(57)【要約】【課題】  臨床プロテオミクスの一手法として、疾患関連バイオマーカーとなる蛋白質、あるいは医薬や医薬候補品を投与した場合の生体応答性の指標となる体内蛋白質であるバイオマーカーを調べることは、医薬の開発や適切な使用のために極めて重要な情報となる。本発明の課題は、疾患関連バイオマーカーとなる蛋白質、あるいは医薬や医薬候補品などの化合物を人や動物に投与した場合の尿中の変動する蛋白質をプロファイリングして検出する方法を提供することにある。【解決手段】  疾患患者から採取された尿や化合物が投与された動物あるいは人から採取された尿から、アルブミンを特に中空糸モジュールを用いて除去して得られた尿濃縮画分をさらに分画し、この画分に含まれる蛋白質とポリペプチドのプロファイル作成し、これを対照条件と比較する。これで見出された特徴的な画分中に含まれるバイオマーカーとなる蛋白質を検出する。また、生体が化合物に反応することによって尿中に出現あるいは消失するバイオマーカー蛋白質を検出する。 【選択図】図１ 
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物あるいは人の尿中の蛋白質を検出する方法であって、中空糸膜によって尿からアルブミンを除去して濃縮した後に得られた画分について、蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを比較する蛋白質の検出方法。
【請求項２】
中空糸膜の形態が、モジュール、樹脂やゲルを充填したカラム、ろ過フィルター、遠心分離の少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質の検出方法。
【請求項３】
蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを電気泳動、液体クロマトグラフィー、質量分析装置、マイクロアレイで得ることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛋白質の検出方法。
【請求項４】
蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを得る際に、蛋白質あるいはポリペプチドをラベル化することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の蛋白質の検出方法。
【請求項５】
データベース化された蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルと比較して行う請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質の検出方法。
【請求項６】
化合物の類似性を調べるために、化合物が投与された動物あるいは人から採取された尿からアルブミンを除去して濃縮した後に得られた画分について、蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを比較する蛋白質の検出方法。
【請求項７】
化合物の類似性を調べるための尿の採取時期が、化合物の投与前と、化合物の投与後24時間以内である請求項６に記載の蛋白質の検出方法。
【請求項８】
医薬品を開発するために化合物の類似性を調べる請求項６又は７に記載の蛋白質の検出方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の蛋白質の検出方法で得られた蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを記載したデータベース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人および動物の尿中蛋白質のプロファイリングによる検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日までに開発されてきた医薬品は、個人差を無視して特定疾患に対する平均的集団に対する有効性の統計学的情報を、多様性に富む個人個人の体質や病態に特に関係なく、一律的な用法・用量で使用していると言われている。このため、平均的な患者集団に対する用法・用量で使用された薬剤では、実際には病態や個人差によってその有用性は異なってきて、逆に患者にとっては好ましくない副作用や治療による新たな疾患や障害が起きる場合がある。この危惧は医療経済的な推計でも示されており、たとえば米国では、1994年の処方１発行数約30億に対して約200万人が副作用で入院しており，約10万人が死亡している。これは全米の死因の第4位で、副作用により派生した医療費は約8.4兆円にもなる（非特許文献１）と報告されている。これをそのまま人口比で日本の場合で推定すると、その医療費は約5兆円算出される。このように、結果的に不適切な医薬の使用は、医療経済上も非常に大きな問題となっている。
【０００３】
