(57)【要約】【課題】  ヘリカーゼの基質特異性を同定する方法の提供。【解決手段】  ５’突出末端を有する二本鎖核酸、３’突出末端を有する二本鎖核酸および突出末端を持たない二本鎖核酸のそれぞれを基質とした被験ヘリカーゼによる酵素反応を行ない、二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を用いて被験ヘリカーゼの各基質に対する反応速度を測定し、各基質についての測定値の組み合わせを被験ヘリカーゼの基質特異性として同定する。【選択図】  図１
2005253364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリカーゼの基質特異性を同定する方法であって、
（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質を用意する工程、
（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質を用意する工程、
（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質を用意する工程、
（ｄ）５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質のそれぞれを基質として、被験ヘリカーゼによる酵素反応を行なう工程、ならびに
（ｅ）前記酵素反応の各反応産物からのシグナル強度を測定する工程
を含んでなり、各基質についてのシグナル強度の増加速度または減少速度の組み合わせが被験ヘリカーゼの基質特異性として同定される、方法。
【請求項２】
前記二本鎖核酸が、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの二本鎖核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験ヘリカーゼが、ＤＮＡヘリカーゼまたはＲＮＡヘリカーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記シグナル発生物質が、各基質に含まれる二本鎖核酸の平滑末端において、両鎖のそれぞれに連結された、蛍光共鳴エネルギー移動現象を起こす２種の発蛍光団である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナル発生物質が、二本鎖核酸にインターカレートすることによって蛍光シグナルを発生させる蛍光色素である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素反応が、基質に含まれる二本鎖核酸から遊離した一本鎖核酸のいずれか一方または両方を捕捉する物質の存在下において行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヘリカーゼの基質特異性の同定に用いるためのキットであって、
（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質、
（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質、ならびに
（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質
を含んでなる、キット。
【請求項８】
前記二本鎖核酸が、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの二本鎖核酸である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記シグナル発生物質が、各基質に含まれる二本鎖核酸の平滑末端において、両鎖のそれぞれに連結された、蛍光共鳴エネルギー移動現象を起こす２種の発蛍光団である、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
前記シグナル発生物質が、二本鎖核酸にインターカレートすることによって蛍光シグナルを発生させる蛍光色素である、請求項７に記載のキット。
【請求項１１】
基質に含まれる二本鎖核酸から遊離したいずれかの一本鎖核酸を捕捉する物質をさらに含んでなる、請求項７に記載のキット。
【請求項１２】
ヘリカーゼの活性を阻害する化合物の同定に用いるためのキットであって、
（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質、
（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質、ならびに
（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質
を含んでなる、キット。
【請求項１３】
基質に含まれる二本鎖核酸から遊離したいずれかの一本鎖核酸を捕捉する物質をさらに含んでなる、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
一本鎖核酸に特異的に結合するタンパク質の同定に用いるためのキットであって、
（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質、
（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質、ならびに
（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質
を含んでなる、キット。
【請求項１５】
ヘリカーゼをさらに含んでなる、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヘリカーゼの基質に対する特異性を同定する方法に関するものである。
【０００２】
背景技術
ヘリカーゼは、ＡＴＰ等の加水分解エネルギーを利用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド等の二本鎖核酸のらせん構造を解く（巻き戻す）作用を有する酵素の総称である。ヘリカーゼは、生体内において、ＤＮＡの複製、組換え、修復、ＲＮＡへの転写、タンパク質への翻訳、プロセッシング等に関与する重要な酵素である。また、ヘリカーゼは構造的にも機能的にも多種多様であることが知られており、さらには、「ヘリカーゼ」と称されないタンパク質の中にも、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質は数多く存在する。さらに、原核生物であるか真核生物であるかを問わず、ヘリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ゲノム全遺伝子の１％に達するとの試算結果が知られており、これによれば、大腸菌は４０〜５０種類のヘリカーゼを有していることになる。
【０００３】
１９９５年から１９９６年にかけて、ともにヒトの遺伝病であるブルーム症候群およびウェルナー症候群の原因遺伝子が相次いで同定されており（例えば、非特許文献１：Ellis NA.ら、Cell (1995) 83: 655-666；非特許文献２：Yu C-E.ら、Science (1996) 272: 258-262参照）、これらの遺伝子は、いずれもＤＮＡヘリカーゼをコードしていることが見出されている。その後、ロスモンド・トムソン症候群の原因遺伝子についても、上記２つの原因遺伝子とアミノ酸配列上で同一の特徴を持つＤＮＡヘリカーゼをコードしていることが明らかとなっている（例えば、非特許文献３：Kitao S.ら、Nature Genetics (1999) 22: 82-84参照）。このように、ヘリカーゼの一部が異常をきたすことで、重篤な遺伝性疾患を引き起こすことが明らかになりつつある。従って、ヘリカーゼの基質特異性をはじめとする諸性質を明らかにすることは、このような遺伝性疾患の迅速な診断およびその病態の解明に重要であるばかりでなく、これら疾病の治療薬となり得るヘリカーゼインヒビター等のスクリーニングにも有用である。
