(57)【要約】【課題】  メタン資化細菌を用いて分解性プラスチックであるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を効率よく産生し、さらに、労力を低減できる方法を提供する。【解決手段】  メタン資化細菌を用いてポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を産生するＰＨＢ産生方法であって、メタン資化細菌がＰＨＢを蓄積する培地中の添加物質の上限濃度をＰＨＢ蓄積濃度としたとき、培地中の添加物質の濃度をＰＨＢ蓄積濃度以下に制限し、メタン資化細菌の増殖と、メタン資化細菌の菌体内におけるＰＨＢの蓄積とを行わせる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタン資化細菌を用いてポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を産生するＰＨＢ産生方法であって、
前記メタン資化細菌がＰＨＢを蓄積する培地中の添加物質の上限濃度をＰＨＢ蓄積濃度としたとき、
前記培地中の前記添加物質の濃度を前記ＰＨＢ蓄積濃度以下に制限し、前記メタン資化細菌の増殖と、前記メタン資化細菌の菌体内におけるＰＨＢの蓄積とを行わせるＰＨＢ産生方法。
【請求項２】
前記メタン資化細菌の培養開始時から前記培地中の前記添加物質の濃度を前記ＰＨＢ蓄積濃度以下に制限する請求項１に記載のＰＨＢ産生方法。
【請求項３】
前記添加物質がマグネシウムである請求項１又は２に記載のＰＨＢ産生方法。
【請求項４】
前記メタン資化細菌が、メチロシナス（Methylosinus）属である請求項１〜３の何れか一項に記載のＰＨＢ産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性プラスチックであるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、プラスチックは化石資源である石油から製造され、化学的に非常に安定した化合物である。そのため、本来の利用が行われている限りは分解する等して環境に悪影響を及ぼすことは殆どないと考えられる。
一方、前記プラスチックは、その化学的安定性ゆえに、微生物により速やかな分解を受け難いとされている。そのため、プラスチック製品を使用後、環境中にそのまま廃棄すると、景観を汚す、野生動物を傷つける等の弊害を引き起こす。また、プラスチック製品をごみ焼却炉で焼却すると有毒ガスを発生する、あるいは、高温を発生して焼却炉を傷める等、様々な問題点がある。
【０００３】
生分解性プラスチックは、使用中は、前記プラスチックと同様な利用が可能であり、さらに、使用後は自然界の微生物によって水と二酸化炭素等の無機物に分解され得る。従って、上述したプラスチックを廃棄処分する際の問題点を解決できるものと期待されている。
【０００４】
そのため、生分解性プラスチックの実用化に向けた研究が進められている。生分解性プラスチックには、大別して、澱粉などの天然物を原料とするもの、微生物合成によるもの、及び、化学合成によるものがある。
【０００５】
脂肪族ポリエステル系生分解性プラスチックは、各種の微生物により産生されるとともに、化学合成によっても種々のものが得られ、また、汎用樹脂（前記プラスチック）に近い物性を持つために多方面での応用が考えられている。
この脂肪族ポリエステル系生分解性プラスチックの１つに、ポリヒドロキシブチレート（以下、ＰＨＢと称する）があり、微生物により産生される。ＰＨＢを産生する微生物として、メタン資化細菌、メタノール資化細菌、及び、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌が知られている。これら細菌は、それぞれ、メタン、メタノール、糖を炭素源としてＰＨＢを菌体内に蓄積する。
分解性プラスチックを汎用プラスチックとして広く利用するためには、低コストで産生できることが必須条件であると考えられる。そのため、原料コストを鑑みると、メタンを炭素源としたメタン資化細菌を用いてＰＨＢを産生するのが合理的である。
