(57)【要約】【課題】抗菌性を有し、乳化性に優れ、かつ、蛋白質中の抗原構造がマスクされた機能性蛋白質及びその製造方法の提供。【解決手段】卵白、魚肉蛋白質、大豆蛋白質、分離大豆蛋白質、濃縮大豆蛋白質、大豆蛋白質分解物、小麦蛋白質（グルテン）等の動物性又は植物性蛋白質とキトサンを、メイラード反応により結合させた蛋白質−キトサン複合体。該蛋白質−キトサン複合体を含有する抗菌用組成物、乳化用組成物、飲食物、及び化粧料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質とキトサンを結合させた蛋白質−キトサン複合体。
【請求項２】
蛋白質とキトサンを、メイラード反応により結合させた蛋白質−キトサン複合体。
【請求項３】
前記蛋白質が、植物性蛋白質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛋白質−キトサン複合体。
【請求項４】
前記植物性蛋白質が、大豆蛋白質であることを特徴とする請求項３に記載の蛋白質−キトサン複合体。
【請求項５】
前記植物性大豆蛋白質が、分離大豆蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の蛋白質−キトサン複合体。
【請求項６】
前記植物性大豆蛋白質が、大豆蛋白質分解物であることを特徴とする請求項４に記載の蛋白質−キトサン複合体。
【請求項７】
蛋白質中の抗原構造がマスクされていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質−キトサン複合体。
【請求項８】
前記蛋白質中の抗原が、３４ｋＤａ蛋白質（Ｇｌｙ  ｍ  Ｂｄ  ３０Ｋ）であることを特徴とする請求項７に記載の蛋白質−キトサン複合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質−キトサン複合体を含有する抗菌用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質−キトサン複合体を含有する乳化用組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質−キトサン複合体を含有する飲食物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質−キトサン複合体を含有する化粧料。
【請求項１３】
蛋白質とキトサンを、メイラード反応により結合させることを特徴する蛋白質−キトサン複合体の製造方法。
【請求項１４】
前記蛋白質が、分離大豆蛋白質であることを特徴とする請求項１３に記載の蛋白質−キトサン複合体の製造方法。
【請求項１５】
前記蛋白質が、大豆蛋白質分解物であることを特徴とする請求項１４に記載の蛋白質−キトサン複合体の製造方法。
【請求項１６】
蛋白質とキトサンを、メイラード反応により結合させる処理を行うことにより、蛋白質中の抗原構造をマスクする方法。
【請求項１７】
前記蛋白質が、分離大豆蛋白質であることを特徴とする請求項１６に記載の蛋白質中の抗原構造をマスクする方法。
【請求項１８】
前記蛋白質が、大豆蛋白質分解物であることを特徴とする請求項１７に記載の蛋白質中の抗原構造をマスクする方法。
【請求項１９】
全脂大豆及び／又は脱脂大豆と、キトサンとを原料として、蛋白質とキトサンをメイラード反応により結合させることを特徴する蛋白質−キトサン複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質と多糖類を含有する蛋白質複合体に関するものであり、さらに詳しくはメイラード反応を用いて結合させた蛋白質複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、オボアルブミン、リゾチーム、大豆蛋白質といった蛋白質を、デキストラン、ガラクトマンナン、キシログリカンといった多糖類で修飾することにより得られる複合体が、優れた乳化性を示すことが報告されている（非特許文献１、２、３、４参照）。
【０００３】
