(57)【要約】【課題】  通常の納豆の品質を維持しながら、且つγ−アミノ酪酸をより高濃度で含有し、血圧降下作用をはじめとするγ−アミノ酪酸の様々な健康機能を発揮できる納豆の提供、並びに該納豆を効率良く製造する手段の提供。【解決手段】  親株よりも低いγ−アミノ酪酸資化能を有することを特徴とする納豆菌変異株；親株のγ−アミノ酪酸分解・代謝に関与する酵素活性が親株よりも低いことを特徴とする前記納豆菌変異株；納豆菌変異株ｇａｂＰＴＤ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６７１）；前記納豆菌変異株を使用して製造されることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有納豆；製造時にγ−アミノ酪酸が添加されることを特徴とする前記γ−アミノ酪酸含有納豆。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親株よりも低いγ−アミノ酪酸資化能を有することを特徴とする納豆菌変異株。
【請求項２】
γ−アミノ酪酸パーミアーゼ活性、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ活性、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素活性が親株よりも低いことを特徴とする請求項１記載の納豆菌変異株。
【請求項３】
親株のγ−アミノ酪酸パーミアーゼ遺伝子、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子を破壊させることによりγ−アミノ酪酸資化能を低下させたことを特徴とする請求項１又は２記載の納豆菌変異株。
【請求項４】
親株のγ−アミノ酪酸パーミアーゼ遺伝子にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されてなると同時に、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなる、γ−アミノ酪酸資化能の低下した納豆菌変異株ｇａｂＰＴＤ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６７１）。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の納豆菌変異株を使用して製造されることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有納豆。
【請求項６】
製造時にγ−アミノ酪酸が添加されることを特徴とする請求項５に記載のγ−アミノ酪酸含有納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された新規納豆に関し、さらに詳細には、γ−アミノ酪酸資化能低下納豆菌、及びγ−アミノ酪酸含有納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品業界で、γ−アミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ，ＧＡＢＡ）は、機能性成分の一つとして注目されている。
γ−アミノ酪酸は、１９５０年に哺乳類の脳抽出液中から発見され、１９５３年には哺乳類の中枢神経系における代表的な抑制物質として働くことが報告された。
その後、様々な研究が行われた結果、γ−アミノ酪酸には血圧正常化作用、血中のコレステロール・中性脂肪抑制作用、腎臓・肝臓・膵臓機能活性化作用、血糖値上昇抑制作用、脳血流向上及び脳細胞代謝活性化作用、肥満防止作用、アルコール代謝促進作用、体臭・口臭・生理臭・老人臭・尿臭等の消臭作用、感情障害・不安障害の解消作用、脳卒中後遺症改善作用、大腸癌抑制作用、成長ホルモン分泌促進作用など様々な効能があることが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
近年の健康食品ブームの中で、γ−アミノ酪酸を日常的に摂取する方策が検討され、γ−アミノ酪酸を高濃度で含有する食品素材が開発された（非特許文献１参照）。例えば、米や小麦の胚芽やフスマなどγ−アミノ酪酸を含有する植物素材からγ−アミノ酪酸を抽出して添加した食品素材（特許文献１参照）や、グルタミン酸又はグルタミン酸ナトリウムに酵母を作用させてγ−アミノ酪酸濃度を高めた食品素材（特許文献２参照）等が挙げられる。
これらの食品素材は食品の主原料としてではなく、食品に添加されて利用されることになるが、該食品素材を添加し過ぎることにより、食品本来の呈味や風味、食感などが損なわれる問題があった。
【０００４】
一方、日本人の食生活に馴染みが深く、健康イメージが強い納豆においても、γ−アミノ酪酸含有量を高めることが試みられている。即ち、納豆中のγ−アミノ酪酸含有量を１０ｍｇ／４５ｇ納豆まで高めたことを謳った納豆が上市されているが、この場合も、納豆中にγ−アミノ酪酸を含有する発芽玄米を添加しているため、従来の納豆とは呈味や風味、食感が異なったものになるという欠点があった。
また、後述するように、納豆菌はγ−アミノ酪酸の資化能を有しているため、通常の納豆にはほとんどγ−アミノ酪酸は含有されておらず、添加しても、発酵中や製品保管中、或いは輸送中に納豆菌により分解されてγ−アミノ酪酸の含量が低下する恐れがあった。
【０００５】
以上のように、納豆の呈味や風味、食感などを損なわず、且つγ−アミノ酪酸含有量を高める手段を開発することが求められていた。
【０００６】
【非特許文献１】ジャパンフードサイエンス、２００２巻、１号、３９頁（２００２）
