(57)【要約】【課題】  ＴＬＲリガンド／ＩＬ−１に応答するＩＬ−６の産生が障害されているＴＬＲリガンド／ＩＬ−１応答傷害性モデル非ヒト動物や、かかる非ヒト動物を利用した、ＴＬＲリガンド／ＩＬ−１に対する応答の促進物質又は抑制物質や、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  ＩκＢ−ζをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＩκＢ−ζを発現する機能を喪失し、ＴＬＲリガンド及びＩＬ−１に応答するＩＬ−６の産生が障害されている、ＴＬＲリガンド／ＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物を作出する。また、かかる非ヒト動物と被検物質を用いて、ＴＬＲリガンド／ＩＬ−１に対する応答の促進物質又は抑制物質や、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防・治療薬をスクリーニングする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩκＢ−ζをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＩκＢ−ζを発現する機能を喪失し、ＴＬＲリガンド及びＩＬ−１に応答するＩＬ−６の産生が障害されていることを特徴とするＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項２】
ＴＬＲリガンドが、ＬＰＳ、ＢＬＰ、ＰＧＮ、ＭＡＬＰ−２、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載のＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項３】
アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を呈することを特徴とする請求項１又は２記載のＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項４】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の非ヒト動物と、被検物質と、ＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物とを用いて、前記非ヒト動物におけるＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に応答するＩＬ−６の産生の程度を測定・評価することを特徴とするＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載の非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、ＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物とを用いて、前記免疫細胞におけるＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に応答するＩＬ−６の産生の程度を測定・評価することを特徴とするＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の非ヒト動物に被検物質を投与し、前記非ヒト動物におけるアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度を測定・評価することを特徴とするアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩκＢ−ζ遺伝子がノックアウトされたＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するリガンド（ＴＬＲリガンド）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）応答障害性モデル非ヒト動物や、かかるモデル非ヒト動物を用いたＴＬＲリガンド又はＩＬ−１に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫系は、細菌やウイルスなどの病原体の侵入を感知しそれを排除する生体防御システムである。自然免疫系がひとたび微生物の存在を探知すると炎症性サイトカインを産生し、生体内で炎症を引き起こす。それと同時に、T細胞やＢ細胞といったリンパ球の活性化を誘導し侵入してきた微生物に対する感染防御機構を成立させる。この自然免疫系における微生物の認識に関与している受容体としてＴＬＲファミリーが知られている。このＴＬＲファミリーや、ＴＬＲファミリーの細胞内ドメインと相同な細胞内領域を有する炎症性インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）ファミリーメンバーを刺激すると、転写因子ＮＦ−κＢやＡＰ−１などを活性化し、ＴＮＦ−α，ＩＬ−６やＩＬ−１２ｐ４０といった炎症性サイトカインなど多数のタンパク質の発現を誘導することが知られている。
【０００３】
かかる免疫応答に関係ある遺伝子の１つにＩκＢ−ζ（ＭＡＩＬ及びＩＮＡＰとしても知られる）と呼ばれる核タンパク質がある（例えば、非特許文献１〜６参照）。ＩκＢ−ζは、そのＣ末端部位にアンキリンリピートを有する核タンパク質であり、ＩκＢファミリーメンバーであるＢｃｌ−３と高い相同性を示す（例えば、非特許文献４〜６参照）。インビトロでの研究の結果、ＩκＢ−ζの異所性発現によりＮＦ−κＢ応答性レポーターの活性が抑制されるが、このことから、ＩκＢ−ζがＮＦ−κＢに対する負の制御因子として機能することが示唆されている（例えば、非特許文献４参照）。一方、ＩκＢ−ζの過剰発現により、線維芽細胞においてＬＰＳに誘導されるＩＬ−６産生が促進され、ＩＬ−６産生におけるＩκＢ−ζの正の効果が示唆されるとの報告もある（例えば、非特許文献５参照）。従って、ＩκＢ−ζの機能が潜在的な共活性化分子又は共抑制化因子であるかどうかについては今後の検討が必要である。ＩＬ−１又はＬＰＳによる刺激は、マクロファージ細胞株及び線維芽細胞においてＩκＢ−ζを誘導することが明らかになっている。ＩＬ−１Ｒと、ＬＰＳの受容体であるＴＬＲ４は、細胞内シグナル伝達経路を共有することも知られている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
【０００４】
ＴＬＲ及びＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路はアダプタータンパク質のＭｙＤ８８を利用して下流へとシグナルを送り、その結果、Ｃｏｘ−２を含む炎症関連因子が発現される（例えば、非特許文献７〜９参照）。ＭｙＤ８８依存性経路に加え、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４シグナル伝達経路にはＭｙＤ８８非依存性経路があり、このＭｙＤ８８非依存性経路はインターフェロンＩ型（ＩＦＮ）や、ＩＰ−１０などのＩＦＮ誘導性遺伝子の発現を誘導する（例えば、非特許文献１０〜１２参照）。また、炎症性サイトカイン産生に関与するＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介したＭｙＤ８８依存性経路は、ＮＦ−κＢ及びマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼを活性化することが知られている（例えば、非特許文献１３〜１５参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Annu. Rev. Immunol. 21, 335-376 (2003)
【非特許文献２】Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002)
