロブリン遺伝子を単離するのに有用な保存的配列が含まれている。免疫グロブリン分子に関する代表的保存配列を示すアミノ酸および核酸配列データは、カバット（Kabat)等、免疫学的に重要な蛋白質の配列、ナショナルインスチチゥートオブヘルス、ベセスダ、ＭＤ（１９８７）に編集されている。ＨまたはＬ鎖のＶ領域は、一般的に各々保存配列を含み比較的変化の少ない四個のフレームワーク（ＦＲ）領域（図１）を含む。ＶHのＦＲ１およびＦＲ４（Ｊ領域）フレームワーク領域由来の保存配列の使用は好ましい態様の一つであり、実施例で説明する。一般に、フレームワーク領域は、いくつか、または全ての免疫グロブリン型に保存されており、従ってそこに含まれる保存配列は、可変部の単離に特に適している。
【００５３】
特に有用な免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖である。免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン重鎖可変部と免疫グロブリン重鎖不変部を含んでいる。免疫グロブリン重鎖可変部は、抗原結合部位（あるいは抗体結合部位）を含むポリペプチドである。それゆえ、免疫グロブリン重鎖可変部は、特定のエピトープを特異的に結合しうる。ＶHは、約１１０乃至１２５アミノ酸残基長であることが望ましい。このアミノ酸残基配列は、ＶHが結合しうる特定の抗原に応じて様々である。通常、ジスルフィド結合で互いに結合し、約６０−７５アミノ酸残基で分離されている少なくとも二個のシステイン残基を含む。免疫グロブリン不変部（ＣH）には、アルファ、ガンマ１、ガンマ２、ガンマ３、デルタ、ミュー、またはイプシロンのヒトアイソタイプがある。もし、免疫グロブリン重鎖がマウス由来なら、ＣHはアルファ、ガンマ１、ガンマ２ａ、ガンマ２ｂ、ガンマ３、デルタ、ミュー、またはイプシロンアイソタイプとなる。ＣHは、通常それが単離される動物種に存在するアイソタイプとなる。ＣHが、種々のアイソタイプに由来するドメインからなり、所定の生物学的機能を増加、または提供することもある。いくつかの異なる不変部アイソタイプ由来のＤＮＡ配列を含む遺伝子を組み合わせて、キメラＣHポリペプチドをコードするキメラ遺伝子を生成しうる。このＤＮＡおよび蛋白質は、使用可能な情報源から容易に得ることが出来る。たとえば、アーリー  フード（Early Hood），遺伝子工学、セトロー（Setlow）およびホランダー（Hollaender)編、３巻、プレナム・パブリッシング・コーポレーション、（１９８１），ｐｐ．１５７−１８８；およびカバティー（Kabaty)等、免疫学的に重要な配列、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ（１９８７）参照。これら二つの情報源は、ＶH，ＶL，およびＣL遺伝子および蛋白質に関する多くの配列を含んでいる。
【００５４】
好ましい免疫グロブリン産物は、先に述べた免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むものである。免疫グロブリン軽鎖は、免疫グロブリン軽鎖可変部（ＶL）および免疫グロブリン軽鎖不変部（ＣL）からなる。ＶLは、約９５−１１５アミノ酸残基長である。ヒトおよびマウスに存在するＣLには、二つのアイソタイプ、ラムダアイソタイプおよびカッパアイソタイプがあることは良く知られている。
別の好ましい態様の免疫グロブリン産物は、ＶHのみか、またはＶLと会合したＶHから成り立ちＦｖフラグメントを形成している。
本発明のトランスジェニック植物は蛋白質マルチマーを含んでいる。この蛋白質マルチマーは、上述の免疫グロブリン産物、酵素、特定のリガンドを結合しうるレセプター、またはアブザイムである。
本発明の酵素は、少なくとも二つのポリペプチドを含む蛋白質マルチマーである。これら二つのポリペプチドは、本発明の方法によりトランスジェニック植物に導入される遺伝子によりコードされている。有用な酵素には、アスパラギンサントランスカルバミラーゼ等がある。別の好ましい態様には、特異的リガンドを結合しうるレセプターがある。一般に、このレセプターは、本発明の方法でトランスジェニック植物に導入される遺伝子によってコードされる少なくとも二つのポリペプチドからなる。このようなレセプターおよびこれらの各リガンドには、ヘモグロビン、Ｏ2、プロテインキナーゼ、ｃＡＭＰ等がある。
【００５５】
本発明の別の好ましい態様の免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖およびそれに関連する可変部、または会合して免疫グロブリン分子、Ｆａｂ，Ｆｖまたは免疫グロブリン分子の実質的部分を形成する免疫グロブリン重鎖および軽鎖によって構成されるアブザイムである。代表的アブザイムは、トラモンタノ（Tramontano)等、Science,２３４：１５６６−１５７０（１９８６）：ポラック（Pollack)等、Science,２３４：１５７０−１５７３（１９８６）：ジャンダ（Janda)等、Science,２４１：１１８８−１１９１（１９８８）：およびジャンダ（Janda)等、Science,２４４：４３７−４４０（１９８９）に報告されている。
一般的に、本発明の蛋白質マルチマーは、少なくとも二つのポリペプチドを含む。しかし、二つ以上のポリペプチドを含むこともできる。これらの各ポリペプチドは、別々のポリペプチドコード遺伝子によってコードされている。これらのポリペプチドは、ジスルフィド結合、水素結合等により互いに会合し蛋白質マルチマーを形成する。
【００５６】
本発明のトランスジェニック植物の子孫、またはその子孫によって生産されるトランスジェニック植物も本発明の一部に含まれる。これらのトランスジェニック植物は、親のトランスジェニック植物に含まれているものと同じ蛋白質マルチマーを含む。このようなトランスジェニック植物は、親植物の無有性的増殖または自家受粉により作製できる。植物の無有性的増殖または自家受粉の過程は、良く知られている。
さらに、本発明は、複合体を含むトランスジェニック植物に関する。一般に、このような複合体含有トランスジェニック植物は、流体サンプルにキレート剤を添加してキレート混合物を調製し、流体サンプル中に存在する金属がキレート剤と結合して金属キレート複合体を形成した後、この金属キレート複合体を本発明のトランスジェニック植物細胞と混合して結合混合物を生成するのに十分な時間、この混合物を維持し、さらに、この結合混合物を、金属キレート複合体が植物細胞中に入り、その植物細胞中に存在する蛋白質マルチマーと結合してその細胞内で複合体を形成するのに十分な時間維持することにより得られる。
また、本発明は、金属キレート複合体および免疫グロブリン産物を含む反応複合体を含有するトランスジェニック植物に関する。一般に、このトランスジェニック植物は、本発明の方法で作製される。
【００５７】
Ｄ．生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー
本発明は、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および（ｂ）コア部分、およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有するポリペプチドを少なくとも二つ含み、しかもシアル酸残基を含まない生物学的に活性なグリコポリペプチドに関する。
好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーには、免疫グロブリン、Ｔ−細胞レセプター複合体分子、主要組織適合生複合体抗原等のアミノ酸残基配列のような免疫グロブリンスーパーファミリー分子のアミノ酸残基配列が含まれる。免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン重鎖可変部、または免疫グロブリン重鎖可変部の一部のアミノ酸残基配列を含む生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが特に好ましい。免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン軽鎖可変部、または免疫グロブリン軽鎖可変部の一部のアミノ酸残基配列を有するグリコポリペプチドマルチマーも好ましい。
【００５８】
ある好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーには、グリコシル化コア部分とＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチ、および他のアミノ酸残基配列を含む少なくとも一つの別のポリペプチドに結合する免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドが含まれる。好ましい態様の別のポリペプチドには、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン重鎖可変部、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン軽鎖可変部、または免疫グロブリン軽鎖の一部のアミノ酸配列が含まれる。
別の好ましい態様のグリコポリペプチドマルチマーには、さらにこのグリコポリペプチドマルチマーに存在する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の一部に結合する免疫グロブリンＪ鎖が含まれる。Ｊ鎖は、ＩｇＡおよびＩｇＭポリマーおよびＩｇＧ，ＩｇＤ，ＩｇＥなどの他の免疫グロブリンおよび他の種々のサブクラスの免疫グロブリンアイソタイプに会合するポリペプチドである。
ヒトおよびマウスのＪ鎖のアミノ酸組成は、モル（Mole)等、Biochemistry, １６：３５０７（１９７７），マックス（Max)およびコースメイヤー（Korsmeyer)，J. Exp. Med,. １６１：８３２（１９８５），カン（Cann) 等、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,７９：６６５６（１９８２），およびコシュランド（Koshland), Annu. Rev, Immunol., ３：４２５（１９８５）に報告されている。Ｊ鎖は、酸性アミノ酸を多く含み、グリシン、スレオニン、システインは少なく、メチオニンはたった一つ含んでいる。Ｊ鎖には８個のシステイン残基が含まれており、そのうちの６個は鎖間のジスルフィド結合に関与しており、他の２個はアルファまたはミュー重鎖などの免疫グロブリン重鎖の末端から二個目のシステイン残基に結合している。メンデス（Mendez) 等、Biochm. Biophys. Res. Commun., ５５：１２９１（１９７３），メステキー（Mesteckey)等、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,７１：５４４（１９７４），メステキー（Mesteckey)およびシュロヘンロハー（Schrohenloher), Nature, ２４９：６５０（１９７４）参照。
【００５９】
また、好ましい態様のグリコポリペプチドマルチマーには、グリコポリペプチドマルチマー中に存在する免疫グロブリン重鎖アミノ酸残基配列のＦｃ領域に結合する分泌要素が含まれる。この分泌要素は、５４９−５５８アミノ酸残基の一本のポリペプチド鎖および５−７個のオリゴサッカライド側鎖としてアスパラギン残基にＮ−グリコシド結合により結合する大量の炭水化物を含んでいる。モストフ（Mostov) 等、Nature, ３０８：３７（１９８４）；エイファート（Eiffert)等、Hoppe Seyler's C. Physiol. Chem., ３６５：１４８９（１９８４）；ヘレマンズ（Hermans), N. The Antigens, M. セラ（Sera) 編、２：３６５，アカデミックプレス、ニューヨーク（１９７４）；トマナ（Tomana) 等、Anal. Biochem., ８９；１１０（１９７８）；プルカヤスサ（Purkayasthaa) 等、 J. Biol, Chem.,２５４：６５８３（１９７９）；およびミゾグチ（Mizohuchi)等、J. Biol, Chem., ２５７：９６１２（１９８２）参照。分泌要素には、鎖内ジスルフィド結合に関する２０個のシステイン残基が含まれている。好ましい態様分泌要素は、グリコポリペプチドマルチマーに存在する免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域に存在するシステイン残基にジスルフィド結合で結合している。
【００６０】
本発明は、グリコシル化したコア部分およびＮ−グルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドを含み、かつ、検出可能なシアル酸を含まないグリコポリペプチドに関する。このポリペプチドは、これに存在するアスパラギンアミノ酸残基のアミド基にＣ（１）炭素を介して直接結合するＮ−アセチルグルコサミンオリゴサッカライドを含むグリコシル化したコア部分を有している。このグリコシル化したコア部分は、図６のボックス領域で示したＭａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎという構造を有している。また、このポリペプチドは、Ｎ−アセチルグルコサミンを含むアウターオリゴサッカライドブランチ（アウターブランチ）を有する。複合体およびハイブリッドアスパラギン結合オリゴサッカライドの両方とも、Ｎ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むが、高マンノースオリゴサッカライドは含まない。バクテリア細胞はアスパラギンに結合するグリコシル化したコア部分を含まない。イースト細胞は複合体型またはハイブリッド型のいずれのアスパラギン結合オリゴサッカライドも含まない。それゆえ、イーストはＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを持たない。植物細胞は、アスパラギンに結合するグリコシル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドを生産しうる。
【００６１】
グリコポリペプチドマルチマーは、グリコシル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドを含み、かつこのマルチマーには、検出可能なシアル酸残基は含まれない。哺乳類の糖蛋白質の末端炭水化物として存在するシアル酸は、植物蛋白質の炭水化物としては同定されていない。植物に存在する末端炭水化物残基には、キシロース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースまたはガラクトースが含まれており、このことはスターム（Sturm)等、J. Biol. Chem., ２６２：１３３９２（１９８７）に報告されている。別の特徴として、植物の糖蛋白質およびその蛋白質に結合する炭水化物は、哺乳類の糖蛋白質に非常に似ている。植物中で生産されるグリコポリペプチドマルチマーには、グリコシル化したコア部分とＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドが含まれるが、検出可能なシアル酸残基は含まれない。
【００６２】
アミノ酸残基配列内に、Ｎ−結合グリコシル化シグナル、アスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニン（Ｘは、おそらくプロリンまたはアスパラギン酸以外のアミノ酸残基）を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、植物細胞内に導入されたときその配列のアスパラギン残基に結合する（Ｎ−結合）オリゴサッカライドによりグリコシル化される。グリコシル化シグナルとして機能するポリペプチド配列の一般的レヴューとしては、マーシャル（Marshall), Ann, Rev. Biochem.,４１：６７３（１９７２）およびマーシャル（Marshall), Biochem. Soc. Symp., ４０：１７（１９７４）参照。これらのシグナルは、哺乳類および植物の両方で認識される。しかし、植物細胞内でのこれらのシグナルは、哺乳類細胞内で見られるような末端シアル酸残基を含むアスパラギン結合オリゴサッカライドは生成せず、Ｎ−結合グリコシル化シグナル配列を含むポリペプチドは、グリコシル化したコア部分とＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むようにグリコシル化され、検出可能なシアル酸残基は含まれない。
【００６３】
本発明のグリコペプチドマルチマー、蛋白質、またはポリペプチドには、小麦胚芽アグルチンまたはリシナス  コムニス（Ricinus communis) アグルチン等のシアル酸に特異的なレクチンへの特異的結合が無いことで示されるように検出可能なシアル酸残基が含まれない。特定のレクチンへのグリコシル化したポリペプチド鎖の結合を測定する方法は良く知られている。たとえば、フェイ（Faye) 等、Anal. Biochem., １４９：２１８（１９８５）およびゴールドステイン（Goldstein)等、Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., ３５：１２７（１９７８）参照。グリコシル化したポリペプチド鎖が特定のレクチンに結合することを検出する方法には、レクチンカラムを使用する方法やグリコシル化したポリペプチドをニトロセルロースに結合させ、ビオチン化したレクチンで検出する方法が含まれる。レクチンの特異性は、シアル酸残基等の特定のオリゴサッカライドとレクチンの結合を競合させることにより測定できる。一般的シアル酸残基を図７に示した。
【００６４】
免疫グロブリンスーパーファミリー分子および免疫グロブリンは、結合する種々の炭水化物残基を有する。一般にこの炭水化物残基は、その重鎖可変部内にトリペプチドアクセプター配列アスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニン（Ｎ−結合シグナル）が存在する場合以外、免疫グロブリン重鎖不変部に存在する。また、そのアミノ酸残基配列内にトリペプチドアクセプター配列（Ｎ−結合グリコシル化配列）を含む他の免疫グロブリンスーパーファミリー分子も、そのトリペプチドアクセプター配列のアスパラギンに結合する炭水化物を含む。図８は、ジェスケ（Jeske)およびカプラ（Capra)、基礎免疫学、Ｗ．Ｅ．ポール（Paul) 編、レーベンプレス、ニューヨーク、ＮＹ（１９８４）に報告されている７個のヒトの重鎖に結合する典型的炭水化物を示している。炭水化物結合部位は、種々の種および相当するクラスの免疫グロブリン重鎖間で非常によく保存されている。表Ｂは、各ヒト免疫グロブリン重鎖に関する種々のオリゴサッカライドを示している。
【００６５】
表Ｂ
ヒト免疫グロブリン重鎖の構造特性
不  変  部                      
全    鎖            
鎖                  ドメイン    鎖間ブリッジ    Ｈ−Ｌブリッジの位置
ガンマ１                  ４        ３                ２２０
ガンマ２                  ４        ５                １３１
ガンマ３                  ４      １２                １３１
ガンマ４                  ４        ３                １３１
アルファ１                ４        ５                １３３
アルファ２  A2m(1)        ４        ４                な  し
アルファ２  A2m(2)        ４        ５                １３３
ミュー                    ５        ４                １４０
エプシロン                ５        ３                １２７
デルタ                    ４        ２                １２８
表Ｂ（続き）
不  変  部                      
オリゴサッカライド   残基のおよその数  
ＧｌｃＮ ＧａｌＮ ヒンジ   Ｃ部  
１          ０          １５      ３３０
１          ０          １２      ３２５
１          ０          ６２      ３７５
１          ０          １４      ３２５
２          ５          ２６      ３５０
４          ０          １３      ３４０
５          ０          １３      ３４０
５          ０            ０      ４５０
６          ０            ０      ４２０
３        ４または５    ６４      ３８０
【００６６】
グリコポリペプチドマルチマーに存在するポリペプチドには、その免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列内にＮ−結合グリコシル化シグナルが含まれることが望ましい。別の好ましい態様では、Ｎ−結合グリコシル化は、免疫グロブリン残基配列ではないポリペプチドの領域に存在する。
好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、分泌性ＩｇＡを含む。分泌性ＩｇＡは、４個の免疫グロブリンアルファ重鎖、４個の免疫グロブリン軽鎖、Ｊ鎖および分泌性要素からなり、これらがすべて結合してＩｇＡダイマーを含む分泌性ＩｇＡ分子を形成している。この分泌性ＩｇＡ分子は、特定の抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖可変部を含む。この分泌性ＩｇＡ分子は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２を含みうる。分泌性ＩｇＡに関する一般的議論については、メステキー（Mesteckey)等、Advances in Immunology, ４０：１５３（１９８７）参照。
【００６７】
動物の最終的に集合した分泌性ＩｇＡは、二つの異なる細胞型：Ｊ鎖を結合するＩｇＡを生産する血漿細胞および分泌性ＩｇＡを生産する上皮細胞の産物である。複合体のトランシトシス、および分泌は、細胞のラミナー表面のみで起こる膜の働きによる。この複合体の４個の成分（アルファ、ガンマ、Ｊ、ＳＣ）の相互作用は、ムコサ表面に関連する分解的環境に対して例外的に耐性のある免疫グロブリン構造を生ずる。
他の好ましい態様の生物学に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、全てジスルフィド結合で互いに結合する５個のＩｇＭ分子、３個のＪ鎖分子および分泌要素を含んでいる。
いずれの分泌性免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＡ）も、蛋白質分解や消化に対して耐性があり、従って肺や消化管などムコサ表面に存在する場合にも活性を有する。トマシ（Tomasi), N．基礎および臨床免疫学、ｐ．１９８，ラング
メディカル  パブリケーション、ロスアラモス、ＣＡ（１９８２）参照。
【００６８】
好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、その中に触媒部位を含む。この触媒部位は、一つ以上のポリペプチドから形成される酵素部位である。一般に、この触媒部位は、単独で、または他のポリペプチドのアミノ酸残基配列と共に触媒部位を形成することが知られているアミノ酸残基配列によって規定される。この触媒部位は酵素の活性部位、または免疫グロブリンの結合部位となる。たとえば、トラモンタノ（Tramontano) 等、Science,２３４：１５６６（１９８６）参照。また、本発明は、 Biochemistry,ワース  バブリッシャー、ＮＹ（１９７５）に述べられている酵素などの触媒部位を含む別の酵素に関する。
別の好ましい態様におけるように、本発明は、グリコシル化コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドを含む生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、かつ別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含むポリペプチドに結合する免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含み、検出可能なシアル酸を含まないマルチマーに関する。
【００６９】
