(57)【要約】【課題】  ボルデテラワクチンの効果を増強あるいは変化させる、ＩＬ−１２を含む新たな組成物、ならびにボルデテラ感染症の予防、治療、または改善におけるそれらの使用方法を提供する。【解決手段】  有効なアジュバント量のインターロイキン−１２およびインビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効なアジュバント量のインターロイキン−１２およびインビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２】
少なくとも１種のボルデテラ抗原およびインビボで発現されて有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３】
少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラによる感染症を予防、治療、または改善する方法であって、抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして抗原が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法。
【請求項４】
少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラによる感染症を予防、治療、または改善する方法であって、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法。
【請求項５】
少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法であって、抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして抗原が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法。
【請求項６】
少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法であって、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法。
【請求項７】
少なくとも１種のボルデテラ抗原を含む第１の組成物および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む第２の組成物を宿主に同時投与することを含む、宿主におけるボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法であって、抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして抗原が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法。
【請求項８】
少なくとも１種のボルデテラ抗原を含む第１の組成物および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む第２の組成物を宿主に同時投与することを含む、宿主におけるボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法であって、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法。
【請求項９】
少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主からのボルデテラのクリアランスを刺激する方法であって、抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして抗原が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法。
【請求項１０】
少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主からのボルデテラのクリアランスを刺激する方法であって、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法。
【請求項１１】
有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を、インビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物と混合することを含む、改良されたワクチン組成物の製造方法。
【請求項１２】
少なくとも１種のボルデテラ抗原を含むワクチン組成物を、インビボで発現されて有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドと混合することを含む、改良されたワクチン組成物の製造方法。
【請求項１３】
アジュバントおよびインビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物における、有効なアジュバント量のインターロイキン−１２をアジュバントとして用いることを含む、ワクチン組成物の改良方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のボルデテラ抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物における、インビボで発現されて有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドをアジュバントとして用いることを含む、ワクチン組成物の改良方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般的には、本発明は、ボルデテラ（Bordetella）種に対するワクチンであって、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をアジュバントとして含有するワクチン、ならびにかかるワクチンにおけるアジュバントとしてのＩＬ−１２の使用方法、あるいはかかるワクチンと組み合わされたＩＬ−１２の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性球桿菌であるボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）の呼吸管コロニー形成は、百日咳ともいわれるゼーゼーいう咳を引き起こし、ヒト小児の病的状態および死亡の大きな原因となる。ボルデテラ近縁の他の２種の単離体もヒトにおいて見いだされており、それらはビー・パラペルツッシス（B. parapertussis）およびビー・ブロンキセプチカ（B. bronchiseptica）である。分子遺伝学的分析により、これら３種の単離体は非常に近縁であり、別の種に分類できないことが示唆されている（Gilchrist, M. J. R., 1991, "Bordetella", in Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., Balows, A. et al., eds., American Society for Microbiology, Washington, D. C.）。ビー・ペルツッシス（B. pertussis）はビー・ブロンキセプチカおよびビー・パラペルツッシスとは、生成するトキシンの性質において異なるが、ビー・ブロンキセプチカおよびビー・パラペルツッシスは活性トキシンを生成すること（Hausman, S. Z. et al., 1996, Infect. Immun. 64: 4020-4026）、ビー・ペルツッシス生物がビー・パラペルツッシス表現型に変化しうることを示すいくつかの証拠がある（Gilchrist, M. J. R., 1991, "Bordetella", in Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., Balows, A. et al., eds., American Society for Microbiology, Washington, D. C.）。ボルデテラ単離体は単離体間で異なるいくつかの表面抗原示すが、１の単離体を認識するモノクローナル抗体は、しばしば、少なくとも１種の他の単離体を認識する（LeBlay, K. et al., 1996, Microbiology 142: 971-978）。ボルデテラ単離体間の高度の分子類似性およびボルデテラ抗原に対するモノクローナル抗体の交差反応性により、１のボルデテラ単離体に対するワクチンにより得られる免疫応答はおそらく他の単離体にも影響する可能性があろうということが示される。
