(57)【要約】【課題】            ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩のヒドロキシル化能を有する微生物は、それ自身がＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩により生育阻害を受けるため、培養液中のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩濃度を低く設定する必要があった。このため、プラバスタチンを工業的に製造する際の効率が悪いという問題があった。また、変換速度が一般に遅いので、培養時間が長くなるという欠点があった。【解決手段】          土壌中より見いだされたストレプトミセス属ハルステディ(Streptomyces halstedii)に属する微生物であるＧＳ０１４７５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２７）により、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩により生育阻害を受けずに、工業的規模でプラバスタチンへの効率的変換を可能にした。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造式（１）
【化１】
2005124490.tif 000007
で示されるＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を、次の一般式（２）
【化２】
2005124490.tif 000008
で示されるプラバスタチンに変換する活性を有するストレプトミセス属ハルステディに属する微生物であるＧＳ０１４７５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２７）。
【請求項２】
請求項１に記載する微生物の培養液中にＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を添加し、プラバスタチンを製造する方法。
【請求項３】
請求項１に記載する微生物由来であって、式（１）で表されるＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を式（２）で表されるプラバスタチンに変換する活性を有する酵素源を含む反応液中にＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を添加し、プラバスタチンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物もしくは微生物酵素の作用によりＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩（式１）
【０００２】
【化１】
2005124490.tif 000002
【０００３】
を変換して効率良くプラバスタチン（式２）
【０００４】
【化２】
2005124490.tif 000003
【０００５】
を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害することにより、コレステロールの生合成量を減らし、その結果、強い血清コレステロール低下作用を示す事が知られている。一方、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩のヒドロキシル化誘導体のいくつかは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの競合的インヒビターとして、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩よりも効果的であることが知られており、その代表的な１つがプラバスタチンである。
【０００７】
ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩のヒドロキシル化は、種々の微生物、例えばアブシディア属、カニンガメラ属、シンセファラストラム属またはストレプトマイセス属の微生物（特許文献１）、ノカルジア属の微生物（特許文献２）、アミコラータ属、サッカロポリスポラ属、アミコラトプシス属、サッカロスリックス属またはジルベールテラ属の微生物（特許文献３）により可能であることが報告されている。
【０００８】
これらの公知微生物を用いたヒドロキシル化の手法としては、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を含有する培地で該微生物を培養するか、あるいは該微生物を培養回収後、その菌体または菌体抽出物を用いてＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を変換する手法が用いられている。しかしながら、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を含有する培地で該微生物を培養する方法では、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩に微生物の生育阻害を起こす作用があるため、培養中のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩の濃度を低く設定する必要があった。例えば、特許文献１の実施例に記載されているストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナスは、０．０５％（ｗ／ｖ）という低濃度のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を含有する培地で該微生物を培養している。また、特許文献２および特許文献３に記載の実施例においても、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩は０．０５％（ｗ／ｖ）という低濃度であった。
【０００９】
他方、特許文献４にはプラバスタチン前駆体に対して高い耐性を有し、酵素的なヒドロキシル化の反応性も高い微生物として、ストレプトミセス・エキソフォリアツス（Streptomyces exfoliatus）YJ-118株が記載されている。しかしながら、特許文献４の実施例に示された変換培養における１回のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩添加濃度は、０．０４〜０．０５％（ｗ／ｖ）にすぎず、上記の公知微生物を用いた場合となんら変わりがなかった。
【００１０】
【特許文献１】特公昭６２−５４４７６号公報
