(57)【要約】      （修正有）【課題】カルシウム動態を容易に制御することが可能な制御分子を提供する、及びカルシウム制御のメカニズムを提供する。【解決手段】本カルシウム制御分子は、以下の(a)又は(b)からなるポリペプチドを含有するカルシウム制御分子。（a ）特定のアミノ酸配列で示される１〜４０６に亘るアミノ酸配列。（ｂ）（a）のアミノ酸の一部が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)からなるポリペプチドを含有するカルシウム制御分子。
（a ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸配列番号１-４０６で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）（a）のアミノ酸の一部が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（a）又は（b）からなる核酸を含む組み換えベクター。
（a）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列からなる核酸。
（b）前記塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項３】
以下の(a)又は(b)からなるポリペプチドを含有するカルシウム制御分子。
（a ） 配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１−４０６で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）（a）のアミノ酸の一部が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項４】
以下の（a）又は（b）からなる核酸を含む組み換えベクター。
（a）配列表の配列番号４に示す、塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列からなる核酸。
（b）前記塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項５】
請求項１又は２項に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項６】
請求項２又は４項記載の前記組み換えベクターで形質転換された培養細胞。
【請求項７】
請求項１又は３項記載のポリペプチドを過剰発現させてCa2+放出能を低下させた請求項６記載の培養細胞。
【請求項８】
請求項１又は３項記載のポリペプチドの発現を抑制させてCa２+放出能を亢進させた請求項６記載の培養細胞。
【請求項９】
請求項５記載の抗体を前記培養細胞内へ導入し、前記抗体と請求項１又は請求項3記載のポリペプチドとを抗原抗体反応させることにより、Ca2+放出能を亢進させた請求項８記載の培養細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定ポリペプチドを含有する制御分子、当該ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換えベクター、及び当該ポリペプチドに対する抗体に関し、特に、小胞体にかかる特定ポリペプチドを含有する制御分子、当該ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換えベクター、及び当該ポリペプチドに対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ca2+は細胞内におけるセカンドメッセンジャーとして多彩な生理機能の調節を担っている。細胞刺激によって誘発される小胞体(ER)からのCa2+の放出は主にイノシトール1,4,5三リン酸受容体(IP3Rs)が活性化され引き起こされる。IP3Rsは3種のサブタイプが存在し、それらの活性がERの微小環境に強く影響をされると考えられているが詳細は不明である。
【０００３】
細胞質ゾルCa2+濃度（[Ca2+]ｃ）は、多くのシグナル形質導入経路の焦点であり、受精から死までの範囲の多様な細胞活動を制御する(Berridge et al.,2003) 。[Ca2+]ｃは、時間、空間、振幅において厳格に制御される。なぜなら細胞は、これらのパラメータから特異的な情報を抽出するからである。Ca2+イオンは、細胞外空間から、又は細胞内Ca２+貯蔵、例えば、小胞体などから細胞質ゾルへ供給されることができる。[Ca２+]ｃ制御に伴う分子の機能障害、特に、小胞体（ER）上のものは、アポトーシス(Orrenius等)、及びハンチントン病、アルツハイマー病などの神経病理学(Mattson and Chan, 2003, Pashen, 2003)の状況に重要な役割を演じると仮定されている。イノシトール１，４，５−三リン酸受容体(IP3Rs)は、Ca２+波及び振幅など[Ca2+]の複雑なパターンの発生に重要な役割を有するERのCa２+放出チャネルである。鳥及び哺乳類において３つのサブタイプ (IP3R１、IP3R2及びIP3R3) がIP3Rに存在する（Sorrentiono等）。IP3R1(Furuichi等)は、脳における優勢なサブタイプであり(Taylor等、1999年)、及びニューロンの展開(Takei等、Xiang等、1999年)、中枢神経系のより高い機能(Matsumoto等、１９９６、Nishiyama等、2000年)、及び人神経病理学（Tand等）において関係する。IP3Rの顕著な特徴は、全構造のおよそ80％を含むIP3結合領域を含む非常に大きい細胞質ゾル領域である(Patel等)。チャネル領域は、6つの膜貫通型領域を含み、ER内腔に存在する3つのループがある。これらの中で、第三の内腔ループは、最も大きいものであり、２つのサブ領域に分けることができる。最初の半分は、（L3V領域）は、サブタイプの中で、かなり不一致な主要な配列を有し(図１b)、微細孔形成領域を含む第2の半分(L３C領域)は、タイプ及び種間において殆ど完全に保存される。面白いことに、各サブタイプのL3V領域の第一配列は、種の間でかなり保存され、この領域は、サブタイプの特異的領域に伴われる。しかしながら,L3V領域の機能は、それが、グリコシル化部位が含まれ、Ca2+へ結合することができることを除いて、ずっと未開発であった(Sienaert等)。
【０００４】
最近、ERの管内腔環境が莫大な量のタンパク質機能を制御することが明白になってきた(Brttifgr,2002年)。
【０００５】
【非特許文献１】Sienaert,I.,DeSmedt,H.,Parys,J.b.,Missiaen,l.,Vanlingen,S.,Sipma,H.,andCasteels,r.(1996).Characterization ofａ cytosolix and a luminal Ca2+ binding site in the type I inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J.Biol. Chem 271, 27005-27012
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、多くの努力が寄与されたが、それがIP3R2の活性をいかに制御するかは不明確なままである。IP3RがER内腔のCa2+濃度によって直接的に制御されているかどうかは、なお議論されている(Caroppo等、2003年)。高いCa2+結合能力をもつCRT、ER内腔レクチンは、IP3誘導Ca2+放出(IICR)を制御するが(Camacho 及びLechleither、1995、Roderick等、1998)、これは、指示した効果ではないようにみえる。なぜなら、CRTは、IP3Rと相互作用せず(Josep等)、CRTは、レクチルCa2+ATPアーゼ（SERCA）２ｂの活性を決定的に制御するからである。分泌顆粒において、クロモグラニンは、IP3RのL3C領域と関連する(Yoo、2000)。試験管内の研究には、クロモグラニンはIP3Rの活性を調節するが、それらの役割は、細胞レベルで特徴付けられていない。
【０００７】
そこで、本発明は、カルシウム動態を容易に制御することが可能な制御分子を提供すること、及びカルシウム制御のメカニズムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、発明者らは、小胞体のカルシウム制御機構に関して検討した結果、本発明のポリペプチドを含有刷るカルシウム制御分子、及び当該ポリペプチドに対する抗体、及び当該ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換えベクターを見出すに至った。
【０００９】
すなわち、本発明のカルシウム制御分子は、以下の(a)又は(b)からなるポリペプチド：（a ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸配列番号１−４０６で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）（a）のアミノ酸の一部が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、を含有することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の組み換えベクターは、以下の（a）又は（b）からなる核酸：（a）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列からなる核酸、
（b）前記塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、を含むことを特徴とする。
【００１１】
また、本発明のカルシウム制御分子は、以下の(a)又は(b)からなるポリペプチド：
（a）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１―４０６で示されるアミノ酸配列、
（b）（a）のアミノ酸の一部が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、を含有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の組み換えベクターは、以下の（a）又は（b）からなる核酸：（a）配列表の配列番号４に示す、塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列からなる核酸、
