(57)【要約】【課題】  自己免疫疾患の発症について、客観的かつ正確な診断を可能とするための判定方法およびその利用を提供する。【解決手段】  末梢リンパ組織に存在するＴ細胞において、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定する判定によれば、己免疫疾患の発症について、客観的かつ正確な診断を可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢リンパ組織に存在するＴ細胞において、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定することを特徴とする判定方法。
【請求項２】
上記判定方法は、
末梢リンパ組織に存在するＴ細胞において、以下の（ａ）〜（ｅ）のうちから選択される少なくとも１つの物質が発現しているか否かを判定する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
（ａ）ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質をコードする核酸
（ｂ）（ａ）の核酸と相補的な塩基配列を有する核酸
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の断片
（ｄ）ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質
（ｅ）（ｄ）の断片
【請求項３】
上記ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が、ＶＤＪリコンビナーゼであることを特徴とする請求項１または２に記載の判定方法。
【請求項４】
上記ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が、ＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項５】
上記末梢リンパ組織が、脾臓または末梢血であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の判定方法を実施するための判定キット。
【請求項７】
ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現を検出するための試薬類を含むことを特徴とする請求項６に記載の判定キット。
【請求項８】
被験者が、自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを診断する方法であって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の判定方法または判定キットを用いて、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定する過程と、
上記判定過程の結果から、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現していることを指標として、被験者が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があると判定する過程と、
を含むことを特徴とする診断方法。
【請求項９】
被験動物が、自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを診断する方法であって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の判定方法または判定キットを用いて、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定する過程と、
上記判定過程の結果から、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現していることを指標として、被験動物が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があると判定する過程と、
を含むことを特徴とする診断方法。
【請求項１０】
被験動物が自己免疫疾患のモデル動物として有用であるか否かを判定するモデル動物の判定方法であって、
請求項９に記載の診断方法により、上記被験動物が自己免疫疾患に罹患しているか否かを診断する診断過程と、
上記診断過程において、被験動物が自己免疫疾患に罹患していることを指標として、上記被験動物が自己免疫疾患のモデル動物として有用であると判定する判定過程と、を備えることを特徴とするモデル動物の判定方法。
【請求項１１】
抗自己免疫疾患薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、
自己免疫疾患のモデル動物に被験物質を与える過程と、
請求項９に記載の診断方法により、上記モデル動物の自己免疫疾患が治癒または改善されたか否かを診断する過程と、
上記モデル動物の自己免疫疾患が治癒または改善していることを指標として、上記被検物質が抗自己免疫疾患薬の候補物質であると判定する過程と、を備えることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の発症に関与する因子の発現を判定する方法およびその利用に関し、特に、末梢リンパ組織において、自己免疫疾患の発症に関与する因子が発現しているか否かを判定する方法およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、本来外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし、時にはこの免疫系の働きが、結果的に生体に有害であることがある。これを一般的にアレルギーと呼んでいる。生体は、外界からの異物に対するのみならず、自己の成分に対しても一種のアレルギー反応・自己免疫応答を起こすことが知られている。これを自己免疫現象（autoimmunity）と称し、これをもとにある病態が生じた場合には、自己免疫疾患（autoimmune disease）と称する。
【０００３】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患と、特異性のない疾患の２つに大別される。臓器特異的自己免疫疾患には、橋本甲状腺炎（慢性甲状腺炎）、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症（甲状腺剤中毒症）、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎（自己免疫性萎縮性胃炎）、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症（発作性ヘモグロビン尿症）、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群がある。臓器非特異的自己免疫疾患には、関節リウマチ（慢性関節リウマチ）、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強（鞏）皮症、混合結合組織病がある。
【０００４】
これら自己免疫疾患のなかでも、特に本発明者らは関節リウマチに着目して研究を進めている。関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【０００５】
ＲＡは、その発症の仕方も多種多様であり、その診断には、アメリカリウマチ学会の診断基準が広く利用されている。しかしながら、ＲＡの発症は、通常、緩徐で数週間から数ヶ月にわたり、アメリカリウマチ学会の診断基準における客観的な指標としてのリウマトイド因子（rheumatoid factor、以下単に「ＲＦ」、または「リウマチ因子」と称する場合もある）の存在は、その陽性率が３ヶ月以内で３３％、１２ヶ月以上においても８８％程度（非特許文献１参照）であり、ＲＡと確実に診断するには至っていない。そこで、組換え抗原と反応する患者血清中のリウマチ性関節炎関連抗体ＩｇＭ抗体を検出し、リウマチ性関節炎を診断しようとする試みなどがなされている（特許文献１参照）。
【０００６】
また、ＲＡの治療は、ＲＡ病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段は異なるのが通常である。一般的に確定診断が下せない初期では、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、確定診断が下せた場合は、ＮＳＡＩＤに加えて疾患修飾性リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を投与する。特にＲＡ発症の初期には、確定診断を下すことは困難であり、現状では、ＮＳＡＩＤを投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他のリウマチ疾患との鑑別を同時に行っている。さらに症状が進行した場合は、ステロイド薬の投与を行う場合もあり、疼痛のための薬物療法と共に関節機能の維持・回復に対して理学療法・装具療法を行う。また、関節破壊により日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