これに対して、患者個人個人の体質や病態に合った適切な医療である、いわゆるテーラーメード医療が実現すると、このような本来不必要な医療費を削減することができると期待される。テーラーメード医療は、ヒトゲノムが解明されたのを契機に、患者個人個人の遺伝子を解析して特性付けを行うという遺伝子プロファイリングが可能となって実現性が出てきた。特に、体質を規定する遺伝子多型である一塩基多型（1塩基単位の遺伝子多型で、Single Nucleotide Polymorphism＝SNPと呼ばれ、ヒトの場合には約30億個の塩基の1000〜2000個に1個の割合で、SNPが存在するといわれている）の解析によって、薬物の代謝や応答性を調べるファーマコゲノミクス（薬理ゲノミクス、Pharmacogenomics）が大きく進展した。
【０００４】
ファーマコゲノミクスは、ヒトゲノム情報やゲノム解析技術を駆使して、薬剤に対する応答性や代謝に関する遺伝子を網羅的・体系的に研究する方法論であることから、医薬の研究開発や臨床での使用に極めて有用な手法となる。すなわち、探索研究においてはin vitro研究における疾患関連遺伝子や治療関連遺伝子の絞り込みと同定、前臨床段階では各種培養細胞や疾患動物モデルなどにおける薬物の作用と遺伝子発現の関係を、また臨床開発段階では、患者における遺伝子発現プロファイルと薬物の有効性と副作用の程度を対応させることによって、最終的には、個々の患者における薬物応答性、副作用の発現などを予測することができ、患者個人個人に適した用法・用量での適正使用という、本来の薬物療法が目指す使い方が期待できるようになる（非特許文献２）。
【０００５】
このようなファーマコゲノミクスに基づいた利用法の概念に対する特許が2002年に我が国で出願されているが（特許文献１）、学術論文としては、ハイスループットで遺伝子発現や蛋白質のプロファイリングすることが創薬に有用であることが2001年あたりから実験的に検証されながら提唱されている（非特許論文３〜５）。
【０００６】
蛋白質の解析については、臨床プロテオミクスという方法論が提唱され、ファーマコゲノミクスと同様に、疾患における関連蛋白質をプロファイルリングすることが薬物応答性や副作用の予測に重要な手法であることも提唱されている（非特許文献６）。
【０００７】
このように、遺伝子や蛋白質を分析して疾患に関連するバイオマーカー（生物学的な指標）を見出し、それを創薬や治療の指標とする手法は、概念と一部の実験で高い有用性が示唆されているものの、具体的な手法や技術はまだ開発途上にあり、大きな課題となっている。特に、遺伝子発現よりも病態の変動に直接関与すると考えられる疾患関連蛋白質のプロファイリングについては、少量の臨床検体から確実な分析を行う蛋白質の検出方法がまだ十分に確立しておらず、その早期の確立が急務となっている。
【特許文献１】特開２００３-３２５０７６号公報
【非特許文献１】JAMA、1998年
【非特許文献２】辻本豪三著、「感染・炎症・免疫」第32巻、2001年、p.194-199.
【非特許文献３】Lee RT.著，Circulation. 2001 Sep 18;104(12):1441-6.
【非特許文献４】Huang J,X, 他著、Clin Chem. 2001 Oct;47(10):1912-6.
【非特許文献５】Xu XR. 他著、Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 18;98(26):15089-94.
【非特許文献６】Shou J他著、Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Mar 5;99(5):2830-5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、臨床プロテオミクスの一手法として、疾患関連バイオマーカーとなる蛋白質、あるいは医薬や医薬候補品を投与した場合の生体応答性の指標となる体内蛋白質を調べることは、医薬の開発や適切な使用のために極めて重要な情報となる。しかしながら、そのための簡便で確実な手法は世界的に開発段階にあり、未だ確立していない。この確立が、患者側から見て最も適切な医療形態のひとつであるテーラーメード医療の推進のための大きな課題となっている。
【０００９】
本発明の課題は、疾患関連バイオマーカーとなる蛋白質、あるいは医薬や医薬候補品などの化合物を人や動物に投与した場合の尿中の変動する蛋白質をプロファイリングして検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、疾患関連バイオマーカーとなる蛋白質、あるいは医薬や医薬候補品などの化合物を人や動物に投与した場合の尿中の変動する蛋白質を、プロファイリングして検出する方法である。本方法は以下のような構成を成す。
（１）  動物あるいは人の尿中の蛋白質を検出する方法であって、中空糸膜によって尿からアルブミンを除去して濃縮した後に得られた画分について、蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを比較する蛋白質の検出方法。
（２）  中空糸膜の形態が、モジュール、樹脂やゲルを充填したカラム、ろ過フィルター、遠心分離の少なくとも１つであることを特徴とする上記の（１）に記載の蛋白質の検出方法。
（３）  蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを電気泳動、液体クロマトグラフィー、質量分析装置、マイクロアレイで得ることを特徴とする上記の（１）又は（２）に記載の蛋白質の検出方法。
