(57)【要約】      （修正有）【課題】反応ステップが少なく、短時間内に高感度化が可能なアルカリフォスファターゼ活性を測定する方法を提供する。【解決手段】アルカリフォスファターゼ活性測定において、リン酸化補酵素を基質として脱リン酸化補酵素へ変換させるアルカリフォスファターゼ反応と、生じた脱リン酸化補酵素を酸化型と還元型とにサイクルさせる酵素的サイクリング法にてシグナル増幅する反応とを、同一反応相にて同時に行うことを特徴とするアルカリフォスファターゼ活性の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリフォスファターゼ活性の決定方法であって、次の４つの工程を一つの反応相にて同時に行うことを特徴とするアルカリフォスファターゼ活性の決定方法。
工程１
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐと、アルカリフォスファターゼとの反応により、それぞれ脱リン酸化された酸化型補酵素Ａまたは還元型補酵素Ａ’を生成させる工程、
工程２
酸化型補酵素Ａを還元型補酵素Ａ’へ変換することができる触媒Ｘ、および、触媒Ｘに対する基質Ｒ存在下反応せしめ、還元型補酵素Ａ’およびＲのＸによる生成物Ｓを生成させる工程、
工程３
還元型補酵素Ａ’を酸化型補酵素Ａへ変換することができる触媒Ｙ、および、触媒Ｙに対する基質Ｔ存在下反応せしめ、酸化型補酵素ＡおよびＴのＹによる生成物Ｕを生成させる工程、
工程４
工程２および工程３を繰り返して蓄積される、ＳまたはＵを決定する工程、
【請求項２】
触媒Ｘが実質的にＡＰと反応しないことを特徴とする請求項１に記載のアルカリフォスファターゼの決定方法。
【請求項３】
触媒Ｙが実質的にＡ’Ｐと反応しないことを特徴とする請求項１あるいは２に記載のアルカリフォスファターゼの決定方法。
【請求項４】
反応相のｐHが７．５から１０．５の範囲であることを特徴とする請求項１〜３に記載のアルカリフォスファターゼの決定方法。
【請求項５】
基質Ｒの濃度が３．９μＭから０．３Ｍの範囲で反応させることを特徴とする請求項１〜４に記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法。
【請求項６】
基質Ｔの濃度が０．００１５６％から０．１％の範囲で反応させることを特徴とする請求項１〜５に記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法。
【請求項７】
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐの濃度が１．５６μＭから１ｍＭの範囲で反応させることを特徴とする請求項１〜６に記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法。
【請求項８】
触媒Ｘが１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１〜７に記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法。
【請求項９】
反応相にリン酸化された補酵素以外にリン酸塩を添加しないことを特徴とする請求項１〜８記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法。
【請求項１０】
触媒ＸまたはＹが反応相において、実質的に安定であるものを用いることを特徴とする請求項１〜９記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法。
【請求項１１】
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰが高純度のものを使用することを特徴とする請求項１〜１０記載のアルカリフォスファターゼの決定方法。
【請求項１２】
基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘおよび触媒Ｙが常温以上で長期安定なものを用いることを特徴とする請求項１〜１１記載のアルカリフォスファターゼの決定方法。
【請求項１３】
少なくとも、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔを含有することを特徴とするアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項１４】
触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分を含有する第一試薬と、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分を含有する試薬であって第一試薬に選択されていない成分を少なくとも１種含有する第二試薬に分割されていることを特徴とする少なくとも２分割された請求項１３記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項１５】
第一試薬及び／又は第二試薬が乾燥状態であり、第一試薬と第二試薬に加えて、第一試薬と第二試薬を溶解することができる液状試薬を含むことを特徴とする請求項１４記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項１６】
第一試薬、第二試薬に加えて、さらに触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分であって第一試薬及び／又は第二試薬に選択されていない成分を少なくとも１種含有する第三試薬に分割されていることを特徴とする少なくとも３分割された請求項１４記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項１７】
第一試薬及び／又は第二試薬が乾燥状試薬であり、第三試薬が第一試薬及び／又は第二試薬を溶解することができる液状試薬であることを特徴とする請求項１６記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項１８】
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐを含有することを特徴とする請求項１３〜１７記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項１９】
アルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物であって、次の４つの工程を一つの反応相にて同時に行うことを特徴とする請求項１８記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
工程１
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐと、アルカリフォスファターゼとの反応により、それぞれ脱リン酸化された酸化型補酵素Ａまたは還元型補酵素Ａ’を生成させる工程、
工程２
酸化型補酵素Ａを還元型補酵素Ａ’へ変換することができる触媒Ｘ、および、触媒Ｘに対する基質Ｒ存在下反応せしめ、還元型型補酵素Ａ’およびＲのＸによる生成物Ｓを生成させる工程、
工程３
還元型補酵素Ａ’を酸化型補酵素Ａへ変換することができる触媒Ｙ、および、触媒Ｙに対する基質Ｔ存在下反応せしめ、酸化型補酵素ＡおよびＴのＹによる生成物Ｕを生成させる工程、
工程４
工程２および工程３を繰り返して蓄積される、ＳまたはＵを決定する工程、
【請求項２０】
触媒Ｘが１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１３〜１９記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項２１】
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰが高純度であることを特徴とする請求項１８又は２０記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項２２】
基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘおよび触媒Ｙが常温以上で長期保存可能なものを用いることを特徴とする請求項１３〜２１記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【請求項２３】
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰ、基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘ、および触媒Ｙが乾燥品であることを特徴とする請求項１８〜２０記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルカリフォスファターゼ活性（以下、ＡＬＰ活性）の測定において、リン酸化された補酵素とアルカリフォスファターゼを作用させ、脱リン酸化補酵素を生ぜしめ、その脱リン酸化補酵素を酵素サイクリング法にて増幅して検出するもので、反応を一つの反応相にて同時に行わせることによりアルカリフォスファターゼ活性を高感度に測定する方法に関する。本発明の測定方法は、臨床診断、食品検査、生体成分検査等の分野において用いられる。
【背景技術】
【０００２】
