(57)【要約】  【課題】免疫学的反応を回避しつつ、細胞機能を高次に維持しそれらを十分量長期保存可能な状態にすることを可能とする、免疫隔離膜内動物臓器細胞の凍結保存方法を提供する。【解決手段】動物生体（ヒトを除く）あるいは脳死状態のヒトからの臓器を消化処理して臓器細胞を分離後、アルギン酸ナトリウムとコラーゲンとを含む塩化ナトリウム溶液に懸濁し、このようにして得られた懸濁液を用いて臓器細胞のマイクロカプセルを形成し、アルギネート／ポリ−Ｌ−リシン法により臓器細胞のマイクロカプセルの外表面を覆い免疫隔離膜を形成し、得られた免疫隔離膜内臓器細胞を細胞障害回避溶媒中に浮遊し、得られた浮遊液を液体窒素にて直ちに凍結することからなる、免疫隔離膜内蔵機細胞の凍結保存方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物生体（ヒトの生体を除く）あるいは脳死状態のヒトからの臓器を消化処理して臓器細胞をばらして分離後、アルギン酸ナトリウムとコラーゲンとを含む塩化ナトリウム溶液に懸濁し、このようにして得られた懸濁液を用いて臓器細胞のマイクロカプセルを形成し、アルギネート／ポリ−Ｌ−リシン法により臓器細胞のマイクロカプセルの外表面を覆って免疫隔離膜を形成して免疫隔離膜内臓器細胞を得、前記免疫隔離膜内臓器細胞を細胞障害回避溶媒中に浮遊し、得られた浮遊液を直ちに液体窒素にて凍結することからなる、免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法。
【請求項２】
前記動物生体臓器と脳死状態のヒトの臓器は、それぞれラット肝臓とヒト肝臓である、請求項１の免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法。
【請求項３】
前記細胞障害回避溶媒が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ジメチルスルオキシドを含むＤＭＥＭである、請求項１または２の免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法。
【請求項４】
マイクロカプセル化され多数の動物生体（ヒトの生体を除く）の臓器細胞あるいは脳死状態のヒトからの臓器細胞を含むマイクロカプセルと、アルギネートとポリ−Ｌ−リシンから形成され該マイクロカプセルを覆う免疫隔離膜とからなるマイクロカプセル化した免疫隔離膜内臓器細胞と、得られた免疫隔離膜内臓器細胞を浮遊する細胞障害回避溶媒とからなり、得られた浮遊液を液体窒素にて直ちに凍結していることからなる、免疫隔離膜内臓器細胞。
【請求項５】
前記動物生体臓器と脳死状態のヒトの臓器は、それぞれラット肝臓とヒト肝臓である、請求項４の免疫隔離膜内臓器細胞。
【請求項６】
前記細胞障害回避溶媒が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ジメチルスルオキシドを含むＤＭＥＭである、請求項４または５の免疫隔離膜内臓器細胞。
【請求項７】
ラジアルフローバイオリアクターと、該ラジアルフローバイオリアクター中に請求項４乃至６のいずれかに記載の凍結保存した免疫隔離膜内臓器細胞を解凍して充填した免疫隔離膜内臓器細胞とからなる、バイオハイブリット人工臓器モジュール。
【請求項８】
バイオハイブリッド人工肝臓モジュールである、請求項７のバイオハイブリッド人工臓器モジュール。
【請求項９】
前記動物生体臓器と脳死状態のヒトの臓器は、それぞれラット肝臓とヒト肝臓である、請求項７または８の免疫隔離膜内臓器細胞のバイオハイブリッド人工臓器モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロカプセル化した免疫隔離膜内臓器細胞（動物生体臓器及び脳死状態のヒト由来の臓器細胞を含む）の凍結保存方法、マイクロカプセル化した免疫隔離膜内臓器細胞、並びにマイクロカプセル化した免疫隔離膜内臓器細胞を用いたバイオハイブリッド人工臓器モジュールに関する。特に、本発明は免疫隔離膜内肝細胞の凍結保存方法、マイクロカプセル化した免疫隔離膜内肝細胞、並びにマイクロカプセル化した免疫隔離膜内肝細胞を用いたバイオハイブリッド人工臓器モジュールに関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の疾患中、急性肝不全は依然として重篤な疾患として認知されているが、最近では血漿交換と血液濾過透析の組み合わせによる機械的な血液浄化法に基づく人工肝補助療法で劇症肝罹患者に対して高い救命率が報告されており、今後の治療成績に大きな期待が寄
