(57)【要約】【課題】本願発明は、難発現性の目的タンパク質を効率よく発現し、目的タンパク質と相互作用するリガンドを同定し、更に、目的タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。【解決手段】本願発明は、難発現性の目的タンパク質を、シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として効率よく発現し、融合タンパク質を高分子担体に固定化することにより、目的タンパク質と相互作用するリガンドを同定する方法を提供する。更に、融合タンパク質を固定化した高分子担体を用いて、目的タンパク質の阻害剤または促進剤をスクリーニングする方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質をシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙ  Ｐｒｏｐｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ）又はその変異体と結合させた融合タンパク質を当該ＰＰＩａｓｅ又はその変異体を介して担持させた高分子担体。
【請求項２】
ＰＰＩａｓｅ又はその変異体と目的タンパク質間にプロテアーゼ切断部位を有する請求項１記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項３】
目的タンパク質が膜タンパク質又抗体関連タンパク質である請求項１又は２記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項４】
シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅがＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項５】
ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅが古細菌由来のＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項４記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項６】
ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅが好熱性古細菌又は超好熱性古細菌由来のＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項４又は５記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項７】
ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅが常温性古細菌由来のＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項４又は５記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項８】
シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅがシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項９】
シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅがパーブリン型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項１０】
ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅがトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅまたはそれと実質的に同等のＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項４記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項１１】
ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅがＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅまたはそれと実質的に同等のＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項４記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項１２】
ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅがＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅまたはそれと実質的に同等のＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項４記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項１３】
シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅがＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅまたはそれと実質的に同等のＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項８記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項１４】
パーブリン型ＰＰＩａｓｅがＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅまたはそれと実質的に同等のＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項９記載の融合タンパク質を担持させた高分子担体。
【請求項１５】
高分子担体がマクロライド化合物を担持し、且つマクロライド化合物とＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅとの特異的親和力で融合タンパク質が高分子担体に固定化されている請求項４、５、６、７、１０、１１又は１２いずれか一項記載の高分子担体。
【請求項１６】
マクロライド化合物がＦＫ５０６若しくはラパマイシン又はその類縁体であることを特徴とする請求項１５記載の高分子担体。
【請求項１７】
高分子担体がシクロスポリンを担持し、且つシクロスポリンとシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅとの特異的親和力で融合タンパク質が高分子担体に固定化されている請求項８又１３記載の高分子担体。
【請求項１８】
高分子担体がジュグロンを担持し、且つジュグロンとパーブリン型ＰＰＩａｓｅとの特異的親和力で融合タンパク質が高分子担体に固定化されている請求項９又は１４記載の高分子担体。
【請求項１９】
目的タンパク質と特異的に相互作用するリガンドの精製方法であって、請求項１−１８いずれか一項記載の高分子担体を用いて、リガンドを精製する方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法で精製して得られた目的タンパク質と特異的に相互作用するリガンド。
【請求項２１】
請求項１―１８いずれか一項記載の高分子担体を用いて、目的タンパク質とリガンドとの特異的な相互作用を阻害又は促進する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法で得られた、目的タンパク質とリガンドとの相互作用を制御する阻害剤又は促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は目的タンパク質と特異的に相互作用するリガンドをスクリーニングする方法に関する。さらには、上記目的タンパク質と相互作用するリガンドの作用を阻害又は促進する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組み換え法により、大腸菌等の宿主において目的タンパク質をコードする遺伝子を発現させると、ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ（封入体）中に蓄積し、水溶性の活性なタンパク質として回収できないことが多い。
【０００３】
