(57)【要約】【課題】  チップ先端からの液だれを防止して、装置内の汚染を防止することのできる給排ロボットおよびこれを備えた自動培養装置を提供すること。【解決手段】  細胞等の検体Ｍに接触させられる先端を有するチップ１４と、該チップ１４内に検体Ｍを吸引し、またはチップ１４内の検体Ｍを排出する液送動力装置１０ｈと、チップ１４を搬送するチップ搬送機構１０ｆと、前記検体Ｍの液面位置を検出する検出手段５０と、検体Ｍの吸引時に、前記検出手段５０により検出された検体Ｍの液面位置に基づいて、前記チップ１４の先端と前記検体Ｍの液面とが接触状態を維持するように、前記液送動力装置１０ｈおよび前記チップ搬送機構１０ｆを制御する制御装置５３とを備える。【選択図】      図８
2005304303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞等の検体に接触させられる先端を有するチップと、
該チップ内に検体を吸引し、またはチップ内の検体を排出する液送動力装置と、
チップを搬送するチップ搬送機構と、
前記検体の液面位置を検出する検出手段と、
検体の吸引時に、前記検出手段により検出された検体の液面位置に基づいて、前記チップの先端と前記検体の液面とが接触状態を維持するように、前記液送動力装置および前記チップ搬送機構を制御する制御装置とを備える給排ロボット。
【請求項２】
前記検出手段が、前記検体の液面を撮像する撮像手段と、該撮像手段により撮像された画像を処理して前記検体の液面位置を算出する画像処理手段とを備える請求項１に記載の給排ロボット。
【請求項３】
前記撮像手段が、前記検体の液面と前記チップの先端とを撮像し、
前記画像処理手段が、撮像手段により撮像された画像を処理して前記検体の液面位置および前記チップの先端位置を算出する請求項２に記載の給排ロボット。
【請求項４】
培地または薬液等の液体に接触させられる先端を有するチップと、
該チップ内に液体を吸引し、またはチップ内の液体を排出する液送動力装置と、
チップを搬送するチップ搬送機構と、
前記液体の液面位置を検出する検出手段と、
液体の吸引時に、前記検出手段により検出された液体の液面位置に基づいて、前記チップの先端と前記液体の液面とが接触状態を維持するように、前記液送動力装置および前記チップ搬送機構を制御する制御装置とを備える分注ロボット。
【請求項５】
前記液体の液面を撮像する撮像手段と、該撮像手段により撮像された画像を処理して前記液体の液面位置を算出する画像処理手段とを具備している請求項４に記載の分注ロボット。
【請求項６】
前記撮像手段が、前記液体の液面と前記チップの先端とを撮像し、
前記画像処理手段が、撮像手段により撮像された画像を処理して前記液体の液面位置および前記チップの先端位置を算出する請求項５に記載の給排ロボット。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載の給排ロボットおよび／または請求項４ないし６のいずれか一項に記載の分注ロボットを具備してなる自動培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、給排ロボットおよび自動培養装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の自動培養装置としては、複数の培養容器を収納可能な固定式の収納棚と、水平・昇降・回転移動可能な搬送手段とを備えたものが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この自動培養装置は、培養室内に配置された収納棚に、鉛直方向に並ぶ複数の小部屋を備え、各小部屋の中に培養容器を１つずつ収容して培養を行い、培養途中あるいは培養終了時に搬送手段を作動させて、小部屋から１つずつ培養容器を取り出し、あるいは、小部屋へ培養容器を収容するよう構成されている。そして、培養室から取り出された培養容器に対しては、培養室の外部において蓋が開けられて内部に培地や薬液等が供給されるようになっている。
【特許文献１】特開２００２−２６２８５６号公報（図１等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記特許文献１に示された自動培養装置では、給排ロボットが細胞等を含んだ検体をチップ内に吸引し、吸引した検体を搬送して培養容器内に数点に分けて播種する際に、チップの先端から検体の液だれが生じ、自動培養装置の底面に付着することが考えられる。そして、底面に付着した検体や、検体を含む培地等は乾燥することにより粉塵となって浮遊することが考えられる。この場合において、１種類の検体のみを取り扱う場合は問題ではないが、多数の検体を取り扱う場合においては、各検体の培養処理ごとに自動培養装置の底面を清掃しなければ、自動培養装置内に舞い上がった粉塵が他の検体を収容する容器内に混入する不都合が考えられる。
また、分注ロボットが培養トレイ内の培地の排出を行ったり培養トレイ内に新たな培地の注入を行う際に、チップの先端から培地の液だれが生じ、装置内を汚染してしまうおそれもある。
【０００４】
この発明は、上記の事情に鑑みてなされたもので、チップ先端からの液だれを防止して、装置内の汚染を防止することのできる給排ロボットおよびこれを備えた自動培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
この発明は、細胞等の検体に接触させられる先端を有するチップと、該チップ内に検体を吸引し、またはチップ内の検体を排出する液送動力装置と、チップを搬送するチップ搬送機構と、前記検体の液面位置を検出する検出手段と、検体の吸引時に、前記検出手段により検出された検体の液面位置に基づいて、前記チップの先端と前記検体の液面とが接触状態を維持するように、前記液送動力装置および前記チップ搬送機構を制御する制御装置とを備える給排ロボットを提供する。
この発明によれば、検体の吸引時には、チップの先端が検体の液面と当接しながら検体がチップ内に吸引されるようになっているので、チップの先端部外表面に付着する検体の量が極僅かに抑えられる。また、仮にチップの先端部外表面に付着した検体が、チップの先端部外表面に沿って下方（すなわち、チップの先端）に移動してきたとしても、その量は極僅かであるため、チップの先端における検体による液玉の発生が防止され、吸引された検体がチップの先端から下方に垂れてしまうことが防止される。さらに、チップの先端から垂れた検体が乾燥して粉塵となって浮遊することが未然に防止されるので、このような粉塵が蓋の開いた培養容器内に混入することを防止することができる。
