(57)【要約】      （修正有）【課題】表面シラノール基が有効に無効化されたクロマトグラフィ用カラムの新規固定相を提供する。【解決手段】１つの単官能シランが結合した基体、又は２つもしくは３つの単官能シランの混合物が結合した基体。当該単官能シランの少なくとも１つは、少なくとも１つの不飽和炭化水素基Ｒ'を有し、且つ以下のシラン構造を有する。2005315889.tif 000010〔式中、Ｒ'はアルケニル、アルキニル、及びフェニルから成る群から独立して選択され、Ｒ''はアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、及びアリール、置換アリールから成る群から選択され、Ｒはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、及びアリール、置換アリール、アルキルアミン、アミド、エーテル、アルコール、カルバメート、エステル、陰イオン交換体、及び陽イオン交換体から成る群から選択される〕【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単官能シランが化学結合している基体であって、少なくとも１つの単官能シランが３つの基Ｒ、Ｒ'、Ｒ''を有し且つ以下の構造
【化１】
2005315889.tif 000006
〔式中、Ｒ'がアルケニル、アルキニル、及びフェニルから成る群から独立して選択され、Ｒ''がアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、及びアリール、置換アリールから成る群から選択され、Ｒがアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、及びアリール、置換アリール、アルキルアミン、アミド、エーテル、アルコール、カルバメート、エステル、陰イオン交換体、及び陽イオン交換体から成る群から選択される〕を有する、基体。
【請求項２】
前記基体が、少なくとも２つの異なる単官能シランの混合物を含む、請求項１に記載の基体。
【請求項３】
前記基体が、少なくとも３つの異なる単官能シランの混合物を含む、請求項１に記載の基体。
【請求項４】
前記単官能シランが、ジメチル置換第三級炭素成分を含まない、請求項１に記載の基体。
【請求項５】
Ｒ'が、ビニル、アリル、エチニル、及びプロピニルから成る群から選択される、請求項１に記載の基体。
【請求項６】
前記基体が、水和金属酸化物、水和非金属酸化物、及び有機ポリマーから成る群から選択される、請求項１に記載の基体。
【請求項７】
前記金属酸化物基体及び前記非金属酸化物基体が、シリカ、酸化クロム、ジルコニア、及び酸化スズを含む、請求項６に記載の基体。
【請求項８】
前記基体が、シリカでコーティングされた剛性材料である、請求項６に記載の基体。
【請求項９】
前記Ｒ、Ｒ'、Ｒ''基が、それぞれ異なっている、請求項１に記載の基体。
【請求項１０】
シリカ基体を含む、ペプチド合成用の基体であって、以下のシラン構造
【化２】
2005315889.tif 000007
〔式中、Ｒ'がビニル、アリル、エチニル、及びプロピニルから成る群から選択され、Ｒ''がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ビニル、アリル、エチニル、及びプロピニルから成る群から選択され、Ｒが−（ＣＨ２）３−ＮＨ２であり、且つＯ基が前記シリカ基体に共有結合している〕を有する、基体。
【請求項１１】
Ｒ'が、−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１に記載の基体。
【請求項１２】
前記Ｒ基が、イオン交換基を含む、請求項１に記載の基体。
【請求項１３】
前記Ｒ基が、アフィニティクロマトグラフィに有用な配位子の結合サイトを備える、請求項１に記載の基体。
【請求項１４】
前記Ｒ基が、触媒の結合サイトを備える、請求項１に記載の基体。
【請求項１５】
前記Ｒ基が、逆相クロマトグラフィに適する疎水性結合サイトをもたらす、請求項１に記載の基体。
【請求項１６】
前記Ｒ基が、サイズ排除クロマトグラフィに適する親水性結合サイトをもたらす、請求項１に記載の基体。
【請求項１７】
前記イオン交換基が、弱陰イオン交換基、強陰イオン交換基、弱陽イオン交換基、又は強陽イオン交換基である、請求項１２に記載の基体。
【請求項１８】
クロマトグラフィによる分離方法であって、
試料を固定相に適用するステップを包含し、前記固定相が、基体及び単官能シランを含んで成る安定な担体構造を含み、少なくとも１つの単官能シランが、少なくとも１つの不飽和炭化水素基Ｒ'と他の官能基Ｒを有し且つ以下のシラン構造
【化３】
2005315889.tif 000008
〔式中、Ｒ'がアルケニル、アルキニル、及びフェニルから成る群から独立して選択され、Ｒ''がアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、及びアリール、置換アリールから成る群から選択され、Ｒがアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、及びアリール、置換アリール、アルキルアミン、アミド、エーテル、アルコール、カルバメート、エステル、陰イオン交換体、及び陽イオン交換体から成る群から選択される〕を有する、方法。
【請求項１９】
前記基体が、少なくとも２つの異なる単官能シランの混合物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記基体が、少なくとも３つの異なる単官能シランの混合物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記単官能シランが、ジメチル置換第三級炭素成分を含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
クロマトグラフィ分離において使用するためのカラムであって、
少なくとも１つの不飽和炭化水素基Ｒ'を有する単官能シランを含む基体を含んで成り、前記単官能シランが、前記基体に共有結合しており且つ以下のシラン構造
【化４】
2005315889.tif 000009
〔式中、Ｒ'がアルケニル、アルキニル、及びフェニルから成る群から独立して選択され、Ｒ''がアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、及びアリール、置換アリールから成る群から選択され、Ｒがアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、及びアリール、置換アリール、アルキルアミン、アミド、エーテル、アルコール、カルバメート、エステル、陰イオン交換体、及び陽イオン交換体から成る群から選択される〕を有する、カラム。
【請求項２３】
前記基体が、少なくとも２つの異なる単官能シランの混合物を含む、請求項２２に記載のカラム。
【請求項２４】
前記基体が、少なくとも３つの異なる単官能シランの混合物を含む、請求項２２に記載のカラム。
【請求項２５】
前記単官能シランが、ジメチル置換第三級炭素成分を含まない、請求項２２に記載のカラム。
【請求項２６】