せられている(非特許文献１)。欧米ではさらなる肝機能補助を目指しハイブリッド型人工肝臓モジュールが臨床応用され、肝移植へ橋渡し的な使用例として成功を収めている(非特許文献２，３)。我が国においても画期的な人工肝臓モジュールの研究開発がなされているが(非特許文献４，５)、ブタのレトロウイルスの感染の問題、免疫学的反応の克服、リアクター内の肝細胞数の調整、細胞ソースの確保および長期保存方法の確立など多くの問題があり、現在の急性肝不全の治療法を凌駕する新たな臨床応用可能な人工肝の開発は依然としてなされていない。（非特許文献１乃至５参照。）
また、従来、動物生体臓器細胞については、細胞の損傷を防ぐため、急激な冷却を回避する必要があり、高価なプログラミングフリーザーを用いてコンピュータ制御により１℃〜２℃／分の速度でゆっくりと冷却するというのが一般的な常識であった。急激に凍結させると細胞懸濁溶媒が針状形状等に結晶化し形成された針状結晶の先端部が細胞を突き刺し細胞を死に至らしめるという技術認識があった。そのため、従来技術では、肝細胞等をマイクロカプセル化し、極低温冷蔵庫（一般的には、−８０℃まで冷却が可能）中で冷却速度をT熱電対等で測定し、電圧をプログラムプログラム調温することによって、冷却速度を例えば０．１〜１０℃あるいは１〜１００℃／ｍｉｎ．等に制御することが行われている。また、上記従来の技術認識から上記極低温冷蔵庫での緩慢な冷却後例えば、−７０℃で２４時間保存し、その後液体窒素にて冷凍するという冷却方法が提案されている。非特許文献６乃至９参照。
それに対して、本発明は、従来の常識方向に反して、細胞障害回避細胞中に浮遊した免疫隔離膜内動物細胞の浮遊液を直ちに液体窒素（−１９６℃）によって凍結する免疫隔離膜内動物生体細胞の凍結保存方法に関するものである。
【非特許文献１】Yoshiba M, et al. Favorable effect of new artificial liver support on survival of patients with fulminant hepatic failure. Artif Organ. 20, 1169-72, 1996.
【非特許文献２】Watanabe FD, Mullon CJ, Hewitt WR, Arkadopoulos N, kahaku E, Eguchi S, Khalili T, Arnaout W, Shackleton CR, Rozga J, Solomon B, Demetriou AA. Clinical experience with a bioartificial liver treatment of severe liver failure. A phase I clinical trial. Ann Surg. 1997: 225; 484-91.
【非特許文献３】Adam M. Extracorporeal liver support: Waiting for the deciding vote. ASAIO J. 49; 2003; 621-32.
【非特許文献４】Mizumoto H, Funatsu K. Liver regeneration using a hybrid artificial liver support system. Artif Organs. 28; 2004; 53-7.
【非特許文献５】Kobayashi N, Okitsu T, Nakaji S, Tanaka N. Hybrid bioartificial liver: establishing a reversibly immortalized human hepatocyte line and developing a bioartificial liver for practical use.