【０００６】
また、この発明は、前記検出手段が、前記検体の液面を撮像する撮像手段と、該撮像手段により撮像された画像を処理して前記検体の液面位置を算出する画像処理手段とを備える給排ロボットを提供する。
この発明によれば、検体の液面が撮像手段により撮像されるとともに、撮像手段により撮像された画像は画像処理手段に送られて、この画像処理手段により検体の液面位置が算出され、画像処理手段で算出された検体の液面位置の情報は制御装置に出力されるようになっている。制御装置はこの液面位置の情報に基づいて、液送動力装置とチップ搬送機構とを制御し、チップの先端面（あるいはチップの極僅かな先端部）のみが検体の液面と当接するようにチップが移動させられるとともに、チップ内に検体が吸引される。
【０００７】
さらに、この発明は、前記撮像手段が、前記検体の液面と前記チップの先端とを撮像し、前記画像処理手段が、撮像手段により撮像された画像を処理して前記検体の液面位置および前記チップの先端位置を算出する給排ロボットを提供する。
この発明によれば、撮像手段により検体の液面とチップの先端とが撮像されるようになっており、検体の液面とチップの先端との位置関係がより正確に把握できる。
【０００８】
さらにまた、この発明は、培地または薬液等の液体に接触させられる先端を有するチップと、該チップ内に液体を吸引し、またはチップ内の液体を排出する液送動力装置と、チップを搬送するチップ搬送機構と、前記液体の液面位置を検出する検出手段と、液体の吸引時に、前記検出手段により検出された液体の液面位置に基づいて、前記チップの先端と前記液体の液面とが接触状態を維持するように、前記液送動力装置および前記チップ搬送機構を制御する制御装置とを備える分注ロボットを提供する。
この発明によれば、液体の吸引時には、チップの先端が液体の液面と当接しながら液体がチップ内に吸引されるようになっているので、チップの先端部外表面に付着する液体の量が極僅かに抑えられる。また、仮にチップの先端部外表面に付着した液体が、チップの先端部外表面に沿って下方（すなわち、チップの先端）に移動してきたとしても、その量は極僅かであるため、チップの先端における液体による液玉の発生が防止され、吸引された液体がチップの先端から下方に垂れてしまうことが防止される。さらに、チップの先端から垂れた液体が乾燥して粉塵となって浮遊することが未然に防止されるので、このような粉塵が蓋の開いた培養容器内に混入することを防止することができる。
【０００９】
さらにまた、この発明は、前記液体の液面を撮像する撮像手段と、該撮像手段により撮像された画像を処理して前記液体の液面位置を算出する画像処理手段とを具備している分注ロボットを提供する。
この発明によれば、液体の液面が撮像手段により撮像されるとともに、撮像手段により撮像された画像は画像処理手段に送られて、この画像処理手段により液体の液面位置が算出され、画像処理手段で算出された液体の液面位置の情報は制御装置に出力されるようになっている。制御装置はこの液面位置の情報に基づいて、液送動力装置とチップ搬送機構とを制御し、チップの先端面（あるいはチップの極僅かな先端部）のみが液体の液面と当接するようにチップが移動させられるとともに、チップ内に検体が吸引される。
【００１０】
さらにまた、この発明は、前記撮像手段が、前記液体の液面と前記チップの先端とを撮像し、前記画像処理手段が、撮像手段により撮像された画像を処理して前記液体の液面位置および前記チップの先端位置を算出する分注ロボットを提供する。
この発明によれば、撮像手段により液体の液面とチップの先端とが撮像されるようになっており、液体の液面とチップの先端との位置関係がより正確に把握できる。
【発明の効果】
【００１１】
この発明によれば、チップ内に検体を吸引する際、チップの先端が検体の液面と当接しながら検体がチップ内に吸引されるようになっているので、チップの先端部外表面に付着する検体の量を極僅かに抑えることができる。また、仮にチップの先端部外表面に付着した検体が、チップの先端部外表面に沿って下方（すなわち、チップの先端）に移動してきたとしても、その量は極僅かであるため、チップの先端における検体による液玉の発生を防止することができるとともに、吸引された検体がチップの先端から下方に垂れてしまうことを防止することができる。さらに、チップの先端から垂れた検体が乾燥して粉塵となって浮遊することを未然に防止することができるので、このような粉塵が蓋の開いた培養容器内に混入することを防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明の一実施形態に係る培養処理装置および自動培養装置について、図１〜図８を参照して説明する。
本実施形態に係る自動培養装置１は、図１に示されるように、外部から観察可能な透明な壁材により密閉され、シャッタ２を介して相互に連絡する第１空間Ｓ１と第２空間Ｓ２とを備えている。
【００１３】
第１空間Ｓ１の両側空間Ｓ１１，Ｓ１３には、培養容器３を収容する培養室４が２個ずつ計４個配置され、中央空間Ｓ１２には、培養容器３を移動するための搬送ロボット（搬送機構）５が備えられている。中央空間Ｓ１２の上部には、中央空間Ｓ１２内の空気を浄化するために清浄な下降気流を送る空気清浄部６が設けられている。
４個の培養室４は、それぞれ中央空間Ｓ１２に向けて扉４ａを配置することにより、横に並んだ２個ずつが相互に扉４ａを対向させて、間隔をあけて配置されている。
【００１４】
前記各培養室４は、図２および図３に示されるように、一側面に開口部４ｂを有し、該開口部４ｂを開閉可能な扉４ａを備えている。開口部４ｂに向かって左右の側壁には、対応する高さ位置に複数のレール状のトレイ保持部材４ｃが設けられており、左右対となる各トレイ保持部材４ｃに掛け渡すようにして、トレイ７を上下方向に複数段収容できるようになっている。各培養室４内は、所定の培養条件、例えば、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ２濃度５％等に維持されている。なお、トレイ保持部材４ｃはレール状に限定されず、トレイ７を出し入れ可能に支持することができれば任意の形態でよい。