【特許文献１】特開平７−２１３２５２号公報
【特許文献２】特開平９−２３８６５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、通常の納豆の品質を維持しながら、且つγ−アミノ酪酸をより高濃度で含有し、血圧降下作用をはじめとするγ−アミノ酪酸の様々な健康機能を発揮できる納豆の提供、並びに該納豆を効率良く製造する手段の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するにあたり、まず、納豆菌のγ−アミノ酪酸合成能について検討した。
γ−アミノ酪酸は、動植物や微生物などの生体内においては、グルタミン酸脱水素酵素、若しくはアルギニン脱炭酸酵素の作用によってグルタミン酸から生成されることが知られている。納豆菌の類縁菌である枯草菌においては、グルタミン酸脱炭酸酵素の存在は知られていないことから（例えば、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３９０巻、ｐ．２４９−２５６、（１９９７）」参照）、この酵素によりγ−アミノ酪酸を生成させる能力を有していないと予想され、これは納豆菌においても同様であると推定された。一方、アルギニン脱炭酸酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌の総ゲノム情報（例えば、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３９０巻、ｐ．２４９−２５６、（１９９７）」参照）からｓｐｅＡが挙げられるが、該遺伝子の納豆菌での機能は明確ではない。
【０００９】
ところで、本発明者らは、納豆製造工程における発酵以前の蒸煮大豆の成分を調べたところ、蒸煮大豆には、原料である大豆由来のγ−アミノ酪酸が含有されていることが確認できた。そこで、本発明者らは、納豆菌のγ−アミノ酪酸資化能を低下、さらには欠損させることができれば、蒸煮大豆に含まれるγ−アミノ酪酸をそのまま含有する納豆の製造が可能になると考えた。
【００１０】
しかしながら、納豆菌のγ−アミノ酪酸分解・代謝に関与する遺伝子の詳細な情報は、今のところ知られていない。
一方、枯草菌においては、γ−アミノ酪酸の資化に関係する可能性のある遺伝子としては、γ−アミノ酪酸の取り込みに関するγ−アミノ酪酸パーミアーゼ（ＧＡＢＡ  ｐｅｒｍｅａｓｅ）遺伝子（ｇａｂＰ遺伝子）、γ−アミノ酪酸の分解に関わるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子（ｇａｂＴ遺伝子）、及びその分解物の代謝に関わるコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子（ｇａｂＤ遺伝子）が知られている。このうち、ｇａｂＴ遺伝子とｇａｂＤ遺伝子は、オペロンを形成している。また、そのオペロンを正に調節するものとして、ｇａｂＲ遺伝子が報告されている（例えば、モレキュラー・マイクロバイオロジー「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４５巻、２号、ｐ．５６９−５８３、（２００２）」参照）。
【００１１】
さらに、枯草菌では、ｇａｂＰ遺伝子を破壊することによりγ−アミノ酪酸の取り込み能が失われることが報告されている（例えば、「モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２２巻、４号、ｐ．６９３−７０１、（１９９６）」参照）。また、ｇａｂＰ遺伝子、ｇａｂＴ遺伝子、ｇａｂＤ遺伝子及びｇａｂＲ遺伝子を個々に破壊した株ではＧＡＢＡを唯一の窒素源とした培地では増殖しないことが報告されている（例えば、「モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、４５巻、２号、ｐ．５６９−５８３、（２００２）」参照）。すなわち、枯草菌の場合、上記複数の遺伝子が共同に作用してγ−アミノ酪酸の資化が行われ、複数の遺伝子のうち一つでも破壊すればγ−アミノ酪酸の資化能が低下ないしは欠損する。
【００１２】
そこで、納豆菌のｇａｂＰ遺伝子、若しくはｇａｂＴＤオペロンを、それぞれ遺伝子組換え法により破壊した納豆菌変異株を構築し、納豆作製時のγ−アミノ酪酸の資化能を検討したところ、それぞれの遺伝子破壊株のγ−アミノ酪酸資化能は、ほとんど低下しなかった。このことから、納豆菌の代謝経路においては、その一部分が機能しない場合にその機能を補完するタンパク質が存在すること、及び、そのタンパク質の発現は非常に低いものであることが推測される。
そこで、本発明者らは試行錯誤を繰り返した結果、ｇａｂＰ遺伝子及びｇａｂＴＤオペロンを同時に破壊したところ、驚くべきことに、γ−アミノ酪酸の資化能をほぼ欠損させた納豆菌変異株が得られることを見出した。
そして、このγ−アミノ酪酸資化能が低下した納豆菌を用いることにより、品質は通常のものと同等で、γ−アミノ酪酸を高含有する納豆を製造できることを見出した。
さらに、上記納豆菌がγ−アミノ酪酸を分解しないことに鑑みて、上記納豆の製造過程において、蒸煮大豆にγ−アミノ酪酸を添加することにより、さらにγ−アミノ酪酸を多く含有する納豆を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
請求項１記載の本発明は、親株よりも低いγ−アミノ酪酸資化能を有することを特徴とする納豆菌変異株である。
