(57)【要約】    【課題】  本発明は、凹凸を有する基板にも多量の試料溶液を使用することなく、少量の試料溶液で効率よく基板上に固定された分子との反応を簡便に行うことが可能な反応キット（反応器具）を提供することを目的としている。    【解決手段】  第一の分子を固定するための固相支持体１１と、第一の分子と相互作用する第二の分子を含む溶液を含浸させるための吸水性部材１３と、を含む反応キットにより上記課題を解決する。この反応キットは、固相支持体１１と吸水性部材１３を接触させることで前記第一の分子と前記第二の分子との反応を行う。この反応キットは、プローブ分子と標的分子との相互作用を利用した標的分子の検出方法に利用してもよい。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の分子を固定するための固相支持体と、
前記第一の分子と相互作用する第二の分子を含む溶液を含浸させるための吸水性部材と、
を含むことを特徴とする反応キット。
【請求項２】
第一の分子を固定するための固相支持体と、
前記第一の分子と相互作用する第二の分子を含む溶液を含浸させるための吸水性部材と、
を含み、前記第一の分子又は第二の分子の一方がプローブ分子であり、他方が当該プローブ分子により探査される標的分子であることを特徴とする検出用キット。
【請求項３】
前記吸水性部材が、多孔質体又は繊維の集合体であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記吸水性部材を構成する素材が、親水性であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
前記固相支持体が、表面に凹凸を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
前記固相支持体の表面の凹凸が、分散した複数の突起部から構成されていることを特徴とする請求項５に記載のキット。
【請求項７】
さらに難吸水性及び／又は撥水性を有する部材を含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
前記難吸水性及び／又は撥水性を有する部材が、緩衝作用を有する材料から構成されていることを特徴とする請求項７に記載のキット。
【請求項９】
さらに緩衝材を含むことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
前記プローブ分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、酵素に対する基質、抗体、抗体に対するエピトープ、抗原、ホルモン、ホルモンレセプター、リガンド、リガンドレセプター、オリゴ糖、ポリ糖及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項２乃至９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
さらに第一の分子を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
さらに第二の分子を含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
第一の分子を固定した固相支持体上に、前記第一の分子と相互作用する第二の分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を接触させることにより前記第一の分子と前記第二の分子とを相互作用させることを特徴とする第一の分子と第二の分子とを相互作用させる方法。
【請求項１４】
前記第一の分子の前記固相支持体への固定が、前記固相支持体を前記第一の分子を含む吸水性部材に接触させることにより行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の分子と前記第二の分子とを相互作用させた後の前記固相支持体に、さらに第三の分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を接触させる工程を含むことを特徴とする請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第一の分子又は第二の分子の一方がプローブ分子であり、他方が当該プローブ分子により探査される標的分子である場合に、前記第一の分子を固定した固相支持体上に、前記第一の分子と相互作用する前記第二の分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を接触させることにより前記第一の分子と前記第二の分子とを相互作用させる接触工程と、
前記第一の分子と前記第二の分子との相互作用を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする標的分子の検出方法。
【請求項１７】
さらに、前記吸水性部材に前記第二の分子を含む溶液を含浸させる工程を含むことを特徴とする請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記接触工程が、前記吸水性部材上に、前記第一の分子が固定した面が前記吸水性部材と接触するように前記固相支持体を重ね合わせる工程であることを特徴とする請求項１６又は請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記吸水性部材の下に、難吸水性及び／又は撥水性を有する部材が載置されていることを特徴とする請求項１６乃至１８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２０】
前記難吸水性及び／又は撥水性を有する部材の上又は下に緩衝材が載置されていることを特徴とする請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２１】
前記接触工程が、前記固相支持体の前記第一の分子が固定された表面上に前記吸水性部材を重ね合わせる工程であることを特徴とする請求項１６に記載の検出方法。
【請求項２２】
前記第一の分子の前記固相支持体への固定が、前記固相支持体を前記第一の分子を含む吸水性基材に接触させることにより行われることを特徴とする請求項１６に記載の検出方法。
【請求項２３】
