(57)【要約】【課題】安価で簡便に核酸を分離可能な核酸の分離方法を提供すること。【解決手段】結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、結合性核酸と複合体を形成可能であって、しかも核酸よりも高分子となる結合体を複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−結合体複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−結合体複合体を結合性核酸と結合体とが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸を結合体から解離させることにした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、結合性核酸と複合体を形成可能であって、しかも核酸よりも高分子となる結合体を複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−結合体複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−結合体複合体を結合性核酸と結合体とが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸を結合体から解離させることを特徴とする核酸の分離方法。
【請求項２】
結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、結合性核酸と複合体を形成可能であって、しかも核酸よりも高分子となる結合体を複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−結合体複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−結合体複合体から結合性核酸を増幅させ、その後、結合性核酸と結合体とが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸を結合体から解離させることを特徴とする核酸の分離方法。
【請求項３】
結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、β-1,3-グルカンを前記結合性核酸と複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−β-1,3-グルカン複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−β-1,3-グルカン複合体を結合性核酸とβ-1,3-グルカンとが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸をβ-1,3-グルカンから解離させることを特徴とする核酸の分離方法。
【請求項４】
前記β-1,3-グルカンは、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン、又はスクレログリカンであることを特徴とする請求項３記載の核酸の分離方法。
【請求項５】
前記フィルターは、限外濾過膜、分子ふるい、又は固体微粒子を充填したカラムであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸の分離方法。
【請求項６】
前記結合性核酸は、ポリＣ、ポリＡ、ポリＵ、ポリｄＡ、又はポリｄＴ配列を含む塩基配列の核酸、又はポリＡテールメッセンジャーＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸の分離方法。
【請求項７】
メッセンジャーＲＮＡと非結合性核酸とを含む溶液に、シゾフィランとカードランとレンチナンの中から選択されるβ-1,3-グルカンを前記メッセンジャーＲＮＡと複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによってメッセンジャーＲＮＡ−β-1,3-グルカン複合体を分離し、さらに、同メッセンジャーＲＮＡ−β-1,3-グルカン複合体をメッセンジャーＲＮＡとβ-1,3-グルカンとが解離する環境下でフィルター透過することによってメッセンジャーＲＮＡをβ-1,3-グルカンから解離させることを特徴とする核酸の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、β-1,3-グルカン類が核酸と特異的な相互作用をすることは知られている（例えば、特許文献１参照。）。これは、β-1,3-グルカン類が天然産生状態では三重鎖らせん構造を形成しており、何らかの方法により一本鎖に解離すると、元々のらせん構造と相似的なへリックスパラメーターを有する核酸を巻き込んで、同核酸と複合体を形成する作用である。
【０００３】
上記β-1,3-グルカン類と核酸との相互作用を利用すれば、標的となる核酸にβ-1,3-グルカンを結合させて核酸を分離することも可能なので、例えば、β-1,3-グルカン類を支持体に固定化することによりアフィニティーカラムを調製して、核酸の選択的な分離精製を行う方法や（例えば、特許文献２参照。）、マトリックスとの結合部位を有するβ-1,3-グルカンと生体高分子の間で複合体を形成して、同複合体をマトリックス上に結合させることにより核酸を分離する方法なども提案されている（例えば、特許文献３参照。）。
