(57)【要約】【課題】  ザリウム菌のうちホウレンソウの萎ちょう病菌のみを簡便で、感度よくかつ高精度で同定しうるホウレンソウ萎ちょう病菌の分子識別方法を提供する。【解決手段】  ＲＡＰＤ−ＳＴＳ（randomly amplified polymorphic DNA-sequence tagged site）法により得られたホウレンソウの萎ちょう病菌に特異的な塩基配列を検出または定量する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ（randomly amplified polymorphic DNA-sequence tagged site）法により決定した、ホウレンソウの萎ちょう病菌に特異的な塩基配列を検出または定量することを特徴とするホウレンソウの萎ちょう病菌の分子識別方法。
【請求項２】
前記塩基配列が、（ａ）配列番号１に示される塩基配列の連続した少なくとも８０塩基からなる塩基配列、または（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記塩基配列から設計されるプライマーを用いてＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを行う請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
プライマーが、配列番号２もしくは配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーまたは各プライマーの塩基配列と少なくとも８０％の塩基配列が一致するプライマーである請求項３記載の方法。
【請求項５】
ホウレンソウ萎ちょう病菌に特異的な塩基配列から設計されるプライマー。
【請求項６】
請求項５記載のプライマーを含むホウレンソウ萎ちょう病菌の分子識別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホウレンソウの栽培において萎ちょう病が発生または蔓延する前にフザリウム属菌の存在を把握することを可能にするホウレンソウ萎ちょう病菌の分子識別方法に関する。詳細には、フザリウム菌のうちホウレンソウ萎ちょう病を引き起こす特定の菌のみに特異的な塩基配列を検出または定量することを特徴とするホウレンソウ萎ちょう病菌の分子識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
野菜工場で栽培されている主要作物の一つであるホウレンソウは、露地物との競合を避けるため、端境期である夏期に栽培されることが多い。しかし、高温・高湿下での繁殖が盛んで、分生子などを通じて水中で拡散できる真菌類（例えばフザリウム属菌、ピシウム属菌など)による病害が発生しやすく、特にフザリウム菌の特定の菌によるホウレンソウ萎ちょう病の被害は深刻である。これらの病害が大発生した場合、作物を栽培しながらの防除は困難であるため、栽培中のホウレンソウを取り除き、培養液の総入れ替えをするなど労力や経済的な面で大きな損失を被る。これらの病害を防止するため、水耕栽培に用いられるオゾンや紫外線などによる物理的な殺菌装置も販売され始めているが、初期投資コストが非常に大きいため、これらを導入して常時運転しておくことは容易でない。そのため、萎ちょう病が、大発生に至る前に適宜対策を講じることを可能にするため、常時培養液中の病原菌の菌体数をモニタリングする必要がある。
【０００３】
一方、菌体数をモニタリングする方法には、一定量の培養液をサンプリングして、それぞれの病原菌だけが選択的に生育するような培地上に様々な希釈濃度で播き、生じた菌叢の数を数える方法がある。しかし、この方法は、滅菌器や培養器などの大型の機械を必要とし、菌の単離に３〜４日、形態・生理に基づく同定に１週間程度を要するため、通常の栽培管理者が日常的に、かつリアルタイムに監視を行うことは困難である。さらに、特定の菌のみが生える選択培地を用いても、フザリウム属菌などでは、形態・生理のほとんど同じである１００種類以上におよぶ亜種が存在するため、病原性を持つ菌を培地上で識別することはほとんど不可能である。また、菌の同定法として、菌から特定の酵素を抽出してその性質の違いを比較して菌株の同定を行うアイソザイム分析法が知られているが、同定に要する時間やその操作の煩雑さはさほど変わらない上、分離・同定能力もそれほど高くはない。
【０００４】