（４）  蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを得る際に、蛋白質あるいはポリペプチドをラベル化することを特徴とする上記の（１）〜（３）のいずれかに記載の蛋白質の検出方法。
（５）  データベース化された蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルと比較して行う上記の（１）〜（４）のいずれかに記載の蛋白質の検出方法。
（６）  化合物の類似性を調べるために、化合物が投与された動物あるいは人から採取された尿からアルブミンを除去して濃縮した後に得られた画分について、蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを比較する蛋白質の検出方法。
（７）  化合物の類似性を調べるための尿の採取時期が、化合物の投与前と、化合物の投与後24時間以内である上記の（６）に記載の蛋白質の検出方法。
（８）  医薬品を開発するために化合物の類似性を調べる上記の（６）又は（７）に記載の蛋白質の検出方法。
（９）  上記の（１）から（８）のいずれかに記載の蛋白質の検出方法で得られた蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを記載したデータベース。
【発明の効果】
【００１１】
本発明における以上の手法によって、人や動物において、疾患関連のバイオマーカーとなる蛋白質あるいは医薬や医薬候補化合物を投与した場合に、その化合物の類似性を尿中蛋白質をプロファイリングから知ることができる。ここで言うプロファイリングとは、変動のある尿中蛋白質とペプチドの種類や存在量あるいはそれらを反映したグロマトグラムや含有蛋白質とペプチドのシグナルピークのパターンなど、尿中蛋白質とペプチドの種類や存在量が特定できる情報を得る作業を指す。これによりバイオマーカーの効率的な同定が可能となるほか、従来細胞や動物を用いて推定していた医薬や医薬候補化合物の薬理学的な分類が可能となる。その結果、疾患の診断や、医薬開発の際の適応症選定や副作用回避に極めて有用な情報を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
疾患に関連して変動するマーカーを健康状態と比較してプロファイリングすることができれば、病気の診断を病態の程度の判定にまで精度を高めることができる。また、医薬や医薬候補となる任意の化合物について、生体に及ぼす作用を薬理学的な観点から統合的に簡便かつ有効にプロファイリングする方法があれば、化合物の投与／非投与との間でそのプロファイルを比較することにより、類似性を導き出し、作用不明の化合物の作用推定や、新たな作用の予測ができる。
【００１３】
これらの方法は、従来は、特定因子に対する臨床検査として行われてきており、一般の臨床診断として、あるいは、いわゆる細胞や動物を用いた薬理学的試験や医薬開発における臨床試験で行われてきており、概念自体は特に新しいものではない。医薬品研究では、薬物の活性部位と薬理学的な作用の関連性を研究する薬物活性相関研究は、そのプロファイリングのための手法のひとつである。その薬物活性相関をデータベースや特定のアルゴリズムでin silicoで解析・予測する手法も従来から行われてきており、ファーマコフォアの解析や設計などにも応用されている。
【００１４】
これらの従来法に加えて、ゲノム解析技術が開発されてからは、疾患や薬物応答に関連する遺伝子の発現をその研究対象として、薬理学的な検討を行うSNP解析を代表とするファーマコゲノミクスがその薬物プロファイリングの予測手段として注目を集めてきた。しかしながら、生体が機能・維持・制御を受ける因子は遺伝子が設計図で機能分子は蛋白質であるため、遺伝子発現解析だけでは十分ではなく、実際に発現された蛋白質のプロファイルを知ることがより重要であることが認識されだした。
【００１５】
疾患における古典的な蛋白質プロファイリングは、従来では、健康診断時の臨床検査に代表されるように、疾患との関連が明らかにされた特定の血清中のバイオマーカーとなる酵素やペプチド成分の個別分析が挙げられる。個別分析であるために、実際の臨床検査では、これらに糖質、脂質、細胞成分、代謝物、mRNA、核酸物質など、多岐にわたる生体成分が組み合わせられ、総合的に評価される場合が多い。手法としては、分光学的な検査や免疫学的な検査ならびに酵素学的な検査等であり、材料としては、臓器、細胞、全血、血清、尿などの生体成分である。これらの検査結果は、単独あるいは複合的に、基準範囲内の数値やパターンと比較され、定量的あるいは定性的に、さらには経験則も加えて総合的に判定され、病的状態の把握、薬物療法の適応性、薬物療法の薬物応答性、副作用や有害事象発現の判定等が行われる。
【００１６】
本発明は、これらの古典的な手法やプロファイリングの概念の提唱のみとは異なり、簡便にして有用性の高いプロファイリング法を用いた蛋白質の検出方法を提供する。すなわち、本発明は下記の要件から構成される。
（１）  動物あるいは人の尿中の蛋白質を検出する方法であって、中空糸膜によって尿からアルブミンを除去して濃縮した後に得られた画分について、蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを比較する蛋白質の検出方法。