【非特許文献６】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３、Ｖｏｌ．５５、Ｎｏ．３、ｐｐ．６１６−６２２
【非特許文献７】日本機械学会年次大会公演論文集、１９９９、Ｖｏｌ．１９９９，Ｎｏ．２、ｐｐ３０９−３１０
【非特許文献８】日本機械学会論文集Ｂ、２００１、Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．６５４、ｐｐ５８０−５８７
【非特許文献９】バイオエンジニアリング学術講演海公演論文集、１９９９、Ｖｏｌ．11、ｐｐ96-97
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
よってハイブリッド型人工肝臓等のハイブリッド型人工臓器を考慮した場合、免疫学的反応の回避が重要であるとともに、細胞機能を高次に維持しそれらを十分量長期保存可能な状態にすることが望まれる。本発明者らはこれらの課題を克服するために、免疫隔離膜
内動物生体細胞の凍結保存方法の確立を目指しこれに成功した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、本発明は、動物生体（動物にはヒトは含まれない）あるいは脳死状態のヒトからの臓器を消化処理して臓器細胞をばらして分離後、アルギン酸ナトリウムとコラーゲンとを含む塩化ナトリウム溶液に懸濁し、このようにして得られた懸濁液を用いて臓器細胞のマイクロカプセルを形成し、アルギネート／ポリ−Ｌ−リシン法により臓器細胞のマイクロカプセルの外表面を覆って免疫隔離膜を形成して免疫隔離膜内臓器細胞を得、免疫隔離膜内臓器細胞を細胞障害回避溶媒中に浮遊し、得られた浮遊液を直ちに液体窒素にて凍結することからなる、免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法を提供するものである。
動物生体（動物にはヒトは含まれない）からの臓器は動物生体から臓器を切り出すことによって得ることができる。脳死状態のヒトからの臓器は状態の良いものについては生体移植に用いられるが、状態の悪いものは研究用に回すか、あるいは破棄される。現在では、米国では脳死状態のヒトからの臓器であって状態の悪いものについて、研究用等のため取引の対象で入手可能となっており、わが国にも輸入されるようになっている。
【０００５】
本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法においては、前記動物生体臓器はラット肝臓とすることができ、脳死状態のヒトの臓器はヒトの肝臓とすることができる。本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法における動物生体細胞は特定の動物生体細胞に限定されないが、急性肝不全は依然として重篤な疾患として認知されており、ハイブリッドバイオ人工臓器モジュールとしてヒト肝臓（脳死状態のヒト由来のもの）あるいはラット肝臓の用途が特に望まれるからである。
【０００６】
本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法においては、前記細胞障害回避溶媒が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ジメチルスルオキシドを含むＤＭＥＭとすることができる。細胞障害回避溶媒としては、凍結保存中の細胞障害を回避できるものであれば特に限定されないが、このような細胞障害回避溶媒としてはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ジメチルスルオキシドを含むＤＭＥＭが特に適合する。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とジメチルスルオキシドの濃度としては、各々１０％（ＤＭＥＭ培養液中における濃度です。例えば、ＤＭＳＯを１ｃｃ、ＤＭＳＯを１ｃｃ、ＤＭＥＭを８ｃｃ）とすることができる。この場合に、本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法において特に適合すると考えられる。なお、ＤＭＥＭは、ダルベッコの変性イーグル培地（低濃度のグルコース、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、ピリドキシンハイドロクロライド）を指し、文献Cat. N0. 12320-032, Lot  No. 1181791) (GIBC0)に記載され公知のものである。
【０００７】