また、リゾチーム−デキストリン複合体及びリゾチーム−ガラクトマンナン複合体が、抗酸化性を有していることや抗菌スペクトラムを拡大させることが報告されている（非特許文献３、４参照）。さらに、多糖化又はグリコシル化させたリゾチームが、蛋白質中の抗原構造をマスクするのに有効であることが示唆されている（非特許文献４参照）。
【０００４】
しかしながら、非特許文献１〜４では、多糖類としてキトサンを使用した蛋白質複合体については検討されておらず、非特許文献１〜３では、蛋白質の複合化により蛋白質中の抗原構造をマスクすることについては検討されていない。また、非特許文献４では、蛋白質としてリゾチーム、多糖類としてガラクトマンナンを使用したリゾチーム−ガラクトマンナン複合体について抗原構造のマスクが報告されているが、今回の検討では、リゾチームの代わりに大豆蛋白質を使用した大豆蛋白質−ガラクトマンナン複合体では、蛋白質中の抗原構造がほとんどマスクされないことがわかった。
【０００５】
そして、非特許文献５には、リゾチーム単体よりもリゾチーム−ガラクトマンナン複合体の方が免疫グロブリン（ＩｇＥ）レベルを６０％に減少させることが報告されている（非特許文献５、Figure.６）。また、大豆蛋白質（Ｐ３４）−ガラクトマンナン複合体も大豆蛋白質（Ｐ３４）単体よりも免疫グロブリン（ＩｇＥ）レベルを７０％に減少させることが報告されている（非特許文献５、Figure.７）。しかしながら、免疫グロブリン（ＩｇＥ）レベルは半分以上残存している。
【０００６】
さらに、特許文献１では、蛋白質−キシログルカン複合体が、安全で優れた乳化特性を有し、耐熱性、耐酸性、耐塩性に優れていることが報告されている。しかしながら、蛋白質−キシログルカン複合体の質中の抗原構造をマスクすることに関しては何ら検討されていない。
【０００７】
以上のように、これまでは、蛋白質、特に植物性蛋白質を原料とした機能性蛋白質で、抗菌性を有し、乳化機能性に優れ、かつ蛋白質中の抗原構造をマスクし、さらに免疫グロブリン（ＩｇＥ）レベルをかなり減少又は０にさせるものについては開発されていなかった。
【０００８】
【非特許文献１】Akio  Kato,外３名「Functional  Polysaccharide  Conjugate  Prepared  by  Controlled  Dry-heating  of  Ovalbumin-Dextran  Mixtures」，Agric.Biol.Chem.，１９９０年，５４（１），ｐ．１０７−１１２
【非特許文献２】小林邦彦，外２名，「大豆たん白質とガラクトマンナン型多糖類とのハイブリッド化による新規食品素材の開発」，大豆たん白質栄養研究会会誌，１９９２年，第１３巻，ｐ．１５−２１
【非特許文献３】加藤昭夫，「多糖類修飾による蛋白質の機能変換と新規食品素材の開発」，Nippon  Shokuhin  Kogyo  Gakkaishi，１９９４年，第４１巻，第４号，ｐ．３０４−３１０
【非特許文献４】加藤昭夫，「タンパク質の多糖類修飾による高機能化」，化学と生物，１９９６年，第３４巻，第１０号，ｐ．６９５−７０１
【非特許文献５】Kayo  Arita，外３名，「Effect  of  Chemical  and  Genetic  Attachment  of  Polysaccharides  to  Proteins  on  the  Production  of  IgG  and  IgE」，J.Agric.Food  Chem.，２００１年，４９，ｐ．２０３０−２０３６
【特許文献１】特開平７−２５８２９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、抗菌性を有し、乳化機能性に優れ、かつ蛋白質中の抗原構造がマスクされた機能性蛋白質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意検討した結果、蛋白質とキトサンを、メイラード反応により結合させて得られる機能性蛋白質である、蛋白質−キトサン複合体を開発することにより上記目的を達成した。
すなわち、本発明者は、蛋白質とキトサンを複合化させることにより得られた蛋白質−キトサン複合体が、抗菌性を有し、乳化機能性に優れ、かつ蛋白質中の抗原構造がマスクされたものであることを見出した。