請求項２記載の本発明は、γ−アミノ酪酸パーミアーゼ活性、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ活性、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素活性が親株よりも低いことを特徴とする請求項１記載の納豆菌変異株である。
請求項３記載の本発明は、親株のγ−アミノ酪酸パーミアーゼ遺伝子、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子を破壊させることによりγ−アミノ酪酸資化能を低下させたことを特徴とする請求項１又は２記載の納豆菌変異株である。
請求項４記載の本発明は、親株のγ−アミノ酪酸パーミアーゼ遺伝子にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されてなると同時に、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなる、γ−アミノ酪酸資化能の低下した納豆菌変異株ｇａｂＰＴＤ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６７１）である。
【００１４】
請求項５記載の本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の納豆菌変異株を使用して製造されることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有納豆である。
請求項６記載の本発明は、製造時にγ−アミノ酪酸が添加されることを特徴とする請求項５に記載のγ−アミノ酪酸含有納豆である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、γ−アミノ酪酸をほとんど分解・代謝しない納豆菌変異株が提供される。該納豆菌変異株を用いることにより、通常の納豆の品質を維持しながら、従来の納豆にはほとんど含まれていなかったγ−アミノ酪酸をより高濃度で含有する納豆を、添加物などを用いなくとも効率良く製造することができる。
本発明により提供されるγ−アミノ酪酸含有納豆は、γ−アミノ酪酸を豊富に含有することから、血圧降下作用などの種々の健康機能が期待される品質の良い納豆として、特定保健用食品、健康食品等として、幼児〜高齢者に至るまで、広く利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の納豆菌変異株の親株である納豆菌は、枯草菌（バシラス・サテラス；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類され、粘物質（糸引物質）などの納豆としての特徴を作り出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌である。
一方、納豆菌は、生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ）として、或いはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．ｎａｔｔｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）のように枯草菌の変種などとして、枯草菌と区別されている。
【００１７】
納豆菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ  ＩＦＯ３００９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがある他、各種の納豆菌が広く使用できる。
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や、該株の形質転換効率向上性変異株であるｒ２２株（特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ3株、東京農業大学菌株保存室）、宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００１８】
このような本発明の納豆菌変異株は、親株よりも低いγ−アミノ酪酸資化能を有するものを育種選抜して得ることができる。例えば、親株のγ−アミノ酪酸分解・代謝機能に関与する酵素活性、例えば、請求項２に記載するように、γ−アミノ酪酸パーミアーゼ活性、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ活性、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素活性が親株よりも低いものを選抜することにより得ることができる。
特に、請求項３に記載するように、親株のγ−アミノ酪酸パーミアーゼ遺伝子（ｇａｂＰ遺伝子）、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｇａｂＴ遺伝子）、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ｇａｂＤ遺伝子）を破壊させることによりγ−アミノ酪酸資化能を低下させたものとして、本発明の納豆菌変異株を得ることができる。
これらの三種の遺伝子全てが破壊されることにより、γ−アミノ酪酸の資化能を低下させることができるが、いずれか１種類、或いはｇａｂＴ及びｇａｂＤの同時破壊だけでは、目的を達成することはできない。その理由については明らかでないが、納豆菌の代謝経路においては、その一部分が機能しない場合にその機能を補完するタンパク質がごく僅かであるが発現することによると推測される。