【０００６】
このメタン資化細菌は、栄養源制限培養など特殊な条件下で菌体内に著量のＰＨＢを蓄積することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。つまり、メタンを炭素源としてメタン資化細菌を増殖させ、相応量増殖後に、窒素、リン、マグネシウム等の栄養源を制限すると、菌体内にＰＨＢを蓄積させることが可能となる。
【０００７】
【非特許文献１】Ｋ.Ｄ.ウェンドラント（K.D.Wendlandt）、Ｍ.ジェコレック（M.Jechorek）、Ｊ.ヘルム（J.Helm）、及び、Ｕ.ストットメイスター（U.Stottmeister）、“Producing poly-3-hydroxybutyrate with a high molecular mass from methane.”、Journal of Biotechnology 86 (2001) p127-p133
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
メタン資化細菌は、培地中に添加した窒素、リン、マグネシウム等の栄養源が不足すると、将来における栄養源の欠乏に対処するため、ＰＨＢを菌体内に蓄積すると考えられる。この性質を利用して、所定時間メタン資化細菌を増殖させた後、人為的に栄養源を制限する栄養制限状態にすることで、ＰＨＢを菌体内に蓄積させていた。
【０００９】
つまり、特許文献１に開示のＰＨＢ産生方法は、メタン資化細菌を増殖させる増殖工程を経た後、ＰＨＢを蓄積させる蓄積工程を行うバッチ式であり、菌体の増殖と菌体内へのＰＨＢの蓄積とを別々に行うものである。
【００１０】
このように、ＰＨＢ産生に際して上記２工程を必要とする方法では、各工程の間に栄養源を制限する処理を施す等の処理を行う必要があるため、作業が中断する、栄養源制限処理を行う必要がある、等の点で工業的利用には問題がある。そのため、各工程間を中断することなく連続してＰＨＢを産生できれば、効率面、或いは、労力低減の面等から好ましいと考えられる。
【００１１】
従って、本発明の目的は、メタン資化細菌を用いて分解性プラスチックであるＰＨＢを効率よく産生し、さらに、労力を低減できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するための本発明に係るＰＨＢ産生方法の第１特徴構成は、
メタン資化細菌を用いてポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を産生するＰＨＢ産生方法であって、
前記メタン資化細菌がＰＨＢを蓄積する培地中の添加物質の上限濃度をＰＨＢ蓄積濃度としたとき、前記培地中の前記添加物質の濃度を前記ＰＨＢ蓄積濃度以下に制限し、前記メタン資化細菌の増殖と、前記メタン資化細菌の菌体内におけるＰＨＢの蓄積とを行わせる点にある。
【００１３】
上述したように、メタン資化細菌は、培地中の栄養源を制限する等、特殊な培養条件下で菌体内に著量のＰＨＢを蓄積する。この方法によると、菌体内にＰＨＢを蓄積させる前に、相応量のメタン資化細菌を得る必要がある。そして、菌体が所望量に達した時点で培養を中断し、培地中の栄養源を制限して菌体内にＰＨＢを蓄積させている。
つまり、この方法では、相応量のメタン資化細菌を得る増殖工程では、ＰＨＢの産生に寄与していないため、ＰＨＢ産生効率の点で不利であると考えられる。
【００１４】
そこで、本発明者らは、メタン資化細菌の増殖中においても菌体内にＰＨＢを蓄積できる方法を鋭意検討したところ、メタン資化細菌の菌体増殖を、培地中の添加物質の濃度を前記ＰＨＢ蓄積濃度以下に制限して行わせると、菌体の増殖に伴い菌体内にＰＨＢを蓄積させることが可能であることを見出し、本発明に想到した。
【００１５】