【非特許文献３】Curr Opin Pharmacol. 3, 396-403 (2003)
【非特許文献４】J Biol Chem. 276, 27657-27662 (2001)
【非特許文献５】FEBS Lett. 485, 53-56 (2000)
【非特許文献６】J Biol Chem. 276, 12485-12488 (2001)
【非特許文献７】Science. 278, 1612-1615 (1997)
【非特許文献８】Immunity. 7, 837-847 (1997)
【非特許文献９】Mol Cell. 2, 253-258 (1998)
【非特許文献１０】Nature. 413, 732-738 (2001)
【非特許文献１１】J Immunol. 167, 5887-5894 (2001)
【非特許文献１２】Immunity. 17, 251-63 (2002)
【非特許文献１３】Cell. 109 Suppl, S81-96 (2002)
【非特許文献１４】J Endotoxin Res. 6, 453-457 (2000)
【非特許文献１５】Mol Cell. 11, 293-302 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＴＬＲリガンド及びＩＬ−１に応答するＩＬ−６の産生が障害されているＴＬＲリガンド及びＩＬ−１応答障害性モデル非ヒト動物や、かかるＴＬＲリガンド及びＩＬ−１応答障害性モデル非ヒト動物を利用した、ＴＬＲリガンド又はＩＬ−１に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法や、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＴＬＲやＩＬ−１Ｒシグナルの活性化により誘導されるタンパク質の一つであるＩκＢ−ζを欠損するマウスを作製したところ、ＴＬＲやＩＬ−１Ｒリガンド（受容体に結合する成分）の刺激による、ＩＬ−６，ＩＬ−１２ｐ４０といったある種の遺伝子の発現がほとんど認められなくなったことから、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路において活性化する一群の遺伝子発現にＩκＢ−ζが必要不可欠であることを見い出した。また、ＴＮＦ−α産生が正常であっても、ＩκＢ−ζ欠損マウスでは、ＴＬＲリガンド及びＩＬ−１に応答するＩＬ−６の産生が著しく損なわれることや、ＩκＢ−ζが過剰発現されると、転写因子ＮＦ−κＢを経由してＩＬ−６プロモーターの基礎活性がアップレギュレートされることや、さらに内因性ＩκＢ−ζはＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットと特異的に会合して、刺激を受けることによりＩＬ−６プロモーターの近傍領域にリクルートされることを見い出した。また、ＮＦ−κＢ１／ｐ５０欠損マウスには、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介した応答という点において、ＩκＢ−ζ欠損マウスと類似の表現型が認められることや、エンドトキシンに誘導されるＩＬ−１２ｐ４０やＧＭ−ＣＳＦ等の他の遺伝子の発現は、ＩκＢ−ζ欠損マクロファージでは欠如していたことを見い出した。ＬＰＳによるＩκＢ−ζの誘導がＩＬ−６の誘導に先立って生じるとしても、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介した応答の中には、誘導性ＩκＢ−ζを必要とする少なくとも２段階の遺伝子発現において調節されるものがあると考えられる。本発明は以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち本発明は、ＩκＢ−ζをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＩκＢ−ζを発現する機能を喪失し、ＴＬＲリガンド及びＩＬ−１に応答するＩＬ−６の産生が障害されていることを特徴とするＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物。（請求項１）や、ＴＬＲリガンドが、ＬＰＳ、ＢＬＰ、ＰＧＮ、ＭＡＬＰ−２、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載のＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物。（請求項２）や、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を呈することを特徴とする請求項１又は２記載のＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物。（請求項３）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物。（請求項４）に関する。
【０００９】
また本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の非ヒト動物と、被検物質と、ＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物とを用いて、前記非ヒト動物におけるＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に応答するＩＬ−６の産生の程度を測定・評価することを特徴とするＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。（請求項５）請求項１〜４のいずれか記載の非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、ＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物とを用いて、前記免疫細胞におけるＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に応答するＩＬ−６の産生の程度を測定・評価することを特徴とするＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。（請求項６）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の非ヒト動物に被検物質を投与し、前記非ヒト動物におけるアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度を測定・評価することを特徴とするアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防・治療薬のスクリーニング方法。（請求項７）に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、ＴＬＲやＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路における遺伝子発現は従来考えられてきたＮＦ−κＢやＡＰ−１の活性化という一段階しかないという考え（1段階発現制御）ではなく、ＩκＢ−ζの事前の発現誘導というさらなる一段階必要不可欠であるという「ＴＬＲやＩＬ−１Ｒシグナル応答における２段階（多段階）発現制御」という新たな概念が提起され（図８参照）、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒによる多段階遺伝子発現制御機構を解明することが可能となる。