(57)【要約】【課題】  本願発明は、遺伝子発現抑制のためのsiRNAの設計において、抑制対象遺伝子配列中のターゲット配列を効率的に決定できる手法を開発することを主たる課題としている。【解決手段】  本発明の方法は、RNAiによって遺伝子の発現抑制を効果的に起こしている実績ある配列のデータをベースにして、その特徴を抜き出し、それを新たなターゲット配列の手掛かりとすることで、効果的かつ効率的に所望のターゲット配列を調製する方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含むRNAiにより遺伝子の発現を抑制する対象遺伝子中のターゲット配列候補を優先順位を付けて同定する方法。
（１）RNAiにより遺伝子発現の抑制に用いられている既知のsiRNAの配列データを収集し整理する工程、
（２）整理されたデータに対して、塩基の配列順(並び)に沿って、各塩基の出現確率を算出する工程、
（３）各塩基の出現確率について、統計的に有意的な特徴の有無を判別し、有意なデータを有意性データとして格納する工程、
（４）格納された有意性データ及び配列の並びにおける塩基の出現確率を考慮して、発現抑制の対象となる遺伝子の配列からターゲット配列候補を選抜する工程、及び
（５）選抜されたターゲット候補配列を列挙し、対象遺伝子領域での相同性を解析し、相同性のあるものを順序付けて選択し、ターゲット配列候補とする工程。
【請求項２】
次の工程を含むRNAiにより遺伝子の発現を抑制する対象遺伝子中のターゲット配列候補を優先順位を付けて同定する方法。
（１）RNAiにより遺伝子発現の抑制に用いられている既知のsiRNAの配列データを収集し整理する工程、
（２）整理されたデータに対して、塩基の配列順(並び)に沿って、各塩基の出現確率を算出する工程、
（３）各塩基の出現確率について、統計的に有意的な特徴の有無を判別し、有意なデータを有意性データとして格納する工程、
（４）格納された有意性データ及び配列の並びにおける塩基の出現確率を考慮して、代表ダーゲット配列を作成する工程、
（５）代表ダーゲット配列で発現抑制の対象となる遺伝子を相同検索することでターゲット配列候補を選抜する工程、及び
（６）選抜されたターゲット候補配列を列挙し、代表ターゲット配列の内、特に有意性の高い塩基と一致しており、かつｇｃ含有量が５０％にちかい順に、ターゲット配列候補を優先順位を付けて選択する工程。
【請求項３】
代表ターゲット配列が配列番号３で示される（aagnnnnann nnannnngng n、ここでｎは、a、ｃ、ｇ、又はｔのいずれかを表す。）であって、特に有意性の高い塩基が配列番号３中の３塩基目の”ｇ”である、
請求項２記載の対象遺伝子中のターゲット配列候補を優先順位を付けて同定する方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項記載の方法で同定されたターゲット配列候補を基にdsRNAを調製することを含む対象となる遺伝子の発現を抑制するsiRNAの設計方法。
【請求項５】
更に選抜されたターゲット配列候補を有効性判定機構で抑制の効果を判定する工程を最後に含む請求項４記載のsiRNAの設計方法。
【請求項６】
siRNAを用いて発現抑制対象遺伝子の発現が抑制されることを実験により確認する工程を更に含む請求項４〜５いずれか１項記載のsiRNAの設計方法。
【請求項７】
次の工程を含む対象遺伝子のsiRNAの候補配列の有効性を判別する方法。
（１）公知の遺伝子の発現を抑制するsiRNA配列を有効配列として収集する工程、
（２）公知の遺伝子の発現に影響を与えない配列を無効配列として収集する工程、
（３）上記（１）又は（２）で収集した配列を有効配列又は無効配列のラベルを付して学習機構に入力する工程、及び
（４）siRNAの候補配列を順次学習機構に質問として入力し、siRNA配列として有効な配列か否かを判別する工程。
【請求項８】
学習機構がサポートベクターマシーンである請求項７項記載のsiRNA候補配列の有効性を判別する方法。
【請求項９】
無効配列として、既存の有効配列と類似性が無いランダムな塩基配列を用いる請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
公知の遺伝子が、対象遺伝子の由来と同じ種又は同じ属に属する生物に由来する公知遺伝子である請求項７又は８記載の方法。
【請求項１１】
公知遺伝子が、対象遺伝子と同じファミリーに属する遺伝子である請求項７〜１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
下記の（１）及び（２）のデータベースを備えたsiRNAの有効性の判別に用いることができるサポートベクターマシーン。
（１）公知の遺伝子の発現を抑制するsiRNA配列を有効配列として収集したデータベース
（２）公知の遺伝子の発現に影響を与えない配列を無効配列として収集したデータベース
【請求項１３】