プローブ分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を、固相支持体表面に接触させることにより前記プローブ分子を前記固相支持体表面に固定化することを特徴とするバイオチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子間の反応を行うための反応器具に関し、詳しくは、少量の試料溶液で効率よく基板上に固定された分子と溶液中に含まれる分子とを反応させることが可能な反応キット、検出用キット、相互作用方法、検出方法及びバイオチップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の識別検出においては、標的となる核酸が特定のプローブと相補的に二本鎖を形成（ハイブリダイゼーション）する性質を利用したＤＮＡチップによる検出方法が注目されている。この検出方法は、ガラスやプラスチック、金属等の非浸透性基板にＤＮＡプローブを多種類固定したＤＮＡチップに、生体等から採取した核酸を含む溶液を滴下してハイブリダイゼーションを行った後、化学的・光学的・電気化学的手法等を用いて識別検出を行っている。
【０００３】
このようなハイブリダイゼーションを行う際に使用する溶液量は、少量（数十マイクロリットルから数百マイクロリットル程度）であるため、ＤＮＡチップ上に形成された全てのスポットに試料溶液を均一に広げることは困難である。
【０００４】
そこで、少量の溶液をＤＮＡチップの所定領域に均一に展開させる方法として、一般に、ＤＮＡプローブを固定したスライドグラスなどの基板上に溶液を滴下したあとにカバーグラスをかぶせる方法が用いられている。また、他の方法としては、例えば特開２００３−２１６３７号公報（特許文献１）に開示してあるように、ＤＮＡチップ上に所定間隔を介してカバープレートを設けることにより、毛細管現象を利用してＤＮＡチップとカバープレートの間のハイブリダイゼーションを実施する領域に試料溶液を展開させる方法がある。
【特許文献１】特開２００３−２１６３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記方法は、ＤＮＡプローブを固定化してある固定面が平坦である場合には有効であるが、固定面の表面に凹凸を有する場合（例えば、凹凸の段差が数ミリメートルあるような場合）には、例えば下記のような問題が生じる虞がある。
【０００６】
試料溶液を滴下後にカバーグラスをかぶせる方法では、ＤＮＡプローブ固定面が平面でない場合には、カバーグラスを持ち上げる表面張力が弱くなり、カバーグラスとスライドグラスの間に水層を形成できないため使用できない場合がある。
【０００７】
一方、特許文献１に記載の方法のように、カバーグラスを例えばスペーサを用いて所定間隔を空けてスライドグラス上に取り付ける方法では、ＤＮＡプローブ固定面に凹凸がある場合には凹凸を含む分スライドグラスとカバーグラスの間の距離を広げる必要があり、その分、多量の試料溶液を要する。
【０００８】
そこで、本発明は、凹凸を有する基板にも多量の試料溶液を使用することなく、少量の試料溶液で効率よく基板上に固定された分子との反応を簡便に行うことが可能な反応キット（反応器具）を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は、第一の分子を固定するための固相支持体（固相担体）と、上記第一の分子と相互作用する第二の分子を含む溶液を含浸させるための吸水性部材と、を含む反応キットである。
【００１０】
従来のガラス、プラスチック、金属等の液体を浸透しない非浸透性基板では、基板上に少量の溶液を固相支持体の第一の分子が固定された領域とほぼ同一の領域にまで略均一に溶液を広げることは困難である。しかし、吸水性部材を用いた場合、吸水作用を利用することで少量の溶液でも容易に吸水性部材内に略均一に広げることが可能となる。したがって、少量の溶液で効率よく固相支持体上に固定された第一の分子と溶液中に含まれる第二の分子とを相互作用させることが可能となる。本発明の反応キットは、例えば上記固相支持体と上記吸水性部材を接触させることで上記第一の分子と上記第二の分子との相互作用（反応）を行う。なお、本発明の反応キットは、後述のように検出用キットとして用いてもよい。
【００１１】
本発明の他の態様は、第一の分子を固定するための固相支持体と、上記第一の分子と相互作用する第二の分子を含む溶液を含浸させるための吸水性部材と、を含み、上記第一の分子又は第二の分子の一方がプローブ分子であり、他方が当該プローブ分子により探査される標的分子である検出用キットである。
【００１２】
吸水性部材を用いた場合、吸水性部材の大きさ及び吸水能等を適宜選択することで、少量の溶液でも容易に所望の領域に均一に溶液を広げることが可能となる。したがって、効率よく標的分子の検出を行うことが可能となる。本発明の検出用キットは、例えば上記固相支持体と上記吸水性部材を接触させることで上記第一の分子と上記第二の分子との相互作用（反応）を行わせ、標的分子である第一の分子又は第二の分子の検出を行う。
【００１３】
上記吸水性部材が、多孔質体又は繊維の集合体であることが好ましい。このような毛細管作用を有する材質を用いることで、第二の分子を含む溶液を吸水部材内に略均一に浸透させることが可能となる。
【００１４】
上記吸水性部材を構成する素材が、親水性であることが好ましい。これによれば、吸水性部材が親水性材料から構成されることで、吸水性部材内への溶液の浸透性を高めることができる。また、それにより、溶液が吸水性部材内により均一に拡散し得る。
【００１５】
本発明に用いられる固相支持体としては、例えば、ガラス基板、シリコン基板等が用いられ、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）等を用いることもできる。
上記固相支持体が、表面に凹凸を有する場合に、より好適に用いられる。本発明は、このような表面に凹凸を有する固相支持体に適用した場合に使用する溶液が少量で済むので特に効果的である。
【００１６】
上記固相支持体の表面の凹凸が、分散した複数の突起部から構成されていてもよい。表面の凹凸には、このように、例えば複数のピン状の突起のような分散した複数の突起部から構成されるものも含まれる。本発明によれば、例えば突起部の先端にのみ相互作用させたい領域（第一の分子が固定化された領域）を含むような場合に、上記吸水性部材をその先端部と接触させることで、少量の溶液で第一の分子と第二の分子とを相互作用させることが可能となる。