ボルデテラ・ペルツッシス全細胞（whole cell）ワクチンでの免疫は百日咳の抑制に有効であることがわかっているが、そのリアクトジェニシティー（reactogenicity）についての心配が生じた。ボルデテラ無細胞（acellular）ワクチンは有意にリアクトジェニシティーが低いが、効力がさまざまである。最近まで、当該細菌は、感染中は純粋に細胞外の適当な位置を占めるので、結果的には、体液性免疫機構が防御における最重要事項であると考えられていた（Robinson, A. et al., 1985, Vaccine 3: 11-22）。しかしながら、ヒトおよびネズミでの研究から、ビー・ペルツッシスは侵入することにより細胞内の適当な位置も占め、肺のマクロファージおよび他の細胞タイプ内で生存できるという証拠が増えている（Friedman, R. L. et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4578-4585; Saukkonen, K. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 1143-1149）。これらの観察結果はビー・ペルツッシスに対する防御免疫機構に関する再検討をさせるものであった。抗体は細菌トキシンの中和および細菌付着の防止において役割を果たす一方で、細胞性免疫もまたビー・ペルツッシスに対する防御において重要な役割を果たしている（Mills, K. H. G. and K. Redhead,1993, J. Med. Microbiol. 39: 163-164; Peppoloni, S. et al., 1991, Infect. Immun. 59: 3768-3773; Peterson, J. P. et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4563-4570）。
感染症に対する免疫におけるＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞についての現在の理解は、抗原特異的１型Ｔヘルパー（Ｔｈ１）細胞はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）を分泌し、細胞性免疫、遅延型過敏症、および炎症応答を媒介するが、２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）細胞はインターロイキン類ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−６を分泌し、主として抗体産生のための特異的Ｔ細胞援助を用意することに関与しているということである（Monsmann, T. R. and R. L. Coffman, 1989, Adv. Immunol. 46: 117-147）。ネズミ呼吸器モデルを用いる以前の研究により、感染により誘導されるビー・ペルツッシスに対する防御免疫はＩＬ−２およびＩＮＦ−γを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞）集団により媒介されることが示された。養子移入実験により、検出可能な抗体応答の不存在下では防御がＴ細胞により提供されうることが示された。ワクチンにより誘導される免疫についての研究において、全細胞百日咳ワクチンでの免疫は選択的にＴｈ１細胞を誘導したが、ビー・ペルツッシス抗原、無毒化ＰＴ、ＦＨＡ、およびペルタクチン（pertactin）を含む無細胞ワクチンはＴｈ２細胞を誘導した。さらにそのうえ、感染後または全細胞ワクチンでの免疫後のＴｈ１応答は、呼吸器感染後の早期の細菌クリアランスに関係があった（Mills, K. H. G. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 399-410; Redhead, K. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 3190-3198）。
インビボでのプライミング（priming）後のＣＤ４＋細胞サイトカイン産生の１型および２型応答への分極は多くの因子により制御されているように思われる
（T. A. et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1551-1561; Zhan, Y. and C. Cheers, 1995, Infect. Immun. 63: 1387-1390)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の解決課題は、ボルデテラワクチンの効果を増強あるいは変化させる、ＩＬ−１２を含む新たな組成物、ならびにボルデテラ感染症の予防、治療、または改善におけるそれらの使用方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を重ね、有効なアジュバント量のインターロイキン−１２およびインビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを組み合わせることにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）有効なアジュバント量のインターロイキン−１２およびインビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物、
（２）少なくとも１種のボルデテラ抗原およびインビボで発現されて有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドを含む組成物、
（３）少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラによる感染症を予防、治療、または改善する方法であって、抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして抗原が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法、
（４）少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラによる感染症を予防、治療、または改善する方法であって、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法、
（５）少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法であって、抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして抗原が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法、
（６）少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法であって、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法、
（７）少なくとも１種のボルデテラ抗原を含む第１の組成物および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む第２の組成物を宿主に同時投与することを含む、宿主におけるボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法であって、抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして抗原が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法、
（８）少なくとも１種のボルデテラ抗原を含む第１の組成物および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む第２の組成物を宿主に同時投与することを含む、宿主におけるボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法であって、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法、
（９）少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主からのボルデテラのクリアランスを刺激する方法であって、抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして抗原が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法、
