(57)【要約】【課題】正確かつ迅速にイヌインターフェロン−γを測定することができる測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】標準イヌインターフェロン−γ溶液と、不溶性担体と、抗イヌインターフェロン−γ抗体と、標識剤結合抗イヌインターフェロン−γ抗体と、酵素複合体と、基質液と、反応停止液と必要に応じて使用される発色剤を用いるサンドイッチ法による酵素免疫測定法によってイヌインターフェロン−γを測定することで、イヌインターフェロン−γをより正確かつ迅速に測定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンドイッチ法による酵素免疫測定法によってイヌインターフェロン−γを測定することを特徴とするイヌインターフェロン−γ測定方法。
【請求項２】
標準イヌインターフェロン−γ溶液、不溶性担体、抗イヌインターフェロン−γ抗体、標識剤結合抗イヌインターフェロン−γ抗体、酵素複合体、基質液および反応停止液を用いることを特徴とする請求項１記載のイヌインターフェロンーγ測定方法。
【請求項３】
さらに発色剤を用いることを特徴とする請求項２記載のイヌインターフェロンーγ測定方法。
【請求項４】
抗イヌインターフェロン−γ抗体および標識剤結合抗イヌインターフェロン−γ抗体の抗イヌインターフェロン−γ抗体がイヌインターフェロン−γをマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２または３記載のイヌインターフェロン−γ測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌインターフェロン−γを測定するために、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍ  ｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ法）を用いたモノクローナル抗体を使用するサンドイッチ法によるイヌインターフェロン−γ測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血清などの体液中の抗原性物質を検出したり、またその抗原性物質の濃度を測定する方法として免疫学的測定方法が近年ますます利用されてきている。かかる方法は周知の方法であって、例えば抗原性物質あるいは抗体を放射性物質で標識し、かかる抗原性物質と抗体との間に錯体を形成させ標識成分を測定することによって測定すべき抗原性物質を検出したり、その濃度を測定することから構成されている。
【０００３】
また、近年の遺伝子操作技術の進歩により各種疾病の治療に有望な生体内に存在するサイトカインなどの有用タンパク質が次々に発見され、医薬品としての用途開発研究が盛んに行われている。なかでもインターフェロン（ＩＦＮ）は免疫調節作用、抗ウイルス作用を持つ生理活性物質であり医薬用途で注目されている。遺伝子操作技術によりヒトのＩＦＮのみならず、ウシ、ウマ、ネコなどの動物のＩＦＮも大量生産が可能となり、その結果ウイルス病や腫瘍などの治療薬としてのＩＦＮの用途開発研究が行われているものもある。  
【０００４】
イヌについても、α，β，γ各タイプのＩＦＮが報告されている。イヌには、乳腺腫瘍など多数の腫瘍、パルボウイルス感染症、ジステンバー感染症など多数のウイルス病およびアトピー性皮膚炎などの多数の皮膚病などが知られている。これらの治療薬としてイヌＩＦＮ−γが特に有効であると考えられるので、発明者らによってイヌＩＦＮ−γの動物用医薬品としての開発を進めている。
【０００５】
イヌＩＦＮ−γを動物用医薬品として開発するにあたっては、当然イヌＩＦＮ−γを測定する必要がある。従来、イヌＩＦＮ−γの測定方法としてＢＣＡ試薬などを用いたタンパク質濃度の測定、細胞変性効果による抗ウイルス活性測定などが用いられている。
【０００６】
一方、イヌインスリンを測定する方法としては、特許文献１にサンドイッチ法による酵素免疫測定法によって測定する方法が記載されている。
【特許文献１】特開平１１−６２６３２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、タンパク質濃度測定の場合は、測定サンプル中のイヌＩＦＮ−γを高純度に精製する必要がある。また抗ウイルス活性測定は操作が煩雑かつ測定に長時間を要するうえ、測定誤差が生じやすいという欠点を有している。したがって、イヌＩＦＮ−γの測定方法としてより簡便、迅速かつ高感度な測定方法が望まれている。  
