(57)【要約】【課題】  本発明は、液状安定性の向上した改変型コレステロールオキシダーゼ及び該改変型コレステロールオキシダーゼの製造法に関する。【解決手段】  コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、４０分間または６０℃、６０分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、６０分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。
【請求項２】
加熱処理後の残存活性率が、改変前に比べて５０％以上増大している請求項１記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
【請求項３】
液状において６０℃、６０分間の加熱処理を施した後のコレステロールオキシダーゼ残存活性率が３５％以上であるコレステロールオキシダーゼ。
【請求項４】
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、６０分間の加熱処理を施した後の残存活性率が３５％以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
【請求項６】
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されてなる請求項１〜４記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
【請求項７】
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、４０分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。
【請求項８】
加熱処理後の残存活性率が、改変前に比べて３０％以上増大している請求項７記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
【請求項９】
液状において６０℃、４０分間の加熱処理を施した後のコレステロール残存活性率が４５％以上であるコレステロールオキシダーゼ。
【請求項１０】
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、４０分間の加熱処理を施した後の残存活性率が４５％以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
【請求項１２】
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されてなる請求項７〜１０記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
【請求項１３】
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されてなる請求項６あるいは１２記載のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
【請求項１４】
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体たんぱく質の一次構造アミノ酸配列の１０９位のスレオニン残基、２５２位のスレオニン残基、４０４位のアラニン残基からなる群より選択される少なくとも１箇所もしくは２箇所以上が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
【請求項１５】
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において２５２位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
【請求項１６】
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、４０４位アラニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
【請求項１７】
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、１０９位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
【請求項１８】
請求項５、６および請求項１１，１２に記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１４〜１７記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項２０】
請求項１８および１９に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞
【請求項２１】
請求項２０に記載の形質転換宿主細胞を培養することにより改変型コレステロールオキシダーゼを生成させ、該改変型コレステロールオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼの製造方法。
【請求項２２】
請求項１〜４、請求項６〜１０および請求項１２のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを含有するコレステロール測定用試薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜４、請求項６〜１０および請求項１２のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロール測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状安定性の向上した改変型コレステロールオキシダーゼ及び該改変型コレステロールオキシダーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．６）は、臨床的に内分泌疾患や代謝異常の診断の指標となっている体液中のコレステロールの測定等に使用されている。
【０００３】
このようなコレステロールオキシダーゼはストレプトマイセス属（例えば、特許文献１参照。）、ブレビバクテリウム属（例えば、特許文献２参照。）、ロードコッカス属（例えば、特許文献３参照。）等の細菌が生産することが知られている。近年の臨床検査の発展及び液状試薬への移行により、より安定な、あるいはより信頼性の高いコレステロールオキシダーゼの開発が望まれている。それらを解決すべく、近年、野生型のコレステロールオキシダーゼを遺伝子工学的手法用い改変し、熱安定性を向上させた例（例えば、特許文献４参照。）が報告されている。
【特許文献１】特許第２０８６６０９号
【特許文献２】特開平４−２１８３６７号
【特許文献３】特許第２５１０４９２号
【特許文献４】特開平８−２４２８６０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
臨床検査試薬として用いるコレステロールオキシダーゼは溶液状態における長期保存時の安定性に優れたものが望まれている。本発明はコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、変異を導入することにより得られた液状安定性の向上した改変型コレステロールオキシダーゼ及び該改変型コレステロールオキシダーゼの製造法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、既にストレプトマイセスｓｐ．ＳＡ−ＣＯＯが産生するコレステロールオキシダーゼの前駆体たんぱく質の一次構造において少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を遺伝子工学的に生じさせることにより、親酵素に比べて熱安定性が優れた新規酵素を造成し、該遺伝子を含む組換えベクターによる形質転換体で大量生産させることに成功している（例えば、特許文献４参照。）。本発明者らはさらに、上記コレステロールオキシダーゼ前駆体タンパク質の一次構造をもとに、液状での安定性に優れたコレステロールオキシダーゼを得るべく鋭意研究を重ねた結果、上記コレステロールオキシダーゼ前駆体タンパク質の一次構造に変異を導入することにより液状での安定性がさらに向上した改変型コレステロールを造成することに成功した。
【０００６】
すなわち本発明は以下のような構成からなるものである。
項１.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、６０分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。
項２.
