(57)【要約】【課題】ハイブリダイゼーションを高速に行う。【解決手段】バイオアッセイ用基板１は、ＣＤ等の光ディスクと同様の主面が円形の平板状の形状を呈している。基板１は、中心孔２を中心に回転駆動される。基板１は、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応の場となるウェル８が表面１ａに複数個形成されている。基板１には、ウェル８の下層に透明電極膜４が形成されている。ハイブリダイゼーション時には、基板１の上面１ａ側から外部電極１８を近接し、透明電極膜４と外部電極１８との間に交流電力を印加して、基板１に対して垂直方向の交流電界を与える。透明電極膜４への電界の印加方法は、チャッキング機構から中央孔を介して行う。【選択図】  図６
2005030784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学反応に用いられる基板である生化学反応用基板において、
上記生化学反応を行う反応領域と、
上記反応領域内に電界を印加するための電極部と、
当該基板を保持及び回転させるための回転軸が挿入される孔部と、
上記回転軸に形成された第１のコンタクト部と接触する第２のコンタクト部とを備え、
上記第２のコンタクト部は、上記電極部と電気的に接続されていること
を特徴とする生化学反応用基板。
【請求項２】
上記回転軸電極部は、上記回転軸に配設されたチャッキング機構に形成され、
上記コンタクト部は、上記チャッキング機構が上記孔部に挿入されたとき、上記回転軸電極部と接触するように配設されていること
を特徴とする請求項１に記載の生化学反応用基板。
【請求項３】
上記化学反応は、ヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション反応であり、
上記反応領域は、上記ヌクレオチド鎖を固定可能な内部処理がされていること
を特徴とする請求項１に記載の生化学反応用基板。
【請求項４】
上記電極部は、上記反応領域の下層に形成された平板電極層であること
を特徴とする請求項１に記載の生化学反応用基板。
【請求項５】
上記第１の平板電極層は、透明電極膜であること
を特徴とする請求項４に記載の生化学反応用基板。
【請求項６】
上記反応領域の上層に形成された第２の平板電極層を備え、
上記チャッキング機構が上記孔部に挿入されたときに当該チャッキング機構に形成された第２の平板電極層と接触する第２のコンタクト部とが形成され、
上記反応領域の下層に形成された第１の平板導電層は上記第１のコンタクト部と電気的に接続され、上記反応領域の上層に形成された第２の平板電極層は上記第２のコンタクト部と電気的に接続されること
を特徴とする請求項４に記載の生化学反応用基板。
【請求項７】
孔部を有する基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置であって、
上記基板の上記孔部に挿入して当該基板を保持及び回転する回転軸と、
上記回転軸に形成され、上記基板の反応領域に形成された電極に、電気的に接続された第２のコンタクト部に接触する第１のコンタクト部と、
上記第１のコンタクト部に電力を供給する電力供給手段とを備えること
を特徴とする生化学反応装置。
【請求項８】
上記電力供給手段は、交流電力を供給すること
を特徴とする請求項７に記載の生化学反応装置。
【請求項９】
上記回転軸に配設されたチャッキング手段を更に備え、
上記第１のコンタクトは、上記基板の上記第２のコンタクトと接触するように、上記チャッキング手段に形成されること
を特徴とする請求項７に記載の生化学反応装置。
【請求項１０】
上記基板の上記電極に対向するように配設された外部電極をさらに備え、
上記電力供給手段は、上記第１のコンタクト部に電気的に接続された上記反応領域の上記電極と上記外部電極との間に電力を供給すること
を特徴とする請求項７に記載の生化学反応装置。
【請求項１１】
上記基板の上記電極は、上記基板の上記反応領域の下層に形成された第１の平板電極であり、
上記基板の上記反応領域の上層に第２の平板電極層が形成され、上記第２の平板電極層に接続された第３のコンタクト部に接触する第４のコンタクト部を更に備え、
上記電力供給手段は、上記第１のコンタクト部と上記第４のコンタクト部に電力を供給すること
を特徴とする請求項７に記載の生化学反応装置。
【請求項１２】
プローブ物質とサンプル物質との相互反応の場となり、上記プローブ物質の一端を固定可能に当該ウェルの内部が処理された複数のウェルと、上記ウェルの内部に電界を印加するための電極部と、当該基板を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される中心孔と、チャッキング機構が挿入されたときに当該チャッキング機構に形成された第２のコンタクト部と接触する第１のコンタクト部とを備え、上記第１のコンタクト部と上記電極部とが電気的に接続されたハイブリダイゼーション用基板に対して、プローブ用のヌクレオチド鎖の一端をウェルの底面に結合し、
プローブ用のヌクレオチド鎖の一端が底面に結合されたウェルの内部に対して、サンプル用のヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、
上記チャッキング機構を上記中心孔に挿入することにより上記ハイブリダイゼーション用基板を保持して上記ウェル上に外部電極を載置し、当該外部電極と上記チャッキング機構との間に交流電力を印加し、上記プローブ用のヌクレオチド鎖と上記サンプル用のヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションすること
を特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項１３】
上記電極部は、上記複数のウェルが形成された部分の下層に形成された平板電極層であること
を特徴とする請求項１２記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１４】
上記第１の平板電極層は、透明電極膜であること
を特徴とする請求項１３記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１５】
上記ハイブリダイゼーション用基板は、複数のウェルが形成された部分の上層に形成された第２の平板電極層と、当該第２の平板電極層と接続された第３のコンタクト部とを備え、
上記複数のウェルの下層に形成された第１の平板導電層は上記第１のコンタクト部と電気的に接続され、上記複数のウェルの上層に形成された第２の平板電極層は上記第２のコンタクト部と電気的に接続され、
上記第２のコンタクト部と第４のコンタクト部との間に交流電力を印加すること
