(57)【要約】【課題】導入されたカタラーゼ遺伝子発現によって窒素固定能が増強された内生ならびに単生窒素固定菌と、この内生ならびに単生窒素固定菌を有効成分とする植物用の製剤を提供する。【解決手段】カタラーゼ遺伝子が導入された形質転換菌であって、この遺伝子の産生するカタラーゼによって窒素固定能が増強された内生ならびに単生窒素固定菌。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カタラーゼ遺伝子が導入された形質転換菌であって、この遺伝子の産生するカタラーゼによって窒素固定能が増強された内生ならびに単生窒素固定菌。
【請求項２】
導入したカタラーゼ遺伝子が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ  Ｓ−１株由来のカタラーゼ遺伝子ｖｋｔＡを含むＤＮＡ断片である請求項１の内生ならびに単生窒素固定菌。
【請求項３】
請求項１または２の内生ならびに単生窒素固定菌を有効成分とする植物用の製剤。
【請求項４】
請求項１または２の内生ならびに単生窒素固定菌、もしくは請求項３の製剤と接触させた植物種子を栽培することを特徴とする植物の栽培方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、窒素固定能が増強された内生ならびに単生窒素固定菌と、この内生ならびに単生窒素固定菌を有効成分とする植物用の製剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の植物体への窒素供与方法としては、化学肥料を散布する方法や、植物の根に共生して空中窒素固定を行う細菌類を利用する方法がよく知られている。このうち、その生産に大量の化石燃料を必要とし、環境汚染の原因となる化学肥料を用いることなく、細菌類を利用する方法が好ましものとして考えられている。このような細菌類は、マメ科植物の根に根粒を形成する根粒菌やマメ科以外の植物においても植物と共生し、宿主細胞の間隙で窒素供給を行う内生窒素固定菌、また細菌単独で空気中の窒素を固定することができ、必ずしも植物との共生を図ることはないが、多くの植物に対して窒素供給を行う単生窒素固定菌類等が知られている。
【０００３】
たとえば、根粒菌は、ダイズ、アズキ、インゲン等のマメ科植物に感染して共生的に根粒を形成し、この根粒中に形成されたバクテロイドによって空中窒素固定を行うことにより、窒素含量の低い土壌においても植物は良好に生育することができる。
【０００４】
このため、上記のようなマメ科植物を栽培する場合には、通常の肥料を与えること以外に、予め培養した根粒菌をマメ科植物の種子に塗布することが考慮されている。
【０００５】
しかしながら、根粒菌は、宿主がマメ科植物に限定されているため、イネやサトウキビ等の作物をはじめとする他の植物には応用することができなかった。
【０００６】
このような根粒菌については、このものが感染した初期には、過酸化水素が生じて、細胞毒となるため、通常植物は、過酸化水素を分解する酵素（カタラーゼ）を有している。ただ、根粒菌自体も高いカタラーゼ活性を有していれば、過酸化水素の細胞毒性をさらに抑制し、植物の成長促進や作物収量のさらなる向上が期待される。そこで、この出願の発明者らは、極めて強いカタラーゼ活性を有する新菌株Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ  Ｓ−１株を単離し（非特許文献１）、さらにこの菌株のカタラーゼ遺伝子を特定（特許文献１、非特許文献２、非特許文献３等）し、Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ  Ｓ−１株由来のカタラーゼ遺伝子（ｖｋｔＡ）を導入した形質転換根粒菌（特許文献２）が、強い根粒着生能と窒素固定能を有することを見出している。
【０００７】
一方、根粒菌以外の窒素固定菌においても、根粒菌と同様にその窒素固定能を有し、これによって植物の成長や収量に重要な役割を果たしている。しかも、宿主対象となる植物は、ほとんどの植物体であるため、これを利用した方法（特許文献３）が提案されている。
【０００８】
そこで、多くの植物を対象に窒素供給を行うことのできる窒素固定菌、あるいは内生ならびに単生窒素固定菌の窒素固定能を増強させることによって、様々な土壌における多くの植物栽培やその収量増加の可能性を大きく拡大するものと期待されている。また、そのような内生窒素固定菌、あるいは単生窒素固定菌による植物の窒素吸収の効率化は、必然的に硫安等の無機窒素肥料への依存度を低減することとなり、農業コストの削減とともに、環境汚染の緩和にも大きく貢献する。特に、単生窒素固定菌においては、菌単独で空気中の窒素を固定することができ、また必ずしも植物との共生を図ることがないため、植物に依存することなく土壌中に長期存在することが期待でき、作物等の植物を収穫した後、新たな作物等を植える度に、窒素固定菌を作物等に接種する回数を減少させることも期待することができる。
【０００９】
【特許文献１】
特開２０００−３１６５８４号公報
【特許文献２】
特開２００３−３３１７４号公報
【特許文献３】
特開平８−１４３４１０号公報
【非特許文献１】
Ｙｕｍｏｔｏ，  Ｉ．，  Ｙａｍａｚａｋｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８５：１１３−１１６，  １９９８
【非特許文献２】
Ｙｕｍｏｔｏ，  Ｉ  Ｉ．，  Ｉｗａｔａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６５：６７−７２，  １９９９
【非特許文献３】
Ｉｃｈｉｓｅ，  Ｎ．，  Ｍｏｒｉｔａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９０：５３０−５３４，  ２０００