【０００７】
特許文献２では、本願発明者らが、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析をＲＡ患者およびその血縁者に対して実施することにより、関節リウマチの疾患遺伝子が位置する3カ所の遺伝子座を特定し、以下の疾患遺伝子を同定している。
（１）ヒト第1染色体の、マイクロサテライトマーカーD1S214および／またはDlS253がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
（２）ヒト第８染色体の、マイクロサテライトマーカーD8S556がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
（３）ヒトＸ染色体の、マイクロサテライトマーカーDXSl001、DXS1047、DXS1205、DXS1227および／またはDXS1232がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±1センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
【０００８】
また、非特許文献２には、本願発明者らが、前記先願発明の各疾患関与遺伝子にうち、前記（１）の疾患関与遺伝子に関係するマーカーD1S214およびD1S253の疾患関与遺伝子として、デスレセプター３（death receptor 3：「ＤＲ３」または「ＤＲ３遺伝子」ともいう）を挙げ、健常人とＲＡ患者との間にＤＲ３の制限断片長多型を確認し、ＤＲ３がＲＡにおける疾患関与遺伝子である可能性を示唆している。
【０００９】
さらに、特許文献３では、本願発明者らが、ＤＲ３遺伝子のゲノム変異と関節リウマチ発症との関係について開示している。
【００１０】
ところで、免疫系の中心的役割を果たすＴ細胞およびＢ細胞に特異的な現象として、遺伝子再構成が知られている。この遺伝子再構成とは、多数のＶＤＪあるいはＶＪ遺伝子断片からなるＴ細胞のＴＣＲ遺伝子（T cell receptor gene）およびＢ細胞のイムノグロブリン遺伝子（immunoglobulin gene）において、これらの遺伝子断片が不可逆的にランダムに遺伝子組換えを起こすことによってレセプターの多様性を生じさせるために必須の現象である。
【００１１】
このＴ細胞またはＢ細胞における遺伝子再構成に関与する因子として、ＲＡＧ（recombination activating gene）が知られている。このＲＡＧは、ゲノムＤＮＡを切断して遺伝子再構成を惹起する働きを有すること、および胸腺および骨髄といった中枢リンパ組織においてのみ発現することが報告されている（非特許文献３参照）。
【特許文献１】特表平１０−５１３２５７号（公開日：１９９８年１２月１５日）
【特許文献２】国際公開ＷＯ９８／５１７９１号（国際公開日：１９９８年１１月１９日）
【特許文献３】国際公開ＷＯ０２／３４９１２号（国際公開日：２００２年  ５月  ２日）
【非特許文献１】治療、第73巻、第３号、第23〜27頁、1991年
【非特許文献２】リウマチ、第39号、第2号、第444頁および第445頁（１９９９年）
【非特許文献３】A Wilson, W Held and HR MacDonald, Two waves of recombinase gene expression in developing thymocytes. J. Exp. Med. 179:1355-1360, 1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述のように、関節リウマチをはじめとする種々の自己免疫疾患について積極的な研究成果が数多く報告されているが、自己免疫疾患の発症を客観的に診断する技術は未だ十分に確立されているとはいえない。
【００１３】
このため、関節リウマチをはじめとする自己免疫疾患の発症についての客観的かつ正確な診断に寄与できる、新たな技術の確立が強く望まれていた。
【００１４】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、自己免疫疾患の発症について、客観的かつ正確な診断を可能とするための判定方法およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討し、遷延感作モデルを用いた自己免疫疾患発症機序の解析を行ったところ、マウスが自己抗体を産生する時期と一致して、マウスの末梢Ｔ細胞にて遺伝子再構成に関与する因子ＲＡＧが発現していることを見出した。この知見から、末梢リンパ組織で発現したＲＡＧの働きによってランダムなＴＣＲ遺伝子再構成が起こり、自己抗体産生を支持するＴ細胞クローンが生成されることが、自己抗体産生、ひいては自己免疫疾患発症の原因となる可能性が考えられる。本発明者らは、この知見に基づき、自己免疫疾患の発症に関与する因子を判定するという本発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は産業上有用な方法または物質として、下記１）〜１１）の発明を含むものである。
【００１７】
１）末梢リンパ組織に存在するＴ細胞において、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定する判定方法。
【００１８】
２）上記判定方法は、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞において、以下の（ａ）〜（ｅ）のうちから選択される少なくとも１つの物質が発現しているか否かを判定する工程を含む１）に記載の判定方法。
（ａ）ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質をコードする核酸（ｍＲＮＡを含む）
（ｂ）（ａ）の核酸と相補的な塩基配列を有する核酸（ｍＲＮＡを含む）
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の断片
（ｄ）ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質（酵素を含む）
（ｅ）（ｄ）の断片
３）上記ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が、ＶＤＪリコンビナーゼである１）または２）に記載の判定方法。
【００１９】
４）上記ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が、ＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２である１）〜３）のいずれかに記載の判定方法。
【００２０】
５）上記末梢リンパ組織が、脾臓または末梢血である１）〜４）のいずれかに記載の判定方法。
【００２１】
６）上記１）〜５）のいずれかに記載の判定方法を実施するための判定キット。
【００２２】
７）ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現を検出するための試薬類を含む６）に記載の判定キット。
【００２３】
８）被験者が、自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを診断する方法であって、上記１）〜７）のいずれかに記載の判定方法または判定キットを用いて、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定する過程と、上記判定過程の結果から、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現していることを指標として、被験者が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があると判定する過程と、を含む診断方法。
【００２４】
９）被験動物が、自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを診断する方法であって、上記１）〜７）のいずれかに記載の判定方法または判定キットを用いて、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定する過程と、上記判定過程の結果から、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現していることを指標として、被験動物が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があると判定する過程と、を含む診断方法。