封入体に蓄積したタンパク質の活性を再生させるためには、尿素やグアニジンのような変性剤で封入体をアンフォールディングし、透析又は希釈により変性剤を除去し、リフォーディング（再生）させる方法が一般的に用いられている。しかしながら、リフォールディングに時間がかかるといわれている。
【０００４】
最近では、活性なタンパク質を得るために、分子シャペロン等シャペロン活性を有するタンパク質が利用されている。分子シャペロンとは、タンパク質の折り畳みを助けるタンパク質のことであって、例えば、大腸菌から生産されるＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｐＥ、ＤｎａＪ、Ｄｎａｋ等が知られている。
【０００５】
これら分子シャペロンを共存させることにより、溶液中の酵素を安定化させる方法（特許文献１）、不活性化タンパク質を活性化させる方法（特許文献２）が知られている。
【０００６】
他方、タンパク質の折り込みに関与する酵素としてＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙ  Ｐｒｏｐｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ポリペプチド中のタンパク質の折り畳みで律速段階となるプロリンイミド結合をシスートランス型へ構造を異性化する酵素）が知られている。ＰＰＩａｓｅには、免疫抑制剤であるシクロスポリンと結合するシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅ（シクロフィリン）、ＦＫ５０６と結合するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＦＫＢＰ）、これらと結合しないパーブリン型ＰＰＩａｓｅ（パーブリン、Ｐａｒｖｕｌｉｎ）の３種のファミリーが存在する。これらのＰＰＩａｓｅのいくつかは、プロリン残基のＮ末端側ペブチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）とは独立した分子シャペロン活性を有することが知られている。分子シャペロン活性とは、変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、または、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性のことを指す。
【０００７】
古細菌由来のＰＰＩａｓｅとしては、大部分がＦＫＢＰ型で、ＦＫＢＰは、分子量が１７−１８ｋＤａのものと、２６−３３ｋＤａのものに分類されている。より具体的には、メタノコッカス属に属する微生物、例えば、メタノコッカス・サーモリソトフィカス由来の１７ＫＤａ    ＰＰＩａｓｅ（非特許文献１）、メタノコッカス・ヤシナイ由来の１７−１８ｋＤａのＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ（特許文献３）、超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１株由来ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）（非特許文献２）が知られている。これら古細菌由来のＰＰＩａｓｅもまた、シャペロン活性を有することが知られている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平７−６７６４１号
【特許文献２】
特開平７−４８３９８号
【特許文献３】
特開２００２−２５３２２７号
【非特許文献１】
Ｆｕｒｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．３９，  ｐ．４５３−４６２
【非特許文献２】
Ｉｄｅｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．３５７，  ２００１、  ｐ．４６５−４７１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子組み換え技術によっては、発現しにくいタンパク質又は発現しても活性があるタンパク質としては得られない組換えタンパク質を、活性あるタンパク質として効率よく発現させることが望まれている。
【００１０】
更に、発現しにくいタンパク質又は発現しても活性があるタンパク質としては得られない組換えタンパク質の機能を明らかにするため、これらに結合するリガンドを同定することが望まれている。また、目的タンパク質の機能を調節するために、リガンドの結合を阻害する阻害剤（アンタゴニスト）、リガンドと同等又は同等以上の刺激を行う促進剤（アゴニスト）をスクリーニングする方法が求められていた。
【００１１】
本願発明は、第１に、目的タンパク質、特にこれまで発現することが困難であった難発現タンパク質を効果的に発現させ、それに対して相互作用するリガンドをスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【００１２】
本願発明は、第２に、上記目的タンパク質とリガンドと相互作用するを阻害又は促進する化合物を効果的にスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本件発明者らは、遺伝子工学的手法で、大腸菌等の微生物を含む、宿主において発現させることが困難であったタンパク質を、シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として構成することにより、遺伝子組み換え法によって、効果的に発現できることを見出した。
【００１４】
宿主において発現することが困難なタンパク質としては、遺伝子発現において、折り込みがうまくいかないタンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質、膜タンパク質等が挙げられ、具体的には、抗体関連ポリペプチド、より具体的には、ＦＡｂ、ｓｖＦｖが挙げられる。
【００１５】
シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、上記の公知のシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅをいずれでも用いることができ、原核微生物、真核生物、古細菌等から単離できる。
【００１６】
本発明でいうＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ）とは、タンパク質のフォールディングに関与する因子の一つであり、細胞内でフォールディング途上のターゲットタンパク質中アミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有している。ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６結合型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型およびパーブリン型の３種類に分類される。ＦＫＢＰ型は免疫阻害剤の一つであるＦＫ５０６により活性が阻害されるＰＰＩａｓｅおよびそのホモログである。シクロフィリン型は、別の免疫阻害剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅまたはそのホモログである。一方、パーブリン型は、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ｊｕｇｌｏｎｅ（ジュグロン）に対してその活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。この３種類のＰＰＩａｓｅは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。本発明で用いられるＰＰＩａｓｅは、いずれのタイプのＰＰＩａｓｅを用いることができるが、これらのうち、特に分子シャペロン活性を持つＰＰＩａｓｅであることが望ましい。
【００１７】
分子シャペロン活性とは、ＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性であり変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、または、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性のことを指す。具体的には、ロダネーゼやクエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース―６―リン酸脱水素酵素などをモデル酵素とし（河田、バイオサイエンスとインダストリー  ５６，５５９３―、１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率でその検定対象物のシャペロン活性を評価することができる。変性タンパク質の再生率を評価する方法には、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法が（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０，３６１−，１９９５年）、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，８５２９−，１９９４年）などがそれぞれ挙げられる。