（b）前記塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、を含有することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の抗体は、前記本発明の請求項１又は２項に記載のポリペプチドに対する抗体であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の培養細胞は、前記本発明の請求項２又は４項記載の前記組み換えベクターで形質転換されたことを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の培養細胞の好ましい実施態様において、請求項１又は３項記載のポリペプチドを過剰発現させてCa2+放出能を低下させたことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の培養細胞の好ましい実施態様において、請求項１又は３項記載のポリペプチドの発現を抑制させてCa2+放出能を亢進させたことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の培養細胞の好ましい実施態様において、請求項５記載の抗体を前記培養細胞内へ導入し、前記抗体と請求項１又は請求項３記載のポリペプチドとを抗原抗体反応させることにより、Ca2+放出能を亢進させたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のカルシウム制御分子によれば、細胞内に導入した場合に、カルシウムの放出量を制御することが可能であるという有利な効果を奏する。
【００１９】
また、本発明の組み換えベクターによれば、上記本発明のカルシウム制御分子を発現することができ、また当該ベクターを培養細胞内に組み込み細胞系を構築することにより、有用なカルシウム制御可能な培養細胞を提供し得るという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のカルシウム制御分子は、以下の(a)又は(b)からなるポリペプチド：（a ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸配列番号１−４０６で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）（a）のアミノ酸の一部が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、を含有する。
また、本発明のカルシウム制御分子は、以下の(a)又は(b)からなるポリペプチド：
（a）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１−４０６で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）（a）のアミノ酸の一部が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、を含有する。
【００２１】
本発明のカルシウム制御分子は、3種(IP3R1、IP3R2、IP3R3)あるイノシトール1,4,5三リン酸受容体のうち IP3R１に特異的に結合することにより、IR3R1を不活性化し、ひいては、カルシウム放出を抑制することが可能である。すなわち、本発明は、本発明者らが、ERp44とIP3R1との機能的相互作用において、IP3R１のチャネル活性がpH、還元状態、及びERp44の効力による[Ca2+]ERによって調節されていることを見出したことによる。
【００２２】
また、本発明の組み換えベクターは、以下の（a）又は（b）からなる核酸：（a）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列からなる核酸、
（b）前記塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、を含む。
【００２３】
さらに、本発明の組み換えベクターは、以下の（a）又は（b）からなる核酸：（a）配列表の配列番号４に示す、塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列からなる核酸、
（b）前記塩基配列番号１−１２２１で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、を含有する。前記核酸は、本発明のカルシウム制御分子に含まれるポリペプチドをコードする核酸である。例えば、塩基配列番号１７２のTがAに置換された核酸、及びその結果として、ポリペプチドの５８番目のシステインがセリンに置換した場合などにおいてもカルシウム制御可能であることが判明している。
【００２４】
当該核酸を含むベクターを、培養細胞に導入して形質転換させると、本発明のカルシウム制御分子に含まれるポリプエチドを発現させることができ、当該培養細胞は、分子生物学、医学、薬学等の分野において基本的な研究材料と成り得ることから当該分野において多大な貢献となる利点を有する。
【００２５】
次に、上記核酸の取得方法について、説明すると以下のようである。上記核酸は、たとえば、生後2週齢のマウス小脳から、Rneasy Mini Kit(キアゲン社)などのキットを用いて、全RNAを抽出した後、逆転写酵素を用いてｃDNAを合成することができる。適当な塩基配列、例えば塩基配列番号１〜２１と１２００〜１２２１を含む人工合成DNAをプライマーとしてｃDNAを鋳型としてPCRを行なうことによって、全長ERp44をコードする核酸を得ることができる。
また、ポリペプチドの取得について、一例を挙げて説明すれば、以下のようである。
上記ERp44の核酸を、例えば、glutachione S-transferase(GST)又はmaltose binding protein (MBP)をコードする塩基配列を含むベクターに組み込む。それらのベクターを大腸菌などの宿主を用いて形質転換させた後、イソプロピルチオガラクトシド刺激によって大腸菌内にGST又はMBP融合ERp44のポリペプチド(GST-ERp44、MBP-ERp44)を大量発現させることができる。超音波処理によって大腸菌を破壊した後、Glutachione Sepharose 又はAmylose Resin によってGST-ERp44、MBP-ERp44をそれぞれ特異的に結合させ、glutachione 溶液又はmaltose 溶液によって特異的に溶出することができる。最後に、溶液中に含まれるglutachione 又はmaltose を限外濾過によって除き、GST-ERp44、MBP-ERp44を精製、ポリペプチドを取得することができる。
【００２６】
このようにして得られる核酸は、通常遺伝子の発現に必須であるプロモーター領域を持たないので、当該核酸の発現にはプロモーターDNAを結合する必要がある。当該プロモーターとして、例えば、ベクタ-プラスミド中のプロモーターを使用することができる。当該プロモーターを有するベクターとして、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを有するpcDNA3.1を挙げることができる。
【００２７】
また、得られた組み換えベクターを用いて培養細胞を形質転換させることができる。形質転換された培養細胞は、上記ポリペプチドを過剰発現させてCa2+放出能を低下させたり、或いは発現を抑制してCa2+放出能を亢進させること可能である。
【００２８】
また、本発明の抗体は、前記本発明の請求項１又は２項に記載のポリペプチドに対する抗体である。当該抗体によれば、当該抗体を細胞内へ導入することにより、ERp44と結合し、その機能を失わせることが可能であり、ひいては、細胞内のCa2+濃度を制御することが可能であるという有利な効果を有する。
【００２９】
また、本発明の培養細胞の好ましい実施態様において、請求項５記載の抗体を前記培養細胞内へ導入し、前記抗体と請求項１又は請求項３記載のポリペプチドとを抗原抗体反応させることにより、Ca2+放出能を亢進させたことができる。
【００３０】
ERp44とIP3Rとの結合は、好ましくは、DDTなどの還元剤の存在下で促進させることができる。また、ERp44とIP3Rとの結合は、酸性(約pH5.2)又はDTTが存在する環境下で、中世、例えば、pH7.5近傍で促進させることができる。
【００３１】
さらに、ERp44とIP3Rとの結合は、好ましくは、IP3R1のシステイン残基に依存的である。すなわち、IP3R1のシステイン残基は、ERp44によるIP3R１活性の抑制に重要な役割を演じ、当該システイン残基の有無によって、Ca2+の放出、抑制を制御することができる。
【００３２】
さらにまた、ERp44は、低Ca２+濃度でIP3R1を不活性化するので、このようなER内腔のCa２+濃度も、Ca2+の放出、抑制を制御する因子と成り得る。
【００３３】
このように、ERp44とIP3Rとの結合は、種々の因子、すなわち、還元剤、ｐH、システイン残基、Ca２+濃度などによって、制御されており、ひいては、当該結合が、Ca２+の放出、抑制を制御している。このメカニズムを利用すれば、カルシウム動態を制御した培養細胞を提供することができ、医学、薬学等の分野に貢献することができる。
【実施例】
【００３４】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能であることは言うまでもない。
【００３５】
