(57)【要約】【課題】  微生物を固定化した微生物膜を利用して水中の有害物質を検出する際に、前記微生物膜内の微生物の活性を速やかに上昇させて安定した出力を短時間で得ることができ、水中に含まれる遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を正確かつ簡便に検出することができる有害物質検出方法を提供する。【解決手段】  微生物に発光遺伝子を導入した組換え微生物を固定化した微生物膜を用い、前記微生物の発光反応による発光量から試料水中の有害物質を検出する有害物質検出方法において、通常は消光しており、遺伝子損傷性物質が存在すると発光する遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜と、通常は発光しており、生育阻害物質が存在すると消光する生育阻害物質検出用微生物を固定化した生育阻害物質検出用微生物膜の少なくとも２種類の微生物膜を試料水に接触させる前に、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分濃度が高い培養液中で加温する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物に発光遺伝子を導入した組換え微生物を固定化した微生物膜を用い、前記微生物の発光反応による発光量から試料水中の有害物質を検出する有害物質検出方法であって、
通常は消光しており、遺伝子損傷性物質が存在すると発光する遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜と、通常は発光しており、生育阻害物質が存在すると消光する生育阻害物質検出用微生物を固定化した生育阻害物質検出用微生物膜の少なくとも２種類の微生物膜を試料水に接触させる前に、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分濃度が高い培養液中で加温することを特徴とする有害物質検出方法。
【請求項２】
前記培養液は、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分を２〜４倍の濃度で含むものである請求項１記載の有害物質検出方法。
【請求項３】
前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、遺伝子損傷性物質によりDNAが損傷を受けたときに発現されるSOS遺伝子とその下流に配置されたルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子により形質転換された微生物を用い、前記生育阻害物質検出用微生物として、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換された微生物を用いる請求項１又は２記載の有害物質検出方法。
【請求項４】
前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、プラスミドpSK1002由来のumuD,C遺伝子の下流に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用い、
前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターに、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いる請求項１〜３のいずれか一つに記載の有害物質検出方法。
【請求項５】
前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のORF内に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いる請求項４記載の有害物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上下水道の各処理プロセスの処理水、河川及び湖沼等の環境水、廃棄物埋立最終処分場の浸出水、産業廃棄物の溶出水、工業排水等に含まれる有害物質を検出するのに好適な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には６〜１０万種もの人為的に合成された化学物質や、トリハロメタン等の消毒副生成物、ダイオキシン等の燃焼副生成物といった非意図的生成物質、更には環境中での変化体等の数多くの化学物質が存在しており、これらの化学物質の中には、急性毒性、発ガン性、変異原性等を有する有害物質が数多くある。
【０００３】
通常、環境水中における上記のような化学物質の濃度はごく微量であると考えられるが、このような環境水を水道原水とする浄水場においては、人体への影響の観点からより高度な水質の連続監視が求められている。
【０００４】
また、下水処理場、廃棄物最終処分場、化学薬品を使用する工場等から排出される廃水には様々な化学物質が含まれているが、最終的には河川等の環境中に排出されるため、通常、オゾン処理や生物処理、活性炭処理等により、安全基準値以下にまで化学物質を分解あるいは除去してから放流されている。そのため、廃水処理プロセスが適切に稼動し、水中の有害物質が除去されているかどうかを監視して、各処理プロセスの評価結果を処理プロセスにフィードバックし、更には処理施設の改善等の措置を講じる必要がある。
【０００５】
従来より、水中の有害物質を監視する手段として、魚類の活動電位又は異常行動を監視する方法や、硝化細菌を利用した急性毒物モニタ等の有害物質検出方法が知られているが、これらの方法では、発ガン性、変異原性等を有する有害物質（本発明では、このような有害物質を遺伝子損傷性物質という。）の蓄積による発ガン性、遺伝毒性、慢性毒性までは評価することができなかった。
【０００６】
また、発ガン性物質の一次選別法として、例えば、umuテストやSOSクロモテスト等の微生物を用いた遺伝子損傷性試験法が知られているが、操作が煩雑、検出感度が低い、高価な発色試薬が必要である等の問題があり、環境水等に含まれる有害物質を検出する方法としてはあまり実用的であるとは言えなかった。
【０００７】
上記のような問題を解決するため、下記特許文献１には、DNAの損傷に対して感受性のSOS遺伝子の下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子を配置した組換え遺伝子により形質転換された微生物を利用して、遺伝子損傷性物質を検出する方法が開示されている。
【０００８】
また、下記特許文献２には、排水から採取した試料水に試供菌体を添加した後、この菌体内のATP濃度の変化から当該排水中の有害物質を検知する有害物質検知方法において、前記試供菌体は、大腸菌（Escherichiacoli）またはサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）であることを特徴とする有害物質検知方法が開示されている。
