(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物の酢酸耐性に関与する新規な遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物、特に酢酸菌の酢酸耐性を向上させる方法を提供すること、さらに、酢酸耐性を向上させた酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供すること。【解決手段】下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＦ、前記タンパク質をコードし酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。（Ｂ）特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＦ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＦをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項３】
下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物。
【請求項５】
微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子のコピー数が増幅されてなる微生物、特にアセトバクター（Acetobacter）属及びグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター（Acetobacter）属及びグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００３】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（例えば、非特許文献１参照）。
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片を、マルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、ＡＬＤＨはアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００６】
【特許文献１】特開平３−２１９８７８号公報
【特許文献２】特開平２−２３６４号公報
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、１７２巻、ｐ．２０９６−２１０４、１９９０年」
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering)、７６巻、２７０−２７５、１９９３年」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、酢酸菌の酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。しかし、酢酸耐性に優れた酢酸菌が開発されれば、従来より高濃度の酢酸発酵が行われ、高濃度酢酸、高濃度食酢の効率的製造が可能となることから、本発明者らは、再度、酢酸菌の酢酸耐性の向上を遺伝子レベルで解明することとした。
そして本発明者らは、各方面から検討した結果、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが重要であるとの観点に立ち、微生物由来の酢酸耐性に関与する新規な遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物、特に酢酸菌の酢酸耐性を向上させる方法を提供すること、さらに、酢酸耐性を向上させた酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを新規技術課題として新たに設定した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在する、との仮説を立てた。そして、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する、従来得ることができなかった新規食酢の効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
【０００９】
従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。しかし、このような方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意検討を重ねた。
その結果、本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換し、通常１％程度の酢酸の存在下でしか生育できない株を、２％の酢酸の存在下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な酢酸耐性遺伝子をクローニングすることにはじめて成功した。
【００１０】
更に本発明者らは、新規な酢酸耐性遺伝子ＤＮＡの塩基配列、及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の決定にも成功した。得られた酢酸耐性遺伝子のコーディング領域は、ＲＮＡポリメラーゼシグマファクター（以下、シグマファクターという場合もある）と称される一群のタンパク質をコードする遺伝子に共通する特徴的な塩基配列を有し、これらのタンパク質とある程度の相同性を有していることから、シグマファクターとある程度似ている酢酸菌の新規なタンパク質をコードする遺伝子であると推定された。
【００１１】
また、該遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換し、コピー数を増幅させた形質転換株においては、顕著に酢酸耐性が向上し、その結果、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場合に、増殖誘導期が短縮する上に、増殖速度、生酸速度が向上すると共に、さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上することなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、請求項１記載の本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＦを提供するものである。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１３】
請求項２記載の本発明は、前記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＦをコードする遺伝子のＤＮＡを提供するものである。
請求項３記載の本発明は、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の遺伝子のＤＮＡを提供するものである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
請求項４記載の本発明は、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物を提供するものである。
請求項５記載の本発明は、微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項４に記載の微生物を提供するものである。
請求項６記載の本発明は、請求項４又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸に対する耐性を付与し、酢酸耐性を増強することができる。アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌の酢酸に対する耐性を実用レベルで顕著に向上させることができ、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
よって、本発明によれば、高濃度酢酸、高濃度食酢の効率的製造が可能となり、食酢の工業的生産において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質ＳＦは、請求項１に記載するように、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１７】
ここで、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼシグマファクターと称される一群のタンパク質に共通する特徴的な塩基配列によりコードされる部分を有し、これらのタンパク質とある程度の相同性を有していることから、シグマファクターとある程度似ている酢酸菌の新規なタンパク質であると推定された。
すなわち、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、ブラディリゾビウム・ヤポニカム（Bradyrhizobium japonicum）のＲＮＡポリメラーゼシグマ−Ｅファクター（ｓｉｇｍａ２４）遺伝子とアミノ酸配列レベルで４４％の、また、ブルセラ・スイス１３３０（Brucella suiss 1330）株のＲＮＡポリメラーゼシグマ−７０ファクター遺伝子とアミノ酸配列レベルで４４％の相同性を有する。
【００１８】
本発明のタンパク質ＳＦは、上述のように、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよいが、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質、（Ａ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質であっても良い。
【００１９】
このような、タンパク質（Ｂ）は、例えば部位特異的変異法によって、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列となるように改変することによっても取得され得る。また、従来知られている突然変異処理によっても取得することができるし、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。取得方法の詳細については、酢酸耐性を増強する機能を有することの確認のための手段を含めて、後述の（２）本発明のＤＮＡについての説明において詳細に説明する。
【００２０】
このような本発明のタンパク質ＳＦは、微生物、例えばアセトバクター（Acetobacter）属又はグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属に属する酢酸菌、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮｏ.１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）に存在し、特にアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）に存在する。