【００１５】
各トレイ７には、複数個、例えば、１０個の培養容器３を並べて載置できるようになっている。各培養容器３は、図４に示されるように、容器本体３ａと、該容器本体３ａの上面に設けられた蓋体３ｂとからなり、容器本体３ａの左右の側面には、後述する第２空間内のハンドにより引っかけられる突起３ｃが設けられている。
【００１６】
各培養室４の下方には、図１に示されるように、未使用の培養容器３をトレイ７に搭載した状態で複数収容するストッカ８が配置されている。ストッカ８は、前記培養室４の扉とは反対側の第１空間Ｓ１の外部に向かう側面に開閉可能なドアを有している。該ドアは、ストッカ８の一側面全体を開放する大きさに形成されている。
【００１７】
前記搬送ロボット５は、４個の培養室４の間隔位置のほぼ中央に配置されている。該搬送ロボット５は、水平回転可能な第１アーム５ａと、該第１アーム５ａの先端に鉛直軸回りに回転可能に連結された第２アーム５ｂと、該第２アーム５ｂの先端に鉛直軸回りに回転可能に取り付けられ、それ自身は駆動部、伝導機構などの培養室内の環境を劣化させる機構を持たないハンド５ｃと、これら第１アーム５ａ、第２アーム５ｂおよびハンド５ｃを昇降可能な昇降機構５ｄとを備えている。これにより、搬送ロボット５は、４個の培養室４内の全てのトレイ７にアクセスするとともに、前記シャッタ２を跨いで第１空間Ｓ１と第２空間Ｓ２との間に配置されたコンベア９上にトレイ７を引き渡すことができる水平方向の動作範囲を有している。
【００１８】
前記コンベア９は、搬送ロボット５のハンド５ｃの幅寸法より大きな間隔をあけて左右に配置された２本の無端ベルト９ａを備え、これら無端ベルト９ａに掛け渡してトレイ７を載置できるようになっている。また、搬送ロボット５は、培養室４内の全てのトレイ７にアクセスするとともに、前記ストッカ８内の少なくとも最上段のトレイ７にアクセスできる垂直方向の動作範囲を有している。
なお、ベルト９ａは無端ベルトに限られない。
【００１９】
前記ハンド５ｃは、トレイ７を載置可能に水平方向に延びる平坦な形状に形成されており、培養室４に収容されているトレイ７間の隙間に挿入可能な厚さ寸法に形成されている。そして、ハンド５ｃは、トレイ７間の隙間に挿入された状態から上昇させられることにより、２本の腕によってトレイ７を下方から押し上げてトレイ保持部材４ｃから取り上げるとともに、トレイ７を安定して保持できるようになっている。
【００２０】
培養処理装置３０は、図１に示されるように、検体抽出装置５０、給排ロボット１０、遠心分離器１１、分注ロボット１３、チップ供給装置１５、チップ回収部３１、試薬等供給装置１６、顕微鏡１７、貯留タンク１８、水平移動機構１９および載置台２１を備えている。
検体抽出装置５０は、例えば、医療機関等で患者から採取された骨髄液を導入され、供給された骨髄液から間葉系幹細胞を多く含む検体を抽出する装置であって、導入された骨髄液を貯留する容器内に溶血剤を注入する溶血剤注入装置５４と、溶血剤が注入された骨髄液を攪拌する給排ロボット１０と、攪拌された骨髄液から間葉系幹細胞を多く含む検体を分離する遠心分離器１１とにより構成されている。
【００２１】
給排ロボット１０は、シャッタ２が開かれた状態で第１空間Ｓ１からコンベア９によって搬送されてきたトレイ７上の培養容器３に対し、上記検体抽出装置５０において抽出された細胞を供給し、あるいは、培地を供給、回収するようになっている。遠心分離機１１は、培養容器３内の培地から細胞を分離するように構成されている。分注ロボット１３は、血清や試薬等の種々の液体を分注するための電動ピペット１２を備えた水平回転および昇降移動可能なロボットであって、第２空間Ｓ２内に４台設置されている。
【００２２】
前記チップ供給装置１５は、これら給排ロボット１０および分注ロボット１３の電動ピペット１２先端に取り付ける使い捨て可能なチップ１４を複数収容していて給排ロボット１０および分注ロボット１３の動作範囲内に提供するようになっている。前記チップ回収部３１は、使用済みのチップ１４を廃棄回収するようになっている。前記試薬等供給装置１６は、血清や試薬等の種々の液体を複数の容器に貯留している。顕微鏡１７は培養容器３内における細胞の様子を観察できるようになっている。貯留タンク１８は、各試薬および培地交換等により廃棄される廃液をそれぞれ貯留するように複数設けられている。水平移動機構１９は、前記コンベア９と各ロボット１０，１３との間で培養容器３を受け渡し可能とするように培養容器３を移動させるようになっている。前記載置台２１は、水平移動機構１９のスライダ２０に取り付けられ、受け取った培養容器３を載置するように構成されている。
【００２３】
また、第２空間Ｓ２には、該第２空間Ｓ２内の空気を清浄化するために清浄な下降気流を形成する空気清浄機３２が設けられている。
前記第２空間Ｓ２に構成された培養処理装置３０は、その高さ方向の中間位置に配され第２空間Ｓ２内を上部空間Ｓ２１と下部空間Ｓ２２とに上下に区画する第１の区画壁３３と、該第１の区画壁３３により形成された下部空間Ｓ２２内をさらに上下に区画する第２の区隔壁３４とにより、上下方向に並ぶ３つの空間Ｓ２１，Ｓ２２１，Ｓ２２２に区画されている。第１の区画壁３３は、前記コンベア９の高さに配置され、その上方の上部空間Ｓ２１内に、載置台２１、給排ロボット１０、分注ロボット１３のアーム１３ａ、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ以上の機構部等を配置している。これらの装置は、培養容器３の移動に必要な装置、および培養容器３の上部開口からアクセスすることが必要な装置だからである。なお、試薬等供給装置１６の上面も第１の区画壁３３の上面に露出しているが、これはチップ１４の挿入口１６ｃを上部空間Ｓ２１に開口させるためである。
【００２４】
また、第１の区画壁３３には、載置台２１を上部空間Ｓ２１において移動させるために、載置台２１を下部空間Ｓ２２内の水平移動機構１９に連結するための長孔３５、第１の区画壁３３の下方の空間Ｓ２２１に配置されたチップ供給装置１５からチップ１４を取り出すための貫通孔３６、使用済みのチップ１４を廃棄するための廃棄口３７が貫通形成されている。
