(57)【要約】【課題】無細胞タンパク質合成系で合成された蛍光標識つきタンパク質とサンプル溶液との反応を簡便に短時間で精度良く検出する方法を提供する。【解決手段】ＧＦＰつき抗体とナノパーティクル表面の糖との結合反応を検出する場合を説明する。マイクロプレート３のウエル内で、ＧＦＰつき抗体１を含む溶液と、ＧＦＰつき抗体と反応する糖を表面に付着させたナノパーティクル２を含む溶液とを混合して混合溶液Ａをつくり、反応後にＦＣＳ計測を行う。【選択図】      図１
2005308412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成系を用いて蛍光標識つきタンパク質を合成するステップと、  
前記蛍光標識つきタンパク質を含む溶液とサンプル溶液とを混合するステップと、  
蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）または蛍光強度分散分析法(FIDA: Fluorescence Intensity Distribution Analysis)により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を求めるステップとを有し、
前記サンプル溶液は、前記タンパク質と反応する複数の反応基を表面に有するビーズを含むことを特徴とするタンパク質と反応基との反応を検出する方法。
【請求項２】
前記混合溶液中より前記ビーズを分離するステップを含むことを特徴とする請求項１のタンパク質と反応基との反応を検出する方法。
【請求項３】
前記混合するステップは、マイクロプレートのウエル内で前記タンパク質を含む溶液と前記サンプル溶液とを混合するステップを含み、
前記ウエル内の前記混合溶液中で前記蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を求めることを特徴とする請求項１のタンパク質と反応基との反応を検出する方法。
【請求項４】
前記タンパク質を合成するステップは、小麦胚芽抽出物中で前記タンパク質を合成するステップを含むことを特徴とする請求項１のタンパク質と反応基との反応を検出する方法。
【請求項５】
前記蛍光標識つきタンパク質は、蛍光タンパク質を含むタンパク質、または蛍光タンパク質以外の蛍光物質と融合したタンパク質であることを特徴とする請求項１のタンパク質と反応基との反応を検出する方法。
【請求項６】
前記混合するステップは、前記タンパク質の構造を変化させる物質を含む溶液を混合するステップを含むことを特徴とする請求項１のタンパク質と反応基との反応を検出する方法。
【請求項７】
無細胞タンパク質合成系を用いて蛍光標識つきタンパク質を合成するステップと、  
前記蛍光標識つきタンパク質を含む溶液とサンプル溶液とを混合するステップと、  
蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence  Correlation Spectroscopy）または蛍光強度分散分析法(FIDA: Fluorescence Intensity Distribution Analysis)により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を求めるステップとを有し、
前記サンプル溶液は、前記蛍光標識つきタンパク質の蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質を含むことを特徴とするタンパク質とサンプル液との反応を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は無細胞下、特に小麦胚芽抽出物中で核酸を用いて人工的に合成したタンパク質の機能解析をする方法に関し、特にＦＣＳまたはＦＩＤＡを用いて解析を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工的に発現させたタンパク質の機能を解析する方法は、反応後、ゲル電気泳動法により、タンパク質を分離し、そのタンパク質の移動度から反応の有無を検出し判断する方法や、被反応物質を放射線同位元素でラベルし、オートラジオグラフィーで検出する方法がある。
【０００３】
特許文献１は、小麦胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を記載する。  
特許文献２は、小麦胚芽抽出液などを用いた無細胞翻訳系において、標識試薬を適当な濃度で存在させることにより合成されたタンパク質部のＣ末端にアクセプター部を介して蛍光物質を結合させることを記載する。また、標識物質の例としてタンパク質を挙げ、タンパク質−分子間相互作用の解析方法の例として蛍光相関分光法を挙げる。
【０００４】
しかしながら、特許文献１および特許文献２は、無細胞タンパク質合成系で合成された蛍光標識つきタンパク質とサンプル溶液との反応の有無を検出する方法で、サンプル溶液がビーズを含むことは記載されていない。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２３６８９６号公報
【０００６】
【特許文献２】国際公開第０１／０１６６００号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術のようなタンパク質を機能解析する場合、ゲル電気泳動法を利用する方法は、操作が煩雑で検出結果がでるまでに時間がかかる。また、電気泳動では一度に泳動できるサンプル数に限りがあり、多検体のスクリーニングには不向きである。
本発明の目的は、無細胞タンパク質合成系で合成された蛍光標識つきタンパク質とサンプル溶液との反応を簡便に短時間で精度良く検出する方法を提供することに有る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成する本発明の特徴は、無細胞タンパク質合成系を用いて蛍光標識つきタンパク質を合成し、合成された蛍光標識つきタンパク質を含む溶液と、蛍光標識つきタンパク質と反応する複数の反応基を表面に有するビーズを含むサンプル溶液とを混合し、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を求めることにある。
