(57)【要約】【課題】  小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制活性を有し、アルツハイマー病などの神経変性疾患、糖尿病改善剤などとして有用な蛋白質(酵素)を有効成分とする医薬組成物、アポトーシス抑制活性を阻害乃至促進する候補物質のスクリーニング系などを提供する。【解決手段】(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび／または(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ標的細胞においてアポトーシス抑制活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)および(b)からなる群から選ばれる少なくとも1種のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物：
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ標的細胞において小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の(c)、(d)および(e)からなる群から選ばれる少なくとも1種のポリヌクレオチドの発現物を有効成分として含有する医薬組成物：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ標的細胞において小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つ標的細胞において小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド。
【請求項３】
小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制剤である請求項1または2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
標的細胞が、神経細胞、神経芽細胞、膵β細胞、肝細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞およびリンパ球からなる群から選ばれるものである請求項1または2に記載の医薬組成物。
【請求項５】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、躁うつ病およびうつ病からなる群から選ばれる疾患の治療剤である請求項1または2に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項1に記載のポリペプチドおよび請求項2に記載の発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制剤。
【請求項７】
処置を要求される患者に請求項1または2に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、躁うつ病およびうつ病からなる群から選ばれる疾患の治療方法。
【請求項８】
被験物質の存在下および非存在下に、下記(a)または(b)のポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニストまたは抑制該作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする、標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法：
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を有するポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度が、核が凝集した標的細胞数を計数し、その数の減少数として求められる請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
被験物質の存在下および非存在下に、以下の(c)、(d)または(e)のポリヌクレオチドの発現物の標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニストまたは該抑制作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする、標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用に対するアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つ標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド。
【請求項１１】
発現物の標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度が、核が凝集した標的細胞数を計数し、その数の減少数として求められる請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
アポトーシスの抑制の程度が、(1)アガロースゲル電気泳動法、(2)パルスフィールド電気泳動法、(3)TUNEL法または(4)フローサイトメトリーによって求められる請求項8または10に記載の方法。
【請求項１３】
以下の(1)〜(5)の工程を含む請求項1に記載のポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制作用を増強する候補物質のスクリーニング方法：
(1)請求項1に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかけてアポトーシスを誘導する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における標的細胞の生存率またはアポトーシス形態の細胞の比率をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下に非形質転換細胞に小胞体ストレス負荷をかけて求められる細胞の生存率またはアポトーシス形態の細胞の比率を基準値として、上記(3)で求められた各値と該基準値との差を求める工程、
(5)候補物質の存在下において求められた差が、非存在下において求められた差と比べて、生存率において大である場合またはアポトーシス形態細胞比率において小である場合に、該候補物質を選択する工程。
【請求項１４】
以下の(1)〜(5)の工程を含む請求項2に記載の小胞体ストレス誘導性アポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチドの標的細胞における発現を増強する候補化合物をスクリーニングする方法：
(1)請求項2に記載のポリヌクレオチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかける工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞のポリヌクレオチドの発現量をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記発現量を、候補物質の存在下における同発現量と対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められた発現量が、非存在下において求められたそれに比して増加している場合に、該候補物質を選択する工程。
【請求項１５】
以下の(1)〜(5)の工程を含む標的細胞における請求項1に記載のポリペプチドの作用を増強する候補物質をスクリーニングする方法：
(1)請求項1に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかける工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞のポリペプチド産生量を該ポリペプチドに対する抗体を用いてそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下において求められた産生量と、候補物質の存在下において求められた産生量とを対比する工程、
(5)候補化合物の存在下における産生量が非存在下におけるそれに比して増加している場合に、該候補物質を選択する工程。
【請求項１６】
標的細胞における請求項1に記載のポリペプチドおよび請求項2に記載の発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種と、小胞体ストレス負荷物とを構成成分として含有することを特徴とする、該ポリペプチドまたは発現物の標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスを抑制する作用に対するアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするためのスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を有する医薬組成物に関する。また、本発明は、小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用を亢進または抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の細胞は、他の真核細胞および原核細胞と同様に、それらの生存を脅かす多様な生理的条件および環境的条件にうまく対処するために、数々のホメオスタティック機構を発達させてきた。なかでも、全生物に普遍的に見られる該機構の一つとして、小胞体関連分解(Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation、以下「ERAD」という)がよく知られている。該ERADは、小胞体内におけるフォールディングされないか、フォールディングを誤った蛋白質の蓄積によるストレス(小胞体ストレス)を軽減する機構の一つである。即ち、ERADは、フォールディングされないか、フォールディングを誤った蛋白質を小胞体外へ輸送し、分解する機構である。
【０００３】
しかるに、小胞体ストレスを受けた哺乳類の細胞は、ERADに拘わらず、細胞死を起こすことがよく知られている(小胞体ストレス応答細胞死)。また、この小胞体ストレス応答細胞死は、神経細胞変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病など）、糖尿病などの疾患と関与することが示唆されている(例えば、非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3など参照)。
【０００４】
小胞体ストレスにより引き起こされる小胞体ストレス応答細胞死を抑制することは、これらの疾患の治療に寄与すると考えられる。それ故、ERADを担う新たな蛋白質、即ち小胞体ストレスの軽減機構に関与する新たな蛋白質を見出すことができれば、この蛋白質は、小胞体ストレス応答細胞死に関連する前記神経細胞変性疾患などの新しい処置に有効であると考えられる。そのような蛋白質は、小胞体ストレス応答細胞死自体の解明、その経路におけるERADによる該細胞死の調節機構の解明などについて、有用な情報を提供する。
【０００５】
本発明者らは、先に、小胞体ストレスにより発現が誘導される小胞体に局在する膜蛋白であり且つERAD関連蛋白質であるユビキチンE3結合酵素HRD1を、培養細胞内で高発現させることで、小胞体ストレス応答細胞死を抑制できることを明らかにした(非特許文献4参照)。
【０００６】
また、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを惹起させる蛋白質として、MAPKKキナーゼ・ファミリーに属する1375個のアミノ酸で構成されるASK1(特許文献1)、小胞体ストレスにより誘導される66個のアミノ酸で構成される小胞体膜蛋白質SERP1(特許文献2)、AIP処理により発現が減少する793個のアミノ酸からなる小胞体ストレスセンサー蛋白質hERRj-1(特許文献3)が報告されている。
【０００７】
このように神経変性疾患、糖尿病を含む細胞変性疾患などの治療のための、新規な小胞体ストレス応答細胞死を抑制することが可能な蛋白質が望まれている。
【特許文献１】国際公開第WO WO02/38179号パンフレット
【特許文献２】特開2000−245474号
【特許文献３】特開2002−335980号
【特許文献４】特開平9-215495号
【非特許文献１】Kudo, T., et.al.,  Ann. N. Y. Acad. Sci., 977: 349-355 (2002)
【非特許文献２】Ryu, E. J., et. al., J. Neurosci., 22 (24): 10690-10698 (2002)
【非特許文献３】Harding, H. P., et al., Diabetes, 51 (3) S455-S461 (2002)
【非特許文献４】Kaneko, M., et al., FEBS Lett., 532: 147-152 (2002)
【非特許文献５】Imai, Y., et al., J. Biol. Chem., 275 (46) : 35661-35664 (2000)
【非特許文献６】Yasojima, K., et. al., B.B.R.C., 231 (2): 481-487 (1997)
【非特許文献７】Lorick, K. L., et. al., P.N.A.S. USA., 96 (20): 11364-11369 (1999)
【非特許文献８】Yamada, M., et. al., B.B.R.C., 278: 150-157 (2000)
【非特許文献９】Kakiuchi, C., et al., Nature Genetics, 1-5 (2003/08/03,オンライン版)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述したように、小胞体ストレス応答細胞死の抑制作用を有する新たな蛋白質乃至これをコードする遺伝子が提供できれば、これらは、小胞体ストレス応答細胞死の経路におけるERADによる調節機構の解明、小胞体ストレス応答細胞死機構の解明、小胞体ストレス誘導性アポトーシス作用の抑制に有用である。また、これらの遺伝子および蛋白質は、その有するアポトーシス抑制作用に基づいて、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患、糖尿病などの細胞変性疾患などの治療および予防剤として期待できる。さらに、これらの遺伝子および蛋白質の利用によって、小胞体ストレス誘導性アポトーシス作用を促進または抑制する候補化合物のスクリーニングも可能となる。
【０００９】
本発明者らは、上記観点から、小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制作用を有する新規な遺伝子の探索を目的として、まず、公共データベースを用いて、ユビキチンE3結合酵素様ドメインを持つ遺伝子の探索を行った。その結果、従来、小胞体ストレス応答細胞死を抑制することが報告されている蛋白質とは異なる、新たなユビキチンE3結合酵素(KF-1と命名)をコードする遺伝子(KF-1遺伝子)を見出した。KF-1は、アルツハイマー患者の大脳皮質において発現していることが報告されている(特許文献4、非特許文献6および非特許文献7参照)。
【００１０】
次いで、本発明者らは、KF-1遺伝子の発現細胞を、カルシウムATPアーゼ阻害薬である「タプシガーギン(thapsigargin)」、N-グルコシド糖鎖合成阻害薬の試薬である「ツニカマイシン(tunicamycin)」などの小胞体ストレス誘導薬剤を用いて処理すると、KF-1の発現量が増加することを見出した。
【００１１】
さらに、本発明者らは、ヒトKF-1安定発現細胞(神経芽細胞)に小胞体ストレスを誘導して、該細胞におけるhKF-1の発現がアポトーシスに対する抑制活性(抗アポトーシス活性)を有することを確認した。
【００１２】
以上のことから、本発明者らは、KF-1が、小胞体ストレス誘導性アポトーシスを抑制するという新しい知見を得た。本発明はこの知見を基礎として更に研究を重ねた結果完成されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、下記項1-16に示される要旨の発明を提供する。
【００１４】
項1．以下の(a)および(b)からなる群から選ばれる少なくとも1種のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物：
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ標的細胞において小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を有するポリペプチド。
【００１５】
項2．以下の(c)、(d)および(e)からなる群から選ばれる少なくとも1種のポリヌクレオチドの発現物を有効成分として含有する医薬組成物：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ標的細胞において小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つ標的細胞において小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド。
【００１６】
項3．小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制剤である項1または2に記載の医薬組成物。
【００１７】
項4．標的細胞が、神経細胞、神経芽細胞、膵β細胞、肝細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞およびリンパ球からなる群から選ばれるものである項1または2に記載の医薬組成物。
【００１８】
項5．アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、躁うつ病およびうつ病からなる群から選ばれる疾患の治療剤である項1または2に記載の医薬組成物。
【００１９】
項6．項1に記載のポリペプチドおよび項2に記載の発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制剤。
【００２０】
項7．処置を要求される患者に項1または2に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、躁うつ病およびうつ病からなる群から選ばれる疾患の治療方法。
【００２１】
項8．被験物質の存在下および非存在下に、下記(a)または(b)のポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニストまたは抑制該作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする、標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法：