さらに、第１の区画壁３３には、その側壁３０ａ，３０ｂに沿って、上下に貫通する通気口３８（図において斜線部で示す）が設けられている。
【００２５】
第１の区画壁３３と第２の区画壁３４との間の空間Ｓ２２１には、図６に示されるように、分注ロボット１３の本体部分、チップ供給装置１５、試薬等供給装置１６、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ以下の部分、水平移動機構１９および、チップ回収部３１の廃棄口３７と廃棄容器３９とを接続するダクト４０が備えられている。前記ダクト４０は、図７に示されるように、例えば、その上端にフランジ部４０ａを備える構造とされ、第１の区画壁３３の下部に設けたフック４４に引っかけることで、第１の区画壁３３と第２の区画壁３４との間に着脱可能に設ければよい。第２の区画壁３４の側壁３０ａ，３０ｂ近傍には、該側壁３０ａ，３０ｂに沿って、上下に貫通する通気口４３（図において斜線部で示す）が設けられている。
【００２６】
さらに、第２の区画壁３４の下方の空間Ｓ２２２には、図８に示されるように、遠心分離機１１、貯留タンク１８、廃棄容器３９、および排気ファン４１が配置されている。排気ファン４１の出口にはＨＥＰＡフィルタのようなフィルタ４２が設けられ、排気される空気を清浄にするようになっている。
【００２７】
前記給排ロボット１０は、水平多関節型ロボットであって、例えば、図１に示す例では、２種類の電動ピペット１０ａ，１０ｂを備えるヘッド１０ｃと、水平旋回可能な２つのアーム１０ｄ，１０ｅと、アーム１０ｅの先端に設けられヘッド１０ｃを昇降させる昇降機構（チップ搬送機構）１０ｆと、液送動力装置１０ｈ（図８参照）とを備えている。電動ピペット１０ａは、貯留タンク１８からダクト１０ｇを介して導かれた培地を供給し、あるいはピペッティング動作を行うようになっている。電動ピペット１０ｂは、培養容器３内あるいは遠心容器内の不要な培地を吸引し、ダクト１０ｇを介して他の貯留タンク１８へ廃液として排出するようになっている。
液送動力装置１０ｈは、電動ピペット１０ａ，１０ｂを駆動制御するものである。
【００２８】
また、本実施形態においては、図８に示すように、混合液（検体）Ｍの液面位置を検出する検出手段５０が設けられている。
検出手段５０は、混合液Ｍの液面を撮像するカメラ（撮像手段）５１と、このカメラ５１により撮像された画像を処理して混合液Ｍの液面位置を算出する画像処理装置（画像処理手段）５２とを主たる要素として構成されたものである。
画像処理装置５２は、カメラ５１で捉えた混合液Ｍの液面の画像を処理して、液面の位置を算出し、混合液Ｍの液面が遠泌管ｔの高さ方向においてどこに位置しているのか、あるいは混合液Ｍの液面がチップ１４の先端とどれ位の距離離間しているのかといった情報を制御装置５３に出力するものである。
制御装置５３は、画像処理装置５２から送られてきた混合液Ｍの液面に関する情報に基づいて、液送動力装置１０ｈおよび昇降機構１０ｆを駆動制御するものであり、これによりチップ１４の先端と混合液Ｍの液面とが接触状態を維持するように、チップ１４内に混合液Ｍが吸引されるようになっている。
【００２９】
電動ピペット１０ａによるピペッティング動作は、前記溶血剤注入装置５４により溶血剤を注入された骨髄液に対して行われるとともに、遠心分離機１１により分離された細胞に対しても行われるようになっている。ピペッティング動作は、電動ピペット１０ａの先端にチップ供給装置１５から供給されたチップ１４を装着して、骨髄液と溶血剤との混合液（検体）、あるいは細胞と培地との混合液（検体）に対し、吸引および放出を１０回〜２０回繰り返す。これにより、混合液を均一に攪拌するようになっている。
【００３０】
また、給排ロボット１０は、ピペッティング動作の後に、電動ピペット１０ａによって、遠心分離機１１により分離された細胞と培地との混合液Ｍを吸引し、載置台２１上に搭載された培養容器３内に上部開口から供給するようになっている。
電動ピペット１０ａが、混合液Ｍを培養容器３内に数点に分けて均等に播種するため、チップ１４内に混合液Ｍを吸引する際には、図８に示すように、制御装置５３により液送動力装置１０ｈおよび昇降機構１０ｆが駆動制御されて、チップ１４の先端面（あるいはチップ１４の極僅かな先端部）のみが混合液Ｍの液面と当接するようになっている。すなわち、混合液Ｍの液面がカメラ５１により撮像されるとともに、カメラ５１により撮像された画像が画像処理装置５２に送られ、この画像処理装置５２により液面の位置が算出されるようになっている。また、画像処理装置５２により算出された液面位置に関する情報が画像処理装置５２から液送動力装置１０ｈおよび昇降機構１０ｆに出力されることにより、チップ１４の先端面（あるいはチップ１４の極僅かな先端部）のみが混合液Ｍの液面と当接しながらチップ１４内に混合液Ｍが吸引されるようになっている。
このように、チップ１４の先端面（あるいはチップ１４の極僅かな先端部）のみが混合液Ｍの液面と当接するように液送動力装置１０ｈおよび昇降機構１０ｆが制御装置５３に駆動制御されることにより、チップ１４の先端部外表面に付着する混合液Ｍの量を極僅かに抑えることができる。また、仮にチップ１４の先端部外表面に付着した混合液Ｍが、チップ１４の先端部外表面に沿って下方（すなわち、チップ１４の先端）に移動してきたとしても、その量は極僅かであるため、チップ１４の先端における混合液Ｍによる液玉の発生を防止することができるとともに、吸引された混合液Ｍがチップ１４の先端から下方に垂れてしまうことを防止することができる。さらに、チップ１４の先端から垂れた混合液Ｍが乾燥して粉塵となって浮遊することを未然に防止することができるので、このような粉塵が蓋の開いた培養容器３内に混入することを防止することができる。
【００３１】
一旦使用された使用済みのチップ１４は、チップ回収部３１において取り外され回収されるようになっている。したがって、給排ロボット１０は、溶血剤注入装置５４、載置台２１、チップ供給装置１５、チップ回収部３１および遠心分離機１１からの細胞供給装置（図示略）等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。
【００３２】