を特徴とする請求項１２記載のハイブリダイゼーション方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばＤＮＡチップ等の生化学反応用基板、生化学反応装置及びヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションするハイブリダイゼーション方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡ（全長又は一部）が微細配列されたいわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれる基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析手法は、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）を逆転写ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅してサンプルＤＮＡを生成し、そのサンプルＤＮＡをＤＮＡチップ上に固相化（固定化）されたプローブＤＮＡに対して滴下して、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。そして、ＤＮＡの２重らせん内に蛍光標識剤を挿入し、所定の検出器でその蛍光測定を行う。このことにより、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとの塩基配列が同一であるか否かを判別する。
【０００４】
ここで、ＤＮＡが負に帯電していることを利用して、プローブＤＮＡに向かう方向の直流電界を用いて、浮遊させたサンプルＤＮＡをプローブＤＮＡの方向に移動させ、ハイブリダイゼーションを高速化させる技術が知られている（特許文献１参照）。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００１−２３８６７４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、一本鎖ＤＮＡは、溶液中で直鎖状とはならずにランダムコイル状となるので、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとを結合するには立体障害が大きく、ハイブリダイゼーションを高速に行うことが困難である。浮遊しているサンプルＤＮＡを電界によってプローブＤＮＡの方向に移動させたとしても、その立体障害の度合いは変わらない。
【０００７】
そこで、本発明では、このような従来の課題を解決するため、ハイブリダイゼーション等を簡易な構成で高速に行うことができる生化学反応用基板及び生化学反応装置を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明では、簡易な構成で高速にハイブリダイゼーションを行うことができるハイブリダイゼーション方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る生化学反応用基板は、生化学反応に用いられる基板である生化学反応用基板であって、上記生化学反応を行う反応領域と、上記反応領域内に電界を印加するための電極部と、当該基板を保持及び回転させるための回転軸が挿入される孔部と、上記回転軸に形成された第１のコンタクト部と接触する第２のコンタクト部とを備え、上記第２のコンタクト部は、上記電極部と電気的に接続されていることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る生化学反応装置は、孔部を有する基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置であって、上記基板の上記孔部に挿入して当該基板を保持及び回転する回転軸と、上記回転軸に形成され、上記基板の反応領域に形成された電極に、電気的に接続された第２のコンタクト部に接触する第１のコンタクト部と、上記第１のコンタクト部に電力を供給する電力供給手段とを備える。
【００１１】
本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、プローブ物質とサンプル物質との相互反応の場となり、上記プローブ物質の一端を固定可能に当該ウェルの内部が処理された複数のウェルと、上記ウェルの内部に電界を印加するための電極部と、当該基板を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される中心孔と、チャッキング機構が挿入されたときに当該チャッキング機構に形成された第２のコンタクト部と接触する第１のコンタクト部とを備え、上記第１のコンタクト部と上記電極部とが電気的に接続されたハイブリダイゼーション用基板に対して、プローブ用のヌクレオチド鎖の一端をウェルの底面に結合し、プローブ用のヌクレオチド鎖の一端が底面に結合されたウェルの内部に対して、サンプル用のヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、上記チャッキング機構を上記中心孔に挿入することにより上記ハイブリダイゼーション用基板を保持して上記ウェル上に外部電極を載置し、当該外部電極と上記チャッキング機構との間に交流電力を印加し、上記プローブ用のヌクレオチド鎖と上記サンプル用のヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションすることを特徴とする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態として、本発明を適用したＤＮＡ解析用のバイオアッセイ用基板及びこのバイオアッセイ用基板を用いたＤＮＡ方法について説明をする。
【００１３】
（バイオアッセイ用基板）
図１に本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板１の上面を模式的に表した図を示し、図２に本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板１の断面を模式的に表した図を示す。
【００１４】
バイオアッセイ用基板１の全体形状は、例えばＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｄｉｓｋ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｄｉｓｋ）等の光ディスクと同様に、主面が円形とされた平板状となっている。バイオアッセイ用基板１の主面の中心には、中心孔２が形成されている。中心孔２には、当該バイオアッセイ用基板１がＤＮＡ解析装置に装着されたときに、当該バイオアッセイ用基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。
