(57)【要約】【課題】        ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞の増殖を促進する活性化剤、該巨核球の成熟を促進する活性化剤、該巨核球の血小板産生を促進する活性化剤を提供する。【解決手段】    グリコサミノグリカン、又はグリコサミノグリカンとトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤、該巨核球成熟促進活性化剤、該巨核球血小板産生促進活性化剤、該活性化剤を含有する医薬。【選択図】  図１
2005187435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤。
【請求項２】
グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球成熟促進活性化剤。
【請求項３】
グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球血小板産生促進活性化剤。
【請求項４】
グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤。
【請求項５】
グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球成熟促進活性化剤。
【請求項６】
グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球血小板産生促進活性化剤。
【請求項７】
請求項１〜６の活性化剤を含有する医薬。
【請求項８】
請求項１〜６の活性化剤を含有する血小板産生医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板産生を促進するグリコサミノグリカンに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄中の多能性造血系幹細胞がある程度分化して、巨核球系だけに方向付けられた巨核球前駆細胞（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ；ＣＦＵ−Ｍｅｇ）となり、さらに増殖・分化して巨核球となる。巨核球はさらに核の倍数性の増加、細胞質の成熟を遂げて、最終的に血小板が放出される。血小板産生過程と深く関与している物質に、生理活性因子（サイトカイン）であるトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）があり、肝臓で産生されている。
発明者らは、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞に対するトロンボポエチンとグリコサミノグリカンの作用を報告している。（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １２１（９）６９１−６９９（２００１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この非特許文献１では、トロンボポエチンと特定のグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸およびヘパラン硫酸）との併用が、臍帯血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞の増殖は促進するものの、巨核球の成熟作用は持たないものと記載されている。
本発明の課題は、ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞の増殖を促進する活性化剤を提供することにある。
本発明の課題は、ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球の成熟を促進する活性化剤を提供することにある。
本発明の課題は、ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球の血小板産生を促進する活性化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は以下の活性化剤に係る。
１.グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤。
【０００５】
２.グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球成熟促進活性化剤。
【０００６】
３.グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球血小板産生促進活性化剤。
４.グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤。
５.グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球成熟促進活性化剤。
６.グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球血小板産生促進活性化剤。
７.上記１〜６の活性化剤を含有する医薬。
８.上記１〜６の活性化剤を含有する血小板産生医薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞の増殖、巨核球の成熟、血小板産生を促進する組成物を提供することができる。本発明の組成物は、血小板減少症の患者本人から少量の造血幹細胞を用いた生体外での巨核球・血小板増殖法や造血幹細胞移植後の血小板回復を促進する為に直接患者に投与する医薬品等として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、グリコサミノグリカンを有効成分とするヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞の増殖、巨核球の成熟、血小板産生を促進する活性化剤を提供する。
【０００９】
本発明で用いるグリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸等を挙げることができる。好ましくは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸が良く、より好ましくは、デルマタン硫酸が良い。
【００１０】
これらのグリコサミノグリカンは、生体組織から分離されたものでも、酵素的、微生物的あるいは化学的に合成されたものでも良い。また、これらグリコサミノグリカンを酵素的、微生物的、化学的あるいは物理的に分子量を調節したものであっても良い。これらグリコサミノグリカンは塩でも良い。これら塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち薬学的に許容されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