（１０）少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主からのボルデテラのクリアランスを刺激する方法であって、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２が投与され、該宿主がヒト以外のものである方法、
（１１）有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を、インビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物と混合することを含む、改良されたワクチン組成物の製造方法、
（１２）少なくとも１種のボルデテラ抗原を含むワクチン組成物を、インビボで発現されて有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドと混合することを含む、改良されたワクチン組成物の製造方法、
（１３）アジュバントおよびインビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物における、有効なアジュバント量のインターロイキン−１２をアジュバントとして用いることを含む、ワクチン組成物の改良方法、
ならびに
（１４）少なくとも１種のボルデテラ抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物における、インビボで発現されて有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドをアジュバントとして用いることを含む、ワクチン組成物の改良方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ボルデテラワクチンの効果を増強あるいは変化させる、ＩＬ−１２を含む新たな組成物、ならびにボルデテラ感染症の予防、治療、または改善におけるそれらの使用方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、無細胞ボルデテラワクチンにおけるアジュバントとしてのＩＬ−１２の使用が、その防御効率を有意に増大させたという知見に基づく。
１の具体例において、本発明は、少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を提供する。好ましくは、抗原はボルデテラ・ペルツッシス抗原であるか、あるいはリポ多糖、ペルツッシストキシン、線状赤血球凝集素、またはペルタクチンであるか、あるいはアラム（alum）に吸着したものである。
【０００８】
もう１つの具体例において、本発明は、有効なアジュバント量のインターロイキン−１２およびインビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
さらなる具体例は、少なくとも１種のボルデテラ抗原およびインビボで発現されて有効ナアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
もう１つの具体例は、少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主におけるボルデテラ感染症の予防、治療、または改善方法を提供する。好ましくは、抗原はボルデテラ・ペルツッシス抗原であるか、あるいはリポ多糖、ペルツッシストキシン、線状赤血球凝集素、またはペルタクチンであるか、あるいはアラム（alum）に吸着したものであるか、あるいは抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして投与されるものである。好ましくは、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２を投与してもよい。
【０００９】
もう１つの具体例において、本発明は、少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を投与することを含む、ボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。好ましくは、抗原はボルデテラ・ペルツッシス抗原であるか、あるいはリポ多糖、ペルツッシストキシン、線状赤血球凝集素、またはペルタクチンであるか、あるいはアラム（alum）に吸着したものであるか、あるいは抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして投与されるものである。好ましくは、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２を投与してもよい。
【００１０】
さらなる具体例において、本発明は、少なくとも１種のボルデテラ抗原を含む第１の組成物および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む第２の組成物を同時投与することを含む、ボルデテラに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。好ましくは、抗原はボルデテラ・ペルツッシス抗原であるか、あるいはリポ多糖、ペルツッシストキシン、線状赤血球凝集素、またはペルタクチンであるか、あるいはアラム（alum）に吸着したものであるか、あるいは抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして投与されるものである。好ましくは、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下でインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２を投与してもよい。
【００１１】
本発明のもう１つの具体例は、少なくとも１種のボルデテラ抗原および有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を含む組成物を投与することを含む、宿主からのボルデテラのクリアランスを刺激する方法を提供する。好ましくは、抗原はボルデテラ・ペルツッシス抗原であるか、あるいはリポ多糖、ペルツッシストキシン、線状赤血球凝集素、またはペルタクチンであるか、あるいはアラム（alum）に吸着したものであるか、あるいは抗原がインビボで発現される条件下において抗原をコードするポリヌクレオチドとして投与されるものである。好ましくは、インターロイキン−１２がインビボで発現される条件下においてインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドとしてインターロイキン−１２を投与してもよい。
さらなる具体例は、有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を、少なくとも１種のボルデテラ抗原を含むワクチン組成物と混合することを含む、改良されたワクチン組成物の製造方法を提供する。好ましくは、抗原はボルデテラ・ペルツッシス抗原であるか、あるいはリポ多糖、ペルツッシストキシン、線状赤血球凝集素、またはペルタクチンであるか、あるいはアラム（alum）に吸着したものである。
有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を、インビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物と混合することを含む、改良されたワクチン組成物の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明のもう１つの態様において、少なくとも１種のボルデテラ抗原を含むワクチン組成物を、インビボで発現されて有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドと混合することを含む、改良されたワクチン組成物の製造方法が提供される。
本発明のもう１つの具体例は、少なくとも１種のボルデテラ抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物における、有効なアジュバント量のインターロイキン−１２をアジュバントとして使用することを含む改良を提供する。好ましくは、抗原はボルデテラ・ペルツッシス抗原であるか、あるいはリポ多糖、ペルツッシストキシン、線状赤血球凝集素、またはペルタクチンであるか、あるいはアラム（alum）に吸着したものである。
