(57)【要約】【課題】  目的とする核酸分子を鋳型として、ＰＣＲ法による核酸の増幅反応に要する時間を短縮可能なＰＣＲ増幅反応方法、それに利用される装置の提供。【解決手段】  ＰＣＲ反応液を収納すう微小容量の液溜め部と、この液溜め部に収納する反応液に対して、直接、熱的接触する局所加熱用ヒーターが付設されたＰＣＲ反応容器を用い、付設されるヒーターにパルス波形電流を供給し、ＰＣＲ反応の温度サイクルを実施し、高速なＰＣＲ増幅反応を実施可能とする方法。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型となる核酸鎖からＰＣＲ反応により、対応する塩基配列を有するＤＮＡ鎖の増幅を行うＰＣＲ増幅反応の方法であって、
前記鋳型となる核酸鎖を含むＰＣＲ反応液を収納する反応容器として、
収容されている反応液に対して、熱的な接触が可能な位置にヒーターが配置されており、
該ヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して発生させる熱パルスに対して、該反応液の液温度が少なくとも０．０１秒オーダーで応答可能な熱容量を示す、反応液の収納量と液収納部形状に設定されている反応容器を用い、
前記設定収納量のＰＣＲ反応液を、該ヒーター付き反応容器の液収納部に収納し、
該ヒーター付き反応容器全体を、所定の温度に保持されているブロックと接触させて、該所定温度に継続的に維持しつつ、
前記反応容器に設けるヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して、該パルス時間幅、パルス電圧高さに対応する、パルス状の加熱によって、ＰＣＲ反応用の温度サイクルを形成し、
前記のパルス状電圧の印加を、周期的に複数回繰り返して、それに対応した複数回の該温度サイクル繰り返しを行って、ＰＣＲ反応を行う工程を設ける
ことを特徴とするＰＣＲ増幅反応方法。
【請求項２】
請求項１に記載するＰＣＲ増幅反応方法に従って、ＰＣＲ反応を実施することが可能なＰＣＲ反応装置であって、
ＰＣＲ反応液を収納する反応容器として、
収容されている反応液に対して、直接、熱的な接触が可能な位置にヒーターが配置されており、
該ヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して発生させる熱パルスに対して、該反応液の液温度が少なくともミリ秒オーダーで応答可能な熱容量を示す、反応液の収納量と液収納部形状に設定されている反応容器を用い、
該ヒーター付き反応容器を保持可能な構造を有し、その反応容器との接触による熱伝導を介して、該反応容器全体を所定の温度に継続的に維持可能なヒート・ブロックと、
該ヒート・ブロックの温度を所定温度に制御するためのヒート・ブロック温度制御機構と、
前記反応容器に配置されているヒーターに対して、所望のパルス時間幅、パルス電圧高さのパルス状電圧を、周期的に所望の繰り返し回数で印加するためのパルス状電圧発生機構と、
前記ヒート・ブロック温度制御機構と、パルス状電圧発生機構の動作を管理するためのＭＰＵユニットと、
前記ＭＰＵユニットによる管理条件を入力・設定するためのキー入力装置と、
前記ＭＰＵユニットによる管理条件、または、管理されている状況情報を表示するための表示器とを有している
ことを特徴とするＰＣＲ反応装置。
【請求項３】
請求項１に記載するＰＣＲ増幅反応方法に従って、ＰＣＲ反応を実施することが可能なＰＣＲ反応容器であって、
該ＰＣＲ反応液を収納する反応容器は、
収容されている反応液に対して、直接、熱的な接触が可能な位置にヒーターが配置されており、
該ヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して発生させる熱パルスに対して、該反応液の液温度が少なくともミリ秒オーダーで応答可能な熱容量を示す、反応液の収納量と液収納部形状に設定されている、ヒーター付き反応容器である
ことを特徴とするＰＣＲ反応容器。
【請求項４】
一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群に含まれる、特定の塩基配列を有する核酸分子を検出し、該核酸分子が示す一塩基多型または遺伝子多型を検出する方法であって、
前記一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群において、相互に塩基配列の相違を示す部分塩基配列に対応する塩基配列を有する核酸プローブ複数種を選択し、
該核酸プローブ複数種において、一塩基多型または遺伝子多型の間において相互に相違を示す塩基の少なくとも一つ以上が、該核酸プローブの塩基配列中において、その３’末端側に位置するように、前記部分塩基配列を選定し、
該核酸プローブ複数種を、その５’末端に連結されたリンカーを介して、同一の担体表面上にアレイ状に結合してなる、マイクロアレイを構成し、
検出対象の特定の塩基配列を有する核酸分子は、マイクロアレイを構成する、該核酸プローブ複数種の一つのみと選択的にハイブリダイズ可能な条件下において、
検出対象の特定の塩基配列を有する核酸分子を鋳型として、該鋳型と選択的にハイブリダイズする、前記核酸プローブ複数種の一つをプライマーとして、温度サイクルを用いるＰＣＲ増幅反応によって、相補的なＤＮＡ鎖の伸長を行い、
マイクロアレイ中において、相補的なＤＮＡ鎖の伸長が得られる、該核酸プローブ複数種の一つを特定することで、
特定される、前記核酸プローブ複数種の一つの有する塩基配列に対応する部分塩基配列を含む、一塩基多型または遺伝子多型の検出を行う
ことを特徴とする一塩基多型または遺伝子多型の検出方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲ増幅反応において、
Ｄｅｎａｔｕｒｅ、ＡｎｎｅａｌおよびＥｘｔｅｎｓｉｏｎの過程からなる温度サイクルを設け、
一温度サイクルを構成する、該Ｄｅｎａｔｕｒｅ、ＡｎｎｅａｌおよびＥｘｔｅｎｓｉｏｎの各過程の時間を、いずれも、１０秒間以下に設定する
ことを特徴とする請求項４に記載の一塩基多型または遺伝子多型の検出方法。
【請求項６】
請求項４の記載の一塩基多型または遺伝子多型の検出方法に従って、一塩基多型または遺伝子多型の検出用のＰＣＲ増幅反応を実施することが可能な、一塩基多型または遺伝子多型の検出用反応容器であって、
対象とする一塩基多型または遺伝子多型の検出は、一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群に含まれる、特定の塩基配列を有する核酸分子を検出し、該核酸分子が示す一塩基多型または遺伝子多型を検出することであり、
前記一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群において、相互に塩基配列の相違を示す部分塩基配列に対応する塩基配列を有する核酸プローブ複数種を選択し、
該核酸プローブ複数種において、一塩基多型または遺伝子多型の間において相互に相違を示す塩基の少なくとも一つ以上が、該核酸プローブの塩基配列中において、その３’末端側に位置するように、前記部分塩基配列を選定して、
該核酸プローブ複数種を、その５’末端に連結されたリンカーを介して、同一の担体表面上にアレイ状に結合してなるマイクロアレイを構成している、前記担体が、その表面を該反応容器中の反応液と接触可能な位置において、該反応容器に付設されており、
かつ、該担体表面上のマイクロアレイを構成している前記核酸プローブ複数種に対して、前記ＰＣＲ増幅反応における温度サイクルの温度変化を形成する熱源と、該担体中の熱伝導を介して熱的接触可能であり、
前記ＰＣＲ増幅反応に際して、前記核酸プローブ複数種と接する反応液量は、該核酸プローブ複数種が結合されている担体表面に対して、その表面に対する法線方向の液厚さが、３ｍｍ以下となるように、該反応容器における、反応液の収納量と液収納部形状が設定されている
ことを特徴とする一塩基多型または遺伝子多型検出用反応容器。
【請求項７】
前記マイクロアレイを構成している核酸プローブ複数種が、その表面に結合される、前記担体の材質は、無機材料である
ことを特徴とする請求項６に記載の一塩基多型または遺伝子多型検出用反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ増幅反応装置、ならびに、該装置を利用するＰＣＲ増幅反応方法に関する。特には、本発明は、遺伝子多型、一塩基多型（ＳＮＰ；Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の解析に利用可能なＰＣＲ増幅反応装置、ならびに、該装置を利用するＰＣＲ増幅反応方法、さらには、該装置、方法を応用する、遺伝子多型、ＳＮＰ等の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、核酸鎖中の特定領域を増幅する代表的な手段として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が利用されている。ＰＣＲ法では、鋳型の核酸鎖、例えば、二本鎖ＤＮＡなどの増幅したい領域に対して、その両末端の部分塩基配列に対応するＰＣＲプライマーと呼ばれる、対のＤＮＡ断片を使って、ＤＮＡポリメラーゼ酵素と基質となる各核酸を加え、ｄｅｎａｔｕｒｅ、ａｎｎｅａｌ、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎといった温度サイクルを繰り返すことによって、目的とする領域のＤＮＡ鎖のみを増幅する。このＰＣＲ反応の温度サイクルには、１サイクル、例えば、ｄｅｎａｔｕｒｅ：９４℃、３０秒、ａｎｎｅａｌ：５５℃、３０秒、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：７２℃、１分の工程を合計３０回繰り返す、というような条件が利用されている。この条件において、温度サイクルに要する時間は、約１．５時間程度となる。また、増幅したい領域の塩基長がより長い核酸鎖を増幅する場合には、プライマーの３’末端からＤＮＡ鎖の伸長反応を行うｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の時間間隔をもっと長めに設定する。従って、温度サイクルに要する延べ時間が、約１．５〜２．５時間に及ぶことが、ごく一般的であった。
【０００３】
このような長時間を要していた、温度サイクル工程を少しでも短縮することを目的として、幾つかの考案がなされ、例えば、約２０〜３０分で増幅反応を終了する装置、ライトサイクラー（ロッシュダイアグノスティックス社）なども近年販売されている。しかしながら、この市販装置に利用される時間短縮法は、単に毛細管状容器に温調された熱風をあてることで、温度変化に費やされる時間の短縮を図る手法である。すなわち、毛細管状容器を利用することで、反応容器自体の体積を小さくでき、その熱容量が小さいことに着眼し、温度変化に費やされる時間の短縮効果を達成したもので、その温度制御手法自体は、従来のものと原理的に何ら変わりはない。なお、加熱・冷却媒体として利用している、空気は密度が低く、その熱伝導率も小さく、最も熱の伝わりにくい媒体の一つである点を考慮すると、最適な温度制御系とはいえない。
【０００４】
一方、ＰＣＲ法の最大の利点は、生体から採取した種々の核酸鎖を含む試料中から、特定の塩基配列を有する核酸鎖を選択的に増幅することが可能である点である。遺伝子多型、ＳＮＰｓ等の解析では、その解析に先立ち、種々の核酸鎖を含む試料中から、解析対象となる塩基配列の相違を示す核酸鎖のみを選択的に増幅する必要がある。この解析ＤＮＡ試料の調製工程においては、前記の塩基配列に対する選択性を利用して、ＰＣＲ増幅方法が広く利用されている。
【０００５】
従来、遺伝子多型、ＳＮＰｓ等の解析手法には、特に、塩基配列に限定された方法はない。種々の遺伝子多型、ＳＮＰｓ等に関して、過去の技術的蓄積に基づき、相違を示す部分塩基配列に対応して、検出プローブ用オリゴヌクレオチド断片が使用されている。また、マイクロアレイ法に準した方法として、Ｌｕｍｉｎｅｘ社の１００種程度のビーズアレイや、Ｎａｎｏｇｅｎ社の電極アレイで、従来のマイクロアレイ法と比較して、ハイブリダイズ反応時間の格段の高速化を図ったものがある。
【０００６】
検出プローブとのハイブリダイズ反応を利用する、マイクロアレイ法以外にも、幾つかの解析方法が知られている。ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法では、選択的に増幅された二本鎖ＤＮＡに対して、相違を示す部分塩基配列を切断可能な制限酵素を作用させ、生成されたＤＮＡ断片複数の電気泳動パターンの相違から、対応する部分塩基配列の有無を判定する。また、直接塩基配列決定法では、遺伝子多型、ＳＮＰｓ等の示す核酸鎖を鋳型として、ＤＮＡシークエンサ用のＤｙｅターミネータを利用したＰＣＲ増幅の後、ダイレクトに塩基配列をＤＮＡシークエンサによって決定することで、相違を示す部分塩基配列の有無を判定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＲＦＬＰ法は、検出可能な多型に関して、その相違を示す部分塩基配列を切断可能な制限酵素を選択して使用する必要がある。従って、利用可能な制限酵素サイトに対応した、部分塩基配列の相違を示す場合にしか適用できないなど、方法論的にある程度の適用範囲に限定を受けてしまう。一方、直接塩基配列決定法は、原理的には、実際に、ＤＮＡシークエンサを用いて直接塩基配列を決定するので、適用範囲に限定はない。しかし、塩基を一つ一つ切り離して泳動するため、一部のＨＬＡタイピングに見られるａｍｂｉｇｕｉｔｙの問題が残されている。その他、ＤＮＡシークエンスに利用する検体の前処理に必要な時間、ＤＮＡシークエンサ装置のランニングコスト、泳動時間など、作業上、経済的効率上の問題を抱えている。特に、同時に分析可能な多型の数は、ＤＮＡシークエンサ装置のキャピラリの数に限定され、逆に、キャピラリの数に対して、分析すべき検体数が少ないと、装置の稼動効率上のロスとなる。これらの実用上の制約を考慮すると、直接塩基配列決定法は、最適な方法とは言いがたい。