前記遠心分離機１１は、ピペッティングにより混合された骨髄液と溶血剤との混合液を貯留した容器を受け取って低速回転させることにより、骨髄液内に含有されている間葉系幹細胞等の白血球をその他の体液から分離して沈下させるようになっている。また、遠心分離機１１は、給排ロボット１０から供給された細胞入り培地を低速回転させることにより培地内に浮遊していた比重の重い細胞を培地から分離して沈下させるようになっている。
【００３３】
前記分注ロボット１３は、それぞれ、先端にチップ１４を着脱可能に取り付ける電動ピペット１２を備えた水平回転可能なアーム１３ａと、該アーム１３ａを昇降させる昇降機構１３ｂとを備えている。分注ロボット１３は、水平移動機構１９によって搬送されて来た培養容器３内へ、培地や種々の試薬を供給するようになっている。したがって、分注ロボット１３は、水平移動機構１９上の載置台２１、チップ供給装置１５、チップ回収部３１および試薬等供給装置１６等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。
【００３４】
前記チップ供給装置１５は、上方に開口した容器１５ａ内に、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２への取付口を上向きにして複数のチップ１４を配列状態に収容しており、給排ロボット１０や分注ロボット１３が、新たなチップ１４を必要とするときに、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２を上方から挿入するだけで、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２の先端にチップ１４を取り付けるように構成されている。容器１５ａは、給排ロボット１０や分注ロボット１３による電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２の移動方向に対して交差する方向に往復移動させられるように移動機構１５ｂに取り付けられている。また、分注ロボット１３にチップ１４を供給するチップ供給装置１５には、移動機構１５ｂによる移動方向とは直交する方向に容器１５ａを移動させる他の移動機構１５ｃが備えられている。これにより、容器１５ａ内の全てのチップ１４に対して電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２がアクセスすることができるようになっている。
【００３５】
前記チップ回収部３１は、廃棄容器３９の入口に、チップ１４を把持する把持装置（図示略）を備えていて、給排ロボット１０や分注ロボット１３において使用されたチップ１４が把持装置に挿入されると、これを把持するようになっている。そして、この状態で給排ロボット１０や分注ロボット１３が電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２を移動させることにより、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２先端から使用済みチップ１４が取り外され、廃棄容器３９内にダクト４０を介して回収されるようになっている。廃棄容器３９は、空間Ｓ２２２内に着脱可能に配置されており、必要に応じて交換可能となっている。
【００３６】
前記ダクト４０および廃棄容器３９の交換時には、培養処理装置３０の側壁３０ａ，３０ｂに設けられた図示しないドアを開くことにより、培養処理装置３０の外部からアクセスすることとすればよい。
【００３７】
前記試薬等供給装置１６は、例えば、図６に示されるように、円筒状のケーシング内部に、水平回転可能なテーブル１６ａを収容し、該テーブル１６ａ上に、扇型の底面形状を有する筒状の試薬等容器１６ｂを周方向に複数配列して搭載している。ケーシング内部は一定の温度に保冷されている。各試薬等容器１６ｂには、種々の試薬等が貯留されている。例えば、細胞を培養するために必要な培地を構成するＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）やヒト血清のような血清、培養容器３内の細胞を剥離させるトリプシンのような蛋白質分解酵素や、培養に際して細胞を成長させるサイトカインのような成長因子、細胞を分化させるデキサメタゾンのような分化誘導因子、ペニシリン系抗生物質のような抗生剤、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤が貯留されている。
【００３８】
試薬等供給装置１６のケーシングの上面には、分注ロボット１３が電動ピペット１２先端のチップ１４を挿入する挿入口１６ｃが設けられている。この挿入口１６ｃは、前記分注ロボット１３の動作範囲内に配置されている。また、各試薬等容器１６ｂは、その上面に、前記挿入口１６ｃに一致する位置に配置される開口部（図示略）を備えている。これにより、テーブル１６ａを回転させて試薬等容器１６ｂの開口部をケーシングの挿入口１６ｃの鉛直下方に配置することで、分注ロボット１３が、電動ピペット１２先端のチップ１４を上方から試薬等容器１６ｂ内へ挿入して、内部に貯留されている試薬等を吸引することができるようになっている。試薬等供給装置１６を２台設けているのは、検体に共通のトリプシンのような薬液と、検体に固有の血清のような液体とを分離して取り扱うようにしているためである。
【００３９】
前記顕微鏡１７は、培養工程の途中、あるいは、培地交換の際に、培養容器３内の細胞の様子や増殖の程度を観察したり、細胞数を計数したりする場合等に使用されるようになっている。顕微鏡１７のＸＹステージ１７ａや作動距離調整、倍率の変更等は全て遠隔操作により行うことができるように構成されている。第２空間Ｓ２の外方に向けて接眼レンズを配置しておくことにより、自動培養装置１の外部から培養容器３内の細胞の状態を観察できるようにしてもよい。
【００４０】
前記貯留タンク１８は、例えば、全ての検体に共通して使用できるＭＥＭやＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等を貯留しておき、必要に応じて試薬等供給装置１６内の試薬等容器１６ｂ内に供給するようになっている。また、貯留タンク１８には、廃液タンクとして、培地交換の際に排出される廃培地等を貯留するものもある。
【００４１】
