(57)【要約】【課題】  配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する酸化型ガレクチン−１又はその誘導体を有効成分として含む、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。【解決手段】  筋萎縮性側索硬化症の治療に有効なガレクチン-1又はその誘導体を有効成分として含む神経障害の治療剤を提供。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する酸化型ガレクチン−１又はその誘導体を有効成分として含む、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
【請求項２】
さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
ガレクチン−１又はその誘導体がレクチン活性をほとんど又は全くもたない、請求項１または２に記載の治療剤。
【請求項４】
誘導体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、神経再生促進作用を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項５】
誘導体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列とアミノ酸レベルで９０％以上の相同性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項６】
ガレクチン−１又はその誘導体のＮ末端がアシル化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
Ｎ末端がアセチル化されている、請求項６に記載の治療剤。
【請求項８】
ガレクチン−１又はその誘導体が水溶性ポリマーと共有結合されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項９】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
ガレクチン−１又はその誘導体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列中の2番目（Cys2）、16番目(Cys16)、42番目(Cys42)、60番目(Cys60)、88番目(Cys88)及び130番目(Cys130)のシステイン残基のうち少なくとも16番目のシステイン(Cys16)と88番目のシステイン(Cys88)の間でジスルフィド結合を形成している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１１】
ガレクチン−１又はその誘導体が、（1）Cys16-Cys88,Cys2-Cys130及びCys42-Cys60;又は（2）Cys16-Cys88,Cys2-Cys60及びCys42-Cys130；又は（3）Cys16-Cys88,Cys2-Cys42及びCys60-Cys130；のいずれかのパターンの各システイン間にジスルフィド結合を形成している、請求項１０に記載の治療剤。
【請求項１２】
ガレクチン−１又はその誘導体が、前記（1）、（2）及び（3）のうち少なくとも２つのパターンの混合物からなる、請求項１１に記載の治療剤。
【請求項１３】
前記混合物が前記（1）のパターンのガレクチン−１又はその誘導体を50％以上含有する、請求項１２に記載の治療剤。
【請求項１４】
筋萎縮性側索硬化症患者において運動機能不全発症を遅延させる請求項１から１３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１５】
筋萎縮性側索硬化症患者において運動機能不全症を改善する請求項１から１３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１６】
筋萎縮性側索硬化症患者において生存期間を延長させる請求項１から１３のいずれか１項に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガレクチン-1を有効成分として含む筋萎縮性側索硬化症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis; ALS）は、運動ニューロンがほぼ選択的に障害され、その結果として骨格筋の筋萎縮や筋力低下が進行し、呼吸筋の麻痺等により死に至る神経変性疾患である。主に成人に発症し、人口１０万人に対して３〜５人の有病率を示す。四肢・体幹の骨格筋の筋力低下により臥床状態になり、嚥下筋の筋力低下により嚥下障害、呼吸筋の筋力低下により呼吸不全をきたす。多くのALS患者は発症後２〜３年で死亡し、５年以内にはほとんどの患者は死亡する。ALS 患者の大部分は孤発性であるが、約10%の症例は血縁者にALS患者が存在する（家族性ALS：FALS）。神経病理学的には脊髄や脳幹運動核の運動ニューロンの変性消失が認められ、一部の症例では大脳運動野の大型錐体細胞の脱落も認められる。また、ALSの初期病変として、脊髄前角運動ニューロンの軸索近位部の病的腫大（スフェロイドと呼ばれる）が認められ、運動ニューロン死の病態に関与すると考えられている。運動ニューロンの選択的変性の成因として、軸索輸送の障害、フリーラジカルによる酸化ストレス、グルタミン酸神経毒性などが挙げられているが、発症機序の解明には至っていない(Cleaveland D.W. Neuron, 24, 515-520 (1999)、 秦野伸二  実験医学、19、2283-2288  (2001)、丹羽淳一＆祖父江元  最新医学、56、1622-1631 (2001)、 Rothstein J.D. Current Opinion in Neurobiology, 6, 679-687 (1996))。