【０００８】
一方、マイクロアレイを用いた方法は、数千〜１万ドットにも及ぶ複数プローブについて、一括分析が可能であるという利点がある。反面、各プローブで検出すべき、核酸鎖に蛍光標識などの標識を付す必要があり、この検体の前処理に必要な時間としては、直接塩基配列決定法と同様、数時間を要し、かつ、対象となるプローブ毎にかかる前処理を行う必要があるという、作業上の煩雑さがある。その上、マイクロアレイ上におけるプローブ・ハイブリダイゼーション反応自体、固相反応であるため、数時間の反応時間を要する。さらには、検体のＤＮＡ鎖長が、ハイブリダイゼーションに関与するプローブ長に比べ長すぎると、場合によっては、他プローブとの交差反応を誘発する可能性がある。ビーズアレイや電極アレイを用いる方法は、プローブ・ハイブリダイゼーション反応時間を大幅に改善する手段ではある。反面、従来のマイクロアレイのような、大規模なプローブ・アレイを形成することは困難であり、プローブ種類が１００程度のアレイに留まっている。例えば、ＨＬＡの多型については、既に二百数十種類のアレルが確認されており、ビーズアレイや電極アレイを用いる方法は、この様に多数種を対象とする分析には、十分な対応が取れない。
【０００９】
以上に説明した通り、従来の遺伝子多型、ＳＮＰｓ等の解析手法は、個別的な応用分野には十分に対応できるが、広範な応用を図る上では、いずれの手法も一長一短である。
【００１０】
いずれの解析手法を利用する上でも、検体の前処理に必要な時間、すなわち、解析対象となる塩基配列の相違を示す核酸鎖のみを選択的に増幅するためのＰＣＲ増幅反応に費やされる時間を低減することが望まれている。
【００１１】
加えて、マイクロアレイを用いた方法は、多数種のプローブについて、一括分析が可能であるという利点があるものの、広範な利用を図る上では、検体の前処理に必要な時間、および、マイクロアレイ上におけるプローブ・ハイブリダイゼーション反応に必要な時間の両者ともに、一層の低減を図ることが望まれている。
【００１２】
本発明は、これらの課題を解決するもので、本発明の第一の目的は、検体の前処理に利用される、ＰＣＲ増幅反応に費やされる時間を大幅に低減することが可能な、新規なＰＣＲ増幅装置、ならびに、該装置を利用するＰＣＲ増幅方法を提供することにある。加えて、本発明の第二の目的は、かかる新規なＰＣＲ増幅装置、ならびに、該装置を利用するＰＣＲ増幅方法を適用可能であり、かつ、マイクロアレイ上に固定したプローブを利用して、遺伝子多型、ＳＮＰｓを高い感度で、同時に、より簡便に、より短い処理時間で検出することを可能とする、新規なＳＮＰｓまたは遺伝子多型を対象とするＤＮＡ検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、先ず、第一の目的の解決手段について検討を進めるに先立ち、ＰＣＲ増幅反応における温度サイクル中、律速となる過程はどの過程であるかを再検討した。一般に、ＰＣＲ増幅反応では、鋳型の一本鎖核酸分子とプライマーとのハイブリダイゼーション反応、すなわち、相補鎖と結合した二本鎖を形成するａｎｎｅａｌ過程；ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素を作用させ、かかる二本鎖を構成するプライマーの３’末端からＤＮＡ鎖の伸長反応を行うｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程；伸長反応後、二本鎖の核酸を熱的に解離させ、鋳型の一本鎖核酸分子とその相補鎖に分離するｄｅｎａｔｕｒｅ過程からなる温度サイクルを利用する。その際、ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素を作用させ、かかる二本鎖を構成するプライマーの３’末端からＤＮＡ鎖の伸長反応を行うｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程において、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素によってＤＮＡ鎖の伸長反応が完結し、相補鎖の合成が完了するに要する時間が、全体の増幅反応を律速することに想到した。一方、二本鎖の核酸を熱的に解離させ、鋳型の一本鎖核酸分子とその相補鎖に分離するｄｅｎａｔｕｒｅ過程は、その温度を十分に高く設定すれば、数十ｍｓの加熱時間でも、大半の二本鎖の熱的な解離は完了することも見出された。
【００１４】
また、通常、鋳型の一本鎖核酸分子とプライマーとのハイブリダイゼーション反応に際し、プライマーがその相補的な塩基配列部分以外と、誤って、ハイブリダイゼーションする、ミスフィット・ハイブリダイゼーションが生じることがある。そのミスフィット・ハイブリダイゼーションを回避するためには、フルマッチ配列とハイブリダイズしたプライマーのＴｍ値（熱解離温度）と、ミスマッチを持つ配列とミスフィット・ハイブリダイズしたプライマーのＴｍ値との差違を利用して、プライマーのミスフィット・ハイブリダイズが生じない温度を、ａｎｎｅａｌ過程の温度に選択している。その後のｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程では、フルマッチ配列とハイブリダイズしたプライマーのＴｍ値（熱解離温度）以下、ａｎｎｅａｌ過程の温度以上の温度範囲において、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応の反応速度に応じて、適宜選択されている。
【００１５】
以上のことを考慮すると、温度サイクル過程では、反応液全体をａｎｎｅａｌ過程の温度に予熱しておき、ｄｅｎａｔｕｒｅ過程の間、数十ｍｓだけ、反応液の液温度を目的とするｄｅｎａｔｕｒｅ温度以上に加熱する手段を短時間適用し、その後、この加熱を停止し、反応液の液温度をａｎｎｅａｌ過程の温度まで急速に冷却することを可能とすれば、一温度サイクルに要する時間を大幅に短縮できることを見出した。この知見に基づき、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法の発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法は、
鋳型となる核酸鎖からＰＣＲ反応により、対応する塩基配列を有するＤＮＡ鎖の増幅を行うＰＣＲ増幅反応の方法であって、
前記鋳型となる核酸鎖を含むＰＣＲ反応液を収納する反応容器として、
収容されている反応液に対して、直接、熱的な接触が可能な位置にヒーターが配置されており、
該ヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して発生させる熱パルスに対して、該反応液の液温度が少なくともミリ秒オーダーで応答可能な熱容量を示す、反応液の収納量と液収納部形状に設定されている反応容器を用い、
前記設定収納量のＰＣＲ反応液を、該ヒーター付き反応容器の液収納部に収納し、
該ヒーター付き反応容器全体を、所定の温度に保持されているヒート・ブロックと接触させて、該所定温度に継続的に維持しつつ、
前記反応容器に設けるヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して、該パルス時間幅、パルス電圧高さに対応する、パルス状の加熱によって、ＰＣＲ反応用の温度サイクルを形成し、
前記のパルス状電圧の印加を、周期的に複数回繰り返して、それに対応した複数回の該温度サイクル繰り返しを行って、ＰＣＲ反応を行う工程を設ける
ことを特徴とするＰＣＲ増幅反応方法である。
【００１７】
本発明者らは、次に、第二の目的の解決手段について検討を進めるに先立ち、ＰＣＲ増幅反応において、鋳型の核酸分子に対して、ミスフィット・ハイブリダイズしたプライマーの３’末端から、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応が進行することを抑制する手段を検討した。仮に、用いるプライマーが鋳型の核酸分子に対して、ミスマッチを持つ配列であっても、その３’末端部が相補的であれば、その３’末端からＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応が進行することが知られている。一方、プライマーの３’末端にミスマッチを有する場合には、そのミスマッチが存在する３’末端に引き続き、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応が開始することは、皆無といってよい程、低い頻度でしか起こらないことを見出した。
【００１８】
また、鋳型の核酸分子に対して、ミスマッチのある塩基配列を有するプライマーに関して、そのミスマッチがプライマーの中央に存在する場合のＴｍ値と、ミスマッチがプライマーの５’末端または３’末端に存在する場合のＴｍ値との比較を行った。その結果、ミスマッチのないプライマーのＴｍ値を基準として、ミスマッチがプライマーの中央に存在する場合のＴｍ値は、有意に高いが、ミスマッチがプライマーの５’末端または３’末端に存在する場合のＴｍ値は、極僅かに高いが、殆ど差違がないことが判明した。
【００１９】
但し、鋳型の核酸分子に対して、ミスフィット・ハイブリダイズしたプライマーの３’末端から、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応の反応産物量を考慮すると、ミスマッチがプライマーの中央に存在する場合、あるいは、ミスマッチがプライマーの５’末端に存在する場合には、相当の効率で、ＤＮＡ鎖伸長がなされた反応産物が得られるが、ミスマッチがプライマーの３’末端に存在する場合には、ＤＮＡ鎖伸長がなされた反応産物は皆無となることが判明した。
【００２０】
一方、仮に、ミスマッチがプライマーの中央に存在する場合、あるいは、ミスマッチがプライマーの５’末端に存在する場合に得られる反応産物は、その５’末端自体は、ミスマッチを有するプライマーの塩基配列を有するものとなる。従って、このミスフィット・ハイブリダイズしたプライマー由来の反応産物は、かかるミスマッチを有するプライマーの塩基配列に相補的なプローブに対しては、完全なハイブリダイズは可能なものとなる。逆に、鋳型の核酸分子に対して、ミスマッチのないプライマー由来の反応産物は、５’末端または３’末端にミスマッチが存在するプライマー塩基配列に相補的なプローブに対しては、高い頻度でミスフィット・ハイブリダイズすることも判明した。
【００２１】
これらの知見に基づき、更なる検討を進め、ミスマッチがその３’末端に存在するプライマーＤＮＡと、ミスマッチのないプライマーＤＮＡとを、その５’末端にリンカーを連結した上で、同一の担体表面上にアレイ状に結合してなる、マイクロアレイを構成したのち、対象となる相補的な一本鎖核酸分子を鋳型として、片鎖ＰＣＲ増幅反応を行わせると、ミスマッチのないプライマーＤＮＡの３’末端のみにＤＮＡ鎖伸長がなされた反応産物が得られ、かつ、担体表面上のマイクロアレイの特定スポット点にのみ、かかる反応産物が結合された状態となることを見出した。加えて、この担体表面上のマイクロアレイの特定スポット点に結合されている反応産物に標識を付すなどして、この存在を容易に検出することができることも判明した。また、かかる片鎖ＰＣＲ増幅反応に際して、担体表面上に結合されているミスマッチのないプライマーＤＮＡと、鋳型の一本鎖核酸分子とのハイブリダイズが高い確率で生じるように、適宜ＰＣＲ反応の温度サイクル条件を設定した上で、温度サイクルを所望回数繰り返すことで、目的とするマイクロアレイの特定スポット点に結合されている反応産物量の増幅がなされることも確認した。これら知見に基づき、本発明のＰＣＲ増幅反応を応用して、第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法の発明を完成するに至った。
【００２２】
すなわち、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法は、
一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群に含まれる、特定の塩基配列を有する核酸分子を検出し、該核酸分子が示す一塩基多型または遺伝子多型を検出する方法であって、
前記一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群において、相互に塩基配列の相違を示す部分塩基配列に対応する塩基配列を有する核酸プローブ複数種を選択し、
該核酸プローブ複数種において、一塩基多型または遺伝子多型の間において相互に相違を示す塩基の少なくとも一つ以上が、該核酸プローブの塩基配列中において、その３’末端側に位置するように、前記部分塩基配列を選定し、
該核酸プローブ複数種を、その５’末端に連結されたリンカーを介して、同一の担体表面上にアレイ状に結合してなる、マイクロアレイを構成し、
検出対象の特定の塩基配列を有する核酸分子は、マイクロアレイを構成する、該核酸プローブ複数種の一つのみと選択的にハイブリダイズ可能な条件下において、
検出対象の特定の塩基配列を有する核酸分子を鋳型として、該鋳型と選択的にハイブリダイズする、前記核酸プローブ複数種の一つをプライマーとして、温度サイクルを用いるＰＣＲ増幅反応によって、相補的なＤＮＡ鎖の伸長を行い、
マイクロアレイ中において、相補的なＤＮＡ鎖の伸長が得られる、該核酸プローブ複数種の一つを特定することで、
特定される、前記核酸プローブ複数種の一つの有する塩基配列に対応する部分塩基配列を含む、一塩基多型または遺伝子多型の検出を行う
ことを特徴とする一塩基多型または遺伝子多型の検出方法である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法を利用することで、検体の前処理、あるいは、検体中に含まれる特定の一本鎖核酸分子を鋳型とし、プライマー３’末端に伸長される相補鎖ＤＮＡの調製に利用される、ＰＣＲ増幅反応に費やされる温度サイクルの時間を大幅に低減することが可能となる。