【特許文献２】特公平３−７１１１６号公報
【特許文献３】特開平７−１８４６７０号公報
【特許文献４】特表２００１−５１９６５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩のヒドロキシル化能を有する公知微生物は、それ自身がＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩により生育阻害を受けるため、培養液中のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩濃度を０．０４〜０．０５％（ｗ／ｖ）と低く設定する必要があった。このため、プラバスタチンを工業的に製造する際の効率が悪いという問題があった。またさらに、公知微生物による変換速度は遅いため、培養時間を長くとる必要があるという問題もあった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決する新規微生物の探索を行った結果、工業的規模でプラバスタチンへの効率的変換を可能にする、ストレプトミセス属ハルステディ(Streptomyces halstedii)に属する微生物であるＧＳ０１４７５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２７）を土壌中より見いだした。本微生物は、培養液中にＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を０．１〜０．２％（ｗ／ｖ）という従来よりも高濃度下で培養することができる上に、短時間かつ高い収率でプラバスタチンを変換する性質を持つことが確認できた。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、公知微生物による従来の変換培養に比べてＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を０．１〜０．２％（ｗ／ｖ）という高濃度で添加しても、短時間、かつ高い収率でプラバスタチンを得ることが出来る点で有用である。本発明により、高脂血症治療剤として有用なプラバスタチンとその塩、およびラクトン体を効率よく生産することが可能になる。
【００１４】
なお、特許文献１に本微生物と同種であるストレプトミセス属ハルステディＩＦＯ３１９９(Streptomyces halstedii IFO 3199)が、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩をヒドロキシル化することは記載されているが、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩添加濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）と低濃度であり、更にプラバスタチンの生成についてはなんら記載されていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ＧＳ０１４７５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２７）の培養液中に、従来の方法に比べて高濃度のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を添加して培養することにより、短時間、かつ高い収率でプラバスタチンが得られることを特徴とする。
【００１６】
本発明に使用するＧＳ０１４７５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２７）は、以下に示すような菌学的性質を有する。
【００１７】
（１）形態的性質：基生菌糸は、合成寒天培地および天然寒天培地においてよく発達し、不規則に分岐する。胞子は、イーストエキス・麦芽エキス寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡観察によると、胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で、胞子は直線〜曲線状〜波状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ、表面は滑らかで、形状は円筒形である。
【００１８】
（２）培地上での生育状態：各種培地で２８℃、１４日間培養したときの肉眼的観察結果を表１に示した。
【００１９】
【表１】
2005124490.tif 000004
【００２０】
（３）炭素源の資化性：プリドハム・ゴトリーブ寒天培地を使用して、１４日間培養後の炭素源の資化性を調べた。結果を表２に示した。
【００２１】
【表２】
2005124490.tif 000005
【００２２】
（４）菌体成分の分析：ＧＳ０１４７５株の細胞壁主要成分について分析した結果、Ｌ，Ｌ−ジアミノピメリン酸およびグリシンが検出された。また、アラビノースおよびガラクトースは検出されなかった。主要キノン系として、ＭＫ−９（Ｈ８）、ＭＫ−９（Ｈ６）が検出された。
【００２３】
（５）１６ＳｒＲＮＡ塩基配列解析：菌体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）の全塩基配列１５００〜１６００ｂｐの領域を増幅した。増幅された１６ＳｒＤＮＡをシークエンスし、検体の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を得た。その結果、ＧＳ０１４７５株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は相同率１００％でストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ３１９９(Streptomyces halstedii NBRC 3199)およびストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ１２７８３(Streptomyces halstedii NBRC 12783)の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列と一致した。
【００２４】