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許文献３に提案されている窒素固定菌の利用方法では、実際に窒素固定能が増強されることではない。また、内生あるいは単生窒素固定菌においては、自然界からの新たな内生あるいは単生窒素固定菌の探索や、あるいは遺伝子操作による改変窒素固定菌の作出によって、実用化可能な程度に窒素固定能が増強された窒素固定菌は得られていない。
【００１１】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、遺伝子導入によって窒素固定能が増強され、多くの植物に使用することのできる新規な内生ならび単生窒素固定菌を提供することを課題としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、カタラーゼ遺伝子が導入された形質転換菌であって、この遺伝子の産生するカタラーゼによって窒素固定能が増強された内生ならびに単生窒素固定菌を提供する。
【００１３】
また、この出願の発明においては、第２には、導入したカタラーゼ遺伝子が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ  Ｓ−１株由来のカタラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片である内生ならびに単生窒素固定菌を提供する。
【００１４】
第３には、前記の内生ならびに単生窒素固定菌を有効成分とする植物用の製剤を提供し、第４には、前記の内生ならびに単生窒素固定菌または製剤と接触させた植物種子を栽培することを特徴とする植物の栽培方法を提供する。
【００１５】
以上のとおりのこの出願の発明のように、窒素固定能の増強にカタラーゼ活性によって内生ならびに単生窒素固定菌の窒素固定能を増強すること、そして実際にカタラーゼ遺伝子の導入によって窒素固定能を増強した内生ならびに単生窒素固定菌は、従来全く知られていない。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明の内生ならびに単生窒素固定菌は、カタラーゼ遺伝子を導入した形質転換菌である。カタラーゼ遺伝子としては、各種の生物種が産生するカタラーゼをコードするポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）を利用することができる。カタラーゼ遺伝子は、たとえば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｌａ由来のカタラーゼ遺伝子（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２：６６７９−６６８６，  ２０００；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ２７６７５２，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １７６：３３９−３４４，  １９９９；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０１７５９５）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のカタラーゼ遺伝子（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３：１４３４−１４４０，  ２００１；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ３１６０３３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ由来のカタラーゼ遺伝子（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２００：２３５−２４０，  ２００１；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ７２０６８）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ由来のカタラーゼ遺伝子（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１：９９３−１００５，  １９９７；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ９３２４４）、Ｓｔｒａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のカタラーゼ遺伝子（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：４６５−４７５，  ２０００；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ０００４７１，  ＡＪ０００４７２）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｐｈａｓｅｏｌｉ由来のカタラーゼ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ２４１：２５９−２６５，  ２０００；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ１７０４４９）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ  Ｓｐ．由来のカタラーゼ遺伝子（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８２：２１１−２１９，  ２０００；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ１９７１６１）等、多くが知られている。したがって、この発明の内生ならびに単生窒素固定菌の範囲には、文献やデータベース等において既知のカタラーゼ遺伝子、あるいは今後同定され得る未知のカタラーゼ遺伝子を用いて作製されたもの全てが含まれる。