公知の遺伝子が同じ種又は同じ属に属する生物に由来する公知遺伝子である請求項１２記載のサポートベクターマシーン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現の抑制技術に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子発現を抑制(サイレンシング)する方法として、広く使われるRNA干渉法(RNAi: RNAinterference)を行うために必要となる標的配列(ターゲット配列と呼称)を効果的／効率的に生成し、かつターゲット配列の抑制有効性を検証する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNAiとは、細胞に2本鎖RNA(dsRNA: double stranded RNA)を導入することにより、相同なmRNAが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象である（非特許文献１：Sharp, P. A. : Genes Dev., 13, 3191-3197(2001)参照）。
【０００３】
RNAiは1998年に線虫において初めて発見され、その後昆虫、植物、更には哺乳細胞等で同様な現象があることが判明した(例えば、特許文献１：ＷＯ９９／３２６１９号、非特許文献２：Hutvagner, G., Zemore, P. D. : Curr. Opin. Genet. Dev., 12, 225-232(2002)参照)。哺乳動物細胞においては、21〜23のdsRNAを細胞に導入することによりRNAiが起こることが知られている。これは、siRNA: small interference RNAと呼ばれている。このsiRNAは化学合成したdsRNAでも同様の効果があることが示されて、遺伝子の発現抑制として急速に使われるようになって来た(例えば、非特許文献３：Elbashir, S. M etc : Nature, 411, 494-498(2001))。
【０００４】
遺伝子の発現抑制としてRNAiを使う場合、まず21〜23塩基のdsRNAを作成する必要があるが、その作成の元になるのが標的配列(ターゲット配列)である。dsRNAは、まず、抑制対象となる遺伝子中から、ターゲット配列を選択、抽出し、ターゲット配列(cDNA)を作り、次に2本鎖のdsRNAの形に合成する。しかしながら、この元になるターゲット配列を含む配列を選択又は抽出する、汎用的な方法は無く、試行錯誤で行うのが一般的な形となっている(例えば、非特許文献４：Elbashir, S. M. etc : Methods, 26, 199-213(2002))。
【０００５】
今まで経験的に、遺伝子のコード領域(ORF)の開始コドンから50〜75下流の塩基"aa"に続く19から21塩基列で、gc含有量が50%前後のものを探し、それをターゲット配列として使えば良いと言われてきた。しかしながら、実際には試行錯誤して選択し、上記以外の様々な部分(位置)からとられてきていることが、文献等から知ることができる(例えば、非特許文献５：Ray, Z. X. etc : Genes Dev., 16, 2923-2934(2002))。また、生成されたターゲット配列が本当に抑制効果を持つかどうかは実際に実験してみないと判らなかった。
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ９９／３２６１９号
【非特許文献１】Sharp, P. A. : Genes Dev., 13, 3191-3197(2001)
【非特許文献２】Hutvagner, G., Zemore, P. D. : Curr. Opin. Genet. Dev., 12, 225-232(2002)
【非特許文献３】Elbashir, S. M etc : Nature, 411, 494-498(2001)
【非特許文献４】Elbashir, S. M. etc : Methods, 26, 199-213(2002)
【非特許文献５】Ray, Z. X. etc : Genes Dev., 16, 2923-2934(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明は、遺伝子発現抑制のためのsiRNAの設計において、抑制対象遺伝子配列中のターゲット配列を効率的に決定できる手法を開発することを主たる課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以下のような方法を採ることで、簡便にターゲット配列を決定できることを見出した。
（１）はじめに、公開文献から、RNAiにより遺伝子発現の抑制を行っているデータを抽出し、それをRNAiにより発現が抑制された遺伝子配列上の標的配列をターゲット配列データとして整理しておく。