【００１７】
さらに難吸水性及び／又は撥水性を有する部材を含むことが好ましい。これにより、吸水性部材に保持した溶液の蒸発又は滲み広がりを低減することが可能となる。
なお、難吸水性及び／又は撥水性を有する部材は吸水性部材と一体的に形成されていてもよい。
【００１８】
上記難吸水性及び／又は撥水性を有する部材が、緩衝作用を有する材料から構成されていることが好ましい。これによれば、吸水性部材と固相支持体表面との接触時における密着性をさらに高めることが可能となる。
【００１９】
上記キットは、さらに緩衝材を含むことが好ましい。これにより、吸水性部材と固相支持体表面との接触時における密着性をさらに高めることが可能となる。
なお、緩衝材は難吸水性及び／又は撥水性を有する部材と一体的に形成されていてもよい。
【００２０】
上記プローブ分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、酵素に対する基質、抗体、抗体に対するエピトープ、抗原、ホルモン、ホルモンレセプター、リガンド、リガンドレセプター、オリゴ糖、ポリ糖及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。
【００２１】
上記キットは、さらに第一の分子を含むものであってもよい。
上記キットは、さらに第二の分子を含むものであってもよい。
【００２２】
本発明の他の態様は、第一の分子を固定した固相支持体上に、上記第一の分子と相互作用する第二の分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を接触させることにより上記第一の分子と上記第二の分子とを相互作用させることを特徴とする第一の分子と第二の分子とを相互作用させる方法（反応方法）である。
これによれば、吸水性部材を用いることで少量の溶液で効率よく固相支持体上に固定された第一の分子と溶液中に含まれる第二の分子とを相互作用（反応）させることが可能である。
【００２３】
上記第一の分子の上記固相支持体への固定が、上記固相支持体を上記第一の分子を含む吸水性部材に接触させることにより行われることが好ましい。これによれば、少量の溶液で第一の分子を固相支持体へ固定することが可能となる。
【００２４】
上記第一の分子と上記第二の分子とを相互作用させた後の上記固相支持体に、さらに第三の分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を接触させる工程を含んでもよい。また、さらに、第四の分子、第五の分子、・・・、を含む溶液を含浸させた吸水性部材を接触させる工程を含んでもよい。さらに、第三の分子、第四の分子、・・・、を含む溶液含浸させる吸水性部材は、第二の分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材などの先に使用した吸水性部材を使用してもよい。すなわち、順次同一の吸水性部材に、異なる分子を含む溶液を足していくことにより、多段階の相互作用（反応）を行ってもよい。また、全ての相互作用（反応）において別の吸水性部材を用いてもよい。
【００２５】
本発明の他の態様は、第一の分子又は第二の分子の一方がプローブ分子であり、他方が当該プローブ分子により探査される標的分子である場合に、上記第一の分子を固定した固相支持体上に、上記第一の分子と相互作用する上記第二の分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を接触させることにより上記第一の分子と上記第二の分子とを相互作用させる接触工程と、上記第一の分子と上記第二の分子との相互作用を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする標的分子の検出方法である。
【００２６】
これによれば、吸水性部材を用いることで少量の溶液で効率よく固相支持体上に固定された第一の分子と溶液中に含まれる第二の分子とを反応させることが可能である。したがって、効率よく標的分子の検出を行うことが可能となる。
【００２７】
さらに、上記吸水性部材に上記第二の分子を含む溶液を含浸させる工程を含んでもよい。予め溶液を含浸させることで、固相支持体と吸水性部材間との摩擦による影響を低減させることが可能となる。
【００２８】
上記接触工程が、上記吸水性部材上に、上記第一の分子が固定した面が上記吸水性部材と接触するように上記固相支持体を重ね合わせる工程であることが好ましい。これによれば、吸水性部材と固相支持体表面とを確実に接触させることが可能となる。
【００２９】
上記吸水性部材の下に、難吸水性及び／又は撥水性を有する部材が載置されていることが好ましい。これによれば、吸水性部材から外部への溶液の滲み広がりを防止し得るとともに、溶液の乾燥を防止することが可能となる。
【００３０】
上記難吸水性及び／又は撥水性を有する部材の上又は下に緩衝材が載置されていることが好ましい。これによれば、吸水性部材と固相支持体表面との密着性をさらに高めることが可能となる。
【００３１】
上記接触工程が、上記固相支持体の上記第一の分子が固定された表面上に上記吸水性部材を重ね合わせる工程であってもよい。
上記第一の分子の上記固相支持体への固定が、上記固相支持体を上記第一の分子を含む吸水性基材に接触させることにより行われてもよい。
【００３２】
本発明の他の態様は、プローブ分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を、固相支持体表面に接触させることにより上記プローブ分子を上記固相支持体表面に固定化するバイオチップの製造方法である。
【００３３】
これによれば、プローブ分子の固定化に多量の溶液を使用せずに済むので、貴重なプローブ分子を含む溶液（プローブ溶液）を無駄にせず、バイオチップの低コスト化を図ることが可能となる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の反応キットによれば、吸水性部材を用いることで少量の溶液で効率よく基板上に固定された分子と溶液中に含まれる分子とを簡便に相互作用させることが可能となる。このような反応キットは、プローブ分子と標的分子とのハイブリダイゼーションを利用した検出用キットにも好適に利用し得る。
【００３５】
本発明の反応方法によれば、少量の試料溶液で簡便に効率よく反応を行うことができる。