クロマトグラフィ用の基体を製造する方法であって、
（ｉ）結合させるためのジビニルアルキルシラン及びモノビニルアルキルシランを調製するステップと、
（ｉｉ）ジビニルアルキルシランもしくはモノビニルアルキルシラン、又は少なくとも１つのシランがモノビニルアルキルシランである２つあるいは３つのシランの混合物、をシリカ基体に結合させて、結合相を生成するステップと、
（ｉｉｉ）残った未結合シリカ表面の少なくとも一部に、モノビニルシラン、ジビニルシラン、及びトリビニルシランから成る群から選択されるシランを結合させるステップと、
を包含する方法。
【請求項２７】
前記表面に約０．２μＭ未満のエンドキャッピング試薬を接触させるステップをさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記エンドキャッピング試薬が、（ジメチルアミノ）トリビニルシラン、クロロトリビニルシランから成る群から選択される、請求項２７に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィにおいて用いるための材料、並びに当該材料の製造法に関する。詳細には、本発明は、液体クロマトグラフィのカラム用充填材に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリカ粒子は、逆相液体クロマトグラフィの固定相において最も広く用いられている担体である。機械的安定性が高く、単分散粒子であり、表面積が大きく、孔径分布の調整が容易であるため、シリカは他の担体よりも効率、剛性、及び性能に関して優れている。また、シリカ上に化合物を結合させることによって、選択性の異なる多種多様な固定相を得ることも可能となる（非特許文献１〜３を参照されたい）。
【０００３】
シランは、液体クロマトグラフィにおいて最もよく用いられる表面修飾試薬である。例えば、非特許文献４〜８には、さまざまなシリコンを含有する表面修飾試薬が開示されている。シリカの誘導（修飾）に用いられる典型的なシランカップリング剤の一般式は、ＥｔＯＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３又はＣｌＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３（ここで、Ｒは、互いに異なってもよく、全てが同じでもよいところの、有機基を表わす）である。逆相クロマトグラフィの場合、シラン結合剤は、伝統的に、−Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ１８Ｈ３７）であり、この場合、Ｃ１８Ｈ３７、即ちオクタデシル基が疎水性表面をもたらす。一般に表面シラノール濃度が約８μｍｏｌ／ｍ２のヒドロキシ化シリカを用いて反応を実施すると、カップリング剤のＲ基による立体的障害のため、反応が完全には完了しない（非特許文献３参照）。シリカ表面のいくつかの残留シラノール基へのアクセスを阻害することによって元の化学結合相の特性を改善するため、当該結合相は、通常、小さい有機シランを用いて、さらにエンドキャッピング（末端保護処理）が施される。エンドキャッピングは、通常、トリメチルシリル基（ＣＨ３）３Ｓｉ−を生成し得る化合物を用いて実施されるが、最も一般的なものは、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）及びヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）である。ジメチルオクタデシルシリル基の下方に存在する自由な（未修飾の）表面シラノールの大部分は、立体障害のため、エンドキャッピング剤と反応することができない。従来のエンドキャッピングステップでは、炭素担持量データに基づいて、〜０．２μｍｏｌ／ｍ２の表面シラノール基だけが結合されていた。実験室レベルの研究で得られた最も高い被覆率は〜４．５μｍｏｌ／ｍ２であったが、商業用クロマトグラフィカラムの場合は、通常、エンドキャッピングの後でさえ、およそ２．７〜３．５μｍｏｌ／ｍ２程度と、はるかに少ない（非特許文献８参照）。
【０００４】
これらの残留表面シラノールは、イオン交換、水素結合、及び双極子−双極子メカニズムによって塩基性分析物及び酸性分析物と相互作用する。分析物と残留シラノール基との間におけるこの二次的相互作用によって、特に中間ｐＨ範囲において塩基性化合物に関して、保持（リテンション）の増大、過剰なピークテーリング、並びに一部の分析物の非可逆性吸着をはじめとする問題が生じる。
【０００５】
塩基性化合物は、環境、化学、食品、及び製薬産業といった、さまざまな分野で広範囲にわたって見受けられる。とりわけ製薬産業の場合、８０％を超える市販の薬剤が、塩基性官能基を有しているものと推定される。従って、表面シラノールの活性を最小限に抑えた実用的なＨＰＬＣ固定相を開発することが重要である。
【０００６】
残留シラノールの問題を克服するため、超高純度シリカ、炭化シリカ、高分子組成物によるシリカ表面のコーティング、残留シラノール基のエンドキャッピング、及び溶離剤への長鎖アミンのようなサプレッサの添加（非特許文献９参照）を利用するといった多くの方法が試みられてきた。実際上、これらのアプローチの何れもが、完全に満足のゆくものではなかった。Ｓｔｅｌｌａらによって、シリカ担体の非活性化に関する一般的な説明が示されている（非特許文献９参照）。
【０００７】
特許文献１には、徹底的なエンドキャッピングによって表面シラノールを排除する１つの方法が記載されている。従来のエンドキャッピングは、いくつかの残留シラノール基を物理的に結合させることが可能であるが、表面シラノールの少なくとも５０％は反応を起こさないままであった。特許文献１には、高温シリル化によるオクタデシルシリル化シリカゲルのエンドキャッピング法が記載されている（非特許文献１０、１１参照）。トリクロロシラン由来の高分子化学結合相を、密封アンプル内において、約２５０℃を超える極めて高い温度において、ヘキサメチルジシラザン又はヘキサメチルシクロトリシロキサンを用いてエンドキャップさせている。その結果生じるエンドキャップされた相は、エンゲルハルド試験（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  ｔｅｓｔ）で優れた性能を発揮することが明らかにされている。しかしながら、高分子相は、通常、物質移動が不十分で、再現性が悪い。また、密封アンプル内における高温のシリル化は、従来の液相エンドキャッピング手順と比較すると、実用的でなく、商業的に実施が困難である。
【０００８】