【０００９】
また、下記特許文献３には、試料と供試菌体とを混合してから一定時間反応させた後、これにATP抽出試薬を注入してから、さらに、これに発光試薬を注入することで生じた光の発光量を計測する工程と、ブランクと供試菌体とを混合してから一定時間反応させた後、これにATP抽出試薬を注入してから、さらに、これに発光試薬を注入することで生じた光の発光量を計測する工程と、前記二つの工程で得られた計測値を比較することで、試料における有害物質の有無を確認する工程とを有する有害物質監視装置であって、被発光量測定試料から発した光を検出するセンサーを備え該試料が供給されるフローセルの一次側経路に、試料とブランクのいずれかを供給するバルブ手段を備え、さらに、このバルブ手段の二次側に、供試菌体供給路と、ATP抽出試薬供給路と、発光試薬供給路と、を備えたことを特徴とする有害物質監視装置が開示されている。
【００１０】
また、本発明者らは、SOS遺伝子と発光遺伝子からなる組換え遺伝子により形質転換した遺伝子損傷性物質検出用微生物と、常時ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子により形質転換された生育阻害物質検知用微生物をそれぞれ微孔性膜上に固定化した２種類の固定化微生物膜を用い、各微生物の発光の有無を測定することにより、試料水中の遺伝子損傷性物質及び生育阻害物質を検出する方法を提案している（特願２００２−３４１７６４号）。
【特許文献１】特許第３２７７４２６号公報
【特許文献２】特開２００１−２３１５９８号公報
【特許文献３】特開２００２−３６５２２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記特許文献１に記載された方法では、試験操作において微生物の培養や分注、希釈等を行う必要があるため測定操作が煩雑であるだけでなく、前記形質転換された微生物は遺伝子損傷性物質が存在する場合に発光するが、微生物に対して生育阻害作用を示し、発光反応を阻害するような有害物質（本発明では、このような有害物質を生育阻害物質という。）、例えば、呼吸阻害物質等が共存すると該微生物の代謝が低下して発光しない場合もあるため、試料水の異常を見逃してしまう恐れもあった。
【００１２】
また、上記特許文献２、３に記載された方法では、生育阻害物質の検出は可能であるが、発ガン性、遺伝毒性、慢性毒性と関連のある遺伝子損傷性物質を検出することはできなかった。更に、測定毎に新たに供試菌体及びATP抽出試薬を補充しなければならず、操作が煩雑であり、また、コストが高くなってしまうという問題もあった。
【００１３】
一方、本発明者らが提案している固定化微生物膜を利用した検出方法は、検出感度や簡便性等の点で優れているが、例えば、連続的なモニタリングを行う場合には、固定化微生物膜内の微生物の活性低下等の理由により定期的な交換が必要になるため、新しい固定化微生物膜を常にストックしておく必要がある。通常、上記の固定化微生物膜は、製作してから使用するまでの間、冷蔵、冷凍あるいは凍結乾燥等により保存され、直前に復元して使用されるが、復元直後の固定化微生物膜は微生物の活性が低下しているため、微生物の活性が戻り、安定した出力を得るまでに時間がかかってしまうという問題があった。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、微生物を固定化した微生物膜を利用して水中の有害物質を検出する際に、前記微生物膜内の微生物の活性を速やかに上昇させて、安定した出力を短時間で得ることができ、水中に含まれる遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を正確かつ簡便に検出することができる有害物質検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明の有害物質検出方法は、微生物に発光遺伝子を導入した組換え微生物を固定化した微生物膜を用い、前記微生物の発光反応による発光量から試料水中の有害物質を検出する有害物質検出方法であって、通常は消光しており、遺伝子損傷性物質が存在すると発光する遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜と、通常は発光しており、生育阻害物質が存在すると消光する生育阻害物質検出用微生物を固定化した生育阻害物質検出用微生物膜の少なくとも２種類の微生物膜を試料水に接触させる前に、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分濃度が高い培養液中で加温することを特徴とする。
【００１６】
本発明の有害物質検出方法によれば、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した微生物膜及び前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した微生物膜を、前記試料水に接触させる前に、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分濃度が高い培養液中で加温することにより、前記各微生物膜内の微生物の活性を速やかに上昇させることができる。その結果、保存等により活性の低下した微生物膜の復元を効率よく行うことができ、微生物膜を交換した際などに、安定した出力を短時間で得ることができ、迅速に試料水中の有害物質を検出することができる。
【００１７】
本発明においては、前記培養液は、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分を２〜４倍の濃度で含むものであることが好ましい。この態様によれば、保存などにより活性が低下した上記微生物膜内の微生物を非常に効率よく活性化することができる。
【００１８】
また、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、遺伝子損傷性物質によりDNAが損傷を受けたときに発現されるSOS遺伝子とその下流に配置されたルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子により形質転換された微生物を用い、前記生育阻害物質検出用微生物として、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換された微生物を用いることが好ましい。
【００１９】
