(57)【要約】【課題】  松枯れなどの原因となるマツノザイセンチュウの駆除剤として、従来からアスペルギルス メリウスなどが知られているが、本発明はさらに殺センチュウ作用の強い薬剤を提供することである。【解決手段】  本発明の殺センチュウ剤は、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger）およびその代謝物の少なくとも１つを有効成分とすることであり、特に前記アスペルギルス・ ニガーが、アスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５４（Aspergillus niger JAM4054）及びアスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５５（Aspergillus niger JAM4055）の少なくとも１つであるときは、殺センチュウ効果が大きい。 【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger）およびその代謝物の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする植物の殺センチュウ剤。
【請求項２】
前記アスペルギルス・ ニガーが、アスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５４（Aspergillus niger JAM4054）及びアスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５５（Aspergillus niger JAM4055）の少なくとも１つである請求項１記載の植物の殺センチュウ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マツノザイセンチュウ、ネコブセンチュウ、シストセンチュウなど植物に寄生して枯らす原因となっているセンチュウ類を駆除するための殺センチュウ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
上記のセンチュウ類は植物を枯らす原因として問題となっており、例えばマツノザイセンチュウは、マツノマダラカミキリを媒介昆虫として松の組織内に侵入繁殖することで松を枯死させることが知られている。そこで、従来からこれを防ぐために、種々の殺マツノザイセンチュウ剤が開発され市販されている。
【０００３】
従来、この種の殺センチュウ剤として、特許文献１に開示された植物のセンチュウ駆除方法が知られている。この駆除方法は、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）などに属する菌又はその代謝産物を用いたマツノザイセンチュウの駆除方法であり、土壌中に存在する有用な微生物に影響を与えることなく、センチュウ類を効果的に駆除する方法として、良好な結果が得られている。ここで用いられるアスペルギルス属の菌は、アスペルギルス メリウス ＪＡＭ４０２２（Aspergillus melleus JAM4022）などである。
【特許文献１】特公平２−３２２５１号
【０００４】
本発明者らは、上記の特許文献１に開示されたアスペルギルス・メリウスより、さらに殺センチュウ作用の強い微生物を探索し続けた結果、ついに有効なる微生物を見出すことが出来、本発明に至ったものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、センチュウ類が原因とされる松の枯死防止をより効果的に防止することのできる殺センチュウ剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る植物の殺センチュウ剤は、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger）およびその代謝物の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明におけるアスペルギルス・ニガーは、殺センチュウ効果を持つものであれば、特に限定されないが、中でもアスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５４（Aspergillus niger JAM4054）（受託番号：FERM BP-8300）、及びアスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５５（Aspergillus niger JAM4055）（受託番号：FERM BP-8301）などが好適に用いられる。
【０００８】
上記のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）は黒麹カビとも呼ばれ、クエン酸やシュウ酸の製造、セルラーゼやアミラーゼなどの酵素剤製造に用いられ、不完全菌類に分類されるものである。本発明のアスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５４、ＪＡＭ４０５５は、いずれも土壌から分離されたもので主要代謝成分がクエン酸およびシュウ酸で、アスペルギルス・ニガーの一般的性質を有し、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）、ツアペック培地、アスペルギルス完全培地において、黒色の分生子頭を密生し、白色又は浅黄色の基底菌糸層から成る。