【００１１】
本発明の第１の発明は、蛋白質とキトサンを結合させた蛋白質−キトサン複合体である。
【００１２】
本発明の第２の発明は、蛋白質とキトサンを、メイラード反応により結合させた蛋白質−キトサン複合体である。
【００１３】
本発明の第３の発明は、前記蛋白質が、植物性蛋白質であることを特徴とする第１の発明又は第２の発明のいずれか１つの発明に記載の蛋白質−キトサン複合体である。
【００１４】
本発明の第４の発明は、前記植物性蛋白質が、大豆蛋白質であることを特徴とする第３の発明に記載の蛋白質−キトサン複合体である。
【００１５】
本発明の第５の発明は、前記植物性大豆蛋白質が、分離大豆蛋白質であることを特徴とする第４の発明に記載の蛋白質−キトサン複合体である。
【００１６】
本発明の第６の発明は、前記植物性大豆蛋白質が、大豆蛋白質分解物であることを特徴とする第４の発明に記載の蛋白質−キトサン複合体である。
【００１７】
本発明の第７の発明は、前記蛋白質中の抗原構造がマスクされていることを特徴とする第１〜第６の発明のいずれか１つの発明に記載の蛋白質−キトサン複合体である。
【００１８】
本発明の第８の発明は、前記蛋白質中の抗原が、３４ｋＤａ蛋白質（Ｇｌｙ  ｍ  Ｂｄ  ３０Ｋ）であることを特徴とする第７の発明に記載の蛋白質−キトサン複合体である。
【００１９】
本発明の第９の発明は、第１〜第８の発明のいずれか１つの発明に記載の蛋白質−キトサン複合体を含有する抗菌用組成物である。
【００２０】
本発明の第１０の発明は、第１〜第８の発明のいずれか１つの発明に記載の蛋白質−キトサン複合体を含有する乳化用組成物である。
【００２１】
本発明の第１１の発明は、第１〜第８の発明のいずれか１つの発明に記載の蛋白質−キトサン複合体を含有する飲食物である。
【００２２】
本発明の第１２の発明は、第１〜第８の発明のいずれか１つの発明に記載の蛋白質−キトサン複合体を含有する化粧料である。
【００２３】
本発明の第１３の発明は、蛋白質とキトサンを、メイラード反応により結合させることを特徴する蛋白質−キトサン複合体の製造方法である。
【００２４】
本発明の第１４の発明は、前記蛋白質が、分離大豆蛋白質であることを特徴とする第１３の発明に記載の蛋白質−キトサン複合体の製造方法である。
【００２５】
本発明の第１５の発明は、前記蛋白質が、大豆蛋白質分解物であることを特徴とする第１４の発明に記載の蛋白質−キトサン複合体の製造方法である。
【００２６】
本発明の第１６の発明は、蛋白質とキトサンを、メイラード反応により結合させる処理を行うことにより、蛋白質中の抗原構造をマスクする方法である。
【００２７】
本発明の第１７の発明は、前記蛋白質が、分離大豆蛋白質であることを特徴とする第１６の発明に記載の蛋白質中の抗原構造をマスクする方法である。
【００２８】
本発明の第１８の発明は、前記蛋白質が、大豆蛋白質分解物であることを特徴とする第１７の発明に記載の蛋白質中の抗原構造をマスクする方法である。
【００２９】
本発明の第１９の発明は、全脂大豆及び／又は脱脂大豆と、キトサンとを原料として、蛋白質とキトサンをメイラード反応により結合させることを特徴する蛋白質−キトサン複合体の製造方法である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の蛋白質−キトサン複合体は、抗菌性を有し、優れた乳化性を有するものである。さらに本発明の蛋白質−キトサン複合体は、蛋白質中の抗原構造がマスクされているため、本発明の蛋白質−キトサン複合体を摂取してもアレルギーを起こしにくい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
まず、蛋白質−キトサン複合体について説明する。
蛋白質−キトサン複合体は、蛋白質とキトサンが結合してできた複合体である。蛋白質−キトサン複合体を構成する蛋白質としては、植物性又は動物性の蛋白質が使用できるが、消費者の植物性指向及び入手の容易さという理由で植物性蛋白質が好ましい。植物性蛋白質として、例えば、大豆蛋白質、小麦蛋白質（グルテン）等が挙げられ、動物性蛋白質としては、卵白、魚肉蛋白質、畜肉蛋白質等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を使用することができる。これらの蛋白質は、市販品を使用することができる。