さらに、本発明は、マイクロカプセル化され多数の分離した動物生体細胞（動物にはヒトを含まない）あるいは脳死状態のヒトからの臓器細胞を含むマイクロカプセルと、アルギネートとポリ−Ｌ−リシンから形成され該マイクロカプセルを覆う免疫隔離膜とからなるマイクロカプセル化した免疫隔離膜内臓器細胞と、得られた免疫隔離膜内臓器細胞を浮遊する細胞障害回避溶媒とからなり、得られた浮遊液を液体窒素にて直ちに凍結していることからなる、免疫隔離膜内臓器細胞を提供するものである。
【０００８】
本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞においては、脳死由来のヒト肝臓あるいはラット肝臓の免疫隔離膜内臓器細胞とすることができること、および前記細胞障害回避溶媒が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ジメチルスルオキシドを含むＤＭＥＭとすることができることは、上述した本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法において述べた通りである。
【０００９】
さらに、本発明は、ラジアルフローバイオリアクターと、該ラジアルフローバイオリアクター中に上記凍結保存した免疫隔離膜内臓器細胞を解凍して充填した免疫隔離膜内臓器細胞とからなる、バイオハイブリット人工臓器モジュールを提供するものである。バイオハイブリッド人工臓器モジュールは、バイオハイブリッド人工肝臓モジュールとすることができる。動物生体細胞は、脳死由来のヒト肝臓あるいはラット肝臓由来のものとすることができる。解凍後は濾過せず、重力に任せてマイクロカプセルを沈殿させ、上澄みの細胞障害回避溶媒を吸いだす。その後、PBS（ピー・ビー・エス：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）で3回洗浄する。洗浄は、マイクロカプセルを重力により沈殿させ、その上澄みを捨てておこなう。洗浄したマイクロカプセルをラジアルフローバイオリアクターに充填する。なお、洗浄後、免疫隔離膜は残存している。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法においては、以下の効果が得られる。
（１）免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法は、動物生体臓器あるいは脳死状態のヒトからの臓器を消化処理して臓器細胞を分離後、アルギン酸ナトリウムとコラーゲンとを含む塩化ナトリウム溶液に懸濁し、このようにして得られた懸濁液を用いて臓器細胞のマイクロカプセルを形成し、アルギネート／ポリ−Ｌ−リシン法により臓器細胞のマイクロカプセルの外表面を覆い免疫隔離膜を形成し、得られた免疫隔離膜内臓器細胞を細胞障害回避溶媒中に浮遊し、得られた浮遊液を直ちに液体窒素にて凍結することからなる。従って、本発明では、液体窒素のように急冷すると細胞が損傷し死に至るという従来の常識あるいは予想に反し、免疫隔離膜内臓器細胞が浮遊した細胞障害回避液を直ちに液体窒素にて凍結することにより、従来の凍結保存方法と比較して簡便な操作でかつ廉価に免疫隔離膜内臓器細胞を凍結保存することができる。
（２）後述するように、本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法においては、免疫隔離膜内臓器細胞を細胞機能を失活させることなく長時間にわたって凍結保存することができ、免疫隔離膜内臓器細胞を長期にわたって広範囲な臨床上応用をすることができる。
（３）本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞の凍結保存方法においては、複雑な薬品群を使用していないので、解凍した免疫隔離膜内臓器細胞を臨床上応用するのが容易であり臨床上有害な影響を抑制することができる。
（４）凍結保存した免疫隔離膜内臓器細胞とラジアルフローバイオリアクターとを組み合わせることによって、新たな体外肝臓補助システム等の体外内蔵補充システムとして機能させることが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明について詳細に説明する。
（１）消化処理法
本発明に係る免疫隔離膜内臓器細胞凍結保存方法においては、切り出した臓器、たとえば脳死状態のヒト肝臓あるいはラット肝臓を２段階コラゲナーゼ消化処理することによって、臓器細胞をばらばらに分離することができる。かかる消化処理は公知であるので詳細についての説明は省略するが、以下に簡単に述べる。
【００１２】
