(57)【要約】【課題】従来のリン酸化検出方法に比べ、より効率良く、より特異的にＳｍａｄリン酸化阻害剤をスクリーニングする。【解決手段】リン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域及びＳｍａｄ３のリンカー領域に特異的なポリクローナル抗体を作製し、これを用いてリンカー領域のリン酸化を阻害することのできる化合物をスクリーニングする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域及びリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域に特異的なポリクローナル抗体。
【請求項２】
Ｓｍａｄ２のリンカー領域及びＳｍａｄ３のリンカー領域のアミノ酸配列に含まれるペプチドのリン酸化物で哺乳動物を免疫化して作製した抗血清から得られる、請求項１記載のポリクローナル抗体。
【請求項３】
免疫化のための前記Ｓｍａｄ２のリンカー領域のアミノ酸配列に含まれるペプチドのリン酸化物が
Pro Ala Glu Leu p-Ser Pro Thr Thr Leu p-Ser Pro Val Asn His Ser
（配列番号１）
（但し、p-Serはリン酸化されたセリンを表す）であり、免疫化のための前記Ｓｍａｄ３のリンカー領域のアミノ酸配列に含まれるペプチドのリン酸化物が
Ala Gly Ser Pro Asn Leu p-Ser Pro Asn Pro Met p-Ser Pro Ala
（配列番号２）
（但し、p-Serはリン酸化されたセリンを表す）
である請求項２記載のポリクローナル抗体。
【請求項４】
前記哺乳動物がウサギである請求項１〜３のいずれか一項記載のポリクローナル抗体。
【請求項５】
更にリン酸化ペプチドでアフィニティー精製したものである請求項１〜４のいずれか一項記載のポリクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載のポリクローナル抗体の、Ｓｍａｄ２リンカー領域及びＳｍａｄ３リンカー領域のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法への使用。
【請求項７】
Ｓｍａｄ２リンカー領域及びＳｍａｄ３リンカー領域のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）ＴＧＦ−β受容体を発現する又は発現させた哺乳類細胞を、ＴＧＦ−βで処理する前に候補薬剤と接触させる段階、
（ｉｉ）該細胞をＴＧＦ−βとともにインキュベーションする段階、
（ｉｉｉ）インキュベーション後の該細胞を回収しホモジナイズしてホモジネートを得る段階、
（ｉｖ）得られたホモジネートを、Smadタンパク質に特異的な抗体とともにインキュベーションして免疫沈降複合体を形成させる段階、
（ｖ）該免疫沈降複合体を請求項１〜６のいずれか一項記載のポリクローナル抗体とともに反応させてリン酸化されたＳｍａｄタンパク質の存在の有無を検出し、リン酸化の阻害を判断する段階、
を含んでなる上記方法。
【請求項８】
前記薬剤が抗線維化である請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）基質としてのＳｍａｄタンパク質と候補薬剤とを接触させる段階、
（ｉｉ）該Ｓｍａｄタンパク質を活性型ｐ３８と、ＡＴＰの存在下で反応させる段階、
（ｉｉｉ）反応させたＳｍａｄタンパク質中のリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を検出し、リン酸化の阻害を判断する段階、
を含んでなる上記方法。
【請求項１０】
Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）任意の細胞をＴＧＦ−βで刺激し、一定時間後に細胞を回収する段階、
（ｉｉ）該回収した細胞のホモジネートをリン酸化酵素の特異抗体で免疫沈降させる段階、
（ｉｉｉ）該免疫沈降させた試料と、候補薬剤と、Ｓｍａｄ２リコンビナントと、Ｓｍａｄ３リコンビナントとを、インビトロにてインキュベートしてＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３をリン酸化させる段階、
（ｉｖ）反応させたＳｍａｄタンパク質中のリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を、リンカー領域のリン酸化に対する抗体を用いたイムノブロット法で検出し、リン酸化の阻害を判断する段階
を含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化部位特異的抗体及びそれを用いた薬剤のスクリーニング方法に関する。より詳細には、本発明は、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）ファミリーのメンバーが関与するシグナルの伝達物質であるＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリンカー領域のリン酸化部位を特異的に認識する新規抗体に関する。更に本発明は, Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリンカー領域のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ等を包含し、生体内において細胞の分化、増殖抑制、組織修復等、様々な生理活性、細胞調節機能を有する多機能タンパク質のファミリーを形成する。ＴＧＦ−βはその代表的なサイトカインであり、シグナル伝達カスケードにより標的遺伝子群の転写活性を促進又は抑制することが知られている。
【０００３】
ＴＧＦ−βは、血小板などの種々の組織で産生され、いろいろな細胞に作用することが知られている。ＴＧＦ−βは、肝細胞などの上皮細胞には細胞増殖を抑制するが、線維芽細胞などの間葉細胞には細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の蓄積を促進することにより、組織の修復に働く。
【０００４】
活性化したＳｍａｄは、Ｉ型コラーゲンやプラスミノーゲン・アクチベーター・インヒビター・I 型 (PAI-1) のようなECM 蛋白のプロモーター領域に直接結合し、AP-1 や ATF-2 など他の転写因子と複合体を形成し、それぞれの転写を活性化している。
【０００５】
ＴＧＦ−β受容体には２種類あり、分子量の違いからＩ型、ＩＩ型 と呼ばれ、これらが殆どの細胞で発現している。受容体はいずれも細胞内にセリン／スレオニンキナーゼ領域を有している。
【０００６】
ＴＧＦ−βは初めにＩＩ型受容体に結合し、次いでＩ型受容体に結合して、複合体を形成する。この時ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、これにより活性化されたＩ型受容体が、更にＳｍａｄと呼ばれるより下流の一連のＴＧＦ−βシグナル伝達因子をリン酸化することによって、細胞内にシグナルが伝達される（非特許文献１）。受容体によって活性化されたＳｍａｄは、核内に移行した後、標的遺伝子の転写因子として作用する。
【０００７】