【０００４】
ヘリカーゼの活性をインビトロで測定する方法としては、主に、二本鎖ＤＮＡとヘリカーゼを反応させた後、遊離した一本鎖ＤＮＡを電気泳動的手法により分離して定量するというエンドポイントアッセイが用いられている。このアッセイでは、まず、放射性同位元素で標識した基質となる二本鎖核酸をヘリカーゼと反応させる。次いで、この反応による生成物をポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上で電気泳動することにより、反応生成物中に含まれる二本鎖核酸と一本鎖核酸とを分離し、標識からの放射能の量を測定することにより一本鎖核酸を定量することができる。
【０００５】
さらに、ヘリカーゼの活性を測定する方法として、数種のアッセイが提案されている。このようなアッセイの一つとして、ヘリカーゼにより巻き戻された後の一本鎖ＤＮＡに、例えばＳ１ヌクレアーゼのような一本鎖特異的ヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼＩなどを作用させて、そのヌクレアーゼ活性を測定することにより、間接的にヘリカーゼ活性を測定する方法がある（例えば、非特許文献４：Palasら、The Journal of Biological Chemistry (1990) 265: 3447参照）。また、他のアッセイとして、一本鎖ＤＮＡ特異的結合性タンパク質を利用した分光学的アッセイも提案されている（例えば、非特許文献５：Romanら, Biochemistry (1989) 28: 2863参照）。この方法は、一本鎖ＤＮＡ特異的結合性タンパク質が、ヘリカーゼによって産生された一本鎖ＤＮＡと結合することにより、タンパク質固有の蛍光が生じることを利用して、ヘリカーゼの活性を測定する方法である。
【０００６】
また、ヘリカーゼインヒビターをハイスループットでスクリーニングする方法として、ヘリカーゼの活性を電気化学的手法により測定する方法が提案されている（特許文献１：特表２００３−５１１６６０号公報参照）。この方法では、一方の末端に電気化学ルミネセンス標識をした第一の一本鎖核酸と、第一の一本鎖核酸と部分的に相補的な配列をもつ第二の環状一本鎖核酸とからなる二本鎖核酸を基質とし、これにヘリカーゼを作用させて第一の一本鎖核酸を解離させる。次いで、解離した第一の一本鎖核酸を、これと相補的な配列を有する、ビオチンで標識された第三の一本鎖核酸との間で二本鎖形成させることによって捕捉し、さらに、得られた二本鎖核酸を、アビジンを担持した磁性ビーズ上に回収する。最後に、標識された第一の一本鎖核酸からの電気化学ルミネセンスを測定することにより、ヘリカーゼ活性が測定される。
【０００７】
この他にも、ヘリカーゼの活性を測定する方法がいくつか提案されている（例えば、特許文献２：米国特許第４，５６８，６４９号明細書；特許文献３：米国特許第５，７０５，３４４号明細書；特許文献４：米国特許第５，７４７，２４７号明細書参照）。
【０００８】
しかしながら、ヘリカーゼの基質特異性を測定する方法は知られていない。また、以上のように、ヘリカーゼの活性を測定するためのいくつかの方法が知られているが、いずれの方法においても、測定感度、アッセイの実施に要求される工程の数、迅速性、簡便性などに関して、ヘリカーゼの基質特異性を測定する上で不十分な点が認められる。
【０００９】
一方で、二本鎖核酸の高次構造変化の観察に利用しうる手段として、蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence Resonance Energy Transfer。以下「ＦＲＥＴ」という）現象が知られている。ＦＲＥＴ現象とは、第一の発蛍光団の蛍光スペクトルが第二の発蛍光団の励起スペクトルと重複し、かつ、これらの発蛍光団同士が近接する位置に存在する場合に、第一の発蛍光団の励起エネルギーが第二の発蛍光団の蛍光発光を誘導し、これに伴なって第一の発蛍光団はエネルギーを失ってその蛍光強度が減少するという現象を意味する（例えば、非特許文献６：Stryerら, Annual Review of Biochemistry (1978) 47: 819-846；非特許文献７：Taylorら、Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture (1089) Part B, Academic Press, New York: 220-245参照）。ＦＲＥＴ現象は、２つの発蛍光団どうしの距離に極めて敏感であることが知られている。
【００１０】
さらに、二本鎖核酸の高次構造変化の観察に利用しうる手段として、二本鎖核酸特異的な蛍光色素が知られている。二本鎖核酸特異的な蛍光色素とは、一本鎖核酸とは反応せず、二本鎖核酸のみにインターカレートして蛍光を発する色素である。すなわち、この色素は、基質である核酸が二本鎖を形成している場合には特定の励起光により蛍光を発するが、二本鎖が巻き戻されて１本鎖になると消光する。
【００１１】
【特許文献１】特表２００３−５１１６６０号公報
【特許文献２】米国特許第４，５６８，６４９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７０５，３４４号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７４７，２４７号明細書
【非特許文献１】Ellis NA.ら、Cell (1995) 83: 655-666
【非特許文献２】Yu C-E.ら、Science (1996) 272: 258-262
【非特許文献３】Kitao S.ら、Nature Genetics (1999) 22: 82-84
【非特許文献４】Palasら、The Journal of Biological Chemistry (1990) 265: 3447
【非特許文献５】Romanら, Biochemistry (1989) 28: 2863
【非特許文献６】Stryerら, Annual Review of Biochemistry (1978) 47: 819-846
【非特許文献７】Taylorら、Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture (1089) Part B, Academic Press, New York: 220-245
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、今般、末端の形状が異なる３種類の二本鎖核酸のそれぞれに二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を組み合わせた３種の基質を用いて、ヘリカーゼの二本鎖核酸の巻き戻し活性を測定することにより、該ヘリカーゼの基質特異性を好適に評価できることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１３】