本発明は、グリコポリペプチドマルチマーの触媒部位が、第一および第二部分からなる触媒性グリコポリペプチドマルチマーに関する。また、触媒性部位の第一部分は、免疫グロブリンアミノ酸残基配列に規定される。触媒性部位の第二部分は、別の免疫グロブリンアミノ酸残基配列に規定される。これらの触媒性部位の第一および第二部分が会合して、より大きい触媒性部位を形成する。より好ましい態様では、触媒性部位の第一部分は免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列により規定され、触媒性部位の第二部分は重鎖アミノ酸残基配列と会合しより大きい触媒性部位を形成する免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列によれ規定される。
【００７０】
また、本発明は、
（1)  グリコシル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチおよび免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有し、かつマウス免疫グロブリン結合レクチンを結合しないポリペプチド、および
（2)  前記ポリペプチドに結合し、前記免疫グロブリンアミノ酸残基配列とは異なる免疫グロブリンアミノ酸残基配列を含む別のポリペプチド、
以上（１）および（２）を含む生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーに関する。
マウス免疫グロブリン結合レクチンには、小麦胚芽アグルチニンおよびリシナス  コムニス（Ricinus communis) アグルチニン等の末端シアル酸残基に特異的に結合するレクチンが含まれる。マウス免疫グロブリン結合レクチンは、末端シアル酸残基に特異的であり、植物で生産された免疫グロブリンは末端シアル酸残基を含まないことから植物細胞で生産された免疫グロブリンには結合しない。レクチン結合性に関する一般的議論については、オサワ（Osawa)等、Ana. Rev. Biochem., ５６：２１−４２（１９８７）参照。
【００７１】
Ｅ．植物で生産された免疫グロブリンを用いた受動免疫化
本発明は、動物のムコサ表面と所定のリガンドを結合しうる本発明の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを含む組成物を接触させることにより所定のリガンドに対して動物を受動免疫化する方法に関する。
所定の抗原を結合しうる免疫グロブリン分子などの生物学的に活性なグリコポリペプチドは、植物細胞で効率的、かつ経済的に生産される。これらの免疫グロブリン分子にはシアル酸が含まれないが、グリコシル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチが含まれる。好ましい態様における免疫グロブリン分子は、ＩｇＡ，ＩｇＭ，分泌性ＩｇＭまたは分泌性ＩｇＡである。
分泌性ＩｇＭおよび分泌性ＩｇＡ等の分泌性免疫グロブリンは、蛋白質分解および変性に対して耐性があり、厳しい環境で使用するには適している。この厳しい環境には酸性環境、高温環境、その他の厳しい環境が含まれる。たとえば、動物の消化管は、プロテアーゼと酸が存在する厳しい環境である。コバヤシ（Kobayashi)等、Immunochemistry,１０：７３（１９７３）参照。動物の受動免疫は、動物のムコサ表面とグリコポリペプチドマルチマーを接触させることにより誘導する。動物には、肺、消化管、上咽頭腔、膣系などを含む種々のムコサ表面がある。一般に、これらのムコサ表面には唾液、涙、鼻汁、気管支液、腸液、胆汁、子宮液などを含む種々の分泌液を生産する細胞が含まれる。
【００７２】
好ましい態様の免疫グロブリン分子などのグリコポリペプチドマルチマーは、所定の抗原に対して免疫特異的である。一般に、この抗原は壊死化腸炎、下痢および腸における発癌性物質の吸収によるガンなどのムコサ表面に関連する病気を起こす病原体上に存在する。たとえば、マクナブ（McNabb) およびトマシ(Tomasi)，Ann. Rev. Microbiol., ３５：４７７（１９８１）およびローレンス（Lawrence) 等、Science,２４３：１４６２（１９８９）参照。ムコサ表面関連病を引き起こす典型的病原体には、大腸菌、Ｓ．チフィムリウム（typhimurium), V. コレラ（cholera)および S．ミュータンス(mutans)等のバクテリアおよびウイルス病原体が含まれる。グリコポリペプチドマルチマーは、これらの病原体に結合し、ムコサ関連またはムコサ侵入病を防ぐことが出来る。
【００７３】
動物のムコサ表面に接触させる好ましい態様の組成物には、植物物質および所定のリガンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが含まれる。この植物物質は、植物細胞壁、植物オルガネラ、植物細胞質、グリコポリペプチドマルチマーを含む植物細胞そのもの、生植物などである。この植物細胞物質は、約１００ナノグラムのグリコポリペプチドマルチマー当たり約１００００グラムの植物物質の割合から、１０グラムのグリコポリペプチドマルチマー当たり約１００ナノグラムの割合の範囲で存在する。より好ましい態様の植物物質は、１mgのグリコポリペプチドマルチマー当たり約１００００グラムの植物物質の割合から、１グラム当たり１００ナノグラムの割合の範囲で存在する。他の好ましい態様における植物物質は、１モリグラムのグリコポリペプチドマルチマー当たり約１００００グラムの割合から、５００mgのグリコポリペプチドマルチマー当たり約１mgの植物物質の割合の範囲で存在する。
【００７４】
好ましい態様における生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを含む組成物は、治療組成物である。活性成分としてポリペプチドまたは蛋白質を含む治療組成物の調製方法は、良く知られている。この治療組成物は、溶液またはサスペンジョンなどの液体、または、摂取前に溶液またはサスペンジョンを調製するのに適した固体である。また、この治療組成物は、エマルジョンとすることもできる。この活性治療成分は、一般に医薬的に許容可能で、かつ活性成分に適合する無機および、または有機キャリヤーと混合する。一般に、このキャリヤーは、治療組成物に混合したとき組成物に適度の濃度と形態を与える概ね不活性な物質を含む生理学的に許容しうる賦形剤である。たとえば、キャリヤーとしては、水、食塩水、デキストロース、グリセリンやこれらの混合物が適する。さらに、必要な場合は、湿潤剤またはエマルジョン剤や活性成分の効果をあげるｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質が含まれる。また、本発明は、栄養価を有するキャリヤーを含む治療組成物にも関する。
【００７５】
好ましい態様における生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを含む組成物には、病原体抗原に免疫特異的な免疫グロブリン分子が含まれる。病原体とは、他の生物に病気を起こす生物である。ムコサ病原体抗原に免疫特異的な免疫グロブリンが特に好ましい。ムコサ病原体抗原は、ムコサ組織を通して生物に侵入するか、またはムコサ関連病を引き起こす病原体にある。ムコサ病原体には、肺病原体、鼻病原体、腸病原体、歯病原体などがある。デービス（Davis)等、Microbiology, 第３編、ハーパーアンドロー版、ハーガースタウン、ＭＤ（１９８０）参照。
病原体に免疫特異的な抗体は、標準的モノクローナル抗体生成技術を用いて生産しうる。抗体：ラボラトリーマニュアル、ハーロー（Harlow) 等、編、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８８）参照。軽鎖および重鎖可変部をコードする遺伝子は、ポリメレースチェーンリアクションおよび適当に選択したプライマーを用いて単離しうる。オランディー（Orlandi)等、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,  ８６：３８３３（１９８９）およびヒューズ（Huse) 等、Science,２４６：１２７５（１９８９）参照。さらに、この可変部を、ハイヤット（Hiatt)等、Nature, ３４２：７６−７８（１９８９）に述べられている発現ベクターなどの植物発現ベクターに挿入する。
【００７６】
好ましい態様における生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、腸病原体抗原に免疫特異的な免疫グロブリンである。大腸菌、サルモネラ（Salmonellae), ビブリオコレラ（Vibrio cholerae), サルモネラ  チフィムリウム（Salmonella typhimurim)、およびストレプトコッカス  ミュータンス（Streptococcus mutans) 等、消化管の病気を起こすバクテリア、ウイルスおよび寄生虫などの腸病原体に免疫特異的な免疫グロブリンが特に好ましい。また、本発明は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８３２９によって生産される抗体など、ジフテリアトキシンに免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマＤ２５３−１５−６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．Ｈ８７８９）によって生産される抗体など、シュードモナス  エルジノサ（Pseudomonas aeruginosa) エクソトキシンＡに免疫特異的な抗体；ハイブリドーマＴＦＴ  Ａｌ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７７１）またはＴＦＴＢ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１７５９）によって生産される免疫グロブリン等、リシンＡまたはＢ鎖に免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマ１３０Ｃ／２Ｂ／８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８０８８）によって生産される抗体など、シストソマ  マンソニ（Schistosoma mansoni)糖蛋白質に免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマ１３Ｃ４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１７４９）によって生産される抗体など、シゲラＳＨＩＧＡトキシンまたはシゲラ様トキシンに免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマ９Ｆ１２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８１７７）およびハイブリドーマＳＡ１３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８５０１）によって生産される免疫グロブリンなど、破傷風トキシンに免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマ７Ｃ２Ｖ５Ｃ１２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８６７８）などトリチネラ  スピラリス（Trichinella spiralis) に免疫特異的な免疫グロブリン；Ｄ３−２Ｈ２−９−２１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ１１４），ハイブリドーマ１５Ｆ３−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ４７），ハイブリドーマ３Ｈ５−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ４６）、ハイブリドーマ５Ｄ４−１１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ４９），ハイブリドーマ１Ｈ１０−６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ４８）によって生産される免疫グロブリンなど、デング熱ウイルスまたは複合体に免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマＨ２５Ｂ１０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ８０１７），ハイブリドーマＨ２１Ｆ８−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ８０１８）など、Ｂ型肝炎表面抗原に免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマ１Ｄ４８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８０６８），ハイブリドーマ３９−Ｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８１８０），ハイブリドーマ５２−Ｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８１８１），ハイブリドーマ３Ｎ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８０６７）によって生産される免疫グロブリンなど、ヘルベスシンプレックスウイルスに免疫特異的な免疫グロブリン；ＨＫ−ＰＥＧ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＬ１８９），ハイブリドーマＭ２−１Ｃ６−４Ｒ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ６４）によって生産される免疫グロブリンなど、インフルエンザウイルスに免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマ９−３−４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８９３５）によって生産される免疫グロブリンなど、パラインフルエンザウイルスに免疫基特異的な免疫グロブリン；および３Ｃ９���Ｄ１１−Ｈ１１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７４５）によって生産される免疫グロブリンなど、パルボウイルスに免疫特異的な免疫グロブリンであるグリコポリペプチドマルチマーに関する。別の好ましい態様における組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマーは、ストレプトコッカス  ミュータンス（Streptococcus mutans) などの歯病原体抗原に免疫特異的な免疫グロブリン分子である。特にハイブリドーマ１５Ｂ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８５１０）によって生産される免疫グロブリンなどのストレプトコッカス  ミュータンス（Streptococcus mutans) に免疫特異的な免疫グロブリンが好ましい。
【００７７】
本発明は、脊椎動物などの動物の受動免疫化に関する。好ましい態様においては、魚、鳥、爬虫類、両生類または昆虫が受動免疫化される。また、別の好ましい態様では、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどが受動免疫化される。特に好ましい態様では、成熟した哺乳類が受動免疫化される。
好ましい態様において、乳離れし、もはや母親からのミルクを摂取しない哺乳類などの動物が受動免疫化される。そのような動物の受動免疫は、その動物に所定のリガンドに免疫特異的なグリコポリペプチドマルチマーを含む十分な量の組成物を投与し、動物体内に予防濃度のグリコポリペプチドマルチマーを提供することにより誘導する。免疫グロブリンなどグリコポリペプチドマルチマーの予防濃度とは、動物に存在する病原体と結合し、これが検出可能な病気が起こるのを防ぐのに十分な量を意味する。予防濃度を実現するのに必要なグリコポリペプチドマルチマーを含む組成物量は、当分野でよく知られているように動物のサイズ、存在する病原体の量、その病原体に対する特定のグリコポリペプチドマルチマーのアフィニティー、特定のグリコポリペプチドマルチマーが動物体内の活性局部に供給される効率などに依存して様々である。
【００７８】
また、本発明は、動物にグリコシル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有し、かつ免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を持つポリペプチドを含み、かつ検出可能なシアル酸残基を含まないマルチマーを予防濃度とするのに十分な量の、病原体抗原を結合しうるカプセル化した生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを投与することにより、その動物に病原体に対する受動免疫を提供する方法に関する。
好ましい態様において、生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは保護コーティングでカプセル化している。カプセル物質には、メンブレン、ゲル、ポリマー等がある。カプセル物質は、含まれる物質の保護およびカプセル内外の物質の流れのコントロールに働いている。好ましい態様では、グリコポリペプチドマルチマーは植物細胞壁、植物細胞、腸被覆物などにカプセル化されている。
好ましい態様において、組織プラスミノーゲン活性化因子、組み換えヒトインシュリン、組み換えアルファインターフェロン、および成長ホルモン等のグリコポリペプチドマルチマーが種々の方法でうまく投与され、口、鼻および直腸のムコサを通して治療効果をあげている。エプスタイン（Eppstein) 等、薬剤としてのペプチドおよび蛋白質のもう一つの配給システム、ＣＲＣ  Critical. Rev. in Therapeutic Drug Carrier Systems, ５：９９−１３９（１９８８）。
【００７９】
好ましい態様では、生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、溶液状の鼻孔内成形物として投与される。この成形物は、以下の三つの方法：カテーテルによる一回の投与；計量投与ポンプ（ネブライザーとも呼ばれる）による複数回の投与；および計量加圧エアロゾルによる複数回の投与のうちの一つを用いて投与される。必要な場合は、鼻孔ムコサを通したペプチドまたは蛋白質の吸収は、非イオン性ポリオキシエチレンエーテル、グリココレート酸ナトリウム（ＳＧＣ）およびデオキシコレート（ＤＯＣ）等の胆汁塩、およびトーロジハイドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）などのフシジン酸誘導物を含む吸収促進剤の添加により促進できる。
【００８０】
計量スプレーポンプを用いたスプレーにより投与した0.９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、１％ＤＯＣおよび0.５Ｕ／kgインシュリンを含む鼻孔インシュリン成形物は、血清インシュリン濃度を急速に上昇させた。モーゼス（Moses)等、Diabetes, ３２：１０４０（１９８３）。鼻孔スプレー成形物における生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーの投与量は、0.１５mg／kgから６００mg／kg，好ましくは0.１５mg／kgから２００mg／kg，およびもっとも好ましくは１mg／kgから２００mg／kgの範囲である。好ましい態様において、マルチマーはムコサメンブレンを通過せず、従って吸収促進剤は必要としない。生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーの直腸への配給には、幾つかの投与成形物が使用できる。これらには、座薬（エマルジョンおよびサスペンジョン）、直腸ゼラチンカプセル（溶液およびサスペンジョン）および浣腸薬（マクロ：１００ml以上；ミクロ；１−２０ml）が含まれる。また、直腸供給用に２４−４０時間に２mlを供給するよう設計された浸透ポンプが開発された。直腸ムコサの通過量を増加させたいなら、この成形物に鼻孔成形物に関して述べた吸収促進剤を含める。生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーに直腸投与を目的とした好ましい成形物は、先に述べた好ましい範囲の許容可能な投与形態で投与されることが望ましい。
生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、体腔のムコサメンブレンに使用して投与することが出来るリポソーム（ミセル）成形物として投与することが出来る。ジュリアーノ（Juliano)等、J. Pharmacol. Exp. Ther., ２１４：３８１（１９８０）。リポソームは、直径約２０−５０ナノメーターのもっとも小さい単一ラミナーベシクルから直径数十ミクロン単位のマルチラミナーベシクルまでの範囲の種々の物理学的構造を生ずる種々の従来法によって調製する。グレゴリチディアス（Gregoriadias) 編、Liposome Technology,１：Ｃｒｃプレス（１９８４）。鼻孔用成形物についてリストした好ましい投与量の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーをマルチラミナーベシクルの凍結乾燥パウダーで水和しグリコポリペプチド含有リポソームを生成する。
【００８１】
より好ましい態様において、上述の好ましい投与量の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが、アゾアロマチック架橋ポリマーでコートしたゼラチンカプセルで経口的に投与される。アゾポリマーコートグリコポリペプヂマルチマーは、胃および小腸での消化から保護される。アゾポリマーコートグリコポリペプヂマルチマーが、大腸に到達したとき、そこに存在するマイクロフローラが、アゾ結合を還元して架橋を壊し、ポリマーフィルムが消化される。この結果、結腸のルーメンにグリコポレペプチドが放出され、続いて局所的な作用や吸収が起こる。
病原特異的グリコポリペプチドマルチマーは、動物中の特定の位置のマルチマー濃度が予防濃度に達するのに十分な量を投与することが好ましい。特定の予防濃度となるように投与されるマルチマー量は、良く知られているように、存在する病原体量、免疫化を必要とする動物内の位置、病原体に対するマルチマーのアフィニティー、変性や分解に対するマルチマーの耐性、病原体失活様式、投与物成形法などに依存する。
このマルチマーは、毎日一回から四回に分けて、マルチマー約0.１mgから２０００mgを含む植物１０ｇから１０0,０００ｇという形で投与することが好ましい。このマルチマー量で、体重kg当たり約0.０１mgから約2,０００mgの予防濃度が得られる。好ましい態様のマルチマー予防濃度は、体重kg当たり約0.０１mgから約６００mgの範囲である。また、別の態様における予防濃度は、体重kg当たり約0.０１mgから約２００mgの範囲にある。
本発明は、所定のリガンドに対して動物に受動免疫を提供する方法に関する。この方法には、動物体内の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー濃度を予防濃度とするのに十分な量の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを動物に投与することが含まれる。投与するマルチマーには、グリコシル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が含まれ、かつ、このマルチマーには、検出可能なシアル酸残基は含まれない。
【００８２】
病原体に対して動物に受動免疫を提供する方法で、動物体内の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー濃度が予防濃度となるのに十分な量のマルチマーを動物に投与することを含む方法が特に好ましい。投与するマルチマーには、グリコシル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が含まれ、かつ、このマルチマーには、検出可能なシアル酸残基は含まれない。
好ましい態様において、マルチマーは、そのマルチマーと栄養価を有する物質から構成される組成物として投与される。栄養価を有する物質とは、動物がカロリーを誘導しうる物質または化合物である。典型的な栄養価を有する物質には、蛋白質、炭水化物、脂質、脂肪、糖蛋白質、グリコーゲンなどが含まれる。栄養価を有する物質としては、植物物質、または動物物質が特に好ましい。