【特許文献１】国際公開第０１／０３４２０７号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−３５７０４号公報
【特許文献３】特開２００３−１３７９０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記従来の核酸の分離方法においては、以下に述べるような問題点があった。
【０００５】
すなわち、前者のβ-1,3-グルカン類を支持体に固定化してアフィニティーカラムを調製する方法では、β-1,3-グルカン類が支持体に固定化されているために、核酸とβ-1,3-グルカン類との複合体形成速度が遅く、分離抽出に要する時間が非常に長くかかる場合があった。例えば、メッセンジャーＲＮＡを分離するにはサンプル溶液をカラム中に入れた状態で６時間以上熟成させなければ分離されない場合があった。また、β-1,3-グルカンを固定化したアフィニティーカラムを調製する際にも手間と費用がかかり、必ずしも経済的な分離方法とはいえなかった。
【０００６】
同様に、後者のβ-1,3-グルカンと生体高分子との複合体をマトリックス上に結合させる方法においても、β-1,3-グルカンにマトリックスとの結合サイトを付与する必要があり、その調製コストは核酸分離コストを上昇させる要因となっていた。
【０００７】
このように、従来の核酸の分離方法においては、核酸を分離させる過程において手間と費用がかかるという問題点があり、これらを根本的に改善することが困難であった。本発明は、前記問題点を解決して、核酸との相互作用を利用した核酸の分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の核酸の分離方法では、結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、結合性核酸と複合体を形成可能であって、しかも核酸よりも高分子となる結合体を複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−結合体複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−結合体複合体を結合性核酸と結合体とが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸を結合体から解離させることにした。
【０００９】
また、本発明の核酸の分離方法では、結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、結合性核酸と複合体を形成可能であって、しかも核酸よりも高分子となる結合体を複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−結合体複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−結合体複合体から結合性核酸を増幅させ、その後、結合性核酸と結合体とが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸を結合体から解離させることにした。
【００１０】
また、本発明の核酸の分離方法では、結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、β-1,3-グルカンを前記結合性核酸と複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−β-1,3-グルカン複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−β-1,3-グルカン複合体を結合性核酸とβ-1,3-グルカンとが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸をβ-1,3-グルカンから解離させることにした。
【００１１】
また、本発明の核酸の分離方法は、以下の点にも特徴を有するものである。
（１）前記β-1,3-グルカンは、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン、又はスクレログリカンであること。
（２）前記フィルターは、限外濾過膜、分子ふるい、又は固体微粒子を充填したカラムであること。
（３）前記結合性核酸は、ポリＣ、ポリＡ、ポリＵ、ポリｄＡ、又はポリｄＴ配列を含む塩基配列の核酸、又はポリＡテールメッセンジャーＲＮＡであること。
【００１２】
また、本発明の核酸の分離方法では、メッセンジャーＲＮＡと非結合性核酸とを含む溶液に、シゾフィランとカードランとレンチナンの中から選択されるβ-1,3-グルカンを前記メッセンジャーＲＮＡと複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによってメッセンジャーＲＮＡ−β-1,3-グルカン複合体を分離し、さらに、同メッセンジャーＲＮＡ−β-1,3-グルカン複合体をメッセンジャーＲＮＡとβ-1,3-グルカンとが解離する環境下でフィルター透過することによってメッセンジャーＲＮＡをβ-1,3-グルカンから解離させることにした。
【発明の効果】
【００１３】