【０００３】
FALS症例のうち、10〜20％の症例 には銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ(copper/zinc superoxide dismutase; SOD1)遺伝子の変異が認められる。SOD1遺伝子変異によるFALSの発症機序については未解明であるが、ヒト変異SOD1遺伝子を導入したTg マウスが作製されており、ヒトALS と同様の神経症状および病理学的変化を呈することから、治療薬開発におけるモデル動物として広く用いられている。治療剤として神経保護効果、神経栄養因子、グルタミン酸抑制作用、カスパーゼ抑制、銅キレート作用などに基いた薬物の効果についての検討が進められてきている。しかし、現状においては、グルタミン酸受容体のアンタゴニストであるリルゾールのみがALS治療薬として販売されているのみである。
【０００４】
加藤らはヒトの弧発性及び家族性ALS患者のスフェロイド中の構成成分としてガレクチン−1を同定した(Kato, T. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 282, 166-172  (2001))。スフェロイドを強く認識するモノクローナル抗体HepSS-1が認識する物質をヒト脊髄より精製・分離し、アミノ酸配列を決定した結果、ガレクチン−1のそれと完全に一致し、更に抗ガレクチン−1ポリクローナル抗体を用いて、ヒトALSの脊髄を免疫染色した結果、スフェロイドが強く認識された。更にこの抗ガレクチン−1ポリクローナル抗体を用いてALS患者の皮膚病変部の免疫組織化学的研究を行なった結果、正常組織と比較してALS患者皮膚組織において、抗ガレクチン−1抗体反応性の減少が明らかになった(Wada, M. et al. J. Neurological Sciences 208, 67-70  (2003))。
【０００５】
ガレクチン−１は、β-ガラクトシド結合動物レクチンであるガレクチンファミリー（Barondes S.H. et al, Cell 76:597-598. (1994)）のプロトタイプである。ガレクチン−1の構造的な特徴として分子内に６ヶ所のシステイン残基を有しており、還元状態でレクチン活性を示すことが知られている。また、ガレクチン−1は通常２量体を形成しており、レクチン活性によって細胞表面の糖鎖、糖タンパク質糖鎖に結合することによって細胞の接着、増殖等へ関与していることが報告されている（Kasai, K. et al, J. Biochem., 119, 1-8 (1996)）。堀江らは、損傷後の末梢神経再生促進因子の探索に取り組み、軸索再生の初期過程を調節する新規因子として酸化型ガレクチン−１を同定した(Horie H. et al, WO  00/06724、Horie, H. et al, J.Neurosci., 19 9964-9974 (1999))。神経再生促進活性を示すガレクチン-１タンパク質の構造解析及び組換え体を用いた構造活性相関についての研究の結果、神経再生促進活性を示すガレクチン−1は、３組の分子内SS結合により架橋された酸化型フォームであり、単量体で存在していることを明らかにした（Inagaki, Y. et al, Eur. J. Biochem. 267 2955-2964. (2000)）。ラット腓骨神経切断―コラーゲンゲル充填チューブ縫合モデルを用いて、末梢神経損傷後の神経再生に対する酸化型ガレクチン−１の効果について調べた結果、酸化型ガレクチン−１を作用させた場合の再生先端の位置はコントロールより先に進んでおり、コラーゲンゲル中にシュワン細胞の遊走を伴って再生した神経軸索を観察した。また、酸化型ガレクチン−1投与によって再生軸索の長さだけでなく、遊走シュワン細胞数、再生軸索数の増加が認められた。更に、凍結融解処理または界面活性剤処理し、細胞を含まない状態の坐骨神経組織片の自家移植と同種移植ラットモデル実験での酸化型ガレクチン−1投与実験の結果、酸化型ガレクチン−1投与によって後根神経節，前角細胞の両者からの軸索再生を促進し、また、移植片内へのシュワン細胞の遊走が促進された（Fukaya K. et al, J Neuropath. & Exp. Neurol., 62, 162-172 (2003)）。その一方で、上記のモデル実験において抗ガレクチン−1抗体を投与した場合に神経再生が強く抑制されことから、酸化型ガレクチン−1が神経再生初期において生理的に重要な役割を果たしていることが示唆されている。
【０００６】
【特許文献１】WO  00/06724
【非特許文献１】Kato, T. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 282, 166-172  (2001)