また、ＩκＢ−ζ欠損マウスはアトピー性皮膚炎様症状を呈することから、今後その局所における病理学的な解析と遺伝子発現制御の詳細な解析とが融合することにより、これまで原因不明であった難治性疾患に対する新たな治療戦略の構築に結実することが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物としては、ＩκＢ−ζをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＩκＢ−ζを発現する機能を喪失し、野生型において発現されるＩκＢ−ζを発現する機能が損なわれ、ＴＬＲリガンド及びＩＬ−１に応答するＩＬ−６の産生が障害されている非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、上記ＴＬＲリガンドとしては、グラム陰性菌の細胞壁に特異的な糖脂質であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ；ＴＬＲ４リガンド）、細菌由来リポプロテイン（ＢＬＰ；ＴＬＲ１／ＴＬＲ２リガンド）、細菌細胞壁の骨格構造であるＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸の繰返し多糖類に比較的短いペプチド鎖が結合したペプチドグリカン（ＰＧＮ；ＴＬＲ２リガンド）、マイコプラズマ属に属する細菌に由来するマクロファージ活性化リポペプチド（ＭＡＬＰ−２；ＴＬＲ６／ＴＬＲ２リガンド）、合成化合物Ｒ−８４８（ＴＬＲ７リガンド）及び細菌由来非メチル化ＣｐＧモチーフを有するＤＮＡ（ＣｐＧ ＤＮＡ；ＴＬＲ９リガンド）などを挙げることができる。
【００１３】
本発明において不応答性とは、ＴＬＲリガンドやＩＬ−１による刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われていることを意味する。したがって、本発明においてＴＬＲリガンド及びＩＬ−１不応答性モデル非ヒト動物とは、ＴＬＲリガンドやＩＬ−１による刺激に対して、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいう。これらの中でも、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を呈する非ヒト動物が好ましい。また、ＴＬＲリガンドやＩＬ−１による刺激としては、ＬＰＳ等のＴＬＲリガンドやＩＬ−１を生体に投与する生体における刺激や、生体から分離された細胞にＬＰＳ等のＴＬＲリガンドやＩＬ−１を接触させる試験管内の刺激等を挙げることができる。
【００１４】
本発明のＩκＢ−ζを発現する機能を喪失した非ヒト動物として、ＩκＢ−ζ-/-マウスの他、例えばＩκＢ−ζ遺伝子の機能が欠損したＩκＢ−ζ-/-ラット等の齧歯目動物を例示することができる。これらＩκＢ−ζ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるＩκＢ−ζ-/-非ヒト動物が、正確な比較実験をすることができる同腹の野生型と共に得ることができる点で好ましい。かかるＩκＢ−ζ遺伝子の機能が欠損した動物の作製方法を、ＩκＢ−ζ-/-マウスを例にとって以下説明する。
【００１５】
ＩκＢ−ζ遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーをＰＣＲ法等により増幅し、得られた遺伝子断片をマウスＩκＢ−ζ遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすることができる。スクリーニングされたＩκＢ−ζ遺伝子は、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定することができる。次に、このＩκＢ−ζをコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３'末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００１６】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス；ＩκＢ−ζ+/-）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、本発明のＩκＢ−ζ-/-マウスを作製することができる。また、ＩκＢ−ζ-/-マウスにおいて、ＩκＢ−ζが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＩκＢ−ζの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００１７】
また、作出されたＩκＢ−ζ-/-マウスがＴＬＲリガンド及びＩＬ−１に対して不応答性であることは、例えば、ＬＰＳをＩκＢ−ζ-/-マウスのマクロファージ、単核細胞、樹状細胞などの免疫細胞にインビトロ又はインビボで接触せしめ、かかる細胞におけるＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＧＭ−ＣＳＦ等の産生量を測定することにより、あるいは、高齢期（例えば１０週齢、好ましくは１５週齢以上）のマウスにおけるアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の発症の程度を観察することにより確認することができる。
【００１８】
本発明のＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法としては、本発明の非ヒト動物と、被検物質と、ＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物とを用いて、前記非ヒト動物におけるＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に応答するＩＬ−６の産生の程度を測定・評価する方法や、本発明の非ヒト動物に由来するマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞と、被検物質と、ＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物とを用いて、前記免疫細胞におけるＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物に応答するＩＬ−６の産生の程度を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、かかる本発明のスクリーニング方法の実施の形態を以下に例を挙げて説明する。
【００１９】
本発明のモデル非ヒト動物から得られるマクロファージ等の免疫細胞と、被検物質と、ＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物とを共に培養し、該免疫細胞におけるＩＬ−６産生の程度を測定・評価するスクリーニング方法や、本発明のモデル非ヒト動物に被検物質をあらかじめ投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞をＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物の存在下で培養し、該免疫細胞におけるＩＬ−６産生の程度を測定・評価するスクリーニング方法や、本発明のモデル非ヒト動物にＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物をあらかじめ投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞におけるＩＬ−６産生の程度を測定・評価するスクリーニング方法や、本発明のモデル非ヒト動物にＴＬＲリガンド若しくはＩＬ−１又はこれらの含有物と被検物質とを同時又はどちらか一方を先に投与し、該非ヒト動物から得られる免疫細胞におけるＩＬ−６産生の程度を測定・評価するスクリーニング方法を挙げることができる。
【００２０】
