(57)【要約】【課題】  Ｌ−乳酸 + 酸素 → ピルビン酸 + 過酸化水素 で表される反応を触媒する熱安定性に優れた乳酸酸化酵素を提供する。【解決手段】  アエロコッカス・ビリダンス(Aerococcus viridans)から得られる乳酸酸化酵素において６残基のアミノ酸を改変することにより熱安定性に優れた乳酸酸化酵素が提供された。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有することを特徴とする乳酸酸化酵素。
【請求項２】
Ｌ−乳酸＋酸素→ピルビン酸＋過酸化水素で表される反応において触媒作用を及ぼすことを特徴とする、請求項１に記載の乳酸酸化酵素。
【請求項３】
乳酸酸化酵素をコードするＤＮＡであって、請求項１または請求項２のいずれかに記載の乳酸酸化酵素をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載されたＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−乳酸 ＋ 酸素 → ピルビン酸 ＋ 過酸化水素
で表される反応を触媒する乳酸酸化酵素に関し、さらに詳しくは耐熱性に優れた乳酸酸化酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸酸化酵素はＬ−乳酸と酸素からピルビン酸と過酸化水素の生成を触媒する酵素で、血液などの体液中あるいは発酵食品製造過程における乳酸濃度を測定するのに非常に有用なだけでなく、キラル化合物のスタート物質として有用なＤ−乳酸をラセミ体であるＤＬ−乳酸から選択的に合成するのにも有用な酵素である（非特許文献１参照）。
【０００３】
当該酵素はこれまでにペディオコッカス(Pediococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、アエロコッカス(Aerococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属に属する細菌等に存在することが知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。
【０００４】
また、本発明者らもすでに複数の耐熱性を有する変異乳酸酸化酵素を開示している(特許文献５および６参照)。
【非特許文献１】Tadao Oikawa, Shuji Mukoyama, Kenji Soda、 Biotechnology and Bioengineering、 2001年、Vol.73、 Issue 1、 pp.80−82
【特許文献１】特公昭５８−４５５７号公報
【特許文献２】特公昭５９−１０１９０号公報
【特許文献３】特開平２−１７７８８６号公報
【特許文献４】特願平９−５７８０８号公報
【特許文献５】特許番号第２６２４２１７号明細書
【特許文献６】特開２００１−０８６９８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述の従来技術では当該酵素の耐熱性は不充分な場合がある。すなわち、特許文献１の記載によるとストレプトコッカスから得られる乳酸酸化酵素は熱安定性が低く、３４℃を超える温度では急速に失活し、また、特許文献４の記載によるとラクトコッカスから得られる乳酸酸化酵素の熱安定性は５０℃以下である。最も熱安定性が高いアエロコッカスから得られる乳酸酸化酵素でも特許文献２の記載によると６５℃１０分間の加熱処理で残存活性が５％以下にまで低下する。本発明者らは従来酵素を改良し上記特許文献５および特許文献６を開示しているが、例えば乳酸センサに応用する場合にはさらなる耐熱化が必要だと考えられる(Minagawa H， Nakayama N， Matsumoto T， Ito N、 Biosensors ＆ Bioelectronics、1998年 Vol.13、pp.313−318)。
【０００６】
本発明の目的は顕著な耐熱性を有する乳酸酸化酵素を開発することを主たる課題とし、上記特許文献６に記載された酵素に新たな変異を加えることにより耐熱性の向上を実現した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［発明の特徴］