（６）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験：ＧＳ０１４７５株およびストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ１２７８３(Streptomyces halstedii NBRC 12783)の培養菌体からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験を行った。その結果、ＧＳ０１４７５株をプローブ（標識ＤＮＡ）側としストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ１２７８３(Streptomyces halstedii NBRC 12783)を固定側としたときの相同値は９３％（３回の平均値）、ストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ１２７８３(Streptomyces halstedii NBRC 12783)をプローブ（標識ＤＮＡ）側としＧＳ０１４７５株を固定側としたときの相同値は８４％（３回の平均値）であった。
【００２５】
以上の結果より、ＧＳ０１４７５株がストレプトミセス属の放線菌であることが判った。加えて、ストレプトミセス属ハルステディ(Streptomyces halstedii)の基準種であるストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ１２７８３(Streptomyces halstedii NBRC 12783)との１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同率が１００％であること、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験の相同値が７０％以上であることから、ＧＳ０１４７５株をストレプトミセス属ハルステディ(Streptomyces halstedii)と同定した。
【００２６】
本発明に使用する株は、本菌株はもとより、その人工変異株あるいは自然変異株も、本変換能力を有するものであれば使用可能である。人工変異株は、例えば紫外線照射、コバルト６０照射、または化学変異誘発剤等により容易に得ることが出来る。また、遺伝子工学的な手法により、本変換能力を他の微生物に導入することも可能である。
【００２７】
ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩からプラバスタチンへの変換培養は、プラバスタチンへの変換反応が進行する任意の条件が選択可能である。培養方法としては、通常の放線菌類の培養法が利用可能であるが、液体培地を用い、振とう培養あるいは攪拌培養による方法が好ましい。また、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩と微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、ビタミン類、ミネラル類以外に、プラバスタチンへの変換反応を助長する添加剤を、培養中に用いても良い。好ましい培養温度は、１８℃から５０℃、より好ましくは２５℃から３３℃である。
【００２８】
本発明は、ストレプトミセス属ハルステディ(Streptomyces halstedii)ＧＳ０１４７５株によるプラバスタチンへの変換の如何なる変換率をも含み、好ましくは３０％以上、より好ましくは６０％以上であるが、８０％以上であることが最も好ましい。
【００２９】
変換培養により生成したプラバスタチンは多くの場合精製される。精製とは、文字通り完全に単一化することも意味するが、培養液の濃縮、沈殿化、有機溶媒による抽出、クロマトグラフィー（薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）、および乾燥などの工程を経たものも含む。
【００３０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
グルコース２．０％、リン酸水素２カリウム０．１５％、硝酸アンモニウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、酵母エキス０．１％、ペプトン０．２％、コーンスティープリカー０．２％、ｐＨ８．０からなる培地２０mLを含有する１００mL容三角フラスコにＧＳ０１４７５株を植菌し、３０℃、２１０r.p.m.で２日間回転振とう培養を行った。この培養液を１００mLの同培地を含有する５００mL容三角フラスコ２０本に２mLずつ植菌し、同時に変換基質であるＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を２．０mg/mLの濃度になるように添加して、３０℃、２１０r.p.m.で４日間回転振とう培養を行った。
【００３２】
培養終了時の培養液中のプラバスタチン濃度をＨＰＬＣで定量したところ、約１．０mg/mL であった。また、培養液中にＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩は検出されなかった。
【００３３】
培養終了後の変換培養液をろ過し、得られたろ液をトリフルオロ酢酸でｐＨ３に調整した。ｐＨ調整したろ液約２Lを酢酸エチル約１Lで３回抽出し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、ろ過濃縮し１Lとして、触媒量のトリフルオロ酢酸を添加してラクトン化した。次にラクトン化した酢酸エチル層を５％炭酸水素ナトリウム溶液１Lで洗浄し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧乾固した。この乾固物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、プラバスタチンのラクトン体を含む画分を分取した。得られた画分をさらに逆相のＨＰＬＣカラム（資生堂 CapcellpakC18 UG120）にて分離分取し、プラバスタチンのラクトン体を６８２mg得た。なお、精製中の類縁体含量は極めて微量であり、精製には何ら支障は認められなかった。
【実施例２】
【００３４】
実施例１と同組成の培地２０mLを含有する１００mL容三角フラスコにＧＳ０１４７５株を植菌し、３０℃、２１０r.p.m.で２日間回転振とう培養を行った。この培養液を１００mLの同培地を含有する５００mL容三角フラスコ１０本に２mLずつ植菌し、同時に変換基質であるＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を１．５mg/mLの濃度になるように添加して、３０℃、２１０r.p.m.で２日間回転振とう培養を行った。その後、変換基質であるＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を１．５mg/mLの濃度として１日ごとに計３回、グルコースを２０mg/mLの濃度として２日ごとに計２回添加して培養を継続した。
【００３５】