また、本発明の検出方法によれば、少量の試料溶液で簡便に効率よく検出を行うことができる。
【００３６】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型などの同時解析に必要なＤＮＡチップ、又はタンパク質の相互解析、発現解析等に必要なプロテインチップ等のように、微小なサンプルにより反応を行う場合に特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明について図面を参照しながら説明する。なお、本発明は下記実施の形態に限定されるものではない。
本発明に係る反応キットは、第一の分子を固定した固相支持体と、当該第一の分子と相互作用（反応）する第二の分子を含む溶液を含浸させる吸水性部材とを含む。
【００３８】
ここで、第一の分子と第二の分子としては、互いに相互作用（反応）する分子であればよく、例えば、プローブ分子とそれにより探査される標的分子、基質とそれに特異的に作用する酵素（例：制限酵素と基質ＤＮＡとの組合せ、基質ＤＮＡ（プローブ）と基質ＤＮＡ（標的分子、ターゲット）とヌクレアーゼとの組合せ等）などの組合せが挙げられる。また、第一の分子及び第二の分子は、各々一種類の分子であっても複数種類の分子を含むものであってもよい。したがって、例えば第一の分子又は第二の分子として複数種のプローブ分子を用いてもよい。
【００３９】
また、相互作用（反応）は、物理的なものであっても化学的なものであってもよく、例えば、酵素による切断反応、ハイブリダイゼーション反応等が挙げられる。
本発明の反応キットによれば、この第一の分子を固定した固相支持体と第二の分子を含む溶液を含浸させた吸水性部材を接触させることで、第一の分子と第二の分子との相互作用を効率よく行うことが可能となる。
【００４０】
以下、本発明の反応キットを検出用キットとして用いた場合を例に採り説明する。本発明の検出用キットは、上記固相支持体と吸水性部材とを含み、第一の分子と第二の分子がプローブ分子と標的分子である場合、第一の分子又は第二の分子のいずれがプローブ分子であっても、標的分子であってもよい。
【００４１】
図１は、本発明の検出用キットを用いた第一の分子と第二の分子との相互作用（反応）の効率化の原理を説明するための図である。以下、第一の分子としてプローブ分子を用い、第二の分子として標的分子を用いた場合を例に採り説明するが、本発明はこれに限定されないことはいうまでもない。
【００４２】
本発明の標的分子の検出方法では、固相支持体１１のプローブ分子を固定した面１２上に標的分子を含む試料溶液（以下、試料溶液という）を含浸させた吸水性部材１３を接触させることにより、プローブ分子と標的分子の相互作用を行う。
【００４３】
従来のカバーグラスを用いた方法では、図１１に示すようにプローブ分子を固定した固相支持体１１上に試料溶液１８を滴下し、その上をカバーグラス１４で覆うことにより相互作用を行っていた。このため、固相支持体１１表面が凹凸を有する場合にはカバーグラスを持ち上げる表面張力が弱く、固相支持体１１表面とカバーグラスとの間に水層を形成することが困難な場合があった。また、乾燥した場合には、剥離が困難になるなどの問題もあった。なお、図１１中の矢印は表面張力を示すものである。
【００４４】
また、固相支持体１１の表面に凹凸がある場合に、カバーグラスをスペーサを介して固相支持体１１上に取り付けた後、試料溶液を浸透させる方法も可能である。しかし、この場合には凹凸の形状によっては多量の試料溶液を必要とする。
【００４５】
これに対し、本発明では、固相支持体１１に標的分子を含む試料溶液を含浸させた吸水性部材１３を接触させることにより固相支持体１１に試料溶液を供給するので、接触させる固相支持体１１の表面形状に関わらず試料溶液の量は少量で済む。すなわち、試料溶液の量は吸水性部材１３に浸透させる量があればよく、それ以上に多量の溶液を必要としない。したがって、少量の試料溶液で確実に、しかも効率よくプローブ分子と標的分子の相互作用を行うことが可能となる。
【００４６】
吸水性部材１３と固相支持体１１とを接触させる際に重ねる順序は特に限定されない。したがって、予め試料溶液を含浸させた吸水性部材１３上に、固相支持体１１のプローブ分子が固定された面を吸水性部材１３に対向するように固相支持体１１を重ねることにより行ってもよい。また、固相支持体１１のプローブ分子が固定されている面１２に、試料溶液を含浸させた吸水性部材１３を重ねてもよい。さらに、固相支持体１１のプローブ分子が固定されている面１２に、吸水性部材１３を重ねた後、吸水性部材１３に試料溶液を含浸させてもよい。
【００４７】
（検出用キットの構成要素）
図２は、本発明の実施形態の検出用キットを構成する要素について説明するための図である。
以下に、本発明の検出用キットを構成する各要素について図２を参照しながら説明する。
【００４８】
図２に示すように、本実施形態の検出用キットは、第一分子としてのプローブ分子を固定した固相支持体１１と、第二分子としての標的分子を含む試料溶液を含浸させる吸水性部材１３から主に構成される。また、検出用キットは、吸水性部材１３の乾燥を防止するための撥水性部材１６を含んでもよい。さらに、固相支持体１１と吸水性部材１３との接触時の密着性を高めるための緩衝材１７を含んでもよい。
【００４９】
固相支持体１１としては、例えば、基板、フィルム、ピン先端等が挙げられる。また、固相支持体１１を構成する材質としては、例えば、ガラス、セラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の高分子材料、金などの導電性材料、シリコン、ガラス、多孔質シリコン、活性炭、織物、不織布、編物、濾紙、メンブレンフィルターなどの多孔質物質等を挙げることができる。また、固相支持体１１は、その表面が平坦なものだけではなく、表面に凹凸を有するものであっても好適に用いられる。また、表面の凹凸とは、微細な凹凸（例1μｍ〜100μｍ程度）の他に、複数の突起部が分散して構成されたものも含む。よって、固相支持体１１は、基板上に電極ピン等の突起部が設けられたものであってもよい。このような固相支持体１１は、さらに具体的にはＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）、プロテインチップ等であってもよい。
【００５０】