【００１５】
バイオアッセイ用基板１は、図２に示すように、下層側から、基板層３と、透明電極層４と、固相化層５と、ウェル形成層６とから形成されている。なお、バイオアッセイ用基板１のウェル形成層６側の表面を上面１ａ、基板層３側の表面を下面１ｂというものとする。
【００１６】
基板層３は、詳細を後述する蛍光標識剤を励起する励起光及び蛍光標識剤の蛍光を透過する材料である。例えば、基板層３は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の材料で形成されている。
【００１７】
透明電極層４は、基板層３上に形成された層である。透明電極層４は、例えばＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）やアルミニウム等の光透過性があり且つ導電性を有する材料から形成されている。透明電極層４は、基板層３上に例えばスパッタリングや電子ビーム蒸着等により２５０ｎｍ程度の厚さに成膜される。
【００１８】
固相化層５は、透明電極層４上に形成された層である。固相化層５は、プローブＤＮＡの一端を固相化させるための材料から形成されている。本例では、固相化層５は、シランにより表面修飾可能なＳｉＯ２が例えばスパッタリングや電子ビーム蒸着により５０ｎｍ程度の厚さに成膜された層となっている。
【００１９】
ウェル形成層６は、固相化層５上に形成された層である。ウェル形成層６は、バイオアッセイ用基板１の上面１ａ側に開口したくぼみ状の複数のウェル８が形成された層である。
【００２０】
ウェル８は、その内部空間が、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖）とサンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖）との相互反応の場、具体的には、ハイブリダイゼーション反応の場となる。ウェル８は、サンプルＤＮＡが含まれた溶液等の液体が滴下されたときにその液体を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっている。例えば、ウェル８は、開口部が１００μｍ四方の大きさに形成され、深さが５μｍ程度とされて、底面１１に固相化層５が露出している。
【００２１】
このようなウェル形成層６は、図３に示すように、固相化層５の上に感光性ポリミイド１３をスピンコート等で５μｍ程度の厚さに塗布する（ステップＳ１）。続いて、塗布した感光性ポリミイド１３上に所定のパターンのフォトマスク１４を形成し、このフォトマスク１４用いて感光性ポリミイド１３露光及び現像する（ステップＳ２）。このことにより、ウェル形成層６に複数のウェル８が形成される（ステップＳ３）。
【００２２】
さらに、ウェル８の底面１１（固相化層５が露出した部分）は、一端が官能基により修飾されたプローブＤＮＡが結合するように、対応する官能基により表面修飾されている。例えば、ウェル８は、図４に示すように、ＳＨ基１５を有するシラン分子１６により、底面１１（ＳｉＯ２から形成されている固相化層５）が表面修飾されている。このため、ウェル８の底面１１には、例えばＳＨ基で一端が修飾されたプローブＤＮＡを結合させることができる。このようにバイオアッセイ用基板１では、ウェル８の底面１１に、プローブＤＮＡの一端を結合させることができるので、図５に示すように、底面１１から垂直方向に鎖が伸びるように、プローブＤＮＡ（Ｐ）を結合させることができる。
【００２３】
また、バイオアッセイ用基板１では、図１に示すように、複数のウェル８が、主面の中心から外周方向に放射状に向かう複数の列上に、例えば４００μｍ程度の間隔で等間隔に並んで配置されている。
【００２４】
また、バイオアッセイ用基板１では、中心孔２の周囲部分で、透明電極層４が上面１ａ側に露出している。すなわち、バイオアッセイ用基板１の中心孔２の周囲部分は、固相化層５及びウェル形成層６が成膜されていない。そのため、バイオアッセイ用基板１では、中間層となっている透明電極層４に対して、上面１ａ側から接触可能となっている。透明電極層４の上面１ａ側に露出した部分を以下コンタクト部９と呼ぶ。
【００２５】
また、バイオアッセイ用基板１には、バイオアッセイ用基板１の下面１ｂ側からレーザ光を照射することにより読み取り可能なアドレスピットが形成されている。アドレスピットは、バイオアッセイ用基板１の平面上における各ウェル８の位置を特定するための情報である。アドレスピットから情報を光学的に読み取ることによって、複数存在するウェル８のうち、現在レーザ光を照射している位置の１つのウェル８がどれであるかを特定することが可能となる。このようなアドレスピットが設けてあることによって、後述する滴下装置による溶液の滴下位置の制御や、対物レンズによる蛍光検出位置の特定を行うことができる。
【００２６】
以上のようなバイオアッセイ用基板１では、円板状に形成されているため、光ディスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、レーザ光のフォーカシング位置を制御するためのフォーカシングサーボ制御、半径方向に対するレーザ光の照射位置や滴下装置による滴下位置の制御のための位置決めサーボ制御、並びに、アドレスピットの情報検出処理をすることができる。つまり、アドレスピットに記録してある情報内容と、そのアドレスピットの近傍にあるウェル８とを対応させておくことにより、アドレスピットの情報を読み出すことで、特定の１つのウェル８に対してのみレーザ光を照射して蛍光が発光しているウェル８の位置を特定したり、特定の１つのウェル８の位置と滴下装置との相対位置を制御して、その特定の１つのウェル８に対して溶液を滴下したりすることができる。
【００２７】
さらに、以上のようなバイオアッセイ用基板１では、ウェル８の上部側から電極を近接させれば当該電極と透明導電層４との間に平行電界を形成させることができる。そのため、例えば、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行う場合には、ウェル８に対して交流電界を与えることによって、ウェル内に浮遊するＤＮＡを伸張させてハイブリダイゼーションの進行を促進させることができる。
【００２８】
（ＤＮＡ解析方法）
つぎに、以上のようなバイオアッセイ用基板１を用いたＤＮＡ解析方法について説明をする。
【００２９】
まず、バイオアッセイ用基板１をＤＮＡ解析装置に装填し、バイオアッセイ用基板１を上面１ａ側が上方向となるように水平に保持するとともに、バイオアッセイ用基板１を回転可能な状態にする。