この態様によれば、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物は、該微生物のDNAが損傷を受けると、SOS応答と共にルシフェラーゼ及びその基質が合成されて発光するので、その発光量を測定することにより、試料水中の遺伝子損傷性物質を容易に検出することができる。一方、前記生育阻害物質検出用微生物は、試料水中の生育阻害物質によって、その代謝活性が低下すると、ルシフェラーゼ活性が低下して発光が弱くなる（あるいは消光する）ので、その発光量を測定することにより、試料水中の遺伝子損傷性物質を容易に検出することができる。
【００２０】
また、本発明においては、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、プラスミドpSK1002由来のumuD,C遺伝子の下流に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用い、前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターに、ビブリオ・フィシェリ（Vibriofischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いることが好ましい。
【００２１】
更に、本発明においては、前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のORF内に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いることが好ましい。
【００２２】
これらの態様によれば、遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物を簡単に作成することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の有害物質検出方法によれば、遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した微生物膜及び前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した微生物膜を、前記試料水に接触させる前に、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分濃度が高い培養液中で加温することにより、凍結保存等により活性の低下した前記微生物膜内の微生物の活性を速やかに上昇させ、安定した出力を短時間で得ることができる。その結果、微生物膜を交換した際などに迅速に試料水中の有害物質を検出することができるので、有害物質を安定して連続的にモニタリングすることが可能となり、各処理プロセスの評価結果を処理プロセスにフィードバックし、更には処理施設の改善などの措置を講じることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明で用いられる遺伝子損傷性物質検出用微生物は、遺伝子損傷性物質に依存して発光する組換え遺伝子により形質転換された微生物であり、通常は消光しているが、遺伝子損傷性物質により微生物のDNAが損傷を受けると発光する。
【００２５】
具体的には、DNAの損傷に対して感受性のSOS遺伝子の下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子を配置した組換え遺伝子により形質転換された微生物が例示できる。この遺伝子損傷性物質検出用微生物は、遺伝子損傷性物質により該微生物のDNAが損傷を受けると、SOS遺伝子の発現と同時にルシフェラーゼ活性を有する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子も発現される。その結果、ルシフェラーゼ活性の基質が菌体内で連続的に供給される条件が達成され、ルシフェラーゼによる連続的な発光反応が起こるので、この発光を測定することにより、例えば、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、２−アミノアントラセン、ベンゾ（ａ）ピレン、１−ニトロピレン、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド等の遺伝子損傷性物質を検出、測定することができる。
【００２６】
すなわち、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物においては、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子をDNAの損傷に依存して発現させるための発現制御手段としてSOS遺伝子を利用するものである。したがって、SOS遺伝子はDNA損傷時に発現されるものであればよく、SOSボックスと称する制御部分を含有するものであればよい。なお、本発明においてDNA損傷時に発現されるSOS遺伝子とは、前記SOSボックスと称される制御部分を含有するものを意味し、SOSボックス自体でもよく、またこれを含有する任意のDNA断片であってもよい。
【００２７】
SOS遺伝子としては、umu遺伝子、例えばumuD遺伝子及びumuC遺伝子、並びにsfiA遺伝子等が例示できるがこれらに限定されない。例えば、umuD，umuC遺伝子は、Pro. Natl. Acad. Sci. USA Vol.82, 4336-4340 (1985)に記載されており、その記載に基いて容易に入手することができる。本発明においては、umuD遺伝子並びにumuC遺伝子の一部とlacZ遺伝子との融合遺伝子を、プラスミドベクターpBR322に導入したプラスミドpSK1002由来のSOS遺伝子が好ましく用いられる。プラスミドpSK1002は、H. Shinagawaら、Gene, 23, 167 (1983)に記載されており、その記載に基いて容易に入手することができる。
【００２８】
一方、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子としては、SOS遺伝子の制御下でその両遺伝子群が発現されるものであればよく、特に限定されないが、例えば、海洋細菌の生物発光遺伝子群を用いることができる。上記性質を有する生物発光遺伝子群を持つ海洋細菌としては、ビブリオ（Vibrio）群のビブリオ（Vibrio）属では、ビブリオ・ハーベイ（V.harveyi）、ビブリオ・フィシェリ（V. fischeri）、ビブリオ・スプレンディドゥス（V. splendidus）、ビブリオ・コレラ（V.cholerae）等が挙げられる。また、フォトバクテリウム（Photobacterium）属では、フォトバクテリウム・ホスホリウム（P.phosphoreum）、フォトバクテリウム・レイノクナシ（P. leiognathi）等が挙げられる。本発明においては、ビブリオ・フィシェリ（V.ficsheri）由来の生物発光遺伝子群（luxA,B,C,D,E）が好ましく用いられる。このビブリオ・フィシェリ（V. ficsheri）由来の生物発光遺伝子群は、リポーター遺伝子として使い易くするために、生物発光遺伝子群のオペレーター領域を取り除き、構造遺伝子部分（ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子群及びその基質であるアルデヒドの生産を触媒する酵素である脂肪酸リダクターゼ活性を発現する遺伝子群）だけを含む種々のカセットベクター、例えば、pUCD320, pUCD613, pUCD614, pUCD618, pUCD620, pUCD623, pUCD1111等が報告されている。これらのカセットベクターについては、Clarence I. Kadoら、Plant Molecular Biology Reporter, 5, 225 (1987)に記載されており、これらのベクターから生物発光遺伝子群の構造遺伝子部分を容易に入手することができる。