【００１８】
本発明でいう分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅのひとつとして、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅまたはその一部を含むポリペプチドが用いられる。我々は古細菌のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの機能について、随意検討した結果、興味深いことに、上記ＰＰＩａｓｅ活性だけでなく、タンパク質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性タンパク質のリフォールディンクを促進させるシャペロン活性を有することを明らかにした（Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ  ３９，４５３−，２０００年；Ｉｄｅｎｏ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，３１３９−，２０００年；Ｉｄｅｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５７，４６５−，２００１年；Ｉｄｅｎｏ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，４６４−，２００２）。シャペロン活性は、本来、分子シャペロンのひとつとして知られるシャペロニンやＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系のタンパク質折り畳みシステムに見いだされた活性である。これらは、細胞内で生合成されたポリペプチドが正しい形に折り畳まれるよう、サポートする機能を果たしている。その際、ＡＴＰなどの高エネルギー物質の加水分解を必要とする。古細菌のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、そのシャペロン活性を発揮する際、上記高エネルギー物質の加水分解反応を必要としない点で優れている。
【００１９】
古細菌のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより、２種類に大別できる。ひとつは分子量が１６−１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、もう一つは２６−３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明で用いられる古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれも使用することが可能である。しかし、一般的に、（ａ）ショートタイプの方がより強いシャペロン活性を有する傾向にあること；（ｂ）タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること；の２点を考慮すると、本発明ではショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの方がより好ましい。上記に記載した分子量の幅はこれまで見いだされているＰＰＩａｓｅの分子量幅であり、本発明で用いられるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、この分子量幅に限定されず、実質的に同じグループに属するものであれば問題なく使用できる。
【００２０】
これまで見いだされている古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとして、ショートタイプではＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１由来、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のものが報告されている（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ  ５，８２１−，２０００）。一方、ロングタイプとしては、ゲノム解析やその他の解析の結果、ほとんどの古細のゲノム上で見いだされている。たとえば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ，Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｏｕｓ，上記Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ，Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ，Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｕｔｉｒｕｂｒｕｍ（Ｉｉｄａ，Ｇｅｎｅ  ２５６，３１９，２０００年）のゲノム上で見いだされている。本発明で用いられる古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、これらの古細菌に限定されるものではなく、どの古細菌由来のものであっても差し支えない。また、その一部分や、それを含む断片、または、一部のアミノ酸を他のアミノ酸に改変したものであっても差し支えない。ロングタイプＦＫＢＰの一例として、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のアミノ酸配列を配列番号１に、ショートタイプＦＫＢＰの一例として、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのアミノ酸配列を配列番号２に、また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１由来のＰＰＩａｓｅの塩基配列を配列番号３に示す。
【００２１】
その他本発明で用いられるシャペロン活性を持つタンパク質としては、（１）ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしてはトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（Ｈｕａｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９，１２５４−，２０００年）、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ａｒｉｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，１９９−，２００１年）、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，１７１５−，１９９６年）、（２）パーブリン型ＰＰＩａｓｅとしては、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｅｈｒｅｎｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０，２８５−，２００１年）が、及び（３）シクロフィリン型ＰＰＩとしてはＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（Ｐｉｒｋｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８，７９５−，２００１年）、ブタ由来１８ｋＤａシクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅなど（Ｏｕ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１０，２３４６−，２００１年）が挙げられる。これらのＰＰＩａｓｅもまた、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと同様に、ＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性としてシャペロン活性を有することが報告されている。
【００２２】