【００３０】
バイオアッセイ用基板１の保持及び回転は、ＤＮＡ解析装置に備えられている光ディスクドライブと同様のチャッキング機構２０を用いて行う。
【００３１】
チャッキング機構２０は、図６に示すように、回転駆動軸に接続されバイオアッセイ用基板１を回転させる中心軸２１と、中心軸２１に対して垂直な板状に形成されバイオアッセイ用基板１を下面１ｂ側から支持するターンプレート２２と、下面１ｂ側から中心孔２に挿入してバイオアッセイ用基板１を上面１ａ側から支持するチャッキング爪２３とを有している。ターンプレート２２及びチャッキング爪２３は、それぞれ中心軸２１に取り付けられており、中心軸２１とともに回転をする。
【００３２】
このようなチャッキング機構２０では、バイオアッセイ用基板１の中心孔２に対して下面１ｂ側からチャッキング爪２３が挿入し、チャッキング爪２３の一部が上面１ａ側に出てバネ等でバイオアッセイ用基板１を上面１ａ側から下側に付勢している。このことにより、チャッキング機構２０では、ターンプレート２２とチャッキング爪２３との間でバイオアッセイ用基板１を挟みこんで保持することができ、バイオアッセイ用基板１を上面１ａを上にして水平に保持するとともにバイオアッセイ用基板１を回転させることができる。なお、チャッキング機構２０には、コンタクト部９（透明電極層４が露出している部分）と接触する部分に電極２４が形成されている。電極２４は、チャッキング機構２０の中心軸２１を介して、ＤＮＡ解析装置の内部の交流電力発生部まで電気的に接続されている。
【００３３】
続いて、以上のようにバイオアッセイ用基板１をチャッキング機構２０で保持した状態で、一端がＳＨ基で修飾されたプローブＤＮＡ（Ｐ）が含有した溶液Ｓを、図７に示すように、例えば滴下用ノズル２５を用いて所定のウェル８に対して滴下する。このとき、１つのバイオアッセイ用基板１を回転駆動して、特定のウェル８と滴下ノズル２５との相対位置を制御しながらプローブＤＮＡを滴下する。さらに、複数種類のプローブＤＮＡをバイオアッセイ用基板１のそれぞれのウェル８に滴下する。だたし、１つのウェル８内には１種類のプローブＤＮＡが入るようにする。なお、各ウェル８にいずれの種類のプローブＤＮＡを滴下するかは、予めウェルとプローブＤＮＡとの対応関係を示す配置マップ等を生成しておき、その配置マップに基づき滴下制御する。
【００３４】
また、溶液Ｓの滴下制御は、光ディスクの駆動システムと同様にバイオアッセイ用基板１を駆動制御することにより行う。すなわち、図６に示すように、バイオアッセイ用基板１を上面１ａを上にして平行に保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Ｖをバイオアッセイ用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射してアドレスピットを検出することによりウェル８の位置を特定しながら、滴下位置の制御を行えばよい。
【００３５】
続いて、図８に示すように、バイオアッセイ用基板１とほぼ同一形状の円板状の平板電極板３０を、バイオアッセイ用基板１の上面１ａ側の外部からウェル形成層６上に覆いかぶせるように載置する。続いて、この平板電極板３０と電極２４との間に、交流電力発生部３１により交流電圧を印加する。このとき、電極２４とコンタクト部９とは接触しているため透明電極層４に電力が印加される。従って、バイオアッセイ用基板１には、平板電極板３０と透明電極層４との間に交流電界が印加される。そのため、各ウェル８には、バイオアッセイ用基板１の主面に対して垂直方向の交流電界が印加される。例えば、ウェル８内に、１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。
【００３６】
このように交流電界を所定のウェル８に印加すると、図９に示すように、ウェル８内の溶液中に浮遊しているプローブＤＮＡ（Ｐ）がバイオアッセイ用基板１の主面に対して垂直方向に伸張するとともに、そのプローブＤＮＡがバイオアッセイ用基板１に垂直方向に移動する。このため、予め表面修飾処理がされた底面１１に、そのプローブＤＮＡの修飾端が結合し、ウェル８の底面１１にプローブＤＮＡを固相化（固定化）することができる。
【００３７】
交流電界を印加すると一本鎖ＤＮＡ（ヌクレオチド鎖）が伸張及び移動する理由は、次のとおりである。すなわち、ヌクレオチド鎖内では、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素イオン（陽電荷）とによってイオン雲が形成されていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトルが、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長するためである。さらに、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は、電気力線が集中する部位に向かって移動もする（Ｓｅｉｉｃｈｉ  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｙａｍａｎａｓｈｉ，  Ｓｈｉｎ−ｉｃｈｉ  Ｔａｚａｗａ，  Ｏｓａｍｕ  Ｋｕｒｏｓａｗａ  ａｎｄ  Ｍａｓａｏ  Ｗａｓｈｉｚｕ：  ”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ＡＣ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ”，  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１，  ｐ．７５−８３  （１９９８）参照）。
【００３８】
このように、交流電界を印加すると、プローブＤＮＡがその電界に平行な方向に伸張して立体障害の少ない状態となり、プローブＤＮＡと底面１１とが結合しやすい状態となる。そして、プローブＤＮＡと底面１１とが結合することにより、ウェル８の底面１１にプローブＤＮＡを固相化（固定化）することができる。
【００３９】
続いて、平面電極板３０を取り外し、生体から抽出したサンプルＤＮＡが含有した溶液を滴下ノズル２５を用いてバイオアッセイ用基板１上の各ウェル８に滴下する。
【００４０】
続いて、サンプルＤＮＡの滴下後、再度、平板電極板３０をバイオアッセイ用基板１の上面１ａ側の外部からウェル形成層６上に覆いかぶせるように載置し、平板電極板３０と電極２４との間に、交流電力発生部３１により交流電圧を印加する。交流電圧の印加とともに、周囲の温度を６０度Ｃ程度に維持する。すなわち、加熱しながらバイオアッセイ用基板１の主面に対して垂直方向の交流電界を印加する。例えば、ウェル８内に１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。