まず、その分子機構をあきらかにするため、IP3Rsの3種あるER内腔ドメインの中でサブタイプ間の相同性が低い領域(L3V)に着目し、そこに結合するタンパク質を探索した。イムノグロブリンFcに融合した各サブタイプIP3RsのL3Vタンパク質を精製し、アフィニテーカラムを作製した。生後２週齢マウスの小脳マイクロソーム画分からIP3R1 L3V(1L3V)特異的に結合する約40 kDaのタンパク質を見いだした。これを質量分析し、その部分アミノ酸配列を決定したところERp44に相同した。ERp44はredoxタンパク質であるthioredoxin(TRX)に相同性を有するER内腔タンパク質であった。免疫沈降法によってERp44がIP3R1に結合することを確認した。更に詳細にERp44とIP3R1の結合について調べる為に、大腸菌で発現させ精製したglutathione S-transferase(GST)融合L3V (GST-L3V) とmaltose binding protein(MBP)融合ERp44(MBP-ERp44)を用いてGST pulldown実験を行った。その結果、Ca2+を含む酸性バッファーにおいてMBP-ERp44と1L3Vが直接結合することがわかった。次に、ERp44と1L3Vが還元剤dithiothreitol(DTT)を含む中性バッファーで結合することがわかった。また、その結合は1L3Vのシステイン残基そしてCa2+濃度依存的であった。更に、MBP-ERp44が３種のサブタイプのなかでIP3R1にのみ結合することを確認した。これら結合実験はERp44がERのredox stateとCa2+濃度を感受しIP3R1に特異的に結合することを示唆している。
【００３６】
次に、ERp44-IP3R1の結合がin vivoにおいてチャンネル活性にどのような影響を与えるかを、様々な細胞を用いたCa2+イメージング実験によって調べた。赤色蛍光タンパク質(RFP)融合ERp44(RFP-ERp44)を細胞に発現させ、IP3産生のアゴニストATP刺激を行った。RFP-ERp44を発現しているHeLa細胞(サブタイプの中でIP3R1が優勢的に発現)ではIP3-induced Ca2+ release(IICR)が著しく減少していた。
【００３７】
次にCOS-7細胞(IP3R1がほとんど発現していない)では、RFP-ERp44の発現はIICRに影響を与えなかった。これらのHeLa, COS-7細胞を用いたCa2+イメージングの結果とin vitroの結合実験は、ERp44が全てのサブタイプのなかでIP3R1にのみ結合し、その活性を抑制することを強く示唆している。
更にこれを確かめるため、ニワトリBリンパ球細胞種DT40を用いた。この細胞の性質を利用して作製されたIP3R全てのサブタイプを欠損させた細胞(DT40-TKO細胞)とIP3R1のみを欠損させたDT40-1KO細胞を作製した。更に、DT40-TKO細胞にstableにIP3R1を発現させた細胞(DT40-KMN60)を作製した。IgM抗体でBCRをクロスリンク後のIICRを調べた。RFP-ERp44を発現している細胞ではIICRは著しく減少したが、DT40-1KO細胞ではIICRへの影響は観察されなかった。これにより、ERp44がIP3R2とIP3R3ではなくIP3R1 を介したIICRを抑制することが示された。
【００３８】
更に、内在性ERp44の機能を調べるために、RNA interference (RNAi)を採用し実験を行った。ERp44をノックダウンしたHeLa細胞ではATP刺激によるIICRを引き起こす細胞の割合、Ca2+ releaseの強さ共に顕著に増大した。一方、COS-7細胞では、ERp44をノックダウンは、IICRに影響を与えなかった。これらloss-of-functionの実験はERp44がIP3R2とIP3R3ではなくIP3R1 を介したIP3-induced Ca2+ releaseを抑制したことを強く示している。またこの結果は、 gain-of-function実験結果を支持する。
【００３９】
更にRNAiによる結果を確認するため、ERp44ノックダウン細胞にERp44を再発現した。ERp44の発現はIICRを顕著に減少させた。これらの結果をもとに、ERp44がIP3R1を抑制すると結論を下した。また、この再発現の系を用いてERp44のどの領域がIP3R1の抑制に重要かを調べた。先ず、ERp44の236-345番目のアミノ酸がIP3R1 binding domain (IPBD) であることを見いだした。しかし、用いた変異体は、驚くべきことにIPBDにおいてさえ、全長ERp44ほどIP3R1を抑制しなかった。これらの結果はIP3R1を抑制には結合領域だけでなくその他の領域も必要であることを示唆している。次に、IP3R1のシステイン残基の重要性を調べた。COS-7細胞に発現させたIP3R1のシステイン変異体とERp44の結合は顕著に低下した。その生理的意義を調べるため、DT40-TKOにIP3R1のシステイン変異体とRFP-ERp44を発現、IgM抗体で刺激したところIICRの抑制は観察されなかった。この結果によりIP3R1のシステイン残基がERp44によるIP3R1活性の抑制に必須であることがわかった。
【００４０】
更に、ERp44のIP3R1との結合がチャンネル活性にどのような影響を与えるかを調べる為に、人工脂質ニ重膜を用いたシングルチャンネルレベルのIP3R1活性の測定を行った。このin vitro再構成系を用いることで厳密にER内腔のCa2+濃度とredox 状態を制御し、ERp44のIP3R1活性への影響を検証することができる。その結果DTT存在下かつ低Ca2+濃度でERp44はIP3R1を不活性化した。この結果は明確にERp44がERのredox stateとCa2+濃度を感受しIP3R1を特異的に抑制することを示している。
【００４１】
これらの事実から、分子生物、生化学、細胞生物学、電気生理学的手法を用いて、全く新しいCa2 signaling 制御機構を見いだされた。
【００４２】
以下詳細に説明する。
イノシトール1,4,5三リン酸受容体(IP3Rs)は、媒体CA2+が小胞体(EP)から抽出され、多くの生物学的プロセス及び疾患に関与する内部チャネルタンパク質である。IP3Rは、種々の細胞質ゾルタンパク質によって識別して統制されているが、ER内腔タンパク質による統制は、かなり未解決のままである。ここに、当方は、ERp44、すなわち、チオレドキシンファミリーのER内腔タンパク質は、IP3Rの第3の内腔ループ(IP3R1)と直接的に相互作用し、相互作用は、pH、還元状態、及び内腔Ca2+濃度に依存することを見出した。脂質二重層系を使用したIP3R1のCa2+イメージ実験及びシングルチャネル記録は、IP3R1のERp44による直接阻害を明確に証明した。これらの結果は、ERp44はER内腔のミクロ環境であることが分かり、その後、それは、IP3R1の制御によって細胞質ゾルCa2+濃度へ変えられることを強く示唆した。
【００４３】
導入
本実施例において、IP3RのER内腔からのタイプ特異的制御の分子メカニズムをあきらかにするために、当方は、IP3RのL3V領域の結合タンパク質を調査した。当方は、その後、IP3R１のL3V領域との特異的結合タンパク質として、酸化タンパク質の折り畳みにおいて以前に関連したチオレドキシンファミリーのタンパク質、ERp44を同定した。ERp44とIP3R1との間の機能的相互作用の独特の特徴は、IP3R1のチャネル活性が、pH、還元状態、及びERp44の効力による[Ca2+]ERによって調節されていることを示唆する。
【００４４】
結論
IP3R1のL3V領域の結合タンパク質としてのERp44の同定
当方は、IP3RのL3V領域へ結合するタンパク質を見出すことを目的とした。細胞質ゾルのIP3R結合タンパク質の同定に成功するイースト２ハイブリッドスクリーニングは、この目的に適当とは考えられない。なぜなら、核の化学環境は、ER内腔のものから完全にことなっているからである。当方は、それゆえ、分泌シグナル及びヒト免疫グロブリンFc領域が、それぞれ、Ｎ及びＣ末端へ融合するl3V-Fcを作った。このタンパク質は、２９３Ｔ細胞において発現し、培地から集められ、アフィニティー樹脂を作るのに利用された。まず、当方は、中性緩衝液(データに示さず、pH7.5)において可溶化したマウス小脳ミクロソーム分画からのいずれの１L3V−Fc相互作用タンパク質の検出にも失敗した。その後、当方は、クロモグラニンＡが、この条件下でのみIP3RのL3V領域へ結合したとき、酸性条件下(Ph5.2)で同様の実験を行なった。その結果、当方は、１L3VFcへ結合したが、対照例Fcへは結合しない２つのタンパク質を同定した(図１Ｃ)。当方は、これらのバンドを摘出して、それらをマススペクトロメトリーによって分析した。2つのペプチド配列は、HPLLHIQK  及び  QFVFDLHSGK  を44kDaタンパク質から得て(図１Ｃ)、このタンパク質は、ERp44であることを示した(Anelli等)。85kDaタンパク質をアコニターゼ、ミトコンドリアタンパク質と同定し、この実験においてさらに特徴付けなかった。同じ手順を使用して、当方は、マウス小脳からIP3R2又はIP3R3(それぞれ、２L3V,又は３L3V)のL3領域用の結合タンパク質も調べたが、これまでいずれも同定できなかった。
【００４５】
ERｐ44は、チオレドキシン（TRX）ファミリーのER内腔タンパク質は、シグナルペプチド（SP）、TRXホモロジー領域（THD）、及びER保持シグナル、RDEL(図１Ｄ)（Anelli等、2002）。ERp44は、マウス組織において広範に発現する。(図１)。ヘマグルチニン（Haemagglutinin）Ａエピトープ（HA）タグERp44（Anelli等、2002）を単一又はGreen 蛍光タンパク質を有するＮ末端IP3R1融合のいずれかのCOS−７細胞において発現させた。HA-Erp44を拡散したネットワークとして観察し、ERp44は、ERにおけるIP3R1と同じ場所に位置したことを示した。IP3R1とERp44との相互作用を確認するために、HA-ERp44をCOS-7細胞において発現した。当方は、全細胞溶解物を酸性緩衝液で調整し（関連が図１Ｃに示す実験において観察される）たとき、最初にHA-ERp44とIP3R1の両方が、おそらく、リソソームプロテアーゼによって大幅に分解されるのを見出した。これを回避するために、感染させた細胞を膜透過性架橋（DSP）、及び可溶化及び免疫沈降を中性緩衝液において行なった。この状況下、抗IP3R1抗体は、HA-ERp44と共沈降し、相互に、抗HA抗体はIP3R1と共沈降し(図１Ｆ)、ERp44とIP3R1は、感染したCOS-7細胞において同じ複合体であることを示した。内在的な関係を調べるために、免疫沈降を相対的に高レベルでIP3R１を発現した非感染のHeLa細胞の全細胞溶解物から行なった。ERp44とIP3R1との間の共沈降は,明確に観察され、それらは、生体内で同じ複合体にあることを示した(図１Ｇ)。
【００４６】
ERp44は、状況依存方法において、特異的にIP3R1と相互作用するが、IP3R2又はIP3R3とは相互作用しない。
【００４７】
