(57)【要約】  【課題】  食物摂取量の増大、高脂血症・脂肪肝、肥満、高インスリン血症等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すインスリン抵抗性疾患モデルマウスを提供すること、及び、該モデルマウスを用いたスクリーニング方法を提供すること。  【解決手段】  インスリン抵抗性疾患モデルとしてのＡ１７０遺伝子ノックアウトマウス及び、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスを用いた、インスリン抵抗性疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、インスリン抵抗性だけでなく、肥満、脂肪肝等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示す。  【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン抵抗性疾患モデルであるＡ１７０遺伝子ノックアウトマウス。
【請求項２】
前記インスリン抵抗性疾患は２型糖尿病である、請求項１に記載のＡ１７０遺伝子ノックアウトマウス。
【請求項３】
Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスを用いる、インスリン抵抗性疾患治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン抵抗性疾患モデルのノックアウトマウス、及び該ノックアウトマウスを用いた方法に関する。より詳細には、インスリン抵抗性疾患モデルとしてのＡ１７０遺伝子ノックアウトマウス、及び該ノックアウトマウスを用いたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン抵抗性疾患とは、インスリン抵抗性の上昇によって引き起こされる疾患のことをいい、２型糖尿病、高脂血症・脂肪肝、肥満、高血圧症、動脈硬化症等の成人病は、インスリン抵抗性疾患と深い関連性を持つ。即ち、インスリン抵抗性の上昇は、２型糖尿病、高脂血症・脂肪肝、肥満等を引き起こし、また、インスリン抵抗性上昇に伴う代償性の高インスリン血症は、高血圧症等の誘因となる。さらに、それらの病態が複合的に連関して、動脈硬化症等が誘発される場合もある（非特許文献１参照）。
【０００３】
これらの病態の作用機序の解析、治療薬の開発等を目的として、疾患モデルマウス（ノックアウトマウス）が多く開発されている。例えば、糖尿病モデルマウスは、糖尿病に関連があると考えられる遺伝子を欠損させることにより作製し、該遺伝子の機能解析や糖尿病治療薬のスクリーニング等に用いられている。非特許文献２には、主な糖尿病モデルマウスが列記されている。
【０００４】
ここで、本発明に係るＡ１７０遺伝子についての公知技術を以下に説明する。
【０００５】
Ａ１７０遺伝子とは、ヒトのｐ６２をコードする遺伝子、ラットのＺＩＰをコードする遺伝子、ＯＳＦ−６と名付けられた骨関連タンパク質をコードする遺伝子等と相同性を示すマウスの遺伝子で（非特許文献３、特許文献１参照）、現在のところ、骨代謝と関連する病変（ページェット病等）との関連が強く示唆されている（特許文献１、非特許文献４参照）。そして、非特許文献４では、ページェット病の解析を目的として、ｐ６２不活性化マウスの作出が行われている。
【０００６】
一方、非特許文献５には、Ａ１７０と相同性を示すＺＩＰが、Ｇｒｂ１４と結合してインスリン・シグナルを制御することが記載されているが、Ａ１７０とインスリン抵抗性疾患との具体的な関わり又は作用機序は、現在のところ知られていない。
【特許文献１】特開平６−２５６２１０号公報
【非特許文献１】「インスリン抵抗性と生活習慣病」、診断と治療社、Ｐ２等参照
【非特許文献２】「別冊・医学の歩み」、医歯薬出版株式会社、Ｐ１１３−１１７（２００４）
【非特許文献３】Geetha T. et al, FEBS Letters 512 (2002) 19-24
【非特許文献４】Duran A. et al, Developmental Cell, Vol.6, 303-309, February,2004
【非特許文献５】Cariou B. et al,Molecular and Cellular Biology, Oct.2002, P.6959-6970
【非特許文献６】日本口腔科学会雑誌ＶＯＬ．５１、Ｎｏ６（２００２）、ｐ５６２、柳川徹ら、「Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスの開発」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記した、従来の糖尿病モデルマウスは、糖尿病と関連する遺伝子の機能解析等には有用であったが、ヒトとマウスとの間で、病態・表現型が異なる場合が多かった。
