(57)【要約】【課題】リン酸化型CaMKIVを特異的に認識し、非リン酸化型CaMKIVを認識しない抗体を提供する。【解決手段】リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVを特異的に認識するモノクローナル抗体。【選択図】図３
2005220032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVに選択的に結合し、非リン酸化カルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVに結合しないモノクローナル抗体。
【請求項３】
リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVに結合することにより、リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVと非リン酸化カルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVを識別するモノクローナル抗体 。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化されたＣａＭＫＩＶ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase
IV）を特異的に認識するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多機能性Ca2+/カルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase, CaMK)は細胞内Ca2+シグナリングにおいて中心的な役割を担ってい
ると考えられているセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素であり、CaMKI、CaMKII
、CaMKIVの3つが知られている（非特許文献1, 2）。一般に、ホルモンなどの刺激によっ
て細胞内の遊離Ca2+濃度が上昇すると、細胞内のCa2+受容体であるカルモデュリン（calmodulin, CaM）にCa2+が結合してCa2+/CaM複合体を形成する。CaMKはこのCa2+/CaMによっ
て活性化され、様々なタンパク質をリン酸化することにより、それらの機能制御に関わっている。
【０００３】
そのうちの一つであるカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IV（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV, CaMKIV）は、脳や胸腺に多く存在しており、細胞内
では核内に局在していることが知られている。CaMKIVはCREB(cyclic AMP-response element binding protein)やATF-1(Activating transcription factor 1)などの転写因子をリ
ン酸化することにより、Ca2+依存的に遺伝子の発現調節を行っていることが知られている（非特許文献3）。CaMKIVの生理機能に関しては、例えばCaMKIVのドミナントネガティブ
型を前脳に過剰発現させた場合、記憶の素過程と考えられている長期増強作用(long term-potentiation, LTP)のうち、特に一生保ち続ける長期記憶のモデルであるlate phase LTP（L‐LTP）を阻害することから、CaMKIVは記憶のメカニズムに深く関与していることが
示唆されている（非特許文献4）。またCaMKIVは精巣、心筋、骨格筋にも発現しており、
精子形成、心筋肥大、骨格筋のミトコンドリア生合成に深く関与していることが示唆されている（非特許文献3, 5）。
【０００４】
CaMKIVは、以下の1)〜5)の特徴を有する：
1)分子量約60000のモノマー酵素で、CaMKIVの一次構造は、N末端側から、触媒ドメイン (catalytic domain)、自己阻害ドメイン (autoinhibitory domain, AID)、Ca2+/calmodulin結合ドメイン (Ca2+/calmodulin-binding domain, CaM)からなっている（図1）。
2)細胞内では核に局在している（図2）。
3)基質特異性が広く、CREBなどの転写因子やsynapsin I、myelin basic protein等を基質としてリン酸化する。
4)核に存在するセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素の一つであるCaM-kinase kinase(CaMKK)によってCaMKIVのactivation loopに存在するThr196がリン酸化されCaMKIVが
活性化される。
5) CaMKIVはThr196がリン酸化されることにより活性化されるが、核に存在するタンパク
質脱リン酸化酵素、例えばCa2+/calmodulin-dependent protein kinase phosphatase-N(CaMKP-N)によってThr196が脱リン酸化されることにより逆に不活性化される（非特許文献5）。