前記水平移動機構１９は、直線移動機構により水平方向に移動可能なスライダ２０を備えている。スライダ２０上には前記載置台２１が搭載されており、載置台２１に搭載された培養容器３を、コンベア９から分注ロボット１３の動作範囲まで移動させることができるようになっている。
【００４２】
前記載置台２１は、コンベア９上のトレイ７内から移載された培養容器３を搭載して保持する保持機構（図示略）を備えている。また、該培養容器３に振動を付与する加振装置（図示略）を備えていてもよい。加振装置は、例えば、培養容器３を所定の角度範囲で往復揺動させる装置の他、超音波振動を加える装置や、水平方向の振動を加える装置を採用してもよい。
本実施形態に係る自動培養装置１の各種装置には、図示しない制御装置が接続されている。制御装置は、各工程の順序や動作タイミング等を制御するとともに、動作履歴等を記録保存するようになっている。
【００４３】
このように構成された本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る自動培養装置１を用いて、間葉系幹細胞を培養するには、まず、患者から採取された骨髄液を容器に入れた状態で培養処理装置３０内に導入し、検体抽出装置５０に供給する。この工程は作業者が行ってもよいが、図示しないハンドリングロボットにより行ってもよい。
【００４４】
検体抽出装置５０においては、溶血剤注入装置５４の作動により、骨髄液に溶血剤が注入されて、給排ロボット１０の電動ピペット１０ｂに取り付けたチップ１４の先端が、骨髄液と溶血剤とが混合された容器内に挿入され、電動ピペット１０ｂの作動により、容器内の混合液が繰り返し吸引、放出される。これにより、骨髄液と溶血剤とが均一に混合されるので、この状態で、例えば、３〜７ｍｉｎ程度放置することにより溶血処理を行う。
【００４５】
溶血処理により、比重の大きな赤血球の細胞膜が破壊され、容器内の赤血球が除去されることになる。
その後、ハンドリングロボットの作動により、容器が遠心分離機１１に投入される。そして、遠心分離機１１が、例えば、８００〜１３００Ｇで３〜５ｍｉｎ間作動させられることにより、骨髄液内の比重の重い間葉系幹細胞を含む細が沈降した状態に集められる。
【００４６】
この状態で、再度ハンドリングロボットの作動により、容器が遠心分離機１１外に取り出される。そして、給排ロボット１０およびチップ供給装置１５の作動により、電動ピペット１０ｂ先端に未使用のチップ１４が取り付けられる。
すなわち、チップ供給装置１５は移動機構１５ｂを作動させることにより、未使用のチップ１４を給排ロボット１０の動作範囲内に配する。すると、給排ロボット１０は、昇降機構１０ｆを作動させることにより、ヘッド１０ｃを下降させて、第１の区画壁３３下方のチップ供給装置１５から未使用のチップ１４を受け取り、電動ピペット１０ｂの先端に取り付ける。
【００４７】
この状態で、給排ロボット１０を作動させて電動ピペット１０ｂのチップ１４の先端を容器内に挿入して吸引する。これにより、容器内の上澄み液が除去され、赤血球を含まない間葉系幹細胞を多く含む細胞が容器内に残される。
【００４８】
次に、容器内に残った検体は、給排ロボット１０により、培養容器３に投入される。投入に先立って、コンベア９の作動により、トレイ７に載せた１０個の空の培養容器３が、第１空間Ｓ１から第２空間Ｓ２に差し出されている。トレイ７上の培養容器３の内の２個の培養容器３が、図示しない移載装置の作動により、載置台２１上に載置される。そして、図示しない蓋体開閉装置の作動により、載置台２１上の培養容器３の蓋体３ｂが開けられる。
【００４９】
この状態で、給排ロボット１０を作動させて、電動ピペット１０ａから容器内に、貯留タンク１８に貯留されているＤＭＥＭやＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等の培地構成液を、所定量供給する。電動ピペット１０ａ先端のチップ１４を容器内に挿入した状態に保持したまま、電動ピペット１０ａを作動させることにより、ピペッティングを行う。これにより、赤血球を含まず、間葉系幹細胞を多く含む細胞と培地構成液とが均一に混合された細胞懸濁液が構成されることになる。
【００５０】
このようにして製造された細胞懸濁液は、電動ピペット１０ａを作動させることにより、チップ１４内に吸引される。吸引された細胞懸濁液は、チップ１４内に保持された状態で、給排ロボット１０を作動させることにより、載置台２１上の培養容器３内に上部開口から投入される。
【００５１】
細胞懸濁液を培養容器３内に投入し終わると、給排ロボット１０は、第１の区画壁３３に形成された廃棄口３７にチップ１４を挿入して取り外し、チップ回収部３１に回収させる。廃棄口３７において取り外されたチップ１４は、ダクト４０を介して、最下位の空間Ｓ２２２に配置されている廃棄容器内に投入される。
【００５２】
次に、細胞懸濁液が投入された培養容器３は、水平移動機構１９を作動させることにより、載置台２１ごと水平移動させられ、各分注ロボット１３の動作範囲内に配置される。分注ロボット１３は、チップ供給装置１５から受け取った未使用のチップ１４を先端に取り付けた電動ピペット１２を作動させることにより、試薬等供給装置１６の試薬等容器１６ｂ内からＤＭＥＭや血清、あるいは各種試薬を適量吸引した後に、培養容器３の上方まで搬送して培養容器３内に注入する。血清や各試薬の吸引は、各試薬等の吸引ごとにチップ供給装置１５から未使用のチップ１４に交換して行われる。これにより、培養容器３内においては、適正な培地内に間葉系幹細胞が混合された状態で存在することになる。なお、培地内において間葉系幹細胞を均一に分布させるために、載置台２１を作動させて、培養容器３ごと加振することにしてもよい。
【００５３】
そして、全ての処理を終えた培養容器３は水平移動機構１９の作動により、コンベア９の近傍まで移動させられ、そこで、再度、蓋体開閉装置および移載装置の作動により、蓋体３ｂにより上部開口を閉じられた状態で、トレイ７に戻される。
トレイ７上の全ての培養容器３に対して所定の処理が行われた後に、コンベア９を作動させることにより、トレイ７に載せられた培養容器３が第２空間Ｓ２から第１空間Ｓ１の中央空間Ｓ１２内に挿入される。
【００５４】