（２）  中空糸膜の形態が、モジュール、樹脂やゲルを充填したカラム、ろ過フィルター、遠心分離の少なくとも１つであることを特徴とする上記の（１）に記載の蛋白質の検出方法。
（３）  蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを電気泳動、液体クロマトグラフィー、質量分析装置、マイクロアレイで得ることを特徴とする上記の（１）又は（２）に記載の蛋白質の検出方法。
（４）  蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを得る際に、蛋白質あるいはポリペプチドをラベル化することを特徴とする上記の（１）〜（３）のいずれかに記載の蛋白質の検出方法。
（５）  データベース化された蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルと比較して行う上記の（１）〜（４）のいずれかに記載の蛋白質の検出方法。
（６）  化合物の類似性を調べるために、化合物が投与された動物あるいは人から採取された尿からアルブミンを除去して濃縮した後に得られた画分について、蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを比較する蛋白質の検出方法。
（７）  化合物の類似性を調べるための尿の採取時期が、化合物の投与前と、化合物の投与後24時間以内である上記の（６）に記載の蛋白質の検出方法。
（８）  医薬品を開発するために化合物の類似性を調べる上記の（６）又は（７）に記載の蛋白質の検出方法。
（９）  上記の（１）から（８）のいずれかに記載の蛋白質の検出方法で得られた蛋白質あるいはポリペプチドのプロファイルを記載したデータベース。
【００１７】
従来、疾患との関連で病態によって変動する蛋白質やポリペプチドを分析してプロファイルを得る場合、または任意の化合物投与時に体内で誘導あるいは消失する蛋白質やポリペプチドを分析してプロファイルを得る場合には、主に血液を材料として検討が行われてきており、尿では十分に検討されていない。
【００１８】
正常の腎臓では糸球体基底膜は陰性荷電を帯び、血中の蛋白質の尿への漏出を抑えている。そのため、本来、血液中の蛋白質は腎臓ではろ過されずに尿への排出はほとんど行われない。しかし、腎臓の糸球体や尿細管に障害が起こると、尿中に蛋白質が漏れ出てくる。この場合、通常はアルブミンの増加が指標とされており、蛋白尿は便宜的ににアルブミン尿ともいわれる。従来、腎障害の程度はアルブミン尿の程度で推定しており、早期の腎機能障害では微量アルブミン尿であるが、腎不全に陥ると持続的なアルブミン尿が出現する。そのため、単にアルブミンを代表として蛋白尿の評価をしてるのが一般的であった。そのため、尿中の蛋白質の種類と含有量を網羅的に調べ、疾患との関連性を判定する技術は、未だ確立していない。
【００１９】
血清成分が漏出した尿をそのまま分析するのでは、相対的に大量に存在するアルブミンなどにより目的とする蛋白質がマスキングされ、検出が難しくなってしまう。
【００２０】
それは、疾患と関連すると考えられるバイオマーカーとなる蛋白質やポリペプチドであるペプチドホルモン、インターロイキン、サイトカイン等の生理活性タンパク質の多くは、血清中に極微量 (<ng/mL)にしか存在せず、一方、アルブミン(分子量66kDa)、免疫グロブリン(150〜190kDa)、トランスフェリン(80kDa)、ハプトグロビン(>85kDa)、リポ蛋白質(数100kDa)等であり、いずれも圧倒的に大量(>mg/mL)に存在するためである。この状況は、血清成分が腎臓から漏れ出る場合にも大きく影響すると思われ、尿からの極微量のバイオマーカーとなる蛋白質の検出を難しくしている。
【００２１】
このような状況下で、疾患とバイオマーカーの蛋白質との関連性を議論したり、化合物投与時に誘導あるいは消失するような因子の評価は、アルブミンを除去し、除去後の画分をさらに濃縮して、微量成分を含む蛋白質やポリペプチドのプロファイルを得て初めて可能となる。
【００２２】
たとえば、上記のとおり、極微量成分をスペクトルやチャート上でプロファイルとして検出しようとすると、ナノやピコレベルでは難しくマイクロレベルまでが信頼性の点からも望ましいが、その場合でも、検出されるべき成分は、1000倍から100万倍程度まで濃縮する必要がある。このためには、特にアルブミンを除去してプロファイリングを行う統合的な手法が必要となるが、従来、この点を考慮した蛋白質の検出方法は十分開発されてはおらず、本発明で初めて可能となった。
【００２３】
腎や膀胱、尿路などの疾患では、尿はこれらの臓器と直結した異常を反映できるという利点があるため、これらの臓器の疾患での臨床診断的な価値は大きい。たとえば、腎炎の病態管理や、膀胱癌の有無及び進行度を把握することのできる技術として用いることができる。 
【００２４】