近年、菌の遺伝子（ＤＮＡ）を利用して分離・同定が行われるようになっている。このＤＮＡを利用する方法には、特定の塩基配列を増幅して検出するＰＣＲ法、菌から抽出したＤＮＡを、制限酵素で切断して生じた断片の電気泳動を行い、得られたパターンの差異によって識別を行うＲＦＬＰ(Restriction Fragment Length Polymorphisms)法（非特許文献１を参照）と、不特定のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたDNA断片を同様に電気泳動によって分離して、得られたバターンの差異によって識別を行うＲＡＰＤ（Random Amplined Polymorphic DNA）法などがある。ＰＣＲ法による菌の同定法としては、リボソームＤＮＡの塩基配列を用いる方法が知られている（特許文献１および２を参照）。しかし、ＰＣＲ法では、目的の菌と他の菌とを識別しうる特異的な塩基配列の決定が前提であり、ｒＤＮＡの全塩基配列を解読比較する必要があるうえ、同種内での病原型を同定するためには精度が劣るという問題である。
【０００５】
ＲＦＬＰ法は、リボソームＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡなど比較的短いＤＮＡやあらかじめ塩基配列が明らかになっている場合には特定の形質と関連した多型を見い出しやすいが、ゲノムのように大きなＤＮＡを解析し、かつ特定のプライマーやプローブが存在しない場合には多型の検出が困難であり、一回の解析に精製度の高い多量のＤＮＡが必要である。また、ＲＡＰＤ法は、少量のＤＮＡを用いても簡便に多型が示せるが、得られた多型情報が実際に目的とする病原性に関連したものであるか否かは明らかにされず、また複数の検査施設や多数の試験における再現性の問題もある。特に、フザリウム属菌はこれまで亜種のレベルで同定に用いうる特異的な塩基配列が見出されておらず、ホウレンソウの萎ちょう病菌についても特有の毒素等の他菌と異なる特徴は全く明らかにされていないことが、これらの方法による萎ちょう病菌の識別を困難にしている。このため、病害菌の同定のみならず培養液や栽培土における病原菌のモニタリングを可能にする、簡便で迅速かつ精度の高い識別法が求められている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２３４３８１号公報
【特許文献２】特開平１０−２３４３９９号公報
【非特許文献１】Mouyna I. et al., Curr. Genet. 30, p.174-180, 1996年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、フザリウム菌のうちホウレンソウの萎ちょう病菌のみを簡便で、感度よくかつ高精度で同定しうるホウレンソウ萎ちょう病菌の分子識別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、萎ちょう病菌を含む複数のフザリウム属菌をＲＡＰＤ−ＳＴＳ（randomly amplified polymorphic DNA-sequence tagged site）法により比較分析して萎ちょう病菌に特異的な塩基配列を得て、得られた配列情報に基づき設計したプライマーを用いるＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法より非常に高感度かつ高精度で目的の病原菌の同定および定量が達成されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ＲＡＰＤ−ＳＴＳ（randomly amplified polymorphic DNA-sequence tagged site）法により決定した、ホウレンソウの萎ちょう病菌に特異的な塩基配列を検出または定量することを特徴とするホウレンソウの萎ちょう病菌の分子識別方法；
［２］前記塩基配列が、（ａ）配列番号１に示される塩基配列の連続した少なくとも８０塩基からなる塩基配列、または（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列である、上記［１］に記載の方法；
［３］前記塩基配列から設計されるプライマーを用いてＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを行う上記［１］または［２］に記載の方法；
［４］プライマーが、配列番号２もしくは配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーまたは各プライマーの塩基配列と少なくとも８０％の塩基配列が一致するプライマーである上記［３］に記載の方法；
［５］ホウレンソウの萎ちょう病菌に特異的な塩基配列から設計されるプライマー；
［６］上記［５］に記載のプライマーを含むホウレンソウの萎ちょう病菌の分子識別用キット；
に関する。
【００１０】