ＡＬＰ活性の測定は生体成分の分析に広く用いられる酵素として良く知られ、生化学検査における体液中のＡＬＰ活性測定や、酵素免疫測定法や免疫組織染色におけるＡＬＰ標識抗体および標識抗原の検出などに広く応用されている。ＡＬＰ活性の測定方法は一般的にパラニトロフェニルリン酸や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウムを基質とし、アルカリ条件下、ＡＬＰの脱リン酸化反応による発色の程度を機器により光学的に判定してきた。これらの方法はＡＬＰ量に応じた単位時間当たりの色素量変化速度あるいは一定時間内の変化量により測定していたが、生体微量成分の分析にはさらなる高感度な方法が求められ、時としてＡＬＰ活性の感度を向上させるために、酵素サイクリングを用いたシグナル増幅法も行われてきた（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
このＡＬＰの酵素サイクリング検出系はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰと略す）またはその還元型（以下ＮＡＤＰＨと略す）を室温、アルカリ条件下、ＡＬＰ活性により脱リン酸化反応を行わせ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略す）へと変化させる第一反応を一定時間行い、次いで、第二反応としてＮＡＤまたはＮＡＤＨの検出を目的とした酵素サイクリング試薬の添加を行い、一定時間のシグナル増幅反応を行う。最終的に検出される色素を測定することで、ＡＬＰ活性で生じた産物由来のシグナルから、ＡＬＰ標識体に反映した生体成分の検出を高感度に行うものである。
【０００４】
酵素サイクリング反応は、室温、中性条件下、アルコール、アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ、ニトロブルーテトラゾリウムを含む反応液の添加により開始され、アルコールとアルコールデヒドロゲナーゼとの反応時にＮＡＤからＮＡＤＨへの変換がなされ、次いでジアフォラーゼによりＮＡＤＨをもう一度ＮＡＤへと変換しアルコールデヒドロゲナーゼにより再利用される。この時、ジアフォラーゼ反応によりニトロブルーテトラゾリウムが反応基質として働き、青紫色の色素が経時的に一定速度で蓄積し、その量を光学機器により測定する。これにより酵素サイクリングを用いないＡＬＰ活性測定法に比べて、色素の増加速度を上げることができ、結果として感度を上げることが可能となる。
【０００５】
しかしながら従来法では、反応をＡＬＰ反応とサイクリング反応とを別々に２段階行わなければならなかったため、操作性に煩雑さがあった。また、たとえ１段階にて同時に行おうとしても、サイクリング反応時に使用されるアルコールのような有機溶媒がＡＬＰ反応に負の影響を及ぼし、また、ＡＬＰ反応が進む条件下では酵素サイクリングの反応性低下を引き起こし、結果として思うように増幅できない欠点があった。増幅率を上げるために反応温度を室温から、酵素の活性が高まる反応温度に上げて反応させようとしても、更なる酵素サイクリング反応の反応性低下により、感度良くＡＬＰを測定することはできなかった。
【０００６】
また、従来法での増幅の態様は、酵素サイクリング反応時、ＡＬＰは最初の脱リン酸化反応とは別の条件下におかれるため、脱リン酸化反応はそれ以上進行しないか極めて小さくなり、結果として、第一反応により得られた一定量のＡＬＰ反応産物であるＮＡＤまたはＮＡＤＨを酵素サイクリング反応で増幅することになる。この方法では、色素の増加は一定量のＮＡＤまたはＮＡＤＨに依存した、単位時間あたり一定速度の増加しかできないため、更なる高感度化をしようとした場合、最初のＡＬＰ反応の長時間化が避けられず、同時に、原理的に一定速度の増幅しかできないため、おのずとその程度には限界があった。このように従来法では、臨床検査や研究の分野において必然的に要求される、測定の短時間化と簡便化による労力の削減、および高感度化による偽陰性の回避と正確な判定にとっては、まだまだ不十分である。
【０００７】
【特許文献１】特開平６−３０３９９６
【非特許文献１】A. Johannsonら:Clinica Chimica Acta, 148, 119-124, 1985
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アルカリフォスファターゼ活性を簡便にかつ高感度に測定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、前記課題を解決するため鋭意努力した結果、ＡＬＰ活性測定において、反応ステップが少なく簡便で、短時間内に高感度化が可能な、酵素サイクリングを用いた増感方法を発明するに至った。すなわち、本願発明は、
（１）アルカリフォスファターゼ活性の決定方法であって、次の４つの工程を一つの反応相にて同時に行うことを特徴とするアルカリフォスファターゼ活性の決定方法；
工程１
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐと、アルカリフォスファターゼとの反応により、それぞれ脱リン酸化された酸化型補酵素Ａまたは還元型補酵素Ａ’を生成させる工程、
工程２
酸化型補酵素Ａを還元型補酵素Ａ’へ変換することができる触媒Ｘ、および、触媒Ｘに対する基質Ｒ存在下反応せしめ、還元型補酵素Ａ’およびＲのＸによる生成物Ｓを生成させる工程、
工程３
還元型補酵素Ａ’を酸化型補酵素Ａへ変換することができる触媒Ｙ、および、触媒Ｙに対する基質Ｔ存在下反応せしめ、酸化型補酵素ＡおよびＴのＹによる生成物Ｕを生成させる工程、
工程４
工程２および工程３を繰り返して蓄積される、ＳまたはＵを決定する工程、
（２）触媒Ｘが実質的にＡＰと反応しないことを特徴とする上記（１）に記載のアルカリフォスファターゼの決定方法；
（３）触媒Ｙが実質的にＡ’Ｐと反応しないことを特徴とする上記（１）あるいは（２）に記載のアルカリフォスファターゼの決定方法；
（４）反応相のｐHが７．５から１０．５の範囲であることを特徴とする上記（１）〜（３）に記載のアルカリフォスファターゼの決定方法；
（５）基質Ｒの濃度が３．９μＭから０．３Ｍの範囲で反応させることを特徴とする上記（１）〜（４）に記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法；
（６）基質Ｔの濃度が０．００１５６％から０．１％の範囲で反応させることを特徴とする上記（１）〜（５）に記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法；
（７）リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐの濃度が１．５６μＭから１ｍＭの範囲で反応させることを特徴とする上記（１）〜（６）に記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法；
（８）触媒Ｘが１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであることを特徴とする上記（１）〜（７）に記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法；
（９）反応相にリン酸化された補酵素以外にリン酸塩を添加しないことを特徴とする上記（１）〜（８）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法；
（１０）触媒ＸまたはＹが反応相において、実質的に安定であるものを用いることを特徴とする上記（１）〜（９）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定方法；
（１１）リン酸化された酸化型補酵素ＡＰが高純度のものを使用することを特徴とする上記（１）〜（１０）記載のアルカリフォスファターゼの決定方法；
（１２）基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘおよび触媒Ｙが常温以上で長期安定なものを用いることを特徴とする上記（１）〜（１１）記載のアルカリフォスファターゼの決定方法；
（１３）少なくとも、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔを含有することを特徴とするアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（１４）  触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分を含有する第一試薬と、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分を含有する試薬であって第一試薬に選択されていない成分を少なくとも１種含有する第二試薬に分割されていることを特徴とする少なくとも２分割された請求項１３記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（１５）第一試薬及び／又は第二試薬が乾燥状態であり、第一試薬と第二試薬に加えて、第一試薬と第二試薬を溶解することができる液状試薬を含むことを特徴とする上記（１４）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（１６）第一試薬、第二試薬に加えて、さらに触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分であって第一試薬及び／又は第二試薬に選択されていない成分を少なくとも１種含有する第三試薬に分割されていることを特徴とする少なくとも３分割された上記（１４）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（１７）第一試薬及び／又は第二試薬が乾燥状試薬であり、第三試薬が第一試薬及び／又は第二試薬を溶解することができる液状試薬であることを特徴とする上記（１６）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（１８）リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐを含有することを特徴とする上記（１４）〜（１７）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（１９）アルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物であって、次の４つの工程を一つの反応相にて同時に行うことを特徴とする上記（１８）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