【００１３】
また本発明は、アジュバントおよびインビボで発現されて少なくとも１種のボルデテラ抗原を生成しうる少なくとも１種の抗原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物における、有効なアジュバント量のインターロイキン−１２をアジュバントとして使用することを含む改良を提供する。
さらなる具体例として、少なくとも１種のボルデテラ抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物における、インビボで発現されて有効なアジュバント量のインターロイキン−１２を生成しうるインターロイキン−１２をコードするポリヌクレオチドをアジュバントとして使用することを含む改良が提供される。
本発明の他の態様および利点は、以下の本発明の好ましい具体例についての詳細な説明を考慮すれば明かであろう。
【００１４】
本発明は、まず、ボルデテラに対する無細胞ワクチンにより生じた細胞性免疫が、全細胞ワクチンを用いて観察された細胞性免疫と同様の応答をすることを示した。通常には、無細胞ボルデテラワクチン調合物でマウスを免疫した後の２型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ２）応答は、ワクチン処方にＩＬ−１２を含ませることによりＴｈ１／Ｔｈ０応答にスイッチされうる。無細胞ペルツッシスワクチン中におけるアジュバントとしてのＩＬ−１２の使用はその防御効率を有意に増大させ、呼吸器への攻撃後の肺からのビー・ペルツッシスのクリアランス速度は、強力な全細胞ワクチンを用いた場合に観察されるのと同等であった。これらの知見は、感染または免疫後のビー・ペルツッシス特異的Ｔｈ１細胞の誘導に対するＩＬ−１２の調節効果を示すものであり、ビー・ペルツッシスに対する防御免疫におけるＴｈ１細胞の役割に関するさらなる証拠を提供するものである。本発明は、ＩＬ−１２をアジュバントとして用いることによる新規ボルデテラワクチン組成物ならびにボルデテラに対する細胞性免疫応答を提供することを意図するボルデテラワクチンのアジュバント機能発揮（adjuvantation）のための方法を提供する。
【００１５】
本明細書の用語「ボルデテラ」は、ボルデテラ・ペルツッシス、ボルデテラ・パラペルツッシス、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ならびに十分に類似していて、１の単離体中に存在する抗原に対して生成した免疫応答（細胞性免疫および／または抗体の生成を包含）が少なくともいくつかの他の株または単離体に対して効力を有するものである他のボルデテラ株または単離体を包含する。
「ボルデテラ抗原」は、ボルデテラ生物全体、ボルデテラ抗原を発現する生物全体、ボルデテラ生物の抗原性部分、組み換え法により製造された抗原もしくはその一部分または抗原を含む融合蛋白、およびボルデテラ抗原の機能的等価物の使用を包含する。ボルデテラ生物の抗原性部分はリポ多糖（ＬＰＳ）、線状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、ペルタクチン、およびぺルツッシストキシン（ＰＴ）を包含する。好ましくは、ボルデテラＬＰＳを、例えばゲル濾過クロマトグラフィーにより精製する。ペルツッシストキシンは活性なものであってもよく、あるいは無処理の生の（naive）ペルツッシストキシン（ａＰＴ）であってもよい。好ましくは、ペルツッシストキシンは熱処理により不活性化されたペルツッシストキシンのごとき不活性化ペルツッシストキシン（ｉＰＴ）、あるいはホルムアミド処理により化学的に無毒化されたペルツッシストキシンのごとき無毒化ペルツッシストキシン（ＰＴｄ）であってもよい。ボルデテラ抗原をアラムに吸着させてもよい。さらに、本発明抗原はボルデテラ抗原をコードするポリヌクレオチドを包含する。かかるポリヌクレオチドの例は、ビー・ペルツッシスＦＨＡ（Renauld-Mongenie, G. et al., 1996, PNAS USA 93: 7944-7949）およびペルツッシストキシン（Steffen, P. et al., 1996, EMBO J. 15: 102-109）に関する遺伝子を含むポリヌクレオチドである。本発明組成物および方法に使用できるボルデテラ生物の他の抗原性部分は、当業者により決定されうる。
【００１６】
もともと天然キラー細胞刺激因子と呼ばれていたインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）はヘテロダイマーサイトカインであり、例えば、M. Kobayashi et al., 1989, J. Exp. Med. 170: 827に記載されている。ＩＬ−１２を天然源から精製することができ、化学合成することができ、あるいは好ましくは組み換えＤＮＡ法により、例えば１９９０年５月１７日に公開された国際特許出願ＷＯ９０／０５１４７（欧州特許出願第４４１９００号）（参照により本明細書に記載されているものとみなす）に記載されたように組み換え宿主細胞中でＩＬ−１２を発現させこれを単離することにより製造することができる。ヘテロダイマーとなったヒトＩＬ−１２の３０ｋＤａおよび４０ｋＤａサブユニットのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、上で引用した国際出願および米国特許第５５７１５１５（参照により本明細書に記載されているものとみなす）中にある。組み換えヒトおよびネズミＩＬ−１２についての多くの研究はGenetics Institute, Inc., Cambridge, Massachusettsから入手可能である。
【００１７】
本明細書の用語「インターロイキン−１２」および「ＩＬ−１２」は、インターロイキン−１２、その個々のサブユニット、ＩＬ−１２アジュバント活性を示すそれらのフラグメント、ＩＬ−１２をコードしているポリヌクレオチド、および「インターロイキン−１２」および「ＩＬ−１２」の機能的等価物をいう。
ボルデテラ抗原およびＩＬ−１２の機能的等価物は、修飾されたボルデテラ抗原およびＩＬ−１２蛋白、それぞれ本明細書記載のものと同じ抗原活性またはアジュバント活性を有するボルデテラ抗原またはＩＬ−１２生成物、遺伝学的コードの縮重により本明細書記載の抗原活性およびＩＬ−１２活性を有するボルデテラ抗原またはＩＬ−１２ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を包含する。例えば、ボルデテラ抗原またはＩＬ−１２の機能的等価物は、「サイレント」コドンまたはアミノ酸置換（例えば、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸での置換、または疎水性アミノ酸のコドンの別の疎水性アミノ酸のコドンでの置換）を含むことができる。
ボルデテラ抗原およびＩＬ−１２のフラグメントも本発明に包含される。好ましくは、かかるフラグメントは所望抗原活性またはアジュバント活性を保持するものであり、あるいは所望活性を生じるように修飾されたものである。ボルデテラ抗原またはＩＬ−１２のフラグメントは直鎖状であってもよく、あるいは既知方法、例えばH. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992)およびR. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992)（ともに参照により本明細書に記載されているものとみなす）に記載された方法を用いて環化してもよい。本明細書記載のボルデテラ抗原およびＩＬ−１２ポリペプチドは、精製抗原およびＩＬ−１２ポリペプチドのアミノ酸配列により特徴づけられる抗原およびＩＬ−１２ポリペプチドをも包含するが、修飾が本来的にされていてもよく、あるいは誘導処理によりされていてもよい。例えば、抗原またはＩＬ−１２ポリペプチド配列あるいは抗原またはＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列における修飾を、当業者は既知方法を用いて行うことができる。ボルデテラ抗原またはＩＬ−１２ポリペプチドにおける所望の修飾は、コーディング配列中の選択されたアミノ酸残基の変更、付加、挿入、欠失、変異、置換、入れ替え、または修飾を包含する。一例として、抗原またはＩＬ−１２のＮ末端にさらなるアミノ酸を付加してもよい。また、抗原またはＩＬ−１２のアミノ酸配列を、ランダム変異法を用いて変更してもよい。炭水化物、脂質、またはポリエチレングリコールを包含する（これらに限らない）他の部分を抗原またはＩＬ−１２に結合させることも可能であり、かかる部分を除去または変更することも可能である。かかる変更、付加、挿入、欠失、変異、置換、入れ替え、または修飾のための方法は当業者によく知られている（例えば、米国特許第４５１８５８４号参照）。好ましくは、かかる変更、付加、挿入、欠失、変異、置換、入れ替え、または修飾はボルデテラ抗原またはＩＬ−１２の所望活性を保持するものであり、あるいは所望活性を作り出すようなものである。