プローブ分子は、目的とする物質（標的分子）を検出するために用いる探査子の意であり、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、酵素に対する基質、抗体、抗体に対するエピトープ、抗原、ホルモン、ホルモンレセプター、リガンド、リガンドレセプター、オリゴ糖、ポリ糖、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５１】
固相支持体１１の表面にプローブ分子を固定させる方法としては、従来公知の方法が用いられる。
【００５２】
吸水性部材１３は、液体を吸収し得る部材をいい、例えば第二の分子としての標的分子を含む溶液を含浸し得るものである。吸水性部材１３の形状は特に限定するものではないが、例えば板状、シート状、フィルム状のものが挙げられる。吸水性部材１３の構造としては、例えば多孔質体又は繊維の集合体が挙げられる。このような構造をとることで毛細管現象により標的分子を含む溶液をほぼ均一に吸水性部材全体に拡散し得る。繊維の集合体としては、例えば、不織布、織物、編物、ろ紙等が挙げられる。また、多孔質体としては、例えば、発泡体等が挙げられる。
【００５３】
このような吸水性部材１３を構成する材料（素材）としては、特に限定するものではないが、例えば、天然繊維、人造繊維、樹脂、セラミックス、粘土、ゲル等が挙げられる。これらは、単独で用いられても組合わせて用いられてもよい。さらに具体的には、天然繊維としては、植物繊維（パルプ等）、動物繊維、鉱物繊維が挙げられる。また、人造繊維としては、合成繊維、半合成繊維、再生繊維等が挙げられる。合成樹脂としては、ポリスチレン、ポリエチレン等が挙げられる。
【００５４】
このような中でも吸水性部材１３としては、下記の性質を満たすものであることが好ましい。
（１）親水性であることが好ましい。これによれば、標的分子を含む溶液が吸水性部材１３内に浸透しやすい。また、それにより、溶液が吸水性部材内により均一に拡散し得る。
吸水性部材１３を構成する材料が疎水性材料である場合には、表面を親水性を有する物質により被覆してもよい。
【００５５】
（２）水に不溶であることが好ましい。また、吸水性部材１３を構成する材料が繊維の集合体である場合には、当該集合体が溶液を浸潤させてもほどけないものであることが好ましい。
（３）吸水により変形の少ない物質であることが好ましい。吸水により変形が生じると、プローブ分子の固定面と吸水性部材１３の接触が不均一になり、プローブ分子と標的分子の相互作用が均一に進行しない場合が生じるからである。
【００５６】
（４）耐薬品性で材料中に容易に溶出してくるような化学物質を使用していないことが好ましい。溶液を含ませたとき、材料内の化学物質等の不純物が混入する虞があるからである。
（５）核酸、タンパク質等の生体分子（標的分子）が吸着・収着し難い材質であることが好ましい。標的分子が吸着・収着してしまうと相互作用に影響をきたすからである。
【００５７】
（６）可撓性又は緩衝作用を有することが好ましい。これによれば、固相支持体１１との密着性又は固相支持体１１表面（第一分子を固定した面）への追従性を向上させることが可能となるからである。また、従来のカバーガラスを用いた方法では、カバーガラスを剥がす際に固相支持体１１表面を傷つける虞があったが、このような材質であれば、固相支持体１１表面を傷つける虞がない。
【００５８】
上記のようないずれかの条件を満たす吸水性部材１３の材質の好適な例としては、例えば、セルロースアセテート、パルプ、レーヨン、多孔質ガラス、アクリルアミドゲル、アガロースゲル、セラミックス、活性炭等が挙げられる。
【００５９】
また、吸水性部材１３の厚みは、固相支持体１１上に固定された第一の分子との相互作用に必要な量の液体が保持し得る限り特に限定するものではないが、不要な液量を低減させるという観点からは、本発明の目的を達成し得る範囲で薄いことが好ましい。
【００６０】
吸水性部材１３の固相支持体１１との接触面の大きさは特に限定するものではないが、固相支持体１１上に固定された第一の分子としてのＤＮＡプローブに第二の分子としての標的分子を含む溶液を十分に行き渡らせるために、ＤＮＡプローブが固定された領域（固定領域）と同等若しくはそれよりも大きいことが好ましい。また、吸水性部材１３は、全体が吸水性を有する必要はなく、一部に吸水性を有さない部位を有していてもよい。さらに、図３に示すように、吸水性部材１３に突出部２１を設けておいてもよい。例えば、吸水性部材１３の一部（突出部２１）を固相支持体１１よりも大きくしておくと、固相支持体１１と吸水性部材１３を剥がす際の作業が容易となる。
【００６１】
また、本発明の検出用キットは、上記固相支持体１１及び吸水性部材１３に加え、吸水性部材１３に含浸される試料溶液の蒸発を防ぎ、また、当該溶液が周囲に滲み広がるのを防止するために難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６を備えていてもよい。このような難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６は、吸水性部材１３の固相支持体１１との接触面の反対側に設置される。
【００６２】
難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６としては、下記の少なくともいずれかの条件を満たすものであることが好ましい。
（１）可撓性及び／又は緩衝作用を有するものであることが好ましい。固相支持体１１との密着性又は固相支持体１１表面（第一分子を固定した面）への追従性を高めることが可能となるからである。
【００６３】
（２）非透水性であることが好ましい。すなわち、水分を透過・吸収しないものであることが好ましい。
このようないずれかの条件を満たす難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６を構成する材料としては、特に限定するものではないが、例えば、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン等の合成樹脂が挙げられる。
【００６４】
なお、このような難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６には、親水性材料にポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン等の難吸水性及び／又は撥水性を有する材料をコーティングしたものも含む。
