(57)【要約】【課題】散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢を予測すること。【解決手段】ａ）被験対象から採取した細胞からゲノムを抽出する段階、ｂ）ＡＰＯＣ２マイクロサテライトを含む遺伝子を増幅して核酸断片を得る段階、およびｃ）ｂ）で得られた核酸断片中のＡＰＯＣ２マイクロサテライトの反復回数を計測する段階、の各段階により、被験対象のＡＰＯＣ２マイクロサテライトの反復回数を計測する。ＡＰＯＣ２マイクロサテライトにあるマイクロサテライトの反復回数が多いほど、アルツハイマー病の発症年齢が高いと予測される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験対象から採取した細胞のゲノム中のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列の反復回数を計測することを含む、散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢の予測方法。
【請求項２】
両対立遺伝子におけるＡＰＯＣ２マイクロサテライト多型のＧＴおよびＧＡリピート数の合計が多いほど散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢が高いと予測する、請求項１に記載の予測方法。
【請求項３】
ＰＣＲ法により遺伝子を増幅させることを含む、請求項１または請求項２に記載の予測方法。
【請求項４】
反復回数を計測が電気泳動度の比較により実行される、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の予測方法。
【請求項５】
散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症リスクの予測と組合せられる、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の予測方法。
【請求項６】
散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢を予測するためのデータを収集する方法であって、被験対象から採取した細胞のゲノム中のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列の反復回数を計測することを含む方法。
【請求項７】
ＰＣＲ法により遺伝子を増幅させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
反復回数を計測が電気泳動度の比較により実行される、請求項６または請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢を予測する方法に関連する。本発明はまた、散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢を予測する方法において使用する配列を含む核酸にも関連する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶、知能、身体全体の機能が衰えていき、ついには死に至る神経変性疾患である。中でも、高齢発症型アルツハイマー病（散発性ＬＯＡＤ）は、高齢者の痴呆の主原因である。ＡＤは、特に病状が進行すると、現在のところ確実な治療法がない難病であり、患者の苦痛のみならず、患者を介護する家族や社会の負担が大きな社会問題となっている。現在、アルツハイマー病の原因解明や治療方法の開発のために、精力的に研究が進められている（Ｆａｒｒｅｒ，  Ｌ．Ａ．  ｅｔ．ａｌ．  ＪＡＭＡ  ２７８，  １３４９−１３５６（１９９７））。
【０００３】
ＡＤには家族性と散発性があり、後者が約９０％を占める。組織病理学的には、ＡＤは、神経細胞の脱落による脳の萎縮、老人班の蓄積および神経原線維変化で特徴付けられ、家族性ＡＤの研究において、これらの病変と関連すると考えられるいくつかの原因遺伝子が発見されている。家族性ＬＯＡＤの患者に頻繁に見られるアポリポタンパク質Ｅ−ε４対立遺伝子（ＡＰＯＥ−ε４）（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，  Ｗ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，  １９７７−１９８１  （１９９３））は、散発性ＬＯＡＤにおいても発症のリスク因子であることが、様々な遺伝的背景の患者で証明された（Ｆａｒｒｅｒ，  Ｌ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．    ＪＡＭＡ  ２７８，  １３４９−１３５６  （１９９７））。この事実は、家族性と散発性とは発症リスクを共有していことを意味している。
【０００４】
ＡＤは、進行すると治療が非常に困難であるが、理論上、器質的な中枢神経障害が軽微な段階であれば治療できる可能性がある。ＡＤの早期発見のためには、定期的に検診を受けることが望ましい。しかし、すべての人が頻繁に検診を受けるのは、被験者の時間的・経済的負担が大きく、また社会全体の医療費を圧迫するという観点からも難しい。そこで、ＡＤ発症リスクとＡＤ発症年齢の予測を行い、発症を予測された年齢の被験者に対して重点的にＡＤ検診を行うのが効率的であると考えられる。
【０００５】
散発性ＬＯＡＤの発症年齢と遺伝的素因の関連について、ＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の保有数が注目されたが、これは発症年齢に対して１０％しか影響を与えておらず（Ｓｌｏｏｔｅｒ，  Ａ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．    Ａｒｃｈ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５５，  ９６４−９６８  （１９９８））、他の遺伝的素因の影響があると考えられた。ＡＰＯＥを含む遺伝子クラスターに位置するＡＰＯＣ２遺伝子のイントロン１には、多型マイクロサテライトがあるが、この遺伝子型と散発性ＬＯＡＤの発症リスクとは関連がないことがわかっている（Ｔｓｕｄａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．    Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ３６，  ９７−１００  （１９９４）．    Ｋａｍｉｎｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．    Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ４２  Ｓｕｐｐｌ  １，  １２−１９  （１９９６））。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｆａｒｒｅｒ，  Ｌ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．    ＪＡＭＡ  ２７８，  １３４９−１３５６  （１９９７）