アルブミン除去を主な対象物質として、すでに実用化されている製品あるいは開示されている技術としては、ブルー色素などのアフィニティーリガンドを固定化した担体（たとえば、日本ミリポア社：Montage Albumin Deplete Kit（登録商標）、日本バイオ・ラッド社：AffiGel Blueゲル（登録商標））、高分子量成分を遠心分離ろ過によって分画する遠心管形式の装置（たとえば、日本ミリポア社：アミコンウルトラ（登録商標））、電気泳動原理によって分画する方法（たとえば、グラディポア社：Gradiflow（登録商標）システム）、Cohnのエタノール沈澱などの伝統的な沈殿法やクロマトグラフィーによって分画する方法などがある。しかしこれらは、いずれも分離分画性能が十分ではなかったり、微量サンプルには不適当であったり、サンプルが希釈されてしまったり、その後の分析に障害となる薬剤が混入したり、また濃縮率も低いなどの問題点がある。
【００２５】
本発明で用いる尿からアルブミンを除去・濃縮用の装置としては、中空糸モジュール、樹脂やゲルを充填したカラム、ろ過フィルター、遠心分離器の少なくとも１つであるが、特に中空糸膜は処理液量あたりの表面積が大きく、圧損も少ないなため、除去のための分画と濃縮を最も効率よく用いることができる。中空糸膜の素材は、セルロース、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメタクリレート、ナイロン、ポリエステル、ポリビニルのいずれがひとつの素材からなり、適宜選ぶことができ、さらに膜表面に加工を施して、機能を付与することもできる。中空糸膜で処理する場合、所要時間としては、1回の処理時間が1〜6時間以内と短時間であり、また1回使用のディスポーザブルで行え、再現性の確保、検体のコンタミネーションおよびバイオハザードの防止の点から好ましい。中空糸モジュールは１個で用いても複数個で用いてもよいが、アルブミンの除去効率を高めるためには、複数個用いることが望ましい。
【００２６】
このようにしてアルブミンが除去され、濃縮された分析検体は、それらの処理を行わなかった検体に比べて、微量分析に特に有用で、液体クロマトグラフに供することができる。分解能が高い手法としては2次元に展開する方法が有用で、液体クロマトグラフでは2次元液体クロマトグラフ（2D-LC）や電気泳動では2次元電気泳動装置(2D-EP) などが用いられる。またキャピラリー電気泳動装置も用いられる。
【００２７】
これらでは、定量的に複数種のサンプル間で定性的あるいは定量的な差を見ることが可能で、この点が、薬物の投与前後の比較を行う際に有用である。一方、サンプル中の蛋白質を蛍光物質等でラベル化することにより、定量性をもたせること、また複数種のサンプルをそれぞれ異なる蛍光物質でラベル化して、複数種を混合して2D-LCや2D-EPで分析して、ラベル化蛍光部分の異なる成分を検出すること、も利用できる。あるいは、複数種の分析プロファイルをコンピュータに記憶させ、これらの差を電子的な演算によって検出する手法も利用できる。
【００２８】
差として検出された検体は、さらにMS分析にかけ、含まれる蛋白質のプロファイリングを行うことができるが、ここで用いられるMSは特に限定されず、イオン化法では、気相 (EI,CI) 法、電界脱離（FD）法、マトリクス支援レーザー脱離 (MALDI) 法、エレクトロスプレー (ESI) 法、大気圧化学(APCI) 法、粒子衝撃 (FAB) 法などが、質量分離部は、磁場型、四重極型 (Q) 、飛行時間 (TOF) 型 、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴 (ICR) 型（フーリエ変換で検出するFT-ICR型）などが、それぞれ組み合わせた形で用いられる。質量分析部はタンデム (MSn) で用いることもある。たとえば、好ましくは、LC-ESI/MS/MS、Q-TOF/MS、MALDI-TOF/MS、FT-MSなどが挙げられる。
【００２９】
本発明で言うプロファイルとは、変動のある尿中蛋白質とペプチドの種類や存在量あるいはそれらを反映したグロマトグラムや含有蛋白質とペプチドのシグナルピークのパターンなど、尿中蛋白質とペプチドの種類や存在量が特定できる情報を得る作業を指し、具体的には、上述の一連の分析操作によって得られる、クロマトグラフパターン、電気泳動後のゲルの染色パターン、電気泳動後のゲルの染色後のデンシトリーパターン、質量分析装置のマス・イオン（m/z）スペクトル、ペプチド・マスフィンガープリント(peptide-mass fingerprint: PMF) 等のデータシート自体、データシートから蛋白質やポリペプチドを同定した分子種リスト、同定された分子の含有量リスト等を指す。
【００３０】
このプロファイルを由来の異なる複数の検体間で比較することで、その差異を見出すことができ、その差異を手がかりとして、検体の特徴づけができる。比較する検体としては、健康人とある疾患患者の検体、健常時と病態時の検体、薬物の非投与時と投与時の検体、治療前と治療後の検体などである。
【００３１】
たとえば、健康人とある疾患患者の検体との比較では、その疾患に特有のバイオマーカーを検索し、診断や治療のためのバイオマーカーとして利用することができる。また、薬物投与前と投与後の検体の比較では、薬物の効果や副作用を同時に観察することにより、薬物応答性や副作用発現性に関するバイオマーカーを調べることができる。
【００３２】