本発明の方法は、ホウレンソウの水耕栽培に用いられる培養液等中のフザリウム病菌(Fusarium oxysporum f.sp. Spinaciae)の存在およびその量の正確な情報を与えるものであり、本発明の方法に用いる塩基配列は、多数のフザリウム属菌のうち、ホウレンソウの萎ちょう病を引き起こす菌を特異的であり、非病原性のフザリウム属菌や他の菌類と交叉しないことが必要である。ここで、分子識別法において、非病原性のフザリウム属菌や他の菌類と交叉すると、培養液等の被検試料中の萎ちょう病菌の正確な菌数を測定することが困難になり、病原菌のモニタリングにおいて誤った情報を与えることになる。特異的な塩基配列を有するＤＮＡの検出は、ハイブリダイゼーション法、配列情報から設計したプライマーを用いるＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法などで実施することができるが、検出感度や簡易性などからＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法が好ましい。また、本発明は、前記方法で定量した萎ちょう病菌のＤＮＡ量に基づき、被検試料中における萎ちょう病菌の菌数を算出する方法を包含する。菌数は、あらかじめ萎ちょう病菌の菌数と検出するＤＮＡ量との検量線など作成しておけば、得られたデータから容易に算出することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、フザリウム菌のうちホウレンソウの萎ちょう病菌のみを簡便で、感度よくかつ高精度で同定しうるホウレンソウの萎ちょう病菌の分子識別方法が提供される。この方法は簡便に萎ちょう病菌を同定・定量でき、またＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法と組み合わせることより非常に高感度かつ高精度で目的の菌を同定および定量することができる。このため、ホウレンソウの生産現場においてルーチン的な萎ちょう病菌のモニタリングや現場における迅速な診断／発生予察に利用可能であるため、非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本明細書において用いる用語の意味等を示し、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、用語「ホウレンソウの萎ちょう病菌」、「萎ちょう病菌」および「フザリウム病菌」は、特にことわりがない限りフザリウム属菌のうちホウレンソウに萎ちょう病を引き起こす菌(Fusarium oxysporum f.sp. Spinaciae)菌を意味する。
本発明の方法は、ホウレンソウの萎ちょう病菌に特異的な塩基配列を検出または定量するものであり、ハイブリダイゼーション法、配列情報から設計したプライマーを用いるＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法により検出または定量する。この特異的な塩基配列は、萎ちょう病菌の間では、少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列が一致するものである。また、この特異的な塩基配列は、萎ちょう病菌を含む複数のフザリウム属菌を培養し、これらの菌から総ＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡをＲＡＰＤ−ＳＴＳ法（randomly amplified polymorphic DNA-sequence tagged site）により決定したものである。ＲＡＰＤ−ＳＴＳ法は、萎ちょう病菌を含む複数のフザリウム属菌から得られたＤＮＡをＲＡＰＤ（randomly amplified polymorphic DNA）法により解析し、萎ちょう病菌とその他の菌を識別しうるＲＡＰＤマーカーを得て、このＲＡＰＤマーカーの塩基配列に基づいて、これを特異的に増幅しうるプライマーを設計することからなる。
【００１３】
１．菌の培養およびＤＮＡの抽出
菌の培養および総ＤＮＡの抽出は、次のように行うことができる。
単離した菌株を５〜１０日ほど培地（例えばジャガイモーデキストロース（ＰＤＢ）培地）で培養・増殖させ、各株の菌糸体を濾過法などにより集菌して凍結乾燥する。次いで、例えばＣＴＡＢ（Cetyl trimethyl ammonium bromide）法などで総ＤＮＡを抽出する。具体的には、粉砕した菌糸体にＣＴＡＢを含む溶液を添加してよく混合する。温浴後、クロロフォルムを加えてよく混合して２５００ｒｐｍで遠心分離する。遠心後、上清に氷冷したイソプロパノールを添加し、−２０℃に１晩保った後、２５００ｒｐｍで遠心分離する。得られた沈殿を緩衝液に溶解し、２.５倍量のエタノールを加えて再度２５００ｒｐｍで遠心分離する。得られた沈殿を乾燥した後、緩衝液等に溶解する。また、ＤＮＡの抽出は、適する市販のキットを用いて行ってもよい。さらに、得られた総ＤＮＡをＲＡＰＤ法に供する前に精製してもよい。