ERp44とIP3Rとの関係をさらに特徴づけるために、当方は、次に、一連のプル-ダウン実験を行なった。グルタチオン（GSH）S-トランスフェラーゼ（GST）及びマルトース結合タンパク質（MBP）をそれぞれ、１L3V及びERp44へ融合させて、これらのタンパク質をE.Coleにおいて発現させて、精製した。酸性条件(pH5.2)、MBP-ERp44は、MBP単独ではないが、GSTではなくGST-1L3Vと相互作用する(図２Ｂ)。しかしながら、相互作用は中性(pH7.2)状況下で(データに示さず)観察されなかった。ER内腔のpHは、文献の大部分において中性近傍と評価されている。（Kim等、1998年、Foyouzi-Youssefi等、2000年）当方は、ある因子が当方のプローダウン測定において見逃されたかもしれないと理由付けて、次に、1L3V及びERp44が中性pHで相互作用する状況下で行なった。
【００４８】
ERp44中のTHDの存在は、このタンパク質の機能が還元依存性であることを示唆し、ERp44は、多くのタンパク質と混合したジスルフィド結合を形成すると報告した(Anelli等、2003、Anelli等、2002)。それゆえ、当方は、１L3VとERp44との間の相互作用が、還元状態に依存しているかどうか調べた。非還元状態下でのSDS-PAGE上のそれらのマイグレーションパターンによって判断できるように、還元剤、ジチオスレイトール（DTT）の不存在下、GST-１L3VとERp44とは、両方とも大部分が、酸化型であった。これらの酸化型間の相互作用は、pH7.5において観察されない(図２Ｃ,レーン１、中間パネル)DTTの添加は、GST-1L3V及びERp44をかなり減少させ、これらタンパク質の還元型は、互いにpH7.5で相互作用することができることを見出した(図２Ｃ,レーン２)。この相互作用は、混合したジスルフィド結合によっても引き起こされないことも明らかにされた。なぜなら、高分子量バンド(すなわち、共有結合したGST-1l3V-ERp44)が観察されなかったからである(データに示さず)。タンパク質が本相互作用に対して重要である還元状態を調べるために、これらのタンパク質残基を、突然変異させた。１L3Vに関して、Cys2496、Cys2504、又はCys2527のいずれかの突然変異は、組み換えERp44への減少した結合を導いた(図２Ｄ)。対照的に、ERp44システイン突然変異体のどれもそれらのGST-1l3Vへの結合には影響しなかった(図２)。これらの結果は、ERp44ではなく、１L3Vの総てのシステイン残基が、これらのタンパク質の相互作用に対して重要であることを示唆した。共に、１L3Vのフリーチオール基が、１L3V及びERp44との相互作用に対して要求されることを強く示唆した。
【００４９】
当方は、ERp44と1L3Vとの間の相互作用が、Ca2+濃度に依存しているかどうかも調べた。図２Ｅに示すように、Ca2+濃度が、100μMより高くなるとき、相互作用が減少した。[Ca2+]ERを、休眠状態下、200μMと１mMとの間であると粗く見積もり（Meldolesi and Pozzan,1998年）、ERp44と1L3Vとの間の相互作用は、休眠状態で非常に強くはなく、[Ca2+]ERが減少したとき（すなわち、Ca2+放出後）高められることを示唆した。
【００５０】
上記知見は、ERp44とIP3R1との相互作用が還元及び/又は低[Ca2+]ER状態を好むことを示唆した。これを生体内で調べるために、GFP-IP3R1及びHA-ERp44を発現するCOS−７細胞を5mMDTTで処理し、その後、HA-ERp44を免疫沈降させた。(図2f)。抗HA抗体で沈降させたHA-ERp44は、未知理由のために還元条件下、常に減少し、HA-ERp44と共沈降したGFP-IP3R1はかなり増加した（図２Ｆ、中間パネル）。次いで、HA-ERp44及びGFP-IP3R1を発現するCOS-7細胞を、10μMATP(閾値濃度)で刺激した。この処理は、およそ2倍でHA-ERp44と共沈降したGFP-IP3R1を増加させて、低[Ca2+]ERは、IP3R1とERp44との間の関係を増大させた。これらの結果は、ER内腔環境の劇的な変化は、IP3R1とERp44との相互作用を制御していることを示唆する。
【００５１】
ついに、当方は、MBP-ERp44は、GST-1L３Vと相互作用するが、GST-２L3V、GST-3L3Vとはいずれも相互作用しないことを見出し、それは、最初のL3V−Fcを使用したスクリーニングの結果と一致した(図１)。総合すれば、サブタイプ特異的、ER内腔環境依存法において、ERp44は直接的にIP3R1のL3V領域と相互作用すると結論付けられた。
【００５２】
ERp44の発現は、IP3R1によってIICRを阻害する。
ERp44のIP3R1への結合の機能的結果を調べるために、当方は、蛍光Ca2+指標fura-2を使用して、シングルセルCa2+イメージ実験を行なった。最初に、当方は、IP3R1が全IP3Rの約半分を構成するHela細胞を使用し、IP3R1とERp44との間の関係を観察した(図１Ｇ)。レッド蛍光タンパク質(RFP)標識ERp44(RFP-ERp44)又はER保持シグナルを有するRFP（RFP-RDEL、−の対照例）をHeLa細胞において発現させ、それらを通常のCa2+フリー培地において、ATPで刺激した。以下の実験において、感染(RFPシグナル+)細胞と非感染（RFPシグナル-）細胞の間の同様の容器におけるCa2+シグナルを比較した。非感染細胞において、ATP（３μM）は、小さい変動で時折、シングルCa2+の短期的出現を典型的に引き起こした。(図３Ａ黒)。RFP−RDELを発現するHeLa細胞は、区別不能な応答を示した(図３Ａ,赤)。他方、RFP-ERp44発現HeLa細胞は、典型的に顕著により小さいCa2+出現を示した。平均して、RFP-ERp44発現細胞におけるピーク振幅は、かなり減少した(非感染細胞のそれの69.3±1.8％、図３Ｃ)。これは、thapsigargin（Tg,SERCA阻害剤）によって励起された-のCa2+リークが未電荷であったので、ER中の放出可能なCa2+の内容物の減少のためではなかった(図３Ｄ,３Ｅ)。これらの結果は、HeLa細胞におけるCa2+貯蔵キャパシティーに影響を与えることなしに、ERp44は、IICRを阻害することを示した。
【００５３】
当方は、次に、事実上IP3R1上で発現するCOS-7細胞におけるERp44の過剰発現の影響を調べた(Boehning and Joseph, 2000, Hattori 等,2004)。非感染細胞及びRFP-RDEL発現細胞において、1μMATPでの刺激は、CA2+出現を誘発させた。驚くことに、RFP-ERp44の過剰発現は、出現の振幅に影響しなかった(図３Ｇ)。REP-RDEL及びRFP-ERp44発現細胞における平均振幅は、非感染細胞におけるものの、それぞれ98.6±0.7％及び104±2.5％であった（ｎ＝６０及び８０、図３Ｈ）。細胞をより弱い刺激(0.3μMATP)(データに示さず)で刺激したときもRFP-ERp44過剰発現の影響は観察されなかった。これらの結果は、ERp44がCOS-7細胞におけるIICRへ影響を及ぼさないことを示した。上記結果は、ERp44は、IP3R1を阻害するが、IP3R2又はIP3R3を阻害しないことを示唆した。このことをさらに確認するために、当方は、同じ親細胞株DT40から誘導した２つ以上の細胞株、DT40-KMN60およびDT40−１KOを使用した。DT40-KMN60は、総ての遺伝子を分裂させるDT40細胞の背景上の安定感染マウスIP3R1遺伝子によって作られる(DT40−TKO,Sugawara等、1997年)。DT40−１KO細胞は、IP2R2及びIP3R3を発現したが。IP3R1を発現しなかった。なぜなら、IP3R1の遺伝子は、分裂されたからである。(Sugawara等、1997年)。Ｂ細胞抗原受容体（BCR）の架橋は、PLC-γを活性化し、DT40細胞中にIP3を生産した。DT40-KMN60細胞において、RFP-RDELの発現は、非感染細胞と比較してBCR誘発Ca2+放出へ影響を及ぼさなかった。(96±2.9％)。他方、RFP-ERp44の発現は、DT40−KMN60細胞におけるBCR誘発Ca2+放出のピーク振幅を減少させた(60.6±9.6％、図３Ｉ及び３Ｋ)。これらの細胞においてTg-誘発Ca2+における減少はなかった。(図３Ｌ及び３Ｍ)。DT４０−１KO細胞において、他方、RFP-ERp44の発現は、BCR誘発Ca2+放出における多少の効果を有した(図３J及び３K)。これらの結果は、ERp44がIP3R1を阻害するが、IP3R2もIP3R3も阻害しないことを強く証明する。
【００５４】
IP3Rの機能は、DT40細胞におけるBCR誘発アポトーシスに対して重要であることが知られている。(Sugawara等、1997年)ので、当方は、次に、ERp44の発現がそれに影響を及ぼすかどうか調べた。RFP-RDELではなく、REP-ERp44発現は、DT40-KMN60細胞におけるアポトーシスを強く阻害した(図３Ｎ及び３Ｏ)。他方、この影響は、DT40-1KO細胞において観察されなかった。(図３Ｏ)。これらの結果は、IP3R1上のERp44によるモジュレーションは、例えばアポトーシスなどの細胞機能へ影響を及ぼすことをほのめかしている。
【００５５】
ERp44の特異的ノックダウンは、IP3R1によるIICRの増大を生じさせる。
内因性ERp44の役割を調査するために、当方は、次に、RNAインタフェランス技術を使用した。当方は、それぞれ、ヒトERp44のオープンリーデングフレーム(4ERp44-ORF)又は3‘非感染領域（siERp44−３U）のいずれかをターゲットとする2つの異なる小さいインタフェアリングRNA（siRNA）配列を調べた。ネガティブ対照例として、当方は、これらのsiRNAにおいて３つの点変異を導入した(si対照例―ORF又はsiERp44−３U,それぞれ)。ウエスタン分析は、siERp44-ORF及びsiERp44-3Uの両方を、HeLa及びCOS-7細胞におけるアクチン、IP3R1及びIP3R3のそれを影響することなく、ERp44の発現を減少させることを明らかにした。不幸にも、ニワトリERp44をターゲットとするsiRNAは、DT40細胞のERp44発現を減少させなかった(データ示さず)。
【００５６】
