(57)【要約】【課題】  遷移金属錯体といったようなレドックス活性半分を用いた核酸の選択的共有結合修飾の提供。【解決手段】  電子供与体及び電子受容体は、予め定められた位置で核酸のリボース−リン酸バックボーンに対し共有結合される。結果として得られた錯体は、極めて速い速度で非常に長い距離にわたり電子を伝達することのできる２分子鋳型である一連の新しい誘導体である。これらの錯体は、全く新しいクラスの生物導体（バイオコンダクター）及び光活性プローブの使用を可能にする独特の構造的特長を有する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの電子供与体成分及び少なくとも１つの電子受容体半分を含有する１本鎖核酸であって、この電子供与体成分及び電子受容体成分が前記核酸に対し共有結合によって付着させられている、１本鎖核酸。
【請求項２】
前記共有結合形付着がこの核酸のリボース−リン酸バックボーンに対するものである、請求の範囲第１項に記載の１本鎖核酸。
【請求項３】
ハイブリダイゼーション錯体を形成するべく第２の１本鎖核酸の中の相補的標的配列に対しハイブリッド形成できる、請求の範囲第１項に記載の１本鎖核酸。
【請求項４】
前記ハイブリダイゼーション錯体が、前記電子供与体成分と前記電子受容体半分の間で少なくとも１つの電子を伝達できる、請求の範囲第３項に記載の１本鎖核酸。
【請求項５】
少なくとも１つの電子供与体成分を含有する第１の１本鎖核酸及び少なくとも１つの電子受容体成分を含有する第２の１本鎖核酸を含む組成物において、前記電子供与体成分及び電子受容体成分が前記第１及び第２の１本鎖核酸のリボース−リン酸バックボーンに対し共有結合されている、組成物。
【請求項６】
前記第１の１本鎖核酸が前記第２の１本鎖核酸に対しハイブリッド形成して２本鎖核酸を形成することができる、請求の範囲第５項に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１の１本鎖核酸が前記第２の１本鎖核酸にハイブリッド形成されている、請求の範囲第６項に記載の２本鎖核酸組成物。
【請求項８】
前記電子供与体成分と前記電子受容体成分の間で少なくとも１つの電子を伝達することができる、請求の範囲第７項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１及び第２の１本鎖核酸が、少なくとも１つの第１の標的ドメインと第２の標的ドメインを含む標的配列要素をもつ核酸に対してハイブリッド形成することができ、前記第１の核酸が前記第１の標的ドメインに対しハイブリッド形成し、前記第２の核酸が前記第２の標的ドメインに対してハイブリッド形成してハイブリッド錯体を形成することができる、請求の範囲第５項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の標的ドメイン及び前記第２の標的ドメインが互いに隣接している、請求の範囲第９項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ハイブリダイゼーション錯体中の前記第１の核酸及び前記第２の核酸が合わせて連結されている、請求の範囲第10項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ハイブリダイゼーション錯体が前記電子供与体成分と前記電子受容体成分の間で少なくとも１つの電子を伝達することができる、請求の範囲第10項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記標的配列にはさらに、前記第１及び前記第２の標的ドメインの間に介在標的配列が含まれている、請求の範囲第10項に記載の組成物。
【請求項１４】
ハイブリダイゼーション錯体を形成するべく前記介在標的ドメインに対してハイブリッド形成することのできる介在１本鎖核酸配列をさらに含んで成る、請求の範囲第13項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ハイブリダイゼーション錯体が、前記電子供与体成分と前記電子受容体成分の間で少なくとも１つの電子を伝達することができる、請求の範囲第14項に記載の組成物。
【請求項１６】
５′末端に電子伝達成分を含む１本鎖核酸を作る方法において
ａ）修飾された１本鎖核酸を形成するべく５′位置で成長しつつある核酸内に修飾されたヌクレオチドを取り込む段階；
ｂ）前記修飾された１本鎖核酸を相補的１本鎖核酸とハイブリッド形成させて２本鎖核酸を形成する段階；
ｃ）前記修飾された１本鎖核酸に対し共有結合によって付着されるように電子伝達成分と前記２本鎖核酸を反応させる段階；及び
ｄ）前記電子伝達成分を含有する前記修飾された１本鎖核酸から前記相補的１本鎖核酸を分離する段階、
を含んで成る方法。
【請求項１７】
内部ヌクレオチドに対して共有結合により付着された電子伝達成分を含む１本鎖核酸を作る方法において、
ａ）修飾されたヌクレオチド二量体を成長しつつある核酸内に取り込んで、修飾された１本鎖核酸を形成する段階、
ｂ）前記修飾された１本鎖核酸を相補的１本鎖核酸とハイブリッド形成させて、２本鎖核酸を形成する段階；
ｃ）前記修飾された１本鎖核酸に対し共有結合により付着されるように電子伝達成分を前記２本鎖核酸と反応させる段階及び
ｄ）前記電子伝達成分を含有する修飾された１本鎖核酸から前記相補的１本鎖核酸を分離させる段階；
を含んで成る方法。
【請求項１８】
３′末端ヌクレオチドに対し共有結合により付着された電子伝達成分を含有する１本鎖核酸を作る方法において、
ａ）核酸の中へ酵素的付加又は置換を介して、修飾されたヌクレオチドを取り込む段階、
ｂ）前記修飾された１本鎖核酸を相補的１本鎖核酸とハイブリッド形成させて２本鎖核酸を形成する段階；
ｃ）前記修飾された１本鎖核酸の前記ホスホラミド結合を通して共有結合で付着されるように電子伝達成分を前記２本鎖核酸と反応させる段階；及び
ｄ）前記電子伝達半分を含有する修飾された１本鎖核酸から前記相補的１本鎖核酸を分離する段階、
を含んで成る方法。
【請求項１９】
１つの核酸標本中の標的配列を検出する方法において、
ａ）少なくとも１つの共有結合により付着された電子供与体成分及び少なくとも１つの共有結合で付着された電子受容体成分を含有する１本鎖核酸を前記標的配列にハイブリッド形成させて、ハイブリダイゼーション錯体を形成する段階；
ｂ）ハイブリダイゼーション錯体の中の前記電子供与体成分と前記電子受容体成分の間の電子伝達速度を決定する段階、
ｃ）前記標的配列の存在又は不在の指標として標識配列の不在下での電子伝達速度と前記電子伝達速度を比較する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２０】
１つの核酸の中で、第１の標的ドメインとこの第１の標的ドメインに隣接する第２の標的ドメインを含んでいる標的配列を検出する方法において、
ａ）前記第１の標的ドメインに対し、少なくとも１つの電子供与体成分を含む第１の核酸をハイブリッド形成させる段階；
ｂ）前記第２の標的ドメインに対し、少なくとも１つの電子受容体成分を含む第２の核酸をハイブリッド形成させる段階；
ｃ）前記第１及び第２の核酸が前記第１及び第２の標的ドメインに対してハイブリッド形成されている間の前記電子供与体成分と前記電子受容体成分の間の電子伝達速度を決定する段階；
ｄ）前記核酸標本中の前記標的配列の存在又は不在の指標として、標的配列の不在下での電子伝達速度と前記電子伝達速度を比較する段階、
を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を介しての電子伝達に関する。より具体的には、本発明は、新しい一連の生物学的材料を製造するためのレドックス活性遷移金属錯体のごとき電子伝達成分を用いた核酸の部位選択的修飾及び、これらの生物学的材料の製造及び利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、部分的には、遷移金属錯体といったレドックス活性成分を用いた核酸の部位選択的修飾のための方法、修飾された核酸自体及びその用途に関する。このような修飾された核酸は、生物導体（バイオコンダクタ）及び光活性核酸プローブとして、特に有用である。
【０００３】
特定の核酸配列の検出は、診断医学及び分子生物学研究のための重要な手段である。遺伝子プローブ検定は現在、細菌及びウイルスなどの感染性生物体を同定する上で、又正常な遺伝子の発現をプローブ探査しガン遺伝子といった突然変異遺伝子を同定する上で、又組織移植に先立ち適合性について組織を型別する上で、又法医学のため組織又は血液標本を符号させる上で、さらに異なる種からの遺伝子の間での相同性を探求するために、役割を果たしている。
【０００４】
理想的には、遺伝子プローブ検定は、感受性が高く特異的でかつ容易に自動化できるものであるべきである（総説として、Nickerson のCurrent Opinion in Biotechnology（今日のバイオテクノロジー評論）を参照のこと）。感受性についての必要条件（すなわち低い検出限界）は、研究者が分析前に特定の核酸配列を指数関数的に増幅することができるようにするポリメラーゼ連鎖反応(PCR）及びその他の増幅技術の開発によって、大幅に軽減されてきた。（総説として、Abramson et al., Current Opinion in Biotechnology, 4:41-47 (1993) を参照のこと）。
【０００５】
これとは対照的に、特異性は、現在利用可能な多くの遺伝子プローブ検定において問題でありつづけている。プローブと標的の間の分子相補性の程度が、相互作用の特異性を規定する。ハイブリダイゼーション媒体中のプローブ、標的及び塩の濃度、反応温度及びプローブの長さの変動が、プローブと標的の相互作用の特異性を変えたり又はそれに影響を及ぼしたりする可能性がある。
【０００６】
いくつかの制限された状況の下では、ミスマッチをもつ標的から完全な相補性をもつ標的を区別することが可能であるかもしれないが、反応条件のわずかな変動がハイブリダイゼーションを変えることから、一般にこれは従来の技術を用いては非常に困難である。標準的プローブを用いたミスマッチ検出のための新しい実験技術としては、単一点のミスマッチが連結を妨げる DNA連結検定、及びミスマッチがプローブ分割のための部位を作り上げるプローブ消化検定が含まれる。
【０００７】
最後に、遺伝子プローブ検定の自動化は、現在のテクノロジーが欠如している１つの分野であり続けている。このような検定は一般に、標的配列に対する標識されたプローブのハイブリダイゼーションとそれに続くハイブリッド形成されなかった遊離プローブの分離に依存している。この分離は一般に標的 DNAのゲル電気泳動又は固相捕捉及び洗浄によって達成され、一般にたやすく自動化することがきわめてむずかしい。
【０００８】
これらの分離段階は時間のかかるものであることから、２つの全く異なる開発手段が導き出された。その１つは、高速、高処理量の自動化可能な電気泳動その他の分離技術の開発が関与するものである。もう１つは、分離以外の均質な遺伝子プローブ検定の開発が関与するものである。
【０００９】
例えば、Gen-Probe Inc., (San Diego, CA）は、ハイブリッド形成されたプローブが塩基加水分解から防御され、かくしてその後に続く化学発光が可能となる、均質防御検定を開発した。（Okwumabua et al. Res. Microbiol. 143:183 (1992))。残念なことに、このアプローチは、高いバックグラウンド光子放出で知られている化学発光性基質に依存していることから、この検定は高い特異性をもたないであろうということが示唆されている。