【００４１】
このような処理をすると、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが垂直方向に伸張して立体障害の少ない状態となるとともに、サンプルＤＮＡがバイオアッセイ用基板１に対して垂直方向に移動する。この結果、互いの塩基配列が相補的な関係にあるサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが同一のウェル８内にある場合には、それらがハイブリダイゼーションを起こす。
【００４２】
続いて、ハイブリダイゼーションを起こさせた後に、平面電極板３０を取り外し、蛍光標識インターカレータ等（例えば、ＰＯＰＯ−１，ＴＯＴＯ−１）をバイオアッセイ用基板１のウェル８内に滴下する。このような蛍光標識剤は、ハイブリダイゼーションを起こしたプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの二重らせん間に挿入して結合する。
【００４３】
続いて、バイオアッセイ用基板１の表面１ａを純水等で洗浄し、ハイブリダイゼーションを起こしていないウェル８内のサンプルＤＮＡ及び蛍光標識剤を除去する。この結果、ハイブリダイゼーションを起こしたウェル８内にのみ、蛍光標識剤が残存することとなる。
【００４４】
続いて、光ディスクの駆動システムと同様にバイオアッセイ用基板１を駆動制御することにより、ウェル８からの蛍光の検出を行う。すなわち、バイオアッセイ用基板１を保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Ｖをバイオアッセイ用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射してアドレスピットを検出することによりウェル８の位置を特定する。それと同時に、励起光をバイオアッセイ用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射して、その励起光に応じて生じる蛍光をやはり下面１ｂ側から検出する。そして、どのウェル８から蛍光が発生されているか否かを検出する。
【００４５】
続いて、バイオアッセイ用基板１上の蛍光が発生していたウェル８の位置を示すマップ作成する。そして、その作成したマップ、並びに、各ウェル８にどのような塩基配列のプローブＤＮＡが滴下されていたかを示す配置マップに基づき、サンプルＤＮＡの塩基配列の解析を行う。
【００４６】
（ＤＮＡ解析装置）
つぎに、本発明の実施の形態のバイオアッセイ基板１を用いてＤＮＡ解析を行うＤＮＡ解析装置５１について、図１０を参照して説明をする。
【００４７】
ＤＮＡ解析装置５１は、図１０に示すように、バイオアッセイ用基板１を保持して回転をさせるディスク装填部５２と、ハイブリダイゼーションのための各種溶液を貯留するとともにバイオアッセイ用基板１のウェル８にその溶液を滴下する滴下部５３と、バイオアッセイ用基板１から励起光を検出するための励起光検出部５４と、上記の各部の管理及び制御を行う制御／サーボ部５５とを備えている。
【００４８】
ディスク装填部５２は、バイオアッセイ用基板１の中心孔２内に挿入して当該バイオアッセイ用基板１を保持するチャッキング機構２０と、チャッキング機構２０を駆動することによりバイオアッセイ用基板１を回転させるスピンドルモータ６２と有している。チャッキング機構２０は、図６に示した機構と同一のものである。ディスク装填部５２は、上面１ａ側が上方向となるようにバイオアッセイ用基板１を水平に保持した状態で、当該バイオアッセイ用基板１を回転駆動する。ディスク装填部５２では、バイオアッセイ用基板１を水平に保持することによって、ウェル８に滴下された溶液が垂れてしまうといった問題を回避することができる。
【００４９】
滴下部５３は、試料溶液Ｓや蛍光標識剤Ｓ´を貯留する貯留部６３と、貯留部６３内の試料溶液Ｓや蛍光標識剤Ｓ´をバイオアッセイ用基板１に滴下する滴下ヘッド６４とを有している。滴下ヘッド６４は、水平に装填されたバイオアッセイ用基板１の上面１ａの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド６４は、バイオアッセイ用基板１のアドレスピットから読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてバイオアッセイ用基板１との相対位置を半径方向に制御し、サンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）を含有する試料溶液Ｓを所定のウェル８に正確に追従して滴下する構成とされている。また、貯留部６３は、貯留部６３と滴下ヘッド６４との組み合わせは、ハイブリダイゼーションのために使用する試料溶液の数だけある。
【００５０】
また、滴下部５３では、バイオアッセイ用基板１上の所定の位置に正確に試料溶液Ｓを滴下するために、例えば、いわゆる「インクジェットプリンティング法」に基づく滴下方法が採用されている。「インクジェットプリンティング法」は、滴下ヘッド６４にいわゆるインクジェットプリンタで用いられるインク噴出機構を適用する方法であり、インクジェットプリンタのようなノズルヘッドからバイオアッセイ用基板１に試料溶液Ｓを噴射するものである。
【００５１】
励起光検出部５４は、光学ヘッド７０を有している。光学ヘッド７０は、水平に装填されたバイオアッセイ用基板１の下方側、すなわち、下面１ｂ側に配置されている。光学ヘッド７０は、例えば、図示していないスレッド機構等により、バイオアッセイ用基板１の半径方向に移動自在とされている。
【００５２】
光学ヘッド７０は、対物レンズ７１と、対物レンズ７１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ７２と、導光ミラー７３とを有している。対物レンズ７１は、その中心軸がバイオアッセイ用基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ７２に支持されている。従って、対物レンズ７１は、バイオアッセイ用基板１の下方側から入射された光束を当該バイオアッセイ用基板１に対して集光することができる。２軸アクチュエータ７２は、バイオアッセイ用基板１の表面に対して垂直な方向、及び、バイオアッセイ用基板１の半径方向の２方向に対物レンズ７１を移動可能に支持している。２軸アクチュエータ７２を駆動することにより、対物レンズ７１により集光された光の焦点を、バイオアッセイ用基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。従って、この光学ヘッド７０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。