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を有するポリペプチド。
【００２２】
項9．ポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度が、核が凝集した標的細胞数を計数し、その数の減少数として求められる項8に記載の方法。
【００２３】
項10．被験物質の存在下および非存在下に、以下の(c)、(d)または(e)のポリヌクレオチドの発現物の標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニストまたは該抑制作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする、標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用に対するアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つ標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド。
【００２４】
項11．発現物の標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度が、核が凝集した標的細胞数を計数し、その数の減少数として求められる項10に記載の方法。
【００２５】
項12．アポトーシスの抑制の程度が、(1)アガロースゲル電気泳動法、(2)パルスフィールド電気泳動法、(3)TUNEL法または(4)フローサイトメトリーによって求められる項8または10に記載の方法。
【００２６】
項13．以下の(1)〜(5)の工程を含む項1に記載のポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制作用を増強する候補物質のスクリーニング方法：
(1)項1に記載のポリペプチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかけてアポトーシスを誘導する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における標的細胞の生存率またはアポトーシス形態の細胞の比率をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下に非形質転換細胞に小胞体ストレス負荷をかけて求められる細胞の生存率またはアポトーシス形態の細胞の比率を基準値として、上記(3)で求められた各値と該基準値との差を求める工程、
(5)候補物質の存在下において求められた差が、非存在下において求められた差と比べて、生存率において大である場合またはアポトーシス形態細胞比率において小である場合に、該候補物質を選択する工程。
【００２７】
項14．以下の(1)〜(5)の工程を含む項2に記載の小胞体ストレス誘導性アポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチドの標的細胞における発現を増強する候補化合物をスクリーニングする方法：
(1)請求項2に記載のポリヌクレオチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかける工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞のポリヌクレオチドの発現量をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記発現量を、候補物質の存在下における同発現量と対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められた発現量が、非存在下において求められたそれに比して増加している場合に、該候補物質を選択する工程。
【００２８】
項15．以下の(1)〜(5)の工程を含む標的細胞における項1に記載のポリペプチドの作用を増強する候補物質をスクリーニングする方法：
(1)項1に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかける工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞のポリペプチド産生量を該ポリペプチドに対する抗体を用いてそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下において求められた産生量と、候補物質の存在下において求められた産生量とを対比する工程、
(5)候補化合物の存在下における産生量が非存在下におけるそれに比して増加している場合に、該候補物質を選択する工程。
【００２９】
項16．標的細胞における項1に記載のポリペプチドおよび項2に記載の発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種と、小胞体ストレス負荷物とを構成成分として含有することを特徴とする、該ポリペプチドまたは発現物の標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスを抑制する作用に対するアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするためのスクリーニング用キット。
【００３０】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(特許庁編)および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００３１】
本明細書において遺伝子とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各1本鎖DNAを包含する趣旨であり、またその長さに制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子(DNA分子)には、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖DNAおよびcDNAを含む1本鎖DNA(センス鎖)並びに該センス鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA(アンチセンス鎖)およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００３２】
また、本明細書において、遺伝子(DNA分子)は、機能領域の別を問うものではなく、発現抑制領域、コード領域、リーダ配列、エキソンおよびイントロンのいずれか少なくともひとつを含むことができる。ポリヌクレオチドには、RNAおよびDNAが含まれる。DNA分子には、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAが含まれる。特定アミノ酸配列を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドには、それらの断片、同族体、誘導体および変異体が含まれる。
【００３３】
ポリヌクレオチドの変異体(変異体DNA)には、天然に存在するアレル変異体；天然に存在しない変異体；欠失、置換、付加および挿入がなされた変異体などが含まれる。但し、これらの変異体は、変異前のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能と実質的に同じ機能を有するポリペプチドをコードするものとする。
【００３４】
ポリペプチドの変異(アミノ酸配列の改変)は、天然において生じるもの、例えば突然変異、翻訳後の修飾などにより生じるものである必要はなく、天然由来の遺伝子(例えば本発明のKF-1遺伝子)を利用して人為的に生じさせたものであってもよい。上記ポリペプチドの変異体は、アレル体、ホモログ、天然の変異体などであって、少なくとも80％、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上が、変異前のポリペプチドと相同するものが含まれる。
【００３５】
変異体DNAは、これによりコードされるアミノ酸についてサイレント(変異した核酸配列によってコードされるアミノ酸残基に変化がない)であるかまたは保存的である。保存的なアミノ酸置換の例を以下に示す。
元のアミノ酸残基          保存的な置換アミノ酸残基
Ala                        Ser
Arg                        Lys
Asn                        GlnまたはHis
Asp                        Glu
Cys                        Ser
Gln                        Asn
Glu                        Asp
Gly                        Pro
His                        AsnまたはGln
Ile                         LeuまたはVal 
Leu                        IleまたはVal
Lys                        Arg, AsnまたはGlu
Met                        LeuまたはIle
Phe                        Met, LeuまたはTyr
Ser                        Thr
Thr                        Ser
Trp                        Tyr
Tyr                        Trp またはPhe
Val                        Ile またはLeu。
【００３６】
一般にCys残基をコードする1またはそれ以上のコドンは、特定ポリペプチドのジスルフィド結合に影響を与える。
【００３７】
蛋白質の特性に変化を与えると一般的に考えられるアミノ酸残基の置換には、以下のものが含まれる。
a) 疎水性残基の親水性残基への置換、例えばLeu、Ile、Phe、ValまたはAlaのSerまたはThrへの置換、
b) CysおよびPro以外のアミノ酸残基のCys またはProへの置換、
c) 電気的陽性側鎖を有している残基、例えばLys、Arg、Hisの、電気的陰性残基、例えば、GluまたはAspへの置換、
d) 非常に大きな側鎖を有しているアミノ酸残基、例えばPheのGlyのような側鎖を有しないアミノ酸残基への置換。
【００３８】
(1)  本発明医薬組成物の有効成分とするポリペプチド
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチド(および本発明スクリーニング方法に利用するポリペプチド)(以下、単に「本発明ポリペプチド」という)は、(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるか或いは(b)該配列番号：1において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用を有するものである。
【００３９】
本発明ポリペプチドは、例えば、ヒト細胞、特にヒト神経細胞、神経芽細胞、膵細胞、膵β細胞、あるいはヒト組織、特に大脳(大脳皮質)、小脳、膵臓、腎臓、肝臓、脾臓、肺、胃、小腸、大腸などを起源とするヒト細胞乃至組織由来ポリペプチドであってもよく、またそのアミノ酸配列情報に従って、化学合成して得られるポリペプチドであってもよい。
【００４０】
本発明ポリペプチドのアミノ酸配列の一具体例としては、配列番号：1で示されるものを例示できる。本発明ポリペプチドのアミノ酸配列は、この配列番号：1で示されるものに限定されず、これと一定の相同性を有するもの(相同物)であることができる。該相同物としては、配列番号：1で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００４１】
上記アポトーシス抑制作用は、より詳しくは、小胞体ストレスによって誘導される細胞のアポトーシスを抑制する作用である。該作用は、結果として、神経細胞や膵β細胞などのアポトーシス(細胞死)を減少させる作用である。該作用はアポトーシスによって生じる細胞変性を抑制または改善する作用、即ち細胞変性抑制作用を含む。尚、前記相同物におけるこの作用は、配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのそれと実質的に同質であればよい。ここで、「実質的に同質」とは、その作用が、生理化学的性質においてまたは薬理学的性質において同質であることを示すものであり、該アポトーシス抑制作用の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００４２】
前記(b)として示す本発明ポリペプチドにおけるアミノ酸の改変、即ち「欠失、挿入、置換または付加」の程度およびそれらの位置は、改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性を有するもの(同効物)であれば、特に制限されない。上記改変の程度は、通常1から数個程度であるのが好ましい。特にこの改変の程度は、アミノ酸配列における相同性が例えば約80％以上、好ましくは約95％以上、より好ましくは約98％以上であるのがよい。
【００４３】
なお、前記(b)として示す改変されたアミノ酸配列からなる本発明ポリペプチドは、アポトーシス抑制作用のほかに、例えば該蛋白質本来の活性(例えば該蛋白質が酵素の場合はその酵素活性)、抗原性および免疫原性活性などにおいても、改変前のアミノ酸配列、即ち配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、実質的に同質であるのが好ましい。
【００４４】
本明細書において、配列番号：1で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび該配列番号：1において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用を有するポリペプチドが有する上記共通する活性を、以下単に「KF-1活性」という。
【００４５】
配列番号：1で表わされるアミノ酸配列からなる本発明ポリペプチドの相同物には、KF-1活性を有する、酵母、線虫、植物組織およびヒト以外の哺乳動物を起源とする蛋白質も含まれる。該哺乳動物としては、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、マウス、ラット、ウサギなどを例示できる。
【００４６】
本発明ポリペプチドの有するアポトーシス抑制作用は、本発明ポリペプチドの発現能を付与した細胞乃至組織に、アポトーシス誘導物質を投与した際、該細胞乃至組織が元の（発現能を付与していない）細胞乃至組織と対比して、アポトーシスを抑制されていることをいう。より具体的には、本発明ポリペプチドの有するアポトーシス抑制作用は、例えばカルシウムATPase阻害剤(タプシガーギン:thapsigargin)、N-グルコシド糖鎖合成阻害薬(ツニカマイシン:tunicamycin)などの小胞体ストレスを誘導する物質により誘導される細胞または組織における小胞体ストレス誘導性アポトーシスに対する抑制作用ということができる。
【００４７】
アポトーシスおよびその抑制作用は、ヘキスト染色した細胞における核の凝集を起こした細胞の数(割合)を指標として、公知の方法、例えばTUNEL法にて測定、検出することができる。また、例えばメチルチアゾール・テトラゾリウムの還元による吸光度の変化を指標とする方法(MTT法)により測定、検出することができる。
【００４８】
より詳しくは、例えば後記実施例に記載するように、Mycエピトープで標識した組換えhKF-1を発現する神経芽細胞（hKF-1発現細胞）に、ツニカマイシンなどの小胞体ストレスを誘導する薬物によって小胞体ストレスを誘導後、ヘキスト染色し、染色された細胞(核の凝集を起こした細胞、アポトーシス細胞)の数(割合)を計測し、この測定値を、非組換え細胞（hKF-1非発現細胞）の同測定値と比較することによって、アポトーシスの抑制の有無を検出することができる。また、アポトーシス細胞は、電子顕微鏡あるいは光学顕微鏡による形態観察によって見分けることができる。即ち、アポトーシス細胞は、細胞の表面微絨毛の消失、核内のクロマチンの凝集、細胞内微細構造の変化などによって検出することができる。
【００４９】
尚、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの相同性は、配列分析ソフトウェア、例えばFASTAプログラムを使用した測定(Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994))によって解析することができる。相同性解析の最も好ましく且つ簡便な方法としては、コンピューターにより読取り可能な媒体(例えば、フレキシブルディスク、CD-ROM、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブ、DVDなど)に配列を記憶させ、ついでその記憶された配列を使用して、よく知られた検索手段に従い既知の配列データベースを検索する方法を例示することができる。既知の配列データベースの具体例には、以下のものが含まれる。
・DNA Database of Japan(DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/);
・Genebank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/web/Genebank/Index.htlm); および
・the European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html)。
【００５０】
相同性解析には多数の検索アルゴリズムが当業者に利用可能である。その一例としては、BLASTプログラムと称されるプログラムが挙げられる。このプログラムには5つのBLAST手段がある。そのうちの3つ(BLASTN、BLASTXおよびTBLASTX)は、ヌクレオチド配列の照会用に設計されたものである。残りの2つ(BLASTPおよびTBLASTN)は、蛋白質配列の照会用に設計されたものである(Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1:543-559 (1997))。
【００５１】
更に追加的なプログラム、例えば配列アライメントプログラム、より遠縁の配列を同定するためのプログラムなどが、同定された配列の分析のために当技術分野において利用可能である。
【００５２】
本発明ポリペプチドの一具体例としては、後述する実施例に示される「hKF-1」と名付けられたPCR産物がコードするポリペプチドを挙げることができる。hKF-1のDNA配列は、配列番号：3に示すとおりであり(全長3423bp)、そのORF(2058bp)によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：1に示すとおりである。即ち、hKF-1は、686アミノ酸配列からなっている(DDBJ アクセッション番号D76444)。
