(57)【要約】【課題】  ナノストランドの表面が、少なくともDNAやRNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、ナノストランドが剛直で、かつ、直径が核酸を構成するポリヌクレオチド鎖と同様に非常に細い構造を有していることを特徴としており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドおよびこれを利用した核酸処理方法を提供する。【解決手段】  金属酸化物を主成分とするナノストランドにおいて、少なくとも5%以上の金属原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有しており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することができることを特徴とする。【選択図】図１４
2005082903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属酸化物を主成分とするナノストランドにおいて、少なくとも5%以上の金属原子が正に荷電しており、かつ、結晶性構造を有しており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することができることを特徴とするナノストランド。
【請求項２】
金属酸化物が、2価の金属イオンの塩の水溶液と塩基性水溶液との混合液から形成され
ることを特徴とする請求項１のナノストランド。
【請求項３】
2価の金属イオンの塩が、カドミウム塩であることを特徴とする請求項２のナノストラ
ンド。
【請求項４】
混合液の液性が、pH 5.0-pH 9.0の範囲であることを特徴とする請求項２のナノストラ
ンド。
【請求項５】
結晶性構造において、円相当径が1.0-3.0nmの範囲であり、長さが円相当径の少なくと
も100倍以上であり、曲率半径が少なくとも20nm以上であることを特徴とする請求項１か
ら４いずれかのナノストランド。
【請求項６】
ナノストランドが、ナノストランドを含有する水溶液に配位性化合物を添加されることにより、消失されることを特徴とする請求項１から５いずれかのナノストランド。
【請求項７】
配位性化合物が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、イミノ二酢酸、または、大環状ポリアミンのいずれかであることを特徴とする請求項６のナノストランド。
【請求項８】
ナノストランドが、酸性水溶液の添加により、ナノストランドを含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範囲とすることで、消失されることを特徴とする請求項１から７いず
れかのナノストランド。
【請求項９】
請求項１から８いずれかのナノストランドを、核酸と接触させることにより結合させ、生じるナノストランドと核酸とを含むことを特徴とするナノ複合体。
【請求項１０】
請求項９のナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範囲とすることで、ナノ複合体中に含まれるナノストランド
を消失させて、核酸が解放されることを特徴とする核酸処理方法。
【請求項１１】
請求項９のナノ複合体をフィルター濾過して取り除くことにより、核酸が除去されることを特徴とする核酸処理方法。
【請求項１２】
請求項９のナノ複合体をフィルター濾過により分取して、このナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範囲とす
ることにより、このナノ複合体中に含まれるナノストランドを消失させて、核酸が分離、精製または濃縮されることを特徴とする核酸処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドおよびこれを利用した核酸処理方法に関するものである。
【０００２】
さらに詳しくは、この出願の発明は、ナノストランドの表面が、DNAやRNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、ナノストランドが剛直で、かつ、直径が核酸を構成するポリヌクレオチド鎖と同様に非常に細い構造を有していることを特徴としており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドおよびこれを利用した核酸処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
DNAやRNA等の核酸の分離や精製技術は、バイオテクノロジーを支える重要な基盤技術となっている。生体組織からのDNAの抽出では、タンパク質を化学的に処理して遠心分離に
より除去した後、アルコールを添加してDNAのみを取り出す。高分子電解質であるDNAは、溶媒の極性を低下させることで、容易に沈殿する。極微量のDNA試料の場合、ビーズやガ
ラスパウダー等の固体表面に吸着させて、分離や精製等の核酸処理が行われている。血液や各種細胞からRNAを抽出する場合には、界面活性剤により不溶化して分離後、水溶液中
に再溶解させる手法が用いられる（たとえば、非特許文献１）。これらの抽出操作の前処理として、クロロホルム等の有機溶媒を用いることも多い。
【０００４】
また、上記のような方法により精製されたDNAは、PCR法より増幅されて電気泳動に用いられたり、直接、DNAチップを用いて診断に利用されたりする。最近では、金ナノ粒子を
用いたマイクロハイブリダイゼーション法（たとえば、非特許文献２）により凝集性を制御することで、遺伝子診断を行うことも可能となりつつある。
【０００５】
一方、近年のナノテクノロジーの発展とともに、マイクロ流路と組み合わせたDNAチッ