別の好ましい態様では、マルチマーは、マルチマーおよび生理学的に不活性な物質から構成される組成物として投与される。生理学的に活性な物質には、水やキャリヤー化合物などの溶液が含まれる。
【００８３】
別の好ましい態様では、動物の消化管に植物細胞壁および所定の抗原を結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および（ｂ）コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有するポリペプチドを含む、少なくとも二つのポリペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まないマルチマーを含む組成物を導入することを含む、所定のリガンドに対して動物を受動免疫化する方法が提供される。
別の好ましい態様は、（１）動物の消化管に所定の抗原を結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および（ｂ）コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有するポリペプチドを含む、少なくとも二つのポリペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まないマルチマーを含む植物細胞を含有する組成物を導入すること、および（２）消化管内でその植物細胞を破壊し、消化管内に生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを放出してその動物を受動免疫化する、以上（１）および（２）を含む所定の抗原に対して動物を受動免疫化する方法に関する。
Ｄ．グリコポリペプチドマルチマーを含む組成物
本発明は、生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および（ｂ）コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有するポリペプチドを含む、少なくとも二つのポリペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まないマルチマーのカプセルを含む生物学的に活性な組成物に関する
【００８４】
好ましい態様におけるグリコポリペプチドマルチマーは、植物細胞、植物細胞壁、腸外被などでカプセル化されている。
組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー１００ナノグラムに対し植物物質約１0,０００グラムから組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー１０グラムに対し植物物質約１００ナノグラムの割合で含む組成物が特に好ましい。また、植物物質が、組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー１ミリグラムに対し植物物質約10, ０００グラムから組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー１グラムに対し植物物質約１００ナノグラムの割合で含まれるのがより好ましい。別の態様では、植物物質が、組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー１ミリグラムに対し植物物質約１0,０００グラムから組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー５００ミリグラムに対し植物物質約１ミリグラムの割合で含まれる。
別の態様では、組成物中に、さらにクロロフィル、共働薬、医薬、医薬植物由来の化合物、種々の調合薬等が含まれる。医薬植物由来の化合物は、医薬植物中でグリコポリペプチドを発現させ、その植物を収穫することにより組成物に添加する。
【００８５】
また、本発明は、（ａ）第一植物種のゲノムにグリコポリペプチドマルチマーの構成部分であるＮ−結合グリコシル化シグナルを有する自己結合性モノマーポリペプチドをコードする第一哺乳類遺伝子を導入し、第一トランスホーマントを生成する、（ｂ）第二植物種のゲノムにグリコポリペプチドマルチマーの構成部分であるもう一つの自己結合性モノマーポリペプチドをコードするもう一つの哺乳類遺伝子を導入し、第二トランスホーマントを生成する、（ｃ）前記第一および第二トランスホーマントから子孫集団を作製する、および（ｄ）前記子孫集団からグリコポリペプチドマルチマーを生産するトランスジェニック植物種を単離する、以上（ａ）乃至（ｄ）のステップを含む方法にしたがって生産したグリコポリペプチドマルチマーに関する。
また、本発明は、本発明の方法で生産した他のマルチマーにも関する。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例は、本発明の範囲を説明するもので、これを制限するものではない。
１．ハイブリドーマ細胞系列６Ｄ４からの免疫グロブリン重鎖コード遺伝子および免疫グロブリン軽鎖コード遺伝子の単離
トラモンタノ（Tramontano) 等、Science,２３４：１５６６−１５７０（１９８６）に述べられている抗体６Ｄ４を分泌するハイブリドーマ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で対数期まで増殖する。ウルリッヒ（Ullrich)等、Science,１９６：１３１３（１９７７）の方法で全ＲＮＡをハイブリドーマ６Ｄ４の対数期培養液２リットルから調製する。簡単にいうと、遠心でハイブリドーマ６Ｄ４細胞を収穫し、ポリトロンホモジナイザーを用い、５mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０），0.１Ｍ  ２−メルカプトエタノール（２Ｍｅ）および0.５％ラウリルサコシン酸ナトリウムを含む４Ｍグアニジンチオシアネート溶液７０ml中、室温で２０秒間ホモジネートする。このホモジネートを８０００×ｇで５分間遠心し、不溶性のデブリを除く。
このホモジネート約２８mlを、ベックマンＳＷ７０  Ｔｉローター中で、４mMエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中5.７Ｍ  ＣｓＣｌ（ベセスダリサーチラボラトリー、ゲイサースバーグ、ＭＤ）溶液１０mlのパド上に乗せた。この溶液を、１５℃、毎分５0,０００回転（rpm ）で、少なくとも５時間遠心した。上清を注意深く吸い取り、チューブの壁が乾くまで残存するホモジネートを除去した。このＲＮＡペレットを１０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.４），２mM  ＥＤＴＡおよび0.５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液に溶解した。この溶液をフェノール溶液で二回抽出した。その水層を再びフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２５：１（容積））を含む溶液で抽出した。この水層に1 ／１０倍容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍容のエタノールを加えてＲＮＡを回収した。この溶液を、−２０℃に１２−１８時間維持してＲＮＡを沈殿させた。沈殿を含む溶液を４℃、１0,０００×ｇで、２０分間遠心してＲＮＡ含有ペレットとした。このペレットに７０％エタノール５mlを加えて、ＲＮＡペレットから過剰の塩を除去し、この溶液を４℃、１0,０００×ｇで、１０分間遠心した。このＲＮＡペレットを0.５mlのＤＥＰＣ−Ｈ2 Ｏに溶解し、２６０nmの吸収を測定するための少量の試料を分け取った後、−７０℃で保存した。
【００８７】
Molecular Cloning ： A Laboratory Manusl, マニアチス（Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８２）の方法で、全細胞ＲＮＡから長いポリＡテールを含む配列に富むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製した。簡単にいうと、上記のように調製した全ＲＮＡを、１mlのＤＥＰＣ−Ｈ2 Ｏに溶解し、６５℃に５分間維持した。このＲＮＡ溶液に、１００mMトリス−ＨＣｌ，１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ），2.０mM  ＥＤＴＡ（ｐＨ7.５）および1.０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２×高塩ロードバッファ１mlを加え、この混合物を室温まで冷やした。ついで、この混合物を予め0.１Ｍ水酸化ナトリウムおよび５mM  ＥＤＴＡを含む溶液で洗浄し、さらにＤＥＰＣ−Ｈ2 Ｏで平衡化したオリゴ−Ｔ（コラボレーティブ  リサーチ、タイプ２または３）カラムにかけた。溶出液を滅菌したポリエチレンチューブに回収し、これを６５℃に５分間加熱した後、再び同カラムにかけた。ついで、このカラムを５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５），５００mM  ＮａＣｌ，１mM  ＥＤＴＡ（ｐＨ7.５）および0.５％ＳＤＳを含む高塩ロードバッファ２０mlで洗浄した。１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５），１mM  ＥＤＴＡ（ｐＨ7.５）および0.０５％ＳＤＳを含むバッファ１mlを用いて、オリゴｄＴカラムからメッセンジャーＲＮＡを溶出した。このメッセンジャーＲＮＡをエタノール沈殿で濃縮し、ＤＥＰＣ−Ｈ2 Ｏに溶解した。
【００８８】
このように調製したｍＲＮＡから、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。第一鎖合成、第二鎖合成、平滑末端化反応は、ワトソン（Watson）等、ＤＮＡクローニング、１巻、Ｄ．Ｍ．グローバー（Glover) 編、の操作に従って行った。簡単にいうと、１０μｇのｍＲＮＡを含む溶液を、６５℃に５分間維持し、素早く氷水中で冷やした。この溶液に５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）８mM  ＭｇＣｌ2 ，５０mM  ＫＣｌ，２μｇオリゴ（ｄＴ），１mMｄＡＴＰ，１mMｄＧＴＰ，１mMｄＴＴＰ，１mMｄＣＴＰ，１０mM  ＤＴＴ、６０ユニットＲＮａｓｉｎ（プロメガコーポレーション、マジソン、ＷＩ），４μｇアクチノマイシン、１３５ユニットＡＭＶ逆転写酵素および１０μＣｉ  α32Ｐ−ｄＣＴＰを含む反応混合物１００μｌを混合することにより、第一ｃＤＮＡ鎖を合成した。この反応混合物を４４℃に１時間維持した。さらに、６０ユニットのＲＮａｓｉｎおよび８０ユニットの逆転写酵素を加え、この反応液を４４℃で３０分間維持した。５０mMＥＤＴＡおよび１０％  ＳＤＳを含む0.００５mlを加えることで、この第一鎖ｃＤＮＡ合成反応を停止した。この核酸をフェノール抽出で精製し、ついでエタノール沈殿で濃縮した。
このように生成した全第一鎖ｃＤＮＡ産物に、２０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５），１０mM  ＫＣｌ，５mM  ＭｇＣｌ2 ，１０mM（ＮＨ4)2 ＳＯ4 ，１０mM  ＤＴＴ，0.０５mg／ml  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），５０μＭ  ｄＧＴＰ，５０μＭ  ｄＡＴＰ，５０μＭ  ｄＴＴＰ，５０μＭ  ｄＣＴＰ，１５０μＭ  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ+ ) （シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ），１５μＣｉ／μｌ（α−32Ｐ）ｄＣＴＰ，３０ユニット大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、2.５ユニットＲＮａｓｅＨおよび４ユニット大腸菌ＤＮＡリガーゼを含む溶液１００μｌを混合することにより、第二鎖ｃＤＮＡを合成した。この溶液を１４℃に１時間維持したのち、さらに２５℃に１時間維持した。この反応は、0.０５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ8.０）溶液５μｌ、１０％
ＳＤＳ溶液５μｌを添加することにより停止した。この核酸をフェノール抽出で精製し、エタノール沈殿で濃縮した。
【００８９】
このように生成した二本鎖ｃＤＮＡの末端を以下の平滑化反応で末端平滑化し、クローニングベクターに挿入する準備をした。この二本鎖のｃＤＮＡの半分を、３3.４mM  トリス−酢酸（ｐＨ7.８），６6.６mM酢酸カリウム、１０mM酢酸マグネシウム、0.５mM  ＤＴＴ，８7.５μｇ／ml  ＢＳＡ，３１０μＭｄＧＴＰ，３１０μＭｄＡＴＰ，３１０μＭｄＴＴＰ，３１０μＭｄＣＴＰおよび８ユニットＴ４ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液に加えた。この溶液を、３７℃に３０分間維持し、0.０５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液５μｌを加えることで反応を停止した。生成した平滑末端化ｃＤＮＡは、フェノール抽出およびエタノール沈殿で精製した。
この平滑末端化ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩアダプターをアニールし、ライゲーションした。簡単にいうと、ポリヌクレオチドＮ１（表１）１μｌおよび２０ユニットＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを７０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.６），１０mM  ＭｇＣｌ2 ，５mM  ＤＴＴ，１０mM  ２Ｍｅおよび５００μｇ／ml  ＢＳＡを含む溶液に加えることで、このポリヌクレオチドを５’リン酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃に１０分間維持して反応を停止した。１／１０倍容の２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.４），２mM  ＭｇＣｌ2 および１５mM  ＮａＣｌを含む溶液とともに２０ngのポリヌクレオチドＮ２（表１）をキナーゼ反応液に加えた。この溶液を７０℃で５分間加熱し、ついで水を入れた５００mlビーカー内で、1.５時間かけて室温、約２５℃まで冷やした。この間に、溶液中に存在する二つのオリゴヌクレオチドがアニールし、二本鎖のＥｃｏＲＩアダプターが生成する。
【００９０】
表１  ＥｃｏＲＩアダプターポリヌクレオチド
（N1）  5'-CCTTGACCGTAAGACATG-3'
（N2）  5'-AATTCATGTCTTACGGTCAAGG-3'
【００９１】
アニールしたアダプター５μｌを、５０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５），７mM  ＭｇＣｌ2 ，１mM  ＤＴＴ，１mM  ＡＴＰおよび１０ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に加え、上述の平滑末端化ｃＤＮＡに二本鎖ＥｃｏＲＩアダプターを共有結合させた。この溶液を、３７℃に３０分間維持し、ついで７２℃に５分間維持してＴ４ＤＮＡリガーゼを失活させた。
上記反応液５μｌと、１０mM  ＡＴＰおよび５ユニットＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液を混ぜて、生成したｃＤＮＡの５’末端をリン酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃に１０分間維持してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。
このように調製したｃＤＮＡを、 Molecular Cloning：A Laboratory Manual,マニアチス（Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８２）の方法と同様の方法でサイズ分画し、長いｃＤＮＡ挿入物を得た。簡単にいうと、上述のように調製した反応混合物を、２０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０），1.２Ｍ  ＮａＣｌ，１mM  ＥＤＴＡおよび0.１％サルコシルを含む等倍容の２×ＣＬ４Ｂカラムバッファに加えた。この溶液を、予め膨潤したセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて調製した５mlのＣＬ−４Ｂカラムにロードした。この試料をカラムに入れてから、カラムを１０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０），６００mM  ＮａＣｌ，１mM  ＥＤＴＡおよび0.１％サルコシルを含む１×カラムバッファで満たした。重力でこのカラムの溶液を流し、約２００μｌのフラクションを手で採取した。各フラクションに存在する二本鎖ｃＤＮＡの大きさは、0.８％アガロースゲル電気泳動で測定した。アガロースゲル電気泳動による測定で高分子量のｃＤＮＡを含むフラクションを集め、ブタノール抽出で濃縮し、エタノール沈殿でサイズ分画したｃＤＮＡを得た。
【００９２】
このサイズ分画したｃＤＮＡを、予め制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化したラムダＺａｐ（ストラタジーンクローニングシステム、ラジョラ、ＣＡ）に直接ライゲーションした。このライゲーション混合物を、ストラタジーンクローニングシステムから市販されているギガパックIIゴールドパッケージングイクストラクトを説明書に従って使用しパッケージ化し、ＢＢ４細胞（ストラタジーンクローニングシステム、ラジョラ、ＣＡ）上にプレーティングしてプラークを得た。
このプラークを、ヒト抗体の不変部を含むラジオラベル化したプローブでスクリーニングした。簡単にいうと、ラビッツ（Rabbitts) 等、Cold Spring Harbor Quantitative Bioogy  ４５：８６７−８７８（１９８０），に報告されているヒトＩｇＧ不変部プローブおよびラビッツ（Rabbitts) 等、Cold Spring Harbor Quantitative Bioogy  ４５：８６７−８７８（１９８０）に報告されているヒトカッパ軽鎖プローブを、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,マニアチス（Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２）に示されている標準法でニックトランスレーションした。この方法で調製し、１×１０8 cpm ／μｇ以上の比活性を持つプローブを、従来法により先に調製したライブラリー由来のプラークにハイブリダイズした。簡単にいうと、先に調製したｃＤＮＡライブラリーのタイターは、このライブラリーを１００mM  ＮａＣｌ，５０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５）および１０mM硫酸マグネシウムを含むバッファで段階的に希釈することにより測定した。各希釈物１０μｌを対数期の大腸菌細胞２００μｌと混合し、３７℃に維持してファージをバクテリア細胞に吸着させた。５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ，２ｇ／ｌ硫酸マグネシウム、５ｇ／ｌイーストイクストラクト、１０ｇ／ｌ  ＮＺアミン（カゼイン加水分解物）および0.７％モルテンアガロースを含むトップアガー３mlを調製し、使用するまで５０℃の水浴に保存した。ファージ、バクテリアおよびトップアガーを混ぜ、保温しておいたバクテリア寒天プレート（５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ，２ｇ／ｌ硫酸マグネシウム、５ｇ／ｌイーストイクストラクト、１０ｇ／ｌ  ＮＺアミンおよび１５ｇ／ｌ  ディコアガー）の表面に均等に広げた。このプレートを３７℃に１２−２４時間維持した。この間にバクテリアローン上にランダプラークが生成する。このラムダプラークを計数して、元のライブラリー中に存在した１ml当たりの全プラーク形成ユニットを測定した。
【００９３】
検定したｃＤＮＡライブラリーをプレーティングして、レプリカフィルターを作製した。このレプリカフィルターを用いて、免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードするｃＤＮＡを含む各クローンを分離した。簡単にいうと、１５０ミリメータープレート当たり２００００プラークを生じる容積の検定したｃＤＮＡライブラリーを対数期の大腸菌６００μｌに添加し、３７℃に１５分間維持してバクテリア細胞にファージを吸着させた。バクテリア細胞およびファージを含む溶液に7.５mlのトップアガーを加えた。ファージが吸着したバクテリアをトップアガーと混合しこの混合物をあらかじめ温めておいたバクテリア寒天プレートの表面上に均等に広げた、このプレートを３７℃に１６時間維持した。この間に、バクテリアローン上にプラークが出現した。このプレート上にニトロセルロースフィルターを置き、各フィルターの方向をインクで印を付けた。このフィルターをバクテリアプレート上に１−５分間維持し、ついで先の丸いピンセットで取り上げて、約１分間1.５Ｍ  ＮａＣｌおよび0.５Ｍ  ＮａＯＨを含む変性バッファに浸したスポンジパッド上に乗せた。さらに、このフィルターを、５分間、1.５Ｍ ＮａＣｌおよび0.５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）を含む中和バッファを含むスポンジパッド上に移した。その後、このフィルターを、0.３６Ｍ  ＮａＣｌ，２０mM  ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ7.４）および２mM  ＥＤＴＡを含む溶液中で濯ぎ、ワットマン３ＭＭペーパー上で乾燥させた。各バクテリアプレートに関してこの操作を繰り返し、ハイブリダゼーション用の第二のレプリカフィルターを作った。全てのフィルターを乾燥後、そのシートをワットマン３ＭＭペーパーの間に挟み、フィルターを真空オープンを用いて８０℃で２時間焼いた。これで特異的プローブによるハイブリダゼーション用のフィルターが出来た。
下から完全に濡れるまで、0.９Ｍ  ＮａＣｌおよび0.０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０）を含む溶液の表面に焼いたフィルターを乗せた。このフィルターを同溶液中５分間浸す。ついで、このフィルターを、５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０），１Ｍ  ＮａＣｌ，１mM  ＥＤＴＡおよび0.１％ＳＤＳを含む予洗溶液に移した。この予洗溶液を４２℃に２時間維持した。
【００９４】
フィルターを予洗溶液から取り出し、２５％ホルムアミド、1.０Ｍ  ＮａＣｌ，５０％硫酸デキストラン、0.０５Ｍ  Ｎａ3 ＰＯ4 （ｐＨ7.７），0.００５Ｍ  ＥＤＴＡ，0.１％フィコール、0.１％ＢＳＡ，0.１％ポリ（ビニルピロリドン），0.１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ml変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液に入れた。このプレハイブリダイゼーション溶液中のフィルターを、穏やかに攪拌しながら４２℃で４−６時間維持した。ついで、このフィルターをプレハイブリダイゼーション溶液から取り出し、少なくとも１×１０8 cpm ／μｇの比活性を有する２×１０6 cpm ／mlの32Ｐ−ラベルしたプローブを含むプレハイブリダイゼーション溶液であるハイブリダイゼーション溶液に入れ、穏やかに攪拌しながら４２℃に１２−２４時間維持した。ハイブリダゼーション完了後、ハイブリダゼーション溶液を除き、大量の0.９Ｍ  ＮａＣｌ，0.０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０）および0.１％ＳＤＳを含む溶液を用い、６０℃、１０分間の洗浄を３−４回繰り返した。洗浄溶液からフィルターを取り出し、室温で、ワットマン３ＭＭペーパーに乗せて空気乾燥した。このフィルターを３ＭＭペーパーにテーピングし、プラスチックラップで包み、これを増感スクリーンを用いた−７０℃でのＸ線フィルム（コダックＸＲまたは相当品）の感光に用いてオートラジオグラムを作製した。このフィルムを説明書にしたがって現像した。ポジティブのハイブリリダイゼーションシグナルを、ニトロセルロースフィルター上の非対称なインクスポットにより正しいプラークに合わせた。