【０００９】
蛍光標識つきタンパク質がビーズ表面の複数の反応基と結合反応した場合に、ビーズ表面の反応基と結合した蛍光標識つきタンパク質の数に比例して、ビーズを含む分子全体の大きさが増加し、かつ、ビーズを含む分子全体の蛍光強度が増加するので、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさ、蛍光強度または数を求めて、その値から蛍光標識つきタンパク質とビーズの表面の反応基との結合反応を知ることができる。
【００１０】
従って、本発明の特徴によれば、タンパク質に化学修飾するなどの処理をせずにタンパク質を蛍光標識でき、溶液中に浮遊したままのタンパク質を利用して、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄、精製作業などの煩雑な操作を行わずに反応試験を行うことができ、タンパク質本来の機能を維持したままで反応試験を行えるとともに、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさ、蛍光強度または数を求めて、その値から蛍光標識つきタンパク質とビーズの表面の反応基との結合反応を知ることができるので、タンパク質とサンプル液との反応の有無を簡便に短時間で精度良く検出することができる。
【００１１】
ビーズの表面には、多数の反応基を付着させることができるので、蛍光標識つきタンパク質と反応基とが結合すると、ビーズの周りに多数の蛍光標識つきタンパク質が集まることになり、ＦＣＳ計測およびＦＩＤＡ計測の値がより精度良く得られる。特に、ビーズとして比重１.0程度、直径０.１〜０．５マイクロメートルのナノパーティクルを用い、反応基を有する低分子をナノパーティクル表面に付着させて、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）などの比較的大きな蛍光タンパク質を融合させて合成した蛍光標識つきタンパク質とナノパーティクル表面の低分子とを結合反応させた場合、反応前の蛍光標識つきタンパク質の蛍光強度と、反応後のナノパーティクル全体の蛍光強度には大きな差があり、結合反応の有無を容易に知ることができる。
【００１２】
また、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法は他の解析方法に比べて、蛍光標識つきタンパク質およびサンプル溶液とも少量で解析を行うことができるので、安価に反応の有無を知ることができる。無細胞タンパク質合成系として、小麦胚芽抽出物中でタンパク質を合成する小麦胚芽無細胞タンパク合成系を用いても良い。
【００１３】
また、ビーズの表面には反応してできた分子が付着しているので、ビーズを含む分子全体を混合溶液から分離することにより、反応してできた分子を測定後に混合溶液から回収することができる。このとき、遠心分離によりビーズを分離しても良い。
また、磁性体のビーズを利用し、磁力により分離してもよい。このとき、精製していない細胞抽出物のようなクルード(crude)なサンプル溶液から未反応成分を除去することなく、活性のある蛍光標識つきタンパク質を容易に回収することができる。
【００１４】
本発明の他の特徴は、タンパク質を含む溶液とサンプル溶液とをマイクロプレートのウエル内で混合し、ウエル内の混合溶液について蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を求めることにある。
【００１５】
この特徴によれば、マイクロプレート上でウエル数の混合溶液について、蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を簡便に短時間で精度良く得ることができ、これらの値からタンパク質とサンプル液との反応の有無を検出することができるので、一度に多種のサンプルとの反応試験を行い、反応液を精製せずにそのままで、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法をもちいてタンパク質とサンプル液との反応の有無を簡便にかつ短時間で検出することができる。多検体についての反応試験を短時間で行うのに有効である。
【００１６】
本発明の他の特徴は、蛍光標識つきタンパク質として、蛍光タンパク質を含むタンパク質が合成されること、または蛍光タンパク質以外の蛍光物質と合成途中で融合したタンパク質が合成されることにある。
この特徴によれば、無細胞蛋白合成系において発現させるタンパク質に対して、本来の機能を失わせるような改変を行わずに蛍光標識できるので、得られた蛍光標識つきタンパク質とサンプルとの反応試験をより精度良く行うことができる。蛍光タンパク質としてＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）などを用いると、ＧＦＰは発現させるタンパク質と融合させることが容易であるので、蛍光標識つきタンパク質を簡便に得ることができる。また、無細胞蛋白合成系を利用してＧＦＰつきタンパク質を合成する方法は、他の方法と比べて費用を安くできる。
【００１７】
また、本発明の他の特徴は、混合溶液を作る際に、タンパク質の構造を変化させる物質を含む溶液を混合することにある。この特徴によれば、タンパク質の構造を変化させる物質によって蛍光標識つきタンパク質のタンパク質部の構造が変化するために、タンパク質の構造を変化させる物質を加えなかった場合よりも、蛍光標識つきタンパク質とビーズの表面の反応基との結合反応が抑制されて、ビーズの周りに集まる蛍光標識つきタンパク質の数が減り、ビーズを含む蛍光を発する分子の分子量が小さくなり、かつ、蛍光強度が小さくなる。従って、反応溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数の値から、タンパク質の構造を変化させる物質による、タンパク質部と反応基との結合反応を抑制する効果の有無や程度を知ることができる。また、反応後に混合溶液からビーズを回収し、タンパク質の構造を変化させる物質を含む溶液と混合させてから、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で測定を行ってもよい。タンパク質の構造を変化させる物質としては、シアン化水素ナトリウムなどの還元剤がある。
