(57)【要約】  【課題】  ゲルの長寿命化と低分子量の分子を含む広範囲に亘る分子量のタンパク質などの各種分子の良好な分離とを同時に達成することができるゲル電気泳動分析システム、ゲル電気泳動分析方法およびこれらに用いる陰極バッファー溶液を提供する。  【解決手段】  ゲル電気泳動分析を行う場合に、アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有する陰極バッファー溶液を用いる。陰極バッファー溶液は、典型的には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）とアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）と硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）とを含有し、ｐＨは６．０以上８．３以下とする。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有する陰極バッファー溶液を用いたことを特徴とするゲル電気泳動分析システム。
【請求項２】
上記陰極バッファー溶液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアスパラギン酸またはグルタミン酸と硫酸ドデシルナトリウムとを含有することを特徴とする請求項１記載のゲル電気泳動分析システム。
【請求項３】
上記陰極バッファー溶液のｐＨが６．０以上８．３以下であることを特徴とする請求項１または２記載のゲル電気泳動分析システム。
【請求項４】
上記アスパラギン酸またはグルタミン酸のモル濃度に対する上記トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのモル濃度の比が１．０以上２．０以下であることを特徴とする請求項２または３記載のゲル電気泳動分析システム。
【請求項５】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアスパラギン酸、グルタミン酸、ＨＣｌまたはＨ2 ＳＯ4 とを含有する陽極バッファー溶液を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載のゲル電気泳動分析システム。
【請求項６】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液にＨＣｌまたはＨ2 ＳＯ4 を加えてｐＨを６．０から８．０の間に調整したゲルバッファー溶液を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載のゲル電気泳動分析システム。
【請求項７】
ポリアクリルアミドゲルを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載のゲル電気泳動分析システム。
【請求項８】
アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有する陰極バッファー溶液を用いて電気泳動を行うようにしたことを特徴とするゲル電気泳動分析方法。
【請求項９】
上記陰極バッファー溶液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアスパラギン酸またはグルタミン酸と硫酸ドデシルナトリウムとを含有することを特徴とする請求項８記載のゲル電気泳動分析方法。
【請求項１０】
上記陰極バッファー溶液のｐＨが６．０以上８．３以下であることを特徴とする請求項８または９記載のゲル電気泳動分析方法。
【請求項１１】
上記アスパラギン酸またはグルタミン酸のモル濃度に対する上記トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのモル濃度の比が１．０以上２．０以下であることを特徴とする請求項８または９記載のゲル電気泳動分析方法。
【請求項１２】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアスパラギン酸、グルタミン酸、ＨＣｌまたはＨ2 ＳＯ4 とを含有する陽極バッファー溶液を用いることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか一項記載のゲル電気泳動分析方法。
【請求項１３】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液にＨＣｌまたはＨ2 ＳＯ4 を加えてｐＨを６．０から８．０の間に調整したゲルバッファー溶液を用いることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか一項記載のゲル電気泳動分析方法。
【請求項１４】
ポリアクリルアミドゲルを用いることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか一項記載のゲル電気泳動分析方法。
【請求項１５】
アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有することを特徴とする陰極バッファー溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ゲル電気泳動分析システム、ゲル電気泳動分析方法および陰極バッファー溶液に関し、例えばタンパク質の分離に適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲル電気泳動はタンパク質などの生体分子の分離に広く用いられており、ゲルとしては通常ポリアクリルアミドゲルが用いられる。このポリアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動法として、試料液中の分子の電荷密度の制御のために硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を系に添加して電気泳動を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Laemmli 法とも呼ばれる) が知られている（非特許文献１）。