【００１０】
EPO出願第86116652,８号は、均質検出方式として供与性プローブから受容体プローブへの非放射性エネルギー伝達を使用する試みについて記述している。しかしながら、螢光エネルギー伝達は、プローブのトポロジー及びトポグラフィの両方によって大きく影響され、 DNA標的自体は、著しくエネルギー消滅（energy quenching）でき、その結果可変性が大きくなる。従って、特異的でかつ標的ミスマッチを検出できしかも配列同定のために自動化されたシステム内に組込むことのできるような DNAプローブに対するニーズが存在する。
【００１１】
以上に概略的に説明したとおり、分子生物学は、従来の遺伝子プローブ検定のため、修飾された又は標識されたオリゴヌクレオチドに依存するところがきわめて大きい。（オリゴヌクレオチド合成：実践的アプローチ。Gait et al., Ed, IRL Press : Oxford, UK, 1984 ：オリゴヌクレオチドと類似体：実践的アプローチ。Ed. F. Eckstein. Oxford University Press, 1991）。その結果、目的に合わせた核酸分子の合成のためのいくつかの技術が現在存在している。核酸は、問題の分子を容易に共有結合により付着させることのできる官能基を天然に含有していないことから、末端リン酸塩又は複素環式塩基のいずれかにおける化学的修飾を可能にする方法が開発された（Dreyer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82:968）。
【００１２】
例えば、糖の２′又は３′位置にアミノ基を含有する共通のデオキシリボ及びリボヌクレオシドの類似体を、確立された化学的技術を用いて作ることができる（Imazawa et al., J. Org. Chem., 1979, 44:2039; Imazawa et al., J. Org. Chem. 43 (15):3044 (1978); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36 (2):250 (1971); Hobbset al., J. Org. Chem. 42 (4):714 (1977) を参照のこと）。さらに、２′−５′又は３′−５′ホスホアミドリンケージを用いてオリゴヌクレオチドを合成することもできる(Beaueage et al., テトラヘドロン49 (10); 1925 (1992); Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800(1970); Sawai, Chem. Lett. 805 (1984); オリゴヌクレオチドと類似体：実践的アプローチ、F. Eckstein, Ed. Oxford University Press (1991))。
【００１３】
核酸の修飾は、次の２つの一般的理由のために行なわれてきた。すなわち、プローブとして用いるべく非放射性 DNAマーカーを作り出すため、そして部位特異的開裂を得るべく化学的に修飾された DNAを使用するため、である。
【００１４】
この目的のため、２本鎖 DNAのニック翻訳再合成における置換類似体として役立つことになるヌクレオチドの変性によって、プローブとして用いるよう DNAを標識づけすることが可能である。化学的に変性されたヌクレオチドは、この場合、ビオチンといった免疫学的又はその他の標識の付着のための反応部位を提供する（Gilliamet al., Anal. Biochem. 157:199 (1986))。もう１つの例では、規定の条件下で光ルミネセンスを生成するべく DNA内に挿入されるルテニウム誘導体が使用される（Friedman et al., J. Am. Chem. Soc. 112:4960 (1990)）。
【００１５】
第２のカテゴリーの中には、ひきつづき DNA鎖の分割をひき起こす DNAに対し共有結合によってリンクされた化合物の例がいくつか存在する。例えば、1.10−フェナントロリンは、Cu2+及び３−メルカプトプロピオン酸の存在下でポリ−dAオリゴヌクレオチドの開裂という結果をもたらすリンカーを介して１本鎖オリゴチミジレートにカップリングされている（Francois et al., Biochemistry 27:2272 (1988)）。EDTA′-Fe （II)(２本鎖 DNA（Boutorin et al., FEBS Lett. 172:43-46 (1986)及び３重 DNA（Strobet et al., Science 249:73 (1990) の両方について）、ポルフィリン−Fe（III )(LeDoan et al., Biochemistry 25:6736-6739 (1986))及び1.10−フェナントロニン−Cu（Ｉ)(Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7147 (1985))についても、同様の実験が行なわれてきており、これらは全て、曝気された溶液中で還元剤の存在下で DNA鎖開裂をもたらしている。ポルフィリンを使用した同様の例は、 DNA鎖分割をもたらし、非常に特異的な条件下で DNAの塩基酸化又は架橋をもたらした（Le Doan et al., Nucleic Acids Res. 15:8643 (1987))。
【００１６】
その他の研究は、複素環塩基の化学的修飾に焦点をあてていた。例えば、修飾された内部塩基に対する無機配位錯体 Fe-EDTAの付着は、分子状酸素の存在下でのハイブリダイゼーション後に DNAの開裂をもたらした（Dreyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:968 (1985)）。ルテニウム化合物は、 DNAハイブリダイゼーション能力ならびにルテニウム標識の分光特性の両方を保持しながら、 DNAオクトマー内の内部塩基にうまくカップリングされた（Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111:7221 (1989)）。その他の実験は、単一の２本鎖 DNA分子に対し２つの別々の分光標識をうまく付加した（Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111:7226 (1989)）。
【００１７】
タンパク質及び DNA内の電子伝達反応の研究も又、長距離電子伝達が可能なシステムを追究する上で探究されてきた。
【００１８】
この目的のため、呼吸経路内のタンパク質及び光合成タンパク質の中に発見されるもののようなタンパク質−タンパク質錯体の中での分子間電子伝達が、生物学的に有意な速度でタンパク質の内部にてかなりの距離にわたって起こるということが示されてきた。（Bowler et al., Progress in Inorgunic Chemistry:Inorganic Chemistry、第38巻、Ed. Stephan J. Lippard (1990) を参照のこと）。さらに、遷移金属を用いた金属酵素の選択的修飾が達成され、これらのシステム内での電子伝達を監視する技術が開発されてきた。
【００１９】
例えば、シトクロムＣといった電子伝達タンパク質が、いくつかのヒスチジンでの付着を通してルテニウムで修飾され、ヘムFe2-から結合Ru3+への電子伝達速度が測定された。結果は、電子伝達「トンネル」経路が存在するということを示唆している(Baum. Chemical &Engineering News, ２月22日、1993, P2023; Chang et al., J. Am. Chem. Soc. 113:7056 (1991)も参照のこと）。関連研究においては、酵素又はタンパク質のレドックスの中心を外部溶剤との非弁別的反応から防御する正常なタンパク質絶縁は、これらの系を電気絶縁体から導体へと変換するべく「配線」された（Heller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990))。
【００２０】
DNAマトリックス内での光誘導された電子伝達の報告はわずかしか存在しない。これらの系においては、電子供与体及び受容体は、 DNAに対し共有結合によって付着されず、 DNAとランダムに会合され、かくして、供与体−受容体系の明示的な解明及び制御を困難にしている。例えば、いくつかの四元ジアゾ芳香族塩の強力な螢光は、 DNA内への挿入時点又は個々のモノヌクレオチドに対する露呈時点で消光され、かくして DNA自体の中での電子供与体プロセスを示す（Brun et al., J. Am. Chem. Soc. 113:8153 (1991)）。
【００２１】
電子伝達メカニズムを決定するむずかしさを示すもう１つの例は、いくかつの光励起可能なルテニウム化合物を用いて行なわれた研究の中に見い出される。初期の研究は、或る種のルテニウム化合物がヌクレオチド塩基内にランダムに挿入されるか又はらせん表面に結合するということを示唆している（Purugganan et al., Science 241:1645 (1988)）。最近の文献は、或る種のルテニウムが DNA内に挿入されず（Satyanarayana et al., Biochemistry 31 (39):9319 (1992)）、むしろ DNAらせんの表面に非共有結合する、ということを示している。
【００２２】
これらの初期の実験においては、コバルト、クロム、ロジウム化合物といったさまざまな電子受容体化合物がいくつかの DNA会合ルテニウム電子供与体化合物に付加された（Puragganan et al., Science 241:1645 (1988); Orellane et al., Photochem. Photobiol. 499:54 (1991); Brun et al., J. Am. Chem. Soc. 113:8153 (1991); Dauis, Chem-Biol, Interactions（相互作用）62:45 (1987);Tomalia et al., Acc. Chem. Res., 24:332 (1991)）。らせんに対してランダムに非共有結合するこれらのさまざまな電子受容体化合物の付加時点で、電子伝達を通しての光励起された状態の消滅が検出された。消滅の速度は、個々の電子供与体及び受容体ならびにそれらの濃度の両方によって左右され、かくしてプロセスを２分子のものとして明らかにした。
【００２３】
１組の実験において、著者らは、表面結合供与体の移動度が大きくなればなるほど、挿入された種よりも高い効率で電子伝達が促進されるということを仮定しており、 DNAの糖−リン酸バックボーンそして場合によっては DNAをとり囲む溶剤媒質が電子伝達において重要な役割を果たす、ということを示唆している（Purugganan etal., Science 241:1645 (1988)）。その他の研究においては、著者らは、供与体及び受容体の移動度並びにそれらの局所的濃度に対する速度の依存性を強調しており、 DNAの役割がまず第１にらせん上の供与体及び受容体の種の局所的濃度の増大を容易にすることにあるものとしている(Orellana et al., 前出）。
【００２４】