【００１８】
また本発明は、開示したボルデテラ抗原およびＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子変種、すなわち、単離ポリヌクレオチドによりコードされる抗原またはＩＬ−１２ポリペプチドと同一、同質、または関連を有する抗原またはＩＬ−１２ポリペプチドをコードする別形態の単離ポリヌクレオチドを包含する。
【００１９】
投与および用量
ＩＬ−１２およびボルデテラ抗原を予防ワクチンとして、ボルデテラに感染または未感染の宿主に、好ましくは哺乳動物宿主に投与することができる。ＩＬ−１２および抗原を治療ワクチンとして、感染した宿主に投与することができ、ボルデテラ生物による疾病状態の改善または除去を行うことができる。本発明組成物および方法に使用するボルデテラ抗原の量は、宿主における有効な免疫刺激応答を生じさせる量である。ＩＬ−１２の有効なアジュバント量は、投与した場合に、ＩＬ−１２が投与されない場合の免疫応答と比較して増強された免疫応答を生じる量である。かかるＩＬ−１２の量はボルデテラ抗原の性質および抗原の用量に依存するであろう。さらに、宿主に投与するボルデテラ抗原およびＩＬ−１２の量は、使用抗原、宿主のサイズ、年齢、体重、健康状態、性別、および養生食、投与時間もしくは期間、ならびに治療または接種すべきボルデテラ感染の個々の性質を包含する種々の他の因子によっても変更されるであろう。一例として、望ましくは、ＩＬ−１２ポリペプチドの有効なアジュバント量は、約２５μｇの抗原につき約０．１μｇないし約０．５ｍｇの間である。個々のワクチンまたは抗原についての有効なアジュバント量を、ＩＬ−１２および抗原の組み合わせの有効性および毒性を比較考量することにより容易に決定されよう。確立した用量範囲の調節および変更は当業者の能力の範囲内であろう。
本発明方法において、ボルデテラ抗原での免疫に近い時間において有効なアジュバント量のＩＬ−１２をボルデテラ抗原と組み合わせて投与して、ＩＬ−１２を投与しない場合の免疫と比較して増強された免疫応答を得る。よって、ＩＬ−１２を免疫前に、好ましくは免疫直前に、免疫時に（すなわち同時に）、あるいは免疫後に（すなわち逐次）投与することができる。ワクチン組成物投与前にＩＬ−１２を投与する場合、ワクチン投与のほぼ１日または２日前に投与するのが望ましい。さらに、ボルデテラ抗原での免疫前にＩＬ−１２を投与し、ついで、抗原での免疫後に後にＩＬ−１２を逐次投与することもできる。
【００２０】
ＩＬ−１２およびボルデテラ抗原を種々の経路で宿主に投与することができる。投与経路は皮内、経皮（例えば、除放性ポリマーによる）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、耳から、硬膜外、肛門もしくは膣（例えば坐薬による）、ならびに鼻腔内経路を包含する。投与のための他の都合の良い経路、例えば、輸液またはボーラス注射、または内皮もしくは粘膜内層からの吸収を用いてもよい。さらに、ＩＬ−１２およびボルデテラ抗原を他の成分または生物学的に活性のある作用剤、例えば他の既知アジュバント（例、アラム、ＭＰＬ、ＱＳ２１）、グリセリドのごとき医薬上許容される界面活性剤、ラクトースのごとき賦形剤、キャリヤ、希釈剤、および担体と組み合わせて投与することができる。所望ならば、ある種の甘味料、香料、および／または着色料を添加してもよい。
ボルデテラ抗原を含有するワクチン組成物にためのアジュバントとして使用する場合、望ましくは、ＩＬ−１２をワクチン組成物自体の一部分として混合し、ワクチンとするボルデテラ抗原と同じ経路により投与する。別法として、ワクチン組成物とは別個にＩＬ−１２を投与することにより、ＩＬ−１２のアジュバント効果を利用してもよい。別個に投与する場合、望ましくは、ＩＬ−１２は、セイラインのごとき適当なキャリヤおよび所望によりＩＬ−１２を除々に放出することを可能にする慣用的な剤中に存在する。このワクチン投与モードに使用するＩＬ−１２の量は、ＩＬ−１２がワクチン組成物の一部である場合の上記範囲と同様である。
【００２１】
さらに、少なくとも１種のボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドの宿主中でのインビボ発現により、ボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２を投与ることもできる。ＩＬ−１２またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドをアジュバントとして用いてもよい。好ましくはＤＮＡ形態のポリヌクレオチドを、ボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２をインビボ発現させるためにワクチン投与した宿主に送達してもよい。いわゆる「裸のＤＮＡ」を用いてボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２を宿主中でインビボ発現させてもよい（Cohen,J., 1993, Science 259: 1691-*1692; Fynan, E. et al., 1993, PNAS USA 90: 11478-11482; およびWolff, J. A. et al., 1991, Biotechniques 11: 474-485には「裸のＤＮＡ」の同様の用法が記載されている。これらすべての文献を、参照により本明細書に記載されているものとみなす）。例えば、バルデテラ生物全体をワクチン抗原として使用する場合には、ＩＬ−１２またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドをボルデテラ生物自体の中に取り込ませ、あるいはトランスダクションしてもよい。もう１つの例において、ボルデテラ抗原をコードするポリヌクレオチドを別の生物の細胞中に取り込ませ、あるいはトランスダクションして、ボルデテラ抗原を細胞表面上に発現させ、これをワクチン抗原として用いてもよい。別法として、ＩＬ−１２またはそのフラグメントをコードしているポリヌクレオチドを、例えば注射により、ボルデテラワクチン組成物の一部として、あるいはワクチン抗原とは別個であるが同時に投与してもよい。
【００２２】
ボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２を、それらをコードするポリヌクレオチドの形態として宿主に送達するための他のさらなるモードが当業者において知られており、所望により、ボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２ポリペプチドを投与するかわりにそれらを用いてもよい。例えば、ベクターの一部として、あるいはプロモーター配列に作動可能に連結されたボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２をコードする配列を含むカセットとしてＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドを投与してもよい（例えば、１９９４年１月２０日公開の国際特許出願ＰＣＴ ＷＯ９４／０１１３９参照（参照により本明細書に記載されているものとみなす））。簡単に説明すると、ボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２蛋白またはその所望フラグメントをコードするＤＮＡを核酸カセット中に挿入してもよい。このカセットを処理加工して、発現させるべき抗原またはＩＬ−１２のほかに、ベクター中への挿入を可能にする他の所望近接配列を含ませてもよい。ついで、このカセットを、適当なベクター中の、当該配列の複製およびインビボでの発現を指令しうるプロモーター、ｍＲＮＡリーダー配列、開始部位、および他の調節配列の下流に挿入してもよい。さらなる調節配列を発現させるべきコーディング配列の下流に挿入してもよい。このベクターは、ボルデテラ抗原および／またはＩＬ−１２の宿主における発現を可能にする。ＩＬ−１２ポリヌクレオチドをアジュバントとして用いる場合、ボルデテラ抗原をコードしているポリヌクレオチド配列にこれらのポリヌクレオチド配列を作動可能に連結してもよい。
【００２３】