【００１８】
上記目的を達成する本発明の特徴は、無細胞タンパク質合成系を用いて蛍光標識つきタンパク質を合成し、合成された蛍光標識つきタンパク質を含む溶液と、蛍光標識つきタンパク質の蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質を含むサンプル溶液とを混合し、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を求めることにある。
【００１９】
蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質によって、蛍光標識つきタンパク質の蛍光タンパク部とタンパク質部とが分離されると、混合溶液中には蛍光タンパク部が蛍光を発する分子として浮遊するようになり、蛍光タンパク部は元の蛍光標識つきタンパク質よりも分子量が小さく、かつ、蛍光強度が小さくなるから、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法により反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさ、蛍光強度または数を求め、その値から蛍光標識つきタンパク質が分離されたかを知ることができる。
【００２０】
従って、本発明の特徴によれば、タンパク質に化学修飾するなどの処理をせずにタンパク質を蛍光標識でき、溶液中に浮遊したままのタンパク質を利用して、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄、精製作業などの煩雑な操作を行わずに反応試験を行うことができ、タンパク質本来の機能を維持したままで反応試験を行えるとともに、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法により反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさ、蛍光強度または数を求め、その値から蛍光標識つきタンパク質が分離されたかを知ることができるので、タンパク質とサンプル液との反応の有無を簡便に短時間で精度良く検出することができる。
【００２１】
特に、蛍光標識部としてＧＦＰを、タンパク質部としてＧＵＳ（β-glucuronidase：β−グルクロニダーゼ）を無細胞タンパク質合成系で合成して、蛍光標識つきタンパク質としてＧＦＰつきＧＵＳを得て、蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質としてプロテアーゼを用いた場合には、プロテアーゼを混合する前の蛍光を発する分子、すなわちＧＦＰつきＧＵＳの並進拡散時間は約350μs、蛍光強度は約80kHzで、混合後の蛍光を発する分子、すなわちＧＦＰ部分の並進拡散時間は約200μs、蛍光強度は約40kHzとなる。従って、プロテアーゼを混合した後に、混合溶液中の蛍光を発する分子について蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法により反応溶液中の蛍光を発する分子の大きさ、蛍光強度または数を求め、その値から、プロテアーゼのＧＦＰつきＧＵＳの分離効果を知ることができる。
【００２２】
蛍光相関分光法を用いて分子の大きさを求めること、および蛍光強度分散分析法を用いて分子の蛍光強度を求めることのどちらかだけでも、タンパク質とサンプル液との反応の有無を検出することができるが、両方を用いれば、より精度良く反応の有無を検出することができる。
【００２３】
また、蛍光標識つきタンパク質が、蛍光タンパク部とタンパク質部との間にペプチドなどの中間部を有している場合には、蛍光標識つきタンパク質の蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質は、中間部を分割するものであってもよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄、精製作業などの煩雑な操作を行わずに反応試験を行うことができ、タンパク質本来の機能を維持したままで反応試験を行えるので、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法によって蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を簡便に短時間で精度良く得ることができ、これらの値からタンパク質とサンプル液との反応の有無を検出することができる。本発明では他の解析方法に比べて、蛍光標識つきタンパク質およびサンプル溶液とも少量で解析を行うことができるので、安価に反応の有無を知ることができる。
【００２５】
また、本発明の他の特徴によれば、反応してできた分子を測定後に混合溶液から回収することができる。また、磁性体のビーズを利用すれば、精製していない細胞抽出物のようなクルード(crude)なサンプル溶液から未反応成分を除去することなく、活性のある蛍光標識つきタンパク質を容易に回収精製することができる。
【００２６】
また、マイクロプレートを用いることで、一度に多種のサンプルとの反応試験を行い、反応液を精製せずにそのままで、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法をもちいてタンパク質とサンプル液との反応の有無を簡便にかつ短時間で検出することができる。多検体についての反応試験を短時間で行うのに有効である。
【００２７】
また、無細胞蛋白合成系において発現させるタンパク質に対して、本来の機能を失わせるような改変を行わずに蛍光標識できるので、得られた蛍光標識つきタンパク質とサンプルとの反応試験をより精度良く行うことができる。ＧＦＰなどを用いれば、蛍光標識つきタンパク質を簡便に得ることができる。また、無細胞蛋白合成系を利用してＧＦＰつきタンパク質を合成する方法は、他の方法と比べて費用を安くできる。