【００２９】
なお、本発明において、ルシフェラーゼ活性の基質とは長鎖アルデヒド等を意味し、これらの生産を触媒する酵素とは、NAD(P)H−FMN還元酵素、脂肪酸リダクターゼ等を意味する。また、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素の遺伝子は同一の起源のものを用いてもよく、異なる起源のこれらの遺伝子を連結して用いてもよい。
【００３０】
SOS遺伝子と、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子は、SOS遺伝子のSOSボックスを少なくとも含有するDNA断片の該SOSボックスより下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子群を連結することにより作製することができる。この連結は、DNAリガーゼを用いて常法にしたがって行うことができる。また、この組換え遺伝子を宿主微生物に導入するためには、上記組換え遺伝子はベクター中に存在する必要があり、例えば、プラスミドベクターとしては、pBR系プラスミド、pUC系プラスミド等を利用することができる。
【００３１】
宿主微生物としては、該微生物のDNAが遺伝子損傷性物質により損傷された際にSOS遺伝子を発現させることができる微生物、すなわちSOS機能を有する微生物であれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Escherichiacoli）、サルモネラ菌（Salmonella typhimurium）、酵母（Saccharomycescerevisiae）等が挙げられる。本発明においては、TA1535株、TA1538株等のサルモネラ菌が好ましく用いられる。
【００３２】
発現ベクターにより宿主微生物を形質転換する方法は、例えば細菌の形質転換に用いられる常法にしたがって該組換え遺伝子を含有する発現ベクターを宿主微生物に導入すればよい。
【００３３】
一方、本発明で用いられる生育阻害物質検出用微生物は、常時発光する組換え遺伝子により形質転換された微生物であり、通常は発光しているが、生育阻害物質により微生物の活性が低下すると発光が弱くなるあるいは消光する。
【００３４】
具体的には、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換された微生物が例示できる。この生育阻害物質検出用微生物は、通常の状態ではルシフェラーゼによる連続的な発光反応が起こっている。したがって、生育阻害物質によって、該微生物の代謝活性が低下すると、ルシフェラーゼによる発光反応が低下するので、この発光状態を測定することにより、例えば、シアン化カリウム、フェノール、２，４−ジクロロフェノール、塩化水銀等の生育阻害物質を検出、測定することができる。
【００３５】
すなわち、本発明で用いられる生育阻害物質検出用微生物においては、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子は、これらの遺伝子が常時発現するような発現制御手段の下に配置されている。このような発現制御手段としては、大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonellatyphimurium）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）等の微生物内でタンパク質を発現させるために用いられる種々の発現ベクターを用いることができ、例えば、プラスミドベクターとしては、pBR系プラスミド、pUC系プラスミド等を利用することができる。本発明においては、プラスミドベクターpBR322が好ましく用いられる。プラスミドベクターpBR322は、例えばタカラバイオ株式会社、東洋紡績株式会社、株式会社ニッポンジーン等から入手することができる。
【００３６】
また、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子は、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物で説明したものと同様のものが用いられる。
【００３７】
ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子は、常法にしたがって上記のような発現ベクターのクローニングサイトに、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子群を組込むことにより作製することができる。本発明においては、pBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のORF内に組込むことが好ましい。
【００３８】
このようにして作製された組換え発現ベクターは、常法にしたがって、宿主微生物に導入すればよい。なお、宿主微生物としては、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物で説明したものと同様のものが用いられ、TA1535株、TA1538株等のサルモネラ菌が好ましく用いられる。
【００３９】
本発明においては、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物は、これらの微生物が漏出せず、かつ少なくとも試料水中の溶解化学物質、栄養成分及び酸素が透過できるポアサイズと親水性を有する微孔性膜と、該微生物からの発光を透過できる光透過性膜との間に薄膜状に固定化した微生物膜として用いられる。
【００４０】
図１には、微生物膜の一例が示されている。この微生物膜５は、微孔性膜２と光透過性膜３がドーナツ状の両面テープ４によって張り合わされたものであり、その中心部には、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物又は生育阻害物質検出用微生物１が薄膜状に固定化されている。