細胞性免疫が必要な場合にワクチン効率を増強させるので、ＩＬ−１２は既知アジュバントよりも好ましいかもしれない。ＩＬ−１２は、ボルデテラワクチンアジュバントとしてアラムに優る利点を有する。なぜならアラムは、ＩＬ−１２により誘導されるＴｈ１細胞よりもＴｈ２ Ｔヘルパー細胞を誘導するからである。よって、アラムをアジュバントとするワクチンは、Ｔｈ１応答が最も有効であるボルデテラのごとき生物に対しては効果が少ないかもしれない。さらに、ＩＬ−１２はＢＣＧのごとき細菌アジュバントよりも優れている。細菌アジュバントはＩＬ−１２以外の予期されないまたは制御されない可能性のある物質または結果を誘導しうるからである。より望ましくは、アジュバントとしてのＩＬ−１２は、ＩＬ−１２ならびに他の多くのサイトカインを誘導する細菌アジュバントのように、他のサイトカインの制御されない産生を誘導すべきでない。細菌アジュバントとは異なり、ＩＬ−１２はヒト起源であり、それゆえ感作を生じさせることがありそうもない。そのうえ、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２のごとき他のアジュバントとは異なり、ＩＬ−１２はインビボで比較的安定である。よって、ＩＬ−１２はボルデテラに対するワクチンにおいて使用される、非常に有用なアジュバントであると予期される。
本明細書で引用した特許および文献を、参照により本明細書に十分に記載されているものとみなす。
下記実施例は本発明の具体例を説明するが、開示の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
実施例１−サイトカイン産生の分析
マウス  メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを繁殖させ、Irish Department of Healthのガイドライン下で維持した。すべてのマウスは、この実施例および以下の実施例の開始時に８ないし１２週齢であった。
サイトカイン産生  ビー・ペルツッシス抗原で刺激したマウス由来の脾臓細胞を用いてインビトロにおいてＴ細胞サイトカイン産生を評価した。免疫したマウスまたは無処理の対照マウスからの脾臓細胞（２ｘ１０６個／ｍｌ）を抗原とともに、あるいは培地のみ（バックグラウンド対照）で培養し、２４時間後に上清を除去してＩＬ−２産生を評価し、７２時間後にＩＦＮ−γ，ＩＬ−４、およびＩＬ−５の濃度を調べた。ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２細胞系の増殖を支持する培養上清の能力によりＩＬ−２放出を評価した。すでに記載されているようにして（B. P. Mahon, K. Katrak, A. Nomoto, A. J. Macadam, P. D. Minor, and K. H. G. Mills, 1995, J. Exp. Med. 181: 1285-1292（参照により本明細書に記載されているものとみなす））、市販抗体（PharMingen, San Diego, CA, USA）を用いる特異的イムノアッセイによりネズミＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＦＮ−γの濃度を調べた。
ＩＬ−１２濃度をイムノアッセイおよびバイオアッセイにより調べた。イムノアッセイにおいて、モノマー、ヘテロダイマーまたはｐ７０ヘテロダイマーの一部としてのネズミＩＬ−１２のｐ４０サブユニットを認識する市販抗−ＩＬ−１２モノクローナル抗体Ｃ１７．８（ラットＩｇＧ２ａ）およびＣ１５．６（ラットＩｇＧ１）（Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA, USA）をそれぞれ捕捉および検出用に使用した。アルカリ性ホスファターゼ抱合マウス抗−ラットＩｇＧ１（PharMingen, San Diego, CA, UAS）を用いて第２の抗−ＩＬ−１２抗体を検出した。バイオアッセイにおいて、生の（naive）脾臓細胞標品によるＩＦＮ−γの産生を刺激する試験上清の能力により、生物学的に活性のあるＩＬ−１２濃度をアッセイした。ＩＦＮ−γの産生がＩＬ−１２の存在によるということを確認するために、５ｎｇ／ｍｌまでのＩＬ−１２を完全に中和できる特異的抗−ＩＬ−１２中和抗体（２．５μｇ／ｍｌのプロテインＧにより精製されたヒツジ抗−ネズミＩＬ−１２， Genetics Institute, Cambridge, MA, USA）の存在下および不存在下においても試験試料をアッセイした。試験試料の増殖またはＯＤ４９２のいずれかを既知濃度の組み換えサイトカインについての標準曲線と比較することによりサイトカイン濃度を決定した。
【実施例２】
【００２５】
実施例２−ボルデテラ抗原に応答してマクロファージはＩＬ−１２を分泌する
この実施例は、殺菌したビー・ペルツッシス全細胞およびピー・ペルツッシス成分の、ネズミマクロファージによるＩＬ−１２産生を刺激する能力を試験するものであった。
マクロファージ  腹腔洗浄により得た細胞をプラスチックに付着させることにより、無処理の動物からネズミ腹腔マクロファージを得た。すでに記載されているようにして（K. Redhead, A. Barnard, J. Watkins, and K. H. G. Mills, 1993, Infect. Immun. 61: 3190-3198）、プラスチック付着により脾臓マクロファージを調製し、気管支肺胞洗浄により肺胞マクロファージを単離した。ネズミマクロファージ細胞系Ｊ７７４もＩＬ−１２産生の研究に使用した。マクロファージに対する細菌の割合を５：１として、マクロファージを生きたフェーズＩのビー・ペルツッシスに２時間感染させ、ついで、徹底的に洗浄した。ポリミキシン硫酸（１００μｇ／ｍｌ）で４０分間細胞外細菌を殺菌し、ついでさらに洗浄した。この処理により細胞外細菌数を５．０ｌｏｇＣＦＵ倍に減少させた。感染マクロファージまたは熱不活性化細菌もしくは細菌抗原で刺激されたマクロファージを、２ｘ１０５個／ｍｌとして３７℃において５％ ＣＯ２雰囲気下で培養した。２４または４８時間後、細胞培養上清を取り、実施例１ですでに説明したようにバイオアッセイまたはイムノアッセイによりＩＬ−１２産生を調べた。
抗原  The third British reference preparation for pertussis vaccine (88/522)を全細胞ワクチンとして用いた。増殖アッセイに用いる熱殺菌したビー・ペルツッシスを、細胞を８０℃で３０分インキュベーションすることにより調製した。ビー・ペルツッシスTohama株から調製されたＰＴ、ＦＨＡ、およびペルタクチンは、親切にもSmithKlineのCarine Capiauにより提供された。７日、ついで、０．０１％ホルムアミド含有ＰＢＳに対して透析した。増殖アッセイに使用する不活性化ＰＴ（ｉＰＴ）を、活性ＰＴを８０℃で３０分加熱することにより調製した（以下、ＰＴは無処理の生のＰＴをいう）。ビー・ペルツッシスＷ２８由来のＬＰＳ（８９／６７０）を、The National Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, Herts, UKから得た。イー・コリ（E. coli）由来のＬＰＳ（フェノール抽出、ついでゲル濾過クロマトグラフィーにより調製）をSigma Chemical Co., Poole, Dorset, UKから購入した。
図１は、ビー・ペルツッシス全細胞およびビー・ペルツッシス成分に応答したマクロファージによるＩＬ−１２産生を示す。イムノアッセイ（Ａ）またはバイオアッセイ（Ｂ）によりＩＬ−１２を試験した。ｐ４０およびｐ７０を検出するイムノアッセイから得られた結果は、熱殺菌ビー・ペルツッシス（１ｘ１０８個／ｍｌおよび５.０ｘ１０８個／ｍｌ）、ビー・ペルツッシスＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、イー・コリＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、ＦＨＡ（１μｇ／ｍｌ）、ペルタクチン（１μｇ／ｍｌ）、活性ＰＴ（１μｇ／ｍｌ）、無毒化ＰＴ（ＰＴｄ，１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベーションした脾臓ンクロファージ、あるいは熱殺菌ビー・ペルツッシスの用量を増加させていって（１０５〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）インキュベーションした腹腔マクロファージの、３系の培養上清の平均濃度である。バイオアッセイにより、２.５μｇ／ｍｌのポリクローナル中和抗−ＩＬ−１２抗体の存在下または不存在下における脾臓マクロファージ（イムノアッセイに関して説明した抗原とともにインキュベーションすることにより刺激）から得られた上清とともに２４時間インキュベーションした生の脾臓細胞により産生されたＩＦＮ−γを測定した。抗−ＩＬ−１２抗体の存在下で産生されたＩＦＮ−γのレベルのみを示し、抗体不存在下において殺菌細菌の１の用量（５.０ｘ１０８個／ｍｌ）を用いて陽性応答が観察されている。結果は３系の平均値であり、４つの別個の実験の値を示す。標準偏差は平均値の２０％未満であった。