【００５３】
本発明ポリペプチドの他の一つの具体例としては、マウスのKF-1(mKF-1)を挙げることができる。そのDNA配列は、配列番号：6に示すとおりであり(全長3263bp)、そのORF (2052bp)によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：4に示すとおりである。即ち、mKF-1は、684アミノ酸配列からなっている(DDBJ アクセッション番号D76445)。このmKF-1は、アミノ酸レベルでhKF-1と93%の同一性を有しており、95%の類似性を有している。また核酸レベルでは92%の同一性を有している。
【００５４】
hKF-1は、正常人の小脳とアルツハイマー患者由来の大脳皮質にその発現がみられる。また、mKF-1は、小脳、大脳の海馬、中脳および脳下錐体にその発現が認められる。尚、mKF-1については、その遺伝子が、アセチルコリン・レセプター関連蛋白質において見出されたと同じく、カルボキシ末端で亜鉛結合リングフィンガー・モチーフを含むこと(非特許文献6)、該遺伝子のC末端側(540-686番目)のリングフィンガー部位のGST融合蛋白を用いてE2依存ユビキチン・リガーゼ活性の検出が確認されたこと(非特許文献7)、および抗うつ剤の長期投与によりラットの脳においてこの遺伝子の発現が異常に上昇することが確認されたこと(非特許文献8)が報告されている。
【００５５】
特許文献4には、アルツハイマー型痴呆患者の大脳に特異的に発現する遺伝子としてヒトKF-1遺伝子および該遺伝子に相同性を有するマウスKF-1遺伝子を単離したことが記載されている。その5欄にはKF-1蛋白質の機能を抑制する物質あるいはKF-1蛋白質により転写調節を受けている遺伝子の発現産物が、治療薬となる可能性を示唆している。
【００５６】
この特許文献4の記載に反して、本発明はむしろKF-1それ自体がアルツハイマー病、パーキンソン病などにみられる小胞体ストレスによる神経細胞の細胞死を抑制する作用を発揮することをその基礎としている。即ち、本発明は、KF-1(ポリペプチド)が、小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制作用を有し、それ故、本明細書に開示する例えばアポトーシス抑制剤などの医薬組成物として、神経疾患や膵β細胞などの細胞変性疾患などの治療および予防に有効であるという知見、殊に小胞体ストレス誘導性アポトーシスによって生じる各種疾患症状、例えばアルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、Machado-Joseph病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの治療および予防に使用できるという知見を基礎として完成されたものである。
【００５７】
小胞体ストレス誘導と疾患との関連については、近年いくつかの報告が、小胞体ストレスセンサー分子の報告と共になされている。例えば、オヤドマリらは、糖尿病モデルマウスであるAkitaマウスが、その病態形成において小胞体(ER, Endoplasmic Reticulum)ストレス関連アポトーシス因子Chopを膵臓において誘導すること、該Chopの発現誘導は、アポトーシスを誘導し、Chop遺伝子の標的化された阻害は、ヘテロ接合のAkitaマウスにおいて、8-10週まで糖尿病のオンセットを遅らせることを報告している。また、β細胞における過剰な異常蛋白質の蓄積は、ERストレスを起こし、Chopの誘導を通してアポトーシスを誘導することを報告している。更に、ERにおけるChop誘導を抑制することによってまたはシャペロンの容量を上昇させることによって、糖尿病のオンセットを予防するための新しい治療的アプローチを提案している（以上、Oyadomari, S., et al., J. Clin. Invest., 109, 525-532 (2002）参照)。
【００５８】
膵臓のβ細胞は非常に発達した小胞体を有するインスリン産生細胞であり、小胞体ストレスセンサー分子といわれるPERKの異常による小胞体の機能異常は、β細胞の死を伴う膵臓異常と糖尿病を引き起こすことが報告されている（Delepine, M., et al., Nature Genet., 25, 406-409 (2000）参照)。
【００５９】
以上の文献に記載されているように、異常インスリンを生成し糖尿病を発症するマウスでは、異常インスリンが蓄積することによって生じる小胞体ストレスによって、糖尿病が発症し、該小胞体ストレスによって生じるアポトーシスを抑制することによって、膵β細胞の細胞変性による機能異常に起因する糖尿病を抑制できると考えられる。このことから後記実施例に示されるように、小胞体ストレスによって誘導されるアポトーシスの抑制作用を有するKF-1またはKF-1遺伝子発現産物を細胞内に導入・投与することによって、糖尿病の治療や病態の進展抑制を図り得ると考えられる、また、膵β細胞などの標的細胞においてKF-1遺伝子発現を促進させるか、増加させる物質による糖尿病治療薬の開発も期待できる。
【００６０】
特許文献1は、小胞体ストレスによるアポトーシス誘導に関連しているASK1の阻害乃至抑制作用を有する化学物質または該ASK1のセンスオリゴヌクレオチド、このようなヌクレオチドなどを含むベクターで形質転換された宿主細胞が、小胞体ストレスに起因する神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症などの予防および治療剤になり得ることを記載している。
【００６１】
イマイズミらは、小胞体はストレスセンサーを起点として異常蛋白質を排除するためのストレス応答システムを有するが、アルツハイマー病では、このシステムに障害が生じ、異常蛋白質の蓄積と、様々な細胞ストレスに対する抵抗性の低下とから、神経細胞死が惹起されること、およびそれらが変性プレセニン1またはエクソン5欠失型プレセニン2によってもたらされることを報告している（Imaizumi, K., et al., Nature Cell Biol., 3, E104 (1999); Katayama, T., et al., J. Biol. Chem., 276, 43446-43454 (2001); 細胞工学、21(4), 382-388 (2002)等参照）。
【００６２】
ハンチントン夢踏病、Machado-Joseph病に代表されるポリグルタミン病と、小胞体ストレス誘導との関係について、西頭らは、マウス初代培養神経細胞にアデノウイルスを用いてポリグルタミン蛋白質を発現させる実験系によって、小胞体ストレスセンサー分子といわれるIRE1, PERKの活性上昇と、小胞体ストレス時に発現誘導が起こる遺伝子といわれているBip, CHOPの発現誘導を確認し、小胞体ストレスが惹起されていることを示すと共に、ASK1-JNK経路が強く活性化されていること、またポリグルタミン凝集塊の蓄積によって比較的穏やかな時間経過で細胞内プロテアソーム活性が抑制され、該活性の持続的な抑制が小胞体ストレスを誘導し、前記と同様に、ASK1-JNK経路が強く活性化されることを示している。ポリグルタミン病においても、ポリグルタミン蛋白質が小胞体ストレスを介して神経細胞死を引き起こすと推察している（西頭英起、細胞工学、21 (4), 377-381 (2002)参照）。
【００６３】
家族性パーキンソン病の原因遺伝子parkinは、小胞体内の異常蛋白質を分解する機構を担っており、小胞体ストレス由来の細胞死に関与するとされている。また、家族性アルツハイマーの原因遺伝子プレセニリン-1 (presenilin-1)、プレセニリン-2 (presenilin-2)が小胞体ストレス由来の細胞死に関与することも報告されており、プレセニンの変異は、小胞体ストレスへの感受性を高め（前記イマイズミらの文献参照）、これによって、神経細胞の細胞死がこれらの疾患を引き起こす。即ち、アルツハイマー病、パーキンソン病は、神経細胞の細胞変性による機能異常に起因すると考えられる。
【００６４】
今居らは、常染色体劣性若年性パーキンソン病の原因遺伝子とされるparkinが異常蛋白質による神経系培養細胞(SH-SY5Y細胞、分化させるとドーパミン産生能を有する)の細胞死を抑制することを報告している（Imai, Y., et al., Cell, 105, 891-902 (2001)参照）。またparkinの基質の一つであるパエルレセプター(pael receptor)は、小胞体ストレスの原因である小胞体での蛋白質の異常なフォールディングを起こしやすい特性があり、parkinは小胞体ストレス条件下における小胞体内において凝集したパエルレセプターによる細胞死を抑制する事実から、parkinの活性喪失によって基質蛋白質であるパエルレセプターの小胞体への蓄積、引き続くドーパミン神経細胞の小胞体ストレス暴露によってアポトーシスが誘導されて細胞死が生じ、パーキンソン病が発症するという仮説を提唱している（今居譲、高橋良輔、細胞工学、21 (4), 389-394 (2002)参照）。
【００６５】
また、XBP1は、小胞体膜貫通蛋白質ATF6の下流にある蛋白質で、小胞体に構造の異常な蛋白質が蓄積した場合、それらの正常化を促す役割を果たしているとされ、細胞の危機管理システムの中心を担う転写因子と考えられており、垣内らは、該XBP1の遺伝子のプロモーター部分の変異が、躁うつ病の患者で多く見られることを明らかにしている。そして、双極性障害(躁うつ病)を有する双子の患者における該遺伝子の発現を解析した結果、XBP1遺伝子はヒト前頭葉外皮で高発現するものであるが、発病した双子では該XBP1遺伝子の発現が低下しており、このXBP1遺伝子の発現低下によって、危機管理機構が作動せず、細胞内環境の正常化が妨げられ、この変異が体内の情報伝達機構を損なう原因となり、双極性障害に罹患する確率を上げると推定している。さらに既存の3種類の躁うつ病治療薬のうち、XBP1プロモーター領域の多型による該遺伝子の発現低下に効果があるものを調べたところ、リチウム製剤、カルマバゼピン、バルプロ酸のうち、バルプロ酸だけがXBP1発現低下に伴う情報伝達の異常を改善することを報告している(非特許文献9参照)。
【００６６】
以上のように、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症、うつ病、躁うつ病などの発症と小胞体ストレスによる神経細胞の細胞死との関係が、それらに関与する小胞体ストレスセンサー分子と共に報告されており、本発明におけるKF-1の作用は、該KF-1自体がこのような神経細胞の細胞死を抑制して、上記各種の疾患の治療、予防に有用であることを示唆している。
【００６７】
(2)  本発明ポリペプチドをコードする遺伝子
本発明ポリペプチドをコードする遺伝子(以下、「本発明遺伝子」という)の一具体例としては、配列番号：2で示されるDNA配列またはその相補鎖を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子を挙げることができる。
【００６８】
他の本発明遺伝子(ポリヌクレオチド)には、上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用を発現可能なポリヌクレオチドが包含される。ここで「ストリンジェントな条件」とは、0.1％SDSを含む0.2×SSC中、50℃でハイブリダイズし、0.1%SDSを含む1×SSC中、60℃での洗浄によっても脱離しない条件を挙げることができる。
【００６９】
更に他の本発明遺伝子(ポリヌクレオチド)には、上記ポリヌクレオチドと80%以上、好ましくは95％以上、より好ましくは約98％以上、相同するDNA配列からなり且つアポトーシス抑制作用(特に小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用)を発現可能なポリヌクレオチドが含まれる。
【００７０】
これらのポリヌクレオチド(以下、「改変体」ということがある)は、アポトーシス抑制作用(特に小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用)を発現可能であることをその必須の要件とする。該要件は、換言すれば、これらのポリヌクレオチド(改変体)を挿入した組換え体発現ベクターで形質転換した形質転換体が、その発現物として、KF-1乃至アポトーシス抑制作用(特に小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用)を有する蛋白を発現できることである。
【００７１】
上記改変体には、配列番号：1に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列(改変されたアミノ酸配列) をコードするDNA配列を含む遺伝子が包含される。該改変体は、その利用によって改変前の本発明遺伝子が検出できるものであってもよい。
【００７２】
本発明遺伝子には、更に、配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド(KF-1遺伝子)の相同物も包含される。ここで「KF-1遺伝子の相同物」とは、KF-1遺伝子と配列相同性を有し、構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性および生物学的機能の類似性より、ひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味する。これにはKF-1遺伝子のアレル体(対立遺伝子)も含まれる。
【００７３】
アミノ酸配列の改変(変異)などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることがある。また天然由来の遺伝子(例えば本発明のKF-1遺伝子)に基づいて人為的に改変することもできる。本発明遺伝子は、このような改変、変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含する。
【００７４】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座1「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法；リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法が例示できる。より具体的には、DNAの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該相補鎖を化学合成した一本鎖とアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて該相補鎖を化学合成した一本鎖に付加することによって得ることができる。
【００７５】
本発明遺伝子(例えばヒトKF-1遺伝子)の具体的一態様である配列番号：2で示されるDNA配列を有する遺伝子のDNA配列は、配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの各アミノ酸残基をコードする各コドンの一つの組合せ例である。本発明遺伝子は、かかる特定のDNA配列を有するDNA分子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択したDNA配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができる。その際には例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００７６】
(3)  本発明遺伝子の製造
本発明遺伝子は、本明細書に開示された本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編(1986)など参照〕。
【００７７】
該製造は、具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択して実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００７８】
上記において、cDNAの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示することができる。これら起源からの全RNAの分離、mRNAの分離および精製、cDNAの取得およびそのクローニングなどは、いずれも常法に従って実施することができる。また、mRNAまたはcDNAライブラリーは市販されている。本発明遺伝子の製造は、それら市販のmRNAまたはcDNAライブラリー、例えばクローンテック社(Clontech Lab.Inc.)などより市販の各種mRNAまたはcDNAライブラリー、特にヒトの小脳またはアルツハイマー患者由来の大脳皮質のmRNAまたはcDNAライブラリーを用いて実施することもできる。
【００７９】
本発明遺伝子をcDNAのライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的方法としては、例えばcDNAによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するcDNAクローンを選択する方法、目的のDNA配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法など、およびこれらの組合せを例示することができる。
【００８０】
上記において用いられるプローブとしては、本発明遺伝子のDNA配列に関する情報をもとにして化学合成されたDNAなどが一般的である。また、既に取得された本発明遺伝子およびその断片も上記プローブとして有利に利用できる。更に、本発明遺伝子のDNA配列情報に基づき設定したセンス・プライマーおよびアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００８１】
プローブとして用いられるヌクレオチドは、配列番号：2に対応する部分ヌクレオチドであって、少なくとも15個の連続したDNA、好ましくは少なくとも100個の連続したDNA、より好ましくは少なくとも150個の連続したDNA、最も好ましくは少なくとも200個の連続したDNAを有するものである。前記した本発明遺伝子の製造のための陽性クローン自体もプローブとして用いることができる。
【００８２】
本発明遺伝子の取得に際しては、PCR法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるDNA/RNA増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のcDNAが得難い場合には、RACE法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に5'-RACE法〔M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。
【００８３】