【非特許文献２】
Ｔｓｕｄａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．    Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ３６，  ９７−１００  （１９９４）．
【非特許文献３】
Ｋａｍｉｎｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．    Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ４２  Ｓｕｐｐｌ  １，  １２−１９  （１９９６）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の技術的課題は、散発性高齢発症型アルツハイマー病（散発性ＬＯＡＤ）の発症年齢を予測することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢とアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ（ＡＰＯＣ２）イントロン１マイクロサテライトの多型との関連性を世界で初めて見出した。この知見に基づき、散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢を予測する方法を完成させた。
【０００９】
本発明の第１の態様は、散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢の予測方法である。その方法は、被験対象から採取した細胞のゲノム中のＡＰＯＣ２のマイクロサテライトの反復回数を計測することを含む。
【００１０】
本発明の第２の態様は、散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢を予測するためのデータを収集する方法である。その方法は、被験対象から採取した細胞のゲノム中のＡＰＯＣ２マイクロサテライトの反復回数を計測することを含む。
【００１１】
本発明の第３の態様は、散発性高齢発症型アルツハイマー病の発症年齢予測に使用するための核酸である。その核酸は、ａ）配列番号１のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列、ｂ）配列番号１のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列に（ＧＴ）ｍ（ＧＡ）ｎが付加または欠失された配列、ｃ）ａ）またはｂ）の配列において、１個または数個のヌクレオチドが欠失、置換および／または付加された配列、のいずれかの配列、またはそれらの相補的配列の全長または一部を含む。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
散発性高齢発症型アルツハイマー病（散発性ＬＯＡＤ）とは、主に６０歳以降に発症するアルツハイマー病で、１ないし２親等内にアルツハイマー病発症者が認められない場合を指す。本発明における「散発性高齢発症型アルツハイマー病」または「散発性ＬＯＡＤ」は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡによるアルツハイマー病の診断基準に該当する疾患の中で、家族性発症がなく、６０歳以上で発症する疾患と定義される。
【００１３】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ（ＡＰＯＣ２）遺伝子は、リポタンパク質リパーゼを活性化するための補因子（ａｐｏＣ−ＩＩ）をコードする遺伝子である（Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ，  Ｗ．Ｃ．，  Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．Ａ．，  Ｓｔｅｉｎｅｒ，  Ｇ．，  Ｃｈｏｗ，  Ａ．，  Ｐｏａｐｓｔ，  Ｍ．    Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２９８，  １２６５−１２７３  （１９７８））。ａｐｏＣ−ＩＩが欠損すると、血漿脂肪酸を送達する血漿カイロミクロンの蓄積による、血漿トリグリセリドの上昇が起こることが知られている。ＡＰＯＣ２についての詳細は、Ｊｏｎｇ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｈｏｆｌｅｒ，  Ｍ．Ｈ．，  Ｈａｖｅｋｅｓ，  Ｌ．Ｍ．    Ａｒｔｅｖｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．：１９９９：１９：４７２−４８４  に記載されている。ＡＰＯＣ２遺伝子は、ＡＰＯＥと同じ遺伝子クラスターに位置する。
【００１４】
約２３８６ｂｐのＡＰＯＣ２の第一イントロン（配列番号１：Ｇｅｎｂａｎｋ  受託番号Ｘ０５１５１）にあるマイクロサテライト領域には、多型が報告されている（Ｗｅｂｅｒ，  Ｊ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｍａｙ，  Ｐ．Ｅ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４４；３８８−３９６，  １９８９）。その領域は、（ＧＴ）ｍ（ＧＡ）ｎの反復配列を含む。
【００１５】
本発明者らは、散発性ＬＯＡＤに罹患した人の発症年齢とＡＰＯＣ２マイクロサテライトにおける反復回数との関連を統計学的に調査した。その結果、散発性ＬＯＡＤ患者では、ＡＰＯＣ２マイクロサテライトの反復回数が多いほど発症年齢が高いことを見出した（実施例参照）。
【００１６】
本発明は、上記の研究結果を利用して散発性高齢発症型アルツハイマー病発症年齢の予測を可能にしたことを特徴としている。以下に、本発明の各態様について具体的に説明する。
【００１７】