【００１７】
導入するカタラーゼ遺伝子は、それ本来の発現制御領域（プロモーター／エンハンサー）を備えたものでもよく、あるいは内生または単性窒素固定菌で高頻度で発現する遺伝子の発現制御領域を連結した融合配列であってもよい。
【００１８】
さらに、この発明の形質転換内生窒素固定菌あるいは形質転換単生窒素固定菌の一つの態様は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ  Ｓ−１株由来のカタラーゼ遺伝子（ｖｋｔＡ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を導入した形質転換菌である。具体的には、この内生ならびに単生窒素固定菌は実施例にも示したように、ｖｋｔＡ遺伝子のコード領域とそのプロモーター配列を含むＤＮＡ断片（４．９ｋｂ）を導入した内生ならびに単生窒素固定菌である。ｖｋｔＡ遺伝子は、特開２０００−３１５６８４号に記載の方法によってＶｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ  Ｓ−１株から単離して用いることができる。あるいは、ＤＮＡ配列の両端一部領域に対応する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｓ−１株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ法によっても得ることができる。さらには、一部配列に基づいて合成したプローブを用いて、Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ  Ｓ−１株から調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって取得することもできる。クローニングしたｖｋｔＡ遺伝子は適当なベクターに公知の方法（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９等）に従いサブクローニングし、内生ならびに単生窒素固定菌の形質転換に使用することができる。また、前記のベクターの種類は、菌体内で自律複製できるベクターであれば特に限定されるものではなく、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２等のような広宿主域ベクター等が例示することできる。
【００１９】
内生窒素固定菌とは、植物と共生し、宿主細胞の間隙で窒素供給を行う窒素固定菌類であり、単生窒素固定菌は、単独で空気中の窒素を固定することができ、必ずしも植物との共生を図ることのない細菌類であるが、植物に対して生育促進作用を有している細菌類である。たとえば、植物が窒素を吸収する際の内生あるいは単性窒素固定菌への依存度は高く、たとえば、サトウキビにおいては、３０％に達すると報告（Ｏｌｉｖｅｉｒａ，  Ａ．Ｌ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｓｏｉｌ，  ２４２（２）：２０５−２１５，  ２００２）されており、またイネにおける依存度は３１〜５４％と報告（Ｄｉｖａｎ  Ｂａｌｄａｎｉ，  Ｖ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｓｏｉｌｓ，  ３０（５−６）：４８５−４９１，  ２０００）されている。この出願の発明は、このような特徴を有する内生ならびに単生窒素固定菌株であれば、特に限定されるものではない。たとえば、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属やＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ａｚｏｓｐｉｌｌｉｕｍ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、光合成細菌である紅色硫黄細菌、緑色硫黄細菌等に属する細菌類が挙げられる。さらに具体的には、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｚｏｓｐｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ等が例示できる。
【００２０】
内生ならびに単生窒素固定菌は、その増殖に適した培地（ＬＧＩＰ培地やＮＦＧ培地等）に適量を接種し、２５〜３０℃で１２〜３６時間程度の振盪培養を行って対数増殖後期（ＯＤ６６０値＝０．６以上）まで増殖させ、遠心分離で集菌して形質転換に供することができる。
【００２１】
ｖｋｔＡ遺伝子の内生ならびに単生窒素固定菌への導入は、導入遺伝子を保有する組換えベクターを、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等、公知の方法によって内生ならびに単生窒素固定菌に導入することによって行うことができる。あるいは、内生ならびに単生窒素固定菌、組換えベクターを保有する細菌宿主（大腸菌等）およびヘルパープラスミドを有する細菌宿主との共培養による接合伝達法によっても形質転換窒素固定菌を作製することもできる。
【００２２】
このようにして作製した形質転換窒素固定菌は、実施例に示したように高い窒素固定能を有している。
【００２３】
