(57)【要約】      （修正有）【課題】被検物質のＩｇＥ産生抑制能のアッセイ方法の提供。【解決手段】ヒトから分離したリンパ球を適当な培養液で培養した後、被験物質の存在下で該リンパ球にＩｇＥを産生させ、その結果産生したＩｇＥの量を検出することを含むが、上記リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で安定的かつ有意にＩｇＥ産生を誘導することを特徴とし、被験物質のＩｇＥ産生抑制能、ひいては抗アレルギー性炎症活性のアッセイ方法を簡便に評価できる方法にかかる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質のＩｇＥ産生抑制能のアッセイ方法であって、
当該方法は、
１．ヒトから分離したリンパ球を適当な培養液中で培養し、
２．被験物質の存在下で該リンパ球にＩｇＥを産生させ、
３．産生したＩｇＥの量を検出することを含み、
ただし、上記リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で行うことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
血漿の濃度が、培養液に対して５〜１５（ｖ／ｖ）％である、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
培養液の培養量を２００μｌ〜１ｍｌとする、請求項１または２に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
臨床医学の分野では、多くの疾患が最終的に炎症に至るため、これを効率的に抑えるためにステロイド系の抗炎症剤が用いられてきた。しかしながら、こうしたステロイド系抗炎症剤は、体内のホルモンバランスを変化させるといった副作用の影響が大きいためその利用に限界がある。特に、アトピー性皮膚炎や気管支喘息といったアレルギー性炎症のように致命的ではないものの、苦痛を伴う疾患に対しては日常生活における食事で症状を緩和することが患者の負担を減少させるための有効な手段である。
【０００２】
この、アレルギー発症のメカニズムは多くの研究者によって研究されており、このメカニズムの最初にＩｇＥとよばれる抗体が血中で増加することが知られている。また、血中でのＩｇＥの産生に関与するリンパ球集団を生体外に取り出して、ＩｇＥの産生を誘導させる実験系が構築されている（非特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３３（２０００）ｐｐ．３３−４０
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述の培養系においては、ＩｇＥの産生が十分ではなく、該培養方法をＩｇＥの安定な産生を必要とする実験系に安定的に用いることに問題があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、培養リンパ球に安定的かつ有意にＩｇＥ産生を誘導しうる培養条件を確立し、これを用いて、被験物質のＩｇＥ産生抑制能、ひいては抗アレルギー性炎症活性のアッセイ方法を簡便に評価できる方法を完成するに至った。
【０００５】
したがって、本願発明は、被験物質のＩｇＥ産生抑制能をアッセイする方法であって、ヒトから分離したリンパ球を適当な培養液で培養した後、被験物質の存在下で該リンパ球にＩｇＥを産生させ、その結果産生したＩｇＥの量を検出することを含むが、上記リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で行うことを特徴とするものである。
【０００６】
本願発明において使用しうるリンパ球とは、ヒト末梢血リンパ球である。
【０００７】
本願発明で使用しうる被験物質とは、食品素材、食品構成成分、食品、化学物質である。被験物質の調製方法は、水溶性の物質は水もしくは生理食塩水などの水を主体とする溶媒に溶解し、非水溶性の物質については、適宜、有機溶媒（ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール）等を用いて溶解する。
【０００８】
本願発明において使用しうるヒト血漿とはヒト末梢血リンパ球の提供者由来の血漿である。
【０００９】
該方法において、リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で行うとＩｇＥ産生量が有意に増加する。そこで、本願発明にかかるリンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で行うものである。
【００１０】
さらに、前記方法においては、血漿の濃度が、培養液に対して５〜１５（ｖ／ｖ）％である場合にＩｇＥ産生量が増加し、１０（ｖ／ｖ）％である場合が特に好ましい。従って、本願発明の第二は、血漿の濃度が培養液に対して５〜１５（ｖ／ｖ）％、特に１０（ｖ／ｖ）％である前記方法である。
【００１１】
次に、本願発明にかかる培養は培養量により免疫賦活能に差が見られ、９６ウェルプレートで１ウェルにつき２００μｌ容量で培養する場合に、２４ウェルプレートで１ウェルにつき１ｍｌ容量で培養する場合より当該免疫賦活能が増大する。従って、本願発明の第三は、その培養量を２００μｌ〜１ｍｌとする前記方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本願発明はＩｇＥ産生抑制能のアッセイ方法であって、ヒトから分離したリンパ球について当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で培養し、被験物質の存在下で該リンパ球にＩｇＥを産生させ、産生したＩｇＥの量を検出することで、ＩｇＥ産生抑制能、ひいては抗アレルギー性炎症活性のアッセイ方法を簡便に評価できる方法である。
【００１３】