【００２１】
（２）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、請求項２に記載するように、上記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＦをコードする遺伝子のＤＮＡである。具体的には、請求項３に記載するように、下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
なお、本発明のＤＮＡが、塩基配列の調整要素及び該遺伝子の構造部分を含んでも良いことは、言うまでもない。
【００２２】
本発明のタンパク質ＳＦをコードするＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により取得することができる。
【００２３】
次に、得られた染色体ＤＮＡから酢酸耐性増強遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々のＤＮＡ断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを部分消化する。なお、後記実施例ではＳａｕ３ＡＩを用いた。
【００２４】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
【００２５】
上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡ（染色体ＤＮＡライブラリー）を得る。
【００２６】
得られた組換えＤＮＡ（染色体ＤＮＡライブラリー）からの前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子、具体的には前記ＤＮＡ（ａ）の選抜は、例えば以下のようにして行うことができる。通常は寒天培地上で１％よりも高濃度の酢酸の存在下では増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチ１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）を、組換えＤＮＡにより形質転換し、その後２％酢酸含有寒天培地に塗布し、培養する。そこで生じたコロニーを液体培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで、目的のＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
こうして、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列を含むＤＮＡを得ることができる。ここで、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列はコーディング領域であり、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、コーディング領域に対応したものである。
タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子、具体的にはＤＮＡ（ａ）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおけるホモロジー検索の結果、ブラディリゾビウム・ヤポニカム（Bradyrhizobium japonicum）のＲＮＡポリメラーゼシグマ−Ｅファクター（ｓｉｇｍａ２４）遺伝子とアミノ酸配列レベルで４４％の、またブルセラ・スイス１３３０（Brucella suiss 1330）株のＲＮＡポリメラーゼシグマ−７０ファクター遺伝子とアミノ酸配列レベルで４４％の相同性を有する。
これらのことから、タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子、具体的にはＤＮＡ（ａ）は、酢酸菌に特異的なタンパク質遺伝子であって、ＲＮＡポリメラーゼシグマファクターと似ている新規な蛋白質をコードする遺伝子であることが推定されたものである。
尚、シグマファクタータンパク質遺伝子が、酢酸耐性と関係していることは従来全く知られていなかったことであり、本発明者が初めて見出したものである。
【００２８】
さらに、本発明のタンパク質ＳＦをコードするＤＮＡは、すでに取得されている酢酸菌の酢酸耐性遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）や酢酸耐性を増強する機能を有するＡＤＨ遺伝子などとも異なる新規な酢酸耐性を増強する機能を有する遺伝子であると同定された。
【００２９】
タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子、具体的にはＤＮＡ（ａ）は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであれば、即ち配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列を含むものであれば、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができ、特にその製造方法は限定されない。
ここで、上記方法でプライマーやプローブとして用いるオリゴヌクレオチドは、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーGene Amp PCR System 2400を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３０】
本発明のタンパク質ＳＦをコードするＤＮＡは、上述のように、（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列を含むＤＮＡであるが、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質、すなわち（Ａ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするものであっても良い。
このような酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、逆位又は付加されるように塩基配列を改変することによっても取得し得る。また、上記のように改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００３１】
また、一般的に、タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６１１〜１０９６からなる塩基配列又は前記塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、得ることができる。
【００３２】
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡどうし、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡどうしがハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡどうしがハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１ｘＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００３３】
酢酸耐性を増強する機能を有することの確認は、例えば、後述の実施例で説明するように、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に目的のＤＮＡを形質転換し、酢酸を２％含む培地で培養し、増殖可能かどうかを調べることにより行なうことができる。
【００３４】
（３）本発明の酢酸菌
本発明の微生物は、請求項４に記載するように、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されてなる、高度な酢酸耐性を有する微生物である。
【００３５】
このような微生物として、アルコール酸化能を有する酢酸菌が挙げられ、中でも、請求項５に記載のアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌は、酢酸の生産量及び生産効率を増大させることができる点で好ましい。
係る高度な酢酸耐性を有する微生物の取得に用いる酢酸菌は、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であり、アセトバクター属の酢酸菌としては例えば、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株が例示される。
また、グルコンアセトバクター属の酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes MH-24）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）が例示される。
【００３６】
微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数を増幅する方法としては、少なくとも請求項２又は３に記載のＤＮＡの構造遺伝子（配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、配列番号６１１〜１０９６）を含むＤＮＡ断片を、酢酸耐性を付与したい微生物中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、前記微生物を形質転換することによって行うことができる。
ここで、プロモーター配列は、酢酸耐性を付与したい微生物中で効率よく機能するものであれば、他の微生物由来のプロモーター配列に置き換えてもよい。例えば、酢酸耐性を付与したい微生物が、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌中である場合、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００３７】
上記プロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いた形質転換は、該組換えＤＮＡを保持するマルチコピーベクターを微生物の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該組換えＤＮＡを保持するプラスミド、トランスポゾン等のマルチコピーベクターを、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