本発明のアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の予防・治療薬のスクリーニング方法としては、本発明の非ヒト動物に被検物質を投与し、前記非ヒト動物におけるアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度を測定・評価する方法であれば特に制限されず、被検物質の投与は、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の発症前であっても、発症後でもよく、発症前投与で症状が改善されれば予防薬として、発症後投与で症状が改善されれば治療薬として有用である。上記アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度を測定・評価する方法としては、眼瞼の浮腫、口唇と顔面の浮腫、顔面と首、前肢屈曲部位、胸部における湿疹や脱毛、前肢による掻痒行動、顔面の皮膚が剥離し、滲出、血痂、びらんの有無を目視等により観察する方法を挙げることができる。
【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
［ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ刺激によるＩκＢ−ζの特異的誘導］
ＩＬ−１又はＬＰＳによる刺激は、マクロファージ細胞株及び線維芽細胞においてＩκＢ−ζを誘導し、ＩＬ−１ＲとＬＰＳの受容体であるＴＬＲ４は、細胞内シグナル伝達経路を共有していることから、他のＴＬＲリガンドにも応答してＩκＢ−ζが誘導されるかどうかを調べた。ＩＬ−１及びＬＰＳに加え、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）（ＴＬＲ２リガンド）、細菌性リポタンパク質（ＢＬＰ）（ＴＬＲ１／ＴＬＲ２リガンド）、フラゲリン（flagellin）（ＴＬＲ５リガンド）、ＭＡＬＰ−２（ＴＬＲ６／ＴＬＲ２リガンド）、Ｒ−８４８（ＴＬＲ７リガンド）、及びＣｐＧ ＤＮＡ（ＴＬＲ９リガンド）による刺激を受けてもＩκＢ−ζのｍＲＮＡは腹腔マクロファージ又は肺由来正常細胞で著しく誘導されたが、ＴＮＦ−αによる刺激では誘導は認められなかった（図１ａ）。他方、ＩκＢファミリーの別のメンバーであるＩκＢ−α及びＢｃｌ−３は、ＴＬＲリガンドやＩＬ−１同様にＴＮＦ−αにも応答して誘導された。これらを総合するとＩκＢ−α及びＢｃｌ−３と異なり、ＩκＢ−ζの誘導はＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒによる刺激に対して特異的に認められる。
【００２３】
次に、ＩκＢ−ζの誘導がＭｙＤ８８依存性又はＭｙＤ８８非依存性経路によって調節されるかどうかを調べてみた。ＭｙＤ８８欠損マウスから得た胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ）では、ＩＬ−１及びＬＰＳに応答するＩκＢ−ζの誘導は完全に欠如していた（図１ｂ）。従ってＩκＢ−ζは、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達のＭｙＤ８８依存性経路における誘導性タンパク質であることがわかった。
【実施例２】
【００２４】
［ＩκＢ−ζ遺伝子ノックアウトマウス］
ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ応答におけるＩκＢ−ζのインビボでの役割を解明するために、標的遺伝子破壊法によりＩκＢ−ζ欠損マウスを作製した。ＩκＢ−ζの中心部分をコードするエキソン２つをネオマイシン耐性（ｎｅｏR）遺伝子に置き換えたターゲッティングベクターを構築した（図２ａ）。胚幹（ＥＳ）細胞で相同的組換えが生じたことがサザンブロット分析により確認され、正しくターゲットされたＥＳ細胞を用いて変異対立遺伝子をもつマウスを作製した（図２ｂ）。ホモ接合型マウスは予想されるメンデルの法則に従って生まれた。変異マウスにおけるＩκＢ−ζｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析により調べた。ＬＰＳは、野生型細胞でＩκＢ−ζ誘導を刺激したが、ＩκＢ−ζ欠損細胞ではＩκＢ−ζｍＲＮＡは全く認められなかった（図２ｃ）。免疫ブロット分析の結果からも、ＩκＢ−ζ遺伝子が破壊されることによりＩκＢ−ζタンパク質の発現が消失することがさらに確認された（図２ｄ）。ＩκＢ−ζ欠損マウスのＢリンパ球及びＴリンパ球は正常な構成を示していた。しかし、ＩκＢ−ζ欠損脾臓細胞ではＬＰＳ応答性の増殖が損なわれていたが、α−ＣＤ４０、ＩＬ−４及びα−ＩｇＭに対する応答性は損なわれず（図２ｅ及び２ｆ）、ＩκＢ−ζ欠損細胞でＴＬＲ４応答が損なわれることを示唆している。
【００２５】
さらに、高齢のＩκＢ−ζ欠損マウスは全てアトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を呈した（図６ａ）。皮膚表現型に関する分析の詳細は数々の文献に記載されている。
【実施例３】
【００２６】
［ＩκＢ−ζ欠損細胞における免疫応答とＩκＢ−ζ誘導のキネティックス］
次に、腹腔マクロファージにおけるＬＰＳに誘導される炎症関連分子の産生を分析した。ＩＦＮ−γ存在下で野生型マクロファージはＬＰＳに応答してＴＮＦ−α及び硝酸オキシド（ＮＯ）を産生した（図３ａ）。ＩκＢ−ζ欠損マウスにおいてＬＰＳ誘導性のＴＮＦ−α及びＮＯの産生は正常であっても、ＩＬ−６の産生は著しく減少していた。さらに、ＣｐＧ ＤＮＡ、Ｒ−８４８、ＰＧＮ、ＭＡＬＰ−２、ＢＬＰ等、別のＴＬＲリガンドに刺激されるＩＬ−６の産生もまたＩκＢ−ζ欠損細胞では顕著に阻害されていた（図３ｂ、３ｃ、及び３ｄ）。また、ＩκＢ−ζ欠損細胞では、ＩＬ−１応答性のＩＬ−６産生の欠如が認められた。しかしＴＮＦ−α誘導性ＩＬ−６産生は、野生型及びＩκＢ−ζ欠損細胞の両方で同程度に観察された（図３ｅ）。次いで、ＬＰＳに応答するＩＬ−６ｍＲＮＡの発現を調べた。ＬＰＳは、野生型細胞においてＩＬ−６ｍＲＮＡ誘導を刺激した。これとは全く対照的に、ＩκＢ−ζ欠損細胞におけるＩＬ−６ｍＲＮＡレベルは劇的に減少しており（図３ｆ）、ＩκＢ−ζ欠損細胞におけるＩＬ−６産生量の減少が、ｍＲＮＡ誘導欠損を反映している可能性を示している。
【００２７】
前記のように、炎症性サイトカイン産生に関与するＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介したＭｙＤ８８依存性経路は、ＮＦ−κＢ及びマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼを活性化することが知られているが、ＩＬ−１に応答するＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼの活性化は、野生型及びＩκＢ−ζ欠損細胞の両方において同程度だった（図６ｂ及び図６ｃ）。次に、完全長ＩκＢ−ζ又は欠損変異型ＩκＢ−ζを、培地又はＩＬ−１で処理したＩκＢ−ζ欠損ＭＥＦｓにトランスフェクトした。ＩＬ−１刺激条件下では、完全長ＩκＢ−ζは、ＩκＢ−ζ欠損細胞におけるＩＬ−６産生の減少を回復させたが、欠損変異型ＩκＢ−ζではかかる回復は認められず（図３ｇ）、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼの活性化同様にＩκＢ−ζ発現もまたＴＬＲ／ＩＬ−１を介したＩＬ−６の産生にとって必要であることが示唆された。
【００２８】
前記のように、ＩκＢ−ζとＩＬ−６はいずれもＴＬＲリガンド及びＩＬ−１に対して応答する誘導遺伝子であることがこれまでに報告されていることから、これら両遺伝子のキネティックスを測定するため、腹腔マクロファージを用いて経時的ノーザンブロット分析を行った。ＬＰＳ刺激の３０分後にＩκＢ−ζが誘導されていることが観察され、１２０分後にかかる誘導が最大値に到達した。他方ＩＬ−６ｍＲＮＡは、ＩκＢ−ζ又はＴＮＦ−αの誘導よりさらに後の時点で誘導された（図３ｈ）。これらの結果を総合すると、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介したＩＬ−６遺伝子の発現には、それに先立ってＩκＢ−ζが誘導されることが必要であることが示唆される。ＩκＢ−ζがＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを経由するシグナル伝達経路における誘導性タンパク質でもあることから、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介した炎症性ＩＬ−６の産生は少なくとも２段階で制御されていると考えられる。