（２）次に、これらの整理されたデータに対して、塩基の配列順(並び)に沿って、各塩基の出現率(発生確率)等の統計処理を行う。これにより、配列順序に対して、各塩基の出現率を明らかにできる。
（３）これらの各塩基の出現率について有意的な特徴が無いかどうかを調べ、有意性があるデータを有意性データとして抽出し格納する。
（４）これらの格納された有意性データと配列の並びにおける塩基の出現率を考慮して、発現抑制の対象となる遺伝子の配列からターゲット配列候補を列挙する。
（５）列挙されたターゲット配列候補候補を元にして、対象遺伝子全体又は対象遺伝子の特定の領域での相同性検索を行う。この検索には、例えば、Blastサーチをデフォルト条件下で行うことができる。これによって、更に候補を順序づけることができ、必要に応じ、絞り込み、実際のターゲット配列を抽出していく。
（６）最後に、必要に応じ、順序付けられた又は得られたターゲット配列を有効性判定機構で抑制の効果を判定していく。
【０００９】
以上の様に、本発明の方法は、RNAiによって遺伝子の発現抑制を効果的に起こしている実績ある配列のデータをベースにして、その特徴を抜き出し、それを新たなターゲット配列の手掛かりとすることで、効果的かつ効率的に所望のターゲット配列を調製する方法を提供する。また、更に、得られたターゲット配列の遺伝子発現抑制の有効性について実験的に確認することなく検証する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、発現を抑制しようとする対象遺伝子に対するsiRNAを効率的に調製することができる。更に、今までの様に実験を行って初めて有効性の確認がされていたものを、実験確認することなく高い確度（例えば、80％以上）で検証することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下本願明細書では、次の用語を以下の通り定義する。
発現抑制対象遺伝子：RNAi法により、遺伝子の発現を抑制しようとする対象の遺伝子のことをいう。対象遺伝子と略して標記することもある。
siRNA候補：本願発明の方法で作成した、siRNAとして機能すると予想されるRNAのことを意味する。
標的配列（ターゲット配列）：siRNAが標的とするmRNA配列をコードする対象遺伝子上の配列のことを意味する。
ターゲット配列候補：対象遺伝子上の配列で、ターゲット配列となるであろうと本願方法で予想された配列のことを意味する。
【００１２】
本発明の具体的手順を図面を用いて詳細に説明する。図1は本発明の手順を示す流れ図である。以下これに基づいて説明していく。
【００１３】
（１）  まず文献よりRNAiとして用いられる配列(実績配列)を抽出する
これは、例えば、The Journal of Biological ChemistryVol.278,pp.7850-7854, 2003に示されている様に遺伝子APH-laは5'-aaggcagatgagggcttagca-3'と求めることが出来る。同様に、文献検索し、種々のsiRNA配列を探し出すことでＲＮＡｉでの実績のある配列を得ることができる。
【００１４】
（２）  次にこれら既知のsiRNA配列を多数集めて、RNAi用配列のデータを、抑制対象とする遺伝子上のターゲット配列として整理する
これは、例えば、図３で示すようにcDNAターゲット配列(5'-3')として整理することできる。
【００１５】
図３においてターゲット配列の並びが1から25まであり、データとしてある塩基の並びで見ると、遺伝子名POSHのように3〜21までの塩基列のものとか、遺伝子名PLC-r1の様に1〜19までのものとかある。siRNAに対応する配列が、一本鎖siRNAの最上流側又は２本鎖siRNAのいずれか一方の最上流側を塩基位置１と決める。
上記のような、遺伝子位置の不揃いは、文献により記載の様式が一致せず、またターゲット配列の選択が一様でないことによっているものである。
【００１６】
（３）  次にこれらの集計されたRNAiデータについて統計解析を行う
ここでは、まず、集計データの3列目から21列目までについて、各配列の並びに対して、どの様な塩基出現の状況（出現率）になっているかを統計処理して調べてみる。
【００１７】
例えば、集計データ全体から見て、配列の3番目には塩基a,g,c,tが各々どの位出現しているかを集計してみることで出現状況を知ることが出来る。4列目から21列目についても同じ様に集計していく。
【００１８】
3番目の塩基から21番目の塩基まで出現率の計算を行うのは、RNAiの動作機構において、この領域の配列がdsRNAを構成し、実際の標的mRNAの分断(分割)に重要な役割を演じているためである。例えば、この様に126種のデータを集計し、統計処理した例を表1に示す。
【００１９】
【表１】
2005284708.tif 000002
【００２０】