【０００８】
即ち、ヒトの糖尿病等インスリン抵抗性疾患は、食物摂取量の増大、高脂血症・脂肪肝、肥満、代償性高インスリン血症による高血圧、動脈硬化等を併発する場合が多いのに対し、そのような病態を併発する糖尿病モデルマウスは作出されていなかった。そのため、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同じ病態を示すモデルマウスの作出が課題となっていた。
【０００９】
従って、本発明は、食物摂取量の増大、高脂血症・脂肪肝、肥満、高インスリン血症等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すインスリン抵抗性疾患モデルマウスを提供すること、及び、該モデルマウスを用いたスクリーニング方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ページェット病等の骨代謝疾患モデルとして、独自に、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスの作出を行った（非特許文献６参照）。その結果、意外にも、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスが、インスリン抵抗性を示すことを新規に見出した。
【００１１】
そこで、本発明では、インスリン抵抗性疾患モデルとしてのＡ１７０遺伝子ノックアウトマウスを提供する。
【００１２】
本発明は、Ａ１７０遺伝子とインスリン抵抗性疾患との間の具体的な相関関係を強く示唆するものであり、インスリン抵抗性疾患の発症機序を明らかにする上で、重要な知見を与える発明である。
【００１３】
即ち、本発明は、Ａ１７０遺伝子と相同性を示すヒトのｐ６２遺伝子が、骨代謝疾患だけではなく、ヒトのインスリン抵抗性疾患の発症因子としても、非常に重要な役割を果たしている可能性を強く示唆している点で、重要性が高い。
【００１４】
また、本発明に係るＡ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、インスリン抵抗性だけでなく、血中インスリン濃度の上昇、血中総コレステロール値・トリグリセリド値の上昇、体重増加（肥満）、食物摂取量の増加、脂肪肝等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示す点で、従来の糖尿病モデルマウス等よりも、有利性がある。
【００１５】
即ち、従来のモデルマウスは、発現する病態（表現型）がヒトのインスリン抵抗性疾患とは必ずしも一致しなかったため、欠損させた遺伝子の機能解析等には適しているが、インスリン抵抗性疾患自体の病態解析、治療剤の開発等には、適用しにくい面があった。それに対し、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスはヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すため、該疾患関連遺伝子の機能解析だけでなく、インスリン抵抗性疾患自体の病態解析、発症機序の解明、治療剤の開発等に応用することができる。
【００１６】
なお、Ａ１７０遺伝子の塩基配列を配列番号１に、Ａ１７０のアミノ酸配列を配列番号２に示した。配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているｃＤＮＡの塩基配列で、翻訳される領域は、３４番目から１３６２番目までの領域である。
【００１７】
次に、本発明では、前記発明に基づき、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスを用いた、インスリン抵抗性疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
本発明に係るＡ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、インスリン抵抗性だけでなく、血中インスリン濃度の上昇、血中総コレステロール値・トリグリセリド値の上昇、体重増加、食物摂取量の増加、脂肪肝等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すため、該ノックアウトマウスに候補物質を投与することにより、これらの病態を改善する物質を探索することができる。
【００１９】
なお、本発明において、インスリン抵抗性疾患とは、インスリン抵抗性を示す疾患をいい、２型糖尿病をはじめ、高インスリン血症、高脂血症、脂肪肝、高血圧、動脈硬化症等、インスリン抵抗性と病態との間に関連性がある疾患を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るノックアウトマウスは、インスリン抵抗性疾患の疾患モデルとすることができる。