【００２４】
また、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法は、検体試料中に含まれる検出対象の一本鎖核酸分子を鋳型とし、その検出対象と相補的な塩基配列を有するプライマーから選択的に伸長される一本鎖ＤＮＡを、該プライマーＤＮＡ鎖の５’末端に連結されたリンカーを介して、担体表面上のマイクロアレイにおける、該プライマーＤＮＡのスポット点に結合した状態とできる。従って、原理的には、片鎖ＰＣＲ法で増幅される反応産物を全量、対応するスポット点に結合させて、検出を行うことができ、高い検出感度を達成できる。一方、検出対象は、従前のマイクロアレイ法と同様に大規模アレイを維持しながら、プローブとハイブリダイズすべき、鋳型の一本鎖核酸分子と同じ塩基配列を有するＤＮＡ鎖を予め調製する、検体の前処理用ＰＣＲ増幅反応、ならびに、その後のプローブ・ハイブリダイゼーション反応に要する、合計の反応時間を大幅に短縮することを可能とする。
【００２５】
加えて、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法を、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法の実施に際し、そのＰＣＲ増幅反応過程に適用することで、一層の反応時間短縮が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に、本発明に関してより詳しく説明する。
【００２７】
［本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法］
まず、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法では、
ＰＣＲ増幅反応において、各温度サイクルは、
鋳型の一本鎖核酸分子とプライマーとのハイブリダイゼーション反応、すなわち、相補鎖と結合した二本鎖を形成するａｎｎｅａｌ過程；
ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素を作用させ、かかる二本鎖を構成するプライマーの３’末端からＤＮＡ鎖の伸長反応を行うｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程；
伸長反応後、二本鎖の核酸を熱的に解離させ、鋳型の一本鎖核酸分子とその相補鎖に分離するｄｅｎａｔｕｒｅ過程とからなるが、
反応容器全体を、ａｎｎｅａｌ温度に保持されているヒート・ブロックに保持して、かかるａｎｎｅａｌ温度に予熱しておき、
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ温度、ならびにｄｅｎａｔｕｒｅ温度への過渡的な加熱は、ＰＣＲ反応容器に付設されている局所加熱用ヒーターを用いて行っている。この局所加熱用ヒーターに所定のパルス状電圧を印加して、熱パルスを発生させ、このヒーターと反応液とが、直接、熱的接触を達成できる形態とすると、反応液は、この熱パルスによって、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ温度、ならびにｄｅｎａｔｕｒｅ温度へと、少なくともミリ秒オーダーの温度応答性で上昇させている。その際、二本鎖の核酸を熱的に解離させ、鋳型の一本鎖核酸分子とその相補鎖に分離するｄｅｎａｔｕｒｅ過程は、その温度を十分に高く設定すれば、数十ｍｓの加熱時間でも、大半の二本鎖の熱的な解離は完了することが可能である。なお、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程において、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素によってＤＮＡ鎖の伸長反応が完結し、相補鎖の合成が完了するに要する時間が、全体の増幅反応を律速するが、極端に伸長される塩基長が長い場合を除き、その時間は、数百ｍｓと選択しても、十分に伸長反応は完了する。この様に、数百ｍｓのｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程、数十ｍｓのｄｅｎａｔｕｒｅ過程、その後に、局所加熱用ヒーターの電圧印加をしないａｎｎｅａｌ過程の順で温度サイクルを実施することで、一温度サイクルの時間は、１秒余りとすることも可能である。温度サイクル繰り返し回数が数十回に及んでも、温度サイクル全体の所要時間は、数十秒間から数分間とすることが可能となる。実際には、ヒート・ブロックによる予熱時間、ＰＣＲ増幅反応完了後の放冷時間は、従来のＰＣＲ反応方法と同様に必要ではあるが、ＰＣＲ増幅反応に必須な温度サイクル自体は、極限近くまで短縮することが可能となる。
【００２８】
なお、ヒート・ブロックを維持する温度については、ａｎｎｅａｌ温度とすることは必須ではなく、ａｎｎｅａｌ温度以下であっても構わないことを確認した。これはａｎｎｅａｌ温度よりも低いほうが、熱流束から判断して原理的に冷却時間を短縮するのに都合がよいことは自明であって、ヒート・ブロック温度がａｎｎｅａｌ温度より低い場合、ヒート・ブロック温度まで下がらなくてもａｎｎｅａｌ温度に達した時点でｄｅｎａｔｕｒｅのためのパルスを印加しても構わないからである。ただし、一方でこのとき急速にｄｅｎａｔｕｒｅ温度に向かわせる際、不利であることも自明である。一例を挙げると、サンプルの温度を安定に維持するためには、３７℃程度にヒート・ブロックを設定しておいても本発明のＰＣＲ方法は可能であった。
【００２９】
本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法は、
鋳型となる核酸鎖からＰＣＲ反応により、対応する塩基配列を有するＤＮＡ鎖の増幅を行うＰＣＲ増幅反応の方法であって、
前記鋳型となる核酸鎖を含むＰＣＲ反応液を収納する反応容器として、
収容されている反応液に対して、直接、熱的な接触が可能な位置にヒーターが配置されており、
該ヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して発生させる熱パルスに対して、該反応液の液温度が少なくともミリ秒オーダーで応答可能な熱容量を示す、反応液の収納量と液収納部形状に設定されている反応容器を用い、
前記設定収納量のＰＣＲ反応液を、該ヒーター付き反応容器の液収納部に収納し、
該ヒーター付き反応容器全体を、所定の温度に保持されているヒート・ブロックと接触させて、該所定温度に継続的に維持しつつ、
前記反応容器に設けるヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して、該パルス時間幅、パルス電圧高さに対応する、パルス状の加熱によって、ＰＣＲ反応用の温度サイクルを形成し、
前記のパルス状電圧の印加を、周期的に複数回繰り返して、それに対応した複数回の該温度サイクル繰り返しを行って、ＰＣＲ反応を行う工程を設ける
ことを特徴とするＰＣＲ増幅反応方法であるが、
本発明の第一の形態では、かかるＰＣＲ増幅反応方法に利用されるＰＣＲ反応装置の発明、ならびにＰＣＲ反応容器の発明も併せて提供される。
【００３０】
すなわち、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ反応装置は、
上記構成を有する、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法に従って、ＰＣＲ反応を実施することが可能なＰＣＲ反応装置であって、
ＰＣＲ反応液を収納する反応容器として、
収容されている反応液に対して、直接、熱的な接触が可能な位置にヒーターが配置されており、
該ヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して発生させる熱パルスに対して、該反応液の液温度が少なくともミリ秒オーダーで応答可能な熱容量を示す、反応液の収納量と液収納部形状に設定されている反応容器を用い、
該ヒーター付き反応容器を保持可能な構造を有し、その反応容器との接触による熱伝導を介して、該反応容器全体を所定の温度に継続的に維持可能なヒート・ブロックと、
該ヒート・ブロックの温度を所定温度に制御するためのヒート・ブロック温度制御機構と、
前記反応容器に配置されているヒーターに対して、所望のパルス時間幅、パルス電圧高さのパルス状電圧を、周期的に所望の繰り返し回数で印加するためのパルス状電圧発生機構と、
前記ヒート・ブロック温度制御機構と、パルス状電圧発生機構の動作を管理するためのＭＰＵユニットと、
前記ＭＰＵユニットによる管理条件を入力・設定するためのキー入力装置と、
前記ＭＰＵユニットによる管理条件、または、管理されている状況情報を表示するための表示器とを有している
ことを特徴とするＰＣＲ反応装置である。
【００３１】
また、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ反応容器は、
上記構成を有する、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法に従って、ＰＣＲ反応を実施することが可能なＰＣＲ反応容器であって、
該ＰＣＲ反応液を収納する反応容器は、
収容されている反応液に対して、直接、熱的な接触が可能な位置にヒーターが配置されており、
該ヒーターに対して、所定のパルス状電圧を印加して発生させる熱パルスに対して、該反応液の液温度が少なくともミリ秒オーダーで応答可能な熱容量を示す、反応液の収納量と液収納部形状に設定されている、ヒーター付き反応容器である
ことを特徴とするＰＣＲ反応容器である。
【００３２】
（ヒーターと反応容器の形態）
図１ならびに図２に、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ反応容器における、代表的な実施形態を表す。
【００３３】
図１は、通常のキャピラリ状のＰＣＲ容器内部に、コイル状のヒーター１を反応液と直接接触する配置で内蔵する例である。この内蔵型のコイル状ヒーター１として、例えば、ニクロム線ヒーター（数十〜数百Ω）を利用し、ＰＣＲ容器３中に入っているＰＣＲ反応液２に対して、ヒーターにパルス状の電流を流す（パルス状の電圧を印加する）ことで発生される熱パルスが供給される。その結果、ＰＣＲ反応液２は、その熱パルスの熱量によって、所望の時間間隔局所的な加熱を受ける。大きな熱容量と高い熱伝導率を有する材料で作製されているヒート・ブロック５に、キャピラリ状のＰＣＲ容器全体は保持されているため、その後、ヒート・ブロック５への熱伝導により、熱放散がなされる。ヒート・ブロック５自体は、ａｎｎｅａｌ温度に保持し、前記内蔵型のコイル状ヒーター１を用いて、数百ｍｓのｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程、数十ｍｓのｄｅｎａｔｕｒｅ過程に対応する局所的なパルス的な加熱を行う。この温度サイクルを繰り返すことで、ＰＣＲ増幅反応を実施することができる。
【００３４】
図２は、反応液自体を保持する液溜め部をプレート状に形成する事例を示す。具体的には、反応容器の液溜め部の底部には、シート状のヒーター層１の表面が利用され、側壁部は、放熱シリコーンゴムシート３のくり抜き部を利用している。この液溜め部に保持される反応液２は、薄い絶縁層は存在するものの、底部を形成するシート状ヒーター層１の表面と直接、熱的接触を達成している。従って、シート状ヒーター層１で発生される熱パルスが直接的に供給され、ＰＣＲ反応液２は、その熱パルスの熱量によって、所望の時間間隔局所的な加熱を受ける。なお、液溜め部の側壁部は、放熱シリコーンゴムシート３で構成され、また、底部を形成するシート状ヒーター層１は、下地のヒート・ブロック５上に密着形成されており、その後、放熱シリコーンゴムシート、ヒート・ブロック５への熱伝導により、熱放散がなされる。
【００３５】
なお、反応容器の全体形態は、ＰＣＲ反応時における反応液中に含まれる水の蒸発を防ぐために、蓋付きの密閉可能な構造とすることが望ましい。
【００３６】
一方、反応液に対する局所的な加熱源として、ヒーターを反応容器内に内蔵する、あるいは、反応容器に付設する形態とする。その際、ヒーターの設置位置は、ヒーターで発生する熱が反応液に速やかに伝達可能な位置を選択する。従って、反応溶液に対して、大きな接触面積を達成できる形態が望ましい。
【００３７】
図１のように、ニクロム線ヒーターを、狭い容器内に可能な限り微細なコイル状にして収納する形態や、図２のように、可能な限り薄い液層に対して、その液溜めの底部に平面状に配置した薄膜ヒーター層の形態として、反応液に対して、大きな接触面積を獲得できる形態とする。また、ヒーター表面と接触するＰＣＲ溶液に供給される熱量は、ＰＣＲ溶液内部では、熱拡散プロセスを介して、液全体の温度を上昇させる。従って、仮に、ヒーターと反応液との間で大きな接触面積が達成できても、ヒーターからの距離が離れすぎている溶液部分では、その温度上昇には有意な遅れが生じる。すなわち、ＰＣＲ容器内部の反応液の収納量と液収納部形状は、反応液の液温度が少なくともミリ秒オーダーで応答可能な熱容量を示し、かつ、ヒーター表面からの反応液の液厚を制限することが望ましい。具体的には、ＰＣＲ反応液の熱的な物性値は、ほぼ水に等しいと考えて差し支えなく、熱伝導過程における、熱拡散率ａは、熱伝導率λと熱容量Ｃｐ、物質の密度ρで定義されるので、
ａ＝λ／（Ｃｐ・ρ）  （ｍ2／ｓ）
この関係式に、水の熱容量Ｃｐ（比熱）：１  ｃａｌ／ｄｅｇ・ｇ、熱伝導度λ：０．００１４２９  ｃａｌ／ｃｍ・ｓ・ｄｅｇ、密度ρ：１ｇ／ｃｍ3の値を代入して、熱拡散率ａを求めると、０．１４３ｍｍ2／ｓとなる。また、√０．１４３  〜０．３８であるから、一次元方向だけの熱放散を考慮すると、平板状の容器において、液厚さ０．３８ｍｍ程度の反応液、または、キャリラリ内のヒーター間に挟まれる反応液の厚さがこの程度であれば、１秒以内に、反応液全体に熱量を拡散することができる。また、ｄｕｔｙ比を制御した複数パルスを実施する場合についても、反応液全体の熱的応答における、時定数はおよそこの値を参考にして、推定することができる。