これら２株を比較すると、前記ＰＤＡ培地で培養した場合の基底菌糸層の色は、アスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５４は白っぽく、ＪＡＭ４０５５がやや黄色がかっている。また、前記分生子頭は放射状をしており、分生子柄は滑面かつ無色である。分生子は単細胞、黒色、球形、粗面である。前記ＰＤＡ培地は、ポテト浸出液末４．０ｇ、ブドウ糖２０ｇ、寒天１５ｇからなる顆粒（日水製薬株式会社製）を蒸留水に溶かして１ｌに調製した培地であり、ツアペック培地は、ＮａＮＯ3  ３重量部、Ｋ２ＨＰＯ４  １重量部、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５重量部、ＫＣｌ  ０．５重量部、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１重量部、蔗糖３０重量部、寒天２０重量部を水１０００重量部に溶かした培地であり、アスペルギルス完全培地はモルトエキス２０重量部、ペプトン1重量部、グルコース２０重量部、寒天１５ｇを蒸留水１０００重量部に溶かした培地である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る植物の殺センチュウ剤によれば、マツノザイセンチュウ、ネコブセンチュウ、シストセンチュウなどに対して、殺センチュウ効果が極めて高く、松枯れなどを有効に防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明に係る植物の殺センチュウ剤の実施形態を詳細に説明する。
本発明は、上記のアスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５４及びＪＡＭ４０５５を単独で用いることができる他、殺センチュウ作用を有する他のアスペルギルス属の菌を混合して用いることもできる。そのような菌としては、例えば、アスペルギルス・メリウス ＪＡＭ４０２２（Aspergillus melleus JAM4022）、アスペルギルス・パラシティクス ＪＡＭ４００２（Aspergillus parasiticus JAM4002）、アスペルギルス・タマリ ＪＡＭ４００７（Aspergillus tamarii JAM4007）、アスペルギルス・フミガタス ＪＡＭ４００８（Aspergillus fumigatus JAM4008）などが挙げられる。
【００１１】
本発明の殺センチュウ剤は、菌自体あるいは菌由来の有効成分を任意の量で含有するものであり、公知の担体や添加剤を用いて粒剤、粉剤や液剤などの各種の剤型に製剤化されて使用することができる。担体は、その使用目的に応じて固体担体及び液体担体のいずれでも使用することができる。
【００１２】
固体担体としては、例えば、鉱物性粉末、アルミナ、硫黄粉末、活性炭などが望ましい。また、菌体自体を保持した形態の製剤を製造するには、後述のように行うことが好ましい。すなわち、菌の長期保存を可能とするためには、菌が胞子の状態で担体と混合されて保持されていることが望ましい。その場合に、菌の胞子形成を促進させるために、殺センチュウ作用を有する菌を固体培地で培養することが望ましい。固体培地としては、菌の胞子形成に必要な栄養分である前記ツアペック培地やふすま、米糠を少なくとも含むものが好適に用いられる。固体培地中における栄養分の量は、菌の胞子形成のために用いられる一般的な量でよい。なお、菌を固体培地で培養する場合には、予め公知の液体培地を用いて培養した菌培養物とし、これを固体培地に加えて行ってもよい。しかしながら、液体培地中では菌の胞子が形成されにくいので、液体培地で培養した菌培養物を直接粒状担体と混合すると、菌の長期保存ができなくなることから、菌を固体培地で培養して胞子を大量に増殖させてから粒状担体と混合するのが望ましい。
【００１３】
固体培地で培養した菌培養物を混合する粒状担体としては、例えば、バーミキュライト、パーライト、ピートモス、植物体などの炭化物等の粒状物が挙げられるが、雑菌が共存することなく有効菌のみを長期保存できる点において、粒状バーミキュライトが好適に用いられる。なお、粒状担体の粒径は、１μｍ〜数ｍｍの範囲であることが望ましい。
【００１４】
固体培地で培養した菌培養物と粒状担体との混合は、例えば、粉体や粒状物を混合するために通常用いられる混合攪拌機を用いて行うことができる。菌培養物および粒状担体の両方、又はそのいずれか一方を予め粉砕して粒状にしておいてから混合してもよいし、混合時に粒状にしてもよい。両者の混合比率は、菌培養物に含まれている菌数を勘案した上で、製造される粒状殺センチュウ剤が所望する数の菌を含むように設定することが望ましい。
【００１５】
一方、液体担体としては、例えば、水、アルコール類、ケトン類、エーテル類などが好適に使用される。液体担体を用いて製剤化する場合の添加剤としては、乳化剤、懸濁剤、安定剤、展着剤、浸透剤、分散剤などを適宜用いることができる。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例の範囲に限定されるものではない。
【００１７】
（実施例１：液状製剤）
アスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５５（Aspergillus niger JAM4055）をシャーレ内の固体培地としてのＰＤＡ培地（日水製薬社製PDA培地３９重量部、蒸留水１０００重量部）に接種し、２５℃にて１週間培養して十分な量の分生子を発生させた。その後、この固体培地上に滅菌蒸留水を注ぎ、培地表面に生成された培養物が液中に懸濁するように攪拌して懸濁液を得た。続いて、液体麦芽培地（オリエンタル酵母工業製のモルトエキス２０重量部、極東製薬製のペプトン1重量部、グルコース２０重量部、蒸留水１０００重量部）にこの懸濁液を加え、２４℃にて２８日間暗所にて培養した。
