(57)【要約】【課題】    十分な精製処理によりタンパク質などの夾雑物が非常に低い濃度に低減することができた検体、及び他の製造方法によりタンパク質などの夾雑物を含まない核酸増幅反応液に対して、少量の核酸から短時間で、十分に満足できる核酸増幅を行なうことができる核酸増幅法を提供する。【解決手段】  ポリメラーゼ連鎖反応法による核酸増幅反応において、タンパク質濃度が０．５ｇ/ｌ以下である核酸増幅反応液に対して、０．１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌのアミン化合物を添加することにより、核酸増幅率を大幅に増加させることができる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応法による核酸増幅反応において、タンパク質濃度が０．５ｇ/ｌ以下である核酸増幅反応液に対して、０．１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌのアミン化合物を添加することを特徴とする核酸増幅法。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応を３０サイクル行なった前記核酸増幅反応において、前記核酸増幅反応液が実質的にタンパク質を含まず、アミン化合物を無添加での核酸増幅率に対して、３倍以上の核酸増幅率を有する請求項１記載の核酸増幅法。
【請求項３】
ポリメラーゼ連鎖反応を３０サイクル行なった前記核酸増幅反応において、前記核酸増幅反応液へのアミン化合物添加前の核酸増幅率に対してアミン化合物添加後の核酸増幅率が４倍以上である請求項１または２記載の核酸増幅法。
【請求項４】
前記核酸増幅反応液への０．１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌのアミン化合物の添加が、ポリメラーゼ連鎖反応の１サイクルにおける核酸増幅率を１．０５倍以上増加させる請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅法、特に試料から予め核酸精製処理により夾雑物を除去して得られた比較的純粋な核酸を基に効率的に核酸を増幅する方法、特にポリメラーゼ連鎖反応法により核酸を増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を増幅する方法としてポリメラーゼ連鎖反応法(以下、ＰＣＲ法と言う。)が知られている。
ＰＣＲ法とは、鋳型核酸（増幅しようとする領域を含む核酸）、プライマー（増幅しようとする領域の末端に相補的な１０〜５０塩基程度の一本鎖核酸）、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、ＤＮＡポリメラーゼ（酵素）等を加え、「鋳型核酸の一本鎖への変性→プライマーの結合→ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長（二本鎖合成）」というステップを繰り返すことにより、目的とする領域の核酸を増幅する手法である。
【０００３】
ＰＣＲ法は非常に多方面にわたって応用されているが、特に各種ウィルスの高感度検出や、遺伝子タイプの判定などに使用されている。その際重要となる迅速で正確な検出のため、より一層の核酸増幅率の増大や増幅時間の短縮が望まれていた。
これに貢献する手段として従来、血液、尿、土などの試料に（鋳型）核酸以外の物質として多く含まれ核酸増幅反応を阻害すると考えられる夾雑物を、これら試料から効率的に除去するフェノール・クロロホルム抽出法などが知られている。しかしながら、このような夾雑物除去のみでは十分な核酸増幅率の増大効果が得られなかった。
【０００４】
また一方、夾雑物を多量に含んだ試料であってもポリアミン等を添加することにより核酸増幅に影響を及ぼしにくくする核酸増幅方法も提案されている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、この方法は生体試料由来の夾雑物が含まれている状態でポリアミンを添加することにより夾雑物の核酸増幅抑制を低減できる方法であって、十分な核酸増幅率を有する核酸増幅反応を提供するものではなかった。
【特許文献１】特開平６−２７７０６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、例えば血液を検体としたＢ型・Ｃ型肝炎ウィルスやＡＩＤＳウィルスの検査等は、少量検体からの短時間での正確な判定が求められており、従来これらに用いていた核酸増幅法では、夾雑物の除去（例え十分な前処理により夾雑物が非常に低い濃度に低減することができた検体であっても）、非除去（ポリアミン添加）に関わらず、短時間で満足のいく核酸増幅を行なうことはできていなかった。