リンパ球は一般的な密度勾配遠心法により分離できるが、以下の手順で行うのが好ましい。すなわち、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  Ｐｌｕｓを分注したチューブに血液を重層して遠心分離した後、血漿をチューブに採取する。次に、リンパ球を採取してチューブに注入し、培地を加えた後に遠心分離する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であるが、ＥＲＤＦ培地を用いるのが好ましい。
【００１４】
その後、上清を吸引除去し、培地を加え、細胞を懸濁後、さらに遠心分離する。本手順に使用しうる培地は動物細胞培養用培地であるが、ＥＲＤＦ培地を用いるのが好ましい。細胞保存液を加えて細胞の密度を調節し、チューブに分注する。
【００１５】
体外免疫は既知の方法で行ってもよいが、以下の手順で行うのが好ましい。すなわち、試料溶液と培地を混合し、段階希釈法にて数種類の段階希釈液を作製し、各々ろ過滅菌して試料液を作製する。使用しうる試料は食品素材、食品構成成分、食品、化学物質である。試料の調製方法は水溶性の物質は水もしくは生理食塩水などの水を主体とする溶媒に溶解し、非水溶性の物質については、適宜、有機溶媒（ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール）等を用いて溶解する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であり、ＥＲＤＦが好ましい。ヒト血漿は予め滅菌された穴径０．２ミクロンのフィルタを用いて滅菌するが、不溶物が多い場合は０．４ミクロンのフィルタでろ過した後、０．２ミクロンのフィルタでろ過して使用する。その後、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ムラミルペプチド（ＭＤＰ）、抗原、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、所定の培養溶液を混合したものに、上述のヒト血漿が特定の濃度となるように加えて、免疫賦活液を調製する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であり、ＥＲＤＦ培地が好ましい。特定の濃度に調製したリンパ球を遠心分離し培地を加えた後、遠心分離して上清を除去し、さらに培地を加え、該リンパ球を懸濁して特定の濃度になるように該培地を加えて調製し、リンパ球懸濁液を作製する。細胞培養は、既知の方法で行ってもよいが、培養プレートに試料溶液とリンパ球懸濁液を注入し、静置培養するのが好ましい。使用する培養プレートは、一般的な滅菌された組織培養用プレートであり、特に９６ウェル培養プレートが好ましい。静置培養の条件は、一般的な３７℃定温インキュベータで行うが、特に３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒに調整するのが好ましい。細胞の計測は、血球計算盤もしくは、セルカウンターで行うが、培養後、培養プレートから上清を回収し、該上清にトリパンブルー溶液を加え、生細胞数と死細胞数を計測するのが好ましい。
【００１６】
ＩｇＥ量は、酵素抗体法で測定することができるが、特にＥＬＩＳＡによる測定が好ましい。すなわち、炭酸ナトリウム緩衝液に特定の抗体を混合した溶液を特定の濃度になるようにＥＬＩＳＡプレートに注入する。使用しうる抗体は抗ＩｇＥ抗体であるが、ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体、ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体が好ましい。一定時間放置した後、プレートの溶液を廃棄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて数回洗浄操作を繰り返す。
【００１７】
検量線作成は以下の手順で行うことができる。標準ＩｇＥについて標準希釈系列を作製したものをプレートに加えて静置した後、ウェル溶液を廃棄して、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で数回洗浄する。その後、ＢＳＡ／ＰＢＳと酵素標識抗ＩｇＥ抗体を混合してプレートに加えて静置し、ウェルの溶液を廃棄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で数回洗浄し、酵素基質を加え、その所定時間後に吸光度を測定する。各培養上清のＩｇＥ量は標準ＩｇＥをプロットした検量線から求める。
【００１８】
以下に、本願発明の実施例を例示するが、本願発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１
リンパ球の分離
１５ｍｌコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  ２１９６）にＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃１７−１４４０−０２）を４ｍｌずつ分注し、５ｍｌの血液をその上に静かに重層し、４００×ｇにて常温で３０分間遠心分離（トミー精工  ＬＣ−１２０）した。上から血漿、リンパ球、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ、赤血球の層が存在することを確認して、オートピペット（ドラモンド  ＰＡ−３００）を用いて血漿をチューブに採取し、−２０℃に保存した。次に、オートピペットを用いて、Ｆｉｃｏｌｌを採取しないように血漿側からリンパ球を採取し、各チューブとも最大で１０ｍｌ程度になるように５０ｍｌチューブ（ＢＤ社  ３５−２０７０）に注入した。ＥＲＤＦ培地（ＥＲＤＦ（極東製薬  ＃２６５００））１７．７ｇ、ＮａＨＣＯ３（Ｗａｋｏ  ＃１９１−０１３０５）１．１３ｇを超純水１０００ｍｌに溶解し０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＧＰＢ  ５０１０）にてろ過滅菌したのち、全容積が４５ｍｌになるように加え、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。