【非特許文献２】Wada, M. et al. J. Neurological Sciences 208, 67-70  (2003)
【非特許文献３】Barondes S.H. et al, Cell 76:597-598. (1994)
【非特許文献４】Kasai, K. et al, J. Biochem., 119, 1-8 (1996)
【非特許文献５】Horie, H. et al, J.Neurosci., 19 9964-9974 (1999)
【非特許文献６】Inagaki, Y. et al, Eur. J. Biochem. 267 2955-2964. (2000)
【非特許文献７】Fukaya K. et al, J Neuropath. & Exp. Neurol., 62, 162-172 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症の治療に有効なガレクチン-1又はその誘導体を有効成分として含む神経障害の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は先に、神経組織の神経線維の切断端からの神経突起再生を促進し、生存を維持する因子を得るべく、成熟または老化ラットの後根神経節神経組織（DRG）をコラーゲンゲル中に包埋し、その神経線維の切断端からの突起再生をみる器官培養アッセイ系を用いて検討を行った（WO  00/06724）。その結果、酸化型ガレクチン-1が神経突起の再生を促進することを見出した。本発明者等は、さらにALS動物モデルを用い酸化型ガレクチン-1が筋萎縮性側索硬化症の治療に有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【０００９】
実施例に示すように、本発明の酸化型ガレクチン-1を有効成分として含む薬剤を、筋萎縮性側索硬化症の動物モデルに投与したところ、運動機能の改善、生存期間の延長効果、神経細胞の増加が認められた。本発明の薬剤は、筋萎縮性側索硬化症の症状の緩和、寛解に効果があり、筋萎縮性側索硬化症の治療剤または予防剤として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するガレクチン−１又はその誘導体を有効成分として含む、筋萎縮性側索硬化症の治療剤を提供する。
【００１１】
本発明で使用される酸化型ガレクチン−1又はその誘導体は、レクチン活性をほとんど又は全くもたない。ここでレクチン活性とはβ−ガラクトシド結合活性を指し、そのような活性をもつレクチンは通常ラクトースカラム結合能又は赤血球凝集能を有している。
【００１２】
本発明の実施態様において、ガレクチン−1又はその誘導体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列中の2番目（Cys2）、16番目(Cys16)、42番目(Cys42)、60番目(Cys60)、88番目(Cys88)及び130番目(Cys130)のシステイン残基のうち少なくとも16番目のシステイン(Cys16)と88番目のシステイン(Cys88)の間でジスルフィド結合を形成している。  本明細書中「酸化型」とは、蛋白質の２つ以上のシステイン残基がジスルフィド結合を形成した、いわゆる酸化状態にあることを意味する。
【００１３】
本発明の実施態様において、ガレクチン−1又はその誘導体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列中以下の各システイン間にジスルフィド結合のパターンを形成しているものが例示される：
（１）Cys16-Cys88,Cys2-Cys130及びCys42-Cys60;又は
（２）Cys16-Cys88,Cys2-Cys60及びCys42-Cys130；又は
（３）Cys16-Cys88,Cys2-Cys42及びCys60-Cys130；
或いは、（1）、（2）及び（3）のうち少なくとも２つの組の結合パターンの混合物、特に（1）が５０％以上含有する混合物。
【００１４】
誘導体としては、例えば以下のものが挙げられる：
(a) 配列番号１に示されるアミノ酸配列において1個以上、好ましくは1個若しくは数個、のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、ガレクチン-1の活性すなわち神経再生促進作用を有するもの、或いは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を実質的に有するもの。ここで「実質的」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列においてその蛋白質の神経再生促進活性に影響を与えない少なくとも1個のアミノ酸の変更（置換、欠失、挿入及び／又は付加）を含みうることを意味する。
(b) 配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較してアミノ酸レベルで８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、なおかつガレクチン-1の活性すなわち神経再生促進作用を有するもの。