つまり、メタン資化細菌は、培地中に添加してある栄養源が制限された状態になるとＰＨＢを菌体内に蓄積する性質を有しているため、増殖当初から栄養制限状態を人為的に作り出すことにより、ＰＨＢを菌体内に蓄積させることができる。このとき、菌体の生育に影響を与えない添加物質をＰＨＢ蓄積濃度以下にして栄養制限状態にすれば、菌体増殖とＰＨＢ蓄積とが同時に行われることになり、効率的である。
【００１６】
従って、本発明の第１特徴構成に記載のＰＨＢ産生方法であれば、メタン資化細菌の増殖中においてもＰＨＢの産生に寄与できる。そして、ＰＨＢ産生に際し、従来のように増殖工程と、ＰＨＢ蓄積工程とに分けるバッチ式にする必要が無く、菌体の増殖開始から所望量のＰＨＢ蓄積に至るまでを連続して行うことが可能となるため、ＰＨＢ産生効率が向上する。また、菌体の増殖開始から所望量のＰＨＢ蓄積に至るまでを連続して行うことを可能とする増殖開始時の添加物質の濃度を設定することができるため、好適にＰＨＢの産生を行うことができる。
さらに、各工程の間に、栄養源を制限する処理を施す等の処理を行う必要がないため、その分、労力を省いてＰＨＢの産生を行うことができる。
【００１７】
本発明に係るＰＨＢ産生方法の第２特徴構成は、前記メタン資化細菌の培養開始時から前記培地中の前記添加物質の濃度をＰＨＢ蓄積濃度以下に制限する点にある。
【００１８】
ここで、「培養開始時」とは、メタン資化細菌の増殖が始まる前を指し、例えば、後述の実施例のように、種菌となる菌体を新たな培地に接種するときのことである。
このように、培養開始時から培地中の添加物質の濃度をＰＨＢ蓄積濃度以下に制限すると、メタン資化細菌の増殖が始まった時点から、確実に菌体内にＰＨＢを蓄積させることができる。
【００１９】
本発明に係るＰＨＢ産生方法の第３特徴構成は、前記添加物質をマグネシウムとしてある点にある。
【００２０】
後述の実施例では、メタン資化細菌の増殖時における、上述した各種栄養源のうちマグネシウムの濃度を人為的に制限した状態でメタン資化細菌の増殖状態、及び、菌体内へのＰＨＢ蓄積率への影響を調べる実験を行っている。
【００２１】
図１に示したように、従来方法における増殖工程での培地中のマグネシウム濃度は１５０μＭであるが、培地中のマグネシウム濃度（Ａ）を０．１５〜１５０μＭの間で変化させたとしても、増殖状態はほとんど変化しないことが判明した。つまり、メタン資化細菌は、通常の培養条件におけるマグネシウム濃度より低い濃度で培養したとしても、通常の培養条件と同様の増殖状態を維持するものと認められる。
【００２２】
そして、図２に示したように、上述した各濃度で培養したメタン資化細菌のＰＨＢ蓄積率を測定したところ、マグネシウム濃度が１５μＭ以下であれば４０％以上の高いＰＨＢ蓄積率を示すことが判明した。従って、このメタン資化細菌がＰＨＢを蓄積するのに必要な培地中のマグネシウム濃度であるＰＨＢ蓄積濃度（Ｂ）は、１５μＭ以下の値となる。
【００２３】
尚、従来のように、メタン資化細菌の増殖時に、培地中のマグネシウム濃度（Ａ）を１５０μＭにした場合、ＰＨＢは菌体内には殆ど蓄積されない（図２参照）。この条件でＰＨＢを蓄積させるためには、菌体の増殖工程を中断して栄養源を制限する処理を施した後、ＰＨＢを蓄積させる蓄積工程を行うバッチ式で行う必要がある。
【００２４】
これに対して、培地中のマグネシウム濃度（Ａ）をＰＨＢ蓄積濃度（Ｂ）以下（Ａ≦Ｂ）、つまり、培地中のマグネシウム濃度を１５μＭ以下としてメタン資化細菌の培養を始めた場合は、通常の培養条件と同様の増殖状態を維持し、かつ、高いＰＨＢ蓄積率を示すことから、菌体の増殖を中断して栄養源を制限する処理を施す必要がない。
【００２５】
このように、菌体の増殖開始から所望量のＰＨＢ蓄積に至るまでを連続して行うことを可能とする添加物質（マグネシウム）を特定できたため、本発明の第３特徴構成に記載のＰＨＢ産生方法であれば、培地中の添加物質を制限しても菌体の増殖に影響を及ぼすことはない。
また、栄養源であるマグネシウムを培地に添加する量が少なくすむため、その分、従来に比べてコストの低減を図ることができる。
【００２６】