Ｓｍａｄタンパク質ファミリーのメンバーは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＢＭＰホモローグであるＤｐｐ（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）のシグナルを修飾する遺伝子のスクリーニングの結果、Ｄｐｐに対するマザー（Ｍａｄ：Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｐｐ）との相同性に基づいて同定された。一方、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＢＭＰ様因子の受容体であるＤＡＦ−４の遺伝子ｄａｆ−４の異常と同様の表現型を示す遺伝子としてｓｍａ−２、−３、−４が得られた。これらの遺伝子がコードするＳｍａタンパク質とＭａｄはいずれもＴＧＦ‐βスーパーファミリーのシグナルを伝達し、互いに高いアミノ酸相同性を有することから、これらをＳｍａｄと呼んでいる。一般にＳｍａｄは５００前後のアミノ酸からなるタンパク質で、哺乳動物ではこれまでに８種類のタンパク質Ｓｍａｄ１〜８が同定されている。
【０００８】
Ｓｍａｄはその構造と機能から３つのタイプに分類することができる。すなわち、受容体によって活性化されてＴＧＦ−βとＢＭＰのそれぞれの経路で特異的なシグナルを伝えるＲ−Ｓｍａｄ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｓｍａｄ）、すべての経路で共通に用いられＲ−Ｓｍａｄと複合体を形成するＣｏ−Ｓｍａｄ（ｃｏｍｍｏｎ−ｍｅｄｉａｔｏｒ  Ｓｍａｄ）、更にこれらのシグナルを伝達するＳｍａｄに抑制的に作用するＩ−Ｓｍａｄ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｓｍａｄ）である。Ｒ−ＳｍａｄとしてはＳｍａｄ１〜３、５及び８が、Ｃｏ−ＳｍａｄとしてはＳｍａｄ４が、Ｉ−ＳｍａｄとしてはＳｍａｄ６及び７が知られている。
【０００９】
一般に、ＳｍａｄのＮ末端側とＣ末端側には、Ｓｍａｄファミリー間で高く保存されたＭＨ１（Ｍａｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  １）ドメイン及びＭＨ２ドメインと呼ばれる領域がそれぞれ存在する。ＭＨ１ドメインとＭＨ２ドメインとはリンカー領域と呼ばれるホモロジーの低い領域で繋がっている。
【００１０】
Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリンカー領域はＥｒｋによってＳｅｒ残基がリン酸化を受けることが知られている（非特許文献２及び３）。同様に、Ｓｍａｄ２のリンカー領域のＳｅｒ２４０及びＳｅｒ２６０はＭＨ１ドメインのＳｅｒ  １１０と同様にＣａｍＫＩＩによってリン酸化される。
【００１１】
Ｒ−Ｓｍａｄの最もＣ末端側にはＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｓｅｒというアミノ酸配列（ＳＳＸＳモチーフ）があり、特にＣ末端に近い２つのＳｅｒがＩ型受容体によってリン酸化を受ける。
【００１２】
ＳｍａｄはＴＧＦ−βファミリーメンバーの経路に特異的な役割を果たし、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３はＴＧＦ−βシグナリングに対して特異的である（非特許文献１）。活性化したＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３はＣｏ−ＳｍａｄであるＳｍａｄ４と相互作用して、核に移行し、標的遺伝子を活性化する。ＴＧＦ−β経路は、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３の活性化と共に、Ｉ−ＳｍａｄであるＳｍａｄ６とＳｍａｄ７によりシグナリングのバランスをとっている。
【００１３】
【非特許文献１】Ｈｅｌｄｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：４６５−４７１，１９９７
【非特許文献２】Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：６１８−６２２，１９９７
【非特許文献３】Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １３：８０４−８１６，１９９９
【非特許文献４】Journal of Biological Chemistry 278(13):11721-11728(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述のように、ＳｍａｄはＴＧＦ−β依存的なECM蛋白の蓄積に関わる重要なタンパク質であることから、このタンパク質を効率よく阻害することは、肝臓をはじめ、腎臓、肺等の線維化に対し、抗線維化の効果が期待できると考えられる。
【００１５】
Ｓｍａｄはその一次構造上、ＤＮＡ結合領域、リンカー領域、調節領域の３つの領域に分けられる。従来Ｃ末端領域のリン酸化に特異的な抗体を用いた解析（非特許文献４）や、Ｃ末端領域を欠くミュータントを３２Ｐによって標識（ｌａｖｅｌ）し解析した結果、ＴＧＦ−βによるＳｍａｄの活性化はＣ末端領域のリン酸化が重要であると考えられてきた（非特許文献４）。しかしながら、これまでリンカー領域のリン酸化を選択的に解析することはできず、従ってその重要性については全く不明であった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
そこで本発明者らは、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリンカー領域のリン酸化を特異的に検出することができる抗体を作製することを鋭意検討し、これを用いてリンカー領域のリン酸化の解析を実施したところ、Ｃ末端領域のリン酸化だけでなくリンカー領域のリン酸化もＳｍａｄの活性化に極めて重要であることを見出した。特に、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３が核に存在することが確認され、そのため転写が持続的に行われると考えられる。これが病態時にECM 蛋白の産生が促進される要因の一つであると考えられる。
【００１７】
そこで、このリンカー領域のリン酸化を阻害することにより、生理的な条件下ではあまり影響を与えないが、ECM蛋白産生などが持続的に行われている病態時にのみ特異的にECM蛋白の転写を抑制することができると考えられる。
【００１８】
即ち、本発明は、リン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域及びＳｍａｄ３のリンカー領域に特異的なポリクローナル抗体に関する。
また、本発明は、Ｓｍａｄ２のリンカー領域及びＳｍａｄ３のリンカー領域のアミノ酸配列に含まれるペプチドのリン酸化物で哺乳動物を免疫化して作製した抗血清から得られる、リン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３に特異的に結合するポリクローナル抗体に関する。
【００１９】
また、本発明は、Ｓｍａｄ２リンカー領域及びＳｍａｄ３リンカー領域のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）ＴＧＦ−β受容体を発現する又は発現させた哺乳類細胞を、ＴＧＦ−βで処理する前に候補薬剤と接触させる段階、
（ｉｉ）該細胞をＴＧＦ−βとともにインキュベーションする段階、