まず、切り出した臓器（臓器の一部の場合も含む）に対して、ＥＤＴＡによってカニュレーション（全灌流）して全血液を放出し、次にＥＤＴＡをさらに流しＥＤＴＡで置換し、コラゲナーゼを加え該臓器を消化する。それによって動物生体細胞、たとえばラット臓器細胞あるいは脳死状態のヒト臓器細胞がばらばらとなる。ばらばらとした臓器細胞を遠心分離機にかけて、沈降した臓器細胞と上澄み液である非実質細胞とを分離する。上澄み液を除き沈降臓器細胞を用いてマイクロカプセル化を行う。
【００１３】
ラットの場合切り出した臓器ではなく、麻酔をかけて生きている状態で、潅流を行った。ヒトの場合は脳死状態のヒトから得た臓器を使用する。
（２）マイクロカプセル化、免疫隔離膜によるマイクロカプセル化した動物生体等の臓器細胞の被覆
消化処理して分離した臓器細胞（例えば、人肝細胞、ラット肝細胞）をアルギン酸塩／ポリ−Ｌ−リシン法によりマイクロカプセル化し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％ジメチルスルオキシド（ＤＭＳＯ）を含むＤＭＥＭ中に浮遊させ、マイクロカプセルを含む浮遊液を液体窒素にて凍結保存する。
（２−１）マイクロカプセル化
細胞マイクロカプセル化は、文献カイ等（ＣａｉＺＨ，Ｓｈｉ ＺＱ，Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｍ，Ｓｕｎ  ＡＭ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９８９、１０（５）、Ｐ８５５−８６０）に記載されているシリンジ押出成形法を用いて行う。まず、原発性肝細胞等の原発性動物生体細胞を、アルギン酸ナトリウム及びコラーゲンＩ型を含む塩化ナトリウム水溶液中に混和、懸濁させ、混和したゲル液を、例えば１０ｃｃの注射器に詰め、エアジェット方式で塩化カルシウム水溶液に滴下してマイクロカプセル化させる。マイクロカプセル中には多数の分離臓器細胞が含まれている。
（２−２）免疫隔離膜によるマイクロカプセル化した臓器細胞の被覆  
ＣＨＥＳ（２（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（シグマ：Ｓｉｇｍａ）（2(N-cyclohexylamino) ethanesulfonic acid (Sigma)）、塩化カルシウム水溶液及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、得られた球状のマイクロカプセルをポリ−Ｌ−リシン（シグマ社）で被覆し、ＣＨＥＳ水溶液、塩化カルシウム水溶液及び塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄する。得られたマイクロカプセルをアルギン酸ナトリウムに曝すことによってマイクロカプセルの外表面に膜状の免疫隔離膜を被覆することができる。マイクロカプセル内には多数のゲル化した分離臓器細胞がゲル状で含まれる。ゲルはアルギン酸ナトリウムでゲル化されたコラーゲンＩ型によって形成され、免疫隔離膜内臓器細胞はこのゲルの中に分散している。
（３）凍結保存
膜状の免疫隔離膜で外表面を被覆して得た得られた免疫隔離膜内臓器細胞を細胞障害回避溶媒中に浮遊し、得られた浮遊液を直ちに液体窒素にて凍結する。細胞障害回避溶媒としては、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ジメチルスルオキシドを含むＤＭＥＭを用いることができることは上述のとおりである。
【００１４】
肝細胞（脳死状態のヒト由来の肝細胞を含む）は特に時間の経過とともにその細胞活性、機能が減弱する。本発明では「直ちに」とは、分離工程、懸濁工程、免疫隔離膜形成工程、細胞障害回避溶媒浮遊工程をできる限り迅速に行い、その後はなるべく早急に液体窒素へ保存することにより、動物生体細胞あるいは脳死状態のヒトから切り出した臓器から得られた臓器細胞（例えば、肝細胞）の細胞活性、機能が減弱することを抑えるということを意味している。例えば、細胞障害回避溶媒浮遊工程を終了した後は１０分以内に凍結する。
（４）解凍
免疫隔離膜内臓器細胞を使用するに際しては、凍結免疫隔離膜内臓器細胞を液体窒素から引き上げて、例えば、３７℃の水浴中で自然解凍し、上述のとおり沈殿、上澄み液の除去、洗浄して得られる免疫隔離膜内臓器細胞をラジアルバイオリアクターに充填して用いる。
（５）人工臓器モジュール
患者生体内から血液をポンプで連続的に取り出し、まず血漿分離機で血球成分と血漿成分に分け、あるいは患者の血液を直接、解凍して得た免疫隔離膜内臓器細胞を充填したラジアルフローバイオリアクターからなるバイオハイブリット人工臓器モジュールに通すことによって、所定の細胞代謝により処理した後血漿を患者生体内に還流させる。
【００１５】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。