本発明の目的は、前処理等で夾雑物が除去され、夾雑物が低減された検体に対して、核酸増幅率の高い核酸増幅法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＰＣＲ法において、鋳型核酸として十分な精製処理によって夾雑物を低濃度にした核酸試料を用い、更に反応液に０．１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌのアミン化合物を含有させることにより、核酸増幅率を格段に向上させることができることを見出した。また、同じ核酸増幅率を目指す場合は、反応時間の低減、または鋳型核酸量の低減を行なうことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ＰＣＲ法による核酸増幅反応において、タンパク質濃度が０．５ｇ/ｌ以下である核酸増幅反応液に対して、０．１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌのアミン化合物を添加することを特徴とする核酸増幅法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、核酸の増幅を効率的に行なうことができ、少量の検体であっても短時間での核酸増幅が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（鋳型核酸（試料、検体））
ＰＣＲ法による核酸増幅に供する鋳型核酸を含む試料、検体としては、生体由来試料（動物由来（皮膚、毛髪、唾液、血液、尿、糞）、植物由来試料（根、茎、葉、種、果肉、花））および環境試料（土、水、空気）から抽出されたもの、およびそれらを基に先行してＰＣＲ法にて増幅した核酸などを使用することが可能である。
【００１０】
（夾雑物）
上記試料中にはしばしば夾雑物が多く含まれており、ＰＣＲ法の阻害要因となるので、できるだけ除去することが望ましい。夾雑物としては、反応に関与しない核酸、タンパク質、糖鎖、脂質等が挙げられる。中でも代表的な夾雑物としてタンパク質が挙げられ、本発明の効果が得られるためには、核酸増幅反応液中のタンパク質濃度は０．５g/l以下である必要がある。更には０．４g/l以下であることが好ましい。
【００１１】
尚、本発明中で示されているタンパク質濃度は、280および260nmでの吸光度を使用し、式(１)で表されるWarburg and Christianの誘導式（Warburg and Christian, Biochemisches Zeitung310, 384 （1941）参照。）から算出される値を使用した。
【００１２】
【数１】
2005304354.tif 000002
【００１３】
本発明で言う実質的にタンパク質を含まない核酸増幅反応液とは、上記測定及び式（１）を用いて得られたタンパク質濃度の値が有効数字小数点以下２位までの値で０．００g/lである核酸増幅反応液を意味する。
【００１４】
（精製方法）
前述の理由から、核酸増幅に先立って、生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものから核酸を抽出し、残存する夾雑物を除去することを目的とする核酸精製処理を行なうことが好ましい。
具体的な精製法としては、公知の方法が使用できるが、フェノール／クロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿法が挙げられる。更にイオン交換樹脂、ガラスビーズ等を使用したカラム、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬を使用して精製度を上げ、タンパク質濃度を０．５ｇ/ｌ以下にすることができる。より夾雑物濃度を低減するため、複数の方法を同時にまたは順次使用することができる。
【００１５】
また、いわゆるＰＣＲ法により既に増幅した核酸や、合成した核酸を使用する場合は、上記のような試料由来の夾雑物がない、若しくは非常に少ないので上記の精製処理を必ずしも行なう必要がない。
【００１６】
（アミン化合物）
本発明におけるアミン化合物とは、第一級、第二級、第三級アミンまたは第四級アンモニウム塩を同一分子内に一つ以上有する化合物の総称である。第一級、第二級、第三級アミンを持つアミン化合物としては、例えば直鎖状構造を有するアミン化合物としてエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン等、分岐状構造を有するアミン化合物としてトリス（２−アミノエチル）アミン等、環状構造を有するアミン化合物としてピペラジン、ピペリジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、1,4−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジン、1,4,10,13,テトラオキサ−7,16ディアザサイクロオクタデカン等が挙げられる。また第四級アンモニウム塩であるアミン化合物としては、臭化テトラエチルアンモニウム、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド、臭化セチルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。
【００１７】