このようにして得られた化合物プロファイルは、コンピュータのハードディスクなどの磁気媒体に電子的に記録し、データベースとすることができる。このデータベース上で、類似のプロファイルを呈する化合物を選択することにより、当該化合物の薬理学的な特徴を高精度に推定することができる。
【実施例】
【００３３】
（実施例１−１）  中空糸型分画システムの作製
図１に中空糸分画システムの概図を表した。各番号は装置の構成部品を示し、矢印は液体の流れる方向を示す。分画分子量約5万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸（図１における番号1）を100本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管（同2）に固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュールの直径は約5mm、長さは約15cmである。ミニモジュールは片端に中空糸内腔に連結する入口（同3）があり、反対側の端は出口（同4）となる。中空糸入口と出口はシリコンチューブによる閉鎖循環系流路（同5）であり、この流路内を液体がペリスタポンプ（同6）に駆動されて循環する。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出してきた液体を排出するポート（同7）を備え、１つモジュールセットが構成される。流路途中にT字のコネクター（同8）によって、モジュールを連結でし、3本連結してひとつの中空糸分子分画システムとした。このシステムを蒸留水にて洗浄し、PBS（0.15mM NaClを含むリン酸緩衝液、pH7.4）水溶液を充填した。分画原料の液体はシステムの流路入口（図１において9）から注入され、分画・濃縮後はシステムの流路出口（同10）から排出される。分画濃縮液は、モジュール毎に分子量約5万で分子篩いがかかり、分子量5万よりも低分子の成分はモジュールで濃縮され、調製されるようになっている。
【００３４】
（実施例１−２）  健康成人尿の処理
健康成人より200mL採尿し、分画分子量約5万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸モジュール（外径20ｘ長さ100ｍｍ）で4ｍLまでに濃縮した。次に実施例１−１に示した中空糸分画システムを用いて尿濃縮液を5mL/min、ろ過流量0.2mL/minの流速で20 ℃、3時間濾過し、4ｍLの画分を得た。この時、中空糸分画システムでろ過された容量分はPBSを尿濃縮液に加え、システム内で循環する液量は一定に保った。得られたろ液はアルブミン等の主に分子量5万以上のタンパク質成分が除去された画分であり、このうち約200μgの蛋白質を二次元液体クロマトグラフ（BeckmanCoulter社PF 2D Protein Fractionation System）にかけ、さらに分画した。すなわち2ｍLを1次元目カラム（HPCF-1D）にアプライし、pH8.5-4.0で流速0.2ｍL/minで分画した。さらに得られた画分を2次元目カラム（HRPR-2D）に自動注入し、0.1％トリフルオロ酢酸下、0.75ｍL/minでアセトニトリルで濃度勾配分画した。
【００３５】
（実施例１−３）  ループス腎炎患者尿の処理
ループス腎炎患者より200mL採尿し、実施例１−２と同様の手法で中空糸分画システム及び二次元液体クロマトグラフを行った。あらかじめ、実施例１−２のクロマトグラムをPF2Dのデータ処理パソコンに記憶させ、健康成人のクロマトグラムとループス腎炎患者患者のクロマトグラムのプロファイルを比較し、健康成人のプロファイルに比べて、ループス腎炎患者患者で大きなピークとして認められた蛋白質分画を同定した。
【００３６】
（実施例１−４）  質量分析装置による蛋白質の同定
実施例１−３で得られた画分をSpeedVac真空遠心器で乾固した。各画分に100μLの還元液（10ｍMジチオステイトール、25ｍM重炭酸アンモニウム）を入れ、56 ℃、1時間処理して還元した後、100μLのアルキル化溶液（55ｍMヨードアセトアミド、25ｍM重炭酸アンモニウム）を加え、遮光下で室温45分処理し、アルキル化を行った。さらに脱水液（50％アセトニトリル、25ｍM重炭酸アンモニウム）に置換して、真空乾固した後、トリプシン消化（37 ℃、1晩処理）してペプチド化を行った。これらを分析試料として、質量分析装置Q-Tof Ultima API（Micromass社）を用いて質量分析を行った。得られたイオンピークをMascotデータベース検索にかけ、蛋白質を同定した。その結果、実施例３で得られた画分に含まれている蛋白質は、β2マイクログロブリン、α1マイクログロブリン、インターロイキン6、インターロイキン8であることがわかった。β2マイクログロブリンとα1マイクログロブリンはいずれも腎障害で増加することが知られている蛋白質であり、さらに2種の炎症性サイトカインも同定され、本発明による手法で疾患関連のマーカー蛋白質が一括同定されることが明らかであった。
【００３７】
（比較例１）  中空糸型分画システムを用いない方法による蛋白質の同定