PCR法の実施の際に用いられるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定し、常法に従って合成することができる。尚、PCR法で増幅させたDNA/RNA断片の単離精製は、常法に従い例えばゲル電気泳動法などによって実施することができる。
【００８４】
上記で得られる本発明遺伝子或いは各種DNA断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕、マキサム-ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、そのDNA配列を決定することができる。
【００８５】
(4)  本発明ポリペプチドの遺伝子工学的製造
本発明ポリペプチド(発現物)は、本発明遺伝子を利用して、通常の遺伝子工学的手法（例えばScience, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など）に従って、該遺伝子の発現物としてまたはこれを含む蛋白質として、容易に、大量に且つ安定して製造することができる。より詳細には、所望の蛋白質をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えDNA(発現ベクター)を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的蛋白質を回収することにより、本発明ポリペプチド(発現物)を得ることができる。
【００８６】
本発明は、本発明遺伝子によってコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの製造のための、例えば本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して本発明ポリペプチドを製造する方法などをも提供する。
【００８７】
上記において、宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。例えば原核生物の宿主は、大腸菌、枯草菌などの一般的に用いられるもののいずれでもよい。好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12株を利用できる。真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母などの細胞が含まれる。前者としては、例えばサルの細胞であるCOS細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００８８】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびSD(シャイン・アンド・ダルガーノ)配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン(例えばATG)を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばpGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech社)、pMAL-C2，pMAL-P2(New England Biolabs社)、pET21，pET21/lacq(Invitrogen社)、pBAD/His(Invitrogen社)などを例示できる。
【００８９】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばSV40の初期プロモーターを保有するpSV2dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕などが例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるベクターの市販品としては、例えばpEGFP-N，pEGFP-C(Clontrech社)、pIND(Invitrogen社)、pcDNA3.1/His(Invitrogen社)などの動物細胞用ベクター、pFastBac HT(GibciBRL社)、pAcGHLT(PharMingen社)、pAc5/V5-His，pMT/V5-His，pMT/Bip/V5-his(以上Invitrogen社)などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００９０】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するpAM82〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばpPICZ(Invitrogen社)、pPICZα(Invitrogen社)なとが包含される。
【００９１】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどを例示できる。
【００９２】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白として発現させるためのpGEX(Promega 社)などを例示できる。
【００９３】
また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列などが例示できる。これらの配列には、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)・タグが含まれる。
【００９４】
所望の組換えDNA(発現ベクター)の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００９５】
得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産(蓄積、分泌)される。
【００９６】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００９７】
かくして得られる組換え蛋白質(本発明ポリペプチド)は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第1版第1刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
【００９８】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理(塩析法)、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明ポリペプチドに対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００９９】
尚、本発明ポリペプチドをコードする遺伝子の設計に際しては、配列番号：2に示されるKF-1遺伝子のDNA配列を利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
【０１００】
また、KF-1遺伝子によりコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基乃至アミノ酸配列を置換、挿入、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法を採用することができる。
【０１０１】
(5)  本発明医薬組成物の有効成分とするDNA分子の発現物
本発明医薬組成物において有効成分とする特定のDNA分子の発現物(および本発明スクリーニング方法に利用する同発現物)(以下、単に「本発明発現物」という)は、前記(4)に示す遺伝子工学的手法により得ることができる。
【０１０２】
本発明発現物のアポトーシス抑制作用は、前記(1)項に記載した本発明ポリペプチドのアポトーシス抑制作用と同義である。この抑制作用の検出は、前記(1)項に示したように、公知の方法によって行うことができる。
【０１０３】
更に詳しくは、アポトーシスおよびその抑制作用の検出は、例えば(1)DNAのヌクレオソーム単位で切断された断片をDNAラダーとして検出するアガロースゲル電気泳動法、(2)数十bpから数百キロbpの高分子DNA断片を生じるアポトーシスを検出するパルスフィールド電気泳動法、(3)組織内のアポトーシス検出のためにDNA切断端を検出するTUNEL法（Gavrieli, Y., et al., J. Cell Biol., 119, 493-501 (1992)）、(4)蛍光色素を用いて細胞染色後、細胞サイズの変化やDNA含有量低下細胞を検出する方法、(5)蛍光色素を用いて細胞染色後、生死細胞の検出などをフローサイトメトリーで行う方法などによって実施することができる。また、アポトーシスに特徴的な活性化型カスパーゼの活性を標識基質の切断量で測定するか、或いは活性化型カスパーゼを特異的に認識する抗体を用いて該活性化型カスパーゼ自体の量を測定する方法によっても、アポトーシス作用及びその抑制作用を検出することができる。該方法の詳細は、例えばCaspSELECT Caspase immunoassay Kits (Bio Vison社製)を参照することができる。
【０１０４】
また、細胞の生死の判定は、細胞染色色素を用いて生死細胞を染め分ける分染法；酵素活性測定法；MTT法；細胞からの遊離51Crを測定するラジオアイソトープ法；コロニー形成法などの公知の各種方法に従って実施することができる。これらの方法によってもアポトーシス抑制作用を検出できる。上述したアポトーシスおよびその抑制作用の検出方法の詳細については、辻本賀英ら,「最新アポトーシス実験法」(羊土社、東京、1995年)；Yamada, H., Surgery Frontier, 3, 119 (1996)などを参照することができる。
【０１０５】
尚、細胞染色のための蛍光色素としては、公知の各種の色素、例えば「Hoechst33342」、「DAPI」、「Calcein-AM」、FDA(Fluorescein diacetate)、CFSE、プロピジウム・イオジド(Propidium iodide :PI)、エチジウム・ブロマイド(Ethidium bromide :EB)を使用することができる。
【０１０６】
(6)  本発明ポリペプチドの化学合成
本発明ポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することもできる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
【０１０７】
ペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明ポリペプチドの合成は、そのいずれによってもよい。
【０１０８】
ペプチド合成に採用される縮合法も常法に従うことができる。例えばアジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA(ジフェニルホスホリルアジド)法、DCC＋添加物(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、N-ヒドロキシサクシンアミド、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドなど)法、ウッドワード法などに従うことができる。
【０１０９】
これら各方法に利用される溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることの知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【０１１０】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第3級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、p-メトキシベンジルエステル、p-ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
【０１１１】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第3級ブチル基などで保護してもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、p-メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン-2-スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【０１１２】
保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明ポリペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア/ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【０１１３】
かくして得られる本発明ポリペプチドは、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製することができる。
【０１１４】
(7)  本発明医薬組成物
本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチドおよび本発明発現物を有効成分とする。該医薬組成物は、例えば小胞体ストレスによって誘導されるアポトーシスの抑制剤として、また該アポトーシスによって生じる神経細胞、膵β細胞などの細胞変性に対する改善剤として有用である。また、上記アポトーシス抑制剤および細胞変性改善剤としての作用を利用して、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などに対する治療剤および予防剤としても有用である。
【０１１５】
より詳しくは、本発明医薬組成物において有効成分とする本発明ポリペプチドおよび本発明発現物(例えばKF-1)は、それらに特有の小胞体ストレスによって誘導されたアポトーシスを抑制する作用を有しており、この作用乃至活性を利用して、各種細胞のアポトーシスおよび細胞変性に関連する疾患の処置に利用することができる。かかるアポトーシスの影響を受ける細胞としては、神経細胞、神経芽細胞、膵β細胞、肝細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、リンパ球などを挙げることができる。これらの細胞を含む重要な組織としては、小脳、大脳皮質、中脳、脳下垂体、膵臓、胃、小腸、肺、肝臓、腎臓、大腸、特に小脳、大脳皮質、脳下垂体、膵臓などを挙げることができる。上記細胞の具体例には、ニューロブラストーマ、グリオーマ細胞、その他の神経細胞、例えばN2aSK-N-SH細胞(ATCC No. HTB-11)、N18TG-2, IMR-32 (ATCC No. CCL-127)、GOTO、NBI、C6BU-1、U251、KNS42、KNS81、NG108-15細胞、PC12細胞(ATCC No. CRL-1721)などが含まれる。またヒト胎児腎臓由来細胞HEK293T細胞も上記細胞の具体例に包含される。
【０１１６】
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチド(発現物)には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明ポリペプチド(発現物)と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩(トシレート)、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナプシレートなどが例示される。
【０１１７】
本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチド(発現物)およびそれらの塩を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な医薬担体ないし希釈剤と共に含有させて医薬製剤形態に調製される。
【０１１８】
該医薬製剤の調製に利用される医薬担体としては、製剤形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。特に好ましい医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用される各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、pH調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【０１１９】
上記において安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のL-アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１２０】
L-アミノ酸としては、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【０１２１】
糖類としても、特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類；マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール；ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類；デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などを使用できる。
【０１２２】
界面活性剤としても、特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。その具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１２３】
セルロース誘導体としても、特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１２４】
上記糖類の添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.01-10mg程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.0001-0.01mg程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.001-0.1mg程度の範囲とするのが適当である。L-アミノ酸の添加量は、有効成分1μg当り約0.001-10mg程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.001-0.1mg程度の範囲とするのが適当である。
【０１２５】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、製剤中に約0.00001-70重量％、好ましくは0.0001-5重量％程度が含まれる量とするのが適当である。
【０１２６】