本発明に係るＰＨＢ産生方法の第４特徴構成は、前記メタン資化細菌が、メチロシナス（Methylosinus）属である点にある。
【００２７】
後述の実施例において、メチロシナス属を含む５種類のメタン資化細菌を増殖させる際に、培地中のマグネシウムの有無による菌体の生育への影響について調べる実験を行っている。
この結果、メチロシナス属においては、培地中のマグネシウムの有無に因らず良好な増殖を示し、一方、他の４種類のメタン資化細菌においては、培地中のマグネシウム無しとすると顕著な増殖低下が確認された（図４参照）。
つまり、メタン資化細菌がメチロシナス属であれば、マグネシウム濃度が非常に低い培養条件でも増殖可能である。これは、例えば、マグネシウム欠乏を培地中に添加されている他の金属で補うような代謝経路を有していると考えられる。
そして、このメチロシナス属は、増殖の最初からマグネシウム欠乏状態で菌体増殖を行うように培地を設定すると、増殖に伴いＰＨＢを菌体内に蓄積する。
【００２８】
従って、メタン資化細菌の増殖時において、添加物質の一例であるマグネシウムを添加しなくても、添加物質の濃度を制限しない場合と同様に増殖できる細菌を特定できたため、本発明の第４特徴構成に記載のＰＨＢ産生方法であれば、増殖当初に添加物質（マグネシウム）欠乏状態であっても、増殖しながらＰＨＢを菌体内に蓄積するという、この細菌の性質を利用してＰＨＢ産生を好適に行うことができる。
【００２９】
また、この細菌は、入手が容易であると共に取り扱いも容易であるため、ＰＨＢの産生を行うのに特別な施設等を必要とせず、ＰＨＢの産生を容易に遂行することができる。
尚、上述した細菌と同様の性質を有するメタン資化細菌であれば、メチロシナス属に限らず、本発明のＰＨＢ産生方法を適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
本実施例では、微生物により産生される脂肪族ポリエステル系生分解性プラスチックであるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を産生する方法について詳述する。
【００３１】
ＰＨＢを産生する微生物として、メタン資化細菌、メタノール資化細菌、及び、アルカリゲネス属細菌が知られている。これらのうち、原料コストを抑える等の観点から、メタンを炭素源としたメタン資化細菌を用いてＰＨＢを産生する場合を例示する。
【００３２】
メタン資化細菌は、培地中の添加物質である窒素、リン、マグネシウム等の栄養源が制限された状態になるとＰＨＢを菌体内に蓄積する性質を有している。
本発明は、菌体の増殖時（好ましくは培養開始時）において培地中の添加物質を設定濃度以下に制限した状態で菌体内にＰＨＢを蓄積させるＰＨＢ産生方法である。そのため、この添加物質を設定濃度以下に制限した状態であっても菌体の増殖に影響を与えない条件を特定することが重要である。つまり、菌体の生育に影響を与えない添加物質を設定濃度以下にして栄養制限状態にすれば、菌体増殖とＰＨＢ蓄積とが同時に行われることになる。
【００３３】
前記条件は、適用する菌種によりその都度決定することが可能であり、限定されるものではない。また、前記設定濃度は、菌体の増殖開始から所望量のＰＨＢ蓄積に至るまでを中断することなく連続して行うことができる濃度であればよい。具体的には、前記設定濃度は、メタン資化細菌がＰＨＢを蓄積する培地中の添加物質の上限濃度であるＰＨＢ蓄積濃度とすることが可能である。
【００３４】
例えば、メタン資化細菌のうちメチロシナス属においては、培地中のマグネシウムの有無に因らず良好な増殖を示す（後述の実施例参照）。この場合、培地中において、設定濃度（ＰＨＢ蓄積濃度）以下に制限した状態であっても菌体の増殖に影響を与えない添加物質はマグネシウムとなる。
【実施例】
【００３５】
以下に、好適な培地中の添加物質、及び、ＰＨＢ産生菌を決定する実験を行った。
＜ＰＨＢ産生菌の選定＞