請求項１記載の本発明によれば、結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、結合性核酸と複合体を形成可能であって、しかも核酸よりも高分子となる結合体を複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−結合体複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−結合体複合体を結合性核酸と結合体とが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸を結合体から解離させることにしたので、結合性核酸を結合体との複合体とすることにより、結合性核酸の見かけ上の分子量を大きくして、結合性核酸を非結合性核酸から分離することができると共に、複合体を形成している結合性核酸と結合体とを分離して、結合性核酸のみを取り出すことができる。しかも、上述した結合性核酸の分離をフィルター透過によって行うことができるので、簡単に且つ安価に結合性核酸を取り出すことができる。
【００１４】
請求項２記載の本発明によれば、結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、結合性核酸と複合体を形成可能であって、しかも核酸よりも高分子となる結合体を複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−結合体複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−結合体複合体から結合性核酸を増幅させ、その後、結合性核酸と結合体とが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸を結合体から解離させることにしたので、結合性核酸の分離をフィルター透過によって行うことができ、簡単に且つ安価に結合性核酸を取り出すことができる。しかも、結合性核酸と結合体との複合体から直接結合性核酸を増幅させ、その後、最終的にフィルター透過することにより結合性核酸を結合体や反応液中のその他の物質から分離して回収するので、結合性核酸と結合体とを解離させる操作と、増幅した結合性核酸を回収する操作とを同時に行うことができ、操作の手間を省いて効率よく結合性核酸を回収することができる。
【００１５】
請求項３記載の本発明によれば、結合性核酸と非結合性核酸とを含む溶液に、β-1,3-グルカンを前記結合性核酸と複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって結合性核酸−β-1,3-グルカン複合体を分離し、さらに、同結合性核酸−β-1,3-グルカン複合体を結合性核酸とβ-1,3-グルカンとが解離する環境下でフィルター透過することによって結合性核酸をβ-1,3-グルカンから解離させることにしたので、結合性核酸の分離をフィルター透過によって行うことができ、簡単に且つ安価に結合性核酸を取り出すことができる。特に、結合性核酸と結合して複合体を形成する結合体に多糖であるβ-1,3-グルカンを用いているので、結合性核酸−β-1,3-グルカン複合体をフィルター透過するときにβ-1,3-グルカンがゲル化し、結合性核酸の見かけ上の分子量がより一層大きくなって非結合性核酸との大きさの違いが明確になる。従って、結合性核酸を非結合性核酸からより確実に分離することができ、結合性核酸の回収率を向上させることができる。
【００１６】
請求項４記載の本発明によれば、前記β-1,3-グルカンを、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン、又はスクレログリカンとしたので、β-1,3-グルカンであれば構造や分子量が異なっても結合性核酸との結合体として使用することができ、前記β-1,3-グルカン類に含まれる各種多糖を状況に応じて使い分けることができる。
【００１７】
請求項５記載の本発明によれば、前記フィルターを、限外濾過膜、分子ふるい、又は固体微粒子を充填したカラムとしたので、結合性核酸と非結合性核酸との分離を各種フィルターによって行うことができ、各フィルターを状況に応じて使い分けることができる。しかも、結合性核酸を分離するために複雑な分離機構を設ける必要がないので、より一層コストをかけることなく簡単に結合性核酸を分離することができる。
【００１８】
請求項６記載の本発明によれば、前記結合性核酸を、ポリＣ、ポリＡ、ポリＵ、ポリｄＡ、又はポリｄＴ配列を含む塩基配列の核酸、又はポリＡテールメッセンジャーＲＮＡとしたので、有用なポリ塩基配列を有する核酸を特異的に分離して役立てることができる。特に、結合体をβ-1,3-グルカンとした場合には、同β-1,3-グルカンは前記ポリ構造を有する核酸と可逆的な相互作用によって特異的に結合することができるので、効果的に前記ポリ構造を有する核酸を分離することができる。
【００１９】
請求項７記載の本発明によれば、メッセンジャーＲＮＡと非結合性核酸とを含む溶液に、シゾフィランとカードランとレンチナンの中から選択されるβ-1,3-グルカンを前記メッセンジャーＲＮＡと複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによってメッセンジャーＲＮＡ−β-1,3-グルカン複合体を分離し、さらに、同メッセンジャーＲＮＡ−β-1,3-グルカン複合体をメッセンジャーＲＮＡとβ-1,3-グルカンとが解離する環境下でフィルター透過することによってメッセンジャーＲＮＡをβ-1,3-グルカンから解離させることにしたので、メッセンジャーＲＮＡの分離をフィルター透過によって行うことができ、簡単に且つ安価にメッセンジャーＲＮＡを取り出すことができる。