従って、本発明の目的は、ヘリカーゼの基質特異性を同定する方法を提供することにある。
【００１４】
そして、本発明による方法は、ヘリカーゼの基質特異性を同定する方法であって、（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質を用意する工程、（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質を用意する工程、（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質を用意する工程、（ｄ）５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質のそれぞれを基質として、被験ヘリカーゼによる酵素反応を行なう工程、ならびに（ｅ）前記酵素反応の各反応産物からのシグナル強度を測定する工程を含んでなり、各基質についてのシグナル強度の増加速度または減少速度の組み合わせが被験ヘリカーゼの基質特異性として同定される方法である。
【００１５】
本発明によれば、基質特異性が知られていないヘリカーゼについては、その基質特異性を迅速に同定することが可能となり、また、基質特異性が知られているヘリカーゼについては、その精製などにおいて、該ヘリカーゼの活性を的確かつ迅速に検出することが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１６】
本発明による方法では、３種の二本鎖核酸基質を用いたヘリカーゼによる酵素反応が行なわれ、それぞれの基質に対する巻き戻し（二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離）の速度の組み合わせが、前記酵素反応に用いられたヘリカーゼの基質特異性として同定される。
【００１７】
本明細書において「ヘリカーゼ」とは、二本鎖核酸を一本鎖の状態に巻き戻す性質を有するタンパク質を意味する。従って、「ヘリカーゼ」という名称が与えられていないタンパク質であっても、二本鎖核酸を一本鎖の状態に巻き戻す性質を有するものであれば、本発明における「ヘリカーゼ」に含まれる。ヘリカーゼは、典型的には、二本鎖核酸の末端から両鎖の間に入り込み、ＡＴＰなどからの加水分解エネルギーを利用して塩基間の水素結合を切断することにより、二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離させることが知られている。このようなヘリカーゼとしては、例えば、ＤＮＡヘリカーゼ、ＲＮＡヘリカーゼなどが挙げられる。
【００１８】
本発明に用いられる３種の二本鎖核酸基質は、（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質、（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質、ならびに（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質である。
【００１９】
本明細書において「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味する。また、ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡが包含される。さらに、二本鎖核酸としては、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの二本鎖核酸が挙げられる。本発明に用いる核酸の塩基配列は、使用の目的に応じて適宜選択することができる。また、核酸の鎖長は特に制限されず、例えば、数十ｂｐから数ｋｂｐまでのものが好適に使用可能である。
【００２０】
本明細書において「５’突出末端」とは、二本鎖核酸を構成する一方の鎖が、その５’末端部分において、他方の鎖の３’末端よりも突出した一本鎖部分を含む場合における、その二本鎖核酸の末端の形状を意味する。また、「３’突出末端」とは、二本鎖核酸を構成する一方の鎖が、その３’末端部分において、他方の鎖の５’末端よりも突出した一本鎖部分を含む場合における、その二本鎖核酸の末端の形状を意味する。さらに、「平滑末端」とは、二本鎖核酸を構成する両方の鎖が上記のような一本鎖部分を含まない場合における、その二本鎖核酸の末端の形状を意味する。
【００２１】
本発明に用いられる５’突出末端基質および３’突出末端基質に含まれる二本鎖核酸は、一方の端部がそれぞれ５’突出末端および３’突出末端となっている。これらの突出末端における一本鎖部分（突出部分）の鎖長およびヌクレオチド配列は、その基質に対するヘリカーゼの作用を妨害しない限りにおいて、特に制限されない。一方で、突出末端基質に対して高い基質特異性を有するヘリカーゼにとって、突出部分は、ヘリカーゼが基質に結合するために必要であると考えられている。この観点から、ヘリカーゼの基質特異性をより的確に同定するためには、突出部分の鎖長を３０塩基以上とすることが好ましく、より好ましくは４０塩基以上とする。また、突出部分は一本鎖核酸であるため、その具体的なヌクレオチド配列によっては突出部分の内部において高次構造を形成し、その結果、ヘリカーゼの突出部分への結合が阻害される可能性がある。従って、突出部分のヌクレオチド配列は、このような高次構造を形成しないように設計することが望ましい。
【００２２】
本発明に用いられるシグナル発生物質としては、二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（巻き戻し）によってそのシグナル強度が増加または減少するものであればよく、例えば、電気化学発光物質、ＦＲＥＴ現象を起こす一組の発蛍光団、二本鎖特異的蛍光色素等が挙げられる。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記シグナル発生物質は、各基質に含まれる二本鎖核酸の平滑末端において、両鎖のそれぞれに連結された、ＦＲＥＴ現象を起こす２種の発蛍光団とされる。
【００２４】
本発明においてＦＲＥＴ現象を起こす２種の発蛍光団を利用する場合における酵素反応の作用機序を、図１に示す。本発明においてＦＲＥＴ現象を利用する場合、ＦＲＥＴを生じる基質は、エネルギー供与性蛍光色素（ドナー：Ｄ）を結合した一本鎖ドナープローブと、エネルギー受容性蛍光色素（アクセプター：Ａ）を結合した一本鎖アクセプタープローブとをハイブリダイズさせた二本鎖プローブである。すなわち、ＦＲＥＴを生じる基質は２種類の一本鎖核酸プローブによって構成され、それぞれのプローブの末端部には、前記ドナー（Ｄ）および前記アクセプター（Ａ）が連結されている。これらの蛍光色素は、基質中においてＦＲＥＴ現象を起こすことが可能な位置関係を有するように各プローブに連結され、好ましくは、基質中の二本鎖核酸に存在する平滑末端において、両鎖のそれぞれに連結された形となるように各プローブに連結される。このような二本鎖プローブにドナー（Ｄ）の励起波長の光を照射すると、ＦＲＥＴ現象によるエネルギー転移により、アクセプター（Ａ）からの蛍光スペクトルが観察される。一方で、この二本鎖プローブがヘリカーゼによる酵素反応によって一本鎖となった場合には、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）の間の距離が離れるため、ＦＲＥＴ現象が解除され、ドナー（Ｄ）からの蛍光スペクトルが観察される。すなわち、ドナー（Ｄ）の蛍光強度の増加は、基質中に含まれる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（巻き戻し）と一元的に対応しており、従って、この蛍光強度の変化を測定することにより、ヘリカーゼの巻き戻し活性を評価することができる。