アミン化合物の添加量（濃度）は、アミン化合物の種類、試料中に含まれる夾雑物の量、試料の由来によって異なるが、ＰＣＲ増幅反応液中で０．１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌである。０．１ｍｍｏｌ／ｌ未満では目的とする核酸増幅率の向上が見られず、また５．０ｍｍｏｌ／ｌを超える場合には、アミン化合物によって核酸増幅反応が阻害される。
好ましいアミン化合物の添加量は０．１〜１．０ｍｍｏｌ／ｌであり、更に好ましくは０．１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌである。
【００１８】
（核酸増幅反応液）
本発明による核酸増幅法で用いる核酸増幅反応液は、タンパク質濃度は０．５ｇ/ｌ以下であり、アミン化合物を０．１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌ含有すること以外は、通常知られている核酸増幅法のものと何ら変わるものではない。そのためアミン化合物以外の条件、例えば鋳型核酸の種類、プライマーの設計指針、ＤＮＡポリメラーゼの選択、デオキシヌクレオチド三リン酸の量、ｐＨならびに反応用緩衝液の選択等については、通常の核酸増幅法と同様の取り扱いをして構わない。
【００１９】
（核酸増幅法の具体的手順）
本発明の核酸増幅法の手順は、反応系内にアミン化合物を添加すること以外は、通常知られている核酸増幅法と何ら変わるものではない。増幅方法としては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとサーマルサイクラーを使用するＰＣＲ法を用いることが、迅速に増幅産物が得られるため好ましい。ＰＣＲ法における具体的例示として、変性反応を９０〜９５℃にて１秒〜１分、会合反応を４０〜７２℃にて１秒〜３分、伸長反応を７２℃付近にて１秒〜３分とし、これら３つの反応を３０回程度繰り返す手順を挙げることができる。
【００２０】
（検出・評価方法）
本発明の核酸増幅法によって増幅される核酸は、通常知られているＰＣＲ法による核酸増幅法により増幅される核酸と何ら変わるものではない。そのため目的の核酸が増幅されたか否かを検出・評価する方法としては、通常知られている核酸検出・評価方法を使用することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動やアクリルアミドゲル電気泳動等により核酸増幅産物を展開し、それらをエチジウムブロミドやＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮ等のインターカレーターにて染色し、インターカレーター由来の蛍光を観察することによって、目的の核酸が増幅されたか否かを確認することができる。また、プライマーとしてＦＩＴＣやＣｙ５等の蛍光色素が結合したものを使用する場合には、同様に核酸増幅産物を展開した後、蛍光色素に由来する蛍光を観察することで、目的の核酸が増幅されたか否かを確認することができる。
【実施例】
【００２１】
（菌体培養抽出液の調製）
比較的多量の夾雑物を含む核酸試料として菌体培養抽出液を調製した。その手順は以下の通り。
（i）ｐＵＣ１１８ベクターにて形質転換した大腸菌を、０．１ｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌにて３７℃、一昼夜培養し、菌体培養液を得た。該菌体培養液をエッペンドルフチューブに移し、６０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することで、該菌体培養液から菌体を回収した。
（ii）回収した菌体を、５００μｌの５０ｍｍｏｌ/ｌブドウ糖/ ２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）/ １０ｍｍｏｌ/l Ｎａ３・ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、さらに２５０μlの０．３Ｎ ＮａＯＨ/ ２質量％ＳＤＳを加えて再懸濁した後、７０℃にて１５分間加熱した。
（iii）加熱した懸濁液に、２００μlの中性フェノール・クロロホルム溶液（５ｇ フェノール/ ５ｍｌクロロホルム/ １ｍｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を加えて懸濁した。
（iv）懸濁後の溶液を、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することによって、有機溶媒相と水相とに分離し、水相のみを分取した。この水相を菌体培養抽出液とした。
【００２２】
（核酸溶液の調製）
夾雑物を含まない核酸試料として核酸溶液を調製した。その手順は以下の通り。
（i）まずヒト血液からＤＮＡ精製キット（ＰＵＲＥＧＥＮＥTM ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（ＧｅｎｔｒａＳｙｓｔｅｍｓ社製））を用いて核酸の抽出を行った。
（ii）次に、抽出した核酸１μｌを鋳型とし、プライマーＡ及びプライマーＢを用いて最終量１００μｌにて一回目の予備的ＰＣＲを行った。（プライマーＡとしては３５塩基からなるオリゴヌクレオチドを１０μｍｏｌ／ｌの濃度に調製したものを、プライマーＢとして３１塩基からなるオリゴヌクレオチドを１０μｍｏｌ／ｌの濃度に調製したものを、それぞれ終濃度が０．５μｍｏｌ／ｌとなるように添加した。これらのプライマーによって増幅される領域は、プライマー自身も含めて約７５０塩基であった。）