本発明では、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する乳酸酸化酵素、該アミノ酸配列を有する乳酸酸化酵素のうちＬ−乳酸 ＋ 酸素 → ピルビン酸 ＋ 過酸化水素 で表される反応において触媒作用を及ぼす乳酸酸化酵素、または配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する乳酸酸化酵素と同程度の耐熱性を有し、配列番号１に記載されたアミノ酸配列から１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有する乳酸酸化酵素、さらには、それらの乳酸酸化酵素をコードするＤＮＡおよびそのＤＮＡを含むことを特徴とするベクターに関する技術を提供する。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
［作用］
本発明者らは乳酸酸化酵素の耐熱性を高めるために上記課題について鋭意検討した結果、前述のアミノ酸配列をもつ乳酸酸化酵素は従来の乳酸酸化酵素に比べて顕著な耐熱性を有することを見いだし、実際に配列番号１のアミノ酸配列を持つ乳酸酸化酵素を作製した。
【発明の効果】
【００１０】
図１に本発明の乳酸酸化酵素の遺伝子配列とアミノ酸配列を示した。アミノ酸配列部分の下線部分がアエロコッカスから得られる野生型乳酸酸化酵素と異なっている。
【００１１】
図２に野生型乳酸酸化酵素、特許文献６に記載された耐熱性変異乳酸酸化酵素および本発明の乳酸酸化酵素を７０℃に保温したときの残存活性の時間変化を示す。本発明の乳酸酸化酵素は野生型乳酸酸化酵素および特許文献６に記載された耐熱性変異乳酸酸化酵素に比べ顕著に耐熱性が向上していることがわかる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の耐熱性乳酸酸化酵素遺伝子は、アエロコッカス・ビリダンス(Aerococcus viridans)由来の乳酸酸化酵素遺伝子あるいは特許文献６に記載されたｐＬＯＤ１２を鋳型とし、公知の技術である部位特異的変異法(site-directed mutagenesis)などを用いて作製することができる。部位特異的変異法は当該分野では周知の技術であり、例えばNucl. Acid Research, 1982年、 Vol.10， pp.6487−6500を参照。作製した本発明の耐熱性乳酸酸化酵素遺伝子を適当なプロモーター(tacプロモーター、lacプロモーターなど)と抗生物質耐性マーカー(アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンなど)を持つベクターに挿入し、適当な宿主、例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)を形質転換させた後蛋白質を発現させ、例えば特許文献５に記載されている方法によって精製することによって本発明の耐熱性乳酸酸化酵素が得られる。
【００１３】
発明の実施の形態については、実施例の項で詳細に述べる。
【実施例】
【００１４】
［耐熱性乳酸酸化酵素遺伝子の作製］
本発明の耐熱性乳酸酸化酵素遺伝子は、特許文献６に記載された耐熱性変異乳酸酸化酵素の遺伝子をもとに公知の技術である部位特異的変異法(site-directed mutagenesis)を用いて作製した。より具体的にはＬＯＤ１２の遺伝子を含むベクター(ｐＬＯＤ１２)を鋳型とし、所定の変異を起こさせるよう設計した４種類のセンスプライマー：ＦＷＧ３６Ｓ(配列番号２)、ＦＷＴ１０３Ｓ(配列番号３)、ＦＷＡ２３２Ｓ(配列番号４)、ＦＷＦ２７７Ｙ(配列番号５)と４種類のアンチセンスプライマー：ＲＥＧ３６Ｓ(配列番号６)、ＲＥＴ１０３Ｓ(配列番号７)、ＲＥＡ２３２Ｓ(配列番号８)、ＲＥＦ２７７Ｙ(配列番号９)を用い、ＦＷＧ３６ＳとＲＥＧ３６Ｓ、ＦＷＴ１０３ＳとＲＥＴ１０３Ｓ、ＦＷＡ２３２ＳとＲＥＡ２３２Ｓ、およびＦＷＦ２７７ＹとＲＥＦ２７７Ｙをそれぞれ一組として、部位特異的変異法を繰り返すことにより目的の変異遺伝子を得ることができる。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