【００４１】
上記微孔性膜としては、ポアサイズ0.2〜0.4μmのセルロース、ニトロセルロース、ポリカーボネート等の材質からなる膜を用いることができ、通常、厚さ10μm程度のものが用いられる。
【００４２】
また、上記光透過性膜としては、ポリエチレン、塩化ビニル等の材質からなり、厚さが30〜100μmである透明又はそれに近い膜が用いられる。
【００４３】
このような微生物膜は、例えば以下のようにして作製することができる。すなわち、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物又は生育阻害物質検出用微生物を常法にしたがって培養し、得られた培養液を遠心して上澄み液を除去した後、1%アルギン酸ナトリウム水溶液を適量加えて懸濁し、菌体懸濁液を得る。
【００４４】
次いで、微孔性膜２の中心部に、上記菌体懸濁液を滴下して、余剰のアルギン酸ナトリウム水溶液を吸引除去した後、更に塩化カルシウム水溶液（30g/L）を適量滴下して、余剰の塩化カルシウム水溶液を吸引除去し、菌体を固定化した面を内側にして、ドーナツ状の両面テープ４を介して光透過性膜３と張り合わせる。そして、最後に塩化カルシウム水溶液（30g/L）に浸漬し、アルギン酸ナトリウムを完全にゲル化させて菌体を固定化すればよい。
【００４５】
このようにして作製した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜は、使用するときまで、保存液（TGA培地85%、グリセロール15%）に浸漬し、−20℃以下で凍結保存することができる。
【００４６】
本発明においては、上記のようにして凍結保存した微生物膜は、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分濃度が高い培養液中で加温（活性化）してから使用される。
【００４７】
上記の通常微生物を培養する培養液とは、一般細菌、主として従属栄養細菌の増殖を図るための増殖培地であって、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物の培養に用いることが可能な培養液を意味し、有機炭素源としてグルコース、スクロース、フルクトース等を含有し、有機窒素源としてアミノ酸や牛肉エキス、タンパク質の加水分解物（トリプトン、ペプトン、酵母エキス等）を含有する増殖培地が挙げられる。具体的には、（１）Nutrient Broth（ニュートリエントブロス）：肉エキス5g、ペプトン10g、NaCl 5g、純水1L、（２）LB培地：トリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl 5g、純水1L、（３）ペプトン培地：ペプトン5g、純水1L、（４）ペプトン酵母エキス：ペプトン5g、酵母エキス1g、硫酸第二鉄0.01g、純水1L、（５）Nutrient Broth No.2（ニュートリエントブロスNo.2）：ペプトン10g、牛肉エキス10g、NaCl 20g、純水1L、（６）最小ブドウ糖寒天平板培地：硫酸マグネシウム７水和物0.2g、クエン酸１水塩2g、リン酸水素２カリウム10g、リン酸１アンモニウム1.92g、水酸化ナトリウム0.66g、グルコース20g、寒天15g、純水1L、（７）TGA培地（トリプトン10g、グルコース2g、NaCl 5g、純水1L）等が例示できる（新版微生物学実験法、講談社、p303〜304、及び上水試験方法（解説編）、日本水道協会、p926, p932 参照）。なお、上記各培地は、他の微生物の増殖を防ぐためにアンピシリンナトリウム等の抗生物質を含むことができる。本発明においては、TGA培地が最も好ましく用いられる。
【００４８】
また、通常微生物を培養する培養液よりも栄養成分濃度が高い培養液とは、上記の培養液中に含まれる有機炭素源及び／又は有機窒素源を通常よりも高い濃度で含む培養液を意味する。本発明においては、微生物膜の活性化に用いる培養液として、有機炭素源及び／又は有機窒素源を通常の培養液よりも、好ましくは２〜４倍の濃度、より好ましくは２〜３倍の濃度、特に好ましくは２倍の濃度で含むものが用いられる。例えば、TGA培地の場合は、好ましくはトリプトン2〜4質量%、グルコース0.4〜0.8質量%含むもの、より好ましくはトリプトン2〜3質量%、グルコース0.4〜0.6質量%含むもの、特に好ましくはトリプトン2質量%、グルコース0.4質量%含むものが用いられる。栄養成分濃度が低過ぎると微生物膜の活性化に時間がかかり、高すぎると微生物の増殖に対し阻害的又は毒性を示し、微生物膜の活性が下がってしまうため好ましくない。
【００４９】
また、加温（活性化）条件は、20〜40℃、好ましくは35〜40℃で、1〜3時間加温することが好ましい。
【００５０】
図２には、本発明の方法を実施するために用いられる有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器の一実施形態を示す断面図が示されている。
【００５１】
このサンプル容器３０は、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａを有する微生物膜セル２７ａと生育阻害物質検出用微生物膜５ｂを有する微生物膜セル２７ｂがＯリング２３を介してそれぞれサンプルセル２１の底面に設けられた微生物膜セル保持部にねじ込まれ、容易に脱着できるようになっている。また、サンプルセル２１の上面にはサンプルセル蓋１０が取り付けられており、該サンプルセル蓋１０には、試料水及び培養液を注入するための試料注入口１１と、培養液と試料水の撹拌及び微生物膜内の微生物へ酸素供給を行うためのエア注入口１２及びエア排出口１３が設けられており、エア排出経路には図示しないフィルター（通常、0.22μmのフィルター）が設けられている。なお、培養液と試料水の撹拌及び微生物膜内の微生物への酸素供給は、撹拌翼やマグネティックスターラーによる撹拌によって行うこともできる。
【００５２】
この例においては、前記各微生物膜セル（２７ａ、２７ｂ）は、微生物膜ホルダー２４、微生物膜（５ａ又は５ｂ）、Ｏリング２２、微生物膜押さえ２５及びネジ２６とから構成されている。そして、前記微生物膜（５ａ又は５ｂ）は、その微孔性膜側が試料水に接触し、光透過性膜側が光検出器側（図中下方向）にあるように前記微生物膜ホルダー２４内に配置され、前記Ｏリング２２を介して前記微生物膜押さえ２５を前記ネジ２６で前記微生物膜ホルダー２４に固定することにより、微生物ホルダー２４内に固定されている。なお、前記微生物膜ホルダー２４は、微生物膜を保持すると共に、微生物膜が培養液及び試料水に接触し、かつ微生物膜の発光状態を測定できるように中空構造となっている。また、前記微生物膜押さえ２５も同様に微生物膜の発光状態を測定できるように中心部に所定の大きさの穴が設けられている。