（ｉｉｉ）インキュベーション後の該細胞を回収しホモジナイズしてホモジネートを得る段階、
（ｉｖ）得られたホモジネートを、Ｓｍａｄタンパク質に特異的な抗体とともにインキュベーションして免疫沈降複合体を形成させる段階、
（ｖ）該免疫沈降複合体を本発明のポリクローナル抗体とともに反応させてリン酸化されたＳｍａｄタンパク質の存在の有無を検出し、リン酸化の阻害を判断する段階、
を含んでなる上記方法、にも関する。
【００２０】
また更に、本発明は、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）基質としてのＳｍａｄタンパク質と候補薬剤とを接触させる段階、
（ｉｉ）該Ｓｍａｄタンパク質を活性型ｐ３８と、ＡＴＰの存在下で反応させる段階、
（ｉｉｉ）反応させたＳｍａｄタンパク質中のリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を検出し、リン酸化の阻害を判断する段階、
を含んでなる上記方法、にも関する。
【００２１】
更に本発明は、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）任意の細胞をＴＧＦ−βで刺激し、一定時間後に細胞を回収する段階、
（ｉｉ）該回収した細胞のホモジネートをリン酸化酵素の特異抗体で免疫沈降させる段階、
（ｉｉｉ）該免疫沈降させた試料と、候補薬剤と、Ｓｍａｄ２リコンビナントと、Ｓｍａｄ３リコンビナントとを、インビトロにてインキュベートしてＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３をリン酸化させる段階、
（ｉｖ）反応させたＳｍａｄタンパク質中のリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を、リンカー領域のリン酸化に対する抗体を用いたイムノブロット法で検出し、リン酸化の阻害を判断する段階、
を含んでなる上記方法、にも関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の抗体、スクリーニング方法等によれば、従来のようにリンカー領域のリン酸化とＣ末端領域のリン酸化とを区別せずにＣ末端領域でのリン酸化のみを検出していたリン酸化検出方法に比べ、より効率良く、より特異的にＳｍａｄリン酸化阻害剤、ひいては抗線維化薬をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、リン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域及びリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域、又は該リンカー領域並びにＳｍａｄ２及び３のＣ末端領域の両方に特異的なポリクローナル抗体に関する。
【００２４】
本発明のポリクローナル抗体は、Ｓｍａｄ２のリンカー領域及びＳｍａｄ３のリンカー領域のアミノ酸配列に含まれるペプチドのリン酸化物で哺乳動物を免疫化して作製した抗血清から得ることができる。
【００２５】
免疫化すべき哺乳動物はウサギ、ヤギ、マウス等であることが好ましい。
本発明のポリクローナル抗体は、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリンカー領域のリン酸化に特異的である。
【００２６】
Ｓｍａｄ２及び３の、リンカー領域及びＣ末端領域を含むアミノ酸配列はそれぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＭ＿００５９０１（ｈｕｍａｎ  Ｓｍａｄ２）及びＧｅｎｂａｎｋ：ＮＭ＿００５９０２（ｈｕｍａｎ  Ｓｍａｄ３）に示されている。リン酸化されるペプチドの位置は図１に模式的に示されている。図１は、Ｓｍａｄ蛋白質の一次構造による各機能ドメインを示し、Ｎ末端側にＭＨ１ドメイン、Ｃ末端側にＭＨ２ドメインを有し、これら二つのドメインを繋げている領域がリンカー領域と呼ばれている。リン酸化酵素によりリン酸化されると考えられる又はリン酸化される部位は、リンカー領域に４箇所、Ｃ末端領域に２箇所ある。
【００２７】
具体的には、以下の通りである。
Ｓｍａｄ２のリンカー領域のリン酸化ペプチドは、アミノ酸残基２４５番目から２５９番目までに対応し、
Pro Ala Glu Leu p-Ser Pro Thr Thr Leu p-Ser Pro Val Asn His Ser  （配列番号１）
で表される。但し、p-Serはリン酸化されたセリンを表し、そのリン酸化部位は２４９番目のＳｅｒ、２５４番目のＳｅｒに該当する。
【００２８】
Ｓｍａｄ３のリンカー領域のリン酸化ペプチドは、アミノ酸残基２０１番目から２１４番目までに対応し、
Ala Gly Ser Pro Asn Leu p-Ser Pro Asn Pro Met p-Ser Pro Ala  （配列番号２）
で表される。但し、p-Serはリン酸化されたセリンを表し、そのリン酸化部位は２０７番目のＳｅｒ、２１２番目のＳｅｒに該当する。
【００２９】
Ｓｍａｄ２のＣ末端リン酸化ペプチドは、アミノ酸残基４５９番目から４６７番目までに対応し、 
Pro Ser Val Arg Cys Ser p-Ser Met p-Ser  （配列番号３）
で表される。但し、p-Serはリン酸化されたセリンを表し、そのリン酸化部位は４６５番目のＳｅｒ、４６７番目のＳｅｒに該当する。
【００３０】
Ｓｍａｄ３のＣ末端リン酸化ペプチドは、アミノ酸残基４１７番目から４２５番目までに対応し、 
Pro Ser Ile Arg Cys Ser p-Ser Val p-Ser  （配列番号４）
で表される。但し、p-Serはリン酸化されたセリンを表し、そのリン酸化部位は４２３番目のＳｅｒ、４２５番目のＳｅｒに該当する。
【００３１】
本発明のポリクローナル抗体は、更にリン酸化ペプチドのアフィニティー精製に付して得られたものであることが好ましい。例えば、Ｓｍａｄ２及び３のリン酸化されたリンカー領域及びＣ末端ペプチドのアフィニティーカラム（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔｈｉｏｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ等）をそれぞれ作製し、それぞれの抗体をアフィニティー精製すればよい。
【００３２】
以下にＳｍａｄタンパク質のリンカー領域のリン酸化物に特異的な抗体の作製方法について述べる。
Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリンカー領域、並びにＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３のＣ末端のそれぞれに特異的な上記の４種のリン酸化ペプチドでウサギ等の哺乳動物を免疫化して、抗血清を得る。得られた抗血清から、リン酸化されたＳｍａｄに特異的な抗血清を選択し、更にリン酸化ペプチドでアフィニティー精製することにより、ポリクローナル抗体を得る。
【００３３】
本発明のリン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域及びリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域に特異的なポリクローナル抗体は、Ｓｍａｄ２リンカー領域及びＳｍａｄ３リンカー領域のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法に使用することができる。