【非特許文献１】Laemmli, UK., Nature 227:680(1970)
【０００３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法においては、ポリアクリルアミドゲルからなる濃縮ゲル（スタッキングゲルとも呼ばれる）および分離ゲル（セパレーションゲルとも呼ばれる）を用い、その濃縮ゲルの上部に分析を行うタンパク質が入った試料液を添加する。濃縮ゲルとしては４％ポリアクリルアミドゲルを用い、ゲルバッファー溶液としては０．１２５Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）とＨＣｌと０．１％ＳＤＳとを含むｐＨ６．８のものを用い、分離ゲルとしては４〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用い、ゲルバッファー溶液としては０．３７５ＭのＴｒｉｓとＨＣｌと０．１％ＳＤＳとを含むｐＨ８．８のものを用いる。試料液の上には上部バッファー槽が設けられ、その中に入れられた陰極バッファー溶液が試料液と接触している。陰極バッファー溶液としては、０．０２５ＭのＴｒｉｓと０．１９２Ｍのグリシンと０．１％ＳＤＳとを含むｐＨ８．３のものを用いる。一方、分離ゲルの下部は、下部バッファー槽の中に入れられた陽極バッファー溶液と接触している。陽極バッファー溶液としては、０．２５ＭのＴｒｉｓと０．１９２Ｍのグリシンと０．１％ＳＤＳとを含むｐＨ８．３のものを用いる。陰極バッファー溶液は陰極に接続され、陽極バッファー溶液は陽極に接続される。
しかしながら、このＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、分離ゲルに用いるゲルバッファー溶液のｐＨが８．８と高いため、加水分解によりゲルの網目構造が壊れやすく、寿命が短いという欠点がある。
【０００４】
なお、特許文献１においては、ゲルの寿命を長くすることなどを目的として、中性ｐＨプレキャスト電気泳動ゲルシステムが提案されている。このゲル電気泳動システムにおいては、ゲルバッファー溶液として、ｐＨが中性付近の一価有機アミンまたは置換アミンを含有し、約６と約７との間のｐＨにＨＣｌで滴定されたものを用い、陰極バッファー溶液として、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯまたはＴＡＰＳＯからなる群から選択される両性イオンバッファーの溶液を含み、水酸化ナトリウムまたは有機塩基で約７のｐＨに滴定されたものを用いることが特徴である。そして、典型的には、陰極バッファー溶液としてはＴｒｉｓ−ＭＥＳを用い、濃縮ゲルとしては４％ポリアクリルアミドゲルを用い、ゲルバッファー溶液としては０．３７５ＭのＢｉｓ−ＴｒｉｓとＨＣｌと０．１％ＳＤＳとを含むｐＨ６．５のものを用い、分離ゲルとしては４〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用い、ゲルバッファー溶液としては０．３７５ＭのＢｉｓ−ＴｒｉｓとＨＣｌと０．１％ＳＤＳとを含むｐＨ６．５のものを用いる。しかしながら、特許文献１には、本発明のように、陰極バッファー溶液として、アスパラギン酸またはグルタミン酸を含むものを用いることは一切開示されていない。
【特許文献１】特表平９−５１２９０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法において、分離ゲルのゲルバッファー溶液のｐＨが８．８と高いためゲルの寿命が短いという欠点は、このゲルバッファー溶液のｐＨを小さくして中性付近の値（例えば、６．５）にすることにより解消することが可能であるが、この場合には、次のような新たな問題が発生する。すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法では、一般に分子量が１０ｋＤａ程度以下の低分子量のタンパク質の分離が困難とされているが、上記のようにゲルバッファー溶液のｐＨを小さくすると、低分子量のタンパク質の分離がより一層困難になってしまう。
そこで、この発明が解決しようとする課題は、ゲルの長寿命化と低分子量の分子を含む広範囲に亘る分子量のタンパク質などの各種分子の良好な分離とを同時に達成することができるゲル電気泳動分析システム、ゲル電気泳動分析方法およびこれらに用いる陰極バッファー溶液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法が有する上記の課題を解決すべく、鋭意検討を行った。その結果、ゲルバッファー溶液のｐＨを小さくして中性付近の値（例えば、６．５）にすれば、ゲルの寿命を長くすることができる反面、特に低分子量の分子を分離することが困難になるという欠点を避けることができないが、陰極バッファー溶液として、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸またはグルタミン酸を含むものを用いることによりこの欠点を解消することができることを見出し、この発明を案出するに至ったものである。
【０００７】
すなわち、上記課題を解決するために、第１の発明は、
アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有する陰極バッファー溶液を用いたことを特徴とするゲル電気泳動分析システムである。
【０００８】
第２の発明は、
アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有する陰極バッファー溶液を用いて電気泳動を行うようにしたことを特徴とするゲル電気泳動分析方法である。
第３の発明は、
アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有することを特徴とする陰極バッファー溶液である。
【０００９】
