(57)【要約】【課題】少サンプル量で短時間でポリマーの官能基の測定が可能な方法の提供。【解決手段】官能基として水酸基又は／及びアミノ基を含むポリマー粒子の該官能基と蛍光物質とを反応させ、得られた粒子の蛍光量を測定することによって、粒子の官能基量を測定する定量方法であって、蛍光物質と粒子の総官能基量のモル比（蛍光物質：粒子の総官能基量）が１：１から１：１００であることを特徴とするポリマー粒子の官能基定量方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能基として水酸基又は／及びアミノ基を含むポリマー粒子の該官能基と蛍光物質とを反応させ、得られた粒子の蛍光量を測定することによって、粒子の官能基量を測定する定量方法であって、蛍光物質と粒子の総官能基量のモル比（蛍光物質：粒子の総官能基量）が１：１から１：１００であることを特徴とするポリマー粒子の官能基定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、診断薬および医薬品担体、クロマトグラフィ担体、粘性調整剤、樹脂成形材料、塗料添加剤、架橋／硬化剤および化粧品添加剤等の用途に好適に使用可能な官能基を有するポリマー粒子の官能基の定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
粒子径が０．０１〜５０μｍの範囲にあるポリマー粒子は、診断薬および医薬品担体、クロマトグラフィ担体、コンビナトリアルケミストリー用担体、粘性調整剤、樹脂成形材料、塗料添加剤、架橋／硬化剤および化粧品添加剤のような用途に有用であり、その官能基量を明確にすることは粒子の特性を管理する上で重要である。
【０００３】
従来用いられているポリマー粒子の官能基量の定量法としては、例えば、ＪＩＳ規格Ｋ００７０に記載されているような高分子の酸価や水酸基価の測定方法、Ｋ７２４５に記載されているプラスチックのアミノ基量の測定方法が挙げられる。
しかし、これらの方法は高分子材料一般に用いることを想定していることから、測定に必要な試料用が多量に必要であったり、測定に時間と手間がかかるという問題があった。
【０００４】
また、非特許文献１には、粒子表面を赤外分光法分析による吸収ピークからの分析や、粒子と試薬との反応量をブランク試験との差分からもとめるような紫外可視光分析が記載されている。
しかし、これらの分析方法は、官能基量を直接定量したものではないことから、同じ官能基量であっても実際の特性が異なったり、試料の表面状態によって得られる値が異なることがあるという問題があった。
一方、フローサイトメーターは、粒子の蛍光強度、散乱強度、および個数を測定できる機器でありこれを用いた測定としては、ラテックス粒子の凝集状態の測定（特許文献１参照）、藻類のシストの定量法（特許文献２参照）及び汚泥中のリン蓄積微生物の定量法（特許文献３参照）が挙げられる。
しかし、これらの方法は、粒子の蛍光の強度を定性的に比較するものであり、測定としては粒子の個数のカウントに重点を置いていることから、粒子の官能基量の定量に応用できるものではなかった。
このように粒子の官能基量を測定するには従来の測定法には課題があった。
【０００５】
【特許文献１】
特開平５−１０７２４９号公報
【特許文献２】
特開平７−２６５０９６号公報
【特許文献３】
特開平９−２５２７９９号公報
【非特許文献１】
有機合成化学協会誌Ｖｏｌ．６０  Ｎｏ．５  ４５４〜４６３頁
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、従来のポリマー粒子の官能基の定量法にあるような工程と時間を有することなく、操作が容易で再現性のよい粒子の官能基量の測定法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、官能基として水酸基又は／及びアミノ基を含むポリマー粒子の該官能基と蛍光物質とを反応させ、得られた粒子の蛍光量を測定することによって、粒子の官能基量を測定する定量方法を見出し、さらに、本発明者らは、意外にも、蛍光物質と粒子の総官能基量のモル比が、蛍光物質が過剰ではなく、逆に蛍光物質：粒子の総官能基量が１：１から１：１００の範囲とすることにより、定量できることを見出し本発明を完成した。
即ち、本発明は次の方法を提供するものである。
【０００８】
〈１〉官能基として水酸基又は／及びアミノ基を含むポリマー粒子の該官能基と蛍光物質とを反応させ、得られた粒子の蛍光量を測定することによって、粒子の官能基量を測定する定量方法であって、蛍光物質と粒子の総官能基量のモル比（蛍光物質：粒子の総官能基量）が１：１から１：１００であることを特徴とする官能基定量方法。
【０００９】
〈２〉  粒子の蛍光量の測定方法がフローサイトメーターを用いることを特徴とする〈１〉記載のポリマー粒子の官能基定量方法  。
【００１０】
〈３〉ポリマー粒子が架橋ポリマー粒子である〈１〉記載のポリマー粒子の官能基定量方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成を詳しく説明する。