【００３４】
そこで、本発明のＳｍａｄ２リンカー領域及びＳｍａｄ３リンカー領域のリン酸化を阻害するかどうかを調べたい薬剤（本願では、候補薬剤とも言う）のスクリーニング方法は、少なくとも以下の段階からなる。
（ｉ）ＴＧＦ−β受容体を発現する又は発現させた哺乳類細胞を、ＴＧＦ−βで処理する前に候補薬剤と接触させる段階、
（ｉｉ）該細胞をＴＧＦ−βとともにインキュベーションする段階、
（ｉｉｉ）インキュベーション後の該細胞を回収しホモジナイズしてホモジネートを得る段階、
（ｉｖ）得られたホモジネートを、Ｓｍａｄタンパク質に特異的な抗体とともにインキュベーションして免疫沈降複合体を形成させる段階、
（ｖ）該免疫沈降複合体を本発明のポリクローナル抗体とともに反応させてリン酸化されたＳｍａｄタンパク質の存在の有無を検出し、リン酸化の阻害を判断する段階。
【００３５】
上記（ｉ）〜（ｖ）の段階では、ＴＧＦ−β受容体を発現する若しくは発現させた哺乳類の培養細胞、又はＳｍａｄ２若しくは３に必要に応じてＧＳＴ、ＦＬＡＧなどのタグを付した融合タンパク質を発現させた細胞を用いる。その細胞をＴＧＦ−βで刺激し、任意の時間後細胞を回収し、ホモジナイズする。そのホモジネートを公知のＳｍａｄ特異抗体で免疫沈降させる。公知のＳｍａｄ特異抗体としては、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、又はＳｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂ．社からの抗Ｓｍａｄ２／３抗体が挙げられる。次いで、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３を特異的に認識する抗体（以下、それぞれＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化特異的抗体とも言う）で領域特異的なリン酸化動態を確認する。この一連の段階において、候補薬剤で細胞を処理した後に、該細胞をＴＧＦ−βとともにインキュベーションし、次いでＳｍａｄタンパク質に特異的な抗体とともにインキュベーションして免疫沈降複合体を形成させてから、この複合体を本発明のリン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域及びリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域に特異的なポリクローナル抗体と反応させ、リン酸化されたＳｍａｄタンパク質の存在の有無を検出すれば、該候補薬剤がＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化を阻害するか否かを判断することができる。すなわち、ポリクローナル抗体がリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を検出すれば、該細胞中のＳｍａｄ２及び３のリンカー領域がＴＧＦ−βシグナル機構によりリン酸化されていたことになり、候補薬剤はＳｍａｄのリン酸化を阻害する薬剤ではないことになる。一方、ポリクローナル抗体がリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を検出しなければ、リンカー領域はリン酸化されていないことになり、候補薬剤はＳｍａｄのリン酸化を阻害する化合物であるということになる。これによりＴＧＦ−βによるＳｍａｄのリン酸化を特異的に阻害する化合物を目的に添ってスクリーニングすることができる。
【００３６】
上記スクリーニング方法は、Ｓｍａｄ２リンカー領域及びＳｍａｄ３リンカー領域のリン酸化を阻害する薬剤の製造方法において、一つの工程（段階）として組み込むことができ、当業者であれば本明細書の開示から容易に上記スクリーニング方法が当該薬剤製造方法の一部をなすことが理解できるはずである。
【００３７】
これにより得られた薬剤は、Ｓｍａｄタンパク質のリンカー領域のリン酸化を阻害し、例えば非生理的なＴＧＦ−βの作用の一つであるコラーゲンの持続的生産等に対する抗線維化薬として有用である。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法のもう一つの態様である、ｐ３８を用いる、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法は、少なくとも以下の段階からなる。
（ｉ）基質としてのＳｍａｄタンパク質と候補薬剤とを接触させる段階、
（ｉｉ）該Ｓｍａｄタンパク質を活性型ｐ３８と、ＡＴＰの存在下で反応させる段階、
（ｉｉｉ）反応させたＳｍａｄタンパク質中のリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を検出し、リン酸化の阻害を判断する段階。
【００３９】
このスクリーニング方法はいわゆるインビトロキナーゼアッセイを用いている。インビトロキナーゼアッセイとは、試験管（チューブ）内で、リン酸化酵素と基質（本発明の場合、Ｓｍａｄタンパク質）をＡＴＰの存在下で反応させて基質をリン酸化させるものである。即ち、細胞内での反応ではなく、また他の干渉物質のない条件下で、Ｓｍａｄタンパク質が直接リン酸化されるか否かを見極められる方法である。
【００４０】
また、本発明のスクリーニング方法のもう一つの態様である、Ｓｍａｄリコンビナントを用いる、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を阻害する薬剤のスクリーニング方法は、少なくとも以下の段階からなる。
（ｉ）任意の細胞をＴＧＦ−βで刺激し、一定時間後に細胞を回収する段階、
（ｉｉ）該回収した細胞のホモジネートをリン酸化酵素の特異抗体で免疫沈降させる段階、
（ｉｉｉ）該免疫沈降させた試料と、候補物質と、Ｓｍａｄ２リコンビナントと、Ｓｍａｄ３リコンビナントとを、インビトロにてインキュベートしてＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３をリン酸化させる段階、
（ｉｖ）反応させたＳｍａｄタンパク質中のリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を、リンカー領域のリン酸化に対する抗体を用いたイムノブロット法で検出し、リン酸化の阻害を判断する段階。
【００４１】
具体的には、培養細胞を無血清条件下で培養した後、TGF-βを処置し、所定時間後に細胞を回収し、リン酸化酵素の活性型であるリン酸化JNK又はリン酸化p38（これらの酵素は、酵素自身がリン酸化されることにより活性型となる）をそれらの特異抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能）で免疫沈降させ、プロテインＧ−セファロースを用いて単離し、キナーゼバッファーで洗浄し懸濁させたものを酵素標品とする。この酵素標品と、大腸菌で作製したリコンビナントGST-Smad3及びGST-Smad2 2μgを100μM ATPを含む50μl キナーゼバッファーにて反応させる。それをSDSポリアクリルアミド電気泳動により分離し、消費されたＡＴＰを化学発光により定量するか、又は作製した各リン酸化抗体を用いたイムノブロット法等によりリン酸化Ｓｍａｄを検出する。