【００５３】
導光ミラー７３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド７０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー７３には、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー７３は、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ７１に入射する。対物レンズ７１に入射された励起光Ｐ及びサーボ光Ｖは、当該対物レンズ７１により集光されてバイオアッセイ用基板１に照射される。また、導光ミラー７３には、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖの反射光Ｒが、バイオアッセイ用基板１から対物レンズ７１を介して入射される。導光ミラー７３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。
【００５４】
なお、光学ヘッド７０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ７２を駆動する駆動信号は、制御／サーボ部５５から与えられる。
【００５５】
また、励起光検出部５４は、励起光Ｐを出射する励起光源７４と、励起光源７４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ７５と、コリメータレンズ７５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー７３に照射する第１のダイクロックミラー７６とを有している。
【００５６】
励起光源７４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源７４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光である。なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ７５は、励起光源７４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー７６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖ（その反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー７６は、光路Ｘ上に４５°の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ７５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー７３に励起光Ｐを照射している。
【００５７】
また、励起光検出部５４は、蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード７７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ７８と、光学ヘッド７０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード７７に照射する第２のダイクロックミラー７９とを有している。
【００５８】
アバランジェフォトダイオード７７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード７７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ７８は、アバランジェフォトダイオード７７上に蛍光Ｆを集光するためのレンズである。第２のダイクロックミラー７９は、光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー７３側から見て第１のダイクロックミラー７６の後段に配置されている。従って、第２のダイクロックミラー７９には、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー７９は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光Ｆの波長の光のみを反射して、サーボ光（反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第２のダイクロックミラー７９は、光学ヘッド７０の導光ミラー７３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ７８を介してアバランジェフォトダイオード７７に蛍光Ｆを照射する。
【００５９】
アバランジェフォトダイオード７７では、このように検出した蛍光Ｆの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御／サーボ部５５に供給する。
【００６０】
また、励起光検出部５４は、サーボ光Ｖを出射するサーボ光源８０と、サーボ光源８０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ８１と、サーボ光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路８２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路８２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ８３と、サーボ光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ８４とを有している。
【００６１】
サーボ光源８０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、サーボ光Ｖの波長は、アドレスピットが検出できる程度の波長であり、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なっていれば７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ８１は、サーボ光源８０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束にする。平行光束とされたサーボ光Ｖは光セパレータ８４に入射される。
【００６２】