ＰＨＢを産生するメタン資化細菌としては、メチロシナス属  トリコスポリウム（Methylosinus  trichosporium：以下、ＭＴと称する）、メチロカルダム属  セジディエンス（Methylocaludum szegediense：以下、ＭＳと称する）、メチロコッカス属  カプサルタス（Methylococcus capsulatus：以下、ＭＣと称する）、メチロシスティス属  パルバス（Methylocystis parvus：以下、ＭＰと称する）、及び、メチロモナス属  グラシルス（Methylomonas gracilis：以下、ＭＧと称する）等が知られている。
これら細菌において、標準培地とＭｇ無添加培地との両方で培養し、菌体増殖時におけるマグネシウム依存性を調べた。尚、Ｍｇ無添加培地とは、標準培地からＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを除いた培地のことをいう。
【００３６】
標準培地（組成を表１に示す）に１．２％寒天を添加したアガロース寒天培地に冷凍保存してある各メタン資化細菌を、５００ｍＬの三角フラスコに収容してある１００ｍＬの標準培地に接種し、シリコン栓で封止する。酸素及びメタンを、それぞれ毎秒１０ｍＬの条件でペリスタポンプにて供給しながら３０℃で２日間振盪培養した。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
２日間培養することにより縣濁度（ＯＤ）が１．０まで増殖した各メタン資化細菌を遠心分離し、菌体をＭｇ無添加培地で洗浄した。この遠心分離、洗浄の操作を５回繰り返すことにより、培地中のマグネシウムを完全に除去した。
【００３９】
その後、縣濁度（ＯＤ）が０．１になるように、洗浄した各メタン資化細菌を、標準培地及びＭｇ無添加培地のそれぞれに接種した。
この菌接種液１０ｍＬを７０ｍＬの血清瓶に収容し、瓶内部の気体が空気：メタン＝５：１になるようにガス置換を行い、３０℃で振盪培養した。
【００４０】
振盪培養後、４８時間経過後の縣濁度（ＯＤ）を測定した結果を、図４に示した。
【００４１】
この結果、ＭＴにおいては、標準培地とＭｇ無添加培地との両方で増殖状態は殆ど変化が見られなかった。一方、他の４種類のメタン資化細菌（ＭＳ、ＭＣ、ＭＰ、ＭＧ）においては、標準培地とＭｇ無添加培地との増殖状態を比較すると、Ｍｇ無添加培地の方で顕著な増殖低下が確認された。
【００４２】
つまり、ＭＴにおいては、菌体の増殖はマグネシウムに依存しないと認められた。これは、ＭＴでは、マグネシウム欠乏状態であっても、例えばマグネシウム欠乏を培地に添加してある他の金属元素で補うような代謝経路を有している等の理由により、菌の増殖に影響を与えることがないと考えられる。
【００４３】
一方、他の４種類のメタン資化細菌は、マグネシウム濃度を制限しすぎると菌体の増殖は抑制される。即ち、菌体増殖当初よりマグネシウム欠乏条件とすると、所定の菌体量に達するまで時間を要するためＰＨＢ産生効率は低いため、ある程度のマグネシウムの添加を必要とする。
【００４４】
従って、培地中において制限する添加物質をマグネシウムとした場合、ＰＨＢ産生菌は、メチロシナス属が適当であり、その中でもトリコスポリウムとするのが適当であることが判明した。
【００４５】
＜菌体増殖時におけるマグネシウム濃度依存性調査＞
菌体増殖時におけるマグネシウム濃度依存性を調べるため、以下の実験を行った。
メタン資化細菌として、上述したメチロシナス属トリコスポリウムにおけるＯＢ３ｂ株（Methylosinus trichosporium Ob3b株：以下、ＯＢ３ｂ株と称する）を用いた。
アガロース寒天培地上に冷凍保存してあるＯＢ３ｂ株から採取した菌体を、５００ｍＬの三角フラスコに収容してある標準培地１００ｍＬに接種し、シリコン栓で封止する。
酸素及びメタンを、それぞれ毎秒１０ｍＬの条件でペリスタポンプにて供給しながら３０℃で２日間振盪培養した。
【００４６】
２日間培養することにより縣濁度（ＯＤ）が０．９８まで増殖したＯＢ３ｂ株を遠心分離し、菌体をＭｇ無添加培地で洗浄した。この遠心分離、洗浄の操作を５回繰り返すことにより、培地中のマグネシウムを完全に除去した。