工程１
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐと、アルカリフォスファターゼとの反応により、それぞれ脱リン酸化された酸化型補酵素Ａまたは還元型補酵素Ａ’を生成させる工程、
工程２
酸化型補酵素Ａを還元型補酵素Ａ’へ変換することができる触媒Ｘ、および、触媒Ｘに対する基質Ｒ存在下反応せしめ、還元型型補酵素Ａ’およびＲのＸによる生成物Ｓを生成させる工程、
工程３
還元型補酵素Ａ’を酸化型補酵素Ａへ変換することができる触媒Ｙ、および、触媒Ｙに対する基質Ｔ存在下反応せしめ、酸化型補酵素ＡおよびＴのＹによる生成物Ｕを生成させる工程、
工程４
工程２および工程３を繰り返して蓄積される、ＳまたはＵを決定する工程、
（２０）触媒Ｘが１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであることを特徴とする上記（１３）〜（１９）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（２１）リン酸化された酸化型補酵素ＡＰが高純度であることを特徴とする上記（１８）又は（２０）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（２２）基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘおよび触媒Ｙが常温以上で長期保存可能なものを用いることを特徴とする上記（１３）〜（２１）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
（２３）リン酸化された酸化型補酵素ＡＰ、基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘ、および触媒Ｙが乾燥品であることを特徴とする上記（１８）〜（２０）記載のアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物；
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明における同時とは、一つの反応相中で、工程１から工程４に必要な成分である、ＡＰまたはＡ’ＰおよびＸ、Ｙ、Ｒ、Ｔを最初から添加し、すべての工程を同一の条件下にて行うことを意味するのであって、工程１を行わせた後、同一反応相にて工程２から工程４に必要な化合物を添加して反応させることや、あるいは工程１を行わせた後、工程２から工程４までの条件を途中で変更して行うこと等を排除する意味である。本法では、ＡＬＰ反応と酵素サイクリング反応が同時に行われるため、ＡＬＰ反応により生じる脱リン酸化補酵素Ａが一定速度で生成を続けながら酵素サイクリングによる増幅反応を行わせるために、産物ＳまたはＵの増加は、経時的にみると指数対数的に急激な上昇を呈する。これにより、操作性を大幅に改善でき、短時間内に高感度なＡＬＰ活性測定法を提供することができる。
【００１１】
本発明についてさらに詳細に述べる（図１及び図２参照）。
リン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’ＰはＡＬＰの作用により脱リン酸化反応されることができ、以後の酵素サイクリング反応に含まれる触媒Ｘおよび触媒Ｙが、酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐに対し実質的に反応しないように組み合わせれば良い。ＡＰまたはＡ’Ｐに対し、実質的に反応しないとは、通常、同濃度のＡまたはＡ’に対する反応性に対して、１％以下の反応性であることをいい、好ましくは０．１％以下が良く、最適には０．０１％以下であることをいう。Ｘ、Ｙは生成した脱リン酸化された酸化型補酵素Ａまたは還元型補酵素Ａ’が以後の酵素サイクリング反応に利用できるものであればよい。
酸化型補酵素ＡＰとしては例えば、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤＰ、アセチルＮＡＤＰ、デアミノＮＡＤＰ、デアミドＮＡＤＰ、からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の補酵素を用いればよく、好ましくはＮＡＤＰが良い。還元型補酵素Ａ’Ｐとしては例えば、ＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＰＨ、アセチルＮＡＤＰＨ、デアミノＮＡＤＰＨ、デアミドＮＡＤＰＨからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の補酵素を用いればよく、好ましくはＮＡＤＰＨが良い。酸化型補酵素ＡＰと還元型補酵素Ａ’Ｐは別々に添加されていても同時に添加されていても構わない。酸化型補酵素ＡＰと還元型補酵素Ａ’Ｐの濃度範囲はＡＬＰが反応するに十分な量が存在していれば良く、好ましい濃度の下限は１μＭ以上、より好ましくは１．５６μＭ以上、さらに好ましくは６．２５μＭ以上であり、好ましい濃度の下限は１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、さらに好ましくは０．４ｍＭ以下である。
【００１２】
ここで言う、「リン酸化された酸化型補酵素ＡＰが高純度のもの」とは、工程２および工程３の繰り返し回数が１分あたり５００回以上、または９００回以上、あるいは１４００回以上の条件下において、アルカリフォスファターゼ活性が存在しないときに、反応液中のＡＰ濃度が２５μモル濃度で得られる２５℃での２分後に変化したバックグラウンドの信号強度を１としたとき、０．０５Ｕのアルカリフォスファターゼ活性を測定したときの２５℃での２分後に変化した信号強度が４以上、または３．５以上、あるいは３以上が良い。高純度なＡＰは、市販されているＡＰをカラムクロマトグラフィーにより精製することによって入手できる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーを用い、適当な緩衝液にて塩化ナトリウムや塩化カリウムの濃度勾配にて溶出させて得ることができる。得られたＡＰの純度の検定は、本願手法において、上記バックグラウンドと一定量のアルカリフォスファターゼ活性を測定したときの信号強度を標準値として、該標準値との相対比として決定すると良い。
【００１３】
さらに詳細に説明すると、例えばモノＱカラムＨＲ１０／１０にて２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を溶媒として用い、塩化ナトリウムの濃度を０から０．５Ｍまで３０分間かけて増加させながら２ｍｌ／ｍｉｎの流速にて溶出させたとき、素通り画分、および濃度勾配開始時間を０として得られる溶出時間９．５分の画分、１１．５分の画分、１２．５分の画分、１９分の画分、２０．５分の画分とＮＡＤＰ画分である１４分の画分とを分離することにより得ることができる。得られるＮＡＤＰ以外の画分は、それぞれ、酵素学的な評価によりバックグラウンドを指標にＮＡＤＰにこれら画分を含まないように分離すると良い。酵素学的な評価を具体的に説明すると、適当な緩衝液に、１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ、コール酸、ニトロブルーテトラゾリウムを含有する酵素サイクリング反応液を調製しておき、得られた画分の液を酵素サイクリング反応液に添加し、一定時間インキュベートする。画分を添加したときに得られる色素量を吸光度計などで測定し、画分を添加せずに同様に反応させて得られた測定値を差し引き、バックグラウンドを評価することで簡単に実施できる。
【００１４】
カラムクロマトグラフィーの担体の種類としては、イオン交換担体、疎水クロマト担体、ゲルろ過担体あるいはアフィニティークロマト担体などが挙げられ、イオン交換担体が特に好ましい。イオン交換担体としては、強イオン交換担体又は弱イオン交換担体が挙げられ、強イオン交換担体が好ましい。また場合によっては、弱イオン交換担体が好ましい。また他の分類としては、陰イオン交換担体あるいは陽イオン交換担体が良く、さらに好ましくは陰イオン交換担体が望ましい。クロマト担体はこれらいくつかを組み合わせて使用しても良く、また単独で使用しても良い。
【００１５】
工程１に用いられるのが酸化型補酵素ＡＰの場合、ＡＬＰ反応によって生じた酸化型補酵素Ａは工程２に供せられ、また、工程１に用いられるのが還元型補酵素Ａ’Ｐの場合、ＡＬＰ反応によって生じた酸化型補酵素Ａ’は工程３に供せられる。                    触媒Ｘは、Ｘそれ自身とＸに対応した基質Ｒおよびその反応産物Ｓが実質的にＡＬＰ反応を阻害することが無いことが望ましい。ここでいう実質的に阻害しないとは、ＲまたはＳが直接間接問わず、ＡＬＰ活性を失活させるか、あるいは活性を低下させることが無いことを意味する。Ｘは、酸化型補酵素Ａを還元型補酵素Ａ’へ変換することができるデヒドロゲナーゼ類であれば良く、実質的に安定であるものが望ましい。本願発明において実質的に安定とは、通常、３０℃よりも高い温度で反応相の条件下、反応時間内にて安定であることをいい、好ましくは、３０℃よりも高く５０℃よりも低い温度条件下で安定であることをいう。ここでいう、安定であるとは、触媒Ｘを反応相中へ添加する前と比べ、Ｘの反応性が反応終了時点で３０％以上の活性を保持していれば良く、好ましくは５０％以上が良く、最適には６０％以上で有れば良い。