【００２５】
エネルギー供与性蛍光色素（ドナー：Ｄ）とエネルギー受容性蛍光色素（アクセプター：Ａ）の組み合わせは、ＦＲＥＴ現象を起こす組み合わせであればよく、特に制限されない。種々の蛍光色素が使用可能であるが、例えば、フルオレセイン系、ローダミン系、Ｃｙ３系の色素等が好適に使用可能である。フルオレセインは４９２ｎｍで励起した場合に５１８ｎｍに蛍光のピークを示し、ローダミンは５７０ｎｍで励起した場合に５９０ｎｍに蛍光ピークを示し、Ｃｙ３は５５２ｎｍで励起した場合に５６５ｎｍに蛍光ピークを示す。例えば、フルオレセインとＣｙ３がＦＲＥＴを生じるのに十分な距離に近接している場合、フルオレセインに４９２ｎｍの励起光を照射すると、エネルギー供与体としてのフルオレセインから、エネルギー受容体としてのＣｙ３への蛍光共鳴エネルギー転移に伴い、フルオレセインからの５１８ｎｍの蛍光強度は減少し、Ｃｙ３からの５６５ｎｍの蛍光強度が増加する。本発明においては、３種類の基質に含まれる二本鎖核酸を同一の蛍光団の組合せで標識して個々にアッセイを行なうことができ、あるいは、３種類の基質に含まれる二本鎖核酸を相互に異なる蛍光団の組合せで標識して同時にアッセイを行うことも可能である。本発明の特に好ましい実施態様によれば、ドナーとしてフルオレセイン発蛍光団を有する色素が用いられ、アクセプターとしてＣｙ３発蛍光団を有する色素が用いられる。
【００２６】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記シグナル発生物質は、二本鎖核酸にインターカレートすることによって蛍光シグナルを発生させる蛍光色素（インターカレート性蛍光色素）とされる。
【００２７】
本発明においてインターカレート性蛍光色素を利用する場合における酵素反応の作用機序を、図１に示す。インターカレート性蛍光色素は、二本鎖核酸の安定な二重らせん構造の溝部内等に特異的に挿入された状態では、励起光の照射によって蛍光を発する。このインターカレート性蛍光色素によって標識した二本鎖核酸をヘリカーゼと反応させると、ヘリカーゼの巻き戻し活性によって核酸の二重らせん構造が解消され、同時にその溝部内等に特異的に挿入されていた蛍光色素が解離する。解離した蛍光色素は、励起光を照射しても蛍光を発しないか、またはその蛍光強度が極めて微弱であるため、蛍光色素の蛍光強度が著しく減少することになる。すなわち、ヘリカーゼによって基質中に含まれる二本鎖核酸が一本鎖に巻き戻されるにつれて、反応産物からの蛍光強度が減少する。従って、インターカレート性蛍光色素からの蛍光強度の減少は核酸の二本鎖構造の解消と一元的に対応しており、よって、この蛍光強度の変化を測定することにより、ヘリカーゼの巻き戻し活性を評価することができる。
【００２８】
本発明に用いられるインターカレート性蛍光色素は、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、例えば、フェナントリジウム（phenanthridinium）系色素、アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＤＤ）、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）、ベンゾオキサゾリウム−４−ピリジニウム（benzoxazolium-4-pyridinium, PO）系色素、ベンゾチアゾリウム−４−ピリジニウム（benzothiazolium-4-pyridinium, BO）系色素、ベンゾオキサゾリウム−４−キノリニウム（benzoxazolium-4-quinolinium, YO）系色素、ベンゾチアゾリウム−４−キノリニウム（benzothiazolium-4-quinolinium, TO）系色素等が挙げられる。これらの蛍光色素は、二本鎖核酸の定量に頻繁に利用されているものであるため、当業者には容易に入手可能である。本発明においては、市販のインターカレート性蛍光色素であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＹＯＹＯ−１等も好適に利用することができる。
【００２９】
本発明に用いられる各基質は、２種の一本鎖核酸を溶液中で適当な温度条件の下でハイブリダイズさせ、さらに、その前後において、シグナル発生物質で標識化することによって製造することができる。このような基質の製造は、当技術分野において周知の標準的な方法に従って行なうことができる。また、基質の製造において、標識化された一本鎖核酸が残存する可能性がある。このような残存一本鎖核酸は、酵素反応後におけるシグナル強度の正確な測定を妨害することがあるため、酵素反応前に除去することが好ましい。このような残存一本鎖核酸の除去は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動、ゲルろ過のような物理的手法、陰イオン交換カラムなどによる静電的分離手法等によって行なうことができる。
【００３０】
本発明においては、上記の５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質のそれぞれを基質として、ヘリカーゼによる酵素反応が行なわれる。酵素反応の各種条件は、対象となるヘリカーゼの至適ｐＨ、安定ｐＨ、至適温度、安定温度等に応じて、当業者により適宜設定される。酵素反応は、具体的には、所定のｐＨを有する緩衝液中に基質およびヘリカーゼを添加した反応溶液を調製し、この反応溶液を所定の温度にてインキュベートすることによって行なうことができる。酵素反応に用いられる各基質の量は、ヘリカーゼによる酵素反応において用いることのできる範囲の量であればよく、特に制限されないが、好ましくは０．３〜３００ｎＭの濃度、より好ましくは３〜３００ｎＭの濃度とされる。
【００３１】
酵素反応においては、ヘリカーゼにより解離した一本鎖核酸が反応中に再度二本鎖を形成しないようにすることが好ましく、これにより、ヘリカーゼの基質特異性をより正確に同定することが可能となる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、上記酵素反応は、基質に含まれる二本鎖核酸から遊離した一本鎖核酸のいずれか一方または両方を捕捉する物質の存在下において行なわれる。このような一本鎖核酸捕捉物質は、ヘリカーゼによって巻き戻された２種の一本鎖核酸が再び二本鎖を形成することを防止できる物質であればよく、このような物質は、当業者であれば適宜選択することができる。一本鎖核酸捕捉物質としては、例えば、二本鎖核酸から解離した２種の一本鎖核酸のいずれか一方に相補的な塩基配列を有し、かつ、上記シグナル発生物質で標識されていない一本鎖核酸またはペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。この非標識一本鎖核酸は、ヘリカーゼの作用により解離した２種の一本鎖核酸のいずれか一方にハイブリダイズし、これにより、シグナル強度の測定値に影響を与える前記２種の一本鎖核酸の二本鎖形成を防止することができる。また、非標識ＰＮＡは、ペプチド骨格を有するため、リン酸基による負電荷の反発がなく、よって、ヘリカーゼの作用により解離した２種の一本鎖核酸のいずれか一方とより強くハイブリダイズすることができる。従って、非標識ＰＮＡは、非標識一本鎖核酸に比べて、シグナル強度の測定値に影響を与える前記２種の一本鎖核酸の二本鎖形成を、より強力に防止することができる。さらに、一本鎖核酸捕捉物質の他の例としては、一本鎖核酸に特異的に結合することができるタンパク質が挙げられる。このような一本鎖核酸特異的結合性タンパク質は生物由来のタンパク質であり、一本鎖核酸に特異的に結合して安定化し、立体障害によって二本鎖への再形成を阻害する。一本鎖核酸捕捉物質の使用量は、当業者であれば適切に設定することができる。例えば、一本鎖核酸捕捉物質として上記の非標識一本鎖核酸または非標識ＰＮＡを使用する場合には、これらを、ヘリカーゼの作用により解離する、対応する一本鎖核酸に対して過剰量添加することが望ましい。