熱殺菌ビー・ペルツッシスで刺激された無処理マウスの脾臓由来の付着性細胞は、ｐ４０およびｐ７０に特異的なイムノアッセイにより検出した場合、有意なレベルのＩＬ−１２を産生していた（図１Ａ）。ビー・ペルツッシスまたは別のグラム陰性細菌であるイー・コリに由来するＬＰＳとともにインキュベーションしたマクロファージから得た上清においても中庸のレベルのＩＬ−１２が検出された。ＩＦＮ−γを培養に添加した場合、これらのレベルは増強された（データ示さず）。対照的に、無細胞ワクチンの成分であるＦＨＡ、ＰＴｄ、またはペルタクチンで刺激されたマクロファージによっては、ＩＬ−１２はほとんど産生されないか、または産生されなかった（図１Ａ）。腹腔マクロファージも、熱殺菌ビー・ペルツッシスでの刺激に応答して、用量依存的にＩＬ−１２を産生した（図１Ａ）。
産生されたＩＬ−１２が生物学的に活性であることを示すために、我々は、中和ポリクローナル抗−ＩＬ−１２抗体の存在下または不存在下におけるネズミ脾臓細胞によるＩＦＮ−γの刺激を測定するバイオアッセイを用いてＩＬ−１２産生を調べた。殺菌細菌または精製ＬＰＳで刺激された脾臓マクロファージからの上清は無処理の脾臓細胞を誘導して高レベルのＩＦＮ−γを産生させ、その産生は抗−ＩＬ−１２抗体により阻害された（図１Ｂ）。活性ＰＴで刺激された脾臓細胞からの上清はＩＦＮ−γの産生を刺激したが、この応答は抗−ＩＬ−１２抗体の添加によっては抑制できなかった。さらにそのうえ、イムノアッセイを用いた場合、ＰＴで刺激されたマクロファージの上清においてＩＬ−１２は検出されなかった（図１Ａ）。それゆえ、活性ＰＴがマクロファージからのＩＬ−１２を誘導することはありそうもない。活性ＰＴはネズミＴ細胞に対して分裂促進的であり、我々は、それが放射線照射補助細胞の存在下でセル（cell）することを見いだしている（Ryan and Mill,未公表の観察結果）。それゆえ、活性ＰＴで刺激されたマクロファージからの上清を用いるＩＬ−１２のバイオアッセイにおいて検出されるＩＦＮ−γは、マクロファージ上清中に持ち越された活性ＰＴによる、脾臓細胞集団中のＴ細胞の直接刺激により生じる可能性がある。
生きたビー・ペルツッシスを拾うことができ、それらはマクロファージ中で生存することができるので、ビー・ペルツッシスでの感染後のマクロファージによるＩＬ−１２の産生を調べた。表１は、ビー・ペルツッシスでの感染に応答したネズミマクロファージによるＩＬ−１２の分泌を示す。マクロファージをビー・ペルツッシスに２時間感染させ、ついで、徹底的に洗浄し、ポリミキシンＢで処理して細胞外細菌を殺菌してから、中和抗−ＩＬ−１２抗体の存在下または不存在下において培養した。感染マクロファージまたは未感染対照マクロファージから得た上清とともに２４時間インキュベーションした無処理脾臓細胞によるＩＦＮ−γ産生を測定するバイオアッセイを用いてＩＬ−１２産生を評価した。結果を、イムノアッセイにより測定した３系の培養上清中のＩＦＮ−γ濃度を平均（±標準偏差）として示す。
【表１】
2005112865.tif 000002
ＩＬ−１２レベルは、殺菌細菌での腹腔マクロファージの刺激後に観察されたもの（図１Ａに示す）ほど高くなかったが、このことは、この実験に使用した生きた細菌の濃度が低かったことを反映しているかもしれない。高レベルの生きたビー・ペルツッシスを他の実験に使用したが、インビトロで使用したマクロファージ集団の細胞死を引き起こした。別の実験において、ビー・ペルツッシスでの感染２４および４８時間後に取得された肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ、Ｊ７７４、および脾臓マクロファージの上清も、イムノアッセイにより検出されるＩＬ−１２を含むことがわかった（データ示さず）。さらにそのうえ、生きたビー・ペルツッシス腹腔内注射２４時間後に回収された腹腔マクロファージは、さらにインビトロで刺激しなくても有意なレベルのＩＬ−１２（１の実験において培養上清１ｍｌあたり５６９ｐｇ）を分泌した。
【実施例３】
【００２６】
実施例３−ビー・ペルツッシス抗原に応答してＩＬ−１２は免疫細胞増殖を刺激する
我々は、アラム存在下または不存在下においてＦＨＡおよびＰＴｄでマウスを免疫することにより、インビボにおいてビー・ペルツッシスに対する免疫応答を転調させるＩＬ−１２の能力について試験した。すでに記載されているようにして（K. H. G. Mills, A.）、熱殺菌ビー・ペルツッシス（１０６個／ｍｌ）、熱不活性化ＰＴ（１.０μｇ／ｍｌ）、ＦＨＡ（１.０μｇ／ｍｌ）、およびペルタクチン（１.０μｇ／ｍｌ）に対するインビトロ増殖に関して免疫マウスまたは対照マウス由来の脾臓細胞を試験した。
【表２】
2005112865.tif 000003
表２は、ＩＬ−１２の同時注射がビー・ペルツッシス抗原に対する細胞性免疫応答を改善することを示す。溶液中のＦＨＡおよびＰＴｄでの免疫から２週間後において、特異的抗原に対する脾臓細胞のインビトロ増殖応答は、培地のみに対して観察された応答と同様であった（表２）。対照的に、ＩＬ−１２存在下のＦＨＡおよびＰＴｄでの免疫は、ＦＨＡ、ｉＰＴ（表２）および殺菌全細胞細菌（データ示さず）に対する増強された増殖応答を生じた。アラム吸着抗原へのＩＬ−１２の添加もまた、ビー・ペルツッシス特異的増殖応答を改善したが、統計学的に有意なレベルには至らなかった（表２）。
可溶性抗原およびＩＬ−１２の同時注射は、抗原により刺激された脾臓細胞によるインビトロでのＩＦＮ−γ分泌レベルを増大させた。Ｔｈ２タイプのサイトカインであるＩＬ−５はこれらの動物由来の脾臓細胞から検出されなかった（表２）。対照的に、アラム存在下のＦＨＡおよびＰＴｄで免疫されたマウス由来の脾臓細胞は、高レベルのＩＬ−５および中庸のレベルのＩＦＮ−γを分泌し、マウスにおいてＴｈ２タイプの応答の誘導を起こしやすいというアラムの既知の効果が確認された。しかしながら、ＩＬ−１２とアラムに吸着されたＦＨＡおよびＰＴｄとの同時注射は、ＩＬ−１２不存在下でアラムとともに処方された抗原を与えられた動物由来の脾臓細胞と比較した場合、ＩＬ−５産生を減少させたが分泌ＩＦＮ−γレベルを有意に増加させなかった（表２）。
【実施例４】
【００２７】
実施例４−ＩＬ−１２は、ボルデテラ抗原で免疫されたマウス由来の免疫細胞によるＩＦＮ−γ産生を刺激する
図２に示すように、インビトロにおけるＩＬ−１２の添加は、Ｔｈ２応答についてプライム（prime）されたマウス由来の脾臓細胞によるＩＦＮ−γ産生を改善する。アラム中のＦＨＡおよびＰＴｄでマウスを免疫し、インビトロにおいて、０、０.２、および２.０ｎｇ／ｍｌの組み換え型ネズミＩＬ−１２の存在下でＦＨＡ、不活性化ＰＴ（ｉＰＴ；１.０μｇ／ｍｌ）、または培地のみで脾臓細胞を刺激した。７２時間後、脾臓細胞上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−５のレベルを試験した。結果を、３系で試験した１群あたり４匹のマウス由来の刺激された脾臓細胞に関するサイトカイン濃度の平均値（±標準偏差）として表す。
アラムに吸着されたＦＨＡおよびＰＴｄでのマウスの免疫は有効なＴｈ２応答を生じさせ、インビトロでの特異的抗原刺激後、脾臓細胞はエクスビボで高レベルのＩＬ−５および低レベルのＩＦＮ−γを生じた（図２）。しかしながら、培地における抗原刺激中に１ｍｌあたり０.２または２.０ｎｇのネズミＩＬ−１２を脾臓細胞に添加すると、ＩＦＮ−γ濃度の有意な上昇およびＩＬ−５レベルのわずかな低下が生じ（図２）、ＩＬ−１２は、インビボでプライムされたＴ細胞によるインビトロでのサイトカイン分泌パターンを変化させうることが示された。
【実施例５】
【００２８】
実施例５−無細胞ペルツッシスワクチンでの免疫に対するＩＬ−１２のアジュバント効果