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはかかる状況に鑑み、イヌＩＦＮ−γを測定する方法を鋭意検討した結果、イヌＩＦＮ−γをマウスに免役して得られたモノクローナル抗体および、標識剤結合イヌＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡ法によりイヌＩＦＮ−γを正確かつ迅速に測定できることを見出して本発明に至った。したがって本発明は、「抗イヌＩＦＮ−γ抗体および標識剤結合抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡ法によってイヌＩＦＮ−γを測定するイヌＩＦＮ−γの測定方法」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明にかかるイヌＩＦＮ−γ測定方法は、従来のイヌＩＦＮ−γ測定方法として知られる抗ウイルス活性測定など比較して、より正確かつ迅速にイヌＩＦＮ−γを測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるイヌＩＦＮ−γの測定方法は上記したように、抗イヌＩＦＮ−γ抗体および標識剤結合抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いるサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡ法である。以下に発明の詳細を説明する。
【００１１】
標準イヌＩＦＮ−γ溶液の調製
本発明のイヌＩＦＮ−γ測定方法に使用されるイヌＩＦＮ−γ標準溶液は当業者に周知の手法によって調製することができる。例えば、イヌＩＦＮ−γのＤＮＡをカイコ多核体ウイルスに組込みカイコ細胞で発現可能な組換ベクターとし、カイコ細胞で生産する方法（特開平９−２３４０８５）で作製することができる。このようにして作製したイヌＩＦＮ−γを用いて標準イヌＩＦＮ−γ溶液を調製する。標準イヌＩＦＮ−γ溶液は、原液を緩衝液で希釈して得ることができる。
【００１２】
抗イヌＩＦＮ−γモノクローナル抗体の製造
本発明において用いられる抗イヌＩＦＮ−γモノクローナル抗体は、常法に従って、例えば、ケーラー・ミルシュタイン法（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．４９５−４９７，１９７５）に従って、イヌＩＦＮ−γを免疫抗原として免疫した免疫動物の脾臓細胞と、同種動物由来のミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞（ハイブリドーマ）から製造することができる。本発明において用いる免疫原としてのイヌＩＦＮ−γを免疫する免疫動物としてマウス、ヌードマウス、ラットなどがあげられる。免疫原の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位などにより適宜決められるが、例えばマウスの場合には、１匹あたりの１回の免疫注射量は０．１μｇないし５ｍｇの免疫原を含むように免疫注射するのが好ましい。また、免疫原の免疫注射は、フロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバンドなどの公知のアジュバンドを添加して行うのが好ましい。このように免疫動物に初回免疫した後、免疫原を２回ないし６回追加免疫注射した。追加免疫注射も、初回免疫の場合と同様に、公知のアジュバンドを添加混合して行うのが好ましい。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法などによって繰り返し行って、抗体価がプラトーに達したら、免疫原を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解した免疫原の水溶液を免疫動物に注射して、最終免疫とする。この最終免疫後適当な時間が経過した後、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞または末梢リンパ球などの抗体産生能を持つ細胞を取得する。
【００１３】