尚、これらの遺伝子のうち、ｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子は、オペロン（ｇａｂＴＤオペロン）を形成している。
【００１９】
親株のｇａｂＰ遺伝子、ｇａｂＴ遺伝子、及びｇａｂＤ遺伝子を欠損させるための育種方法の一つとして、相同組換えを利用した遺伝子改良法が採用可能である。本方法の利点は狙いを定めた遺伝子だけを特異的に欠損させることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利用される微生物においては、他の優れた特性は壊さずに、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異を起こさせて改良することができることである。
【００２０】
さらに、スタールらが枯草菌バシラス・サテラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において開発した相同組換え能を利用した遺伝子失活法（例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５８巻、ｐ．４１１−４１８、（１９８４）」参照）を納豆菌用に改変した方法も利用可能である。この方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去することができる方法であるため、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならないなどの長所を有している。
【００２１】
また、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、納豆菌を遺伝子導入活性が高くなる状態にするいわゆるコンピテンス法（例えば、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、（１９７１）」参照）が利用可能である。
そして、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、ファージベクターを利用した形質導入法が既に開発されており（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６３巻、ｐ．４０８３−４０８９、（１９９７）」参照）、本発明ではこの方法も利用可能である。
【００２２】
本発明者らは、上記手法のうち、コンピテンス法を利用して、請求項４に記載するように、親株のｇａｂＰ遺伝子にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されてなると同時に、ｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されてなる、γ−アミノ酪酸資化能の低下した納豆菌変異株ｇａｂＰＴＤ１を得ることができた。ｇａｂＰＴＤ１は、後述の実施例に示すように、γ−アミノ酪酸資化能が親株に比べて顕著に低く、γ−アミノ酪酸をほとんど分解・代謝しないことが証明されている。
この納豆菌変異株ｇａｂＰＴＤ１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６７１である。
【００２３】
尚、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、即ち、既に目的遺伝子が欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、薬剤変異法などによってこれらの遺伝子を変異欠損させるなどの突然変異法など、従来から実施されているような他の方法によっても育種が可能である。
【００２４】
このようにして、親株よりも低いγ−アミノ酪酸資化能を有する本発明の納豆菌変異株を得ることができる。
親株を含む通常の納豆菌は、γ−アミノ酪酸資化能があるので、蒸煮大豆に対して植菌すると、蒸煮大豆中のγ−アミノ酪酸を分解・代謝し尽くしてしまうが、本発明の納豆菌変異株は、親株と比べてγ−アミノ酪酸資化能が低下、若しくは欠損しているために、蒸煮大豆に対して植菌すると、蒸煮大豆中のγ−アミノ酪酸をほとんど分解・代謝することがない。
従って、本発明の納豆菌変異株は、γ−アミノ酪酸資化能が親株に比べて顕著に低いという性質は、γ−アミノ酪酸含有納豆の製造に好ましく利用することができ、このような高付加価値の納豆を提供するのが、請求項５記載の本発明である。
すなわち、請求項５記載の本発明のγ−アミノ酪酸含有納豆は、上記本発明の納豆菌変異株を使用して製造されることを特徴とする。
【００２５】
本発明のγ−アミノ酪酸含有納豆は、上記本発明の納豆菌変異株を用いて製造されるのであれば、その製造条件及び製造工程について特に制限はなく、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２Ｋｇ／ｃｍ２・１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
このような従来の納豆の製造方法において、本発明のγ−アミノ酪酸含有納豆を得る場合は、発酵工程で用いる納豆菌を、本発明の納豆菌変異株に代えて使用することができる。
【００２６】
尚、本発明の納豆菌変異株との相乗効果を期待して、請求項６に記載するように、γ−アミノ酪酸を添加することにより、生産される納豆のγ−アミノ酪酸量をさらに増強させることも可能である。
γ−アミノ酪酸の添加は、蒸煮大豆にγ−アミノ酪酸溶液を加えることにより行うこともでき、その際のγ−アミノ酪酸の添加量は、一般に納豆とした場合に、γ−アミノ酪酸が析出しない程度の範囲とすることができる。
【００２７】