表1において、最上位行にある3〜21は塩基の配列順を示し、最左端のa,g,c,tは塩基の種別を表している。従って、この表1は配列中のどの位置(並び)にどの塩基がどの位出現しているかを示している。例えば、配列中の8番目の塩基位置をみるとaが44、gが32、cが20、tが30となっているが、これは、126種のデータを集計して、配列8番目には塩基aが44個、塩基gが32個、塩基cが20個、塩基tが30個出現していることを示している。他の列についても同様の意味である。更に、これを比率(百分率)で表したものが、表2である。
【００２１】
【表２】
2005284708.tif 000003
【００２２】
（４）  次にこれらのデータを統計的検定の観点から有意性があるかどうかを判別する
これは、例えば、表2において、各列における塩基の出現率が、各塩基が均等に出現した場合に比べ、どの位の信頼性で有意性があるかについて、次式(1)を使って調べる事で判る。(例えば、岩原信九朗臨”教育と心理のための推計学”日本文化科学杜)
【００２３】
【数１】
2005284708.tif 000004
【００２４】
ここで
pa：表2における各塩基の出現率、
pb：各塩基の理論的出現率(各塩基同確率)*、
P：paとpbの加重平均
na：表1でのサンプル数(126)、
nb：pbのサンプル数(10000)
*：pbは各塩基とも等しく出現するもの(25%)としている。
【００２５】
式1を使って統計的検定を行い、整理したものが表3である。表3において、例えば、3番目の塩基aは99%の信頼性で有意性のあるデータであるということを示している。3番目の塩基g, tについても同様の意味である。8番目は、塩基cが95%の信頼性で有意性があることを示している。他の列についても同様の意味である。
【００２６】
【表３】
2005284708.tif 000005
【００２７】
（５）  次に有意性データや塩基の出現率からターゲット配列の候補を選択する
例えば、出現率の高い有意性データを基にして、その問を他の塩基で補うことにより、遺伝子抑制の確率が高い配列候補を抽出することで生成する事が出来る。表2、表3を例にとると、次の様になる。
【００２８】
（選択法１）
（イ）まず、出現率の高い有意性のある塩基を最初に設定する。例えば、3番目には"g"、8番目には"a"、13番目には"a"、18番目には"g"、20番目には"g"を設定する。
（ロ）次に、これらの塩基に続く塩基で出現率の高いものを表２のデータから選択して設定する。例えば、4番目には"g"、9番目には"g"、14番目には"g"、19番目には"t"、21番目には"a"を設定することが出来る。また、前記に続く出現の確率が高いものとして、4番目は"a"、9番目は"c"、14番目は"t"、19番目は"a"という形も候補として考えられる。
（ハ）次に塩基の並びにおいて、各塩基の位置における出現率の高い塩基を表2で示される出現率の高い塩基順に選択して塩基の組み合わせを作成する。この様な形で間を補い、3番目から21番目までの配列を作り、この配列を正規のターゲット配列探索の目安にしていく。
【００２９】
【表４】
2005284708.tif 000006
【００３０】
このような形で作ったターゲット配列の設定例を表4に示している。表4において、Xに入る塩基は表2で示される出現率の高い塩基から逮択していく。例えば、5列目では、出現率の高い順序はg,a,c,tとなるので、このような優先順位で入れていく。他の列についても同様に選択していく。Xに入る塩基の組合わせは多数有り得るが、この選択基準の一つとして、横一列としてみたときの確率が一番高い順に選択していく。即ち、表2で示されている3番目から21番目に入る塩基列の出現確率を積算して、大きい順に候補を作っていく。例えば、配列番号１(gaggaagatgaggctgtga)は出現確率が0.37×10-9となり、配列番号２(ggggagcatgatgctgagc)は出現確率が0.15×10-9となるので、配列番号１の優先順位が高くなる。この方法は、出現率に関する実績データに重きを置き、一部塩基列の繋がり確率を考慮した方法である。
【００３１】
（他の選択法）
別の方法として、3〜21列目の塩基群をマルコフモデルとしてみて、前塩基や前々塩基との確率を考慮して処理していく方法(3塩基の周期考慮)や、3〜21列目を幾つかに分割(例えば、3分割、4分割等)して、その中で実績データとマルコフモデルを組合わせて活用することや、各種統計処理(6塩基の文字列出現頻度、コドン使用頻度、GC含量等)を組合わせて活用する方法も考えられる。
【００３２】
（６）  次に存在率の高い候補群の中からターゲット配列を生成する
これは、前記の候補群の中から、優先順位に従って、配列候補をもとにして発現の抑制を遺伝子領域に対して相同性探索(ホモロジーサーチ、例えば、Blast)をし、発現の抑制を行う対象遺伝子と相同性がある配列を探していくことにより実現する。
【００３３】