＜ポリマー粒子＞
本発明に用いる水酸基又は／及びアミノ基を含むポリマー粒子は、該官能基が粒子表面もしくは粒子内部に存在しているものであって、その製造法としては例えば、官能基を有する単量体をあらかじめ媒体中で懸濁重合し粒子化する方法、ポリマー粒子を構成する母材粒子に官能基を導入すること等によって得ることが可能であるがこれらに限定されるものではない。
【００１２】
ポリマー粒子を構成する母材粒子は、架橋ポリマー粒子が好ましく、たとえば（メタ）アクリレート重合体を有する架橋ポリマー粒子が好ましく、具体的にはｔ−ブチル（メタ）アクリレート、２−メチル−２−ブチル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、メトキシベンジル（メタ）アクリレート、エトキシベンジル（メタ）アクリレート、ジメトキシベンジル（メタ）アクリレート、メチルベンジル（メタ）アクリレート、ジメチルベンジル（メタ）アクリレート、エチルベンジル（メタ）アクリレート、４−フルオロベンジル（メタ）アクリレートなどの重合体が架橋構造体を形成しているポリマー粒子等が挙げられる。この中でも特にｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレートの重合体が単量体の入手性、価格、反応性の点で好ましい。
【００１３】
架橋ポリマー粒子は単量体の重合体の他に、他の単量体を共重合させてもよい。粒子化には公知の方法が利用できる。すなわち、懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法、シード重合法が好適に用いられる。さらに膜乳化法と知られる乳化方法を使って懸濁重合することもできる。
【００１４】
粒子に官能基を導入する方法としては、特に限定されず、種々の公知の方法を用いることが可能である。例えば、水酸基では、（１）水酸基に変換しうる官能基を有する単量体をあらかじめ水性媒体中で懸濁重合し粒子化した後、該官能基を水酸基に変換する方法、（２）反応性官能基を有する架橋ポリマー粒子をあらかじめ作製し、該反応性官能基と反応して粒子に結合する水酸基含有化合物とを反応させることによって水酸基を粒子に導入する方法、さらに、（３）あらかじめｔ−ブチル（メタ）アクリレート重合体のごときエステル交換可能な官能基を有するポリマーからなる粒子を作製し、テトラ−ｎ−プロポキシチタンのようなエステル交換触媒を利用してエチレングリコールのごときジオールを反応させ水酸基を粒子に導入する方法が挙げられる。
【００１５】
同様に、アミノ基の導入方法としては、（１）反応性官能基を有する架橋ポリマー粒子をあらかじめ作製し該反応性官能基と反応して粒子に結合するアミノ基含有化合物とを反応させることによってアミノ基を粒子に導入する方法、さらには、（２）ｔ−ブチル（メタ）アクリレート重合体のごときエステル交換可能な官能基を有するポリマーからなる粒子を作製し、テトラ−ｎ−プロポキシチタンのようなエステル交換触媒を利用して１，６−ジアミノヘキサンのごときジアミンを反応させアミノ基を粒子に導入する方法も挙げられる。
【００１６】
本発明における官能基を有するポリマー粒子の大きさは、粒子径で０．５から１００μｍの範囲が好ましく、特に１から５０μｍの範囲が好ましい。粒子の大きさがこの範囲より小さくなるとフローサイトメーターで検出が難しくなることから好ましくない。また、この範囲より大きくなると粒子がフローサイトメーターの検出ノズルを通過することが出来なくなるため好ましくない。
【００１７】
＜蛍光物質＞
本発明に用いる蛍光物質は、ポリマー粒子に存在する水酸基又は／及びアミノ基との反応が可能なものである。すなわち、蛍光物質は、構造中に水酸基又は／及びアミノ基と反応可能な官能基を有しているものであり、該官能基をしては、イソチオシアン酸基、ジクロロトリアジン基、スクシンイミド基、カルボキシル基等が挙げられる。蛍光物質としては、具体的にはイソチオシアン酸フルオレセイン、ジクロロトリアジルアミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエーテル、カルボキシフルオレセイン等モレキュラープローブ社から販売されている５−ＤＴＡＦ、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＳＦＸ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記に記載したような官能基を有していないが、９−アントロイルニトリル、ダンシルアミノフェニルホウ酸等の化合物は反応条件によっては粒子の官能基との反応が可能であるため、これらも用いることが出来る。
【００１８】
＜定量法＞