【００５３】
図３には、上記サンプル容器３０を有するセンサユニットを用いた有害物質検出装置の概略構成図が示されており、（ａ）は上面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。
【００５４】
この有害物質検出装置４０は、操作手順や測定結果を表示する表示部３１を有し、外光の侵入がない遮光可能な恒温槽３２内に、微生物膜が取付けられた複数個のサンプル容器３０が設置され、各サンプル容器の下側に微生物膜の発光を検出するための光検出器３３がそれぞれ設置されることによりセンサユニットが構成されている。また、サンプル容器３０にエアを送り、エアレーションによる培養液及び試料水の撹拌と微生物への酸素供給を行うことができるようにエアポンプ３４が設置されている。なお、前記光検出器３３は、各サンプル容器３０の底面に取り付けられた微生物膜の光透過性膜と光検出器の受光面とが向き合うように、その受光面を上向きにして設置されている。
【００５５】
上記光検出器としては、光電子増倍管やフォトダイオード等の公知の検出手段を採用することができる。また、有害物質検出装置４０は、上記以外に、測定条件や操作を制御する制御手段や光検出器の出力に基づいて有害物質の有無を判定する演算手段等を備えている。
【００５６】
次に、上記有害物質検出装置４０を用いた本発明の有害物質の測定方法を、図４に示すフローチャートに基づいて説明する。
【００５７】
まず、有害物質装置４０の電源を入れ、ウォーミングアップし、恒温槽３２を所定温度（37℃）になるまで加温する。恒温槽３２が設定温度に到達するとスタンバイ状態となるので、OKキーを押す。そして、測定準備段階として、冷凍保存された、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａを取り付けた微生物膜ホルダー２７ａと生育阻害物質検出用微生物膜５ｂを取り付けた微生物膜ホルダー２７ｂをそれぞれサンプルセル２１に取り付けると共に、サンプルセル蓋１０も取り付けてサンプル容器３０を構築した後、サンプルセル蓋１０の試料注入口１１から、通常の培養液よりも栄養成分を好ましくは２〜４倍の濃度、より好ましくは２〜３倍の濃度、特に好ましくは２倍の濃度で含む培養液をシリンジ等で注入する。そして、サンプル容器３０を有害物質検出装置４０の恒温槽３２内に設置し、サンプルセル蓋１０のエア注入口１２及びエア排出口１３にそれぞれエアポンプ３４の配管とエア排出管を接続した後、恒温槽３２の蓋を閉めて、測定準備ができたら再度OKキーを押す（ステップＳ１）。
【００５８】
次に、活性化キーを押すと、エアポンプ３４が作動し、所定温度（37℃）に温められたエアがサンプル容器３０内に送られ、培養液を撹拌すると共に微生物膜内の微生物に酸素を供給する。そして、所定時間（1〜3時間）経過後、逆流を防ぐためにエアポンプ３４が停止する。このステップで、微生物膜を所定温度で所定時間保温することにより、冷凍保存により活性が低下した微生物を効率よく短時間で活性化させることができる（ステップＳ２）。
【００５９】
次に、この状態で、試料注入口１１から試料水をシリンジ等で注入し、微生物の応答（発光反応）を見て、問題がなければOKキーを押す（ステップＳ３）。
【００６０】
そして、再び恒温槽３２の蓋を閉めて測定キーを押すと、恒温槽３２の設定温度が測定に適した温度（好ましくは30℃）に切り替わると同時に、エアポンプ３４が作動し、所定温度に温められたエアがサンプル容器３０内に送られ、培養液を撹拌すると共に微生物膜内の微生物に酸素を供給する。また、前記微生物膜の発光を測定するため光検出器３３がオンとなり、各微生物膜の発光量をセンサ出力として経時的に収集しはじめる（ステップＳ４）。
【００６１】
設定時間経過後、光検出器３３とエアポンプ３４がオフとなり、測定が終了すると共に、収集したセンサ出力の結果から試料水が正常であるか、又は試料水中に遺伝子損傷性物質が存在するか、生育阻害物質が存在するかが判定され、表示部３１に表示される。こうして測定が終了した後、本体電源をＯＦＦにする（ステップＳ５）。
【００６２】
上記判定は以下のようにして行われる。すなわち、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜の発光量が設置値よりも小さく、生育阻害物質検出用微生物膜の発光量が設定値よりも大きい場合は試料水が正常であると判定される。一方、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜の発光量が設定値を超え、生育阻害物質検出用微生物膜の発光量が設定値よりも大きい場合は試料水中に遺伝子損傷性物質が混入していると判定される。また、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜の発光量が設置値よりも小さく、生育阻害物質検出用微生物膜の発光量が設定値よりも下回った場合は試料水中に生育阻害物質が混入していると判定される。
【実施例１】
【００６３】
（１）遺伝子損傷性物質検出用微生物
特許第３２７７４２６号公報に記載された方法にしたがって、遺伝子損傷性物質検出用微生物を作製した。
【００６４】
すなわち、SOS遺伝子として、大腸菌（CSH26「Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972」：F- ara del(lac-pro)thi）に導入されたプラスミドpSK1002のumuD,C遺伝子を利用した。
【００６５】
また、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子としては、大腸菌（HB101：hsd20 (rB -, mB -）, recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, supE44）に導入されたプラスミドpUCD620（Clarence I. Kadoら、Plant Molecular Biology Reporter, 5, 225 (1987)）の発光遺伝子群を利用した。
【００６６】
導入する微生物として、サルモネラ菌（TA1535「Ames, B. N., J. McCann, E. Yamasaki, Mutation Res., 31, 347, 1975」：hisG46, Δgal, Δchl, Δbio, ΔuvrB, rfa-, SJ10002：r-, m+）を利用した。
【００６７】
（i）SOS遺伝子の調製
