(57)【要約】【課題】  試験期間において電極を耐久化し、また一定期間を要する中期又は長期における薬物評価等の試験期間中、電気的刺激による安定した人工的咳促進を得ること。【解決手段】人工的咳促進のための電気的気管刺激方法であって、（１）電気パルス発生装置を用いて発生された電気パルスを、動物の気管に双極状態で植え込まれた電極に接続されかつ体外に引き出される導線を経由して、当該電極に伝達させる第一工程、及び（２）伝達された電気パルスが動物の気管を選択的に刺激して咳反応を誘発させる第二工程を有することを特徴とする方法、並びに、当該方法により誘発される咳反応における動物の薬物レスポンスに基づき薬物の鎮咳効果の有無を判定することを特徴とする薬物の鎮咳効果を評価する方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工的咳促進のための電気的気管刺激方法であって、
（１）電気パルス発生装置を用いて発生された電気パルスを、動物の気管に双極状態で植え込まれた電極に接続されかつ体外に引き出される導線を経由して、当該電極に伝達させる第一工程、及び
（２）伝達された電気パルスが動物の気管を選択的に刺激して咳反応を誘発させる第二工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
植え込まれた電極における双極状態が、気管の長手方向に対して略平行方向となる位置関係である双極状態であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
植え込まれた電極の各々の電極が、動物の気管に、当該気管の長手方向に対して略垂直方向に縫い付けられた電極であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
導線が、頸部皮下を通して肩甲骨より体外に引き出される導線であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
導線が、中空のシリコンチューブで覆われてなる導線であることを特徴とする請求項１〜４記載のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５記載のいずれかの請求項記載の方法により誘発される咳反応における動物の薬物レスポンスに基づき薬物の鎮咳効果の有無を判定することを特徴とする薬物の鎮咳効果を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工的咳促進のための電気的気管刺激方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工的咳促進のための方法としては、咳反応を電気的気管刺激により発生させることが知られている。このために、例えば、電極を実験動物の気管へ植え込み、当該電極を通じて気管に電気を与える必要がある（非特許文献１参照）。このような実験動物の気管への電極の設置方法は、試験系への大きな影響を与え、特にその試験系の利用可能期間や感度等に対する影響は大きい。
実験動物の気管へ電極を設置するには、通常、電極を実験動物の気管に貫通させるのみであり、また電極を実験動物の気管に留置させるには、生体用瞬間接着剤を用いることが繁用であった。
【０００３】
【非特許文献１】Stefko, PL and Benson, WM (1953) A method for the evaluation of antitussive agents in the unanesthetized dog. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 108, 217-223
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記方法では、特に実験動物としてイヌ等を用いた試験系の場合には、頸部の柔軟な行動や後肢による頸部のひっかき行動等により、電極が実験動物の気管から脱離したり、電極が途中で断線することがあり、一定期間を要する中期又は長期における薬物評価の遂行がしばしば困難となり、深刻な問題を生じていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．人工的咳促進のための電気的気管刺激方法であって、
（１）電気パルス発生装置を用いて発生された電気パルスを、動物の気管に双極状態で植え込まれた電極に接続されかつ体外に引き出される導線を経由して、当該電極に伝達させる第一工程、及び
（２）伝達された電気パルスが動物の気管を選択的に刺激して咳反応を誘発させる第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．植え込まれた電極における双極状態が、気管の長手方向に対して略平行方向となる位置関係である双極状態であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．植え込まれた電極の各々の電極が、動物の気管に、当該気管の長手方向に対して略垂直方向に縫い付けられた電極であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．導線が、頸部皮下を通して肩甲骨より体外に引き出される導線であることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．導線が、中空のシリコンチューブで覆われてなる導線であることを特徴とする請求項１〜４記載のいずれかの前項記載の方法；