【００３２】
本発明においては、上記の酵素反応によって得られる反応産物からのシグナル強度が測定される。このようなシグナル強度の測定は、使用されるシグナル発生物質の種類に応じて、当業者であれば適切に行なうことが可能である。例えば、シグナル発生物質として蛍光色素を用いる場合には、前記シグナル強度は、蛍光強度を測定するための標準的な装置を用いて測定することができる。また、蛍光強度の測定においては、より高感度の測定を行なうため、励起波長の選択、蛍光の選択的測定のためのフィルターの使用、２種類の蛍光を同時に測定するための手段など、当業者であれば適切な手段を採用することも可能である。
【００３３】
本発明においては、さらに、得られたシグナル強度の測定値から、シグナル強度の変化速度が決定される。この変化速度は、基質に含まれる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加する場合にはシグナル強度の増加速度とされ、基質に含まれる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が減少する場合にはシグナル強度の減少速度とされる。このようなシグナル強度の増加速度または減少速度は、当業者であれば適切に決定することができる。例えば、シグナル強度の増加速度または減少速度は、酵素反応が行なわれている間に適当な時間間隔を置いて複数回のシグナル強度測定を行ない、その測定値をプロットすることによって得られるグラフの傾きとすることができる。あるいは、所定の時間で酵素反応を行なった後にシグナル強度測定を行ない、得られた測定値から酵素反応前におけるシグナル強度測定値を差し引いた値を、前記増加速度または前記減少速度としてもよい。
【００３４】
本発明においては、５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質のそれぞれについて得られた上記シグナル強度の増加速度または減少速度の組み合わせが、酵素反応に用いられたヘリカーゼの基質特異性として同定される。このような基質特異性は、既知の特性を有するヘリカーゼについて得られた上記シグナル強度の増加速度または減少速度の組み合わせと比較することもでき、これにより、対象とするヘリカーゼの相対的な基質特異性を知ることも可能である。
【００３５】
本発明による方法を実施するため、必要な試薬類をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、ヘリカーゼの基質特異性の同定に用いるためのキットが提供され、該キットは、（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質、（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質、ならびに（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質を含んでなる。このキットは、基質に含まれる二本鎖核酸から遊離したいずれかの一本鎖核酸を捕捉する物質をさらに含んでなることが好ましく、さらには、緩衝液などの他の試薬類、本発明による方法の具体的手順を記載した説明書等を含んでいてもよい。
【００３６】
また、本発明による方法を応用することにより、ヘリカーゼインヒビターをハイスループットにスクリーニングすることが可能である。ヘリカーゼインヒビターとは、ヘリカーゼの活性を阻害するタンパク質などの化合物であり、対象となるヘリカーゼが疾患の原因である場合、そのヘリカーゼインヒビターは疾患の治療に有用な一群の薬理学的物質を提供する。この応用例では、本発明による方法において、ヘリカーゼの阻害活性を有する可能性のある被験化合物の存在下において酵素反応を行ない、反応産物からのシグナル強度の増加速度または減少速度を決定し、これを、被験化合物の不在下で酵素反応を行なった場合に得られるものと比較する。
【００３７】
従って、本発明によれば、ヘリカーゼの活性を阻害する化合物を同定する方法が提供され、該方法は、（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質を用意する工程、（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質を用意する工程、（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質を用意する工程、（ｄ）５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質のそれぞれを基質として、被験化合物の存在下においてヘリカーゼによる酵素反応を行なう工程、ならびに（ｅ）前記酵素反応の各反応産物からのシグナル強度を測定する工程を含んでなる。この方法においては、いずれかの基質についてのシグナル強度の増加速度または減少速度が、被験化合物の不在下において前記酵素反応を行なったときに得られる速度よりも減少している場合に、その被験化合物が前記ヘリカーゼの阻害剤として同定される。この方法によれば、５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質のうちの特定の基質に対するヘリカーゼの活性を阻害する化合物を同定することも可能である。
【００３８】
本発明によるヘリカーゼ阻害剤の同定法を実施するため、必要な試薬類をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、ヘリカーゼの活性を阻害する化合物の同定に用いるためのキットが提供され、該キットは、（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質、（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質、ならびに（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質を含んでなる。このキットは、基質に含まれる二本鎖核酸から遊離したいずれかの一本鎖核酸を捕捉する物質をさらに含んでなることが好ましく、さらには、緩衝液などの他の試薬類、本発明によるヘリカーゼ阻害剤の同定法の具体的手順を記載した説明書等を含んでいてもよい。
【００３９】
さらに、本発明による方法を応用することにより、新規な一本鎖核酸特異的結合性タンパク質をハイスループットにスクリーニングすることが可能である。この応用例では、本発明による方法において、一本鎖核酸特異的結合活性を有する可能性のある被験タンパク質の存在下において酵素反応を行ない、反応産物からのシグナル強度の増加速度または減少速度を決定し、これを、被験タンパク質の不在下で酵素反応を行なった場合に得られるものと比較する。
【００４０】