（iii）さらに一回目の予備的ＰＣＲ後の溶液１μｌを鋳型とし、プライマーＡ及びプライマーＢを用いて最終量１００μｌにて二回目の予備的ＰＣＲを行った。
（iv）二回目の予備的ＰＣＲ後の溶液を、滅菌水にて１０万倍に希釈したものを核酸溶液とした。
二回の予備的ＰＣＲを行うことにより、夾雑物、特に実質的にタンパク質を含まない核酸溶液が得られた。タンパク質が含まれないことを、分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３０００）にて２８０ｎｍおよび２６０ｎｍの吸光度を測定し、前述の式（１）から、タンパク質濃度（g/l）を算出することにより確認した。
【００２３】
（鋳型核酸溶液の調製）
以下の実施例及び比較例の核酸増幅反応に用いた鋳型核酸溶液Ａ、Ｂ及びＣは、前記核酸溶液と菌体培養抽出液とを、表１に記載の比率で混合し調製した。得られた鋳型核酸溶液のタンパク質濃度も下記の方法で算出し、記載した。
鋳型核酸溶液Ａには９９μｌの滅菌水を加え、鋳型核酸溶液Ｂには９８μｌの滅菌水を加え、鋳型核酸溶液Ｃには９６．５μｌの滅菌水を加えて全量が１００μｌとなるように希釈した後、分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３０００）にて２８０ｎｍおよび２６０ｎｍの吸光度を測定し、前述の式（１）から、タンパク質濃度（g/l）を算出した。
【００２４】
【表１】
2005304354.tif 000003
【００２５】
（核酸増幅反応液の調製）
アミン化合物を添加すること以外は、通常知られている核酸増幅法と同様に核酸増幅反応液の調製を行った。
鋳型核酸としては、前述の鋳型核酸溶液Ａ、Ｂ及びＣを用いた。
アミン化合物溶液としては、ペンタエチレンヘキサミン水溶液を使用し、終濃度が０、０．１ｍｍｏｌ／ｌ、０．２５ｍｍｏｌ／ｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加した。対照としてアミン化合物を含まない試験区も設けた。
プライマー１としては、ＦＩＴＣにて標識された２２塩基からなるオリゴヌクレオチドを、プライマー２としては（未標識でプライマー１とは塩基配列の異なる）２２塩基からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ１０μｍｏｌ／ｌの濃度に調製して使用した。これらを終濃度が０．５μｍｏｌ／ｌとなるように添加した。（これらのプライマーによって増幅される領域は、プライマー自身も含めて７４塩基であった。）
ＤＮＡポリメラーゼとしては、ジーンタック（日本ジーン社製）を用い、反応液への添加量は０．５μｌであった。
また緩衝液ならびにデオキシヌクレオチド三リン酸については、ジーンタックに添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒならびに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを使用した。
前記に全量が１００μｌとなるように滅菌水を加え、核酸増幅反応液とした。具体的には表２〜４に示した通りである。尚、断りがない限り、表中の数字の単位はμlである。
【００２６】
表２：ＰＣＲ用鋳型核酸溶液Ａを使用した場合の核酸増幅反応液組成  
【００２７】
【表２】
2005304354.tif 000004
【００２８】
表３：ＰＣＲ用鋳型核酸溶液Ｂを使用した場合の核酸増幅反応液組成
【００２９】
【表３】
2005304354.tif 000005
【００３０】
表４：ＰＣＲ用鋳型核酸溶液Ｃを使用した場合の核酸増幅反応液組成
【００３１】
【表４】
2005304354.tif 000006
【００３２】
（実施例１-１〜４、２-１〜４、及び２、比較例１、２、３、３-１〜３-４）
（核酸増幅反応条件）
調製した核酸増幅反応溶液を、ＰＣＲ反応用サーマルサイクラーを用いて９５℃にて３分加熱した後、９５℃にて３０秒、６０℃にて５秒、７２℃にて１秒加熱するサイクルを３０回繰り返した。
【００３３】
（核酸増幅反応産物の定量方法（相対的））
ＰＣＲ法による核酸増幅後の核酸増幅反応溶液を、０．５×ＴＢＥ緩衝液（１０×ＴＢＥ緩衝液（和光純薬工業製の「１０×ＴＢＥ粉末」を１リットルの滅菌水に溶かしたもの）を蒸留水にて２０倍に希釈した緩衝液）を電気泳動用緩衝液とし、２．５％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  Ｌ０３  「ＴＡＫＡＲＡ」（タカラバイオ株式会社製）を０．５×ＴＢＥ緩衝液に２．５％濃度で溶解した後、ゲル化したもの）中に展開した。展開後のゲルを、蛍光画像分析機（富士写真フィルム社製、ＦＬＡ３０００Ｇ）を用いて、４７３ｎｍにて励起し、５２０ｎｍの蛍光波長を観察した（図１）。また蛍光観察後のゲルを０．５ｍｇ／ｌのエチジウムブロミドにて１０分間染色し、染色後のゲルを３１２ｎｍの紫外線照射下にて観察し、展開した核酸増幅反応産物の塩基鎖長を確認した（図２）。