【００１４】
ＤＮＡの精製は、例えば次のようにおこなうことができる。
緩衝液に溶解したＤＮＡに適量の塩化セシウムを溶解するとともにエチジウムブロマイドを添加して、８００００ｒｐｍ／８時間の超遠分離を行う。その後、紫外線照射下で目視によって確認しながらＤＮＡのバンドを分取して、等量のイソプロバノールを数回加えてエチジウムブロマイドを分離・除去し、大量の緩衝液に対して透析を行って脱塩する。得られた溶液に、エタノールを２.５倍容量加えて１５０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた沈殿を乾燥した後、緩衝液に溶解して最終的なＤＮＡ溶液とする。
【００１５】
２．ＲＡＰＤ−ＳＴＳ法
（１）ＲＡＰＤマーカー
ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲ反応では、各反応の温度条件・時間、およびプライマーの選択と添加量などが、増幅の成否を決定する重要な要因である。中でも特にアニール温度の設定が重要であり、ＲＡＰＤ法ではなるべく多くの不特定多数の領域とプライマーを反応させ、多くのＤＮＡ断片を得ることが目的であることから、通常のＰＣＲ反応で用いる温度より１０℃以上低い３０〜４８℃の温度範囲において検討を行う。具体的には、各菌株から抽出した総ＤＮＡを鋳型として、ランダムプライマーを用いてディネーチャー（９４℃）、アニール（３０〜４０℃）の各温度、ＤＮＡ鎖伸長（７２℃）、反復回数（５〜４０回）で予備的にＰＣＲを行う。得られた増幅産物は、アガロースゲル電気泳動に供して分離し、鮮明な特異的増幅断片が得られるＰＣＲ条件を決定する。本発明においては、ディネーチャー（９４℃／１分）、アニール（３６℃／１分）、ＤＮＡ鎖伸長（７２℃／１分）の各温度・時間において、３０回サイクルのＰＣＲ反応を行う。なお、反応サイクルの開始前のディネーチャーを確実にするために、予備的なディネーチャーとして９４℃／１分の反応を行う。
【００１６】
次に、９種類のフザリウム菌（５種の由来を異にするホウレンソウ病原性F . o. pv. Spinaciae、１種類の非病原性フザリウムF . o. pv. Spinaciae、１種類のサツマイモ病原性フザリウムF. o. pv. batata、および２種類のトマト病原性フザリウムF. o. pv. licopersici）と１種類のピシウム菌（Pythium ultimum）から得たＤＮＡを鋳型として、ランダムプライマーキット（１２ｍｅｒ，Ａ０１〜Ｈ１２プライマー；合計９６プライマー，和光純薬工業）を用いて上記条件でＰＣＲ増幅を行う。次いで、得られたDNA断片はアガロースゲル電気泳動によって分離し（１％アガロース、１００Ｖ／定電圧条件において４５分泳動）、泳動像を撮影して、目視により多型の検出を行う。さらに、９６プライマーのうち２２プライマーを選択してＰＣＲ増幅を行い、ホウレンソウの萎ちょう病菌に特異的なバンドを同定し、ＲＡＰＤマーカーとする。
【００１７】
（２）ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化
得られた特的バンド（ＲＡＰＤマーカー）は定法に従ってゲルから切り出した後、プラスミドにクローニングし、ホウレンソウの萎ちょう病菌に特異的に塩基配列を決定する。次に、得られたの配列情報に基づき、萎ちょう病菌の識別用プライマーを設計する。なお、プライマーの設計は、プライマーのＧＣ含量、センス、アンチセンスプライマーの値Ｔｍ、プライマーの３′末端側で相補的配列を有していない、プライマーが高次構造を形成しない、プライマーの全長を５〜５０ｍｅｒ、好ましくは１５〜３５ｍｅｒ、プライマーの３′末端側のＧＣ含量を低くする、プライマー内で同一ヌクレオチドが多数連続する配列は回避する、３′末端側の相補性を高くする、鋳型ＤＮＡにプライマー領域の他に同様の配列がない等の条件に留意する。一般的に、ＰＣＲにより増幅すべき領域（鋳型ＤＮＡ領域）がほぼ同一であれば、プライマーの配列が５′側および／または３′側に１〜１０数塩基ずれても同様のＰＣＲ結果（ＰＣＲ産物）が得られる可能性があることが知られている。したがって、本発明のプライマーは、特定の配列および長さのプライマーに限定されず、該プライマーと実質的に同一の機能を有するプライマーもまた包含する。故に、本発明は、例えば上記のように設計したプライマーの他に、１または数塩基を欠失、置換、付加および／または挿入したプライマー、対応する鋳型ＤＮＡに対し５′側および／または３′側に１または数塩基ないしは１０数塩基ずれているプライマー、もとのプライマーと少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列が一致するプライマーを包含する。
【００１８】
４．識別方法