【００３８】
また、反応容器自体の材質についても、熱パルス投入後、冷却される過程の時定数に関して、その物性値を代入して、適正な熱拡散特性を示す材質を選定することができる。なお、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法では、反応容器全体は、外側のヒート・ブロック５自体の温度をａｎｎｅａｌ温度に保持し、ａｎｎｅａｌ過程を終えるまでの間に、このａｎｎｅａｌ温度に冷却されればよいので、特に、問題となることは多くない。ただし、プラスチックなどの高分子材料の容器を利用する際、熱伝導度λ／熱容量Ｃｐ（比熱）の比率が水と同程度に小さくなる場合もあり、その場合には、容器自体の厚さは、これと同程度以下か、あまり分厚い容器としないほうが望ましい。
【００３９】
（印加される電流パルスの形態）
ＰＣＲ反応における温度サイクルは、通常、ｄｅｎａｔｕｒｅ過程、ａｎｎｅａｌ過程、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の順に、周期的に液温度を変化させるサイクルを繰り返すことによって構成される。また、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の温度は、ｄｅｎａｔｕｒｅ温度とａｎｎｅａｌ温度の間に設定される。場合によっては、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の温度とａｎｎｅａｌ温度とを等しく設定することも可能であり、その際には、温度サイクルは、ｄｅｎａｔｕｒｅ温度と、ａｎｎｅａｌ温度の順に、周期的に液温度を変化させるサイクルを繰り返すことになる。
【００４０】
例えば、通常、７２℃のｅｘｔｅｎｔｉｏｎのとき、２０ｍｅｒ前後であるプライマー配列の長さをさらに長くすることによって、プライマーのＴｍが高くなり、よりｄｅｎａｔｕｒｅ側温度に近い条件でＰＣＲをすることが可能である。こうした場合、通常、２０ｍｅｒ前後であるときの５５〜６０℃といったａｎｎｅａｌ温度まで下げる必要が無いので、温度サイクルの高速化にとって有利である。例えば、Ｔｍが７６℃になるようにプライマーを長めに設計し、７６℃とｄｅａｔｕｒｅの温度を往来するといった系でも本発明の高速なＰＣＲが可能であった。
【００４１】
本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法では、外側のヒート・ブロック５自体の温度をａｎｎｅａｌ温度に保持し、反応容器全体を、このａｎｎｅａｌ温度に予熱しておく。このａｎｎｅａｌ温度より高い温度に選択される、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の温度、ならびに、ｄｅｎａｔｕｒｅ温度の時間、ヒーターにパルス状に電流を流し、熱パルスを発生させる。
【００４２】
図６に、このヒーターにパルス状に電流を流すために、ヒーター線の両端間に印加されるパルス状電圧の形態の一例を示す。図６中、（１）と（２）は、ａｎｎｅａｌ温度、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の温度、ｄｅｎａｔｕｒｅ温度の、三段階のステップを設ける温度サイクルに対応する。ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の温度は、ａｎｎｅａｌ温度より高く、ｄｅｎａｔｕｒｅ温度より低く設定するため、ａｎｎｅａｌ過程後、波高値の低いｅｘｔｅｎｓｉｏｎのためのパルスと、その後に、波高値の高いｄｅｎａｔｕｒｅのためのパルスが印加される。このｄｅｎａｔｕｒｅのためのパルス印加後、一旦上昇した液温は、外側のヒート・ブロックへの熱放散によって、再び、ａｎｎｅａｌ温度まで低下する。
【００４３】
図６中、（３）は、ａｎｎｅａｌ温度とｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の温度を等しく選択する場合に相当する。波高値の高いｄｅｎａｔｕｒｅのためのパルス印加により、二本鎖核酸は、一本鎖に解離される。その後、次第に、液温は、ａｎｎｅａｌ温度まで低下し、再び、鋳型の一本鎖核酸分子にプライマーがハイブリダイズし、引き続き、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素の作用によって、プライマーの３’末端に、相補鎖ＤＮＡの伸長がなされ、二本鎖核酸が調製される。
【００４４】
なお、図６中、（３）のような単一のパルス電流を用い、その電流量を制御する代わりに、十分に狭いパルス幅でより高いパルス高さを示すパルス電流列を利用し、そのｄｕｔｙ比を制御することで、その間において平均化される液温が、所望のｄｅｎａｔｕｒｅ温度に維持されるような構成を選択することも可能である。すなわち、用いるＰＣＲ容器内部の反応液の収納量と液収納部形状に基づき、予め測定された熱的時定数に基づき、パルス電流列の利用した際における、平均化される液温を推定することが可能である。このｄｕｔｙ比を制御するパルス電流列を利用すると、ｄｅｎａｔｕｒｅ温度に保持する時間において、単一パルス電流を用いる場合には、部分的に温度が目標とする温度を大幅に超えるオーバー・シュートが引き起こされる場合に、そのオーバー・シュート現象を回避することが可能となる。
【００４５】
（ＰＣＲ反応装置の全体構成）
ＰＣＲ反応装置の大まかな構成は、上述のヒーター１を内蔵したＰＣＲ反応容器３を保持するための構造を有したヒート・ブロック５と、ヒーター１にパルス状電流を供給するための信号発生手段や、ヒート・ブロック５を温度制御するための機構を具えたＭＰＵユニット４からなる。図３に、ＭＰＵユニット４の内部構成を示す。１チップマイコン６は、Ａ／Ｄコンバータ内蔵のアナログ入力７と、デジタル入出力のＩ／Ｏポート８と、任意パルス・シークエンス発生のためのタイマ・カウンタポート９を内蔵している。発生された任意パルス・シークエンスは、電流ドライバ回路１０に入力される。電流ドライバ回路１０はデジタル入出力のＩ／Ｏポート８からのマルチセレクタを内蔵しており、予め設定済みである幾つかの波高値のいずれかを選択して、ヒーター１にパルス電流を送る（パルス電圧印加を行う）ことができる。ＭＰＵユニット４は、この他に、装置の状態などを知らせるための表示器１２や、ＰＣＲ反応条件に相当する、パルス・シークエンスのインストラクションをするためのキー入力装置１１を具えている。これらの情報は、１チップマイコン６内のメモリにデータ蓄積可能である。また、外側のヒート・ブロック５を、ベースとなるａｎｎｅａｌ温度に予熱・設定するためのペルチェ・ドライバ回路１３は、デジタル入出力のＩ／Ｏポート８と接続され、ペルチェ素子及びヒート・ブロック５に組み込まれる内蔵型温度センサから温度の情報が、アナログ入力７に入力され、温度コントロールのフィード・バックに利用される。
【００４６】
ＰＣＲ反応における温度サイクルの実行に際しては、パルス・シークエンス用のプログラムのスタートボタンを、実験者が押して、開始させる形態でもよい。あるいは、本発明の第一の形態のかかかるＰＣＲ増幅反応方法においては、ＰＣＲ反応に用いる温度サイクルの所要時間は、数十秒程度となる場合もある。従って、ヒート・ブロック５による予熱時間の選択を含め、全温度プロセスを予めプログラミングした上で、例えば、ヒーター１を内蔵した反応容器３をヒート・ブロック５上に装着し、ヒーター１の接続が完了した時点を、そのヒーター抵抗の検出によって確認し、プログラムを自動スタートさせる形態としてもよい。
【００４７】
以上に説明したように、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法を適用することで、従来と同程度の繰り返し回数の温度サイクルによるＰＣＲ増幅反応に要する時間を、数十秒まで短縮することが可能となる。また、各温度サイクルに要する時間を短縮することで、ＰＣＲ増幅反応中、用いる耐熱性ポリメラーゼ酵素が高温に曝される時間も短縮される。従って、ＰＣＲ増幅反応中における、耐熱性ポリメラーゼ酵素の熱的な劣化を格段に少なくでき、その酵素活性保持にも有効な手段となる。
【００４８】
加えて、上に説明した、図２に例示するプレート状の反応容器形態は、その底部は、市販の顕微鏡スライドガラスと同等の形状とでき、その表面に付設されるヒーター層用の絶縁層の表面に、アレイ状に核酸プローブを固定した上で、ＰＣＲ容器を構成すれば、その底部表面にＤＮＡマイクロアレイを設けたＰＣＲ容器となる。この態様のＤＮＡマイクロアレイを設けたＰＣＲ容器は、以下に説明する、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法を実施する際に、好適に利用可能なものである。
【００４９】
［本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法］
また、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、ＰＣＲ増幅反応を利用して、一塩基多型または遺伝子多型を示す核酸分子複数種のうち、特定の塩基配列を有する核酸分子のみを選択的に検出する方法である。
【００５０】
従来は、一次試料中に含まれる一塩基多型または遺伝子多型を示す核酸分子複数種を鋳型として、予めＰＣＲ増幅反応によって、対応する塩基配列を有するＤＮＡ鎖をＰＣＲ産物として調製した上で、このＰＣＲ産物を各一塩基多型または遺伝子多型に特異的な塩基配列を有するプローブを用いて検出する手法が一般的であった。一方、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、各一塩基多型または遺伝子多型に特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを利用して、一次試料中に含まれる一塩基多型または遺伝子多型を示す核酸分子複数種のうち、対応する塩基配列を有するものを鋳型として、片鎖ＰＣＲ増幅反応によって、選択的にＤＮＡ鎖の伸長を行った産物を検出する。その際、利用するＤＮＡプライマー自体を、予め担体表面に固定化しておくことによって、選択的にＤＮＡ鎖の伸長がなされた増幅産物を効率的に検出することが可能となっている。
【００５１】
本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法でも、従来のマイクロアレイ法を利用する検出方法と同じく、各一塩基多型または遺伝子多型に特異的な塩基配列を有する核酸プローブ複数種を同一の担体表面上にアレイ状に固定したＤＮＡプローブ・マイクロアレイを利用する。この核酸プローブ複数種は、いずれも、その５’末端にリンカーを介して担体表面上に固定し、対応する塩基配列を有する一本鎖核酸分子とハイブリタイズ可能な形態とする。一方、各核酸プローブは、一塩基多型または遺伝子多型を示す核酸分子複数種のうち、一つのものとは、完全に一致する塩基配列を有し、それ以外のものとは、塩基配列に相違があり、特に、その３’末端側に、ミスマッチ塩基を少なくとも一つ以上含むように、その塩基配列を選択する。従って、核酸プローブは、フルマッチする一本鎖核酸分子とハイブリタイズさせた後、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素をこの二本鎖部分に作用させると、フルマッチする一本鎖核酸分子を鋳型として、核酸プローブの３’末端に相補的なＤＮＡ鎖の伸長がなされる。一方、核酸プローブは、ミスマッチを有する一本鎖核酸分子とミスフィット・ハイブリタイズを起こす場合はあるものの、少なくとも、その３’末端にミスマッチ塩基が存在するため、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素をこの二本鎖部分に作用させても、原理的に、核酸プローブの３’末端へＤＮＡ鎖の伸長は生じない。結果的に、担体表面上にアレイ状に固定されている核酸プローブのうち、検体試料中に含まれる一本鎖核酸分子とフルマッチ・ハイブリタイズ可能な塩基配列を有する核酸プローブに対してのみ、その３’末端に相補的なＤＮＡ鎖の伸長がなされる。このＤＮＡ鎖の伸長がなされている核酸プローブのスポットを検出することで、検体試料中に含まれる一本鎖核酸分子の特定がなされる。このＤＮＡ鎖の伸長反応自体は、担体表面上にリンカーを介して固定されている核酸プローブを、プライマーとしたＰＣＲ反応を利用するものであり、上述する本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法を利用することで、全体の検出時間の大幅な短縮が可能となる。
【００５２】
本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法は、
一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群に含まれる、特定の塩基配列を有する核酸分子を検出し、該核酸分子が示す一塩基多型または遺伝子多型を検出する方法であって、
前記一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群において、相互に塩基配列の相違を示す部分塩基配列に対応する塩基配列を有する核酸プローブ複数種を選択し、
該核酸プローブ複数種において、一塩基多型または遺伝子多型の間において相互に相違を示す塩基の少なくとも一つ以上が、該核酸プローブの塩基配列中において、その３’末端側に位置するように、前記部分塩基配列を選定し、
該核酸プローブ複数種を、その５’末端に連結されたリンカーを介して、同一の担体表面上にアレイ状に結合してなる、マイクロアレイを構成し、
検出対象の特定の塩基配列を有する核酸分子は、マイクロアレイを構成する、該核酸プローブ複数種の一つのみと選択的にハイブリダイズ可能な条件下において、