【非特許文献１】Soderling, T.R., and Stull, J.T. (2001) Structure and regulation of calcium/calmodulin-dependent protein kinases. Chem. Rev., 101, 2341-2351
【非特許文献２】Fujisawa, H. (2001) Regulation of the activities of multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases. J. Biochem., 129, 193-199
【非特許文献３】Hook, S.S., and Means, A.R. (2001) Ca2+/CaM-dependent kinases: from activation to function. Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 41, 471-505
【非特許文献４】Kang, H., Sun, L.D., Atkins, C.M., Soderling, T.R., Wilson, M.A., and Tonegawa, S. (2001) An important role of neural activity-dependent CaMKIV signaling in the consolidation of long-term memory. Cell, 106, 771-783
【非特許文献５】Ishida, A., Shigeri, Y., Taniguchi, T., and Kameshita, I. (2003) Protein phosphatases that regulate multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases: from biochemistry to pharmacology. Pharmacology and Therapeutics, 100, 291-305
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
CaMKIVの生理機能を解明するには、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスなどの遺伝子・個体レベルでのアプローチやKN-62(1-[N,O-bis-(5-Isoquinolinesulfonyl)-N-methyl-L-tyrosyl]-4-phenylpiperazine)などの阻害剤を用いた方法が行われてきた。
しかし、CaMKIVの局在化やCaMKIVの細胞内での活性化のモニタリングのためにはThr196がリン酸化された活性化型CaMKIV、すなわちリン酸化型CaMKIVを特異的に認識する抗体が必要不可欠である。CaMKIVのN末端領域等を抗原とした、非リン酸化型及びリン酸化型CaMKIVを両方認識するモノクローナル抗体は種々の会社から市販されている。しかし、リン酸
化型CaMKIVを特異的に認識する抗体は現在まで報告されていない。
【０００６】
本発明は、リン酸化型CaMKIVを特異的に認識し、非リン酸化型CaMKIVを認識しない抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、CaMKIVのThr196付近の、以下の配列からなるリン酸化ペプチド(pCaMKIV
peptide)：
LSKIVEHQVLMKT(p)VCGTPGYC
を抗原とするモノクローナル抗体の作成を試み、特異的にリン酸化型CaMKIVを認識するモノクローナル抗体を得た。
【０００８】
本発明は、以下のモノクローナル抗体に関する。
項１．  リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVを特異的に認識するモノクローナル抗体。
項２．  リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVに選択的に結合し、非リン酸化カルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVに結合しないモノクローナル抗体。
項３．  リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVに結合することにより、リン酸化されたカルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVと非リン酸化カルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IVを識別するモノクローナル抗体 。
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体は、CaMKIVの生理機能の解明や、CaMKIVの細胞内でのモニタリングに有用である。
【００１０】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、リン酸化ペプチド(pCaMKIVペプチド、LSKIVEHQVLMKT(p)VCGTPGYC)の部分においてリン酸化され