(c) Ｎ末端がアシル化（例えば、ホルミル化、アセチル化など）されているもの。
(d) Ｎ末端にＭｅｔ−1Ｌｙｓ−2又はＭｅｔ−１が付加されているもの。
(e) 水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）又は炭水化物鎖と共有結合されているもの。
【００１５】
これらの誘導体が、ガレクチン-1の活性を有しているかは、WO  00/06724に記載の神経損傷モデルを用いた検討を行い神経再生促進作用を有しているか否かを調べればよい。上記アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加はガレクチン-１の活性を失わせないアミノ酸位置における置換、欠失、挿入及び／又は付加であり、公知の方法で1個以上、好ましくは1個若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入及び／又は付加し、上記方法でガレクチン-１の活性を有しているか否か調べることによりガレクチン-１の活性を失わせないアミノ酸位置における置換、欠失、挿入及び／又は付加がどのアミノ酸位置における置換、欠失、挿入及び／又は付加であるかは容易に調べることができる。また、ガレクチン-１の活性を失わせないアミノ酸位置は以下の基準で予測することが可能である。
【００１６】
一般に蛋白質の熱力学的安定性を向上させる方法として、プロリン残基の導入とグリシン残基の除去が有効であることが理論的に示されている（Matthewsら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 6663-6667，1987 ）。そこで、安定性の向上を目的としたガレクチン−１誘導体を設計する場合、プロリン残基を導入したガレクチン−１誘導体およびグリシン残基を除去したガレクチン−１誘導体を考えることができる。
【００１７】
また、一般に蛋白質は、疎水性アミノ酸を内側に、親水性アミノ酸を外側に立体構造が形成されることから、蛋白質表面に存在するアミノ酸をより親水性の高い荷電性アミノ酸に置換することによって蛋白質の溶解性の向上を期待することができる。ガレクチン−１の場合でも、このような観点から誘導体を設計することができる。
【００１８】
さらに、相同性を有する他の生物種由来のガレクチン-1（ニワトリガレクチン：Ohyama,Y.ら、Biochem.Biophys.Res.Commum. 134巻、51-56頁、(1986)、ラットガレクチン：Clerch,L.B.ら、Biochemistry 27巻、692-699頁、(1988)、マウスガレクチン：Wilson,T.J.G.ら、Biochem.J. 261巻、847-852 頁、(1989)、ウシガレクチン：Abbot,W.M.ら、Biochem.J. 259巻、283-290頁、(1989),等）のアミノ酸配列を利用することができる。例えば、ヒト型とラット型のアミノ酸配列を比較し、ヒト型ではプロリンではないがラット型ではプロリンを有する部位、あるいは、ヒト型ではグリシンだがラット型ではグリシン以外のアミノ酸を有する部位を選ぶことができる。
【００１９】
また、本発明の治療剤に用い得るガレクチン−１としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒト型のガレクチン−１、および前述の誘導体の−２位にメチオニン残基、かつ−１位にリジン残基が付加されたガレクチン−１、−１位にメチオニン残基が付加されたガレクチン−１も含まれる。宿主として細菌（例えば、大腸菌）を用いて菌体内発現を行う場合には、神経再生促進活性を有する蛋白質のＮ末端側に開始メチオニン残基の付加された蛋白質が得られる場合もあることが知られている。また、用いる宿主によっては、産生される神経再生促進活性を有するガレクチン−１はグリコシル化されている場合やN末端がアセチル基、ホルミル基等によりブロックされている場合もあるし、あるいはされていない場合もあるがいずれも、ガレクチン−１に含まれる。
【００２０】
本発明の治療剤に用い得るガレクチン−１は、天然の供給源（例えば、神経再生促進活性を含むならし培地、またはヒト肺、腎臓、胎盤等）から精製および単離されたものでもよいが、好ましくは遺伝子組換え法によって得られたものである。後者の場合、大量生産が可能であるという利点がある。
【００２１】
本発明の治療剤に用い得る酸化型ガレクチン-1およびその誘導体は、WO  00/06724、Horie, H. et al, J.Neurosci., 19 9964-9974 (1999)およびInagaki, Y. et al, Eur. J. Biochem. 267; 2955-2964(2000)の記載にしたがって、得ることができる。
【００２２】
例えば、酸化型ガレクチン-１は、以下のようにして得ることができる。