プの研究も盛んに行われている。DNAは、剛直な高分子電解質に特徴的な電場応答あるい
は流体力学的な特性を有しており、これらは、マイクロ流路中でのDNAの捕捉・結合や濃
縮に利用されつつある。また、光ピンセットを用いて、単一DNA鎖をマニピュレーション
する技術も、特に基礎研究分野において活発に利用されている。
【０００６】
このように、DNAやRNA等の核酸を対象とする分離や精製、濃縮の核酸処理方法は、近年、著しく発達したように見える。しかしながら、実用面で広く普及している方法は、ポリアニオンとしての溶解性を利用した抽出、遠心分離、ビーズ等の固体表面への吸着、ゲル電気泳動などの技術を巧みに組み合わせることで、多様な要求に対応させているに過ぎない。また、DNAやRNA等の核酸に結合させる物質としては、ビーズ等の固体表面、DNAやRNA自身（ハイブリダイゼーション等）、結合性タンパク質、そしてカチオン性の界面活性剤に限られている。
【０００７】
ポリアニオンであるDNAやRNA等の核酸（以下、「核酸」とする場合がある）が、正に荷電した物質と強く相互作用することは、容易に予想できる。しかしながら、溶液中で核酸との効率的な結合を実現するには、いくつかの構造上の特徴を必要とする。
【０００８】
カチオン性界面活性剤が形成する棒状ミセルは、高い表面電荷密度を有し、核酸と強く結合する。しかしながら、このようなミセルは、一般に数mM以上の濃度条件においてのみ形成される。また、分子設計により剛直なロット状ミセルを形成させることも可能であるが、この場合、核酸と強固な凝集体を形成してしまうという問題があった。一方、カチオ
ン性の高分子は、DNA鎖に不必要に絡みつき、そのコンフォメーションに重大な影響を与
える。さらに、一旦絡み合って吸着したカチオン性高分子を核酸から取り除くことは、極めて難しい。
【０００９】
剛直、かつ、正に荷電した無機物のナノファイバーであれば、核酸と絡み合いを最小限に抑え、かつ強力な相互作用が得られるものと期待できる。たとえば、ある種の金属塩は、アルカリ性にすることで金属酸化物のナノファイバーを形成し、その表面は正に荷電していることが知られている（特許文献１）。
【特許文献１】特願2003-052877号公報
【非特許文献１】D. E. Macfarlane, et al., Nature, Vol.362, p186-188, 1993
【非特許文献２】C. A. Mirkin, et al., Nature, Vol. 382, p607-609, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
DNA等の核酸との強い相互作用を実現するためには、ナノファイバーの表面が、少なく
ともDNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電している必要がある。また、核酸との相補
的な静電相互作用により効率的な補足を達成するには、ナノファイバーが剛直で、かつ、直径2nmのDNA鎖と同様に非常に細い構造であることが望まれる。さらに、核酸の抽出や精製を行うためには、上記ナノファイバーを核酸から取り除く技術が必要になる。しかしながら、このような条件を満たすことのできるナノファイバーは、いまだ見つかっておらず、生物由来の物質を利用する方法（ハイブリダイゼーション等）を用いない限り、水溶液中の核酸を効率的に処理することができなかった。
【００１１】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ナノストランドの表面が、少なくともDNAやRNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、ナノストランドが剛直で、かつ、直径が核酸を構成するポリヌクレオチド鎖と同様に非常に細い構造を有していることを特徴としており、核酸と結合し、、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドを提供することを課題としている。
【００１２】
また、この出願の発明は、DNAやRNA等の核酸の抽出や精製等を行うために、上記ナノストランドを核酸から解放することに基づいた新しい核酸処理方法を提供することも課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この出願の発明は、前記の課題を解決するために、発明者が鋭意研究を行った結果として、以下の(1)から(12)の発明を提供する。
(1) 金属酸化物を主成分とするナノストランドにおいて、少なくとも5%以上の金属原子が正に荷電しており、かつ、ナノストランドは結晶性構造を有しており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することができることを特徴とするナノストランド。
(2) 金属酸化物が、2価の金属イオンの塩の水溶液と塩基性水溶液との混合液から形成さ
れることを特徴とする前記発明(1)のナノストランド。
(3) 2価の金属イオンの塩が、カドミウム塩であることを特徴とする前記発明(2)のナノストランド。
(4) 混合液の液性が、pH 5.0-pH 9.0の範囲であることを特徴とする前記発明(2)のナノストランド。
(5) 結晶性構造において、円相当径が1.0-3.0nmの範囲であり、長さが円相当径の少なく
とも100倍以上であり、曲率半径が少なくとも20nm以上であることを特徴とする前記発明(1)から(4)いずれかのナノストランド。
(6) ナノストランドが、ナノストランドを含有する水溶液に配位性化合物を添加されることにより、消失されることを特徴とする前記発明(1)から(5)いずれかのナノストランド。