従って、本発明によれば、一本鎖核酸に特異的に結合するタンパク質を同定する方法が提供され、該方法は、（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質を用意する工程、（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質を用意する工程、（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質を用意する工程、（ｄ）５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質のそれぞれを基質として、被験タンパク質の存在下においてヘリカーゼによる酵素反応を行なう工程、ならびに（ｅ）前記酵素反応の各反応産物からのシグナル強度を測定する工程を含んでなる。この方法においては、いずれかの基質についてのシグナル強度の増加速度または減少速度が、被験タンパク質の不在下において前記酵素反応を行なったときに得られる速度よりも増加している場合に、その被験タンパク質が一本鎖核酸に特異的に結合するタンパク質として同定される。この方法によれば、一本鎖核酸特異的結合性タンパク質の力価を評価することも可能である。
【００４１】
本発明による一本鎖核酸特異的結合性タンパク質の同定法を実施するため、必要な試薬類をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、一本鎖核酸に特異的に結合するタンパク質の同定に用いるためのキットが提供され、該キットは、（ａ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が５’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる５’突出末端基質、（ｂ）一方の端部が平滑末端であり、かつ、他方の端部が３’突出末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる３’突出末端基質、ならびに（ｃ）両方の端部が平滑末端である二本鎖核酸、および該二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離によってシグナル強度が増加または減少するシグナル発生物質を含んでなる平滑末端基質を含んでなる。このキットは、ヘリカーゼをさらに含んでなることが好ましく、さらには、緩衝液などの他の試薬類、本発明による一本鎖核酸特異的結合性タンパク質の同定法の具体的手順を記載した説明書等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００４３】
例１：５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質を用いたヘリカーゼの基質特異性の同定
（１）二本鎖ＤＮＡの調製
３’末端または５’末端にフルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはＣｙ３を標識した、下記表１に示す一本鎖ＤＮＡを、PROLIGO社より入手した。
【００４４】
【表１】
2005253364.tif 000003
【００４５】
等モルの標識ＤＮＡ−１と標識ＤＮＡ−２を、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）中、９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。その後、ＤＴＴおよびＢＳＡを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌになるように反応溶液に添加し、これを５’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ（５’突出末端基質）を含む基質溶液とした。
【００４６】
同様に、等モルの標識ＤＮＡ−３と標識ＤＮＡ−４を、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）中、９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。その後、ＤＴＴおよびＢＳＡを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌになるように反応溶液に添加し、これを３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ（３’突出末端基質）を含む基質溶液とした。
【００４７】
同様に、等モルの標識ＤＮＡ−１と標識ＤＮＡ−５を、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）中、９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。その後、ＤＴＴおよびＢＳＡを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌになるように反応溶液に添加し、これを突出を有さない二本鎖ＤＮＡ（平滑末端基質）を含む基質溶液とした。
【００４８】
（２）二本鎖ＤＮＡ基質におけるＦＲＥＴ現象の確認
上記（１）に記載の方法に従って、５’突出末端基質の最終濃度が３０ｎＭになるように基質溶液を調製し、該基質溶液を波長４９２ｎｍの光により励起したときのフルオレセインの蛍光スペクトルを、蛍光分光光度計Ｆ４０１０（日立製作所）を用いて測定した。その結果を図２に示した。
【００４９】
図２には、５’突出末端基質を波長４９２ｎｍの光で励起したときのフルオレセインの蛍光スペクトルを表示した。ＦＲＥＴ現象が起きていないときの蛍光スペクトルとして、フルオレセイン標識した一本鎖核酸（配列番号２）のみの蛍光スペクトルも表示した。
【００５０】
フルオレセインを含む標識ＤＮＡ−２のみによる蛍光スペクトルと比較して、５’突出末端基質による蛍光スペクトルでは、フルオレセインの５１８ｎｍの蛍光ピークが減少しているのが認められた。これは、標識ＤＮＡ−１と標識ＤＮＡ−２が二本鎖を形成したことによりフルオレセインとＣｙ３の距離が近接し、ＦＲＥＴ現象が生じていることを表している。また、３’突出末端基質および平滑末端基質についても、同様のＦＲＥＴ現象が認められた（データ示さず）。また、巻き戻されて一本鎖化した後、配列番号１と相補的な配列を有する非標識化一本鎖核酸を捕捉物質として添加すると、再結合によるＦＲＥＴ現象が濃度依存的に解除されることが確認された。
【００５１】
（３）一本鎖核酸特異的結合性タンパク質の存在下におけるＦＲＥＴ現象の検証
上記（１）に記載の方法に従って、５’突出末端基質の最終濃度が３０ｎＭになるように基質溶液を調製し、該基質溶液を９５℃で１０分間加熱した後に氷上で急冷した。得られた基質溶液に、大腸菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Stratagene社製、以下「ＳＳＢ」という）を、最終濃度が０〜９００ｎＭ（０、３０、６０、１８０、３００、６００または９００ｎＭ）となるように添加した。これらの溶液を室温で１時間放置した後、波長４９２ｎｍの光で励起したときの波長５１８ｎｍでの蛍光強度を、蛍光分光光度計Ｆ４０１０（日立製作所）を用いて測定した。その結果を図３に示した。図３の結果から、加熱により解離した一本鎖核酸にＳＳＢが結合し、それに伴ってＦＲＥＴ現象が解消することが認められた。また、ＦＲＥＴ解消の度合いは反応溶液に添加したＳＳＢの濃度に依存しており、反応溶液中に６００ｎＭまたは９００ｎＭのＳＳＢを添加した場合に一本鎖核酸の捕捉が十分に行われ、ＦＲＥＴが有効に解除された。これらの結果から、本発明による測定方法において、ＳＳＢの添加は、一旦解離した一本鎖核酸どうしの再結合を防ぐのに有効であることが示された。