培地などの被検試料から、慣用の方法でＤＮＡを抽出する。この場合、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用しうるものが抽出することができればよく、また、市販の抽出キットなどを用いてもよい。次いで、本発明の１つの実施形態として、本発明のプライマーを用いて常法に従ってＰＣＲを行う。その際に、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ，ＭｇＣｌ２等の試薬は調製してもよいし、市販のＰＣＲキットを用いてもよい。また、ＰＣＲ条件は、例えば９５℃／３０秒＋６３℃／３０秒＋７２℃／３０秒を１サイクルとして４０サイクル行い、最後に終了反応として７２℃７分間という条件が挙げられるが、プライマーのＴｍ値、増幅されるＤＮＡの長さ、鋳型として用いる試料ＤＮＡの濃度などを考慮して適宜変更することができる。増幅されたＰＣＲ産物は、ＤＮＡ断片を同定しうる任意の方法、具体的にはアガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリダイゼーション、免疫学的方法などを用いて検出することができる。一般的には、ＰＣＲ産物をアガロースゲルによる電気泳動に供し、バンドを検出する。
【００１９】
本発明の１つの実施形態において、リアルタイムＰＣＲ法により萎ちょう病菌の識別をしてもよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法であり、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れている。この方法は、あらかじめ段階希釈した既知量のＤＮＡを標準としてＰＣＲを行い、検量線を作成する。被検試料についても同じ条件下でＰＣＲを行い、試料中の検出すべきＤＮＡの検出およびその濃度を測定する。本発明においてリアルタイムＰＣＲ法は、例えば次の条件：９５℃／６００秒ホールドの後、９５℃／１０秒＋５３℃／１５秒＋６８℃／３０秒のサイクルを４０回実施するが、プライマーのＴｍ値、増幅されるＤＮＡの長さなどを考慮して適宜変更することができる。本発明はまた上記検量線と萎ちょう病菌の菌数を相関させることにより、萎ちょう病菌の菌数を容易に求めることができる。
【００２０】
本発明は、上述の検出または定量方法で用いるプライマーを含むキットを包含する。また、キットはプライマーのほか、他の試薬、例えばｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、蛍光試薬、緩衝液、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、蒸留水等を包含してもよい。これらの試薬はキットの中で、それぞれ独立に梱包されてもよいし、２種以上の試薬が混合されたものでもよい。また、キットには、好適なＰＣＲ条件等の情報が添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよい。
【００２１】
［実施例］
以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。
１．菌株および培養
本実施例において、表１に示す９種類のフザリウム属菌（５種の由来を異にするホウレンソウの萎ちょう病菌、１種の非病原性フザリウム、１種類のサツマイモ病原性フザリウム、および２種類のトマト病原性フザリウム）と１種類のピシウム菌Pythium ultimumを用いた。これらの菌株を、２５０ｍｌのコジャガイモーデキストロース（ＰＤＢ）培地で２８℃、暗黒下１２５ｒｐｍにて培養した。各菌株の菌糸体を、東洋濃紙Ｎｏ５Ｂで濃過集菌した。
【００２２】
【表１】
2005304432.tif 000002
【００２３】
２．ＲＡＰＤ−ＳＴＳ
上記１．で集菌したものを−８０℃で予備凍結させた後に凍結乾燥した。これを乳鉢と乳棒を用いて粉末状に磨砕した。次に、市販のキット（ISOPLANT kit 、NIPPON GENE, Toyama, Japan）を用いてＤＮＡを抽出した。ＰＣＲは総反応液量５０μｌとして、抽出したゲノムＤＮＡ  １００ｎｇ、プライマー  ２０ｎｇを添加し、市販のＰＣＲ用試薬（Super Taq Premix Kit、Sawady Tec. Inc.,）を用いた。プライマーとして、９６種類のプライマー（１２ｍｅｒ，ランダムプライマー、和光純薬工業）を用いてＰＣＲを行い、表２に示す２２種類のプライマーを選択した。なお、ＰＣＲ条件は９４℃／１分初回ディネーチャー、９４℃／１分＋３６℃／１分＋７２℃／１分で３０サイクル、最終伸長反応７２℃／７分とした。
【００２４】
【表２】
2005304432.tif 000003
【００２５】