SiRNA−感染HeLa細胞を、1,3,10μMATPで刺激した。Si対照例-3U-感染細胞において、1μMATPは、識別可能なCa2+シグナルを殆ど再現しない(図４Ｂ及び４Ｃ、黒及びバー)。他方、応答細胞の数は、siERp44-3U感染細胞において、およそ５倍より高くなった。3μMATPのその後の刺激は、対照例細胞の46.9±3.1％のIICRを誘発し、細胞の90.3±2.4％が、siERp44 −3Uへ感染した(図４Ｂ及び4Ｃ)。10μM  ATPで刺激したとき、殆どの細胞は、いずれかの調整物に応答した(それぞれ、96.9±1.9％及び99.6±0.4％、図４Ｃ)。平均ピーク振幅は、総てのATP濃度の下、si対照例―３U感染細胞におけるものよりsiERp44−３U-感染細胞におけるものがより高かった。(図４Ｄ)。ERp44のノックダウンは、Tgによって誘発されたCa2+リークに影響を及ぼさなかった(データに示さず)。これらの結果は、内因性ERp44は、HeLa細胞におけるIICRを消極的に統制していることを示唆した。
【００５７】
次に、当方は、COS-7細胞において同様の実験を行なった。COS-7細胞がIP3R1を発現しないので、当方の予測は、ERp44のノックダウンは、この細胞株におけるIICRへの影響はなく、それは実際にこの場合であった。(図４Ｅ−４Ｇ)。これらの結果は、ERp44がIP3R1のみを阻害するという考えを示唆した。
ERp44ノックダウンが特異的であるというさらなる確認のために、当方は、siRNA感染細胞におけるERp44の発現を復元した。HeLa細胞は、si対照例―３U又はsiERp44-3Uのいずれかで感染させて、24時間後、細胞をRFP-RDEL又はRFP-ERp44用の発現ベクターで感染させた。SiERp44-3Uは、RFP-ERp44用の発現ベクターにない3’UTR配列を標的としたので、RFP-ERp44のものではなく、内因性ERp44の発現は、siERp44-3Uによって抑制された(図５Ａ,レーン４)。これらの処理後、細胞を３μMATPで刺激した。SiERp44-3U予備処理細胞において（すなわち、IICRの振幅が増加した）、RFP-RDELの回復は、IICRに対して多少の影響を及ぼす一方、RFP-ERp44のものは、かなりそれを抑制した。(図５Ｃ)、ともに、ERp44は特異的にIP3R1を阻害することを結論付けた。
【００５８】
更に、この系は、ERp44の領域が、IICRの阻害に重要であるという評価を可能とした。まず、ERp44の最小の1l3V相互作用領域を試験管内で決定した。(図５Ｄ及び５Ｅ)。ERp44の全長(N末端シグナル配列なしの)又はサブフラグメントをMBPと融合し、GST-1L3Vとのそれらの相互作用は、DTTの存在下、中性pHにおいてテストした。野生型MBP-ERp44及びMBO-ERp44-a（Ｃ末端半分）は、GST-1L3Vと強く相互作用し(図５Ｅ,それぞれレーン２及び３)、THDは、相互作用に不要であることを示唆した。かなり保存されたグルタミン酸塩リッチ領域を含むが、ヒスチジンリッチ領域を含まないMBP-ERp44-bも、幾分弱いが、GST-1L3Vへ結合する一方(図５Ｅ,レーン４)、他のテストされた突然変異体は、結合しなかった。(図５Ｅ,それぞれレーン５−７)。これらの結果は、ERp44のアミノ酸残基236-345は、１L3V（以後、IP3R1結合侶域という）（IPBD）へ結合するのに必要かつ十分であった。IPBDの主要配列は、データベースでいずれの配列にも類似していないが、種間ではよく保存されている。(図３)。
【００５９】
その後、siERp44−３Uで予め処理したHeLa細胞は、RFP標的ERp44突然変異体で感染させて、IICRを阻害するための能力を調べた(図５Ｆ)。IPBDではなく、THDを保持するRFP-ERp44−ｆは、どの影響も及ぼさない。興味深いことに、IPBDを保持するRFP-ERp44-aもRFP-ERp44-b-RDELのいずれもIICRを阻害せず、(図５Ｆ,レーン５及び６)、IPBD単独は、IP3R1の阻害に十分ではないことを示した。さらに、他のタンパク質との混合したジスルフィド結合の形成に対して重要なシステイン残基を突然変異させたREP-ERp44-c58S（Anelli等、2003）のみが、RFP-RDEL感染細胞と比較して(図５Ｆ,３レーン)、僅かにCa2+応答を阻害した(77.1±4.5％、ｎ=82,統計的に重要ではない)。これらの結果は、THD（Cｙｓ５８を含む）及びIPBDの両方が、IP3F1活性を阻害するのに必要であることを指示した。
１L3Vにおけるシステイン残基は、ERp44によるIP3R1チャネル活性の阻害に重要な役割を有する。
【００６０】
１L３Vのシステイン残基の重要性を調べるために、当方は、L3V領域におけるシステイン残基が単独又は組み合わせのいずれかで、セリンと置換するGFP-IP3R1用の発現ベクターを構築した。各ベクターは、IP3R不完全DT40-TKO細胞へ感染させて、そのIICR活性をチェックした。結果として、チャネルコア領域へ近接するc2527の置換は、IP3R1のチャネル活性を阻害し(図６Ａ)、それゆえこの突然変異体はさらに使用されないことがあきらかとなった。C2496及びc2504における突然変異は、チャネル活性に影響を与えなかった(図６Ａ)。これらのシステイン突然変異体とERp44との間の相互作用は、かなり減少し（図６Ｂ）、組み換えタンパク質を使用した結果と一致した(図２Ｄ)。これらの突然変異体は、RFP-RDEL又はRFP-ERp44のいずれかでDT40−TKO細胞へ共に感染させて、シングル細胞Ca2+画像実験を行なった。GFP-IP3R1Iを経たIICR(すなわち、野生型)は、RFP-RDELではなく、RFP−ERp44の共発現によって抑制された。(図６Ｃ,図６Ｆ)。驚くことに、ERp44による阻害は、GFP-IP3R1のc2496又はc2504の置換によって殆ど完全に撤回された。(それぞれ、図６Ｄ及び６Ｅ、及び図６Ｆ)。これは、これらの突然変異体間の親和性を減少させることによって説明することができるか、あるいは、両方のシステイン残基が、ERp44の両方のIPBD及びCys58がIP3R1の阻害を要求するという事実によって指示されるERp44によって阻害が要求される可能性がある(図５Ｆ)。いずれにしても、これあの結果は、１L3Vにおけるフリーチオール基がERp44の阻害に対して重要であることを明確に証明する。
ERp44は、脂質二重層系において、IP3R1のチャネル活性を不活性化する。
【００６１】
ERp44はIP3R1が阻害することを明確に示すために、当方は、IP3Rの99％以上がIP3R1であるマウス小脳ミクロソームで融合した人口脂質二重層において記録するシングルチャネル電流を実行した。当方は、まず、３mMDTTを含む内腔サイド溶液中のGST-１L3VとMBP-ERp44との相互作用を確認した。(図７Ａ)。IP3R1活性は、トランス(内腔)区画において3mMDTTの存在下電荷キャリアとしてBa2+で記録された。この条件下、IP3R1は、6.4μMIP3のシス（細胞質ゾル）区画（データに示さず）への添加によって最大限活性化された。MBP（ネガティブコントロール）の内腔区画への添加は、IP3R1活性に対して影響を及ぼさなかった。(データ示さず)。対照的に、MBP-ERp44の添加は、投与依存方法においてチャネル活性の阻害を生じた(図７Ｂ)。シングルチャネル開口の可能性が、1.0μM  MBP-ERｐ４４のIC50、及び2.3のヒル係数(図7Ｃ)で減少し、少なくとも2つのERp44分子のIP3R1ヘテロテトラマーへの結合が不活性化に要求されることを示唆した。非常に興味深いことに、この不活性化は、DTTの不存在下で観察されず(データを示さず)、さらに、１L3Vの遊離チオール基が、ERp44の阻害に巻き込まれるという考えを示唆した。IP3R1の平均開口時間、電流振幅、及びコンダクタンスが、MBP-ERp44の添加によって影響されず(データ示さず)、ERp44の機能は、その開口状態の特性に影響を与えるよりむしろIP3R1の近接した状態を保持することであることが明らかにされた。
【００６２】
ディスカッション
この研究において、当方は、ERp44、ER内腔タンパク質がIP3R1のL3V領域と特異的に相互作用し、それによって、そのチャネル活性を阻害することを見出した。この機能的相互作用は、ｐH、還元状態、及び[Ca2+]ERに依存する。これは、ER内腔におけるIP3Rのネガティブ制御の最初の例であり、IP3Rが管内腔環境によって特異的かつ一時的に制御させる考えを具体化する。
【００６３】
ｐH、還元状態、及び[Ca2+]ERのなかで、どの因子が、ERp44IP3R1相互作用の制御において最も優勢なのか(又は重要なのか)？この問題は、いかにERの管内腔環境が、細胞質ゾル又は細胞外条件によって制御及び/又は変化させられかに関係する。多くの研究は、ER管内腔環境を、証明するために行なってきたが、それらか引き出された結果は、必ずしも必要な構成ではない。ｐHに関して、しかしながら、Ca2+放出中又は後でさえ、それは、中性付近で安定であるというコンセンサスがあるようにみえる。（Foyouzi-Youssefi等、2000年、Kim等、1998年）。これらの観察から、当方は、ｐHが生体内でのERp44/IP3R1相互作用の制御に重要な役割を演ずるという考えを好まない。しかしながら、それは、なお、ｐHは、ER膜の隣接付近で劇的に変化するか（おそらく、非常に短期間のみ）、ｐHの変化は、ｐHが酸性である間にレチクル又は分泌顆粒に重要な役割を有する可能性がなお存在する。(Kamp等、1998年、Quesada等、2003年)。
【００６４】
ER内腔は、細胞質ゾルよりさらに酸化することが広く受け入れられている。ER内腔において、減少したGSHの酸化物に対する割合は、３：１〜１：１と見積もられる(Bass等2003年、Hwang等、1992年)。細胞外環境に対して運命付けられたタンパク質のシステイン残基は、大部分が酸化されERオキシドレダクターゼの効果によってジスルフィド結合を形成する。細胞外タンパク質の還元状態及びERオキドレダクターゼが制御される分子メカニズムは、明らかになっているが（Sevier及びKaiser、2002年）、いかに他のER残基タンパク質（IP3Rを含め）の還元状態が制御されているのか利用されていないままであろ。当方の結果は、ERp44と１L3Vとの間の相互作用は、１L3V上の遊離チオール基の数が減少するにつれて、より弱くなることを示唆した。(図２Ｄ,２Ｆ,及び６Ｂ)。さらに、IP3R1j上のERp44の阻害効果は、他のIP3Rサブタイプの貢献が除外される場合の系においてかなり部分的であり(図３I,６Ｃ,７Ｃ)、IP3R1の総てがERp44によって阻害を受けないことを示唆した。全体として、当方は、1L3Vにおけるシステイン残基のいくつかは、それらの遊離(還元)型（すなわち、ERp44阻害を受ける）であり、その他は、分子内、又は分子外のいずれかで(すなわち、ERp44相互作用又は阻害)、ジスルフィド結合を形成することを提案した。これらの状態間のバランスは、(たとえば、ERオキシドレダクターゼによって)厳格に制御されているようである。スルフィドリル酸化剤は(例えば、チメロサール)、HeLa細胞を含め多くの細胞型において、可逆的に敏感であることが周知である。（Bootman等、1992年、Karhapaa等1996年、Montero等、2001年）。さらに、IP3R3ではなくIP3R1は、チメロナール処理によって敏感になる。（Missiaen等、1998年）。これらの現象は、ERp44のIP3R1に対する還元依存性阻害効果の反映かもしれない。