【実施例４】
【００２９】
［ＩＬ−６プロモーター上のＩκＢ−ζの試験管内における分析］
ＩκＢ−ζが、リガンドに誘導されるＩＬ−６プロモーターの活性化を促進するかどうかを調べるため、ＩＬ−６又はＥＬＡＭ１遺伝子のいずれかのプロモーターを有するルシフェラーゼレポータープラスミドを、対照又はＩκＢ−ζ発現ベクターと共にＲＡＷ２６４．７細胞に導入した。ＬＰＳは、ＩＬ−６及びＥＬＡＭ１プロモーター両方の活性を投与量依存で刺激した。ＩκＢ−ζが過剰発現する場合、ＲＡＷ２６４．７細胞においてＩＬ−６のプロモーター活性がさらに亢進されるが、ＥＬＡＭ１においてはその傾向が認められなかったことを見い出した（図４ａ）。かかる亢進傾向が非刺激細胞で観察されたことから、ＩκＢ−ζの異所性発現が、未刺激ＲＡＷ２６４．７細胞においてＩＬ−６プロモーターの活性に正の効果を示すかどうかを調べた。ＩκＢ−ζの導入量を増加することにより、ＩＬ−６プロモーターの基礎活性が未刺激細胞においてもアップレギュレートされることが観察された（図４ｂ）。
【００３０】
次に、ＩκＢ−ζの過剰発現の亢進に、ＩＬ−６プロモーターのどの部位が関与しているかを調べてみた。ＩＬ−６プロモーターのＮＦ−κＢ結合部位が、活性化に重要な役割を担っていることが明らかになっているので、野生型レポーター又はＮＦ−κＢ結合部位が欠損している変異型レポーターをＰ１９胚性癌細胞にトランスフェクトした（Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 10193-10197(1993)）。ＩκＢ−ζが異所性発現することにより、野生型レポーターが活性化された。それとは対照的に変異型レポーターを導入した場合は、ＩκＢ−ζの過剰発現の効果は完全に消失した（図４ｃ）。
【００３１】
ＩＬ−６プロモーターのκＢ部位におけるＩκＢ−ζの特異的関与を直接調べるために、α−ＩκＢ−ζ、α−ＮＦ−κＢｐ５０、α−ＮＦ−κＢ、ＲｅｌＡの各抗体及び対照抗体を用いるクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）を行った。ＬＰＳで刺激した細胞をα−ｐ５０及びαＲｅｌＡにより免疫沈降した場合、ＩＬ−６及びＥＬＡＭ１プロモーターのκＢ部位は検出されたが、ＩＬ−６遺伝子の３'末端では認められなかった。特に、既に報告（Mol Cell. 9, 625-636 (2002)）されているように、非刺激細胞のＩＬ−６κＢ部位においてｐ５０サブユニットは容易に検出された。それとは全く対照的に、ＬＰＳ刺激細胞においてＩＬ−６κＢ部位は、α−ＩκＢ−ζと免疫共沈降したが、ＥＬＡＭ１κＢ部位においてもＩＬ−６遺伝子の３'末端においてもかかる免疫共沈降は生じず（図４ｄ）、ＩＬ−６プロモーターにおけるＩκＢ−ζの選択的関与が明らかになった。
【００３２】
最後にＩκＢ−ζとＮＦ−κＢファミリーメンバーとの会合を検討した。免疫沈降分析の結果、ＩκＢ−ζタンパク質とｐ５０との相互作用が認められたが、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５２サブユニットのいずれとも相互作用を生じなかった（図４ｅ）。これらの知見から、ＩκＢ−ζによる正の効果がｐ５０サブユニットとの会合を介してもたらされることが示された。
【実施例５】
【００３３】
［ＮＦ−κＢ１欠損マウスにおけるＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒの応答及びＩκＢ−ζ欠損細胞のマイクロアレイ分析］
遺伝子学的手法により上記仮説を確認するため、ＮＦ−κＢ１／ｐ５０欠損マウスから腹腔マクロファージ及びＭＥＦｓを得て、ＬＰＳ誘導性のサイトカイン産生を分析した。既に報告されているように、ＩＦＮ−γ存在下においてＮＦ−κＢ１欠損マクロファージにおけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−αの産生は、野生型細胞の場合と変化がなかった。他方、ＮＦ−κＢ１欠損細胞では、ＬＰＳに応答するＩＬ−６産生が損なわれていた（Cell. 80, 321-330 (1995), Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 12705-12710 (2000)、及び図５ａ）。また、ＩＬ−１や他のＴＬＲリガンドに誘導されるＩＬ−６産生は、ＮＦ−κＢ１欠損細胞で著しく損なわれていた（図５ｂ）。結果的に、ＮＦ−κＢ１欠損マウスにおけるＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介した応答は、ＩκＢ−ζ欠損マウスにおける応答を想起させるものであった。
【００３４】
さらに、ＮＦ−κＢ１欠損細胞においてＩκＢ−ζの異所性発現がＩＬ−６の産生を誘導するかどうかを試験した。野生型細胞と比較して、ＩκＢ−ζを介したＩＬ−６の産生はＮＦ−κＢ１欠損ＭＥＦｓでは減少しており、ＮＦ−κＢ１がＩκＢ−ζの効果を発揮する際に重要な役割を果たしていることが示唆される（図５ｃ）。ＩＬ−１及びＴＮＦ−αによる刺激のいずれも、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼ等、類似のシグナル伝達分子セットの活性化をもたらし、ＩＬ−６が発現される。しかし、ＩＬ−１／ＴＬＲリガンドを経由するシグナル伝達は、ＩκＢ−ζをＩＬ−６プロモーターに特異的に補充するが、ＴＮＦ−αを経由するシグナル伝達にはそのような補充は認められず（図５ｄ）、ＴＬＲ／ＩＬ−１ＲとＴＮＦＲの応答性の間にみられる差異が説明できると推察される。
【００３５】
次に、マイクロアレイ分析により、ＩκＢ−ζによって調節される他のＬＰＳ誘導性遺伝子を検索した。ＩκＢ−ζの欠損により、多数のＬＰＳ誘導性遺伝子が顕著な影響を受けていた（図７ａ）。次にそれら遺伝子のいくつかをノーザンブロット分析にかけて精度を確認した。それら遺伝子の中で、ＬＰＳに誘導されたＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｐ４０、Ｇ−ＣＳＦ、Ｃ／ＥＢＰ−δ及びエンドセリン１の発現は、ＩκＢ−ζ欠損マクロファージでは減少しており（図５ｅ）、ＩＬ−６に加え、ＩκＢ−ζが上記遺伝子の発現を調節していることを示している。実際、経時的ノーザンブロット分析の結果からは、ＬＰＳに応答する上記遺伝子の誘導に関する動態は、ＴＮＦ−αよりむしろＩＬ−６のキネティックスに似ていることが示され（図３ｈ及び図７ｂ）、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路における上記遺伝子の少なくとも２段階ある調節モデルをさらに支持している。
【００３６】
最後に、ＩκＢ−ζの要件が、試験した遺伝子のκＢ部位の配列と相関しているかどうかを調べた。しかし、プロモーターに別々のκＢ部位が含まれ、相当するκＢ部位の配列間に共通の特徴があるか識別することができず（図７ｃ）、特定プロモーター上で機能するＩκＢ−ζの能力は、ＮＦ−κＢの能力同様に、恐らく、κＢ部位におけるＤＮＡ−タンパク質相互作用によってのみ決まる訳ではなく、隣接塩基配列と結合又は相互作用する他の転写因子又はコアクチベーターによっても決定されると考えられる（EMBO J. 22, 5530-5539 (2003)）。さらに、それらの中でＩＬ−６プロモーターのκＢ部位と最大の相同性を示すＩκＢ−ζプロモーターのκＢ部位にも関わらず（図７ｃ）、ＬＰＳ誘導性のＩκＢ−ζｍＲＮＡの発現は通常ＮＦ−κＢ１欠損細胞で観察され（図７ｄ）、ＬＰＳに応答するＩκＢ−ζ自体の調節が、ＩＬ−６の調節とは異なることが示唆される。