（６−１）効率的には、一群の候補を、上記(５)の出現率の高い有意性のある塩基を最初に設定し、これ以外を任意の塩基とした配列（以下代表ターゲット配列という）で検索する方法がある。たとえば、具体的には、上記（５）（イ）の要件を満たす、表3において、ポジション3"g"、8"a"、13"a"、18"g"、20"gを基に、先頭2bpに"aa"を加えた"aagxxxxaxxxxaxxxxgxgx"(ここで、"x"はa,g,c,tのいずれか)配列（代表ターゲット配列ともいう。）、言い換えれば、配列番号3（aagnnnnann nnannnngng n、ここでｎは、a、ｃ、ｇ、又はｔのいずれか１塩基を表す。）で検索する方法である。
【００３４】
もし相同性があるものがあれば、これを該当遺伝子から抽出して、当該ターゲット配列候補とする。
【００３５】
上記配列番号３中のＸ以外の７つの塩基の内、ターゲット配列候補と一致数の多い順にターゲット配列候補を整理する。同じ塩基数一致するターゲット配列候補については、有意性の最も高い"g"の出現可否や全塩基の出現率及びgc含量(”gc”含量は”aa”を除く19塩基の中にどの位”g”や”c”が含まれているかを意味する。)を加味して、優先順位付けする。例えば、（イ）一番出現率の高い有意性を持つ3番目の”g”があるかを第一にして他の有意性の高い塩基の数を調べ、次に（ロ）”ｇｃ”含量は５０％に近いものを優先してターゲット配列候補を整理する。
【００３６】
（６−２）また、例えば出現確率を積算して、大きい順に作成した候補、先の配列番号１、配列番号２の順に、既知の遺伝子のデータベースに対してホモロジーサーチ（BLASTN）をし、BLASTNの結果に所望する遺伝子が含まれているかを調べる。ホモロジーサーチは例えば、ＫＥＧＧのGENOMENETをBLAST２によりデフォルト条件でサーチできる。もし、含まれている場合には、該当遺伝子の対応配列を抽出して、ターゲット配列を決定することが出来る。
【００３７】
例えば、遺伝子CE1177が発現を抑制しようとする対象遺伝子であるとすると、配列番号１、配列番号２の順で、既知のコード配列領域に全てに対してデフォルト条件を用いてBlast2でサーチすると、配列番号２でサーチした場合に１０番目にヒットした（図４）。  この遺伝子の全塩基配列を抽出して、この全塩基配列に対しホモロジーサーチで一致している部分を抽出し、ホモロジーを有する部分を含んだ21塩基の配列を作ることでターゲット配列とすることができる。
【００３８】
図５は本遺伝子CE1177の塩基列を抽出したもので、その194bpから207bp(14塩基、クエリーの第５塩基から第１８塩基まで)がホモロジーサーチで一致している部分である。従って、この部分を含んだ前後の21配列を抽出することでターゲット配列を作ることが出来る。候補配列の塩基１に対応するのは、１９４より４塩基上流であるから190bpであるので、190ｂｐから210bpまでを選択すると21塩基列となり、一つのターゲット配列となる。この例では、開始2bpがaaとなっている形となっている。
【００３９】
また、（５）と（６）を組み合わせた方法として、出現率の高い有意性のデータを基にして、遺伝子発現を抑制したい遺伝子の塩基配列領域をサーチして、ターゲット配列候補を列挙し、それらを個々の塩基出現率等を考慮して優先順位をつけていく事も可能である。
更に、上記の各手法に加味して、開始の2bpが"aa"やgc含量(目安50%前後)を考慮してターゲット配列を抽出していくことも有効であると考えられる。
【００４０】
（７）更に、必要に応じ、最後にターゲット配列の抑制有効性について検証する。
ターゲット配列が抽出されると、この配列が遺伝子抑制配列として有効かどうか検証する。この検証方法をより明瞭に示したものが図2である。
【００４１】
まず、既存のRNAiターゲット配列で遺伝子抑制を行う有効配列と、そうでない配列（遺伝子抑制を起こさない無効配列）を入力して、ターゲット配列の有効領域と無効領域を分けておく。有効領域（有効配列）と無効領域（無効配列）の区別の基準（抑制率）は正規の発現に対して、３０％を基準とする。発現が３０％以下なら有効に抑制しているので、有効領域にいるものとみなす。無効配列は、（１）例えばランダムの塩基配列を作り、既存の有効配列と類似性が無い配列を、無効配列とすることもできる。又、（２）siRNAが公知の遺伝子については、当該公知遺伝子についてのsiRNAのターゲット配列として用いることができると確認（発現率３０％以下と確認された）された以外の配列を、無効配列として入力できる。
【００４２】
具体的には、下記ＳＶＭで行う。
これは例えば、RNAiのターゲット配列を19次元の各点と見なして、それらを識別する学習機構として実現することが出来る(例えば、T. Hastie etc "The Elements of Statistical Learning" Springer 2002で示されているSVM(Support Vecter Machine)手法を使って領域分けすることが出来る。またサポートベクターマシンのためのソフトウエアは、例えば、http://kernel-machines.org/に公開されているものもある。