【００２５】
１０）被験動物が自己免疫疾患のモデル動物として有用であるか否かを判定するモデル動物の判定方法であって、上記９）に記載の診断方法により、上記被験動物が自己免疫疾患に罹患しているか否かを診断する診断過程と、上記診断過程において、被験動物が自己免疫疾患に罹患していることを指標として、上記被験動物が自己免疫疾患のモデル動物として有用であると判定する判定過程と、を備えるモデル動物の判定方法。
【００２６】
１１）抗自己免疫疾患薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、自己免疫疾患のモデル動物に被験物質を与える過程と、上記９）に記載の診断方法により、上記モデル動物の自己免疫疾患が治癒または改善されたか否かを診断する過程と、上記モデル動物の自己免疫疾患が治癒または改善していることを指標として、上記被検物質が抗自己免疫疾患薬の候補物質であると判定する過程と、を備えるスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る判定方法によれば、自己免疫疾患の発症に関与する生物学的マーカーと考えられる、末梢Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かについて、正確かつ簡便に判定することができる。末梢Ｔ細胞でＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現している場合、末梢Ｔ細胞においてランダムなＴＣＲ遺伝子の再構成が起こっていると考えられる。そして、ランダムなＴＣＲ遺伝子の再構成が起こると、末梢リンパ組織において自己抗体産生を支持するＴ細胞クローンが生み出されることになり、その結果、自己抗体が産生され、ひいては自己免疫疾患発症の原因になると考えられる。
【００２８】
したがって、本発明に係る判定方法を用いることで、被験者または被験動物が自己免疫疾患を罹患しているか否か、あるいは罹患する可能性があるか否かを客観的かつ正確に診断することができるという効果を奏する。なお、本発明に係る判定方法は、上記診断方法以外にも種々の有用な利用を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、関節リウマチ等の自己免疫疾患の発症・進展の客観的な判断に資すために、ＴＣＲ遺伝子の再構築に関与する因子（例えば、ＲＡＧ等）の発現を指標として、末梢Ｔ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構築が行われているか否かを簡便かつ正確に判定する方法およびその利用を提供するものである。そこで、以下の説明では、まず本発明に係る判定方法について説明し、続いてその利用として、判定キット、被験者または被験動物の診断方法、モデル動物の判定方法、およびスクリーニング方法について順に説明する。
【００３０】
〔１〕判定方法
本発明に係る判定方法は、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞において、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定する方法であればよく、その他の具体的な工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。
【００３１】
ここで「末梢リンパ組織」とは、免疫反応の担い手であるリンパ球の発生、分化、増殖、および機能発現の場となる器官であるリンパ組織のうち、リンパ球の抗原依存性の増殖と反応の場を意味し、二次的（末梢性）リンパ器官（secondary lymphoid tissue）とも称される。すなわち、「末梢リンパ組織」とは、リンパ球の増殖、分化の場で、免疫応答の場でない一次（中枢性）リンパ器官（primary lymphoid tissue）である胸腺、哺乳類の骨髄、鳥類のファブリキウス嚢（bursa of Fabricius）以外のリンパ組織をいうと換言できる。
【００３２】
このような「末梢リンパ組織」としては、例えば、リンパ節、脾（臓）、末梢血、腸付属リンパ組織（gut‐associated lymphoid tissue（扁桃、Peyer板など））などを挙げることができる。なかでも、後述する実施例に示すように、末梢リンパ組織として、脾臓、もしくは末梢血を用いることが好ましい。脾臓もしくは末梢血を用いることにより、簡便かつ正確に、本発明に係る判定方法を実施することができるためである。特に、末梢血を用いる場合は、生体から容易に検体を採取することができる点で、非常に有用である。
【００３３】
また、「Ｔ細胞」とは、免疫応答の活性化（ヘルパーＴ細胞）、抑制（サプレッサーＴ細胞）など免疫応答の制御、および、ウイルスが感染した細胞および癌細胞の傷害（キラーＴ細胞）や遅延型アレルギーなどに関与するリンパ球亜群をいう。
【００３４】
「ＴＣＲ遺伝子」とは、Ｔ細胞抗原受容体（T cell antigen receptor、Ｔ細胞レセプターともいう）をコードする遺伝子である。ＴＣＲは、２種類の遺伝子からコードされたポリペプチドのヘテロ二量体で、αβタイプとγδタイプとに分類される。α鎖およびγ鎖は、Ｖ、Ｊ、Ｃ領域遺伝子から構成されており、β鎖およびδ鎖は、Ｖ、Ｄ、Ｊ、Ｃ領域遺伝子からなる。なお、δ鎖遺伝子は、ＶαとＪαの遺伝子の間に介在して存在する。
【００３５】
また、上記ＴＣＲ遺伝子における、それぞれの領域遺伝子は、生殖細胞では離れて存在するが、Ｔ細胞分化の過程でＶ−Ｄ−Ｊ結合、Ｖ−Ｊ結合という遺伝子の再構成が起こり、一連の遺伝子となるが、この現象を「ＴＣＲ遺伝子の再構成」と称する。この遺伝子再構成を起こす組換えシグナル配列（ＲＳＳ；recombination signal sequence）としては、抗体遺伝子（immunoglobulin gene）の再構成の場合と同様に、ヘプタマー（７ｍｅｒ）、ノナマー（９ｍｅｒ）；１２／２３スペーサーが用いられている。さらに再構成後、その結合部位には結合部のずれやランダムヌクレオチドの挿入も起きて、Ｔ細胞レセプターは抗体遺伝子と同様あるいはそれ以上の多様性を獲得することになる。
【００３６】
「ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子」とは、上述のＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質（例えば、酵素等）または該タンパク質の断片であるポリペプチド、あるいは該タンパク質をコードする核酸、該核酸の断片であるポリヌクレオチドをいう。かかるＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質としては、例えば、ＶＤＪリコンビナーゼ（recombinase）と呼ばれる一連の酵素群が挙げられる。この「ＶＤＪリコンビナーゼ」とは、ＴＣＲ遺伝子におけるＶ、Ｄ、Ｊ領域の切断及び／又は修復（結合）を行う酵素群を意味する。この酵素群の大部分は、ＤＮＡの切断や修復に関わる、細胞に恒常的に発現している酵素群であるが、特に、ＲＡＧが好適である。
【００３７】
特に、ＲＡＧは分化段階にあるリンパ球のみに発現し、ヘプタマーとＶ，Ｄ，Ｊ，Ｃ遺伝子の間で２本鎖ＤＮＡを切断して再構成させる酵素であり、ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２が知られており、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する酵素群のなかでも最も重要な酵素である。
【００３８】
また、かかる「ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子」が、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞において、発現しているか否かを判定する具体的な方法としては、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではないが、例えば、以下の（ａ）〜（ｅ）のうちから選択される少なくとも１つの物質が発現しているか否かを判定する工程によって、好適に行うことができる。
（ａ）ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質をコードする核酸
（ｂ）（ａ）の核酸と相補的な塩基配列を有する核酸
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の断片