もう１つの実験においては、電子供与体は DNA塩基の積み重ね内にランダムに挿入され、一方受容体は DNAの表面とランダムに会合されるとのことであった。電子伝達消滅速度は、供与体と受容体の密な接触を表わしていた。又この系は、媒質に対する塩の付加に伴う電子伝達速度の増強も示している（Fromhers et al., J. Am. Chem. Soc. 108:5361 (1986)）。
これらの実験全てにおいて、非共有結合した供与体及び受容体についての電子伝達速度は、遊離溶液中で見られるものよりも数ケタ低い。
【００２５】
長距離電子伝達系の開発のための重要な刺激は、合成の集光系を作り出すことにある。これまでの研究は、人工的集光系がエネルギー伝達複合体、エネルギー移動複合体、電子伝達複合体及び電子移動複合体を含有することを示唆している（この分野の話題的な総説については、Chemical & Engineering News,1993年３月15日、Ｐ38〜Ｐ48を参照のこと）。次の２つのタイプの分子が試された：すなわち、ａ）共有結合によって付着された電子伝達種を伴う炭化水素のごとき長い有機分子又は挿入されたもしくは部分的に挿入された又はらせん会合された電子伝達種を伴う DNA、及びｂ）合成重合体、である。
【００２６】
かなり剛性であるものの、長い有機分子は、開発をむずかしくしている数多くの要因によって影響される。これらの要因としては、溶剤の組成及び極性、供与体及び受容体基の配向、そして分子に対する電子伝達種の会合又は共有結合型リンケージのいずれかの化学的特性、が含まれる。
利用可能な重合体が可とう性の高いものでありすぎて複数の伝達様式が起こることから、受容可能な重合体電子伝達系を作り出すことは困難であった。充分な剛性をもつ重合体は往々にして電子伝達メカニズムに著しく干渉するか又はきわめて合成し難いものである。
【００２７】
従って、人工集光系を開発する上で、充分な剛性をもち規定の間隔で共有結合により付着された電子伝達種を有し合成し易くかつ電子伝達メカニズムと著しく干渉することがない電子伝達系の開発が有用であろう。
【００２８】
結論としては、供与体と受容体の間の距離が短かいものである可能性と結びつけられた電子供与体及び受容体対の無作為の分布及び移動度、供与体と受容体のゆるいそしておそらくは可逆的である会合、報告された溶剤に対する依存性及び推定上の広い電子経路、そして正常な塩基対合を不可能にする挿入された化合物の DNA構造の分断が全て、 DNAマトリックス内の長い範囲の電子伝達の明白な制限条件として役立っている。従って、核酸構造の最小限の混乱及び正常に塩基対合するその能力の保持を得るため、電子供与体及び受容体のリキッドな共有結合型付着の生成方法が望まれる。本発明は、新しい生物導体（バイオコンダクタ）及び診断プローブの開発を可能にするこのような系を提供するのに役立つ。
【発明の開示】
【００２９】
本発明は、遷移金属錯体のごときレドックス活性成分を用いた特定の部位での核酸の選択的修飾を提供する。電子供与体及び／又は電子受容体成分が、好ましくは予め定められた位置で核酸のリボース−リン酸バックボーンに沿って共有結合される。得られる錯体は、極めて速い速度で非常に長い距離にわたり電子を伝達することのできる生物分子鋳型である一連の新しい誘導体を表わす。これらの複合体は、全く新しいクラスの生物導体及び診断用プローブの使用を可能にする独特の構造的特長を有する。
【００３０】
従って、本発明の目的は、共有結合によって付着された電子供与体成分と電子受容体成分を両方共有する１本鎖核酸を提供することにある。これらの成分は、核酸のリボースリン酸又はそれに類似するバックボーンを通して付着される。１本鎖核酸は、１つの１本鎖核酸内の相補的標的配列に対してハイブリッド形成することができ、又供与体と受容体の間で電子を伝達することができる。
【００３１】
本発明のもう１つの目的は、塩基対ミスマッチを検出することのできる核酸プローブを提供することにある。この実験態様では、共有結合により付着された電子供与体及び電子受容体成分を伴う１本鎖核酸は、１つの１本鎖核酸内の相補的標的配列に対しハイブリッド形成される。ハイブリダイゼーションの領域が少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含有している場合、プローブと標的配列の間に完全な相補性が存在する場合に比べ、供与体成分と受容体成分の間の電子伝達速度は低減されるか又は無くなる。
【００３２】
本発明のもう１つの目的は、少なくとも１つの電子供与体成分を伴う第１の１本鎖核酸及び少なくとも１つの電子受容体成分を伴う第２の１本鎖核酸を含有する複合体を提供することにある。本発明のその他の実施態様の場合と同様に、前記成分は核酸のリボース−リン酸バックボーンに対して共有結合によりリンクされている。
本発明の１つの態様においては、第１及び第２の１本鎖核酸は互いにハイブリッド形成し合って２本鎖核酸を形成し電子供与体成分と電子受容体成分の間で電子を伝達することができる。
【００３３】
本発明のもう１つの態様においては、１本鎖核酸中の標的配列は、互いに直接隣接している第１及び第２の標的ドメインを少なくとも含んでいる。第１の１本鎖核酸は第１の標的ドメインに対しハイブリッド形成し第２の１本鎖核酸は第２の標的ドメインに対してハイブリッド形成し、かくして第１及び第２の１本鎖核酸が互いに隣接するようになっている。結果として得られたこのハイブリダイゼーション錯体は、第１及び第２の核酸上で電子供与体成分と電子受容体成分の間で電子を伝達することができる。
【００３４】
本発明のもう１つの態様においては、１本鎖核酸内の標的配列は、第１の標的ドメイン、介在標的ドメイン及び第２の標的ドメインを含んでいる。介在標的ドメインは１又は複数のヌクレオチドを含む。第１及び第２の１本鎖核酸は第１及び第２の標的ドメインに対してハイブリッド形成する。１又は複数のヌクレオチドを含む介在核酸が標的介在ドメインに対しハイブリッド形成し、かくして電子は第１及び第２の核酸上で電子供与体成分と電子受容体成分の間で伝達され得るようになっている。
【００３５】
本発明は同様に、核酸の５′末端に共有結合によって付着された電子伝達成分を含む１本鎖核酸を作る方法をも提供する。この方法には、修飾されたヌクレオチドを５′位置において成長しつつある核酸内に取り込んで、修飾された１本鎖核酸を形成する段階が含まれている。このとき、修飾された１本鎖核酸は、相補的な１本鎖核酸とハイブリッド形成して２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸は、修飾された１本鎖核酸に対し共有結合によって付着されるような形で電子伝達成分と反応させられる。電子伝達成分を含有する修飾された１本鎖核酸は、相補的な修飾されていない１本鎖核酸から分離される。
【００３６】
本発明は同様に、内部ヌクレオチドに対し共有結合によって付着された電子伝達成分を含有する１本鎖核酸を作る方法も提供する。この方法には、ホスホラミド結合によって結合されたヌクレオチド２量体を作り出す段階そしてこのヌクレオチド２量体を成長する核酸の中に取り込んで修飾された１本鎖核酸を形成する段階が含まれる。修飾された１本鎖核酸は次に、相補的１本鎖核酸とハイブリッド形成させられて２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸は、成分が修飾された１本鎖核酸に対して共有結合によって付着させられるように、電子伝達成分と反応させられる。電子伝達成分を含有する修飾された１本鎖核酸は、相補的な未修飾１本鎖核酸から分離される。
【００３７】
本発明のもう１つの態様は、標的配列の検出方法を提供している。この方法には、共有結合によって付着された電子供与体成分と電子受容体成分を伴う１本鎖核酸を作り出す段階が含まれる。この場合、電子伝達成分を含有する１本鎖核酸は標的配列に対しハイブリッド形成され、電子供与体と電子受容体の間の電子伝達速度が決定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
相反する記述のないかぎり、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又はその文法上の同等語はここでは、互いに共有結合によってリンクした少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含有するが、いくつかのケースでは、以下で概略説明する通り、核酸は、例えばホスホラミド(Beaucage et al., テトラヘドロン49 (10);1925 (1993) 及びその中の参考文献；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970))、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダイトリンケージ（Eckstein, Oligonucleotids and Analog : A Practical Approach, Oxford University Press参照）又はペプチド核酸リンケージ（Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992):Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature,365:566 (1993)を参照）を含む類似のバックボーンを有する可能性がある。
【００３９】
核酸は、規定される通り１本鎖であっても２本鎖であってもよい。核酸は、デオキシリボ−及びリボ−ヌクレオチドの任意の組合せ及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン及びグアニンの任意の組合せを含む場合、 DNA,  RNA又はハイブリッドであってよい。いくつかの例において、例えば「介在核酸」の場合においては、核酸という語は、１又は複数のヌクレオチドのことを言う。
【００４０】
「電子供与体成分」、「電子受容体成分」及び「電子伝達成分」又はその文法的同等語は、ここでは、或る種の条件下で電子伝達が可能な分子のことを意味する。電子供与体及び受容体の能力が相対的なものであることを理解しなければならない；すなわち、或る種実験条件下で電子を失なう可能性のある分子は、異なる実験条件下で電子を受容することができる。一般に、電子伝達成分は構成成分として遷移金属を含有するが、つねにそうであるとはかぎらない。
【００４１】
「標的配列」又はその文法的同等語は、ここでは、核酸の１本鎖上の核酸配列を意味する。標的配列は、１つの遺伝子、調節配列、ゲノミック DNA，mRNA又はその他のものの一部であってよい。これはどんな長さのものでもよいが、配列が長くなればなるほどより特異的である。一般的に言うと、この語は、当業者であれば理解できるものである。
【００４２】
本発明のプローブは、標的配列に対し相補的となるように設計されており、かくして本発明のプローブと標的配列のハイブリダイゼーションが起こるようになっている。以下で概略説明する通り、この相補性は完全なものである必要はない。本発明の１本鎖核酸と標的配列の間のハイブリダイゼーションに干渉することになる任意の数の塩基対ミスマッチがあるかもしれない。しかしながら、最低の緊縮性のハイブリダイゼーション条件下でさえいかなるハイブリダイゼーションも起こり得ないほど突然変異の数が多い場合、配列は相補的標的配列ではない。
【００４３】