【００３７】
本発明において、ＩκＢ−ζがＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介した免疫応答に重要な役割を果たしていることの遺伝学的証拠を示した。特にＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介したＩＬ−６産生の場合には、その適切な産生のためには、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼの活性化同様に、ＩκＢ−ζが先行して発現することが必要であると考えられる。ＩκＢ−ζ自体が誘導性タンパク質であることから、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介したＩＬ−６発現は、２段階の機構で調節されている可能性がある。また、マイクロアレイ分析の結果から、ＩκＢ−ζがＩＬ−６以外のＬＰＳ誘導性遺伝子を制御している可能性が示された。ＩκＢ−ζ依存性遺伝子発現の分子的基礎を解明する分析をさらに行うことにより、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒを介したＭｙＤ８８依存性免疫応答に関する新たな知見が期待される。
【実施例６】
【００３８】
［方法］
（１）ＩκＢ−ζ欠損マウスの作製
１２９／ＳＶマウスゲノムライブラリーからＩκＢ−ζ遺伝子を有するゲノムＤＮＡを単離し、制限酵素マッピング及び配列分析により特徴付けを行った。ＩκＢ−ζの中心部分をコードする２．０ｋｂ断片をｎｅｏRカセットに置き換えることにより、ターゲッティングベクターを構築し、負の選択を行うために上記ゲノム断片中のＰＧＫプロモーターによって転写される単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを挿入した（図２ａ）。このターゲッティングベクターを胚性幹細胞（Ｅ１４．１）にトランスフェクトした。Ｇ４１８とガンシクロビアに二重に耐性をもつコロニーを選択し、ＰＣＲ及びサザンブロッティングによるスクリーニングを行った。２つの異なる相同組換え体をＣ５７ＢＬ／６雌マウスにマイクロインジェクションし、ヘテロ接合体Ｆ１世代を交配させてＩκＢ−ζ欠損マウスを得た。これら異なるクローンから得られたマウスは同じ表現型を示した。６〜８週齢のＩκＢ−ζ欠損マウス及びそれらの同腹野生型を本発明の実験に用いた。全ての動物実験は、微生物病研究所付属実験動物研究委員会（大阪大学、大阪、日本）の承認を得て実施した。
【００３９】
（２）試薬及びマウス
サルモネラ菌（Salmonella Minnesota Re 595）由来のＬＰＳと黄色ブドウ球菌(S.aureus)由来のＰＧＮは、それぞれSigma社とFluka社から購入した。ＭＡＬＰ−２及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは文献（J Immunol. 164, 554-557 (2000), Nature. 408, 740-745 (2000)）記載の方法に従って調製した。フラゲリン及びＲ−８４８はそれぞれA. Adrem博士及びH. Tomizawa博士から提供を受けた。ＩκＢ−ζに対するポリクローナル抗体は、細菌で発現させたマウスＩκＢ−ζタンパク質のＣ末端部分を用いてウサギを免疫して得た。リン酸化ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８に対する各抗体はCell Signaling社から購入した。ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＲｅｌＡ、ｐ５０、ｃ−Ｒｅｌ及びＣ／ＥＢＰ−βのそれぞれに対する抗体はSanta Cruz社から入手した。組換えＴＮＦ−α及びＩＬ−１βはGenzyme社から入手した。ＮＦ−κＢ１／ｐ５０欠損マウス又はＭｙＤ８８欠損マウスは文献（Cell. 80, 321-330 (1995), Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 1473-1476 (1992)）記載の方法に従って調製した。
【００４０】
（３）炎症性サイトカイン濃度及びＮＯの測定
チオグリコール酸に誘導される腹腔マクロファージ又はＭＥＦｓを９６ウエルプレート（マクロファージは１ウエルあたり５×１０4細胞、ＭＥＦｓは１×１０4細胞）において所定濃度の所定リガンド共存下で培養した。製造者マニュアルに従ってＥＬＩＳＡを行い、培養上清のＴＮＦ−α及びＩＬ−６の濃度を測定した（ＴＮＦ−αにはGenzyme社製、ＩＬ−６にはＲ＆Ｄ社製）。ＮＯ濃度は製造者（DOJINDO）の指示に従い、Griess法により測定した。
【００４１】
（４）電気泳動移動度シフトアッセイ
１０ｎｇ ｍｌ-1のＩＬ−１βでＭＥＦｓ（１×１０6）を所定期間刺激した。文献（Nature. 408, 740-745 (2000)）記載の方法に従い、細胞から核抽出物を精製し、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合部位に対する特異的プローブの共存下でインキュベートし、電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーで視覚化した。
【００４２】
（５）プラスミド及びレトロウイルストランスフェクション
レポータープラスミドは、マウスＩＬ−６遺伝子の５'フランキング領域（−１２４０／＋４０）で構成され、図４ａ及び４ｂで使用した。図４ｃで用いたレポータープラスミドは文献収載のものである（Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 10193-10197(1993), Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 1473-1476 (1992)）。ＥＬＡＭ１プロモーター由来ルシフェラーゼレポータープラスミドは、D. T. Golenbockから譲られたものである。完全長ＩκＢ−ζ（Full）又はＣ末端部位を欠く欠失変異型ＩκＢ−ζ（ΔＣ、J Biol Chem. 276, 27657-27662 (2001)）を文献収載の方法どおりにしてｐＭＲＸレトロウイルスベクターにクローニングした（J Biol Chem. 278, 36005-36012 (2003)）。Plat−Ｅパッケージング細胞は、T. Kitamura博士の厚意で提供を受けた（Gene Ther. 7, 1063-1066 (2000)）。要点を述べると、レトロウイルスを作出するために、リポフェクタミン２０００試薬（Invitrogen社製）を用いてPlat−Ｅ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの６０時間後にレトロウイルスを含むPlat−Ｅ細胞の培養上清を回収した。４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下でＭＥＦｓを６時間感染させ、感染４８時間後に分析した。
【００４３】
（６）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
SUPERFECTトランスフェクション試薬（QIAGEN社製）を用い、レポータープラスミドを対照又はＩκＢ−ζ発現ベクターのいずれかと共にＲＡＷ２６４．７及びＰ１９細胞に一過性に共トランスフェクトした。文献記載（２８，２９）の方法に従い、全細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製、Maiden, W1）を用いて測定した（Nat Immunol. 3, 392-398 (2002), Nat Immunol. 2, 835-841 (2001)）。