還元型ガレクチン−１を酸化型ガレクチン−１に変換する酸化方法としては化学的酸化法あるいはジスルフィド交換反応を利用することができる。化学的酸化法としては空気酸化法、重金属イオン（例えばCu2+）を触媒として用いる空気酸化法、ヨードソ安息香酸や過酸化水素を用いる方法等を利用できる。また、ジスルフィド交換反応としては還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンを含む酸化還元緩衝液を用いる方法が代表的であるが、システインやジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール、システアミンをベースにした酸化還元緩衝液を用いる方法も利用できる。これによって、 配列番号１に示されるアミノ酸配列中の2番目（Cys2）、16番目(Cys16)、42番目(Cys42)、60番目(Cys60)、88番目(Cys88)及び130番目(Cys130)のシステイン残基のうち少なくとも16番目のシステイン(Cys16)と88番目のシステイン(Cys88)の間でジスルフィド結合を形成している本発明のガレクチン−１を得ることができる。ガレクチン−１中、ジスルフィド結合は1個以上3個以下、好ましくは２〜3個、さらに好ましくは３個である。配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするDNAを大腸菌で発現させリフォールディング操作を行った場合には、以下の各システイン間にジスルフィド結合を有する（1）Cys16-Cys88,Cys2-Cys130及びCys42-Cys60;（2）Cys16-Cys88,Cys2-Cys60及びCys42-Cys130；（3）Cys16-Cys88,Cys2-Cys42及びCys60-Cys130の3種類の酸化型ガレクチン−１からなり、（１）のガレクチン−１を50％以上含む混合物として得られる。
【００２３】
本発明の治療剤は、筋萎縮性側索硬化症の治療剤または予防剤として用いることができる。
【００２４】
本発明の治療剤が対象とする筋萎縮性側索硬化症には、孤発性のものも家族性のものも含まれる。本発明の治療剤は、筋萎縮性側索硬化症の症状の進行を緩和し、あるいは停止させ、生存期間を延長させることができる。さらに、運動機能が低下した患者の運動機能を改善することもできる。また、筋萎縮性側索硬化症の発症を予防することも可能で、特に家族性筋萎縮性側索硬化症において、近親者に筋萎縮性側索硬化症患者が存在し、筋萎縮性側索硬化症発症のリスクを有する者に対して有用である。
【００２５】
治療剤には、一般的な適当な液体または固体担体の他に、希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントが含有されてもよい（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Edition, Mack Publishing Company, 1995参照）。このような組成物は、液体または固体からなる形態であって、種々のpHおよびイオン強度から成る緩衝剤（例えばトリス- 塩酸、酢酸塩、リン酸塩）より選択した希釈剤、表面に吸着しないようにするためのアルブミンまたはゼラチンのような添加剤、界面活性剤（例えばTween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、賦形剤または等張化剤（例えばラクトース、マンニトール）を配合し得る。
【００２６】
また、蛋白質に対するポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーとの共有結合、金属イオンとの錯体化、あるいはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのような重合化合物の粒状製剤中またはその表面上への、あるいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト中への該物質の取り込みを包含する。このような組成物は、本発明のガレクチン−１の物理的状態、溶解性、安定性、インビボ 放出速度、インビボ クリアランスに影響を及ぼすと思われるので、組成物の選択は、神経再生促進活性を有するガレクチン−１の物理的および化学的特性による。
【００２７】
本発明の治療剤は、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与等の非経口、経肺、経鼻、経口、局部埋め込みを含めた種々の投与経路が可能であり、投与経路に応じて粒状形態、保護被膜、プロテアーゼ阻害剤の配合、吸収促進剤の配合、コラーゲンなどの生体材料または生体適合材料への包接、等とすることができる。剤型としては、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、エアゾル剤、腸溶剤、徐放製剤、埋め込み型製剤などであるが、これらに制限されない。本発明の実施態様において、本発明のガレクチン−１をコラーゲンゲル中に含有させ神経障害局部に直接埋め込む形態のものであってもよいが、例えば、薬剤、担体等の必要な成分を生体適合性材料（例えば、シリコンゴム、コラーゲン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミドなど）からなるチューブ内に封入し得る。
【００２８】
ガレクチン−１を含有する本発明の治療剤は、活性成分として通常０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重を、年齢、体重、病状、性別、投与経路等に応じて、一日1回〜数回程度投与することができる。しかし、投与量はこの範囲に限定されず、治療上の種々の要因によって変動させ得る。