【００３４】
なお、図１、図２において左から
レーン１：分子量マーカー（２０ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ株式会社製））
レーン２〜６：核酸増幅反応用鋳型核酸溶液Ａを使用。（詳細は以下の通り）
（比較例1）  レーン２：  アミン化合物を  ０        ｍｍｏｌ／ｌ添加（無添加）。
（実施例1-1）レーン３：  アミン化合物を  ０．１    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（実施例1-2）レーン４：  アミン化合物を  ０．２５  ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（実施例1-3）レーン５：  アミン化合物を  ０．５    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（実施例1-4）レーン６：  アミン化合物を  １．０    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
レーン７〜１１：核酸増幅反応用鋳型核酸溶液Ｂを使用。（詳細は以下の通り）
（比較例2）  レーン７：  アミン化合物を  ０        ｍｍｏｌ／ｌ添加（無添加）。
（実施例2-1）レーン８：  アミン化合物を  ０．１    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（実施例2-2）レーン９：  アミン化合物を  ０．２５  ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（実施例2-3）レーン１０：アミン化合物を  ０．５    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（実施例2-4）ーン１１：アミン化合物を    １．０    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
レーン１２〜１６：核酸増幅反応用鋳型核酸溶液Ｃを使用。（詳細は以下の通り）
（比較例3）レーン１２：アミン化合物を  ０          ｍｍｏｌ／ｌ添加（無添加）。
（比較例3-1）レーン１３：アミン化合物を  ０．１    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（比較例3-2）レーン１４：アミン化合物を  ０．２５  ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（比較例3-3）レーン１５：アミン化合物を  ０．５    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
（比較例3-4）レーン１６：アミン化合物を  １．０    ｍｍｏｌ／ｌ添加。
【００３５】
前記蛍光観察の結果を基に、核酸増幅反応液中のタンパク質濃度及びアミン化合物添加量と増幅された核酸量との関係をまとめ、表５に示した。断りがない限り、表中の数字の単位はＬＡＵ／ｍｍ２（蛍光強度）である。
【００３６】
表５中データ項の２行目の括弧内に記載した倍率は、タンパク質が実質的に含まれておらず、アミン化合物も添加していない系（比較例１）での核酸増幅率を１．００としたときの各系の核酸増幅率の倍率を示す。
また、表５中各データ項の３行目の括弧内に記載した倍率は、各鋳型核酸溶液でのアミン化合物未添加系での核酸増幅率（比較例２及び比較例３）を１．００としたときのアミン添加系の核酸増幅率の倍率を示す。
【００３７】
表５：タンパク質濃度及びアミン化合物添加量と増幅された核酸量の比較
【００３８】
【表５】
2005304354.tif 000007
【００３９】
アミン化合物未添加の場合、系中のタンパク質濃度が０．００ｇ/ｌから０．３８ｇ/ｌ、２．１３ｇ/ｌに増えると、核酸増幅率はそれぞれ０．５９倍、０．０２倍にまで急激に低下した（比較例１〜３）。
従来、このようにタンパク質などの夾雑物含有率が高く、核酸増幅が強く阻害されている系にアミン化合物を添加すると、核酸増幅阻害が軽減されることが知られていた。確かにタンパク質が２．１３ｇ/ｌ含まれた系にアミン化合物を０．２５ｍｍｏｌ／ｌ添加した系（比較例３−２）では、比較例３に比して、核酸増幅率において８．８４倍の改善が見られた。しかしながら、増幅された核酸量は少なく、タンパク質が実質的に含まれず（タンパク質濃度  0.00g/l）、アミン化合物も含まない系（比較例１）と比較すると、わずかに０．２２倍の核酸増幅率となった。
【００４０】
一方で、タンパク質が実質的に含まれない系や、タンパク質濃度が０．５ｇ/ｌより少ない０．３８ｇ/ｌ含有系にアミン化合物を添加した場合には、アミン化合物を添加しない系に比して数倍以上の核酸増幅率が同じ時間で得られた（実施例１−１〜１−４、実施例２−１〜２−４）。特に本発明の一例であるタンパク質濃度が０．００ｇ/ｌの核酸増幅反応液に対して、アミン化合物を０．１ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加した系（実施例１−１）では、アミン無添加系（比較例１）に対して７．３７倍の核酸増幅率の向上が見られた。