検出対象の特定の塩基配列を有する核酸分子を鋳型として、該鋳型と選択的にハイブリダイズする、前記核酸プローブ複数種の一つをプライマーとして、温度サイクルを用いるＰＣＲ増幅反応によって、相補的なＤＮＡ鎖の伸長を行い、
マイクロアレイ中において、相補的なＤＮＡ鎖の伸長が得られる、該核酸プローブ複数種の一つを特定することで、
特定される、前記核酸プローブ複数種の一つの有する塩基配列に対応する部分塩基配列を含む、一塩基多型または遺伝子多型の検出を行う
ことを特徴とする一塩基多型または遺伝子多型の検出方法であるが、
その際、前記ＰＣＲ増幅反応において、
Ｄｅｎａｔｕｒｅ、ＡｎｎｅａｌおよびＥｘｔｅｎｓｉｏｎの過程からなる温度サイクルを設け、
一温度サイクルを構成する、該Ｄｅｎａｔｕｒｅ、ＡｎｎｅａｌおよびＥｘｔｅｎｓｉｏｎの各過程の時間を、いずれも、１０秒間以下に設定することが可能であり、かつ好ましいものである。
【００５３】
加えて、本発明の第二の形態では、かかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法におけるＰＣＲ増幅反応工程に利用可能な反応容器の発明も併せて提供される。
【００５４】
すなわち、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型検出用反応容器は、
上記構成を有する、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法に従って、一塩基多型または遺伝子多型の検出用のＰＣＲ増幅反応を実施することが可能な、一塩基多型または遺伝子多型の検出用反応容器であって、
対象とする一塩基多型または遺伝子多型の検出は、一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群に含まれる、特定の塩基配列を有する核酸分子を検出し、該核酸分子が示す一塩基多型または遺伝子多型を検出することであり、
前記一塩基多型または遺伝子多型を有する遺伝子核酸分子群において、相互に塩基配列の相違を示す部分塩基配列に対応する塩基配列を有する核酸プローブ複数種を選択し、
該核酸プローブ複数種において、一塩基多型または遺伝子多型の間において相互に相違を示す塩基の少なくとも一つ以上が、該核酸プローブの塩基配列中において、その３’末端側に位置するように、前記部分塩基配列を選定して、
該核酸プローブ複数種を、その５’末端に連結されたリンカーを介して、同一の担体表面上にアレイ状に結合してなるマイクロアレイを構成している、前記担体が、その表面を該反応容器中の反応液と接触可能な位置において、該反応容器に付設されており、
かつ、該担体表面上のマイクロアレイを構成している前記核酸プローブ複数種に対して、前記ＰＣＲ増幅反応における温度サイクルの温度変化を形成する熱源と、該担体中の熱伝導を介して熱的接触可能であり、
前記ＰＣＲ増幅反応に際して、前記核酸プローブ複数種と接する反応液量は、該核酸プローブ複数種が結合されている担体表面に対して、その表面に対する法線方向の液厚さが、３ｍｍ以下となるように、該反応容器における、反応液の収納量と液収納部形状が設定されている
ことを特徴とする一塩基多型または遺伝子多型検出用反応容器である。なお、この反応容器において、前記マイクロアレイを構成している核酸プローブ複数種が、その表面に結合される、前記担体の材質は、無機材料であることが望ましい。
【００５５】
本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、検出に利用する核酸プローブは、従来のマイクロアレイ法を利用する検出方法と同じく、各一塩基多型または遺伝子多型に特異的な塩基配列を有する核酸プローブ複数種を同一の担体表面上にアレイ状に固定したＤＮＡプローブ・マイクロアレイの形態を利用できる。従って、マイクロアレイの特色である、核酸プローブの種類数が多い場合にも対応可能な大規模なアレイを構成できるという利点を保持している。
【００５６】
一方、検出工程において利用されるＰＣＲ増幅反応は、同一の担体表面上に、その５’末端に連結されたリンカーを介して結合されている核酸プローブを、ＰＣＲプライマーとして利用して実施される。そのため、このＰＣＲ増幅反応過程に利用される反応液は、マイクロアレイ表面上を覆う液厚さを必要以上に厚くする必要はない。換言するならば、ＰＣＲ増幅反応過程において、マイクロアレイ表面上を覆う反応液の液厚さは、反応液の蒸散防止がなされている際には、場合によっては、０．１ｍｍ程度まで薄くすることも可能である。少なくとも、本発明の検出方法においては、ＰＣＲ増幅反応に供する反応液の液厚さは、マイクロアレイ表面上、一般に、３ｍｍ以下の範囲、好ましくは、１ｍｍ以下の範囲に選択することができる。
【００５７】
キャピラリ容器を利用するＰＣＲ反応装置においても、例えば、ロッシュ社のライトサイクラーなどは、樹脂製容器と比較し、熱伝導性の優れたガラス製キャピラリ容器を利用して、温度サイクルにおける昇・降温時の温度変化率を大きくし、従来の１／２から１／３の時間でＰＣＲの温度サイクルを完了させることができる装置を発売している。また、ＳＣＩＥＮＣＥ、  Ｖｏｌ．２８０、  １５  ＭＡＹ  １９９８には、同じく、熱容量の小さなキャピラリ中でのＰＣＲ増幅反応において、最大９０秒間の温度サイクルで、所望の増幅率を達成したという報告がなされている。
【００５８】
本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法においても、ＰＣＲ増幅反応過程においては、マイクロアレイ表面上を覆う反応液の液厚さを僅かなものとでき、また、マイクロアレイ用の担体として、ガラスなどの熱伝導性の優れた材料を利用することができ、この担体側から反応液の加熱、冷却を行うことで、ＰＣＲの温度サイクルを大幅に短縮することができる。より具体的には、先に説明した本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応方法を適用することで、マイクロアレイ表面上におけるＰＣＲ増幅反応における、温度サイクルを数十秒間で完了することも可能である。その際には、例えば、図２に例示するプレート型ＰＣＲ反応容器において、底部に利用されるヒーター層表面の絶縁層、例えば、ＳｉＯ2層を、マイクロアレイ用の担体表面として利用することが可能である。
【００５９】
従来のマイクロアレイ法を利用する検出方法では、一次サンプル液中に含まれる核酸分子について、予め、樹脂製の反応容器を利用して、ＰＣＲ増幅反応を実施し、対応する塩基配列を有するＤＮＡ鎖の増幅を前処理として実施している。その後、この前処理で調製される増幅産物ＤＮＡ鎖と、マイクロアレイ上の核酸プローブとのハイブリダイズ反応によって、対応する核酸プローブのスポット点に検出対象の増幅産物ＤＮＡ鎖を固定している。一方、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、マイクロアレイ上に固定されている核酸プローブを、ＰＣＲプライマーとして利用して、片鎖ＰＣＲ増幅反応によって、核酸プローブの３’末端にＤＮＡ鎖の伸長を起こし、直接検出している。従って、少なくとも、従来方法における後段工程のハイブリダイズ反応は、本発明の検出方法では、必要がなく、更に、検出時間の短縮を図る上で貢献を有する。
【００６０】
図８は、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型検出用反応容器の実施態様の一例を示す。この反応容器において、その底部には、マイクロアレイ用担体３１が配置され、反応容器の底部としても機能している。このマイクロアレイ用担体３１の表面に、核酸プローブ３３は、その５’末端に連結されたリンカー３２を介して、同担体表面上の所定のスポット点にアレイ状に結合され、マイクロアレイを構成している。反応液は、このマイクロアレイの表面を覆うように、反応容器内に注入されて、ＰＣＲ増幅反応に供される。その際、反応液の液厚さは、３ｍｍ以下に選択するため、容器の平面形状サイズと比較して、十分に小さく、反応液の加熱・冷却は、主に、底部のマイクロアレイ用担体３１を介する熱伝導過程によって行う。そのため、このマイクロアレイ用担体３１の材質としては、熱伝導率λに優れ、下記する式で定義される熱拡散率ａが優れる材料を利用することが望ましい。熱伝導過程において、その熱拡散率ａは、熱伝導率λ、熱容量Ｃｐ、物質の密度ρを用いて、以下の式で定義される。
【００６１】
ａ＝λ／（Ｃｐ・ρ）  （ｍ2／ｓ）
従来のマイクロアレイ法では、ＤＮＡマイクロアレイ用担体として、スライドガラス等が用いられてきた。通常のガラスより、石英ガラスの熱伝導率は高いが、結晶性シリコンの熱伝導率よりも一桁低く、金属の熱伝導率と比較すると、約二桁低い。マイクロアレイ用担体３１の下に熱源、外部ヒート・シンクを設け、加熱・冷却を行う場合、結晶性シリコンや金属材料を担体の主要な構成材料とすることが好ましい。なお、マイクロアレイ用担体３１全体の熱容量は、担体の厚さに比例し、また、下の熱源、外部ヒート・シンクと熱の授受過程の応答速度も、担体の厚さに依存する。従って、反応容器全体のハンドリングに際して、十分な機械的な強度を有する範囲内で、担体の厚さを薄くすることが望ましい。例えば、スライドガラス形状の矩形シリコンウエハでは、厚さ数百ミクロン程度であれば、通常のハンドリングに関して、特に問題となることはない。
【００６２】
熱容量Ｃｐと、物質の密度ρは、材質の固有な物性値であり、それらをも考慮に入れ、熱拡散率ａを算定すると、一般的に、プラスチックなどの有機高分子化合物よりも、無機材料が好適である。同じ材料の無機アモルファス材料と、結晶性の無機材料とを比較すると、通常、結晶性の無機材料がより望ましい。例えば、本発明の第二の形態において、マイクロアレイ用担体としては、ガラス、シリコンウエハや、アルミなどが利用可能で、また、作製コストの面での、経済的な利点を有する。なお、ガラス、シリコンウエハを基材とし、その表面のマイクロアレイ形成部分に、金、白金、銀などの金属被膜をシリコンウエハの上に成膜して、面内の温度均一性を向上させるこの可能である。なお、表面のマイクロアレイ形成部分に金属被膜を設けると、核酸プローブの５’末端に連結されたリンカーを介して固定化を行う際、そのリンカー部にスルファニル基（ＳＨ基）を予め導入して、簡便に固定化に利用できる。スルファニル基（ＳＨ基）の求核性を利用して、金属原子との間に結合を形成し、リンカー端を容易に結合固定することも可能である。
【００６３】
また、シリコンウエハや、ＳｉＯ2膜（ガラスを含む）に対しては、予め表面にシランカップリング剤処理を施し、結合形成に利用可能な反応性官能基を導入する。この表面に導入された官能基を利用して、核酸プローブの５’末端に連結されたリンカーとの間に共有結合的な連結を形成し、固定化を行うことができる。
【００６４】
更には、先に説明した図２に示す形態の、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応容器のように、この反応容器の底部を構成する矩形シリコンウエハの表面に、局所加熱用のヒーターとして利用可能なヒーター層を設けることも可能である。その表面は、絶縁層として、ＳｉＯ2膜で覆われており、核酸プローブの５’末端に連結されたリンカーを固定する担体表面として利用可能である。一方、付設されているヒーター層に電流を流すことで、反応液を直接的に加熱することが可能となる。すなわち、上で説明したように、ＰＣＲ反応の温度サイクルにおける、ｄｅｎａｔｕｒｅ過程、およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程の加熱のみを、この付設されているヒーター層にパルス電流を流し、熱パルスを発生させることで行うことができる。その結果、反応液の液厚さが０．３ｍｍ程度の場合、１温度サイクルを約１秒程度に設定して、ＰＣＲ反応を実施でき、また、液厚さが３ｍｍ以下であれば、ステップ応答時間を数秒程度に設定して、ＰＣＲ反応を実施できる。
【００６５】
その際、パルス状加熱後の冷却は、担体を介した熱放散によるが、無機材料であれば、ガラスであっても、水よりも熱放散率ａは、一桁程度大きく、速やかな放散が達成される。但し、プラスチックなどの有機高分子材料では、その熱放散率ａは、水と然程差がなく、その厚さが厚いと、冷却時の応答性は、無機材料を用いた場合より有意に劣るものとなる。
【００６６】
なお、反応液の液厚さを薄くすると、ＰＣＲ反応における加熱に伴い、その表面から水の蒸散が進み、反応液の過度の濃縮が起こることもある。それを回避するため、反応液の液厚さを薄くする際には、反応容器に蓋を設け、液溜め部を密閉する構造とすることが好ましい。また、液溜め部自体の内容積をも小さくし、反応液から蒸散し、密閉された液溜め部内部を占める水蒸気量の低減も図ることが望ましい。
【００６７】
本発明の第二の形態では、ＰＣＲ増幅反応は、マイクロアレイ表面で進行し、例えば、この表面近傍におけるＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素の基質が消費される。特に、マイクロアレイ表面の近接するスポット点で、基質の消費が進行すると、局所的に反応速度の低下が生じる場合もある。その観点では、反応液の液厚さを薄くする場合は、反応液の攪拌を行うことが望ましい。例えば、ボルテックスミキサーやシェイカー等、攪拌機能を具えるＰＣＲ装置とすると、この目的に合致したものとなる。なお、ヒート・ブロック加熱型の市販のＰＣＲ装置を利用する場合には、加熱源用ヒート・ブロック自体の温度追従性を高めるように、ヒート・ブロックの熱容量を小さくすることが、一般に望ましい。また、加熱源として、市販のペルチェ素子単体と市販のペルチェ温度コントローラを組み合わせて、温度追従性を高めることも可能である。
【００６８】