「第１の標的ドメイン」及び「第２の標的ドメイン」又はその文法的同等語は、ここでは、検討中の核酸内の１つの標的配列の２つの部分を意味している。第１の標的ドメインは、第２の標的ドメインに直接隣接していてもよいし、或いは、第１及び第２のの標的ドメインが１つの介在標的ドメインによって分離されていてもよい。「第１」及び「第２」という語は、標的配列５′−３′配向に対するその配列の配向を付与するものではない。例えば、相補的標的配列の５′−３′配向を仮定すると、最初の標的ドメインは第２のドメインに対し５′のところ又は第２のドメインに対し３′のところにあってよい。
【００４４】
本発明は、一部には、核酸マトリックスを通して電子を長距離伝達できる新しい一連の生物学的材料の調製のための、遷移金属錯体といったレドックス活性成分を用いた核酸の部位選択的修飾に関する。本発明は、１本鎖又は２本鎖核酸上の予め定められた部位における電子伝達供与体及び受容体成分の精確な位置づけを提供する。一般に２重らせん核酸内の電子供与体と受容体成分の間の電子伝達は、２重らせん構造内の電子供与体と受容体の間の配列内にヌクレオチド塩基対合が存在するのでないかぎり、測定できる速度では起こらない。
【００４５】
電子伝達速度のこの差異が、プローブとしての用途のための本発明の有用性の基礎を成すものである。電子伝達成分が核酸のバックボーンに共有結合されている本発明の系においては、電子は、推定上、２本鎖核酸の積重ねられた塩基対のπ−軌道関数を介して走行する。電子伝達速度は、電子供与体−受容体対の間の距離、反応の自由エネルギー（ΔＧ）、再編成エネルギー（λ）、介在媒質の寄与、供与体と受容体対の配向と電子カップリング及び塩基間の水素結合を含め、さまざまな要因によって左右される。前記最後の項目は、Ａ−Ｔ対がＣ−Ｇ対に比べ１つ少ない水素結合を含有していることから、実際の核酸配列に対する依存性を付与する。
【００４６】
しかしながらこの配列依存性は、 DNA塩基対マトリックス内の電子伝達速度とリボース−リン酸バックボーン、溶剤又はその他の電子トンネルを通しての速度の間には測定可能な差異が存在するという事実確認によって影が薄くなっている。この速度差は、少なくとも数ケタ分であると考えられ、積重ねられたヌクレオチド塩基を通しての場合は、その他の電子伝達経路に比べて４ケタ分も大きい可能性がある。従って、例えば遺伝子プローブ検定中の２重鎖核酸の存在は、ハイブリッド形成していないプローブについての電子伝達速度をハイブリッド形成されたプローブについての速度と比較することによって決定できる。
【００４７】
１つの実施態様においては、本発明は、分子生物学及び診断医学において有用である新しい遺伝子プローブを提供している。この実施態様においては、予め定められた配列及び共有結合によって付着された電子供与体及び電子受容体成分をもつ１本鎖核酸が合成される。この配列は、電子供与体と電子受容体の間の領域内で相補的標的配列に対するハイブリダイゼーションが起こった場合に電子伝達が評価可能かつ検出可能な速度で進行するように、既知の標的配列に基づいて選択される。
【００４８】
従って、本発明は、新しい形の標識された遺伝子プローブとして広く一般に使用されうるものである。さらに、ハイブリッド形成されていなプローブ内での検出可能な電子伝達は評価できないことから、本発明のプローブは、ハイブリッド形成されていないプローブを除去することなく標的配列の検出を可能にする。従って、本発明は自動化された遺伝子プローブ検定にのみ適している。
【００４９】
本発明は同様に、標的核酸配列中の突然変異の検出のための唯一の方法としても使用される。その結果、電子伝達成分を含有する１本鎖核酸が突然変異を伴う標的配列に対してハイブリッド形成させられた場合、その結果としてのヌクレオチドの塩基対合の混乱は、電子伝達速度に測定可能なほどの影響を及ぼすことになる。これは、突然変異が置換、挿入又は欠失である場合に言えることである。従って、本発明は、標的配列中の突然変異の検出を提供する。
【００５０】
かくして、本発明は、いくつかの実施態様において、ハイブリッド形成していないプローブを除去することなく標的配列を検出することのできる極めて特異的かつ感応性の高いプローブを提供する。これは、自動化された遺伝子プローブ検定の生成において有用である。
【００５１】
１つの変形実施態様においては、２本鎖核酸は、相対するストランド上に共有結合によって付着された電子供与体及び電子受容体成分を有する。このような核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR）において遺伝子増幅の成功を検出するのに有用である。例えば、２つの PCRプライマーのうちの１つが５′末端に付着された電子供与体を含有し、もう一つが５′末端に付着された電子受容体を含有している場合、数回の PCRが２重に標識付けされた２本鎖フラグメント（場合によって「アンプリコン」と呼ばれる）を生成することになる。適切な光誘導の後、電子伝達の検出は、いかなる増幅も起こらない場合と比べての標識配列の増幅の成功の表示を提供する。本発明の特に有利な点は、電子伝達成分を含有するプローブ配列について以上で概略説明されている通り、増幅された２本鎖 DNAからの１本鎖プライマーの分離が不要である、ということにある。
【００５２】
もう１つの実施態様においては、本発明は、生物導体又は「分子ワイヤー」として役立つべく、共有結合によって付着された電子供与体及び電子受容体成分を伴う２本鎖核酸を提供している。電子伝達は、電子供与体及び受容体対１つあたり最高28Å及びそれ以上の距離にわたって起こり得る。さらに、電子伝達速度は、電子供与体と受容体成分の間の距離によって左右されるにせよ、非常に速いものである。電子供与体及び／又は電子受容体成分を用いて規則的間隔で核酸を修飾することにより、長距離にわたって電子を伝達することが可能となり、かくして生物導体が作り出される。これらの生物導体は、電気化学的反応及びプロセスのための媒介物といったような導体についての従来の利用分野を含む多数の利用分野において有用である。
【００５３】
さらに、これらの生物導体は、光合成反応のためのプローブとして、ならびに合成集光系の構築において有用であり得る。人工集光系の電子伝達構成要素についての現在のモデルには、溶剤の極性及び組成に対する依存性及び困難な合成無くしては充分な剛性が欠如すること、といったものを含め、いくつかの問題点がある。従って本発明は、新しい形の生物導体ならびに新しい遺伝子プローブの両方として有用である。
【００５４】
さらに、本発明は、以前に修飾されたヌクレオチドに対する電子供与体及び電子受容体成分の、核酸のリボース−リン酸バックボーンに対する部位特異付加のための新しい方法を提供する。
１つの実施態様においては、電子供与体及び受容体成分は、核酸の３′及び／又は５′末端に付加される。変形実施態様においては、電子供与体及び受容体成分は、１又は複数の内部ヌクレオチドすなわち３′又は５′末端ヌクレオチドでないあらゆるヌクレオチドのバックボーンに付加される。もう１つの実施態様においては、電子供与体及び受容体分子は、内部及び末端ヌクレオチドの両方のバックボーンに付加される。
【００５５】
好ましい実施態様においては、修飾されたヌクレオチド、好ましくはアミノ修飾されたヌクレオチドを利用する手順を通して、遷移金属電子伝達成分が付加される。この実施態様では、電子伝達成分は、ホスホラミドリンケージ中の窒素基を通して糖リン酸バックボーンに付加される。このとき、修飾されたヌクレオチドは、核酸の３′又は５′末端か又は任意の内部ヌクレオチドに対して遷移金属電子伝達成分を部位特異的に付加するために使用される。
【００５６】
分子力学計算によると、核酸の末端ヌクレオチドの修飾による混乱が最小限のものであり、ワトソン−クリック塩基対合が分断されていない(Molecular Simulations Inc., San Diego, CAからの Bioqrafを用いた未公開データ）ということがわかる。従って１つの実施態様においては、核酸の５′末端に電子伝達成分を付加するために、修飾されたヌクレオチドが用いられる。この実施態様においては、電子伝達種の付加に先立ちデオキシリボ−又はリボ−ヌクレオシドのリボースの２′位置が修飾され、リボースの３′末端をその後の鎖付着のために未修飾状態で残している。好ましい実施態様においては、確立された化学的技術を用いて糖の２′炭素に対して１つのアミノ基が付加される（Imazawa et al., J. Org. Chem., 44:2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4):714 (1977);Verheyden et al., J. Org. Chem. 36(2):250 (1971)）。
【００５７】
修飾されたヌクレオチドがひとたび調製され、防御され活性化されたならば、これらを５′末端ヌクレオチドとして標準的な合成技術（Gait、オリゴヌクレオチド合成：実践的アプローチ、IRL Press, Oxford, UK 1984; Eckstein）により、成長するオリゴヌクレオチド内に取り込むことができる。従って、この方法は、核酸の５′末端に対する遷移金属電子伝達成分の付加を可能にする。
【００５８】
１つの変形態様においては、遷移金属電子伝達成分を付加するために、３′末端ヌクレオシドは修飾される。この実施態様では、３′ヌクレオシドはリボース糖の２′又は３′炭素のいずれかで修飾される。好ましい一実施態様においては、確立された化学的技術（Imazawa et al., J. Org. Chem., 44:2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4):714 (1977); Verheyden et al., J. Org.Chem. 36 (2):250 (1971))を用いて、糖の２′又は３′炭素に対しアミノ基が付加される。
【００５９】
上述の手順は、図３に示されている通り、 DNA及び RNA誘導体の両方に対して適用できる。
【００６０】
上述の通りに作られたアミノ修飾されたヌクレオチドは、標準的な生化学方法（Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 4:2671 (1973)）を用いて２′又は３′で修飾されたヌクレオチド三リン酸形へと変換される。次に１又は複数の修飾されたヌクレオシドが、酵素 DNAポリメラーゼＩ又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの使用によるものなどの標準的分子生物学技術を用いて、３′末端で付着される（Ratliff 、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ。Enzymes 第14Ａ巻、P.D. Boyer ed. p105 〜 118中。Academic Press, San Diegom CA. 1981)。
【００６１】
その他の実施態様においては、核酸の中央すなわち内部ヌクレオチドに対して、遷移金属電子伝達成分が１又は複数付加される。これは、３つの方法で達成できる。
１つの好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドが、上述の通り５′末端にてアミノ修飾される。この実施態様では、オリゴヌクレオチド合成が、標準的技術を用いてアミノ修飾されたヌクレオチドから５′末端を単純に延長させる。こうして内部的にアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドがもたらされる。