従って、既存データにより、各種遺伝子のターゲット配列群を抑制効果のある有効領域と  無効領域に区分けすることが出来る。
【００４３】
また、新規のターゲット配列が抽出されると、この配列を前記の学習機構（例えば、ＳＶＭ）に問い合わせ、該配列がどの領域に属するかを判定させることができる。ここでもし有効領域に入っていれば、それをターゲット配列として使用することができる。無効領域には入っている場合は、（５）にもどり別の候補を選択し、有効領域に入っていることが確認できた段階まで同じ操作を繰り返すことができる。
【００４４】
これにより、今までの様に実験を行って初めて有効性の確認がされていたものを、事前に実験確認することなく、既存データの性質や配魂の非線形関数の形状にもよるが、高い確度、例えば、80％以上、で検証していくことができる。
【００４５】
（８）生成又は同定されたターゲット配列を基にcDNAを調製し、次に2本鎖のdsRNAの形に合成し、必要に応じ、オーバーハングなどを付して、siRNA調製することができる。
【実施例】
【００４６】
既知のRNAｉにおける塩基の出現率を基に設計したＲＮＡiのターゲット配列の有効性評価
（１）[ターゲット配列の設計]
次に、RNAi用のターゲット配列を従来法で抽出した場合と、本発明の方法を用いて抽出した場合について、実際の遺伝子発現抑制効果がどのように表れるかについて実験により確認してみた。
【００４７】
発現抑制の対象とした遺伝子は、アクセッションナンバーNM_031966(Homo sapiens cyclin B1(CCNB1))である。本遺伝子はCDSとして約1300配列長あるので、先頭から約1/3の領域についてターゲット配列候補を抽出して、それらの内どの配列で、遺伝子発現抑制が出てくるかについて調べてみた。
【００４８】
（１−１）従来法によるターゲット配列の抽出
従来法：スタートコドンより50塩基以上下流のORFから"aa"から始まる19から21塩基、好適には19塩基を選び、gc含量50%前後を目安とする方法を用いた。なお、”gc”含量は”aa”を除く19塩基の中にどの位”g”や”c”が含まれているかを計算し、以下に示した。
(ex.http://www.iwai-chem.co.jp/products/dharmacon/design.htm)
【００４９】
上記の従来法により、CCNB1からターゲット配列の候補を抽出していくと次の様なものが見出される。
候補（１）  開始位置：229、配列：aagatcaacatggcaggcgca          gc含量：58％
候補（２）    〃    ：235、配列：aacatggcaggcgcaaagcgc            〃  ：68％
候補（３）    〃    ：249、配列：aagcgcgttcctacggcccct            〃  ：74％
候補（４）    〃    ：250、配列：aagcgcgttcctacggcccct            〃  ：74％
候補（５）    〃    ：276、配列：aacctccaagcccggactgag            〃  ：68％
候補（６）    〃    ：283、配列：aagcccggactgaggccaaga            〃  ：68％
候補（７）    〃    ：300、配列：aagaacagctcttggggacat            〃  ：53％
候補（８）    〃    ：303、配列：aacagctcttggggacattgg            〃  ：58％
候補（９）    〃    ：325、配列：aacaaagtcagtgaacaactg            〃  ：42％
候補（１０）  〃    ：328、配列：aaagtcagtgaacaactgcag            〃  ：47％
候補（１１）  〃    ：329、配列：aagtcagtgaacaactgcagg            〃  ：53％
候補（１２）  〃    ：338、配列：aacaactgcaggccaaaatgc            〃  ：53％
【００５０】
これ以外にも数多くの候補が存在する。全体の約1/3の領域で調べると、40のターゲット配列候補が存在する。(全領域では、123候補が存在する。)
【００５１】
（１−２）  本発明の方法によるターゲット配列候補の抽出
方法：出現率の高い有意性データを基にして、遺伝子領域を検索する方法を以下の方法を用いた。即ち、表3において有意であると示されている、ポジション3"g"、8"a"、13"a"、18"g"、20"gを基に、先頭2bpに"aa"を加えた"aagxxxxaxxxxaxxxxgxgx"(ここで、"x"はa,g,c,tのいずれか)、言い換えれば、配列番号3（aagnnnnann nnannnngng n、ここでｎは、ａ、ｃ、ｇ、又はｔのいずれか１塩基を表す。）で発現抑制対象の遺伝子をホモロジーサーチする方法である。