（１）  トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅは、大腸菌をはじめ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｕｍ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ，Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｓｅなど、ほとんどすべてのバクテリアのゲノム上で見つかっている。本発明で用いられるトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅとしては、アミノ酸配列において、バクテリア由来トリガーファクターと実質的に同じと認められるグループに属するものであれば、いずれのトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅであってもかまわない。一例として大腸菌由来のトリガーファクターのアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号４及び５にそれぞれ示す。
【００２３】
ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅも、大腸菌をはじめとするグラム陰性バクテリアのぺリプラズム領域に発現するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅもまた、シャペロン活性を示すタンパク質として知られている（Ｒａｍｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５−１７１０６−，２０００年）。ＦｋｐＡは、すでに大腸菌ぺリプラズムにおけるタンパク質生産性向上に関する研究や、インビトロにおけるリフォールディングに関する研究が報告されているが（Ａｒｉａ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，１９９−，２００１年；Ｒａｍｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１７１０６−，２０００年）、これらのＰＰＩａｓｅと難発現性タンパク質とを融合型タンパク質として発現させることにより、その生産性をさらに飛躍させることができる。ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅは、グラム陰性バクテリアのゲノムに見られるだけでなく、酵母などの真核生物のゲノムでもそのホモログが見つかってきている。本発明で用いられるＦｋｐＡとしては、グラム陰性バクテリア由来のものだけでなく、それらと同じグループに属するものであれば、どの生物由来のＰＰＩａｓｅを用いても差し支えない。ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅの一例として、大腸菌由来のもののアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号６及び７にそれぞれ示した。
【００２４】
ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅは、真核生物中に見いだされたＰＰＩａｓｅである。ＦＫＢＰ５２は、約５２ｋＤａ程度のＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅでｐ５９またはＨＳＰ５６などとも呼ばれる。そのアミノ酸配列上の構造は、ヒト由来１２ｋＤａ  ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅと相同性の高い領域２つがタンデムに連なり、さらにそのＣ末端側にカルモジュリン結合部位を含む領域が連なった構造をしている（Ｒａｔａｊｃｚａｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１３１８７−，１９９３）。ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅは、Ｎ末端にＰＰＩａｓｅを担うドメインを、そのＣ末端にヒートショックタンパク質の一つであるＨＳＰ９０と結合するテトラトリコベプチドリピート（ＴＰＲ）を含むドメインから成ることを特徴とする。いずれも真核生物においてステロイドホルモンレセプター形成に関与するＰＰＩａｓｅである（Ｇａｌａｔ，Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−Ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８年）。ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅの一例として、ヒト由来のもののアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号８及び９にそれぞれ示した。
【００２５】
（２）  ＳｕｒＡは、大腸菌をはじめとするグラム陰性バクテリアのぺリプラズム領域に発現し、ＦＫ５０６及び他の免疫抑制剤であるシクロスポリンのいずれの免疫抑制剤に対して感受性を示さない、パーブリン型ＰＰＩａｓｅホモログの一つである。ＳｕｒＡもまた、シャペロン活性を示すタンパク質として知られる（Ｂｅｈｒｅｎｓ，ＥＭＢＯ．Ｊ  ２０，２８５−，２００１年）。ＳｕｒＡのＰＰＩａｓｅは、グラム陰性バクテリアのゲノムに見られるだけでなく、酵母などの真核生物のゲノムでもそのホモログが見つかってきている。
【００２６】
ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの一例として、大腸菌由来のもののアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号１０及び１１にそれぞれ示した。
【００２７】
（３）  ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅと同様に真核生物中に見いだされる。ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは、４０ｋＤａ程度の分子量を持ち、免疫抑制剤であるシクロスポリン感受性であるシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅの一つである。ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅと同様にそのＮ末端にＰＰＩａｓｅを担うドメインを、そのＣ末端にヒートショックタンパク質の一つであるＨＳＰ９０と結合するテトラトリコベプチドリピート（ＴＰＲ）を含むドメインから成ることを特徴とする。いずれも真核生物においてステロイドホルモンレセプター形成に関与するＰＰＩａｓｅである（Ｇａｌａｔ，Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−Ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８年）。本ＰＰＩａｓｅがインビトロでシャペロン活性を有することはすでに報告されているが（Ｐｉｒｋｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８，７９５−，２００１年）、これらのＰＰＩａｓｅと融合型タンパク質として難発現性タンパク質を発現させることにより、さらにその生産性を飛躍させることができる。ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの一例として、ヒト由来のもののアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号１２及び配列番号１３にそれぞれ示した。
また、ブタ由来１８ＫＤａシクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅは、最近そのシャペロン活性が再評価されたものである。
【００２８】
本発明で用いられる分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、以上に挙げたものに限定されるものではなく、上記ＰＰＩａｓｅと実質的に同等のシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであれば、好適に用いることができる。
【００２９】
さらに、公知のシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの変異体も、シャペロン活性及びＰＰＩａｓｅを有する限り、本願発明のシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして使用することができる。