本発明医薬製剤中には、また各種の添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε-アミノカプロン酸、グルタミン酸および/またはそれらに対応する塩(例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)などを例示できる。など張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１２７】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として調製できる他に、これを凍結乾燥し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製される凍結乾燥剤形態とすることも可能である。
【０１２８】
本発明医薬製剤の投与単位形態は、治療目的に応じて適宜選択できる。その代表例には、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態および溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１２９】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１３０】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、1日当り体重1kg当り、約0.01μg-10mg程度、好ましくは約0.1μg-1mg程度とするのがよく、該製剤は1日に1-数回に分けて投与することができる。
【０１３１】
(8)  遺伝子治療
後記実施例に示すように、本発明遺伝子(KF-1遺伝子)の発現は、小脳、中脳、脳下垂体、膵β細胞、アルツハイマー患者由来大脳皮質などの組織において認められることから、本発明にかかるKF-1遺伝子のセンスDNAの全部または一部は、これを直接またはこれを含む任意の遺伝子発現ベクターの形態で、小脳、膵臓などの組織細胞内にウイルスやリポソームを利用して導入することによって、該細胞内で相補的配列を有するRNAを作り出し、翻訳を促進することによって強制的にKF-1遺伝子の発現を増加させることができる。かくして、小脳、膵臓などの組織におけるアポトーシスを抑制し、結果としてアポトーシスによって生じる細胞変性または細胞死を抑制して、アポトーシスによって生じる細胞変性または細胞死に関連した疾患の病態進展を抑制または改善することができる。このような作用によって、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの進展の抑制または改善に利用することができる。本発明は、このようなアポトーシス抑制作用を有する遺伝子治療用組成物或いは遺伝子治療剤をも提供する。
【０１３２】
本発明は、上述したように、KF-1遺伝子の全部または一部を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりKF-1遺伝子を導入した細胞を有効成分とする医薬組成物を提供する。より詳しくは、本発明は、配列番号：2で示されるDNA配列のセンスDNAの全部または一部の配列を含むセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりセンス遺伝子を導入した細胞並びに該遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりセンス遺伝子を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤を提供する。なお、上記および以下において「一部の配列」とは、アポトーシス抑制活性を発現し得る配列を含む部分配列を意味する。
【０１３３】
また、本発明は、配列番号：2で示されるDNA配列のセンスDNAの全部または一部の配列を含むセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりセンス遺伝子を導入した細胞を、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの患者の骨格筋細胞または筋肉組織部位に投与することによって、これら組織におけるアポトーシスによって生じる細胞変性を抑制または改善し、上記各疾患における病態の進展を抑制または改善する方法、即ち細胞変性改善方法、特にアポトーシス抑制方法を提供する。
【０１３４】
以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。尚、以下の遺伝子治療の実施においては、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、遺伝学および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。これらは、例えばマニアティス(Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982))、サムブルック(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981))、アウスベル(Ausbel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, (1992))、グローバー(Glover, D., DNA Cloning, I and II (Oxford Press) (1985))、アナンド(Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, Academic Press (1992))、グスリー(Guthrie, G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press (1991))およびフィンク(Fink, et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19(1992))などに記載されている。
【０１３５】
本発明遺伝子治療は、KF-1遺伝子を発現する細胞において、細胞内のmRNAに対して相補的配列を持つRNAを作り出し、翻訳を阻害し、KF-1遺伝子の発現を抑制するためのセンス医薬によるアポトーシスの抑制方法、特に小胞体ストレス誘導により生じたアポトーシスの抑制方法、または細胞もしくは組織における細胞変性の抑制方法を含む。該治療法は、例えばKF-1遺伝子の発現が低下しているかもしくは著しく低下しているKF-1遺伝子発現細胞に対して、KF-1発現細胞本来の量もしくは過剰量のmRNAを提供することによって、転写或いは翻訳の過程を亢進させて、標的とする遺伝子の発現を増加させる方法である。該方法においては、標的遺伝子のmRNAと相補的なセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該センス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する。このように、KF-1遺伝子の発現機能を促進する作用を標的細胞に供給すれば、受容細胞/標的細胞におけるアポトーシスを抑制することができ、また細胞変性を抑制することができる。
【０１３６】
上記センス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する具体例としては、センス・オリゴヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを標的細胞に導入してその染色体外に該センス・オリゴヌクレオチドを維持する方法を挙げることができる。
【０１３７】
本発明に係わるセンス・オリゴヌクレオチドを用いたアポトーシスの抑制作用に基づく細胞変性抑制の遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、AAV由来のベクターなどにセンス・オリゴヌクレオチドを組み込み、これをKF-1発現細胞に感染させて、センス・オリゴヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望のアポトーシス抑制作用を増加または亢進させることができ、かくしてアポトーシス抑制効果あるいは細胞変性抑制効果を得ることができる。
【０１３８】
KF-1遺伝子を有する標的細胞に、センス・オリゴヌクレオチドを導入してKF-1の発現を抑制させる場合、当該センス・オリゴヌクレオチドは、KF-1遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、KF-1遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、例えば前記した改変体であっても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺伝子であってもよい。
【０１３９】
センス・オリゴヌクレオチドのベクターへの組み込みおよび標的細胞染色体外維持の双方のための、所望遺伝子導入用ベクターとしては、当該分野において既に知られている各種のベクターをいずれも使用することができる。該ベクターは、例えば発現制御エレメントに連結したKF-1のセンス・オリゴヌクレオチドのコピーを含み、かつ標的細胞内で当該センス・オリゴヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。その具体例としては、例えば米国特許第5252479号明細書およびPCT国際公開WO93/07282号パンフレットに開示された発現ベクター(pWP-7A、pwP-19、pWU-1、pWP-8A、pWP-21および/またはpRSVL)、pRC/CMV(Invitrogen社製)などを用いて調製されたベクターを挙げることができる。好適なベクターは後述する各種ウイルス・ベクターである。
【０１４０】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【０１４１】
その具体例としては、例えば、脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン、チロシンヒドロキシラーゼ膵臓ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示することができる。
【０１４２】
甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示することができる。
【０１４３】
骨に対しては、α1コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示することができる。
【０１４４】
腎臓に対してはレニン、肝臓/骨/腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを例示することができる。
【０１４５】
膵臓に対しては、アミラーゼ、PAP1などを例示することができる。
【０１４６】
小腸に対しては、ビリン、ラクターゼ、アデノシンデアミダーゼ、カルビンディニン、小腸脂肪酸結合蛋白質、ナトリウムブドウ糖共輸送体などを例示することができる。
【０１４７】
大腸に対しては、コロンカルボン酸脱水素酵素などを例示することができる。
【０１４８】
肝臓に対しては、アルブミン、α-フェトプロティン、α1-アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示することができる。
【０１４９】
結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼI、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示することができる。
【０１５０】
子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームP450、コレステロール側鎖切断P450、17アルファーヒドロキシラーゼP450などを例示することができる。
【０１５１】
前立腺に対しては、前立腺抗原、gp91-フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示することができる。
【０１５２】
乳房に対しては、erb-B2、erb-B3、β-カゼイン、β-ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示することができる。
【０１５３】
肺に対しては、活性剤蛋白質Cウログロブリンなどを例示することができる。
【０１５４】
皮膚に対しては、K-14-ケラチン、ヒトケラチン1または6、ロイクリンなどを例示することができる。
【０１５５】
なお、センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、導入されるセンス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子に対応する相補配列の全部または一部)は、KF-1遺伝子のDNA配列情報に基づいて、前記したように一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することができる。
【０１５６】
センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの標的細胞への導入は、細胞にDNAを導入する当該分野において既に知られている各種の方法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などに従って行うことができる。KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態でアポトーシス抑制作用または細胞変性を抑制するための医薬品として、また治療研究のためのモデル系として利用することもできる。
【０１５７】
センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより、患者の標的細胞内に導入することができる。全身的投与によれば、KF-1mRNAが発現し得るいずれの細胞にも所望のベクターを到達させ得る。形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれないような場合には、該投与を定期的に繰り返すことができる。
【０１５８】
本発明の遺伝子治療方法は、センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを直接体内に投与するインビボ(in vivo)法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して、体外で遺伝子を導入し、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ(ex vivo)法の両者を包含する。
【０１５９】
本発明遺伝子治療は、特にアポトーシスによって生じる細胞変性疾患患者を対象とするアポトーシスの抑制として利用されるのが好ましい。また、本発明遺伝子治療(処置)は、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病とそれらの合併症などの治療を対象とすることもできる。更に、本発明は、遺伝子治療に限らず、例えば遺伝子標識をその目的とすることもできる。
【０１６０】
センス・オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療(処置)の対象により適宜選択することができる。該標的細胞としては、KF-1の発現が認められる各種の細胞およびその集合体である組織、特に小脳、大脳皮質、脳下垂体、肝臓、膵臓、肺、小腸組織、リンパ球、神経細胞、神経芽細胞、膵β細胞、脂肪細胞、肝細胞、繊維芽細胞、粘膜上皮細胞、造血幹細胞、表皮系細胞などを挙げることができる。
【０１６１】
遺伝子治療におけるセンス・オリゴヌクレオチドの導入方法には、ウイルス的導入方法と非ウイルス的導入方法が含まれる。
【０１６２】
ウイルス的導入方法としては、例えばKF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、HIV(human immunodeficiency virus)ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV, adeno-associated virus)、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、エプスタイン-バーウイルス(EBV, Epstein-Barr virus)ベクターなどが挙げられる。
【０１６３】
非ウイルス的導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；DNAを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスとを融合させて膜融合リポソームを作成し、これを細胞膜に直接融合させてDNAを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Kato, K., et al., J. Biol. Chem., 266, 22071-22074 (1991)〕；プラスミドDNAを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にDNAを導入する方法〔Yang, N. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 9568-9572 (1990)〕；プラスミドDNAを直接インビボで臓器や標的組織に注入するネイキッド(naked)DNA法〔Wolff, J. A., et al., Science, 247,1465-1467 (1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあゆみ, Vol.175, No.9, 635-637 (1995)〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをDNAと結合させてそれを投与するリガンド-DNA複合体法〔Frindeis, et al., Trends Biotechnol., 11, 202 (1993); Miller, et al., FASEB J.,9,190 (1995)〕などを挙げることができる。
【０１６４】
リガンド-DNA複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲットとして、アシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法〔Wu, et al., J. Biol. Chem.,  266, 14338 (1991); Ferkol, et al., FASEB. J., 7, 1081-1091 (1993)〕、標的細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 3410 (1990)〕などが含まれる。
【０１６５】