加熱処理後の残存活性率が、改変前に比べて５０％以上増大している、項１記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項３.
液状において６０℃、６０分間の加熱処理を施した後のコレステロールオキシダーゼ残存活性率が３５％以上であるコレステロールオキシダーゼ。
項４.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、６０分間の加熱処理を施した後の残存活性率が３５％以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。
項５.
項１〜４のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
項６.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されてなる、項１〜４記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項７.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、４０分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。
項８.
加熱処理後の残存活性率が、改変前に比べて３０％以上増大している、項７記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項９.
液状において６０℃、４０分間の加熱処理を施した後のコレステロール残存活性率が４５％以上であるコレステロールオキシダーゼ。
項１０.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において６０℃、４０分間の加熱処理を施した後の残存活性率が４５％以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。
項１１.
項７〜１０のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
項１２.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されてなる、項７〜１０記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項１３.
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されてなる、項６あるいは１２記載のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項１４.  
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体たんぱく質の一次構造アミノ酸配列の１０９位のスレオニン残基、２５２位のスレオニン残基、４０４位のアラニン残基からなる群より選択される少なくとも１箇所もしくは２箇所以上が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項１５.
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において２５２位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項１６.
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、４０４位アラニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項１７.
配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、１０９位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項１８.
項５、６および、項１１，１２に記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
項１９.
項１４〜１７記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
項２０.
項１８および１９に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞
項２１.
項２０に記載の形質転換宿主細胞を培養することにより改変型コレステロールオキシダーゼを生成させ、該改変型コレステロールオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼの製造方法。
項２２.
項１〜４、項６〜１０および項１２のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを含有するコレステロール測定用試薬組成物。
項２３.
項１〜４、項６〜１０および項１２のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロール測定方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変型タンパク質は、親酵素に対し熱安定が向上している。さらに、遺伝子工学技術により、該改変型コレステロールオキシダーゼを高純度にかつ大量に供給することができる。従って、本発明のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変型タンパク質を臨床検査用試薬等に用いることにより、より安定性の高い試薬にする事が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の改変の基になるコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質は、特に限定されるものではない。その起源としては、好ましく微生物であって、具体的な例としては、ストレプトマイセス属、ブレビバクテリウム属、ロードコッカス属、ノカルディア属、シュウドモナス属などの細菌が例示される。最も好ましい一例としては、特開平８−２４２８６０に開示されている、ストレプトマイセスｓｐ．ＳＡ−ＣＯＯが産生するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質を遺伝子工学的手法を用いて改変させて得られた酵素の１つであるＳ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅを挙げることができる。このコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造は配列表の配列番号１に示すとおりである。
【０００９】
ここで、「Ｓ１０３Ｔ」などの「ローマ字・数字・ローマ字」の表記は、特に断りがなければ、配列番号１の当該配列番号に位置するアミノ酸（１文字記号）を置換することを意味する。（この事例ではＳ：セリンをＴ：スレオニンに置換）
【００１０】
本発明の改変型コレステロールオキシダーゼは、例えば上記のようなコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質の一次構造において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された一次構造を有するもので、本発明の改変型コレステロールオキシダーゼは液状安定性が改変前と比べて向上していることを特徴とする。
【００１１】
本発明における液状安定性は、中性緩衝液中に存在するコレステロールオキシダーゼを加熱処理した後の残存活性の割合で示される。具体的には、酵素濃度約０．８Ｕ／ｍｌ、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０℃、４０分または６０分加熱処理した後の残存活性率を測定する。