そして、この発明の植物用の製剤は、前記の形質転換窒素固定菌を有効成分としている。具体的には、この製剤は、内生ならびに単生窒素固定菌が生育可能な液体培地（たとえば、ＬＧＩＰ培地あるいはＮＦＧ培地等）にこの発明の内生あるいは単生窒素固定菌を１０５〜１０８個／ｍｌ程度に混合したものとして調製することができる。あるいは、有機質または無機質の担体と混合することもできる。具体的には、赤玉土、焼成赤玉土、鹿沼土、黒ボク土、バーミキュライト、パーライト、ゼオライト等の無機質担体、ピートモス、木炭、パルプ、藁、バガス、油かす、魚かす、骨粉、血粉、貝化石、カニがら等の有機質担体である。この発明の内生ならびに単生窒素固定菌を担体に担持させるには、内生ならびに単生窒素固定菌の混濁液と担体とを混合することによって行うことができる。その場合の内生あるいは単生窒素固定菌の含有量は、担体に単性窒素固定菌が保持されるのであれば、特に限定されるものではないが、担体１ｇに対して内生あるいは単生窒素固定菌１０５〜１０８個程度を混合することが考慮される。さらに、内生ならびに単生窒素固定菌と担体との混合物には、水を４０％以上含有させることによって単生窒素固定菌の安定性を向上させることもできることが考えられる。またさらに、石炭灰等を担体の一部として配合することによって製剤のｐＨを６．３〜７．０程度に調整することによって内生ならびに単生窒素固定菌の保存安定性を一層向上させることもできる。
【００２４】
このようにして調製した製剤は、たとえば、植え付け前の種子と適量を混合したり、あるいは農地への蒔種時に肥料とともに散布したりすることができる。
【００２５】
この出願の発明の対象となる宿主植物は、シクラメン、ベゴニア、日々草等の花卉類、サトウキビやイネ、トマト、キューリ、ピーマン等の野菜・作物類、さらにはクスノキ、ケヤキ、ジンチョウゲ等の樹木類等が例示できる。
【００２６】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
１．  組換えベクターの構築
ｖｋｔＡ遺伝子（プロモーター配列とカタラーゼコード領域を含む）を広宿主域ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（Ｇｅｎｅ  １６６：１７５−１７６，  １９９５）に挿入し、ｖｋｔＡ遺伝子を保有する組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：ｖｋｔＡを定法に従い構築した。
２．  形質転換菌の構築
２．１    使用菌株：
形質転換する窒素固定菌（受容菌）として、サトウキビに対しては内生窒素固定菌とされているＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ  ＡＴＣＣ３５８９４（以下、Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅとすることがある）を、イネに対しては単性窒素固定菌とされているＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  １４２０１Ｔ（以下、Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａとすることがある）をそれぞれ使用した。供与するプラスミドＤＮＡとしては、組換えベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：ｖｋｔＡを使用した。
【００２８】
Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅの最適培地として、ＬＧＩＰ培地（０．２ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，  ０．６ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，  ０．２ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．０２ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，  ０．００２ｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，  ０．０１ｇ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ，  ５．０ｇ  ｓｕｃｒｏｓｅ，  １ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，  ０．０２ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ／Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，  ｐＨ  ５．５）にビート廃糖蜜終濃度０．５％添加した培地（ｐＨ  ６．３−６．８）を、Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａの最適培地として、ＮＦＧ培地（１０ｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  ０．２ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．１ｇ  ＮａＣｌ，  １．０ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，  ０．０５ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ２ｍｇ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  １ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，  １ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，  ０．１ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ／Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，  ｐＨ  ７．０）を使用した。
２．２    電気穿孔法による遺伝子導入：