【実施例１】
【００２１】
＜Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスの作製＞
Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスの作製は、通常用いられているジーンターゲティング法により行った。具体的な手順は、以下のとおりに行った。
【００２２】
まず、ターゲッティングベクターに組み込むＤＮＡの調製を行った。ＢＡＣ／１２９ＳｖＪゲノムライブラリーより、Ａ１７０遺伝子（Ａ１７０遺伝子上流からＡ１７０遺伝子のエクソン８まで）を含むクローン数個をスクリーニングした。そして、スクリーニングにより得たクローンをもとにして、Ａ１７０遺伝子をコードするＤＮＡを調製した後、Ａ１７０遺伝子のエクソン１からエクソン４をコードする領域を、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）に置換して、目的のＤＮＡを作製した。
【００２３】
なお、図１は、ターゲッティングベクターに組み込むＤＮＡの構成を示したものであり、図１中、数字１〜８はＡ１７０遺伝子のエクソン１〜エクソン８を、Ｎｅｏｒはネオマイシン耐性遺伝子を示している。Ｎｅｏｒの両端には、解糖系の酵素ＰＧＫ（ポリグリセリン酸キナーゼ）のプロモータとポリＡ末端が取り付けられており、ネオマイシン耐性遺伝子が常時発現するようにしてある。
【００２４】
次に、ターゲッティングベクターの作製を行った。ターゲッティングベクターの作製には、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ社製のベクターパック「ｐＧＴ−Ｎ２８」を用いた。添付プロトコルに従って、「ｐＧＴ−Ｎ２８」に、制限酵素的に目的のＤＮＡを組み込み、ターゲッティングベクターを作製した。
【００２５】
次に、エレクトロポレーション法を用いて、マウスＥＳ細胞に、作製したターゲッティングベクターを導入した。マウスＥＳ細胞は、１２９Ｓｖ／Ｂ６由来のものを用いた。
【００２６】
作製したターゲッティングベクターにはネオマイシン耐性遺伝子が含まれているため、ネオマイシン添加条件下でマウスＥＳ細胞を培養することにより、相同的組換えの起こったマウスＥＳ細胞を選抜することができた。このマウスＥＳ細胞は、相同的組換えにより、Ａ１７０遺伝子のエクソン１からエクソン４をコードする領域が欠損している。
【００２７】
次に、相同的組換えの起こったＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採取したブラストシストに注入してキメラ胚を作製し、そのキメラ胚を、偽妊娠雌マウス（レシピエントマウス）の子宮に移植した。そして、偽妊娠雌マウスに出産させ、キメラマウスを得た。なお、キメラマウスの判定は毛色で行い、野鼠色の部分は注入したＥＳ細胞由来、黒色部分はＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採取したブラストシストの細胞由来であると判断した。
【００２８】
次に、該キメラマウスを交配し、Ｆ１マウスを作製し、さらにＦ１マウス同士を交配してＦ２マウスを作製し、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスを完成させた。なお、作製したＡ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、メンデルの法則に従い、野生型（Ａ１７０＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０＋／−）、ホモ型（Ａ１７０−／−）が１：２：１の割合で生まれた。また、作製したノックアウトマウスの生殖性も維持されていた。
【実施例２】
【００２９】
＜作製したノックアウトマウスに対するグルコース付加試験、インスリン付加試験＞
グルコース負荷試験は、次の通り行った。実施例１で作製した、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスを１８時間絶食させた後、１ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内投与し、１５分、３０分、６０分、１２０分後に血糖値を測定した。結果を図２に示す。図２中、横軸（Ｔｉｍｅ）は時間（ｍｉｎ）を、縦軸（Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示している。
【００３０】