【００６５】
以前の研究は、IICRは、ER膜を横切るCa2+濃度の減少した勾配によって完全に説明することができない低[Ca2+]ERで減少することを示した。(例えば、Caroppo等、2003年)。当方の生化学的結果(図２Ｅ)は、[Ca2+]ERが100μM以上のとき（すなわち、休息レベル）、ERp44とIP3R1との間の相互作用が弱められることを示唆した。それゆえ、低[Ca2+]ER条件での観察されたIICRの阻害がERp44によってIP3R1への向上した結合のためであると考えることにひきつけられている。当該メカニズムは、[Ca2+]ERが他の内腔タンパク質（たとえば、Ca2+依存酵素及びシャペロンなど）が低くなりすぎ、それらの機能を働かせることを妨げるのに有効かもしれない。
【００６６】
IP3R1のERp44による阻害の生理学的な重要性は何か？一つの可能性は、ER内腔環境を[Ca2+]Ｃの中へ翻訳することである。ERは、多くのシグナル経路の交差点である。(Berridge,2002,Orrenius等、2003)。それゆえ、IP3R1のERp44による阻害は、ERで集中する情報が、細胞質ゾル/核へ運ばれるフィードバック系の一部かもしれない。別の可能性は、[Ca2+]ERが他の内腔タンパク質（たとえば、Ca2+依存酵素及びシャペロンなど）が低くなりすぎ、それらの機能を働かせることを妨げることである。ERp44は、先ず、混合したジスルフィド結合をEro1α、ERオキドレダクターゼを形成するタンパク質として先ず同定され(Anelli等、2002)、それは、そのER維持において伴われることが示された(Anelli等、2003)。Ero1ファミリータンパク質の詳細な機能は、十分に理解されていないが、ER内腔において酸化タンパク質の折り畳みに重要な役割を演じる（Tu及びWeissman,2002年）。ERp44過剰発現は、Ero1αの還元状態を酸化型へシフトさせ、それゆえ、酸化折り畳みを促進すると考えられる(Anelli等、2002年)。それゆえ、ERp44は、タンパク質の折り畳みに重要な役割を演じ、不活性化IP3R1によってCa2+の放出を阻害し、Ero1α/オキシドレダクターゼ系を高めることによって、ジスルフィド結合形成をサポートする。この考えは、さらに、ERp44がまだ折り畳まれていないタンパク質応答中に誘発されるという事実によって支持される。（Anelli等、2002年）。
【００６７】
ERp44が、完全な膜タンパク質を含め多くのタンパク質と、混合したジスルフィド結合を形成することも以前に示された(Anelli等、2003年、Anelli当、2002年)。現時点で、ERp44がIP3R1と混合したジスルフィド結合を形成するかどうかは知られていない。組み換えタンパク質を使用したプル-ダウン測定は、IPBDがこれらのタンパク質との間の相互作用において十分であることを明らかにした。他方、感染させた細胞におけるERp44-c58SとIP3R1との間の相互作用は、減少され、ERp44−C58Sは、IP3R1を阻害ずる際に不適当である(図６Ｆ)。これらの結果は、C58がIP3R1との相互作用において生体内で重要な役割を演ずることを示唆する。しかしながら、これらの結果の別の解釈は、ERp44(ERp44−C58S（Anelli等、2003年）ではなく)が生体内においてジスルフィド結合でホモダイマーを形成することができるので、一つのERp44分子の相互作用が、IP3R1を共沈降及び阻害する別の分子を持ってくることである。いずれにしても、更なる研究が、ERp44の活動の正確なメカニズムの理解に要求されるであろう。IP3R1は、ERにおいてERp44によって保持されるようである。なぜなら、IP3R1のL3V領域は、ER保持用に不要であり、IP3R1は、ERp44がノックダウンされた細胞においてERへなお局在する(データに示さず)。
【００６８】
Ero1の大部分の生化学的特性及び機能が、イーストと哺乳類との間で保存されている一方、イーストは、ERp44オルトローグを有していない。(Anelli等、2003年)。イーストは、IP3Rを有しておらず、C.eleganは、ERp44及びIP3Rの両方を有し、これらのタンパク質は、放出の仮定で同時期に出現することが可能であることを示唆する。
【００６９】
近年、SERCA2ｂが[Ca2+]ER-及び還元状態依存法においてCRT及びERp57、ER内腔オキシドレダクターゼによって調節されることが報告された(Li及びCamacho,2004年)。SERCA2ｂのポンプ活性は、内腔ループのチオール基が減少したとき、より高い。それゆえ、ER内腔環境が、還元条件にシフトしたとき、SERCA2bによって取り込まれたCa2+は、(ERp57によって)高められ、IP3R1を経由したCa2+放出は、(ERp44によって)阻害される。さらに、還元したER内腔環境は、タンパク質の折り畳みに好適ではない。それゆえ、IP3R1を阻害し、SERCA  2bを活性化することによって[Ca2+]ERを増加させるのに理由がある。なぜなら、多くのシャペロンの機能は、相対的に高い[Ca2+]ERを要求するからである。
【００７０】
最終的に、IP3R2又はIP3R3ではなくIP3R1のみが、ERp44によって制御されるが、IP3R2及びIP3R3がER内腔環境に感受性がないことを必ずしも意味しない。当方は、脳(IP3R1が独占的に発現される)からIP3R2又はIP3R3への内腔領域へ結合するいかなるタンパク質も見出すことは不可能であるが、これらのサイドタイプは、脳において存在しない異なる結合タンパク質を有するようである。L3V領域におけるシステイン残基は変えられるという事実は(図１Ｂ)、この仮定をサポートする。
【００７１】
実験手順
プラスミド
全長のERp44ｃDNAを逆転写酵素PCRによってp14マウス小脳によって得た。エピトープ標識したか、又は蛍光タンパク質標識したERp44用の発現ベクターIP3R及びそれらの突然変異体をPCRを用いて構築した。使用したプライマーの配列を含め詳細な方法は、要求により提供される。総ての構築物を配列決定によって証明した。
【００７２】
抗体
ERp44に対するウサギポリクローナル抗体は、精製したHis６-ERp44で増加し、CNBr活性化セファロース４Bへ結合したMBP-ERp44でアフィニティ精製した（Amersham）。使用した他の抗体は、抗IP3R1(18A10、(Maeda等、1988)、抗IP3R1(KM1082、(Sufiyama等、1994年))、Dr. Tadachi Yamamotoから与えられた抗-HA(12CA5)、抗HAペルオキシターゼ（３F10,Poche）、抗CRT(Affinity BioReagents)、抗−MBP(New England Biolabs),抗ヒトIｇG（Vector Laboratiories）、抗−GST（Amersham）、抗-GFP、及び抗-アクチン（Santa  Cruz）である。抗IgM（M-4クローン）を生産するハイブリッドーマは、Dr.Tomohiro Kurosakiによって提供された(Kansai Medical University)。
【００７３】
細胞培養及び感染
COS−７、HeLa,及び283T細胞は、10％熱不活性化胎児ウシ血清で補ったダルベッコ修正Eagle培地において培養した。DY40細胞は、10％熱不活性化胎児ウシ血清、１％ニワトリ血清、100Ｕ/mLペニシリン及びストレプトマイシン、2mMグルタミン及び50μMメルカプトエタノールで補ったRPMI1640培地で培養した。HeLa及びCOS-7細胞を、以前に述べたように（Hattori等、2004年）、それぞれ、TransIT（Mirus）又はLipofectamine2000(Invitrogen)を使用して発現ベクター又はsiRNAで感染させた。DT40細胞をNucleofectorを使用する発現ベクターで感染させた（Amaxa）。
【００７４】
ERp44の同定
１L3V又は対照例Fcは、293T細胞において発現させた。培地を集め、タンパク質Gセファロース（Amercham）で２時間4℃でインキュベーションし、その後、ビーズを10mMトリスHCl（ｐH8.0）、150ｍM NaClで洗浄した。約0.2mgの１L3V又は対照例Fcは、カラム上に設置したビーズど結合した。P14マウス小脳をアイス冷却PBSで洗浄し、0.32Mサッカロース、10mMトリスHCl(pH7.5)、２mM  EDTA、及び1mM  DTTを含む緩衝液においてホモジナイズした。ホモジネートを1時間、100,000ｘｇで2℃で遠心分離した。ペレットを30mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、４mMCaCｌ2、１％TritonＸ-100を含む緩衝液中で、1時間4℃で可溶化し、10,000ｘｇで15分間遠心分離した。上清をアフィニティカラムに適用した。カラムを同じ緩衝液で洗浄し、その後、中世Ｃａ2+緩衝液(10mMトリスＨＣｌ(ｐＨ7.5)、150mMNaCl、4mM CaCｌ2、及び１％TritonX-100)、で,その後、中性緩衝液（10mMトリスHCl(pH7.5)、150mMNaCl、4mMEDTA,４mMEGTA、及び１％TritonX-100）で洗浄した。分画を収集し、SDS-PAGEで分離した。ゲルの銀染色後、バンドを以前に述べたように、切り取り、分析した。（Ichimura等、2002年）
【００７５】
ウエスタンブロット分析
タンパク質をSDS-PAGEによって、分離し、ジフッ化ポリビニリジン膜へ感染させた。膜を5％スキムミルクで0.2％Tween-20を含むPBS（PBST）で30分間ブロックして、第一抗体で3時間室温（RT）で探索した。PBSTで洗浄後、膜を適当な第二抗体で1時間インキュベートし、シグナルをECLプラスキットを用いて検出した（Amercham）。