【００６５】
難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６は、吸水性部材１３に含浸される試料溶液の蒸発を防ぎ、当該溶液が周囲に滲み広がるのを防止するという上記観点から、吸水性部材１３よりも大きいことが好ましい。
なお、難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６は、吸水性部材１３と一体的に形成されていてもよい。
【００６６】
また、本発明の検出用キットは、さらに緩衝材１７を含んでもよい。このような緩衝材（弾性素材）１７は、吸水性部材１３上に固相支持体１１を重ね合わせて用いる場合において、吸水性部材１３と固相支持体１１との密着性を高めるために、例えば、吸水性部材１３の下に難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６を介して配置される。
【００６７】
緩衝材１７は、緩衝作用を有するものである。固相支持体１１などを重ねたときに、緩衝材１７を有すると、緩衝材１７がクッションの役割を果たし、固相支持体１１がその重みで緩衝材１７内に沈むため密着度が増すからである。
【００６８】
このような緩衝材１７としては、例えば、ゲル、ポリウレタン、ポリエチレン等の合成樹脂、溶液やゾルを非透水性素材で覆ったものなどが挙げられる。
なお、緩衝材１７は、撥水性部材１６と一体的に形成されていてもよく、さらに吸水性部材１３をも含む三層構造に形成されていてもよい。
【００６９】
なお、上記例においては、第一の分子と第二の分子としてプローブ分子と標的分子を用いた場合を例に挙げたが、これに限定されず、第一の分子として基質ＤＮＡを用い、第二の分子として制限酵素を用いてもよい。
【００７０】
（検出方法）
次に、上記検出用キットを用いた標的分子の検出方法について、好適な例を挙げ具体的に説明する。なお、本発明の検出方法は、この実施態様に限定されない。
図４は、本発明の実施の形態に係る標的分子の検出方法について説明するための図である。
【００７１】
図４（ａ）に示すように、緩衝材１７、難吸水性及び／又は撥水性を有する部材１６、吸水性部材１３の順に各部材を下から重ね合わせる。
図４（ｂ）に示すように、標的物質を含む試料溶液を吸水性部材１３上に滴下して、吸水性部材１３内に試料溶液を十分浸透させる。
【００７２】
吸水性部材１３に試料溶液を含ませる方法は、例えば、吸水性部材１３上の任意の箇所に必要十分量を滴下することにより行われる。吸水性部材１３が有する毛細管作用により、吸水性部材全体にサンプル溶液が均一に拡散することが可能となる。これにより、従来のカバーグラスを用いる方法と異なり、熟練した手技を必要とせず、誤差の少ない検出結果を得ることが可能となる。吸水性部材１３に含ませる試料溶液の量は、特に限定するものではないが、例えば、縦×横：２１ｍｍ×２１ｍｍ、厚さ：１３５μｍのセルロースアセテートから構成される吸水性部材に対しては、３０〜５０μｌ程度滴下する。
【００７３】
図４（ｃ）に示すように、別途準備したＤＮＡプローブ等のプローブ分子を固定した固相支持体１１を、プローブ分子固定面１２が、吸水性部材１３に接するように重ね合わせる。なお、プローブ分子の固相支持体１１への固定化は従来公知の方法により行うことができる。
【００７４】
このように得られた層状体３０を、相互作用に好適な条件下でしばらく放置し、相互作用（反応）を十分に行う。このような条件（温度条件、湿度条件、圧力条件等）は、プローブ分子と標的分子の組合せ、反応の種類等によって適宜定められる。
【００７５】
次に、相互作用したプローブ分子と標的分子を検出する。この検出方法は、プローブ分子と標的分子の組合せ等によって異なり、従来公知の方法で行うことができる。
例えば、標的分子としてＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を用い、プローブ分子としてＤＮＡプローブを用いる場合には、例えば、ＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光法等）を利用することで、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００７６】
本実施形態に係る検出方法によれば、上記検出用キットを用いているので、少量の試料溶液で効率よくプローブ分子と標的分子の相互作用を行うことが可能となる。また、熟練者でなくとも作業が容易に行え、信頼性の高い結果を得ることが可能となる。
【００７７】
なお、上記例では、吸水性部材１３上にプローブ分子が固定された固相支持体１１を載せる方法について説明したが、これに限定されず、固相支持体１１のプローブ固定面１２を上向きにし、その上に吸水性部材１３を載せる態様で相互作用（反応）を行ってもよい（図１（ａ）参照）。
【００７８】
また、上記例では、第一の分子としてプローブ分子、第二の分子として標的分子を例示したが、第一の分子としてＤＮＡ断片、第二の分子として制限酵素を用いてもよい。
また、吸水性部材１３に試料溶液を含ませる方法として、試料溶液を吸水性部材１３上に滴下する方法を挙げたが、これに限定されず、例えば、吸水性部材１３を試料溶液を溜めた容器内に浸すことにより行ってもよい。
【００７９】
図５に、本発明の効果を説明するための比較例としての凹凸形状を有するプローブ固定面１２への試料溶液の供給方法を示す。ここでは、電極ピン２３が表面に植設された、固相支持体１１としてのＤＮＡチップを使用した場合を例に採り説明する。このＤＮＡチップ１１では、電極ピン２３の先端にプローブ分子が貼付けられており、この電極ピン２３の先端部に試料溶液を供給することでハイブリダイゼーションが行われる。
【００８０】
図５（ａ）は、標的分子を含む試料溶液を貯めた容器内に、固相１１の表面に設けられた電極ピン２３の先端部を浸すことにより標的分子とのハイブリダイゼーションを行う方法を示している。しかし、この方法では、試料溶液を大量に使用する。
【００８１】
図５（ｂ）は、電極ピン２３の各先端部に、マイクロピペット等の滴下器具２４により試料溶液を滴下する方法について示している。しかし、この方法では、各電極ピン２３ごとに試料溶液を滴下するため、精度が要求され、また作業が煩雑であった。
しかしながら、本発明の方法によれば、このような問題が生ずる虞がない。
【実施例】
【００８２】
［使用器具・材料］