（ｄ）ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質
（ｅ）（ｄ）の断片
（ａ）は、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質をコードする核酸であればよい。また（ｂ）は、（ａ）の核酸と相補的な塩基配列を有する核酸であればよい。すなわち、（ａ）または（ｂ）の典型例としては、例えば、ＲＡＧ−１やＲＡＧ−２のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡが挙げられよう。また、これらのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの翻訳領域の末端及び／又は内部に調節配列やポリアデニル配列等の任意のポリヌクレオチドが含まれていてもよい。また、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質が複数の対立遺伝子によってコードされ得る場合には、全ての対立遺伝子、それらの転写産物、およびｃＤＮＡがかかる核酸に含まれる。なお、本明細書において、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
【００３９】
また、（ｃ）は、（ａ）または（ｂ）の核酸の断片であればよい。「核酸の断片」とは、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を規定する核酸または該核酸の一部を含むポリヌクレオチドを意味し、典型的には、ＲＡＧ−１やＲＡＧ−２のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの断片が挙げられる。
【００４０】
なお、このような核酸の具体例としては、例えば、ヒトのＲＡＧ−１をコードする遺伝子（accession #：NM_000448）、ヒトのＲＡＧ−２をコードする遺伝子（accession #：NM_000536）、マウスのＲＡＧ−１をコードする遺伝子（accession #：NM_009019）、ＲＡＧ−２をコードする遺伝子（accession #：NM_009020）やこれらの断片などが挙げられる。なお、ＮＣＢＩのサイトは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/LocRpt.cgi?l=7436である。
【００４１】
また、本発明に利用可能なＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、上記ヒトやマウスのＲＡＧをコードする遺伝子に限られず、各種実験動物におけるＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を好適に用いることができる。その際、どの動物のどの遺伝子を用いるかは、被験対象の生物にあわせて適宜選択可能であることはいうまでもない。
【００４２】
また（ｄ）は、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質、例えば、上述のＶＤＪリコンビナーゼと呼ばれる一連の酵素群などである。なお、かかるＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するタンパク質とは、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するポリペプチドも含む概念である。また（ｅ）は、（ｄ）のタンパク質の断片であればよく、部分タンパク質やポリペプチド、オリゴペプチドをも含む。このようなタンパク質の具体例として、例えば、ヒトのＲＡＧ−１（accession #：NP_000439）、ヒトのＲＡＧ−２（accession #：NP_000527）、マウスのＲＡＧ−１（accession #：NP_033405）、ＲＡＧ−２（accession #：NP_033406）やこれらの断片などが挙げられる。
【００４３】
また、本発明に係る判定方法では、単に末梢Ｔ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子として上記（ａ）〜（ｅ）が発現しているか否かを確認しているに過ぎないが、これ以外にも、例えば、上記（ａ）〜（ｅ）の発現量を定量的に求め、この定量値が所定の範囲内にあるか否かを判定する定量値の判定方法が本発明に含まれてもよい。
【００４４】
すなわち、本発明には、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現量を測定して定量値を求める測定工程と、上記測定工程によって得られた定量値が、所定の範囲内にあるか否かを判定する定量値の判定工程とを有する判定方法が含まれていてもよい。なお、ここでいう「所定の範囲」とは、自己免疫疾患を発症していない健常生物の末梢リンパ組織に存在するＴ細胞において、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現量の範囲、つまり正常値の範囲をいう。
【００４５】
上記定量値の判定方法では、上記測定工程によって得られた定量値が、上記所定の範囲内にあるか否かを判定する工程であればよい。すなわち、上記測定工程において所定のＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子（核酸の定量及び／又はタンパク質）の定量を行った後、その定量値が所定の範囲内にあるか否かを判定することになる。ここで「所定の範囲」として、上記正常値に基づき設定された閾値の範囲を用いてもよい。
【００４６】
上記定量値の判定方法では、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現量の定量値が所定の範囲内にある場合は、自己免疫疾患を発症していない（または発症の危険性が低い）と判定することができるであろうし、上記定量値が所定の範囲内にない場合は、自己免疫疾患を発症している（または発症の危険性が高い）と判定することができる。本定量値の判定方法によれば、単に末梢リンパ組織に存在するＴ細胞においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否かを判定する場合に比べて、より一層正確かつ客観的に自己免疫疾患の発症（または発症可能性）を診断することができよう。
【００４７】
また、本発明に係る判定方法において、上記（ａ）〜（ｃ）の核酸の発現を確認したり、これら核酸の発現量を定量したりする場合、被験対象の生物から試料を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作を行う。この試料から核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の抽出方法を使用することができる。また、ｍＲＮＡを抽出する場合には、オリゴｄＴカラムにかけてもよい。核酸の量が少ないときには、必要に応じて、核酸を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（以下、単にＰＣＲと略記する）によって行うことができる。また、以下に記載するように、増幅操作は、定量操作として、又は定量操作を兼ねて行ってもよい。
【００４８】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後には、上記（ａ）〜（ｃ）の核酸からなる群より選択される少なくとも１つの核酸を定量する。例えば、核酸の発現を確認するために、後述する実施例では、PCR-Southern hybridization（RT-PCR-Southern hybridization）、ＬＭ−ＰＣＲ（ligation-mediated PCR）法などを用いている。これ以外にも、核酸を定量するために、定量的ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮＡ消化酵素保護マッピング法、およびそれらの組み合わせを含む本分野で周知の任意の手法を使用することができる。
【００４９】
定量的ＰＣＲとしては、典型的には、放射性物質（例えば、32Ｐ等）や蛍光物質等でラベルされたヌクレオチドを用いて増幅産物を内部標識する方法を使用することができる。また、放射性物質や蛍光物質でラベルされたプライマーを用いて増幅産物をエンドラベルする方法も使用し得る。標識された増幅産物は、ゲル濾過、アルコール沈澱、トリクロロ酢酸沈澱、グラスフィルター等への物理的吸着を含む周知の方法を用いて、遊離の放射性（または蛍光物質を付加した）ヌクレオチドまたはプライマーと分離することができる。
【００５０】