（ラット肝細胞）
ラット肝細胞等の動物生体細胞あるいは脳死状態のヒト由来の人肝細胞を２段階コラゲナーゼ・ＥＤＴＡ消化法によって臓器細胞にばらばらにし分離後、パコール密度勾配溶液と混合した後、細胞の活性をトリパンブルーエクスクルージョン（ｔｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）によって判断したところ細胞生存率は９５％以上であった。
（マイクロカプセル化した肝細胞の培養）
数百のマイクロカプセル化した肝細胞を等分量に手動で分けて、それぞれの分画に１０％ＦＢＳ，０．２％ウシ血清アルブミン、２０ｍＨＥＰＥＳ、２５ｍＭＮａＨＣＯ３、１ｍｇ／ｍｌガラクトース、３０μｇ／ｍｌＬ−プロリン、０．５ｍＭグルタミン、１０−７Ｍデキサメタゾン、１０ｍＭニコチンアミド、０．５μｇ／ｍｌＩＴＳ５１５００、２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ，０．１ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェート（Ａｃｓ−２Ｐ）、１００μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンで強化したＤＭＥＭ中に入れ、それぞれを懸濁液培養皿（直径６０ｍｍｘ厚１５ｍｍ、コーニング社、ＮＹ）に移して、その後２８日間培養した。細胞培養物を３７℃で湿気のある空気中／５重量％ＣＯ２に維持した。３つの異なった肝細胞からの細胞を用いて、各実験を３度繰り返した。
（実験例１）
試験法アルギン酸塩／ポリ−Ｌ−リシン法によりマイクロカプセル化し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％ジメチルスルオキシド（ＤＭＳＯ）を含むＤＭＥＭ中に浮遊させ、浮遊液を直ちに液体窒素入れ凍結保存した。凍結保存した免疫隔離膜内肝細胞マイクロカプセルは３７℃の水浴にて経時的に解凍し、組織学的評価（Hematoxylin＆Eosin（Ｈ−Ｅ）,パス染色（ＰＡＳ染色），アルブミン（ＡＬＢ），）薬物代謝能（シトクロムP450ＩＩＩ Ａ２とＡ９）を検討した。凍結保存後1日目、7日目、１４日目、２８日目、９０日目に凍結カプセル内ラット肝細胞を解凍し細胞活性を調べたところ、ＡＬＢ、ＰＡＳに陽性発現し、ＯＡＴ２，ＣＹＰ４５０ＩＩＩ１Ａ２，Ａ９の発現を認めた。９０日間凍結カプセル内ラット肝細胞はviabilityを維持していることが分かった。
【００１６】
図１はＨ−Ｅ染色試験結果を示し、免疫隔離膜内ラット肝細胞が９０日凍結保存後も生存していることを示す。図２は、アルブミン染色試験結果を示し、凍結細胞が３ヶ月後においてもアルブミンを産出しており、免疫隔離膜内ラット肝細胞が３ヶ月凍結保存後も生存していることを示す。図３は、薬物代謝能指標であるＯＡＴ２，ＹＰ４５０ＩＩＩ１Ａ２，Ａ９の発現していることを示す。
（実験例２）
肝特異的代謝能（アルブミン合成能、尿素窒素合成能）、組織学的にその機能を評価（H-E，PAS，ALB）した。
【００１７】
１週間凍結カプセルを３７℃の水浴で解凍して、１週間培養した結果を示す。図４の上部は、Ｈ−Ｅ染色試験結果を示し、下部はアルブミン染色結果を示す（左から順に、１日目、３日目、７日目）。凍結カプセルは１週間培養後もその肝特殊代謝機能を維持していた。また、図５は培養中における尿素合成量を観察した結果を示し、凍結免疫隔離膜内ラット細胞は、解凍培養において（図５の上の折線）、凍結処理していないもの（図５の下の折線）に比較して１日目から１４日目の培養に渡り尿素合成能が高く、より高い肝細胞機能が維持されていることが分かる。
（実験例３）実験例１と同様にして得た初代ヒト肝細胞由来の凍結保存免疫隔離膜内肝細胞を３７℃の水浴中で解凍し、肝特異的代謝能（尿素窒素合成能、アンモニア代謝能）、組織学的検討（H−E，ALB）を行ない、凍結保存した免疫隔離膜内肝細胞が正常に機能しているかどうかを調べた。
【００１８】
図６は、解凍した免疫隔膜内肝細胞をホルマリン処理してパラフィンで固定し薄片を作製し位相差顕微鏡にて観察して得た結果を示す。図６から分かるように、凍結、解凍によって免疫隔離膜内肝細胞の形状の変化がなく、破壊されないことを示している。図７は、免疫隔離膜内肝細胞作製直後、１週間後、２週間後、４週間後、３ヶ月間後に解凍した免疫隔離膜内肝細胞のＨ−Ｅ染色結果を示し、また図８は免疫隔離膜内肝細胞作製直後、１週間後、２週間後、4週間後、3ヶ月間後に解凍した免疫隔離膜内肝細胞のアルブミン染色結果を示す。図７と図８とから、１週間後、２週間後、４週間後、３ヶ月間後に解凍した免疫隔離膜内肝細胞は生存し正常に機能していることがわかる。