【００４２】
ここで、上記リン酸化酵素の特異抗体とは、ｐ３８又はＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ）の活性化型酵素に対する特異的抗体のことを言う。ｐ３８やＪＮＫはいずれもリン酸化されることにより活性化され、それぞれの活性化型酵素に対する抗体としては、以下のものが挙げられる。
【００４３】
抗  活性型p３８抗体（Ａｎｔｉ‐Ａｃｔｉｖｅ  ｐ３８／ｐＴＧｐＹ、  ｒａｂｂｉｔ、メーカー：Ｐｒｏｍｅｇａ社）
ｐ３８自身のリン酸化部位であるアミノ酸182番目のThr、183番目のGly、184番目のTyrの内、182番目のThr、184番目のTyrがリン酸化されているp38に対する特異的な抗体。
抗  活性型JNK抗体（Ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｖｅ  ＪＮＫ／ｐＴＰｐＹ、 ｒａｂｂｉｔ）／メーカー：Ｐｒｏｍｅｇａ社）
ＪＮＫ自身のリン酸化部位であるアミノ酸183番目のThr、184番目のPro、185番目のTyrの内、183番目のThr、185番目のTyrがリン酸化されているJNKに対する特異的な抗体。
【００４４】
Ｓｍａｄ２リコンビナント及びＳｍａｄ３リコンビナントとは、Ｓｍａｄ３及びＳｍａｄ２のＮ末端にＧＳＴを融合させたリコンビナント蛋白質のことであり、大腸菌（ＤＨ５α）を用いて作製したものである。ＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で発現誘導されるよう構成させたＧＳＴ−Ｓｍａｄ２及びＧＳＴ−Ｓｍａｄ３を含むプラスミドを大腸菌に組み込み、その大腸菌を一晩培養し、ＩＰＴＧで発現させた後、超音波破砕により大腸菌を破壊する。得られた抽出液の遠心上清をグルタチオンセファロース４Ｂカラムに添加し、ＰＢＳ（−)及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ  ８．０で洗浄後、１０ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ  ８．０でＧＳＴ−Ｓｍａｄタンパク質を溶出する。このようにして得られたＧＳＴ−Ｓｍａｄ３及びＧＳＴ−Ｓｍａｄ２を各試験に用いる。
本発明の抗体を用いてＳｍａｄ３のリンカー領域がｐ３８及びＪＮＫによりリン酸化されることが確認された。本反応系に候補化合物で処置することにより、リン酸化を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
【００４５】
（１）Ｓｍａｄを介する肝線維化シグナル伝達機構
ＴＧＦ−βシグナル伝達物質であるＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３の、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）によりリン酸化されるそれぞれのリンカー部位と、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体によってリン酸化されるそれぞれのＣ末端部位とに対して特異的な、抗Ｓｍａｄ２及び３のリン酸化物に対する抗体を、本発明者らは計４種類作製した。更に、培養筋線維芽細胞を用いた検討から、活性化したｐ３８ＭＡＰＫが、Ｓｍａｄ３のリンカー部位をリン酸化させることで、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の産生を促していることを見出した。本発明者らは、これら抗体を用い、障害肝組織中の活性化星細胞（ＨＳＣ）及び筋繊維芽細胞（ＭＦＢ）におけるＳｍａｄ２及び３のリン酸化状態を比較検討し、Ｓｍａｄを介したシグナル伝達を明らかにした。
それぞれの部位に特異的なリン酸化ペプチドで各々ウサギ３〜５羽を免疫し、抗血清を得た。これらからリン酸化されたＳｍａｄに特異的な抗血清だけを選択し、抗原特異性を高めるために、免疫したペプチドでアフィニティ精製した。
【００４６】
急性肝障害ラットでは、ＣＣｌ４投与後３６時間で中心静脈域を中心に肝細胞の脱落と強い炎症細胞浸潤が認められ、７２時間でこれらは改善した。
免疫組織学的検討では、肝障害の中心静脈域にα  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｔｌｅ  Ａｃｔｉｎ及びＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性となった活性化ＨＳＣ細胞を認めた。正常肝には認められなかったが、障害肝の活性化ＨＳＣ細胞において、リンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３とＣ末端がリン酸化されたＳｍａｄ２及び３は、核内に認められた。また、リンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ２は細胞質に認められた。
【００４７】
ラット肝から星細胞を分離し、抗Ｓｍａｄ２及び３抗体で免疫沈降後、ウェスタン法でリン酸化状態を解析した。正常星細胞でＳｍａｄ２及び３は殆どリン酸化されていなかった。投与後３６時間をピークにＳｍａｄ２及び３のリンカー部とＣ末端のリン酸化は全て亢進し、７２時間後に減少した。
【００４８】
慢性肝障害ラットの組織学的検討では、ＣＣｌ４連続投与後３〜６週間で線維化の進展に伴い小葉構造の改築が認められた。
免疫組織学的検討では、障害肝において線維束に沿ってαＳＭＡ及びＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性のＭＦＢ様細胞を認めた。この細胞では、リンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３とＣ末端がリン酸化されたＳｍａｄ２はそれぞれ核内に認められ、リンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ２は細胞質に認められた。しかし、Ｃ末端がリン酸化されたＳｍａｄ３は認められなかった。
【００４９】
ＭＦＢ様細胞を分離し、ウェスタン法でリン酸化状態を解析した。連続投与後３〜６週間でＳｍａｄ２及び３のそれぞれのリンカー部とＣ末端のリン酸化が強く認められた。しかし、血中ＴＧＦ−β濃度の上昇にもかかわらずＳｍａｄ３のＣ末端のリン酸化は認められなかった。
急性肝障害後のＨＳＣ細胞とは異なり、慢性肝障害過程のＭＦＢ細胞においては、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化に伴ってＳｍａｄ３のリンカー部位が恒常的にリン酸化され核に移行しているため、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体からＣ末端リン酸化ができなくなっていると考えられる。
【００５０】
（２）初代培養星細胞におけるリン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３に特異的な抗体を用いたＴＧＦ−βシグナル伝達機構の解析
本発明者らは、肝疾患におけるＴＧＦ−βシグナル伝達の意義について報告した（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００２，３５：４９−６１）。
【００５１】