インスリン負荷試験は、次の通り行った。実施例１で作製した、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスに、０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔内投与し、１５分、３０分、６０分、１２０分後に血糖値を測定した。結果を図３に示す。図３中、横軸（Ｔｉｍｅ）は時間（ｍｉｎ）を、縦軸（Ｇｌｕｃｏｓｅ）は測定時の血糖値を投与時の血糖値で割った値（％  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｖａｌｕｅ）を示している。
【００３１】
図２に示すとおり、グルコース負荷試験では、野生型・ヘテロ型のマウスとホモ型マウス（ノックアウトマウス）との間で、１５分後の測定値には有意差が見られたものの、その他の時間では、有意差が見られなかった。一方、図３のインスリン負荷試験では、ホモ型マウス（ノックアウトマウス）は、野生型・ヘテロ型のマウスと比較し、明らかに血糖値の低下が少なかった。
【００３２】
以上の結果は、本発明に係るノックアウトマウスのインスリン抵抗性が有意に上昇していることを示している。従って、本発明に係るノックアウトマウスは、インスリン抵抗性疾患モデルとして有効である。
【実施例３】
【００３３】
＜作製したノックアウトマウスの血中インスリン濃度の測定＞
実施例１で作製した、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスについて、通常飼育時と２４時間絶食後の血中インスリン濃度を測定した。なお、図４中、「ｆｅｄ」は通常に餌を与えた個体を、「２４ｆａｓｔｅｄ」は２４時間絶食させた個体を示している。また、縦軸（Ｉｎｓｕｌｉｎ）は血中インスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示している。
【００３４】
その結果、図４に示すとおり、ホモ型マウス（ノックアウトマウス）は、野生型・ヘテロ型のマウスと比較し、通常飼育時・２４時間絶食後ともに、明らかに血中インスリン濃度が上昇していた。
【００３５】
この結果は、本発明に係るノックアウトマウスが、ヒトのインスリン抵抗性疾患の病態と同様に、高インスリン血症をも引き起こしていることを示している。従って、本発明に係るノックアウトマウスは、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様に高インスリン血症をも引き起こしている点で、従来のインスリン抵抗性疾患モデルマウスよりも有利性がある。
【実施例４】
【００３６】
＜作製したノックアウトマウスの血中総コレステロール及びトリグリセリドの測定＞
実施例１で作製した、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）の３５週齢マウスについて、通常飼育時と２４時間絶食後の血中総コレステロール及びトリグリセリドを測定した。血中総コレステロールの測定値を図５に、トリグリセリドの測定値を図６に示す。なお、図５、図６中の、「ｆｅｄ」は通常に餌を与えた個体を、「２４ｆａｓｔｅｄ」は２４時間絶食させた個体を示している。また、図５の縦軸（Ｔｏｔａｌ  Ｃｈｏｒｅｓｔｅｒｏｌ）は血中総コレステロール（ｍｇ／ｄｌ）を、図６の縦軸（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）はトリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）を示している。
【００３７】
その結果、図５、図６に示すとおり、通常飼育時では、ホモ型マウス（ノックアウトマウス）は、野生型マウスと比較し、有意に血中総コレステロール値・トリグリセリド値ともに上昇していた。但し、絶食時には、有意な差は見られなかった。
【００３８】
この結果は、本発明に係るノックアウトマウスが、ヒトのインスリン抵抗性疾患の病態と同様に、高脂血症をも引き起こしていることを示している。従って、本発明に係るノックアウトマウスは、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様に高脂血症をも引き起こす可能性がある点で、従来のインスリン抵抗性疾患モデルマウスよりも有利性がある。
【実施例５】
【００３９】
＜作製したノックアウトマウスの体重増加と食物摂取量＞
実施例１で作製したノックアウトマウスを通常の飼育条件下で飼育し、体重及び食物摂取量を観察した。
【００４０】
図７は野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスの体重の経時的変化を示した表である。横軸（ａｇｅ）はマウスの週齢を、縦軸（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）は体重（ｇ）を示している。      
【００４１】
図７に示すとおり、野生型とヘテロ型のマウスは、ほとんど体重の差はなかったのに対し、ホモ型のノックアウトマウスは、野生型・ヘテロ型と比較して有意に体重増加が見られた。
【００４２】