【００１２】
本発明の具体的な実施態様としては、例えば、配列表の配列番号１に記載される一次構造の１０９位のスレオニン残基、２５２位のスレオニン残基、４０４位のアラニン残基、４０２位のメチオニン残基からなる群より選択される少なくとも１箇所もしくは２箇所以上が他のアミノ酸に置換された改変型コレステロールオキシダーゼである。
【００１３】
更に具体的には配列表の配列番号１に記載される一次構造の、２５２位のスレオニンがアラニン、グリシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンへ、４０４番目のアラニン残基がバリンへ、１０９位のスレオニンがイソロイシンへ、４０２位のメチオニンがロイシン、バリンへの置換のうち、少なくとも１つまたは２つ以上を含む、改変型コレステロールオキシダーゼである。
【００１４】
また、Ｎ３７１、Ｎ３９０、Ｍ３６９、Ｅ５３６、Ｎ４４３の部位に関する単独、及びそれらの少なくとも一つを含む改変型コレステロールオキシダーゼの安定性が改変前と比べて向上するかもしれないであろうと類推することは容易に考えつく範囲である。
【００１５】
また、本発明の改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子は、配列表の配列番号１に記載される一次構造の２５２位のスレオニン残基、４０４番目のアラニン残基、１０９位のスレオニン残基、４０２位のメチオニン残基のうちの少なくとも１つまたは２つ以上が他のアミノ酸に置換された、改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子である。
【００１６】
更に具体的には配列表の配列番号１に記載される一次構造の２５２位のスレオニンがアラニン、グリシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンへ、４０４位のバリンがアラニンへ、１０９位のスレオニンがイソロイシンへ４０２位のメチオニンがロイシン、バリンへの置換のうち、少なくとも１つまたは２つ以上を含む、改変型コレステロールオキシダーゼコードする遺伝子が挙げられる。
【００１７】
本発明の改変型コレステロールオキシダーゼを作製するために、コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法をも用いることができる。すなわち、コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子と変異原となる薬剤を接触させる方法、紫外線照射による方法、また遺伝子修復機構が欠損しているために高頻度に遺伝子に変異が生じる大腸菌を用いる方法がある。また部位特異的変異を導入する方法として合成オリゴヌクレオチドを用いた方法ＰＣＲ法や市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００１８】
作製された改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子は、ベクターに連結した状態で複製可能な宿主微生物に移入後、得られた形質転換体を培養し、その培養物から該変異型コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含むベクターを分離、精製し、該ベクターから改変型コレステロールオキシダーゼ遺伝子を採取することができる。
【００１９】
すなわち供与微生物を例えば１から３日間攪拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることにより改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームやβ―グルカナ―ゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００２０】
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法にしたがって、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除タンパク処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００２１】
ベクターには、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては例えばエシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ−ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ−ｇｔ１１などが使用できる。また、プラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが使用できる。
【００２２】
宿主微生物は、組換えベクターが安定かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＨＢ１１０、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９などを用いることができる。
【００２３】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合にはカルシウム処理法によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用いることができる。
【００２４】
上記のように得られた形質転換体である微生物は栄養培地で培養されることにより、改変型コレステロールオキシダーゼを安定に生産し得ることが可能である。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとコレステロールオキシダーゼを同時に発現する微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつコレステロールオキシダーゼを生成する微生物を選択すればよい。
【００２５】
上記のようにして得られた改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列はＳｃｉｅｎｃｅ  第２１４巻、第１２０５〜１２１０頁（１９８１年）に報告されているジデオキシ法により解読し、また該改変型コレステロールオキシダーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定できる。このようにして一度選択された改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲにより改変型コレステロール遺伝子であるＤＮＡを回収し他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００２６】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるのもが広く利用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２７】
培養温度は菌が生育し、コレステロールオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るがエシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、コレステロールオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培値ｐＨは菌が発育しコレステロールオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００２８】