上記２種類の受容菌をコンピテント細胞とするため、上記の受容菌それぞれの４００ｍｌ最適培地にて３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）し、対数増殖後期（ＯＤ６００＝０．５−０．６以上）まで増殖させた。４本の５０ｍｌ容のプラスチックチューブで、２−３回に分けて遠心分離法（７，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）で集菌し、上清を捨てて滅菌水で懸濁し、再び遠心分離処理を行い上清を捨てる操作によって洗浄した。この洗浄操作は、２本のチューブに全菌体をまとめながら行い、この操作を５回繰り返した。そして、１本のチューブにまとめて、１回洗浄し、さらに５０ｍｌの１０％グリセロールで１回洗浄し、１ｍｌの１０％グリセロールに懸濁してコンピテント細胞とした。この１ｍｌのコンピテント細胞を８０μｌづつを１．５ｍｌ容プラスチックチューブ（エッペンチューブ）に分注し、−８０℃以下で凍結保存した。
【００２９】
上記のように作製したコンピテント細胞を用いて、遺伝子導入を行った。８０μｌのコンピテント細胞に対して、５μｌのｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：ｖｋｔＡを電極幅２ｍｍ（または、１ｍｍ）のキュベット内で混合して混合細胞液とし、２，５００Ｖ（１２．５ｋＶ／ｃｍ、または２５．０ｋＶ／ｃｍ）で上記の混合細胞液に電気パルスを与えた。直ちに各菌株における最適培地１ｍｌを電気パルスを与えた混合細胞液に加え、３０℃で２−３時間振盪培養した。培養後、その内の１００−２００μｌをカナマイシンを含有する寒天最適培地の培養プレートに塗抹して、３０℃で１〜２日間培養した。形成されたコロニーの周縁部に直接３％  Ｈ２Ｏ２水溶液を直接添加する操作によって、ｖｋｔＡによる窒素固定菌の形質転換株を１次スクリーニングした。強い発泡が確認することができたコロニーが、目的とする形質転換株である。
３．  カタラーゼ活性の測定
３．１    培養条件：
ＬＧＩＰ液体培地（廃糖蜜を含む）あるいは、ＮＦＧ液体培地５ｍｌにて３０℃、往復振盪培養（１００ストローク／分）を行った対数増殖後期の菌液（前培養培地）０．１ｍｌを前培養と同じ組成の培地を本培養培地とし、この本培養培地５ｍｌに移し、３０℃で対数増殖後期から定常期初期まで培養した。
３．２    無細胞抽出液の調製：
培養菌液５ｍｌを１４，０００ｒｐｍで１分間、４℃で遠心し、集菌した。その後、得られた菌ペレットを５０ｍＭ  ＫＰＢ  （５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を８．５ｍｌ、５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４を９１．５ｍｌ；ｐＨ７．８）を用いて２回洗浄した。そして、１ｍｌのＫＰＢに懸濁後、超音波処理（２００Ｗ、２分×８回）により、菌体を破砕し、１８，０００ｒｐｍで３５分間、４℃で遠心し、その上清を無細胞抽出液として測定に用いた。
３．３    カタラーゼ活性の測定：
Ｈ２Ｏを２．６４５ｍｌ、０．５Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ  ６．９）を０．３ｍｌ、３０％  Ｈ２Ｏ２を５μｌを石英セル中で混合し、２５℃で３分間プレインキュベートして、温度平衡させた。その後に、無細胞抽出液５０μｌを加え、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数０．０４３６Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、２４０ｎｍにおける吸光値の変化から酵素活性を測定した（Ｈａｎｋｓ，  Ｊ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏ．，  ７１：８６９−８７３，  １９８３）。
３．４    タンパク量の測定：
タンパク量の測定は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．Ｍ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７２：２４８−２５７，  １９７６）。ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ  ２５０）溶液は、ＣＢＢ  １００ｍｇを９５％エタノール５０ｍｌに溶解し、１００ｍｌの８５％（ｗ／ｖ）リン酸を加えた後、１リットルに希釈して調製された。このＣＢＢ溶液５ｍｌに上記３．２で得られた無細胞抽出液１００μｌを混合し、５９５ｎｍの吸光値から定量した。コントロールの標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いた。
３．５    結果：
ｖｋｔＡ遺伝子で形質転換したＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ  ＡＴＣＣ３５８９４およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  １４２０１Ｔのカタラーゼ活性は、それぞれ１．２×１０４  Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎおよび１．９×１０４  Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、それぞれの親株のカタラーゼ活性（５．０および２１．５  Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に比較して非常に高い酵素活性を顕著に示した。
４．  窒素固定活性の測定
４．１    菌液の調製：