このようにして取得したかかる抗体産生能を有する細胞を同種哺乳動物由来の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）と細胞融合される。かかるミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリジシル・トランスフェラーゼ（ＧＰＲＴ）またはチミンキナーゼ（ＴＫ）などの酵素欠損細胞株などが挙げられる。この細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール、リポゾーム、センダイウイルスなどの融合促進剤を用いてまたは電気融合法により行うことができる。そのミエローマ細胞がＧＰＲＴ欠損株またはＴＫ欠損細胞株由来である場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）のみ選択的に培養し、増殖させることができる。このようにして得られたハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法などの免疫学的測定法により測定することにより、変性もしくは修飾されていないイヌＩＦＮ−γとは結合していなくて、変性もしくは修飾されたイヌＩＦＮ−γと特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができ、この方法と、限界希釈法などの公知のスクリーニング法とを組み合わせることによって、本発明に使用するモノクローナル抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。このモノクローナル抗体産生細胞株を、無血清培地などの適当な培地で培養して、例えば、その培養上清から、本発明に使用するモノクローナル抗体を常法により得ることができる。
【００１４】
標識剤結合抗イヌＩＦＮ−γ抗体の製造
次いで、上記のようにして別途製造した抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を標識剤と結合する。結合の方法は常法に従って、例えば「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（東京化学同人発行：１９８６年発行、１０２−１１２頁）に記載された方法に従って行うことができる。使用される標識剤としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、等の酵素、ビオチン、ヘム等の補酵素、補欠分子族などが挙げられる。
【００１５】
抗イヌＩＦＮ−γモノクローナル抗体の固相化
前記のようにして得られた抗イヌＩＦＮ−γモノクローナル抗体は次いで不溶性担体に固相化して固相試薬が製造される。使用される不溶性担体としては、例えばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子物質、紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組み合わせなどが挙げられる。また、かかる不溶性担体の形状としても特に限定されたものではなく、例えば、マイクロタイタープレート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、試験管などの管状、繊維状、膜状、ラテックス粒子などの微粒子状、セルなど種々の形状であってもよく、測定条件によって適宜変えることができる。また、上記抗イヌＩＦＮ−γモノクローナル抗体を上記不溶性担体に固相化して固相試薬を得る方法にしても当業者に周知の方法が使用できる。
【００１６】
抗原と固相試薬との反応による抗原−抗体複合体の生成
次いで、上記の用にして調製された固相試薬を検体もしくは標準イヌＩＦＮ−γ溶液と標識剤結合抗イヌＩＦＮ−γモノクローナル抗体とを反応させる。この反応により、検体もしくは標準イヌＩＦＮ−γ溶液に存在する抗原としてのイヌＩＦＮ−γを固相化試薬標識剤結合抗イヌＩＦＮ−γモノクローナル抗体に結合して、サンドイッチ型抗原−抗体複合体を生成する。
【００１７】
抗体−標識物質複合体の生成
上記のようにして生成された抗原−抗体複合体は更に標識物質を一定温度で一定時間反応させて、抗体−標識物質複合体が生成される。標識物質としては酵素、発光物質、蛍光物質などが一般的に使用される。酵素としては例えば、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。発光物質としては例えば、イソルシノール、ルシゲニン、などが挙げられ、また蛍光物質としては例えば、フルオレッセインイソチオシアネート、フィコビリプロテインなどが挙げられる。