その後、培地中のマグネシウム濃度（Ａ）を種々変更した培地に、洗浄した菌体を接種する。本実施例では、培地中のマグネシウムの最終濃度（Ａ）がそれぞれ０．１５μＭ、１．５μＭ、１５μＭ、１５０μＭになるようにＭｇＳＯ４をＭｇ無添加培地に添加した１００ｍＬの培地１〜４に、洗浄した菌体を接種した。尚、従来方法における増殖工程での培地中のマグネシウム濃度（Ａ）は１５０μＭである。また、上記培地中のマグネシウム濃度（Ａ）は一例であり、これに限られるものではない。
【００４７】
この菌接種液１００ｍＬを６００ｍＬのバイアル瓶に収容し、瓶内部の気体が酸素：メタン＝１：１になるようにガス置換を行い、３０℃で振盪培養した。
【００４８】
ここで、一定時間経過後の培地１〜４それぞれの懸濁度（ＯＤ）を測定した（図１参照）。菌縣濁度（ＯＤ）の測定は、分光光度計Ｕ−３２００（（株）日立製作所製）を用い、６００ｎｍでの透過度を測定することにより行った。
【００４９】
この結果、図１に示したように、培地中のマグネシウム濃度（Ａ）を０．１５〜１５０μＭの間で変化させたとしても増殖状態はほとんど変化せず、菌体は生育できることが判明した。つまり、培地中のマグネシウム濃度を通常の１００分の１に制限したとしても生育のばらつきは無く、通常の培養条件と同様の増殖状態を維持するものと認められる。
【００５０】
＜ＰＨＢ蓄積率測定＞
種々のマグネシウム濃度条件で培養した結果、菌体内に蓄積されたＰＨＢの蓄積量を測定するため、以下の実験を行った。
各培地１〜４で７２時間培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、凍結乾燥させた。この凍結乾燥菌体２〜５ｍｇに、トリクロロエチレン０．５ｍＬ、１-プロパノール０．４ｍＬ、濃塩酸０．１ｍＬを加えて、１００℃で２時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、蒸留水１ｍＬを加え、激しく攪拌した。
【００５１】
そして、１０分間遠心分離（１２００Ｇ）したのち、トリクロロエチレン層を分種し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、表２に示す条件でＰＨＢの定量を行った。各培地１〜４で培養した菌体において、乾燥菌体重量あたりのＰＨＢ蓄積率（ＰＨＢ（ｇ）/乾燥菌体（ｇ））を比較した（図２）。
【００５２】
【表２】
2005304484.tif 000003
【００５３】
この結果、マグネシウム濃度（Ａ）が１５μＭ以下（培地１〜３）であれば４０％以上の高いＰＨＢ蓄積率を有する、言い換えれば、Ｏｂ３ｂ株がＰＨＢを蓄積する培地中のマグネシウムの上限濃度であるＰＨＢ蓄積濃度（Ｂ）は１５μＭ以下であることが判明した。
一方、培地中のマグネシウム濃度（Ａ）を１５０μＭにした場合、ＰＨＢは菌体内には殆ど蓄積されないことが判明した。このマグネシウム濃度条件でＰＨＢを蓄積させるためには、増殖工程を中断して栄養源を制限する処理を施した後、ＰＨＢを蓄積させる蓄積工程を行うバッチ式で行う必要がある。
【００５４】
このように、ＰＨＢ蓄積濃度（Ｂ）を１５μＭ以下とすると、マグネシウム濃度（Ａ）を、ＰＨＢ蓄積濃度（Ｂ）以下の濃度（Ａ≦Ｂ）としてメタン資化細菌の培養を始めた場合は、通常の培養条件と同様の増殖状態を維持し、かつ、高いＰＨＢ蓄積率を示す。この場合、菌体の増殖を中断して栄養源を制限する処理を施す必要がない。従って、菌体の増殖開始から所望量のＰＨＢ蓄積に至るまでを連続して行うことが可能となる。
【００５５】
＜ＰＨＢの平均分子量＞
前記Ｏｂ３ｂ株の菌体内に蓄積されたＰＨＢの平均分子量を測定するため、以下の実験を行った。
各培地１〜４で７２時間培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、凍結乾燥させた。この凍結乾燥菌体５gを乳鉢でよくすりつぶした後、クロロホルム３００ｍＬを加え、６０℃で５時間加熱した。ガラスフィルターに通して菌体残渣を除去した後、液体画分についてエバポレーター用いてクロロホルムを除去した。