プラスミドpSK1002を含む大腸菌（CSH26）を、アンピシリンを含むLB培地（バクトトリプトン（商品名）1質量%、酵母エキス0.5質量%、NaCl 1質量%）で培養し、アルカリ抽出法「Birnboim, H. C., Doly, J., Nucl. Acids Res., 11, 1513, 1979」によって、pSK1002を大量に調製した。このプラスミドpSK1002をSalI及びSmaIで切断し、umuD,C遺伝子を含む約7.5kbのSalI−SmaI DNA断片を得、このDNA断片を、T4 DNAリガーゼにより連結し、常法に従い大腸菌（DH5）を形質転換した。
【００６８】
得られた形質転換体からアルカリ抽出法によりプラスミドを単離し、このプラスミドをMluIで切断後、T4DNAポリメラーゼにより平滑末端化した。
【００６９】
一方、umuCに対して終止コドンとして働き、かつBamHIサイトを持つ配列番号１に示すDNAリンカーを化学合成した。
【００７０】
そして、上記DNAリンカーと、前記MluI DNA断片をT4 DNAリガーゼにより連結し、常法に従い大腸菌（DH5）を形質転換した。得られた形質転換体からアルカリ抽出法によりプラスミドを抽出し、このプラスミドをBamHI及びSalIで切断して、umuD,C遺伝子を含む約7.4kbのBamHI−SalI DNA断片を得た。
【００７１】
（ii）発光遺伝子群の調製
プラスミドpUCD620を含む大腸菌（HB101）を、アンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、アルカリ抽出法によってpUCD620を大量に調製した。プラスミドpUCD620をBamHI及びSalIで切断し、発光遺伝子群を含む約7.5kbのBamHI−SalI DNA断片を得た。
【００７２】
（iii）SOS遺伝子と発光遺伝子群との連結及び発光ベクターのクローニング
上記発光遺伝子群を含むBamHI−SalI DNA断片（約7.5kb）と、前記umuD,C遺伝子を含むBamHI−SalI DNA断片（約7.4kb）をT4 DNAリガーゼにより連結し、発光ベクター（pTL210）を構築した。
【００７３】
大腸菌（SJ10002）をLB培地で一夜培養し、LB培地に、1/100容量の前記培養液を加え、600nmにおける濁度（OD６００）が約0.4になるまで培養した。
【００７４】
この培養液5mlを遠心分離し、沈澱画分を5mlの30mM CaCl２水溶液に懸濁し、45分間氷中に放置した後、再度遠心分離を行い、菌体を0.4mlの30mM CaCl２水溶液に懸濁し、大腸菌（SJ10002）のコンピテントセルを調製した。
【００７５】
大腸菌（SJ10002）のコンピテントセル100μlに、前記発光ベクター（pTL210）約200ngを加え、30分間氷中に放置した。42℃で2分間処理した後、室温にて5分間放置した。LB培地1mlを加え、37℃で1時間インキュベートした。この液を、アンピシリン50μg/mlを含むLBプレートに播種して得られたSJ10002の形質転換体から、前記発光ベクター（pTL210）をアルカリ抽出法で調製した。
【００７６】
（iv）形質転換体の調製
サルモネラ菌（TA1535）をLB培地で一夜培養し、LB培地に、1/100容量の前記培養液を加え、OD６００が約0.4になるまで培養した。この培養液5mlを遠心分離し、沈澱画分を5mlの10mM CaCl２、10mM MnCl２、10mM MgCl２水溶液に懸濁し、45分間氷中に放置した後、再度遠心分離を行い、菌体を0.4mlの10mM CaCl２、10mM MnCl２、10mM MgCl２水溶液に懸濁し、サルモネラ菌（TA1535）のコンピテントセルを調製した。
【００７７】
そして、前記と同様の方法で、サルモネラ菌（TA1535）に前記発光ベクター（pTL210）を導入し、形質転換体（遺伝子損傷性物質検出用微生物）を得た。
【００７８】
（２）生育阻害物質検出用微生物
プラスミドpBR322（株式会社ニッポンジーン製）を、BamHI及びSalI（いずれの切断部位もテトラサイクリン耐性遺伝子のORF内にある）で切断し、アンピシリン耐性遺伝子を含む約4.1kbのDNA断片を得た。
【００７９】
このDNA断片と、上記（１）（ii）で調製した発光遺伝子群を含む約7.5kbのBamHI−SalI DNA断片とをT4 DNAリガーゼにより連結し、発光ベクター（pTL210ctl）を構築した。
【００８０】
この発光ベクター（pTL210ctl）を上記（１）と同様の方法で大腸菌（SJ10002）に導入して形質転換体を得、この形質転換体からアルカリ抽出法によって発光ベクター（pTL210ctl）を調製した。
【００８１】
そして、上記（１）と同様の方法で、サルモネラ菌（TA1535）に発光ベクター（pTL210ctl）を導入し、形質転換体（生育阻害物質検出用微生物）を得た。
【００８２】
（３）微生物膜の作製
−80℃で凍結保存した上記（１）で得られた遺伝子損傷性物質検出用微生物を解凍し、TGA培地（バクトトリプトン（商品名）1質量%、塩化ナトリウム0.5質量%、グルコース0.2質量%、アンピシリンナトリウム20μg/ml）に1/1000容量植菌し、30℃で一晩、旋回振とう培養を行い、この培養液を新しいTGAに1/50容量植菌して、さらに30℃で1.5時間、旋回振とう培養を行い、濁度（OD６００）を測定し、OD６００＝0.1になるようにTGA培地で希釈して、微生物膜作製用培養液を調製した。
【００８３】
この微生物膜作製用培養液1ml（菌体数約2.5×10７個）を用いて常法にしたがって遺伝子損傷性物質検出用微生物膜を作製した。なお、微孔性膜として、商品名「メンブレンフィルター・セルロース混合エステル」（ミリポア社製）、光透過性膜として、商品名「LDPEローデンポリ」（大倉工業株式会社製）を用いた。
【００８４】
また、上記（２）で得られた生育阻害物質検出用微生物を用いた以外は上記と同様にして生育阻害物質検出用微生物膜を作製した。
【００８５】
なお、作製したこれらの微生物膜は、使用するときまで保存液（TGA培地85%、グリセロール15%）に浸漬し、−20℃で凍結保存した。
【００８６】
（４）遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜の活性化条件の検討
上記遺伝子損傷性物質検出用微生物及び上記生育阻害物質検出用微生物の培養に用いたTGA培地（バクトトリプトン（商品名）10g/L、塩化ナトリウム5g/L、グルコース2g/L、アンピシリンナトリウム20μg/mL）と、その栄養成分であるバクトトリプトン（商品名）とグルコースの量を、表１に示すように２〜４倍に増やした培養液をそれぞれ調製した。なお、塩化ナトリウムは高濃度になると浸透圧が高くなり微生物に悪影響を及ぼすため各濃度の培養液とも一定量とした。また、アンピシリンナトリウムは抗生物質であり他の雑菌の繁殖を防ぐために添加するため各濃度の培養液とも一定量とした。