ＥＣＡチップ（固相支持体）：ＴＵＭジーン社製、電極ピン  全２５本
吸水性シート（吸水性部材）：セルロースアセテートタイプメンブレンシート、大きさ  ２１ｍｍ×２１ｍｍ、厚さ  １３５μｍ
撥水性シート（難吸水性及び／又は撥水性を有する部材）：ポリ塩化ビニリデン製ラップシート、大きさ  ３０ｍｍ×３０ｍｍ、厚さ  ２００μｍ
緩衝材：ポリウレタン製スポンジ、大きさ  ３０ｍｍ×３０ｍｍ、厚さ  ２ｃｍ
インターカレーター溶液（２本差ＤＮＡ特異的結合酸化還元試薬）／組成：インターカレーター、酢酸カリウム、塩化カリウム、水
ＤＮＡプローブＡ（40 mer）／ATATTCGACATTCGGATCATTAAGCGCGGATCGATCCTAG
試料溶液１／ハイブリダイゼーション溶液（組成：クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水）、合成オリゴターゲットＤＮＡ（CTAGGATCGATCCGCGCTTAATGATCCGAATGTCGAATAT：10 pmol/μL：ＤＮＡプローブＡと完全相補配列の40 mer）等
洗浄溶液１／組成：クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水
Ｓ１ヌクレアーゼ溶液／Ｓ１酵素、酵素バッファー（組成：酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、水）等
ＤＮＡプローブTEL-AML（20 mer）／AGGTCGAGTTCTTGGAGGTG
ＤＮＡプローブGAPDH（20 mer）／TGAGGTACCGGTTAGCATTA
試料溶液２／ハイブリダイゼーション溶液（組成：クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水）、PRI(Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)、ＲＮＡターゲット（ヒト乳がん由来細胞（OWBM）totalＲＮＡ：160 ng/μL：ＲＮＡに対する相補的領域は、ＤＮＡプローブTEL-AML の場合、TEL領域は10 mer、AML領域は10 mer、ＤＮＡプローブGAPDHの場合は20 mer）等
洗浄溶液２／組成：クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、水
【００８３】
（実施例１）
ＴＵＭジーン社製のＥＣＡチップを用いて評価を行った。図６に模式的に示すように、ＴＵＭジーン社製のＥＣＡチップ１１は基板２２に電極ピン２３が設置された構造を有しており、ＤＮＡプローブの固定面は深い凹凸を有する構造となっている。
このＥＣＡチップ１１の電極ピン２３（全２５本）にＤＮＡプローブＡを固定した。
次に、緩衝材１７上に撥水性シート１６、吸水性シート１３の順で重ね合わせた。この吸水性シート１３上に別途調製した試料溶液１を５０μｌ滴下し、その上に静かにＤＮＡプローブＡを固定したＥＣＡチップ１１を載せた。これを保湿箱にて密封し、室温で１０分間放置した（図７参照）。次いで、反応後のＥＣＡチップ反応面は洗浄溶液１を用いて洗浄した。本反応の前後における酸化還元電流値変化はインターカレーター溶液を用い、（株）ＴＵＭジーン製のＥＣＡ  ＣＨＩＰ  リーダーＴＧＥ２１００にて計測した。各電極ピンにおけるハイブリダイゼーション効率のバラツキを、反応前後の電流値変化から各ピンの相対的増加率を求め、そのときのピン間差を標準偏差として求めた。結果を図８に示す。
なお、ここで反応前の初期電流値よりも反応後の電流値が増加していれば、ハイブリダイゼーションが起きたものと見なされる。
【００８４】
（比較対照例１：常用処理のピン滴下法）
実施例１と同様にＤＮＡプローブＡを電極ピン２３に固定したＥＣＡチップ１１を準備した。
各電極ピン２３に実施例１で用いたのと同じ試料溶液１を１ピン当たり２μｌずつ滴下して反応を行った（図５（ｂ）参照）。次いで、反応後のＥＣＡチップ反応面は洗浄溶液１を用いて洗浄した。本反応の前後における酸化還元電流値変化は実施例１と同様の手法にて計測した。各電極ピン２３におけるハイブリダイゼーション効率のバラツキを、反応前後の電流値変化から各ピンの相対的増加率を求め、そのときのピン間差を標準偏差として求めた。結果を図８に示す。
【００８５】
実施例１及び比較対照例１の結果を比較すると、本発明のシートを使用した方法と常用処理のピン滴下法とにおける電流値増加率の比較より、双方ともに良好なハイブリダイゼーション反応が起きていることが確認できた。その際のハイブリダイゼーション効率のバラツキにおいても、ほとんど変わりないことから、シート使用法を用いてもサンプルＤＮＡ及びバッファー類が均等に拡散できていることが明らかとなった。また同時に、シートによる固定化プローブへの物理的摩擦影響等の問題もないことが証明された。
【００８６】
（実施例２）
実施例１と同様にＤＮＡプローブＡを電極ピン２３に固定したＥＣＡチップ１１を準備した。
次に、緩衝材１７上に撥水性シート１６、吸水性シート１３の順で重ね合わせた。この吸水性シート１３上にＳ１ヌクレアーゼ溶液を５０μｌ滴下し、その上に静かにＥＣＡチップ１１を載せた。これを保湿箱にて密封し、室温で６０分間放置した（図７参照）。
Ｓ１ヌクレアーゼは、１本鎖ＤＮＡを特異的に分解する酵素で、本実験ではＥＣＡチップ１１上に固定された１本鎖ＤＮＡプローブＡを消化（切断）する。次いで反応後のＥＣＡチップ反応面を水洗洗浄した。本反応の前後における酸化還元電流値変化は実施例１と同様の手法にて計測し、消化に伴い減少する電流値のバラツキを求めた。結果を図９に示す。
【００８７】
（比較対照例２：常用処理のピン滴下法）
実施例１と同様にＤＮＡプローブＡを電極ピン２３に固定したＥＣＡチップ１１を準備した。
各電極ピン２３に実施例２で用いたのと同じＳ１ヌクレアーゼ溶液を１ピン当たり２μｌずつ滴下して室温で６０分間放置し、反応を行った（図５（ｂ）参照）。そして、実施例２と同様の洗浄を行い、反応の前後における酸化還元電流値変化についても実施例２と同様の手法にて計測し、消化に伴い減少する電流値のバラツキを求めた。結果を図９に示す。
【００８８】