【００９５】
ハイブリダゼーションプラークを純度良く単離し、ストラタジーンクローニングシステムズ（ラジョラ、ＣＡ）の説明書およびショート（Short)等、Nucleic Acids Res., １６：７５８３−７６００（１９８８）の基本的なインビボ切りだし法に従い、ラムダＺＡＰベクターから挿入物を切りだした。このインビボ切りだし法でラムダＺＡＰベクターからクローン化した挿入物をファージミドに移し、操作やシーケンシングを容易にした。このハイブリダイズ挿入物を、サンガー（Sanger) 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，７４：５４６３−５４６７（１９７７）のダイデオキシ法に従い、シークエネースＤＮＡシーケンーシングキット（ユナイティドステートバイオケミカルコーポレーション、クリーブランド、ＯＨ）を用いてシーケンシングした。ｐＡＢＺ１００およびｐＡＢＺ１０１と命名した二つの全長軽鎖クローンは、ＤＮＡシーケンシングで同定した。さらに、ｐＡＢＺ２００と命名した一つの全長重鎖クローンも同定した。
これらの全長ｃＤＮＡクローンを、 Molecular Cloning：A Laboratory Manual,マニアチス（Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８２）の操作を用い、ｍｐ１８にサブクローニングした。簡単にいうと、全長ｃＤＮＡクローンを含むファードミドを制限エンドヌクレアーゼで消化し、その全長ｃＤＮＡ挿入物をゲル電気泳動で単離した。この挿入物を予めＥｃｏＲＩで消化したＭ１３ｍｐ１８にライゲーションした。このライゲーション混合物を適当なバクテリア宿主細胞上にプレーティングし、全長ｃＤＮＡ挿入物を含むファージプラークを単離した。このクローニングステップの正しさは、制限地図で確認した。
【００９６】
ミュータジーンＭ１３インビトロミュータジェネシスキット（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）に示されている操作に従い、一本鎖ウラシル含有テンプレートＤＮＡを調製した。簡単にいうと、ｄｕｔおよびｕｎｇ両変異を含むバクテリアＣＪ２３６株の単離クローンを、３０μｇ／mlクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（１０ｇ／１バクトトリプトン、５ｇ／ｌイーストイクストラクトおよび５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）２０mlと混合した。この溶液を３７℃に１２−１６時間維持し、一晩培養物を調製した。この培養物１mlを２５０mlフラスコ中、３０μｇ／ｌクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地（１６ｇ／ｌ  バクトトリプトン、５ｇ／ｌ  イーストイクストラクトおよび５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）５０mlと混合した。この溶液を振盪しながら３７℃で約４時間維持するか、または６００nmの光学密度が0.３になるまで維持した。この光学密度は、ml当たり約１×１０7 個のコロニー形成ユニットに対応する。全長ｃＤＮＡ挿入物を含むＭ１３ファージを多重感染度0.２以下となるように添加した。この溶液を振盪しながら３７℃に４−６時間維持した。この培養物３０mlを５０ml遠心チューブに移し、４℃、１7,０００×ｇ（１2,０００rpm 、ソーバルＳＳ−３４ローター）で１５分間遠心した。このファージ含有上清を新しい遠心チューブに移し、４℃、１7,０００×ｇで１５分間遠心した。この上清を新しいポリアロマー遠心チューブに移し、１５０μｇのＲＮａｓｅＡを添加した。この上清を室温に３０分間維持して存在するＲＮＡを分解した。４分の１倍容の3.５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２０％ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００）をこの上清に混合した。この上清を氷水中に３０分間維持した。この間に存在するファージ粒子がＰＥＧ８０００によって沈殿する。沈殿したファージ粒子を、４℃、１7,０００×ｇ、１５分間の遠心で回収した。このペレットを高塩バッファ（３００mM  ＮａＣｌ，１００mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）および１mM  ＥＤＴＡ）２００μｌに懸濁した。この溶液を氷水中に３０分間維持し、マイクロフュージで２分間遠心して不溶性物質を除去した。この上清を新しいチューブに移し、ファージストックとして使用するまで４℃に保存した。
一本鎖ウラシル含有テンプレートＤＮＡは、２００μｌのファージストック全部を等容量の中和フェノールで二度抽出することにより調製した。もう一度この水層をフェノールクロロホルム溶液（２５：２５：１  フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）で抽出し、さらに数回クロロホルムイソアミルアルコール（１：１／４８  クロロホルム；イソアミルアルコール）で抽出した。この水層に、１０分の１倍容の7.８Ｍ酢酸アンモニウムおよび2.５倍容のエタノールを混合した。この溶液を−７０℃に少なくとも３０分間維持して、ＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを４℃で１５分間遠心することにより回収した。このＤＮＡペレットを９０％エタノールで一回抽出し、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.６）および１Ｍ  ＥＤＴＡを含む２０μｌに懸濁した。この溶液に存在するウラシル含有テンプレートＤＮＡの量は、ゲル電気泳動で測定した。さらに突然異変誘発ステップでこのウラシル含有テンプレートＤＮＡを用いて、全長ｃＤＮＡに制限エンドヌクレアーゼ部位を導入した。変異した全長ｃＤＮＡは、ミュージーンシット（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）の操作にしたがって合成した。簡単にいうと、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するように設計したポリヌクレオチドを用いて、一本鎖ウラシル含有テンプレートＤＮＡからの変異鎖合成を行った。このポリヌクレオチドは、選択した２００ピコモル（pmole)を１００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０），１０mM  ＭｇＣｌ2 ，５mM  ＤＴＴ，0.４mM  ＡＴＰおよび4.５ユニット  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液と混合してリン酸化した。この溶液を３７℃に４５分間維持した。このキナーゼ反応は、６５℃に１０分間維持することにより停止した。このリン酸化したポリヌクレオチドを、１０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.６）および１ml  ＥＤＴＡ）を含む溶液で希釈して６mole／μｌとした。
【００９７】
２００mgのウラシル含有テンプレートＤＮＡ、３moleのリン酸化ポリヌクレオチド、２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.４）、２mM  ＭｇＣｌ2 および５０mM  ＮａＣｌを混合して、リン酸化したポリヌクレオチドを一本鎖ウラシル含有ＤＮＡテンプレートにアニールした。この溶液を７０℃に５分間維持し、ついで毎分約１℃の速度で３０℃まで冷やした。この溶液は使用するまで氷水中に保存した。この溶液に、４ｍＭｄＡＴＰ，４ｍＭｄＣＴＰ，４ｍＭｄＧＴＰ，４ｍＭｄＴＴＰ，7.５ｍＭ  ＡＴＰ，１７５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.４），３7.５mMＭｇＣｌ2 ，２１５mM  ＤＴＴを含む溶液１μｌ、５ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼおよび１ユニットＴ４ＤＮＡポリメラーゼを混合した。この溶液を氷水中に５分間維持し、ポリヌクレオチドがウラシル含有テンプレートに結合する条件下でＤＮＡ合成を開始することによりポリヌクレオチドプライマーを安定化した。この溶液を２５℃に５分間維持してから、さらに３７℃に９０分間維持した。この溶液に停止バッファ（１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）および１０mM  ＥＤＴＡ）９０μｌを混合することで、合成反応を停止し凍結した。この合成反応液を使用するまで−２０℃に保存した。
【００９８】
ミュータジーンキットの操作にしたがい、この合成反応物質をコンピテント細胞ＭＶ１１９０にトランスホームした。簡単にいうと、コンピテント細胞ＭＶ１１９０は、ＭＶ１１９０細胞の単離コロニーを１０mlのＬＢ培地に混合し、振盪しながら３７℃に一晩維持することにより調製した。次の日、４０mlのＬＢ培地を十分量のＭＶ１１９０一晩培養物と混合し、６００nmの光学密度を約0.１とした。この溶液を振盪しながら３７℃に約２時間維持した。この間にこの培養物の光学密度は、0.８−0.９に達する。それから、ＭＶ１１９０細胞を０℃、５０００rpm で５分間遠心した。このＭＶ１１９０細胞ペレットを氷冷した５０mM  ＣａＣｌ2 溶液１mlに懸濁した。さらに、氷冷した５０mM  ＣａＣｌ2 溶液１９mlをこの溶液に混合した。この溶液を氷水中に３０分間維持した。細胞を０℃、５０００rpm 、５分間の遠心で回収した。このＭＶ１１９０再報ペレットを氷冷した５０mM  ＣａＣｌ2 溶液１mlに懸濁した。さらに、氷冷した５０mM  ＣａＣｌ2 溶液３mlを加え、氷水中で冷やした。このようにして、トランスホーメーション用のＭＶ１１９０のコンピテント細胞が調製される。冷やした1.５ml滅菌ポリスチレンチューブ中、先に調製した合成反応物１０μｌをＭＶ１１９０コンピテント細胞0.３mlと穏やかに混合した。この溶液を氷水中に９０分間維持した。この溶液を４２℃の水浴に３分間置き、直ちに氷水中に戻した。このトランスホーム細胞を三種類の濃度のＭＶ１１９０細胞上にプレーティングした。0.３mlのＭＶ１１９０一晩培養物を入れた各チューブに１０μｌ、５０μｌおよび１００μｌのトランスホーム細胞を入れた。この溶液を穏やかに、かつ完全に混合し、これに２％５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）５０μｌ、１００mMイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）２０μｌおよび予め約５０℃に冷やしたモルテントップアガー（0.７ｇバクトアガー／１００mlＬＢ培地）2.５mlを混合し、直ちに１５ｇ／ｌ
バクトアガーＬＢ培地を入れたバクテリアプレート表面上に注いだ。寒天を約１０分間冷し、逆さにして３７℃に一晩維持してＭＶ１１９０ローン上にプラークを出現させた。
【００９９】
各トランスホーメーション物から生じた単離プラークをピックアップし、ミュータジーンキット（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）の説明書にしたがって増殖させた。 Molecular Cloning：A Laboratory Manual,マニアチス（Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８２）に述べられているアルカリ分解ミニプレップ法を用いて各プラークから二本鎖ＲＦ  ＤＮＡを調製した。このＤＮＡを目的のポリヌクレオチドを含む変異体の同定が可能な制限エンドヌクレアーゼで消化した。
このようにして同定した変異体をシーケンシングして免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードする変異ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を確認した。
２．カッパ軽鎖遺伝子を含む発現ベクターの構築
カッパリーダーを含む全カッパ軽鎖遺伝子を含む発現ベクターを以下のように調製した。単離した全長カッパ軽鎖遺伝子ｃＤＮＡをポリヌクレオチドＰ１およびＰ３（表２）および上述の突然変異誘発法を用いて変異した。ポリヌクレオチドＰ１は、全長カッパｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチドＰ３は、全長カッパ軽鎖ｃＤＮＡクローンの３’末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を誘導する。変異体にポリヌクレオチドＰ１およびＰ３が導入したことを示す二つのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異トランスホーマントを単離した。これらのトランスホーマントをシーケンシングし、それらがＰ１およびＰ３両ポリヌクレオチド配列を含むことを確認した。
【０１００】
５’および３’末端にある制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ部位で、全長カッパ軽鎖ｃＤＮＡ（図１Ａ）を切りだし、その制限断片をゲル電気泳動で単離した。この断片を予めＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭＯＮ５３０に直接ライゲーションした（図２）。このライゲーション混合物で適当な宿主細胞をトランスホームし、各トランスホーマントを単離した。 Molecular Cloning：A Laboratory Manual,マニアチス（Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８２）に述べられている標準的方法を用い、各トランスホーマントからＤＮＡを調製した。このトランスホーマントＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、発現ベクター内のカッパ軽鎖ｃＤＮＡ遺伝子の方向を確認した。生成したカッパ軽鎖発現ベクターは、カッパリーダーを含む全カッパ鎖を含んでいた。
リーダーを含まないカッパ軽鎖遺伝子を含む発現ベクターは、以下のように調製した。単離した全長カッパ軽鎖遺伝子ｃＤＮＡをポリヌクレオチドＰ２およびＰ３（表２）および先の突然変異誘発法を用いて変異した。ポリヌクレオチドＰ２は、成熟カッパ軽鎖のＮ−末端アミノ酸をコードする配列の丁度５’側にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入し、野生型のｃＤＮＡで転写されるカッパ軽鎖リーダー配列を除去する。ポリヌクレオチドＰ３は、全長カッパ軽鎖ｃＤＮＡクローンの３’末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。変異体中にＰ２およびＰ３両ポリヌクレオチドが導入されたことを示す二つのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異体トランスホーマントを単離し、シーケンシングして実際にＰ２およびＰ３両ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列を含むことを確認した。
【０１０１】
この突然変異誘発で生成したリーダーレスカッパ軽鎖ｃＤＮＡを５’および３’末端にある制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ部位で切りだし、その制限断片をゲル電気泳動で単離した。このフラグメントを予めＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭＯＮ５３０に直接ライゲーションした（図２）。このライゲーション混合物で適当な宿主細胞をトランスホームし、各トランスホーマントを単離した。各トランスホーマントからＤＮＡを単離し、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化することにより発現ベクター内のリーダーレスカッパ軽鎖ｃＤＮＡ遺伝子の方向を確認した。このリーダーレスカッパ軽鎖発現ベクターは、通常のリーダー配列を含まないカッパ鎖をコードする遺伝子を含んでいた。
【０１０２】
表２  変異用ポリヌクレオチド
(P1) -5'-TGTGAAAACCATATTGAATTCCACCAATACAAA-3'
(P2) -5'-ATTTAGCACAACATCCATGTCGACGAATTCAATCCAAAAAAGCAT-3'
(P3) -5'-GGGGAGCTGGTGGTGGAATTCGTCGACCTTTGTCTCTAACAC-3'
(P4) -5'-CCATCCCATGGTTGAATTCAGTGTCGTCAG-3'
(P5) -5'-CTGCAACTGGACCTGCATGTCGACGAATTCAGCTCCTGACAGGAG-3'
(P6) -5'-CCTGTAGGACCAGAGGAATTCGTCGACACTGGGATTATTTAC-3'   
【０１０３】
３．ガンマ重鎖遺伝子和含む発現ベクターの構築
ガマリーダーを含む全ガンマ重鎖遺伝子を含む発現ベクターを以下のように調製した。単離した全長ガンマ重鎖遺伝子ｃＤＮＡをポリヌクレオチドＰ４およびＰ６（表２）および先に述べた突然変異誘発法を用いて変異した。ポリヌクレオチドＰ４は、本来の全長ガンマｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチドＰ６は、全長ガンマ重鎖ｃＤＮＡクローンの３’末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチドＰ４およびＰ６の両方が変異体に導入したことを示す二つの付加的ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異トランスホーマントを単離し、これをシーケンシングしてＰ４およびＰ６両オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を含むことを確認した。
全長ガンマ重鎖ｃＤＮＡをその５’および３′末端にある制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ部位（図１Ｂ）で切りだし、ゲル電気泳動でそのフラグメントを単離した。この制限フラグメントを予めＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭＯＮ５３０に直接ライゲーションした（図２）。このライゲーション混合物を適当な宿主にトランスホームし、各トランスホーマントを単離した。各トランスホーマントからＤＮＡを調製し、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化して発現ベクター内のガンマ重鎖ｃＤＮＡの方向を確認した。このガンマ重鎖発現ベクターは、ガンマリーダーを含むガンマ重鎖をコードする遺伝子を含んでいた。
【０１０４】
リーダーを含まないガンマ重鎖遺伝子を含む発現ベクターを以下のように調製した。単離した全長ガンマ重鎖遺伝子ｃＤＮＡを、ポリヌクレオチドＰ５およびＰ６（表２）および先に述べた突然変異誘発法を用いて変異させた。ポリヌクレオチドＰ５で、成熟蛋白質のＮ−末端をコードする配列のすぐ５’側にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し、通常のガンマリーダー配列を除去する。また、ポリヌクレオチドＰ６は、全長ガンマ重鎖ｃＤＮＡクローンの３’末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。Ｐ５およびＰ６両ポリヌクレオチドの変異体への導入を示す二つの新たなＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異体トランスホーマントが単離された。これらの変異体をシーケンシングし、Ｐ５およびＰ６両ポリヌクレオチドが含まれていることを確認した。
このリーダーレスガンマ重鎖ｃＤＮＡをその５’および３’末端にある制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切りだし、その制限フラグメントをゲル電気泳動で単離した。このフラグメントを、予めＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭＯＮ５３０に直接ライゲーションした（図２）。このライゲーション混合物を適当な宿主にトランスホームし、各トランスホーマントを単離した。各トランスホーマントからＤＮＡを単離し、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化して発現ベクター内のガンマ重鎖ｃＤＮＡの方向を確認した。生成したガンマ重鎖発現ベクターには、本来のガンマリーダーを含まないガンマ重鎖をコードする遺伝子が含まれていた。
【０１０５】
４．植物への免疫グロブリン遺伝子の導入
先の実施例で調製したリーダーレスカッパ発現ベクター、リーダーレスガンマ発現ベクター、本来のカッパ発現ベクターおよび本来のガンマ発現ベクターを、ジッタ（Ditta)等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７７：７３４７−７３５１（１９８０）のトリペアレンタル・コンジュゲーション・システムを用い、アグロバクテリウム（Agrobacterium)ＧＶ３１１１−ＳＥ株に導入した。簡単にいうと、アグロバクテリウム（Agrobacterium)（アクセプター）ＧＶ３１１１−ＳＥを、2.６ｇ／ｌ  イーストイクストラクト、５ｇ／ｌ  トリプトファン、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ，５ｇ／ｌ  マニトール、1.１６ｇ／ｌ  グルタミン酸一ナトリウム、0.２５ｇ／ｌ  ＫＨ2 ＰＯ4 ，0.１ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4 −７Ｈ2 Ｏおよび１mg／ｌビオチン（ｐＨ7.０）を含むＭＧＬ培地を入れた寒天プレート中、２８℃で１２−１８時間培養した。ベター（Better) 等、J. Bacteriol.,１５５：３１１（１９８３）に述べられているモービライゲーションプラスミドｐＲＫ２０７３を含む大腸菌（ヘルパー）をＬＢ寒天培地（５ｇ／ｌ  イーストイクストラクト、１０ｇ／ｌ  トリプトファン、１０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ，１５ｇ／ｌ  バクトアガー、ｐＨ7.０）中、３７℃で１２−１８時間培養した。各発現ベクターを含む大腸菌を、３７℃で１２−１８時間、３μｇ／mlテトラサイクリンおよび１０μｇ／mlカナマイシンを補ったＬＢ培地を含むバクテリア培養寒天培地で培養した。同量（約１×１０8 細胞）の三種のバクテリア、アクセプターアグロバクテリウム（Agrobacterium)、ヘルパー大腸菌、および発現ベクターを含む大腸菌を混合し、１００μｇ／ml  カナマイシン、２００μｇ／ml  スペクチノマイシンおよび５０μｇ／ml  クロラムフェニコールを含むＡＢ寒天培地（１リットル当たり１ｇ  ＮＨ4Ｃｌ，0.３ｇ  ＭｇＳＯ4−Ｈ2Ｏ，0.１５ｇ  ＫＣｌ，0.０１ｇ  ＣａＣｌ2，2.５mg  ＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ，３ｇ  Ｋ2ＨＰＯ4，1.１５ｇ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏ，５ｇ  グルコースおよび１５ｇ  バクトアガーを含む）を含むバクテリアプレートで培養した。このバクテリア培養プレートを２−４日間２８℃でインキュベーションした。単一のトランスホーマントコロニーを、１００μｇ／mlカナマイシン、２００μｇ／mlスペクチノマイシンおよび５０μｇ／mlクロラムフェニコールを補ったＬＢ培地を入れた培養フラスコ内に入れ、穏やかに振盪しながら２８℃で１２−１８時間維持した。先の実施例で調製した各発現ベクターは、このアグロバクテリウム（Agrobacterium)培養物中に存在し、これで植物中の導入する準備が完了した。
【０１０６】