続いて、放射性物質を用いた場合は、電気泳動やハイブリダイゼーションを行って、又は行わずに、液体シンチレーション、オートラジオグラフィー、イメージングプレート（バイオイメージングアナライザー（ＢＡＳ；富士写真フィルム）等）等の操作によって、増幅産物を定量する。放射性物質の代わりに、蛍光物質や発光物質を標識物質として使用する場合は、分光蛍光光度計、蛍光用マイクロプレートリーダー、ＣＣＤカメラ等を用いて増幅産物を定量してもよい。
【００５１】
また、上記ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子がｍＲＮＡである場合、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う工程が含まれていてもよい。定量的ＲＴ−ＰＣＲとして、いわゆるリアルタイムＰＣＲを行うことも可能である。リアルタイムＰＣＲとしては、インカレーター法、TaqMan プローブ法、サイクリングプローブ法等の従来公知の手法を用いることができる。
【００５２】
「インカレーター法」とは、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター：SYBRR Green I 、EtBr など）をＰＣＲ反応系に加える方法である。インターカレーターはＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発するため、この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターできる。
【００５３】
また、「TaqMan プローブ法」とは、５’末端を蛍光物質（ＦＡＭなど）で、３’末端をクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡなど）で修飾したオリゴヌクレオチド（TaqMan プローブ）をＰＣＲ反応系に加える方法である。TaqMan プローブは、アニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。そして、伸長反応ステップのときに、TaqDNA ポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqMan プローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられる。
【００５４】
また「サイクリングプローブ法」とは、ＲＮＡ（あるいはＲＮＡとＤＮＡのキメラ）プローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の特定配列を効率良く検出することができる。プローブは５’端が蛍光物質（リポーター）で、３’端が蛍光を消光する物質（クエンチャー物質）で標識されている。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより強い蛍光を発することはないが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にRNaseH によりＲＮＡ部分が切断されると、強い蛍光を発するようになる。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の量をモニターすることができる。
【００５５】
なお、上記各方法で用いる各種プローブやＰＣＲ用のプライマーは、従来公知の方法にて、好適な領域を選択して任意に作製することができ、特に限定されるものではない。
【００５６】
また、定量的ＰＣＲ等を行わない場合、最も一般的には、核酸を含む試料を電気泳動にかけ、サザンブロットやノーザンブロットを行った後、検出可能な標識物質でラベルされたプローブを用いて定量することも可能である。また、多種類の核酸を同時に定量する場合には、これらの手法と共に、又はこれらの手法に代えて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイを用いてもよい。核酸の定量に代えて、又は核酸の定量と共に、ｍＲＮＡ（遺伝子）から産生されるタンパク質を定量することにより、遺伝子の発現量を間接的に推定してもよい。本発明の判定方法を利用して、自己免疫疾患を診断するには、核酸よりも、核酸がコードするタンパク質の発現を確認したり、発現量を定量したりすることが有用である場合もあろう。
【００５７】
一方、本測定工程において、上記（ｄ）、（ｅ）のタンパク質またはその断片（以下、単にタンパク質等と称する）の発現を確認したり、これらの発現量を定量したりする場合、被験対象の生物から試料を採取した後、通常は、該試料からタンパク質等を抽出する操作を行う。このタンパク質等を試料（例えば、組織など）から抽出する方法、およびタンパク質を定量する方法としては、本分野において周知である任意の方法を使用することができる。例えば、タンパク質の発現を確認したり、発現量を定量したりする場合には、ウエスタンブロット法、固相酵素免疫検定法を含む酵素免疫検定法、免疫細胞化学法、免疫組織化学法を使用し得る。なお、本明細書では、最も一般的な操作の概略を例示したにすぎないので、上記方法の様々な変法や全く異なる方法も使用できる。現在、電気泳動装置やＰＣＲ装置等を組み合わせて、核酸の抽出、増幅、分離、定量を全自動で行う装置が市販されているので、このような装置を用いることも好ましい。このような装置を用いれば、通常の臨床検査と同じように、自己免疫疾患の診断を行うことが可能となる。
【００５８】
また、本発明に係る判定方法の実施対象の生物は、末梢リンパ組織を有する全ての動物が対象となり、特に限定されるものではない。つまり、各種実験動物だけでなく、ヒト（人間）も本判定方法の対象生物に含まれることはいうまでもない。
【００５９】
これまで、上述のＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子は、中枢リンパ組織においてのみ発現していると考えられていた。しかし、後述する実施例に示すように、本発明者らは、自己抗体を産生し自己免疫疾患を発症している遷延感作モデルマウスにおいて、該マウスが自己抗体を産生する時期と一致して、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与するＲＡＧが末梢リンパ組織でも発現していることをはじめて見出した。末梢Ｔ細胞でのＲＡＧの発現が確認されたことにより、自己免疫疾患を発症している遷延感作モデルマウスでは、ＴＣＲ遺伝子の再構成が末梢リンパ組織でも起こっている可能性が示唆された。このことは、自己免疫疾患を発症している生物では、末梢リンパ組織においてランダムなＴＣＲ遺伝子再構成が起こり、自己抗体産生を支持するＴ細胞クローンが生成され、その結果、自己抗体が産生され、ひいては自己免疫疾患の発症の原因となる可能性を示唆するものである。つまり、末梢リンパ組織でのＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現は、自己免疫疾患を発症する生物に特異的に認められる現象であって、健常生物ではかかる末梢リンパ組織でのＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現は起こっていないと考えられる。
【００６０】
したがって、本発明に係る判定方法を実施することによって、末梢リンパ組織に存在するＴ細胞におけるＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現を検出することにより、自己免疫疾患の発症または発症可能性を客観的に診断することができる。
【００６１】
なお、本発明の主題は、末梢Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子の発現を客観的に判定する方法を提供することに存するのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の抽出操作、検出操作、および解析操作に存するのではない。したがって、上記各操作以外の操作を用いた解析方法も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００６２】
〔２〕利用
本発明に係る判定方法は、上述の利点を有するため、種々の利用法が本発明には含まれる。以下、本発明に係る判定方法の利用法として判定キット、被験者または被験動物の診断方法、モデル動物の判定方法、およびスクリーニング方法について順に説明する。
【００６３】
〔２−１〕判定キット
本発明に係る判定キットは、上記〔１〕欄で説明した判定方法を実施するためのものであればよく、これに含まれる具体的な構成、材料、機器等は、特に限定されるものではない。具体的には、上記判定方法の各工程を実施するための物が含まれていればよい。例えば、被験対象生物から試料（臓器や細胞等）を採取する場合、組織や細胞等を採取するための従来公知の医療機器や理化学機器等が挙げられる。また、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現を確認する場合は、上記特定の核酸やタンパク質等を実施するために必要な各種試薬や実験器具等が挙げられよう。