【００２８】
本発明の他の特徴によれば、タンパク質の構造を変化させる物質を加えなかった場合よりも、蛍光標識つきタンパク質とビーズの表面の反応基との結合反応が抑制されて、ビーズの周りに集まる蛍光標識つきタンパク質の数が減り、ビーズを含む蛍光を発する分子の分子量が小さくなり、かつ、蛍光強度が小さくなる。従って、反応溶液中の蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数の値から、タンパク質の構造を変化させる物質による、タンパク質部と反応基との結合反応を抑制する効果の有無や程度を知ることができる。
【００２９】
本発明によれば、タンパク質に化学修飾するなどの処理をせずにタンパク質を蛍光標識でき、溶液中に浮遊したままのタンパク質を利用して、放射性同位元素の利用、電気泳動法、固体基質への分子の固定作業、洗浄、精製作業などの煩雑な操作を行わずに反応試験を行うことができ、タンパク質本来の機能を維持したままで反応試験を行えるとともに、蛍光標識つきタンパク質が分離されたかを知ることができるので、タンパク質とサンプル液との反応の有無を簡便に短時間で精度良く検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
１．  ＦＣＳ計測とＦＩＤＡ計測  
１分子蛍光分析装置を使って、マイクロプレートウエル中の反応液について蛍光相関分光法(FCS：Fluorescence Correlation Spectroscopy)または蛍光強度分布解析法（FIDA：Fluorescence Intensity Distribution Analysis）で蛍光解析を行う。蛍光相関分光法による蛍光解析（ＦＣＳ計測）と蛍光強度分布解析法による蛍光解析（ＦＩＤＡ計測）のうち、どちらか一方でも反応の有無を知ることができるが、両方の計測を行えば、より精度よく反応の有無を知ることができる。
【００３１】
１．１  ＦＣＳ測定  
ＦＣＳ測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、得られた情報に基づいて並進拡散時間(Diffusion Time)を求める。並進拡散時間の大小は分子量の大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子量の増加または減少がわかる。分子量の増加は生体分子間の結合反応を、分子量の減少は生体分子の分解反応を示す。従って、蛍光標識タンパク質とサンプルとの反応の前後で、蛍光標識された物質の並進拡散時間の増加を検出することにより、蛍光標識タンパク質とサンプルとの結合反応を検出することができる。また、蛍光を発する分子を同じ数含む２つ以上の溶液にそれぞれに、蛍光を発する分子と反応を起こす分子を含む溶液を混合した場合には、各混合溶液の間で、並進拡散時間を比較することにより、各混合溶液における反応の有無や程度を知ることができる。
【００３２】
しかし、サンプル中の生体分子で蛍光標識タンパク質と反応する生体分子の分子量が、蛍光標識タンパク質の分子量に対して非常に小さい場合は、結合反応後の分子量の増加が小さいので、ＦＣＳ計測で並進拡散時間の増加が検出できない。このような場合は、蛍光標識タンパク質に影響を与えない大きな分子を、サンプル中の生体分子に予め結合させておくとよい。生体分子と蛍光標識タンパク質とが結合反応すると、結合反応後にできた蛍光を発する分子の分子量は、生体分子と大きな分子とを合わせた分だけ増加するので、ＦＣＳ計測によって、並進拡散時間の増加が検出できるようになる。生体分子に予め結合させる大きな分子としては、ナノパーティクルなどのビーズを用いても良い。
【００３３】
１．１．１  反応の前後での比較  
反応の前後で、ＧＦＰつき抗体とナノパーティクル表面の糖との結合反応を検出する場合を説明する。マイクロプレート３のウエル内で、ＧＦＰつき抗体１を含む溶液と、ＧＦＰつき抗体１と反応する糖を表面に付着させたナノパーティクル２を含む溶液とを混合して混合溶液Ａをつくり、反応後にＦＣＳ計測を行う（図１を参照）。ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖が結合反応をすれば、１つのナノパーティクル２の表面にＧＦＰつき抗体１が複数集まるので、
反応前のＧＦＰつき抗体１の並進拡散時間τ１と個数ｎ１、  
反応後のナノパーティクル２を含む蛍光を発する分子４の並進拡散時間τ２Ａと個数ｎ２Ａ、
を測定し、反応の前後で並進拡散時間τと個数ｎを比較することによって、混合溶液ＡにおけるＧＦＰつき抗体１と糖との反応の有無を知ることができる。
【００３４】
例えば、τ２Ａ＞ｑ１であれば、この測定結果は、反応後の混合溶液Ａ中のナノパーティクル２を含む蛍光を発する分子４の並進拡散時間が大きい、すなわち混合溶液Ａ中では多くのＧＦＰつき抗体１がナノパーティクル２表面に集まったために、ナノパーティクル２を含む蛍光を発する分子４の分子量が増加したことを示す。従って、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖が結合反応したことが分かる。
【００３５】
また、ｎ１＞ｎ２Ａ＞０であれば、この測定結果は、反応後の混合溶液Ａ中ではＧＦＰつき抗体１がナノパーティクル２表面に集まり、一まとまりの分子４となったために蛍光を発する分子の総数が減ったことを示す。従って、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖とが結合反応したことがわかる。
【００３６】
また、反応後に、反応前と並進拡散時間τ１に変化が無い分子、すなわちナノパーティクルに結合しなかったＧＦＰつき抗体５の数ｎ３を測定し、反応の前後で数を比較することによっても、ＧＦＰつき抗体１と糖との反応の有無を知ることができる。例えば、ｎ１＞ｎ３＞０であれば、この測定結果は、反応後の混合溶液Ａ中ではナノパーティクル２表面に集まらなかったＧＦＰつき抗体５が存在するが、その数は反応前のＧＦＰつき抗体１の数ｎ１よりも小さいことを示す。従って、残りのＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖とが結合反応したことがわかる。