フォトディテクト回路８２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及びアドレスピットの再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、サーボ光Ｖがバイオアッセイ用基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、サーボ光と同一の７８０ｎｍである。
【００６３】
なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ７１により集光された光の合焦位置と、バイオアッセイ用基板１の基板層３との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が０となったときに、対物レンズ７１とバイオアッセイ用基板１との間の距離が最適になる。位置決めエラー信号は、所定のウェル８の位置と、焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。位置決めエラー信号が０となったときに、サーボ光Ｖのディスク半径方向に対する照射位置が任意のウェル８に一致したこととなる。アドレスピットの再生信号は、バイオアッセイ用基板１に記録されているアドレスピットに記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在サーボ光Ｖを照射しているウェル８を特定することができる。
【００６４】
フォトディテクト回路８２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピットの再生信号を制御／サーボ部５５に供給する。
【００６５】
シリンドリカルレンズ８３は、フォトディテクト回路８２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路８２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。
【００６６】
光セパレータ８４は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面８４ａと１／４波長板８４ｂにより構成されている。光セパレータ８４では、１／４波長板８４ｂの逆側から入射された光を光分離面８４ａが透過し、その透過光の反射光が１／４波長板８４側から入射された場合には光分離面８４ａが反射する機能を有している。光セパレータ８４は、光分離面８４ａが光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー７３側から見て第２のダイクロックミラー７９の後段に配置されている。従って、光セパレータ８４では、コリメータレンズ８１から出射されたサーボ光Ｖを透過して光学ヘッド７０内の導光ミラー７３に対してそのサーボ光Ｖを入射させているとともに、光学ヘッド７０の導光ミラー７３から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折され、シリンドリカルレンズ８３介してフォトディテクト回路８２に反射光Ｒを照射する。
【００６７】
制御／サーボ部５５は、励起光検出部５４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピットの再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。
【００６８】
すなわち、制御／サーボ部５５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド７０内の２軸アクチュエータ７２を駆動して対物レンズ７１とバイオアッセイ用基板１との間の間隔を制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部５５は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド７０内の２軸アクチュエータ７２を駆動して対物レンズ７１をバイオアッセイ用基板１の半径方向に移動制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部５５は、アドレスピットの再生信号に基づき光学ヘッド７０のスレッド移動制御を行って光学ヘッド７０を所定の半径位置に移動し、目的のウェル位置に対物レンズ７１を移動させる。
【００６９】
また、制御／サーボ部５５は、ハイブリダイゼーション時に、交流電力発生部３１を制御し、チャッキング機構２０を介して電力の供給の制御も行う。
【００７０】
以上のような構成のＤＮＡ解析装置５１では、次のような動作を行う。
【００７１】
ＤＮＡ解析装置５１は、バイオアッセイ用基板１を回転させながら、ウェル８上にサンプルＤＮＡが含有した溶液を滴下し、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。ハイブリダイゼーション時には上述した電界の制御も行う。また、ハイブリダイゼーション処理の済んだバイオアッセイ用基板１上に、蛍光標識剤を含んだバッファ溶液を滴下する。
【００７２】
また、ＤＮＡ解析装置５１は、蛍光標識剤が滴下された後のバイオアッセイ用基板１を回転させ、励起光Ｐを当該バイオアッセイ用基板１の下面１ｂ側から入射させてウェル８内の蛍光標識剤に照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光Ｆをバイオアッセイ用基板１の下方から検出する。
【００７３】
ここで、ＤＮＡ解析装置５１では、励起光Ｐとサーボ光Ｖとを同一の対物レンズ７１を介してバイオアッセイ用基板１に照射している。そのため、ＤＮＡ解析装置５１では、サーボ光Ｖを用いたフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの照射位置、すなわち、蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定することができる。
【００７４】
以上のようなバイオアッセイ用基板１では、溶液中に浮遊したプローブＤＮＡを基板１の表面に対して垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させながら、一端をウェル８の底面１１に接続する。従って、バイオアッセイ用基板１に対して垂直に電界を与えるので、例えば、基板上に電極をパターニングして生成しなくてもよいため、非常に簡易的な層構造の電極を用いて、プローブＤＮＡを固定することができる。
【００７５】