我々はすでに、非常に防御的な全細胞ワクチンがＴｈ１応答を誘導することを示しているので、我々は、全細胞ワクチンにより誘導された免疫応答および防御を、ＩＬ−１２存在下または不存在下で投与された無細胞ワクチンによるものと比較することにした。ボルデテラ・ペルツッシス無細胞ワクチンでの免疫に対するＩＬ−１２のアジュバント効果に関するこれらの研究において、２０匹のマウスの群に、組み換え型ネズミＩＬ−１２（０.５μｇ／マウス）とともに、あるいはなしで、全細胞ワクチン（８８／５２２）、または５μｇのＦＨＡ、ペルタクチン、およびＰＴｄをそれぞれ含む無細胞ワクチンをヒトの１／５の用量（０.８ＩＵ）にて４週間間隔で２回腹腔内（ｉ.ｐ.）免疫した。対照マウスにはＰＢＳ媒体のみを与えた。２回目の免疫から２週間後、マウスを殺して免疫応答を評価するか、あるいはマウスをビー・ペルツッシスで攻撃した。
エアロゾル感染  マウスの呼吸器感染を、もともとSato et al. 1980, infect. Immun. 29: 261-266により記載されたエアロゾル感染（下記のごとく２カ所改変）により開始した。ビー・ペルツッシスＷ２８フェーズＩを、Stainer-Scholte液体培地中撹拌条件下３６℃で増殖させた。４８時間培養の細菌を１ｍｌあたり約２ｘ１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の濃度として１％カゼイン含有生理食塩水中に再懸濁した。２０〜２４匹のマウスの群を入れたエアロゾルチャンバ中につながった霧化器を用いて攻撃接種をエアロゾルとして１２分間投与した。エアロゾル攻撃後２時間および２、５および９日後に各実験群の４匹のマウスを殺してビー・ペルツッシス生菌数を評価した。
肺における生菌の計数  肺を無菌的に除去し、氷上の１％カゼイン含有滅菌生理食塩水１ｍｌ中でホモジナイズした。各肺由来の１００μｌの希釈していないホモジネートまたは系列希釈したホモジネートを、３個のBordet-Gengou寒天プレートそれぞれの上に３系でスポットし、インキュベーション５日後にＣＦＵ数を数えた。結果を、４匹のマウスからの個々の肺についてのビー・ペルツッシス生菌数の平均値として表す。検出限界は肺１個あたり約ｌｏｇ１００.５ＣＦＵであった。
０および４週目に、０.５μｇのＩＬ−１２とともに、またはなしで、あるいはＰＢＳのみ（対照）とともに全細胞ワクチン（ＷＣＶ）、無細胞ワクチン（ＡＣＶ；可溶性ＰＴｄ、ＦＨＡ、およびペルタクチン各５μｇ）でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。２回目の免疫から２週間後、ビー・ペルツッシスのエアロゾル接種によりマウスを攻撃した。攻撃後一定間隔で生菌数を調べることにより呼吸器感染の経時変化を調べた。結果は、各時点の１群あたり４匹につき３系で行ったＣＦＵ計数値の平均値（±標準偏差）である。
図３に示すように、アジュバントとしてのＩＬ−１２は、無細胞ペルツッシスワクチンの防御効率を上昇させた。対照マウス中の細菌レベルは攻撃９日目においてもまだ高かった（図３）。全細胞ワクチンで免疫されたマウスの呼吸器感染の経時変化は５日目までに完全にクリアランスがおこり、非常に短かった。無細胞ワクチンで免疫されたマウスの細菌クリアランスはより遅かった。攻撃後９日目でも完全クリアランスが起こらなかった。しかしながら、無細胞ワクチン処方へのＩＬ−１２の添加は、その防御効率を有意に向上させた。細菌クリアランスは５日目までに完了し、２日目の細菌量は全細胞ワクチンで免疫されたマウスにおいて観察されるよりも少なかった（図３）。
Ｔｈ１細胞の防御的役割に関する我々の初期の示唆を確認するために、そしてＩＬ−１２とともに注射された無細胞ワクチンで得られた優れた防御効率が増強された細胞性免疫によるものであるということを確認するために、我々は、免疫マウスの免疫応答を攻撃の日に調べた。図４に示すように、ＩＬ−１２は、無細胞ペルツッシスワクチンで刺激された脾臓細胞の免疫応答をＴｈ２応答からＴｈ１／Ｔｈ０応答に変える。上の図３について説明したようにして、０.５μｇのＩＬ−１２とともに、またはなしで、あるいはＰＢＳのみ（対照）とともに全細胞ワクチン（ＷＣＶ）、無細胞ワクチン（ＡＣＶ；可溶性ＰＴｄ、ＦＨＡ、およびペルタクチン各５μｇ）でマウスを免疫した。免疫されたマウス由来の脾臓細胞をｉＰＴ（０.２〜１.０μｇ／ｍｌ）、ＦＨＡ（０.２〜５.０μｇ／ｍｌ）、およびペルタクチン（０.２〜５.０μｇ／ｍｌ）で刺激した後、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−５の分泌を調べた。結果を、３系で試験した１群あたり４匹のマウス由来の脾臓細胞についての最適抗原濃度に対するサイトカイン濃度の平均値（±標準偏差）として示す。
殺菌ビー・ペルツッシス、ＦＨＡ、不活性化ＰＴ、およびペルタクチンに対する、無細胞ワクチンで免疫されたマウス由来の脾臓細胞の増殖応答を検出したが、ＩＬ−１２存在下において有意に増強されず、全細胞ワクチンを用いて観察されたレベル（文献２０、データ示さず）に至るにとどまった。インビトロにおいて特異的抗原で刺激された脾臓細胞により得られるサイトカイン産生の特徴を調べたところ、全細胞ワクチンで免疫されたマウス由来の脾臓細胞は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌するが、検出可能なＩＬ−５を分泌しないことが明かとなった（図４）。対照的に、ＩＬ−１２不存在の無細胞ワクチンを与えられたマウス由来の脾臓細胞は、低レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ、ならびに低いが検出可能なレベルのＩＬ−５を分泌した。しかしながら、ＩＬ−１２の存在する無細胞ワクチンで免疫されたマウス由来の脾臓細胞は、有意なレベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌した。興味深いことに、ＩＬ−１２は、異なる抗原特異性を有するＴ細胞に対して異なった効果を有するように思われ、ＦＨＡおよびペルタクチンに特異的なＴ細胞によるＩＬ−２産生ならびにＰＴに特異的なＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生を有効なものにする。まとめると、アジュバントとしてＩＬ−１２を含む無細胞ワクチンは、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２またはＴｈ０プロフィールであるとして最もうまく説明される。
これらの重要かつ新しい知見は、無処理のマウスの肺、脾臓、または腹腔から回収されたものを包含する組織マクロファージは、生きたまたは殺菌されたビー・ペルツッシスに曝露後にＩＬ−１２を産生し、ペルツッシス無細胞ワクチンへのアジュバントとしてのＩＬ−１２の添加は、１型Ｔ細胞サイトカイン産生を促進することによりその防御効率を増大させるということである。我々は、アラムに吸着したＰＴｄ、ＦＨＡ、およびペルタクチンを含むペルツッシス無細胞ワクチンでのマウスの免疫は、マウスにおけるＴｈ２応答を生じさせ、呼吸器攻撃後の細菌クリアランスの遅延に関連していたことを示した。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の百日咳の予防および治療用のワクチンは、百日咳の予防および治療のためのワクチンの製造等の分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、実施例２において説明するように、ボルデテラ抗原で刺激されたマクロファージによるＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの産生を示す棒グラフである。
【図２】図２は、実施例４において説明するように、ボルデテラ抗原でマウスを免疫した後、マウス脾臓細胞をＩＬ−１２と一緒になったボルデテラ抗原でインビトロにおいて刺激した場合のマウス脾臓細胞によるＩＬ−５およびＩＦＮ−γの産生を示す棒グラフである。
【図３】図３は、実施例５において説明するように、ビー・ペルツッシス全細胞ワクチンまたは無細胞ワクチンでマウスを免疫した後、生きたビー・ペルツッシスで攻撃されたマウスの肺における生きたビー・ペルツッシスの計数結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例５において説明するように、ビー・ペルツッシス全細胞ワクチンまたは無細胞ワクチンでマウスを免疫した後、インビトロにおいてマウス脾臓細胞をボルデテラ抗原で刺激した場合のマウス脾臓細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−５の産生を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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