ロジャース（Rogers)等、Methods For Plant Molecular Biology,アカデミックプレス、サンディエゴ、ＣＡ（１９８８）の方法でタバコ葉ディスクをトランスホームした。健康で若いタバコの葉を、２０％家庭用ブリーチ（ｗ／ｖ）および0.１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含む溶液に８分間浸すことにより表面を滅菌した。この葉を９８％エタノールを含む溶液に６０分間移し、二回蒸留滅菌水で二回濯いだ。この葉ディスクを６−ｍｍペーパーパンチでパンチした。このディスクをＭＡ１０溶液（ＭＳ塩、ギブコ、グランドアイランド、ＮＹ，0.０１mg／ml塩酸チアミン0.００１mg／ml塩酸プリドキシン、0.００１mg／mlニコチン酸および0.１mg／mlイノシトール、３０ｇスクロース、0.０１μｇ／mlナフタレンアシジン酸（ＮＡＡ），1.０μｇ／mlベンジルアデニル（ＢＡ），および１０ｇ／ｌバクトアガー、ｐＨ6.０）に沈めた。各ディスクを発現ベクターを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium)培養物と５秒間混合した。さらに、このディスクを滅菌濾紙上で乾燥し、ＭＳ１０培地に移してから通常の生育条件に４８時間維持した。その後、各ディスクを滅菌水で洗浄して発現ベクターを含むほとんどのアグロバクテリウム（Agrobacterium)を除いた。この葉ディスクを滅菌したワットマン No.９濾紙上で乾燥し、ついで２００μｇ／ml硫酸カナマイシンおよび５００μｇ／mlカルベニシリンを含むＭＳ１０選択培地プレート上に裏返して乗せた。このプレートを通常の生育条件に二週間維持した。二週間以内にカルスが出現し、すぐ後に芽が現れる。葉が現れたのち、それらをＭＳ０（ＮＨＡまたはＢＡを含まないＭＳＩＯ）および２００μｇ／ml硫酸カナマイシンおよび５００μｇ／mlカルベニシリンを含む再生プレートに移した。再生プレートに根づいた芽を土壌に移し、植物体に生育させた。この植物を成熟するまで標準的生育条件に維持した。
先の実施例で構築した各発現ベクターから、概説した操作を用いて植物群を調製した。各植物群の葉抽出物を、エングバル（Engvall)等、J. Immunol.,１０９：１２９−１３５（１９７２）の方法に基づくＥＬＩＳＡ法を用いて免疫グロブリン重鎖または軽鎖の存在に関してスクリーニングした。簡単にいうと、１５０mM  ＮａＣｌおよび２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）（ＴＢＳ）を含む溶液５０μｌおよび、ヤギ抗マウス重鎖または軽鎖特異的ＩｇＧ（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）をマイクロプレートのウェル中で混合した。水でウェルを四回洗浄したのち、５％脱脂肪ドライミルクを含むＴＢＳ２００μｌをマイクロプレートのウェルに入れた。このウェルを２０℃に少なくとも３０分間維持した後、振ってウェルを空にし、乾燥して固体サポート、即ち、ヤギ抗体を機能的に結合する固体マトリクスを作製した。
【０１０７】
各トランスホーマントの葉を葉脈除去後乳鉢でホモジナイズした。１／４倍容の５×ＴＢＳ（７５０mM  ＮａＣｌおよび１００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０））をホモジナイズしたトランスホーマント葉に混合した。ＴＢＳ（１５０mM  ＮａＣｌおよび２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０））でホモジネートの一連の二倍希釈物を調製した。これらの各希釈物５０μｌを各マイクロプレートウェルに入れ、これを４℃に少なくとも１８時間維持して固相免疫反応生成物を生成させた。その後、ウェルを常温の蒸留水で洗浄した。ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）に結合したヤギ抗マウス重鎖または軽鎖特異的抗体の１０００分の１ＴＢＳ希釈物５０μｌをマイクロプレートの各ウェルに入れた。このウェルを３７℃に２時間維持し、説明書にしたがって検出を行った。コントロールのウェルにはベクターのみでトランスホームした植物由来の抽出物を入れ、同様に操作したが、検出可能な免疫グロブリン産物の発現は無かった。
各植物の免疫グロブリン含量は二度測定し、表３にはその平均値を示した。各植物群のうちの少なくとも９個をこのように検定した。免疫グロブリン重鎖または軽鎖を発現する植物で免疫グロブリン遺伝子でトランスホームしていることが示され、これらをトランスホーマントまたはトランスジェニック植物とした。
【０１０８】
表３  タバコにおける免疫グロブリンガンマおよびカッパ鎖の発現
ガンマーＮＬ            ガンマーＬ
３０±１６            １４１２±２７０
（６０）                （２４００）
カッパーＮＬ            カッパーＬ
1.４±1.２                ５６±５
（3.５）                  （８０）
表３に示した結果は、個々の免疫グロブリン鎖の蓄積にシグナル配列が重要であることを示している。シグナル配列がｃＤＮＡに存在するとカッパ鎖の蓄積は、（平均）４０倍増加し、ガンマ鎖の蓄積は、４７倍増加した。
【０１０９】
５．免疫グロブリン重鎖および軽鎖の両方を発現する子孫集団の生成
各免疫グロブリン鎖を発現する実施例４で生成したトランスホーマントを有性的に交配し、両鎖を発現する子孫を作製した。簡単にいうと、一つの免疫グロブリン鎖を発現する一つのトランスホーマントから葯を取り除き雌のトランスホーマントを作製することにより、去勢した未成熟の花を作ることでハイブリッドの子孫を調製した。この雌のトランスホーマントを別の免疫グロブリン鎖を発現する別のトランスホーマント（雄）と交配した。交配受粉後、ハイブリッド種が生産されるまで雌のトランスホーマントを通常の生育条件下で維持した。このハイブリッド種を発芽させ、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の両方を含むハイブリッド子孫を生成した。ハイブリッド子孫を作製する模式図を図３に示す。その葉をホモジナイズし、実施例４で述べたＥＬＩＳＡ法を用い免疫グロブリン重鎖または軽鎖に関し、そのホモジネートを検定した。免疫グロブリン重鎖または軽鎖を発現するハイブリッド子孫の数を表４に示す。カッパリーダー構築物およびガンマリーダー構築物を発現するトランスホーマントの交配から生成したハイブリッドは、ガンマ重鎖およびカッパ軽鎖の両方を含む集合型免疫グロブリン分子を含んでいた。
【０１１０】
表４  ハイブリッドにおける免疫グロブリンガンマおよびカッパ鎖の発現
ガンマーＬ              ガンマーＮＬ
（カッパ−Ｌ）          （カッパーＮＬ）
３３３０±２０００          ３２±２６
（１２８００）            （６０）
カッパーＬ              カッパーＮＬ
（ガンマーＬ）          （ガンマーＮＬ）
３７００±２３００          6.５±５
（１２８００）            （２０）
【０１１１】
表５  ハイブリッドにおける免疫グロブリンガンマおよびカッパ鎖の発現および集合
ガンマのみ カッパのみ ガンマ・カッパ な  し
カッパーＮＬ×      ４        ６              ３            ５
ガンマーＮＬ                                          （集合物０％）
カッパーＬ×        ３      １０            １１            ４
ガンマーＬ                                          （集合物95±16％）
【０１１２】
表４および５に示した結果は、二つの免疫グロブリン鎖の集合の重要性を示している。親のトランスホーマントと比較して、両免疫グロブリン鎖を同時に発現する子孫は、各鎖をより多く蓄積する。平均してガンマ鎖は２，５倍も蓄積し、カッパ鎖は６６倍も蓄積した。リーダーを含まないｃＤＮＡを発現するトランスホーマントと比べて、有性的に交配してリーダー配列および両方の鎖の発現に関する蓄積量の増加は、驚くほど大きい。ガンマ鎖は１１０倍増加し、カッパ鎖は２６００倍増加した。
【０１１３】
６．トランスジェニック植物の於ける免疫グロブリン重鎖コード遺伝子および免疫グロブリン軽鎖コード遺伝子の検出
トランスジェニック植物またはハイブリッド子孫における免疫グロブリン重鎖コード遺伝子または免疫グロブリン軽鎖コード遺伝子の存在は、マニアチス（Maniatis) 等、Molecular Cloning： A Laboratory Manusl, コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８２）のサザンブロッティング法を用いたトランスジェニック植物由来のＤＮＡを分析することにより示された。簡単にいうと、液体窒素で凍結した重鎖遺伝子トランスホーマント、軽鎖遺伝子トランスホーマントまたはハイブリッド子孫から収穫した１グラムの成熟した葉の断片からＤＮＡを抽出した。この凍結セグメントを、シュア（Shure)等、Cell, ２５：２２５−２３３（１９８６）の方法にしたがって乳鉢を用いてウレアミックス（４２０ｇ／ｌ尿素、３１2.５mM  ＮａＣｌ，５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０），２０mM  ＥＤＴＡおよび１％サルコシン）中でホモジナイズした。この葉のホモジネートをフェノール：ＣＨＣｌ3 （１：１ｖ／ｖ）で抽出し、その溶液に１／６倍容の4.４Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ5.２）および１倍容のイソプロピルアルコールを添加し、−２０℃に３０分間維持することにより核酸を沈殿させた。核酸沈殿を含む溶液を４℃、７５００×ｇで１５分間遠心し、核酸沈殿を回収した。このペレットを、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.６）および１mM  ＥＤＴＡを含むＴＥ溶液に溶かした。この溶液中のＤＮＡ濃度は、分光学的に測定した。
【０１１４】
上述の方法を用いて各トランスホーマントからＤＮＡを調製した。トランスホーマント２０μｇを製造業者ストラタジーンクローニングシステム、ラジョラ、ＣＡが推薦する条件下、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII で消化した。生じた制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、マニアチス（Maniatis)等、Molecular Cloning： A Laboratory Manusl, コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８２）の方法を用い、アガロースゲルでサイズ分画したのちニトロセルロースにブロッティングした。簡単にいうと、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡをサイズ分画したのち、エチジウムブロマイドで染色してゲルの写真を撮った。このＤＮＡを含むゲルを1.５Ｍ  ＮａＣｌおよび0.５Ｍ  ＮａＯＨを含む溶液中、室温で１時間穏やかに振盪した。ついで、このＤＮＡを含むゲルを１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）および1.５Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液中、室温で１時間穏やかに振盪した。ゲルの小片を取り出し、少量の蒸留水のｐＨを測定することによりゲルのｐＨを周期的にチェックした。ゲルのｐＨがおよそ8.０になったとき、８7.６５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ，１3.８ｇ／ｌ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏおよび3.７ｇ／ｌＥＤＴＡ（ｐＨ7.４）（１０×ＳＳＣ）を含む溶液に浸した厚いガーゼの上に乗せた。あらかじめゲルと同じサイズに切り、１０×ＳＳＣに浸したニトロセルロースフィルター（シュレイチャーアンドシュエル  ＢＡ８５，キーン、ＮＨ）をゲルの上に置き、間の気泡を除いた。ニトロセルロースフィルターと同じ大きさに切ったワットマン３ＭＭペーパー二枚を２×ＳＳＣ（１7.５３ｇ／ｌ  ＮａＣｌ，2.７６ｇ／ｌ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏおよび0.７４ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ7.４））に浸し、ニトロセルロースフィルターの上において間の気泡を除いた。積み重ねたペーパータオル（５−８cmの高さ）をワットマン３ＭＭペーパーよりも少し小さい大きさに切り、それをワットマン３ＭＭペーパーの上に置いた。この上に硝子プレートを置き、さらに５００グラムの重りを乗せた。１２−２４時間かけ毛細管現象によりゲルのＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移した。この重ね合わせ物を解体し、ニトロセルロースフィルターを室温で５分間、６×ＳＳＣ（５2.５９ｇ／ｌ  ＮａＣｌ，8.２８ｇ／ｌ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏおよび2.２２ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ7.４））に浸した。このフィルターを乾燥したワットマン３ＭＭペーパーの上に置き、空気乾燥させた。乾燥したフィルターを二枚の３ＭＭペーパーの間に挟み、減圧下、８０℃で２時間焼き、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに機能的に結合させた。
焼いたフィルターを下から完全に湿るまで0.９Ｍ  ＮａＣｌおよび0.０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０）を含む溶液の上に乗せた。このフィルターを同じ溶液に５分間浸した。
【０１１５】
このフィルターを、５０％ホルムアミド、0.９Ｍ  ＮａＣｌ，0.０５Ｍ  ＮａＰＯ4（ｐＨ7.７），0.００５Ｍ  ＥＤＴＡ，0.１％フィコール、0.１％ＢＳＡ，0.１％ポリビニルピロリドン、0.１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ml変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブルダイゼーション溶液に入れた。この溶液を穏やかに攪拌しながら４２℃に１２−１８時間維持した。この溶液からフィルターを取り出し、１×１０6 cpm／mlの32Ｐラベルガンマ鎖プローブ（全ガンマ発現ベクターラベル化物）および１×１０6 cpm／mlの32Ｐラベルカッパ鎖プローブ（全カッパ発現ベクターラベル化物）を含むプレハイブリダイゼーション溶液であるハイブリダゼーション溶液に浸した。この溶液を穏やかに攪拌しながら４２℃に１２−２４時間維持した。ハイブリダゼーションが完了したのち、ハイブリダゼーション溶液を除去し、室温の0.３Ｍ  ＮａＣｌ，0.０３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０）および0.１％ＳＤＳを含む大量の溶液による１０分間の洗浄を４回繰り返した。さらに、このフィルターを、穏やかに攪拌しながら４２℃で１時間、0.２×ＳＳＣ（0.０３Ｍ  ＮａＣｌ，0.００３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０）および0.１％ＳＤＳを含む溶液に移して洗浄した。洗浄液からフィルターを取り出し、室温でワットマン３ＭＭペーパー上で乾燥した。このフィルターを３ＭＭペーパーにテーピングし、プラスチックラップで包み、増感スクリーンを用いて−７０℃でＸ線フィルム（コダックＸＲまたは相当品）を感光させオートラジオグラムを作製した。このフィルムを説明書にしたがって現像した。
このオートラジオグラムを図４Ａに示す。リーダー無し（レーン１）またはリーダー配列有り（レーン３）のカッパ軽鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホーマントで検出されるハイブリダイズＤＮＡフラグメントが示されている。リーダー無し（レーン２）またはリーダー配列有り（レーン４）のガンマ重鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホーマントで検出されるハイブリダイズＤＮＡフラグメントが示されている。本来のリーダーを含むカッパ軽鎖および本来のリーダーを含むガンマ重鎖の両方を含むハイブリッド子孫で検出されるハイブリダイズＤＮＡフラグメントも示されている（レーン５）。
【０１１６】
７．トランスジェニック植物の於ける免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするｍＲＮＡの検出
トランスジェニック植物またはハイブリッドにおける免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖遺伝子をコードするｍＲＮＡの存在が、Molecular Cloning ， A Laboratory Manusl（上述）の方法を用い、トランスジェニック植物から抽出したＲＮＡを分析することで示された。簡単にいうと、重鎖遺伝子トランスホーマント、軽鎖遺伝子トランスホーマントまたはハイブリッド子孫から収穫した成熟葉組織１グラムからＲＮＡを調製した。この葉組織を小さく切り、0.１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ9.０）およびこのバッファで飽和したフェノールを含む溶液１０mlを混合する。この葉組織をこの溶液中、高速で１分間ポリトンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。このホモジネートを室温で４０００rpmの遠心を１５分間行った。水層を取り除き、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ5.２）１mlおよびイソプロパノール２５mlを混合することによりＲＮＡを沈殿させた。この溶液を−２０℃に２０分間維持してＲＮＡを沈殿させた。この溶液を４℃、４０００×ｇで１５分間遠心することにより沈殿したＲＮＡを回収した。このＲＮＡペレットを４００μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏに溶かし、1.５mlのエッペンドルフチューブに移した。この溶液をエッペンドルフ遠心機を用い最高速度で５分間遠心した。この上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ5.２）４０μｌおよびエタノール１mlを混合した。この溶液を−２０℃に２０分間維持してから、エッペンドルフ遠心機で５分間遠心した。生成したＲＮＡペレットを４００μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏに溶かし、少量の試料を取り、２６０nmの吸光度からＲＮＡ濃度を測定した。残りの溶液は、使用するまで−７０℃で凍結して保存した。
【０１１７】
このようにして調製したＲＮＡを変性ホルムアルデヒドアガロースゲルでサイズ分画し、ついでナイロンメンブレンに移した。使用した方法は、Molecular Cloning ： A Laboratory Manual, マニアチス（Maniatis) 等、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８２）の方法である。簡単にいうと、７3.３mlのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ液中1.４ｇのアガロースを融解し、この溶液を６０℃まで水浴で冷却することにより変形ホルムアミドアガロースゲルを調製した。この溶液に、５０mM  ＮａＨ2ＰＯ4，５０mM  Ｎａ2ＨＰＯ4，５０mM酢酸ナトリウム、および１０mM  ＥＤＴＡを含むバッファ１０mlを加えた。さらに、３７％ホルムアミド１6.６６mlを加え、ゲルモールドに注いで固化させた。これで変性ホルムアミドアガロースゲルが使用できる。
【０１１８】
先に調製したＲＮＡ２０μｇを、１５μｌのホルムアミド、５μｌの３７％ホルムアルデヒド、および５０mM  ＮａＨ2ＰＯ4，５０mM  Ｎａ2ＨＰＯ4，５０mM酢酸ナトリウムおよび１０mM  ＥＤＴＡを含むバッファ３μｌと混合した。この溶液を５５℃に１５分間維持し、直ちに氷水中で冷却した。５０％グリセリン、１mM  ＥＤＴＡ，0.４％ブロモフェノールブルーおよび0.４％キシレンシアノールを含む１／１０倍容の溶液と完全に混合してから、上述の変性ホルムアルデヒドゲルに乗せた。このゲルを、５mM  ＮａＨ2ＰＯ4，５mM  Ｎａ2ＨＰＯ4，５mM酢酸ナトリウム、および１mM  ＥＤＴＡを含むバッファ中、室温で２時間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを数回水を取り替えながら水中に１０−１５分間浸した。その後、このゲルを、0.１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５）を含む溶液に４５分間浸した。さらに、このゲルを、３Ｍ  ＮａＣｌおよび0.３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０）を含む溶液に入れた。1.５Ｍ  ＮａＣｌおよび0.１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０）を含む溶液に浸した厚いガーゼの上にゲルを置き、さらに予めゲルと同じ大きさに切り、１０×ＳＳＣに浸したナイロンメンブレン（ハンボンド−Ｎ，アマーシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ）を乗せて間の気泡を除いた。ナイロンメンブレンと同じ大きさに正確に切った二枚のワットマン３ＭＭペーパーを２×ＳＳＣ（0.３Ｍ  ＮａＣｌおよび0.０３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０））に浸し、ナイロンメンブレンの上において間の気泡を除いた。ワットマン３ＭＭペーパーよりわずかに大きいサイズに切った重ねたペーパータオル（高さ５−８cm）をワットマン３ＭＭペーパーの上に置いた。この上に硝子プレートを置き、さらに５００ｇの重りを置いた。１２−２４時間かけ、毛細管現象でゲルのＲＮＡをナイロンメンブレンに移した。この重ね合わせ物を解体し、ナイロンメンブレンを６×ＳＳＣ（0.９Ｍ  ＮａＣｌおよび0.０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.０））に室温で５分間浸した。このナイロンメンブレンを１０分間紫外線照射ボックスに入れ、ＲＮＡをナイロンメンブレンに機能的に結合させた。
【０１１９】
カッパ軽鎖コード配列またはガンマ重鎖コード配列を含むＲＮＡを実施例６で述べた方法を用いてナイロンメンブレンをプレハイブリダイズおよびハイブリダイズすることにより検出した。このオートラジオグラムを図４Ｂに示した。リーダー配列無し（レーン１）または本来のリーダー配列有り（レーン３）のカッパ軽鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホーマント由来のＲＮＡ中の検出されるハイブリダイズＲＮＡ種が示されている。また、リーダー配列無し（レーン２）または本来のリーダー配列有り（レーン４）のガンマ重鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホーマント由来のＲＮＡ中の検出されるハイブリダイズＲＮＡ種が示されている。本来のリーダーを有するカッパ軽鎖および本来のリーダーを有するガンマ重鎖の両方を含むハイブリッド子孫中に検出されるハイブリダイズＲＮＡ種も示されている（レーン５）。
【０１２０】
８．トランスジェニック植物における免疫グロブリン重鎖および軽鎖の検出
トランスジェニック植物およびハイブリッド子孫における免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現は、重鎖および軽鎖の両方が検出されるウエスタンブロッティングで示された。ウエスタンブロッティングは、Antibody： A Laboratory Manual, ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane)編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８８）に従った。簡単にいうと、成熟した植物の葉セグメント１ｇを0.０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５）および１mMフゥニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む溶液１ml中、乳鉢でホモジナイズし、生成した葉抽出物を指示されているように２mM  ＤＴＴ有り、または無しの条件下、最終濃度４Ｍ尿素および１％ＳＤＳとなるように溶液を加え、３分間煮沸した。その後、この溶液を、Ｎ．Ｈ．チュア（Chua)、Methods in Enzymol.,６   