【００３０】
公知のシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの変異体としては、例えば、公知のシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅのアミノ酸の１〜数個が欠失、置換、付加され、しかもシャペロン活性及びＰＰＩａｓｅ活性を有する変異体も包含する。また、シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、例えば、４０％、５０％、６０％  又は７０％、好適には、８０％、更に好適には、９０％又は９５％以上の同一性を有し、シャペロン活性及びＰＰＩａｓｅ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を用いて、遺伝子組み換え法により製造されたシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅも包含する。
ＰＰＩａｓｅの同一性はＣｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いることで判断することができる。
【００３１】
融合タンパク質から目的タンパク質を酵素切断によって切り出せるように、融合タンパク質をコードする核酸配列は、目的タンパク質とＰＰＩａｓｅとの間に、酵素で切断可能なリンカー部分を形成するように設計することもできる。
切断に用いる酵素としては、基質特異性の高い酵素が好ましいが、好適には、トロンビンが挙げられる。
【００３２】
融合タンパク質の発現系には、通常用いられる周知の発現系、例えば、大腸菌では、ｐＥＴベクター、哺乳類細胞を用いる系では、例えば、ＣＨＯ細胞又はＣＯＳ細胞を宿主としてｐＣＭＶベクターを用いることができる。
【００３３】
本件発明者らは、ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を、架橋により高分子担体に結合し固定化することに成功した。
固定化手段は、特に問わないが、好適には、ＦＫＢＰについては、マクロライド化合物、特にＦＫ５０６若しくはラパマイシン又はその類縁体などを高分子担体に結合し、ＦＫ５０６又はラパマイシンの類縁体などとＦＫＢＰとの特異的結合を利用し、融合タンパク質を固定化する方法を用いることができる。シクロフィリンとの融合タンパク質については、シクロスポリンを高分子担体に結合し、シクロスポリンとシクロフィリンとの特異的結合を利用することができる。パーブリン（Ｐａｒｖｕｌｉｎ）型ＰＰＩａｓｅの融合タンパク質については、ジュグロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）を高分子担体に結合し、ジュグロンとパーブリン型ＰＰＩａｓｅとの特異的結合を利用し、固定化することができる。
【００３４】
ＦＫ５０６，シクロスポリン、又はシュグロンの高分子担体への結合においては、それぞれ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ，シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅ、又はパーブリン型ＰＰＩａｓｅとの結合を阻害しないように、架橋により担体に固定化すればよい。
【００３５】
上記担体に使用される疎水性架橋性単量体としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコ一ルジ（メタ）アクリレートなどのジ（メタ）アクリル酸エステル；テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレートなどの多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エステル；ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレンなどの２個以上のビニル基を有する芳香族化合物などが挙げられる。
【００３６】
必要に応じて加えられ得る疎水性非架橋性単量体としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル，酪酸ビニル、カプロン酸ビニルなどのカルボン酸ビニル類；およびスチレン、メチルスチレンなどのスチレン系単量体が挙げられる。
【００３７】
担体に使用される疎水性架橋重合体粒子を被覆する親水性重合体は、ＦＫ５０６若しくはラパマイシン又はその類縁化合物、シクロフィリン若しくはその類縁化合物、又はジュグロン若しくはその類縁化合物などを固定化するために用いられ得る官能基を有する親水性単量体を、重合して得られる。これらの固定化（直接またはスペーサを介しての固定化）に用いられ得る官能基としては、例えば、次の基が挙げられる；−ＯＨ基、−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ２基、グリシジル基、−ＣＮ基、−ＣＨＯ基。分子内に同一の官能基を２個以上有する単量体、および／または異なる官能基を２種以上有する単量体も使用可能である。−ＯＨ基を有する親水性単量体としては、２−ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。−ＣＯＯＨ基を有する親水性単量体としては、（メタ）アクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フタル酸、２−カルボキシエチル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。−ＮＨ２基を有する親水性単量体としては、（メタ）アクリルアミド、マレイン酸アミド、フマル酸アミド、アリルアミンなどが挙げられる。グリシジル基を有する親水性単量体とては、グリシジル（メタ）アクリレート、オキシラニルメチル（メタ）アクリレート、オキシラニルノニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。−ＣＮ基を有する親水性単量体としては、（メタ）アクリロニトリル，シアノアクリレートなどが挙げられる。−ＣＨＯ基を有する単量体としては、（メタ）アクロレイン、クロトンアルデヒドなどが挙げられる。
本担体には磁性体材料として鉄、コバルト、ニッケルなど３ｄ遷移金属を主体とする単体又は合金などからなる磁性粒子を含むことも可能である。
【００３８】
ＦＫ５０６若しくはラパマイシン又はその類縁化合物、シクロフィリン若しくはその類緑化合物、又はジュグロン若しくはその類緑化合物などを担体に固定化するための架橋化方法は、とくに限定されないが、化合物中の水酸基との間でのエステル架橋する方法、化合物中かまたは担体にアミノ基を導入し、カップリングする方法などをもちいることができる。
【００３９】
目的タンパク質と相互作用するリガンドとは、目的蛋白質と親和性が高い、又は目的蛋白質と特異的に結合するポリペプチドや低分子リガンドをあげることができる。
【００４０】
本件発明を用いることにより、従来発現ができず、そのため機能が不明であった膜タンパク質、受容体タンパク質など、その機能が細胞内の調節機構に深く関わっていると推定されながら、その役割が十分解明されてこなかった目的タンパク質についても、目的タンパク質とシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現させ、目的タンパク質とシャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質をＰＰＩａｓｅを介して担持させた高分子担体を用いて、目的タンパク質と結合するリガンドを同定することができる。例えば、更に、同定されたリガンドを、目的タンパク質と結合させ、そのタンパク質にどのような変化が生じるかを検出することにより、その機能の解明に役立てることもできる。
【００４１】
また、種々の化合物を目的タンパク質又は目的タンパク質とリガンドの結合物に接触させ、目的タンパク質とリガンドとの相互作用、例えば特異的結合に変化が生じるかを調べることにより、又は、当該目的タンパク質の機能にどのような影響を与えるかを調べることにより、阻害剤、促進剤をスクリーニングすることができる。
【００４２】
更には、リガンドを特定し、その阻害剤、促進剤をスクリーニングすることにより、目的タンパク質の調節機能を制御することによる薬剤開発に有効であり、リード化合物の同定に役立てることができる。
【００４３】
【実施例】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００４４】
〔実施例１〕超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１株由来ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）との融合タンパク質発現ベクターの構築
シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして、超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１株由来ＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８；Ｉｄｅｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５７，４６５−、２００１年）を用い、以下の通りその融合タンパク質発現ベクターを構築した。すなわち、ＴｃＦＫＢＰ１８の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Ｉｉｄａ、Ｇｅｎｅ  ２２２，２４９−、１９９８）を鋳型とし、そのＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＴｃＦｕ―Ｆ１及びＴｃＦｕ―Ｒ２を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。一方、ＴｃＦＫＢＰ１８融合型タンパク質がプロテアーゼによりＴｃＦＫＢＰ１８と目的タンパク質とに切断するためのリンカーをコードする塩基配列として、Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２及びその相補鎖を設計した。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２は、その５’側にＳｐｅＩサイトを、３’側にＥｃｏＲＩサイトをそれぞれ有している（図１）。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２のトロンビン切断部分のＤＮＡ配列の下流には、ＢａｍＨＩサイト、ＮｄｅＩサイトを有しているため、目的タンパク質の遺伝子断片はこれらの制限酵素サイトを利用して導入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質を得ることができる（図１）。
【００４５】
上記ＴｃＦＫＢＰ１８の遺伝子断片と、トロンビン切断部分をコードするＤＮＡ断片を、各々の制限酵素で処理し、あらかじめＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡ（ノバジェン社）に、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆ２の順でライゲーションした。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをｐＴＦＫＦ２とした。ＴｃＦＫＢＰ１８のＤＮＡ配列を配列番号３に示す。
【００４６】
【表１】
2005013067.tif 000003
【００４７】
〔実施例２〕大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクター構築
大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌Ｋ１２株から、終止コドンを除いたＴＦ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＮＣＢＩコード：  ＮＰ＃４１４９７０で登録されている塩基配列情報を元に設計した。プライマーには５‘側にＮｃｏＩ制限酵素サイトを、３’側にＳｐｅＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた（表１；ＴＦ−Ｆ１及びＴＦ−Ｒ１）。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したｐＴＦＫＦ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＴＦ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＴＦ遺伝子を回収した。得られたＴＦ遺伝子と上記ベクターをライゲーションし、ＴＦ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のｐＴＦＫＦ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＴＦ遺伝子に置き換わった、ＴＦ融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＴＦ融合タンパク質発現用プラスミドをＴＦｆ２とした。
【００４８】
〔実施例３〕ヒト由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
ヒト由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（ｈＦＫＢＰ５２）と融合するための発現ベクターを構築するために、ヒトｃＤＮＡライブラリーから、終止コドンを除いたＦＫＢＰ５２遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＮＣＢＩコード：  ＮＭ＿００２０１４で登録されている塩基配列を元に設計した。プライマーには５‘側にＮｃｏＩ制限酵素サイトを、３’側にＳｐｅＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた（表１；ＦＫ５２−Ｆ１及びＦＫ５２−Ｒ１）。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したｐＴＦＫＦ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ｈＦＫＢＰ５２遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたｈＦＫＢＰ５２遺伝子の断片を回収した。得られたｈＦＫＢＰ５２遺伝子断片と上記ベクターをライゲーションし、ｈＦＫＢＰ５２遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のｐＴＦＫＦ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がｈＦＫＢＰ５２遺伝子に置き換わったｈＦＫＢＰ５２との融合タンパク質発現系が構築できた。得られたｈＦＫＢＰ５２融合タンパク質発現用プラスミドをＦＫ５２ｆ２とした。
【００４９】
〔実施例４〕ヒト由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
ヒト由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（ＣｙＰ４０）と融合するための発現ベクターを構築するために、ヒトｃＤＮＡライブラリーから、終止コドンを除いたｈＣｙＰ４０遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＮＣＢＩコード：  Ｌ１１６６７で登録されているｃＤＮＡ配列を元に設計した。プライマーには５‘側にＮｃｏＩ制限酵素サイトを、３’側にＳｐｅＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた（表１；ＣＰ４０−Ｆ１及びＣＰ４０−Ｒ１）。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したｐＴＦＫＦ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ｈＣＹＰ４０遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたｈＣＹＰ４０遺伝子を回収した。得られたｈＣＹＰ４０遺伝子と上記ベクターをライゲーションし、ｈＣＹＰ４０遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のｐＴＦＫＦ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がｈＣＹＰ４０遺伝子に置き換わったｈＣＹＰ４０との融合タンパク質発現系が構築できた。得られたｈＣｙＰ４０融合タンパク質発現用プラスミドをＣＰ４０ｆ２とした。
【００５０】
〔実施例５〕大腸菌由来ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