実施例１で作製された中空糸型分画システムを用いずに、健康成人の尿とループス腎炎患者の尿の濃縮液を、それぞれ蛋白質として約200μgを実施例１−２及び実施例１−３で用いた二次元液体クロマトグラフに直接アプライしてクラマトグラムを比較した。その結果、健康成人とループス腎炎患者のクロマトグラフ・プロファイルを比較して、わずかに違いのある画分のみが見出され、蛋白質としてはβ2マイクログロブリンのみが同定された。中空糸型分画システムを用いた場合に比べて、明らかにマーカーとなる蛋白質の数と種類は少なかった。
【００３８】
（実施例２−１）  健康成人および腎不全患者尿の処理
健康成人5名および慢性腎不全患者5名よりそれぞれ200mL採尿し、分画分子量約5万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸モジュール（外径20ｘ長さ100ｍｍ）で4ｍLまでに濃縮した。次に実施例１−１に示した中空糸分画システムを用いて尿濃縮液を5mL/min、ろ過流量0.2mL/minの流速で20 ℃、3時間濾過し、4ｍLの画分を得た。健康成人1名あたり0.8mLを採取して混合し、健康成人群尿とした。同様にして、患者5名から得たものを患者群尿とした。実施例１−１に示した中空糸分画システムを用いて尿を5mL/min、濾過流量0.2mL/minの流速で20 ℃、3時間濾過し、4ｍLの画分を得た。この時、中空糸分画システムで濾過された容量分はPBSを尿に加え、システム内で循環する液量は一定に保った。得られた濾液はアルブミン等の分子量5万以上の蛋白質成分が除去された画分である。
【００３９】
尿の各分画回収溶液を凍結乾燥した後、蛋白質濃度が1μg/μLになるように25mM重炭酸アンモニウム溶液（SIGMA, Cat. A6141-500G）で各々懸濁した。10μg相当のタンパク質を含む各溶液に対して30mM 1,4-ジチオ-DL-スレイトール（Fluka, Cat. 43815）/200mM重炭酸アンモニウム溶液を5μL加え、80℃で20分間反応させた。次に40mMヨードアセトアミド（和光純薬、Cat. 095-02151）/100mM重炭酸アンモニウム溶液を5μL加え、37℃で30分間、遮光条件下で反応させた後、20mM塩化カルシウム（和光純薬、Cat. 039-00475）/100mM重炭酸アンモニウム溶液を80μL加えた。
【００４０】
トリプシン消化は以下の条件で実施した。最初に、20μgのトリプシン凍結乾燥品（Promega、Cat. V5111）に50mM酢酸（付属）を20μLを加えて溶解し、30℃で15分間活性化した後、重炭酸アンモニウム溶液（pH8.2）を80μL加えた。このようにして調整したトリプシン溶液1μLを上述の各蛋白質溶液に加え、37℃で3時間反応させた。この操作を2回繰り返した後、さらにトリプシン溶液1μLを加え、37℃で16時間反応させた後、ギ酸を1μL加えることにより反応を停止させた。
【００４１】
（実施例２−２）  質量分析装置による蛋白質の同定
トリプシン消化物の解析には、DiNaシステム（KYA テクノロジーズ）とQ-Tof ultima（マイクロマス社）を組み合わせた2DLC/MS/MSシステムを用いた。最初に、前述のトリプシン消化物各20μLを強イオン交換カラム（HiQ sil SCX 0.32 mmφ×35 mm、KYA テクノロジーズ）に注入し、素通りした消化物をトラップカラム（HiQ sil C18-3 0.5 mmφ×1 mm、KYA テクノロジーズ）に吸着させた。次にトラップカラムから分離カラム（HiQ sil C18W-3 0.15 mmφ×50 mm、KYA テクノロジーズ）に素通り画分を移動させ、0% アセトニトリル 10分, 0%-7% アセトニトリル 40分, 7%-35% アセトニトリル 70分, 35%-70% アセトニトリル 10分, 70% アセトニトリル 30分, 0% アセトニトリル 20分のグラジェント条件で分離し、オンラインでMS/MS解析を行った。
【００４２】
さらに強イオン交換カラムに吸着したトリプシン消化物を分析するため、酢酸アンモニウム濃度を(1)0mMから50mM、(2)50mMから100mM、(3)500mMの3段階で溶出し、各条件で溶出される消化物をトラップカラムに吸着させた。トラップカラムから分離カラムに各画分を移動させた後、上記のグラジェント条件でMS/MS解析を行った。なお、いずれのMS/MS解析も以下の条件で行った。
Function Parameters - Function 1 - TOF SURVEY FUNCTION
[SURVEY]
Survey Start Mass  400.0
Survey End Mass  1700.0
Survey Start Time  0.0
Survey End Mass  200.0
Survey Scans To Sum  1000000
Survey Ion Mode  ES Mode
Survey Polarity  Positive
Survey Data Format  Continuum
Survey Scan Time  1.0
Survey Interscan Time  0.1
Survey Use Tune Page CV  NO
Survey Cone Voltage (V)  80.0
[MS TO MSMS]
Intensity Threshold  6.0