蛍光物質と粒子の官能基の反応時の仕込みモル比は１：１から１：１００の範囲であり、好ましくは１：２から１：２０の範囲である。一般的に機器分析では官能基と反応する色素量は色素量を１から数倍当量に仕込むが、本発明の場合、仕込み時の蛍光物質量が粒子の官能基量のモル比１：１より大きくなると反応溶液中で色素が過剰になり析出したり、必要以上の蛍光物質が粒子中に取り込まれてしまうので好ましくない。また、蛍光物質量が粒子の官能基量のモル比１：１００より小さくなると蛍光物質の量が不十分であり、粒子の定量に十分な蛍光が得られなくなるため好ましくない。  本発明の定量におけるメカニズムは定かではないが、蛍光物質が粒子の官能基と１００％反応するのではなく一定の割合の官能基と反応して粒子を染色することから、この蛍光強度を測定することで粒子の官能器量の定量が可能なものと考えられる。
【００１９】
粒子と蛍光物質の反応は特に限定されるものではないが、例えば、蛍光物質を溶解させた溶液中に一定量の粒子を分散させ、一定時間混合させて反応させる方法が挙げられる。この際必要に応じて加熱してもかまわない。アミノ基を定量する場合は、イソチオシアン酸フルオレセイン、ジクロロトリアジルアミノフルオレセインを粒子と０．１〜２時間反応させることが、水酸基を定量する場合は、ジクロロトリアジルアミノフルオレセイン、９−アントロイルニトリルを粒子と１〜１２時間反応させることが、アミノ基と水酸基の両方を定量する場合は、ジクロロトリアジルアミノフルオレセインと粒子を１〜２時間反応させることが好ましい。
また、粒子の官能基量の定量法としては、例えば、既知の官能基量を有する粒子と官能基量未知の粒子を同じ条件で染色しフローサイトメーターで蛍光量を測定し、既知試料の官能基量と蛍光量の検量線を作成し、未知試料の官能基量を求める方法が挙げられる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、部は重量部を示す。
【００２１】
参考例１（水酸基含有ポリマー粒子の合成）
ｔ−ブチルメタクリレート（和光純薬（株）製）１００部、ジビニルベンゼン（純度５５％）５部を用いて懸濁重合を行い、分級操作を施し平均粒径１５  ｍ  の架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋重合体微粒子を得た。  得られた架橋ポリマー粒子１０部をポリエチレングリコール２００（和光純薬（株）製）５０部に分散させ、メシチレン（和光純薬（株）製）１５部を加え、窒素雰囲気下テトラ  ｎ  プロポキシチタンを０．２部滴下し、３、５、７、１０、１４、４８  時間、還流下反応させた。得られた粒子をそれぞれ、メタノールに分散／洗浄しさらにイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して水酸基含有ポリマー粒子１〜６を得た。
【００２２】
実施例１
下記組成の溶液を調製し反応液Ａとした。
【００２３】
2005030883.tif 000002
【００２４】
キャップ付き試験管に下記の組成になるように調製し、室温で振とう機で２時間攪拌した。
【００２５】
2005030883.tif 000003
【００２６】
次いで、試料をキャップ付き試験管のまま３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して粒子と上澄みに分け、さらに、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９）  （和光純薬（株）製）で超音波分散と遠心分離繰り返し洗浄した。  得られたそれぞれの粒子を、フローサイトメーター用シース液（ＦＡＣＳ  ＦＬＯＷ  ベクトンディケンソン社製）に分散し、フローサイトメーター（Ｆａｃｓ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ベクトンディケンソン社製）を用いて、測定条件一定で、検出波長５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。
【００２７】
比較例１  （ＪＩＳ    Ｋ００７０  の方法）
下記組成の溶液を調製し反応液Ｂとした。
【００２８】
反応液Ｂ
無水酢酸  （和光純薬（株）製）                              ２５部
ピリジン  （和光純薬（株）製）                              ７５部
【００２９】
キャップ付き試験管に下記の組成になるように調製し、９５度の温度条件で２４時間加熱した。
【００３０】
水酸基含有ポリマー粒子                            １部
反応液  Ｂ                                                        １部
【００３１】
さらに、蒸留水を加えて試験管中の無水酢酸を加水分解させた後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して粒子と上澄みに分けた。粒子をさらにエタノール（和光純薬（株）製）で超音波分散と遠心分離を繰り返し洗浄し、上澄みと洗浄液とをコニカルビーカーに集め、指示薬にフェノールフタレイン（和光純薬（株）製）を用いて０．１規定のエタノール性水酸化カリウム溶液（和光純薬（株）製）で滴定した。粒子を用いないブランク実験も行い、その差分から下式に従って水酸基量Ａ１（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出した。