【００５２】
（４）ＰＮＡの存在下におけるＦＲＥＴ現象の検証
上記（１）に記載の方法に従って、５’突出末端基質の最終濃度が３０ｎＭになるように基質溶液を調製し、９５℃で１０分間加熱した後に氷上で急冷した。得られた基質溶液に、標識ＤＮＡ−１に相補的な塩基配列を有するＰＮＡ（5'-CCCAGTCACGACGTTCCGCCTCTCCCCGCCCGTTGCCGCC-3'：配列番号１０；グライナージャパン社より入手）の溶液を、該ＰＮＡの最終濃度が０〜１００ｎＭ（０、２５、５０、７５または１００ｎＭ）となるように添加した。これらの溶液を室温で３時間放置した後、波長４９２ｎｍの光で励起したときの波長５１８ｎｍでの蛍光強度を、蛍光分光光度計Ｆ４０１０（日立製作所）を用いて測定した。その結果を図４に示した。図４の結果から、加熱により解離した標識ＤＮＡ−１に前記ＰＮＡが結合し、それに伴ってＦＲＥＴ現象が解消することが認められた。また、ＦＲＥＴ解消の度合いは反応溶液に添加した前記ＰＮＡの濃度に依存しており、反応溶液中に７５ｎＭまたは１００ｎＭのＰＮＡを添加した場合に標識ＤＮＡ−１の捕捉が十分に行われ、ＦＲＥＴが有効に解除された。これらの結果から、本発明による測定方法において、ＰＮＡの添加は、一旦解離した一本鎖核酸どうしの再結合を防ぐのに有効であることが示された。
【００５３】
（５）測定に用いる基質濃度の決定
標識ＤＮＡ−１と標識ＤＮＡ−２を、５’突出末端基質の最終濃度が０．７５、４．０、７．５、４０または７５ｎＭになるように、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）に添加し、得られた溶液を９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。得られた５’突出末端基質を含む基質溶液のそれぞれについて、波長４９２ｎｍの光により励起したときの波長５１８ｎｍでの蛍光強度を、蛍光分光光度計Ｆ４０１０（日立製作所）を用いて測定した。その結果を図５に示した。図５の結果から、二本鎖ＤＮＡの濃度に比例したフルオレセインの蛍光強度の増加が見られた。よって、前記蛍光強度が基質の濃度に依存していることが示された。
【００５４】
さらに、以下の手順に従い、基質をヘリカーゼとの反応に用いる反応温度に３０分間放置したときのフルオレセインの蛍光強度の変化を調べた。７．５ｎＭの５’突出末端基質を含む基質溶液を３７℃にて３０分間放置し、波長４８５ｎｍの光により励起したときの５２７ｎｍでの蛍光強度を、蛍光プレートリーダーFluoroskan Ascent CF（Thremo Labsystems社）を用いて１分ごとに測定した。その結果を図６に示した。図６の結果から、ヘリカーゼを含まない基質溶液において、該基質溶液を反応温度に３０分間放置しても蛍光強度の増加が認められないことが示された。このことから、ヘリカーゼと３０分間反応させたときに基質溶液から蛍光強度が変化した場合には、その蛍光強度変化はヘリカーゼの作用によるものであると判断することができる。
【００５５】
（６）ヘリカーゼの基質特異性測定
上記（１）に記載の方法に従って、５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質について、これら基質の最終濃度が７．５ｎＭになるようにそれぞれの基質溶液を調製した。各基質溶液に、大腸菌由来のＤＮＡヘリカーゼＩＩ（以下「ＵｖｒＤ」という）を、その最終濃度が３０ｎＭになるように添加し、３７℃で３分間インキュベートした。その後、５ｍＭのＡＴＰを添加して反応を開始させ、３７℃で１０分間インキュベートした。この１０分間のインキュベートの間、各反応溶液において、波長４８５ｎｍの光により励起したときの５２７ｎｍでの蛍光強度を、蛍光プレートリーダーFluoroskan Ascent CF（Thremo Labsystems社）を用いて５秒ごとに測定した。その結果を図７に示す。
【００５６】
同様にして、５’突出末端基質、３’突出末端基質および平滑末端基質について、７．５ｎＭの基質を含むそれぞれの基質溶液を調製した。各基質溶液に、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質であるショウジョウバエ由来のＤＮＡヘリカーゼＫｕ７０（以下「ＭＢＰ−ＤｍＫｕ７０」という）を、その最終濃度が１９０ｎＭになるように添加し、３７℃で３分間インキュベートした。その後、５ｍＭのＡＴＰを添加して反応を開始させ、３７℃で３０分間インキュベートした。この３０分間のインキュベートの間、各反応溶液において、波長４８５ｎｍの光により励起したときの５２７ｎｍでの蛍光強度を、蛍光プレートリーダーFluoroskan Ascent CF（Thremo Labsystems社）を用いて３０秒ごとに測定した。その結果を図８に示す。
【００５７】
図７および図８に示される結果から、上記３種類の基質において、ヘリカーゼの巻き戻し反応によるフルオレセインの蛍光強度の経時的な増加が確認された。これにより、ヘリカーゼの作用によって二本鎖核酸が一本鎖に巻き戻されることによりＦＲＥＴ現象が解消され、これに対応してフルオレセインの蛍光が経時的に増加していくことが示された。さらに、一定時間における蛍光強度の増加率（増加速度）は３種類の基質の間で異なっており、反応に用いられたヘリカーゼの基質特異性が認められた。
【００５８】
図７の結果によれば、ＵｖｒＤの基質特異性は、基質に対して４倍の濃度のＵｖｒＤを用いた場合において明確に認められ、反応開始後１０分間における蛍光強度の増加率（傾き）は、３’突出末端基質が最も大きく、次いで平滑末端基質が大きく、５’突出末端基質が最も小さかった。すなわち、ＵｖｒＤは３’突出末端基質に対して最も高い活性を有することがこれにより判断できる。
【００５９】
図８の結果によれば、ＭＢＰ−ＤｍＫｕ７０の基質特異性は、基質に対して約２５倍の濃度のＭＢＰ−ＤｍＫｕ７０を用いた場合において明確に認められ、反応開始後３０分間における蛍光強度の増加率は、５’突出末端基質と平滑末端基質がほぼ同レベルで、３’突出末端基質が最も小さかった。すなわち、ＭＢＰ−ＤｍＫｕ７０は５’突出末端基質および平滑末端基質に対して高い活性を有している。
【００６０】
以上のことから、本測定法により、ヘリカーゼの活性の強さと基質特異性を明確に評価できることが示された。
【００６１】
（６）突出部の長さによるヘリカーゼの活性の検証
５’末端にフルオレセイン（ＦＩＴＣ）を標識した、下記表２に示す一本鎖ＤＮＡを、PROLIGO社より入手した。
【００６２】
【表２】
2005253364.tif 000004
【００６３】
標識ＤＮＡ−３と標識ＤＮＡ−６を、それぞれの最終濃度が７．５ｎＭになるように、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）に添加し、得られた溶液を９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。その後、ＤＴＴおよびＢＳＡを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌになるように反応溶液に添加し、これを１０ヌクレオチドの３’突出部を有するプローブ（Ａ）を含むプローブ溶液とした。