【００６２】
一変形実施態様においては、リボース以外の部位でバックボーンに電子伝達成分が付加される。例えば、遷移金属修飾のための部位ホスホジエステルリンケージではなくむしろホスホラミドリンケージを用いることができる。これらの遷移金属は電子伝達反応のための供与体及び受容体として役立つ。未変性ホスホジエステルリンケージからの構造的偏向がまさに発生しCD及び NMRを用いて研究されてきたが（Heller. Acc. Chem. Res. 23:123 (1990); Schumann et al., J. Am. Chem. Soc. 113:1394 (1991))、ホスホラミダイトのヌクレオチド間リンクは相補的ポリヌクレオチドに対し結合することが報告されてきており、又安定している(Beaucage et al., 前出、及びその中の参考文献；Letsinger 、前出；Sawai 、前出；Jager 、生化学27:7237 (1988)）。
【００６３】
この実施態様においては、ヌクレオチドの２量体が２′−５′又は３′−５′のいずれかの位置でのホスホラミドリンケージを用いて作り出される。好ましい１つの実施態様は、ホスホラミドリンケージのために３′−５′位置を利用しており、このためその後のワトソン−クリック塩基対合の構造的分析は最小限におさえられるようになっている。これらの２量体ユニットは、以下で概略説明するように規定の間隔で、上述の通り成長するオリゴヌクレオチド鎖の中へ取り込まれる。
【００６４】
上述の技術を内部残基の修飾のために使用する場合には、最後から２つめの３′末端ヌクレオチド上に電子伝達種をもつ核酸を作り出し、かくして、３′末端で標識づけされたヌクレオチドを産生するのに必要とされる追加のステップを不要にすることが可能である、ということにも留意すべきである。
【００６５】
内部残基の修飾のためのもう１つの実施態様においては、３′ヌクレオチド修飾のために前述の技術を用いて２′又は３′で修飾されたヌクレオチド三リン酸が生成される。修飾されたヌクレオチドは、 DNA及び RNAを標識づけするため、標準的な分子生物学技術を用いて核酸内に内部的に挿入される。前記標識づけのために用いられる酵素としては、 DNAポリメラーゼ、例えばポリメラーゼＩ，T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、 Taq DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、及び RNAポリメラーゼ、例えば、E. coli RNA ポリメラーゼ又はファージSP６, Ｔ７又はＴ３からの RNAポリメラーゼ（分子生物学の短いプロトコル、1992, Ausubel et al. Ed. p3.11-3.30)が含まれる。
【００６６】
好ましい実施態様においては、電子供与体及び受容体成分は、独特の防御ハイブリダイゼーション段階を利用する方法によって、修飾されたヌクレオチドに付着される。この実施態様においては、修飾された１本鎖核酸が未修飾の相補的配列に対しハイブリッド形成される。こうして、遷移金属電子伝達種による攻撃を受けやすいものである複素環塩基上の部位が遮断される。
【００６７】
リボースの２′又は３′位置にある露呈されたアミン又はその他のリガンド、ホスホラミドリンケージ又はその他の本発明において有用なリンケージは、当該技術分野において周知の技術を用いてさまざまな遷移金属錯体で直ちに修飾される（例えば、Millet et al. 「生物学系における金属」中、Sigel et al. Ed.  第27巻p223〜264. Marcell Dekker Inc. New York, 1991 及びDurham et al. 「ACS Advamus in Chemistry Series 」中、Johnson et al. Eds. 第 226巻p180〜193, American Chemical Society, Washington D.C.;及びMeade et a;., J. Am. Chem. Soc. 111:4353 (1989) を参照のこと）。望ましい金属錯体をうまく付加した後、修飾された２重鎖核酸は、当該技術分野において周知の技術を用いて１本鎖へと分離される。
【００６８】
好ましい一実施態様においては、１つの電子供与体成分と１つの電子受容体成分を含有する１本鎖核酸が作られる。電子供与体及び電子受容体成分は、１本鎖核酸の５′又は３′末端のいずれかにおいて付着され得る。代替的には、電子伝達成分を内部ヌクレオチドに付着させることもできるし、又は１つを内部ヌクレオチドにそして１つを末端ヌクレオチドに付着させることもできる。核酸の５′−３′配向との関係における電子伝達種の配向が確定的なものでないということを理解すべきである。従って、図１に概略説明されている通り、この実施態様においては内部及び末端ヌクレオチドのあらゆる組合せを利用することができる。
【００６９】
１つの好ましい変形態様においては、少なくとも１つの電子供与体成分及び少なくとも１つの電子受容体成分を伴う１本鎖核酸が、相補的標的配列内の突然変異を検出するために使用される。置換、挿入又は欠失のいずれであるかに関わらず、１又は複数のヌクレオチドの突然変異は、核酸のハイブリッド形成された２重らせんの中の正しくない塩基対合という結果をもたらす。従って、電子供与体成分から電子受容体成分までの電子の経路がミス対合のある領域にまたがっている場合、電子伝達は削除又は低減されることとなり、このため相対速度の変化が見られるようになる。従って、この実施態様では、電子供与体成分は突然変異から５′の位置にある核酸に対し付着され、電子受容体成分は３′の位置で付着されるか又はその逆である。
【００７０】
この実施態様では、１又は複数のミスマッチが存在するハイブリダイゼーションを検出するため修飾された１本鎖核酸上で付加的な標識を使用することも可能である。相補的標的核酸が突然変異を含む場合、電子伝達は低減されるか又は削除される。対照として作用するためには、修飾された１本鎖核酸は、従来の分子生物学技術に従って標的配列に対するハイブリダイゼーションを検出することができるように、放射性又は螢光標識付けを受けることができる。これは、標的配列が存在するものの１又は複数のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を含有するという決定を見越しているものである。代替的には、標的配列の存在についての対照として、正確な符号を伴う領域に対しハイブリッド形成する少なくとも１つの電子供与体成分と１つの電子受容体成分を伴う１本鎖核酸を使用することができる。
【００７１】
２本鎖核酸らせんを通しての電子伝達率が電子供与体及び電子受容体成分の間のヌクレオチド距離によって左右されるということを理解すべきである。距離が長くなればなるほど速度は遅くなり、速度の考慮はプローブ及び生物導体の設計における１つのパラメータとなることだろう。かくして、 100ヌクレオチド以上の距離について速度を測定することは可能であるものの、好ましい実施態様は３個以上 100個以下のヌクレオチドだけ離隔した電子供与体成分と電子受容体成分を有する。より好ましくは、成分は８〜64個のヌクレオチドで離隔され、15個というのが最も好ましい距離である。
【００７２】
さらに、或る一定の距離は、異なる検出システムの利用を可能にするかもしれない、ということに留意されたい。例えば、いくつかの検出システムの感度は、極めて速い速度の検出を可能にするかもしれない：すなわち、電子伝達成分は互いに非常に接近していてよい。又その他の検出システムは、やや遅い速度を必要とし、電子伝達成分がさらに離れることができるようにするかもしれない。
１つの変形態様においては、１本鎖核酸が複数の電子供与体又は受容体成分で修飾される。例えばこれらのプローブから得られるシグナルを増大させるか又は所要検出器感度を低減させるため、電子供与体・受容体対の多数のセットを使用することができる。
【００７３】
上述の通り、いくつかの実施態様においては、１本鎖核酸に対して異なる電子伝達成分が付加される。例えば、１つの電子供与体成分及び電子受容体成分を付加すべき場合又はいくつかの異なる電子供与体又は電子受容体を付加すべき場合、１本鎖核酸の合成は複数の段階で進行する。まず第１に、上述の技術を用いて、各々単一の電子伝達種すなわち単一の伝達成分又は複数の同一伝達成分のいずれかを含む部分的核酸配列が作られる。その後、これらの部分的核酸配列は、相補的１本鎖に対する個々の修飾された部分的核酸のハイブリダイゼーションとそれに続く市販のリガーゼでの連結といったような当該技術分野において一般的である技術を用いて互いに連結される。
【００７４】
好ましい一実施態様においては、１つの電子供与体成分又は１つの電子受容体成分を含む１本鎖核酸が作られる。電子供与体及び電子受容体成分は１本鎖核酸の５′又は３′末端のいずれかに付着される。代替的には、電子伝達成分は１つの内部ヌクレオチドに付着させられる。
１つの１本鎖核酸に対して異なる種の電子供与体及び受容体成分を付着させることができるということを理解すべきである。かくして、任意の１本鎖核酸に対して１つ以上のタイプの電子供与体半分又は電子受容体成分を付加することができる。
【００７５】
好ましい１実施態様においては、１又は複数の電子供与体成分が付着された状態で第１の１本鎖核酸が作られる。第２の１本鎖核酸では１又は複数の電子受容体成分が付着されている。この実施態様においては、相補的標的配列のためのプローブとして使用するため、１本鎖核酸が作られる。１つの実施態様では、相補的標的配列は第１の標的ドメインと第２の標的ドメインで構成され、ここでこの第１及び第２の標的ドメインは互いに直接隣接している。
【００７６】
この実施態様では、電子供与体成分及び電子受容体成分の両方ではなくいずれか一方のみを含有する第１の修飾された１本鎖核酸は第１の標的ドメインに対しハイブリッド形成し、対応する電子伝達種のみを含有する第２の修飾された１本鎖核酸は第２の標的ドメインに結合する。電子伝達種の相対的配向は、図２で概略的に示すとおり、重要でなく、本発明は考えられる全ての配向を含むように意図されている。
【００７７】
隣接する第１及び第２の標的配列に対しハイブリッド形成する２つの１本鎖核酸から成るプローブの設計においては、いくつかの要因を考慮に入れなくてはならない。これらの要因の中には、ハイブリッド形成された形態における電子供与体成分と電子受容体成分の間の距離及び個々の１本鎖プローブの長さが含まれる。例えば、５′末端で標識づけされたプローブのみを合成することが望まれる可能性もある。この場合、第１の配列に対しハイブリッド形成する１本鎖核酸は比較的短かく、プローブ間の望ましい距離を達成することができるようになっていてもよい。例えば、電子伝達成分の間の最適な距離が15ヌクレオチドであるならば、第１のプローブの長さは15ヌクレオチドであってよい。
【００７８】
この実施態様の一例においては、隣接する第１及び第２の標的ドメインに対しハイブリッド形成した２つの１本鎖核酸は、電子伝達反応に先立ち互いに連結される。これは、T4 DNAリガーゼといった DNAリガーゼを利用する標準的分子生物学技術を用いて行なうことができる。
【００７９】