【００１６】
例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６）、グリセロール−３リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８，ＥＣ１．１．１．９４）、イノシトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１８）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７）、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３０）りんご酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３７）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４１）、ガラクトースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４８）、グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９）、３α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．５０）、１２α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１７６）、β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．５１）、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５９）、カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１０８）、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２０４）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１４）、ソルビトール−６リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１４０）、マンにトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６７）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１）、グリセロアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１２）、アラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２、ＥＣ１．４．１．３）Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．５）、セリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．７）、バリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．８）ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．９）およびグリシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１０）からなる群より選ばれた１種以上の酵素が挙げられ、好ましくは１２α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いるのが良い。
【００１７】
基質Ｒは、Ｘに対応した基質特異性を有するものであれば何でも良い。例えば、Ｘが１２α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの場合、ステロイド骨格の１２位に水酸基が付与されているものであれば何でも良く、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸およびタウロウルソグリコデオキシコール酸からなる群より選ばれる１種以上のものであればよいが、好ましくはコール酸またはデオキシコール酸が良い。
Ｒの濃度は、Ｘが反応するために必要十分な量が添加されていれば良く、好ましい濃度の下限は１μＭ以上、より好ましくは３．９μＭ以上、さらに好ましくは１５．６μＭ以上であり、好ましい濃度の下限は１Ｍ以下、より好ましくは０．３Ｍ以下、さらに好ましくは０．２Ｍ以下である。
【００１８】
触媒ＹはＹそれ自身とＹに対応した基質Ｔおよびその反応産物Ｕが実質的にＡＬＰ反応を阻害することが無いことが望ましい。ここでいう実質的に阻害しないとは、ＴまたはＵが直接間接問わず、ＡＬＰ活性を失活させるか、あるいは活性を低下させることが無いことを意味する。還元型補酵素Ａ’を酸化型補酵素Ａに変換するデヒドロゲナーゼ類、あるいは電子キャリアー類であればよく、デヒドロゲナーゼ類は前記触媒Ｘの中で、Ｘにて用いるものとは異なるものの１種かそれ以上であれば何でも使える。
また、Ｘには使えないがＹに使うことのできる、Ａ’をＡに変換する反応性を有する酵素類としては、例えばＮＡＤデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．６．９９．３）、ジアフォラーゼ（ＥＣ１．６．４．３）、チトクロームｂ５リダクターゼ（ＥＣ１．６．２．２）が挙げられ、電子キャリアー類としては、例えばフェナジンメトサルフェート、メルドラスブルー、ピロシアニンおよび１−メトキシＰＭＳなどが挙げられ、これらの中から１種かそれ以上を用いればそれでよく、好ましくはジアフォラーゼを用いるのが良い。Ｙは反応相内で３０℃よりも高い温度で反応時間内にて安定であるものが望ましく、好ましくは３０℃よりも高く５０℃よりも低い温度で安定なものが良い。ここでいう、安定であるとは、触媒Ｙを反応相中へ添加する前と比べ、Ｙの活性が反応終了時点で３０％以上の活性を保持していれば良く、好ましくは５０％以上が良く、最適には６０％以上で有れば良い。
基質Ｔは、触媒Ｙに対応した基質特異性を示す受容体であれば良く、例えば、メチレンブルー、フラビン類、キノン類、２，６−ジクロロフェノール、インドフェノールなどが挙げられ、テトラゾリウムブルー、ニトロブルーテトラゾリウム、ネオテトラゾリウムブルー、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルー２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３−（４，５−ジメチルー２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルー２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、ＷＳＴ−１およびＷＳＴ−３からなる群より選ばれた１種以上のものであればそれで良く、好ましくはニトロブルーテトラゾリウムが良い。Ｔの濃度は、Ｙが反応するに必要十分な量が存在していれば良く、好ましい濃度の下限としては０．０００１％以上、より好ましくは０．００１５６％以上、好ましい下限としては１％以下、より好ましくは０．１％以下の範囲で反応させるのが良い。
【００１９】
基質ＲまたはＴの選択は、生成物ＳまたはＵからシグナルを得ることができればよく、Ｓのみから、Ｕのみから、あるいはＳとＵの両方からシグナルを得ても良い。
ＳまたはＵの決定方法はそのシグナルを検出または測定すればよく、シグナルの種類としては、発光、蛍光、色素、吸光度など特に問わず、好ましくは色素または吸光度が良い。ＳまたはＵが色素である場合は、光学機器にて測定する以外にも、目視にて判定できる。また、ＳまたはＵを直接決定できない場合であっても、ＳまたはＵを他のシグナルを有する物質に変換して決定することもできる。他の物質に変換して測定する場合も、発光、蛍光、色素、吸光度などが挙げられ、例えば、ＳまたはＵに特異的に作用する酵素を用いて測定することもできる。
さらに詳しく述べると、例えば触媒Ｘがキサンチンデヒドロゲナーゼで、Ｒがキサンチンを用いた場合、Ｓである尿酸とウリカーゼとを反応させ、得られた過酸化水素をパーオキシダーゼと発色基質とともに発色させれば簡単に測定できる。
反応相のｐＨは工程１でのＡＬＰ反応と工程２から４の酵素サイクリング反応が同時に行えるならば特に限定されず、そのｐＨ範囲の下限としては、ｐＨ７．５以上、より好ましくはｐＨ９以上、好ましい上限としてはｐＨ１１以下、より好ましくはｐＨ１０．５以下の範囲で反応させるのがよい。
【００２０】