たCaMKIVに選択的に結合することで、リン酸化されたCaMKIVとリン酸化されていないCaMKIVとを識別することができる。
【００１２】
本発明は、リン酸化CaMKIVに選択的に結合するとともに、リン酸化されたCaMKIVとリン
酸化されていないCaMKIVとを識別するモノクローナル抗体を産生する細胞にも関する。この細胞によって産生されるモノクローナル抗体は、ヒト、ラット、マウスなどの動物で完全に保存されたアミノ酸配列を有する前記リン酸化ペプチドを抗原として使用して得られたものであり、すべての動物のリン酸化CaMKIVを等しく検出するであろう。
【００１３】
該細胞はハイブリドーマ細胞であってもよいし、組換え細胞であってもよい。したがって、本発明は、不死化ハイブリドーマまたは組換え細胞系を包含するものである。
【００１４】
キットも本発明の対象である。一般に、本発明のキットには、本発明のモノクローナル抗体、リン酸化されたCaMKIVに結合された本発明のモノクローナル抗体を検出する試薬が含まれる。１つの態様においては、蛍光免疫検出試薬（フルオレセインやローダミンを用いて誘導体化した抗免疫グロブリン抗体、またはフルオレセインやローダミンを用いて誘導体化したアビジンやストレプトアビジンと組み合わせたビオチニル化抗免疫グロブリン抗体）、免疫組織化学的または免疫細胞化学的検出試薬（アルカリホスファターゼやセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて誘導体化した抗免疫グロブリン抗体、またはアルカリホスファターゼやセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて誘導体化したアビジンやストレプトアビジンと組み合わせたビオチニル化抗免疫グロブリン抗体）を含んでもよい。１つの態様においては、キットは、１種類以上の免疫ペルオキシダーゼ染色試薬（セイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて誘導体化した抗免疫グロブリン抗体、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて誘導体化したアビジンやストレプトアビジンと組み合わせたビオチニル化抗免疫グロブリン抗体）、ならびにそのための発色基質（たとえばジアミノベンジジン）を含む。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のリン酸化CaMKIVとの複合体は直接または間接的に検出することができる。すなわち、本発明のｍＡｂは検出可能な形で標識したり、検出可能な形で標識された免疫試薬やその他の試薬と結合させることができる。さらに詳しくは、本発明のｍＡｂは放射性同位体、蛍光体、発色体、金属原子、ハプテン、化学架橋剤、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、受容体リガンド、受容体、または酵素を用いて誘導体化することができる。１つの実施態様においては、本発明のｍＡｂは、任意に酵素、ビオチン、または放射性同位体に結合させた第２の抗体（抗免疫グロブリン抗体）をはじめとするさらに別の免疫試薬やその他の試薬、同様に誘導体化されたアビジンやストレプトアビジン、酵素に結合させた市販のアビジン−ビオチン増幅系を用いて検出することができる。好ましい酵素 としては、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペ
ルオキシダーゼなどが挙げられる。
【発明の効果】
【００１６】
CaMKIVは核内に局在し、転写因子をリン酸化することにより、Ca2+依存的に遺伝子の発現調節を行っている。CaMKIVは特に脳、胸腺に強く発現している他、精巣、心筋、骨格筋においても発現が認められ、記憶などの高次神経機能、精子形成、心筋肥大、骨格筋のミトコンドリア生合成に深く関与していることが示唆されている。CaMKIVの局在化やCaMKIVの細胞内での活性化のモニタリングのためには、CaMKIVの活性化型であるリン酸化型CaMKIVを認識する抗体が必要不可欠であった。しかし、これまでリン酸化型CaMKIVを特異的に認識する抗体は開発されておらず、本発明であるモノクローナル抗体は、精製した蛋白質レベル、あるいは細胞レベルでもリン酸化型CaMKIVを特異的に認識することから、CaMKIVの生理機能の解明にとって有用なツールとなるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例1＞抗原ペプチドの作成
Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV (CaMKIV)の184〜204のアミノ酸配列に相当しThr196に相当するThrがリン酸化されているリン酸化ペプチド(pCaMKIV peptide:LSKIVEHQVLMKT(p)VCGTPGYC)を島津社製のペプチド固相合成機PSSM8を使用し、Fmoc Chemistryを用いたペプチド合成法により合成した。合成したペプチドは逆相カラムクロマトグラフィーを用い、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。ペプチドの分子量決定は、飛行時間型質量分析計(ABI社/Voyager-DE STR)を用い行った。