【００６４】
上記の構成によれば、簡便かつ確実に本発明に係る判定方法を実施することができる。このため、本判定キットを用いて、自己免疫疾患の判定（診断）を行うこともできる。
【００６５】
また、本判定キットの具体的な構成としては、例えば、上記〔１〕欄で説明した（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸を増幅させたり、定量的に検出したりするためのＰＣＲ用プライマー、プローブや各種試薬類が挙げられる。本明細書でいう「試薬類」とは、酵素や試薬だけでなく、各種測定機器や培養機器等も含まれる広い概念であり、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、サーマルサイクラー等のＰＣＲ機器などを挙げることができよう。
【００６６】
また、上記〔１〕欄で説明した（ｄ）、（ｅ）のタンパク質等を検出する場合は、ウエスタンブロット法、固相酵素免疫検定法を含む酵素免疫検定法、免疫細胞化学法、免疫組織化学法等の従来公知の方法に使用し得る各種試薬類（抗体、発色または呈色反応を触媒する酵素、専用ウェルを備えたプレート、振とう装置等）が含まれていることが好ましい。
【００６７】
〔２−２〕診断方法
また、本発明には、被験対象の生物が自己免疫疾患であるか否か、または被験対象の生物が自己免疫疾患に罹患する可能性（発症可能性）があるか否かを診断する方法も含まれる。本明細書でいう「発症可能性」とは、自己免疫疾患が発生する危険度を示す指標をいい、発症可能性が高ければそれだけ自己免疫疾患に罹患しやすく、逆に発症可能性が低ければ自己免疫疾患に罹患し難いということを示すものである。
【００６８】
本診断方法は、上記の判定方法または判定キットを用いていればよく、その他の具体的な構成、条件等は特に限定されない。例えば、自己免疫疾患に罹患していない生物（健常生物）における末梢リンパ組織のＴ細胞ではＲＡＧ等のＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現が認められない場合、被験対象の生物における末梢リンパ組織のＴ細胞においてＲＡＧ等のＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現が認められることを指標として、該被験対象の生物が自己免疫疾患を発症している、または発症可能性が高いと診断することができる。
【００６９】
また、健常生物における末梢リンパ組織のＴ細胞でもＲＡＧ等のＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現が認められるが、自己免疫疾患を発症している生物におけるその発現量と有意な差が認められる場合、被験対象の生物における末梢リンパ組織のＴ細胞においてＲＡＧ等のＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現量の定量値を求めて、その定量値が所定の範囲（健常生物の発現量の範囲、すなわち正常値の範囲）内にないことを指標として、該被験対象の生物が自己免疫疾患に罹患しているか否かを判定することもできよう。より具体的には、所定の核酸及び／又はタンパク質の定量値を指標として診断する場合、正常値を参考にして適切な閾値を設定し、該閾値を上回っているか、又は下回っていれば、自己免疫疾患を発症している可能性が高いと診断できる。すなわち、自己免疫疾患の患者内で上記ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現量が増加する場合には、設定した閾値を上回っていれば、該患者は自己免疫疾患である可能性が高いと判定し得るであろう。
【００７０】
したがって、本診断方法によれば、簡便かつ正確に被験対象の生物が自己免疫疾患であるか否か、または被験対象の生物が自己免疫疾患に罹患する可能性があるか否かを診断することができる。また、本診断方法は、被験者に対する診断方法と、被験動物に対する診断方法に分けることができる。本明細書において、「被験者」とはヒトであり、特に本発明の方法等の対象である患者を意味する。本明細書において、「被験動物」とはヒト以外の動物であり、特に実験動物として好適なマウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ、サル、チンパンジー等を意味する。
【００７１】
ヒトに対する診断方法の有用性は述べるまでもなく、各種自己免疫疾患の診断に適用することが可能である。また、被験動物に対する診断方法は、例えば、自己免疫疾患の治療薬を開発する際などの動物実験やスクリーニングの際などに非常に有用であろう。
【００７２】
また、本発明に係る診断方法で診断できる「自己免疫疾患」には、上述したように、臓器特異性のある疾患と、特異性のない疾患の２つが含まれる。臓器特異的自己免疫疾患には、橋本甲状腺炎（慢性甲状腺炎）、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症（甲状腺剤中毒症）、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎（自己免疫性萎縮性胃炎）、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症（発作性ヘモグロビン尿症）、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群がある。臓器非特異的自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強（鞏）皮症、混合結合組織病がある。これらの中でも、特に、関節リウマチ（ＲＡ）の診断に用いることが好適である。なぜなら、上述したように、ＲＡは、時には生命をも脅かす重篤な疾患であり、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになるためである。さらに、後述する実施例に示すように、本発明は、ＲＡに関する研究から見出された知見に基づき、完成されたものだからでもある。
【００７３】
〔２−３〕モデル動物の判定方法、スクリーニング方法
本発明の判定方法や判定キットは、ヒトを除く自己免疫疾患のモデル動物の有用性を判定する方法、およびこのようなモデル動物を用いた薬物スクリーニングにおいて、薬物の有効性を判定する方法に応用し得る。すなわち、自己免疫疾患のモデル動物の有用性を判定する場合には、前記判定方法や診断方法と同様に、末梢リンパ組織においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否か、またはその発現量に基づいて、被験動物が自己免疫疾患を発症しているか否かを判断し、該動物が自己免疫疾患を発症していれば、自己免疫疾患のモデル動物として有用であると判定することができる。
【００７４】
ここでいう「被験動物」には、マウス、ラット、及びサルが含まれるが、ヒト以外の動物であれば、任意の動物が「被験動物」になり得る。さらに、このようなモデル動物に、抗自己免疫疾患薬の候補物質を投与した後、上記のごとく末梢リンパ組織においてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子が発現しているか否か、またはその発現量を定量し、自己免疫疾患が治癒または改善されていれば、前記候補物質は抗自己免疫疾患作用を有していると判断し得る。すなわち、本発明の判定方法を利用すれば、抗自己免疫疾患薬の候補物質を容易かつ正確にスクリーニングすることができる。なお、ここでいう「抗自己免疫疾患薬の候補物質」は、試験者が所望する任意の物質であり得る。
【００７５】
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７６】
（１）ＴＣＲレパトアの解析
関節リウマチ（ＲＡ）の診断に用いられるリウマチ因子（ＲＦ）について検討した。より詳細には、宿主に対して慢性的に抗原を暴露することが、ＲＦの誘導に必須か否かについて検討した。ＲＦの誘導のメカニズムについてより検討すべく、まず、スーパー抗原であるＳＥＢ（Staphylococcal enterotoxin B）を繰り返しＢＡＬＢ／ｃマウスに投与し、自己抗体を産生させた後、該マウス脾臓における末梢Ｔ細胞のＶβ鎖を解析した。具体的には、ＣＤＲ３スペクトラタイピング技術（CDR3 spectratyping technique）を用いて、ＳＥＢを繰り返し投与したマウス脾臓より採取したＴ細胞におけるＴＣＲレパトア（TCR repertoire）の解析を行った。
【００７７】