また、蛋白質−キトサン複合体の蛋白質原料として、全脂大豆や脱脂大豆等の大豆蛋白質を含有するものも使用することができ、これらの１種又は２種以上を使用することができる。さらに、大豆蛋白質を含有するものと、先に説明した蛋白質とを併用することもできる。
【００３２】
特に、食用用途として使用する場合には、大豆蛋白質の原料である大豆は、ＩＰハンドリング品であることが望ましい。ここで、ＩＰとはＩｄｅｎｔｉｔｙ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｄの略であり、ＩＰハンドリング品とは分別生産流通管理された大豆のことをいう。
【００３３】
大豆蛋白質とは、大豆の子葉および胚軸に含有される蛋白質のことを意味し、乾燥種子の３５〜５０質量％を占め、分子量、分子形の差異により２Ｓ、７Ｓ、１１Ｓ、１５Ｓに分けられる。大豆蛋白質としては、分離大豆蛋白質、抽出大豆蛋白質、濃縮大豆蛋白質、大豆蛋白質分解物等が挙げられる。さらに、蛋白質−キトサン複合体の蛋白質原料として、全脂大豆や脱脂大豆等の大豆蛋白質を含有するものも使用することができる。
【００３４】
脱脂大豆としては、例えば日清オイリオ（株）社製の商品：ソーヤフラワーＡ等が挙げられる。分離大豆蛋白質とは、脱脂大豆から中性から弱アルカリ水で抽出した溶液を酸沈澱させて得られる蛋白質のことであって、市販品として、例えば日清オイリオ（株）社製の商品：ソルピー５０００等が挙げられる。また、大豆蛋白質分解物とは、大豆蛋白質を原料としてプロテアーゼ等の酵素で分解したものや、酸又はアルカリにより化学的に分解することにより得られるもののことであって、市販品として、例えば日清オイリオ（株）社製の商品：ソルピー１５００等が挙げられる。
【００３５】
本発明の蛋白質−キトサン複合体を調製すると、蛋白質中の抗原構造のほとんど又はすべてがマスクされるため、蛋白質−キトサン複合体を摂取してもアレルギーを引き起こしにくい。
蛋白質中の抗原構造をマスクすることによる蛋白質−キトサン複合体の免疫グロブリン（ＩｇＥ）の活性レベルは、蛋白質とキトサンを混合しただけの混合物の活性レベル１００に対して、０〜５に減少させているものが好ましく、０〜１に減少させているものがより好ましく、０に減少させているものが最も好ましい。
複合化によりマスクされる抗原としては、３４ｋＤａ蛋白質（Ｇｌｙ  ｍ  Ｂｄ  ３０Ｋ）が挙げられる。
【００３６】
本発明の蛋白質−キトサン複合体の蛋白質中の抗原構造がマスクされていることを確認する方法として、例えばＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法で得られるパターン図によるスポットの確認が挙げられる。この方法により、アレルギー物質である３４ｋＤａ蛋白質（Ｇｌｙ  ｍ  Ｂｄ  ３０Ｋ）の構造がマスクされていることが確認できる。
【００３７】
本発明の蛋白質−キトサン複合体の蛋白質−キトサン複合体の免疫グロブリン（ＩｇＥ）の活性レベルは、例えばＩｇＥ抗体産生の抑制を測定することで確認することができる。
【００３８】
蛋白質−キトサン複合体の蛋白質含量は特に限定しないが、蛋白質−キトサン複合体中、好ましくは５〜９５質量％、より好ましくは１０〜９０質量％、最も好ましくは３０〜７０質量％である。
【００３９】
蛋白質−キトサン複合体を構成するキトサンとしては、市販品及び試薬のいずれも使用することができるが、食用の観点で風味が良好で、かつ、着色が少ないものが好ましい。キトサンの市販品として、例えば和光純薬（株）社製の試薬：キトサン（分子量３０ｋＤａ）等が挙げられる。
【００４０】
蛋白質−キトサン複合体のキトサン含量は特に限定しないが、蛋白質−キトサン複合体中、好ましくは５〜９５質量％、より好ましくは１０〜９０質量％、最も好ましくは３０〜７０質量％である。
【００４１】