(7) 配位性化合物が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、イミノ二酢酸、または、大環状ポリアミンのいずれかであることを特徴とする前記発明(6)のナノストランド。
(8) ナノストランドが、酸性水溶液の添加により、ナノストランドを含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範囲とすることで、消失されることを特徴とする前記発明(1)から(7)いずれかのナノストランド。
(9) 前記発明(1)から(8)いずれかのナノストランドを、核酸と接触させることにより結合させ、生じるナノストランドと核酸とを含むことを特徴とするナノ複合体。
(10) 前記発明(9)のナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範囲とすることで、ナノ複合体中に含まれるナノスト
ランドを消失させて、核酸が解放されることを特徴とする核酸処理方法。
(11) 前記発明(9)のナノ複合体をフィルター濾過して取り除くことにより、核酸が除去されることを特徴とする核酸処理方法。
(12) 前記発明(9)のナノ複合体をフィルター濾過により分取して、このナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範
囲とすることにより、このナノ複合体中に含まれるナノストランドを消失させて、核酸が分離、精製または濃縮されることを特徴とする核酸処理方法。
【発明の効果】
【００１４】
上記第１の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、DNAやRNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、また、ナノストランドが剛直な構造を有しているため、核酸とを効率よく結合し、かつ、結合した核酸を解放することを実現することができる。
【００１５】
上記第２の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第１のナノストランドと同様な効果が得られ、核酸との結合能と解放能とがバランスよく保持させることができる。
【００１６】
上記第３の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第２のナノストランドと同様な効果が得られ、核酸との結合能および解放能を向上させることができる。
【００１７】
上記第４の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第１から第３のナノストランドと同様な効果が得られ、核酸との結合能および解放能をより向上させることができる。
【００１８】
上記第５の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第１から第４のナノストランドと同様な効果が得られ、高い剛直性を有することとなり、特に核酸との結合能を向上させることができる。
【００１９】
上記第６の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第１から第５のナノストランドと同様な効果が得られ、特にナノストランドから核酸を効率よく解放することができる。
【００２０】
上記第７の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第６のナノストランドと同様な効果が得られ、ナノストランドから核酸を、さらに効率よく解放することができる。
【００２１】
上記第８の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第６のナノストランドと同様な効果が得られ、ナノストランドから核酸を効率よく解放することができる。
【００２２】
上記第９のナノストランドと核酸とを含むナノ複合体によれば、核酸の効率よい回収、分離、精製等の処理に用いることができる。
【００２３】
上記第１０の核酸処理方法によれば、ナノストランドが消失し、ナノ複合体に含まれる核酸を解放し、回収することができる。
【００２４】
上記第１１の核酸処理方法によれば、ナノ複合体を除去することにより、ナノストランドとともに核酸を効率よく除去することができる。
【００２５】
上記第１２の核酸処理方法によれば、ナノ複合体を効率よく分取することができ、このナノ複合体を構成するナノストランドを消失させることにより、効率よく核酸を分離、精製、さらには濃縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものである。以下にその実施の形態について説明する。
【００２７】
この出願の発明において、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドは、金属酸化物を主成分としている。このナノストランドは、構成成分全体のうち、少なくとも5%以上の金属原子が正に荷電しており、かつ、ナノストランドは結晶性構造を有していることを特徴としている。なお、この出願の発明における、核酸としては、二本鎖型DNA、一本鎖型DNA、様々なRNA（mRNA、tRNA、rRNA等）、PCR法等に利用されるオリゴヌクレオチド、あるいは、これらの混合物等を例示することができる。
【００２８】
この出願の発明のナノストランドは、発明者が、様々な金属酸化物のナノファイバーを研究する過程で、「金属原子が正に荷電」および「結晶性構造」の2つの特徴を同時に有
することが、核酸の効率的な捕捉（結合）に重要であることを見出したことに基づくものである。すなわち、このナノストランドは、正に荷電した原子の割合が極めて高く、数ナノメートル以下の極めて細長い構造であり、さらに、結晶性の高い構造であることから剛直性をも有しているものである。なお、発明者は、ナノストランドの幅が2nm程度であっ