６．前項１〜５記載のいずれかの請求項記載の方法により誘発される咳反応における動物の薬物レスポンスに基づき薬物の鎮咳効果の有無を判定することを特徴とする薬物の鎮咳効果を評価する方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、試験期間における電極の耐久化に成功した。また、電極の植え込みを実験動物の気管に双極状態で植え込むこと等により、より広範囲の気管粘膜に対して電気的気管刺激を与えることが可能となり、一定期間を要する中期又は長期における薬物評価等の試験期間中、電気的刺激による安定した人工的咳促進を得ることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法は、覚醒下かつ慢性的に咳反応に対する薬物の鎮咳効果を繰り返し評価するうえで極めて有用である。また本発明方法は、鎮咳効果を有する薬物をスクリーニングするための試験にも利用可能であり、医薬品開発への応用もできる。
本発明方法は、人工的咳促進のための電気的気管刺激方法であって、（１）電気パルス発生装置を用いて発生された電気パルスを、動物の気管に双極状態で植え込まれた電極に接続されかつ体外に引き出される導線を経由して、当該電極に伝達させる第一工程、及び（２）伝達された電気パルスが動物の気管を選択的に刺激して咳反応を誘発させる第二工程、を有することを特徴としている。
【０００８】
本発明において対象となる動物としては、上記のような特徴的な工程を与えることができる動物であれば如何なるものであってもよいが、その操作性等の面から、例えば、イヌを好ましいものとして挙げることができる。より好ましくはビーグル種のイヌビーグル犬が挙げられる。尚、これら動物、例えばビーグル種のイヌは、エルエスジー株式会社等から商業的に入手することができる。
【０００９】
本発明方法において用いられる電気パルス発生装置としては、複数の電極の各々と電気的に接触して一連の電気パルスを発生させるための発生装置であれば特に限定されるものではなく、一般に市販されている製品を用いればよい。具体的には例えば、電気刺激装置（型式：SEN-7203、日本光電株式会社）等をあげることができる。
【００１０】
当該電気パルス発生装置は、通常、例えば、約２．５〜３０ボルト、５０ヘルツ、１ミリ秒の矩形波を１秒間、５秒間隔で１０回程度の負荷を与える。動物の個体により電気刺激に対する咳反応感受性が異なるため、通常、例えば、咳反応総回数が約８〜１５回程度に安定して誘発されるように負荷する上記の刺激電圧を調節すればよい。
【００１１】
このように発生された電気パルスを、後述する導線を経由して下記の電極に伝達させ、伝達された電気パルスが動物の気管を選択的に刺激して咳反応を誘発させる。
【００１２】
本発明方法において用いられる、動物の気管に双極状態で植え込まれた電極としては、銅、ステンレス、銀、白金等の金属又は生理学的に許容される他の導電性材料により形成されている。一般的には、電極は生理学的用途に合わせた慣用的且つ都合の良い形状とするのが適当である。
【００１３】
本発明方法で使用される電極の植え込み方法では、動物の気管に双極状態で植え込むことが重要である。当該方法によれば、広範囲の気管粘膜に対して電気的気管刺激を与えることが可能となり、一定期間を要する中期又は長期における薬物評価等の試験期間中、電気的刺激による安定した人工的咳促進を得ることが可能になる。好ましくは、植え込まれた電極における双極状態が気管の長手方向に対して略平行方向となる位置関係である双極状態になるように、２極の電極を気管の長手方向に対して略平行方向に植え込むことがよく、また２極の電極間には１〜数個の気管輪状軟骨を挟むことがよい。
【００１４】
また、本発明方法で使用される電極の植え込み方法では、植え込まれた電極の各々の電極が動物の気管に当該気管の長手方向に対して略垂直方向に縫い付けられた電極になるように、電極の各々の電極が、動物の気管に、当該気管の長手方向に対して略垂直方向に縫い付けられることが特に好ましい。さらに、留置を確実にするために、例えば、電極を植え込む際に、縫合針を用いて電極を気管に縫い付けた後、当該電極の先端と縫い付け元とを入念にらせん巻きにねじ込めばよい。
【００１５】
具体的には例えば、本発明方法の一つの実施態様においては、図１のように、一対の電極が、気管領域の粘膜に、気管領域の両側の輪状軟骨の直上において、気管の長手方向に対して略平行方向となる位置関係になるように、配置される。さらにまた、植え込まれた電極の各々の電極が、動物の気管に当該気管の長手方向に対して略垂直方向に縫い付けられる。
このように実験動物において予め気管に双極状態で植え込まれた電極に電気刺激を負荷させることにより咳反応を誘発させればよい。
【００１６】
本発明方法において用いられる、電極に接続されかつ体外に引き出される導線は、例えば、各電極に接続され、頸部皮下を通して肩甲骨より体外に引き出され、電気パルス発生装置に接続する。当該導線は、生理学的に許容される導電性金属（例えば、アルミニウム線）により形成されている。好ましくは、体外に引き出される際に電極の断線を防ぐために、導線は中空のシリコンチューブで覆われることがよい。  
【００１７】
本発明は、本発明方法により誘発される咳反応における動物の薬物レスポンスに基づき薬物の鎮咳効果の有無を判定することを特徴とする薬物の鎮咳効果を評価する方法（即ち、本発明評価方法）等も含み、これをも提供するものである。
【００１８】
本発明評価方法において評価される薬物とは、本発明方法により誘発される咳反応における動物の薬物レスポンスに対して影響又は無影響を与えるような薬物であって、例えば、鎮咳効果を有する又は有さない薬物等をあげることができる。
このような薬物を、本発明方法に基づく電気的気管刺激を与える前に、実験動物に投与する。投与量は薬物の種類に応じて適宜選択すればよいが、例えば、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重とすればよい。投与に際しては、例えば、薬物を精製水又は生理食塩液にて適当な濃度に希釈し、これを経口投与又は皮下投与すればよい。