本発明のγ−アミノ酪酸含有納豆は、γ−アミノ酪酸資化能が親株に比べて顕著に低い納豆菌変異株を用いて製造されるものであるから、γ−アミノ酪酸を高い濃度で含有している。この点は、後述の実施例からも実際に証明されており、従って、本発明のγ−アミノ酪酸含有納豆は、γ−アミノ酪酸の健康機能が期待できる優れた納豆であることが明らかである。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明の実施例について述べる。
実施例１（γ−アミノ酪酸資化能低下納豆菌の構築）
（１）基本条件
親株としては、納豆菌バシラス・サテラスｒ２２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｒ２２）株（以下、ｒ２２株と称する場合もある）（例えば、「特開２０００−２２４９８２号公報」参照）を用いた。ｒ２２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌であるＯ−２株を、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した形質転換能を高めた変異株である。
【００２９】
即ち、Ｏ−２株を常法に準じＮＴＧ処理（ＮＴＧ濃度１６０μｇ／ｍｌ、３０℃、１時間、生存率７．３％）して、得られた変異菌５×１０６個を、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１６８巻、ｐ．１１１−１１５、１９７９年」に記載されているバシラス・サテラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の方法に準じたプロトプラスト法により、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで形質転換した。形質転換後のプロトプラスト培地としてＮＰ再生培地（表１）を用い、テトラサイクリン耐性を指標として数十株の形質転換株を得た。形質転換株のうち３０株を選択し、胞子形成培地で培養して胞子を形成させた。
その後、それぞれの形質転換株から得られた胞子を培養後、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの保持の有無を調べ、得られた２１株のベクター除去株について、プロトプラストを形成し、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで再度形質転換し、親株Ｏ−２よりも形質転換能が向上しているもの１５株を選抜した。さらに、これら１５株について常法による納豆製造試験を行い、発酵能や品質評価を比較検討した結果、外観上納豆となったものを製造できる４株のうち、品質の悪いものや糸引きが極端に悪くなったものを除いた１株をｒ２２株として得た。
【００３０】
【表１】
2005304320.tif 000002
【００３１】
また、他には大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α）株（タカラバイオ社製）を用いた。
プラスミドベクターとしては、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ｐＣ１９４（ＡＴＣＣより入手）及びｐＩＣ３３３（例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１７８巻、ｐ．１１７８−１１８６、（１９９６）」参照）を用いた。
なお、特に記載しない限り、培養条件や培地及びその他の遺伝子組換え技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版（１９９２）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ」の記載に従った。
また、基本的な培養は、下記の表２に示す組成からなるＬＢ培地を用いて行った。
【００３２】
【表２】
2005304320.tif 000003
【００３３】
他の培地として、ＧＡＢＡを唯一窒素源とする最少栄養培地（例えば、「モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、４５巻、２号、ｐ．５６９−５８３、（２００２）」参照）を以下の表３に示した。
【００３４】
【表３】
2005304320.tif 000004
【００３５】
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅には、Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は添付のマニュアルに従った。
納豆菌の染色体ＤＮＡの調製は、市販のキットを使用して行ない、また、形質転換は「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、（１９７１）」の方法に従って行った。
納豆菌の胞子は、以下の表４に示す組成からなるＳｔｅｒｌｉｎｉ−Ｍａｄｅｌｓｔａｍ置換培地を用いて調製した。
【００３６】
【表４】
2005304320.tif 000005
【００３７】
（２）プライマーの設計
ａ．ｇａｂＰ遺伝子の破壊
ｒ２２株のｇａｂＰ遺伝子領域付近の上流側約２．７ｋｂｐの増幅には、プライマー１（配列表の配列番号１参照）及びプライマー２（配列表の配列番号２参照）を使用し、下流側約２．６ｋｂｐの増幅には、プライマー３（配列表の配列番号３参照）及びプライマー４（配列表の配列番号４に記載）を使用した。