ても結晶性であり得ることを高分解能電子顕微鏡の観察により確認している（図示せず）。
【００２９】
この出願の発明のナノストランドは、一般に、金属イオンの塩の水溶液と塩基性水溶液との混合液から形成される。特に2価の金属イオンの塩の水溶液から形成させることが好
ましい。さらに、2価の金属イオンの塩の中でも、カドミウム塩であることが特に好まし
い。代表的な例としては、硝酸カドミウム（Cd(NO3)2）等が挙げられる。ナノストランドの形成には、2価の金属イオンの塩を他の金属イオンの塩と組み合わせて用いることもで
きる。
【００３０】
ランタノイド等の3価の金属イオンは、一般に、中性条件下で柔軟なナノファイバーを
形成することが知られている。しかし、このようなナノファイバーは、ファイバーを構成する3価の金属イオンと比較して、核酸との結合力が弱い。また、3価の金属イオンは、核酸を強力に凝集してしまい、このように凝集した核酸は、再び分散させることが困難となる。一方、1価の金属イオンでは、ナノストランド全体の5％以上の金属原子が正に荷電したナノストランドを形成することができない。
【００３１】
この出願の発明は、ナノストランドの水溶液に酸（たとえば、塩酸や硫酸等）を添加すると、ナノストランドは消失して金属イオンとなる。このことを利用して、ナノストラン
ドに捕捉、結合された核酸をナノストランドから解放することが可能となる。ナノストランドは、核酸との効率的な結合のために、中性付近で形成されるものが好ましい。この中性付近とは、液性がpH 5.0〜pH 9.0の範囲のこと指す。
【００３２】
前述の「金属原子が正に荷電」および「結晶性構造」の2つの特徴は、ナノストランド
の形態によって明記することができる。すなわち、この出願の発明のナノストランドの結晶性構造において、円相当径が1.0〜3.0nmの範囲であることが好ましく、長さが少なくとも円相当径の100倍以上であり、さらに曲率半径が少なくとも20nm以上であるものが特に
好ましい。
【００３３】
また、この出願の発明に係るナノストランドは、配位性化合物の添加により消失することが望ましい。配位性化合物としては、特に限定されるものではないが、金属イオンとの大きな錯形成定数を有するものが好ましい。このため、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、チオール基、スルフィド基などの配位性基を有する化合物が好ましく、これらの配位性基を複数有するキレート型の化合物がより好ましい。もちろん、上記の配位性基を組み合わせて有するものであってもよい。たとえば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、イミノ二酢酸、大環状ポリアミン等が挙げられる。また、金属イオンに配位し、不溶性あるいは難溶性の無機塩を作るようなイオンを添加してもよい。
【００３４】
この配位性化合物によりナノストランドを消失させる場合においては、液性が中性付近、すなわちpH 5.0〜pH 9.0の範囲で行われることが好ましい。
【００３５】
さらに、酸性水溶液の添加により、ナノストランドを含有する水溶液の液性を弱酸性とすることで、ナノストランドを消失させてもよい。この弱酸性とは、pH 3.0-pH 5.0の範
囲であることが好ましい。
【００３６】
次に、この出願の発明におけるナノストランドを用いた核酸の処理方法を以下に説明する。
【００３７】
この出願の発明のナノストランドは、金属塩の水溶液に激しく攪拌しながら塩基性水溶液を一気に加えることで形成される。金属塩の濃度は、0.1〜10mM程度が好ましい。また
、塩基性水溶液としては、たとえば0.1〜10 mM程度の水酸化ナトリウム水溶液が好適に用いられるが、塩基性水溶液は、この例示に限定されるものではない。上記水溶液の温度は、0〜40℃の範囲内が好ましく、室温付近がより好ましい。添加に要する時間は、水溶液
の量にも依存するが、１分以内であることが好ましい。
【００３８】
金属イオンと水酸化物イオンの組成比は、ナノストランドの形成において、重要である。たとえば、硝酸カドミウムと水酸化ナトリウムから水酸化カドミウムのナノストランドを形成する場合には、水酸化物イオンの添加量は、カドミウムイオンに対して、0.5〜1.5倍の範囲が好ましく、0.5〜1.0の範囲がさらに好ましい。水酸化物イオンの添加量が少ない後者の範囲では、表面に多くの正電荷を有するナノストランドが形成される。ナノストランドの表面の電荷量は、複数のスルホン酸基を有する色素分子で滴定することができる。また、ナノストランドの長さ、円相当径、曲率半径ならびに結晶性は、高分解能電子顕微鏡より評価できる。
【００３９】
このようにして形成されたナノストランドと核酸とを接触させることで、核酸をナノストランドに静電的に捕捉、結合させることができる。接触は、通常、ナノストランドと核酸の水溶液を混合することで行われる。混合は室温で行うことが好ましい。
【００４０】
ナノストランドは、ビーズやガラスパウダー等の固体の表面に固定化することができ、
このような状態で核酸と接触させることも可能である。
【００４１】
上記の混合して接触させる際、ナノストランドの濃度は、ナノストランドを構成している金属原子の濃度に換算して、0.05〜5mMの範囲が適当である。また、核酸の水溶液の濃
度は、0.1mg/mL以下が適当である。さらに、ナノストランドを構成している金属原子の濃度は、核酸を構成している核酸塩基の濃度に換算して、その20倍以上あることが好ましい。ナノストランドの濃度に対する核酸の濃度の下限は、たとえば、DNAの濃度が4.0×10-5mg/mlの場合で、95%以上のDNAを捕捉することが可能であることが確認されている。すな