【０１２１】
９：４３４−４４６（１９８０）に述べられているＳＤＳ含有１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。この電気泳動した蛋白質を、Antibodies： A Laboratory Manual, ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane)編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ＮＹ（１９８８）に述べられているようにニトロセルロースシートに固定化した。簡単にいうと、ニトロセルロースシートを、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および0.５％脱脂肪ドライミルクを補ったバッファ（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０），１５０mM  ＮａＣｌ，0.０％ポリオキシエチレン  ソルビタンモノラウレート（Tween ２０））（ＴＢＳＴ）に浸し、４℃に６時間維持した。このニトロセルロースをビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カペル、マルベリー、ＰＡ）の１：５００  ＴＢＳＴ希釈物を含む溶液に浸し、４℃に２４時間維持した。この間に、ニトロセルロースシートに固定化した免疫グロブリン重鎖および軽鎖が、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と免疫反応し、ニトロセルロースシート上に免疫反応物が生成する。この溶液からニトロセルロースシートを取り出し、ＴＢＳＴ溶液で洗浄してからストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（フィッシャーサイエンフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）を含むＴＢＳＴ溶液の浸して、２５℃に１時間維持した。この溶液からニトロセルロースシートを取り出し、ＴＢＳＴで洗浄した。
【０１２２】
このニトロセルロースシートを室温で３０分間、１００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ9.５），１００mM  ＮａＣｌ，５mM  ＭｇＣｌ2，0.３mg／ml  ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および１５０μｇ／ml  ５−ブロミル−４−クロリル−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）を含む溶液に浸すことにより免疫反応産物を観察した。フィルターに残存する発色溶液を、２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.５）および１５０mM  ＮａＣｌを含む溶液で濯いだ。このフィルターを、１mM  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む停止溶液に浸した。強い紫色の発色は、免疫反応物の位置を示している。
軽鎖トランスホーマントにおける免疫グロブリン軽鎖、重鎖トランスホーマントにおける免疫グロブリン重鎖、およびハイブリッド子孫における免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現は、ウエスタンブロットを用いて示された（図５）。さらに、非還元条件で見られる高分子量免疫反応性ガンマおよびカッパ鎖で明らかなように、ハイブリッド子孫で生成した免疫グロブリン重鎖および軽鎖は会合していた。
【０１２３】
９．トランスジェニック植物中で発現する免疫グロブリン分子は、抗原を結合する。
トランスジェニック植物中で発現される免疫グロブリン分子による抗原の結合は、実施例４で述べたＥＬＩＳＡ法と同様の方法で示された。この抗原結合ＥＬＩＳＡ検定は、以下のように修正した。マイクロプレートのウェルにヤギ抗体を吸着する代わりに、トラモンタノ（Tramontano)等、Proc, Nati. Acad. Sci. USA, ８３：６７３６−６７４０（１９８６）の方法に従いＢＳＡに結合した抗原Ｐ３をマイクロプレートのウェルに吸着させた。各植物群由来の葉抽出物をウェルに入れ、ホモジネート中に存在する免疫グロブリン分子の結合が、実施例４に述べたＨＲＰＯに結合したヤギ抗マウス重鎖を用いて検出した。
トランスジェニック植物中で発現する免疫グロブリン分子は、この抗原結合ＥＬＩＳＡ検定においてその特異的抗原Ｐ３に直接結合した。この抗体抗原相互作用の特異性を示すために、別の競争ＥＬＩＳＡ検定を行った。この検定法は、葉ホモジネートの一連の希釈前に、５００μＭのＰ３溶液５μｌを二つのウェルに添加し、ウェルに吸着したＰ３−ＢＳＡに結合する抗体の対する競争者として作用させること以外は、先に述べた抗原結合ＥＬＩＳＡ検定法と同様である。この競争ＥＬＩＳＡ検定の残りの部分は、実施例４と同様に行った。
トランスジェニック植物中で発現する抗体とその特異的抗原Ｐ３の相互作用は、ＢＫ競争ＥＬＩＳＡ検定において遊離した抗原により特異的に阻害された。
【０１２４】
１０．トランスジェニック植物で発現する触媒性免疫グロブリン
トランスジェニック植物で発現される免疫グロブリン分子の触媒活性は、機能性免疫グロブリンを発現するタバコ植物由来の免疫グロブリン分子６Ｄ４を精製し、その触媒活性を測定することにより示された。
簡単にいうと、集合型免疫グロブリン分子を含む植物は、実施例１，２，３，４，５，６および８で述べた方法および操作を用いて作製した。マウスで生産される通常のグリコシル化した抗体６Ｄ４は、カルボン酸エステルの加水分解を触媒することから、植物中での発現に免疫グロブリン分子６Ｄ４を選択した。トラモンタノ（Tramontano) 等、Science,２３４：１５６６（１９８６）参照。
免疫グロブリン６Ｄ４は、セファクリル分画およびプロテインＡ−セファロースへの吸着により免疫グロブリンを発現するタバコ植物の葉から精製した。簡単にいうと、若い葉１０グラムから葉脈を除去し、これを５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）および１mM  ＰＮＳＦを含むホモジネーションバッファ５０ml中で手でホモジネートした。このホモジネートを１００００×ｇで遠心し、その上清をセントリコン３０（アミコン、デンバース、ＭＡ）を用い最終的に１０mlまで濃縮した。この濃縮ホモジネートを予め調製したセファクリルＳ−３００カラムにロッドした。このカラムを0.１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ5.０）で溶出し、１mlの溶出液フラクションを採用した。各フラクションの存在する免疫グロブリン量は、実施例４で述べたＥＬＩＳＡ検定法で測定した。
溶出した大部分の免疫グロブリンを含むフラクションを集め、1.５Ｍグリシン（ｐＨ8.９）および3.０Ｍ  ＮａＣｌをふくむ結合バッファに対して十分に透析した。透析後、この免疫グロブリンを、２ｇのプロテインＡ−セファロース（ファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ）を含むカラムにゆっくり通し、免疫グロブリンをカラムに結合させた。プロテインＡ−セファロースを２０mlの結合バッファで洗浄した。結合した免疫グロブリンは、0.１Ｍクエン酸塩（ｐＨ6.０）を含む溶出バッファ１０mlで溶出した。この溶出物を、セントリコン３０を用いて１ml当たり免疫グロブリン５０μｇとなるまで濃縮した。濃縮した免疫グロブリンを５０mMリン酸バッファ（ｐＨ8.０）に対して透析した。この溶液中に存在する免疫グロブリンの最終濃度は、実施例８に述べたＥＬＩＳＡ検定を用いて測定した。
【０１２５】
この６Ｄ４免疫グロブリンのアミノ酸配列を、マツダイラ（Matsudaira)、P., J. Biol. Chem., ２６２：１００３５−１００３８（１９８７）の方法を用いて測定した。簡単にいうと、約１μｇの免疫グロブリン６Ｄ４の１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により免疫グロブリンガンマ重鎖およびカッパ軽鎖を分離した。この免疫グロブリンの電気泳動は、ガンマ重鎖およびカッパ軽鎖が分離するまで行った。分離したガンマ重鎖およびカッパ軽鎖を、マツダイラ（Matsudaira)，P., J. Biol. Chem., ２６２：１００３５−１００３８（１９８７）の方法によりポリビニリデンジフルオライドメンブレンにブロッティングし、アミノ酸配列を決定した。
マウス由来の６Ｄ４モノクローナル抗体を植物のは由来の抗体を精製したのに用いた方法を使用してマウスの腹水から精製した。簡単にいうと、モノクローナル抗体６Ｄ４を含むマウス由来の腹水をセファクリル（Ｓ−３００）カラムおよびプロテインＡ−セファロースカラムを用いて分画した。この精製したマウスモノクローナル抗体６Ｄ４を0.１Ｍクエン酸塩（ｐＨ6.０）バッファで５００μｇ／mlとした。
トラモンタノ（Tramontano)等、Science,２３４：１５６６−１５６９（１９８６）の方法を用い、特異的インヒビター有無の条件下で基質と精製した抗体をインキュベートすることにより植物由来およびマウス由来の抗体６Ｄ４の触媒活性を検定した（図９）。簡単にいうと、約１００nMのマウス由来または植物由来の抗体６Ｄ４を５０mMリン酸バッファ（ｐＨ8.０）中、２５℃でプリインキュベートした。基質を含む種々の量のジオキサンストック溶液を混合することにより、５％ジオキサンおよび１乃至８mMの範囲の基質を含む一連の反応混合物を調製した。この反応混合物を、２５℃に１時間維持し、ついで、エステル基質の加水分解をヒューレットパッカード８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を用い、２４５ナノメーター（nm）での吸光度変化をモニターすることで測定した。コントロール反応混合物に非特異的エステラーゼ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を加えることにより最高の吸光度変化が得られた。その速度パラメーターは、トラモンタノ（Tramontano)等、Science,２３４：１５６６（１９８６）に述べられているラインウィーバー・バーク・データ処理を用い、バックグランド加水分解値を差し引いて得た。阻害定数は、１００nMおよび３００nMリン酸塩で得られる傾斜をプロットすることで測定した。
ＫM, Ｋl, ＶmzxおよびＫcatで測定される精製した植物由来およびマウス由来の抗体６Ｄ４の触媒活性を表６に示す。植物由来およびマウス由来の抗体６Ｄ４には、約桁の差があった。
【０１２６】
表６  ６Ｄ４の触媒活性b
起源 タバコ 腹水
ＫM           1.４１×１０-6Ｍ                9.８×１０-6Ｍ
Ｖmzx         0.０５７×１０-8Ｍｓｅｃ-1      0.３１×１０-8Ｍｓｅｃ-1
Ｋl           0.４７×１０-6Ｍ              1.０６×１０-6Ｍ
（競争）                      （競争）
Ｋcat         0.００８ｓｅｃ-1              0.０２５ｓｅｃ-1
ｂ：このデータは、直線回帰で分析した。                                 
【０１２７】
１１．植物における異種リーダー配列による免疫グロブリンの生産
植物における免疫グロブリン集合に関する異種リーダー配列の効果を測定するために、実施例１で述べた本来のマウスリーダー配列の代わりにサッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae) のα−メイティング因子由来のシグナル配列を含む免疫グロブリンｃＤＮＡを調製した。サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae) のα−メイティング因子の配列は、カーザン（Kurzan) 等、Cell, ３０：９３３−９４３（１９８２）に報告されており、これを表７に示した。
【０１２８】
表７  ガンマまたはカッパ鎖に結合したα−メイティング因子リーダー配列の配列
GAATTCATTCAAGAATAGTTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCA 
TACACAATATAAACGATTAAAAGA  MRFPSIFTAVLFAASSAL
AAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLP
FSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDLKR/DVVL
（カッパ鎖）；／ＥＶＥＬ（ガンマ鎖）
【０１２９】
下線の文字は、イーストプレプロ配列の５’非翻訳ヌクレオチドを示している。残りの文字はアミノ酸である；／は、プレプロ配列とカッパまたはガンマ鎖の結合部を示している。
簡単にいうと、カーザン（Kurzqn）等、Cell,３０：９３３−９４３（１９８２）に述べられているサッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)α−メーティング因子由来のプレプロ配列を、ｐ６９Ａ由来のα−メーティンイグ因子を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼフラグメントを単離することによりＭ１３ｍｐ１８にサブクローニングした。このα−メーティング因子含有制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、予めＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼで消化したＭ１３ｍｐ１８ベクターにライゲーションした。このクローニングステップの正確性は、α−メーティング因子ＤＮＡを含むＭ１３クローンの制限エンドヌクレアーゼ消化により検定した。
【０１３０】
実施例１で調製した内在性マウスリーダー配列を含まない６Ｄ４カッパおよびガンマ鎖ベクターをＨｉｎｄIIIで消化し、生成する５’リン酸基を除去した。このα−メーティングベクターを、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化し、α−メーティング因子を含むＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼフラグメントを作製した。このフラグメントは、アガロースゲル電気泳動による分離後、エレクトロエリュウター（ＢＲＬ，ベセスダ、ＭＤ）を用いて単離した。
単離したα−メーティング因子含有制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、別のライゲーション反応でＨｉｎｄIII消化したガンマおよびカッパベクターにライゲーションした。オリゴヌクレオチド依存突然変異誘発を用い、α−メーティング因子プレプロ配列の末端およびＧｌｎコドン（ガンマ鎖）またはＡｓｐコドン（カッパ鎖）の間の余分のヌクレオチドを除去して、キメラｃＤＮＡを生成した。オリゴヌクレオチド依存突然変異誘発の正確性は、ＤＮＡシーケンシングで確認した。
α−メーティング因子プレプロ配列およびガンマまたはカッパ免疫グロブリンコード配列を含むキメラｃＤＮＡを、ロジャース（Rogers)等、Me th. Enzymol. １５３：２５３（１９８７）に述べられているｐＭＯＮ５３０ベクターに挿入した。簡単にいうと、このキメラｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼによりｐＭＯＮ５３０ベクターに結合した。このライゲーション反応の生産物を、ベセスダリサーチラボラトリーズ（ベセスダ、ＭＤ）のバクテリア種および方法を用いて大腸菌に導入した。各プラスミド（キメラｃＤＮＡを含む組み換えｐＭＯＮ５３０）を、制限エンドヌクレアーゼ消化およびシーケンシングで分析した。
【０１３１】
このキメラガンマおよびカッパｃＤＮＡ発現ベクターを用い、ホーシュ（Horsch)等、Science,２７７：１２２９−１２３１（１９８５）および実施例４に述べられているように葉ディスクをトランスホームした。
ガンマmat鎖またはカッパmat鎖のいずれかを発現する各再生物を内在性マウスリーダーペプチドを含む本来の６Ｄ４抗体を発現する植物と交配し、本来のガンマ鎖およびカッパmatを含む子孫、またはガンマmatおよび本来のカッパ鎖を含む子孫を作製した。また、これらの子孫を、実施例４に述べたＥＬＩＳＡ検定法でスクリーニングした。
各子孫の抗体発現レベルは、実施例４で述べたＥＬＩＳＡ検定法を用いて測定し、その結果を表８に報告した。
【０１３２】
表８  ガンマまたはカッパ鎖の蓄積およびガンマ／カッパ複合体を結合する抗原
ガンマｍａｔa                       カッパｍａｔ
７４３±２６０                      ４８±８
（１０３０）                        （７２）
ガンマｍａｔ（カッパｍａｔ）c       カッパｍａｔ（ガンマｍａｔ）
２４１０±１２３０                  ２２８０±１３００
（７７００）                        （７７００）
ガンマｍａｔ（カッパマウス）        カッパｍａｔ（ガンママウス）
２６１５±１５０５                  ２４９０±１１７５
（８３００）                        （８３００）
ガンマ−ｔ（カッパリーダー無し）    カッパｍａｔ（ガンマリーダー無し）
７０５±３００                      ３８±８
（０）                              （０）
【０１３３】
＊精製したマウス腹水由来の抗体６Ｄ４をＥＬＩＳＡ標準物質として用い、値は、ｎｇ／ｍｇ−全蛋白質で表した。括弧のなかの数値は、もっとも高い発現レベルを示している。
ｃ  α（Ｋ）は、ＥＬＩＳＡで測定されたようにＫ鎖を発現する植物における豊富なα鎖およびその逆を意味する（有性的交配の子孫）。この場合の括弧のなかの値は、ＢＳＡに結合したホスホネート抗原（Ｐ３）（先に、トラモンタノ（Ｔｔａｍｏｎｔａｎｏ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３：６７３６−６７４０（１９８６）に報告されている）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに結合する抗体の結果である。ハイアット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：７６−７８（１９８９）。もっとも高いレベルのＫ複合体を発現する植物のみを、抗原結合検定に使用した。
サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）リーダー配列を含む各ガンマおよびカッパ鎖は、すでにハイアット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：７６−７８（１９８９）に報告されている本来のマウスリーダーを発現する構築物とほぼ同じレベルで蓄積した。さらに、機能的抗体は、同じシグナル（ガンマmat×カッパmat）または異なるシグナル（カッパmat×ガンマnative；カッパnative×ガンマmat）を含むガンマおよびカッパ鎖を交配することにより生成した。この事は、リーダーを含まない免疫グロブリンを発現する親が、ハイアット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：７６−７８（１９８９）に報告されているように機能性抗体を生産しない場合の植物の交配と対照的である。
【０１３４】
植物エンドメンブレンシステムによるマウス免疫グロブリンＮ−末端のプロセシングの信頼性は、マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１００３５−１００３８（１９８７）に述べられている自動配列分析で確認した。一般に、哺乳類カッパ鎖Ｎ末端アミノ酸は、カパット（Ｋａｂａｔ）等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，パブリックヘルスサービス、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、メリーランドに報告されているようにアスパラギン酸である。ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）等、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６６：８４３−８４７（１９７５）に報告されているように、多くのマウスＩｇＧ１ガンマ鎖はピログルタミン酸でブロックされる。配列分析は、本来のマウスリーダーを発現する植物由来のガンマ鎖で、ブロックされたＮ末端を含むことを示している。本来のマウスリーダーを発現するカッパ鎖の末端配列は、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕであり、カッパ鎖の適当な蛋白質分解的プロセシングを示している。
【０１３５】
１２．植物由来の免疫グロブリン分子のグリコシル化
植物由来の免疫グロブリンのガンマ鎖グリコシル化パターンを測定するために、フェイ（Ｆａｙｅ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４９：２１８−２２４（１９８５）に述べられているように精製した抗体をニトロセルロースにブロッティングし、ビチオン化したレクチンで探った。簡単にいうと、１μｇ／ｍｌのビオチン化レクチン（ビアス、ロックフォード、ＩＬ）を含むバッファ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2,０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2,および０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ2)（ＴＩＢＳ）中、室温で１時間ニトロセルロースメンブレンでインキューベートした。このフィルターをＴＩＢＳで洗浄し、室温で１時間、１μｇ／ｍｌストレプトアビジン・アルカリホスファターゼを含むＴＩＢＳ中でインキュベートした。ハイアット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：７６−７８（１９８９）に述べられているように、結合したアルカリホスファターゼは、ブロモ−クロロ−インドリルホスフェートを用いて観察した。
ある場合には、ブロッティング前に２００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）５０μｌ中、３７℃で２時間４０ミリユニットのエンドグリサシダーゼＨ（シグナルケミカル、セントルイス、ＭＯ）と共に精製した抗体をインキュベートして、高マンノース型糖を除去した。
【０１３６】
図１０に示した結果は、マンノースおよびグルコースに特異的なコンカナバリンＡのみが植物由来の抗体に結合するが、一方、マウス腹水由来の抗体は、リシナス  コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来のレクチン同様、末端ガラクトース残基（Ｎ−アセチルガラクトサミン）に特異的なコンカナバリンＡにより、並びに比較的程度は小さいが末端シアル酸残基を有するＮ−アセチルグルコサミンダイマーに特異的な小麦胚芽アグルチニンにより認識された。種々のレクチンの特異性はキジモト−オチアイ（Ｋｉｊｉｍｏｔｏ−Ｏｃｈｉａｉ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５７：４３−４９（１９８９）に議論されている。Ｎ−アセチルグリコサミンオリゴマーおよびＮ−アセチルラクトサミンに特異的なダツラ  ストラモニウム（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）由来のレクランおよびＧａｌ  β１、４ｇｌｃＮａｃ  β１、２マンノースに特異的なファセオラス  バルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のレクチンは、植物またはマウス腹水由来のガンマ鎖のいずれにも結合しなかった。α−メチルグルコシドを用いたニトロセルロースブロットからのレクチンの溶出を用いてコンカナバリンＡの植物およびマウス腹水由来の抗体に対する相対的アフィニティーを比較した。ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）等、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６６：８４３−８４７（１９７５）参照。この検定法を用いて、植物およびマウス腹水由来の抗体を、コンカナバリンＡへのアフィニティー並びにガンマ鎖μｇ当たりのコンカナバリンＡ結合量に関して区別しうる。