ＣＤＲ３スペクトラタイピング技術は、Pannetier, C. et al. The size of the CDR3 hypervariable regions of the murine T- cell receptor chains vary as function of the recombined germ-line segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:4319-4323, 1993を参照して行うことができる。
【００７８】
該文献に基づくＴＣＲレパトアの多様性を解析する方法の原理について、図１を用いて簡単に説明する。
【００７９】
まず、図１に示すように、マウス脾臓から採取したＣＤ４＋細胞のＲＮＡからｃＤＮＡを調製した後、このｃＤＮＡをＣβ鎖特異的プライマーとＶβ８．３鎖特異的プライマーとを用いてＰＣＲにて増幅する。
【００８０】
次に、ＰＣＲ増幅産物に対して、蛍光ラベルしたＪβ鎖特異的プライマー（図１中、星印のプライマー）を用いて開始される鎖長延長反応を行う。
【００８１】
続いて、蛍光ラベルされたＰＣＲ産物をシークエンスゲルにて電気泳動し、解析する。ノーマルのＢＡＬＢ／ｃマウスでは、ＣＤＲ３のサイズパターンは、図１の右下パネルに示すように、ガウス様形状に分布する。
【００８２】
上記の原理に基づき、具体的には、以下の方法により、ＴＣＲレパトアの多様性を解析した。
【００８３】
まず、ＰＢＳを８回繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウス、ＳＥＢを２回繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウス、ＳＥＢを８回繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのそれぞれから脾臓細胞および胸腺細胞を採取した後、これらの脾臓細胞および胸腺細胞のそれぞれからtotal ＲＮＡを抽出した。
【００８４】
１μｇのtotal ＲＮＡからmurine leukemia virus reverse transcriptaseを用いた逆転写反応を行って得たｃＤＮＡをテンプレートとして、今回はＴＣＲＶｂ８．１、８．２、８．３遺伝子にそれぞれ特異的なプライマー（Primer TCRVb8.1、Primer TCRVb8.2、Primer TCRVb8.3）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＴＣＲ遺伝子転写産物を増幅した。なお、プライマーの配列は以下の通り。
・Primer TCRVb8.1: 5'-CATTACTCATATGTCGCTGAC-3' （配列番号１）
・Primer TCRVb8.2: 5'-CATTATTCATATGGTGCTGGC-3' （配列番号２）
・Primer TCRVb8.3: 5'-TGCTGGCAACCTTCGAATAGGA-3' （配列番号３）
上述のＰＣＲ産物をテンプレートとして、ＴＥＴ標識ＴＣＲＪβ鎖特異的蛍光プライマーを用いたrun-off reactionを行い、その産物をアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、DNA sequencerとGeneScan software (Perkin-Elmer Applied Biosystems)を用いて解析した。なお、今回用いたプライマーの配列は以下の通り。
・Primer TCRJb1.1： 5'-ACTGTGAGTCTGGTTCCTTTACC-3' （配列番号４）
・Primer TCRJb1.3： 5'-CTTCCTTCTCCAAAATAGAGC-3' （配列番号５）
・Primer TCRJb2.4： 5'-GTGCCCGCACCAAAGTACAAG-3' （配列番号６）
その結果を図２に示す。図中、「spleen」は脾臓から採取した細胞を示し、「thymus」は胸腺から採取した細胞を示す。また、「PBSx8」はＰＢＳを繰り返し８回投与した場合、「SEBx2」はＳＥＢを２回投与した場合、「SEBx8」はＳＥＢを繰り返し８回投与した場合を示す。
【００８５】
この図２に示すように、ＰＢＳを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓（spleen）から採取したＣＤ４＋細胞におけるＣＤＲ３の長さの分布は、典型的なガウス形状であり、典型的な多様性を有し偏りのないＴＣＲレパトアであることがわかる。また、ＳＥＢを２回投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から採取したＣＤ４＋細胞におけるＣＤＲ３の長さの分布もまた、典型的なガウス形状であり、典型的な多様性を有し偏りのないＴＣＲレパトアであることがわかる。一方、ＳＥＢを２回投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から採取したＣＤ４＋細胞におけるＣＤＲ３の長さの分布は、図２中の円で囲んだ領域に示すように、非常に偏り（歪み）が認められる。ここで得られたＶβ鎖とＪβ鎖との組み合わせでは、偏りのある分布とＲＦの生産の程度とは、相関が認められなかった。対照的に、胸腺（thymus）から採取したＣＤ４＋細胞では、ＣＤＲ３の長さの分布に偏りが認められなかった。このことは、ＳＥＢを繰り返し投与することが、胸腺におけるＴ細胞の選択に影響を与えないことを示している。
【００８６】
この結果より、ＳＥＢを繰り返し投与し、自己抗体を産生させた自己免疫疾患モデルマウスにおいて、末梢リンパ組織である脾臓のＴ細胞では、ＴＣＲ遺伝子の再構成が起こっていると考えられた。
【００８７】
（２）ＲＡＧの検討
上記（１）で見られたＴＣＲレパトアの分布に偏りがあるという現象について、より詳細な検討を行うべく、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子であるＲＡＧおよびＴｄＴについて解析した。末梢Ｔ細胞においてＴＣＲレパトアに変化が生じたのは、ＴＣＲ遺伝子再構成が起こっているためと考えられ、その要因としてＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子の発現が考えられたためである。具体的には、以下のように、PCR-Southern hybridization法により、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子であるＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２について、それぞれｍＲＮＡ発現の検出を行った。
【００８８】
より詳細には、まず、ＰＢＳを８回繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウス、ＳＥＢを８回繰り返し投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのそれぞれから脾臓細胞および胸腺細胞を採取した後、これらの脾臓細胞および胸腺細胞のそれぞれからtotal ＲＮＡを抽出した。そして、１μｇのtotal ＲＮＡからmurine leukemia virus reverse transcriptaseを用いた逆転写反応を行って得たｃＤＮＡをテンプレートとして、ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２それぞれに特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。プライマーの塩基配列は以下の通り。アニーリングはいずれも５９℃で行った。
・Primer RAG-1 forward： 5'-CCAAGCTGCAGACATTCTAGCACTC-3' （配列番号７）
・Primer RAG-1 reverse： 5'-CAACATCTGCCTTCACGTCGATCC-3' （配列番号８）
・Primer RAG-2 forward： 5'-CACATCCACAAGCAGGAAGTACAC-3' （配列番号９）
・Primer RAG-2 reverse： 5'-GGTTCAGGGACATCTCCTACTAAG-3' （配列番号１０）
上述のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ナイロンメンブレンに転写した後、Gene Images CDP-star labeling & detection module (Roche)を用いたSouthern hybridizationによって、ＲＡＧ−１／２特異的なバンドを検出した。Southern hybridizationに用いたプローブは以下の通りである。ハイブリダイゼーション反応はいずれも５５℃で行った。