わち、この出願の発明のナノストランドは、極めて低濃度の核酸を捕捉することができる。
【００４２】
上記のようにナノストランドと核酸を接触させることによって、核酸を捕捉（結合）して、ナノ複合体を形成させることができる。このナノ複合体は、遠心分離や濾過等で分離することが可能である。ナノ複合体は、核酸の濃度が高い場合、ゲル状の物質として得られ、核酸の濃度が低い場合、水溶液に分散したまま存在する。いずれの場合においても、ナノ複合体は、0.2μｍ程度の細孔を有するフィルターで濾過、分離することが可能であ
る。
【００４３】
このナノ複合体を形成させた後、上記に例示した各種の配位性化合物の添加、または、液性を弱酸性（pH 3.0-pH 5.0の範囲が好ましい）とすることにより、ナノストランドが
消失する。前者の場合、ナノストランドを構成している金属原子に錯化させるのに十分な量の配位性化合物を加えればよい。配位性化合物は、水溶液として添加することが好ましく、ナノ複合体の水溶液に近いpHに調製して添加することがより好ましい。たとえば、水酸化カドミウムのナノストランドとDNAとのナノ複合体からDNAを解放させるためには、EDTA・3NaOH水溶液（90ｍM、pH 7.7）を用いることが好ましい。ナノ複合体からの核酸の解放の程度は、先の0.2μｍ程度の細孔を有すフィルターによる分離実験から評価すること
が可能である。
【００４４】
この出願の発明は、ナノ複合体を前記のフィルターを用いて、濾過することによりナノ複合体を取り除くことができ、その結果、ナノ複合体を構成している核酸も除去することができる。すなわち、この出願の発明は、核酸を除去するための方法として用いることができる。
【００４５】
さらには、核酸を効率よく分離、精製、あるいは、濃縮することのできる核酸処理方法として、ナノ複合体を前記フィルターを用いた濾過により分取し、このナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性を弱酸性（pH 3.0-pH 5.0の範囲が好ましい）とすることにより、このナノ複合体中に含まれるナノストランド
を消失させることに基づいた核酸処理方法としても活用することができる。
【００４６】
なお、ナノ複合体の分取には、上記のフィルターを利用する以外に、遠心分離処理によって行うことも可能である。
【実施例】
【００４７】
次に、実施例を示して、この出願の発明の特徴をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、適宜変更することができる。したがって、この出願の発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。
（実施例１）
実施例１として、カドミウム塩の水溶液のpHを適当な範囲に設定することで、水酸化カドミウムのナノストランドが形成されることを示すために、透過型電子顕微鏡による観察を行った。
【００４８】
16mMの水酸化ナトリウム水溶液の所定量に純水を加えて20mLにする。この水溶液を、4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液20mLに激しく攪拌しながら一気に加える。図
１には、16mMの水酸化ナトリウム水溶液の使用量に対し、硝酸カドミウムの水溶液との混合後のpHをプロットした。水溶液のpHは、水酸化ナトリウムの使用量とともに変化する。硝酸カドミウム単独の水溶液は、pH 5.44であるが、水酸化ナトリウムの使用量が2mLでは、pH 8.19となる。pH値は、水酸化カドミウムの使用量が硝酸カドミウムに対して2倍量（すなわち、10mL）になるまで緩やかに上昇し、その後、急激に上昇する。pH 9以上の水溶液では、暫くして白色の沈殿が生じてくる。なお、実施例１での全ての溶液には、混合の際のpHの局所的な上昇を緩和するため、少量のポリアクリルアミン塩酸塩（モノマーの濃度として0.2mM）を加えてある。
【００４９】
図中の矢印で示したpHにおいて、約1mLの水溶液を清浄なガラス基板上に展開し、透過
型電子顕微鏡用のマイクログリットを浮かべて1分間放置し、過剰に吸着した水溶液を濾
紙で拭った後、常温で乾燥させた。
【００５０】
図２から４には、このようにして得られた試料の透過型電子顕微鏡像を合わせて示す。なお、図１中に示した矢印aは図２と、矢印bは図３と、矢印cは図４とそれぞれ対応して
いる。pH 8.43の試料（図２）では、極めて細いナノストランドが形成されており、その
長さは、数マイクロメートルを超えるものもある。pH 8.59の試料（図３）では、直径200nm程度の球状の塊が見られる。この塊は、pH 8.75（図４）で六角形の微結晶へと成長す
る。この微結晶は、六方晶系の水酸化カドミウムである。
【００５１】
本実施例では、カドミウム塩の水溶液のpHを適当な範囲に設定することで、幅が3nm以
下の水酸化カドミウムのナノストランドを優先的に形成できることを示している。また、図１から明らかなように、ナノストランドの長さは直径の100倍以上であり、曲率半径は20nm以上である。
（実施例２）
実施例２として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが形成されることを示すために、高分解能透過型電子顕微鏡による観察を行った。
【００５２】
4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液20mLに、2mMの水酸化ナトリウム水溶液20mLを激しく攪拌しながら一気に加えた。この水溶液を5日間室温で放置した。溶液のpHは
、7.95であった。この水溶液の約1mLを清浄なガラス基板上に展開し、高分解能電子顕微
鏡観察用のマイクログリットを浮かべて1分間放置し、過剰に吸着した溶液を濾紙で拭っ