培養物中の改変型コレステロールオキシダーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法にしたがってコレステロールオキシダーゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、コレステロールオキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。コレステロールオキシダーゼが菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過、遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を用いてコレステロールオキシダーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２９】
このようにして得られた改変型コレステロールオキシダーゼ含有液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮，更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは、メタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製された変異型コレステロールオキシダーゼを得ることができる。
【００３０】
例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ファルマシアバイオテク製）などによるゲル濾過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク製）、フェニルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク製）カラムクロマトグラフィーにより、分離、精製することにより、精製酵素標品を得ることができる。
【００３１】
本願明細書に開示されている本願発明のコレステロールオキシダーゼは、さらにまた、触媒としての本質が失なわれない範囲で、少なくとも１つのアミノ酸を付加、欠失、挿入される等の改変が行なわれたものであっても良い。
【００３２】
また本願発明の一態様は、特許請求の範囲または本願明細書のいずれかに開示されている本願発明のコレステロールオキシダーゼを含有するコレステロール測定用試薬組成物である。本発明のコレステロール測定用試薬組成物は、エステル型コレステロールや遊離型コレステロール、あるいはまた、高密度リポ蛋白中のコレステロール、低密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール及びカイロミクロン中のコレステロールなど、種々の態様のコレステロールの測定に利用できる。
【００３３】
また本願発明の一態様は、特許請求の範囲または本願明細書のいずれかに開示されている本願発明のコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロール測定方法である。本発明のコレステロール測定方法は、エステル型コレステロールや遊離型コレステロール、あるいはまた、高密度リポ蛋白中のコレステロール、低密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール及びカイロミクロン中のコレステロールなど、種々の態様のコレステロールの測定に適用できる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって何ら限定されるものではない。
コレステロールオキシダーゼの酵素活性は、コレステロールを基質とし、その消失量を５００ｎｍの吸光度の変化で測定することにより測定した。具体的方法を以下に示す。
５ｍｇ／ｍｌ  コレステロール溶液（５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４％（Ｗ／Ｖ）  コール酸ナトリウム塩を含む）、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．７６％  ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）水溶液、６．０％フェノール水溶液、ぺルオキシダーゼ（ＰＯＤ）１５，０００Ｕ／ｍｌ−０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を調製し、下記反応混液を調製した。
５１．０ｍｌ  ０．１Ｍ  ０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
４．０ｍｌ  コレステロール溶液
１．０ｍｌ  ４ＡＡ水溶液
２．０ｍｌ  フェノール水溶液
２．０ｍｌ  ＰＯＤ溶液。    
上記反応混合液を３．０ｍｌ取り、３７℃で約５分間予備加温した後、測定試料（酵素液）を０．０５ｍｌを添加し、混和後、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素液の代わりに２０ｍＭ、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を０．０５ｍｌ加え上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化量を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきコレステロールオキシダーゼの酵素活性を算出した。なお上記条件下で１分間に１マイクロモルのＨ２Ｏ２を酸化する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．０５（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３．７８×１／２×１．０×０．０５（ｍｌ）｝
１３．７８  ：  Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素の上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数
１／２  ：  酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の２分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素は１分子であることによる係数  
１．０  ：  セルの光路長（ｃｍ）
【００３５】
実施例１  コレステロールオキシダーゼ遺伝子への変異の導入
遺伝子工学的手法を用いた改変により熱安定性が向上したコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ（特開平８−２４２８６０）で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩神振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調製した。該プラスミドを鋳型として用いＤｉｖｅｒｓｉｆｙＴＭ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  社製）を用いた変異処理をそのプロトコールに従って施し、コレステロールオキシダーゼの生産能力を有する、改変型コレステロールオキシダーゼ変異プラスドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００３６】
実施例２熱安定性の向上した変異体のスクリーニング
実施例１で調製したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、該形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって菌体を回収し、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００３７】