他の１つの方法は、長鎖オクタデシルに埋め込み極性基を導入することである。一般に、特許文献２に開示されるような窒素原子及びアミド（非特許文献１２〜１６参照）、特許文献３に開示されるようなカルバメート（非特許文献１７、１８参照）、及び最近における尿素基（非特許文献１９参照）を含有する、当該埋め込み基は、望ましくないシラノール相互作用を最小限に抑えるのに重要な役割を果たすことが明らかにされている。埋め込み極性基を有する相は、従来のＣ１８相と比べると、明らかに、塩基性化合物に関してより低いテーリング係数を示す。いくつかのメカニズムが提案されているが、いくつかの証拠に基づいて、埋め込み極性基相の表面層は、シリカ表面に近い極性基の水素結合能力のため、水の濃度が高くなるのであろうと考えられている。この仮の水層は、塩基性分析物と残留表面シラノールとの相互作用を抑制し、１００％の水濃度を有する移動相との分離を可能にする（非特許文献２０参照）。一方において、この水層の存在は、アルキルＣ８及びＣ１８の対応品に比べると、これらのシリカ担体のより急速な溶解につながるようである。Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄによる体系的カラム安定性評価において（非特許文献２１参照）、アミド極性基の埋め込まれた固定相の安定性は低いことが報告されている。この結果は、埋め込み極性相の場合、下方に存在するシリカ表面近傍における水の含量が多いことに起因するものと予測することができる。さらに、当該相が加水分解されたり、又は当該相の調製時に十分に反応が起こらず（非特許文献１９参照）、アミン又はヒドロキシ基が表面に残る場合には、埋め込み極性基は、分析物の一部を吸着することになる。例えば、ヒドロキシ化アミド相の場合、表面にアミノプロピル成分が残り、酸性化合物及び極性化合物を強く吸着して、ピークテーリングあるいはピーク欠落（ｐｅａｋ  ｍｉｓｓｉｎｇ）が起こり得る。
【０００９】
埋め込み極性相はまた、従来のＣ１８相に比べて親水性も高い。分析物の保持は、従来のＣ１８カラムよりもはるかに少ない。その結果、当該相の選択性は、従来のＣ１８と全く異なるため、ピークの順序が変化することになる。従来のＣ１８に関して開発された方法を、埋め込み極性相カラムに転用することはできない。
【００１０】
反応性表面シラノールの問題に対処するもう１つの方法は、表面シラノールを立体保護することが可能な相を利用することである。デュポン社の特許文献４には、かさ高いジイソブチル（Ｃ１８を備えた）又はイソプロピル（Ｃ８、Ｃ３、及びＣ１４アミドを備えた）側鎖基（Ｚｏｒｂａｘ（商標）Ｓｔａｂｌｅ  Ｂｏｎｄ逆相カラム）によって、長鎖単官能配位子及び短鎖単官能配位子の両方が安定化され、低ｐＨにおける加水分解及び損失から保護されることを記載している（非特許文献２２参照）。かさ高い側鎖によって、相の加水分解安定性が増す。こうした成分は、低ｐＨにおいて分解されにくく、下方に存在するシラノールをより有効に保護する。立体保護された相は、低ｐＨにおいて極めて安定である。立体保護されたシラン相は、エンドキャップされておらず、従って、小さい、酸性移動相条件下において加水分解されやすいエンドキャッピング試薬の損失が回避される。ｐＨ＜３において、当該相は、ピーク、再現性、及び寿命に関して優れた性能を示す。このｐＨ範囲においては、Ｂ型シリカ上のシラノール基はほぼ完全にプロトン化され、結果として、二次的相互作用サイトとして機能しなくなる。しかしながら、被覆密度は、ジメチルＯＤＳ相の場合よりもはるかに低い。配位子密度が３．３７μｍｏｌ／ｍ２である、関連する古典的なジメチルオクタデシル相と比較すると、ジイソブチルオクタデシル相の配位子密度は〜２μｍｏｌ／ｍ２である。特許文献５には、橋かけプロピレン二座シラン（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｂｉｄｅｎｔａｔｅ  ｓｉｌａｎｅ）又は二座Ｃ１８相（Ｚｏｒｂａｘ（商標）Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８カラム）を利用して、２つのＣ１８配位子間にプロピレンの橋を組み込むことにより、分析物が残留シラノールにアクセスするのを制限する方法が開示されている（非特許文献２３参照）。当該二座Ｃ１８相は、単官能シラン相の利点（高カラム効率、反応再現性）を有すると共に、高ｐＨ及び低ｐＨ移動相における良好な安定性を示す。Ｚｏｒｂａｘ  Ｓｔａｂｌｅ−Ｂｏｎｄ  Ｃ１８（ＳＢ−Ｃ１８）及びＺｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８カラムはまた、従来のＣ１８カラムと極めてよく似た選択性も示す。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，１３４，１１０号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第９０３０２０９５．４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３７４，７５５号明細書
【特許文献４】米国特許第４，７０５，７２５号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９４８，５３１号明細書
【非特許文献１】Ｂｕｃｈｍｅｉｓｅｒ，Ｍ．Ｒ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｒ．Ａ  ２００１，９１８，２３３−２６６
【非特許文献２】Ｎｅｕｅ，Ｕ．Ｄ．著、Ｍｅｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１
【非特許文献３】Ｎａｗｒｏｃｋｉ，Ｊ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １９９７，７７９，２９
【非特許文献４】「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」，Ｃｈａｐｔｅｒ７、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３５２，１９９（１９８６）
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２６７，３９（１９８３）
【非特許文献７】Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６，９５，１９７６
【非特許文献８】Ｎｏｍｕｒａ，Ａ．，Ｙａｍａｄａ，Ｊ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｋ．による、Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．１９８７，３，２０９
【非特許文献９】Ｓｔｅｌｌａ，Ｃ．，Ｒｕｄａｚ，Ｓ．，Ｖｅｕｔｈｅｙ，Ｊ．−Ｌ．，Ｔｃｈａｐｌａ，Ａ．による、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  ２００１，５３，Ｓ１１３−Ｓ１１５
【非特許文献１０】Ｓｕｄｏ，Ｙ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１９９６，７３７，１３９
【非特許文献１１】Ｓｕｄｏ，Ｙ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１９９７，７５７，２１
【非特許文献１２】Ｎｏｍｕｒａ，Ａ．，Ｙａｍａｄａ，Ｊ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｋ．による、Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，１９８７，３，２０９