Window  2.5
Number of components  3
Exclude Retention Time  1.0
Charge State Tolerance Window  0.1
Charge State Extraction Window  2.5
Precursor Selection  Everything
Detected Precursor Inclusion  Include After Time
Include After Time (s)  120.0
Discard survey data  NO
[MSMS TO MS]
Use MSMS to MS Switch Default  NO
Use MSMS to MS Switch After Time  YES
MSMS Switch After Time (sec)  10.0
MSMS to MS Switch Criteria    Intensity Falling Below Threshold
Switchback threshold (counts/second)  2.0
[MSMS TEMPLATE]
MSMS Start Mass  50.0
MSMS End Mass  1500.0
MSMS Data Format  Continuum
MSMS Ion Mode  ES Mode
MSMS Polarity  Positive
MSMS Scan Time (sec)  1.0
MSMS Interscan Time (sec)  0.1
Use Tune Page Cone Voltage  NO
MSMS Cone Voltage (V)  80.0
Use Tune Page Collision Energy  NO
MSMS Collision Energy (eV)  30.0
[INCLUDE]
Use Include Masses List  NO
Include Mass Range
Use Include File Masses  NO
Include Mass Filename
Include Window +/- (mDa)  100.0
Use Include By Charge State  YES
Charge State(s)  2,3
Number Of Include Components  80
[EXCLUDE]
Use Exclude Masses List  NO
Exclude Mass Range
Use Exclude File Masses  YES
Exclude Window +/- (mDa)  100.0
[ADDUCTS]
Use Adduct File Masses  NO
Adduct Filename
[COLLISION ENERGY]
Use Default CE  NO
Use CE Profile  NO
CE Profile Filename
Use Charge State Recognition  YES
Maximum Charge State  3
Charge State 1 Filename  C:\CollisionEnergy\Charge state 1 CE.txt
Charge State 2 Filename  C:\CollisionEnergy\Charge state 2 CE.txt
Charge State 3 Filename  C:\CollisionEnergy\Charge state 3 CE.txt
（実施例３）  データベース検索、およびディファレンシャル解析
実施例１および２で得られたマススペクトル、MS/MSスペクトルデータをマイクロマス社の解析ソフトMassLynxを用いてピークファイルを作成した後、各ステップのピークファイルを統合してMascotデータベース検索を行った。その結果、慢性腎不全患者尿からは250種の蛋白質（Mascotスコア40以上）、健康成人尿からは222種の蛋白質（Mascotスコア40以上）を同定した。そこで患者と健常人の蛋白質データを比較した結果、表1および表２の蛋白質リストのとおり65種の蛋白質（蛋白質番号１から65）が患者で出現し、表３の蛋白質リストのとおり43種の蛋白質（蛋白質番号101から141）が患者で消失していることを見出した。これらはいずれも慢性腎不全患者で特有に変動する蛋白質で病態のプロファイリングに有用であることがわかった。
【００４３】
【表１】
2005315875.tif 000003
【００４４】
【表２】
2005315875.tif 000004
【００４５】
【表３】
2005315875.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の蛋白質分画のための中空糸分画装置の概念図である。
【符号の説明】
【００４７】
1  ポリスルホン中空糸
2  ガラス管
3  中空糸内腔に連結する入口
4  中空糸内腔に連結する出口
5  シリコンチューブによる閉鎖循環系流路
6  送液用ペピスタポンプ
7  液体を排出するポート
8  連結用T字のコネクター
9  分画原料の注入流路入口
10  分画濃縮液の流路出口
【図１】
2005315875.tif 000006