蛋白質−キトサン複合体中の蛋白質とキトサンの質量比（蛋白質／キトサン）は、特に限定しないが、蛋白質中の抗原構造を効率的にマスクするために、好ましくは９０／１０〜４０／６０であり、より好ましくは６０／４０〜４０／６０であり、最も好ましくは５０／５０である。
【００４２】
本発明の蛋白質−キトサン複合体の抗菌力は、大腸菌Ｋ−１２に対する殺菌力を測定することにより確認することができる。大腸菌Ｋ−１２の繁殖阻止率が高いほど、抗菌力が高いということが確認できる。
また、本発明の蛋白質−キトサン複合体の乳化力は、コーン油と水を、蛋白質−キトサン複合体で乳化することにより得られた乳化液を０．１％ＳＤＳ溶液で希釈し、得られた希釈液の５００ｎｍにおける透過率の経時変化（透過率の低下の緩慢）により確認することができる。透過率の低下が緩慢であるほど、乳化機能が高い。
【００４３】
次に、本発明の蛋白質−キトサン複合体の製造方法について説明する。
本発明の蛋白質−キトサン複合体は、蛋白質とキトサンをメイラード反応により結合させることにより製造することができる。このメイラード反応とは、アミノカルボニル反応とも言う。蛋白質及びキトサンとしては、先に説明したものが使用できる。さらに、全脂大豆や脱脂大豆等の大豆蛋白質を含有するものとキトサンとを原料にして、蛋白質とキトサンをメイラード反応により結合させることによっても製造することができる。
【００４４】
まず、蛋白質／キトサンの質量比が、より好ましくは６０／４０〜４０／６０となる量の蛋白質及びキトサンを、水に混合溶解し、水溶液中の蛋白質及びキトサンの合計含量が５〜３０質量％となるように調製する。得られた水溶液を凍結乾燥することにより粉末化する。得られた粉末を温度５０〜８０℃、より好ましくは５５〜６５℃、相対湿度５０〜８０％、より好ましくは６０〜７０％の条件下で、２〜２０日、より好ましくは７〜１４日、メイラード反応させることにより本発明の蛋白質−キトサン複合体を製造することができる。
【００４５】
本発明の蛋白質−キトサン複合体の生成は、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）電気泳動により得られるプレートを、染色処理したものにより、蛋白質−キトサン複合体である高分子物質の生成を確認することができる。
【００４６】
次に、本発明の抗菌用組成物について説明する。
本発明の抗菌用組成物は、先に説明した蛋白質−キトサン複合体を、抗菌力をより保持させるために、好ましくは１０〜１００質量％、より好ましくは３０〜１００質量％、最も好ましくは５０〜１００質量％含有するものである。
抗菌用組成物中の蛋白質−キトサン複合体以外の成分としては、デキストリン、レシチン等を使用することができる。
抗菌用組成物中の蛋白質−キトサン複合体以外の成分含量は、好ましくは０〜９０質量％、より好ましくは０〜７０質量％、最も好ましくは０〜５０質量％である。
【００４７】
本発明の抗菌用組成物の製造は、例えば、蛋白質−キトサン複合体を７０質量％含有する抗菌用組成物の場合、蛋白質−キトサン複合体７０質量％とデキストリン等の賦形剤３０質量％をＶ型混合機で混合することにより製造することができる。
【００４８】
本発明の抗菌用組成物は、飲食物及び化粧料に使用することができる。
本発明の抗菌用組成物は、大腸菌、カビ・酵母に対して、抗菌力を有する。したがって飲食物及び化粧料に抗菌の目的で使用することができる。
本発明の抗菌用組成物の飲食物への添加量は、添加後の飲食物中の蛋白質−キトサン複合体含量が、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜５質量％、最も好ましくは０．０１〜１質量％である。
【００４９】
飲食物として、例えば、クッキー、スナック菓子、ケーキ、パン、麺等の小麦粉製品、ドレッシング、マヨネーズ等の調味料、ちくわ、かまぼこ等の魚肉練り製品、ハム、ソーセージ、ハンバーグ等の畜肉製品、おにぎり、べんとう、乳酸発酵飲料、栄養ドリンク、ジュース、コーヒー、お茶、デザート類等が挙げられる。
【００５０】