【非特許文献１３】Ｂｕｓｚｅｗｓｋｉ，Ｂ．，Ｋａｓｔｕｒｉ，Ｐ．，Ｇｉｌｐｉｎ，Ｐ．Ｋ．，Ｇａｎｇｏｄａ，Ｍ．Ｅ．，Ｊａｒｏｎｉｅｃ，Ｍ．による、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，１９９４，３９，１５５
【非特許文献１４】Ｂｕｓｚｅｗｓｋｉ，Ｂ．，Ｊａｒｏｎｉｅｃ，Ｍ．，Ｇｉｌｐｉｎ，Ｐ．Ｋ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１９９４，６６８，２９３
【非特許文献１５】Ｊａｒｏｎｉｅｃ，Ｃ．Ｐ．，Ｇｉｌｐｉｎ，Ｐ．Ｋ．，Ｊａｒｏｎｉｅｃ，Ｍ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１９９８，７９７，１０３
【非特許文献１６】Ａｓｃａｈ，Ｔ．Ｌ．，Ｋａｌｌｕｒｙ，Ｋ．Ｍ．Ｌ．，Ｓｚａｆｒａｎｓｋｉ，Ｃ．Ａ．，Ｃｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｌｕｉ，Ｆ．による、Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，１９，３０４９
【非特許文献１７】Ｏ’Ｇａｒａ，Ｊ．Ｅ．，Ａｌｄｅｎ，Ｂ．Ａ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｔ．Ｈ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄｅｒ，Ｃ．Ｌ．，Ｎｅｕｅ，Ｕ．Ｄ．による、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６７，３８０９
【非特許文献１８】Ｏ’Ｇａｒａ，Ｊ．Ｅ．，Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｐ．，Ａｌｄｅｎ，Ｂ．Ａ．，Ｃａｓｅｌｌｉｎｉ，Ｐ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｔ．Ｈ．による、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，７１，２９９２
【非特許文献１９】Ｓｉｌｖａ，Ｃ．Ｒ．，Ｊａｒｄｉｍ，Ｉ．Ｃ．Ｓ．Ｆ．，Ａｉｒｏｌｄｉ，Ｃ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２００３，９８７，１２７−１３８
【非特許文献２０】Ｎｅｕｅ，Ｕ．Ｄ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｆ．，Ａｌｄｅｎ，Ｂ．Ａ．，Ｉｒａｎｅｔａ，Ｐ．Ｃ．，Ｐｈｏｅｂｅ，Ｃ．Ｈ．，ｖａｎＴｒａｎ，Ｋ．による、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，２００１，５４，１６９
【非特許文献２１】Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．，ＤｅＳｔｅｆａｎｏ，Ｊ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ，Ｈ．Ａ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１９９７，７６２，９７
【非特許文献２２】Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｈｅｒｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．，１９９４，３２，４７３−４８０
【非特許文献２３】Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｊ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｂ．Ｊｒ．，ｖａｎ  Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ，Ｈ．Ａ．による、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，４３４４−４３５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、表面シラノール基が有効に無効化された、クロマトグラフィ用カラムの新規固定相を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態では、本発明は、側鎖基として、ビニル、アリル、エチニル、プロピニルのような１つ又は複数の不飽和基を備える側鎖基を有する、クロマトグラフィにおいて使用するための固定相を提供する。他の実施形態では、本発明は、ビニル、アリル、エチニル、プロピニル等のような１つ又は複数の不飽和基を含むエンドキャッピング試薬を用いて、反応性シラノールを無効化するための方法を提供する。一態様では、本発明による固定相は、疎水性層を含む。他の態様では、固定相は、活性の低下した表面シラノールを含み、その結果、化合物分離時のピークテーリングを低下させることができる。
【００１４】
一態様では、本発明は、単官能シラン、又は少なくとも１つのシランが少なくとも１つの不飽和炭化水素基を含む２つあるいは３つのシランの混合物、を有するシリカ基体を提供する。他の態様では、シランは、以下の化学式の化合物から構成される。
【００１５】
【化５】
2005315889.tif 000002
【００１６】
式中、Ｒは、例えば、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アリール、置換アリール、アルキルアミノ、アミド、エーテル、カルバメート、エステル、アルコール、疎水性相互作用をもたらし得る基、イオン交換基等をはじめとするクロマトグラフィで有用な官能基であり、Ｒ'は、例えば、アルケニル基、アルキニル基、アリール基などの不飽和基であり、Ｒ''は、アルケニル、アリール、アルキニル、短鎖アルキルであり、基体は、シリカである。一態様では、Ｒ''は、不飽和炭化水素を含まない。一態様では、当該化合物には、ジメチル置換第三級炭素成分は含まれない。
【００１７】
基体は、１つ又は複数の異なるシランと結合することが可能であり、本発明の他の実施形態では、基体にクロマトグラフィ機能をもたらす１つのＲ基と、エンドキャッピング（即ち、シラノール無効化）機能をもたらす第２の試薬を結合させ得る。
【００１８】
本発明はまた、エンドキャッピングステップにおいて、又はエンドキャッピングステップ後に、アミン基を含有する化学物質によって、上記基体をさらに非活性化する方法も提供する。
【００１９】