・Probe RAG-1： 5'-AACATGGCCTCCTTGCCGTCTACCCT-3' （配列番号１１）
・Probe RAG-2： 5'-GCAATCTTCTCTAAAGATTCCTGCTACCT-3' （配列番号１２）
この方法を用いると、ＲＡＧ−１／２の発現は、それぞれ５６３ｂｐ、４７２ｂｐのＰＣＲ産物として確認することができる。なお、ＲＡＧ−１／２がＴ細胞、Ｂ細胞のどちらで発現しているか検討するためには、脾臓細胞を抗Ｔｈｙ１．２モノクローナル抗体または抗Ｂ２２０モノクローナル抗体および補体と反応させて、脾臓細胞からそれぞれＴ、Ｂ細胞を除去したのちに抽出したtotal ＲＮＡを用いてＲＡＧ−１／２の発現を検討した。
【００８９】
その結果を図３に示す。図中、「whole」は脾臓細胞全体を、「Thy1.2(-)」は抗Ｔｈｙ１．２モノクローナル抗体によりＴ細胞を除去したＢ細胞のみを、「B220(-)」は抗Ｂ２２０モノクローナル抗体および補体によりＢ細胞を除去したＴ細胞のみを調べた結果を示す。
【００９０】
この図３に示すように、ＳＥＢを繰り返し８回投与したマウスから採取した脾臓細胞全体（lane3）とＴ細胞（lane5）では、ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２が発現していることがわかった。また、Ｂ細胞のみ（lane4）、およびＰＢＳを投与したマウスより採取した脾臓細胞（lane2）ではＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２の発現は認められなかった。
【００９１】
この結果より、ＳＥＢを繰り返し投与し、自己抗体を産生させた自己免疫疾患モデルマウスにおいて、末梢リンパ組織である脾臓のＴ細胞では、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２が発現しており、その結果としてＴＣＲ遺伝子の再構成が起こっていると考えられた。
【００９２】
（３）ＲＡＧ機能の検討
次に、ＬＭ−ＰＣＲ（ligation-mediated PCR）法を用いてＲＡＧの機能を検討した。図４に従いＬＭ−ＰＣＲ法を用いたＲＡＧ機能解析の概略を模式的に説明する。
【００９３】
図４に示すように、ＴＣＲ遺伝子断片の末端にはヘプタマー（heptamaer）とノナマー（nonamer）との間にスペーサー（spacer）が挟まれて形成される組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を有する。ＲＡＧはゲノム上のＴＣＲ遺伝子断片の末端にある、このＲＳＳを認識してゲノムＤＮＡを切断する機能を有する。そのため、ＲＡＧが機能すると末端にＲＳＳを含む２本鎖ＤＮＡ断端が生じ、このＤＮＡ断端をＬＭ−ＰＣＲ法によって検出することで、ＲＡＧによってＴＣＲ遺伝子の再構成が誘導されていることを証明することができる。なお、本発明者らは、これまでの実験において、ＴＣＲＶ２断片およびＴＣＲＪ１３断片のＲＳＳを含む遺伝子断端をＬＭ−ＰＣＲ法によって検出している。具体的には、以下のように行った。
【００９４】
まず、ＢＷ−１ＨＲとＢＷ−２とを氷の上でアニールさせてＢＷリンカーとした。ＢＷリンカーと脾臓細胞または胸腺細胞から抽出したゲノムＤＮＡをT4 ligaseを用いてライゲーションさせた。そのライゲーション産物を、ＴＣＲＡＶ２およびＴＣＲＡＪ１３特異的なプライマーとＢＷ−１ＨＲを用いた２段階ＰＣＲのテンプレートとして用いた。なお、ＢＷリンカーとＴＣＲＡＶ２およびＴＣＲＡＪ１３特異的なプライマーの配列は以下の通りである。
・BW-1HR ：5'-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC-3' （配列番号１３）
・BW-2 ：5'-GAATTCAGATC-3' （配列番号１４）
・Primer TCRAV2 first： 5'-AGATGATACAGAGACAAAATGTGAGC-3' （配列番号１５）
・Primer TCRAV2 nested： 5'-TATTGTGGATGCTAACAAGTGCTTTC-3' （配列番号１６）
・Primer TCRAJ13 first： 5'-AAGAATTAATGGTTCATGCAGAC-3' （配列番号１７）
・Primer TCRAJ13 nested： 5'-CTCAGCTGAAACACATCCAGGTC-3' （配列番号１８）
上述のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ナイロンメンブレンに転写した後、Gene Images CDP-star labeling & detection module (Roche)を用いたSouthern hybridizationによって、各遺伝子断片特異的なバンドを検出した。Southern hybridizationに用いたプローブは以下の通りである。なお、ハイブリダイゼーション反応はいずれも５５℃で行った。
・Probe TCRAV2： 5'-TAACATAAGAATGCACGCTTACACC-3' （配列番号１９）
・Probe TCRAJ13： 5'-GAAAGAAGCCATTTTGTAAAGACCTCACT-3' （配列番号２０）
この方法を用いると、ＴＣＲＡＶ２、ＴＣＲＡＪ１３遺伝子断端は、それぞれ３８０ｂｐ、４００ｂｐのＰＣＲ産物として確認することができる。ＴＣＲ遺伝子の配列及び名称は、ImMmnoGeneTics (IMGT) database (http://imgt.cnusc.fr)を参照した。
【００９５】
その結果を図５に示す。図５最上部のパネルにはＴＣＲαＶ２遺伝子断片を検出した結果、真中のパネルにはＴＣＲαＪ１３遺伝子断片を検出した結果、最下部のパネルにはＴＣＲαの定常領域の遺伝子断片を検出した結果を示す。
【００９６】
この図５の矢印で示すように、ＰＢＳを８回投与したマウス脾臓より採取した細胞では、ＴＣＲαＶ２遺伝子断片およびＴＣＲαＪ１３遺伝子断片は検出されず、ＴＣＲαの定常領域の遺伝子断片のみが検出されたのに対して、ＳＥＢを８回投与したマウス脾臓より採取した細胞では、ＴＣＲαＶ２遺伝子断片、ＴＣＲαＪ１３遺伝子断片、ＴＣＲαの定常領域の遺伝子断片のそれぞれが検出された。
【００９７】
この結果より、ＳＥＢを繰り返し投与し、自己抗体を産生させた自己免疫疾患モデルマウスにおいて、末梢リンパ組織である脾臓のＴ細胞では、ＴＣＲ遺伝子の再構成に関与する因子ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２が発現し有効に機能していることがわかった。そして、その結果としてＴＣＲ遺伝子の再構成が起こっていると考えられた。
【００９８】
以上の結果をまとめると、遷延感作モデルを用いた自己免疫疾患発症機序の解析を行ったところ、マウスが自己抗体を産生する時期と一致して、マウスの末梢Ｔ細胞でＲＡＧが発現していることを見いだした。本来、ＲＡＧは胸腺及び骨髄といった中枢リンパ組織においてのみ発現するとされていたが、本発明者らは、自己抗体を産生する遷延感作マウスにおいては末梢リンパ組織（脾臓）においてもＲＡＧが発現していることを見いだした。末梢で発現したＲＡＧの働きによってランダムなＴＣＲ遺伝子再構成が起こり、自己抗体産生を支持するＴ細胞クローンが生成されることが、自己抗体産生、ひいては自己免疫疾患発症の原因となる可能性が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明に係る判定方法およびその利用は、関節リウマチをはじめとした自己免疫疾患の発症のメカニズムの解明に有効に利用することができると考えられる。また、本発明によれば、関節リウマチ等の自己免疫疾患の発症またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に行うことができる。それゆえ、本発明は自己免疫疾患の予防および治療の分野において、高い利用可能性を有しているといえる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本実施例において行ったＴＣＲレパトアの多様性を解析する方法の原理を模式的に説明する図である。
【図２】本実施例において行ったＴＣＲレパトアの多様性を解析した結果を示す図である。
【図３】本実施例におけるPCR-Southern hybridization法によるＲＡＧのｍＲＮＡ発現を検出した結果を示す図である。
【図４】本実施例におけるＬＭ−ＰＣＲ法を用いたＲＡＧ機能解析の概略を模式的に説明する図である。
【図５】本実施例におけるＬＭ−ＰＣＲ法を用いたＲＡＧ機能解析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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