【００６４】
同様に、標識ＤＮＡ−３と標識ＤＮＡ−７を、それぞれの最終濃度が７．５ｎＭになるように、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）に添加し、得られた溶液を９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。その後、ＤＴＴおよびＢＳＡを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌになるように反応溶液に添加し、これを２０ヌクレオチドの３’突出部を有するプローブ（Ｂ）を含むプローブ溶液とした。
【００６５】
同様に、標識ＤＮＡ−３と標識ＤＮＡ−８を、それぞれの最終濃度が７．５ｎＭになるように、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）に添加し、得られた溶液を９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。その後、ＤＴＴおよびＢＳＡを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌになるように反応溶液に添加し、これを３０ヌクレオチドの３’突出部を有するプローブ（Ｃ）を含むプローブ溶液とした。
【００６６】
同様に、標識ＤＮＡ−３と標識ＤＮＡ−４を、それぞれの最終濃度が７．５ｎＭになるように、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）に添加し、得られた溶液を９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。その後、ＤＴＴおよびＢＳＡを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌになるように反応溶液に添加し、これを４０ヌクレオチドの３’突出部を有するプローブ（Ｄ）を含むプローブ溶液とした。
【００６７】
同様に、標識ＤＮＡ−３と標識ＤＮＡ−９を、それぞれの最終濃度が７．５ｎＭになるように、２０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ，ｐＨ８．０）に添加し、得られた溶液を９５℃で１０分間加熱した後、室温に一晩放置して二本鎖を形成させた。その後、ＤＴＴおよびＢＳＡを、最終濃度がそれぞれ１ｍＭおよび５０μｇ／ｍｌになるように反応溶液に添加し、これを８０ヌクレオチドの３’突出部を有するプローブ（Ｅ）を含むプローブ溶液とした。
【００６８】
上述の各プローブ溶液に、ＵｖｒＤを、その最終濃度が３０ｎＭになるように添加し、３７℃で３分間インキュベートした。その後、５ｍＭのＡＴＰを添加して反応を開始させ、３７℃で１０分間インキュベートした。この１０分間のインキュベートの間、各反応溶液において、波長４８５ｎｍの光により励起したときの５２７ｎｍでの蛍光強度を、蛍光プレートリーダーFluoroskan Ascent CF（Thremo Labsystems社）を用いて１分ごとに測定した。その結果を図９に示す。
【００６９】
図９の結果から、フルオレセインの蛍光強度の経時的な増加率（増加速度）は、プローブにおける末端の突出部分の長さによって異なることが明らかになった。このことから、５’突出末端基質および３’突出末端基質においては、突出部分の長さによってヘリカーゼの反応効率が異なり、末端の形状の違いによるヘリカーゼの基質特異性を評価するためには、突出末端基質における突出部分の長さを３０塩基以上とすることが望ましいと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、本発明による方法において、ＦＲＥＴ現象またはインターカレート性蛍光色素を利用する場合における作用機序の概略を示す図である。
【図２】図２は、本発明による方法におけるＦＲＥＴ現象を示す図である。
【図３】図３は、熱変性により一本鎖化した５’突出末端基質に、種々の濃度のＳＳＢを添加した場合において、波長４９２ｎｍの光で励起したときの波長５１８ｎｍの蛍光強度を示す図である。
【図４】図４は、熱変性により一本鎖化した５’突出末端基質に、種々の濃度のＰＮＡを添加した場合において、波長４９２ｎｍの光で励起したときの波長５１８ｎｍの蛍光強度を示す図である。
【図５】図５は、５’突出末端基質の濃度を０．７５、４、７．５、４０、７５ｎＭとした場合において、波長４９２ｎｍの光により励起したときの波長５１８ｎｍの蛍光強度を示す図である。
【図６】図６は、５’突出末端基質（７．５ｎＭ）を反応温度（３７℃）で３０分間放置した場合において、波長４８５ｎｍの光により励起したときの波長５２７ｎｍの蛍光強度を示す図である。
【図７】図７は、３’突出末端基質、５’突出末端基質、および平滑末端基質のそれぞれを基質とし、ヘリカーゼとしてＵｖｒＤを用いた酵素反応を行なった場合において、波長４８５ｎｍの光で励起したときの波長５２７ｎｍの蛍光強度を経時的に示した図である。
【図８】図８は、３’突出末端基質、５’突出末端基質、および平滑末端基質のそれぞれを基質とし、ヘリカーゼとしてＭＢＰ−ＤｍＫｕ７０を用いた酵素反応を行なった場合において、波長４８５ｎｍの光で励起したときの波長５２７ｎｍの蛍光強度を経時的に示した図である。
【図９】様々な鎖長の突出部を含むプローブを基質とし、ヘリカーゼとしてＵｖｒＤを用いた酵素反応を行なった場合において、波長４８５ｎｍの光で励起したときの波長５２７ｎｍの蛍光強度を経時的に示した図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１：５’末端をＣｙ３で標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号２：３’末端をフルオレセイン  イソチオシアネイトで標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号３：３’末端をＣｙ３で標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号４：５’末端をフルオレセイン  イソチオシアネイトで標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号５：３’末端をフルオレセイン  イソチオシアネイトで標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号６：５’末端をフルオレセイン  イソチオシアネイトで標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号７：５’末端をフルオレセイン  イソチオシアネイトで標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号８：５’末端をフルオレセイン  イソチオシアネイトで標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号９：５’末端をフルオレセイン  イソチオシアネイトで標識された合成一本鎖ＤＮＡ
配列番号１０：合成ペプチド核酸（ＰＮＡ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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