【００４４】
（７）クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰアッセイ）
ＣｈＩＰアッセイは基本的に説明書にあるプロトコール（Upstate Biotechnology社製）に則って行った。概要を述べると、ＬＰＳ（１μｇ ｍｌ-1、３時間）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ ｍｌ-1、３時間）又はＴＮＦ−α（１０ｎｇ ｍｌ-1、３時間）で、２×１０6個のＲＡＷ２６４．７細胞又は５×１０5個のＭＥＦｓをそれぞれ刺激し、ホルムアルデヒドを用い、３７℃で６０分間固定した。これらの細胞を溶解し、超音波処理にかけて分断（sheared）し、特異的抗体共存下で一晩インキュベーションし、続いて鮭精子ＤＮＡ（Upstate Biotechnology社製）で飽和したプロテインＡアガロースの共存下でインキュベーションした。沈殿ＤＮＡを以下のプライマーを用いて定量ＰＣＲ（３５〜４０サイクル）で分析した。
【００４５】
定量ＰＣＲに使用したプライマー；
ＩＬ−６プロモーターのκＢ部位には、
5'-CGATGCTAAACGACGTCACATTGTGCA-3'（配列番号１）
及び 5'-CTCCAGAGCAGAATGAGCTACAGACAT-3'（配列番号２）
ＩＬ−６プロモーターの３´遺伝子セグメントには、
5'- GCAGATGGACTTAGCTCGTCTCATTCA -3'（配列番号３）
及び 5'- CCACTCCTTCTGTGACTCCAGCTTATC -3'（配列番号４）
ＥＬＡＭ１プロモーターのκＢ部位には、
5'-GATGCAGTTGAGAATTTCCTCTTAGCC-3'（配列番号５）
及び 5'-TGGAATAGTTGTTCTGGCGTTGGATCC-3'（配列番号６）
【００４６】
（８）ウエスタンブロット分析及び免疫沈降
腹腔マクロファージ及びＭＥＦｓを所定リガンドで所定期間刺激した。１．０％Nonidet−Ｐ４０、１５０ｍM ＮａＣｌ、２０ｍM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍM ＥＤＴＡ及び蛋白質阻害物質（Roche社製）を含む溶解緩衝液に上記細胞を溶解した。この細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解し、ＰＶＤＦ膜上に移した。免疫沈降を行うため、細胞溶解物をプロテインＧセファロースTM（Amersham Pharmacia Biotech社製）で２時間前処理（preclear）し、所定抗体１．０μｇを含むプロテインＧセファロースTM共存下において４℃で１２時間攪拌下でインキュベーションした。免疫沈降物を溶解緩衝液で４回洗浄し、Laemmliサンプル緩衝液を用いて沸騰溶出し、α−ＩκＢ−ζを用い、上述のとおりにしてウエスタンブロッティングに供した。
【００４７】
（９）遺伝子チップ分析
野生型腹腔マクロファージ及びＩκＢ−ζ欠損腹腔マクロファージを用い、ＬＰＳに応答するマイクロアレイ分析（Affimetrix社製）を文献収載の方法（Blood. 102, 4123-4129 (2003)）に従って行った。GeneSpring6.0（Silicon Genetics社製）ソフトウエアを使用して遺伝子発現のカラー画像を作成した。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＩκＢ−ζがＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ刺激により特異的に誘導されることを示す図である。ａ．１００ｎｇ ｍｌ-1ＢＬＰ、１０μｇ ｍｌ-1ＰＧＮ、３０ｎｇ ｍｌ-1ＭＡＬＰ−2、１００ｎＭ Ｒ−８４８、３μＭ ＣｐＧ ＤＮＡ、１０ｎｇ ｍｌ-1ＩＬ−１β、１０μｇ ｍｌ-1ＬＰＳ、１００ｎｇ ｍｌ-1フラゲリン、及び１０ｎｇ ｍｌ-1ＴＮＦ−αで２時間、腹腔マクロファージ及び肺一次細胞を刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を抽出し、ノーザンブロット分析にかけて、ＩκＢ−ζ、Ｂｃｌ−３、ＩκＢ−α、及びβ−アクチンの発現を調べた。ｂ．１０ｎｇ ｍｌ-1ＩＬ−１β、１０μｇ ｍｌ-1ＬＰＳで野生型マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスのＭＥＦｓを所定期間刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を抽出し、ノーザンブロット分析にかけ、ＩκＢ−ζ、Ｃｏｘ−２、ＩＰ−１０、及びβ−アクチンの発現を調べた。
【図２】マウスＩκＢ−ζ遺伝子におけるターゲット破壊の様子を示す図である。ａ．ＩκＢ−ζ遺伝子、ターゲッティングベクター及び予測される破壊遺伝子の構造を示す図である。黒い囲みはＩｋＢζとなるエクソン部位を示す。制限酵素：Ｅ，EcoRI．ｂ．ヘテロ接合体を交配させて出生したマウスのサザンブロット分析の結果を示す図である。ゲノムＤＮＡをマウス尾部から抽出し、EcoRIで消化し、電気泳動にかけ、ａ．に示した放射標識プローブとハイブリダイズさせた。サザンブロッティングの結果、野生型マウス（＋／＋）では、１０．３ｋｂのバンド１本が認められ、ホモ接合体マウス（−／−）では２．２ｋｂのバンドが認められ、ヘテロ接合体マウス（＋／−）では両方のバンドが認められた。ｃ．１０ｎｇ ｍｌ-1ＬＰＳで刺激した腹腔マクロファージのノーザンブロット分析の結果である。細胞から抽出した全ＲＮＡ（１０μｇ）の電気泳動を行い、ナイロン膜上に移し、ＩκＢ−ζ及びβ−アクチンを用いてハイブリダイズさせた。ｄ．腹腔マクロファージのウエスタンブロット分析の結果を示す図である。細胞溶解物をα−ＩκＢ−ζと共に免疫ブロッティングに供した。同じ溶解物をα−ＥＲＫ１／２とも免疫ブロッティングに供してタンパク質の発現を観察した。ｅ，ｆ．所定濃度のＬＰＳ、１０μｇ ｍｌ-1のα−ＣＤ４０、２００Ｕｍｌ-1のＩＬ−４、及び１０μｇ ｍｌ-1のα−ＩｇＭの共存下で脾臓細胞を４８時間培養した。培養時間の最後１２時間に［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ）をパルスした。［3Ｈ］チミジンの取込み量をシンチレーションカウンター（Packard社製）で測定した。
【図３】ＩκＢ−ζ欠損細胞における免疫応答、並びにＩκＢ−ζ誘導のキネティックスを示す図である。ａ，ｂ，ｃ，ｄ．野生型マウス及びＩκＢ−ζ欠損マウス由来の腹腔マクロファージを、３０ｎｇ ｍｌ-1ＩＦＮ−γ存在下において、所定濃度のＰＧＮ、Ｒ−８４８、ＣｐＧ ＤＮＡと共に、１０ｎｇ ｍｌ-1ＬＰＳ、１００ｎｇ ｍｌ-1ＢＬＰ及び３０ｎｇ ｍｌ-1ＭＡＬＰ−２の共存下で２４時間培養した。培養上清中のＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＮＯの濃度を測定した。表記した数値は、３回試験した結果の平均値±ＳＤである。Ｎ．Ｄ．検出されず。ｅ．野生型マウス及びＩκＢ−ζ欠損マウス由来のＭＥＦｓを１０ｎｇ ｍｌ-1ＩＬ−１β及び１０ｎｇ ｍｌ-1ＴＮＦ−αで刺激した。２４時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡでＩＬ−６を調べた。表記した数値は、３回試験した結果の平均値±ＳＤである。Ｎ．Ｄ．検出されず。ｆ．腹腔マクロファージを１０ｎｇ ｍｌ-1ＬＰＳで所定期間刺激した。全ＲＮＡ（５μｇ）を抽出し、ノーザンブロット分析を行い、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びβ−アクチンの発現を調べた。ｇ．完全長ＩκＢ−ζ（Full）をレトロウイルスを用いてトランスフェクションすることによりＩκＢ−ζ欠損ＭＥＦｓにおけるＩＬ−１応答性が復活するが、欠失変異型ＩκＢ−ζ（ΔＣ）を細胞へ導入しても復活しなかったことを示す図である。１０ｎｇ ｍｌ-1ＩＬ−１βの存在下又は不在下における培養上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡで測定した。表記した数値は、３回試験した結果の平均値±ＳＤである。ｈ．電気泳動により分離（resolve）した野生型腹腔マクロファージをＬＰＳで刺激したことにより生じたＩκＢ−ζ、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αに由来するｍＲＮＡ転写物を表す二重ＲＮＡ産物を示す図である。別個に由来する野生型細胞を用いて別々に２回行った実験結果をPhospholmagerで定量し、β−アクチンに対する任意ユニットにおける所定遺伝子のｍＲＮＡ量をグラフに表した（左はＩκＢ−ζ及びＩＬ−６、右はＴＮＦ−α）。