【００２９】
本発明の治療剤においてガレクチン−１と単独あるいは他の付加的神経栄養活性を有する因子類と組み合わせても、筋萎縮性側索硬化症の治療に有用である。他の付加的因子としては、 NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6等のニューロトロフィンファミリーやインスリン、IGF-I、IGF-II等のインスリンファミリー、aFGF、bFGF、FGF-5等のFGFファミリー、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6等のインターロイキン類やLIF、GM-CSF、G-CSF、EPO、TPO、CNTF、オンコスタチン（oncostatin）M、TNFα、チオレドキシン、GDNF、TGFβ、EGF、成長促進活性（growth promoting activity）、成長抑制因子（growth inhibitory factor）、プラスミノーゲン（plasminogen）、グリア由来ネキシン（glia-derived nexin）、α2マクログロブリン（macroglobulin）、S100蛋白質、アネキシン（annexin）V、神経特異的エノラーゼ（neuron specific enolase）、トロンボスポンジン（thrombospondin）、肝細胞成長因子（hepatocyte growth factor）を挙げることができる。更にGM1、GM2等のガングリオシドやアデノコルチコトロピンホルモン（adrenocorticotropic hormone(ATCH)）、チロトロピン放出ホルモン（thyrotropin-releasing hormon  (TRH)）、海馬コリン作動性神経栄養ペプチド（hippocampal cholinergic neurotrophic peptide (HCNP)）、コルチコトロピン放出ホルモン（corticotropin-releasing hormon (CRF)）等の神経ペプチドを挙げることができる。望ましくは、 NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、NT-6、IGF-I、IGF-II、CNTF、 GDNFを挙げることができる。
【００３０】
また、ガレクチン−１は、細胞外マトリックスや傍神経系細胞と組み合わせても神経系障害の治療に有用である。細胞外マトリックスとしては、ラミニン、フィブロネクチン、スロンボスポンディン、コラーゲン等が挙げられる。傍神経系細胞としては、シュワン細胞、線維芽細胞、サテライト細胞、マクロファージ、グリア細胞等が挙げられる。また、傍神経系細胞の基底膜との組み合わせも神経障害治療に有用である。
【００３１】
本発明のガレクチン−１含有治療剤を安定化するために、糖類、界面活性剤等の安定化剤を添加し得るが、例えば以下のものが挙げられる。
【００３２】
糖類としては、マンニトール、ラクトース、シュクロース、マルトース、グルコース、イノシトール、キシロース、ソルビトール、フルクトース、ガラクトース、リボース、マンノース、セロビオース、シクロデキストリンなどが利用できる。これらの中でもソルビトール、マンニトール、シュクロースが好ましい。
【００３３】
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリソルベート８０やモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（別名：ポリソルベート２０）などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタンなどのソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖モノラウリン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステル、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウムなどの芳香族四級アンモニウム塩、カプリル酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどが利用できる。この中でも、ポリソルベート８０やポリソルベート２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油が好ましい。
【００３４】
本発明において用いられるこれらの糖類、界面活性剤は、本発明のガレクチン−１含有治療剤中、糖類の場合には０．１〜５０％（W/V ）、界面活性剤の場合には０．０００１〜５０％（w/v ）の範囲で使用され得る。
【００３５】
本発明のガレクチン−１含有治療剤としては、上述の神経栄養活性を有する種々の蛋白質のみならず、該蛋白質が少なくとも一つの水溶性ポリマーに結合している化学修飾した本発明の蛋白質も含まれる。水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（N−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコールなどから選択される。これらのポリマーは、蛋白質のＮ末端のα−アミノ基やリシンのε−アミノ基とアルデヒドのような反応性基を介して共有結合することができる。特に本発明の治療剤においてガレクチン−１は反応性ポリエチレングリコール（PEG）分子と反応して、PEGをガレクチン−１に付加させたものが好ましい。また、PEGの分子量は６ｋDa〜50ｋDaのものが好ましい。