上記ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片は、ミニサブマリン型電気泳動槽（ｍｕｐｉｄ、コスモ石油(株)）を用いてアガロースゲル電気泳動によって分離し（１％アガロース、１００Ｖ／定電圧条件において４５分泳動）、泳動像を撮影して目視により多型を検出した。検出されたバンドの中からＲＡＰＤマーカーとなる６６個の多型断片について、ソフトフェア（ＵＰＧＭＡ解析、Genetyx-Win ver.5）を用いた各菌種毎の遺伝的近縁性を樹状解析したところ、図１に示すように５つのクラスターに分類された。クラスター１はピシウム菌、クラスター２はF . o. pv. Spinaciaeのうち非病原性のもの、クラスター３はトマトに病原性を持つフザリウム属菌、クラスター４はサツマイモに病原性を持つフザリウム属菌、クラスター５はホウレンソウに病原性をもつフザリウム属菌であった。なお、これらのクラスターは明確に５つに分類されるが、各々の遺伝的近縁性は非常に近接していることが示された。
【００２６】
また、上記ＰＣＲ増幅において、プライマーＣ０５（配列番号９）、Ｃ０９（配列番号１０）、Ｃ１１（配列番号１１）、Ｄ０３（配列番号１２）、Ｆ１０（配列番号２２）およびＧ１１（配列番号２４）を用いた場合にホウレンソウの萎ちょう病菌について特異的な鮮明なバンド（ＲＡＰＤマーカー）が得られた。この得られた特異的なＲＡＰＤマーカー３０個を、定法に従ってゲルから切り出した後、プラスミドｐＣＲ（TOPO(R) vector、TOPO AT Cloning(R)  キット）にクローニングし、塩基配列を決定した（ABI PRIMSTM 3100 Genetic Analyzer, Perkin-Elmer）。ここで、Ｃ０５プライマーから得られたＲＡＰＤマーカーの塩基配列（配列番号１）に基づき、ホウレンソウの萎ちょう病菌識別用のプライマーを設計した。設計したプライマーについて、ＰＣＲによって特異的フラグメントの再現性を確認した。その結果、Ｃ０５−Ｆ（配列番号２）とＣ０５−Ｒ（配列番号３）のプライマーのセットを用いてＰＣＲを行ったが、ホウレンソウの萎ちょう病菌を同定する特異的なＰＣＲ増幅の再現性が確認された（図２を参照）。
【００２７】
３．リアルタイムＰＣＲ
Ｃ０５−ＦとＣ０５−Ｒのプライマーセットを用いて、リアルタイムＰＣＲを以下のように実施した。
全ての反応は総反応液量を２５μｌ（１２.５μｌ  ＳＹＢＲ(R) Ｇｒｅｅｎ，２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applied Biosystems）、ゲノムＤＮＡ  ２ｎｇ、０.３μＭプライマー、滅菌蒸留水）とした。リアルタイムＰＣＲにはタカラバイオのＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ(R)を用い、９５℃／６００秒ホールドの後、９５℃／１０秒＋５３℃／１５秒＋６８℃／３０秒を４０サイクルの条件で反応を行った。その結果、通常のＰＣＲによって確認されたように、ホウレンソウ病原性のフザリウム５菌株のみがポジティブな増幅産物が得られたが、その他の菌株については増幅されなかった（図３を参照）。
【００２８】
４．感度と定量性
本発明のＣ０５−ＦとＣ０５−Ｒのプライマーのセットについて、通常のＰＣＲとリアルタイムＰＣＲにより、ホウレンソウの萎ちょう病菌の同定感度を検証した。その結果、通常のＰＣＲでは１０〜１００ｐｇのＤＮＡが必要であった（図４）が、リアルタイムＰＣＲ法ではわずか１ｐｇの萎ちょう病菌のＤＮＡがあれば同定が可能であった（図５）。さらに、リアルタイムＰＣＲの定量性について検討したところ、サイクル数と鋳型として用いたＤＮＡ（対数値）との間に強い正の相関が認められた（Ｒ２＞０．９９；図６）。本発明のプライマーとリアルタイムＰＣＲ法を組み合わせることにより、定量性と感度の両面から優れた識別結果が得られることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】各菌種の遺伝的近縁性を樹状解析した結果を示す図である。
【図２】ＰＣＲによりホウレンソウの萎ちょう病菌を特異的に検出した結果を示す図である。
【図３】リアルタイムＰＣＲによりホウレンソウの萎ちょう病菌を特異的に検出した結果を示す図である。
【図４】ＰＣＲにおける検出感度の検証の結果を示す電気泳動像である。
【図５】リアルタイムＰＣＲにおける検出感度の検証の結果を示すグラフである。
【図６】リアルタイムＰＣＲにおけるサイクル数と鋳型ＤＮＡの相関を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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