（ｉ）  Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ  ＡＴＣＣ３５８９４
上記２．２で得られたＨ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅは、最適培地（ＬＧＩＰ培地）４００ｍｌに植菌して、３０℃で振盪培養にて対数増殖期（ＯＤ６６０＝０．６以上）まで増殖させた。この菌液を７，７００ｒｐｍ、１０分、４℃で数回遠心分離処理を行い、集菌した。次に、Ｎｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液（０．３４ｇ  ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ，  ０．１７ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，  ０．２５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ２ｍｇ  Ｆｅ−ｃｉｔｒａｔｅ，  ０．０７５ｇ  ＫＣｌ，  ０．５ｍｌ  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ／Ｌ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ，  ｐＨ  ７．２）で１−２回洗浄した。そして、適当量のＮｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液に菌ペレットを懸濁することで濃縮菌液として調製した（宿主接種の場合には、２倍濃度に調製する）。
【００３０】
なお、Ｎｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液の組成成分の内「ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ」は、０．２０３ｇ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ，  ７．８ｍｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ０．０２２ｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．１４３ｇ  Ｈ３ＢＯ３，  １ｍｇ  （ＮＨ４）６Ｍｏ４Ｏ２・４Ｈ２Ｏ／１００ｍｌによって調製されたものである。
【００３１】
（ｉｉ）  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  １４２０１Ｔ
上記２．２で得られたＫ．  ｏｘｙｔｏｃａは、最適培地（ＮＦＧ培地）４００ｍｌに植菌し、３０℃で振盪培養にて対数増殖期（ＯＤ６６０＝０．５以上）まで増殖させた。この菌液を上記（ｉ）のＨ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅと同様に、７，７００ｒｐｍ、１０分、４℃で数回遠心分離処理を行い、集菌した。次に、Ｎｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液で１−２回洗浄した。そして、適当量のＮｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液に菌ペレットを懸濁することで濃縮菌液として調製した（宿主接種の場合には、２倍濃度に調製する）。
４．２    窒素固定活性の測定：
窒素固定菌の状態における窒素固定活性をアセチレン還元活性からガスクロマトグラフィー（日立Ｋ５３、検出器ＦＩＤ、カラムＰＯＲＡＰＡＫ−Ｎ５０〜８０ｍｅｓｈ、カラム温度５０℃、インジェクション温度１５０℃、流速３０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて測定した。
【００３２】
２０ｍｌ容のゴムフタ付きガラスバイアルに、２ｍｌの無窒素軟寒天培地を入れ、また上記４．１にて調製した菌体を集菌し、無窒素培地（上記２．１で使用した培地から（ＮＨ４）２ＳＯ４およびｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔを除いたもの）で１−２回洗浄したこの菌液１００μｌも入れた。コントロールとしてのブランクは、菌液の代わりに無窒素培地を入れたものを使用した。
【００３３】
次に、この菌液を、バイアルのフタを閉めて密封し、注射器の針をゴムフタ付きから差し込みバイアル内部から２ｍｌの空気を抜き取り、５３０ｐｐｍのアセチレンガスを２ｍｌ注入して培養した。アセチレンガスが、ｖｋｔＡ遺伝子により形質転換された内生ならびに単性窒素固定菌の菌液によって還元され、生成されるエチレン含量を測定することによって、窒素固定活性の測定結果とした。
４．３    結果：
（ｉ）  Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ
菌濃度を培養時の１００倍に濃縮し、カナマイシン（Ｋｍ）を含まない条件下で窒素固定活性を親株と比較・測定した。
【００３４】
ｖｋｔＡ遺伝子を導入したＨ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅの窒素固定活性は、培養４８時間まで時間の経過とともに約０．８５μｍｏｌ  ｏｆ  Ｃ２Ｈ４／ｖｉａｌまで増加した。
【００３５】
一方、親株の窒素固定活性も増加したが、培養４８時間で約０．５μｍｏｌ  ｏｆ  Ｃ２Ｈ４／ｖｉａｌであり、形質転換菌のおよそ５９％程度であった。
【００３６】
（ｉｉ）  Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａ
Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａの場合においても、無窒素培地で育成したところ、親株窒素固定活性および形質転換菌ともに窒素固定活性が増加することが確認することができた。