本発明はまた、ｐＨ１〜１２という広範囲のｐＨにわたって利用し得る基体を製造するための方法も提供する。一態様では、基体は、約２〜１０のｐＨ範囲で利用することが可能である。幾つかの態様では、室温で基体を利用することもできる。当該方法は、限定はしないが、結合させるためのジビニルアルキルシラン又はメチルビニルアルキルシランをはじめとする、１つ又は複数の不飽和基を備えるシランを調製するステップと、シリカと不飽和シランを結合させて、結合基体を得るステップとを包含する。一態様では、残留した未結合シリカに、トリメチルシラン、モノビニルシラン、ジビニルシラン、又はトリビニルシランなどのシランを接触させ、且つ／又は、アミノ基を含有する化学物質を用いてさらに処理する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、表面シラノール基が効率よく無効化された、クロマトグラフィ用カラムのための新規固定相を提供することができる。本発明の他の目的及び特徴については、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって、より深く理解することができるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、その表面にシランが結合している基体を提供し、当該シランは、担体構造がクロマトグラフィ用の固定相として用いられる場合に特定の利点をもたらす。基体の表面には、不飽和シラン、即ちジビニルシラン、メチルビニルシランなどのビニルシランをはじめとする、アルケニル基もしくはアルキニル基を含有する少なくとも１つの不飽和シランを含むシラン混合物が結合している。結合剤として用い得る、又は結合させるための混合物中に用い得るシランの例として、限定はしないが、クロロジビニルオクタデシルシラン、クロロメチルビニルオクタデシルシラン、クロロジビニルオクチルシラン、クロロメチルビニルオクチルシラン、クロロトリビニルシラン、（ジメチルアミノ）ジビニルオクタデシルシラン、（ジメチルアミノ）メチルビニルオクタデシルシランが挙げられる。本発明の固定相並びにエンドキャッピング試薬のための不飽和シランは、以下の構造を有している。
【００２２】
【化６】
2005315889.tif 000003
【００２３】
式中、Ｒ'はビニル、アリル、エチニル、プロピニルなどのアルケニル、アルキニル、フェニル基、又は他のアルケニル及びアルキニル基であり、Ｒ''は短鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル基であり、Ｒはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アリール、置換アリール、アルキルアミン、アミド、エーテル、アルコール、カルバメート、エステル、陰イオン交換体、陽イオン交換体であり、ＸはＣｌ、メトキシ、エトキシなどのアルコキシ基、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ基などのジアルキルアミノ基である。
【００２４】
官能基Ｒは、意図する用途に向くよう適応させることが可能である。例えば、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」（Ｌ．Ｒ．Ｓｙｎｄｅｒ及びＪ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）の第７章に記載の方法で実施される逆相クロマトグラフィの場合、分析物を保持するための所望の疎水性相互作用をもたらし得る他の官能基を提供するため、シランのＲは、炭素数３〜２０（例えば、Ｃ３、Ｃ４、ｎ‐Ｃ８、ｎ‐Ｃ１８等）のアルキル基あるいはアリル基、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒなどのアミド、−（ＣＨ２）３ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲなどのカルバメートから構成されるのが望ましい。イオン交換クロマトグラフィの場合、Ｒ基には、例えば、陰イオン交換体としての‐（ＣＨ２）３Ｎ＋（ＣＨ３）３‐及び陽イオン交換体としての‐（ＣＨ２）３‐Ｃ６Ｈ４‐ＳＯ３Ｈのような、イオン交換機能を備えた基を含むことができる。サイズ排除クロマトグラフィの場合、とりわけ、蛋白質のような極性の強い水溶性生体巨大分子を分離する場合には、基体の表面は、‐（ＣＨ２）３‐Ｏ‐ＣＨ（ＯＨ）‐ＣＨＯＨのような極性の強いＲ基、いわゆる「ジオール」官能基で修飾される。疎水性相互作用クロマトグラフィの場合、担体に関しては、疎水性の弱い固定相が望ましい。例えば、Ｒがメチル、エチル、ｎ−プロピル、あるいはイソプロピルの場合、この様式のクロマトグラフィ的な保持によって、必要とされる適度な疎水性相互作用がもたらされる。順相クロマトグラフィの場合、例えば、‐（ＣＨ２）３‐ＮＨ２及び‐（ＣＨ２）３‐ＣＮのような、極性官能基がＲ基としてシランに取り込まれる。
【００２５】
シリカ表面へのシランの結合に関しては、周知の技法が開発されている。例えば、米国特許第４，９１９，８０４号明細書；Ｃ．Ａ．Ｄｏｙｌｅらによる、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，７８，２９３−３２３（１９９８）；米国特許第５，８６９，７２４号明細書；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄらによる、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７０，４３４４−４３５２（１９９８）；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄらによる、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６１，２−１１（１９８９）；及びＫ．Ｄ．Ｌｏｒｋらによる、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３５２，１９９−２１１（１９８６）を参照されたい。シランとクロマトグラフィ担体表面との反応に関する一般的な論考については、「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」（Ｌ．Ｒ．Ｓｙｎｄｅｒ及びＪ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）の第７章に記載がある。シランと多孔性シリカとの反応に関するさらなる詳細については、「Ｐｏｒｏｕｓ  Ｓｉｌｉｃａ」（Ｋ．Ｋ．Ｕｎｇｅｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）の１０８ページから始まる説明において得ることができる。シランとさまざまな材料との反応に関する一般的の論考については、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ」（Ｗ．Ｎｏｌｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６８）において得ることができる。シラン及びエンドキャッピング試薬は、従来の液相反応を利用して、シリカ表面に結合させる。
【００２６】
本発明の調製及び性能の利点については、以下の実施例、並びにそこで参照する図をみることによって理解することができる。
【実施例１】
【００２７】