５日間培養した後の培養液中のプラバスタチン濃度をＨＰＬＣで定量したところ、約３．０mg/mL であった。また、培養液中にＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩は検出されなかった。
【００３６】
この後、実施例１と同様の方法によりプラバスタチンのラクトン体を９２６mg得た。精製中の類縁体含量は実施例１と同様に極めて微量であり、精製には何ら支障は認められなかった
【実施例３】
【００３７】
実施例１と同組成の培地５０mLを含有する５００mL容三角フラスコにＧＳ０１４７５株を植菌し、３０℃、２１０r.p.m.で２日間回転振とう培養を行った。この培養液を１．５Ｌの同培地を含有する３Ｌ容ミニジャーに５０mL植菌し、同時に変換基質であるＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を１．０mg/mLの濃度になるように添加して、３０℃、３５０r.p.m.、１．０v.v.m.で２日間通気撹拌培養を行った。その後、変換基質であるＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を１．０mg/mLの濃度として１２時間ごとに計５回、グルコースを２０mg/mLの濃度として２日ごとに計２回添加して培養を継続した。
【００３８】
５日間培養した後の培養液中のプラバスタチン濃度をＨＰＬＣで定量したところ、約３．０mg/mL であった。また、培養液中にＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩は検出されなかった。
【００３９】
この後、実施例１と同様の方法によりプラバスタチンのラクトン体を１４２８mg得た。精製中の類縁体含量は実施例１と同様に極めて微量であり、精製には何ら支障は認められなかった。
【実施例４】
【００４０】
本発明の微生物ＧＳ０１４７５株と、特許文献１記載の公知微生物であるストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ３１９９(Streptomyces halstedii NBRC 3199)およびストレプトミセス属ハルステディ(Streptomyces halstedii)の基準種であるストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ１２７８３(Streptomyces halstedii NBRC 12783)とについて、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩をプラバスタチンナトリウム塩に変換する培養における変換速度を比較した。
【００４１】
実施例１と同組成の培地２０mLを含有する１００mL容三角フラスコに、上記３株をそれぞれ植菌し、２８℃、２１０r.p.m.で２日間回転振とう培養を行った。これらの培養液を１００mLの同培地を含有する５００mL容三角フラスコ３本に２mLずつ植菌し、同時に変換基質であるＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩をそれぞれ１．０mg/mL、１．５mg/mLおよび２．０mg/mLの濃度になるように添加して、２８℃、２１０r.p.m.で回転振とう培養を行った。経時的にサンプリングを行い、培養液中のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩の濃度をＨＰＬＣ（カラム：資生堂 CapcellpakC18 UG120、容離液：アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝５５０／４５０／０．０１、温度：４０℃）により、また変換生成物であるプラバスタチンナトリウム塩の濃度をＨＰＬＣ（カラム：資生堂 CapcellpakC18 UG120、容離液：メタノール／水／トリエチルアミン／酢酸＝５００／５００／１／１、温度：４０℃）により測定した。
【００４２】
その結果、表３に示すように、ＭＬ−２３６Ｂナトリウムを培地に添加した時点から、培地中のＭＬ−２３６Ｂナトリウムの５０％量が消費されるまでの所要時間において、本発明の微生物ＧＳ０１４７５株は、特許文献１記載の公知微生物であるストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ３１９９(Streptomyces halstedii NBRC 3199)や、ストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ１２７８３(Streptomyces halstedii NBRC 12783)と比べて、いずれのＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩濃度でも変換速度が速く、さらにその差はＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩濃度が高いほど顕著であった。
【００４３】
【表３】
2005124490.tif 000006
【００４４】
また、図１の初発添加濃度２．０mg/mLのＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩での消費経過に示すように、本発明の微生物ＧＳ０１４７５株は、ストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ３１９９(Streptomyces halstedii NBRC 3199)やストレプトミセス属ハルステディＮＢＲＣ１２７８３(Streptomyces halstedii NBRC 12783)と比べて、高濃度のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩の存在下においてもＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩に対する高い耐性を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩消費経過
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、従来方法に比べて高濃度のＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩を培養液中に添加して、短時間、かつ高い収率でプラバスタチンを得ることが出来るようになった。本発明により、高脂血症治療剤として有用なプラバスタチンとその塩、およびラクトン体を効率よく生産することが可能になった。
【図１】
2005124490.tif 000009