【００３７】
しかし、ｎ２Ａ＝０、またはｎ３Ａ＝ｎ１であれば、この測定結果は、混合溶液中でナノパーティクル２表面にＧＦＰつき抗体１が集まらなかったことを示し、従って、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖との間に結合反応が起こらなかったことがわかる。
【００３８】
並進拡散時間または蛍光を発する分子数のどちらかを測定するだけでも、反応の有無を知ることができるが、両方を測定して比較することにより、より精度良く反応の有無を知ることができる。
１．１．２  ＦＣＳの混合溶液間の比較  
２つの混合溶液Ａ，Ｂで、種類の異なる糖とＧＦＰつき抗体との結合反応を比較する場合を説明する。混合溶液Ａは、ＧＦＰつき抗体１を含む溶液と、ＧＦＰつき抗体と反応する糖を表面に付着させたナノパーティクル２を含む溶液とを混合して作られたものである。混合溶液Ｂは、混合溶液Ａで用いたのと同じＧＦＰつき抗体１を含む溶液と、混合溶液Ａとは異なる糖を表面に付着させたナノパーティクル６を含む溶液とを混合して作られたものである。それぞれをマイクロプレート３のウエル内に作り、ＦＣＳ計測を行い、反応後のナノパーティクルを含む蛍光を発する分子の並進拡散時間τ２と数ｎ２、および反応しなかったＧＦＰつき抗体５の数ｎ３を測定し、混合溶液Ａ，Ｂ間で比較する（図１を参照）。
【００３９】
例えば、τ２Ａ＞τ２Ｂであれば、この測定結果は、反応後の混合溶液Ａ中のナノパーティクル２を含む蛍光を発する分子４の並進拡散時間が大きい、すなわち混合溶液Ａ中では混合溶液Ｂよりも多くのＧＦＰつき抗体１がナノパーティクル２表面に集まったために、ナノパーティクル１を含む蛍光を発する分子４の分子量が増加したことを示す。従って、混合溶液Ａは混合溶液Ｂよりも、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖とがよく結合反応したことがわかる。
【００４０】
また、ｎ２Ａ＋ｎ３Ａ＜ｎ２Ｂ＋ｎ３Ｂであれば、この測定結果は、混合溶液Ａ中の蛍光を発する分子４の総数が少なく、すなわち混合溶液Ａ中では、多くのＧＦＰつき抗体１がナノパーティクル２表面に集まり、一まとまりの分子４となったために蛍光を発する分子の総数が減ったことを示し、従って、混合溶液Ａは混合溶液Ｂよりも、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖とがよく結合反応したことがわかる。
【００４１】
並進拡散時間または蛍光を発する分子数のどちらかを測定するだけでも、反応の有無を知ることができるが、両方を測定して比較することにより、より精度良く反応の有無を知ることができる。
１．２  ＦＩＤＡ計測  
混合溶液Ａ，Ｂの間で、ＧＦＰつき抗体とナノパーティクル表面の糖との結合反応の程度に差があると、各混合溶液Ａ，Ｂ中のナノパーティクルにはそれぞれ異なる数のＧＦＰつき抗体が集まることになる。すなわち、混合溶液Ａ，Ｂ中に存在するＧＦＰつき抗体が集まったナノパーティクルの分子量は、それぞれ異なる。
【００４２】
しかし、ＧＦＰつき抗体の分子量がナノパーティクルの分子量よりも非常に小さいために、混合溶液Ａ，Ｂ間で、ＧＦＰつき抗体が集まったナノパーティクルの分子量の差が小さい場合には、混合溶液Ａ、Ｂ中に存在する蛍光を発する分子についてそれぞれＦＣＳ測定で並進拡散時間を求めても、分子量の差を検出できる程度に、値の差が得られない。したがって、ＦＣＳ計測では結合反応の程度の差を検出することが難しい。
【００４３】
このような場合は、ＦＩＤＡ計測で蛍光強度を求めることにより、反応の程度を検出することができる。ナノパーティクルに集まったＧＦＰつき抗体の数の大小で、蛍光強度の大小が変わるから、混合溶液Ａ、Ｂ中に存在する蛍光を発する分子の蛍光強度をＦＩＤＡ計測で求めて、その値の違いから、混合溶液Ａ、Ｂ間で結合反応の程度の差を知ることができる。
【００４４】
ＦＣＳ計測で結合反応の程度の差を検出できる場合でも、合わせてＦＩＤＡ計測を行って、蛍光強度から結合反応の程度の差を求めれば、より精度よく結合反応の程度の差を知ることができる。
ＦＩＤＡ測定では、微小領域内の蛍光を発している分子の蛍光強度と数を測定する。
【００４５】
蛍光を発する分子同士が結合したり、蛍光を発する幾つかの分子に分離したりすると、分子が発する蛍光強度が変化する。また蛍光を発する分子の数も変化する。従って、反応の前後で蛍光強度または蛍光を発する分子の数を比較することにより、分子の反応の有無を知ることができる。また、蛍光を発する分子を同じ数含む２つ以上の溶液にそれぞれ、蛍光を発する分子と反応を起こす分子を含む溶液を混合した場合には、各混合溶液の間で、蛍光強度または蛍光を発する分子の数を比較することにより、各混合溶液における反応の有無や程度を知ることができる。
【００４６】
１．２．１  ＦＩＤＡの反応の前後での比較  
反応の前後で、ＧＦＰつき抗体とナノパーティクル表面の糖との結合反応を検出する場合を説明する。マイクロプレート３のウエル内で、ＧＦＰつき抗体１を含む溶液と、ＧＦＰつき抗体１と反応する糖を表面に付着させたナノパーティクル２を含む溶液とを混合して混合溶液Ａをつくり、反応後にＦＩＤＡ計測を行う（図２を参照）。ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖が結合反応をすれば、１つのナノパーティクル２の表面にＧＦＰつき抗体１が複数集まるので、
反応前のＧＦＰつき抗体１の蛍光強度ｑ１と数Ｃ１、  
反応後のナノパーティクル２を含む蛍光を発する分子４の蛍光強度ｑ２Ａと数Ｃ２Ａ、
を測定し、反応の前後で蛍光強度ｑと数Ｃを比較することによって、混合溶液ＡにおけるＧＦＰつき抗体１と糖との反応の有無を知ることができる。
【００４７】