また、本発明の抗菌用組成物の化粧料への添加量は、添加後の化粧料中の蛋白質−キトサン複合体含量が、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜５質量％、最も好ましくは０．０１〜１質量％である。
【００５１】
化粧料として、例えば、ファンデーション、ローション、乳液、口紅、頭髪料、養毛剤、シャンプー、リンス等が挙げられる。
【００５２】
次に、本発明の乳化用組成物について説明する。
本発明の乳化用組成物は、先に説明した蛋白質−キトサン複合体を、より高い乳化機能を保持させるために、好ましくは１０〜１００質量％、より好ましくは３０〜１００質量％、最も好ましくは５０〜１００質量％含有するものである。
乳化用組成物中の蛋白質−キトサン複合体以外の成分としては、グリセリン脂肪酸モノエステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤や、デキストリン、澱粉等の賦形剤を使用することができる。
乳化用組成物中の蛋白質−キトサン複合体以外の成分含量は、好ましくは０〜９０質量％、より好ましくは０〜７０質量％、最も好ましくは０〜５０質量％である。
【００５３】
本発明の乳化用組成物の製造は、例えば、蛋白質−キトサン複合体を７０質量％含有する乳化用組成物の場合、蛋白質−キトサン複合体７０質量％とデキストリン３０質量％を水に分散して、固形分１０質量％の水溶液とし、得られた水溶液をスプレードライ（温度８０℃）で乾燥することにより製造することができる。
【００５４】
本発明の乳化用組成物は、飲食物及び化粧料に使用することができる。
本発明の乳化用組成物の飲食物への添加量は、添加後の飲食物中の蛋白質−キトサン複合体含量が、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜５質量％、最も好ましくは０．０１〜１質量％である。
【００５５】
飲食物として、例えば、クッキー、スナック菓子、ケーキ、パン、麺等の小麦粉製品、ドレッシング、マヨネーズ等の調味料、ちくわ、かまぼこ等の魚肉練り製品、ハム、ソーセージ、ハンバーグ等の畜肉製品、おにぎり、べんとう、乳酸発酵飲料、栄養ドリンク、ジュース、コーヒー、お茶、デザート類等が挙げられる。
【００５６】
また、本発明の乳化用組成物の化粧料への添加量は、添加後の化粧料中の蛋白質−キトサン複合体含量が、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜５質量％、最も好ましくは０．０１〜１質量％である。
【００５７】
化粧料として、例えば、ファンデーション、ローション、乳液、口紅、頭髪料、養毛剤、シャンプー、リンス等が挙げられる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
製造例１〔蛋白質−キトサン複合体に用いる分離大豆蛋白質の調製〕
丸大豆から油分を除去した脱脂大豆（ＩＰハンドリング品）１００ｇを０．０３ＭＴｒｉｓ塩酸バッファー（ｐＨ８）２Ｌに１時間浸漬した後、遠心分離で沈殿物を除去して上清液を回収した。回収した上清液を、２Ｎ塩酸を用いてｐＨ４．８にした後、遠心分離処理（条件１，０００ｒｐｍ）をして、沈殿物を回収した。得られた沈殿物５０ｇを蒸留水５００ｇに溶解させて、１Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８に調整した後凍結乾燥処理することにより、粉末状の分離大豆蛋白質１５ｇを得た。
【００６０】
製造実施例１〔蛋白質−キトサン複合体の製造〕
製造例１で得られた分離大豆蛋白質５ｇとキトサン（和光純薬（株）製、試薬、分子量：３０ｋＤａ）５ｇを混合（混合質量比１：１）した後、水溶液中の分離大豆蛋白質及びキトサンの含有量が１０質量％になるように蒸留水に溶解させた後、凍結乾燥処理により粉末を得た。この粉末を相対湿度６５％（飽和ヨウ化カリウムで調整）の条件下、６０℃で３日間、７日間又は１４日間加熱を行い、蛋白質−キトサン複合体をそれぞれ３．３ｇずつ（３日間反応品、７日間反応品、１４日間反応品）得た。
【００６１】
製造比較例１〔蛋白質−ガラクトマンナン複合体の製造〕