特に、メッセンジャーＲＮＡと結合して複合体を形成する結合体に多糖であるβ-1,3-グルカンを用いているので、メッセンジャーＲＮＡ−β-1,3-グルカン複合体をフィルター透過するときにβ-1,3-グルカンがゲル化し、メッセンジャーＲＮＡの見かけ上の分子量がより一層大きくなって非結合性核酸との大きさの違いが明確になる。従って、メッセンジャーＲＮＡを非結合性核酸からより確実に分離することができ、結合性核酸の回収率を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明に係る核酸の分離方法は、ＤＮＡやＲＮＡや遺伝子等からなる結合性核酸と非結合性核酸とを含む核酸溶液に、前記結合性核酸と複合体を形成可能であって、しかも核酸よりも分子量の大きい高分子物質となる結合体を複合体を形成する環境下で混合し、その混合液をフィルター透過することによって、混合液から結合性核酸−結合体複合体を分離すると共に、同結合性核酸−結合体複合体を結合性核酸と結合体とが解離する環境下でフィルター透過することによって、結合性核酸と結合体とを分離する方法である。
【００２１】
上記分離方法では、図１に示すように、結合性核酸に結合体を結合させて結合性核酸−結合体複合体を形成することにより、同結合性核酸−結合体複合体の分子サイズ（分子量）を、見かけ上、複合体を形成しない非結合性核酸やその他の不純物に比べて大きくし、分子サイズに基づき結合性核酸−結合体複合体のみをフィルターにより分離する。しかも、かかる結合性核酸−結合体複合体の分離時とは処理環境を変えて再びフィルター透過を行い、今度は結合性核酸と結合体とを解離させる。このように、本分離方法では、結合性核酸−結合体複合体の分離時と、結合性核酸と結合体との解離時とで処理環境を変えることによって、同じフィルターを用いていながら、前者においては、結合性核酸と結合体とを解離させることなく結合性核酸−結合体複合体を分離し、後者においては、結合性核酸−結合体複合体を結合性核酸と結合体とに解離させて、結合性核酸を取り出している。
【００２２】
従って、本分離方法によれば、１．試料溶液への結合体の混合、２．結合性核酸−結合体複合体を分離するための１回目のフィルター透過、３．結合性核酸と結合体とを解離させるための２回目のフィルター透過（所謂、フィルター洗浄。）という簡便な操作のみで結合性核酸と非結合性核酸とを分離することができ、しかも必須となる機器がフィルターのみなので、安価に結合性核酸を取り出すことができる。
【００２３】
なお、１回目のフィルター透過により非結合性核酸から分離した結合性核酸−結合体複合体は、結合性核酸と結合体に分離することなくフィルターに吸着したままの状態でフィルターごとＤＮＡへの逆転写反応やＰＣＲ（ポリメラ−ゼ連鎖反応）に使用することもできる。その場合は、逆転写反応やＰＣＲによって結合性核酸の塩基配列を増幅させた後に、その反応液を結合性核酸と結合体とが解離する環境下で２回目のフィルター透過にかけ、結合性核酸の塩基配列情報を含んだＤＮＡ産物として結合体から分離する。
【００２４】
このように、結合性核酸の塩基配列を増幅させた後に、同塩基配列を含んだＤＮＡ産物として結合性核酸を分離すれば、結合性核酸と結合体とを解離させる操作と、増幅した結合性核酸を回収する操作とを２回目のフィルター透過（フィルター洗浄）において同時に行うことができ、操作の手間を省いて効率よく結合性核酸を回収することができる。
【００２５】
ところで、前記１回目のフィルター透過における処理環境から前記２回目のフィルター透過における処理環境への変化としては、例えば、温度変化やpH変化や溶媒変化や解離剤の添加などが挙げられる。すなわち、２回目のフィルター透過時に、加熱、pH変化、アミノ化合物の添加、塩の添加、溶媒の変化など、結合性核酸−結合体複合体が解離する処理環境でフィルター透過（フィルター洗浄）を行うことにより、フィルター上に残った結合性核酸−結合体複合体から結合性核酸を回収することができる。
【００２６】
例えば、前記１回目のフィルター透過において、結合性核酸のみを結合体と結合させて非結合性核酸と差別化するための溶媒としては水が一般的であるが、必要に応じて塩を添加したり、Tris緩衝液等の緩衝液を用いたりした方が、複合体形成が促進されることがある。また、分離対象となる結合性核酸の種類によっては、ホルムアミド、N-メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒及びこれらの混合物を用いた方が複合体の形成が促進され分離効率が向上することがある。また、β-1,3-グルカンを凝集させ、フィルターで回収する効率を上げるためにアセトンなどの貧溶媒を加えることも可能である。
【００２７】
また、前記２回目のフィルター透過（フィルター洗浄）において、分離対象とする結合性核酸を結合体から解離して抽出するための溶媒としては水が一般であるが、結合性核酸−結合体複合体が解離しやすいように、酸、アルカリ、アミノ化合物、塩、緩衝液、グアニジウムチオシアネート、核酸やタンパク質の変性剤などを添加することも可能である。また、水以外の溶媒を用いることも可能である。また、抽出した結合性核酸を次の操作に用い易いように、次の操作に適した溶媒を選択することも可能である。
【００２８】
また、本発明におけるフィルターとは、分子量の大きな分子と小さな分子を分離でき、しかも、フィルター透過時に非結合性核酸を誤って吸着することのない核酸吸着性の無いものを指し、必ずしもシート状である必要はない。例えば、限外濾過膜、多孔質膜、分子ふるい、透析膜、濾紙などはもちろん、カラム充填剤、ゲル、シリカゲル、セライト、といった固体微粒子をカラム等に充填したものも含まれる。そして、これらのフィルターを用いて結合性核酸−結合体複合体を含む溶液を自然濾過、加圧濾過、遠心濾過、スピンカラム、電気泳動等により分離するのである。