一変形態様においては、相補的標的配列は第１の標的ドメイン、介在標的ドメイン及び第２の標的ドメインを有することになる。この実施態様では、電子供与体成分及び電子受容体成分の両方ではなくいずれか一方のみを含む第１の修飾された１本鎖核酸は第１の標的ドメインに対しハイブリッド形成し、対応する電子伝達種のみを含有する第２の修飾された１本鎖核酸は第２の標的ドメインに結合する。介在１本鎖核酸が介在標的配列に対してハイブリッド形成する場合、供与体と受容体の間の電子伝達が可能である。
【００８０】
介在配列はいかなる長さであってもよく、単一のヌクレオチドを内含することができる。しかしながら、その長さは、第１及び第２の修飾された核酸上の電子供与体及び受容体成分の間の望ましい距離を考慮に入れたものでなくてはならない。より長い介配配列が用いられた場合に２本鎖核酸を形成するべく介在配列がハイブリッド形成された状態にとどまる確率がより高くなることから、14以上の長さの介在配列が望ましい。介在配列の存在又は不在は、挿入及び欠失を検出するのに使用することができる。
【００８１】
この実施態様の１例においては、第１の標的ドメインに対してハイブリッド形成された第１の１本鎖核酸、介在ドメインに対しハイブリッド形成された介在核酸及び第２の標的ドメインに対しハイブリッド形成された第２の１本鎖核酸は、電子伝達反応に先立って互いに連結され得る。これは、標準的な分子生物学技術を用いて行なうことができる。例えば、核酸が DNAである場合、T4 DNAリガーゼといった DNAリガーゼを用いることができる。
【００８２】
本発明の相補的標的１本鎖核酸は数多くの形態をとることができる。例えば、相補的標的１本鎖核酸配列は、より大きな核酸配列すなわち遺伝子又はmRNAの全部又は一部分、なかんづくプラスミド又はゲノミック DNAの制限フラグメントの中に内含されうる。分子生物学の当業者であれば、本発明を用いたさまざまな標的配列のために有用なプローブの構築方法を理解できることだろう。
【００８３】
一つの実施態様においては、共有結合によって付着された電子伝達成分を伴う２つの１本鎖核酸は相補的配列をもち、かくしてこれらは互いにハイブリッド形成して１つの生物導体を形成することができる。この実施態様では、ハイブリッド形成された２本鎖分子は少なくとも１つの電子を電子供与体成分から電子受容体成分まで伝達することができる。好ましい一実施態様においては、個々の１本鎖核酸は、平滑末端を有するように整列させられる；変形実施態様においては、核酸は、２重らせんが付着末端を有するように整列させられる。いずれの実施態様においても、電子が積重ねられた塩基対の中を走行できるように電子供与体成分と電子受容体成分の間に中断のない２重らせん塩基対合が存在することが好まれる。
【００８４】
１つの生物導体の実施態様においては、２本鎖核酸は、電子伝達成分の全てを支持する１つの１本鎖核酸を有する。もう１つの実施態様においては、電子伝達成分はいずれかのストランド上で任意の配向で支持されていてよい。例えば、１本のストランドが電子供与体のみを支持しもう１本が電子受容体のみを支持していてもよいし、或いは両方のストランドが両方を支持していてもよい。
【００８５】
１つの実施態様では、２本鎖核酸は、電子の長い範囲の伝達を容易にするため、定まった配向で共有結合によって付着された異なる電子伝達成分を有することができる。このタイプの系は、電子伝達種がそれらの酸化的状態に応じて電子供与体及び受容体の両方として作用できるという事実を活用したものである。かくして、電子供与体成分は、１つの電子の喪失の後、電子受容体として作用することができ、その逆も可能である。
【００８６】
従って、非常に長い距離にわたる電子の指向性伝達を達成できるように、２本鎖核酸のいずれかのストランド上で電子伝達成分を逐次的に配向させることができる。例えば、２本鎖核酸は、分子全体を通して、同じ又は異なる組成の複数の電子受容体成分と１方の端部にある単一の電子供与体を含有できるだろう。このような要領で電子伝達のカスケード効果が達成でき、その結果、電子の極めて長い範囲の伝達をもたらすことができる。
【００８７】
特定の電子供与体及び受容体対の選択は、使用される電子伝達測定のタイプによって影響されることになる。再考のためには、Winkler et al., Chem. Rev. 92:369-379 (1992)を参照のこと。永続する励起状態がレドックス部位の一つに準備できる場合、光誘導後の電子伝達速度の直接的値を、例えばChang et al., J. Amer. Chem. Soc. 113:7057 (1991) の閃光−消光方法を用いて測定することができる。
【００８８】
この好ましい実施態様においては、基底状態種よりも優れた受容体及び供与体である励起されたレドックス部位は、電子をレドックスパートナーへ又はそれから伝達することができる。この方法の利点は、２つの電子伝達速度すなわち、光誘導された電子伝達速度と熱電子−正孔組換え反応を測定できるという点にある。かくして、完全な相補性をもつハイブリッド形成された核酸及びミス対合をもつ核酸について、速度差を測定することができる。
【００８９】
変形実施態様においては、いずれのレドックス部位も永続的な励起状態をもたず、電子伝達測定は速動性中間体の２分子生成によって左右される。再考のためには、Winkler et al., 前出、を参照のこと。この中間体は次に、以下に示すとおり、消光物質を用いた分子内電子伝達を介して熱力学的産物になるまで弛緩する：
【００９０】
【化１】
2005013222.tif 000002
【００９１】
この方法を用いた測定可能な分子内電子伝達速度の上限は、１秒あたり約104 である。
変形実施態様では、Winkler et al., 前出の中で再考されているとおり、１つの供与体の中に電子を注入するか又は供与体から電子を除去する還元又は酸化ラジカルのパルス−放射線分解による生成が使用される。
電子伝達は、電子伝達成分の電気的、電気化学的、光子（レーザーを含む）又は化学的活性化を用いて開始されることになる。これらの事象は、過渡的な吸収の変化によってか又は電子伝達成分の螢光、リン光又は化学発光によって検出される。
【００９２】
好ましい実施態様においては、電子伝達はレーザーでの光誘発の後で起こる。この実施態様においては、電子供与体成分は、電子の供与後に、或る種の状況下で電子受容体として役立つ。同様にして、電子受容体成分は、或る種の状況下で電子供与体として役立つことができる。
【００９３】
好ましい実施態様においては、 DNAが電子供与体及び電子受容体成分の付加によって修飾される。一変形実施態様においては、 RNAが修飾される。さらにもう１つの実施態様においては、生物導体として使用するための２本鎖核酸が、いくつかのデオキシリボ−ヌクレオチド、いくつかのリボースヌクレオチドそしてアデノシン、チミジン、シトシン、グアニン及びウラシル塩基の混合物を含有することになる。
【００９４】
本発明のさらにもう１つの態様に従うと、供与体及び受容体のための好ましい処方は、一連のリガンドに共有結合によって付着されさらにリボース環（２′又は３′位置）の一部としてアミン基に対して又はペプチド結合、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合又はＯ−メチルホスホラミデート結合によってリンクされたヌクレオチド２量体の一部として窒素又は硫黄原子に対して共有結合によって付着された遷移金属を有している。
【００９５】
利用可能な１つのクラスの供与体及び受容体を表わす一般構造式が図４のＡ内に示されている。この図では、ＭはCd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe, Ruのいずれであってもよく、最も好ましいのはルテニウムである。Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ4 及びＲ3 の基は、選ばれた金属に対し共有結合できるあらゆる協調リガンドであってよく、これには、NH3 、ピリジン、イソニコチンアミド、イミダゾール、ビピリジン及びビピリジンの置換誘導体、フェナントロリン及びフェナントロリンの置換誘導体、ポルフィリン及びポルフィリン族の置換誘導体といったリガンドが含まれ得る。リガンドとしてビスビピリジン及びイミダゾールを用いたルテニウム電子伝達種の構造は、図４のＢに示されている。有用な電子伝達錯体の特定的例には表１に示されているものが含まれるが、これらに限られるわけではない。
【００９６】
【表１】
2005013222.tif 000003
【００９７】
考えられる電子供与体成分及び電子受容体成分の数は非常に多いということ、そして電子伝達化合物の当業者であれば本発明の中で数多くの化合物を利用できるであろうということを理解すべきである。
一変形実施態様においては、電子伝達成分の１つは電極といったような固体支持体の形をしていてよい。もう１つの電子伝達成分が溶解状態にある場合、その系は、電子供与体及び電子伝達成分が両方共同じ位相にある均質な系に対し、不均質系と呼ばれる。
【００９８】
この実施態様において使用される技術は、レドックスタンパク質ではなくむしろ本発明の核酸が用いられるという点を除いて、電極に対するタンパク質の配線と類似している（例えばGregg et al.,J. Phys. Chem. 95:5970 (1991); Heller et al., センサーとアクチュエーター R., 13-14:180 (1993);及びPishko et al., Anal. Chem., 63:2268 (1991)を参照のこと）。この実施態様では、Os(bpy)2Clのポリ（ビニルピリジン）錯体といったレドックス重合体がジエポキシドといったエポキシドと架橋して、金、ガラス質炭素、グラファイト及びその他の導電性材料から成る電極に対し強く結合することのできるレドックス伝導性エポキシドセメントを形成することが好まれる。
【００９９】
この強い付着は、この実施態様については、「共有結合によって付着された」という語の定義づけの中に含まれている。このとき、エポキシド架橋重合体は、例えば、核酸を錯体に対して共有結合によって付着させ電極の表面上に「レドックスハイドロゲル」を形成する上述のアミノ修飾された核酸のアミンといったような露呈されたアミンと反応させられる。
【０１００】
この実施態様においては、少なくとも１つの電子伝達成分を含む一本鎖核酸プローブが、このレドックスハイドロゲルを介して電極の表面に付着されている。その後、標的配列のハイブリダイゼーションを、核酸の一方の端部に共有結合によって付着された電子伝達成分ともう一方の端部にある電極の間の伝導度の関数として測定することができる。これは、上述の参考文献中に記述されているもののような当該技術分野において周知の機器及び技術を用いて行なうことができる。
【０１０１】
類似の実施態様においては、前述の通り、２つの核酸がプローブとして利用される。例えば、１つの核酸が固体電極に付着され、共有結合によって付着された電子伝達成分を伴うもう１つの核酸は、溶液中に遊離している。標的配列のハイブリダイゼーションの時点で２つの核酸は、ハイブリッド形成された核酸の電子伝達成分と電極の間の電子伝達が起こるように整列させられる。電子伝達は、上で概略説明された通りに、或いは当該技術分野において周知の技術を用いた電流測定、電位差測定又は導電率測定による電気化学センサーを使用することによって検出される。
【０１０２】
以下の例は、上述の発明の使用要領をより完全に説明するためならびに本発明のさまざまな態様を実施する目的で考慮されている最良の様式を規定するために役立つものである。これらの例がいかなる形であれ、本発明の真の範囲を制限するのに役立つものでなく、むしろ例示を目的として示されているということがわかる。