グリコサミノグリカンの重量平均分子量は、通常、ヒアルロン酸の場合は、約１０００〜１０００万であり、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸の場合は、約１０００〜１２万であるが、本発明に使用するグリコサミノグリカンの分子量はこれに限定されない。本発明において重量平均分子量は以下の方法により測定した。
グリコサミノグリカンの１％水溶液５μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるゲル濾過で分析した。カラムはＴＳＫｇｅｌ−（Ｇ４０００＋Ｇ３０００＋Ｇ２５００）ＰＷＸ（東ソー、７.８ｍｍ×３０ｃｍ）を用い０.２Ｍ塩化ナトリウムを使用して、４０℃、０.６ｍｌ／分の流速で展開した。各種グリコサミノグリカンの分子量標準品を対照にして求めた。
【００１２】
グリコサミノグリカンとしては市販のものを用いることもできる。ヒアルロン酸としては、生化学工業株式会社製の、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ブタ皮由来、分子量４００００〜６００００）、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来、分子量８０万〜１２０万）、ヒアルロン酸ナトリウム塩（鶏冠由来、分子量６０万〜１２０万）、ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍帯由来）、ヒアルロン酸カリウム（ヒト臍帯由来）等が挙げられる。
【００１３】
ケラタン硫酸としては、生化学工業株式会社製ケラタン硫酸ナトリウム塩（ウシ角膜由来）等が挙げられる。
【００１４】
コンドロイチン硫酸としては、生化学工業株式会社製の、コンドロイチンナトリウム塩、コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩（チョウザメ脊索由来）、コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩（クジラ軟骨由来）、コンドロイチン硫酸ＡナトリウムＳＳＧ（クジラ軟骨由来、分子量２５０００〜５００００）、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウム塩（ブタ皮由来、分子量１１０００〜２５０００）、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩ＳＧ（サメ軟骨由来）、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩ＳＳＧ（サメ軟骨由来、分子量４００００〜８００００）、コンドロイチン硫酸Ｄナトリウム塩（サメ軟骨由来）、コンドロイチン硫酸Ｅナトリウム塩（イカ軟骨由来）等が挙げられる。
【００１５】
ヘパラン硫酸としては、シグマ社製牛腸粘膜由来ヘパラン硫酸（分子量約７５００）、生化学工業株式会社製ヘパラン硫酸ナトリウム塩（ウシ腎臓由来）等が挙げられる。
【００１６】
デルマタン硫酸としては、生化学工業株式会社製の、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウム塩（ブタ皮由来、分子量１１０００〜２５０００）等が挙げられる。
【００１７】
トロンボポエチンとしては、ヒトトロンボポエチンあるいは非ヒトトロンボポエチン等のトロンボポエチン活性を有するものであれば制限はないが、好ましくは、ヒトトロンボポエチンが良い。ヒトトロンボポエチンとしては、ヒト血清中やヒト血漿中に存在するもの、内在性または外来性のヒト各種細胞、例えば、ヒト肝臓由来細胞（ＨｅｐＧ２）やヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）等から産出されるもの等を用いることができる。ヒトトロンボポエチンを使用した場合、抗原性の低下、体内動態の改善をもたらす。
本発明で「トロンボポエチン活性」とは、巨核球前駆細胞の増殖、巨核球の成熟、血小板産生を促進する活性をいう。
【００１８】
本発明においてグリコサミノグリカンをトロンボポエチンと併用しない場合、ヒト体内に存在するトロンボポエチンを利用する。この場合、グリコサミノグリカンの使用量としては、ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞増殖促進の場合は、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重が良い。ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球成熟促進の場合は、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重が良い。ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球血小板産生促進の場合は、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重が良い。
【００１９】
グリコサミノグリカンをトロンボポエチンと併用する場合、グリコサミノグリカンの使用量としては、ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞増殖促進の場合は、トロンボポエチン１００μｇ／ｍｌに対して、１〜２００００μｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２００μｇ／ｍｌが良い。ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球成熟促進の場合は、トロンボポエチン１００μｇ／ｍｌに対して、１〜２００００μｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２００μｇ／ｍｌが良い。ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球血小板産生促進の場合は、トロンボポエチン１００μｇ／ｍｌに対して、１〜２００００μｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２００μｇ／ｍｌが良い。
【００２０】
ヒト末梢血由来ＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞の増殖促進、巨核球の成熟促進、血小板産生促進方法としては、例えば、ヒト末梢血から採取したＣＤ３４陽性巨核球前駆細胞を、トロンボポエチン存在下、グリコサミノグリカンを添加し、ｐｌａｓｍａ  ｃｌｏｔ法や軟寒天法で培養する方法を挙げることができる。