また、基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘおよび触媒Ｙが常温以上で長期保存可能なものを用いるのが良く、ここでいう常温とは１５℃以上、あるいは２０℃以上、さらには３０℃以上が良く、場合によっては４０℃以上あるいは５０℃以上を意味し、「長期安定である」としては、１ヶ月以上、または３ヶ月以上、さらには６ヶ月以上の間、保存開始時の反応性を１００％としたときに７０％以上、または８０％以上、あるいは９０％以上、さらには９５％以上の反応性を維持していることが挙げられる。特に触媒Ｘおよび触媒Ｙが乾燥状態であるのが良く、該乾燥法としては、凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等が挙げられ、好ましくは風乾が良い。このとき、ＡＰは同様に常温で長期安定であることが望ましいが、ＡＰは別途用意して保存しておいた基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘおよび触媒Ｙに後から添加しても良い。常温で長期保存可能とする触媒Ｘは特に規定されることはないが、好ましくはハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ類が良く、より好ましくは、３α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．５０）、１２α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１７６）、β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．５１）、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５９）が良く、最適には１２α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが良い。また触媒Ｙも別段規定されるものではないが、好ましくは、ジアフォラーゼ（ＥＣ１．６．４．３）、フェナジンメトサルフェートおよび１−メトキシＰＭＳがよく、より好ましくはジアフォラーゼおよび１−メトキシＰＭＳがよく、最適にはジアフォラーゼが良い。
【００２１】
この基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘおよび触媒Ｙから構成される常温以上で長期安定な組成物はアルカリフォスファターゼ活性測定のために用いられるのみならず、アンモニアの測定やアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の測定にも用いることができる。
【００２２】
たとえば本願の工程１のかわりに、ＮＡＤ合成酵素とデアミドＮＡＤおよびアンモニアを含有する反応液に、測定対象物としてのＡＴＰ存在下、ＮＡＤを生成させ、このＮＡＤを本願工程２、３および４を行うことでＡＴＰ量を測定できる。具体的には、ＡＴＰの決定方法であって、次の４つの工程を一つの反応相にて同時に行うことを特徴とし、
工程１
ＮＡＤ合成酵素とデアミドＮＡＤおよびアンモニアを含有する溶液にＡＴＰを添加して、ＮＡＤを生成させる工程、
工程２
ＮＡＤをＮＡＤＨへ変換することができる触媒Ｘ、および、触媒Ｘに対する基質Ｒ存在下反応せしめ、ＮＡＤＨおよびＲのＸによる生成物Ｓを生成させる工程、
工程３
ＮＡＤＨをＮＡＤへ変換することができる触媒Ｙ、および、触媒Ｙに対する基質Ｔ存在下反応せしめ、ＮＡＤおよびＴのＹによる生成物Ｕを生成させる工程、
工程４
工程２および工程３を繰り返して蓄積される、ＳまたはＵを決定する工程によりできる。
【００２３】
また、被検体をアンモニアとしたときには、本願の工程１のかわりに、ＮＡＤ合成酵素とデアミドＮＡＤおよびＡＴＰを含有する反応液に、測定対象物としてのアンモニア存在下、ＮＡＤを生成させ、同様に本願工程２、３および４を行うことでアンモニア量を測定できる。具体的にはアンモニアの決定方法であって、次の４つの工程を一つの反応相にて同時に行うことを特徴とし、
工程１
ＮＡＤ合成酵素とデアミドＮＡＤおよびＡＴＰを含有する溶液にアンモニアを添加して、ＮＡＤを生成させる工程、
工程２
ＮＡＤをＮＡＤＨへ変換することができる触媒Ｘ、および、触媒Ｘに対する基質Ｒ存在下反応せしめ、ＮＡＤＨおよびＲのＸによる生成物Ｓを生成させる工程、
工程３
ＮＡＤＨをＮＡＤへ変換することができる触媒Ｙ、および、触媒Ｙに対する基質Ｔ存在下反応せしめ、ＮＡＤおよびＴのＹによる生成物Ｕを生成させる工程、
工程４
工程２および工程３を繰り返して蓄積される、ＳまたはＵを決定する工程によりできる。
【００２４】
このように、基質Ｒ、基質Ｔ、触媒Ｘおよび触媒Ｙが常温以上で長期安定なものを提供することにより、冷蔵や冷凍保存などの特別な設備を必要とせず、保存スペースの制約が少ないことから大量購入による試薬の安価な入手が可能となる。
【００２５】
触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒおよび基質Ｔは、工程２から工程４が進行しないように、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分を含有する第一試薬と、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分を含有する試薬であって第一試薬に選択されていない成分を少なくとも１種含有する第二試薬に分割されていることを特徴とする少なくとも２分割されたアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物とすることが好ましい。また、第一試薬、第二試薬に加えて、さらに触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種以上３種以下の成分であって第一試薬及び／又は第二試薬に選択されていない成分を少なくとも１種含有する第三試薬に分割されていることを特徴とする少なくとも３分割されたアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物とすることも好ましい。さらには、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種の成分を含有する第一試薬と、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種の成分を含有する試薬であって第一試薬に選択されていない成分を含有する第二試薬と、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種の成分を含有する試薬であって第一試薬及び第二試薬に選択されていない成分を含有する第三試薬と、触媒Ｘ、触媒Ｙ、基質Ｒ、及び基質Ｔからなる群より選ばれる１種の成分を含有する試薬であって第一試薬、第二試薬、及び第三試薬に選択されていない成分を含有する第四試薬に分割されていることを特徴とする少なくとも４分割されたアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物とすることも好ましい。
【００２６】
また、上記分割されたアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物において、少なくとも１つの試薬が乾燥状試薬である場合、残りの分割試薬のうち少なくとも１つの試薬が該乾燥状試薬を溶解することができる液状試薬であることが好ましい。或いは、上記分割試薬以外にさらに溶解液を添えてアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物とすることも大変に好ましく、例えば、第一試薬及び／又は第二試薬が乾燥状態であり、これら第一試薬と第二試薬以外に加えて、第一試薬と第二試薬を溶解することができる液状試薬を含むことを特徴とするアルカリフォスファターゼ活性の決定用組成物等が挙げられる。
【００２７】
好ましい一態様としては、例えば、触媒Ｘ、触媒Ｙおよび基質Ｒを第一試薬、基質Ｔを第二試薬とすることが挙げられる。該第一試薬（触媒Ｘ、触媒Ｙおよび基質Ｒを含有する試薬）は、適当な緩衝液中に保存安定化剤とともに調製し、これを乾燥させると良い。安定化剤としては、糖類、タンパク質などがあげられ、糖類としては、糖アルコールや糖が良く、単糖類でも多糖類でも用いることができる。糖アルコールとしてはマンニトールが良くまた、糖類としては２糖類が良く、その中ではトレハロース、スクロース、マルトースが良く、これらより選ばれる１種以上の組み合わせが良い。さらにより好ましくは、トレハロースまたはスクロースがよく、最適にはトレハロースがよい。また、タンパク質としては、アルブミン、グロブリン、ポリＬリジンやＭＰＣポリマーなどの人工タンパク質が挙げられる。緩衝液の種類としては、特に規定されず、酵素のｐＨ安定性の特性にあわせて選択すると良い。ｐＨの条件は３から１２がよく、より好ましくは４から１０．５がよく、最適には５から１０がよい。
【００２８】
第一試薬もしくは第二試薬には、さらにリン酸化された酸化型補酵素ＡＰまたは還元型補酵素Ａ’Ｐを含有することも好ましい。該第一試薬もしくは第二試薬は、適当な緩衝液中に保存安定化剤とともに調製し、これを乾燥させると良い。また、好ましくは、第一試薬と第二試薬の組み合わせとしては、ＡＰを含有する試薬には、触媒Ｘおよび触媒Ｙを含まないことが望ましい。
【００２９】
該第一試薬および該第二試薬は溶解液にて溶解させると、そのままアルカリフォスターゼ活性測定用の反応液として用いることができる。                                    アルカリフォスファターゼ活性測定のための反応液には、リン酸化補酵素以外のリン酸塩を含んでいないことが好ましい。選択される緩衝液は、ＡＬＰ反応と酵素サイクリング反応が同時に行えるものであれば良く、特に限定されるものではない。例えばエタノールアミン緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、メチルアミン緩衝液、エチルアミン緩衝液、ジメチルアミン緩衝液、トリメチルアミン緩衝液、トリエチルアミン緩衝液、ｎ−ブチルアミン緩衝液、２−エチルアミノエタノール緩衝液、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン緩衝液、グリシン緩衝液、セリン緩衝液、アラニン緩衝液、ロイシン緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、ε−アミノカプロン酸緩衝液、γ−アミノ酪酸緩衝液、２アミノ−２メチル−１，３プロパンジオール緩衝液、２アミノ−２エチル−１，３プロパンジオール緩衝液、２アミノ−２メチル−１プロパノール緩衝液、エチレンジアミン緩衝液、４−アミノピリジン緩衝液、ヘキサメチレンジアミン緩衝液、ベロナ−ル緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、アンモニア緩衝液、エフェドリン緩衝液、ヒドロキシプロリン緩衝液、ｎ−プロピルアルコール緩衝液およびピペリジン緩衝液からなる群より選ばれた１種以上が含まれていれば良いが、好ましくはジエタノールアミン緩衝液、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン緩衝液および２−エチルアミノエタノール緩衝液が良い。