【００５２】
この結果は以下の様である。
1) 全部(7塩基、aa以外の5塩基が一致するもの)  ：無
2) 6塩基(aa以外に4塩基が一致するもの)        ：無
3) 5塩基(aa以外に3塩基が一致するもの)        ：5配列
(開始位置：283、329、364、428、482)
4) 4塩基(aa以外に2塩基が一致するもの)        ：10配列
(開始位置：229、235、250、371、395、407、410、430、508、509)
5) 3塩基(aa以外に1塩基が一致するもの)        ：18配列
(開始位置：省略)
6) 2塩基(aa以外は一致しないもの)             ：7配列
【００５３】
上記3)の5個の配列候補を有意性の最も高い"g"の出現可否や全塩基の出現率及びgc含量を加味して、次の様に優先順位付けする。一番出現率の高い3番目の”g”をもつものは283、329、364であるが、”gc”含量が329が53％で一番50％に近いのでこれを最優先とした。ついで、５０％に近い順に364、283とした。もし、ｇｃ含量が同じ程度であれば、入れ替えても良い。482,428についても同じように、検討した。  
【００５４】
優先順位(開始位置順)：329、283、364、482、428
（本願方法候補１）329：aagtcagtga  acaactgcag  g    ＧＣ含量（１９塩基）：５３％
（本願方法候補２）364：aagaaggaag  caaaaccttc  a    〃                  ：４２％
（本願方法候補３）283：aagcccggac  tgaggccaag  a    〃                  ：６８％
（本願方法候補４）482：aacctgagcc  agaacctgag  c    〃                  ：５３％
（本願方法候補５）428：aaaaggtacc  tatgctggtg  c    〃                  ：６３％
【００５５】
4)の配列候補についても同様の順位付けをしておく。
優先順位（開始位置で示す）：395、480、371、509、229、250、235、407、410、508
5)についても同様の順位付けをしておく。
以上が、ターゲット配列候補として抽出された。
【００５６】
（２）「遺伝子発現の抑制確認実験」
次にこれらのターゲット配列候補を用いてdsRNAを合成し、実際の遺伝子発現の抑制状況を実験により調べてみた。
この詳細な手順は１．siRNAアニーリング、２．siRNAトランスフェクションという形で行われる。例えば、次の様に行われる。
【００５７】
１．siRNAアニーリング
１−１
RNAサンプルをそれぞれ50μM(50ｐmol/μl)に希釈する、
乾固したRNAは水に溶けにくいので、時々氷につけながら、時間を掛けて、ボルテックスミキサーを使ってよく溶かす。透明な浮遊物がなくなるまで溶かす。
１−２
RNAサンプルを30μlずつと5×annealing buffer(500 mM potassium acetate,150mM HEPES-KOH pH 7.4,10mM magnesium acetate)15μlを混合する（Total ５×１５＝75μl）。
）
１−３
溶液を90℃で1分間加熱し、スピンダウン後に37℃60分間静置する。オリゴは2本鎖になり、最終濃度は20μM(20pmol/μl)になる。
【００５８】
２．siRNAトランスフェクション
２−１  細胞のプレーティング
トランスフェクションをする１日前に、細胞を3.5ｃｍプレートにまく。
細胞量は20−50％コンフルエントになるようにする。
37℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。
２−２  oligo dilutionの調製
20μＭのアニーリングしたオリゴ10μlを170μlのOpti-MEM mediumで希釈する。
２−３  transfection Reagentの調製
4μlのOligofectAMINE(Invitrogen社)16μlをOpti-MEM mediumで希釈する。
室温で5分から１0分間静置する。
２−４  
oligo dilutionをtransfection Reagentに加え、軽く混合する。ボルテックス禁止。
室温で15分から20分間静置する。
２−５
細胞をOpti-MEMで洗った後、Opti-MEMを800μl加える。
２−６
2-4のTransfection mixtureを細胞に加え(Total 1ml)軽く混合する。
２−７
細胞をスライドガラスの上に播き37℃、5%CO2で培養する。
２−８