【００２１】
本発明の活性化剤は医薬の有効成分として用いることができる。医薬としては、その製剤化の目的に応じて安定化剤、希釈剤、可溶化剤、防腐剤、酸化防止剤、賦形剤および等張化剤等を含有することができる。
【００２２】
本発明の医薬は、注射等の非経口、経肺、経鼻および経口を含めた種々の投与経路に応じた剤形として、溶液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、凍結乾燥製剤等が例示される。
本発明のグリコサミノグリカンを活性成分とする医薬は、活性成分として通常０.０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を、病状、性別および投与経路等に応じて、１日１回〜数回程度に分けて投与することができる。
【００２３】
本発明のグリコサミノグリカンおよびトロンボポエチンを活性成分とする医薬は、活性成分としてグリコサミノグリカン通常０.０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を、トロンボポエチンを通常０.０５μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重を、病状、性別および投与経路等に応じて、１日１回〜数回程度に分けて投与することができる。
【００２４】
本発明によれば、本発明のグリコサミノグリカンあるいはグリコサミノグリカンおよびトロンボポエチンを有効成分とし、血小板の増加を必要とする多数の疾患患者に対する血小板増加剤が提供される。
さらには、制癌剤や免疫抑制剤の投与による化学療法や放射線療法、あるいは骨髄移植（ＢＭＴ）や末梢血幹細胞移植術（ＰＢＳＣＴ）、臍帯血移植（ＣＢＳＣＴ）施行患者における血小板減少症の治療剤が提供される。
【００２５】
さらに、血小板障害、例えば、血小板産生障害や血小板の寿命短縮（血小板破壊の亢進、あるいは血小板消費の亢進）による血小板減少を特徴とする多数の疾患への治療剤が提供される。
例えば、先天性のファンコニ貧血、化学療法や放射線療法に伴う再生不良性貧血、骨髄異型性症候群、急性骨髄性白血病または骨髄移植のような骨髄形成不全による血小板減少症などが挙げられ、このような患者の血小板の回復を促進する為に用いることもできる。
また、トロンボポエチン産生異常による血小板減少症にも有用である。血小板や巨核球の寿命短縮による血小板減少症としては例えば、突発性血小板減少性紫斑病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少症等があり、このような患者の血小板回復促進にも有用である。
【００２６】
さらに、外科手術前に投与して自分の血小板を増加させ、その血小板を自分の手術時に輸血用血小板として用いる、いわゆる自己血小板輸血への用途としても有用である。
さらに、例えば他の化学薬品または医薬品、または治療的処置による一過性の血小板の欠損または損傷によってもたらされた血小板障害の治療にも有用である。そのような患者で新しい無傷の血小板の放出を促進するのに用いることができる。さらにトロンボポエチンの主たる産生臓器の一つが肝臓であることが明らかにされていることから、血小板減少をきたす各種の肝臓病、例えば、胆道閉鎖症、肝臓移植、肝硬変、肝炎等にも投与の臨床応用が期待される。さらに、保存血小板の止血血栓形成能を回復させる用途としても有用である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。また、実施例及び比較例において、各種物性測定は以下の方法で行った。
【００２８】
（１）試料および試薬
本発明では全て以下に示した生化学工業株式会社製のグリコサミノグリカンを使用した。
ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−ｈ：ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ、ＨＡ−ｐ：ｆｒｏｍ  ｐｉｇ  ｓｋｉｎ、ＨＡ−ｒ：ｆｒｏｍ  ｒｏｏｓｔｅｒ  ｃｏｍｂ）、ケラタン硫酸ナトリウム塩（ＫＳ：ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃｏｒｎｅａ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ−Ａ：ｆｒｏｍ  ｗｈａｌｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ、ＣＳ−Ｃ：ｆｒｏｍ  ｓｈａｒｋ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ、ＣＳ−Ｄ：ｆｒｏｍ  ｓｈａｒｋ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ、ＣＳ−Ｅ：ｆｒｏｍ  ｓｑｕｉｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、デルマタン硫酸（ＤＳ：ｆｒｏｍ  ｈｏｇ  ｓｋｉｎ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ：ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）をそれぞれＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔｓ（ＰＢＳ）に５ｍｇ／ｍｌになるように溶解後、メンブランフィルター（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＰ、０.２２μｍ）に通してろ過滅菌し、サンプルとした。
遺伝子組換え型ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）および遺伝子組換え型ヒトｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）は、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ製を使用した。
【００２９】
フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ）の測定に使用した各種蛍光抗体溶液は全て以下に示したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈのモノクローナル抗体を使用した。