つまり、夾雑物が０．５ｇ/ｌより少ない系にアミン化合物を添加した場合には、夾雑物による核酸増幅阻害軽減ではなく、明らかにそれとは別の機構によって、核酸増幅反応の促進が起こっていることが分かる。
【００４１】
本発明の核酸増幅法によるポリメラーゼ連鎖反応を３０サイクル行なった核酸増幅反応により、前記アミン化合物を無添加であって、実質的にタンパク質を含まない核酸増幅反応液での核酸増幅率に対して、３倍以上の核酸増幅率を得ることができた。好ましくは５倍以上、更に好ましくは７倍以上の核酸増幅率を得ることができた。
【００４２】
また、本発明の核酸増幅法によるポリメラーゼ連鎖反応を３０サイクル行なった核酸増幅反応により、前記核酸増幅反応液へのアミン化合物添加前の核酸増幅率に対してアミン化合物添加により４倍以上の核酸増幅率を得ることができた。好ましくは７倍以上、更に好ましくは９倍以上の核酸増幅率を得ることができた。
【００４３】
（実施例４）
アミン化合物としてペンタエチレンヘキサミンを３ｍｍｏｌ／ｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ、７ｍｍｏｌ／ｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌとした以外は実施例２と同様の方法で核酸増幅反応を行なった。得られた核酸増幅量を表６に示す。表中の数字の単位はＬＡＵ／ｍｍ２（蛍光強度）である。
【００４４】
表６：タンパク質濃度及びアミン化合物添加量と核酸増幅量の比較
【００４５】
【表６】
2005304354.tif 000008
【００４６】
実施例２の結果と併せて評価すると、タンパク質濃度が０．５ｇ／ｌ以下のときアミン化合物を０．１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌの範囲で添加することにより核酸増幅率が飛躍的に促進されることが明らかとなった。これは即ち、従来と同程度の核酸増幅率で良い場合には、増幅に要する工程時間を大幅に短縮できることを意味する。この知見は今まで得られていないものであると同時に、少量で迅速な検査が求められる遺伝子検査にその効果は絶大なものであるということができる。
【００４７】
本発明の核酸増幅方法は、アミン化合物を添加することにより１サイクルにおける核酸増幅率を増加させて、複数サイクルの増幅を行なった結果の核酸増幅率を増加させることができると考えられる。
アミン添加前後の最終的な核酸増幅率の比は、アミン添加前後の１サイクルにおける核酸増幅率の比とＰＣＲ増幅サイクル数により式（２）のように表すことができる。
【００４８】
【数２】
2005304354.tif 000009
【００４９】
但し、
２ｒ０：  アミン化合物添加前の１サイクルにおける核酸増幅率
２ｒ１：  アミン化合物添加後の１サイクルにおける核酸増幅率  
Ｋ    ：  ＰＣＲ増幅サイクル数  
である。
【００５０】
実施例及び比較例のいずれの場合も核酸増幅率はＰＣＲ増幅サイクルを３０サイクル行なった結果、つまりＫ＝３０である。
表５で得られた結果に基づいて、アミン無添加系に対する各系での１サイクルにおける核酸増幅率の比（ｒ１／ｒ０）を式（２）より求めて表７にまとめた。
【００５１】
【表７】
2005304354.tif 000010
このように、上記の式（２）で定義される１サイクルにおける核酸増幅率を、アミンの添加により１．０５倍以上増加させることができることがわかる。好ましい場合には１．０６倍以上、更に好ましくは１．０７倍以上にすることが可能となる。
タンパク質濃度が２．１３ｇ／ｌと高い系においても１サイクルにおける核酸増幅率の比（ｒ１／ｒ０）は増加しているが、アミン無添加系（比較例３）での核酸増幅率の低減が大きいため、十分な核酸増幅量（比較例１の０．２２倍程度以下）が得られず、本発明の課題である十分な核酸増幅量を得るに至らない。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
Ｂ型・Ｃ型肝炎ウィルスやＡＩＤＳウィルスの検査の迅速化が医療の現場などで強く求められている。本発明は、このような迅速な遺伝子解析・診断に有用な手法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＰＣＲ後の核酸増幅反応液をアガロースゲル電気泳動で展開し、蛍光画像分析機（富士写真フィルム社製、ＦＬＡ３０００Ｇ）を用いて、４７３ｎｍにて励起し、５２０ｎｍ周辺の蛍光波長により観察したものである。
【図２】図１のアガロースゲルを、０．５ｍｇ／ｌのエチジウムブロミドにて１０分間染色し、染色後のゲルを３１２ｎｍの紫外線照射下にて観察したものである。
【図１】
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【図２】
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