その後、上清を吸引除去し、１０ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、細胞を懸濁後、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。細胞の密度が１〜３×１０７細胞／ｍｌになるように予め調製しておいた細胞保存液（１０％ＤＭＳＯ／２０％ＦＢＳ／７０％ＥＲＤＦ培地（ＦＢＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＤＭＳＯ：Ｗａｋｏ））に懸濁し、クライオチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃４３０２８９）に分注し、−８０℃で保存した。
【００２０】
実施例２
体外免疫
体外免疫は以下の手順で行った。
Ａ．２％試料液の作製
本実施例で用いた試料は、牛肉抽出エキス（カルニッチ５、伊藤ハム）、コラーゲンペプチド（ＰＲＡ、ニッピ）、ロイヤルゼリー（ローヤルゼリー、秋田屋本店）、難消化性デキストリン（ファイバーゾル、松谷化学工業）、ホエイペプチド（Ｗ２５００、森永乳業）、カゼインペプチド（Ｃ２５００、森永乳業）、小麦ペプチド（ＷＧＥ８０ＧＰＡ、ＤＭＶ）、メイラード反応産物（森永製菓）、ソバ（そば粉、ベストアメニティー）、クロレラ（クロレラ粒、東海緑藻工業）、ウーロン茶（ウーロン茶、伊藤園）、ビフィズス菌（ビフィズス菌末Ｍ−１６Ｖ、森永乳業）、ハチミツ（純粋はちみつ、埼玉養蜂）、椎茸エキス（しいたけエキスパウダー、協和発酵）、のほか食品成分で１９０試料であり、これらは、食品原料となる材料をはじめ、漢方薬に処方されるもの、微生物の破壊物、食品加工時に反応熱で生じる反応産物などである。
【００２１】
まず、各々の４００μｌ試料溶液と２０ｍｌのＥＲＤＦ培地を混合し、０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＬＧＶＲ  ２５  ＬＳ）を用いて、ろ過滅菌した。以下、段階希釈法にて、上記混合液から２ｍｌ採取したものを１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合し、ろ過滅菌したものを０．２％試料溶液とし、この混合液から２ｍｌ採取し、同様に１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合してろ過滅菌したものを０．０２％試料溶液とし、さらに、この混合液から２ｍｌ採取し、１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合したものをろ過滅菌して０．００２％の試料溶液を各々作製した。
【００２２】
Ｂ．免疫賦活液の調製
まず、保存しておいたヒト血漿を３７℃のウォーターバスで解凍した後、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。その後、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＬＨＶＲ  ２５  ＬＳ）を用いてろ過した。ろ過したヒト血漿１ｍｌに、０．１ｍｌのＩＬ−２（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２２０２）、０．１ｍｌのＩＬ−４（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２００４）、０．１ｍｌのＩＬ−６（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２００６）、０．１ｍｌのＭＤＰ（ｓｔｏｃｋ  １ｍｇ／ｍｌ）（Ｃｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＲ００４）、抗原としてＣｅｄａｒ  ｐｏｌｌｅｎ（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（ＬＳＬ  ＬＧ  ５２２９）、０．５ｍｌのＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．５ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、全量を２．５ｍｌとした。
【００２３】
Ｃ．リンパ球懸濁液の作製
まず、−８０℃に保存しておいたリンパ球（１×１０７細胞）を３７℃培養器（アステック社  ＡＣ−１６５）にて解凍した後に５０ｍｌチューブに移し、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地を加えた後、４００×ｇにて常温で５分間遠心分離した。上清を除去した後、２．５ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、リンパ球を懸濁し、４×１０６細胞／ｍｌとなるように調製した。
【００２４】
Ｄ．細胞培養の条件
９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に、Ａ．で調製した試料溶液を１００μｌ、Ｂ．で調製した免疫賦活液を５０μｌ、Ｃで調製したリンパ球懸濁液５０μｌを注入し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒに調整した培養器（アステック社  ＡＣＩ−１６５）内で、１０日間培養した。
【００２５】
細胞回収
上記の９６ウェルプレートの各ウェルからピペットマン（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｐ−２００）を用いて１００μｌずつ上清を回収した。その細胞上清に、５０μｌのトリパンブルー溶液を加え、血球計算盤（ミナトメディカル  ＫＡ−１１５  ビルケンチュルク型）にて生細胞数と死細胞数をカウンター（ライオン事務機  ２２７−０１）を用いて計測した。