実施例２及び比較対照例２の結果を比較すると、本発明のシートを使用した方法と常用処理のピン滴下法とにおける電流値増加率の比較より、双方ともに良好な消化反応が起きていることが確認できた。その際の消化効率のバラツキにおいても、ほとんど変わりないことから、シート使用法を用いてもタンパク質であるＳ１ヌクレアーゼ及び酵素バッファー類が均一に拡散できていることが明らかとなった。また同時に、シートによる固定化プローブへの物理的摩擦影響等の問題もないことが証明された。
【００８９】
（実施例３）
ＴＵＭジーン社製のＥＣＡチップを用いて評価を行った。
このＥＣＡチップ１１の電極ピン２３（全２５本）の奇数番号ピンにＤＮＡプローブTEL-AMLを固定化し、偶数番号ピンにはＤＮＡプローブGAPDHを固定した。
次に、緩衝材１７上に撥水性シート１６、吸水性シート１３の順で重ね合わせた。この吸水性シート１３上に別途調製した試料溶液２（OWBM細胞由来total RNA溶液）を５０μｌ滴下し、その上に静かにＤＮＡプローブを固定したＥＣＡチップ１１を載せた。これを保湿箱にて密封し、室温で一晩放置した（図７参照）。反応後のＥＣＡチップ反応面は洗浄溶液２を用いて洗浄した。本反応の前後における酸化還元電流値変化は実施例１と同様の手法にて計測した。各電極ピンにおけるハイブリダイゼーション効率のバラツキを、反応前後の電流値変化から各ピンの相対的増加率を求め、そのときのピン間差を標準偏差として求めた。結果を図１０に示す。
なお、ここで反応前の初期電流値よりも反応後の電流値が増加していれば、ハイブリダイゼーションが起きたものと見なされる。また、OWBM細胞では、GAPDH遺伝子を発現しているので、GAPDHプローブを固定したピンにおいてはハイブリダイゼーションが起こるが、TEL-AMLプローブは、転座遺伝子を検出するプローブであり、OWBM細胞ではTEL-AMLを発現していないことから、ハイブリダイゼーションが起こりうる領域がＤＮＡプローブGAPDHの半分の10 merしか存在しないため、分子間の結合力が弱く、洗浄の過程で洗い流されてしまうため、結果としてハイブリダイゼーションが起こらない。なお、本実施例で用いたOWBM細胞は、予め転座変異が起きていないことを確認したものを用いた。
【００９０】
（比較対照例３：常用処理のピン滴下法）
実施例３と同様にＤＮＡプローブTEL-AML及びＤＮＡプローブGAPDHを電極ピン２３に固定したＥＣＡチップ１１を準備した。
各電極ピン２３に実施例３で用いたのと同じtotalＲＮＡ溶液を１ピン当たり２μｌずつ滴下して反応を行った（図５（ｂ）参照）。反応後のＥＣＡチップ反応面は洗浄溶液２を用いて洗浄した。本反応の前後における酸化還元電流値変化は実施例１と同様の手法にて計測した。各電極ピン２３におけるハイブリダイゼーション効率のバラツキを、反応前後の電流値変化から各ピンの相対的増加率を求め、そのときのピン間の電流値の差を標準偏差として求めた。結果を図１０に示す。
【００９１】
図１０に示すように、本発明のシートを使用した方法（実施例３）においても常用処理のピン滴下法（比較対照例３）を用いた場合と同様に、GAPDHプローブを用いた際のハイブリダイゼーション効率の誤差範囲（エラーバーの値）が、TEL-AMLの誤差範囲（エラーバーの値）と重複せず、十分離れた範囲となっている。このことから、本発明のシートを使用した方法においても、ハイブリダイゼーションの検出を良好になし得ることが確認できた。
【００９２】
（実施例４）
２１ｍｍ×２１ｍｍの反応領域を有する固相支持体と反応させるのに必要な試料溶液の量についての検討を行った。
上記した撥水性シート上に載置した吸水性シートに、試料溶液１を滴下し、吸水性シート全体に均一展開するのに必要な溶液量を計測した。その結果、５０μｌの量の試料溶液１でも略均一に吸水性シート全体に溶液を展開することができた。
【００９３】
（比較対照例４）
実施例４と同様に、２１ｍｍ×２１ｍｍの反応領域を有する固相支持体と反応させるのに必要な試料溶液の量について検討した。
ガラス基板上に、試料溶液１を滴下し、反応領域とほぼ同等の面積にまで展開するのに必要な溶液量を計測した。その結果、約２ｍｌの試料溶液１が必要であった。
実施例４及び比較対照例４の結果から、反応に使用する試料溶液を大幅に低減することが可能であることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、本発明の検出用キットを用いた第一の分子と第二の分子との相互作用（反応）の効率化の原理を説明するための図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態の検出用キットを構成する要素について説明するための断面図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態の検出用キットを構成する要素について説明するための上面図である。
【図４】図４は、本発明の実施の形態に係る標的分子の検出方法について説明するための図である。
【図５】図５は、比較例としての凹凸形状を有するプローブ固定面への試料溶液の供給方法を示す図である。
【図６】図６は、本発明の実施例に用いられるＥＣＡチップを模式的に示した図である。
【図７】図７は、本発明の実施例の方法を説明するための図である。
【図８】図８は、ハイブリダイゼーション反応を行った際の電流値変化とハイブリダイゼーション効率のバラツキを示すグラフである。
【図９】図９は、Ｓ１ヌクレアーゼ消化反応を行った際の電流値変化と酵素消化率のバラツキを示すグラフである。
【図１０】図１０は、DNA-RNAハイブリダイゼーション反応を行った際のハイブリダイゼーション効率のバラツキを示すグラフである。
【図１１】図１１は、従来のカバーグラスを用いた方法を説明するための図である。
【符号の説明】
【００９５】
１１・・・固相支持体、１２・・・第一の分子固定面、１３・・・吸水性部材、１４・・・カバーグラス、１６・・・難吸水性及び／又は撥水性を有する部材、１７・・・緩衝材、１８・・・試料溶液、２１・・・突出部、２２・・・基板、２３・・・電極ピン、２４・・・滴下器具、２５・・・チップ、３０・・・層状体
【図１】
2005315576.tif 000003
【図２】
2005315576.tif 000004
【図３】
2005315576.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005315576.tif 000011
【図１０】
2005315576.tif 000012
【図１１】
2005315576.tif 000013
【配列表】
2005315576000001.app