【００２９】
このように、結合性核酸と非結合性核酸との分離に上述したような各種フィルターを用いることができるので、状況に応じて各フィルターを使い分けて、より効果的な核酸の分離を行うことができる。しかも、結合性核酸を分離するために複雑な分離機構を設ける必要がないので、コストをかけることなく簡単に結合性核酸を分離することができる。
【００３０】
前記結合体は、分離対象となる結合性核酸や非結合性核酸よりも分子量が大きいことが望ましい。ただし、たとえ１分子では核酸より低分子であっても、１回目のフィルター透過の時点で分子間で相互作用したり絡み合ったりすることによって見かけ上の分子量が核酸よりも増大し、核酸よりも高分子となるものであれば結合体として使用することができ、特にβ-1,3-グルカンを好適に用いることができる。
【００３１】
β-1,3-グルカンは、天然又は人工的に合成される多糖の一種で、グルコース環が、β結合で１位と３位の水酸基間が結合したものであり、特定の核酸と可逆的な相互作用を介して結合することができる。従って、β-1,3-グルカンを結合体に用いれば、複数種類存在する核酸の中からβ-1,3-グルカンに特異的に結合する結合性核酸を分離することができる。しかも、本分離方法では、分子サイズによって結合性核酸と非結合性核酸とを分離するので、β-1,3-グルカンに特殊な処理を施さなくても、そのままの状態で分離剤（結合体）として使用することができる。また、β-1,3-グルカンは、フィルター透過時にβ-1,3-グルカン同士が絡み合い微視的にゲル状となるので、結合性核酸−結合体（β-1,3-グルカン）複合体の見かけの分子サイズをより増大させることができ、フィルター透過時により効果的に結合性核酸を分離することができる。
【００３２】
本発明におけるβ-1,3-グルカンとは、化学的に純粋なβ-1,3-グルカンを含む化合物の総称で、具体的には、10重量パーセント以上、好ましくは、20重量パーセント以上、当該多糖を含むことが好ましい。β-1,3-グルカンは、側鎖構造、架橋、分子量、抽出された生物種の違い等から様々な名称が付けられ、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン、スクレログリカンと呼ばれる物質が存在する。これらは全てβ-1,3-グルカンに含まれる。このように、β-1,3-グルカンであれば構造や分子量等が異なっても結合性核酸との結合体として使用することができるので、β-1,3-グルカンに含まれる上記各種多糖を状況に応じて使い分けることができる。
【００３３】
本発明では、分子サイズに基づき結合性核酸の分離を行うので、特別な化学修飾をすることなくβ-1,3-グルカンを核酸の分離に用いることができるが、無論、機能性、分離性能を向上させるために化学修飾を施したβ-1,3-グルカンを用いても良い。本発明では、これら全てを「β-1,3-グルカン」と言う。
【００３４】
さらに、β-1,3-グルカンは、フィルター透過による結合性核酸の分離率を高めるために、その重量平均分子量が1,000以上、さらに好ましくは100,000以上、最もこの好ましくは500,000以上であることが求められるが、無論、使用するフィルター、分離対象とする核酸の種類によって異なる。
【００３５】
例えば、結合体であるβ-1,3-グルカンの重量平均分子量が2,000,000程度である場合には、粒径20〜40μmの固体微粒子を充填したカラムをフィルターとして用いれば、前記１回目のフィルター透過における複合体の分離と、２回目のフィルター透過における結合性核酸と結合体であるβ-1,3-グルカンとの解離とをどちらも円滑に行うことができ、結合性核酸の分離を短時間で効率よく行うことができる。
【００３６】
なお、前記カラムに充填する固体微粒子の粒径が20μm未満になると、核酸もフィルターを透過しにくくなって、結合性核酸と非結合性核酸との分離が困難になる不都合が生じ、40μmを越えると、結合体であるβ-1,3-グルカンの重量平均分子量をさらに大きくしなければならなくなって、結合体の調整に手間がかかるという不都合が生じるが、そのような20〜40μmの範囲から外れた粒径の固体微粒子を使用することも可能である。
【００３７】
上記β-1,3-グルカンを結合体として用いた場合には、同β-1,3-グルカンに可逆的な相互作用を介して結合可能なＤＮＡやＲＮＡや遺伝子等が結合性核酸となる。
【００３８】
ある核酸がβ-1,3-グルカンと結合可能な結合性核酸（以下、多糖結合性核酸という。）であるか否かは、ゲル電気泳動、円二色性スペクトル測定、可視紫外吸収スペクトル測定、蛍光偏光解消測定、アフィニティーカラム測定等により判別することができる。核酸がβ-1,3-グルカンと複合体を形成すると、ゲル電気泳動実験においては、核酸単独の場合に比べて泳動距離の低下が観察される（櫻井、水、新海、Biomacromolecules、2巻、641ページ、2001年）。円二色性スペクトル測定においては、複合体の形成により、核酸に由来するスペクトルの波形及び強度の変化が誘起される（櫻井、新海、J. Am. Chem. Soc.、122巻、4520ページ、2000年）。可視紫外吸収スペクトル測定においては、複合体の形成により核酸塩基由来の吸光度の減少が観察される（櫻井、水、新海、Biomacromolecules、2巻、641ページ、2001年）。蛍光偏光解消測定においては、蛍光を発する官能基を核酸又はβ-1,3-グルカンのいずれかに結合させておき、次に、核酸とβ-1,3-グルカンの混合溶液について測定を行って、Ｐ値が核酸及びβ-1,3-グルカン単独の場合よりも減少すれば複合体を形成しているといえる（櫻井、井口、甲元、木村、水、久枝、新海、Biopolymers、65巻、1ページ、2002年)。アフィニティーカラム測定においては、β-1,3-グルカンをゲル担体などに結合させた充填剤を充填したアフィニティーカラムに、核酸溶液を通過させると、多糖結合性核酸はカラム中に保持される（木村、甲元、水、櫻井、新海、Chem. Lett.、12巻、1240ページ、2002年）。