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（ＦＩＴＣ−ＣＤ３４）、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４１（ＦＩＴＣ−ＣＤ４１）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４１（ＰＥ−ＣＤ４１）、ＰＥ−ｃｙａｎｉｎ  ５  ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ  ｔａｎｄｅｍ（ＰＣ５）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４５（ＰＣ５−ＣＤ４５）。
【００３０】
（２）ヒト末梢血採取法
末梢血は、赤十字血液センターが採取したＡ型成人４００ｍｌ献血由来血清学的検査済みＢｕｆｆｙ  ｃｏａｔ（核酸検査未確定）の供与を受け用いた。
【００３１】
（３）ＣＤ３４陽性細胞の分離
採取後４８時間以内の末梢血を５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを用いて約２倍に希釈後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）１５ｍｌ上に希釈試料２０ｍｌを積層し、遠心分離（３００ｇ、３０ｍｉｎ）した。Ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔを回収し、５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで洗浄した。末梢血Ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔは希釈せず同様に積層した。得られたｌｉｇｈｔ−ｄｅｎｓｉｔｙ細胞より、ＭＡＣＳ磁気ビーズカラム法（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＣＤ３４陽性細胞を分離・精製した。ｌｉｇｈｔ−ｄｅｎｓｉｔｙ細胞懸濁液にブロッキング試薬、ＣＤ３４抗体を添加し、４℃、１５分間インキュベートした。０.５％ＢＳＡ  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを用いて洗浄遠心（４℃、２５０ｇ、１０ｍｉｎ）、再懸濁後、マイクロビーズを添加し４℃、１５分間インキュベートした。終了後、同様に洗浄、再懸濁し磁気ビーズカラムにかけ非吸着細胞を溶出した。プランジャーを用いて吸着細胞を回収し、ＣＤ３４陽性細胞とした。生細胞数は、トリパンブルーを用い血球算定盤にて計算した。ＣＤ３４細胞陽性率は、フローサイトメーターを用いて測定した。陽性率は、８２〜９２％であった。
【００３２】
（４）造血前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）の測定
ＣＦＵ−Ｍｅｇの測定は、ｈｕｍａｎ  ＡＢ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ（ヒト血漿）を用いたｐｌａｓｍａ  ｃｌｏｔ法もしくは軟寒天法で行った。イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＮＹ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１ｍＭ  ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％  ＭＥＭビタミン混液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％  ＭＥＭｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌアミノ酸（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）、１×１０−３Ｍチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、０.２μｇ／ｍｌＬ−アスパラギン（和光純薬、東京）、７.４μｇ／ｍｌ塩化カルシウム（和光純薬）、０.２％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を加えたＩＭＤＭ混液に、造血因子として５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯおよび５０〜２００μｇ／ｍｌ各種グリコサミノグリカンを加え、さらに２％アプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ、バイエル薬品、大阪）および１５％ヒト血漿を含む培地を調製し、ＣＤ３４陽性細胞を１×１０３個／ｍｌになるように懸濁した。この混合液を２４ｗｅｌｌｓのプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、ＮＪ）に３００μｌ／ｗｅｌｌになるように播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下１１〜１２日間培養した。培養後アセトン・メタノール混液（２：１）で固定、乾燥後、コロニー数測定まで−２０℃で保存した。
【００３３】
（５）巨核球コロニー染色法
固定処理後の各ｗｅｌｌに、０.５％ＢＳＡ−ＰＢＳ４００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で１０分間インキュベートした。０.５％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１００〜１５０倍に希釈調製したＦＩＴＣ−ＣＤ４１抗体溶液２００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、室温遮光下で６０分間インキュベートした。処理後抗体溶液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄後、０.１％クエン酸ナトリウム溶液で希釈調製したｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）溶液（０.３μｇ／ｍｌ）２００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、２分間インキュベートした。ＰＩ溶液を捨て、超純水で２回洗浄後、室温遮光下にて乾燥させた。処理後、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京）下、ＦＩＴＣ陽性細胞３個以上５０個未満の小型コロニーと５０個以上の大型コロニーをそれぞれ計数した。
【００３４】
（６）液体培養法