また、遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的および物理学的遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドDNAをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合せる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明センス・オリゴヌクレオチドの細胞内導入を行い得る。この方法では、アデノアイルスベクターにカップリングしたDNAが損傷される前に、効率的な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。また、リポソーム/DNA複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【０１６６】
各遺伝子導入用ベクターは、公知の方法により作成することができる。例えばEBVベクターの製造は、清水らの方法に準じて実施できる〔清水則夫ら、細胞工学, 14(3), 280-287 (1995)〕。
【０１６７】
非ウイルス的導入方法は、組換えウイルスベクターを用いることなく所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法である。該方法の一つである膜融合リポソームによる遺伝子導入法は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Nakanishi, M., et al., Exp. Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi, M., et al., Gene introduction into animal tissues. In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. by Lee, V. H. et al.), Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。
【０１６８】
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には2種類の方法が含まれる。
【０１６９】
その第1法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン-2(IL-2)などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするKF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチドを導入した後、得られる細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。
【０１７０】
第2法は、目的センス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)を直接患者の体内や骨格筋などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法(直接法)である。
【０１７１】
上記遺伝子治療の第1法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置によって単球から分取し、分取細胞をIL-2の存在下にAIM-V培地などの適当な培地で72時間程度培養し、導入すべきセンス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)を含有するベクターを加える。センス・オリゴヌクレオチドの導入効率をあげるために、プロタミン存在下に32℃で1時間、2500回転にて遠心分離した後、37℃で10％炭酸ガス条件下において24時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にIL-2存在下にAIM-V培地などで48時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、センス・オリゴヌクレオチド導入効率を前記in situ PCRや、例えば所望の対象が本発明のようにアポトーシス抑制作用の程度を測定することにより、あるいは小胞体ストレス誘導により生じたアポトーシスの抑制作用を測定することにより、目的センス・オリゴヌクレオチドの導入効果を確認する。
【０１７２】
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの存在を検索するなどして、安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のセンス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を、例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。ウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞1×108細胞に対して1×103cfuから1×108cfuの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１７３】
上記第1法の別法として、目的センス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)を含有するレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞にセンス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)を導入する方法を採用することもできる。
【０１７４】
遺伝子治療の第2法(直接法)の実施に当たっては、遺伝子導入法によって実際に目的のセンス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)が導入されるか否かを、体外における予備実験、例えばベクター遺伝子cDNAのPCRによる検索やin situPCRによって予め確認しておくか、あるいは目的センス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)の導入に基づく所望の治療効果であるアポトーシス抑制作用や標的細胞のアポトーシス減少、変性細胞数減少などを予め確認しておくことが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をPCRで行うか、逆転写酵素活性を測定するか、あるいは膜蛋白(env)遺伝子をPCRでモニターするなどにより、遺伝子治療に際してセンス・オリゴヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要である。
【０１７５】
本発明遺伝子治療において、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病などの患者の脳神経細胞を対象とする場合は、患者の骨髄から骨髄幹細胞(KF-1発現細胞)を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする培養された骨髄幹細胞(KF-1発現細胞)に導入し、G418細胞にてスクリーニングした後、IL-12などの発現量を測定(in vivo)し、次いで放射線処理を施した後、該細胞を患者の脳に接種する方法を好ましい方法として挙げることができる。
【０１７６】
I型、II型糖尿病患者を対象とする場合は、患者の膵臓から膵β細胞(KF-1発現細胞)を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばリポソームにて所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする培養された膵β細胞(KF-1発現細胞)に導入し、G418細胞にてスクリーニングした後、IL-12などの発現量を測定(in vivo)し、次いで放射線処理を施した後、該細胞を患者の膵臓に接種する方法を好ましい方法として挙げることができる。
【０１７７】
(9)  遺伝子治療剤の調製
本発明は、センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターまたはセンス・オリゴヌクレオチド(KF-1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)が導入された細胞を活性成分とし、それらの薬学的有効量を、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤(遺伝子治療剤)を提供する。
【０１７８】
本発明の医薬組成物(医薬製剤)に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
【０１７９】
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、前記(7)項で詳述したものと同様のものを挙げることができる。これは治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
【０１８０】
例えば、センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望のセンス・オリゴヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
【０１８１】
これらは、リン酸緩衝生理食塩液(pH7.4)、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【０１８２】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【０１８３】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
【０１８４】
一般には、医薬製剤としての所望センス・オリゴヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与量は、1日当り体重1kg当り、例えばレトロウイルスの力価として約1×103pfuから1×1015pfu程度とするのがよい。
【０１８５】
また所望の導入用センス・オリゴヌクレオチドが導入された細胞の場合は、1×104細胞/bodyから1×1015細胞/body程度の範囲から選ばれるのが適当である。
【０１８６】
該製剤は1日に1回または数回に分けて投与することもでき、1から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１８７】
(10)  KF-1遺伝子の検出
本発明は、細胞のアポトーシス抑制作用(特に小胞体ストレス誘導により誘導されるアポトーシス抑制作用)を有するKF-1およびこれをコードする遺伝子(特にこの遺伝子は小胞体ストレス誘導により高発現する)の存在を検出する方法を提供する。
【０１８８】
該方法は、血液または血清のごとき生物学的試料を調製し、所望により該試料から核酸を抽出し、これら試料および核酸中にKF-1に対する感受性遺伝子が存在する否かを分析するものである。
【０１８９】
また、本発明は、KF-1遺伝子の検出によって、細胞または組織におけるKF-1活性のレベル(アポトーシス抑制作用、特に小胞体ストレス誘導により誘導されるアポトーシス抑制作用、KF-1mRNAの発現レベルなど)を測定し、アポトーシスの程度あるいはアポトーシスによって生じた細胞変性(アポトーシス細胞)の進行の程度、細胞死の増加の程度または予後を判定する方法を提供する。該方法は、細胞に(小胞体ストレスにより)アポトーシスが誘導されて細胞変性を起こす生物学的試料を調製し、該試料中にKF-1遺伝子が存在するか否かを分析するか、あるいはKF-1遺伝子のmRNAの量を分析することをその基本的操作とする。
【０１９０】
本発明KF-1遺伝子の検出方法の実施によって、細胞または組織における小胞体ストレス誘導により誘導されるアポトーシス抑制作用、KF-1mRNAの発現レベル、アポトーシスの亢進あるいはアポトーシスによって生じた細胞変性(アポトーシス細胞)の進行の程度、細胞死の増加の程度または予後の指標を得ることが可能となる。また、例えばアポトーシスの亢進あるいはアポトーシスによって生じた細胞変性(アポトーシス細胞)、細胞死などの診断、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの治療効果の判定乃至予後の予測が可能となる。
【０１９１】
該検出方法においては、先ず小胞体ストレス誘導によるアポトーシスにより生じたアポトーシス細胞または変性した細胞の試料より得られたKF-1遺伝子に関する情報を基に、KF-1遺伝子のスクリーニングおよび/またはその増幅に利用できるように設計したDNA断片を作成する。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などに利用できるプローブとしての性質を有するDNA断片を作成する。また、DNA配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅したKF-1遺伝子の全部または一部のDNA断片を得るためのプローブとしての性質を有するDNA断片を作成する。
【０１９２】
次いで、例えばKF-1遺伝子と同じ配列を持つプライマーをスクリーニング用プローブとして用いて、生物学的試料(核酸試料)と反応させて、試料中のKF-1遺伝子の存在を確認する。該試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。
【０１９３】
KF-1遺伝子の存在確認のためのスクリーニング方法は、特にPCRを用いるのが感度の点から好ましい。該方法は、KF-1遺伝子断片をプライマーとして用いて、従来公知の方法(Science, 230, 1350-1354(1985))や新たに開発された或いは将来使用されるPCRの変法(例えば榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35(17)(1990))に従い実施することができる。
【０１９４】
プライマーとして使用されるDNA断片は、本発明遺伝子(KF-1遺伝子)を特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り特に制限はない。これは化学合成したオリゴDNAでよい。該オリゴDNAの合成は、自動DNA合成装置など、例えばDNA合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)を使用して行い得る。合成されるプライマー(センス・ライマーまたはアンチセンス・ライマー)の長さは約10-50ヌクレオチド程度であるのが好ましく、より好ましくは15-30ヌクレオチド程度である。また、合成されるプライマーは、特に他の公知の類似するDNA配列を区別できる配列であるのが好ましい。
【０１９５】
上記スクリーニング方法に用いられるプローブは、通常、標識されるのが普通であるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、当該技術分野で知られており、例えばニック・トランスレーション、ランダム・プライミングム、キナーゼ処理のような方法に従うことができる。標識剤としても、例えば放射性標識剤、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などのいずれをも利用することかできる。
【０１９６】
検出のために用いるPCRは、例えばRT-PCR〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕が好ましいが、当該分野で用いられる種々の方法を適宜応用することも勿論可能である。該方法としては、例えば、ノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ RT-PCR〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕、in situハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、NASBA法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法を挙げることができる。
【０１９７】
(11)  KF-1遺伝子検出用および診断用キット
本発明検出法は、キットを利用することによって、より簡便に実施することができる。本発明は、KF-1遺伝子のDNA断片を含有するKF-1遺伝子の検出用キットをも提供する。
【０１９８】
該キットは、少なくとも配列番号：2で示されるDNA配列もしくはその相補的DNA配列の一部または全てにハイブリダイズするDNA断片を必須構成成分として含むことを必須とする。他は、通常のこの種試薬キットと同様に、例えば標識剤、PCRに必須の試薬(例えばTaqDNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマー)などを含むことができる。
【０１９９】
標識剤としては、放射性同位元素、蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、DNA断片自身が予め標識剤とコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットには、測定の実施における便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含ませることもできる。
【０２００】
本発明KF-1遺伝子検出用キットは、KF-1遺伝子の測定、検出に利用できるのみならず、この検出結果に基づいて、アポトーシスによる細胞障害の程度を検出できる。特に小胞体ストレスによって誘導されたアポトーシスの状態または細胞変性の進展の診断を行うことができる。従って本発明はアポトーシスによる細胞障害の診断用キットをも提供する。
【０２０１】
また、本発明に従う規定、検出方法では、被検試料から得られるKF-1遺伝子のDNA配列を直接的もしくは間接的に配列決定することができ、これにより野生型KF-1遺伝子と相同性の高い相同物である新たなKF-1遺伝子に関連する関連遺伝子を見出すこともできる。本発明はかかる測定、検出と被検試料中のKF-1遺伝子DNA配列の決定によって、被検試料中のヒトKF-1遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供する。
【０２０２】
(12)  本発明ポリペプチドに対する抗体
また、本発明は、配列番号：1で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド(発現物)に結合する抗体(ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体)を提供する。該抗体は、配列番号：1で示されるヒトKF-1遺伝子がコードするポリペプチド(発現物)または配列番号：1において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド或いは該ポリペプチドの断片を抗原として利用して製造することができる。