【００３６】
あるいは、本発明は、本発明の上記治療剤を、筋萎縮性側索硬化症の治療を必要とする患者（ヒトを含む）に投与することを含む該神経障害を治療する方法をも包含する。
【実施例】
【００３７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
＜実施例１＞トランスジェニック（Tg）マウス
（東北大学医学部の糸山教授より供与された）ヒトH46R変異SOD1遺伝子発現トランスジェニックマウスを評価に用いた（特開2002-142610号公報）。Tgマウスの作製法の概略を以下に示す。
【００３９】
約11.5kbのヒトSOD1遺伝子をPACライブラリーから調製し、H46RSOD1変異遺伝子をPCR primer-directed mutagenesisによって作製した。ヒトH46RSOD1変異遺伝子の同定は、ヒトSOD1特異的プライマー（sense: 5’-TTGGGAGGAGGTAGTGATTA-3’（配列番号２）、antisense: 5’-AGCTAGCAGGATAACAGATGA-3’ （配列番号３））を用いたtail clip PCR法により同定した。プロモーター領域を含むヒトH46RSOD1遺伝子をEcoRIとBamHIで切り取り、C57BL/6マウスにマイクロインジェクションした。ヒトH46RSOD1遺伝子変異した雄マウスを野生型雌マウスと交配した。実験には雄の同腹子を用いた。
【００４０】
＜実施例２＞ヒト酸化型ガレクチン−1の作製
ヒト酸化型ガレクチン−1の作製は既報告の報告（Horie H. et al, WO 00/06724、Horie, H. et al., J. Neurosci., 19, 9964-9974 (1999)、Inagaki Y. et al, Eur. J. Biochem. 267 2955-2964. (2000)）に基き、以下のように実施した。ヒトガレクチン−1遺伝子をSuperScriptTMHuman Liver cDNA Libraryから調製し、大腸菌発現ベクターであるpET-3d（ストラタジーン社製）に挿入した。得られたヒトガレクチン−1ｃDNAを組み込んだ大腸菌発現用プラスミドpETGal1(1-134)を導入した大腸菌（E.coli BL21 (DE3)）を取得した。この大腸菌を培養し、増殖、IPTG添加によってヒトガレクチン−1の発現誘導後、菌体ペレットを集めた。ペレットを超音波破砕後、遠心分離し、得られた上清中にヒトガレクチン−1タンパク質を回収した。この溶液から、イオン交換クロマトグラフィーによってヒトガレクチン−1タンパク質を精製した。得られたヒトガレクチン−1画分を20mMトリス塩酸緩衝液(pH８)で希釈後、最終濃度0.0001％となるよう硫酸銅を添加し、一晩SS結合形成反応（リフォールディング）を行った。リフォールディング反応終了後、逆相HPLCを用いて酸化型ガレクチン−1を精製し、引き続きゲルろ過または透析によりPBSに溶媒置換した。精製ヒトガレクチン−1標品はろ過滅菌後、凍結保存した。標品のタンパク質濃度はアミノ酸分析によって測定した。
【００４１】
得られたガレクチン-１は、Cys2-Cys130、Cys16-Cys88、Cys42-Cys60の間でS-S結合を形成していた。
【００４２】
＜実施例３＞試験物質の投与
次に示す3種の試験物質を投与するため、Tgマウスを無作為に３つのグループに分けた：（１）低用量群：rhGAL-1/Ox 0.025μg /g体重量 n=15、（２）高用量群：rhGAL-1/Ox 0.25μg /g体重量 n=14、（３）コントロール群：60μＬ生理食塩水n=14。生理食塩水で希釈したrhGAL-1/Oxまたはコントロール溶液は、27ゲージの注射針を装着したマイクロシリンジを用いて左側腓腹筋に筋肉内投与した。投与は出生10週目から開始し、その後は週に一回実施した。
【００４３】
＜実施例４＞運動機能評価法
運動機能評価はRotarod（室町機械）を用いて、週に一回実施した。5及び20rpmで回転する直径30mmの金属棒(ロッド)上にマウスを乗せると落下しないようにその上で運動を続ける。この運動を継続できる時間を測定した。測定は最長420秒とし、420秒到達時に自動的にロッドの回転が停止するようにした。評価は、生後6週以後、各マウス1週間に一度実施した。Rotarod試験において、20rpmの速度で420秒間の完遂ができなくなった日を運動機能障害の発症日とした。マウス生存期間は、死亡が確認された日を死亡日とし、その日齢を生存期間とした。ALS罹病期間は、各個体における生存期間と発症時期の差をとって、これを罹病期間とした。
【００４４】
＜実施例５＞組織病理学的評価法
生後147日（21週令）に脊髄運動神経細胞の数を調べた。腰髄膨大部（L4-5）から厚さ10μmの15枚の連続横断切片を調製し、ニッスル染色した後、光学顕微鏡下40倍で写真を撮影した。前角細胞数の評価はブラインド試験によって実施した。神経細胞数は左右の前角、各々について計測した。次の３つ基準を全て満たす前角神経細胞を計数した：（１）脊髄中心管の腹側端を通る接線より腹側に位置する前角神経細胞、（２）神経細胞の胞体の最大直径が20μmまたはそれ以上、（３）明瞭な核小体を有する神経細胞。