た後、常温で乾燥させた。図５から図７には、このようにして得られた試料の透過型電子顕微鏡像を示す。図５、図６、図７は、それぞれ異なる倍率（各図中のスケールバーを参照）で撮影されたものである。
【００５３】
図５および図６から明らかなように、ナノストランドは、約2nmの一定の幅を有する。
図５および図６より高倍率で撮影した図７では、幅1.9nmのナノストランドに沿って斜め
に0.26nmの周期構造を確認することができる。
【００５４】
図８には、水酸化カドミウムの結晶学的データ（Structure axes：hexagonal、ａ：3.496Å、ｃ：4.702Å、Space group：P-3m1）を用いて計算されたナノストランドの推定構
造の模式図を例示した。まず、ナノストランドの直径（1.9nm）から、水酸化カドミウム
のユニットセルが7つ配列していることを推定し、その断面が六角形であると仮定した。
この37個のユニットセルのプレートを1ユニットづつずらしてパッキングした。このよう
にして得られた推定構造では、ナノストランドの成長方向に対して斜めの0.26nmの周期構造が完全に再現できている。
【００５５】
以上の結果から、本実施例のナノストランドが水酸化カドミウムと同じ単位格子から形成されており、1.9nmという極めて細い構造にも関わらず、結晶性の剛直なナノストラン
ドであることが確認できた。
（実施例３）
実施例３として、ナノストランド全体の5%以上の金属原子が正に荷電している水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが形成できることを示すために、色素分子（Evans Blue）による滴定を行った。
【００５６】
4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液200mLに、4mMの水酸化ナトリウム水溶液200mLを激しく攪拌しながら一気に加えた。この水溶液の所定量に純水を加えて24mLにし、1mMのEvans Blue水溶液（1mL）を攪拌しながら加え、1時間室温で放置した。Evans Blue
の最終的な濃度は、0.04mMである。また、水酸化カドミウムのナノストランドの使用量（すなわち、前述の所定量）は、カドミウム原子の最終的な濃度に換算して、0mM、0.16mM
、0.32mM、0.48mM、0.64mM、0.80mM、0.96mMとなるようにした。
【００５７】
次に、上記７つの水溶液をそれぞれ0.2μmの細孔を有するWhatman PVDFフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。
【００５８】
図９に例示したように、608nmに位置するEvans Blueの吸収ピークは、ナノストランド
の混合量を段階的に増やすことで、化学量論的に減少した。このことは、ナノストランドとEvans Blueからなる一定組成の沈殿が得られていることを意味する。全ての色素分子を沈殿させるのに必要なナノストランドの使用量は、カドミウム原子数に換算してEvans Blue分子の24倍であった。図中に示すように、この色素が4つのアニオン電荷を有すること
を考慮すると、ナノストランドを構成するカドミウム原子の約6分の1が正に荷電しているものと考えられる。
【００５９】
図１０は、実施例２での推定構造において、六角形のプレートの頂点が正に荷電していると仮定した場合の構造を例示した模式図である。この場合、断面の37個のカドミウム原子の中で6個のカドミウム原子が正に荷電しており、全体のカドミウム原子数の約6分の1
が正に荷電していることを説明することができる。
【００６０】
以上の結果から、本実施例の水酸化カドミウムによる剛直なナノストランドにおいて、ナノストランド全体の5%以上の金属原子が正に荷電していることを確認することができた。
（実施例４）
実施例４として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがDNAを捕捉（結合）し、
配位性化合物の添加によりナノストランドが消失し、DNAが解放されることを示すために
、紫外・可視吸収スペクトルの測定を行った。
Salmon sperm DNA（200〜2500bp、1mg/mL）とHoechst 33342（0.04mg/mL）を含む溶液（DNA混合溶液）を調製し、4℃で2日間放置した。この溶液1mLを24mLの純水に希釈した（溶
液1）。一方、4mMの硝酸カドミウムの水溶液20mLに、2mM水酸化ナトリウム水溶液40mLを
激しく攪拌しながら一気に加えた。この溶液24mLに、先のDNA混合溶液1mLを加えると、瞬時に白色のゲルが形成した（溶液2）。図１１に、溶液1と溶液2の様子を写真として例示
した。さらに、別に準備した白色のゲルを含む溶液2に、90mMのEDTA・3NaOH水溶液（pH 7.72）を１mL加えると、ゲルが完全に消失した（溶液3）。また、コントロール実験として、先のDNA混合溶液1mLを1.33mMの硝酸カドミウム水溶液24mLと混合した（溶液4）。
【００６１】
上記4つの水溶液をそれぞれ0.2μmの細孔を有するWhatman PVDFフィルターで濾過し、
濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図１２に示す。溶液1のスペク
トルは、フィルターで濾過する前と全く同じであった。すなわち、Salmon sperm DNAは、0.2μmの細孔のPVDFフィルターを通過することができる。溶液1のスペクトルにおいて、258nmでの吸収ピークは、主にDNA鎖の複素環に、353nmの吸収ピークは、DNA鎖にインター
カレートしたHoechst 33342に由来する。ナノストランドと混合した溶液2では、DNA鎖やHoechst 33342に由来する吸収ピークが全く観察されない。即ち、全てのDNA鎖は、ナノス