さらに、各温度サイクルを高速に実施できると、ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素が高温にさらされる時間が短くなる。従って、従来の温度サイクルに要する時間では、繰り返し回数が４０回を超えると、酵素活性の低下が見出されているが、各温度サイクルに要する時間を短縮することで、酵素活性の低下を回避して、繰り返し回数を１００回程度に増すことが可能となる。その利点を生かすことで、担体表面に固定されている核酸プローブをプライマーとする片鎖ＰＣＲ増幅反応のみでも、目的とするＤＮＡ鎖の伸長がなされた核酸プローブの総量は、その検出感度を十分に満足できるものとなる。
【００６９】
すなわち、従来の前処理では、二本鎖のＤＮＡ鎖の双方ともを同時に増幅することで、繰り返し回数には制約があるものの、全体の増幅効率を高くしている。その後、マイクロアレイ上の核酸プローブとのハイブリダイズ効率は、必ずしも高くないものの、当初の増幅効率を高くすることで、スポット点上でハイブリダイズ固定される、伸長されるＤＮＡ鎖の総量は、必要な検出感度を達成できる範囲としていた。本発明の第二の形態では、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する場合、増幅効率自体の向上はないものの、繰り返し回数を増し、また、伸長されたＤＮＡ鎖は核酸プローブと連結されている。結果として、各スポット点上に固定されて、検出される伸長されたＤＮＡ鎖の総量は、必要な検出感度を達成できる範囲となる。
【００７０】
さらには、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、担体表面上に固定されている核酸プローブをプライマーとして、片鎖ＰＣＲ増幅反応を行う形態だけでなく、対象となる一塩基多型または遺伝子多型の核酸分子間で共通する塩基配列に対応するプライマーをも利用して、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を行う形態も利用できる。すなわち、担体表面上に固定されている核酸プローブの３’末端に選択的に伸長されるＤＮＡ鎖を鋳型として、共通する塩基配列を有するプライマーを用いて、両プライマーで挟まれる部分のＰＣＲ増幅産物を得る。このＰＣＲ増幅産物の３’末端は、当然、担体表面上に固定されている鋳型ＤＮＡ鎖の５’末端部分、すなわち、核酸プローブの塩基配列と相補的なものとなる。従って、次の三段の温度サイクルでは、この二段目のＰＣＲ増幅産物も、核酸プローブとフルマッチ・ハイブリダイズし、その核酸プローブの３’末端に選択的に伸長されるＤＮＡ鎖を与える。このマルチプレックスＰＣＲ増幅反応を利用する場合、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する場合よりも、遥かに高い増幅効率が達成されるので、検体試料中に含まれる検出対象の核酸分子量が少なく場合に有効である。
【００７１】
また、検体中に入れるプライマーは、例えばアレイが大規模であるとき、多型が複数のｅｘｏｎにまたがるとき等、複数となる場合もある。また核酸プローブの固定化量と、検体側に入れるプライマーは非対称ＰＣＲの構成であってもよい。
【００７２】
いずれの場合も、用いている核酸プローブの３’末端側に、他の一塩基多型または遺伝子多型の核酸分子に対しては、ミスマッチであるが、目的とする一塩基多型または遺伝子多型の核酸分子に対しては、マッチする塩基を配することで、この目的とする一塩基多型または遺伝子多型の核酸分子を鋳型とするＤＮＡ鎖の伸長のみが選択的に起こる現象を利用している。従って、一塩基多型（ＳＮＰ）において、相違を有する塩基が唯一つしか存在していない場合であっても、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法を適用することで、その検出が可能となる。
【００７３】
一方、従来の方法では、核酸プローブと予め増幅されたＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションを行う際、ミスマッチの塩基が唯一つの場合、ある程度の頻度で、ミスフィット・ハイブリダイゼーションが生じていた。その区別には、対象とする一塩基多型（ＳＮＰ）に関して、目的とする核酸プローブと、対応する塩基配列に変異を有する他の三種核酸プローブとを、それぞれスポットした上で、フルマッチ・ハイブリダイズするスポット点と、残るミスフィット・ハイブリダイゼーションが生じている３つのスポット点に固定されるＤＮＡ鎖の量を対比して、フルマッチ・ハイブリダイズするスポット点を確認する必要があった。特に、フルマッチ・ハイブリダイズと、ミスフィット・ハイブリダイズとの間で、そのＴｍ値に顕著な差違がない場合には、その判定には、熟練を必要とするものであった。
【００７４】
それに対して、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、対象とする一塩基多型（ＳＮＰ）に関して、その一つのみで選択的にＤＮＡ鎖の伸長が起こるので、その判定は、高い確度で行える。すなわち、対象とする一塩基多型（ＳＮＰ）において、検出された核酸分子は、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれの塩基を有するものかが、一義的に高い確度で決定される。
【００７５】
加えて、従来の方法では、核酸プローブと予め増幅されたＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションを行う際、ハイブリダイゼーション後に、マイクロアレイの担体表面に物理的に伸長されたＤＮＡ鎖が吸着する現象に伴い、バックグラウンドが高くなることも少なくない。その影響を防止するため、予めブロッキング処理を施す、ＵＶ−無水コハク酸処理を行うなどの、付加的な処理が必要な場合が多々見られる。それに対して、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する際には、検出対象の核酸プローブの３’末端側に伸長されたＤＮＡ鎖以外には、本来の検体試料中に存在している核酸分子しかなく、その量は問題となるものではない。加えて、検出対象の核酸プローブの３’末端側に伸長されたＤＮＡ鎖は、担体表面に強固に結合されていので、十分な洗浄を行うことで、物理的に吸着される核酸分子の効果的な除去が達成可能である。
【００７６】
また、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を利用する場合には、検出対象の核酸プローブの３’末端側に伸長されたＤＮＡ鎖以外に、それと相補的なＤＮＡ鎖も存在するが、その大半は、ＰＣＲ増幅反応後、ｄｅｎａｔｕｒｅ処理した後、洗浄することで除去することもできる。あるいは、逆に、適正な温度で処理して、検出対象の核酸プローブの３’末端側に伸長されたＤＮＡ鎖と相補的なＤＮＡ鎖とを二本鎖ＤＮＡとしておいてもよい。いずれの場合も、マイクロアレイの担体表面に物理的に伸長されたＤＮＡ鎖が吸着する現象に伴い、バックグラウンドが高くなるという不具合を回避することが可能である。
【００７７】
本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する際には、検出対象の核酸プローブの３’末端側に伸長されたＤＮＡ鎖に標識を付し、その検出を行う。例えば、放射標識を付したｄＮＴＰを基質に用い、放射標識を行うことができる。あるいは、片鎖ＰＣＲ増幅反応を実施する際、その反応液は、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素と基質のｄＮＴＰならびにＤｙｅターミネータを加えてものを利用すると、核酸プローブの３’末端側に伸長されるＤＮＡ鎖は、Ｄｙｅターミネータが３’末端に取り込まれた時点で、その伸長は停止する。すなわち、片鎖ＰＣＲ増幅反応により得られる、核酸プローブの３’末端側に伸長されるＤＮＡ鎖は、そのＤＮＡ鎖長は様々となるが、いずれも、その３’末端はＤｙｅターミネータにより終端されたものとなる。
【００７８】
図９には、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法において、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する際、核酸プローブの３’末端側に伸長されるＤＮＡ鎖に対して、Ｄｙｅターミネータ３４〜３７を利用して、蛍光標識を定量的に付す態様における反応液を模式的に示す。反応液中には、細胞中から予め抽出された検体の二本鎖ＤＮＡ３８に対して、ＰＣＲ反応用緩衝液中に、ＤＮＡポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）３９、４種の核酸に対応するダイ・ターミネーター３４〜３７、ならびにｄＮＴＰｍｉｘが加えられる。ＰＣＲ反応の温度サイクルを開始すると、ｄｅｎａｔｕｒｅ過程で、検体の二本鎖ＤＮＡ３８は解離し、一本鎖ＤＮＡとなる。次いで、ａｎｎｅａｌ過程で、マイクロアレイ用担体３１上に、その５’末端に連結したリンカー３２を介して結合されている核酸プローブ３３と、相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡがハイブリダイズする。その際、核酸プローブ３３とフルマッチ・ハイブリダイズをしている一本鎖ＤＮＡに対しては、次のｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程において、核酸プローブ３３の３’末端から、その一本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑポリメラーゼによって、ＤＮＡ鎖の伸長が開始する。そのＤＮＡ鎖の伸長段階で、ｄＮＴＰに代えて、対応するＤｙｅターミネータの核酸が連結されると、それ以降のＤＮＡ鎖の伸長は停止される。得られる核酸プローブ３３の３’末端側に伸長されたＤＮＡ鎖は、このＤｙｅターミネータで終端され、結果的に、蛍光標識が定量的になされる。次段の温度サイクルが開始すると、ｄｅｎａｔｕｒｅ過程において、得られる核酸プローブ３３の３’末端側に伸長されたＤＮＡ鎖から、鋳型の一本鎖ＤＮＡが解離する。以降同様の過程が繰り返され、温度サイクルの繰り返しが終わった時点では、図１０に示すように、このスポット点上に存在する核酸プローブ３３の相当部分は、３’末端側に伸長されたＤＮＡ鎖と末端にＤｙｅターミネータよる蛍光標識が付されたものとなる。
【００７９】
特には、反応液中に、ｄＮＴＰｍｉｘを加えず、４種の核酸に対応するダイ・ターミネーター３４〜３７のみを、ＤＮＡポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）３９の基質として加えて、同様の片鎖ＰＣＲ増幅反応を実施すると、核酸プローブ３３の３’末端に次の塩基に対応する、一種類のＤｙｅターミネータが連結された状態で伸長反応は停止する。結果として、このスポット点には、この一種類のＤｙｅターミネータにより蛍光標識が付されたものとなる。また、ＤＮＡ鎖の伸長は、直ぐに、Ｄｙｅターミネータの連結で終端されており、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程に必要な時間は、通常の鋳型一本鎖核酸分子の５’末端に達するまでの時間より大幅に少ない。また、ｄｅｎａｔｕｒｅ過程においても、塩基長の短い核酸プローブ３３のＴｍ値は、相対的に低いため、僅かな時間で、鋳型一本鎖核酸分子の解離が達成できる。結果的に、ｄｅｎａｔｕｒｅ過程、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ過程に要する時間が短縮でき、より高速な温度サイクルを選択できる。
【００８０】
図８〜図１０には、担体表面上に、その５’末端に連結されたリンカーを介して結合されている核酸プローブをプライマーとして、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する態様を例示している。一方、相補鎖に対するプライマーをも利用して、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を利用する場合には、Ｄｙｅターミネータを利用すると、二本鎖ＰＣＲ増幅反応はできないため、通常のｄＮＴＰｍｉｘとｄＵＴＰ蛍光標識物とを利用して、鎖中に蛍光標識を導入する。その場合、核酸プローブ３３の３’末端に伸長されるＤＮＡ鎖中に導入される蛍光標識は、定量的ではないが、検出感度に影響を及ぼすものではない。なお、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を利用する場合には、相補鎖の伸長を行うため、各段の温度サイクルに要する時間は、相対的に長くなるものの、全体的な増幅効率自体は加速度的に高くなる。すなわち、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する場合と比較し、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を利用する際、温度サイクルの繰り返し回数を少なく設定し、温度サイクルに要する時間を同程度としても、核酸プローブ３３の３’末端に伸長されるＤＮＡ鎖の生成量をより多くすることが可能である。従って、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応の利用は、主に、一次サンプル中に存在する検出対象の核酸分子量が少ない場合になされるが、温度サイクルに要する時間を数十分程度とすれば、十分な検出感度を達成するに必要な、核酸プローブ３３の３’末端に伸長されるＤＮＡ鎖量を得ることが可能である。特に、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応の利用を図る場合、先に説明した図２に示す形態の、本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅反応容器のように温度応答性に優れた反応容器を利用することで、温度サイクルに要する時間を短くすることが可能である。
【００８１】