この発明において、陰極バッファー溶液は、典型的には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）とアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）と硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）とを含有する。この陰極バッファー溶液のｐＨは、好適には７（中性）付近の値に設定され、具体的には例えば６．０以上８．３以下である。この陰極バッファー溶液においては、分析を安定にしかも高い再現性で行うなどの観点より、好適には、アスパラギン酸またはグルタミン酸のモル濃度およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのモル濃度は、アスパラギン酸またはグルタミン酸のモル濃度に対するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのモル濃度の比が１．０以上２．０以下となるように選ばれる。一方、陽極バッファー溶液としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアスパラギン酸、グルタミン酸、ＨＣｌまたはＨ2 ＳＯ4 とを含有するものが用いられる。この陽極バッファー溶液としては、最も一般的には、陰極バッファー溶液と同じものが用いられる。例えば、陰極バッファー溶液として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアスパラギン酸と硫酸ドデシルナトリウムとを含有するものを用いる場合には、陽極バッファー溶液として、同じくトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとアスパラギン酸と硫酸ドデシルナトリウムとを含有するものが用いられる。ゲルバッファー溶液としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液にＨＣｌまたはＨ2 ＳＯ4 を加えてｐＨを６以上８以下、好適には６以上７．７以下、より好適には６．５以上７．７以下の値に調整したものが用いられる。ゲルとしては通常、ポリアクリルアミドゲルが用いられる。
【００１０】
上述のように構成されたこの発明においては、アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有する陰極バッファー溶液を用いることにより、ゲルバッファー溶液としてｐＨが７付近の値のものを用いても、高分子量の分子だけでなく、低分子量の分子も電気泳動により良好に分離されるようになる。
【発明の効果】
【００１１】
この発明によれば、ゲルバッファー溶液としてｐＨが７付近の値のものを用いることによりゲルの長寿命化を図りつつ、アスパラギン酸またはグルタミン酸を含有する陰極バッファー溶液を用いることにより、低分子量の分子を含む広範囲に亘る分子量のタンパク質などの各種分子を良好に分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、この発明の一実施形態について図面を参照しながら説明する。
図１はこの一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを示す。
図１に示すように、このゲル電気泳動分析システムにおいては、いずれもポリアクリルアミドゲルからなる濃縮ゲル１１および分離ゲル１２を用い、その濃縮ゲル１１の上部に分析を行うタンパク質が入った試料液１３を添加する。濃縮ゲル１１としては４％ポリアクリルアミドゲルを用い、ゲルバッファー溶液としては０．３ＭのＴｒｉｓとＨＣｌと０．１％ＳＤＳとを含むｐＨ７．２のものを用いる。分離ゲル１２としては４〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用い、ゲルバッファー溶液としては０．３ＭのＴｒｉｓとＨＣｌと０．１％ＳＤＳとを含むｐＨ７．２のものを用いる。この分離ゲル１２として用いられるポリアクリルアミドゲルの濃度は、寿命を長くする観点からは、例えば１２％以下のものが望ましい。この分離ゲル１２として用いられるポリアクリルアミドゲルは、濃度勾配を持つもの、例えば濃度が下方に向かって４％から２０％まで徐々に増加する濃度勾配を持つものであってもよい。これらの濃縮ゲル１１および分離ゲル１２としては、例えばレディーメイド・ゲルが用いられる。試料液１３は、例えば、分析を行うタンパク質と０．１５ＭのＴｒｉｓとＨＣｌと２％ＳＤＳと１２％グリセロールと所定のマーカー色素とを含み、ｐＨは例えば８．４５である。試料液１３の上には上部バッファー槽１４が設けられ、その中に入れられた陰極バッファー溶液１５が試料液１３と接触している。符号１４ａはシール部材を示す。陰極バッファー溶液１５は、ＴｒｉｓとＡｓｐまたはＧｌｕと０．１％ＳＤＳとを含み、ＡｓｐまたはＧｌｕのモル濃度に対するＴｒｉｓのモル濃度の比は１．０〜２．０、ｐＨは６．０〜８．３である。一方、分離ゲル１２の下部は、下部バッファー槽１６の中に入れられた陽極バッファー溶液１７と接触している。陽極バッファー溶液１７は陰極バッファー溶液１５と同じものが用いられる。陰極バッファー溶液１５は図示省略した電源の陰極（−）に接続され、陽極バッファー溶液１７は陽極（＋）に接続され、両者の間に所定の電圧が印加され、電気泳動が行われる。
【００１３】
このゲル電気泳動分析システムの性能を検証するために、タンパク質の分子量マーカーを使って電気泳動分析を行った結果について説明する。
陰極バッファー溶液１５として、表１に示すＴｒｉｓ−Ａｓｐ系の４種類のものおよび表２に示すＴｒｉｓ−Ｇｌｕ系の４種類のものの合計８種類（溶液１〜８）を調製し、これを用いて電気泳動分析を行った。分離ゲル１２としては１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた。
【表１】