【００３９】
上述したいずれかの測定を１つ以上を行うことにより、その核酸が多糖結合性核酸であるか否かを判別することができる。ただ、多糖結合性核酸であっても、β-1,3-グルカンとの結合部位が核酸の全塩基配列の一部であり、上記の測定を行っても見かけ上ほとんど変化が見られない場合がある。また、核酸の鎖長や塩基配列などの条件によっては上記の測定を行うことができない場合がある。この様な場合、該当する核酸のβ-1,3-グルカンとの結合部位を含むと思われる一部分の塩基配列の核酸を代用して測定に用いることが可能である。
【００４０】
また、多糖結合性核酸の特に好ましい態様としてβ-1,3-グルカンに類似したヘリックスパラメーターを一部又は全体に有する核酸が挙げられる。このような特徴を有する核酸は、β-1,3-グルカンと規則的な複合体を形成することが知られている。これは、核酸がβ-1,3-グルカンと類似のへリックスパラメーターを有する場合、核酸とβ-1,3-グルカンとの間で水素結合及び疎水的相互作用が効果的に作用し、複合体の形成が熱力学的に容易となることに起因する。
【００４１】
ここで言うヘリックスパラメーターとは、当該分野で知られているように螺旋状化合物の形態を表示するのに用いられ、ヘリックスピッチ（ｈ）、１ヘリックスピッチ中の官能基の数（Ｒ）、および螺旋の巻き方向（右巻き又は左巻き）で定義される量である。多糖結合性核酸のヘリックスパラメーターは、相互作用して複合体を形成すべきβ-1,3-グルカンに応じてコントロールされる。核酸と複合体を形成するためには、巻き方向は一致する必要があるが、他の量であるｈとＲについては近い値を持っていれば十分で、完全に一致する必要はない。すなわち、多糖結合性核酸は、水溶液中で部分的にでも核酸と類似のヘリックスパラメーターを有していればよい。類似の目安としては、核酸のｈ／Ｒ（一官能基あたりのピッチ長）の値が2から4Åの間にあることから、多糖結合性核酸のｈ／Ｒが、好ましくは2〜4Å、さらに好ましくは単一核酸鎖の値である2.4〜3.6Åとなればよい。
【００４２】
また、多糖結合性核酸のさらに好ましい態様としては、ＤＮＡではアデニン（ｄＡ）、チミン（ｄＴ）、ＲＮＡではアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）のいずれか１つ又は複数の核酸塩基が連続した領域を１カ所以上有する核酸が挙げられる。これらの塩基のみからなるポリｄＡ、ポリｄＴ、ポリＡ、ポリＣ、ポリＵは、β-1,3-グルカンと複合体を形成する（櫻井、水、新海、Biomacromolecules、2巻、641ページ、2001年）。また、核酸の全塩基配列の中に部分的に上記の塩基配列を有する核酸も、多糖結合性核酸としてβ-1,3-グルカンと複合体を形成する。同様に、生物のポリＡテールメッセンジャーＲＮＡは末端に数十から数百量体のポリＡ配列を有するので、当然多糖結合性核酸となる。従って、β-1,3-グルカンを結合体に用いた場合には、上記ポリｄＡ、ポリｄＴ、ポリＡ、ポリＣ、ポリＵ配列を含む塩基配列の核酸を効果的に分離することができる。
【００４３】
β-1,3-グルカンと複合体を形成するのに必要な核酸における連続した塩基の数は、核酸塩基の種類、使用するβ-1,3-グルカンの種類、分子量により変わる。例えば、分子量15万のシゾフィランは、45量体以上のポリｄＡと複合体を形成することが知られている。また、β-1,3-グルカンにアミノ基などを修飾したものを用いることによってより短い核酸配列との複合体形成が可能となる。
【００４４】
以下、本発明に係る核酸の分離方法の特徴をさらに明らかにするために、図面を参照しながら実施例を説明する。なお、以下に示す表１には、実施例１〜３及び比較例１〜４の実施条件を示している。
【００４５】
【表１】
2005112828.tif 000003
【実施例１】
【００４６】
実施例１では、試料溶液としてポリＣ水溶液を、結合体としてシゾフィラン（分子量2,000,000）を、フィルターとして粒径20〜40μmのポリスチレン多孔質担体をプラスチックカラムに充填したものを用い、フィルター透過実験を行った。
【００４７】
まず、多糖結合性核酸としてポリＣを含むポリＣ水溶液と、結合体としてのシゾフィラン（分子量2,000,000）ジメチルスルホキシド溶液との混合液を生成し、同混合液を、ポリスチレン多孔質担体（TOYOPEARL-HW75  super fine東ソー製）（1ml）を充填したプラスチックカラムからなるフィルターに低温条件下（ここでは5℃）で加えた。次に、低温条件下でフィルターに溶媒としての溶出液（pH7.5）を10ml加え、１回目の溶出（フィルター透過）を行った。次に、１回目の溶出よりも高い温度からなる高温条件下（ここでは70℃）で溶媒としての溶出液（pH6.0）を加え、２回目の溶出（フィルター透過）を行った。１回目及び２回目の溶出で得られた溶出画分は、それぞれ吸収スペクトル測定（吸光度測定）を行い、溶出曲線を作成してポリＣの溶出挙動について検討した。