＜実施例2＞モノクローナル抗体の作成
モノクローナル抗体の作成は既知の方法に従って行った（Harlow, E., and Lane, D. (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press）。pCaMKIV の合成ペプチド(LSKIVEHQVLMKT(p)VCGTPGYC)をPIERCE社製のImject Maleimide Activated mcKLH Kitを使用しヘモシアニン（KLH）に結合した抗原溶液をマウス(BALB/c)に
免疫し、以後2週間ごとに計3回免疫した。最終免疫が終了した3日後にマウスをエーテル
麻酔した後、70%エタノールで消毒し、頸動脈より全採血を行った。採れた血液は血餅と
血清に分離し、この血清を抗血清（ポリクローナル抗体）とした。その後左側腹部を切開し、脾臓を摘出してRPMI1640培地で5回洗浄した。さらにGIT変法培地を10ml加えて脾臓をつぶし、脾細胞懸濁液とした。ミエローマ細胞はBALB/cマウス由来骨髄腫細胞P3X63Ag8.653細胞を用い、GIT培地で培養したものを用いた。
【００１８】
脾細胞の全細胞とその5分の1のP3X63Ag8.653細胞を混合、遠心し細胞を集め、血清を含まないRPMI1640培地で洗浄した。この混合細胞に、37℃に暖めておいた50%ポリエチレン
グリコール溶液1mlを加えた。2分間攪拌を続けた後、RPMI1640培地を徐々に10mlを加え、遠心して細胞を回収した。細胞ペレットにHATを添加したGIT培地10mlを加え細胞を完全に懸濁し、50mlの上記培地を加え融合細胞懸濁液とした。
【００１９】
作成した融合細胞懸濁液を96 well plateに0.1mlずつ播種し培養を行った。
**HAT添加GIT培地
HAT(Hypoxanthine 13.6 mg/ml, Aminopterin 0.18mg/ml, Thymidine 3.9mg/ml)+GIT培地
細胞融合から1週間後に各wellの培養上清を採取し、ELISAにより抗体産生の有無を検討した。抗原にはpCaMKIV peptide(LSKIVEHQVLMKT(p)VCGTPGYC)あるいは非リン酸化ペプチ
ドCaMKIV peptide(LSKIVEHQVLMKTVCGTPGYC)の二つの合成ペプチドを用いた。モノクロー
ナル抗体の産生チェックは、pCaMKIV peptide(LSKIVEHQVLMKT(p)VCGTPGYC)を抗原として
認識するが、CaMKIV peptideを抗原として認識しないものを陽性と判定した。陽性と判定したwellは限界希釈法により限界希釈し培養した。再度培養上清をサンプリングし、ELISAにより陽性wellを確認した。その後、ELISAの結果がすべてのwellで陽性となるまで繰り返し、すべての陽性となった時点でモノクローナル抗体産生融合細胞の樹立とした。なお、樹立されたリン酸化CaMKIVに対するモノクローナル抗体産生融合細胞は、Mouse hybridoma 8D-4として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１６年１月２８日付けで寄託した（受託番号FERM P-19647）。
【００２０】
該融合細胞の上清を適当な希釈倍率で薄めて実験に用いた。
＜実施例3＞モノクローナル抗体の解析
CaMKIはアフリカツメガエル由来のCaMKI (CaMKIx, Acc. No. AB098710, Xenopus laevis 由来 Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I-like protein)を大腸菌で発現さ
せ精製したものを使用した。CaMKIV及びCaMKKaはそれぞれマウス由来のものを大腸菌で発現させ精製したものを用いた。アフリカツメガエル由来のCaMKIをウサギに免疫して得た
ポリクローナル抗体を抗CaMKI抗体として用いた。抗CaMKIV抗体はBD Biosciences社（米
国、カリフォルニア州）のものを用いた。この抗体は抗原としてCaMKIVのN末端領域のア
ミノ酸配列1-241に相当する部分を免疫して得られたものである。
【００２１】
CaMKI及びCaMKIVをATP存在下にCaMKKaでリン酸化したものと(図3の+ATP)、非リン酸化
のものを調製し(図3の-ATP)、抗CaMKI抗体、抗CaMKIV抗体、実施例2で得られたモノクロ
ーナル抗体を用いてWestern blotを行った（Harlow, E., and Lane, D. (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press）。その結果、CaMKI
及びリン酸化されたCaMKIは抗CaMKI抗体により検出されたが、CaMKIV及びリン酸化されたCaMKIVは検出されなかった（図3A）。また抗CaMKIV抗体はCaMKI及びリン酸化されたCaMKIは認識しなかった。しかし抗CaMKIV抗体は、60kDa付近の下側のバンドに相当するCaMKIV