【００７６】
免疫染色
細胞を４％ホルムアルデヒドで10分間室温で固定化し、0.2％TritonXで10分間室温で浸透させた。５％やぎ血清を含むPBSで1時間、室温で阻害した後、細胞を第一抗体で3時間、室温でインキュベーションした。その後、適当なAlexa Fluor  488又は594第二抗体(分子プローブ)で1時間インキュベーションし、カバーグラスをVectachield  マウント培地を使用して載せて、共焦蛍光顕微鏡(FV-300, Olympus)を使用して分析した。
【００７７】
免疫沈降
細胞をPBSで洗浄し、その後20mMDSP（Pierce）でPBS中で30分間室温で処理した。PBSで洗浄後、細胞をTNE緩衝液(150mMトリスHCl(pH7.5)、500mM  NaCl,１ｍMEDTA、１％TritonX−100、0.1％SDS)で可溶化した。溶解物を標識した抗体及びタンパク質Gセファロースで2時間4℃でインキュベートした。ビーズを5回TNE緩衝液で洗浄し、タンパク質をSDS-PAGEサンプル緩衝液において沸騰させることによって溶出した。
【００７８】
GSTプルダウン測定
組み換えタンパク質をBL21バクテリア株において発現させて、GSHセファロース（Amercham）又はアミロース樹脂（New  England  Biolabs）を使用して精製した。ERp44をGST-ERp44からトロンビンプロテアーゼの消化によって除去した（Amercham  Biosciences）。図２Ｂにおいて、GST又はGST融合タンパク質をMBP又はMBP融合タンパク質で1時間4℃で酸性溶液中でインキュベーションした(30mMMAOAｃ(p5.2)、150mM  NaCl、４mMCaCl2、0.1％TritonX-100)。図２Ｃ及び２において、タンパク質を中性溶液(20mMトリスHCｌ(pH7.5)、150mMNaCl、５mMEGTA、0.1％TritonX-100)で、3mMDTTを用いるか、又は用いないでインキュベーションした。図２Ｅにおいて、GST-1L3V及びMBP`-ERp44をｐH7.5緩衝液中又は、EGTAがCaCl2の指標した濃度に設定したpH7.5緩衝液でインキュベーションした。図２Ｈ及び５Ｅにおける実験は、3mMDTTを含む中性溶液中で行なった。各混合物をその後、さらに２時間GSH−セファロースでインキュベーションした。ビーズを5回洗浄し、ウエスタンブロット分析にかけた。
【００７９】
ERp44に対するRNAインタフェアレンス
SiRNAデュプレックスをDharmaconから購入した。ターゲット配列は、si対照例C（５‘−AAGUAGUGUAUGCUAGAGUGG−３’）、siERp44−C（５‘AAGUAGUGUUUGCCAGAGUUG-37）、si対照例―３U（５’AACAGCACCAUCGACCAACGU−３‘）、siERp44-3U(5’-AACAGCAGCAUCAACCUACGU-3’)。
【００８０】
Ca2+イメージ
感染24〜48時間後、HeLa,COS-7、DT40-KMN60、DT40−１KO、及びDT40−TKO細胞を30分間、5μMＦフラ-2アセトキシメチルエステル(Dojindo)。フラ-２-積層細胞を反転した蛍光顕微鏡(IX-70.Olympus)のステージに載せ、平衡化した塩溶液（BSS）で潅流した。イメージ補足と工程をArgus50/CA系(Hamamatsu  Photomics)を用いて室温で行なった。340nmと380nm励起の別の証明を用いて、蛍光イメージの組(それぞれ、f340及びf380)を対物レンズ(Uapo 20/340又はUplanApo 100 Oil Iris, Olympus)及び エミションフィルター(510〜550nm ) ,を通じて得て、シリコン増大ターゲットビデオカメラ（C2400-8、Hamamatsu  Photomics）で補足した。GFP及びRFPの蛍光イメージを、別々に要求し、Ca2+イメージ用のそれらとして同じ光学分野におけるコンピューターにセーブした。
【００８１】
人工脂質二重層実験
マウス小脳ミクロソームにおけるIP3R1のシングルチャネル記録を以前に記載したように(Michikawa等、1999)、53mMBa2+を使用した20mVトランス膜ポテンシャルで行なった。シスチャンバーは、250mMHEPES(pH7.33)、1.11mMK2-H-HEDTA（N-ヒドロキシメチルエチレンジアミン-N,N’,N’-トリ酢酸、）、0.12mM  K-Ca2+−HEDTAに溶解した108mMトリスを含んだ。トランスチャンバーは、250mMHEPES(pH7.33)、53mMBa(OH)2,3mMDTTを含んだ。IP3R1を、6.4mMIP3及び0.5mMATPをシスチャンバーへ添加することによって活性化した。精製したMBP又はMBP−ERp44を直接トランス側へ加えた。IP3R1シグナルチャネル電流を増幅し(Axon  Instruments)、低透過Besselフィルターによって１  kHzでろ過し（Model,NF Instruments）,10 kHz でサンプル化し、分析した(Michikawa等、1999)。シングルチャネル振幅は、1kHzでろ過したデータの総ての点の振幅ヒストグラムへガウス曲線を固定することによって決定した。電流トレースの調整用に、データを0.5kHzでろ過した。
【産業上の利用分野】
【００８２】
本発明によれば、不斉触媒の配位子として有効に使用することができ、当該不斉触媒を利用することにより得られる生成物（キラルシアノヒドリン）は、不斉4級αヒドロキシカルボニル誘導体、β−アミノアルコールに効果的に変換することができるので、化学分野のみならず、薬学及び医学における有用性が極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、IP3R1のL3V領域への結合タンパクとしてのERｐ44の同定を示す。（A）IP3R構造の概略図を示す。IP3Rｓは、6つの膜スピン領域(緑)及び３つの内腔領域、L1,L2及びL3を含む。L3は、L3V(赤)及びL3Cに分けられる。IP3は、N末端細胞質ゾル領域へ結合する。L3Vは、２つのグリコシル化部位を含む。（B）マウスIP3Rｓの3つのサブタイプ間のL3Vの配列比較。保存されているアミノ酸残基を示す(赤ボックス)。保存されているシステイン残基を矢印で示す。（C）１L3V相互作用タンパク質の精製。酸性溶液(pH5.2)中で可溶化した小脳ミクロソーム分画を対照例Fc又は１L3V-Fcカラムのいずれかへ加えた。次いで、カラムを同じ緩衝液 (レーム３および１１)、中性の緩衝液(レーン4-5  及び12-13) で洗浄し、その後、EGTA/EDTAを含む中性の緩衝液(レーン６及び１４)、１M  NaCl(レーン  ７及び１５)及びグリシンーHCｌ(レーン8及び１６)で溶出した。矢印は、１L3V-Fcへ特異的に結合する45kDaバンドを示し、ERｐ44であると判明した。（D）EPｐ４４の構造。シグナルペプチド（SP、aa 1-30）, チオレドキシン ホモロジー領域（THD,aa 31-141）,及びER保持シグナルRDELモチーフを示す。（E）  ha-ERp44及びGFP-IP3R1発現COS-7細胞は、α−HAで染色した(パネル１及び２)。パネル3及び４において、HA-ERｐ44発現細胞をαCRT及びαHAで染色した。スケールバー：１０μm。（F）ERｐ44及びIP3R1との間の生体内相互作用。HA-ERｐ44及びIP3R1発現COS-7細胞は、膜浸透性クロスリンカー、DSPで処理し、その後可溶化した。細胞溶解物はα−IP3P1(レーン３)、α−HA(レーン４)、又は対照例マウスーIgG(レーン２)と免疫沈降させた。溶解物(入力、レーン１)と免疫沈降をα-IP3R1(上部)及びα―HA(底部)を用いてウエスタンブロッテリングによって分析した。（G）内因性ERｐ44及びIP3R1との間の生体内相互作用。（F）としてDSPで処理されたHeLa細胞の溶解物を、α-IP3R1(レーン３)、α-ERp44(レーン5)、ラットーIgG(IP3R1に対する対照例、レーン２)、又はウサギ-IgG（ERｐ44に対する対照例、レーン４）で免疫沈降させた。溶解物(入力、レーン１)及び免疫沈降をウエスタンブロッティングによって分析した。
【図２】図２は、条件依存方法においてIP3R1と特異的相互作用するERp44を示す。（A）組み換えタンパク質の概略的表現を示す。（B）ERp44は、酸性緩衝液中で１L3Vと直接的に相互作用する。精製したGST(レーン１及びレーン２)又はGST-1L3V(レーン３及び４)をCa2+含有酸性溶液(pH5.2)中で、精製したMBP(レーン1及び３)又はMBP-ERp44(レーン2及び4)でインキュベーションし、その後、GSH-セファロースビーズで沈殿させた。沈殿させたタンパク質をα-MBP又はα-GSTでウエスタンブロッティングに供した。（C）ERp44は、中性緩衝液中においてDTT及びEGTAの存在下１L3Vと直接的に相互作用する。未標識ERp44を得るために、精製したGST-ERp44をトロンビンによって切断し、その後、放出したGSTをGSHセファロースとのインキュベーションによって除去した。このERp44タンパク質を３mMDTTの存在又は不存在下５mMEGTAを含む中性溶液(pH7.5)でGST-1L3Vとインキュベーションした。投入及びビーズ結合タンパク質をSDS-PAGEで非還元条件下分解し、α-ERp44(上部及び中間)又はα―GST(底部)でウエスタンブロッティングによって分析した。（D）精製したGST-1L3V(レーン１)、又はシステイン突然変異体、C2496S(レーン２)、c2504S(レーン３)、C2527S(レーン４)、又は３CS(c2496S/c2504S/c2527S,レーン５)を、３mMDTT及び５ｍMEGTAの存在下、ERp44(Cで準備した)でインキュベーションした。その後、タンパク質をGSHセファロースで沈殿させて、αERｐ４４(中間)又はα-GST(底部)を用いてウエスタンブロッティングにさらした。結合反応へ加えられたERｐ44の量は、上部に示す。ヒストグラムは、３つの独立実験からデンシトメトリー分析を表す。（E）1l3V間のERp44との相互作用のCa2+依存性。結合分析を、EGTAの存在下又は指示したCa2+濃度で3mMDTTを用いて行なった。