ＣＤ３４陽性細胞２〜５×１０３個／ｍｌを、ＴＰＯ５０ｎｇ／ｍｌおよび２０％ヒト血漿を含むＩＭＤＭ混液に懸濁し、２４ｗｅｌｌｓプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に５００μｌ／ｗｅｌｌになるように捲き、３７℃、５％ＣＯ２存在下１１〜１２日間培養した。このヒト血漿濃度ではｐｌａｓｍａ  ｃｌｏｔは形成されない。培養後細胞を回収し、フローサイトメーターを用いて表面抗原ならびにＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙの解析を行った。
【００３５】
（７）免疫学的表面抗原の測定法
培養前のＣＤ３４陽性細胞および液体培養後回収された細胞の懸濁液を、ＦＩＴＣ−ＣＤ３４、ＰＥ−ＣＤ４１、ＰＣ５−ＣＤ４５の抗体混合溶液に添加し、暗所室温にて２０分間インキュベート後、５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを用いて洗浄遠心（４℃、２５０ｇ、１０ｍｉｎ）し、０.５％ＢＳＡ−５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液を３５μｍのナイロンメッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に通し、フローサイトメーターを用いて測定した。
【００３６】
（８）ＤＮＡ  Ｐｌｏｉｄｙの測定法
ＤＮＡ  Ｐｌｏｉｄｙの測定は、萩原らの方法（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ.，２６，２２８〜２３５，１９９８）により行った。培養前のＣＤ３４陽性細胞および液体培養後、回収された細胞懸濁液にＦＩＴＣ−ＣＤ４１抗体を加え、室温にて２０分間インキュベートした。０.５％ＢＳＡ  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで洗浄遠心（４℃、２５０ｇ、５ｍｉｎ）し、沈殿をＣＡＴＣＨ  ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、４℃、１時間インキュベートした。終了後、１％パラホルムアルデヒド（和光純薬）−ＣＡＴＣＨ  ｍｅｄｉｕｍ溶液を当量添加し、５分間固定後ＰＢＳで洗浄遠心（４℃、２５０ｇ、５ｍｉｎ）した。沈殿を５０μｇ／ｍｌ  ＰＩ−０.７％クエン酸−０.６％塩化ナトリウム溶液で４℃、１時間処理後、５０μｇ／ｍｌ  ＲＮＡａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、暗所室温にて３０分間インキュベートした。その後、３５μｍのナイロンメッシュに通し、フローサイトメーターを用いて測定した。ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙの分布は、新鮮分離したヒト末梢血由来単核細胞の蛍光強度を２Ｎとして相対評価を行った。コントロール群と処理群間の有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。
【００３７】
実施例１
ＣＦＵ−Ｍｅｇ  由来巨核球コロニー形成に対する各種グリコサミノグリカンの作用
末消血ＣＤ３４陽性細胞の培養において、ＨＡ−ｈ  ５０μｇ／ｍｌの添加で巨核球コロニーはコントロールの１.３倍に増加した（表１）。ＣＳ−Ａは、５０，１００μｇ／ｍｌにおいても、コントロールの約１.３倍に増加させた。さらにＤＳは、いずれの濃度においても総コロニーをコントロールに比べおよそ１.５倍と有意に増加させた。ヒト末消血ＣＤ３４陽性細胞は、臍帯血や骨髄にくらべ成熟した細胞集団であり、その分化増殖能も相対的に低いことが知られている。さらに、造血幹細胞移植後の造血回復に要する時間が、骨髄、臍帯血及び末梢血それぞれを使用した場合で大きく異なっている。これは、造血幹細胞表面に発現している各種接着因子の差に由来することが最近になって明らかにされている。このように標的細胞であるＣＤ３４陽性ＣＦＵ−Ｍｅｇの違いやＧＡＧの親和性との差が、本研究にてＧＡＧの作用の違いになってあらわれた要因の一つである可能性が推察される。
【００３８】
【表１】
2005187435.tif 000003
【００３９】
実施例２
ヒト末消血由来ＣＤ３４陽性細胞の液体培養におけるＤＳの作用
液体培養（９日間）の結果、細胞数は培養開始時の１.２倍に増加したのに対し、ＤＳ添加では約２倍に増加した（表２）。また回収された各細胞に含まれる巨核球数およびＣＦＵ−Ｍｅｇ数は培養開始時のおよそ３７倍、１.３倍にそれぞれ増加し、ＤＳの添加では、およそ６０倍、２.７倍に増加した。
【００４０】
【表２】
2005187435.tif 000004
【００４１】
各細胞のＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙ  の測定から培養開始時に９２.６％の細胞のＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙ  が２Ｎであったのに対し、培養後８Ｎ，１６Ｎ，３２Ｎの高倍数体巨核球が検出され、（表３）、培養によって巨核球が成熟することが示された。培養開始時ほぼ７％程度であった４Ｎ以上の巨核球は、コントロールで４５.８％、ＤＳ添加では５３.６％と、ＤＳに巨核球成熟の増加傾向が認められた。以上の結果から、ＤＳは末梢血ＣＤ３４陽性ＣＦＵ−Ｍｅｇの巨核球への分化増殖を促進すると共に、巨核球の成熟も促進することが明らかとなった。
【００４２】
【表３】
2005187435.tif 000005
【００４３】
実施例３  巨核球からの血小板様粒子放出に対するグリコサミノグリカンの影響
末梢血ＣＤ３４陽性細胞で巨核球コロニー形成促進作用の見られたＨＡ−ｈ，ＣＳ−Ａ，ＤＳについて巨核球からの血小板様粒子放出に対する影響を検討した（図１）。その結果、コロニー形成促進作用の見られたＨＡ−ｈ，ＣＳ−Ａは、コントロールとの間に有意な差は示さなかった。一方ＤＳの添加でおよそ４０％の巨核球に血小板様粒子放出促進作用が認められた。しかし相互の組み合わせによる相乗作用は認められなかった。ＤＳには成熟巨核球からの血小板放出を強く促進することが示された。
【００４４】
以上の結果より、ＴＰＯによるヒト巨核球・血小板造血作用をデルタマン硫酸は優位に促進した。このことは、細胞外マトリックス成分として生体内に広く分布するデルタマン硫酸が、医薬品としての応用的価値を有することを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】巨核球からの血小板様粒子放出に対するグリコサミノグリカンの影響を示すグラフである。
【図１】
2005187435.tif 000006