上記の租酵素液を用いて、上述した活性測定法によりコレステロールオキシダーゼ活性を測定した。また、同租酵素液を６０℃で４０分間加熱処理した後、コレステロールオキシダーゼ活性を測定し、１４種の熱安定性の向上した変異体を取得した。こらら９種の改変体をコードするプラスミドをｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ２、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ３、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ４、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ５、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ６、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ７、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ８、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ９、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１０、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１１、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１２、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１３、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１４と命名した。
【００３８】
ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ２、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ３、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ４、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ５、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ６、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ７、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ８、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ９、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１０、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１１、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１２、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１３、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１４の変異箇所を同定するためにＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ；  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１では配列表配列番号１記載の１２１番目のバリンがアラニン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ２では２５２番目のスレオニンがアラニン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ３では１０３番目のスレオニンがイソロイシン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ４では１０９番目のスレオニンがイソロイシン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ５では１０９番目のスレオニンがプロリン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ６では２５２番目のスレオニンがチロシン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ７では２５２番目のスレオニンがトリプトファン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ８では２５２番目のスレオニンがフェニルアラニン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ９では２５２番目のスレオニンがグリシン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１０では４０４番目のアラニンがバリン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１１では４０２番目のメチオニンがロイシン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１２では４０２番目のメチオニンがバリン、３７１番目のアスパラギンがヒスチジン、３９０番目のアスパラギンがセリン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１３では４０２番目のメチオニンがバリン、３６９番目のメチオニンがイソロイシン、５３６番目のグルタミン酸がバリン、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１４では４０２番目のメチオニンがバリン、４４３番目のアスパラギンがセリンに置換されていることが確認された。またＴ２５２Ａ変異とＶ１２１Ａ、Ｔ１０９Ｉ、Ｔ１０３Ｉ変異部位を組み合わせた改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含むプラスミド（ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ＋Ｔ２５２Ａ＋Ｖ１２１Ａ、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ＋Ｔ２５２Ａ＋Ｔ１０９Ｉ、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ＋Ｔ２５２Ａ＋Ｔ１０３Ｉ）を制限酵素サイトを利用して作製し、同様にＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ；  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）で塩基配列を確認した。
【００３９】
実施例３  改変体コレステロールオキシダーゼの製造