【実施例】
【０１０３】
アミノ修飾された単量体ユニットは、公表された手順の変形態様によって調製され、標準的な合成技術により、成長するオリゴヌクレオチドの中に取り込まれる。この手順は DNA及び RNA誘導体の両方に適用できる。
例１．５′末端で電子伝達成分を伴うオリゴヌクレオチド２本鎖分子の合成
この例では、各１本鎖がリボース糖の２′炭素にて５′末端ウリジンヌクレオチドに対し共有結合によって付着された単一の電子伝達半分を有している状態で、８ヌクレオチドの２本鎖核酸が産生された。
【０１０４】
ステップ１：５′−ジ（ｐ−メトキシフェニル）メチルエーテル−２′−（トリフルオロアセタミド）−２′−デオキシウリジンの合成
公表された手順(Imazawa, 前出）をわずかに修正したものによって調製された２′−（トリフルオロアセタミド）−２′−デオキシウリジン(2.0ｇ, 5.9mmoles)を最小限の非常に乾燥した CH3CNの中でくり返し溶解させ、乾燥するまで回転蒸発させ、次に不活性雰囲気真空ラインへと移送し、さらに１時間乾燥させた。
【０１０５】
Gait（前出）から、材料合成のための次の手順を適合させた：すなわち、陽圧アルゴン下で、乾燥させ蒸留したばかりのピリジンの中で材料を溶解させ、反応混合物に対して0.05当量（重量）の４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）， 1.5当量のトリエチルアミン(TEA）及び 1.2当量の4.4 ′−ジメトキシトリチルクロリド(DMTr-Cl）を付加した。反応の進展をシリカゲルTLC(98i2の塩化メチレン：メタノール、流動相）により監視した。30分後、DMTr-Cl 及び TEAの各々の付加的な 0.5当量を付加し、反応をさらに３時間進行させた。この反応混合物に対して等しい体積の水を付加し、溶液をジエチルエーテルで数回抽出した。エーテル層を乾燥するまで回転蒸発させ、最小限の量の塩化メチレン中で再度溶解させ、閃光クロマトグラフィ（99：１の塩化メチレン：メタノール、流動層）によって精製して、５′−ジ（ｐ−メトキシフェニル）メチルエーテル−２′−（トリフルオロアセタミド）−２′−デオキシウリジン産物を得た。
【０１０６】
ステップ２：５′−２′−アミノウリジン− GCTACGA及び５′−２′−アミノウリジン− CGTAGCA減圧下（ガラス）で５′−ジ（ｐ−メオキシフェニル）メチルエーテル−２′−（トリフルオロアセタミド）−２′−デオキシウリジンを乾燥させ、乾燥及び蒸留したばかりの CH3CNの中に溶解させ、特別に作った円錐形のバイアルの中に入れ、ABI DNA 合成装置上に置いた。標準（すなわち未修正の）オリゴヌクレオチドの調製のためのプログラムは、最終的塩基（アミノ修飾済み）付加の間に15〜30分のカップリング時間に変更された。オリゴヌクレオチドを標準的な手順によってカラムから分割させ、C-18逆相HPLCによって精製した。この要領で、５′−２′−アミノウリジン− GCTACGA及び５′−２′−アミノウリジン− CGTAGCAが調製された。さらに、以下の電子伝達成分の合成において使用するため、両方の産物に対する未修飾の相補的ストランドが作られた。
【０１０７】
ステップ３：５′−２′−ルテニウムビスビピリジンイミダゾール−アミノウリジン− GCTACGA
先行ステップにおいて産生された５′−２′−アミノウリジンGCTACGA を、標準的な技術を用いて相補的未修飾ストランドへとアニールした。遷移金属の付加に先立つアニールされた２本鎖分子の操作は全て、４℃で扱かわれた。 DNAが修飾中アニールされた状態に確実にとどまるようにするため、反応は１Ｍの塩の中で行なわれた。 0.2ＭのHEPES, 0.8ＭのNaCl, pH6.8 の中で５′−アミノ修飾された２重鎖 DNAを溶解させ、Schelenkライン上で反復的に排出させた。以前に調製したルテニウムビスビピリジンカーボネートを上述の緩衝液中で溶解させ、Schelenkラインを介しての反復的な排出及びアルゴンでのパージにより酵素を除去した。
【０１０８】
ルテニウム錯体を、カニューレ挿入（アルゴン／真空）を介して DNAに移送させ、24時間、撹拌しながら陽圧アルゴン下で反応を進行させた。この反応に対して、50当量のイミダゾールをフラスコに付加し、さらに24時間反応を続行させた。反応混合物を真空ラインから除去し、PD-10 ゲルろ過カラムに加え水で溶離させて余剰のルテニウム錯体を除去した。収集した分画の体積を、急速乾燥を通じて乾燥するまで縮減させ、固体を 0.1Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム（TEAC）, pH6.0の中で取り上げた。２重鎖 DNAを50％のホルムアミドと共に15分間60℃まで加熱して、２本鎖分子を変性した。ダイオードアレイ検出器の備わったC-18逆相HPLCを用い、 pH6.0の 0.1ＭのTEAC内の３％〜35％のアセトニトリルの勾配を利用して、１本鎖 DNAを精製した。
【０１０９】
ステップ４：５′−２′−ルテニウムテトラミンピリジン−アミノウリジン− CGTAGCA５′−アミノウリジン− CGTAGCA(0.3μｍ）を 0.2ＭのHEPES, 0.8ＭのNaCl緩衝液、 pH6.8の中に溶解させ、真空ライン上で脱気した。撹拌棒と隔膜の備わった10ml入り円錐形フラスコへと、同じ緩衝液中のRu（III ）テトラアミンピリジンクロリド（10μｍ）をスラリー化した。別のフラスコ内で、Zn／Hgアマルガムを調製し、減圧下で乾燥させ、ルテニウムIII 溶液をZn／Hgアマルガムへと移行させた（カニューレ挿入を介して）。
【０１１０】
透明な黄色い溶液（λmax ＝ 406nm）が直ちに形成されたことは、ルテニウムの還元形が達成されたことを表わしており、反応は30分間続行された。この溶液を、アミノ修飾された DNAを含むフラスコへと移し、アルゴン下で24時間室温にて反応を続行させた。真空ラインから反応混合物を除去し、50倍の余剰のコバルトEDTA（Kirschener, 無機合成(1957), p186）を溶液に付加した。余剰のルテニウム錯体を除去するためSephadex G-25 ゲルろ過カラムに対して溶液を加え、上述のとおり逆相HPLCによりさらに精製した。標準的技術によって２つのルテニウム修飾されたヌクレオチドをアニールし、特徴づけした（例５参照）。
【０１１１】
例２．５′末端にある電子伝達成分を伴った長い DNA２本鎖分子の合成
この例では、修飾されたプライマストランドのヌクレオチドの重合によって（Saiki et al., Science 239:487 (1988)）修飾された２重鎖 DNAを生成するために、インビトロ DNA増幅技術 PCR（Abramson et al., Curr. Op. in Biotech. 4:41-47 (1993) 内で再考されているもの）が使用される。互いに相補的でない長さ18塩基の２つのオリゴヌクレオチドが、例１にある通り、５′ヌクレオチドの２′−リボース位置に対するアミノ修飾を伴って合成される。
【０１１２】
40塩基で開始して増大する長さをもつ一連のオリゴヌクレオチドが、標準的な化学を用いて化学合成される。 PCR鋳型の各々は、１つの修飾された18マーと同一の５′配列を共有している。鋳型オリゴヌクレオチドの３′末端は、その他の18マーに対し相補的である１つの配列を共有する。
【０１１３】
PCRは、鋳型として未修飾ストランドを用いて修飾された18マーの各々の５′−３′ DNA合成の触媒作用によって、修飾された２重鎖 DNAを生成する。２つの修飾された18マーが各々 100ナノモルずつ、2000単位の Taqポリメラーゼ、各々 0.2Ｍのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、50mMの KCl, 10mMのトリス−Cl, pH8.8, 1.5mMのMgCl2,３mMのジチオトレイトール及び 0.1mg／mlのウシ血清アルブミンを含む１mlの水溶液中で混合される。長さ40塩基の１フエムトモルの鋳型ストランドが混合物に付加される。標本は変性のため１分間94℃で、又アニーリングのため55℃で２分間、そして延長のため72℃で３分間加熱される。このサイクルが、自動式サーマルサイクラーを用いて30回くり返される。
【０１１４】
両方の５′末端上に遷移金属錯体を伴う増幅された鋳型配列は、アガロースゲル電気泳動によって精製され、直接電子伝達の利用分野で使用される。
【０１１５】
例３．２重鎖 DNAのヌクレオチド間リンケージにおける共有結合した電子伝達成分の合成
この例においては、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルリンケージに対する代替的バックボーンが利用される。これらのヌクレオチド間リンケージ内に取り込まれた官能基は、電子伝達成分の共通結合付着のための部位として役立つ。これらの代替的ヌクレオチド間リンケージには、ペプチド結合、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合及びＯ−メチルホスホロアミデート結合が含まれるが、これらに限られるわけではない。
【０１１６】
ペプチド核酸(PNA）の調製は、選ばれた塩基（チミジン）の Boc防御されたペンタフルオロフェニルエステルの合成を伴って、文献の手順（Engholm 、前出）に従う。結果として得られる PNAは、CH2Cl2中の30％（体積）の DMF内の 0.1Ｍのチミニル単量体での単一カップリングプロトコルを用いて、Merrifieldの固相方法（Merrifield, Science, 232:341 (1986))を利用して調製することができる。反応の進捗は、定量的ニンヒドリン分析（Sarin, Anal. Biochem., 117:147 (1981))によって追跡される。結果として得られる PNAは、例１に概略説明されているように適当な遷移金属錯体で修飾できる。
【０１１７】
ホスホラミデートの合成（Beaucage、前出、Letsinger 、前出、Sawai 、前出）及びＮ−アルキルホスホラミデート（Jagar 、前出）ヌクレオチド間リンケージの合成は、わずかに修正を加えただけで標準的な文献の手順に従う（手順は、固体支持体への単一塩基の付加の後停止され、その後分割されてジヌクレオチドホスホラミデートを得る）。典型的な例は５′Ｏ−イソブチルオキシカルボニルチミジル−（３′−５′）−５′−アミノ−５′−デオキシチミジンのフェニルエステルの調製である（Letsinger. J. Org. Chem.,前出）。二量体ユニットは、立証済みの自動化された技術を用いて、 DNAの調製中に選ばれた間隔で標準的オリゴヌクレオチドに置換させられる。修飾されたリンケージの遷移金属修飾は、例１に記されたとおりに起こる。
【０１１８】
ホスオロチオエート及びホスホロジチオエートの合成（Eckstein、前出、及びその中の参考文献）のヌクレオチド間リンケージの合成は、充分に文献にて証明されている。公表された１つのプロトコルでは、テトラエチルチウラムジスルフィド（TETD）での硫化後キャッピングする修正されたＰ−シアノエチルホスホロアミジットサイクルを用いたApplied Biosystemsの DNA合成装置が利用される（Iyer. J. Org. Chem. 55:4693 (1990)）。ホスホチエート及びホスホロジチオエート類似体は２量体として調製され、固体支持体から分割され、HPLC（アセトニトリル／酢酸トリエチルアンモニウム、流動相）によって精製される。