【００３０】
反応させる温度は特に規定されないが、ＡＬＰ反応と酵素サイクリング反応の両方の反応性を有し、ＸまたはＹが安定な温度であれば良く、反応温度の下限としては、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上、上限としては好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下が良い。
また、反応時には必要に応じて１価または２価の金属塩を適当量添加すると良い。反応させる時間は、酵素サイクリング反応による増幅が持続する範囲であれば特に限定されず、反応時間の下限としては１秒以上、より好ましくは５秒以上、さらに好ましくは１０秒以上、上限としては１時間以内、より好ましくは３０分以内が良い。
【００３１】
本発明における方法は、ＡＬＰ活性を決定するものであれば、何ら限定されるのもでもない。本願発明においてＡＬＰ活性を決定するとは、ＡＬＰ活性を定量的に測定する場合のみならず、目視による判定も含む概念である。最適な用いられ方としては、核酸や抗原および抗体等を測定する際にＡＬＰ標識抗体、ＡＬＰ標識レセプター、ＡＬＰ標識リガンドあるいはＡＬＰ標識抗原等を検出するのに有効である。例えば、大腸菌Ｏ１５７遺伝子を検出するためのプローブ核酸をプラスチックプレートに予め固定化しておき、サンプルである大腸菌Ｏ１５７から核酸を抽出して得られた溶液をプレートへ分注し、一定時間室温か３７℃でインキュベート後、プレートを洗浄液で、洗浄する。次に大腸菌Ｏ１５７遺伝子に相補的な配列でかつプレート固相上のプローブとは異なる領域の、ジゴキシゲニン標識核酸を添加し、一定時間室温か３７℃でインキュベート後、プレートを洗浄し、抗ジゴキシゲン抗体ＡＬＰ標識を添加し、室温か３７℃で一定時間インキュベートする。プレート洗浄後、固相上に形成した抗ジゴキシゲン抗体ＡＬＰ標識−ジゴキシゲニン−核酸複合体を検出するために、緩衝液中に溶解したＮＡＤＰ、１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアフォラーゼ、コール酸、ニトロブルーテトラゾリウムを含む反応液を添加し、一定時間室温か３７℃でインキュベートする。プレート上で発色したフォルマザン色素の量をプレートリーダーなどの光学機器で読み取るか、目視で判定し、サンプル中の大腸菌Ｏ１５７の存在を確認する。存在する場合はＯ１５７遺伝子に裏付けられたＡＬＰ活性により強度に発色し、逆に存在しない場合は、発色はしないか、極めて小さなものとなる。
以下に、実施例、比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら制限されるものではない。
【００３２】
〔実施例１〕アルカリフォスファターゼ活性測定用試薬の製造とその保存安定性
（１）アルカリフォスファターゼ活性測定用試薬の製造
第一試薬として、２０ｍＭのＴＥＳ（ｐＨ７）、１０００Ｕ／ｍｌの１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１２Ｕ／ｍｌのジアフォラーゼ、１０ｍＭのコール酸、０．１％のプロクリン３００からなる酵素液に、トレハロース、スクロースをそれぞれ５％の濃度で含まれる溶液を２種類調製した。また、比較のため、トレハロース、スクロースを含まない酵素液も同様に調製した。酵素液をガラスバイアルに２５μｌずつ分注し、恒温機にて５０℃２時間乾燥させた。ガラスバイアルに蓋をして、乾燥剤を入れたアルミシート中にて第一試薬として保存した。
【００３３】
第二試薬として、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１．２５ｍＭのＮＡＤＰ、０．６２５％のニトロブルーテトラゾリウム、７％のラクトース、１５％のトレハロース、０．１％のプロクリン３００を含有するＮＡＤＰ溶液を調製した。ＮＡＤＰ溶液をガラスバイアルに２５μｌずつ分注し、恒温機にて５０℃２時間乾燥させた。ガラスバイアルに蓋をして、乾燥剤を入れたアルミシート中にて第二試薬として保存した。
【００３４】
溶解液として、０．１Ｍのジエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）、１ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のプロクリン３００を含有する溶液を調製した。溶液をガラスバイアルに１．５ｍｌずつ分注し、蓋をして、溶解液として保存した。
（２）保存安定性試験
調製した第一試薬、第二試薬および溶解液を４℃、２５℃、３２℃、３７℃、４２℃、５０℃にそれぞれ保存した。保存した第一試薬に保存した溶解液１ｍｌを加えて第一試薬を完全に溶解させ、溶解させた液の全てを第二試薬に移して、溶解させ、アルカリフォスファターゼ活性測定用の酵素サイクリング溶液とした。
１．アルカリフォスファターゼ測定能力の評価
酵素サイクリング溶液に０Ｕ／ｍｌまたは０．０５Ｕ／ｍｌの牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（ロシュダイアグノスティクス社製）５μｌを添加し、分光光度計を用いて、２分後の550nmの吸光度変化量を測定した。また、測定直前に調製した第一試薬、第二試薬および溶解液を用いて同様に酵素サイクリング溶液を調製して同様にアルカリフォスファターゼ測定能力の評価を行った。得られた値を１００％として、保存しておいた試薬を用いたときに得られる測定値を残存％として計算した。
２．１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性の測定
酵素サイリング溶液を１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ８）にて５０倍に希釈し、４０ｍＭのジエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）、３．３ｍＭのβ−ＮＡＤ、１ｍＭのコール酸を含有する反応液０．５ｍｌを試験管に取り、３７℃３分間加温し、希釈した酵素サイクリング溶液を１０μｌ添加し、３７℃６分反応させた。０．５％のドデシル硫酸ナトリウム溶液を０．２５ｍｌ添加して、３４０ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定し酵素活性を算出した。また、測定直前に調製した第一試薬、第二試薬および溶解液を用いて同様に酵素サイクリング溶液を調製して同様に１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性の測定を行った。得られた値を１００％として、保存しておいた試薬を用いたときに得られる測定値を残存％として計算した。
３．ジアフォラーゼ活性の測定
酵素サイリング溶液を１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ８）にて1０倍に希釈し、０．１ＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ８）、０．０２５％のニトロブルーテトラゾリウム、０．１％の牛血清アルブミン、１ｍＭのβ−ＮＡＤＨを含有する反応液０．５ｍｌを試験管に取り、３７℃３分間加温し、希釈した酵素サイクリング溶液を１０μｌ添加し、３７℃６分反応させた。０．５％のドデシル硫酸ナトリウム溶液を０．２５ｍｌ添加して、５５０ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定し酵素活性を算出した。また、測定直前に調製した第一試薬、第二試薬および溶解液を用いて同様に酵素サイクリング溶液を調製して同様にジアフォラーゼ活性の測定を行った。得られた値を１００％として、保存しておいた試薬を用いたときに得られる測定値を残存％として計算した。
【００３５】
結果を図に示した（図３、図４及び図５参照）。図３には、各温度条件下での保存試薬のアルカリフォスファターゼ活性測定能力を示した。図４には、各温度条件下での保存試薬中の１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性の安定性を示した。また、図５には、各温度条件下での保存試薬中のジアフォラーゼ活性の安定性を示した。いずれの場合においても、トレハロース、スクロースいずれの糖を添加した場合で、４℃から５０℃の保存条件下、１ヶ月で７０％以上の活性を残存しており、アルカリフォスファターゼ活性測定能力においても、いずれの温度条件、いずれの糖条件でも８０％以上維持し、良好な安定性を示した。
【００３６】
〔実施例２〕高純度ＮＡＤＰの製造
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）（オリエンタル酵母社製）５０ｍｇを２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）にて１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように調製し、全量を２ｍｌ／ｍｉｎの流速でモノＱカラムＨＲ１０／１０に吸着させた。２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）から０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液まで、３０分間の直線的濃度勾配にて２ｍｌ／ｍｉｎの流速にて溶出させた。