【図４】ＩＬ−６プロモーター上のＩκＢ−ζの試験管内分析の結果を示す図である。ａ．対照又はＩκＢ−ζ発現プラスミドのいずれかと共に、マウスＩＬ−６プロモーター又はＥＬＡＭ１プロモーターのいずれかのルシフェラーゼレポーター構築物をＲＡＷ２６４．７細胞に一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、非トランスフェクト細胞から調製した溶解物によって示されるバックグラウンドに対して何倍に増加したかで表した。データは個別に３回行った実験を代表するものである。３回の実験全てにおいて、所定濃度のＬＰＳで細胞を刺激した。ｂ．所定量のＩκＢ−ζ発現ベクターを一定量のＩＬ−６レポータープラスミドと共に、無処理のＲＡＷ２６４．７細胞に一過性に細胞へ導入した。データは個別に３回行った実験を代表するものである。ｃ．野生型又は変異型ＩＬ−６プロモーターのいずれかであるレポーター構築物を、対照又はＩκＢ−ζ発現プラスミドのいずれかと共に、Ｐ１９胚性癌細胞に一過性に細胞へ導入した。それぞれの場合のレポーター構築物に関し、溶解物によって示されるバックグラウンドに対するＩκＢ−ζ発現細胞の増加率をモック発現細胞の増加率で割ることにより、ルシフェラーゼ活性を正規化した。ｄ．ＣｈＩＰには、無処理の（−）又はＬＰＳ処理した（＋）（１μｇ ｍｌ-1で３時間）ＲＡＷ２６４．７細胞から得たクロマチンを、表記の所定抗体と共に用いた。ＩＬ−６κＢ部位（左）、ＩＬ−６遺伝子の３´領域、（中央）、又はＥＬＡＭ１プロモーター（右）における沈殿ＤＮＡをＰＣＲ（ＣｈＩＰ）で測定した。データは個別に２回行った実験を代表するものである。ｅ．非刺激腹腔マクロファージ又はＬＰＳで刺激した（１０ｎｇ ｍｌ-1）腹腔マクロファージを所定抗体と共に免疫沈降させた。その後、α−ＩκＢ−ζと共に免疫沈降溶解物の免疫ブロッティングを行った。
【図５】ＮＦ−κＢ１欠損マウスにおけるＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒの応答及びＩκＢ−ζ欠損細胞のマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ａ．野生型及びＮＦ−κＢ１欠損マウスの腹腔マクロファージを３０ｎｇ ｍｌ-1ＩＦＮ−γ存在下で１０ｎｇ ｍｌ-1ＬＰＳと２４時間共培養した。培養上清中のＩＬ−６及びＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。図に示す値は３回試験した結果の平均値±ＳＤである。ｂ．３０ｎｇ ｍｌ-1ＩＦＮ−γ存在下において、また１００ｎｇ ｍｌ-1ＢＬＰ、１０μｇ ｍｌ-1ＰＧＮ、３０ｎｇ ｍｌ-1ＭＡＬＰ−２、１００ｎＭ Ｒ−８４８、３μＭ ＣｐＧ ＤＮＡ、１０ｎｇ ｍｌ-1ＩＬ−１β又は１０ｎｇ ｍｌ-1ＴＮＦ−αの共存下で、野生型及びＮＦ−κＢ１欠損マウスの腹腔マクロファージ及びＭＥＦｓを２４時間培養した。ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに誘導されるＩＬ−６産生をＭＥＦｓによって分析した。ＥＬＩＳＡにより、培養上清中のＩＬ−６濃度を測定した。表記値は３回試験した結果の平均値±ＳＤである。ｃ．完全長ＩκＢ−ζ（Full）又は欠失変異型ＩκＢ−ζ（ΔＣ）を野生型及びＮＦ−κＢ１欠損ＭＥＦｓにレトロウイルスを用いて細胞へ導入した。また、１０ｎｇ ｍｌ-1ＴＮＦ−αを用いて非細胞導入細胞の同株を刺激した。培養上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。表記値は３回試験した結果の平均値±ＳＤである。ｄ．無処理の（−）、ＩＬ−１βで処理した（上、＋）（１０ｎｇ ｍｌ-1で３時間）又はＴＮＦ−αで処理した（下、＋）（１０ｎｇ ｍｌ-1で３時間）ＭＥＦｓから得たクロマチンと、図に示す所定抗体を用いてＣｈＩＰを行った。インプット用の沈殿ＤＮＡ（左）、又はＩＬ−６ｋＢ部位（右）のＰＣＲ（ＣｈＩＰ）アッセイを行った。データは２回行った実験結果を代表するものである。ｅ．野生型及びＮＦ−κＢ１欠損マウスの腹腔マクロファージを１０ｎｇ ｍｌ-1ＬＰＳで所定期間刺激した。全ＲＮＡ（５μｇ）を抽出し、ノーザンブロット分析にかけて所定プローブの発現を調べた。
【図６】ＩκＢ−ζ欠損マウスにおけるインビボでのＩＬ−６産生、並びにＩκＢ−ζ欠損ＭＥＦｓにおけるシグナル伝達経路の、ＩＬ−１βに誘導される活性化の様子を示す図である。ａ．１６週齢のＩκＢ−ζ欠損マウス（右）及び野生型マウス（左）の全体像である。ｂ．１０ｎｇ ｍｌ-1ＩＬ−１βでＭＥＦｓを所定期間刺激した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢ特異的プローブを用いるＥＭＳＡにより、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を測定した。ｃ．抗リン酸化ＪＮＫ、ｐ３８、及びＥＲＫ抗体を用いる細胞抽出物をウエスタンブロッティングに供し、ＪＮＫ、ｐ３８及びＥＲＫの活性も測定した。
【図７】統計的に選択した遺伝子を用いるＬＰＳ誘導性遺伝子の遺伝子発現分析の結果を示す図である。ａ．１００ｎｇ ｍｌ-1ＬＰＳに応答する野生型マクロファージ及びＩκＢ−ζ欠損マクロファージの遺伝子発現プロフィールを比較するAffimetrixマイクロアレイ分析の結果から得た実験的系等図及び遺伝子系統図である。「発現された」遺伝子は赤色で示し、「少なく発現された」遺伝子は青色で示した。相対発現レベルを右のカラムに示した。ｂ．電気泳動によって分離した野生型腹腔マクロファージに対するＬＰＳ刺激を受けて、ＩκＢ−ζ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１２ｐ４０に由来するｍＲＮＡ転写物を表す二重ＲＮＡ産物を示す図である。別々に由来する野生型細胞を用いて行う別々の２回の実験をPhospholmagerで定量し、β−アクチンに対する任意ユニットにおける所定遺伝子のｍＲＮＡ量をグラフに表した（左はＩκＢ−ζ及びＩＬ−１２ｐ４０、右はＧＭ−ＣＳＦ）。ｃ．検索対象のプロモーター／エンハンサーのＮＦ−κＢ部位を示す図である。マッピングしたときに転写開始部位に相当する位置を示す。ｄ．野生型及びＮＦ−κＢ１欠損マウスの腹腔マクロファージを１０ｎｇ ｍｌ-1ＬＰＳで所定期間刺激した。全ＲＮＡ（５μｇ）を抽出し、ノーザンブロット分析により、所定プローブの発現を調べた。
【図８】ＩκＢ−ζを介したＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナルによる多段階遺伝子発現機構を説明する模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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