加えて、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法は、従来のマイクロアレイ法と比較して、以下の利点を有している。
【００８２】
先ず、従来のマイクロアレイ法においては、前処理工程として、一塩基多型または遺伝子多型の核酸分子を鋳型として、ＰＣＲ増幅反応を行って、各一塩基多型または遺伝子多型を特徴付ける塩基配列部分を含むＤＮＡ鎖を予め増幅する。この前処理過程において、増幅されるＤＮＡ鎖に対して、予め蛍光標識を付している。例えば、通常のｄＮＴＰｍｉｘとｄＵＴＰ蛍光標識物とを利用して、鎖中に蛍光標識を導入する際、増幅されるＤＮＡ鎖中に導入される蛍光標識の量は、一般に広い分布を示すことになる。加えて、増幅されるＤＮＡ鎖中に導入される蛍光標識は、同一の蛍光波長を示すものとなる。
【００８３】
そのため、核酸プローブとハイブリダイゼーションする際、検出対象の蛍光標識済みＤＮＡ鎖とフルマッチする核酸プローブに加えて、ミスマッチを示す核酸プローブに対する、ミスフィット・ハイブリダイゼーションが生じる際、増幅されるＤＮＡ鎖中に導入される蛍光標識の量のバラツキによっては、両者間の蛍光輝度の差違が不明確となる場合もあった。
【００８４】
それに対して、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、高い頻度でミスフィット・ハイブリダイゼーションが起こる核酸プローブの塩基配列であっても、片鎖ＰＣＲ増幅反応において、担体上に固定されている核酸プローブの３’末端側の塩基が、検体の一本鎖核酸分子とミスマッチを示す場合には、このミスマッチを示す３’末端へのＤＮＡ鎖の伸長はなされないので、蛍光標識が付されることもない。すなわち、一塩基多型または遺伝子多型の検出に利用する核酸プローブの塩基配列は、目的のミスマッチの塩基配列以外に対して、少なくとも、その３’末端側にミスマッチを示す条件を満たす限り、そのＴｍ値には、有意な差違を生じないものを選択できる点で、より広い自由度を有する。
【００８５】
さらには、従来のマイクロアレイ法においては、フルマッチとミスマッチのＴｍ値の差違を考慮して、ハイブリダイゼーション反応の温度設定を行うが、マイクロアレイを構成する多数の核酸プローブに対して、最適なハイブリダイゼーション反応の温度設定を行うことは容易でないことも少なくない。それに対して、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、ハイブリダイゼーション反応を利用していないため、マイクロアレイを構成する多数の核酸プローブ対して、Ｔｍ値をそろえて反応の均一性を見出し易く、より広い適用範囲を有する。この利点から、ミスマッチを示す塩基数が少ない一塩基多型の検出に際して、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法は、特に有効な方法となる。
【００８６】
加えて、上記ＤＮＡ鎖の伸長過程で蛍光標識を施す、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する態様では、仮に、一次サンプル中に、担体表面に物理的に吸着する核酸分子が多量に存在していても、それらの核酸分子は、蛍光標識がなされてなく、バックグランド蛍光として、干渉を及ぼすこともない。従って、担体表面に対する物理的吸着を防止するための処理も不必要となる。また、ＤＮＡ鎖の伸長過程での蛍光標識効率に多少のバラツキがあっても、検出感度に対して、本質的な影響を示さない。
【００８７】
特に、片鎖ＰＣＲ増幅反応を利用する態様において、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素の基質として、４種の塩基に対応するＤｙｅターミネータのみを用い、核酸プローブの３’末端に直接、一つのＤｙｅターミネータを連結させ、蛍光標識を施す手法を採用すると、検出すべきスポット点は、最大４色のＤｙｅターミネータによる色分けを施すことが可能である。そのため、従来のマイクロアレイ法のように、利用される蛍光標識が一種である場合より、その識別力は大幅に向上する。例えば、ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙが存在するＭＨＣの多型解析などにおいて、ゲノム遺伝子上には、両親に由来する二つの対立遺伝子が存在すると、その双方を検出する必要がある。従来のマイクロアレイ法では、通常、利用される蛍光標識が一種であるため、両者の重ね合わせイメージとなり、対象のアレルの型によっては、その判別を行うことが容易でない場合もあった。それに対して、最大４色のＤｙｅターミネータによる色分けを施すことで、その判別は格段に容易なものとなる。
【００８８】
その他、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、担体表面上に、その５’末端に連結されたリンカーを介して結合されている、核酸プローブの３’末端にＤＮＡ鎖を伸長する過程で蛍光標識を施す態様のみでなく、核酸プローブの３’末端にＤＮＡ鎖を一旦伸長した後、この伸長されたＤＮＡ鎖に対して、高い定量性でハイブリダイズする、蛍光標識二次プローブを利用して、検出する態様を選択することも可能である。この二次プローブには、例えば、一塩基多型または遺伝子多型の一群の核酸分子に対して、それらに共通する塩基配列を有するものを用いることもできる。すなわち、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法では、担体表面上に結合される核酸プローブの３’末端に伸長されるＤＮＡ鎖の有無を示す目的で、蛍光標識二次プローブを用いるので、個々のＤＮＡ鎖の塩基配列に対する特異性は必要としない。換言するならば、蛍光標識二次プローブの塩基配列に対する自由度は高く、そのハイブリダイズ条件の設定は極めて容易なものとなる。
【００８９】
以上に説明したように、本発明の第二の形態にかかる一塩基多型または遺伝子多型の検出方法は、マイクロアレイ法の特長である、多数の核酸プローブの使用に適する大規模アレイを維持しながら、検出に際して実施する、ＰＣＲ増幅の反応時間を大幅に短縮できる。加えて、片鎖ＰＣＲ増幅法を適用する際には、その検出感度アップがなされ、さらには、非干渉なマルチプレックスＰＣＲ増幅としても、適用可能である。一方、バックグランド蛍光に起因する検出感度の低下も回避され、特に、ＳＮＰｓ、多型解析を行う上で、有用な方法である。
【実施例】
【００９０】
以下に、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。下記の実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例の形態に限定されない。
【００９１】
（実施例１−１）
本実施例１−１では、市販のＰＣＲ容器の内部に、ＰＣＲ反応液を直接加熱可能なマイクロ・ヒーター線を内蔵する形状のＰＣＲ反応容器を作製した。
【００９２】
先ず、マイクロ・ヒーター線として、ニクロム線ヒータ（Φ＝２３０μｍ、２６Ω／ｍ）をピアノ線（Φ＝５００μｍ）に巻きつけ、コイル間隔：約５００μｍ、コイル外径：約１０００μｍ、コイル部長：１０ｍｍのコイル状ニクロム線ヒーターを形成した。このコイル状ヒーター１を、市販の２００μｌ容ＰＣＲ容器に装着した。コイル状ヒーター１のＰＣＲ容器への固定は、ヒーターに通電して局所的に加熱し、樹脂製容器の口付近を溶融させ、ヒーター線の末端を固定した。このマイクロ・ヒーター線内蔵型ＰＣＲ容器３は、ヒート・ブロック５の固定穴内に挿入された状態で使用する。このヒート・ブロック５自体は、大きな熱容量を有し、一定温度に加熱保持される。従って、コイル状ヒーター１に通電していない状態では、マイクロ・ヒーター線内蔵型ＰＣＲ容器３全体は、所望のａｎｎｅａｌ温度に維持される。一方、コイル状ヒーター１に通電し、局所加熱を行った後、通電を停止すると、ＰＣＲ容器３からヒート・ブロック５への熱伝導により、急速な放熱がなされる。
【００９３】
マイクロ・ヒーター線内蔵型ＰＣＲ容器３に、純水２５μｌを入れ、パルス幅：１００ｍｓ、周期：１Ｈｚの方形波パルス電圧をヒーター線に印加し、徐々に、パルス電圧を上げた。その際、パルス波高値：４３Ｖに達した時点で、水の気化による発泡が見られることを確認された。従って、前記のパルス電圧印加条件において、ＰＣＲ容器内部、コイル状ヒーター付近の純水は、印加パルス時間の最終には、沸点（１００℃）まで加熱されることが確認された。すなわち、印加パルスの初期では、当初、水温は室温程度に低下しているが、印加パルスの間に、徐々に加熱を受け、温度上昇し、印加パルスの最終点では、沸点（１００℃）まで上昇する。その後、電圧の印加がなされない９００ｍｓの期間に、徐々に熱放散が進み、次の印加パルス直前には、５０℃以下の水準に低下される。
【００９４】
この条件をパルス電圧印加装置４にプログラムし、ＰＣＲサイクルとして、コイル状ヒーターへ印加するパルス電圧を、繰返し周期：１Ｈｚ、パルス波高値：４３Ｖ、パルス幅：１００ｍｓ、繰り返し回数：３０回に設定した。作製されたマイクロ・ヒーター線内蔵型ＰＣＲ容器３に、下記組成の反応液を加えた。
【００９５】
【表１】
2005304445.tif 000003
【００９６】
この反応液２に、先ほどのＰＣＲサイクルを施し、ＤＮＡ断片の増幅を行った。図４に、このＰＣＲ産物を含むサンプルを電気泳動（バイオアナライザ、アジレントテクノロジー社）にて分析した結果を示す。鋳型のプラスミドｐＵＣ１１８の塩基配列とＰＣＲプライマー対の塩基配列を参照すると、目標とするＰＣＲ増幅産物のサイズに対応して、約８５ｂｐ付近にバンドが確認された。
【００９７】
（実施例１−２）
本実施例１−２では、シリコンウエハ上に、ＳｉＯ2／ｐｏｌｙＳｉ／ＳｉＯ2の積層構造を形成し、そのポリシリコン膜をヒーター層とし、さらに、表面に、内部にくり抜きを設けた放熱シリコーンゴムシートを積層して、プレート状のＰＣＲ反応容器を作製した。
【００９８】
先ず、シリコンウエハを通常の顕微鏡スライドガラス規格サイズ（縦×横＝２５ｍｍ×７５ｍｍ）にカットした。その表面に、ＲＦスパッタ装置を利用し、雰囲気：８０％Ａｒ−２０％Ｏ2、圧力：５ｍＴｏｒｒ、印加ＲＦパワー：６Ｗ／ｃｍ2の条件で、膜厚０．１μｍのＳｉＯ2膜（下部絶縁層）を形成した。
【００９９】
そのＳｉＯ2膜（下部絶縁層）表面に、ＲＦスパッタ法により、ターゲットをＳｉとして、表２の成膜条件で１μｍのポリシリコン膜を成膜した。
【０１００】
【表２】
2005304445.tif 000004
【０１０１】
さらに、ポリシリコン膜表面に、下部絶縁層用ＳｉＯ2膜と同じ条件で、上部絶縁層として、ＳｉＯ2膜を０．１μｍ成膜して、ＳｉＯ2／ｐｏｌｙＳｉ／ＳｉＯ2の積層構造とした。
【０１０２】
一方、厚さ１．０ｍｍの放熱シリコーンゴムシートを、外形は、スライドガラス規格より横５ｍｍだけ小さく（縦×横＝２５ｍｍ×７０ｍｍ）、内側に、縦×横＝２０ｍｍ×３０ｍｍの矩形のくり抜き部を有する形状に加工した。その放熱シリコーンゴムシートを、表面にＳｉＯ2／ｐｏｌｙＳｉ／ＳｉＯ2の積層構造を設けたシリコンウエハの上に密着させた。従って、放熱シリコーンゴムシートのくり抜き部は、サンプル溶液を溜める、深さ１．０ｍｍのプール状容器部となる。その上に、蓋部として、縦×横＝２０×７０ｍｍのシリコンウエハを重ね、容器を密閉できる構造とした。この容器においては、ＳｉＯ2／ｐｏｌｙＳｉ／ＳｉＯ2の積層構造中、ポリシリコン膜をヒーター層として利用し、前記プール状容器の底部より加熱を行う形態となっている。
【０１０３】
このヒーター付設型ＰＣＲ容器３は、ヒート・ブロック５上に密着された状態で使用する。このヒート・ブロック５自体は、大きな熱容量を有し、一定温度に加熱保持される。従って、シート状ヒーター１に通電していない状態では、ヒーター付設型ＰＣＲ容器３全体は、所望のａｎｎｅａｌ温度に維持される。一方、シート状ヒーター１に通電し、局所加熱を行った後、通電を停止すると、ＰＣＲ容器３からヒート・ブロック５への熱伝導により、急速な放熱がなされる。
【０１０４】
ＰＣＲサイクルにおいて、ポリシリコン膜ヒーターに印加するパルス電圧として、図７に示す、繰返し周期：１Ｈｚ、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ時の印加電圧：２Ｖ、４５０ｍｓ、ｄｅｎａｔｕｒｅ時の印加電圧：２０Ｖ、５０ｍｓ、ａｎｎｅａｌ時：０Ｖ、５００ｍｓ、繰り返し回数：３０回を設定した。作製されたヒーター付設型ＰＣＲ容器に、下記組成の反応液を加えた。
【０１０５】
【表３】
2005304445.tif 000005
【０１０６】
この５０μｌ（５０ｍｍ3）の反応液を２０ｍｍ×３０ｍｍのくり抜き部に入れ、先ほどのＰＣＲサイクルを施し、ＤＮＡ断片の増幅を行った。図５に、このＰＣＲ産物を含むサンプルを電気泳動（バイオアナライザ、アジレントテクノロジー社）にて分析した結果を示す。鋳型のプラスミドｐＵＣ１１８の塩基配列とＰＣＲプライマー対の塩基配列を参照すると、目標とするＰＣＲ増幅産物のサイズに対応して、約３５０ｂｐ付近にバンドが確認された。
【０１０７】
（実施例２−１）
［ＰＣＲ反応容器の作製］
本実施例１−２では、シリコンウエハ表面に、内部にくり抜きを設けた放熱シリコーンゴムシートを積層して、プレート状のＰＣＲ反応容器を作製した。
【０１０８】
先ず、シリコンウエハを通常の顕微鏡スライドガラス規格サイズ（縦×横＝２５ｍｍ×７５ｍｍ）にカットした。また、厚さ１．０ｍｍの放熱シリコーンゴムシートを、外形は、スライドガラス規格（縦×横＝２５ｍｍ×７５ｍｍ）、内側に、縦×横＝２０ｍｍ×３０ｍｍの矩形のくり抜き部を有する形状に加工した。その放熱シリコーンゴムシートを、前記矩形にカットしたシリコンウエハの上に密着させた。従って、放熱シリコーンゴムシートのくり抜き部は、サンプル溶液を溜める、深さ１．０ｍｍのプール状容器部となる。その上に、蓋部として、同じく、スライドガラス規格にカットしたシリコンウエハを重ね、プール状容器部を密閉できる構造とした。