【００３２】
Ａ１＝（（Ｂ−Ｃ）×０．１×ｆ）／ｗ
【００３３】
ここで、Ｂはブランク実験での滴下量（ｍｌ）、Ｃはサンプルの滴下量（ｍｌ）、ｆは水酸化カリウム溶液のファクター、ｗは粒子の重量（ｇ）である。
【００３４】
比較例２
実施例１において、水酸基含有ポリマー粒子１〜４について、粒子と反応液の組成を下記のように変えた以外は同様の方法で、粒子の蛍光強度の測定を行った。
【００３５】
水酸基含有ポリマー粒子                        ０．００５部
反応液  Ａ                                                            １部
【００３６】
実施例１、比較例１の測定結果を表１、図１に示す。図１では横軸に比較例の水酸基量を示し、縦軸にフローサイトメーターで得られた蛍光強度の相対値としてプロットした。本図から明らかなように、実施例１の測定法では、粒子の水酸基量に依存して蛍光強度が直線的に高まった。これより、実施例１の粒子の蛍光強度が比較例の従来測定法による水酸基量に応じて定量評価が可能であることが明らかである。  また、比較例１の水酸基量を用いて仕込み時の蛍光染料と粒子の水酸基量のモル比を計算した結果を表２に示す。これより実施例１の測定法は比較例２と比較して、仕込み比が適当な範囲であることから良好な結果が得られたことがわかる。
【００３７】
【表１】
2005030883.tif 000004
【００３８】
【表２】
2005030883.tif 000005
【００３９】
参考例２（アミノ基含有ポリマー粒子の合成）
ｔ−ブチルメタクリレート（和光純薬（株）製）１４０部、ジビニルベンゼン（純度５５％）５部、スチレン（東京化成（株）製）０、１００、２００、３００部を用いて懸濁重合を行い、分級操作を施し平均粒径１５  ｍ  の架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子１〜４を得た。  得られた架橋ポリマー粒子１〜４をそれぞれ１０部づつジエチレントリアミン（和光純薬（株）製）５０部に分散させ、メシチレン（和光純薬（株）製）１５部を加え、窒素雰囲気下テトラ  ｎ  プロポキシチタン（和光純薬（株）製）を０．２部滴下し、１４時間還流下反応させた。得られた微粒子をメタノールに分散／洗浄しさらにイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥してアミノ基含有ポリマー粒子１〜４を得た。
【００４０】
実施例２
実施例１において、粒子と反応液の組成を下記のように変え、反応時間を３０分で行った以外は同様の方法で、粒子の蛍光強度の測定を行った。
2005030883.tif 000006
【００４１】
比較例３
アミノ基含有ポリマー粒子粒子をキャップ付き試験管に秤量し、下記の組成で室温で１時間攪拌した。
【００４２】
2005030883.tif 000007
【００４３】
次いで、反応液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して粒子と上澄みに分けた。粒子をさらに酢酸（和光純薬（株）製）で超音波分散と遠心分離を繰り返し洗浄し、上澄みと洗浄液とをビーカーに集め、自動滴定装置（京都電子工業（株）製  ＡＴ−４１０）を用いて０．１規定の酢酸ナトリウム酢酸溶液（関東化学（株）製）で滴定した。粒子を加えないブランク実験も同時に行い、滴下量の差分から下式に従ってアミノ基量Ａ２（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出した。
【００４４】
Ａ２＝（（Ｂ−Ｃ）×０．１×ｆ）／ｗ
【００４５】
ここで、Ｂはブランク実験での滴下量（ｍｌ）、Ｃはサンプルの滴下量（ｍｌ）、ｆは酢酸ナトリウム酢酸溶液のファクター、ｗは粒子の重量（ｇ）である。実施例２、比較例３の測定結果を表３、図２に示す。図２では横軸に比較例のアミノ基量を示し、縦軸にフローサイトメーターで得られた蛍光強度の相対値としてプロットした。本図から水酸基粒子同様にアミノ基粒子も定量評価が可能であることが明らかである。
【００４６】
【表３】
2005030883.tif 000008
【００４７】
【発明の効果】
上記実施例の結果から明らかなように、本発明により、少サンプル量で短時間でポリマーの官能基の測定が可能となった。また、さらには、簡易で低コストで安全性が高く、複雑な操作を必要とすることなく、粒子の官能基を定量することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】水酸基価と蛍光強度を示す図である。
【図２】アミノ基価と蛍光強度を示す図である。
【図１】
2005030883.tif 000009
【図２】
2005030883.tif 000010