【０１１９】
例４．各々５′末端に電子伝達成分を伴う２つのオリゴヌクレオチドの合成
この例においては、介在配列無しで単一の標的配列にハイブリッド形成する２つのオリゴヌクレオチドが作られる。１つのオリゴヌクレオチドは、５′末端に共有結合によって付着された１つの電子供与体成分を有し、もう１つのオリゴヌクレオチドは、５′末端に共有結合によって付着された電子受容体成分を有する。この例においては、電子伝達種はウラジンヌクレオチドを介して付着されているが、当業者であれば、この方法があらゆるヌクレオチドを修飾するのに用いることができる、ということを理解することだろう。さらに当業者は、この手順が８マーの生成に限定されず、さまざまな長さのオリゴヌクレオチドプローブの生成に有用であるということを認識することになるだろう。
【０１２０】
この手順は、生成された８−マーが互いに相補的でなく、その代り16ヌクレオチドの標的配列に対して相補的であるという点を除いて、例１に示されているものと全く同じである。従って、例１のステップ４の最終的アニーリング段階は行なわれない。その代り、２つの修飾されたオリゴヌクレオチドは標的配列にアニールされ、結果として得られる複合体は例５の場合と同様に特徴づけされる。
【０１２１】
例５．修飾された核酸の特徴づけ
酵素による消化
例１の修飾されたオリゴヌクレオチドを、立証されたプロトコルを用いて酵素的消化に付し、ホスホジエステラーゼ及びアルカリ性ホスファターゼを用いた逐次的反応によりそれらを構成するヌクレオシドに変換した。実験により得られた総合的HPLCグラフ及び消化されたオリゴヌクレオチドの紫外線−可視光線 (UV-vis）スペクトルを標準（２′−アミノウリジン及び２′−アミノアデニンを含む）と比較することにより、予想された保持時間及び特徴的UV-visスペクトルにおけるアミノ修飾された塩基の存在が確認された。遷移金属で修飾された２重鎖 DNAについて同じ手順が実施され、構成要素のヌクレオチドの割当てにより予測された部位での単一部位修飾が立証された。
【０１２２】
螢光標識付けされたアミノ修飾を受けたオリゴヌクレオチド
フルオロクロム、つまりフルオレセインイソチオシアネート（FITC）は、ヌクレオチド塩基上に存在するアミン又はアミドに対し結合しないものの修飾されたオリゴヌクレオチド上の第一アミンを標識づけするのに特異的であることが実証されてきた。（Haugland、螢光プローブ及び研究用化学薬品の手引き、第５版 (1992))。この反応は、例１で記述された通りに合成されたアミノオリゴヌクレオチドを用いて、２′−アミノ−リボース基が存在しない同一の塩基配列上で実施された。これらのオリゴヌクレオチドの両方について螢光分光測定値を収集した。結果は、５′末端リボース環上のアミンの存在を確認している。
【０１２３】
修飾された２重鎖 DNAの熱力学的融合曲線
２重鎖 DNAの熱力学パラメータを測定するための充分に立証された技術は、 DNA融解曲線の獲得である。修飾された２重鎖 DNAの濃度の関数としての１連の融解曲線を、当該技術分野において周知の技術を用いて、温度制御されたUV-vis（Hewlett-Packard)を介して測定した。これらの結果は、アミノ修飾及び遷移金属修飾を受けた DNAのハイブリダイゼーションが起こったことを確認している。さらにこれらの結果は、修飾された DNAが、未修飾のオリゴヌクレオチド標準の安定性と比較できる安定した２本鎖分子を形成するとい
うことを示している。
【０１２４】
２次元核磁気共鳴(NMR）分光学
Winkler et al., Chem. Rev. 92:369 〜379(1992) の中に、測定技術の優れた概覧を見い出すことができる。供与体はRu(bpy)2(NHウリジン）im, Ｅ0 −１Ｖであり、受容体はRu(NH3)4py(NH ウリジン）im, Ｅ0 − 330mVである。精製した遷移金属修飾を受けたオリゴヌクレオチド(UNHRu(bpy)21mGCATCGA 及び UNHRu(NH3)6(py)1mCGATGCA を、10分間60℃までpH6.8 (100mMのNaPi, 900mM のNaCl）中のオリゴヌクレオチド（30μモル：２mlの緩衝液中DNA 60nmoles）の等モル混合物を加熱し次に４時間にわたり室温までゆっくりと冷却することによって、アニールした。真空ラインへの取りつけのためのアダプター及び磁気撹拌棒の備わった不活性雰囲気キュベットへと、溶液を移した。溶液を数回脱ガスし、密封した器具にArガスをくり返し充てんした。
【０１２５】
XeClエクサイマー圧送された色素レーザーを用いた装備の一部として、器具全体をキュベットホルダー内に挿入し、データを、 360, 410, 460及び 480nmを含む複数の波長にて収集した。光誘導された電子伝達速度は、28Åの距離全体にわたり、 1.6×106 ｓ-1である。
【０１２６】
例６．２つの電子伝達成分で標識づけされた１本鎖核酸の合成
この例は、各々電子伝達成分が付着されている２つの修飾されたオリゴヌクレオチドを生成するため、前述の基本手順を使用する。２つの修飾されたストランドの互いに対する連結は、５′及び３′の標識づけされた末端、５′の標識づけされた末端及び内部ヌクレオチド標識、３′の標識づけ末端及び内部ヌクレオチド標識及び２重内部ヌクレオチド標識、という４つの構造のいずれかもつ２重標識づけされた核酸を産生する。具体的には、５′末端上の電子伝達供与体成分及び内部電子伝達成分を伴う長さ24塩基のオリゴヌクレオチドの合成について記述される。
【０１２７】
上で詳述した通り、１つのオリゴヌクレオチド「Ｄ」上のルテニウム（II）ビスビピリジンイミダゾール及び第２のオリゴヌクレオチド「Ａ」上のルテニウム（III ）テトラアミンピリジンを用いて、長さ12塩基の２つの５′−標識づけされたオリゴヌクレオチドの各々を 500ナノモルずつ合成する。
【０１２８】
５′→３′方向にオリゴヌクレオチド「Ａ」が続くオリゴヌクレオチド「Ｄ」の並置に対し相補的である長さ24塩基の未修飾オリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術によって生成する。 500ナノモルのこのハイブリダイゼーション鋳型を、 500mMのトリス−Cl,  pH7.5, 50mMのMgCl2 , 50mMのジチオトレイトール及び５mg／mlのゼラチンを含む５mlの水溶液中のオリゴヌクレオチド「Ａ」及び「Ｄ」の混合物に対して付加する。
【０１２９】
相補鎖に対する標識づけされたオリゴヌクレオチドの最大限のハイブリダイゼーションを促進するため、混合物を10分間60℃でインキュベートし、次に12℃の最終温度まで１時間につき約10℃の割合でゆっくりと冷却する。２つの標識づけされたストランドの酵素的連結は、その他の２本鎖分子に対する２重鎖 DNAの連結及びオリゴマー化（平滑末端連結）を防ぐため12℃でT4 DNAリガーゼを用いて達成される。代替的には、平滑末端連結を触媒しないことからE. coli  DNAリガーゼを使用することが可能である。
【０１３０】
アニールされた DNAに対し 100ワイス単位のT4 DNAリガーゼを付加し、 0.5mMの最終濃度までアデノシントリホスフェートを付加する。オリゴヌクレオチド「Ａ」の５′末端リン酸塩とオリゴヌクレオチド「Ｄ」の３′末端ヒドロキシル基の間のホスホジエステルリンケージの形成の触媒として作用する反応を12℃で18時間進行させる。10分間75℃での酵素の熱不活性化によって、反応を終結させる。２重に標識づけされたオリゴヌクレオチドを、前述の例と同様尿素の存在下でのHPLCにより一回標識づけされたオリゴヌクレオチド及び相補的な標識づけされていないオリゴヌクレオチドから分離させる。この例の２重に標識づけされたオリゴヌクレオチドは、以下で詳述されているように光活性遺伝子プローブとしての使用に理想的に適している。
【０１３１】
例７．相補的核酸配列の検出のための光活性プローブとしての、電子伝達成分を伴う２重に修飾されたオリゴヌクレオチドの使用
この例では、シグナル検出に先立つハイブリッド形成されていないプローブの除去が不要である独特のタイプの遺伝子プローブ検定において、例６のオリゴヌクレオチド24マーが利用される。検定手順においては、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（HIV-Ｉ）の gag遺伝子の１つの領域がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される（Saikiet al., Science 239;487-491 (1988)）。HIV-Ｉのこの領域は、異なる臨床的分離株の中で保存度の高いものである。
【０１３２】
例６の２重に標識づけされた24マープローブを50ナノモル含む６×SSC のハイブリダイゼーション溶液(0.9ＭのNaCl, 0.09Ｍのクエン酸Na, pH7.2)に対して、増幅された標的 DNA対HIV-Ｉ DNAの欠如した対照を付加する。穏やかに撹拌しながら10分間60℃でハイブリダイゼーションを進行させる。レーザー励起に続く電子伝達の検出を、例５にある通りに実施する。ハイブリッド形成されたプローブが欠如している対照の標本は、無視できる電子伝達速度を示す。 gag配列に対してハイブリッド形成されたプローブは、 DNA２重らせんを通して効率の良い高速電子伝達を示し、きわめて特異的で均質でかつ自動化可能なHIV-Ｉ検出検定を提供する。
【０１３３】
類似した１つの均質遺伝子プローブには、プローブが互いに突き合わさった縦列構造でHIV-Ｉの gag領域とハイブリッド形成する電子供与体及び電子受容体という２つのプローブの使用が関与する。この検定においては、２つの電子伝達成分の間の電子カップリングは完全に、標的 DNAとのハイブリダイゼーションに依存している。該当する場合、１つのプローブから他のプローブへの電子伝達は図６にあるようにT4 DNAリガーゼを用いた並置された末端の連結によって増強される。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、１本鎖核酸上の電子供与体(EDM）及び電子受容体(EAM）の考えられる配向を例示している。
【図２Ａ】図２Ａは、２つの隣接する１本鎖核酸上の電子伝達成分 EDM及び EAMの配向を例示している。これらの配向は、２つのプローブが介在配列によって分離されている場合にもあてはまる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２つの隣接する１本鎖核酸上の電子伝達成分 EDM及び EAMの配向を例示している。これらの配向は、２つのプローブが介在配列によって分離されている場合にもあてはまる。
【図３】図３は、オリゴヌクレオチド内への取込み前の一連のアミノ修飾されたヌクレオチド前駆体を例示している。
【図４】図４においてＡ及びＢは、電子伝達成分の構造を描いている。図４Ａは、代表的クラスの電子供与体及び受容体の一般構造式を示す。図４Ｂは、リガンドとしてヒスビピリジン及びイミダゾールを用いたルテニウム電子伝達成分の特定的一例を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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