また、以上のようなバイオアッセイ用基板１では、溶液中に浮遊したサンプルＤＮＡ及び一端がウェル８の底面に固定されたプローブＤＮＡに対して、垂直方向の交流電界を与えて垂直方向に伸張及び移動させる。従って、サンプルＤＮＡ及びプローブＤＮＡがともに同方向に伸張及び移動するので、ハイブリダイゼーションが促進する。さらに、このような電界を与えるための電極を基板上に電極をパターニングして生成しなくてもよいため、非常に簡易的な層構造の電極を用いて、プローブＤＮＡを固定することができる。
【００７６】
また、以上のようなバイオアッセイ用基板１では、当該バイオアッセイ用基板１を保持するチャッキング機構２０を介して電力が供給されるので、バイオアッセイ用基板１とＤＮＡ解析装置（又はハイブリダイゼーション装置）との電気的な接続を非常に容易に行うことが可能となる。
【００７７】
なお、本発明の実施の形態では、平板電極板３０をバイオアッセイ用基板１の上面１ａ側の外部から覆いかぶせるように載置して交流電圧の通電をしてハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーションを終了すると平板電極板３０を取り外したが、バイオアッセイ用基板１に対して平板電極３０を一体的に形成してもよい。
【００７８】
ただし、この場合、そのままではプローブＤＮＡ及びサンプルＤＮＡを各ウェルに滴下することができないので、図１１に示すように、ウェル形成層６には、放射状に配置された複数のウェル８とともに、内周から外周に向かう一列のウェル８を連通する複数の溝４１を形成しておく。さらに、図１２に示すように、溝４１の一端に対応した部分に開口部４２が形成された平板電極３０を、ウェル形成層６上に張り合わせる。このようにバイオアッセイ用基板１を形成することにより、開口部４２からプローブＤＮＡ及びサンプルＤＮＡをウェル８内に注入することが可能となる。
【００７９】
また、このように平板電極３０をバイオアッセイ用基板１に一体的に形成した場合には、この平板電極３０にもチャッキング機構２０を介して通電することが可能となる。
【００８０】
この場合のチャッキング機構２０には、図１３に示すように、中心軸２１、ターンプレート２２、チャッキング爪２３及び電極２４とともに、コンタクト部４３を設ければよい。コンタクト部４３は、チャッキング機構２０が中心孔２に挿入したときに平板電極３０に形成されたコンタクト部４４と接触する
【００８１】
【発明の効果】
本発明に係る生化学反応用基板は、生化学反応に用いられる基板である生化学反応用基板であって、上記生化学反応を行う反応領域と、上記反応領域内に電界を印加するための電極部と、当該基板を保持及び回転させるための回転軸が挿入される孔部と、上記回転軸に形成された第１のコンタクト部と接触する第２のコンタクト部とを備え、上記第２のコンタクト部は、上記電極部と電気的に接続されていることを特徴とする。
【００８２】
このことにより、本発明に係る生化学反応用基板では、ハイブリダイゼーション等を簡易な構成で高速に行うことができる。
【００８３】
本発明に係る生化学反応装置は、孔部を有する基板を用いて生化学反応を行う生化学反応装置であって、上記基板の上記孔部に挿入して当該基板を保持及び回転する回転軸と、上記回転軸に形成され、上記基板の反応領域に形成された電極に、電気的に接続された第２のコンタクト部に接触する第１のコンタクト部と、上記第１のコンタクト部に電力を供給する電力供給手段とを備える。
【００８４】
このことにより、本発明に係る生化学反応装置では、ハイブリダイゼーション等を簡易な構成で高速に行うことができる。
【００８５】
本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、次のような基板を用いる。
【００８６】
上記基板は、基板表面に物質間の相互反応の場となるウェルが形成され、さらにそのウェルの上側及び下側に導電層を備えている。従って、この基板では、２つの導電層間に電界を印加することによりウェルに対して平行電界を与えることができる。また、この基板は、チャッキング機構が中心孔に挿入されたときに当該チャッキング機構に形成された第１及び第２の電極部と接触するコンタクト部が形成されている。
【００８７】
本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、以上のような基板を用いて、ウェルに対してチャッキング機構を介して電界を印加する。
【００８８】
このことにより、本発明に係るハイブリダイゼーション方法では、ハイブリダイゼーションを簡易な構成で高速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板の平面図である。
【図２】本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板の断面図である。
【図３】バイオアッセイ用基板のウェルを形成する工程を示した図である。
【図４】ウェルの底面に修飾されるＯＨ基を有するシラン分子を示す図である。
【図５】ウェルの底面に結合したプローブＤＮＡを示す図である。
【図６】バイオアッセイ用基板に対して溶液の滴下制御を説明するための図である。
【図７】滴下用ノズルを用いて所定のウェルに対して溶液を滴下している状態を説明するための図である。
【図８】バイオアッセイ用基板に対して交流電界の印加の方法を説明するための図である。
【図９】ウェルに印加されている交流電界及びこのときのＤＮＡの状態を説明するための図である。
【図１０】本発明の実施の形態のバイオアッセイ用基板を用いてＤＮＡ解析を行うＤＮＡ解析装置の構成図である。
【図１１】平板電極が一体形成されたバイオアッセイ基板を示す図である。
【図１２】放射状に配置された複数のウェルとともに内周から外周に向かう一列のウェルを連通する複数の溝、及び、平板電極に形成された開口部を説明するための図である。
【図１３】平板電極が形成されたバイオアッセイ基板に対して交流電界の印加の方法を説明するための図である。
【符号の説明】
１  バイオアッセイ用基板、２  中心孔、３  基板層、４  透明電極層、５  固相化層、６  ウェル形成層、８  ウェル
【図１】
2005030784.tif 000003
【図２】
2005030784.tif 000004
【図３】
2005030784.tif 000005
【図４】
2005030784.tif 000006
【図５】
2005030784.tif 000007
【図６】
2005030784.tif 000008
【図７】
2005030784.tif 000009
【図８】
2005030784.tif 000010
【図９】
2005030784.tif 000011
【図１０】
2005030784.tif 000012
【図１１】
2005030784.tif 000013
【図１２】
2005030784.tif 000014
【図１３】
2005030784.tif 000015