ｐＩＣ３３３のスペクチノマイシン耐性遺伝子の増幅には、プライマー５（配列表の配列番号５参照）及びプライマー６（配列表の配列番号６参照）を用いた。
【００３８】
ｂ．ｇａｂＴ及びｇａｂＤ遺伝子の破壊
ｒ２２株のｇａｂＴ及びｇａｂＤ遺伝子領域付近の上流側約２．６ｋｂｐの増幅には、プライマー７（配列表の配列番号７参照）及びプライマー８（配列表の配列番号８参照）を使用し、下流側約２．５ｋｂｐの増幅には、プライマー９（配列表の配列番号９参照）及びプライマー１０（配列表の配列番号１０参照）を使用した。
ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の増幅には、プライマー１１（配列表の配列番号１１参照）及びプライマー１２（配列表の配列番号１２参照）を用いた。
【００３９】
尚、それぞれのプライマーは、枯草菌バシラス・サテラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｇａｂＰ遺伝子、ｇａｂＴ遺伝子、及びｇａｂＤ遺伝子を含む付近の塩基配列（例えば、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３９０巻、Ｐ．２４９−２５６、（１９９７）」参照）、ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列（例えば、「プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・イン・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｕ．Ｓ．Ａ．）、７７巻、１２号、ｐ．７０７９−７０８３、（１９８０）」参照）、並びに、ｐＩＣ３３３上のスペクチノマイシン耐性遺伝子は遺伝子情報データベースＧｅｎｂａｎｋ−ｔｏｄａｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ−ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｆｉｎｄ？ｇｅｎｂａｎｋ−ｕｐｄ）に記載されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓトランスポゾンＴｎ５５４由来の塩基配列情報のそれぞれを基にして設計した。
【００４０】
（３）ベクターの構築
ａ．ｇａｂＰ遺伝子の破壊
ｒ２２株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１参照）及びプライマー２（配列表の配列番号２参照）を用いて、ｇａｂＰ遺伝子領域付近の上流側約２．７ｋｂｐを増幅するとともに制限酵素サイトｓａｃＩおよびＳｍａＩを両端に導入した（ＤＮＡ断片１（DNA fragment 1））。
また、プライマー３（配列表の配列番号３参照）及びプライマー４（配列表の配列番号４参照）を用いて、ｇａｂＰ遺伝子領域付近の下流側約２．６ｋｂｐを増幅するとともに、制限酵素サイトＳｍａＩおよびＢａｍＨＩを両端に導入した（ＤＮＡ断片２（DNA fragment 2））。
さらに、ｐＩＣ３３３を鋳型にし、プライマー５（配列表の配列番号５参照）及びプライマー６（配列表の配列番号６に記載）を用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅するとともに制限酵素サイトＳｍａＩを該遺伝子の両端に導入した（ＤＮＡ断片３（DNA fragment 3））。
【００４１】
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いて大腸菌ＤＨ５αを宿主としてベクターを構築した。その概略を図１に示した。
即ち、ＤＮＡ断片１を制限酵素ＳａｃＩ及びＳｍａＩで、ＤＮＡ断片２をＳｍａＩ及びＢａｍＨＩで、ＤＮＡ断片３をＳｍａＩで、それぞれ処理した。得られた断片を、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト上のＳａｃＩ〜ＢａｍＨＩにＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２を同時に導入した（図１の（ａ）参照）。その後、ＳｍａＩで処理した箇所にＤＮＡ断片３を導入し（図１の（ｂ）参照）、プラスミドｐＧＰＳ１を得た。
【００４２】
ｂ．ｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子の破壊
ｒ２２株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、プライマー７（配列表の配列番号７参照）及びプライマー８（配列表の配列番号８参照）を用いて、ｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子領域付近の上流側約２．６ｋｂｐを増幅するとともに制限酵素サイトＳａｌＩ及びＸｈｏＩを両端に導入した（ＤＮＡ断片４（DNA fragment 4））。
また、プライマー９（配列表の配列番号９参照）及びプライマー１０（配列表の配列番号１０参照）を用いて、ｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子領域付近の下流側約２．５ｋｂｐを増幅するとともに、制限酵素サイトＸｈｏＩおよびＳｐｈＩを両端に導入した（ＤＮＡ断片５（DNA fragment 5））。
さらに、ｐＣ１９４を鋳型にし、プライマー１１（配列表の配列番号１１参照）及びプライマー１２（配列表の配列番号１２参照）を用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅するとともに、制限酵素サイトＸｈｏＩを該遺伝子の両端に導入した（ＤＮＡ断片６（DNA fragment 6））。