【００４８】
図２(Ｂ)にはその結果を示しており、図からも分かるとおり、ポリＣは、低温条件下での溶出画分にはほとんど含まれず、高温条件下での溶出画分に多く含まれていることが明らかとなった。このことから、低温条件下ではシゾフィランとポリＣが複合体を形成してフィルター上に保持され、ポリＣが溶出されないのに対し、高温条件下では前記複合体が解離して、ポリＣが溶出されることが確認された。
【００４９】
また、上記実施例１の比較例として、以下に示す３つのフィルター透過実験を行った。
【００５０】
比較例１では、実施例１と同様の操作を、結合体としてのシゾフィランを加えることなく行った。得られた溶出画分の吸光度を測定し、溶出曲線を作成したところ、図２(Ａ)に示すように、ポリＣは、ポリＣは低温での溶出においてほぼ全量が溶出することが明らかとなった。このことから、β-1,3 -グルカンを加えなければ核酸は低温条件下においても速やかに溶出してしまうことが確認された。
【００５１】
比較例２では、実施例１と同様の操作を、ポリＣの代わりにポリＧを用いて行った。得られた溶出画分の吸光度を測定し、溶出曲線を作成したところ、図２(Ｄ)に示すように、ポリＧは低温での溶出においてほぼ全量が溶出することが明らかとなった。
【００５２】
比較例３では、比較例１と同様の操作を、ポリＣの代わりにポリＧを用いて行った。得られた溶出画分の吸光度を測定し、溶出曲線を作成したところ、図２(Ｃ)に示すように、ポリＧは低温での溶出においてほぼ全量が溶出することが明らかとなった。
【００５３】
上記比較例２及び３の結果からは、多糖結合性核酸ではない核酸はβ-1,3 -グルカンの有無にかかわらず、低温条件下においても速やかに溶出してしまうことが確認された。
【００５４】
このように、上記実施例１及び比較例１〜３からは、多糖結合性核酸は、β-1,3 -グルカンと複合体を形成することで多糖結合性核酸以外の核酸から分離されることが分かる。
【実施例２】
【００５５】
実施例２では、試料溶液としてトータルＲＮＡ（ＲＮＡ混合物）溶液を、結合体としてシゾフィラン（分子量2,000,000）を、フィルターとして粒径20〜40μmのポリスチレン多孔質担体をプラスチックカラムに充填したものを用い、フィルター透過実験を行った。
【００５６】
まず、酵母由来のトータルＲＮＡ（ＲＮＡ混合物） (10 g/l) 5μlをTris緩衝液（pH7.5、100 mM）470μlに溶解してトータルＲＮＡ溶液を生成し、同トータルＲＮＡ溶液にシゾフィラン（分子量2,000,000）ジメチルスルホキシド溶液を加えて5℃で10分熟成した。これにより生成された混合液を、ポリスチレン多孔質担体（TOYOPEARL-HW75  super fine東ソー製）（1ml）を充填したプラスチックカラムからなるフィルターに低温条件下（ここでは5℃）で加えた。次に、低温条件下でフィルターに溶媒としての溶出液（pH7.5）5mlを加え、１回目の溶出（フィルター透過）を行った。次に、１回目の溶出よりも高い温度からなる高温条件下（ここでは70℃）で溶媒としての溶出液（pH6.0）5mlを加え、２回目の溶出（フィルター透過）を行った。１回目及び２回目の溶出で得られた溶出画分は、それぞれ吸収スペクトル測定（吸光度測定）を行い、溶出曲線を作成した。
【００５７】
図３(Ａ)には、その結果を示しており、図からも分かるとおり、ＲＮＡは、低温条件下での溶出画分（フラクション１）に多く含まれ、高温条件下での溶出画分（フラクション２）には微量しか含まれていなかった。
【００５８】
また、両溶出画分についてオリゴｄＴをプローブとしてノーザンブロットを行ったところ、図４(Ａ)に示すように、高温条件下での溶出画分（フラクション２）に強い発色が確認された。この測定ではポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡの存在量に対応して発色が起こる。このことから、多糖結合性核酸ではないＲＮＡは低温条件下においてフィルターを透過し速やかに溶出してしまうのに対し、ポリＡテールメッセンジャーＲＮＡは低温条件下ではフィルター上に保持され、高温条件下で溶出することが明らかとなった。このように、上記操作によってトータルＲＮＡからポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡを分離できることが確認された。
【００５９】
また、高温条件下での溶出画分（フラクション２）については、トータルＲＮＡ溶液と共にゲル電気泳動も行った。図５にはその結果を示しており、図からも分かるとおり、前記フィルター透過を行う前のトータルＲＮＡ溶液では、多糖結合性核酸ではないリポソ−マルＲＮＡの存在を示す２本のシャープなバンドが表れたのに対し、高温条件下での溶出画分（フラクション２）では、前記リポソ−マルＲＮＡの存在を示すバンドが非常にうすくなっていることが確認された。これは、高温条件下での溶出画分（フラクション２）には多糖結合性核酸ではないリポソ−マルＲＮＡの混入が少ないことを示すものであり、このことからも、高温条件下での溶出画分（フラクション２）には、メッセンジャーＲＮＡが高純度で含まれていることが分かった。
【００６０】