クロロメチルビニルオクタデシルシランの調製
オルガノシランは、米国ペンシルベニア州モリスビルのゲルスト社（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．）から購入し、溶媒及びその他の化学製品は、特に指示のない限り、米国ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ社から購入した。
【００２８】
ＴＨＦ（３００ｍｌ）／ヘキサン（５００ｍｌ）中にジクロロメチルビニルシラン（１１２．８ｇ、０．８ｍｏｌ）を溶かした溶液に、ＴＨＦ（８００ｍｌ、０．５Ｍ）中に溶かした塩化オクタデシルマグネシウムを、室温で、滴下添加した。添加後、当該混合物を室温で一晩中撹拌した。そして溶媒を、蒸留によって除去した。当該残留物に、ヘキサン（５００ｍｌ）を添加した。白色固形物を濾過し、それをアルゴン雰囲気下においてヘキサン（４００ｍｌ×３）を用いて洗浄した。そして溶媒を、蒸留によって除去した。当該残留物を真空下（１８０〜１９０℃／０．０５ｍｍ  Ｈｇで）で蒸留することによって、所望の生成物６３．３２ｇ（収率４４．２％）を得た。
【実施例２】
【００２９】
（ジメチルアミノ）メチルビニルオクタデシルシランの調製
４つ口フラスコに、１つの機械式撹拌器と、２つのドライアイス凝縮器を備え付けた。一方のドライアイス凝縮器を介して穏やかに窒素でパージし、もう一方の凝縮器から送り出した。クロロメチルビニルオクタデシルシラン（６３．３２ｇ、０．１７５ｍｏｌ）及びヘキサン（１００ｍｌ）を、当該フラスコ内に添加した。ドライアイス凝縮器を介してシステム内をジメチルアミンガスでパージし、そして混合物中に滴下した。それにより、白色沈殿物が形成した。ＧＣを用いて、当該反応物を追跡（分析）した。クロロメチルビニルオクタデシルシランのピークがＧＣにおいて消失するまで、ジメチルアミンのパージを続行した。沈殿物を濾過し、それをアルゴン雰囲気下においてヘキサン（４００ｍｌ×３）を用いて洗浄した。次いで、ヘキサンを蒸留によって除去した。残留物を真空下に（２１０℃／０．０６ｍｍ  Ｈｇで）で蒸留することによって、所望の生成物６１．２２ｇ（収率９４．８％）を得た。
【実施例３】
【００３０】
（ジメチルアミノ）トリビニルシランの調製
（ジメチルアミノ）トリビニルシランを、実施例２と同じ方法で得た。４つ口フラスコには、１つの機械式撹拌器と、２つのドライアイス凝縮器を備え付けた。一方のドライアイス凝縮器を介して穏やかに窒素でパージし、もう一方の凝縮器から送り出した。クロロトリビニルシラン（１０３ｇ、０．７１３ｍｏｌ）及びヘキサン（１００ｍｌ）を、当該フラスコ内に添加した。ドライアイス凝縮器を介してシステム内をジメチルアミンガスでパージし、そして混合物中に滴下した。それにより、白色沈殿物が形成した。ＧＣを用いることによって、当該反応物を追跡（分析）した。クロロトリビニルシランのピークがＧＣにおいて消失するまで、ジメチルアミンのパージを続行した。沈殿物を濾過し、それをヘキサン（４００ｍｌ×３）を用いて洗浄した。次いで、ヘキサンを、蒸留によって除去した。残留物を真空下（２２℃／０．４ｍｍ  Ｈｇで）で蒸留することによって、所望の生成物７４ｇ（収率６８％）を得た。
【実施例４】
【００３１】
トリビニルシランでエンドキャッピングしたメチルビニル−Ｃ１８相の調製
Ｂ型Ｚｏｒｂａｘ  Ｒｘ−Ｓｉｌシリカ担体（Ｒｘ８０）を、結合及びカラムに利用した。精製度の高いＢ型Ｚｏｒｂａｘシリカの物理特性及び表面特性は、以前に報告されている（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｊ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｂ．Ｊｒ．，ｖａｎ  Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ，Ｈ．Ａ．による、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，４３４４−４３５２を参照）。このシリカ担体の表面積は、一般に、１８０ｍ２／ｇであり、孔径は８０Åである。シリカ担体との反応は、前述の報告（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｊ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｂ．Ｊｒ．，ｖａｎ  Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ，Ｈ．Ａ．による、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，４３４４−４３５２）と同様にして実施した。結合の前に、Ｚｏｒｂａｘ  Ｒｘ８０は、一晩中、１１０℃、真空下において乾燥させた。
【００３２】
クロロメチルビニルオクタデシルシランからのメチルビニル−Ｃ１８充填物の調製：
Ｒｘ８０（３０ｇ、５μｍ、表面積１８４ｍ２／ｇ、４４．１５ｍｍｏｌの表面シラノール）及びトルエン（１５０ｍｌ）を、機械式撹拌器、凝縮器、バレットトラップ、及び温度計が備え付けられている４つ口フラスコに入れた。トルエン（３０ｍｌ）を蒸留除去しバレットトラップに収集した。混合物を沸点未満の温度にまで冷却した後、バレットトラップを取り外し、イミダゾール（３．００ｇ、４４．１６ｍｍｏｌ）を添加して、引き続き、クロロメチルビニルオクタデシルシラン（２３．７５ｇ、６６．２４ｍｍｏｌ）を添加した。当該混合物を、１日間、還流条件下で撹拌した。その混合物を、まだ高温のうちに濾過し、高温のトルエン、ＴＨＦ、ＭｅＯＨを用いて洗浄した。シリカ粒子を、半時間にわたって、ＭｅＯＨ／水（８０／２０ｖ／ｖ、１５０ｍｌ）中に懸濁させた。次いで、シリカを濾過し、ＭｅＯＨ、ＣＨ３ＣＮを用いて洗浄し、真空下、１１０℃で、一晩中乾燥させた。
【００３３】
（ジメチルアミノ）メチルビニルオクタデシルシランからのメチルビニル−Ｃ１８充填物の調製：
Ｒｘ８０（２１ｇ、５μｍ、表面積１８４ｍ２／ｇ、３０．９１ｍｍｏｌの表面シラノール）及びトルエン（１００ｍｌ）を、機械式撹拌器、凝縮器、バレットトラップ、及び温度計が備え付けられている４つ口フラスコに入れた。トルエン（３０ｍｌ）を蒸留除去しバレットトラップに収集した。混合物を沸点未満の温度にまで冷却した後、バレットトラップを取り外し、（ジメチルアミノ）メチルビニルオクタデシルシラン（１７．５３ｇ、４７．７６ｍｍｏｌ）を添加した。当該混合物を、１日間、還流条件下で撹拌した。その混合物を、まだ高温のうちに濾過し、高温のトルエン、ＴＨＦ、ＣＨ３ＣＮを用いて洗浄し、真空下、１１０℃で、一晩中乾燥させた。
【００３４】
クロロトリビニルシランによるメチルビニル−Ｃ１８充填物のエンドキャッピング：  