例えば、ｑ２Ａ＞ｑ１であれば、この測定結果は、反応後の混合溶液Ａ中のナノパーティクル２を含む蛍光を発する分子４の蛍光強度が大きい、すなわち混合溶液Ａ中では多くのＧＦＰつき抗体１がナノパーティクル２表面に集まったために、ナノパーティクル１を含む蛍光を発する分子４の蛍光強度が増したことを示す。従って、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖が結合反応したことが分かる。
【００４８】
また、Ｃ１＞Ｃ２Ａ＞０であれば、この測定結果は、反応後の混合溶液Ａ中ではＧＦＰつき抗体１がナノパーティクル２表面に集まり、一まとまりの分子４となったために蛍光を発する分子の総数が減ったことを示す。従って、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖とが結合反応したことがわかる。
【００４９】
また、反応後に、反応前と蛍光強度ｑ１に変化が無い分子、すなわちナノパーティクルに結合しなかったＧＦＰつき抗体５の数Ｃ３を測定し、反応の前後で数を比較することによっても、ＧＦＰつき抗体１と糖との反応の有無を知ることができる。例えば、Ｃ１＞Ｃ３＞０であれば、この測定結果は、反応後の混合溶液Ａ中ではナノパーティクル２表面に集まらなかったＧＦＰつき抗体５が存在するが、その数は反応前のＧＦＰつき抗体１の数Ｃ１よりも小さいことを示す。従って、残りのＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖とが結合反応したことがわかる。
【００５０】
しかし、Ｃ２Ａ＝０、またはＣ３＝Ｃ１であれば、この測定結果は、混合溶液中でナノパーティクル２表面にＧＦＰつき抗体１が集まらなかったことを示し、従って、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖との間に結合反応が起こらなかったことがわかる。
【００５１】
蛍光強度または蛍光を発する分子数のどちらかを測定するだけでも、反応の有無を知ることができるが、両方を測定して比較することにより、より精度良く反応の有無を知ることができる。
１．２．２  ＦＩＤＡの混合溶液間の比較  
２つの混合溶液Ａ，Ｂで、種類の異なる糖とＧＦＰつき抗体との結合反応を比較する場合を説明する。混合溶液Ａは、ＧＦＰつき抗体１を含む溶液と、ＧＦＰつき抗体１と反応する糖を表面に付着させたナノパーティクル２を含む溶液とを混合して作られたものである。混合溶液Ｂは、混合溶液Ａで用いたのと同じＧＦＰつき抗体１を含む溶液と、混合溶液Ａとは異なる糖を表面に付着させたナノパーティクル６を含む溶液とを混合して作られたものである。それぞれをマイクロプレート３のウエル内に作り、ＦＩＤＡ計測を行い、反応後のナノパーティクルを含む蛍光を発する分子の蛍光強度ｑ２と数Ｃ２、および反応しなかったＧＦＰつき抗体５の数Ｃ３を測定し、混合溶液Ａ，Ｂ間で比較する（図２を参照）。
【００５２】
例えば、ｑ２Ａ＞ｑ２Ｂであれば、この測定結果は、混合溶液Ａ中の蛍光を発する分子４の蛍光強度が大きく、すなわち混合溶液Ａ中では多くのＧＦＰつき抗体１がナノパーティクル２表面に集まったことを示し、従って、混合溶液Ａは混合溶液Ｂよりも、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖とがよく結合反応したことがわかる。
【００５３】
また、Ｃ２Ａ＋Ｃ３Ａ＜Ｃ２Ｂ＋Ｃ３Ｂであれば、この測定結果は、混合溶液Ａ中の蛍光を発する分子４の総数が少なく、すなわち混合溶液Ａ中では、多くのＧＦＰつき抗体１がナノパーティクル表面に集まり、一まとまりの分子４となったために蛍光を発する分子の総数が減ったことを示し、従って、混合溶液Ａは混合溶液Ｂよりも、ＧＦＰつき抗体１とナノパーティクル２表面の糖とがよく結合反応したことがわかる。
【００５４】
蛍光強度または蛍光を発する分子数のどちらかを測定するだけでも、反応の有無を知ることができるが、両方を測定して比較することにより、より精度良く反応の有無を知ることができる。
以上のように、ＦＣＳ計測またはＦＩＤＡ計測で、反応の前後で結合反応の有無を知ることができ、また混合溶液間で反応の有無や程度を知ることができる。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）糖と一本鎖抗体の相互作用  
本実施例では、糖と無細胞タンパク質合成系で合成された一本鎖抗体（scFv）との相互作用をＦＣＳ計測およびＦＩＤＡ計測で検出する。
（１）ＧＦＰつき一本鎖抗体の準備  
無細胞タンパク質合成系として小麦胚芽無細胞タンパク合成系を用い、小麦胚芽抽出物中で、抗サルモネラ抗体の一本鎖抗体（scFv）に蛍光を発するタンパク質であるＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）が融合したタンパク質を合成した。
【００５６】
（２）糖の準備  
糖にはサルモネラ抗原、ガラクトース抗原、大腸菌抗原およびマンノース抗原の糖鎖を用いる。これらをそれぞれ異なるナノパーティクル（バングスビーズ：アミノ基修飾マイクロスフィアＰＡ０３Ｎ  500nm粒径）の表面に付着させ、糖つきナノパーティクルを準備した。
【００５７】
（３）ＧＦＰつき一本鎖抗体と糖の反応  
ＧＦＰつき一本鎖抗体（scFv）の溶液（濃度２００nＭ）と糖つきナノパーティクルの溶液（濃度２００μＭ）とをマイクロプレートのウエル内で混合し、室温，１５分で反応させて反応液１５μＬをつくる。反応後，５０ｍＭ Tris-HCl (pH 8.0) を２４μＬ加えて（全量３９μL）、ＦＩＤＡ測定を行う。また、比較のため糖を付着させないナノパーティクルを混合した溶液のＦＩＤＡ測定も行う。
【００５８】
各溶液について、各溶液中に含まれる蛍光を発する分子の蛍光分子数と蛍光強度を図３に示す。サルモネラ抗原の糖鎖１０を付着させたナノパーティクル１１との反応では、蛍光強度が上昇し、さらに蛍光分子数が減少した。蛍光強度の上昇は、多くのＧＦＰつき一本鎖抗体７がナノパーティクル１１表面に集まったことを示す（図４参照）。また、蛍光分子数の減少は、ＧＦＰつき一本鎖抗体７がナノパーティクル表面に集まって一まとまりの分子１２となったために蛍光を発する分子の総数が減ったことを示す。したがって、ＧＦＰ融合抗サルモネラ抗体とナノパーティクル表面のサルモネラ抗原の糖とが結合反応したことがわかる。