【０２０３】
抗体の製造法および精製法は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれらの常法を適当に採用することができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編(1986)など参照〕。
【０２０４】
得られる抗体は、例えばKF-1などの本発明ポリペプチドの精製およびその免疫学的手法による測定、識別などに利用することができる。より具体的には、本発明遺伝子の発現は神経細胞、特にヒトの小脳、アルツハイマー患者由来の大脳皮質や抗うつ薬長期投与のラット海馬などの組織において確認されていることから、該抗体は、これら組織中でのKF-1濃度の測定に利用することができる。
【０２０５】
また、該抗体または該抗体の断片は、例えばKF-1との結合を介してKF-1活性、即ちKF-1のアポトーシス抑制作用などを阻害または低下させる作用を発揮することができる。
【０２０６】
本発明抗体は、上記のようにKF-1活性を阻害または低下させる物質として有用であると共に、例えば野生型KF-1および/または変異型KF-1の測定にも利用することができる。従って、本発明は、本発明ポリペプチドに結合する抗体を利用した野生型KF-1および/または変異型KF-1の測定法をも提供する。
【０２０７】
該測定法によって、KF-1活性の程度、アポトーシスによる細胞障害の程度、アポトーシスによる細胞変性、細胞死の程度などを、野生型KF-1の変化に基づいて、検出することも可能である。本発明抗体を利用した該測定法の具体例としては、例えばKF-1抗体を用いて、ヒトより採取した生体材料試料を含有する溶液からKF-1蛋白質を免疫沈降させる方法、或いは生体材料試料を含有する溶液中のKF-1蛋白質を直接ポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロット上でKF-1抗体と反応させる方法を挙げることができる。また、KF-1抗体を用いて、免疫組織化学的技術に従いパラフィンまたは凍結組織切片中のKF-1を検出することもできる。
【０２０８】
野生型KF-1または変異型KF-1を測定するより好ましい方法には、モノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ法(ELISA)、放射線免疫検定法(RIA)、免疫放射線検定法(IRMA)および免疫酵素法(IEMA)が含まれる。
【０２０９】
(13)  KF-1活性(アポトーシス抑制作用)促進物質(アゴニスト)および阻害物質(アンタゴニスト)のスクリーニング
本発明は、KF-1活性(小胞体ストレス誘導性によるアポトーシスの抑制作用)を促進または阻害する候補化合物をスクリーニングする方法をも提供する。
【０２１０】
該方法は、被験物質の存在下および非存在下に、配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは該アミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つKF-1活性を有するポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニストまたは該作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする。ここで、ポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度は、例えば核が凝集した標的細胞数を計数し、その数の減少数として求められる。また、ポリペプチドはKF-1活性を有する遺伝子発現物を包含する。
【０２１１】
また、該方法は、被験物質の存在下および非存在下に、以下の配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つ標的細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチドの発現物の標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニストまたは該抑制作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする。ここで、発現物の標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスの抑制の程度は、例えば核が凝集した標的細胞数を計数し、その数の減少数として求められる。また、細胞におけるアポトーシスの検出は、例えば前述したような(1)アガロースゲル電気泳動法(DNAラダーとして検出)、(2)パルスフィールド電気泳動法、(3)TUNEL法（Gavrieli, Y., et al., J. Cell Biol., 119, 493-501 (1992)）、(4)蛍光色素を用いて細胞染色後、細胞サイズの変化やDNA含有量低下細胞を検出する方法、(5)蛍光色素を用いて細胞染色後、生死細胞の検出などをフローサイトメトリーで行う方法などによって実施することができる。また、細胞の生死の判定は、(6)細胞染色色素を用いて生死細胞を染め分ける分染法、(7)酵素活性測定法、(8)MTT法、(9)細胞からの遊離51Crを測定するラジオアイソトープ法、(10)コロニー形成法などの公知の各種方法に従って実施することができる。これらの方法によってもアポトーシス抑制作用を検出できる。
【０２１２】
また、本発明は、以下の(1)〜(5)の工程を含む、本発明ポリペプチドの標的細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制作用を増強する候補物質のスクリーニング方法を提供する。
(1)本発明ポリペプチドをコードする遺伝子の発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかけてアポトーシスを誘導する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における標的細胞の生存率またはアポトーシス形態の細胞の比率をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下に非形質転換細胞に小胞体ストレス負荷をかけて求められる細胞の生存率またはアポトーシス形態の細胞の比率を基準値として、上記(3)で求められる各値と該基準値との差を求める工程、
(5)候補化合物の存在下において求められた差が、非存在下で求められた差と比べて生存率において大である場合またはアポトーシス形態細胞比率において小である場合に、該候補物質を選択する工程。
【０２１３】
更に、本発明は、以下の(1)〜(5)の工程を含む本発明発現物をコードするホリヌクレオチド（本発明遺伝子）の標的細胞における発現を増強する候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。
(1)本発明遺伝子の発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかける工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞の本発明遺伝子の発現量をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記発現量を、候補物質の存在下における同発現量と対比する工程、
(5)候補化合物の存在下において求められた上記発現量が、候補物質の非存在下において求められたそれに比して増加している場合に、該候補物質を選択する工程。
【０２１４】
更に、本発明は、以下の(1)〜(5)の工程を含む標的細胞における本発明ポリペプチドの作用を増強する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
(1)本発明遺伝子の発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、該標的細胞に小胞体ストレス負荷をかけてアポトーシスを誘導する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞のポリペプチド産生量を該ポリペプチドに対する抗体を用いてそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下において求められた産生量と、候補物質の存在下において求められた産生量とを対比する工程、
(5)候補化合物の存在下における産生量が非存在下におけるそれに比して増加している場合に、該候補物質を選択する工程。
【０２１５】
これらのスクリーニング方法において、本発明ポリペプチド(例えばKF-1もしくはKF-1遺伝子発現物、以下、これらを単に「KF-1」という)の発現量乃至産生量は、該ポリペプチドに対する抗体を、被験物質を含む被検液中で標識化されたKF-1と競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたKF-1の割合として測定することができる。また、被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された別の異なる抗KF-1抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによっても、被検液中のKF-1を定量することが可能である。
【０２１６】
本発明スクリーニング方法によれば、KF-1とリガンドとの結合を、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然物混合物中で評価することができる。
【０２１７】
KF-1が有するアポトーシス抑制作用の促進または亢進剤あるいは阻害(インヒビター)または低下剤は、天然の基質またはリガンドであってもよく、それらの構造的または機能的模擬体であってもよい。
【０２１８】
本発明スクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニング技術を応用することができる。この技術の応用によれば、例えば、アポトーシス抑制剤またはアポトーシス促進剤に関するスクリーニングにおいては、合成反応混合物、細胞画分、例えば小胞体、膜、細胞エンベロープ、細胞壁またはこれらのいずれかの調製物(KF-1と該ポリペプチドの標識リガンドを含むもの)を、スクリーニングされる候補化合物の存在下または不存在下でインキュベートする。該候補化合物がKF-1を作動させるかまたはKF-1作用に拮抗するかは、該標識リガンドの結合の減少により検出される。KF-1の作用を誘導することなくアポトーシスを抑制する候補化合物が良好なアポトーシス抑制剤である可能性が高い。一方、KF-1に結合してアポトーシスを増加させる化合物は、KF-1阻害剤とみなされる。KF-1の活性レベルの検出は、比色標識など(これに限定されるものではない)のレポーター系、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答するレポーター遺伝子の組込みおよび当技術分野で公知の結合アッセイを用いることにより実施され得る。
【０２１９】
KF-1およびその他のアポトーシス抑制剤を、それらに結合する化合物と組合せる競合アッセイも、アポトーシス抑制または促進剤としての候補化合物のスクリーニングに用いることができる。
【０２２０】
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質(薬剤候補化合物)は、KF-1活性促進物質(特にアポトーシス抑制物質：アゴニスト)およびKF-1活性抑制物質(特にアポトーシス促進物質：アンタゴニスト)の両者を含んでいる。即ち、アゴニストは、本発明スクリーニング系において、その存在によって測定されるKF-1活性を上昇させる物質であり、アンタゴニストは、逆にその存在によって測定されるKF-1活性を低下させる物質であり得る。
【０２２１】
これら被験物質の具体例には、例えばオリゴペプチド、蛋白質、抗体、RNA分子、siRNA、非ペプチド性化合物(合成化合物)、発酵生産物、細胞抽出液(植物抽出液、動物組織抽出液など)、血漿などが含まれる。これらの物質は新たに開発されたものであっても、既知物質であってもよい。
【０２２２】
アポトーシス抑制物質には、KF-1に結合してその活性を増加する無機または有機の低分子化合物、天然もしくは合成のまたは遺伝子組換え技術により調製されたペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。また、生体内に直接にまたは組換えベクターに挿入された形態で投与されるKF-1 DNAに対するセンスDNA分子も含まれる。
【０２２３】
アポトーシス促進物質には、KF-1により誘導される活性（アポトーシス抑制活性）を誘導することなく、KF-1が結合する分子の同一部位に結合してKF-1の作用をその結合の阻止により妨げる作用を奏し得る有機または無機の低分子化合物、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アンチセンスDNA分子(例えば、Okano, J. Neurochem, 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)を参照)、RNAインターフェアランス効果を有するRNA分子(例えば、McCaffrey, A. P., et al., Nature, 418, 38-39(2002)を参照)などが含まれる。
【０２２４】
本発明スクリーニング方法に従ってスクリーニングされるKF-1活性を活性化または阻害する作用を有する候補物質の評価は、次の如くして行うことができる。即ち、KF-1活性がコントロール(被験物質非存在)の場合に比べて、約20％以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上促進している場合、該候補物質はKF-1活性を促進する化合物として選択することができる。一方、例えば、KF-1活性がコントロール(被験物質非存在)の場合に比べて、約20％以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上阻害されている場合、該被験物質はKF-1活性を阻害する化合物として選択することができる。
【０２２５】
KF-1は、特に小脳、大脳皮質、中脳、下垂体、膵臓などの組織にその発現が見られることから、これらの部位に誘導されたアポトーシスによって生じた細胞変性、特に神経細胞、神経芽細胞、膵β細胞などの細胞変性に関連する疾患に対して、KF-1活性の促進剤および阻害剤は有用である。例えば、小脳、大脳皮質、中脳、下垂体および膵臓組織内のKF-1活性を促進する化合物は、小胞体ストレス誘導によるアポトーシスを抑制することにより、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病患者の病態改善または進展を阻害すると考えられる。また、KF-1活性を阻害する化合物は、神経細胞、神経芽細胞におけるアポトーシスを促進することから、脳腫瘍、膵臓癌の癌治療および自己免疫疾患、リウマチの治療などに有用と考えられる。
【０２２６】
本発明スクリーニング方法により得られるKF-1活性を促進する物質は、細胞のKF-1濃度を増加し、細胞におけるアポトーシスの抑制またはアポトーシス細胞の量を低下させると考えられることから、これを有効成分とするKF-1増量剤として、医薬品分野をはじめとする各種の分野で有用である。
【０２２７】
該KF-1活性促進物質を有効成分とするKF-1増量剤は、特に小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制剤として、例えば(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病患者の病態改善または進展を阻害する治療・予防のための医薬として有効に利用することができる。
【０２２８】
本発明スクリーニング方法により得られるKF-1活性を阻害する物質は、細胞のKF-1濃度を低下し、細胞におけるアポトーシスを促進またはアポトーシス細胞数を増加させると考えられることから、これを有効成分とするKF-1低下剤として、医薬品分野をはじめとする各種の分野で有用である。
【０２２９】
該KF-1活性阻害物質を有効成分とするKF-1低下剤は、特に小胞体ストレス誘導性アポトーシス促進剤として、例えば脳腫瘍、膵臓癌の癌治療および自己免疫疾患、リウマチ疾患の予防・治療のための医薬として有効に利用することができる。
【０２３０】
上記KF-1増量剤、小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制剤、KF-1低下剤、小胞体ストレス誘導性アポトーシス促進剤は、それぞれの作用を示す有効量を適当な製剤学的担体と共に含有する医薬組成物として、上記各疾患に適用することができる。
【０２３１】
該医薬組成物(医薬製剤)において有効成分として利用するKF-1促進物質乃至阻害物質は、医薬的に許容される塩とすることができる。この塩の種類、その調製法、医薬組成物の調製法、医薬組成物に利用される希釈剤、賦形剤などの医薬担体、医薬組成物の投与単位形態、投与経路、投与方法などは、前記本発明ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物において詳述したそれらと、略同様のものとすることができる。
【０２３２】
医薬製剤中に含有させるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般には、投与量は、1日当り体重1kg当り、約0.01μg-10mg程度、好ましくは約0.1μg-1mg程度とするのがよく、該製剤は1日に1-数回に分けて投与することができる。
【０２３３】
(14)  スクリーニング用キット
本発明は、KF-1のアポトーシス抑制作用(KF-1活性)を促進または阻害(低下)する物質をスクリーニングするためのスクリーニング用キットを提供する。
【０２３４】
本発明スクリーニング用キットの一具体例は、本発明ポリペプチド(例えば、配列番号：1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)または本発明発現物(例えば、配列番号：2で示されるDNA配列のポリヌクレオチドの発現物)と、小胞体ストレス負荷物、即ち小胞体にストレス誘導を促すことによって細胞にアポトーシスを誘導する物質、例えばカルシウムATPase阻害剤(タプシガーギン：thapsigargin)、N-グルコシド糖鎖合成阻害剤(ツニカマイシン：tunicamycin)などとを必須構成成分として含むことが重要であって、他はこの種スクリーニング用キットと同様とすることができる。例えば、KF-1活性を有するKF-1およびツニカマイシンと共に、任意成分として、細胞培養液、反応希釈液、染色剤、緩衝液、固定液、洗浄剤などの各種試薬類を含むキットを挙げることができる。
【０２３５】