市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９；ＴＯＹＯＢＯ社製）を計１７種類の改変型コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターでそれぞれ形質転換することにより改変コレステロールオキシダーゼ生産菌株１２種類を造成した。これらの菌株ををアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）でそれぞれ３０℃、２４時間培養し、約１００−５００ｍＵ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼ活性を得た。ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１、ｐＣＯ−１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ２、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ３、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ４、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ５、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ６、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ７、ｐＣＯ−１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５ＥＭ８、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ９、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１０、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１１、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１２、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１３、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ−Ｍ１４の各プラスミドに由来するコレステロールオキシダーゼをＶ１２１Ａ，  Ｔ２５２Ａ，  Ｔ１０３Ｉ，  Ｔ１０９Ｉ，Ｔ１０９Ｐ，  Ｔ２５２Ｙ，  Ｔ２５２Ｗ，  Ｔ２５２Ｆ，  Ｔ２５２Ｇ，  Ａ４０４Ｖ、Ｍ４０２Ｌ、Ｍ４０２Ｖ＋Ｎ３７１Ｈ＋Ｎ３９０Ｓ、Ｍ４０２Ｖ＋Ｍ３６９Ｉ＋Ｅ５３６Ｖ、Ｍ４０２Ｖ＋Ｎ４４３Ｓ、また、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ＋Ｔ２５２Ａ＋Ｖ１２１Ａ、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ＋Ｔ２５２Ａ＋Ｔ１０９Ｉ、ｐＣＯ１１０−Ｓ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅ＋Ｔ２５２Ａ＋Ｔ１０３Ｉの各プラスミドに由来するオキシダーゼをＶ１２１Ａ＋Ｔ２５２Ａ，  Ｔ１０９Ｉ＋Ｔ２５２Ａ，  Ｔ１０３Ｉ＋Ｔ２５２Ａと命名した。
なお、確認のために述べるが、本実施例においては、改変の基になるコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質として、ストレプトマイセスｓｐ．ＳＡ−ＣＯＯが産生するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質を遺伝子工学的手法を用いて改変させて得られた酵素の１つであるＳ１０３Ｔ＋Ｖ１４５Ｅを用いているため、本実施例におけるコレステロールオキシダーゼは、すべてＳ１０３ＴとＶ１４５Ｅの２箇所の変異を持っている。
したがって、上記において例えばＶ１２１Ａとは、Ｓ１０３ＴおよびＶ１４５Ｅの２箇所が変異した変異体にさらにＶ１２１Ａの変異が加わったものを示す。また、上記において例えばＶ１２１Ａ＋Ｔ２５２Ａとは、Ｓ１０３ＴとＶ１４５Ｅの２箇所が変異した変異体にさらにＶ１２１ＡとＴ２５２Ａの２箇所の変異が加わったものを示す。
【００４０】
しかしながら、改変の基になるコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質は特に上記に限定されるものではない。
【００４１】
上記方法にて培養した菌体を集め、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）  に再懸濁後、超音波処理にて破砕し、遠心分離により上清液（粗酵素液）を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンを用いた除核酸、硫酸アンモニウムを用いた塩析により、コレステロールオキシダーゼを分画した。さらにＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグラフィーによりコレステロールオキシダーゼを精製した。
【００４２】
実施例４  改変型コレステロールオキシダーゼＶ１２１Ａ，Ｔ２５２Ａ，Ｔ１０３Ｉ，Ｔ１０９Ｉ粗酵素液サンプルと親酵素の熱安定性の比較
Ｖ１２１Ａ，Ｔ２５２Ａ，Ｔ１０３Ｉ，Ｔ１０９Ｉ，Ｔ１０９Ｐ粗酵素液サンプルを６０℃、４０分加熱処理した時の残存活性を比較した時の残存活性を比較した結果を図１に示す。図１から分かるようにコレステロールオキシダーゼに対して遺伝子レベルでの改変を行うことにより熱安定性が有意に向上するものが取得できることが確認された。
【００４３】
実施例５  改変型コレステロールオキシダーゼＶ１２１Ａ＋Ｔ２５２Ａ，Ｔ１０９Ｉ＋Ｔ２５２Ａ，Ｔ１０３Ｉ＋Ｔ２５２Ａ，Ｔ２５２Ａ粗酵素液サンプルと親酵素の熱安定性の比較
各種改変型組み合わせコレステロールオキシダーゼ粗酵素液サンプルを６０℃、６０分加熱処理した時の残存活性を比較した時の残存活性を比較した結果を図２に示す。図２から分かるように熱安定性の向上コレステロールオキシダーゼに対して遺伝子レベルでの変異部位を組み合わせた改変体を作製することによりＴ１０９Ｉ＋Ｔ２５２Ａにおいて大きな相乗効果が認められることが確認され、６０℃、６０分加熱処理後も９０％以上の活性を保持していた。
【００４４】
実施例６  改変型コレステロールオキシダーゼＴ２５２Ｙ，Ｔ２５２Ｗ，Ｔ２５２Ｆ，Ｔ２５２Ｇ，Ａ４０４Ｖ，Ｖ１２１Ａ，Ｔ２５２Ａ，Ｍ４０２Ｌ，Ｍ４０２Ｖ＋Ｎ３７１Ｈ＋Ｎ３９０Ｓ，Ｍ４０２Ｖ＋Ｍ３６９Ｉ＋Ｅ５３６Ｖ，Ｍ４０２Ｖ＋Ｎ４４３Ｓ粗精製サンプルと親酵素の熱安定性の比較
各種改変体コレステロールオキシダーゼと親酵素を２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０℃、６０分加熱処理を施した時の残存活性を比較した結果を図３に示す、図３から分かるようにこれら改変型コレステロールオキシダーゼの熱安定性は親酵素の熱安定性よりも有意に向上していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明のコレステロールオキシダーゼは、液状にて高い安定性を示す等の優れた特性を持つため、臨床検査分野で用いられる診断薬等に用いる酵素として優れており、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】改変型コレステロールオキシダーゼＶ１２１Ａ，Ｔ２５２Ａ，Ｔ１０３Ｉ，Ｔ１０９Ｉ，Ｔ１０９Ｐ粗酵素液サンプルと親酵素の熱安定性の比較
【図２】改変型コレステロールオキシダーゼＶ１２１Ａ＋Ｔ２５２Ａ，Ｔ１０９Ｉ＋Ｔ２５２Ａ，Ｔ１０３Ｉ＋Ｔ２５２Ａ，Ｔ２５２Ａ粗酵素液サンプルと親酵素の熱安定性の比較
【図３】改変型コレステロールオキシダーゼＴ２５２Ｙ，Ｔ２５２Ｗ，Ｔ２５２Ｆ，Ｔ２５２Ｇ，Ｔ２５２Ａ，Ｖ１２１Ａ，Ａ４０４Ｖ，Ｍ４０２Ｌ，Ｍ４０２Ｖ＋Ｎ３７１Ｈ＋Ｎ３９０Ｓ，Ｍ４０２Ｖ＋Ｍ３６９Ｉ＋Ｅ５３６Ｖ，Ｍ４０２Ｖ＋Ｎ４４３Ｓ精製サンプルと親酵素の熱安定性の比較
【図１】
2005124492.tif 000002
【図２】
2005124492.tif 000003
【図３】
2005124492.tif 000004
【配列表】
2005124492000001.app