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【表２】
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【００１４】
その結果を図２〜図９に示す。ここで、図２〜図９の各図のＡは電気泳動を行った後の濃縮ゲル１１および分離ゲル１２の全体をコピー機でコピーしたものであり、各図のＢは縦軸にタンパク質の分子量マーカーの分子量、横軸にマーカー色素として用いたクマシーブリリアントブルーＧ２５０（ＣＢＢ）に対する相対移動度（Ｒｆ）を取ったグラフである。ただし、タンパク質の分子量マーカーとしては、ｋＤａ単位で２０５、１１６、９７．４、６９、５５、３６．５、２９、２０．１、１４．３、６．５、３．５、２．５の高分子量から低分子量に亘る合計１１種類のものを用いた。図２〜図９の各図のＡに示される数字は、タンパク質の分子量マーカーの分子量の大きいものから小さいものに、１から順に番号を付けたものである。図２〜図９より、溶液１〜８のいずれを用いても、１１種類のタンパク質の分子量マーカー全てについて、ＣＢＢで染色されたタンパク質のバンドが明確に分離されていることが分かる。ゲルバッファー溶液としてｐＨが７．２と小さいものを用いているにもかかわらず、このように低分子量のタンパク質までバンドが明確に分離されるのは、陰極バッファー溶液１５として酸性アミノ酸であるアスパラギン酸またはグルタミン酸を含有するものを用いている結果である。
【００１５】
比較のために、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法において、分離ゲルのゲルバッファー溶液としてｐＨが７．２のものを用い、上記と同様な試料液を用いて電気泳動を行った場合の結果を図１０に示す。ただし、分離ゲルとしては１０％ポリアクリルアミドゲルを用い、印加電圧は１５０Ｖ、泳動時間は１３５ｍｉｎである。図１０より、２０５ｋＤａから５５ｋＤａのタンパク質しか分離されておらず、３６．５ｋＤａ以下の分子量のタンパク質は分離されていないことが分かる。
【００１６】
以上のように、この一実施形態によれば、ゲルバッファー溶液としてｐＨが７．２のほぼ中性のものを用いていることにより、分離ゲル１２の劣化を防止することができ、寿命を長くすることができるとともに、陰極バッファー溶液１５として、ＴｒｉｓとＡｓｐまたはＧｌｕと０．１％ＳＤＳとを含み、ＡｓｐまたはＧｌｕのモル濃度に対するＴｒｉｓのモル濃度の比が１．０〜２．０、ｐＨが６．０〜８．３のものを用いていることにより、低分子量のタンパク質を含む広範囲の分子量のタンパク質を良好に分離することができる。すなわち、ゲルの長寿命化と低分子量の分子を含む広範囲に亘る分子量のタンパク質の良好な分離とを同時に達成することができる。
【００１７】
以上、この発明の一実施形態について具体的に説明したが、この発明は上述の実施形態に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施形態において挙げた数値、構造、溶液、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、溶液、材料などを用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを示す略線図である。
【図２】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを用いて行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【図３】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを用いて行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【図４】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを用いて行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【図５】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを用いて行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【図６】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを用いて行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【図７】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを用いて行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【図８】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを用いて行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【図９】この発明の一実施形態によるゲル電気泳動分析システムを用いて行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【図１０】従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法において分離ゲルのゲルバッファー溶液のｐＨを７．２として行った電気泳動実験の結果を示す図面代用写真および略線図である。
【符号の説明】
【００１９】
１１…濃縮ゲル、１２…分離ゲル、１３…試料液、１４…上部バッファー槽、１５…陰極バッファー溶液、１６…下部バッファー槽、１７…陽極バッファー溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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