また、実施例２については、フィルター透過によって溶出した溶出画分に含まれるシゾフィランの量もβ-1,3-グルカン定量試薬（ファンギテックＧテスト  生化学工業製）を用いて測定した。図６にはその結果を示しており、溶出画分に含まれるシゾフィランの含有濃度は、低温条件下での溶出画分（フラクション１）においても、高温条件下での溶出画分（フラクション２）においても400pg/ml以下であり、溶出したシゾフィランの総量は、添加した量の2％以下であった。このことから、β-1,3 -グルカンはフィルターをほとんど透過していないことが分かり、結合性核酸を分離する結合体として有効に使用できることが証明された。
【００６１】
また、上記実施例２の比較例として、以下に示す比較例４のフィルター透過実験を行った。
【００６２】
比較例４では、実施例２と同様の操作を、結合体としてのシゾフィランを加えることなく行った。得られた溶出画分の吸光度を測定し、溶出曲線を作成したところ、図３(Ｂ)に示すように、実施例２の溶出曲線とほぼ同様の結果を得た。しかし、低温条件下での溶出画分（フラクション１）と、高温条件下での溶出画分（フラクション２）との両画分について、オリゴｄＴをプローブとしてノーザンブロットを行ったところ、図４(Ｂ)に示すように、低温条件下での溶出画分（フラクション１）に強い発色が確認され、高温条件下での溶出画分（フラクション２）にはほとんど発色は見られなかった。すなわち、β-1,3 -グルカンを加えなければ、多糖結合性核酸のメッセンジャーＲＮＡもその他の非多糖結合性核酸と同様に低温条件下で速やかに溶出してしまい、上記の操作によってはトータルＲＮＡからポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡを分離できないことが明らかとなった。
【実施例３】
【００６３】
実施例３では、トータルＲＮＡ（ＲＮＡ混合物）溶液をフィルター透過し、フィルター上に保持されたポリＡテールＲＮＡをフィルターごと試料として、逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を行った。
【００６４】
まず、酵母由来のトータルＲＮＡ（ＲＮＡ混合物） (10 g/l) 5μlをTris緩衝液（pH7.5、100 mM）470μlに溶解してトータルＲＮＡ溶液を生成し、同トータルＲＮＡ溶液にシゾフィラン（分子量2,000,000）ジメチルスルホキシド溶液を加えて5℃で10分熟成した。これにより生成された混合液を、粒径20〜40μmのポリスチレン多孔質担体（TOYOPEARL-HW75  super fine東ソー製）（0.5ml）を充填したプラスチックカラムからなるフィルターに低温条件下（ここでは5℃）で加えた。次に、低温条件下でフィルターに溶媒としての溶出液（pH7.5）5mlを加え、１回目の溶出（フィルター透過）を行った。その後、カラムからポリスチレン多孔質担体を20mgすくい取り、水70μlにけん濁させた。このけん濁液を試料溶液として逆転写ＰＣＲ実験を行った。
【００６５】
逆転写ＰＣＲ実験では、インビトロゲン社の逆転写用キットサーモスクリプトRT-ＰＣＲシステムを用い、ターゲット遺伝子をACT YEAST (全長1128  bases，プライマーはGAAGGGTAGATAGCAGCCATC及びTCTTATGCTGCTTTCACCAGGの塩基配列を持つＤＮＡを用いた。) として、ＤＮＡへの逆転写反応、増幅反応（40サイクル）を行った。得られた反応液（増幅液）を用いてゲル電気泳動を行ったところ、図７に示すように、ほぼ１つのシャープなバンドが観察され、約1000塩基長のＤＮＡが増幅していることが明らかとなった。このことから、トータルＲＮＡ（ＲＮＡ混合物）溶液をフィルター透過し、フィルター上に保持されたポリＡテールＲＮＡは、わざわざフィルターから取り外さなくてもフィルターに保持されたそのままの状態で逆転写ＰＣＲの試料として使用できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の概念を模式的に示した説明図である。
【図２】実施例１において、ポリスチレン多孔質を充填したカラムをフィルターとして、試料溶液を低温条件下及び高温条件下でフィルター透過させた時の核酸の溶出曲線を示す図であり、（Ａ）は試料溶液がポリＣ水溶液の場合、（Ｂ）は試料溶液がシゾフィラン-ポリＣ混合物の場合、（Ｃ）は試料溶液がポリＧ水溶液の場合、（Ｄ）は試料溶液がシゾフィラン-ポリＧ混合物の場合の溶出曲線を示す図である。
【図３】実施例２において、ポリスチレン多孔質を充填したカラムをフィルターとして、試料溶液を低温条件下及び高温条件下でフィルター透過させた時の核酸の溶出曲線を示す図であり、（Ａ）は試料溶液がトータルＲＮＡ-シゾフィラン混合物の場合、（Ｂ）は試料溶液がトータルＲＮＡ溶液の場合の溶出曲線を示す図である。
【図４】実施例２で得られた各溶出画分についてオリゴｄＴをプローブとしてノーザンブロット実験を行った結果を示す説明図である。
【図５】実施例２で得られた高温条件下で溶出した溶出画分（フラクション２）のゲル電気泳動実験の結果を示す説明図である。
【図６】実施例２で得られた各溶出画分に含まれるシゾフィランの濃度を示す説明図である。
【図７】実施例３において、逆転写ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を行い、反応液についてゲル電気泳動実験を行った結果を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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