本発明者らは更に、ＴＧＦ−βによるＳｍａｄ２及び３のリン酸化に焦点を絞り、このリン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３に特異的な抗体を用いて初代培養星細胞におけるＳｍａｄ２とＳｍａｄ３を介するシグナル伝達の相違を明らかにした。
【００５２】
それぞれの部位に特異的なリン酸化ペプチドで各々ウサギ３〜５羽を免疫し、抗血清を得た。これらからリン酸化されたＳｍａｄに特異的な抗血清だけを選択し、抗原特異性を高めるために、免疫したペプチドでアフィニティ精製した。
【００５３】
常法により初代培養星細胞を分離培養し、ＴＧＦ−βを添加したところ、５分後からほぼ同時にＳｍａｄ２及び３のＣ末端のみならずＳｍａｄ３のリンカー部位が著明にリン酸化された。しかし、Ｓｍａｄ２リンカー部位のＴＧＦ−β依存性リン酸化は軽度であった。
【００５４】
Ｓｍａｄ３リンカー部位のリン酸化は、ＴＧＦ−βを添加すると、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化を伴って増強し、その阻害剤で減弱した。
Ｓｍａｄ２のリンカーがリン酸化されると、Ｓｍａｄ４との２量体形成が促進した。しかし、Ｓｍａｄ２の核移行にはＣ末端のリン酸化が必要であった。
【００５５】
ＴＧＦ−β添加後、Ｓｍａｄ３は、リンカー部がリン酸化されない場合においてもＩ型受容体によりＣ末端がリン酸化され、Ｓｍａｄ４と２量体を形成し、核に移行していた。Ｓｍａｄ３・Ｓｍａｄ４複合体は、標的遺伝子Ｓｍａｄ７の転写調節領域上のＳｍａｄ結合部位に存在しており、ＴＧＦ−β依存性にその転写活性を促進した。
【００５６】
逆に、Ｃ末端がリン酸化されない場合においても、ｐ３８ＭＡＰＫによる刺激だけでリンカー部がリン酸化され、Ｓｍａｄ４と２量体を形成し、核に移行していた。このＳｍａｄ３・Ｓｍａｄ４複合体も、Ｓｍａｄ７のＳｍａｄ結合部位に存在していたが、驚いたことにＳｍａｄ７の転写活性は促進されなかった。
【００５７】
ｐ３８ＭＡＰＫ依存性にリン酸化されたＳｍａｄ３は、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体依存性にリン酸化されたＳｍａｄ３とは異なる独立したシグナルを伝達すると考えられた。初代培養星細胞におけるＳｍａｄ７転写の活性化には、Ｓｍａｄ３のＣ末端がリン酸化されることが必要であると考察された。
【００５８】
（３）培養筋線維芽細胞におけるリン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３に特異的な抗体を用いたＴＧＦ−βシグナル伝達機構の解析
星細胞の活性化に伴い形質転換した筋線維芽細胞は、肝線維化に重要な役割を果たすことが知られている。またＴＧＦ−βは肝線維化を進展させる重要なサイトカインである。しかし培養筋線維芽細胞におけるＴＧＦ−βシグナル伝達物質であるＳｍａｄ２及び３の部位特異的リン酸化を指標としたＴＧＦ−βシグナル伝達の解析は、これまで報告されていない。
【００５９】
本発明者らは、Ｓｍａｄ２及び３のリン酸化に焦点を絞り、このリン酸化抗体を用いて培養筋線維芽細胞におけるＳｍａｄを介するシグナル伝達を明らかにした。
【００６０】
Ｓｍａｄ２及び３のそれぞれのリンカー部位とＣ末端部位に特異的なリン酸化ペプチドで各々ウサギ３〜５羽を免疫し、抗血清を得た。
常法により初代培養星細胞を分離培養し、１４日目の活性化星細胞（筋線維芽細胞様細胞）を実験に用いた。Ｓｍａｄ２及び３のリン酸化は、抗Ｓｍａｄ２及び３抗体で免疫沈降後、部位特異的にリン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３に対する抗体を用いたウェスタン法によって検討した。本細胞においてＳｍａｄ２及び３のリンカー部位とＳｍａｄ２のＣ末端は、すでにリン酸化された状態であった。ＴＧＦ−βを添加したところ、Ｓｍａｄ２のＣ末端のみならずＳｍａｄ３のリンカー部位が著名にリン酸化された。しかし、Ｓｍａｄ３のＣ末端はリン酸化されなかった。
【００６１】
Ｓｍａｄ３のリンカー部位のリン酸化に比例して、ｐ３８ＭＡＰＫもリン酸化されており、ＴＧＦ−βを添加すると著明にリン酸化された。Ｓｍａｄ３のリンカー部位のリン酸化は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤によって減弱したことから、ＴＧＦ−βによって活性化されたｐ３８ＭＡＰＫがリン酸化に関わっていると推測された。
【００６２】
ｐ３８ＭＡＰＫによる刺激でリン酸化されたＳｍａｄ３は、Ｓｍａｄ４と２量体を形成し、核に移行していた。このＳｍａｄ３・Ｓｍａｄ４複合体は、ＥＣＭタンパク質の一つであるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）のＳｍａｄ結合部位に存在しており、その転写活性を促進した。
【００６３】
初代培養星細胞と異なり、筋線維芽細胞ではｐ３８ＭＡＰＫが活性化され、Ｓｍａｄ３のリンカー部位が恒常的にリン酸化され核に移行するため、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体からＣ末端のリン酸化ができなくなっていると推測される。リンカー部位のリン酸化に伴うＳｍａｄ３の活性化は、同細胞におけるＥＣＭタンパク質の持続的蓄積性に強く関わっているものと考察された。
【実施例】
【００６４】
例１  リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄに特異的な抗体の作製と特異性の確認
（１）結果の概要
Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のそれぞれのリンカー領域、並びにそれぞれのＣ末端に特異的なリン酸化ペプチド
Pro Ala Glu Leu p-Ser Pro Thr Thr Leu p-Ser Pro Val Asn His Ser  （配列番号１）、
Ala Gly Ser Pro Asn Leu p-Ser Pro Asn Pro Met p-Ser Pro Ala  （配列番号２）、
Pro Ser Val Arg Cys Ser p-Ser Met p-Ser  （配列番号３）、
Pro Ser Ile Arg Cys Ser p-Ser Val p-Ser  （配列番号４）
（但し、p-Serはリン酸化されたセリンを表す）
を作製し、それぞれのペプチドとキャリアタンパク質として用いるウシサイクログロブリンとを結合させ、その融合タンパク質とアジュバンドとの混合物を作製した。このアジュバンド複合体で３〜５匹のウサギを免疫し、その後２週間おきに同様の方法で追加免疫を４〜７回実施した。最終的にそれぞれのウサギから採血し、抗血清を得た。次いで、リン酸化されたＳｍａｄ２及び３のリンカー領域及びＣ末端ペプチドのアフィニティーカラム（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔｈｉｏｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をそれぞれ作製し、それぞれの抗体をアフィニティー精製した。即ち、作製したリン酸化ペプチドのアフィニティーカラムにそれぞれ得られた抗血清を添加し、０．２Ｍ  グリシン‐ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ２．５）で溶出後、目的の抗体を含む分画を採取し、精製抗体とした。用いたペプチドのＳｍａｄタンパク質の１次構造上における位置を図１に示す。