（実験例４）実験１と同様にして得た初代ラット肝細胞由来の凍結保存免疫隔離膜内肝細胞を３７℃の水浴中で解凍し、その免疫隔離膜内肝細胞の活性を調べた。解凍した免疫隔離膜内肝細胞をラジアルフローバイオリアクター（株式会社エイブル）へ充填し、肝特異的代謝能（尿素窒素合成能、アンモニア代謝能）、組織学的検討（H−E，ALB）を行ない、凍結保存した免疫隔離膜内肝細胞が正常に機能しているかどうかを調べた。
【００１９】
図９はラジアルフローバイオリアクター（株式会社エイブル）を示す。図中、右側の溶液は培養液であり、ポンプ、チューブを介して左側のマイクロカプセル化ラット肝細胞に培養液を灌流した。図１０は灌流後６時間、１２時間、２４時間、７２時間後のＨＥ染色結果およびアルブミン染色結果を示す。図１０から分かるように、マイクロカプセル化ラット肝細胞は灌流後６時間、１２時間、２４時間、７２時間後においても正常に生存し、機能していることが分かる。図１１は、バイオリアクター中２４時間、７２時間灌流させた場合のアンモニア量および尿素合成量を調べたところ、肝細胞は正常に機能していることが分かった。すなわち、ラジアルフローリアクター内肝細胞は少なくとも72時間肝特異的代謝能を維持した。
【００２０】
なお、リアクターの容量を５ｃｃとし、細胞の充填量を３Ｘ１０７とし、温度を３７℃とし、ＣＯ２のインキュベータ内で、流量を４．５ｃｃ／分でリアクター内を外周から中心部に向かって液を流した。培養液は１０％ＦＢＳ，０．２％ウシ血清アルブミン、２０ｍＨＥＰＥＳ、２５ｍＭＮａＨＣＯ３、１ｍｇ／ｍｌガラクトース、３０μｇ／ｍｌＬ−プロリン、０．５ｍＭグルタミン、１０−７Ｍデキサメタゾン、１０ｍＭニコチンアミド、０．５μｇ／ｍｌＩＴＳ５１５００、２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ，０．１ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェート（Ａｃｓ−２Ｐ）、１００μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンで強化したＤＭＥＭとした。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｈ−Ｅ染色試験結果を示し、免疫隔離膜内ラット肝細胞が９０日凍結保存後も生存していることを示す。
【図２】アルブミン染色試験結果を示し、凍結細胞が３ヶ月後においてもアルブミンを産出しており、免疫隔離膜内ラット肝細胞が３ヶ月後においても凍結保存後も生存していることを示す。
【図３】実施例１において、薬物代謝能指標であるＯＡＴ２，ＣＹＰ４５０ＩＩ１Ａ２，Ａ９の発現していることを示す。
【図４】上部は、Ｈ−Ｅ染色試験結果を示し、下部はアルブミン染色結果を示す（左から順に、１日目、３日目、７日目）し、凍結カプセルは１週間培養後もその肝特殊代謝機能を維持していたことを示す。
【図５】培養中における尿素合成量を観察した結果を示し、凍結免疫隔離膜内ラット細胞は、解凍培養において（図５の上の折線）、凍結処理していないもの（図５の下の折線）に比較して１日目から１４日目の培養にわたり尿素合成能が高く、より細胞活性が高いことが分かる。
【図６】解凍した免疫隔膜内ヒト肝細胞をフォルマリン処理してパラフィンで固定し薄片を作製し位相差顕微鏡にて観察して得た結果を示し、凍結、解凍、培養によって免疫隔離膜内ヒト肝細胞の形状の変化がなく、破壊されないことを示す。
【図７】免疫隔離膜内ヒト肝細胞作製直後、１週間後、２週間後、４週間後、３ヶ月間後に解凍した免疫隔離膜内ヒト肝細胞のＨ−Ｅ染色結果を示し、１週間後、２週間後、４週間後、３ヶ月間後に解凍した免疫隔離膜内肝細胞は生存していることがわかる。
【図８】免疫隔離膜内ヒト肝細胞作製直後、１週間後、２週間後、4週間後、3ヶ月間後に解凍した免疫隔離膜内ヒト肝細胞のアルブミン染色結果を示し、１週間後、２週間後、４週間後、３ヶ月間後に解凍した免疫隔離膜内ヒト肝細胞は生存していることがわかる
【図９】ラジアルフローバイオリアクター（株式会社エイブル）を示す。
【図１０】灌流後６時間、１２時間、２４時間、７２時間後のＨＥ染色結果およびアルブミン染色結果を示し、マイクロカプセル化ラット肝細胞は灌流６時間、１２時間、２４時間、７２時間後においても正常に生存していることが分かる。
【図１１】２４時間、７２時間乾溜させたアンモニア量および尿素合成量を調べた結果を示し、肝細胞は正常に機能していることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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