本発明における「散発性高齢発症型アルツハイマー病発症年齢」とは、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｇｉｎｇ  （ＦＡＳＴ）の  Ｓｔａｇｅ  ３  に適合する症状および／またはそれに類似する症状を有するに至る年齢を意味する。
【００１８】
本発明の散発性高齢発症型アルツハイマー病（散発性ＬＯＡＤ）の発症年齢の予測方法は、被験対象から採取した細胞のゲノム中のＡＰＯＣ２マイクロサテライトの反復回数を計測することを含む。本発明の「被験対象」とは、散発性ＬＯＡＤに罹患する可能性のある哺乳動物、特にヒト、マウス、ウマ、愛玩動物を意味するが、散発性ＬＯＡＤに罹患している対象に対しても本発明の方法を使用できる。細胞は被験対象のいかなる組織から採取してもよく、血液から採取するのが容易である。
【００１９】
ＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列の反復回数の計測には、ａ）被験対象から採取した細胞からゲノムを抽出する段階、ｂ）ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域を含む遺伝子を増幅して核酸断片を得る段階、およびｃ）ｂ）で得られた核酸断片中のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列の反復回数を計測する段階、が含まれる。段階ａ）では、市販の核酸抽出キットなどを使用して細胞中のゲノムを単離する。場合によっては、段階ｂ）で使用する核酸増幅用成分がゲノムに接近し得る程度に細胞を溶解するだけでよく、他の細胞成分からゲノムを単離しなくてもよい。
【００２０】
段階ｂ）では、ＰＣＲ法、ＲＮＡポリメラーゼを利用する核酸増幅法、鎖置換増幅法などでＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域のＤＮＡを増幅する。最も一般的なＲＣＲ法による増幅では、ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域の上流および下流に位置する配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域の核酸を増幅させる。増幅させる核酸は、ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域を含んでいれば、どのような長さであってもよい。当業者は、ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域を含む核酸の増幅に使用するプライマーを適宜設計し、合成することができる。プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、約１５個から約５０個、好ましくは約１５個から３５個のヌクレオチドからなる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０５１５１の塩基配列を参照して、ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域の上流に位置するヌクレオチド配列からなるプライマーと、下流に位置するヌクレオチド配列に相補的な配列からなるプライマーを使用して増幅させる。ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域の増幅に使用するプライマーのオリゴヌクレオチドは、段階ｃ）で反復回数を計測するために、ＦＡＭ（カルボキシフルオロセイン）などの蛍光物質や放射性同位元素などで標識化されていてもよい。
【００２１】
段階ｃ）では、ｂ）で得られた核酸断片中のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列の反復回数を計測する。本発明の方法では、公知のＤＮＡシークエンス法やＤＮＡチップを使用する方法などいかなる手段で反復回数を計測してもよい。ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域の多型は配列長の差異を特徴とするので、特に、最も簡便な反復回数の計測方法は、当分野で日常的に実施されている電気泳動法である。本発明の方法では、数個のヌクレオチド長の差異でも検出できるように、アクリルアミドゲル電気泳動や、キャピラリーシークエンサーを利用する電気泳動が好ましい。電気泳動後、各々の電気泳動方法およびｂ）で使用したプライマーの標識に適する方法で核酸断片の長さを確認する。アクリルアミド電気泳動の場合、段階ｂ）で使用するプライマーは放射性標識を有するのが好ましく、キャピラリーシークエンサーを利用する電気泳動の場合、該プライマーは蛍光標識を有するのが好ましい。
【００２２】
本発明では、ＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列の反復回数が多い被験対象は、散発性ＬＯＡＤ発症年齢が高いと予測する。反復回数とは、各対立遺伝子にコードされているＡＰＯＣ２マイクロサテライトの多型の（ｍ＋ｎ）数を合計したものである。
【００２３】
本発明の方法は、発症リスクの予測と組合せてもよい。発症リスクは、ＡＰＯＥ遺伝子ε４型の保有数から予測できる。その方法は、Ｗｅｎｈａｍ，  Ｐ．Ｒ．，  Ｐｒｉｃｅ，  Ｗ．Ｈ．，  Ｂｌａｎｄｅｌｌ，  Ｇ．    Ｌａｎｃｅｔ  ３３７，  １１５８−１１５９  （１９９１）に記載されている  Ｗｅｎｈａｍ  らのプロトコールに従って、あるいはＳＮＰ検出法により、当業者により適宜実施される。
【００２４】
本発明の第２の態様は、被験対象から採取した細胞のゲノム中のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列の反復回数を計測することを含む、散発性ＬＯＡＤ発症年齢を予測するためのデータを収集する方法である。その具体的方法は、上記の第１の態様と同様である。
【００２５】