【０１３７】
トリムブル（Ｔｒｉｍｖｌｅ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４１：５１５−５２２（１９８４）に述べられている条件を用いたエンドグリコシダーゼＨによる植物およびマウス腹水由来の抗体の消化を行い、その抗体をニトロセルロースに移した。エンドグリコシダーゼで消化した抗体は、コンカナバリンＡのオベルブミンへの結合が減少する条件下で、コンカナバリンＡへの結合は減少しなかった。
これらの結果は、植物由来の免疫グロブリンがマウス腹水由来の抗体と同様の細胞成分を介して処理されることを示している。ガンマ鎖のコンカナバリンＡへの結合およびこのグリカンのカンドグリコトダーゼＨによる消化に対する耐性は、正しいカッパ鎖Ｎ−末端と共に抗体が小胞体からゴルジ体に移動し、細胞膜から分泌されることを示している。ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：４９９−５１６（１９８６）参照。
【０１３８】
いくつかのレクチンの植物由来の抗体への結合の差異は、植物由来の抗体およびマウス腹水由来の抗体の最終的なグリコシル化パターンが異なることを示している。植物由来の抗体は、末端ガラクトースおよび末端シアル酸に特異的なレクチンに結合せず、一方マウス腹水由来の抗体は結合した。
１３．植物細胞壁における免疫グロブリンの保持
細胞壁を含まない植物プロトプラストからの免疫グロブリンの分泌速度は、本来の植物壁からの免疫グロブリンの分泌速度と比較した。植物細胞からのプロトプラストの調製は、トリコリ（Ｔｒｉｃｏｌｅ）等、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，５：３３４−３３７（１９８６）に報告されている。簡単にいうと、タバコの葉１ｃｍ2片をセルリシン（カルバイオケム）、マセラーゼ（カルバイオケム）およびドリセラーゼ（シグマ）を含む混合物中、１８時間インキュベートして細胞壁を消化し、その葉からプロトプラストを放出させた。このプロトプラストを、０．４Ｍマニトール中での遠心で（１００×ｇ、２分間）精製した。２×１０6個のプロトプラストを１０μＣｉ  ｍＣｉの35Ｓ−メチオニンを含むマニトール培地０．５ｍｌに懸濁することにより、プロトプラストまたは元の植物細胞から生産される免疫グロブリンをラベル化した。この細胞をラベル培地中で２時間維持し、細胞および培地の一部を採取して抗体６Ｄ４へのラベル化メチオニンの取り込みを測定した。インキュベーション培地におけるラベル化６Ｄ４抗体の量は、プロテインＡ−セファロースカラムへの培地中に含まれる免疫グロブリンの吸着およびカラムに吸着した全ラベル量の測定により決定した。細胞中で抗体６Ｄ４に取り込まれたラベル化メチオニン量は、ハイアット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１２９３−１２９８（１９８６）に述べられているように、細胞の調製およびその分解物の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により測定した。抗体６Ｄ４を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの部分を切り出し、そのゲルからラベル化した抗体を溶出した。存在する全ラベル化抗体量を測定した。さらに、１００ｍＭメチオニン存在下でラサに２時間維持したのちに同様の測定を行った。
【０１３９】
ハイアット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１２９３−１２９８（１９８６）に述べられているように、適当な成長ホルモン中で葉セグメントをインキュベートすることにより８週間に渡ってカルス細胞系列を成長させた。液体サスペンジョン細胞系列はカルス細胞の塊から調製し、さきに述べて35Ｓ−メチオオンの取り込みに使用した。
この分泌分析の結果を表９に示す。２時間のラベル後、新たに合成された抗体の一部が、プロトプラストから有意に分泌された。１００ｍＭメチオニンによる２時間のチェイス後、ラベル化抗体のほとんどがプロトプラストから培地中に分泌されていた。このことは抗体の分泌が起こっていることを示している。一方、約４０％のラベル化抗体が元の細胞壁を有するカルスサスペンジョン細胞系列内に保持された。これらの細胞は、薄い一次細胞壁を有しており、したがってその細胞壁内に抗体を保持してしまう。
【０１４０】
表９  ２時間での６Ｄ４への35Ｓ−メチオニンの取り込み（培地／細胞）
プロトプラスト                プロテインＡ      ０．３３
〃                        ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ０．３１
カルスサスペンジョン細胞      プロテインＡ      ０．３９
〃                        ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ０．２５
２時間チェイス後の６Ｄ４への取り込み
プロトプラスト                プロテインＡ      ６．６０
〃                        ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ６．３１
カルスサスペンジョン細胞      プロテインＡ      ２．７７
〃                        ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ２．１４
【０１４１】
１４．植物細胞における分泌性ＩｇＡの生産
Ａ．病原特異的可変部をコードするメッセンジャーＲＮＡの単離
所定の抗原に免疫特異的な分泌性ＩｇＡは、まず所定のハイブリドーマから可変部コード遺伝子を単離することにより植物中で生産する。メッセンジャーＲＮＡは、ストラタジーン（ラジョラ、ＣＡ）によって製造されているＲＮＡ単離キットおよびその説明書を用い、チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９（１９８７）の方法に従って調製した。簡単にいうと、ガラスホモジナイザーを使用して約１×１０7個の細胞を、４．０Ｍグアニンイソチオシアネート、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含む変性溶液１０ｍｌ中でホモジナイズする。ｐＨ４．０の２Ｍ  酢酸ナトリウム１ｍｌをホモジナイズした細胞を含む変性溶液に混合する。このホモジネートに、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）２ｍｌを添加する。このホモジネートを１０秒間激しく攪拌し、氷水中で１５分間維持した。このホモジネートを厚みのある５０ｍｌポリプロピレン遠心チューブ（フィッシャーサイエンティフィックカンパニー、ピックバーグ、ＰＡ）に移す。この溶液を４℃、１００００×ｇで２０分間遠心し、上のＲＮＡ含有水層を新しい５０ｍｌポリエチレン遠心チューブに移して等容量のイソプロピルアルコールを混合する。この溶液を−２０℃に少なくとも１時間維持してＲＮＡを沈殿させる。沈殿したＲＮＡを含む溶液を、４℃、１００００×ｇで，２０分間遠心する。ペレット化した全細胞ＲＮＡを回収し、先に述べた変性溶液３ｍｌに溶かした。
この全細胞性ＲＮＡに、イサアミルアルコール３ｍｌに溶かした。イソアミルアルコール３ｍｌを全細胞性ＲＮＡに添加し、激しく攪拌する。この溶液を−２０℃に少なくとも１時間維持してＲＮＡを沈殿させる。ＲＮＡの沈殿を含む溶液を４℃、１００００×ｇで１０分間遠心する。ペレット化したＲＮＡを７５％エタノールを含む溶液を洗浄した。ペレット化したＲＮＡを減圧化で１５分間乾燥し、ついでジメチルピロカーボネート処理した（ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ）Ｈ2Ｏに懸濁した。
【０１４２】
このように調製したメッセンジャーＲＮＡについて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，第２編、サムブロック（Ｓａｍｂｏｏｋ）等、編、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８９）に述べられているように長いポリＡテールを含む配列を濃縮した。簡単にいうと、ハイブリドーマ細胞から単離した全ＲＮＡの半分を１ｍｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏに溶解し、６５℃に５分間維持した。１００ｍＭトリス−ＨＣｌ，１Ｍ塩化ナトリウム、２．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．５），および０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２×高塩ロードバッファ１ｍｌをこのＲＮＡサスペンジョンに加え、室温まで冷却する。ついで、この混合物を、予め０．１Ｍ水酸化ナトリウムおよび５ｍＭＥＤＴＡを含む溶液を洗浄し、ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏで平衡化したオリゴーｄＴ（コラボラティブリサーチ、タイプ２または３）カラムにロードする。このカラム溶出物を滅菌したポリプロピレンチューブに回収し、６５℃に５分間加熱した後、再び同じカラムにかけた。このカラムを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）および０．１％ＳＤＳを含む高塩ロードバッファ２ｍｌで洗浄する。さらに、このカラムを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含む１×中塩バッファ２ｍｌで洗浄する。このカラムから、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）および０．０５％ＳＤＳを含むバッファ１ｍｌを用いてメッセンジャーＲＮＡを溶出する。この溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、ついで１００％クロロホルムで一度抽出することによりメッセンジャーＲＮＡを精製した。このメッセンジャーＲＮＡをエタノール沈殿で濃縮し、ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏに溶解して使用するまで−７０℃で保存した。
【０１４３】
このように精製したメッセンジャーＲＮＡは、ハイブリドーマにより生産された抗体を構成する重鎖および軽鎖両可変部をコードするメッセンジャーＲＮＡを含んでいる。
Ｂ．ポリメレースチェーンリアクションを用いた可変部の単離
ＰＣＲ増幅を目的とした調製物では、プライマー伸長反応によるｃＤＮＡ合成用のテンプレートとしてて先の実施例で調製したｍＲＮＡを使用する。典型的な５０μｌの転写反応では、まず５−１０μｇのハイブリドーマｍＲＮＡの水溶液を、６５℃で５分間かけて５００ｎｇ（５０．０ｐｍｏｌ）の３’ＶHプライマーとハイブリダイス（アニール）する。オランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：３８３３−３９３７（１９８９）参照。つづいて、この混合物を、１．５ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ，４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），８ｍＭ  ＭｇＣｌ2,５０ｍＭ  ＮａＣｌ，および２ｍＭ  スペルミジンとなるように調整する。この溶液にモロニー・ムライン白血病ウイルス逆転写酵素（２６ユニット、ストラタジーン）を添加し、３７℃に１時間維持する。
ＰＣＲ増幅は、逆転写反応産物（約５μｇのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）、オランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．８６：３８３３−３９３７（１９８９）に述べられている３’ＶHプライマー３００ｎｇ、オランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）等、（上述）に述べられている８個の５’ＶHプライマー各３００ｎｇ，２００ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、５０１ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2,０．１％ゼラチンおよび２ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌの反応液で行う。この反応物にミネラルオイルを重層し、増幅を４０サイクル行う。各増幅サイクルには、９２℃、１分間の変性、５２℃、２分間のアニーリング、およひ７２℃、１．５分間のプライマー伸長によりポリヌクレオチド合成（伸長反応）が含まれる。増幅されるＶH−コードＤＮＡホモログ含有サンプルを、フェノール−クロロホルムで２回およびクロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿後、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液に溶解して−７０℃で保存した。
【０１４４】
ラムダまたはカッパ軽鎖に特異的な３’ＶLプライマーおよび５’ＶLプライマーを使用すること以外は先の方法と同様に軽鎖可変部を単離する。ＰＣＴ増幅条件は、重鎖可変部について述べたものと同じである。
Ｃ．植物発現ベクターへの病原体特異的重鎖および軽鎖可変部の挿入
先に述べたように、病原体特異的重鎖および軽鎖可変部を単離し、ＩｇＡの不変部を含む植物発現ベクターに挿入する。標準的分子生物学的技術を用いて、このベクターを構築する。このベクターは、実施例１で述べた抗体６Ｄ４由来の免疫グロブリンシグナル配列および完全に配列決定され、オーフレー（Ａｕｆｆｒａｙ）等、Ｇｅｎｅ，１３：３６５−３７４（１９８１）に報告されているＭＯＰＣ３１５から単離した免疫グロブリンα不変部の両方を含むｐＭＯＮ５３０の誘導体である。また、このベクターには、免疫グロブリンシグナル配列およびＩｇＡ不変部遺伝子の間にポリリンカー部分が含まれ、病原体特異的重鎖可変部の挿入が容易となっている。ポリリンカー中に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位は、重鎖可変部の単離に使用するＰＣＲプライマー中に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位に一致する。ベクターを適当な制限酵素で切断し、かつ可変部を単離するのに用いたＰＣＲプライマー中に存在する適当な制限酵素部位で病原体特異的可変部を切断することにより、病原体特異的重鎖可変部をベクターに挿入する。ついで、このベクターに病原体特異的可変部をライゲーションする。
このベクターを実施例４で述べた方法を用いて植物に導入する。病原体特異的ＩｇＡ重鎖を含む植物が同定され、これを病原体特異的重鎖可変部含有植物と交配する。
病原体特異的重鎖可変部含有植物と同様の技術を用いて、適当な軽鎖に結合した病原体特異的軽鎖可変部を含む植物を作製する。
【０１４５】
有性的交配を用いて同一の植物中に病原体特異的重鎖および軽い鎖を含ませ、集合型ＩｇＡを含む植物を作製する。
ｐＭＯＮ５３０ベクターなどの植物発現ベクターに分泌要素をコードする遺伝子を導入することにより、ＩｇＡの分泌要素を含む植物を作製する。分泌要素の配列は、モストフ（Ｍｏｓｔｏｖ）等、Ｎａｔｕｒｅ，３０８：３７（１９８４）に報告されている。標準的分子生物学的技術を用い、適当なシグナル配列とともに分泌要素遺伝子をｐＭＯＮ５３０ベクターに挿入する。この分泌要素含有ベクターを用いて植物細胞をトランスホームし、分泌要素を含み、これを発現する植物を作製する。
分泌要素、軽鎖および重鎖に関して述べられているように、植物発現ベクターにＪ鎖をコードする遺伝子を挿入することにより、免疫グロブリンＩｇＡのＪまたは結合鎖を含む植物を作製する。Ｊ鎖遺伝子の配列は、マックス（Ｍａｘ）等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６１：８３２−８４９（１９８５）に報告されている。さらに、他のＪ鎖の配列は、免疫学的に重要な蛋白質の配列、第四編、アメリカ、デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービス（１９８７）から入手できる。このベクターを用いＪ鎖を発現する植物を作製する。
これらのＪ鎖発現植物と分泌要素を発現する植物と交配し、分泌要素およびＪ鎖の両方を発現する植物を作製する。これらの植物を病原体特異的ＩｇＡ抗体を発現する植物と交配し、二つのＩｇＡ分子、分泌要素およびＪ鎖からなる真の分泌性ＩｇＡを発現する植物を作製する。
【０１４６】Ｄ．選択した病原体に対する受動免疫の誘導  分泌性ＩｇＡを生産する植物を実施例１１にしたがって生産する。これらの植物は、赤痢菌トキシンに免疫特異的な分泌性ＩｇＡを生産した。この分泌性ＩｇＡは、１３Ｃ２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７９４）と命名したハイブリドーマから重鎖および軽鎖可変部を単離することにより生産した。分泌性ＩｇＡを発現する植物は、植物物質１０−１００グラム当たり約１ミリグラムの分泌性ＩｇＡを含んでいた。これらの植物を収穫し、この植物が新鮮なうちに受動免疫に使用する。  毎日１−４回、分泌性ＩｇＡを発現する植物１０−１００グラムを摂取させることにより受動免疫が必要とされる成人を免疫化する。この免疫グロブリン摂取は、全部で三日間行い、（公序良俗違反につき、不掲載）【０１４７】  赤痢菌トキシンおよび赤痢菌様トキシン（ＳＬＴ１）に免疫特異的な分泌性植物を、ハイブリドーマ１３Ｃ２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７９４）由来の重鎖および軽鎖可変部を単離することにより調製する。この植物は、植物物質１０−１００グラム当たり約１mgの抗赤痢菌抗体を含んでいる。抗赤痢菌抗体を含む植物を単離し、ホモジナイズして小児用に使用する。  小児には、通常の食事への補填物として、三回以上に分けて１日に必要な植物物質量に存在する６−６００mgの抗体等価物を与える。（公序良俗違反につき、不掲載）  これまでの事項は本発明を説明するためのものであり、これを制限するものではない。これらを本発明の精神および範囲を逸脱すること無しに修正および変化しうることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】ハイブリドーマ６Ｄ４由来のカッパ鎖ｃＤＮＡ（図１Ａ）およびガンマ鎖ｃＤＮＡ（図１Ｂ）の主な特性を示す図である。重要な制限エンドヌクレアーゼ部位の位置が示されている。相補性決定領域、フレームワーク領域および不変領域の位置が示されている。
【図２】ロジャース（Rogers)等、Meth. In Enzymol.,１５３：２５３（１９８７）に述べられているｐＭＯＮ５３０  ３５Ｓ−ＮＯＳバイナリーカセットベクターの模式図である。ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターセグメント；３’，ＮＯＳ  ３’非翻訳配列、また、ｐＢＲ３２２複製オリジンを有する1.６kbセグメント、ノパリンＴ−ＤＮＡの右境界および本来のノパリンシンテース（ＮＯＳ）遺伝子を含むノパリン型ｐＴｉＴ３７プラスミドの2.４kbセグメント、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子を含むＴｎ７の2.２kbセグメント、トランスホーム植物細胞に選択可能なカナマイシン耐性を提供するキメラＮＯＳ−ＮＰＴＩＩ’−ＮＯＳ遺伝子をコードする1.６kbセグメントおよび他のＤＮＡセグメントの挿入用の単一の制限部位を含む合成マルチリンカーが存在する。
【図３】各カッパおよびガンマ鎖を含む植物を有性的に交配する事による植物中での抗体分子の安定な発現を示す模式図である。
【図４】図４Ａでは、トランスジェニック植物ゲノムへのカッパおよびガンマ両遺伝子の組み込みを示すトランスジェニック葉ＤＮＡのサザンブロットが示されている。リーダー配列を含まない軽鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホーマント（ｐＨｉ１０１）由来のＤＮＡが、レーン１に示されている。レーン２は、リーダーを含まない重鎖を発現するｃＤＮＡトランスホーマント（ｐＨｉ２０１）由来のＤＮＡを含んでいる。レーン３は、リーダーを含む軽鎖全ｃＤＮＡを発現するトランスホーマント（ｐＨｉ２０２）由来のＤＮＡを含んでいる。レーン５は、全ガンマｃＤＮＡを発現する植物と全カッパｃＤＮＡを発現する植物の交配に由来するＦ１植物（ｐＨｉ１０２×ｐＨｉ２０１）由来のＤＮＡを含んでいる。図４Ｂは、トランスジェニック植物の葉中でのカッパおよびガンマｍＲＮＡの発現を示すトランスジェニックタバコ植物の葉のＲＮＡのノーザンブロットである。レーン１は、リーダー配列を含まない軽鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホーマント（ｐＨｉ１０１）由来のＲＮＡを含んでいる。レーン２は、リーダーを含まない重鎖ｃＤＮＡトランスホーマント（ｐＨｉ２０１）由来のＲＮＡを含んでいる。レーン３は、リーダーを含む全軽鎖を発現するトランスホーマント（ｐＨｉ１０２）由来のＲＮＡを含み、レーン４は、リーダーを含む重鎖を発現するトランスホーマント（ｐＨｉ２０２）由来のＲＮＡを含んでいる。レーン５は、全ガンマｃＤＮＡを発現する植物および全カッパｃＤＮＡを発現する植物の交配によるＦ１植物（ｐＨｉ１０２×ｐＨｉ２０１）由来のＲＮＡを含んでいる。別のハイブリダゼーション由来のレーンを、メチレンブルー染色による検出されるブロット上の１８Ｓ（１９００bp）および２５Ｓ（３７００bp）リボゾームＲＮＡバンドと共に整列させた。
【図５】免疫グロブリンカッパ鎖、免疫グロブリンガンマ鎖または集合免疫グロブリンＩｇＧを発現するトランスジェニックタバコ植物由来の葉の蛋白質のウエスタンブロットを示している。レーン１−７の葉蛋白質抽出物はジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含んでおり、レーン８および９の葉蛋白質抽出物は、ＤＴＴを含んでいない。レーン１は、ハイブリドーマ６Ｄ４由来の精製蛋白質１００ngを含んでいる。レーン２は、野生型植物抽出蛋白質１５μｇを含んでいる。レーン３は、リーダー配列を含まない短縮型カッパ鎖ｃＤＮＡでトランスホームした植物（ｐＨｉ１０１）由来の蛋白質１５μｇを含んでいる。レーン４は、短縮型ガンマ鎖ｃＤＮＡでトランスホームした植物（ｐＨｉ１０２）由来の植物抽出物１５μｇを含んでいる。レーン５は、全カッパｃＤＮＡトランスホーマント（ｐＨｉ２０２）由来の植物抽出物１５μｇを含んでいる。レーン６は、全ガンマ鎖ｃＤＮＡトランスホーマント（ｐＨｉ２０２）由来の植物抽出物１５μｇを含んでいる。レーン７は、カッパおよびガンマトランスホーマントの交配によるＦ１植物由来の植物抽出物１５μｇを含んでいる。レーン８は、６Ｄ４抗体１００ｇを含む（ＤＴＴなし）。レーン９は、サンプル中にＤＴＴが存在しない事以外はレーン７と同様である。左のガンマおよびカッパは、６Ｄ４重鎖および軽鎖の位置を示している。
【図６】主要なアスパラギン結合オリゴサッカライド（Ｎ−結合オリゴサッカライド）の構造を示している。ボックス領域は、全てのＮ−結合オリゴサッカライドに共通なペンタサッカライドコア（グリコシル化したコア部分）を示している。複合型およびハイブリッドＮ−結合オリゴサッカライドは、アウターブランチを含むＮ−アセチルグルコサミンを有するが、高マンノースＮ−結合オリゴサッカライドは、それを含まない。複合型、ハイブリッドおよび高マンノースオリゴサッカライドをそれぞれ図６Ａ、ＢおよびＣに示す。
【図７】ハゲス（Hughes),糖蛋白質、チャップマンアンドホール版、ニューヨーク、ＮＹ（１９８３）に述べられているＮ−アセチルノイラミン酸および他のシアル酸の構造を示している。
【図８】ジェスケ（Jeske)およびカプラ（Capra)，基礎免疫学、Ｗ．Ｅ．ポール（Paul)編、レーベンプレス、ニューヨーク、ＮＹ（１９８４）に述べられているヒト軽鎖中の炭水化物の位置を示している。グルコサミンオリゴサッカライドは、縦の線で示した。二つ以上の鎖で同じ位置にある場合は斜線で、単一の位置にある場合は白線で示してある。横の線は、ガラクトサミンオリゴサッカライドの位置を示している。上のスケールは上の五つの鎖の残基位置を示し、下のスケールはμおよびε鎖の位置を示している。