【００１８】
標識物質として酵素を使用する場合には、その活性を測定するためには基質を使用するのが好ましいが、必要に応じて発色剤も使用することができる。例えば、酵素としてＨＲＰを使用する場合には、基質として過酸化水素、ペルオキシダーゼアビジンなどを使用し、発色剤としては２，２’−アジノジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジンなどを使用するのが好ましい。また、酵素としてアルカリフォスファターゼを使用する場合には、基質としてはθ−ニトロフェニルフォスフェートなどを使用するのが好ましく、更に酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用する場合には、基質としては、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレッセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを使用するのが好ましい。
【００１９】
次いで、上記のようにして得られた抗体−標識物質複合体に基質液を反応させる。この反応を所定時間行って、反応が進行した段階で、その反応を停止させるために反応停止剤が使用される。使用する反応停止剤としては例えば、硫酸などの酸などの当業者にとって周知の薬剤を使用することができる。得られた反応液は、所定の波長でその吸光度が測定されて、該抗体−標識物質複合体中における該標識物質としての酵素の活性を測定する。例えば、上記のようにして得られた抗原−抗体複合体に、ストレプトアビジン複合体を作用させて抗体−酵素複合体を形成させ、該複合体にｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを反応させて、遊離したｐ−ニトロフェノールを、波長４１５ｎｍで比色定量することによって、該複合体中のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。同様に、該複合体にペルオキシダーゼアビジン結合体を反応させる場合には、θ−フェニレンジアミンでは波長４１２ｎｍ、テトラメチルベンチジンでは波長４５０ｎｍで比色定量する事によって、該複合体中のペルオキシダーゼ活性を測定することができる。
【００２０】
標準イヌＩＦＮ−γ濃度の検量曲線の作製
標準イヌＩＦＮ−γ溶液濃度の算出は、方対数グラフ用紙のＸ線（ｌｏｇ側）にイヌＩＦＮ−γ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、Ｙ軸にそれぞれの吸光度をとり、標準イヌＩＦＮ−γ濃度に対して得られた吸光度をプロットして標準曲線を作成し、この標準曲線から、検体の吸光度に対応するイヌＩＦＮ−γ濃度を読みとることによって、イヌＩＦＮ−γ濃度を算出することができる。
【００２１】
従って、本発明にかかるイヌＩＦＮ−γ測定方法は、一つの実施態様として、上記したように標準イヌＩＦＮ−γ溶液と、不溶性担体と、標識剤結合抗イヌＩＦＮ−γ抗体と、酵素複合体と、基質液と、反応停止液と、必要に応じて使用される発色剤を用いる。本発明のイヌＩＦＮ−γ測定方法によってイヌＩＦＮ−γの測定を行うには、抗原抗体反応を利用することを特徴としている。この抗原抗体反応を利用したＩＦＮ−γなどのタンパク質を測定する手法も種々開発されているが、本発明に利用できるかかる測定手法は特に限定されるものではなく、タンパク質を測定するために採用されている手法であればいずれでもよく、特に酵素免疫法（ＥＩＡ法）を使用するのが好ましい。また、このＥＩＡ法には、競合法と非競合法とがあるが、本発明にかかる測定方法はいずれも利用することができる。
【００２２】