上述のプライマー１組とｐＬＯＤ１２をそれぞれ０．１μｇ用いて、Quick Change Mutagenesis Kit(STRATGENE社製、フナコシ)にしたがってＰｆｕポリメラーゼによるＰＣＲを行った後、ＤｐｎＩで３７℃１時間の処理を行った。このＤｐｎＩ処理ＰＣＲ産物を用いてE.coli XL1-Blueを形質転換させ、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地(１％ Tryptone、０．５％ Yeast Extract、０．５％ ＮａＣｌ、１．５％ Agar、０．０１％ Ampicillin Sodium)で３７℃、一晩培養した。得られたコロニーを、アンピシリンを含むＬＢ液体培地(１％ Tryptone、０．５％ Yeast Extract、０．５％ ＮａＣｌ、０．０１％ Ampicillin)で３７℃、一晩培養し、キアゲンプラスミド精製キット(QIAGEN社製)を用いてプラスミドを抽出、精製した。得られたプラスミドの該酵素部分の塩基配列は、ＤＮＡシーケンサ(ABI373：アプライドバイオシステムズ社製)を用いて塩基配列を確認し、このプラスミドを鋳型として別のプライマーの組を用いて上述の部位特異的変異を繰り返すことにより目的の変異プラスミドを得た。詳しくは図３を参照されたい。以上のように得られた変異乳酸酸化酵素遺伝子を含むプラスミドをｐＬＯＤ１７とした。
【００１７】
［耐熱性乳酸酸化酵素の発現と酵素溶液の作製］
ｐＬＯＤ１７、ｐＬＯＤ１２、ｐＬＯＤｗｔ(アエロコッカスから得られる野生型の乳酸酸化酵素遺伝子を含み、その他の部分はｐＬＯＤ１７、ｐＬＯＤ１２と同じプラスミド)をそれぞれ１０ｎｇ用いてE. coli JM109をドゥワーらの方法(Dower et al.、 Nucleic Acids Research、 1988年、 Vol.16、 No.13、 pp.6127−6145)にしたがい、電気穿孔法により形質転換させた。具体的にはプラスミドとE. coli JM109を混合して氷中に１分間静置した後、ジーンパルサーＴＭ(BioRad社製)を用いて２００オーム、２５μＦ、１８ｋＶ／ｃｍの条件で電気穿孔法による遺伝子の導入を行った後、菌体をＳＯＣ培地(２％ Tryptone、０．５％ Yeast Extract、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ Glucose)中で３７℃、１時間培養した。培養後菌体をＬＡＨ培地(１％Tryptone、０．５％Yeast Extract、０．５％ ＮａＣｌ、１．５％ Agar、０．０１％Ampicillin Sodium、０．０１％ ＡＢＴＳ、５０ｍＭ Ｌ−乳酸リチウム塩(Lithium−L−Lactate)、１Ｕ／ｍｌ Horseradish Peroxidase)にまいて３７℃で一晩培養した。生じたコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップし、４ｍｌのＬＡ培地(１％ Tryptone、０．５％Yeast Extract、０．５％ ＮａＣｌ、０．０１％ Ampicillin Sodium)に接種し、３７℃で８時間培養した後、１ｍｌの培養液を１００ｍｌのＬＡ培地に殖菌し、３７℃で一晩培養した。１００ｍＭ ＩＰＴＧ(Isopropyl Thiogalactopyranoside)を１００μｌ加えてさらに３７℃で３時間培養した後、菌体を１２０００ｒｐｍ  ５分の遠心で集菌し、１０ｍｌのリン酸カリウム緩衝液(５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．１)で菌体を洗浄した後、１０ｍｌの同緩衝液に懸濁した。細胞懸濁液にＰＭＳＦ(Phenylmethylsulfonylfluoride)とエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)を終濃度１ｍＭになるように加え、氷中で超音波処理(ＶＰ−６０：TAITEC社製)した。