【００１８】
上記で得られた培養液から殺マツノザイセンチュウ活性を有する成分を以下のようにして抽出・精製した。なお、以下の説明中、液体の混合比は体積比を表す。先ず、得られた培養液を濾紙（Ｎｏ．５）を用いて濾過し、培養濾液と残渣（菌体）とに分離した。次いで、得られた培養濾液に２Ｎ塩酸を加えてｐＨ２〜３に調整し、この培養濾液と酢酸エチルを１：３の比率で分液漏斗を用いて振とう抽出した後、静置して上層の酢酸エチル抽出画分と下層の塩酸水溶液画分を得た。下層の塩酸水溶液画分に対して新たに酢酸エチルを上記と同様の比率で加え、同様の操作を２回繰り返し、それぞれ酢酸エチル抽出画分を得た。得られた抽出３回分の酢酸エチル抽出画分を混合し、濃縮乾固して組成物を得た。この組成物１０ｍｇに１００μｌ〜５００μｌのアセトンまたはメタノールを適宜加えて溶解または懸濁し、さらに精製水を用いて希釈し、１００００ｐｐｍとして製剤原液とした。この原液を水で希釈し、濃度５００ｐｐｍ、濃度１０００ｐｐｍの液体製剤をそれぞれ調製した。
【００１９】
（試験例１）液体製剤の殺センチュウ効果試験
実施例１で得られた液体製剤の殺マツノザイセンチュウ活性は次のようにして評価した。実施例１の製造工程中で得られた濃度１００００ｐｐｍの製剤原液から、実施例１の製剤濃度の２倍濃度に調製した試験溶液すなわち１０００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍの溶液をそれぞれ調製した。これらを９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れ、さらにマツノザイセンチュウの蒸留水懸濁液（４００〜１０００頭／ｍｌ）１００μｌを加え、２５℃、暗所にて１週間放置した。各ウェル内のマツノザイセンチュウの生存数と死亡数とを顕微鏡観察により数え、その死亡率（％）で表した。その結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
なお、死亡率は、１濃度につき３連で試験した平均値である。また、マツノザイセンチュウが仮死状態である場合を想定して、上記のようにしてウェル内にてマツノザイセンチュウの死亡率を測定した後、各ウェル内の液をそれぞれチューブに移し、遠心分離して上清を取り除き、さらに蒸留水で２、３回洗浄した沈渣をセンチュウ計数板上に移した。顕微鏡観察によりマツノザイセンチュウの生存数と死亡数とを数え、上記と同様の死亡率を算出した。その結果、マイクロプレートを用いて求められた死亡率とセンチュウ計数板を用いて求められた死亡率とがほぼ一致することを確認した。
【００２２】
表１に示したように、本試験において、５００ｐｐｍ液体製剤および１０００ｐｐｍ液体製剤におけるマツノザイセンチュウの死亡率は、５００ｐｐｍ製剤が６９．４％、１０００ｐｐｍ液体製剤が９０．１％の何れも高い値を示した。
【００２３】
（実施例２：粒状製剤）
アスペルギルス・ニガー ＪＡＭ４０５５の胞子を点接種して前培養を行ったＰＤＡ培地（日水製薬社製のＰＤＡ培地３９重量部、蒸留水１０００重量部）を、液体培地（オリエンタル酵母工業製のモルトエキス２０重量部、極東製薬製のペプトン1重量部、グルコース２０重量部、蒸留水１０００重量部）に接種し、２５℃で７日間振盪培養した。こうして得られた培養液１重量部を、固体培地〔ＮａＮＯ3  ２．２５重量部、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．７５重量部、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３２５重量部、ＫＣｌ  ０．３２５重量部、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００７５重量部、蔗糖２２．５重量部、パーライト５００重量部、米ぬか５００重量部、籾殻（水分調整用）１６５重量部、蒸留水７５０重量部〕１６重量部に接種し、２５℃で１４日間培養した。菌糸と固体培地とで凝集塊を形成した際、その都度攪拌して粒状に崩壊させた。こうして得られた菌培養物には菌が１０8ＣＦＵ／ｍｇ以上含まれていることを寒天平板培地希釈法により確認した。
【００２４】
上記で得られた粒状の菌培養物を、粒径が数１０μｍ〜数ｍｍのバーミキュライトと常温中で混合攪拌機を用いて混合し粒状殺センチュウ剤を製造した。両者の混合比率は、製造される粒状殺センチュウ剤が、このバーミキュライトの混合による希釈により菌を１０６ＣＦＵ／ｍｇ以上含むように設定した。
【００２５】
（試験例２：松林におけるセンチュウ抑制試験）
実施例２で作製した粒状製剤を神奈川県三浦ふれあい村の黒松林において散布し、４ヶ月後の松枯れの様子を観察した。実験した黒松林は、各黒松が見た目には健康のように見えるが、土壌中にセンチュウが確認されている場所である。実験では健康そうに見える黒松１９本を実験区とし、各黒松の根元周囲に適宜深さの穴を複数個設け、１本あたり計約１００ｇをその中に散布した。一方、前記実験区の直ぐ近くに黒松２８本の対照区を設け、この対照区の黒松には、なんら薬剤を散布することはなかった。
【００２６】
実験を開始してから４ヶ月後の結果を表２に示す。それによれば、対照区では黒松４本（約１４．３％）がセンチュウによる松枯れを起こしたが、実験区では１本も松枯れを起こすことなく全ての黒松１９本が健康な状態を維持していた。
【００２７】
【表２】
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