【００５９】
一方、ガラクトース抗原、大腸菌抗原、マンノース抗原の糖鎖を付着させたナノパーティクルとの反応ではいずれも、糖を付着させないナノパーティクルの混合溶液の場合とほぼ同程度の蛍光強度および蛍光分子数の値が求められた。したがって、他の抗原種とＧＦＰ融合抗サルモネラ抗体とは結合反応をしないことが分かった。
【００６０】
本実施例のように、ＧＦＰつき抗体と糖との結合反応を検出するにあたって、糖を予めナノパーティクルなどの大きな分子に付着させておき、ＧＦＰつき抗体の溶液と糖つきナノパーティクルの溶液とを混合し、反応溶液についてＦＩＤＡ計測を行い、蛍光標識を有する物質の大きさ、蛍光強度または数を簡便に短時間で精度良く得ることができ、これらの値からＧＦＰつき抗体と糖との反応の有無を検出することができる。この方法は、ＧＦＰつき抗体の溶液および糖を含むサンプル溶液とも少量で解析を行うことができるので、安価に反応の有無を知ることができる。
【００６１】
２．  還元剤による反応抑制の検出  
次に、ＧＦＰつき抗体のタンパク質部の構造を変化させる物質による、反応抑制の検出を説明する。
マイクロプレートのウエル内で、ＧＦＰつき抗体を含む溶液、ＧＦＰつき抗体と反応する糖を表面に付着させたナノパーティクルを含む溶液、およびＧＦＰつき抗体のタンパク質部の構造を変化させる物質を含む溶液を混合して混合溶液Ａをつくり、反応後にＦＣＳ計測またはＦＩＤＡ計測を行う。
【００６２】
ＧＦＰつき抗体とナノパーティクル表面の糖が結合反応をすれば、１つのナノパーティクルの表面にＧＦＰつき抗体が複数集まるが、タンパク質の構造を変化させる物質によって蛍光標識つきタンパク質のタンパク質部の構造が変化するために、糖とＧＦＰつき抗体との結合が抑制され、ナノパーティクルの表面に集まるＧＦＰつき抗体の数が減る、すなわち、ビーズを含む蛍光を発する分子の分子量が小さくなり、かつ、蛍光強度が小さくなる。したがって、反応後にビーズを含む蛍光を発する分子について、ＦＣＳ計測またはＦＩＤＡ計測を行い、並進拡散時間、蛍光強度または数を求め、タンパク質の構造を変化させる物質を混合しない場合の値と比較することで、タンパク質部と反応基との結合反応を抑制する効果の有無や程度を知ることができる。
【００６３】
また、ＧＦＰつき抗体を含む溶液とＧＦＰつき抗体と反応する糖を表面に付着させたナノパーティクルを含む溶液とを混合して反応させた後に、混合溶液からビーズを回収し、タンパク質の構造を変化させる物質を含む溶液と混合させてから、蛍光相関分光法または蛍光強度分散分析法で測定を行ってもよい。
【００６４】
（実施例２）ＤＴＴによるｓ−ｓ結合の還元  
本実施例では、還元剤によるＧＦＰつき一本鎖抗体（scFv）と糖との結合反応の抑制を検出する。還元剤としてＤＴＴを用いる。ＧＦＰつき一本鎖抗体（scFv）７として、ＧＦＰ融合抗サルモネラ抗体を用いる。糖として、サルモネラ抗原の糖鎖でナノパーティクル表面に付着させたものを用いる。ＤＴＴ（Dithiothreitol）等の還元剤は、抗体のｓ―ｓ結合（ジスルフィド結合）１３を還元し、タンパク質９の立体構造を変化させる。タンパク質の立体構造が変化すると、抗体機能の活性が失われ、タンパク質１４と糖１０との結合反応が起こりにくくなる（図５参照）。
【００６５】
ＧＦＰ融合抗サルモネラ抗体の溶液、サルモネラ抗原の糖つきナノパーティクルの溶液およびＤＴＴ溶液をマイクロプレートのウエル内で混合し、反応後にＦＩＤＡ測定も行った。混合溶液は、ＤＴＴの添加濃度を変えて数種類を用意した。
図６に各溶液について、蛍光を発する分子の蛍光分子数と蛍光強度を示す。ＤＴＴの添加濃度が大きいほど、蛍光強度が小さく、蛍光分子数が多い。
蛍光強度が小さいことは、ナノパーティクル表面に集まったＧＦＰ融合抗サルモネラ抗体の数が少ないことを示す。また、蛍光分子数が大きいことは、ＧＦＰ融合抗サルモネラ抗体がナノパーティクル表面に集まらずに、溶液内を浮遊していることを示す。したがって、ＤＴＴの添加によって、ＧＦＰ融合抗サルモネラ抗体とナノパーティクル表面のサルモネラ抗原の糖との結合反応が抑制されたこと、すなわち抗原-抗体結合反応が弱まることがわかった。
【００６６】
したがって、タンパク質がｓ−ｓ結合を有するかを検出する場合に、無細胞系で作られた蛍光標識つきタンパク質を含む溶液、そのタンパク質と結合反応する物質を含む溶液、およびＤＴＴなどのｓ−ｓ結合を切断する還元剤の溶液を混合してＦＩＤＡ計測を行うとよい。混合溶液中の蛍光を発する分子についての蛍光強度および数から、還元剤による結合抑制の程度を検出することができ、タンパク質のｓ−ｓ結合の有無を知ることができる。また、タンパク質の立体構造が他の分子との相互作用に影響するのか検出する場合にも、タンパク質の立体構造を変化させる物資を、無細胞系で作られた蛍光標識つきタンパク質を含む溶液とそのタンパク質と結合反応する物質を含む溶液との混合溶液に加えてＦＩＤＡ計測を行うとよい。
【００６７】
また、特定物質と特異的に結合するタンパク質を検出する場合に、タンパク質が表面に集まったナノパーティクルを含む溶液に、ＤＴＴなどのｓ−ｓ結合を切断する還元剤の溶液を混合してＦＩＤＡ計測を行うとよい。
還元剤を混合すると、ナノパーティクル表面の特定物質と特異的に結合していたタンパク質は、還元剤によって立体構造が変化するために、特定物質との特異的な結合が解消されて、ナノパーティクル表面から離れる。一方、ナノパーティクル表面の特定物質と特異的に結合していないタンパク質、例えばナノパーティクル表面に付着していただけのタンパク質は、還元剤によって立体構造が変化してもナノパーティクル表面から離れない。還元剤を混合する前後でＦＩＤＡ計測し、混合後のナノパーティクルを含む蛍光を発する分子の蛍光強度が小さくなり、かつ、蛍光を発する分子の総数が多くなれば、タンパク質がナノパーティクル表面の特定物質と特異的に結合していたことになる。