【図９】図９Ａは基質を示し、図９Ｂはタバコ植物中で生産される６Ｄ４抗体が基質を触媒するよう機能する事を示すのに用いるインヒビターを示している。
【図１０】ガンマ重鎖の種々のレクチンへの結合を示している。植物またはマウス中で生産されるＩｇＧ抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、チュー（Chua), Meth. Enzymol. ６９：４３４−４４６（１９８０）およびハーロー（Harlow)およびレーン（Lans),  抗体、ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８８）に述べられている操作にしたがってニトロセルロースに移した。レーン１は、タバコ植物に生産されたＩｇＧ６Ｄ４抗体１mgを含み、レーン２は、マウス腹水から単離したＩｇＧ６Ｄ４抗体１mgを含む。レーン３は、フェイ（Faye)およびクリスピールス（Chrispeels), Anal. Biochem.,１４９：２１８−２４（１９８５）に述べられているヒトのトランスフェリン（複合型炭水化物）各１mgを含む。略号：Ｃｏｎ  Ａ：コンカナバリンＡ；ＲＣＡ：リシナス  コムニス（Ricinus communis)アグルチニン；ＰＨＡ：ファセオラス  バルガリス（Phaseolus vulgaris)エリスロレクチン； Endo Ｈ：エンドグリコシダーゼＨ；α−ＭＧ：α−メチルグルコピラノシド。
【図１】
2005112857.tif 000002
【図２】
2005112857.tif 000003
【図３】
2005112857.tif 000004
【図４】
2005112857.tif 000005
【図５】
2005112857.tif 000006
【図６】
2005112857.tif 000007
【図７】
2005112857.tif 000008
【図８】
2005112857.tif 000009
【図９】
2005112857.tif 000010
【図１０】
2005112857.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月4日(2004.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコポリペプチドマルチマー及び植物物質を含むグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、該グリコポリペプチドの一つが(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列と(b)コア部分及びＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有し、前記組成物がシアル酸残基を含まず、前記植物物質が単子葉植物由来である、上記グリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項２】
前記アミノ酸残基配列が、重鎖または軽鎖免疫グロブリン可変部アミノ酸残基配列を含む、請求項１記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項３】
少なくとも一つの触媒部位または酵素部位を含む、請求項１記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項４】
第一及び第二のポリペチド及び植物物質を含むグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、第一のポリペプチドがグリコシル化コア部分、Ｎ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチ及び第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含み、かつ第一のポリペプチドは前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列と異なる第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む第二のポリペプチドに結合しており、前記組成物が検出可能なシアル酸を含まず、前記植物物質が単子葉植物由来である、グリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項５】
前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項４記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項６】
前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項４記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項７】
前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列を含み、および前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項４記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項８】
前記第一の免疫グロブリンアミノ酸残基配列が触媒部位の第一部分を規定し、ならびに前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が該触媒部位の第二部分を規定し、かつ該第一および第二部分が会合して該触媒部位を形成する請求項４記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項９】
前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の一部を規定する免疫グロブリン重鎖可変部のアミノ酸残基配列を含む請求項４記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項１０】
前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の一部を規定する免疫グロブリン軽鎖可変部のアミノ酸残基配列を含む請求項４記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項１１】
前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の第一部分を規定する免疫グロブリン重鎖可変部のアミノ酸残基配列を含み、ならびに前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の第二部分を規定する免疫グロブリン軽鎖可変部のアミノ酸残基配列を含み、かつ該第一および第二部分が会合して該触媒部位を形成する請求項４記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項１２】
（i）Ｎ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むグリコシル化コア部分で規定されるオリゴサッカライドおよび免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有し、マウス免疫グロブリン結合レクチンに結合しない第一のポリペプチド、および
（ii）異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含み、前記第一のポリペプチドに結合する第二のポリペプチド、および
（iii）単子葉植物由来である植物物質、
を含むグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項12記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項１４】
前記異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項12記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項１５】
前記マウス免疫グロブリン結合レクチンが小麦胚芽アグルチニンである請求項12記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項１６】
前記マウス免疫グロブリン結合レクチンがリシナス コムニス（Ricinus communis）アグルチニンである請求項12記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
【請求項１７】
該植物物質が、植物細胞壁、植物細胞器官、植物細胞質、植物プロトプラスト、植物細胞、無処置植物、生植物、植物葉抽出物、植物葉ホモジネート、薬用植物からの誘導物質およびクロロフィルからなる群から選択される、請求項1、4または12記載のマルチマー組成物。
【請求項１８】
前記植物物質が、存在する１００ｎｇのグリコポリペプチドマルチマー当たり植物物質が１００００ｇから１０ｇのグリコポリプチドマルチマー当たり植物物質が１００ｎｇの比率で存在する、請求項1、4または12記載のマルチマー組成物。
【請求項１９】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項1、4または12記載のマルチマー組成物。
【請求項２０】
所定のリガンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーと植物物質を含む予防量の組成物を動物（ヒトを除く）のムコサ表面と接触させることを含む所定のリガンドに対する動物（ヒトを除く）の受動免疫化の方法であって、該マルチマーはグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、かつ検出可能なシアル酸残基を含まず、前記植物物質が単子葉植物由来である、上記動物（ヒトを除く）の受動免疫化方法。
【請求項２１】
動物（ヒトを除く）に所定のリガンドに対する受動免疫を提供する方法であって、所定のリガンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーと植物物質を含む組成物を該動物体内で予防濃度となるのに十分な量で該動物に投与することを含み、該マルチマーがグリコシル化コア部分並びにＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチ、および免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、かつ検出可能なシアル酸残基を含まず、前記植物物質が単子葉植物由来である、上記動物（ヒトを除く）に受動免疫を提供する方法。
【請求項２２】
前記組成物が、カプセル化されている請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、植物細胞壁または腸溶コーティングにカプセル化されている請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が生理学的に不活性な物質を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
前記植物物質が、存在する１００ｎｇのグリコポリペプチドマルチマー当たり植物物質が１００００ｇから１０ｇのグリコポリプチドマルチマー当たり植物物質が１００ｎｇの比率で存在する、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
前記所定のリガンドが病原体抗原である、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーがＩｇＡ分子である請求項20記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが分泌性ＩｇＡである請求項20記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーがＩｇＡ不変部アミノ酸残基配列を含む請求項20記載の方法。
【請求項３１】
前記所定のリガンドがムコサ、腸、または歯病原菌抗原である請求項20記載の方法。
【請求項３２】
前記腸病原菌抗原が大腸菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ）、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはストレプトコッカスミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）抗原である請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記動物が脊椎動物である請求項20記載の方法。
【請求項３４】
前記動物が哺乳動物である請求項20記載の方法。
【請求項３５】
前記動物が魚、鳥または反芻動物である請求項20記載の方法。
【請求項３６】
前記動物が離乳した哺乳類または成熟した哺乳類である請求項20記載の方法。
【請求項３７】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項20記載の方法。
【請求項３８】
所定のリガンドに対して動物（ヒトを除く）を受動免疫化する方法であって、植物細胞壁および所定のリガンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および(b)コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するグリコポリペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まず、前記植物細胞壁が単子葉植物由来である、マルチマーを含む組成物を動物（ヒトを除く）の消化管に導入することを含む方法。
【請求項３９】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
グリコポリペプチドマルチマーと植物物質とを含むカプセル化したグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、該グリコポリペプチドの一つが(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列及び(b)コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有し、及び該マルチマー組成物がシアル酸残基を含まず、前記植物物質が単子葉植物由来である、上記マルチマー組成物。
【請求項４１】
前記カプセルが植物細胞または腸溶コーティングである請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項40記載のマルチマー組成物。
【請求項４３】
グリコポリペプチドマルチマーと植物物質とを含むグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、該グリコポリペプチドの一つが(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列及び(b)コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドであり、及び該マルチマー組成物がシアル酸残基を含まず、かつ少なくとも一つの触媒部位を有し、前記植物物質が単子葉植物由来である、上記マルチマー組成物。
【請求項４４】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項43記載のマルチマー組成物。
【請求項４５】
複数のマルチマー形成ポリペプチドコード哺乳類遺伝子、及び該遺伝子によってコードされる少なくとも二つのマルチマー形成ポリペプチドであって、互いに会合してポリペプチドマルチマーとなっているマルチマー形成ポリペプチド、を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項４６】
前記複数のマルチマー形成ポリペプチドコード哺乳類遺伝子が、分泌シグナル配列を含む免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチドをコードする少なくとも一つの遺伝子、及び分泌シグナル配列を含む免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチドをコードする少なくとも別の遺伝子を含み、前記ポリペプチドマルチマーがヘテロダイマー抗体である、請求項45記載のトランスジェニック植物。
【請求項４７】
前記ヘテロダイマー抗体がＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントである、請求項46記載の植物。
【請求項４８】
前記免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチド若しくは前記免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチド、または両者いずれもが完全長より短い、請求項46記載の植物。
【請求項４９】
前記ポリペプチドマルチマーが酵素、アブザイムまたは所定のリガンドを特異的に結合し得るレセプターである請求項45記載の植物。
【請求項５０】
米またはとうもろこしから選択される、請求項45記載の植物。
【請求項５１】
マルチマー蛋白を生産しうるトランスジェニック植物の作製方法であって、以下の(a)〜(d)を含む方法。
(a)  分泌シグナル配列を含む、マルチマー形成哺乳類ポリペプチドをコードする第一遺伝子を第一植物種のゲノムに導入し、第一トランスホーマントを生成する、
(b)  分泌シグナル配列を含む、異なるマルチマー形成哺乳類ポリペプチドをコードする第二の遺伝子を第二の同じ植物種のゲノムに導入し、第二トランスホーマントを生成する、
(c)  該第一及び第二トランスホーマントから子孫集団を生成する、及び
(d)  該子孫集団から該マルチマー蛋白を生産するトランスジェニック植物を単離する。
【請求項５２】
前記第一遺伝子が分泌シグナル配列を有する免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチドをコードし、前記第二遺伝子が分泌シグナル配列を有する免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチドをコードし、及び前記マルチマー蛋白がヘテロダイマー抗体である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記子孫集団から、ヘテロダイマー抗体を生産する植物種が単離され、前記免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチド若しくは前記免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチド、または両者いずれもが完全長より短い、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
前記子孫集団からＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントを生産する植物種を単離することを特徴とする請求項52記載の方法。
【請求項５５】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項51記載の方法。
【請求項５６】
ヘテロダイマー抗体の製造方法であって、以下の(a)〜(c)を含む方法。
(a)  請求項46に記載のトランスジェニック植物を培養する、
(b)  該トランスジェニック植物を収穫する、及び
(c)  収穫した植物からヘテロダイマー抗体を回収する。
【請求項５７】
前記回収ステップが、(i) 収穫した植物の少なくとも一部をホモジナイズし、パルプとすること、及び(ii)該パルプからヘテロダイマー抗体を抽出することを含む請求項56記載の方法。
【請求項５８】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項56記載の方法。
【請求項５９】
以下を含む、グリコポリペプチドマルチマーを生産するトランスジェニック植物を作製する方法。
(a)  グリコポリペプチドマルチマーの構成部分であるＮ−結合グリコシル化シグナルを有するマルチマー形成ポリぺプチドをコードする第一哺乳類遺伝子を第一植物種のゲノムに導入し、第一トランスホーマントを生成すること、
(b)  グリコポリぺプチドマルチマーの構成部分である別のマルチマー形成モノマーポリペプチドをコードする第二の哺乳類遺伝子を第二の同じ植物種のゲノムに導入し、第二トランスホーマントを生成すること、
(c)  該第一及び第二トランスホーマントから子孫集団を生成すること、及び
(d)  該子孫集団から該グリコポリペプチドマルチマーを生産するトランスジェニック植物を単離すること。
【請求項６０】
前記第一哺乳類遺伝子が免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチドをコードし、前記第二哺乳類遺伝子が免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチドをコードし、及び前記グリコポリペプチドマルチマーがグリコシル化ヘテロダイマー抗体である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
前記第一及び第二哺乳類遺伝子を分離ベクターにより導入することを特徴とする、請求項59記載の方法。
【請求項６２】
Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントの形態のヘテロダイマー抗体を生産する植物種が前記子孫集団から単離されることを特徴とする、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
前記子孫集団がヘテロダイマー抗体を生産する植物種であり、前記免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチド若しくは前記免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチド、または両者いずれもが完全長より短い、請求項60記載の方法。
【請求項６４】
前記単子葉植物が米またはとうもろこしから選択される、請求項59記載の方法。
【請求項６５】
以下を含む植物：
ａ）免疫グロブリン重鎖ポリペプチド若しくはその部分または免疫グロブリン軽鎖若しくはその部分を含む免疫グロブリン一本鎖ポリペプチド生成物をコードするヌクレオチド配列であって、分泌シグナルを形成するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞；及び
ｂ）該ヌクレオチド配列によりコードされる免疫グロブリン一本鎖ポリペプチド生成物であって、該リーダー配列がタンパク質分解プロセスに続いて該ポリペプチド生成物から開裂するものであるポリペプチド生成物。
【請求項６６】
前記免疫グロブリン生成物が抗原に特異的に結合することができる、請求項65記載の植物。
【請求項６７】
前記免疫グロブリン生成物がアブザイムである、請求項65記載の植物。
【請求項６８】
前記免疫グロブリン生成物がパラトープを含む、請求項65記載の植物。
【請求項６９】
藻類である、請求項65記載の植物。
【請求項７０】
米またはとうもろこしから選択される、請求項65記載の植物。
【請求項７１】
以下を含む植物：
ａ）免疫グロブリン重鎖ポリペプチド若しくはその部分および免疫グロブリン軽鎖若しくはその部分を含む免疫グロブリン一本鎖ポリペプチド生成物をコードするヌクレオチド配列であって、分泌シグナルを形成するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞；及び
ｂ）該ヌクレオチド配列によりコードされる免疫グロブリン一本鎖ポリペプチド生成物であって、該リーダー配列がタンパク質分解プロセスに続いて該ポリペプチド生成物から開裂するものであるポリペプチド生成物。
【請求項７２】
前記免疫グロブリン生成物が一本鎖Ｆｖ抗原結合蛋白質である、請求項71記載の植物。
【請求項７３】
前記免疫グロブリン生成物が抗体に特異的に結合することができる、請求項71記載の植物。
【請求項７４】
前記免疫グロブリン生成物がアブザイムである、請求項71記載の植物。
【請求項７５】
前記免疫グロブリン生成物がパラトープを含む、請求項71記載の植物。
【請求項７６】
藻類である、請求項71記載の植物。
【請求項７７】
米またはとうもろこしから選択される、請求項71記載の植物。