その後、得られたフィルム状物質をメタノールで３回洗浄して脂肪等の不純物を除去したのち、エバポレーターを用いて残留メタノールを除去した。得られたフィルム状物質をクロロホルムに溶解し、ガスパヒュージョンクロマトグラフィ（以下、ＧＰＣと称する）を用いて、表３に示す条件で平均分子量を測定した。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
図３に培地１で培養した菌体内に蓄積されたＰＨＢの分子量を測定した生データを示した。そして、これを基に計算すると、各培地１〜４で培養した菌体内に蓄積されたＰＨＢの平均分子量は、何れも２ｘ１０６程度であることが判明した。
従って、培地中のマグネシウム濃度を制限し、菌体の増殖開始から所望量のＰＨＢ蓄積に至るまで連続して行ったとしても、高分子のＰＨＢを得ることができると認められた。
【００５８】
＜ＰＨＢの連続生産＞
前記Ｏｂ３ｂ株の菌体増殖時における菌体量および菌体内のＰＨＢ蓄積量の経時変化を調べた。
菌体の培養は、上述したマグネシウム濃度依存性調査の項で述べた培養方法において、標準培地を４００ｍＬとし、さらに、初期懸濁度（ＯＤ）が９．０になるまで増殖させること以外は、当該培養方法に準じて行った。
そして、遠心分離およびＭｇ無添加培地による洗浄の操作を行ってマグネシウムを除去した後、菌体に４００ｍＬのＭｇ無添加培地を加え、１Ｌのベッセルフラスコに入れた。当該ベッセルフラスコを３０℃に維持し、酸素：メタン＝１：１に調整したガスを毎分１０ｍＬの条件で供給した。
さらに、当該ベッセルフラスコ中の培養液からペリスタポンプを用いて１時間あたり４．２ｍＬの割合で連続的に培養液を引き抜くと共に、同じ割合で新しいＭｇ無添加培地を連続的に添加した。
【００５９】
そして、およそ６時間毎に、引き抜いた培養液から１ｍＬを採取し、遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体量（ｇ）およびＰＨＢ蓄積量（ｇ）をそれぞれ測定した。結果を図５に示した。
尚、測定データは乾燥重量で示し、各採取データを積算して図示した。また、ＰＨＢの菌体重量あたりの蓄積率（％）を図６に示した。
【００６０】
この結果、測定された菌体量およびＰＨＢ蓄積量は、ほぼ時間に比例して増加し、それに伴いＰＨＢ蓄積量もほぼ時間に比例して増加することが判明した。そして、約１００時間経過後には、ＰＨＢは菌体重量に対して４０％程度の蓄積量を占めるに至っているため、従来別々に行われていた菌体の増殖工程とＰＨＢの蓄積工程とを同時に進行させても、効率よくＰＨＢを産生できることが判明した。
従って、本発明のＰＨＢ産生方法は、安定してＰＨＢを産生できるため工業的に利用できるものと認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のＰＨＢの産生方法は、工業的なＰＨＢの産生に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】培地中のマグネシウム濃度を種々変更した場合、各培地１〜４で培養したＯＢ３ｂ株の増殖状態を調べたグラフ
【図２】培地中のマグネシウム濃度を種々変更した場合、各培地１〜４で培養したＯＢ３ｂ株の菌体中に蓄積されたＰＨＢの割合（ＰＨＢ（ｇ）/乾燥菌体（ｇ））を示したグラフ
【図３】培地１で培養したＯＢ３ｂ株の菌体内に蓄積されたＰＨＢの分子量を測定したグラフ
【図４】ＰＨＢを産生する５種のメタン資化細菌において、菌体増殖時のマグネシウム依存性を調べたグラフ
【図５】菌体量およびＰＨＢ蓄積量の経時変化を示したグラフ
【図６】ＰＨＢの菌体重量あたりの蓄積率（％）の経時変化を示したグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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