大腸菌由来ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌ＣＴＦ０７３株から、終止コドンを除いたＦｋｐＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＮＣＢＩコード：  ＡＥ０１６７６７で登録されている塩基配列を元に設計した。プライマーには５‘側にＮｃｏＩ制限酵素サイトを、３’側にＳｐｅＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた（表１；ＦＫＰＡ−Ｆ１及びＦＫＰＡ−Ｒ１）。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したｐＴＦＫＦ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＦｋｐＡ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＦｋｐＡ遺伝子を回収した。得られたＦｋｐＡ遺伝子と上記ベクターをライゲーションし、ＦｋｐＡ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のｐＴＦＫＦ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＦｋｐＡ遺伝子に置き換わったＦｋｐＡとの融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＦｋｐＡ融合タンパク質発現用プラスミドをＦｋｐＡｆ２とした。
【００５１】
〔実施例６〕大腸菌由来ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
大腸菌由来ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌Ｋ１２株から、終止コドンを除いたＳｕｒＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＮＣＢＩコード：  ＡＥ０００１１５で登録されている塩基配列を元に設計した。プライマーには５‘側にＮｃｏＩ制限酵素サイトを、３’側にＳｐｅＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた（表１；ＳＵＲ−Ｆ１及びＳＵＲ−Ｒ１）。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したｐＴＦＫＦ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＳｕｒＡ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＳｕｒＡ遺伝子を回収した。得られたＳｕｒＡ遺伝子と上記ベクターをライゲーションし、ＳｕｒＡ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のｐＴＦＫＦ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＳｕｒＡ遺伝子に置き換わったＳｕｒＡとの融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＳｕｒＡ融合タンパク質発現用プラスミドをＳｕｒＡｆ２とした。
【００５２】
〔実施例７〕ＴｃＦＫＢＰ１８及び目的タンパク質（ｓｃＦｖ抗体断片）の融合発現
マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）に対する  ｓｃＦｖ抗体断片とＴｃＦＫＢＰ１８の融合タンパク質を以下の通り発現させた。すなわち、ＨＥＬに対するｓｃＦｖ抗体断片の発現プラスミドｐＡＡＬＳＣ（伊庭ら  １９９７，Ｇｅｎｅ１９４，３５−）を鋳型とし、下記表２に示したＳＣＦ−Ｆ３およびＳＣＦ−Ｒ３をプライマーして用いるＰＣＲにより、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖフラグメントの遺伝子を増幅した。この遺伝子をＴＡクローニングにより、ｐＴ７ブルーベクターにライゲーションし、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、あらかじめ同制限酵素により処理しておいたｐＴＦＫＦ２に再度ライゲーションすることで、ＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖの融合タンパク質発現系を構築した。
【００５３】
得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフォーメーションし、２リットルの三角フラスコに２×ＹＴ培地  （Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒｕｃｔ  １６ｇＬ−１，  ＢＡＣＴＯ  ＴＲＹＰＴＯＮ  ２０ｇＬ−１，  ＮａＣｌ  ５ｇＬ−１，アンピシリン  １００  マイクロｇ  ｍｌ−１，  ｐＨ７．５）  ７００ｍｌを入れ、組み換え大腸菌２〜３白金耳を接種した。３５℃で２４時間回転培養（１１０ｒｐｍ）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）にて菌体を回収した。得られた菌体は１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍｌに懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００５４】
回収した菌は超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。沈殿画分は、さらに封入体画分に精製するため、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁後、３０分間反応させることで膜成分を可溶化し、遠心分離にて沈殿する封入体成分を回収した。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿部を封入体画分とした。可溶性画分１０μｇと、それに相当する封入体画分の容量をそれぞれ１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。クーマシーブリリアントブルーにて染色した結果、ｓｃＦｖはＴｃＦＫＢＰ１８と融合した形態で可溶画分にメジャーバンドとして大量に発現されることが示された（図２Ａ）。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１４％であった。
【００５５】
【表２】
2005013067.tif 000004
【００５６】
〔実施例８〕マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖとＴＦとの融合タンパク質の発現
実施例７で調製したマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖフラグメントを含むｐＴ７ブルーベクターのＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を、あらかじめ同制限酵素により処理しておいた実施例２のＴＦｆ２にライゲーションすることにより、ＴＦとｓｃＦｖの融合タンパク質発現系を構築した。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。ＴＦと融合発現させた場合、可溶性画分に大量に発現されることがわかった。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約７％であった。
【００５７】
〔実施例９〕マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖとｈＦＫＢＰ５２との融合タンパク質の発現
実施例７で調製したＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖ融合タンパク質発現ベクターをＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ処理し、ｓｃＦｖフラグメントを含むＤＮＡ断片を調製した。あらかじめ同制限酵素により処理しておいた実施例３のＦＫ５２ｆ２に上記ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、ｈＦＫＢＰ５２とｓｃＦｖの融合タンパク質発現系を構築した。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。ｈＦＫＢＰ５２と融合発現させた場合、可溶性画分に大量に発現されることがわかった。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約９％であった。
【００５８】
〔実施例１０〕マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖとｈＣｙＰ４０との融合タンパク質の発現