上記のようにして得たＲｘ８０メチルビニルＣ−１８（１９．４４ｇ）及びトルエン（１００ｍｌ）を、機械式撹拌器、凝縮器、バレットトラップ、及び温度計が備え付けられている４つ口フラスコに入れた。トルエン（３０ｍｌ）を蒸留除去し、バレットトラップに収集した。混合物を沸点未満の温度にまで冷却した後、バレットトラップを取り外して、イミダゾール（２．００ｇ、２９．４１ｍｍｏｌ）を添加し、引き続き、クロロトリビニルシラン（６．３８ｇ、４４．１５ｍｍｏｌ）を添加した。当該混合物を、１日間、還流条件下で撹拌した。その混合物を、まだ高温のうちに濾過し、高温のトルエン、ＴＨＦ、ＭｅＯＨを用いて洗浄した。シリカ粒子を、半時間にわたって、ＭｅＯＨ／水（８０／２０ｖ／ｖ、１００ｍｌ）中に懸濁させた。次いで、シリカを濾過し、ＭｅＯＨ、ＣＨ３ＣＮを用いて洗浄し、真空下、１１０℃で、一晩中乾燥させた。
【００３５】
（ジメチルアミノ）トリビニルシランによるメチルビニル−Ｃ１８充填物のエンドキャッピング：
上記のようにして得たＲｘ８０メチルビニルＣ−１８（１２．０９ｇ）及びトルエン（６０ｍｌ）を、機械式撹拌器、凝縮器、バレットトラップ、及び温度計が備え付けられている４つ口フラスコに入れた。トルエン（３０ｍｌ）を蒸留除去しバレットトラップに収集した。混合物を沸点未満の温度にまで冷却した後、バレットトラップを取り外して、（ジメチルアミノ）トリビニルシランを添加した。当該混合物を、１日間、還流条件下で撹拌した。シリカを、まだ高温のうちに濾過し、高温のトルエン、ＴＨＦ、ＣＨ３ＣＮを用いて洗浄し、真空下、１１０℃で、一晩中乾燥させた。
【００３６】
表１に、これらのカラムと共に、ヘキサメチルジシラザン／（ジメチルアミノ）トリメチルシラン（ＨＭＤＳ／ＤＴＭＳ）あるいは（ジメチルアミノ）トリビニルシランでエンドキャップしたＲｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８のテーリング係数をリストアップしている。Ｚｏｒｂａｘ  Ｒｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８充填物は、密に結合しているジメチルシラン置換Ｃ１８相から構成されている。全ての相が同様の炭素含量を有し、表面においてＮ及びＣｌが検出されることはほとんどなかった。エンドキャッピングは、クロロトリビニルシランを用いるよりも、（ジメチルアミノ）トリビニルシランを利用したほうが効率が良い。結合時に（ジメチルアミノ）メチルビニル−Ｃ１８を用いることにより、あるいはエンドキャッピング時に（ジメチルアミノ）トリビニルシランを用いることにより、又はその両方を用いることにより製造されたＲｘ８０  メチルビニル−Ｃ１８は、ピーク形状が、ＨＭＤＳでエンドキャッピングされたＸＤＢ−Ｃ１８よりも優れることが確認できる。Ｒｘ８０  メチルビニル−Ｃ１８カラム（表１、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）ほどの改善ではないにしても、（ジメチルアミノ）トリビニルシランでエンドキャッピングしたＲｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８（表１、Ｖ）もまた、ＨＭＤＳ／ＤＴＭＳでエンドキャップしたＲｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８（表１、ＶＩ）よりも優れたピーク形状を示す。結合ステップあるいはエンドキャッピングステップにおけるジメチルアミノ基や二重結合は、酸性化合物のピーク形状は改善しないが、塩基性化合物のピーク形状は改善させる傾向がある。全てのＲｘ８０メチルビニル−Ｃ１８カラムに関して、Ｒｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８カラムよりも安息香酸のピークテーリングが悪いことが確認された。クロロメチルビニル−Ｃ１８シランの結合及びクロロトリビニルシランのエンドキャッピングによって製造されたカラムは、Ｒｘ８０メチルビニル−Ｃ１８カラムの中でも、塩基性化合物と酸性化合物の両方に関して、悪いピークテーリングを呈する。
【００３７】
【表１】
2005315889.tif 000004
【００３８】
エンドキャッピングは、クロロトリビニルシラン、（ジメチルアミノ）トリビニルシランや、当分野において既知のエンドキャッピング試薬を用いて、実施することができる。
【００３９】
一態様では、約０．２μＭ未満といった、微量のエンドキャッピング試薬を用いてエンドキャッピングを実施する。
【００４０】
Ｃ１８結合によってはほぼ３μｍｏｌの表面シラノールが被覆されるのに対し、エンドキャッピングによっては約０．１〜０．２μｍｏｌの表面シラノールだけしか被覆されないにもかかわらず、（ジメチルアミノ）トリビニルシランを用いてエンドキャップすると、（ジメチルアミノ）オクタデシルシランを結合させた場合と同じほど、塩基性化合物のピーク形状を改善することができる（表１、ＩＩＩ及びＩＶ）。
【実施例５】
【００４１】
図１には、ｐＨ７．６、Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ移動相における、これらのカラムのクロマトグラムを示している。
【実施例６】
【００４２】
図２は、ｐＨ７．６、ＡＣＮ／水移動相における、０％、２５％、５０％、７５％のビニル基を有するＲｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８相のクロマトグラムを示している。Ｚｏｒｂａｘ  Ｒｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８充填物は、専有権の付与されている方法（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．，ＤｅＳｔｅｆａｎｏ，Ｊ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ，Ｈ．Ａ．による、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，１９９７，７６２，９７参照）によってジメチルシラン基及びトリメチルシラン基で徹底的に二重にエンドキャップされている、密に結合しているジメチルシラン置換Ｃ１８相から構成されている。ここでは、（ジメチルアミノ）ジメチルオクタデシルシランを結合反応に用いた。ビニル基を含む混合ＸＤＢ−Ｃ１８相は、単なる（ジメチルアミノ）ジメチルオクタデシルシランではなく（ジメチルアミノ）ジメチルオクタデシルシランの混合物（反応及びＨＭＤＳ／ＤＴＭＳによる単一エンドキャッピングにおいて、２５％、５０％、７５％のジメチル−Ｃ１８をメチルビニル−Ｃ１８に置き換えたもの）を用いたことを除いて、同じ結合物質によって調製した。アミトリプチリンのテーリング係数は、ＸＤＢ−Ｃ１８に関しては２．８７であるのに対し、７５％、５０％、２５％のビニル基を有するものに関しては、それぞれ、１．２３、１．４１、１．６４であり、低いことが分かる。ビニル基が多くなるほど、水／ＡＣＮにおけるｐＨ７．６でのテーリング係数は低下した。標準的なＸＤＢ−Ｃ１８相と比較すると、当該混合相は、塩基性化合物に関してはるかに優れたピーク形状を示した。２５％のビニル基を有するカラムは、５０％及び７５％のビニル基を有するカラムよりもテーリングがわずかに大きい。
【実施例７】
【００４３】