図８の図面代用写真は、３５週齢の同腹の雄マウスである。上のマウス（３５  ｗｅｅｋｓ  Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）は野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、下のマウス（３５  ｗｅｅｋｓ  Ａ１７０  ＫＯ）はノックアウトマウス（Ａ１７０遺伝子−／−）である。
【００４３】
図８に示すとおり、Ａ１７０遺伝子ノックアウトマウスは、外見上、明らかに肥満化した。
【００４４】
図９は、野生型（Ａ１７０遺伝子＋／＋）、ヘテロ型（Ａ１７０遺伝子＋／−）、ホモ型（Ａ１７０遺伝子−／−）のマウスの食物摂取量の経時的変化を示した表である。横軸（ａｇｅ）はマウスの週齢を、縦軸（Ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ）は食物摂取量（ｇ／ｄａｙ）を示している。
【００４５】
図９に示すとおり、野生型とヘテロ型のマウスは、ほとんど食物摂取量の増加は観察されなかったのに対し、ホモ型のノックアウトマウスは、野生型・ヘテロ型と比較して有意に食物摂取量の増加が見られた。
【００４６】
以上の結果は、本発明に係るノックアウトマウスが、食物摂取量に関し、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すことを明らかにしている。従来の糖尿病疾患モデルマウス等は、肥満化・食物摂取量の増加等、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を必ずしも示さなかった。それに対し、本発明に係るノックアウトマウスは、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示す点で、有利性がある。
【実施例６】
【００４７】
＜作製したノックアウトマウスと脂肪肝との相関＞
実施例１で作製したノックアウトマウスを通常の飼育条件下で飼育し、４２週齢（図１１の顕微鏡所見は４０週齢）となった時点で、解剖して肝臓を観察した。
【００４８】
図１０の図面代用写真は、野生型マウス（Ａ１７０遺伝子＋／＋）及びノックアウトマウス（Ａ１７０遺伝子−／−）の肝臓肉眼所見である。図１０中、左側の写真（４２  ｗｅｅｋｓ  ＷＴ  ｆｅｍａｌｅ）は野生型マウスの肉眼所見、右側の写真（４２  ｗｅｅｋｓ  Ａ１７０ＫＯ  ｆｅｍａｌｅ）はノックアウトマウスの肉眼所見を示す。また、図１１は、野生型マウス（Ａ１７０遺伝子＋／＋）及びノックアウトマウス（Ａ１７０遺伝子−／−）の肝臓顕微鏡写真である。左側の写真（ＷＴ）は野生型マウスの顕微鏡写真、右側の写真（Ａ１７０ＫＯ）はノックアウトマウスの顕微鏡写真である。図１１の顕微鏡写真は、オイルレッド染色により脂肪を赤く染色した切片である。
【００４９】
図１０中、野生型マウスとノックアウトマウスを比較すると、ノックアウトマウスの肝臓は、明らかに黄赤色に変色しており、脂肪肝の所見である。また、図１１の顕微鏡写真でも、ノックアウトマウスでは赤色に染色された部分が多く観察され、脂肪肝であると判断できる。
【００５０】
この結果は、本発明に係るノックアウトマウスが、脂肪肝を併発する点で、ヒトのインスリン抵抗性疾患と同様の病態を示すことを明らかにしている。従来の糖尿病疾患モデルマウス等は、脂肪肝の病態を必ずしも併発していなかった。それに対し、本発明に係るノックアウトマウスは、脂肪肝を併発しており、ヒトのインスリン抵抗性疾患と極めて類似した病態を示している点で、有利性がある。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明に係るノックアウトマウスは、２型糖尿病等インスリン抵抗性疾患モデルとして、産業上有用である。本発明に係る方法は、創薬、機能性食品の開発等に貢献する可能性があるため、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ターゲッティングベクターの構成を示す図。
【図２】グルコース負荷試験の結果を示す表。
【図３】インスリン負荷試験の結果を示す表。
【図４】血中インスリン濃度の測定結果を示す表。
【図５】血中総コレステロールの測定結果を示す表。
【図６】血中トリグリセリドの測定結果を示す表。
【図７】体重増加を示す表。
【図８】ノックアウトマウスの肥満化を示す図面代用写真。
【図９】食物摂取量の変化を示す表。
【図１０】ノックアウトマウスの脂肪肝を示す肝臓肉眼所見の図面代用写真。
【図１１】ノックアウトマウスの脂肪肝を示す肝臓顕微鏡写真の図面代用写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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