と上側のバンドに相当するリン酸化されたCaMKIVを検出することができた（図3B）。しかしながら、実施例2で得られたモノクローナル抗体は60kDa付近の上側のバンドに相当するリン酸化されたCaMKIVのみを検出した（図3C）。またラット大脳皮質から精製したCaMKII及びリン酸化されたCaMKIIは実施例2で得られたモノクローナル抗体によって認識されな
かった。
＜実施例4＞
実施例2で得られたモノクローナル抗体により検出可能な抗原量の限界を調べるためにDot immunobinding assayを行った（Harlow, E., and Lane, D. (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press）。ニトロセルロースフィルター上に1, 2.5, 5, 10, 20 ngのCaMKIV及びリン酸化されたCaMKIVをスポットし、実施例2
で得られたモノクローナル抗体により検出を試みた結果、抗体は2.5 ngのリン酸化されたCaMKIVまで認識する事ができたが、20 ngの非リン酸化CaMKIVは認識できなかった。
＜実施例5＞
実施例2で得られたモノクローナル抗体が細胞レベルでリン酸化されたCaMKIVを認識す
るかどうか検討した。ヒト子宮頸癌由来のHeLa細胞を6穴のプラスチックディシュで10%牛胎児血清を含むダルベッコ変法培地で培養した。その後1 mg HA(hemagglutinin-tagged)-CaMKIV in pME18s plasmidあるいは、 1 mg HA(hemagglutinin-tagged)-CaMKIV in pME18s plasmid + 50 ng CaMKKb(Val 269/Phe) in pME18s plasmidをLipofectAmine reagent（Invitrogen社）存在下でトランスフェクションを行った。24時間培養後、CaMKKに特異的
な阻害剤であるSTO-609(7H-benzimidazo[2,1-a]benz[de]isoquinoline-7-one-3-carboxylic acid) （Tokumitsu, H., Inuzuka, H., Ishikawa, Y., Ikeda, M., Saji, I., and Kobayashi, R. (2002) STO-609, a specific inhibitor of the Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase. J. Biol. Chem., 277, 15813-15818）を添加した血清を含ま
ないダルベッコ変法培地で6時間さらに培養した。細胞をその後Ca2+イオノフォアである1
mMのionomycinで10分間処理した。150  mｌの SDS-PAGEサンプルバッファー（63 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 1% mercaptoethanol, 0.001% bromophenol blue）で細胞を溶解した後、SDS電気泳動を行い、抗CaMKIV抗体、実施例2で得られたモノク
ローナル抗体を用いてWestern blotを行った。抗CaMKIV抗体を用いた実験の結果、ionomycin刺激、STO-609処理、STO-609に非感受性なCaMKKの変異体であるCaMKKb(Val 269/Phe)
（Tokumitsu, H., Inuzuka, H., Ishikawa, Y., and Kobayashi, R. (2003) A single amino acid difference between a and b Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase dictates sensitivity to the specific inhibitor, STO-609. J. Biol. Chem., 278, 10908-10913）の発現の有無にかかわらず、CaMKIVが発現していることが確認された
（図4A）。一方、実施例2で得られたモノクローナル抗体を用いた実験の結果、ionomycin刺激をした場合のみバンドが認められた（図4B）。しかもそのバンドはCaMKKに特異的な
阻害剤であるSTO-609を同時に処理すると濃度依存的にバンドは薄くなった。しかし、STO-609に非感受性なCaMKKの変異体であるCaMKKb (Val269/Phe)を共発現させておくとバンドは認められることから、実施例2で得られたモノクローナル抗体は細胞レベルでもリン酸
化されたCaMKIVを認識することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Structure of Ca2+/CaM-依存性タンパク質キナーゼIV (CaMKIV)の構造。
【図２】Ca2+/CaM-依存性タンパク質キナーゼIV の調節
【図３】抗リン酸化CaMKIV抗体（I）の特徴付け
【図４】抗リン酸化CaMKIV抗体（II）の特徴付け
【図１】
2005220032.tif 000003
【図２】
2005220032.tif 000004
【図３】
2005220032.tif 000005
【図４】
2005220032.tif 000006
【配列表】
2005220032000001.app