５．  植物への形質転換窒素固定菌の接種
５．１    宿主作物：
サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ  （Ｌ．）  ｃｖ．  ＲＫ８６−１２９）およびイネ（Ｏｒｉｚａ  ｓａｔｉｖａ  （Ｌ．）  ｃｖ．  Ｋａｓａｌａｔｈ）を使用した。
【００３７】
（ｉ）サトウキビ多芽体の再生と根誘導
再分化培地は、０．２％  Ｇｅｌｒｉｔｅ（Ｋｅｌｃｏ，  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．  Ｉｎｃ．）と３％  ｓｕｃｒｏｓｅを含むＭＳ固体培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，  １９６２）に、さらに０．２ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンおよび０．０１ｍｇ／Ｌのカイネチンを添加したものである。根誘導培地は、０．２ｍｇ／ＬのＮＡＡを添加した。無菌個体を取得するため、宿主はすべて生長点から再生した個体を用いた。多芽体を滅菌済みのガラスシャーレ上にて、滅菌済みピンセットを用いて１つ１つに分け、根誘導培地に植え継いだ。約１−２週間の培養後、発根した植物体を滅菌済みポットに移し、グロースチャンバー（ＮＫ−Ｂｉｏｔｒｏｎ；１サイクル  照度２：２６℃、２時間  照度３：２８℃、１０時間  照度２：２６℃、２時間  照度０：２４℃、１０時間）内で栽培した。また、多芽体の充分な試料数の確保のため、株分けした多芽体を新たな再分化培地に植え継ぐ方法を約１ヶ月行った。
【００３８】
（ｉｉ）  イネ（Ｏｒｉｚａ  ｓａｔｉｖａ  （Ｌ．）  ｃｖ．  Ｋａｓａｌａｔｈ）の処理
イネ種子は、籾殻を取り除き、１，０００倍に希釈したベンレートに３０分間浸して殺菌し、滅菌水で７−８回洗浄した。次に、水でよく湿らせたろ紙を敷いた滅菌済みガラスシャーレにイネ種子を約１５−２０粒づつ置床し、根毛が出るまで約２−７日間、２５−３０℃で培養した。
５．２    接種菌：
上記４．１（ｉ）（ｉｉ）の方法で調製したｖｋｔＡ遺伝子による形質転換されたＨ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅと形質転換Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａを接種菌液とし、またコントロールとしてそれぞれの菌種の親株も接種菌液として調整した。
５．３    窒素固定菌の宿主作物への接種：
（ｉ）  サトウキビへの接種
Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅをサトウキビに接種した。接種工程は、以下のとおりである。
（１）プラントボックス（ＣＵＬ−ＪＡＲ３００、ＩＷＡＫＩ）の底中央に直径約８ｍｍの穴を    開けた。
（２）長さ約２０ｃｍのロープ（綿１００％が好ましい）の一端をかた結びした。
（３）このロープは、結び目をプラントボックス内部に残すように先程の穴に  通され、約１０ｃｍのロープ部分が外に露出させた。
（４）このようにして用意したプラントボックスＡを、穴を開けていないプラ  ントボックスＢ（すなわち、ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｐｏｕｃｈの下段に相当する）に      重ねた。
（５）プラントボックスＢには、３−４分目（約１００ｍｌ）までＮｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液      を１００ｍｌ注いだ。
（６）プラントボックスＡには、６−７分目まで無機質担体としてバーミキュ    ライトを入れた。
（７）Ｎｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液１００ｍｌを注いだ。なお、この時、植物体が安定に生長    するまで、適度な量の窒素源を必要に応じて添加してもよい。たとえば      、窒素源としてＫＮＯ３を０．０５ｍＭ加える等。
（８）フタをし、プラントボックス全体をアルミホイルで覆った。
（９）これらを１２１℃、２０分、オートクレーブ滅菌した。
（１０）接種試験を行う１週間前に、発根したサトウキビ多芽体をこのプラン  トボックスに移植（プラントボックスあたり、１植物体）し、安定化さ    せた。
（１１）安定化させたサトウキビ多芽体を静かに抜き取り、Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅの  濃縮菌液が入った５００ｍｌ容ビーカー等に１時間浸した。
（１２）元のプラントボックスに植え戻し、残った濃縮菌液をさらに植物体に  あたり１０ｍｌずつ接種した。
（１３）栽培はグロースチャンバー内（１サイクル  照度２：２６℃、２時間      照度３：２８℃、１０時間  照度２：２６℃、２時間  照度０：２４℃、１０時間      ）で、１．５−２ヶ月間行った。
（１４）２０日目にＮｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液にて追肥し、滅菌蒸留水を適宜に与えた。
【００３９】
（ｉｉ）  イネへの接種
Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａをイネに接種した。接種工程は、以下のとおりである。
（１）プラントボックス（ＣＵＬ−ＪＡＲ３００、ＩＷＡＫＩ）の６−７分目までバーミキュ    ライトを入れた。
（２）Ｎｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液を１００ｍｌを注いだ。
（３）フタをし、プラントボックス全体をアルミホイルで覆った。
（４）１２１℃、２０分でオートクレーブ滅菌した。