【００８７】
【表１】
2005253351.tif 000002
【００８８】
そして、上記各培養液を用いて、凍結保存した微生物膜を37℃で1時間、2時間、3時間加温して微生物膜の活性化を行った後、試料水に遺伝子損傷性物質である４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド（4NQO）を0.3mg/Lの濃度になるように添加して、その応答を比較した。図５に通常のTGA培地、図６に２倍濃度のTGA培地、図７に３倍濃度のTGA培地、図８に４倍濃度のTGA培地を用いた結果を示す。なお、図５〜８において、横軸は試料添加からの時間、縦軸は有害物質検出装置のセンサ出力（発光量）である。また、グラフ中の実線は遺伝子損傷性物質検出用微生物膜のセンサ出力、破線は生育阻害物質検出用微生物膜のセンサ出力である。
【００８９】
4NQOの検出基準を、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜のセンサ出力が0.5V以上かつ生育阻害物質検出用微生物膜のセンサ出力が0.25Vであるとすると、図５から、通常のTGA培地を用いた場合、4NQOが検出可能となるまでに2時間以上加温（活性化）しなければならないことが分かる。なお、加温時間が1時間では、活性化時間が短かすぎて菌株の活性が十分に上昇せず、加温時間が3時間では、活性化時間が長時間となったため活性化段階で培地の栄養成分が菌株によって消費されて、発光測定段階では栄養分が枯渇して微生物の活性が低下してしまい、発光反応が低下していると考えられる（図５（ａ）、（ｃ）参照）。
【００９０】
一方、図６〜８から、２〜４倍濃度のTGA培地を用いた場合、1時間の加温で4NQOの検出が可能になることが分かる。特に２倍濃度のTGA培地を用いた場合、発光量が最も高いことが分かる。また、４倍濃度のTGA培地を用いた場合は、測定結果に規則性がみられなかったが、これは微生物膜への酸素供給と試料の撹拌のために行われるエアレーションにより培養液が発泡し、排気側に培養液が漏出して培養液量が変化するため、微生物膜の活性化にムラが生じたためと考えられる。なお、いずれの場合も加温時間が長くなると、センサ出力が低くなり、栄養成分の不足による菌株の活性低下、又は老廃物の蓄積による活性低下の兆候が見られた。
【００９１】
また、図９に、４NQO暴露3時間後の遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜のセンサ出力を、加温時間と培養液濃度で比較した結果を示す。
【００９２】
図９から、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜のセンサ出力は、２倍濃度のTGA培地を用いて1時間加温（活性化）したときが最も高くなることが分かる。一方、生育阻害物質検出用微生物膜のセンサ出力は、３倍濃度のTGA培地を用いて2時間加温（活性化）したときが最も高く、次いで２倍濃度のTGA培地を用いて1時間加温（活性化）したときが高いことが分かる。
【００９３】
以上の結果から、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜を活性化する際に、２倍濃度のTGA培地を用いることにより、より短時間で各微生物膜を活性化することができ、迅速に有害物質を検出できることが示唆された。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：umuCに対して終止コドンとして働き、かつBamHIサイトを持つDNAリンカー。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の方法は、上下水道の各処理プロセスの処理水、河川及び湖沼等の環境水、廃棄物埋立最終処分場の浸出水、産業廃棄物の溶出水、工業排水等に含まれる有害物質の検出方法として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明で用いられる微生物膜の一例を示す概略構成図である。
【図２】本発明の方法の実施に用いられる有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器の一実施形態を示す断面図である。
【図３】図２に示すサンプル容器を有するセンサユニットを用いた有害物質検出装置の概略構成図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。
【図４】図３に示す有害物質検出装置を用いた有害物質の測定方法のフローチャート図である。
【図５】通常のTGA培地を用いて遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜を活性し、遺伝子損傷性物質（4NQO）の検出を行った結果を示す図である。
【図６】2倍濃度のTGA培地を用いて遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜を活性し、遺伝子損傷性物質（4NQO）の検出を行った結果を示す図である。
【図７】3倍濃度のTGA培地を用いて遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜を活性し、遺伝子損傷性物質（4NQO）の検出を行った結果を示す図である。
【図８】4倍濃度のTGA培地を用いて遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜を活性し、遺伝子損傷性物質（4NQO）の検出を行った結果を示す図である。
【図９】遺伝子損傷性物質（4NQO）暴露３時間後の遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜のセンサ出力を、加温時間と培養液濃度で比較した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００９６】
１．微生物
２．微孔性膜
３．光透過性膜
４．両面テープ
５．微生物膜
５ａ．遺伝子損傷性物質検出用微生物膜
５ｂ．生育阻害物質検出用微生物膜
１０．サンプルセル蓋
１１．試料注入口
１２．エア注入口
１３．エア排出口
２１．サンプルセル
２２、２３．Ｏリング
２４．微生物膜ホルダー
２５．微生物膜押さえ
２６．ネジ
２７ａ、２７ｂ．微生物膜セル
３０．サンプル容器
３１．表示部
３２．恒温槽
３３．光検出器
３４．エアポンプ
４０．有害物質検出装置
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【配列表】
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