【００１９】
本発明評価方法において、実験動物に対して鎮咳効果を有する薬物が有効量投与された場合には、本発明方法に基づく電気的気管刺激を与えても、咳反応を誘発させることがないか又は当該反応を抑制させるような薬物レスポンスを生じる。一方、実験動物に対して鎮咳効果を有する薬物が非有効量投与された場合や実験動物に対して鎮咳効果を有さない薬物が投与された場合には、本発明方法に基づく電気的気管刺激を与えると、咳反応を誘発させるか又は当該反応を増大させるような薬物レスポンスを生じる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
本発明方法の実施態様の一つを図１のとおり例示する。
実験動物としてイヌ（ビーグル種、体重１０ｋｇ程度）を用いた場合における具体例である。
一対の電極が、イヌの気管領域の粘膜に、気管領域の両側の輪状軟骨の直上において、気管の長手方向に対して略平行方向となる位置関係になるように配置され、植え込まれた電極の各々の電極が、動物の気管に当該気管の長手方向に対して略垂直方向に植え込まれている。留置を確実にするために、イヌの気管への電極植え込み固定の際には、縫合針を用いて縫い付けたあと、電極先端と縫い付け元とをらせん巻きにねじ込むことにより強固に固定留置している。さらにこの後、電極は中空のシリコンチューブを通して断線を防いでいる。
本発明方法において用いられる、電極に接続されかつ体外に引き出される導線は、例えば、頸部皮下を通して肩甲骨より体外に引き出されている。体外に引き出される際に電極の断線を防ぐために、導線は中空のシリコンチューブで覆われている。
電気パルス発生装置は、実験動物の気管領域の組織に電気的に接触して選択的に配置されるように適合させた電極の各々と電気的に接触して一連の電気パルスを発生させるための発生装置を含んでいる。尚、当該装置は二つの電極を存在していた。
このように実験動物において予め気管に双極状態で植え込まれた電極に電気刺激を負荷させることにより咳反応を誘発させた。
【００２２】
実施例２
ビーグル犬（日本エルエスジー）を検疫、馴化した後に試験に供した。当該動物は室温２３±２℃、湿度４０〜８０％、換気回数１０回以上／時間、人工照明１２時間（８時〜２０時）に設定された飼育室で、ステンレス・アルミケージ（７００Ｗ×９００Ｌ×８００Ｈ  ｍｍ）に１頭ずつ個別に飼育した。飼育期間中に用いた飼料は、イヌ用固型飼料（ＴＣ−１、マルハペットフード）であり、これを１頭につき１日３００ｇずつを給餌した。健康状態が不良となった個体には補助食として動物用缶詰肉（健犬テシオ、マルハペットフード）を１頭あたり１日１００ｇずつ給餌した。また飼育期間中に用いた飲水は水道水であり、これを自由摂取させた。
鎮咳効果を有する薬物を生理食塩水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させものを用いた。
上記のビーグル犬に対して、実施例１記載の動物の気管への電極の植え込み手術をあらかじめ施した。当該動物の体力が回復した後、当該動物に対して上記の薬物を５、１５、４５ｍｇ／ｋｇの用量にて経口投与した。
前記薬物によるレスポンスを観察するため、当該薬物の投与開始前及び投与開始から一定間隔毎に本発明方法に基づく電気的気管刺激（2.5-30ボルト、50ヘルツ、1ミリ秒の矩形波を1秒間、5秒間隔で10回の一連の電気パルス）を与えた。その結果、当該薬物の投与開始からの時間の経過に伴い、当該動物の咳反応を薬物投与前と比較対照することにより、当該人工的咳反応が抑制させるようなレスポンスが観察された。さらに時間の経過によって最終的には、当該動物の咳反応が当該薬物の投与開始前における咳反応と同等までに回復される現象が観察された。
【００２３】
対照試験として、鎮咳効果を有する薬物の代わりに鎮咳効果を有さない薬物又は精製水のみを用いること以外には実施例２と同様な方法により、（薬物）レスポンスを観察した。
その結果、当該薬物の投与開始からの時間の経過に伴っても、当該動物の咳反応を抑制させるような（薬物）レスポンスは観察されることはなかった。さらに、当該薬物の投与を中止してから一定間隔毎に本発明方法に基づく電気的気管刺激（2.5-30ボルト、50ヘルツ、1ミリ秒の矩形波を1秒間、5秒間隔で10回の一連の電気パルス）を、上記同様に与えた。その結果、当該薬物又は精製水の投与中断からの時間の経過に伴っても、当該動物の咳反応を誘発させるようなレスポンスが継続して観察された。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明により、試験期間における電極の耐久化に成功した。また、電極の植え込みを実験動物の気管に双極状態で植え込むこと等により、より広範囲の気管粘膜に対して電気的気管刺激を与えることが可能となり、一定期間を要する中期又は長期における薬物評価等の試験期間中、電気的刺激による安定した人工的咳促進を得ることが可能になる。
当該方法は、覚醒下かつ慢性的に咳反応に対する薬物の鎮咳効果を繰り返し評価するうえで極めて有用である。また本発明方法は、鎮咳効果を有する薬物をスクリーニングするための試験にも利用可能であり、医薬品開発への応用もできる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明方法の実施態様の一つである、実験動物としてイヌを用いた場合における具体例である。図中の中央部にある白い横長のものが気管（６個程度の輪状軟骨が観察されている。）であり、その両側にある黒い線状のものが気管の長手方向に対して略平行方向に双極状態で植え込まれた電極である。
【図１】
2005253838.tif 000002