（５）接種試験を行う１週間前に、発芽・発根したイネ種子をこのプラントボ  ックスに移植し、安定化させた。
（６）安定化させたこのイネ種子を静かにピンセット等で採取し、Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａ  の濃縮菌液が入った５００ｍｌ容ビーカー等に１時間浸した。
（７）元のプラントボックスに植え戻し、残った濃縮菌液をさらに植物体にあ  たり５ｍｌずつ接種した。
（８）栽培は、２６℃の温室で１．５−２ヶ月間行った。
（９）また、２０日目にＮｏｒｒｉｓ−Ｄａｔｅ氏液にて追肥し、滅菌蒸留水を適宜に与え  た。
５．４    結果：
（ｉ）  Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅにおける効果
図１は、ｖｋｔＡ遺伝子で形質転換した内生窒素固定菌Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅを接種したサトウキビ（高カタラーゼ株）、その親株を接種したサトウキビおよび無接種のサトウキビの成長の度合いを示した図である。（Ａ）はプラントボックス内での状態を、（Ｂ）はプラントボックスから取り出して、根の部分の様子をそれぞれ示している。また、表１は、図１で示した各サトウキビの株数、茎長、葉数および植物体重量（生重量および乾燥重量）の比較である。
【００４０】
図１および表１に示したように、形質転換菌株を接種したサトウキビは、茎長においては、有意な差は確認できなかったものの、株数や葉数の生長は高カタラーゼ株、親株の接種によって促進された。その成長率は、無接種を１００とした場合、親株は１２５．１（株数）および１３０．４（葉数）、高カタラーゼ株は１６０．８（株数）および１７５．２（葉数）であった。また、植物体重量は、親株の接種では、有意な増加を確認できなかったが、無接種を１００とした場合、高カタラーゼ株は１３３．１（生重量）および１２５．４（乾燥重量）であった。
【００４１】
これらの結果から、植物体（この場合、サトウキビ）に対してＨ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅには優れた生長促進効果を有し、しかもｖｋｔＡ遺伝子（カタラーゼ遺伝子）を導入することによって、その効果は増強されることが確認された。
【００４２】
【表１】
2005013003.tif 000002
【００４３】
（ｉｉ）  Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａにおける効果
図２は、ｖｋｔＡ遺伝子で形質転換した単生窒素固定菌Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａを接種したイネ（高カタラーゼ株）、その親株を接種したイネおよび無接種のイネの生長の度合いを示した図である。（Ａ）はプラントボックス内での状態を、（Ｂ）はプラントボックスから取り出して、根の部分の様子をそれぞれ示している。また、表２は、図２で示した各イネの株数、茎長、葉数および植物体重量（生重量および乾燥重量）の比較である。
【００４４】
図２および表２に示したように、形質転換菌株を接種したイネは、茎長および葉数いずれにおいても無接種の場合と比べ、親株、高カタラーゼ株の接種によって生長が促進され、また親株よりも高カタラーゼ株の方がより大きく促進された。この生長の促進効果は、植物体上部および植物体下部の両方において確認することができた。その生長率は、無接種を１００とした場合、親株は１３２．７（茎長）および１００．８（葉数）、高カタラーゼ株は１５９．４（茎長）および１１１．２（葉数）であった。
【００４５】
植物体重量においても、親株および高カタラーゼ株によって、有意にイネの生長促進の効果が確認された。無接種を生重量、乾燥重量ともに１００とした場合、親株は、１２４．７（生重量）および１２４．８（乾燥重量）であり、高カタラーゼ株は２５２．３（生重量）および１７０．９（乾燥重量）であった。
【００４６】
これらの結果から、Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅの場合と同様に、植物体（この場合、イネ）に対してＫ．  ｏｘｙｔｏｃａにおいても優れた生長促進効果を有し、しかもｖｋｔＡ遺伝子（カタラーゼ遺伝子）を導入することによって、その効果は増強されることが確認された。
【００４７】
【表２】
2005013003.tif 000003
【００４８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、カタラーゼ遺伝子の導入によって形質転換された窒素固定能の優れた内生ならびに単生窒素固定菌が提供される。これによって、植物の成長促進とマメ収量の増加が可能となる。また窒素肥料の削減による農業コストと低減化と環境汚染の緩和も図られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｖｋｔＡ遺伝子で形質転換した内生窒素固定菌Ｈ．  ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅを接種したサトウキビ（高カタラーゼ株）、その親株を接種したサトウキビおよび無接種のサトウキビの成長の度合いを示した図である。（Ａ）はプラントボックス内での状態を、（Ｂ）はプラントボックスから取り出して、根の部分の様子をそれぞれ示している。
【図２】図２は、ｖｋｔＡ遺伝子で形質転換した単生窒素固定菌Ｋ．  ｏｘｙｔｏｃａを接種したイネ（高カタラーゼ株）、その親株を接種したイネおよび無接種のイネの生長の度合いを示した図である。（Ａ）はプラントボックス内での状態を、（Ｂ）はプラントボックスから取り出して、根の部分の様子をそれぞれ示している。
【図１】
2005013003.tif 000004
【図２】
2005013003.tif 000005