１２０００ｒｐｍ  １０分の遠心で細胞破砕物を除き、遠心上清を氷中でゆっくり撹拌しながら硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）を５０％飽和になるように加えてさらに３０分間撹拌した。１２０００ｒｐｍ  １０分の遠心で沈殿を集め、カリウム緩衝液Ａ(５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．１)に溶解させ、カリウム緩衝液Ａで平衡化してあるSephadexG25(アマシャム・ファルマシア社)にかけて脱塩を行った。脱塩したサンプルをカリウム緩衝液Ａで平衡化した陰イオン交換カラムQ−SepharorseFF(アマシャム・ファルマシア社)にかけ、カリウム緩衝液Ｂ(５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．１)で塩濃度の連続勾配をかけて溶出させ、乳酸酸化酵素活性を示す画分を集め、カリウム緩衝液Ｂで平衡化した疎水性カラムPhenylsepharose(アマシャム・ファルマシア社)にかけてカリウム緩衝液Ａで溶出し、乳酸酸化酵素活性を示す画分を集めた。このように精製した乳酸酸化酵素はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上で単一のバンドを示した。乳酸酸化酵素濃度はBCA Protein assay Kit(Pierce社製、宝酒造)により牛血清アルブミン(ＢＳＡ)を標準試料として測定した。ＬＯＤ１７(本発明による乳酸酸化酵素)、ＬＯＤ１２(特許文献６に記載の耐熱性乳酸酸化酵素)、ＬＯＤｗｔ(アエロコッカスから得られる野生型乳酸酸化酵素)のそれぞれの蛋白質濃度が５０μｇ／ｍｌになるように調整���、乳酸酸化酵素活性を測定した。
【００１８】
［乳酸酸化酵素の活性測定］
上記ＬＯＤ１７を本発明の乳酸酸化酵素として、上記ＬＯＤ１２およびＬＯＤｗｔを本発明の乳酸酸化酵素に対する比較の乳酸酸化酵素として、Ducanらの方法(Ducan et al., B.B.R.C., 1989年, Vol.164, No.2, pp.919-926)にしたがって活性の測定を行った。
【００１９】
２．７ｍｌの純水に、ＨＥＰＥＳ緩衝液(１Ｍ、ｐＨ７．３)を１２０μｌ、Ｌ−乳酸リチウム塩(９６ｍｇ／ｍｌ)を３０μｌ、４−アミノアンチピリン(３０ｍｇ／ｍｌ)を３０μｌ、フェノール(３１ｍｇ／ｍｌ)を３０μｌ、ＨＲＰ(Horseradish Peroxidase、１００Ｕ／ｍｌ)を６０μｌ加えて混合し、光路長１ｃｍのキュベットに入れた後、乳酸酸化酵素溶液を６０μｌ加えて撹拌後直ちに吸光光度計(ＵＶ−３６５：島津製作所製)で５００ｎｍの吸光度の時間変化を測定した。酵素溶液を７０℃の恒温槽に一定時間(５、１０、２０、４０分)静置した後、氷中に静置し、酵素活性(残存活性)を測定した。図２にＬＯＤｗｔ(アエロコッカスから得られる野生型乳酸酸化酵素)、ＬＯＤ１２(特許文献６に記載の耐熱性乳酸酸化酵素)および本発明の乳酸酸化酵素の７０℃における残存活性の時間変化をプロットしたものを示した。
【００２０】
図２によると、７０℃における残存活性は、野生型ＬＯＤでは１０分経過すると０％に低下してしまう。一方、特許文献２に記載の、最も熱安定性が高いアエロコッカスから得られる乳酸酸化酵素：ＬＯＤ１２と本発明の乳酸酸化酵素との残存活性を比較すると、本発明の乳酸酸化酵素はいずれの保持時間においてもＬＯＤ１２よりも高い残存活性値を示し、したがって本発明により耐熱性の高い乳酸酸化酵素を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１（ａ）】本発明の乳酸酸化酵素遺伝子配列とアミノ酸配列を示す図である。
【図１（ｂ）】本発明の乳酸酸化酵素遺伝子配列とアミノ酸配列を示す図である。
【図２】本発明の乳酸酸化酵素の耐熱性を示す図である。
【図３】本発明の乳酸酸化酵素遺伝子の作製法を示す図である。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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