GSH-セファロースビーズへ結合するタンパク質は、その後沈殿し、α-MBP(上部)又はα-GST(底部)でウエスタンブロッティングにさらした。3つの独立実験からの量分析を行なった。（F）IP3R1及びERp44との間の生体内相互作用は、還元状態下で向上した。GFP-IP3R1及びha-ERp44発現COS-7細胞を5mMDTTの有り（+）又は無し（-）で処理し、その後、DSPで処理した。細胞溶解物から、HA-ERp44を免疫沈降させた。溶解物及び免疫沈降物をα-GFP(上部及び中間)又はα―HA(底部)を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。（F）IP3R1とERp44との間の生体内相互作用は、ERCa2+減少後向上した。GFP-IP3R1及びha-ERp44を発現するCOS−７細胞は、5分間１０μMATPへさらす（+）からさらさず（-）、その後、DSPで処理した。細胞溶解物から、HA-ERp44を免疫沈降させた。溶解物及び免疫沈降物をα−GFP(上部及び中間)又はα−HA(底部)を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。（H）ERp44は、IP3R1とは特異的に相互作用するが、IP3R2又はIP3R3とは相互作用しない。精製したGST(レーン１)、GST-1L３V(レーン２)、GST−２L3V(レーン３)、又はGST-3L3V(レーン４)を、EGTA及びDTTを含む中性溶液(pH7.5)においてMBP-ERp44とともにインキュベーションした。ビーズ結合タンパク質を、αMBP(中間)又はα−GST（底部）を用いたウエスタンブロッティングにさらした。
【図３】図３は、ERp44の発現物は、HeLa細胞、及びDT40-KMN60細胞中のIICRを阻害するが、COS-7又はDT40−１KO細胞を阻害しない。(A及びB)  ERｐ４４は、HeLa細胞中のIICRを阻害する。RFP−RDEL（A）又はREP-ERp44（B）のいずれかで感染させた細胞を3μMで名目上Ca2+フリー培地において刺激した。非感染(黒)及び感染細胞(赤)における代表的なCa2+応答を示す。（C）結果の定量をA及びBにおいて示した。通常の応答は、非感染細胞の平均のピーク振幅を１００％として、計算した(平均±SEM)。REP-RDELと比較してP<0.05（D）Ca3+貯蔵容量は、REP-ERｐ44発現Hela細胞においてチャージされない。細胞を1μMTgで刺激し、非感染(黒)及び感染細胞(赤)における代表的なCa2+応答を示す。（E）Dにおける結果の定量（F-H）ERp44はCOS-7細胞におけるIICRへ影響しない。RFPRDEL（F）又はRFP-ERp44（G）のいずれかで感染させた細胞を１μMATPで名目上Ca2+フリー培地で感染させた。非感染(黒)及び感染細胞(赤)における代表的なCa2+応答を示した。（H）結果の定量化をＦ及びＧに示す。（I-K）ERp44は、DT40−KMN60におけるIICRを阻害するが、DT40−KO細胞を阻害しない。細胞を２μg/mlの抗-IgMで刺激した。非感染(黒)及び感染(赤)細胞における代表的なCa2+応答が示され、その定量が、Kに示される。（L及びM）ERp44は、DT40-KMN60細胞におけるCa2+貯蔵容量に影響しない。Ca2+は非感染(黒)及び感染細胞(赤)に応答し、その定量が示された(M)。（N及びO）ERp44は、DT40-KMN60細胞におけるBCR誘導アポトーシスを阻害するが、DT40−１KO細胞は阻害しない。REP-RDEL又はRFP-ERp44発現DT40-KMN60及びDT40−１KO細胞を抗-IgM(2μg/ml)で24時間処理し、アポトーシスをTUNEL測定によって測定した（Roche）。少なくとも250細胞を欠くスライド上の地区からランダムに選択した10個からカウントした。データは、2つの独立した実験からのREP-RDEL（灰色）又はRFP-ERｐ４４(赤)を発現する総ての細胞以外のTUNELポジティブ細胞の割合の平均±SDである。
【図４】図４は、ERp44の特異的ノックダウンは、HeLa細胞におけるERp44を増大させるが、COS-7細胞のものは増大させない。（A9Hela及びCOS-7細胞のERp44のノックダウン。指標したsiRNAで感染させたHeLa(左)及びCOS-7細胞(右)の溶解物を、指標した抗体でウエスタンブロットによって分析した。（B）ERp44のノックダウンは、HeLa細胞のIICRを増大させた。細胞を、１、３及び10μMで細胞外Ca2+の存在下刺激した。si対照例-3U-感染(黒)及びsiERp44−３U感染細胞(赤)における代表的なCa2+応答を示す。（C）HeLa細胞の割合データは少なくとも150細胞が分析された3つの独立した実験から計算した。（D）Ca2+のピーク振幅の平均は、それぞれ少なくとも150細胞が分析された3つの独立した実験からsi対照例-3U(灰色カラム)又はsiERp44−３U(赤カラム)で感染させたHeLa細胞において応答する。（E）COS-7細胞を0.1、9,3及び１μM  ATPで、細胞外Ca2+の存在下で刺激した。Si対照例―＃U（灰色バー）又はsiERp44−３Ui感染細胞(赤)における代表的なCa2+応答が示される。Si対照例―３U(灰色バー)又はsiERp44−３U(赤バー)のいずれかで感染させたCOS-7細胞の割合は、識別可能なCa2+が指標されたATP濃度へ応答することを示した。データは、3つの独立した実験から計算された。（G）Ca2+のピーク振幅の平均は、少なくとも120細胞が分析された3つの独立した実験からsi対照例-3U(灰色カラム)又はsiERp44−３U(赤カラム)で感染させたCOS-7細胞において応答する。総てのデータは、平均±SDである。
【図５】図５は、ERp44のTHD及びIPBDの両方は、IICRの阻害へ要求されることを示す。（A）ERp44発現のERp44ノックダウン細胞における回復。HeLa細胞は、si対照例―３U又はsiEPp44−３Uで感染させた。24時間後、細胞をRFP―RDEL又はsiERp44-3U用発現ベクターで感染させた。さらに24時間後、細胞を培養し、ウエスタンブロッティングで分析した。（B及びC）ERp44の回復は、IICRを阻害する。内因性のERp44がノックダウンされたHeLa細胞は、RFP-RDEL（B）又はRFP-ERp44(C)用の発現ベクターで感染させた。細胞を３μM  ATPで名目上Ca2+フリー培地において刺激した。非感染(黒及び感染（赤）における代表的なCa2+応答が示された。（D）ERp44及びその突然変異体の概略的表現（E）ERp44のアミノ酸残基２３５〜345は、１L3Vとの相互作用を担当する。GST-1L3Vは、ERp44(レーン２)のサブ断片を含むMBP(レーン１)又はMBP融合タンパク質と共にインキュベーションした。結合測定を（E）として行なった。MBP及びMBP−ERp44融合タンパク質の結合反応への投入が示される(上部)。内在性ERp44がノックダウンされたHeLa細胞におけるIICRのERp4４突然変異体の発現の効果。割合のピーク振幅を図３Dに述べたように得られた。RFP-RDELで比較したP<0/005。
【図６】図６は、１L3Vのシステイン残基は、ERp44によるIP３R１の阻害を要求することを示す。（A）GFP,GFP-IP3O1、又はシステイン置換GFP-IP3R1発現DT40-TKO細胞を２μg。Mlの抗IgMで刺激した。Ca2+応答のピーク振幅の平均は、少なくとも70個の細胞が分析された少なくとも３つの独立した実験(平均±SEM)から示される。（B）IP3R1のL3V領域のシステイン残基は、IP3R1及びERp44間の相互作用に対して重要である。GFP-IP3R1及びその突然変異体は、COS-7細胞においてHA-ERp44で感染させた。感染36時間後、細胞をDSPで処理し、その後可溶化した。HA-ERp44は細胞溶解物から免疫沈降させた。溶解物及び免疫沈降物をα-GFP（上部及び中間）又はα―HA(底部)でウエスタンブロッティングによって分析した。（C-E）ERp44は、IP3R1発現DT40-TKO細胞においてIICRを阻害するが、IP3R1システイン突然変異体発言DT40−TKO細胞で阻害しない。RFP-RDEL又はRFP-ERp44のいずれかを、GFｐ−IP3R1−N又はそのシステイン突然変態体でDT40−TKO細胞の中へそれぞれ感染させた。感染36時間後、細胞を2μg。ｍL抗IgMで刺激した。RFP-RDEL感染(黒)及びRFP-ERp44感染細胞(赤)における代表的なCa2+応答を示す。（F）C〜Eno実験をイメージするCa2+の要約。割合のピーク振幅の平均は、少なくとも50個の細胞が分析された少なくとも３つの独立した実験(平均±SEM)から示される。
【図７】図７は、ERp44は、IP3R1のシグナルチャネル活性を還元条件下で阻害することを示す。（A）MBP-ERp44及びGST-１L3Vをトランス溶液（２５０ｍMHEPES(pH7.33)、５３ｍM  Ba（OH）2）において３ｍMDTTが有るか（+）又は無い（-）場合にインキュベーションし、その後GSH−セファロースで沈殿させた。沈殿したタンパク質をαMBP及びα―GSTを用いてウエスタンブロッティングによって分析した。（B）IP3R1のシグナルチャネル活性での6.4μM細胞質ゾル（シス）IP3及び３ｍM(トランス)DTTの存在下でのIP3R1の単一チャネル活性に対するERp44の影響。単一チャネル電流は、20ｍVで荷電粒子として53mMトランスBa2+で記録した。精製したMBP-ERp44を順に内腔成分として加えた。示したデータは、６つの独立した実験の代表である。（C）内腔還元条件下ERp44によるIP3R1の投与依存不活性化。IP3R1開口可能性の平均は、各実験に観察された最大IP３R1に標準化される。データは、6つの独立した実験からの平均±SDである。（D）IP3R1のERp44によるチャネル活性の規則化用モデル。IP3R1のL3V領域を酸化したとき、ERp44はIP3R1へ結合できず、IP3R1がアゴニスト刺激(通常)によってその活性を利用できることを可能にする。他方、IP3R１のL3V領域が還元され、ERp44はIP3R1と相互作用することができ、チャネル不活性化を生じる。(不活性化される)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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