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いてベクターを大腸菌ＤＨ５αを宿主として構築したが、その概略は図２に示した。即ち、ＤＮＡ断片４を制限酵素ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで、ＤＮＡ断片５をＸｈｏＩおよびＳｐｈＩで、ＤＮＡ断片６をＸｈｏＩで処理した。得られた断片をｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト上のＳａｌＩ〜ＳｐｈＩにＤＮＡ断片４とＤＮＡ断片５を同時に導入した（図２の（ａ）参照）。その後、ＸｈｏＩで処理した箇所にＤＮＡ断片６を導入し（図２の（ｂ）参照）、プラスミドｐＧＴＤＣ１を得た。
【００４３】
（４）形質転換
ａ．ｇａｂＰ遺伝子破壊株の作製
プラスミドｐＧＰＳ１のプラスミドＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４に記載）を用いて、ｇａｂＰ遺伝子領域及びスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む約６．５Ｋｂｐを増幅した。増幅されたＤＮＡを用いてｒ２２株へ形質転換した。形質転換株の選択は、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で、３７℃、１８時間培養することによって行った。
このようにして得られた形質転換株であるバシラス・サテラスｇａｂＰ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇａｂＰ１）株（以下、ｇａｂＰ１株と称する場合もある）のｇａｂＰ遺伝子は、塩基番号６０−１３２９の１２６９塩基がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることが、ＰＣＲ法による解析によって確認された。
【００４４】
ｂ．ｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子破壊株の作製
プラスミドｐＧＴＤＣ１のプラスミドＤＮＡを鋳型にし、プライマー７（配列表の配列番号７参照）及びプライマー１０（配列表の配列番号１０参照）を用いて、ｇａｂＴ遺伝子領域、ｇａｂＤ遺伝子領域及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む約６Ｋｂｐを増幅した。増幅されたＤＮＡを用いてｒ２２株へ形質転換した。形質転換株の選択は、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で、３７℃、１８時間培養することによって行った。
このようにして得られた形質転換株であるバシラス・サテラスｇａｂＴＤ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇａｂＴＤ１）株（以下、ｇａｂＴＤ１株と称する場合もある）のｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子は、ｇａｂＴ遺伝子の塩基番号３５からｇａｂＤ遺伝子の塩基番号１３４２までの計２６８６塩基がクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることが、ＰＣＲ法による解析によって確認された。
【００４５】
ｃ．ｇａｂＰ遺伝子、ｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子の同時破壊株の作製
上記ａで構築した破壊株の染色体ＤＮＡを供与ＤＮＡとして用いて、上記ｂで構築した破壊株を宿主として形質転換を行った。形質転換株の選択は、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌとスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌとを添加したＬＢ培地で、３７℃、１８時間培養することによって行った。
このようにして得られた形質転換株であるバシラス・サテラスｇａｂＰＴＤ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇａｂＰＴＤ１）株（以下、ｇａｂＰＴＤ１株と称する場合もある）のｇａｂＰ遺伝子は、塩基番号６０−１３２９の１２６９塩基がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していること、及び、該株のｇａｂＴ及びｇａｂＤ遺伝子は、ｇａｂＴ遺伝子の塩基番号３５からｇａｂＤ遺伝子の塩基番号１３４２までの計２６８６塩基がクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることが、ＰＣＲ法による解析によって確認された。
【００４６】
実施例２（納豆試作と品質評価）
常法に従い、実施例１で親株として使用したｒ２２株、並びに実施例１で前記ｒ２２株を親株として得られた３種類の変異株、ｇａｂＰ１株、ｇａｂＴＤ１株、及びｇａｂＰＴＤ１株の胞子液を調製した。
即ち、ｒ２２株、ｇａｂＰ１株、ｇａｂＴＤ１株、及びｇａｂＰＴＤ１株を、表１に示す組成からなるＮＢ培地にそれぞれ１白菌耳植菌し、３７℃、一晩培養した。得られる各培養液を、表２に示す組成からなる胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して４種類の胞子液を調製した。