この状態で、搬送ロボット５を作動させることにより、ハンド５ｃによってトレイ７を持ち上げる。そして、トレイ７を収容する培養室４の前まで搬送したところで、当該培養室４の扉４ａを開き、搬送ロボット５によって、空いているトレイ保持部材４ｃ上にトレイ７を挿入する。そして、再度、扉４ａを閉じることにより、培養室４内の培養条件を一定に保持して細胞の培養が行われることになる。なお、細胞懸濁液６１の投入や、ＤＭＥＭ、血清、各種試薬の投入や吸引の順序は適宜変更してもよいのは言うまでもない。
【００５５】
また、培地交換や容器交換の際にも、上記と同様にして、培養室４外に配置されている搬送ロボット５の作動により、培養室４内の培養容器３がトレイ７ごと取り出され、第１空間Ｓ１から第２空間Ｓ２へ受け渡される。第２空間Ｓ２では、培養容器３内にトリプシンが注入されて、培養容器３内の細胞が剥離させられた状態で、給排ロボット１０の作動によって遠心分離機１１内に投入され、間葉系幹細胞等の必要なもののみが集められる。その他の処理工程は上記と同様である。
【００５６】
そして、複数回の培地交換や容器交換を介した所定期間にわたる培養工程を行うことにより、間葉系幹細胞が十分な細胞数まで増殖させられることになる。十分な細胞数に達したか否かは、給排ロボット１０の作動により、間葉系幹細胞が底面に付着した培養容器３を顕微鏡１７まで搬送することにより、観察あるいは測定され、細胞の増殖の程度が判断される。なお、トレイ７上には、同一検体の培養容器３が載置されていてもよいし、異なる検体の培養容器３が混在していてもよい。また、載置台２１上には同一検体の培養容器３が載置されてもよいし、異なる検体の培養容器３が混在していてもよい。
【００５７】
このようにして、本実施形態に係る自動培養装置１により、患者から採取した骨髄液から十分な細胞数の間葉系幹細胞を自動的に培養することが可能となる。なお、十分な間葉系幹細胞が得られた後には、培養容器３内にリン酸カルシウムのような生体組織補填材およびデキサメタゾンのような分化誘導因子を投入して、再度培養工程を継続することにより、生体の欠損部に補填可能な、生体組織補填体を製造することにしてもよい。
【００５８】
この場合において、本実施形態に係る自動培養装置１によれば、培養室４内に、培養容器３を取り出すための機構部が存在しない。すなわち、培養室４内には、トレイ７を載置した状態に支持するトレイ保持部材４ｃが設けられているのみであり、培養容器３を取り出すための機構部は全て培養室４外に配置された搬送ロボット５に集約されている。そして、搬送ロボット５は、トレイ７の出し入れ作業が行われた後には、培養室４の扉４ａの外側に完全に退避することができるようになっている。
【００５９】
したがって、扉４ａが閉じられた状態では、培養室４内に機構部が存在せず、機構部の作動によって発生するような塵埃の発生は全く存在しない。また、培養室４内は、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ２濃度５％等に維持されるが、機構部が存在しないために、このような環境下においても、腐食等の問題が生ずることがない。また、扉４ａが開かれた状態においても、培養室４内に挿入されるのは搬送ロボット５のハンド５ｃ先端のみであり、実質的に回転機構や摺動機構が培養室４内に入ることはない。その結果、培養室４内への塵埃の侵入が抑制され、培養室４内部の清浄度を高めることができる。
なお、培養室４は、ＣＯ２インキュベータ、マルチガスインキュベータ、インキュベータ、または保冷庫等のように、培養に利用されるものあるいはその組合せで構成されていてもよい。
【００６０】
また、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、医療機関等において患者から採取された状態の骨髄液に何ら前処理を施すことなく培養処理装置３０に導入するだけで、早期に間葉系幹細胞を必要細胞数まで増殖させることができる。したがって、医療機関や作業者に特別な設備や作業を発生させることがないという利点がある。
【００６１】
特に、細胞懸濁液６１を製造するためのピペッティング作業と、溶血処理を行うためのピペッティング作業とを同一の給排ロボット１０に行わせることができるので、設置スペースを増大させることなくコンパクトに構成することができる。
【００６２】
さらに、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、電動ピペット１０ａが、混合液Ｍを培養容器３内に数点に分けて均等に播種するために、チップ１４内に混合液Ｍを吸引する際、制御装置５３によりチップ１４の先端面（あるいはチップ１４の極僅かな先端部）のみが混合液Ｍの液面と当接するように液送動力装置１０ｈおよび昇降装置１０ｆが駆動制御されるようになっているので、電動ピペット１０ａにより吸引された混合液Ｍがチップ１４の先端から下方（すなわち、第１の区画壁３３の表面）に垂れてしまうことを防止することができるとともに、細胞を含む液体（混合液Ｍ）が乾燥して形成される粉塵等の、蓋の開いた培養容器３内への混入を確実に防止することができる。
【００６３】
さらにまた、上部空間Ｓ２１に清浄な下降気流を発生させる空気清浄機３２が設けられているとともに、第１の区画壁３３に、その側壁３０ａ，３０ｂの近傍に通気口３８が設けられ、第２の区画壁３４にも、側壁３０ａ，３０ｂに沿って通気口４３が設けられているので、上部空間Ｓ２１から流入した塵埃を含む気流が、空間Ｓ２２１内に広がることなく、スムーズに空間Ｓ２２２に向けて流通させられることになる。
【００６４】
さらにまた、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、蓋体３ｂを開かれた状態の培養容器３が移動させられる上部空間Ｓ２１には、培養容器３の移動に必要な載置台２１、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ、培養容器３の上部開口からアクセスすることが必要な給排ロボット１０、分注ロボット１３の電動ピペット１２、顕微鏡１７の光源部分等のみが配置され、その他の機構部は下部空間Ｓ２２に配置されている。したがって、上部空間Ｓ２１における塵埃の発生が最小限に抑えられ、培養容器３内への塵埃の混入の可能性が低減されることになる。
【００６５】