【００２６】
実施例３
ＩｇＥ量のＥＬＩＳＡによる測定
【００２７】
１０ｍｌの１５ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．６）、５μｌのヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（タゴバイオソース  ＡＨＩ−１８０１）、５μｌのヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体（タゴバイオソース  ＡＨＩ−１９０１）を混合したものを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に１００μｌ／ウェルになるよう加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、３００μｌ／ウェルとなるようにＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。その後、３００μｌ／ウェルとなるように１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を３００μｌ／ウェルになるように加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。１０００ｎｇ／ｍｌの標準ＩｇＥ溶液から３倍希釈した標準希釈系列（３３３、１１１、３７．０、１２．３、４．１２、１．３７、０．４６、０．１５２ｎｇ／ｍｌ）を作製し、標準希釈系列または回収した培養上清を各々５０μｌ／ウェルになるようにウェルに加え、室温で２時間静置した後、ウェル溶液を廃棄した。その後、３００μｌ／ウェルとなるようにＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。次に、１０ｍｌの１％  ＢＳＡ／ＰＢＳと５μｌのＨＲＰ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＥポリクローナル抗体を混合し、１００μｌ／ウェルになるよう各々のウェルに加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を３００μｌ／ウェルになるように加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。そして４．５ｍｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ  ４．０）（０．１Ｍクエン酸、０．０００３％Ｈ２Ｏ２）に０．５０ｍｇのＡＢＴＳ（Ｗａｋｏ  ０１８  １０３１１）を溶解して作製した液を５０μｌ／ウェルになるように加えた後、プレートリーダー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ．  ＮＪ２３００）にて４１９ｎｍ（Ｓｕｂ．４９０ｎｍ）の吸光度を１５分後、３０分後、４５分後に測定した。各培養上清からのＩｇＥは標準ＩｇＥをプロットした検量線から求めた。生細胞の割合から、ＩｇＥ量の補正を行った。結果の一部を表１に示した。
【００２８】
【表１】
2005013042.tif 000002
表１により、コラーゲンペプチドや蜂蜜などにはＩｇＥ抗体産生抑制効果が２０〜３０％見られた。
【００２９】
実施例４
リンパ球と同一ヒト由来の血漿を用いた場合のＩｇＥ産生
ヒトリンパ球と同じヒト由来の血漿を使用した場合の効果を検討するため、被験者４人から採取したリンパ球と血漿を用いて、上述の手順により、ＩｇＥ抗体産生濃度を測定し、結果を表２に示した。
【００３０】
【表２】
2005013042.tif 000003
表２により、リンパ球と同一のヒト由来の血漿を用いた場合のＩｇＥ産生誘導の効果は、他人由来の血漿を用いた場合に比し高いことが示された。
【００３１】
実施例５
血漿の濃度の検討
上述の試験に用いるヒト血漿についての、最適濃度の検討を行った。培養液に加えるヒト血漿の濃度をそれぞれ０％、５％、１０％、及び２０％として、上述の手順に従って試験を行い、結果を表３に示した。
【００３２】
【表３】
2005013042.tif 000004
表３より、ＩｇＥ産生に最適なヒト血漿濃度は１０％であることが示された。
【００３３】
実施例６
培養スケールの検討
食品成分のＩｇＥ抗体産生抑制効果を確認するための、ＩｇＥ抗体の産生に最適な培養スケールの検討を行った。５％濃度の牛胎児血清及び、１０％濃度のヒト血漿を含むＥＲＤＦ培地中に１×１０６細胞／ｍｌのヒト末梢血リンパ球を懸濁し、ＭＤＰ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｃｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＲ００４）、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２２０２）、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２２０４）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２２０６）、抗原となるコナヒョウダニ抽出物（１００ｎｇ／ｍｌ）（ＬＳＬ社ＬＧ−５３３９）を加えて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ（アステックＡＣＩ−１６５）で１０日間培養した。結果を表４に示した。
【００３４】
【表４】
2005013042.tif 000005
表４に示したように培養培地に種々の免疫賦活剤を加えることによりＩｇＥ抗体が誘導されることを確認した。これにより、２４ウェル、９６ウェル培養プレートのいずれも、免疫賦活剤を加えることにより同等のＩｇＥ抗体が産生されるが、９６ウェル培養プレートの方が、ＩｇＥ抗体産生量の増加割合が高いことが示された。