トランドと結合してゲル化し、フィルターで除去されている。一方、EDTAを加えた溶液3
では、これらピーク強度が完全に回復する。この結果は、ナノストランドを構成していたカドミウムイオンがEDTA-Cd2+錯体を形成し、ナノストランド自身が消失したため、ナノ
ストランドに拘束されていたDNAが解放されたことを示している。
【００６２】
また、コントロール実験として調製した溶液4では、溶液1と比較して吸収ピークの強度がやや減少した。この結果は、DNA鎖がカドミウムイオンによって僅かに凝集しているこ
とを示している。しかしながら、カドミウムイオンによる凝集の効果は、ナノストランドによるゲル化の効果より著しく小さい。
【００６３】
以上の結果から、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが、DNAを捕捉
（結合）し、配位性化合物の添加により消失し、DNAを解放することが確認できた。
（実施例５）
実施例５として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがDNAを効率的に捕捉する
ことを示すために、蛍光スペクトルの測定を行った。
【００６４】
Salmon sperm DNA（200〜2500bp、1mg/mL）とHoechst 33342（0.04mg/mL）を含む溶液
（DNA混合溶液）を調製し、4℃で2日間放置した。この溶液を純水で10分の1に希釈した（希釈溶液）。この希釈溶液10μLを24.99mLの純水に希釈した（溶液1）。一方、4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液20mLに、2mM水酸化ナトリウム水溶液40mLを激しく攪
拌しながら一気に加えた。この溶液24.99mLに、先の希釈溶液10μLを加えた（溶液2）。
溶液1と溶液2をそれぞれ0.2μmの細孔を有するWhatman PVDFフィルターで濾過し、濾液の蛍光スペクトルを測定した。その結果を図１３に示す。溶液1では、360nmの励起光を照射すると、450nmにピークをもつHoechst 33342の蛍光スペクトルが得られた。一方、溶液2
では、この蛍光が確認できない。この実験条件では、DNAとHoechst 33342の濃度は、それぞれ、4.0×10-5mg/mL、1.6×10-6mg/mLである。このような条件でもDNAの少なくとも95
％は、PVDFフィルターによって濾過されている。
【００６５】
図１４には、実施例５でのHoechst 33342を含んだDNA鎖と水酸化カドミウムのナノストランドから形成されたゲルの構造を模式的に例示した。本実施例のナノストランドは、DNA鎖（直径2nm）とほぼ同じ幅をもち、結晶性で剛直であり、かつ表面に正電荷が高密度にかつ周期的に配列していると考えられる。このため、DNA鎖との相補的な静電相互作用が
可能となり、低濃度のDNAを効率的に捕捉、結合する。この図１４に示すように、DNA鎖とナノストランドは、多くの部分で平行に配向しており、静電的に強く吸着しているものと考えられる。また、DNA鎖とナノストランドは、互いに橋架することで、ゲルを形成する
。この結果、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドは、DNAを効率的に捕
捉、結合することが可能となる。
（実施例６）
実施例６として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがRNAを結合し、弱酸性に
することでナノストランドが消失し、RNAが解放されることを示すために、紫外・可視吸
収スペクトルの測定を行った。
【００６６】
Baker's Yeast RNA（1mg/mL）を含む溶液（RNA溶液）を調製し、4℃で2日間放置した。この溶液1mLを24mLの純水に希釈した（溶液1）。一方、4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液5mLに、0.211mM水酸化ナトリウム水溶液95mLを激しく攪拌しながら一気に加
えた。この溶液24mLに、先のRNA溶液1mL を加えた（溶液2）。さらに、別に準備した溶液2に、160mMの塩酸水溶液を50μLを加えた（溶液3）。また、コントロール実験として、先のRNA溶液1mLを0.2mMの硝酸カドミウム水溶液24mLと混合した（溶液4）。
【００６７】
上記4つの水溶液をそれぞれ0.2μmの細孔を有するWhatman PVDFフィルターで濾過し、
濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図１５に示した。溶液1のスペ
クトルは、フィルターで濾過する前と全く同じであった。すなわち、Baker's Yeast RNA
は、0.2μmの細孔のPVDFフィルターを通過することができる。溶液1のスペクトルにおい
て、258nmでの吸収ピークは、RNA鎖の複素環に由来する。ナノストランドと混合した溶液2では、DNA鎖の複素環に由来する吸収ピークが47％減少した。すなわち、一部のRNA鎖は
、ナノストランドと結合し、フィルターで除去されている。一方、HCLを加えた溶液3では、このピークの強度が増加する。この結果は、ナノストランドを構成していたカドミウムイオンが再溶解し、ナノストランド自身が消失したため、ナノストランドに拘束されていたRNAが解放されたことを示している。
【００６８】
そして、コントロール実験として調製した溶液4では、溶液1と比較して吸収ピークの強度がやや減少した。この結果は、RNA鎖がカドミウムイオンによって僅かに凝集すること
を示している。
【００６９】