細胞サンプルを、４時間後、１日目、及び３日目に、取り出し、細胞を100%メタノールで室温 1分で固定する。その後 Phosphate buffer saline (PBS)で2回洗浄する。目的タンパクの抗体を PBSで適当量に希釈する。適当量の抗体希釈液を細胞に与える。37℃で1時間インキュベートした後、PBSで5回洗浄する。蛍光物質で標識された二次抗体を PBSで適当量に希釈して、細胞に与える。この時、二次抗体希釈液には、0.2 μg/ml 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)を含んだ液を使う。この、4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)は核を特異的に染色する。これを核染色と呼ぶ。染色は核染色も蛍光抗体を用いた染色も同時に同じ細胞に行う。蛍光顕微鏡で検鏡するときに、蛍光フィルタの異なった写真をそれぞれ撮ることで、一方は核染色、一方は抗サイクリンB蛍光染色と同じ細胞から異なる染色写真を得ることができる。これにより、抗体による蛍光染色の対染色としてDAPIによる核染色も同時に行い、蛍光染色が観察されない部位にも細胞が確かに存在していることを確認できる。
【００５９】
従来法は、gc含量の50%前後をベースに候補を選別し、次の様な順番で調べた。
順番：候補（１）開始位置229、候補（７）開始位置300、候補（８）開始位置303、候補（１０）開始位置328、候補（１１）開始位置329、候補（１４）開始位置338、・・・
(候補（２）〜（６）及び候補（９）等はgc含量の条件から除外された。)
本発明の方法は前記3)、4)、5)で優先順位付けされた次の様な順番で調べた。
順番（開始位置）：329、283、364、482、428、395、430、・・・
【００６０】
（３）［実験の結果］
従来法で選択したターゲット配列である候補（１）、候補（７）、候補（８）、候補（１０）では遺伝子発現の抑制効果はみられず、候補（１１）で初めて期待する抑制効果を得ることが出来た。即ち、5回目の試行で初めて期待する効果を得られた。
【００６１】
一方、本提案の方法では、調べるべき配列順位として先頭のものは開始位置329であり、これは従来法の候補（１１）にあたるものである。従って、直ちに期待する効果を得ることが出来たのでこの時点で終了することが出来た。
【００６２】
この発現抑制効果は図６に示されている。図６には、3組のセットが示されているが、最上位にあるものは遺伝子発現の抑制効果があるもので、最下位にあるものは遺伝子発現の抑制効果が無いものである。図６を時間経緯のDay0(0日目)、 Day1(1日目)、 Day3(3日目)とみていくと、最上位はDay1でCyclin B1の抗体による染色が出ていない(遺伝子の発現抑制が行われている)が、最下段については、抗体による染色が残っており、遺伝子発現の抑制が行われていないことが判る。最上段の表示のものは、本願方法候補１（ターゲット配列の開始位置329）のものであり、最下段は候補（８）（開始位置が303のもの）である。遺伝子発現を起こさない他の配列についても、同様の表示となることが確認された。この様に従来法では、特に優先の順位があるわけではないので、可能性のあるものを逐次調べていく必要があり、場合によっては、期待する効果を得るまでに、多くの試行を重ねる必要が出てくる。これに反して、本手法は効率よく検索していくことが可能である。
【００６３】
以上の様に、本手法は効果的にRNAiによる抑制を起こしている実績データの配列をベースにして、その特徴を抜き出し、それを新たなターゲット配列の手掛かりとすることで、効果的かつ効率的に所望のターゲット配列を抽出していくと共に、それを検証していく事で遺伝子抑制度の高い配列を作成する方法である。これは、ヒト遺伝子のRNAi抑制効果がmRNAの配列に依存している(mRNAを分断する位置によって、抑制効果が大きく異なる)という報告(例えば、Holen, T etc : Nucleic Acids Rescarch, 30, 1757-1766(2002))があることからも、実際に効果のあった部分の配列を活用し、検証することが有効な方法であるということが出来る。
【００６４】
本発明の方法は、生物種に区別無く全部を一緒にした実績ベースのターゲット配列データを集計した場合を示したが、その他の方法として、生物種毎に分類し、それらの特徴点(特長配列)を抽出して活用する方法も本発明から出てくる派生の一形態として容易に表現することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の手順を示す流れ図
【図２】ターゲット配列の有効性検証方法
【図３】実証されたターゲット配列一覧図
【図４】配列番号２によるホモロジーサーチ結果
【図５】配列番号２とＣＥ１１７７とのアライメント
【図６】サイクリンＢ１の発現抑制
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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