経時的に分取した液の２０μｌと、０．１Ｍのジエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）、０．１２５％のニトロブルーテトラゾリウム、１ｍＭのコール酸、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、５０Ｕ／ｍｌの１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、６Ｕ／ｍｌのジアフォラーゼを含有する酵素サイクリング反応液とを混合し、３７℃６分反応させた。０．５％のドデシル硫酸ナトリウム溶液を０．２５ｍｌ添加して、５５０ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。
【００３７】
この測定値の結果と、溶出液の２８０ｎｍの吸光度パターンの結果から、素通り画分、および濃度勾配開始時間を０分として溶出時間９．５分の画分、１１．５分の画分、１２．５分の画分、１９分の画分、２０．５分の画分とＮＡＤＰ画分である１４分の画分を特定しそれぞれ分取し、ＮＡＤＰ画分とそれ以外の画分が混ざらないように分取した。
【００３８】
得られた、ＮＡＤＰ画分を蒸留水にて１．２５ｍＭに調製し、この２０μｌと、０．１Ｍのジエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）、０．１２５％のニトロブルーテトラゾリウム、１ｍＭのコール酸、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、６５Ｕ／ｍｌの１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、６Ｕ／ｍｌのジアフォラーゼを含有する酵素サイクリング反応液とを混合し、２５℃６分反応させ、２分間あたりの５５０ｎｍの吸光度変化量をバックグランド値として測定した。さらに、この反応液に０．０５Ｕ／ｍｌの牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ５μｌを添加して、２５℃２分間の吸光度の変化量を求めた。また、同様に１３０Ｕ／ｍｌおよび２６０Ｕ／ｍｌの１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いて測定した。
【００３９】
得られた結果から、バックグラウンドの吸光度変化を１としたとき、アルカリフォスファターゼ添加後２分間に変化した吸光度を計算した。                                  また、６５Ｕ／ｍｌ、１３０Ｕ／ｍｌおよび２６０Ｕ／ｍｌの１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いたときのβ−ＮＡＤの酵素サイクリング率を求めるために、１μＭのβ−ＮＡＤ２０μｌを２５℃に加温しておいた酵素サイクリング反応液に添加し、一定時間２５℃で反応させた。１回転／分のサイクリング率を０．２２Ａｂｓ／分として、１分あたりの５５０ｎｍの吸光度変化量から各酵素濃度条件におけるサイクリング率を算出した。
【００４０】
結果を表１にまとめた。精製されたＮＡＤＰを用いたアルカリフォスファターゼ活性測定において、バックグラウンドに対する良好な信号強度が得られ、高純度なＮＡＤＰを得ることができた。
【００４１】
【表１】
2005304483.tif 000002
【００４２】
〔実施例３〕アルカリフォスファターゼ活性の測定
実験例として、酵素サイクリング反応液として、１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．０１２５％ニトロブルーテトラゾリウム、１ｍＭコール酸、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、Bacillus megaterium由来ジアフォラーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）６．６Ｕ／ｍｌ、Bacillus sphaericus由来１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）１７．６Ｕ／ｍｌ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸０．０２５ｍＭとなるように調製された溶液１ｍｌを３７℃３分間加温し、続いて１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）溶液中に溶解した０Ｕ／ｍｌまたは０．１Ｕ／ｍｌの牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（ロシュダイアグノスティクス社製）５μｌを添加し、分光光度計を用いて、１分後と２分後それぞれの550nmの吸光度変化速度および、２分間に変化した550nmの吸光度を測定した。
【００４３】
〔比較例１〕比較例として、１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍｇ／ｍｌのパラニトロフェニルリン酸２ナトリウムとなるように調製された溶液１ｍｌを３７℃３分間加温し、続いて同様に０Ｕ／ｍｌまたは０．１Ｕ／ｍｌも牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ５μｌを添加し、分光光度計を用いて、１分後と２分後それぞれの550nmの吸光度変化速度および、２分間に変化した550nmの吸光度を測定した。
【００４４】
その結果、表２に示す実験例では、比較例に比べアルカリフォスファターゼから得られる吸光度変化速度が向上し、また、表３に示す比較例では１分後吸光度変化速度と２分後吸光度変化速度にほとんど変化が無いのに対して、実験例では１分後に比較して２分後吸光度変化速度が高くなっており、指数的な発色増加が認められたことから、実験例が、アルカリフォスファターゼ活性測定において、著しい高感度化を図れることが確認できた。
【００４５】
【表２】
2005304483.tif 000003
【００４６】
【表３】
2005304483.tif 000004
【００４７】
〔実施例３〕各ｐHにおける反応性                                                酵素サイクリング反応液として、１００ｍMのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、または、１００ｍMのＰＩＰＥＳ&mdash;ＮａＯＨ（ｐＨ８）、または、１００ｍMのＴＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）、または、１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９）、または、１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、または、１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ１０）、または、グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）、または、グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１１）を含む、０．０１２５％ニトロブルーテトラゾリウム、１ｍＭコール酸、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、Bacillus megaterium由来ジアフォラーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）６．６Ｕ／ｍｌ、Bacillus sphaericus由来１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）１７．６Ｕ／ｍｌ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸０．０２５ｍＭとなるように調製された溶液を８種類調製し、各反応液１ｍｌを３７℃３分間加温し、続いて１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）溶液中に溶解した０Ｕ／ｍｌまたは０．１Ｕ／ｍｌの牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（ロシュダイアグノスティクス社製）５μｌを添加し、分光光度計を用いて、１分後と３分後それぞれの550nmの吸光度変化速度および、２分間に変化した550nmの吸光度を測定した。
【００４８】
その結果、表４−１．及び表４−２に示すように、ｐH９．５を最大にｐH７．５からｐH１０．５までの範囲でアルカリフォスファターゼ活性測定における酵素サイクリングの良好な反応性が認められた。
【００４９】
【表４−１】
2005304483.tif 000005
【００５０】
【表４−２】
2005304483.tif 000006
【００５１】
〔実施例４〕各ニトロブルーテトラゾリウム塩濃度における反応性