【００６５】
（２）方法
リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３の検出並びに抗体の特異性を確認した。
ＴＧＦ−β受容体を発現する培養細胞又は発現させた培養細胞、又はＳｍａｄ２又はＳｍａｄ３にＧＳＴ等のタグが付いた融合タンパク質を発現させた細胞を、ＴＧＦ−βで刺激し、任意の時間後細胞を回収し、ホモジネートする。そのホモジネートをＳｍａｄ特異抗体で免疫沈降させた後、それぞれリン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３に特異的な抗体で領域特異的なリン酸化動態を確認する。より具体的には以下の操作を行った。
【００６６】
ＦＬＡＧタグＳｍａｄ３及びＳｍａｄ２ｃＤＮＡ（ＷＴ）、それらのリンカー領域のリン酸化部位を変異させたｃＤＮＡ（ＥＰＳＭ）、及びＣ末端領域のリン酸化部位を変異させたｃＤＮＡ（３Ｓ−Ａ）を作製し、ＣＭＶプロモーター下で構成的に発現させるような発現ベクターを構築した。細胞は既述のＣＣｌ４処置ラットから単離精製した肝星細胞（ＨＳＣ）を培養し、筋線維芽細胞様に分化させた細胞、及びラット正常肝臓から樹立された肝細胞クローン９(I.B.,Weinstein, et.al. Cancer Res. 35, 253-263 (1975))を用いた。すなわち、ＤＭＥＭ培地（５％ ウシ胎児血清含有）にて培養したラット肝由来筋線維芽細胞(2×106cells/100mm dish)に、無血清条件下にて培養したクローン９に、lipofectAMINE（invitrogen）を用いたリポフェクション法によりそれぞれのベクターを導入した。細胞を洗浄後36時間培養し、無血清条件下にて２００ｐＭ ＴＧＦ-β（R&D  Systems）と30分培養した。細胞をRIPA バッファー（10 mM Tris-HCl, pH7.8/1% NP40/0.15M MaCl/1 mM EDTA/10μg/ml aprotinin）にてホモジネーションし、得られたライゼートの15000g遠心上清を抗Flag抗体（sigma）、ｐｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Amersham Bioscience）を用いインキュベーションすることにより免疫沈降反応させた。反応後、沈降物の一部についてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行い、得られたゲルをPVDF膜に転写後、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリンカー領域リン酸化特異的抗体並びにＣ末端リン酸化特異的抗体を用いてイムノブロットを行った。検出は、ＨＲＰ標識した2次抗体/抗ＩｇＧ、ＩｇＨ抗体（Amersham Bioscience）を用いた化学発光法にて行った。これにより、リンカー領域のリン酸化に対する抗体は、リンカー領域のリン酸化部位を変異させた蛋白質（ＥＰＳＭ）は認識せず、Ｃ末端のリン酸化に対する抗体はＣ末端のリン酸化部位を変異させた蛋白質（３Ｓ−Ａ）は認識しなかったことより、各抗体の特異性は確認した。
【００６７】
なお、３Ｓ−ＡとはＣ末端のリン酸化部位であるＳｅｒ２箇所をＡｌａに置換したものである。Ｓｍａｄ３及びＳｍａｄ２それぞれのリン酸化されるＳｅｒの位置はＳｍａｄ３では４２３番目のＳｅｒ、４２５番目のＳｅｒであり、Ｓｍａｄ２では４６５番目のＳｅｒ、４６７番目のＳｅｒである。
【００６８】
また、ＥＰＳＭはリンカー領域のリン酸化部位であるＳｅｒ３箇所をＡｌａに置換し、ＴｈｒをＶａｌに置換したものである。Ｓｍａｄ３及びＳｍａｄ２それぞれのリン酸化されるＳｅｒ及びＴｈｒの位置は、Ｓｍａｄ３では１７８番目のＴｈｒ、２０３番目のＳｅｒ、２０７番目のＳｅｒ、２１２番目のＳｅｒであり、Ｓｍａｄ２では２２０番目のＴｈｒ、２４５番目のＳｅｒ、２５０番目のＳｅｒ、２５５番目のＳｅｒである。
【００６９】
例２  本抗体を用いた試験系においてリン酸化を阻害する化合物を検出した一例／既知のp38（リン酸化酵素）阻害剤を用いた実験例
（１）結果の概要
上記例１の実験方法に基づき、化合物をＴＧＦ-βで処置する前に既知のp38阻害剤で処置しておくことにより、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を阻害する化合物をスクリーニングできる。本系においてリン酸化酵素であるp38の阻害剤ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２１０１９０、ＰＤ１６９３１６（いずれもCalbiochem）はリンカー領域のリン酸化を阻害した（図３）。
【００７０】
リンカー領域のリン酸化部位を変異させたｃＤＮＡを発現させた細胞ではＴＧＦ-β依存的な転写活性が抑制されることは既報により報告されている（F.Furukawa, K.Matsuzaki et.al., Hepatology in press）。また、リンカー領域のリン酸化を阻害するp38阻害剤処置においてもＴＧＦ-β依存的な転写活性が抑制された（図４）。
【００７１】
これらのことより、Smad3のリンカー領域のリン酸化を阻害することはその活性を抑制することにつながり、本抗体を用いたリン酸化の検出ならびにリン酸化阻害の検出方法は、リン酸化を阻害する化合物の検出のみならずSmad3を阻害する化合物のスクリーニングにもなり得る。
【００７２】
（２）方法
ラット肝由来筋線維芽細胞(ＭＦＢ,  2×106cells/100mm dish)をＤＭＥＭ（５％ウシ胎児血清含有）にて数日間培養し、無血清条件下にて２００ｐＭ ＴＧＦ-β（R&D  Systems）と30分培養した。細胞をRIPA バッファー（10 mM Tris-HCl, pH7.8/1% NP40/0.15M MaCl/1 mM EDTA/10μg/ml aprotinin）にてホモジネーションし、得られたライゼートの15000g遠心上清をＳｍａｄ特異抗体、ｐｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Amersham Bioscience）を用いインキュベーションすることにより免疫沈降反応させた。反応後、沈降物の一部についてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行い、得られたゲルをPVDF膜に転写後、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリンカー領域リン酸化特異的抗体並びにＣ末端リン酸化特異的抗体を用いてイムノブロットを行った。検出は、ＨＲＰ標識した2次抗体/抗ＩｇＧ、ＩｇＨ抗体（Amersham Bioscience）を用いた化学発光法にて行った。化合物の処置は、TGF-β添加の30分前に行い、前記の方法に従い実施した。検出されたバンドは、イメージングアナライザーを用いて定量化した。
【００７３】