本発明の第３の態様は、散発性ＬＯＡＤ発症年齢の予測に使用するための配列であって、ａ）配列番号１のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列、ｂ）配列番号１のＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列に（ＧＴ）ｍ（ＧＡ）ｎが付加または欠失された配列、ｃ）ａ）またはｂ）の配列において、１個または数個のヌクレオチドが欠失、置換および／または付加された配列、のいずれかの配列、またはそれらの相補的配列の全長または一部を含む核酸である。ＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域を含むＡＰＯＣ２遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号Ｘ０５１５１に公開されている。核酸は、デオキシリボヌクレオチドからなるＤＮＡ、リボヌクレオチドからなるＲＮＡ、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両者からなる核酸であってよく、ヌクレオチド類似体を含有してもよい。これらの核酸は１本鎖または２本鎖であり得る。「全長または一部を含む核酸」とは、ａ）ないしｃ）のいずれかの配列の全長または一部に加えて、例えばＡＰＯＣ２マイクロサテライト領域に隣接する領域の配列、リンカー配列、ベクターの配列などの、ＡＰＯＣ２マイクロサテライト配列の反復回数を計測するために必要とされる配列も含み得ることを意味する。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００２７】
ＡＤの疑いのある患者を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ  −  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  （ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ）（ＭｃＫｈａｎｎ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．    Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４，  ９３９−９４４  （１９８４））の基準に従って診断した。Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｇｉｎｇ  （ＦＡＳＴ）（Ｒｅｉｓｂｅｒｇ，  Ｂ．    Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ  ４１，  ３０−４６  （１９８６））の  Ｓｔａｇｅ  ３  に適合する発症年齢は、知力のある被験者との面談および医療記録から判定した。大阪大学ゲノム倫理委員会および愛媛医科大学によりに認証されたプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを収集した。ＡＰＯＥの遺伝子型は、Ｗｅｎｈａｍ  らのプロトコールに従って判定した（Ｗｅｎｈａｍ，  Ｐ．Ｒ．，  Ｐｒｉｃｅ，  Ｗ．Ｈ．，  Ｂｌａｎｄｅｌｌ，  Ｇ．    Ｌａｎｃｅｔ  ３３７，  １１５８−１１５９  （１９９１））。ＡＰＯＣ２遺伝子イントロン１のマイクロサテライト領域を、ＦＡＭ標識プライマーＡＰＯＣ２Ａ：ＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＴ（配列番号２）および非標識のＡＰＯＣ２Ｂ：ＣＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴ（配列番号３）を用いて、ＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ産物の長さを  ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００  キャピラリーシークエンサー  （Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して判定した。反復回数はマーカーとの比較で計測した。反復回数の計測は、全て匿名で実施した。
【００２８】
表１に示すように、マイクロサテライト対立遺伝子の分散は我々の以前の結果（Ｋａｍｉｎｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．    Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ４２  Ｓｕｐｐｌ  １，  １２−１９  （１９９６））と同様であり、ＬＯＡＤ群と対照群との間で差がなかった。しかしながら、発症年齢への重回帰により、ＡＰＯＣ２マイクロサテライトの反復回数は、発症年齢に対して有意な影響を示した（ｐ＝０．０００１）。重回帰分析の標準相関係数は、反復回数が発症年齢のバリエーション値の２７．７％を説明することを示した。この相関は、ＡＰＯＥ−ε４陽性ＬＯＡＤで明らかであり（ｐ＝０．０００６）、ＡＰＯＥ−ε４陰性ＬＯＡＤでも同様の傾向が見られたが、このデータセットでは僅かに有意でなかった。一方、ＡＰＯＥ−ε４量は、ロジスティック回帰で有意なＬＯＡＤのリスクを示す（ｐ＜０．０００１）ことが確認されたが、発症年齢への影響は統計学的には有意には至らなかった。
【００２９】
【表１】
2005013148.tif 000002
【００３０】
ＬＯＡＤ群と対照群を、反復回数が５５以下の群と５６以上の群に分けた。カプラン・マイヤー統計値は、無病率が２群の間で有意に異なることを示し、これは、マンテル・コックスのログランク検定（ｐ＝０．００５６）、Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｇｅｈａｎ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  検定（ｐ＜０．０００１）、Ｔａｒｏｎｅ−Ｗａｒｅ  検定（ｐ＝０．０００３）、Ｐｅｔｏ−Ｐｅｔｏ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  検定（ｐ＝０．０００５）、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ−Ｆｌｅｍｉｎｇ  検定（ｐ＝０．００１７）によって支持された（図１）。従って、我々はＡＰＯＣ２マイクロサテライト反復の回数がＬＯＡＤ発症年齢の変化因子であると結論付けた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、散発性ＬＯＡＤ発症年齢を簡単かつ迅速に予測することが可能になる。このことは、散発性ＬＯＡＤの処置や予防に有用である。
【配列表】
2005013148.tif 000003
2005013148.tif 000004
2005013148.tif 000005
2005013148.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロサテライト長が異なるグループ間の、ＬＯＡＤの無病率の差異を示す。
【図１】
2005013148.tif 000007