【０１０９】
［マイクロアレイの作製］
（シリコンウエハ表面への官能基導入）
スライドガラス規格にカットした矩形シリコンウエハの表面に、ＤＮＡプローブの固定に利用する官能基の導入を、以下の手順で行った。
【０１１０】
先ず、矩形シリコンウエハに、超純水超音波洗浄５分間を施した。アミノ・シランカップリング剤水溶液は、純水中、シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を濃度１％となるように添加し、２時間室温で攪拌、溶解させて、調製した。続いて、洗浄済み矩形シリコンウエハをシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。この浸漬処理後、シリコンウエハを引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した。引き続き、窒素ガスを矩形シリコンウエハの両面に吹き付けて乾燥させた。次に、乾燥した矩形シリコンウエハを、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークした。このベーク処理により、シリコンウエハ表面へのカップリング剤の反応が完結し、シリコンウエハ表面にシランカップリング剤由来のアミノ基が導入される。
【０１１１】
次いで、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に、最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解して、ＥＭＣＳ溶液を調製した。前記ベーク処理終了後、シリコンウエハを放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。このＥＭＣＳ溶液中への浸漬処理において、表面に導入されている、シランカップリング剤由来のアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基との反応が進み、シリコンウエハ表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた矩形シリコンウエハを、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒を用いて洗浄して、未反応のＥＭＣＳを除去した。さらに、エタノールにより洗浄し、混合溶媒を除去した後、表面にマレイミド基が導入されたシリコンウエハの乾燥を行った。
【０１１２】
（プローブＤＮＡの準備）
公表された遺伝子情報の登録がなされている、データ・バンクＥＢＩ（The European Bioinformatics Institute）のサイト（http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）から、ＨＬＡのＢＲＢ1に関する遺伝子データを入手し、以下のアレルを識別するための４種類のプローブ塩基配列を選定した。
>DRB1*0804
5'-  cggtgacggagctggggcggcctg
>DRB1*0407
5'-  tgcagacacaactacggggttggt
>DRB1*1303
5'-  gtgacggagctggggcggcctagc
>DRB1*0301
5'-  atacttccataaccaggaggagaa
選択された塩基配列を有する、プローブＤＮＡの合成は、ＤＮＡ合成メーカーに依頼した。また、合成されるプローブＤＮＡの５’末端には、予め、ＳＨ基を導入している。このＳＨ基導入では、市販のチオール・モディファイヤ（グレンリサーチ社製）を使用し、固相合成されるオリゴヌクレオチド鎖：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮに対して、
その５’末端にリンカー鎖として、−（ＣＨ2）6−を介して、
5’  HS−(CH2)6−O−PO2−O−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−3’の形態でスルファニル基（−ＳＨ）が導入される。
【０１１３】
なお、各プローブの３’末端には、他のアレルの塩基配列に対してミスマッチを含み、加えて、それぞれのミスマッチを示す塩基は、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇの４種類となるように配慮した上で、その塩基配列の選択がなされている。合成されたプローブＤＮＡは、それぞれ、ＤＮＡの含有濃度が吸光度０．４ＯＤ（吸収波長２６０ｎｍ）となるように、グリセリン５％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１％水に溶解した。調製されたプローブＤＮＡ溶液は、バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０  キヤノン社製）用インクタンクに充填した。なお、このバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、最小ドット・ピッチ約１２０μｍで、数ピコリットルのプローブＤＮＡ含有液滴をスポッティングすることが可能となっている。
【０１１４】
（マイクロアレイの作製）
前述の官能基導入済みシリコンウエハに対して、１プローブＤＮＡに対して４ドット、合計１６ドットのマイクロアレイとなるように、プローブＤＮＡ含有液滴をスポッティングした。スポッティング後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、シリコンウエハ表面のマレイミド基と、プローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。その後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、シリコンウエハ表面に残留する未反応プローブＤＮＡを洗浄した。シリコンウエハ表面上に、各オリゴヌクレオチド鎖が５’末端で、リンカー鎖−（ＣＨ2）6−を介して固定されているマイクロアレイが得られた。
【０１１５】
［サンプル溶液の調製］
ＩＨＷＧ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）より、表のパネルセル４種を入手した。各パネルセルを、細胞密度１０×１０6／ｍｌになるようにセル懸濁液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に懸濁した。この細胞懸濁液０．５ｍｌをサンプルし、プロティナーゼＫ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｄＨ2Ｏ）を５０μｌ、１０％ＳＤＳ（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｄＨ2Ｏ）を５０μｌ添加し、４５℃３時間インキュベートした。
【０１１６】
さらに、等量０．６ｍｌのＰＣＩ（フェノールクロロホルムイソアミルアルコール２５：２４：１）を加え、１０分間シェイクし、細胞の破砕を終えた。この細胞破砕後、水層を別のチューブに取る操作を二回繰り返した。分取した可溶性画分（水層）サンプルに、通常のエタノール沈澱の操作を施し、含まれる核酸鎖を析出させた。その後、析出した核酸鎖の沈澱を、バキューム遠心機にかけ、軽く乾燥した。
【０１１７】
【表４】
2005304445.tif 000006
【０１１８】
［ＰＣＲによる目的物の検出反応］
上記のサンプル調製により、分離される核酸鎖の沈澱物中には、各パネルセルのゲノム遺伝子が含まれている。チューブ容器中で脱水乾燥した、核酸鎖の沈澱物サンプルに対して、ダイ・ターミネーターの入ったＰＣＲ反応ｍｉｘｔｕｒｅ（ＡＢＩ社、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）４０μｌ、バッファー（ＡＢＩ社、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）１６０μｌを加え、混和して、反応液とした。この反応液２００μｌを、上記表面にマイクロアレイが形成された矩形シリコンウエハで作製される、ＰＣＲ反応容器に入れ、蒸発を防ぐように、蓋用の矩形シリコンウエハで覆って密閉した。この反応容器中に入れた反応液に、下記表５の温度サイクルで、一本鎖ＤＮＡの増幅反応を行った。
【０１１９】
【表５】
2005304445.tif 000007
【０１２０】
前記の一本鎖ＤＮＡ増幅反応を終了後、反応容器のマイクロアレイが形成された矩形シリコンウエハの表面に対して、シェイカー上で７０％エタノールを用いて１分間洗浄を二回繰り返した。洗浄液を遠心除去し、矩形シリコンウエハの表面に形成されているマイクロアレイ領域の蛍光顕微鏡観察を行った。すなわち、パネルセルから調製された、ゲノム遺伝子を含むＤＮＡサンプルより、そのＨＬＡ−ＤＲＢ１のアレルに対応するプローブＤＮＡの３’末端では、ＤＮＡ鎖の伸長がなされ、その末端にダイ・ターミネーターが結合したものとなる。そのＤＮＡ鎖の伸長に伴い、プローブＤＮＡの３’末端側に結合されるダイ・ターミネーターに起因する蛍光の有無を観察した結果を、表６にまとめる。
【０１２１】
【表６】
2005304445.tif 000008
【０１２２】
以上の結果から、各パネルセルが有しているアレルに対応して、そのアレル遺伝子とハイブリダイズ可能なプローブＤＮＡのスポットのみが、一本鎖ＤＮＡ増幅反応後、蛍光染色されていることが確認される。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明のＰＣＲ反応方法は、ライフサイエンス、バイオテクノロジーなどの分野で利用される、核酸鎖のＰＣＲ増幅反応の効率化に利用でき、
加えて、本発明のＰＣＲ増幅反応を利用する核酸の検出方法は、ゲノムの多様性、遺伝子多型、ＳＮＰｓ等、変異またはミスマッチ塩基の検出に応用される、所謂、ＤＮＡマイクロアレイを利用した核酸の検出方法となる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅方法に利用される、マイクロ・ヒーター線内蔵型ＰＣＲ容器と、そのマイクロ・ヒーター線へのパルス電圧印加による、高応答性の反応液加熱方式を模式的に示す図である。
【図２】本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅方法に利用される、シート状のヒーター付設型ＰＣＲ容器と、そのシート状のヒーターへのパルス電圧印加による、高応答性の反応液加熱方式を模式的に示す図である。
【図３】本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅方法に利用される、局所加熱用ヒーター１へのパルス電圧印加、ならびにヒート・ブロック５の加熱、温度制御を行う機能を持つ、ＭＰＵユニット４の構成を模式的に示す図である。
【図４】実施例１−１に示す、ＰＣＲ反応により得られるＰＣＲ増幅産物の電気泳動による解析結果を示す。
【図５】実施例１−２に示す、ＰＣＲ反応により得られるＰＣＲ増幅産物の電気泳動による解析結果を示す。
【図６】本発明の第一の形態にかかるＰＣＲ増幅方法に利用される、局所加熱用ヒーターに対するパルス電圧印加の形態の例を模式的に示す図である。
【図７】実施例１−２に示す、ＰＣＲ反応に利用される、温度サイクルにおける局所加熱用ヒーターに対するパルス電圧印加の形態を示す図である。
【図８】本発明の第二の形態にかかる、ＳＮＰｓまたは遺伝子多型の検出方法に利用される、核酸プローブのマイクロアレイをその底面部に形成したＰＣＲ増幅反応用容器の例を模式的に示す図である。
【図９】本発明の第二の形態にかかる、ＳＮＰｓまたは遺伝子多型の検出方法に利用される、ダイ・ターミネーターの入ったＰＣＲ反応ｍｉｘｔｕｒｅと、鋳型となる二本鎖ＤＮＡとを含む反応液を用い、核酸プローブのマイクロアレイをその底面部に形成したＰＣＲ増幅反応用容器内で実施するＰＣＲ反応を模式的に示す図である。
【図１０】本発明の第二の形態にかかる、ＳＮＰｓまたは遺伝子多型の検出方法に利用される、ダイ・ターミネーターの入ったＰＣＲ反応ｍｉｘｔｕｒｅと、鋳型となる二本鎖ＤＮＡとを含む反応液を用い、核酸プローブのマイクロアレイをその底面部に形成したＰＣＲ増幅反応用容器内で実施するＰＣＲ反応に伴い、伸長される核酸プローブの３’末端側に結合されるダイ・ターミネーターによる蛍光染色を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【０１２５】
１  コイル状ヒーター
１Ｓ  シート状ヒーター層
２  反応液
３  ＰＣＲ反応容器
４  ＭＰＵユニット
５  ヒート・ブロック
６  １チップ・マイコン
７  Ａ／Ｄコンバータ内蔵アナログ入力ポート
８  デジタル入出力のＩ／Ｏポート
９  パルス・シークエンス発生用タイマー／カウンターポート
１０  電流ドライバ回路
１１  キー入力装置
１２  表示器
１３  ペルチェ・ドライバ回路
３１  マイクロアレイ用担体
３２  リンカー
３３  核酸プローブ
３４〜３７  ダイ・ターミネーター
３８  検体（鋳型の二本鎖核酸分子）
３９  ＤＮＡポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）
【図１】
2005304445.tif 000009
【図２】
2005304445.tif 000010
【図３】
2005304445.tif 000011
【図４】
2005304445.tif 000012
【図５】
2005304445.tif 000013
【図６】
2005304445.tif 000014
【図７】
2005304445.tif 000015
【図８】
2005304445.tif 000016
【図９】
2005304445.tif 000017
【図１０】
2005304445.tif 000018
【配列表】
2005304445000001.app