実施例９のＦＫ５２ｆ２の代わりに、実施例４で調製したＣＰ４０ｆ２を用いたこと以外は実施例９と同様の方法でｈＣｙＰ４０とｓｃＦｖの融合タンパク質を発現させた。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１１％であった。
【００５９】
〔実施例１１〕ヒト由来セロトニンレセプターとＦｋｐＡとの融合タンパク質の発現
７回膜貫通型膜タンパク質の一つであるヒト由来セロトニンレセプター（ＨＴ１ａレセプター）と大腸菌由来ＦｋｐＡの融合タンパク質発現系を構築するためにヒトｃＤＮＡライブラリーからＨＴ１ａレセプター遺伝子のクローニングを行った。すなわち、ＮＣＢＩコード：ＨＳＳＥＲＲ５１として登録されている塩基配列情報を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲにより、ＨＴ１ａレセプター遺伝子を増幅した。
ＨＴ１ａのアミノ酸配列及び塩基配列は配列番号１４及び１５に示した。プライマーには５‘側にＮｄｅＩ制限酵素サイトを、３’側にＮｏｔＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた（表１；ＨＴ１−Ｆ１及びＨＴ１−Ｒ１）。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理により、ＨＴ１ａ遺伝子を含むＤＮＡ断片を切断・精製後、あらかじめＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理しておいた実施例５のＦｋｐＡｆ２にライゲーションし、ＨＴ１ａ遺伝子を含むベクターを回収した。得られたＦｋｐＡとＨＴ１ａ融合タンパク質発現ベクターを実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を超音波破砕後、３０００ｒｐｍにて遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分画した。実施例７と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色と、抗セロトニンレセプター抗体を用いたウエスタンブロッティング法により、発現したＨＴ１ａを特異的に検出した。その結果、ＣＢＢ染色において、ＨＴ１ａはＦｋｐＡと融合した形態で可溶画分に発現されることが示され、ウエスタンブロッティングにおいても、確かに発現していることが確認された。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２％であった。
【００６０】
〔実施例１２〕  ヒト由来セロトニンレセプターとＳｕｒＡとの融合タンパク質の発現
実施例１１のＦｋｐＡｆ２の代わりに、実施例６で調製したＳｕｒＡｆ２を用いたこと以外は実施例１１と同様の方法でＳｕｒＡとＨＴ１ａの融合タンパク質を発現させた。
実施例７と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色と、抗セロトニンレセプター抗体を用いたウエスタンブロッティング法により発現したＨＴ１ａを特異的に検出したところ、ＣＢＢ染色において、ＨＴ１ａはＳｕｒＡと融合した形態で可溶画分に発現されることが示され、ウエスタンブロッティングにおいても、確かに発現していることが確認された。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２％であった。
【００６１】
〔実施例１３〕ＦＫ５０６担体の調製及び融合タンパク質の担体への固定化
ＦＫ５０６のＣ２２位ケトンをＬ−セレクトリド存在下で還元し、テトラオールとした。次に、Ｎ３（ＣＨ２）２ＣＯＣｌでＦＫ５０６をアシル化後、アジド基を還元し、ＦＫ５０６にアミノ基を導入した。得られたアミノ化ＦＫ５０６を０．１ＮのＮａＨＣＯ３存在化で、バイオラッド社のアフィゲル１０と４時間カップリングさせることにより、ＦＫ５０６をアフィゲル担体上に固定化した。
【００６２】
一方、実施例７で得られたＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖの融合タンパク質は、ＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａ液：  ２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  緩衝液  （ｐＨ  ６．８）、  Ｂ液：  ０．５  Ｍ  ＮａＣｌ  を含む２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  緩衝液  （ｐＨ  ６．８）、流速１  ｍｌ  ｍｉｎ−１）、及び、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー（溶離液：  １００  ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．０；  ０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ含有、流速：  ３  ｍｌ  ｍｉｎ−１）の順でカラム精製を繰り返すことにより、融合タンパク質をほぼ単一にまで精製した。精製した融合タンパク質５ｍｇを上記で調製したＦＫ５０６固定化担体懸濁液５００μｌと室温にて３時間インキュベートすることにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖの融合タンパク質固定化担体を調製した。
【００６３】
〔実施例１４〕融合タンパク質固定化担体を用いた目的タンパク質（ｓｃＦｖ抗体断片）と親和性を持つタンパク質のスクリーニング
ＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖの融合タンパク質が固定化された担体を用い、上記ｓｃＦｖの抗原であるニワトリリゾチームが特異的にスクリーニングできるか否かを以下の通り検証した。すなわち、ニワトリリゾチームを混合した大腸菌破砕液に、実施例１３にて調製した融合タンパク質の固定化担体５００μｌを懸濁し、２時間作用させた。担体を回収し、ＰＢＳにて洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーと作用することにより、担体に結合したタンパク質を上記バッファー中に回収した。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果、融合タンパク質の固定化担体を用いることにより、ｓｃＦｖの特異的相互作用するタンパク質であるニワトリリゾチームが、特異的に回収できることが示された（図３）。
【００６４】
〔比較例１〕目的タンパク質（ｓｃＦｖ抗体断片）の単独発現
実施例７で得られたｓｃＦｖ抗体断片遺伝子を含むｐＴ７ブルーベクターをＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、あらかじめ同制限酵素により処理しておいたｐＥＴ２１ａ（ノバジェン）に再度ライゲーションすることで、ｓｃＦｖの発現系を構築した。得られた発現プラスミドを実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７に示した方法と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。その結果、ｓｃＦｖ抗体断片は可溶画分にはほとんど発現せず、不溶性画分にのみ発現することが確認された（図２Ｂ）。目的タンパク質は可溶性画分に発現することができず、担体ビーズに固定化することができなかった。
【００６５】
【発明の効果】
本願発明により、これら従来は発現が困難又は発現しても活性がある水溶性タンパク質としては得られない組換えタンパク質発現について、相互作用するリガンドをスクリーニングすることができ、更に、これらタンパク質の機能を調節する、阻害剤、促進剤をスクリーニングすることもできる。
【００６６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと融合タンパク質を作成するためのベクターｐＴＦＫＦの遺伝子配置を示す図である。
【図２】（Ａ）  ｓｃＦｖフラグメントおよびＴｃＦＫＢＰ１８とからなる融合タンパク質の発現を示す図である。
（Ｂ）  フラグメント単独での発現を示す図である。
【図３】ｓｃＦｖ−ＰＰＩａｓｅ融合タンパク質固定化ビーズを用いた特異抗原の精製を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月10日(2003.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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