マルチコピーベクターとしては、ｐＧＩ１８（特願２００３−３５０２６５号明細書参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）等が挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）、５２巻、ｐ．３１２５−３１２９、１９８８年」参照）も用いることができる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
これらのうち、アセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌への遺伝子導入効率が高く、且つ細胞内での安定性に優れる点で、ｐＧＩ１８が好ましい。
【００３８】
マルチコピーベクターの微生物の細胞への導入は、塩化カルシウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）、４９巻、ｐ．２０９１−２０９７、１９８５年」参照）やエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry）、５８巻、ｐ．９７４−９７５、１９９４年」参照）等によって行なうことができる。
このようにして得られる微生物は、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅されていることから、高度な酢酸耐性を有するものである。中でも、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにして細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数を増幅すると、酢酸耐性が選択的に増強され、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００３９】
（４）本発明の食酢の製造方法
本発明の食酢の製造方法は、請求項６に記載するように、請求項４又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法である。
即ち、本発明の食酢の製造方法は、微生物細胞内における請求項２又は３に記載のＤＮＡのコピー数が増幅され、酢酸耐性が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造するものである。
【００４０】
本発明の製造方法におけるアルコールを含有する培地での培養は、従来の酢酸菌による酢酸発酵と同様に行なえば良い。
アルコールを含有する培地とは、エタノール等のアルコールと、炭素源、窒素源、無機物等を含有する培地であり、いわゆる酢酸発酵の際に用いられる培地と同様の組成のものを使用することができる。必要に応じて、使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００４１】
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
【実施例】
【００４２】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１（グルコンアセトバクター・エンタニイからの酢酸耐性遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定）
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を酢酸６％とエタノール４％を添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）で３０℃にて振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００ｘｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００４３】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩ(宝酒造社製)で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2、宝酒造社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００４４】
（２）酢酸耐性遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に形質転換した。
その後、形質転換されたアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、酢酸２％、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地で、３０℃で４日間培養した。
【００４５】
そこで生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、約２ｋｂｐのＨａｅＩ断片がクローン化されたプラスミドが回収できた。
図１に、クローン化された約２ｋｂｐのＨａｅＩ断片の制限酵素地図を酢酸耐性遺伝子の位置と共に示した。
【００４６】
さらに酢酸２％を含有するＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を生育可能にするＤＮＡ断片は、約２ｋｂｐのＨａｅＩ断片であることが確認できた。
このようにして通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖できないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸含有寒天培地でも増殖可能にする酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
【００４７】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＨａｅＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。決定した配列の一部を配列番号１に記載した。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号６１１から塩基番号１０９６にかけて、配列番号２に記載したような１６２個のアミノ酸をコードするオープンリーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。
【００４８】
実施例２（グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強）
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の酢酸耐性遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＳＦ２４を作製した。プラスミドｐＳＦ２４に挿入された増幅断片の概略及び酢酸耐性遺伝子の位置を図１に示した。
【００４９】
ＰＣＲ法は、次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（primer #1：配列表の配列番号３記載の塩基配列参照）及びプライマー２（primer #2：配列表の配列番号４記載の塩基配列参照）を用い、下記する条件にて、ＰＣＲ法を実施した。すなわち、ＰＣＲ法は９４℃３０秒、５５℃３０秒、６８℃５０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。
このｐＳＦ２４をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience，Biotechnology and Biochemistry）、５８巻、ｐ．９７４−９７５、１９９４年」参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００５０】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＳＦ２４を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
具体的には、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地と、エタノール３％、酢酸３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地のそれぞれに、ｐＳＦ２４を有する形質転換株とシャトルベクターｐＧＩ１８を有する元株を接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での培養経過（生育状況）を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。形質転換株及び元株の培養経過を、図２に示す。
【００５１】
その結果、図２に示すように、酢酸を含有しない培地では形質転換株及び元株はほぼ同様の増殖が可能であったのに対し、３％酢酸と３％エタノールを添加した培地では、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００５２】
以上、本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いて、より高酢酸濃度の食酢を高効率で製造することが可能な育種株を取得することができる。更に、該育種株を用いた、より高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸に対する耐性を付与し、酢酸耐性を増強することができる。とりわけ、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌の酢酸に対する耐性を実用レベルで顕著に向上させることができ、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
よって、本発明によれば、高濃度酢酸、高濃度食酢の効率的製造が可能となるので、本発明は食酢の工業的生産において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】クローン化されたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図、酢酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミドｐＳＦ２４に挿入された増幅断片の概略を示す図である。
【図２】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来酢酸耐性遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株及び元株の培養経過を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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