次に、本発明の測定方法にもちいるサンドイッチ法を用いたＥＬＩＳＡ法について説明する。当然のことながら本発明の測定方法は下記に例示した測定手法には何ら限定されるものではないことは明かである。まず、精製した抗ＩＦＮ−γ抗体を緩衝液で一定量に希釈し、この抗体溶液の一定量を９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに添加して、一定温度で一定時間反応させた後、過剰な抗体液を除去する。その後、プレートの各ウエルに安定化剤、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）を一定量添加して、一定温度で一定時間反応させることによって抗ＩＦＮ−γ固相化プレートを得ることができる。抗ＩＦＮ−γ固相化プレートの各ウエルにＰＢＳで希釈した検体または標準ＩＦＮ−γ溶液を一定量添加して、一定温度で一定時間反応する。反応完了後、ウエル内の溶液を除去して、洗浄液で洗浄する。その後、各ウエルにビオチン結合抗ＩＦＮ−γ抗体などの標識剤結合抗ＩＦＮ−γ抗体ＰＢＳ含有溶液を一定量添加して、一定温度で一定時間反応する。この反応完了後、ウエル内の溶液を除去し、洗浄液で洗浄する。洗浄した後、ペルオキシダーゼアビチン結合体などや、３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）塩酸塩と過酸化水素との混合物などの酵素液や基質液を各ウエルに一定量添加して、一定温度で一定時間反応させる。この反応を停止させるために、一定時間反応させた後、硫酸などの反応停止液を添加する。このようにして得られた反応液を分光光度計を用いて所定の波長における吸光度を測定する。この測定値を、別に作成した標準ＩＦＮ−γ溶液の検量曲線にプロットすることにより検体サンプルに含まれるＩＦＮ−γ濃度を測定する。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２４】
標準イヌＩＦＮ−γ溶液の調製
前記文献の方法に準じて標準イヌＩＦＮ−γ溶液を調製した。標準イヌＩＦＮ−γ溶液は、原液をＰＢＳで希釈して所定の濃度に希釈して得た。
【００２５】
抗イヌＩＦＮ−γ抗体の作製
イヌＩＦＮ−γ抗原をマウスに免疫して下記のような限界希釈法の常法によってモノクローナル抗体を作製した。イヌＩＦＮ−γ抗原を滅菌蒸留水に溶解し、ＩＦＮ−γ濃度１０ｍｇ／ｍｌとした抗原液を調製した。この溶液にフロイント完全アジュバンドを等量混合し、油性エマルジョンとした。これにＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、雌）の背部に０．２ｍｌづつ初回免疫として皮下注射した。初回免疫後、７日目と１６日目に追加免疫をし、更に細胞融合の３日前に最終免疫として抗原液を０．２５ｍｇ／０．２ｍｌづつ腹腔内に注射した。最終免疫後３日してマウスの脾臓を摘出して、その脾細胞をミエローマ細胞と１０：１の割合となるように混合して、５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて細胞融合させ、ＨＡＴ培地を用いて選択した。細胞融合後１４日目に培養上清中のイヌＩＦＮ−γに対する活性をＥＩＡ法によって測定した。つまりイヌＩＦＮ−γを１００μｌのタンパク濃度で固相化した９６穴ＥＩＡプレートの各ウエルに細胞融合の培養液を２００μｌづつ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後洗浄して、ぺルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（１：５００）２００μｌを添加した。洗浄後、基質液として０．１Ｍθ−フェニレンジアミンと０．０１２％過酸化水素水との混合液を各ウエルに２００μＬづつ添加し、室温で１５分間反応させた。その後、４Ｎ硫酸を各ウエルに５０μＬづつ添加して酵素反応を停止させた。次いで、４９２ｎｍにおける吸光値を測定して、イヌＩＦＮ−γのみに対して陽性のクローンを限界希釈法により２回クローニングした。このクローニングによって腹水として得られたモノクローナル抗体１Ｄ６株、１Ｈ１０株、５Ｅ１株等を次のようにして精製した。つまり、得られたそれぞれの腹水１ｍｌに対して、ＰＢＳ１ｍｌで２倍に希釈し、飽和硫酸アンモニウム２ｍｌを滴下し、４℃で４時間放置した後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離をし、得られた沈殿をＰＢＳ２ｍｌで浮遊させて透析後、０．２μｍのフィルターで濾過して精製抗イヌＩＦＮ−γ抗体のクローンのイムノグロブリンサブクラスはＩｇＧ１であることが判明した。
【００２６】
（実施例１）
抗体固相化プレートの作製