以上の結果から、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが、RNAを捕捉
（結合）し、弱酸性にすることで消失され、RNAを解放することを確認することができた
。
【００７０】
なお、実施例６では、ナノストランドの濃度を実施例４の15%に設定している。この値
は、カドミウム元素の濃度として0.2mMに対応し、正に荷電したカドミウムイオンの濃度
として、0.033mMに対応する。一方、実施例６の実験条件下のRNAの濃度は、0.04mg/mLで
ある。この値は、RNAのユニット分子量を350とすると、0.114mMに対応することとなる。
したがって、混合溶液中のナノストランドが有する正の荷電量は、RNAの負の荷電量の約30％に相当する。実施例６におけるRNAの結合率は47％であり、RNAを効率的に捕捉・結合
していると言える。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
この出願の発明は、金属酸化物を主成分とし、核酸を効率的に捕捉（結合）するための優れた化学的、構造的な特徴を有するナノストランドを提供する。また、このナノストランドは、配位性化合物の添加、あるいは弱酸性にすることで消失し、核酸を解放することができる。このため、微量な生体試料からの核酸の抽出あるいは除去、核酸の分離や精製や濃縮などを効率的に行うことが可能となる。その結果、この出願の発明のナノストランドは、遺伝子診断やDNA鑑定、核酸に関連する医学的、生物学的な研究や治療等に役立ち
、また、水溶液中の核酸の機能を一時的に抑制することにも利用できる。
【００７２】
この出願の発明のナノストランドと核酸との結合により精製されるナノ複合体は、DNA
の保存、安定化、あるいは固定化手法としても魅力的であり、核酸の新しいマニピュレーション手法として期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】実施例１での水酸化ナトリウムの添加量に対する水溶液のpH変化ならびに水酸化カドミウムのナノストランドの電子顕微鏡観察像を示した図である。
【図２】図１における、矢印aのpHの水溶液中に形成されたナノストランドの電子顕微鏡観察像を示した図である。
【図３】図１における、矢印bのpHの水溶液中に形成されたナノストランドの電子顕微鏡観察像を示した図である。
【図４】図１における、矢印cのpHの水溶液中に形成されたナノストランドの電子顕微鏡観察像を示した図である。
【図５】実施例２での水酸化カドミウムのナノストランドの高分解能電子顕微鏡像を低倍率にて例示した図である。
【図６】実施例２での水酸化カドミウムのナノストランドの高分解能電子顕微鏡像を中倍率にて例示した図である。
【図７】実施例２での水酸化カドミウムのナノストランドの高分解能電子顕微鏡像を高倍率にて例示した図である。
【図８】実施例２での高分解能電子顕微鏡観察で得られたナノストランドの大きさと格子イメージに基づき、水酸化カドミウムの結晶学的データから計算されたナノストランドの推定構造を例示した模式図である。なお、この推定構造では、電子顕微鏡の観察イメージに合致するように、カドミウム原子の直径が酸素原子の2倍に設定されている。
【図９】実施例３での水酸化カドミウムのナノストランドによるEvans Blueの滴定における濾液の紫外・可視吸収スペクトル変化を示す図である。図中のCd：EBは、カドミウム原子とEvans Blueのモル比を表す。
【図１０】実施例３での滴定において推定されたナノストランドの電荷密度を模式的に例示した図である。この模式図は、実施例２の推定構造に基づいており、簡略のため、カドミウム原子のみを描いてある。
【図１１】実施例４でのHoechst 33342を含んだDNAの水溶液（溶液1）ならびにDNAと水酸化カドミウムのナノストランドから形成されたゲル（溶液2）の様子を例示した図である。
【図１２】実施例４での溶液1、溶液2、溶液3、溶液4を、それぞれフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した結果を示した図である。図中には、Hoechst 33342の構造ならびにHoechst 33342を含んだDNA鎖の模式図を合わせて例示している。
【図１３】実施例５での溶液1、溶液2を、それぞれフィルターで濾過し、濾液の蛍光スペクトルを測定した結果を示した図である。410nmでのピークは、測定機器に由来するものである。
【図１４】実施例５でのHoechst 33342を含んだDNA鎖と水酸化カドミウムのナノストランドから形成されたゲルの構造を模式的に例示した図である。
【図１５】実施例６での溶液1、溶液2、溶液3、溶液4を、それぞれフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した結果を示した図である。
【図１】
2005082903.tif 000003
【図２】
2005082903.tif 000004
【図３】
2005082903.tif 000005
【図４】
2005082903.tif 000006
【図５】
2005082903.tif 000007
【図６】
2005082903.tif 000008
【図７】
2005082903.tif 000009
【図８】
2005082903.tif 000010
【図９】
2005082903.tif 000011
【図１０】
2005082903.tif 000012
【図１１】
2005082903.tif 000013
【図１２】
2005082903.tif 000014
【図１３】
2005082903.tif 000015
【図１４】
2005082903.tif 000016
【図１５】
2005082903.tif 000017