【００６８】
したがって、予めナノパーティクル表面の物質とタンパク質とを反応させておいたサンプル溶液に、還元剤を混合することによって、ナノパーティクル表面の特定物質と特異的に結合しているタンパク質をスクリーニングすることができる。
３．  プロテアーゼによるＧＦＰつき抗体の切断  
次に、ＧＦＰつき抗体の蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質について、分離反応の検出を説明する。マイクロプレートのウエル内で、ＧＦＰつき抗体を含む溶液と、蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質を含む溶液とを混合して混合溶液をつくり、反応後にＦＣＳ計測またはＦＩＤＡ計測を行う。
【００６９】
ＧＦＰつき抗体に蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質が作用すれば、ＧＦＰつき抗体が蛍光タンパク部とタンパク質部とに分離されるために、蛍光タンパク部が混合溶液中の蛍光を発する分子となる。すなわち、反応の前後で蛍光を発する分子の分子量は小さくなる。また、反応の前後で蛍光を発する分子の蛍光強度が変化する。したがって、反応後に蛍光を発する分子について、ＦＣＳ計測またはＦＩＤＡ計測を行い、並進拡散時間、蛍光強度または数を求め、蛍光タンパク部とタンパク質部とを分離する物質を混合しない場合の値と比較することで、分離反応を検出することができる。
【００７０】
（実施例３）プロテアーゼの活性測定  
無細胞小麦胚芽タンパク質合成系で、ＧＦＰ融合ＳＡＲＳタンパク質であるＧＦＰ１５つきＧＵＳ１６（β-glucuronidase：β−グルクロニダーゼ）を合成し、ＧＦＰ１５つきＧＵＳ１６を含む溶液Ａを得た。この溶液とＳＡＲＳプロテアーゼを含む溶液を、マイクロプレートのウエル内で混合し反応させて反応液Ｂを得た。
【００７１】
ＧＦＰつきＧＵＳは、ＧＦＰ１５とＧＵＳ１６領域の間にＳＡＲＳプロテアーゼ切断部位１７をもつ。ＳＡＲＳプロテアーゼは、ＳＡＲＳプロテアーゼ切断部位１７で、ＧＦＰ部１８とＧＵＳ部１９に切断する機能をもつ（図７参照）。
溶液Ａと反応液ＢについてＦＣＳ測定とＦＩＤＡ計測を行った。ＦＣＳ測定は後に、波長４８８ｎｍ、出力３００μWのレーザー光を１回に１０秒照射する条件で５回行った。ＦＩＤＡ計測は、波長４８８ｎｍ、出力３００μWのレーザー光を1回に２秒照射する条件で５回行った。
【００７２】
溶液Ａ（反応前）および反応液Ｂ（反応後）について、ＦＣＳ計測の結果を表１に、ＦＩＤＡ計測の結果を表２に示す。溶液Ａ（反応前）および反応液Ｂ（反応後）について、各液中に含まれる蛍光を発する分子の並進拡散時間を図８に、蛍光強度を図９に示す。
【００７３】
【表１】
2005308412.tif 000003
【００７４】
【表２】
2005308412.tif 000004
【００７５】
溶液Ａ中の蛍光を発する分子の並進拡散時間は約350μs、蛍光強度は約80kHzで、反応液Ｂ中の蛍光を発する分子の並進拡散時間は約200μs、蛍光強度は約40kHzとなる。
反応後に蛍光を発する分子の並進拡散時間が減少していることから、蛍光を発する分子の分子量が小さくなっていることが分かり、したがって、蛍光を発する分子すなわちＧＦＰつきＧＵＳがＳＡＲＳプロテアーゼによって切断されたことがわかる。また、蛍光を発する分子の蛍光強度が小さくなることからも、ＧＦＰつきＧＵＳがＳＡＲＳプロテアーゼによって切断されたこと、すなわちＳＡＲＳプロテアーゼが活性を有することがわかる。
【００７６】
したがって、阻害アッセイ法によりＳＡＲＳプロテアーゼを阻害する物質をスクリーニングする場合に、サンプルとＳＡＲＳプロテアーゼとを混合した溶液についてＦＣＳ測定またはＦＩＤＡ計測を行うことにより、ＳＡＲＳプロテアーゼを阻害する物質を見つけることができる。このとき、ＦＣＳ測定およびＦＩＤＡ計測の両方を行うと、より精度良くスクリーニングを行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は創薬スクリーニングにおけるアッセイに適用でき、汎用性が高い。特に、サンプルを未処理のまま行うスクリーニングに適している。また、簡単、迅速、低コストにアッセイを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＧＦＰつき抗体とナノパーティクル表面の糖との結合反応を示す図。
【図２】ＧＦＰつき抗体とナノパーティクル表面の糖との他の結合反応を示す図。
【図３】実施例１の各溶液について蛍光分子数と蛍光強度を示す図。
【図４】実施例１のＧＦＰつき一本鎖抗体（scFv）と糖の結合反応を示す図。
【図５】実施例２のタンパク質立体構造の変化を示す図。
【図６】実施例２の各溶液について蛍光分子数と蛍光強度を示す図。
【図７】実施例３のＳＡＲＳプロテアーゼによるＧＦＰつきＧＵＳの切断を示す図。
【図８】実施例３の各液について並進拡散時間を示す図。
【図９】実施例３の各液について蛍光強度を示す図。
【符号の説明】
【００７９】
１…ＧＦＰつき抗体、２…ナノパーティクル、３…マイクロプレート、４…蛍光を発する分子、５…反応しなかったＧＦＰつき抗体、６…ナノパーティクル、７…ＧＦＰつき一本鎖抗体、８…ＧＦＰ、９…タンパク質、１０…糖、１１…ナノパーティクル、１２…一まとまりの分子、１３…ｓ―ｓ結合、１４…タンパク質、１５…ＧＦＰ、１６…ＧＵＳ、１７…ＳＡＲＳプロテアーゼ切断部位、１８…ＧＦＰ部、１９…ＧＵＳ部。
【図１】
2005308412.tif 000005
【図２】
2005308412.tif 000006
【図３】
2005308412.tif 000007
【図４】
2005308412.tif 000008
【図５】
2005308412.tif 000009
【図６】
2005308412.tif 000010
【図７】
2005308412.tif 000011
【図８】
2005308412.tif 000012
【図９】
2005308412.tif 000013