９６穴プレートの各ウエルに、上記のようにして得た抗イヌＩＦＮ−γ抗体１Ｄ６株を炭酸水素ナトリウムで５０００倍に希釈して、１００μｌづつ分注して、コーティングして、４℃で一晩静置後、洗浄液で洗浄した。その後、ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに１００μｌづつ添加し、室温で１から２時間静置後、洗浄液で洗浄した。
【００２７】
抗原−抗体複合体の生成
上記のようにして抗イヌＩＦＮ−γ抗体１Ｄ６株を固相化した９６穴プレートの各ウエルにＰＢＳで希釈したイヌＩＦＮ−γ含有検体を１００μｌづつ添加し、コーティングして室温で１時間反応後、洗浄液で洗浄した。その後、ＰＢＳで２０００倍に希釈したビオチン標識結合抗イヌＩＦＮ−γ抗体５Ｅ１株を１００μｌづつ各ウエルに添加し、コーティングして室温で１時間反応後、洗浄液で洗浄した。
【００２８】
抗体−酵素複合体の生成
上記のようにして反応させた後洗浄した該抗体固相化プレートの各ウエルにペルオキシダーゼ−アビジン結合体を１００μｌづつ各ウエルに添加し、室温で１時間反応させた後、洗浄液で洗浄した。
【００２９】
吸光度の測定
発色液としてＴＭＢ塩酸塩と過酸化水素との混合物を１００μｌづつ該抗体固相化プレートの各ウエルに添加し、室温で５から３０分反応させた。その後反応停止液として６Ｎ硫酸と２Ｎ塩酸を等量混合したものを１００μｌづつ各ウエルに添加し、反応を停止させた。得られた反応液をプレートリーダーで４９２ｎｍの波長を測定した。
【００３０】
標準イヌＩＦＮ−γ曲線の検量曲線の作成
標準イヌＩＦＮ−γ濃度の算出は片対数グラフ用紙のＸ線（ｌｏｇ側）にイヌＩＦＮ−γ濃度、Ｙ軸にそれぞれの吸光度をとり、標準イヌＩＦＮ−γ濃度に対して得られた吸光度をプロットして標準曲線を作成した。図１に標準イヌＩＦＮ−γ濃度の標準曲線を示す。この標準曲線から、イヌＩＦＮ−γの濃度は、検体の吸光度に対応するイヌＩＦＮ−γ濃度を読みとることによって算出した。
【００３１】
（実施例２）
抗体固相化プレートの作製
９６穴プレートの各ウエルに、上記のようにして得た抗イヌＩＦＮ−γ抗体１Ｈ１０株を炭酸水素ナトリウムで１０００倍に希釈して、１００μｌづつ分注して、コーティングして、４℃で一晩静置後、洗浄液で洗浄した。その後、ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエルに１００μｌづつ添加し、室温で１から２時間静置後、洗浄液で洗浄した。
【００３２】
抗原−抗体複合体の生成
上記のようにして抗イヌＩＦＮ−γ抗体１Ｈ１０株を固相化した９６穴プレートの各ウエルにＰＢＳで希釈したイヌＩＦＮ−γ含有検体を１００μｌづつ添加し、コーティングして室温で１時間反応後、洗浄液で洗浄した。その後、ＰＢＳで１０００倍に希釈したビオチン標識結合抗イヌＩＦＮ−γ抗体５Ｅ１株を１００μｌづつ各ウエルに添加し、コーティングして室温で１時間反応後、洗浄液で洗浄した。
【００３３】
抗体−酵素複合体の生成
上記のようにして反応させた後洗浄した該抗体固相化プレートの各ウエルに２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ−アビジン結合体を１００μｌづつ各ウエルに添加し、室温で１時間反応させた後、洗浄液で洗浄した。
【００３４】
吸光度の測定
発色液としてＴＭＢ塩酸塩と過酸化水素との混合物を１００μｌづつ該抗体固相化プレートの各ウエルに添加し、室温で５から３０分反応させた。その後反応停止液として６Ｎ硫酸と２Ｎ塩酸を等量混合したものを１００μｌづつ各ウエルに添加し、反応を停止させた。得られた反応液をプレートリーダーで４９２ｎｍの波長を測定した。
【００３５】
標準イヌＩＦＮ−γ曲線の検量曲線の作成
標準イヌＩＦＮ−γ濃度の算出は片対数グラフ用紙のＸ線（ｌｏｇ側）にイヌＩＦＮ−γ濃度、Ｙ軸にそれぞれの吸光度をとり、標準イヌＩＦＮ−γ濃度に対して得られた吸光度をプロットして標準曲線を作成した。図２に標準イヌＩＦＮ−γ濃度の標準曲線を示す。この標準曲線から、イヌＩＦＮ−γの濃度は、検体の吸光度に対応するイヌＩＦＮ−γ濃度を読みとることによって算出した。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例１で得られた標準イヌＩＦＮ−γ溶液の標準曲線を示す図である。
【図２】実施例２で得られた標準イヌＩＦＮ−γ溶液の標準曲線を示す図である。
【図１】
2005315859.tif 000002
【図２】
2005315859.tif 000003