製造例１で得られた分離大豆蛋白質５ｇとガラクトマンナン（グアガム酵素分解物で平均分子量１５ｋＤａ）５ｇを混合（混合質量比１：１）した後、水溶液中の分離大豆蛋白質及びガラクトマンナンの含有量が１０質量％になるように蒸留水に溶解させた後、凍結乾燥処理により粉末を得た。この粉末を相対湿度６５％（飽和ヨウ化カリウムで調整）の条件条件下、６０℃で７日間又は１４日間加熱を行い、蛋白質−ガラクトマンナン複合体をそれぞれ５ｇずつ（７日間反応品、１４日間反応品）得た。
【００６２】
〔蛋白質−ガラクトマンナン複合体、又は蛋白質−キトサン複合体の生成確認試験〕
蛋白質−ガラクトマンナン複合体、又は蛋白質−キトサン複合体を、１％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）を含有するトリグリシンバッファー（ｐＨ８．８）に溶解させ、複合体を０．２質量％に調製したサンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に基づきＳＤＳ電気泳動で分子量分布を測定した。ＳＤＳ電気泳動は、１０ｍＡの電流で１時間行い、その後２０ｍＡで２時間行った。その後、泳動させたプレートを、０．２％Coomassie  brilliant  blue-R250溶液を噴霧することにより染色した。高分子物質のスポットが出現したことにより蛋白質−ガラクトマンナン複合体、又は蛋白質−キトサン複合体の生成を確認した。
【００６３】
実施例１〔蛋白質−キトサン複合体の生成確認〕
製造実施例１で得られた蛋白質−キトサン複合体の生成をＳＤＳ電気泳動法により確認した。染色させたスポットのパターン図を図１に示す。図１のＡＰＰ−ＣＴのパターン図から、反応前のスポットと比較して、１週間及び２週間反応後のスポットが高分子側に移行していることが示されていることから、７日間及び１４日間反応させたものについて、蛋白質−キトサン複合体が生成されていることが確認できた。
【００６４】
比較例１〔蛋白質−ガラクトマンナン複合体の生成確認〕
製造比較例１で得られた蛋白質−ガラクトマンナン複合体の生成をＳＤＳ電気泳動により確認した。染色させたスポットのパターン図を図１に示す。図１のＡＰＰ−ＣＴのパターン図から、反応前のスポットと比較して、１週間及び２週間反応後のスポットが高分子側に移行していることが示されていることから、７日間及び１４日間反応させたものについて、蛋白質−ガラクトマンナン複合体が生成されていることが確認できた。
【００６５】
〔蛋白質−キトサン複合体、及び蛋白質−ガラクトマンナン複合体の評価方法〕
以下に示す抗菌性評価、乳化性評価、及び抗原構造のマスク評価により、蛋白質−キトサン複合体、及び蛋白質−ガラクトマンナン複合体を評価した。
【００６６】
１．抗菌性評価
抗菌性の測定には大腸菌Ｋ−１２株を用いる。これをＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で１０時間培養した後に２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）で１，０００倍希釈した。蛋白質−キトサン複合体を２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）に５０μｇ／ｍｌとなるように溶解し、蛋白質−キトサン複合体のサンプル溶液を調製した。その後、大腸菌Ｋ−１２株の１，０００倍希釈液４．５ｍｌに対し抗菌性を測定する蛋白質−キトサン複合体のサンプル溶液（濃度５０μｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを混合し２０℃又は３７℃で３０分間培養した。そして、この培養液１００μｌを分取して寒天培地上に広げた。さらに、この寒天培地を３７℃で一晩培養後、コロニー数を数え、コロニー数が少なかったものほど大腸菌Ｋ−１２株の繁殖阻止率が高く、抗菌力があると評価した。
【００６７】
２．乳化性評価
まず、１．０ｍｌのコーン油と蛋白質−キトサン複合体を０．１Ｍリン酸バッファーに溶解して０．２質量％とした溶液３．０ｍｌを、混合し１２，０００ｒｐｍで１分間ホモジェナイズした。その後、この乳化液５０μｌを０．１％ＳＤＳ溶液で希釈して５ｍｌとした。この希釈液の５００ｎｍの混合直後（０分後）、１分後、２分後、５分後、１０分後における透過率を測定した。透過率の低下が緩慢であるほど、乳化機能が高いと評価した。