【００４７】
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。即ち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧１．８ＫＰａで１８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のｒ２２株又はｇａｂＰ１、ｇａｂＴＤ１、ｇａｂＰＴＤ１株の胞子液を滅菌水で２０倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ植菌し、３９℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間保存して、納豆を調製した。
【００４８】
その結果、ｇａｂＰ１株、ｇａｂＴＤ１株、及びｇａｂＰＴＤ１株のそれぞれを用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延や発酵中の納豆品温の低下等は見られなかったことから、ｇａｂＰ遺伝子、ｇａｂＴ遺伝子及びｇａｂＤ遺伝子の各遺伝子の欠損変異操作は、納豆菌の生育に影響を及ぼさないことが分かった。
【００４９】
続いて、試作により得られた納豆を官能検査に供した。
その結果、親株（ｒ２２株）と変異株（ｇａｂＰ１、ｇａｂＴＤ１、ｇａｂＰＴＤ１株）とで品質上に違いが見られず、ｇａｂＰ１株、ｇａｂＴＤ１株、及びｇａｂＰＴＤ１株を種菌に用いて作製した納豆は、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
その後、納豆中のγ−アミノ酪酸の含有量を測定した。
即ち、磨り潰した納豆２ｇを秤量し、０．２Ｎ塩酸を加え懸濁し５０ｍｌにメスアップし、一晩放置してからＮｏ．２濾紙（Ｎｏ．２、φ１２５ｍｍ  ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）でろ過した。５ｍｌを採取し、これに３％の５−Ｓｕｌｆｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄを含むｄｉｈｙｄｒａｔｅを２０ｍｌ添加して、１５分間懸濁してから、Ｎｏ．５Ｃ濾紙（Ｎｏ．５Ｃ、φ１２５ｍｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）で濾過した。
濾液２０ｇにＬｉＯＨを添加してｐＨ２．２に調整し、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ａｃｅｔａｔｅ膜（孔径０．４５μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）でろ過したものについて、アミノ酸分析を行った。
分析の結果明らかとなった各納豆のγ−アミノ酪酸含有量を、表５に示した。
【００５０】
【表５】
2005304320.tif 000006
Ｎ．Ｄ．＝ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ
【００５１】
表５に示すように、変異株ｇａｂＰ１株及びｇａｂＴＤ１株で作製した納豆中には、親株ｒ２２で作製した納豆と同様に、γ−アミノ酪酸は含まれていないが、変異株ｇａｂＰＴＤ１株で作製した納豆中には原資（蒸煮大豆）とほぼ同量のγ−アミノ酪酸の残存が確認できた。
このことから、原資（蒸煮大豆）に含まれるγ−アミノ酪酸は、通常の納豆菌や、ｇａｂＰ遺伝子又はｇａｂＴＤオペロンのみを破壊した株では分解され代謝し尽くされてしまうのに対し、ｇａｂＰ遺伝子及びｇａｂＴＤオペロンの両方が破壊された変異株ｇａｂＰＴＤ１株は、γ−アミノ酪酸の分解・代謝を行わなかったこと、すなわち、γ−アミノ酪酸資化能が低下していることが明らかである。
以上より、γ−アミノ酪酸資化能が低下した変異株ｇａｂＰＴＤ１株は、通常の納豆菌と同様の条件で生育可能であると共に、γ−アミノ酪酸を豊富に含む納豆を生産できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、γ−アミノ酪酸をほとんど分解・代謝しない納豆菌変異株が提供される。該納豆菌変異株を用いることにより、通常の納豆の品質を維持しながら、従来の納豆にはほとんど含まれていなかったγ−アミノ酪酸をより高濃度で含有する納豆を、添加物などを用いなくとも効率良く製造することができる。
本発明により提供されるγ−アミノ酪酸含有納豆は、γ−アミノ酪酸を豊富に含有することから、血圧降下作用などの種々の健康機能が期待される品質の良い納豆として、特定保健用食品、健康食品等として、幼児〜高齢者に至るまで、広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ｇａｂＰ遺伝子破壊用ベクター構築の概略を示す図である。
【図２】ｇａｂＴ及びｇａｂＤ遺伝子破壊用ベクター構築の概略を示す図である。
【符号の説明】
【００５４】
図１の（ａ）は、ＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２を同時に導入した際の模式図を示し、（ｂ）は、ＳｍａＩで処理した箇所にＤＮＡ断片３を導入した際の概略を示す模式図を示す。
図２の（ａ）は、ＤＮＡ断片４とＤＮＡ断片５を同時に導入した際の模式図を示し、（ｂ）は、ＸｈｏＩで処理した箇所にＤＮＡ断片６を導入した際の概略を示す模式図を示す。
【図１】
2005304320.tif 000007
【図２】
2005304320.tif 000008
【配列表】
2005304320000001.app