また、ＴＧＦ-β依存的な転写活性は、既報に従い測定した。すなわち、ＴＧＦ-βの標的遺伝子として知られているプラスミノーゲンアクチベータインヒビターI（ＰＡＩ-Ｉ）のプロモーター領域のｐＳｍａｄ３結合部位を含む領域のＤＮＡを組み込んだｐＧＬ３ルシフェラーザ発現ベクターを用いた。作製したルシフェラーゼ発現ベクターは、ＲＰＭＩ１６４０（５％ ウシ胎児血清含有）にて数日間培養したＨｅｐＧ２細胞の場合、ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（QIAGEN）を用いたリポフェクション法にて導入し、MFBF1の場合、lipofectAMINE（invitrogen）を用いたリポフェクション法にて導入した。その後、化合物を処置し、120分後にTGF-βを添加し、24あるいは48時間後細胞を回収しルシフェラーゼ活性を既報に従い測定した。
【００７４】
例３  抗体を用いたリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の局在性の検出
（１）結果の概要
リンカー領域のリン酸化部位に変異を与えたＳｍａｄ３を細胞に発現させ、TGF-β刺激で刺激後、リンカー領域のリン酸化を作製した特異抗体で免疫組織化学的な検出を行った。この抗体を用いることによりＳｍａｄ３のリンカー領域のリン酸化及びその局在性が確認された（図５Ａ）。また、リンカー領域の変異によりＳｍａｄ３の核への蓄積が抑制され、さらにp38阻害剤処置においてもその抑制が本抗体を用いることにより観察された（図５Ｂ）。
【００７５】
一方、ＣＣｌ4処置により作製した線維化ラットの肝臓の組織切片を用い、本抗体で免疫組織学的検討を実施した。その結果、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３は、病態の進行に応じコラーゲン産生細胞の核に特異的に検出された（図６）。このように、本抗体を用いることにより、リンカー領域のリン酸化されたＳｍａｄ３を病態時の病理切片で確認することが示された。
【００７６】
よって、本抗体を用いることにより、活性化に重要なリンカー領域のリン酸化されたＳｍａｄ３の細胞内局在が検出可能となり、病理組織標本を用いた診断も可能となる。
【００７７】
（２）方法
細胞内の検出は既報（Cancer  Res.；K.Matsuzaki et.al. 60, 1394-1402 (2000)）に従って実施した。すなわち、ラット正常肝臓より樹立された肝細胞クローン９(I.B.,Weinstein, et.al. Cancer Res. 35, 253-263 (1975))をLAB TEK chambersにて培養し、200pMのTGF-βと１時間インキュベーションした後、４％パラホルムアルデヒドにより細胞固定化した。それぞれ1次抗体（Ｓｍａｄ２のＣ末端及びリンカー領域、並びにＳｍａｄ３のＣ末端及びリンカー領域の各リン酸化特異的抗体）ならびに抗FLAG抗体にて4℃、16時間インキュベーションした。洗浄後Cy2ラベルしたヤギ抗マウスIgG抗体を処置し、蛍光顕微鏡で検出した。
【００７８】
ＣＣｌ4処置したラット肝臓の凍結断片より４μｍの厚さの病理切片を作製し、アセトンにて、4℃、10分間固定させた後、0.3％過酸化水素を含むPBSを室温にて10分間処置した。この固定化切片を用い免疫染色を行った。得られた切片を正常ヤギ血清にて前処置し、1次抗体（Ｓｍａｄ２のＣ末端及びリンカー領域、並びにＳｍａｄ３のＣ末端及びリンカー領域の各リン酸化特異的抗体）を4℃、一昼夜インキュベーションし、洗浄後ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG（Vector  Laboratories）と更に室温にて40分間インキュベーションした。検出は、ストレプトアビジンHRP regent(Vector  Laboratories)と室温で30分間インキュベーション後、０．０２％３，３’-デアミノベンジジンテトラヒドロクロリド、０．００６％ 過酸化水素を含むＰＢＳにて発色させることにより行った。
【００７９】
例４
（１）結果の概要
任意の細胞をＴＧＦ−βで刺激し、一定時間後に細胞を回収した。そのホモジネートをリン酸化酵素の特異抗体で免疫沈降後、その試料とＳｍａｄ３リコンビナントとをインビトロにてインキュベートすることによりＳｍａｄ３をリン酸化させ、特異抗体でリン酸化Ｓｍａｄ３を検出する。本抗体を用いてＳｍａｄ３のリンカー領域がｐ３８及びＪＮＫによりリン酸化されることが確認された。本反応系に候補化合物で処置することにより、リン酸化を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
【００８０】
（２）方法
培養細胞（ｃｌｏｎｅ９という細胞を使用）を15時間無血清条件下で培養した後、ＴＧＦ-βを処置し、15分又は60分後に細胞を回収し、リン酸化酵素の活性型であるリン酸化ＪＮＫ又はリン酸化ｐ３８（これらの酵素は、酵素自身がリン酸化されることにより活性型となる）をそれらの特異抗体（いずれもＰｒｏｍｅｇａ社）で免疫沈降させ、プロテインＧ-セファロースを用いて単離し、キナーゼバッファー(２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５  ｍＭ β-グリセロホスフェート、２  ｍＭ  ＤＴＴ、  ０．１  ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ３、１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２)で洗浄し、懸濁させたものを酵素標品とした。この酵素標品と、大腸菌で作製したリコンビナントＧＳＴ−Ｓｍａｄ３及びＧＳＴ−Ｓｍａｄ２  ２μｇを１００μＭ  ＡＴＰを含む５０μｌ  キナーゼバッファーにて反応させた。それをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により分離し、作製した各リン酸化抗体を用いたイムノブロット法によりリン酸化Ｓｍａｄを検出した。その結果を図７に示す。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の抗体及びスクリーニング方法は効率的かつ特異的にＳｍａｄリン酸化阻害剤及び抗線維化薬をスクリーニング・取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】用いたペプチドのＳｍａｄ２及び３の１次構造上における位置を示す。
【図２Ａ】クローン９細胞を用いたＳｍａｄ２抗体の特異性を示す。
【図２Ｂ】クローン９細胞を用いたＳｍａｄ３抗体の特異性を示す。
【図２Ｃ】ＭＦＢ細胞を用いたＳｍａｄ３抗体の特異性を示す。
【図３】既知のp38（リン酸化酵素）阻害剤を用いた実験例を示す。
【図４】p38阻害剤のＴＧＦ-β依存的転写活性に対する作用（ＨｅｐＧ２細胞）を示す。
【図５Ａ】Smad3のリンカー領域のリン酸化およびその局在性を示す。
【図５Ｂ】p38阻害剤処置におけるリン酸化抑制の本抗体を用いることによる観察結果を示す。
【図６】組織切片を用いる免疫組織学的検討により、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３は、病態の進行に応じコラーゲン産生細胞の核に特異的に検出されることを示す。
【図７】キナーゼアッセイにおけるイムノブロット法によるリン酸化Ｓｍａｄの検出を示す。
【図１】
2005112812.tif 000002
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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