本発明キットの具体例としては、次の構成1-4または1-5からなるものを挙げることができる。
構成1.  標的細胞(標的KF-1発現細胞)、測定対象とする細胞にKF-1遺伝子が導入されて形質転換された細胞)を、0.5-1×105細胞／ウエルでダルベッコ修飾イーグルズ培地などを用いて60mmディッシュで5%炭酸ガス下に37℃で培養したもの、
構成2.  小胞体ストレス負荷物(アポトーシス誘導物質、例えばツニカマイシン、タブシガーギンなど)
構成3.  核染色液(例えば「ヘキスト33258」など)
構成4.  測定用緩衝液（0.05%EDTA-PBSおよび1%グルタルアルデヒド-PBSなど）、
構成5.  観察のための検出用顕微鏡
本発明スクリーニング用キットを利用したスクリーニング方法においては、供試化合物(被験物質、薬剤候補化合物)を加えたウエル単位視野当たりの細胞のアポトーシスに典型的な観察像である核が凝集した細胞数を、染色細胞数としてカウントし、供試化合物を加えていないコントロールのウエルにおける同細胞数との有意差検定を行えばよい。
【０２３６】
アポトーシス（アポトーシスによる死細胞）は、上記以外にも、例えば細胞障害の度合いや生細胞数の減少として評価、検出することもできる。更に顕微鏡などを利用して、細胞の変化(萎縮、変性など)を観察することによってもアポトーシスを評価することができる。細胞障害の程度は、例えば一定時間細胞を培養後、培地中に漏出したLDH(乳酸脱水素酵素)などの活性を測定して評価することができる。生細胞数は、例えばトリパンブルーなどを用いた色素排除試験によって評価することができる。これらの測定、評価自体常法に従って実施することができる。
【発明の効果】
【０２３７】
以上詳述したとおり、本発明は、特に小胞体ストレス誘導性のアポトーシス抑制作用を有するポリペプチド(ヒトKF-1)を含む医薬組成物を提供する。本発明組成物は、KF-1遺伝子およびその産物が関与する各種の疾患(アポトーシスによって生じた細胞変性または細胞死に関連する疾患)、例えば、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの処置のために、アポトーシス抑制剤、小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制剤、細胞変性改善剤などとして有用である。
【０２３８】
本発明によって見出されたKF-1(KF-1遺伝子発現物)とアポトーシス抑制作用(特に小胞体ストレスによって誘導されるアポトーシス抑制作用)との関連の解明は、神経細胞、神経芽細胞、膵β細胞などの小胞体ストレスによって誘導される細胞変性、特に神経細胞、膵β細胞などに生じたアポトーシスに起因する各種病理状態、例えば(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの解明、把握、診断、予防、治療などに関する有用な情報乃至手段を与える。
【０２３９】
また本発明は、本発明ポリペプチドをコードする遺伝子(KF-1遺伝子)の発現、もしくは本発明ポリペプチド（本発明遺伝子発現物）の有するアポトーシス抑制作用、を促進または抑制する新薬の開発のための候補化合物のスクリーニング技術をも提供する。
【０２４０】
更に本発明は、個体或は組織における本発明ポリペプチドの発現の検出技術、該発現のための遺伝子の変異(欠失や点変異)乃至発現異常の検出技術をも提供する。かかる検出技術は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、糖尿病、うつ病、躁うつ病などの病態の解明、診断に好適に利用できる。
【０２４１】
更に本発明は、KF-1センス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子導入用ベクター、該ベクターを導入した細胞などを提供する。これらは遺伝子治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２４２】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０２４３】
1. ヒトKF-1の特定
ヒトKF-1の特定はリングフィンガー・モチーフを有するヒト遺伝子についてデータベースを用いた相同性検索によって実施した。即ち、HRD1 (GenBank Accession No. NP#115807.1)のアミノ酸配列を用い、SMART program （http://smart.embl-heidelberg.de/）により、リング−フィンガー・モチーフ(RING-finger motif)を含む蛋白質を抽出し、得られたヒトの完全長配列について、前記配列を用いて、細胞内局在を予想するPSORT program (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)により、小胞体局在蛋白質を検索した。
【０２４４】
その結果、リング−フイガー・モチーフを有する小胞体蛋白質hKF-1 (DDBJ Accession No: D76444)を見出した。また、そのマウス相同物(mKF-1; DDBJ Accession No: D76445)を見出した。
【０２４５】
2. 小胞体ストレス誘導による遺伝子発現の誘導
hKF-1遺伝子が、小胞体ストレス誘導薬剤処理により、発現量変動を示すかどうかを以下の通り調べた。即ち、ヒト肝細胞HepG2 (ATCC Accession No: HB-8065) 2×106細胞を直径60mmの培養皿にまき、0.1μMのタプシガーギン(thapsigargin: 和光純薬社製)および2μg/mLのツニカマイシン(tunicamycin: 和光純薬社製)のいずれかを培養皿に加え、1、3、6、12、24または48時間培養した後、total RNAを調製し、cDNA合成を行い、RT-PCRにより発現量変動を観察した。
【０２４６】
RT-PCRはHepG2細胞から抽出したTotal RNAを用いて合成したcDNAを鋳型として実施した。hKF-1遺伝子の発現量は、配列番号:7に示す配列のhKF-1upと配列番号:8に示す配列のhKF-1lowとをプライマーとして用いたRT-PCRにより求めた。
【０２４７】
また、C/EBP homologous protein (以下「CHOP」と略す)は、小胞体ストレス誘導性発現誘導を示す遺伝子であり(Price and Calderwood, Cancer Res., 52: 3814-3817 (1992); Halleck et al., Cell Stress Chaper. 2: 31-40 (1997)参照)、発現誘導の陽性コントロールとして用いた。
【０２４８】
CHOP遺伝子の発現量は、それぞれ配列番号：9のCHOP-upper-primerと配列番号：10のCHOP-lower-primerとをプライマーとしてRT-PCRを実施し、その遺伝子の発現量を観察した。グリセロアルデヒド-3-ホスフェートデハイドロゲナーゼ(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase；以下「GAPDH」と略す)は、試料の量的補正に一般に用いられる遺伝子であり、cDNA量の確認に用いた。GAPDHmRNA由来のcDNA量は、それぞれ配列番号：11のGAPDH-upper-primerと配列番号：12のGAPDH-lower-primerとをプライマーとしてRT-PCRを実施し、その遺伝子の発現量を観察した。それぞれの遺伝子についてのPCR条件は次の通りである。
【０２４９】
いずれの遺伝子の場合も、2μLの10×PCR緩衝液(10mM Tris-HCl (pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2: SIGMA 社製)、0.4μLの10μM各dNTP混合物、0.1μLの20μM upper primer (0.1mM)、2μLの20μM lower primer (0.1mM)および0.1μLの5U/μL Taq polymerase (SIGMA社製)を加え、滅菌精製水で全量を18μLとし、2μLのcDNA試料を加えた。PCR反応は、Gene Amp PCR system 2400-R (Perkin Elmer社製)を用いて、各遺伝子につき以下の条件で実施した。
KF-1:
94℃/3分、[(94℃/30秒、55.1℃/30秒、72℃/30秒)×25サイクル]、72℃/5分
CHOP:
94℃/3分、[(94℃/30秒、55.2℃/30秒、72℃/30秒)×24サイクル]、72℃/5分
GAPDH:
94℃/3分、[(94℃/30秒、59.0℃/30秒、72℃/30秒)×18サイクル]、72℃/5分
PCR産物は、アガロースゲル電気泳動を行って、そのバンドの濃さより発現量を求めた。
【０２５０】
得られた結果を図1に示す。
【０２５１】
図1中、最上段(KF-1と表示)は、コントロール(control; 小胞体ストレス誘導薬剤無添加)の場合、タプシガーギン(thapsigargin)0.1μM添加において上段に示された時間処理した場合、およびツニカマイシン(tunicamycin)2μg/mL添加において上段に示された時間処理した場合のそれぞれの、ヒト肝細胞でのhKF-1遺伝子の小胞体ストレス応答性発現誘導を示す。上から2段目(CHOPと表示)は、小胞体ストレス応答性発現誘導を示す遺伝子として既知(前記文献参照)のCHOPにおける各場合の発現誘導を示す(陽性コントロールである)。また、最下段(GAPDHと表示)は、GAPDHにおける各場合の発現誘導結果であり、PCRに用いたHepG2細胞由来のcDNAの量的補正として利用した。
【０２５２】
図1に示される結果から、KF-1(最上段参照)は、未処理のコントロール群に比して、タブシガーギン処理において、12時間後に最も発現量が増大するような発現量増加を示すことが確認された。また、ツニカマイシン処理において、3時間後に最も発現量が増大するような発現量増加を示すことが確認できた。
【０２５３】
3. 哺乳細胞発現ベクターの構築
小胞体ストレスのセンサー蛋白質であり、様々な小胞体ストレス応答性エレメントを持つ遺伝子の転写を活性化することが知られているATF6のN末端の転写活性化領域（Haze, K., et al., Mol. Biol. Cell., 10: 3787-3799 (1999)参照）を発現させたヒト胎児腎臓細胞HEK293T細胞 (ATCC Accession No: B-8065)から抽出したmRNA を逆転写してcDNAを得、該cDNAを鋳型として、配列番号:13に示す配列のプライマーと配列番号:14に示す配列のプライマーとを用いてPCRにてhKF-1の終止コドンのみを除く全コーディング領域を含む配列を増幅した。
【０２５４】
増幅断片を制限酵素Kpn IとXba Iとを用いて消化させた後、挿入配列のC末端でMyc(c-Myc)およびポリヒスチジン(6 x His)エピトープを発現するpcDNA6-Myc/Hisベクター(インビトロジェン社製：Invitrogen)のKpn I/Xba I部位に上記で得られた消化物を挿入して、hKF-1を発現する発現ベクターpcDNA6-Myc/His-hKF-1を得た。
【０２５５】
4. 小胞体ストレス誘導性細胞死抑制活性
Mycエピトープで標識したhKF-1を発現するpcDNA6-Myc/His-hKF-1の8μgとLipofectamineTM2000 (インビトロジェン社製：Invitrogen)15μLとを混合し、20分間室温で放置後、混合物をマウス神経芽細胞Neuro-2a (ATCC Accession No: CCL-131、以下「N2a」と略記する）と混合して細胞内に遺伝子を導入した。該細胞を1日培養後、最終濃度10μg/mLとなる量のBlasticidin (インビトロジェン社製：Invitrogen)を添加したダルベッコ修飾イーグルズ培地(Dulbecco's modified Eagle's medium)(10%(v/v)熱不活性化された牛胎児血清、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン含有)を用いて、遺伝子導入細胞を選抜し、hKF-1安定発現株2株を樹立した。これらをそれぞれKF-1 stable N2a(#2)およびKF-1 stable N2a(#3)と命名した。
【０２５６】
これらの2株を用いてKF-1蛋白質の細胞内での発現と細胞内局在の確認および小胞体ストレス応答性細胞死(アポトーシス)に対する耐性度の確認を以下の通り行った。即ち、Mycエピトープで標識したhKF-1を安定発現させたN2a細胞において、抗Myc一次抗体および抗マウス-Alexia488二次抗体を用いて免疫染色を行い、蛍光顕微鏡により細胞内での発現の有無とその細胞内局在を確認した。
【０２５７】
得られた結果を図2に示す。
【０２５８】
図2において、KF-1 stable N2a(#2)および(#3)は、上記で調製したMycエピトープで標識したhKF-1を安定発現させたN2a細胞であり、Normal N2aは、比較対照としてのhKF-1遺伝子を導入していない非処理N2a細胞(KF-1非発現N2a細胞)である
図2に示される結果から、樹立したKF-1 stable N2a(#2)および(#3)において、細胞内での蛍光を観察できた。該蛍光は小胞体において認められた。このことより2つの安定発現細胞株においてKF-1は過剰発現しており、KF-1蛋白質は、小胞体に局在することが明らかとなった。
【０２５９】
アポトーシスの検出は、以下の通り実施した。即ち、0.5-1×105の細胞を直径60mmのディッシュに蒔き、5μg/mLのツニカマイシンを用いて42時間処理して小胞体ストレスを誘導させた。次いで、0.05% EDTA-PBSを用いて細胞を回収し、1%のグルタールアルデヒド-PBSで10分固定後、アポトーシスの典型的な観察像である核の凝集を、ヘキスト染色［Hoechst 33258 (Bisbenzimide H 33258: 和光純薬株式会社製使用]して観察した。
【０２６０】
1つのサンプルについて3箇所の異なる視野にて、視野中に観察される染色した細胞のおよそ30-70個をカウントし、その平均値を算出した。実験は各サンプルについて5回繰り返した。
【０２６１】
上記で観察される細胞の染色像を図3および図4に示す。また算出された細胞数（割合）を比較した結果を図5に示す。
【０２６２】
図3および図4において、normal-, normal Tm, No.2-, No.2Tm, No.3-, No.3Tmは、それぞれKF-1非発現N2a細胞（小胞体ストレス薬剤処理無）、KF-1非発現N2a細胞（小胞体ストレス薬剤(ツニカマイシン;Tm)処理有）、KF-1 stable N2a(#2)（小胞体ストレス薬剤処理無）、KF-1 stable N2a(#2)（小胞体ストレス薬剤(Tm)処理有）、KF-1 stable N2a(#3)（小胞体ストレス薬剤処理無）、KF-1 stable N2a(#3)（小胞体ストレス薬剤(Tm)処理有）を示す。各図中、矢印を付して示した細胞が、核の凝集を起こしている細胞(染色されたアポトーシス細胞)である。
【０２６３】
また、図5において、縦軸は細胞死(Cell death)を認めた細胞の全細胞に対する割合(Cell death (%))であり、横軸はそれぞれ「KF-1非発現N2a細胞」(normalと表示)、「KF-1 stable N2a(#2)」 (KF-1stableNo.2と表示)および「KF-1 stable N2a(#3)」(KF-1stable No.3と表示)を示す。各棒グラフは、ツニカマイシン無添加（黒塗棒）およびツニカマイシン5μg/mL添加（白抜棒）をそれぞれ示す。
【０２６４】
図3-図5に示される通り、hKF-1発現細胞株であるKF-1 stable N2a(#2)および(#3)は、非発現細胞に比して、核凝集を起こしている細胞の割合が少なく、明らかな細胞死耐性を獲得していることが確認できた。このことから、本発明のKF-1は、小胞体ストレス誘導により生じたアポトーシスを抑制することが確認された。
【０２６５】
以上の試験結果から、hKF-1は、小胞体ストレス誘導によりその発現亢進を示す小胞体蛋白質であることが明らかになった。また、このKF-1を安定発現させたN2a細胞は、ツニカマイシンによる小胞体ストレス誘導時におけるアポトーシスに顕著な耐性を示すことが明らかとなった。
【０２６６】
以上の結果は、KF-1蛋白質の機能亢進が、神経細胞における小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを顕著に抑制することを示しており、hKF-1の発現亢進、安定化などの機能促進を担う物質は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病のような神経細胞変性に伴う中枢性の疾患、膵β細胞変性を含めた、I型、II型糖尿病などのアポトーシス関連性疾患に対して有効な処置効果を奏し得ることを証明するものである。
【０２６７】
また最近、KF-1遺伝子の発現が、抗うつ剤持続投与、電撃療法などにより亢進されることが明らかにされており、このことから、KF-1遺伝子発現物はうつ病、躁うつ病の治療の新たなターゲットにもなり得ると予想できる。
【０２６８】
さらに、KF-1遺伝子の機能抑制により細胞死の亢進が示唆されるので、hKF-1の阻害物質は、癌、細胞の過剰増殖を含めた自己免疫疾患、リューマチなどの治療にも有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】ヒト肝細胞HepG2をタブシガーギンおよびツニカマイシンで処理後、Total RNAを調製し、RT-PCRにより解析した結果(hKF-1発現量を調べた結果)を示す図である。
【図２】hKF-1発現ベクターpcDNA6-KF-1/Mycを導入したマウス神経芽細胞Neuro-2aにおけるhKF-1の細胞内局在を免疫染色によって調べた蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。
【図３】hKF-1発現ベクターを導入したマウス神経芽細胞Neuro-2aの小胞体ストレス応答性細胞死に対する耐性度を調べた結果（核凝集を起こしている細胞の染色像）を示す図である。
【図４】hKF-1発現ベクターを導入したマウス神経芽細胞Neuro-2aの小胞体ストレス応答性細胞死に対する耐性度を調べた結果（核凝集を起こしている細胞の染色像）を示す図である。
【図５】hKF-1発現ベクターを導入したマウス神経芽細胞Neuro-2aの小胞体ストレス応答性細胞死に対する耐性度を調べた結果（核凝集を起こしている細胞数の全細胞粋に対する割合）を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０２７０】
配列番号：7-8：hKF-1用プライマー配列
配列番号：9-10：CHOP用プライマー配列
配列番号：11-12：GAPDH用プライマー配列
配列番号：13-14：hKF-1用プライマー配列
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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