【００６８】
３．抗原構造のマスク評価
Western  blotting法により蛋白質中の３４ｋＤａ蛋白質のマスク評価を行った。
【００６９】
実施例２〔蛋白質−キトサン複合体の抗菌性評価〕
製造実施例１で１４日間反応により得られた蛋白質−キトサン複合体の抗菌性評価結果を図２に示す。その結果、蛋白質−キトサン複合体は、複合化前の蛋白質とキトサン混合物に比べて、２０℃及び３７℃の両方において、抗菌性が２〜３倍増加することが確認された。
【００７０】
実施例３〔蛋白質−キトサン複合体の乳化性評価〕
製造実施例１で３日間、７日間又は１４日間反応により得られた蛋白質−キトサン複合体の乳化性評価結果を図３に示す。この結果より蛋白質−キトサン複合体は、複合化前の蛋白質とキトサン混合物に比べて乳化性が向上していることがわかった。
【００７１】
実施例４〔蛋白質−キトサン複合体中の抗原構造のマスク確認〕
製造実施例１で１４日間反応により得られた蛋白質−キトサン複合体中の抗原構造のマスクについて、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により調べた。得られたパターン図を図４に示す。パターン図には、大豆蛋白質−キトサン複合体（７、８）では、（Ｇｌｙ  ｍ  Ｂｄ  ３０Ｋ）に該当するスポットが現れていないことから、大豆蛋白質中のアレルギー物質である３４ｋＤａ蛋白質（Ｇｌｙ  ｍ  Ｂｄ  ３０Ｋ）構造のほとんどがマスクされていることが確認された。
【００７２】
比較例２〔蛋白質−ガラクトマンナン複合体中の抗原構造のマスク確認〕
製造比較例１で７日間又は１４日間の反応により得られた蛋白質−ガラクトマンナン複合体中の抗原構造のマスクについて、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により調べた。得られたパターン図を図４に示す。パターン図からは、大豆蛋白質−ガラクトマンナン複合体（３、４、５、６）では、（Ｇｌｙ  ｍ  Ｂｄ  ３０Ｋ）に該当するスポットが現れていることから、３４ｋＤａ蛋白質（Ｇｌｙ  ｍ  Ｂｄ  ３０Ｋ）構造がほとんどマスクされていないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の蛋白質−キトサン複合体は、抗菌性を有し、乳化機能性に優れ、かつ蛋白質中の抗原構造がマスクされたものであるため、広く食品及び化粧料の分野に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】大豆蛋白質、大豆蛋白質−ガラクトマンナン複合体、及び大豆蛋白質−キトサン複合体（未反応、７日間反応、１４日間反応）の生成をＳＤＳ電気泳動法により確認した染色スポットのパターン図である。縦軸は、分子量を示す。（実施例１、比較例１）
【図２】大豆蛋白質とキトサンの混合物、及び大豆蛋白質−キトサン複合体（１４日間反応）の抗菌性評価結果のグラフ図である。縦軸は、大腸菌Ｋ１２の繁殖阻止率（％）を示す。（実施例２）
【図３】大豆蛋白質とキトサンの混合物、及び大豆蛋白質とキトサンを反応させることにより得られた大豆蛋白質−キトサン複合体（３日間反応、７日間反応、１４日間反応）の乳化評価結果のグラフ図である。縦軸は、乳化懸濁液の０．１％ＳＤＳ溶液希釈液の５００ｎｍにおける透過率（％）を示す。（実施例３）
【図４】大豆蛋白質、大豆蛋白質−ガラクトマンナン複合体（７日間反応、１４日間反応）、及び大豆蛋白質−キトサン複合体（１４日間反応）の生成を確認したＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法によるパターン図である。縦軸は、分子量を示す。（実施例４、比較例２）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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