さらにまた、特に、塵埃を発生する可能性の高い装置、例えば、遠心分離機１１、廃棄容器３９、排気ファン４１等は、下部空間Ｓ２２の内、さらに第２の区画壁３４によって区画された最下位の空間Ｓ２２２内に配置されているので、そこで発生した塵埃が上部空間Ｓ２１に流入することはない。さらに、空間Ｓ２２２内の空気は排気ファン４１によって吸引され、ＨＥＰＡフィルタ４２によって塵埃を除去された後に培養処理装置３０の外部に放出される。したがって、上部空間Ｓ２１の清浄度は、極めて高い清浄度に維持されることになる。
【００６６】
さらにまた、培地や細胞が付着した使用済みのチップ１４を収容した廃棄容器３９は、着脱可能であり、必要によりまたは定期的に交換することで、下部空間Ｓ２２の清浄度をも高い状態に回復することができる。さらに、廃棄容器３９への廃棄の際に使用済みのチップ１４を通過させるダクト４０も、必要によりまたは定期的に取り外して、交換あるいは清掃することで、清浄度の向上に寄与することができる。
【００６７】
さらにまた、本実施形態に係る自動培養装置１は、搬送ロボット５の設置されている中央空間Ｓ１２の上部に、空気清浄部６を備えているので、搬送ロボット５の存在する中央空間Ｓ１２内も常に清浄度が維持されている。したがって、培養室４の扉４ａが開かれたときにも、培養室４内に塵埃が流入することを最小限に抑えることが可能となる。
したがって、本実施形態に係る自動培養装置１によれば、培養中の細胞が塵埃等によって汚染される可能性を低減し、健全な細胞を培養することができるという効果がある。
【００６８】
なお、この発明は、上記実施形態に示した構成に限定されるものではない。すなわち、培養室４の形状や数、搬送ロボット５、給排ロボット１０および分注ロボット１３の形態や数、各種装置の形態や数等は、何ら限定されることなく、適用条件に合わせて任意に設定することができる。
【００６９】
また、この発明は、給排ロボット１０の電動ピペット１０ａのみに適用されるものではなく、分注ロボット１３の電動ピペット１２にも適用し得るものである。
これにより、電動ピペット１２が、培地や種々の試薬を培養容器３内へ供給するために、チップ１４内に培地や種々の試薬を吸引する際、前述した制御装置５３と同様の装置によりチップ１４の先端面（あるいはチップ１４の極僅かな先端部）のみが混合液Ｍの液面と当接するように液送動力装置１０ｈと同様の装置および昇降装置１０ｆと同様の装置が駆動制御されるようになっているので、電動ピペット１２により吸引された培地や種々の試薬がチップ１４の先端から下方（すなわち、第１の区画壁３３の表面）に垂れてしまうことを防止することができて、第１の区画壁３３の表面をクリーンな状態に保つことができる。
【００７０】
さらに、この発明は、給排ロボット１０の電動ピペット１０ｂにも適用することができる。
これにより、チップ１４の先端面（あるいはチップ１４の極僅かな先端部）のみが混合液Ｍの液面と当接するように電動ピペット１０ｂが駆動制御されるようになっているので、電動ピペット１０ｂにより吸引された混合液Ｍがチップ１４の先端から下方（すなわち、第１の区画壁３３の表面）に垂れてしまうことを防止することができるとともに、細胞を含む混合液Ｍが乾燥して形成される粉塵等の、蓋の開いた培養容器３内への混入をより確実に防止することができる。
【００７１】
さらにまた、この発明は、カメラ５１が混合液Ｍの液面とチップ１４の先端とを撮像し、画像処理装置５２がカメラ５１により撮像された画像を処理して混合液Ｍの液面位置とチップ１４の先端位置とを算出することができるものであればさらに好適である。
これにより、混合液Ｍの液面とチップ１４の先端との位置関係をより正確に把握することができて、チップ１４の先端をより正確に混合液Ｍの液面に当接させることができる。
【００７２】
さらにまた、成長因子としては、サイトカインの他に、例えば、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を採用することにしてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
なお、この発明に係る自動培養装置は、骨髄の間葉系幹細胞の培養に限定されるものではない。生体の種々の組織から採取された細胞や、樹立された細胞ラインを培養してもよい。
【００７３】
さらにまた、生体組織補填材としては、リン酸カルシウムに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。また、生体組織補填材は、顆粒状でもブロック状でもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】この発明の一実施形態に係る自動培養装置を示す斜視図である。
【図２】図１の自動培養装置の第１空間を概略的に示す縦断面図である。
【図３】図１の自動培養装置の第１空間を概略的に示す平面図である。
【図４】図１の自動培養装置において用いられる培養容器の一例を示す斜視図である。
【図５】図１の自動培養装置の培養処理装置の第１の区画壁を除去して第２の区画壁上の装置を示す斜視図である。
【図６】図１の自動培養装置の培養処理装置の廃棄容器に接続するダクトの取付構造例を示す縦断面図である。
【図７】図１の自動培養装置の培養処理装置の第１および第２の区画壁を除去して最下位の空間内に設置された装置を示す斜視図である。
【図８】図１に示す給排ロボットの電動ピペットを駆動制御する構成を説明するための概略構成図である。
【符号の説明】
【００７５】
１    自動培養装置
１０    給排ロボット
１０ｆ  昇降機構（チップ搬送機構）
１０ｈ  液送動力装置
１３    分注ロボット
１４    チップ
５０    検出手段
５１    カメラ（撮像手段）
５２    画像処理装置（画像処理手段）
５３    制御装置
Ｍ    混合液（検体）
【図１】
2005304303.tif 000003
【図２】
2005304303.tif 000004
【図３】
2005304303.tif 000005
【図４】
2005304303.tif 000006
【図５】
2005304303.tif 000007
【図６】
2005304303.tif 000008
【図７】
2005304303.tif 000009
【図８】
2005304303.tif 000010