【００４５】
＜実施例６＞統計解析法
発症時点、生存期間、発症期間は、Log-Rank test及びtwo-tailed student’s t testで統計解析した。Rotarodを用いた運動機能評価については、ANOVAを用いて統計解析した。運動神経数はtwo-tailed student’s t testで比較統計解析した。統計解析は全てコンピュータソフト（SPSS ver.11.0、SPSS inc.）を用いて実施した。
【００４６】
＜実施例７＞運動機能不全発症の遅延効果
Tgマウスの運動機能障害の発症日のKaplan-Meier曲線を図１に示す。また、発症日の平均値を図２及び表1に示した。コントロール群が138.29±1.68日であったのに対して、高用量群は143.5±1.48日、低用量群では141.27±2.47日であった。コントロール群と比較して、高用量群では有意な発症日の遅延が認められた。
【００４７】
【表１】
2005187433.tif 000002
【００４８】
＜実施例８＞生存期間の延長効果
Tgマウスの生存期間のKaplan-Meier曲線を図３に示す。また、平均生存期間を図４及び表1に示した。コントロール群が160.36±2.35日であったのに対して、高用量群は172.21±1.33日、低用量群では164.53±2.93日であった。コントロール群と比較して、高用量群では有意な生存期間の延長が認められた（t test, P=0.028）。
【００４９】
＜実施例９＞罹病期間の延長効果
TgマウスのALS罹病期間のKaplan-Meier曲線を図５に示す。また、平均罹病期間を図６及び表1に示した。コントロール群が22.07±1.39日であったのに対して、高用量群は28.71±1.83日、低用量群では23.27±1.28日であった。コントロール群と比較して、高用量群では有意なALS罹病期間の延長が認められた（three groups Log-Rank test, P<0.05）。
【００５０】
＜実施例10＞運動機能の改善効果
Tgマウスの週令と運動機能（Rotarodにより評価）との関係を図７および８に示した。5 rpmでの評価では、有意差はなかったが、高用量群で運動機能の改善傾向がみられた。20rpmの評価では、コントロール群と比較して、高用量群で有意な運動機能改善効果が認められた（ANOVA, P=0.034）。
【００５１】
＜実施例11＞運動ニューロン生存効果
147日齢Tgマウスの腰髄膨大部（L4-5）のニッスル染色像を図９A（高用量）、図９B（低用量）および図９C（コントロール）に、残存大型神経細胞数の計測結果を図１０および図１１ならびに表2に示した。1切片当たりの残存大型神経細胞数はコントロール群が10.64±0.85であったのに対して、高用量群は17.62±2.61日、低用量群では15.52±3.01日と容量依存的に残存大型神経細胞数の増加傾向がみられた。特に高用量群ではコントロール群に対して有意に残存大型神経細胞数の増加が認められた（P<0.05）。脊髄前角の左右では残存神経細胞数に差は認められなかった（図１０）。
【００５２】
【表２】
2005187433.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Tgマウスの運動機能障害の発症日のKaplan-Meier曲線を示す図である。
【図２】Tgマウスの運動機能障害の発症日の平均値を示す図である。
【図３】Tgマウスの生存期間のKaplan-Meier曲線を示す図である。
【図４】Tgマウスの平均生存期間を示す図である。
【図５】TgマウスのALS罹病期間のKaplan-Meier曲線を示す図である。
【図６】TgマウスのALSの平均罹病期間を示す図である。
【図７】Tgマウスの週令と運動機能（Rotarodにより評価、5rpm）との関係を示す図である。
【図８】Tgマウスの週令と運動機能（Rotarodにより評価、20rpm）との関係を示す図である。
【図９】147日齢Tgマウスの腰髄膨大部（L4-5）のニッスル染色像を示す図である。
【図１０】脊髄(L4-5)前角残存大型神経細胞数の計測結果を示す図である。
【図１１】脊髄(L4-5)前角残存大型神経細胞数の計測結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号２，３：合成DNA
【図１】
2005187433.tif 000004
【図２】
2005187433.tif 000005
【図３】
2005187433.tif 000006
【図４】
2005187433.tif 000007
【図５】
2005187433.tif 000008
【図６】
2005187433.tif 000009
【図７】
2005187433.tif 000010
【図８】
2005187433.tif 000011
【図９】
2005187433.tif 000012
【図１０】
2005187433.tif 000013
【図１１】
2005187433.tif 000014
【配列表】
2005187433000001.app