図３は、ｐＨ２．７における、酸性化合物、ここでは安息香酸に関する、これらの相のクロマトグラムを示している。安息香酸のテーリング係数は、ＸＤＢ−Ｃ１８相と比較すると、ビニル基を有するＸＤＢ−Ｃ１８においてわずかに増大した。しかしながら、これらビニル基を有するＸＤＢ−Ｃ１８は全て、安息香酸に関しほぼ同じ優れたピーク形状を示し、テーリング係数は、７５％、５０％、２５％、及び０％のビニル基の場合、それぞれ、１．２９、１．２１、１．２７、及び１．０２であった。
【００４４】
表２は、これらのカラムや、ＨＭＤＳ／ＤＴＭＳによるエンドキャッピングを施されたＸＤＢ−Ｃ１８カラムの、アミトリプチリン及び安息香酸に関するテーリング係数をまとめている。メチル／ビニル混合Ｃ−１８相を用いたカラムは、ｐＨ７．６では、アミトリプチリンに関するテーリング係数が競合カラムよりもはるかに低く、ｐＨ２．７では、アミトリプチリン及び安息香酸に関するテーリング係数が同様である。ｐＨ２．７において、５０％のビニル基を用いたカラムは、アミトリプチリン及び安息香酸に関するピーク形状が、２５％及び７５％のビニル基を用いたカラムよりもわずかに優れている。
【００４５】
【表２】
2005315889.tif 000005
【実施例８】
【００４６】
図４は、５０％のビニルを用いたＲｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム、及びＲｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８カラムにおける、極性及び塩基性化合物（ベンジルアミン、プロカインアミド、ベンジル・アルコール、アセチルプロカインアミド、テオフィリン、カフェイン、フェノール）のクロマトグラムを示している。５０％のビニルを用いたＲｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８カラムは、Ｒｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８と極めてよく似た極性及び塩基性化合物の選択性を示すが、ベンジルアミンに関するピーク形状（ピーク＃１）が優れている。
【実施例９】
【００４７】
図５は、５０％のビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８カラム及びＸＤＢ−Ｃ１８カラムの安定性に関する比較結果を示している。カラムは、中間ｐＨにおける利用に合わせて設計されているため、シリカの溶解がカラムの寿命にとって最大の問題となる。カラムの寿命は、ｐＨ１０、５０℃にて評価した。中性化合物であるナフタリンを用いて、カラム効率及び保持率をモニタした。効率の低下は、シリカの溶解がより多いことを示す。５０％のビニルを有するＸＤＢ−Ｃ１８が示す効率の低下はＸＤＢ−Ｃ１８よりも少なく、また同時に両カラムのＫ'は、経時変化の検討期間中、同じに保たれた。
【実施例１０】
【００４８】
図６は、５０％のビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８カラム及びＸＤＢ−Ｃ１８カラムの導入可能量（試料注入可能量）に関する比較結果を示している。カラムの導入可能量は、水／ＡＣＮ移動相において、ｐＨ２．７及びｐＨ７．０で評価した。両カラムとも、ｐＨ７．０よりもｐＨ２．７における導入可能量の方がはるかに低い。両カラムともピーク形状に優れているため、ｐＨ２．７の場合、この導入可能量の差は、５０％のビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８カラムのテーリング係数がＸＤＢ−Ｃ１８カラムに比べてはるかに低くなるｐＨ７．０の場合ほど顕著ではない。試料注入量が少ない場合（分析レベルの場合）、５０％のビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８カラムのピーク形状は、ｐＨ２．７及びｐＨ７．０の両方において極めて良好である。試料注入量が多い場合（分析レベルを超える場合）、ｐＨ２．７において、ビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８は、０．６μｇを超える注入後、テーリング係数が高くなる。ｐＨ２．７では、５０％のビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８は、ＸＤＢ−Ｃ１８と同じ傾向の導入可能量を示すが、ｐＨ７．０では、ただ単に、ビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８の方がピークテーリング係数がはるかに低いため、ＸＤＢ−Ｃ１８よりもはるかに優れた導入可能量を示すことになる。
【実施例１１】
【００４９】
図７は、ｐＨ７．０における、導入可能量に関するクロマトグラムの一例を示している。５０％のビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８におけるアミトリプチリンのテーリング係数は、注入量が０．０６μｇの場合の１．１７から、注入量が２．８５μｇの場合の１．６７まで上昇し、一方、ＸＤＢ−Ｃ１８におけるテーリング係数は、３．５４から４．０２まで上昇する。５０％のビニルを用いたＸＤＢ−Ｃ１８の導入可能量は、ＸＤＢ−Ｃ１８よりもはるかに高い。
【００５０】
メチルビニル−Ｃ１８を利用するか、又はＲｘ８０  ＸＤＢ−Ｃ１８におけるメチル基の一部をビニル基に置換することによって、二重結合に加えられた微量のジメチルアミン基によって、シリカ強酸性表面シラノールを非活性化することができる。その結果、カラムは、低ｐＨ及び中間ｐＨにおいて、塩基性化合物に関して優れたピーク形状を示すが、酸性化合物についてもやはり、良好なピーク形状を保つ。ビニル基を用いた混合ＸＤＢ−Ｃ１８カラムは、中間ｐＨにおいて、ＸＤＢ−Ｃ１８よりも寿命及び導入可能量に優れている。表面におけるジメチルアミン基の量が極めて少ないため、混合Ｃ１８相は、やはり、ＸＤＢ−Ｃ１８カラムと同程度の感度のままであるが、塩基性化合物に関するピーク形状が改善され、従って、これらの方法は、容易に新しいカラムに転用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の一実施形態による一連の組成物の性能を他のカラム材料と比較して示すクロマトグラム
【図２】ｐＨ７．６における塩基性化合物の分離において、本発明の態様による一連の組成物の性能を比較して示すクロマトグラム
【図３】ｐＨ２．７における安息香酸の精製において、本発明の態様による一連の組成物の性能を比較して示すクロマトグラム
【図４】本発明の一態様による組成物の性能を他のカラムと比較して示すクロマトグラム
【図５】高ｐＨにおいて、本発明の一態様による組成物の寿命を他のカラムと比較して示す図
【図６】ｐＨ２．７及びｐＨ７．６において、本発明の一態様による組成物の導入可能量を他のカラムと比較して示す図
【図７】本発明の一態様による組成物及び他のカラムの導入可能量を示す２組のクロマトグラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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