酵素サイクリング反応液として、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２５％、０．０１２５％、０．００６２５％、０．００３１２５％、０．００１５６％、０．０００７８％、０．０００３９％、０．０００１９％の各濃度のニトロブルーテトラゾリウム(NBT)を含む、１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ｍＭコール酸、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、Bacillus megaterium由来ジアフォラーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）６．６Ｕ／ｍｌ、Bacillus sphaericus由来１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）１７．６Ｕ／ｍｌ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸０．０２５ｍＭとなるように調製された溶液を１１種類用意した。各反応液の１ｍｌを３７℃３分間加温し、続いて１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）溶液中に溶解した０Ｕ／ｍｌまたは０．１Ｕ／ｍｌの牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（ロシュダイアグノスティクス社製）５μｌを添加し、分光光度計を用いて、１分後と２分後それぞれの550nmの吸光度変化速度および、２分間に変化した550nmの吸光度を測定した。
【００５２】
その結果、表５−１、及び表５−２に示すように、NBT濃度が０．００１５６％から０．１％の範囲でアルカリフォスファターゼ活性測定における酵素サイクリングの良好な反応性が認められた。
【００５３】
【表５−１】
2005304483.tif 000007
【００５４】
【表５−２】
2005304483.tif 000008
【００５５】
〔実施例５〕各コール酸濃度における反応性
酵素サイクリング反応液として、０．３Ｍ、０．２Ｍ、０．１Ｍ、０．０２Ｍ、８ｍＭ、４ｍＭ、１ｍＭ、０．２５ｍＭ、６２．５μＭ、１５．６μＭ、３．９μＭの各濃度のコール酸を含む、１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．０１２５％ニトロブルーテトラゾリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、Bacillus megaterium由来ジアフォラーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）６．６Ｕ／ｍｌ、Bacillus sphaericus由来１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）１７．６Ｕ／ｍｌ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸０．０２５ｍＭとなるように調製された溶液を１１種類用意した。各反応液の１ｍｌを３７℃３分間加温し、続いて１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）溶液中に溶解した０Ｕ／ｍｌまたは０．１Ｕ／ｍｌの牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（ロシュダイアグノスティクス社製）５μｌを添加し、分光光度計を用いて、１分後と２分後それぞれの550nmの吸光度変化速度および、２分間に変化した550nmの吸光度を測定した。                                                          その結果、表６−１、及び表６−２に示すようにコール酸濃度が３．９μＭから０．３Ｍの範囲でアルカリフォスファターゼ活性測定における酵素サイクリングの良好な反応性が認められた。
【００５６】
【表６−１】
2005304483.tif 000009
【００５７】
【表６−２】
2005304483.tif 000010
【００５８】
〔実施例６〕各コール酸誘導体における反応性
酵素サイクリング反応液として、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸それぞれが１ｍＭ含まれる１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．０１２５％ニトロブルーテトラゾリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、Bacillus megaterium由来ジアフォラーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）６．６Ｕ／ｍｌ、Bacillus sphaericus由来１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）１７．６Ｕ／ｍｌ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸０．０２５ｍＭとなるように調製された溶液を５種類用意した。各反応液の１ｍｌを３７℃３分間加温し、続いて１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）溶液中に溶解した０Ｕ／ｍｌまたは０．０１Ｕ／ｍｌの牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（ロシュダイアグノスティクス社製）５μｌを添加し、分光光度計を用いて、１分後と３分後それぞれの550nmの吸光度変化速度および、３分間に変化した550nmの吸光度を測定した。                                                                                その結果、表７−１、及び表７−２に示すように、５種類のいずれのコール酸誘導体においても、アルカリフォスファターゼ活性測定における酵素サイクリングの反応性が認められた。
【００５９】
【表７−１】
2005304483.tif 000011
【００６０】
【表７−２】
2005304483.tif 000012
【００６１】
〔実施例７〕各ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸濃度における反応性
酵素サイクリング反応液として、１ｍＭ、４００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２μＭ、３．１２５μＭ、１．５６μＭ、の各濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を含む、１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．０１２５％ニトロブルーテトラゾリウム、１ｍＭコール酸、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、Bacillus megaterium由来ジアフォラーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）６．６Ｕ／ｍｌ、Bacillus sphaericus由来１２αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（旭化成ファーマ株式会社製）１７．６Ｕ／ｍｌ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸０．０２５ｍＭとなるように調製された溶液を１０種類用意した。各反応液の１ｍｌを３７℃３分間加温し、続いて１ｍＭ塩化マグネシウムを含む１００ｍＭジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）溶液中に溶解した０Ｕ／ｍｌまたは０．１Ｕ／ｍｌの牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ（ロシュダイアグノスティクス社製）５μｌを添加し、分光光度計を用いて、１分後と２分後それぞれの550nmの吸光度変化速度および、２分間に変化した550nmの吸光度を測定した。
【００６２】
その結果、表８−１、及び表８−２に示すように、NADP濃度が１．５６μＭから０．４Ｍの範囲でアルカリフォスファターゼ活性測定における酵素サイクリングの良好な反応性が認められた。
【００６３】
【表８−１】
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【００６４】
【表８−２】
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【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の方法は、高感度かつ簡便な測定が要求される臨床検査分野や食品検査分野において好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明のリン酸化された酸化型補酵素ＡＰを用いた場合のＡＬＰ活性測定の反応模式図
【図２】本発明のリン酸化された還元型補酵素Ａ’Ｐを用いた場合のＡＬＰ活性測定の反応模式図
【図３】各温度条件下での保存試薬のアルカリフォスファターゼ活性測定能力
【図４】各温度条件下での保存試薬中の１２αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性の安定性
【図５】各温度条件下での保存試薬中のジアフォラーゼ活性の安定性
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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